Brevet FR2541578A1 — publié le 19840831

La présente invention concerne un médicament et un vaccin pour lutter contre les parasitoses à helminthes. Parmi les parasitoses à helminthes connues, on sait que la bilharziose est une maladie tropicale qui atteint quelques centaines de millions d'individus Elle est le fait d'un parasite appartenant à la famille des helminthes (vers) caractérisée par un cycle biologique à deux hôtes:un vertébré (par exemple l'homme) et un mollusque. L'évolution de la maladie est longue, de 3 à 20 ans, les différentes variétés de parasites affectant plus spécifique- ment tel ou tel organe. Les moyens de lutte contre les parasitoses sont très divers et très insuffisants On peut distinguer L'action sanitaire et l'hygiène: Ces moyens pourraient être très efficaces mais ils pré- supposent, en fait, le décollage économique des régions concernées avec adduction d'eau, nouvelles habitudes alimentaires, etc Or les parasitoses elles-mêmes sont un obstacle majeur au développement: outre qu'elles altèrent la capacité de travail des populations concernées, elles exercent un effet dissuasif sur les activités de coopéra- tion technique ou le tourisme C'est donc un cercle vicieux La destruction des mollusques dans l'eau n'est possible que sur des régions très limitées. Au niveau de l'individu, on dispose depuis peu, par exemple d'antibîlharziens d'une réelle efficacité mais qui laissent encore un pourcentage non négligeable de cas rebelles et, en tout état de cause, ils ne sont administrés qu'après l'apparition des premiers signes cliniques Leur diffusion à grande échelle dans le Tiers-Monde pose encore des problèmes d'ordre sanitaire et économique. La recherche de vaccins anti-parasitaires a marqué le pas jusqu'ici Outre que les parasites sont dotés de capacités remarquables pour se protéger du système immunitaire, on ne sait faire que des vaccins excessivement coûteux, soit 2. à partir de protéines naturelles extraites de parasites en culture (quand la culture est possible), soit de façon plus prospective à partir de peptides de synthèse. La présente invention vise un moyen de lutte contre les parasitoses à helminthes comme par exemple la bilharziose. On sait déjà que, par couplage entre l'ecdysone ou 2 p, 3-9, 14 (, 22 R, 25-penta-hydroxy-5 f-cholest-7-ene- 6-on (hormone de mue des artropodes) ou la 20-hydroxy- ecdysone, avec une macromolécule telle une protéine, on obtient un conjugué qui,-injecté à un lapin, provoque la formation d'anti-corps capables de neutraliser 17 ecdysone. Cette propriété est mise à profit pour le dosage radio- immunologique de l'ecdysone ou pour provoquer un effet antagoniste de l'ecdysone dans les systèmes de cultures de tissus. Toutefois, rien de ces connaissances antérieures ne pouvait suggérer ou laisser supposer la possibilité de lutter contre les parasites au moyen de tels anticorps En effet, la demanderesse a trouvé de façon surprenante et inattendue, d'une part, que l'administration d'anticorps anti-ecdysone était capable de bloquer le développement d'un parasite de type helminthe chez son hôte définitif (mammifère) et, d'autre part, que la production de ces anticorps par une vaccination à l'aide d'un conjugué ecdystéroide- protéine entrainait la protection des sujets sains et la guérison des sujets parasites. L'invention ouvre ainsi une voie nouvelle dans la thérapeutique antiparasitose à helminthes, par exemple anti-bilharziose, en fournissant un nouveau médicament ainsi qu'un nouveau vaccin. Le médicament selon l'invention est caractérisé par le fait qu'il est constitué des immunoglobulines anti- ecdysone ou de leurs fragments anti-ecdysone obtenues à partir d'un conjugué ecdystérolde-macromolécule et: soit 3. extraites du sérum d'un animal immunisé avec ce conjugué, soit produites par un hybridome obtenu à partir descellules d'un animal immunisé, soit produites par des cellules modifiées par manipulation génétique. Le vaccin selon l'invention est essentiellement constitué par un conjugué ecdystéroide-macromolécule dans lequel ladite macromolécule est avantageusement une protéine. On entend dans la présente description par conjugué ecdystéroide-macromolécule, le produit résultant du couplage de façon covalente entre un support constitué par une macromolécule et un composé ecdystérolde. Suivant d'autres caractéristiques: La macromolécule du conjugué ecdystérolde-macromolécule entrant dans l'élaboration du médicament est de nature quelconque; La macromolécule protéique entrant dans la constitution du vaccin peut être de nature quelconque Ce peut être, par exemple, l'albumine du sérum (d'origine humaine, bovine, etc) ou une autre protéine, de préférence de haut poids moléculaire, comme les immunoglobulines, les hémo- cyanines, etc, ou même un polymère synthétique tel que la polylysine; Le composé ecdystéroide peut être l'ecdysone de formule: 21 26 2,ON K 26 > 2 .OHO 0 OH ou l'un de ses dérivés tel que les 2 hémi-succinate; 3 hémisuccinate; 22 hémi-succinate; 6 carboxyméthyl oxime de même que les analogues très proches tels que la 4. -hydroxy-ecdysone (ou ecdystérone), l'inokostérone qui diffère de l'ecdysone par l'hydroxylation de la chaîne latérale en position 26 au lieu de 25 et, dans ce cas, c'est le dérivé carboxylique en 26 qui sert au couplage mais, de façon générale, ce composé peut être tout analogue induisant la formation d'anticorps reconnaissant l'ecdysone. Suivant une variante et pour renforcer l'effica- cité vaccinale, on peut utiliser comme composé actif un composé tel que défini ci-dessus dans lequel le support protéique est en outre couplé à un adjuvant de l'immunité comme le muramyl dipeptide. De façon avantageuse, le couplage du composé ecdystéroide sur le support protéique est réalisé par l'une des positions 2,3,22,6 ou 26. De façon également avantageuse, le produit de ce couplage présente un rapport pondérai ecdystérolde/ protéine de 2 à 15 %. Les exemples suivants feront mieux ressortir la portée et l'intérêt de l'invention. Exemple d'obtention d'un vaccin selon l'invention: 3,2 mg de succinyl ecdystérone sont dissous dans 300 ml de diméthylformamide à température ambiante; On ajoute alors 30 il de triéthylamine au 1/11 e dans la diméthylformamide; A froid, on introduit 30 M 1 d'éthylchloroformate au 1/16 e dans la diméthylformamide dans le milieu réactionnel et on laisse l'activation se poursuivre pendant 12 minutes; Apres avoir soustrait 50 M 1 destinés au couplage au tyrosine méthylester, on ajoute aux 310 sl restants 6 mg de sérum à albumine lyophilisée L'incubation est alors maintenue une demi-heure. Le conjugué obtenu est purifié sur une colonne de G 25 SEPHADEX (longueur 10 cm, diamètre 1,5 cm) équilibrée avec du tampon phosphate de Na 10 '2 M, Na Cl 1,5 10 '2 M p H 7. Sur ce type de colonne, le conjugué est recueilli dans le volume mort Les fractions contenant le conjugué sont 5. réunies et dialysées pendant 36 heures contre deux fois 1 litre de H 20 distillée afin d'éliminer les sels Après dialyse, on enregistre un spectre U V afin de calculer le rendement du couplage Enfin, le produit est lyophilisé et conservé à l'abri de l'humidité. Ce produit peut être dilué au moyen de sérum physiologique et injecté directement à l'homme ou l'animal selon les protocoles de vaccination classiques. Exemple de médicament selon l'invention: Les immunoglobulines obtenues par immunisation d'un lapin au moyen d'un conjugué tel que défini ci- dessus sont purifiées par précipitation au sulfate d'ammonium puis dialysées et chromatographiées sur protéine A Après élution à p H 2,4, les immunoglobulines sont neutralisées et lyophi- lisées. Elles peuvent être administrées après redissolution dans le sérum physiologique par injection intra-veineuse. Effets pharmacologiques et toxicolo iues: Les tests effectués ont montré que le principe actif (anticorps anti-ecdysone) n'interférait avec aucune fonction physiologique, son action 4 tant spécifique du parasite. Le médicament selon l'invention présente à forte dose ou en cas d'injections répétées, une toxicité analogue à celle des immunoglobulines déjà utilisées comme médicament (anti-tétanique par exemple). Le vaccin selon l'invention est bien toléré et induit une protection efficace et durable. Le médicament et le vaccin selon l'invention se sont avérés particulièrement efficaces dans les cas de bilharziose. Il va de soi crue l'invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification utile pourra y être apportée sans sortir de son cadre. 6. REVENDICATIONS 1 Médicament et va'ccin pour lutter contre les parasitoses à helminthes, caractérisés par le fait qu'ils sont constitués de produits dérivant d'un composé ecdysté- roide. 2 Médicament selon la revendication 1, caracté- risé par le fait qu'il est essentiellement constitué des immunoglobulines anti-ecdysone ou de leurs fragments anti- ecdysone obtenues à partir d'un conjugué ecdystérolde- macromolécule et: soit extraites du sérum d'un animal immunisé avec ce conjugué, soit produites par un hybridome obtenu à partir des cellules d'un animal immunisé, soit produites par des cellules modifiées par manipulation génétique. 3 Médicament selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que le conjugué ecdystéroide- macromolécule est le produit résultant du couplage de façon covalente entre un support constitué par une macromolécule et au moins un composé ecdystérolde. 4 Vaccin selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est essentiellement constitué par un conjugué ecdystéroïde-macromolêcule dans lequel ladite macromolécule est avantageusement une protéine, Vaccin selon la revendication 4, caractérisé par le fait que ledit conjugué est le produit résultant du couplage de façon covalente entre un support protéique et un composé ecdystéroide. 6 Vaccin selon la revendication 4 ou 5, caractérisé par le fait que le support protéique est de nature quelconque. 7 Vaccin selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le support protéique est choisi parmi les suivants: sérumnalbumine (d'origine humaine ou animale), protéines de préférence de haut poids moléculaire du type immunoglobulines, hémocyanines et analogues, polymères 7. synthétiques du type polylysine et analogues. 8 Vaccin et médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisés par le fait que le composé ecdystéroide peut être l'ecdysone de formule: 21,26 1 S 23 25 t O A 27 OH OH ou l'un de ses dérivés tels que les 2 hémi-succinate; 3 hémi-succinate; 22 hémi-succinate; 6 carboxyméthyl oxime de même que les analogues très proches tels que la -hydroxy-ecdysone (ou ecdystérone), l'inokostérone qui diffère de l'ecdysone par l'hydroxylation de la chaîne latérale en position 26 au lieu de 25 et de façon générale tout composé analogue induisant la formation d'anticorps reconnaissant l'ecdysone. 9 Vaccin selon l'une quelconque des revendica- tions 1 et 4 à 8, caractérisé par le fait que le support protéique est de plus couplé à un adjuvant de l'immunité du type muramyl dipeptide. Vaccin selon l'une quelconque des revendica- tions 1 et 4 à 9, caractérisé par le fait que le composé ecdystéroide est couplé au support protéique par l'une des positions 2, 3, 22, 6 ou 26. 11 Vaccin selon l'une quelconque des revendica- tions 1 et 4 à 10, caractérisé par le fait que le produit de couplage présente un rapport pondéral de 2 à 15 %.