Brevet FR2537602A2 — publié le 19840615

FR 2537602 A2 19840615 FR 8220904 A 19821213 La présente invention concerne un perfectonnement aux ADN recombinants décrits dans le brevet principal nO 82 16069 au nom du demandeur et en particulier concerne des souches de Bacillus subtilis transformées par lesdits ADN recombinants et surproducteurs d'une a-amylase thermostable. Le brevet principal décrit des ADN recombinants comportant un gène codant pour a-amylase thermostable, ainsi que les souches obtenues par transformation à l'aide de ces ADN recombinants. Des expériences ont montré qu'il était possible de cette façon d'obtenir des souches de E.coli surproductrices d'une a-amylase thermostable. I1 est particulièrement intéressant de pouvoir utiliser au stade industriel Bacillus subtilis au lieu de E.coli, en effet Bacillus 'subtilis est un organisme non pathogène ne produisant pas d'endotoxine et ne présentant donc aucune limitation quant à son utilisation à des fins alimentaires ou médicales. En outre Bacillus subtilis est un microorganisme déjà largement utilisé au stade industriel et dont les conditions de fermentation sont largement étudiées dans la technique antérieure. Enfin, Bacillus subtilis comme la plupart des bactéries gram positives est connu pour être un organisme excrétant de nombreuses protéines (amylases et protéases) à la différence des bactéries gram négatives telles que E.coli. L'invention concerne donc un perfectionnement aux ADN recombinants décrits au brevet principal qui peuvent exprimer un gène codé dans Bacillus subtilis. Ces ADN recombinants comportant un gène codant une a-amylase thermostable sont caractérisés en ce qu'ils comportent- au moins - le fragment d'ADN d'une souche de Bacillus licheniformis codant pour une a-amylase thermostable, et - un fragment d'ADN d'un plasmide, ou d'un dérivé de phage X se répliquant dans Bacillus subtilis. Le fragment drADN codant pour une a-amylase thermostable est de préférence constitué par tout ou partie du fragment d'environ 3,3 kb limité par deux sites de restriction HindIII qui a déjà été décrit dans le brevet principal, il ressort en effet des différentes expériences qutil s'agit là d'un fragment qui à lui seul contient l'information génétique nécessaire à la synthèse de l'amylase en cause. Parmi les plasmides pouvant se répliquer dans B subtilis il faut citer en particulier le plasmide PUB 110 et de façon générale les plasmides se répliquant dans 13. subtilis conférant la résistance à la kanamycine. I1 est possible également d'utiliser des plasmides hybrides se répliquant à la fois dans E.coli et Bacillus subtilis, c'est le cas du plasmide qui sera décrit dans les exemples et est constitué par fusion de PUB 110 issu destaphylococcusaureus conférant la résistance à la kanamycine et se répliquant dans Bacillus subtilis et pBR 322 qui confère la résistance à la tétracycline et à l'ampicilline,et qui est capable de se répliquer dans E.coli. L'invention concerne également les souches de B. subtilis transformées par les ADN recombinants, les procédés de fermentation mettent en oeuvre ces souches transformees et l'a-amylase thermostable obtenu dans ces fermentations. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention. Exemple 1 Matériel et méthode a) vecteur de clonage utilisé et souche réceptrice Le plasmide utilisé est un plasmide hybride obtenu à partir des plasmides pUB 110 et des plasmides pBR 322 (tous deux commercialisés notamment par la Société Bethesda Research Laboratories, Zinc.). La souche réceptrice est une souche de B.subtilis BS 151. Les différentes enzymes sont utilisées dans les conditions prescrites par le fabricant. b) transformation de Bacillus subtilis La souche de Bacillus subtilis a été transformée par le procédé décrit par D. Erhlich (B. Niaudet et coll. : In vitro Genetic labelling of Bacillus subtilis cryptic plasmid PHV400. Plasmid 2 : 48-58 (1979)). Les milieux de sélection sont des milieux LB contenant 5 pg/ml de kanamycine et 1 % d'amidon soluble. Enfin l'activité amylolytique des clones transformés a été testée par exposition aux vapeurs d'iode. c) Construction des Plasmides hybrides DUB 110, pBR 322. Les plasmides pUB 110 et pBR 322 sont traités par l'enzyme de restriction EcoRI qui dans chacun de ces plasmides constitue un site de restriction unique. Les produits de restriction sont soumis à l'action de la ligase T4 afin de fusionner les deux plasmides par leur site unique. Le mélange de ligation est ensuite utilisé pour transformer une souche de E.coli et l'on sélectionne les transformants présentant une résistance à la tétracycline, à l'ampicilline et à la kanamycine,' qui ont donc intégré un plasmide hybride de pUB 110 et de pBR 322. d) Insertion du fragment Hindili de 3ff3 kb dans le plasmide hybride. Le plasmide hybride pUB 110 et pBR 322 préparé précédemment ainsi que le plasmide pBR 322 Amy+ qui a été décrit dans la demande de brevet principal sont restreints par l'enzyme Hindili mélanges puis soumis à l'action de la ligase T4. Comme précédemment, les plasmides recombinants ayant intégré le fragment de 3,3 kb conférant le caractère Amy+ - sont sélectionnés dans des transformants d'E.coli en recherchant le phénotype Kanr Apr Tc5 TcS amy+. Les transformants présentant le phénotype précédent sont alors traités comme cela a été décrit au brevet principal afin d'en extraire les plasmides pour les purifier sur un gradient de chlorure de césium. e) Transformation de Bacillus subtilis Les plasmides hybrides purifiés précédemment sont utilisés pour transformer Bacillus subtilis BS 151. L'activité amylolytique des clones transformés est testée par exposition aux vapeurs d'iode. On constate que dans tous les cas où les clones présentent le phénotype Kanr, ils s'entourent également d'un large halo due décoloration correspondant à une activité amylolytique. f) Dosage de l'activité amylolytique L'activité amylolytique d'un clone kanamycine résistant est dosée dans le surnageant d'une culture d'une nuit en milieu LB contenant 5 pg/ml de kanamycine. La culture de la souche réceptrice ne contenant pas de plasmide est menée dans les mêmes conditions et en absence de kanamycine. L'activité amylolytique est dosée par la méthode au D.N.S. qui a déjà été décrite dans le brevet principal. Dans ces conditions, on observe les résultats suivants : TABLEAU I Souche Amylase activité X activité EO MAL/ML/10' 370C relative BS 151 DO-: 0,032 0.09 i BS 151 / 3,3 kb DO : 0,946 2.8 29.5 On constate que dans ces conditions la culture d'un clone transformé par le plasmide hybride amy produit près de 30 fois plus d'activité que la souche réceptrice. L'acquisition de la résistance à la kanamycine s'accompagne donc d'une surproduction d'activité amylolytique qui ne peut être que la conséquence de l'introduction du fragment HindIII et de son expression par l'intermédiaire du plasmide hybride. Etude de la thermorésistance Des aliquots de surnageant d'une culture d'une nuit d'un clone kanamycine résistant est soumis préalablement durant 10 minutes à des températures croissantes avant de doser l'activité résiduelle. La figure 1 représente le pourcentage d'activité résiduelle amylolytique en fonction de la température à laquelle a été soumis le surnageant. On constate que la thermostabilité de l'activité amylolytique contenue dans le surnageant est comparable à celui de l'a-amylase de Bacillus licheniformis. Ceci confirme que les transformants de Bacillus subtilis excrètent bien une a-amylase thermostable en tout point identique à celle de Bacillus licheniformis. Ceci constitue sur le plan industriel un avantage considérable puisqu'il n'est plus nécessaire d'effectuer la lyse des-bactéries pour en récupérer l'a-amylase. REVENDICATIONS 1/ ADN recombinant comportant un gène codant pour une a-amylase thermostable caractérisé en ce qu'il comporte au moins - le fragment d'ADN d'une souche de Bacillus licheniformis codant pour une a-amylase thermostable1 et - un fragment d'ADN dgun plasmide, ou d'un derivé de phage X se répliquant dans B subtilis. 2/ ADN selon la. revendication 1, caractérisé en ce que le fragment d'ADN bactérien codant pour 1'a-amylase comporte tout ou partie d'un fragment d'environ 3,3 kb limité par deux sites de restriction HindîlI. 3/ ADN selon l'une des revendications 1 et 2, caractériséen ce que le fragment d'ADN d'un plasmide est le fragment du plasmide pUB 110. 4/ ADN selon la revendication 3, caractérisé en e que 1'ADN d'un plasmide est un ADN hybride de pUB 110 et de pBR 322. 5/ Souche de Bacillus subtilis transforme par un ADN selon l'une des revendications 1 à 4. 6/ Procédé de production d'a-amylase caractérisé en ce que l'on cultive sur un milieu approprié une souche bactérienne selon la revendication 5 et on récupère l'a-amylase dans le milieu de croissance. 7/ a-amylase thermos table obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 6.