Brevet FR2536280A1 — publié le 19840525

Composition pharmaceutique et procédé pour le traitement de tumeurs. La présente invention vise un extrait soluble dans la pyri- dine d'un micro-organisme qui, combiné avec un squelette de paroi cellulaire (SPC) et un dimycolate de trehalose (DMT) fournit une composition pharmaceutique possédant des propriétés anti-tumeurs O Les bactéries telles que Corynebacterium parvum ont fait l'objet de travaux expérimentaux pour les isoler et caracté- riser le composant auquel on doit l'inhibition de la crois- sance des tumeurs (voir par exemple Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C parvum; Cantrell 8 et al, Cancer Research 39, pp 3554-3563 (septembre 1979})0 En dehors de son activité anti-tumeur, C parvum s'est révélé être un stimulateur puis- sant Cdu système lymphoréticulaire, conduisant à une augmen- tation indésirable des poids de la rate et du foie et à la blastogénèseo La Demanderesse a découvert quun extrait de micro-organisme soluble dans la pyridine possède des proprié- tés anti-tumeur puissantes sans les effets toxiques indé- sirables associés aux produits de la technique antérieureo Le squelette de paroi cellulaire est essentiellement une paroi cellulaire dont on a éliminé une grande partie de la protéine et des lipides qui s Uy trouvent normalement. C'est un mucopeptide polymère acide mycolique:arabinogalac- tane contenant des restes de mycolates de tréhalose (U'P 3 ") et des tuberculoprotéines non digéréeso On obtient le sque- lette de paroi cellulaire à partir de n'importe quel micro- organisme O y compris, mais non exclusivement O M smegmatis, Mophlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacte- rium diphteria, Corynebacterium parvum, Mokansasii, Mter culosis (souches H 37 RV et Ayoma B) et M bovis souche BC Go On peut en outre obtenir le squelette de paroi cellulaire à partir d'autres micro-organismes tels que Eocoli, Babortus et Coxiella burnettii. On peut produire le squelette de paroi cellulaire en culti- vant d'abord et en récoltant des bactéries telles que Mobovis souche BCG (Bacille Calmette Guérin) On fait passer le résidu cellulaire entier résultant dans un fractionnateur de cellules (Ribi Cell Fractionator (Sorvall, Model g F-A)3 qui rompt les cellules, séparant l'enveloppe extérieure ou paroi cellulaire des impuretés protoplasmiqueso On soumet ensuite les parois cellulaires résultantes à une série d'ex- tractions par solvant et de traitements enzymatiques (par exemple trypsine et/ou chymotrypsine) pour arriver au squelette de paroi cellulaire purifié. On pe Lt obtenir les dimycolates de tréhalose à partir des organismes tels que par exemple M avium, Mo El l M.tuberculosis (souches H 37 RV et Ayoma B) O Mobovis BCG, M.smegmatis, Mokansasii, Nocardia rubra, M bovinis et Corynebacterium diphteriaeo On cultive, on récolte, puis on tue par la chaleur des bactéries telles que M aviumo On extrait alors la masse cellulaire par plusieurs solvants puis on extrait une frac- tion active soluble dans les solvants On pousse la purifiî cation de cet extrait par une série d'extractions par sol- vant pour obtenir un DMT brut (voir biologically active components from mycobacterial cell wallso i O isolation and composition of cell wall skeleton and comnponent p 3; Azuma, et al Journal of the National Cancer Institute, Volume 52, ppo 95-101, 1974) incorporé ici par référence. Comme décrit dans Azuma et al, on peut encore purifier le DMT brut par chromatographie centrifuge sur gel de silice microparticulaire pour obtenir du DMT purifiée Le but de l'invention est donc de fournir une composition pharmaceutique contenant un extrait soluble dans la pyridine d'un micro-organisme en combinaison avec un squelette de paroi cellulaire et un dimycolate de tréhalose. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de traitement des tumeurs chez les animaux à sang chaud et les humains, utilisant la composition contenant l'extrait solu- ble dans la pyridine d'un micro-organisme, le squelette de paroi cellulaire et un dimycolate de tréhalose. La présente invention concerne des compositions pharmaceu- tiques comprenant un extrait soluble dans la pyridine d'un microorganisme, contenant entre environ 7 et 20 % en poids de protéine, environ 10 à 16 % en poids de sucre et environ à 55 % en poids d'acides gras en combinaison avec le sque- lette de paroi cellulaire (SPC) et un dimycolate de tréha- lose (DMT). On peut utiliser n'importe quel micro-organisme pour obtenir l'extrait soluble dans la pyridine, y compris par exemple M.bovis BCG, M phlei, M smegmatis, M kansasii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphteriae et Corynebacterium parvum. Corynebacterium parvum est spécialement préféré. On mélange à la pyridine les cellules entières du micro- organisme, de préférence sous forme d'une pâte On sépare le mélange résultant pour obtenir une fraction surnageante qui contient l'extrait soluble dans la pyridine et un résidu. En option, on peut soumettre le résidu j à des procédures répétées de séparation comme décrit ci-dessus en utilisant de la pyridine pour retirer des quantités supplémentaires de l'extrait désiré. On élimine ensuite la pyridine de l'extrait et on dialyse l'extrait séché face à un liquide convenable tel que l'eau distillée L'absence de cellules entières ou de fragments de cellules constituant des contaminants est confirmée par microscopie électronique L'extrait purifié résultant peut alors être lyophilisé par des procédés connus pour obtenir un produit stable. L'extrait soluble dans la pyridine produit conformément à l'invention peut être combiné avec le SPC et le DMú pour fournir une composition ayant une puissante activité anti- tumeur sans stimuler l'hypertrophie de la rate et du foie. Les cancers qui peuvent être traités par cette composition comprennent des tumeurs animales telles que le carcinome à cellule squameuse bovin, le fibrosarcome bovin, la sarcolde équine, le mélanome équin, le carcinome à cellule squameuse équin, les tumeurs mammaires canines, l'adénome canin et le mélanome canin, et des tumeurs humaines telles que les tumeurs du sein, lés tumeurs du poumon, les tumeurs du colon, le mélanome malin, les carcinomes à cellule squa- meuse et les tumeurs ovariennes. La composition est, de préférence, administrée par injection, dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile, directement dans la tumeur, dans des conditions décrites plus particulièrement ci-après. La composition susdite peut être stabilisée, par exemple par une procédure de lyophilisation, et reconstituée ensuite sans perte d'activité. La quantité d'extrait soluble dans la pyridine dans une seule injection pour le traitement des animaux est comprise entre environ 375 et 2500 microgrammes/millilitre -Les quantités de SPC et de DTM sont comprises chacune entre environ 125 et 375 microgrammes/mill-ilitre. Le nombre de millilitres injectésdans la tumeur est déterminé par la taille de la tumeur conformément au tableau suivant: Posologie animale en fonction de la taille de la tumeur. Diamètre de la tumeur (cm}) Quantité injectée (ml) 0-1 jusqu'à 0,5 1-2 0,5 à 2,5 2-3 2,5 à 5 3-5 5 à 10 5-8 10 à 15 supérieur à 8 15 à 20 La dose maximale par injection est d'environ 40 milligrammes pour l'extrait soluble dans la pyridine, 40 milligrammes pour le SPC et 6 milligrammes pour le DM To Le déroulement du traitement comprend jusqu'à six injections administrées à environ deux semaines d'intervalle. La présente composition dans un milieu d'injection convena- ble tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile est adminis- trée directement dans les tumeurs humaines La quantité d'extrait soluble dans la pyridine dans une seule injection est comprise entre environ 800 et 1200 microgrammeso La quantité de SPC est comprise entre environ 50 et 2000 micro- grammes O tandis que la quantité de DMT est comprise entre environ 50 et 1000 microgrammeso La posologie unitaire préférée tant pour le SPC que pour le DMT est comprise entre environ 475 et 525 microgrammeso Toutes les posologies mentionnées ci-dessus sont basées sur un patient adulte représentatif pesant 70 kilogrammeso Les injections sont administrées environ une fois par semaine et jusqu'à un total de quinze injections Comme décrit ci-dessus, la composition pour le traitement des animaux à sang chaud et des humains peut être utilisée sous forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile La quan- tité d'huile utilisée est dans le domaine allant d'environ 0,5 à 3,0 % en volume basée sur le volume total de la compo- sitiono On préfère utiliser entre environ 0,75 et 1,5 % en volume d'huile Des exemples de telles huiles comprennent l'huile minérale, le squalane, le squalène, le 7-n-hexylocta- deécane, l'huile supérieure Conoco et l'huile minérale Drakeol 6 VR (produites par Penreco Company, Butler, Pennsylvanie). Le mélange contenant de l'huile, homogénéisé, est ensuite combiné avec un détergent qui peut facultativement être dissous dans une solution saline avant mélange La quantité de détergent est de façon caractéristique comprise entre environ 0,02 et 0,25 % en volume et, de préférenceentre envi- ron 0,10 % et 0,20 % en volume basé sur le volume total de la composition On peut utiliser n'importe quel détergent courant, y compris Tween-80 et Arlacel {produits par Atlas Chemical Company) On homogénéise ensuite le mélange résultant de l'addition de détergent pour former une suspension présentant un pour- centage élevé de gouttelettes d'huile revêtues par les composants actifs comme on s'en est rendu compte par obser- vation au microscope. Les exemples suivants sont donnés seulement à titre illus- tratif et n'ont pas pour but de limiter ou de redéfinir en aucune façon l'invention telle que revendiquée dans les revendications annexéeso Exemple 1 Préparation d'un extrait soluble dans la pyri- dine à partir de Corynebacterium Parvum. On a cultivé et récolté Corynebacterium Parvum (Poacnes, souche 4182) à 37 WC dans un bouillon de thioglycolate de N Ii H 7- pendant 48 à 72 heures pour obtenir une pâte de cellules entières On a ensuite lavé la pâte avec 500 millilitres d'eau distillée On a mélangé 90 grammes (poids humide) de pâte lavée avec 200 millilitres de pyridine sèche et on a centrifugé à 1700 g pendant une heure à 4 Co On a retiré un extrait soluble dans la pyridine sous forme de fraction surnageante On a extrait le résidu restant de nouveau à la pyridine dans des conditions identiques à celles décrites ci-dessus,Après filtration au moyen de papier Whatman N -1, on a réuni les extraits à la pyridine et éliminé le solvant par évaporation à 50 C dans un Rotavapor de Buchi (Brinkmann Instruments, Westbury, New York) L'extrait à la pyridine séché a été dialysé de façon poussée vis-à-vis d'eau dis- tillée puis lyophilisé o L'extrait à la pyridine purifie résultant contenait environ 12 % en poids de protéine, envi- ron 12 % en poids de sucre et environ 45 % en poids d'acides gras On a examiné l'extrait au microscope électronique et on a constaté qu'il était exempt de contamination par des cellules entières et des fragments de parois cellulaires. Le rendement de l'extrait soluble dans la pyridine était 9 % ( 8,1 grammes). Exemple 2 Préparation d'extrait soluble dans la pyridine à partir de M bovis souche BCG On a cultivé et récolté Mobovis souche BCG dans le bouillon de Sautons à 37 C pendant environ trois à quatre semaines pour obtenir une pâte de cellules entières lavée On a alors traité 50 grammes (poids humide) de pâte lavée de la meme façon que dans l'exemple 1 pour obtenir un rendement en extrait soluble dans la pyridine de 7 % ( 3,5 grammes). L'extrait contenait 15 % en poids de protéine, 10 % en poids de sucre et 52 % en poids d'acides graso Exemple 3 Essai sur des tumeurs de rang 10 de cobayes. On a injecté une fois à six cobayes de souche 2 présentant des grosseurs tumorales de rang 10 d'environ 9 millimètres de diamètre, 0,4 millilitre d'une émulsion stérile de gouttelettes d'huile, à savoir l'huile minérale Drakeol 6 VR (Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania), con 9 tenant 300 microgrammes de l'extrait soluble dans la pyridine préparé conformément à l'exemple 1, 50 mierogrammes de squelette de paroi cellulaire et 50 microgrammes de dimy- colate de tréhalose, directement dans le tissu tumoral. On a examiné les animaux après trois mois, et chez cinq des six animaux une régression totale s'était produite. Dans une expérience de contrôle, on a injecté une fois à six cobayes de souche 2 ayant des grosseurs tumorales de rang 10 d'environ 9 millimètres de diamètre 0,4 millilitre de l'émulsion stérile de gouttelettes d'huile décrite ci- dessus sans extrait à la pyridine ni squelette de paroi cellulaire Les injections ont été faites directement dans le tissu tumoral Aucune des six tumeurs ne présentait de -20 signe de régression après trois mois. Revendications. 1 Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait soluble dans la pyridine d'un micro-organisme, ledit extrait contenant entre environ 7 et 20 % en poids de protéine, entre environ 10 et 16 % en poids de sucre et entre environ 35 et % en poids d'acides gras, un squelette de paroi cellulaire et un dimycolate de tréhalose, et un support pharmaceuti- quement acceptable. 2 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le microorganisme est M bovis BCG, M phlei O M smegmatis, M Kansasii, Nocardia rubrap Corynebacterium diphteriae ou Corynebacterium parvum et, de préférence, Corynebacterium parvum. 3 Composition selon l'une des revendications 1 et 20 carac- térisée en ce que l'extrait contient environ 12 % en poids de protéine, environ 12 % en poids de sucre et environ 45 % en poids d'acides gras, que les quantités d'extrait soluble dans la pyridine et de squelette de paroi cellulaire peuvent atteindre environ 40 milligrammes et la quantité de dimyco- late de tréhalose environ 6 milligrammes, la composition étant sous forme lyophilisée ou sous forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile. 4 o Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'huile est une huile minérale légère, le squalane, le squalène, le 7-nhexyloctadécane, l'huile supérieure Conoco ou l'huile minérale Drakeol 6 VR, la quantité d'huile pré- sente étant comprise entre environ 0,5 et 3,0 % en volume sur la base du volume total de la composition. 5 Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité de détergent comprise entre environ 0,02 et 0125 % en volume sur la base du volume total de la composition et que le produit d'extraction soluble dans la pyridine est compris entre 200 et 5000 microgrammes,. la quantité de squelette de paroi cellulaire est comprise entre environ 50 et 2000 microgrammes et la quantité de dimycolate de tréhalose est comprise entre environ 50 et 1000 microgrammes. 6 Procédé de traitement des tumeurs chez des animaux à sang chaud, caractérisé en ce qu'on administre par injection, î O directement dans la tumeur, la composition selon l'uné des revendications précédentes auxdits animaux à sang chaud. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on injecte dans la tumeur une composition contenant entre environ 375 et 2500 microgrammes par millilitre d'un produit d'extraction soluble dans la pyridine, entre environ 125 et 375 microgrammes par millilitre de squelette de paroi cellulaire et entre environ 125 et 375 microgrammes par millilitre de dimycolate de tréhalose. 8 Procédé selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce qu'on effectue jusqu'à six injections de la composi- tion directement dans la tumeur à des intervalles d'environ deux semaines O 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on injecte dans la tumeur la composition contenant entre enviî ron 200 et 5000 microgrammes du produit d'extraction soluble dans la pyridine, entre environ 50 et 2000 microgrammes de squelette de paroi cellulaire et entre environ 50 et 1000 raicrogrammes de dimycolate de tréhalose, la quantitê d'ex- trait soluble dans la pyridine étant comprise entre environ 800 et 1200 microgrammes et les quantités de squelette de paroi cellulaire et de dimycolate de tréhalose étant comprises entre environ 475 et 525 microgrammes, jusqu' quinze injections étant effectuées à des intervalles d'en- vrion une semaine.