Brevet FR2540514A1 — publié le 19840810

DISPOSITIF POUR L'IDENTIFICATION DE MICRO-ORGANISMES. La présente invention concerne un dispositif pour l'identification de micro-organismes, basé sur des essais biochimiqsues Plus particulirement, la présente invention concerne un dispositif pour l'identification de micro-orga- nismes, qui est composé par une série de récipients qui con- tiennent chacun des réactifs pour l'identification desdits microorganismes,et qui sont réunis sur un seul support sur lequel est indiauée également une série de marques réunis- sant tous les récipients dans lesquels tous les essais bio- chimiques ont lieu, marques qui suffisent à identifier un micro-organisme spécifique. Les marques ont des longueurs F des couleurs et/ou des formes graphiques différentes, et peuvent également être partiellement remplacées par des symboles et/ou par des nombres 7 Le dispositif a de préférence un pourtour circulaire et les récipients ont de préférence la forme de tubes à essais. Afin de rendre le dispositif plus facile à utiliser, le nom du micro-organisme à identifier peut être écrit le long de la marque d'identification. Les réactifs pour les essais biochimiques placés dans les récipients peuvent être sous forme de produits secs, lyophilisés, solides et également comprimés, ou sous la forme d'une solution. Les récipients peuvent faire corps avec le disposi- tif lui-même ou bien ils peuvent être fixes sur la surface supérieure (dessus) du dispositif en question par collage ou par insertion Le dispositif peut également être muni d'un trou central qui est de préférence circulaire. Dans le cas en étude, on décrira à titre d'exemple non limitatif l'application d'un tel dispositif à lidentifi- cation d'espèces pathogènes du genre Candida, Un grand nombre d'espèces Candida, et toutes les espèces pathogènes parmi celles-ci, sont des espèces commen- sales apparaissant fréquemment dans les cavités naturelles à leintérieur du corps humain Ces espèces, dans des conditions de prédisposition du système, sont capables d'engendrer par un mécanisme endogène un certain nombre de phénomènes patho- lo O aiues - En plus du Candida albicans, qui est l'espèce la plus fréquemment isolée, un certain caractère pathogène est admis pour au moins six espèces différentes, c'est-à-dire * Candida stellatoidea, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida guillermondii, Candida parapsilosis. Par conséquent, du point de vue du diagnostic, une fois que la souche de Candida a été isolée, il est nécessaire de déterminer si on a à faire à une espèce-pathogène pour l'homme. L'identification de l'espèce à laquelle le micro- organisme concerné appartient est faite en ayànt recours à des essais biochimiques tels que: a) Assimilation-de quelques sucres dans un milieu de culture qui ne contient pas d'autres sources de carbone (auxanogram- me de C); ' - b) Essais de fermentation pour quelques sucres, et c) Développement en présence de certaines substances. Les essais d'assimilation sont effectués en préparant avec la suspension de la souche à identifier et l'auxano- gramme de C spécifique du milieu, un agar-agar germinatif. Sur ce dernier, sont déposés soit des disques de papier qui ont été imbibés juste au moment de l'utilisation avec dif- férentes solutions de sucres, soit des disques de papier sur lesquels sont déposés les sucres en question à l'état sec, soit, également des godets de porcelaine contenant les solutions de sucres. On peut utiliser des plaques pour un usage spécifique, dont la surface inférieure est subdivisée en secteurs par des cloisons Si une plaque spécifique est utilisée, la subdivision en secteurs existe déjà et l'opérateur n'a pas à la faire, il lui suffit seulement d'inscrire le symbole des sucres à essayer. Les résultats des essais d'assimilation sont lus après une incubation de 24 à 48 heures à 25 C-37 C Quand des halos de développement sont observés autour des sucres d'assimilation,on considère que ces halos représentent des résultats d'essais positifs et on leur attribue des signes (+), tandis que l'absence de halos est indiquée par le signe (-). Les essais de fermentation sont habituellement ef- fectués après avoir réalisé l'auxanogramme, parce qu'ils complètent le dernier essai: en fait, un sucre qui n'a pas été assimilé ne peut pas avoir fermenté Seuls, les sucres assimilés sont donc déterminés. Les essais peuvent être préparés dans de l'eau con- tenant la levure ou dans des solutions contenant des facteurs vitaminiques à une concentration choisie au préa- lable et avec une concentration appropriée du sucre à es- sayer Afin de mettre en évidence le dégagement de gaz, on peut utiliser des calottes de barbotage Durham, ou un mélange de sciure de paraffine et de vaseline. La réalisation de ces essais nécessite l'inocula- tion de la suspension à essayer, son incubation à 25 QC-37 C et des lectures quotidiennes des résultats jusqu'à 10 jours d'incubation. Ensuite, il est possible d'identifier les espèces en se référant à des tableaux préparés spécialement et men- tionnésdans un grand nombre de livres de références, parmi lesquels on peut citer l'ouvrage suivant: J Lodder, 1970 Edn, The Yeast, North Holland Publishing Co, Amsterdam. Les essais d'assimilation et de fermentation des hydrates de carbone peuvent être effectués avec des équipements du commerce faciles à utiliser Parmi ceux-ci, le "A Pl 20 C Yeast Syrstem" (Analytab Products, Inc, New York) et le "Uni- Yeast Tek System" (Flow Diagnostics) peuvent être mentionnés. L'A Pl 20 C est constitué par un tunnel de 20 cellules, et les cellules contiennent des hydrates de carbone déshydra- tés pour les essais d'assimilation et de fermentation. Les cellules sont remplies avec une suspension du champignon à essayer, préparée dans l'agar-agar en solution et refroidie à 500 C, fournie avec l'équipement Après une incu- bation à 300 C pendant 48 à 72 heures, la fermentation des sucres est constatée, car elle est-indiquée par le changement de couleur d'un indicateur, et par la production de gaz observée par la formation de bulles. L'assimilation des hydrates de carbone est indiquée par le développement de la souche dans les cellules. Le "Uni-Yeast Tek System", par contre, est constitué par deux tubes à essai et une boîte de Pétri comportant de nombreuses cloisons Les tubes à essais contiennent les milieux de culture pour la détection-des pseudotubules germi- natives et pour l'assimilation du saccharose, respectivement, et'permettre d'identifier le C stellatoidea La boîte comprend 11 compartiments périphériques qui contiennent les milieux solides pour la fermentation des hydrates de carbone, pour la détection de l'uréase et pour l'assimilation des hydrates de carbone et des nitrates Au centre de la boîte, se trouve une petite cellule qui contient de l'agar-agar avec de la farine de mals pour déceler le'mycelium et les chlamydospores. La boîte est ensemencée avec-une goutte d'une sus- pension, dans l'eau distillée, du champignon à essayer et est mise en incubation à 250 C pendant 2 à 7 jours. Les auteurs de la présente invention ont maintenant découvert un dispositif qui permet d'identifier les espèces auxquelles appartiennent les micro-organismes, dans le cas présent, un micro-organisme appartenant au-genre Candida, d'une façon simple et efficace et qui est basé sur des essais d'assimilation et de fermentation de quelques sucres en ce qui concerne la possibilité de développement en présence de KNO 3, et avec la présence de bycloheximide en ce qui concerne l'aptitude à produire l'uréase. Le dispositif en question a de préférence un pourtour circulaire et comporte sur le dessus une série de récipients, qui ont de préférence la forme de tubes à essai, ou bien une série d'espaces creux, dont le nombre est au moins de-16 dans le cas présent, dispositif qui est prévu pour-le genre Candida. Les récipients contiennent les réactifs pour les es- sais biochimiques sous une quelconque des formes mentionnées ci-dessus. Sur le dessus du dispositif, se trouvent des marques ayant des longueurs/des couleurs et/ou-des formes graphiques différentes (remplacées également en partie par des symboles et/ou des chiffres) qui unissent tous les récipients, dans lesquelles tous les essais biochimiques ont lieu, marques qui sont suffisantes pour identifier un micro-organisme spécifiqueo. Le long de la marque, on peut inscrire le nom de l'espèce Candida à identifier. Un tel dispositif permet aux sucres à essayer d'être assimilés et de subir la fermentation, tout en assurant simul- tanément le développement en présence de KNO 3 et l'aptitude à produire l'uréase dans le cycloheximide. On peut ainsi se reporter rapidement et efficacement aux espèces à identifier. La figure unique montre un mode de réalisation pos- sible du dispositif pour identifier l'espèce pathogène de Candida Dans le dispositif se trouvent 7 marques 17-23 en arc de cercle ayant des longueurs et des couleurs dif- férentes; le type de couleur est purement et simplement oc- casionnel et est indiqué dans la liste ci-dessous, les couleurs qui sont indiquées correspondant à plusieurs espèces identifiables Jaune Candida guillermondii ( 17) Rouge Candida albicans ( 20) Vert Candida parapsilosis ( 21) Blanc Candida pseudotropicalis -( 19) Bleu-ciel Candida tropicalis ( 18) Violet Candida krusei ( 23) Orangé Candida- stellatoidea ( 22) En plus, si la maraue est un trait continu () le résultat des essais est positif, tandis que si la marque est en trait discontinu (), le résultat des essais est variable, et enfin, si la marque est absente, le résultat de l'essai est négatif. Le dispositif comporte également des symboles qui ont les significations suivantes: f pour la fermentation a pour l'acidification f/a pour la fermentation ou l'acidification -/a pour négatif ou acidification f/ pour fermentation ou négatif v pour variable Un sucre a fermenté s'il y a production d'acide et de gaz carbonique. Un sucre est dit acidifié s'il y a seulement produc- tion d'un acide. Au centre du dispositif, se trouve un trou central 24 aui, au moment o la boite de Pétri est placée, sert à déposer un certain volume d'eau afin d'humidifier l'environ- nement Les réactifs pour les essais biochimiques sont placés dans les 16 récipients de 1 à 16 inclus sous une quelconque des formes qui ont déjà été décrites et peuvent être identi- fiées après les symboles des réactifs. Les 16 récipients contiennent les réactifs suivants: Essais de fermentation: Glucose (GLU) ( 13) Maltose (MAL) ( 14) Saccharose (SAC) ( 15) Lactose (LAT) ( 16) Essais de développement KNO 3 ( 1) Cycloheximide + glucose (C EX) ( 12) Piroduction d'uréase: Urée (URE) ( 3) Essais d'assimilation: Inositol ( 4) Maltose ( 5) Tréhalose (TRE) ( 6) Glucose (GLU) ( 7) Saccharose (SAC) ( 8) Cellobiose (CEL) ( 9) Raffinose (RAF) ( 10) Lactose (LAT) ( 11) Essais témoins: Pas de réactif ( 2) (pour les essais d'assimilation de l'azote). Les indicateurs de p H peuvent être également ajoutés au réactif afin de rendre les réactions plus perceptibles. Pour l'identification des espèces pathogènes du genre Candida, le schéma du procédé est le suivant le dispositif de la figure unique est placé dans une boite de Pétri et les huit récipients contenant les sucres à essayer dans les essais d'assimilation, et mentionnés ci-des- sus, et le récipient contenant de cycloheximide sont remplis avec un milieu de culture solidifiable, ne contenant pas d'autres sources de carbone, avec ou sans indicateur de p H. Le récipient pour l'essai d'assimilation de la source d'azote et le récipient témoin (comparaison) sont remplis avec un autre milieu de culture solidifiable, avec ou sans indicateur- de p H, et sans source d'azote quelconque. On prépare ensuite la suspension du micro-organisme à essayer en la prélevant à partir d'une plaque d'isolation (par exemple Sabouraud) et avec cette suspension, on inocule tous les récipients pour les essais de fermentation énumérés ci-dessus, et également le récipient contenant l'urée est inocule, et en plus, une goutte de la suspension est déposée dans les récipients contenant les milieux de culture déjà solidifiés. Les récipients envisagés pour les essais de fermen- tation sont ensuite fermés avec de la vaseline fondue au préalable L'assemblage complet est ensuite mis en incubation à 25 OC-300 C Une fois le stade d'incubation terminé, les essais d'assimilation des sucres sont évalués:si dans l'échantillon essayé, le micro-organisme attendu existe, il se développera ou il se produira un changement de couleur de l'indicateur du p H, sinon on n'observera aucun changement. On observe la couleur de la marque réunissant l'essai d'assimilation à l'essai de développement dans le cyclohexi- mide, qui a donné des résultats positifs (développement ou changement de couleur de l'indicateur de p H) et l'espèce du genre Candida est déterminée. Par exemple, si les essais d'assimilation dans le maltose (MAL), le tréhalose (TRE), le-glucose (GLU) et que le développement dans le cycloheximide se révèle positif, cela signifie que le Candida stellatoldea (ligne orangée continue) est présent En suivant la marque colorée le long de sa cir- conférence, on lit les résultats des essais biochimiques qui confirment l'identification; dans le cas de Candida stella- toldea, les essais de fermentation pour le glucose (GLU), et le maltose (MAL) seront positifs (f), tandis que ceux du saccharose (SAC) seront négatifs (-/a). L'essai témoin sert de référence pour les essais d'assimilation de la source d'azote (KN 03). Le dispositif, objet de la présente demande, par exemple celui montré sur la figure unique, peut servir éga- lement pour l'identification d'autres levures pathogènes: leur identification est basée sur des esssais similaires effectués avec le même procédé et a lieu à l'aide d'un tableau sur lequel les résultats de ces essais ont été con- signés. Ces tableaux se trouvent dans de nombreux livres de référence spécifiques, tels que J Lodder, 1970 Edn, The Yeast, North Holland Publishing Co, Amsterdam. La présente invention est illustrée par l'exemple descriptif et non limitatif ci-après. EXEMPLE Dans le dispositif montré sur la figure unique, les réactifs pour les essais d'assimilation de sucres sont repré- sentés par des solutions de plusieurs sucres ( 20 % à 40 %) dans l'eau distillée, avec de l'alcool polyvinylique ( 1 % à 0,5 %). Le réactif pour les essais d'assimilation du nitrate de potassium est une solution de KNO 3 à la concentration de 10 % dans l'alcool polyvinylique à 1 %-0,5 %. Il n'y a aucun réactif dans la solution témoin pour l'assimilation d'azote. Le réactif pour l'essai de sensibilité au cyclohexi- mide est une solution de glucose à 20 % dans l'eau distillée et d'alcool polyvinylique ( 1 % à 0,5 %) et de cycloheximide ( 0,5 %). Pour l'essai de production de l'uréase, le réactif est 25405 4 un bouillon spécifique type Christensen avec un indicateur de p H. Les réactifs pour les essais de fermentation sont sous forme d'un bouillon spécifique classique à base d'extrait de viande de boeuf, de chlorure de sodium et d'eau distillée qui contiennent séparément chacun des sucres à la concentra- tion de 2 % et du bleu de bromothymol comme indicateur de p H. Des portions de 100 microlitres de chaque solution sont déposées dans les récipients respectifs A ce stade, le dispositif est placé dans un appareil dans lequel les réactifs subissent un cycle de séchage, par exemple sous vide. Une fois ce cycle terminé, le dispositif peut être placé dans une enveloppe en une matière appropriée telle qu'une matière plastique (seule ou dans une boite de Pétri), qui est fermée hermétiquement La stérilisation peut être effectuée soit avec de l'oxyde d'éthylèhe, soit par des rayons gamma Après cette stérilisation, le dispositif (seul ou dans une boite de Pétri) est glissé dans une enveloppe en une matière qui donne une sécurité suffisante vis-à-vis des effets de l'humidité. Le dispositif ainsi préparé peut être stocké également pendant une longue durée à + 20 C + 80 C avant d'être utilisé pour l'identification des micro-organismes. Le milieu de culture pour l'essai d'assimilation des sucres est à base d'un bouillon nutritif de levure (Y N B) (Difco), 2 % d'agar-agar, et du pourpre de bromocrésol comme indicateur de p H. Le milieu de culture pour l'essai d'assimilation de la source d'azote est à base d'un bouillon de culture de levure (Y C B) (Difco), 2 % 6 d'agar-agar et du bleu de bromothymol comme indicateur de p H. REVENDICATIONS 1 Dispositif pour l'identification de micro-orga- nismes, basé sur des essais biochimiques et constitué par une série de récipients, chacun contenant des réactifs pour 1 'i- dentification de ces micro-organismes, et assemblés sur un seul élémentsupport sur lequel une série de marques est indiquée qui relient tous les récipients dans lesquels tous les essais biochimiques ont lieu, marques qui sont suffisantes pour identifier un-micro-organisme spécifique. 2 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les réactifs-pour identifier les micro-orga- nismes peuvent être sous la forme de produits secs, lyophi- lisés ou solides, également sous forme de pastilles. 3 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les marques ont des longueurs, des couleurs et/ou des formes graphiques, différentes, et peuvent égale- ment être remplacées partiellement par des symboles et/ou des chiffres. 4 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ces récipients peuvent faire corps avec le dispositif ou ils peuvent être placés sur le dessus de celui-ci, par collage o ils peuvent y être insérés. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il peut être traversé par un trou central. 6 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le micro-organisme est une levure. 7 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le micro-organisme appartient à une espèce pathogène du genre Candida. 8 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les espèces qui sont communément considérées comme étant des espèces pathogènes du genre Candida, sont Candida albicans, Candida stellatoidea, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida guillermondii, Candida parapsilosis, et Candida pseudotropicalis. 9 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 et 8, caractérisé par le fait que les récipients placés dans 1 l le dispositif sont au nombre de 16. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 7 et 8, caractérisé par le fait que les récipients contiennent KN 03, du cycloheximide plus glucose, de l'urée, du glucose seul, du saccharose, du lactose, du maltose, du raffinose, du cellobiose, de l'inositol, du tréhalose. 11 Procédé pour la détermination de micro-organismes, caractérisé par le fait qu'il consiste à utiliser le disposi- tif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.