Brevet FR2542011A1 — publié le 19840907

ô 1 La présente invention concerne des vecteurs de clonage et d'expression du gène sac B, des bactéries transformées par ces vecteurs et un procédé pour la préparation de la levansaccharase codée par le gène sac B. La levansaccharase ou 0-2,6 fructan:D glucose- 1-fructosyl transférase; Eo Co 2 o 4 1 o 10, est une enzyme sécrétée dans le milieu de culture par Bacillus subtilis après induction par le saccharoseo Cette enzyme catalyse essentiellement la réaction suivante saccharose + accepteur glucose + accepteur-fructose. Les accepteurs possibles sont divers, par exemple l'eau (réaction d'hydrolyse) ou les levanes (réaction d'élongation des levanes). L'un des intérêts actuel de la levansaccharase est précisément dans cette réaction d'élongation des levanes. En effetla réaction de transfructosylation catalysée par la levansaccharase est actuellement à l'étude afin de stocker le fructose sous forme de hauts polymères à partir du saccharose Cette technologie pourrait, notamment, être appliquée au traitement des mélasses afin de transformer un sous produit de peu de valeur en un sucre beaucoup plus facile à valoriser. L'un des objectifs de la présente invention est donc la mise au point d'un vecteur d'expression de la levansaccharase assurant une surproduction de l'enzyme. C'est pourquoi la présente invention concerne des vecteurs de clonage et d'expression, caractérisés en ce qu'ils comportent au moins des éléments assurant l'expression du gène sac B, l'ADN du gène sac B, ainsi que l'origine de réplication d'un plasmide. Ce type de vecteur plasmidique permet, par transformation de Eschérichia coli, d'obtenir des extraits environ 30 fois plus actifs en levansaccharase que ceux de la souche de référence de B subtilis. Mais les études faites sur les vecteurs ainsi obtenus ont montré que ceuxci pouvaient également être très utiles comme vecteurs de clonage et d'expression d'autres gènes, en particulier dans les colibacilles. En effet, les souches de E coli transformées par les vecteurs selon l'invention sont empoisonnées par le saccharose, il s'agit là d'un empoisonnement spécifique dont la nature exacte n'a pas encore été déterminée. Afin d'être utilisables notamment comme vecteur de clonage d'un gène étranger, les vecteurs selon l'invention comporteront de préférence au moins un site unique de restriction situé dans une position telle que l'insertion d'une séquence d'ADN dans ce site inhibe la synthèse de la levansaccharase. Ainsi, en utilisant ce site unique du vecteur pour cloner un gène étranger, il est aisé,après transformation de souches de Eo coli par le mélange de ligation, de détecter les souches de E coli trans- formées par le vecteur portant l'insertion désirée puisque dans un milieu nutritif contenant du saccharose les souches portant le plasmide sans insertion meurent. Parmi les plasmides de l'invention, le plasmide p L 58 par exemple présente un site unique de restriction Kpn dans le gène sac B. Les vecteurs selon tl'invention peuvent comporter un site de régulation sac R (promoteur opérateur) contigu à sac B Chez B subtilis ce site permet la régulation de la transcription du gène sac B par les produits des gènes sacs et sac U (Lepesant et col 1976) Cette dernière régulation a été mise en évidence par les mutations pléiotropes du locus sac U (pap) qui affectent le niveau de synthèse de la lévansaccharase, de deux pro- téases exocellulaires et de l'a-amylase et altèrent diverses fonctions cellulaires telles que la synthèse des flagelles et le déclenchement de la sporulation (Kunst et col, 1976) Le mode d'action et la signi- fication de cette régulation pléiotrope sont encore incomplètement connus. Il est intéressant,comme cela sera démontré dans les exemples, d'utiliser un vecteur comportant un ou plusieurs des gènes de régulation mentionnés précédemment, notamment sac R ou sac U. En effet, comme cela a été dit précédemment, chez certains mutants comportant une mutation dans le gène sac U, la synthèse de plusieurs enzymes exocellulaires, amylases, protéases, levanes, saccharases, est significativement accrue par rapport à la souche-de référence. Enfin, ces vecteurs qui assurent l'expression de la levansaccharase, protéine qui chez Bacillus est directement exportée dans le milieu-de culture, constituent un point de départ intéressant pour des vecteurs d'excrétion - Les vecteurs selon l'invention peuvent également comporter le promoteur du gène sac B. Parmi les origines de réplication des plasmides vecteurs selon l'inventions on retiendra surtout celles des plamides susceptibles de se répliquer dans les Colibacilles, c'est-à-dire par exemple les origines de réplication de type Col El tel que celle de p BR 322. Il a été mis en évidence que le fragment portant les éléments nécessaires à l'expression de la levan- saccharase était porté sur un fragment d'environ 4,1 kb autour de sac B et incorporant sac R, ce fragment étant limité par deux sites Hind III. Ce fragment peut donc être introduit dans un plasmide tel que p BR 325 (dérivé de p BR 322) qui comporte un site unique Hind III,pour obtenir un plasmide p L 58 qui assure l'expression de la levansaccharase dans E coli. 254200 11 5. L'invention concerne également les bactéries, et notamment les souches de E coli, transformées par les vecteurs selon l'invention comportant ou non l'insertion d'un gène codant pour une protéine autre que la levansaccharase. Il est intéressant d'intégrer un vecteur selon l'invention dans le chromosome de B subtilis. Cette intégration dépend de la présence dans le vecteur de séquences d'ADN homologues à celles des séquences chromosomiques Ces dernières séquences peuvent elles mêmes être des séquences plasmidiques intégrées au préalable dans le chromosome. L'homologie de séquence permet l'intégration par recombinaison générique mettant en jeu un seul "crossing over". L'intégration dans le chromosome de B subtilis d'un gène cloné en phase à la suite du promoteur de sac B permet qu'il soit mis sous la dépendance des gênes de régulation sac S et sac U avec les avantages décrits précédemment. Enfin l'invention concerne un procédé de préparation de levansaccharase dans lequel on fait fermenter un milieu par une souche bactérienne trans- formée par les vecteurs selon l'invention. Matériels et Méthodes Souches et vecteurs de clonage Les souches utilisées sont rassemblées dans le tableau 1. Le plasmide p H 4 est un dérivé de p HV 33 décrit dans Primrose et col, 1981, obtenu par digestion partielle par Hha I Il a perdu la fonction p C 194 et le site Eco RI de la partie p BR 322 de p HV 33. La nomenclature des phénotypes est la suivante: 1) Lvs+/Lvs indique la capacité à synthétiser la levan- saccharase que l'on détecte par l'activité saccharolytique; Lsc i 2) Lvs C/Lvs indique que la synthèse est constitutive/ inductible; 3) Lev+ /Lev indique la capacité de la levansaccharase à synthétiser des levanes sur un milieu solide approprié. Milieux La multiplication des phages À Charon est supportée par la souche DP 50 (sup F) {Blattner, 1977) croissant sur un milieu contenant: "Bactotryptone" (Difco) 20 g/l "Bacto-yeast extract" (Difco) 10 g/l Na Cl 10 g/1 Mg C 12 10 m M Acide diaminopimélique (Sigma)100 mg/l Thymidine (Sigma) 50 mg/l. Pour la croissance des autres souches de E coli on utilise un milieu LB liquide ou solide contenant: "Bacto-tryptone" 10 g Extrait de levure 5 g Na Cl 10 g H 20 1000 ml. Bacillus subtilis est cultivé sur plaque "Tryptone Blood Agar Base" Difco ou sur milieu minéral MM décrit dans Anagnostopoulos et col, 1961 o Le milieu SG est un milieu minéral MM supplémenté avec 20 g/l de sucrose et 1 g/l de glucose. Isolement et purification d'ADN ADN de bactériophage X: Les lysats de phages sont concentrés par précipitation (PEG 6000 (Baker), 100 g/l, Na Cl 0,5 M). Les phages sont purifiés par centrifugation sur gradient de Cs Clo Les ADN sont extraits deux fois avec du phénol et le phénol residuel est extrait à l'éther. Après précipitation à l'éthanol, les ADN sont solubilisés dans TE (Tris-HC 1 10 m M, p H 7,5, EDTA 1 m M). ADN plasmidique: Pour des isolements sur grande échelle, les souches incorporant les plasmides sont cultivées selon le processus décrit par Bolivar et col, 1977 o L'amplification est obtenue par addition soit de chloramphénicol ( 170 mg/l) ou de spectinomycine ( 300 mg/1) Les ADN sont extraits selon la technique décrite par Humphreys et col, 1975 Les ADN plasmidiques sont purifiés par séparation sur Cs Cl 2 ou chromatogrphie sur hydroxyapatite,comme cela est décrit dans Colman et col, 1978 Pour des isolements sur petite échelle on utilise la procédure alcaline rapide décrite par Birnboimet Doly, 1979. Les ADN transformants de B subtilis sont extraits selon le procédé de Marmur, 1961. Analyse et clonage d'ADN Les différentes enzymes de restriction mises - en oeuvre sont disponibles dans le commerce mais peuvent également être préparées par des procédés connus, elles sont mises en oeuvre selon les processus préconisés par les fabricants ou bien par des processus équivalents. Les électrophorèses sur plaque de gel (agarose, Sigma, réf a 6877) sont effectuées dans un tampon Tris-acétate ( 40 m M tris base, 20 m M acétate de sodium, 2 m M EDTA,) ajusté à p H 7,9 avec l'acide acétique. L'ADN de phage de Charon 4 soumis à une double digestion par Eco RI et Bam HI ou l'ADN de p BR 322 mis digestion avec Hpa II sont utilisés comme référence de poids moléculaire. Techniques génétiques Les souches de E coli sont transformées selon le procédé décrit par Dagert et Erhlich, 1979 Les colonies Cmr, Tetr, Ampr sont sélectionnées sur des plaques LB supplémentées avec l'antibiotique corres- pondant, le chloramphénicol, 15 mg/l, la tétracycline, mg/l et l'ampicilline 200 mg/l. Les souches de B subtilis sont transformées selon le procédé décrit par Anagnostopoulos et col, 1961, en utilisant la modification des milieux MG I et MG II décrite par Borenstein et col, 1969. Les transformants prototrophiques sont sélection- nés sur plaques MM auxquelles il manque soit du tryptophane soit de la cystéine Le phénotype Smo/Rou est déterminé sur des plaques TBAB par une technique de réplication des colonies isolées. Le phénotype correspondant à la levansaccharase est déterminé selon le processus décrit par Lepesant et col, 1972. + Le phénotype de Lev est identifié par la synthèse du lévane qui entoure les colonies sur des plaques SG. Le phénotype Lvs /Lvsi est identifié sur des colonies isolées sur plaques MM supplémentées avec du glycérol au lieu de glucose. Après 24 heures de croissance à 37 C, les plaques sont pulvérisées avec un mélange de chloramphénicol ( 2 mg/ml) et de saccharose ( 500 mg/ml) et incubées à 37 C pendant encore 90 minutes puis pulvérisées avec un réactif GOD Perid. Le phénotype constitutif correspond à un halo gris qui entoure les colonies. Extraits bactériens et détermination de l'activité levansaccharase Les souches de E coli, traitées par l VEDTA ( 1 m M dans Tris-H Cl 100 m M, p H 7,5), sont sédimentées et remises en suspension dans un tampon phosphate de potassium 50 m M, p H 6,0 On ajoute 1 mg/ml de lysôzyme et les cellules sont mises en incubation à O C pendant minutes La lyse est achevée par refroidissement et décongélation Les extraits sont traités par de la D Nase, 50 gg/ml, de façon à éviter une viscosité excessive. La levansaccharase est dosée par la méthode décrite par Chambert et col, 1974 On utilise du saccharose ou du glucose marqué au carbone 14 de façon uniforme, qui est fourni par Amersham corp. Ces sucres sont purifies par chromatographie sur papier avant leur utilisation. La transfructosylation sur glucose (réaction d'échange) est essayée sur le mélange suivant: Glucose C 200 m M ( 0,1 I Ci/g M) Sucrose 100 m M Tampon phosphate de potassium 50 m M p H 6,0. La transfructosylation sur des levanes est mise en évidence dans un mélange comprenant: Sucrose C 14 240 m M Levanes purifiés (poids moléculaire 10 000) 10 mg/ml Tampon phosphate de potassium 50 m M p H 6,0. En l'absence de levane à titre d'accepteur, l'incubation de levansaccharase dans ce mélange conduit uniquement à l'hydrolyse du saccharose. Dans tous les cas des aliquots des mélanges de réaction sont soumis à une chromatographie sur papier (papier Schleicher et Sch Ull 2043 a, solvant: n-butanol/ acide acétique/eau 4/1/1, v/v/v)D Les taches radioactives sontlocalisées par autoradiographie La radiographie de chacune des taches est estimnde directement à partir d'un papier immergé dans un fluide de scintillation. L'activité de la levansaccharase synthétisée par les souches de E coli peut être également révélée sur milieu solide par un test adapté du test mis au point pour B subtilis par Lepesant et col, 1972. Apres 24 heures de croissance à 37 C sur milieu solide M 63 + glycérol + CM ( 25 gg/ml) les colonies sont: 1 1 1) recouvertes par pulvérisation avec un mélange de lysozyme ( 10 mg/ml) et d'EDTA ( 10 -3 M) et incubées minutes à 37 C; 2) recouvertes avec une solution de saccharose ( 1,5 M et incubées 60 minutes à 370 C; 3) recouvertes avec le réactif du glucose GOD-Perid (Boehringer). Un halo vert autour des colonies révèle le glucose produit à partir du saccharose par la levan- saccharase. I) 12 2542011 EXEMPLE 1 Isolement d'un clone portant le gène sac B d'une banque de phages X charon 4 A La construction d'une banque d'ADN de B subtilis provenant de la souche 168 M (trp C, smo) clones dans les sites Eco RI du phage X charon 4 a été décrite dans l'article de Ferrari et col, 1981. Lorsque cette banque a été testée pour son activité de transformation sur des souches de B subtilis compétentes, 70 % des marqueurs testés ont été détectés sur un échantillon de 1710 plaques. Le même échantillon a été testé pour détecter la présence de clones qui portent le gène de structure codant pour l'exoenzyme levansaccharose. La transformation des allèles sac B dans le type sauvage ne permet pas une sélection directe des recombinants Toutefois, les types sauvages Lev+ peuvent être distingués des Lev sur milieu SG car ils sont entourés de levaneo De façon à identifier les colonies Lev+ dans les populations transformées, les transformants sont sélectionnés par congression avec un marqueur d'auxotrophie non lié. Une culture, compétente de souche QB 1058 (sac B 197, trp C 2, sac 52) est exposée à une quantité sous saturante d'ADN de la souche PG 790 (sac B 197, sac 52) et étalée sur un milieu SG pour obtenir moins de + 5000 colonies trp par plaque. Les ADN provenant de chacun des 19 sous-ensembles d'environ 90 plaques de phages A recombinants sont disposés sur des cellules compétentes. + Parmi les colonies Trp ainsi sélectionnées, + les colonies Lev sont trouvées sur deux taches; ceci indique que certains clones recombinants portant l'allèle sac B sont présents dans deux sous-ensembles. Les lysats bruts sont préparés à partir de chaque plaque d'un sousensemble et sont utilisés comme source d'ADN dans les expériences de transformation décrites. Ceci permet l'identification et l'isolement d'une plaque X LSC 66, dont l'ADN transforme l'allèle sac B 197 Le clone est purifié deux fois et cultivé pour en obtenir des quantités importantes. EXEMPLE 2 Le produit de digestion de l'ADN de A LSC 66 par Hind III est mis en ligation dans le site Hindii du plasmide p H 4. Les plasmides obtenus sont utilisés pour transformer une souche de E coli La sélection des transformants Ampra Tets permet d'isoler un clone incorporant le plasmide p L 55. Ce plasmide n'est pas capable d'assurer l'activité levansaccharase dans une souche hôte de E colio Afin de construire un plasmide plus complet, on insère dans le site unique Eco RI de p L 55 un fragment de restriction Eco RI de l'ADN de X LSC 66. Le plasmide recombinant p L 57 est identifié en analysant par restriction l'ADN des souches de Eo coli r transformées Amp. L'insert de 5,5 kb de ce plasmide contient les 4,1 kb de l'extrémité à gauche de X LSC 66, une partie de ce matériel est en double. Les transformantg'E ''c Oli p L 57 synthétisent la levansaccharase Toutefois, les colonies Lvs+ de E coli tendent à ségréger des colonies Lvs avec un taux assez élevé Ces colonies Lvs possèdent un plasmide similaire à p L 55. EXEMPLE 3 Afin d'obtenir un plasmide présentant une stabilité améliorée, on insère un fragment de restriction Hind III de À LSC 66 dans p BR 325 Le mélange de digestion de l'ADN de X LSC 66 par Hind III est mis en ligation dans le site Hind III du plasmide p BR 325 et le mélange de ligation obtenu est utilisé pour transformer la souche de E coli HVC 45 L'étude des transformants permet l'isolation de transformants portant le plasmide p L 58 dans lequel le gène Tet de p BR 325 a été inactivé. EXEMPLE 4 Identification de la levansaccharase dans une souche de E coli incorporant p L 58 Un extrait brut de la souche HVC 45 portant le plasmide p L 58 est obtenu comme cela a été décrit - précédemment. L'activité fructosyl transférase de la levan- saccharase synthétisée par cette souche est carac- térisée par trois réactions différentes: 1) la réaction d'échange (transfert fructosyl du saccharose au glucose radioactif; 2) hydrolyse du saccharose; 3) transfert fructosyl à un accepteur levane. Comme aucune réaction d'échange et aucune synthèse de levane ne peut être mise en évidence dans les souches de E coli incorporant des vecteurs qui ne contiennent pas l'allèle sac B, ces expériences démontrent l'expression du gène sac B. L'activité spécifique de l'enzyme est d'environ 0,8 unité par mg de protéines Ceci correspond à un taux de synthèse d'environ 10 il unité d'enzyme par cellule par minute Ce taux évidemment dépend du nombre de copies du gène sac B dans la cellule. p L 58 qui dérive du plasmide p BR 325 présente un mode de réplication Col El. Clewell et col, 1972, ont montré que des plasmides Col El étaient présents dans E coli au taux d'environ 24 copies par cellule Les étudessur p L 58 sans amplification permettent d'estimer le nombre des plasmides au même ordre de grandeur. Dans B subtilis le taux de levansaccharase mesuré sur la souche de référence 168 M est de l'ordre de 10 12 unité/cellule/minute. En milieu liquide, LB + CM, la vitesse de croissance de la souche comportant le plasmide p L 58 est semblable à celle de la souche parente portant p BR 325 L'addition de saccharose a un effet toxique sur la première, mais n'affecte pas la deuxième. L'addition de saccharose ( 150 m M) est suivie à 60 minutes plus tard d'une lyse rapide mise en évidence par la chute de densité optique et confirmée par observation microscopique Cette lyse affecte en 30 minutes 40 à 70 % de la population, puis se poursuit à une vitesse beaucoup plus lente Le comptage des bactéries viables par étalement sur milieu solide LB + CM montre que c'est en fait la quasi-totalité de la population qui est empoisonnée de manière irréversible L'addition de saccharose à des concentrations plus faibles ( 60 m M et 100 m M) donne lieu à des empoisonnements plus lents. Ni la localisation cellulaire de cette intoxication, ni son mécanisme ne sont connus avec certitude. Les études effectuées sur des mutants comportant le plasmide p L 58 muni d'une insertion dans le segment correspondant au gène sac B ont montré que ceux-ci résistent à l'effet toxique du saccharose. Ceci permet donc d'envisager l'utilisation des vecteurs selon la présente invention comme vecteurs de clonage et d'expression pour des gènes autres que sac B en assurant une sélection aisée des mutants désirés. 2 5 4 2 O 1 1 1 7 TABLEAU 1 LISTE DES SOUCHES Souche Génotvoe Phénotype B subtilis 168 M QB 1058 PG 790 E Coli DP 50 u F HVC 45 Trp Smo Trp Lev Smo tr PC 2 smo sac A 321-sac B 197 sac 532 Lr EC 2 smo sac A 321 gac B 197 sac 532 M-O F gap D 8 lac Y Mgal uvr BI Ljh XA mal Arhds S su Il ÉUIII thr Al leu 6 thil lac Yl Aup E 44-hsd R str R ton Al Le V SMO Amps cms Tets REFERENCES-BIBLIOGRAPHIQUES Anagnostopoulos C et Spizizen J, 1961 Requirements for transformation in Bacîllus Subtilis J Bacteriol. 81:741-746 '. 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REVENDICATIONS 1) Vecteur de clonage et d'expression, caractérisé en ce qu'il comporte au moins des éléments assurant l'expression du gène sac B, et le gêne sac B ainsi que l'origine de réplication d'un plasmide. 2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte le promoteur de sac Bo 3) Vecteur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comporte le gène sac R. 4) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte au moins l'un des gènes de régulation de sac B. ) Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comporte le gène de régulation sac Uo 6) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comporte l'origine de réplication de Col El. 7) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte l'ADN du plasmide p BR 325 et une insertion de 4,1 kb limitée par deux sites- Hind III portant le gène sac R et le gène sac B situés dans le site unique de Hind II de p BR 325. 8) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte,en outre, au moins un site unique de restriction situé à un endroit tel que l'insertion d'une séquence d' ADN dans ce site inhibe la synthèse de levansaccharase. 9) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence d'ADN codant pour une protéine déterminée autre que la levan- saccharase sous la dépendance des éléments assurant l'expression du gène sac B. ) Bactérie transformée par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 8. 11) Bactérie transformée par un vecteur selon la revendication 9. 12) Bactérie selon l'une des revendications et 11, caractériséeen ce qu'il s'agit d'une souche d'Escherichia coli. 13) Bactéries selon l'une des revendications et 11, caractérisées en ce qu'il s'agit de souche de B subtilis transformée par intégration des vecteurs. 14) Procédé de préparation de levansaccharase caractérisé en ce qu'on fait fermenter un milieu de culture par une bactérie selon l'une des revendications à 13. 15) Procédé de préparation d'une protéine déterminée, caractérisé en ce qu'on fait fermenter un milieu de culture par une bactérie selon l'une des revendications 11, 12 et 13. 16) Levansaccharase obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 14.