Brevet FR2543440A1 — publié le 19841005

l La présente invention concerne un procédé de préparation d'un pansement ou enveloppe pour blessures et/ou brûlures Il est depuis longtemps reconnu qu'un tissu animal constitue une source utile de matière pour l'enveloppement de blessures Bien qu'il n'y ait pas identité avec la peau humaine, la composition et l'activité du tissu animal pré- sentent une ressemblance avec la peau humaine Par exemple, une enveloppe pour blessures, théoriquement, protège à la fois la blessure du contact avec l'humidité et avec les impuretés externes, tout en étant perméable également aux excré- tions, en particulier à la vapeur d'eau, qui sont produites par les processus métaboliques normaux. Le sel d'argent de la sulfadiazine (Ag SD) est un agent antimicrobien réputé utile dans le traitement de blessures et notamment de brûlures (voir brevet des Etats- Unis d'Amérique N O 3 761 590; Fox, Bose, Storing Amniotic Membrane in Silver Sulfadiazine Suspension, The Canadian Medical Association Journal, 127, No 2, page 112 ( 15 juillet 1982); Fox, Modak et Stanford, Silver Treated Graft Materials for Coverage of Infected Burn Wounds, Ann Chir. Plast 24, N O 3, 265-267 ( 1979). Bien que'le tissu animal, et la peau de porc en particulier, satisfassent à certains critères pour l'en- veloppement de brûlures et de blessures, il existe certains inconvénients qui militent contre l'utilisation d'un simple tissu animal non traité comme enveloppe protégeant une blessure Le premier inconvénient, qui est le plus impor- tant, réside dans le fait que bien qu'un tissu animal, lorsqu'on l'utilise comme enveloppe pour blessure, puisse protéger la blessure d'agents et d'influences externes, il n'empêche pas et ne peut pas empêcher une infection causée par des bactéries, par exemple, qui peuvent avoir eu accès à la blessure avant l'application de l'enveloppe, ou de toutes bactéries qui peuvent pénétrer à travers l'enveloppe Bien que ce problème puisse être en partie atténué par l'utilisation d'un bactéricide topique (par exemple une crème au sel d'argent de la sulfadiazine) appliqué à l'enveloppe de peau, il existe encore un risque 254344 d'infection de la blessure au moment o le pansement doit être changé Ces changements doivent être effectués avec une certaine fréquence du fait que l'enveloppe de la bles- sure, bien que perméable, tend à s'imprégner des bactéri- cides topiques ainsi que des déchets métaboliques Ces changements de pansement permettent aux bactéries de péné- trer, même si la blessure est laissée découverte pendant une période très courte De même, bien que le tissu animal soit traité soigneusement afin d'assurer qu'il soit ini- tialement dépourvu de bactéries, la stérilité ne peut pas être garantie, notamment lors de l'application comme enve- loppe de blessure En particulier, si la blessure doit pouvoir être exposée à l'air, le risque d'infection par des bactéries présentes dans l'air est rendu encore plus grand. La Demanderesse a découvert qu'une solution ammoniée ou aqueuse ammoniée du sel d'argent de la sulfa- diazine incorporée au tissu animal offrait un pansement efficace pour brûlures et/ou blessures L'incorporation de sel d'argent de la sulfadiazine au tissu animal peut s'accomplir de diverses façons, comme décrit dans le pré- sent mémoire Après que l'incorporation de sel d'argent de sulfadiazine ammonié au tissu animal a eu lieu, l'ana- lyse révèle que la quantité d'argent incorporée est plus grande qu'on ne devrait s'y attendre On pense que l'in- corporation d'argent en excès est le résultat de l'incor- poration d'ions argent à des molécules de collagène du tissu, bien que cela ne soit pas une certitude, et que la Demanderesse ne désire pas s'attacher à-cette théorie. Des échantillons de tissu prélevés sur des animaux abattus sont tout d'abord préparés à recevoir un traitement ultérieur en vue de leur utilisation comme pansements pour blessures Les échantillons de tissu sont choisis sur des animaux sains venant d'être abattus Le tissu est avantageusement prélevé sur des animaux qui n'ont pas été abattus plus d'une heure avant le choix du tissu Des tissus appréciés comprennent de la peau d'ani- mal, par exemple du tissu porcin ou peau de porc, et du tissu amniotique humain Le tissu porcin est prélevé à l'aide d'un scalpel propre et le tissu prélevé est immé- diatement enfermé dans des récipients de réfrigération, puis transporté dans un laboratoire de traitement Dans ce laboratoire, les échantillons sont découpés à des dimensions qui conviennent à leur utilisation comme enve- loppes pour blessures particulières, et les échantillons sont alors prêts pour la phase suivante de leur prépara- tion, en tant que pansements pour blessures. Q Attendu que des types différents de lésions nécessitent des dimensions et des formes différentes de pansements, le tissu nettoyé est découpé aux cotes et selon les formes appropriées Le tissu est ensuite pré- paré en vue du traitement. Des échantillons sont introduits dans des réci- pients qui contiennent des solutions physiologiques nor- males de sel Les récipients sont scellés à chaud, puis irradiés avec des rayons bêta ou gamma Ce traitement d'irradiation a pour effet, à la fois, de stabiliser la matière et de la tanner Après-le traitement par irradia- tion, les échantillons sont mis-en quarantaine au congé- lateur, puis soumis à des méthodes de culture pour déter- miner leur stérilité La méthode de culture implique l'immersion du tissu dans un milieu de culture qui a été choisi de manière qu'il soit favorable à un développement bactérien On observe le tissu pour déceler le développe- ment de bactéries et si ce développement se manifeste au bout de 14 jours ou moins, le tissu est jeté en tant que tissu non stérile Si un tel développement n'est pas observé, le tissu est considéra comme stérile, et il est jugé apte à être traité à la sulfadiazine et avec des solutions contenant aussi de l'argent en présence d'ions ammonium. Les échantillons de tissu animal stérile peuvent ensuite, par exemple, être placés dans une solution aqueuse contenant du sel d'argent de sulfadiazine ammoniacal La source des ions ammonium peut varier, bien qu'une source privilégiée d'ions ammoniun consiste en NH 4 OH en solution. Les échantillons sont maintenus dans la solution pendant la période désirée, puis retirés et exposés à un séchage partiel Un séchage total n'est pas souhaitable, attendu qu'il peut en résulter une contraction, un durcissement et une fissuration des échantillons, les rendant inaptes à être utilisés dans le traitement de brûlures et de blessures Après le séchage partiel, les échantillons sont conservés dans des conditions stériles. L'imprégnation ne constitue pas l'unique moyen d'incorporation de-sel d'argent de sulfadiazine ammonié au tissu animal Par exemple, il est possible de pulvériser des solutions ammoniacales de sel d'argent de sulfadiazine sur des échantillons de tissu animal préalablement préparés. Le contact du sel d'argent de sulfadiazine ammonié avec le tissu animal entraîne l'incorporation au sein de la matrice du tissu comme précédemment décrit, et les méthodes subséquentes de conservation et de manipulation sont identiques. Pour utiliser comme enveloppe de blessure le tissu animal auquel est incorporé le sel d'argent de sulfadiazine ammonié, on applique directement ce tissu à la brûlure ou à la blessure et on le maintient au con- tact de la surface brûlée ou blessée pendant la durée du traitement Le traitement de blessures ou de brûlures avec de telles enveloppes ou pansements a pour conséquence une très bonne protection et une très bonne résistance vis-à-vis d'une infection bactérienne Les exemples suivants illustrent plus concrète- ment la mise en oeuvre et les avantages de la mise en oeuvre de l'invention. Exemple 1 Des plaques de peau de porc de 8 x 10 cm ont été immergées dans 100 ml de solution à 10 gmoles/ml de sel de sodium de sulfadiazine Les plaques sont immergées pendant 4 jours (une exposition plus courte à l'action du sel de sodium de la sulfadiazine a eu tendance à donner un produit moins efficace), après quoi les plaques sont séchées sur des carrés de gaze de 10,16 x 10,16 cm. 254344 G Les plaques sont ensuite plongées dans 100 ml de solution à 50 gmoles/ml de Ag NO 3 pendant 10 minutes Après ce traite- ment dans la solution de nitrate d'argent, la peau de porc est lavée quatre fois à l'eau distillée. Pour déterminer la quantité de sulfadiazine et de Ag" présente dans les échantillons de tissu, on a utilisé des méthodes classiques d'analyse La teneur en sulfadiazine a été déterminée par la méthode de Bratton et Marshall, et la teneur en Ag+ a été déterminée par colorimétrie en uti- lisant le pyrogallol comme indicateur coloré rouge Ces analyses ont révélé que 0,5 Amole/cm 2 de sulfadiazine était disponible dans un échantillon de peau de porc, tandis que la quantité de Ag disponible était de 0,83 mmole/cm 2 Cela suggère qu'un peu d'argent est fixé par des molécules de protéine présentes dans la peau de porc, en plus de la formation de composés d'argent de la sulfadiazine. Les molécules protéiniques auxquelles l'argent se fixe sont vraisemblablement des molécules de collagène (voir Fox, Modak et Stanford, "Silver Treated Graft Mate- rials for Covering of Infected Burn Wounds", J Ann Chir. Plast, 1979, 24, pages 265-67. Exemple 2 L'efficacité d'échantillons de peau de porc aux- quels du sel d'argent de sulfadiazine avait été incorporé, a été éprouvée et comparée à celle d'un pansement classi- que pour blessures, contenant l'ion Ag+ en l'absence de sulfadiazine. On a préparé des échantillons de peau de porc conformément au procédé décrit dans liexemple 1 Des dis- ques de peau de porc traitée mesurant 1 cm de diamètre ont été découpés dans ces échantillons et déposés sur des milieux de culture contenant des colonies de Pseudomonas aeruginosa On a observé que les échantillons de peau de porc qui contiennent du sel d'argent de la sulfadiazine pro- duisent sur ces cultures une zone d'inhibition mesurant 16-17 mm de diamètre A titre comparatif, l'enveloppe pour blessures en peau de porc disponible dans le commerce sous le nom de MEDISKIN (produit de la firme Genetic Laboratories, Inc), renfermant de l'argent mais ne contenant pas de sel d'argent de la sulfadiazine, a produit une zone d'inhi- bition de 12-13 mm dans des conditions identiques. Exemple 3 On a effectué des essais in vivo afin de déter- miner l'efficacité de peau de porc renfermant du sel d'argent de la sulfadiazine conformément à l'invention et on a effec- tué la comparaison avec d'autres enveloppes pour blessures. Des souris de laboratoire ont été réparties en - trois groupes de cinq souris chacun et des brûlures de -contact ont été effectuées en appliquant une source de chaleur (plaque chauffante) à 150 C pendant 5 secondes à la région dorsale qui avait été rasée à l'aide d'une ton- deuse électrique L'escarre de brûlure qui s'est formée a été détachée une heure après la brûlure, et les blessures ont été contaminées avec une souche bactérienne virulente de Pseudomonas aeruginosa (Boston) Les infections ont été effectuées avec 0,1 ml d'inoculum ayant une densité optique de 0,6 à 600 nm Les blessures ont ensuite été recouvertes de l'un des trois pansements suivants: MEDISKIN ordinaire (produit de la firme Genetic Laboratories, Inc), MEDISKIN renfermant de l'argent, ou peau de porc à laquelle le sel d'argent de la sulfadiazine avait été incor- poré Le critère observé était le nombre de survivants. Les résultats sont récapitulés sur le tableau I suivant: A Peau de porc + Ag SD Nombre Taux de morta jours (nomb après la pourc brûlure tage) 1 O 2 O 3 O 4 1 2 Exemple 4 1 2 TABLEAU I B MEDISKIN + Ag de lité re et en- 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % Nombre de jours après la brûlure Taux de mortalité (nombre et pour- centage) 2 40 % 100 % 100 % 100 %" 100-% C MEDISKIN ordinaire Nombre de jours après la brûlure Taux de mortalité (nombre et pour- centage) 2 40 % 100 % 100 % 100 % 100 % On a effectué une seconde comparaison entre le produit MEDISKIN ordinaire et de la peau de porc à laquel- le du sel d'argent de la sulfadiazine avait été incorporé Chaque groupe comportait trois souris et les conditions ont été les mêmes que celles qui sont décrites dans l'exem- ple 3 o Les résultats de cet essai sont reproduits sur le tableau II: TABLEAU II Peau de porc +Ag SD Nombre de jours après la brûlure 3 8 Mortalité (% et nombre) 0 % O 0 % O 0 % O 0 % O O t O 0 %,O 33 % 1 33 % 1 33 % 1 MEDISKIN ordinaire Nombre de jours après la brûlure -8 Mortalité (% et nombre) 0 % O 33 % 1 67 % 2 67 % 2 67 % 2 67 % 2 67 % 2 67 % 2 67 % 2 Exemole 5 On a effectué une observation in vivo des pro- priétés bactéricides de peau de porc imprégnée de Ag NO 3 et de peau de porc à laquelle du sel d'argent de la sulfa- diazine avait été incorporé. Quinze femelles de rats ont été blessées par brûlures à l'aide d'une plaqué= chauffante métallique appliquée à la région dorsale rasée, ce qui a produit des brûlures mesurant environ 4 x 8 cm Environ 24 heures plus tard, les escarres de blessures ont été détachées et les blessures ont été contaminées avec des échantillons bactériens de 0,5 ml de Pseudomonas aeruginosa (Boston), de densité optique égale à 0,60 Une heure plus tard, des enveloppes pour blessures ont été appliquées à douze des rats: les blessures de trois rats ont été recouvertes de peau de porc qui avait été immergée pendant 1 heure dans du nitrate d'argent 0,01 M; les blessures d'un second groupe ont été recouvertes de peau de porc qui avait été immergée pendant 1 heure dans une solution 0,01 M de sel d'argent de la sulfadiazine; les blessures du troisième groupe ont été recouvertes de peau de porc ordinaire qui n'avait été immergée dans aucune solution; un quatrième groupe a reçu des enveloppes de peau de porc ayant été plongées dans l'eau distillée, et les blessures de trois rats du cinquième groupe ont été laissées à l'air libre Les rats dont les blessures ont été laissées découvertes et ceux dont les enveloppes des blessures avaient été plongées dans l'eau ont servi de témoins pour l'infection initiale. Les rats ont été observés de jour en jour et ceux qui ont survécu plus de 9 jours ont été observés en vue de déceler une infection au moment o les pansements ont été changés. Les résultats obtenus pour ces trois groupes (peau de porc ordinaire, peau de porc au nitrate d'argent et peau de porc au sel d'argent de la sulfadiazine) sont les sui- vants: SUJET Matière No 1 N 2 NI 3 Peau de porc Mort: Pseudo Mort: Pseudo Mort: 13 jours ordinaire monas-5 jours monas-6 jours (Pseudomonas suspecté) Peauide porc Mort: Proteus Mort: Pseudo Grave infec- au nitrate 5 jours monas-6 jours tion à d'argent Pseudomonas Peau de porc Infection Infection Pas d'infec- au sel modérée à modérée à tion- d'argent de Proteus Proteus la sulfa- diazine Aucune infection à Pseudomonas n'a été-constatée chez l'un quelconque des trois rats traités avec la peau de porc imprégnée de sel d'argent de la sulfadiazine Des infections modérées à Proteus ont été constatées chez deux d'entre eux, mais les infections n'ont pas-été assez graves pour entraîner la mort Une infection à Pseudomonas a égale- ment été observée chez les rats qui avaient été traités avec la peau de porc immergée dans l'eau. Exemple 6 On a testé l'efficacité de peau de porc à laquelle avait été incorporé du sel d'argent de sulfadiazine dans des solutions ammoniacales Des échantillons de peau de porc imprégnée de sel d'argent de sulfadiazine en solutions ammoniacales comme décrit dans l'exemple 1 ont été préparés et soumis à un test d'activité antibactérienne Le test impliquait l'utilisation de disques circulaires normaux qui avaient été découpés dans les échantillons et placés sur des cultures en boîte de gélose au sang infectées avec Pseudomonas aeruginosa Des tests comparatifs ont été effec- tués avec des disques circulaires de même diamètre, qui avaient été imprégnés d'une association de sel de sodium de sulfadiazine et de nitrate d'argent (Na SD + Ag NO 3), d'hydroxyde d'ammonium et,,à titre de témoin, avec des échantillons de peau de porc non imprégnée de sels Les résultats sont reproduits sur le tableau III. TABLEAU III Efficacité in vitro d'enveloppes de blessures imprégnées de diverses substances Substance Zone d'inhibition Na SD + Ag NO 3 18 mm Ag SD en solution ammoniacale 24 mm- NH 40 H a mm Néant O mm Les résultats indiquent clairement la supériorité du tissu de peau de porc auquel le sel d'argent de sulfadiazine en solution ammoniacale est incorporé. Exemple 7 On a examiné l'efficacité in vivo de peau de porc imprégnée de sel d'argent-de sulfadiazine ammonié. Des souris Swiss ont été anesthésiées et brûlées dans la région dorsale sur des étendues de 2 x 3 cm sur des plaques chauffantes à 150 'C, l'opération étant suivie d'une excision de l'escarre de brûlure et d'une infection avec Pseudomonas aeruginosa à des concentrations de 10 Les souris ont été réparties en trois groupes et leurs brûlures ont été enveloppées à l'aide des enveloppes suivantes: peau de porc non traitée et peau de porc qui - *avait été immergée dans une solution ammoniacale de sel d'argent de sulfadiazine comme indiqué en-détail dans l'exemple 1 En outre, un troisième groupe de souris a reçu des applications de crème au sel d'argent de la sulfa- diazine qui n'avait pas été préparée en solution airmoniacale. Le critère observé a été la proportion de survivants - c'est-à-dire que les souris ont été observées à des inter- valles de deux jours, et que le pourcentage de mortalité a été calculé, en donnant les résultats indiqués sur le tableau suivant. TABLEAU II Efficacité in vivo du sel d'argent de la sulfa- diazine Mortalité, % Enveloppe de la blessure 2 jours 4 jours 6 jours Peau de porc non traitée 100 100 100 Peau de porc traitée au sel d'argent de sulfa- diazine dans l'hydroxyde d'ammonium O O 33 Les souris qui ont été traitées au sel d'argent de sulfadiazine non ammonié ont reçu ce sel sous la forme d'une crème à 1 % de sel d'argent de sulfadiazine adminis- trée par-dessus les enveloppes de blessures en peau de porc non traitée Ces souris ont présenté un taux de mor- talité de 80 % au cours de la même période de six jours. Exemple 8 Pour tester l'efficacité in vivo de peau de porc imprégnée de sel d'argent de sulfadiazine ammonié, on a effectué des expériences sur des animaux. Des femelles de souris Swiss ont été anesthésiées et la peau du dos a été brûlée sur une étendue de 2 x 3 cm à 1500 C au moyen d'une plaque chauffante Au bout d'une heure, on a détaché 1,5 cm 2 d'escarre de brûlure de chaque blessure et on a introduit dans les blessures à l'aide d'un écouvillon des cultures de Pseudomonas aeruginosa de densité optique de 0,03 Après une période d'incubation d'une heure, on a utilisé pour recouvrir les blessures des morceaux de peau de porc mesurant 2 x 3 cm Cette peau de porc ou bien avait été traitée au sel d'argent de sulfadiazine ammonié, à la crème au sel d'argent de sulfadiazine (silvadène), ou bien elle avait été laissée non traitée Le critère observé au cours d'une période de six jours a été le taux de survie Les résultats corres- pondants sont reproduits ci-dessous. Mortalité, % (nombre de jours après la brûlure) - Peau de porc 1 2 3 4 5 6 Non traitée O 60 100 100 100 100 Crème à l'Ag SD O O 50 50 100 100 Ag SD ammonié O O O O 10 10 Exemple 9 D'autres essais in vitro ont été effectués afin de déterminer la zone d'inhibition de peau de porc à laquelle du sel d'argent de sulfadiazine ammonié avait été incorporé. Des disques circulaires normaux ont été découpés dans des pansements imprégnés et ils ont été soumis à un test d'acti- vité antibactérienne contre Pseudomonas aeruginosa sur des cultures en boite de gélose au sang A titre de témoins, on a préparé des disques circulaires identiques renfermant Ag NO 3 et NHAOH Les zones d'inhibition sont comparées ci- dessous Zone Ag SD ammonié 30 mm Ag NO 3 12 mm NH 4 OH O mm Exemple 10 L'incorporation de sel d'argent de sulfadiazine à des homéogreffes et sa rétention subséquente ont été testés. Des homéogreffes de peau humaine ont été découpées en morceaux de 2 cm 2, puis plongées pendant 4 heures dans une solution ammoniacale à 4 % de 110 Ag SD Après l'impré- gnation, les échantillons d'homéogreffes ont été séchés à la température ambiante à l'obscurité jusqu'à ce-que l'ammoniac ait été éliminé. Ensuite, les morceaux ont été répartis en deux groupes dont l'un a été lavé cinq fois à l'eau et l'autre est resté non traité Les échantillons ont ensuite été testés afin de déterminer les taux d'incorporation de sel d'argent de sulfadiazine et les zones d'inhibition Les résultats sont reproduits ci-dessous: Hornéogreiffe lavée Homnéogreffe non lavée Taux de substance Zone d'inhibi- active tion 0,21 gmole/mg 25 mm 0,24 gmole/mg mmn 1.4 REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un tissu animal à usage de pansement pour brûlures ou blessures, caractérisé en ce qu'il consiste à faire tremper du tissu animal dans une solution aqueuse contenant de la sulfadiazine soluble de manière à incorporer de la sulfadiazine audit tissu, à faire tremper le tissu renfermant de la sulfadiazine dans une solution contenant du nitrate d'argent dans des conditions entraînant la formation in situ de sel d'argent de sulfadiazine dans ledit tissu, puis à rincer et à sécher partiellement le tissu auquel le sel d'argent de la sulfa- diazine est incorporé. 2.-Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ledit tissu animal consiste en peau de porc. 3 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ledit tissu animal est du tissu amniotique. 4 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ledit tissu animal est de la peau humaine. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ladite sulfadiazine soluble est le sel de sodium de la sulfadiazine. 6 Tissu animal renfermant du sel d'argent de sulfadiazine incorporé in situ, obtenu comme produit du procédé suivant la revendication 1. 7 Tissu de peau de porc renfermant du sel d'argent de sulfadiazine incorporé ih situ, Qbtenu comme produit du procédé suivant la revendication 1. 8 Tissu amniotique renfermant du sel d'argent de sulfadiazine incorporé in situ, obtenu comme produit du procédé suivant la revendication 1. 9 Tissu de peau-humaine renfermant du sel d'argent de sulfadiazine incorporé in situ, obtenu comme produit du procédé suivant la revendication 1.