Brevet FR2543969A1 — publié le 19841012

Anticorps dirigé contre les champignons du genre Candida, hybridome et procédé pour la préparation de cet anticorps, procédé d'identification et/ou de classification des cham- pianons du aenre Candida utilisant cet anticorps ou un de ses dérivés ou oroduits de restriction et médicament contre les candidoses contenant cet anticorps ou ses dérivés. La présente invention concerne un anticorps di- rigé contre les champignons du genre Candida, un hybridome et un procédé pour la préparation de cet anticorps, un pro- cédé d'identification et/ou de classification des champi- gnons du genre Candida utilisant cet anticorps ou un de ses dérivés ou produits de restriction et un médicament contre les candidoses contenant cet anticorps ou ses dérivés. De façon générale, l'invention concerne le do- maine des techniques de fusion cellulaire, en particulier un anticorps produit par fusionnement d'une cellule capable de produire un anticorps et d'une cellule capable de proli- férer de façon permanente in vitro par repiquage, la cel- lule de fusionnement étant appelée ci-après "hybridome". Plus particulièrement, l'invention concerne un anticorps contre l'antigène de surface d'un champignon appartenant au genre Candida, cet anticorps ayant une activité très spé-ifique (monoclonale) L'invention concerne également un hybridome produisant un tel anticorps et la préparation et l'emploi d'un tel anticorps. Depuis peu, les maladies infectieuses provoquées par les bactéries ont régressé en raison du développement de la médecine préventive et de la diffusion des"-ntibio- tiques, tandis qu'au contraire, les maladies provoquées par les champignons, c'est-à-dire les mycoses, tendent à s'accroître dans le monde Beaucoup des champignons provo- quant des mycoses sont généralement présents dans l'envi- ronnement normal, par exemple dans la bouche, les voies digestives, le pharynx, la peau ou le vagin des sujets sains Parmi les mycoses, des endocardites, des pneumonies, des uropathies, des méningites, des ostéopathies, des arthrites, des'dermatoses et similaires ont été mention- nées On sait également-que les mycoses existent simulta- nément avec des maladies -chroniques consomptives telles que la phtisie et le cancer et en aggravent considérable- ment les symptômes. Actuellement, on connaît peu de médicaments ef- ficaces pour guérir les mycoses et, de plus, les médica- ments dont on dispose actuellement provoquent des effets secondaires graves Par ailleurs, des antibiotiques anti- fongiques tels que l'amphotéricine B et la 5-fluorocyto- sine ont été utilisés à ce jour pour le traitement des mycoses Leur effet sur les champignons est cependant insuffisant et leur emploi s'accompagne d'effets secon- daires. Un traitement de ces maladies par un anticorps a également été tenté, par exemple par administration d'une préparation de gammaglobulines humaines contre l'infection d'un malade Cependant, on considère que cette préparation a une faible teneur en anticorps spécifique vis-à-vis du champignon provoquant l'infection, car le procédé de sa préparation n'a pas comporté par exemple une immunisation, si bien que les activités sont limitées dans une certaine mesure Comme traitement avec un anti- corps ayant un titre accru dû à une immunisation, on con- nait la sérothérapie pour lutter par exemple contre un empoisonnement aigu dû par exemple à une morsure de ser- pent Bien que ce traitement ait un effet remarquable, il peut provoquer une réaction immunitaire à un antigène étranger et une réaction allergique peut se produire car le sérum est un sérum étranger, par exemple de cheval, qui contient de nombreux contaminants en plus de l'anti- corps spécifique Cette sérothérapie n'a pas été appliquée au traitement des mycoses. ? 543969 La détection rapide et l'identification précise de ces champignons sont donc importantes pour le diagnostic clinique et on recherche un procédé efficace de traitement des mycoses D'autre part, il est nécessaire d'identifier et de séparer une levure fermentaire des champignons nui- sibles dans les opérations de fermentation et de brassage. Les Candida auxquels s'applique l'invention constituent un exemple typique de tels champignons. A ce jour, la classification et l'identification des champignons du genre Candida reposent sur leurs pro- priétés morphologiques et biochimiques Ces méthodes néces- sitent des analyses expérimentales longues et malaisées et, par conséquent, ne conviennent pas à l'utilisation pratique. On connait également une méthode d'identification sérologi- que qui utilise des facteurs sériques obtenus par immunisa- tion d'un animal tel que le lapin puis absorption avec des cellules d'une espèce différente de celle utilisée pour l'immunisation Le facteur sérique est un mélange de divers anticorps ayant des spécificités différentes et,par consé- quent, la spécificité ou le titre varie inévitablement dans une certaine mesure d'un lot à l'autre De plus, une réac- tion secondaire imprévue due à des contaminants peut par- fois se produire D'autre part, le titre du facteur sérique obtenu est généralement relativement faible car les champi- gnons appartenant au meme genre ont des propriétés antigé- niques qui se ressemblent De plus, une telle immunisation nécessite des opérations malaisées Donc, ces méthodes de classification et/ou d'identification des Candida sont li- mitées dans une certaine mesure du point de vue -d la fia- bilité et de la complexité. La demanderesse a consacré de grands efforts pour trouver un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal contre un champignon du genre Candida et a réalisé l'inven- tion selon laquelle un tel anticorpsltèrès spécifique à titre élevé et à faible teneur en impuretés peut être obtenu à partir d'un hybridome formé entre une cellule ca- pable de produire un anticorps contre un champignon du genre Candida Cqu'on appelle parfois ci-après "cellule productrice d'anticorps anti-candida" ou simplement "cel- lule productrice d'anticorps") et une cellule capable de repiquage permanent in vitro (qu'on appelle parfois ci- après "cellule repiquée") La demanderesse a également découvert qu'un tel anticorps est utile pour la classifi- cation et/ou l'identification d'un champignon du genre Candida L'anticorps peut être également utile pour four- nir un procédé efficace de traitement d'une infection pro- voquée par de tels champignons. On sait déjà que l'on peut obtenir un hybridome pouvant produire un anticorps spécifique par fusion cellu- laire entre une cellule capable de produire un anticorps et une cellule de myélome Voir par exemple Kbhler et coll, Nature, 256, 495-497 ( 1975) et Eur J Immunol, 6, 511-519 ( 1976) Cependant, on ne connaissait pas avant l'invention un hybridome capable de produire un anticorps contre un champignon tel que Candida. L'invention a donc pour buts de fournir un procédé pour la préparation d'un anticorps spécifique vis-à-vis de l'antigène de surface d'un champignon appartenant au genre Candida; de fournir un anticorps anti-candida très, spéci- fique et un procédé de sa préparation selon une technique de fusion cellulaire; de fournir un hybridome capable de produire un tel anticorps; de fournir un procédé de classification et/ou d'identification des champignons du genre Candida avec un tel anticorps; et de fournir un médicament contre les candidoses contenant un tel anticorps comme composant actif. L'invention a également pour but de fournir un, dérivé de l'anticorps utile pour la classification et l'i- dentification des champignons du genre Candida et/ou le traitement des malzadies provoquées par ces champignons. D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention ressortiront de la description qui suit de modes de réalisation spécifiques non limitatifs - Le procédé de préparation d'un anticorps anti- candida de la présente invention comprend la préparation d'un hybridome à partir d'une cellule productrice d'anti- corps anti-candida et d'une cellule repiquée, en particu- lier une cellule de myélome, et la récupération de l'anti- corps sécrété par l'hybridome. Le procédé de l'invention va être décrit de fa- çon plus détaillée ci-après. A Préparation de la cellule Productrice d'anticorps. Dans l'invention, une cellule capable de produire un anticorps contre un champignon appartenant au genre Candida et une cellule que l'on peut entretenir de façon permanente par repiquage in vitro sont indispensables à l'obtention d'un hybridome capable de produire l'anticorps anti-candida et proliférant de façon permanente par repi- quage in vitro. La cellule productrice d'anticorps anti-candida peut être obtenue à partir d'une espèce animale quelconque, y compris l'espèce humaine Une immunisation de l'animal n'est pas indispensable, bien que cette immunisation pré- liminaire puisse améliorer remarquablement l'efficacité du recouvrement de l'hybridome désiré. Lorsque cette cellule est d'origine humaine, on peut choisir un sujet quelconque ayant des antécédents de candidose ou des titres élevés d'anticorps sériques diri- gés contre le champignon du genre Candida Sinon, cette cellule peut être obtenue à partir d'un organisme vivant immunisé avec un immunogène L'immunogènepeut être une cellule viable, une cellule traitée par le glutaraldéhyde, la mitomycine ou la chaleur et ne pouvant donc pas prolifé- rer, ou l'antigène de surface séparé d'une cellule par un traitement approprié, par exemple avec une enzyme, et pu- rifié. On peut dans l'invention-utiliser une espèce quelconque du genre Candida et une morphologie quelconque est acceptable, par exemple des hyphes, des levures, des spores à membrane épaisse (chlamydospores), etc On peut citer comme exemples de telles espèces: Candida albicans Sérotype A, Candida albicans Sérotype B, Candida tropicalis, Candida auilliermondii, Candida kursei, Candida parapsilosis ou Candida pseudotropicalis. L'immunogène utilisé pour l'immunisation peut être mélangé avec un adjuvant tel que l'adjuvant complet ou incomplet de Freund L'immunogène peut être administré de façon classique quelconque, par exemple par injection sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intrader- mique et intramusculaire On peut préférer une injection sous-cutanée ou intrapéritonéale Une seule immunisation peut être suffisante, bien que l'immunisation puisse être répétée plusieurs fois avec un intervalle approprié, par exemple de 1 à 5 semaines Par mesure du titre en anti- corps du sérum de l'animal immunisé, on peut utiliser un animal dont le titre est suffisamment élevé pour obtenir la cellule productrice d'anticorps, ce qui améliore l'ef- ficacité des opérations ultérieures De préférence, la cellule est prélevée à l'animal 3 à 5 jours après l'immu- nisation finale La cellule productrice d'anticorps est un plasmocyte ou un lymphocyte qui en est le précurs 4 ur et peut provenir d'un point quelconque de l'organisme, géné- ralement la rate, les ganglions lymphatiques, le sang pé- riphérique ou l'une quelconque de leurs combinaisons. B Fusion cellulaire. Une cellule pouvant être entretenue de façon permanente par repiquage in vitro peut être une cellule appropriée pouvant être fusionnée avec la cellule produc- trice d'anticorps pour former un hybridome capable de pro- duire un anticorps désiré De préférence, une telle cel- lule est une cellule leucémique telle qu'une cellule de myélome Une telle cellule peut provenir d'une espèce quel- conque telle que l'homme, le rat, la souris, etc On pré- fère une cellule déficiente en hypoxanthine-guanine phos- phoribosyltransférase (HGPRT) ou en thymidine kinase (TK) car ces cellules parentes ne peuvent pas se développer dans un milieu sélectif. Des exemples de lignées cellulaires préférables sont GM-1500 6 TG-A 1-2 ou RPM 18226 d'origine humaine ou P 3-X 63-Ag 8, P 3-NSI/1-Ag 4-1, Sp 2/O- Ag 14, X 63-Ag 8 653, etc, provenant de souris. On préfère utiliser une cellule productrice d'anticorps et une cellule repiquée dérivant toutes deux de la même espèce, bien que cela ne soit pas essentiel, pour des raisons d'efficacité de la fusion, de stabilité des propriétés des cellules de fusionnement et de la fa- ci-lité de leur culture in vivo En particulier, lorsqu'on utilise les lignées cellulaires P 3-X 63-Ag 8, P 3-NSI/1-Ag 4-1, Sp 2/O-Ag 14 ou X 63 Ag 8 653 comme cellules repiquées, on peut de préférence utiliser une souris BALB/c consanguine ou un hybride correspondant. Pour le fusionnement, on peut utiliser un accé- lérateur tel que le virus Sendai (HVJ) et le polyéthylène- glycol et on peut de préférence utiliser en particulier le polyéthylèneglycol 1000, 1540, 2000, 4000 ou 6000 La fu- sion cellulaire peut être effectuée dans une solucion con- tenant environ 30 à 55 % d'un tel polyéthylèneglycol De plus, du diméthylsulfoxyde peut être présent dans la solu- tion. C Sélection de l'hybridome. Dans la solution après la fusion, il existe en plus des cellules de fusionnement les cellules parentes productrices d'anticorps et les cellules parentes repi- quées restantes Les premières ne peuvent pas survivre au cours de la culture in vitro qui suit, tandis que les sui- vantes peuvent se propager avec l'hybridome désiré Il est donc préférable ou même nécessaire d'éliminer les cellules repiquées de là solution contenant le mélange des cellules. Pour cela, on utilise de préférence une cellule déficiente en HGPRT ou en TK comme cellule repiquée parente et les cellules mélangées contenant les cellules parentes sont cultivées dans un milieu de sélection contenant de l'hypo- xanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine après la fusion cellulaire, ce qui permet le développement sélectif uniquement de l'hybridome désiré Sinon, la cellule repi- quée parente, lorsqu'elle n'est pas une telle cellule dé- ficiente en HGPRT ou en TK, peut être traitée avec l'émé- tine et l'actinomycine D avant la fusion cellulaire Ce traitement empêche la prolifération de la cellule parente et, par conséquent, on peut facilement sélectionner l'hy- bridome désiré dans les cellules mélangées. 2 b Les hybridomes ainsi obtenus sont généralement constitués de deux ou plusieurs clones qui peuvent ne pas avoir totalement les mêmes propriétés Pour les séparer en les clones individuels, un clonage peut être souhaitable ou même nécessaire lorsqu'on désire un anticorps monoclonal. Le clonage est également efficace pour éviter la variation de la population qui peut souvent se produire dans la cul- ture à long terme d'un système dans lequel de nombreux clones sont mélangés Le clonage peut être effectué par culture avec dilution limitante, culture sur gélose molle ou culture sur gélose de fibrine Un appareil de tri des cellules rendues fluorescentes peut également être utilisé pour séparer les cellules lors du clonage Le clonage peut également être utilisé pour séparer les cellules variantes éventuelles apparaissant au cours d'une culture prolongée et pour conserver les cellules ayant les mêmes propriétés que l'hybridome d'origine. L'hybridome ainsi obtenu peut être entretenu par repiquage in vitro ou in vivo ou sous forme lyophilisée selon un procédé classique quelconque. D Production et récupération de l'anticorps. Pour la production de l'anticorps, l'hybridome produisant un anticorps ànti-candida est cultivé in vitro ou in vivo. Dans la culture in vitro, on peut choisir un bouillon nutritif approprié à l'hybridome de l'invention, par exemple le milieu RPMI 1640 contenant du sérum de veau -5 foetal à 10 % (v/v), du $-mercaptoéthanol 5 x 10 du pyru- vate de sodium 1 m M et des antibiotiques, ou le milieu mini- mum essentiel d'Eagle modifié par Dulbecco (appelé ci-après 1 MEM de Dulbecco) contenant 4,5 g/l de glucose au lieu du milieu RPMI 1640 Une concentration cellulaire initiale appropriée à la prolifération peut être généralement d'en- viron 105/ml, bien qu'elle puisse varier selon chaque hy- bridome, et la concentration cellulaire pendant la culture peut de préférence atteindre 2 x 106/ml. Dans la culture in vivo, l'hybridome est trans- planté dans un organisme vivant et cultivé sous une forme solide ou dans le liquide d'ascite Une humeur de l'orga- nisme, de préférence du sérum ou du liquide d'ascite est prélevé à l'organisme vivant pour récupérer l'anticorps sécrété par l'hybridome La solution brute de l'anticorps obtenue peut contenir comme impuretés (contaminants) di- verses substances provenant de l'organisme vivant servant d'hôte, néanmoins, elle est supérieure à la soluit J on d'an- ticorps obtenue in vivo par sa concentration accrue en anticorps désiré Lorsque l'hybridome est transplanté par voieintrapéritonéale, du pristane ( 2,6,10,14-tétraméthyl- pentadécane) peut être administré par voie intrapéritonéale avant la transplantation, de préférence 3 à 9 semaines avant la transplantation Ce traitement peut accroître le rendement de la solution brute d'anticorps, mais n'est pas indispensable Comme hôte, on préfère un animal de la même espèce et consanguin à l'animal dont dérivent la ou les cellules parentes et, dans ce cas, l'hybridome peut être développé chez l'animal, même si ce dernier n'a pas suivi un traitement spécial Lorsque les sérotypes d'histocompa- tibilité des antigènes de l'hybridome et de l'hôte ne coïncident pas, il est nécessaire de traiter préalablement l'hôte, par exemple par administration d'un anticorps anti- lymphocytaire ou par irradiation par les rayons X Les cel- lules commencent à se développer 1 à 3 semaines après la transplantation. Les anticorps obtenus comprennent des anticorps réagissant avec Candida albicans, des anticorps réagissant avec d'autres espèces du genre Candida telles que Candida tropicalis, Candida auilliermondii, Candida krusei, Candida parapsilosis et Candida pseudotropicalis ainsi que Candida Albicans, et des anticorps réagissant également avec les autres champignons. Par exemple, les anticorps obtenus par absorption par Candida tropicalis d'un antisérum de lapin immunisé par Candida albicans réagissent avec les autres espèces du genre Candida (Candida parapsilosis) ainsi qu'avec Candida albicans De plus, l'anticorps obtenu par absorption de l'antisérum par Candida tronicalis, Candida auilliermondii, Candida krusei, Candida parapsilosis ou Candida Dseudotro- Dicalis a un titre très faible et ne réagit guère avec Candida albicans. Les anticorps de l'invention peuvent et-re utili- sés tels quels sous forme de la solution brute d'anticorps ou peuvent être purifiés pour l'emploi selon tout procédé classique utilisé pour les immunoglobulines, par exemple le fractionnement par le sulfate d'ammonium ou la chroma- togra Dhie avec échange d'ions, ou par chromatographie d'affinité avec la protéine A ou un antigèneo Ces anticorps il purifiés peuvent être utilisés indépendamment ou en mélan- ges. Selon-le procédé de préparation de l'anticorps anti-candida de l'invention, le défaut des procédés clas- siques est essentiellement éliminé L'hybridome de l'inven- tion peut être repiqué et maintenu en prolifération quasi- permanente in vitro et in vivo De plus, l'hybridome peut produire un anticorps dirigé contre un déterminant antigé- nique spécifique L'anticorps produit pouvant donc avoir une spécificité monoclonale, est un anticorps dirigé contre un champignon du genre Candida et est constitué essentiel- lement d'une espèce moléculaire unique Le procédé de l'in- vention permet la production à la demande de la quantité nécessaire d'anticorps, évite les variations d'un lot à l'autre et permet de plus de préparer une solution ayant un titre élevé en anticorps De plus, le procédé ne néces- site pas une absorption malaisée qui, classiquement, était inévitable De plus, un antigène non purifié tel qu'un champignon du genre Candida peut être utilisé sans diffi- cultés dans le procédé et même dans ce cas, on obtient un anticorps très spécifique Une telle réactivité importante de l'anticorps avec un antigène permet une identification rapide d'un champignon du genre Candida de façon très fia- ble sans les opérations classiques malaisées Par ailleurs, la pureté de l'anticorps est si élevée que des réactions allergiques dues aux contaminants contenus inévitablement dans les préparations classiques sont rares, ce qui permet son emploi comme médicament contre les candidoses. Le procédé de classification et/ou d' tçUentifica- tion de l'invention peut s'appliquer à une matière d'ori- gine quelconque Par exemple, on sépare dés cellules fon- giques de produits cliniques tels que les crachats, l'uri- ne, les sécrétions vaginales ou les tissus de malades pré- sentant des signes cliniques évocateurs d'une candidose, puis on les cultive ou on peut utiliser de la levure de brasserie pour différencierles champignons nuisibles de la levure dans des opérations de fabrication de la bière telles que le brassage. Dans l'identification, on met un réactif conte- nant l'anticorps de l'invention en contact avec une matière contenant des cellules de Candida On peut, de façon prati- que, utiliser simplement une réaction antigène-anticorps (réaction d'agglutination, etc) ou utiliser un examen mi- * croscopique d'immunofluorescence, l'immuno-électro-microsco- pie, une détermination par fixation radio-active, une déter- mination immunoenzymatique, un test de fixation du complé- ment, etc Dans la microscopie par immunofluorescence di- recte, on peut utiliser de façon pratique l'anticorps de l'invention après l'avoir marqué avec un colorant fluores- cent tel que la fluorescéine et la rhodamine L'anticorps de l'invention peut également, de façon pratique, être mar- qué avec un marqueur tel que la ferritine pour l'immuno- électro-microscopie ou marqué avec un radio-isotope tel que I et 135 I pour la détermination par fixation radio-ac- tive ou marqué avec une enzyme telle que la peroxydase, une phosphatase alcaline et la 0-galactosidase pour une détermination immuno-enzymatique Bien entendu, on peut utiliser une méthode indirecte avec un anticorps secondaire ou, sinon, un de ses produits de fixation, par exemple uti- liser un anticorps anti-candida marqué par la biotine avec de l'avidine comme anticorps secondaire Egalement, on peut utiliser, au lieu de l'anticorps lui-même, une partie de l'anticorps obtenue par clivage restrictif par traitement chimique et/ou enzymatique, telle qu'un fragment:'(ab')2. Ces divers dérivés et produits de restriction sont utiles pour le procédé de classification et/ou d'identification de l'invention et entrent donc dans le cadre de l'invention. L'anticorps, ses dérivés et ses produits de restriction peuvent, s'il est nécessaire, être utilisés en mélanges. De plus, le réactif de classification et/ou d'identifica- Ze-43969 tion de l'invention peut contenir également un support ou un diluant classiques. L'invention concerne également un agent curatif (médicament) contre la candidose des voies urinaires, des poumons, des reins, etc, infectés par un champignon du genre Candida tel que Candida albicans, Candida t^opilis Candida auilliermondii, Candida parapsilosis, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, etc. L'effet thérapeutique de l'agent pharmaceutique de l'invention peut être évalué et établi par la protec- tion contre l'infection mortelle que provoque un champi- gnon du genre Candida, comme indiqué ci-après dans un exemple On peut considérer que le mécanisme de protection est une accélération de la réaction de fixation du complé- ment et une attaque des champignons du genre Candida par les macrophages et/ou d'autres immunocytes lorsque l'anti- corps administré se fixe à l'antigène de surface du cham- pignon Ces réactions peuvent également être confirmées in vitro. Les anticorps de l'invention peuvent être admi- nistrés tels quels, indépendamment ou en mélanges Lorsque l'anticorps est combiné chimiquement à un agent germicide ou antifongique, tel que l'amphotéricine B, la 5-fluoro- cytosine, la nystatine et la griséofulvine, des avantages complémentaires peuvent être obtenus Une partie de l'an- ticorps obtenue par clivage respectif par traitement chi- mique ou enzymatique, par exemple un fragment F(ab')2, peut également être utilisée comme médicament de l'inven- tion au lieu de l'anticorps lui-même Dans ce cas, on peut éviter que le tissu de l'hôte soit lésé par une réaction non spécifique de fixation du complément, etc Ces dérivés (produits de la combinaison avec un agent antifongique ou un germicide) et les produits de restriction peuvent être utilisés soit indépendamment, soit en mélanges comme médi- caments de l'invention. Pour évaluer la toxicité aiguë des anticorps, de leurs dérivés ou des produits de restriction, on a adminis- tré le médicament de l'invention à 3 groupes (de 10 animaux chacun) de souris ICR; d'abord par voie perorale à raison de 2 g/kg, ensuite par voie intrapéritonéale à raison de 400 mg/kg et enfin par voie intraveineuse à raison de mg/kg et aucune mort n'a été observée pendant 14 jours. Le médicament de l'invention peut donc être considéré comme un remède sans danger contre les maladies infectieuses pro- voquées par les champignons du genre Candida. L'agent pharmaceutique de l'invention utile au traitement des candidoses de l'homme et des animaux peut être administré par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, de préférence par injection souscutanée ou intramusculaire Le médicament peut être administré par voie perorale car une partie de l'agent administré peut être absorbée par les voies intestinales en conservant sa structure d'anticorps, comme l'a confirmé la demanderesse. Une préparation injectable peut être obtenue, par exemple par dissolution ou mise en suspension de 10 mg de l'anti- corps ou de son dérivé dans de l'eau distillée jusqu'à ob- tention d'un volume de 10 ml, stérilisation de façon clas- sique, répartition en ampoules de 2 ml chacune et lyophili- sation Le produit obtenu est dissous dans du soluté salé avant l'emploi Une préparation injectable peut contenir,- en plus de l'anticorps, un support, un diluant, un tampon, un stabilisant, un agent d'isotinicité, etc, ces agents étant bien connus du spécialiste Une préparation injecta- ble peut être obtenue sous une forme quelconqueconvenant à l'injection sous-cutanée, intramusculaire ou intravei- neuse Un agent pouvant être administré par voie orale peut être préparé de façon classique quelconque sous une forme à délitage intestinal La posologie du médicament de l'invention dépend principalement des symptômes et elle est généralement de 0,001 mg à 10 mg par jour et par kg de poids corporel pour un animal tel que la souris, et de 0,01 à 3 000 mg par jour et par kg de poids corporel chez l'homme. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1. ( 1) Préparation d'immunogène. On ensemence un tube de milieu de Sabouraud in- cliné-avec Candida albicans ATCC 752 et on incube à 370 C pendant 3 jours Après addition de tampon salé phosphaté (PBS, p H 7,2) au milieu, on met les cellules en suspension par pipetage et on centrifuge à 1 000 x g et à 40 C pendant minutes pour obtenir un culot cellulaire On répète trois fois cette opération de lavage puis on ajoute du glutaraldéhyde à 1,0 % au culot cellulaire et on fixe les cellules à 00 C pendant 30 minutes On lave ensuite trois fois les cellules avec du PBS On ajuste la concentration des cellules avec du PBS à 2 x 107/ml pour obtenir une suspension d'immunogène qu'on utilise dans les expériences suivantes. -( 2) Préparation de cellules productrices d'anticorps. On administre par voie intrapéritonéale la sus- pension d'immunogène à raison de 0,2 ml à des souris fe- melles BALB/c de 8 semaines (NIHON CHARLES RIVER, JAPON) pour les immuniser On répète l'immunisation tous les dix jours et on effectue une injection intraveineuse de rappel de 0,2 ml de la suspension d'immunogène le centième jour après le début de l'immunisation Trois jours après le rappel, on saigne les souris à blanc et on prélève asep- tiquement la rate dans une enceinte propre (HITACHI LTD, JAPON) On place la rate dans une boite de Pétri contenant du milieu RPMI 1640, on fragmente en petits morceaux avec des pinces, on pipette doucement et on filtre avec un gril- lage inoxydable pour obtenir une suspension de cellules spléniques Après centrifugation ( 500 x g, 10 min), on ajoute du tampon Tris-HC 1 1,7 m M (p H 7,65) contenant du chlorure d'ammonium à 0,747 % pour mettre le culot cellu- laire en suspension et pour faire éclater et éliminer les érythrocytes On centrifuge à nouveau la suspension de cellules spléniques à 500 x g pendant 3 minutes Après avoir lavé trois fois le culot obtenu avec du milieu RPMI 1640, on ajuste la concentration cellulaire à 108/ml par addition de milieu RPMI 1640. ( 3) Fusion cellulaire pour la préparation d'hybridome. On mélange la suspension de cellules spléniques préparée en ( 2) ( 1 x 108 cellules) avec 1 x 107 cellules de myélome de souris de la lignée Sp 2/0-Ag 14 préalablement cultivées in vitro Après centrifugation du mélange de cellules à 500 x g pendant 5 minutes, on rejette le sur- nageant pour obtenir un culot cellulaire Après désagré- gation du culot cellulaire par tapotement du fond du réci- pient, on ajoute 1 ml de milieu RPMI 1640 contenant du polyéthylèneglycol 4000 à 50 % (v/v) ( 37 C) et on Iaisse reposer pendant 1 minute On place le récipient dans une étuve thermostatée ( 37 C) et on fait tourner doucement pendant 1 minute pour mélanger la solution de polyéthylène- glycol avec le culot cellulaire On ajoute au mélange une quantité totale de 10 ml de milieu RPMI 1640 maintenu à 37 C à un débit de 1 ml/30 secondes et on centrifuge à 500 x g pendant 5 minutes Après avoir rejeté le surnageant, on remet le culot cellulaire en suspension dans le milieu RPMI 1640 et on centrifuge à 500 x g pendant 5 minutes pour obtenir un culot cellulaire On répète cette opératign de lavage On met soigneusement le culot cellulaireo-btenu en suspension dans 20 ml de milieu HAT (milieu RPMI 1640 con- tenant du sérum de veau foetal à 20 %, de la glutamine 2 m M, de l'acide pyruvique 1 m M, 4,5 g/l de glucose, du e-mer- captoéthanol 5 x 10-5 M, de l'hypoxanthine 1 x 10-4 M, de l'aminoptérine 4 x 10-7 M, de la thymidine 1,6 x 10-5 M et 50 mg/1 de sulfate de kanamycine) On place la suspen- sion cellulaire obtenue dans les 96 godets d'une plaque de culture tissulaire (Nunc 167008, NUNC INC, Danemark) avec Pl dans chaque godet et on incube dans un incubateur à Co 2 contenant 5 % de dioxyde de carbone à 370 C Vingt-quatre heures après le début de l'incubation, on ajoute 100 pl de milieu HAT dans chaque godet On poursuit l'incubation en éliminant 100 pl de milieu dans chaque godet et en ajoutant pl de milieu HAT frais dans chaque godet tous les deux ou trois jours et on sélectionne ainsi les hybridomes capa- bles de proliférer dans le milieu HAT. Deux semaines après le début de l'incubation, on observe la croissance de l'hybridome et on détermine la production d'anticorps dans le surnageant de chaque godet, comme décrit-en ( 4) ci-après. ( 4) Sélection et clonaae de l'hybridome producteur d'anti- corps. On utilise une méthode immuno-enzymatique pour déterminer la présen d'anticorps sécrétés dans le surna- geant des godets de culture On injecte cinq fois par voie intraveineuse 2 x 107 cellules de Candida albicans prétrai- tées à 1000 C pendant 2,5 heures à un lapin pour l'immuniser et on soumet le sérum du lapin à un relargage par le sul- fate d'ammonium pour obtenir une fraction d'Ig G On ajuste la fraction (anticorps anti-Candidà albicans) avec du bi- carbonate de sodium 0,1 M à une concentration en protéines de 30 pg/ml On verse dans chaque godet d'une plaque de culture tissulaire à 96 godets (Nunc 167008, Nunc Inc, Danemark), 50 pl de la solution obtenue et on laisse repo- ser à 40 C pendant 24 heures On lave soigneusemest chaque godet avec de l'eau distillée et on place dans chaque godet pl d'une suspension cellulaire de Candida albicans ATCC 752 ( 2 x 107 cellules/ml) et on fait réagir à la tempéra- ture ordinaire On sèche la plaque à godets à 700 C pendant 3 heures puis on la conserve à -200 C jusqu'à l'emploi On verse dans chaque godet de la plaque 50 pl de PBS contenant 0,5 % de glutaraldéhyde et on laisse reposer à la tempéra- ture ordinaire pendant 30 minutes Après avoir lavé chaque godet trois fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 %, on ajoute 100 p 1 du produit étudié (le surnageant de chaque godet) à chaque godet et on fait réagir à 370 C pendant 1 heure Après avoir lavé trois fois chaque godet avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 %, on verse dans chaque godet 50 pl d'une solution d'anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de souris fixé à de la peroxy- dase provenant du raifort (Cappel Corp, USA), diluée au 1/1 000 avec du sérum de cheval, et on fait réagir à 37 C pendant 1 heure Après réaction, on lave chaque godet 5 fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % et on ajoute à chaque godet 100 pl de tampon citrate 0,1 M (p H 4,5) contenant 1 mg/ml d'o-phénylènediamine et 0,04 % (v/v) d'une solution aqueuse à 31 % de peroxyde d'hydrogène et on fait réagir à la température ordinaire pendant 30 minu- tes On arrête la réaction enzymatique par addition de pl d'acide sulfurique à 12,5 % à chaque godet et la mesure de l'absorption à 492 nm montre la production d'an- ticorps dans 22 godets sur 192. On clone ensuite les hybridomes des godets qui se sont révélés produire des anticorps Pour cela, on ob- tient des cellules spléniques servant de cellules nourri- cières, comme décrit en ( 2) ci-dessus à partir de rates prélevées à des souris femelles BALB/c non traitées (té- moins) âgées de 8 jours et on ajuste la concentration cel- lulaire à 5 x 10 /ml avec du milieu HAT On ajoute l'hybri- dome précité à la suspension de cellules spléniqs obtenue à raison de 2 cellules/ml et on agite soigneusement On ensemence chaque godet d'une plaque de culture tissulaire à 96 godets (Nunc 167008, Nunc Inc, Danemark) avec 100 pl du mélange cellulaire Après 24 heures, on ajoute à chaque godet 100 pl de milieu HAT et on incube à 37 C dans un incubateur contenant 5 % de dioxyde de carbone Après 2 semaines de clonage, on observe le développement de l'hy- bridome et on détermine la présence d'anticorps dans le surnageant de chaque godet comme précédemment mentionné. Ce clonage fournit pour chaque godet 2 à 80 clones produc- teurs d'anticorps Parmi ces clones, on choisit les clones stables capables de produire une quantité importante d'an- ticorps et à forte prolifération et on les clone à nouveau comme précédemment mentionné pour obtenir les hybridomes producteurs d'anticorps CD-1, CD-2 et CD-3. ( 5) Production d'anticor Ds (culture in vitro). On met en suspension l'hybridome CD-1, CD-2 ou CD-3 dans du milieu RPMI 1640 contenant du sérum de veau foetal à 20 %, de la glutamine 2 m M, de l'acide pyruvique 1 m M, 4,5 g/l de glucose, du $-mercaptoéthanol 5 x 105 M et 50 mg/1 de sulfate de kanamycine, à une concentration cellulaire de 1 x 105/ml On place la suspension obtenue ( 25 ml) dans un flacon de culture tissulaire de 75 cm 2 (Corning Glass Works, USA) et on incube à 37 C dans un incubateur à C 02 contenant 5 % de CO 2 Le quatrième jour, on-recueille le surnageant du flacon dans lequel la culture est en phase stationnaire Le nombre des cellules cultivées est d'environ 2 x 106/ml et les teneurs en anticorps des surnageants sont respectivement de 3,0 ig/ml (CD-1), 2,3 ig/ml (CD-2) et 2,8 pg/ml (CD-3). (Culture-in vivo). On injecte 0,5 ml de pristane ( 2,6,10,14-tétra- méthylpentadécane) par voie intrapéritonéale à des souris BALB/c et, entre le dixième et le trentième jour suivant l'injection, on inocule aux souris par voie iptr Epérito- néale 5 x 106 cellules de l'hybridome CD-1, CD-2 ou CD-3 ayant proliféré in vitro Après 2 ou 3 semaines, on re- cueille le liquide d'ascite et on centrifuge à 1 000 x g à 40 C pendant 15 minutes pour obtenir le surnageant asci- tique On obtient environ 30 ml du surnageant ascitique à partir de 10 souris pour chaque hybridome et les teneurs en anticorps sont respectivement de 1,5 mg/ml (CD-1), 2,3 mg/ml (CD-2) et 1,8 mg/ml (CD-3). ( 6) Spécificité et propriétés de l'anticorps. (Spécificité): Les cellules utilisées sont des cellules de Candida albicans ATCC 752 (comme autres souches de la même espèce), Candida albicans IFO 0588, 1385, 1389, 1594 et 1269, (comme autres espèces appartenant au même genre Candida tropicalis ATCC 750, Candida quilliermondii IFO 0679, Candida kursei IFO 1395, Candida parapsilosis IFO 1396 et Candida pseudotropicalis IFO 0432 On cultive chaque souche selon la méthode décrite en ( 1) ci-dessus, on traite par la formaline et on ajuste à 1 x 108/ml avec du PBS contenant Tween 20 (R) à 0,05 % On verse la suspen- sion cellulaire dans des tubes à essai silicones de 1,2 cm de diamètre à raison de 0,3 ml et on centrifuge à 1 000 x g pendant 5 minutes Après avoir rejeté le surnageant, on ajoute à chaque tube 0,5 ml du surnageant obtenu dans la culture in vitro de l'hybridome CD-1, CD-2 ou CD-3 obtenue en ( 5) ci-dessus puis on fait réagir à 37 C pendant 1 heure. Après réaction, on lave chaque tube trois fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R)à 0,05 % puis on ajoute à chaque tube 0,5 ml d'une solution d'anticorps anti-immunoglobu- lines de souris fixé à de la peroxydase provenant du rai- fort (Cappel Corp, USA) diluée au 1/1 000 avec du sérum de cheval et on fait réagir à 37 C pendant 1 heure Après avoir lavé cinq fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 %, on ajoute à chaque tube 1 ml de tampon citrate 0,1 M contenant 1 mg/ml d'o-phénylènediamine et 0,04 % (v/v) de peroxyde d'hydrogène aqueux à 31 % et onq maintient à la température ordinaire pendant 30 minutes On arrête la réaction par addition de 0,5 ml d'acide sulfurique à 12,5 % et on mesure l'absorption à 492 nm pour identifier l'anticorps produit Les résultats figurent dans le tableau 1 ci-après. (Propriétés): On verse dans chaque godet d'une plaque de culture tissulaire à 96 godets à fond plat (Nunc 167008, Nunc, Danemark) 50 1 pl d'une solution d'anticorps anti-Ig G de souris, d'anticorps anti-Ig A de souris et d'anticorps anti-Ig M de souris (Miles, USA) diluée au 1/100 avec du bicarbonate de sodium 0,1 M et on laisse séjourner à 40 C pendant 24 heures Après avoir soigneusement lavé chaque godet avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 %, on ajoute dans chaque godet 100 pil du surnageant des cultures de CD-1, CD-2 ou CD-3 obtenues en ( 5) ci- dessus et on incube à 370 C pendant 1 heure Après réaction, on lave cha- que godet trois fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % et on ajoute à chaque godet 50 pl d'une solution d'anticorps antiimmunoglobulines de souris fixé à de la peroxydase provenant du raifort (Cappel, USA) diluée au 1/1 000 avec du sérum de cheval et on incube à 370 C pendant 1 heure Après avoir lavé cinq fois chaque godet avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 %, on ajoute dans chaque godet 100 pl de tampon citrate 0,1 M (p H 4,5) contenant 1 mg/ml d'o-phénylènediamine et 0,04 % (v/v) de peroxyde d'hydrogène aqueux à 31 % et on incube à la température ordinaire pendant 30 minutes On arrête la réaction enzymatique par addition d'acide sulfurique à 12,5 % dans chaque godet et on mesure l'absorption à 492 nm pour identifier l'anticorps produit Les résultats figurent dans le tableau I ci-dessous. Exemple 2. ( 1) Préparation d'immunoqène. On ensemence un tube de gélose de Sabouraud in- cliné avec Candida albicans IFO 1594 et on incube à 370 C pendant 3 jours dans un incubateur On ajoute du PBS (p H 7,2), on met les cellules en suspension par pipetage, on centrifuge à 1 000 x g à 4 C pendant 10 minutes et on ob- tient un culot cellulaire Après avoir répété trois fois ces opérations de lavage, on ajuste la concentration cellu- laire à 5 x 105/ml avec du PBS et on utilise cette suspen- sion comme suspension d'immunogène. ( 2) Préparation de cellules Productrices d'anticorps. On administre par voie intraveineuse la suspen- sion d'immunogène à raison de 0,2 ml à des souris femelles CDF 1 âgées de 8 semaines (NIPPON KREA, JAPON) pour les im- muniser On immunise les souris de façon répétée toutes les deux semaines Le soixante-dixième jour suivant le début de l'immunisation, on soumet les souris à une in- jection intraveineuse de rappel avec 0,2 ml de la suspen- sion Le troisième jour après le rappel, on saigne les souris à blanc et on prélève la rate en conditions asepti- ques dans une enceinte propre (HITACHI LTD,, JAPON) On place ensuite la rate dans une boite de Pétri contenant du milieu MEM de Dulbecco et on obtient une suspension de cellules spléniques à 1 x 108 cellules/ml de la même façon que dans l'exemple 1 ( 2). ( 3) Fusion cellulaire pour la préparation d'hybridome. On mélange avec la suspension de cellules splé- niques ( 1 x 108)-des ce-l lès de myélome de souris-de la lignée P 3-X 63Ag 8 ( 1 x 107) préalablement cultivées in vitro, on centrifuge ( 500 x g, 5 minutes) et on rejette le surnageant pour obtenir un culot cellulaire Après avoir désagrégé le culot en tapotant doucement le fond du récipient, on maintient la température à 37 o C et on ajoute progressivement en environ 1 minute 1 ml de milieu MEM de Dulbecco contenant 45 % de polyéthylèneglycol 4000 ( 370 C) Après maintien à 370 C pendant 7 minutes, on ajoute ml de milieu MEM de Dulbecco à 37 WC le long de la paroi du récipient en environ 5 minutes en faisant tourner-dou cement le récipient On ajoute ensuite environ 25 ml de milieu MEM de Dulbecco, on centrifuge ( 500 x g, 5 minutes) et on rejette le surnageant. On ajoute au culot cellulaire du milieu MEM de Dulbecco contenant du sérum de beau foetal à 10 % à 37 WC, on ajuste à 1 x 106 cellules/ml, on mélange doucement avec une pipette, on place dans chaque godet d'une boîte de culture tissulaire à 24 godets (Nunclon, Nunc, Danemark) à raison de 1 x 106 cellules par godet et on incube à 370 C dans un incubateur contenant 5 % de dioxyde de carbone. Vingt-quatre heures après le début de-l'incubation, on ajoute 1 ml de milieu HAT à chaque godet Pendant la cul- ture, on élimine 1 ml du milieu dans chaque godet et on ajoute 1 ml de milieu HAT frais dans chaque godet tous les deux ou trois jours On sélectionne l'hybridome capable de proliférer dans le milieu HAT. Deux semaines après le début de l'incubation, on observe le développement de l'hybridome et on examine la production d'anticorps dans le surnageant de chaque godet selon la méthode décrite dans l'exemple 1 ( 4) Parmi les quarante-huit godets, dix présentent une production d'anti- corps. ( 4) Constitution d'un hybridome producteur d'anticorps. On clone en utilisant une gélose molle les hybri- domes producteurs d'anticorps des dix godets Pour cela, on mélange 30 ml de gélose à 2,5 % (Difco, République Fédérale d'Allemagne) à 450 C et 3 ml de milieu MEM de Dulbecco à la concentration de -10 fois et on ajoute 117 ml de milieu MEM de Dulbecco à 450 C A cette solution gélosée, on ajoute des cellules spléniques de souris femelles CDF 1 non trai- tées (témoins) âgées de 8 semaines à raison de 5 x 105 cellules/ml comme cellules nourricières On place des por- tions de 10 ml de la solution gélosée obtenue dans des boites de Pétri (Falcon 3003, Becton-Dickinson, USA) de cm de diamètre et on laisse reposer à la température ordinaire pendant 10 minutes pour assurer la géeification. On mélange environ 2 ml de la suspension d'hyrbridome de chaque godet présentant une production positive d'anti- corps et la quantité équivalente de milieu MEM de Dulbecco contenant 0,5 % de gélose et on place des portions de 2 ml du mélange obtenu sur le gel obtenu ci-dessus de façon à ce que les cellules soient réparties uniformément sur la couche de gel On incube à 370 C dans un incubateur à 5 % de CO 2 Le dixième jour suivant le début de l'incubation, on recueille avec une pipette Pasteur les colonies se développant sur la gélose molle et on les transfère dans une plaque de culture tissulaire à 96 godets à fond plat, on ajoute de plus 0,2 ml de milieu MEM de Dulbecco à cha- que godet et on incube à 370 C dans un incubateur à 5 % de C 02 On observe la croissance de l'hybridome et on recher- che simultanément la présence d'anticorps dans le surna- geant de chaque godet selon la méthode décrite dans l'exem- ple 1 ( 4). On choisit parmi les hybridomes positifs des clones stables produisant une quantité importante d'anti- corps et se propageant bien, on les clone à nouveau comme décrit cidessus et on obtient les hybridomes CD-4 et CD-5 producteurs d'anticorps. ( 5) Production d'anticorps (culture in vitro). On cultive les hybridomes CD-4 et CD-5 selon la méthode décrite dans l'exemple 1 ( 5) pour obtenir les sur- nageants. (Culture in vivo). Selon le procédé de l'exemple 1 ( 5), on trans- plante par voie intrapéritonéale les hybridomes CD-4 et CD-5 à des souris CDF 1, on recueille le liquide d'ascite après 2 ou 3 semaines et on obtient le surnageant asciti- que On obtient à partir de 10 souris environ 30 ml de surnageant. ( 6) Spécificité et propriétés des anticorps - On détermine selon le procédé de l'exemple 1 ( 6) les spécificités et les catégories d'immunoglobulines des anticorps contenus dans les surnageants des cultures des hybridomes CD-4 et CD-5 Les résultats figurent dans le tableau 1 ci-dessous. Exemple 3. ( 1) Préparation d'immunoaène. On ensemence un tube de gélose de Sabouraud in- clinée avec Candida albicans IFO 0588 et on incube à 37 C pendant 3 jours Après incubation, on recueille les cellu- les avec une anse de platine, on met en suspension dans du PBS (p H 7,2) et on centrifuge à 1 000 x g à 4 C pendant 10 minutes pour obtenir un culot cellulaire Après avoir ré- pété trois fois cette opération de lavage, on chauffe les cellules à 100 C pendant 2,5 heures. Après avoir lavé trois fois les cellules avec du PBS, on ajuste la concentration en cellules à 2 x 107/ml avec du PBS et on utilise la suspension obtenue comme sus- pension d'immunogène. ( 2) Préparation de cellules productrices d'anticorps. On injecte par voie intrapéritonéale la suspen- sion d'immunogène à raison de 0,2 ml à des souris femelles BALB/c (NIHON CHARLES RIVER, JAPON) de 8 semaines pour les immuniser On répète l'immunisation toutes les deux semai- nes et on administre comme rappel par voie intraveineuse, la' dixième semaine suivant la première immunisation, 0,2 ml de la suspension d'immunogène Après 3 jours, on saigne les souris à blanc et on prélève aseptiquement les rates dans une enceinte propre (HITACHI LTD, JAPON) o On place la rate dans une boite de Pétri contenant du milieu RPMI 1640 et on obtient selon le procédé de l'exemple 1 ( 2) une suspension de cellules spléniques à 5 x 107 cellules/ml. ( 3) Fusion cellulaire pour la préparation d'hybridome. On mélange des cellules de myélome de souris de la lignée P 3-NSI/1-Ag 41 préalablement cultivéein vitro ( 0,5 x 107 cellules) et la suspension de cellules spléni- ques ( 5 x 107 cellules), on centrifuge ( 500 x g, 5 minutes) * et on élimine le surnageant pour obtenir un culot cellu- laire Après avoir désagrégé le culot cellulaire en tapo- tant doucement le fond du récipient, on ajoute 0,5 ml de milieu RPMI 1640 contenant 42,5 % de polyéthylèneglycol 1540 à 37 C et 15 % de diméthylsulfoxyde et on laisse réa- gir pendant 1 minute Pendant la réaction, on fait tourner doucement le récipient entre les doigts pour mélanger soi- gneusement la solution de polyéthylèneglycol avec le culot cellulaire Après 1 minute de mélange, on ajoute une quan- tité totale de 10 ml de milieu RPMI 1640 à 37 C à un débit de 1 ml/30 secondes en faisant tourner de façon semblable le récipient et on centrifuge le mélange à 500 x g pendant 5 minutes Après avoir éliminé le surnageant, on met le culot cellulaire en suspension dans du milieu RPMI 1640 et on centrifuge ( 500 x g, 5 minutes) pour obtenir à nou- veau un culot cellulaire Après avoir à nouveau lavé de la même façon, on ajoute au culot cellulaire 10 ml du milieu RPMI 1640 contenant du sérum de veau foetal à 10 %, de la glutamine 2 m M, de l'acide pyruvique 1 m M, 4,5 g/l de glu- cose, du e-mercaptoéthanol 5 x 10-5 M et 50 mg/l de sulfate de kanamycine comme milieu de culture à 37 C et on met soigneusement en-suspension On introduit 200 pil de sus- pension cellulaire dans chaque godet d'une plaque de cul- ture cellulaire à 96 godets (Nunc 167008, Nunc, Danemark) et on incube à 370 C dans un incubateur à CO 2 Après 24 heures, on rejette la moitié du surnageant et on ajoute pl du milieu HAT précité à 370 C contenant 1 x 104 M d'hypoxanthine, 4 x 10-7 M d'aminoptérine et 1,6 x 10-5 M de thymidine Tous les 2 ou 3 jours, on-prélève 100 1 pl du milieu dans chaque godet et on les remplace par 100 pl de milieu HAT frais On choisit les hybridomes capables de proliférer dans le milieu HAT. Après 2 semaines de culture, on obsere le déve- loppement des hybridomes et, simultanément, on recherche les anticorps dans le surnageant de chaque godet comme dans l'exemple 1 ( 4) Dans cet exemple, on utilise Candida albi- cans IFO 0588 comme cellule à fixer à la plaque Sur 48 go- dets, trois présentent une production d'anticorps. ( 4) Constitution d'hvbridome producteur d'anticorps. On clone les hybridomes des trois godets produc- teurs d'anticorps selon le procédé de l'exemple 1 ( 4) et on obtient les hybridomes producteurs d'anticorps CD-6 et CD-7. En utilisant le milieu HT (c'est-à-dire le milieu de culture précité contenant 1 x 10-4 M d'hypoxanthine et 1,6 x 10-5 M de thymidine) au lieu du milieu HAT, on rem- place progressivement le milieu de culture par le milieu HT Après 2 semaines de culture dans le milieu HT, on rem- place le milieu HT par le milieu de culture dépourvu d'hy- poxanthine, d'aminoptérine et de thymidine et on rend ainsi les hybridomes capables de proliférer dans un milieu de culture normal au lieu du milieu de sélection. ( 5) Production d'anticorps (culture in vitro). On cultive les hybridomes CD-6 et CD-7 selon le procédé de l'exemple 1 ( 5) pour obtenir les surnageants. Dans cet exemple, la concentration cellulaire initiale est de 2 x 105/ml Et les teneurs en anticorps des surna- geants sont respectivement de 2,5 pg/ml (CD-6) et 3,0 pg/ml (CD-7). (Culture in vivo). On inocule par voie intrapéritonéale des souris BALB/c avec les hybridomes CD-6 et CD-7 selon le procédé de l'exemple 1 ( 5) à raison de 1 x 107 cellules, on pré- lève le liquide d'ascite 2 ou 3 semaines après l'inocula- tion et on obtient les surnagéants ascitiques On obtient environ 30 ml de surnageant à partir de 10 souris. ( 6) Spécificité et propriétés des anticor Ds. Selon le procédé de l'exemple 1 ( 6), -6 N détermine les spécificités et les catégories des immunoglobulines des anticorps des surnageants de culture des hybridomes CD-6 et CD-7 Les résultats figurent dans le tableau 1 ci-dessous. Exemple 4. ( 1) Préparation d'immunoaène. On ensemence une boite de gélose contenant de la farine de mais (NISSUI SEIYAKU, JAPON) avec Candida albi- cans ATCC 752 et on incube à 250 C pendant 10 jours Après l'incubation, on recueille avec une cuillère une partie riche en mycélium et en chlamydospores, on met en suspen- -sion dans du PBS (p H 7,2), on homogénéise et on centrifuge à 1 000 x g à 40 C pendant 10 minutes pour obtenir un culot cellulaire Après avoir répété trois fois ces opérations, -on utilise du PBS pour ajuster la concentration à 1 % (p/v) et on utilise la suspension d'immunogène obtenue dans les opérations expérimentales qui suivent. ( 2) Préparation de cellules productrices d'anticorps. On immunise des souris BALB/c femelles (NIHON CHARLES RIVER, JAPON) âgées de 8 semaines par injection intrapéritonéale de 0,2 ml de la suspension d'immunogène. On immunise ensuite les souris tous les 14 jours Le soi- xante-dixième jour après le début de l'immunisation, on administre comme rappel par voie intrapéritonéale 0,2 ml de la suspension d'immunogène Après 3 jours, on saigne les souris à blanc et on prélève aseptiquement la rate et lés ganglions lymphatiques mésentériques dans une enceinte propre (HITACHI LTD, JAPON) On obtient selon le procédé de l'exemple 1 ( 2) unesuspension de cellules spléniques à 108 cellules/ml. ( 3) Fusion cellulaire pour la Préparation d'hybridome. On mélange des cellules de myélome de souris de la lignée X 63-Ag 8 653 ( 1 x 107) préalablement cultivées in vitro et la suspension de cellules spléniques ( 1 x 108) et- on réalise la fusion cellulaire comme dans l'exemple 2 ( 3) pour préparer des hybridomes La production d'anticorps est confirmée dans 10 godets sur 48. ( 4) Constitution d' hybridomes producteurs d'anticorps. On clone ensuite les hybridomes producteurs d'an- ticorps par culture sur gel de fibrine Pour cela, on in- troduit 1 ml d'une solution contenant 2,5 mg/ml de fibri- nogène (Miles, USA), 8 mg/ml de chlorure de sodium, 0,5 mg/ml de chlorure de potassium et du citrate de sodium dans une boite de Pétri (Falcon 3002, Beckton-Dickinson, USA) et on étale uniformément sur le fond de la boite puis on ajoute 4 ml de milieu MEM de Dulbecco contenant 10 m U/ml de thrombine (Miles, USA) et du sérum de veau foetal à 20 % et on laisse reposer à 370 C pendant 1 heure pour assurer la gélification On ajoute au gel 100 pl de la suspension d'hybridome ( 1 x 10 /ml) et on répartit uniformément, puis on incube à 37 o C dans un incubateur à 5 % de CO 2 Après 10 jours ou plus, on recueille avec une pipette Pasteur les colonies se développant sur le gel, on les transfère dans une boite de culture cellulaire à 96 godets à fond plat, on ajoute 0,2 ml de milieu MEM de Dulbecco et on incube à 37 WC dans un incubateur à 5 % de C 02 On observe la culture des hybridomes et on recherche la présence d'anticorps dans le surnageant de chaque godet selon le procédé de l'exemple 1 ( 4) Parmi les hybridomes producteurs d'anti- corps, on choisit les clones stables produisant une quanti- té élevée d'anticorps et proliférant bien et on les clone à nouveau comme précédemment mentionné pour constituer les hybridomes producteurs d'anticorps CD-8 et CD-9. ( 5) Production d'anticorps. On cultive les hybridomes CD-8 et CD-9 in vitro et in vivo selon le procédé de l'exemple 1 ( 5) pour obtenir le surnageant de la culture in vitro et le liquide d'ascite (in vivo). ( 6) Spécificité et propriétés des anticorps. Les spécificités des anticorps et les catégories des immunoglobulines contenues dans les surnageants des cultures des hybridomes CD-8 et CD-9 ont été déterminées selon le procédé de l'exemple 1 ( 6) Les résultats figurent dans le tableau 1 ci-dessous. TABLEAU i Spécificités et catégories des immunoglobulines des anticorps anti-candida de l'invention. HYBRIDOME PRODUCTEUR D'ANTICORPS CD-1 CD-2 CD-3 CD-4 CD-5 CD-6 CD-7 CD-8 CD-9 Candida albicans ATCC 752 + + + + + + + + + CE andida a Ibicans IF 00588 + + + + + + + + + i EE Candida aibicans IF 01385 + + + + + + + + + ESPECE Candida albi Cans IF 01389 + + + + + + + + + Candi Yalbicans IF 01594 + + + + + + + + + DPE Candida albicans IF 01269 + + + + + + + + + I Candida tropicalis ATCC 750 + + + + + MEME Candida guilliermnondii IF 00679 + + + + + Candida krusei IF 01395 + + + + + E ENR andidia prpioi F 19 + ±+ + + aniapseudotropicalis IF 00432 + + + + + UTREE Torulopsis glabrata IF 00622 + CHAMH Saccharomyces cerevisiae IAM 4207 + Pi Hansenula anolama IAM 4213 + GNONS Debaryomyces hansenii IAM 4356 + PROPRIETEECATEGORIE D'IMMUNOGLOBULINES Ig Ig IMIMIMIGIGIG G -J positif:négatif. MJ tn 4 o Exemple 5. On administre les anticorps obtenus dans les exemples 1-4 à -des groupes de 10 souris ICR à raison de 2 g/kg par voie perorale, 400 mg/kg par voie intrapérito- néale ou 200 mg/kg par voie intraveineuse et on-observe les souris pendant 14 jours On n'observe aucune mort due aux anticorps - Par ailleurs, les formes des hybridomes CD-1 à CD-9 sont approximativement sphériques, leurs dimensions sont de 10-20 pm, le plus souvent d'environ 15 Vm, et les hybridomes CD-1 à CD-9 flottent et adhèrent mal à la paroi du récipient. Exemple 6: Identification de champignons du genre Candida avec des anticorps. (i) Echantillon: On utilise un échantillon de crachat, d'urine ou de sécrétion vaginale de cinq malades atteints de façon certaine de candidose, on les étale dans une boite de Pétri contenant des la gélose de Sabouraud glucosée et on incube à 37 C pendant 5 jours On utilise comme échantillon les colonies apparaissant sur la boite de gélose. (ii) Identification On effectue l'identification par ag- glutination sur lame ou selon une technique à anticorps fluorescent en utilisant les anticorps (surnageant asciti- que) sécrétés par l'hybridome CD-1. Dans la méthode d'agglutination sur lame, on place une goutte de la solution d'anticorps sur une lame de verre, on ajoute une petite quantité de cellules pro- venant des colonies échantillons avec une anse de platine et on observe l'agglutination à l'oeil nu au microscope. Dans la technique à anticorps fluorescents, on étale sur une lame de verre une petite quantité des cellu- les obtenues par prélèvement avec une anse de platine sur les colonies à étudier, on fixe avec de la formaline à 1,0 % à 40 C pendant une nuit, on lave avec du PBS (p H 7,2) puis on ajoute une goutte de la dilution au 1/100 de la solution d'anticorps précitée et on incube à 370 C pendant une heure Après lavage soigneux avec du PBS (p H 7,2) pour éliminer les anticorps n'ayant pas réagi, on ajoute une goutte de l'immunoglobuline antisouris fixée à de la fluo- rescéine (Cappel, USA) diluée au 1/100 et on incube à 370 C pendant une heure Après avoir éliminé l'immunoglobuline antisouris fixée à la fluorescéine n'ayant pas réagi, on lave avec du PBS (p H 7,2), on observe la fluorescence avec un microscope à fluorescence (Olympus Vanox, Olympus, Japon) de chaque cellule échantillon sur la lame. Simultanément, on effectue une observation mor- phologique et biochimique des échantillons Pour cela, on étudie la morphologie des chlamydospores sur culture en lame avec de la gélose à la farine de mais et on effectue une étude biochimique de l'utilisation du glucose, du saccharose, du maltose et du lactose. (iii) Résultats (tableau 2): Comme le montre le tableau 2, les résultats de l'identification avec les anticorps de l'invention coincident totalement avec les résultats des méthodes morphologiques et biochimiques. TABLEAU 2 éthode identification Méthode morphologique-biologique par les anticorps Résultats de CD-1 (souche Formation utilisation des sucres identifiée) de chlamy- aggluti anticorps dospores glu saccha mal lac- Echan nation fluores cose rose tose tose tillon cents crachats + + + Candida (patient A) + + + + +albicans urine (pa + + + + + + _ tient B) sécrétions vaginales + + + + + + (patient C) urine (pa + + + + + _ tient D) crachats + + + _ Saccharomyces (patient E) cerevisiae w w t A i #D t N 0 % % O Exemple 7. ( 1) Marauaae par la peroxvdase d'anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 et CD-8. On dissout 4 mg de peroxydase de raifort (Sigma Type VI, Sigma, USA) dans 1 ml d'eau distillée, on ajoute ml d'une solution 0,1 M de Na IO 4 préparée immédiatement avant l'emploi et on mélange à la température ordinaire pendant 20 minutes On dialyse la solution obtenue pendant une nuit contre du tampon acétate de sodium 1 m M (p H 4,4) et on ajoute 20 ml de solution 0,2 M de carbonate de so- dium Peu après, on ajoute les anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 ou CD-8 (surnageant ascitique purifié, teneur en protéines: 10 mg) dissous dans 1 ml de tampon carbonate 0,01 M et on maintient à la température ordinaire pendant 2 heures en agitant Après la réaction, on ajoute 0,1 ml d'une solution aqueuse fraîchement pré- parée de Na BH 4 ( 4 mg de Na BH 4 dissous dans 1 ml d'eau dis- tillée), on laisse reposer à 4 C pendant 2 heures et on dialyse pendant une nuit contre du PBS. On applique la solution mixte obtenue à une co- lonne de Sephadex G-l OO(R) (Pharmacia, Suède), on élue avec du PBS et on recueille la première fraction dont les absorptions à 280 nm et 403 nm correspondent entre elles. A 1 ml de la fraction (produit de fixation, enzyme-anti- corps), on ajoute 10 mg de sérum-albumine de lapin, on dissout et on conserve à -70 C jusqu'à l'emploi. ( 2) Marquace par une phosphatase alcaline d'anticorps sé- crétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 et CD-8. On dissout dans du PBS à un volume total de 1 ml 5 mg de phosphatase alcaline de type VII (Sigma, USA) préa- lablement dialysée contre du PBS pour éliminer totalement le sulfate d'ammonium et 17 mg d'anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 ou CD-8 (surnageant asci- tique purifié) A la solution obtenue, on ajoute 10 pl d'une solution à 20 % de glutaraldéhyde et on agite à la température ordinaire pendant 2heures Après la réaction, on applique le mélange réactionnel à une colonne de Sepha- dex G-200 (R) (Pharmacia, Suède) équilibrée avec du tampon Tris-H Cl (p H 7,6) et on élue avec le même tampon On re- cueille une fraction de poids moléculaire élevé comprise entre le volume interstitiel et le point d'élution de l'Ig G, on ajoute de la sérumalbumine bovine à 5 % (p/v), on stérilise par passage sur un filtre Millipore ( 0,22 pm, Millipore, USA) et on conserve à 40 C dans l'obscurité jusqu'à l'emploi. ( 3) Marauaqe par la -galactosidase d'anticorps sécrétés par les hvbridomes CD-1, CD-4, CD-6 et CD-8. On marque avec de la e-galactosidase selon le procédé de ( 2) ci-dessus les anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 et CD-8 On utilise la a-galac- tosidase Sigma grade IV (Sigma, USA). ( 4) Marquaqe par 125 I d'anticorps sécrétés par les hybri- domes CD-1, CD-4, CD-6 et CD-8. A 10 p 1 de solution de Na 125 I à 100 m Ci/ml (sans support, Amersham, USA), on ajoute 50 pl de la solution d'anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 ou CD-8 (surnageant ascitique purifié, teneur en protéines: 1,0 mg/ml) et 30 pl de tampon phosphate 0,5 M (p H 7,2) con- tenant 0,30 mg/ml de chloramine T et on mélange soigneuse- ment Après 15 secondes, on ajoute 100 pl de PBS saturé de L-tyrosine et on mélange immédiatement On chromatographie le mélange obtenu sur une colonne garnie d'Amberlite IRA 400 et on élue avec du PBS contenant 1 % de sérum-alkumine bovine On recueille la fraction élevée et on corserve à 4 C jusqu'à l'emploi L'activité spécifique du produit marqué est de 1,0 p Ci/mg d'anticorps protéique. ( 5) Marquage par la fluorescéine d'anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1 CD-4, CD-6 et CD-8. A 1 ml de solution des anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 ou CD-8 (surnageant asci- tique purifié) à la concentration de 10 mg/ml, on ajoute 0,1 ml de tampon carbonate 0,5 M (p H 9,3), on ajoute de plus 0,1 mg de poudre d'isothiocyanate de fluorescéine et on agite à 40 C pendant 6 heures sans former de bulles. Immédiatement après la réaction, on applique le mélange réactionnel à une colonne de Sephadex G-25 (R) (Pharmacia, Suède) pour éliminer les substances de bas poids molécu- laire n'ayant pas réagi et on obtient la fraction de poids moléculaire élevé désirée On conserve le produit obtenu à 4 C à l'obscurité jusqu'à l'emploi. ( 6) Marauaae par la tétraméth 1 vlrhodamine d'anticorps sé- crétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 et CD-8. A 1 ml de solution à 10 mg/ml des anticorps sé- crétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 ou CD-8 (sur- nageant ascitique purifié), on ajoute 0,1 ml de tampon carbonate 0,5 M (p H 9,3), on ajoute de plus 0,2 mg de poudre d'isothiocyanate de tétraméthylrhodamine et on agite à 4 C pendant 20 heures sans former de bulles Après la réaction, on applique immédiatement le mélange réaction- nel à une colonne de Sephadex G-25 (R) (Pharmacia, Suède) pour éliminer les substances de bas poids moléculaire n'ayant pas réagi et on obtient la fraction de poids molé- culaire élevé désirée On conserve le produit à 4 C à l'obscurité. ( 7) Marquace par la biotine d'anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 et CD-8. On dissout 1 m M de d-biotine ( 244 mg) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japon) et 1,5 m M de N-hydroxy- succinimide ( 173 mg) (Eastman Kodak, USA) dans un mélange de 8 ml de diméthylsulfoxyde (Wako Pure Chemical Indus- tries, Ltd) et 5 ml de 1,2-diméthoxyéthane (Nakadai Che- mical, Japon) On ajoute à la solution obtenue une solu- tion de 206 mg ( 1 m M) de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (Kanto Chemical, Japon) dans 0,5 ml de 1,2-diméthoxyéthane et on fait réagir à 4 C pendant une nuit On sépare par filtration le précipité obtenu pour obtenir un filtrat. On élimine sous vide le solvant du filtrat et on dissout la matière huileuse résiduelle dans 10 ml de dichloromé- thane (Wako Chemical Industries, Ltd, Japon) et on re- froidit à 4 C On ajoute ensuite 10 ml d'une solution 0,1 M de Na HCO 3 ( 4 C) et on agite pour bien mélanger. On élimine la phase de dichlorométhane obtenue, on ajoute ml de Na HCO 3 0,1 M puis 10 ml d'eau distillée à 4 C et on répète à nouveau ce traitement On ajoute du sulfate de sodium anhydre en poudre (Koizumi Chemical, Japon) à la phase de dichlorométhane obtenue pour la déshydrater. On sépare la poudre par filtration et on ajoute du n-he- xane au filtrat jusqu'à formation d'un trouble On refroi- dit la solution à -20 C puis on place les cristaux préci- pités dans un dessiccateur pour chasser le solvant et sécher On obtient ainsi le produit, l'ester N-hydroxy- succinimidique de la biotine. On dissout l'ester N-hydroxysuccinimidique de la biotine dans du diméthylsulfoxyde et on ajuste la con- centration à 1 mg/Ml On mélange la solution ( 60 pi) avec 1 ml de solution d'anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 qu CD-8 (surnageant ascitique purifié, teneur en protéines 1 mg/ml) et on fait réagir à la tem- pérature ordinaire pendant 4 heures Après la réaction, on dialyse la solution contre du PBS à 40 C pendant 3 jours On change trois fois le liquide de dialyse On conserve le dialysat (solution contenue dans le tube de dialyse) à 40 C jusqu'à l'emploi. Exemple 8. ( 1) Champiqnons échantillons. On ensemence une gélose de Sabouraud inclinée avec Candida albicans ATCC 752, Candida tropicalis ATCC 750 ou Candida quilliermondii IFO 0679 et on incube à 37 WC pendant 3 jours On recueille les cellules avec une anse de platine et on les utilise comme champignons échantillons. ( 2) Identification selon la méthode des anticorps fluo- rescents. On étale une petite quantité de chaque champi- gnon échantillon sur une lame de verre, on fixe avec de la formaline à 1, 0 X à 4 C pendant une nuit et on lave avec du PBS (p H 7,2) On ajoute une goutte d'une solution diluée au 1/10 des anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1, CD-4, CD-6 ou CD-8 marqués par la fluorescéine préparés dans l'exemple 7 ( 5) et on fait réagir à 37 C pendant une heure Par lavage soigneux avec du PBS, on élimine les anticorps n'ayant pas réagi On observe la fluorescence de la lame avec un microscope à fluorescence (Olympus Vanox, Olympus, Japon) On observe une fluorescence sur Candida albicans ATCC 752. On effectue une expérience semblable avec les anticorps marqués par la rhodamine préparés dans l'exemple 7 ( 6) et on observe une fluorescence sur Candida albicans ATCC 752. De façon semblable, on fixe aux champignons échantillons chaque anticorps marqué par la biotine pré- paré dans l'exemple 7 ( 7), on lave soigneusement avec du PBS, on ajoute une goutte d'une solution à 5 pg/ml d'avi- dine liée à la fluorescéine (Funakoshi Yakuhin, Japon) et on fait réagir à 37 C pendant une heure Après lavage soi- gneux au PBS, on observe une fluorescence au microscope à fluorescence sur la lame de Candide albicans ATCC 752. ( 3) Identification par détermination immuno-enzymatique. On introduit 0,3 ml d'une suspension des cellules du champignon échantillon dans un tube à essai s-4 liconé de 1,2 cm de diamètre et on centrifuge à 1 000 x g pendant minutes Après avoir éliminé le surnageant, on ajoute 0,5 ml de solution diluée au 1/100 avec du sérum de cheval des anticorps marqués par la peroxydase, la phosphatase alcaline ou la egalactosidase préparés en ( 1), ( 2) ou ( 3) de l'exemple 7 et on fait réagir à 37 C pendant une heure. Après réaction, on lave 5 fois le mélange réactionnel avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % et on ajoute 1 ml de solution échantillon. Plus particulièrement, dans l'anticorps marqué par la peroxydase, on ajoute 1 ml de tampon citrate 0,1 M (p H 4,5) contenant 1 mg/ml d'ophénylènediamine et 0,04 % (v/v) de peroxyde d'hydrogène aqueux à 31 %, on fait réagir à la température ordinaire pendant 30 minutes puis on ajoute 0,5 ml d'acide sulfurique à 12,5 % pour arrêter la réaction et on mesure l'absorption à 492 nm. On ajoute à l'anticorps marqué par la phosphatase alcaline 1 ml d'une solution substrat (p H 9,8) contenant 1 mg/ml de phosphate de pnitrophényle (Sigma, USA), 9,7 % (v/v) de diéthanolamine et 0,01 % de Mg C 12 6 H 20, on fait réagir à la température ordinaire pendant 30 minutes puis on ajoute 0,5 ml d'hydroxyde de sodium 5 M pour arrêter la réaction et on mesure l'absorption à 405 nm. A l'anticorps marqué par la -galactosidase, on ajoute 1 ml de tampon borate (p H 8,5) contenant 1 mg/ml de 4-méthylombelliféryl-e-galactoside, on fait réagir à 30 CC pendant 10 minutes puis on ajoute 0,5 ml de tampon glycine- hydroxyde de sodium 0,1 M (p H 10,3) pour arrêter la réac- tion et on mesure la quantité de 4-méthylombelliférone li- bérée avec le spectrofluoromètre HITACHI ( 360 nm comme longueur d'onde d'excitation et 450 nm comme longueur d'onde d'émission, HITACHI, JAPON). Les anticorps à marquage enzymatique de l'inven- tion réagissent avec Candida albicans ATCC 752. ( 4) Identification par détermination radio-immumneloqiaue. * On met les champignons échantillohs en suspension dans du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % On introduit 1 ml de la suspension dans un tube à essai siliconé de 1,2 cm de diamètre et on centrifuge à 1 000 x g pendant minutes pour obtenir un culot cellulaire Après avoir lavé deux fois le culot cellulaire avec du PBS contenant du Tween 20 (R), à 0,05 % On ajoute 50 pi de l'anticorps marqué au 125 I préparé dans l'exemple 7 ( 4) (activité spécifique 1 p Ci/mg d'anticorps) et on fait réagir à 37 C pendant une heure Après avoir lavé 5 fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 %, on mesure la radio- activité fixée aux champignons échantillons avec un comp- teur gamma (Beckman Gamma 8500, Beckman, USA). On observe une radio-activité plus importante sur Candida albicans ATCC 752 comme le montre le tableau 3 dans le cas de l'anticorps marqué au 125 I de l'invention. TABLEAU 3 r Radioactivité fixée aux cellules (c p m) Anticorps marqués \ Anticorps Anticorps Anticorps Anticorps Immunoglobu- 125 125 125 lines de sou- Champignons I-CD-1 I-CD_ 4 12 I-CD-6 12 I-CD-8 rines marqde souées échantillons au 125 I Candida albicans ATCC 752 8900 10400 13600 11000 630 Candida tropicalis ATCC 750 760 890 672 700 790 Candida guilliermondii 53 916 778 855 575 IFO 0679530 916 778 855 575 j-. tn o o Exemple 9. On ensemence des milieux gélosés glucoses de Sabouraud avec les urines de trois malades éventuellement atteints de candidose des voies urinaires et avec Candida albicans ATCC 752 et on incube à 37 C pendant 5 jours On prélève avec une anse de platine les colonies semblables à des levures apparaissant sur la boite de gélose, on les met en suspension dans 3 ml de PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % et on homogénéise dans un homogénéiseur, puis on utilise la suspension cellulaire obtenue comme échantillon. ( 1) Identification par détermination immuno-enzymatiqcue. On introduit 0,3 ml de suspension cellulaire dans un tube à essai siliconé de 1,2 cm de diamètre et on cen- trifuge ( 1 000 x g, 5 minutes) Après élimination du sur- nageant, on ajoute 0,5 ml d'une solution diluée à 1/100 avec du sérum de cheval d'anticorps marqués par la peroxy- dase, la phosphatase alcaline ou la e-galactosidase prépa- rés en ( 1), ( 2) ou ( 3) de l'exemple 7 et on fait réagir à 370 C pendant une heure On lave le mélange réactionnel 5 fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % On ajoute ensuite 1 ml de la solution échantillon. Plus particulièrement, on ajoute à l'anticorps marqué par la peroxydase 1 ml de tampon citrate 0,1 M (p H 4,5) contenant 1 mg/ml d'ophénylènediamine et 0,04 % (v/v) d'une solution aqueuse à 31 % de peroxyde d'hydrogène et on fait réagir à la température ordinaire pendant 30 minutes, on ajoute ensuite 0,5 ml d'acide sulfurique à 12,5 % pour arrêter la réaction et on mesure l'absorption à 492 nm. On ajoute à l'anticorps marqué par la phospha- tase alcaline 1 ml d'une solution substrat (p H 9,8) conte- nant 1 mg/ml de phosphate de p-nitrophényle (Sigma, USA), 9,7 % (v/v) de diéthanolamine et 0,01 % de chlorure de magnésium hexahydraté et on fait réagir à la température ordinaire pendant 30 minutes On ajoute ensuite 0, 5 ml d'hydroxyde de sodium 5 M pour arrêter la réaction et on mesure l'absorption à 405 nm. On ajoute à l'anticorps marqué par la 8-galacto- sidase 1 ml de tampon borate (p H 8,5) contenant 1 mg/ml de 4méthylombelliféryl-e-galactoside et on fait réagir à 300 C pendant 10 minutes, on ajoute ensuite 0,5 ml de tampon glycine-hydroxyde de sodium 0, 1 M (p H 10,3) pour arrêter la réaction et on mesure la quantité de 4-méthylombellifé- rone libre avec un spectrofluoromètre HITACHI ( 360 nm comme longueur d'onde d'excitation et 450 nm comme longueur d'on- de d'émission, HITACHI, JAPON). Les résultats figurent dans le tableau 4. ( 2) Identification avec un anticorps fluorescent. On étale la suspension cellulaire sur une lame de verre, on fixe avec de la formaline à 1,0 % pendant une nuit et on lave au PBS On ajoute une goutte d'une solu- tion, diluée au 1/100 avec du sérum de cheval, d'anticorps marqués par la fluorescéine, la rhodamine ou la biotine préparés en ( 5), ( 6) ou ( 7) de l'exemple 7, on fait réagir à 370 C pendant une heure et on lave soigneusement avec du PBS pour éliminer les anticorps n'ayant pas réagi. Dans le cas de l'anticorps marqué par la fluores- céine ou la rhodamine, on recherche la présence d'une fluorescence des champignons échantillons avec un microsco- pe à-fluorescence (Olympus Vanox, Olympus, Japon) sur la lame. Dans le cas de l'anticorps marqué par la biotine, on ajoute une goutte d'avidine D fixée à de la fluorescéine à 5 pg/ml (Funakoshi Yakuhin, Japon), on fait réagir à la température ordinaire pendant une heure et on lave soigneu- sement avec du PBS On recherche avec un microscope à fluorescence la présence d'une fluorescence sur la lame. Les résultats figurent dans le tableau 4. D'autre part, on identifie les colonies prove- nant des urines des malades F et G comme étant Candida albicans par des déterminations morphologiques et biochi- miques effectuées simultanément, en complet accord avec les résultats obtenus avec les anticorps marqués De plus, les colonies provenant de l'urine du malade H sont identi- fiées comme Saccharomyces cerevisiae. TABLEAU 4 Mé I Réactif utilisé Echantillon thode Source dl *urine du urine du urine du Candida albicans Marqueur anticorps patient F patient G patient H ATCC 752 CD-1 +( 492 nm>+ CD-4 + - +{ le) -( le + logi alcaline CD-6 +( +( " *+ CD-1 + + -+ e-galactosidase D-4 + + + CD-6 + + -+ u CD-8 + ±+ CD-1 + + -+ Tech fluorescéine CD-4 + + nique CD-6 + + -+ à CD-8 + + -+ anti- corps CD-1 + + -+ fluo rh odamine CD-4 + + -+ res CD-6 + + -+ cent CD-8 + + -+ CD-1 + ±+ biotin_ CD-4 + + -+ CD-6 + + -+ CD-8 + + -+ + absorption ou fluorescence positive absorption ou fluorescence négative. tn % O NO Exemple 10. On met en suspension dans du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % 20 ml d'urine de deux malades éven- tuellement atteints de candidose des voies urinaires et une petite quantité de Candida albicans ATCC 752 On verse 1 ml de la suspension dans un tube à essai siliconé de 1,2 cm de diamètre et on centrifuge ( 1 500 x g, 20 minutes) pour obtenir un culot cellulaire. Après avoir lavé deux fois le culot cellulaire avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 %, 50 pl d'an- ticorps marqués au 125 I préparés dans l'exemple 7 ( 4) (ac- tivité spécifique, 1 p Ci/mg d'anticorps) ou des immuno- globulines de souris marquées au 125 I (activité spécifique, 1,5 p Ci/mg de protéines) et on fait réagir à 37 C pendant une heure Après avoir lavé cinq fois avec du PBS conte- nant du Tween 20 (R) à 0,05 %, on mesure la radio-activité avec un compteur gamma (Beckman Gamma 8500, Beckman, USA). Simultanément, on ensemence avec les cellules échantillons un milieu gélosé glucosé de Sabouraud et on incube à 37 C pendant 5 jours, puis on effectue un examen morphologique et biochimique des colonies obtenues. Les résultats figurent dans le tableau 5. Comme le montre le tableau 5, les échantillons se fixent aux anticorps marqués par le 125 I, ce qui indi- que qu'ils contiennent Candida albicans D'autre part, les déterminations morphologiques et biochimiques simultanées montrent que les échantillons contiennent Candida albicans. TABLEAU 5 Anticorps Radioactivité (c p m) utilisé Anticorps de CD-1 Immunoglobulines marqué au 125 I de souris mar- Echantillon quées au 125 I Urine du 313 155 patient F Urine du 422 147 patient G Candida albicans 844 172 ATCC 752 Exemple 11 Effet curatif des anticorps sur les candidoses. On inocule par voie intrapéritonéale à des grou- pes de 15 souris femelles BALB/c àgées de 8 semaines (NIHON CHARLES RIVER, JAPON) Candida albicans ATCC 752 ( 5 x 106 unités formatrices de colonies) Après 3 semaines, on administre par voie intraveineuse 0,2 ml de solution d'anticorps sécrétés par les hybridomes CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5, CD-6, CD-7, CD-8 ou CD-9 (titre d'agglutina- tion 1/512) Après 2 heures, on injecte par voie intravei- neuse une quantité létale de Candida albicans ATCC 752 ( 5 x 107 unités formatrices de colonies) et on observe pendant 14 jours la mortalité due à l'infection,. Les résultats figurent dans le tableau 6. Comme le montre le tableau 6, tous les animaux auxquels l'anticorps n'a pas été administré meurent, tan- dis que dans le groupe ayant reçu l'anticorps, un certain nombre de souris survivent, ce qui indique l'effet théra- peutique net de l'anticorps sur les maladies infectieuses provoquées par des champignons du genre Candida. TABLEAU 6 Survivants / Animaux totaux Témoin (non traité) 0/15 Traité avec les anticorps des hybridomes CD-1 5/15 " CD-2 6/15 " CD-3 7/15 CD-4 4/15 l" CD-5 5/15 la CD-6 6/15 " CD-7 4/15 " CD-8 8/15 " CD-9 6/15 O Nombre d'animaux survivant 14 jours après l'inoculation d'une quantité létale de Candida albicans. Exemple 12 Accroissement de la phagocytose des macrophaaes intrapéritonéaux par des anticorps. On administre 1 ml de glycogène à 0,1 % (Kanto Chemical, Japon) par voie intrapéritonéale à des souris femelles BALB/c de 8 semaines (NIHON CHARLES RIVER, JAPON). Après 4 jours, on tue les souris On entraîne par lavage avec du milieu RPMI 1640 contenant du sérum de veau foetal à 10 % les cellules ayant traversé le péritoine et on les recueille par centrifugation ( 500 x g, 5 minutes) O met les cellules en suspension dans du milieu RPMI 1640 conte- nant du sérum de veau foetal à 10 %, on ajuste à 1 x 106, on place dans une chambre de culture tissulaire (Lab-Tek Inc, USA) par portions de 1 ml et on laisse reposer à 37 C pendant 30 minutes pour que les macrophages des cel- lules ayant traversé le péritoine adhèrent au fond de la chambre On lave la chambre avec du milieu RPMI 1640 pour éliminer les cellules non adhérentes, on ajoute 1 ml de milieu RPMI 1640 contenant du sérum de veau foetal à 10 % et Candida albicans ATCC 752 à une concentration cellulaire de 1 x 106/ml et on fait réagir à 37 C pendant 2 heures. Simultanément, on ajoute les anticorps obtenus à partir des hybridomes CD-1,-CD-2, CD-3, CD-4, CD-5, CD-6, CD-7, CD-8 ou CD-9 Après lavage de la chambre avec du PBS (p H 7,2), on fixe les cellules avec de la formaline à 1,0 % On me- sure le nombre des macrophages phagocytaires par coloration de May-Gr Unwald. Les résultats figurent dans le tableau 7 Le taux de phagocytose est exprimé par le rapport des macrophages phagocytaires aux macrophages totaux. Comme le montre le tableau 7, le taux de phagocy- tose est accru d'environ 14-23 % par suite de l'addition des anticorps. TABLEAU 7 Taux de phagocytose (%) Témoin (non traité) 25 Traité avec les anticorps des hybridomes CD-1 42 CD-2 45 CD-3 40 CD-4 42 CD-5 48 CD-6 41 CD-7 42 CD-8 39 CD-9 43 Exemple 13. Après avoir par addition d'eau distillée ajusté à 10,4 mg/ml la concentration des anticorps (surnageant ascitique purifié) des hybridomes CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5, CD-6, CD-7, CD-8 ou CD-9, on ajoute 13,0 mg/ml de solution de dixéthylsulfoxyde d'amphotéricine B puis on ajoute de l'acide chlorhydrique en agitant pour ajuster le p H de la solution à 4,75 et on ajoute simultanément 3,7 mg de chlorhydrate de 1-éthyl-3-( 3-diméthylaminopro- pyl)-carbodiimide Après 1, 3 ou 4 heures de réaction, on arrête la réaction par addition de 2 ml de tampon acé- tate (p H 4,70) On dialyse ensuite le mélange réactionnel contre 5 1 d'eau distillée à 4 C pendant 72 heures en chan- geant trois fois la solution de dialyse Après concentra- tion du dialysat, on applique le mélange réactionnel à une colonne de 1,5 cm de diamètre et 55 cm de hauteur chargée de Sephadex G-25 (R) (Pharmacia, Suède) pour éliminer tota- lement les substances de bas poids moléculaire On lyophi- lise la solution obtenue à -200 C pour obtenir le produit de fixation amphotéricine B-anticorps Les quantités d'am- photéricine B fixées dans les produits par mg d'anticorps figurent dans le tableau 8. On obtient, comme précédemment indiqué, les pro- duits de fixation de la 5-fluorocytosine et des anticorps. Les quantités de 5-fluorocytosine fixées dans les produits par mg d'anticorps figurent également dans le tableau 8. D'autre part, on administre ces produits de fixa- tion d'un agent antifongique et de l'anticorps à des souris ICR à raison de 10 animaux par groupe à la dose de 2 g/kg par voie perorale, 400 mg/kg par voie intrapéritonéale ou mg/kg par voie intraveineuse On n'observe pas de mor- talité pendant 14 jours. Agent antifongique Anticorps Taux de fixation (pg/mg) l'heure 3 heures 4 heures Dérivant de CD-1 1 PO 2 O 2,5 CD-2 OP 8 118 2 P 8 CD-3 1,0 2 O 2 5 amphotéricine B CD-4 110 17 5 273 CD-5 1 O 2 3 310 CD-6 l'o ir 5 215 CD-7 173 1 P 5 -218 CD-8 110 210 2 Y 5 CD- 9 170 210 5 CD-1 ois l 8 21 5; CD-2 lO 270 218 CD-3 l'o 270 313 CD-4 113 115 278 -fluorocytosine CD-5 410 1,8 2 5 y CD-6 170 1,5 2,5 CD-7 lo 1,5 275 CD-8 11 PO it 5 2 P 3 CD-9 0118 1,3 2,5 2 '543969 ' I.ABLEAU 8 Exemple 14. On examine l'effet thérapeutique sur les maladies infectieuses des produits de fixation agent antifongique- anticorps préparés dans l'exemple 13 Pour cela, on admi- nistre par voie intraveineuse Candida albicans ATCC 752 ( 5 x 107) à des souris femelles BALB/c de 8 semaines (NIHON CHARLES RIVER, JAPON) à raison de 15 animaux par groupe et on administre les produits de fixation agent antifongique-anticorps préparés dans l'exemple 13 par réaction pendant 4 heures, par voie intraveineuse (pro- duits de fixation de l'amphotéricine B) ou par voie intra- péritonéale (produit de fixation de la 5-fluorocytosine) 1, 24 ou 48 heures après l'infection D'autre part, on administre respectivement par voie intraveineuse et pero- rale les produits comparatifs que sont l'amphotéricine B et la 5fluorocytosine Les quantités administrées des produits de fixation de l'invention sont 5 pg en amphoté- ricine B et 20 pg en 5-fluorocytosine pour chaque animal. Les résultats figurent dans le tableau 9. Comme le montre le tableau 9, les produits de fixation d'un agent antifongique de la présente invention présentent apparemment un effet thérapeutique notable dans les maladies infectieuses provoquées par Candida albicans. TABLEAU 9 survivants O/total Témoin 0/15 amphotéricine B 5 Pg (i v)4/15 Produit de fixation de l'amphotéricine B et de l'anticorps dérivant de: (i v) CD-1 8/15 CD-2 7/15 CD-3 9/15 CD-4 10/10 CD-5 8/15 CD-6 9/15 CD-7 7/15 CD-8 8/15 CD-9 8/15 -fluorocytosine 2000 ig (p o) 3/15 Produit de fixation de la 5fluorocytosine et de l'anticorps dérivant de: (i p) CD-1 7/15 CD-2 6/15 CD-3 5/15 CD-4 7/15 CD-5 8/15 CD-6 6/15 CD-7 6/15 CD-8 7/15 CD-9 6/15 O Nombre d'animaux survivant 14 jours après l'inoculation de Candida albicans. REVENDICATIONS 1 Procédé pour préparer un anticorps dirigé contre l'antigène de surface d'un champignon appartenant au genre Candida, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation d'un hybridome entre une cellule capable de produire l'anticorps et une cellule qu'on peut entretenir de façon permanente par repiquage in vitro et la récupéra- tion de l'anticorps sécrété par l'hybridome. 2 Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cellule capable de produire l'anticorps est une cellule splénique, une cellule de ganglions lylphatiques, une cel- lule leucocytaire du sang périphérique ou un de leurs mé- langes. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la cellule provient d'une souris. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la souris est une souris BALB/c ou une souris hybride correspondante. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellule qu'on peut entretenir de façon perma- nente par repiquage in vitro est une cellule de myélome. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellule qu'on peut entretenir de façon perma- nente par repiquage in vitro est déficiente en hypoxanthine- guanine phosphoribosyltransférase ou en thymidine kinase. 7 Procédé selon la revendication 5 ou 6, carac- térisé en ce que la cellule provient d'une souris. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la cellule dérive des lignées cellulaires - P 3-X 63-Ag 8, P 3-NSI/l-Ag 4-1, Sp 2/0-Agl 4 ou X 63-Ag 8 653. 9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellule capable de produire l'anticorps pro- vient d'un animal immunisé avec le champignon. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridome est préparé en présence de polyéthy- lèneglycol. 11 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridome est cultivé dans un milieu contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine pour effectuer une sélection. 12 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridome est cloné pour obtenir une clone uni- que. 13 Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le clonage est effectué par culture à dilution li- mitante, culture sur gélose molle ou culture sur gel de fi- brine. 14 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridome est cultivé in vitro pour la sécré- tion de l'anticorps. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridome est transplanté à un animal et cultivé in vivo et en ce que l'anticorps sécrété est séparé d'une humeur de l'organisme de l'animal. 16 Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'humeur est le sérum ou le liquide d'ascite. 17 Procédé selon la revendication 15 ou 16, ca- ractérisé en ce que l'animal est une souris. 18 Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la souris est une souris BALB/c ou une souris hy- bride correspondante. 19 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 18, caractérisé en ce que le champignon est une souche de Candida albicans. 20 Hybridome produisant un anticorps dirigé con- tre l'antigène de surface d'un champignon appartenant au genre Candida, caractérisé en ce qu'on l'a préparé à partir d'une cellule capable de produire l'anticorps et d'une cel- lule pouvant être entretenue de façon permanente par repi- quage in vitro. 21 Hybridome selon la revendication 20, caracté- risé en ce qu'il est l'hybridome CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5, CD-6, CD-7, CD-8 ou CD-9. 22 Anticorps dirigé contre l'antigène de surface d'un diampignon appartenant au genre Candida, caractérisé en ce qu'on l'a préparé selon le procédé de la revendica- tion 1. 23 Anticorps selon la revendication 22, caracté- risé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5, CD-6, CD-7, CD-8 ou CD-9. 24 Anticorps dirigé contre l'antigène de surface d'une souche de Candida albicans, car-ctérisé en ce qu'il est sécrété par l'hybridome CD-1, CD-4, CD-6 ou CD-8. Anticorps dirigé contre l'antigène de surface d'une souche de Candida albicans, Candida tropicalis, Candida auilliermondii, Candida krusei, Candida parapsilo- sis et Candida pseudotropicalis, caractérisé en ee qu'il est sécrété par l'hybridome CD-2, CD-5, CD-7 ou CD-9. 26 Réactif pour la classification et/ou l'iden- tification d'un champignon appartenant au genre Candida, caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs anticorps selon la revendication 22. 27 Réactif selon la revendication 26, caractéri- sé en ce qu'il contient de plus un support ou un diluant. 28 Réactif pour la classification et/ou l'iden- tification d'une souche de Candida albicans, caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs anticorps selon la revendication 24. 29 Réactif selon la revendication 26,= 1 i 28, ca- ractérisé en ce qu'il convient à l'identification des can- didoses humaines ou animales. Dérivé ou produit de restriction de l'anti- corps selon la revendication 22. 31 Dérivé selon la revendication 30, caractéri- sé en ce qu'une substance radio-active, un colorant fluo- rescent, une enzyme un marqueur pour microscopie électro- nique ou un groupe résiduel contenant une structure permet- tant une combinaison secondaire est unie chimiquement à l'anticorps. 32 Produit de restriction selon la revendication , caractérisé en ce qu'on l'a obtenu par clivage respec- tif de l'anticorps par traitement chimique ou enzymatique. 33 Dérivé selon la revendication 31, caractérisé en ce que la substance radio-active est 125 I. 34 Dérivé selon la revendication 31, caractérisé en ce que le colorant fluorescent est la fluorescéine ou la rhodamine. Dérivé selon la revendication 31, caractérisé en ce que l'enzyme est une peroxydase, une phosphatase al- caline ou une 0-galactosidase. 36 Dérivé selon la revendication 31, caractérisé en ce que la structure est la biotine. 37 Réactif pour la classification et/ou l'iden- tification d'un champignon appartenant au genre Candida, caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs dérivés ou produits de restriction selon la revendication 30. 38 Réactif selon la revendication 37, caractéri- sé en ce qu'il contient de plus un support ou un diluant. 39 Procédé de classification et/ou d'identifica- tion d'un champignon appartenant au genre Candida, caracté- risé par l'utilisation du réactif selon la revendication 26 ou 37. Procédé selon la revendication 39, caractéri- sé en ce que l'échantillon contenant le champigpon est mis en contact avec le réactif et en ce qu'on utilise la réac- tion d'agglutination. 41 Procédé selon la revendication 39, caractéri- sé en ce que l'échantillon contenant le champignon est mis en contact avec le réactif et en ce qu'on utilise une réac- tion antigène-anticorps autre que la réaction d'agglutina- tion. 42 Procédé selon la revendication 40 ou 41, ca- ractérisé en ce que l'échantillon-est d'origine humaine ou -animale. 43 Médicament contre les candidoses, caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs anticorps selon la re- vendication 22. 44 Médicament selon la revendication 43, carac- térisé en ce qu'il contient de plus un support ou un di- luant. Produit de fixation de l'anticorps de la re- vendication 22 avec un agent antifongique. 46 Produit selon la revendication 45, caractéri- sé en ce que l'agent antifongique est l'amphotéricine B ou la 5-fluorocytosine. 47 Médicament contre les candidoses, caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs produits de fixation selon la revendication 45.