Brevet FR2542758A1 — publié le 19840921

- PROCEDE DE PREPARATION DE L'ACIDE L-GLUTAMIQUE La présente invention concerne un procédé de pré- paration de l'acide L-glutamique. De nombreux procédés ont été proposés jusqu'ici pour la préparation à l'échelle industrielle de l'acide L-glutamique par des techniques de fermentation, et un procédé de fermentation utilisant un micro-organisme qui nécessite la présence de l'acide oléiaue mais pas celle de la biotine pour se développer, a été proposé comme un pro- cédé industriellement avantageux de préparation de l'acide L-glutamique Les auteurs de la présente invention ont orienté leurs recherches sur la mise au point d'un procédé encore plus avantageux assurant un rendement de production plus élevé en acide L-glutamique et ont découvert qu'une conversion relativement plus grande des sources de carbone en acide Lglutamique peut être réalisée en cultivant un micro-organisme producteur d'acide L-glutamique qui exige la présence de l'acide oléique mais pas celle de la bioti- ne pour se développer dans un milieu contenant de l'acide oléique et une quantité en excès de biotine, le rapport de l'hydrate de carbone à l'acide acétique étant maintenu dans une gamme fixe La présente invention est basée sur cette découverte et sur les études faites ultérieurement. La présente invention concerne un procédé de pré- paration de l'acide L-glutamique caractérisé par le fait qu'un microorganisme producteur d'acide L-glutamique qui exige la présence de l'acide oléique mais pas celle de la biotine pour se développer est cultivé dans un milieu de culture contenant un composé d'acide oléique et un composé de biotine représentant moins de 100 g J/litre en biotine, l'hydrate de carbone et l'acide acétique pris comme sources de carbone étant maintenus dans un rapport pondéral allant d'environ 80:20 jusqu'à environ 40:60. Le micro-organisme utilisé dans la présente inven- tion est un micro-organisme producteur d'acide L-alutami- que qui exige la présence de l'acide oléique mais pas celle 2 - de la biotine pour se développer (Il sera désigné par la suite quelquefois par souche productrice d'acide L-gluta- mique de la présente invention), sans tenir compte de sa classification taxonomique. Parmi ces souches, les auteurs de la présente in- vention ont trouvé que les micro-organismes appartenant au groupe Brevibacterium ou au genre Corynebacterium sont par- ticulièrement utiles pour les objectifs de la présente in- vention Par exemple le Brevibacterium thiogenitalis D-248, Brevibacterium flavum BN-11 et Corynebacterium glutamicum N 534-MS-023 peuvent être mentionnés comme représentants des souches productrices de l'acide Lglutamique de la présente invention. Les souches que l'on vient de mentionner ont été déposées à l'Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japon et au Fermentation Research Institute, Agency of In- dustrial Science and Technology, Ministère du Commerce In- ternational et de l'Industrie (FRI), Japon Les dépôts des souches au FRI sont converties en dépôts selon la Conven- tion de Budapest et les souches ont été stockées au FRI. Les numéros et les dates des dépôts sont montrées dans le tableau 1. Tableau 1 IFO FRI ouche Numéro de dépôt Numéro de dépôt Numéro de dépôt suivant Souches Date du dépôt Date du dépot la convention de Budapest Brevibacterium IFO 12331 FERM P-6989 FERM BP-433 thiogenitalis D-248 25 décembre 1965 10 mars 1983, Brevibacterium flavum IFO 12525 FERM P-6991 FERM BP-435 BN-11 12 avril 1967 10 mars 1983 Corynebacterium IFO 12523 FERM P-6990 FERM BP- 434 glutamicum glutamicum 12 avril 1967 10 mars 1983 No 534- MS-023 I I el J-t r) Co 4 - Parmi ces souches, le Brevibacterium thiogeni- talis a les mêmes caractéristiques microbiologiques que celles mentionnées dans la publication de la demande du brevet japonais n Sho 45 ( 1970)-942 sauf que cette sou- che exige la présence de l'racide oléique mais pas celle de la biotine pour se développer Les caractéristiques mi- crobiologiques du Brevibacterium flavum sont identiques à celles décrites dans la publication de la demande de bre- vet japonais NO Sho 39 ( 1964)-17348 sauf que cette souche exige la présence de l'acide oléique mais pas celle de la biotine pour sedévelopper Les caractéristiques microbio- logiques du Corynebacterium glutamicum sont identiques à celles décrites dans le Journal of the Agricultural Che- mical Society of Japan 39, 328 ( 1965) sauf que cette sou- che exige la présence de l'acide oléique mais pas celle de la biotine pour se développer. Généralement, les micro-organismes du genre Bre- vibacterium et Corynebacterium peuvent subir des change- ments dans leurs caractéristiques et subir facilement des mutations spontanément aussi bien que sous l'influence de traitements mutagènes artificiels tels que l'irradiation par les rayons X, les rayons ultra-violets ou autres rayon- nements, ou par traitement avec divers réactifs mutagènes. Ces mutants, s'ils sont seulement susceptibles de produire de l'acide Lglutamique, et exigent la présence de l'acide oléique mais non celle de la biotine pour se développer, peuvent être utilisés également pour les objectifs de la présente invention. Le composé d'acide oléique utilisé selon la pré- sente invention peut être soit l'acide oléique libre, soit un sel ou un ester de cet acide ou une matière conte- nant de l'acide oléique Comme exemples de sel de l'acide oléique, on peut citer les sels de sodium, de potassium et de magnésium L'ester de l'acide oléique comprend par exemple le mono-oléate de sorbitane, le mono-oléate de po- lyoxyéthylènesorbitane et le mono-oléate de polyoxyéthy- -5- léneglycol ainsi que les sesquioléates et trioléates cor- respondants, etc Comme exemples de ladite matière conte- nant de l'acide oléique, on peut mentionner l'huile de lard, les graisses et les huiles,-etc. Dans le procédé selon la présente invention, le composé d'acide oléique est ajouté au milieu en une quan- tité qui est au minimum d'environ 60 mg/litre et de préfé- rence comprise entre environ 60 et 300 mg/litre, exprimé en acide oléique Bien que le fait d'ajouter cette quanti- té d'acide oléique au milieu initial soit suffisant, on peut ajouter de l'acide oléique pendant la culture pour établir la concentration ci-dessus. Le composé de biotine utilisé selon la présente invention peut être soit la biotine elle-même, soit une substance active à base de biotine. Dans le procédé selon la présente invention, le composé de biotine est incorporé dans le milieu en une con- centration minimum d'environ 100 gg/litre et, de préféren- ce, comprise entre environ 200 et 500 gg/litre, exprimé en biotine Bien que le fait d'ajouter la quantité de biotine indiquée au milieu initial soit suffisant, elle peut être ajoutée pendant la culture pour établir la concentration susmentionnée. Dans la présente invention, l'hydrate de' carbone et l'acide acétique sont utilisés comme source de carbone dans le milieu de culture Le rapport pondéral de l'hydra- te de carbone à l'acide acétique est maintenu entre envi- ron 80:20 et environ 40:60 et de préférence entre environ :30 et environ 50:50 et encore mieux à environ 60:40 pendant toute la période de culture en y comprenant le milieu initial. En ce qui concerne le procédé d'addition de l'hy- drate de carbone et de l'acide acétique, il suffit de s'as- surer que les deux constituants existent dans le milieu de culture dans le rapport précité Par conséquent, tous les deux peuvent être ajoutés simultanément ou l'un des deux 6 - est ajouté en complément une fois qu'il a été consommé afin que le rapport ci-dessus puisse être maintenu En somme, il suffit seulement de s'assurer que les deux constituants sont présents dans la gamme précitée. L'hydrate de carbone utilisé dans le procédé de la présente invention peut être un quelconque hydrate de car- bone utilisé par le micro-organisme producteur de l'acide L-glutamique de la présente invention pour élaborer l'aci- de L-glutamique On peut citer comme exemple de cet hydra- te de carbone le glucose, le fructose, le saccharose, les sucres bruts, les mélasses et divers amidons saccharifiés (par exemple tapioca, sagou et fécule de patates douces) et on peut utiliser ces hydrates de carbone sous forme de mélanges. Dans le procédé de la présente invention l'acide acétique est ajouté dans le milieu initial pour avoir au maximum une concentration d'environ 2 % (poids/volume) et de préférence d'environ 1 % (poids/volume) Aux stades in- termédiaires de la culture, l'acide acétique est ajouté en une quantité telle que la concentration de l'acide rési- duel dans le milieu ne dépasse pas environ 1 % (poids/vo- lume) Il n'est pas nécessaire que l'acide acétique utili- sé dans le procédé de la présente invention soit l'acide acétique libre mais on peut utiliser un de ses sels, (par exemple le sel de sodium, de potassium, d'ammonium, etc) ou un mélange de ces sels. Si nécessaire, le milieu de culture utilisé selon la présente invention peut contenir en plus des sources de carbone spécifiques mentionnées ci-dessus, de l'acide olé- ique et de la biotine, divers autres constituants du milieu qui sont habituellement utilisés dans la fermentation de l'acide L-glutamique, tels que divers composés azotés or- ganiques et minéraux, des sels métalliques minéraux, des vitamines, etc On peut ajouter au milieu également un agent anti-mousse Il est inutile que le procédé de cultu- re soit un procédé spécial différent des procédés classi- -7- ques, et on effectue la culture aérée sous agitation, avec une température d'incubation de 25 à 370 C Pendant l'incu- bation, le p H du milieu est maintenu entre environ 7 et environ 8,5 en utilisant du gaz ammoniac, de l'ammoniaque, de l'urée ou un produit alcalin tel que l'hydroxyde de so- dium, l'hydroxyde de potassium, etc soit seul, soit en combinaison. La récupération de l'acide L-glutamique à partir du bouillon de fermentation peut être effectuée par les procédés classiques. Le procédé de la présente invention se caractérise par un taux de conversion élevé de l'hydrate de carbone en acide L-glutamique, et, par conséquent, il peut fournir de l'acide L-glutamique avec un rendement élevé Par consé- quent, la séparation et l'isolement de l'acide L-glutami- que sont facilités et les coûts de production sont réduits. La présente invention est illustrée par les exem- ples de référence et les exemples d'application descriptifs et non limitatifs ci-après. Exemple de Référence 1 On répartit par portions de 20 ml dans des fioles coniques de 200 ml de capacité, un bouillon de culture d'ensemencement contenant par litre 20 g de glucose, 2 g d'urée, 1 g de KH 2 PO 4, 0,40 de Mg SO 4 7 H 20, 20 g de liqueur de macération du mais, 1 g de Ca CO 3, 4 mg de Cu SO 4 5 H 20, mg de Fe SO 4 7 H 20 et 300 mg d'oléate de sodium Après la stérilisation, on introduit dans chaque fiole une boucle d'une culture sur plan incliné de Brevibacterium thiogeni- talis D-248 (IFO-12331, FERM t P-433) et on effectue l'in- cubation à 280 C pendant 18 heures sur une secoueuse rota- tive tournant à la vitesse de 200 tours/minute La culture résultante est utilisée comme culture d'ensemencement. Séparément, on répartit par portionsde 50 ml dans des fioles coniques à bouchon rodé de 200 ml de capacité, un milieu de culture principal contenant par litre 1 % des sources de carbone dans le rapport indiqué dans le tableau 8 - 2, 1,5 g de KH 2 PO 4, 0,4 g de Mg SO 4 7 H 20, 2 g de liqueur de macération du mais, 5 mg de Mn SO 4 4-6 H 20, 200 Fg de bioti- ne, 200 mg d'oléate de sodium et 10 mg de rouge de phénol (p H 7,2) Après la stérilisation, on transfère dans chaque fiole 2,5 ml de la culture d'ensemencement ci-dessus, et on commence à effectuer l'incubation à 32 C sur une secou- euse rotative tournant à la vitesse de 200 tours/minute. 8 heures après le début de l'incubation, on commence à ajouter les sources de carbone correspondant au rapport initial des sources de carbone, à raison de 0,4 % (poids/ volume) par rapport au milieu initial, à la fréquence de une fois par heure, soit au total en 35 fois. Les résultats sont mentionnés dans le tableau 2. Dans la description suivante, le degré de croissance du micro-organisme est exprimé par la mesure de l'absorbance à 590 nm de la culture diluée 50 fois La détermination de l'acide L-glutamique est effectuée par la méthode manomé- trique de Warburg en utilisant la décarboxylase de l'acide glutamique. Tableau 2 Rapport*des sources de Rendement en acide carbone Croissance** L-glutamique Glucose Acide acétique (%) O 0,29 51,3 20 0,29 64,0 30 0,29 68,5 40 0,29 70,8 50 0,29 66,0 60 0,30 63,2 70 0,27 61,2 80 0,26 60,0 0 100 0,21 55,4 en poias ** Absorbance à 590 nm de la culture diluée 50 fois. -9- D'après le tableau 2, on voit que, comparativement aux cas dans lesquels le glucose ou l'acide acétique sont utilisés seuls, l'utilisation combinée des deux dans un rapport pondéral de 80:20 à 40:60 et, particulièrement de 70:30 à 50:50, entraîne une augmentation remarquable du rendement en acide L-glutamique. Exemple de Référence 2 On répartit par portions de 50 ml dans des fioles coniques à bouchon rodé de 200 ml de capacité, un milieu de fermentation contenant par litre 6 g de glucose, 5,8 g d'acétate d'ammonium (soit 4 g calculés en acide acétique), 1,5 g de KH 2 PO 4, 0,4 g de Mg SO 4 7 H 20, 2 g de liqueur de ma- cération du mais, 5 mg de Mn SO 4 4-6 H 20, la quantité de bio- tine indiquée dans le tableau 3, 200 mg d'oléate de sodium, et 10 mg de rouge de phénol (p H 7,2) Après stérilisation, des portions de 2,5 ml d'une culture d'ensemencement pré- parée de la même façon que dans l'exemple de référence 1 sont transférées dans chaque fiole et on commence l'incuba- tion à 320 C sur une secoueuse rotative tournant à la vites- se de 200 tours/minute 8 heures après le début de l'incu- bation, on commence à introduire par intervalles de une heure et au total en 35 fois, 0,5 ml d'une solution aqueu- se à 24 % (poids/volume) de glucose, (soit 0,12 g de gluco- se) et 0,5 ml d'une solution aqueuse à 16 % (poids/volume d'acide acétique (soit 0,08 g d'acide acétique) réglée au préalable à p H 5,5 avec de l'ammoniaque Pendant cette pé- riode, en utilisant le colorant rouge de phénol comme in- dicateur, on règle le p H du milieu entre 7,2 et 8 avec de l'hydroxyde de sodium à 30 % Les résultats sont indiqués dans le tableau 3. - Tableau 3 Biotine Croissance* Rendement en acide L-glutamique ( 4 g/litre) (%) 1 0,33 5,1 0,30 6,3 0,29 29,0 0,29 65,3 0,29 71,5 500 0,29 71,4 *Absorbance à 590 nm de la culture diluée 50 fois. Le tableau 3 montre que, bien que la croissance du micro-organisme soit fortement influencée par la biotine et qu'on obtient dans ce cas des croissances sensiblement meilleures pour des concentrations de biotine plus faibles, le rendement en acide L-glutamique augmente quand la con- centration de la biotine augmente Par conséquent, on voit nettement que, pour produire et accumuler de l'acide L- glutamique avec un rendement élevé, il est nécessaire d'in- corporer au moins environ 100 gg/litre de biotine dans le milieu. Exemple 1 On répartit par portions de 20 ml, dans des fioles coniques de 200 ml de capacité, un milieu de culture d'en- semencement contenant par litre 20 g de glucose, 2 g d'urée, 1 g de KH 2 PO 4, 0,4 g de Mg SO 4 7 H 20, 20 g de liqueur de ma- cération du mals, 1 g de Ca CO 3, 4 mg de Cu SO 4 5 H 2 D, 150 mg de Fe SO 4 7 H 20 et 300 mg d'oléate de sodium Après stérili- sation, le milieu de culture de ces fioles est inoculé avec les trois souches différentes mentionnées dans le ta- bleau-4 et on effectue l'incubation à 28 C pendant 18 heu- res sur une secoueuse rotative tournant à la vitesse de tours/minute La culture est utilisée comme culture d'ensemencement. Séparément, on répartit par portions de 50 ml dans 11 - des fioles coniques à bouchon rodé de 200 ml de capacité un milieu de fermentation (p H 7,2) contenant par litre 6 g de glucose, 5,8 g d' acétate d'ammonium (représentant 4 g d'acide acétique), 1,5 g de KH 2 P 04, 0,4 g de Mg SO 4 7 H 20, D 2 g de liqueur de macération du mais, 5 mg de Mn SO 4 6 H 20, gg de biotine, 200 mg d'oléate de sodium et 10 mg de rouge de phénol Après stérilisation, des portions de - 2,5 ml de la culture d'ensemencement ci-dessus sont trans- férés dans les fioles et on commence l'incubation à 32 C sur une secoueuse rotative tournant à la vitesse de 200 tours/minute 8 heures après le début de l'incubation, on commence à introduire simultanément par intervalles de une heure, et au total en 35 fois, O; 5 ml d'une solution à 24 % (poids/volume) de glucose (soit 0,12 g de glucose) et 0,5 ml d'une solution à 16 % (poids/volume) d'acide acéti- que, (soit 0,08 g d'acide acétique), réglée au préalable à p H 5,5 par de l'ammoniaque Pendant ce temps, en utili- sant le colorant rouge de phénol comme indicateur, on rè- gle le p H du milieu dans la gamme de 7,2 à 8, avec une so- lution à 30 % d'hydroxyde de sodium Les résultats sont indiqués dans le tableau 4. Tableau 4 Souche Rendement en acide L-glutamique (%) Brevibacterium thiogenitalis 715 71,5 D-248 (IFO 12331, FERM BP-433) Brevibacterium fluvum BN-11 710 (IFO 12525, FERM BP-435) Corynebacterium glutamicum N 534-MS-023 (IFO 12523, FERM BP-434) 70,8 Exemple 2 Le procédé de culture de l'exemple 1 est répété pour le Brevibacterium thiogenitalis D-248 (IFO 12331, FERM BP-433) sauf qu'on utilise du saccharose comme source de 12 - carbone dans le milieu de fermentation Le rendement en acide L-glutamique par rapport à la source de carbone uti- lisée est de 70,8 %. Exemple 3 On répartit par portions de 50 ml dans des fioles coniques à bouchon rodé de 200 ml de capacité, un milieu de fermentation (p H 7,2) contenant par litre 12 g d'un hydrolysat enzymatique de fécule de patates douces (expri- mées en glucose), 11,6 g d'acétate d'ammonium (représen- tant 8 g d'acide acétique), 1,5 g de KH 2 PO 4, 0,4 g de Mg SO 4 7 H 20, 2 g de liqueur de macération du mais, 5 mg de Mn SO 4 4-6 H 20, 200 Fg de biotine, 175 mg d'oléate de sodium et 10 mg de rouge de phénol Après stérilisation, 2,5 ml d'une culture d'ensemencement de Brevibacterium thiogeni- talis (IFO 12231, FERM BP-433), préparée de la même façon que dans l'exemple 1, sont transférés dans chaque fiole et on effectue l'incubation 10 heures après le début de l'in- cubation, on commence à introduire simultanément par inter- valles de 1 heure, et au total en 26 fois, 0,5 ml d'une liqueur de saccharification contenant 30 % (poids/volume) de glucose (soit 0,15 g de glucose) et 0,5 ml d'une solu- tion à 20 % (poids/volume) d'acide acétique (soit 0,1 g d'acide acétique), réglée au préalable à p H 5,5 avec de l'ammoniaque Pendant cette période, le milieu est mainte- nu dans une gamme de p H de 7,2 à 8,0 avec une solution aqueuse à 30 % d'hydroxyde de sodium Le rendement en aci- de L-glutamique par rapport aux sources de carbone utili- sées, est de 69,2 %. Exemple 4 Un milieu de fermentation (p H 7,2) contenant par litre, 14 g de mélasse (sucre total), 8,7 g d'acétate d'am- monium (représentant 6 g d'acide acétique), 1,5 g de KH 2 PO 4, 0,4 g de Mg SO 4 7 H 20, 1 g de liqueur de macération du mais, 5 mg de Mn SO 4 4-6 H 20, 150 gg de biotine, et 150 mg d'oléate de sodium, est introduit en un volume de 4 litres dans un fermenteur en forme de jarre de 10 litres, et après 13 - stérilisation, on lui inocule 200 ml d'une culture d'ense- mencement de Brevibacteriuwt thiogenitalis D-248 (IFO 12331, FERM BP-433) préparée de la même façon que dans l'exemple 1 L'incubation est commencée à 320 C, à la vitesse de 500 tours/minute et en aérant avec un débit d'air de 2 litres/ minute Une fois que les sources de carbone initiales ont été presque complètement consommées, 0,105 % (poids/volume) de mélasses (calculé en sucre total) et 0,045 % (poids/vo- lume) d'acide acétique, ces deux pourcentages calculés sur le volume initial du milieu, sont introduits chaque fois que la concentration de l'oxygène dissous augmente de fa- çon à ce que l'incubation soit poursuivie jusqu'à ce que * la quantité totale des sources de carbone utilisées attei- gne 15 % (poids/volume) du volume initial de la liqueur. Pendant cette période, le p H du milieu est maintenu auto- matiquement dans la gamme de 7,3 à 7,7 avec de l'ammonia- que La culture est terminée au bout d'environ 30 heures, temps au bout duquel, 62,5 mg/ml d'acide L-glutamique se sont accumulés dans le bouillon de culture ( 6,1 litres). Ainsi, le rendement calculé sur les sources de carbone est de 63,5 % Quand le bouillon est traité de façon classique, on obtient 328 g de cristaux d'acide L-glutamique bruts. Exemple 5 Un milieu de fermentation (p H 7,2) contenant par litre 12 g de glucose, 11,6 g d'acétate d'ammonium (repré- sentant 8 g d'acide acétique), 1,5 g de KH 2 PO 4, 0,4 g de Mg SO 4 7 H 20, 2 g de liqueur de macération du mais, 5 mg de Mn SO 4 4-6 H 20, 200 gg de biotine et 200 mg d'oléate de so- dium, est introduit en un volume de 4 litres dans un fer- menteur en forme de jarre de 10 litres et, après stérili- sation, on lui inocule 200 ml d'une culture d'ensemencement de Brevibacterium thiogenitalis D-248 (IFO 12331, FERM BP- 433) préparée comme dans l'exemple 1 On commence l'incu- bation à 320 C, à la vitesse de 500 tours/minute et en aé- rant avec un débit d'air de 2 litres/minute Ensuite, les mélasses et l'acide acétique (réglée préalablement à p H 5,5 14 - avec de l'ammoniaque) sont introduits dans les mêmes pro- portions que dans l'exemple 4 jusqu'à ce que la quantité totale des sources de carbone utilisées atteigne 16 % (poids/volume) Le p H du milieu est toutefois réglé avec- de l'hydroxyde de sodium à 30 % La culture est terminée en environ 36 heures, temps au bout duquel on trouve 67,1 mg/ml d'acide L-glutamique dans le bouillon de culture ( 6,2 litres) Le rendement par rapport aux hydrates de car- bone est de 65 % Quand l'acide L-glutamique est récupéré à partir de ce bouillon, de la façon classique, on obtient 370 g de cristaux bruts. - REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'acide L-glutamique, caractérisé par le fait qu'on cultive un micro-organisme producteur d'acide L-glutamique exigeant la présence de l'acide oléique mais pas celle de la biotine pour se développer, dans un milieu de culture contenant un composé d'acide oléique et un composé de biotine représentant au minimum 100 gg/litre de biotine, l'hydrate de carbone et l'acide acétique comme sources de carbone étant maintenus dans un rapport pondérai d'environ 80:20 à environ 40:60. 2. Procédé selon la par le fait que l'hydrate de 3. Procédé selon la par le fait que l'hydrate de 4. Procédé selon la par le fait que l'hydrate de rifiée de la patate douce. 5. Procédé selon la par le fait que l'hydrate de 6. Procédé selon la par le fait que l'hydrate de revendication 1, caractérisé carbone est le glucose. revendication 1, caractérisé carbone est le saccharose. revendication 1, caractérisé carbone est la fécule saccha- revendication 1, caractérisé carbone est les mélasses. revendication 1, caractérisé carbone et l'acide acétique sont maintenus dans le milieu de culture dans un rapport pondérai allant d'environ 70:30 à environ 50:50. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'hydrate de carbone et l'acide acétique sont maintenus dans le milieu de culture dans un rapport pondérai d'environ 60:40. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la quantité du composé d'acide oléique con-. tenue dans le milieu est au minimum d'environ 60 mg/litre.