Brevet FR2543439A1 — publié le 19841005

La présente invention se rapporte à un perfectionnement de l'adsorption d'antigènes sur un gel de phosphate de calcium. Elle concerne plus particulièrement le procédé de préparation de gels pour l'adsorption d'un ou de plusieurs antigènes, notamment des allergènes. L'invention comprend également les compositions thérapeutiques ou autres, constituées par de tels gels perfectionnés à base de phosphate de calcium. Il est connu d'utiliser un gel de phosphate de calcium pour y fixer un ou plusieurs antigènes; en effet, la brushite, PO4HCa, a été employée depuis iongtemps pour l'adsor- ption de vaccins. Un perfectionnement, décrit dans le brevet français publié sous le nO 2 181 426, consiste à remplacer la brushite par un phosphate spécial, dans lequel le rapport pondéral Ca/P est de 1,55 à 1,90: le gel de ce composé présente un pouvoir adsorbant très élevé et permet l'obtention dtadsorbats de différents antigènes d'excel-len- te stabilité. Ce sont de telles compositions stables, faites à partir de différents antigènes, et en particulier avec des vaccins, qui sont décrites dans le brevet précité.Des études ultérieures sur les allergènes ont montré qu'lest avantageux, pour des raisons de stabilité et d'innocuité, d'employer -pour l'adsorption sur un gel - des antigènes de masses moléculaires convenablement choisies Cette technique est décrite dans le brevet français publié sous le nO 2 466 991. Or, les travaux, qui ont conduit à la présente invention, ont révélé ce fait inattendu qu'une bonne stabilité et l'innocuité peuvent également être assurées par certaines mesures opératoires, dans le procédé de préparation d'un gel de phosphate de calcium et dans l'adsorp- tion de l'antigène sur ce gel à partir d'un extrait aqueux,antigènique. Suivant la présente invention, des résultats améliorés sont obtenus, lorsque le gel de phosphate, avant et pendant l'adsorption de l'antigènesest maintenu à un pH aussi voisin que possible de 7. il est à noter effet que,selon la publication n 2 181 426, le pH du gel, dès la précipitation à partir du phosphate disodique et d'un sel de calcium,devait litre ramené à une valeur de 6,8 à 7,2; d'autre part, on devait rétablir ce même pH après la stérilisation à chaud. Mais, dans le cadre de la présente invention, on a constaté que le pH baisse à la suite de chacune des opérations de lavage du gel à l'eau salée; on a ainsi trouvé qu'il convient de ramener le pH du milieu à sa valeur voisine de la neutralité, notamment vers 6,85 à 7,15 pour améliorer les qualités de la composition d'antigène adsorbé par le phosphate. Le procédé perfectionné suivant 1'invention consiste à effectuer un rajustement du pH à la suite de chacune des opérations qui, au cours de la préparation d'un gel de phosphate de calcium, ont tendance à faire baisser le pH du milieu. Plus spécialement, ie procédé comprend l'élévation du pH a une valeur de 6,85 à 7,15 après chaque lavage du gel avec de l'eau salée. Bien entendu, les rajustements de pH précédemment connus, c'est-à-dire immédiatement après la précipitation et après stérilisation, sont effectués comme par le passé. Etant donné que la précipitation du gel peut être réalisée en présence d'un ou de plusieurs antigènes à adsorber, ou bien avant leur addition, il en résulte que les rajustements de pH,suivant la présente invention, peuvent avoir lieu en présence ou en l'absence d'antigène. Le procédé suivant l'invention est applicable à la préparation de gel, quelle que soit la nature du phosphate et des réactifs utilisés;cependant, comme le phosphate spécial à rapport Ca/P= 1,55 à 1.90, et de préférence 1,62 à 1,85 (brevet françains n 72 12036 de l'Institut Pasteur,publié sous le n 2 181 426) est de beaucoup le plus intéressant, il est normal d'appliquer l'invention surtout à la préparation de ce phosphate et des compositions antigeniques obtenues avec luio Les détails opératoires de la préparation de ce gel spécial ayant été donnés dans le brevet cité, il n'y a pas lieu de les répéter ici. Le perfectiounement, suivant la présente invention s'applique aussi bien dans le cas de la préparation du gel lui-même, sans adjonction d'aucune substance adsorbable, que dans les cas de la préparation de compositions antigèniques, comme par exemple de-s allergènes ou des vaccins adsorbés. Comme déjà mentionné plus haut, ladsorption d'un antigène par le phosphate peut être-mise en oeuvre par la précipitation du phosphate de calcium à partir de réactifs dont un au moins renferme antigène voulu. Un autre mode de réalisation consiste à préparer sabord le gel de phosphate, en le neutralisant après chaque lavage à l'eau salée; le gel obtenu est ensuite mélangé avec une solution ou suspension du ou des antigènes voulus. Dans ce cas, il est possible d' ajouter un milieu d'antigène concentré à du gel relativement dilué, se servir, au contraire, d'un gel concentré avec un milieu d'antigène dilué, ou bien mélanger les deux pris à des concentrations courantes. Il est ainsi facile de choisir la meilleure méthode pour obtenir la concentration désirée en antigène. Des exemples de vaccins1 pouvant être adsorbés par le gel de phosphate spécial, sont donnée dans le bre- vet précité. On cite ici des exemples d'autres antigènes et en particulier des extraits allergénique Substances végétales : pollen, poussières végétales, farines, foin, sciure de bois, lichen, mousse des arbres, chanvre, coton, kapok, gomme arabique, tabac, tourteau de soja, etc. Matières animales: pois, plumes, squames, laine, soie, insectes, acariens, etcOO Champignons et moisissures: Alternaria, Aspergillus7 Penieillium Trichophyton, eto Buspension de levure: Candida, Saccharomyces, ete. Suspension microbienne : Staphylocoques, Streptocoques, Protéus, Pseudomonas, ete, Les exemples non limitatife, qui suivent, il- lustrent l'invention dans le cas particulier où la com- position d'adsorbat est un allergène retard. EXEMPLE 1 Une solution d'extrait de poussière de maison dans de l'eau contenant 0,0698 mol PO4RNa2, 12aq par li. tre (25 g/l) est préparée à la manière décrite dans le brevet français N 1 604 135 du 26.9 . 1967, page 1, linges 13 à 35, et page 2,lignes 15-26, avec cette seule différence que la solution finale contient les 25 g/l susindiqués de phosphate disodique. A 2 litres de cet extrait on ajoute très rapidement 2 li- tres d'une solution aqueuse à 0,0694 mol/litre de CaCl2. 2ag (10,2 g/l) et le tout est mélangé rapidement, réalisant ainsi la préparation d'un gel de phosphate de calcium spé- cial, décrit dans le brevet français 72. 12036, publié sous le N 2 181 426 le 7.12.1973. Le milieu présente alors un pH de 6,0 que l'on fait remonter à 7,0 par l'addition de 45 ml de NaOHN, après quoi, on y dissout 20 g de NaCl. On constate que le pH a baissé à nouveau à 6,1; on ajoute 24 ml de soule normale pour amener le pH à la valeur de 6,85. Un lavage est ensuite effectué par décantation et addi- tion d'une solution aqueuse à 9 g/l de NaCl:cela fait descendre le pH à 6,4 que l'on corrige par l'addition de 7 ml NaOHN, amenant ainsi le pH à 7,15. Le gel obtenu titre 1,43 mg de Ca/ml et 0,86 mg P/ml, soit rapport pondéral Ca/P= 1,66; sa teneur en azote est de 0,32 mg/ml. Après stérilisation à 120 C durant 1 heure et rajustement du volume à 4 litres avec de l'eau distillée, stérile, le pH retombe à 6,05; par l'adjonction de soude normale, il est remonté à 7,1. 400 mg de merthiolate sont dissous dans le gel final. Lorsqu'on laisse décanter et prélève un peu deliquide surnageant, on constate que celui-ci ne contient pas d'azote, ce qui signifie que l'extrait allergénique de la poussière de maison est entièrement adsorbé par le gel de phosphate. On a donc obtenu un allergène adsorbé, par la précipitation du phosphate de calcium au sein d'une solution renfermant l'antigène voulu. EXE!\rPLE 2 Les opérations de l'exemple 1 sont répétées avec une solution d'extrait d'acariens, renfermant 0,08 mole de PO4HNa2î2aq par litre, à la place de l'extrait de poussière de maison. La solution de CaCl2, employée pour la précipitation du phosphate de calcium, titre 0,08 mol/ litre. Comme plus haut, non seulement le pH est amené à 7,05 après la précipitation, mais il est de même ramené à 7 + 0,1 après chaque lavage et chaque dilution avec une solution saline de NaCl. Le gel finalement obtenu, lavé, stérilisé, additionné de 0,5% de phénol, titre 1,59 mg Ca/ml et 0,924 mg P/ml, ce qui correspond à un rapport pondéral Ca/P de 1,72. Il renferme 0,37 mg d'azote par ml et 8,9 mg NaCl/ml. EXEMPLE 3 Une préparation identiaue à celle de l'exemple 1 est effectuée à partir d'un extrait de dactyle dans une solution aqueuse à 0,07 moles de phosphate dispdique par litre. Le gel final titre en mg/ml: Ca 1,366; P 0,81(Ca/Pa 1,69); azote 0,27; NaCl 8s9;merthiolate 1,0. On ne trouve pas d'azote dans le liquide clair,-décanté, qui est d'ailleurs inactif au point de vue allergologique, Des échantillons de ce gel, conservés pendant 3 ansh la température ambiante, n'ont subi aucune modification; la phase phosphate se redisperse aisément dans le liquide décante et. se redépose lentement; son activi.té désensibilisante reste inchangée. EXEMPLES 4 à 12 Un gel aqueux de phosphate de calcium, ayant un rapport pondéral Ca/P de 1,68 est préparé comme dans l'exemple 1 du brevet publié sous le n 2 181 426, cité plus haut, avec - en plus - neutralisation vers pH 6,90 à 7,15, après chaque lavage et chaque addition d'eau salée. Après la dernière décantation, la stérilisation et l'élévation du pH à 7.1. le gel concentré renferme par ml: 10 mg Ca, 5,98 mg P et 4 mg NaCl. Dans une série de préparations on ajoute, chaque fois, à 100 mi de ce gel, 900 ml d'une solution aqueuse à 9 g NaCl/l et 5 g/l de phénol d'un antigène constitué par un extrait des matières suivantes: Exemple N Extrait de 4 Poussière de maison 5 Acariens 6 Dactyle 7 Pollen 8 Coton 9 Poils de chat 10 Plumes 11 Aspergillus 12 Staphylocoques Après homogénéisation, puis décantation, on trouve dans tous les cas que l'antigène est entièrement adsorbé sur le phosphate, le liquide surnageant en étant exempt. Dans chaque cas, le litre de gel homogénéisé est prêt à l'emploi comme allergène-, pour des désensibilisations, à diverses dilutions selon la technique connue en soi. EXE?-PLES 13 à 18 A l'inverse des exemples.4 à 12, c'est un extrait concentré d'antigène en solution dans l'eau salée, additionnée de merthiolate, que l'on ajoute à un gel non con centré préalablement. Ainsi mélange-t-on 100 mi d'extrait allergénique avec 900 ml de gel de phosphate tel qu'obtenu dans l'exemple 1 de la publication n 2 181 426 précitée, mais avec rétablissement d'un pH de 6,85 à 7,15 après chaque lavage et chaque addition de solution de NaCl. Exemple n0 Extrait de 13 Poussière de maison 14 Acariens 15 Dactyle 16 Plumes 17 Squames 18 Saccharomyces L'adsorption complète est constatée comme dans les exemples précédents EXEMPLE 19 APPLICATIONS DES GELS AYANT ADSORBE DES ANTIGENES A SA DESENSIBILISATION. Les produits des exemples 1 à 18 ont été essayés, sur de nombreux patients, comme allergènes sous différentes dilutions. La méthode clinique9allergolog\queest connue en soi, il n'y a donc pas lieu de la décrire ici. On rappelle que l'unité de concentration d'un extrait allergénique, ou unité Noon, est définie comme 1 microgramme d'azote pour 100 ml de solution, soit 0,01 / g par mie Mais, selon la nature de l'antigène, le meme nombre d'u- nités peut constituer un allergène fort ou faible. Le Tableau ci-après donne de telles appréciations qualitatives pour extrait de poussière de maison et celui des acariens respectivement. Tableau I Force de Poussière de maison Acariens l'allergène Unités/ml gN/ml Unités/ml Fort 100 = 10 10-5 Normal 100 = 1 10-6 Tableau I(suite) Faible 10 = 0,1 10.7 Très faible 1 = 0.01 10-8 A ces diverses concentrations, on a utilisé en clinique trois sortes d'extraits: poussière de maison seule, acariens seuls et poussière conjointement avec acariens les dilutions étaient effectuées avec une solution aqueuse de NaCl à 9 g/1. L'activité allergénique de chacune des préparationa été estimée par comparaison avec l'activité d'une préparation étalon usuelle, par intradermoréaction chez des su jets sensibilisés. Les résultats sont réunis au Tableau Ilo TABLEAU II Extraits Résultats Très Bons Bons Lédiocres Echecs Total Acariens 6 5 3 1 15 Poussière 3 4 a - 2 9 Poussière + Acariens 19 14 13 2 48 TOTAUX 28 23 16 5 72 39 32 22 7 100 L'ensemble des résultats du Tableau Il est repris au Tableau III suivant, où les appréciations sont classées selon le mode d'administration de l'allergène, notamment suivant que les doses étaient fixes ou croissantes. Un certain avantage se dessine en faveur des doses fixes. Les résultats des tableaux précédents sont classés d'après la nature de la maladie au Tableau IV. On y trouve aux lignes: (1) - l'asthme isolé ou avec diverses manifestations associées, telles que rhinites ou eczémas; (2) - affections dee voies respiratoires supérieures (VRS),notamment rhinites et rhino-sinusites; (3) - divers, comme bronchite, urticaire et conjonc tivite (chaque fois un malade) TABLEAU III DOSES - Fixes Croissantes 61 malades il malades Résultats Total % Total Très bons 25 41 3 27 Bons 19 31 4 36 Médiocres 13 21 3 27 Echecs 4 7 1 9 TABLEAU IV Nombre Résultats Maladies de Très Bons hiédiocres Echecs malades Bons (1) Asthme 39 17 13 9 (2) Affecti ons VRS 30 9 9 7 5 (3) Divers 3 2 1 - TOTAL 72 28 23 16 5 Le Tableau II indique, par ses résultats globaux des deux dernières lignes horizontales, que les allergènes suivant l'invention apportent une amélioration sensible dans cette thérapeutique: le total des résultats très bons et bons s'élèva en effet à 71% alors qu'il ne dépasse généralement pas 65% avec les allergènes employés jusqu'à présent. Quant au tableau IV, il montre que, dans des cas d'asthme, on a-bien plus de succès(77%) qu'avec des affections VRS (60%).Chacune de ces données statistiques est encore d'au moins 5 à 10 unités supérieure à ce que l'on obtient avec des allergènes classiques. Dans le cas de la préparation d'une composition d'allergènes destinée à un seul individu, pour un traitement spécifique, il est préférable d'utiliser le deuxième mode de réalisation de l'invention, indiqué à la page 3 de la présente description. Ainsi peut-on utiliser le procédé, décrit plus haut à la fin des exemples 4 à 12, pour préparer une composition spécifique, destiné au traitement d'un seul individu. Revendications 1. Perfectionnement à la préparation d'un gel de phosphate de calcium utile à l'adsorption d1antigènes,com- prenant un ou plusieurs lavages-du gel avec une solution saline1 aqueuse, caractérisé en ce que l'on réajuste le pH du milieu à une valeur voisine de 7,notamment de 6,85 à 7,15 chaque fois qu'au cours de la préparation du gel le pH baisse. 2. Perfectionnement suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le pH est ramené à une valeur de 6,85 à 7,15 après chaque lavage du gel avec une solution saline, aqueuse, notamment avec une solution de NaCl. 3. Perfectionnement suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la précipitation d'un phosphate, dont le rapport pondéral Ca/P est de 1,55 à 1,90 par addition très rapide d'une solution aqueuse de CaCl2 à une solution aqueuse de PO4HNa2, suivie de décantations et de l'addition de NaCl. 4. Perfectionnement suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que 1'un des réactifs, servant à la préparation du phosphate de calcium,contient un ou plusieurs antigènes devant entre adsorbés sur le phosphate. 5. Perfectionnement suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le ou les antigènes sont en solution ou/et en suspension dans une solution aqueuse de phosphate disodique destiné à la- précipitation de phosphate de calcium par l'adjonction d'un sel de calciumo 6. Application du perfectionnement suivant une des revendications 1 à 5 à la préparation d'un allergène adsorbé sur'un gel de phosphate de calcium. 7. Application suivant la revendication 6, carac térisé en ce qu'elle-comprend l'utilisation d'un extrait aqueux d'allergène d'origine végétale, animale, crypto- gamique ou bactérienne 8. Application du perpectionnement suivant une des revendications 1 à 5 à la préparation d'un vaccin adsorbé surun gel de phosphate de calcium 9. Allergène absorbé sur du phosphate de calcium, destiné au traitement d'un seul individu.