Brevet FR2544318A1 — publié le 19841019

La présente invention, réalisée au Centre de Recherches PIERRE FABLES est relative a un nouveau procédé d'extraction qui permet d'obtenir industriellement et avec de bons rendements la vindoline et la catharanthine. La vindoline (mAthoxycarbonyl 3 acétyl 4 didéhydro 6-7 hydroxy-3-méthoxy 16 méthyl 1 aspidosper- midine) est un alcaloïde dihydro indolique de formule La catharanthine (méthoxycarbonyl 18 didéhydro 3-4 ibogamine) est un alcaloïde indolique de formule Ces deux alcaloldes, bien que n'étant pas utilisés directement en thérapeutique humaine,présentent un très grand intérêt, car ils constituent la matière première pour accéder par hémisynthèse à de nombreux alcaloïdes bisindoliques antitumoraux, parmi lesquels on peut citer à titre d'exemple la vincaleucoblastine (Pr. POTIER et Coll. J.Am. Chem. Soc. 1979,101- 8, p. 2243) et la Nor 5' anhydrovinblastine (EP-A-O 010 458). Les deux alcaloides, dont la préparation constitue l'objet de la présente invention, sont présents dans diverses espèces végétales de la famille des Apocynacées, en particulier du genre Catharanthus, tel que Catharanthus roseus, Catharanthus ovalis, Catharanthus longifolius, et plus particulièrement dans les parties aériennes de ces espèces végétales. Dans ce domaine particulier l'état de la technique antérieure est très peu développé contrairement à la littérature abondante qu'a suscite lextraction des alcaloïdes bisindoliques. Pour illustrer cet état de la technique, on retiendra cependant la méthode d'extraction et de séparation des alcaloïdes employée par SVOBODA et Coll. (J. Am. Assoc. Sci. Ed. 48,659) ainsi que BE-A- 867 670. Ces techniques antérieures reposent sur des extractions liquide-liquide â pH contrôlé suivies de chromatographies et de cristallisation des alcaloïdes ainsi séparés. La présente invention permet, en particulier dans l'optique des réactions de couplage vindolinecatharanthine, d'obtenir un mélange de ces deux alcaloïdes suffisamment purs pour pouvoir être utilisé directement en synthèse. En effet, le N-oxyde de vindoline ne se formant pas, il est possible d'effectuer le couplage en partant directement du mélange de ces deux alcaloldes sans passer par l'isolement de chacun d'eux. En outre, l'invention simplifie les procédés précédemment décrits et permet d'obtenir rapidement la catharanthine et la vindoline en les cristallisant directement et sélectivement de leur mélange alcaloidique. Elle permet également d'isoler une fraction d'alcaloides bisindoliques de laquelle peuvent être extraites selon les procédés classiques la vinblastine, la vincristine et la leurosine. Le procédé objet de la présente invention se caractérise par l'ensemble des opérations successives suivantes extraction d'une espèce végétale de la famille des Apocynacées par un solvant organique . concentration de l'extrait obtenu et reprise éven tutelle de l'extrait par un solvant organique non entièrement miscible à l'eau . extraction liquide-liquide de la phase organique par une solution aqueuse acide lavage de la solution aqueuse acide par un solvant organique apolaire . neutralisation de la phase aqueuse et extraction par un solvant organique non miscible à l'eau concentration à extrait sec des alcaloïdes totaux, et . isolement de la fraction alcaloldique vindoline+ catharanthine par chromatographie liquide. D'autres caractéristiques additionnelles du procédé conforme à l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée faite ci-après notamment en référence à des exemples de mise en oeuvre particuliers. Le procédé, objet de la présente invention, peut être subdivisé en les trois étapes essentielles suivantes 1) Extraction du végétal Cette étape consiste en une extraction directe de la plante soit - par des alcools aliphatiques contenant de 1 à 4 atomes de carbone ou par leurs mélanges avec de l'eau dans des proportions allant jusqu'a environ 50 % en volume d'eau, le pH pouvant éventuellement être amené entre 2 et 7 par addition d'un acide organique, tel que tartrique, citrique, oxalique ou d'un acide minéral, tel que phosphorique, chlorhydrique, sulfurique - par des esters organiques, tels que l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle et l'acétate d'iso propyle, - par des solvants hydrocarbonés chlorés, tels que le chlorure de méthylène, le chloroforme et le dichloroéthane 2) Obtention des alcaloldes totaux Cette étape peut être décomposée en plusieurs opérations a) L'extrait précédent est concentré et repris par un solvant non entièrement miscible a l'eau, tel que les esters organiques et les solvants hydrocarbonés chlorés cités précédemment. Cette opération de reprise est toutefois supprimée lorsque le solvant d'extraction initial n'est pas miscible à l'eau. Il n'y a alors pas de changement de solvant. b) La phase organique obtenue est extraite par une solution aqueuse dont le pH est sensiblement compris entre 1 et 4 et qui est obtenue par dilution d'un acide minéral ou organique parmi lesquels on peut citer a titre d'exemples, les acides sulfurique, chlorhydrique, phosphorique, acétique, tartrique et citrique. c) Lavage de la solution aqueuse par un solvant orga nique non polaire tel que l'hexane ou l'éther de pétrole. d) Neutralisation de la phase aqueuse par un agent alcalin et extraction par un solvant organique non miscible à l'eau, tel que les esters et les solvants hydrocarbonés chlorés précités. e) Obtention des alcaloides totaux par concentration sous pression réduite du solvant organique. 3) Isolement des alcaloïdes Cette étape peut être decomposée elle-même en deux opérations a) Isolement de la fraction alcaloidique vindoline + catharanthine par chromatographie liquide. On utilisera à cet effet une chromatographie sur silice et/ou une chromatographie sur alumine basique ou neutre, l'élution étant réalisée a l'aide d'un solvant ou deun mélange de solvants de polarité convenablement choisie. b) Séparation éventuelle des alcaloïdes par cristalli sation fractionnée sous forme soit de bases,soit de sels. On citera a titre d'exemples non limitatifs la cristallisation de la vindoline base dans l'éther éthylique, de la catharanthine base dans l'acétone contenant jusqu't environ 10 % d'eau, et de la catharanthine sulfate dans l'éthanol, le méthanol ou l'eau. La vindoline ainsi obtenue peut en outre etre purifiée par exemple par filtration sur colonne d'alumine basique. Le procédé, objet de la présente invention, sera décrit plus en détail à propos de quelques exemples non limitatifs suivants I) Extraction du végétal a) ExemEle type 10 kg de feuilles de Vinca rosea convenablement broyées sont extraits par 60 litres de méthanol a tempé rature ambiante pendant une heure. Après séparation de l'extrait, on effectue une deuxième extraction avec 40 litres de méthanol et l'on rince le marc résiduel par 20 litres de méthanol. Les phases méthanoliques sont groupées. b) Variante i 10 kg de feuilles de Vinca rosea, convenablement broyées, sont extraits par 60 litres de chlorure de méthylène à température ambiante pendant une heure. Après séparation de l'extrait, deux nouvelles extractions sont effectuées dans des conditions identiques a la première. Les extraits sont alors groupes. c) Variante Il 10 kg de feuilles de Vinca rosea convenablement broyées, sont extraits suivant les conditions ci-dessus par un mélange méthanol-eau tartrique 1 % dans les pro portions de 55 % - 45 t. II) Obtention des alcaloides totaux a) ExemEle type Les jus d'extraction méthanolique, groupés, sont portés à extrait mou, sous vide à une température d'environ 400C. L'extrait mou est repris par 10 litres d'acétate d'éthyle, puis extrait par trois fois 10 litres d'acide sulfurique 0,5 N. Les phases sulfuriques, groupées,sont extraites par 5 litres d'hexane, puis ramenées a pH 7 par addition de soude après addition de 20 litres de chlorure de méthylène. Après agitation puis décantation, la phase organique est soutirée, puis la phase aqueuse est réextraite par 20 litres de chlorure de méthylène.Les phases organiques groupées sont séchées sur sulfate de sodium, puis concentrées a extrait sec sous vide a une température inférieure à 500C pour obtenir"les alcaloides totaux". b) Variante I Le procédé est réalisé selon ltexemple IIa), mais l'extrait méthanolique est repris par le chlorure de méthylène. c) Variante Il Le procédé consiste a extraire la solution hydroalcoolique acide après concentration, clarification et neutralisation, par du chlorure de méthylène dans les proportions indiquées ci-dessus. III) Isolement des alcalòides a) Premier exemEle Les alcaloïdes totaux, 80g, obtenus selon II a), sont chromatographiés sur gel de silice (500g). Un mélange chlorure àe-méthylène-acétate d'éthyle (80-20) élue la fraction alcaloldique vindoline + catharanthine. L'élution par l'acétone permet d'obtenir une fraction alcaloidique contenant la vinblastine. La fraction vindoline + catharanthine est concentrée et reprise sur 100 ml d'éther éthylique. On obtient par cristallisation 6,3g de vindoline base. Le filtrat, concentré, est filtré sur colonne d'alumine basique (100g) et élué par l'éther isopropylique. L'éther isopropylique est concentré sur de l'acétone et l'on cristallise de la solution 4,4g de catharanthine base. Le filtrat peut être retraité pour obtenir des seconds jets de vindoline et catharanthine selon le même procédé que ci-dessus. b) Deuxieme exemEle La fraction alcaloidique vindoline + catharanthine obtenue-selon III a) est reprise par 50 ml de toluène et extraite par deux fois 100 ml d'acide sulfurique 0,5 N. Le sulfate de catharanthine (4,7g) cristallise de la phase aqueuse acide. Le filtrat est neutralisé par addition de carbonate de sodium, puis extrait par trais fois 100 ml de chlorure de méthylène. Les phases organiques groupées sont séchées sur sulfate de sodium, concentrées et reprises par 50 ml d'éther éthylique. La vindoline (5,6g) base cristallise de la solution éthérée. Les alcaloses obtenus selon ces deux méthodes sont isolés par filtration sous vide, puis séchés a l'étuve sous vide à une température inférieure à 600C jusqu'a poids constant. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de vindoline et de catharanthine, caractérisé en ce que l'on réalise les opérations successives suivantes . extraction d'une espèce végétale de la famille des Apocynacées par un solvant organique . concentration de l'extrait obtenu et reprise éven tuelle de l'extrait par un solvant organique non entièrement miscible a l'eau . extraction liquide-liquide de la phase organique par une solution aqueuse acide . lavage de la solution aqueuse acide par un solvant organique apolaire . neutralisation de la phase aqueuse et extraction par un solvant organique non miscible à l'eau . concentration à extrait sec des alcaloïdes totaux, et . isolement de la fraction alcaloldique vindoline + catharanthine par chromatographie liquide. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce que l'espèce végétale de la famille des Apocynacées est le Catharanthus et plus particulièrement Catharanthus roseus, Catharanthus ovalis ou Catharanthus longifolius. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractdris en ce que le solvant d'extraction est choisi parmi - les alcools aliphatiques contenant de l a 4 atomes de carbone ou leursmélanges avec de l'eau dans des proportions allant jusqu'a 50 % en volume d'eau, le pH pouvant éventuellement être amené entre 2 et 7 par addition d'un acide - les esters organiques, tels que l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle et l'acétate d'isopropyle - les solvants hydrocarbonés chlorés, tels que le chlorure de méthylène, le chloroforme et le dichloroéthane. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 a 3, caractérisé en ce que l'extrait végétal est obtenu a l'aide d'un solvant organique miscible a l'eau, et en ce qu'après concentration de l'extrait ainsi obtenu, ce dernier est repris par un second solvant organique non entièrement miscible a l'eau, notamment choisi parmi les esters organiques,tels que les acétates de méthyle, d'éthyle et d'isopropyle, et les solvants hydrocarbonés chlorés, tels que le chlorure de méthylène, le chloroforme et le dichloroéthane. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'extraction liquide-liquide est réalisée par une solution aqueuse acide dont le pH est sensiblement compris entre 1 et 4 et qui est obtenue å partir d'un acide minéral ou organique, en particulier l'acide sulfurique ou l'acide chlorhydrique. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 a 5, caractérisé en ce que la solution aqueuse acide est lavée par un solvant organique apolaire choisi parmi l'hexane et l'éther de pétrole. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 a 6, caractérisé en ce que la phase acide est neutralisée par un agent alcalin, en particulier la soude ou le carbonate de sodium, puis est extraite par un solvant organique non entièrement miscible à l'eau, notamment choisi parmi les esters organiques, tels que les acétates de méthyle, d'éthyle et d'isopropyle, et les solvants hydrocarbonés chlorés, tels que le chlorure de méthylène, le chloroforme et le dichloroéthane. 8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'isolement de la fraction alca nordique vindoline + catharanthine est obtenu par chromatographie liquide sur gel de silice ou sur alumine basique ou neutre. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on sépare par cristallisation le mélange alcaloldique obtenu vindoline + catharanthine. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la vindoline cristallise du mélange alcaloldique en solution dans l'éther éthylique. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le filtrat de cristallisation de la vindoline est purifié par filtration sur colonne d'alumine basique. 12) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la catharanthine est cristallisée par reprise du mélange alcaloidique dans une solution sulfurique sous forme de sulfate de catharanthine. 13) Procédé selon la revendication 9, caracté-risé en ce que la catharanthine base cristallise dans l'acétone contenant jusqu'd 10 % d'eau.