Brevet FR2543145A1 — publié le 19840928

- La présente invention est relative à de nouveaux sul'ates de xylanes, à ieur procédé ce oréparation et à 1 eur application en médecine humaine et vétérinaire. Il est classique, lorsqu'on désire obtenir en théraceutique une action arnt-coagulante et ant-thromboticue, d'utiliser énérlement l'crine. Cette oernière, qui est une substance d'extraction animale appartenant à la classe des muccpolysaccharides acides est ainsi administrée en clinique, comme agent anti-coagulant, par exemple ehsn hémodialyse rénale, et comme agent anzi- -thrombotique dans la prévention et le traitement des -thrombcses veineuses profondes et dans le traitement des thromboses artéril'les et dbs embolies Dulmo- nalres Cependant, cette thérapeutique présente d'assez sérieux inconvénients, liés d'une part aux risques d'hémorragie qu'elle provoque, et d'autre part au fait qu'on observe fréquemment, lors de son administration, des thrombo- pénies accompagnées dans certains cas de complications thrombo-emboliques et éventuellement associées à des thromboses, ainsi qu'un certain nombre d'autres effets secondaires Chocs, alopécies, ostéoporosesl. On connait, par ailleurs, un autre polysacoharide sulfaté, appelé dans la littérature SP 54 ou PZ 68, qui présente une efficacité clinique comparable à lihéparine. Ce composé,qui est obtenu par hémisynthèse à partir du bois du hêtre, présente en outre la caractéristique d'être d'un coot très inférieur à celui de l'héparine Il se présente sous la forme d'un mélange de sulfates de xylanes de différents poids moléculaires Ce produit est cependant mal défini et on trouve à son sujet dans la littérature différentes caractéristiques analytiques. Ainsi, VINAZZER et al reportent successivement un poids moléculaire moyen de 2000 (Thromb Res, 1980, 20, 57-68) puis de 3000 (thromb Res, 1982, 27, 341-352) C O ESQUIVEL et al C Thromb Res,-1982, 28, 389-399) décrivent un poids moléculaire moyen de 4000; enfin C SORIA et al C Thromb Res 1980, 19, 45 S-483) signalent un poids molécuiaire moyen de 6000. Cette disparité dans les poids moléculaires moyens, est sans doute due aux méthodes d'analyse et aux standards utilisés ainsi qu'à l'absence de précision sur la nature Capparenta, en poids, en nombre) de la masse molai- re publiée. -7 2543145 La:emanderesss a trcuvé que ce orcduit cu répond la eormule =ve lcooe suivants: Q O O RO' i O) O R| OR OR OR dans laquelle R représente le groupe _SO' Na ou: l'hydrogène dans des propor- tions telles que le degré de sulfatation ( O S) soit de 1,81. Ce produit est défini par les caractères analytiques suivants: Ma (masses moléculaires moyennes apparentssl: 6000 Mn -= (masses moléculaires moyennes en nombrel: 5400 Mw = (masses moléculaires moyennes en poids): 7000 Ces déterminations de masses moléculaires ont été confirmées par une mesure de la masse molaire par dosage de formol après oxydation des extrémités réductrices: M = 6300 Le produit SP 54 est encore défini par les caractéristiques suivantes: Dispersion: O = Mw/Mn = 1,29 % d'acides uroniques: 5,8 % de pentoses: 35,5 La présente invention concerne de nouvelles fractions de sulfates de xylanes, répondant encore à la formule CI) mais définies par une masse molaire apparente comprise entre 7000 et 12000 et par les autres caractéristiques sui- vantes: le degré de sulfatation est compris entre 1,5 et 2,0 le pourcentage en acide urcnique est compris entre O et 10 le pourcentage en pentose est compris entre 30 et 40, es nouvelles fractions conservant ane efficacité clinique ccmparable à celle ds l'héparine. 3 543145 Les caractères analytiques ci-Hcessus ont étà déterminées d'acrès les méthodes'ci aprèàs I-Détermination dle la -masse moléculaire:Ella est réalisée par chroarrogaaa phie d'exclusion à travers deux colonnes de s:li-ce poreusa placées en série. L'a P Parai' utilisé eastu celui:le H-4 EW Ll TTP'ACKAR O AQ 81 j S 3 éau 4 pé d'nris-rac- tomètre WATERS R 401 et d'un 4 n Jectesur HP 79841 'A L'ensemble estteroat à 30 ' C La phase mobil-e est praérar 6 ée selon SARTIH H G et S Mriîi T O A ( Cr c- îmatogr, 19841, 2 Q 08 410-415 j et modifeiée an a Joutant du oclyéthyliàne Iglyc Cit pour éviter les interaction S de type pont hydrogène Les masses moléculaire Ms Moyennes en nombre, imnl, an poids ( 1 Mw) et apparente (Ma) sont calculées à partir d'un étalonnage ré-a-lisé à l'aide d'aligcsacchàrides neutres et de Dextrans. 2 Masse moléculaire moyenne en nombre par libération de formol Xlane: La détermination de la masse moléculaire absolue moyenne cri nombre est réalisée par la méthode de VASKOVSKI V E et ISAY S V (Anal Siochem, 1969, 30, 25-31) après réduction par le borohydrurs de sodium. Polysglfate dexylane La détarmination absolue de la masse moléculaire moyenne en nombre est réalisée comme pour les xylanes mais après désulfatation du produit. 3 Le degré de disoersion ( 0) est défini par le rapport Fml/Mn 4 Dosage des acides uraninues La méthode employée est celle au carbazole de SITTER T et MUIR H M (Anal Siochem, 1962, 4, 330 ?r 334) - Microdosage du eou-Fre Après minéralisation en fiols de SH O NIGER W. (Mikrochurn Acta 1956, 1, 869-876), le soufre set dosé conductrimétriquement - par perchlorate de baryum. Le degré de sulf-atation (O S) est dé-fini par S fais le ra Cp ort S (mles) 6 ocsage des pentoses La -Méthode em Plyée sest celle zé Ioroinol et au chlorure ferriaue en milieu chlorhydrique (?MEJEAUM W 7 Z Physiol Chem, 1979, 258, 117 l en prenant le xylose comme é-talon. L'invention comprend également un procédé de préDaration des fractions de l'invention de la formule 7 I ci-dessus, caractérisée en ce que la produit Sp e 54 es soumis d rectement à des Fractlonnements qui peuvent âtra cbtenus, soi-, par chromatographie sur colonne> soit parulr-ittc. -a fract 2 onnement peut ître effeectt 5 e aretsur - 9 S Xylane S zczanus après -asu 2-eat 4 atticn tu SP 54. Selon cette varianta, l-= sel Ce cye'ij Mz 'u Sp i est soumis = pat trafftare-t avec tu éilsl:yeac Ci 4 tionné s ze 3 % à 10 '% c'eau, à Jas températures zcmerises enzre 5-C: et 1 CO' La xylane obtenu, qui répond à la ecrmule tàvelcp Dée 6 = suivante \L N CE os OH Ol OS CIIl C Eol est défini par les caractéristiques ci-après Ma 3 Of 000 Tn 1950 T Mw3500 D 1,81 Masse moléculaire (dosage chimique) M 2000 Degré de sulfatation (O S) -O Pourcentage d'acides uroniques:16,5 % en poids (exprimé en acide glucuronique) Pourcentage de pentoses:79,5 % en poids (exprimé en xylosa mono'mère). Le xylane est alors fractionné par solubilisation et/ou par chroma- Mgraphie sur colonne, ou ultra-filtration On choisit ansu-itl B les fractions recherchées qui, par sulfatation, conduisent aux composés de l'inventionr. Cette sulfatation est effectuée soit par l'acide chlcrcsulfonique -en présence de pyridine et éventuellemeiit de diméthylfarm-amide(D M 1 F), soït mar le complexe trioxyde de soufre-trimétthylamine dans le diméthylformramide. Les exenples non limitatifs-suivants illustrent l'invention - j xemoie 1: ésulfataticn du polysuleate de xylane 'SP 54 ' Une solution de 8 C O g, ae olysulfate de xylane SP 54 (sal de sodium) dans 50 ml d'eau distillée est 5 iuée avec de l'eau distillée sur une zolonne se - 500 G ml de resine échangeuse de cations lIRN 77 Formse Les éluats acids sont cirectement rsousiiis dans *n récipient contenant 32 ml de pyridine - t olacés dans un bain de alace. La solution obtenue est lyophilisée Le sei de pyr dinum -u polysulfate de xylane est récupéré sous forme de poudre blanche: m = 8 g Une solution de 36 g de ce sel de cyridinium dans 100 ml de diméthylsulfoxyde à 5 % d'eau est chauffée pendant 4 heures à 580 C Après refroidissement, le milieu réactionnel est versé dans 600 ml de méthanol Le précipité formé est recueilli par filtration, lavé avec de l'éthanol, puis redissous dans 100 ml d'eau distillée Le p H de cette solution est ajusté à 7,0 par addition de sou- de N Puis cette solution est dessalée an trois opérations sur une colonne pré- parative de gel 'Séphadex G 15 (longueur 45 cm, diamètre 10 cm), éluése avec de'l'eau distillée Les fractions de têtes qui contiennent le polymère désul- faté, exempt de sulfate minéral sont recueillies puis lyophilisées On recueil- :s 11,3 g de xylane désulfaté. J.racteéristigue S analytigues n = 1950 Mw = 3500 O = 1,81 Ma 3000 Masse moléculaire (dosage chimique) = 2000 Degré de sulfatation = nul Pourcentage d'acides uroniques = 1 S,5 % en poids texprimé en acide glucuronique). ?ourcentage de pentoses = 79,5 % en poids (exprimé en xylose monomère) xemple 2 Fractionnement du Xylane mar sclubilisat'ion puls sulftation. ractionnement du xylane n ajouts en petites portions, sous agitation magnéticue, 150 j de xylane S;exemcll 1) dans 1400 l d'eau disti 11 e maintsnue à 50 O C. = ==sse revenir;a suspension à température ambiant. 1 i la eraczion de xylane insoluble est séparée par centrifugation puis remise an suspension dans l'eau et lyophilisée. 2 oids 44,1: rendement en poids: 29,4 %. ?Pourcentage d'acides uroniques:15,7 ^ % en poids lexprimé an acide glucuroni- que) 2) La fraction soluble du xylane (surnageant) est lyophilisée à son tour On récupère 36,5 g de poudre de couleur crème Rendement en poids: 57,7 %. Pourcentage d'acides uroniques: 17,02 % en poids (exprimé en acide gluco- ronique). Sulfatation de la fraction de xylane insoluble dans l'eau à 10 % poids/volume Dans un tricol de 500 ml, on dissout sous atmosphère d'azote et agitation magné- tique 12 g du xylane ci-dessus dans un mélange de 65 ml de pyridine anhydre et ml de diméthylformamide anhydre. On ajoute goutte à goutte dans la solution maintenue à O ' C, 28,3 g( 16, 2 ml) d'acide chlorasulfonique Après la fin de l'addition le milieu réactionnel est chauffé à 75 C pendant 4 h 30 Après refroidissement le mélange est ensuite versé dans 1200 ml de méthanol Le précipité formé est filtré et dissous dans ml d'eau distillée' La solution (p H 3,95) est basifiée avec de la soude N jusqu'à p H 8,9 On évapore et le résidu est repris avec 50 ml d'eau distillée. Le p H est contrôlé ( 7,6) puis la solution est versée dans 1300 ml de méthanol. Le précipité formé est filtré, repris avec 100 ml d'eau puis la solution ainsi obtenue est traitée avec 30 g de noir animal a 75 O C pendant 1 heure. On filtre et répète l'opération avec 30 g de noir animal La solution finale est filtrée sur Millipore 0,5 micron, puis lyophilisée On obtient 18,2-g d'une poudre de couleur marron. Caractéri stigues anal Xticu as Mn7690 Mw = 10890 O = 1,42 Ma = 9470 O Degré de sulfatation = 1,72 Pourcentage d'acides uroniques = 4,98 % en poids (exprimé en acide glucuronique) Pourcentage de pentose = 30,4 % en poids lexprimé en xylose monomère) Exemole 3: Fractionnement du xylane par soiubilisetion puis su-eatatn Fractionnement du Xy 13 al g de xylane Cexemple 1) scnt mis sn suspensicn dans 240 ml d'eau istlée. Le milieu est porté à ph 12 par adoition de 3 ml me scude 6 N et abanconné une nuit sous agitation aet tmcsphère d'azote. La fraction de xylane insoluble est recueillie car centrifugation. Las culots sont repris avec ce l'eau et les suspensions obtenues sont lyophilisées. Poids 7,3 g Pourcentage sn acides uroniques: 12,6 % (exprimé en acide glucuroniques' Réaction de sulfatation du x lane insoluble à e H 12 y On dissout, sous atmosphère d'azote, 7 g de xylane ci-dessus dans un mélange de 25 ml de pyridine anhydre et 25 ml de'OMF anhydre - La solution refroidie à O C est additionnée goutte à goutte de 16,4 g d'acids chlorosulfonique Après la fin de l'addition, le mélange réactionnel est chauffé à 750 C pendant 4 h 30. Après refroidissement, la solution est versée dans 850 ml de méthanol Le sel de pyridinium du sulfate de xylane est filtré, rincé avec de l'acétone, et dissous dans 80 ml d'eau (p H 2,85) La solution-est basifiée jusqu'à p H 8,1 avec -de la souds N, puis évaporés sous vide Le résidu est repris avec 30 ml d'eau (p H 4,5) On ramène le p H à 11 avec de la soude N et verse la solution dans 1200 ml de méthanol. Le précipité crème est filtré, lavé avec de l'éther puis séché sous vide. Poids obtenu S Caractéristigues analytigues - Mn = 7550 Mw ='10270 O' = 1,33 Ma = 9120 Cegré de sulfatation 1,59 Pourcentage d'acides uroniques = 6,10 % en poids (exorimé en acide glucuroniquel Pourcentage de pentoses = 31,3 % an poids (exprimé en xylose monomère). = -:r' = rec -izr-remenz car:n:atr:i xy:arc =ci -e:ar-s:' Mau -e rceuit z éa' ans:açte C 5 rs Car zn cb:zent:ar roglttich iair: i" On cflrcmamtograpniea J' z xy ane 3 oliC:e Ä 2 Sur 2:telonnes :zncueu-r:75 zm, dizamêtrs i,C =ml zari' es ce creuse Scherasil XC' -'-OC 'grsnulométrie a 0-100 mnesm porcasité 3 c A) accto _r' acca-gi: zrcmatagraphis préparative 'AATEERS Prsc ECO an isntccmme eélueant Ze 7 'ac Je acétique à 2 % dans de l'eau distillée la détecteur ast un réf ractomètre dif-férentiel. Le courbe réponse cbtenue par réfractornétrie est tâccuoée en S parti-es et les fractions liquides correspondantes sont lyophilisées On reccrrrrence l'opération cinq fois et on rassemble les fractions homologues. Bilan cumulé des 6 opérations Fraction I 1,15 g Fraction 2 3,47 g Fraction 3 3,55 g Fraction 4 7,50 g Fraction 5 5,70 g Fraction S 0,30 g Réaction de sul Fatation de la ra 1 On suspend, sous atmosphère d'azote sec, 3,40 g de xylane (fraction 2 ci-dessusl, dans 30 mnl de diméthylformamide anhydre. On ajoute 14 g ( 103 mmoles) de complexe trioxyce de soufre-triméthyl- amine et l'an chauffe le milieu réactionnel pendant S heures à 75 ' C Aprèâs refroidissement, le milieu réactionnel est évapor à Sec SOUS Vide La raésidu obtenu est repris avec 52 mi J IC souce 2 M et 'La solution obtenue est à nouveau évaporée à sec Le ré-sid-u est dissous d-ans 70 ml d'eau distillée 1 _ le z Cinitialement à 5,5) est ramené à a,o par addition de 15 mi de souce 2 Ml acres evaporation à sec, le résidu est repris avec 70 il d ' e et 1 - obtenue (p H 7) est filtré sur miliiocre S Li-, puis chrcrnatograchiée sur 2 lclnnes de silice poreuse léluant eau citle)an 'é 5 liminer les sels minéraux. La fraction d'éluant corresponcant au sulfate de xylane est lyophilisée. On obtient 5,30 g= dz* pcudre crême. S - Caractéristi 9 ues analyi^ues Mn = 9260 Fw = 10330 O 1,12 a M Degré de sulfatation = 4,7 Pourcentage d'acides uroniques = 8,25 % en ocids 'exprimé en acice glucoronique). Pourcentaage de centoses = 32 % en poids (exprimé en xylose monomères). Exemole 5: Fractionnement par ultrafiltration du xylane soluble dans l'eau obtenu à l'exemple 2,puis sulfatation. Fractionnement du xyln e- On dissout 25 g de la fraction soluble de xylane dans l'eau, comme décrit à l'exemple 2, dans 1000 ml d'eau distillée Cette solution est traitée dans un système d'ultrafiltration équipée d'une cartouche de fibres creuses R H 1 P 10-8 de marque AMICON (seuil de coupure 10 000 daltons) à une pression inférieure ou égale à 1 Bar. L'opération est terminée lorsque 5000 ml d'eau distillée ont été consommés par le système. Le retentat d'ultrafiltration est alors soutiré du système, puis lyophilisé. On recueille après séchage 4,4 g de poudre crème (rendement: 17,6 % par rapport à la quantité initiale). Réaction de sulfatation On suspend, sous atmosphère d'azote sec, 3 g du xylane précédemment isolé, dans 30 mi de diméthylformamide anhydre On ajoute à la suspension, en plusieurs opérations, 7,50 g ( 56,7 mmoles) de complexe trioxyde de soufre- triméthylamine Puis le mélange réactionnel est chauffé à 75 C pendant h 30. Après refroidissement, on ajoute 80 ml de soude N puis on évapore à sec sous vide de la trompe à eau. Le résidu est repris avec 30 ml d'eau distillée, on remonte le p H de la solution obtenue de 5 à 12 par addition de 20 ml de soude N puis on concentre sous vide La résidu d'évaporation est repris par 30 ml d'eau distil- lée et le p H de la solution obtenue est 9 On ajoute alors de l'acide chlorhy- drique N pour ramener le p H à 7, puis la solution est dessalée par élution sur une colonne (L= 90 cm Z = 4,4 cm) de Sephadex G 15 (détection réfractométr 4 nue). La fraction d'éluat contenant les polysulfates de xylane est recueillie puis lyophilisée. 1 _ - On r"ucèrs après séchage sous vide poussé, à température frmb-antae, 4,3 g O e poudre blanche. arsctsristiques analytiques în = 9035, Mw = 10550, O = 1,17, a = 9840, degré _e su: atation: 1,4 xemola S: Fractionnement par ultrafiltration du xylane obtenu à l'sxsmple 2 puis sulfatation. Fractionnement du xylane Une solution de 15 g de la fraction du xylane soluble dans l'eau obtenue selon l'exemple 2, dans 1500 ml d'eau distillée est ultra-filtrée sur un système équipé d'une cartouche de fibres creuses de seuil de coupure 5000 R (type H 1 P 5-20 marque AMICON), sous une pression S 1 Bar avec apport continu d'eau distillée. 1 5 L'opération est terminée lorsque 8000 ml d'eau distillée ont été utilisés. Après concentration de la solution retenue par les fibres creuses elle est soutirée du système, puis lyophilisée. On récupère 4,5 g ( 30 % de la quantité initialel de poudre de couleur crème Réaction de sulfatation On suspend, sous atmosphère d'azote sec, 4 g du xylane obtenu ci-dessus dans 60 ml de diméthylformamide anhydre On additionne en plusieurs opérations ,5 g ( 7,5 mmoles) de complexe trioxyde de soufre-triméthylamine, et on chauffe à 80 C pendant 6 heures Après retour à température ambiants, le milieu réactionnel est additionné de 80 ml de soude N puis évaporé à sec sous vide. O Le résidu est repris par 50 ml d'eau distillée Le p H de la solution obtenue est porté de 6,25 à 12,4 par addition de 5 ml de soude N La solution est évaporée à sec, sous vide, puis le résidu est repris par 50 ml d'eau distillée Le p H est ramené de 10,7 à 7,35 par addition de 1,35 ml d'acide chlorhydrique N La solution est alors ultra-filtrée sur un système équipé de fibres creuses de seuil de coupure 5000 (type H 1 P 520, marque AMICON) afin d'éliminer les sels minéraux résiduels, sous une pression inférieure ou égale à 1 Bar. La solution retenue par le système est lyophilisée On récupère 6,7 g de poudre blanche. 11 2543145 Caractéristiques = y _cu es "n= 8340, 'w = I, 31,, Z = 1,2 S, a 3 = 2 '0 3 egré de sulfa ati-zn = ', 5 -Pourcentage:'acices -rcniquss: 3,12 % sn Doo-s lxprm é en ac:-ze =lucuronîce' Pourcentage ae Pentoses: 38,3 % en poidm Cexorlmé en xylose monomère Exemple 7: Fractionnement par précipitation de la fraction de xylane soluble dans l'eau obtenue à l'exemple 2 puis sulfatation. Fractionnement du xylane On dissout sous agitation magnétique, 40 g de la fraction de xylane soluble dans l'eau obtenue salon l'exemple 2 dans 400 ml d'eau distillée. On ajoute à cette solution, en maintenant l'agitation, 200-ml d'éthanol à 95 . Après une demi-heure d'agitation, la suspension obtenue est centrifugée. Les culots de centrifugation sont décantés, repris par de l'eau et récupérés par lyophilisation On obtient 2,4 g de produit de couleur crème. Réaction ds sulfatation On suspend sous agitation magnétique et atmosphère d'azote sac, 2 g de ia fraction de xylane obtenu ci-dessus dans 25 mi de diméthylfor- mamide anhydre. On ajoute à ce mélange 5,25 g ( 0,037 moles) de compslexe trioxyde ds soufre-triméthylamine et l'on chauffe à 75 C pendant S heures 30. Après retour à température ambiants, on ajoute au mi 4 ieu réactionnel 52 ml de soude N, et l'on évapore à sec sous vide Le rgsidu ainsi obtenu est repris par 40 ml d'eau distillée, et le p H de la solution obtenue est porté de e à 13 par addition de 1 Q ml de soude N On évapore à sec sous vide et le résidu est repris par 40 ml d'seu dis- tillée Cette solution est rmensée à p H 7 avec de l'acide chlorhycrique N puis filtrée sur Millipore 3,, et enfin éluée sur une colonne de -12- Sephaasx G 15 pour éliminer les résidus minéraux. _a -raction d'éluat correspondanz au-polysuats de xylane gst recueillia et lyophilisee Oh obtient 3,75 g de poudre blanche. Caractéristiques analiytiques 7 N = 10 040, Mw = asoc, O = 1,18, ma= 10 685 Degré ce sulfatation = 1,72 Exemple 8: Fractionnement par solubilisation du xylane obtenu à l'exemple 1 puis sulfatation Fractionnement du xylane On ajouts, sous agitation magnétique, 150 g de xylane obtenu selon le procédé décrit à l'exemple I dans 1000 ml d'eau distillée thermos- tatée à 50 C Après 8 heures d'agitation, on laisse revenir à tempé- rature ambiante, et la fraction insoluble est récupérée par centrifu- gation. Les culots de centrifugation repris par un peu d'eau distillée sont' -20 rassemblés et Ilyophilisés "- On récupère 38,3 g de poudre ds couleur crèmeo Réaction du sulfatation On met en suspension, sous agitation magnétique et sous atmosphère d'azote sec, 5 g de xylane obtenu ci-dessus, dans 50 ml de diméthyleor- mamide anhydre La suspension est additionnée de 13,5 g ( 94,5 mmolesl de complexe trioxyde de soufre-trimnthylamine et l'on chauffe le miiieu eacticnnel à 75 C pendant 8 heures Après retour à température ambiante le mélange est basifié avec 150 ml'de soude N jusqu'3 p H 8 puis évaporé sec sous vide Le résidu est repris avec 50 ml d'eau distillée et le p H de la solution est ramené de 8,3 à 6,85 par addition de 0,9 ml d'acide chlorhydrique N. La solution est alors ultrafiltrée sur un système à fibres creuses équipé d'une cartouche à seuil ds coupure 5000 Daltons, de type H 1-P 5-20, marque AMICON), sous une pression inférieure ou égale à 1 3 ar, afin d'éliminer les sels minéraux. ré-tenzaz est ensuite lyophilisé. Zn recuei? 2 e 7,2 j e noudre c-r 8 me, Caractéristiques analyrtiques fiqn = SE 70, 7-w = 11430, 'D 11,72, Mia= 93 G O Cagri *ie:u 9 to 1,73 Pourcentage z' scides uroniques 5,1 % en ooids Cexprimé en acide zlucur Cnique) Pourcentage de Pentcses:39,2 % en poids (exprimé en xylosa monomère 2 - Exemple 9 Fractionnement du polysulfiate de xylane (SP 54) par chroma- tographie. une colonne de chromatographie(L = 50 cm, O = 4,4 cml est remplie de cellulose échangeuse d'ions (WHATMAN DE 52) préalablement conditionnée avec un mélange tampon C Ac O Na 0,2 Mi, Ac O H 0,06 MIl à p H 6,5. Le débit de l'gluant est contrdlà par une pompe péristaltique et l'analyse des éluats est réalisé p ar un détcteur U V (; = 254 nm). On injecte sur la colonne 20 g de polysulfate de xylane (SP 54), dissous dans-SQ ml de tampon nitial, puis on élue avec le m me tamypon jusqu'à stabilisation du produit sur le gel échangeur. On glue ensuite avec une succession de solutions de chlorure de sodium, de concentrations croissantes. Les -fractiorsd'éluat correspondant à chaque solution fluante sont recusillies et lyophilisées. Succession d'gluants utilisés 0,3 fi Na Cl Fl' 0,4 fi Na Ci F 2 0,5 fi Ma Ci F 3 Go fi Na CI F 4 0,7 Mi Na C 1 F 55 0,3 fi Nia Ci FS 0 l i 3 M 1 Ia C 1 F 7 M 2 f a CI -F Chaque *fraction est dessalés, mar chromatographie sur zolonne Ze silice pocreuse Céluant:Eau distillés) et la -fraction corresoondant aux sulfates de polysaccharides purifiés est r 6-cupér 'e par lycphili 4 sat 4 4 n. L'acération est recommencée plusieurs -fois pour pouvoir obtenir des utis sueffisantes te chaque produit, par rassemblement des fractions nomo cgues. i.7 an llol F 1 4,2 g F 2 5,3 m F 3 4,65 ga F 4 5 > 25 we FS 6,45 g FS '5,30 gr F 7 6,65 ag FB 3,3 g F 9 0,85 g de quatre ooératicns (tampon 0,3 M M Ja C 41) (tampon 0,4 M Na CI) (tampon 0,5 M Na Cl-) (tampon 0,6 M Na CI) (tampon 0,7 M Na Cl) (tampon 0,8 M Na Cl) (tampon 0, 9 M Na Cl) (tampon 1,0 M Na Cll (tampon 1,2 M Na Cl) Caractéristiques analytiques des fractions sélectionnées % acides T Mw Oisp Ma O S uroniques % Pentoses F 6 8120 9090 1,2 879 0 1,58 5,38 38,04 F 7 10500 12050 1,14 10960 1,71 4,70 38,68 FB 11320 12880 1,12 11500 1,59 4,88 38,04 Fa 11740 13240 1,12 11940 1,71 2,08 35,49 Exemple 10 Fractionnement - u polysul-Fats de xylane (SP 541) par ultra- eiltration- O Une solution de 30 g de polysuifate de xyiane (SP 54) dans 800 mi d'eau distillée est ultrafiltrée dans un système équipé d'une rieîbrare AMICON 9.YM 5 (seuil Je coucure 50003 et d'une réserve d'eau distillée. La pression de travail est assurée par de 'l'azote sous 4 Bars Après avoir recueilli 800 ml d'ultrafiltrat, le contenu de la cellule est ré- cucéré et lyophilisé. s On obtient 11,75 de poudre blanche (soit 39,1 % du pcics initiall. Caractéristiques analytiques: Mn = 7180, MW = 9500, O = 1,3 Z; Ma= 7890 eere d ulratation: 1,71 Exemple 11: Fractionnement du polysulfate de xylane (SP 54) par chroma- tographie. On injecte 3 g de polysulfate de xylane (SP 54)dans 10 ml d'eau distillée sur un système chromatographique composé de deux colonnes en série (L= 75 cm, O = 6 cm) garnies de silice poreuse Spherosil XOA 400 (granu- O lométrie 40-100 mesh, porosité 80 A) avec un débit d'éluant (eau distil- lée) de 40 ml/mn. La détection est assurée par un réfractomètre différentiel. La partie d'éluant contenant le polysulfate de xylane est fractionnée en quatre volumes. L'opération est recommence 15 fois et les fractions homologues sont regroupées et lyophilisées. Bilan des 1 S opérations: F 1 5,9 g (rendement en poids 12,3 %) F 2 5,7 g (rendement en poids 12 %) F 3 13,S g (rendement en poids 28,3 %) F 4 15, 74 g (rendement en poids 32,8 %) Caractéristiques analytiques de la fraction de plus haut poids molécu- laire (fraction 1) Mn = 9370, Mw = 11 160, O = 1,19, Ma = 9840 Degré de sulfatation = 1,73 xemole 12: fractionnement du polysulfate de xylane (SP 54) par ultrafiltration. On soumet une solution de 20 g de polysulfate de xylane (SP 54) dans 300 ml d'eau distillée à une ultrafiltraticn sur un systèms équipé de fibres creuses de seuil ce coupure 5000 Qaltcns (type H I P 5-20 marque AMICON), sous une pression in Férieure ou égale à 1 Bar. Acrès:,us la aystème ai Sacsor Zé 6 15 CCi'z ' La-* = -auts -mc 4 imi ulirs rsz=enus mar les -r=sa ases zrs z:-e Syszi-me et lchlse Z.n recusi i e 5, 7 g= -e pot ors zlarche %scre: 3, '-*a Zarect 9 rtstimues analy/ticuesdu 3 R 24837 MN= 71 SO Mw = 3520, O 1 23, Ma 32 c 3 C 3 egré de sulfastatiocn 1,71 Exemple 13 Fractionnement du polysul-fate de xylane SP 54) car ultra- filtrations. On soumet une solution de 60 g de polysulfatte de xylane (SP 54) dans -1000 ml d'eau distillée à une ultrafi Lltratîon sur un système équipé de fibres creuses dé seuil de coupure 10 000 (type H I Pi O-8, marque AMICON) ,. sous une pression inférieure ou égale à I B 5 ar. Après que le système ait absorbé 5000 ml d'eau d stillée, la solution- des hauts poids moléculaires retenue par les fibres creuses est soutirédu système et lyophilisée. On recueille 3,6 gde poudre blanche (rendement 6 % en poids de la quantitié initiale). Caractéristiques analytiques - Mn = 9500, Mw Il 720, O = 1,20 Oegré de sulfa tation = 1,63 Exemple 14 Fractionnement du polysulfats de xyiane (SP 5541 mer ultra-filtration. Une solution de 30 g de polysuleete de xylane C Sp 54, discous zans O Co -1 l de Na NO 1 M est utaité sur le s Ystè-me déjà util-1 isé cans l'exemple 10 équipé d'une m-iembrane identique de S 7 euil de coupurg z 5000 type -y M marque AM 7 CON', mais la réserve Hd'Aéuant est rnempl-ie avec jne solut-ion de nitrate de sodium lm. La pression de t ravail est assures par de l'azote sous 4 _ars. Après avoir recueilli 1900 ml d'ultrailtrat, le zontenu de 'a cellu'l est récupéré, puis injecté an plusieurs opérations, sur une colonne préparative lL= 45 cm, a = 10 cm), garnie de Sepnadex G 25, lluée l'eau distillée, afin t'éliminer l nitrat e dsodim. Les -frac-ions éluant contenant les polymères purifiés sont rassemblées et lyophilisées. On recueille S,87 g de poudre blanche (rendement: 22,9 % en poids de la quantitié initialel. Caractéristiques analytiques: Mn = 9850, Mw = 11815, O = 1,20 Oegré de sulfatation = 1,70 Les résultats des essais pharmacologiques, qui sont rapportés ci-après, ont permis de mettre en évidence les intéressantes propriétés des produits de l'invention, c'est-à-dire les différentes fractions qui ont été obtenues à partir du SP 54. * L'invention a donc encore pour objet un médicament ayant en particulier des propriétés anti-thrombotique et hypolipémiante carac- térisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, au moins une des fractions préparées par le procédé de l'invention et répondant à la formule (Z 3. L'étude pharmacologique a porté sur les actions anticoagu- lante, anti-thrombotique, fibrinolytique, lipolytique et le temps de saignement; ces études ont été effectuées comparativement, d'une part à l'héparine, et d'autre part au SP 54. L'action anticoagulante est déterminée par le temps de céphaline activé CCAEN J, LARRIEU M J, SAMAMA M In: L'hémostase: méthodes d'explora- ''' tion et diagnostic pratique Ed: l'Expansion Scientifique Française, 1975 p 169). La temps de cépnaline activé lTCA), mesure la recalcification du plasma déplaquetté en présence c'un optimum de lipides (céphaline) et de célite qui active de manière standardisée les facteurs de la prnase de contact (las facteurs XII, XI, IX) I' mesure donc la -formation de prothrombi- nase endogène à l'exception des facteurs plaquettaires remplacés par la céphaline. 18 - L'action antithrombotique est appréciée par l'activité anti Xa (YIN E T, WESSLER S, BUTLER J V J Lab Clin Med, 1973, 51, 298-310) Le temps de yin mesure l'action neutralisante du SP 54 et de ses frac- tions vis à vis du facteur Xa en présence d'un excès d'antithrombine III et facteur Xa. L'activité antithrombotique est aussi testée à l'aide d'un modèle de thrombose expérimentale sur fil de soie introduit dans un shunt artério- veineux chez le rat CUMETSU T, SANAI K Thromb Haemost, 1978, 39, 74- 83 l. -L'activité fibrinolytique est mesurée par le temps de lyse des euglobu- lines plasmatiques (KLUFT C Haemostasis, 1976, 5 136). Le temps de lyse des euglobulines plasmatiques est une méthode sensibili- sée permettant d'apprécier l'action fibrinolytique globale du SP 54 et de ses fractions en l'absence des inhibiteurs physiologiques de la fibri- nolyse, éliminés par dilution et acidification du plasma. L'action lipolytique est mesurée par l'activité lipoprotéine lipase cir- culante (NIKKILA E A, HUTTUNEN J K, EHNHOLM C Métabolism, 1977, 26, 179). La détermination de l'activité lipoprotéine lipase circulante est une me- sure indirecte de l'impact du SP 54 et de ses fractions sur le catabolis- me des triglycérides (pouvoir clarifiant) L'activité enzymatique est déterminée par sa capacité d'hydrolyser le substrat 14 C-trioleine en 14 C-acide oléique. Le temps de saignement est déterminé après section transversale de la queue du rat (STELLA L, DONATI M B, DE GAETANO G Thromb Res, 1975, 7, 709-716) Pour ces différentes expérimentations, des rats mâles (Sprague Oawley) d'-un poids de 200 g à 300 g ont été utilisés. Ces animaux sont anesthésiés au pentobarbital ( 50 mg/Kg) par la voie intrapéritonéale et les produits à tester sont administrés par la voie intraveineuse (veine du pénisl Quinze minutes après l'administration des produits, les échantillons sanguins sont prélevés à l'aorte abdomi- nale et rendus incoagulables par une solution de citrate trisodique à 3,8 p 100 ( 1 volume d'anticoagulant pour 9 volumes de sang) ou de l'hé- parine ( 25 U/ml de sang). Immédiatement après le prélèvement sanguin, les échantillons sont cen- trifugés à 2000 x g pendant 15 minutes à 4 C pour la préparation du plasma citraté qui est utilisé pour les différents dosages. 19 - Les résu tats sont rassemblés dans les 'ab eaux I St 2 leur analyse statisticue a etc a-effectuée a) selon la test de STUDENT (groupe de comparaison SP 54) bl selon la test U de MANN et WHITNEY Ccrcupe me cmomaraison témoins). Ns non significatif X p 0,05 XX p 0,01 XXX p 0,001 06 k U tk aldwexp szk xxx Ook k X)w kez Dez Ok al-dwaxp )EX ze XX 69 ú: SN) St? k ose z 7 91 dw Bx:l XX 99 XXX ttle XXII etz otle 6 kk Bldwax 3 xxx op X)ey get, xx-X esk z o 8-ldwaxzi xxx Zkk Ezz xx> etz k SA 6 eldwaxp xxx 'tok) XY c 9 XXIX zkz dos kk e -4 6 aldwexp xx tz xxx ztt XXX 99 k 096 ok ZJ 6 aldw BX 3 Mx Z 9 (SN) OPL (SN) zok osz p qi 6 aldwexp xx ez xxx k 9 t x t'a k 09 E 6 p ajdwex: xxx oz xxx kas Xk X, o 6 k 599 ok Z aldwax D xxx zkk XXX DU k 9 aldw BX 3 )DE e 9 osz xx 6 z xxx 060 k X-wh t, LZ otle 6 9 aldwaxg xxx ka XXXI ztlt? XW - ezk 06 Z 6 t aldwexp xxx úp Xl x z k O Zk 6 E aldwax- xx zs -Y esz Oz- Z e Tdwaxm 2-c E-r O on r Iz 3 NIUV:DH CI Sl Tnoobd Croyez k neelqei q L 1) L r, ^Si= L-rmcp Rn '-RCMSCSE -NOL E S O =ROCU 17 S 2, 2, 3 N g k 3 % 4,act 4 % -je cacteur vat on -"et -eon ïon cng 9 men-: 48 59 3 >X X l's 4 H'E P A R I N E 20 I-00 40 54 5 7 yr) O X-) Exemple 2 9 a 7 ri 57 XX 84 Y X Da X -1,8 Exemple 3 9 120 57 XY 105 x-lyçx as xx X 4,2 YX Exemple 4 9 790 55 XXY 101 XXX 96 xx Exemple 5 9 1940 61 Y XX as xx as X-X Exemple 6 9 260 50 CNS) 97 xxlyç 26 (NS) X 310 xx Exemple 7 10 685 37 XX 84 Y X Exemple a 9 380 46 CNS) 77 XX -100 Xx X 10 xx Exemple 9 FS a 790 36 xx 64 (NS) E>cemple 9 F 7 10 960 41 xx 77 XXX Exemple 9 FB il 500 60 XXX 92 XXX 42 M X 114 CNS) Exemple 9 4 S 2 XXX 115 XXX Exemple 10 7 390 sa XX 160 XXX 85 xx X 2,1 X- Exemple 1 1 9 840 63)(X-X 78 Yr X 79 XX X 2,7 X Exemple 12 7 390 42 CNS) 96 XXX Exemple 13 lo INS) 94 XXX Exemole 14 10 190 35 XX 85 1 \ 1 X 43145 21 - 1 5 Tableau 2 _es ravaux ___ J-er nent Z_' ees rz^ -_s zn zvcdence lss ressarnes:rcri:s S an:: nrz-cct ue: -vzz -czém-art-e es z-z-_ S -s 2 'imvernt:r. f-, et, z_ N _ U zr zc sane ne acczr' asr -tnrcmcctique Lrccr:ante, ' erret an::cogu:anz u téc zament ze -'_ aventon est ? 13, réduisant ainsi nctamment les r:sques z'émorrag e qu acccm- pagnenz: type Ce mécicaments. Le médicament ce 'invention peut tre orésenté sous des -crm es asministreles par iss voiss orale, parent Srale, rectale St n locale. Chaque dose unitaire contient avantageusement de 0,010 g 0,250 g, les doses administrables journellement pouvant varier de 0,010 g à 0,500 g en fonction de l'âge et de la gravité de l'afectation traitée. On donnera ci-après à titre d'exemple non limitatif quelques formulations pharmaceutiques du médicament de l'invention. 1 comprimés Fraction n 2 0,050 g Excipient q s p 1 comprimé 2 Gélules Fraction n 0,075 g Excipient q s p I gélule 3 ampoules injectables Fraction n 8 0,100 g Solvant isotonique q s p 1 ampoule de 2 ml 4 Pommade Fraction n 10 0,150 g Excipient q s p I tube Je 30 g Par leur action sur les différents stades de la coagulation san- guine et de la fibrinolyse, ces médicaments peuvent être utilisés avec pro- fit, en cures prolongées et repétées dans-le traitement préventif ou cura- tif d'accidents thrombo-emboliques veineux ou artériels dans les cas de phlébites, embolies pulmonaires et autres situations cliniques du mime type, angines dç poitrine, infarctus du myocarde, artérites chroniques des mem- bres inférieurs, troubles circulatoires superficiels et ulcères des jambes. Ils peuvent également être utilisés pour prévenir les thromboses dans les circuits extra-corporels Chémodialyses rénales)l. 23 - En outre, leur action sur la lipoproteine-lipase (facteur óla- rifiant) les rend particulièrement utiles dans le traitement des dyslipé- mies athérogènes. Enfin, ces médicaments peuvent également être utilisés avec profit dans le traitement de certaines maladies inflammatoires, telles que polyarthrite rhumatoide, arthroses et ostéoarthrites. REV Ei G Z 47:r-lS I S fa:es ce xylanes réconcant 'a 9 crmu 2 vellc Dcée sui',,-: e, R OR OR OR OR dans laquelle R représente le groupe-SO 3 Na ou l'hydrogène dans des pro- portions telles que le degré de sulfatation est compris entre 1,5 et 2,0 et caractérisés par une masse molaire apparente comprise entre 7000 et 12000, un pourcentage en acides uroniques compris entre O et 10 et un pourcentage en pentoses compris entre 30 et 40. 2 Procédé de préparation des composés selon la revendication I carac- térisé en ce que le polysulfate de xylane SP 54, dont la masse molécu- laire apparente est inférieure à 7 000, est soumis à des fractionnements par chromatographie sur colonne. 3 Procédé de préparation des composés selon Ia'revendicaticn I carecté- risé en ce que 'La fractionnement est obtenu par ultra fitraticn 4 Procédé de préparation selon une des revendications 2 et 3 caracté- risé en ce que, selon une variante, le fractionnement peut âtre-effectué après désulfatation du SP 54 et les fractions alors obtenues sont ensuite sulfatées de nouveau. Procédé de préparation selon la revendication 4 caractérisé en ce que la désulfatation est effectuée par traitement avec du diméthylflr- mamide additionné de 3 p 100 à 10 p 100 d'eau à des températures com- prises entre 50 C et 100 C. 6 Procédé de préparation selon une des revendications 4 et 5 caracté- risé en ce que la sulfatation est effectuée soit par l'acide chlorosul- -25 2543145 fanique en présencs je pyridine et de dimnétyl-eormamide, sc 4 i: par le complexe trioxyde de sou-Fre-triméthylamine dans l e d 4 imétyl-,o,lrmam cie. 7 Médicament ayant nctamment des activit-és anihcbteet hypo- lipémiante caracterfise en coe qu'il contient, à ti 4 tre de Princice acht m ú un composé tel que d é-F 4 ni à la revend 4 icat:Lon 1. 8 Miédicament selcfl la revendication 7 caractérisé en ce mu'il est présenté sous forme appropriée à l'administration crale, parentérale, rectale ou locale, associé à des véhicules ou excipients thérapeuti-J quement acceptables. 9 Médicament selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il est présenté sous forme de doses unitaires contenant chacune de 0,010 g à 0,250 gdce principe actif.