Brevet FR2538253A1 — publié le 19840629

Fraction polypeptidique de poids moléculaire moyen 75.000 inductrice d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme et compositions immunogènes les contenant. L'invention concerne des fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme, ainsi que des compositions im- munogènes les contenant, susceptibles de conduire à la production de vaccins pour l'homme et l'animal. Elle est également relative aux anticorps spécifiques induits in vivo par ces fractions. Les fractions polypeptidiques selon l'invention présentent les caractéristiques suivantes - elles possèdent une masse moléculaire moyenne de l'ordre de 75.000 (mesurable dans un système de migra tion électrophorétique et par comparaison aux migra tions dans des conditions semblables de peptides mar qués, notamment à l'isothyocyanate de fluorescéine, et de poids moléculaires connus, plus particulièrement des IgG humaines, la sérumaîbumine bovine (BSA) et ltoval- bumine de poulet) ; - elles sont reconnues par des anticorps actifs à l'égard de Plasmodium falciparum et par des anticorps monoclo naux ou polyclonaux formés contre elles-memes ;; - elles peuvent etre mises en évidence par 11 incorpora- tion métabolique d'acides aminés marqués, par exemple la méthionine 35S ; - elles sont inductrices notamment chez le singe, et plus particulièrement le singe SADIXRI SCIUREUS, d'anti corps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de Plasmodium falciparum ou des para sites qui présentent les memes caractéristiques biolo giques essentielles. En particulier les fractions polypeptidiques selon l'invention sont reconnues par des sérums ou des fractions immunoglobulines provenant d'animaux, notamment de singes SAIMIRI SClFEUS, résistants au parasite et susceptibles de rendre résistants des animaux sensibles au parasite. Plasmodium falciparum est bien connu des spécialistes. Les schizontes et les mérozoites de ce parasite ont déjà été utilisés pour réaliser des vaccins expérimentaux contre la malaria, notamment chez le singe (MITCHELL et al, (1977) Lancet, i, 1335 et SIDDIQUI, W.A. (1977) Science. 197, 388 (1977)). Ce dernier article intitulé "An effective immunization of experimental monkeys against the human malaria parasite, Plasmodium falciparum" peut être considéré comme témoignant un caractère si- gnificatif vis-à-vis de I'hoIne des résultats biologiques susceptibles d'être observés chez le singe. Il en est de même des résultats susceptibles d'être observés avec les fractions polypeptidiques de l'invention. Celles-ci ont été obtenues à partir alune souche de Plasmodium falciparum qui a fait l'objet d'un dépôt à la Collection Nationale des Cultures de Micro Organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris (C.N.C.M.) sous le nO FUPC I-212 le 23 décembre 1982. Par l'expression 'polypeptide", il faut entendre tout constituant peptidique ou protéique, notamment du type protéine ou glycoprotéine, tels que ceux susceptibles de provenir de Plasmodium falciparum ou de parasites qui en sont dérivés. L'invention concerne encore des préparations immunogènes contenant lesdites fractions en association avec un véhicule du type de ceux qui sont utilisés dans les compositions de vaccins, ces préparations immunogènes étant aptes à conduire à la production de vaccins effi caces contre le paludisme, plus particulièrement du type de celui qui est induit par Plasmodium falciparum ou de parasites apparentés. L'invention concerne encore un procédé d'obten tion de telles fractions immunogènes. Ce procédé consis te à traiter une préparation préalablement obtenue de Plasmodium falciparum avec une solution d'un- détergent, tel que le Sodium Dodenyl Sulfate (SDS)oucelui connu sous la désignation commerciale TRITON x 100, ou analogue, suscep tible d'induire la dissolution de la majeure partie des structures cellulaires et des constituants protéiques du parasite, de récupérer et de séparer à partir de ce milieu ceux des polypeptides qui présentent un poids molé culaire moyen de l'ordre de 75.00è daltons, qui sont suscepti bles de réagir avec des anticorps (sérums ou fractions d'immunoglobulines) orig-inaires d'animaux résistants à Plasmodium falciparum et, le cas échéant, dtêtre marqués par la méthionine ''S. Des caractéristiques supplémentaires de l'inven tion apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'un exemple de production de fractions polypepti diques selon l'invention, à partir d'une culture de para sites, et des propriétés biologiques de ces fractions. Culture des parasites et préparation. Les parasites sqnt cultivés sur globules rouges humains de groupe Ae dans du milieu RPMI 1640 % de sérum humain du même groupe, sous une atmosphère contenant 1 % 02, 3 % C02, 96 %-N2 (% en volumes). Les cultures sont synchronisées au stade "anneaux", tel que-défini dans l'article de Science 1976, 1932 673g par traitement au sorbitol (LAMBROS 1979, vol. 55,p. 418 J. of Parasitology). Elles sont récoltées 40 heures plus tard, lorsque les parasites atteignent le stade de schizontes mûrs, à 8 noyaux en moyenne. Les globules rouges sont lavés par centrifugation en RPMI 1640 et lysés par action de la Saponine à 0,025 % en RPs % en poids), en présence d'inhibiteurs de protéases "PMSF", "TtCK" (SIGMA) 10-3 M, pendant 10 minutes à 370C. Les parasites libres sont purifiés par centrifugation dans un gradient discontinu en PBS comportant 40 à 70 e de PERCOLL (P-llARt:iACIA), pendant 30 minutes à 40C. L'interface 40-70 % est récoltée par pipettage et lavée deux à trois fois en PBS. Préparation des protéines semi-purifiées Les parasites sont traités par 5 à 10 volumes de tampon pour électrophorèse, contenant 6 % en poids de SDS et 10 % de ss-mercapto-éthanol (ou d'un agent analogue susceptible de couper les ponts disulfure des protéines et de linéariser les chaînes polypeptidiques), deux fois pendant 5 minutes à 1000 C. Les extraits sont centrifugés 5 minutes à 15.000 g, les surnageants (contenant plus de 90 Z des protéines totales initialement contenues dans les parasites) sont soumis à une électrophorèse (pendant 4 heures sous 200 V) en gel contenant 10 % en poids/volume d'acrylamide au sein d'un tampon Tris aqueux (à pH 8-9) contenant 0,2 % de SDS (en poids/volume). Après électrophorèse, des bandes de gels sont coupées aux niveaux correspondants aux poids moléculaires 75.000 + 7.500 daltons repérés sur le gel par électrophorèse simultanée de peptides marqués à l'isothyocyanate de fluorescéine (IgG humaines, BSA et ovalbumine). Les polypeptides sont élués à partir des bandes de gel par électrophorèse dans un tampon sans SDS, et récoltés dans un sac à dialyse. La concentration en protéines est déterminée par dosage colorimétrique des protéines ("Biorad Assay",test commercialisé par BIORAD et décrit par SPECTOR, Analytical Biochemistry, 1978,86, 142). Les préparations sont analysées par électrophorèse en gel polyacrylamide-SDS et révélées par coloration au nitrate d'argent. On peut ainsi séparer encore - 3 bandes majeures dans la zone de poids moléculaires 72.000, 76.000, 80.000 daltons, - 1 bande mineure dans la zone de poids moléculaires 90.000 daltons. Des produits de dégradation mineurs de cette bande de 75.000 sont vus dans les zones 33.000 et 45.000 daltons. Les propriétésbiologiques de cette fraction, qu'il s'agisse de l'ensemble de la fraction de poids moléculaire moyen 75.000 (ou 75.000 + 5.000) ou des fractions protéiques davantage purifiées qui peuvent être isolées à partir des dernières bandes susmentionnées, peuvent être mises en évidence comme décrit ciaprès en rapport avec la fraction globale. Essai d'immunisation de singes SAIMIRI SCIUREUS Les résultats d'immunisation susceptibles d'être observés dans ces primates sont particulièrement représentatifs. de ce qui pourrait être obtenu de façon semblable chez lthomme. Ces animaux peuvent être davantage encore rendus sensibles à l'infection parasitaire par splénectomie : l'infection se développe rapidement chez des singes splénectcmisés. Elle se manifeste par des parasitemies importantes (50 % environ de leurs globules rouges pouvant être parasités). Les animaux splénectomisés et impaludésmeurent au bout d'une durée de l'ordre de 10 jours. Les essais qui suivent ont été réalisés chez des animaux splénectomisés répartis respectivement endeux groupes de 5 et 10 singes. Les animaux du premier groupe sont inoculés trois fois avec chaque fois une dose de 100 ug de la préparation diluée dans 0,5 ml de PBS émulsionnée avec un volume égal d'adjuvant de Freund,complet pour la première inocu latin, incomplet pour les deux suivantes. Ces inoculations se font à trois semaines d'intervalle, sous la forme d'injections sous-cutanées. Les singes du deuxième groupe (témoins) ne re çoivent que les adjuvants. Trois semaines après la troisième immunisation, les animaux sont infectés avec 50 x 106 globules rouges parasités,par voie intraveineuse. La parasitémie est ensuite contrôlée chaque jour pendant trois semaines. On observe tout de suite un important retard de la multiplication parasitaire chez ceux des animaux qui ont été immunisés. 15 jours plus tard, la proportion de globules rouges parasités chez les animaux immunisés est inférieure à 10 %, alors que chez le groupe témoin 5 jours après la dernière injection la parasitémie est de plus de 25 Ces résultats sont hautement significatifs, compte tenu du caractère splénectomisé des animaux. Des résultats semblables peuvent être obtenus avec des fractions davantage purifiées encore. Les fractions peptidiques selon l'invention constituent tout d'abord des réactifs biologiques particulièrement intéressants en ce qu'ils sont actifs in vivo. Ils peuvent être utilisés comme référence de mesure de l'activité in vivo d'autres préparations immunogènes obtenues à partir de parasites responsables des diverses formes de paludisme. L'invention concerne encore plus particulièrement les compositions vaccinantes contenant lesdites fractions polypeptidiques en association, comme on l'a déjà indiqué, avec les divers véhicules pharmaceutiques et/ou agents adjuvants couramment utilisés dans les compositions de vaccins. De préférence, l'invention concerne des solutions injectables desdités fractions polypeptidiques Les fractions polypeptidiques selon l'invention peuvent encore être utilisées pour la fabrication d'anticorps plus spécifiques à l'égard de Plasmodium falciparum que les sérums ou fractions purifiés d'immunoglobulines susceptibles d'être obtenus à partir d'animaux devenus résistants.Avantageusement, on aura recours pour la fabrication de ces anticorps plus spécifiques à la technique de fabrication des hybrides cellulaires ou hybridomes,comportant alors les étapes essentielles suivantes (susceptibles d'être mises en oeuvre selon des techniques aujourd'hui connues ) - fusion d-e cellules myélomateuses et de cellules splé niques de souris ou de rat, voire de singe, ayant au préalable été immunisées avec les fractions peptidiques sus-définies, - sélection parmi les hybridomes formés de ceux qui sécrè- tent des anticorps monoclonaux actifs contre les susdites fractions polypeptidiques. Ces anticorps plus spécifiques, particulièrement ces anticorps monoclonaux, peuvent alors être à leur tour utilisés, par exemple pour constituer des colonnes de chromatographie d'affinité. Une telle colonne est par exemple obtenue par fixation de ces anticorps monoclonaux sur la résine commercialisée par PHAStACIA sous la marque SEPHARO SE par la méthode bien connue au bromure de cyanogène. Ces colonnes de chromatographie d'affinité peuvent alors à leur tour être utilisées pour réaliser la séparation de fractions polypeptidiques immunogènes, que ce soit à partir de solutions obtenues à partir de préparations de parasites traités avec des agents dissolvants, du genre de ceux qui ont été mentionnés plus haut, ou à partir de fractions déjà concentrées et dont un état de plus grande pureté est recherché. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs dejà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés 9 elle en embrasse au contraire toutes les variantes, notamment celles dans lesquelles les fractions immunogènes de poids moléculaire moyen de 75.000 sont obtenues à partir de parasites distincts de Plasmodium falciparum, mais qui en possèdent les propriétés biologiques essentielles. L'invention s'étend -encore à celles des fractions polypeptidiques qui peuvent être obtenues à partir de parasites qui peuvent être consi- dérés comme des dérivés ou même encore des mutants de Plasmodium falciparum.Notamment sont inclus dans le cadre des revendications tous les polypeptides immunogènes ayant un poids moléculaire moyen de l'ordre de 75.000, qui sont reconnus par des anticorps protecteurs, obtenus à partir d'animaux résistants à la souche de Plasmodium falciparum déposée à la C.N.C.M. sous le n FUPC I-212 le 23 décembre 1982, et plus particulièrement encore les anticorps protecteurs plus spécifiques susceptibles d'être obtenus à partir des animaux immunisés avec les polypeptides de poids molécu laire moyen de l'ordre de 75.000 issus de cette même souche ou à partir des hybridomes formés dans les condi tions qui ont également été indiquées, en mettant en oeu vre, pour l'immunisation des ànimaux donneurs des cel lules spléniques requises, lesdits polypeptides issus de ladite même souche. D'une façon générale, on pourra,à partir d'une préparation donnée de parasites, déterminer ceux des constituants protéiques susceptibles d'induire in vivo la production d'anticorps protecteurs en procédant comme suit. On part d'une culture du parasite étudié, préalablement réalisée au sein d'un milieu de culture contenant un marqueur radioactif spécifique des constituants protéiques des parasites en question, tel que la méthionine 355 Les constituants parasitaires sont alors recueillis et traités comme il a été décrit plus haut en ce qui concerne Plasmodium falciparum, mais en vue de dissoudre la majeure partie des constituants cellulaires et protéiques du parasite cho-isi, sauf que l'on utilise le détergent TRITON X100 en lieu et place du SDS. Le TRITON X100 solubilise en effet les protéines antigéniques sans altérer profondement leur structure, de sorte qu'elles peuvent toujours encore être reconnues par des anticorps. On procede alors aux séries d'opérations suivantes. Première série d'oDerations a) On fait une électrophorèse d'un échantillon de l'ensemble des constituants protéiques des parasites. On obtient toute une sériedebandes visualisa bleus par autoradiographie. Par comparaison avec des protéines dont les poids moléculaires sont connus, on détermine les successions de poids moléculaires, par rapport aux migrations réalisées de façon concommittante par des peptides de poids moléculaires connus. b )Partant d > un échantillon distinct desdits constituants protéiques (il s'agit toujours de- la préparation marquée), on le fait réagir avec les anticorps provenant d'un singe résistant au parasite ; on fait ensuite réagir l'ensemble avec la protéine A du staphylocoque doré (préparation commerciale). On sépare par centrifugation le précipité formé,qui contient un complexe protéine A - anticorps - antigène radioactif. Après lavage du précipité, on le redissout en présence de SDS. Celui-ci dissocie l'antigène de l'anticorps et de la protéine A; On resoumet l'ensemble à électrophorèse et on repère les bandes marquées-, en nombre plus réduit que dans le cas précédent, ainsi que leurs poids moléculaires respectifs. Deuxième série d'opérations On répète I'ensemble des étapes a) et b) cidessus, mais en utilisant cette fois-ci des anticorps provenant d'un singe sensible au parasite Par comparaison des bandes obtenues sur les gels après les réactions avec les anticorps provenant d'animaux résistants, d'une part, etde celles obtenues après réaction avec des anticorps provenant d'animauxsensibles, d'autre part, on détermine celles des bandes qui n'ont été obtenues qu' au terme de l'étape b) de la première série d'opérations et leurs régions de poids moléculaires. Ces bandes contiennent des constituants pro téiques reconnus préférentiellement par des sérums d'animaux résistants et, de ce fait, les antigènes reconnus spécifiquement par des anticorps protecteurs. Troisième série d'opérations On réalise enfin une nouvelle culture du même parasite, mais en l'absence du marqueur radioactif, et on procède à une nouvelle séparation électrophorétique de ses constituants- protéiques dans les mêmes conditions que dans la première et deuxième sérié d'opérations. On teste ensuite la capacité des constituants ayant migré aux mêmes distances que ceux qui ont été reconnus par les anticorps à l'issue de la deuxième série d'opérations, à induire in vivo la production d'anticorps protecteurs, et l'on recùeille ceux de ces constituants qui ont induit une réaction immunologique positive, par exemple dans les mêmes conditions que celles évoquées précédemment à propos des constituants protéiques actifs de Plasmodium falciparum. Ces dernières entrent de ce fait dans le champ des revendications ou constituent des équivalents des constituants protéiques qui ont plus particulièrement été revendiqués. REVENDICATIONS 1 - Fraction polypeptidique inductrice d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme qui présentent les caractéristiques suivantes - elles possèdent une masse moléculaire moyenne de l'ordre de 75.000 ; - elles sont reconnues par des anticorps dirigés contre de Plasmodium falciparum et par des anticorps monoclonaux ou potclonaux formes contre elles-mêmes - elles peuvent être mises en évidence par incorporation métabolique d'acides aminés marqués, par exemple la méthionine 35, ; - elles sont inductrices notamment chez le singe, et plus particulièrement le singe SAIMIRI SCIUREUS, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de Plasmodium falciparum ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles. 2 - Fraction polypeptidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire de l'ordre de 75.000 - 5.000. 3 - Fraction polypeptidique telle qu'elle peut être isolée à partir de la fraction selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée par l'un des-poids moléculaires moyens suivants 72.000, 76.000, 80.000 ou 90.000 daltons. 4 - Procédé pour I'obtention des fractions poly- peptidiques selon la revendication 1 ou la revendication 2, consistant à traiter une préparation préalablement obtenue de Plasmodium falciparum avec une solution d'un détergent tel que le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)cucelui connu sous la désignation commerciale TRITO4' X100, ou analogie, susceptible d'induire la dissolution de la majeure partie des structures cellulaires et des constituants protéiques du parasite, de récupérer et de séparer à partir de ce milieu ceux des polypeptides qui présentent un poids moléculaire moyen de l'ordre de 75.000, qui sont susceptibles de réagir avec des anticorps (sérums ou fractions d'immunoglobulines) originaires d'animaux résistants à Plasmodium falciparum et, le cas échéant, d'être marqués par la méthionine 355 5 - Fraction polypeptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est reconnue par les anticorps spécifiques préalablement formés contre les peptides immunogènes con trimes à l'une quelconque de ces revendications et tels qu'obtenus à partir de la souche déposée d la C.N.C.M. tous le n0FUPCI-212. 6 - Préparation immunogène associant une fraction conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 4 avec un véhicule ou un excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins. 7 - Préparation d'anticorps spécifiques à l'égard des fractions polypeptidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 8 - Application à des fins de diagnostic de la fraction selon l'une des revendications 1 à 3.