Brevet FR2536416A1 — publié le 19840525

La présente invention concerne une composition pour la détermination de lipases Plus particulièrement, elle concerne une composition pour la détermination de lipases comprenant un monoglycéride ou 1,2-diglycéride consistant en acide gras supérieur et un agent tensio-actif non- ionique. Jusqu'à présent, dans un essai pour la détermination de l'activité de lipases du pancrés, on a utilisé un tri- glycéride comme substrat Il est connu aussi que les lipases décomposent les monoglycérides et diglycérides. On a mesuré l'activité de lipases en émulsionnant une huile d'olive, contenant principalement des triglycérides, avec addition de gomme arabique ou d'alcool polyvinylique dans l'eau pour préparer l'émulsion, et en titrant l'acti- vité des acides gras libérés comme résultat de l'action des lipases Cette composition en émulsion n'a pas pu être utilisée, toutefois, pour mesure spectrométrique de l'acti- vité des lipases en raison de la turbidité de l'émulsion. De plus, cette composition a des inconvénients de séparation de phases dans un stockage de longue durée et donc la détermination des lipases ne pouvait pas être effectuée avec une bonne reproductibilité. On connaît une méthode de détermination des acides gras libres, par exemple une méthode de titrage de l'acidité des acides gras, une méthode de traitement aux sels de cuivre pour l'extraction d'acides gras utilisant un réactif à base de cuivre /-Clinical Assay: 15 ( 2): 191, 19717 et une mesure spectrométrique utilisant l'acyl-Co A oxydase / En résumé, Congrès de Japan Agr Chem Soc, page 38, 19807. De plus, une détermination spectrométrique utilisant l'acyl-Co A synthétase, l'acyl-Co A oxydase, l'énoyl-Co A hydratase, la 3-hydroxyacyl-Co A déhydrogénase et la 3-céto- acyl-Co A thiolase est connue comme méthode de détermination des acides gras pour détermination des lipases (Demande de -2- brevet japonais N 56148313) Une méthode mesurant un glycérol libéré par un substrat triglycéride est connue aussi (Nature, 196: 987 988, 1962, Biochem Z 239: 313, 1957, Can J Biochem Biophys, 40: 1129, 1962, brevet des E U A N 4 241 178). Ces méthodes de détermination des acides gras libres peuvent être utilisées pour la détermination des lipases; toutefois, comme expliqué ci-dessus, comme une composition utilisée comme substrat pour la détermination des lipases est une émulsion, il y a un certain nombre d'inconvénients. On a trouvé qu'une composition, obtenue à partir de monoglycéride ou de 1, 2-diglycéride consistant en acide gras supérieur de plus de 12 atomes de carbone solubilisé dans l'eau à l'aide d'un agent tensio-actif nonionique, peut être conservée pendant longtemps avec une bonne stabilité, peut être utilisée pour mesure spectrométrique en raison de la forme soluble dans l'eau, et est utile pour la détermination de lipases avec une bonne repro- ductibilité. Un but de la présente invention est de fournir une composition pour la détermination de lipases comprenant un monoglycéride ou 1,2-diglycéride consistant en acide gras supérieur et un agent tensio-actif non-ionique. Un monoglycéride ou 1,2-diglycéride consistant en acide gras supérieur est un composé de la formule (I): 1 CH 20 R 1 H OR 2 ( 2) CH 2 H dans laquelle R 1 est un résidu d'acide gras supérieur et R 2 est de l'hydrogène ou un résidu d'acide gras supérieur. Le résidu d'acide gras supérieur R ou R est un résidu 1 2 d'acide gras de plus de 12 atomes de carbone Des exemples d'acides gras supérieurs saturés sont: acide laurique (C 12:0), acide tridécylénique (C 13:0), acide myristique (C 14:0), acide pentadécylénique (C 15:0), acide palmitique -3- (C 16:0, acide margrique (C 17:0), acide stéarique (C 18:0) , acide nonadécylénique (C 19:0), acide arachidique (C 20:0), acide béhénique (C 21:0) ou acide lignocérique (C 22:0). Des exemples d'acides gras supérieurs insaturés sont acide palmitoléique (C 16:1), acide 9-octadécénique (C 18:1; acide oléique), acide 11octadécénique (C 18:1; acide bacucénique), acide 12-octadécénolque (C 18:1), acide 9- eicosanoique (C 20:1), acide 11-eicosanoique (C 20:1), acide 11docosanoique (C 22:1), acide 13-docosanoique (C 22 _i; acide érucique), acide linolique (C 18:2), acide linolénique (C 18:3), acide 11,14-eicosadiénoique (C 20:2, acide 8,11,14- eicosatriénoique (C 20:3) ou acide 5,8,11,14-eicosatétra- énoique (C 20:4; acide arachidonique) Un,glycéride dans lequel R 1 et R 2 sont des acides gras insaturés est préfé- rable en raison de la solution claire résultante Un mono- glycéride ou 1,2-diglycéride préférable est un glycéride ayant au moins un ou plus d'un résidu d'acide gras insaturé de plus de 16 atomes de carbone Un 1,2-diglycéride dans lequel un des résidus R 1 et R 2 est un résidu d'acide gras supérieur insaturé et l'autre est un résidu d'acide gras supérieur saturé peut être utilisé de manière particuliè- rement préférable. Un exemple spécialement préférable est un 1,2-diglycé- ride dans lequel R est un résidu d'acide gras supérieur insaturé (C 16:1 ' C 18:1 ' C 20:1 ' C 22:1 ' C 18:2 ' C 18:3, C 20:2, C 20:3 ou C 20 4) et R 2 est un résidu d'acide gras supérieur saturé (C l-linoléyl-2-myristoyl-glycérol, 1-linoléyl-2-palmitoyl- glycérol, l-linoléyl-2-stéaroyl-glycérol, 1-linolénoyl-2- lauroyl-glycérol, 1-linolénoyl-2-myristoyl-glycérol, -4- l-linolénoyl-2-palmitoyl-glycérol, l-linolénoyl-2- stéaroyl-glycérol, 1-( 1 l, 14-eicosénoyl)-2-myristoyl- glycérol, 1-(ll,14-eicosénoyl)-2-palmitoyl-glycérol, 1-( 8 l,11,4,17eicosatétraénoyl)-2-lauroyl-glycérol, 1-( 8,11,14,17-eicosatétraénoyl)-2palmitoyl-glycérol, l,2-dilinoléoyl-glycérol ou 1,2-dilinolénoyl-glycérol. Des monoglycérides et l,2-diglycérides peuvent aussi être obtenus comme suit Par exemple, on peut préparer un 1-monoglycéride en faisant réagir la lysolécithine avec la phospholipase C, l'acide lysophosphatidique avec la phosphatidate phosphatase ou la lysolécithine avec la phospholipase D et la phosphatidate phosphatase On peut préparer un 1,2-diglycéride en faisant réagir la lécithine avec la phospholipase C, l'acide phosphatidique avec la phosphatidate phosphatase ou la lécithine avec la phospho- lipase D et la phosphatidate phosphatase Ces monoglycé- rides et 1,2-diglycérides peuvent être utilisés directement sans isolement et purification, par exemple un mélange de réaction de phospholipase C et de lysolécithine et d'autres mélanges de réaction d'une combinaison d'enzyme et de substrat pour 1-monoglycéride comme ci- dessus, et un mélange de réaction de phospholipase C et de lécithine et d'autres mélanges de réaction d'une combinaison pour 1,2- diglycéride comme ci-dessus peuvent aussi être utilisés. Des exemples d'agents tensio-actifs non-ioniques sont: les suivants: Dérivés polyoxyéthyléniques (POE) d'alcools aliphatiques: EMULGEN 106 (Kao Atlas Co; éther POE d'alcool laurylique: HLB 10,5) EMULGEN 108 (éther POE d'alcool laurylique: HLB 12,1) " 220 (éther POE d'alcool cétylique: HLB 14,2) " 408 -(éther POE d'alcool oléylique: HLB 10,0) Brij 35 (éther POE ( 23) d'alcool laurylique-: HLB 16,9) " 78 (éther POE ( 20) d'alcool stéarylique: HLB 15,3) " 98 (éther POE ( 120) d'alcool oléylique: HLB 15,3) EMULGEN 340 (POE stéaryl éther: HLB 17,3) NONIOLITE AL-11 (Kyoeisha Yushi Co POE lauryl éther: HLB 14,0) " AO-20 (POE oléyl éther: HLB 15,4) NIKKOL *B-20 (Nikko Chem Co, POE béhényl éther: HLB 17), " BL-9 EX, BO-1 OTX, BC-15 TX, BH-5 EMULEX BA 10 (Nippon Emulsion Co, éther POE d'alcool butylique: HLB 16,9) " BA 15 (éther POE d'alcool butylique: HLB 18,7) " 130 (éther POE d'alcool cétylique: HLB 16,0) " 100 (éther POE d'alcool cétylique: HLB 14, 5) " 550 (éther POE d'alcool oléylique: HLB 18,2) " 700 (éther POE d'alcool laurylique: HLB 16,7) NONION E-213 (Nippon Yushi Co, éther POE d'alcool oléylique: HLB 13,6) " E-220 (éther POE d'alcool oléylique: HLB 15,3) " P-225 (éther POE d'alcool cétylique: HLB 16,4) " S-215 (éther POE d'alcool stéarylique: HLB 14,2) " T-208,5 (éther POE d'alcool tridécylique: HLB 13,0) LIPONOX OCS (Lion Yushi Co, POE alcoyl éther: HLB 15,0) " LCR (POE alcoyl éther): HLB 16,2 " O (POE alcoyl éther: HLB 14,3) Adekatol SO-120 (Asahi Denka Co, POE éthoxylate d'alcool secondaire à chaîne droite), " SO-145 (POE éthoxylate d'alcool secondaire à chaîne droite) " LO-9 (POE éthoxylate d'alcool primaire à chaîne droite) " LO-15 (POE éthoxylate d'alcool primaire à chaîne droite) POE alcoylaryl éthers: EMULGEN 810 (Kao Atlas Co,-POE octyl phényl éther: HLB 13,1) -6- EMULGEN 911 (POE nonyl phényl éther: HLB 13,7) 930 ( " " ": HLB 15,1) " 950 ( " " " ": HLB 18,2) NONIOLITE PO-9 (Kyoeisha Yushi Co, POE octyl phényl éther: HLB 13,2) " PA15 (POE alcoyl phényl éther: HLB 14,3) EMULEX NP-15 (Nippon Emulsion Co, POE alcoyl phénol éther: HLB 13,2) " OP-25 (POE alcoyl phénol éther: HLB 15,8) NONION NS-215 (Nippon Yushi Co, POE nonyl phénol éther: HLB 15,0) " NS-220 (POE nonyl phénol éther: HLB 16,0) " HS-212 (POE octyl phénol éther: HLB 14,4) " HS-220 ( " " " ": HLB 16,2) LIPONOX NCM (Lion Yushi Co, POE alcoyl phénol éther: HLB 14,5) " NCN (POE alcoyl phénql éther: HLB 14,8) " NCO ( " " " ": HLB 15,0) Nonidet P-40 (Shell Oil Co, POE alcoyl aryl éther) Triton X-100 (Rohm and Haas Co, POE alcoyl éryl éther) NIKKOL NP-10 (Nikko Chem Co), NP-18 TX, NP-20, OP-40 POE esters d'acides gras: EMANON 1112 (Kao Atlas Co, POE monolaurate: HLB 13,7) " 4115 (POE monooléate: HLB 13,4) Myrj 45 (POE( 8) stéarate: HLB 11,1 " 52 (POE( 40) stéarate: HLB 16,9) " 53 (POE( 50) stéarate: HLB 17,9) NONIOLITE S-100 (Kyoeisha Yushi Co, POE stéarate: HLB 15,6) " T-40 (POE ester d'acide gras de tallol: HLB 11,5) EMULEX 202 (Nippon Emulsion Co, POE oléate: HLB 15,1) " 203 (POE oléate: HLB 10,6) " 800 (POE monolaurate: HLB 15,8) NONION P-10 (POE monopalmitate: HLB 15,7) " S-10 (POE monostéarate: HLB 15,2) 25364 1 6 -7- NONION S-40 (POE monostéarate: HLB 18,2) MYL-10, MYO-10 (Nikko Chem Co) Ester d'acide gras de POE sorbitanne: EMASOL 1130 (Kao Atlas Co, monolaurate de POE sorbitanne: HLB 16,3) " 3130 (monostéarate de POE sorbitanne: HLB 14,9) Tween 20 (monolaurate de POE( 20) sorbitanne: HLB 16,7 " 40 (monopalmitate de POE( 20) sorbitanne:- HLB 15,6 " 80 (monooléate de POE( 20) sorbitanne: HLB 15,0) NONIOLITE TWL-20 (Kyoeisha Yushi Co, monolaurate de POE( 20) sorbitanne: HLB 16,2) " TWS13 (monostéarate de POE( 13) sorbitanne: HLB 12,5) SOLGEN TX-20 (Daiichi Kogyo Seiyaku Co, monolaurate de POE sorbitanne: HLB 16,7) TW-80 (monooléate de POE sorbitanne: HLB 15,0) NIKKOL TSDL-2020 L (Nikkox Chem Co, ester de POE sorbi- tanne d'acide gras d'olive: HLB 16,5) TL-10, TO-106 EMULEX ET-2000 (Nippon Emulsion Co, laurylate de POE sorbitanne: HLB 16,6) NONION LT-221 (Nippon Yushi Co, laurylate de POE sorbitanne: HLB 16,7) " ST-221 (stéarate de POE sorbitanne; HLB 14,9) OT-221 (oléate de POE sorbitanne: HLB 15,0) Sorbon T-20 (Toho Chem Co monolaurate de POE sorbitanne: HLB 16,7) " T-40 (monopalmitate de POE sorbitanne: HLB 15,7) " T-80 (monooléate de POE sorbitanne: HLB 15,0) Ester d'acide gras de POE sorbitol: Atlox 1045 A (Kao Atlas Co, oléate-laurate de POE sorbitol HLB 13,2) " 1196 (oldate de POE sorbitol: HLB 11,4) G-1045 (laurate de POE sorbitol: HLB 11,5) -8- G-1045 (dérivé de lanoline de POE sorbitol: HLB 14) NIKKOL TSOL-1020 L (Nikko Chem CO, ester de POE sorbitol d'acide gras d'olive: HLB 16,0) GL-1 Dérivé POE d'huile de ricin et dérivé POE d'huile de ricin durcie: G-1288 (Kao Atlas Co, produit d'addition huile de ricinoxyde d'éthylène: HLB 16,0) G-1295 (produit d'addition huile de ricin durcie- oxyde d'éthylène: HLB 17,5) G-1292 (produit d'addition huile de ricin durcie- oxyde d'éthylène: HLB 10,8) NIKKOL CO-60 TX (Nikko Chem Co, POE ( 60) huile de ricin: HLB 14,1) Ester d'acide gras de POE glycérol: NIKKOL TGSO 215 (Nikko Chem Co, ester de POE glycérol d'acide gras d'huile végétale:HLB 14,0) TGSO 220 (ester de POE glycérol d'acide gras d'huile végétale: HLB 15,5) TDGOL-2010 (ester de POE diglycérol d'acide gras d'olive: HLB 12,5) Dérivé POE de lanoline: G-1790 (Kao Atlas Co) G-1795 BWA-5 (Nikko Chem Co) Agent tensio-actif non-ionique de type POE comme un POE alcoylthioéther et un monoester d'acide gras de POE- propylèneglycol; Agent tensio-actif non-ionique du type à blocs constitué d'un bloc de polyoxypropylène et d'un bloc de POE: Pluronic L 121, L 122 (Asahi Denka Kogyo Co) Agent tensio-actif non-ionique de type alcool polyhydrique comprenant un ester d'un alcool polyhydrique de plus de 6 atomes de carbone comme le sorbitanne, le mannitol, le sorbitol ou le sucrose et d'un acide gras supérieur de plus -9- de 12 atomes de carbone comme l'acide laurique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide isostéarique et d'autres acides gras naturels. A propos de ces agents tensio-actifs non-ioniques, une combinaison préférable est celle d'un 1,2-diglycéride et d'un agent tensio-actif de la série des POE alcoylaryl éthers ou d'un agent tensio-actif non-ionique du type à blocs. Un agent tensio-actif non-ionique préférable a géné- ralement une valeur HLB de plus de 10, de préférence de plus de 11, et on peut obtenir une valeur HLB de plus de en utilisant conjointement deux agents tensio-actifs non-ioniques ou plus. On peut préparer une composition en ajoutant une quantité aliquote de monoglycéride ou de 1,2-diglycéride à une solution aqueuse à 1-5 % en poids d'agent tensio-actif non-ionique et en chauffant On mélange 5-100 parties en poids de monoglycéride ou de 1,2-diglycéride avec 100-500 parties en poids d'agent tensio-actif non-ionique Une composition aqueuse peut contenir de préférence 0,5-10 g de monoglycéride ou de 1,2diglycéride et 10-50 g d'agent tensio-actif non-ionique dans 1 litre de solution. Cette composition peut être utilisée directement comme substrat pour la détermination de lipases et un autre réactif approprié pour l'acide gras ou le glycérol qui est libéré par l'action des lipases peut aussir Pêtre ajouté à la composition. Les réactifs qui peuvent être ajoutés sont des réactifs connus pour les acides gras ou les glycérols. En effet, un composé de formule (I) qui est contenu dans la composition est décomposé par l'action des lipases pour libérer un acide gras et du glycérol (Réaction (II)) 25364 16 -1 O- CH 220 R 1 C Hr OI WII CH OR 2 -:, H O -O OH R O H+Ch O: O CIIOH lipase CO: O glycerol o quand R 1 et R 2 sont chacun un résidu d'acide gras supérieur, N = 2; et quand R 1 est un résidu d'acide gras supérieur et R 2 est de l'hydrogène, N = 1. Des exemples de méthodes de détermination des acides gras libérés R 1 OH (dans les détails: Ri COOH) et R 2 OH (R 2: résidu d'acide gras supérieur, dans les détails RCOOH) (ci-après ils sont désignés par RCH 2 CH 2 COOH) sont illustrés comme suit. On utilise les abréviations suivantes: AMP: monophosphate d'adénosine RCH 2 CH 2 COS Co A: acyl coenzyme A RCH=CHCOS Co A:2,3-déshydroacyl coenzyme A RCHCH 2 COS Co A: hydroxyl acyl coenzyme A OH RCOCH 2 COS Co A: 3cétoacyl coenzyme A ADP: diphosphate d'adénosine ITP: triphosphate d'inosine Co ASH: coenzyme A. ( 1) Une méthode utilisant ATP, Co ASH, l'acyl-Co A synthétase (EC:6 2 1 3) et l'acyl-Co A oxydase (brevet des E.U A N 4 340 173): -Etape a: R-CH 2-CH 2-COOH + ATP + Co ASH (acide gras) o -acyl-Co A synthétase> R-CH 2-CH 2-C-S Co A + AMP + P Pl (acyl-Co A) 25364 1 6 -11- -li Etape b: o O R-CH 2-CH 2-C-S Co A + 02 (acyl-Co A) > R-CH=CH-C-S Co A + H O acyl-Co A oxydase 2 2 (déshydroacyl-Co A) Etape c: on mesure la quantité de 02 consommée ou de H 202 produite. ( 2) Une méthode utilisant ATP, Co ASH, l'acyl-Co A synthétase, l'acyl-Co A oxydase, l'énoyl-Co A hydratase (EC 4 2 1 17), la 3-hydroxy-Co A déshydrogénase (EC 1 1 1. ), la 3-cétoacyl-Co A thiolase (EC 2 3 o 1 16), NAD et éventuellement de la catalase; ou utilisant une enzyme multi-active pour l'énoyl-Co A hydratase, la 3 -hydroxy-Co A déshydrogénase et la 3-cétoacyl-Co A thiolase à la place des 3 enzymes ci-dessus (par exemple, une enzyme obtenue à partir de Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P N 5701; demande de brevet du Royaume Uni N 8 218 552): Etape a: R-CH 2-CH 2-COOH + ATP + Co ASH (acide gras) Il acyl-Co synthtase> R-CH -CH -C-S Co A + AMP + P Pl acyl-Co A, synthétase 2 2 (acyl-Co A) Etape b: O Il R-CH 2-CH 2-C-S Co A + 02 (acyl-Co A) O > R-CH=CH-C-S Co A + H 202 acyl-Co A oxydase 22 (déshydroacyl-Co A) -12- Etape c: O - R-CH=CH-C-S Co A + H 20 (déshydroacyl-Co A) OH 0 I Il R-CH-CH énoyl-Co A hydratase R-CH-CH 2-C-S Co A (hydroxyacyl-Co A) Etape d: OH O I II D-CH-CH 2-C-S Co A + NAD O O > R-C-CH -C-S Co A + NAD réduit 3-hydroxyacyl-Co A 2 déshydrogénase Etape e: O O Il Il R-C-C -C-C-S Co A + Co ASH (cétoacyl-Co A) O O " " activité de 3-cétyl-Co A > R-C-S Co A + CH 3 C S Co A thiolase (acyl-Co A) Etape f: (le produit RCOS Co A obtenu dans l'étape e est soupis à un recyclage à la réaction de l'étape b), on mesure la quantité de 02 consommée, de H 202 produite ou de NAD réduite. ( 3) Une méthode utilisant ATP, Co ASH, l'acyl-Co A synthétase, la myokinase (EC 2 7 4 3), Mg C 12, le phospho- énolpyruvate (PEP), la pyruvate kinase (EC 2 7 1 40), NAD réduit et la Llactate déshydrogénase (EC 1 1 1 27): Etape a: R-CH 2-CH 2-COOH + ATP + Co ASH (acide gras) O II R-CH -CH -C-S Co A + AMP + P Pl acyl-Co A synthétase RCH 2-C 2 (acyl-Co A) -13- Etape b: AMP + ATP myokinase > 2 ADP Etape c:- 2 ADP + 2 PEP pyruvate kinase> 2 ATP + 2 pyruvate Etape d: 2 pyruvate + 2 NAD réduit L-lactate dshydrognas L-lactate déshydrogénase 2 L-lactate + 2 NAD + Etape e: on mesure la quantité consommée de NAD réduit. ( 4) Une méthode utilisant la pyruvate oxydase (EC 1.2 3 3) à la place de NAD réduit et de la lactate déshydrogénase dans la méthode ci-dessus: Etape d: 2 pyruvate + 2 02 pyruvate oxydase 2 acétylphosphate + 2 CO 2 + 2 H 202 ( 5) Une méthode utilisant ATP, Co ASH, l'acyl-Co A synthétase et 1 'AMP désaminase (EC 3 5 4 6): Etape a: R-CH 2-CH 2-COOH + ATP + Co ASH (acide gras) O i acyl-Co A synthétase> R-CH 2 CH 2-C-S Co A + AMP + P Pl Etape b: i AMP + H 20 AMP désaminase 5-inocinate + NH 3 Etape c: On mesure la quantité de NH 3 produite. ( 6) Une méthode utilisant ATP, Co ASH, l'acyl-Co A synthétase, l'AMP nucléosidase (EC 3 2 2 4) et l'adénind désaminase (EC 3 5 4 2): Etape a: R-CH 2-CH 2-COOH + ATP + Co As H (acide gras) O acyl-Co A synthétase Etape b: AMP + H 20 AMP nu O 2 AMP nuc' I > R-CH 2-CH 2-C-S Co A + AMP + P Pl 2 12 Léosidase adénine + D-ribose-5 '-phosphate J -14 - :Etape c: adénine + H 20 adénine désaminase> hypoxanthine + NH 3 -Etape d: On mesure la quantité de NH 3 produite. ( 7) Une méthode utilisant ATP, Co ASH, l'acyl-Co A synthétase, la myokinase, le chlorure de magnésium, l'ADP désaminase (EC 3 5 4 7): Etape a: R-CH 2-CH 2-C-COOH + ATP + Co AS H I acyl-Co A synthétase> R-CH 2-CH 2C-S Co A + AMP + P Pl (acyl-Co A) Etape b: AMP + ATP myokina> 2 ADP myokinase' Etape c: 2 ADP + 2 H 2 A> 2 IDP + 2 NH 2 ADP désaminase 3 Etape d: on mesure la quantité de NH 3 produite. ( 8) Une méthode utilisant ATP, Co ASH, l'acyl-Co A synthétase, ia myokinase, le chlorure de magnésium, la GTP-adénylate kinase (EC 2 7 4 10), le diphosphate d'ino- sine (IPP), l'hexokinase (EC 2 7 1 1), la glucose-6- phosphate déshydrogénase (EC 1 1 1 45) et NADP: Etape a: R-CH 2-CH 2-COOH + ATP + Co ASH (acide gras) 0 ' Il > R-CH 2-CH 2-C-S Co A + AMP + P Pl acyl-Co A synthétase 2 2 (acyl-Co A) Etape b: AMP + ATP myokinase> 2 APP Etape c: 2 ADP + 2 IDP GTP adénylate kinase 2 AMP + 2 ITP Etape d: 2 ITP + 2 glucose hexokinase> 2 glucose-6-phosphate + 2 IDP Etape e: 2-glucose-6-phosphate + 2 NADP+ glucose-6- phosphate dshydrognase> 2 glucono lactone-6-phosphate phos 40 Etape f: on mesure la quantit hydrogénaseduite de NADP rduit. Etape f: on mesure la quantité produite de NADP réduit. -15- ( 9) Une méthode utilisant ATP, Co ASH, l'acyl=Co A synthétase, l'AMP pyrophosphorylase (EC 2 o 4 2 7), AMP et l'adénine desaminase: Etape a: R-CH 2-CH 2-COOH + ATP + Co ASH (acide gras) O I acyl-Co A synthétase' R-CH 2-CH 2-C-S Co A + AMP + P Pl (acyl-Co A) Etape b: pyrophosphate + AMP AMP pyrophosphorylase> adénine + 5-phospho-D- ribosylpyrophosphate Etape c: adénine + H O 2 adénine désaminase hypoxanthine + NH 3 Etape d: on mesure la quantité de NH produite. D'autres méthodes de détermination pour le glycérol libéré par un composé (I) sont illustrées comme suit. ( 10) Une méthode utilisant le chlorure de magnésium, ATP, la glycérol kinase (EC 2 7 i 30) et la glycérophosphate oxydase (brevets des E U A N 4 166 005 et 4 275 161): Etape a: glycérol + ATP glycérol kinase> glycéro3-phosphate + ADP Etape b: glycéro-3-phosphate + 02 glycérophosphate oxydase> phosphate de dihydroxyacétone + H 202 Etape c: on mesure la quantité de 02 consommée ou de H 202 produite. ( 11) Une méthode utilisant le chlorure de magnésium, ATP, la glycérol kinase, la glycérophosphate déshydrogénase (EC 1 1 99 5) et un accepteur d'hydrogène (méthosulfate de phénazine, etc): Etape a: glycérol + ATP glyc>rol kinase glycérol kinase glycéro-3-phosphate + ADP Etape b: glycéro-2-phosphate + méthosulfate de phénazine (PMS) glycérophosphate déshydrogénase> phosphate de dihydroxyacétone + PMS réduit -16- Etape c: PMS réduit + 02 > PMS + H 20 Etape d: on mesure la quantité de 02 consommée. ( 12) Une méthode utilisant la glycérol déshydrogénase (EC 1 1 1 6) et NAD+: Etape a: glycérol + NAD + glycerol déshydrogénase dihydroxyacétone + NAD réduit Etape b: on pesure la quantité produite de NAD réduit. ( 13) Une méthode utilisant le chlorure de magnésium, ATP, la glycérol kinase, PEP, la pyruvate kinase et la pyruvate oxydase: Etape a: glycérol + AT Pglycro kinas> glycerol kinase glycéro-3-phosphate + ADP Etape b: ADP + PEP pyruvate kinas> pyruvate + ATP Etape c pyruvate + 02 pyruvate oxydase > phosphate d'acétyle + CO 2 + H 202 Etape d: on mesure la sonsommation de 02 ou la production de CO 2 ou de H 202. ( 14) Une méthode utilisant le chlorure de magnésium, ATP, la glycérol kinase, PEP, la pyruvate kinase, la L-lactat Etape a Etape b Etape c Etape d ( 15) ATP, la Etape a Etape b te déshydrogénase et NAD réduit: : glycérol + ATP glycérol kinase> glycéro-3-phosphate + ADP : ADP + PEP pyruvate kinasepruvate +ATP pyruvate kinase p : pyruvate + NAD réduit lactate déshydrogénase> L-lactate + NAD+ : on mesure la quantité consommée de NAD réduit. Une méthode utilisant le chlorure de magnésium, glycérol kinase et l'ADP désaminase: : glycérol + ATP l > ADP + H 20 on mesure on mesure glycéro-3-phosphate + ADP ADP dsaminase> IDP + NH 3 ADP désaminase 3 la quantité de NH 3 produite. Etape c: -17- Dans les méthodes ci-dessus, le pyruvate produit dans les étapes ( 3) c, ( 13) b et ( 14) b peut être déterminé par réaction avec une hydrazine, comme la 2,4-dinitrophényl- hydrazine, afin de produire un pigment ayant une absorption maximale à 440 nm, et l'accepteur d'hydrogène, le métho- sulfate de phénazine, peut être remplacé par du cytochrome c, du bleu de méthylène ou du ferricyanure de potassium. De plus, dans la méthode ( 2), quand on utilise la catalase, l'eau oxygénée produite dans l'étape b est décomposée et on peut de préférence mesurer la quantité de NADH 2 produite. Dans la méthode ci-dessus, l'oxygène consommé peut de préférence être mesuré par des méthodes électrochimiques utilisant une électrode à oxygène L'eau oxygénée produite peut être mesurée par une électrode à eau oxygénée ou par un indicateur d'eau oxygénée Par exemple, on peut utiliser un réactif colorant l'eau oxygénée qui indique les chan- gements de couleur par des rayons visibles, un réactif fluorescent pour l'eau oxygénée qui présente une fluores- cence sous l'action de rayons ultraviolets ou un réactif d'émission pour l'eau oxygénée Et un réactif colorant l'eau oxygénée, tel qu'une combinaison de peroxydase et de chromogène, est préférable Un exemple préférable est la peroxydase de raifort (EC 1 11 1 7) avec plus de 0,05 unité par essai, de préférence 0,1 500 unités Un exemple de chromogène est une combinaison d'accepteur d'électrons et d'agent de couplage à une concentration de plus de 1 m M. Des exemples d'accepteurs d'électrons sont la 4-amino- antipyrine, le 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-l,2,4- triazole, le 2-hydrazinobenzotriazole, la 3-méthyl-2-benzo- thiazolidone et le 2-aminobenzothiazole. Des exemples d'agents de couplage sont le phénol, la 3-méthyl-N-éthyl-N-(bêta-hydroxyéthyl)-aniline, l'acide p- hydroxybenzoique, le p-chlorophénol, le 2,4-dichlorophénol, -18- le 4,6-dichloro-o-crésol, le 2,4-dibromophénol, le 3,5- dichloro-2-hydroxybenz ènesulfonate, la N,N-diéthyl-m- toluidine, la N,N-diméthyl-m-méthoxyaniline, la N-éthyl- N-sulfopropyl-m-toluidine, la N-éthyl-N-( 3-méthylphényl)- N'-acétyléthylènediamine, la 3-acétamino-N,N-diéthyl- aniline, le 3,5xylénol et la N,N-diméthylaniline Des substrats fluorescents sont des substances déjà connues comme l'oxalate de bis( 2,4,6-trichlorophénol), la phényl- thiohydantoine, l'acide homovanillique, l'acide 4- hydroxyphényl acétique, la vanillylamine, la 3-méthoxy- tyramine, la phlorétine, l'hordénine, le luminol monoamion et la lucigénine, et peuvent être utilisés en même temps qu'un accepteur d'électrons On peut mesurer NAD et NADP réduits (ce qu'on désignera ciaprès par NAD(P) réduit) par absorption à 340 nm ou par colorimétrie en utilisant un réactif colorant pour NAD(P) réduit Un réactif colorant pour NAD(P) réduit est un réactif pour la formation de pigment formazane en utilisant la diaphorase (NADH) (EC 1 6. 9.9) ou la diaphorase (NADPH (EC 1 6 9 9), à raison de plus de 0,01 unité, de préférence à raison de 0,1 10 unités et plus de 0,01 m M, 0,05 0,5 ml de sel de tétra- zolium Des sels de tétrazolium sont le chlorure de tétrazolium nitrobleu, le bromure de 3-( 4 ',5 '-diméthyl- triazolyl)-2,4-diphényl-tétrazolium, le chlorure de 2-(p-iodophényl)-3-(pnitrophényl)-5-phényl-tétrazolium, le chlorure de 2,2 ',5,5 '-tétra-(p-nitrophényl)-3,3 '-( 3- diméthoxy-4-phénylène)-ditétrazolium, le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium et le chlorure de néotétrazolium. La diaphorase peut être remplacée par le méthosulfate de phénazine, la 8diméthylamino-2,3-benzophénoxadine ou le méthylsulfate de l-méthoxy-5méthylphénazium La quantité de NH 3 produite peut être mesurée par uneélectrode à ammonium ou une électrode à ions Le CO 2 produit peut aussi être mesuré par des méthodes électro-chimiques. -19- Ces réactifs pour déterminer les acides gras ou le glycérol, des moyens électro-chimiques, d'autres réactifs et une composition contenant un monoglycéride ou un 1,2- diglycéride et un agent tensio-actif non-ionique sont com- binés d'une manière appropriée A une composition qui contient un monoglycéride ou un 1,2-glycéride et un agent tensio-actif non-ionique, on ajoute de préférence du désoxycholate de sodium et de la colipase L'activité de lipases peut être mesurée en ajoutant ces réactifs et une enzyme La concentration du désoxycholate est de préférence supérieure à 0, 5 m M dans une solution de substrat pour lipase et est de préférence de 1 20 m M et on en utilise 0,1 0,5 ml pour chaque détermination La quantité de colipase à ajouter est de 500 unités ou plus pour une détermination, de préférence de 2000 4000 unités La. solution de substrat pour lipase peut éventuellement être préparée en mélangeant la composition contenant un monoglycéride ou un 1,2-diglycéride, un agent tensio- actif non-ionique et de préférence du désoxycholate et de la colipase, des réactifs pour mesurer les acides gras ou le glycérol et les réactifs nécessaires pour mesurer les changements détectables par spectrophotométrie La quantité de la composition contenant un monoglycdride ou un 1,2-diglycéride et un agent tensio-actif non-ionique est éventuellement de 1 1 dans une solution de substrat, 20 et de plus de 0,5-m M, de préférence 1,5 5-m M pour le monoglycéride ou le 1,2diglycéride et de plus de 0,1 %, de préférence 0,2 0,5 % pour l'agent tensio-actif non- ionique. Des exemples de la composition contenant un substrat sont illustrés comme suit. Une composition contenant ATP, Co ASH, du désoxycholate, de la colipase, de l'acyl-Co A synthétase, de l'acyl-Co A oxydase, du monoglycéride ou du 1,2-diglycéride, un agent tensio-actif non-ionique et un réactif colorant l'eau oxygénée, et de préférence un réàctif pour SH comme du -20maléimide, du N-méthylmaléimide, du N-éthylmaléimide ou du Nphénylmaléimide; une composition contenant ATP, Co ASH, du désoxycholate, de la colipase, de l'acyl-Co A synthétase, de l'acyl-Co A oxydase, de l'énoyl-Co A hydratase, de la 3-hydroxyacyl-Co A déshydrogénase, de la 3-cétoacyl-Co A thiolase, un mono- glycéride ou 1,2-diglycéride, un agent tensio-actif non- ionique et NAD(P), et de préférence de la catalase, du flavine adinine dinucléotide et des réactifs colorant NAD(P); une composition contenant du chlorure de magnésium, ATP, du désoxycholate, de la colipase, de la glycérol kinase, de la glycérophosphate oxydase, un monoglycéride ou 1,2diglycéride, un agent tensio-actif non-ionique et un réactif colorant l'eau oxygénée une composition contenant du chlorure de magnésium, ATP, du désoxycholate, de la colipase, de la glycérol kinase, de la glycérophosphate déhydrogénase, un monogly- céride ou 1,2-diglycéride, un agent tensio-actif non- ionique et un accepteur d'hydrogène; une composition contenant du désoxycholate, de la colipase, de la glycérol déshydrogénase, NAD(P), un mono- glycéride ou 1,2-diglycéride, un agent tensio-actif non- ionique et un réactif colorant NAD(P). La quantité et la concentration des réactifs utilisés sont illustrées comme suit-: ATP et Co ASH: excès molaire de plus de plusieurs fois, comme 0,5 50 g M, 0,05 gmole par essai, de préférence plus de 2 Lmoles. NAD(P):-solution 0,5 50 m M, plus de 0,05 gmole, de préférence plus de 2 gmoles par essai. Chlorure de magnésium: solution 5 50 m M, 0,1 0,5 ml par essai. Acyl-Co A synthétase: plus de 0,1 u, de préférence 0,5 1 u par essai. Acyl-Co A oxydase: plus de 1 u, de préférence 5 20 u par essai. * -21- Enoyl-Co A hydratase, 3-hydroxyacyl-Co A déshydrogénase et 3cétoacyl-Co A thiolase: plus de 1 u, de préférence u par essai. Glycérol kinase: plus de 0,01 u, de préférence 0,05 5 u par essai. Glycérophosphate oxydase: plus de 0,5 u, de préférence 1 20 u par essai. Glycérol déshydrogénase: plus de 0,5 u, de préférence 1 20 u par essai. On utilise ces réactifs par dissolution dans une solution tampon à un p H de 7 9 Des exemples de solutions tampon sont des solutions 10 500 m M de phosphate, de glycylglycine, de Tris-H Cl, de glutarate de diméthyle, d'imidazole-H Cl, de produit de Good comme de PIPES-Na OH ou de tampon glycine. Les concentrations et quantités ci-dessus sont indiquées à titre d'illustration et peuvent éventuellement être modifiées De plus, si nécessaire, on peut ajouter Na Cl, un stabilisant pour les enzymes ou un conservateur Les autres traitements requis peuvent éventuellement être effectués, si nécessaire Par exemple, dans la méthode ( 1) ci-dessus, l'eau oxygénée produite peut être mise à réagir avec un agent réducteur comme le Co ASH résiduel de l'étape précédente, et ainsi ce Co ASH résiduel sera de préférence bloqué par un réactif pour SH Pour cette raison, chaque réactif de l'étape a, b ou c est de préfé- rence préparé séparément. Comme expliqué ci-dessus, on peut préparer une compo- sition pour la détermination de lipases contenant un mono- glycéride ou 1,2-diglycéride et un agent tensio-actif non- ionique, de préférence une composition contenant aussi un désoxycholate et de colipase, ou d'une façon encore préfé- rable une composition contenant un réactif pour mesurer les acides gras ou le glycérol présents et une composition de substrat contenant éventuellement un réactif mesurant les changements détectables. -22- On utilise habituellement ces compositions à raison de 0,1 5 mipar essai pour 0,1 5 ml de l'échantillon à 37 C pendant une minute ou plus L'activité de lipase dans l'échantillon peut être déterminée en mesurant les chan- gements détectables finalement apparus par spectrométrie ou par des méthodes électro-chimiques. La composition pour détermination de lipases de la pré- sente invention a un certain nombre d'avantages, par exemple l'absence de séparation de phases, la stabilité, l'absence de turbidité et la reproductibilité des déter- minations. L'exemple suivant illustre la présente invention, mais ne doit pas être considéré comme la limitant. Exemple 1) Préparation d'une composition pour la détermination de lipases: De nombreuses espèces de glycérides, un substrat pour la détermination de lipases, ont été ajoutées dans une solution aqueuse ( 10 ml) de 2 5 % (en poids/volume) d'un agent tensio-actif non-ionique et chauffées à 37 C pendant minutes pour solubilisation afin de préparer une solution de substrat d'une concentration de 20 m M Du glycéride disponible dans le commerce dans un solvant organique a été utilisé après élimination du solvant dans un évaporateur rotatif Un triglycéride a été mélangé avec un agent tensio-actif non-ionique et traité aux ultrasons pour préparation de l'émulsion. 2) Mesure de la turbidité: On a préparé une solution de substrat pour la détermi- nation de lipases comprenant la solution à 20 m M de substrat préparée en ( 1) ci-dessus ( 100 il), une solution tampon 0,2 M PIPES-Na OH (p H 7,5, 200 4 l, une solution 2 M de Na Cl ( 100 il), une solution 50 m M de Mg C 12 ( 30 il), une solution m M de désoxycholate de Na ( 25 pl) et de l'eau distillée ( 545 il) et on a mesuré le pouvoir absorbant (A 340 nm) 340 nm. -23- Les résultats sont présentés dans le Tableau I. Comme résultat, le 1,3-dioléyl-glycérol et le tri- oléylglycérol présentent un pouvoir absorbant plus fort que ceux d'un monoglycéride comme le 1-oléylglycérol et d'un 1,2-diglycéride comme le 1, 2-dioléylglycérol et le l-linoléoyl-2-palmitoylglycérol, et sont désavantageux pour une détermination spectrométrique de lipase Au con- traire, les monoglycérides et 1,2-diglycérides présentent une plus forte transparence en raison de leur bonne solubilité dans l'eau. 3) Détermination de lipase en utilisant un 1,2-diglycéride comme substrat: Solution de réaction I: tampon 0,2 M PIPES-Na OH (p H 7,5) 0,20 ml 2 M Na Cl 0,10 " m M Mg C 12 0,025 m M ATP 0,05 m M Co ASH 0,025 " 12 m M désoxycholate de Na -0,25 " colipase (Boehringer, 27 000 U/ml) 0,10 " 18 m M 1,2-dioléoylglycérol dans solution à 3,5 % de Nonidet P-40 0,10 " Acyl-Co A synthétase (Toyo Jozo Co, 10 U/ml) 0,10 " eau distillée 0,05 25 Total 1,00 ml Solution de réaction II: tampon 0,2 M PIPES-Na OH (p H 7, 5) 0,1 ml 0,3 % 4-aminoantipyrine 0,3 " 0,2 % phénol 0,3 peroxydase (Sigma Co, 45 U/ml) 0,1 " 1 % Triton X-100 0,1 " Acyl-Co A oxydase (Toyo Jozo Co, 150 U/ml) 0,1 " eau distillée 0,5 " Total 1,5 ml 25364 1 6 -24- De la lipase pancréatique porcine ( 0,15 U/ml, par la méthode d'émulsion à l'huile d'olive)( 20 4 l) a été ajoutée à la solution de réaction I et mise à incuber à 37 C pendant 10 minutes On y a ajouté 20 m M N-éthylmaléimide ( 0,5 ml) pour arrêter la réaction L'acide oléique libéré à partir du 1,2-diglycéride a été déterminé comme suit. On a ajouté la solution de réaction II ( 1,5 ml) au mélange de réaction ci-dessus et l'ensemble a été mis à incuber à 37 C pendant 5 minutes, puis on a mesuré le pouvoir absorbant à 500 nm (O D 500 nm = 0,076), indiquant une activité de lipase de 0,19 U/ml, 4) Détermination de lipase en utilisant un 1,2-diglycéride: tampon 0,4 M PIPES-Na OH (p H 7,5) 0,1 ml 2 M Na Cl 0,1 " 50 m M Mg C 12 0,025 0,25 m M ATP 0,01 " m M NAD 0,025 " m M Co ASH 0,025 " 12 m M désoxycholate de Na 0,25 " colipase (Boehringer, 27 000 U/ml) 0,10 " 18 m M l-linoléoyl-2-palmitoyl glycérol (dissous dans une solution à 3,5 % de Nonidet P-40 0,10 " Acyl-Co A synthétase (Toyo Jozo Co, 300 U/ml) 0,05 " HDT (enzyme multi-active comprenant de l'énoyl- Co A hydratase, de la 3-hydroxy-Co A déshydro- génase et de la 3-cétoacyl-Co A thiolase déshydrogénase 400 U/ml) 0,02 1 m M FAD 0,02 " eau distillée 0,075 Total 1,00 ml -25- ___ ___ ___ ___ __ Tableau i glycéride agent tensio-actif non-ionique A 340 nm L 1-olécylglycérol Brij 98 0,096 (POE éther d'alcool oléylique) Nonidet P 40 0,093 (POE alcoylaryl, éther)) Triton X-100 0,090 (POE alccylaryl éther) Nonion NS-220 0,088 (POE nonyl phénol éther) NIKKOI 4 OP-10 0,092 (POE octylphényl éther) Myrj 52 0,088 (POE stéarate) Nonion ST-221 -0,095 (POE sorbitan stéarate) " Tween 80 0,494 O W " NIKKOL'-OP-10 0,102 Pluronic L 122 0,125 1-linoléoyl-2 Nonidet P 40 0,107 palIn Utoylglycérol Triton X-100 0,109 Nonion NS-220 0,099 N Jfl KOL OP-10 0,086 Pluronic L 122 0,269 1,3-dioléoyl-glycérol Brij 98 1,74 Il Nonidet P 40 1, 76 Triton X-100 1,74 Nonion P-10 1,69 t' il ST-221 1,80 Ttveen 80 1,78 _____ ____ ____ ____ PluronicL 122 1,86 trioléoyl-glrycérol Brij 98 2,49 ti Nonidet P 40 2,44 i" Triton X-100 2,34 Nonion P-10 2,37 Tween 80 2,47 _____ ____ ____ ____ PluronicL 122 2,68 -26- On a préparé le l-linoléoyl-2-palmitoyl glycérol ci- dessus en faisant réagir de la trilinoléoyl-2-palmitoyl-sm- glycéro-3-phosphoryl-choline (Nippon Shoji Co, phospho- lipide synthétique) avec de la phospholipase C (Toyo Jozo Co). On a ajouté de la lipase pancréatique porcine ( 0,15 U/ml, 20 4 l) au mélange de réaction ci-dessus ( 1,00 ml), on a fait incuber à 37 C et on mesuré de manière continue le NAD réduit produit à 340 nm On a observé observé l'augmentation du facteur d'absorption en fonction du temps de réaction et l'augmentation de densité optique était de 0,082/min. Dans la réaction ci-dessus, de l'acide linoléique était libéré à partir du 1,2-diglycéride par l'action de la lipase pancréatique et un rapport molaire de 5 de NAD réduit a été produit par recyclage d'acyl-Co A synthétase, d'acyl-Co A oxydase et de HDT La quantité d'acide lino- léique est calculée en multipliant de coefficient en mmoles ( 6,1) de NAD réduit par le rapport 5 moles = 30,5 et l'activité de lipase est calculée comme suit: 1 1000 -01 activité de lipase (U/ml) = 0,082 x d x O = 0,13 ) Détermination de lipase en utilisant un monoglycéride: tampon 0,2 M Tris-H Cl (p H 7,2) 0, 5 ml 0,3 % 4-aminoantipyrine 0,3 " 0,2 % phénol 0,3 m M Mg C 12 0,l m M ATP 0,1 " 12 m M désoxycholate de Na 0,25 colipase ( 27 000 U/ml) 0,1 " ( 10 U/ml) glycérol kinase 0,05 ( 50 U/ml) glycérophosphate oxydase 0,1 " ( 50 U/ml) peroxydase 0,1 l m M l-oléoyl glycérol 0,1 (dissous dans 3 % Triton X-100) eau distillée 1,00 Total 3,0 ml -27- De la lipase ( 3,0 U/ml, 20 1) obtenue à partir de Chromobacterium viscosum a été ajoutée au mélange réac- tionnel ci-dessus, le mélange a été mis à incuber à 37 C pendant 10 minutes et on a mesuré le facteur d'absorption à 500 nm On a obtenu O Do 500 nm = 0,043 et on a calculé à partir de ce résuilat l'activité de lipase comme étant de 0,107 U/ml. 6) Détermination de lipase en utilisant un 1,2-phospho- diglycéride dérivé de phospholipase C et de lécithine: tampon 0,2 M diméthyl glutarate-Na OH (p H 7,5) 0,2-ml m M linoléoyl-2-palmitoyl lécithine (dissoute dans 3,7 % Nikkol OP-10) 0,1 r " phospholipase C ( 50 U/ml, Toyo Jozo Co) 0,05 acyl-Co A synthétase ( 10 U/ml) 0,1 " 50 m M Mg C 12 0,03 " 12 m M désoxycholate de Na 0,25 colipase ( 27 000 U/ml) 0,1 " m M Co ASH 0,05 " m M ATP 0,05 " eau distillée 0,07 " Total 1,0 ml Le mélange réactionnel ci-dessus ( 1,0 ml) a été mis à incuber à 37 C pour produire un 1,2-diglycéride ( 1 * linoléoyl-2-palmitoyl glycérol)-à partir de la l-linoléoyl- * 25 2-palmitoyl lécithine par une action de la phospholipase C. On y a ajouté de la lipase ( 0,6 U/ml, comme déterminé par émulsion d'huile d'olive-Adekatol SO-120, 20 11) obtenue à partir de Chromobacterium viscosum et le mélange a été mis à incuber à 37 C pendant 10 minutes On a arrêté la réaction par addition de 20 m M éthyl-maléimide ( 0,5 ml) On a ajouté le mélange de réaction II, 3) ci-dessus ( 1,5 ml) et l'ensemble a été mis à incuber à 37 C pendant 5 minutes, puis on a mesuré le facteur d'absorption à 500 nm pour obtenir O D = 0,091 et ainsi l'activité de lipase a été définie comme étant de 0,23 U/ml. -28- 7) Détermination de lipase en utilisant un 1-monoglycéride dérivé de phospholipase C et de lysolécithine: tampon 0,2 M diméthylglutarate-Na OH (p H 7,5) 0,2 ml 16 m M 1-oléoyl lécithine (dissoute dans 3,5 % Triton X100) 0,1 " phospholipase C ( 120 U/ml) 0,05 acyl-Co A synthétase ( 10 U/ml) 0,1 " m M Mg C 12 0,03 m M Co ASH 0,05 10 m M ATP 0,05 " 12 m M désoxycholate de Na 0,25 colipase ( 27 000 U/ml) 0,1 " eau distillée 0,07 Total 1,0 ml Le mélange réactionnel ci-dessus ( 1,0 mi) a été mis à incuber à 37 C pendant 30 minutes pour produire un 1-mono- glycéride à partir de la l-oléoyl lécithine par la phospho- lipase L'activité de lipase a été déterminée selon la méthode décrite en 6) ci-dessus et on a trouvé qu'elle était de 0,05 U/ml. 8) Détermin'ation de lipase en utilisant un 1,2-diglycéride dérivé de phosphatidate phosphatase et de phosphatidate: tampon 0,2 M Tris-HC 1 (p H 7,5) 0,2 ml m M phosphatidate (dissous dans 4 % Nonidet P-40) 0,1 " phosphatidate phosphatase ( 13 U/ml) 0,1 " acyl-Co A synthétase ( 20 U/ml) 0,05 m M Mg C 12 0,03 " m M Co ASH 0,05 10 m M ATP 0,05 " 12 m M désoxycholate de Na 0,25 colipase ( 27 000 U/ml) 0,10 eau distillée 0,07 Total 1,0 ml Le mélange réactionnel ci-dessus ( 1,0 ml) a été mis à incuber à 37 C pendant 10 minutes pour produire un -29- 1,2-diglycéride à partir du phosphatidate par la phosphatidate phosphatase. De la lipase pancréatique porcine ( 0,15 U/ml, 20 1) a été ajoutée au mélange de réaction et l'ensemble a été mis à incuber à 37 C pendant 10 minutes On a ajouté du m M N-éthylmaléimide ( 0,5 ml) pour arrêter la réaction. L'acide gras produit a été coloré par addition du mélange de réaction II 3) ci-dessus et mesuré à 500 nm On a obtenu O D '500 nm = 0,080, d'o l'activité de lipase a été définie comme étant de 0,20 U/ml. 9) Détermination de lipase en utilisant un 1-monoglycéride dérivé de phosphatidate phosphatase et de lysophospha- tidate: Le phosphatidate selon 8) ci-dessus a été remplacé par le lysophosphatidate pour mesurer l'activité de lipase comme étant de 0,03 U/ml. ) Détermination de lipase en utilisant un 1,2-diglycéride dérivé de phospholipase'D, de phosphatidate phosphatase et de lécithine: tampon 0,2 M PIPES-Na OH (p H 7,5) 0,2 mi m M 1,2-dioléoyl lécithine (dissoute dans 4 % Nonidet P-40) 0,1 " phospholipase D ( 20 U/ml, Toyo Jozo Co) 0,05 phosphatidate phosphatase ( 13 U/ml) 0,1 " acyl-Co A synthétase ( 20 U/ml) 0,05 m M Mg C 12 0,03 m M Co ASH 0,05 m M ATP 0,05 12 m M désoxycholate de Na 0,25 colipase ( 27 000 U/ml) 0,10 eau distillée 0,02 Total 1,0 ml Le mélange réactionnel ci-dessus ( 1,0 ml) a-été mis à incuber à 37 C pendant 15 minutes pour produire un 1,2- diglycéride à partir de la lécithine par la phospholipase D -30- et la phosphatidate phosphatase. On y a ajouté de la lipase pancréatique porcine ( 0,15 U/ml, 20 il) et le mélange a été mis à incuber à 37 C pendant 10 minutes On y a ajouté du 20 m M éthyl- maléimide ( 0,5 ml) pour arrêter la réaction L'acide gras produit a été coloré par addition du mélange de réaction II, 3) ci-dessus et mesuré à 500 nm On o obtenu O.D 500 nm = 0,072, d'o l'activité de lipase a été définie comme étant de 0,18 U/ml. 11) Détermination de lipase en utilisant un 1-monoglycéride dérivé de phospholipase D, de phosphatidate phosphatase et de lysolécithine: La lécithine dans le mélange réactionnel 10) ci-dessus a été remplacée par le l-monooléoyl lécithine pour produire un monoglycéride à partir de la lysolécithine par la phospholipase D et la phosphatidate phosphatase L'activité de lipase a été définie comme étnt de 0,028 U/ml. 25364 1 6 -31- REVENDICATIONS 1 Une composition pour la détermination de lipases comprenant un monoglycéride ou 1,2-diglycéride consistant en acide gras supérieur et un agent tensio-actif non-ionique. 2 Une composition selon la revendication 1, caracté- risée en ce que l'acide gras supérieur est un acide gras supérieur de plus de 12 atomes de carbone. 3 Une composition selon la revendication 1, dans laquelle l'acide gras supérieur est un acide gras supérieur insaturé de plus de 16 atomes de carbone. 4 Une composition selon la revendication 1, caracté- risée en ce que la concentration de monoglycéride ou de 1,2-diglycéride est de plus de 0,5 m M dans la composition. Une composition selon la revendication 1, caracté- risée en ce que l'agent tensio-actif non-ionique est un agent tensio-actif non-ionique du type polyoxyéthylène, un agent tensio-actif non-ionique du type alcool polyhydrique ou un agent tensio-actif non-ionique du type-polymère séquencé. 6 Une composition selon la revendication 5, caracté- risée en ce que l'agent tensio-actif non-ionique du type polyoxyéthylène est un polyoxyéthylène éther d'alcool d'acide gras, un polyoxyéthylène alcoylaryl éther, un poly- oxyéthylène ester d'acide gras, un ester d'acide gras de polyoxyéthylène sorbitanne, un ester d'acide gras de polyoxyéthylène sorbitol ou un dérivé de polyoxyéthylène et d'huile de ricin ou d'huile de ricin durcie. 7 Une composition selon la revendication 5, caracté- risée en ce que l'agent tensio-actif non-ionique du type alcool polyhydrique est un ester d'alcool polyhydrique de sorbitanne, de mannitol, de sorbitol ou de sucrose et d'un acide gras supérieur de plus de 12 atomes de carbone. 8 Une composition selon la revendication 5, caracté- risée en ce que l'agent tensio-actif non-ionique du type -32- polymère séquencé comprend des blocs de polypropylène et des blocs de polyoxyéthylène. 9 Une composition selon la revendication 1, carac- térisée en ce que la concentration de l'agent tensio-actif non-ionique est de plus de 0,1 % dans la composition. Une composition selon la revendication 1, carac- térisée en ce que l'agent tensio-actif non-ionique est un agent tensioactif non-ionique ayant une valeur HLB de plus de 10. 11 Une composition selon la revendication 1, carac- térisée en ce que la composition contient un désoxycholate et de la colipase. 12 Une composition selon la revendication 1, caracté- risée en ce que la composition contient du triphosphate d'adénosine, de la coenzyme A, du désoxycholate, de la colipase, de l'acyl-Co A synthétase, de l'acyl-Co A oxydase et un réactif colorant pour l'eau oxygénée. 13 Une composition selon la revendication 1, caracté- risée en ce que la composition contient du triphosphate d'adénosine, de la coenzyme A, du desoxycholate, de la colipase, de l'acyl-Co A synthétase, de l'acyl-Co A oxydase, de l'énoyl-Co A hydratase, de la 3- hydroxyacyl-Co A déshydrogénase, de la 3-cétoacyl-Co A thiolase et du nicotine adénine dinucléotide. 14 Une composition selon la revendication 1, caracté- risée en ce que la composition contient du chlorure de magnésium, du triphosphate d'adénosine, du désoxycholate, de la colipase, de la glycérol kinase, de la glycéro- phosphate oxydase et un réactif colorant pour l'eau oxygénée. Une composition selon la revendication 1, caracté- risée en ce que la composition contient du chlorure de magnésium, du triphosphate d'adénosine, du désoxycholate, de la colipase, de la glycérol kinase, de la glycéro- phosphate déshydrogénase et un accepteur d'hydrogène. -33- 16 Une composition selon la revendication 1, caracté- risée en ce que la composition contient du désoxycholate, de la colipase, de la glycérol déshydrogénase et du nicotine adénine dinucléotide 17 Une composition selon la revendication 1, caracté- risée en ce que le monoglycéride consistant en acide gras supérieur est un monoglycéride dérivé d'un mélange con- tenant de la phospholipase C et de la lysolécithine, de la phosphatidate phosphatase et de l'acide lysophosphatique, ou de la phospholipase D, de la phosphatidate phosphatase et de la lysolécithine. 18 Une composition selon la revendication 1, caracté- risée en ce que le 1,2-diglycéride consistant en acide gras supérieur est un 1,2-diglycéride dérivé d'un mélange contenant de la phospholipase C et de la lécithine, de la phosphatidate phosphatase et de l'acide phospha- tidique ou de la phospholipase Dr de la phosphatidate phosphatase et de la lécithine.