Brevet FR2547594A1 — publié le 19841221

? 7594 1 NOUVEAUX CO EXES ANTITUMORAUX ANTIBIOTIQUES L'invention a pour objet de nouvelles substances anti-tumorales à propriétés antibiotiques et se rapporte a leur production et à leur séparation. Les composés antibiotiques antitumoraux selon la présente invention n'ont pas jusqu'à présent été identifiés en terme de structure Du fait de leurs propriétés physique, chimique et biologique spécifiques cependant, la demanderesse pense que les antibiotiques BBM-1675 selon la présente invention sont des substances nouvelles. La demande de brevet européen n 951 54 A 1 décrit la fermentation des Actinomadura pulveraceus sp (nov n 6049, ATCC 39100) pour produire des antibiotiques antitumoraux qu'elle appelle WA 6049-A et WS 6049-B Les structures des antibiotiques WS 6049 n'ont pas été déter15 minées jusqu'à présent mais les propriétés antibiotiques qui les caractérisent indiquent que WS 6049-A et WS 6049-B sont apparentés quant à leur structure aux antibiotiques BBM-1675 selon la présente invention. Les données spectrales montrent, cependant, que ni la WS 6049-A, ni la WS 6049-B sont identiques à un des composés BBM-1675 selon l'invention. 20 De plus, l'organisme producteur décrit dans la demande de brevet européen publié sous le numéro 95154 A 1 peut se distinguer totalement de l'Actinomadura verrucosospora employé conformément à la présente invention quant à la couleur du mycelium aérien obtenu sur milieu ISP nos 2, 3 et 4, quant à la peptonisation lactique positive et quant à son utili25 sation positive des D-fructose, D-mannitol, tréhalose et cellulose. La présente invention a pour objet un nouveau complexe antibiotique antitumoral, appelé dans la présente BBM-1675, ce complexe étant produit par culture d'une souche d'Actinomadura verrucosospora productrice de BBM1675, plus particulièrement de la souche Actinomadura verrucoso30 spora H 964-92 (ATCC 39334) ou de la souche Actinomadura verrucosospora A 1327 Y (ATCC 39638) ou d'un de ses mutants, dans un milieu aqueux nutri- tif contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, dans des conditions aérobies submergées jusqueà ce qu'une quantité substantielle dudit complexe BBM-1675 soit produite par ledit organisme dans ledit milieu de culture et éventuellement par sa récupération du milieu de culture. La présente invention a également pour objet deux constituants bioactifs majeurs du complexe BBM-1675 appelés BBM-1675 A 1 et BBM-1675 A 2 et quatre constituants bioactifs mineurs dudit complexe appelés BBM1675 A 3, A 4, B 1 et B 2 Les constituants peuvent être séparés et purifiés par des 10 procédures de chromatographie classiques La BBM-1675 complexe et ses constituants bioactifs présentent à la fois une activité antimicrobienne et une activité antitumorale. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des dessins donnés a titre 15 non limitatif. la figure 1 présente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-1675 A 1 partiellement purifié (pellet K Br); la figure 2 présente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-1675 A 2 partiellement purifié (pellet K Br); 20 la figure 3 présente le spectre d'absorption infrarouge de BBM1675 A 3 (pellet K Br); la figure 4 montre le spectre d'absorption infrarouge de BBM-1675 A 4 (pellet K Br); la figure 5 présente le spectre de résonance magnétique proto25 nique de BBM-1675 A 1 partiellement purifié dans CD C 13 ( 60 M Hz); la figure 6 présente le spectre de résonance magnétique proto nique de BBM-1675 A 2 partiellement purifié dans CDC 13 ( 60 M Hz); la figure 7 présente le spectre de résonance magnétique protonique de BBM-1675 A 3 dans CDC 13 ( 60 M Hz); la figure 8 présente le spectre de résonance magnétique protonique de BBM-1675 A 4 dans CDC 13 ( 60 M Hz); la figure 9 présente le spectre d'absorption infrarouge de 35 BBM-1675 A 1 purifié (pellet K Br); la figure 10 présente le spectre de résonance magnétique protonique de BBM-1675 A 1 purifié dans CD C 13 ( 360 M Hz); la figure 11 présente le spectre de résonance magnétique dans le 2547594 1 carbone 13 C de BBM-1675 A 1 purifié dans CDC 13 ( 90,3 M Hz); la figure 12 présente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-1675 A 2 purifié (pellet K Br); la figure 13 présente le spectre de résonance magnétique protonique de BBM-1675 A 2 purifié dans CDC 13 ( 360 M Hz); la figure 14 présente le spectre de résonance magnétique dans 13 C de BBM-1675 A 2 purifié dans CD C 13 ( 90,3 M Hz). L'invention a pour objet un nouveau complexe antibiotique anti10 tumoral appelé dans la présente BBM-1675 et se rapporte également à sa préparation par fermentation de certaines souches d'Actinomadura verrucosospora, et plus particulièrement de la souche Actinomadura verrucosospora H 964-92 et d'un de ses mutants appelés souche Actinomadura Verrucosospora A 1327 Y La souche parente précitée est isolée d'un échantillon de 15 sol recueilli à Pto Esperanza, Misiones, Argentine Une culture biologiquement pure de l'organisme a été déposée dans la collection américaine dite American Type Culture Collection, Washington, D C et ajoutée a sacollection permanente de micro- organismes sous le numéro de collection ATCC 39334 Ultérieurement, la souche de mutant A 1327 Y a été obtenue par 20 traitement classique à la nitrosoguanidine (NTG) de la souche H 964-92 et a été également déposée dans la collection précitée American Type Culture Collection sous le numéro de référence ATCC 39638. Comme dans le cas de nombreuses cultures productrices d'antibiotiques, la fermentation de la souche Actinomadura Verrucosospora H 964-92 25 ou de la souche A 1327 Y conduit à la production d'un mélange ou d'un complexe formé de substances constitutives Deux constituants bioactifs majeurs, BBM-1675 A 1 et A 2 et quatre constituants bioactifs mineurs BBM-1675 A 3, A 4, Bl et B 2 ont été séparés à partir du complexe BBM-1675 produit durant le procédé de fermentation. La BBM-1675 et ses constituants BBM-1675 A 1, A 2, A 3, A 4, B 1 et B 2 présentent une activité antimicrobienne vis-à-vis d'un large spectre de micro-organismes y compris des bactéries gram-positif Le complexe BBM1675 et ses constituants bioactifs distincts présentent également des propriétés inductrices de phage dans les bactéries lysogénes Deux 35 des constituants, à savoir BBM-1675 A 1 et BBM-1675 A 2, ont été soumis à des tests de détermination in vivo sur divers systèmes de tumeurs de souris et démontrent une activité inhibitrice vis-à-vis de la leucémie L-1210, de la leucémie P:388, des mélanomes B 16 et des carcinomes du 25475-94 poumon de Lewis La BBM-1675 A 3 et la BBM-1675 A 4 ont montré une activité vis-à-vis de la leucémie P-388 de la souris Le complexe et ses constituants bioactifs, par conséquent, peuvent être utilisés en tant qu'agents antimicrobiens ou en tant qu'agents antitumoraux pour inhiber des tumeurs chez des mammifères. Le micro-organisme La souche actinomycète H 964-92 a été isolée à partir d'un échantillon de sol et par des procédures classiques mise sous la forme de culture biologiquement pure pour sa caractérisation La souche H 974-92 10 comporte sur le mycelium aérien des courtes chaînes de spores qui ont des formes allongées, tortueuses ou en forme de crochet Les spores ont une forme ovale ou sphérique et présentent une surface verruqueuse Le mycelium aérien se forme faiblement sur la plupart des milieux La couleur de la masse aérienne est blanche et ultérieurement elle passe à une 15 coloration dans les violets ou voit sa couleur changer en une couleur bleuàtre dans certains milieux comprenant de l'agar La couleur du mycélium formant le substrat est incolore ou légèrement rose La température de croissance est comprise entre 15 C et 43 C La composition en aminoacide de la paroi des cellules et les constituants sucres des hydrolysats 20 de la totalité de la cellule montrent que la souche H 964-92 appartient au type IIIB de paroi cellulaire La ménaquinone a été identifiée en tant que MK-9 (H 6) MK-9 (H 8). Sur la base des caractéristiques morphologiques, culturelles et physiologiques majeures ainsi que des caractéristiques de composition chimique de la paroi cellulaire, on peut classer la souche H 964-92 dans le genre Actinomadura. Quoique la souche originale H 964-92 ne donne lieu qu'à une croissance modérée et à un mycelium aérien clairsemé, une variante montrant une bonne croissance et une formation de mycelium aérien améliorée consiste en un traitement de H 964-92 à la nitrosoguanidine (NTG) La variante, appelée souche A 1327 Y, rend plus aisée l'investigation taxonomique et a été par conséquent en tant qu'Actinomadura Verrucosospora. Méthode Les milieux et les procédures utilisés pour l'examen des caracté35 ristiques de culture et l'utilisation des hydrates de carbone sont celles recommandées par International Streptomyces Project (Intl J Syst. Bacteriol 16: 313-340, 1966) Le milieu additionnel décrit par S.A Waksman (The Actinomycetes, vol 2) et G M Lvedemann (Intl J. Syst Bacteriol 21: 240-247, 1971) a été également utilisé. La composition en amino acide de la paroi cellulaire et les constituants sucres de l'hydrolysat de la cellule sont analysés conformément aux méthodes décrites par Becker et coll dans Appl Microbiol 13: 236-243, 1965 et par Lechevalier et Lechevalier dans Actinomycetes, Ed Ho Prauser, Jena, Gustav Fischer Verlag, pages 393-405, 1970, respectivement La ménaquinone a été identifiée par l'analyse spectrale de masse conformément aux procédés de Collins et coll dans J Gen Microbiol 100: 221-230, 1977, et la composition de la ménaquinone est représentée sur la base du système décrit par Yamada et coll dans J Gen Appl Micro10 biol 23: 331-335, 1977. Morphologie La souche H 964-92 forme à la fois un substrat et un mycelium aérien Le mycelium du substrat est long, ramifié et n'est pas fragmenté en petits filaments Dans le mycélium aérien se forment des chaînes de 15 spores courtes, monopodes ou à extrémités hyphale Des branches ayant la forme de verticilles ou de chaîne de spores sont également observées à proximité de l'extrémité hyphaleo Ces chaînes de spores contiennent de deux à dix spores par chaîne et ont une forme droite, flexueuse ou tortueuse Les spores présentent une surface verruqueuse et ont une 20 forme comprise entre la forme sphérique et la forme elliptique ( 0,5-0,6 x 0,6-1,4 pm) avec des extrémités pointues ou arrondies Après maturation, chaque spore est souvent obtenu avec une feuille vide Des spores, sporanges ou granules sclérotiques mobiles n'ont été trouvés dans aucun des milieux examinés. Caractéristiques physiologiques et de culture La croissance de la souche H 964-92 est de faible à modérée aussi bien dans les milieux organiques naturels que dans les milieux chimiques définis La formation du mycelium aérien est en général faible mais est modérée dans l'agar de farine d'avoine (milieu ISP n 3), dans l'agar 30 d'amidon+sels minéraux (milieu ISP n 4) et dans l'agar de Bennett Des variantes spontanées qui manquent de mycelium aérien se produisent aux fréquences élevées La couleur dy mycelium aérien est blanc et ultérieurement il devient rose pale dans l'agar de farine d'avoine, l'agar d'amidon+sels minéraux et l'agar d'asparagine+glycérol (milieu ISP N 05). 35 La couleur de la masse aérienne change ultérieurement pour passer à une couleur bleuâtre après une longue période d'incubation ( 5 mois) dans l'agar de farine d'avoine, l'agar d'asparagine+glycérol et l'agar de tyrosine La couleur du mycélium de substrat est incolore à jaune dans l'agar de Czapek, iagar de tyrosine, l'agar d'extrait de malt+ extrait de levure (milieu ISP n 2), l'agar de fer+extrait de levure+peptone (milieu ISP n 6) et l'agar de Bennett et est de couleur violette dans l'agar d'asparagine+glycone et l'agar d'asparagine+glycérol Des mêla5 no Tdes et autres pigments diffusibles ne sont pas produits Une variante n A 1327 Y, qui a été obtenue à partir de la souche originale, forme de façon prédominante un mycélium aérien bleu pèle et porte une masse de spores aériennes abondante. La souche H 964-92 se développe à 15 C, 28 C, 37 C et 43 C, mais 10 ne se développe pas à 10 C ou à 47 C Elle est sensible à Na Cl à 7 %, et résistante à la lysozyme à 0,01 %. Les caractéristiques physiologiques et de cultures de la souche productrice sont consignées dans les tableaux 1 et 2 respectivement. L'utilisation de sources de carbone est montrée dans le tableau 3. 15 TABLEAU 1 Caractéristiques de culture de la souche H 964-92 (souche originale ATCC 39334 et mutant A 1327 Y) Souche n H 964-92 agar extrait de levure +tryptone (ISP n 1) souche originale (ATCC 39334) G abondant, floccose, sédimenté et non pigmenté Mutant n A 1327 Y modéré, floccose, sédimenté et non pigmenté Actinomadura Verrucosospora KCC A-0147 modéré, floccose, sédimenté et non pigmenté agar de nitrate+sucrose (agar de Czapek) agar d'asparagine+glucose G modéré R incolore A rare, gris clair ( 264), à rose pale ( 7) D rien G modéré R blanc ( 263) à rose jaunâtre profond A rien ou très rare; rose pèle ( 7) D rien G faible à modéré R incolore à rose jaun tre clair A faible; rose jaunatre clair après mois, gris bleuâtre clair ( 190) D rien faible incolore rien ou rare; blanc rosâtre ( 9) rien faible incolore rien ou très rare; blanc rien modéré rose jaunâtre clair ( 28) modéré; blanc à rose clair ( 4) faible incolore rien ou rare, pèle bleu ( 185) rien faible incolore rien ou très rare; blanc rien modéré rose jaunâtre clair ( 28) à rose jaunâtre profond ( 27) modéré; blanc à rose puissant ( 2) agar d'asparagine+glycérol (ISP n 5) rien rien agar d'amidon+sels minéraux (ISP n 4) agar de tyrosyne (ISP N 4) G abondant R blanc jaunâtre ( 92) A abondant; rose clair ( 4) à gris rosâtre ( 10) D rien G modéré R blanc jaunâtre ( 29) A faible; rose jaunâtre clair ( 28), plus tard ( 5 mois), partiellemnt gris bleuâtre clair ( 190) D rien G faible à modéré R jaune pale ( 89) modéré rose jaunâtre clair ( 28) modéré; gris bleu clair ( 190) rien modéré rose jaunâtre fort ( 26) modéré; blanc à rose clair ( 4) rien modéré rose jaunâtre fort ( 26) modéré; blanc à rose clair ( 4) modéré rose jaunâtre clair ( 28) abondant, bleu pâle ( 185) agar nutritif rien faible incolore à rose pale ( 7) rien rien rien faible incolore à rose pâle ( 7) rien rien agar extrait de malte +extrait de levure (ISP n 2) agar de farine d'avoine (ISP n 3) A rien D rien G abondant R jaune pale ( 89) A faible; blanc ( 263) D rien G modéré R incolore à rose pâle ( 7) A faible, blanc rosâtre '( 9) à gris bleuâtre clair ( 190) D rien G abondant R jaune grisâtre ( 90) abondant rose jaunâtre fort ( 26) faible; blanc à rose pâle ( 7) rien faible rose jaunâtre pâle ( 31) très rare; bleu pâle vif ( 184) rien abondant rose jaunâtre fort ( 26) modéré; rose jaunâtre pale ( 31) et blanc bleuâtre ( 189) rien abondant rose jaunâtre fort ( 26) faible; blanc à rose pale ( 7) rien faible rose jaunâtre pâle ( 31) très rare; bleu pâle vif ( 184) rien abondant rose jaunâtre fort ( 26) rien rien agar de Bennett A modéré; blanc ( 263) à blanc jaunâtre ( 92) D rien G modéré R incolore A rien D rien agar fer-extrait de levure peptone (ISP n 6) abondant incolore rien rien abondant incolore rien rien * observé après incubation à 35 C pendant 3 semaines, ** abréviations: G = croissance, R = couleur inverse, A = mycélium aérien, D = pigment diffusible, *** couleur et nombre entre parenthèses suivent la norme de couleur selon Kelly, K L. et D B Judd; ISCC-NBS chartes des noms de couleurs illustrés par Colors Centroid. U.S Dept of Comm Cir 553, Washington, D C, Nov 1975. 2547594 1 TABLEAU 2 Caractéristiques physiologiques de la souche H 964-92 Essai Réponse Méthode et milieu Domaine de température Croissance maximum entre Agarde Bennett pour la croissance 28 C et 37 C Modérée à 20 C et 43 C. Aucune croissance à 10 C et 47 C. Liquéfaction dans la 10 gélatine Hydrolyse dans l'amidon Liquéfiée Milieu gélatine+ peptone+glucose Plaque d'agar d'amidon Hydrolysée Réaction dans du lait 15 écrémé Non coagulée et complètement peptonisé Lait écrémé Difco Formation de pigment mélanoide Réduction par le nitrate Non produit Non réduit Agar de tyrosine, agar de fer+levure+ peptone et bouillon d'extrait de levure +tryptone bouillon de nitrate +glucose de Czapek et bouillon.de nitrate+extrait de levure+glucose Résistance Na Cl Croissance à 5 % ou moins Aucune croissance à 7 % Agar d'extrait de levure+tryptone Lysozyme Résistant Croissance à 0,01 % en moins. Aucune croissance à 0,1 % Croissance entre 5,0 et 9,5 Aucune croissance à 4,5 et à 10,0. Agar d'extrait de levure+tryptone Agar d'extrait de levure+tryptone 2 47594 I TABLEAU 3 Utilisation des sources de carbone Souche n H 964-92 Actinomadura Souche originale Mutant n A 1327 Y Verrucosospora KCC A-0147 glycérol + + + D(-)-arabinose L(+)-arabinose + + D-xylose + + D-ribose + L-rhamnose + + + D-glucose + + + D-galactose D-fructose + + + D-mannose L(-)-sorbose sucrose + + + lactose cellobiose + + + mélibiose théhalose + + + raffinose D(+)-mélezitose amidon soluble + + + cellulose + + + dulcitol inositol + D-mannitol + + + D-sorbitol 30 Salicine Observé après incubation à 28 C pendant 3 semaines, milieu de base: milieu minéral Gottlieb-Pridham. Composition des parois de la cellule et constituants sucre de l'ensemble e la cellule La paroi cellulaire purifiée de la souche H 964-92 contient de l'acide mésodiaminopimélique mais manque de glycine L'hydrolysat de l'ensemble de la cellule montre la présence de madurose ( 3-0 OméthylDgalactose), de glucose et de ribose L'amino-acide de la paroi de la 2547594 1 cellule et la totalité des constituants sucre de la cellule indiquent que la souche H 964-92 est une paroi cellulaire du type IIIB Deux constituants majeurs de ménaquinone sont identifiés en tant que MK-9 (H 6) et MK-9 (H 8). Position taxonomique de la souche H 964-92 La souche H 964-92 présente les caractéristiques majeures suivantes: ( 1) chaînes de spore aériennes: courtes, allongées, flexueuses ou tortueuses quant à la forme; ( 2) spores: surface verruqueuse; ( 3) mycelium aérien: couleur rosâtre ou bleuâtre; ( 4) mycélium du substrat: rosâtre dans certains milieux; ( 5) pigment diffusible: aucun; ( 6) -mésophile ( 7) paroi de la cellule du type IIIB, ( 8) système ménaquinone: MK-9 (H 6) et MK-9 (H 8). Ces caractéristiques majeures indiquent que la souche H 964-92 est du genre Actinomadura Les espèces déjà connues du genre Actinomadura ont été isolées sur des mammifères Certaines souches ont également été 20 obtenues à partir de plantes Cependant, la plupart des nouvelles espèces proposées récemment ont été isolées à partir du sol Selon la taxonomie numérique et la classification de l'Actinomadura et des actinomycètes qui lui sont apparentés de Goodfellox et coll dans J Gen Microbiol 112: 95- 111 ( 1979), la plupart des espèces d'Actinomadura d'origine 25 terrienne sont spécifiées dans le groupe 7 des 14 groupes décrits La souche H 964- 92 est plutôt apparentée à l'espèce du groupe 7 Nonomura et Ohara dans J Ferment; Technol 49: 904-912 ( 1971) ont indiqué l'existence de cinq espèces de saprophytes du genre Actinomadura et Nonomura (J Ferment Technol 52: 71-77, 1974) et Preobrazhenskaya et coll. 30 (Actinomycetes and Related Organisms 12: 30-38, 1977) ont publié les clés de l'identification et de la classification des espèces du genre Actinomadura Comme résultat de la comparaison des descriptions des trente espèces comprenant des organismes décrits dans les brevets, la souche H 964-92 apparait la plus semblable à l'Actinomadura coerulea décrite par The Preobrazhenskaza et coll, (référence infra) et Actinomadura verrucosospora décrite par Nonomura, (référence infra). La souche N O H 964-92 est directement comparée à la souche A verrucosospora KCC A-0147 et on a constaté qu'elle est étroitement apparentée à A verrucosospora quant à ses caractéristiques morphologiques, caractéristiques de culture et caractéristiques physiologiques Ainsi, la souche H 964-92 est classifiée en tant que nouvelle souche d'Actinomadura verrucosospora. Il faut bien comprendre que pour la production de BBM-1675, la présente invention quoique décrite en détail en référence à la souche particulière Actinomadura verrucosospora, souche H 964-92 (ATCC 39334) et à la souche de mutants à laquelle elle a conduit, désignee sous le nom de souche A 1327 Y (ATCC 39638), ne saurait être limitée à ces microorganismes ou à des micro-organismes totalement décrits par les caracté10 ristiques de culture indiquées ici Il est bien entendu que de façon spécifique, l'invention embrasse toutes les souches H 964-92 et tous les mutants produits naturellement ou artificiellement de la BBM-1675 ainsi que les variantes qui en dérivent. Production antibiotique Les antibiotiques BBM-1675 de la présente invention peuvent être préparés par culture d'une couche productrice de BBM-1675 du genre Actinomadura verrucosospora, de préference une couche d'Actinomadura verrucosospora présentant les caractéristiques d'identification de 'ATCC 39334 ou ATCC 39638, ou d'un de leur mutant, dans un milieu nutritif aqueux 20 convenable L'organisme se développe dans un milieu nutritif contenant: des sources nutritionnelles connues convenant aux actinomycetes, c'està-dire des sources assimilables de carbone et d'azote plus éventuellement des sels minéraux et autres facteurs de croissance connus Des conditions aérobies submergées sont de préférence employées pour la production de 25 grandes quantités d'antibiotiques, quoique pour la production de petites quantités, des cultures de surface ou en flacons puissent également être utilisés Les procédures généralement utilisées pour la culture d'autres actinomycetes sont applicables au procédé selon la présente invention. Le milieu nutritif doit contenir une source de carbone assimila30 ble convenable, tel que glycérol, L(+)-arabinose, D-xylose, D-ribose, Lrhamnose, D-glycose, D-fructose, sucrose, cellobiose, amidon soluble, Dmannitol ou inositol En tant que sources d'azote, on peut citer le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'urée, le nitrate d'ammonium, le nitrate de sodium, etc, utilisé seul ou en combinaison avec 35 des sources d'azote organique telles que peptone, extrait de viande, extrait de levure, liqueur de ma Ts, poudre de soja, farine de graine de coton, etc On peut également ajouter, le cas échéant, des sels minéraux nutritifs pour fournir des sources de sodium, de-potassium, de calcium, d'ammonium, de phosphate, de sulfate, de chlorure, de bromure, de carbonate, de zinc, de magnésium, de manganèse, de cobalt, de fer et similaire. La production des antibiotiques BBM-1675 peut être effectuée à 5 n'importe quelle température convenant à la croissance convenable de l'organisme producteur, c'est-à-dire de 15 à 45 C et est de façon convenable, mise en oeuvre à une température de l'ordre de 27 à 32 C En général, la production optimum est obtenue après une période d'incubation de 68 à 180 heures en fonction des méthodes employees (secouage, 10 agitation ou fermentation Lorsque la fermentation en réservoirs est mise en oeuvre, il est souhaitable de produire un inoculum végétatif dans un bouillon de culture par inoculation de la culture du bouillon par une quelconque culture telle culture de sol ou culture lyophilisée de l'organisme producteur Apres obtention d'un inoculum actif selon 15 cette méthode, celui-ci est transféré de façon aseptique au milieu du réservoir de fermentation La production d'antibiotique peut être surveillée par le test de diffusion agar sur disque de papier à l'aide de Staphylococcus aureus 209 P constituant l'organisme test. Isolement et purification Lorsque la fermentation est achevée, le complexe BBM-1675 peut être obtenu à partir du bouillon par les procédures d'isolement conventionnelles telles qu'extraction par solvant Ainsi par exemple, l'ensemble du bouillon peut être séparé par filtration et centrifugation dans un récipient mycélial et un surnageant du bouillon de culture L'antibio25 tique dans le gâteau mycélial peut être récupéré par suspension du gâteau dans du méthanol, séparation par filtration des matières insolubles et concentration de l'extrait méthanolique L'activité du surnageant du bouillon peut être récupérée par extraction à l'aide de n-butanol Les extraits de méthanol et de n-butanol mentionnés ci-dessus peuvent alors 30 être combinés et évaporés par une méthode azéotropique dans une solution aqueuse dans laquelle se dépse la plus grande partie de l'activité antibiotique sous la forme d'un solide huileux Le solide peut alors être dissous dans le méthanol et la solution est filtrée Le filtrat est concentré et ajouté à un mélange d'acétate d'éthyle et d'eau L'extrait 35 organique résultant contient le complexe BBM-1675 brut qui peut être séparé de la solution par addition d'un anti-solvant tel que le n-hexane. Le complexe BB-1675 brut est un mélange de divers constituants y compris les constituants bioactifs majeurs BBM-1675 A 1 et A 2, et de quatre constituants bioactifs mineurs BBM-1775 A 3, A 4, B 1 et B 2 o Ces constituants bioactifs peuvent être séparés et purifiés par des procedures chromatographiques classiques Selon un mode de mise en oeuvre du procédé, le complexe BBM-1675 brut est tout d'abord dissous dans le méthanol et purifié par une chromatographie dans une colonne de Sephadex LH-20 à l'aide de méthanol agissant en tant que solvant d'élution Ce complexe partiellement purifié peut alors être chromatographié sur une colonne de gel de silice éluée par étapes a l'aide de chloroforme plus une concentration croissante de méthanol pour conduite à BBM-1675 A 1, un 10 mélange de BBM-1675 A 2, A 3 et A 4 et un mélange BBM-1675 Bl et B 2 Le constituant A 1 peut subir une purification supplémentaire dans une colonne de chromatographie Sephadex LH-20, le méthanol constituant le solvant d'élution Le mélange de A 2, A 3 et A 4 peut être séparé par chromatographie sur une colonne de Bondapak C 18 (Waters Associates, Inc) faisant emploi de concentrations croissantes d'une solution aqueuse d'acétonitrile en tant qu'éluant Le mélange des constituants B 1 et B 2 peut être séparé par chromatographie sur une colonne de gel de silice employant un mélange de chloroforme et de méthanol en tant que solvant d'élution. D'autres détails des procédures de séparation chromatographique préférées 20 sont donnés dans les exemples qui suivent. Propriétés physico-chimiques des constituants BBM-1675 Les six constituants bioactifs du complexe BBM-1675 se distinguent les uns des autres par deux systèmes de chromatographie en couche mince (TLC) ainsi que le montre le tableau suivant. 25 TABLEAU 4 Chromatographie en couche mince des constituants de BBM-1675 Valeurs Rf Si 02 * silanisée Constituant CH C 13-CH 30 H ( 5/1 v/v) CH 3 CN-H 20 ( 75/25 v/v) BBM-1675 A 1 0,74 0,18 BBM-1675 A 2 0,71 0,21 BBM-1675 A 3 0,72 0,28 BBM-1675 A 4 0,71 0,78 BBM-1675 Bl 0,63 0,23 BBM-1675 B 2 0,60 0,16 * gel de silice en phase inverse C 18. La séparation de BBM-1675 A 2, A 3 et A 4 est difficile à l'aide d'un système de chromatographie en couche mince en phase ordinaire mais peut être obtenue par chromatographie en couche mince en phase inverse. Les constituants de BBM-1675 individuels présentent une solubi5 lité et des réactions colorées semblables les uns aux autres Par exemple, ils sont solubles dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, légérement solubles dans le benzène et l'eau et insolubles dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone Ils donnent lieu à des réactions positives avec le chlorure de fer, les réactifs d'Ehrlich et de Tollen et à des réponses négatives aux essais de Sakaguchi, à la -ninhydrine et à l'anthrone. Les propriétés physico-chimiques caractéristiques des constituants de BBM1675 sont consignées dans le tableau 5 ci-dessous. TABLEAU 5 Propriétés physico-chimiques des constituants de BBM-1675 BBM-1675 A A A A B B point de fusion (dec) 156-158 4 147- 49 o C 125-127 C 123-126 C 159161 C 156- 59 o C (a)02 (c 0,5, CHC 1) -1910 -179,40 -161 -176 -171 -1220 D 3 Analyse trouvée (%) C: 51,52 53,81 55,00 53,67 H: 5,81 6,31 6,52 6,35: N: 4,02 3,82 3,57 3,45 (par différence) 0: 38,65 36,06 34,91 36,53 UV nm (E)max cm dans CH 3011 253 ( 325) 253 ( 281) 253 ( 286) 253 ( 257) 253 ( 225) 248 ( 212) 282 ( 195) 282 ( 172) 282 ( 158) 282 ( 153) 282 ( 140) 279 ( 141) 320 ( 143) 320 ( 128) 320 ( 122) 320 ( 117) 320 ( 104) 318 ( 103) 25 dans H Cl-CH 30 H 0,01 N 253 ( 323) 253 ( 276) 253 ( 287) 253 ( 258) 253 ( 225) 248 ( 210) 282 ( 192) 282 ( 167) 282 ( 160) 282 ( 155) 282 ( 140) 279 ( 140) 320 ( 144) 320 ( 128) 320 ( 126) 320 ( 118) 320 ( 105) 318 ( 103) dans Na OH-CH 30 H 0,01 N 252 ( 325) 252 ( 289) 252 ( 280) 252 ( 266) 252 ( 236) 248 ( 233) 283 ( 172) 283 ( 171) 283 ( 162) 283 ( 160) 282 ( 141) 278 ( 150) 30 318 ( 136) 318 ( 122) 318 ( 120) 318 ( 118) 318 ( 105) 318 ( 110) Poids moléculaire (valeur approximative) 1 300 1 100 1 100 1 400 (gel HPLC, gel Finepak o 101). L'absorption ultraviolette maximum des constituants BBM-1675 observée à 35 253, 282 et 320 nm, ne varie pas que ce soit en solution acide ou en solution alcaline Les spectres IR et RMP de BBM-1675 A 1, A 2, A 3 et A 4 sont consignés dans les figures 1 à 4, et 5 à 8 respectivement Le spectre RMP à 360 M Hz de BBM-1675 A 1 indique la présence d'un groupe acétyle ( 6: 2,11 ppm), d'un groupe N-CH 3 ( 2,52 ppm), de quatre groupes OCH 3 ( 3, 42; 3,80; 3,88 et 3,98 ppm) et d'un groupe exométhylène ( 4,57 et ,48 ppm) en même temps que la présence de deux protons aromatiques ( 7,50 et 8,59 ppm) et d'un proton NH ( 11,79 ppm) Le spectre RMC de BBM-1675 A 1 présente 55 signaux de carbone incluant un signal d'intensité triple ( 6: 56,0 ppm, OCH 3) La formule moléculaire de BBM-1675 A 1 semble être C 57 H 72 N 4032 si l'on se base sur le spectre RMN au 13 C et spectre protonique, la détermination du poids moléculaire par HPLC et SIMC (spectrométrie de masse ionique secondaire) et la microanalyse. 10 Etude structurelle de BBM-1675 A 1 I Apres traitement à l'aide de H C 11-CH 30 H 0,5 N à température ambiante, la BBM-1675 A 1 perd sa bioactivité et fournit une substance chromophore lipophile (composé I) en même temps que divers fragments non identifiés Le composé I présente une absorption ultraviolette similaire à I 5 celle de l'antibiotique parent ce qui montre que le composé I-conserve la structure chromophore du BBM-1675 A 1 Deux autres fragments chromophores apparentés au composé I sont obtenus par hydrolyse alcaline de BBM-1675 A 1 L'hydrolyse avec KOH-CH 30 H 0,05 N à 55 C durant 1 h conduit au composé II présentant une absorption ultraviolette maximum à 252, 20 284, 297 (épaulement) et 322 nm, tandis que la réaction dans KOH-CH 30 H 1 N conduit A une substance chromophore acide appelée composé III Les propriétés physico-chimiques des composés I, II et III sont résumées dans le tableau 6 ci-dessous. TABLEAU 6 Propriétés des composés I, II et III Composé I Composé II Composé III point de fusion 82-83 C 133 C 253-255 C " 21 H 31 N 10 C 14 H 17 NO 6 C 13 H 15 N 06 CHOH UV Xmaç nm (e) 244 ( 21 850) 252 ( 26 600) 248 ( 26 900) 276 ( 9 400) 283 ( 11 200) 295 ( 14 400) 318 ( 6 300) 197 (sh 8 800) 310 ( 13 500) 35 322 ( 11 700) Composé I Composé II Composé III MS m/z 457 (M+) 295 (M) 281 (M+) 425 280 263 341 263 236 281 251 222 264 248 218 TLC (xylène MEK-CH 30 H= /5/1 v/v) Rf 0,58 0,66 0,13 *MEK = méthyléthylcétone Les informations relatives à la structure des composés II et III sont obtenues à partir de la transformation chimique et des données de spectres suivantes. La RMN protonique au 13 C indique la présente de quatre groupes OCH 3, un l groupe =CH 2, sept groupes -C= deux groupes >C=O et un groupe >NH dans le composé II. Le spectre RMN du composé III est semblable à celui du composé Il et ne diffère que par l'absence d'un des quatre groupes OCH 3 observés pour le composé II Cette différence, en même temps que la nature acide du compo20 sé III, suggère que le composé II est un ester méthylique du composé III. Lorsqu'il est chauffé sous reflux à l'aide de KOH IN méthanolique, le composé II est converti quantitativement en composé III tandis que le composé III est converti en le composé II par traitement par le diazométhane Le traitement du composé II à l'aide de Na BH 4 dans C 2 H 50 H conduit 25 à un produit de réduction (composé IV, M:m/z 267) qui montre un groupe -CH 20 H dans le RMN au lieu du groupe -COOCH 3 du composé II Apres hydrogénation sur palladium fixé sur charbon, le composé II conduit à la formation d'un dérivé dihydro (composé V, M:m/z 297) Le spectre RMN protonique du composé V montre un signal méthyle sous forme d'un doublet 30 nouveau et l'absence du groupe exométhylène présent dans le composé II. De plus, l'un des groupes OCH 3 apparaît pour un champ ( 6: 3,50 ppm) plus élevé du composé V Ces résultats indiquent la présence d'un groupe: -C=CH 2 OCH 3 dans le composé II qui est réduit après hydrogénation en le groupe -H-CH 3 0 C 3 OCH 3 dans le composé V Le composé II est chauffé par de l'acide chlorhydrique méthanolique 1,5 N à 80 C durant 3 heures et l'hydrolysat est 2547594 I chromatographié sur une colonne de gel de silice pour conduire à l'obtention d'un composé faiblement basique (composé VI, M+:m/z 211) Le spectre infrarouge et les propriétes physico-chimiques indiquent que le composé VI contient un groupe NH 2 Le composé VI est identifié comme 5 étant le 4,5-diméthoxy-anthranilate par comparaison des résultats des analyses RMN et IR avec ceux d'un échantillon authentique Il en résulte que les structures des composés II à VI sont déterminees ainsi qu'il est montré ci-dessus. Structures des composés II, III, IV, V et VI Composé II Compose III CH 3 ( 15 C 3 L-CO-C //OCH 3 co 3 CO Ml POSE IV 25 H +/Me OH COMPOSE VI CH 3 NH 2 CE 30 O OOCE 3 COMPOSE V CH CH 3 00 NH-CO-CH C Hl V COCH 3 CH 3 O ' COOCH 3 Par traitement à l'aide de KOH-CH 30 H O,05 N à 55 C, le composé I 35 est divisé en deux fragments chromophores nouveaux (composé VII, C 15 H 2 N 07, M+: m/z 327) et un sucre (composé VIII) Le spectre de RMN du C 15 H 21 NO 7composé VII montre un singulet C-CH 3 et deux groupes OCH 3 à champ élevé en plus de trois champs faibles OCH 3 et des deux protons aromatiques 2547594 ' couramment observés pour les composés II IV et VI Une hydrolyse supplémentaire du composé VII à l'aide d'acide chlorhydrique méthanolique 1,5 N conduit au composé VI que l'on identifie comme étant semblable au composé II préalablement obtenu Après élimination de VI, l'hydrolysat 5 est traité par le 2,4-dinitrophénylhydrazine pour précipiter un solide jaune qui est identifié comme étant la 2,4-dinitrophénylhydrazone de l'acide pyruvique Ainsi le composé VII est le 4,5-diméthoxy-N-( 2 ',2 'diméthoxypropionyl)anthranilate de méthyle Le composé VIII ne présente pas le pic ionique moléculaire mais présente le pic M-OCH 3 pour m/z 131 10 dans le spectre de masse ainsi que le prévoit la formule moléculaire C 7 H 1404 Le spectre de RMN indique que le composé VIII a la structure de la 2,6-didéoxyhéxopyranose Ceci est confirmé par la résonance magnétique nucléaire sur 13 C du composé I qui donne lieu à un groupe C-CH 3, un groupe -CH 2, trois groupes O-CH COMPOSE I COMPOSE VII COMPOSE VI ? 3 OH-/CH OH CH 3 + 2 % es 30-co-1-CH 3 _ 3 3 O CO-c H 3 E 3 J 2 O CI 3 3 X 3 CE COOCH O OH composÉ VIII CH 3 3 H 3 C-OI 300 I 3 Le poids moléculaire du composé I ( 457) semble correspondre à environ 1/3 de molécule totale de BBM-1675 A 1 (formule proposée H -Ilc o C Loo a 3 "'-c O 3 j CE 3 Le poids moléculaire du composé I ( 457) semble correspondreà environ 1/3 de molécule totale de BBM-1675 A, (formule proposée C 57 H 72 N 4032; poids moléculaire calculé = 1324) La structure partielle de BBM-1675 semble être la suivante: CH 3 NH-CO-=CEH \ l OCH 3 CH 30 O\ O CM O OH )_ O O Ultérieurement au dépôt de la demande de brevet de base aux U.S A n 495 231, on a constaté que les constituants BBM-1675 A 1 et A 2 décrits ci-dessus, et produits conformément à l'exemple 2 ci-dessous; ne sont en fait pas complètement purs et que certaines des propriétés carac15 térisantes utilisées pour définir de telles constituants ne sont pas exactes En suivant les procédures de purification chromatographiques supplémentaires telles que décrites plus en détail dans les exemples 3 et 6 ci-dessus, on isole la BBM-1675 A 1 et la BBM-1675 A 2 sous forme plus purifiée et totalement caractérisée ainsi que décrit ci-dessous De 20 même, les données de l'analyse élémentaire des constituants A 3 et A 4 sont révisées pour montrer la présence de soufre dans ces composés et les durées de rétention HPLC sont calculées pour ces deux constituants. On a résumé ci-dessous les propriétés physico-chimiques révisées des constituants de BBM-1675. BBM-1675 A 1 Description: cristaux de couleur blanche à jaune pâle; point de fusion 156-158 (avec décomposition) Analyse élémentaire: Analyse 1 Analyse 2 Moyenne C: 51,60 % C: 52,74 % C: 52,17 % H: 6,31 % H: 5,99 % H: 6,15 % N: 5,31 % N: 3,94 % N: 4,63 % S: 8,47 % S: 9,71 % S: 9,09 % O (par différence): O (par différence): O (par différence) 28,31 % 27,62 % 27,96 % Spectre d'absorption ultraviolette: appareil UV Varian, Cary 219 solvant: méthanol concentration: 0,01356 g/l 2547594 ' 15 Xmax (nm) absorptivités 320 12,4 280 sh (épaulement) 253 25,1 210 25,5 Aucune variation significative avec un acide ou une base. Rotation optique: solvant CH C 13 (")J = -207 (C = 0,0351) Une deuxième analyse montre la rotation optique suivante: (a)27 = -191 (C = 0,5, CHC 13) Spectre d'absorption infrarouge: cf figure 9 bandes d'absorption majeures (K Br): 985, 1015, 1070, 1110, 1150, 1210, 1250, 1308, 1380, 1405, 1446, 1520, 1592, 1608, 1668, 1715, 2920, 2960, 3360, 3440 cm-1. Spectre de masse: instrument VG-ZAB-2 F FAB-MS-thioglycérol ions du domaine de poids moléculaire (m/z): 1249, 1357, 1463; avec addition de Na Cl (m/z): 1271, 1379, 1485, 1597. FAB-MS-MB (MB: matrice, poids moléculaire 154); ions du domaine de masse moléculaire (m/z): 1249, 1283, 1403, 1555; avec addition de Na Cl (miz): 1249, 1271, 1303, 1425, 1483, 1577. FAB-MS-glycérol-DMSO: ions du domaine de masse moléculaire (m/z): 1215, 1247, 1279, 1293, 1325, 1353; avec addition de Na Cl (m/z): 1215, 1247, 1247, 1269, 1325, 1347, 1375. Instrument: Kratos MS-50 FAB-MS-thioglycérol; ions du domaine de masse moléculaire (m/z): 1347, 1463. 25 30 Poids moléculaire (basé sur les données du spectre de masse indiquées cidessus) poids moléculaire apparent: 1248 Spectre de résonance magnétique nucléaire: Instrument WM 360 Brucker Solvant: CD C 13 RM Ni: 360 M Hz 6 (ppm): 11,75 ( 1 H, s); 8,55 ( 1 H, s); 7,45 ( 1 H, s); 6,61 ( 1 H, m); 6, 23 ( 1 H, brs); 6,17 ( 1 H, brs); 5,93 ( 1 H, d, I = 9,3); 5,82 ( 1 H, d, I = 9,3); ,7 ( 1 H, brs); 5,49 ( 1 H, m); 5,45 ( 1 H, d, I = 2,3); 5,38 ( 1 H, brs); 4,95 ( 1 H, d, I = 10,2); 4,64 ( 2 H, m); 4,54 ( 1 H, d, I = 2, 3); 4,2 ( 1 H, s); 4,15-3,35 ( 26-28 H) { 4,10 ( 1 H,m); 4,02 ( 1 H, brs); 3,95 ( 3 H, s); 10 3,85 ( 3 H, s); 3,79 ( 3 H, s); 3,46 ( 1 H, m); 3,40 ( 3 H, s)}; 2,82-2,70 ( 3 H, brm); 3,50 ( 3 H, s); 2,47 ( 1 H, m); 2,38-2, 22 ( 5 H); 2,12 ( 1 H, m); 2,11 ( 3 H, s); 1,60-1,05 ( 22 H) { 1,39 ( 3 H, d, I = 6,3); 6,31 ( 3 H, d, I = 6,3); 1,29 ( 3 H, d, I = 6,3); 1,08 ( 6 H)}. 15 Cf Figure 10 Résonance magnétique nucléaire au 13 C: 90,3 M Hz. Cf Figure 11. Dans un essai distinct, le spectre de résonance magnétique nucléaire au C de la BBM-1675 A 1 purifié est déterminé pour un échantil20 lon dissous dans Cd C 13 ( 80 M Hz) Les pics majeurs sont indiqués ci dessous. RMC de BBM-1675 A 1 ( 80 M Hz dans CDC 13) Pic chimique en ppm (multiplicité) BBM-1675 A 1 13,7 (q) 16,6 (q) 17,5 (q) 19,8 (q) 22,2 (a) 22,6 (q) 23,4 (q) 29,0 (t) 34,0 (t) 25,1 (t) 39,5 (t) 47,2 (d) 52,5 (q) 55,6 (u) 56,0 (q) 57,1 (d) 62,4 (t) 64,5 (d) 67,7 (d) 68,2 (d) 68,8 (t) 69,2 (d) 69,6 (t) 70,2 (d) 71,9 (d) 76,0 (d) 76,6 (d) 77,1 (u) 77,3 (d) 83,4 (s) 86,6 (d) 88,4 (s) 90,5 (t) 97,2 (d) 98,3 (s) 99,0 (d) 30 99,6 (d) 103,8 (d) 107,6 (s) 112,5 (d) 123,1 (d) 124,9 (d) ,1 (d) 131,5 (s) 134,9 (s) 136,7 (s) 144,0 (s) 147,2 (s) 153,8 (s) 154,4 (s) 155,0 (s) 160,7 (s) 166,4 (s) 191,8 (s) * multiplicité q = quartet; d = doublet; u = incertain 35 t = triplet; S = singulet. 15 BBM-1675 A 2 Description: cristaux blanc; point de fusion 147-149 O C. Analyse élémentaire: C: 52,71 % H: 5394 % N: 3,94 % S: 9,39 % 0 (par différence): 28,01 % Spectre d'absorption ultraviolette: appareil UV Varian, Cary 219 solvant méthanol concentration 0,02052 g/l Amax (nm) absorptivités Xmax (m 320 12,2 282 16,3 252 26,2 214 25,8 Aucune variation significative avec un acide ou une base. Rotation optique: (a)27 = -279,4 (C = 0,5, CH Cl 3) D Spectre d'absorption infrarouge: cf figure 12 Instrument: Beckman Modèle IR 4240 bandes d'absorption majeures (K Br): 950, 1015, 1070, 1100, 1155, 1213, 1250, 1313, 1375, 1405, 1450, 1520, 1595, 1610, 1685, 1735, 2940, 2980, 3440 cm-1. Spectre de masse: instrument VG-ZAB-2 F FAB-MS-thioglycérol ions du domaine de poids moléculaire (m/z): 968, 1249, 1355, 1357, 1463, 1579; avec addition de Na Cl (m/z): 990, 1271, 1379, 1485, 1593. 30 FAB-MS-MB (MB: matrice, poids moléculaire 154); ions du domaine de masse moléculaire (m/z): 1249, 1403, 1419, 1555, 1571, 1587; avec addition de Na Cl (m/z): 1249, 1271, 1425, 1441, 1457, 1483, 1577. FAB-MS-glycérol- DMSO: ions du domaine de masse molé35 culaire (m/z): 1215, 1231, 1247, 1263, 1279, 1293, 1309, 1325, 1326, 1341, 1353, 1369. Poids moléculaire (basé sur les données de spectre de masse décrit ci-dessus): poids moléculaire apparent: 1248 Spectre de résonance magnétique nucléaire: cf figure 13 Instrument WM 360 Brucker Solvant: CD C 13 RMN 1: 360 M Hz 6 (ppm): 11,91 ( 1 H,s); 8,62 ( 1 H, s); 5 7,58 ( 1 H, s); 6,56 ( 1 H,m); 6, 22 ( 1 H,s); 6,15 ( 1 H, brs); 5,91 ( 1 H, d, I = 9,6); 5,83 ( 1 H, d, I = 9,6); 5,70 ( 1 H, m); 5,45 ( 1 H, d, I = 2,2); 5,44 ( 1 H, s); 5,34 ( 1 H, brs); 4,95 ( 1 H, d, I = 10,2); 4,75 ( 1 H, m); 4,65 ( 1 H, d, I = 6,8) ; 4,54 ( 1 H, d, I = 2,2); 4,47 10 ( 1 H, m); 4,18 ( 1 H, s); 4,10 ( 1 H, brs); 4,05-3,50 ( 20-24 H); { 3,96 ( 3 H, s); 3,87 ( 3 H, s); 3,77 ( 3 H, s)}; 3,46 ( 1 H,;m); 3,39 ( 3 H, s); 2,79 ( 1 H, m); 3,73 ( 2 H, m); 2,50 ( 3 H, s); 2,50 ( 1 H, m); 2,38-2,22 ( 3 H); 2,14 ( 1 H, m); 2,10 ( 3 H, s); 1,98 ( 2 H, m); 1,65-1,45 ( 6-8 H); 15 1,38 ( 3 H, d, I = 6,0); 1,34 ( 3 H, d, I = 6,0); 1,22 ( 3 H, d, I 6,8); 1,10 ( 6 H). Résonance magnétique nucléaire au 13 C: 90,3 M Hz. Cf Figure 14. Dans un essai distinct, le spectre de résonance magnétique nu: cléaire au 13 C de la BBM-1675 A 2 purifié est déterminé pour un échantillon dissous dans Cd C 13 ( 80 M Hz) Les pics majeurs sont indiqués ci-dessous. BBM-1675 A 2 13,7 16,9 17,5 19,8 22,3 22,7 23,4 33,1 34,1 35,1 39,3 47,6 52,6 55,7 56,0 56,1 57,6 62,4 64,5 64,9 65,9 68,3 69,2 69,7 71,9 73,6 75,8 76,1 77,1 77,7 78, 1 78,3 83,3 86,2 88,4 90,4 97,2 98,3 99,1 99,5 99,6 103,8 107,1 112,4 123, 2 124,8 129,9 137,3 30 144,1 154,2 154,5 160,9 167,9 192,2 TABLEAU 7 Propriétés physico-chimiques des BBM-1675 A 3, A 4, B 1, B 2 A A B B point de fusion (dec) 125-{ 27 c 123: 26 C 159-161 C 156- 59 C 35 (a) 2 (c 0,5, c Hc 13) -161 -176 -171 -122 Analyse trouvée (%) C: 54, 55 54,65 H: 6,46 6,29 N: 3,73 3,51 S: 7,49 8,07 A 3 1 % l) A nm (E) max lcm dans Me OH dans HCI 0,01 N-Me O H *253 ( 286) 282 ( 158) 320 ( 122) 253 ( 287) 282 ( 160) 320 ( 126) 252 ( 280) 283 ( 162) 318 ( 120) A 4 253 ( 257) 282 ( 153) 320 ( 117) 253 ( 258) 282 ( 155) 320 ( 118) 252 ( 266) 283 ( 160) 318 ( 118) B 1 243 ( 225) 282 ( 140) 320 ( 104) 253 ( 225) 282 ( 140) 320 ( 105) 252 ( 236) 282 ( 141) 318 ( 105) B 248 ( 212) 279 ( 141) 318 ( 103) 248 ( 210) 279 ( 140) 318 ( 103) 248 ( 233) 278 ( 150) 318 ( 110) dans Na OH 0,01 N-Me OH Résultat de la chromatographie en couche mince (TLC) et de la chromatographie liquide à performance élevee sur les constituants BBM-1675 A Etude n 1 résumé BBM-1675 A 1 BBM-1675 A 2 BBM-1675 A 3 25 BBM-1675 A 4 BBM-1675 B 1 BBM-1675 B 2 * gel B Etude n 2 TABLEAU 8 TLC et HPLC des constituants BBM-1675 TLC (Rf) HPLC (di urée de rétention en minutes) Si O 2 CH 3 CN-H 20 Lichrosorb RP-18 CH C 13-Me OH silanisé * CH 3 CN-Me OH-0 1 M CH 3 COONH 4 ( 5/1 v/v) ( 75/25 v/v) ( 5/2/3 v/v) 0,74 0,18 13,3 0,71 0,21 17,3 0,72 0,28 8,0 0,71 0,78 5,1 0,63 0,23 0,60 0,16 de silice en phase inverse C 18. TLC et HPLC pour des constituants A 1 et A 2 purifiés TLC chromatographie On utilise pour toutes les chromatographies en phase normale des plaques du type dit Uniplates de gel de silice GHLF d'Analtech On utilise des plaques de 2,5 cm x 10 cm pour une chromatographie en couche mince en une dimension On procède au développement dans des cylindres 35 de verre mesurant 6,4 cm de diamètre sur 12 cm de longueur et contenant ml d'éluant Des plaques mesurant 7,5 x 10 cm sont utilisés pour la chromatographie en couche mince en deux dimensions L'échantillon est appliqué sur le coin gauche inférieur à 1 cm des bords La plaque est développée d'abord dans un récipient (largeur 12, 7 cm, 8,6 cm de profondeur, 13 cm de hauteur) contenant 50 ml du premier éluant La plaque est alors séchée à l'air, tournée de 90 en sens contraire des aiguilles d'une montre et développée dans un deuxième récipient contenant 50 ml du deuxième éluant. Les plaques analytiques de gel de silice C 18 prérevêtues du type Whatman sont utilisées pour toutes les étapes de chromatographie en phase inverse Les plaques mesurant 2,5 cm x 7,6 cm sont développées dans des cylindres en verre contenant 10 ml d'éluant. Les plaques de phase normale sont placées tout d'abord sous lumière ultraviolette à 254 nm Les plaques sont alors insérées dans un récipient en verre ( 6,4 cm de diamètre x 12 cm de longueur) contenant des cristaux 12 Les plaques sont alors examinées après environ 2 minutes Les plaques de phase inverse sont visualisées sous une lumière 15 ultraviolette à 254 nm seulement On détecte des zones en essayant par trempe la fluorescence d'un colorant imprégné. HPLC analytique Les constituants suivants sont utilisés pour construire un système HPLC analytique Une pompe de système de distribution de solvant modèle 6000 A de Waters Associates; un varian Varichrom modèle VUV-10 par rapport à un système de détecteur à 254 nm 091 OD; un panneau d'enregistrement série 5000 d'enregistrement Fisher; des programmeurs de solvant modèle 660 Waters Associates; un injecteur modèle U 6 K de Waters Associates, une colonne de 10 p, p-Bondapak C 18 d'Alltech (diamètre 4,6 mm x 25 cm) 25 avec une colonne de garde Pell ODS ( 0,03-0,038 mm) de Whatman Co Les constituants sont reliés à un tube en acier inoxydable 316 ( 1,6 mm de diamètre 0,23 mm de longueur) L'éluant est amené par pompe sous un débit de 2 ml/mn pendant la totalité de l'analyse. HPLC préparative Les constituants suivants sont utilisés pour créer un système de chromatographie liquide à pression moyenne: une pompe de laboratoire modèle RP-SY 2 CSC FMI de la Société Fluid Metering, Inc; un humidificateur par pulsation modèle PD-60 LF FMI de la Société Fluid Metering, Tnc; une boucle d'échantillon de 15 ml construite à partir d'un tube de 35 polypropylène ( 3,0 mm de diamètre x 1,5 mm de longueur) enroulé autour d'un tube de carton ( 8,65 cm de diamètre); des colonnes séries 3500 Universal LC de Glenco; un appareil de contrôle d'absorption/fluorescence modèle UA-5 de Instrument Specialties Co avec une unité optique de type 6; une valve d'interruption de débit modèle 590 de la Société Instrumentation Specialties Co;-et un collecteur de fraction modèle 328 de la Société Instrumentation Specialties Co. Les divers éléments sont reliés par des canalisations en polypropylene et en téflon ( 3,0 mm de diamètre x 1,5 mm de longueur) et des valves et connecteurs multiprises Glenco selon l'ordre indiqué. Les colonnes des séries 3500 Universal LC de Glenco sont garnies de suspensions de l'adsorbant défini en suspension dans le solvant indiqué à l'aide de techniques standards Le vide entre le lit au repos et le haut du tube est rempli de sable Ottawa Standard L'éluant est pompé selon un débit maximum qui ne dépassera pas une contre-pression de psi (environ 20 ml/mn). Elution par gradient Un appareil d'élution par gradient Glenco conformé de deux chambres de volume, de hauteur et-de diamètre égaux, relié en tandem avec une vanne de téflon sont utilisés pour toutes les élutions par gradient. Une chambre est utilisée en tant que chambre de mélange et une en tant que réservoir statique Le solvant le moins polaire est initialement maintenu dans la chambre de mélange Le solvant le plus polaire est maintenu dans la chambre statique Des barres d'agitation magnétique revêtues de téflon ( 1,0 x 3,7 mm) sont placées dans les deux chambres et entrainées par un appareil d'entraînement des agitateurs de modèle Magne- matic de Thomas L'éluant est amené par pompe dans la chambre de mélange à la pression moyenne du système HPLC par un tube de polypropylene ( 1,5 mm de diamètre x 3,0 mm de longueur) Lorsque l'éluant est 25 éliminé de la chambre de mélange, le solvant du réservoir statique est autorisé à le remplacer librement, ce qui crée par conséquent un gradient linéaire de l'éluant. Analyses TLC de BBM-1675 A 1 et A 2 Sont résumées dans le tableau 9 cidessous, les valeurs Rf obser30 vées pour BBM-1675 A 1 et A 2 sur des plaques en phase normale Rf est calculé par division de la distance mesurée du centre d'une zone au point de l'introduction de l'échantillon par la distance mesurée du front de solvant au point d'introduction de l'échantillon. TABLEAU 9 Rf Système/composé BBM-1675 A 1 BBM-1675 A 2 4 % de méthanol dans le chloroforme 0,33 0,30 % de méthanol dans l'éther diéthylique 0,39 % d'acétone dans Skellysolve B 0,38 0,31 Sont résumées dans le tableau 10 ci-dessous, les valeurs Rf observées pour BBM-1675 A 1 et A 2 sur des plaques en phase normale développées en deux dimensions Les positions des tâches sont exprimées en coordonnées cartésiennes La coordonnée X est la valeur Rf du système de sol5 vant de la deuxième liste La coordonnée Y est la valeur Rf du système de solvant de la première liste. TABLEAU 10 Rf Système/composé 4 % de méthanol dans le chloroforme vs % de méthanol dans l'éther diéthylique BBM-1675 A 1 BBM-1675 A 2 ( 0,34, 0,33) ( 0,28, 0,23) 4 % de méthanol dans le chloroforme vs % d'acétone dans skellysolve B ( 0, 33, 0,28) Sont résumées dans le tableau 11 ci-dessous, les vées pour BBM1675 A 1 et A 2 en chromatographie en phase des plaques développées dans des éluants binaires. TABLEAU 11 valeurs inverse Rf WobserC 18 sur Rf Système/composé BBM-1675 A 1 BBM1675 A 2: % Na Cl 0,5 M dans l'acétonitrile 0,18 0,21 % d'eau dans l'acétonitrile 0,00 0,00 Sont résumées dans le tableau 12 ci-dessous, les valeurs Rf observées pour BBM-1675 A 1 et A 2 en chromatographie en couche mince en phase 25 inverse C 18 sur des plaques développées par des éluants ternaires. TABLEAU 12 Rf Système/composé Acétonitrile Méthanol 30 80 % 10 % % 10 % % 30 % % 50 % % 30 % 40 % 40 % % 20 % % 20 % BBM-1675 A 1 BBM-1675 A 2 Na Cl 0,5 M % 30 % 30 % 20 % 20 % 20 % 20 % 20 % 1,00 0,57 0,32 0,44 0,62 0,60 0,42 0,74 - 1,00 0,50 0,22 0,33 0,54 0,49 0,34 0,69 2547594 ' Acétonitrile % Acétonitrile % Acétonitrile % Analyse HPLC Méthanol Eau % 30 % Méthanol NH 40 Ac 0,1 M % 30 % Méthanol Na H 2 P 04 0,1 M % 30 % de BBM-1675 A 1 et A 2 0,00 0,32 0,00 0,00 0,22 0,00 On procède à des essais sur BBM-1675 A 1 et BBM-1675 A 2 à l'aide d'éluants simple, binaire et tertiaire sur des colonnes de gel de silice en phase inverse C 18 Sont résumées dans les tableaux 13, 14 et 15 cidessous, les valeurs K' observées pour ces composées Les valeurs K' sont calculées à l'aide de la formule suivante: K' = TR-To dans laquelle: TR est la durée de rétention mesurée au moment de l'injection par rapport au sommet du pic; et To est le temps de volume vide. TABLEAU 13 25 Système/composé Acétonitrile Tétrahydrofuranne Méthanol BBM-1675 A 1 a a 0,00 K' BBM-1675 A 2 a a 0,00 a = le composé n'est pas élué de la colonne. TABLEAU 14 Système/composé % d'eau dans l'acétonitrile 30 25 % de méthanol dans l'eau a = le composé n'est pi K' BBM-1675 A 1 BBM-1675 A 2 a a 1,25 1,25 la colonne. as élué de TABLEAU 15 Eluants ternaires K' BBM-1675 A 2 Système/composé Acétonitrile Méthanol % 30 % BBM-1675 A 1 Eau 30 % a a 2 47594 Acétonitrile Méthanol NH 40 Ac 0,1 M % 30 % 30 % 1,7 3,0 % 20 % 30 % 3,8 6,5 43,3 % 23,3 % 33,3 % 6,1 b 42,5 % 22,5 % 35,0 % 7,8 b 41,5 % 21,5 % 37,0 % 9,7 b a = le composé n'est pas élué b = n'est pas déterminé. Propriétés biologiques des constituants BBM-1675 L'activité antimicrobienne des constituants BBM-1675 est déterminée vis-à-vis de diverses bactéries (gram-positive, gram-négative et résistantes aux acides) et de champignons par la méthode connue de dilution deux fois en série dans l'agar Le milieu d'agar nutritif est utilisé pour les bactéries gram-positiv et gram-négatif et le milieu n 1001 15 ( 3 % de glycérol, 0,3 % de L-glutamate de sodium, 0,2 % de peptone, 0,31 % de Na 2 HP 04, 0,1 % de KH 2 P 04, 0,005 % de citrate d'ammonium, 0,001 % de Mg SO 4 et 1,5 % d'agar) pour les organismes résistants aux acides Le milieu d'agar de Sabouraud est utilisé pour les champignons (fongis). Ainsi qu'il est montré dans le Tableau 16, chacun des six constituants 2de BBM-1675 (A 1, A 2, A 3, A 4, B 1, B 2) montre un large spectre d'activité antimicrobienne Les BBM-1675 A 1, A 2, A 3 et A 4 en particulier sont très actifs vis-à-vis des bactéries gram-positives. TABLEAU 16 Activité antimicrobienne des constituants BBM-1675 25 MIC en mcg/ml souche s BBM-1675 A 1 A A B B S.2 a 0,0 3 O 124 O 1 2 S aureus 209 P purifiés (ainsi que préparés dans l'exemple 3 ci-dessous) et les constituants A 3 et A 4 Les données sont résumées ci-dessous. -2547594 Ia C en rcg/ml Souche BBM-1675 A A S ie 2 puissent posséder une activité antitumorale. TABLEAU 17 Activité d'induction lysogène des constituants BBM-1675 Antibiotique MIC (mcg/ml) BBM-1675 A 1 0,0063 BBM-1675 A 2 0,0125 BBM-1675 A 3 0,05 BBM-1675 A 4 0,10 BBM-1675 B 1 0,10 BBM-1675 B 2 0,20 * concentration inductive minimum L'activité antitumorale de BBM-1675 A 1 et A 2 est déterminée sur 35 divers systèmes de tumeurs sur des souris Les leucémie lymphocytique P-388, leucémie lympoidique L-1210, mélanome mélanotique B 16 et carcinome du poumon de Lewis sont implantés par voie intrapéritonéale chez des souris mâle BDF 1 selon une dose d'inoculum de 106, 105, 5 x 105 et 106 cellules par souris respectivement Des doses graduées des composés testés sont administrées aux souris par voie intrapéritonéale 24 heures 2547594 ' après inoculation de la tumeur. Les traitements sont effectués une fois le premier jour seulement, puis au premier, quatrième et septième (q 3 j x 3), une fois par jour pendant 9 jours (qj 1 à 9), et onze jours (qj 1 à 11) Les constituants A 3 et A 4 sont testés uniquement vis-à-vis de la leucémie P-388 par un q 3 j x 3 dû fait d'un manque de matière. Les BBM-1675 A 1, A 2, A 3 et A 4 sont dissous dans une solution saline à 0,9 % contenant 10 % de diméthyl sulfoxyde et la chromomycine A 3 (Toyomycine, Takeda) est employée en tant que composé de référence dissou10 te dans une solution saline à 0,9 % La mort ou la survie des souris traités et non traités est quotidiennement enregistrée et la durée de survie moyenne (MST) est calculée pour chacun des groupes testés (T) et témoin (C) Une valeur T/C égal à ou supérieur à 125 % indique qu'un effet antitumoral significatif est obtenu Les résultats sont consignés 15 dans le tableau 18 à 23 Les BBM-1675 A 1 et A 2 montrent une activité antitumorale extrêmement puissante vis-a-vis des leucémies P-388 avec une valeur T/C maximum de 160 % Elles sont approximativement 100 à 3 000 fois plus actif que la chromomycine A 3 en terme de dose efficace minimum Les BBM-1675 A 3 et A 4 cependant sont moins actifs que le consti20 tuant A 1 ou A 2 vis-à-vis de la leucémie P-388 (tableau 19) Les BBM-1675 A 1 et A 2 sont également actives-vis-à-vis de la leucémie L-1210 (tableau 21), les mélanomes B 16 (tableau 22) et les carcinomes de poumons de Lewis (tableau 23) La toxicité de BBM-1675 A 1 et A 2 est déterminée chez des souris mâles dd Y par administration intrapéritonéale ou intraveineuse; 25 la BBM-1675 A 1 est environ dix fois plus toxique que la BBM-1675 A 2 (tableau 24) Les indices thérapeutiques des BBM-1675 A 1 et A 2 sont de 4 à 8 et de 8 à 20 fois supérieurs à ceux de la chromomycine A 3 respectivement, sur le système de la leucémie P-388 (tableau 25) Des deuxièmes essais sont effectués par administration intraveineuse de constituants 30 de BBM-1675 à l'encontre des leucémies P-388 et L-1210 qui sont inoculées par voie intraveineuse à raison de 5 x 105 et 104 cellules par souris respectivement Dans ces essais, on utilise l'adriamycine en tant qu'agent de référence, adriamycine que l'on dissout dans une solution à 0,9 % saline et que l'on administre au premier, quatrième et septième jours Les résultats obtenus sont consignés dans les tableaux 26 et 27. Les deux constituants A 1 et A 2 sont supérieurs à l'adriamycine pour ce qui concerne les valeurs T/C maximum, la dose efficace minimum et le domaine d'activité. 254759 4 1 TABLEAU 18 Effet des constituants de BBM-1675 sur la leucémie P-388 (traitement du premier jour) Dose par Variation voie ip (mg/kg/jour*) BBM-1675 A 1 15 BBM-1675 A, 20 25 Chromomycir 30 Véhicule 0,03 0,01 0,003 0,001 0,0003 0,0001 0,00003 MST (jours) 19,0 19,0 18,0 20,0 16,0 15,0 14,0 T/C moyenne de (%) poids au Survivants jour jour 45 152 ** 152 ** 144 ** 160 ** 128 ** 120 112 ème jour ( 9) -2,6 -1,0 -1,0 -1,4 0,0 -0,2 -0,2 /5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0,3 6,0 48 -3,8 3, 0,1 20,0 160 ** -1,8 5 0,03 18,0 144 ** -1,4 5, 0,01 17,0 136 ** -0,6 5 0,003 17,0 136 ** -0,4 5, 0,001 16,0 128 ** 0,0 5, 0,0003 15,0 120 0,0 5 0,0001 14,0 112 0,0 5 ne A 3 1 19,0 152 ** -0,2 4 0,3 17,0 136 ** + 0,6 5 0,1 16,0 -128 ** + 0,8 5 0,03 14,0 112 0,0 5 0,01 14,0 112 -0,2 5, 12,5 + 0,1 10 * jour 1, i p voie intrapéritonéale ** indique une activité antitumorale significative. /5 /5 /5 /5 /5 /5 /5 /5 /5 /5 /5 /5 /5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 ' 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 /10 0/10 2547594 33 TABLEAU 19 Effet des constituants de BBM-1675 sur la leucêmie P-388 (jours de traitement 1, Dose par voie ip (mg/kg/jour*) BBM-1675 A 1 BBM-1675 A 2 0,03 0,01 0,003 0,001 0,0003 0,0001 0,00003 0,3 0,1 0,03 0,01 0,003 0,001 0,0003 0,0001 0,00003 MST 7,0 19,0 19,0 16,0 17,0 16,0 14,0 tox. 11,0 18,0 18,0 18,0 17,0 16,0 16,0 15,0 T/C 152 ** 152 ** 128 ** 136 ** 128 ** 112 144 ** 144 ** 144 ** 136 ** 128 ** 128 ** 120 4 et 7) Variation moyenne de poids au ême jour (g) -2,8 -1,0 -0,6 -0,4 -0,4 -0,2 + 0,4 -1,0 -1,2 -0,4 -0,4 -0,4 -0,4 -0,2 -0,4 Survivants jour jour 45 /5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 2/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 ' 0/5 0/5 0/5 BBM-1675 A BBM-1675 A 4 BBM-1675 A 4 30 0,01 0,001 0,0001 0,01 0,001 0,0001 17,5 15,0 13,5 16,5 14,0 12,5 ** 120 108 132 ** 112 + 0,2 + 0,6 + 0,6 + 0,2 + 0,4 + 0,6 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 Chromomycine A 3 0,3 0,1 0,03 0,01 18,0 18,0 17,0 14,0 144 ** 144 ** 136 ** 112 + 0,6 -+ 0,6 -0,2 0,0 /5 5/5 5/5 5/5 1/5 0/5 0/5 0/5 Véhicule 12,5 + 0,4 /10 0/10 * jours 1, 4 et 7, par voie intrapéritonéale ** indique une activité antitumorale significative. TABLEAU 20 Effet des constituants de BBM-1675 (traitement qd 1 sur la leucémie P-388 a 9) Variation Dose par voie ip (mg/kg/jour*) MST (jours) T/C (%) BBM-1675 A 1 0,01 0,003 0,001 O,0003 0,0001 0,00003 0,00001 *BBM-1675 A 2 0,1 0,03 0,01 0,003 0,001 0,0003 0,0001 0,00003 0,00001 7,0 13,0 19,0 19,0 18,0 16,0 16,0 6,0 13,0 18,0 18,0 18,0 17,0 16,0 15,0 15,0 152 ** 152 ** 144 ** 128 ** 128 ** 104 144 ** 144 ** 144 ** 136 ** 128 ** 120 120 moyenne de poids au ème jour (g) -1,8 -1,0 -1,2 -0,8 0,0 + 0,2 -0,2 -2,2 -1,4 -1,0 -0,6 -0,8 -0,4 -0,4 -0,6 + 0,4 /5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 4/5 5/5 5/5 5/5 5/5 /5 5/5 5/5 5/5 Survivants jour jour 45 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Chromomycine A 3 0,3 0,1 0,03 0,01 0,003 9,0 18,0 18,0 15,0 13,0 72 144 ** 144 ** 120 + 2,0 + 0,4 0,0 -0,2 -0,2 /5 5/5 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Véhicule 12,5 + 0,4 /10 0/10 * jour 1 à 9, par voie intrapéritonéale ** indique une activité antitumorale significative. 2547594 35 TABLEAU 21 Effet des constituants de BBM-1675 sur la leucémie L-i 210 Dose par voie ip (mg/kg/jour*) BBM-1675 A 1 -0,003 0,001 0,0003 0,0001 MST (jours) 14,5 12,0 12,0 11,0 T/C 153 ** 126 ** 126 ** 116 Variation moyenne de poids au ème jour (g) -1,7 -0,5 + 0,3 + 1,0 Survivants jour jour 45 6/6 6/6 6/6 6/6 0/6 1/6 0/6 0/6 BBM-1675 A 2 0,03 0,01 0,003 0,001 0,0003 0,3 0,1 0 ,03 0,01 0,003 ,5 13,5 13,0 11,0 10,5 8,5 11,5 11,0 11,0 10,0 111 142 ** 137 ** 116 89 121 116 116 105 -1,5 -1,2 -0,2 + 1,3 + 1,0 -1,2 + 1,2 + 1,2 + 1,3 + 1,5 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 -0/6 0/6 0/6 0/6 0,6 Chromomycine A 3 Véhicule 9,5 + 1,4 12/12 0/12 * jour 1 à 9, par voie intrapéritonéale ** indique une activité antitumorale significative. 2547594 ' TABLEAU 22 Effet des constituants de BBM-1675 sur le mélanome B 16 Dose par voie ip (mg/kg/jour*) BBM-1675 A 1 0,003 0,001 0,0003 0,0001 0,00003 0,00001 MST (jours) ,0 31,5 40,5 27,0 22,0 18,0 T/C (%) 191 ** 245 ** 164 ** 133 ** 109 Variation moyenne de poids au ème jour ( 9) -0,7 0,0 + 0,3 + 0,8 + 1,8 + 2,2 Survivants jour jour 45 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 BBM-1675 A 2 0,03 0,01 0,003 0,001 0,0003 0,0001 0,00003 0,1 0,03 0,01 0,003 11,0 26,5 29,5 26,0 22,0 18,0 17,0 ,5 23; O 21,0 18,0 161 ** 179 ** 158 ** 133 ** 109 103 ** 139 ** 127 ** -0,8 + 0,3 + 0,2 + 0,8 + 0,2 + 0,2 + 1,7 + 2,3 + 2,2 + 2,3 + 2,2 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0,6 Chromomycine A 3 Véhicule 16,5 + 2,1 12/12 0/12 * jour 1 à 9, par voie intrapéritonéale ** indique une activité antitumorale significative. 2547594 ' TABLEAU 23 Effet des constituants de BBM-1675 sur le carcinome du poumon de Lewis BBM-1675 A 1 Dose par voie ip (mg/kg/jour*) 0,003 0,001 0,0003 0,0001 0,00003 0,00001 MST (jours) ,0 31,5 21,5 21,0 13,0 11,5 T/C 91 286 ** 195 ** 191 ** 118 105 Variation moyenne de poids au ème jour (_) -1,7 -0,7 -0,7 + 1,0 + 1,0 + 1,0 Survivants jour jour 45 /6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 0/6 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6 BBM-1675 A 2 0,03 0,01 0,003 0,001 0,0003 0,0001 0,00003 0,1 0,03 0,01 0,003 ,0 25,5 28,5 17,0 ,0 10,5 11,0 21,5 17,0 17,0 11,5 232 ** 259 ** 155 ** 136 ** -95 ** 155 ** 155 ** 105 -1,8 -1,7 0,0 -0,3 + 1,2 + 0,5 + 0,8 + 1,2 + 1,7 + 1,5 + 1,7 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 5/5 6/6 6/6 0/6 0/6 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6 1/6 0/5 0/6 0,6 Chromomycine A 3 Véhicule * jour 1 a 11, 11,0 par voie + 0,8 intrapéritonéale 12/12 1/12 ** indique une activité antitumorale significative, TABLEAU 24 Toxicité des constituants de BBM-1675 LD 50 (mg/kg/jour) Doses multiples Dose simple (qd 1 à 9) i.p io V J p. 0,019 0,010 0,00046 0,18 0,10 0,0072 0,81 0,41 0,23 BBM-1675 A 1 BBM-1675 A 2 Chromomysine A 3 TABLEAU 25 Indices thérapeutiques LD 50/MED* P-388 simple 9 BBM-1675 A 1 63 BBM-1675 A 2 180 Chromomycine A 3 8 * dose efficace minimum. Id 1 a 9 > 46 72 L-1210 2 2 inactive B 16 24 23 LL 24 23 25 30 TABLEAU 26 Effet des constituants de BBM-1675 sur la leucémie P-388 implantée par voie intraveineuse Variation Dose (mg/kg/jour*) BBM-1675 A 1 0,01 0,003 0,001 0,0003 MST (jours) 9,5 14,0 11,5 9,0 T/C 106 156 ** 128 ** moyenne de poids au ème jour ( 9) -1,7 -0,3 + 0,3 + 0,3 Survivants jour jour 45 6/6 6/6 6/6 6/6 0/6 0/6 1/6 0/6 BBM-1675 A 2 0,1 0,03 0,01 ' 0,003 7,0 15,0 12,0 9,0 78 167 ** 133 ** 133 ** -3,7 -1,0 -0,5 + 1,0 -1,5 + 0,7 + 1,7 6/6 6/6 6/6 6/6 0/6 6/6 6/6 6/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Adriamycine tox. 9,0 12,0 9,0 Véhicule 9,0 * jour 1, 4 et 7, par voie + 1,7 intraveineuse. 12/12 0/12 ** indique une activité antitumorale significative. TABLEAU 27 Effet des constituants de BBM-1675 sur la leucémie L-1210 implantée par voie intraveineuse Dose (mg/kg/jour*) BBM-1675 A 1 0,008 0,004 0,002 0,001 0,0005 MST (jours) 9,5 14,0 13,0 9,5 9,0 T/C 119 175 ** 163 ** 119 113 Variation moyenne de poids au ème jour (g) -2,0 -0,2 + 0,2 + 0,8 + 0,8 Survivants jour jour 45 4/6 0/6 6/6 0/6 6/6 0/6 6/6 0/6 6/6 0/6 BBM-1675 A 2 0,063 0,032 0,016 0,008 0,004 11,0 14,0 10,5 8,0 8,0 138 ** ** 131 ** 100 100 ** 113 -1,8 + 0,2 + 0,8 + 1,2 + 0,8 + 0,2 + 1,5 + 1,7 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 2/6 6/6 6/6 6/6 *0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Adriamycine 16.8 tox. 12,0 9,0 8,0 Véhicule 8,0 par voie _ + 1,4 intraveineuse. 12/12 0/12 * jour 1, 4 et 7, **indique une activité antitumorale L'activité antitumorale des constituants significative. de BBM-1675 A 1 et A 2 est également déterminée par un deuxième essai vis-à-vis de la leucémie 30 P388 de la leucémie L-1210 et du mélanome B 16 chez les souris Les résultats de ces essais sont montrés ci-dessous dans les tableaux 28, 29 et 30 Les détails des méthodes utilisées dans ces essais ont été décrits dans Cancer Chemother Rep 3: -87 (Part 3), 1972. TABLEAU 28 Effet des BBM-1675 A 1 et A 2 sur la leucémie P-388 Matière *NSC 38270 BBM-1675 A 1 DMSO->saline Programme de traitement qj 1 à 9 j 1 Dose, IP pg/kg/jour 400 200 51,2 25,6 12,8 6,4 3,2 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 MST jours 13,0 11,0 20,0 18,0 16,5 13,0 12,0 11,0 10,5 10,0 10,0 10,0 Effet MST % T/C 163 138 250 225 206 163 150 138 131 * 125 125 125 AWC, g jour 5 -0,6 -0,9 -2,1 -1,8 -1,1 + 0,1 -0,3 -0,3 o O + 0,4 + 0,3 o O j 1, 5 et 9 25 ,6 12,8 6,4 3,2 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0,05 12,8 6,4 3,2 1,6 0,8 0,4 0,2 0,I 0,05 0,025 8,0 13,5 16,5 16,0 15,5 12,5 12,0 11,5 12,0 ,0 TOX 6,0 13,0 14,5 16,5 16,0 15,0 13,0 12,0 12,0 169 206 200 194 156 150 144 150 125 TOX 75 163 181 206 200 188 163 150 -1,8 -1,5 -0,8 -0,8 + 0,3 + 0,3 -0,1 + 0,2 + 0,8 + 0,8 TOX -1,5 -1,2 -1,6 -2,3 -0,9 -0,8 -0,4 + 0,1 -0,7 Survivants jour 5 ( 30) 6/6 6/6 4/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 1/6 4/6 6/6 6/6 6/6 6/6 5/5 6/6.6/6 6/6 qj 1 à 9 BBM-1674 A 2 DMSO->saline j 1 256 128 64 32 16 0,5 128 64 32 16 0,5 TOX 12,5 27,0 26,0 16,0 15,5 15,0 12,0 12,0 10,0 TOX TOX TOX 24,5 17,5 15,0 15,0 12,5 12,0 TOX 156 338 325 200 194 188 150 150 125 TOX TOX TOX 306 219 188 188 156 150 TOX -3,5 -1,9 -2,0 -1,8 -1,9 -0,7 -0,5 o O + 0,2 TOX TOX -1,3 -1,3 -1,1 o + 0,1 -0,4 -0,4 0/6 4/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 0/6 0/6 2/6 5/5 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 j 1, 5 et 9 20 BBM-1675 A 2 DMSO->saline 0,25 11,0 138 -0,4 dj 1 à 9 35 64 32 16 0,5 0,25 0,125 TOX 6,0 8,0 15,5 17,0 15,0 14,0 14,0 12,0 12,0 TOX 75 194 213 188 175 175 150 150 TOX -2,9 -1,9 -1,3 -1,8 -1,1 -0,5 -0,6 -0,1 + 0,1 6/6 1/6 4/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 Témoin saline 8,0 + 0,5 /10 Inoculum de la tumeur: 106 cellules d'ascites implantées par voie intrapéritonéale. hôte toxicité évaluation effet critère * souris CDF 1 + : 125 considéré comme une activité antitumorale significative % NSC 38270 = olivomycine A. TABLEAU 29 Effet des BBM-1675 A 1 et A 2 sur la leucémie L-1210 Matière BBM-1675 A 1 Programme de traitement j 1 20 Dose, IP pg/kg/jour 51,2 25,6 12,8 6,4 3,2 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 MST jours 12,0 7,0 9,0 9,5 6,0 7,0 8,0 7,0 7,0 7,0 Effet MST % T/C 129 136 86 114 100 100 AWC, g jour 5 -1,1 -2,3 -1,1 -0,5 -1,7 -0,8 -0,4 + 0,3 -0,5 + 0,8 Survivants jour 5 ( 30) /6 6/6 5/6 6/6 6/6 6/6 6/6. 6/6 5/6 5/6 j 1, 5 et 9 ,6 12,8 6,4 3,2 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0,05 TOX 9,0 9,0 8,0 8,5 8,0 7,5 8,0 8,0 7,o TOX 129 129 114 121 114 107 115 114 TOX -1,8 -0,8 -1,9 -0,4 -1,3 o + 0,4 + 0,3 1/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 5/6 6/6 qj 1 à 9 10 12,8 6,4 3,2 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0,05 0,025 256 128 64 32 16 8 4 2 0,5 TOX 8,0 8,0 9,0 8,5 8,0 8,0 7,0 7,0 6,0 TOX 7,0 7,5 8,0 7,0 9,5 8,5 8,0 8,0 8,0 TOX 114 114 129 121 114 114 100 86 TOX 107 114 136 121 114 114 114 -2,4 -1,6 -1,7 -2,1 -1,6 -1,0 -0,5 + 0,3 + 0,3 -0,6 TOX -1,8 -1,3 -2,2 -2,3 -1,4 -1,1 -0,8 -0,1 3/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 5/6 6/6 6/6 6/6 0/6 5/6 4/6 5/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 BBM-1674 A 2 j 1 25 30 TABLEAU 30 Effet des BBM-1675 A 1 et A 2 sur le mélanome B 16 Matière BBM-1675 A 1 Dose, IP Eg/kg/jour 3,2 M 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 MST jours TOX 16,0 34,5 56,5 47,0 37,0 MST % T/C TOX 64 168 226 188 148 Effet g jour 5 -1,8 -1,8 -1,8 -0,9 -0,7 -0,7 AWC, Survivants jour 5 ( 30) 2/10 /10 /10 10/10 ( 2)b 10/10 10/10 BBM-1675 A 2 16 M 1 0,5 13,0 29,5 43,5 50,5 0,5 38,0 52 118 174 202 140 152 -2,1 -2,0 -1,1 -2,1 -1,0 -1,1 /10 10/10 10/10 /10 ( 3)b 10/10 10/10 Témoin saline ,0 0,1 /10 a seulement un sans tumeur; MST d m o = 55,0 ( 220 %) b deux sans tumeur; MST d m o = 46,0 ( 184 %). 25 Inoculum de la tumeur: 0,5 ml d'un bouillon à 10 %, ip hôte: souris BDF 1 + traitement:qj I 1 à 9 toxicité: 125 considéré comme une activité antitumorale significative Après purification ultérieure de la BBM-1675 A 1 conformément à l'exemple 6, les échantillons du composé purifié sont testés vis-à-vis de la leucémie L- 1210, la leucémie P-388 et le mélanome B 16 chez les souris Les résultats de ces essais sont donnés ci-dessous. TABLEAU 31 Effet de la BBM-1675 A 1 sur la leucémie P= 388 (traitement au jour 1) Dose, IP Matière pg/kg/jour BBM-1675 A 1 15 0,1024 0,0512 0,0256 0,0128 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008 0,0004 0,0256 0, 0128 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008 0,0004 0,0002 0,0001 0,00005 Route MST programme jours i.p, qjxl TOX 17,5 16,5 17,5 15,5 15,5 16,5 15, 0 15,0 i.p, q 4 jx 3 TOX ,0 17,5 17,0 17,0 15,0 ,0 13,0 13,0 13,5 TOX 159 150 159 141 141 150 136 136 TOX 91 159 155 155 136 136 118 118 123 -1,8 -2,6 -1,4 -2,2 -2,5 -1,0 -1,2 -2,0 -1,5 -2,5 -1,9 -0,8 -2,0 -1,7 -0, 4 -0,8 -1,3 -1,0 Moyenne T/C variation % au 5 é jour Survivants au 5 ème jour 0/6 4/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 1/6 5/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 25 0,0128 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008 0,0004 0,0002 0,0001 0,00005 0,000025 i.p, qjx 5 TOX TOX 17,5 14,5 15,5 16,0 17,0 14,0 15,0 15,0 TOX TOX 155 132 141 145 155 127 136 136 -3,6 -2,2 -2,0 -2,2 -2,8 -1,3 -1,6 -1,6 -1,0 -0,7 0/6 3/6 5/6 6/6 6/6 6/6 6/6 5/6 6/6 6/6 9/9 Témoin véhicule 1 x 106 i p, d 4 jx 3 11,0 100 Hôte: souris femelle CDF 1 niveau d'implant et site: 1 x 106 cellules par voie intrapéritonéale. TABLEAU 32 Effet de la BBM-1675 A 1 sur la leucémie L-1210 (traitement au jour 1) Dose, IP Matière pg/kg/jour Route programme i.p, qjxl BBM-1675 A 1 15 0,1024 0,0512 0,0256 0,0128 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008 MST jours TOX TOX 8,0 11,0 11,0 10,0 10,0 8,0 Moyenne T/C variation % au-5 è jour TOX TOX -2,0 114 -2,0 157 -2,0 157 -1,9 143 -2,0 143 2,6 114 -0,4 Survivants au 5 ème jour 1/6 0/6 4/6 6/6 6/6 6/6 5/6 6/6 0,0256 0,0128 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008.0,0004 0,0002 ' i.p, q 4 jx 3 i.p, qjx 5 TOX 10,5 11,0 11,0 10,5 9,0 8,5 8,0 TOX 7,0 11,5 11,0 10,0 8,5 8,5 8,5 TOX 150 157 157 150 120 121 114 TOX 164 157 143 121 121 121 -2,3 -1,7 -1,8 -1,4 -1,9 -0,6 -0,7 -0,5 -2,8 -1,8 -1,0 -1,5 -1,6 -0,4 0,1 0,0 2/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 2/6 5/6 6/6 6/6 5/6 6/6 6/6 6/6 0,0128 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008 0,0004 0,0002 0,0001 Témoin véhicule I x 106 i.p, d 4 jx 3 7,0 100 0,1 /10 Hôte: souris femelle CDF 1 niveau d'implant et site: 1 x 106 cellules par voie intrapéritonéale. TABLEAU 33 Effet de la BBM-1675 A 1 sur le mélanome B 16 (traitement au jour 1) Dose, IP Route Matière pg/kg/jour *BBM-1675 A 1 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008 0,0004 programme i.p, q 4 jx 3 MST jours 16,5 22,5 25,0 22,0 24,0 T/C % 150 167 147 160 Moyenne variation au 5 è jour -3,8 -3,0 -1,8 -2,3 -1,8 Survivants au 5 ème jour 8/10 /10 10/10 10/10 9/10 Témoin (véhicule) 20 0,0016 0,0008 0,0004 0,0002 0,0001 i.p, qjx 9 27,0 27,0 26,0 24,5 25,5 180 173 163 170 -3,7 -2,9 -2,3 -2,4 -2,3 -0,3 /10 10/10 10/10 10/10 10/10 /10 0,5 ML i p, qjx 9 ,0 100 **BBM-1675 A 2 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008 0,0004 i.v, q 4 jx 3 ,0 32,5 26,0 24,0 24,5 86 186 149 137 140 -4,7 -2,1 -1,4 -0,4 -0,0 /10 10/10 10/10 10/10 /10 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008 0,0004 i.p,'q 4 jx 3 18,0 23,0 24,0 25,5 21,5 103 131 137 146 123 -2,7 -1,4 -0,7 -0,8 -1,4 -0,4 /10 10/10 /10 10/10 10/10 /10 Témoin véhicule 0,2 Ml i p, d 4 jx 3 17,5 100 Hôte: souris femelle CDF 1 *niveau d'implant et site: 0,5 ml bouillon a 10 % par voie intrapéritonéale. **niveau d'implant et site: fragment, s c. Les données des tests ci-dessus indiquent que le constituant de BBM-1675 A 1 purifié a pratiquement les mêmes propriétés antitumorales que l'échantillon moins purifié préalablement testé Le composé présente une puissance extrêmement élevée car l'activité a été obtenue pour une 5 dose de 25 nanogrammes/kg sur un programme de 5 doses quotidiennes sur la leucémie P-388 de la souris Les essais sur des leucémies P-388 et L-1210 ont montré que la BBM-1675 A 1 est efficace qu'elle soit administrée comme injection unique au premier jour, au quatrième jour après trois injections ou en dose quotidienne pendant 5 jours. Vis-à-vis du mélanome B 16, le composé est également efficace qu'il soit administré par voie intraveineuse à des animaux portant des tumeurs souscutanés ou par voie intrapéritonéale à des animaux portant des tumeurs implantées par voie intratumorale Cette propriété de transfert pharmacologique efficace d'un médicament à une tumeur se trouvant en un 15 site distant est inhabituelle parmi les antibiotiques antitumoraux. Ainsi qu'il est montré ci-dessus, les constituants BBM-1675 présentent une activité antimicrobienne puissante et sont par conséquent utiles dans le traitement thérapeutique des mammifères et d'autres animaux ayant des maladies infectieuses provoquées par de tels micro-orga20 nismes En outre, les constituants peuvent être utilisés pour d'autres: applications classiques des agents antimicrobiens, telles que par exemple la désinfection des appareils dentaires ou médicaux. L'induction prophagique dans les bactéries lysogénes et l'activité temoignée-vis-à-vis des tumeurs des souris montrent que les constituants 25 de BBM-1675 sont également utiles du point de vue thérapeutique pour inhiber la croissance des tumeurs chez les mammifères. La présente invention a par conséquent pour objet un procédé pour le traitement thérapeutique d'un autre animal souffrant d'une infection microbienne ou d'une tumeur maligne, qui consiste à administrer audit 30 animal ou hôte une quantité antimicrobienne ou une dose inhibitrice de tumeur de BBM-1675 A 1, A 2, A 3, A 4, B 1 ou B 2 ou d'une composition pharmaceutique les contenant. * Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet une Composition pharmaceutique qui comprend une quantité efficace du point 35 de vue antimicrobien ou de l'inhibition de tumeur de BBM-1675 A 1, A 2, A 3, A 4, Bl ou B 2 ou en association avec un diluant ou véhicule acceptable du point de vue pharmacologique et inerte Ces compositions peuvent être mises sous n'importe quelle forme pharmaceutique convenable destinée à une administration par voie parentérale. Les préparations conformes à la présente invention pour l'administration parentérale incluent des êmulsions, suspensions ou solutions aqueuses ou non aqueuses Elles peuvent également être mises sous la forme de compositions solides stériles qui sont susceptibles d'être 5 dissoutes dans de l'eau stérile, dans une solution physiologique ou autre milieu d'injection stérile, immédiatement avant emploi. Il conviendra de remarquer que les quantités préférées véritablement employées des antibiotiques BBM-1675 varieront en fonction du constituant particulier, de la formulation particulière, du mode d'applica10 tion et du site tumoral et de la maladie particulière à traiter De nombreux facteurs qui modifient l'action du médicament sont pris en considération par l'homme de l'art, par exemple l'âge, le poids de l'hôte, le sexe, la diète, la durée d'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion, l'état de l'hôte, les combinaisons de médicaments, la sensibilité à la réaction et la sévérité de la maladie. L'administration peut être effectuée en continu ou par étapes aux doses maximum tolérées Les taux d'application optimum pour un jeu donné de conditions peuvent être déterminés par l'homme de l'art à partir des essais de détermination de doses classiques dans le cadre des données 20 ci-dessus. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et ne constituent en aucune façon une limitation de l'invention. EXEMPLE 1 Fermentation de BBM-1675 Une souche d'Actinomadura N O H 964-92 est développée et maintenue sur une base d'agar contenant 1 % d'extrait de malt, 0,4 % de glucose, 0,4 % d'extrait de levure, 0,05 % de Ca CO 3 et 1, 6 % d'agar Une base d'agar bien développée est utilisée pour inoculer un milieu végétatif contenant 3 % d'amidon soluble, 3 % de levure sèche, 0,3 % K 2 HPO 4, 0,1 % de KH 2 PO 4, 30 0,05 % de Mg SO 4, 7 H 20, 0,2 % de Na Cl et 0,1 % de Ca CO 3, le p H étant ajusté à une valeur de 7,0 avant stérilisation La culture végétative est incubée à 32 C durant 72 heures sur un agitateur rotatif ( 250 rpm) et 5 ml du bouillon de culture sont transférés dans un Erlenmeyer de 500 ml qui contient 100 ml du milieu de fermentation formé de 3 % de molasse de 35 canne à sucre, de 1 % d'amidon de mais, de 1 % de farine de poisson, de 0,1 % de Ca CO 3 et 0,005 % de Cu SO 4,5 H 2 (p H 7,0 avant stérilisation) La fermentation est mise en oeuvre à 28 C pendant 6 jours sur un agitateur rotatif L'activité antibiotique dans le bouillon de culture est déterminée par diffusion d'agar sur disque de papier, le Staphylococcus aureus 209 P constituant l'organisme de test La puissance d'antibiotique atteint un minimum d'environ 1 mcg/ml après 5 jours de fermentation ' La fermentation de la BBM-1675 est également effectuée dans des fermenteurs agités Cinq cent millilitres d'inocuium tel que préparé ci-dessus, sont transférés dans un fermenteur de 20 1 contenant 10 1 de milieu de fermentation qui est formé des mêmes ingrédients que ceux qui 10 ont été utilisés pour la fermentation en récipient secoué La fermentation est effectuée à 32 C avec un débit d'aération de 2 l/mn et une agitation de 250 tpm Dans ces conditions, la production d'antibiotique atteint un maximum d'environ 0,9 mcg/ml après 68-76 heures de fermentation. Les études de fermentation sont également effectuées dans des récipients de fermentation Une culture de germe est effectuée pendant 4 jours à 30 C dans un Erlenmeyer contenant un milieu végétatif constitué de 3 % d'amidon soluble, 3 % de levure sèche, 0,3 % de K 2 HP 04, 0,1 % KH 2 PO 4, 0,05 % de Mg SO 4 7 H 20, 0,2 % de Na Cl et 0,1 % de Ca CO 3 La culture 20 de germe est inoculée dans un récipient de germe de 200 litres contenant litres de milieu de germe présentant la même composition que cidessus et le récipient de germe est agité à 240 tr/mn à 30 C pendant 31 heures La deuxième culture de germe est utilisée pour inoculer 3 ml de milieu de fermentation contenant 1 % d'amidon de blé, 3 % de molasse de 25 canne à sucre, 1 % de farine de poisson, 0,005 % de Cu SO 4 5 H 20 et 0,1 % de Ca CO 3 Le réservoir de production fonctionne à 28 C à raison de 164 tr/mn et avec un débit d'aération de 2 ml/mn Le p H du bouillon de culture s'élève graduellement avec le développement de la fermentation et atteint une valeur de 7,7-7,8 après 170-180 heures lorsqu'un pic d'activi30 té antibiotique de 1,7 mcg/ml est obtenu. EXEMPLE 2 Isolement et purification des constituants de BBM-1675 Le bouillon de fermentation récolté ( 3 000 litres, p H 7,8) est séparé en gâteau mycélien et surnageant à l'aide d'une centrifugeuse Sharpless Le gâteau mycélien est mis en suspension dans 1 600 litres de méthanol et le mélange est agité durant 1 heure Les matières insolubles sont séparées par filtration et l'extrait méthanolique est concentré sous vide à un volume de 43 litres L'activité contenue dans le surnageant du bouillon est récupérée par extraction de portion de 1 000 litres de n-butanol Les extraits de n-butanol et les extraits de méthanol concentré sont combinés et évaporés par voie azéotropique avec addition occasionnelle d'eau jusqu'à l'obtention de 20 litres d'une solution aqueuse dans laquelle se dépose la plus grande de l'activité antibiotique sous forme d'un solide huileux Le solide est digéré dans 30 litres de méthanol et les insolubles sont éliminés par filtration L'extrait m 6thanolique est alors concentré sous vide jusqu'à l'obtention d'une solution de 10 litres à laquelle on ajoute 40 litres d'acétate d'éthyle et 30 litres d'eau Apres agitation durant 30 minutes, la couche organique est séparée, séchée sur sulfate de sodium et évaporée sous vide jusqu'à l'obtention d'un volume de 4 litres L'addition du concentrat dans 20 litres de n-hexane conduit à un solide jaune pâle formé du 15 complexe BBM-1675 brut ( 90,14 g, puissance 55 mcg/ml) A la TLC, le complexe apparait être formé d'un mélange de deux constituants majeurs BBM-1675 A 1 et A 2 et de quelques uns des constituants mineurs Ils sont séparés et purifiés par chromatographie répétée que l'on met en oeuvre dans une enceinte refroidie pour empêcher toute détérioration. Le complexe de BBM-1675 ( 20 g) est dissous dans 20 ml de méthanol et introduit dans une colonne de Sephadex LH-20 (diamètre 5,5 x 85 cm). La colonne est traitée par le méthanol et l'élution est surveillée par un bio-essai sur staphylococcus aureus 209 P Les éluats actifs sont combinés, concentrés sous vide et lyophilisés; on obtient ainsi un solide 25 semi pur du complexe de BBM-1675 ( 4,19 g) Le solide est alors chromatographié sur une colonne de gel de silice (diamètre 5,0 x 50 cm) dans laquelle en tant qu'éluant est utilisé du chloroforme plus une quantité croissante ( 1 à 5 % v/v) de méthanol. Les éluats sont recueillis sur la base de l'activité antibacté30 rienne (par rapport à S aureus) et la TLC (Si O 2; CH C 13-CH 3 OH = 5/1 v/v) est concentrée sous vide Apres évaporation, de la BBM-1675 pratiquement homogène (rendement après évaporation 351 mg) est éluée tout d'abord à l'aide de 2 % de méthanol dans le chloroforme puis un mélange de BBM-1675 A 2, A 3 et A 5 ( 507 mg) suivi d'un mélange de BBM-1675 B ( 310 g) avec du 35 méthanol à 3 % dans le chloroforme Le solide de BBM-1675 A 1 est traité dans une colonne de Sephadex LH-20 (diamètre 2,0 x 80 cm) que l'on développe à l'aide de méthanol Les fractions actives sont concentrées sous vide à sec et le solide résiduel est cristallisé dans le méthanol. On obtient ainsi des plaques incolores de BBM-1675 pur ( 124 mg) (cette matière est la matière de départ de l'exemple 3 A) Le complexe de BBM1675 A 2, A 3 et A 4 est séparé par chromatographie sur une colonne de Bondapak C 18 (Waters,dianiètre 3,0 x 50 cm) L'élution est effectuée à l'aide d'acétonitrile en solution aqueuse et les éluats bioactifs sont examinés par TLC (Merck, CH 3 CN-H 20 silanisé * = 75/25 v/v) (* gel de silice en phase inverse C 18) Les constituants mineurs A 4 ( 33 mg) et A 3 ( 18 mg) sont élues avec succès dans cet ordre avec 20 % d'acétonitrile suivi d'un autre constituant majeur A 2 (cette matière est la matière de 10 départ de l'exemple 3 B) à l'aide d'acêtonitrile à 50 %. Le solide contenant les BBM-1675 Bl et B 2 est chromatographié sur une colonne de gel de silice (diamètre 3,0 x 40 cm) à l'aide de chloroforme et de méthanol en tant qu'agents de développement Les fractions actives éluées à l'aide de méthanol à 4 % dans du chloroforme sont combi15 nées et évaporées; on obtient ainsi la BBM-1675 Bl pure ( 7 mg) Une autre fraction active est éluée avec une concentration de méthanol à 5 %; après évaporation, elle permet d'obtenir la BBM-1675 B 2 ( 8 mg)o EXEMPLE 3 Autre purification de BBM 1675 A 1 et A 2 20 A Purification de BBM-1675 A 1 Une colonne de 2,67 cm de diamètre x 75 cm de long est garnie a l'aide d'une suspension de gel de silice C 18 dans une phase octadécyl liée Baker (dimension particulière 40 microns) dans le méthanol La colonne est reliée à un système de HPLC sous pression moyenne et équi25 librée avec 1, 5 litres d'un éluant formé de 41,6 % d'acétonitrile, 21,6 % de méthanol et 36,8 % d'acétate d'ammonium 0,1 M De la BBM-1675 A 1 partiellement purifiée ( 100,5 mg) obtenue conformément à la procedure de purification de l'exemple 2 est dissoute dans 2 ml d'acétonitrile et introduite dans une boucle de l'échantillon L'échantillon est amené par 30 pompage dans la colonne La colonne est éluée à l'aide de l'éluant ciJessus de façon à permettre l'obtention de fractions de 87 ml L'éluant est contrôlé à 254 nm et 340 nm Les fractions 55 à 71 sont recueillies et subissent deux extractions successives à l'aide d'aliquots de 1 50 ml de chloroforme Le chloroforme est évaporé à sec; on obtient ainsi 89,8 mg du résidu C. Une colonne de Glenco de 1,5 cm de diamètre x 20 cm de long est garnie par une suspension formée de 12 g de gel de silice de Woelm (particules de 60 à 200 microns) Le résidu C est introduit dans la colonne dans une sol'tion chloroformique La colonne est éluée a l'aide d'un gradient linéaire formé de 500 ml de chloroforme à 10 % de méthanol dans le chloroforme, ce qui permet d'obtenir des fractions de 20 a 25 ml. Apres analyse par TLC sur gel de silice, les fractions 6 à 9 sont re5 cueillies, évaporées à sec; on obtient ainsi 73 mg du résidu D. Une colonne de Glenco de 1,5 cm de diamètre x 20 cm est garnie à l'aide d'une suspension de 12 g de gel de silice de Woelm (particules de 63 à 200 microns) dans le Skellysolve B Le résidu D est dissous dans environ 2 ml de CHCI 3 et introduit dans la colonne La colonne est dé10 placée à l'aide de 25 ml de Skellysolve B La colonne est alors éluée à l'aide de 500 ml d'un gradient linéaire de Skellysolve B pour recueillir des fractions de 25 à 28 ml dans le Skellysolve B contenant 60 % d'acétone. Les fractions 19 à 23 sont recueillies et évaporées à sec; on obtient ainsi 65,6 mg de BBM-1675 A 1 pur. Le résidu est homogène-dans trois systèmes TLC ( 5 % de méthanol dans le chloroforme; 5 % de méthanol dans l'éther et 50 % d'acétone dans Skellysolve B sur gel de silice) et HPLC (gel de silice C 18; acétonitrile 41,5 %/méthanol 21,5 %/acétate d'ammonium 0,1 % 37,0 %). Chromatographie par permeation de 9 el avec BBM-1675 A 1 purifié Une colonne Pharmacia de 2,5 cm de diamètre x 45 cm est garnie a l'aide d'une suspension de Sephadex LH 20 dans le méthanol et son p H est ajusté de façon à ce que le lit chromatographique soit de 33,4 cm De la BBM-1675 A 1 purifiée (environ 120 mg) est dissoute dans 2 ml de méthanol puis transféré dans un réservoir d'échantillon de 2,5 ml L'échantillon 25 est introduit dans la colonne et l'élution est commencée à 1,5 ml/mn à l'aide de méthanol ce qui permet de recueillir dix fractions de 10 ml (collecteur de fractions Pharmacia Frac-100) L'éluant est contrôlé à 254 nm à l'aide d'un détecteur Isco U Ao 5 On constate que la BBM-1675 A élue à Ve/Vt = 0,79 à 0,91 (Ve = volume délution; Vt = volume du lit). 30 B Purification de la BBM-1675 A 2 Une colonne de Glenco de 2,65 cm de diamètre x 75 cm est garnie à l'aide d'une suspension de gel de silice C 18 dans une phase octadécyl par Baker (dimension particulière 40 microns) dans le méthanol La co35 lonne est reliée au système HPLC à pression moyenne et équilibrée à l'aide de 1,5 litres d'éluant ( 50 % d'acétonitrile, 20 % de méthanol, 30 % d'acétate d'ammonium 0,1 M) De la BBM-1675 A 2 partiellement purifiée ( 76,9 mg) ainsi qu'obtenue par la procédure de l'exemple 2, est dissoute dans 2 ml d'acétonitrile et introduite dans la boucle d'échantillonnage. 2547594 ' L'échantillon est amené par pompage dans la colonne La colonne est éluée à l'aide de l'éluant précité de façon à permettre de recueillir des fractions de 87 ml L'éluant est contrôlé à 254 nm et 340 nm Les fractions 31 à 38 sont stockées et subissent deux extractions successives avec des aliquots de 500 ml de chloroforme Le-chloroforme est évaporé à sec; on obtient ainsi 65,8 mg de BBM-1675 A 2 homogène. La BBM-1675 A 2 est homogène dans deux systèmes TLC, le système d'analyse TLC 2-j et par HPLC. EXEMPLE 4 Procédé d'extraction préféré de la BBM-1675 A Le jus brut de fermentation ( 6,8 1) obtenu conformément au procédé général de l'exemple 1 est transféré dans un récipient de polypropylene ( 12 cm de diamètre en haut, 10 cm de diamètre en bas, 37 cm de hauteur) pourvu d'un robinet en cuve Un volume égal de chloroforme est 15 ajouté Le mélange est agité à une bonne vitesse à l'aide d'un agitateur mû par l'air CRC pendant 2 heures Environ 4 litres ( 1,3 kg) de Dicalite (adjuvant de filtration) sont ajoutés et on le laisse se mélanger à la masse Le mélange est filtré sur un tampon de Dicalite que l'on a introduit dans un entonnoir de Buchner n 12 Le filtrat est recueilli dans 20 une bouteille de solution de 19 litres pourvue d'un ajutage de mise sous vide (Ace n 5396-06) La masse est lavée à l'aide de 2 1 de chloroforme Le filtrat est transféré dans une ampoule-de séparation de 20 litres et les phases laissées se séparer La phase inférieure (phase chloroformique) est enlevée. Un tube de Glenco de 2,5 cm de diamètre x 40 cm de haut est rempli à l'aide d'une suspension de 91 g de gel de silice de Woelm (particules de 63 à 200 microns) A l'aide de la pompe FMI RPY-2 CSD, la phase chloroformique précitée est introduite par pompage dans la colonne La colonne est rincée avec 600 ml de chloroforme frais Le chloroforme formant l'éluant est rejeté La colonne est alors éluée à l'aide de 600 ml de 10 % de méthanol dans le chloroforme Cet éluant est évaporé à sec; on obtient ainsi 547 mg du résidu A. Le résidu A est dissous dans 50 ml de chloroforme La solution de chloroforme est ajoutée à 20 g de Dicalite dans un récipient à fond rond 35 de 1 litre Une suspension est formée par addition d'environ 200 ml de Skellysolve B Les solvants sont éliminés dans un évaporateur rotatif. Le résidu est mis en suspension dans 300 ml de Skellysolve B La suspension est introduite dans un tube de chromatographie du type Ace (partie n B 5872-14) ( 41 mm de diamètre x 45,7 cm) à l'aide de la procédure suivante Un bouchon de laine de verre est inséré dans la gorge d'un robinet de blocage entre le robinet et le tube de la colonne Une couche de 1 cm de sable d'Ottawa classique est ajoutée sur la laine de verre. Le bouchon de blocage, la laine de verre et le lit de sable sont purges d'air par passage d'un courant sous pression ( 5,7 psi, 0,40 bar) de Skellysolve B au travers de ces divers éléments La suspension est alors introduite dans la colonne et on la laisse former un lit de garnissage sous le courant sous pression On ne laisse jamais la colonne devenir 10 sèche Lorsque l'on a obtenu un lit de colonne stable, une couche de 2 cm de sable d'Ottawa est ajoutée au sommet du lit Le lit est alors élué à l'aide d'une quantité supplémentaire de 600 à 700 ml de Skellysolve B Le lit est élué à l'aide de 500 ml de toluène L'éluant que forme le toluène est évaporé à sec de façon à donner 93 mg du résidu B. 15 Cette BBM-1675 A 1 partiellement purifiée peut alors être éventuellement purifiée selon la procédure de l'exemple 3. EXEMPLE 5 Fermentation du complexe BBM-1675 à l'aide du mutant H 964-92A 1327 Y Une souche de mutant A 1327 Y est obtenue par traitement à la NTG: de l'Actinomadura Verrucosospora, souche n H 964-92, est utilisée pour inoculer un milieu végétatif contenant 2 % d'amidon soluble, 1 % de glucose, 0,5 % d'extrait de levure, 0,5 % de NB-amine type A et 0,1 % de Ca CO 3, le p H étant ajusté à une valeur de 7,0 avant stérilisation La 25 culture végétative est incubée à 32 C durant 4 jours sur un agitateur rotatif ( 250 tr/mn) et 5 ml de la masse ainsi formée sont transférés dans un Erlenweyer de 500 ml qui contient 100 ml de milieu de fermentation formé de 3 % de molasse de canne à sucre, de 1 % d'amidon de mais, 1 % de farine de poisson, 0,005 % de Cu SO 4 5 H 20, 0,05 % de Mg SO 4 7 H 20 et 30 0,1 % de Ca CO 3, le p H étant ajusté à 7,0 avant stérilisation. La fermentation est effectuée à 28 C pendant 7 jours sur un agitateur rotatif La production d'antibiotique atteint un maximum d'environ 1,5 mcg/ml. EXEMPLE 6 Isolement et purification des constituants de BBM-1675 Le bouillon de fermentation récolté dans l'exemple 5 ( 3 000 1, p H 7,6) est séparé en gâteau mycélien et surnageant par utilisation d'une centrifugeuse Sharpless Le gâteau de mycelium est agité dans 2 000 litres de méthanol pendant 1 heure et les matières insolubles sont éliminées par filtration L'activité contenue dans le surnageant du bouillon en est extraite à l'aide de 1 800 litres de n-butanolo Les extraits méthanolique et nbutanolique sont combinés et concentrés par voie azéotropique avec addition éventuelle d'eau jusqu'à l'obtention de 20 litres d'une solution aqueuse, dans laquelle s'est déposée la plus grande partie de l'activité antibiotique sous forme d'un solide huileux. Le mélange est alors secoué à trois reprises avec 20 litres chaque fois d'acétate d'éthyle pour extraire l'activité Les extraits sont recueillis, filtrés pour éliminer les insolubles et évaporés sous vide jusqu'à un volume de 4 litres L'addition du concentrat dans 30 litres de n-hexane sous agitation conduit à l'obtention d'un solide jaune pâle formé du complexe BBM-1675 brut ( 81,7 9, puissance 159 mcg/mg). ar TLC et HPLC, le complexe apparait comme étant formé d'un mélange de 15 deux constituants majeurs BBM-1675 A 1 et A 2 et de plusieurs constituants mineurs Ils sont séparés et purifiés par une série de chromatographies qui sont mises en oeuvre dans une enceinte froide pour empêcher la détérioration. Le complexe de BBM-1675 brut ( 20 g) est dissous dans 20 ml de 20 méthanol et introduit dans une colonne de Sephadex LH-20 (diamètre 5,5 x 85 cm) La colonne est développée à l'aide de méthanol et l'élution suivie par un bio-essai faisant emploi de Staphylococcus aureus 209 P Les éluats actifs sont recueillis, concentrés sous vide et lyophilisés; on obtient ainsi un solide semi-pur consistant en le comple25 xe BBM-1675 ( 4,86 g, puissance 203 mcg/mg) Le solide est alors chromatographié sur une colonne de gel de silice (diamètre 3,0 x 70 cm) à l'aide de chloroforme et une quantité croissante ( 1 à 5 %) de méthanol en tant que solvant de développement Les éluats sont recueillis sur la base de l'activité antibactérienne vis-à-vis de S aureus et subissent une TLC 30 (Si O 2, CH C 13-Me OH = 5/1 v/v) et sont concentrés sous vide La BBM-1675 A 1 ( 425 mg après évaporation, puissance 960 mcg/mg) est éluée tout d'abord à l'aide de 2 % de méthanol dans le chloroforme puis d'un mélange de BBM- 1675 A 2, A 3 et A 4 ( 732 mg, puissance 340 mcg/mg) suivi d'un complexe de BBM-1675 B ( 200 mg, puissance 190 mcg/mg) avec 3 % de méthanol 35 dans le chloroforme La BBM-1675 précitée est rechromatographiée sur un gel de silice (colonne diamètre 2,2 mm x 44 cm de longueur) à l'aide de 2 % de méthanol dans du benzène Les éluats bioactifs sont examinés par FIPLC (Lichrosorb RP-18: CH 3 CN-Me OH-CH 3 COONH 4 0,1 M = 5/2/3 v/v) et les fractions contenant les BBM-1675 A 1 homogène sont évaporées sous vide a sec Le solide résiduel est cristallisé dans le méthanol ( 10 ml) pour donner des prismes incolores de BBM-1675 A 1 ( 197 mg, puissance 1 000 mcg/mg). Le complexe de BBM-1675 A 2, A 3 et A 4 t 537 mg) est séparé par chromatographie sur colonne de Bondapak C 18 (Waters, diamètre 2,0 x 42 cm) L'éluation est effectuée à l'aide d'acétonitrile en solution aqueuse et les éluats bioactifs sont examines par TLC (Merck, 10 CH 3 CN silanisé H 20 = 75/25 v/v) Les constituants majeurs BBM-1675 A 4 ( 45 mg, puissance 410 mcg/mg) et A 3 ( 19 mg, puissance 300 mcg/mg) sont élués successivement à l'aide de 20 % d'acétonitrile suivi du constituant majeur BBM-1675 A 2 ( 203 mg) à l'aide d'acétonitrile à 50 % La fraction de BBM-1675 A 2 est cristallisée dans le mélange chloroforme-n-hexane de 15 façon à que se déposent des tiges incolores ( 70 rag, puissance 290 mcg/mg) Le solide contenant le mélange de BBM-1675 B est chromatographié sur une colonne de gel de silice (diamètre 3,0 x 40 cm) à l'aide de chloroforme et de méthanol en tant que solvants de développement Les fractions actives éluées à l'aide de 4 % de méthanol dans le chloroforme 20 sont recueillis et évaporées pour conduire à l'obtention de BBM-1675 Bl pure ( 7 mg, puissance 180 mcg/mg) Une autre fraction active est éluée à l'aide d'une concentration de méthanol à 5 % qui, après évaporation, conduit à BBM-1675 B 2 ( 8 mg, puissance 140 mcg/mg). REVENDICATIONS 1. Antibiotique antitumoral BBM-1675 A 1 pratiquement sous forme pure et qui: (a) se présente sous forme de cristaux blancs à jaunes pâles; (b) est soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, légèrement soluble dans le benzène et l'eau et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone; (c) donne une réaction positive avec le chlorure ferrique, les réac10 tifs d'Ehrlich et de Tollen et une réaction négative aux tests de Sakaguchi, à, la ninhydrine et à l'anthrone; (d) conduit à un spectre d'absorption infrarouge (K Br) substantiellement semblable à celui de la figure 9; (e) lorsqu'il est dissous dans CD C 13 présente un spectre de résonance 15 magnétique protonique substantiellement semblable à celui de la figure 10; (f) présente un point de fusion de l'ordre de 156 à 158 C; 27 (g) présente une rotation optique (a)7: -191 o C (c-0,5, CH C 13); (h) présente un point moléculaire apparent, déterminé par spectroscopie de masse de 1 248; (i) présente une composition élémentaire approximative de; 52,17 % de carbone, 6,15 % d'hydrogène, 4,63 % d'azote, 9,09 % de soufre, et 27,96 % (par différence) d'oxygène; (j) présente à la chromatographie en couche mince sur gel de silice avec le système de solvant CH C 13-CH 30 H ( 5/1 v/v) une valeur Rf de 0,74, et présente à la chromat Qgraphie en couche mince sur gel de 30 -silice en phase inverse une valeur Rf de 0,18 avec un système de solvant CH 3 CN-H 20 ( 75/25 v/v); (k) lorsqu'il est dissous dans le méthanol à une concentration de 0,01356 g/l présente les maximum d'absorption ultraviolette et absorptivités suivantes: max (nm) adsorptivités 1 max (m 320 12,4 280 épaulement 253 25,1 210 25,5 sans modification significative lorsque l'on ajoute un acide ou une base; ( 1) présente une durée de rétention à la chromatographie liquide sous haute performance de 13,3 minutes sur une colonne de gel de sili5 ce en phase inverse C 18 et avec le système de solvant formé de CH 3 CN-CH 30 HCH 3 COONH 4 0,1 M ( 5/2/3 v/v); (m) est efficace pour inhiber la croissance de divers bactéries et champignons (fongis); (n) induit des prophages dans les bactéries lysogênes; et, (o) est efficace pour inhiber la croissance de la leucémie P-388, de la leucémie L-1210, du mélanome B 16 et du carcinome du poumon de Lewis chez les souris. 2. Antibiotique antitumoral BBM-1675 A 2 sous forme pratiquement purifiée qui: (a) est sous forme de cristaux blancs; (b) est soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, légèrement soluble dans le benzene et l'eau et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone; (c) donne une réaction' positive avec le chlorure ferrique, les réactifs d'Ehrlich et de Tollen et une réaction négative aux tests de Sakaguchi, à la ninhydrine et à l'anthrone; (d) présente un spectre d'absorption infrarouge (K Br) pratiquement semblable à celui de la figure 12; (e) lorsqu'il est dissous dans CDC 13 présente un spectre de résonance magnétique protonique pratiquement semblable à celui de la figure 13; (f) présente un point de fusion de l'ordre de 147- 149 C; (d) présente une rotation optique (a)D 7 = -179,4 o C (c 0,5, CHC 13); 30 (h) présente un point moléculaire apparent tel que déterminé par spectroscopie de masse de 1 248; (i) présente une composition élémentaire approximative de: 52,17 % de carbone, ,94 % d'hydrogène, 3,94 % d'azote, 9,39 % de soufre, et28,01 % (par différence) d'oxygène; (j) présente en chromatographie en couche mince sur gel de silice pour le système de solvant CH C 13-CH 30 H ( 5/1 v/v) une valeur Rf de 0,71 et présente en chromatographie en couche mince sur gel de silice en phase inverse avec le système de solvant CH 3 CN-H 20 ( 75/25 v/v) une valeur Rf de 0,21; (k) lorsqu'il est dissous dans le méthanol à une concentration de 0,02042 g/l présente les maximum d'absorption ultraviolette et absorptivités suivantes: Xmax (nm) adsorptivités 320 12,2 282 16,3 282 26,2 214 25,8 sans donner lieu à une modification significative après addition 15 d'acide ou de base; ( 1) présente une duree de rétention en chromatographie liquide à performance élevée de 17,3 minutes pour une colonne de gel de silice en phase inverse C 18 et le système de solvant formé de CH 3 CN-CH 30 H-CH 3 COONH 4 0,1 M ( 5/2/3 v/v); (m) est efficace pour inhiber la croissance de divers bactéries et: champignons (fongis); (n) induit des prophages dans les bactéries lysogènes; et, (o) est efficace pour inhiber la croissance de la leucémie P-388, de la leucémie L-1210, le mélanome B 16 et le carcinome du poumon de 25 Lewis chez les souris. 3. Antibiotique antitumoral BBM-1675 A 3 qui: (a) est soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, légèrement soluble dans le benzène et l'eau et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de car30 bone; (b) donne une réaction positive avec le chlorure ferrique, les réactifs d'Ehrlich et de Tollen et une réaction négative aux tests de Sakaguchi, à la ninhydrine et à l'anthrone; (c) présente un spectre d'absorption infrarouge (K Br) pratiquement 35 semblable à celui de la figure 3; (d) lorsqu'il est dissous dans CD C 13 présente un spectre de résonance magnétique protonique pratiquement semblable à celui de la figure 7; (e) présente un point de fusion de l'ordre d'environ 125-127 C; (f) présente une rotation optique (a)D 7 = 161 o C (c 0,5, CHC 13); (g) présente une composition élémentaire approximative de: 54,55 % de carbone, 6,46 % d'hydrogène, 3,73 % d'azote, 7,49 % de soufre, et 27,77 % (par différence) d'oxygène; (h) présente en chromatographie en couche mince sur gel de silice avec le système de solvant CHC 13 =CH 30 H ( 5/1 v/v) une valeur Rf de 10 0,72 et présente en chromatographie en couche mince sur gel de silice en phase inverse avec le système de solvant CH 3 CN-H 20 ( 75/25 v/v) une valeur Rf de 0, 28; (i) présente les maximum d'absorption ultraviolette lorsqu'ils sont dissous dans le méthanol, HC 1-CH 30 H 0,01 N et Na OH-CH 30 H 0,01 N 1533 suivants: UV amax nm (Ec: 253 ( 286) dans le méthanol 282 ( 158) 320 ( 122) 1 UV max nm (E%):253 ( 287) max lcm dans HC 1 l-CH 30 H 0,01 N 282 ( 160) 320 ( 126) 1 % UV Xmax nm (E 1 %): 252 ( 280) lcm dans Na OH-CH 30 H 0,01 N 283 ( 162) 318 ( 120) (j) présente une durée de rétention en chromatographie liquide à performance élevée de 8 minutes avec une colonne de gel de silice en phase inverse C 18 et le système de solvant formé de CH 3 CN-CH 30 H-CH 3 COONH 4 0,1 M ( 5/2/3 v/v); (k) est efficace pour inhiber la croissance de divers bactéries et champignons (fongis); ( 1) induit des prophages dans les bactéries lysogènes; et, (m) est efficace pour inhiber la croissance de la leucémie P-388 chez les souris. 4. Antibiotique antitumoral BBM-1675 A 4 qui: (a) est soluble dans le chloroforme, l'acetate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, légèrement soluble dans le benzène et l'eau et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone; (b) donne une readtion positive avec le chlorure ferrique, les reactifs d'Ehrlich et de Tollen et une réaction négative aux tests de Sakaguchi, à la ninhydrine et à l'anthrone; (c) présente un spectre d'absorption infrarouge (K Br) pratiquement semblable à celui de la figure 4; (d) lorsqu'il est dissous dans CD C 13 présente un spectre de résonance magnétique protonique pratiquement semblable à celui de la figure 7; (e) présente un point de fusion de l'ordre d'environ 123-127 C; 27 (f) présente une rotation optique (a)D = -176 o C (c 0,5, CHC 13); 15 (g) présente une composition elémentaire approximative de: 54,65 % de carbone, 6,29 % d'hydrogène, 3,51 % d'azote, 8,07 % de soufre, et 27,48 % (par différence) d'oxygène; (h) présente en chromatographie en couche mince sur gel de silice avec le système de solvant CH C 13-CH 30 H ( 5/1 v/v)' une valeur Rf de 0,71 et présente en chromatographie en couche mince sur gel de silice en phase inverse avec le système de solvant CH 3 CN-H 20 ( 75/25 v/v) une valeur Rf de 0,78; (i) présente l'absorption ultraviolette maximum suivante lorsqu'il est dissous dans le méthanol, H Cl-CH 30 H 0,01 N et Na OH-CH 30 H 0,01 N suivants: UV max nm (Elc: 253 ( 257) i dans le méthanol 282 ( 153) 320 ( 117) UV X nm (El%) max lcm dans HCI-CH 3 OH 0,01 N : 253 ( 258) 282 320 ( 155) ( 118) UV Xmax nm (E 1 %: 252 ( 266) lcm dans Na OH-CH 30 H 0,01 N 283 ( 160) 318 ( 118) (j) présente une durée de rétention en chromatographie liquide à performance élevée de 5,1 minutes avec une colonne de gel de silice en phase inverse C 18 et le système de solvant formé deCH 3 CN-CH 30 H-CH 3 COONH 4 0,1 M ( 5/2/3 v/v); (k) est efficace pour inhiber la croissance de divers bactéries et 10 fongis; ( 1) induit des prophages dans les bactéries lysogènes; et, (m) est efficace pour inhiber la croissance de la leucémie P-388 chez les souris. 5. Antibiotique antitumoral BBM-1675 Bl qui: (a) est soluble dans-le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, légèrement soluble dans le benzène et l'eau et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone; (b) donne une réaction positive avec le chlorure ferrique, les réac 20 tifs d'Ehrlich et de Tollen et une réaction négative aux tests de Sakaguchi, à la ninhydrine et à l'anthrone; (c) présente un point de fusion de l'ordre d'environ 159-161 C; (d) présente une rotation optique ()27 = -1710 C (c 0,5, CHC 13); (e) présente en chromatographie en couche mince sur gel de silice avec le système de solvant CH C 13-CH 30 H ( 5/1 v/v) une valeur Rf de 0,63 et présente en chromatographie en couche mince sur gel de silice en phase inverse avec le système de solvant CH 3 CN-H 20 ( 75/25 v/v) une valeur Rf de 0,23; (f) présente l'absorption ultraviolette maximum suivante lorsqu'il est dissous dans le méthanol, H Cl-CH 30 H 0,01 N et Na OH-CH 30 H 0,01 N suivants: UV max nm (E 1 %): 253 ( 225) max lcm dans le méthanol 282 ( 140) * 35 320 ( 104) UV max nm (E 1 %): 253 ( 225) lcm dans H Cl-CH 30 H 0,01 N 282 ( 140) 320 ( 105) UV max nm (E 1 %): 252 ( 236) max lcm dans Na OH-CH 30 H 0,01 N 283 ( 141) 318 ( 105) (g) est efficace pour inhiber la croissance de divers bactéries et champignons (fongis); (h) induit des prophages dans les bactéries lysogènes. 6. Antibiotique antitumoral BBM-1675 B 2 qui: (a) est soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, 10 l'éthanol et le méthanol, légèrement soluble dans le benzène et l'eau et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone; (b) donne une réaction positive avec le chlorure ferrique, les réactifs d'Ehrlich et de Tollen et une réaction négative aux tests de 15 Sakaguchi, à la ninhydrine et à l'anthrone; (c) présente un point de fusion de l'ordre d'environ 156-159 C; (d) présente une rotation optique (a)27 = -122 C (c 0,5, CHC 13); (e) présente en chromatographie en couche mince sur gel de silice avec le système de solvant CHC 13-CH 30 H ( 5/1 v/v) une valeur Rf de 20 0,60 et présente en chromatographie en couche mince sur gel de: silice en phase inverse avec le système de solvant CH 3 CN-H 20 ( 75/25 v/v) une valeur Rf de 0,16; (f) présente l'absorption ultraviolette maximum suivante lorsqu'il est dissous dans le méthanol, HC 1-CH 30 H 0,01 N et Na OH-CH 30 H 0,01 N 25 suivants: UV Àmax nm (E 1 %): 248 ( 212) 1 cm dans le méthanol 279 ( 141) 318 ( 103) UV 'max nm (E 1 %):248 ( 210) lcm dans H Cl-CH 30 H O,01 N 279 ( 140) 318 ( 103) 1 UV max nm (E 1 %) 248 ( 233) lcm dans Na OH-CH 30 H 0,01 N 278 ( 150) 318 ( 110) (g) est efficace pour inhiber la croissance de divers bactéries et fongis; (h) induit des prophages dans les bactéries lysogènes. 7. Procédé de production de l'antibiotique antitumoral BBM-1675 A 1 5 qui consiste à cultiver une souche productrice de BBM-1675 A 1 d'Actinomadura verrucosospora dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, dans des conditions aérobie submergées jusqu'à production d'une quantité substantielle de BBM-1675 dans ledit milieu de culture puis récupération de la BBM-1675 A 1 du milieu de 10 culture. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel l'organisme producteur de BBM-1675 A 1 a les caractéristiques d'identification de l'Actinomadura verrucosospora, souche H 964-92 (ATCC 39334), de l'Actinomadura verrucosospora souche A 1327 Y (ATCC 39638) ou d'un de leur mutants. 15 9 Procédé de production de l'antibiotique antitumoral BBM-1675 A 2 qui consiste à cultiver une souche productrice de BBM-1675 A 2 d'Actinomadura verrucosospora dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, dans les conditions aérobiques submergées jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle de BBM-1675 dans 20 ledit milieu de culture puis récupération de la BBM-1675 A 2 du milieu de culture. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'organisme producteur de BBM-1675 A 2 présente-les caractéristiques d'identification de l'Actinomadura verrucosospora, souche H 964-92 (ATCC 39334), de l'Acti25 nomadura verrucosospora souche A 1327 Y (ATCC 39638) ou d'un de leur mutants. 11. Procédé de production de l'antibiotique antitumoral BBM-1675 A 3 qui consiste à cultiver une souche productrice de BBM-1675 A 3 d'Actinomadura verrucosospora dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources 30 assimilables de carbone et d'azote, dans les conditions aérobiques submergées jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle de BBM-1675 dans ledit milieu de culture puis récupération de la BBM-1675 A 3 du milieu de culture. 12 Procédé selon la revendication 11, dans lequel l'organisme producteur de BBM-1675 A 3 présente les caractéristiques d'identification de l'Actinomadura verrucosospora, souche H 964-92 (ATCC 39334), de l'Actinomadura verrucosospora souche A 1327 Y (ATCC 39638) ou d'un de leur mutants. 13. Procédé de production de l'antibiotique antitumoral BBM-1675 A 4 qui consiste à cultiver une souche productrice de BBM-1675 A 4 d'Actinomadura verrucosospora dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, dans les conditions aérobiques submer5 gées jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle de BBM-1675 dans ledit milieu de culture puis récupération de la BBM-1675 A 4 du milieu de culture. 14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel l'organisme producteur de BBM-1675 A 4 présente les caractéristiques d'identification 10 de l'Actinomadura verrucosospora, souche H 964-92 (ATCC 39334),de l'Actinomadura verrucosospora souche A 1327 Y (ATCC 39638) ou d'un de leur mutants. 15. Procédé de production de l'antibiotique antitumoral BBM-1675 B qui consiste à cultiver une souche productrice de BBM-1675 Bl d'Actino15 madura verrucosospora dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, dans les conditions aérobies submergées jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle de BBM-1675 dans ledit milieu de culture puis récupération de la BBM-1675 B 1 du milieu de culture. 16 Procédé selon la revendication 15, dans lequel l'organisme: producteur de BBM-1675 Bl présente les caractéristiques d'identification de l'Actinomadura verrucosospora, souche H 964-92 (ATCC 39334), de l'Actinomadura verrucosospora souche A 1327 Y (ATCC 39638) ou d'un de leur mutants. 17 Procédé de production de l'antibiotique antitumoral BBM- 1675 B 2 qui consiste à cultiver une souche productrice de BBM-1675 B 2 d'Actinomadura verrucosospora dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, dans les conditions aérobiques submergées jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle de BBM-1675 dans 30 ledit milieu de culture puis récupération de la BBM-1675 B 2 du milieu de culture. 18. Procédé selon la revendication 18, dans lequel l'organisme producteur de BBM-1675 B 2 présente les caractéristiques d'identification de l'Actinomadura verrucosospora, souche H 964-92 (ATCC 39334), de 35 l'Actinomadura verrucosospora souche A 1327 Y (ATCC 39638) ou d'un de leurs mutants. 19. A titre de médicaments nouveaux pour le traitement d'un hôte animal affligé d'une infection microbienne, toute composition contenant une dose efficace du point de vue antimicrobien de BBM-1675 A 1, de BBM-1675 A 2, de BBM-1675 A 3, de BBM-1675 A 4, de BBM-1675 B 1 ou de BBM-1675 B 2. 20. A titre de médicaments nouveaux, toute composition pharma5 ceutique contenant une dose efficace du point de vue antimicrobien d'un ou plusieurs des BBM-1675 A 1, BBM-1675 A 2, BBM-1675 A 3, BBM-1675 A 4, BBM1675 B 1 et BBM-1675 B 2 en association avec un support ou diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable. 21. A titre de médicaments nouveaux, toute composition pharma10 ceutique contenant une dose inhibitrice de tumeur efficace d'un ou plusieurs des BBM-1675 A 1, BBM-1675 A 2, BBM-1675 A 3, BBM-1675 A 4, BBM-1675 B 1 et BBM-1675 B 2 en association avec un support ou diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable. 22. Culture biologiquement pure du micro-organisme Actinomadura 15 verrucosospora souche H 964-92 (ATCC 39334), ladite culture étant capable de produire l'antibiotique BBM-1675 en une quantité récupérable, après ensemencement dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote. 23. Culture biologiquement pure du micro-organisme Actinomadura 20 verrucosospora souche A 1327 Y (ATCC 39638), ladite culture étant capable de produire l'antibiotique BBM-1675 en une quantité récupérable, après ensemencement dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote.