Brevet FR2537130A1 — publié le 19840608

La présente invention concerne des procédés de production de L-carnitine Elle se rapporte plus par- ticulièrement à un procédé de réduction microbiologique d'esters ou amides acétoacétiques {-substitués en leurs dérivés respectifs d'acides Lp-hydroxybutyriques substi- tués end Y, lesquels dérivés peuvent être facilement trans- formés en chlorure de L-carnitine L'invention concerne également de nouveaux intermédiaires chimiques utilisés dans ce procédé. Comme on le sait, la carnitine (acide p- hydroxy- triméthylamino-butyrique) contient un centre d'asymétrie et, en conséquence, elle existe sous deux for- mes stéréoisomères, les formes D et L. La L-carnitine est normalement présente dans le corps o elle a pour rôle de transporter les acides gras libres activés à longue chaîne à travers la membrane des mitochondries Etant donné que la membrane des mito- chondries est imperméable aux dérivés d'acyl-Co A, les acides gras libres à longue chaîne ne peuvent pénétrer que lorsqu'a eu lieu l'estérification avec la L-carniti- ne Le rôle de transporteur de la L-carnitine s'exerce à la fois pour le transport des acides gras à longue chai- ne actifs des sites de leur biosynthèse, par exemple les microsomes, aux mitochondries o ils sont oxydés, et pour le transport d'acétyl-Co A des mitochondries o il se forme, aux sites extérieurs aux mitochondries o a lieu la synthèse des acides gras à longue chaîne, par exemple dans les microsomes o l'acétyl-Co A peut être utilisé pour la synthèse du cholestérol et des acides gras. Bien qu'il soit établi que l'isomère lévogyre (L-carnitine) exclusivement est la forme biologique (la D-carnitine n'a jamais été décelée jusqu'à présent dans les tissus de mammifères), le racémate de D,L-carnitine a été utilisé depuis un certain nombre d'années pour dif- férentes applications Par exemple, la D,L-carnitine est vendue en Europe comme stimulant de l'appétit, et il a été indiqué que la matière exerce un effet sur la vitesse de croissance des enfants; voir par exemple Clinica Chemica Acta, 5, 171-176, 1960 de Borniche et collaborateurs et "Protides in the Biological Fluids", 6 ème Colloque, Bruges, 1958, 306- 310 de Alexander et collaborateurs Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 830 931 décrit des amélio- rations de la contractilité du myocarde et du rythme systolique dans le cas d'une défaillance cardiaque con- gestive, qui peuvent souvent être obtenues par adminis- tration de D,L-carnitine Le brevet des Etats-Unis d'Amé- rique n 3 968 241 décrit l'utilisation de D,L-carnitine dans les arythmies cardiaques Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 810 994 décrit l'utilisation de D,L- carnitine dans le traitement de l'obésité. Récemment, cependant, on s'est attaché de plus en plus à l'importance de l'utilisation exclusive de l'isomère lévogyre de la carnitine pour au moins cer- taines applications thérapeutiques Il a en fait été dé- montré que la D-carnitine est un inhibiteur compétitif d'enzymes liées à la carnitine tels que la carnitine- acétyl-transférase (CAT) et la carnitine palmityl- transférase (PTC) En outre, des éléments récents srent que la D-carnitine peut déplacer la L-carnitine du tissu du coeur Par conséquent, il est essentiel que la L- carnitine soit exclusivement administrée aux malades sous traitement médical pour troubles cardiaques ou l'abaisse- ment du taux de lipides du sang. Divers procédés ont été proposés pour produire la carnitine à échelle industrielle Cependant, la synthè- se chimique de la carnitine aboutit inévitablement à un mélange racémique des isomères D et L En conséquence, on doit faire appel à des procédés de dédoublement pour obte- nir les antipodes optiques séparés à partir du racémate. Ces procédés de dédoublement sont cependant fastidieux et coûteux. La présente invention se propose de produire de la L-carnitine en un rendement satisfaisant par une combinaison de procédés microbiologiques et chimiques, La présente invention se propose de fournir un procédé perfectionné pour effectuer la synthèse de la L-carnitine à partir de matières de départ peu coûteuses facilement disponibles. Un autre but de la présente invention est-la préparation d'intermédiaires optiquement actifs, nouveaux et utiles pour-la synthèse de la L-carnitine et de ses sels ou esters. Un autre but de la présente invention est de fournir des procédés de préparation de L-carnitine par l'intermédiaire du déplacement par la triméthylamine-du groupe halogéno d'un 4-halogéno-3 (R)-hydroxybutyrate. Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé de production de 4-iodo ou 4-bromo- 3 (R)-hydroxy-butyrates à partir de 4-chloro-3 (R)-hydro- xybutyrates. Ces buts ainsi que d'autres ressortiront de la description qui va suivre. Le fait que la fonction p-cétonique en posi- tion 3 des dérivés d'acide;acétoacétique substitués en peut être réduite par hydrogénation sur Pt/C est connu (par exemple brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 969 406). Cependant, le composé hydroxylé résultant d'un tel procé- dé est racémique Au contraire, en utilisant l'action de fermentation d'un microorganisme selon le procédé de la présente invention, l'hydrogénation de la fonction oxo en position 3 peut être effectuée de façon stéréosélec- tive en donnant des dérivés d'acides P-hydroxybutyriques substitués en eoptiquement actifs. En particulier, après un choix approprié (voir ci-après) du substrat devant être exposé à l'action de fermentation des microorganismes selonle procédé de la présente invention, on obtient la configuration épimêre 3 (R) ou L Cette configuration est nécessaire à la trans- formation en L-carnitine naturelle, En gros, la présente inyention comnprend l'uti- lisation de la réductase microbienne, la L-p-hydroxyacyl- Co A-déshydrogénase ^^C 1 1 1 357 ', pour catalyser l'hydro- génation stéréosélective de dérivés d'acides acétoacéti- ques substitués en Y comme défini ci-après. * Par conséquent, selon son aspect le plus large, le procédé de la présente invention, destiné à la prépara- tion de dérivés d'acides P-hydroxybutyriques substitués en 6 optiauement actifs de formule: OH O X e R dans laquelle X est choisi parmi C 1, Br, I et OH et R est un radical à configuration en chaîne droite, en chaîne, ramifiée, ou cyclique, choisi parmi des radicaux alkoxy ayant de 1 'à environ 15 atomes de carbone; des radicaux alkylamino ayant d'environ 5 à environ 15 atomes de carbone; des radicaux cycloalkoxy et cycloalkylamino ayant d'environ 5 à environ 12 atomes de carbone; des radicaux phénoxy et phénylalkoxy ayant de 7 à environ 14 atomes de carbone; des radicaux phenylamino et phénylalkylamino ayant les formules Y Y Z -N-0-A; et -N-CH-0-A o Y et Z sont choisis parmi H, un groupe alkyle de 1 à environ 8 atomes de carbone, phényle ou benzyle et A est choisi parmi H, CH 3, Cl et Br à partir des esters ou amides d'acide acétoacétique correspondants substitués en Y, consiste à soumettre les- dits esters ou amides d'acides acétoacétiques substitués en kà l'action enzymatique de fermentation d'un microorga- nisme qui élabore la L--hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase 2537 13 O JEC 1 1 ol 35 J, et à récupérer les dérivés d'acide 3-hydro- xybutyrique substitués enloptiquement actifs désirés. En particulier, pour préparer les dérivés d'acide 3 (R)-hydroxybutyrique substitués en Yoptiquement actifs ayant la formule et la configuration 3 (R) OH H O X A"/} | R le procédé consiste à soumettre des composés de formule: 0 O tl il XCH 2-C-CH 2 CR o X et R ont les significations indiquées ci-dessus à condition que si R est un radical alkoxy, il comporte de 5 à environ 15 atomes de carbone, à l'action enzymatique de fermentation d'un microorganisme qui éla- bore la L-p-hydroxyacyi-Co A-déshydrogénase ZEC 1 1 1 35), et à récupérer les dérivés d'acide 3 (R)-hydroxybutyrique substitués en 4 optiquement actifs désirés à partir du mé- lange réactionnel de fermentation. On a trouvé que tout microorganisme qui pro- duit l'enzyme désiré est capable de catalyser la réduc- tion stéréosélective Sont particulièrement appropriés les microorganismes de la classe des Ascomycètes, l'ordre des Endomycétales, Mucorales, Moniliales et Eurotiales et le genre Saccharomyces On préfère en particulier Saccharomyces Cerevisiae. Pour préparer les esters d'acide 3 (R)-hydro- xybutyrique substitués en 4 optiquement actifs, contenant 1 à 4 atomes de carbone, il est nécessaire d'utiliser de la L-p-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase purifiée CEC 1 1. 1 357 telle que celle de coeur de porc, car un microorga- nisme intact possède des oxydo-réductases gênantes de con- figuration opposée Par suite, la réduction microbienne, par exemple d'esters 4-chloro-acétoacétiques de 1 à 4 ato- mes de carbone produit des 4-chloro-3-hydroxybutyrates de pureté optique peu satisfaisante. Par conséquent, la-présente invention fournit également un procédé de préparation de dérivés d'acide 3 (R)-hydroxy-butyrique substitués en OH O X R dans laquelle X représente Ci, Br, I ou OH et R est un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone, qui consiste à soumettre des composés de formule: O C XCH 2-C-CH C-R dans laquelle X et R ont les significations précédemment indiquées à l'action enzymatique de la L-)-hydroxyacyl- Co A-déshydrogénase /ZC 1 1 1 35 J sous forme purifiée, et à récupérer les dérivés d'acide 3 (R)-hydroxybutyrique substitués en optiquement actifs désirés à partir du mélange réactionnel enzymatique. La présente invention fournit donc des composés ayant la formule et la configuration 3 (R) OH H X "R dans laquelle X est choisi parmi C 1, Br, I et OH et R est un radical à configuration en chaîne droite, en chaîne ramifiée ou cyclique, choisi dans la classe comprenant des radicaux alkoxy ayant de 1 à envi- ron 15 atomes de carbone; des radicaux alkylamino ayant d'environ 5 à environ 15 atomes de carbone; des radicaux cycloalkoxy et cycloalkylamino ayant environ de 5 à environ 12 atomes-de carbone; des radicaux phénoxy et phénylalkoxy ayant de 7 à environ 14 atomes de carbone; des radicaux phénylamino et phénylalkylamino ayant les formules: y Y Z l y -N-0-A; etN-CH-0-A o Y et Z sont choisis parmi H, un groupe alkyle de 1 à environ 8 atomes de carbone, phényle ou benzyle et A est choisi parmi H, CH 3, Cl et Br. Les dérivés d'acide L-p-hydroxybutyrique substitués en avec la triméthylamine en donnant le dérivé d'acide"- triméthylammonium-L-p-hydroxybutyrique correspondant qui peut ensuite être facilement converti en L-carnitine par traitement avec des acides aqueux On donne ci-après un schéma des étapes de réaction de ce procédé. x X I R I OH Micro- -organisme I ou L-B-hydroxyacyi- Co A-déshydrogénase X=C 1, Br, I,3 OH CE 3 OH a HC -N c 2 H 4 - ca 3 X C 3 V IV 3 O H OH Oou R 3 C 1 R C 3 III L-Carnii tine s S O -,R Il CU 3 CH 1 C c 3- a I VI 253713 D On a constaté que la réaction ci-dessus I >Il a lieu plus facilement si X = C 1 Cependant, étant donné que la réaction subséquente Ir >III a lieu en de meilleurs rendements lorsque X = iode ou brome, il est préférable de préparer tout d'abord le dérivé Cl puis de le conver- tir en le dérivé I ou Br correspondant. La présente invention fournit également un procédé perfectionné qui consiste à transformer tout d'abord l'ester 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique en les 4- icdo ou 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrates correspondants. Dans un but de simplicité, on se référera ci-après au dérivé I L'iodhydrine (V) peut être amenée à réagir dou- cement avec la triméthylamine à la température ambiante pour donner VI qui est facilement transformé en L-carniti- ne selon la séquence réactionnelle suivante: HO 0, O Hé A - Cl SO Mal > C RI 'OR R 5 H or ester H Cj c H 3 CH 3 CH 3 OH O CH 3 OHH o CH 3-5 ?C _ 3 Résine CH 3 CH 3 forme OH ICH 3 I YI- L-carnitine Le procédé ci-dessus, tel qu'illustré par l'équation, est sujet à de nombreuses variantes Quelle que soit la forme sous laquelle on l'obtient, l'ester est amené à réagir avec l'iodure de sodium dans un sol- vant approprié tel que la 2-butanone, l'acétone, le butanol, etc La réaction principale désirée à ce point de la réaction avec l'iodure de sodium est une réaction de la réaction avec l'iodure de sodium est une réaction de déplacement qui forme la iodhydrine V sans perturber le centre de chiralité de l'atome de carbone adjacentt Cette réaction nécessite au moins suffisamment d'iodure de sodium pour déplacer la totalité du chlorure à partir de II Généralement, on utilise un léger excès d'iodure de sodium. La réaction de V avec la triméthylamine peut être effectuée à une température modérée (par exemple C) (Voir S G Boots et M R Boots, J Pharma Sci; 64, 1262, 1975), dans divers solvants tels que le méthanol ou l'éthanol contenant un excès de triméthylamine Il est intéressant de noter que selon le solvant alcoolique uti- lisé, il se produit un échange de groupes ester Par exemple lorsqu'on utilise le méthanol comme solvant, on obtient l'ester méthylique de la L-carnitine Cette réac- tion d'échange est avantageuse car on sait que l'ester méthylique de la L-carnitine peut être transformé directe- ment en la forme base libre de la L-carnitine par passage à travers une colonne d'échange d'ions (OH-) voir E. Strack et J Lorenz, J Physiol Chem ( 1966) 344, 2762. On peut voir d'après la description des procédés ci-dessus qu'on forme un certain nombre d'intermédiaires optiquement actifs nouveaux et d'une grande utilité Sont particulièrement intéressants les esters alkyliques de l'acide 4-iodo-3 (R)- hydroxybutyrique dans lesquels les groupes alkyle comportent six à dix atomes de carbone chacun. On préfère tout particulièrement l'ester octyli- que. Les microorganismes qui exercent l'activité d'oxydo-réductase sont bien connus dans la technique mi- crobiologique et on peut faire appel à l'une quelconque de ces microorganismes pour mettre en oeuvre le procédé de la présente invention (Voir K Kieslich "Microbial Transformations of Non-Stezold Cyclic Compounds" (Georg Thieme Publishers, Stuttgart, 1976)), n'importe lequel des genres de microorganismes décrits en particulier ici étant particulièrement applicable On a constaté que des microorganismes facilement disponibles et peu coûteux du genre Saccharomyces, par exemple la levure de bière, la levure de boulangerie et la levure de vinification (Sac- charomyces vini) produisaient le L-p-hydroxylacyl-Co A- déshydrogénase lEL 1 1 1 357 et étaient particulièrement avantageux dans la mise en oeuvre du procédé de l'inven- tion L'enzyme est décrit par S J Wakil et E M Barnes Jr dans Comprehensive Biochemistry, Volume 185 ( 1971), pages 57-104. Le substrat acétoacétique substitué en 4 peut être incorporé dans un milieu nutritif de composi- tion classique dans lequel de tels microorganismes sont cultivés et les conditions usuelles de fermentation peu- vent ensuite être utilisées pour effectuer la transforma- tion réductrice En variante, le principe actif peut être retiré de la culture en cours de développement du microor- ganisme, par exemple par lyse des cellules pour libérer les enzymes, ou par mise en suspension des cellules res- tantes dans un système aqueux frais Dans l'une ou l'au- tre de ces techniques, la fonction p-cétonique est sélec- tivement réduite pour autant que l'enzyme active élaborée par les microorganismes soit présente dans le milieu. Naturellement, les conditions de température, de durée et de pression auxquelles la mise en contact du dérivé acétoacétique substitué en 4 avec l'enzyme réductrice est effectuée sont interdépendantes comme s'en rendra compte le spécialiste Par exemple, dans le cas d'un chauffage doux et à la pression atmosphérique, la durée nécessaire pour effectuer la transformation réductrice sera moindre que dans le cas o l'on opère à la température ambiante, les autres conditions étant les mêmes Naturellement, la température, la pression et le temps ne doivent pas être suffisamment élevés pour qu'il en résulte une dégradation du substrat Lorsqu'on utilise une culture de croissance il du microorganismef les conditions opératoires doivent être égalerment suffisamment-modérées, pour que le microor- ganisme ne soit pas détruit avant qu'il élabore suffisam- ment d'enz-ymes hydrolytiques afin de permettre à la réac- tion de prcgresser En général, à la pression atmosphéri- que, la température peut se situer entre environ 10 C et environ 35:C, et la durée entre environ 12 heures et envi- ron 10 jours. Dans les exemples suivants qui n'ont pour but que d'illustrer la présente invention et ne doivent pas être considérés comme limitatifs, les substrats constitués de dérivés d'acide r-halogéno-acétoacétique devant être soumis à une réduction microbiologique sont préparés à partir de dicétène conformément au procédé général de C D. Hurd et H L Abernethy (J Am Chem Soc-, 62, 1147,1940) pour les dérivés Y-chloro-acétoacétiques et de F Chick, N.T M Wilsmore IJ Chem Soc, 1978 ( 1910)l pour les dé- rivés Y-bromo-acétoacétiques par l'intermédiaire de la séquence réactionnelle suivante: o H 2 CC C-C=O-/ dke'etene R OR Xl 2 C= 2 Cm X{ 2 Cz 2 COR o X = C 1 ou Br Y = H ou alkyle R = comme défini précédemment En variante, si on le désire, les dérivés Y- halogénoacétoacétiques peuvent être préparés à partir d'es- ters f'-halogéno-acétiques par une réaction classique de Grignard Par exemple l'ester octylique de l'acide %-chloro- acétoacétique peut être facilement préparé par chauffage au reflux de l'ester Y-chloro-octylique avec deux équivalents de magnésium dans l'éther pendant 48 heures Après avoir chassé le solvant, on récupère l'ester octylique de l'acide acétoacétique en un rendement d'environ 70 %. Les dérivés d'acide f-hydroxy-acétoacétiques sont préparés à partir de leurs dérivés d'acide Y-bromo-acéto- acétique correspondants par agitation dans une solution dioxanne-eau ( 1:1) contenant Ca CO 3 à 25 C pendant 12 heures. Chacun des produits obtenus selon les exemples suivants est identifié quant à sa structure en utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN), les spectres in- frarouges et par les mobilités en chromatographie en cou- che mince La pureté optique et la configuration absolue des produits sont établies par leur taux de conversion en L- carnitine ainsi que par leur taux de conversion en leurs esters qui sont facilement analysés par spectrométrie RMN, et la rotation optique. Exemple 1 (Levures) On prépare comme suit l'ester octylique de l'aci- de (+)4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique: > C 0 C 8 a 17 O CSH 17 A Fermentation Une culture obtenue en surface sur gélose inclinée âgée d'une semaine de Candida Keyfr NRRL Y-329, développée sur gélose ayant la composition suivante: Grammes Gélose 20 Glucose 10 Extrait de levure 2,5 K 2 HPO 4 1 Eau distillée, q s 1 litre (stérilisée pendant 15 minutes sous pression de 140 k Pa) est mise en suspension dans 5 ml d'une solution saline à 0, 85 % On utilise des portions de 1 ml de cette suspension pour inoculer un ballon de Erlenmeyer de 250 ml (stade F-1) contenant 50 ml du milieu suivant (milieu de Vogel) - Extrait de levure 5 Casamino-acides 5 Dextrose 40 Citrate de Na 3-5 1/2 H 20 3 g KH 2 PO 4 5 g g NH 4 NO 3 2 g Ca C 12 2 H 20 0,1 g 2 Mg SO 47 H 20 0,2 g Solution d'oligo-éléments 0,1 ml Eau distillée, q s 1 litre p H 5,6 (stérilisée pendant 15 minutes à 210 k Pa) Solution d'oligoéléments Gm/100 ml - Acide-citrique 5 Zn SO 4 7 H 20 5 Fe(NH 4) 2 ( 504)6 H 20 1 Cu SO 45 H 20 0,25 Mn SO 41 H 20 0,05 HBO 39, H 3 803 0,05 Na H 2 Mo 04 2 H 20 0,05 On fait incuber le ballon à 25 C sur une secoueuse rotative ( 250 cycles/min rayon de 5 cm) pendant 24 heures, après quoi on transfert 10 % en volume dans un autre ballon de Erlenmeyer de 250 ml (stade 1-2) contenant 50 ml de milieu de Vogel Après 24 heures d'incubation sur une secoueuse rota- * tive, on ajoute 15 Omg d'ester octylique d'acide t-chloracéto- acétique dans 0,1 ml de Tween 80 à 10 % On fait ensuite incu- ber le ballon du stade F-2 pendant 24 heures supplémentaires dans les conditions utilisées dans l'incubation des ballons du stade F-1. B Isolement Vingt-quatre heures après l'addition de l'ester octylique de l'acide J'-chloracétoacétique, -on élimine les-'cel- lules par centifugation, On extrait à fond trois fois la li- queur surnageante avec 50 ml d'acétate d'éthyle On déshydrate l'acétate d'éthyle sur Na 2504, et on évapore pour obtenir un résidu huileux ( 186 mg) On dissout le résidu dans 0,5 ml de la phase mobile et l'ajoute dans une colonne ( 1 x 25 cm) de gel de silice (MN-kieselgel 60), On élue la colonne avec un mé- lange Skelly B: acétate d'éthyle ( 8:1) et on recueille des fractions de 14 ml On réunit les fractions 6 et 7 contenant le produit désiré, et les concentre_ à siccité pour obtenir - mg de résidu cristallin Par recristallisation dans un - mélange acétate d'éthylerhexane on obtient 107 mg d'esteri-: octylique d'acide 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrique, (a) 23 + 13,30 (c 4,45) (CHC 13); RMP (b CDC 13) 0,88 ( 3 H, distorsion de tr. CH 3-(CH 2)n-?; 1,28 n OH, s, -c(CH 2)5-; 1,65 ( 2 H, m, -CH 2- CH 2-CH 20); 2,62 ( 2 H, d, J = 6 Hz, -H-CH 2-COOR); 3,22 ( 1 H, large,OH); 3,60 ( 2 H, d, J = 6 Hz, C 1 CH 2 H-R); 4,20 ( 3 H,-CH 2-CH-CH 2 et - -O-CH 2 CH 2). Analyse: Calculé pour C 12 H 2303 Cl C% H% 57,47 9,25 -Trouvé: 57,52 9,07 lCCM Rf 0,5, plaque de gel de silice Brinkmann 0,25 cm EM; Skelly B:acétate d'éthyle ( 5:1)7. E>;e 1 e 2 Cellules restantes On met en suspension 100 g de levure de boulangerie fraîche du commerce Saccharomyces cerevisiae (Re( Star) dans 250 ml d'eau du robinet additionnée de 10 g de saccharose et 3,6 g d'ester octylique de l'acide Y-chlorace- toacétique Apres avoir fait incuber le contenu à 25 C sur une secoueuse rotative ( 250 cycles/minute rayon de 5 cm) pendant 24 heures, on ajoute un supplément de 10 g de saccharose dans le ballon et on laisse la réaction progresser pendant encore 24 heures On retire ensuite les cellules par filtration sur un tampon de "Celite" On lave les cellules à l'eau et à l'acétate d'éthyle On combine les liqueurs de lavage avec le filtrat et les extrait à fond à l'acétate d'éthyle On déshy- drate la phase d'acétate sur Mg SO 4 et on évapore pour obtenir un résidu huileux que l'on chromatographie sur une colonne de gel de silice pour obtenir 2,52 g d'ester octylique d'acide 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique, sous forme d'un solide de bas point de fusion; 23 + 13,20 (c,4,0,CHC 13). Exemple '3 On prépare l'ester benzylique de l'acide (+)4- chloro-3 (R)hydroxybutyrique de la façon suivante: Ci CR 2 C 2 OCH 20 A Fermentation Une culture obtenue en surface sur gélose inclinée âgée d'une semaine de Gliocladium virens ATCC 13362, développée sur gélose ayant la composition suivante: g Extrait de malt 20 Glucose 20 Peptone 1 Gélose 20 Eau distillée, q s 1 litre (stérilisé 15 minutes à 140 k Pa) est nise en scs Denúion dans 5 ml d'u-ne solution saline à 0,85 %. On utilise des portions de 1 ml de cette suspension pour inoculer un balon Erlenmeyer de 250 ml (stade F-1) contenant ml du milieu suivant (milieu de dextrose et de soja): Farine de soja 5 g Dextrose 20 g Na Cl 5 g KH 2 HPO 4 5 g 2 4 Levure 5 g Eau 1 1 p H ajusté à 7,0 Passage en autoclave sous pression de 105 k Pa pendant 15 minutes. On fait incuber le ballon à 25 C sur une secoueuse rotative ( 250 cycles/minute rayon de 5 cm) pendant 24 heures après quoi on effectue un transfert de 10 % en volume dans un autre ballon de Erlenmeyer de 250 ml (stade F-2) contenant ml de milieu de dextrose et de soja Au bout de 24 heures d'incubation sur une secoueuse rotative, on ajoute 150 mg d'es- ter benzylique d'acide -chloracétoacétique dans 0,1 ml de Tween 80 à 10 % On fait ensuite incuber le ballon du stade F-2 pendant encore 24 heures dans les conditions utilisées dans l'incubation des ballons de stade F-1. B Isolement Vingt-quatre heures après l'addition de l'ester benzylique d'acide Y-chloracétoacétique, on sépare le mycé- lium par filtration On extrait le filtrat à fond trois fois avec 50 ml d'acétate d'éthyle On déshydrate la phase d'acé- tate d'éthyle sur Mg SO 4 et la concentre sous vide pour obtenir un résidu ( 160 mg) On chromatographie le résidu sur une co- lonne ( 1 x 25 cm) de gel de silice (MN-Kieselgel 60) On élue la colonne avec Skelly B et de l'acétate d'éthyle ( 10:1) et on recueille des fractions de 12 ml On réunit les fractions 11-16 contenant le produit désiré et les concentre à sec pour obtenir 115 mg d'ester benzylique d'acide 4-chloro-3 (R)-hydro- 235 xybutyrique, + 8,7 (,5,26; CHC 3); RMP (CDC 13) 2,65 xybutyrique, Z" TD + 8,70 (c,5,26; CHCI 3) RMP (CDCI 13) 2,65 ( 2 H, d, J = 6 Hz, H-CH 2 Coor), 3,20 ( 1 H, large, -OH); 3,54 ( 2 H, d, J = 6 Hz, C 1-CH 2 H) 4, 20 ( 1 H, m, -CH 2 CH 2-) 5,12 ( 2 H, s, -O-CH 2 C 6 H 5); 7,31 ( 5 H, s, cinq protons aro- matiques Analyse: Calculé pour C l H 1303 Cl C% H% 57,77 5,73 Trouvé: 57,64 5,67 /CCM sur plaque de gel de silice EM Brinkmann, 0,25 cm, Rf = 0,43, Skelly B-acétate d'éthyle { 5:1)7. Exemples 4 à 23 ' On répète le processus de l'Exemple 1 avec cha cun des microorganismes énumérés dans le Tableau i à la différence qu'on ajoute l'ester octylique de l'acide '-chloro- acétoacétique à une concentration de 1 mg/ml On obtient la transformation en-le produit désit é, l'ester octylique de l'acide (+)4-chloro-3 (R)hydroxybutyrique On répète les modes opératoires de ces Exemples en ajoutant en continu le substrat aux milieux de levure Le rapport pondéral substrat/ levure est d'environ 1:1,5 tout en donnant une excellente: transformation en le produit désiré. Exemples 24-48 On répète le mode opératoire de l'Exemple 3 avec chacun des microorganismes énumérés dans le Tableau 2 à la différenoe qu'on utilise l'ester octylique de l'acide Y-chloro acétoa- cétique ( 1 mg/ml) On obtient la transformation en le composé désiré, l'ester octylique de l'acide (+)4-chloro-3 (R)-hydro- xybutyrique. Exemples 49-68 On répète le mode opératoire de l'Exemple 1 avec chacun des microorganismes énumérés dans le Tableau 1 à la différence qu'on utilise comme substrat l'ester benzylique de l'acide r-chloro-acétoacétique On obtient la transformation en le produit désiré, l'ester benzylique de l'acide (+)4- chloro-3 (R) -hydroxybutyrique. Exemples 69-93 On répète le mode opératoire de l'Exemple 3 avec chacun des microorganismes énumérés dans le Tableau 2 en uti- lisant comme substrat l'ester benzylique de l'acide Y-chloro- acétoacétique (lmg/ml) On obtient la transformation en le composé désiré, l'ester benzylique de l'acide (+)4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrique_- Exemple 94 On prépare l'anilide d'acide (+)4-chloro-3 (R)- hydroxybutyrique conformément au mode opératoire de l'Exem-: ple 2, àla différence qu'on utilise le 4-chloracétoacéta nilide àune concentration de 1 mg/ml. OH ci a C_ NO N comme substrat pour la transformation en le produit optique- ndanà 10-110 C; 23 O ment actif désiré fondant à 110-111 C; + 17,50 (c,3, O, CHC 13); RMP (SCD 3 CD 3) 2,67 ( 2 H, d, J = 6 Hz,-HOHCH 2-CONHR), 3,66 ( 2 H, d, J _ 6 Hz, Cl CH 2 CHOH-R), 4,43 ( 1 H, m, -CH 2-CHOH- CH 2-), 7,03 7,44 ( 3 H, m, protons aromatiques, méta et para), 7,69 ( 2 H, d, J = 6 HZ, protons aromatiques, ortho), 9,24 ( 1 H, large, N-0) Analyse: C % H % Calculé pour CH 12 NO 2 C 156,21 5,66 Trouvé: 56,17 5,47 Exemples 95-114 On répète le mode opératoire de l'Exemple 1 avec chacun des microorganismes énumérés dans le Tableau 1, à la différence qu'on ajoute le Y-bhloro-acétoacétanilide à une 253713 o concentration de 1 mg/ml, Dans tous les cas, on obtient la transformation en le produit désiré, l'anilide d'acide (+) 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique, Exemles 115-139 On répète le mode opératoire de l'Exemple 3 avec les microorganismes énumérés dans le Tableau 2 On introduit le >-chloracétoacétanilide à une concentration de 1 mg/ml. Dans ce cas, on obtient une transformation en l'anilide d'a- cide (+)4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique désiré. Exemples 140-159 On répète le mode opératoire de l'Exemple 1 avec les microorganismes énumérés dans le Tableau 1, à la diffé- rence qu'on utilise comme substrat l'ester octylique de l'a- cide e-bromacétoacétique ( 1 mg/ml) On obtient la transfor- mation en le produit désiré, l'ester octylique de l'acide (+)4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrique. Exemples 160-184 On répète le mode opératoire de l'Exemple 3 avec les microorganismes énumérés dans le Tableau 2 à la différence qu'on utilise l'ester octylique de l'acide cétique ( 1 mg/ml) On obtient la transformation en le produit désiré, l'ester octylique de l'acide (+)4-bromo-3 (R)-hydroxy- butyrique. Exemples 185-204 On répète le mode opératoire de l'Exemple 1 avec les microorganismes indiqués dans le Tableau 1, à la différence qu'on utilise comme substrat l'ester benzylique de l'acide Y-bromoacétoacétique ( 1 mg/ml) On obtient la transformation en le produit désiré, l'ester benzylique de l'acide (+)4- bromo-3 (R)-hydroxybutyrique. Exemples 205-229 On répète le mode opératoire de l'Exemple 3 avec les microorganismes énumérés dans le Tableau 2 à la différence qu'on utilise l'ester benzylique de l'acide Y-bromacétoacé- tique ( 1 mg/ml) On obtient la transformation en le produit désiré, l'ester benzylique de l'acide (+)4-bromo-3 (R)-hydro- xybutyrique. 2 O Exe I, es 230-249 On répète le mode opératoire de l'Exemple 1 avec les microorganismes énumérés dans le Tableau 1 à la différence qu'on utilise comme substrat le Y-bromacétoacétanilide ( 1 mg/ml), On obtient la transformation en l'anilide de l'acide (+)4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrique désiré. Exemples 250-274 On répète le mode opératoire de l'Exemple 3 avec les microorganismes énumérés dans le Tableau 2 à la différence qu'on utilise comme substrat le X-bromacétoacétanilide ( 1 mg/ml) On obtient la transformation en l'anilide de l'acide (+) 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrique désiré. Exemples 275-294 On répète le mode opératoire de l'Exemple 1 avec - les microorganismes énumérés dans le Tableau 1 à la différence qu'on utilise comme substrat l'ester octylique de l'acide Yhydroxyacétoacétique ( 1 mg/ml) On obtient la transformation en l'ester octylique d'acide 4-hydroxy-3 (R)-hydroxybutyrique désiré, Exemples 295319 On répète le mode opératoire de l'Exemple 3 avec les microorganismes énumérés dans le Tableau 2 à la différence qu'on utilise comme substrat l'ester octylique de l'acide y-hydroxyacétoacétique ( 1 mg/ml) On obtient la transformation en l'ester octylique de l'acide 4-hydroxy-3 (R)hydroxybutyrique désiré. Exemples 320-339 On répète le mode opératoire de l'Exemple 1 avec les microorganismes énumérés dans le Tableau 1, à la différence qu'on utilise comme substrat le Y-hydroxyacétoacétanilide ( 1 mg/ml), On obtient la transformation en l'anilide d'acide 4-hydroxy-3 (R)-hydroxybutyrique désiré. Exemples 340-364 On répète le mode opératoire de l'Exemple 3 avec les microorganismes énumérés dans le Tableau 2 à la diffé- rence qu'on utilise comme substrat le Y-hydroxyacétoacé- tanilide ( 1 mg/ml) On obtient la transformation en l'anilide d'acide 4-hydroxy-3 (R)-hydroxybutyrique désiré. Exemple 365 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate de méthyle (VIII) c VII VIII V I On fait incuber-l O O mg de 4-chloracétoacétate:- de méthyle (VII-)avec 29 unités de coeur de porc (EC -r 1 1 -35), phydroxyacyl-Co A-déshydrogénase (Sigma, H 4626) et 1,36 g de NADH (Sigma, 90 %) dans 30 ml de phosphate de sodium 0,1 M tampon, p H 6,5. Au bout de 30 heures à 25 C, on extrait le mé- lange réactionnel quatre fois avec 30 ml d'acétate d' éthyle - On déshydrate la phase organique sur sulfate de sodium et l'évapore à sec sous pression réduite On chromatographie le résidu ( 90 mg) sur une colonne ( 1,3 x 34 cm) de- gel de silice ( 12 g) On élue la colonne avec un système de solvants con- sistant en Skelly B-acétate d'éthyle ( 8:1) et on recueille des fractions de 20 ml On réunit les fractions 9-11 qui con- tiennent le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de méthyle (VIII) désiré comme mis en évidence par la CCM Zc 73 + 23,50 (c 5,2; CHC 13). Exemple 366 On répète le mode opératoire de l'Exemple 365 en Ủtilisant le 4chlôracétoacétate d'éthyle comme substrat pour obtenir le 4-chloro-3 (R)hydroxybutyrate d'éthyle ( 3 + 22,70 (c 4,7;CHC 13). Exemple 367 On répète le mode opératoire de l'Exemple 365 en utilisant le 4chloracétoacétate de n-propyle comme substrat z 53713 '0 pour obtenir le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de n-propyle A_ 723 + 21,50 (c 5,0; CHC 13) , Exemple 368 On répète le mode opératoire de l'Exemple 365 en utilisant le 4chloracétoacétate de n-butyle comme substrat pour obtenir le 4-chloro 3 (R)-hydroxybutyrate de n-butyle 23 + 20,10 (c 3; 1; CHC 13). Processus général de transformation d'esters et amides 4 halogéno-3 (R) hydroxybutyrigues en L-carnitine: Exe'mple 369 On chauffe à 80-90 'C pendant environ 2 heures un mélange d'ester octylique de l'acide 4-chloro-3 (R)-hydro- xybutyrique ( 1,5 g), d'éthanol ( 3 ml) et de triméthylamine (solution à 25 % en poids) dans del_'eau-_( 3 ml) On évapore. les solvants et l'excès de triméthylamine à sec sous vide pour obtenir 1, 8 g de résidu brut On chauffe le produit brut ( 1 g) à 80-90 'C dans une solution de HC 1 à 10 % ( 7 ml) pendant 1,5 heure Après évaporation des solvants sous pres- sion réduite; on extrait:lèeuproduitbrttt, deux -fois avec de-; 'l'éthanol absolu ( 10 ml) et on évapore l'éthanol sous vide On dissout le résidu-cristallin dans une petite quantité d'éthanol et on précipite le chlorure de L-carnitine par addition d'éther avec un bon rendement ( 320 mg), point de fusion 142 &C (déc); 7 23,7 " '(c 4,5; H 20). On peut facilement transformer le chlorure de L-carnitine en le sel interne de la L-carnitine que l'on préfère du point de vue pharmaceutique, par échange d'ions comme on le sait en pratique. Exemple 370 4-iodom,3 (R)Z'hydroxybutyrate d'octyle (IX) CE - JUI 81 l l X il On chauffe au reflux pendant 24 heures un mélange de 4chloro-3 (R)-hydroxybutyrate d'octyle (II) ( 1,426 g) et d'iodure de sodium anhydre ( 1,2 g) dans 15 ml de méthyl-éthyl- cétone On évapore le mélange à l'évaporateur rotatif et le fait réagir avec de l'éther ( 100 ml) et de l'eau ( 50 mi). On sépare la phase organique et la lave avec une solution - à 10 % de thiosulfate de sodium ( 150 ml), de la saumure ( 150 ml) et la déshydrate sur sulfate anhydre de sodium On évapore le solvant sous pression réduite pour obtenir 1,762 g de composé IX sous forme d'une huile jaune pâle; IR (pel- licule mince) 3460 cm (OH) et 1730 cm (ester C=O); RMP (CDC 13) 3,93-4,27 (m, 3 H), 3,17 (d, 2 H), 2,50 (d, 2 H), 1,50-1,87 (m, 2 H), 1,30 (s, 12 H), 0,93 (m, 3 H). Transformation du 4-iodo-3 (R)-hydro xybutyrate d'octyle (IX) en L-carnitine. o H 3 o OS O N-O 3 r- I \> 2 \ O C 8 r 17C Eo X 3 C 3 ' 3 XX: X CE 3 OH c 3 f L-Carnittne - On ajoute à une solution de composé IX ( 1,593 g) dans le méthanol ( 15 ml) une solution à 25 % de triméthylamine 3 O aqueuse ( 8 ml) On agite le mélange à 27 C pendant 20 heures. On évapore les solvants et l'excès de triméthylamine sous pression réduite pour obtenir un solide semi-cristallin, le composé X On lave ce résidu avec de petites quantités d'éther I, pour chasser l'octanol, puis on le dissout dans l'eau et le JJ fait passer sur une colonne de Dowex l-x 4 b orme OH 0,1449- 0,297 mm, ( 2,5 x 15 cm)7, On lave la colonne avec de l'eau distillée Par élimination du solvant sous vide à partir des premiers 200 ml de l'éluat, on obtient la L-carnitine sous forme d'un solide cristallin blanc ( 490 mg, rendement %) 23 _ 29,2 (c 6,5; H 20). Exemple 371 On répète le mode opératoire de l'Exemple 370 en utilisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate d'hexyle pour obtenir le 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate d'hexyle que l'on transforme ensuite en L-carnitine. Exemple 372 On répète le mode opératoire de l'Exemple 370 en utilisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate d'heptyle pour obtenir le 4-iodo-3 (R)hydroxybutyrate d'heptyle que l'on transforme ensuite en L-carnitine. Exemple 373 On répète le mode opératoire de l'Exemple 370 en utilisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de décyle pour obtenir le 4-iodo-3 (R)hydroxybutyrate de décyle que l'on transforme ensuite en L-carnitine. Exemple 374 On répète le mode opératoire de l'Exemple 370 en utilisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de méthyle (VIII) pour obtenir le 4-iodo-3 (R)hydroxybutyrate de méthyle que l'on transforme ensuite en L-carnitine. Exemple 375 On répète le mode opératoire de l'Exemple 370 en utilisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate d'éthyle pour obtenir le 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate d'éthyle que l'on transforme ensuite en L-carnitine. Exemple 376 On répète le mode opératoire de l'Exemple 370 en utilisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de n-propyle pour obtenir te 4-iodo-3 (R)hydroxybutyrate de n-propyle que Z 537130 l'on -transforme ensuite en L-carnitine. Exemple 377 On répète le mode opératoire de, l'Exemple 370 en utilis ant le 4-chloro 3 (R>-hydroxybutyratede n -butyle pour obtenir le 4 "iodo-3 (R) hydroxybutyrate de n-butyle que l'on transforme ensuite en L-carnitine. Des exemples de levures qui produisent l'enzyme désiré sont énumérés sur le Tableau i et des exemples de- champignons sont énumérés sur le Tableau 2. T-ableau i (Levures) 1. 2. 4. 5. 6. 7. a. '9 10. il. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. NRRL ATCC Candrda 6-imo 1 vti-ca NRJRL Y-1095, candida vseudotroieaî iz NRRL Y-1264 Mycoder- ma cerevisiae NRRL Y-16 '15 Torula lactosa NPRRL Y-329 Geotricehum candidunm NRRL Y o 552 Hanseriula anomala NRRL Y-366 Hansenula sub-oelliculosa NRRL Y-1683 Pichia alcoholonhila NRIRL Y- 2026 Saccharomyces cerevisiae NRRL -Y-12, 632 Saccharomnvees lactis NP-PL Y-1140 Zygosaccharomvces priorianus NRRL Y-12,524 12. Saceh Iaromvces acidifaciens NP RL Y-7253 Kloeckera corticis ATCC 20109 Crv-totcoctis mascerans ATC-C 24194 Rhodotorula so ATCC 20254 Candida aibicans ATCC 752 Dimodascus albidus ATCC 12934 Saccharomycees d'êrevisiaa (Red Star du commerce) Rhodotorula rubra NRRL Y-1592 Oosmora lacti S ATCC 14318 & Northeru Regional Reseaîcihi Lab a Peoria, Illinois. Axnerican Type Cultu-re Collection à Rockville, Maryland Tal:'eé-=u 2 (Chanloiçnons) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. a. 9. 10. il. 12. i 3. 14. 15. 16. 17. la. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. vi-ens ATCC 13362 Caldaricmyces flimal J 0, ATCC 16373 Linderizia pennisomora ATCIC 12442 As-pergillus'ochraceus NRRL 405 Tr-ichode na ligno, ATCC 8678 Heterocer,halum autantiacum AZCC 16328 Entomiophthora coronata NRRL 1912 Scorula îoosis const-antini In ZRL 1860 Zylâorhnchus heterogamus ATCC 6743 Sco-oular-ici Dsis brevica-ulis NRRL 2137- Rhiz -Pus arrhizus -NILU 2286 Penicillium thomii NRRL 2077 Mucor hiernalis C-) NRRL 4088 Byssochiamys n-4 vea ATCC 12550 NRRL 1952 Metarrhizium aniso-cliae ATCC 24942 Penicillium islandicum ATCC 10127 Cunnin Ehamella elegans ATCC 10028 a Cunnin 2 hamella echinulata ATCC 11585 a Aspergillus fumigatus ATCC 16907 Aspergillus amstelodami NRRL 90 Gliocladium rose= ATCC 10521 Asperl Zillus giganteus ATCC 10059 Absidia blakeleeana ATC 41 10148 b Penicillium rocueforti NRIRL 849 a 253713 O REVENDICATIONS 1 Composés caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule et ont la configuration 3 (R): CH H X@t dans laquelle X est choisi parmi C 1, Br, I et OH et R est un radical à configuration en chaîne droite, en chaîne ramifiée ou cyclique choisi parmi: les radicaux alkoxy ayant de 1 à environ 15 atomes de carbone les radicaux alkylamino ayant d'environ 5 à en- viron 15 atomes de carbone; les radicaux cycloalkoxy et cycloalkylamino ayant d'environ 5 à environ 12 atomes de carbone les radicaux phénoxy et phénylalkoxy ayant de 7 à environ 14 atomes de carbone; les radicaux phénylamino et phénylalkylamino ayant les formules: Y Y Z 1, 121 -N-0-A; et -N-CH-0-A o Y et Z sont choisis parmi H, un groupe alkyle de 1 à environ 8 atomes de carbone, phényle ou benzyle et A est choisi parmi H, CH 3, Cl et Br. 2 Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un radical alcoxy à chaîne droite ayant 1 à 10 atomes de carbone. 3 Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R représente OC 1 o H 21. 4 Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R représente OC 8 H 17 8 17 ' Composé selon la revendication 2, caractérisé en-ce que R représente OC 7 H 15. 7 15 253713-0 6 Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R représente OC 6 H 13. 7 Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un radical alcoxy inférieur ayant 1 à 4 atomes de carbone. 8 Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est choisi parmi des radicaux phénoxy et phé- nylalkoxy substitués par un groupe alkyle inférieur, halo- géno ou nitro. 9 Composé selon la revendication 8, caractérisé en ce que R est un groupe benz Xyloxy et X est choisi parmi-r{ C 1 et Br. Composé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que R est un groupe phénylamino et X est choisi entre Cl et Br. 11 Procédé de préparation de dérivés d'acides P-hydroxybutyriques substitués en Y optiquement actifs répondant à la formule: OH H x X ^^,R dans laquelle X est choisi parmi Cl, Br, I et OH et R est un radical à configuration en chaîne droite, en chaîne ramifiée ou cyclique choisi parmi: des radicaux alkoxy ayant de 1 à environ 15 ato- mes de carbone des radicaux alkylamino ayant d'environ 5 à 15 atomes de carbone; des radicaux cycloalkoxy et cycloalkylamino ayant d'environ 5 à environ 12 atomes de carbone; des radicaux phénoxy et phénylalkoxy ayant de 7 à environ 14 atomes de carbone des radicaux phénylamino et phénylalkylamino ayant les for- mules: Y YZ = II I -N-0; et -N-CI l -NL-A, et -N-CH-0-A o Y et Z sont choisis parmi H,-un groupe alkyle de 1 à environ 8 atomes de car- bone,, phényle ou benzyle et A estchoisi parmi H, CH 3, Cl et Br à partir des esters ou amides d'acide acétoacétiques. substitués en i correspondants, caractérisé en ce qu'il consiste: à soumettre lesdits esters ou amides d'acide acétoacétique substitué en Và l'action enzymatique de fer- mentation d'un microorganisme qui élabore la L hydroxy- acyl-Co A-déshydrogénase-lEC 1- 1 1 35 l, et à récupérer les- dits dérivés d'acide f-hydroxybutyrique substitué en Y op- tiquement actifs désires. 12 Procédé selon la revendication -11, destiné': à la préparation de dérivés d-acide 31 R)-hydroxybutyrique - substitué en Yoptiquement actifs ayant la formule et la configuration 3 (R) dans laquelle X et R ont les significations données à la revendication 11, à condition que si R est un radical alkoxy-il comporte de 5 à environ 15 atomes de carbone, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre les composés ,' de formule À 0 O XCH 2-C-CH 2 CR dans laquelle X et R ont les significations données plus haut à l'action enzymatique de fermentation d'un microor- ganisme qui élabore la L--hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase lEC 1 1 1 35 l, et à récupérer les dérivés d'acide 3-(R)- hydroxybutyrique substitués en 4 optiquement actifs dé- sirés à partir du mélange réactionnel de fermentation. 13 Procédé selon la revendication 12, caracté- risé en ce que le microorganisme est choisi parmi la clas-: se des Ascomycètes. 14 Procédé selon la revendication 12, caracté- risé en ce que le microorganisme est choisi parmi les ordres des Endomycétales, des Mucorales, des Monoliales ou des Eurotiales. Procédé selon la revendication 12, carac- térisé en ce que le microorganisme est choisi parmi le genre Saccharomyces. 16 Procédé selon la revendication 15, caracté- risé en ce que le microorganisme est Sacchar-omyces cerevia siae. -17 Procédé selon la revendication 12, caracté- risé en ce que le dérivé acétoacétique substitué en Y sou- mis à l'action enzymatique de fermentation-est 1-'ester oc tylique de l'acide g -chloro-acétoacétique 18 Procédé selon la revendication 12, caracté- risé en ce que le dérivé d'acide acétoacétique substitué- en Y soumis à l'action enzymatique de fermentation est l'ester benzylique de l'acide chloro-acétoacétique - 19 Procédé selon la revendication 12, carac- térisé en ce que le dérivé d'acide acéto-acétique substi- tué en Y soumis à l'action enzymatique de fermentation est le -chloro-acétoacétanilide. Procédé selon la revendication 17, caracté- risé en ce que le microorganisme est Saccharomyces cerevi- siae - 21 Procédé selon la revendication 18, caractéri- sé en ce que le microorganisme est Saccharomyces cerevi- siae. 22 Procédé selon la revendication 19, carac- térisé en ce que le microorganisme est Saccharomyces ce- revisiae. 3 b 23 Procédé selon la revendication 1 I pour la préparation de dérivés d'acide 3 (R)-hydroxybutyrique subs- titué en optiquement actifs ayant la formule et la configuration 3 (R) X a Hns O H T O x 1 2 dans laquelle X a les significations données à la reven- dication 11 et R est un radical alkoxy ayant 1 à 4 atomes de carbone, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre des composés de formule: 0 O XCH 2-C-CH 2 C-R dans laquelle X et R ont la signification donnée plus haut à l'action enzymatique de la L hydroxyacyl-Co A-déshydro- génase lEC 1 1 1 35 l sous forme purifiée, et à récupérer-les dérivés d'acide 3 (R)-hydroxybutyrique substitué en ' opti- quement actifs désirés à partir du mélange réactionnel enzy- matique. 24 Procédé selon la revendication 23, caractéri- séen ce que la L-,B-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase lEC 1 1. 1.35 l sous forme purifiée est celle isolée de coeur de porc. Procédé de préparation du sel interne de la L-carnitine, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un dérivé d'acide 3 (R)-hydroxybutyrique substitué en 4 se- lon la revendication 1, successivement avec la triméthyl- amine et l'acide chlorhydrique, à extraire le chlorure de L-carnitine, et à soumettre ledit chlorure à un échange d'ions et à récupérer le sel interne de L-carnitine. 26 Procédé de préparation d'un dérivé d'acide 4-iodo ou 4-bromo-3 (R)hydroxybutyrique, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un dérivé d'acide 4-chloro- 3 (R)-hydroxybutyrique avec l'iodure de sodium ou le bromure de sodium dans un solvant à une température de 50 C à 100 C pour former le dérivé d'acide 4-iodo ou 4-bromo-(R)-hydro- xybutyrique correspondant. 27 Procédé de préparation du sel interne de la L-carnitine, caractérisé en ce qu'il consiste: a) à faire réagir un ester alkylique de l'acide 4- iodo ou 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrique cnmant 1 10 ataess de carbone avec la triméthylamine dans le méthanol ou l'éthanol pour former un ester méthylique ou éthylique de L-carnitine, et b) à transformer ledit ester de L-carnitine en sel interne de L-carnitine.