Brevet FR2545695A1 — publié le 19841116

Digestion microbienne des tabacs par utilisation de cultures mixtes La présente invention concerne un procédé pour trai- ter le tabac De façon plus particulière, cette invention concerne un procédé pour traiter les tiges de tabac par une culture mixte de bactéries et de champignons pour dégrader la pectine et la cellulose dans le tabac. Lorsqu'on traite le tabac pour l'utiliser dans la fabrication de produits à fumer, l'on souhaite souvent trai- ter le tabac pour en retirer les composants indésirables. Dans le traitement du tabac, diverses parties des plants de tabac, telles que parenchyme, nervures, côtes et/ou tiges, bien qu'utilisables, ne sont pas nécessairement à la dimen- sion appropriée pour être incorporées dans les produits de tabac Du fait de leur nature cellulaire rigide, les tiges, nervures et côtes exigent normalement un travail mécanique considérable pour obtenir un produit de tabac utilisable. Pour décomposer la pectine ou la cellulose, qui maintient ensemble ces segments de plants, on a proposé antérieurement la digestion microbienne Par exemple, le brevet USN 03 747 608 enseigne l'utilisation d'une culture pure d'Erwinia carotovora pour dégrader le liant pectine dans le tabac. Le brevet US N 03 513 857 décrit un traitement des tiges de tabac par utilisation d'enzymes d'hydrolyse des polysaccharides contenant une pectinase, une cellulase et une hémicellulase catalytiques Le brevet US N 03 242 214 décrit également un traitement des tiges de tabac par de l'eau dans un système d'enzymes catalytiques, ce système contenant une cellulase, une hémicellulase et une pectinase Le brevet US N 03 132 651 décrit le traitement du tabac dans un mélange aqueux avec une cellulase provenant de l'espèce fongoide Aspergillus et de traiter ensuite avec une cellulase et des enzymes protéolytiques. C'est un but de la présente invention de procurer un procédé pour dégrader simultanément la pectine et la cel- lulose des tabacs C'est un autre but de cette invention de procurer un procédé de préparation d'une culture mixte de bactéries et de champignons pour l'utiliser dans le traitemrent des tabacs D'autres buts et avantaqes de cette invention apparaîtront aux hommes de l'art à la lecture de la descrip- tion ci-après. La présente invention est basée sur la constatation que certains microorganismes en solution aqueuse, lorsqu'ils viennent en contact avec le tabac, en dégradent la fraction pectine, tandis que d'autres microorganismes en dégradent la fraction cellulose On a trouvé qu'en utilisant une cul- ture mixte de bactéries et de champignons on obtient de façon inattendue une meilleure désintégration des fraction pectine et cellulose des tabacs que lorsqu'on utilise ces cultures séparément ou séquentiellement. La culture préférée pour produire des enzymes pour la dégradation de la fraction pectine du tabac est Erwinia carotorova et l'enzyme préférée pour produire des micro- organismes qui dégradent la fraction cellulose du tabac est Trichoderma longibrachiatum Une culture mixte contenant les enzymes précitées s'est révélée particulièrement utile dans les procédés de production de tabac reconstitués, le produit obtenu étant un tabac plus doux et plus justiciable d'un traitement ultérieur Par ailleurs, l'utilisation de cultures en croissance dans un système de traitement du tabac procure l'avantage d'éliminer le stade de séparation nécessaire pour obtenir des enzymes pures pour ajouter au système de traite- ment du tabac En outre, avec des cultures vivantes, les enzymes continuent à être produites lors du traitement au lieu de nécessiter un réapprovisionnement extérieur De plus, l'utilisation d'enzymes pures limite également souvent la plage des p H de fonctionnement plus que lorsqu'on utilise les cultures elles-mêmes En conséquence, le réglage du p H de digestion du tabac est moins critique lorsqu'on utilise des cultures mixtes que lorsqu'on utilise des enzymes pures. Selon la présente invention, un procédé préféré de traitement du tabac par une culture mixte de bactéries et de champignons consiste à préparer séparément un milieu aqueux contenant des micro-organismes (bactéries) qui dégra- deront la pectine et un milieu aqueux contenant des micro- organismes (champignons) qui dégraderont la cellulose. Dans la préparation-d'un milieu aqueux dans lequel peuvent croître les bactéries et les champignons, on prépare une (première) solution nutritive d'agar-agar en ajoutant à de l'eau distillée un agar-agar nutritif du commerce, par exemple un agar-agar extrait du tryptone glucose, la quantité d'agar-agar étant généralement au moins 5 grammes par litre Cette solution est ensuite stérilisée pour obtenir des surfaces inclinées à l'intérieur de tubes; autrement dit, on place des tubes à essai contenant la solution nutri- tive d'agar-agar en les inclinant de façon à obtenir une sur- face inclinée lors du refroidissement suivant un traitement à l'autoclave pendant au moins 15 minutes à une pression de 1,06 kg/cm et à 121 'C Le milieu stérilisé est ensuite placé dans un réfrigérateur pour un usage ultérieur. EXEMPLE 1 Dans un exemple selon la présente invention, on pré- pare des cultures mixtes de bactéries et de champignons pour la digestion du tabac. La première culture, une bactérie aérobie, de préfé- rence Erwinia carotorova, est cultivée sur des surfaces incli- nées à température ambiante pendant environ un jour Ces sur- faces sont ensuite lavées avec de l'eau distillée stérile et les produits de lavage (inoculum) sont ensuite utilisés pour inoculer le bouillon de dextrose nutritif (par exemple, on ajoute 7,5 ml d'inoculum dans 250 ml de bouillon dans un fla- con de 500 ml). On fait ensuite incuber les flacons pendant 24 heures dans un secoueur à bain d'eau et on les fait tourner à 229 tours par minute. On prépare alors un mélange de la culture bactérienne ainsi obtenue comme il est indiqué dans le tableau 1. TABLEAU 1 Composant Volume (en poids) 1 Inoculum bactérien provenant du bouillon de dextrose nutritif 600 ml 2 Tiges de tabac Burley 480 g 3 Eau du robinet 600 ml On fait ensuite incuber le mélange pendant 16 heures à la température ambiante tout en l'agitant à 600 t/min en utilisant un arbre et une palette d'agitation interne et en l'aérant au taux de 9 1/min en utilisant un anneau d'air interne. Après incubation, la culture avait dégradé les tiges de tabac pour l'amener à la consistance d'une purée homogène. On enlève alors la purée de tiges de tabac contenant la cul- ture bactérienne et on l'utilise pour traiter d'autres tiges. Ce premier stade procure ainsi une culture pour d'autres traitements de tabac. On prépare une deuxième culture en utilisant une cul- ture de Trichoderma (champignons), en l'occurence T longibrachiat um; cette seconde culture est cultivée pen- dant 20 jours dans un milieu à base de cellulose dans un secoueur rotatif, à vitesse modérée et à température ambiante. Le milieu à base de cellulose est préparé comme décrit sur la page 392 publiée dans American Chemical Society, dans Cellulases and Their Applications, Advances in Chemistry Series, volume 95, 1969, par M Mandels et J Weber. L'effet des deux cultures sur les tiges de tabac fut déterminé séparément et en combinaison comme il est indiqué sur le tableau 2. Les conditions du traitement furent les suivantes Volume d'eau: 600 ml Réglage du p H: néant Durée du traitement 6 jours à 30 'C. TABLEAU 2 On prépare des feuilles coulées à partir des mélanges en mélangeant 200 ml de bouillie traitée avec 100 ml d'eau du robinet pendant une minute à faible vitesse dans un récipient mélangeur de Waring d'un litre et en coulant sur une plaque d'acier inoxydable sur un bain de vapeur. On note les observations suivantes, indiquées sur le tableau 3, en ce qui concerne les feuilles coulées à la main à partir de la bouillie de chaque récipient après six heures de traitement. TABLEAU 3 Feuille du Observations subjectives du degré de décom- récipient position des tiges A Bonne; feuille lisse composée de nombreuses petites fibres; couleur brun foncé. B Très bonne; feuille lisse composée de nombreu- ses petites fibres; moins de petites fibres que -30 dans la feuille du récipient A; couleur brun plus clair (plus proche des couleurs du tabac naturel) que dans la feuille du récipient A Le verso de la feuille est plus lisse que celui de la feuille de A, avec des fibres moins nombreu- ses en surface. C Ne se coule pas en une feuille continue. Réci Volume de culture (ml)Vitesse Taux Mélange en parties pient égales de tiges de E T d'agitation d'aération Burley et de caroto longibra 3 Flue-cured rova chiatum (t / min) (dm /min) (g) %de solides dans la bouillie A 600 O 680 9,55 480 7,3 B 400 200 680 9,55 480 7,3 C O 550 680 9,55 480 7,3 Le tableau 4 indique les lectures de (cultures pures) et le tableau 5 indique les produits soumis à un traitement par cultures TABLEAU 4 Inoculum pl H de l'inoculum analyses des mixtes. Récipient Durée (heures) I p H E carotorova O 5,97 Inoculum (cultivé dans un mélange de 16 6,69 tiges de Burley et d'eau) utilisé pour le récipient A. T longibrachiatum 20 jours 4,83 Flacon d'inoculum Flacon non inoculé 20 jours 5,24 TABLEAU 5 Traitements du tabac Récipient Durée (heures) p H A O 6,07 (E darotorova inoculé) 2 7,12 4 7,06 6 6,82 B (Culture mixte inoculée O 5,74 E carotorova et T 2 6,18 longibrachiatum) 4 6,95 6 6,95 C O 5,37 (T longibrachiatum inoculé) 2 5,41 4 5,38 6 5,39 Le p H augmente lors du traitement des tiges par E carotorova seul, mais reste constant lorsque T longibra- chiatum est le seul organisme traitant La culture mixte pro- duit un modèle de p H similaire au système de E carotorova. Ce modèle n'est pas contradictoire à l'action combinée des deux cultures En fait, ce modèle de p H, combiné à la décom- position des tiges observées, indique que les deux cultures fonctionnent lorsqu'elles sont mélangées La variation du p H est dûe à l'action de E carotorova tandis que l'activité de T longibrachiatum est mise en évidence Dar un produit de digestion amélioré par rapport à celui de E carotorova seul. Pour démontrer l'effet de ces deux cultures, lorsqu' elles sont mélangées en séquence au lieu de l'être simultané- ment pour la digestion du tabac, on effectue l'expérience suivante: on ajoute une culture de E carotorova telle que précédemment décrite, à un mélange de tiges de tabac (flue- cured et burley) soit à la valeur initiale du p H naturel du tabac ( 5,3-5,7) soit à un p H initialement relevé pour per- mettre une dégradation initiale plus rapide de la pectine. Avec E carotorova comme inoculum initial et dans le premier cas, la digestion des tabacs s'effectue plus lentement lors- que le p H initial n'est pas modifié par rapport au cas o le p H est initialement ajusté à environ 6,0 On ajoute la cul- ture de T longibrachiatum après, dans le temps, l'addition de E carotorova et il en résulte que le traitement total est amélioré dans les deux cas du fait du relachement initial du tissu de tabac par E carotorova à l'un ou l'autre des p H initiaux. On a trouvé que l'addition dans l'ordre inverse des deux cultures, T longibrachiatum en premier et E carotorova en second, avait un certain effet sur le tabac, mais que cet effet était moins intéressant que si l'on faisait agir E carotorova en premier. Dans un autre procédé du domaine de l'invention, les tiges de tabac sont préalablement imprégnées pendant une durée déterminée avant d'être traitées simultanément par E carotorova et T longibrachiatum; il en résulte que la durée du traitement ultérieur est réduite, dans lequel les tiges sont exposées aux cultures mixtes de bactéries et de champignons. La présente invention considère également d'autres combinaisons possibles de cultures de bactéries et de cham- pignons pour améliorer la qualité de la désintégration du tabac au delà de celle obtenue en utilisant seule l'une des deux cultures. Parmi d'autres bactéries produisant des enzymes pectolytiques, considérées comme efficaces, on peut citer: d'autres espèces d'Erwinia, Bacillus pol ymyx et l'espèce Pseudomonas Outre T longibrachiatum d'autres champignons efficaces sont, par exemple, l'espèce Aspergillus et l'es- pèce Penicillium qui produisent des cellulases. REVENDICATIONS 1 Procédé de digestion de produits de plants de tabac en utilisant une culture mixte de bactéries et de champignons, caractérisé en ce que: i) on mélange une quantité sélectionnée de bouillie aqueuse de produits de tabac avec une quantité sélectionnée de micro-organismes produisant des enzymes pectolytiques et de micro-organismes produisant une cellulase; ii) on aère le mélange; et iii) on enlève le tabac digéré de la bouillie. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les micro-organismes produisant des enzymes pectoly- tiques sont choisis dans la classe comportant les espèces Erwinia, Bacillus et Pseudomonas. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les champignons produisant une cellulase sont choisis dans la classe comportant Trichoderma longibrachiatum et les espèces Aspergilus et Penicillium. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le p H de cette bouillie est ajusté dans la plage de ,5 à 7,5 avant addition de la culture mixte. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries produisant les enzymes pectolytiques sont Erwinia carotorova et que les champignons produisant la cellulase sont Trichoderma longibrachiatum. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la digestion est conduite à une température d'environ C. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la digestion dure de 5 à 7 heures. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la digestion est conduite avec une teneur en solides dans la bouillie d'environ 7,3 %.