Brevet FR2537585A1 — publié le 19840615

"Procédé et produit pour stimuler la synthèse du pigment mélanique de la peau, notamment pour le traitement du vitiligo, et procédé de préparation de ce produit" La présente invention concerne un procédé et un pro- duit pour stimuler la synthèse du pigment mélanique de la peau, utiles essentiellement pour le traitement du vitili- go, maladie dermatologique produite par l'absence de pig- ment mélanique dans diverses régions du corps humain. On connaît divers composés chimiques,d'origine végé- tale ou semi-synthétiques,connus sous le nom de psoralènes qui, lorsqu'ils sont ingérés par le malade ou appliqués sur la peau de celui-ci,se concentrent dans les mélano- phores, c'est-à-dire les cellules qui produisent le pig- ment dermique en absorbant l'énergie du rayonnement ultra- violet et en produisant le pigment dermique (mélanique). Malheureusement ces produits chimiques connus présen- tent l'inconvénient d'être toxiques; ils peuvent en effet, lorsqu'on les applique sur la peau, produire une dermatose et une nécrose de la peau; si l'on ingère de tels composés, ils peuvent produire des désordres chimiques. De tels composés sont décrits dans les publications suivantes: Arnold, M J Jr "Psoralens and Suntan" Hawaii Med J 1957 16-391. Becker, S W Jr "Methods of increasing skin pigmentations". J Sec Cosmetic Ehem 1958-9-80. Fitzpatric, T B "Pigmentary Diseases" Current Therapy 1958, p 514. Becker, S W Jr "Effects of 8-Methoxy Posralen and ultra- violet light in human skin" Science 1958-127-878. Sidi, E Planat, P "Practical considerations on actual treatment of vitiligo" Revue of Medicine, 1968-23 Dec. Jusqu'à ce jour les psoralènes sont les meilleurs re- mèdes connus pour le traitement du vitiligo ou de la leu- codermie, mais ils ont,en plus de leur toxicité, un certain nombre d'inconvénients, notamment: un coût très élevé, un effet lent et réversible lorsque le traitement est ar- rêté, quelques difficultés d'application,étant donné qu'il est nécessaire d'accroître progressivement la durée d'ex- position aux rayonnements ultraviolets,et de graves réac- tions toxiques,telles que des brûlures,peuvent se produire quand on les applique sur la peau; enfin leur ingestion risque de produire une insuffisance hépatique et des trou- bles digestifs et nerveux. Par contre le produit selon l'invention stimule la synthèse du pigment mélanique de la peau et la reprodac- tion des cellules produisant le pigment mélanicpue, comme cela est prouvé par des tests phaxracologiques, sans les inconvénients précités. Des essais toxicologiques, tératologiques et clini- ques ont prouvé également qu'il n'y a pas de réactions se- condaires graves avec le produit selon l'invention. Le produit selon l'invention est facile à obtenir et facile à utiliser, car il ne nécessite qu'une courte durée d'exposition de la personne malade aux rayonnements ultra- violets; son efficacité commence très rapidement (au bout de 15 à 20 jours) après le traitement initial, la couleur de la peau résultant du traitement avec le produit selon l'invention est identique ou sensiblement identique à la couleur de la peau normale de la personne malade (avant sa maladie) et l'intensité de la couleur de la peau saine n'augmente pas, comme c'est le cas lorsqu'on utilise des psoralènes. Etant donné que le produit selon l'invention est ob- tenu à partir de tissus humains, il ne provoque pas de réaction immunologique et ne présente pas de contre-indi- cation relative à l'âge, le sexe ou la race. Le produit selon l'invention est destiné principale- ment à guérir le vitiligo Cette maladie est une des plus anciennes des maladies humaines Elle affecte approximati- vement 1 % de la population du globe sans discrimination d'âge, de sexe ou de race Son étiologie est inconnue et on ne connaît pas de médicament défini pour la combattre. Cette maladie est caractérisée par une décoloration pro- gressive de la peau des personnes atteintes,qui sont-su- jettes à un stress ou tension nerveuse importante Elle affecte défavorablement la psychologie des personnes at- teintes, ainsi que leur comportement socialdu fait que 1 o ses symptômes apparaissent sous la forme de zones de peau blanche entourées par un halo d'hyperpigmentation de la -figure, du tronc et d'autres régions. Le produit selon l'invention est obtenu par un nou- veau procédé pour extraire un composé des cotylédons pla- centaire humains On traite les cotylédons en utilisant des solvants organiques (alcool éthylique et acide benzol- ques) Puis on filtre au moyen d'un gel du type Sephadex. Le produit obtenu contient une lypo-protéine et l'essai de migration par électrophorèse permet de l'identifier comme une alpha lypo-protéine On lyophilise le produit et on -le dissout dans de l'alcool éthylique. On va donner maintenant quelques exemples de prépara- tion du composé selon l'invention. On part d'un kilogramme de cotylédons placentaires humains après leur congélation pendant 7 à 10 jours, puis on les triture et les fait macérer dans l'alcool éthylique à 95 % en parties égales (poids/volume) On filtre ensuite le produit obtenu à travers de la gaze fine et on le laisse décanter pendant 24 heures. On détermine ensuite l'activité pigmentaire du pro- duit surnageant actif, qui était positivependant 20 à 50 jours après son utilisation sur la peau de mamelles de cobayes. Ensuite on a prélevé 20 ml dans cet extrait avec le facteur de pigmentation et on a ajouté 10 ml d'al- cool éthylique saturé à 95 % d'acide benzoîque en utili- sant une aiguille hypodermique. Solution saturée d'acide benzoique/éthanol On prépare un mélange de 2 à 8 g d'acide benzoique dans 5 à 12 ml d'alcool éthylique à 95 % et on agite ce mélange pendant 10 à 15 mn, puis on le filtre sur un en- tonnoir de Buchner avec un papier filtre Whatman n 2 à 5, puis on lave le précipité en utilisant 200 à 500 ml d'eau saturée avec de l'acide benzoique. Solution saturée d'eau/acide benzoique On prépare un mélange de 2 à 10 g d'acide benzolque dans 300 à 1000 ml d'eau distillée Puis on élimine le précipitat sur le papier filtre en utilisant une spatule et on ajoute ensuite 100 à 500 ml d'acétone pure ou d'acé- tone à 30 % Puis on centrifuge le produit résultant à 1500 tours/minute pendant 10 à 30 mn en mettant de côté la portion surnageante. On lave le précipité de nouveau 2 à 10 fois en u- tilisant 100 à 500 ml d'acétone, puis on le sèche sous vide et à la température ambiante Puis on dissout le pro- duit dans l'alcool à 95 % et on utilise un cochon d'Inde ou cobaye pour déterminer l'activité pigmentaire Puis on filtre ml de ce produit à activité biologique au moyen d'un filtre Sephadex g-30 ou 100 équilibré au moyen d'un tampon de phosphate de sodium 5 par 10 à 5 par 10 6 M au p H 4 à 8, puis on en remplit une colonne de 1 à 3 cm de diamètre et 18 à 40 cm de hauteur par fractions de 5 à 10 ml c/u On a obtenu deux pics de protéine, le premier entre 100 et 300 mcg/ml et le second à 20-150 mcg/ml L'activité pigmen- taire était positive pour le second pic Elle apparaissait de 10 à 20 jours après que le mélange lyophilisé a été ap- pliqué sur la peau du cochon d'Inde. On a déterminé l'efficacité du produit selon l'inven- tion par des expériences cliniques effectuées sur 200 personnes malades, hommes et femmes du service de derma- tologie de l'Hôpital Calixto Garcia à La Havane Les ma- lades présentaient les lésions caractéristiques-du vitili- go,dispersées ou localisées sur leur corps et ayant des dimensions variées L'âge des patientsétait compris en- tre deux et soixante-quatre ans et ils ne se trouvaient sous aucun traitement au début des expériences Les ré- sultats obtenus pendant quatre ans et deux mois par mise en oeuvre de l'invention peuvent être résumés comme suit: total despersonnes malades 200 ( 100 %) total despersonnes repigmentées 168 ( 84 %) total despersonnes complètement 63 ( 31,5 %) repigmentées total des personnes partiellement 105 ( 52,5 %) repigmentées total des personnes non repigmen 5 ( 2,5 %) tées total dcspersonnes qui ont 27 ( 13,5 %) abandonné le traitement Il n'y a pas eu de réactiors secondaires locales ou sys- tématiques,ni rechute après le traitement Des biopsies ont été réalisées sur la membrane basale, ce qui a prouvé que le produit selon l'invention produit la synthèse du pigment mélanique de la peau en éliminant le défaut qui est la caractéristique de cette maladie et qui est produit en l'absence de pigment mélanique dans la membrane basale. Les biopsies mentionnées ont été réalisées au dépar- tement d'anatomie pathologique à l'Hôpital Calixto Garcia. Le procédé d'utilisation du produit selon l'invention pour guérir le vitiligo est le suivant - On applique le produit selon l'invention, qui se pré- sente sous la forme d'une lotion,topiquement trois fois par jour en frottant fortement avec les doigts les zones affectées,jusqu'à rougissement Puis on expose à la lu- mière du soleil ou à la lumière ultraviolette les zones ainsi traitées, pendant 15 mn une fois par jour après l'une des applications journalières du produit. La quantité journalière à utiliser dépend de la dimen- sion et du nombre des zones affectées du corps du patient. Cette quantité n'est pas critique étant donné qu'il n'y a pas d'effet secondaire ou toxique, ainsi que cela a été constaté au cours des traitements effectués à l'Hôpital Calixto Garcia. Des essais précliniques effectués sur des souris, des rats, des cochons d'Inde et des lapins, avec application topique du produit trois fois par jour,suivie d'une expo- sition journalière de 15 mn à la lumière du soleil, n'ont pas permis de constater d'altération macroscopique ou microscopique, bien que la durée de l'expérience a duré fort longtemps (une année entière avec des animaux adultes, à 75 jours avec des femelles enceintes et 15 jours avec des animaux nouveaux-nés) Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs dé- jà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse, au con- traire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un composé du type alpha- lypo-protéine pour stimuler la synthèse du pigment méla- nique de la peau afin de guérir le vitiligo sans effet toxique, avec une efficacité non réversible après cessa- tion du traitement, caractérisé en ce qu'on extrait ce com- posé de cotylédons placentaires humains au moyen de sol- vants organiques, puis filtration suivie d'une lyophilisa- tion et d'une solution dans l'alcool éthylique. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit solvant organique-est constitué par de l'al- cool éthylique et/ou de l'acide benzoique. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la filtration a lieu au moyen d'un gel de Sepha- dex. 4 Composé du type alpha-lypo-protéine pour stimuler la synthèse du pigment mélanique de la peau afin de guérir le vitiligo sans effet toxique, avec une efficacité non réversible après cessation du traitement, caractérisé en ce qu'il est préparé par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 '