Brevet FR2537282A1 — publié le 19840608

la présente invention concerne un dispositif ori- ginal pour détecter automatiquement la configuration d'une électrophorèse sur gel de plusieurs échantillons d'ADN ac- tivés. Pour détecter la configuration d'électrophorèse sur gel de plusieurs échantillons d'ADN activés, on a lar- gement utilisé dans l'art antérieur le procédé d'autoradio- graphie, dans lequel un film sensible aux rayons X est fixé directement à une plaque d'électrophorèse sur gel et est exposé à la lumière. Cependant, dans ce procédé, une opération d'élec- trophorèse doit ttre interrompue pendant l'opération de détection, et il est extrêmement difficile de soumettre à l'électrophorèse la plaque d'électrophorèse sur gel à la- quelle on a appliqué le procédé d'autoradiographie Un opé- rateur ne peut donc prélever des configurations d'électro- phorèse qu'à certains instants En ouire, ce procédé pré- sente divers inconvénients, comme une longue durée d'expoo sition à la lumière pour la détection d'échantillons d'ADN faiblement radioactifs, des opérations complexes et la dif- ficulté de l'automatisations L'invention a pour but de procurer un procédé ef- ficace pour éliminer les inconvénients précités, qui est conçu de façon à permettre la mesure des configurations d'électrophorèse sur gel, automatiquement et en temps réel, pour plusieurs échantillons d'ADN, par l'utilisation d'un compteur proportionnel sensible à la position (qu'on appel- lera ci-après en abrégé O PSP), et d'un dispositif destiné à déplacer le OPSP perpendiculairement à la direction de dé- placement des échantillons d'ADN. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre d'un mode de réalisation pré- féré d'un analyseur d'ADN conforme à l'invention, et en se référant aux dessins annexés sur lesquels: La figure 1 est une représentation en vue latéra- le, partiellement schématique, d'une plaque d'électrophorè- se; La figure 2 est une représentation en vue de face partiellement schématique, de la partie principale; et La figure 5 est une représentation schématique développée de la partie principale. Sur les figures 1 et 2, la référence 1 désigne une plaque d'électrophorèse sur gel qui comporte un élec- trolyte SI, 52 aux deux extrémités Plusieurs échantillons d'ADN sont transférés sur la plaque d'électrophorèse 1 à partir de l'électrolyte 51, dans la direction indiquée par la flèche A La référence E désigne une source d'alimenta- tion pour l'électrophorèse, qui est commandée par un micro- ordinateur C la référence 2 désigne un compteur propor- tionnel sensible à la position (CPSP) appliqué fermement sur la plaque d'électrophorèse 1, la référence M désigne un dispositif de déplacement qui déplace le CP 8 P sur la plaque d'électrophorèse sur gel, parallèlemen à la direc- tion B qui est perpendiculaire à la direction A de l'élec- trophorèse des échantillons d'ADI Ce dispositif de dépla- cement M contient un moteur (non représenté) qui est com- mandé par le micro-ordinateur C, et il est guidé sur un rail R accouplé à l'axe du moteuro Le CPSP 2 comporte un boitier de blindage 3 qui possède une fenêtre ouverte dans une face appliquée contre la plaque d'électrophorèse sur gel, 1, un fil d'anode 4 qui s'étend dans le bottier de blindage 3, parallèlement à la direction d'électrophorèse A, en étant isolé électriquement du bottier de blindage 3, et une ligne à retard 5 qui s'étend près du fil dtanode 4 et parallèlement à celui-ci Le boitier de blindage 3 com- porte en outre une valve d'entrée 6 pour introduire à l'intérieur de ce boîtier un gaz chargé tel que de l'argon, et une valve d'évacuation 7 pour l'écoulement du gaz char- gé Le fil d'anode 4 est connecté à une source d'alimenta- tion de haute tension 9 par l'intermédiaire d'une boumrne 8 montée sur le bottier de blindage 3 La ligne à retard 5 est connectée à des bornes 10 et 11 qui sont montées sur. le boîtier de blindage 3 et des signaux présents sur la ligne à retard sont prélevés au moyen de ces bornes, sous la forme de signaux de sortie 12 et 13 Le signal de sortie 12 est appliqué à une borne d'entrée de départ 17 d'un con- vertisseur temps-amplitude 16 (qu'on appellera ci-après en abrégé "OTA"), par l'intermédiaire d'un amplificateur 14 et d'un discriminateur 15, et le signal de sortie 13 est appli- qué à une borne d'entrée d'arrêt 21 du CTA 16, par l'inter- médiaire d'un amplificateur 18, d'un discriminateur 19 et d'un circuit de retard 20 le OTA 16 est connecté à un analyseur multicanal 22 (qu'on appellera ci-après en apregé "AMO"), et l'AMC 22 est conneeté à une mémoire 23 et au micro-ordinateur O pour commander la source d'alimentation E pour l'opération d'électrophorèse et pour le dispositif de déplacement M Les amplificateurs 14, 18, les discrimi- nateurs 15, 19, le circuit de retard 20, le OTA 16, l'AMO 22, le micro-ordinateur O et la mémoire 23 forment une par- tie de traitement de signal destinée au traitement des si- gnaux de sortie 12 et 13. Le fonctionnement de l'analyseur d'ADN de l'in- vention est décrit dans les paragraphes qui suivent. Sur la figure 3, un rayon de radioactivité éma- nant de l'échantillon d'ADN active, a, ionise le gaz chargé tel que de l'argon, etc, pour émettre des électrons Du fait que la source d'alimentation de haute tension 9 appli- que un potentiel positif au fil d'anode 4, ce fil recueille les électrons tout en produisant des électrons secondaires, ce qui produit une impulsion de courant à la position b sur le fil d'anode 4 L'impulsion est transmise vers la position c sur la ligne à retard, du fait d'une interaction électro- magnétique mutuelle Cette impulsion se propage dans les deux directions x et y sur la ligne à retard 5 et elle est émise vers l'extérieur sous la forme des signaux 12 et 13 o la distance D entre la plaque dtélectrophorèse sur gel et le fil d'anode 4 est d'environ 1 mm Le signal 12 qui est prélevé de cette manière est amplifié par l'amplificateur 14 sur la figure 1, il est séparé par le discriminateur 15 en une composante de-bruit et en une composante de signal, et seule la composante de signal est appliquée à la borne d'entrée de départ du OTA 16 D'autre part, le signal 13 est amplifié par l'amplificateur 18 et il est séparé par le discriminateur 19 en une composante de signal et une composante de bruit Seule la composante de signal est en- suite appliquée à la borne d'entrée d'arrêt 21 du OTA 16, par l'intermédiaire du circuit de retard 20, après l'écou- lement d'une durée de retard prédéterminée T On supposera que la durée de retard T établie par le circuit de retard 20 est égale à la durée de retard de la ligne à retard 5. Le OTA 16 convertit en une valeur électrique analogique la durée qui commence au moment du signal d'entrée de départ et se termine au moment du signal d'entrée d'arr 9 t, et il fournit cette valeur sous la forme du signal de sortie 24. Du fait que la vitesse de propagation de l'impulsion sur la ligne à retard est constante, les données de différence de temps à cet instant sont équivalentes aux données de la position de génération d'impulsion sur la ligne à retard. Le signal de sortie 24 du d TA est appliqué à l'AlC 22, et après avoir été enregistré pendant une certaine durée dans le canal correspondant à sa valeur électrique analogique, il est transmis vers le micro-ordinateur C le micro-ordina- teur C accomplit sur les données transmises les opérations d'étalonnage et de correction pour la compensation des si- gnaux de fond, il place les données de positions nécessaires dans la mémoire 23 et il restaure l'AOM pour 18 initialiser. Le micro-ordinateur C applique ensuite un signal au-disposi- tif de déplacement 1 M afin d'actionner le moteur (non repré- senté) et de déplacer le OPSP 2 dans la direction B, sur une distance prédéterminée, pour préparer la mesure suivante. Le fonctionnement ci-dessus se répète automatique- ment à des instants prédéterminés, ce qui conduit à la lec- ture des configurations d'électrophorèse de plusieurs échantillons d'ADN placés sur la plaque d'électrophorèse sur gel, en parallèle dans la direction d'électrophorèse A, et à l'enregistrement de toutes leurs données de position dans la mémoire 23 Dans le cas oh la mesure exige beaucoup de temps du fait de la faible radioactivité des échantillons d'ADN, le micro-ordinateur C applique un signal à la source d'alimentation E pour l'électrophorèse, dans le but de di- minuer la tension d'électrophorèse et de diminuer la vitesse d'électrophorèses pour pouvoir maintenir la relation tempo- relle de la configuration mesurée. En outre, dans le cas oh la plaque d'électropho- rèse sur gel 1 est trop longue pour le CPSP 2, ou pour me- surer une configuration d'électrophorèse qui change constam- ment, on peut répéter l'ensemble du fonctionnement ci-dessus à l'expiration de la durée prédéterminée. Le mode de réalisation considéré permet de détec- ter automatiquement la configuration du rayonnement de ra- dioactivité des échantillons d'ADN sur la plaque d'électro- phorèse en une courte durée, et il permet de mesurer des variations instantanées des configurations d Oélectrophorèse des échantillons d'ADN Il offre en outre un grand avantage consistant dans la possibilité de mesurer presque simultané- ment les configurations d Vélectrophorèse de plusieurs échan- tillons, avec un seul OPSP, en déplaçant ce dernier. Il va de soi que de nombreuses modifications peu- vent 4 tre apportées au dispositif décrit et représenté, sans sortir du cadre de l'invention. RV Ell DICATION O Analyseur d VADN caractérise en ce queil comprend un dispositif d'électrophorèse sur gel, un compteur pro- portionnel sensible à la position (appelé ci-après CPSP) qui est monté en contact intime avec une plaque d'éleotro- phorèse du dispositif d'électrophorèse sur gel, un dispo- sitif de déplacement destiné à entraîner le OPSP dans la direction perpendiculaire à la direction du déplacement d'un échantillon d'ADN qui se déplace sur la plaque d'élee- trophorèse, et un circuit de traitement de signal destiné à traiter le signal obtenu à partir du OPSP; et en ce qu'on détecte le rayonnement de radioactivité provenant de plu- sieurs échantillons d'ADN qui se déplacent parallèlement les uns aux autres sur la plaque d'électrophorèse.