Brevet FR2536306A1 — publié le 19840525

L'invention concerne une unité rdcipient pour la "'cyto- centrifugation"> clest- dire pour la technique de l'obtention, g partir de suspensions, de preparations cellulaires destinées des examens de laboratoire médcaux tels que la microscopie photoélectrique et la microscopie électronique & balayage cores ceux pratiqués en particulier par les aboratoires cytolog ques sur des liquides biologiques contenant des cellules Pendant la centrifugation, les cellules se déposent sur des porte-objets microscopiques Leur distribution, leur forme et leur taille ?>ermettent ensuite de diagnostiquer ëventuellement des maladies ou d'autres altérations Avec les "Vcytocentrifugeuses" connues, on applique la technique dite de papier filtrant, selon laquelle le liquide s'écoule dans une bande de papier filtrant, tandis que les cellules se déposent sur le porte=objet Cette technique l 5 pose des difficultés en ce qui concerns la sereté hygiénique et le risque de pertes de cellules. L'invention vise à créer un procédé et un dispositif qui permettent également de se dispenser complètement du filtrage pour la sédimentation de cellutes ou de matériaux analogues. Selon 12 invention, une unité récipient pour centrifu aus es cytologiques ou cytocentri'uge eue comprenant un bloc alvëolé, un porte-récpient et un porte-objet microscopique> avec interposition d'un filtre ou d'ur dispositif d'étanchéité entre le bloc alvéolé et le porteoobjet, est caractérisée en 2 ce que le bloc alvéolé contient au moins deux cavités droites et traversantes, qui sont perpendiculaires ou au moins sensible= ment perpendiculaires au porteoobjet et sont destinées à recevoir des échantillons, et que le bloc alvéolé est maintenu en position de travail par des éléments élastiques prévus sur le porte- récipiento Les principaux avantages réalisables grâce à l'inven tion sont indiqués ci-après. Après la centrifugation, il suffit duenlever le liquide qui recouvre la substance cellulaire déposée sur le port@ 3 Sr objet Le coût du papier filtrant est éliminé L'unité récipient peut être fermée de façon étanche Les superpositions et les déplacernents de cellules par suite de V 45 coulement du liquide Zi travers le papier filtrant sont évités. Grâce à l'invention, il est possible aussi, pour la prsmière foais, d'esaminer simultanément des échantillons doubles sur hu por te-objet, Par exrem Ple un échantillon Principal et un 4 échantillon de contcrble d'u-n ee'ul et tugme petiean C êelon un wde de réalisation rcxetavsntage Lx de livnin lec bloc elvéolê " résente dao cavités réceptrices coniques ?pour inéee ckec échinti Jlons ('do formas conique), ce Qui pemt am un ercisxin cellulaire, ce qui n'est pa S possibl e dans U atactuel d'a la technique. Lorsque, selon un mode d 1 e réalisation préfé 6 ré, le bloc lvoéde uiré rcipient sttransparent, d'ventuellos impure- tr-os contenrues dans l'ae échanitillons sont: ijmaédiatement visibleo et peuvent etre elésfclaet 1) un-ité réicipient se laisse facilement mmttre en place danas le potéiint lnetas nécessaire, lors de cette opée ati Or L, de respecter:aornttn riciredu bloc aivéolé Il est égalewent avantageux et úacile de mirettre lu eni place dans un récipi ent trel qu'un bêch Gr ( nuleetà lidu dkdapteurs) camele ceux utilisés habituellement dans les cn Zrîfug'acuses avec dos rotors dans lesquels les récipients sont dispos 3 de telle manière qu'îlo sont déplacés vers l'extêrieur sous la force centrifuge Il est avantageux qu un tel récipient Puisse tre fermé de f'agon éftanch-te au vide. Une marque (un nuér ed patient par exemple) est apposée de façon bien visible sur le porte-objet avant la centrifugation, ce que dimnue le risque d'interversions des éhtiln Ceb marquage n'est pas recouvert par le bloc alvéolé de l'unité récipient dans la direction d'observation normale. D'autres caractéristiques et avantages de l Vinvention ressortiront plus clairement de la description qui va suivre d'execm ples dte réalisation non limitatif Cs, ainsi que des dessinrs annexés, sur lesquels la figure la représente an coupe verticale et an plan un bloc av léprésentant deux cavités cylindriques parallèles; la figure lb est une représentation analogue d'un bloc alvéolé présentant deux cavités coniques; la figure 2 a est une vue de côté partiellement en coupe d'un bloc alvéolé comme celui de figure la après sa mise en place, conjointement avec un porte-objet microscopique, dans un porte-récipient; la figure 2 b est une vue en bout de I'unité récipient de figure 2 a; la figure 3 est une vue en perspective d'un bloc alvéolé comme celui de figure la avec un filtre et un porge- objet; la figure 4 est une vue en perspective des différents composants d'une unité récipient destinée à être mise en place dans un bécher conçu pour être monté oscillant dans le rotor d'une centrifugeuse o les béchers sont déplacés vers l'extérieur Rous l'effet de la force centrifuge; et la figure 5 est une vue en perspective d'un tel rotor de centrifugeuse avec des récipients (béchers) dans lesquels ont été mises en place des unités récipients selon l'invention. Les unités récipients selon l'invention comportent chacune un bloc alvéolé 1 qui est transparent et possède essentiels lement une forme parallélépipédique, dans lequel sont formées au moins deux cavités traversantes, qui sont étanchées en bas par rapport au porte-objet, par des joints toriques par exemples et dont les ouvertures d'introduction des échantillons, prévues en haut, sont ouvertes. La figure la représente un bloc alvéolé 1 qui possède des cavités cylindriques 2 pour la réception d'échantillons= Les cavités 2 sont parallèles et sont disposées symétriquement par rapport à un plan transversal médian du bloc alvéolé 1 La fi- gure lb représente un bloc alvéolé 1 avec des cavités réceptrices d'échantillons 3 qui sont coniques Ces cavités sont également disposées symétriquement par rapport à un plan transversal médian du bloc Alors qu'une cavité cylindrique 2 comme celles visibles sur la figure la peut avoir une contenance d'environ 1,5 ml par exemple, les cavités 3 de l'exemple représenté sur la figure lb peuvent recevoir des échantillons dont le volume est à peu près le double Il est ainsi possible (avec le même diamètre de l'ou- verture d'échantillon) d'obtenir un enrichissement en cellules d'un facteur 5 environ L'exécution à cavités coniques est par conséquent Préférée. Le bloc alvéolé 1 est mis en place, ensemble avec le porteobjet, dans le porte-récipient 5, comme le montrent les figures 2 a et 2 b, de sorte qu'on obtient une unité-transportable. Le bloc 1 est immobilisé sur le porte-récipient 5 par des res- sorts de blocage 4, avec disposition du porte-objet 6 entre le bloc 1 et le po'rte-récipient 5 Les dessins montrent clairement les Joints toriques 7, faits d'un élastomère fluoré comme celui connu sous la marque "Viton" Sur les figures la, lb, 2 a et 2 b, les joints toriques 7, tenus dans des rainures en queue d'aronde, sont situés en bas, c'est-à-dire tournés vers le fond du réci- pient Les ressorts de blocage 4, fixés sur le porte-récipient 5, sont conformés de manière à permettre une mise en place facile du bloc alvéolé et à assurer néanmoins un maintien en place solide du bloc en position de travail et pendant l'oscillation et la rotation dans la centrifugeuse Les ressorts de blocage présentent des renflements 9 pour le maintien en place de l'unité récipient dans un adapteur, u N bêcher de centrifugeuse ou dans un autre récipient destiné à recevoir l'unité Le bloc 1 a préalablement été recouvert en haut d'une plaque de recouvrement 8, laquelle est également tenue par les ressorts de blocage 4 Cette plaque de recouvrement comporte de-petits couvercles 10 qui sont situés directement au-dessus des cavités 2 ou 3 et dont le nombre, la forme et la grandeur sont adaptés à ceux des cavités réceptrices d'échantillons Les ressorts de blocage peuvent âtre fixés amovibles au porte-récipient par des vis 11 Le bloc alvéolé 1 présente des rainures de guidage 12, visibles sur la figure 3, qui sont destinées à recevoir et à maintenir en place les ressorts de blocage 14 sur les deux côtés du bloc, Dans la représentation de la figure 3, les joints toriques 7, maintenus en place dans les rainures en queue d'aronde, sont situés en haut Cette figure montre également la réalisation symétrique du bloc alvéolé 1 par rapport à-un plan central Comme déjà mentionné, le bloc sera généralement fait d'un matériau transparent, de verre acrylique par exemple, Entre le porte- récipient et le bloc alvéolé peut être disposé un porte-objet pourvu d'une plage-de marquage 15, d'une plage d'inscription par exemple, qui est située sur un petit côté du porte-objet 6 et qui dépasse de l'extrémité cor- respondante du bloc alvéolé Une bande de papier filtrant 14 de forme analogue peut être placée entre le porte-objet 6 et le bloc alvéolé 1 au cas o il faut travailler avec de telles bandes. En pareil cas, c'est-à-dire s'il faut travailler selon la technique de filtrage et non pas selon ia technique de décantation, le bloc alvéolé 1 est retourné (tourné de 180 ), de sorte que les jnints toriques 7 se trouvent en haut Les faces opposées du bloc doivent être autant que possible planes et lisses pour assurer l'étanchéité et 12 écoulement convenables Le marquage du porte-objet représente un avantage évident, d'autant plus qu'il n'est pas recouvert par le bloc alvéolé (on voit clairement sur la figure 3 que la plage de marquage dépasse du bloc 1) o Les risques d'interversions sont ainsi pratiquement exclus, le marquage restant également visible dans la centrifugeuse lorsque le rotor est arrêté. Les blocs alvéolées avec leurs cavités réceptrices d'échantillons à axes parallèles se laissent facilement nettoyer et désinfecter ou stériliser Des souillures sont facilement visibles La désinfection des unités récipients peut être faite avec une solution aqueuse de dialddhyde glutariqueo Les blocs comportent en particulier deux cavités mais il est parfaitement possible de prévoir 4, 6, 8 ou un nombre quelconque de cavités dans chaque bloc. Afin d'améliorer l'adhérence des cellules sur le porte- objet, on peut enduire celui-ci préalablement d'une mince couche de blanc d'oeuf glycérine ou de gélatine glycérinae. Comme on peut le voir sur la figure 4, une unité récipient selon l'invention peut être décomposée et assemblée pour être mise en place dans un récipient de centrifugeuse tel qu'un bêcher oscillant La figure 4 montre, de droite à gauche, la plaque de recouvrement 8, le bloc alvéolé 1, le porte-récipient 5 2536306 i avec les ressorts de blocage 4 et un adapteur 16 pour la mise en place de l'unité récipient dans un récipient 17, constitué de pré- férence par un bécher oscillant d'un rotor, comme le rotor 18 représenté sur la figure 5, o les béchers sont montés de manière à osciller vers l'extérieur sous l'effet de la force centrifuge pendant la rotation. En cas d'interposition d'un papier filtrant entre le bloc alvéolé et le porte-objet microscopique, on peut prévoir un récipient collecteur de liquide qui entoure au moins partiellement l'unité récipient. Les différentes opérations d'une-eytocentrifugation sont les suivantes 1 Mise en place du bloc alvéolé dans le porte-récipient, o se trouve déjà un porte=objet microscopique (éventuellement recou- vert d'une bande de papier filtrant)0 2 Introduction du matériau & examiner tel qu'une suspension cellulaire dans l'unit récipient, c'est-àadire dans les cavités, au moyen d'une pipette et par les ouvertures en haut dei cavités. 3 Marquage du porte-objet, par exemple par un numéro de patiente 4 Mise en place de l'unité récipient dans le rotor de la centri- fugeuseo La centrifugation consécutive s'effectue avec des nombres g, dans le plan du porte-objet, entre 100 et environ 1 000, de pref Erence entre environ 200 et 800 g; suivant le diamètre du rotor: cela correspond à des nombres g de 500 et 3 000 min 1 l de préférence entre environ 850 et 2700 min - Apres la centrifugation, on enlève le liquide qui recouvre le dépôt sur le porte-objet, par exemple à la pipette ou par déver- sement. 6 Le bloc alvéolé avec le porte-objet sont retirés du porte- récipient et les préparations sont ensuite colorées selon des procédés connus, recouvertes de verre de recouvrement et fixées en ce sens que les cellules avec leurs structures albwuminoides sont stabilisées par coagulation Les solutions colorantes contiennent normalement de la colle La coloration s'effectue de façon connue dans des bains et pendant une durée fixée avec 2536306 ' précision Avec-l'unité récipient selon l'invention, la fixation peut s'effectuer à l'alcool ou l'aldéhyde immédiatement après l'enlèvement du liquide recouvrant le dépôto En raisondas cavités droites traversantes du bloc alvéolé dans une unité récipient selon l'invention, la fixation peut s'effectuer également au moyen d'un agent de fixation sous forme de vapeur ou d'aérosol, par exemple à partir d'une bouteille de pulvérisation. C'est ensuite seulement que l'on retire le porte-objet avec le dépôt ou sédiment cellulaire (mince couche) et que-l'on effectue la coloration. La coloration est normalement suivie de l'enrobage de la préparation cellulaire dans la gélatine et son recouvrement par des plaquettes de verre L'examen microscopique proprement dit a seulement lieu ensuite. Appli cations La cytocentrifugation dans son sens le plus large est intéressante pour un grand nombre de disciplines médicales: cytologie immunologie cytopathologie pédiatrie- urologie gérontologie anatomie embryologie génétique toxicologie médecine nucléaire médecine ldgale neurologie biométrie hématologie oncologie et aussi dans la biologie pour: botanistes virologues zoologues biotechnologues biologues de la mer biochimistes bactériologues cytochimistes paléobotanistes paléologues mais aussi pour d'autres domaines limitrophes importants pharmacologie minéralogie examens de la structure géologie cristalline sur le porte- objet chimie des eaux usées chimie-des aérosols matières en suspension chimie des aérosols- Tout à fait en haut de la gamme des applications se trouve spécialement l'oncologie (cancérologie) mais aussi la can- cérologie en coopération avec toutes les autres disciplines de recherches médicales mentionnées plus haut (en particulier l'uro- logie et la cytopathologie). Ce qui importe les cytologistes en premier lieu lors des examens ce sont des phénotypes qualitatifs dans le sédiment cellulaire, c'est-à-dire, par exemple, des modifications morpho- logiques de cellules ou de noyaux cellulaires, ou l'apparition de types de cellules qui n'avaient pas été prévues, et ainsi de suite. Les évaluations quantitatives concernent tout au plus le rapport de différents types de cellules entre eux. Les plus importants liquides-échantillons organiques dans lesquels sont examinés des cellules sont les suivants liquide cérébral liquide prostatique liquide céphalo-rachidien liquide tissulaire (liquide obtenu par ponction de salive la colonne vertébrale) urine cellules sanguines liquide mammaire liquide lymphatique liquide obtenu par ponction cle liquide pancréatique la pleurocentèse D'autres possibilités d'application du système décrit ici sont des examens autres que par microscopie ordinaire (optique) qui demandent des dépûts ou des précipitations de substances en couches minces, tels que: 1 microscopie électronique à balayage 2 imunofluorescence 3 microscopie électronique par transmission 4 autoradiographie et d'autres encore. 9- REVENDICATIONS 1 Unité récipient pour centrifugeuses cytologiques ou cytocentrifugeuses, comprenant un bloc alvéolé ( 1), un porte- récipient ( 5) et un porte-objet microscopique ( 6), avec inter- position d'un filtre M 4)ou d'un dispositif d'étanchéité ( 7) entre le bloc alvéolé et le porte-objet, caractérisée en ce que le bloc alvéolé ( 1) présente au moins deux cavités droites et traver- santes ( 2, 3), qui sont perpendiculaires ou au moias sensiblement perpendiculaires au porte-objet ( 6) et sont destinées a recevoir des échantillons, et que le bloc alvéolé ( 1) est maintenu en position de travail par des éléments él-astiques ( 4) prévus sur le porte-récipient ( 5). 2 Unité selon la revendication 1 i caractérisée en ce que le bloc alvéolé ( 1) peut être disposé dans le porte-récipient ( 5) par une face portant des joints d'étanchéités ( 7) ou par une face destinée à venir s'appliquer contre du papier filtrant ( 14). 3 Unité selon la revendication 1 ou 2, -caractérisée en ce que le bloc alvéolé ( 1) présente des cavités cylindriques ( 2) ou coniques ( 3), dont une extrémité, celle tournée vers le porte- objet microscopique ( 6) sur le fond du porte-récipient ( 5), est pourvue d'une bague d'étanchéité ( 7) dont le diamètre est adapte au plus petit diamètre de la cavité. 4 Unité selon l'une quelconque des revendications pré- cédentes, caractérisée en ce que le bloc alvéolé ( 1) est réalisé symétriquement par rapport à un plan central et en ce que 1 Xa face opposée à celle contenant les bagues d'étanchéité ( 7 > est conçue pour venir s'appliquer contre un papier filtrant ( 14) disposé sur le fond du porte-récipient ( 5). Unité selon l'une quelconque des revendications pré- cédentes, caractérisée en ce que les baguesd 'tanchéité prévues dans le bloc alvéolé ( 1) sont des joints toriques ( 7) qui sont maintenus de façon amovible dans le bloc. 6 Unité selon la revendication 5, caractérisée en ce que les joints toriques ( 7) sont en élastomère fluoré. 2536306 ' 7 Unité selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisée en ce que le bloc alvéolé ( 1) présente des rainures de guidage ( 12) pour la réception des éléments élas-. tiques ( 4) prévus sur le porte-récipient ( 5). 8 Unité selon l'une quelconque des revendications pricé- denges, caractérisée en ce que le bloc alvéolé ( 1) comporte une plaque de recouvrement ( 8) qui contient des couvercles GO) dont le nombre, la forme et la taille correspondent à ceux des cavités réceptrices d'échantillons ( 2, 3). IO 9 Unité selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisée en ce que la plaque de recouvrement ( 8) est susceptible d'être retirée du bloc alvéolé ( 1) pour enlever des cavités ( 2, 3), par déversement ou à la pipette, du liquide recouvrant les dépôts formes sur le porte-objet ( 6). 10 Unité selon l'une quelconque des revendications prdcé- dentes, caractérisée en ce que le bloc alvéolé est fait d'un matériau synthétique transparent, en particulier de verre acrylique. 1 l Unité selon l'une quelconque des revendications prdcé- dentes, caractérisée en ce que, en cas d'interposition d'un papier filtrant ( 14) entre le bloc alvéolé ( 1) et le porte-objet micros- copique ( 6), un récipient collecteur de liquide entoure au moins partiellement l'unité récipient. 12 Unité selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisée en ce qu'il est combiné avec u Ln récipient qui entoure l'unité récipient avec le bloc alvéolé ( 1) et qui est constitué par un récipient ( 17) d'un rotor de centrifugeuse dont les récipients sont déplaçables vers l'extérieur sous l'effet de la force centrifuge, l'unité récipient pouvant éventuellement être mise en place dans ce récipient à l'aide d'un adapteur ( 16). 13 Unité selon la revendication 12, caractérisée en ce que le récipient récepteur ( 17) peut Etre fermé de façon étanche au vide. 14 Unité selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisée en ce que le bloc alvéolé ( 1) est plus petit que le porte-objet ( 6) et en ce que ce dernier est susceptible d'être pourvu d'un marquage ( 15) qui n'est pas couvert par le bloc alvéolé. 25363 o 6 ' Unité selon l'une quelconque des revendications pré- cédentes, caractéris Ae en ce que les éltments élastiques ( 4), prévus sur le porte-récipient ( 5), présentent des renflements_ ( 9) pour le maintien en place de l'unité dans un récipient, éventuel- lement à l'aide d'un adapteur ( 16), en particulier dans un réci- pient ( 17) d'un-rotor de centrifugeuse portant des récipients déplaçables vers l Vegtérieur sous l'effet de la force centrifuge.