Brevet FR2546752A1 — publié le 19841207

La présente invention est relative à un pro- duit has Ont-sait qu'un certain nombre d'affections pa- thologiques s'accompagnent de la libération d'histaminepar les leucocytes et les thrombocytes du sang, et les mastocytes tissulaires Ces affections peuvent-être rangées en deux catégories principales, à savoir: les phénomènes allergiques; " l'agrégation plaquettaire ( premier temps de la formation des caillots sanguins): ce phénomène marque notamment le début des thromboses, qu'elles soient d'origine inflamma- toire', ou autres. La présente invention concerne un pr Dduit hautement dilué, susceptible d'être utilisé, soit comme mé- dicament pour lutter contre les affections précitées,soit comme réactif de laboratoire, pour effectuer des essais,non plus seu lement qualitatifs, mais également quantitatifs pour l'étude des phénomènes: de dégranulation de certains élé- ments figurés du sang. On connaît un produit chimique dit "Plate- let activating factor acether" ou, en abrégé " PAF-Acether. On sait que, lorsqu'on utilise ce produit à des concentrations de l'ordre de la nanomolarité, il pro- vique la libération de l'histamine,par certains éléments fi- gurés du sang Ce processus peut même avoir des conséquences qui entraînent la mort. La présente invention vise à préparer, à par- tir de ce produit connu, un médicament ou un réactif de labo- ratoire, d'un type nouveau, dont les effets sur l'organisme humain soient exactement contraires à ceux qỉ viennent d'être rappelés. Le procédé selon l'invention pour la fabrica- tion de ce produit nouveau consiste à partir d'un échantillon de PAFAcether, et il est caractérisé en ce qua'on dilue ce cet échantillon par la méthode hahnemannienne telle qu'elle est décrite à la Pharmacopée; Française, jusqu'à amener l'en- semble à une dilution inférieure ou égale à la 6 CH, chacune des opérations successives de dilution étant accompagnée d' une-dynamisation consistant à secouer le récipient de chaque sôlution intermédiaire, ou par toute autre méthode permet- tant d'aboutir à une concentration égale ou inférieure au pi- co molaire. Suivant une autre caractéristique de l'inven- tion, le produit obtenu par ce procédé est une dilution tel- le que décrite ci-dessus de PAF-Acether, susceptible d'être utilisée aussi bien comme médicament, que comme réactif de laboratoire. Suivant une autre caractéristique de l'inven- tion, chaque dilution intermédiaire est effectuée au cen- tième, le produit final étant préférablement dilué à la 11 CH, selon la méthodeé-hahnemannienne Bien entendu, toute autre méthode de dilution pourrait être utilisée, dont l'emploi est connu en homéopa- thie, notamment: dilution Korsakovienne consistant à vider à chaque cycle un flacon dont n'est conservé que le liquide adhérant aux parois, après quoi on remplit le flacon du liquide de di- lution, et on le dynamise; diltion par turbulence, consistant à agiter le liquide au fur et à mesure de la dilution. Les cas particuliers qui vont suivre, donnés à titre d'exemples non limitatifs, permettront de mieux com- prendre l'invention,et les caractéristiques qu'elle présente. ) Le test de dégranulation des basophi- les humains (TDBH) ou des mastocytes d'origine tissulaire. Modèle expérimental l'expérimentation repose sur l'utilisation du test de dégranulation des basophiles humains (TDBH) selon la technique de Jacques BENVENISTE Ce test consiste à mettre en présence-les basophiles obtenus par concentration d'un prélèvement de sang, et l'allergène sensibilisant. Lorsque les basophiles portent des anti- corps anaphylactiques fixés sur leurs récepteurs membranai- res, ils dégranulent à 370, c'est-à-dire qu'ils libèrent dans le milieu extérieur, les médiateurs préformés ou néofor- més contenus dans les granules cytoplasmiques. Cette réaction sert d'ailleurs de définition à l'hypersensibilité immédiate ( de type I) selon la classi- fication de GELL et COM 4 BS Les basophiles ayant dégranulé sont différenciés de ceux n'ayant pas dégranulé par la per- te de leur affinité tinctoriale métachromatique Vis-à-vis du bleu de Toluidine. Un calcul statistique basé sur l'application de la loi de Poisson, permet de définir un seuil de signifi- cativité, en moyenne compris entre 20 et 35 %, selon le nombre de basophiles comptés - Technique Le produit à étudier est utilisé pour la dilu- tion d'un tampon minéral, dit tampon de lavage des basophi les, concentré dix fois. Les basophiles contenus dans le prélèvement sont centrifugés à vitesse très lente,resuspendus dans ce mi- lieu et préincubés vingt minutes à 37 . Un aliquot d E cette concentration est ensui- te utilisé afin de réaliser le TDBH Pour ce faire, dix micro- litres de la suspension de basophiles sont introduits dans les cupules d'une plaque de microtitration au fond desquel- les l'antigène a été préalablement séché Après quinze minu- tes d'incubation à 370, les basophiles n'ayant pas dégranulé sont dénombrés en Ies-mettant en présence d'une solution acide de bleu de Toluidine. Six dilutions de l'antigène sont systémati- quement testées et l'on obtient ainsi généralement une cour- be en "cloche " avec ses deux zones d'inhibition par excès d' anticorps et excès d'antigène. Le pourcentage maximum de dégranulation est alors calculé. Une méthode identique est applicable aux mas- tocytes d'origine tissulaire. 20) Le test de libération d'histamine Dans les conditions expérimentales que nous rapportons, ce test a les mêmes finalités que le test de dé- granulation des basophiles. Il permet une étude quantitative de la libéra- tion de l'histamine par des basophiles humains d'un sujet pié- sentant une allergie à un allergène connu. Comme dans le test précédent, on provoque une libération de l'histamine par mise en présence des basophiles d'un sujet donné, avec l'allergène auquel ce sujet se trou- ve être allergique. La dégranulation des basophiles qii est ainsi provoquée aboutit à une libération de l'histamine dans le milieu extra-cellulaire Le test sur lequel nous nous ap- puyons consiste en un dosage de l'histamine dans le milieu extracellulaire, avant et après le contact des basophiles et de l'allergène Ce dosage se fait par la méthode des tra- ceurs radio-actifs grâce à H 3 histamine. Dans le cas qui nous intéresse, les basophi- les sont répartis en deux lots, dont l'un est préalablement incubé avec le produit à tester, et l'autre avec de l'eau distillée Dans l'un et l'autre cas, la solution d'aller- gène est alors ajoutée à des concentrations variables pour éviter le -hénomène dé zone. Le dosage d'histamine dans l'un et l'autre lot permet d'évaluer l'inhibition de la libération de cette mê- me histamine. 3 ) Le test d'agrégation plaquettaire Mesure de l'activité agrégante L'activité agrégante des différents analogues est testée sur des plaquettes lavées de lapin à 37 sous agi- tation ( 1500 révolutions par minute) dans un agrégâmètre Icare ( Marseille France) Cinquante > l de la suspension plaquettaire concentrée sont ajoutés dans le tube d'agréga- 2 + mètre, à trois cents >l de TG Ca, ;afin d'obtenir un pourcentage de transmission de lumière constant, correspon- dant à une concentration plaquettaire d'environ 2,5 X 108 plaquettes/ml Nous avons ajouté dans le tampon TG Ca 2 + d'agrégation, du CP/CPK ( i m M /10 U/ml: concentrations finales pemmettant d'inhiber l'agrégation induite par 67 d'ADP) afin de transformer en ATP, l'ADP pouvant être secrétée pendant l'agrégation. La voie de la cyclo-oxygénase est bloquée par l'incubation des plaquettes pendant quinze minutes avec de l'ASA ( 100 FIH) juste avant le deuxième lavage ( sauf lorsque l'agrégation indudt:paàr 1 'AA est étudiée). Les plaquettes sont stimulées par un à qua- tre l d'une solution de PAF-Acether ou d'analogues dans 1 ' éthanol à 60 % Une solution standard de PAF-Acether synthé- tique permet de tracer une gamme-étalon L'activité agrégante des produits est exprimée par la CE 50, c'est-à- dire la concentration molaire requise pour obtenir 50 % de l'agrégation macimale induite par la solution standard de PAF 4 Acether ( moyenne + déviation standard de trois à six expériences). Test d'inhibition Les plaquettes lavées de lapin sont préincu- bées 0,2 ou 3 minutes, sans agitation à 22 o C,avec l'agent d'inhibition de l'agrégation plaquettaire, dans notre cas les dilutions homéopathiques de PAF-Acether. Le PAF-Acether synthétique ( 0,13 à 1,4 /4 M) l'AA ( 0,2 à 4,7)LI 4) ou 1 'ADP ( 1,3 à 13 p M) sont alors ajou- tés à une concentration qui induit une agrégation submaxima- le sur des plaquettes contrôles ( incubées en présence du solvant éthanol). Afin de bien séparer les trois voies d'agré- gation, nous avons étudié l'agrégation induite par le PAF- acéther sur des plaquettes traitées à l'ASA ( 100 k LM) en,, présence du complexe CP/CPK ( 1 m M/10 U/ml) Pour l'étude de l'agrégation induite par l'AA, ou 1 'ADP, l'ASA ou le CP/CPK sont omis respectivement. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition par comparaison des agrégations obtenues avec l'agrégation des plaquettes contr 8 les, incubées en présen- ce du solvant (moyenne + une déviation standard de trois ex- périences). LEGENDE CPLCPK: créatine phosphate/créatine phosphokinase ADP: adénosinediphosphate ATP: adénosine-triphosphate AA: acide arachinodique ASA: acide acétylsalicylique REVENDICATIONS 1 Procédé pour la fabrication d'un produit utilisable comme médicament, et comme réactif de laboratoi- re, consistant à utiliser au départ, un échantillon de PAF- Acether, caractérisé en ce qu'on dilue cet échantillon par- des dilutions homéopathiques successives pratiquées jusqu'à diluer entre 10 12 et 10 30 chaque dilution intermédiai- re étant accompagnée d'une opération de dynamisation 2 Médicament homéopathique obtenu par la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il est constitué par une dilution hahnemannien- ne de PAF-Acether,à concentration comprise entre 6 CH et 15 CH, tandis que, par ailleurs, il possède des propriétés curatives anti-histaminiques. 3 Médicament homéopathique obtenu par la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractéri- sé en ce qu'il est constitué par une dilution Korsakovienne de PAFL Acether,à concentration comprise entre 100 K et 10 000 K, tandis que, par ailleurs, il possède des proprié- tés curatives anti-histaminiques. 4 Médicament homéopathique obtenu par la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractéri- sé en ce qu'il est constitué par une dilution avec turbulence de PAFAcether, tandis que, par ailleurs, il possède des propriétéscuratives anti-histaminiques. Réactif de laboratoire obtenu par la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par une dilution hahnemannienne de PAF- Acether, à une dilution inférieure à la 6 CH, chaque dilu- tion intermédiaire ayant été accompagnée d'une opération de dynamisation, ce qui lui confère des propriétés inhibant la dégranulation des basophiles du sujet étudié, si bien qu' on peut l'utiliser dans des essais quantitatifs pour mesurer le degré de dégranulation des basophiles du sang ou des mas- tocytes tissulaires, ou encore le degré d'agrégation des plaquettes. 6 Produit homéopathique suivant l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le solvant de dilution utilisé est de l'eau. 7 Produit homéopathique suivant l'une quel- conque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le solvant de dilution utilisé est de l'alcool éthylique. 8Produit homéopathique suivant l'une quel- conque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le solvant utilisé est un mélange d'eau, et d'alcool.