Brevet FR2543572A1 — publié le 19841005

PREPARATIONS D'INOCULUM DE PSEUDOMONAS SYRINGE A FAIBLE ACTIVITE DE L'EAU ET UTILISATION DANS LA LUTTE BIOLOGIQUE CONTRE LA GRAPHIOSE DE L'ORNE La présente invention concerne une préparation de Pseudomonas syringae. Elle concerne plus particulièrement une préparation de Pseudomonas syringae à faible activité de l'eau présentant une longue viabilité et une résistance améliorée à la température. Cette préparation est utilisée notamment dans la lutte biologique contre la graphiose de l1 orme. Cette maladie, qui a détruit plusieurs millions d'ormes depuis son apparition signalée en France en 1918, est imputable à un champignon Ceratocystis ulmi dont la forme imparfaite asexuée est connue sous le nom de Graphium ulmi ; ce champignon revêt au cours de son cycle plusieurs formes (mycelium, spores issues du bourgeonnement -du mycelium, conidiospores, ascospores) qui toutes sont infectieuses pour l'orme. Le champignon au cours de sa croissance synthétise des toxines qui entrainent la mort du parenchyme ligneux. La contamination des arbres sains par les arbres malades se fait soit directement par contact des racines, soit par dispersion des spores par l'intermédiaire de coléoptères du genre Scoltus, Aussi pour lutter contre cette maladie, divers moyens ont été essayés : abattage des arbres atteints, écorçage, application de fongicides, piges à phéromonas, sélection d'ormes résistants. On a aussi essayé de lutter contre le principal agent vecteur de cette maladie1 c'est-a-dire contre les coléoptères à l'aide d'insecticides chimiques ou biologiques. Ce traitement permet d'éviter la propagation de la maladie mais ne résoud en rien le probleme consistant à traiter les ormes malades. Le traitement de cette maladie a été tenté grâce à l'injection dans le tronc de nombreux fongicides systémiques de la famille des benzimidazoles. Mais cette technique est essentiellement préventive et doit être répétée fréquemment. D'autre part, son coat est très élevé et sa mise en oeuvre délicate. I1 est aussi connu d'apres le brevet US 4 342 746 de traiter cette maladie par voie biologique par des bactéries capables de se développer dans la sève de l'orme et de'produire une substance fortement inhibitrice vis-à-vis de Ceratocystis ulmi. Cette méthode de traitement uniquement biologique a pour avantage d'éviter de nuire à l'environnement en utilisant comme microorganisme le Pseudo montas syringae qui n'est pas toxique ni pour l'homme, ni pour les végétaux. Afin de développer efficacement cette technique, il est nécessaire de pouvoir disposer de quantités importantes de Pseudomonas syringae. Nais il est toujours difficile de stocker des organismes vivants sans avoir des pertes importantes. Le stockage des bactéries en milieu liquide est possible mais il doit être réalisé à une température maximale de 40 C et pendant des périodes relativement courtes en évitant toute contaminationétrangere ce qui pose de nombreux problèmes techniques et de lourdes contraintes technologiques. Vu l'importance écologique de ces préparations, de longues études ont permis de réaliser un inoculum de Pseudomonas syringae présentant une longue viabilité et une résistance améliorée à la température caractérisé par le fait que l'on inclut le Pseudomonas syringae dans un gel de polymère, que l'on abaisse l'activité de l'eau à une valeur inférieure à 0,3 et de préférence inférieure à 0,1 et qu'on la maintient à cette valeur. L'invention a également pour objet la préparation de ces inoculun ainsi que leur ueilisation en tant que fongicide biologique. Le moyen selon l'invention pour préparer ces inoculun consiste à inclure les bactéries dans un polymère auquel on fait subir un traitement de réticulation au moins partiel puis à modifier la disponibilité de l'eau de façon à bloquer son pouvoir calorique et de solvation. Cette disponibilité de l'eau exprimée en terme d'activité de l'eau permet lorsqu'elle atteint des valeurs extrêmement faibles de soustraire les bactéries aux actions néfastes des solutés présents dans le milieu de culture, des contaminants capables de se multiplier dans le milieu et au pouvoir de transmission calorique de l'eau. Cette activité de l'eau minimum au-delà de laquelle les bactéries seront préservées est fonction des constituants du milieu de culture, du polymère dans lequel sont insérées les bactéries. La valeur limite de l'activité de l'eau en-dessous de laquelle l'ensemble de ces facteurs présente une influence réduite est de 0,3 et de préférence de 0,1. Les valeurs de l'activité de l'eau sont déterminées par la méthode dite des solutions aqueuses saturées (MULTON, 1981, Techniques d'analyse et de contrôle dans les industries agro-alimentaires, APRIA) ou par leur mesure directe à l'aide d'un hygromètre (Hygroscop) ROTRONIC BT, J. RICHARD et PEKLY. Les bactéries pouvant être mises en oeuvre selon la présente invention appartiennent aux souches de Pseudomonas syringae. Les essais et les résultats rapportés dans la présente invention ont porté sur une souche de Pseudomonas : Pseudomonas syringe M 27 fournie par Ortho Chevron Chemical Company et déposée a la Northern Utilization Research and Development Division sous le numéro NRRL B 12050 et à l'Institut Pasteur sous le numéro I 142. Le milieu de culture de Pseudomonas syringae renferme au moins une source hydrocarbonée, des sels minéraux, une source azotée et éventuellement des facteurs de croissance. La source hydrocarbonée est choisie parmi les sucres tels que le mannitol, le galactose, le glycérol, le sorbitol, le saceharose, le glucose, le fructose > les alcools > les di ou polyosides et les polysaccharides et de préférence parmi le mannitol, le glucoses le glycérol et le saccharose La source azotée peut etre d'origine minérale telle que nitrate d'ammonium, de potassium ou d'origine organique telle que notaitirnent lysine, arginîne, glycines glutamate oa extrait de levure. Le milieu de culture préférentiel est le suivant Extrait de levure Disco 1 gil PO4HK2 0,5 MgS04 71120 0,2 NaCl 0,2 FeC13 0,004 Sucre (mannitol ou glucose ou 10 glycerol ou saccharose) La concentration de la source hydrocarbonée dans le milieu de culture varie de 10 à 30 g/l, celle de la source azotée varie de 1 a 10 g/l. L'inclusion des bactéries dans le polymère selon l'invention peut etre réalisée à partir de la culture liquide directement ou à partir d'un concentré de bactéries obtenu après centrifugation. On fait subir au dit polymère un traitement de réticulation au moins partiel. Par traitement de réticulation au moins partiel, on entend un traitement susceptible de modifier la structure du polysaccharide tel que traitement thermique, traitement par un sel métallique ou par un autre polymère. Le polymère dans lequel sont incluses les bactéries doit pour répondre aux projets de normes antipollution être biodégradable. Aussi, les polymères a base de polysaccharides sont utilisés de préférence aux autres polymères. Ils présentent l'avantage d'être rapidement biodégradables et de libérer ainsi facilement les bactéries Les polysaccharides sont avantageusement d'origine bacterienne ou végétale. Les polysaccharides d'origine bactérienne sont obtenus par fermentation d'un hydrate de carbone par un micro-organisme notamment du genre Xanthomonas ou Arthrobacter ou par des champignons appartenant par exemple au genre Sclérotium. Les polysaccharides d'origine végétale peuvent avoir des provenances diverses telles que notamment algues (alginates, carraghénanes) exsudats de plantes (gomme karaya, adragante) et de graines (guar, caroube). La réticulation peut se faire par exemple pour le cas des alginates par des sels-métalliques tels que de calcium. - Selon un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, on prépare un-milieu de culture que l'on ensemence avec la souche de Pseudomonas syringae. Après quelques jours d'incubation, la culture totale ou les bactéries obtenues après centrifugation de la culture sont mélangées à un polymère ; après réticulation de ce polymère, le gel obtenu est déshydraté. La concentration en polymères dans la suspension à sécher se situe entre 1 et 2 %. On peut ajouter à la suspension avant séchage des additifs tels que les constituants de la source hydrocarbonée précédemment cités ou tout autre produit inerte. L'ensemble gel, sel minéral, source hydrocarbonée et source azotée constitue entre 2 et 10 x en poids de la suspension à sécher. L'étape de déshydratation consiste à diminuer l'activité de l'eau en-dessous de sa valeur critique c'est-à-dire en-dessous de 0,3 et de préférence en-dessous de 0,1. L'étape de déshydratation peut se faire de diverses manières en une ou plusieurs étapes. Selon l'invention, un simple contact à l'air dans les conditions habituelles de température et d'humidité relative n'est pas suffisant. Selon un premier mode de mise en oeuvre de l'étape de déshydre- tation, on fait appel a des techniques qui permettent d'obtenir une dessiccation plus poussée telles- que - flux d'air chaud et sec, évidemment dans les conditions compatibles avec la survie du micro-organisme. - séchage à l'air complèté par une déshydratation de la poudre obtenue dans une enceinte hermétiquement close contenant une solution saturée en un composé présentant l'activité de l'eau requisse, évoluant vers l'équilibre avec l'inoculum. Selon un deuxième mode de mise en oeuvre de l'étape de déshydratation, on peut faire appel à une technique de séchage par atomisation, qui, de manière inattendue conduit à des inoculum dans. lesquels la survie du micro-organisme est préservée alors meme que les températures des gaz de traitement sont largement supérieures à celles que le micro-organisme peut subir. Bien évidemment, on peut combiner plusieurs de ces techniques. Ainsi du point de vue économique, il est préférable d'adopter un système de séchage bi-étagé comme celui utilisé pour la déshydra- tation du lait. Ce système se compose d'un séchage par atomisation qui lorsqu'il est effectué avec une température convenable conduit à une activité de l'eau de l'ordre de 0,2 à 0,4 puis un séchage par lit fluidisé jusqu'a notamment une activité de l'eau inférieure à 0,1. L'utilisation d'un système bi-étagé permet d'augmenter le débit de la substance a sécher, par conséquent l'écart de température entre la sortie et l'entrée dans l'atomiseur. Le lit fluidisé utilisé pour terminer le séchage et atteindre une activité de l'eau inférieure a 0,3 et de préférence inférieure à 0,1 consomme 2 à 4 fois moins d'énergie pour l'élimination de la dernière fraction d'eau que l'atomisation. Globalement l'économie d'énergie réalisée par rapport à un atomiseur simple est de l'ordre de 20 X. Pour maintenir l'activité de l'eau à une valeur optimale, on fait appel à un mode d'emballage étanche limitant les transferts d'eau entre l'atmosphère environnante et l'atmosphère interne des inoculun lors du stockage. Les inoculun se présentent sous forme de particules, à structure souple, facile à mettre en oeuvre, on peut utiliser avantageusement pour leur application la pulvérisation, la remise en suspension dans de l'eau ou dans une solution, puis l'injection dans la sève de l'orme. Ces inoculun sont utilisés comme fongicides biologiques, ils sont notamment actifs contre Ceratocystis ulmi agent de la graphiose de l'orme. La présente invention sera plus aisément comprise à l'aide des exemples suivants, donnés à titre indicatif mais nullement limitatif. Exemple 1 10) Culture de Pseudomonas syringae La culture est développée durant trois jours sur gélose. Cette culture sert à ensemencer un erlenmeyer de 300 ml contenant un milieu de culture YEM de composition suivante Extrait de levure Difco 1 g/l P04HK2 0,5 MgS04, 7 H20 0,2 NaCl 0,2 FeCl3 0,004 Mannitol 10 Après trois jours d'incubation à 280 C, on ensemence un erlen meyer de 2 000 ml contenant le milieu YEM précédemment décrit. Après 24 heures, on ensemence un fermenteur de 75 litres contenant le même milieu. Après 24 heures d'incubation, le nombre de germes obtenu est de 3,2 109 germes/ml. 20) préparation d ' un inoculum polymère xanthane-farine de graines de caroube On prépare deux solutions (les valeurs sont données pour la préparation de 300 g d'inoculum). a) Solution de gomme xanthane : polysaccharide de type anionique de PM > 2.106 résultant de la fermentation d'hydrates de carbone par un micro-organisme de genre Xanthomonas que l'on désignera par produit 1. On amène 100 ml d'eau distillée à 70-800 C, on ajoute 1,5 g du produit 1, on maintient cette température 20 à 30 minutes, sous agitation puis on le ramène entre 40 et 500 C. b) Solution de farine de graine de caroube = polysaccharide constitué d'unités - D - manno pyranosyl (liaisons 1 - 4) une sur quatre ou cinq étant substituée en G6 par un - D - galacto-pyranosyl PH = 3,1 105 que l'on désignera par la suite par produit 2. On procède de la même façon en remplaçant le produit 1 par 1,5 g de farine de graine de caroube. Lorsque les deux solutions sont à 40-450 C, on ajoute sous agitation, à chacune d'elle, 50 ml de suspension de Pseudomonas syringae. On verse alors, en agitant vigoureusement le mélange culture + gomme xanthane dans le mélange culture + farine de graine de caroube. L'obtention d'un gel consistant est instantanée. 30) Préparation d'un inoculum polymère alginate CaSO4 Deux étapes sont nécessaires a) Préparation de la suspension de Pseudomonas svringae dans un alginate de viscosite comprise entre 150 10-3 et 1.000 10-3 Pa.s. On dissout dans 80 ml de suspension de bactéries Ig d'alginate. Pour cela, on disperse la poudre en pluie fine sur la culture en 11 agitant continuellement jusq'à solubilisation complète de l'alginate. b) Gélification de la suspension On ajoute à la suspension de Pseudomonas syringae dans l'algi- nate 20 ml d'une solution de CaS042H20 à 6 g/l. La prise en masse du gel est instantanée. Le pH du milieu est ajusté à 6,8. Comme dit précédemment, le séchage est un point important puisque les modes de séchage utilisés dans llart antérieur pour la survie des bactéries telles que de Pseudomonas syrinae conduisaient à la destruction des bactéries. Dans les exemples suivants, on règle l'activité de l'eau au moyen de solutions satures dont les valeurs des activités de l'eau à une température de 250 C sont exposées dans le tableau 1; a = w : SOLUTES (solutions saturées) : Activité de l'eau à 250C : Actigel (composé déshydratant) : 0,04 : NaOH : 0,07 : KC2H302 - 1,5 R20 0,23 CaC12 - 6H2O 0,31 : Ca(No3)2 41120 0,51 : CuC12 0,69 : NaCl 0,75 : KCl : 0,84 Exemple 2 On place les gels d'alginate séchés contenant Pseudomonas- syringe dans des enceintes correspondant aux activités de lteau suivantes 0,04 - 0,07 - 0,23 - 0,31 - 0,51 - 0,75 - 0,34 pendant 90 jours à une température de 28 C. Avant stockage, le logarithme du nombre de germes par gramme est de 9,3. A la suite de cette période (90 jours) les bactéries sont dénombrées par la méthode des suspensions dilutions bien connue de l'homme de l'art. Les résultats obtenus (tableau 2) montrent que Pseudomonas syringae présente une très bonne survie au cours du temps lorsqu'il est stocké à une activité de l'eau (a ) inférieure ou égale à 0,07 et une survie correcte lorsqu'il est stocké à une activité de l'eau inférieure à 0,3. : aw : 0,04 0,07 0,23 0,31 0,51 0,75 0,84 : log nb g/g : 9,2 9,2 8,4 7,1 0 0 0 ExPnple 3 On mesure l'activité de Pseudomonas syringae sur Ceratocystis ulmi responsable de la graphiose de l'orme. On mesure l'activité de suspensions de Pseudomonas syringae obtenues à partir d'une culture de Pseudomonas syringae incluse dans un gel d'alginate séchée et stockée 80 jours à une activité de l'eau de 0,07 puis remise en suspension à raison de 60 mg de poudre déshydratée pour 9 ml de tampon pH 7, par estimation de l'inhibition de la croissance de Ceratocystis ulmi en botte de Petri. Le pourcentage d'inhibition de la culture incluse atteint 90 .X par rapport à un témoin développé dans les memes conditions en absence de Pseudomonas syringae inclus. L'activité de Pseudomonas syringae sur Ceratocystis ulmi est parfaitement conservée après un stockage de 80 jours à une activité de l'eau de 0,07. Exemple 4 Influence de la source hydrocarbonée sur la survie de Pseudomonas syringae Des milieux de culture contenant des sources hydrocarbonées différentes ont été essayés. La suspension de Pseudomcnas syringae obtenue a été incluse dans un gel qui a été séché puis stocké pendant 122 jours à 280 C à une activité de l'eau de l'ordre de 0,07. Le nombre de bactéries survivantes a été déterminé par la technique des suspensions dilutions. Le milieu de culture assurant une survie optimale de Pseudomonas syringae est le milieu YEN contenant comme source hydrocarbonée le mannitol. Exemple 5 Comparaison de l'efficacité de diverses souches de Pseudomonas syringae sur Ceratocystis ulmi. Les souches essayées ont été fournies par = Ortho Chevron Chemical-company - Institut National de la Recherche Agronomique Collection Nationale de Bactéries Phytopathogènes (C.N.B.P.). : Souches de : Nb. de germes : Inhibition : Pseudomonas syringae : par ml : C. Ulmi : : : % : Chevron M 27 : 2,5 109 : 90 : INRA 62311 : 3,0 109 : O : INRA 62224 : 2,2 109 : O : INRA 64611 : 1,0 109 : 60 : INRA 5911 : 3,4 109 : 0 : CNBP 1585 : 1,9 109 : 80 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'inoculum de Pseudomonas syringae caractérisé en ce qu'on inclut le Pseudomonas syringae dans un gel de polymère et que l'on abaisse l'activité de l'eau en-dessous de 0,3 et de préférence en-dessous de 0,1 et qu'on la maintient à cette valeur. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère est du groupe des polysaccharides auquel on fait subir une réticulation au moins partielle. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le polymère est réticulé par l'un des modes de traitement suivants : thermique, à l'aide d'un sel métallique, au moyen d'un autre polymère. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le polymère est un hétéropolymère à base de gomme, xanthane et de farine de caroube. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que qu le polymère est un polymère à base d'alginate. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture du Pseudomonas contient une source hydrocarbonée choisie parmi les sucres, les alcools, les di ou polyosides et les polysaccharides. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient une source azotée minérale telle que le nitrate d'ammonium, de potassium ou organique telle que la lysine, l'arginine, la glycine, le glutamate et l'extrait de levure. 8. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ee que l'activité de l'eau est abaissée par atomisation 9. Procédé selon la revendication B, caractérisé an ce que l'activité de l'eau est abaissée par atomisation et passage sur un lit fluidisé. 10. Inoculum obtenu en mettant en oeuvre le procédé selon l'une des revendications I à 9, caractérisé en ce qu'il comprend Pseudomonas syringae inclus dans un gel de polymère au moins partiellement réticulé. 11. Application de l'inoculum selon l'une quelconque des revendications précédentes à la lutte biologique contre la graphiose de l'orme.