Brevet FR2537723A1 — publié le 19840615

La présente invention concerne un procédé et une composition pour évaluer la réaction phagocytaire d'un organisme c'est-à-dire pour mesurer la capacité d'un organisme de résister à une infection et l'invention concerne également un procédé de fabrication de telles compositions. L'observation que certaines cellules phagocyta Jres que l'on trouve dans le sang et dans les organes tels que les poumons créent de la lumière à cause de l'injection physique de particules telles que des bactéries ou des compositions non-vivantesa été publiée depuis des années dans la littérature scientifique Ces observations sont basées sur des cellules spécifiques trouvées dans le sang ou les organes lesquelles cellules sont connues pour servir une fonction critique de découvrir, phagocyter (avaler) et tuer les particules teles que les bactéries par des mécanismes chimiques complexes Ces cellules peuvent également découvrir et éliminer des agents non-infectueux tels que des particules polluantes de l'atmosphère Une partie de ce mécanisme chimique cellulai- re comporte la production d'intermédiaires oxygénés à énergie relativement élevée La cellule produira ces compo- sés chimiques lorsqu'elle est stimulée pour la phagocytose. Ces intermédiaires oxygénés d'énergie élevée descendront vers des niveaux d'énergie plus faibles et au cours du procédé, de la lumière sera produite Bien que ces niveaux faibles de lumière sont détectables en utilisant des instru- ments tels que des spectromètres à cintillation à liqui- de, ceci est une technique très encombrante qui ne permet pas une analyse d'un grand nombre d'échantillons ou d'échan- tillons avec un grand nombre de variables à rechercher. Et, bien que ce phénomène soit connu depuis un certain temps, on en a peu profité du fait des limitations décrites ci-dessus ensemble avec la nondisponibilité de réactifs relativement stables. La présente invention concerne un procédé pour mesurer la réaction phagocytaire de diverses cellules pha- gocytaires Un tel procédé est basé sur le procédé de phagocytose employé par un organisme pour résister à -2 - l'infection ou pour éliminer une matière étrangère des poumons, etc Un échantillon de cellules phagocytaires provenant du sang ou d'un organe est prelevé d'un être humain ou autre animal et une matière contenant des particules est ajoutée à celui-ci et cette matière est avalée par les cellules phagocytaires Les cellules réagissent contre la matière contenant les particules et créent des intermédiaires oxygénés qui à leur tour réagissent avec un composé chimique dans la matière contenant des particules Cette réaction crée de la lumière. Cette lumière ainsi produite est détectée et mesurée. Un autre aspect de l'invention comprend un tel réactif contenant les particules adaptées pour être phagocytées par les cellules et consiste en des perles polymères enrobées de protéines auxquelles est lié un compo- sé chimique luminescent tel que la 5-amino-2,3,dihydro-1,4- phthalazinedione (luminol). Un autre but de l'invention est un autre réactif contenant des particules adaptées pour être phagocytées par les cellules et comprend des particules de poly- saccharides provenant des parois de cellules de levure (zymosan) absorbées avec des protéines auxquel Les est mélan- gé un composé chimique (luminol). Un autre but de l'invention est un procédé de fabrication de perles polymères particulières enrobées selon la présente invention Les perles polymères d'en- viron 2 à environ 9 pam de diamètre sont enrobées d'une protéine et d'un composé chimique luminescent Le composé chimique luminescent peut être appliqué sur la protéine ou mélangé avec la protéine et les deux sont appliqués ensemble sur les perles polymères Les particules résultantes sont lavées, remises en suspension jusqu'à une concentration finale et lyophilisée. Un autre but de l'invention est un procédé de fabrication de particules de zymosan enrobées utiles pour la présente invention Les particules de zymosan sont enrobées d'une protéine Le luminol est mélangé avec les particules enrobées et la matière résultante est lyophilisée en un produit stable homogène. -3 Pour que l'invention puisse être mieux comprise, référence est faite aux figures suivantes o: La figure 1 montre la réaction typique d'un test chimioluminescent sur du sang complet, dilué en utilisant un réactif à base de zymosan. La figure 2 montre une réaction typique d'un test sur des neutrophiles isolés en utilisant un réactif à base de zymosan. La figure 3 montre une réaction typique d'un test sur des neutrophiles isolés en utilisant un réactif à base de perles polymères. La figure 4 montre une réaction typique d'un test chimioluminescent sur du sang complet dilué en utilisant un réactif à base-de zymosan. La figure 5 représente une réaction typique d'un test sur des neutrophiles isolés en utilisant un réactif à base de zymosan. La figure 6 représente une réaction typique d'un test sur des neutrophiles isolés en utilisant un réactif à base de perles polymères. Bien que toute matière à base de particules compatibles avec le système de cellules phagocytaires puisse être utilisée, on a trouvé qu'une matière polymère organique et en particulier des polyacrylamides (par exemple, des particules de Bio-Rad( avérés particulièrement appropriés. Pour que ce système puisse fonctionner convena- blement, il est nécessaire d'enduire une protéine sur la matière particulaire Ce revêtement peut être appliqué par réticulation chimique réelle de la protéine sur la parti- cule ou par simple adsorbtion électrostatique Toute protéine ou mélange de protéines convenable peut être utilisé pour ainsi sensibiliser les perles Les protéines convenables comprennent l'immunoglobuline G humaine, purifiée ou du serum animal. Ensuite un composé chimique luminescent est enduit soit chimiquement soit par adsorption sur les particules enrobées de protéine ou est mélangé avec celles- 4 - ci Bien que tout composé chimique luminescent qui réagisse avec les intermédiaires oxygénés en créant directement ou indirectement de la lumière puisse être utilisé, on a trou- vé que le luminol (disponible chez Eastman Organics, Rochester, New York) convenait particulièrement Si la perle de polymère est utilisée, le luminol est dissous dans une solution tampon aqueuse et on le fait réagir, de préférence, pour former un azo-composé intermédiaire réactif L'azocomposé intermédiaire réagit ensuite avec les particules polymères enrobées de protéine Ceci résul- te en un produit d'addition azoluminol-protéine et également en du luminol-polyacrybmide liés électrostatiquement On lave les particules résultantes, on les remet en suspension jusqu'à une concentration finale, on les introduit dans des fioles et on les lyophilise La matière obtenue par ce procédé donne un produit stable homogène o Le luminol peut également être simplement mélangé avec une suspension de particules de zymosan au préalable enduites d'une protéine convenable Le mélange résultant est introduit dans des fioles et lyophilisé. La matière obtenue par ce procédé donne un produit stable homogène. Le produit lyophilisé décrit ci-dessus, est après reconstitution avec de l'eau, prêt pour être utilisé dans le test. Pour le test utilisant des particules polymères, on mélange 1 000 000 à environ 2 000 000 de particules de polyacrylamide dans 50 microlitres de tampon avec environ 200 000 cellules phagocytaires purifiées dans 100 microlitres de tampon Deux exemples de procédé pour le test en utilisant simultanément des particules des zymo- san sont: ( 1) on dilue du sang complet en proportions 1: 3 (une partie de sang anticoagulé plus deux parties de tam- pon) On mélange cinquante microlitres de cette dilution avec 200 microlitres de zymosan enrobé contenant du lumi- nol Chaque millilitre de m Iélange de zymosan contient environ 50 000 000 de particules et ( 2) on mélange cinquan- te microlitres de suspension de zymosan avec 100 micro- litres de tampon contenant environ 200 000 cellules phago- cytaires purifiées La lumière créée à partir de ces mélanges est mesurée périodiquement en fonction du temps et reflète i'activité phagocytaire et biochimique de la préparation de cellules phagocytaires Les cellules qui peuvent être évaluées par cette technique comprennent les neutrophiles, les monocytes et les macrophages alvéo- laires Les deux premiers de ces types de cellules sont obtenus à partir du sang complet disposé sur un gradient de densité tel que Ficoll-Hypaque (désignation commerciale) et centrifugés Ces cellules se groupent dans le gradient et sont donc purifiées Les macrophages sont obtenues à partir de lavages de poumons et n'exigent pas de purifica- tion Dans les exemples suivants, on utilise des neutro- philes. Exemple 1 On suspend 200 mg de perles de polyacrylamide décrites ci-dessus ayant un diamètre de 2-9 pm dans 20 ml d'eau A cette suspension, on ajoute 10 mg d'immunoglobine G (Ig G) humaine On mélange modérément la suspension de perles enrobées de protéine et on la refroidit à 2 C- 8 C On ajoute 40 mg de chlorhydrate de 1-éthyl-3,3-diméthyl aminopropyl carbodiimide Six heures plus tard, on ajoute mg de glycine On agite le mélange durant une nuit à 2 C 8 C Le jour suivant, on lave la suspension par centrifugation avec une solution saline tamponnée au phosphate, du chlorure de sodium 1,4 M dans une solution saline tamponnée au phosphate et finalement 0,005 M de tampon phosphate On centrifuge de nouveau les perles et on les remet en suspension dans 8,5 ml de tampon borate p H 8,5. On prépare un sel de diazonium de luminol par mise en suspension de 200 mg de luminol dans 20 ml d'H Cl 2,4 N On refroidit le mélange sur de la glace On ajoute 2,0 ml de solution de 100 mg par ml de nitrite de sodium, on mélange,suivi rapidement par addition de tampon refroi- di, 50 ml, 0,5 M, p H 8,5 On observe le p H et on l'ajuste avec de l'hydroxyde de sodium 10 N à p H 7,1 * 0,1 On ajou- te alors 14 ml de sel de diazonium de luminol à 8,5 ml des perles remises en suspension décrites ci-dessus et le p H 37723 est ajusté à p H 8,5 On mélange la suspension durant 3 heures dans le noir à 20 C-8 C. La suspension de perles diazotées est alors dialysée contre plusieurs changements de 0,2 M de tampon de borate p H 8,0 à 2 OC-80 C La dialyse a lieu durant au moins 24 heures. On lave alors les perles par centrifugation en utilisant un tampon de borate 0,2 M, p H 8,0 jusqu'à ce que le surnageant comprenne moins de 1, Q% de la lumière initiale de la suspension totale, c'est-à-dire que plus de 99 % de luminol est associé avec les perles. On centrifuge alors les perles encore une fois. On remet les perles en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate La concentration de perles est ajustée jusqu'à environ 50 millions de perles par ml, déter- minée par un hémocytomètre On introduit alors la suspen- sion dans des fioles en portions de 1,0 ml et on la lyophi- lise jusqu'à moins de 5,0 % d'humidité résiduelle, déterminée par titrage selon la méthode de Karl Fisher. Pour réaliser le test phagocytaire, une fiole est reconstitue par addition de 1,0 ml d'eau purifiée. Exemple 2 On met en suspension du zymosan A (Sigma Chemical Co St Louis, Missouri) dans une solution saline tamponnée au phosphaté jusqu'à une concentration de 24 mg par ml. A cette suspension on ajoute un volume égal de sérum de lapin 50 % normal dilué dans la solution saline tamponnée au phosphate On incube la suspension durant une heure à 37 C dans un bain d'eau agité On centrifuge alors la suspension, on rejette le liquide surnageant et le zymosan A (pellet) ainsi traité Et remis en suspension dans un petit volume de solution tamponnée au phosphate On aspire alors la suspension au travers d'une aiguille de seringue (ouverture 18-26) pour homogénéiser la suspension Finalement on ajoute suffisamment de solution saline tamponnée au phosphate pour quadrupler le volume original de la suspen- sion ce qui donne une suspension d'environ 6 mg par ml. On passe alors cette suspension au travers d'un bouchon de laine de verre pour piéger tout grumeau de zymosan. 7- On prépare une solution mère de luminol en le dissolvant dans de l'hydroxyde de sodium 0,01 N Une partie aliquote de cette solution mère est alors ajoutée à une solution contenant 20 % de sérum de veau foetal dans une solution saline tamponnée au phosphate ce qui. résulte en une concentration de luminol de 14,4 pg par ml. A un volume de suspension de zymosan, -on ajoute un volume de solution de sérum de veau foetal -luminol On mélange la suspension résultante, on l'introduit dans des fioles en des portions de 2,0 ml et on la lyophilise jusqu'à moins de 5 % d'humidité résiduelle déterminée par titrage selon la méthode de Karl Fisher. Pour une utilisation dans le test de phagocytose, un flacon est reconstitué avec 2,0 ml d',eau purifiée. Exemple 3 Plusieurs enfants sur lesquels on a préalablement diagnostiqué une maladie granulomateuse chronique (MGC),, ont été examinés en utilisant les réactifs et le procédé du test décrits di-dessus Cette maladie a été choisie parce que la dysfonction est comprise MGC est provoquée par l'absence de certains enzymes que l'on trouve dans les cellules phagocytaires du sang Bien que les cellules phagocytaires sont capables dbavaler les bactéries (parti- cules), ces cellules sont incapables d'inactiver ou tuer les bactéries étant donné que les cellules phagocytaires n'ont pas la capacité de créer des composés intermédiaires oxygénés de haute énergie Comme tels, ils ne peuvent provoquer une oxydation du'luminol ainsi avalé par les cellules, de sorte qu'aucune réaction lumineuse détectable n'est observée Cliniquement, ces enfants présentent ou manifestent typiquement cette diminution sous forme d'une sévère réduction de leur capacité à résister aux infectbns. Voir les figures 1 à 3 pour la réponse typique Lorsque ces enfants ont été testés ensemble avec des sujets témoins apparemment sains, il ne se produisait aucune lumière due à l'oxydation du luminol, bien qu'elles avalaient les parti- cules aussi efficacement que les témoins. Exemple 4 On a testé un groupe d'enfants sur lesquels on a -8- précédemment diagnostiqué de l'asthme, en fonction de leur réaction phagocytaire/biochimique des cellules phagocytai- res Environ la moitié des enfants ont reçu des doses thérapeutiques de théophylline; le restant des enfants n'avaient pas été soumis à cette médication Il est admis que la théophylline a un effet sur l'adénosine monophos- phate cyclique (c-AMP) qui est reconnue comme exerçant un contrôle régulatoire sur certaines actions biochimiques des cellules phagocytaires Voir les figures 4-6 Les enfants ayant reçu la théophylline en général présentaient des niveaux réduits de production d'intermédiaires oxygénés quantifiés par l'oxydation réduite du luminol et la produc- tion réduite de lumière. De tels procédés tels que ceux décrits ont une utilité particulière pour la quantification de la résistance infectueuse en termes d'activité phagocytaire. Cependant, un tel procédé a également une application pour le diagnostique médical, l'itmmunotoxicologie de l'en- vironnement, la pharmacologie, par exemple pour contrôler la toxicité ou la chimiothérapie et la thérapie au rayon- nement des patients par exemple, ils peuvent être utili- sés pour l'évaluation de l'immuno-compétence, de certains défauts de protéines dans le sérum sanguin etc Comme outil de recherche, ils peuvent être utilisés pour tester les composés pharmaceutiques et leur effet sur les phagocytes, les effets des polluants sur les cellules phagocytaires et l'effet des composés toxiques sur les animaux et les humains. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux procédés et compositions qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. -9- Revendications: 1 Procédé pour mesurer la capacité d'un organisme à résister à une infection caractérisé en ce qu'il consiste à prélever un échantillon de sang de l'organisme, séparer les cellules phagocytaires du sang, ajouter aux cellules phagocytaires des particules enrobées de protéine à laquelle sont liées des composés chimiques luminescents, permettre aux cellules phagocytaires d'avaler les particu- les activant ainsi le mécanisme biochimique des cellules qui réagissent avec le composé chimique luminescent créant de la lumière qui est mesurée sur un luminomètre. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les particules sont des perles polymères ayant des diamètres d'environ 2 um à environ 9 Fm. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les perles sont en polyacrylamide. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les particules sont des particules de zymosan. 5 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé chimique luminescent est le luminol. 6 Composition phagocytaire caractérisée en ce qu' elle comprend des particules de polyacrylamide ayant un diamètre d'environ 2 pm à environ 9 pi enrobées d'une cou- che de protéine de sérum à laquelle est liée une couche de luminol. 7 Composition phagocytaire caractérisée en ce qu'elle comprend des particules de zymosan enrobées d'une couche de protéine de sérum et de luminol I 8 Composition selon l'une quelconque des revendi- cations 6 et 7, caractérisée en ce qu'elle est sous forme lyophilisée. 9 Procédé de fabrication d'un réactif phagocytaire de l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il consiste à enrober une matière particulaire à particules de deux à environ neuf 1 m de diamètre, d'une couche de protéine et de composé chimique luminescent, et lyophiliser les particules enrobées pour obtenir un produit stable, homogène. 10 Procédé selon la revendication 9, caractérisé - en ce que la couche de protéine est appliquée d'abord et le composé chimique luminescent est appliqué sur cette couche de protéine. 11 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le composé chimique luminescent est mélangé avec un protéine avant l'application à la matière parti- culaire. 12 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le composé chimique luminescent est le luminol. 13 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la matière particulaire est du polyacrylamide ou du zymosan.