Brevet FR2543971A1 — publié le 19841012

z:; - Anticorps contre le cancer humain de la vessie. La présente invention concerne le cancer humain de la vessie, plus particulièrement un anticorps spécifique du cancer de la vessie qui peut être produit par une cellu- le obtenue par fusion entre une cellule capable de produire un tel anticorps et une cellule capable de proliférer de façon permanente in vitro par repiquage, la cellule obtenue par fusion étant désignée par la suite sous le nom d' "hy- bridome". Il y a beaucoup de gens qui souffrent de cancers et un grand nombre de personnes meurent de cancers, aussi c'est un problème social des plus importants En dépit de gros efforts de la part de nombreux chercheurs dans tous les domaines de la science, aucun procédé de traitement primaire d'un cancer n'a été trouvé jusqu'à présent Au Japon, la moitié ou plus de la totalité des morts par des cancers sont causées par le cancer gastrique, le cancer du poumon ou le cancer du foie, d'autres sortes de cancer, cependant, tendent à augmenter à mesure que le mode de vie change au Japon, par exemple le cancer rectal ou la tumeur maligne des organes urinaires comprenant le cancer de la vessie urinaire qui concerne l'objet de la présente inven- tion. Les procédés de traitement de tels cancers con- sistent principalement en opérations chirurgicales en com- binaison avec de la radiothérapie, de la chimiothérapie et/ou de l'immunothérapie De tels procédés sont, cepen- dant, limités dans une certaine mesure au traitement du cancer anaphase ou du cancer progressif Ainsi, un diagnos- tic précoce et un traitement précoce sont importants dans tous les cas Dans ces conditions, un procédé rapide, hau- tement fiable pour l'identification et/ou le diagnostic de la cellule cancéreuse et/ou du tissu cancéreux est forte- ment requis. Des recherches nombreuses et extensives ont été faites sur un antigène spécifique concernant un cancer qui est présent à la surface de la cellule cancéreuse En par- ticulier, un tel antigène de surface a été confirmé dans l'étude utilisant des animaux expérimentaux Au contraire, une approche suffisante n'a pas été faite pour le cancer humain D'après les connaissances présentes, un tel anti- gène de surface d'un cancer comprend par exemple, ( 1) un antigène présent seulement de manière autologue (même sou- che), ( 2) un antigène présent habituellement dans les mêmes sortes de tumeurs, ou ( 3) un antigène présent également dans des tumeurs d'autres organes ou même des cellules normales de même que des cellules des tumeurs en question. Un procédé immunologique utilisant un antisérum du même ou de différents type(s) est généralement utile pour l'analyse d'un antigène Pour préparer un tel anti- sérum qui peut être utilisé pour reconnaître les trois sortes d'antigènes mentionnés ci-dessus, il est nécessaire de répéter le procédé d'absorption de l'antisérum Une di- minution du titre de l'anticorps s'ensuit inévitablement avec une telle procédure et l'antisérum résultant ne peut pas être utilisé dans la pratique De plus, si on peut obtenir l'antisérum souhaitable, il est presque impossible de reproduire le même antisérum ayant la même spécificité. Dans ces circonstances, un nouveau moyen est requis pour l'identification des antigènes liés au cancer et des anti- gènes spécifiques du cancer à la surface d'une cellule cancéreuse. L'un de ces moyens a été développé par Kbhler et Milstein en 1975, Nature, 256, 495 ( 1975), c'est-à-dire la technique de fusion des cellules pour préparer un anti- corps monoclonal La technique de fusion des cellules répond aux exigences telles que celles mentionnées ci- dessus et on a signalé récemment des sous-groupes d'anti- corps de lymphocytes et monoclonaux humains contre l'anti- gène de surface de cellules leucémiques humaines ou de mélanome humain. Généralement, bien qu'on puisse obtenir un anti- corps monoclonal spécifique par une telle technique de fusion de cellules, l'Iantigénicité d'une cellule cancé- reuse varie suivant les diverses cellules cancéreuses et par conséquent on ne peut pas prédire actuellement si on va obtenir réellement un excellent anticorps ayant la spécificité désirée En ce qui concerne les cellules can- céreuses humaines, on n'a signalé jusqu'ici que peu de cellules cancéreuses spéciales comme décrit ci-dessus En particulier, aucune publication n'a été faite sur le cancer de la vessie urinaire humain Bien entendu, n'importe quel anticorps contre le cancer de la vessie n'est pas réelle- ment utilisable actuellement. Les inventeurs de la présente invention ont fait de gros efforts pour rechercher un procédé pour préparer un anticorps monoclonal contre l'antigène de surface d'une cellule du cancer de la vessie urinaire humain et ont abou- ti à l'invention selon laquelle on peut obtenir un tel anticorps avec une haute spécificité, un titre élevé et une faible concentration en contaminants à partir d'un hybridome entre une cellule capable de produire un anti- corps contre une cellule du cancer de la vessie humain (désignée quelquefois par la suite sous le nom de "cellule productrice d'anticorps anti-cancer de la vessie", ou sim- plement "cellule productrice d'anticorps" et une cellule capable de repiquage in vitro permanent (désignée quelque- fois par la suite sous le nom de "cellule repiquée") Les présents inventeurs ont également découvert qu'un tel an- ticorps est utile pour la classification et/ou l'identifi- cation d'une cellule du cancer de la vessie urinaire hu- main L'anticorps peut être également utile pour fournir un traitement efficace du cancer de la vessie urinaire humain. Un objet de la présente invention est de fournir un procédé pour la préparation d'un anticorps spécifique de l'antigène de su-face d'une cellule du cancer de la vessie humain. Un autre objet de l'invention est de fournir un anticorps anti-cancer de la vessie hautement spécifique et un procédé de préparation de celui-ci par'la technique de la fusion de cellules. Un objet de l'invention est de fournir un hybri- dome capable de produire un tel anticorps. Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé de classification et/ou d'identification des cel- lhles du cancer de la vessie urinaire humain à l'aide de l'anticorps, de l'invention. Encore un autre objet de la présente invention est de fournir un agent pharmaceutique pour le traitement du cancer de la vessie humain, lequel agent contient l'an- ticorps de l'invention comme composant efficace. La présente invention a également pour objet de fournir un dérivé utile d'un tel anticorps efficace dans l'utilisation pour la classification et/ou l'identifica- tion des cellules du cancer de la vessie humain et le traitement du cancer de la vessie humain. D'autres objets et les avantages remarquables de la présente invention seront évidents pour les experts dans l'art à partir des descriptions détaillées suivantes sur les modes de réalisation non limitatifs, spécifiques. Le procédé de préparation d'un anticorps anti- cancer de la vessie de la présente invention consiste à préparer un hybridome à partir d'une cellule productrice de l'anticorps anti-cancer de la vessie et une cellule repiquée, en particulier de myélome, et à récupérer l'anti- corps sécrété par l'hybridome. Le procédé de l'invention va être décrit dans la suite avec plus de détails. A PREPARATION DE LA CELLULE PRODUCTRICE D'ANTICORPS. Dans la présente invention, la cellule productri- ce d'anticorps anti-cancer de la vessie peut être obtenue à partir de n'importe quelle espèce animale y compris l'homme Une immunisation de l'animal n'est pas essentielle bien qu'une telle immunisation préliminaire puisse remar- quablement améliorer l'efficacité de récupération de l'hy- bridome désirable. Lorsque l'origine d'une telle cellule est humai- ne, toute personne ayant un antécédent de cancer de la vessie ou un titre élevé de sérum contre la cellule du cancer de la vessie peut être choisie Ou bien encore, on peut obtenir une telle cellule à partir d'un corps vivant immunisé avec un immunogène L'immunogène peut être une cellule cancéreuse per e, une cellule qui est traitée avec du glutaraldéhyde, de la mitomycine ou de la chaleur et de ce fait ne peut pas proliférer, ou l'antigène de surface séparé d'une cellule cancéreuse par un traitement approprié avec par exemple une enzyme et purifiée. L'immunogène utilisé dans l'immunisation peut être mélangé avec un adjuvant tel que l'adjuvant complet ou incomplet de Freund L'immunogène peut être administré par tout moyen classique tel que des injections sous-cuta- nées, intrapéritonéales, intraveineuses, intradermiques et intramusculaires -Une injection sous-cutanée ou intra- péritonéale peut être préférable Il est possible qu'une seule immunisation soit possible bien que l'immunisation puisse être effectuée de façon répétée plusieurs fois avec un intervalle de temps approprié par exemple de une à cinq semaines En mesurant le titre de l'anticorps dans le sé- rum de l'animal immunisé, on peut utiliser l'animal dont le titre a été suffisamment élevé pour obtenir la cellule productrice d'anticorps, ce qui a pour effet d'améliorer l'efficacité des opérations suivantes La cellule préfé- rable est extraite de l'animal le 3 ème-5 ème jour après l'immunisation finale La cellule productrice de l'anti- corps est un plasmocyte ou un lymphocyte qui est une cel- lule précurseur de celui-ci et peut provenir de n'importe quel site du corps, généralement la rate, un ganglion lym- phatique, le sang périphérique ou toute combinaison de ceux-ci. B FUSION DES CELLULES. Une cellule qui peut être conservée de façon permanente par repiquage in vitro peut être toute cellule appropriée qui peut être fusionnée avec la cellule produc- trice d'anticorps pour donner un hybridome capable de pro- duire un anticorps désiré L'une de ces cellules qui est préférable est une cellule leucémique telle qu'une cellule de myélome Une telle cellule peut provenir de n'importe quelle espèce telle que l'homme, le rat, la souris, etc. La cellule qui est dépourvue d'hypoxanthine-guanine phos- phoribosyltransférase (HGPRT) ou de thymidine kinase (TK) est préférable du fait que de telles cellules parentes ne peuvent pas se développer dans un milieu sélectif. Un exemple de lignée de cellules préférable est la lignée GM-1500-6 TG-A 1-2 ou RPMI 8226 dérivée de l'homme ou P 3-X 63-Ag 8, P 3/NSI/1-Ag 4-1, Sp 2-0-Ag 14, X 63-Ag 8 653, etc, dérivée de la souris. Il est préférable d'utiliser une cellule produc- trice d'anticorps et une cellule repiquée, les deux prove- nant des mêmes espèces, bien que ce ne soit pas essentiel, aux plans de l'efficacité de la fusion, de la stabilité des propriétés des cellules obtenues par fusion et de la facilité de culture in vivo de celles-ci En particulier, lorsqu'on utilise la lignée de cellules P 3-X 63-Ag 8, P 3/NSI/1-Ag 4-1, Sp 2/0-Ag 14 ou X 63-Ag 8 653 comme cellule repiquée, on peut utiliser de préférence une souris BALB/c consanguine ou sa souris hybride. Pour la fusion, on peut utiliser un accélérateur tel que le virus Sendai (HVJ) et du polyéthylëreglyco;l, en particulier, on peut utiliser de préférence le polyéthylène 1000, 1540, 2000, 4000 bu 6000 La fusion des cellules peut être réalisée dans une solution contenant environ 30 à 55 % d 1 'un tel polyéthylèneglycol En outre, le diméthylsulfoxyde peut être présent dans la solution. C SELECTION DE L'HYBRIDOME. Dans la solution après la fusion, sont présents, en plus de la cellule obtenue par fusion, la cellule pa- rente productrice d'anticorps restante et la cellule pa- rente repiquée La première ne peut pas survivre pendant la culture in vitro ultérieure tandis que la dernière peut se propager avec l'hybridome désiré Il est par conséquent préférable ou même nécessaire d'éliminer la cellule repi- quée de la solution contenant les cellules mélangées Pour cela, on utilise de préférence la cellule dépourvue de HGPRT ou de TK comme cellule parente repiquée et les cel- lules mélangées contenant les cellules parentes sont culti- vées dans un milieu de sélection contenant de l'hypoxan- thine, de 1 'aminoptérine et de la thymidine après la fusion des cellules, ce qui permet la croissance sélective de l'hybridome-désiré uniquement Ou bien encore, la cellule repiquée parente, lorsqu'elle n'est pas une cellule man- quant de HGPRT ou de TK, peut être traitée avec de l'émé- tine et de l'actinomycine D avant la fusion des cellules. La cellule parente ne peut pas proliférer avec un tel trai- tement et par conséquent on peut choisir facilement l'hy- bridome désiré à partir des cellules mélangées. Les hybridomes ainsi obtenus contiennent généra- lement deux ou plusieurs clones, par conséquent ceux-là peuvent ne pas avoir tout à fait les mêmes propriétés. Pour les séparer en clones individuels, le clonage peut être nécessaire et même désiré lorsqu'un anticorps est susceptible d'être requis Le clonage est également effi- cace du point de vue de la prévention du changement de po- pulation qui peut souvent se produire dans une culture à long terme d'un système avec un certain nombre de clones mélangés Le clonage peut être réalisé par culture à dilu- tion limitante, par culture sur gélose molle ou par culture sur gel de fibrine On peut également utiliser un trieur de cellules activées fluorescentes pour trier les cellules dans le clonage Le clonage peut être utilisé également pour séparer les cellules aberrantes possibles apparaissant 2 pendant la longue culture et pour conserver les cellules qui ont les mêmes propriétés que l'hybridome d'origine. L'hybridome de la présente invention dans la phase de croissance logarithmique peut être maintenu en suspension pendant une longue période sous une forme con- gelée et à raison de 1 10 x 106 par ml en suspension dans un sérum bovin foetal contenant 5 % (v/v) de diméthylsul- foxyde Le procédé de congélation est réalisé de préférence à une vitesse de refroidissement de 10 C par minute Il est préférable de conserver l'hybridome à 800 C ou plus bas. L'hybridome congelé, conservé, est décongelé de préférence aussi rapidement que possible Si les cellules sont lavées avec un milieu destiné à éliminer le diméthyl- sulfoxyde immédiatement après dissolution, les cellules peuvent être mises en suspension dans un milieu classique et peuvent être cultivées Lorsqu'après décongélation, il ne reste qu'une petite quantité de cellules survivant et se développant, il faut ajouter des cellules de rate de souris, etc. D PREPARATION ET RECUPERATION DE L'ANTICORPS. Pour la préparation de l'anticorps, l'hybridome producteur d'un anticorps anti-cancer de la vessie est cultivé in vitro ou in vivo. Dans la culture in vitro, on peut choisir un bouillon nutritif approprié à l'hybridome de la présente invention, par exemple, le milieu RPMI 1640 qui contient % (v/v) de sérum bovin foetal, du e-mercaptoéthanol 5 x 10 M, 1 m M de pyruvate de sodium et des antibiotiques, ou bien, le milieu MEM de Eagle modifié de Dulbecco (dési- gné ci-après par D-MEM) qui contient 4,5 g/l de glucose à la place du milieu RPMI 1640 Une concentration initiale en cellules appropriée à la prolifération peut être en général de l'ordre de 10 par ml tout en pouvant dépendre- de chaque hybridome, et la concentration en cellules pen- dant la culture va de préférence jusqu'à 2 x 106 par ml. Dans la culture in vivo, l'hybridome est trans- planté dans un corps vivant et développé sous la forme solide ou dans des ascites On prélève dans le corps vi- vant un fluide corporel, de préférence du sérum ou de l'ascite, pour récupérer l'anticorps sécrété par l'hybri- dome La solution brute de l'anticorps obtenue peut conte- nir comme impuretés (contaminants) diverses substances issues du corps vivant hôte, néanmoins elle est plus re- marquable que la solution d'anticorps obtenue in vitro à cause de la concentration plus élevée de l'anticorps désiré Lorsque l'hybridome est transplanté intrapérito- néalement, on peut administrer du pristane ( 2,6,10,14- tétraméthylpentadécane) intrapéritonéalement avant la transplantation, de préférence 3 à 9 semaines avant la transplantation Ce traitement peut augmenter le rendement de la solution brute d'anticorps mais n'est pas essentiel. Comme hôte, un animal de la même espèce et du même sang que l'animal duquel la ou les cellule(s) parente(s) pro- vient (proviennent) est préférable et dans ce cas l'hybri- dome peut se développer dans l'animal même s'il n'a pas été traité spécialement Lorsque les sérotypes de l'histo- compatibilité des antigènes coïncident les uns les autres entre l'hybridome et l'hôte, l'hôte est nécessairement Z 2543971 traité au préalable en lui administrant par exemple un anticorps antilymphocyte ou par irradiation avec des rayons X Les cellules commencent à se développer à partir de 1 à 3 semaines après la transplantation. Dans la culture in vitro ou in vivo de l'hybri- dome pour la sécrétion des anticorps, une substance radio- active telle que la leucine et la lysine marquée par un radio-isotope peut être ajoutée au milieu ou administrée à l'h 6 te Un tel traitement peut donner un anticorps ayant la même structure chimique que l'anticorps non mar qué et contenant la substance radioactive dans une molécule. Les anticorps de la présente invention peuvent être utilisés tels quels dans la solution d'anticorps brute, ou bien ils peuvent être purifiés pour l'utilisation par n'importe quel procédé classique pour l'immunoglobuline, par exemple, par fractionnement par le sulfate d'ammonium ou par chromatographie par échange d'ions, ou par chroma- tographie par affinité avec-la protéine A ou l'antigène. De tels anticorps purifiés peuvent être utilisés indépen- damment ou en mélange. Selon le procédé de préparation de l'anticorps anti-cancer de la vessie de la présente invention, l'in- convénient lié aux procédés classiques peut être nettement surmonté L'hybridome de l'invention peut être repiqué et on peut le faire proliférer substantiellement de manière permanente à la fois in vitro et in vivo En outre, l'hy- bridome peut produire un anticorps contre un déterminant antigénique spécifique L'anticorps produit, par consé- quent, peut avoir une spécificité monoclonale, est un anticorps vis-à-vis de l'antigène de surface d'une cellule du cancer de la vessie urinaire et se compose essentielle- ment d'une seule espèce moléculaire Le procédé de la pré- sente invention permet la production d'une quantité néces- saire de l'anticorps dépendant de la demande, la suppres- sion de la dispersion entre les lots et de plus la prépa- il ration d'une solution contenant l'anticorps ayant un titre élevé De plus, le procédé n'exige pas une absorption dif- ficile qui a été classiquement inévitable Par ailleurs, on peut utiliser un antigène non purifié tel qu'une cellule per se sans difficulté dans le procédé et même on peut obtenir dans un tel cas l'anticorps hautement spécifique. Une réactivité aussi élevée avec un antigène de l'anticorps permet une identification rapide d'une cellule de cancer de la vessie avec une haute fiabilité sans passer par les procédés classiques difficiles De plus, étant donné la pureté élevée de l'anticorps, les réactions allergiques dues aux contaminants contenus inévitablement dans la pré-. paration classique se produisent rarement, permettant son utilisation comme remède contre le cancer de la vessie. Le procédé de classification et/ou d'identifica- tion de la présente invention peut être appliqué à un sujet de toute origine Par exemple, on peut utiliser des maté- riaux cliniques tels que l'urine, un lymphocyte ou autre tissu bioptique obtenus à partir d'un patient souffrant éventuellement d'un cancer de la vessie urinaire du point de vue clinique. Dans l'identification, un réactif contenant l'an- ticorps de la présente invention est mis en contact avec un sujet contenant des cellules de cancer de la vessie. Elle peut utiliser commodément la microscopie d'immuno- fluorescence, l'immunoélectromicroscopie, le test de liai- son radioactif, l'immunotest enzymatique, etc En microsco- pie d'immunofluorescence directe, on peut-utiliser commodé- ment l'anticorps de l'invention après l'avoir marqué avec un colorant fluorescent tel que la-fluorescéine et la rho- damine L'autre forme commode de l'anticorps de l'invention peut être une forme marquée avec une substance de marquage telle que la ferritine pour une immunoélectromicroscopie, une forme marquée avec un radio-isotope tel que 12 I et I pour un test de liaison radioactif ou une forme mar quée avec une enzyme telle que la peroxydase, la phospha- tase alcaline et la 0-galactosidase pour un immunotest en- zymatique Bien entendu, on peut réaliser un procédé in- direct à l'aide d'un anticorps secondaire ou de son produit de liaison comme substitut, par exemple on peut utiliser un anticorps anti-cancer humain de la vessie avec l'avidine comme anticorps secondaire Egalement, une partie de l'an- ticorps obtenue par clivage restrictif avec un traitement chimique et/ou enzymatique tel que F(ab')2 peut être uti- lisée à la place de l'anticorps per se Des dérivés et des produits de restriction aussi variés sont utiles pour le * procédé de classification et/ou d'identification de l'in- vention et par conséquent sont inclus dans le cadre de la présente invention. L'anticorps, ses dérivés et ses produits de res- triction peuvent être mélangés pour l'utilisation si c'est nécessaire De plus, le réactif pour la classification et/ ou l'identification de l'invention peut encore contenir un support ou un diluant classiquement utilisé. La présente invention concerne également un agent curatif (remède) pour le traitement du cancer de la vessie urinaire. On peut considérer que le mécanisme curatif des anticorps de la présente invention accélère une réaction de fixation complémentaire et l'attaque du macrophage et/ou- d'autres immunocytes contre les cellules cancéreuses lors- que l'anticorps administré se lie avec l'antigène de sur- face de la cellule cancéreuse. L'anticorps de la présente invention peut être administré per se indépendamment ou en mélange Lorsque l'anticorps est combiné chimiquement avec un agent anti- cancer tel que le chlorhydrate de mitomycine et de doxo- rubicine ou une toxine telle que la ricine, on peut obte- nir plus d'avantages Dans ce cas, on peut considérer que le mécanisme est tel que l'agent anti-cancer ou la toxine peuvent attaquer les cellules cancéreuses lorsque l'anti- corps administré se lie à l'antigène de surface de la cel- lule cancéreuse, ayant pour résultat une plus faible toxi- cité de l'agent anti-cancer ou de la toxine que lorsqu'il est utilisé seul Une fraction de l'anticorps obtenue par division restrictive par un traitement chimique ou enzyma- tique, par exemple F(ab')2, peut être également utilisé pour l'agent de guérison de l'invention à la place de l'an- ticorps per se Dans ce cas, on peut éviter une possibilité qu'a le tissu d'un hôte de pouvoir être affecté par une détérioration due à une réaction de fixation complémentaire non spécifique etc Ces dérivés (produits de combinaison avec un agent anti-cancer ou avec une toxine) et ces pro- duits de restriction peuvent être utilisés soit indépen- damment soit en mélange comme agent curatif de la présente invention. Pour évaluer la toxicité aiguë des anticorps, de ses dérivés et des produits de restriction, on a administré l'agent curatif de l'invention a trois groupes (de 10 ani- maux chacun) de souris IRC; premièrement en une quantité de 2 g/kg par voie orale, deuxièmement en une quantité de 400 mg/kg par voie intrapéritonéale et troisièmement en une quantité de 200 mg/kg par voie intraveineuse, et aucune mort n'a été observée pendant 14 jours L'agent de guérison de l'invention peut donc être utilisé sans danger comme remède contre le cancer de la vessie urinaire humain. L'agent de guérison de l'invention peut être ad- ministré par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intra- veineuse, de préférence par injection sous-cutanée ou in- tramusculaire L'agent de guérison peut être administré par voie orale étant donné qu'une partie de l'agent admi- nistré peut être absorbé par la voie intestinale tout en retenant la structure comme anticorps, ce qui a été con- firmé par les présents inventeurs. On peut préparer une préparation à injecter en dissolvant ou en mettant en suspension par exemple 10 mg de l'anticorps ou de son dérivé avec 50 mg de mannitol dans 10 ml d'eau distillée, en stérilisant de n'importe quelle manière classique, en la divisant en fractions de 2 ml chacune pour la mettre dans des ampoules et en lyo- philisant Le produit obtenu sera dissous ou mis en sus- pension dans une solution saline au moment de l'utilisation. Une préparation injectable peut contenir en plus de l'anti- corps un support, un diluant, un tampon, un stabilisant, un agent isotonique, etc, ces agents étant donnus de ceux qui sont spécialistes dans l'art On peut préparer la prépara- tion injectable sous n'importe quelle forme d'injection sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse On peut préparer un agent administrable par voie orale par n'im- porte quel procédé classique et l'introduire dans un médi- cament entérique Une quantité unitaire de l'agent de gué- ri.son de l'invention peut dépendre principalement des symp- tômes, et va généralement de 0,001 mg à 10 g par jour par kg de poids corporel chez un animal tel que la souris et de 0,01 à 3 000 mg par jour par kg de poids corporel chez l'homme. La présente invention va être illustrée par les exemples non limitatifs suivants - EXEMPLE 1: PREPARATION D'UN ANTICORPS CONTRE UNE CELLULE DE CANCER HUMAIN DE LA VESSIE. A IMMUNISATION ET FUSION DE CELLULES. ( 1) PREPARATION DE LA CELLULE IMMUNOGENE: On a fait incu- ber une lignée de cellules de cancer de l'épithélium tran- sitionnel de la vessie humain T 24 ( 2 x 105), obtenue par repiquage in vitro pendant une longue période, à 370 C dans un environnement humide contenant 5 % de C 02 dans un milieu de sel, de Earle de MEM de Eagle (désigné ci-après par MEM) contenant 10 % (v/v) de sérum bovin foetal et du sulfate de kanamycine (concentration finale 60 mg/l) dans une boite de culture-(Falcon 3003, Becton-Dickinson, USA). Après trois jours de culture, on a exfolié les cellules en force et on a éliminé le liquide surnageant par centrifuga- tion On a lavé ensuite les cellules avec une solution saline tamponnée de phosphate (PBS, p H 7,2) en centrifu- geant et on les a mises en suspension dans du milieu PBS. On a obtenu environ 2 x 106 cellules dans le récipient de culture. ( 2) CULTURE DU MYELOME:-On a cultivé une lignée de cellu- les de myélome de souris Sp 2/O-Ag 14 ( 105 par ml) dans du D-MEM contenant 10 % (v/v) de sérum bovin foetal, 1 M 4 d'acide pyruvique, 2 m M de glutamine et 60 mg/l de sulfate de kanamycine par repiquage tous les trois jours On a ajusté la cellule à une concentration en cellules de 2,5 x 105 par ml le jour précédant la fusion des cellules sui- vantes et on l'a cultivée dans le milieu mentionné ci- dessus. ( 3) IMMUNISATION AVEC DES CELLULES T 24: Les cellules T 24 ( 5 x 106 10 x 106) obtenues en ( 1) ci-dessus et mises en suspension dans 0,4 ml de PBS ont été injectées par voie intrapéritonéale à des souris femelles BALB/c (NIHON CHARLES LIVER, JAPON, âgées de 9 semaines) quatre fois environ par mois pour l'immunisation. ( 4) FUSION DES CELLULES: On a effectué la fusion des cel- lules selon le procédé de Kbhler et Mistein (Immunotests; Clinical Laboratory Techniques pour l'éd de 1980 par Nakamura R M et al, E S Alan R Liss, Inc, N Y 1980, p 301-324). Le quatrième jour après l'immunisation finale, on a tué les souris pour extraire la rate La rate a été détachée, passée à travers un tamis de 150 mailles, cen- trifugée à 400 x g et on a ajouté du tampon tris-H Cl (tris- (hydroxyméthyl)aminométhane 0,017 M, p H 7,65) contenant 0,747 % de chlorure d'ammonium aux cellules précipitées pour éliminer les érythrocites et on a récupéré les cellu- les par centrifugation ( 400 x g) Après avoir ajouté du MEM aux cellules, on a effectué la centrifugation à 400 x g et on a mis encore les cellules en suspension dans du MEM frais Après avoir répété ce procédé de lavage trois fois, on a finalement mis les cellules en suspension dans du MEM. Les cellules Sp 2/0-Ag 14 ont été exfoliées du récipient de culture en pipettant et ont été transférées dans un tube à centrifugation Après centrifugation ( 400 x g), les cellules récupérées ont été mises en suspension dans du MEM, centrifugées ( 400 x g) pour éliminer le sérum et mises une nouvelle fois en suspension dans du MEM. La cellule de rate ( 5 x 107) et la lignée Sp 2/O-Ag 14 ( 107) ont été mélangées, pipettées avec soin et centrifugées ( 400 x g) Après avoir rejeté le liquide surnageant, on a détaché le précipité en frappant douce- ment le tube à centrifugation Aux cellules détachées, on a.ajouté 0,3 ml d'une solution de polyéthylèneglycol (PEG 1000) à 30 % (v/v) dans du MEM maintenu à 37 C Après avoir remué doucement, on a laissé reposer la solution à la tem- pérature ambiante pendant 5 minutes La centrifugation a été effectu 4 e à 7 x g pendant 2 minutes et on a ajouté progressivement 5 ml de MEM Après avoir agité doucement, on a effectué la centrifugation ( 400 x g) à la température ambiante pendant 5 minutes On a écarté le liquide surna- geant, on a ajouté 5 ml de MEM au précipité, centrifugé de la même manière que mentionné ci-dessus et on a éliminé le liquide surnageant. Aux cellules précipitées, on a ajouté 5 ml de milieu D-MEM contenant 10 % de sérum bovin foetal, 2 m M de glutamine, du e-mercaptol 5 x 10 M, 60 mg/1 de sulfate de kanamycine et encore du glucose à 4,5 g/l (désigné ciaprès par milieu D-MEM-FBS) Après avoir pipette, on a ajouté 20 ml de DMEM-FBS à la suspension de cellules résultante ( 5 ml) On a inooulé chaque fraction de 25 ml dans un récipient de culture de 25 cm 2 (C-25100, Corning, USA) et on l'a laissée incuber dans une ambiance humide contenant 5 % de C 02 à 37 C pendant la nuit, conditions d'incubation qui ont toujours été utilisées dans les pro- cédures suivantes. Le jour suivant l'inoculation, on a transféré la culture dans un tube de centrifugation après l'avoir pipettée doucement, et on l'a centrifugée à 400 x g. Après avoir éliminé le liquide surnageant, la boulette de cellules a été mise en suspension dans 35 ml de D-MEM- FBS contenant de l'hypoxanthine 1 x 10-4 M, de l'aminopté- rine 4 x 10-7 M et de la thymidine 1,6 x 10-5 M (milieu HAT). La suspension ( 0,1 ml) a été placée dans chaque godet d'une plaque à 96 godets (Falcon 3072, Becton-Dickinson, USA) et cultivée pendant une semaine Après une culture d'une semaine dans du milieu HAT, on a ajouté 25 pl de milieu HT (milieu HAT sans aminoptérine) tous les 2 ou 3 jours. B SELECTION ET CROISSANCE DE L'ANTICORPS PRODUISANT L'HYBRIDOME. On a utilisé un immunotest enzymatique en phase solide pour examiner la production de l'anticorps contre les cellules T 24 dans le liquide surnageant de chaque godet la seconde semaine après la fusion des cellules. On a fait réagir les cellules T 24 fixées sur une plaque (Falcon 3072) avec 40 pl du liquide surnageant dans chaque godet à la température ambiante pendant deux heures, on les a lavées avec du PBS, laissées réagir pendant deux heures avec 100 pl d'anticorps immunoglobuline anti- souris lié à la peroxydase (catalogue N 3211-0231, Cappel Lab. Inc, USA) qui a été dilué 1000 fois avec du sérum de che- val, et lavées entièrement avec du PBS 200 41 de tampon de citrate ( 0,1 M, p H 4,5) contenant 1 mg/ml d'un substrat (o-phénylènediamine) et 0,4 pl/ml d'une solution aqueuse d'eau oxygenée à 31 % ont été ajoutés et laissés réagir pendant 30 minutes jusqu'à coloration. On a effectué le clonage dans trois godets con- tenant les anticorps réagissant avec les cellules T 24 par la méthode de dilution limitante comme suit: hybridomes issus de chacun des trois godets positifs quant à la production de l'anticorps ont été mis en suspension dans du D-MEM-FBS et mélangés avec des cel- lules de rate obtenues à partir de souris BALB/c de la même manière que celle utilisée lors de la fusion des cellules et ajustés dans du D-MEM-FBS ( 108 cellules). On a ajusté la concentration en cellules à 5 x 10 par ml en ajoutant du DMEM-FBS et on a inoculé le mélange de cellules dans chaque godet de la plaque à 96 godets (Falcon 3072) en une quantité de 0,2 ml chacun et on l'a cultivé Le treizième jour après l'amorçage de la culture, on a examiné la production de l'anticorps dans chaque godet à l'aide de l'immunotest enzymatique en phase solide mentionné ci-dessus 33 hybridomes producteurs d'anticorps ont été obtenus y compris 6 hybridomes indiqués dans le tableau 1 ci-dessous. EXEMPLE 2: PROPRIETES DE L'ANTICORPS CONTRE LA CELLULE DE CANCER DE LA VESSIE HUMAIN. A COMPARAISON DE LA REACTIVITE AVEC D'AUTRES CELLULES. On a utilisé 1 'immunotest enzymatique en phase solide de l'exemple 1 pour examiner les réactivités des liquides surnageants obtenus dans l'exemple 1 avec d'au- tres cellules repiquées in vitro; Intestin 407 (lignée de cellules de l'intestin humain foetal), Du 145 (lignée de cellules du cancer de la prostate humain) et 235 J (li- gnée de cellules du cancer rénopelvique humain) de même que T 24 (lignée de cellules du cancer de la vessie urinaire humain) Comme on le voit dans le tableau 1 ci-dessous, les anticorps sécrétés par les hybridomes autres que T-002 ont réagi fortement avec la lignée T 24 et ont réagi légè- rement ou faiblement avec les autres cellules, tandis que l'anticorps sécrété par 1 'hybridome T-002 a réagi avec la lignée T 24, a réagi faiblement avec les cellules de l'in- testin foetales et n'a pas réagi avec les autres cellules. B COLORATION DE LA CELLULE PAR LA TECHNIQUE DE L'ANTICORPS FLUORESCENT. Les cellules T 24 ont été colorées par la techni- que de l'anticorps fluorescent indirecte en utilisant l'an- ticorps sécrété par l'hybridome T-003 A savoir, les cellu- les T 24 ont été fixées sur une lamelle de verre sans fluo- rescence, ont réagi avec le liquide surnageant ( 50 p) à 37 C pendant 45 minutes en atmosphère humide et ont été lavées en les traitant pendant 3 à 5 minutes par une solu- tion de PBS contenant 1 % d'albumine de sérum de bovin, m M de HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2- éthanesulfonique) et 0,1 % de nitrure de sodium, ce procédé de lavage étant répété trois fois La réaction a encore été réalisée dans les mêmes conditions pendant 45 minutes avec p 1 d'une solution diluée 20 fois de Ig G anti-souris liée à de la fluorescéine (Miles-Yoda Ltd, Israël, Code N 65- 171) et on a réalisé le procédé de lavage de la même maniè- re que mentionné ci-dessus Après séchage, la solution de glycérine tamponnée au carbonate ( 0,05 M, p H 9,5, 10 % de glycérine) a été mise de côté et on a placé un couvercle en verre dessus pour faire une observation au moyen du microscope de fluorescence (Olympus, Japon, Modèle AH-RFL- LB) On a observé une forte fluorescence à la surface de la cellule T 24 On a utilisé l'Ig G anti-souris liée à la fluorescence après l'avoir soumise six fois à l'absorption avec la cellule T 24. C IDENTIFICATION DES CLASSES D'IMMUNOGLOBULINE. On a identifié les classes des immunoglobulines des anticorps sécrétés par les hybridomes T-001 à T-OO 6 par l'immunotest enzymatique en phase solide qui utilise l'anti-immunoglobuline (Ig), anti-Ig C et anti-Ig M (Cappel Lab Inc, USA, Catalogue N 3211-0231, 3211-0081, 3211- 0201) comme anticorps immunoglobuline anti-souris lié à la peroxydase Comme on le voit dans le tableau 1 ci-après, tous les anticorps examinés étaient des Ig G. EXEMPLE 3: PREPARATION D'ANTICORPS CONTRE UNE CELLULE HUMAINE DE CANCER DE LA VESSIE. A IMMUNISATION ET FUSION DES CELLULES. ( 1) PREPARATION DE CELLULES IMMUNOGENES: On a fait incuber la lignée de cellules du cancer de l'épithélium transition- nel de la vessie urinaire humain T 24 ( 2 x 105) obtenue par repiquage in vitro pendant une longue période, à 37 C dans une ambiance humide contenant 5 % d'anhydride carbonique dans le milieu MEM qui contient 10 % (v/v) de sérum bovin foetal et du sulfate de kanamycine (concentration finale, mg/l) dans un récipient de culture de 100 mm (Falcon 3003, BectonDickinson, USA) Après trois jours de culture, on a exfolié les cellules en force et on a éliminé le li- quide surnageant par centrifugation Les cellules ont en- suite été lavées avec du PBS (p H 7,2) par centrifugation et mises en suspension dans du PBS On a obtenu environ 2 x 106 cellules à partir d'un récipient de culture. ( 2) CULTURE DE MYELOMES: On a cultivé la lignée de cellu- les de myélome de souris Sp 2/O-Ag 14 ( 105 par ml) dans du D-MEM contenant 10 % (v/v) de sérum bovin foetal, 1 m M d'acide pyruvique, 2 m M de glutamine et 60 mg/1 de sulfate de kanamycine par repiquage tous les trois jours La cel- lule a été ajustée à une concentration en cellules de 2,5 x 105 par ml le jour précédant la fusion de cellules suivante et cultivée dans le milieu mentionné ci-dessus. ( 3) IMMUNISATION AVEC LES CELLULES T 24: Les cellules T 24 ( 5 x 106 10 x 106) obtenues en ( 1) ci-dessus et mises en suspension dans 0,4 ml de PBS ont été injectées par voie intrapéritonéale à des souris BALB/c femelles (NIHON CHARLES LIVER JAPON, âgées de 9 semaines) quatre fois chaque mois approximativement pour l'immunisation. ( 4) FUSION DES CELLULES: On a réalisé la fusion des cel- iules selon 'e procédé de-Kbhler et Milstein. Le quatrième jour après l'immunisation finale, on a tué les souris pour prélever la rate La rate a été détachée avec soin, passée à travers une toile en acier à 150 mailles, centrifugée à 400 x g et on a ajouté du tampon de tris-H Cl (p H 7,65) contenant 0,747 % de chlorure d'ammonium aux cellules précipitées pour éliminer les érythrocytes et on a récupéré les cellules par centrifuga- tion ( 400 x g) Après avoir ajouté du MEM aux cellules, on a effectué la centrifugation à 400 x g et on a mis une nouvelle fois les cellules en suspension dans du MEM frais. Après avoir répété trois fois ce procédé de lavage, on a mis finalement les cellules en suspension dans du MEM. On a exfolié les cellules Sp 2/0-Ag 14 du récipient de culture en pipettant et on les a transférées dans un tube à centrifugation Après centrifugation ( 400 x g), on a mis les cellules récupérées en suspension dans du MEM, et on les a centrifugées ( 400 x g) pour éliminer le sérum et on les a mises une nouvelle fois en suspension dans du MEM. Les cellules de rate ( 2 x 10) et les cellules Sp 2/0-Agl 4 ( 4 x 10) ont été mélangées, pipettées avec soin et centrifugées ( 400 x g) Après avoir évacué le li- quide surnageant, on a détaché doucement le précipité en frappant doucement le tube à centrifugation Aux cellules détachées, on a ajouté 1,2 ml d'une solution de polyéthy- lèneglycol (PEG 1000) à 30 X (v/v) dans du MEM maintenu à 370 c Après avoir agité doucement, on a laissé reposer la solution à la température ambiante pendant 5 minutes. On a réalisé la centrifugation à 7 x g pendant 2 minutes et on a ajouté progressivement 20 ml de MEM Après avoir agité doucement, on a effectué la centrifugation ( 400 x g) à la température ambiante pendant 5 minutes On a éliminé ensuite le liquide surnageant, on a ajouté 20 ml de MEM au précipité, centrifugé de la même manière et on a éli- miné le liquide surnageant. Aux cellules précipitées, on a ajouté 15 ml de milieu de D-MEM-FBS Après avoir pipetté, on a ajouté 90 ml de D-MEM-FBS à la suspension de cellules résultantes ( 15 ml) On a inoculé environ 25 ml de la suspension de cellu- les dans chaque récipient de culture de 25 cm 2 (Corning, USA, C-25100) et on les a fait incuber tout en les laissant reposer dans une ambiance humide contenant 5 % de C 02 à 370 C pendant la nuit, ces conditions d'incubation étant utilisées dans les procédures suivantes. Le jour suivant, on a pipetté la culture douce- ment, on l'a transférée dans un tube à centrifugation et centrifugée à 400 x g Après avoir éliminé le liquide sur- nageant, la boulette de cellules a été mise en suspension dans 100 ml de milieu HAT Chaque fraction de 0,1 ml de la suspension de cellules a été inoculée dans chaque godet de la plaque de culture à 96 godets (Falcon 3072, Becton- Dickinson, USA) et cultivée pendant une semaine Après cul- ture dans du milieu HAT pendant une autre semaine, on a ajouté 25 pl de milieu HT tous les 2 ou 3 jours. B SELECTION ET CROISSANCE DE L'HYBRIDOME PRODUISANT L'ANTICORPS. On a utilisé un immunotest enzymatique en phase solide pour examiner la production de l'anticorps contre les cellules T 24 dans le liquide surnageant de chaque go- det au cours de la seconde semaine après la fusion des cellules. On a fait réagir les cellules T 24 fixées sur la plaque (Falcon 3072) avec 40 pi du liquide surnageant dans chaque godet à la température ambiante, pendant deux heu- res, on les a lavées complètement avec du PBS, on les a fait réagir pendant deux heures avec 100 pl d'anticorps immunoglobuline anti-souris lié à la peroxydase (Cappel Lab Inc, USA, Catalogue No 3211-0231) qui a été dilué 1000 fois avec du sérum de cheval, et on les a lavées entièrement avec du PBS- 200 pl de tampon de citrate ( 0,1 M, p H 4,5) contenant 1 mg/ml d'o-phénylènedimaine et 0,4 pl/ml de solution aqueuse d'eau oxygénée ont été ajou- tés et on les a fait réagir pendant 30 minutes pour obtenir la coloration. On a effectué le clonage dans trois godets conte- nant les anticorps qui réagissent avec les cellules T 24 par le procédé de la dilution limitante A savoir, 100 hybrido- mes de chacun des trois godets positifs en production d'an- ticorps ont été mis en suspension dans du D-MEM-FBS et mé- langés avec des cellules de rate obtenues à partir-de sou- ris BALB /c de la même manière que celle utilisée dans la fusion des cellules et ajustées dans du D-MEM-FBS ( 108 cellules) La concentration en cellules a été ajustée à x 10 par ml en ajoutant du D-MEM-FBS Chaque fraction de 0,2 ml du mélange de cellules a été inoculée dans chaque godet de la plaque de culture à 96 godets (Falcon 3072) et cultivée Le 14 ème jour après l'amorçage de la culture, la production de l'anticorps-a été examinée dans chaque godet au moyen de l'immunotest enzymatique en phase solide men- tionnée ci-dessus On a obtenu au total 16 hybridomes y compris T-009 à T-012 indiqués dans le' tableau 1 ci-dessous. EXEMPLE 4: PROPRIETES DE L'ANTICORPS CONTRE LA CELLULE DE CANCER HUMAIN DE LA VESSIE. A COMPARAISON DE LA REACTIVITE AVEC LES AUTRES CELLULES. On a utilisé l'immunotest enzymatique en phase solide de l'exemple 1 pour examiner les réactivités des liquides surnageants obtenus dans l'exemple 3 avec d'autres cellules obtenues par repiquage jin vitro; Intestin 407 (lignée de cellules de l'intestin humain foetale), K-562 (lignée de cellules leucémiques humaine) et 253 J (lignée de cellules de cancer rénopelvique humaine) de même que T 24 (lignée de cellules de cancer de la vessie urinaire humain) Comme on le voit dans le tableau 1 ci-dessous, l'anticorps sécrété par l'hybridome T-O 10 était hautement spécifique, c'est-à-dire a réagi fortement avec la T 24 alors qu'il a réagi à peine avec les autres cellules Les autres hybridomes ont montré des propriétés semblables. B COLORATION DE LA CELLULE PAR LA TECHNIQUE DE L'ANTICORPS FLUORESCENT. Les cellules T 24 ont été colorées par la techni- que de l'anticorps fluorescent indirecte en utilisant l'an- ticorps sécrété par l'hybridome T-O 10 A savoir, les cellu- les T 24 ont été fixées sur une lamelle de verre sans fluo- rescence, ont réagi avec le liquide surnageant ( 50 1) à 37 C pendant 45 minutes en atmosphère humide et ont été lavées par traitement pendant 3 à 5 minutes avec une solu- tion de PBS contenant 1 % d'albumine de sérum bovin, 10 m M de HEPES et 0,1 % de nitrure de sodium, ce procédé de lava- ge étant répété trois fois La réaction a encore été réali- sée dans les mêmes conditions pendant 45 minutes avec 50 pl d'une solution diluée 20 fois de Ig G anti-souris liée à de la fluorescéine (Miles-Yeda Ltd, Israel, Code N 65-171) et on a réalisé le procédé de lavage de la m&me manière que mentionné ci-dessus Après avoir séché légèrement, le tam- pon de carbonate ( 0,05 M, p H 9,5) contenant 10 % de glycé- rine a été mis de c 6 té et on a placé un couvercle en verre dessus pour faire une observation au moyen du microscope de fluorescence (Olympus, Japon, Model AH-RFL-LB)o On a observé une forte fluorescence à la surface de la cellule T 24 On a utilisé l'Ig G anti-souris liée à la fluorescéine après l'avoir soumise six fois à l'absorption avec la cel- lule T 24. C IDENTIFICATION DES CLASSES D'IMMUNOGLOBULINE. On a identifié les classes des immunoglobulines des anticorps sécrétés par les hybridomes T-OO 9 à T-012 par l'immunotest enzymatique en phase solide qui utilise l'anti-immunoglobuline (Ig), l'anti-Ig C et l'anti-Ig M (Cappel Lab Inc, USA, Catalogue N 3211-0231, 3211-0081, 3211-0201) comme anticorps immunoglobuline anti-souris lié à la peroxydase Les résultats sont indiqués dans le ta- bleau 1 ci-dessous. EXEMPLE 5: PREPARATION DE L'ANTICORPS CONTRE LA CELLULE DU CANCER HUMAIN DE LA VESSIE. A IMMUNISATION ET FUSION DES CELLULES. ( 1) PREPARATION DES CELLULES IMMUNOGENES: On a fait incu- ber la lignée de cellules du cancer de l'épithélium transi- tionnel de la vessie urinaire humain T 24 ( 2 x 105) obtenue par repiquage in vitro pendant une longue période, à 370 C dans une ambiance humide contenant 5 % d'anhydride carbo- nique dans du milieu MEM qui contient 10 % (v/v) de sérum bovin foetal et du sulfate de kanamycine (concentration finale, 60 mg/l) dans un récipient de culture de 100 mm (Falcon 3003, Becton-Dickinson, USA) Après trois jours de culture, on a exfolié les cellules en force et on a éliminé le liquide surnageant par-centrifugation Les cel- lules ont ensuite été lavées avec du PBS On a obtenu en- * viron 2 x 106 cellules par récipient de culture. ( 2) CULTURE DES MYELOMES: On a cultivé la lignée de cel- lules de myélome de souris Sp 2/O-Ag 14 ( 105 par ml) dans du D-MEM contenant 10 % (v/v) de sérum bovin foetal, 1 m M d'acide pyruvique, 2 m M de glutamine et 60 mg/l de sulfate de kanamycine par repiquage tous les trois jours La cel- lule a été ajustée à une concentration cellulaire de 2,5 x 105 par ml le jour précédant la fusion des cellules suivante et cultivée dans le milieu mentionné ci-dessus. ( 3) IMMUNISATION AVEC LES CELLULES T 24: Les cellules T 24 ( 5 x 106 10 x 106) obtenues en ( 1) ci-dessus et mises en suspension dans 0,4 ml de PBS ont été injectées par voie intrapéritonéale à des souris BALB/c femelles (NIHON CHARLES LIVER, JAPON, âgées de 9 semaines) quatre fois chaque mois approximativement pour l'immunisation. ( 4) FUSION DES CELLULES: On a réalisé la fusion des cel- lules selon le procédé de Kbhler et Milstein. Le quatrième jour après l'immunisation finale, on a tué les souris pour prélever la rate La rate a été détachée avec soin, passée à travers une toile en acier à mailles, centrifugée à 400 x g et on a ajouté aux cellules précipitées du tampon de tris-H Cl (p H 7,65) con- tenant 0,747 % de chlorure d'ammonium pour éliminer les érythrocytes et on a récupéré les cellules par centrifuga- tion ( 400 x g) Après avoirajouté du MEM aux cellules, on a effectué la centrifugation à 400 x g et on a mis une nouvelle fois les cellules en suspension dans du MEM frais. Après avoir répété trois fois ce procédé de lavage, on a mis finalement les cellules en suspension dans du MEM. On a exfolié les cellules Sp 2/0-Agl 4 du récipient de culture en pipettant et on les a transférées dans un tube à centrifugation Après centrifugation ( 400 x g), on a mis les cellules récupérées en suspension dans du MEM, on les a centrifugées ( 400 x g) pour éliminer le sérum et on les a mises une nouvelle fois en suspension dans du MEM. Les cellules de rate ( 8,5 x 107) et les cellules Sp 2/0-Agl 4 ( 1,7 x 107) ont été mélangées, pipettées avec soin et centrifugées ( 400 x g) Après avoir évacué le liquide surnageant, on a détaché le précipité en frappant doucement le tube à centrifugation Aux cellules détachées, on a ajouté 0,6 ml d'une solution de polyéthylèneglycol (PEG 1000) à 30 lo (v/v) dans du MEM maintenu à 37 WC Après avoir agité doucement, on a laissé reposer la solution à la température ambiante pendant 5 minutes On a réalisé la centrifugation à 7 x g pendant 2 minutes et on a ajouté progressivement 5 ml de MEM Après avoir agité doucement, on a effectué la centrifugation ( 400 x g) à la température ambiante pendant 5 minutes On a éliminé le liquide surna- geant, on a ajouté 5 ml de MEM au précipité centrifugé de la même manière et on a éliminé le liquide surnageant. Aux cellules précipitées, on a ajouté 5 ml de milieu D-MEM-FBS Après avoir pipetté, on a ajouté 30 ml de D-MEM-FBS à la suspension de cellules résultantes ( 5 ml). On a inoculé environ 25 mi de la suspension dans chaque récipient de culture de 25 cm (Corning, USA, C-25100) et on les a fait incuber tout en les laissant reposer dans une ambiance humide contenant 5 % de C 02 à 370 C pendant la nuit, ces conditions d'incubation étant utilisées dans les procédures suivantes. Le jour suivant, on a pipetté la culture douce- ment, on l'a transférée dans un tube à centrifugation et centrifugée à 400 x g Après avoir éliminé le liquide sur- nageant, la boulette de cellules a été mise en suspension dans 35 ml de milieu HAT Chaque fraction de 1 ml de la suspension a été inoculée dans chaque godet de la plaque de culture à 24 godets (Nunc 143982, Nunc, Danemark) et cultivée pendant une semaine A chaque godet, on a ajouté 0,25 ml de milieu HT tous les deux ou trois jours. B SELECTION ET CROISSANCE DE L'HYBRIDOME PRODUISANT L'ANTICORPS. On a utilisé un immunotest enzymatique en phase solide pour examiner la production de l'anticorps contre les cellules T 24 dans le liquide surnageant de chaque godet le 15 ème jour après la fusion des cellules. On a-fait réagir les cellules T 24 fixées sur une plaque (Falcon 3072) avec 40 Pl du liquide surnageant dans chaque godet à la température ambiante, pendant deux heu- res, on les a lavées complètement avec du PBS, on les a fait réagir pendant deux heures avec 100 pil d'anticorps immunoglobuline anti-souris lié à la peroxydase (Cappel Lab Inc USA, Catalogue No 3211-0231) qui a été dilué 1000 fois avec du sérum de cheval, et on les a lavées entièrement avec du PBS On a ajouté 200 pl de tampon de citrate ( 0,1 M, p H 4,5) contenant 1 mg/ml d'o-phénylène- diamine comme substrat et 0,4 pl/ml et on les a fait réa- gir pendant 30 minutes pour obtenir la coloration. On a effectué le clonage dans deux godets conte- nant les anticorps qui réagissent avec les cellules T 24 par culture de dilution limitante A savoir, 100 hybri- domes de chacun des deux godets positifs en production d'anticorps ont été mis en suspension dans du D-MEM-FBS et mélangés avec des cellules de rate obtenues à partir de souris BALB/c de la même manière que celle utilisée dans la fusion et ajustés dans du D-MEM-FBS ( 10 cellules). La concentration en cellules a été ajustée à 5 x 10 par ml en ajoutant du DMEM-FBS Chaque fraction de 0,2 ml du mélange de cellules a été inoculée dans chaque godet de la plaque de culture à 96 godets (Falcon 3072, Becton-Dickin- son, USA) et cultivée Le 12 ème jour après l'amorçage de la culture, on a examiné la production de l'anticorps dans chaque godet au moyen de l'immunotest enzymatique en phase solide mentionné ci-dessus On a obtenu au total 10 hybri- domes y compris T-007 et T-008 indiqués dans le tableau 1 ci-dessous. EXEMPLE 6: PROPRIETES DE L'ANTICORPS CONTRE LA CELLULE DE CANCER DE LA VESSIE HUMAIN. A COMPARAISON DE LA REACTIVITE AVEC LES AUTRES CELLULES - On a utilisé l'immunotest enzymatique en phase solide de l'exemple 1 pour examiner les réactivités des liquides surnageants obtenus dans l'exemple 5avec d'autres cellules obtenues par repiquage in vitro; Intestin 407 (lignée cellulaire d'intestin humain foetale), Du 145 (lignée cellulaire de cancer de la prostate humain) et 253 J (lignée cellulaire de cancer rénopelvique humain) de même que T 24 (lignée cellulaire du cancer de la vessie urinaire humain) Comme on le voit dans le tableau 1, l'an- ticorps sécrété par l'hybridome T-007 a fortement réagi avec la T-24 et a montré des réactivités légère ou relati- vement élevée avec les autres cellules L'anticorps sécré- té par la T-008 a fortement réagi avec la T 24 et n'a pas réagi avec l'Intestinale 407 ni avec la 253 J. B COLORATION DE LA CELLULE PAR LA TECHNIQUE DE L'ANTICORPS FLUORESCENT. Les cellules T 24 ont été colorées par la techni- que de l'anticorps fluorescent indirecte en utilisant l'an- ticorps sécrété par l'hybridome T-008 A savoir, les cel- lules T 24 ont été fixées sur une lamelle de verre sans fluorescence, ont réagi avec le liquide surnageant ( 50 pl) à 370 C pendant 45 minutes en atmosphère humain et ont été lavées par traitement pendant 3 à 5 minutes avec une solu- tion de PBS contenant 1 X d'albumine de sérum de bovin, m M de HEPES et 0, 1 % de nitrure de sodium, ce procédé de lavage étant répété trois fois La réaction a été réa- lisée encore dans les mêmes conditions pendant 45 minutes avec 50 pl d'une solution diluée 20 fois de Ig G anti-souris liée à de la fluorescéine (Miles-Yeda, Ltd, Israël, Code N 65-171) et on a réalisé le procédé de lavage de la même manière que mentionné ci-dessus Après avoir séché légère- ment, le tampon de carbonate ( 0,05 M, p H 9,5) contenant X de glycérine a été mis de côté et on a placé dessus un couvre-objet en verre pour faire une observation au microscope de fluorescence (Olympus, Japon, modèle AH-RPL- LB) On a observé une forte fluorescence à la surface des cellules T 24 On a utilisé l'Ig G anti-souris liée à la fluorescence après l'avoir soumise six fois à l'absorption avec les cellules T 24. (C) IDENTIFICATION DES CLASSES D'IMMUNOGLOBULIN Eo Les classes des immunoglobulines des anticorps sécrétés par les hybridomes T-007 et T-008 ont été identi- fiées par l'immunotest enzymatique en phase solide utili- sant l'anti-immunoglobuline (Ig), l'anti-Ig G et l'anti-Ig M (Cappel Lab Inc USA, Catalogue N 3211-0231, 3211-0081, 3211-0201) comme anticorps immunoglobuline anti-souris lié à la peroxydase Les résultats sont indiqués dans le ta- bleau ci-dessous. TABLEAU 1 SPECIFICITE classe Cancer Intestin Cancer Cancer Leucemie de 1 ' Hybri humain foetal humain humain humaine Immuno- dome de la humain de la réno globuline vessie prostate peltique T-24 I407 Du-145 253-J K-562 T-001 + + + + Ig G T-002 ++ + Ig G T-003 +++ + ++ + Ig G T-004 +++ ++ + Ig G T-005 +++ ++ + ++ Ig G T-006 +++ + + Ig G T-007 ++++ ++ ++ +++ Ig G T-008 ++++ ++ Ig G T-009 ++++ + + Ig M T-010 +++ + Ig G T-0-11 ++++ + + + Ig G T-012 ++++ + ++ Ig G +: positif: négatif EXEMPLE 7: PRODUCTION D'ANTICORPS (CULTURE IN VITRO): On a mis en suspension l'hybridome T-OO 1, T-002, T-003, T-004, T-005, T-006, T-007, T-008, T009, T-010, T-Oll ou T-012 dans du D-MEM contenant 20 X de sérum bovin foetal, 2 m M de glutamine, 1 m M d'acide pyruvique, 4,5 g/l de glucose, du 5-mercaptoéthanol 5 x 10-5 et 50 mg/1 de sulfate de ka- namycine à une concentration cellulaire de 1 x 105 par ml. On a inoculé la suspension résultante ( 25 ml) dans un réci- pient de 75 cm 2 pour la culture du tissu (Corning, USA) et on a fait incuber dans un incubateur à 5 % de C 02 à 37 C. Le quatrième jour, on a récupéré le liquide surnageant du récipient à l'état de croissance stationnaire Le nombre de cellules développées était approximativement de 2 x 106 par ml dans chaque hybridome et la teneur en anticorps des li- quides surnageants était respectivement de 1,9 (T-O Ol), 3,3 (T-002), 2,3 (T-003), 2,6 (T-004), 2,7 (T-005), 2,1 (T-006), 3,3 (T-007), 2,0 (T-008), 2,1 (T-OO 9), 3,1 (T-O 10), 4,0 (T-Ol) et 2,3 pg/ml (T-012). CULTURE IN VIVO: Uu 10 ème au 30 ème jour après injection intrapéritonéale de 0,5 ml de pristane, on a inoculé à des souris BALB/c par voie intrapéritonéale, 5 x 106 de chaque hybridome T-OO 1 à T-012, développé in vitro Deux ou trois semaines après, on a récupéré l'ascite et on l'a centrifugé à 100 x g, 4 C, 15 minutes pour obtenir le liquide surna- geant ascitique en une quantité de 30 ml environ pour chaque hybridome provenant de 10 souris La teneur en anticorps des liquides surnageants était respectivement de 1,1 (T-001), 1,3 (T-002), 2,6 (T-003), 2,3 (T-004), 2,1 (T-005), 1,7 (T-006), 2,0 (T-007), 3,1 (T-008), 2,0 (T-OO 9), 1,4 (T-O 10), 2,2 (T-Oil) et 3,0 mg/ml (T-012). Ces anticorps ont été administrés à des souris ICR ( 10 animaux dans chaque groupe) en une quantité de 2 g/kg par voie orale, 400 mg/kg par voie intrapéritonéale ou 200 mg/kg par voie intraveineuse et on a observé les souris pendant 14 jours On n'a observé aucune mort due à l'anticorps. Par ailleurs, les formes des hybridomes T-OO 1 à T-012 étaient approximativement sphériques, leurs dimen- sions étaient de 10-20 V, la plupart étant de 15 p environ, et les hybridomes flottaient et adhéraient faiblement à la paroi du récipient. EXEMPLE 8: IDENTIFICATION DU CANCER HUMAIN DE LA VESSIE PAR L'ANTICORPS. ( 1) SUJET: Un tissu contenant des cellules de cancer de la vessie urinaire humain obtenu par une opération chirur- gicale a été coagulé avec de l'alcool à 95 % enrobé dans de la paraffine pour préparer un échantillon de 4 pm. ( 2) IDENTIFICATION: Les identifications ont été effectuées par une technique d'anticorps fluorescent utilisant des anticorps (liquide surnageant ascitique) sécrétés par l'hybridome T-003. A savoir, on a ajouté à l'échantillon de tissu 0,1 ml de la solution, diluée 100 fois, de l'anticorps sus- mentionné et on a fait incuber à la température ambiante pendant une heure Après avoir lavé complètement avec du PBS, on a ajouté 0,1 ml de l'Ig G anti-souris liée à de la fluorescéine (Miles, USA) diluée 10 O fois et on l'a fait incuber à la température ambiante pendant une heure Après avoir éliminé par lavage avec du PBS, l'Ig G anti-souris lié à la fluorescéine n'ayant pas réagi, on a observé la fluorescence sur chaque échantillon de tissu de sujet de la lamelle de verre au moyen d'un microscope de fluores- cence (Olympus Vanox, Olympus, Japon) On n'a observé presque pas de fluorescence sur un tissu normal tandis qu'on a observé une forte fluorescence sur le tissu du cancer de la vessie Dans le but d'éviter une liaison non spécifique; l'Ig G anti-souris liée à la fluorescéine a été traitée préalablement par absorption avec la lignée de cellules T 24 du cancer de la vessie humain. EXEMPLE 9: ( 1) MARQUAGE PAR LA PEROXYDASE DE L'ANTICORPS SECRETE PAR L'HYBRIDOME T-006. On a dissous dans 1 ml d'eau distillée 4 mg de peroxydase de raifort (Sigma Type VI, Sigma, USA) et'on a ajouté 60 1 d'une solution de Na I 04 0,1 M préparée immé- diatement avant l'emploi, et on a mélangé à la température ambiante pendant 20 minutes On a dialysé la solution ré- sultante pendant toute la nuit contre un tampon à 1 m M d'acétate de sodium (p H 4,4) et on a ajouté 20 pm de solu- tion de carbonate de sodium 0,2 M Tout de suite après, on a ajouté l'anticorps sécrété par l'hybridome T-006 (li- quide surnageant ascitique purifié, teneur en protéine de mg) dissous dans 1 ml de tampon de carbonate 0,01 M (p H 9,5) et on l'a maintenu à la température ambiante pendant deux heures tout en agitant Après réaction, on a ajouté 0,1 ml de solution aqueuse de Na BH 4 fraîchement préparée ( 4 mg de Na BH 4 dissous dans 1 ml d'eau distillée) et on l'a laissée reposer à 40 C pendant deux heures et dialysée la nuit contre du PBS. La solution mélangée résultante a été envoyée (R) sur une colonne de Sephadex G-100 (R) (Pharmacia, Suède), éluée avec du PBS et on a récupéré la première fraction dont les absorbances à 280 nm et 403 nm correspondaient entre elles A 1 ml de la fraction (produit de liaison anticorps-enzyme), on a ajouté 10 mg d'albumine de sérum de lapin pour la dissolution et on l'a conservée à -70 C jusqu'à utilisation. ( 2) MARQUAGE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE DE L'ANTICORPS SECRETE PAR L'HYBRIDOME T-006. 5 mg de phosphatase alcaline de type VII (Sigma, USA), dialysée au préalable contre du PBS pour éliminer complètement le sulfate d'ammonium, et 17 mg d'anticorps sécrété par l'hybridome T-006 ont été dissous dans du PBS ramené à un volume total de 1 ml A la solution résultante, on a ajouté 10 pl d'une solution de glutaraldéhyde à 20 % et on a agité à la température ambiante pendant deux heu- res Après réaction, on a envoyé le mélange réactionnel sur une colonne de Sephadex G-200 (R) (Pharmacia, Suède) complété avec du tampon tris-H Cl (p H 7,6) et on l'a élué à l'aide du même tampon On a collecté une fraction de poids moléculaire élevé, du volume vide au point d'éluction de l'Ic G, on lui a ajouté jusqu'à 5 % (v/v) d'albumine de sérum de bovin, on l'a stérilisée par passage sur un filtre millipore ( 0,22, Millipore, USA) et l'a conservée à 40 C dans le noir jusqu'à utilisation. ( 3) MARQUAGE PAR LA e-GALACTOSIDASE DE L'ANTICORPS SECRETE PAR L'HYBRIDOME T-006. L'anticorps sécrété par l'hybridome T-006 a été marqué avec de la $galactosidase selon le procédé de ( 2) ci-dessus La e-galactosidase utilisée était du type Sigma qualité IV (Sigma, USA). ( 4) MARQUAGE PAR I DE L'ANTICORPS SECRETE PAR L'HYBRIDOME T-006. A 10 Pl de solution de Na I à 100 m Ci/ml (exempt de support, Amersham, USA), on a ajouté 50 pl de la solution d'anticorps sécrété par l'hybridome T-006 (liquide surnageant ascitique purifié, teneur en protéine de 1,0 mg/ml) et 30 il de tampon phosphate 0,5 M (p H 7,2) contenant 0,30 mg/ml de chloramine T et on a mélangé avec soin 15 secondes après, on a ajouté 100 1 pl de PBS saturé avec de la L-tyrosine et on a mélangé tout de suite On a chromatographié le mélange résultant sur une colonne char- gée avec de l'Amberlite IRA 400 et on l'a élué avec du PBS contenant 1 % d'albumine de sérum bovin La fraction éluée a été récupérée etconservée à 4 C jusqu'à utilisation. L'activité spécifique du produit marqué était de 1,0 p Ci par mg de protéine d'anticorps. ( 5) MARQUAGE PAR LA FLUORESCEINE DE L'ANTICORPS SECRETE PAR L'HYBRIDOME T-006. A 1 ml de solution de l'anticorps sécrété par l'hybridome T-006 (liquide surnageant ascitique purifié) à une concentration de 10 mg/ml, on a ajouté 0,1 ml de tampon carbonate 0,5 M (p H 9,3), on a ajouté encore 0,1 mg de poudre d'isothiocyanate de fluorescéine et on a agité à 4 C pendant 6 heures sans faire barboter Immédiatement après réaction, on a envoyé le mélange réactionnel sur une colonne Sephadex G-25 (R) (Pharmacia, Suède) pour éliminer les substances de bas poids moléculaire n'ayant pas réagi et on a obtenu la fraction de poids moléculaire élevé dé- sirée Le produit obtenu a été conservé à 4 C dans le noir jusqu'à utilisation. ( 6) MARQUAGE PAR LA TETRAMETHYLRHODAMINE DE L'ANTICORPS SECRETE PAR L'HYBRIDOME T-006. A 1 ml de solution à 10 mg/ml de l'anticorps se- crété par l'hybridome T-006 (liquide surnageant ascitique purifié), on a ajouté 0,1 ml de tampon carbonate de tétra- méthylrhodamine-isothiocyanate et on a agité à 40 C pendant heures sans barbottage Après réaction, le mélange réactionnel a été immédiatement envoyé sur une colonne Sephadex G-20 (R) (Pharmacia, Suède) pour éliminer les substances de bas poids moléculaire n'ayant pas réagi et on a obtenu la fraction de poids moléculaire élevé désirée. Le produit a été conservé à 4 C dans le noir avant utilisa- tion. ( 7) MARQUAGE PAR LA BIOTINE DE L'ANTICORPS SECRETE PAR L'HYBRIDOME T-006. 1 m M de d-biotine ( 244 mg) (Walko Pure Chemical Industries, Ltd, Japon) et 1,5 m M de N-hydroxysuccinimide ( 173 mg) (Eastam Kodak, USA) ont été dissous dans un mélan- ge de 8 ml de diméthylsulfoxyde (Walko Pure Chemical Indus- tries, Ltd, Japon) et de 5 ml de 1,2-diméthoxyéthane (Nakarai Chemical, Japon) A la solution résultante, on a ajouté une solution de 206 mg ( 1 m M), de N,N')dicyclohexyl- carbodiimide (Kanto Chemical, Japon) dans O,5 ml de 1,2- diméthoxyéthane et on fait réagir à 4 C pendant la nuit. Le précipité résultant a été séparé par filtration pour obtenir un filtrat On a éliminé sous vide le solvant contenu dans le filtrat et on a dissous le matériau huileux résiduel dans 10 ml de dichlorométhane (Walko Pure Chemical Industries, Ltd, Japon) et on a refroidi à 4 C On a ajouté ml d'une solution de Na HCO 3 0,1 M ( 4 C) et on a agité pour bien mélanger On a éliminé la phase dichlorométhane résultante, on a ajouté 10 ml de Na HCO 3 0,1 M et puis 10 ml d'eau distillée à 4 C, et on a répété encore ces procédures. On a ajouté la phase dichlorométhane résultante à de la poudre anhydre de sulfate de sodium (Koisumi Chemical, Japon) pour la déshydrater On a séparé la poudre par fil- tration et on a ajouté progressivement du m-hexane au fil- trat à rendre trouble On a refroidi la solution à -200 C, on a placé le cristal précipité dans un dessicateur pour éliminer le solvant et le faire sécher On a obtenu le pro- duit, l'ester de biotine-N-hydroxysuccinimide. On a dissous la biotine-N-hydroxysuccinimide dans du diméthylsulfoxyde et on a ajusté la concentration à 1 mg/ml On a mélangé la solution ( 60 p 1) avec 1 ml de solu- tion de l'anticorps sécrété par l'hybridome T-006 (liquide surnageant ascitique purifié, teneur en protéine de 1 mg/ml) et on l'a fait réagir à la température ambiante pendant 4 heures Après réaction, la solution a été dialysée contre du PBS à 4 C pendant trois jours Pour cela, le liquide de dialyse a été changé trois fois Le dialysat (solution dans le tube à dialyse) a été conservé à 4 C jusqu'à utili- sation. EXEMPLE 10: IDENTIFICATION DU CANCER HUMAIN DE LA VESSIE PAR DES ANTICORPS MARQUES. ( 1) SUJET: Des tissus contenant le cancer de la vessie urinaire humain ont été obtenus lors d'opérations chirur- gicales A savoir, les tissus bruts de 5 x 5 x 2 mm de di- mensions ou moins sont fixés tout en agitant à 4 C pendant 6 heures dans un liquide de fixation PLP (tampon de phos- phate de sodium, p H 6,2, contenant 0,01 M de Na IO 4, 0,075 M de lysine et 3 X de paraformaldéhyde) Les tissus fixés ont été lavés en les traitant avec du PBS contenant 10 % de su- crose ( 4 C, pendant la nuit), du PBS contenant 15 % de su- crose ( 40 C, 6 heures), du PBS contenant 20 Z de sucrose ( 4 C, 6 heures), et ensuite dans du PBS contenant 20 % de sucrose et 10 % de glycérine ( 4 C, 1 heure) successivement. Après avoir été lavé, le tissu a été enrobé, congelé dans de l'éthanolglace sec et soumis à un cryostat pour obtenir un spécimen congelé de 10 Nm. ( 2) METHODE D'IDENTIFICATION: On a placé l'échantillon congelé sur une lame porte-objet revêtue d'albumine de sérum bovin et on l'a séché Après avoir été lavé trois fois avec du PBS à 40 C pendant 5 minutes, on a fait réagir l'échantillon avec de l'acide periodique 0,005 M à la tem- pérature ambiante pendant 10 minutes Après avoir lavé trois fois avec du PBS maintenu à 4 C, on a traité l'é- chantillon à la température ambiante pendant 10 minutes avec du PBS contenant 10 % de sérum de cheval On a placé sur l'échantillon à l'aide d'une pipette capillaire la solution de l'anticorps diluée 10 fois, issue de l'hybri- dome T-006 marqué par de la peroxydase, de la phosphatase alcaline, de la fluorescéine, de la rhodamine ou de la biotine préparée dans l'exemple 9 et on l'a fait réagir à la température ambiante pendant 45 minutes et ensuite lavé cinq fois avec du PBS à 4 C L'échantillon obtenu a été identifié de la manière suivante. (a) METHODE DE L'ANTICORPS FLUORESCENT: Dans les anticorps marqués par la rhodamine et par la fluorescéine, l'échan- tillon a été noyé dans la glycérine et observé sous un microscope à fluorescence (Olympus Vanox, Olympus, Japon). Dans l'anticorps marqué à la biotine, une goutte d'avidine à 5 pg/ml liée à de la fluorescéine (Funakoshi Yakuhin, Japon) a été ajoutée sur l'échantillon et on l'a faite réagir à 37 C pendant 1 heure Après avoir lavé cinq fois avec du PBS, l'échantillon qui a réagi a été noyé dans la glycérine et examiné sous un microscope à fluorescence (Olympus Vanox, Olympus, Japon). (b) IMMUNOTEST ENZYMATIQUE: Dans l'anticorps marqués à la peroxydase, on a fait réagir l'échantillon avec un tampon de tris-H Cl 0,1 M (p H 7,6) contenant 0,02 ml/ml de H 202 à 1 % et 0,5 mg/ml de 3,3-diaminobenzidine-H Cl à la tem- pérature ambiante pendant 10 minutes Après réaction, on a lavé l'échantillon qui a réagi avec du PBS, à 4 C, trois fois, et avec de l'eau distillée une fois Après l'avoir coloré avec du tampon véronalacétate (p H 4,0) contenant 1 % de vert de méthyle, l'échantillon a été déshydraté par l'éthanol, dialysépar du xylol, enrobé dans du baume et on a observé la couleur (brun) au microscope. Dans l'anticorps marqué par la phosphatase alca- line, on a fait réagir l'échantillon avec du tampon tris-H Cl 0,2 M (p H 8,5, filtré immédiatement après utili- sation) contenant du sulfate de magnésium 0,39 M, 0,2 X de citrate de plomb, 0,6 % d'acide 0-glycérophosphorique et 4 X de sucrose à la température ambiante pendant 10 minutes Après réaction, l'échantillon ayant réagi a été lavé trois fois avec du PBS maintenu à 40 C et puis une fois avec de l'eau distillée On a fait réagir ensuite l'échan- tillon dans une solution à 1 % de sulfure d'ammonium jaune à la température ambiante pendant 5 minutes, on l'a lavé complètement avec du PBS, incorporé dans de la glycérine et on a observé la couleur (brun noir) au microscope. Ces résultats sont indiqués dans le tableau 2. TABLEAU 2 Méthode Marquage de Réactivité l'anticorps Tissu Tissu cancéreux normal Méthode de Fluorescéine + l'anticorps fluorescent Rhodamine + Biotine + Immunotest Peroxydase + 1 enzymatique Phosphatase + 2 alcaline +: fluorescence positive + 1: brun observé + 2: brun non observé : négatif EXEMPLE 11: IMAGE SCINTIGRAPHIQUE DE LA CELLULE CANCEREUSE PAR L'ANTICORPS. Une lignée de cellules T 24 ( 1 x 10 cellules) de cancer de la vessie urinaire humain a été transplanté par voie sous-cutanée dans la cuisse droite de souris BALB/c nu/nu femelles âgées de 8 semaines (trois animaux dans chaque groupe) 30 jours après, la dimension de la tumeur était de 1 cm 2 ou plus et on a injecté par voie intravei- neuse l'anticorps marqué à l'I 125 sécrété par l'hybridome T-006, préparé dans l'exemple 9, en une quantité unitaire de 35 p Ci par souris ou l'Ig G de souris marquée à l'u 12 pour comparaison en une quantité unitaire de 10 p Ci par souris 96 heures après, on a réalisé à l'aide d'une caméra gamma la scintigraphie du corps entier. On a observé sur la tumeur une remarquable accu- mulation de radioactivité chez tous les animaux auxquels on avait administré l'anticorps marqué à l'I 125 de l'inven- tion tandis qu'on a observé moins d'accumulation chez les animaux témoins. EXEMPLE 12: MARQUAGE DE L'ANTICORPS PAR LE CHLORHYDRATE DE DOXORUBINE OU DE MITOMYCINE. Après avoir ajusté à 10,4 mg/ml par addition d'eau distillée, on a ajouté à l'anticorps (liquide surna- geant ascitique purifié) issu de l'hybridome T-002, T-008 ou T-O 10, 13,0 mg de mitomycine, et ensuite on a ajouté de l'acide chlorhydrique tout en agitant afin d'ajuster le p H de la solution à 4,75 et simultanément 3,7 mg de chlorhy- drate de 1-éthyl-3 ( 3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide. * Apres avoir fait réagir pendant 10, 30 ou 60 minutes, on a arrêté la réaction en ajoutant 2 ml de tampon d'acétate (p H 4,70) On a ensuite dialysé le mélange réactionnel contre 5 litres d'eau distillée à 4 C pendant 72 heures tout en changeant trois fois la solution de dialyse Après avoir concentré, le dialysat a été envoyé sur une colonne de 1,5 cm de diamètre et 55 cm de hauteur chargée en Sephadex G-25 (R) (Pharmacia, Suède) afin d'éliminer com- plètement les substances de bas poids moléculaires Afin d'obtenir le produit de liaison mitomycine-anticorps, la solution résultante a été lyophilisée à -20 o C Les propor- tions de liaison de la mitomycine dans les produits par mg d'anticorps sont indiquées dans le tableau 3. Les produits de liaison du chlorhydrate de doxo- rubicine avec les anticorps ont été obtenus de la même manière que mentionné ci-avant Les proportions de liaison du chlorhydrate de doxorubicine dans les produits par mg d'anticorps sont indiquées dans le tableau 3. D'autre part, ces produits de liaison d'agent anticancéreux avec l'anticorps ont été administrés à des souris IRC de groupes de 10 animaux chacun en une quantité unitaire de 400 mg/kg par voie orale, 100 mg/kg par voie intrapéritonéale ou 50 mg/kg par voie intraveineuse Aucun décès n'a été observé pendant 14 jours. TABLEAU 3 Agent anti Anticorps Taux de liaison (pg/mg) cancéreux min 30 min 60 min. dérivé de T-002 4 8 10 mitomycine " T-008 4 8 9 " T-O 10 4 7 10 chlorhydrate dérivé de T-002 4 7 11 de doxo " T-008 4 7 10 rubicine " T010 4 7 10 EXEMPLE 13: EFFET ANTITUMEUR IN VITRO DE L'ANTICORPS. Pour examiner l'effet antitumeur de lianticorps, ou du produit de liaison avec l'agent anticancéreux préparé dans l'exemple 12, on a utilisé une lignée de cellules T 24 de cancer de la vessie urinaire humain repiquées in vitro. A savoir, on a ajusté les cellules avec du MEM de Eagle contenant 10 % de sérum bovin foetal à une concentration cellulaire de 5 x 104 par ml, on les a placées dans une boite de pétri en des fractions de 5 ml chacune, et on les a fait incuber à 370 C pendant 24 heures dans-un incubateur à 5 % de C 02 L'anticorps issu de l'hybridome T-008 ou l'anticorps lié à la mitomycine issu de l'hybridome T-008 (produit d'une réaction de 60 minutes) a été ajouté dans la boite et cultivé ultérieurement 24 heures après l'addi- tion du médicament, on a ajouté 1 p Ci/ml de L-(U-C 14) leu- cine (RCC, USA, radioactivité spécifique de 342 m Ci/m mole) au mélange réactionnel et on a fait incuber pendant deux Ieures Après culture, on a éliminé le milieu de culture et on a lavé les cellules trois fois avec du PBS (p H 7,2) et on les a refroidies à 00 C, traitées avec une solution d'acide trichloracétique à 5 % et on a transféré les cellu- les lavées sur un filtre en papier et on les a séchées On a mesuré la radioactivité incorporée dans la protéine cel- lulaire à l'aide d'un compteur à scintillation liquide (Packard, USA). Les résultats sont indiqués dans la figure 1. Dans la figure 1, l'ordonnée représente la quantité de radioactivité (C leucine) en pourcentage de la quantité incorporée par le témoin non traité. Comme on observe dans la figure 1, la concentra- tion indiquant 50 % d'inhibition de l'incorporation de la radioactivité a été diminuée par le produit de liaison de l'anticorps et de la initomycine par rapport au témoin. EXEMPLE 14: EFFET ANTITUMEUR IN VIVO DE L'ANTIGENE. Une lignée de cellules T 24 ( 6 x 10 cellules par animal) de cancer de la vessie urinaire humain a été transplantée par voieintrapéritonéale à des souris BALB/c nu/nu femelles par groupes de 10 animaux chacun 5 et 72 heures après, l'anticorps sécrété par l'hybridome T-008 ou le produit de liaison avec la mitomycine de l'anticorps issu de T-008 (produit de réaction de 60 minutes, 50 pg/ml de mitomycine) a été injecté par voie intrapéritonéale aux souris en une quantité unitaire de 450 pg par souris ( 20 pg de mitomycine par souris) et la proportion de survivants a été observée pendant 60 jours pour estimer l'activité anti- tumeur du médicament administré. Les résultats sont indiqués dans la figure 2. Dans la figure 2, l'ordonnée représente le taux de survi- vant (%) et l'abscisse représente le nombre de jours après transplantation des cellules tumorales. Comme on peut observer à partir de la figure 2, le nombre de jours pour lequel 50 % des animaux survécurent a été prolongé par le produit de liaison mitomycine-anti- gène De plus, on a observé aussi la prolongation de la durée de vie par l'administration de l'antigène seul. REVENDICATIONS 1 Procédé pour préparer un anticorps contre l'antigène de surface d'une cellule de cancer humain de la vessie, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation -5 d'un hybridome entre une cellule capable de produire l'an- ticorps et une cellule qui peut être conservée de façon permanente par repiquage in vitro et td récupération de l'anticorps sécrété par l'hybridome. 2 Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cellule capable de produire l'anticorps est une cellule de rate, une cellule de ganglion lymphatique, une cellule - leucocyte du sang périphérique ou un mélange de celles-ci. 3 Procédé selon la revendication 2, dans lequel la cellule est dérivée d'une souris. 4 Procédé'selon la revendication 3, dans lequel la souris est une souris BALB/c ou une souris hybride de celle-ci. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cellule qui peut être conservée de manière permanente par repiquage in vitro-est une cellule de myélome 6 Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cellule qui peut être conservée de manière permanente par repiquage in vitro est déficitaire en hypoxanthine- guanine phosphoribosyltransférase ou en thymidine kinase. 7 Procédé selon la revendication 5 ou 6, dans lequel la cellule est dérivée d'une souris. 8 Procédé selon la revendication 7, dans lequel la cellule est dérivée de la lignée de cellules P 3-X 63-Ag 8, P 3/NSI/1-Ag 4-1, Sp 2/0-Agl 4 ou X 63-Ag 8 653. 9 Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cellule capable deproduire l'anticorps est dérivée d'un animal immunisé avec les cellules du cancer de la vessie urinaire humain. Procédé selon la revendication 1, dans le- quel l'hybridome est préparé en présence de polyéthylène- glycol. 11 Procédé selon la revendication 1, dans le- quel l'hybridome est cultivé dans un milieu contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine pour la sélection. 12 Procédé selon la revendication 1, dans le- quel l'hybridome est cloné pour obtenir un clone unique. 13 Procédé selon la revendication 12, dans le- quel le clonage est réalisé par culture de dilution limi- tante, culture sur gélose molle ou culture sur gel de fi- brine. 14 Procédé selon la revendication 1, dans le- quel l'hybridome est cultivé in vitro pour la sécrétion de l'anticorps. 15 Procédé selon la revendication 1, dans le- quel l'hybridome est transplanté dans un animal et cultivé in vitro et l'anticorps sécrété est séparé d'un fluide cor- porel de l'animal. 16 Procédé selon la revendication 15, dans le quel le fluide corporel est le sérum ou l'ascite. 17 Procédé selon la revendication 15 ou 16, dans lequel l'animal est une souris. 18 Procédé selon la revendication 17, dans le- quel la souris est une souris BALB/c ou une souris hybride de celles-ci. 19 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 18, dans lequel le cancer de la vessie urinaire humain est une lignée de cellules cancéreuses T 24 de l'épi- thélium transitionnel de la vessie urinaire humain. 20 Hybridome produisant un anticorps contre l'antigène de surface d'une cellule de cancer de la vessie urinaire humain, préparé à partir d'une cellule capable de produire l'anticorps et une cellule qui peut être conservée de façon permanente par repiquage in vitro. 21 Hybridome T-001, T-002, T-003, T-004, T-005, T-006, T-007 i T-008, T-009, T-010, T-011 ou T-012. 22 Anticorps contre l'antigène de surface d'une cellule de cancer de la vessie urinaire humain, préparé selon le procédé de la revendication 1. 23 Anticorps selon la revendication 22, qui est sécrété par l'hybridome T001, T-002, T-003, T-004, T-005, T-006, T-007, T-008, T-009, T-010, T-011 ou T-012. 24 Réactif pour la classification et/ou l'iden- tificat::on du cancer de la vessie urinaire humain, qui contient un ou plusieurs anticorps selon la revendication- 22. Réactif selon la revendication 24, qui con- tient de plus un support ou un diluant. 26 Réactif selon la revendication 24 ou 25, dans lequel le cancer de la vessie urinaire humain est la lignée de cellules T 24 du cancer de l'épithélium transi- tionnel de la vessie urinaire. 27 Réactif pour l'identification du cancer de la vessie urinaire dé l'homme ou d'un animal. 28 Dérivé ou produit de restriction de l'anti- corps selon la revendication 22. 29 Dérivé selon la revendication 28, -dans lequel une substance radioactive, un colorant fluorescent, une enzyme, une substance de marquage pour la microscopie électronique ou un groupe résiduel contenant une structure pour la combinaison secondaire de celui-ci est lié(e) chi- miquement à l'anticorps. Produit de restriction selon la revendication 28, qui est obtenu par clivage restrictif de l'anticorps par un traitement chimique ou un traitement enzymatique. 31 Dérivé selon la revendication 28, dans lequel la substance radioactive est 1 I. 32 Dérivé selon la revendication 29, dans lequel le colorant fluorescent est la fluorescéine ou la rhodamine. 33 Dérivé selon la revendication 29, dans lequel l'enzyme est la peroxydase ou la phosphatase alcaline. 34 Dérivé selon la revendication 29, dans lequel la structure est la biotine. Réactif pour la classification et/ou l'iden- tification du cancer de la vessie urinaire humain, qui con- tient un ou plusieurs dérivés ou produits de restriction selon la revendication 28. 36 Réactif selon la revendication 35, qui con- tient de plus un support ou un diluant. 37 Procédé de classification et/ou d'identifi- cation du cancer de la vessie urinaire humain avec l'uti- lisation du réactif selon la revendication 24 ou 35. 38 Procédé selon la revendication 37, dans le- quel un sujet contenant la cellule de cancer de la vessie urinaire humain est en contact avec le réactif et on utili- se la réaction antigène-anticorps. 39 Procédé selon la revendication 38, dans le- quel le sujet est dérivé de l'homme ou d'un animal. Agent pharmaceutique sous la forme de quan- tité unitaire pour le traitement du cancer de la vessie urinaire humain contenant un ou plusieurs anticorps selon la revendication 22. 41 Agent selon la revendication 40, qui contient de plus un support ou un diluant. 42 Produit de liaison de l'anticorps selon la re- vendication 22 avec un agent anti-cancer. 43 Produit selon la revendication 42, dans le- quel l'agent anti-cancer est le chlorhydrate de mitomycine ou de doxorubicine. 44 Agent pharmaceutique pour le traitement du cancer de la vessie urinaire humain contenant un ou plu- sieurs produits de liaison selon la revendication 42. Agent pharmaceutique selon la revendication ou 44, qui est sous la forme injectable. 46 Procédé de traitement du cancer de la vessie urinaire humain avec l'utilisation de l'agent selon -la revendication 40 ou 44.