Brevet FR2545502A1 — publié le 19841109

La présente invention se rapporte d'une manière générale à un procédé amélioré pour la fabrication de la céphalosporine C. Elle concerne plus particulièrement l'addition de certains composés du phosphore organiques et inorganiques au milieu de culture pendant la fermentation d'un micro- organisme produisant la céphalosporine C et qui produit également la désacétylcéphalosporine indésirable L'addition de composés de phosphore inhibe grandement la formation de l'impureté constituée par la désacétylcéphalosporine C, de façon à faciliter ainsi la récupération de la céphalosporine C du bouillon de fermentation et sa trans- formation subséquente en acide 7-aminocéphalosporanique ( 7-ACA). On sait que la céphalosporine C lacide 3-acétoxy- méthyl-7,/ -(D-5-amino-5-carboxypentanamido)céph-3-em-4- carboxylique 3 est un composé qui, tout en présentant une activité antibiotique en soi, est d'une importance primor- diale comme matériau de départ pour la préparation des antibiotiques semisynthétiques de céphalosporine Ainsi, la céphalosporine C peut être transformée par des procédés connus en acide 3-acétoxyméthyl-7, -aminocéph-3-em-4- carboxylique ( 7-ACA) qui est ensuite utilisé comme un intermédiaire clé pour la préparation d'une grande variété d'antibiotiques commerciaux de céphalosporine. On sait que la céphalosporine C peut être obtenue par fermentation de divers micro-organismes comprenant tout spécialement les champignons du genre Emericellopsis- Cephalosporium A titre d'illustration de micro-organismes produisant la céphalosporine C, on peut citer la souche originelle Brotzu de Cephalosporium, c'est-à-dire Cephalosporium spo I M I 49137 (ATCC 11550), et les mutants de cette souche, telle que la souche mutante 8650 (ATCC 14553),décrite dans le brevet britannique N 1 109 362, Cephalosporium sp I B I 1131 décrite dans le brevet britannique N 1 503 851 et la souche de Cephalosporium F.12 (ATCC 20339) décrite dans le brevet britannique N 1 400 433 D'autres exemples d'organismes produisant la céphalosporine C sont décrits dans la littérature et sont Cephalosporium polyaleurum Y-505 (FERM-P N 1160) décrit dans le brevet britannique I 488 822, Cephalosporium acremonium K-121 (ATCC 20427) et Cephalosporium acremonium N-75 (ATCC 20 428) décrit dans le brevet britannique N 1 488 821, et Cephalosporium polyaleurum 199 (ATCC 20359), ainsi qu'un mutant de cette souche identifié par la référence Y-505 (ATCC 20360) décrit dans le brevet britan- nique N 1 389 714 La céphalosporine C est généralement produite à l'échelle industrielle en utilisant une souche mutante à taux de production élevé de Cephalosporium acremonium (également connue sous le nom de Acremonium chrysogenum) Des exemples de telles souches mutantes et de méthodes pour leur préparation ont été exhaustivement décrits dans la littérature. En dépit d'une recherche exhaustive pendant des années, la fermentation de la céphalosporine C à l'échelle commerciale n'est pas encore entièrement satisfaisante. La plupart des micro-organismes de production de la céphalosporine C, spécialement les souches à taux de production élevé utilisées pour une production commerciale, réalisent la co-production d'une proportion significative de désacétylcéphalosporine C, qui est une impureté extrême- ment difficile à séparer du produit désiré de céphalospo- rine C en raison de ses caractéristiques physiques et chimiques similaires La présence de la désacétyl- céphalosporine C, typiquement suivant des proportions d'environ 15 % de la quantité totale de céphalosporine produite pendant la fermentation, résulte dans la récupé- ration de céphalosporine C (ou plus communément un dérivé de celle-ci qui peut être extrait par solvant) contaminée par de la désacétylcéphalosporine C (ou un dérivé de celle-ci) Par ailleurs, étant donné qu'à l'échelle industrielle, la céphalosporine C (ou un dérivé de celle-ci) n'est habituellement pas purifiée avant transformation subséquente en 7-ACA, la qualité du produit de 7-ACA est également affectée d'une manière néfaste par la production concomitante de désacétylcéphalosporine C dans le milieu de fermentation initial. L'art antérieur relatif à la production de la céphalosporine C est essentiellement axé sur la décou- verte de nouveaux micro-organismes permettant une produc- tivité plus élevée de céphalosporine C et sur des additifs de fermentation qui augmentent la production de céphalosporine C Ainsi par exemple, les souches mutantes de Cephalosporium acremonium ont été développées et ces souches produisent des rendements sensiblement plus élevés de céphalosporine C Il a été suggéré d'ajouter divers additifs au milieu de nutrition pendant la fermentation d'un micro-organisme produisant la céphalosporine C de façon à augmenter le rendement en céphalosporine C. Ainsi, l'utilisation de composés de soufre tels que le sulfite de sodium, le métabisulfite de sodium, le thio- sulfate de sodium, l'hydrosulfite de sodium, le thiosulfate -de sodium et le sulfate de sodium est décrite dans le brevet britannique NO 820 422; l'utilisation de méthionine, de chlorure de calcium, de chlorure de magnésium, de sulfate d'ammonium et de certains carbohydrates, d'huiles et d'acides gras est décrite dans le brevet britannique NO 938 755; l'utilisation de la norvaline et de la norleucine est décrite dans le brevet britannique NI 975 393; l'utilisation de l'acide phénylacétique est décrite dans le brevet britannique NO 975 394, et l'utilisation du j E-caprolactame, de la 2-butanone, de l'alcool butylique secondaire et du 1,3-butanediol est décrite dans le brevet britannique NO 1 503 851 Le problème de la co-production de la désacétylcéphalosporine C pendant la fermentation de la céphalosporine C a été évoqué seulement en termes de micro-organismes qui produisent des proportions plus élevées de céphalosporine sous la forme de céphalosporine C, ou en termes de processus d'extraction/isolation (voir par exemple brevet américain NO 4 059 573). La désacétylcéphalosporine C fut d'abord détectée dans des filtrats de culture de Cephalosporium acremonium. Abraham et autres ont prétendu que la formation de cette substance était due à ladésacétylation enzymatique de la céphalosporine C (voir la publication Biochem J 81: 591-596, 1961) Par la suite, des enzymes d'estérase capables de désacétyler la céphalosporine C ont été isolés à partir d'une grande variété de sources, telles que par exemple, les citrons, les bactéries, les actinomycètes, le germe de blé, le foie et les reins de mammifères et Rhodotorula Pisano et autres dans la publication Develop. Ind Microbiol 8: 417-423, 1967 ont expliqué que l'activité de l'estérase est très étendue pour l'espèce Cephalosporium La majorité de ces enzymes d'acétyl- estérase apparaît présenter de larges tolérances de substrat, c'est-àdire que le,3-naphtyl acétate et la triacétine sont des substrats actifs, et leur activité sur la céphalosporine C n'apparatt pas unique. Nuesch et autres, dans la publication Second International Symp on Genetics of Industrial Micro- organisms, Proc, 1975, éd Mac Donald, K D, New York, Academic Press, pages 451 à 472 et Fujisawa et autres dans la publication Agr Biol Chem 32 ( 6): 1303-1309 ( 1975) ont indépendamment purifié partiellement de l'estérase de céphalosporine C avec la partie surnageante d'un bouillon extracellulaire de Cephalosporium acremonium, et ont conclu que la présence de l'activité enzymatique était partiellement responsable de l'existence de désacétyl- céphalosporine C dans les fermentations de C acremonium. Une activité d'estérase similaire a été détectée avec les Streptomycètes produisant la céphalosporine C, à savoir Streptomyces clavuligerus (voir publication Antimicrob. Agents Chemother 1: 237-241, 1972) Cependant Huber dans la publication Al Microbiol 16 ( 7): 1011-1014 ( 1968), a mis en évidence que la formation de désacétylcéphalospo- rine C pendant le processus de fermentation est due à l'hydrolyse non enzymatique de la céphalosporine C. C'est 1 'opinion des présents inventeurs que la formation de désacétylcéphalosporine C est due à la fois à l'hydrolyse enzymatique et non enzymatique, avec une activité d'acétylesté-ase enzymatique jouant un rôle significatif. Les rapports faits par Liersch et autres dans la publication Second International Symp on Genetics of Industrial Microorganisms, Proc, 1976, éd Mac Donald, K.D, New York, Academic Press, pages 179-195 et par Felix et autres dans la publication FEMS Microbiol Lett 8: 55-58, 1980 ont indiqué que la désacétylcéphalosporine C est également un intermédiaire intracellulaire dans la biosynthèse de la céphalosporine C à partir de la désacétoxycéphalosporine C. L 'activité enzymatique de l'acétylestérase partiellement purifiée de cephalosporium - acremonium a été décrite comme étant inhibée par le diisopropylfluorophosphate, un inhibiteur reconnu des estérases (Agr Biol Chem 39 ( 6): 1303-1309, 1975). La toxicité extrême et le coût élevé de cet inhibiteur de phosphore pour l'acétylestérase, empêche cependant son utilisation dans la production commerciale de céphalosporine C. La céphalosporine C, en raison de sa nature amphotère, est normalement transformée en un dérivé de sorte qu'elle peut être plus facilement récupérée à partir du milieu de fermentation par des processus d'extraction par solvant Des exemples de tels dérivés sont donnés dans la demande de brevet britannique NO 2 021 640 A Un procédé particulièrement préféré est décrit dans le brevet américain N 3 573 296 Le dérivé de céphalosporine C obtenu par un tel procédé préféré peut être récupéré sous la forme d'un sel cristallin de bis-dicyclohexylamine comme décrit dans le brevet américain N 3 830 809, La céphalosporine C ou son dérivé récupéré à partir du milieu de fermentation est ensuite clivé par une méthode classique, par exemple le procédé selon le brevet américain N 3 932 392, pour donner le 7-ACA. Comme expliqué ci-dessus, la désacétyl- céphalosporine C est une impureté typiquement obtenue pendant la fermentation suivant des quantités d'environ % de la céphalosporine totale (céphalosporine C et désacétylcéphalosporine C) et elle présente des caracté- ristiques physiques et chimiques tout à fait siminaires à celles de la céphalosporine C désirée Dès lors, lorsque la céphalosporine C est transformée en un dérivé qui peut être extrait par solvant, la désacétyl- céphalosporine C est également transformée en un dérivé similaire et le dérivé de céphalosporine C ensuite isolé est contaminé avec le dérivé de désacétylcéphalosporine C. On peut voir par conséquent que la réduction de la proportion de céphalosporine obtenue sous la forme de désacétylcéphalosporine C permettra d'obtenir un produit ou un dérivé de céphalosporine C qui est plus pur Par ailleurs, étant donné que ce dérivé n'est pas normalement purifié avant la transformation en 7-ACA, des quantités réduites de désacétylcéphalosporine C dans le milieu de fermentation conduiront également à une meilleure qualité du produit 7-ACA. La présente invention est axée sur ou propose certains composés du phosphore qui agissent comme inhibiteurs de la production de désacétylcéphalosporine C pendant la fermentation de la céphalosporine C Le milieu de fermentation résultant contient une proportion signifi- cativement plus élevée de céphalosporine C par rapport à la désacétylcéphalosporine C, améliorant ainsi la qualité de la céphalosporine C récupérée et par conséquent la qualité de l'intermédiaire ultime 7-ACA préparé à partir d'un tel produit de céphalosporine C. La présente invention se rapporte à la production améliorée de céphalosporine C par une culture aérobie submergée de micro- organismes produisant la céphalosporine C Plus précisément, la présente invention a pour objet un procédé pour inhiber la formation de désacétylcéphalosporine C durant la fermentation d'un micro-organisme produisant la céphalosporine C et qui produit également la désacétylcéphalosporine C, par l'addition de certains composés de phosphore organiques et inorganiques au milieu de culture. Les composés de phosphore ou inhibiteurs proposés par la présente invention présentent les formules générales suivantes: R 10 R 4 O P-OR 3 P-OR R 20 O/ 5 / \R 6 R 50/PR 6 I II R 50 Rio O OR 1 p ou P P R 8 \R 9 R 20 OR III IV dans lesquelles R 1, R 2 et R 3 sont chacun indépendamment des groupes alcoyle, aryle ou aralcoyle facultativement substitués, R 4 est un groupe alcoyle facultativement substitué ou est/-OR 10, R 10 étant l'hydrogène ou un groupe alcoyle, aryle ou aralcoyle facultativement substitué, R 5 est l'hydrogène ou un groupe alcoyle, aryle ou aralcoyle facultativement substitué, R est hydrogène, hydroxy, alcényle, alcanoyle ou alcoyle facultativement substitué et R 8 et R 9 sont soit tous les deux hydrogène, soit tous les deux chloro. De tels composés diminuent efficacement la formation de désacétylcéphalosporine C pendant la fermentation de la céphalosporine C Par ailleurs, ces composés sont sensiblement moins non toxiques que le diisopropylfluorophosphate et sont en général relativement peu coûteux, ce qui permet leur utilisation pratique dans une production à grande échelle de la céphalosporine C. Le procédé de la présente invention est applicable à n'importe quel processus classique de fermentation pour la préparation de la céphalosporine C, à condition qu'un tel processus utilise un micro-organisme produisant la céphalosporine C qui produit également la désacétyl- céphalosporine C dans le milieu ou bouillon de fermentation. De nombreux exemples de tels micro-organismes sont décrits dans la littérature, par exemple dans la demande de brevet britannique NO 2 060 610 A D'autres micro-organismes produisant la céphalosporine C peuvent être facilement testés pour la production de la désacétylcéphalosporine C par des essais classiques bien connus pour ceux qui sont familiers de la technique Le micro-organisme de production de la céphalosporine C le plus préféré pour une utilisation dans le cadre de la présente invention est une souche de Cephalosporium acremonium (également connue sous le nom Acremonium chrysogenum), laquelle produit à la fois la céphalosporine C et la désacétylcéphalosporine C Des souches de production typiques de Cephalosporium acremonium permettent la formation d'approximativement 15 % de la céphalosporine C totale (céphalosporine C et désacétyl- céphalosporine C) sous la forme de désacétylcéphalosporine C. Le procédé de l'invention sera avantageusement mis en oeuvre en cultivant un microorganisme produisant la céphalosporine C (à savoir un micro -organisme capable de produire à la fois la céphalosporine C et la désacétyl- céphalosporine C) sous des conditions-aérobie, de préférence en culture submergée, dans un milieu nutritif classique de céphalosporine C selon les processus classiques de fermentation de la céphalosporine C La présente invention réside dans la découverte que l'addi- tion de certains composés du phosphore au milieu nutritif réduira sensiblement la production de désacétyl- céphalosporine C pendant la fermentation, et permettra d'obtenir un bouillon ou milieu final contenant une proportion sensiblement plus élevée de la céphalosporine C désirée, par rapport à la désacétylcéphalosporine C non désirée. Le milieu nutritif employé contiendra des sources assimilables de carbone et d'azote et, si on le désire, des substances favorisant la croissance aussi bien que des sels minéraux. Comme sources convenables de carbone, on citera par exemple le glucose, le sucrose, l'amidon, l'amidon soluble, les huiles végétales et animales, la dextrine et le maltose. Comme sources convenables d'azote, on citera par exemple les substances naturelles contenant de l'azote ou les matières préparées à partir de ces substances, telles que les extraits de viande, la peptone, la caséine, la liqueur de blé macéré ("cornsteep liquor"'), les extraits de levure, la farine de soja, la tryptone, la farine de coton et le son de blé Des composés orga- niques ou inorganiques contenant de l'azote peuvent également être utilisés, tels que par exemple l'urée, les nitrates et les sels d'ammonium tels que l'acétate d'ammonium, le chlorure d'ammonium ou le sulfate d'ammonium. Les sels minéraux qui peuvent être utilisés dans le milieu de fermentation comprennent les sulfates, les nitrates, les chlorures, les carbonates etc, qui ont été utilisés dans la production de la céphalosporine C. Les substances favorisant la croissance qui peuvent être utilisées comprennent par exemple la cystéine, la cystine, le thiosulfate, le méthyl oléate et, en particulier, la méthionine et également des éléments sous forme de traces, tels que le fer, le zinc, le cuivre et le manganèse. Les conditions de culture telles que la tempéra- ture, le p H et le temps de fermentation sont choisies de telle façon que le micro-organisme utilisé puisse accumuler une quantité maximum de la céphalosporine C désirée La température est normalement maintenue à environ 15-45 , de préférence à environ 25 C, et la fermentation est réalisée pendant une période comprise entre environ 1 et 20 jours, de préférence 4-10 jours et plus préférablement environ 6 jours. Il a désormais été trouvé que certains composés de phosphore organiques et inorganiques, lorsqu'ils sont ajoutés au milieu de culture pendant la culture du micro- organisme produisant la céphalosporine C, assurent une production sensiblement réduite de désacétylcéphalosporine C dans le milieu de fermentation On pense que cette réduc- tion dans la production de-désacétylcéphalosporine C résulte de l'inhibition de l'enzyme acétylestérase produit typiquement pendant la culture des micro- organismes produisant la céphalosporine C. Les composés de phosphore qui peuvent être utilisés dans le procédé de la présente invention peuvent être représentés par les formules suivantes: R 10 4 O P-OR 3 R p R 20 R 50 X \R 6 I II \ O R\ou 2 XP\ R 8 R 9 R 20 OR 2 III IV dans lesquelles R 1, R 2 et R 3 sont chacun indépendamment des groupes alcoyle, aryle ou aralcoyle facultativement substitués, R 4 est un groupe alcoyle facultativement substitué ou -OR 10, R 10 étant l'hydrogène ou un groupe alcoyle, aryle ou aralcoyle facultativement substitué, R 5 est l'hydrogène ou un groupe alcoyle, aryle, ou aralcoyle facultativement substitué, R 6 est l'hydrogène, hydroxy, alcényle, alcanoyle ou un groupe alcoyle faculta- tivement substitué et R 8 et R 9 sont tous les deux soit l'hydrogène, soit chloro. Des composés préférés de phosphore sont ceux des formules I, II, III et IV dans lesquelles:R 1, R 2 et R 3 représentent chacun indépendamment un groupe alcoyle C 1-C 10 à chatne droite ou ramifiée, un groupe phényle ou un groupe phénylalcoyle(C 1-C 4), ledit groupe alcoyle ou la partie alcoyle du groupe phénylalcoyle étant facultative- ment substitué par un ou plus, de préférence 1 à 3, substituants tels que halo (chloro, bromo, fluoro, iodo) ou carboxy/et ledit groupe phényle ou la partie phényle du groupe phénylalcoyle étant facultativement substitué par un ou plus, de préférence 1 à 3, substituants choisis indépendamment parmi des groupes tels que alcoyle C 1-C 6, alcoxy C 1-C 6 et halo; R est un groupe alcoyle C 1-C 6 facultativement substitué par un ou plus, de préférence I à 3, groupes halo ou est/-OR 10, R 10 étant l'hydrogène, un groupe alcoyle C 1-C 10, un groupe phényle ou un groupe phénylalcoyle(C 1C 4), lesdits radicaux alcoyle, phényle et phénylalcoyle étant facultativement substitués comme défini ci-dessus pour R 1; R 5 est l'hydrogène, un groupe alcoyle C 1-C 10, un groupe phényle ou phénylalcoyle(C 1-C 4), lesdits radicaux alcoyle, phényle et phénylalcoyle étant facultativement substitués comme défini ci-dessus pour R 1, R 6 est l'hydrogène, un groupe hydroxy, un groupe alcényle C 2- C 6, un groupe alcanoyle C 2-C 6, ou alcoyle C 1-C 6, ledit groupe alcoyle étant facultativement substitué par un ou plusieurs, de préférence I à 3, substituants tels que cyano, alcanoyle C 2-C 6 ou carboalcoxy(C 1-C 6 et R 8 et R 9 sont tous les deux soit hydrogène soit chloro. Comme composés de phosphite de formule I on citera par exemple le triméthylphosphite, le triéthylphosphite le triisopropylphosphite, le tributylphosphite, le triphénylphosphite et le tris( 2-chloroéthyl)phosphite. Des phosphites à fonction mixte tels que le benzyl- diéthylphosphite et le diphénylisodécylphosphite peuvent également être utilisés. Comme composés de phosphore de formule II on citera à titre d'exemple l'acide phosphoreux, le dibenzylphosphite, le dibutylphosphite, le diéthylphosphite, le diisopropylphosphite, le diméthylphosphite, le diphényl- phosphite, le triéthylphosphonoacétate, l'acide 2-chloro- éthylphosphonique, le diéthylcyanométhylphosphonate, le diméthylméthylphosphonate, le diméthylphosphate, le triméthylphosphonoacétate, le diéthyléthylphosphonate, le diéthylcarbométhoxyméthylphosphonate, le diéthyl- acétylphosphonate, le diméthylacétylméthylphosphonate, le diméthylcyanométhylphosphonate, le diéthylallyl- phosphonate et l'acide 2-carboxyéthylphosphonique. Les composés de formule générale III peuvent être illustrés par l'acide hypophosphoreux, le monométhyl- phosphonate, le monoéthylphosphonate et le 2,2,2- trichloroéthylphosphorodichloridite. Les composés de pyrophosphite de formule IV peuvent être illustrés par le tétraméthylpyrophosphite et le tétraéthylpyrophosphite. Les composés inhibiteurs préférés de phosphore comprennent l'acide phosphoreux, l'acide hypophosphoreux, le diisopropylphosphite, le triisopropylphosphite, le dibenzylphosphite, le diméthylphosphite, le tributyl- phosphite, le triéthylphosphonoacétate, l'acide 2-chloro- éthylphosphonique, le tétraéthylpyrophosphite, le diéthylcyanométhylphosphonate, le diméthylméthyl- phosphonate, le 2,2,2-trichloroéthylphosphorodichloridite, le diméthylphosphate, le diphénylphosphite, le triphényl- phosphite, le triméthylphosphite, le dibutylphosphite, le tris( 2-chloroéthyl)phosphite, le triméthylphosphono- acétate, le diéthyléthylphosphonate, le diéthylcarbo- méthoxyméthylphosphonate, le diéthylacétylphosphonate, le diméthylacétylméthylphosphonate, le 25455 02 diméthylcyanométhylphosphonate et le diéthylallyl- phosphonate. Des composés particulièrement préférés sont l'acide phosphoreux, l'acide hypophosphoreux, le diisopropylphosphite, le triisopropylphosphite, le dibenzylphosphite, le diméthylphosphite et le tributyl- phosphite. Le composé de phosphore le plus préféré comme inhibiteur est l'acide phosphoreux. Les composés de phosphore sont de préférence utilisés de façon à donner des concentrations du milieu final comprises entre environ 100 et 3 000 parties par million (basées sur le poids) et plus préférablement comprises entre 200 et 1 000 parties par million Le composé inhibiteur peut être ajouté en une seule fois ou à des intervalles périodiques pendent le cours de la fermentation D'une manière très avantageuse, les composés organiques du phosphore sont ajoutés aux fermentations en cours entre environ 70 et 140 heures sous la forme d'injections uniques ou multiples Les composés inorganiques de phosphore peuvent avantageusement être ajoutés aux fermentations en cours immédiatement après l'inoculation jusqu'à environ 140 heures après l'inoculation Alterna- tivement, ils peuvent être introduits dans le milieu de fermentation avant stérilisation. L'utilisation des composés de phosphore ci-dessus mentionnés selon le procédé de la présente invention abaisse sensiblement le pourcentage de désacétyl- céphalosporine C (basé sur la céphalosporine totale qui est constituée par la céphalosporine C et la désacétyl- céphalosporine C) dans le milieu de fermentation. Lorsqu'on les utilise dans les fermentations typiques de céphalosporine C, les niveaux ou quantités de désacétyl- céphalosporine C ont été réduits à environ 4 % de la céphalosporine totale comparativement à environ 15 % dans les milieux de fermentation non traités. Dans les fermentations traitées en flacons agités, la quantité totale de céphalosporine produite apparait rester inchangée et ainsi les titres ou quantités de céphalosporine C sont généralement augmentés d'une quantité appropriée Dans les fermentations à plus grande échelle il n'a pas été établi que l'utilisation des composés inhibiteurs de phosphore produise des quantités accrues de céphalosporine C Cependant, même si les quantités de céphalosporine C demeurent constantes, la quantité réduite de désacétylcéphalosporine C dans les fermentations traitées facilite grandement la récupération de la céphalosporine C désirée suivant un état de pureté plus élevé, Les composés de phosphore de la présente invention ont été trouvés comme présentant une activité inhibitrice au niveau de l'enzyme Ainsi, l'activité d'estérase de la céphalosporine C fut partiellement purifiée à partir du milieu surnageant de la culture de Cephalosporium acremonium par chromatographie en colonne DEAE Sephadex A 50, et l'activité hydrolytique de cette préparation (mesurée par chromatographie liquide haute pression en suivant la transformation de céphalosporine C en désacétyl- céphalosporine C) fut trouvée comme étant inhibée par les composés de phosphore des formules I, II, III et IV. Après que la fermentation est complète, le produit désiré de céphalosporine C est de préférence transformé par des méthodes connues telles que celles décrites dans le brevet américain NO 3 573 296 en un dérivé qui peut être plus facilement récupéré à partir du milieu de culture par des processus d'extraction par solvant La céphalosporine C ou son dérivé obtenu de la fermentation peut ensuite être transformé par des méthodes connues en 7-ACA, qui est un intermédiaire clé dans la préparation de nombreuses céphalosporines semi-synthétiques. En utilisant les composés de phosphore inhibiteurs, selon la présente invention, la céphalosporine C ou son dérivé et l'intermédiaire ultime 7ACA sont obtenus plus efficacement et suivant un degré de pureté plus élevé lorsqu'on fait la comparaison avec les procédés antérieurs sur des milieux de culture non traités. Les exemples suivants sont destinés à illustrer la présente invention sans en limiter d'une manière quelconque la portée aux modes de réalisation décrits. L'expression 1 'ppm" utilisée dans les exemples se réfère à une base poids/poids. EXEMPLE 1 Des fermentations standard en flacons agités de Ce Dhalosporium Lacremonium (souche mutante efficace pour produire la céphalosporine C et pour produire égale- ment la désacétylcéphalosporine C) furent mises en route selon le programme suivant On a a Imrcée une culture à partir de l'inoculation d'un milieu à base de glucose et de liqueur de blé macéré, d'une culture conservée par congélation Les récipients ou flacons ensemencés furent cultivés pendant trois jours à 28 WC tout en étant agités à 260 t/mn et un volume d'inoculum 10 % fut utilisé pour le démarrage des fermentations permettant la production Le milieu de production était basé sur une composition équilibrée de liqueur de blé macéré, de produit connu sous le nom commercial "PHARMAMEDIA" (farine de coton vendue par la société Traders Oil Mill Company, Forth Worth, Texas), de dextrine, d'huile de soja, de méthionine et de sulfate d'ammonium Les flacons furent agités à 250 C à 260 t/mn pendant une période totale de six jours, ce après quoi des parties du milieu de fermentation furent diluées, filtrées et analysées pour déterminer la quantité de céphalosporine C et de désacétylcéphalosporine C par chromatographie liquide haute pression Des composés inhibiteurs furent ajoutés suivant des quantités détermi- nées ou enregistrées au 4 ème jour ( 96 heures) Les résultats sont résumés ci-dessous. Inhibiteur ajouté diisopropyl- phosphite triisopropyl- phosphite dibenzyl- phosphite diméthyle hydrogène phosphite (de Mobil Chem Co) diméthyle hydrogène phosphite (de Alfa Chem Co) diéthyl- acétyl phosphonate Quantité ajoutée ppm témoin, pas d'addition Céph C Dés Céph C mcg/g 11.000 10.615 mcg/g * Céph C + Dés Céph C EXEMPLE 2 En utilisant les conditions de fermentation standard en flacons agités, et la même culture que décrite dans l'exemple 1, des composés de phosphore organiques et inorganiques furent ajoutés aux fermentations en cours à 0,48 et 96 heures après l'inoculation pour donner des concentrations finales de 100 à 800 ppm Les résultats sont résumés dans le tableau qui suit. us.c Céphaios- porine totae * 4,83 ,01 4,96 ,56 4,92 6,68 3,60 4,67 3,49 4,23 4,52 4,40 7,45 -t 545502 Composé inhibiteur Heure d'addition/ conc finale en ppm acide phosphoreux heure 0/100 heure 48/100 heure 96/100 diphénylphosphite heure 96/100 Témoin (pas d'addition d'inhibiteur) Jour 6 Céph Cf Dés Céph C en mcg/g 11.810/730 10.540/460 9.940/350 10.600/390 10.300/710 9.895/535 10.030/405 9.200/355 8.355/755 7.670/670 7.830/640 10.140/780 10.565/1 145 10.345/935 9.985/690 9.615/780 *D C+D % ,8 4,2 3,4 3,5 6,4 ,1 3,8 3,7 8,3 7,5 7,1 9,7 8,2 6,4 7,5 8 o 055/1145 12,5 Jour 7 *D Céph C/ - Dés Céph C C+D en mcg/g % 10.300/925 8,2 11.585/935 7,4 10.240/500 4,6 10.335/425 3,9 9.370/820 8 9.950/710 6,6 9.305/480 4,9 9.180/470 4,8 10.240/1 430 12,2 9.605/975 9,2 8.645/705 7,5 *8.225/770 8,5 9.705/1220 11,2 10.000/1410 12,3 9.250/945 9,2 8.800/720 7,5 8.784/1 562 15,1 * conc dés céph C conc céph C + dés céph C x 100 EXEMPLE 3 En utilisant des conditions de fermentation standard en flacons agités, ainsi que la même culture que décrite dans l'exemple 1, des composés inhibiteurs de phosphore inorganiques furent ajoutés au milieu avant la stérilisation par autoclave à 121 C pendant 20 minutes. Les résultats sont donnés dans le tableau qui suit. Composé inhibiteur/ Jour 6 conc finale en ppm Céph C/ *D_ D Ss C SphC C + D en mcg/g %' Acide phosphoreux/200 9 740/600 5,8 400 8 050/340 4 800 7 111/285 3,8 Acide hypophosphoreux/150 8 110/1 130 12,2 300 8 600/1 000 10,4 450 9 080/940 9,4 Témoin (pas d'addition 7 840/1 060 11,9 d'inhibiteur) conc dés céph C conc céph C + dés céph C x 100 EXEMPLE 4 On a réalisé la fermentation de Cephalosporium acrémonium dans des appareils ou réservoirs agités de fermentation de 30 litres selon le processus standard pour obtenir une culture et une fermentation. Les récipients furent inoculés à 10 % du volume du milieu avec une culture répartie sur un milieu de liqueur de blé macéré -PHARMAMEDIA-glucose Le milieu de fermenta- tion se composait de liqueur de blé macéré, de farine de soja et d'huile de soja comme source d'azote et de carbone organique Du sirop de glucose et de l'huile de soja furent introduits pendant la fermentation On a ajouté à l'appareil de fermentation du tributylphosphite à 96 heures jusqu'à une concentration finale du milieu de 300 ppm. L'effet de l'addition est donné ci-dessous en termes de changements dans les quantités de céphalosporine C et de désacétylcéphalosporine C. Tributylphosphite-300 ppm à 96 heures *D C + D Temps (heures) * Temps (heures) 109 - 4,2 3,7 4,3 4,6 ,8 6,9 7,9 9,1 conc dés céph C conc céph C + dés céph C X 100 Essai-témoin aucun inhibiteur nécessaire *D C +D /50 4,8 4,5 ,1 6,9 8, 9 12,6 13,2 L'addition de tributylphosphite a abaissé la quantité de désacétylcéphalosporine C produite jusqu'à 9,1 % de la quantité totale de céphalosporine comparativement à % dans l'essai-témoin. EXEMPLE 5 On a réalisé la fermentation de Cephalosporium acremonium dans un appareil ou réservoir de fermentation agité de 3 000 litres, en utilisant des milieux classiques de céphalosporine C ainsi que des processus classiques. Du diméthyle hydrogène phosphite fut ajouté à 100 heures jusqu'à une concentration finale du milieu de 600 ppm. Les résultats de l'addition d'inhibiteur sont résumés dans les tableaux qui suivent. 0 Diméthyle hydrogène phosphite à 100 heures Temps (heures) 102 163 Temps (heures) 107 168 * Conc dés céph C conc céph C + dés céph C x Témoin aucun inhibiteur * conc dés céph C conc céph C + dés céph C *D C + D C+D ,8 7,4 8,8 7,7 6, 9 7,9 7,4 8,3 nécessaire *D C + D C+D (%) ,8 8,2 ,7 11,9 13,8 16,9 18,9 , 9 22,5 x 100 EXEMPLE 6 Les composés de phosphore supplémentaires suivants furent également testés dans des fermentations en flacons agités, et présentaient une activité inhibitrice par rapport à la production de désacétylcéphalosporine C: triéthylphosphonoacétate acide 2- chloroéthylphosphonique tétraéthylpyrophosphite diéthylcyanométhylphosphonate 2,2,2-trichloroéthylphosphorodichloridite diméthylphosphate triméthylphosphite triéthylphosphite dibutylphosphite tris( 2-chloroéthyl)phosphite triméthylphosphonoacétate diéthyléthylphosphonate tributylphosphite triphénylphosphite diéthylcarbométhoxyméthylphosphonate diméthylacétylméthylphosphonate diméthylcyanométhylphosphonate diéthylallylphosphonate EXEMPLE 7 Les composés de phosphore supplémentaires suivants ont également été testés dans des appareils de fermentation et ils présentaient une activité inhibitrice par rapport à la production de désacétylcéphalosporine C: triéthylphosphonoacétate acide 2- chloroéthylphosphonique tétraéthylpyrophosphite diéthylcyanométhylphosphonate diméthylméthylphosphonate 2,2,2- trichloroéthylphosphorodichloridite diméthylphosphate triéthylphosphite diphénylphosphite triphénylphosphite diisopropylphosphite triisopropylphosphite La présente invention n'est nullement limitée aux exemples ci-dessus décrits. REVENDICATI O NS ___________________________ 1. Procédé de production ou de fabrication de la céphalosporine C par culture d'un micro-organisme produisant la céphalosporine C et qui produit également la désacétylcéphalosporine C, dans un milieu de nutrition, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter audit milieu un composé de phosphore de formule R 10 R 4 O P-OR 3 I R 2 ô( R 50/ R 6 I II R 50 O R 10 OR 1 p ou P P R 8 R R 2 o/ o R 2 III IV dans laquelle R 1, R 2 et R 3 représentent chacun indépendam- ment un groupe alcoyle C 1 à C 10 à chaine droite ou rami- fiée, un groupe phényle ou un groupe phénylalcoyle(C 1 à C 4), ledit groupe alcoyle ou la partie alcoyle du groupe phénylalcoyle étant facultativement substitué par un ou plusieurs substituants halo ou carboxy, et ledit groupe phényle ou la partie phényle du groupe phénylalcoyle étant facultativement substitué par un ou plusieurs substituants alcoyle C 1 à C 6, alcoxy C 1 à C 6 ou halo; R est un-groupe alcoyle C 1 à C 6 facultativement substitué par un ou plusieurs groupes halo ou est -OR 10 dans lequel R est l'hydrogène ou est comme défini cidessus pour R; R 5 est l'hydrogène ou est comme défini ci-dessus pour R 1; R est l'hydrogène, hydroxy, un groupe alcényle C 2 à C 6 R est l'hydrogène, hydroxy, un groupe alcényle C 2 à C 6, un groupe alcanoyle C 2 à C 6 ou un groupe alcoyle C 1 à C 6, ledit groupe alcoyle étant facultativement substitué par un ou plusieurs radicaux cyano, alcanoyle C 2 à C 6 ou carboalcoxy (C 1 à C 6); et R 8 et R 9 sont soit tous les deux l'hydrogènej soit tous les deux chloro, suivant une concentration comprise entre environ 100 et 3.000 parties par million. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est une souche produisant la céphalosporine C du genre Cephalosporium. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est une souche produisant la céphalosporine C de Cephalosporium acremonium. 4 Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé de phosphore présente la formule R O O P-OR 3 R 20/ dans laquelle R, R 2 et R 3 sont chacun indépendamment un groupe alcoyle C 1-C 10, un groupe alcoyle C 1 à C 10 halo-substitué, un groupe phényle ou un groupe benzyle. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que R 1, R 2 et R 3 sont chacun indépendam- ment un groupe méthyle, éthyle, isopropyle, n-butyle, phényle, benzyle, isodécyle ou 2-chloroéthyle. 6. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé de phosphore présente la formule R 4 O O p R 50 \R 6 2545502 dans laquelle R 4 est un groupe alcoyle C 1 à C 6, un groupe alcoyle C 1 à C 6 halo-substitué ou est -OR 10, R 10 étant l'hydrogène, un groupe alcoyle C 1 i C 10, un groupe alcoyle C 1 à C 10 halo-substitué, un groupe phényle ou un groupe benzyle; R 5 est l'hydrogène, un groupe alcoyle C 1 à C 10, un groupe alcoyle C 1 à C 10 halo-substitué, un groupe phényle ou un groupe benzyle; et R 6 est l'hydrogène, hydroxy, un groupe alcényle C 2 C 6, un groupe alcoyle C 1 à C 6 un groupe alcanoyle C 2 à C 6 ou un groupe alcoyle C 1 à C substitué par un groupe alcanoyle C 2 à C 6, carboalcoxy(C 1 à C 6) ou cyano. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que R 4 est un groupe 2-chloroéthyle ou -OR 10, R 10 étant l'hydrogène, un groupe benzyle, n-butyle, éthyle, isopropyle, méthyle, phényle ou 2,2,2-trichloro- éthyle; R 5 est l'hydrogène, un groupe éthyle, méthyle, 2-chloroéthyle, nbutyle, phényle, isopropyle ou benzyle; et R 6 est l'hydrogène, hydroxy, un groupe allyle, cyanométhyle, carboéthoxyméthyle, méthyle, carbométhoxy- méthyle, éthyle, acétyle ou acétylméthyle. 8. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé de phosphore présente la formule R 50 O P R 8 R 9 dans laquelle R est l'hydrogène, un groupe alcoyle C 1 à C 10, un groupe alcoyle halo-substitué C 1 à C 10, un groupe phényle ou benzyle; et R 8 et R 9 sont tous les deux soit hydrogène, soit chloro. 9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que R 5 est l'hydrogène, méthyle, éthyle ou 2,2,2-trichloroéthyle. 10. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé de phosphore est du tétraméthylpyrophosphite ou du tétraéthylpyrophosphite. 11. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé de phosphore est choisi parmi le groupe consistant de l'acide phosphorique, l'acide hypophosphorique, le diisopropylphosphite, le triisopropylphosphite, le dibenzylphosphite, le diméthyl- phosphite, le tributylphosphite, le triéthylphosphono- acétate, l'acide 2-chloroéthylphosphonique, le tétraéthyl- pyrophosphite, le diéthylcyanométhylphosphonate, le diméthylméthylphosphonate, le 2,2,2-trichloroéthyl- phosphorodichloridite, le diméthylphosphate, le diphénylphosphite, le triphénylphosphite, le triméthyl- phosphite, le dibutylphosphite, le tris( 2-chloroéthyl)- phosphite, le triméthylphosphonoacétate, le diéthyléthyl- phosphonate, le diéthy Icarbométhoxymé-thylphosphonate, le diéthylacétylphosphonate, le diméthylacétylméthyl- phosphonate, le diméthylcyanométhylphosphonate et le diéthylallylphosphonate. 12. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé de phosphore est choisi dans le groupe comprenant l'acide phosphoreux, l'acide hypophosphoreux, le diisopropylphosphite, le triisopropyl- phosphite, le dibenzylphosphite, le diméthylphosphite et le tributylphosphite. 13. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé de phosphore est l'acide phosphoreux. 14 Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'un composé de phosphore organique est ajouté à la fermentation en cours entre environ et 140 heures après l'inoculation. 15. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'un composé de phosphore inorganique est ajouté au milieu de culture avant la stérilisation ou entre O et 140 heures après l'inoculation. 16. Céphalosporine C obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.