Brevet FR2541271A1 — publié le 19840824

Nouvelle synthèse du hpGRF en phase liquide. Le hpGRF (human Pancreatic Growth Hormone releasing Factor) ou Somatocrinine est un peptide constitué par l'enchaîne- ment de 44 aminoacides. Sa séquence est la suivante 1 5 10 H - Tyr - Ala - Asp - Ala - Ile - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr Arg - Lys - Val - Leu - Gly - Gln - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys 25 30 Leu - Leu - Gln - Asp - Ile - PIet - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly 35 40 Glu - Ser - Asn - Gln - Glu - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg 44 Leu - NH2 Il a été récemment découvert par A. Guillemin et coll. (Science, 218, 585-587 (1982)) à partir d'extraits d'une tumeur pan creatique humaine. Ce peptide est particulièrement actif sur la stimu- lation de la libération de l'hormone de croissance (GH) aussi bien in vitro qu'in viro, In vitro, en particulier son efficacité se manifeste à des doses de. quelques fento moles/ml (ED50=15 fento moles/ml). L'intérêt thérapeutique en médecine humaine de cette substance va donc se situer au niveau du traitement du nanisme et des retards à la croissance en pédiatrie. D'autres applications sont possibles dans les cas de déficience anabolique protéique (ulcères de stress, réparation de fractures ou d'atteintes du cartilage, brûlures étendues (pendant la phase anabolique), réparations cutanées, ostéo poroses...). Dans le domaine vétérinaire, ce composé présente un intérêt évident au niveau de la croissance pondérale des animaux d'élevage (bovins, ovins, porcins, poulets, ...) et de l'augmenta- tion de la lactation (bovins, ovins, ...) Le développement industriel de ce composé polypepti dique nécessite la synthèse de quantités importantes de cette substance. Les procédés classiques de la synthèse en phase solide permettent la préparation en des temps courts de faibles quantités de ce principe actif (Science, 218, 585-587 (1982)) à des coüts très élevés et incompatibles avec un développement pharmaceutique à grande échelle. bizous décrivons un procédé de synthèse en phase liquide pouvant être transposé à l'échelle industrielle permettant un accès au principe actif avec un rendement et un taux de pureté excellents. Ce procédé est basé sur le principe d'une synthèse par fragments. L'exemple décrit utilise 9 fragmentes, dont les points de coupure ont été déterminés sur la base de considérations chimiques (risques minimaux de racémisation pendant les phases de couplage des fragments). Le découpage de ces fragments aurait pu être organisé autrement et la synthèse dzerite n'a qu'une valeur d'exemple. Un avantage évident d'un procédé par fragments par rapport à une stratégie pas à pas ("Step Wise") est qu'il est possible de synthétiser ces fragments en parallèle, ce qui se traduit par un gain de temps notable. Au niveau de l'élongation complète du peptide à partir de ces 9 fragments tout se passe comme si on synthétisait un nonapeptîde. Le procédé de la présente invention est caractérisé en outre en ce que l'on couple, l'un après l'autre et dans l'ordre de la séquence, les fragments dans lesquels a) les fonctions acides latérales des acides aspartique et glutamique et la fonction amine latérale de la lysine sont protégées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de déprotection du groupement Boc, b) la fonction guanidine de i'arginine est protégée par protonation, et c) l'acide aminé N-terminal est protégé sur l'amine par le groupement Boc, en éliminant sélectivement le groupe Boc de l'amine N-termi nale du peptide en phase d'élongation par hydrolyse à l'acide tri fluoroacétique, ledit couplage étant effectué dans un solvant polaire aprotique et on élimine en fin de séquence tous les groupes protecteurs par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à 1 Vii d'acide méthanesulfonique ou trifluorométhanesulfonique dans l'acide tri fluoroacétique. Le procédé de la présente invention peut aussi s'appliquer à la synthèse du hpGRF 1-40, produit naturel isolé également par R. GUILLEMIN, presque aussi actif que le hpGRF 1-44 et utilisable dans les mêmes indications thérapeutiques. La présente invention a donc pour objet la préparation du hpGRF, procédé de synthèse par fragments en phase liquide selon une stratégie du type schématisé ci-après à propos du hpGRF 1-44. G R F - STRATEGIE DE SYNTHESE Dans laquelle les acides a-aminés sont représentés par les symboles recommandés par la commission de nomenclature de 1'IUPAC-IUB section biochimie. Ala : alanine Arg : arginine Asn : asparagine asp : acide aspartique Gln : glutamine Glu : acide glutamique Gly . glycine Ile : isoleucine Leu : leucine Lys : lysine Met : méthionine Phe : phénylalanine Ser : sérine Thr : Thréonine Tyr : tyrosine Val : valine Ils ont tous la configuration L, chaque aminoacide est affecté de son numéro d'ordre dans la séquence du GRF. Les protections des chaîneslatérales sont symbo-lisées par X1 = ester du type benzyle(0 Bzl), X2 = protection carbamate du type benzyloxyearbonyle(Z). Les flèches verticales délimitent les fragments utilisés dans la synthèse décrite et chacun d'eux est désigné par une lettre majuscule A : fragment 40 - 44 5 : fragment 33 - 39 C : fragment 28 - 32 D : fragment 25 - 27 E : fragment 21 - 24 F : fragment 16 - 20 G : fragment 12 - 15 H : fragment 5 - 11 I : fragment 1 - 4 Le procédé de synthèse du GRF décrit se caractérise en outre par les aspects suivants - application du principe de la protection minimale au niveau des chaînes latérales fonctionnalisées; - protection temporaire de la fonction guanidine latérale de l'ar ginine par le groupement nitro. L'arginine est introduite en séquence sous forme nitro granidine.La fonction nitro est ensuite éliminée le plus tôt possible (voir synthèse des fragments) par hydrogénation catalytique à l'aide de Pd/charbon, ou bien en uti lisant à la place de l'hydrogène gaz un générateur d'hydrogène, comme l'acide formique ou le formiate d'ammonium. Ainsi, tous les fragments synthétisés possédant de l'arginine dans leur séquence (A, B, F, H) ont en fin de synthèse les fonctions guanidine sim plement protégées par protonation à l'aide d'un acide fort (acide chrolhydrique par exemple). X1 - Les fonctions acide carboxylique des chaînes laté- rales de l'acide glutamique (B) et aspartique (D.I.) sont protégées par des groupements clivables par hydrogénation catalytique (H2/Pd/charbon) ou bien en milieu acide fort, comme les mélanges acide méthanesulfonique (0,5 M) - acide trifluoroacétique, ou acide trifluorométhanesulfonique (0,5 M) - acide trifluoroacétique. Nous préconisons comme protecteurs l'esterjbenzyiique (0 Bzl) ou 2,6dichlorobenzylique. Ces groupements protecteurs sont stables dans les conditions des déprotections intermittentes des amines en &alpha;(éli- mination des groupements t,-butyloxyearbonyle : Boc par l'acide trifluoroacétique). X2 - Les fonctions amines des chaînes latérales des lysines sont protégées par des groupements clivables dans les mêmes conditions que précédemment. Nous préconisons les groupements benzyl oxycarbonyl (Z), 2-chloro ou 2-bromobenzyloxyearbonyle (2-C1 ou 2-3r Z) stables dans les conditions de déprotection intermittente par l'acide trifluoroacétique. Les fonctions hydroxyle présentes'dans la thréonine, la sérine et la tyrosine ne sont pas protégées. L'élongation du peptide à partir des fragments synthéti sés (A à I) est réalisée en utilisant comme agent de couplage l'hexafluorophosphate de benzotriazolyloxyphosphonium (B 0 P), ou la dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroEy-l benzotriazole, dans un solvant approprié comme le diméthylformamide ou le dimdthyl- sulfoxyde. L'isolement du produit du milieu réactionnel est effectué par introduction d'un tiers solvant insolubilisant (éther, acétate d'éthyle, ...) qui précipite le peptide. On se limite pendant les étapes de couplage à des purifications sommaires du type lavage en phase solide à l'aide de solvants appropriés afin d'éliminer le léger excès du dernier fragment couplé, ainsi que les impuretés apportées par les agents de couplage. Chaque opération de couplage d'un fragment est suivie d'une phase de déprotection intermittente du groupement protecteur Boc (tertiobutyloxycarbonyle), au niveau de l'amine sur laquelle va être effectué le couplage suivant. Cette déprotection est assurée par l'acide trifluoroacétique dans le chlorure de méthylène (50/50 en volume). Les déprotections des chaînes latérales en fin d'élonga- tion du peptide peuvent être effectuées par hydrogénation en présence d'un catalyseur (comme le Pd/C) à l'aide d'hydrogène gazeux sous légère pression (1 à 5 bars), ou bien avec un générateur d'hydrogène, comme 11 acide formique ou le formiate d'ammonium. I1 est également possible d'éliminer ce type de groupements protecteurs par un acide fort, comme les mélanges d'acide méthanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique (0,5 M) ou bien d'acide trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique (0,5 M). Le produit est purifié en utilisant la technique de la distribution à contre-courant à l'aide d'un système à deux phases non miscibles, comme le milieu de Partridge (n-butanol-eau-acide acétique), et la purification est complétée par une filtration sur gel de Sephadex G 50 dans l'acide acétique dilué (10-20%). Chacun des fragments intervenant dans la synthèse du GRF décrite a été synthétisé selon une stratégie adaptée à chaque cas de figure. Les différentes stratégies utilisées pour la synthèse des fragments A à I sont reportées sur les tableaux suivants. Elles relèvent toutes de procédés "Step-Wise" en phase liquide. Dans le cas où l'on souhaite synthétiser le hpGRF 1-40, le fragment A est réduit à l'alanine amide (H-A1-NH2). TABLEAU I (fragment A) Ala Arg a ----- A ra I---Leu NH2 s I- t t ,* N 2 '2 , / L Boc L Boc 't OH 2 t t t t t I t t t NO Soc TFA NH2 I t t t t t I t NO I I t t 2 t t t t I I 1 I Bar - -! NH I 2 ) I 1 BOP NO, I I + ' 2 t I v OC NH t BOc-----, ---- 2 t I I I I t TFA NO2 So BOC H~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ I I NH 2 BOP I BOP I t I t I Soc , 4 wN02 , Boc m 'H2 1NO2 'NO t '2 H : ,N02 I N02 I H t I I t t I t 2 i N02 t NO 4, 2 Ni' z1 t I t 2 t SS H I t H, t H + I ' + 2 H t I I I I I I I I R NH2,3HCl TABLEAU II (fragment B) Glu Ser - AsDr--------Gln ---- Glu Arg Arg ~" Gly I I t I î I t I I I t t I I I t I I I t t I t I t t t I I t :1 t t t t I ,O t I t I t 2 I I I t t z I I 1 2 I LH I I I t I I I I I 5 t I I I t t I M02 I t I I I J t I t I s t t t I I t I r O3zi t I I I t t I t I I t + I I I t H I I I I Bzl t 21 Il t I t ::0 I I I t s I I t I I Np H OH I t t Boc; I t oB-l I I OH t I I I H: I I t .oBzlV I I t t I I t '-ff OH I t I I I I 2,/ ' OHI I I I I t I I I t t I I I I ItO Boc I t I I t t Bzl I I I &num;)Np H H+ I I I I I I I t HNp t t : oBzl : I t I t '' , oSzl / I I I I , ,' Boc t I I 5 Il I I r ptH 1|TFA I t I TFA I t I t t t I t t t I t t I I H I ; OH 50cW e-rr--t-Ot I t + I I I I t I I Bzl I t t oBzl t H : I I t I I I t ( : Boc. : t : Bzl + : ', !, oBzl ' ,TFA I t I Boc BocONbH : . OH I -I t + I I r , I t 'I t oBz H t I t t I t t I t I Boc + OH t I OH pBzl I t + TFA ' 3zl I I t t H : o Bz0 I I I I t I oc - I t I :tOH Ip H- I I I I + B o3zl 1 t I t tH t I I t o t I I floc t I t I t r OH TABLEAU III (fragment C) Ser Ar5g Gfn I s s s s s J s J s J s s t s J I s I s s s s s I. t J I t j , , ! , Z ~~~~~~~OH H 30p I s ' I Z! GCEA I J t J N 2 ' s s s 2/pu s s 2 s s s s s s s s Oc, H : I CH3 I s s N 2 Bop s , ,' ,/ i s J 2 s s s s s s s I Boc - , OCH3 CH s > s s J s 3 s t J J s I 2 s I I ONb s oc3s Boy s s - s OCH3 I I s s I N02 NO2 , , I s s s J s s J floc > -------,1-rs s OCH I , H+ , d * I | H2/Pd Boc Boc IIPPs. I t 0CR3 X X yz 3 I 9 s OH I : x OH s : OH TABLEAU IV (fragment D) Asp I1 e ~ lie I I t I t t I I Soc ' OH H ' MH-NH-Troc , !1A, I I t s Boc s s i Soc NH-NH-Troc OBzl j TFA | , Boc . -1/ ONSu ~I~ t B I NH-NH-Troc I 1 'Bzl t s t s Soc , -- CH2 NH-NH-Troc . OSzl Soc : ?;H-NH2 t s OBzl NO2Na v t N3 TABLEAU V (fragment E) Lys Leu Leu . Le,u Gln I t I I 1 I I I I I I I I I I I I t , Z ' OH H ' -O 3Ut I 1 - I I I MA I I t j t I I Il t Z O -'- - 3 Sut I I t I 1 1 I 1 I I I I 8, Bor ' NH H ' O 3ut. I s s t I I t t t t I MA MUA g I t J s I Bor ' . . - O But t I t t I I , I I t, T.FA Boc ;OSSU H 4 OH I t I I I t I 7 Soc / .... I . ,t OH TABLEAU VI (fragment F) Gln Leu - Ser Ser Al a . Arg I I I I I I s i t t I ' , ', Soc ' OBZt t I 1 s I Tt t T;A' I r5 I 5 I I 5 t s s t s s I t ', I Boc ' . OH z f 1 I I t s I I 80P X ', s I I I ,, > s I I s -Nb 60c I I . uNb Boc 1 t I I I I t NO2 I t I , I I I t ( SOC t I OBZI s t I I : TFI\ I I ,, t TFA I c I I OH I t 3ocOH H -- ! I OBzl s f BOP 3/ I 1 I , I I I Il Z s s I I i I I I S I I OSzi Boc; = I I 15 s I 1 TFA } t : 12 s i s I I ' , IOBz Boc-q -ONp H z I t t s s 2 t s s s I s I t Boct , OBzi s I t H/Pd 1 : H* I t 2 'y I I I I ( ' t t t OH TABLEAU VII (fragment G) Lys I Val Leu . Gly 5 s I t t 5 S I 5 s ~ z 5 ONp H Ont H I - CH 1 l s I I 5 I I S I s I i I Z ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ CH S I I O t I 5 I s I S /Pc: s S I ZOH H W OCH3 I 1 MA | ' MA I S I I st I S s I S z' I OCH i 5 ~ ~ tt OCH3 I I I s I I S I S / s Soc'ONp S s S H : ' OCH3 s I . Z I S S I I I 5 , Boc - g t ~ t | OCH3 OH t I 4 OH S S Soc 'I I ' OH TABLEAU VIII (fragment H) IlPhr Thr--------Asn Ser-7yr ---- Arg j I I j j j j j I j I r I j g t I j j j I j t I t j j "I! ti-2 j I j j j Sot H Boc I 1 'BSP : NO2 ( F F I 1 Soc TrA NO2 j j j j ≈ TFA 1 N02 I j j I j j ^Bz j j j j j t j I j j I j I j r', ( t j j 3oc0Nb ONb z, 1 I I I i i F | l | H :, N02 l j I , , s s j I 5 1-OEzi I I j ' 3oc z j I j j j j j 15 : j j TrA NO2 I j t I : F j t j j 5 I j j 1 1 I j j I j j j t r , Boc : --ONb I 1 t j j j j t j I j j I02 t I t | I t PrO 2 I j j j j j t I t k j j j j I t j I j Szl t I s Boc j L Bzl I t j 5 j j j j I j FA , I I j I I3Bzl j j j j t j j I j j , Boc j 3ocfr0NSu R t I j j j j I t I I l l l t j I t j j ''2 I t j j I I t j j t j t Soc : (' ----- Boc ( j j j t j I j j j j j j I t 9 1 NO2 1 H j j OBzl I Boc t 111 t t t t tj t t sa O j a , j t I I j t j j j j j j j I t t r' j Boc t t j j t i j t j j : j j j j t t tî. j t nBzl j I j j j j j t j j I t n Bocf- OH j j flOP : NO j j j j s t 2 j j j j j j t j I j 5 j j I j flos : tj F ; t II j j j I t t j H t j j j j ; j j j j j j j j 5 I j t j I I ( j ' ' !, Z OH TABLEAU IX (fragment I) Tyr Ala Asp Ala t j t Tyr ... 5 Al s s 5 s OSz 5 , I I I/ I I I IC)SUt À4NSii ,OSut Soc H 5 5 :0 Szl Soc Y . ', .... OBut 5 j I I TFA I I 1/ I-- I 30c w OTcp H :;;i ,OH j ,' 5 OH . s Soc 5 Boc Boc 5 5 OBzl TFA5 I IG ' ZrONp H , / ' '' OH , OB21 , . , OH 7 5 j Dans la présente demande, les abréviations utilisées ont les significations ci-après CC chromatographie-sur couches minces ED 50 dose efficace 50 OBzl ester benzylique Z benzyloxycarbonylamino (carbamate) # Boc tertiobutyloxyearbonyl-amino (carbamate) DMF diméthylformamide NEM N-éthylmorpholine TFA acide trifluoroacétique MA méthode de couplage aux anhydrides mixtes ONSU ester activé avec la N-hydroxy succinimide ON ester activé avec l'ortho nitrophénol o Troe trichloroéthoxycarbonylamino CCl3-CH2-O-C-NH (carbamate) 0But ester avec le tertiobutanol OTcp ester activé avec le 2,3,5-tri chlorophénol OHBT N-hydroxybenzotriazote ONb ester activé avec le N-hydroxy norbornène-5 dicarboximide-2,3 BOR hexafluorophosphate de benzo triazolyloxyphosphonium Les exemples non limitatifs ci-après illustrent l'inven- tion EXEMPLE I Synthese de il - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 (fragment A) NO2 1. H-Arg-Leu-NH2 Dissoudre à la température ambiante 130 g de leucine amide (H-Leu-NH2) dans 1,5 1 de DMF. Ajouter 333 g de Boc-Arg (NO2)-OH puis 500 g de BOP. Ajuster le pH à 7 au papier pH (sur de petits prélèvements dilués à l'eau) et à l'aide de N-éthylmorpholine (NEM). Le milieu est agité et on suit l'évolution de la réaction par C.C.M. La réaction est terminée au bout de 4 h. Le milieu est évaporé a sec sous vide à 25 . Le résidu est repris par 1 litre d'eau et on obtient un solide qui est lavé à l'eau, puis avec une solution aqueuse de NaH C03 à 5% à l'eau, à l'acétate d'éthyle et, finalement, on seche le solide a l'air. On contrôle par C.C.M. Le solide précédent est introduit dans 2 1 d'un mélange 50-50 en volume d d'acide trifluoroacdtique-chlorure de méthylène. Le milieu est agité 10 min à la température ambiante et évaporé à sec sous vide à la température ambiante. Le résidu d'évaporation est repris dans l'éther, essoré, séché et contrôlé par C.C.M. et R.M.N. Rendement : 339 g (90%) en trifluoroacétate d'un solide blanc. 2. H - Ala - Arg (NO2) Leu - NH2 443 g de trifluoroacétate de H-Arg (NO2) Leu - NH2 sont dissous dans 2 1 de DMF. On ajoute 200 g de Boc - Ala - OH et ensuite 500 g de BOP. On ajuste le pH z 7 au papier pH (sur de petits prélèvements du milieu réactionnel) à l'aide de NEM. Le milieu est agité et l'évolution de la réaction est suivie par C.C.M. La réaction est terminée au bout de 4 h. Le milieu est évaporé à sec sous vide à 25 . Le résidu repris par 2 1 l'eau et 2 1 d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par une solution aqueuse de NaHCO3 à 5%, à l'eau: séchée et évaporée. Le tripeptide est recristallisé dans l'acétate d'éthyle-éther, et finalement séché sous vide. Il est contrôlé par C.C.M. et R.M.N. Le précédent produit séché est traité par un mélange 50-50 (volume) de TFA-CH2Cl2 dans les conditions de l'exemple pré cédent (I-1). L'isolenent est effectué également dans les mêmes conditions. Rendement : 412 g (80%) exprimé en trifluoroacétate d'un produit pulvérulent blanc (contrôlé en C.C.M. et R.M.N.). 3. Arg (NO2) - Ala - Arg (NO2) - Leu - NH2 A partir de 515 g de H - Ala - Arg (NO2) - Leu - NH2 dans 2,5 1 de DbE et 333 g de Boc - Arg (NO2) - OH et 500 g de BOP, on obtient en utilisant les conditions opératoires décrites dans l'exemple I-l,après traitement au mélange TFA- CH2C12, 6Q7 g (85%) d'un solide blanc contrôlé par C.C.M. et R.M.N. 4. Z - Ala - Arg (NO2) - Ala - Arg - Leu - NH2 A partir de 715 g de trifluoroacétate de H - Arg (NO2) Ala Arg (NO2) - Leu - NH2 en solution dans 4 1 de DMF et 233 g de Z - Ala - OH et 500 g de BOP en utilisant la même technique que celle décrite en I-2 (et sans traitement dans ce cas par TFA - CH2C12), on obtient après recristallisation dans le mélange DMF - éther, 612 g de Z - Ala - Arg (NO2) - Ala - Arg (NO2) Leu - NH2 (76%) sous forme d'un solide pulvérulent blanc, contrôlé par C.C.M. et R.M.N. 5. Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2, 3 HCl 200 g de Z - Ala - Arg (NO2) Ala - Arg (N 2) - Leu -NH2 (0,25 25 mole) sont mis en suspension dans 2 1 dé méthanol contenant 0,8 mole de HC1. On ajoute 40 g de Pd/C à 10% de Pd, et le milieu est agité sous atmosphère d'hydrogène sous 1,2 bar de pression, pendant 24 h. Après cet intervalle de temps, on contrôle la fin de la réaction par C.C.X. Le catalyseur est éliminé par filtration et le solvant évaporé sous vide à la température ambiante. Le résidu solide est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme milieu d'élution le mélange butanol, pyridine, HO2CCH3,OH2 (50 - 12 - 12 - 25 en volume). Les fractions contenant le produit pur sont réunies, évaporées et lyophilisées. Rendement : 119 g (69%) d'un solide pulvérulent blanc. Contrôles : K.M.N., C.C.X. Analyse d'aminoacides : Leu 1,03 (1) Arg 1,92 (2) Ala 1,95 (2) EXEMPLE II Synthèse de Poc - Glu - Ser - Asn - Gin - Glu - Arg - Gly - OH (fragment B) 1. Z - Arg (NO2) - Gly - O Bzl 353 g de tosylate de glycine benzylester (H-Gly-O-Bzl, tosylate) sont dissous dans 2 1 de DMF, on ajoute 115 g de NEM puis 353 g de Z - Arg (NO2) -OH et enfir. 500 g de BOP. Le pH du milieu est ajusté à 7 à l'aide de NEM et en utilisant du papier indicateur de pH sur des prélèvements du milieu réactionnel dilués à l'eau. Le milieu réactionnel est agité et l'état d'avancement de la réaction suivi par C.C.M. Au bout de 4 h, la réaction est complète et le milieu évaporé à sec sous vide à 35 , Le résidu d'évaporation est repris par 2 1 d'acétate d'éthyle et 2 1 d'eau. On obtient dans ces conditions un solide qui est essoré et lavé successivement en phase solide avec une solution aqueuse à 5% de HKSO4 T K2SO4, à l'eau pure, avec une solution aqueuse à 5% de NaHCO3 et finalement à l'eau. Le produit est séché à l'air et contrôlé par R.M.N. et C.C.M. Rendement : 410 g (82%). 2. H - Glu (OBzl) - Arg - Gly - OH 500 g du précédent produit en solution dans 3 1 de HC1N dans le DMF et en présence de 100 g de Pd/C à 10% en Pd sont hydrogênés sous une pression de 1,5 bar d'hydrogène. Après 24 h, la réaction est terminée (contrôle par C.C.M.). Le catalyseur est filtré et le pH du milieu ajusté à 7 par addition de N-éthylmorpholine et en utilisant du papier indicateur de pH sur des prélèvements dilués à l'eau. On introduit 458 g de Boc - Glu (O Bzol) - 0 Np en solution dans 1 litre de DMP. Le milieu réactionnel est dilué par addition de 1 litre d'eau et on ajoute progressivement 135 g de OHBT et de la NEM en quantités suffisantes pour maintenir le pH à 7. Le milieu est agité 4 h à la température ambiante. On s assure que la réaction est complète et le solvant est évaporé sous vide à la température de 350. Le résidu d'évaporation est repris dans l'acétate d'éthyle. Dans ces conditions, le produit s'organise en solide. Il est essoré et chromatographié sur gel de silice en utilisant comme éluant le chloroforme-méthanol (70-30 en volume). L'évaporation des fractions de chromatographie contenant le produit: pur conduit à 412 g (75%) d'un composé pulvérulent blanc après lyophilisation. I1 est contrôlé par C.C.M. et R.N.N. Le précédent produit est dissous à la température ambiante dans 3 1 d'un mélange (50/50) de TFA et de CH2C12. On maintient le milieu 15 min à la température ambiante et on évapore à sec sous vide, en maintenant la température à 200. Le résidu est repris dans l'éther éthylique et le solide obtenu est essoré et séché. Le rendement est de 423 g (100%) sous forme de trifluoroacétate. 3. H - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - OH 564 g de trifluoracétate de H-Glu (O Bzl) - Arg - Gly - OH sont dissous dans 3 1 de diméthylformamide. Le pH est ajusté à 7 par addition de NEM sur des prélèvements dilués à l'eau et à l'aide de papier indicateur de pH. On introduit ensuite 367 g de Boc - Gln - ONp en solution dans 1 litre de DMP. Le milieu réactionnel est dilué par addition de 1 litre d'eau. On ajoute progressivement 135 g de QHBT et la quantité suffisante de NEM pour que le pH se maintienne à 7. Le mélange est agité 4 h à la température ambiante. On contrôle la fin de la réaction par C.C.M. et le solvant est évaporé sous vide poussé à 35 . Le résidu d'évaporation est trituré dans l'acétate d'éthyle. On obtient dans ces conditions un solide hygroscopique qui est utilisé tel quel pour le traitement à l'acide trifluoroacétique - CH2C12 ( 2 1 du mélange 50-50 en volume). Le milieu est conservé 10 min à la température ambiante et, enfin, évaporé sous vide à 200. Le résidu d'évaporation est trituré dans l'éther éthylique pour donner 525 g (76%) de H - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - OH (controlé par R.M.N et C.C.M.). 4. H - Asn - Gln - Glu (O Bzl) Arg - Gly - OH En utilisant rigoureusement les conditions de exemple II-2 et à partir de H - Gln - Glu (O Bzl) - Arg Gly - OH, trifluoracétate (691 g) et 393 g de Boc - Asn - ONb, on obtient 685 g (85% d'un produit solide blanc contrôlé par R.M.N. et C.C.M. 5. H - Ser - Asn - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - OH Egalement dans les conditions de l'exemple II-2 et à partir de 806 g de H - Asn - Gln - Glu (O Bzl) Arg - Gly - OH et de 366 g de Boc - Ser - ONb, on obtient le produit contrôlé par R.M.N. et C.C.N. avec un rendement de 688 g (77%) et sous forme trifluoracétate. 6. Boc - Glu (O Bzl) - Ser - Asn - Gln - Glu (O Szl) - Arg - Gly - OH (fragment B) A partir de 894 g de H - Ser - Asn - Gln - Glu (O Bzl) Arg - Gly - OH trifluoracétate et 458 g de Boc - Glu (O Bzl) - ONp, on obtient 824 g (80%) du produit attendu après purification par cristallisation dans le milieu DMF - éther (50-50 en volume). Le produit est contrôlé par R.M.N, C.C.M. et analyse d'aminoacides Gln - Glu : 2,92 (3) Ser : 0,97 (1) Asn : 1,03 (1) Arg : 0,97 (1) Gly : 0,95 (1) En suivant les stratégies présentées dans les tableaux III, IV, V, VI, VII, VIII et IX et les techniques décrites dans les exemples I et II, les composés suivants peuvent être obtenus Boc - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - OH (fragment C) Boc - Asp (O Bzl) - Ile - Met - N3 (fragment D) Boc - Lys (Z) - Leu - Leu - Gln - OH (fragment E) floc - Gln - Leu - Ser - Ala - Arg - OH (fragment F) Boc - Lys (Z) - Val - Leu - Gly - OH (fragment G) Boc - île - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - OH (fragment H) Z - Tyr Ala - Asp - Ala - OH (fragments I) EXEMPLE III Synthèse de Boc - Glu (O Bzl) - Ser - Asn - Gin - Glu (O Bzl) - Arg Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 (fragment B-A) 69,2 g du fragment A chlorhydrate sont dissous dans 500 mi de DMF. On juste le pH à 7 sur des prélèvements dilués à l'eau et à l'aide de papier indicateur de pH et de NEM. On ajoute ensuite 117 g du fragment B, 55 g de BOP, on ajuste à nouveau le pli à 7 à l'aide de NEM et le milieu est agité pendant 14 h à la température ambiante. Après contrôle de fin de réaction par C.C.M., on ajoute au milieu réactionnel 2 1 d'éther éthylique. Un précipité pulvérulent blanc se dépose dans ces conditions.Il est purifié par recristallisation dans le DMP - acétate d'éthyle. Le produit essoré est ensuite lavé à l'acétate d'éthyle en phase solide et séché. On obtient 149 g (81%) d'un produit blanc contrôlé par C.C.M. et R.M.N. Analyse d'aminoacides : Gln - Glu : 2,92 (3) Ser : 1,02 (1) Asn : 0,97 (1) Arg : 2,89 (3) Gly : 1,01 (1) Ala : 1,98 (2) Leu : 0,93 (1) EXEMPLE IV Le produit décrit dans le précédent exemple (184 g) est introduit dans un mélange constitué par 750 ml de TFA et 750 ml de CH2C12 sous agitation et à la température ambiante. Après dissolution ie mélange est conservé 15 min à la même température et évaporé sous vide en maintenant le milieu d'évaporation à 250C. Le résidu d'évaporation est trituré dans l'éther et Iton obtient dans ces conditions un solide pulvérulent blanc, qui est séché sous vide et contrôlé par C.C.M. et R.M.N. Sont revendiqués les composés suivant pouvant être obtenus selon les techniques des exemples III et IV et représentant les différents stades de l'élongation du peptide. Fragment : C - B - A Boc - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser - Asn - Gln - Glu - (H) Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 Fragment : D - C - B - A OBzl Boc - Asp - île - Met - Ser - Arg - Gîn - Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser - (H) Asn - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg Leu - NH2 Dans ce cas particulier, le fragment D est introduit en utilisant l'activation aux azides (-C-N3)(courante en synthèse peptidique). O Dès que la méthionine est en séquence, un balayeur sera utilise au cours des différents traitements par le TFA-CH2Cl2 pendant les phases de déprotection sélective (élimination du Boc). Nous préconisons le thio-anisole comme agent de. protection de la méthionine à l'oxydation dans la proportion de 5% dans le milieu TFA - CH2C12. Fragment : E - D - C - B - A Boc - Lys (Z) - Leu - Leu - Gln - Asp (O Bzl) - Ile - Met - Ser - Arg - Gln (H) Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser - Asn - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 Fragment : F - E - D - C - B - A Boc - Gln - Leu - Ser - Ala - Arg -Lys (Z) - Leu - Leu - Gln - Asp (OBzl) (H) Ile - Met - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser - Asn Gin - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 Fragment :F - F - E - D - C - B - A Boc - Lys (Z) - Val - Leu - Gly - Gln - Leu - Ser - Ala - Arg Lys (Z) - Leu - Leu - Ser - Asp (O Bzl) - Ile - Met - Ser - Arg Gln - Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser - Asn - Gln - Glu (O Bzl) - Arg Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 Fragment :H - G - F - E - D - C - B - A Boc - île - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg -Lys (Z) - Val - Leu- (H) Gly - Gln - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys (Z) - Leu - Leu - Gln Asp- (O Bzl) - Ile - Met - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu (O Bzl) Ser - Asn - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg Leu - NH2 hp GRF protégé Z - Tyr - Al. - Asp (O Bzl) - Ala - Ile - Phe - Thr - Asn - Ser Tyr - Arg - Lys (Z) - Val - Leu - Gly - Gln - Leu - Ser - Ala - Arg Lys (Z) - Leu - Leu - Gln - Asp (O Bzl) - Ile - Met - Ser - Arg Gln - Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser - Asn - Gln - Glu (O Bzl) - Arg Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 EXEMPLE V Déprotection des chaînes latérales du hp GRF protégé 60 g de hP GRF protégé sont dissous à 0 C dans 1 litre d'acide trifluoracétique contenant 0,2 mole/l d'acide méthanesulfo- nique et 50 ml de thioanisole. Le milieu est agité 10 min à 0 C et ensuite 60 min à 250. Le milieu est évaporé à 250 sous vide et le résidu d'évaporation est repris par l'éther et abondamment lavé dans l'acé- tate d'éthyle. On obtient dans ces conditions un solide pulvérulent de couleur ocre. Rendement : 55 g EXEMPLE VI Purification du hp GRF Le brut de réaction obtenu dans l'exemple précédent est purifié en utilisant la technique de la distribution à contrecourant à l'aide du système de solvant butanol-eau-acide acétique (4-5-1, en volumes). Les fractions présentant le maximum de pureté sont réunies, évaporées et lyophilisées. Le précédent lyophilisat est dissous dans l'acide acétique à 30% et soumis à une chromatographie de perméation sur gel de Sephadex G 50 fine. Les fractions de chromatographie présentant le maximum de pureté (contrôle C.C.M.) sont réunies, évaporées, et le résidu redissous dans l'eau et lyophilisé. L'état de pureté a été jugé suffisant sur la base de contrôles C.C.M., HPLC et analyse d'aminoacides. Analyse d'aminoacîdes : Tyr : 1,91 (2) Ala : 4,88 (5) Asn, Asp : 3,86 (4) Ile : 1,96 (2) Phe : 0,93 (1) Thr : 1,02 (1) Ser : 3,88 (4) Arg : 5,89 (6) Lys : 1,98 (2) Val : 1,01 (1) Leu : 5,10 (5) Gly : 2,98 (3) Gln, Glu : 6,82 (7) Met : 0,91 (t) REVENDICATIONS 1 - Procédé pour la préparation du hp GRF par fragments, caractérisé en ce que l'on couple l'un après l'autre et dans l'ordre de la séquence les fragments dans lesquels a) les fonctions acides latérales des acides aspartique et gluta mique et la fonction amine latérale de la lysine sont protégées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de déprotec tion du groupement Boc, b) la fonction guanidine de 1 'arginine est protégée par protonation, et c) l'acide aminé N-terminal est protégé sur l'amine par le groupementBoc, en éliminant sélectivement le groupement Boc de l'amine N-terminale du peptide en phase d'élongation par hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, ledit couplage étant effectué dans un solvant po-laire aprotique et on élimine en fin de séquence tous les groupes protecteurs par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à 1 M d'acide méthanesulfonique ou trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'après chaque couplage le produit obtenu est isolé du milieu réactionnel par précipitation à l'aide d'un solvant apolaire. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit brut de réaction est purifié par la distribution à contre-courant et la chromatographie de perméation sur gel. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le premier fragment introduit en séquence est llala nine amide, conduisant ainsi au hp GRF 1-40.