Brevet FR2546907A1 — publié le 19841207

La présente invention concerne un procédé de production de la riboflavine employée, par exemple, comme additif au fourrage du bétail ou dans les industries alimentaire et pharmaceutique. On connait un procédé de production microbiologique de la riboflavine à l'aide d'une culture du champignon Eremothecium ashbyii sur un milieu de fermentation de soja contenant de l'hydrol et de l'extrait de mais (Certificat d'Auteur de l'URSS NO 389132). Il s'accumule jusqu'à 2000-2500 mg/1 de riboflavine en 96 heures de fermentation. Ce procédé est caractérisé par une longue période de croissance de la culture, d'où découle une durée prolongée de la fermentation, ainsi que par une sensibilité élevée de la culture la contamination avec une microflore étrangère. On connait également un procédé de production de la riboflavine par culture de microorganismes producteurs de l'espèce Bacillus subtilis sur un milieu nutritif contenant 8% de glucose comme source de carbone, les sels minéraux nécessaires et des sources de substances de croissance telles que. extrait de levure, peptone, acide glutamique, préparations de l'ARN, purines et composés analogues aux purines (Brevet des Etats Unis d'Amérique NO 3900368). Il s'est accumulé jusqu'à 560 mg/l de riboflavine après 44 heures de fermentation. Ce procédé de production de la riboflavine est caractérisé par une grande vitesse de croissance des bacilles et, par conséquent, par une réduction de la durée de fermentation. Cependant les inconvénients de ce procédé sont un niveau relativement bas de l'activité de la culture de Bacillus subtilis et la nécessité d'utiliser des milieux de fermentation et de croissance compliqués quant à leur composition. On s'est donc proposé en utilisant une nouvelle souche productrice de la riboflavine d'élever le rendement en ce produit et de rendre plus simple la technologie de sa production. Dans le procédé selon l'invention de production de la riboflavine par culture submergée dans des conditions aérobies du microorganisme producteur de la riboflavine de l'espèce Bacillus subtilis sur un milieu nutritif contenant les sources de carbone et d'azote, les sels minéraux, les stimulateurs de croissance, avec isolement ultérieur de la riboflavine on utilise en qualité de microorganisme producteur de la riboflavine la souche de Bacillus subtilisde VNIIgenetika 304/pMX 45, obtenue par une méthode d'ingénièrie génétique et déposée au Tsentralny muzei promyshlennykh mikroorganizmov (TsMPM) Vsesojuznogo nauchno-issledovatelskogo instituta genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganismov (VNIIgenetika) sous le numéro d'enregistrement TsMPM B-2694.Pour augmenter le rendement en riboflavine, on introduit la source de carbone dans le milieu nutritif d'abord à raison de 5 à 7% en masse du milieu, et on l'ajoute ensuite à raison de 3 à 5% en masse de 12 à 18 heures après le début de la culture. Pour augmenter le rendement en riboflavine, il est rationnel de réaliser le processus de culture à une température de 39 à 410C. Le procédé de l'invention permet d'élever de 4 à 8 fois le rendement en riboflavine par rapport à celui des méthodes connues, grâce à l'utilisation d'une souche productrice hautement active. De plus, le procédé permet d'utiliser des milieux nutritifs simples facilement accessibles. La souche nouvelle Bacillus subtilis VNIIgenetika 304/pMX 45 productrice de la riboflavine utilisée dans le présent procédé a été obtenue par les méthodes d'ingénierie génétique. Le travail de "construction" de la souche de VNIIgenetika 304/pMX 45 comprend plusieurs étapes: 1. Construction du plasmide hybride portant l'opéron de riboflavine de B.subtilis par les méthodes d'ingénièrie génétique. 2. Introduction du plasmide ainsi obtenu dans la souche réceptrice. 3. Vérification de l'expression de l'opéron de riboflavine dans la composition du plasmide dans la cellule pacteuse. Au vecteur ou porteur pMX 33 déterminant la résistance des bacilles à l'érythromycine et ayant un poids moléculaire de 12 MD (M Dalton) on a additionné un fragment de l'acide desoxyribonucléique contenant les gènes de l'opéron de riboflavine de Bacillus subtilis. Il en résulte un plasmide hybride désigné par pMX 45 assurant la résistance à 20)eg/ml d'érythromycine (poids moléculaire 18 MD). La souche de B.subtilis VNllgenetika 304, déposée au Tsentralny muzei promyshlennykh mikroorganizmov (TsMPM) Vsesoju2nogo nauchno-issledovatelskogo instituta genetiki i selektsii promyshlenyykh mikroorganizmov (VNIIgenetika) sous le numéro d'enregistrement TsMPM B-2-117 servait de souche réceptrice dans laquelle on a introduit le plasmide pMX 45. Cette souche réceptrice est "construite" par les méthodes d'ingénièrie génétique à partir des mutations obtenues indépendemment, dont chacune améliore le rendement de la synthèse de la riboflavine : rosr ribc-AGR(résistance à la roséoflavine rosr, mutation en gène régulateur ribc, résistance à la 8-azaguanine AGR). On a ensuite réalisé un traitement mutagène par la nitrosoguanidine, la nitrosométhyl-urée, l'irradiation avec un rayonnement ultraviolet et la sélection des variantes actives sur le milieu de fermentation. Le plasmide pMX 45 a été introduit dans la souche réceptrice par les méthodes de transformation génétique. Les souches transformées ont été choisies d'après les indices de résistance à 20g/ml d'érythromycine et d'après l'accroissement du niveau de la biosynthèse de la riboflavine. Une expression effective de l'opéron de riboflavine dans la composition du plasmide hybride a été observé dans les souches transformées, portant simultanément le plasmide hybride et les gènes, en chromosome, assurant la synthèse de la riboflavine. La souche B. subtilis VNIIgenetika 304/pMX 45 est capable de synthétiser jusqu'à 4500 mg/1 de riboflavine (vitamine B2). Cette souche présente des propriétés morphologiques et culturales analogues à celles de la souche réceptrice B. subtilis VNllgenetika-304. Caractères culturaux et morphologiques de la souche VNIIgenetika 304/pMX 45 N Morphologie au bâtonnet grampositif de d'ordre microscope 2/3 de longueur 1 2 3 Morphologie dans divers milieux 1 Agar à peptone de Après 1 à 2 jours de croissance viande à une températures de 28 à 37 C forme des colonies à bord irrégulier dentelé de 3-4 mm de diamètre, en une surface plate, brillante, de couleur jaune. 2. Bouillon à pepto- La croissance suivant la pi ne de viande qure est modérée, principa lement sur la surface du milieu. La croissance est sans fluctuation sous forme de pellicule sur la surface. 3. Milieu minimal Au 2e jour de la croissance se de Specizen conte- forment des colonies rondes nant du glucose de 2-3 mm de diamètre, bril lantes,de couleur jaune vif, fluorescentes en jaune sous irradiations U.V. 4. Caractères phy- Il croît à une température de siologiques et 28 à 42 C, optimum à 37 C, biochimiques pH 5,0-9,0. Sources de car bone : utilise bien le gluco se, le saccharose, l'amidon. Sources d'azote: assimile bien l'ammonium, l'urée, leS nitrates. Il fluidifie la géla tine. Le procédé selon l'invention de production de la riboflavine est mis en oeuvre de la manière suivante. Une culture âgée de 1 jour, cultivée sur l'agar de viande-peptone incliné ou agar de viande-peptone avec 20flg/ml d'érythromycine, est placée dans des fioles avec le milieu d'ensemencement, contenant de la mélasse ou du saccharose, de la biomasse de levures de fourrage desséchés et des sels minéraux. On cultive le milieu ensemencé à la température de 370C pendant 17 à 24 heures dans des conditions aérobies et on l'introduit à raison de 10z en masse au maximum dans le milieu de fermentation principal. On réalise la fermentation à une température de 37 à 410C dans un fermenteur sous agitation et aération intensives.Le milieu de fermentation renferme comme source de carbone du glucose ou du saccharose ou de la mélasse ou de l'amidon, des sources d'azote minéral, par exemple, de l'urée ou des sels d'ammonium ou des nitrates, ainsi que des sels minéraux nécessaires. On peut utiliser comme source de facteurs de croissance dans le milieu nutritif la biomasse desséchée de levures de fourrage ou alimentaires, un extrait de levure, de la peptone, de l'hydrolysat de caséine, de l'extrait de mais. On peut effectuer la fermentation par deux procédés.Suivant le premier procédé, on introduit dans le milieu en une fois les quantités de carbone nécessaire, suivant l'autre procédé le milieu au début de la fermentation contient 5-7 - en masse de source de carbone, et on introduit encore 3-5%- en masse 12 à 18 heures après que la culture ait atteint la phase de croissance stationnaire. Après 40 à 48 heures de culture de la souche de B.subtilis VNIIgenetiMa 304/pMX 45, il s'accumule dans le liquide de culture de 1600 à 4500 mg/1 de riboflavine. On isole la riboflavine par les méthodes connues, par évaporation du liquide de culture obtenue avec la biomasse. On obtient alors un concentré de riboflavine. La riboflavine peut etre également isolée à l'état pur, sous forme d'une substance cristalline, selon la technologie connue. Le procédé proposé permet d'augmenter de 4 à 8 fois le rendement en riboflavine par rapport à celui des procédés connus et de rendre plus simple la technologie du processus par utilisation de milieux nutritifs simples et d'accès facile. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de réalisation concrets. EXEMPLE 1 La culture âgée d'un jour de Bacillus subtilis VNIfgenetika 3O4/pMX 45 cultivée sur l'agar de viandepeptone incliné est placé par piqûre dans un milieu d'ensemencement liquide de composition suivante, en % en masse:: mélasse ................................... 6,0 biomasse desséchée de levures de fourrage ........................ 1,0 (NH4)2S04 0,1 KH2PO$ ..................................... 0,3 K2HPO4 ..................................... 0,7 MgSO4 ...................................... 0,01 eau complément à ..................... 100 pH = 6,5 On cultive le milieu d'ensemencement dans des fioles d'Erlenmeyer de 750 ml de volume (celui du milieu 25 ml) sur une machine oscillante réglée à 200 alternances par minute à la température de 370C pendant 20 heures et on l'introduit à raison de 10% en masse dans le milieu de fermentation de composition suivante, en % en masse:: mélasse ................................... 12,0 biomasse desséchée de levures de fourrage .................................. 2,0 (NH4)2S04 .............. 0,4 KH2PO4 0,1 K2HPO4 .................................... 0,1 MgSO4 0,2 eau complément à .................... 100. pH=7,0. On réalise la fermentation dans des fioles de 750 ml de capacité (volume du milieu 25 ml) sur une secoueuse de 200tr/mn à la température de 37 C. Après 48 heures de fermentation le liquide de culture contient 1600 mg/1 de riboflavine. EXEMPLE 2 On cultive le milieu d'ensemencement comme dans l'exemple 1. Le milieu de fermentation a la composition suivante, en % en masse: saccharose ....... ... 10,0 biomasse desséchée de levures de fourrage ...,..,.....,................... 2,0 urée ........................................ 0,6 KH2PO4 ...................................... 0,1 K2HPO4 0 Ó.O 0,1 MgSO4 ......................................... 0,2 eau complément à ... .... .. . 100 pH = 6,5. On réalise la fermentation dans un fermenteur de 0,5 l de capacité sous aération intensive (1,5 volume d'air pour 1 volume de milieu) et agitation (700-1000 tr/mn de l'agitateur) à la température de 370C. Après 48 heures de fermentation le liquide de culture contient 2100 mg/l de riboflavine. EXEMPLE 3 La culture âgée d'un jour de Bacillus subtilis VNIIgenetika 304/pMX 45 cultivée sur l'agar de viandepeptone incliné est transférée par piqûre sur un milieu d'ensemencement de composition suivante, en % en masse; saocharose ................................... 3,0 biomasse desséchée de levures de fourrage .................................. 2,0 urée 0 0,6 KH2P04 j 0,1 K2HP04 o 0,1 MgS04 0,2 eau domplément à ............................ 100 pH=6,5. On cultive la semence dans des fioles d'Erlenmeyer de 750 ml de capacité (volume du milieu 30 ml) sur une secoueuse de 200 tr/mn à la température de 370C pendant 20 heures et on l'introduit à raison de 5% en masse dans un milieu de fermentation de composition suivante, en % en masse: saccharose .................................. 7,0 biomasse desséchée de levures de fourrage .................................. 2,0 urée ......................................... 0,6 KH2PO4 ....................................... 0,1 K2HPO4 0 0,1 MgSO4 ......................................... 0,2 eau complément à D . 100 pH = 6,5. On effectue la fermentation dans un fermenteur de 0,5 1 de capacité sous aération (1,5 volume d'air pour 1 volume de milieu) et agitation intensives (1000 tr/mn de l'agitateur) à la température de 400C. Après 16 heures de fermentation on introduit d'une façon stérile 3% en masse de sucre. Après 40 heures de fermentation, le liquide de culture contient 3500 mg/l de riboflavine. EXEMPLE 4 La culture âgée d'un jour de Bacillus subtilis VNIIgenetika 304/pMX 45 cultivée sur le milieu d'agar de viande-peptone avec de l'érythromycine est incubée pendant 12 heures sur un milieu d'ensemencement nutritif de composition suivante, en % en masse: sucre alimentaire 0 5,0 biomasse desséchée de levures de fourrage * 1,0 urée .......................................... 0,6 KH2PO4 ........................................ 0,1 K2HPO4 ........................................ 0,1 MgSO 0,1 eau complément à ............................. 100 pH = 6,5 On réalise la fermentation dans un fermenteur de 630 1 de capacité, le volume du milieu de travail étant de 300 1, la vitesse de la machine oscillante étant 140 alternances par minute et sous aération de 18 m /mn les premières 18 heures de la croissance et de 24 à 27 m3/mn durant les heures suivantes de la croissance et à une température de 39 à 410C. On introduit la semence à raison de 1% en masse dans le milieu nutritif de fermentation de composition suivante, en % en masse: : sucre alimentaire ............................... 5,0 biomasse desséchée de levures de fourrage 2,0 urée ............................................. 0,6 MgSO4 ............................................ 0,2 KH2P04 0,1 K2HPO4 .......................................... 0,1 eau complément à .................. 100 pH = 6,5 Après 12 heures de fermentation on ajoute encore 5% en masse de sucre. Après 25 heures de fermentation le liquide de culture contient 4500 mg/l de riboflavine. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de la riboflavine par culture submergée dans les conditions aérobies du microorganisme producteur de la riboflavine de l'espèce Bacillus subtilis sur un milieu nutritif contenant les sources de carbone, et d'azote, les sels minéraux, les stimulateurs de croissance, avec isolement ultérieur de la riboflavine, caractérisé en ce qu'on utilise comme microorganisme producteur de la riboflavine la souche de Bacillus subtilis VNIIgenetika 304/pMX 45 obtenue par les méthodes d'ingénièrie génétique et déposée au Tsentralny muzei promyshlennykh mikroorganizmov (TsMPM) Vsesojuznogo nauchno-issledovatelskogo instituta genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganizmov (VNIIgenetika) sous le numéro d'enregistrement TsMPM B-2694. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit la source de carbone dans le milieu nutritif d'abord à raison de 5 à 7% en masse du poids du milieu, et,de 12 à 18 heures après le début de la culture,à raison de 3 à 5% en masse. 3. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'on effectue la culture à une température de 39 à 410C.