Brevet FR2543973A1 — publié le 19841012

Procédé de préparation de polysaccharides par voie bactériologique. La présente invention concerne un procédé pour la préparation de polysaccharides par voie bactériologique à l'aide de la bactérie Zoogloea ramigera, souche 115. D'après la littérature, on connait déjà la façon de préparer des polysaccharides à l'échelle du laboratoire à l'aide de la bactérie Zoogloea ramigera, souche 115 Toute- fois, il faut une durée de culture très longue De plus, on n'a pas pu obtenir une concentration élevée de polymères Il existe également un problème concernant la viscosité élevée du milieu de culture. Les inconvénients dus à une durée de culture longue sont, par exemple, l'infection du récipient de la culture et la faible productivité. La concentration faible de polymères obtenue avec les procédés antérieurs a entraîné par exemple des coûts de récupération élevés. Une viscosité élevée du milieu de culture soulève de grandes difficultés, particulièrement en ce qui concerne le transfert de l'oxygène à la bactérie. Ceci est extrêmement sérieux, car la bactérie en question a un métabolisme aérobie. Par suite des inconvénients mentionnés ci-dessus des procédés antérieurs connus, il est devenu rapidement impos- sible de produire des polysaccharides à l'échelle industrielle avec la bactérie Zoogloea ramigera, souche 115. Selon la présente invention, il est devenu possible d'une façon tout à fait surprenante de pallier les inconvé- nients mentionnés liés aux procédés antérieurs connus et de fournir un procédé de préparation des polysaccharides par voie bactériologique à l'aide de la bactérie Zoogloea ramigera, souche 115 Le procédé consiste (A) à développer la Zoogloea ramegera dans un milieu aqueux stérile contenant une source de carbone telle que glucose, amidon ou pommes de terre, une Z 5439 ? 3 source d'azote telle que chlorure d'ammonium, nitrate d'air- monium ou nitrate de potassium, des sels nutritifs tels que phosphates et sulfates, et un sel de fer tel;que Fe C 13 ou Fe 2 (SO 4)3 à une concentration de 0,15 à 45 mg/l, de préférence 0,5 à 5 mg/l, une suspension dense de ladite bactérie étant obtenue, et (B) à transférer ladite suspension dans un fermenteur contenant un milieu aqueux stérile avec la composition ci-dessus, fermenteur dans lequel la bactérie est abandonnée pendant environ 20 à 60 heures, de préfé- rence 30 à 50 heures, pour qu'elle consomme principalement la totalité de la source de carbone ajoutée, à une concen- tration initiale d'environ 10 à 50 g de source de carbone par litre, un produit faiblement visqueux contenant 10 à g/l de polymère étant obtenu, ledit polymère étant présent sous la forme de capsules. La souche 115 connue de la bactérie Zoogloea ramigera utilisée selon la présente invention, est déposée à The American Type Culture Collection, USA sous le No ATCC 25935. Le polysaccharide obtenu par le procédé conforme à l'invention est constitué habituellement, entre autres choses, par du glucose, du galactose et de l'acide pyruvique. L'addition de sel de fer au milieu de culture s'est révélée fortement favorable à l'augmentation de la vitesse de croissance de la bactérie De préférence, on utilise une solution de fer stérile filtrée La quantité de sel de fer calculée en Fe 3 +, doit être au moins de 0,15 mg/l et au maximum de 45 mg/l du milieu de culture; De préférence, elle est au moins de 0,5 mg/l et au maximum de 5 mg/l. Le p H du milieu de culture doit normalement être au moins de 6,0 et pas supérieure à 8,0, de préférence il est compris entre 6,5 et 7,5. Pendant le premier stade de la culture, la crois- sance de la bactérie est stipulée La croissance s'arrêtera quand la quantité d'azote initialement ajoutée sera consommée, puisque l'azote est l'élément qui limite la croissance. Le stade suivant de la culture consiste à produire le polysaccharide qui est stocké sous la forme de-capsules volumineuses environnant la bactérie. Il faut qu'une source de carbone soit présente dans le milieu de culture au moment de la production du poly- saccharide, d'une part pour fournir à l'organisme la matière de départ qui est transformée en blocs constitutifs qui sont inclus dans le polysaccharide, d'autre part, pour satis- faire le besoin en énergie de la bactérie. Selon un mode de réalisation de la présente inven- tion, la concentration en polymère du produit faiblement visqueux provenant du stade (B) ci-dessus peut être encore augmenté par une addition contrôlée successive d'une quanti- té supplémentaire-de source de carbone dans un stade ulté- rieur (F). Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la concentration en polymère du-produit faible- ment visqueux provenant du stade (B) peut être encore aug- mentée par une addition contrôlée successive de quantités supplémentaires de source de carbone et de source d'azote dans un stade ultérieur (G). Quand la source de carbone ajoutée initialement dans le stade (B) est consommée, l'addition de quantité sup- plémentaire de source de carbone dans les stades (F) et (G), respectivement, est réalisée convenablement à partir d'un récipient séparé à l'aide d,'une pompe qui est commandée par un signal provenant d'un analyseur de C 02 L'analyseur contrôle continuellement le taux de C 02 dans le gaz sortant du fermenteur. Quand l'addition de la source de carbone au milieu de culture est effectuée, le taux de C 02 dans le gaz sortant du fermenteur augmente jusqu'à ce que la quantité de subs- trat envoyé dans le fermenteur par une pompe soit consommée. Ensuite, le taux de C 02 diminue rapidement et l'addition de la source de carbone est répétée Grâce à ce procédé unique, l'addition de la source de carbone peut être contrôlée, de sorte que la concentration de la source de carbone sera main- tenue dans un intervalle désiré pendant la phase o le polysaccharide est synthétisé. Un taux de CO 2 approprié est au moins-de 0,2 et au maximum de 3,0 %, de préférence il est compris entre 0,7 et 1,3 %. Aux modes de réalisation ci-dessus qui comprennent les stades (F) et (G) respectivement, o davantage de source de carbone, et davantage de source de carbone et de source d'azote sont respectivement ajoutées, la concentration totale de source de carbone dans les stades (B) plus (F) et (B) plus (G), respectivement, est de 15 à 75 g/l, de préférence de 20 à 50 g par litre. Comme source de carbone dans les stades (F) et (G), respectivement,-on peut utiliser par exemple le lactose, le glucose, l'amidon ou les pommes de terre. Les stades (B) plus (F) et (B) plus (G) sont respec- tivement terminés de préférence en l'espace de 30 à 48 heures. Grâce à une combinaison de l'addition de source de carbone et de source d'azote dans le stade (G), on obtient un avantage supplémentaire d'une production de polysaccharide uniforme et élevée pendant tout le stade (G). Selon un mode de réalisation approprié de l'inven- tion, on utilise l'amidon comme source de carbone, le chlorure d'ammonium comme source d'azote et Fe C 13 comme sel de fer. Normalement, la récupération du polysaccharide et de la bactérie dans le stade (C) est effectuée par précipi- tation en ajoutant un alcool tel que l'éthanol ou l'isopro- panol On recueille ensuite le précipité obtenu d'une façon appropriée par centrigutation (D) puis séchage usuel (E) pour avoir le produit fini. Les stades (C), (D) et (E) peuvent toutefois être réalisés par-d'autres voies, par exemple selon l'utilisation du produit fini. On va maintenant expliquer l'invention en détail en se référant à la figure unique ci-jointe, qui montre un schéma du procédé pour la préparation de polysaccharides selon la présente invention, et à l'aide des exemples de réalisation ci-après, parmi lesquels les exemples 1 à 5 concernent des essais comparatifs n'appartenant pas à la présente invention, tandis que les exemples 6 à Il concer- nent le procédé de la présente invention. Sur la figure unique sont représentés trois modes de réalisation différents de l'invention Les différents repères avec des lettres sur la figure ont la significa- tion suivante: - A Stade de développement dans lequel on laisse se développer la bactérie dans un milieu aqueux contenant une source de carbone, une source d'azote, des sels nutritifs et un sel de fer, selon la présente invention. B Stade de culture dans fermenteur o se réalise la production de polysaccharides. C Stade de récupération comprenant par exemple un stade de précipitation o le polysaccharide et la bacté- rie sont précipités. D Stade de centrifugation o le produit précipité est recueilli. E Stade de séchage. F Stade de culture dans un fermenteur o a lieu une addition successive supplémentaire de source de carbone. G Stade de culture dans un fermenteur o a lieu une addition successive supplémentaire de source de carbone et de source d'azote. La présente invention est illustrée par les exem- ples descriptifs et non limitatifs ci-après. Exemple 1 On transfère une colonie de la bactérie Zoogloea ramigera, souche 115, d'une plaque d'agar-agar dans une 25439 ? 3 fiole erlenmeyer munie d'un réducteur de diamètre de 2 litres (A) contenant 250 ml d'un milieu stérile consti- tué par g/litre de la solution aqueuse Glucose 25 K 2 HPO 4 2 KH 2 PO 4 1 NH 4 CI 1 Mg SO 4 x 7 H 20 0,2 Extrait de levure (Difco) 0,01 On place ensuite le ballon pendant 18 heures sur une secoueuse rotative ( 100 à 300 tours/minute) ayant une température de 260 C On utilise la suspension de bacté- ries obtenue pour inoculer (B) un milieu stérilisé dans un fermenteur Le milieu a la même composition que celle mentionnée ci-dessus On insuffle dans le fermenteur, 0,5 litre d'air par litre de milieu et par minute, tout en agitant à environ 800 tours/minute La température du fermenteur est de 260 C Le p H du milieu est réglé à 7,0 par un titrage automatique avec Na OH. Le glucose est consommé après 95 heures de culture et la concentration de polysaccharide est de 11,5 g/l. Exemple 2 On répète le procédé de l'exemple 1, sauf qu'au stade (B) on ajoute une solution de Ca C 12 au milieu La quantité totale de calcium ajoutée est de 3 mg/i du milieu de culture Le glucose est consommé après 95 heures et la concentration de polysaccharide est de 10,1 g/l. Exemple 3 On répète le procédé de l'exemple 1, sauf qu'au stade (B) on ajoute une solution de Mn SO 4 au milieu La quantité totale de manganèse ajoutée est de 3 mg/i du milieu de culture Le glucose est consommé après 85 heures et la concentration de polysaccharide est de 10,2 g/1. Exemple 4 On répète le procédé de l'exemple 1, sauf qu'au stade (B) on ajoute une solution de Cu C 14 La quantité totale de cuivre ajoutée est de 3 mg/l du milieu de cul- ture Le glucose est consommé après 88 heures et la concen- tration de polysaccharide est de 11,0 g/l. Exemple 5 On répète le procédé de l'exemple 1, sauf qu'au stade (B) on ajoute une solution de Zn C 12 La quantité totale de zinc ajoutée est de 3 mg/1 du milieu de culture. Le glucose est consommé après 90 heures et la concentration de polysaccharide est de 9,2 g/l. Exemple 6 On répète le procédé de l'exemple 1, sauf qu'aux stades (A) et (B) on ajoute une solution de Fe C 13 au milieu La quantité totale de fer ajoutée est de 3 mg/l du milieu de culture Le glucose est consommé déjà apres heures et la concentration de polysaccharide est de 13,2 g/l La viscosité est de 40 centipoises ( 0,04 Pa s). Exemple 7 On établit le rapport optimal C/N d'un milieu de culture pour la production de polysaccharide extracellulaire avec la souche 115 de Zoogloea ramigera dans des cultures discontinues séparées sans système d'alimentation On utilise pour les essais une concentration de glucose d'environ 25 g/l En faisant varier la quantité de source d'azote ajoutée ( 0,25-4 g de NH 4 Cl/1) au milieu pour les différentes cultures, on a établi que la production opti- male de polysaccharides à partir du glucose ajouté est obtenue habituellement pour 0,5 à 2 g de NH 4 Cl/l La durée totale de la culture est souvent de 36 à 60 heures. Exemple 8 Le rapport optimal C/N d'un milieu de culture, quand on produit du polysaccharide avec la souche 115 de Zoogloea ramigera dans un système discontinu qui, grâce à un système d'alimentation est approvisionné en source de carbone supplémentaire par addition de glucose, a été établi en général comme étant compris entre 10 et 25 En tolérant une teneur en azote supérieure pendant le processus initial discontinu, il se développe une masse de cellules supérieure à la normale Une fois le glucose initial consom- mé, l'addition du glucose commence La masse de cellules existante transforme efficacement le glucose ajouté en polymère Le dosage du glucose est contrôlé automatique- ment au moyen d'une valeur de signal provenant de l'analy- seur de CO 2 qui mesure le taux de Ca 2 dans le gaz sortant du fermenteur L'addition du glucose commence quand la valeur de signal diminue au-dessous d'une valeur affichée. La durée de culture nécessaire est généralement d'environ 36 à 54 heures. Exemple 9 On établit le taux optimal de 2 dissous dans un milieu de culture avec la souche 115 de Zoogloea ramigera dans des cultures en discontinu On fait varier la vitesse d'aération dans des essais séparés L'agitation qui influ- ence également le taux d'O 2 dissous est maintenue constante à 800 tours par minute Si le débit d'air traversant le fermenteur est maintenu à 0,251,5 vvm (volume d'air par volume de milieu et par minute) les meilleures conditions pour convertir le glucose en polymère sont obtenues Le taux de 2 dissous n'est jamais inférieur à 20 % de la valeur de saturation pour les essais qui doninent une bonne conversion du glucose en polymère. Exemple 10 Selon la présente invention, on a établi que le fer était un élément nécessaire à l'état de traces pour une production efficace du polymère avec la Zoogloea ramigera. Il faut ajouter du fer pendant la phase de croissance de la bactérie D'une façon appropriée, cette addition est Z 543973 effectuée en ajoutant par dose dans le milieu du fermen- teur une solution de fer (à environ 0,01 M) au début de la culture Le taux de sel de fer dans le milieu du fermenteur doit être de 0,15 à 45 mg/l, de préférence de 0,5 à 5 mg/l, calculé en fer Les exemples 7 à 9 ci- dessus sont effectués en ajoutant du fer au milieu sous la forme d'une solution de Fe C 13 à une concentration de 2,5 mg/l de milieu du fermenteur L'addition de fer donne comme résultat que la durée totale du procédé peut être ramenée de la durée normale d'environ 100 heures à environ 36-60 heures. Exemple 11 Description de la culture avec apport de glucose, o le rapport C/N est établi. Essai 1: La concentration initiale du glucose est de 25 g/l et la concentration d'azote est de 0,26 g/l. En outre le milieu contient également les composés suivants (g/l): K 2 HPO 4, 2 KH 2 PO 4, 1 Mg SO 4 x 7 H 20 0,2 extrait de levure (Difco) 0,01 Essai 2: On ajoute par dose 2,5 mg/l de Fe C 13 x 6 H 20 O Le glucose ajouté au départ est consommé en 50 heures. Une addition supplémentaire de glucose ( 5 g/l) dans le milieu du fermenteur entraîne une concen- tration accrue du polymère, mais la synthèse du polymère est ralentie. Concentration finale du polymère: 18 g/l Masse de cellules finale: 2,3 g/l Viscosité:250 c P ( 0,25 Pa s) La concentration en azote du milieu de culture est de 0,52 g/l, mais le reste est conforme à l'essai 1 La production de la masse de cellules est arrêtée après 14 heures La quantité initiale de glucose est consommée après 22 heures L'ad- dition de glucose frais entraîne une conversion rapide du glucose en polymère A la fin de la culture 225 c P ( 0,225 Pa s). Essai 3 La concentration en azote du milieu de culture est de 1,04 g/l, mais le reste est inchangé confor- mément à l'essai 1 La production de la masse de cellules est arrêtée après 18 heures Le glucose ajouté au départ est consommé après 20 heures. L'addition de glucose frais entraîne une conver- sion très rapide du glucose en polymère mais de grandes quantités de glucose sont perdues dans ce cas sous forme de CO 2 A la fin de la culture ( 45 heures) la concentration du polymère est de g/l La masse de cellules est de 9,8 g/l La viscosité est de 230 c P ( 0,23 Pa s). Les modes de réalisation ci-dessus montrent que l'absence de fer dans le milieu de culture, ou l'utilisation d'autres sels métalliques tels qu'un sel de calcium, un sel de manganèse, un sel de cuivre ou un sel de zinc, donne une durée de culture bien plus longue que le procédé selon l'invention, o une quantité spécifique de sel de fer est utilisée. Il doit être bien entendu que la description qui précède n'a été donnée qu'a titre purement illustratif et non limitatif et que toute variante ou modification peut y être apportée sans sortir pour autant du cadre général de la présente invention, tel que défini dans les revendications ci-annexées. 1 l REVENDICATIONS 1 Procédé pour la préparation de polysaccharides par voie bactériologique à l'aide de la bactérie toogloea ramigera souche 115, qui consiste (A) à développer le Zoogloea ramigera dans un milieu aqueux stérile contenant une source de carbone telle que glucose, amidon ou pommes de terre, une source d'azote telle que chlorure d'ammo- nium, nitrate d'ammonium ou nitrate de potassium, des sels nutritifs tels que phosphates et sulfates, et un sel de fer tel que Fe C 13 ou Fe 2 (SO 4)3 à une concentration de 0,15-45 Mg/l, de préférence 0,5 à 5 mg/l, une suspension dense de ladite bactérie étant obtenue,-et (B) à transfé- rer ladite suspension dans un fermenteur contenant un milieu aqueux stérile ayant la composition ci-dessus, fermenteur dans lequel la bactérie est abandonnée pendant environ 20 à 60 heures, de préférence 30 à 50 heures, pour qu'elle consomme principalement toute la source de carbone ajoutée, à une concentration initiale d'environ 10 à 50 g de source de carbone par litre, un produit faiblement visqueux contenant 10 à 35 g/l de polymère étant obtenu, ledit polymère étant présent sous la forme de capsules. 2 Procédé selon la revendication 1, qui consiste (C) à récupérer le produit à partir du stade (B), ladite récupération comprenant une précipitation avec un alcool, par exemple l'éthanol ou l'isopropanol, (D) un stade de séparation mettant en oeuvre la centrifugation afin de recueillir le précipité obtenu et (E) de préférence, le séchage du produit séparé pour avoir un produit fini. 3 Procédé selon les revendications 1 ou 2, qui consiste à augmenter encore la concentration du polymère du produit faiblement visqueux provenant du stade (B), par (F) une addition contrôlée successive de source de carbone. 4 Procédé selon les revendications 1 ou 2, qui consiste à augmenter encore la concentration du polymère du produit faiblement visqueux provenant du stade (B) par (G) une addition contrôlée successive de source de carbone et de source d'azote. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, qui consiste à utiliser de l'amidon comme source de carbone, du chlorure d'ammonium comme source d'azote et Fe C 13 comme sel 6 Procédé selon par le fait que les stades -minés en l'espace de 30 à 7 Procédé selon par le fait que les stades minés en l'espace de 30 à 8 Procédé selon térisé par le fait que le de carbone dans les stades 9 Procédé selon de fer. la revendication 3, caractérisé (B) et (F) sont ensemble ter- 48 heures. la revendication 4, caractérisé (B) et (G) sont ensemble ter- 48 heures. les revendications 3 ou 4, carac- lactose est ajouté comme source (F) et (G) respectivement. les revendications 3 ou 4, carac- térisé par le fait que l'addition successive de source de carbone dans les stades (F) et (G) est commandée,respec- tivement, par un signal provenant d'un analyseur de CO 2.