Brevet FR2547982A1 — publié le 19850104

Les préparations des capitules de la camomille vraie (Chamomilla recutica (L) Rauschert, synonyme de Matricaria chamomilla, L.) trouvent, en raison de leur action antiphlogistique et spasmolytique, une large utilisation thérapeutique et constituent un élément important de l'arsenal de la phytothérapie Il convient d'attribuer à cet égard une importance particulière aux constituants actifs (-)-C-bisabolole et chamazulène Pour cette raison, une bonne drogue tirée de la camomille doit présenter une teneur aussi élevée que possible en ces deux substances. Sous la désignation DEGUMILL (il s'agit là de l'espèce de camomille mentionnée dans la revendication du brevet allemand 24 02 802; propriété industrielle des espèces en République démocratique allemande, Degumill; brevet italien 1 035 096), on connatt une espèce de camomille qui présente à la fois une forte 15 teneur en (-) bisabolole et en chamazulène Toutefois, la teneur en chamazulène et en bisabolole de cette espèce de camomille DEGUMILL n'est stable que si l'on empêche tout croisement ou fécondation étrangère avec d'autres espèces de camomille dont la teneur en bisabolole et en chamazulène est nettement plus faible ou avec la camomille sauvage, pauvre en substances actives, qui est présente partout Ce risque de croisement par fécondation étrangère est presque toujours présent, car la camomille sauvage pousse pratiquement en tout lieu. On connaît par ailleurs différentes espèces de camomille 25 tétra Dloldes (par exemple BODEGOLD, RDA; POHORELICKY, CSSR; ZLOTY IAN, Pologne; BK-2, Hongrie) Ces espèces de camomille tétraploldes présentent une teneur en chamazulène qui ne se situe guère au-dessous de celle de la nouvelle espèce de camomille Manzala Mais par contre, la substance active importante qu'est le (-) e-bisabolone n'est présente que dans des quantités extrêmement faibles dans ces espèces de camomille tétraplol- des connues et, au lieu de cela, les autres bisaboloides (oxyde de bisabolole A et B, ainsi qu'oxyde de bisabolone) sont prédominants et constituent ensemble plus de la moitié des huiles essentielles dans les espèces de camomille tétraploldes connues. Or, il a été découvert un procédé pour la production d'une nouvelle espèce de camomille tétraplolde possédant des propriétés avantageuses L'invention concerne donc une nouvelle espèce de camomille tétraploide et un matériel pour sa propagation, un 10 procédé pour sa production et pour celle de ce matériel, ainsi qu'une drogue tirée de cette plante et un procédé pour sa préparation. La nouvelle espèce de camomille tétraplolde en question, portant la désignation Manzana, se distingue de manière surpre15 nante de l'espèce de camomille connue DEGUMILL, ainsi que des autres espèces de camomille tétraploldes connues, par une série de propriétés nouvelles et avantageuses Contrairement à la DEGUMILI, elle n'est plus sujette à la fécondation étrangère avec les populations de camomille qui poussent naturellement (camomil20 le sauvage) En outre, elle a une-teneur nettement plus élevée en substance active importante, le (-)-O-bisabolole, que l'espèce DEGUMIIL L'espèce Manzana en question se différencie de façon surprenante des espèces de camomille tétraploides connues par une teneur incomparablement plus élevée en la substance active importante qu'est le (-)-o,-bisabolole, ainsi que par une très faible teneur en les autres bisabololdes. Par ailleurs, l'espèce Manzana en question se distingue encore de façon surprenante, del espèces de camomilles tétraploldes connues, par les caractéristiques suivantes: pouvoir germi30 natif amélioré des graines; moindre production de tiges feuillues non utilisables (c'est-à-dire rendement plus élevé en fleurs); moindre teneur en eau des fleurs (ce qui se traduit par un meilleur rendement en fleurs séchées et par des temps de séchage plus courts); meilleure aptitude à la récolte mécanisée, 35 du fait que les fleurs sont situées dans une large mesure dans un même plan et que la plupart d'entre elles fleurissent en même temps (une seule date de récolte est aini possible); meilleure conservabilité de la drogue (moindre tendance à la décomposition et à la formation de poussière); odeur de camomille particulièrement aromatique et typique. De plus, l'espèce de camomille Manzana en question est homogène en ce qui concerne ses constituants en comparaison des 5 espèces de camomille tétraploides jusqu'ici connues, ses caractéristiques de teneur en chamazulène et en (-) (-bisabolole (c'est-à-dire son homozygotie) étant stables Par contre, les essais de plantation individuelle des espèces de camomille tétraploades connues montrent qu'on doit attribuer des types de constituants variables aux différents individus, c'est-à-dire que chaque échantillon pris au hasard d'une drogue préparée à partir d'eux donne un résultat non homogène, différent aussi bien qualitativement que quantitativement. Le but de l'invention est la production d'une nouvelle espèce de camomille tétraploide ayant des propriétés améliorées, en particulier une plus forte teneur en (-) c-bisabolole. la production de la nouvelle espèce de camomille tétraplolde en question s'effectue par tétraploidisation de l'espèce de camomille DEGUMILL (mutation des gènes), suivie de nouvelles 20 phases de sélection et de multiplication ( culture de lignée pedigree pour le fécondateur étranger multipliable végétativement) L'espèce Manzana se compose de 34 souches ou branches qui ont été traitées séparément en culture de conservation. La tétraploidisation peut être effectuée par exemple de 25 façon connue en soi par traitement d'éléments de la plante (graines, racines, pointes de rejetons, germes, bourgeons axillaires) ou de tissus de la plante camomille DUGUMILI par des produits chimiques, des rayons X, des rayons gamma ou des rayons UV Elle peut être effectuée en outre par la méthode du cal de décapitation, par culture d'anthères ou par l'application de températures élevées ou même basses à la plante camomille DEGUMILL ou à des éléments ou des tissus de la plante camomille DEGUMILL On se référera à cet égard à l'ouvrage de Werner Gottschalk, "Die Bedeutung des Polyploidie f Ur die Evolution der Pflanze", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1976, en particulier aux pages 13 à 22. Tétraploidisation par produits chimiques. Entrent par exemple en ligne de compte, en tant que produits chimiques pour la tétraploidisation, les substances suivantes: colchicine, acénaphtène, alcaloides tels que l'atropine, la vératrine, la nicotine, la sanguinarine, dérivés du benzène, du diphényle et du phénanthrène, naphtalène et dérivés du naphtalè5 ne, diphénylamine, tribromaniline, paradichlorobenzène, méthylnaphtoquinone, méthylnaphtohydroquinone, acide salicylique et substances apparentées, hexachlorhexane, pervitine (hydrochlorure), carbamates d'alcoyl-alcali tels que le carbamate d'isopropyl-sodium, phényluréthane, sels de l'acide cacodylique (par 10 exemple sel sodique), glucosides de la convallaria tels que la convallarine, la convallatoxine et la convallamarine, hétéroauxine, germisan (phénylmercuripyrocatéchine), composés organiques du mercure tels que le phosphate d'éthyl-mercure, le chlorure d'éthyl-mercure, l'hydroxyde de phényl-mercure, le dinaphtyl15 méthane-disulfonate de phényl-mercure, chloroforme, gaz hilarant (N 20), ainsi que des mélanges de ces substances Entrent aussi en ligne de compte des tourteaux de graines oléagineuses, des composts et des fumiers de vaches. Le traitement par les substances ici mentionnées est effectué par exemple à des températures comprises entre 0-et C, de préférence entre 12 et O O C, en particulier entre 15 et 2500 C L'application s'effectue par traitement de graines, de pointes de rejetons, de racines (en particulier de pointes de racines ou de racines de plantules), d'ovaires, de surfaces de 25 coupe sur des feuilles ou des tiges, de suspensions de cellules du méristème, de cultures de cal, ou même par injection dans la région de base de la tige ou dans la région des bourgeons axillaires Les produits chimiqus sont utilisés en général sous la forme de solutions dans l'eau, de solutions faiblement alcoo30 liques (teneur en alcool inférieure à 5 % en règle générale) ou faiblement acides le p H des solutions faiblement acides se situe par exemple dans la région de 5,5 à 6,5, l'acidification étant effectuée par exemple au moyen d'acides organiques aliphatiques inférieurs, tels que l'acide acétique Au cas o lion 35 utilise des solutions alcooliques, celles-ci peuvent être également faiblement acides La concentration des produits chimiques dans ces solutions peut par exemple s'élever à 0,01 0,5 %, de préférence 0,02 à 0,2 % et en particulier 0,05 à 0,1 %. les s:ubstances gazeuses peuvent être utilisées telles quelles, e cas échéant sous pression (par exemple de 1 à 10 bar), la durée de traitement est par exemple de 1 à 36 h, de préférence de 2 -a 1 i h et en particulier de 4 à 6 he Les concentrations les plus actives, ainsi que la durée d'action seront opportunément déterminées chaque Lois par des essais préalables. On obtient par exemple des résultats particulièrement favorables en traitant par la colchicine à des températures comprises 10 entre 0 et 35 C, de préférence entre 12 et 30 C, notamment entre 15 et 25 C On peut y procéder par exemple en faisant gonfler des graines de l'espèce de camomille DEGUMILL dans une solution de colchicine à 0,01 0,2 %, notamment à 0,02 0,1 %, de préférence à 0,05 %, ou en plongeant des plantules germées 15 et bien développées de l'espèce de camomille DEGUMILL, âgées de 5 à 7 jours (avec les cotylédons vers le bas) dans une solution de colchicine à 0,01 0,2 %, notamment à 0,02 0,1 %, de préférence à 0,05 % Lorsqu'on opère de cette dernière manière, l'atmosphère ambiante doit présenter une humidité relative de l'air de presque 100 % la durée du traitement par la colchicine est par exemple de 3 à 36 heures, et en particulier de 4 à heures En cas d'utilisation de plantules, une durée d'action de 10 heures au maximum est suffisante en général Lorsqu'on utilise des graines, la durée d'action peut se prolonger jusqu'à 25 36 heures le cas échéant. A la suite du traitement par les produits chimiques, les graines gonflées, les plantules ou les autres éléments de la plante sont rincés à l'eau à plusieurs reprises Les graines gonflées sont par exemple découpées à la scie Les plantes dont 3 00 11 racines ou autres éléments ont été traités ou les plantules tiait ées sont par exemple repiquées dans des bacs à plantes A p i r des graines ou plantules ainsi traitées, on fait pousser les plantes (par exemple en serre: température entre 18 et 25 C _e ' our et entre 10 et 16 C la nuit) et on sélectiornne celes 35 dcen les grains de pollen son environ I 1/2 fois plus gros ue e du matériel de dé-art, ciest-à-dire qutils présentent u nhombre de chromosomes de 36 des cellules somatiques Au cas o lion soumet d'autres éelements de la plante (parties aériennes ou souterraines) au traitement par des produits chimiques B, n fera subir exclusivement aux pousses, racines ou fleurs/graines provenant de ces éléments traités un contrôle ultérieur de tétraploîdisation réussie Lorsqu'il a été procédé par exemple 5 à un traitement des rejetons ou à un traitement des aisselles, on n'examine ensuite le nombre de chromosomes que des nouvelles pousses formées à partir de ces bourgeons axillaires ou de ces re etons et des fleurs ou graines formées sur ces pousses. Les mesures de grosseur du pollen et le comptage chromoso10 mique peuvent être effectués par exemple de la manière indiquée dans l'exemple 1. Tétraploidisation par irradiation. L'intervention est effectuée par exemple sur des graines ou des pointes de racines à une température de O à 35 C, de préférence de 10 à 3000 C, et notamment de 15 à 250 C Dose totale d'irradiation: 5 à 50 krads On utilisera de préférence les rayons gamma ou X En tant que rayons UV, on pourra utiliser par exemple ceux dont la longueur d'onde est de 400 à 30 Dm, de préférence de 350 nm. Les plantes ou éléments de plantes ainsi irradiés sont ensuite également soumis au même traitement ultérieur qu'en cas d'utilisation de produits chimiques. Application de hautes et de basses températures. Entrent par exemple en ligne de compte, en tant que hautes 25 températures, des températures comprises entre 33 et 50 C, de préférence entre 42 et 4500 C A ces températures sont par exemple exposés des graines gonflées,-des plantules, des pointes de pousses et des tissus méristéma-Iques Durée du traitement: par exemple 1 à 48 h, de préférence 12 à 24 h. Entrent par exemple en ligne de compte, en tant que basses températures, des températures de O à 5 C, de préférence de 0,5 à 4 C et notamment de 2 C A ces températures sont par exemple exposés des graines gonflées, des plantules, des pousses et des tissus méristématiques t-rée du traitement: par exemple 35 1 à 100 et, de préférence, 20 à 40 jours Les plantes ou éléments de plantes ainsi traités sont également soumis au même traitement ultérieur qu'en cas d'utilisation de produits chimiques. Méthode du cal de décapitation (décapitation = étêtage, épointage ou coupe arrière) la décapitation est effectuée par exemple sur de jeunes plantes au niveau de la tige, de préférence au niveau du c 8 ne végétatif apical, après la formation de 4 à 6 feuilles ou même au niveau de pétioles ou de pousses latérales Les bourgeons ou rejetons qui se forment à partir du tissu blessé (tissu de cal) sont coupés, mis à prendre racine, élevés dans des pots et les plantes tétraploldisées sont sélectionnées de la même manière 10 qu'en cas de traitement par des produits chimiques. Culture d'anthères (production de plantes à simple garniture chromosomique à partir des anthères, suivie d'une tétraploidisation spontanée ou artificielle). Sur des plantes en fleurs, on récolte des fleurs tubulées fermées, dont les anthères (sacs de pollen) se trouvent au stade précédant la première mitose pollinique Au moyen d'un micromanipulateur, les anthères sont prélevées dans les boutons de fleurs et transférées dans des boites de Petri qui sont remplies par exemple d'un milieu nutritif de Nitsch et Nitsch (tableau 1). 20 Puis les boites de Petri sont conservées dans une chambre de culture à la lumière pendant 16 heures par jour, à une température diurne de 28 C et nocturne de 20 C Au bout de quatre semaines environ, les anthères commencent à s'ouvrir et des plantules commencent à pousser Celles-ci sont haploïdes lors25 que l'élément parent est diploïde et élles sont dihaploides avec un élément parent tétraploide; après formation de racines, elles sont mises en pot, par exemple dans de la terre de jardin, et amenées à la floraison en serre Ces plantes (di) haploides sont stériles, mais elles peuvent être polyploidi30 sées par traitement des pointes de rejetons, des racines ou des tiges par des produits chimiques, comme par exemple la colchicine, auquel cas il se forme des plantes homozygotes qui peuvent être ensuite multipliées par l'intermédiaire de graines Pour le reste du mode opératoire, on se référera aux indications données à propos du traitement par des produits chimiques (par exemple le traitement par la colchicine). Tableau 1 Milieu de culture de Nitsch et Nitsch (Science, 1969). mg/1 KNO 3 NH 4 NO 3 Mg SO 4 x 7 H 20 Ca C 12 KH 2 PO 4 Mn SO 4 x 4 H 20 10 H 3 BO 3 Zn SO 4 x 7 H 20 Na 2 Mo O 4 x 2 H 20 Cu SO 4 x 5 H 20 ml d'une solution de 7,45 g de sel disodique d'acide éthylènediamine-tétraacétique et de 15 5,57 g de Fe SO 4 x 7 H 20 dans 1000 ml myo-inosite Glycocolle Acide nicotinique 20 Pyridoxine-H Cl Thiamine-H Cl Acide folique Biotine Saccharose Base de milieu nutritif (Bacto-Agar DIFCO) Acide indole-acétique 950 720 185 166 68 25 10 0,25 0,025 2 5 0,5 0,5 0,5 0,05 20 g 8 g 0,1 p H du milieu réglé à 5,5 Parmi les plantes de camomille tétraploldes qui peuvent être obtenues suivant les différentes possibilités décrites ci-dessus et qui ont été sélectionnées par mesure de la grosseur du pollen et/ou comptage des chromosomes, on sélection5 ne ensuite de nouveau les plantes qui remplissent les conditions suivantes: a) Floraison à peu près simultanée, b) Ramification régulière au niveau du sol et zone étroite de fleurs, de 5 cm environ, c) Grands capitules, ayant un diamètre extérieur d'environ mm ( 25 à 35 mm), d) Teneur minimale en chamazulène de 150 mg O o et en bisabolole de 300 mg % et teneur en autres bisaboloides (en particulier en oxydes de bisabolole) de moins de 50 mg % (sur la 15 base des fleurs séchées; voir l'exemple). Les plantes ainsi sélectionnées sont alors multipliées végétativement par bouturage (clonées) et triées sur 3 à 5 générations, la sélection s'effectuant toujours d'après les critères a) d) indiqués ci-dessus Cela veut dire que les plantes sélectionnées d'après les critères a) d) sont clonées, des semences sont récupérées sur les plantes clonées, les plantes qui en résultent sont sélectionnées d'après les critères a) d) et des semences sont de nouveau prélevées sur ces dernières Ia séquenceflensemencement sélection d'après a) 25 d) récupénation des semences Ipeut êre répétée 2 à 4 fois. A cela fait suite encore une fois une séquence L ensemencement sélection d'après a) d) clonage récupération des semences 7 Les semences obtenues en dernier lieu constituent alors le matériel de multiplication de l'espèce de camomille Manzana 30 en question. la multiplication par bouturage s'effectue de la manière suivante Pour la multiplication par bouture, les plantes de départ (plantes-mères clonées) doivent former des pousses courtes, dépourvues de boutons à fleurs, dans des conditions de jour court Pour cela, on opère dans le semestre d'hiver à la serre sans éclairage supplémentaire, ou dans des chambres climatisées avec une durée de jour de 6 à 10, de préférence de 8 heures et à des températures de 10 à 15, de préférence 12 C. Conviennent, pour le clonage ou multiplication, des boutures de feuilles, de pousses et en particulier de pousses courtes (pousses latérales) On leur fait prendre racine à une température de 12 à 18 C, de préférence 15 C, et avec une durée de 5 jour de 12 à 16, de préférence 14 heures, en atmosphère fermée ( 100 % environ d'humidité relative de l'air) En tant que substrat, on peut utiliser par exemple un mélange de tourbe et de sable dans le rapport 1: 1; mais du sable siliceux pur, des cubes de bouturage en laine minérale, des cubes de bouturage 10 en tourbe ou similaires conviennent également. Pour l'ensemencement, on utilisera par exemple les sols suivants: terres de jardin; terres argileuses de poids moyen humiques; terres sableuses, argileuses ou humiques. On peut ensemencer en serre ou même en plein champ Les tempé15 ratures pour la germination et la croissance des plantes se situent par exemple entre 12 et 24 C, en particulier entre 18 et 20 C Au cas o l'ensemencement est effectué en plein champ, on sème de préférence à l'automne (septembre/octobre) ou au printemps (mars/avril) Ces périodes conviennent pour toutes les régions de culture envisageables (par exemple l'hémisphère Nord, les régions de climat tempéré à subtropical). La nouvelle espèce de camomille Manzana en question appartient au genre de plantes de culture de la camomille vraie portant la désignation botanique Matricaria chamomilla L. (synonyme de Chamomilla recutica (L), Rauschert) et elle est définie par les teneurs suivantes en substances actives de ses fleurs séchées à 40 C: au moins 150 mg % de chamazulène, au moins 300 mg % de (-)-_ -bisaebolole et moins de 50 mg % d'autres bisaboloides, sur la base de la matière sèche Ces valeurs concernant les teneurs en substances actives concernent le stade de développement des fleurs qui est atteint lorsque à 70 %, et notamment 40 à 60 % de toutes les fleurs tubulées d'un capitule sont ouvertes (ce qui veut dire que les fleurs utilisées pour le dosage des substances actives ont été cueil35 lies à ce moment, puis ont été séchées pendant 72 heures à 40 C dans l'armoire séchoir). Dans le cas o la récolte des fleurs de camomille est effectuée à une époque à laquelle le stade de développement de ces fleurs est plus avancé, c'est-à-dire à laquelle 100 % ou près de 100 % de toutes les fleurs tubulées d'un capitule sont par exemple ouvertes (par exemple au stade de la pleine floraison) et/ou dans le cas o le séchage des fleurs récoltées est effectué à une température plus élevée que 40 C, la teneur en les substances actives (-) "-bisabolole et chamazulène est plus faible Si donc la récolte a lieu à un stade de végétation 10 o 30 à 100 % des fleurs tubulées d'un capitule sont ouvertes et si le séchage est effectué à une température jusqu'à 60 C (de préférence à l'abri de la lumière du soleil, par exemple dans les conditions de séchage qui sont indiquées quelques pages plus loin), la drogue de camomille qui est ainsi obtenue contient 15 au moins 120 mg % de chamazulène et au moins 200 mg % de (-)- o -bisabolole, tandis que la teneur en autres bisabololdes reste inférieure à 50 mg % après comme avant. Par-la désignation "autres bisaboloides", on entend en particulier: l'oxyde de (-)-t-bisabolole A et B, l'oxyde de (-) O-bisabololeo L'huile essentielle de l'espèce de camomille en question a pour autres constituants des en-in-dicycloéthers, le farnésol, le spathulénol et, en moindres concentrations, différents hydrocarbures terpéniques très volatils Par exemple, les fleurs de l'espèce Manzana en question, récoltées au stade 25 de développement des fleurs o 30 à 70 % des fleurs tubulées d'un capitule sont ouvertes et séchées à 40 C à l'armoire séchoir, contiennent entre 150 et 200 mg % de chamazulène, entre 300 et 450 mg % de (-) c-bisabolole et un peu seulement, c'està-dire entre 5 et 50 mg % d'autres bisaboloides, sur la base de la substance sèche (c'est-àdire sur la base du poids à sec absolu des fleurs) Ce poids à sec est déterminé par séchage d'un échantillon séparé de fleurs de camomille de l'espèce Manzana en question, dans l'armoire séchoir à 1050 C jusqu'à ce que le poids soit constant ( 72 à 96 heures) La teneur en substances actives des fleurs séchées par exemple entre 35 et o 10 50 C (drogue) est alors calculée par rapport au poids à sec des fleurs, déterminé à 1050 C. Dans son phénotype, l'espèce Manzana en question est semblable aux espèces de camomille tétraploides déjà connues (par exemple Bodegold, Zloty Ian, BK-2, Pohorelicky Velkokvety); 15 elle s'en différencie en particulier par le fait que dans le cas de l'espèce Manzana en question, le (-)-X-bisabolone est le constituant principal de l'huile essentielle des fleurs, qu'en outre la teneur en chamazulène est plus élevée et que la teneur en autres bisaboloides (oxydes de bisabolole A et B, oxyde de bisabolone) est beaucoup plus faible L'huile essen20 tielle de l'espèce Manzana a pour autres constituants du farnésol, du spathulénol et des en-in-dicycloéthers. L'espèce de camomille en question peut être cultivée avec succès sur tous les sols, à l'exception de sols ayant une teneur 25 de plus de 20 % en substances organiques (matières humiques et microorganismes de la terre); elle ne nécessite pas de procédés agrotechniques spéciaux, ni de mesures de culture particulières; il suffit simplement pour la culture d'un jour terrestre de plus de 13 heures de durée maximale, ce qui veut dire que 30 les zones tempérées et les régions subtropicales conviennent en particulier pour sa culture. L'espèce de camomille Manzana en question a une période de récolte mitardive, une hauteur de croissance homogène avec une zone de fleurs étroite et de gros capitules et, pour ces raisons, elle se prête particulièrement bien à la récolte mécanique A cela s'ajoute que des plantes de l'espèce Manzana 5 qui ont été semées en même temps défleurissent en général pratiquement en même temps, ce qui simplifie et facilite considérablement la récolte. L'espèce de camomille Manzana en question fournit un haut rapport A titre d'exemples de possibilités d'utilisation, on 10 citera la préparation de drogues à base de camomille, d'huile de camomille, d'extraits de camomille, ainsi que de (-)-abisabolole naturel. Une drogue préparée à partir de l'espèce de camomille Manzana en question présente le maximum de teneur en substances 15 actives chamazulène et bisabolole lorsque la récolte des capitules de camomille est effectuée au stade de végétation o par exemple 30 à 70 %, de préférence 40 à 60 %, c'est-à-dire en général 50 % des fleurs tubulées d'un capitule sont ouverts et lorsque le séchage est effectué à une température de l'air 20 de 50 C au maximum, par exemple de 35 à 50 C Le séchage peut s'effectuer, soit par apport d'air artificiel, soit par séchage à l'ombre et même, le cas échéant, au soleil, en veillant toutefois à ce que l'apport de chaleur ne dépasse pas la mesure nécessaire pour le séchage complet Il est donc avantageux que 25 l'on s'assure du moment o est atteinfe la constance de poids par des pesées de contrôle Le séchage peut s'effectuer spontanément ou artificiellement (par exemple avec de l'air chaud artificiel) Le rendement en substances actives atteint un maximum en cas de séchage spontané à l'abri de la lumière du 30 soleil L'opération de séchage doit avoir lieu aussi tôt que possible après la récolte Le séchage doit être effectué en couches minces, par exemple de 5 à 20 cm et, de préférence, de 10 cm d'épaisseur. Le dosage du chamazulène est effectué par spectrophotométrie, 35 de manière analogue à la procédure suivie d'habitude avec des extraits de camomille Le dosage du (-)-cw-bisabolole et des autres constituants de l'essence de camomille s'effectue suivant les méthodes de chromatographie en phase gazeuse appliquées ordinairement à cet effet On trouvera, dans l'Annexe A, une description précise des méthodes analytiques de dosage. Ia substance active chamazulène est présente, dans les fleurs de camomille, non pas en tant que telle, mais sous la 5 forme de sa sesquiterpène-lactone, la matricine Ia matricine possède une activité pharmacologique qui correspond à celle du chamazulène A partir de ce progéniteur, la matricine, le chamazulène se forme aussitôt, par exemple au chauffage (par exemple par entraînement à la vapeur, lors de l'infusion de thé) C'est pourquoi on a l'habitude, pour la camomille, d'indiquer non pas la teneur en matricine, mais la teneur en le chamazulène qui se forme à partir de celle-ci, teneur qui peut être déterminée analytiquement. Exemple 1 Des graines de l'espèce de camomille DEGUMIIL ont été placées sur une feuille de papier-filtre imprégnée de solution aqueuse à 0,05 % de colchicine et on les a laissé gonfler pendant 6 heures à la température ambiante ( 20 C) Elles ont été ensuite retirées de la feuille de papierfiltre, rincées à l'eau plusieurs fois et semées dans des bacs de'plantation (en serre) Terre: mélange de tourbe et de sable 1: 1; température: 18 à 20 C; humidité relative de l'air: 60 % environ; durée du jour en éclairage artificiel: 14 heures. Les plantes en germe ont été surveillées jusqu'à la floraison, le succèsde la polyplo Idisation a été constaté par mesure comparative de la grosseur des grains de pollen et des graines, ainsi que par comptage des chromosomes des plantes (descendance F 1 = première génération, tirée de graines, des plantes colchicinées dont la tétraploidie a été établie). Ia tétraplocdisation peut aussi s'effectuer de la manière suivante Des plantules de camomille de l'espèce DEGUMIIT bien développées, âgées de 5 à 7 jours, germées sur du papierfiltre imprégné d'eau, ont été placées, les cotylédons dirigés vers le bas, dans une solution à 0,05 / de colchicine à la température ambiante ( 20 C) pendant 4 à 6 heures Les racines des germes, qui sont vulnérables, étaient ainsi ménagées: afin d'éviter de les endommager par séchage, l'atmosphère ambiante doit présenter une humidité relative de l'air de presque % A la suite du traitement, les plantules ont été rincées à l'eau à plusieurs reprises et repiquées dans des caisses de plantation Le traitement ultérieur a été le même que dans le cas des graines. Les mesures de grosseur des grains de pollen sont effectuées avec un microscope de recherche binoculaire Ieitz, équipé d'un oculaire de mesure à micromètre et d'un porte-objet à micromètre. Le comptage des chromosomes s'effectue aux pointes des 10 racines: sur les jeunes plantes ou plantules cultivées en serre, on recueille des bouts de racines fraîches de 1 à 2 cm, puis on les place pendant 5 heures dans une solution' 0,002 molaire d'hydroxyquinoléine et ensuite dans H Cl 1 N Pour l'examen, 1 mm environ des pointes de racines est coloré à l'orcéine15 acide acétique à 2 %, pour être observé au microscope en immersion dans l'huile Dans les cellules qui sont en mitose, on peut ainsi déterminer un stoc 1 de chromosones quatre fois supérieur à celui des cellules somatiques ( 4 N = 36). Les plantes dont les grains de pollen ont un diamètre supérieur d'environ 50 % à celui du matériel de départ diploïde ( 30 microns environ au lieu de 20 microns environ) et dans lesquelles le stock de chromosomes des cellules somatiques a été doublé à 36 (dans le matériel de départ diploïde, le nombre correspondant est de 18) sont tétraploldes Celles-ci ont été 25 sélectionnées A peu près 0,1 à 0,5 %'des graines ou des plantules ont été tétraploidisées avec la méthode indiquée cidessus et ont donné des plantes intactes, capables de fleurir. On passe alors aux phases suivantes. Phase 1 Parmi les plantes de camomille tétraploides sélectionnées (de la manière décrite ci-dessus), on a choisi les individus qui a) fleurissaient à peu près en même temps, b) présentaient une ramification régulière au niveau du sol et une zone étroite de fleurs, d'environ 5 cm, c) comportaient de grands capitules ayant un diamètre extérieur d'environ 30 mm, d) atteignaient ou dépassaient une teneur minimale en chamazulène de 150 mg % et en bisabolole de 300 mg %, leur teneur en autres bisabololdes (en particulier les oxydes de bisabolol étant nettement inférieure à 50 mg % (toutes ces valeurs sont rapportées à des capitules qui ont été séchés à 40 C et dont la récolte a été effectuée au stade o il n'avait fleuri qu'environ 50 c ( 40 à 60 %) des fleurs tubulées d'un capitule). Ces plantes ont été clonées A cet effet, les plantes (plantes-mères de clone) ont été tout d'abord recoupées à 15 cm environ de longueur de pousse, puis mises à repousser (courtes 10 pousses latérales) avec une durée de jour de 8 à 10 heures et à une température de 12 à 14 C Les courtes pousses ont été coupées et plantées dans un mélange de tourbe et de sable Avec une humidité relative de l'air d'environ 100 %, une température de l'air de 15 C et une durée de jour de 14 heures, l'enracine15 ment des boutures prend 7 à 14 jours. A la place du clonage classique indiqué (multiplication par bouture), on peut aussi pratiquer la multiplication in vitro de parties tissulaires divisibles de la plante (multiplication dite méristèmatique) Différentes parties de la plante, de préférence les pointes des rejetons ou les bourgeons axillaires, conviennent pour l'établissement d'une culture de camomille. Après rinçage des plantes avec H 202, on prélève dans des conditions aseptiques, au "Iaminar Flow" (filtre à haute capacité pour matières suspendues dans l'air, à écoulement de refou25 lement sans turbulence), des pointes de pousses de bourgeons axillaires des feuilles et on les transfère dans des tubes à essais qui sont remplis d'un rilieu nutritif, par exemple un milieu de Murashige et Skoog (Pfsiol Plant 15, 473-497, 1962). Les tubes à réaction sont placés dans une chambre climatique o 30 la durée de jour est de 12 à 18 h, de préférence 16 h (obtenue par des tubes fluorescents), l'intensité de la lumière est de 500 à 10 000 lux, de préférence 1000 à 3000 lux, et la température est de 15 à 300 C, de préférence 22 à 27 C. Dès que les explants manifestent un bon développement, ils 35 sont transférés sur le milieu nutritif défini ci-dessus, mais ayant une plus forte concentration de cytokinine ( 30 mg/l de N 6-isopentényladénine) et moins ou même pas du tout d'auxine ( O 0,3 mg/l d'acide indole-acétique) Par la suite, les axes s'étendent et il est formé des organes adventifs, ainsi que des bourgeons axillaires multipliés Ceux-ci peuvent être recueillis et mis à pousser de la manière indiquée précédemment. Les explants destinés en grand nombre à la multiplication 5 des plantes ( 3 ème passage = 3 ème génération de multiplication) sont transférés, après avoir pris racine et avoir formé des feuilles sur le milieu nutritif mentionné en premier, sur une couche nourricière qui contient 10 mg/l d'acide indole-acétiriue ou d'acide 3-indole-butyrique ou 0,1 à 0,3 mg/l d'acide "10 naphtylacétique Dans ces conditions, les plantes prennent racine et peuvent être plantées, au bout d'environ 4 semaines, dans des pots remplis de terre de jardin stérilisée (traitée à la vapeur à 120 C pendant 12 heures), pour être cultivées ultérieurement en serre (dans des conditions semblables à celles qui sont appliquées d'habitude pour la multiplication par bouture classique). Milieu nutritif de Murashige et Skoog NH 4 NO 3 400 (mg/l) Acide indoleacétique 2,0 (mg/l) Ca(N 03)2 4 H 20 144 Furfuryladénine 0,1 KN 03 80 Thiamine 0,1 KH 2 PO 4 12,5 Acide nicotinique 0,5 Mg SO 4 7 H 20 72 Pyridoxine 0,5 K Cl 65 Glycocolle 2,0 Na Fe-EDTA 25 Myo-inosite 100 H 3 B 03 1,6 Hydro Iysat de caséine 1000 Mn SO 4 4 H 20 6,5 Saccharose 2 % Znso 4 7 H 20 2,7 Poudre d'agar-agar Ki 0,75 purifiée 1 % Phase 2 Les plantes obtenues dans la phase 1 se fanent ensemble dans des conditions isolées en serre Les plantes étaient dans des pots de 11 cm, remplis de terre de jardin, à une température de jour de 18 à 24 C et de nuit de 12 à 14 C La durée de jour était d'au moins 14 heures et a été atteinte dans le semestre 35 d'hiver par éclairement supplémentaire ( 200 W/m 2) L'alimentation en eau se faisait à la demande. Sur la totalité des individus sélectionnés, on a récolté, pour la récupération de semences, au cours d'une période de 4 semaines, les capitules qui avaient fleuri et étaient près de tomber Après séchage des fleurs récoltées à la température ambiante, les semences ont été récupérées par soufflage des composants plus légers des fleurs. Phase 3 Sur les semences obtenues dans la phase 2, on a prélevé un échantillon pris au hasard, à partir duquel environ 2000 descendants ont été cultivés (conditions écologiques semblables à celles de la phase 2) et soumis à une sélection suivant 10 les mêmes critères a) à d) que ceux de la phase 1 Avec les individus sélectionnés, on a alors procédé de la même manière que dans la phase 2. Phase 4 Une partie des semences de la phase 3 a été semée en 15 automne en deux emplacements différents. Emplacement A) Altitude 450 m, 48,5 de latitude nord, 11,5 de longitude est. Précipitations annuelles totales, 750 mm Climat tempéré-humide Janvier, 10 à O C Juillet, + 10 à + 20 C. Emplacement B) Altitude 200 m, 42 de latitude nord, 1 de longitude est. Précipitations annuelles totales, 400 mm. 25 Climat méditerranéen. Janvier, O à + 10 C Juillet, + 20 à + 30 C. Aux deux emplacements, l'ensemencement a été effectué fin septembre/début octobre. Les plantations expérimentales sur le terrain ainsi obtenues ont été examinées et évaluées (contrôle de qualité) en ce qui concerne l'homogénéité de croissance, la grosseur des fleurs et la période de récolte; en outre, des échantillons des fleurs pris au hasard ont été soumis à des dosages de substances acti35 ves Dans ces plantations sur le terrain, on a de nouveau sélectionné les individus qui correspondaient aux paramètres fixés pour la phase 1 A partir de ceux-ci, on a obtenu des semences de la façon indiquée dans le dernier paragraphe de la phase 2. Phase 5 Avec les semences de la phase 4, on a répété les phases 3 et 4 dans l'ordre et de la manière indiqués. Phase A partir des semences obtenues dans la phase 5, on a cultivé environ 1500 individus (mêmes conditions écologiques que dans la phase 2) et on les a sélectionnés suivant le même principe que celui qui a été indiqué à propos de la phase 1 Parmi les plantes ainsi sélectionnées, on a choisi 34 individus et on les a clonés en procédant comme dans la phase 1 Les plantes de chaque clone ont été plantées dix par dix en une distribution aléatoire, à distance de 40 x 30 cm en plein champ (emplacement A, voir phase 4), en des points isolés La terre était un loess, 15 p H 7,0; la plantation a été effectuée début juin, la première récolte des graines a eu lieu au milieu de juillet, puis les plantes ont été recoupées, ont fleuri de nouveau et ont donné, entre le milieu et la fin d'ao t, une seconde récolte de semences. La récupération des semences de ce matériel a été effectuée de la m 9 me manière que dans la phase 2. Les semences obtenues dans la phase 6 sonstituent le matériel de multiplication de l'espèce de camomille Manzana en question Les fleurs de plantes provenant de ce matériel de 25 multiplication (ensemencement en septémbre/octobre, récolte début juin de l'année suivante), qui sont cueillies au moment ou environ 50 % ( 40 à 60 %) des fleurs tubulées d'un capitule sont ouverts, et qui sont séchées aussitôt après dans l'armoire séchoir à 40 C pendant 72 heures, contiennent par exemple, sur la base du poids des fleurs séchées (substance sèche): 150 mg % de chamazulène, 300 mg % de (-)-ot-bisabolole et au maximum mg % d'autres bisaboloides. Autres données, fournies à titre d'exemples, concernant les plantes de l'espèce de camomille en question, obtenues suivant 35 l'exemple 1. 1 Croissance Hauteur de croissance homogène (alignement) avec une zone de fleurs étroite, convenant donc particulièrement bien pour la récolte mécanique, gros capitules, rendement moyen. Forme: ramifié au niveau du sol ( 3 à 5 fois) Tige: verticale, peu ramifiée. 2 Feuillage Feuille: pennée, 2 à 3 fois Epaisseur: moyenne Feuille pennée, couleur vert moyen Feuille pennée (tige médiane); moyennement à fortement pennée. 3 Inflorescence Fleurs disposées en petit panier (capitule): diamètre extérieur, environ 30 mm diamètre intérieur, environ 15 mm. Poids des capitules individuels (à sec): 45 mg environ. Pousse à fleur, longueur (mm): 700 environ, mais dépendante du lieu de culture (climat), de la période d'ensemencement, du sol, du fumage, du traitement des plantes, du temps. Début de la floraison (jours à partir du 1 er janvier): 160 ème jour (ensemencement en septembre; emplacement, Freising, République fédérale allemande; autrement, dépend des facteurs cités 20 ci-dessus). Floraison: mi-juin (voir ci-dessus). Inflorescences sans tige: Teneur en huiles essentielles (% de la substance sèche): environ 1,0 %; teneur en azulène dans les huiles essentielles: au moins 15 %. Désintégration des inflorescences séchées, drogues: faibles en cas de récolte avant l'ouverture des dernières fleurs tubulées. Diamètre du pollen: environ 30 microns ongueur des graines: environ 1,25 mm Nombre de chromosomes des cellules somatiques: 4 N = 36. 4 Fruit Poids de 1000 grains des graines: 0,06 à 0,13 g. Capacité de germination ,75 %. 6 Pureté 94 95 % 7 Autres caractéristiques Rapport de séchage frais/sec (fleurs) = 5,5 à 6: 1; odeur aromatique caractéristique de la drogue; goût finement aromatique, typique de l'infusion de thé. Annexe A Production de l'huile essentielle La matière de départ est une drogue tirée de l'espèce de camomille Manzana Pour la préparation de la drogue, on n'utili5 se que des capitules dans lesquels 30 à 70 %, et notamment 40 à 60 % des fleurs tubulées sont ouvertes Le séchage s'effectue dans une armoire séchoir à 40 C pendant 72 heures. L'huile essentielle des fleurs de camomille est obtenue, comme décrit ci-après, par entrainement à la vapeur pendant 10 deux heures de la drogue. 2,0 g de drogue non broyée sont mélangés, dans un ballon à fond rond d'un litre, avec 250 ml d'eau déminéralisée et soumis à une distillation à retour de liquide de deux heures dans un appareil Clevenger (Appareil à reflux d'entrainement à 15 la vapeur pour le dosage gravimétrique de petites quantités d'huiles essentielles) En tant que charge préalable, on utilise 1 ml de pentane par analyse La vitesse de reflux est de + 4 gouttes/mn Après l'achèvement de la distillation, _ l'huile essentielle dissoute dans le pentane est vidée dans des 20 tubes à réactions à l'état aussi anhydre que possible et l'huile essentielle éventuellement résiduelle qui adhère à l'appareillage est rincée au pentane Pour l'élimination d'éventuels résidus d'eau, une pointe-de spatule de Na 2 SO 4 est ajoutée à la solution qui est ensuite filtrée à la trompe, à travers un entonnoir-filtre de verre de porosité D 3 ou D 4, dans des flacons à collet Après évaporation du pentane à 40 C au bain-marie et séchage à l'exsiccateur, la quantité d'huile est déterminée gravimétriquement. Dans l'huile ainsi obtenue ( 20 mg environ), on dose ensui30 te le chamazulène et le bisabolole. D 2 sag 2 _e 22 E 2 ch 2 ométriquedu_ chamazulène Solution de mesure: la totalité de l'huile essentielle, obtenue à partir de 2 g de drogue ( 20 mg environ) (obtenue de la manière décrite ci-dessus) est dissoute dans 25 ml 35 de n-hexane ou de cyclohexane. Appareil de mesure: Photomètre à filtres (par exemple Eppendorf). Longueur d'onde: 578 nm. 23 2547982 23 Cuvette: 1 cm Extinction spécifique du chamazulène ( 1 g/100 ml; 1 cm): 20,8 Liquide de compensation: n-hexane ou cyclohexane. Teneur en chamazulène trouvée, en mg/100 g: 120 E 578 Si l'on ne dispose pas de photomètre à filtres pour la mesure, on peut aussi effectuer le dosage avec un spectrophotomètre: Appareil de mesure: Spectrophotomètre (par exemple PM Q II ou 10 PM Q III "ZEISS") Longueur d'onde: 605 nm Cuvette: 1 cm Extinction spécifique du chamazulène ( 1 g/100 ml; 1 cm): 24,5 Liquide de compensation: n-hexane ou cyclohexane Teneur en chamazulène trouvée, en mg/100 g: 102 E 605 On dose ensuite le bisabolole dans la solution de mesure. Dosagepar chromat o$rahie en _hase _azeuse du bisabolole et des autres bisaboloides Chromatographe pour phase gazeuse: Hewlett Packard Modèle 5750, Erba Fractovap 2350 ou appareil similaire. Détecteur: Détecteur d'ionisation-de flammes. Gaz porteur: Hélium Colonne: 1/8 de pouce; 200 cm; acier. Garnissage de colonne: 3 % caoutchouc nitrile-silicone "XE 60 " Sur terre d'infusoires silanisée"Chromosorb WAW HP" 125 à microns servant de support. Température Détecteur: 3200 C Bloc d'injection: 220 o C Colonne: 85 220 C. Programmation de température: 40/mn Solution échantillon: On a utilisé la solution de mesure pour le chamazulène. Solution type: Environ 15 mg de bisabolole standard ont été dissous à 25 ml dans le cyclohexane. Quantité d'injection: 5 Fl de chacune des solution échantillon et solution type. Evaluation: L'évaluation s'effectue par comparaison des surfaces de crête. Teneur en bisabolole en mg pour 100 g de drogue: x Quantité pesée (témoin) /-mg_ 7 x Surfaeé-hatillonmg_ 7 urace échantoin 7 Le dosage des autres bisabololdes peut être effectué également par chromatographie en phase gazeuse, par exemple dans les conditions opératoires suivantes: Appareil: Packard, Modèle 7721, série 800 ou Erba Fractovap, série 2350. Colonnes: Colonnes de verre, 3 m/2 mm de diamètre; 2 m/2 mm de diamètre. Garnissage: 3 % de caoutchouc méthylphénylsilicone "OV 1 " 1 sur terre d'infusoires silanisée "Gaschrom Q"I', 125 à 150 servant de support. Gaz porteur: 30 ml/mn de N 2 Programme de température: 80 à 180 C, 2,5 ( 3) C/mn/ Température de l'injecteur/détecteur: 200 C Détecteur: Détecteur d'ionisation de flammes. Quantité injectée: 2 el environ de l'huile essentielle diluée 20 à 1: 50 environ. L'évaluation s'effectue en partie sans et en partie avec standard interne Conviennent, en tant que standard interne, l'ester méthylique d'acide laurique ou l'hexadécane pour les huiles pauvres en chamazulène ou exemptes de chamazulène Dans 25 le cas d'huiles dont la teneur en chamazulène est supérieure à %, l'ester est à préférer camme standard interne, la détermination de la teneur étant effecwtuée photométriquement (à 578 nn). REVENDICATIONS 1 Camomille tétraplo Xde du genre de plantes de culture camomille vraie (Chamomilla recutica (I) Rauschert, synonyme de Matricaria chamomilla L, astéracées), dont les fleurs, séchées à 40 C, contiennent au moins 150 mg % de chamazulène; au moins 300 mg % de (-) "-bisabolole et moins de 50 mg % d'autres bisabololdes, sur la base de la substance sèche. 2 Matériel de multiplication d'une camomille selon la revendication 1. 3 Procédé pour la production d'une nouvelle espèce de camomille tétraploide (désignation Manzana) du genre de plantes de culture camomille vraie (Chamomilla recutica (L) Rauschert, synonyme de Matricaria chamomilla L, astéracées), dont les fleurs, séchées à 400 C, contiennent au moins 150 mg % de chamazulène, au 15 moins 300 mg % de (-)oc-bisabolole-et moins de 50 mg % d'autres bisabololdes sur la base de la substance sèche, caractérisé en ce que l'espèce de camomille diploïde DEGUMILL est tétraplo Ydisée de façon connue en soi, les plantes t 6 traploldes sélectionnées sont soumises à de nouvelles phases de sélection et de multipli20 cation et, le cas échéant, un matériel de multiplication et/ou une drogue à base de camom 2 lle sont préparés à partir de plantes de camomille qui sont obtenues de la sorte. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la tétraploidisation est effectuée au moyen de produits chimiques à des températures comprises entre O et 35 C, au moyen de rayons gamma, de rayons X ou de rayons UV à des températures comprises entre O et 35 C, au moyen de hautes températures de 33 à 50 C, au moyen de basses températures de O à 5 C, au moyen de la méthode du cal de décapitation ou par culture d'anthères. 5 Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'à la suite de la tétraploidisation: 26 2547982 a) une sélection des plantes tétraplo Xdes est effectuée d'après leur teneur en substances actives (au moins 150 mg % de chamazulène, au moins 300 mg % de bisabolole et moins de 50 mg % d'autres bisaboloides, le tout sur la base de la substance 5 sèche), d'après la simultanéité de la date de floraison, d'après l'uniformité de la ramification au niveau du sol et d'après la grosseur des capitules qui doit être comprise entre 25 et mm, les plantes ainsi sélectionnées sont clonées et des semences sont récupérées à partir des plantes obtenues par le clonage, 10 b) des descendants issus des semences ainsi obtenues sont cultivés, puis une sélection suivant a) est effectuée et des semences sont de nouveau récupérées à partir des plantes sélectionnées, c) les opérations selon b) sont répétées 2 à 4 fois, d) des descendants issus des semences obtenues en c) sont cultivés, on procède à une sélection suivant a), les plantes ainsi sélectionnées sont clonées et des semences sont récupérées à partir des plantes obtenues par le clonage. 6 Camomille ou matériel de multiplication de camomille, obtenu 20 d'après l'une quelconque des revendications 3 à 5. 7 Utilisation de camomille selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la production d'un matériel de multiplication. 8 Procédé pour la préparation d'un matériel de multiplication, caractérisé en ce que des graines ou des boutures sont récupérées, 25 de façon connue en soi, à partir de plantes de camomille selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 9 Utilisation d'une camomille selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la préparation d'une drogue à la camomille. 10 Procédé pour la préparation d'une drogue à la camomille à partir de fleurs de la camomille selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, drogue qui contient-au- moins 150 mg % de chamazulène et au moins 300 mg % de (-)-o en autres bisaboloîdes se situant au-dessous de 50 mg %. 11 Procédé pour la préparation d'une drogue à la camomille à partir de fleurs de la camomille selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, drogue qui contient au moins 150 mg % de chamazulène, au moins 300 mg % de (-) "-bisabolole et moins de 27 2547982 mg % d'autres bisaboloides, caractérisé en ce que les fleurs sont récoltées au stade de végétation ou il n'y a que à 70 % des fleurs tubulées d'un capitule à être ouvertes et en ce que les fleurs sont séchées à une température de l'air qui ne dépasse pas 500 C. 12 Drogue à la camomille qui contient au moins 150 mg % de chamazulène, au moins 300 mg % de (-) î-bisabolole et moins de 50 mg % d'autres bisaboloides, caractérisée en ce qu'on utilise, pour sa préparation, des fleurs de la camomille selon l'une 10 quelconque des revendications 1 à 6.