Brevet FR2544307A1 — publié le 19841019

Nouveaux dérivés peptides inhibiteurs de la rénine. Il est connu que la Rénine, une protéase qui coupe la prohormone désignée sous le nom d'angio tensiogène en libérant l'angiotensine I, joue un rôle très important dans la régulation de la pression sati- guine. Toutefois la structure de la rénine restait inconnue et ce n'est que tres récemment que les travaux de J.J. PANTHIER et ai. (Nature 298, pages 90-2, 1982) ont révélé la séquence complète du gène de la rénine sous maxillaire de souris. Ces travaux montrent l'existence d'un profragment, ce qui suppose que la rénine est synthétisée sous forme dfun précurseur inactif. Schématiquement, ce précurseur peut être représenté par I J f "Pre" "Pro chaîne A chatne B Rénine Dans tout ce qui va suivre, nous utili- serons pour désigner leso amino-acides les abréviations à 3 lettres recommandées par la Commission de Nomenclature de 1'IUPAC-IUB, section Biochimie. Ces acides aminés sont de configuration L. I1 a été trouvé, selon la présente invention, que des composés polypeptidiques appartenant à la séquence 29-37 de la prorénine H - Glu - Arg - Ile - Pro - Leu - Lys - Lys - Met Pro - OH présentent dtinteressantes propriétés inhibitrices de la Rénine susceptibles d'être utilisées en thérapeutique humaine. En particulier les composés qui répondent à la formule générale suivante R1 - A - Leu - Lys - Lys - Met - Pro - R2 (I) dans laquelle R1 représente l'hydrogène ou un groupe protecteur de la fonction amine tel que acétyle, tertiobutyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle..., A A désigne, soit une délétion (absence d'amino acide ou simple liaison, soit la Proline, le dipeptide Ile - Pro, le tripeptide Arg - Ile - Pro, ou le tétrapeptide Glu- Arg - Ile - Pro; R2 représente OR3 dans lequel R3 désigne l'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur, se sont révélés intéressants. Les composés selon l'invention peuvent être préparés par les techniques habituelles de synthèse peptidique, soit en phase solide selon Nerrifield, soit en phase liquide. Dans ce dernier cas, les réaetionsde couplage sont effectuées dans l'acétonitrile en présence d'hexafluorophosphate de benzotriazolyl-oxy-tris-diméthylamino-phosphonium (BOP) comme agent de couplage. Tous les aminoacides sont incorpores sous la forme du dérivé protégé t-butyloxycarbonyle (Boc) sur l'amine en alpha. Le groupe aminé de la channe latérale de la lysine est protégé par un groupe benzyloxycarbonyle (Z). Le groupe guanidino de l'arginine est protégé par un groupe nitro. Enfin, le groupe carboxyle terminal en alpha est protégé sous forme d'ester méthy lique, tandis que le groupe carboxylique en beta de l'acide glutamique est protégé sous forme d'ester benzylique. Après chaque réaction de couplage, la déprotection de l'amine en o On prépare ainsi le pentapeptide protégé représenté par Boc - Leu - Lys (NL g Z). - Lys (NLZ) - Met - Pro.OCH3 (II) Les peptides plus longs sont obtenus en couplant sur le peptide II et selon la même méthode un peptide convenablement protégé R1 -A' - OH dans lequel A' correspond à Arec, pour seule différence, la protection des fonctions des chaines latérales ainsi que mentionné précédemment. Les peptides R1 - A - OH sont pour leur part synthétisés de façon analogue au peptide II. Finalement les peptides protégés ainsi obtenus sont entièrement déprotégés, à l'exception de l'ester C-terminal et du BOC sur l'amine terminale, par hydrogénolyse par transfert catalytique utilisant le formiate d' ammonium comme donneur d'hydrogène. Enfin, les peptides où R2 désigne I'hydrogéne sont obtenus par saponification des peptides où R2 désigne un groupe OAlkyl par saponification alcaline en milieu très dilué à basse température. Les exemples suivants non limitatifs permettront de mieux comprendre l'invention. Dans les exemples qui vont suivre on utilisera les abréviations suivantes Acides aminés et groupes protecteurs Leu :Leucine Lys : Lysine Met : Methionine Pro : Proline Ile - Isoleucine Arg : arginine Glu : Acide glutamique Tous ces acides aminés sont de configuration L Boc : Tertiobutyloxycarbonyle Z : Benzyloxycarbonyle NO2 : Nitrate Bzl : Benzyle De plus on utilisera l'abréviation BOP pour désigner l'hexafluorophosphate de benzotriazolyl-oxy-tris-dimé- thylaminosphosphonium. Chromatographie en couche mince Sauf indication contraire, elles sont effectuées dans 2 systèmes solvants - Acétate d'éthyle - CMA ou chloroforme 95 - méthanol 5 acide acétique 3. H P L C : (Chromatographie en phase liquide, sous haute pression) Les échantillons sont injectés sur une colonne ??phase reverse" 1'C18 microbundapackt" (3,9 mm x 30 cm) et élués par un gradient de solvant dont les 2 composants sont - A = tampon phosphate d triéthylamine (0,25 N, pH = 3,0) 80% -acétonitrile 20% - B = tampon phosphate / triéthylamine (0,25 M, pH = 3,0). 40% - acétonitrile 60%. On passe en 10 minutes de 100% de A à 100% de B. EXEMPLE 1 Boc- - Leu - Lys - Lys - Met - Pro - OCH3. peptide de formule (I) où R1 = BOC ; A = liaison ; R2 = - OCH3 a) - Boc Met - Pro - OCH3. A la solution de 2,49 g de Boc-Met et 1,555 g de chlorhydrate de Pro-OCH3 dans 50 ml d'acétonitrile, on ajoute 4,42 g de BOP et 3,2 g de triéthylamine et laisse 18 heures à température ambiante sous agitation. On hydrolyse par addition d'une solution saturée de chlorure de sodium et extrait avec de l'acétate d'éthyle. On lave la solution 3 fois avec une solution d'acide chlorhydrique 2 N, 1 fois avec une solution saturée de chlorure de sodium, 3 fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium et 2 fois avec une solution saturée de chlorure de sodium. On sèche la solution sur sulfate de magnésium et évapore le solvant. L'huile résiduaire est chromatographiée sur gel de silice. En éluant avec de l'acétate d'éthyle, on obtient le produit attendu sous forme d'une huile. Rendement : 30%. Chromatographie en couche mince : Rf = 0,75 (acétate d' éthyle); Rf : 0,96 (CMA). b) - Boc Lys (N tZ) - Met - Pro - OCH3. - On traite 1,05 g du dipeptide obtenu ci-dessus par 10 ml du mélange acide trifluoracétique - chlorure de méthylène (1-1 vol/vol) pendant 30 minutes. On évapore à siccité. - On dissout le résidu dans 10 ml d'acétonitrile et neutralise par la triéthylamine. On ajoute 1,125 g de Boc - Lys (N Z), 1,326 g de BOP et 0,606 g de triéthylamine. On laisse une nuit sous agitation à température ambiante , puis on hydrolyse par addition dtune solution saturée de chlorure de sodium. On extrait avec de l'acétate d'éthyle et lave la solution comme indiqué au paragraphe a). On sèche la solution et évapore à siccité. On obtient un résidu gommeux. On chromatographie sur gel de silice. En éluant avec de l'acétate d'éthyle, on obtient 1,19 g du produit attendu. Rendement : 65%. Chromatographie en couche mince : Rf = 0,47 (acétate d'e'thyle) Rf = 0,96 (CMA). c) - Boc - Lys (NZ) - Lys (Nf Z) - Met Pro - OCH - On traite 1,21 g du trîpeptide obtenu en b) par 10 ml du mélange acide trifluoracétiquechlorure de méthylène (1-1 vol/vol) pendant 30 minutes. Par addition d'éther, on précipite le trifluoracétate quton essore. - On dissout le trifluoracétate dans 10 ml d'acétonitrile et neutralise par addition de triéthylamine puis on ajoute 0,75 g de Boc Lys (nez), 0,884 g de BOP, 0,404 g de triéthylamine. On laisse une nuit sous agitation à température ambiante, puis on hydrolyse par addition dune solution saturée de chlorure de sodium. On extrait avec de l'acétate d'éthyle etlave la solution comme indiqué au paragraphe a). Par évaporation du solvant, on obtient une gomme (1,67 g) qu'on purifie par chromatographie sur gel de silice. En éluant avec de l'acétate d'éthyle on obtient le produit attendu (1,16 g); Rendement : 69%. Chromatographie en couche inince Rf = 0,53 (acétate d' éthyle); Rf = 0,93 (CMA). d) - Boc - Leu - Lys (NIZ) - Lys (N# Z) Met - Pro - OCH3. ~~~~~~~~~~~~~~~~~ - On traite 1,16 g du tétrapeptide obtenu en c) par 8 ml du mélange acide trifluoracétique chlorure de méthylène (1-1 vol/vol) pendant 30 minutes et évapore à siccité. - On reprend le résidu dans 15 ml d'acétonitrile et ajoute -0,334 g de Boc-Leu monohydrate, 0,562 g de BOP et 0,27 g de triéthylamine. Après une nuit à température ambiante, on évapore le solvant et reprend le résidu dans une solution saturée de chlorure de sodium. il se sépare un précipité jaunâtre qu'on essore et lave avec une solution d'acide chlorhydrique 2 N, puis avec une solution saturée de chlorure de sodium et enfin avec une solution saturée de bicarbonate de sodium. On redissout le solide dans le minimum de méthanol et précipite par addition d'éther. On obtient une poudre blanche (l,12g). Rendement : 85% ; F : 144-146 C [&alpha;]D25 = - 450 (c = 1, méthanol) ; Rf = 0,30 (acétate d'éthyle) Rf = 0,95 (CMA) ; Hplc : 1 pic à 20,6 min Analyse acides amine : Met : 1,02 - Leu : î,08 Lys - 1,92. e) - Boc - Leu - lys - Lys - Met - Pro - OCH3. A la solution de 0,03 g du peptide obtenu ci-dessus dans 2 ml de méthanol, on ajoute 0,06 g de formiate d'ammonium et 20 mg de palladium sur charbon à 10%. On agite pendant quelques minutes puis laisse 72 heures au repos à température ambiante. On filtre sur celite et rince avec du méthanol. On évapore le solvant à siccité sous vide et reprend le résidu dans un peu de méthanol et chromatographie sur une colonne de Sephadex LH 20. En éluant avec du méthanol, on obtient le produit attendu (0,021 g). 6 g7D= ~5 (c = 0,028, méthanol) ; Hplc : 1 pic à 6,3 m. Rf = 0,33 (butanol30 - pyridine 20 - acide acétique 6 Eau 24, vol/vol) Analyse d'acides aminés : Met : 0,96 - Leu : 1,38 - Lys 2,33. EXEMPLE 2: Boc Arg - Ile - Pro - Leu - Lys - Lys - Met - Pro -OCH3, peptide de formule (I) où-R1 = Boc 9 A = Arg - Ile - Pro; R2 = OCH3 A - Synthèse du fragment Boc Arg (N02)-Ile-Pro- OH. a) - Boc - Ile - Pro - OCH3. On met-en suspension 1,65 g de Boc Ile hemi- hydrate et 1,40 g chlorhydrate de proline méthyl ester dans 20 ml d'acétonitrile. On ajoute 4,42 g de BOP et 3,03 g de triéthylamine et agite le mélange pendant 18 heures. On hydrolyse par addition de solution saturée de chlorure de sodium puis on extrait avec de l'acétate d'éthyle. On lave la solution comme indiqué à l'exemple 1 a), sèche sur sulfate de magnésium et évapore le solvant. I1 reste une huile orangée qui est reprise dans l'acétate d'éthyle et chromatographiée sur gel de silice. En éluant avec de acétate d'éthyle, on obtient 2,30 g d'huile (rendement 70%)0 b) - Boc - Arg (NO2) - Ile - Pro - OCH3. - On traite 2,30 g du dipeptide obtenu cidessus par 10 ml du mélange acide trifluoracétique- chlorure de méthylène (1-1 vol/vol) et on évapore à siccité. - On reprend le résidu dans 10 ml d'acétonitrile, neutralise par la triéthylamine et toute 2,856 g de Boc-Arg (nO2), 3,094 g de BOP et 1,40 g de triéthylamine. Il se forme un précipité qu'on redissout par addition de 10 ml d'acétonitrile. Après une nuit, on hydrolyse par addition de solution saturée de chlorure de sodium. I1 se forme un précipité incolore qu'on essore et lave 2 fois avec une solution d'acide chlorhydrique 2 N, 1 fois avec de l'eau, 2 fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, 2 fois avec de l'eau et finalement 1 fois avec de l'éther. On obtient une poudre in colore (3,587 g). F : 72-760C ; Rendement : 81%. 2 25= -400 (c = 1, méthanol). Rf = 0,38 (acétate d'éthyle) ; Rf = 0,87 (C}S) HPLC : 1 pic à 11,0 min Analyse d'acides aminés : Ile = 1,00 ; Arg : 0,96. c) - Boc - Arg (NO2) - Ile - Pro - OH. On met en suspension 1,6g du tripeptide obtenu en b) dans 5 ml dtacétone et refroidit dans un bain de glace. On ajoute alors goutte a goutte 3 ml de solution de soude 1 N et le solide se dissout progressivement. Après 1 heure, on neutralise par addition d'une solution d'acide chlorhydrique 2 N et extrait avec de l'acétate d'éthyle. On sèche la solution sur sulfate de magnésium et évapore le solvant à siccité. Le résidu trituré avec un peu dtacétonitrile fournit un solide incolore (0,505 g). F : 177-179 C ; Rendement 47 %. Rf = 0,50 (butanol 4 - Acide acétique 1 - Eau 1) B - Condensation - On traite 0,977 g du pentapeptide protégé obtenu à l'exemple 1 d) par 5 ml du mélange acide trifluoracétique-chlorure de méthylène (1/1 vol/vol) pendant 30 minutes à température ambiante puis on évapore à siccité. - On reprend le résidu dans 5 ml d'acétonitrile et neutralise par la triéthylamine. On ajoute la solution de 0,516 g du tripeptide Boc-Arg (NO2)-lle-Pro- OH (obtenu précédemment) dans 3 ml d'acétonitrile, puis on ajoute 0,442 g de BOP et 0,202 g de triéthylamine. Après une nuit on hydrolyse par addition de solution saturée de chlorure de sodium. I1 se sépare une gomme jaune qu'on sépare par décantation et redissout dans l'acétate d'éthyle chaud. On chromatographie la solution sur gel de silice. En éluant avec 50 ml d'acétate d'éthyle puis avec un mélange acétate déthyle-méthanol (95-5 vol/vol), on obtient 0,212 g dune poudre incolore. F : 103-105 C to HPLC : 1 pic à 17 minutes Rf = 0,62 (butanol 4 / acide acétique - 1 / eau - 1) Analyse d'acidesaminés : Arg : 0,95 - Ile - 1,05 - Leu 1,02 - Lys : 1,93 - Met : 1,01. C - Déprotection. On dissout 0,015 g de lwoctapeptide protégé obtenu ci-dessus dans 1 ml de méthanol et on ajoute 0,020 g de formiate d'ammonium et 0,020 g de palladium sur charbon à 10%. Après 24 heures, on rajoute 0,010 g de palladium sur charbon à 10 et poursuit la réaction pendant 48 heures. On filtre sur célite que l'on rince avec 50 ml de méthanol. On évapore le solvant, reprend le résidu dans le méthanol et dessale par passage sur résine LH-20. On obtient finalement 0,011 g du produit attendu. HPLC : 1 pic à 7 minutes Analyse d'acides aminés : Arg : O,90 - Ile : 1,01 Leu : 1,16 - Lys : 1,99 Met : 1,17. EXEMPLE 3 Boc - Glu - Arg - île - Pro - Leu - Lys - Lys Met - Pro - OCH3 peptide de formule (I) où R1 = Boc ; A = Glu - Arg - Ile Pro ; R2 = OCH3 a) - Boc - Glu - (ss Bzl) - Arg (N02) - Ile Pro - Leu - Lys (N#Z)-Lys (N#Z) - Met - Pro - OCH3. - On traite 0,083 g de leoctapeptide protégé obtenu à l'exemple 2 B) par 4 ml du mélange acide trifluoracétique-chlorure de méthylène (1-1 sol/vol) pendant 30 minutes à température ambiante. On évapore à siccité et reprend le résidu par l'éther. Le sel précipité sous forme de gomme qu'on Sépare par décantation. - On dissout cette gomme dans 3 ml dwacéto- nitrile et neutralise par la triéthylamine. On ajoute 0,040 g de Boc-Glu (/-j B81), 0,053 g de BOP et 0,013 g de triéthylamine. On laisse 4 heures à température ambiante puis on évapore le solvant et reprend dans 5 ml d'eau. I1 se sépare une gomme qu'on décante, sèche et reprend dans l'acétate d'éthyle. On chromatographie sur gel de silice. En éluant avec 50 ml d'acétate d'éthyle puis avec un mélange acétate d'éthyle méthanol (95-5 vol/vol), on obtient 0,032 g d'une poudre incolore. HPLC : 1 pic à 19,5 min. b) - Déprotection. On opère la déprotection selon la technique de l'exemple 2 C) qui conduit au produit attendu Analyse d'acides aminés : Glu : 1,04 - Arg : 0,71 Ilé : 0,92 - Leu : 1,02 Lys t 2,09 - Met :~0,970 Les composés selon l'invention ont été étudiés en ce qui concerne leurs propriétés thérapeutiques. plus particulièrement les composés ont été étudiés "in vitro" sur l'inhibition de l'activité de la Rénine. La méthode utilisée consiste à incuber pendant 30 minutes à 370C une picomole de rénine de la glande sous maxillaire de souris et 28 nanomoles du substrat synthétique Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr Ser dans le tampon citrate phosphate O, 5 M pH = 6,0 en présence de concentrations variables des peptides à étudier. La réaction est stoppée par refroidissement à O0C et l'activité enzymatique est déterminée par la formation d'angiotensine 1, mesurée par dosage radioimmunologique rJ. Renard et K.L. Catt, Endocrinology, 90 422, (1972)2. Des expériences de contrôle ne comportant pas de peptide inhibiteur permettent de déterminer la valeur de l'activité 100%. Les résultats des essais effectués avec les produits à tester sont exprimés en pourcentage d'inhibition de l'activité de la rénine. Les résultats obtenus avec les produits selon l'invention sont rassemblés dans la figure 1 où les courbes représentent le % d'activité en fonction de la concentration en ut des peptides de l'exemple 1 (courbe 1) de l'exemple 2 (courbe 2) et de l'exemple 3 (courbe 3). Tous les peptides testés inhibent la rénine et à partir des courbes tracées on peut déterminer les concentrations inhibitrices50 (CI 50) ou concentrations inhibant 50% de l'activité de la rénine. Les CI 50 sont respectivement - 2pN pour le peptide de l'exemple 1 - 3 P pour le peptide de l'exemple 3 - 20 pM pour le peptide de 1exemple 2. Cette activité très importante permet l'emploi des produits selon lBinvention en thérapeutique humaine pour le traitement de l'hypertension artérielle. Les peptides de la présente invention peuvent être utilisés de préférence par voie injectable : intraveineuse, intramusculaire ou sous cutanée. Ils sont utilisés dans un solvant tel que le sérum physiologique (solution saline isotonique) ou dans un tampon tel que le tampon phosphate. La posologie varie suivant l'intensité de l'effet thérapeutique recherchée, la gravité de l'affection à traiter et la voie d'administration utilisée. Elle doit donc être déterminée pour chaque patient en fonction de ces divers critères. Le plus souvent elle est comprise entre 1 et 100 mg de principe actif. REVENDICATIONS 1. Dérivés peptidiques de formule (I) : R1 - A - Leu - Lys - Lys - Met - Pro - R2 dans laquelle : - R1 représente l'hydrogène ou un groupe protecteur de la fonction amine - A désigne soit une liaison simple, soit un reste proline, dipeptide île - Pro, tripeptide Arg Ile - Pro, ou tétrapéptide Glu - Arg - Ile - Pro - R2 représente le groupe - OR dans lequel R désigne un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur. 2. Dérivé peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans la formule I, R1 représente un groupe t-butyloxycarbonyle A représente une liaison simple et R2 est le groupe méthoxy. 3. Dérivé peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans la formule I, R1 représente un groupe t-butyloxycarbonyle, A représente le reste du tripeptide Arg - Ile - Pro, et R2 est le goupe méthoxy. 4. Dérivé peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans la formule I, R1 représente un groupe t-butyloxycarbonyle , A le reste du tétrapeptide Glu - Arg - Ile - Pro, et R2 est le groupe méthoxy. 5. Procédé de préparation des dérivés peptidiques selon lune des revendicationsl à 4; caractérisé en ce qu'on prépare d'abord le pentapeptide protégé de formule (II) : Boc - Leu - Lys (NfZ) - Lys (Na Z) - Met Pro - OCH3 dans laquelle Boc représente le groupe t-butyloxycar- bonyle et Z le groupe benzyloxycarbonyle) selon les techniques habituelles de synthèse peptidiques en phase liquide, les réactions de couplage étant effectuées dans l'acétonitrile en présence d'hexafluorophosphate de benzotriazolyl-oxy-tris-diméthylaminophosphonium;;- puis on couple le peptide il avec un peptide de formule R1- A' -OH, convenablement protégé, A' étant identique à A ci-dessus mais avec des chaînes latérales protégées; finalement, les peptides protégés obtenus sont entièrement déprotégés à l'exception de lester C-terminal et du groupe protecteur de l'amine terminal par hydrogénolyse par transfert catalytique utilisant le formiate d'ammonium comme donneur dthydrogène. 6. Compositions pharmaceutiques, utiles notamment comme inhibiteurs de rénine, caractérisée en ce quelles contiennent comme principe actif, l'un au moins des dérivés peptidiques selon l'une des revendications 1 à 4. 7. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 6, caractérisée en ce quelles sont sous une forme administrables par voie injectable.