Brevet FR2537993A1 — publié le 19840622

La présente invention est relative à un procédé nouveau et amélioré pour la production de gamma-interféron humain Il est connu que les leucocytes humains produisent du gamma-interféron (interféron immun) sous lgeffet d'agents mitogènes Le gamma-interféron diffère cependant, par ses propriétés biologiques; des alpha-interférons leucocytaires et des béta-interférons fibroblastiques, produits à la sutie d'une infection virale par des leucocytes et formés sous l'influence de polynucléotides de synthèse dans des cellules d'origine fibroblastique, respectivement. Grâce à son effet inhibiteur de la division cellulaire et son influence sur le fonctionnement des cellules du système immunologique, le gamma-interféron manifeste des effets nettement plus intéressants que ceux des alpha- et beta- interférons et le gamma-interféron est, en conséquence, de plus en plus largement utilisé en thérapie des maladies tumorales ÇNature 294, 6 (1981), Celular Immunology 49, 390 (1980)JO Du gamma-interféron peut etre, produit par la séparation de la fraction leucocytaire (couenne) du sang, l'élimination des érythrocites par centrifugation oblique, ou de préférence par une hémolyse réalisée par traitement avec du chlorure d'ammonium, incubation des leucocytes purifiés, traitement de ceux-ci avec des agents mitogènes spécifiques convenables et enfin isolation du gamma-interféron ainsi produit du liquide surnageant. Conformément à l'art antérieur, on peut utiliser la Concanavaline A fect. Immun. 26, 36 (1979)7, Phytohemagglutinine prou. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1601 (1981)2 ou Entérotoxine Sont. Res. Commun. Sys. Med. Sci. 7, 595 (1979)2 à titre d'agent mitogène. Selon l'art antérieur, plusieurs essais ont été faits pour augmenter la production de gamma-interféron induit par des agents mitogènes. Conformément à un procédé, la production de gamma-interféron est accrue par pré-traite ment des leucocytes avec du 12-O-tétradécanoyl-phorbol- 13-acétate rVilcek et al. o Biochemical Characterization of Lymphokines - Academia, New York, page 323, (1980)i. Linconvient de cette méthode réside en ce que le 12-O tétradécanoyl-phorbol-1 3-acétate est une substance cancérogène et qu'alors, le gamma-interféron ainsi produit, ne convient évidemment pas pour être utilise en thérapie humaine. Selon une autre référence, nature 292, 842, (1981)J les auteurs essaient d'accroître la production de gamma-interléron en traitant les leucocytes avec du butylate de sodium ou du dexamethason, ces essais ont été cependant infructueux. La présente invention a pour objet d'augmenter la production de gamma-interféron par des leucocytes, induite par des agents mitogènes et d'élever le nombre d'unités par ml. Conformément à la présente invention, on fournit un procédé pour la production de gamma-interféron humain, selon lequel on sépare la fraction leucocytaire (couenne) du sang, on enlève les érythrocytes, on met en suspension les leucocytes dans un milieu nutritif convenable, on trai- te ceux-ci avec un agent mitogène et l'on sépare le liquide contenant l'interféron des cellules, caractérisé en ce qu'on pré-traite les leucocytes avec de préférence 200 à 20 000 IU (ml d'alpha- ou de béta-interféron avant d'effectuer le traitement avec l'agent mitogène. La présente invention repose sur la constatation que la production de gamma-interféron peut être notablement accrue - d'environ 500 à 1000 % - lorsqu'on soumet les leucocytes à un pré-traitément avec de llalpha- ou du béta-interféron avant de les traiter avec l'agent mitogène. L'alpha- ou le béta-interféron est utilisé pour le prétraitement en une quantité de 200 à 20 000 IU/ml, de préférence de 500 à 5 000 IU/ml. (IU = Unité Internationale) Conformément à une modalité préférée du procédé de la présente invention, le traitement est réalisé avec une quantité de 100 à 2000, en particulier de 1500 IU/ml d'alpha-interféron. Conformément à une autre modalité préférée de la présente invention, le traitement est réalisé avec une quantité de 2 000 à 3 000, en particuliér 2 500 IU/ml de béta-interféron. Le prétraitement est de préférence réalise 1 à 12 heures, en particulier 2 à 8 heures et plus avantageusement, 4 heures avant le traitement avec l'agent mitogène- Le prétraitement avec de l'alpha- ou du béta-interféron est de préférence effectué pendant environ 1 à 12 heures, en particulier pendant environ 4 heures. La température de ce prétraitement est de préférence de 35 à 390C et en particulier elle est de 370C. L'interféron est de préférence- enlevé après le prétraitement par l'alpha- ou le béta-interféron et avant l'addition d'agent mitogène. Cette étape peut être réalisée de préférence par lavage des cellules, en particulier avec une solution de Hanks. On peut aussi procéder en laissant l'interféron utilisé pour le prétraitement dans le milieu nutritif des cellules. Dans ce cas, le gamma-interféron produit doit être séparé de l'alpha- ou du béta-interféron utilisé dans l'étape de prétraitement. La séparation peut être effectuée par des méthodes connues en elles-mêmes, par exemple, par chromatographie sur verre. A titre de milieu nutritif dans le procédé conforme à la présente invention, on peut utiliser des milieux nutritifs pour culture de tissu contenant divers amino-acides et vitamines (par exemple, MEM du type Eagle, RPMI 1640 MEM du type Dulbecco, MEM modifié de Glasgow, etc). On pr- fère utiliser un milieu nutritif qui présente la composition suivante ; l'avantage de ce milieu est qu'il n'est. pas coûteux, qu'il-est simple et facilement applicable dans un autoclave. Composant Quantité Chlorure de calcium 175-350 mg/l potassium 300-500 Sulfate de magnésium ou une quantité équivalente de chlorure de magnésium 175-500 Chlorure de sodium 5000-7000 Carbonate acide de sodium 200-3500 -Phosphate d'acide de sodium 30-150 " Glucose 500-5500 Nitrate ferrique 0-0,2 Sérum 0,5-10 La production de gamma-interféron est réalisée en présence de divers sérums sanguins d'homme ou d'animaux, ou de plasma dépourvu de gamma-globuiine (0,5 à 10%). Conformément au procédé de la présente invention, des leucocytes (couenne) obtenus à partir de sang humain traité par un anticoagulant, conservé pendant une période inférieure ou égale à 72 heures à 0-80C, sont utilisés comme matière de départ. On peut employer une solution ACD (solution contenant de l'acide citrique et du dextrose) ou une solution ACD complétée avec diverses bases (par exemple,adenine ou guanine) comme anticoagulant. Les leucocytes collectés peuvent être éliminés par centrifugation oblique (par exemple, avec l'aide de Ficoîl ou Percoll - fabricant -: Pharmacia Suède) ou, de préférence, par hémolyse effectuée avec du chlorure d'ammonium. On peut procéder de préférence en mélangeant la suspension concentrée de leucocytes avec une solution de chlorure d'ammonium de 0,5 à 1% - de préférence 0,83 % - à une température de 0 à 100C, selon un rapport volume/volume de 1 : 3 à 20, de préférence 1 : 5. La solution est incubée pendant 5 à 20 minutes - de préférence pendant environ 10 minutes - entre 0 et 80C avec ou sans agitation. Les leucocytes sont séparés des érythrocytes dé sagrégés, par exemple par centrifugation.On peut procéder de préférence en répétant le traitement par le chlorure d ammonium, en utilisant 10 parties en volume de solution de chlorure d'ammonium pour 1 partie en poids de suspension de cellules Les leucocytes purifiés sont mis en suspension dans un milieu nutritif pour culture de tissu (par exemple un MEM de type Eagle, RPNI 1640, MEM de type Dulbecco, MEM modifié de Glasgow, etc) ou dans un milieu nutritif moins coûteux, tel que décrit plus haut (ne contenant ni amino-acides, ni vitamines) et le nombre de cellules est ajusté à une valeur comprise entre 106 et î08çellules/m. Conformément à une forme avantageuse de réalisation du procédé, on utilise le milieu utritif bon marché décrit plus haut et ne contenant ni aminoacides ni vitamines, à la fois pour remettre en suspension les cellules et pour ajuster le nombre de cellules.Le milieu nutritif ou la solution nutritive utilisé est complété avec du sérum sanguin humain ou animal, ou de préférence avec du plasma humain dépourvu de gamma-globuline (0,5 à 10P. On préfère ajouter un antibiotique au milieu nutritif ou à la solution nutritive ; à ce propos, la néomycine peut avantageusement être choisie et utilisée à une concentration d'environ 10 à 50/9g/ml, en particulier 25 gemlQ Les cellules sont alors soumises à un traitement avec l'alpha- ou le béta-interférèn.Pour cela, on peut utiliser de l'alpha- ou du béta-interféron brut ou purifié, dépourvu d'inducteur (sans virus, ni polynucléotides de synthèse) en une quantité de 200 à 20 000 IU/ml.Ce prétraitement est effectué à une température d'environ 35 à 39"C, de préférence à 370C, pendant environ 1 à 12 heures et de préférence pendant 4 heures. L'interféron utilisé dans cette étape de prétraitement peut être enlevé des cellules, de préférence par lavage. Cette étape peut être accomplie de préférence par utilisation d'une solution de Hanks. Après avoir éliminé par lavage l'interféron, on ajuste la concentration cellulaire à la valeur initiale dans un milieu nutritif ou une solution nutritive qui renferme du sérum animal ou humain, ou du plasma débarrassé de gamma-globuline, de préférence du sérum humain dépourvu de gamma globuline Il n'est pas absolument nécessaire d'enlever par lavage l'interféron, parce que la présence d'alphaou de béta-interféron ne nuit pas à la production du gamma-interféron.Dans ce cas, le gamma-interféron produit est séparé de l'alpha- ou du béta-interféron présent, selon des méthodes connues. Les cellules sont alors mises en contact avec un inducteur d'interféron convenable. A ce propos, on peut utiliser de préférence la Concanavaline A, la Phytohemagglutinine, la Staphylococcus enterotoxine etc. - indiqués plus haut - . Conformément à une modalité préférée du procédé de la présente invention, on emploie la Concanavaline A comme inducteur, de préférence à la concentration de 2,5 à 30/gXmly en particulier 15 g/ml. L'induction est généralement effectuée pendant environ 5 à A8 heures, de préférence pendant 10 à 12 heures à une température d'environ 35 à 390C, de préférence à 370C. Après une certaine période de temps (environ une heure) l'inducteur peut être éliminé par lavage ; cette étape peut cependant être omise, parue que la présence de l'inducteur ne nuit pas à la production de gamma-interféron. L'inducteur n'est donc pas éliminé en général. Ensuite, les cellules sont enlevées de la couche surnageante par centrifugation. La couche surnageante contient le gamma-interféron brut qui peut être conservé à basse température (à environ -200C), ou bien purifié selon des méthodes connues. Applicabilité à l'échelle industrielle L'avantage du procédé conforme à la présente in- vention est, qu'à la suite du prétraitement effectué avec l'alpha- ou le béta-interféron, la production de gamma-interféron est accrue de 5 à 10 fois. Les propriétés physico chimiques (sensibilité à pE 2, stabilité mesurée à 560 et à 370C) et l'activité biologique- (effet antiviral et effet anticellulaire) du gamma-interféron -produit conformément au procédé de la présente invention, sont complètement équivalentes et égales à celles du gamma-interféron produit par des méthodes classiques. Outre les dispositions qui précèdent,l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'inventiont dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 Du sang obtenu dans une solution ACD (solution aqueuse contenant de l'acide citrique et du dextrose) est conservé à +40C pendant 3 heures. La fraction de "couenne" est recueillie par centrifugation et-laissée reposer 16 heures à +4"C. On mélange 1 partie en volume d'un concentrat de leucocytes ainsi obtenu, avec 5 parties en poids d'une solution aqueuse à 0,83 de chlorure d'ammonium (température : +40C). La suspension est laissée reposer à +4 C C jusqu'à dissolution des érythrocytes ( 5 à 10 minutes) et les leucocytes sont isolés par centrifugation-. Les leucocytes sont mis en suspension dans un milieu nutritif ayant la composition suivante. Composant Quantité mg/l Chlorure de calcium 265 Nitrate férrique 0,1 Chlorure de potassium 400 Sulfate de magnésium heptahydraté 200 Chlorure de sodium 6400 Carbonate acide de sodium 2750 Phosphate diacide de sodium dihydraté 140 Glucose 4500 La dissolution des érythrocytes par la méthode ci-dessus est répétée, si ce n'est que 10 parties en volume d'une solution aqueuse à 0,83% de chlorure d'ammonium sont utilisées. Les leucocytes sont mis en suspension dans une solution nutritive ayant la composition ci-dessus et le nombre de cellules est ajusté à la valeur de 107/ml. La solution nutritive renferme 2 mg/ml de gamma-sérum humain et 25 g/ml de néomycine. Les cellules sont traitées avec une quantité de 1500 IU/ml d'alpha-interféron concentré, traité (débarrassé du virus Sendai) à pH 2, sous agitation constante.Ensuite, l'alpha-X-nterféron utilisé pour le prétraitement est enlevé par lavage à deux reprises avec une solution de Hanks. Les cellules sont traitées avec une quantité de 15 g/ml de Concanavaline A et incubées à 370C pendant 12 heures, sous agitation constante. La teneur en gamma-interféron du liquide surnageant se monte à 50 000 IU/ml. A titre de comparaison, l'exemple ci-dessus est réalisé de la même façon, si ce n'est que les leucocytes ne sont pas traités avec l'alpha-interféron, avant addition de linduc- teur. Le titre du gamma-interféron ainsi obtenu nratteint que 6 500 lU/ml Exemple 2 On répète la procédure de l'exempl,,e 1,-si ce n'est que le milieu nutritif MEM du type Glasgow sert de solution nutritive- Sirology 14, 359 (1961 > J. La teneur en ingrédient actif du gamma-interféron brut ainsi obtenu se monte à 48 000 IU/ml. Le procédé ci-dessus est répété, si ce n'est que le traitement avec l'alpha-interfEron est omis. La teneur en ingrédient actif du gamma-interféron brut ainsi obtenu, n'atteint que 6 200 IU/ml. Exemple 3 On procède selon la manière qui est décrite dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on n'élimine pas l'alpha-interféron utilisé pour le prétraitement. Le traitement avec l'alpha-in terphéron ayant été achevé, les cellules sont incubées avec agitation, en présence de 15,Omg/ml de Concanavaline A, à 37 C pendant 12 heures, sous agitation constante. La teneur en inteflVéron du liquide surnageant s'élève à 52 000 IU/ ml. Le produit ainsi obtenu, contenant de l'alpha- et du gamma-interféron, est séparé en ses composants par chromatographie sur verre CPG. Le produit brut est appliqué sur une colonne garnie de verre CPG, llalpha-interféron et les contaminants passent à travers la colonne, tandis que le gamma-interféron reste fixé. Le gamma-interféron est élué avec une solution aqueuse contenant 20 parties en volume d'éthylène glycol, 150 millimoles de chlorure de sodium et 20 millimoles de tampon au phosphate. Exemple 4 On répète la procédure de l'exemple 1, si ce n'est que dans l'étape de prétraitement, on utilise 2 500 lU/ml de béta-interféron à la place de l'alpha-interféron. La teneur en gamma-interféron du produit brut ainsi obtenu est de 56 000 IU/ml. Le procédé ci-dessus est répété, si ce n'est que le prétraitement avec le béta-interféron est omis. On recueille ainsi du gamma-interféron brut ayant une teneur en ingrédient actif de 6 800 IU/ml. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, llinven- tion ne se limite nullement à ceux de ses modes qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à les prit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. Revendications 1. ProcédA pour la production do gamma-interféron hu- main par séparation de la fraction leucocytaire (couenne) du sang, élimination des érythrocytesemise en suspension des leucocytes dans un milieu nutritif convenable, traité tement de ceux-ci avec un agent mitogène, et séparation du liquide contenant l'interféron des cellules, caracté- risé en ce qu'il comprend le prétraitement des leucocytes avec un alpha- ou un béta-interféron avant le traitement avec un agent mitogène 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue le prétraitement avec une quantité de 200 à 20 000, de préférence 500 à 5 000 IU/ml d'alpha- ou de béta-interféron. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on effectue le prétraitement avec une quantité de 1000 à 2000 TU/mle de préférence 1500 lU/ml d'alpha-inter- féron. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on effectue le prétraitement avec une quantité de 2 000 à 3 000 lU/ml, de préférence 2 500 TU/ml de bêta- interféron 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on effectue le--prétraitement 1 à 12 heures, de préférence 2 à 8 heures et plus avantageusement 4 heures avant le traitement avec l'agent mitogène. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on effectue le prétraitement avec de l'-alpha- ou du béta-interféron pendant 1 à 12 heures, de préférence pendant 4 heures. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on élimine,en le lavant, l'aipha-. ou le béta-interféron utilisé dans le pré-traitement, avant de procéder au traitement avec l'agent mitogène. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, ca ractérisé en ce qu'on utilise la Concanavaline A, la Phytohémagglutine ou 1'Entérotoxine comme agent mitogène. 9. Procédé selon l'une des revendicatiosn 1 à 8, caractérisé en ce qu'on enlève les érythrocytes de la fraction de couenne du sang, par hémolyse avec du chlorure d'ammonium. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérise en ce qu'on utilise à titre de milieu nutritif, une solution aqueuse contenant 175 à 350 mg/l de chlorure de calcium ; 300 à 500 mg/l de chlorure de potassium 175 à 500 mg/l de sulfate de magnésium ou une quantité équivalente de chlorure de magnésium 1 5000 à 7000 mg/l de chlorure de sodium ; 200 à 3500 mg/l de carbonate acide de sodium ; 30 à 150 mg de phosphate acide disodique 500 à 5500 mg/l de glucose et éventuellement 0,05 à 0,2 mg/l de nitrate ferrique et 0,5 à 10% de sérum.