Brevet FR2539628A1 — publié le 19840727

Procédé de séparation de cellules mobiles, notamment de spermatozoldes mobiles, ainsi que dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé." La présente invention se rapporte à un procédé de séparation de cellules mobiles se trouvant dans un milieu visqueux et, notamment des spermatozoides mobiles;; des autres constituants du sperme éjaculé, ainsi qu'wu dis positif pour la mise en oeuvre de ce procédé." Depuis quelques années, la recherche médica- le tente d'apporter des solutions aux problèmes posés par la stérilité des couples, Certaines techniques ont permis d'apporter l'espoir à des femmes pour lesquelles, jusqu'à présent, la venue au monde d'un enfant était une hypothèse peu probable.Au premier rang de ces techniques, il faut mentionner l'insémination artificielle qui est de nos jours parfaitement au point0 Très récemment, certains médecins ont nieme réussi à faire naître dans les meilleures conditions pos sibles des enfants issus de mère n'ayant pas ou plus de trompes, après une fécondation "in vitro". Il s'agit là d'une technique qui n'en est encore qu'au stade expérimen- tal, mais qui devrait, ces toutes prochaines années, être tentée à plus grande échelle, Pour avoir le maximum de chance de succès, que ce soit dans le cas de fécondation "in untero" ou "in vitro", il est nécessaire d'utiliser un sperme qui soit de la meilleure qualité possible, et donc qui possède le plus grand pourcentage possible de spermatozoïdes mobiles. A cet effet, on a déjà proposé divers types de traitements du sperme éjaculé, se proposant d'améliorer son "degré d'efficacité", ce qui revient à augmenter la proportion de spermatozoïdes mobiles par rapport aux autres constituants, c'est-à-dire les spermatozoïdes immobiles ou morts, les cellules rondes et le plasma seminal. La méthode qui est actuellement la plus utilisée dans ce but est la centrifugation. Celle-ci n'est cependant pas sans inconvénient, vu qu'elle est d'une mise en oeuvre peu aisée, et ne donne pas toujours des résultats satisfaisants. La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients en proposant un procédé permettant de séparer les spermatozoïdes mobiles des autres constituants du sperme éjaculé, qui soit d'une mise en oeuvre simple, et permette d'aboutir, en un temps relativement court, à un résultat satisfaisant. A cet effet, le procédé qui fait l'objet de l'invention est caractérisé en ce que l'on remplit d'un milieu aqueux tampon un récipient, notamment tubulaire, divisé en sa partie inférieure en deux compartiments, à savoir un compartiment d'introduction et un compartiment de prélèvement, séparés par une barrière, le compartiement de prélèvement étant nettement plus profond que le compati ment d'introduction et le niveau du milieu tampon dépassant la barrière, on dépose, notamment à l'aide d'une pi- pette le sperme au fond du compartiment d'introduction, en quantité insuffisante pour que son niveau dépasse la barrière, on laisse reposer la préparation ainsi obtenue pour laisser le temps aux spermatozoïdes mobiles de migrer dans le milieu tampon vers le compartiment de prélèvement et de sédimenter dans ce compartiment d'où ils ne peuvent ressortir du fait de la trop grande hauteur de la barrière, puis, on prélève la partie inférieure du compartiment de prélèvement à l'aide d'une pipette. Ce procédé permet d'aboutir à une séparation satisfaisante des spermatozoïdes mobiles en un laps de temps de l'ordre de 3 heures0 Le milieu tampon aqueux peut en fait être quelconque, pour peu qu'il ait un pH voisin de 7, et qu'il contienne du glucose. On peut, de manière satisfaisante, utiliser un milieu tampon renfermant des acides aminés et/ ou des sels minéraux, Le procédé qui fait l'objet de l'invention est basé sur la différence de densité existant entre le sperme et le milieu tamponp qui fait que le sperme reste au fond au compartiement d'introductionsans risque de mé- lange, et, que seuls les spermatozoïdes mobiles sont susm ceptibles de passer rapidement dans le milieu tampon de par leur propre mouvement de propulsion et de traverser la barrière, pour se trouver au droit du compartiment de prélèvement où ils sédimentent rapidement. Il est particulièrement important que le com- partiment de prélèvement soit suffisamment profond pour éviter tout risque de retour des spermatozoïdes mobiles vers le compartiment d'introduction0 On a obtenu des résultats satisfaisants en utilisant un compartiment d'introduction ayant une profondeur de 5 mm, et un compartiment de prélèvement ayant une profondeur de 20 ami avec, une injection dans le comm partiment d'introduction, d'une quantité de sperme telle que son niveau reste à environ 2 mm au-dessous de la barw rière. Selon une autre caractéristique de l'inven- tion, permettant d'améliorer le taux et la vitesse de séparation, pendant la phase de repos, on injecte dans la préparation un courant d'oxygène et de gaz carbonique. En plus de la lutte contre la stérilité9 le procédé qui fait l'objet de l'invention peut etre appli- que dans divers domaine-s de la recherche pure, notamment pour la recherche d'anticorps anti-spermatozoïdes. Ce procédé peut aussi trouver une applica tion dans le domaine vétérinaire, pour améliorer le rendement des élevages. L'invention concerne également un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé qui a été décrit ci dessus. Ce dispositif se compose d'un récipient, notamment tubulaireS comportant à sa partie inférieure un compartiment dlintroduction et un compartiment de prélève ment, plus profond que le compartiement d'introduction, ces deux compartiments étant séparés par une barrière0 Selon l'invention, ce dispositif est carac térisé en ce que le compartiment d'introduction a la forme d'un anneau entourant le compartiment de prélèvement. Cette disposition spécifique des deux compar- timents est celle qui s'est révélée la plus favorable pour augmenter au maximum la probabilité pour que les spermato- roides mobiles se sédimentent au droit du compartiment de prélèvement, vers le fond de ce compartiment. Pour faciliter l'opération de prélèvement des spermatozoïdes mobiles an fond du compartiment de pré lèvement, opération qui est effectuée- à l'aide d'une pipette de type "Pasteur" selon une caractéristique préfé rentielle de l'invention, le compartiment de prélèvement se rétrécit en forme de une à sa partie inférieure Selon une autre caractéristique de l'inven- tion, la barrière de séparation des deux compartiments a la forme d'un cylindre et constitue, avec les parois du compartiment de prélèvement, un tube continu à fond conique. Par ailleurs, ce dispositif peut comporter un bouchon munI, le cas échéant, d'une ouverture permettant l'introduction d'un gaz lors de la phase de repos. Le dispositif qui fait l'objet de l'inven tion peut être conçu en un matériau quelconque, mais, sa forme particulièrement simple permet de concevoir des diso positifs à usage unique en une matière plastique transparente non toxique. Les caractéristiques du procédé, ainsi que du dispositif qui font l'objet de l'invention, seront ddw crites plus en détail en se référant aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 est une vue en perspective de ce dispositif, - la figure 2 est une vue en coupe de ce me dispositif, Selon les figures 1 et 2, le dispositif qui fait l'objet de l'invention se compose d'un récipient tubulaire 1 séparé, en sa partie inférieure, en deux compas timents, à savoir un compartiment d'introduction 2 et un compartiment de prélèvement 3 plus profond que le compas timent d'introduction Ces deux compartiments sont séparés par une barrière 4. Selon la figure 29 le compartiment d'intro duction 2 a la forme d'un anneau qui entoureS sur toute sa périphérie le compartiment de prélèvement qui est consu titué par un cylindre dont la partie inférieure 5 se rétrécit en forme de c8ne et dont la partie supérieure 4 constitue la barrière de séparation des deux compartiments 2 et 3. Pour assurer l'équilibre du dispositif, les parois latérales 6 du tube 1 se poursuivent au-delà des parois inférieures annulaires 7 du compartiment dyintron diction. Le dispositif 1 est par ailleurs muni d'un bouchon 8 comportant un orifice 12 permettant en cours de processus l'introduction d'un gaz, notamment un mélange de gaz carbonique et d'oxygène selon la flèche A. Ce dispositif, qui est de préférence en une matière plastique transparente, non toxique, et doit entre jeté après usage, est destiné à la mise en oeuvre d'un procédé de séparation des spermatozoïdes mobiles des autrès constituants du sperme éjaculé. Selon la figure 2, pour la mise en oeuvre de ce procédé, on remplit le tube 1 d'un milieu tampon 9 con tenant du-glucose et, le cas échéant, des. acides aminés et/ou des sels minéraux jusqu'à un niveau dépassant l'ex- trémité supérieure 10 de la barrière 4, puis, on dépose à l'aide d'une pipette le sperme à séparer 11 au fond du compartiment d'introduction 2 de façon que son niveau vienne jusqu'à environ 2 mm en dessous de l'extrémité supérieu- re de la barrière 4, puis, on laisse reposer la préparation ainsi obtenue pendant une période d'environ 3 heures, le cas échéant, en bouchant le tube avec le bouchon 8 et en introduisant un courant dto2ygène et/ou- de gaz carbonique selon la flèche A par l'orifice 12. Pendant ce repos, les spermatozoïdes immobiles ou morts, les cellules rondes et le plasma séminal cons- titutifs du sperme restent au fond du compartiment 2 sans rIsquer de se mélanger avec le milieu tampon 9, tandis que les spermatozoïdes mobiles et eux seuls, sont susceptibles de passer dans le milieu aqueux 9 du fait de leur propre mouvement de propulsion selon la flèche B, et une propor- tion importante d'entre eus est susceptible de passer au dessus de la barrière 4 pour se trouver au droit du cons partiment de prélèvement 3 où ils sédimentent rapidement du fait de la faible viscosité du milieu 9, pour se retrouver à la partie. inférieure 13 de ce compartiment où ils peuvent être prélevés, notamment à l'aide d'une pipette "Pasteur". A titre d'exemmle, les résultats les plus satisfaisants ont été obtenus à partir d'un dispositif de dimensions suivantes : Hauteur totale a du tube 1 : 45 mm Largeur b du tube 1 : 1-3 mm épaisseur c des parois de ce tube o 1,5 mm Hauteur d du compartiment de prélèvement 3 : 20 mm Longueur e de la partie cylindrique de ce tube : 10 me Hauteur f de la barrière 4 : 5 me Epaisseur g des parois du compartiment de prélèvement 3 : 0,5 mm Largeur h de ce compartiment 3 : 6 mm Bien entendu, ces données ne sont indiquées qu'à titre d'exemple et ne sauraient, en aucun cas9 constituer une limitation de l'invention. E V E N D I C A-T I 0 N S 1.- Procédé de séparation de cellules mobiles se trouvant dans un milieu visqueux et, notamment, des spermatozoïdes mobiles des autres constituants du sperme éjaculé, procédé caractérisé en ce que l'on remplit d'un milieu tampon aqueus (9) un récipient notamment tubulaire (1) divisé en sa partie inférieure en deux compar- timents, à savoir un compartiment d'introduction (2) et un compartiment de prélèvement (3), séparés par une barrière (4)J le compartiment de prélèvement (3) étant nettement plus profond que le compartiment d'introduction (2) et le niveau du milieu tampon (9) dépassant la barrière (4), on dépose, notamment à l'aide d9une pipette le sperme au fond du compartiment d'introduction (2) en quantité insuffi- mante pour que son niveau dépasse la barrière (4), on låisb se reposer la préparation ainsi obtenue pour laisser le temps aux spermatozoïdes mobiles de migrer dans le milieu tampon (9) vers le compartiment de prélèvement (3) et de sédimenter dans ce compartiment (3) d'où ils ne peuvent ressortir du fait de la trop grande hauteur de la barrière (4) pais on prélève la partie inférieure (5) du compartiment de prélèvement (4) à l'aide d'une pipette. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on laisse reposer la préparation pendant environ 3 heures. 3.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le milieu tampon (9) renferme du glucose. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu tampon (9) renferme des acides aminés et/ou des sels minéraux. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que pendant la phase de repos, on injecte dans la préparation un courant d'oxy- gène et de gaz carbonique. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le compartiment de prélèvement (3) est environ trois fois plus profond que le compartiment d'introduction (2)o 7.- Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, se composant d'un récipient (1) notamment tubulaire9 con portant à sa partie inférieure un compartiment dtintroducu tion (2) et un compartiment de prélèvement (3) plus prow fond que le compartiment d'introduction (2), ces deux com- partiments étant séparés par une barrière (4), dispositif caractérisé en ce que le compartiment d'introduction (2) a la forme d'uni anneau entourant le compartiment de pré lèvement (3). 8. Dispositif selon la revendication 7, ca ractérisé en ce que le compartiment de prélèvement (3) se rétrécit en forme de côme à sa partie inférieure (5)0 9.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 et 8 caractérisé en ce que la barrière (4) de séparation des deux compartiments (2, 3) a la forme d'un cylindre. 10.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte un bouchon (8)o