Brevet FR2536763A1 — publié le 19840601

La présente invention concerne le nouvel anti- biotique antitumoral awamycine et sa production Plus particulièrement, l'invention concerne le nouvel antibiotique awamycine que l'on produit en cultivant le microorganisme producteur de l'antibiotique awamycine et appartenant au genre Streptomyces, qui présente une activité antimicrobienne contre les bactéries grame- positives et présente une activité d'inhibition de la croissance contre les cellules du carcinome de l'ascite d'Ehrlich et les cellules 180 du sarcome ou son sel et sa production. On a maintenant trouvé qu'une souche de microorganisme 80-217 isolée à partir d'un échantillon de sol recueilli à Minagawa-cho, Tochigi-ken, Japon, produit une substance antibiotique active contre les bactéries gram-positives et présente une activité d'inhibition de la croissance contre les cellules du carcinome de l'ascite d'Ehrlich et les cellules 180 du sarcome On a également isolé et purifié ladite substance active à partir dudit bouillon cultivé et désigné ladite substance comme le nouvel antibiotique awamycine. L'invention a pour objet de fournir un anti- biotique awamycine ayant les propriétés physico- chimiques présentées ci-dessous. L'invention a également pour objet de fournir un procédé de production du nouvel antibiotique awamy- cine dans lequel on cultive le microorganisme produc- teur de l'antibiotique awamycine et appartenant au genre Streptomyces pour accumuler l'antibiotique awamycine et isoler l'antibiotique awamycine dudit bouillon cultivé. On emploie un microorganisme producteur de l'antibiotique awamycine (appelé ci-dessous awamycine) et appartenant au genre Streptoomyces, et la-Bouche de microorganisme 80-217 appartenant au genre Streptomyces isolée par les présents inventeurs est la souche préférée utilisée dans l'invention. Les propriétés taxonomiques de la souche de microorganisme 80-217 sont les suivantes: a: Propriétés morphologiques: A l'observation à 270 C pendant 11 jours sur un milieu en plaque de gélose de Waksman, la souche 80-217 a un mycélium aérien cylindrique avec une surface écailleuse et des sporangiophores de 0,78-0,95 i de longueur. b: Les conditions de croissance observées sur divers milieux à 27 WC pendant 14 jours de culture sont les suivantes. Mycélium aérien Envers Pigment soluble Levure gélose modérée gris brun - d'extrait de malt Gélose de fari modérée gris gras - ne d'avoine Gélose inor bonne gris-blanc brun-jau brun ganique d'ami n Atre pâle don Glycérol gélo bonne gris-blanc brun - se d'asparagine pâle Peptone Gélose modérée brun pâle doré fer-levure blanc Gélose de modérée gris brun - tyrosine pâle Gélose modérée gris gris - nutritive : trace de pigment soluble formation. (mélanoïde) ou pas de c Propriétés physiologiques: ( 1) Température de croissance: 20-37 C, optimum à 27 "C, ( 2) Liquéfaction de la gélatine (gélose glucose-peptone- gélatine): positive, ( 3) Hydrolyse de l'amidon (gélose amidoninorganique): positive, ( 4) Coagulation du lait écrémé et peptonisation (milieu lait écrémé à 10 %): faiblement positive pour la peptonisation; ( 5) Formation de pigment de type mélanine (milieu gélose de tyrosine et milieu gélose peptone-extrait de levure-fer): négative, Milieu Croissance ( 6) Formation d'H 2 S (milieu de gélose peptone-extrait de levure): négative, ( 7) Formation de nitrite (milieu nitrate): positive. d Assimilation des sources gélose de Pridham-Gottlieb, L-arabinose Dxylose D-glucose D-fructose Saccharose Inositol L-rhamnose Raffinose Dmannitol de carbone (milieu de 27 "C, 1 à 2 mois): ++ + ++ + + e) Composition de la paroi cellulaire: On détecte l'acide diaminopimélique type LL par le procédé de Becker et collo (Appl Microbiol, 13, 236-243 ( 1965)). Comme il a été dit ci-dessus, la souche 80-217 de l'invention appartient au genre Streptomyceso La souche a été déposée au Fermentation Institute, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, Japon, sous le n FERM P-6786. On peut en général facilement obtenir une mutation des propriétés taxonomiques de Streptomyces par une mutation naturelle ou artificielle classique, par exemple par irradiation UV, irradiation aux rayons X ou par des agents mutagènes chimiques comme la N méthyl-N-nitro-Nnitrosoguanidine ou le méthanesulfonate d'éthyle On peut utiliser dans l'invention un mutant produit par mutation artificielle ou naturelle, apparte- nant à Streptomyces et ayant une activité de production s de Ilantibiotique awamycine. Dans l'invention, on cultive le microorganisme producteur d'awamycine et appartenant au genre Streptomyces dans un milieu classique pour Streptomyces. On utilise un milieu nutritif contenant des sources de carbone assimilables, des sources d'azote et si néces- saire des sels inorganiques Comme exemples de sources de carbone assimilables on peut citer le glucose, le saccharose, le mannitol, la mélasse, l'amidon, la dextrine, la cellulose, le glycérol ou un acide organi- que, combinés ou isolément Comme exemples de sources d'azote assimilables on peut citer l'azote organique comme la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la levure sèche, la poudre de soja, la liqueur de mais macéré, le tourteau de graine de coton, la caséine, l'hydrolysat deprotéine de soja, les acides aminés ou l'urée ou des sources d'azote inorganique comme les nitrates ou les sels d'ammonium, combinés ou isolément. En outre, si nécessaire, on peut ajouter un sel inorganique comme de sodium, de potassium de calcium ou de magnésium, ou un sel de phosphata On peut si on le désire ajouter au milieu d'autres oligo-éléments nutri- tifs, stimulateurs de croissance ou précurseurs. La culture s'effectue dans des conditions aéro- bies comme en agitant ou dans une culture agitée avec aération Dans la production industrielle, on préfère la culture aérée en gélose profonde Le-p H du milieu est de préférence acide ou neutre La température de culture est à 20-370 C, habituellement à 24-30 *C ou de préférence à 270 C Dans une culture liquide, la durée de culture est généralement de 4 à 6 jours. La culture doit naturellement être arrêtée au maximum de production d'antibiotique Ces conditions peuvent être modifiées selon le type de souche utilisé ou d'autres conditions On peut également ajouter si on le désire un agent anti-mousse comme une huile de silicone, une huile végétale ou un agent tensio-actif. L'antibiotique awamycine ainsi produit est accumulé dans un bouillon de culture, et peut être iso- lé du filtrat de culture en filtrant le bouillon cultivé à l'aide de Célite ou d'Hyflosupercel (marques déposées), ou par centrifugation. Afin d'isoler et de purifier l'antibiotique awamycine,on peut utiliser un procédé de purification appliquant la nature dudit antibiotique, insoluble dans l'hexane ou l'éther de pétrole, légèrement soluble dans l'eau ou le diéthyléther et soluble dans un solvant de la série alcool comme le méthanol ou l'éthanol, un solvant de la série chloroforme comme l'acétone ou la méthyl-isobutyl-cétone, un solvant de la série ester comme l'acétate d'éthyle ou l'acétate de butyle, le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde En général, 1 'awamycine est transférée à un solvant organique par extraction du filtrat de culture avec un solvant orga- nique non miscible à l'eau comme le chloroforme, la méthylisobutylcétone, l'acétate d'éthyle ou l'acétate de butyle, de préférence à un p H de 6,0-7,0. Si on le désire, on lave la couche organique obtenue avec une solution diluée de tétraacétate d'éthylènediamine (EDTA) pour isoler l'ion métallique, puis on déshydrate en ajoutant du sulfate de sodium anhydre, du sulfate de magnésium anhydre ou un gel de perles On enlève la couche organique séchée par distil- lation sous vide Bien que l'awamycine soit stable au chauffage, il est cependant préférable de maintenir la température de chauffage sous vide en-despous de 600 C. On peut précipiter l'awamycine en ajoutant au résidu del'hexane ou de l'éther de pétrole On lave le précipité plusieurs fois avec de l'hexane, on filtre ou on centrifuge pour obtenir l'awamycine brute On peut effectuer unepurification plus poussée par chromatogra- phie échangeuse d'ions en utilisant une résine échan- geuse d'ions comme la cellulose échangeuse d'ions ou le Sephadex (marque déposée) échangeur d'ions, une chroma- tographie d'adsorption en utilisant du charbon activé, du gel de silice, de l'alumine, de l'hydroxyapatite, de la cellulose ou une résine d'adsorption comme HP-10, une chromatographie sur gel en utilisant du Sephadex ou du Biogel (marque déposée), une électrophorèse, une dis- tribution à contre-courant, une ultrafiltration ou une concentration, en combinaison ou séparément Par exemple, on introduit la substance brute dissoute dans une faible quantité de méthanol, d'acétone, de chloroforme ou de benzène dans une colonne de gel de silice, on l'en élue avec un mélange de benzène et d'acétone et on concentre sous vide les fractions actives Ensuite, on dissout le concentré dans une faible quantité de chloroforme, on l'introduit à nouveau dans une colonne de gel de silice et on élue avec du chloroforme-méthanol. On fait passer les fractions actives à travers une colonne de Sephadex LH20 que l'on élue avec du méthanol et que l'on chromatographie sur une colonne de gel de silice, puis on élue avec du benzène-méthanol pour purifier la substance active. L'awamycine ainsi obtenue est une substance basi- que et on la transforme en sel par unprocédé classique. Ce sel est un sel pharmacologiquement acceptable, par exemple un sel de métal alcalin comme le sodium ou le potassium, un sel de métal alcalinoterreux comme le calcium ou le magnésium, ou un sel d'amine-organique connu. Les propriétés physico-chimiques et les propriétés biologiques de l'awamycine sont les suivantes. 1 Propriétés physico-chimiques: ( 1) Analyse élémentaire: comprend du carbone, de l'hydro- gène, de l'oxygène et de l'azote; C 59,16 %; H 6,48 %; N 1,88 %. ( 2) Poids moléculaire: 744 + 1 (spectre de masse FD), ( 3) Pf: 158 C, ( 4) Pouvoir rotatoire spécifique: lal 4 = + 836 (c = - 0,1, chloroforme), ( 5) Spectre UV: figure 1, Me OH 1 max (E %cm) 218 nm ( 352), 245 nm (inflexion), 272 nm (inflexion), 340 nm (inflexion), 480 nm, X Na OH 0,1 N/Me OH = 225 nm, 350 nm (inflexion), 480 nm, max ( 6) Spectre infra-rouge (K Br=: figure 2, 3500-3400, 2900, 1730, 1660, 1620, 1480, 1460, 1438, 1403, 1370, 1290, 1250, 1210, 1170, 1142, 1105, 1080, 1060, 1040, 980, 970, 920, 880, 830, 790, 740, 700 cm 1 ( 7) Solubilité: insoluble dans: hexane et éther de pétrole, légèrement soluble dans: diéthyléther, soluble dans: solvant de la série alcool comme le méthanol ou laéthanol, solvant de la série méthane chloré comme le dichlorométhane ou le chloroforme, solvant de la série cétone comme l'acétone ou la méthyl-isobutyl-cétone, solvant de la série ester comme l'acétae d'éthyle ou l'acétate de butyle, solvant de la série benzène comme le benzène ou le toluène, diméthylformaide ou diméthylsulfoxyde, ( 8) Réaction colorée: positive: réaction de la quinone alcaline et réaction de l'acétate de magnésium (violet rouge), négative: réaction de Molisch et réaction de la ninhydrine, ( 9) Nature: substance acide, ( 10) Couleur: poudre de couleur orange, ( 11) CCM sur gel de silice: support: plaque de gel de silice pour CCM (Merck), liquide de développement: benzène-méthanol ( 5:1), Rf = environ 0,5. 2 Propriétés biologiques. ( 1) Propriétés antimicrobiennes: organismes expérimentaux Staphylococcus aureus FDA 209 P Escherichia coli NIHJ Shigella sonnai Salmonella typhimurium Pseudomonas aeruginosa P-3 Saccharomyces saké Candida albicans Aspergillus niger Pyricularia oryzae Trichophyton ferrugineum CMI 0,8 0,1 0,05 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 pg/ml Comme on le voit, l'awamycine présente une acti- vité anti-bactérienne contre certaines bactéries gram-positives, mais cependant aucune action contre les bactéries gram-négatives, la levure et les champignons. ( 2) Activité antitumorale: 1) Effet sur le carcinome de l'ascite d'Ehrlich: On inocule le carcinome de l'ascite d'Ehrlich, 2 x 106 cellules, à des souris (dd Y mâles, âgées de 6 semaines) par voie intrapéritonéale, on administre l'awamycine comme il est dit dans le tableau et on observe le nombre de jours de survie. Tableau 1 Dose administrée Jour d'adminis Nombre de jours Accroissement (mg/kg/jour) tration de survie de la durée (médiane) de vie (%) Témoin 22 O 6,3 1-9 38 73 Témoin 20 0 0, 1, 40 100 Le jour d'administration se rapporte au-jour zéro fixé à la date d'inoculation de la tumeur Le nombre de jours de survie est présenté sous la forme de la valeur médiane chez 4-5 souris dans un groupe L'ac- croissement de la durée de vie est calculé selon l'équa- tion suivante: Accroissement de la durée de vie (%): valeur moyenne du nombre de jours de survie dans le groupe traité valeur moyenne du nombre de jours de survie dans le groupe témoin x 100 100. ll 2) Effet sur le sarcome 180: On inocule le sarcome 180 (l x 105 cellules) par voie intrapéritonéale à des souris-(ICR, mâles, âgées de 6 semaines), on administre le médicament et on observe le nombre de jours de survie. Tableau 2 Quantité Jour Nombre de jours Accroissement de administrée de survie la durée de (mg/kg/jour) d'administration (valeur moyenne) vie ( Témoin 14 O 6,3 1 9 40 186 3,1 1 9 > 60 > 329 1,5 1 9 42 200 0,75 1 9 23 64 Témoin 12 O 0, 1, 24 100 Comme il a été vu ci-dessus, l'awamycine a une activité antitumorale contre le carcinome de l'ascite d'Ehrlich et le sarcome 180 - L'awamycine peut avoir la structure d'une quinone dans sa molécule si l'on considère les propriétés de spectre UV, spectre IR, de réactions colorées, etc, pré- sentées ci-dessus On connaît jusqu'à présent un grand nombre de substances antitumorales ayant une structure de quinone Parmi les antibiotiques connus dont l'analyse élémentaire et la structure de quinone sont semblables, on peut citer l'adriamycine, la luraomycine et la baracidine Cependant, l'awamycine est différente de ces substances connues comme le montre le tableau 3 Tableau 3 Pf Absorption UV Adriamycine 205 233, 253, 290, 477, 475, Luraomycine 151 280, 420 440 Balacidine 261 246, 294, 375 Awamycine 156 218, 245 (inflexion), 272, 340 (inflexion), 445 Comme il a été dit, l'awamycine diffère des anti- biotiques connus quant au point de fusion et à l'absorp- tion UV. Les exemples suivants précisent l'invention mais ne sont pas conçus comme limitatifs. Exemple 1 Culture en ballon agité On stérilise un milieu liquide (milieu A, p H 7,0, 100 ml) contenant du glucose ( 2,0 %), de la peptone ( 0,5 %), de l'extrait de-viande ( 0,5 %), de la levure sèche ( 0,3 %), du Na Cl ( 0,5 %) et du carbonate de calcium ( 0,3 %) dans un Erlenmeyer de 500 mlo On inocule au milieu liquide ci-dessus une boucle de Streptomyces -217 FERM P-6786 cultivée à 27 C pendant 6 jours, sur un milieu gélose en biseau contenant du glucose ( 1 %), de la peptone ( 0,5 %), de l'extrait de viande ( 0,5 %), du Na Cl ( 0,3 %) et de l'agar-agar ( 1,2 %), et on cultive en agitant à 27 C pendant 72 h, à 120 va-et-vient par minu- te, amplitude 17 cm On inocule le bouillon cultivé obtenu ( 2 ml) à un milieu liquide (milieu B, 100 ml-) contenant du glucose (Q,2 %), de l'amidon ( 1,5 %) de la peptone ( 0,25 %), de l'extrait de viande ( 0,3 %) , de la levure sèche ( 0,15 %) et du carbonate de calcium ( 0,25 %) dans un Erlenmeyer de 500 ml, et on cultive en agitant par va-et-vient à 27-C pendant 20 h. Exemple 2 Culture dans une jarre de fermentation de 30 litres On inocule une culture d'ensemencement ( 100 ml x ballons) obtenue dans l'exemple 1 dans un milieu B ( 20 litres) dans une jarre de fermentation de 30 litres, et on cultive en agitant à 250 tpm et en aérant à raison de 10 litres/minutes, à 270 C pendant 20 heures. Exemple 3 Filtrat de culture et extraction de la substance active avec de l'acétate d'éthyle On ajoute de l'acétate d'éthyle ( 30 litres) au bouillon cultivé (jarre de fermentation de 30 litres x 2) obtenu dans l'exemple 2, on agite à 250 tpm par agitateur chimique pendant 20 minutes,et on sépare la couche organique par une centrifugation continue de type sans choc ( 18 000 tpm) On filtre par succion la couche acétate d'éthyle On concentre l'extrait sous vide pour obtenir une substance huileuse. Exemple 4 Extraction de la substance active avec du benzène On ajoute du benzène ( 4 litres) à la substance huileuse obtenue dans l'exemple 3, et on ajoute encore une solution aqueuse ( 2 litres) d'EDTA sadique à 0,5 %, puis on agite bien On ajoute encore une solution aqueuse ( 2 litres) d'EDTA sodique à 0,5 % dans une couche de benzène séparée et on agite bien On sépare la couche benzénique. Exemple 5 Enlèvement des impuretés huileuses avec de l'hexane On ajoute du sulfate de sodium anhydre à la couche benzénique obtenue dans l'exemple 4 pour déshy- drater complètement, et on concente sous vide On ajoute de l'hexane ( 100 ml) au résidu et on sépare la substance de couleur orange précipitée par centrifugation ( 5 minu- tes, 2000 tpm) On lave le précipité avec de l'hexane pour obtenir l'awamycine brute ( 100 mg). Exemple 6 Séparation de l'awamycine par chromatographie sur gel de silice ( 1): On introduit de l'awamycine brute, obtenue dans l'exemple 5, dissoute dans le benzène ( 5 ml), dans une colonne ( 2,5 x 40 cm) de gel de silice 60 (Merck) remplie de benzène, puis on lave avec du benzène ( 300 ml), puis on élue avec du benzène-méthanol ( 10:1) ( 500 ml); On vérifie toutes les fractions par bioautographie en utilisant Bacillus subtilis et on concentre la fraction active sous vide pour obtenir une substance de couleur orange. Exemple 7 Séparation de l'awamycine par chromatographie sur gel de silice ( 2) On met du gel de silice 60 (Merck) avec du chloro- forme dans une colonne ( 2,5 x 40 cm) On introduit dans la colonne la poudre de couleur orange obtenue dans l'exemple 6 dissoute dans le chloroforme ( 5 ml), on lave avec du chloroforme ( 300 ml) et on élue avec du chloro- forme-méthanol ( 50:1) ( 500 ml) On vérifie toutes les fractions par bioautographie en utilisant Bacillus subtilis et on concentre les fractions actives sous vide pour obtenir une poudre de couleur orange. Exemple 8 Purification de lsawamycine par chromatographie sur gel Sephadex LH-20 On verse du Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chem. Co.) avec du méthanol dans une colonne ( 1,45 x 4-5 cm). On verse dans la colonne la poudre de couleur orange obtenue dans l'exemple 7 dissoute dans le méthanol ( 1 ml) et on élue avec du méthanol On vérifie toutes les fractions par bioautographie en utilisant Bacillus substilis et on concentre les fractions actives sous vide pour obtenir une poudre de couleur orange. Exemple 9 Séparation de l'awamycine par chromatographe sur gel de silice ( 3) On verse la poudre de couleur orange obtenue dans l'exemple 8, dissoute dans une faible quantité de méthanol, sur une plaque préparative de couche mince de gel de silice 60 (Merck, plaque CCM 20 x 20 cm) à 3 cm de dis- tance du bord On développe la bande séchée avec du benzène-méthanol ( 5:1) La bande active se déplace à environ Rf = 0,5, déterminé visuellement ou vérifié par balayage CCM à 480 nm pour définir la zone de bande pure On gratte avec précaution ladite zone de bande avec une micro-spatule, on mélange avec du méthanol et on agite bien On sépare la couche méthanol par centrifuga- tion ( 2000 tpm, 10 minutes) On agite bien à nouveau le gel de silice résiduel avec du méthanol ( 3 ml) On répète ces extractions 3 fois On sèche la couche méthanol combinée sous vide pour obtenir une poudre colorée en orange. Exemple 10 Purification de l'awamycine avec le chloroforme-hexane ( 1:10) On dissout la poudre de couleur orange obtenue dans l'exemple 9 dans le chloroforme ( 5 ml) On y ajoute de l'hexane ( 50 ml), on agite bien et on laisse reposer dans un réfrigérateur (-20 C) pendant 2 à 3 jours. On sépare le précipité de couleur orange'par centrifu- gation ( 2000 tpm, 5 minutes) à -20 C, et on sèche sous vide pour obtenir l'awamycine purifiée ( 10 mg). 4 Brève légende des dessins: Figure 1: spectre UV de l'awamycine Figure: spectre IR de l'awamycine. REVENDICATIONS 1 L'antibiotique awamycine ayant les propriétés physico- chimiques suivantes: 1) Analyse élémentaire: comprenant du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène et de l'azote: C 59,16 %, H 6,48 %, N 1,88 %. 2) Poids moléculaire: 744 + 1 (analyse au spectre de masse), 3) Point de fusion: 158 C, 4) Pouvoir rotatoire optique: llD = + 836 D (c = 0,1, chloroforme), ) Spectre d'absorption ultraviolet présenté dans la Fig 1, 6) Spectre d'absorption infra-rouge: présenté dans la Fig 2, 7) Solubilité: insoluble dans l'hexane et l'éther de pétrole, difficilement soluble dans l'eau et le diéthyléther, et soluble dans le méthanol, l'éthanol, le dichlorométhane, le chloroforme, l'axétone, l'acétate d'éthyle, le benzène et le diméthylformamide, 8) Réactions colorées: positive pour la réaction de la quinone alêaline (violet) et la réaction de l'acé- tate de magnésium (violet rouge), négative pour la réaction de Molisch et la réaction de la ninhydrine, 9) Nature: substance acide, et ) Couleur: poudre colorée en orange. 2 Procédé de production de l'antibiotique awamycine dans lequel on cultive le microorganisme producteur de l'antibiotique awamycine appartenant au genre Streptomyces dans un milieu pour accumuler l'antibio- tique awamycine et on isole l'antibiotique awamycine du bouillon cultivé. 3 Procédé selon la revendication 2 o le micro- organisme producteur de l'antibiotique awamycine appartenant au genre Streptomyces est Streptomyces -217 FERM P-6786 o