Brevet FR2544720A1 — publié le 19841026

L'apparition de l'A D N (acide désoxyribonucléi- que) recombinant et de l'ingéniérie génétique comme métho- dologies importantes tant pour la recherche fondamentale que pour la recherche appliquée a été rendue possible par la mise au point de plusieurs techniques expérimentales qui, utilisées simultanément, permettent une manipulation beaucoup plus complexe de la matière génétique et des cel- lules vivantes qu'on ne l'aurait rêvé il y a moins de dix ans Ces techniquespermettent la dissection du génome hu- main en gènes individuels qui peuvent être transférés dans des microorganismes tels que des bactéries Là, les gènes peuvent être reproduits par les bactéries en des quantités permettant de définir leur structure chimique De plus, les microorganismes contenant le gène humain peuvent être amenés à produire de grandes quantités du produit protéini- que codé par le gène, permettant ainsi la production de grandes quantités de protéines humaines peu abondantes tel- les que l'interféron, l'hormone de croissance et l'insuline. Une des techniques expérimentales qui ont pris une part essentielle au développement rapide de l'ingénie- rie génétique est la synthèse chimique d'oligonucléotides de structure définie Ces oligonucléotides forment souvent une partie essentielle du processus d'isolement d'un gène unique a partir d'une bibliothèque contenant des dizaines de milliers à des millions de gènes qui peuvent être expri- més par une cellule vivante individuelle à tout moment En raison de la structure chimique unique de l'A D N, un mor- ceau d'A D N présentant une séquence particulière ne re- connaîtra et ne se fixera qu'à un autre morceau ayant une séquence complémentaire, ignorant tous les morceaux d'A D N d'un mélange complexe ayant les mauvaises séquences Par conséquent, de petits morceaux d'A D N préparés par synthè- se chimique peuvent être utilisés comme échantillons molé- culaires uniques pour repérer des morceaux d'A D N beaucoup plus grands, et même des gènes entiers, qui contiennent la séquence complémentaire appropriée La séquence correcte à incorporer aux échantillons peut être déduite de la struc- 2544720 O ture de la protéine codée par le gêne en traduisant, au moyen du code génétique, la séquence protéinique en séquen- ce d'A D N Comme le code génétique est dégénéré, c'est-à- dire que la plupart des motifs chimiques de la séquence protéique peuvent être codés par plusieurs groupes de mo- tifs chimiques de la séquence de l'A D N, on doit souvent préparer par synthèse une série d'échantillons d'A D N con- tenant des séquences apparentées mais non identiques pour s'assurer que l'on prépare la séquence complémentaire au gène désiré Ceci impose de sévères contraintes aux procé- dés utilisés pour préparer l'A D N par synthèse Pour être utilisables dans un travail de routine, ils doivent être rapides, simples, sûrs et peu coûteux, car on doit souvent préparer par synthèse plusieurs douzaines de molécules d'A D N différentes pour repérer un gène unique. Un procédé pour la synthèse d'oligonucléotides a été mis au point par Caruthers et coll (M D Matteucci et M H Caruthers, J Amer Chem Soc 103, 3185-3191, 1981; S L Beaucage et M H Caruthers, Tet Lett 22, 1859-1862, 1981). Ces oligonucléotides sont prépares par synthèse par addition progressive de monodésoxynucléosides à un déso- xynucléoside fixé par covalence à un support polymère de gel de silice Les stades individuels pour chaque addition mettent en jeu la condensation du nucléoside activé sous forme de phosphite (stade 1), le blocage covalent de grou- pes 5 'hydroxyle du nucléoside n'ayant pas réagi (stade 2), l'oxydation du phosphite en phosphate (stade 3) et l'élimi- nation du groupe bloquant en 5 ' du nucléoside ajouté dans chaque cycle (stade 4) Dès que le nombre désiré de mono- mères a été ajouté à la chaîne qui s'allonge, l'oligonuclé- otide terminé est retiré du support de silice et les autres groupes bloquants sont éliminés de l'oligonucléotide par traitement par du thiophénol et de l'hydroxyde d'ammonium. Le procédé de Caruthers et Coll présente les ca- ractérigtiqus-suivantes: ( 1) les oligonucléotides sont préparés par synthè- se sur un support polymère insoluble Comme des synthèses multi-stades sont mises en jeu, ce développement simplifie la purification d'intermédiaires synthétiques Les réactifs en excès et la plupart des sous-produits de la réaction non désirés sont extraits par lavage du support par des sole vants sans éliminer le polymère en cours de croissance. ( 2) les phosphites de nucléosides activés sont les intermédiaires utilisés pour la synthèse d'oligonucléo- tides Ces phosphites réagissent rapidement et avec un ren- dement élevé Ces caractéristiques sont idéales pour que des réactions de condensation cyclique soient achevées sur un support polymère. ( 3) une série de réactifs ont été mis au point par Caruthers et Coll pour l'élimination sélective de grou- pes bloquants en 5 ' de nucléosides, nucléotides et oligonu- cléotides Ces réactifs sont des acides de Lewis tels que Zn Br 2, BF 3, Al C 13, et Ti C 14 Ces réactifs éliminent effica- cement les groupes protecteurs des éthers sans dégradation d'oligonucléotides préformés. ( 4) le processus global de synthèse est extrême- ment rapide Chaque addition de monodésoxynucléoside, y compris tous les stades de traitement, exige environ 2 heu- res 1/2. ( 5) on observe des rendements dépassant 95 % avec chacun des mononucléosides activés. Le support polymère utilisé dans le procédé de Caruthers et Coll est composé d'un des quatre nucléosides convenablement bloqués, uni par covalence a des perles de gel de silice macroporeuses. Le stade initial du procédé de Caruthers et Coll. est la synthèse de nucléosides activés Les nucléosides con- tiennent tous les quatre un groupe bloquant en 5 ' tel que l'éther di-panisylphénylméthylique (diméthoxytritylique, DM Tr) Cependant, on peut utiliser n'importe quel autre groupe protecteur en 5 ' approprié Il est également souhai- table de protéger les groupes amino sur la cytosine, l'adê- mine et le guanine On peut utiliser des groupes benzoyle, isobutyryle ou similaires Par conséquent, la 5 '-0-dimétho- xytrityl-désoxythymidine (DM Trd(T)), la 5 '-0-diméthoxytri- tyl-N-benzoyldésoxycytidine (DM Trd(bz C)), la 5 '-0-dimétho- xytrityl-N-benzoyldésoxyadénosine (DM Trd(bz A)), et la 5 '- 0-diméthoxytrityl-N-isobutyryldésoxyguanosine (DM Trd(ib G)), ont été utilisées comme nucléosides protégés. Les nucléosides protégés doivent être activés pour le couplage Idéalement, le nucléoside activé doit être stable et facile à manipuler, et en même temps il doit être hautement réactif vis-à-vis du groupe 5 '-hydro- xyle non protégé du nucléoside auquel il va se coupler. Ces exigences sont satisfaites au mieux par un groupe phosphite stable, partiellement active, qui peut être transformé in situ en le composé réactif désiré dans une réaction simple Ces composés décrits par Caruthers et Coll, comprennent les phosphoramidites de nucléosides. Ceux-ci peuvent être préparés par synthèse par le mode opératoire suivant Le DM Tr nucléoside ( 1 mmole) est dis- sous dans 3 ml de chloroforme sec, exempt d'acide et dans de la diisopropyléthylamine ( 4 mmoles) dans un récipient réactionnel de 10 ml balayé au préalable avec de l'azote sec On ajoute goutte à goutte (sur 30 60 sec) une chlo- ro-N,N-dialkylaminométhoxyphosphine ( 2 mmoles, les groupes alcyle peuvent être des groupes méthyle, éthyle, isopropy- le ou similaires) avec une seringue à la solution sous azote à la température ambiante Au bout de 15 min, on fait passer la solution avec 35 ml d'acétate d'éthyle dans une ampoule à décanter de 125 ml On extrait la solution 4 fois avec une solution aqueuse, saturée, de chlorure de sodium ( 80 ml) On sèche la phase organique sur du sulfate de sodium anhydre et on la fait évaporer sous pression ré- duite, jusqu'à obtention d'une mousse On dissout la mousse avec du toluène ( 10 ml) ou de l'acétate d'éthyle ( 10 ml) et on ajoute la solution goutte à goutte à 50 ml d'hexanes froids ( 78 C) en agitant énergiquement On filtre la sus- pension froide et on lave la poudre blanche avec 75 ml d'hexanes froids ( 78 C) On sèche la poudre blanche sous pression réduite et on la conserve sous azote. Pour commencer la synthèse de l'oligonucléotide désiré, on doit coupler le premier monomère à un support solide, en général un gel de silice de qualité pour chroma- tographie liquide à hautes performances ou un verre à tail- le de pores réglée, ces deux supports macroporeux ayant des surfaces spécifiques élevées On transforme d'abord le sup- port en dérivé pour permettre sa fixation au monomère. Caruthers et Coll ont décrit un mode opératoire approprié qui met en jeu la réaction de la silice avec le ( 3-amino- propyl)triéthoxysilane, la réaction de la silice transfor- mée en dérivé aminé avec de l'anhydride succinique, et le blocage des groupes silanol éventuellement restants avec du chlorure de triméthylsilyle Puis on couple le DM Tr-nu- cléoside désiré au groupe carboxyle fixé à la silice en utilisant du dicyclohexylcarbodiimide dans de la pyridine anhydre Les groupes carboxyle résiduels restant au-bout de 40 heures de traitement sont bloqués par traitement d'a- bord par le p-nitrophénol, puis par la morpholine Le pro- duit obtenu contient environ 50 micro-moles de nucléoside par gramme de silice. Les stades impliqués dans la fixation du nucléo- side suivant et des nucléosides ultérieurs sont en résumé les suivants. On élimine d'abord le groupe 5 '-DM Tr du nucléo- side fixé par traitement par un acide (en général Zn Br 2 dans du nitrométhane ou l'acide trichloracétique dans du chloroforme) Puis on lave la silice avec des solvants pour éliminer le réactif de scission Ces solvants comprennent par exemple, pour Zn Br 2, le n-butanol et la 2,6lutidine dans du tétrahydrofurane, puis le tétrahydrofurane, et pour l'acide trichloracétique, le nitrométhane puis le méthanol, puis l'acétonitrile On active ensuite le phosphoramidite désiré par traitement par 10-20 équivalents molaires de tétrazole et on l'ajoute au gel de silice pour le coupler au groupe 5 '-hydroxyle libre du nucléoside qu'il contient. Le nucléoside activé et le tétrazole sont tous deux dissous dans un solvant tel que l'acétonitrile Dès que la réaction de couplage est terminée, en général en 1 10 min, on la- ve le réactif en excès de la silice avec des solvants tels que le tétrahydrofurane et l'acétonitrile Si on le désire, on peut bloquer les groupes 5 '-hydroxyle n'ayant pas réagi par traitement par l'anhydride acétique dans la 2,6-luti- dine/tétrahydrofurane avant les lavages aux solvants, bien que ce stade ne soit pas essentiel pour la synthèse On transforme ensuite l'ester phosphoreux formé par cette opé- ration de couplage en ester phosphorique par oxydation avec de l'iode dans un mélange d'eau, de 2,6-lutidine et de té- trahydrofurane On élimine ensuite la solution d'iode en excès de la silice par extraction par le méthanol puis par le nitrométhane pour préparer l'élimination de 5 '-DM Tr sui- vante. On répète le processus ci-dessus avec lès addi- tions de nucléosides désirées jusqu'à ce que la séquence d'oligonucléotides correcte soit obtenue Puis on élimine les groupes méthyle contenus dans les phosphotriesters par traitement avec du thiophénol/triathylamine/dioxane (mélan- ge 1: 1: 2 en volume) pendant 45 minutes à la température ambiante Ce stade est suivi d'un traitement par de l'hydro- xyde d'ammonium concentré à la température ambiante pendant 3 heures pour hydrolyser l'ester unissant l'extrémité 3 ' de l'oligonucléide au support, d'une séparation de l'oligonu- cleotide scindé du support par filtration, et d'un chauffa- ge du filtrat à 50 C pendant 12 heures Puis on purifie l'oligonucléotide par chromatographie liquide à hautes per- formances, le groupe 5 '-DM Tr restant servant de marqueur pendant la chromatographie et enfin on élimine le groupe '-DM Tr par traitement par de l'acide acétique à 80 % On peut aussi éliminer le groupe 51-DM Tr avant la purification si la méthode chromatographique est remplacée par une élec- trophorèse sur gel de polyacrylamide. Un des principaux avantages du procédé de Caru- thers et Coll est sa rapidité potentielle Des rendements élevés peuvent être maintenus tout au long du procédé, aug- mentant ainsi la longueur de la séquence qui peut être pré- parée par synthèse, et aucun stade de purification intermé- diaire n'est nécessaire Cependant, il est extrêmement la- borieux, et l'automatisation des divers stades du procédé, en particulier de ceux mettant en jeu le couplage répéti- tif de monomères supplémentaires à la chaîne en cours de croissance, est souhaitable Caruthers et Coll ont décrit un appareil manuel dans lequel la synthèse est effectuée, imais cet appareil ne convient pas pour l'automatisation complè- te parce qu'il ne contient pas de moyens de formation in situ de nucléosides complètement activés aussitôt avant le couplage Ceci est une limitation importante, en raison de l'instabilité lors de la manipulation de ces composés La présente invention permet de surmonter cette limitation en incorporant un récipient préréactionnel dans lequel les nucléosides partiellement activés sont complètement activés aussitôt avant leur introduction dans le récipient réac- tionnel primaire contenant le support solide sur lequel l'oligonucléotide est préparé par synthèse. Fondamentalement, alors que Caruthers et Coll. utilisent un processus réactionnel par étapes, la présente invention en diffère nettement en ce qu'elle fournit un procédé dans lequel des nucléosides complètement activés sont mis à réagir simultanément dans une zone de réaction comprenant le récipient réactionnel primaire contenant le support solide. Ceci permet une automatisation complète du pro- cessus De plus, ceci permet d'utiliser des quantités beau- coup plus faibles de produits chimiques onéreux que celles qu'exige la technique d'activation manuelle Ceci permet aussi une incorporation simple et sure de l'un quelconque des quatre nucléosides monomères ou de tous les quatre à n'importe quel stade de couplage dans le procédé de synthè- se Ceci n'est pas facile à réaliser lorsqu'on utilise le Drocessus d'activation manuel, et ce point est essentiel lorsqu'on doit préparer une grande série de molécules d'A D N ayant des séquences similaires. Un autre inconvénient de l'appareil de Caruthers et Coll est qu'il utilise une pompe mécanique pour dépla- cer le liquide à travers le récipient réactionnel contenant le support de silice Ce système mécanique est sujet au blocage de l'écoulement provoqué par la formation de bulles de gaz ou de précipité dans les chambres de pompage De mê- me, l'action de pompage introduit des pulsations de pres- sion qui peuvent conduire à la fragmentation du support de silice et au colmatage du récipient réactionnel et des ca- nalisations La pompe introduit aussi un volume mort con- sidérable dans les canalisations entrant dans le récipient réactionnel et en sortant Ce volume mort, s'ajoutant à l'obligation d'éviter l'introduction de gaz dans les cana- lisations, conduit à une dilution importante des réactifs, ou encore à utiliser des volumes beaucoup plus importants de réactifs onéreux pour remplir le volume mort L'appa- reil de Caruthers et Coll comporte une soupape de recycla- ge qui permet de pomper et de repomper les réactifs dilués à travers le réacteur, mais ceci augmente les temps de ré- action et de balayage par les solvants La présente inven- tion utilise une pression de gaz pneumatique dans les ré- servoirs contenant les réactifs et les solvants pour assu- rer le déplacement de ces produits chimiques a travers le réacteur En outre, elle comporte l'utilisation de soupape sans volume mort, miniaturisées, qui réduisent au minimum la consommation de réactifs et permettent des temps de cy- cle de couplage de 15 min, seulement Ce système mécani- que n'est pas sujet au blocage par des bulles d'air (en fait, il utilise un gaz inerte pour purger la plus grande partie des réactifs en excès des canalisations et des réac- teurs avant d'achever la purge par des solvants) et, comme il n'utilise pas de pompes mécaniques pulsantes, il ne pro- voque pas de destruction physique du support de silice. En bref, la présente invention a pour objet une nouvelle installation pour la synthèse d'oligonucléotides plus complexes à partir de composés chimiques plus simples, dans laquelle au moins un de ces composés chimiques plus simples est porté par une matrice solide comprenant plu- sieurs perles placées dans une chambre réactionnelle et est soumis successivement à plusieurs autres composés chimiques plus simples envoyés à travers la chambre dans un courant, provoquant une interaction chimique entre les composés chi- miques plus simples pour former-les dits composés plus com- plexes Certains des composés chimiques plus simples sont mélangés dans un récipient préréactionnel avant d'être en- voyés à travers la chambre pour donner naissance aux espè- ces réactives appropriées. Par un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un nouveau procédé qui comprend l'introduction dans une zone réactionnelle primaire contenant un support soli- de, de plusieurs nucléosides pleinement activés et permet- tant à ces nucléosides de réagir sur le support solide pour former un oligonucléoside. Un des buts de l'invention est de fournir une nouvelle installation pour la synthèse d'oligonucléotides. Plus particulièrement, un des buts de l'inven- tion est de fournir une installation perfectionnée pour la synthèse d'oligonucléotides. Un des buts de l'invention est également de four- nir un nouveau procédé pour préparer par synthèse un oligo- nucléoside par réaction simultanée, dans une zone réaction- nelle, de plusieurs nucléosides inter-réactifs et complète- ment activés. Ces buts et avantages de l'invention ainsi que d'autres ressortiront de la description détaillée ci-après faite en rapport avec les dessins annexés sur lesquels: les figures 1 A et 1 B prises côte à côte repré- sentent, sous forme schématique, la nouvelle installation de l'invention, la figure 2 est une coupe du réacteur primaire de la figure 1 B, la figure 3 est une coupe partielle à plus grande échelle de la partie centrale de la figure 2, et la figure 4 est une coupe du récipient préréac- tionnel de la figure 1 A. On considérera à présent les dessins plus en dé- tails L'installation 10 de l'invention est représenté aux figures 1 A et 1 B. De manière typique un récipient à solvant 12 com- munique avec une soupape 14, un régulateur de pression 16 et un bloc de soupapes 18 Une canalisation 20 munie d'un régulateur de pression 22 fournit un gaz inerte tel que l'argon La source de gaz inerte n'est pas représentée aux dessins Un réservoir 24 contient de préférence un réactif chimique simple tel que le tétrazole, et il est également associé à une soupape 26 et au régulateur de pression 28. Le réservoir 30 contient un nucléoside unique, OS protégé partiellement activé tel que celui correspondant à l'adénosine De même, des réservoirs 32, 34 et 36 con- tiennent d'autres dérivés de nucléosides, tels que ceux correspondant à la thymine, à la guanine et à la cytosine, respectivement. Des réservoirs 30, 32, 34 et 36 sont munis de soupapes 38, 42, 46 et 50, respectivement, et de régula- teurs de pression 40, 44, 48 et 52, respectivement. Le récipient 12 et les réservoirs 24, 30, 32, 34 et 36 ont des soupapes régulatrices de débit individuelles 54 et des régulateurs 56 de soupapes régulatrices de débit qui permettent d'évacuer les réservoirs dans le piège a déchets 114. Le bloc de soupape 18 alimente un préréacteur 58 par une canalisation 404 Une soupape 60 et une canalisa- tion 400 évacuent le préréacteur 58 vers le piège a déchets 114 Le préréacteur 58 communique avec un bloc de soupapes 62 par une canalisation 402 Un gaz inerte est envoyé dans le bloc de soupapes 62 par une canalisation 64 Une canali- sation 66 évacue vers le piège a déchets 114. Le mélange de nucléosides simple sous forme de composés ayant préréagi se déplace vers un bloc de soupapes *par une canalisation 72. Des réservoirs 80, 82, 84, 86 et 88 communiquent avec le bloc de soupape 70. Les réservoirs 80, 82, 84, 86 et 88 ont chacun des soupapes 90, des régulateurs de pression 92, des sou- papes régulatrices de débit 94 et des régulateurs 96 de soupapes régulatrices de débit appropriés. Un réacteur primaire 98 est placé dans un envi- ronnement thermostaté 100 et définit une chambre réaction- nelle 102 ayant un orifice d'entrée 104 et un orifice de sortie 106. L'orifice de sortie 106 est relié à un bloc de soupapes 108. Le bloc de soupapes 108 communique avec un col- lecteur de fractions 112 Le bloc de soupapes 108 commu- nique aussi avec le piège à déchets 114 soit par une cana- lisation 198, soit par un régulateur de débit 200 et une canalisation 202. Les blocs de soupapes 18, 62, 70 et 108 et les soupapes 14, 26, 38, 42, 46, 50, 54, 60, 90 et 94 sont com- mandés électriquement par l'unité de commande 68. Le réacteur primaire 98 est représenté en détails aux figures 2 et 3, il comprend une base 122 portant un manchon 124 qui contient des éléments 126, 128, 130 et 132. Au-dessous de la base 122 se trouve le bloc de soupapes 108 dont on a discuté ci-dessus à propos des figu- res 1 A et 1 B. Les éléments 122 et 124 sont maintenus assemblés par un collier fileté intérieurement 134. Un collier supérieur 136 maintient l'élément 132 en position d'obturation à l'intérieur d'un manchon 124. La chambre 102 est remplie de perles macroporeu- ses constituées de sphères de silice ayant des cavités Les perles peuvent aussi être modifiées chimiquement d'au- tres manières. Le préréacteur 58 est représenté en détails à la figure 4; il comprend un flacon 420, une fermeture à bou- chon à vis 410, une série de tubes de raccordement 400, 402 et 404 et une rondelle d'étanchéité 440 Les tubes 400, 402 et 404 communiquent avec les blocs de soupapes 60, 62 et 18, respectivement L'activation des nucléosides s'ef- fectue dans la cavité 430 à l'intérieur du flacon 420 Les surfaces filetées appariées 412 et 422 sur 410 et 420, respectivement, permettent la compression de la rondelle 440 sur les surfaces 414 et 416 pour obturer la cavité 430, à l'exception des tubes de raccordement. Les blocs de soupapes 18, 62, 70 et 108 sont des soupapes multi-éléments, construites de préférence sans volume mort Des blocs de soupape tels que ceux décrits par Wittmann et Coll (US-P-4 008 736), Hunkapiller et Hood 12 - (US-P-4 252 769), Hood et Coll (US-A-380 109) et Stark (US-A-300 184) sont acceptables Les éléments de soupape individuels dans les blocs sont commandés électroniquement et individuellement par unité de commande 68. La mise en oeuvre de l'installation ci-dessus pour préparer par synthèse un oligonucléotide se compose de trois procédures fondamentales: introduction du sup- port solide contenant le premier nucléoside lié dans le réacteur primaire, réalisation du cycle de couplage décrit ci-dessous une ou plusieurs fois en utilisant l'un ou la totalité des dérivés de nucléosides, a volonté, à chaque cycle, et élimination du nucléotide terminé lié au support du réacteur primaire, puis séparation d'avec le support et élimination des groupes protecteurs du nucléotide L'ordre des additions de nucléosides est programmé dans l'unité de commande 68 avant la mise en route du cycle de couplage. Pour introduire le support contenant le premier nucléoside lié dans la chambre 102 du réacteur primaire 98, on démonte partiellement le réacteur primaire en déserrant la vis 103 retenant la canalisation et en enlevant dans l'ordre, le collier supérieur 136, la bague d'arrêt 121, la rondelle de Teflon, marque déposée pour des résines fluorocarbonées 123, l'élément 132, la rondelle de Teflon poreuse 127, l'élément 130 et, ensemble, l'élément 128, la rondelle de Teflon poreuse 125 et l'élément 126 On re- tire de la chambre 102 la matière de support précédemment utilisée éventuellement présente et on jette les rondelles de Teflon poreuses 125 et 127 On remonte ensuite le réac- teur primaire 98 en replaçant, dans l'ordre, l'élément 126, une nouvélle rondelle de Teflon poreuse 125, l'élément 128, l'élément 130, un nouveau support contenant le premier nu- cléoside fixé dans la chambre 102, le support de Teflon PO- reux 127, l'élément 132, la rondelle de Teflon 123, la ba- gue d'arrêt 121 et le collier supérieur 136 On termine le montage en serrant la vis 103 retenant la canalisation. Un cycle de couplage typique se compose des sta- des suivants: Stade 1 Durée: 30 secondes Balayer le réac- teur primaire avec du nitrométhane ( 2,5 ml) L'effluent est envoyé dans la canalisation 198. Stade 2 Durée: 10 secondes Balayer le réac- teur primaire à l'argon pour éliminer le nitrométhane. L'effluent est envoyé dans la canalisation 198. Stade 3 Durée: 30 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'acide trichloracétique à 3 % dans du chloroforme ( 1,5 ml) pour effectuer la détritylation. L'effluent est envoyé dans le collecteur de fractions 112. Stade 4 Durée: 10 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'argon pour éliminer la solution acide L'effluent est envoyé dans le collecteur de fractions 112. Stade 5 Durée: 20 secondes Balayer le réac- teur primaire avec du nitrométhane ( 1,5 ml) L'effluent est envoyé dans le collecteur de fractions 112. Stade 6 Durée: 10 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'argon pour éliminer le nitrométhane. L'effluent est envoyé dans le collecteur de fractions 112. Stade 7 Durée: 20 secondes Balayer le réac- teur primaire avec du méthanol ( 1,3 ml) L'effluent est envoyé dans la canalisation 198. Stade 8 Durée: 10 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'argon pour éliminer le méthanol. L'effluent est envoyé dans la canalisation 198. Stade 9 Durée: 30 secondes Mettre les réser- voirs à nucléosides sous pression d'argon. Stade 10 Durée: 15 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'acétonitrile ( 1,1 ml) L'effluent sortant du réacteur primaire est envoyé dans la canalisa- tion 198 Envoyer du phosphoramidite de nucléoside dans l'acétonitrile ( 0,2 ml) dans le préréacteur. Stade 11 Durée: 5 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'acétonitrile ( 0,4 ml) L'effluent sortant du réacteur primaire est envoyé dans la canalisa- tion 198 Balayer le préréacteur avec de l'argon pour pous- ser le phosphoramidite de nucléoside dans le préréacteur. Stade 12 Durée: 30 secondes Mettre sous pression le réservoir le tétrazole. Stade 13 Durée: 20 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'acétonitrile ( 1,4 ml) L'effluent sortant du réacteur primaire est envoyé dans la canalisa- tion 198 Envoyer du tétrazole dans l'acétonitrile ( 0,4 ml) dans le préréacteur. Stade 14 Durée: 5 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'acétonitrile ( 0,4 ml) L'effluent du réacteur primaire est envoyé dans la canalisation 198. Balayer le préréacteur avec de l'argon pour pousser du té- trazole dans le préréacteur. Stade 15 Durée: 15 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'acétonitrile ( 1,1 ml) L'effluent du réacteur primaire est envoyé dans la canalisation 198. Faire barboter de l'argon dans le préréacteur pour mélan- ger les solutions de nucléoside et de tétrazole et effec- tuer l'activation du nucléoside pour le couplage. Stade 16 Durée: 10 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'argon pour éliminer l'acétonitrile. L'effluent est envoyé dans la canalisation 198. Stade 17 Durée: 2 secondes Mettre le préréac- teur sous pression avec de l'argon. Stade 18 Durée: 360 secondes Chasser le nu- cléoside activé du prêréacteur à travers le réacteur pri- maire avec de l'argon envoyé dans le préréacteur Cette opération réalise le couplage du nucléoside activé au nu- cléotide fixé sur le support présent dans le réacteur pri- maire L'effluent sortant du réacteur primaire est envoyé travers le régulateur d'écoulement 200. Stade 19 Durée: 5 secondes Balayer le préré- acteur et le réacteur primaire avec de l'argon pour éliminer le nucléoside activé L'effluent sortant du réacteur primai- re est envoyé dans la canalisation 198. Stade 20 Durée: 10 secondes Envoyer de l'acé- tonitrile ( 1,5 ml) dans le préréacteur. Stade 21 Durée: 30 secondes Chasser l'acétoni- trile du préréacteur à travers le réacteur primaire avec ce l'argon envoyé dans le préréacteur L'effluent sortant du réacteur primaire est envoyé dans la canalisation 198. Stade 22 Durée: 10 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'acétonitrile ( 0,7 ml) L'effluent sortant du réacteur primaire est envoyé dans la canalisa- tion 198 Envoyer de l'acétonitrile ( 1,5 ml) dans le pré- réacteur. Stade 23 Durée: 25 secondes Balayer le réac- teur primaire ( 1,8 ml) avec de l'acétonitrile L'effluent sortant du réacteur primaire est envoyé dans la canalisa- tion 198 Balayer le préréacteur avec de l'argon pour éli- miner l'acétonitrile L'effluent sortant du préréacteur est envoyé dans la canalisation 66. Stade 24 Durée: 10 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'argon L'effluent est envoyé dans la canalisation 198. Stade 25 Durée: 60 secondes Balayer le réac- teur primaire avec une solution iode/eau/2,6-lutidine/té- trahydrofurane ( 2,0 mi) pour effectuer l'oxydation du phos- phite en phosphate L'effluent est envoyé dans la canalisa- tion 198. Stade 26 Durée: 10 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'argon pour éliminer la solution d'iode L'effluent est envoyé dans la canalisation 198. Stade 27 Durée: 60 secondes Envoyer du métha- nol ( 3,0 ml) à travers le réacteur primaire L'effluent est envoyé dans la canalisation 198. Stade 28 Durée: 10 secondes Balayer le réac- teur primaire avec de l'argon L'effluent est envoyé dans la canalisation 198. Lorsque le cycle de couplage décrit ci-dessus a été répété le nombre de fois désiré, l'oligonucléotide ter- miné lié au support est retiré du réacteur primaire pour effectuer la séparation du support et des groupes proté- geant les bases Le retrait du réacteur primaire est effec- tué en répétant le mode opératoire décrit ci-dessus pour introduire un nouveau support de silice dans le réacteur primaire L'opération de scission et de déblocage est en- suite effectuée manuellement hors de l'appareil 10 par un procédé tel que celui décrit par Caruthers et Coll. Comme variante du cycle de couplage ordinaire, on peut citer l'utilisation de Zn Br 2 (solution saturée dans du nitrométhane> plutôt que de la solution d'acide trichloracétique pour le stade de détritylation Dans ce cas, la détritylation doit être poussée jusqu'à 10 à 20 min Une autre variante consiste à envoyer plus d'un nu- cléoside activé dans le réacteur primaire au cours du sta- de de couplage Ceci s'effectue en envoyant deux, trois ou quatre nucléosides partiellement activés dans le préréac- teur (en utilisant 1/2, 1/3 ou 1/4 du temps normal d'envoi d'un nucleotide, respectivement), en ajoutant le tétrazole au mélange de nucléosides, et en refoulant le mélange de nucléosides activé à travers le réacteur primaire. Le degré d'achèvement des réactions de couplage peut être suivi commodément en recueillant, à chaque cycle, l'effluent de la détritylation et des stades ultérieurs de balayage par des solvants et en mesurant l'absorbance a 498 mu du cation dim 6thoxytrityle au spectrophotomètre Les quantités relatives d'absorbance dans chacun des tubes suc- cessifs du collecteur de fractions peuvent être utilisées pour calculer un rendement de couplage par cycle Des ren- dements typiques sont de 95 % ou davantage. REVENDICATIONS 1 Installation perfectionnée pour la synthèse d'oligonucléotides complexes à partir de composés chimiques plus simples, caractérisée en ce qu'au moins un de ces com- OS posés chimiques plus simples est porté par une matrice so- lide comprenant plusieurs perles logée dans une chambre de réaction ( 102) et est soumis successivement à plusieurs autres composés chimiques plus simples envoyés à travers la chambre dans un courant, provoquant une interaction chimi- que entre les composés chimiques plus simples pour former les dits composés plus complexes, en ce qu'un pré-réacteur ( 58) est prévu, conjointement à la chambre de réaction ( 102) et en communication de fluide avec elle, et en ce que des nucléosides partiellement activés sont complètement activés aussitôt avant leur introduction dans la chambre de réac- tion ( 102). 2 Installation suivant la revendication 1, carac- térisée en ce qu'une série de réservoirs ( 80, 82, 84, 86, 88) pour contenir les réactifs et les solvants sont prévus en amont de la chambre de réaction ( 102) et en communica- tion de fluide avec elle, et en ce que des moyens pneumati- ques pour appliquer une pression de gaz sont prévus en ass Q- ciation avec ces réservoirs pour réaliser un déplacement pneumatique de ces matières à travers la chambre de réac- tion ( 102). 3 Installation suivant la revendication 2, carac- térisée en ce qu'une série de réservoirs ( 12, 24, 30, 32, 34, 36) pour contenir des réactifs et des solvants sont éga- lement prévus en amont du pré-réacteur ( 58) et en communi- cation de fluide avec lui. 4 Installation suivant la revendication 3, carac- térisée en ce que des blocs de soupapes ( 18,62,7-0) sont prévus en a- mont du pré-réacteur ( 58) et entre le pré-réacteur ( 58) et la chambre de réaction ( 102) pour régler l'écoulement des fluides, et en ce que ces blocs de soupapessont sans volume mort. Installation suivant la revendication 4, carac- térisée en ce que les dites perles sont constituées de sphères de silice macroporeuse contenant des cavités. 6 Installation suivant la revendication 1, carac- térisée en ce qu'un bloc de soupape ( 108) est également pré-' vu en aval de la chambre de réaction ( 102) et en communica- tion de fluide avec elle, ce bloc de soupapes communiquant en outre avec un collecteur de fractions ( 112). 7 Installation suivant la revendication 6, carac- térisée en ce que les sphères de silice macroporeuses sont supportées par une feuille poreuse en résine fluorocarbonée formant le fond de la chambre de réaction ( 102). 8 Procédé qui consiste à introduire dans une zo- ne réactionnelle primaire contenant un support solide, plu- sieurs nucléosides complètement activés et à permettre à ces nucléosides de réagir simultanément sur le support pour former un oligonucléoside, caractérisé en ce que des nucl 6- osides partiellement activés sont complètement activés dans une zone de pré-réaction juste avant leur introduction dans la zone réactionnelle primaire. 9 Procédé suivant la revendication 8, caractéri- sé en ce que le support solide porte un nucléotide et les dits nucléosides actives se couplent a ce nucléotide.