Brevet FR2547583A1 — publié le 19841221

Cé paci antibiotique La présente inventio concerne une nouvelle substance antibiotique, la cépacine, qui a été analysée et qui s'est avérée être constituée de deux composés, à savoir la 5-l 3-l 3(hepta-1,2-dién-4,6diynyl)oxiran-2-yll-3-hydroxy-1-propényll dihydro-2 ( 3 H)-furanone, composé de formule HC-EC-C-C-CH=C=CH-CH CH-CH-CH=CH /CH C C'H 2 H 2 appelé cépacine A, et la 5-ll 3-l 3-(hepta-1,2-dién-4,6-diynyl)2oxiranyll-2-oxiranyllhydroxy-méthylldihydro-2 ( 3 H)-furanone, 15 composé de formule 0 o O o HC-C-C=C-CH=C=Cl I-CH CH-C 4 $CH H CH C Ril CH 2 C 2 appelé cépacine B. Chacun des composés ci-dessus fait preuve d'une action sur les bactéries gram positives La cepacine A montre une action sur certaines bactéries gram négatives, et la cépacine B montre une action sur une gamme plus large de bactéries gram négatives La nouvelle substance antibiotique, 25 la cépacine, est produite par culture d'une souche du microorganisme Pseudomonas cepacia SC 11 783, qui a été déposée dans l'American Type Culture Collection sous le no A T C C 39356. Le micro-organisme Le micro-organisme utilisé pour la production de la 30 cépacine est Pseudomonas cepacia, SC 11 783 Une sous-culture de ce microorganisme peut être obtenue de la collection permanente de l'American Type Culture Collection, à Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique Son numéro d'accès dans le dépôt est A T C C no 39356 Il va de soi que pour produire 35 de la cépacine, on peut cultiver, outre le micro-organisme spécifique qui est décrit et caractérisé ici, des mutants de ce microorganisme (par exemple, des mutants obtenus à l'aide de rayons X, d'un rayonnement ultra-violet ou de moutardes à l'azote). -2 On peut réaliser l'isolement de Pseudomonas cepacia SC 11 783 d'un échantillon de terre (obtenu à West Windsor, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique) dans lequel il est présent, en déposant la terre sur une gélose ayant la composition suivante: l Sels demer synthétiques 1,0 gramme Acide aspartique 0,05 gramme Asparagine 0,05 gramme Extrait de levure 1,0 gramme KH 2 PO 4 0,02 gramme K 2 HPO 4 0,02 gramme 2 Extrait de compost 300,0 ml Eau distillée 700,0 ml Glycérol 5,0 ml On ajuste le milieu à p H de 6,5 environ et on le stérilise dans un autoclave à 121 C pendant 30 mn Apres avoir refroidi à température ambiante, on complète le milieu stérile 20 et refroidi avec les éléments suivants 3 Biotine (solution à 0,1 %) 1,0 ml 3 Thiamine (solution à 0,2 %) 1,0 ml 3 Actidione (solution à 1,0 %) 10,0 ml Apres 24 à 72 heures d'incubation à 28 C, on isole de la terre déposée sur la gélose les colonies de Pseudomonas cepacia SC 11 783 On recueille les colonies isolées et on les maintient sur un milieu de gélose composé de: 1 Sels de mer synthétiques mis sous le marché sous la dénomination "Instant Ocean" par Sea Aquarium Systems, 33208 Lakeland Blvd, Eastlake, Ohio 44094. 2 Extrait de compost préparé en portant à ébullition une suspension de litière de feuilles dans de l'eau du robinet ( 2:1 v/v) puis en laissant mijoter pendant 30 mn environ. Apres refroidissement, on filtre l'extrait d'abord sur de l'étamine et enfin sur du papier filtre Whatman n 4 On stérilise le liquide résultant par autoclavage à 121 C pendant 20 mn. 3 Ces solutions sont stérilisées sur filtre. Extrait de levure 1 g Extrait de boeuf 1 g NZ Amine A 2 g Glucose 10 g Gélose 15 g Eau distillée pour faire 1000 ml On ajuste le milieu à p H 7,3 et on le stérilise dans 10 un autoclave à 121 C pendant 30 mn. Pseudomonas cepacia SC 11 o 783 est un bacille gram négatif, dont la motilité est due à des flagelles polaires multifilamenteux Il est non fluorescent, positif à l'oxydase, il accumule le poly hydroxybutyrate comme matière de réserve 15 intracellulaire La dihydrolase d'arginine est absente, le nitrate est réduit en nitrite, et la croissance se fait à 41 C. Les composés suivants sont utilisés comme unique source de carbone sur le milieu fondamental qui est décrit dans Stanier et al, J Gen Microbiol, 43:159 ( 1966): glucose, 20 xylose, arabinose, fructose, saccharose, ribose, mannitol, sorbitol, salicine, acétates citrate, d-tartrate, et putrescine Le rhamnose, le maltose, le lactose et l'érythritol ne sont pas utilisés. Pseudomonas cepacia SC 11 783 est identique à Pseudomonas cepacia Ao To C Co n 17759 et correspond à la description publiée de cette espèce (Ballard et al, J Gen. Microbiol, 60:199 ( 1970)), sauf qu'elle ne produit pas un pigment intracellulaire jaune. Production de l'antibiotique Pseudomonas cepacia SC 11 783 produit de la cépacine. Pour former de la cépacine selon la méthodologie préférée, on cultive le micro-organisme à la température ambiante ( 25 C) ou au voisinage de celle-ci dans des conditions aérobies immergées dans un milieu nutritif aqueux contenant une source d'hydrates 35 de carbone et d'azote assimilables On poursuit la fermentation jusqu'à ce qu'une activité notable soit conférée au milieu, c'est-à-dire pendant habituellement 12 à 40 heures environ, de préférence 18 à 20 heures environ. -4- A la récolte, on peut séparer les cellules par centrifugation La cépacine peut être extraite du surnageant dans des solvants organiques modérément polaires (par exemple, le n-butanol, l'acétate d'éthyle, le chloroforme et le dichlorométhane) et peut ensuite être purifiée par chromatographie en phase normale sur gel de silice ou sur acide silicique, ou bien par chromatographie de partage sur "Sephadex LH-20 " dans un mélange 1:3:6 de méthanol, de chloroforme et d'heptane, pour donner de la cépacine A et de la cépacine B en quantités à peu près égales Ces antibiotiques peuvent également être séparés par chromatographie en phase inverse sur une colonne "Waters C 18 w Bondapack", en éluant avec un mélange 3:7 d'acétonitrile et d'eau, et en contrôlant l'effluent à 261 nm. La cépacine A et la cépacine B sont très instables lorsque la totalité du solvant est éliminée, et se décomposent rapidement en donnant un solide insoluble brun foncéo Elles 20 doivent donc être conservées en solution diluée Elles sont également très labiles aux bases, se transposant en un système triyne-ène Cette transposition a été observée dans un mélange 1:9 d'éthanol et d'eau sans base ajoutée, et on présume qu'elle est catalysée par des traces de base sur le verre Le cycle 25 y-lactone est sujet à méthanolyse, aussi faut-il éviter une conservation dans le méthanol. Les exemples suivants illustrent plus en détail la préparation et l'isolement de la cépacine A et de la cépacine B. Exemple de fermentation de Pseudomonas cepacia SC 11 783 On a maintenu Pseudomonas cepacia SC 11 783 sur le milieu de gélose stérilisé suivant (A): Extrait de levure 1,0 g Extrait de boeuf 1,0 g NZ Amine A 2,0 g Glucose 10,0 g Gélose 15,0 g Eau distillée pour faire 1 litre. -5 On a ajusté le p H à 7,3 avant de stériliser à 121 C pendant 30 mn On a utilisé une "loupe" de croissance de sur5 face d'une culture inclinée de gélose (milieu A) de Pseudomonas cepacia SC 11 783 pour inoculer chacune de quatre fioles d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml chacune du milieu stérilisé suivant (B): Extrait de levure 4,0 g Extrait de malt 10,0 g Dextrose 4,0 g Eau distillée pour faire 1 litre. On a ajusté le p H à 7,3 avant de stériliser à 121 C pendant 15 mn Après inoculation, on a fait incuber les fioles 15 à 25 C sur une secoueuse rotative ( 300 t/mn, course de 5 cm) pendant 24 heures environ Apres incubation comme décrit cidessus, on a procédé à des transferts de 1 % (volume/volume) des fioles de culture à trente fioles d'Erlenmeyer de 500 ml contenant chacune 100 ml de milieu stérilisé (B) comme décrit 20 cidessus Après inoculation, on a à nouveau fait incuber les fioles à 25 C sur une secoueuse rotative ( 300 t/mn, course de cm) pendant 24 heures environ Apres incubation comme décrit ci-dessus, on a procédé à un transfert de 1 % (volume/volume) dans une cuve de fermentation en acier inoxydable de 380 litres 25 contenant 250 litres de milieu stérilisé (B) Après inoculation, on a poursuivi la fermentation dans les conditions suivantes: température 25 C; pression 0,7 kg/cm 2; aération 4,7 1/s; agitation 155 t/mn On a ajouté de l'"Ucon LB-625 " (polypropylène glycol; Union Carbide) dans la mesure du nécessaire 30 comme agent anti-mousse Au bout de 18 à 20 heures environ, la fermentation était terminée On a ensuite ajusté le p H du bouillon de fermentation à 5,0 à l'aide d'acide chlorhydrique et on a centrifugé le bouillon contenu dans le réservoir, ce qui a donné environ 240 litres de bouillon surnageant. Exemple d'isolement de la cépacine d'une fermentation de 50 1 On a extrait le surnageant du bouillon (p H 6) d'une fermentation de 50 1 de Pseudomonas cepacia SC 11 783, avec 16 1 de dichlorométhane, et on a concentré l'extrait sous vide à 700 ml On a séché le concentré sur sulfate de sodium, on l'a repris à siccité, et on a immédiatement redissous le résidu dans un mélange 2:3:4:1 de chloroforme, d'heptane, de méthanol et d'eau (système I) On a séparé la phase inférieure (riche en eau), on l'a lavée une fois avec un volume égal de la phase supérieure du système I, puis on l'a concentrée à ml sous vide On a extrait le concentré avec 25 ml de chloroforme, ce qui a donné 45 ml de phase inférieure, LP-1, crue l'ona conservée dans le congélateur jusqu'à nouvelle purification( 1) La solution contenait 180 mg d'une substance non volatile, dont 50 mg environ étaient constitués de cépacine A et de cépacine B, d'après l'absorption UV à 263 nm. 15 On a concentré LP-1 sous vide et on a immédiatement dissous le résidu dans 5 ml d'un mélange 1:3:6 de méthanol, de chloroforme et d'heptane (système II) On a fait subir à la solution une chromatographie sur une colonne de 2,5 x 90 cm ( 450 ml) de "Sephadex LH-20 " dans le système II, en diluant à 20 2 ml/mn et en recueillant des fractions de 20 ml On a repéré la cépacine A et la cépacine B par l'absorption UV à 263 nm On a réuni les fractions 95 à 103, on les a concentrées sous vide à 5 ml et on les a diluées avec du chloroforme pour obtenir 35 ml d'une solution qui contenait 6,8 mg de cépacine 1 A: UV max dans CHC 13 (E 1 %) 248,5 ( 613), 262,0 ( 827), 276, 8 nm ( 672); RMN dans CD C 13 + CD 3 OD: 52,05 ( 1 H, m), 2,47 ( 1 H, m), 2,50 ( 1 H, m, J d'être mise au congélateur. 8,2 Hz), 2,66 ( 1 H, J= 17,9, 9,8, 5,7 Hz), 3,01 ( 1 H, J= 4,3, 1,8 Hz), 3,15 ( 1 H, J= 4,3, 2,1 Hz), 3,21 ( 1 H, J= 4,0, 2,1 Hz), 3,46 ( 1 H, J= 7,9, 1,9, 0,6 Hz), 3,69 ( 1 H, J= 4,0, 4,0 Hz), 4,61 ( 1 H, J= 7,0, 7,0, 3,6 Hz), 5,31 ( 1 H, J= 7,9, 6,7, 0,6 Hz), 5,70 ppm ( 1 H, J= 6,7, 0,9, 0, 9 Hz); IR dans CH C 13: 3295, 221 2197, 1946, 1773, 1180 cm-1. Exemple d'isolement de la cépacine d'une fermentation de 250 l On a extrait de la cépacine avec du dichlorométhane partir de 200 i de surnageant de bouillon, partagés dans un mélange 2:3:4:1 de chloroforme, d'heptane, de méthanol et d'eau, et extraits dans du chloroforme comme décrit dans l'exemple précédent On a fait passer l'extrait chloroformiquc 15 dans une colonne de 1 litre de gel de silice "Whatman LPS-1 ". On a lavé la colonne avec 1 litre de chloroforme puis on l'a éluée avec un mélange 3:1 de chloroforme et d'acétate d'éthyl E en recueillant des fractions de 250 ml On a contrôlé l'effluent par chromatographie en couche mince sur gel de 20 silice lmélange 1:1 de chloroforme et d'acétate d'éthyle, détection avec de l'acide-phosphomolybdique; cépacine A, Rf 0,19; cépacine B, Rf 0,13 l Les fractions 6 et 7 contenaient de la cépacine A et les fractions 9 à 12 contenaient de la cépacine B Les composés étaient tous deux purs à 50 % enviror 25 à ce stade et on les a encore purifiés par chromatographie de partage sur "Sephadex LH-20 " dans un mélange 1:3:6 de méthanol de chloroforme et d'heptane, comme décrit dans l'exemple précédent. Activité biologique On utilise la méthodologie suivante pour déterminer la concentration inhibitrice minimale (ci-après désignée par les initiales CIM) des composés selon la présente invention. On cultive les organismes d'essai dans environ 15 à ml de bouillon dlessai d'antibiotiques (Difco) en inoculant 35 (dans des tubes) le bouillon avec une "loupe" de l'organisme provenant d'une culture inclinée de gélose BHI (Difco) On fait incuber les tubes inoculés à 37 C pendant 18 à 20 heures On suppose que ces cultures contiennent 109 unités de formati( de colonies (ci-après UFC) par ml On dilue les cultures au 1/100 pour obtenir un niveau final d'inoculum de 107 UFC; on a réalisé les dilutions avec du bouillon K-10::. On dissout les composés dans le diluant approprié à une concentration de 1000 pg/ml On réalise de doubles dilutions dans du bouillon K-10, ce qui permet d'obtenir une gamme de 1000 pg/ml à 0,5 g/ml On place 1,5 ml de chaque 10 dilution dans des boîtes de Petri carrées individuelles auxquelles on ajoute 13,5 ml de gélose K-10 X Xo La concentration finale de l'antibiotique dans la gélose s'échelonne de 100 pg/ml à 0,05 mg/ml On prépare des plaques témoins de croissance d'organismes ne contenant que de la gélose et on les inocule avant et après les plaques d'essai On applique les organismes sur la surface de gélose de chaque plaque avec l'"Inoculateur Multipoint" de Denley (qui délivre environ 0,001 mi de chaque organisme), ce qui permet d'obtenir un niveau final d'inoculum de 104 UFC à la surface de la gélose. On fait incuber les plaques à 37 C pendant 18 heures et on détermine les CIM La CIM est la plus faible concentration de composé qui inhibe la croissance de l'organisme. ::Le bouillon K-10 est un bouillon de boeuf et de levure contenant: Extrait de boeuf 1,5 g Extrait de levure 3,0 g Peptone 6,0 g Dextrose 1,0 g Eau distillée, q s p 1 litre 30::Gélose K-10 Extrait de boeuf 1,5 g Extrait de levure 3,0 g Peptone 6,0 g Dextrose 1,0 g Gélose 15,0 g Eau distillée, q s p 1 litre Les tableaux qui suivent donnent les résultats classés que l'on a obtenus lorsque l'on a essayé l'activité des composés selon l'invention sur divers organismes Le numéro qui suit chaque organisme est celui de l'organisme dans la collection de E R Squibb & Sons, Inc, Princeton, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique Un tiret (-) dans les tableaux signifie que le composé essayé n'a pas manifesté d'action sur l'organisme en question à 50 ig/ml. Organisme SC n :: Staphylococcus aureus 1276 Staphylococcus aureus 2399 Staphylococcus aureus 2400 Staphylococcus aureus 10165 Streptococcus faecalis 9011 Streptococcus agalactiae 9287 Micrococcus luteus 2495 Escherichia coli 8294 Escherichia coli 10857 Escherichia coli 10896 Escherichia coli 10909 Klebsiella aerogenes 10440 Klebsiella pneumoniae 9527 Proteus mirabilis 3855 Proteus rettgeri 8479 Proteus vulgaris 9416 Salmonella typhosa 1195 Shigella sonnei 8449 Enterobacter aleacae 8236 Enterobacter aerogenes 10078 Citrobacter freundii 9518 Serratia marcescens 9783 Pseudomonas aeruginosa 9545 Pseudomonas aeruginosa 8329 Acinetobacter calcoacetieus 8333 C.I M (pg/ml) Cépacine A Cépacine B 0,2 0,1 0,2 0,2 50 0,2 3,13 0,78 1,6 0,1 12,5 0,4 6,3 0,2 O N 78 > 25 1,6 25 50 6,3 6,3 ::Organismes de la collection de Inc. cultures de E R Squibb & Sons Revendications 1 5-l 3-l 3-(hepta-l,2-dién-4,6-diynyl)oxiran-2-yll-35 hydroxy-lpropénylldihydro-2 ( 311)-furanone. 2 5-ll 3-l 3-(hepta-1,2-dién-4,6-diynyl)-2-oxiranyll2oxiranyllhydroxyméthylldihydro-2 ( 3 H)-furanone.