Brevet FR2543571A1 — publié le 19841005

PREPARATION ENTOMOPATHOGENE ne A FAIBLE ACTIVITE DE L'EAU ET UTILISATION COMME INSECTICIDE BIOLOGIQUE La présente invention concerne une préparation à base de cham- pignons entomopathogènes. Elle concerne plus particulièrement une préparation entomopathogène a faible activité de l'eau présentant une longue viabilité et une résistance améliorée à la température. Cette préparation est utilisée en lutte biologique et notamment dans la lutte biologique contre les insectes. Il est connu d'après l'article publié par PERRON (1978 Biological control of insectes pests by entomogenous fungi. Ann. Rev. Entomol. 23 409-42) de lutter contre les insectes par épandage de poudres constituées de conidiospores de Beauvaria bassiana et d'un support inerte essentiellement à base de kaolin ou des poudres constituées de conidiospores de Hetarhizium anisopliae développées sur du riz ou des céréales diverses broyées. Ces champignons entomopathogènes sont cultivés au moins en partie sur support nutritif solide avec formation de spores asexuées ou conidiospores. Cette technique de culture, en raison des manipulations nombreuses qu'elle nécessite, des rendements faibles qu'elle procure et de son coût élevé est difficilement transposable à l'échelle industrielle. Afin de diminuer le nombre des manipulations, une technique de culture en milieu liquide de ces champignons a été essayée. La formation des spores secondaires ou blastospores obtenue par cette technique de culture en milieu liquide est plus facilement transposable au stade industriel que la technique de culture sur support solide mais en revanche la conservation de ces blastospores est beaucoup plus difficile. En effet, ces spores sont extrêmement sensibles à la température et à la dessiccation. Des préparations humides ont été obtenues mais elles sont sensibles aux contaminations et ont une durée de conservation limitée à deux mois pour une température de stockage de + 40C et une conservation très faible pour une température de + 230C (SIEMASZKO Ann. Zool Ecol. anim 1973, 5 (1), p. 69-79). Suite aux difficultés de stockage de ces préparations humides, différents moyens de séchage ont été tentés afin d'améliorer la durée de conservation de ces blastospores. Ainsi dans le brevet français n" 7235452 publié sous le nO 2 202 159 est décrit un procédé d'obtention de préparations entomopathogènes où les blastospores sont fixées sur un support inerte base de silice puis deshydratées en présence d'un mélange protecteur à base de glutamate de sodium, de saccharose et d'huile de paraffine-contenant un glycéride oléique polyoxyéthyléné. Mais ces préparations doivent etre conservées à + 40 C ou être conditionnees sous vide ou sous azote. Les difficultés rencontrées au niveau de la conservation des blastospores étaient telles que la technique de production de blastospores en milieu liquide, suivie d'un séchage, a été pratiquement abandonnée. Vu l'importance écotoxicologique de ces préparations, des études ont été reprises et ont permis de réaliser un inoculum entomopathogène, objet de la présente invention, présentant une longue viabilité et une résistance améliorée à la température caractérisé par le fait que l'on inclut les blastospores produites par ces champignons dans un gel de polymère, que l'on abaisse l'activité de l'eau dans l'inoculez a une valeur inférieure a 0,3 et de préférence inférieure à 0,1 et qu'on la maintient à cette valeur. L'invention a également pour objet la préparation de ces inoculum ainsi que leur utilisation en tant qu insecticide biologique. Le moyen selon l'invention pour préparer ces inoculum consiste à inclure les blastospores dans un polymère auquel on fait subir un traitement de réticulation au moins partiel et à modifier la disponibilité de l'eau de façon à bloquer son pouvoir calorique et de solvation. Cette disponibilité de l'eau exprimée en terme d'activité de l'eau permet lorsqu'elle atteint des valeurs entre mement faibles de soustraire les blastospores aux actions néfastes des solutés présents dans le milieu de culture, des contaminants capables de se multiplier dans le milieu et au pouvoir de transmission calorique de l'eau. Cette activité de l'eau minimale au-delà de laquelle les blastospores seront préservées est fonction des constituants du milieu de culture, du polymère dans lequel sont incluses les blastospores. La valeur limite de l'activité de l'eau en-dessous de laquelle l'ensemble de ces facteurs ne présente qu'une influence réduite, est de 0,3 et de préférence de 0,1. Les valeurs de l'activité de l'eau sont déterminées par la méthode dite des solutions aqueuses saturées (MULTON, 1981, Techniques d'analyse et de contrôle dans les industries agroalimentaires, APRIA) ou par leur mesure directe à l'aide d'un hygromètre (Hygroscop) ROTRONIC BT, J. RICHARD et PEKLY. Les champignons pouvant être mis en oeuvre selon la présente invention appartiennent au groupe des Fungi imperfecti. Ils sont choisis notamment parmi les espèces suivantes Beauvaria bassiana, Metarhiziuin anisopliae, Sorosporella uvella, Beauvaria tenella... Bien que des blastospores de toute provenance soient également utilisables, les essais et les résultats rapportés dans la présente invention ont porté sur une espèce de champignon entomopathogène Beauvaria bassiana souche Bb 169 (Collection INRA). Le milieu de culture des champignons entomopathogènes renferme au moins une source hydrocarbonée, des sels minéraux, une source azotée et éventuellemént des facteurs de croissance. La source hydrocarbonée est choisie parmi les sucres tels que le glycérol, le sorbitol, le saccharose, le glucose, le fructose ; les alcools ; les di ou polyosides et les polysaccharides. La source azotée peut être d'origine minerale telle que nitrate d'ammonium, de potassium ou d'origine organique telle que notamment lysine, arginine, glycine, glutamate, extrait soluble de mais, extrait de levure La concentration de la source hydrocarbonée dans le milieu de culture varie de 10 à 30 g/I, celle de la source azote varie de I à 20 gil. L'inclusion des blastospores dans le polymère selon l'invention peut être réalisée à partir de la culture liquide directement ou à partir d'un concentré de blastospores obtenu après filtration ou centrifugation. On fait subir au dit polymère un traitement de réticulation au moins partiel. Par traitement de réticulation au moins partiel, on entend un traitement susceptible de modifier la structure du polysaccharide tel que traitement thermique, traitement par un sel métallique ou par un autre polymère. Le polymère dans lequel sont incluses les blastospores doit pour répendre aux projets de normes antipollution être biodégradiable. Aussi, les polymères à base de polysaccharides sont utilisés de préférence aux autres polymères. Ils présentent l'avantage d'être rapidement biodégradables, de libérer ainsi facilement les blastospores et de permettre leur germination, ils influent fortement sur le devenir du champignon après inoculation car - la taille des particules de polysaccharide permet la meilleure dissémination sur les semences ou le végétal à protéger et permet d'appliquer des quantités d'inoculum minimales ; - la poudre de polysaccharide se réhumidifie rapidement ; - le polysaccharide se lie facilement aux particules de sols, aux semences, aux parties de la plante, aux insectes. Les polysaccharides sont atantageusement d'origine bacterienne ou végétale. Les polysaccharides d'origine bactérienne sont obtenus par fermentation d'un hydrate de carbone par un micro-organisme notamr ment du genre Xanthomonas ou Arthrobacter ou par des champignons appartenant par exemple au genre Sclerotium. Les polysaccharides d'origine végétale peuvent avoir des provenances diverses telles que notamment algues (alginates, carraghénanes) exsudats de plantes (gomme karaya, adragante) et de graines (guar, caroube). La réticulation peut se faire par exemple pour le cas des alginates par des sels métalliques tels que de calcium. Selon un mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, on prépare un milieu de culture que l'on ensemence avec la souche de 3eauvaria bassiana. Après quelques jours d'incubation, la culture totale ou les spores obtenues après centrifugation de la culture sont mélangées à un polymère ; après réticulation le gel obtenu est déshydraté. La concentration en polymères dans la suspension à sécher se situe entre 1 et 2 %. On peut ajouter à la suspension :avant séchage des additifs tels que les constituants de la source hydrocarbonée précédemment cités ou tout autre produit inerte. L'ensemble spores, gel, sel minéral, source hydrocarbonée et source azotée constitue entre 2 et 10 Z en poids de la suspension à sécher. L'étape de déshydratation consiste à diminuer ltactivite de l'eau en-dessous de sa valeur critique c'est à dire en dessous de 0,3 et de préférence en dessous de 0,1. L'étape de déshydratation peut se faire de diverses manières en une ou plusieurs étapes. Selon l'invention, un simple contact à l'air dans les conditions habituelles de température et d'humidité relative n'est pas suffisant. Selon un premier mode de mise en oeuvre de l'étape de déshy- dratation, on fait appel à des techniques qui permettent d'obtenir une dessiccation plus poussée telles que - flux d'air chaud et sec, évidemment dans les conditions compatibles avec la survie du micro-organisme. - séchage à l'air complète par une deshydratation de la poudre obtenue dans une enceinte hermétiquement close contenant une solution saturée en un composé présentant l'activité de l'eau requise, évoluant vers l'équilibre avec l'inoculum. Selon un deuxième mode de mise en oeuvre de l'étape de déshydratation, on peut faire appel à une technique de séchage par atomisation, qui, de manière inattendue conduit à des inoculum dans lesquels la survie du micro-organisme est préservée alors même que les températures des gaz de traitement sont largement su périeures à celles que le micro-organisme peut subir. Bien évidemment, on peut combiner plusieurs de ces techniques. Ainsi du point de vue économique, il est préférable d'adopter un système de séchage bi-étagé comme celui utilisé pour la déshydratation du lait. Ce système se compose d'un séchage par atomisation qui lorsqu'il est effectué avec une température convenable conduit à une activité de l'eau de l'ordre de 0,2 à 0,4 puis un sechage par lit fluidisé jusqu a notamment une activité de l'eau inférieure à 0,1. L'utilisation d'un système bi-étagé permet d'augmenter le débit de la substance à sécher, par conséquent l'écart de température entre la sortie et l'entrée dans l'atomiseur. Le lit fluidisé utilisé pour terminer le séchage et atteindre une activité de l'eau inferieure à 0,1 consomme 2 à 4 fois moins d'énergie pour l'élimination de la dernière fraction d'eau que l'atomisation. Globalement l'économie d'énergie réalisée par rapport à un atomiseur simple est de l'ordre de 20 t. Pour maintenir l'activité de l'eau à une valeur optimale, on fait appel à un mode d'emballage étanche limitant les transferts d'eau entre l'atmosphère environnante et l'atmosphère interne des inoculum lors du stockage. Les inoculum se présentent sous forme de particules, à structure souple, facile à mettre en oeuvre, on peut utiliser avantageusement pour leur application la pulvérisation, la remise en suspension dans de l'eau ou dans une solution, l'épandage tel quel sur les sols ou sur les végétaux. Par ailleurs, on peut apporter l'inoculum sur un support tel que à base de silice. Ce support peut avantageusement être constitué par une silice précipitée de surface BET comprise entre 50 et 600 m2/g. Dans le cas où l'on fait appel à une méthode impliquant un absorbant tel que la silice, cet absorbant peut en plus remplir une fonction de support et charge facilitant la mise en oeuvre et la manipulation de l'inoculum. Dans le cas particulier où l'on introduit une charge minérale présentant des qualités absorbantes telle que par exemple la silice la valeur limite de I'activité-de l'eau permettant une conservation des blastospores est déplacée vers des valeurs plus élevées. Ces inoculum sont utilisés comme insecticides biologiques, ils sont notamment actifs contre les aphides, les diptères, les coléoptères, les lépidoptères. La présente invention sera plus aisément comprise à l'aide des exemples suivants donnes à titre indicatif mais nullement limitatif. Exemple 1 10) Culture de blastospores de Beauvaria bassiana La culture des blastospores est développée durant 5 jours en milieu à base d'extrait soluble de mals/saccharose de composition suivante (CATROUX et al. 1970) extrait soluble de mais 20 g/l saccharose 30 KN03 5 Ka, P04 6,8 CaC03 0,2 NgSO4 7H20 0,1 H20 qsp 1.000 20) Préparation d'un inoculum polymère xanthane-farine de graines de caroube On prépare deux solutions (les valeurs sont données pour la préparation de 300 g d'inoculum). a) Solution de gomme xanthane : polysaccharide de type anionique de PM > - 2.106 résultant de la fermentation d'hydrates de carbone par un micro-organisme de genre Xanthomonas que l'on désignera par produit 1. On amène 100 ml d'eau distillée à 70-80 C, on ajoute 1,5 g du produit 1, on maintient cette température 20 à 30 minutes, sous agitation puis on le ramène entre 40 et 50 C, b) Solution de farine de graine de caroube = polysaccharide constitué d'unites - - D - manno pyranosyl (liaisons 1 - 4) une sur quatre ou cinq étant substituée en C6 par un - D - galacto-pyrano- syl PM = 3,1 10 que l'on désignera par la suite par produit 2. On procède de la meme façon en remplaçant le produit l par 1,5 g de farine de graine de caroube. Lorsque les deux solutions sont à 40-450C, on ajoute sous agitation, à chacune d'elle, 50 ml de suspension de spores de Beauvaria bassiana. On verse alors, en agitant vigoureusement le mélange culture + gomme xanthane dans le mélange culture + farine de graine de caroube. L'obtention d'un gel consistant est instantanée. 30) Préparation d'un inoculum polymère alginate CaSO4 Deux étapes sont nécessaires a) Préparation de la suspension de Beauvaria bassiana dans un alginate de viscosité comprise entre 150 10-3 et 1.000 10-3 Pa.s. On dissout dans 80 mi de suspension de spores 1 g d'alginate. Pour cela, on disperse la poudre en pluie fine sur la culture en l'agitant continuellement jusqu a solubilisation complète de l'alginate. b) Gélification On ajoute à la suspension de spores de Beauvaria bassiana dans l'alginate 20 ml d'une solution de CaS042H20 à 6 g/l. La prise en masse du gel est instantanée. Comme dit précédemment, le séchage est un point important puisque les modes de séchage utilisés dans l'art antérieur pour la survie des blastospores telles que de Beauvaria bassiana conduisaient à la destruction-des blastospores. Dans les exemples suivants, on règle l'activité de l'eau au moyen de solutions saturées dont les valeurs des activités de l'eau à une température de 250C sont exposées dans le tableau 1. : SOLUTES (solutions saturées) Activité de l'eau à 250C : Actigel (composé déshydratant)- : 0,04 : NaOH : 0,07 : KC2H302 - 1,5 H20 . 0,23 CaC12 - 6H20 0,31 : Ca(N03)2 4H2O : 0,51 : CuC12 0,69 : NaCl 0,73 : KC1 : 0,84 La figure 1 représente l'allure des courbes de survie des blastospores placées à ces différentes activités de l'eau Courbe aw 1 0,07 2 0,23 3 0,31 4 0,51 5 0,68 - à aw = 0,07 la survie des blastospores est de 100 % durant au moins un an de stockage à 280C. - à aw = 0,23 et 0,31 la perte des blastospores est de 90 Z environ après 100 jours de stockage à 280C. La figure 2 représente l'allure des courbes de survie des gels contenant les blastospores après addition de 10 à 40 % du poids du gel de silice naturelle ou synthétique, séchage et stockage 105 jours à 280 C à différentes activités de l'eau. Courbe (1) addition de silice (I) à une culture de Beauvaria Bassiana Courbe (2) spores sans additif Courbe (3) spores + silice FLO Courbe (4) spores + silice (I) Courbe (5) spores + silice (II) On a choisi 3 types de silice - une silice naturelle (silice Clarcel FLO à base de perlite) - une silice précipité -silice (I)- commercialisée sous la marque Zeosil 45 présentant - une surface BET 250 m/g - une prise d'huile 320 cm /100 g - CTAB 170 m2/g - une silice expérimentale -silice (Il)- présentant - une surface BET 200 m/g - une prise d'huile 350 cm /100 g - CTAB 90 m26g La présence de silice permet une conservation des blastospores de Beauvaria Bassiana busqua une activité de l'eau de 0,3 donc augmentée par rapport au gel contenant les spores sans additif. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'inoculum entomopathogène caractérisé en ce qu T on inclut les spores des champignons entomopathogènes dans un gel de polymère et que l'on abaisse l'activité de l'eau en-dessous de 0,3 et qu'on la maintient à cette valeur. 2. Procédé de préparation selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on abaisse l'activité de l'eau en-dessous de 0,1 et qu'on la maintient à cette valeur. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère est du groupe des polysaccharides auquel on fait subir une réticulation au moins partielle. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polymère est réticulé par l'un des modes de traitement suivants thermique, à l'aide d'un sel métallique, au moyen d'un autre polymère. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que le polymère est un hétéropolymère à base de gomme xanthane et de farine de caroube. 6. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que le polymère est un polymère à base d'alginate. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient une source hydrocarbonée choisie parmi les sucres, les alcools, les di ou polyosides et les polysaccharides. 8. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le milieu de culture contient une source azote minérale telle que le nitrate d'ammonium, de potassium ou organique telle que la lysine, l'arginine, la glycine et le glutamate, l'extrait soluble de malus, l'extrait de levure. 9. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le champignon entomopathogène appartient au groupe des Fungi imperfecti. 10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que le champignon entomopathogène est choisi parmi Beauvaria Bassiana, Metharizium anisopliae, Sorosporella uvella, Beauvaria tenella. 11. Procédé selon la revendication 9 et 10 caractérisé en ce que le champignon entomopathogène est Beauvaria bassiana. 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activité de l'eau est abaissée par atomisation. 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activité de l'eau est abaissée par atomisation et passage sur un lit fluidisé. 14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inoculum est apporté sur un support à base de silice. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le support est constitué par une silice précipitée de surface BET comprise entre 50 et 600 m2/g. 16. Inoculum obtenu en mettant en oeuvre le procédé selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisé en ce qu'il comprend un champignon entomopathogène inclus dans un gel de polymère au moins partiellement réticulé. 17. Application de l'inoculum selon l'une quelconque des revendications précédentes à la lutte biologique contre les insectes.