Brevet FR2547924A1 — publié le 19841228

La présente invention se rapporte à la stabilisation de cellules biologiques, comme des particules du sang, pour une utilisation dans des réactifs de référence employés dans des instruments de comptage et de dimensionnement des particules du sang. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à la stabilisation des. cellules biologiques qui ont été traitées pour une fixation avec un polyaldéhyde. Dans le développement des équipements électroniques perfectionnés de comptage et de dimensionnement des particules du sang, comme les instruments du type Coulter (marque déposée), l'augmentation de la discrimination entre les types de particules, déterminés par les distributions de dimensions, a nécessité la continuation de l'amélioration des solutions de référence à une concentration en particuleset à des distributions de dimensions connues et bien établies, pour une utilisation comme témoins pour garantir que les instruments fonctionnent bien. Tandis que le sang humain frais peut entre modifié pour préparer des témoins de référence en hématologie de sang entier, de telles suspensions ont une durée limitée de conservation et commencent à perdre leur stabilité au bout d'environ trente jours, même avec un stockage refroidi.Une telle instabilité a pour résultat une altération du volume moyen des cellules (MCV) avec diminution conséquente de la discrimination fiable des particules. Dans une tentative pour stabiliser un témoin standard de sang liquide par congélation réelle avec des additifs de diol ou de triol , le brevet US NO 4 199 471 enseigne un traitement où les globules rouges sont traités en succession avec un aldéhyde avec ensuite un mélange lent avec un diol ou un triol, et rétention dans une solution tampon. L'accentuation de ce brevet sur un mélange du diol ou du triol, en contraste avec la réaction, est illustrée par l'utilisation du formaldéhyde comme aldéhyde préféré dans les exemples du traitement révélé. Dans un autre procédé révélé dans le brevet US N 4 160 644, un témoin de référence de plaquettes est stabilisé par addition d'une quantité mineure de polyéthylène glycol solide soit dans la suspension des plaquettes ou bien dans le diluant pour la suspension des plaquettes, on obtient ainsi à la fois une stabilisation du temps et de l'agitation ; le polyéthylène glycol liquide,ayant un poids moléculaire inférieur, s'est révélé inefficace. L'utilisation de réactifs témoins de référence séparés pour des types différents de particules a été plus difficile que l'utilisation de témoins de sang entier. Par exemple, tout système pour le comptage des plaquettes, qui fait la distinction entre les plaquettes d'êtres humains et d'autres cellules dans un échantillon de sang en se basant sur la plage caractéristique de dimensions et la distribution de volume des plaquettes nécessite que le matériau témoin utilisé simule également précisément la même plage de dimensions des plaquettes et la même distribution de volumee Tout témoin de référence contenant des plaquettes ou des plaquettes simulées qui ont une plage étroite de distribution de dimensions ne peut être utilisé pour déterminer si les limites de distribution de dimensions ont été établies correctement. A cette fin, le matériau témoin de référence doit avoir une dimension moyenne se trouvant entre les limites supérieure et inférieure de dimensions et doit avoir un histogramme de distribution de volume s'approchant très précisément de la distribution logarithmique normale des plaquettes du sang humain frais. De nombreux types de technologi ont été appliqués à ce problème pour donner un produit approprié par la dimension, la forme et le volume ainsi que la résistivité électrique, ainsi que la stabilité à la température et dans le temps, une distribution uniforme des particules et une inhibition microbiologique. Les types principaux de particules précédemment recherchés étaient des particules synthétiques, comme un latex de polystyrène, une levure non animale et des cellules de pollen , des plaquettes d'êtres humains ou autres mammifères chimiquement fixées et des cellules animales chimiquement fixées d'autres types. Les particules synthétiques peuvent être fabriquées à des spécifications très précises de volume moyen et de distribution de dimensions, mais des suspensions lisses, stables et uniformes sont très difficiles à préparer. De plus, la forme sphérique de ces particules présente une "forme" électronique différente pour un compteur Coulter (marque déposées et ces volumes doivent être "corrigés" pour tenir compte de la différence de forme, par un facteur arbitraire de forme. L'introduction d'un facteur mathématique indéfini dans le processus de contr8le n'est pas souhaitable. Les pollens et les levures partagent ces mêmes inconvénients et de plus, souffrent d'un manque d'uniformité d'un lot à l'autre et d'un manque de disponibilité. Les plaquettes humaines et plaquettes animales sont assez difficiles et coûteuses à recueillir et à préparer.Les procédé de conservation actuellement en usage commercial provoquent un rétrécisse ment important des plaquettes qui perturbe la distribution normale de population en volume; et les plaquettes sont affectées de façon néfaste lors du vieillissement, par la détérioration, ce qui limite l'utilité d'un lot donné- de plaquettes de contrôle. Dans un procédé révélé dans le brevet US NO 3 553 310, des cellules biologiques, comme des érythrocytes de chèvre et des cellules microbiennes, sont stabilisées par une fixation chimique dans une réaction avec des aldéhydes, en particulier du glutaraldéhyde, pour former des particules qui sont préservées et stabilisées vis-à-vis d'une lyse. Bien que la fixation aux aldéhydes soit souhaitable en termes de la stabilité des particules, une telle fixation provoque également une réticulation qui peut se produire entre des particules, qui conduit à une agglutination non souhaitable. rpLqoemit,unseelaes groupes aldéhydes du glutaraldéhyde (1,5-pâ?tandialdéhyde , OHCCHaCH2CH2CH0) reagit avec une cellule biologique, par exemple une molécule de protéine de membrane d'érythrocyte (RBc), laissant l'autre groupe aldéhyde libre de se réticuler avec d'autres groupes fonctionnels adjacents sur la même cellule ou sur d'autres cellules. D'autres mécanismes proposés pour cette réaction comprennent la formation d'un digère de glutaraldéhyde contenant un C=C avec un hydrogène actif en position bêta. La condensation en cette position laisse les deux groupes aldéhydes libres. dimère de glutaraldéhyde Par chaque mécanisme, il il en resulte une pseudo- hémagglutination (ctest a-dire réticulation entre cellules adjacentes), provoquant des amas de cellules qui se déposent très rapidement et ont tendance à rester collés au fond du récipient. Bien que ce procédé soit lent, il affecte sérieusement la stabilité et l'utilité de tout témoin analogique fait de cette façon. Selon l'invention, des cellules biologiques, qui ont été traitées avec un polyaldéhyde, peuvent être stabilisées pour empêcher une réticulation cellule cellule desdites cellules, par formation d'acétal qui préserve la fonctionnalité de l'aldéhyde n'ayant pas réagi. Un procédé de préparation des cellules biologiques stabilisées à l'acétal comprend la réaction de cellules biologiques traitées au polyaldéhyde avec un alcool en conditions acides; ensuite, le pH peut être élevé à une condition basique, stabilisant la formation d'acétal. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la formation d'acétal cyclique stabilise les cellules biologiques traitées à l'aldéhyde en employant un 1,3-dialcool ou 1,2-dialcool, en particulier de l'éthylène glycol, pour réagir avec l'aldéhyde libre. Les cellules biologiques stabilisées de l'invention sont particulièrement utiles comme analogues des particules du sang humain dans des réactifs de référence employés dans des instruments d'essai dhémato- logie du type Coulter (marque déposée). Coulter et Coulter Gounter sont des marques déposées de Coulter Electronics, Inc à Hialean, Floride, Etats Unis d'Qmérique. En général, les cellules biologiques, comme les érythrocytes des mammifères et des aviens que l'on emploie. comme analogues des particules du sang humain, ont été fixées en utilisant l'aldéhyde, en particulier du glutaraldéhyde, comme cela est mieux décrit par Pearse dans"Histochemistry : Theorical and Applied", 3ème édition, volume 1 (1968) au chapitre 5. Tandis que le glutaraldéhyde et l'aldéhyde préféré utilisé pour la fixation de cellules biologiques stabilisées selon l'invention, d'autres polyaldéhydes comme par exemple les dialdéhydes oxalique, malonique, succinique et adipique, peuvent avantageusement être employés pour une fixation des cellules biologiques. En général, selon l'invention, les groupes aldéhydes n'ayant pas réagi ou libres sur les cellules biologiques traitées au polyaldéhyde peuvent réagir avec un alcool pour former des acétals, ce qui empoche une réticulation subséquente cellule-cellule et stabilise les cellules biologiques pour une utilisation dans des suspens ions ayant une durée étendue de conservation sans agglutination. Des alcools appropriés à une réaction avec des aldéhydes pour former des acétals , par exemple, les alcools ayant de 1 à 6 atomes de carbone, peuvent être employés dans l'invention. Les alcools préférés utilisés dans l'invention réagissent avec l'aldéhyde pour produire un acétal cyclique. Des exemples de tels alcools sont les glycols sans empêchement stérique à proximité des fonctions hydroxyles, comme le triméthylène glycol (1,3-propane diol) qui réagit avec l'aldéhyde pour former un acétal cyclique à 6 membres . Pour une utilisation dans la présente invention, on préfère les192 dialcooD qui réagissent avec l'aldéhyde pour former un acétal cyclique à 5 membru donnant des cellules biologiques particulièrement stabilisées et favorisant la résistance à l'agglutination des cellules de la suspension.Ainsi, le propylène glycol et en particulier l'éthylène glycol sont des exemples des 1,2-dialcoo tout à fait préférai. Moins préférable est le glycérol comme exemple d'un alcool trihydrique qui peut former de l'acétal cyclique mais qui laisse un hydroxyle libre qui peut subséquemment réagir pour une réticulation entre les cellules biologiques avec résistance réduite à l'agglutination. D'autres alcools que l'on peut employer selon l'invention comprennent le 1,2-cyclopentanediol et le 1,2-cyclohexanediol, par exemple. Pour préparer les cellules biologiques stabili- sées selon l'invention, on fait réagir les cellules traitées au polyaldéhyde avec un alcool en conditions acides pour favoriser la formation de l'acétal; ainsi, la formation des acétals est favorisée par une réaction en présence d'un alcool en excès pour garantir une fonctionnalité d'équivalent hydroxyle supérieure à l'équivalent d'aldéhyde libre réactif. Par exemple, si l'on utilise 0,25'/o de glutaraldéhyde dans une solution saline pour une réaction dans une suspension d'environ 75.000 à 100.000 cellules par millimètre cube , la réaction avec l'éthylène glycol ajouté à une concentration d'environ 3% (volume/volume) de la suspension totale donnera un hydroxyl alcool en excès approprié. On a déterminé que la solution de la réaction pouvait être maintenue à un pH de préférence compris entre environ 2,3 et 2,9 afin de favoriser la formation d'acétal sur les cellules biologiques traitées à l'aldéhyde, comme des érythrocytes d'animaux, dans une solution contenant des hydroxyles en excès. Subséquemment, la solution résultante du produit peut être ajustée à une condition basique, de préférence légèrement au-delà de la neutralite. On a déterminé que l'ajustement de la solution du produit résultant à un pH de préférence compris entre environ 7,2 et 7,6 était particulièrement efficace pour stabiliser les cellules biologiques stabilisées à l'acétal formé. L'ajustement basique approprié a été obtenu par addition d'une solution de tampons de phosphate conventionnelle, et si nécessaire, des petites quantités d'une base forte, comme de la soude à 6 N, peuvent être ajoutées. La réaction qui suit est représentative de la réaction de stabilisation selon l'invention, où l'érythrocyte traité au glutaraldéhyde (RBC) réagit en condition acide avec de l'éthylène glycol pour former une stabilisation à l'acétal cyclique d'éthylène glycol de la cellule, qui est particulièrement stable lors d'un ajustement de la solution du produit à une condition basique Les cellules biologiques stabilisées préparées selon l'invention ont été développées pour une utilisation comme analogues de particules du sang humain dans des solutions de référence employées dans des instruments de comptage et de dimensionnement en hématologie, Dans de telles applications, les cellules stabilisées peuvent être mises en suspension dans un milieu diluant contenant de préférence un alcool approprié pour empêcher une transacétalisation non souhaitée et des agents bactéricides et antimousses conventionnels, avec un tampon pour maintenir un pH d'environ 7,4. Les meilleurs résultats ont été obtenus dans la production d'analogues de particules de sang humain par la préparation d'érythrocytes d'animaux, comme des globules rouges d'êtres humains et de chèvres, stabilisés selon l'invention. Par exemple, les érythrocytes de la chèvre ont été stabilisés selon l'invention pour une utilisation pour le mélange d'un analogue de plaquettes d'être humain à une dimension moyenne comprise entre 2 et 20 microns au cube et une population logarithmique normale en volume.Dans une application semblable, des érythrocytes d'êtres humains ont été stabilisés selon l'invention pour une utilisation comme analogues de leucocyt d'8tre humains ou de globule blanc (WBC). Les cellules stabilisées peuvent être utilisées dans des analogues autonomes ou dans des simulations de sang entier pour le centrale des réactifs de référence. L'exemple qui suit illustre le traitement de l'érythrocyte de mammifère selon l'invention; EXEMPLE Du sang frais de chèvre a été recueilli par voie aspetique, dans un anticoagulant. Le sang a été lentement centrifugé pour retirer le plasma et l'anticoagulant . Les érythrocytes ont été lavés trois fois avec une solution saline de tampons de phosphate, pH 7,4 ajuste à environ 410 milliosmoles par kilogramme. On- a mis en suspension environ 100 à 150 ml des érythrocytes fraichement lavés dans 2 1 d'une solution saline, 410-Mos/kg, et on a agité avec un agitateur magnétique. Ensuite, on a ajouté, goutte à goutte, 500 ml d'une solution saline à 0,31% (poids/volume) de glutaraldéhyde dans 410 m0sm/kg 0e )irb Ssikia7e à un débit de 10-15 ml par minute avec ensuite agitation continue pendant 15 minutes et encore addition de 500 ml d'une solution saline à 0,44% (poids/volume) de glutaraldéhyde dans 410 m0sm/kg à un débit de 10-15 ml par minute. Après agitation continue pendant 15 minutes, on a ajouté 120 ml d'éthylène glycol et 75 ml d'un tampon à 0,5 M HCl de glycine à I M,pH2,4 avec ensuite agitation pendant 30 minutes. Le pH final était de 2,8+ 0,1. Dans la solution résultante, on a ajouté environ 100 ml d'un tampon de phosphate à 2 M, pH 7,4, pour amener le pH à 7,4+ 0,2.Les érythorcytes se sont déposés pendant la nuit. Après décantation du liquide surnageant, les érythrocytes ont été lavés trois fois avec de l'eau. Les érythrocytes ont alors été remis en suspens ion dans un milieu de suspension à un compte de 1 million + 500.000/ml avec ensuite mise en place dans un bain à ultrasons pendant 1 à 2 heures pour désintégrer les amas et filtration à travers un filtre de micro-agrégat de 20 microns avant stockage final. La préparation était stable à la température ambiante. Formule du milieu de suspension IL Eau 800 ml NaH2P04. H20 0,2 g NaHP04* 7H20 2,0 g Ethylène glycol 150 ml 4-chloro-3,5-xylénol, sodium 0,5 g Na2EDTA 0,25 g Isopropanol 100 ml Ajuste au volume avec de l'eau distillée et filtré avec un filtre de 0,2 micron. Dans des applications comme la simulation des leucocytes humains du lymphoide et du myloide, des cellules stabilisées d'espèces multiples peuvent être mélangées pour obtenir la population double de volume de cellules souhaitée, nécessitant typiquement des plages moyennes de volume des cellules de 70-90 microns au cube et plus de 100 microns au cube pour un analogue précis de leucocyte humain dans un témoin de sang entier. Ceux qui sont compétents en la matière noteront facilement la largè plage d'utilisation des cellules biologiques stabilisées obtenues par cette invention. REVEND;(CATI0NS 1. Composition de cellules biologiques stabilisées, caractérisée en ce que ladite composition de cellules est traitée pour comprendre au moins un radical acétal choisi dans le groupe consistant en où R1 , R2 , R3 et R4 sont des groupes ayant 1 à environ 6 atomes de carbone. 2.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le radical acétal précité a la structure cyclique 3.- Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que la structure cyclique précitée comprend où R3 est CH2 et R4 est CH2CH2. 4.- Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que la structure cyclique comprend où R3 est CH2 et R4 est CH2 5.- Composition selon l'une quelconque des revendications 1,2 ou 4, caractérisée en ce que la cellule biologique comprend un érythrocyte d'animal. 6.- Procédé de stabilisation de la fixation de cellules biologiques traitées avec un polyaldéhyde afin d'empêcher une réticulation cellule-cellule desdites cellules, caractérisé en ce qu'il consiste à (a) faire réagir lesdites cellules biologiques traitées à l'aldéhyde avec au moins un alcool dans une solution maintenue en condition acide pour former de l'acétal, et ensuite, (b) ajuster la solution du produit résultant de l'étape (a) à une condition basique. 7.;Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la solution de réaction acide précitée à l'étape (a) est maintenue à un pH compris entre environ 2,3 et 2,9. 8.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'alcool précité comprend au moins un 1,2-diol. 9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le 1,2-diol précité comprend de 1 'éthylène glycol. 10.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la condition basique précitée est effectuée à l'étape (b) par addition d'une solution de tampons de phosphate en une quantité suffisante pour obtenir un pH d'environ 7,2 à 7,6. 11.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les cellules biologiques précitées comprennent des érythrocytes d'animaux. 12.- Composition de cellules biologiques stabilisées, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé selon la revendication 6. 13.-Suspension de cellules biologiques stabilisées, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé selon la revendication 6.