Brevet FR2537156A1 — publié le 19840608

La présente invention est relative à un appareil de décollement mécanique de cellules ou de couches tissulaires ou autres. Les cellules peuvent provenir de tissus animaux ou de biopsies humaines obtenues au cours d'une intervention chirurgicale et sont mises en culture pendant plusieurs jours pour obtenir une préparation homogène, qui se prête à l'étude du mécanisme d'action et de la régulation de ces cellules par diverses substances. Etant donné que certains des paramètres que l'on veut mesurer se trouvent situes à l'intérieur de ces cellules, il est nécessaire de pouvoir récupérer ces der nières sans qu'elles subissent de détérioration, exigence qui est compromise en particulier par le fait que certains types cellulaires se fixent fortement aux boîtes de culture. Les moyens connus dans l'Art antérieur pour récu pérer ces cellules sont - des moyens chimiques, tels que la trypsine, l'acide chlorhydrique ou la soude - des moyens mécaniques, consistant en un petit balai en matière clastique ou en caoutchouc, notamment du type "RUBBER POLICEMAN" qui permet de décoller les cellules par grattage. L'emploi des moyens de l'Art antérieur présente certains inconvenients, qui sont notamment les suivants - en ce qui concerne les moyens chimiques utilisés, tels que la trypsine, l'acide chlorhydrique ou la soude, ces produits détruisent certaines substances intracellu laires que contiennent les cellules, et, en outre, il est difficile de s'en débarrasser pour les dosages ulté rieurs desdites substances intracellulaires - en ce qui concerne les petits balais en matière plas tique ou en caoutchouc, notamment du type "RUBBER POLICEMAN, leur emploi est limité aux grosses boites de culture traditionnelles du type ancien,telles que les boites de Pétri, ce qui implique des surfaces de culture relativement importantes et l'utilisation d'un grand nombre de cellules, et aux types cellulaires qui se décollent facilement, car lesdits balais ne permettent pas le décollage des cellules fortement fixées aux parois des bof- tes de culture. Toutefois, dans certains cas, il faut, pour permettre le développement d'une culture, que les cellules soient en contact étroit les unes avec les autres, en sorte qu'elles doivent être cultivées sur de petites surfaces en outre, l'exigence de petites surfaces de culture stim- pose pour réduire convenablement le volume de stockage des cultures cellulaires. De ce fait, on utilise actuellement des plaques de culture genre "FALCON" de BECTON DICKINSON & Co, pourvues de puits de petit diamètre, notamment des plaques à 24 ou 96 puits, dans lesquels lesdits petits balais n'entrent pas. En pareil cas, seul un grattage manuel, long à réaliser, peut être mis en oeuvre pour décoller les cellules. La nécessité de pouvoir disposer de moyens mécaniques de décollement des cellules cultivées dans des petites boîtes ou dans des puits de petit diamètre ou de decollement des cellules fortement fixées aux parois des boites de culture, s'iratosait donc impérativement. La présente invention a en conséquence pour but de pourvoir à un appareil de décollement des cellules qui sont maintenues en survie dans des boites de culture, qui répond mieux aux nécessités de la pratique,notamment en ce qu'il permet le décollement mécanique rapide.des cellules collées aux parois des boîtes de culture, même si ces cellules sont fortement fixées à ces dernières, et mêmedans des boites ou puits de faibles dimensions, en ce qu'il permet la récupération totale des cellules, sans les détériorer, en ce que la rapidité avec laquelle l'appareil conforme à l'invention réalise le décollement total (moins d'une minute) des cellules d'une culture est un facteur favorable pour le maintien de la viabilité des cellules en cultures et en ce que l'appareil conformé à l'invention est d'une-maniabilité facile, d'un faible poids et de dimensions réduites,telles qu'il tient dans le creux de la main. La présente invention a pour objet un appareil de décollement mecanique des cellules mises en culture dans des boites de culture, caractérisé en ce qu'il comprend une tige de décollement de cellules, de faible diamètre et de longueur appropriée, associée par l'intermédiaire d'un mandrin,à un micromoteur qui l'entraîne en rotation, laquelle tige de décollement est réalisée en un matériau apte à vibrer. Selon un mode de réalisation avantageux de l'appareil de décollement mécanique de cellules en culture, conforme à l'invention, le mandrin qui est associe au micromoteur et qui porte la tige de décollement est logé dans un bâti qui contient également la partie supérieure de la tige de décollement. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'appareil conforme à l'invention, ie bâti dans lequel sont logés le mandrin et la partie superieure de la tige de décollement est monte,par l'intermediaire d'une bague de fixation,sur un deuxième bâti dans lequel est logé le micromoteur. Selon un mode de réalisation avantageux de l'appareil conforme à l'invention, un joint annulaire en matériau anti-vibration d'épaisseur appropriée est disposé à l'intérieur du bâti, dans lequel sont logés le mandrin et la partiesupérieure de la tige de décollement, à la base dudit bâti. Selon un mode de réalisation avantageux de l'appareil conforme à l'invention, --le bâti dans lequel est logé le micromoteur est pourvu d'un organe d'obturation en matériau isolant- phonique. Selon un mode de réalisation préféré de l'appareil conforme à l'invention, le micromoteur est du type à courant électrique continu. Selon un mode de réalisation préféré de 1' appareil conforme à l'invention,la tige de décollement est du type interchangeable,de ma-. nière à pouvoir adapter sur 1 'appareil des tiges de diamètres et de longueurs variables en fonction du type de cellules à décoller et du type de la boîte ou de la plaque de culture,cette interchangeabilite étant obtenue par la disposition d'ailettes sur la partie supérieure de la tige ,qui viennent se loger dans des rainures correspondantes ménagées intérieurerent dans le mandrin. Selon un mode de réalisation préféré de l'appareil conforme à l'invention,la tige de décollement est recouverte d'une structure nique qui en assure la protection,amiiible et destinée à être utilisée pour le déoellement de cellules continues dans un puits ou une boîte de culture déterminés,afin d'éviter la contamination des cellules contenues dans d'autres puits ou boites,ladite structure ayant en outre pour roule d'atténuer l'action de "grattage" de la tige de decollement. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la structure conique est montée à force sur la tige de décollement. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la structure conique comporte une projection apte à se mettre en butée sur une projection correspondante de la tige de décollement. Selon un mode de réalisation avantageux de l'appareil conforme à l'invention, un interrupteur de commande de l'appareil, associé au micromoteur,est placé sur le bâti dans lequel est logé le micromoteur. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, l'interrupteur est du type à bascule. Selon une autre disposition préférée de ce mode de réalisation, l'interrupteur est du type à bouton-poussoir. Selon un mode de réalisation préféré de l'appareil de décollement mécanique de cellules en culture,conforme à l'invention, sa vitesse de rotation maximale est avantageusement de 10 000 tours/minute. Selon encore un autre mode de réalisation préféré de l'appareil conforme à l'invention, celui-ci est pourvu d'un dispositif apte à lui permettre de fonctionner à des vitesses variables. Conformément à l'invention, le dispositif variateur de vitesses est constitué par un trans formateur-redresseur fournissant une tension continue réglable, jusqu'a une tension correspondant à la vitesse de rotation maximale recherchez pour la tige. Egalement conformément à l'invention, le dispositif variateur de vitesse comprend une batterie de piles associée à un adaptateur. I1 peut être prévu, dans le cadre de l'invention, que ladite batterie associée à l'adaptateur est présente dans ledit appareil à coté du transformateur-redresseur- pour jouer le rôle d'alimentation de réserve. Selon encore un mode de réalisation avantageux de l'appareil conforme à l'invention, la tige de décollement et le micromoteur sont logés dans un bâti unique. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels - la figure 1 est une vue en perspective de l'appareil de décollemsent de cellules , conformes à l'invention - la figure 2 est une vue éclatée de l'appareil représenté dans la figure 1-,- et - la figure 3 est une vue en coupe longitudinale de l'appareil de décollement de .cellules représenté à la figure 1. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces dessins et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration.de l'objet de l'invention, dont iis ne constituent en aucune manière une limitation. La figure l représente une vue en perspective de l'appareil de décollement de cellules, en position de fonctionnement dans une bote de culture 5. La tige de décollement 4 est réalisée en un matériau apte à vibrer, choisi pour sa grande résistance à la rupture, et en particulier en un matériau dur et rigide tel qu'acier, matière plastique à module de résistance élevé, etc.. Cette tige 4 est entraînée en rotation par un micromoteur 8 logé dans un bâti cylindrique 1, qui peut être en tous matériaux appropriés tels que matière plastique, cuivre, laiton, etc... De ce fait, des vibrations sont produites permettant. la tige 4 de décoller efficacement les cellules. A cet effet, il est avantageux que la tige de décollement 4 soit du type interchangeable de manière à pouvoir adapter sur l'appareil des tiges de longueur et diamètre différents, car - dans la mesure où le type de cellules à décoller le permet - l'emploi d'une longueur relativement importante fait décrire à la pointe de la tige de décollement 4 une ellipse au lieu d'une circonférence, ce qui permet de décoller plus de cellules et de rendre plus rapide-le décollement. En outre, la longueur de la tige de décollement 4 doit varier avec la profondeur des boîtes de cultures ou des puits associés aux plaques-de culture. La figure 2. montre une vue éclatee de l'appareil conforme à l'invention : on peut observer que la tige de décollement 4 est raccordée au micromoteur 8, contenu dans le bâti cylindrique 1, par l'intermédiaire d'un mandrin 9 associé à l'arbre 13 dudit micromoteur 8. En outre, le bâti cylindrique 2 est pourvu d'une bague de fixation 2a, qui permet d'adapter de façon amovible, notamment par vissage, le bâti cylindrique 2 au bâti cylindrique 1. La figure 3 met en evidence les relations mutuelles des différents éléments qui entrent dans la composition de l'appareil conforme à l'invention, quand ils sont assemblés. En particulier, il faut remarquer la présence d'un joint annulaire 12 en matériau anti-vibrations, notamment caoutchouc naturel ou synthétique, qui a pour rôle d'amortir les vibrations latérales de la-tige de décollement 4, lequel joint 12 présente une épaisseur appropriée et est disposé à l'intérieur du bâti cylindrique 2, à-la base de ce dernier. Sur la figure 3 est-visible également un organe d'obturation 3 du bâti cylindrique 1 contentant le micromDteur 8 : il a essentiellement le rôle d'isolant phonique par rapport au bruit produit par la rotation du micromoteur 8 et est réalisé en tous matériaux isolants phoniques appropriés, notamment mousse de caoutchouc compacte, polystyrène epnse, liège, etc.. g un orifice central pratiqué dans l'organe d'obturation 3 permet le passage du câble 7 d'alinentation du micromoteur 8. On peut voir en outre un interrupteur 10 du type à bascule, placé sur le bâti-cylindrique 1, contenant le micromoteur 8, près de l'organe d'obturation 3, de façon qu'il soit commande par le pouce dé l'opérateur.. Toute- fois, le type et l'emplacement de cet interrupteur ne sont pas limitatifs : par exemple, de façon préférentielle, l'interrupteur 10 pourrait être du type à bouton-poussoir et être placé sur le bâti cylindrique 1, mais près de la bague de fixation 2a, ou mieux encore sur le bâti cylindrique 2, en sorte qu'il soit commandé par l'index et non par le pouce de l'opérateur. La figure 3 montre également une vue en coupe longitudinale d'une structure conique amovible 11, de préférence en matière plastique, laquelle est montée à force sur la tige de décollement 4 et permet d'éviter la contamination des cellules, notamment quand on réalise successivement le décollementde ceîlules.contenues dans une pluralité de boites ou de puits de culture, en changeant de structure conique chaque fois que l'on change de boite ou de puits ; en même temps, la structure conique 11 rend le décollement plus "doux" que si l'on attaquait la surface a décoller directement avec la tige de décollement 4. De façon avantageuse, mais non limitative, ladite structure conique 11 peut être obtenue à partir des pointes coniques pour pipettes automatiques, lesquelles sont habituellement en polypropylène : il en existe de marque GILSON type C20, ayant une capacité de 200 microlitres (ut), et type C200, de capacité 1 millilitre (ml). Ladite structure conique 11 peut, en variante, comporter de façon avantageuse une projection (non représen tée) susceptible de se mettre en butée sur une projection correspondante de la tige de décollement 4, pour réaliser sa solidarisation avec ladite tige de décollement 4. La figure 1 montre également un transiormateur-redresseur 6 fournissant une tension continue réglable allant de 0 à 12 volts, étant entendu que cette gamme de tension n'est pas limitative, mais est fonction de la vitesse mullmale de rotation de la tige et des contraintes de sécurité ; on obtient ainsi une vitesse de rotation de la tige 4 variable, de façon à obtenir des vibrations d'intensité variable permettant un décollement des cellules plus ou moins "doux", suivant les résultats souhaités ; par exemple, une vitesse de rotation relativement faible (correspondant à une tension de l'ordre de 6 volts,par exemple),permet.de décoller un maximum de cellules vivantes,avec un taux de viabilité de l'ordre de 98 %, tandis qu'une grande vitesse de rotation de la tige (correspondant à une tension de 12 volts par exemple), permet une récupération de la totalité des cellules, dont, toutefois, la plupart sont lysées ; de plus, l'application de vitesses de rotation croissantes, dans un m8me puits ou boite, permet un décollement progressif des cellules, avec un minimum de lyse. La limite supérieure de la tension continue est imposée - d'une part, par la nécessité de contenir les vibrations, qui, autrement, peuvent casser la plaque de culture -altérant ainsi la ccmposition du milieu cellulaire- et détryure les cellules : la vitesse de rotation de 10 000 tours/minute doit etre consiee catie une limite supérieure correspondant à la tension nominale d'un micromoteur de puissance appropriée - d'autre part, colgle on l'audit plus haut, pour des rai sons de sécurité d'emploi. Dans le cas de la figure 1, le transformateur 6, raccordé au réseau électrique, est du type APEL Modele AL 2-03/U, sans que cela soit limitatif, tout autre transformateur-redresseur d'une capacité suffisante, de 300 mA par exemple, qui transforme le courant alternatif à 220 volts en courant continu réglable, avec tension nominale 12 volts, pouvant être utilisa. Au lieu d'une alimentation assurée par un transfor mateur-redres-seur, l'alimentation de l'appareil conforme à l'invention peut, en variante, être assuree par une batterie de piles, la tension de chaque pile et le nombre -de piles composantes dépendant de la vitesse de rotation souhaitée, ladite batterie étant associée à un adaptateur à titre d'exemple, avec une batterie de deux piles plates 4,5 volts, associée à un adaptateur "Wonder", on obtient une autonomie allant de 15 minutes à 2 heures et demi selon la qualité des piles et l'intensité de l'emploi de l'appareil. Un tel système d'alimentation peut etre utilisé, en outre, en tant qu'alimentation de réserve en cas de panne du réseau électrique auquel est raccordé le transformateur redresseur. L'efficacité de l'appareil de décollement de cellu les conforme à l'invention est démontrée par l'observation au microscope à contraste de phase qui permet de montrer qu'il n'y a plus d'adhérence de cellules sur les surfaces de culture en verre, ou en plastique, de toute dimension, même après décollement effectué par vibrations obtenues à vitesse de rotation faible. En outre, l'appareil conforme à l'invention permet de réaliser un gain de temps appréciable par rapport au grattage manuel des boites de petit diamètre et des puits des plaques de culture, puisqu'alors qu'un tel grattage manuel requiert 5 minutes au minimum par boite ou par puits, l'appareil conforme à l'invention permet de réaliser un décollement total des cellules en moins d'une minute, gain de temps appréciable pour le maintien de la viabilité des cellules en cultures. Bien que la description se soit essentiellement ré féree a l'utilisation de l'appareil conforme à l'invention pour le décollement de cellules en cultures, il va de soi que ledit. appareil présente un nombre important d'applications voisines, et peut être utilisé notamment pour - le décollement des couchés tissulaires, comme dans le cas de certaines biopsies nécessitant un décollement progressif des tissus - les tests en immunologie (anticorps) ; - les repiquages de cellules ou de bactéries, ce qui est important dans les laboratoires d'analysesmédi- cales - le clônage, afin d'obtenir des lignées cellulaires homo gènes. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention, et notamment la variante selon laquelle la tige de décollement et le micromoteur sont logés dans un bâti unique. REVENDICATIONS 10- Appareil de décollement mécanique des cellules mises en culture dans des boîtes de culture, caractérisé en ce qu'il comprend une tige (4) de décollement de cellules, de faible diamètre-et de longueur appropriée, associée par l'intermédiaire d'un mandrin (9), à un micromoteur (8) qui l'entraîne en rotation, laquelle tige (4) de décollement est réalisée en un matériau apte à vibrer. 20- Appareil selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le mandrin (9) qui est associé au micromoteur (8) et qui porte la tige de décollement (4), est logé dans un bâti (2) qui contient également la partie supe- rieurs de la tige de décollement (4). 30- Appareil selon l'une quelconque des Revendica tions.l et 2, caractérisé en ce que le bâti (2) dans lequel sont logés le mandrin et la partie supérieure de la tige de décpllement (.4) est monté,par l'intermédiaire d'une bague de fixation (2a),sur un deuxième bâti (l)-dans lequel est logé le micromoteur. 40- Appareil selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'un joint annulaire (12) en matériau anti-vibration d'épaisseur appropriée, est disposé à l'intérieur du bâti (2), dans lequel sont logés le mandrin (9) et la partie supérieure de la tige de dëcol- lement (4), à la base dudit bâti (2). 5 - Appareil selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le bâti (1) dans lequel est logé le micromoteur (8) est pourvu d'un organe d'obturation (3) en matériau isolant phonique. 60- Appareil selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le micromoteur (8) est du type à courant électrique continu. 70- Appareil selon la Revendication,l, caractérisé en ce que la tige de décollement (4) est du type interchangeable de manière à pouvoir adapter sur l'appareil des tiges de diamètres et de longueurs variables en fonction du type de cellules à décoller et du type de la boite ou de la plaque.de culture,cette interchangeabilité étant obtenue par la disposition d'ailettes sur la partie supérieure de la tige,qui viennent se loger dans des rainures correspondantes ménagées intérieurement dans le mandrin. 80- Appareil selon l'une quelconque des Revendications 1 et 7, caractérisé en ce que la tige de décollement (4) est recouverte d'une structure conique (11) qui en assure la protection,amDvible et destinée à être utilisée pour le decollement de cellules contenues dans un puits ou une boite de culture déterminés,afin d'éviter la contamination des cellules contenues dans d'autres puits ou boites,ladite structure (11) ayant en outre pour rôle d'atténuer l'action de "grattage" de la tige de décollement (4). 90- Appareil selon la Revendication 8, caractérisé en ce que la structure conique (11) est montée à force sur la tige de décollement (4). 10 - Appareil selon la Revendication 8, caractérisé en ce que la structure conique (11) comporte une projection apte à se mettre en butée sur une projection correspondante de la tige de décollement (4). 110- Appareil selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'.un interrupteur (10) de commande de l'appareil associé au micromoteur (8), est placé sur le bâti (1) dans lequel est logé le micromoteur. 120- Appareil selon la Revendication 11, caractérisé en ce que.l'interrupteur (10) est du type à bascule. 130- Appareil selon la Revendication 11, caractérisé en ce que l'interrupteur est dru type à-bouton-poussoir. 140- Appareil selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la vitesse de rotation maximale de la tige de décollement (4), est avantageusement de 10 000 tours/minute. 150- Appareil selon la Revendication 1, caracté- risé en ce qu'il est pourvu d'un dispositif apte à lui permettre de fonctionner à des vitesses variables. 160- Appareil selon la Pwevendication 15, caractérisé en ce que le dispositif variateur de vitesses est constitué par un transformateur-redresseur (6) fournissant une tension continue rE- glable jusqu'à une tension correspondant à la vitesse de rotation maximale recherchée pour la tige. 170- Appareil selon la Revendication 15, caractérisé en ce que le dispositif variateur de vitesse comprend une batterie de piles associée à un adapteur. 180- Appareil selon la Revendication 15 et les Revendications 16 et 17, caractérisé en ce que ladite batterie associée à l'adaptateur est présente dans ledit appareil à cOté du transformateur redresseur (6) pour jouer le rôle d'alimentation de réserve. 190- Appareil selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la tige de décollement (4) et le micromoteur (8) sont logés dans un bâti unique.