Brevet FR2545099A1 — publié le 19841102

La présente invention concerne essentiellement une nouvelle souche de Trichoderma harzianum, un procédé d'isolement de cette souche, un procédé de culture de cette souche, de nouveaux peptides produits par cette souche nouvellement dénommés Trichorzianines et l'application de cette souche, des nouveaux peptides ou du produit obtenu par le procédé de culture comme moyen de lutte biologique, en particulier sous forme de produit phytosanitaire Plus précisement, cette nouvelle souche de Trichoderma harzianum peut etre utilisée comme moyen de lutte biologique, en particulier sous forme de produit phytosanitaire, contre le champignon parasite Botrytis cinerea (pourriture grise de la vigne) ou contre le champignon parasite Stereum purpureum (maladie du plomb des arbres fruitiers) ou encore contre Ceratocystis ulmi (graphiose de l'orme) ou encore contre le champignon parasite Sclérotinia (sclérotiniose) ou encore contre le champignon parasite Stereum hirsutum, exemples non limitatifs. La nouvelle souche de Trichoderma harzianum isolée par la demanderesse a fait l'objet d'un dépôt auprès de l'Institut Pasteur le 2 Mars 1983 sous le N I 223 ainsi que d'un dépôt auprès de l'American Type Culture Collection, en abrégé ATCC sous le N ATCC 20672 le 22 Avril 1983. Cette nouvelle souche I 223 a été reconnue comme étant un champignon Trichoderma harzianum selon la classi- fication Rifai. Cette nouvelle souche de lrichoderma harzianum I 223 présente en effet l'aspect cultural suivant: un mycélium ras, translucide à peine discernable à l'oeil nu, à la surface duquel apparaissent au bout de trois jours environ de culture, des formations sporogènes d'abord blanches qui se colorent par la suite en vert sombre La structure sporifère est la suivante: les conidiophores portent des branches ramifiées de façon orthogonale, les cellules sporogènes (phialides) portées nar ces dernières peuvent être groupées par deux ou trois, elles sont de taille variable ( 8 à 12 microns), étroites ( 2,5 microns), peu ventrues et souvent recourbées, les spores qu'elles portent sont globuleuses à sub-globuleuses, colorées en vert et mesurent en moyenne 3 microns de diamètre, elles apparaissent lisses au grandissement 1000. La paroi des spcres est complètementlisse au microscope électronique. La température de croissance est de 17 à 32 C avec un optimum de 20 à 24 C Elles poussent sur milieu classique, c'est-à-dire malt-agar; pomme de terre-glucose-agar; flocons d'avoine; et à un p H compris entre 4 et 7 avec un optimum vers 5. La sporulation est plus importante sur un milieu riche et sa croissance est aérobie. Le procédé d'isolement de cette nouvelle souche de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCO N 20672 a pour but d'obtenir une souche: -présentant une croissance rapide, la souche doit se développer rapidement afin d'être efficace vis à vis des parasites, ayant une bonne croissance en milieu pauvre, se développant à température assez basse ( 15-17 C), ayant la plus importante production de spores par unité de milieu gélosé, ayant la plus importante production de substance antifongique par unité de poids de spores, production que l'on peut évaluer soit par comparaison des pouvoirs antagonistes à distance (comme il sera expliqué plus loin à l'exemple 7) soit par extraction aux solvants de ces substances. Les meilleures souches obtenues permettent d'obtenir une quantité de substances de 2 % (exprimée en poids de substance par poids de produit final) ayant le meilleur pouvoir antagoniste par contact. 2545099 i Ce procédé d'isolement est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes: A on prélève des champignons Trichoderma harzianum dans un endroit approprié, c'est-à-dire connu pour pouvoir contenir des champignons Trichoderma harzianum, tel que sol humide comme un sol maraîcher ou un sol cultivé; B on fait croltre les champignons de Trichoderma harzianum prélevés, sur un milieu de culture gélosé en botte de Pétri à 240 C à la lumière pendant 3 à 7 jours; C on prélève le maximum de spores de Trichoderma harzianum de couleur verte; D on met en suspension dans l'eau ce prélèvement de Trichoderma harzianum pour dissocier les spores; E on détermine la ou les meilleures souches parmi les souches dissociées par un programme de sélection par clonage de préférence réalisé comme suit: a) on effectue une culture séparée de chaque spore dissociée sur un milieu gélosé riche tel que milieu aux flocons d'avoine en botte de Pétri; b) au bout de 48 heures, on remet en suspension la totalité des spores de chaque botte prise séparément, et on ajuste le titre à 106 spores/millilitre; c) on prélève une ou plusieurs gouttes de suspension de souche obtenue après l'étape b) que l'on inocule dans l'un des milieux suivants: i un milieu gélosé pauvre, par exemple à l'extrait de malt à 20 grammes par litre en boite de Pétri et que l'on cultive à 24 C; ii un milieu riche, par exemple aux flocons d'avoine à 30 grammes par litre, que l'on cultive à une température assez basse, par 2545099 i exemple de 15 à 170 C; iii un milieu de croissance du parasite Botrytis cinerea, par exemple essentiellement à base de concentré de jus de tomate, préalablement ensemencé du parasite lui-même Botrytis cinerea, en vue de réaliser un essai de pouvoir antagoniste par contact, et à distance, avec culture à 24 C; iiii un milieu riche, par exemple aux flocons d'avoine à 30 grammes par litre que l'on cultive à 24 0, en vue de déterminer les souches ayant la production la plus importante de spores par unité de surface de milieu gélosé, d) on observe la croissance et le comportement des souches à partir de 48 heures, toutes les 24 heures, et on évalue selon des critères-connus en soi la qualité de cette croissance; e) on retient la ou les souches ayant obtenu la meilleure performance sur l'ensemble des essais de l'étape c) ci-dessus et produisant la plus grande quantité de peptides; cette souche constitue la souche déposée auprès de l'Institut Pasteur comme nouvelle souche Trichoderma harzianum I 225, également déposée auprès de l'ATCC scus le y 20672 2545099 i La présente invention concerne également un procédé de culture de la souche ou des souches de Trichoderma arzianum ainsi sélectionnées, et de préférence de la souche Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC 20672 caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la ou lesdites souches de Trichoderma harzianum, et de préférence Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC NO 20672 sur un milieu liquide, composé de constituants nutritifs habituels en fermentation, stérilement, en couches fines sur un plateau et à la lumière pendant un temps de fermentation tel que les spores atteignent leur maturité; à la fin de la fermentation, on sèche le produit total que l'on broie finement et que l'on tamise de manière à obtenir une poudre sèche et fine ayant de préférence un diamètre inférieur à 200 microns, contenant les spores viables, et pouvant se mettre en suspension dans l'eau et être pulvérisée. Ce produit de base titre de préférence au moins 1010 éléments ou spores revivifiables par gramme et peut servir de base à des formulations diverses On donne ci-après plusieurs exemples de cultures de la souche Trichoderma h:arzianum en référence à la souche déposée auprès de l'Institut Pasteur sous le NI I 223 ou à l'ATCC sous le NO ATCC 20672 EXEMPLE 1 On prépare le milieu de culture ou de préculture ayant la composition suivante glucose 40 grammes extrait de levure 5 grammes bactopeptone 5 grammes Na NO 3 3 grammes KH 2 PO 4 1 gramme Mg SO 4,7 H 20 0,5 gramme K Cl 0,5 gramme Eau déminéralisée qsp 1 litre 2545099 i Le p H naturel de ce milieu est de 5,85 et celui-ci est ajusté à 4,8 par addition de H Cl. On stérilise ce milieu 20 minutes à 121 C puis on ensemence à partir de spores de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 obtenues sur milieu gélosé ou à partir d'une préculture réalisée dans le milieu agité ci-dessus décrit. On laisse incuber à 24 C en couches minces, sous lumière permanente ou par intermittence jusqu'à ce que les spores atteignent leur maturité. On sèche la totalité du milieu et l'on réalise le broyage pour obtenir une poudre sèche et fine ayant de préférence une granulométrie inférieure à 200 microns et qui contient les spores viables de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 EXEMPLE 2 On prépare un milieu de culture ayant la composi- tion suivante: glucose 5 grammes KH 2 PO 4 0,8 gramme Ca(P 04 H 2)2 0,2 gramme Mg SO 4,7 H 20 0,5 gramme Mn SO 4,55 H 20 0,01 gramme Zn SO 4,7 H 20 0,01 gramme Cu SO 4,5 H 20 0,005 gramme Fe SO 4,7 H 20 0,001 gramme KNO 0,72 gramme (NH-) 504 2 grammes Eau deminéralisée qsp 1 000 millilitres. On effectue une stérilisation de ce milieu pendant 25 minutes à 105 C et ce milieu présente alors un p H égal à 6. Ce milieu peut être modifié en ajoutant un certain- taux de farine de céréale pour obtenir un milieu plus pâteux (par exemple farine de soja, de mais, d'orge, etc). Le milieu est ensemencé à partir de spores de 2545099-i Trichoderma barzianum I 223 ou ATCC NO 20672 obtenues sur milieu gélosé ou à partir de préculture (de préférence le milieu de l'exemple 1) en milieu liquide et agité. Après incubation à 240 C en couches minces jusqu'à maturité des spores, on sèche la totalité du milieu et l'on réalise le broyage pour obtenir une poudre fine ayant de préférence une granulométrie inférieure à 200 microns contenant les spores viables, qui est facilement mise en suspension et pulvérisable. EXEMPLE 3 On prépare le milieu de culture suivant: Flocons d'avoine 30 grammes Gélose 20 grammes Eau déminéralisée qsp 1 000 millilitres. Le p H ajusté avec H Cl avant la stérilisation de minutes à 1210 C doit être après stérilisation de ,5-5,7. Lorsque le milieu est chaud, on le répartit en cou- ches minces dans des plateaux. Après refroidissement, on ensemence en surface à partir d'une préculture (de préférence réalisée avec le milieu de l'exemple 1) qui a été réalisée pendant 18 heures et on laisse incuber à 240 C avec lumière par intermittence ou continuellement. Après incubation jusqu'à maturité des spores, on racle la surface de la gélose pour récolter les spores formées pour réaliser un séchage et un broyage comme dans les exemples 1 ou 2 précédents Cette poudre ne contient que des spores viables de Trichoderma arzianum I 223 ou ATCC Ne 20672 à raison de 8-i 10 ol spores viables/gramme de poudre. EXEMPLE 4 On prépare un milieu de culture ayant la composi- tion suivante: Amidon de mals hydrolysé 100 grammes Corn steep liquide 40 grammes Acide lactique 1 gramme Citrate de sodium 0,5 gramme KH 2 P 04 0, 25 gramme Na NO 3 0,25 gramme Thiamine 100 gamma Eau déminéralisée qsp 1 000 millilitres. Le p H après stérilisation de 30 minutes à 121 C doit être de 4-4,2. Le milieu est préparé dans un fermenteur de 15 litres, type New Brunswick. L'amidon est hydrolysé partiellement par de l'alpha-amylase pour éviter sa prise en masse après stéri- lisation et refroidissement. Après stérilisation, le milieu est mis sous agitation et refroidi Lorsque la température atteint 24 C, le milieu est ensemencé à raison de 6 % en poids avec une préculture de 18 heures d'âge, qui est de préférence réalisée à partir du milieu de l'exemple 1, puis répartie dans de larges plateaux, sur un demi-centimètre d'épaisseur. Ces plateaux sont glissés dans des gaines plastiques scellées à la base et bouchées à l'aide d'un coton à l'autre extrémité L'incubation est faite à 24 C sous lumière totale ou par intermittence, pendant 7 jours. On sèche la totalité du milieu incubé et on réalise le broyage du produit sec obtenu, de préférence jusqu'à une granulométrie inférieure à 200 microns Le produit obtenu contient 2 1010 spores viables par gramme de poudre. Ainsi, les poudres obtenues dans les différentsexempes précédents contiennent 1 108 à 8 11010 spores par gramme de poudre et dans le cas de l'texemple 3 ou 4, 2 1010 à 8 1010 spores par gramme de poudre Ces spores sont viables et donc en mesure de se reproduire et de-multiplier leur activité-. Cette poudre est verte, après broyage et tamisage de granulométrie inférieure à 200 microns Cette poudre se met facilement en suspension dans l'eau, l'eau utilisée pouvant être de l'eau déminéralisée, de l'eau de pluie, de l'eau de robinet, sans aucun problème de germination des spores. La suspension ainsi préparée peut être conservée 2 à 3 heures sans problème. Les essais de décantation effectués montrent qu'en minutes, le taux de décantation est de O à 0,5 %. La demanderesse a pu constater d'autre part que ce produit obtenu est incapable d'attaquer la cellulose constitutive de la paroi des végétaux ce qui démontre que le Trichoderma harzianum nouvellement isolé par la demanderesse est non cellulolytique. En effet, les organismes cellulolytiques sont pourvus de deux enzymes Cl et CX L'activité Cl a une action cellulolytique sur les plantes et cette activité est démontrée par un essai fait sur la cellulose micro- cristalline Avicel (marque déposée). Le Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC NO 20672 ne produit pas ou très peu cetieenzyme Cl car il n'y a pas eu d'éclaircissement du milieu soumis à essai de cellulose microcristalline Avicel. Un autre essai a été réalisé en utilisant de la cellulose régénérée, c'est-à-dire partiellement cristalline, caractérisant la présence des enzymes Cl et CX Il y a une activité de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N O 20672 sur cette cellulose, ce qui permet de conclure à la présence de l'enzyme CX. D'après ces deux essais, il apparaît donc que la nouvelle souche de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC NO 20672 n'a que l'activité CX et ne produira donc pas de dégâts sur les végétaux sur lesquels elle devra être appliquée pour agir contre les parasites selon les applications qui seront explicitées plus loin. D'autre part, la présente invention concerne 2545099 i 1 ' également un procédé d'extraction des spores produites par Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC NI 20672 pour en isoler les peptides Ce procédé comprend les étapes successives suivantes: a) Introduire les spores de culture de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC NO 20672 de préférence obtenues à partir de l'un quelconque des exemples 1 à 4 précédents dans de l'acétone pour y dissoudre la partie soluble des spores et obtenir après évaporation de l'acétone un extrait brut. (Cette première extraction des spores est plus complète à l'éthanol mais les extraits obtenus sont plus complexes quepar extraction à: l'acétone et donc l'acétone a été de préférence retenue) - b) Soumettre cet extrait brut à au moins une étape d'extraction par l'éther pour en recueillir la fraction insoluble La fraction soluble contient divers lipides, stérols d'aucune activité pour l'application de lutte biologique envisagée. c) Extraire cette fraction insoluble dans l'éther au méthanol pour en recueillir la fraction soluble La fraction insoluble contient du mannitol ne présentant pas d'activité pour l'application de lutte biologique. d) Chromatographier la fraction soluble dans le méthanol pour en recueillir la ou les fractions de tête ou fractions lourdes qui contiennent essentiellement les peptides recherchés qui sont nouveaux et qui sont dénommés par la demanderesse du nom nouveau de Trichorzianines. Ces substances sont actives pour l'application de lutte biologique envisagée comme cela sera démontré plus loin. La dernière étape d'extraction par chromatographie pour séparer les peptides peut être réalisée sur colonne Séphadex LH 20 qui par élution d'un mélange méthanol-eau ( 65/35 v/v) permet d'obtenir en tête de colonne une fraction qui par spectrométrie dans l'infrarouge présente une absorption à 1 650 cm 1 qui est la fréquence de vibration de la liaison peptidique et qui démontre la présence de peptides. 2545099 i Pour suivre durant l'extraction et la purification l'activité des différentes fractions, la demanderesse a utilisé le test suivant: dans 10 millilitres de milieu gélosé à 450 C tel que PDA (pomme de terre-dextrose-agar) ou malt agar, on ajoute l'extrait à tester. Après agitation, ce milieu est versé dans une boîte de Pétri de 5 cm de diamètre Après refroidissement, une pastille prélevée dans une culture de Botrytis cinerea en boite de Pétri est déposée au centre. Des bottes témoins sont faites en parallèle dans lesquelles la même quantité de solvant pur a été introduite pour être certain que la croissance de Botrytis cinerea peut se faire sans inconvénient. (Le méthanol est toxique pour la croissance de Botrytis Cinerea, l'utilisation de l'éthanol est possible en faibles quantités; par contre l'acétone n'a aucun effet sur la croissance). L'évolution des cultures est mesurée journellement. Un exemple d'extraction est donné ci-après. EXEMPLE 5 Exemple d'extraction des Trichorzianines à partir des spores de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC NO 20672 On extrait 1 kg de spores obtenues à partir de l'exemple 3, par 4 litres dl-acétone On obtient une huile jaune dorée après concentration des extraits acétoniques. On reprend cette huile dans l'éther et on obtient une solution renfermant 55 grammes d'un mélange de substances de caractère lipidique, sans activité anti- fongique selon l'essai précité. Ilreste 14 grammes d' insolublesayant une activité contre Botrytis cinerea. Cette fraction insoluble est reprise dans le méthanol -35 et passée sur colonne Sephadex LH 20 avec comme éluant le 2545099 t méthanol conformément à la dernière étape d'extraction par chromatographie précitée. Les premières molécules éluées sont les plus grosses et sont actives et il s'agit naturellement des nouvelles Trichorzianines. Pour séparer les divers produits de cette fraction chromatographiée, on peut faire une chromatographie sur plaque de gel de silice avec comme éluant le mélange n-butanol-acide acétique-eau dans les proportions 6-2-2 (rapport volumique) (BAE 6-2-2). Ce chromatogramme montre quatre produits dans la fraction active après passage sur Sephadex LH 20 dont l'activité selon l'essai de pouvoir antagoniste précité dans les conditions de l'exemple 7 est la suivante: Une fraction très majoritaire dénommée TCZ 11 à activité: +++ Une fraction assez importante dénommée TCZ 10 à activité: + Deux fractions minoritaires dénommées TCZ 12-TCZ 13 à activité: + A partir de I gramme de la fraction active après passage sur Sephadex, on fait une séparation par chromato- graphie sur plaque de silice. Les dépôts ont été réalisés sur des plaques Anachem de 500 microns d'épaisseur et l'éluanta été le mélange précité BAE 6-2-2. On obtient alors une fraction de 500 milligrammes de TCZ 11 (Rf: 0,54) et 130 milligrammes de TCZ 10 (Rf: 0,35). A partir de ces séparations, on retrouve l'activité dans la fraction TCZ 11 Une faible activité de TCZ 10 semble être due à une contamination par TCZ 11. TCZ 10 a une masse moléculaire assez élevée, c'est un produit polaire mais une hydrolyse acide qui conduit à sa dégradationne fait pas apparaître d'acides aminés. 1 3 Une analyse plus poussée a montré que TCZ 10 était une lécithine. La demanderesse a donc été amenée à étudier plus profondément la fraction TCZ 11 majoritaire et la plus active. Il s'agit donc d'une macromolécule éluée en tête de colonne Sephadex LH 20 Comme indiqué précédemment cette macromolécule présente une forte absorption à 1 650 cm 1 qui suggère qu'il s'agit d'un peptide. Une hydrolyse acide (H C 16 N, 24 heures à 1100 C) de cette fraction TCZ 11 la décompose en une série d'amino- acides dont la plupart ont été déterminés par chromato- graphie sur plaque en couche mince Le résultat de cette chromatographie fait l'objet de la figure No 1 annexée. L'éluant est constitué par le mélange butanol/acide acétique/ eau ( 60/20/20 volume/volume) On peut constater à partir des résultats de cette chromatographie que l'hydrolyse acide montre la présence de valine, leucine, acide glutamique, Proline, Alanine, acide alphaaminoisobutyrique (AIB), Phénylalaninol (PHEOL). Afin de déterminer s'il s'agissait d'un peptide unique ou d'un mélange, la fraction TCZ 11 a été analysée par chromatographie dans des conditions différentes. Une chromatographie sur plaque de gel de silice, greffée (plaque Whatman 200 KC 18, éluant méthanol/eau 95-5 en rapport volumique) fait apparaître deux taches d'inten- sité différente Mbdemême aspect avec les réactifs de révélation: TCZ 11 A avec une valeur Rf égale à 0,60 comme constituant majoritaire TCZ 11 B avec comme Rf: 0,73 Les révélations des plaques peuvent être faites de plusieurs façons soit par observation de la plaque en lumière ultraviolette: légère absorption qui donne une tache plus sombre, 2545099. soit par pulvérisation de ninhydrine dans l'éthanol puis pulvérisation ensuite d'acide sulfurique concentré. Les TCZ 11 donnent à froid une coloration jaune, stable à la lumière. Après avoir mis en évidence sur plaque le mélange de la fraction lourde après Sephadex, celui-ci a été chromatographié sur colonne de gel de silice avec comme éluant le système méthanol-chloroforme-eau en rapport volumique 65-24-4. Trois fractions ont été éluées successivement: TCZ 13 TCZ 11 A TCZ 11 B + TCZ 10. On retrouve ainsi les principaux composants. La fraction TCZ 11 B se trouve en mélange avec TCZ 10 Ces deux fractions peuvent être séparées par chromatographie sur gel de silice avec comme éluant le méthanol Il s'avère alors que la fraction TCZ 11 B n'est pas en quantité importante Ces produits isolés sur chromatographie en couche mince de gel de silice avec comme éluant le système BAE précité avec comme rapport volumique 6-2-2 se différencient d'un peptide isolé par la firme américaine UPJOHN: l'alaméthicine qui ne forme aucune coloration avec le réactif de révélation choisi et déjà cité (ninhydrine puis acide sulfurique concentré). Cette différence a été vérifiée dans d'autres systèmes de chromatographie. Etant donné que la fraction TCZ 11 A est la fraction majoritaire et la fraction de loin la plus active, celle-ci a été étudiée d'une façon plus approfondie. On a pu obtenir la fraction TCZ 11 A à l'état cristallin en utilisant comme solvant de cristallisation un mélange acétonitrile et eau en rapport volumique 80/20 Le point de fusion est de 251-252 o C. La purification des peptides s'est révélée impossible dans les conditions classiques de chromato- graphie et il a donc été nécessaire d'avoir recours à la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et cette chromatographie est donc préférée. Après de multiples essais, les conditions convena- bles ont pu être définies en choisissant pour phase stationnaire une silice très fine greffée par des hydro- carbures en C 18 (micro Bondapak C 18, dénomination commer- ciale) et en utilisant comme éluant, soit un mélange méthanol-eau 78-22 en volume/volume (ME) soit un mélange éthanol-eau en r apport volumique 65-35 (EE). L'appareil utilisé est un chromatographe Waters. Les peptides élués ont été détectés à 225 nm à l'aide d'un détecteur UV variable Waters M 450. Les conditions de chromatographie ont été définies pour une colonne analytique micro Bondapak C 18 ( 0,39 x 30 cm) de granulométrie 9 microns, concentration des échantillons environ 50 mg/ml de méthanol. Le chromatogramme obtenu avec par exemple la fraction TCZ 11 A fait l'objet de la figure 2 et met en évidence les différents peptides composant-la fraction TCZ 11 A Chaque fraction est numérotée de I à VII selon l'ordre de sortie de la colonne Le débit dans la colonne de chromatographie liquide haute performance était de 2 millilitres par minute. On peut constater à partir de ce chromatogramme de la figure 2 que les peptides des fractions III et IV sont les peptides majoritaires. Pour obtenir des fractions de ces différents peptides, une préséparation par chromatographie à pression normale sur une grande colonne de gel de silice (système éluant CH C 12-CH 3 OH-H 20 à un rapport volumique 64-254) a été effectuée, ce-qui a permis d'enrichir des fractions en certains des constituants. En opérant sur ces fractions enrichies des chromatographies HPLC (EE comme éluant) des petites quantités de TCZ 11 A III, TCZ 11 A IV, TCZ 11 A VI, TCZ 11 A VII (peptides majoritaires) ont été isolées et une analyse structurale a pu être entreprise. Le spectre de masse RMN 1 H à 80 MHZ de la fraction VI du chromatogramme de la figure 2 dans CD 3 QD fait l'objet de la figure 3 et montre l'absence de tryptophane. Le spectre RMN réalisé dans les mêmes conditions de la fraction IV fait l'objet de la figure 4 et celui de la fraction VII fait l'objet de la figure 5, ce dernier étant réalisé en RMN 13 C à 20,1 MHZ CD 3 OD 12 C. Enfin, la figure 6 concerne le spectre de RMN à 20,1 MHZ en 13 C et dans CD 3 OD 12 C de la fraction III majo- ritaire; la région des C = O qui fait apparaître les 22 carbonyles de la molécule est mise en évidence sur la figure 7. Làfg 8 o$amnelespectre de RMN 1 H de la fraction III majoritaire ou fraction TCZ 11 A III de la région des NH qui fait appa- raître les fonctions NH de la molécule (conditions d'expé- rience 400 M Hz, dans CD 3 OH). Ainsi, les spectres de RMN du proton ou du carbone 13 de ces quatre peptides montrent qu'ils se répartissent en deux groupes. TCZ 11 A III et TCZ 11 A IV renferment du tryptophane et les fractions TCZ 11 A VI et TCZ 11 A VII renferment de la phénylalanine. Après une mise au point complémentaire de chromato- graphie HPLC, la fraction TCZ 11 A III a été décomposée en deux peptides très minoritaires et un peptide majoritaire TCZ 11 A III C. Ce peptide majoritaire, constituant l'une des nouvelles 7 richorzianines de la présente invention, dénommée TCZ A III C, a été défini par spectrométrie RMN à haut champ. La Trichorzianine TCZ 11 A III C est un solide incolore cristallisé fondant à 253-254 C optiquement actif (")22 = -23 D Sa composition en acides aminés a été déterminée par chromatographie et analyse des produits deson hydrolyse. Le spectre d'absorption ultraviolette de ce peptide donne ( Et OH = 284 nm, = 5 400) et est max très proche de celui du tryptophane ( Et Oa H = 284 nm, max o 10 = 5 500). L'absence de réaction avec la ninhydrine a obligé la demanderesse à vérifier la nature et le nombre des aminoacides inclus dans la Trichorzianine TCZ 11 A III C par une autre méthode: la résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 1 H) à haut champ ( 400 MHZ), et celle du carbone 13 (RMN 13 C) à 100,6 MHZ, qui font l'objet respecti- vement des figures 9 et 10. L'analyse de ces spectres de RMN de 1 H et du 13 C de la Trichorzianinecristallisée et purifiée dénommée TCZ 11 A III C permet de la définir comme composée de: un groupe acétyle terminal CH 3-CO; dix aminoacides possédant un CH": 2 Ala-lval-l Leu-l Ile-l Ser-l Pro-3 Gln; huit aminoacides dont le C est quaternaire: 8 AIB (méthylalanine); un alcool aminé terminal: le tryptophanol. La composition ainsi définie implique comme formule brute: C 91 H 149 N 23024; soit une masse moléculaire de 1 948. La vérification en spectrométrie de masse en utili- sant la technique de bombardement par des atomes rapides dénommée en anglais "Fast atoms bombardment" en mode négatif a permis de confirmer les résultats précédents (pics (M-H)-) très bien résolus à 1947 uma. Enfin, les fractions III, IV, VI et VII ont subi une hydrolyse acide en vue de déterminer la nature des acides aminés constituant les Trichorzianines et le résultat de la chromatographie est répertorié au tableau I ci-après. TABLEAU I COMPOSITION EN ACIDES AMINES DES PEPTIDES TRICHODERMA HARZI ANUM I 223, ATCC No (TRICHORZIANINES) DE Or OO H Id 1 O *-4 "I Da Ir-, 1 oo > 4 O àOr-O 5 GC c > HG> F 'O Hr Ir O> 01 ALAMETHICINE l 2 8 2 O I O 2 I 2 O O OO O Phényl- alaninol SUKUKACILLINE I 2 10 3 O 2 2 O I 2 O O O O Phényl- alaninol TRICHOTOXINE I 2 9 O I I O I O O 2 O O O O Valinol HYPELCINE A I I 10 I O I O 2 O 3 O O O O Leucinol Phényl- EMERICINE III I I 5 I I I O O 2 O I I O O alaninol ANTIAMOBEINE 1 O 6 O 2 I O I 2 I I I O O O Phényl- alaninol ZERV AMICINE IAO O 4 I I I 1 I 2 I I O I O I Phényl- ZERVAMICINE IIBO o 4 O I I 2 I 2 O 2 O I O I alaninol Peptides isolés de Trichoderma I 223 ou ATCC ou Trichorzianines III O 3 7,2 2 1,2 0,81 O 3,6 O I I O Tryptophanl IV O 3 7 2,8 1,2 0,81 O 3,6 O I I O Tryptophani VI O 3 6,6 3 1,2 0,81 O 3,6 O O -i O Phényl- VII O 3 6,6 3 1,2 0,81 O 3,6 O, O I O Phényl- alaninol Le mtl majoritaire est ____ ___ ___ ___ leet e i _ _ _ co En outre, des analyses des extraits pepti- diques bruts ou Trichorzianines obtenus à partir de différents clones, c'est-à-dire obtenus à partir d'une souche unique de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N O 20672 ont montré une identité pour toutes les souches ce qui démontre que la multiplicité des peptides est une caractéristique génétique La teneur en peptides est variable selon les conditions de culture et celle-ci peut atteindre 2 % en poids de peptides ou Trichorzianines par poids de produit final, sur milieu riche. On donne ci-après un exemple d'essai de pouvoir antagoniste. *EXEMPLE 6 Essai de-pouvoir atagoniste de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N O 20672 Cet essai de pouvoir antagoniste est effectué in vitro en boite de Pétri. Une goutte de suspension contenant 106 spores vivantes de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC NO 20672 est placée au bord d'une botte de Pétri sur le milieu gélosé de croissance du Botrytis cinerea, en l'occurrence ce milieu est essentiellement constitué de concentré de tomate. A l'opposé, on place une pastille de 4 millimètres prélevée dans une boite de Pétri o l'on a réalisé la croissance du Botrytis cinerea. Après trois jours d'incubation, la croissance du champignon parasite est freinée par rapport à la croissance témoin de ce même champignon et après cinq jours, la croissance de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC NO 20672 a rejoint le Botrytis cinerea et commence à le recouvrir progressivement. On constate donc ici le fort pouvoir antagoniste par contact de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 vis-à-vis du champignon parasite Le même essai a été réalisé à l'égard d'autres champignons parasites tels que Stereum-purpureum, Sclerotinia, Stereum hirsutum et Ceratocystis ulmi Tous ces essais se sont révélés positifs avec la nouvelle souche de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 Ce même essai de pouvoir antagoniste par contact a été réalisé également sur tous ces champignons parasites pour les peptides extraits de Trichoderma Ceci fait l'objet de l'exemple 8 EXEMPLE 7 Pouvoir antagoniste à distance de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 Pour réaliser cet essai de pouvoir antagoniste à distance de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 on inhibe tout d'abord la croissance du mycélium de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 par une barrière de fongicide chimique connu pour inhiber la croissance de Trichoderma harzianum sans inhiber celle du parasite, comme par exemple le Bénomyl et on place à l'opposé une pastille de 4 millimètres prélevée dans une bo Ite de Pétri o l'on a réalisé la croissance du parasite. On observe si la croissance du mycélium du champignon parasite est freinée. L'évaluation de ce ralentissement de croissance permet d'apprécier la production et la diffusion des polypeptides antifongiques ou Trichorzianines sécrétés par la souche de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 La demanderesse a effectué un essai de pouvoir antagoniste à distance pour chacun des champignons parasites mentionnés précédemment et a pu observer que la nouvelle souche de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 avait un fort pouvoir antagoniste à distance relativement à chacun de ces parasites. EXEMPLE 8 Pouvoir antagoniste des Trichorzianines ou peptides extrait de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 L'extrait de Trichorzianine est mélangé à un milieu gél 9 sé dans une botte de Pétri Lorsque le milieu est refroidi, un inoculum dense des différents parasites à tester est placé au centre de la botte. On laisse incuber à la température optimale pour les parasites, on constate un ralentissement de la croissance du parasite ou même une inhibition complète et ceci démontre le pouvoir antagoniste des Trichorzianines vis-à-vis des champignons parasites tels que Botrytis cinerea,Stereumxpurpureu Sclerotinia, Stereum hirsutum ou Ceratocystis ulmi. Exemple 9 Préparation de produit phytosanitaire On obtient une préparation de produit phyto- sanitaire en mettant en suspension dans l'eau, par exemple l'eau du robinet, la poudre obtenue selon l'un quelconque des exemples I à 4, et de préférence obtenue à partir de l'exemple 3 ou de l'exemple 4, en vue de préférence à obtenir une concentration de 108 spores viables/ml de la solution. Cette solution en suspension est préparée de préférence juste avant l'application par pulvérisation sur le milieu à protéger, qui peut être des plants de vigne (lutte contre Botrytis cinerea, cause de la pourri- ture grise de la vigne) ou des arbres fruitiers (lutte contre Stereum purpureum responsable de la maladie du plomb des arbres fruitiers) ou de l'orme (lutte contre Ceratosystis ulmi responsable de la graphiose de l'orme). Cette pulvérisation peut être répétée autant que nécessaire de manière habituelle jusqu'à guérison complète. EXEMPLE 10 Traitement de la souche de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 pour la rendre résistante aux antifongiques chimiques Il est préféré selon l'invention de modifier la souche de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 pour la rendre résistante aux agents chimiques en vue d'une utilisation du produit en traitement de lutte intégrée, c'est-à-dire un traitement avec antifongiques chimiques plus traitement avec souche de Trichoderma. Pour ce faire, il est nécessaire de rendre la souche résistante aux antifongiques chimiques (lorsqu'elle ne l'est pas, ce qui est généralement le cas) en particu- lier: bénomyl, procymidone, iprodione, peltar, etc. Pour cela, on procède à une adaptation de la souche de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 à des quantités croissantes d'antifongiques chimiques et on procède comme suit: Sur un milieu gélosé à base de flocons d'avoine, on ajoute une quantité d'antifongiques chimiques, légère- ment inférieure à la quantité minimale inhibitrice déterminée comme indiqué plus loin. On étale une suspension de spores de Trichoderma harzianum I 223 et l'on incube à 24 C sous lumière. Après une incubation plus longue que la normale (supérieure ou égale à 5 jours), quelques colonies apparaissent. Ces colonies sont repiquées sur le milieu gélosé aux flocons d'avoine contenant une dose supérieure ou égale à la dose précédemment employée de l'antifongique et ainsi de suite jusqu'à obtention d'une résistance aux quantités habituelles utilisées dans les champs. Des quantités minimales inhibitrices sont préalablement déterminées pour chaque antifongique chimique en observant la croissance de la souche sur le milieu aux flocons d'avoine auquel on a aouté des quantités croissantes d'antifongique chimique Lorsque la souche cesse de croître, la quantité minimale inhibitrice d'antifongique chimique est atteinte. Pour le bénomyl, cette quantité minimale inhibitrice est de 0,1 i/ml de gélose. Ainsi, selon la présente invention, lorsque la souche de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 020672 est utilisée comme moyen de lutte biologique, alors, de préférence cette souche est rendue résistante aux agents chimiques conformément à l'essai précédent. REVENDICATIONS 1. Nouvelle souche de Trichoderma harzianum, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche Trichoderma harzianum déposée à l'Institut Pasteur sous le N I 223 ou à l'ATCC sous le N 20672 2. Nouvelle souche de Trichoderma harzianum selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente l'aspect cultural suivant: un mycélium ras, translucide à peine discernable à l'oeil nu, à la surface duquel apparaissent au bout de trois jours environ de culture, des formations sporogènes d'abord blanches qui se colorent par la suite en vert sombre; structure sporifère: les conidiophores portent des branches ramifiées de façon orthogonale, les cellules sporogènes (phialides) portées par ces dernières peuvent être groupées par deux ou trois, elles sont de taille variable ( 8 à 12 microns) étroites ( 2,5 microns) peu ventrues et souvent recourbées, les spores qu'elles portent sont globuleuses à sub- globuleuses, colorées en vert et mesurent en moyenne 3 microns de diamètre, elles apparaissent presque lisses au grandissement 1000. La paroi des spores est complètement lisse au microscope; la température de croissance est de 17 à 32 C avec un optimum de 20 à 24 C; elles poussent sur milieu classique: * malt-agar * pomme de terre-glucose-agar, * flocons d'avoine et à un p H compris entre 4 et 7 et avec un optimum vers 5 La sporulation est plus importante sur un milieu riche; sa croissance est aérobie. 3. Procédé d'isolement de la nouvelle souche de Trichoderma arzianum I 223 ou ATCC N O 20672, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes A on prélève des champignons de Trichoderma harzianum dans un endroit approprié tel que sol humide comme un sol maraîcher ou un sol cultivé; B on fait croître les champignons de Trichoderma harzianum prélevés sur un milieu de culture gélosé en botte de Pétri à 240 C à la lumière pendant 3 à 7 jours; C on prélève le maximum de spores de Trichoderma harzianum de couleur verte; D on met en suspension dans l'eau ce prélèvement de Trichoderma harzianum pour dissocier les spores; D on détermine la ou les meilleures souches parmi les souches dissociées par un programme de sélection par clonage de préférence réalisé comme suit: a) on effectue une culture séparée de chaque spore dissociée sur un milieu gélosé riche tel que milieu aux flocons d'avoine en botte de Pétri; b) au bout de 48 heures, on remet en suspension la totalité des spores de chaque botte prise séparèment et on ajuste le titre à 106 spores/millilitre. c) on prélève une ou plusieurs gouttes de suspension de souche obtenue après l'étape b) que l'on inocule dans l'un des milieux suivants: i un milieu gélosé pauvre, par exemple extrait de malt à 20 grammes par litre en boite de Pétri que l'on cultive à 240 C; ii un milieu riche, par exemple aux flocons d'avoine à 30 grammes par litre, que l'on cultive à une température assez basse, par exemple de 15 à 17 'C; iii un milieu de croissance du parasite Botrytis Cinerea, par exemple essentiellement à base de concentré de jus de tomate, préalablement ensemencé du parasite, dans une boîte de Pétri, en vue de déterminer le pouvoir antagoniste visà-vis de ce parasite par contact età distaace avec culture à 240 C iiii un essai sur milieu gélosé riche par exemple aux flocons d'avoine, pour déterminer les souches ayant la production la plus importante de spores par unité de surface du milieu gélosé; d) on observe la croissance des souches à partir de 48 heures, toutes les 24 heures et on évalue selon des critères connus en soi la qualité de cette croissance; e) on retient la ou les souches ayant obtenu la meilleure performance sur l'ensemble des essais et produisant la plus grande quantité de peptides, cette souche constitue la aauibedéposée auprès de l'Institut Pasteur sous le NO I 223 et auprès de 1 'ATCC sous le NO 20672. 4. Procédé de culture de la souche Trichoderma arzianum selon la revendication 1 ou 2, ou obtenue selon le procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la souche de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N O 20672, sur un milieu liquide, composé de constituants nutritifs habituels en fermentation, stérile- ment, en couches fines sur un plateau et à la lumière pendant un temps de fermentation tel que les spores atteignent leur maturité; à la fin de la fermentation on sèche le produit total que l'on broie finement et que l'on tamise de manière à obtenir une poudre sèche et fine ayant de préférence un diamètre inférieur à 200 microns, contenant les spores vivantes, et pouvant se mettre en suspension dans l'eau et être pulvérisée. 5. Nouveaux peptides, caractérisés en ce qu'il s'agit de Trichorzianines isolées à partir des souches obtenues par clonage de champignons du type Trichoderma harzianum de préférence selon le procédé faisant l'objet de la revendication 3. 6. Nouveaux peptides selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'il s'agit des Trichorzianines isolées à partir des spores obtenues avec le champignon Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672 7. Nouveaux peptides selon la revendication 5 ou 6, caractérisés en ce qu'il s'agit de la fraction peptidique obtenue par extraction selon le procédé de la revendication ou 16 du milieu de culture obtenu conformément au procédé de la revendication 4 et de préférence, constituée par la fraction III ou IV du chromatogramme de la figure 2. 8. Nouveaux peptides selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisés en ce qu'il s'agit de la fraction majoritaire des Trichorzianines ayant un poids moléculaire égal à 1948 et donnant par hydrolyse acide dix- neuf acides aminés se décomposant comme suit: huit Méthylalanines; deux Alanines; une Isoleucine; une Leucine; une Valine; une Proline; une Sérine; trois Glutamines; un Tryptophanol et les fractions minoritaires ayant au lieu du Tryptophanol un Phénylalaninol en position terminale. 9. Nouvelle souche de champignon Trichoderma harzianum Institut Pasteur N I 223 o U ATCC N 20672 comme moyen de lutte biologique; par exemple comme produit phytosanitaire. 10. Produit obtenu, selon la revendication 4 comme moyen de lutte biologique, par exemple comme produit phytosa- nitaire. 11. Nouveaux peptides ou Trichorzianines selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, de préférence obtenus à partir des spores de Trichoderma harzianum Institut Pasteur N I 223 ou ATCC N 20672, caractérisés en ce qu'ils sont utilisés comme moyen de lutte biologique, en particulier sous forme de produit phytosanitaire. 12 Application de la nouvelle souche de Trichoderma harzianum Institut Pasteur N I 223 ou ATCC N 20672 selon la revendication 1 ou 2, ou des Trichorzianines selon 1 ' une des revendications 5 à 8 ou 25450-99 du produit obtenu par le procédé de culture selon la revendication 4, sous forme de produit phytosanitaire pour lutter contre le champignon parasite Botrytis c'nerea. 35. Application de la-souche de Trichoderma harziasr 3 um Institut Pasteur N I 223 ou ATCC N 20672 selon la revendication 1 ou 2, ou -des Trichorzianines selon l'une des revendications 5 à 8, ou du produit obtenu par le procédé de culture selon la revendication 4 sous forme de produit phytosanitaire pour lutter contre les champignon parasite Ceratocystis ulmi. 14. Application de la souche Trichoderma harzianum Institut Pasteur N I 223 ou ATCC N 20672 selon la revendication 1 ou 2, ou des Trichorzianines selon l'une des revendications 5 à 8, ou du produit obtenu par le procédé de culture selon la revendication-4, pour lutter contre le champignon parasite Sclérotinia. 15. Application de la souche Trichoderma harzianum Institut Pasteur N I 223 ou ATCC N 20672 selon la revendication 1 ou 2, ou des Trichorzianines selon l'une des revendications 5 à 8, ou du produit obtenu par le procédé de culture selon la revendication 4, sous forme de produit phytosanitaire pour lutter; contre le champignon arasite Stereu purpurtum ou Stereum hirautum. 16. Procédé d'isolement des Trichorzianines par extraction des spores de Trichoderma harzianum I 223 ou ATCC N 20672, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes: a) introduire les spores de culture de Trichoderma harzianum Institut Pasteur N 223 ou ATCC NI 20672 dans de l'acétone pour y dissoudre la partie soluble des spores et obtenir après évaporation de l'acétone un extrait brut; b) soumettre cet extrait brut àuneétape d'extrac- tion par l'éther pour en-recueillir la fraction insoluble; c) extraire cette fraction insoluble dans l'éther 2 '9 au méthanol pour en recueillir la fraction soluble; d) chromatographier la fraction soluble dans le méthanol pour en recueillir-la fraction de tête ou fraction lourde qui contient essentiellement les Trichorzianines; 17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'on réalise l'étape d'extraction par chromato- graphie précitée, par chromatographie liquide haute performance en utilisant comme phase stationnaire de chromatographie une silice très fine et greffée par des hydrocarbures en C 18 et en utilisant comme éluant un mélange éthanol-eau ( 65/35 v/V). 18. Application de la souche de Trichoderma h arzianum Institut Pasteur NI I 223 ou ATCC NI 20672 selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisée en ce que ladite souche a été rendue résistante aux agents chimiques.