Brevet FR2540116A1 — publié le 19840803

La présente invention a essentiellement pour objet un nouvel antibiotique depsipeptidique cyclique, la luzopeptine E 2, ainsi qu'un procédé pour sa préparation et sa récupération. L'invention vise également les compositions pharmaceutiques contenant ce nouvel antibiotique qui constitue un agent antimicrobien et antitumoral. Dans la demande de brevet britannique N 2 0503844, on a décrit un complexe antibactérien et antitumoral appelé BBM-928, ainsi que sa production par fermentation d'une nouvelle souche d'actinomycetes, désignée souche G 455-101 (ATCC 31491) Ce brevet antérieur révèle que le complexe BBM-928 comporte au moins six constituants désignés BBM-928 A, B, C, D, E et F Les constituants A, B, C et D sont complètement caractérisés dans ce brevet, tandis que les constituants E et F sont caractérisés seulement par leurs valeurs Rf dans deux systèmes de chromatographie en couch E minces(CCM) sur silicagel, et par leurs activités antimicrobiennes in vitro contre certaines bactéries aérobies. La souche G 455-101 de micro-organismes produisant le complexe BBM-928 fut déterminée plus tard comme étant une nouvelle espèce du genre Actinomadura et désignée Actinomadura luzonensis nov sp (voir la publication J Antibiotics, 33 ( 10): 1098-1102, 1980). La publication J Am Chem Soc 103: 1241 ( 1981) décrit les structures du BBM-928 A, B et C, comme le fait la publication Peptide Chemistry, 1980, K Okawa (Ed), Protein Research Foundation, Osaka, Japon, p 119-124 ( 1981) ,ainsi que la publication J Antibiotics 34 ( 2): 148-159 ( 1981). La production, l'isolement, la caractérisation et l'activité antitumorale des constituants du BBM-928 sont décrits dans la publication J Antibiotics 33 ( 10): 1087-1097 ( 1980) Comme dans la demande de brevet britannique N 2 050 384 A, les composés E et F sont caractérisés seulement par leurs valeurs de Rf dans deux systèmes CCM sur silicagel. Un mécanisme proposé de l'activité antitumorale du BBM-928 A est décrit dans la publication Biochemistry 19: 5537 ( 1980). Les antibiotiques BBM-928 sont présentement appelés les antibiotiques de luzopeptine selon leur espèce de production Ici par conséquent, il faut considérer que les luzopeptines A, B, C etc sont identiques au BBM-928 A, B, C, etc précédemment appelé comme tel dans la littérature. L'invention sera mieux comprise à l'aide des dessins annexés, donnés à titre d'exemple, et dans lesquels: la figure 1 montre le spectre d'absorption infrarouge de la luzopeptine E 2 mise en comprimé dans K Br. Dans cette figure, on a porté en abscisses le nombre d'ondes en cm-1 (trait horizontal inférieur), et la longueur d'ondes en microns (trait horizontal supérieur), et en ordonnées la transmission en pourcent; la figure 2 montre le spectre de résonance magnétique du proton de la luzopeptine E 2 dissoute dans CD C 13 (ppm en abscisses); et la figure 3 montre le spectre de résonance magnétique nucléaire carbone-13 de la luzopeptine E 2 dissoute dans CDC 13 (p p m en abscisses). La présente invention concerne un nouvel anti- biotique antitumoral appelé luzopeptine E 2,ainsi qu'un procédé pour sa préparation et son isolement suivant un état pur dépourvu de substances co-produites Cet antibiotique est obtenu en cultivant une souche produisant la luzopeptine E 2, de Actinomadura luzonensis, de préférence Actinomadura luzonensis ATCC 31491 ou un mutant de cette souche, dans un milieu aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans des conditions aérobies immergées jusqu'à ce qu'une quantité sensible de luzopeptine E 2 soit produite par l'organisme précité dans le milieu de culture, et en récupérant la luzopeptine E 2 du milieu de culture sous une forme purifiée sensiblement dépourvue de sous-produits. La luzopeptine E 2 présente une activité à la fois antimicrobienne et antitumorale. La luzopeptine E 2 proposée par la présente invention a été trouvée comme étant un constituant mineur du complexe antibiotique de luzopeptine (ou BBM-928) dans la demande de brevet britannique N 2 050 384 A Cette demande décrit la fermentation de Actinomadura luzonensis sp nov pour produire un complexe antibiotique de luzopeptine, ainsi que la séparation d'un tel complexe en six composés bioactifs appelés maintenant luzopeptines A, B, C, D, E et F. Dans cette demande, il n'y a cependant aucune description de l'antibiotique luzopeptine E 2, qui a présentement été découvert comme étant co-produit lors de la fermenta- tion de Actinomadura luzonensis. Le nouvel antibiotique de la présente invention a été isolé du bouillon de culture ou de fermentation contenant Actinomadura luzonensis, suivant une forme essentiellement pure et a été caractérisé par ses propriétés physiques, chimiques et biologiques comme il sera décrit en détail plus loin. Des études menées par des collègues des inven- teurs ont établi, après isolation et caractérisation de la luzopeptine E 2, que la luzopeptine E (voir par exemple demande de brevet britannique NO 2 050 384 A) n'est pas en fait un composé antibiotique unique, mais est plutôt un mélange de composés comprenant la luzopeptine E 2. La luzopeptine E 2 est un antibiotique cyclique depsipeptidique contenant un noyau quinoléine comme chromophore Après analyse spectrale et chimique, la luzopeptine E 2 a été déterminée comme ayant la formule structurelle suivante CH 30 3 D CH 2 D La luzopeptine E 2 est un solide blanc présentant un point de fusion de 201-203 C, un poids moléculaire de 1315,3732 et une formule moléculaire C 60 H 78 N 14020 L'analyse élémentaire indique les pourcentages moyens suivants en poids: carbone 53,19 hydrogène 5,40 azote 12,92 oxygène (par différence) 28,49. Le spectre d'absorption infrarouge de la luzopeptine E 2 mise en comprimé dans du K Br est montré sur la figure I des dessins annexés Des bandes d'absorption infrarouge caractéristiques sont présentes aux fréquences suivantes exprimées en centimètres-1: 3470, 3370, 2980, 2983, 2850, 1740, 1645, 1520, 1418, 1350, 1285, 1230, 1195, 1150, 1128, 1105, 1065, 1025, 905, 885, 795, 785 et 750. Les spectres de résonance magnétique du proton (RMP) et de résonance magnétique nucléaire du carbone-13 (RMC), de la luzopeptine E 2 furent déterminés avec un spectromètre Bruker modèle WM-360, fonctionnant à 360 et M Hz respectivement Les spectres RMP et RMC sont montrés sur les figures 2 et 3 des dessins. Dans un système solvant consistant de xylène- méthyléthylcétone-méthanol ( 5:5:1 v/v), la luzopeptine E 2 présente une valeur Rf de 0,33 déterminée par chromato- graphie en couches minces (CCM) sur silicagel. La caractéristique structurelle clé de la luzopeptine E 2 qui la distingue des composés de luzopeptine connus est la présence d'une fraction ou partie hexahydropyridazine au lieu du groupe tétrahydro- pyridazine. La luzopeptine E 2 peut être produite en cultivant une souche productrice de luzopeptine E 2, de Actinomadura luzonensis, préférablement une souche de Actinomadura luzonensis ayant les caractéristiques d'une souche ATCC 31491, ou bien un mutant de cette souche, dans des conditions aérobies immergées dans un milieu nutritif aqueux. Les organismes de production pour la luzopeptine E 2 et les conditions de fermentation pour l'obtenir sont comme décrit dans la demande de brevet britannique N 2 050 384 A. Bien que l'organisme préféré de production soit constitué par la souche Actinomadura luzonensis G 455-101 (ATCC 31491), toute souche productrice de luzopeptine E 2 ou tout mutant de l'organisme préféré qui peut être produit à partir d'un tel organisme par des moyens classiques tels que rayonnement X, rayonnement ultraviolet, traitement avec moutardes à l'azote, exposition aux phages ou analogues, doit être considéré comme compris dans le cadre ou la portée de la présente invention. L'organisme de production est élevé dans un milieu nutritif classique contenant une source de carbone assimi- lable telle que amidon, glucose, dextrine, maltose, lactose, sucrose, fructose, mannose, mélasse, glycérol ou analogues. Le milieu nutritif doit également contenir une source d'azote assimilable telle que protéine, hydrolysat de protéine, polypeptides, acides aminés, liqueur de blé macéré, caséine, urée ou analogues, aussi bien que des sels minéraux nutritifs qui procurent des cations et anions minéraux, tels que potassium, sodium, ammonium, calcium, sulfate, carbonate, phosphate, chlorure, nitrate ou analogues. Bien que cela ne soit pas essentiel pour produire et récupérer la luzopeptine E 2, on préfère ajouter au milieu nutritif un composé contenant du soufre et choisi dans le groupe comprenant la D,L-méthionine, la S-méthyl- cystéine, la S-éthyl-L-cystéine, la D,L-éthionine, la D-méthionine, la Lméthionine, l'acétyl-méthionine, le 2-aminoéthanethiol, l'acide 2-hydroxy-4-(méthylthio)- butyrique, la D,L-0-méthyl-sérine, la L-cystéïne et la L-méthionylglycine Les composés préférés contenant du soufre sont la D,L-méthionine et la S-méthyl-cystéine. De tels composés contenant du soufre peuvent être ajoutés par exemple suivant une concentration d'environ 0,05 % à environ 0,5 % (poids/volume) du milieu de fermentation, les concentrations les plus préférées pour la D,L-méthionine et la S-méthyl-cystéfne étant de 0,15 % et 0,1 % respective- ment L'addition d'un composé ci-dessus contenant du soufre a été trouvée comme augmentant la production de la luzopeptine E 2 de sorte que celleci peut être plus rapidement testée et isolée. Pour produire la luzopeptine E 2, toute tempéra- ture conduisant à une croissance satisfaisante de l'orga- nisme de production peut être utilisée Des températures comprises entre environ 20 et 45 C sont utilisables, bien qu'un intervalle de température compris entre 27 et 35 C soit plus préférable Une production maximum de luzopeptine E 2 est obtenue généralement après un temps compris entre environ 72 et 96 heures. Des méthodes classiques sont utilisées pour le processus de fermentation Par exemple, la préparation de petites quantités peut être convenablement réalisée dans des fioles agitées ou par des cultures de surface La préparation de grandes quantités est de préférence réalisée dans des conditions aérobies immergées, et cela dans des récipients stériles Avec la fermentation en récipient, un inoculum végétatif est d'abord produit dans un bain de fermentation nutritif en inoculant la culture avec une spore de l'organisme pour réaliser une culture ensemencée active et jeune qui est ensuite transférée de manière aseptique au milieu du réservoir de fermentation L'aération dans les récipients et les bouteilles peut être réalisée par de l'air stérile forcé au travers de ou sur la surface du milieu de fermentation avec une agitation supplémentaire dans les récipients, laquelle est réalisée à l'aide d'un système mécanique avec pale ou roue mobile. Des agents antimoussants tels que l'huile de silicone, l'huile de soja et l'huile de lard ou axonge, peuvent être ajoutés si besoin est. Le cours de la fermentation peut être suivi en testant le milieu de fermentation de temps en temps avec un organisme sensible à la luzopeptine E 2, tel que Bacillus subtilis ATCC 6633 La luzopeptine E 2 peut également être détectée par observation ultraviolette à 360 nm ou par sa valeur Rf de 0,37 dans le système xylène-méthyléthylcétone- méthanol ( 9:9:1 v/v) par chromatographie en couches minces sur silicagel. La luzopeptine E 2 peut être isolée à partir du bouillon de fermentation par des méthodes classiques telles que des méthodes d'extraction par solvant ou des méthodes chromatographiques comme cela sera complètement décrit dans l'exemple De telles méthodes permettent de recueillir le composé de luzopeptine E 2 sous une forme purifiée sensiblement dépourvue de sous-produits. On décrira maintenant des données concernant l'activité biologique. Les concentrations inhibitrices minima in vitro (CIM) de la luzopeptine E 2 furent déterminées par la méthode de dilution agar-agar en série De l'agar-agar Mueller-Hinton fut généralement utilisé pour les bactéries gram-positives et gram-négatives sauf pour les bactéries résistant aux acides, dans quel cas du milieu N 1001 ( 3 % de glycérol, 0,3 % de Lglutamate de sodium, 0,2 % de peptone, 0,31 % de Na 2 HPO 4, 0,1 % de KH 2 PO 4, 0,005 % de citrate d'ammonium, 0,001 % de Mg 504 et 1,5 % d'agaragar), fut utilisé Les résultats sont montrés sur le tableau I comparativement à l'activité de la luzopeptine A. Tableau I Activité antimicrobienne in vitro de la luzopeptine E 2 Organisme d'essai Staphylococcus aureus 209 P Staphylococcus aureus Smith Streptococcus pyogenes S-23 Micrococcus flavus D 12 Corynebacterium xerosis 53 K-I Bacillus megaterium D-2 Bacillus anthracis A 9540 Escherichia coli NIHJ Klebsiella pneumoniae D-11 Proteus vulgaris A 9436 Pseudomonas aeruginosa A 9930 Mycobacterium smegmatis 607 Mycobacterium phlei D 88 CIM en mcg/ml Luzopeptine Luzopeptine E 2 A 0,4 0,4 0,4 0,8 0,1 0,2 0,2 0,2 0,8 0,8 0,2 0,8 0,2 0,2 0,1 0,2 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 0,8 0,4 1,6 0,4 L'activité antitumorale de la luzopeptine E 2 contre la leucémie P 388 fut évaluée sur des souris BDF à l'aide de méthodes précédemment décrites (voir publications Can Chem Rep 50: 479, 1966 et Can Chem Rep 3: 1, 1972). Les résultats de ce test sont consignés dans le tableau 2 ci-dessous avec, à titre de comparaison, les résultats pour la luzopeptine A. Tableau 2 Effet de la luzopeptine E 2 sur la leucémie lvmphatiaue P-388 Composé Dose (mg/kg/jour) Luzopeptine E 2 Inhibition tumeur TSM (% T/Te) Toxique Luzopeptine A Traitement: une fois par jour pour neuf injections Sujet: souris femelles BDF 1 Evaluation: TSM = temps de survie moyen % T/Te = TSM sujets traités/TSM sujets témoins x 100 Critère: T/Te > 125 fut considéré comme représentant un effet antitumoral significatif Toxicité: Dans un second testal'activité antitumorale de la luzopeptine E 2 fut évaluée contre la leucémie P 388 chez les souris BDF 1 par la méthode rapportée dans la publication J Antibiotics 33:1087-1097 ( 1980) La luzopeptine A fut testée comparativement et a servi de composé de référence Comme montré sur le tableau 3, les luzopeptines A et E 2 présentaient une activité antitumorale presqu'équivalente La toxicité intra- péritonéale déterminée après doses multiples (une dose par jour pendant 9 jours) de la luzopeptine A et E 2, est montrée dans la dernière ligne du tableau 3 La toxicité de la luzopeptine E 2 est presque la moitié de celle de la luzopeptine A. Tableau 3 Activité antitumorale de la luzopeptine A sur la leucémie P 388 Activité antitumorale Dose* (ip) (% T/Te en TSM) en mg/kg/jour Luzopeptine Luzopeptine A E 2 0,1 0,03 89 143 0,01 174 181 0,003 168 149 0,001 141 129 0,0003 121 117 DEM* (mg/kg/jour) 0,001 0,001 DL 50 * (mg/kg/jour) 0,019 0,034 * Posologie: une dose par jour du premier au neuvième jour DEM = Dose efficace minimum DL 50 = Dose léthale moyenne Comme indiqué par les informatiors données ci- avant sur l'activité antimicrobienne et sur les tumeurs chez la souris, la luzopeptine E 2 est utile comme antibiotique et également comme agent antitumoral pour inhiber les tumeurs malignes des mammifères, telles que la leucémie P 388 Dans le cadre de l'invention, rentrent les compositions pharmaceutiques contenant une quantité efficace antimicrobienne et inhibant les tumeurs, de luzopeptine E 2 en combinaison avec un diluant ou support inerte pharmaceutiquement acceptable De telles composi- tions peuvent également contenir d'autres agents actifs antitumeurs ou antimicrobiens et peuvent être réalisées sous une forme appropriée quelconque en fonction de la voie choisie pour l'administration Des exemples de telles compositions comprennent des compositions solides pour administration orale, telles que des comprimés, des capsules, des pilules, des poudres et des granulés, des compositions liquides pour administration orale telles que des solutions, des suspensions, des sirops ou des élixirs et des préparations pour administration parentérale telles que des émulsions, des suspensions ou des solutions stériles Ces compositions peuvent également être fabriquées sous la forme de compositions solides et stériles qui peuvent être dissoutes dans de l'eau stérile, du sérum physiologique ou quelque autre milieu stérile injectable, immédiatement avant utilisation. L'invention procure également une méthode pour le traitement thérapeutique d'un sujet mammifère affecté par une infection microbienne ou par une tumeur maligne (par exemple la leucémie P 388), cette méthode consistant à administrer audit sujet une dose efficace antimicrobienne ou inhibant les tumeurs, de luzopeptine E 2 ou bien d'une composition pharmaceutique contenant cet antibiotique. L'exemple suivant illustrera l'invention qui ne doit pas être considérée comme limitée au mode de réalisation spécifiquement décrit Dans cet exemple, "Pharmamedia" est une marque de fabrique appartenant à la société Buckeye Oilseed Products Co, Fort Worth, Texas, pour de la farine de coton "Nutrisoy" est une marque de fabrique appartenant à la société Archer Daniels Midland Co, Decatur, Illinois, pour du soja broyé en farine "Fermo 30 " est une marque de fabrique de la société Yeast Products Inc, Clifton, New Jersey, pour désigner de la levure en poudre. "Skellysolve B" est une marque de fabrique appartenant à la société Skelly Oil Co, Kansas City, Missouri, pour désigner un solvant de pétrole comprenant des hexanes isomères et présentant un point d'ébullition de 60 -68 C. "Nylon Copol 8 " est une pièce tubulaire de nylon utilisée comme colonne à la place du verre Le nylon peut résister à certains solvants pt, lorsque la chromatographie est achevée, la colonne peut être découpée pour obtenir les fractions. EXEMPLE Préparation de la luzopeptine E 2 A Fermentation Une préparation végétative et ayant subi une bonne croissancede Actinomadura luzonensis souche G 455-101 fut maintenue congelée (-12 C) dans du sucrose à une concentration finale de 20 % Cette préparation congelée fut utilisée pour inoculer un milieu végétatif contenant 3 % de cérélose, 1 % de Pharmamedia (farine de coton), 1 % de Nutrisoy (farine de soja) et 0,3 % de Ca CO 3 La culture fut incubée à 35 C pendant 48 heures sur un agitateur rotatif ( 210 tours/min) et 7 ml de la culture furent transférés dans un récipient Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu de fermentation composé de 3 % de cérélose, 2 % de Pharmamedia, 1 % de Fermo 30 (poudre de levure), 0,5 % de Ca CO 3 et 0,15 % de DL- méthionine, le p H étant ajusté à 7 avant stérilisation La production de luzopeptine E 2 a atteint un maximum entre 72 et 96 heures à la température d'incubation de 35 C. B Détection La luzopeptine E 2 peut être isolée du mélange de fermentation par dilution de l'entier bouillon de culture avec un volume égal de tampon 0,5 M tris-H Cl, p H 8, puis on procède à une extraction avec deux volumes de chlorure de méthylène. Après une brève centrifugation pour casser l'émulsion, la couche de solvant fut déposée sur des plaques de silicagel connu sous la dénomination Analtech, et développée dans un système xylène-méthyléthylcétone- méthanol ( 9:9:1) La luzopeptine E 2 apparaît pour Rf = 0,37, entre le BBM-928 A (Rf= 0,57) et le BBM-928 B (Rf= 0,27) Les trois composés peuvent être détectés par observation aux ultraviolets à 360 nm ou par bio- autographie en utilisant de l'agar-agar ajusté à p H 8 et ensemencé avec Bacillus subtilis ATCC 6633. C Isolement La totalité du bouillon de culture ou de fermen- tation ( 10 litres), obtenu à partir d'une fermentation de Actinomadura luzonensis souche G 455-101 dont la croissance s'est faite en présence de DL-méthionine ( 1,5 g/l), fut ajustéeà p H 8 avec du carbonate de sodium et agitéependant 2 heures avec 4 litres de n-butanol en présence de terre de diatomées comme aide de filtration. Le mélange résultant fut filtré, et la phase organique séparée et concentrée sous pression réduite jusqu'à donner un résidu huileux La trituration du résidu huileux avec du Skellysolve B (marque de fabrique de Skelly Oil Co, pour un solvant de pétrole comprenant des hexanes isomères et présentant un point d'ébullition de 60-68 C) et avec du diéthyléther, a donné, après filtration et séchage, 4 grammes de complexe de luzopeptine enrichi Ce complexe de luzopeptine enrichi fut soumis à la chromatographie sur une colonne de silicagel sec préparée selon Loev et Goodman (voir publication "Progress in Separation and Purification"P volume 3, page 73, 1970) La colonne de silicagel sec (Merck; 280 grammes) fut désactivée par l'addition de 40 ml d'eau distillée et une agitation vigoureuse pendant 3 heures, puis mise en équilibre pendant 3 heures supplémentaires avec 18 ml d'un mélange de xylène-méthyléthylcétone ( 1:1 en vol) Le silicagel fut ensuite utilisé pour garnir la colonne en utilisant une colonne de Nylon Copol 8, calibre 160 ( 4 x 100 cm), avec l'aide de laine de verre. Le complexe de luzopeptine ( 4 g) fut dissous dans 30 ml de xylèneméthyléthylcétone ( 1:1 en vol), filtré, déposé sur le silicagel par enlèvement du solvant sous pression réduite et appliqué sur la colonne sèche. La colonne fut développée avec du méthyléthylcétone- xylène-méthanol ( 5:5:1 en vol) jusqu'à ce que l'éluant ait juste dépassé le lit de la colonne. L'observation de la colonne avec une lampe à ultraviolet portable à 360 nm fut faite, puis les zones fluorescentes jaunes furent coupées et les parties de silicagel résultantes furent éluées avec du chloroforme- méthanol ( 1:1 en volume) et, après analyse par chromato- graphie en couches minces (CCM) sur Si O 2 (méthyléthyl- cétone-xylène-méthanol; 5:5:1 en vol), les produits solides contenant la luzopeptine E 2 furent combinés ( 494 mg) La fraction enrichie de luzopeptine E 2 ( 494 mg) fut dissoute dans du chlorure de méthylène, déposée sur du silicagel et soumise à la chromatographie sur une bouillie formant une colonne de silicagel de 2 x 80 cm et englobée dans du toluène avec un gradient de toluène- méthanol ( O à 10 %) Les fractions furent recueillies et analysées par CCM sur silicagel (méthyléthylcétone-xylène- méthanol; 5:5:1 en vol) L'élution avec du méthanol 7 % a donné de la luzopeptine A et des impuretés puis on a procédé à l'élution de la luzopeptine A et de la luzopeptine E 2 (fractions 71-75) et de la luzopeptine E 2 pure (fractions 76-80) La cristallisation de la luzopeptine E 2 pure à partir d'un mélange chlorure de méthylène-toluène a donné 22 mg de cristaux de luzopeptine E 2. L'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. Elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont effectuées suivant son esprit. R E V E N D I C A T I O NS 1. Antibiotique et antitumoral constitué par la luzopeptine E 2 et sensiblement exempt de substances co-produites, caractérisé en ce qu'il présente la formule structurelle suivante: H C CH 3 \ / 3 C-OH CH H 3 CI 13 31 t 1 C O O=C-NH-CH 2-CO-N-CH 2-CO-N-CH L CHO D O CO N.,3 O-NH HC O N l O N e CHCO Nt H-COXO o 0/ H 2 CO NH -CO-CH-NH-CO t N DI L H C-CH 2 C 2 HO C HO_ H 03 Cd H 3 C/ 'CH 3 2. Procédé pour la préparation de l'antibiotique luzopeptine E 2 présentant la formule suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver Actinomadura luzonensis ATCC 31491, ou un mutant de cette souche produisant la luzopeptine E 2, dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans des conditions aérobies immergées jusqu'à ce qu'une quantité sensible de luzopeptine E 2 soit produite par l'organisme précité dans ledit milieu de culture, et à isoler la luzopeptine E 2 du milieu de culture de manière sensiblement dépourvue ou exempte de sous-produits ou substances co- produites. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu nutritif pendant la phase de fermentation un composé contenant du soufre et choisi dans le groupe comprenant la D,L-méthionine, la S-méthyl-cystéine, la S-éthyl-L-cystéfne, la D,L- éthionine, la D-méthionine, la L-méthionine, l'acétyl- méthionine, le 2-aminoéthanediol, l'acide 2-hydroxy-4- (méthylthio)butyrique, la D,L-0-méthyl-sérine, la L-cystélne et la L-méthionyl-glycine. 4 Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la D,L-méthionine ou la S-méthyl- cystéine est, de préférence, ajoutée au milieu nutritif pendant la phase de fermentation. 5. Compositions pharmaceutiques contenant une quantité efficace de luzopeptine E 2 sur le plan anti- microbien ou antitumoral, avec un diluant ou un support ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.