Brevet FR2541289A1 — publié le 19840824

La présente invention concerne un nouveau procédé de traitement de bouillies de fermentation contenant de la vitamine B 12 et d'autres corrinoides, afin d'en obtenir la vitamine B 12 et d'autres corrinoides biologiquement actifs, ou selon les cas des concentrés contenant ces substances actives, avec de bons rendements et une con- centration élevée. On sait que dans la préparation de la vitamine B 12 et d'autres corrinoides s'effectuant par voie microbio- logique la vitamine B 12 produite par les microorganismes s'accumule surtout de façon intracellulaire; c'est pour- quoi pour isoler les substances actives on travaille généralement de manière à séparer après la fin de la fermentation la masse cellulaire obtenue de la bouillie de fermentation, p ex par filtration, sédimentation et/ou centrifugation, à désagréger les cellules bactériennes contenues dans ladite biomasse éventuellement après des opérations ultérieures de puri- fication ou d'enrichissement pouvant être isolés par des procédés d'extraction et/ou d'adsorption. Les procédés connus et employés jusqu'ici pour la préparation microbiologique et l'isolement de la vitamine B 12 et d'autres corrinoides sont décrits de manière résumée p ex dans la monographie de W Friedrich "Vitamin B 12 und verwandte Corrinoide" (dans l'ouvrage de R Amon: Fermente-Hormone-Vitamine, vol III/2, éd G. Thieme, Stuttgart, 1975, pp 10-13). Dans la réalisation des procédés connus décrits ci- dessus des difficultés importantes sont causées par le fait que l'isolement des cellules de microorqanismes contenant les corrinoides à partir de la bouillie de fermentation ne peut s'effectuer techniquement avec un bon rendement D'autres difficultés viennent du fait que la vitamine B 12 à isoler n'est présente dans la bouillie de fermentation qu'à très faibles concentrations et accompagnée de très grandes quantités d'impuretés prove- nant de la fermentation, en partie en suspension, en partie dissoutes, ce qui fait que les substances actives désirées ne peuvent être isolées de la solution très diluée obtenue après la désagrégation des cellules que très difficilement de manière économique et techniquement rationnelle Ces difficultés sont particulièrement graves dans le traitement de bouillies de fermentation auxquelles on inocule une boue d'eaux usées ou d'autres fermen- tations septiques effectuées avec des produits de départ contenant beaucoup d'impuretés, o les corrinoides produits doivent être isolés à partir de milieux conte- nant nettement plus d'impuretés par ailleurs plus diffi- ciles à enlever, comme p ex avec les fermentations asep- tiques effectuées avec des propionibactéries. Pour éliminer ces difficultés on a déjà recommandé nombre de procédés différents, dans lesquels on a recom- mandé surtout diverses opérations supplémentaires de purification ou d'enrichissement pour faciliter l'obten- tion de la vitamine B 12 à l'état pur. Ainsi selon le brevet hongrois N O 158 809 on sépare les cellules à partir du liquide de fermentation obtenu avec Propionibacterium shermanii, on désagrège la biomasse ainsi obtenue et on amène par étapes le p H du milieu à 5,5 à 6,5, une partie des impuretés qui l'accompagnent, en particulier les protéines, étant liées à la biomasse désagrégée elle-même, tandis que la vitamine B 12 reste en solution On sépare ensuite la biomasse désagrégée avec les impuretés qui l'accompagnent par centrifugation ou sédimentation et on fixe les autres corrinoides à partir de la solution purifiée de cette manière à l'aide d'échangeurs d'ions et on les isole Cependant la réa- lisation à l'échelle industrielle de ce procédé est assez difficile étant donné qu'on ne peut que difficile- ment séparer de la phase liquide les cellules désagré- gées avec les impuretés qui les accompagnent, tandis que l'application d'additifs de filtration et de sédimenta- tion peut provoquer de notables pertes de substance active. Selon le brevet soviétique n'161 709 on désagrège l'ensemble du liquide de fermentation ou la biomasse séparée par traitement à la chaleur en milieu acide, on sépare les parties solides par centrifugation et on fixe à partir du liquide surnageant les substances acti- ves sur de l'oxyde d'aluminium ou sur une résine échan- geuse d'ions Cependant on ne peut entièrement retirer les fractions cellulaires de l'ordre de grandeur du micron et les autres particules solides fines en suspen- sion, tandis que les fines impuretés solides restantes gênent l'adsorption des substances actives et diminuent l'effet de l'obtention, la réalisation de ce procédé étant encore rendue plus difficile par d'autres problèmes techniques. L'obtention des substances actives à partir des fractions cellulaires désagrégées et de liquides de fermentation contenant d'autres impuretés solides est notablement facilitée par l'application de ce qu'on appelle des résines d'adsorption macroréticulaires. Ces polymères en suspension, insolubles, poreux, apolaires ou polaires à des degrés différents, ayant une grande surface spécifique, ont cet avantage spécifique qu'à cause de leur taille de pores favorable, de leur granulo- métrie et de leur stabilité mécanique ils permettent l'adsorption des substances actives dissoutes même à partir de mélanges liquides contenant des particules solides. Ainsi dans le traitement des liquides de fermentation on peut éviter la filtration ou centrifugation le plus souvent difficile, on peut introduire l'ensemble du li- quide de fermentation immédiatement dans le système d'adsorption, la résine d'adsorption pouvant être mise en contact avec le liquide de fermentation p ex - par délayage ou dans un lit fluide Cependant l'introduc- tion directe du liquide de fermentation sur l'adsorbant a cet inconvénient qu'avec la substance activé désirée des quantités notables d'impuretés sont également adsor- bées sur la résine Cette circonstance complique également l'application de ce procédé à l'adsorption directe des substances actives à partir des liquides de fermentation, bien que l'on sache (cf brevet américain N O 3 531 463) que les corrinoïdes sont également adsorbés par certaines résines macroréticulaires à partir de solutions aqueuses concentrées et que les corrinoides adsorbés peuvent être bien élués de ces résines par des solvants appropriés cependant on ne connaissait jusqu'à présent aucun procédé techniquement facile à réaliser pour l'adsorption directe des corrino des à partir de liquides des fermentation, permettant outre l'élimination des inconvénients mentionnés des procédés connus d'obtenir les substances actives avec une pureté satisfaisante et un bon rendement. On a maintenant trouvé que l'on peut obtenir les corrinoïdes produits par des microorganismes et présents de façon intracellulaire dans le liquide de fermentation selon un nouveau procédé d'adsorption en deux étapes avec une bonne pureté et un rendement élevé, ainsi que sans endommager la résine adsorbante, en travaillant de la manière suivante: Dans la première étape du procédé on-traite le liquide de fermentation obtenu à la fin de la fermentation, conte- nant encore des cellules intactes, sans aucun pré-traite- ment, à la température ambiante avec une résine d'adsorp- tion macroporeuse, appelée macroréticulaire, à grande sur- face spécifique Dans de telles conditions seuls les additifs du bouillon de culture non consommés présents sont fixés sur la résine macroréticulaire, ainsi que les produits métaboliques apparus au cours de la fermen- tation, tandis que les cellules intactes non désagrégées restent en suspension dans la phase liquide avec les corrinoides qu'elles contiennent. Selon ce traitement les cellules du liquide de fermen- tation déjà purifié dans une mesure notable de la manière décrite cidessus sont désagrégées de façon connue, p ex. par traitement thermique conduit en présence d'ions cyanure, les corrinoides venant dans la solution, tandis que les débris des cellules désagrégées restent à l'état de suspension dans le liquide de fermentation. Immédiatement ensuite, sans séparation préalable de ces débris cellulaires en suspension et d'autres impuretés solides, on soumet le liquide de fermentation traité de cette manière à un second traitement avec une résine d'adsorption macroréticulaire, les matières actives elles-mêmes étant alors fixées sur l'adsorbant. Etant donné que de manière inévitable lors de la désa- grégation des cellules des impuretés solubles viennent également en solution à partir des cellules, dans cette seconde étape d'adsorption une partie de ces impuretés solubles est également adsorbée sur la résine; cependant on peut dans une large mesure retirer sélectivement ces impuretés de la surface de la résine en lavant la résine avec de l'eau rendue alcaline, tandis que les corrino des eux-mêmes restent fixés sur la résine. Dans le traitement de liquides de fermentation conte- nant moins d'impuretés, p ex provenant de fermentations aseptiques, il peut arriver que dans cette seconde étape d'adsorption aucune impureté soluble de ce genre ne soit adsorbée sur la résine; dans ces cas le traitement aqueux-alcalin mentionné de la résine contenant les corrinoides adsorbés peut ne pas s'effectuer, étant donné que déjà par un simple lavage à l'eau on peut enlever les impuretés solides présentes, si bien que l'on peut ensuite éluer les corrinoúdes adsorbés avec une bonne pureté. On élue ensuite la résine lavée de la manière indiquée ci-dessus avec de l'eau alcaline ou simple afin d'obte- nir les corrinoides adsorbés avec un solvant organique miscible à l'eau, éventuellement contenant également de l'eau, p ex avec un alcool ou une cétone aliphatique inférieur(e) On peut alors traiter l'éluat de façon connue pour préparer des additifs pour fourrage contenant de la vitamine B 12 ou pour obtenir de la vitamine B 12 cristalline pure et d'autres corrinoides. L'invention a donc pour objet un nouveau procédé de purification de liquides de fermentation contenant de la vitamine B 12 et d'autres corrinoides dans le but de préparer des concentrés de vitamine B 12 ou de la vitamine B 12 cristalline, caractérisé en ce qu'on traite le liquide de fermentation contenant des cellules de microorganismes non désagrégées avec une résine d'adsorption macro- réticulaire non ionique de 10 8 à 10 7 mètres de taille de pores au moins 10 4 mètres de diamètre granulométrique et au moins 200 m 2/g de surface spécifique, puis a) on traite après désagrégation des cellules conduite de façon classique le liquide avec une résine d'adsorption non ionique de 10 8 a 10 7 mètres de taille de pores, au moins 10-4 mètres de diamètre granulométrique et au moins 200 m 2/g de surface spécifique, on lave la résine 2 541289 séparée avec de l'eau et/ou on la traite avec une solution basique aqueuse de p H 8 à 12 et on élue de la résine la vitamine B 12 et d'autres corrinoides liés à la résine de façon classique, en pratique avec un sol- vant organique miscible à l'eau et éventuellement aqueux, et éventuellement on traite plus avant de façon classique pour obtenir la vitamine B 12 cristalline et/ou un additif de fourrage pour animaux contenant de la vitamine B 2 ou b) on sépare du liquide de-fermentation les cellules non désagrégées et on met sous une forme sèche, immédia- temment utilisable comme additifs d'aliment pour animaux contenant de la vitamine B 12 la biomasse obtenue, en pratique par séchage par pulvérisation et/ou on traite plus avant de façon connue pour obtenir la vitamine B 12 cristalline. Comme résines adsorbantes on peut utiliser avec un bon succès dans les deux étapes d'adsorption du procédé selon l'invention des résines macroréticulaires non ioniques quelconques tion ayant de 10 8 à 10 7 mètres de taille de pores, au moins 10 4 mètres de granulométrie et au moins m /g de surface spécifique), p ex Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7, XAD-8 ou XAD-9 (produits de la société américaine Rohm & Haas), DIAION HP-20, HP 21 ou PH-2 MG (produits de la société japonaise Mitsubishi) On peut dans les deux étapes d'adsorption utiliser comme adsorbants des résines semblables ou différentes; si l'on utilise dans les deux étapes d'adsorption des résines différentes, elles peuvent différer dans la taille de leurs pores ou dans leur polarité superficielle Le type opti- mal de résine à utiliser dépend de la qualité du liquide de fermentation et du caractère des impuretés présentes, et peut être déterminée par des expériences simples dans les différents cas Le cas échéant il peut être intéressant de traiter le liquide de fermentation non encore désagrégé dans la première étape d'adsorption successi- vement avec deux résines différentes, et l'on peut utiliser p ex une résine avec de gros pores et une résine à petits pores, ou une résine non ionique à surface apolaire et ensuite une résine également non ionique, mais à surface plus ou moins polaire Les deux étapes d'adsorption sont généralement conduites à la température ambiante; leurs autres conditions, comme le p H optimal du liquide de fermentation et la durée optimale du traitement avec la résine d'adsorption dépendent également de la qualité et de la composition du liquide de fermentation et peuvent de manière intéres- sante être déterminées par des expériences en particulier en cas de fonctionnement continu. Dans le traitement du liquide de fermentation conte- nant les cellules non désagrégées avec la résine d'adsorption on ne doit appliquer aucune condition nocive pour les cellules, comme des milieux fortement acides (p H inférieur à 5) ou fortement basiques (p H supérieur à 8) ou des températures élevées Si la première étape d'adsorption est conduite correctement, dans des conditions optimales, on obtient un liquide de fermenta- tion purifié largement débanassé des impuretés colorées et malodorantes et ne contenant qu'un minimum de lipoïdes. Dans les pré-expériences mentionnées pour déterminer les conditions optimales des étapes d'absorption on peut contrôler la présence d'impuretés colorées ou malodorantes par un examen organoleptique, tandis qu'on peut déterminer la teneur en lipoïdes du liquide de fermentation par extraction avec des solvants gras et détermination de la teneur de l'extrait en matière grasse. Le mode de réalisation technique de l'adsorption peut également dépendre des dispositifs disponibles dans le cas considéré On peut ainsi conduire l'adsorption avec un bon succès en délayant la résine dans le liquide de fermentation et en séparant la résine contenant les corps adsorbés par des procéces habituels, comme par sédimentation ou filtration Cependant il peut également être très intéressant de conduire l'adsorption en appliquant la technique connue des lits fluidisés. Selon la seconde étape d'adsorption, dans laquelle on traite avec la résine le liquide de fermentation préalablement purifié dans la première étape d'adsorption et contenant les cellules déjà à l'état désagrégé, on petut utiliser en pratique dans le traitement alcalin aqueux de la résine servant à retirer de manière sélec- tive les impuretés également fixées sur la résine, outre les substances actives, une solution aqueuse diluée d'hydroxyde d'ammonium, p ex de l'eau amenée avec de l'hydroxyde d'ammonium à p H 8 à 12, de préférence à p H 9 à 10 comme liquide de lavage Cependant on peut également utiliser à cet effet d'autres solutions aqueuses alcalines, p ex une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium amenée à environ p H 10. Selon ce lavage aqueux-alcalin ou selon les cas (cf ci-dessus) seulement aqueux de la résine, l'élu- tion des substances actives peut s'effectuer de façon connue, p ex avec du méthanol ou avec du méthanol aqueux. En concentrant l'éluat obtenu de cette manière on obtient un produit brut contenant la vitamine B 12 et d'autres corrinoides à l'état largement purifié, sous la forme d'un concentré soluble dans l'eau; la teneur en substance active ïdes biologiquement actifs) de ce concentré par rapport à la substance sèche s'élève à 10 à 25 % On peut utiliser ce produit brut à l'état sec immédiatement comme additif de fourrage contenant de la vitamine B 12 mais d'un autre côté on peut également l'utiliser étant donné sa pureté élevée et sa forte concentration en substance active, comme un produit de départ excellent pour obtenir de la vitamine B 12 cristalline et ce qu'on appelle le facteur III (cyanure de 5-hydroxy-benzimidazolyl-cobamide). Comme les propriétés gênantes (goût et odeur désagréables, etc) empêchant d'appliquer ce produit brut comme additif de fourrage, dans le liquide de fermenta- tion contenant les cellules non désagrégées obtenu comme produit immédiat de fermentation sont déjà lar- gement éliminées dans la première étape d'adsorption, le liquide de fermentation contenant des cellules non désagrégées purifié seulement dans la première étape d'adsorption peut être déjà utilisé dans cette étape pour préparer un additif de fourrage contenant de la vitamine B 12, en séparant à partir de ce liquide de fermentation seulement purifié dans la première étape d'adsorption selon l'invention les cellules non désa- grégées contenant la substance active de façon classique, p ex par centrifugation, et en amenant à l'état sec, p ex par séchage par pulvérisation, la biomasse obtenue de cette manière, riche en vitamine B 12 et en autres corrinoïdes, mais déjà débarrasee des lipoïdes et des impuretés malodorantes Il faut remarquer à ce propos que par la purification selon le procédé de la première étape d'adsorption selon l'invention le liquide de fermentation n'est pas seulement débarrassé des impuretés indésirables, mais son poids spécifique est également réduit et sa consistance est modifiée de manière intéressante, si bien qu'ainsi la possibilité de séparer les cellules de microorganisme est également nettement meilleure Grâce à la séparation et au séchage de la biomasse effectués de la manière indiquée ci-dessus on obtient un produit de couleur claire, dépourvu d'odeur désagréable, immédiatement utilisable comme additif alimentaire, contenant de 2 à 3 mg/g de substance active. D'après les indications données ci-dessus on peut résumer les avantages du procédé selon l'invention de la façon suivante: 1) On peut conduire les deux étapes d'adsorption du procédé et la désagrégation des cellules intervenant entre ces traitements d'adsorption d'un bout à l'autre dans le liquide defermentation d'origine, d'o du point de vue technique l'avantage tout à fait essen- tiel que l'on n'a pas à isoler la biomasse entre les différentes étapes du procédé. 2) La quantité principale des impuretés extra- cellulaires qui dans les procédés ultérieurs étaient fixées à l'adsorbant avec les substances actives après la désagrégation des cellules est retirée du liquide de fermentation dans le procédé selon l'invention dans la première étape d'adsorption, donc avant la désagréga- tion des cellules; il s'ensuit que l'on a besoin d'une quantité nettement plus faible d'adsorbant pour fixer entièrement les substances actives, ce qui accroît éga- lement la capacité de l'adsorbant calculée par rapport à la substance activez 3) Etant donné les circonstances décrites ci-dessus on a également besoin pour éluer les substances actives de quantités nettement plus faibles de solvant, si bien que l'on peut obtenir les substances actives dans l'éluat à une concentration nettement plus élevée. 4) Gr 9 ce à la double purification effectuée au cours du procédé (prépurification du liquide de fermentation dans la première étape d'adsorption et élution sélective des impuretés adsorbées avec les substances actives par le traitement basique-aqueux de la résine selon la seconde étape d'adsorption) on obtient les substances actives éluées du second adsorbant avec une pureté nettement plus élevée que dans les procédés connus antérieurement. Ainsi on peut arriver à ce que, contrairement aux préparations d'additifs de fourrage contenant de la vitamine B 12 que l'on peut actuellement obtenir dans le commerce, qui contiennent généralement de 0,1 à 0,3 %, par exception au plus 2 % de corrinoides, selon le procédé de l'invention on peut préparer immédiatement, c'est-à- dire sans autre opération d'enrichissement, des produits contenant 10 % ou encore plus de corrinoides. ) Il est également facile de conduire le procédé selon l'invention à l'échelle industrielle, et il n'exige pas d'appareillages spéciaux et coûteux Autre avantage, le procédé peut être également très bien réalisé en appliquant la technique des lits fluidisés connue et permettant un travail continu. 6) Comme on retire du liquide de fermentation les impuretés extracellulaires dès la première étape d'adsorption,donc avant la désagrégation des cellules, les produits obtenus dans les autres étapes du procédé conviennent mieux pour tous les objectifs du traitement ultérieur à cause de leur pureté supérieure. Les exemples suivants précisent la réalisation pratique du procédé selon l'invention. Exemple 1 On purifie de la manière suivante 2 m d'un liquide de fermentation prélevé dans une fermentation anaérobie semi-continue effectuée avec une population de bactéries mixte provenant d'une boue d'eaux usées (teneur en subs- tance sèche: 1,5 %, p H 6,3, teneur en substance active: vitamine B 12 26 mg/litre, facteur III ( 5-hydroxy- benzimidazole-cobalamine) 4,2 mg/litre) dans un système d'adsorption à deux éléments constitué de deux appareils à lit fluidisé disposés successivement: On fait passer en un courant continu le liquide de fermentation non filtré à un débit de 200 litres par heure à travers deux appareils d'adsorption à lit fluidisé ayant chacun un volume utile de 50 litres disposés l'un après l'autre et contenant chacun 10 litres de résine macroréticulaire DIAION HP 20 (produit de la société japonaise Mitsubishi) On adsorbe alors sur la résine la quantité principale des impuretés extra-cellulaires présentes dans le liquide de fermentation Après qu'on ait fait passer le liquide de fermentation on lave les appareils avec 100 litres d'eau. On mélange le liquide de fermentation préalablement purifié de la manière indiquée ci-dessus avec 250 ml de solution aqueuse à 1 % de cyanure de potassium puis on amène à p H 4 en ajoutant de façon continue de l'acide sulfurique aqueux à 50 % On chauffe à 1100 C le liquide de fermentation traité de cette manière dans un système continu avec 10 minutes de temps de séjour, les cellules étant désagrégées et les corrinoïdes libérés à partir des cellules étant dissous dans le liquide de fermentation. On refroidit à moins de 300 C dans un système d'échange de chaleur le liquide de fermentation désagrégé de cette manière puis on fait passer avec un débit de 200 litres par heure à travers un deuxième système d'adsorption à deux éléments constitué de deux appareils d'adsorption à lit fluidisé ayant chacun un volume utile de 50 litres disposés l'un après l'autre et contenant chacun 20 litres de résine d'adsorption macroréticulaire DIAION HP 20. Dans cette seconde étape d'adsorption on adsorbe les corrinoldes sur la résine; le liquide ayant passé à travers l'appareil et ne contenant plus de corrinoide est rejeté dans la canalisation d'eaux usées On fait ensuite passer tout d'abord 250 litres d'eau avec un débit de 1 m 3/h en direction inverse pour retirer les résidus cellulaires restant dans l'appareil puis on lave les lipoïdes adhérents à la résine adsorbante et les im- puretés jaunes et brunes non identifiées en faisant passer 200 litres d'eau amenés à p H 9 à 10 avec de l'hydroxyde d'ammonium pour les séparer de la résine retenant les corrinoides On lave avec de l'eau jusqu'à neutralité la résine traitée avec l'eau basique puis on élue de la résine adsorbante les corrinoïdes avec litres de méthanol à un débit de 100 litres par heure. A partir de l'éluat on fait évaporer le méthanol sous vide à une température ne dépassant pas 500 C, et il reste 10 litres de solution aqueuse Ce résidu aqueux contient 45,2 g de vitamine B 12 et 7,3 g de facteur III; sa teneur totale en substance sèche est de 331 g, la teneur en substance active du produit, calculée par rapport à la substance sèche, est donc de ,9 % Le degré d'enrichissement des substances actives dans ce concentré obtenu comme produit immédiat est donc fermentation d'origine s'élève à 87 %. Le produit sec que l'on peut obtenir par séchage par pulvérisation à partir du concentré aqueux obtenu de la manière indiquée ci-dessus peut être utilisé immédiatement sans autre traitement ultérieur comme additif de fourrage à haute teneur en vitamine B 12 d'un autre côté on peut de façon classique préparer à partir de ce concentré aqueux la vitamine B 12 cristalline, par exemple par extraction et purification par échange d'ions. Exemple 2 On mélange 100 litres d'un liquide de fermentation (p H = 5,9) contenant 45 mg/litre de vitamine B 12 et 1,35 % de substance sèche provenant d'une fermentation aseptique conduite avec Propionibacterium shermannii avec 2 litres de résine macroréticulaire Amberlite XAD 2 On agite lentement le mélange pendant 1 h, puis on sépare la résine par filtration sur un filtre lais- sant passer les microorganismes non désagrégés présents dans le liquide de fermentation On amène à p H 5 le liquide de fermentation purifié obtenu comme filtrat puis on le désagrège de façon connues en présence d'ions cyanure. On amène à 5 à 5,5 le p H du liquide de fermentation désagrégé et refroidi à 30 'C puis on ajoute 5 litres de résine macroréticulaire Amberlite XAD-2 On agite le mélange pendant 3 h; pendant ce temps la totalité de la substance active se trouvant dans la solution est adsorbée sur la résine On sépare la résine par filtra- tion, on la lave à l'eau puis on élue les substances actives en mélangeant la résine avec 10 litres d'acétone aqueuse à 60 % On répète l'élution avec encore 5 litres d'acétone aqueuse à 60 %, on rassemble les deux éluats eton distille l'acétone sous vide La solution aqueuse obtenue comme résidu 13 litres) contient 3,96 g de vitamine B 12; la teneur en substance sèche de la solution est de 27,0 g, la teneur spécifique en substance active par rapport à la substance sèche est donc de 14,66 % Dans le concentré obtenu la teneur en substance active calculée par rapport au liquide de fermentation utilisé comme produit de départ est donc de 88 %. Le concentré aqueux obtenu de la manière indiquée ci-dessus peut être traité de la manière décrite dans l'exemple 1. Exemple 3 On fait passer 10 litres du liquide de fermentation mentionné dans l'exemple là travers une colonne contenant 200 ml de résine Amberlite XAD 7 On amène le p H du liquide que l'on fait passer à 3 à 3,5, on ajoute 2 ml de solution à 1 % de cyanure de potassium et on maintient le mélange pendant 10 minutes à 80 WC On refroidit à 20-30 'C le liquide de fermentation désagré- gé de cette manière et on le fait passer à travers une colonne contenant 200 ml de résine d'adsorption Amberlite ER 180 On jette le liquide que l'on a fait passer, on lave la résine tout d'abord avec de l'eau, puis avec une solution diluée d'hydroxyde de potassium (p H = 10) et enfin à nouveau avec de l'eau jusqu'à réaction neutre. On élue alors la substance active avec 2 litres de métha- nol aqueux à 70 %; on fait évaporer le méthanol à partir de l'éluat sous vide La solution aqueuse obtenue comme résidu ( 500 ml) contient 216 mg de vitamine B 12, sa teneur en substance sèche est de l,2 g La teneur spécifique en substance active calculée par rapport à la substance sèche est de 18 %, le rendement calculé par rapport au liquide de fermentation utilisé comme produit de départ est de 83 % On peut traiter plus avant le concentré obtenu de la manière décrite dans l'exemple 1 pour préparer un additif de fourrage sec ou la vitamine B 12 cristalline. Exemple 4 - On fait passer 10 litres d'un liquide de fermentation contenant 26 mg/litre de vitamine B 12 provenant d'une fermentation aérobie septique réalisée par inoculation de boue d'eaux usées à travers une colonne contenant ml de résine Amberlite XAD 7 puis à travers une seconde colonne contenant 100 ml de résine Amberlite ER On désagrège alors le liquide de fermentation préa- lablement purifié de cette manière, de la manière décrite dans l'exemple 3, et on le traite plus avant. La solution aqueuse obtenue par concentration de l'éluat obtenu après la seconde étape d'adsorption contient 202 mg de vitamine B 12; la teneur totale en substance sèche de ce concentré aqueux est de 900 mg La teneur spécifique en substance-active est ainsi de 22,4 %; le rendement calculé par rapport à la teneur en substance active du liquide de fermentation d'origine est de 77,7 %. Exemple 5 On fait passer 1 m d'un liquide de fermentation contenant 25 mg/litre de vitamine B 12 et provenant d'une fermentation anaérobie inoculée avec de la boue d'eaux usées, dont la viscosité relative par rapport à l'eau est de 1,5, avec un débit de 200 litres par heure à tra- vers 3 colonnes d'adsorption à lit fluidisé disposées en série et contenant chacune 10 litres de résine adsorbante-DIAION HP 21 Le liquide sortant est de couleur claire, et n'a pas d'odeur désagréable; sa viscosité relative par rapport à l'eau est de 1:1. A partir du liquide de fermentation préalablement purifié de la manière indiquée ci-dessus on sépare la biomasse et on effectue un sechage par pulvérisation On obtient 9,5 kg de produit sec immédiatement utilisable comme additif de fourrage, dont la teneur en vitamine B 12 est de 22,5 g, activité spécifique: 2370 mg/kg. Exemple 6 On traite plus avant le concentré aqueux obtenu selon l'exemple 1 de la manière suivante pour préparer la vita- mine B 12 cristalline utilisable en thérapeutique humaine: On mélange 10 litres d'un concentré aqueux contenant au total 45,2 g de vitamine B 12 et 7,3 g de facteur II (teneur totale en substance sèche 331 g) avec 200 ml de phénol liquéfié puis on extrait avec 2 litres de mélange 1:6 de phénol et de chloroforme On sépare la phase organique et on extrait encore une fois la phase aqueuse avec 1 litre de mélange 1:6 de phénol et de chloroforme On rassemble les phases organiques et on les lave avec 1,5 litre d'eau contenant 2 % de phénol. On rassemble ce liquide de lavage aqueux avec la phase aqueuse restant dans l'extraction ci-dessus. On mélange la solution de phénol-chloroforme ( 3 litres) contenant de la vitamine B 12, obtenue de cette manière, avec le même volume ( 3 litres) d'acétone et avec 1500 ml d'eau La vitamine B 12 passe alors dans la phase aqueuse; on sépare la phase aqueuse et on extrait 2 fois la phase organique avec à chaque fois 200 ml d'eau On lave les phases aqueuses réunies avec 1 litre de chloroforme poure retirer les traces de phénol restantes On obtient de cette manière 2100 ml de solution aqueuse dont la teneur en vitamine B 12 est de 21,7 g ( 48 % de la quantité théorique); l'examen de la solution par chromatographie sur papier montre que les autres facteurs de cobalamine ne sont présents qu'à l'état de traces (à moins de 1 %). MI On concentre cette solution aqueuse à un volume d'en- viron 500 ml et on amène la vitamine B 12 à se cristalli- ser de manière habituelle en ajoutant 3000 ml d'acétone. On obtient 18,1 g de vitamine B 12 cristalline avec une teneur en cyanocobalamine de 90,0 %. A partir de la liqueur-mère obtenue dans la cristal- lisation on distille l'acétone, on mélange le résidu aqueux avec la phase aqueuse de l'extraction conduite avec le mélange 1:6 de phénol et de chloroforme et avec le liquide de lavage aqueux du mélange phénol-chloroforme. On libère cette solution aqueuse (environ 12 litres) des résidus de phénol par extraction avec seulement % en volume de chloroforme, on concentre et on sèche par pulvérisation Le produit secondaire obtenu de cette manière contient 24,4 g de vitamine B 12 et 6,5 g de facteur III Ce produit correspond aux spécifications de qualité de la "vitamine B 12 de qualité alimentaire". REVENDICATIONS 1 Procédé de traitement de liquides de fermentation contenant de la vitamine B 12 et d'autres corrinoides 12 1 pour préparer des concentrés de vitamine B 12 ou la vitamine B 12 cristalline, caractérisé en ce qu'on traite le liquide de fermentation contenant des cellules de microorganismes intactes avec une résine d'adsorption macroréticulaire non ionique d'une taille de pores comprise entre 10 8 et 10 7 mètres, d'un diamètre granulométrique d'au moins 10 4 mètres et d'au moins 200 m /g de surface spécifique, puis a) après désagrégation des cellules effectuée de façon classique on traite le liquide avec une résine d'adsorp- tion non ionique de 10 8 à 10 mètres de taille de pore% au moins 10-4 mètres de diamètre granulométrique et au moins 200 m 2/g de surface spécifique, on lave la résine séparée avec de l'eau et/ou on la traite avec une solu- tion basique aqueuse de p H 8 à 12 et on élue de façon classique la vitamine B 12 et les autres corrinoúdes liés à la résine, en -pratique avec un solvant organique miscible à l'eau et éventuellement aqueux pour les séparer de la résine, et le cas échéant on traite plus avant de façon classique pour donner la vitamine B 12 cristalline et/ou un additif de fourrage contenant la vitamine B 12, ou b) on sépare les cellules non désagrégées du liquide de fermentation et on amène sous une forme sèche, immédiatement utilisable comme additif de fourrage conte- nant de la vitamine B 12 la biomasse obtenue, en pratique par séchage par pulvérisation et/ou on la traite de façon connue pour donner la vitamine B 12 cristalline. 2 Procédé selon la revendication 1, paragraphe a), carac- térisé en ce qu'on utilise pour purifier par adsorption le liquide de fermentation contenant des cellules intac- tes et pour fixer par adsorption la teneur en substance active du liquide de fermentation désagrégé des résines d'adsorption du même type. 3 Procédé selon la revendication 1, paragraphe a), carac- térisé en ce qu'on utilise pour purifier par adsorption le liquide de fermentation contenant des cellules intac- tes, ou pour fixer par adsorption la teneur en substance active du liquide de fermentation désagrégé des résines différentes l'une de l'autre. 4 Procédé selon la revendication 1, paragraphe a), caractérisé en ce qu'on utilise pour le traitement basique aqueux de la résine contenant la vitamine B 12 fixée une solution aqueuse d'hydroxyde d'ammonium ou d'hydroxyde de métal alcalin de p H 8 à 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on conduit la purification par adsorption du liquide de fermentation contenant les cellules intactes en deux étapes, avec des résines d'adsorption semblables ou différentes l'une de l'autre.