Brevet FR2540501A1 — publié le 19840810

La présente invention se rapporte au domaine de la médecine et a notamment pour objet un nouvel analogue cyclique de l'homone tissulaire qu'est l'angiotensine, à savoir, la cyclo (I# -8)-/LysI/ angiotensine, possédant un effet hypotensif et pouvant être utilisée en médecine en tant que principe actif de médicament. On connaRt des analogues de structures proche du composé proposé : la cyclo (Ie -8)-angiotensine, la cyclo (2# -8)-/dés-Asp1, Lys2/ angiotensine et la cyclo (2#-8)-/dés-AspI, Orn, (Phe-Gly)8/angiotensine ("Peptides : Chemistry, Structure and Biology" (Eds. Walter R., Meienhofer J.). New-York, AnnArlor Science, 1975. De Coen J.L. et al. "Cyclic an giotensin", p. 53; "Chimie bio-organique1', 7, 1981; Vegner R.E., Chipens G.I., Grinsteine I.V. et al. "Synthèse des analogues linéaires et cycliques de l'angiotensi- ne modifiés aux positions 9 et 5 ", voir p. 325). Cependant, le premier composé ne possède aucune activité vasculaire, et pour les deux autres composés cette activité ne s'exprime que très faiblement Aucun analogue de l'angiotensine possédant une activité hypotensive n'est connu actuellement L'analogue cyclique de l'angiotensine faisant l'objet de l'invention, c'est-à-dire la cyclo (I# -8)-/LysI/ angiotensine, n'a pas été décrite jusqu'ici dans la littérature. L9invention est donc destinée à résoudre le problème de l'obtention d'un nouvel analogue de l'hormone tissub laire qu'est l'angiotensine, possédant un effet hypotensif. Le nouvel analogue cyclique de l'angiotensine faisant l'objet de l'invention, c'est-à-dire la cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine, est caractérise en ce qu'il répond à la formule Le composé conforme à l'invention possède un effet hypotensif. Ladite nouvelle substance, la cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine, répondait à la formule: est une poudre blanche amorphe à température de fusiondécomposition supérieure à 220 C. Données de l'analyse élémentaire Trouvé (% en poids): C 55,17: H 7,38: N 16,01. Calculé pour C52H76N14O9. 2CH3COOH. 3H2O C 55,34, H 7,46; N 16,13. Données de l'analyse, des amino-acides: Lys-1,01 ; Arg-0,9 ; Val-1,11 ; Tyr-0,83 ; Ile-0,97 ; His-1,07 ; Pro-0,78 ; Phe-0,90. Données de l'analyse électrophorétique : l'activité électrophorétique est déterminée par rapport à l'histidi- ne dans l'acide acétique 5N sur papier FN-15 (RDA), à une différence de potentiel de 900V; pour la nouvelle substance de l'invention: EHis = 0,73 (pH 1,9). Données de l'analyse chromatographique: la mobilité chromatographique sur plaques '1Merck" constitue Rf 0s59 (acétate d'éthyle-pyridine-acide acétique-eau 5:3:1:2). L'activité biologique de la cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine a été étudiée en procédant à des expériences in vivo et in vitro, en utilisant, en qualité de préparatlon standard, l'angiotensinamide. Lors des expériences in vivo, on a déterminé l'influence de la cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine sur le pression artérielle des rats. Les expériences ont été faites sur des rats blancs des deux sexes, d'une masse de 180^200 g, narcotisés à l'uréthane. Les substances ont été intro duites dans la veine fémorale à des doses de 0,5 à 1200 g/kg.Pour l'étude de l'influence du nouvel analogue cyclique de l'angiotensine sur l'effet de l'angiotensi- namide, on a administré à l'animal la dose à étudier de cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine, et une fois l'influence de celle-ci terminée, on a administré une dose a'an- giotensinamide de 1 > ig/kg Celle-ci a été introduite sur fond d'effet prolongé de doses élevées de cyclo LysI/ angiotensine, trois minutes après l'établissement d'une pression constante. La pression artérielle a été enregistrée sur l'artère carotide primitive à l'aide d'un manomètre à mercure sur une bande ndircie de kymographe. L'activité myotrope de la cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine a été étudiée lors d'expériences in vitro d'après la méthode de van Rossum, par enregistrement des contrac tisons isotoniques du côlon ascendant du ratO ("Arch. Int.Pharmacodyn"., 1963, 143; Van Rossum. Cumulative dose-response curve. Il. Technique for the making of dose-response curve in isolated organs and the evaluation of drug parameters, p. 299-330). Les propriétés agonistiques et antagonistes de la cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine ont été étudiées dans la gamme de concentrations de 10-10 à 10-5 M. On a déterminé les paramètres caractérisant l'interaction de la subs tance avec les récepteurs (&alpha;- - activité intérieure, pD2 - affinité spécifique) et on a calculé l'indice d'antagonisme concurrent pA20 La durée d'exposition préalable des organes avec le composé à étudier lors de la détermination de son effet antagoniste a été de 3 minutes. Pour le calcul- des courbes de valeurs cumulées "concentration-effet", chaque point a été défini comme la moyenne de 6 expérience + l'erreur standard pour Pe0,05 Lors des expériences précitées, les essais in vivo sur des rats narcotisés à l'uréthanne ont permis d'établir qu'en cas d'introduction intraveineuse à une dose de 60 Sg/kg, la cyclo (I# -8)-/LysI/ angiotensine ne modifie pas le niveau de la pression sanguine et n'influe pas sur l'effet de la dose d'angiotensinamide de 1 pg/kg. Aux doses de 120, 300, 600 et 1200 g/kg, au lieu de l'effet presseur propre à l'angiotensine, la substance à étudier manifeste d'une manière inattendue, en fonction de la dose administrée, un effet hypotensif prononce(1733, 2932,6, 4399 et 6665 Pa, ou 13, 22, 33 et 50 mm de Hg, respectivement). Avec l'augmentation de la dose, augmente la durée de l'effet hypotensif, constituant 1 minute à la dose de 120 g/kg, 1,5 minute à la dose de 300 g/kg, de 10 à 2Q minutes à la dose de 600 g/kg ; et à la dose de 1200 g/kg la pression artérielle ne se rétablit pas durant- 30 minutes (elle atteint en moyenne 60,V/o du niveau initial).Aux doses élevées (1220 g/kg), la cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine, sur fond d'effet hypotensif, est également douée d'une action antagoniste relativement à l'angiotensine (l'effet de l'angiotensine à la dose de 1 Xg/kg diminue de 5Q0,o), mais l'action antagoniste dure en moyenne environ 10 minutes, après quoi l'effet presseur de l'angiotensine se rétablit complètement. Dans les expériences in vitro sur le côlon ascendant du rat dans une gamme de faibles concentrations (10 9 à 10-7 M), la cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine exerce une action d'inhibition concenrrentede l'effet myotrope de l'angiotensine (pA2 = 8,83+0,5). L'analogue cyclique de l'angiotensine à étudier n'est doué que d'une activité myotrope rudimentaire :&alpha;=0,39 # 0,03 ; pD2 = 5,8#0,1. La toxicité de la cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine a été étudiée lors d'expériences sur des souris blanches par introduction intraveineuse. Il a été établi que sa DL50 constitue 35+6 mg/kg, ce qui excède de plus de 30 fois la dose maximale étudiée. La cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine est obtenue de la manière suivante. Par réaction de N -benzyloxycarbonyle de lysine avec l'ester p-nitrophénylique de tertiobutyloxycarbonyl-phény lalanine, on obtient la Nss;- benzyloxycarbonyl-N# (tertiboutyloxycarbonyl-phénylalanyl)lysine ; par traitement avec une solution 4N d'hydrogène chloré dans l'éthylacétate on sépare le groupement &alpha;- tertiobutyloxycarbonyle et on condense l'hydrochlorure de N&alpha;;- bonzy loxycarbonyl-N@-phénylanyl - lysine obtenu avec la tertiobutyloxycarbonyl -valyl-O-benzyltyrosyl-isoleucyl-Nim benzylhistidyl-proline par la méthode de l'azoture. Après l'élimination du groupement tertiobutyloxycarbonyl, le produit obtenu est condensé par la méthode des anhydrides mixtes avec la tertiboutyloxycarbonyl-NG-nitroarginine, et par traitement avec le complexe "# " on obtient un ester pentafluorophénylique d'octapeptide On sépare ensuite le groupement tertiobutyloxycarbonyle, on réalise une cyclisation dans une solution de dioxanne et on sépare tous les groupements protecteurs par hydrogénolyse cata lytique Pour une meilleure compréhension de la présente in vention, plusieurs exemples concrets mais non limitatifs de synthèse de la cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine faisant l'objet de l'invention sont décrits ci-après et sont illustrés par le schéma annexé. Pour la synthèse de la cyclo (I8)-/Lys1/-angiotens- ine on utilise des dérivés d'amino-acides de la firme "Reanal" (Hongrie). Tous les amino-acides sont de confi guration L. Les températures de fusion déterminées dans des capillaires ouverts sont présentées sans corrections. L'identité de tous les composés obtenus est contrôlée par chromatographie dans une mince couche de silicagel de la marque "Merck" et par la méthode de résonance magnétique nucléaire. Les mobilités chromatographiques sont déterminées dans les sytèmes suivants: A- chloroforme-alcool méthylique-acide acétique (85:10:5); B-chloroforme-alcool éthylique-alcool n-butylique acétate d'éthyle-eau (10:6:4: 3:1); C-chlorofoime-alcool éthylique-acétate d'ethyle-acide acétique-eau-alcool isopropylique (20:1:2:0,5:0,1:0,1). D-alcool n-butylique-eau-acide acétique (4:1:1); E-chloroforme-alcool méthylique-acétate d'éthyle-eau (8:6:8:2); F- acétate d'éthyle-alcool n-butylique-acide acétique-eau (2:1:1:1); G- acétate d'éthyle-pyridine-acide acétique eau (5:3:1:2). La mobilité électrophorétique a été déterminée relativement à l'histidine EHis is sur papier FN-15 dans une solution 5N d'acide acétique (pH 1,9). L'analyse de la composition en amino acides a été effectuée sur appareil Liquimat III. N -benzyloxycarbonyl-N#-(tertiobutyloxycarbonyl- phénylalanyl) lysine (3). On agite pendant 4 heures, à a température ambiante, une suspension de 4,2 g (0,015 mole) de N&alpha;-benzyloxy- carbonyl-lysine(2) et de 5,8 g (0,015; mole) d'ester p- nitrophénylique de tertiobutyloxycarbonyl-phénylalanine (1) dans 50 ml de diméthylformamide (DMFA); à la fin de la réaction, la solution estlimpide. On réduit le volume de la solution par évaporation, on dissout ensuite le résidu dans l'acétate d'éthyde et on lave successivement avec une solution à 5% de bicarbonate de sodium, avec de l'eau, avec une solution à 5 % de bisulfate de sodium, et de nouveau avec de l'eau. On réduit le volume de l'acétate d'éthyle par évaporation et on reprécipite le résidu dans l'éther et l'hexane.Le séchage se fait sous vide au-dessus de KOH/P2O5. Rendement: 7g (91,3%); F(température de fusion) = 59-610C. EHis =0,11 (pH 1,9); Rf=0,68(B); Rf=0,52 (A). Hydrochlorure de N&alpha;-bonzyloxycarbonyl-N&alpha;-hénylalanyl lysine (5). A une solution de 7g (0,014 moM) de N&alpha; -benzyl oxycarbonyl-N&alpha;-(tertiboutyloxycarbonyl-phénylalanyl)- lysine (3) dans 30 ml d'acétate d'éthyle, on ajoute 12,3 mi (0,49 mole) d'une solution 4N d'acide chlorhydrique dans l'acétate d'éthyle. On maintient pendant 30 minutes à 200C, puis on procède à une évaporation sous vide. On soumet le résidu à une trituration à l'éther, on le filtre et on le sèche sous vide au-dessus de P2O5/KOH. Rendement : 6,1 g (98%). EHis = 0,5 (pH 1,9); Rf=0,27 (B) ; Rf=0,12 (A). Tertiobutyloxycarbonyl-valyl-O-benzyltyrosyl-isoleucyl Nim-benzylhistidyl-prolyl-phénylalanyl-N&alpha;-benzyloxycarbonyl- lysine (6). A une solution, refroidie jusqu'à -200C, de 0,5g(0,54 mmole) d'hydrazide de tertiobutyloxycarbonyl-valyl-Obenzyltyrosyl-isoleucyl-Nim-benzylhistidyl-proline (4) dans 20 ml de DMFA on ajoute 0,5 ml (2 mmole) d'une solution 4N d'acide chlorhydrique dans l'acétate d'éthyle, 0,062ml (0,54 mmole) de tertiobutylnitrite dans 3 ml de DMFA et on maintient pendant 30 minutes à -20 C et pendant 10 minutes à -50. On refroidit le mélange réactionnel à -400C et on ajoute une solution refroidie à -10 C de 0,28ml (2mmole) de triéthylamine dans 5 ml de DMFA et une solution refroidie à -20 C de N&alpha;;-benzyloxycarbonyl-N# -phénylalanyl-lysine (5) préparée par addition de 0,075 ml (0,54 mmole) de triéthylamine à une solution refroidie à 0 C de 0,23 g (0,54 mmole) d'hydrochlorure de N&alpha;-benzyloxycarbonyl-N -phénylalanyllysine dans 10 ml de DMFA (le précipité de chlorure de triéthylammonium est éliminé par filtration). On maintient pendant 24 heures à 4 C, puis on concentre la DMFA par évaporation sous vide, on triture le résidu avec de l'eau, ensuite on le filtre. On le sèche sous vide audessus de P2O5/KON. Rendement: 0,5 g (70,4%); F=127 à 1300C; Rf=0,67 (D); Rf=0,56 (A); Rf=0,77 (B). Di-hydrochlorure-valyl-O-benzyltrosyl-isoleucyl-Nim benzylhistidyl-prolyl-phénylalanyl-N&alpha;-benzyloxycarbonyl- -lysine (8). A une solution de 0,48 g -(0,36 mmole) de tertiobutyl oxycarbonyl-valyl-O-benzyltyrosyl-isoleucyl-Nim-benzylhis ti dyl-prolyl-phénylal anyl- -benzyloxyc arbonyl-lysine (6) dans IO ml d'acide acétique, on ajoute 3,15 ml (1,26 mmole) d'une solution 4N d'acide chlorhydrique dans l'acide acétique. On maintient dans le vide, puis on triture le résidu à l'éther, ensuite on le filtre et on le sèche sous vide au-dessus de P205/KOH. Rendement: 0,45 g (95,7%); F = 155 à 1580C; EHis = 06 (pH 1,9); Rf = 0,26 (D); Rf= 0,6 (F). Tertiobutyloxycarbonyl-NG-nitroarginyl-volyl-O- benzyltyrosyl-isoleucyl-Nim-benzylhistidyl-prolyl-phé lalanyl-N&alpha;-benzyloxycarbonyl-lysine (9). A une solution de 0,86 g (2,7 mmoles) de tertiobutyloxyarbonyl-NG-nitroarginine (7) dans 10 ml de DMFA à 0 C on ajoute 0,37 ml (0,27 mmole) de triéthylamine, et à la température de -50C,0,27 ml (0,27 mmole) de chlorocarbonate d'éthyle dans Sml de IMFA. On maintient la solution à la température de -50C pendant 25 minutes et, à cette même température, on ajoute goutte à goutte une solution de 3,3 g (2,6 mmoles) de dihydrochlorure (8) et de 0,72 ml (5,2 mmoles) de triéthylamine dans 20 ml de DMFA. On maintient le mélange réactionnel pendant 1 heure, puis on le verse dans de l'eau, on filtre le précipité, et on le sèche dans le vide au-dessus de P2o5/KOH.Après épuration sur. silicagel dans le système (A): rendement: 2,6g(67%); F=160 à 162 C; Rf=0,72 (D); Rf=0,47 (E); Rf=0,4 (A). Ether pentafluorophénylique de tertiobutyloxicarbonyl NG-nitroarginyl-valyl-O-benzyltyrosyl-isoleucyl-Nim benzylhistidyl-prolyl-phénylalanyl-N&alpha;-benzyloxycarbonyl- lysine (10). A une solution de 1,52g (1 mmole) de tertiobutylo -xycarbonyl-NG-nitroarginyl-valyl-O-benzyltyrosyl isoleucyl-Nim-benzylhistidyl-prolyl-phénylalanyl-N&alpha;- -benzyloxycarbonyl-lysine (9) dans 30 ml de dioxanne, on ajoute 1,14 g (1,5 mmole) de complexe " # dans 10 ml de dioxanne et on agite pendant 24 heures à 200C. On concentre le dioxanne par évaporation sous vide, on triture le résidu à l'éther, puis on le sèche sous vide au-dessus de P2O5/KOH. Rendement : 1,5 g (89,2%) ; Rf=0,8 (A); Rf=0,6(E) Ether pentafluorophénylique de NG-nitroarginylvalyl-O-benzyltyrosyl-isoleucyl-Nim-benzylhistidyl prolyl-phénylalanyl-N&alpha;-benzyloxycarbonyl-lysine (11). On obtient ce composé à partir (10) suivant la méthode 4. Rendement : 1,38 g (94%) ; Rf = 0,22 (E) ; Rf = 0,72 (A); Rf = 0,73 (F). Cyclo-(NG-nitroarginyl-valyl-O-benzyltyrosyl isoleucyl-Nim-benzylhistidyl-prolyl-phénylalenyl-N&alpha;- benzyloxycarbonyl-lysine-) (12). On dissout 1,38 g (0,83 mmole) d'ester pentafluoro- phénylique de NG-nitroarginyl-valyl-O-benzyltyrosyl isoleucyl-Nim-benzylhistidyl-prolyl-phénylalanyl-N&alpha;- -benzyloxycarbonyl-lysine dans 20 ml de DMFA, puis on ajoute 850 ml de dioxanne. A la température de 120C on ajoute 0,57 ml (3,3 mmoles) de di-isopropyl-éthylamine dans 500 ml de dioxanne. On agite la solution pendant 24 heures à 20 C. On concentre le dioxanne par évaporation sous vide et on trituré le résidu à l'eau. Après épuration sur silicagel dans le système (C), on obtient 0,5 g (43,1%). Rf = 0,48 (B). Cyclo (I#-8)-/LysI/ angiotensine A une solution de 0,5 g (0236 mmole) de cyclo (N@ nitroarginyl-valyl-O-benzyltyrosyl-isoloucyl-Nim-benzyl histidyl-prolyl-phénylalanyl-N&alpha;-benzyloxycarbonyl-lysine-) dans 10 ml d'un mélange d'alcool méthylique, d'acide acétique et d'eau (5:1:1), on ajoute du noir de palladium et on hydrogène la solution pendant 24 heures; on soumet le catalyseur à une filtration et le filtrat à une concentration par évaporation. L'épuration se fait à la phase inversée Zordax ODS 4,6 ml x 25cm sur appareil Du Pont 830. Eluant- 50% CH3CN, 50% 0,1N NH4OCOCN3. Rendement : 0,035 g (8 %) ; Rf = 0,59 (G); EHis=0,73 (pH 1,-9). L'analyse des amino-acides après l'hydrolyse complète (6N-HCl, 24 heures à 110 C) : Lys-1,01 ; Arg-0,91 ; Val-1,11; Tyr-0,83; Ile-0,97; His-1 ,07; Pro-0,78; Phe-0,90. Schéme de synthèse de la cyclo (I#-8)-/LysI)angiotensine REV EN DI C AT ION Analogue cyclique de l'angiotensine, caractérisé en ce qu'il est constitué par la cyclo (I#-8)-/LysI/ -angiotensine répondant à la formule