Brevet FR2540381A1 — publié le 19840810

La présente invention concerne un procédé pour stimuler la croissance des cellules, par exemple des fibroblastes. Elle concerne également des compositions cosmétiques, pharmaceutiques ou complémentaires pour des milieux de culture cellulaire appliquant le procédé ci-dessus. Pour stimuler la croissance des cellules, notamment dans des cultures cellulaires, par exemple, pour la fabrication de vaccins, on utilise très fréquemment des extraits placentaires, des protéines provenant par exemple de peaux d'animaux ou de tendons, des peptides contenus dans le lait humain comme indiqué dans l'Article de Michaël Klagsbrun publié dans "Proc. Natl Acad Sci USA, vol 75 n 10, page 5 05725 061, Octobre 1978 sous le titre "Human Milk stimulates DNA synthesis and cellular proliferation in cultured fibroblasts", des sérums ou extraitsde sérum tels que par exemple le sérum de veau, comme indiqué dans l'Article de C DE LUCA et al paru dans "Experimental Cell Research 43,98-106 ( 1966) sous le titre "The stimulation of Growth of mammalian cells in vitro by a peptide fraction from enzymatic digests of serum" et dans l'Article de Robert W Pierson, Jr et Howard Mo Temin paru dans J Cell Physiol 79 319-330 sous le titre "The partial purification from Calf serum of a fraction with multiplication-stimulating activity for chicken fibroblsts in cell culture and vith non-suppressible insulin-like activity". On sait également, par exemple, à partir des brevets français n 2 353 282, 2 472 385 et 2 380 294 qu'il est possible d'utiliser des composants peptidiques, telsque le collagène, l'élastine dans des compositions cosmétiques pour par exemple la régénérescence de la peau, Toutefois, l'utilisation de substancesbiologiques, comme les sérums, les extraits placentaires, les extraits produits par la macération de tissus provoque parfois des phénomènes d'intolérance quand ellessont appliquées, même à l'état dilué, sur la peau. Par ailleurs, il est parfois difficile d'incorporer ces substances biologiques ou les composants peptidiques dans des compositions cosmétiques 9 pharmaceutiques ou autres, sans diminuer l'activité de ces substances sur les cellules. La présente invention a notamment pour but de remédier à ces inconvénients en proposant un procédé permettant d'appliquer des substances peptidiques sur la peau, de les administrer sous forme de médicaments, ou de les additionner dans des milieux de culture cellulaire pour stimuler la croissance des cellules, en supprimant sensiblementou' totalement les risques d'intolérance par rapport à la peau ou au milieu de culture cellulaire ou à l'organisme humain, et en augmentant sensiblement l'activité de ces substances peptidiques sur la cellule notamment sur les fibroblastes Ainsi, le procédé de l'invention permet de remplacernotamment dans les milieux de culture cellulaire, partiellement ou totalement les sérums ou extraits placentaires ou analogues. A cet effet, l'invention propose un procédé pour stimuler la croissance des cellules, notamment des fibroblastes, par action de peptides ou polypeptides sur lesdites cellules, caractérisé en ce qu'il consiste à encapsuler le ou lesdits peptides ou polypeptides ou un mélange de ceuxci dans une phase lamellaire lipidique hydratée telle que, par exemple, des liposomes, et à mettre en contact lesdites particules avec les cellules à traiter. Avantageusement le ou les peptides ou polypeptides précités sont obtenus par hydrolyse de protéines ou de macromolécules de structure des tissus, notamment l'élastine, la fibroine, la kératine, le collagène, la myosine, l'actine, la tubuline, la fibrine ou analogue. Selon une autre caractéristique de l'invention, le peptide ou polypeptide précité est un hydrolysat d'élastine ou de collagènede poids moléculaire compris entre environ 1 000 et 75 000 De préférence, les constituants lipidiques formant la phase lamellaire lipidique hydratée précité sont choisis parmi les composés appartenant à la famille des glycolipides, phospholipides ou phospho- aminolipides, et avantageusementsontla lécithine de soja ou d'oeuf Selon une nouvelle caractéristique de l'invention, des substances à caractère hyrophobe tel quel'ubiquinone, des stérols, par exemple le cholestérol, le lanostérol, le stigmastérol, le sitostérol, sont incorporées aux couches de la phase lamellaire lipidique hydratée précitée. L'invention a également pour objet une composition cosmétique pour la revitalisation de la peau, caractérisée en ce qu'elle applique le procédé décrit ci-dessus. Cette composition cosmétique comprend la phase lamellaire lipidique hydratée dans laquelle sont encapsulés ou incorporés le ou les peptidesou polypeptides, mélangée à au moins un excipient convenable pour obtenir par exemple, une lotion, une crème, un baume, un gel; -la concentration pondérale en lipides constituant la phase lamellaire lipidique dans ladite composition est comprise entre environ O,OI % et environ 80 ' Avantageusement, le peptide ou le polypeptide incorporé ou encapsulé dans les couches de la phase lamellaire lipidique hydratée précitée est un hydrolysat d'élastine ou un hydrolysat de collagène. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique pour notamment favoriser la cicatrisation de plaies, brûlures ou analogues, appliquant le procédé décrit ci-dessus et contenant une quantité thérapeutiquement efficace de la phase lamellaire lipidique hydratée précitée dans laquelle sont incorporés ou encapsulés le ou les peptides ou polypeptides précités, mélangés avec un excipient physiologiquement compatibles. L'invention a également pour objet une composition complémentaire pour milieu de culture cellulaire utilisé lo par-exemple pour la fabrication de vaccins, de produits chimiques par action de micro-organismes, ou pour réaliser des tests de toxicité Cette composition complémentaire comprend une quantité efficace de phase lamellaire lipidique hydratée dans laquelle sont encapsulés ou incorporés le ou les peptides ou polypeptides précités, mélangés éventuellement avec un excipient convenable pour la culture cellulaire, par exemple un milieu minimum d'Eagle (M E M). De préférence, la concentration pondérale en lipides constituant la phase lamellaire lipidique hydratée, dans ladite composition complémentaire est comprise entre environ 0,01 A et environ 80 % Avantageusement cette concentration est comprise entre environ 0,01 % et environ 20 %. Ainsi, selon l'invention les peptides oupolypeptides par exemple obtenus par hydrolyse de protéines, sont incorporés ou encapsulés dans des phases lamellaires lipidiques hydratées pour former notamment des liposomes, pour faciliter l'application des peptides ou polypeptides sur les cellules et notamment la pénétration de ces substances dans la peau Donc le procédé de l'invention permet d'améliorer de manière sensible l'efficacité des peptides ou polypeptides sur les fibroblastes et, en conséquence, augmente les effets de revitalisation de la peau des compositions cosmétiques con- tenant ces liposomes De plus, comme les constituants lipidiques formant les liposomes selon l'invention,sont facilement acceptés par la peau humaine, les risques d'intolérance sont diminués ou même supprimés. Par ailleurs, le procédé de l'invention permet de remplacer partiellement ou totalement les substances biologiques utilisées dans les compositions cosmétiques,phar- maceutiques ou complémentaires pour milieu de culture cellulaire, telles que par exemple les sérums, les extraits placentaires, les extraits embryonnaires ou analogues, qui sont d'un cot de revient relativement élevé et, par ailleurs contiennent de nombreuses substances ne stimulant pas la croissance des cellules. L'invention sera mieux illustrée et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparattront plus clairement au vu des exemples suivants non limitatifs, et donnés uniquement à titre d'illustration de la présente invention. Les concentrations indiquées dans les exemples suivants sont des concentrations pondérales, la concen- tration en phase phospholipidique représente la concentration pondérale en lipides constituant cette phase phospholipidiquedans la composition. Exepe 1 Préparation d'une lotion cosmétique ayant un effet adoucissant pour la peau du visage La composition de cette lotion cosmétique est: phase phospholipidique contenant 10 % de cholestérol: 1 %O polypeptides d'élastine(hydrolysat) 1 % excipients aqueux stabilisés par des conservateurs q s po 100 La phase phospholipidique contenant le cholestérol est préparée selon un procédé convenable et notamment selon le procédé d'atomisation décrit dans la demande de brevet français n 82 02620 du 17 Février 1982. grammes de poudre ainsi obtenue sontdispersés dans oogrammes"d'eau stabilisée" contenant 20 grammes de polypeptides d'élastine, puis on homogénéise cette dispersion par, par exemple, le procédé d'homogénéisation décrit dans la demande de brevet français Na 82 17 311 du 15 Octobre 1982 pour obtenir une suspension de particules ayant des dimensions désirées A cette suspension, on ajoute la quantité nécessaire d'excipients aqueux stabilisé pour obtenir les concentrations indiquées ci-dessuso La lotion ainsi obtenue est appliquée quotidiennement par exemple après le nettoyage matinal de la peau On obtient une peau très douce sur laquelle on peut appliquer facilement un maquillage. Exemple 2 Préparation d'une composition cosmétique utilisée pour les soins de beauté de la peau du visage. Composition: phase phospholipidique à % de sitostérol 5 % polypeptides de collagène (hydrolysat) 1 % polypeptides d'èlastine (hydrolysat) t % excipients aqueux stabilisés par des conservateurs q s po 100 La préparation de la phase phospholipidique, l'encapsulation du polypeptide de collagène et polypeptide d'élastine dans la phase phospholipidique, et l'homogénéi- sation de la dispersion ainsi obtenue sont effectuées comme dans l'exemple 1, L'application répétée pendant 8 jours de ce produit sur la peau du visage permet d'obtenir une peau plus belle, plus souple et plus tendue. Exemle 3 Préparation d'un gel cosmétique pour le peau du visage: Composition phase phospholipidique à 10 % de lanostérol 2 % hydrolysat de collagène i % eau "stabillsée" par des conservateurs et éxcipients pour la préparation d'un gel q s p 100 % La préparation de la phase phospholipidique contenant du lanostérol et l'encapsulation de l'hydrolysat de collagène sont réaliséesselon le procédé décrit dans l'exemple 1. Après dispersion de la phase lamellaire lipidique hydratée ainsi obtenue dans de l'eau "stabilisée" et homogénéisation selon le procédé décrit dans l'exemple 11 on ajoute les excipients pour la préparation d'un gel, à savoir un polymère carboxyvinylique et la triéthanolamine. L'application quotidienne de ce gel sur la peau permet d'hydrater celleci et la rend plus douce et plus souple. Exemple 4. Préparation d'un masque de traitement de son de beauté de la peau du visage. Composition: phase phospholipidique à , de sitostérol 20 % hydrolysat d'élastine 2 % excipients aqueux stabilisés avec des conservateurs q s p 100 La préparation de la phase phospholipidique, l'encapsulation de l'hydrolysat d'élastine et l'homogénéi- sation de la dispersion de la phase lamellaire lipidique hydratée sont réaliséesselon les procédés de l'exemple 1. Le produit ainsi obtenu est appliqué sur la peau du visage et laissé pendant au moins 1 heure-, et avantageusement pendant une nuit. La peau est ensuite rincée par de l'eau fraîche ou avec une lotion puis séchée par petits tapotements avec une serviette Ce traitement rend la peau plus ferme et plus tendue. Exemple 5. Préparation d'une lotion de beauté pour la peau du corps. Composition: phase phospholipidique contenant 5 % de sitostérol 2 % polypeptides de fibroine de soie 1 % excipients aqueux "stabilisés" avec des conservateurs q s p 100 La préparation de la phase phospholipidique, l'encapsu- lation des polypeptides de fibroine de soie, et l'homogénéisa- O 10 tion de la dispersion obtenuesont réalisés selon les procédés de l'exemple 1. La lotion ainsi obtenue est appliquée sur la peau du corps après chaque bain ou douche Ce traitement rend la peau plus souple et plus douceo Exemple 6. Préparation d'une composition cosmétique de soins de beauté des ongles. Composition phase phospholipidique contenant 7 % de lanostérol 80 % hydrolysat de Kératine (polypeptides) 1 excipients q s p 100 Le mélange de constituants lipidiques est obtenu par le procédé d'atomisation de l'exemple 1 La quantité nécessaire d'excipients contenant, en solution, l'hydrolysat de Kératine est préparée puis mélangée au mélange pulvérulent lipidique atomisé Ce mélange est homogénéisé au moyen d'un broyeur à rouleaux On obtient ainsi une phase lamellaire lipidique peu hydratée. L'application de cette composition sur les ongles les rend moins cassants. Exemple 7. Préparation d'une composition pharmaceutique activant la cicatrisation des plaies. Composition phase phospholipidique 2 o hydrolysat d'élastine 3 carraghénane 0,8 % glycérol 5 excipients q s p 100 La phase phopholipidique est préparée selon le procédé décrit dans la demande de brevet français N 082 02620 du 17 Février 1982 La poudre obtenue est dispersée dans une solution d'hydrolysat d'élastine pour obtenir ainsi des phases lamellaires lipidiques hydratées. La dispersion ainsi obtenue est homogénéiséepar exemple selon le procédé décrit dans la demande de brevet français Nu 82 17311 du 15 Octobre 1982. Ces phases lamellaires lipidiques hydratées sont mises en suspension dans de l'eau "stabilisée" contenant le carraghénane et le glycérol. La suspension obtenue est mélangée avec un excipient physiologiquement compatible pour former un baume qui sera appliqué pendant 8 jours après la fermeture d'une plaie. Ce produit accélère la cicatrisation de cette plaies Exemple 8. Préparation d'une composition pharmaceutiquepour activer la cicatrisation des plaies. Composition. phase phospholipidique à de lanostérol 20 %, hydrolysat d'élastine 2, excipients aqueux "stabilisés" par des conservateurs qos p 100 La préparation de la phase phopholipidique contenant du lanostérol, l'encapsulation de l'élastine et l'homogénéi- sation de la suspension de la phase lamellaire lipidique hydratée ainsi obtenue ou de liposomes sont réalisées selon les procédés de l'exemple 1. Cette suspension appliquée quotidiennement après la fermeture d'une plaie accélère la cicatrisation de celle-ci. Exemple 9. Préparation d'une pommade pour peau gercée Composiion phase phospholipidique à % de lanostérol 60 hydrolysat de collagène 1 % excipients gras qos p 100 La préparation de la phase phospholipidique peu hydratée est obtenue selon le procédé décrit dans l'exemple 6, l'hydrolysat de collagène étant ajouté à l'excipient gras. La pommade obtenue est appliquée quotidiennement,avant et après l'expositiion de la peau aux basses températures. Exemple 10. Cet exemple concerne des compositions complémentaires pour des milieux de culture cellulaire et illustre les résultats obtenus par le procédé de l'invention sur la vitesse de croissance des cellules en comparaison aux produits complémentaires pour culture cellulaire connus. Pour cela, on prépare des compositions A, B contenant un hydrolysat d 1 élastine ou un hydrolysat de collagène non encapsulé dans une phase lamellaire lipidique hydratée, et des compositions complémenatires C 9 D conformes au procédé décrit dans l'exemple 1. Composition A. hydrolysat d'élastine (PM ? 2-4000) 1 soluté physiologique q s p 100 Composition B. hydrolysat de collagène (PM 2 4000) 1 soluté physiologique q s po 100 Composition c. phase phospholipidique 1 hydrolysat d'élastine (PM ?-4000) 1 % soluté physiologique q s p 100 Composition D. phase phospholipidique 1 % hydrolysat de collagène (PM-4000) 1 soluté physiologique q s p 100 Les compositions C, D sont fabriquées selon les procédés décrits à l'exemple 1 Elles sont filtrées, de même que les compositions A et B à travers un filtre ayant des pores de 0,22 nanomètres. On effectue des tests de comparaison sur une culture de fibroblastes de souris Cette culture est réalisée dans des bottes de Pétri dans un milieu M E M contenant 100 microgrammes par millilitre de streptomycine et 100 UI par millilitre de pénicilline. Pour déterminer l'activité des compositions complémen- taires A, B, C, D on ajoute dans une première botte de Petri % de sérum de veau et dans une seconde botte 10 /% de sérum de veau On détermine le nombre de cellules produites dans chacune de ces deux bottes témoins après un temps déterminé: Nt représente le nombre de cellules produites dans la boite de Petri témoin contenant 10 'A de sérum de veau. Nt 5 représente le nombre de cellules produites dans la boîte de Petri contenant 5 % de sérum de veau. Pour déterminer l'activité des compositions complémen- taires A, B, C, D, on remplace une certaine quantité du milieu de culture contenant 10 y de sérum de veau contenu dans dans ure boîte de Pétri, par une quantité équivalente d'un milieu frais de culture contenant 5 % de sérum de veau et une c o m p o S i t i o N c o m p 1 é m e N t a i r e AB, C ou D, avec une concentration en composition égale à 100 micro- grammes par millilitre de milieux de culture à 5 l O de sérum. On remplace-également dans les bottes de Petri témoins la même quantité de milieu de culture par un milieu frais contenant respectivement 5 % de sérum de veau pour la botte de Petri témoin à 5 % et 10 " 6 de sérum de veau pour la botte de Petri témoin à 10 %; mais ce milieu frais ne contient pas de composition complémentaire A, B, C ou D. Dans le présent exemple, 2 millilitres de milieu M EM contenant soit 5 %D de sérum de veau, soit 10 Do de sérum de veau sont ensemencés avec 2 x 105 cellules Après un jour, on remplace dans chaque botte de Petri 2 millilitresdu milieu de culture existant par 2 millilitresde milieu frais contenant ou non une composition complémentaire ABC ou D, et bien entendu soit 5 'a' soit 10 % de sérum de veau. Après 3 jours de culture, et un traitement à la trypsine pour décoller les cellules, on dénombre les cellules produites Le nombre de cellules produites dans les boîtes de Petri contenant une composition Co complémentaire A, B,C ou D sont exprimés par Ne e L'activité des compositons complémentaires A, B, C, D est donné par la formule suivante activité = N Co Nt e t N 10 Nt 5 x 100 Les résultats obtenus sont indiqués dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 o Il apparaît clairement à partir de ces résultats que la caractéristique consistant à encapsuler un peptide ou un polypeptide dans une phase lamellaire Iipidique hydratée avant son addition dans un milieu de culture augmente de manière importante et significative son action sur la croissance des celluleso Pour les deux peptides étudiéscette activité c. mp o concentration finale en 1 composition composition ôomplémentair ACTIVITE complémentaire ng par ml de milieu de culture vaà '" en serum de, hydrolysat l 7 d'élastine (A) 100 liposomes + hydrolysat 100 108 % d'élastine (C) hydrolysat 100 41 de collagène(B) j liposomes + hydrolysat 100 87 l de collagne(D) _ a été environ doublée. En conséquence, le procédé de l'inventiqn permet de remplacer les extraits biologiques utilisés actuellement pour stimuler la croissance des cellules par des produits moins coûteux et plus purs permettant d'incorporer dans ces cultures des composants connus à des concentrations connues Au contraire, avec l'addition d'extraits biologiques on ajoute simultanément un nombre relativement important de substances à des concentrations plus ou moins fortes, substances qui n'ont aucune influence sur la croissance des cellules et qui peuvent mème diminuer l'effet des substances efficaces contenues dans lesdits extraits biologiques. R e v e N d i c a t i o N s 1 Procédé pour stimuler la croissance des cellules, notamment des fibroblastes, par action de peptides ou polypeptides, caractérisé en ce qu'il consiste à encapsuler ou incorporer le ou lesdits peptides ou polypeptides ou un mélange de ceux-ci dans une phase lamellaire lipidique hydratée telle que, par exemple, des liposomes, et à mettre en contact ladite phase avec les cellules à traiter. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ou les peptides ou polypeptides précités sont obtenus par hydrolyse de protéines, ou de macro- molécules de structure de tissus, notamment l'élastine, la fibrone, la kératine, le collagène, la myosine, l'actine, la tubuline, la fibrine. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le peptide ou le polypeptide précité est un hydrolysat d'élastine ou un hydrolysat de collagène, de poids moléculaire compris entre environ 1 000 et 75 000 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les constituants lipidiques formant la phase lamellaire lipidique hydratée précitée sont choisis parmi les composés appartenant à la famille des glycolipides, phospholipides, ou phosphoaminolipides, et de préférence sont la lécithine de soja ou d'oeuf. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que des substances à caractère hydrophobe telles que l'ubiquinone, des stérols, par exemple, le cholestérol, le lanostérol, le stigma- stérol, le sitostérol sont incorporées aux couches de la phase lamellaire lipidique hydratée précitée. 6 Composition cosmétique pour la revitalisation de la peau, caractérisée en ce qu'elle applique le procédé selon l'une des revendications 1 à 5. 7 Composition cosmétique selon la revendication 6, caractérisée en ce que la phase lamellaire lipidique hydratée précitée contenant le ou les peptides ou les polypeptides précités est mélangée à au moins un excipient convenable pour obtenir, par exemple, une lotion, une Sxème, un baume, un gel, la concentration pondérale en lipides constituant ladite phase lamellaire lipidique dans ladite composition est comprise entre environ 0,01 % et environ 80 A. 8 Composition cosmétique selon la revendication 7 e caractérisée en ce que le peptide ou le polypeptide incorporé ou encapsulé dans la phase lamellaire lipidique hydratée est un hydrolysat d'élastine ou un hydrolysat de collagène. 9 Composition pharmaceutique pour notamment favoriser la cicatrisation de plaies ou de brûlures, caractérisée en ce qu'elle applique le procédé selon liune des revendications 1 à 5. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, caractérisée en ce que la concentration pondérale en lipides constituant ladite phase lamellaire lipidique dans ladite composition est comprise entre environ 0, 01 A et environ 80 %. l Composition complémentaire à des milieux de culture cellulaire pour favoriser la croissance des cellules, caractérisée en ce qu'elle applique le procédé selon l'une des revendications 1 à 5. 12 Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que la concentration pondérale en lipides-constituant ladite phase lamellaire lipidique d'ans ladite composition complémentaire est comprise entre environ 0,01 %et environ % 9 de préférence entre environ 0,01 D et environ 20 0. 13 Composition selon la revendication 11 ou 122, caractérisée en ce que le peptide ou polypeptide précité encapsulé ou incorporé dans la phase lamellaire lipidique hydratée est un hydrolysat de collagène ou un hydrolysat d'élastine.