Brevet FR2544986A1 — publié le 19841102

I La présente invention concerne une composition associant un aminoglycoside ayant une néphrotoxicité avec un agent inhibiteur de néphrotoxicité à base de polymère d'asparagine ou d'acide aspartique ou des copolymères de ceux-ci et unité de dosage réalisée sur la base d'une telle combinaison Plus précisément, selon l'invention la néphrotoxicité des antibiotiques aminoglycosides est sensiblement réduite ou éliminée par l'emploi conjoint d'un polymère d'asparagine (par exemple la poly-lasparagine) ou un polymère de l'acide aspartique (par exemple l'acide poly-l-aspartique), un copolymère de ceux-ci, ou un copolymère d'asparagine ou d'acide aspartique avec un co- monomère. Des antibiotiques aminoglycosides, par exemple la gentamicine, sont liés à et transportés dans les cellules de tubule proximal dans les reins lHumes et al, Am J. Kidney Diseases 11: 5-29 ( 1982) 3 Nécrose des cellules de tubules proxinaux et compromission ultérieure des résultats de la fonction rénale t Cronin, Clinical Nephrolo__ 11: 251-256 ( 1979) l Cette néphrotoxicité limite l'emploi clinique de ces antibiotiques sauvant la vie lCronin, Clin__ical Nephrolog 11: 251-256 ( 1979); Nennett, Mineral Electrolyte Metab 6: 277-86 ( 1981); Schor et al, Kidney International 19: 288-296 ( 1981) l Actuellement il n'y a pas de moyen sûr pour limiter ou pour éviter la néphrotoxicité de l'aminoglycoside t Francke et al. Infections in_ Surgr e March: 205-214 ( 1983)l. On a montré que de nombreuses polyamines, dont quelques-unes d'entre elles potentiellement néphrotoxiques, inhibent la liaison de transport des antibiotiques aminoglycosides dans les tissus des reins,Josephovitz et autres, J Pharmacol Exp Ther, 223: 314-321 ( 1982)l ou des fractions subcellulaires des reins lspermine - Lipsky et al, J Pharmacol Exp Ther, 215: 390-393 ( 1980); et des polyamines telles que la spermine, spermidine, polymyxine, et polylysine Kornguth et al, J Antimicrob Chemother, 6: 121-131 ( 1980) 3 Cependant, Josephovitz et al, supra, ont mis en doute l'emploi d'organopolycations pour réduire le potentiel néphrotoxique des aminoglycosides à cause de la néphrotoxicité possible associée avec les polycations en tant que classe ou groupe. Des méthodes pour étudier le transport des médicaments et des substances endogènes à travers les cellules épithéliales telles que celles existant dans le rein incluent l'emploi de vésicules de membrane isolée; Murer et al, J Membrane Biol, 55: 81-95 ( 1980) Des procédures pour l'isolation et la purification de membranes à bordure ciliaire à partir de tissus de reins pour l'emploi décrit ici (criblage ou examen d'inhibition de transport de membrane in vitro) ont été rapportées; Williams et al, Toxicology and Applied Pharmacology, 61: 243-251 ( 1981) et Kinsella et al, Biochimica et Biophysica Acta, 552: 468-477 ( 1979) Des études de transport/ liaison de gentamicine utilisant des vésicules de membrane rénale isolée ont été également rapportées; Lipsky et al, supra, Sastraskih et al, J Pharmacol Exper Ther, 222: 350-358 ( 1982); on a également employé une inhibition de liaison mitochondriale et microsomale de reins; Kornguth et al, supra Josephovitz et al, supra, ont conduit des études in vivo d'inhibition de prise de gentamicine dans le cortex rénal de rats par des polycations organiques. Les inventeurs ont découvert que certains polyamino- acides neutres et anioniques évitent ou retardent le transport de membrane (in vitro) et la néphrotoxicité (in vivo) des antibiotiques aminoglycosides Antérieurement, on a rapporté seulement des polycations pour inhiber la liaison de membrane rénale ou l'accumulation de tissu des aminoglycosides Des rapports des agents inhibiteurs de néphrotoxicité d'aminoglycoside ont été limités à des substances sans rapport entre elles telles que la fosfomycine t Inouye et al, J Pharm Dyn, 5: 659-669 ( 1982) glucarolactones/glycarolactames Furunto et al, Japan J Pharmacol, 27: 371-378 ( 1977); J Antibiotics, 29: 950-953 ( 1976); Furunto et al, J Antibiotics, 29: 187-194 ( 1976); brevets U S 4 122 171; U S 3 929 583, U. S 3 962 429 2 et le formaldéhyde bisulfite de sodium lPindell et al, Chemotherapia, 8: 163-174 ( 1964); Brevet U K 957 433; brevet DE-OS 2 641 388 1 On a maintenant découvert que des polymères d'aminoacide neutre, l'asparagine, par exemple la poly-l-asparagine et des polymères d'aminoacide acide, l'acide aspartique, par exemple l'acide poly-laspartique, lorsqu'il est conjointement administré à un mammifère avec un antibiotique aminoglycoside néphrotoxique, réduit la néphrotoxicité de l'antibiotique aminoglycoside, apparemment en inhibant la prise rénale ou la liaison rénale de l'aminoglycoside. L'antibiotique aminoglycoside qui peut être employé en conjonction avec les polymères d'inhibition de la prise ou accumulation rénale selon l'invention et tout antibiotique aminoglycoside qui s'accumule dans le tissu rénal, et comprend ainsi tout antibiotique aminoglycoside. Des exemples de tels antibiotiques aminoglycosides incluent la canamycine (Merck Index 9 ème édition page 5132), la gentamicine (Merck Index 9 ème édition page 4224), - amicacine (Merk Index 9 ème édition page A 1), dibécacine (Merck Index 9 ème édition page 2969), tobramycine (Merck Index 9 ème édition page 9193), néomycine (Merck Index 9 ème édition page 6278), streptomycine (Merck Index 9 ème édition pages 8611/8612), paromomycine (Merck Index 9 ème édition, page 6844), sisomicine (Merck Index 9 ème édition page 8292), et la nétilmicine, toutes connues dans le métier Les antibiotiques utiles incluent diverses variantes structurelles des composés ci-dessus (par exemple canamycine A, Bet C; gentamicine A, C 1 9 Cla X C 2 et D; la néomycine B et C et analogues). Tous les antibiotiques aminoglycosides testés à ce jour s'accumulent dans le tissu rénal et possèdent un certain potentiel néphrotoxique l Luft et al, J Inf Dis;, 138 ( 4): 541-595 ( 1978) l Ainsi, la présente invention est utile avec tout antibiotique aminoglycoside Les bases libres, ainsi que les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables de ces antibiotiques aminoglycosides peuvent être employés. Dans le contexte de cette description, les termes "sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables" signifieront un mono ou poly sel formé par l'interaction d'une molécule de l'antibiotique aminoglycoside avec une ou plusieurs moles d'un sel pharmaceutiquement acceptable. Inclus parmi ceux-ci sont les acides acétique, chlorhydrique, sulfurique, maléique, phosphorique, nitrique, bromhydrique, ascorbique, malique et citrique, et les autres acides communément utilisés pour faire des sels de produits pharmaceutiques contenant une fonction amine. Les agents inhibiteurs de prise rénale conjointe- ment utilisés avec les aminoglycosides néphrotoxiques de la présente invention sont des polymères d'asparagine ou d'acide aspartique, incluant les homopolymères de chacun, les copolymères de l'un avec l'autre et les copolymères pharmaceutiquement acceptables de l'asparagine et/ou de l'acide aspartique avec des comonomères, lesquels copoly- mères contiennent une majeure quantité d'asparagine ou d'acide aspartique Les polymères utiles ont un poids moléculaire compris entre environ 1 000 et 100 000, de préférence entre environ 5 500 et environ 16 000, et encore de préférence entre environ 8 000 et 15 000 Si le polymère est l'acide poly-l-aspartique ou contient l'acide aspartique comme copolymère, il peut être employé sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable, par exemple sous forme du sel de sodium. Les combinaisons de l'invention peuvent être conjointement utilisées dans une variété de modes De préférence, les antibiotiques aminoglycosides et le polymère inhibiteur sont combinés dans une unité de dosage unique, de préférence avec un support pharmaceutiquement acceptable, par exemple, une cosolution ou dispersion dans un solvant pharmaceutiquement acceptable inerte ou un agent de dispersion pharmaceutiquement acceptable ou analogue Typiquement, les supports pharmaceutiquement acceptables peuvent être n'importe lequel de ceux employés jusqu'à présent ou compatibles avec l'antibiotique aminoglycoside seul. Alternativement,mais de manière moins préférée, le polymère inhibiteur peut être séparément formulé avec des matériaux pharmaceutiquement acceptables et administré séparément, de préférence sensiblement concurremment, avec l'antibiotique aminoglycoside ou, de manière moins préférée, environ une heure avant ou après l'administration de l'antibiotique aminoglycoside. Le mode d'administration, le dosage et la fréquence de dosage est gouverné par le mode d'administra- tion et les considérations de dosage conventionnellement employées avec l'antibiotique aminoglycoside Ainsi, par exemple, diverses combinaisons de l'invention peuvent être administrées intramusculairement ou intraveineusement, ou d'une autre manière, comme dicté par la pratique médicale et pharmacologique par rapport à l'emploi désiré de l'antibiotique particulier employé. Les quantités proportionnelles et absolues de l'antibiotique et du polymère inhibiteur sont sujettes à variation Typiquement, l'antibiotique est employé dans ses quantités thérapeutiques reconnues dans l'art conventionnel Dans les essais décrits dans les exemples, ci-après, le polymère inhibiteur n'a pas réduit l'activité antimicrobienne de l'antibiotique aminoglycoside. La quantité du polymère inhibiteur employé en conjonction avec l'antibiotique aminoglycoside est une quantité de réduction de la néphrotoxicité de l'anti- biotique aminoglycoside La quantité varie selon l'amino- glycoside employé De manière typique, la quantité de polymère inhibiteur employé est d'au moins environ 0,002 mole et de préférence d'au moins environ 0,005 mole du polymère par mole de l'antibiotique aminoglycoside. La limite supérieure est dictée par le poids pratique et des considérations de coût Des quantités aussi élevées que 10 moles de polymère par mole d'antibiotique ont été considérées et apparaissent pour être non nécessaires pour autant que des niveaux inférieurs apparaissent fournir une inhibition excellente. La figure 1 est une représentation graphique du transport de gentamicine représentant en ordonnées le transport de gentamicine en nanomoles de gentamicine par milligramme de protéine en fonction du temps (v) exprimé en minutes et en fonction de la concentration de gentamicine (A) et en fonction de la spécificité (CM), en abscisses. La figure 2 est un graphe de comparaison des puissances d'inhibition de transport de l'inhibition de néphrotoxicité in vivo de la poly-lasparagine et de l'acide poly-l-aspartique En ordonnées on a représenté le pourcentage d'inhibition tandis qu'en abscisses on a représenté un multiple molaire de la gentamicine La courbe en triangle ( ) est celle obtenue avec la poly asparagine in vitro, la courbe obtenue avec les triangles (à) est celle obtenue avec la poly asparagine in vivo; la courbe obtenue avec le cercle ( o) est obtenue avec l'acide poly aspartique in vitro et la courbe obtenue avec le cercle ( v) este celle résultant de l'acide poly aspartique in vivo. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre faite en référence aux exemples suivants donnés simplement à titre d'illus- tration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention Toutes les parties et les pourcentages dans la description sont donnés en poids sauf indication contraire explicite On doit noter que dans les exemples suivants on emploie la gentamicine commerciale, qui est un mélange de gentamicines Ci (envi- ron 28 %), C 2 (environ 37 %) et Cia (environ 35 %) Ainsi, le poids moléculaire moyen pesé est d'environ 462,6. Egalement, les poly-l-asparagine employées dans les exemples sont des polymères consistant d'approximativement -90 unités de répétition, avec des poids moléculaires d'approximativement 9 000-10 000 (fournis par le fourni- seur) Les acides poly-l-aspartiques employés dans les exemples sont les sels de sodium des polymères consistant d'approximativement 90-100 unités de répétition ou de récurrence, avec un poids moléculaire proche de 14 000 (fournis par le fournisseur). EXEMPLE 1 Un programme de criblage ou d'examen in vitro a été établi pour étudier l'inhibition sélective du transport d'aminoglycoside au travers des membranes de bordure ciliaire rénale des cellules de tubule proximal L'essai de criblage employait de la membrane de bordure ciliaire. purifiée isolée, comme décrite par Kinsella et al, Biochem. Biophys Acta, 552: 468-477 ( 1979) et Williams et al, Tox Applied Pharmacol, 61: 243251 ( 1981), comprenant l'isolation et la purification de membranes corticales rénales de rat via une centrifugation différentielle, la précipitation cationique et des techniques de gradient de sucrose discontinues L'essai de transport a été conduit par incubation de sulfate de gentamicine-3 H avec des vésicules de membrane de bordure ciliaire suivie par la cueillette des vésicules sur des filtres Millipore sous vide Le transport a été quantifié par des techniques de scintillation liquide comme décrit par Kinsella et al, J Pharmacol Exp Ther, 209: 443- 450 ( 1970) Le transport de gentamicine-a été caractérisé, figure 1, par rapport au temps (courbe en'cercle ), par rapport à la dépendance de concentration, en triangle A, et par rapport à la spécificité, en carré g (plus gentamicine "froide") Le transport de gentamicine a été mesuré à une concentration fixe de gentamicine ( 0,5 mmole) en présence d'agents inhibiteurs de prospection à 5 fois la concentration molaire. Spécifiquement, l'essai de transport de membrane comprenait l'incubation de 3 H-gentamicine ou 3 H-amicacine 0,4 millimolaire avec 100-200 microgrammes de membrane dans un volume réactionnel de 100 microlitres pendant secondes (la réaction est initiée par l'addition de la protéine de membrane -approximativement 20 microlitres). A la suite des 30 secondes de réaction le transport est stoppé par addition de 2,0 millilitres de tampon froid de glace (mannitol 250 millimolaires, KC Ol 15 fois milli- molaire et Hepes 20 millimolaires-p H 7,4 avec TRIS). Le milieu réactionnel est ensuite filtré sous vide sur des filtres Millipore de 0,3 micron Les filtres sont lavés deux fois avec 2 ml du tampon et enlevés et comptés en utilisant des techniques de spectroscopie de scintillation liquide. On mesure l'inhibition de transport en contrôlant les essais de transport ci-dessus en présence des agents inhibiteurs de prospection à des concentrations initiales comprises dans le domaine allant de 1-10 fois la concen- tration molaire d'aminoglycoside Les agents inhibiteurs sont solubilisés dans le tampon décrit ci-dessus. Le tableau I donne la liste de divers produits chimiques criblés ou examinés dans cet essai in vitro. Tableau I Produits chimiques criblés ou examinés In Vitro SUCRES DERIVES ( 16) POLYAMINES ( 14) Acétylgalactosamine Acétylglucosamine Acétylmannosamine Galactosamine Glucarolactame Glucarolactone Gluconolactone Glucuronamide Acide glucuronique Glucuronolactone Glucose Lyxosylamine Mannose Méthylglucamine -0-méthylglucose Xylose Agmatine Diaminodé cane Diaminodipropylamine Diaminododécane Diaminoheptane Diaminooctane Acide diéthylène- triamine penta- acétique Diméthylaminopropyl- amine Hexanediamine Spermine Tributylamine Triéthylènediamine Triéthylènetétramine Tripropylamine Tableau I (suite) PRODUITS DIVERS ( 19) Amicacire tétragluconate Caféine Chlorure de caloium Ferritine cationisée Cytidine Fosfomycine Glutaraldéhyde Acide glutarique Lysozyme l Myoinositol phosphate Acide polyadénylique Acide polycytidylique Inhibiteur de dipeptidase rénale AMINOACIDES MONO ( 8) POLY ( 12) alanine alanine 42 asparagine asparagine 90 arginine arginine 390 cysta ornithine 90 thione ythione histidine 70 cystéine glutamine 2 glutamine acide glycine glutamique 60 lysine lysine 2 4, , 20 acide aspartique 90 (BCH-1) Acide sialique Acétone bisulfite de sodium Aldéhyde bisulfite de sodium Formaldéhyde bisulfite de sodium Glutaraldéhyde bisulfite de sodium AMINES TERTIAIRES ( 4) Choline Bromure de tétrabutylammonium Bromure de tétraéthylammonium Bromure de tétrahexylammonium Le tableau II présente les quatorze produits chimiques ( 14) dont on a trouvé qu'ils inhibent le transport de gentamicine en employant ce procédé de criblage ou d'examen Ces agents inhibiteurs de transport diffèrent de manière marquée en puissance comme cela est reflété par des multiples molaires produisant l'inhibition de transport à 50 %. Tableau II Agents inhibiteurs de transport de membrane Inhibiteurs I 50 Polyamines Diaminodipropylamine I OX Spermine 3 X Polysminoacides Lysine 4 10 X Lysine 10 lx Lysine 20 O O 05 X Asparagine 90 O,1 X Acide aspartique 90 l'essai de plaque en coupelle avec Bacillus subtilis "cup plate assay". On n'a pas observé de signe de perte d'activité amino- glycoside dans aucune des combinaisons Les agents - inhibiteurs detransport de membrane ont également été essayés seuls pour certifier aucune activité antibiotique qui pourrait influencer l'interprétation des données sur les combinaisons Aucun des agents inhibiteurs n'a montré d'activité antimicrobienne détectable envers B subtilis. Des données in vivo sur neuf ( 9) agents inhibiteurs de transport à partir du criblage in vitro sont présentées au tableau III. Tableau III Inhibiteurs de transport de membrane In Vivo Inhibiteur Lysine 4 Lysine 10 Lysine 20 Na Form Bisulfite Na Glut Bisulfite Diaminopropylamine Acide aspartique 90 Acide glutamique 60 Asparagine 90 ,, Multiple Molaire 0,30,1 0,3- 1,0 0,5 0,3 0,15 0,10 de dose AG Mg 0,7 2,5 Activité néphro- protectrice o O + + O o O +++ o O +++ +++ + + + + = moins de 50 % de réduction +++ = réduction 100 % Il I 1 Pour les composés tels que la polyasparagine et l'acide polyaspartique qui montraient le degré le plus élevé d'activité néphroprotectrice in vivo, une corrélation excellente existe entre une puissance molaire in vitro et in vivo Cette relation est démontrée à la figure 2 Dans les séries de polylysines des agents inhibiteurs de transport de membrane, la puissance in vitro a montré une corrélation avec la dimension du polymère, et seulement l'agent inhibiteur de transport le plus puissant (la polylysine 20) n'a pas montré d'activité néphro- protectrice (voir tableau III). EXAMPLE II On a soumis un nombre de candidats à partir du criblage in vitro ci-dessus à des études in vivo. Modèle animal in vivo On a utilisé un modèle de néphrotoxicité sub- aigu de quatorze jours ( 14) chez les rats pour tester l'efficacité in vivo des combinaisons d'agent inhibiteur de transport-aminoglycoside Ce modèle est un parallèle des régimes de traitement de courte durée en clinique. Bien qu'on contrôle l'azote de l'urée du sang ("BUN") comme paramètre clinique de la fonction rénale, 1 'évalua- tion primaire de la néphrotoxicité dans ce modèle inclut l'examen histopathologique des tissus rénaux, qui est une méthode plus correcte et sensible pour tester la néphro- toxicité l Hottendorf et al, Antimicrob Agents Chemother, 18: 176-181 ( 1980)l La dose de gentamicine nécessaire pour aboutir à une réponse néphrotoxique significative et reproductible dans ce modèle est de 20 mg/kg/jour (bid, 14 jours). ANIMAUX D'ESSAI: On a utilisé des rats Sprague-Dawley mâles t Charles River Breeding Laboratories, Inc, (CRL: COBS CD (SD) BR) l approximativement âgés de 6 semaines et pesant 140-160 grammes à l'arrivée Ils ont été conditionnés pendant au moins 5 jours avant le début de l'étude On a sélectionné seulement les animaux dont on a trouvé qu'ils étaient cliniquement sains Les rats ont été identifiés individuellement par un numéro sur l'ongle avec des stylos marquants noir Pendant l'étude les rats ont été logés individuellement dans des cages de dimension et de type appropriés dans une pièce à température contrôlée De la nourriture de laboratoire de rongeur (comprimé, commercialisé par Purina Ralston Company) et de l'eau ont été offerts ad libitum. ARTICLES D'ESSAI ET PROCEDURES DE CONTROLE: Garamycine (sulfate de gentamicine) contenant mg de gentamicine base/ml. Poly-l-asparagineo 90 (P Aspgo 90), (Sigma Chemical Co, Saint-Louis, Missouri). Acide poly-l-aspartique 90 (PAA 90), (Sigma Chemical Co, Saint-Louis, Missouri). Acide poly-l-glutamique 60 (P Glu 60), (Sigma Chemical Co, Saint-Louis, Missouri). Tétralysine (P Lys 4), sel pentahydrochlorique, (Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada). On a déterminé les concentration de gentamicine base dans toutes les solutions de dosage une fois pendant l'étude On a déterminé l'activité par l'essai en plaque sous forme de coupelle avec Bacillus subtilis. PREPARATION DE LA DOSE ET PROCEDURES: On a administré de manière sous-cutanée deux fois par jour pendant 14 jours de l'aminoglycoside et des mélanges d'aminoglycoside et de l'agent inhibiteur d'aminoglycoside. On a préparé les solutions de dosage de gentamicine en diluant la Garamycine commerciale ( 40 mg/ml) à une concentration de 4 mg/ml (dilution 1:10) On a dilué cette solution avec des volumes égaux d'eau ou les solutions appropriées des autres agents d'essai à une concentration finale de 2 mg de gentamicine base/ml Le groupement des rats et les descriptions des solutions de dosage volumes sont présentés dans les tableaux IV et V dessous. Tableau IV Identification du groupe Groupe N I II III IV V VI VII VIII Animal Numéro 51-60 26-30 51-35 1-5 6-10 11-15 16-20 21-25 Rapport Traitement molaire Sol physilogique (salin) - Gentamicine - Gentamicine - Gentm/P Asp 90 7:1 Gentm/P Asp 90 3,5:1 Gentm/PAA 90 3:1 Gentm/P Glu 60 1:1 Gentm/P Lys 4 1:16 A cause du caractère trouble et de l'activité diminuée de la solution de dosage du groupe IV Gentm/P Asp 90 à rapport molaire 7:1 ( 20:60 mg/kg),pour les animaux d'étude 1-5 on a arrêté le dosage le 2 ème jour d'étude et on a dosé les animaux de contrôle salin 56-60 avec une concentration différente de cette combinaison et on les a substitués et affectés comme animaux d'étude 1-5, groupe IV. * En termes d'activité de base. et les ci- Doses (m/k*) - :60 -120 :200 :350 :500 Traitement Salin (sol. physiologique> Gentm Gentm Gentm /P Asp 90 Gentm/P Asp 90 Gentm/PAA 90 Gentm/P Glu 60 Gentm/P Ly 54 Tableau V- Solutions de dosage et volumes de dosag Concentration initiale Concentration finale Demi-dose k M= mg/ml) Journalière Aminoglycoside Autre Aminoglycoside autre m 10 g 1,00 4,00 -2,00 -0,25 4,00 -2,00 -0,50 ,0 60,0 10,-00 30,0 0,10 C 4,00 24,00 2,00 12,00 0,50 4,00 40,00 2,00 20,00 0,50 4,00 70,00 2,00 35,00 0,50 4,00 100,00 2,00 50,00 0,50 Group e No I I III IV V VI VII VIII, ra Co PATHOLOGIE ANATOMIQUE Tous les rats ont été euthanisés par une overdose de pentobarbital de sodium au 15 ème jour d'étude Les reins ont été enlevés, examinés grossièrement et placés dans de la formaline tamponnée neutre à 10 % pour une évaluation histopathologique ultérieure. Les résultats de l'évaluation histopathologique ont résumés comme suit. Tableau VI Animal N 52 Animal NO 31 Groupe I CONTROLES SALINS Histopath. Score (TOTAL 2,0 Groupe III GENTM 20 Histopath. Score (TOTAL) 4,8 - Animal NO Groupe II GENTM 10 Histopath. Score (TOTAL) 4,2 Groupe IV GENTM/P Asp ( 20:60) Animal Histopath. NO Score (TOTAL) I 2 2,8 Tableau VI (suite) Groupe V GENTM/P Asp ( 20:120) Animal Histopath. N Score (TOTAL) 6 3 3,0 Groupe VII GENTM/P Glu-( 20:350) Animal N 19 Histopath. Score (TOTAL) 7,4 Groupe VI GENTM/PAA ( 20:200) Animal Histopath. N Score (TOTAL) 11 2 o O 1,8 Groupe VIII GENTM/Plys/, ( 20:500) Animal Histopath. N Score (TOTAL) 21 4 22 7 23 5 24 5 8 ,8 Les groupes II et III démontrent la néphroto- toxicité de la gentamicine Les groupes IV, V et VI démontrent l'effet inhibitoire de l'invention. 10 1,5 î Les groupes VII et VIII démontrent l'absence comparative d'effet inhibiteur d'autres agents inhibiteurs potentiels hors de la portée de l'invention. EXEMPLE III De façon à déterminer le potentiel de plusieurs agents inhibiteurs in vitro de transport de gentamicine pour prévenir la néphrotoxicité de l'aminoglycoside chez les rats, on a coadministré la poly-l-lysine (Plys O lo,12), la poly-l-asparagine 90 (P Aspgo) et le formaldéhyde bisulfite de sodium (Me S) avec l'amicacine et la gentamicine comme mélanges pendant quatorze jours de manière sous-cutanée. On a contr 81 é la néphrotoxicité par l'analyse de l'azote de l'urée du sang (BUN) et l'examen histopathologique des tissus rénaux. ARTICLES D'ESSAI ET PROCEDURES DE CONTROLE a) Amicine (sulfate d'amicacine) contenant 250 mg d'amicacine base par ml. b) Garamycine (sulfate de gentamicine) contenant 40 mg de gentamicine base par ml. c) Poly-l-lysine 10 o-(Plys 10), Sigma Chemical Co, Saint-Louis, Missouri. d) Poly-l-lysine 12 (Plys 12), Miles Laboratories, Inc, Elkhart, Indiana. e) Poly-l-asparagine 90 (P Aspgo 90), Sigma Chemical Co, Saint-Louis, Missouri. f) Formaldéhyde bisulfite de sodium (Me S), Eastman Kodak Co, Rochester, New York. g) On a déterminé les concentrations d'amicacine et de gentamicine bases dans toutes les solutions de dosage une fois pendant l'étude On a également analysé les agents préparés en mélanges avec l'amicacine ou la gentamicine pour la bioactivité séparément dans des concentrations utilisées en mélanges L'activité a été déterminée par l'essai en plaque en forme de coupelle avec Bacillus subtilis. ANIMAUX D'ESSAI: On a utilisé des rats mâles Sprague-Dawley L Charles River Breeding Laboratories, Inc, l CRL: COBS CD (SD) BR) j 3 approximativement âgés de six semaines et pesant 130-150 grammes à leur arrivée Ils ont été conditionnés pendant au moins 5 jours avant le début de l'étude On a sélectionné seulement les animaux dont on a trouvé qu'ils étaient cliniquement sains On a identifié les rats indivi- duellement par numéro sur l'ongle avec des stylos de marquage en noir. Pendant l'étude les rats ont été logés individuel- * lement dans des cages du type et de dimension appropriés dans une pièce à température contrôlée On leur a offert de la mangeaille de laboratoire de rongeur (comprimé, de Purina Ralston Company) et de l'eau ad libitum. PREPARATION DES DOSES ET PROCEDURES: On a administré de manière sous-cutanée deux fois par jour pendant quatorze jours des aminoglycosides et des mélanges d'aminoglycoside agent inhibiteur On a préparé des solutions d'amicacine tout d'abord en diluant l'amicine commerciale ( 250 mg/ml) avec de l'eau stérile pour injection, USP, jusqu'à une concentration de 20 mg/ml (dilution 1:12,5) On a préparé des solutions de gentamicine de manière similaire en diluant la garamycine commerciale ( 40 mg/ml) jusqu'à une concentration de 4 mg/ml (dilution 1:10) On a dilué ces solutions avec des volumes égaux d'eau ou des solutions appropriées des autres agents d'essai jusqu'à une concentration finale de 10 mg d'amicacine ou de 2 mg de gentamicine base/ml Le groupage des rats et les descriptions des solutions de dosage et des-volumes sont présentés dans les tableaux ci-dessous. Tableau VII Identification des groupes Groupe Animal Rapport Doses NO N O I Traitement molaire (mg/kg*) I 46-55 Salin Il 36-40 Gentamicine 20 III 11- 15 Gentm/P Asp 90 1:1 20:400 IV 1- 5 Gentm/Plys 13 1:1 20:125 V 6-10 Gentm/Plys 1 1:3 20:'275 VI 16-20 Gentm/M'e S 1:68 20:400 VII 21-25 Gentm/Me S 1:136 20:800 VIII 26-30 Amic/Me S 1:9 200:400 IX 31-35 Amic/Me S 1:18 200:800 X 41-45 Amicacine -200 * En-termes d'activité de base. Tableau VIII Solutions de dosage et volumes de dosage Traitement Salin Gentami cine Gentm/P Asp O Gentm/Plys 12 Gentm/Plys 10 Gentm/Me S Gentm/Me S Amic/Me S Amic/Me S Amicacine Concentration initiale (Mg/Ml) Amninoglycoside Autre 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 o 4,00 ,00 ,00 ,00 ,0 ,00 ,00 ,00 ,00 ,00 ,00 Concentration final e (mg/ml) Amnino lycoside Autre 2,00 2,00 2,00 2,00 2, 00 2,00 ,00 ,00 ,00 ,00 12,50 27,50 ,00 ,00 ,00 ,00 Demi-dose journalière -(mnl/10 g 1,0 0,.5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,0 1,0 1,0 Groupe NO I I III iv V VI VII VIII Ix x N N\ 3 '> Lni Co PATHOLOGIE CLINIQUE ET ANATOMIQUE:- On a recueilli du sang à partir de tous les rats le 15 ème jour d'étude pour déterminer l'azote de l'urée du sang (BUN). Tous les rats ont été euthanisés par une overdose de pentobarbital de sodium le 15 ème jour d'étude Les reins ont été prélevés, examinés grossièrement et placés dans de la formaline tamponnée neutre à 10 % pour une évaluation histopathologique subséquente. Tableau IX Résultats d'étude histopathologicue Groupe I CONTROLES SALINS Groupe Il GENTANICINE ( 20 mg Histopatho Score (TOTAL) 1,6 Rat No Histopath. Score (TOTAL) 8,8 Rat No 49 54 Tableau IX (suite) Groupe III GENT/P Asp 90 * Groupe IV GENT/Plys 12 ( 1:1) Histopath. Score (TOTAL) 2, 2 Groupe V GENT/Plys 10 ( 1:3) Histopath. Score (TOTAL) 7,0 Groupe VII GENT/Me S ( 1: 136) Histopath. Score (TOTAL) 4,8 Rat NO 1- Rat N Rat NO Hispatoph. Score (TOTAL) 1 il 6,2 Groupe VI GENT/Me S ( 1:68) Histopath. Score (TOTAL) ,8 Groupe VIII AMIC/Me S ( 1:9) Histopath. Score (TOTAL) il 13,4 Rat N Rat NO Rat NO Tableau IX (fin) Groupe IX Groupe X AMIC/Me S ( 1:18) AMICACINE ( 200 mg/kg Rat Histopath Rat Histopath. N 5 Score (TOTAL) N Score (TOTAL) 31 13 41 15 32 14 42 11 33 14 43 12 34 8 44 14 35 10 45 14 11,8 13,2 A cette dose, la P Asp a provoqué la formation de vacuoles dans les tubules proximaux qui apparatt être liée à la présence de P Asp La signification de ce changement est inconnue. Le groupe II démontre la néphrotoxicité de la gentamicine dans cet essai Le groupe III démontre l'effet inhibiteur de l'invention Les groupes IV à IX démontrent l'absence comparative d'effet inhibiteur d'autres agents inhibiteurs potentiels hors de la portée de l'invention. Le groupe X démontre la néphrotoxicité de l'amicacine dans cet essai. EXEMPLE IV On a déterminé le potentiel de la poly-l-asparagine et de l'acide poly-laspartique pour prévenir ou éviter la néphrotoxicité de l'amicacine chez les rats par une co- administration de ces agents avec l'amicacine sous forme de mélanges pendant quatorze jours de manière sous-cutanée. On a contrôlé la néphrotoxicité par un examen histopatho- logique des tissus rénaux. ARTICLES D'ESSAI ET PROCEDURES DE CONTROLE: a) Amicine (sulfate d'amicacine) contenant 250 mg d'amicacine base par ml. b) Poly-l-asparagine 80 (P Asp 80), poids moléculaire d'approximativement 9 000. c) Acide poly-l-aspartique 100 (PAA 100), poids moléculaire d'environ 14 000. d) Les concentrations d'amicacine base ont été déterminées sur toutes les solutions de dosage une fois pendant l'étude L'activité a été déter- minée par l'essai de plaque en forme de coupelle avec Bacillus subtilis. ANIMAUX D'ESSAI: On a utilisé vingt-cinq ( 25) rats mâles Sprague- Dawley l Charles River Breeding Laboratories, Inc, (CRL: COBS CD (SD) BR) l approximativement âgés de six semaines et pesant 130-150 grammes à leur arrivée Ils ont été conditionnés pendant au moins 5 jours avant le début de l'étude On a sélectionné seulement les animaux dont on a trouvé qu'ils étaient cliniquement sains Les rats ont été identifiés individuellement par un numéro ( 1-25) sur l'ongle avec des stylos de marquage en noir. Pendant l'étude les rats ont été logés individuel- lement dans des cages de la dimension et du type appropriés dans une pièce à température contrôlée La mangeaille de laboratoire de rongeur (comprimé, Purina Ralston Company) et de l'eau ont été offerts ad libitum. PREPARATION DES DOSES ET PROCEDURES: On a administré l'amicacine et des mélanges d'amicacine de manière souscutanée deux fois par jour pendant quatorze jours. On a préparé les solutions de dosage d'amicacine en diluant l'amicine commerciale ( 250 mg/ml) avec de l'eau stérile pour injection, USP, jusqu'à une concentration initiale de 20 mg/ml (dilution 1:12,5) Cette solution a ensuite été diluée avec des volumes égaux d'eau stérile ou les solutions appropriées des autres agents d'essai jusqu'à une concentration finalede 10 mg d'amicacine/ml. Tableau X Identification des groupes Traitement Amic/P Asp 80 Amic/PAA 100 Amicacine Salin (solution physiologique) Rapport molaire :1 :1 Doses (mg/kg*) :600 :500 En termes d'activité de base. Groupe NO I II III IV Animal N 1-5 6-10 11-15 16-25 * Tableau XI Solutions de dosage et volumes de dosage Groupe NO Traitement Concentration initiale (mg/ml) Amicacine Autre Concentration finale (mg/ml) _ Amicacine Autre Demi-dose journalière (ml/100 g) I Amic/P Asp 80 II Amic/PAA 100 III Amicacine IV Salin (solution physiologique) I,00 1, 00 1,00 1,00 L Ji 4 O co o' PATHOLOGIE ANATOMIQUE On a euthanisé tous les rats avec une overdose de pentobarbital de sodium le 15 ème jour d'étude On a enlevé les reins, que l'on a examinés grossièrement et placés dans de la formaline tamponnée neutre à 10 % pour une évaluation histopathologique subséquente. Tableau XII Résultats d'étude histopathologigue Groupe I Amicacine/P Asp 80 ( 5:1) Histopath. Score (TOT Pl 3,2 Groupe III Amicacine Histopath. Score (TOTAL) il 12,8 Groupe II Amicacine PAA 00 ( 10:1) Rat Histopath. N_ Score (TOTAL) 6 O 7 6 8 3 9 3 4 3,2 Rat NO Groupe IV Salin Histopath. Score (TOTAL) 1,9 Rat NO 2 Rat N L'invention comprend naturellement tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs diverses combinaisons. R E V E N D I C A T I O N S 1. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) un aminoglycoside, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, ayant un potentiel néphrotoxique, et b) au moins 0,002 mole, par mole d'aminoglycoside, de: i) polyasparagine, ii) acide polyaspartique ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, iii) un copolymère de la polyasparagine et de l'acide polyaspartique, ou un sel pharmaceuti- quement acceptable de celui-ci, ou iv) un copolymère de polyasparagine ou d'acide polyaspartique, ou d'un sel pharmaceuti- quement acceptable de celui-ci, avec un comonomère pharmaceutiquement acceptable, ledit copolymère contenant une quantité substantielle d'asparagine ou d'acide aspartique, ledit polymère ou copolymère ayant un poids moléculaire allant d'environ 1 000 à environ 100 000. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) un aminoglycoside, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, ayant un potentiel néphrotoxique, et b) au moins 0,005 mole, par mole d'aminoglycoside, de poly-l-asparagine ou d'acide poly-l- aspartique, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, ledit polymère ayant un poids moléculaire allant d'environ 5.500 à environ 16 000. 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'aminoglycoside est la gentamicine 2544986- ou l'amicacine. 4. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la gentamicine, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celleci, et au moins environ 0,005 mole, par mole de gentamicine, de poly-lasparagine ayant un poids moléculaire d'environ 8 000 à environ 15 000, 5. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la gentamicine, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle- ci, et au moins environ 0,005 mole, par mole de gentamicine, d'acide - poly-l-aspartique ayant un poids moléculaire d'environ 8 000 à environ 15 000, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci. 6 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend de l'amicacine, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celleci, et au moins 0,005 mole, par mole d'amicacine, de poly-l-asparagine ayant un poids moléculaire d'environ 8 000 à environ 15 000. 7 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend de l-'amicacine, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, et au moins environ 0,005 mole, par mole d'amicacine, d'acide poly-l- aspartique ayant un poids moléculaire d'environ 8 000 à environ 15 000, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le sel d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptable est un mono ou poly sel formé par interaction d'une molécule de l'antibiotique aminoglycoside avec une ou plusieurs moles d'un acide pharmaceutiquement acceptable choisi parmi le groupe consistant d'acide acétique, chlorhydrique, sulfurique, maléique, phosphorique, nitrique, bromhydrique, ascorbique, malique et citrique. 2544986. 9. Unité de dosage, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) une quantité thérapeutiquement efficace d'un antibiotique aminoglycoside ayant un potentiel néphrotoxique, et b) une quantité réduisant la néphrotoxicité de: i) polyasparagine, ii) acide polyaspartique ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, iii) un copolymère de polyasparagine et d'acide polyaspartique, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, ou iv) un copolymère de polyasparagine ou d'acide polyaspartique, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, avec un comonomère pharmaceutiquement acceptable, ledit copolymère contenant une quantité substantielle d'asparagine ou d'acide aspartique, ledit polymère ou copolymère ayant un poids moléculaire allant d'environ 1 000 à environ 100 000. 10. Unité de dosage selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un support pharmaceutiquement acceptable. 11. Unité de dosage selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que le polymère ou le copolymère précité a un poids moléculaire d'environ 5 500 à environ 16 000. 12. Unité de dosage selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que le polymère ou copolymère précité a un poids moléculaire d'environ 8 000 à environ 15 000 13. Unité de dosage selon la revendication 12, caractérisée en ce que le polymèreest la poly-l-asparagine ou l'acide poly-l-aspartique, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et est présent en une quantité d'au moins environ 0,005 mole par mole d'antibiotique aminoglycoside. 14. Unité de dosage selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un support pharmaceutiquement acceptable. 15 Unité de dosage selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce que l'aminoglyooside est la gentamicine ou l'amicacine. 16. Unité de dosage selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, caractérisée en ce que le sel d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptable est un mono ou poly sel formé par interaction d'une molécule de l'antibiotique aminoglycoside avec une ou plusieurs moles d'un acide pharmaceutiquement acceptable choisi parmi le groupe consistant de l'acide acétique, chlorhydrique, sulfurique, maléique, phosphorique, nitrique, bromhydrique, ascorbique, malique et citrique.