Brevet FR2544742A1 — publié le 19841026

L'invention a pour objet un procédé de sélection de dérivés phénoliques capables de former un mélange stable avec l'uréase en solution aqueuse. Elle concerne également 1 appli- cation de ce procédé au dosage de l'urée par voie enzymatique et notamment des procédé et réactifs convenant pour un tel dosage. La réaction de BERTHELOT pour le dosage de l'ammoniac, conduisant à un produit coloré du type indophénol, est très ancienne (M. BERTHELOT, Répertoire de Chimie Appliquée, édité par la Société Chimique de PARIS 1, 284, (1859)) Cette réaction est couramment appliquée à la détermination de l'urée par voie enzymatique (FAWC7ETT J.K., SCOUT J.E. J. Clin. Path., 1960, 13, 156). En effet, l'hydrolyse de l'u rée par l'uréase libère de façon stoechiométrique de l'ammoni ac La séquence des réactions peut etre illustrée comme suit : (PATTON et al - Anal. Chem. 49, 464, 1977) Le nitroprussiate qui sert de catalyseur au cours de la réaction II. peut également être remplacé par de l'aquopentacyanoferrate.Classiquement cette réaction est faite en trois étapes, matérialisées par trois réactifs séparés - une étape impliquant l'action de 1'uréase, avec libération quantitative d'ammoniac (réaction I) - une étape impliquant l'utilisation d'un phénol et de nitroprussiate (ou catalyseur équivalent) (réaction III), - une étape de coloration avec addition d'ions hypoch lorite et OR - (réaction II). Dans la pratique, le nonbre des étapes (et des réactifs correspondants)ne peut pas entre réduit autant qu'on le désire en raison des risques d'interaction et d'inactivation des ré actifs. Ainsi, l'uréase peut être facilement dénaturée en présence de phénol et/ou d'hypochlorite de sodium --e glus, le mélange phénol-hypochlorite per très rapidement son poutoir de réaction, et ces réactifs doivent etre ajoutés séparément, et dans l'ordre phénol - hypochiorite. Le choix d'un dérivé phénolique approprié est donc important, dès lors qu'il est souhaité de diminuer le nombre d'étapes du dosage de l'urée, en particulier en passant de trois à deux étapes en vue de mieux satisfaire notamment au: exigences des équipements automatiques d'analyse. Le brevet français 79 22994 (publication 2.436.185) décri. déjà un procédé de détermination de l'urée, qui utilise la technique générale décrite précédemment mais qui, grâce au choix d-un dérivé phénolique particulier, à savoir d'un dérivé aromatique portant en plus du groupement OH du phénol, au moins une fonction acide carboxylique sur le noyau, permet de réduire à deux le nombre de réactifs et d'étapes nécessaires au dosage.Des exemples représentatifs de tels phénols sont l'acide salicylique et ses dérivés, L'enseignement du brevet français publié sous le n0 2,436.185 est limité à l'utilisation de dérivés phénoliques déterminés, Cependant, de nombreux phénols substitués sont envisageables pour la réaction de BERTHELCT. On peut également observer que la mise en oeuvre d'acide salicylique en vue du dosage de l'urée avait déjà été proposée - il est vrai dans une réaction en trois étapes - voir (SEARCY R.L., REARDON JE. et FOREUSE JA., Am. J. of ed. Techn. - 1967, 33, 151. Il est souhaitable de trouver d'autres dérivés phénoli ques permettant de réduire de trois à deux le nombre d'étapes de la réaction de dosage et conduisant à des résultats meilleurs que l'acide salicylique ou ses dérivés. invention a donc pour premier objet un procédé géné- ral de sélection de dérivés phénoliques capables de former un mélange stable avec l'uréase en solution aqueuse et, par conséquent, capables d'entre utilisés dans un procédé en deux étapes de dosage de l'urée par voie enzymatique selon la technique connue. L'invention concerne donc un tel procédé de sélection caractérisé en ce qu'on prépare un certain nombre de solutions d'essai constituées chacune d'une solution aqueuse du dérivé phénolique à essayer, la gamme de solutions d'essai étant réa lisée à diverses concentrations du dérivé phénolique à partir de 0,1 g/l, encre qu'on ajuste le pH desdites solutions d'essai à une valeur faiblement basique, en ce qu'on ajoute aux solutions d'essai une quantité déterminée d'uréase, cette quantité étant la même pour chaque solution d'essai, en ce qu'on constitue des échantillons en prélevant un volume déterminé et identique de chaque solution d'essai. en ce qu'on ajoute à chaque échantillon une merle quantité d'une solution d'urée à une concentration correspondant à celle habituellement rencontrée dans les fluides biologiques, en ce qu'on ajoute ensuite à chaque échantillon une mime quantité d'une solution capable de libérer des ions ClO dans le milieu aqueux et de provoquer la coloration de celui-ci, et en ce qu'on apprécis l'importance de la coloration par une technique colorimétrique connue, en ce qu'on sélectionne, dans la gamme d'échantillons de solutions d'essai, celui qui donne la plus forte absorbance et en ce que, en partant de cet échantillon sélectionné et en appliquant le mme mode opératoire avec diverses concentrations d'urée, on vérifie que l'intensité de la coloration obtenue varie linéairement avec la concentration d'urée, et en ce qu'on vérifie enfin que sensiblement les m8- mes résultats sont obtenus après vieillissement des échantil- lons contenant simultanément le dérivé phénolique et l'uréase, après quoi on sélectionne le dérivé phénolique qui a satisfait à tous les essais précédents. Selon l'invention, --on commence par préparer un certain nombre de solutions d'essai en dissolvant dans l'eau des quantités variables du dérivé phénolique à essayer. Les dérivés phénoliques trop faiblement solubles dans l'eau sont à éliminer d'emblée. C'est pourquoi il convient de partir d'une concentration minimale de 0,1 g/l de dérivé phénolique. Dans la pratique, une gamme de concentrations satisfaisantes en dérivé phénolique se situe entre 0,1 g/l et 10 g/l. Il se peut toutefois que certains dérivés phénoliques ne soient pas solubles dans l'eau jusqu'à 10 g/l. Dans ce cas, il convient de se limiter à la concentration de saturation à + 4 C en solution aqueuse. On ajuste ensuite chacune des solutions d'essai à un pH faiblement basique, de préférence compris entre 7 et 8 en viron. On peut utiliser à cet effet tous moyens connus de 1'homme du métier. Il suffit de tamponner chaque solution par addition de sels de phosphates, en quantité appropriée pour assurer le pH. Chaque solution d'essai est alors additionnée d'une quantité déterminée d'uréase. La quantité d'uréase n'est pas critique. On peut par exemple mettre en oeuvre 2.000 à 10.000 et notamment 5.000 unités d'uréase par litre de solution pour chaque solution d'essai. L'essentiel est d'obtenir des résultats comparables pour toute la gamme de solutions d'essai contenant des concentrations variées de dérivé phénolique. A partir des solutions d'essai, contenant simultanément le dérivé phénolique et 1' uréase, on prélève un volume déterminé pour constituer des échantillons correspondant à chaque solution. On ajoute alors à chaque échantillon une mebme quantité d'une solution d'urée à une concentration correspondant à celle habituellement rencontrée dans les fluides biologiques. La concentration d'urée mise en oeuvre n'est pas critique Etant donné que les dérivés phénoliques à sélectionner seront avantageusement utilisés pour le dosage de l'urée dans le sang, il convient de mettre en oeuvre des concentrations d'urée de l'ordre de 0,2 g/l à 5 g/l, et par exemple de I g/l. On laisse en contact l'urée et l'échantillon contenant le dérivé phénolique et l'uréase pendant une durée suffisante pour que l'urée soit décomposée totalement par l'uréase. Psur accélérer la réaction, il est intéressant mais non indispensable de chauffer modérément les échantillons. par exemple à 37 C. Les conditions de température doivent entre identiques pour tous les échantillons essayés. Cependant, il est également possible de travailler à la température ambiante. Lorsque la réaction entre l'urée et l'uréase est terminée, on ajoute à chaque échantillon une meme quantité d'une solution capable de libérer des ions ClO . Une telle solution peut être une solution d'hypochlorite de sodium, par exemple à une concentration de 6 à 60 sol/l. On peut également faire appel à une solution ayant une fonction similaire, par exemple une solution de dichloro-isocyanurate de sodium dans de l'hy- droxyde de sodium, par exemple une solution de dichloro-iso- cyanurate de sodium à 3 à 30 mmol/1 dans de l'hydroxyde de sodium en solution à 150 à 750 mmol/l. D'une manière connue, l'- addition d'une telle solution provoque l'apparition d'une co- loration dans le milieu. Selon l'invention, il faut que le dé- rive phénolique à sélectionner procure une coloration satis- faisante. On sélectionne donc2 dans la gamme d'échantillons de solutions d'essai, celui qui donne la plus forte absorbance lors des mesures colorimétriques.Dans la pratique, on apprécie par rapport à un échantillon de référence, l'apparition d'une coloration supérieure à 0,1 unité d'absorbance au sommet du pic d'absorption, pour un échantillon correspondant à une concentration d'urée de 1 g/l. Dans ces conditions, la coloration peut être appréciée d'une manière quantitative, pour des valeurs inférieures à 0,1 unité d'absorbance, l'appréciation pourrait n'être que qualitative. Une fois que l'on a constaté que le dérivé phénolique à essayer fournissait une intensité de coloration satisfaisant aux exigences précitées, on soumet ce même dérivé phénolique à une vérification complémentaire en appliquant le mme mode opératoire que ci-dessus, mais avec diverses concentrations d'urée, pour s assurer que l'intensité de la coloration obtenue varie linéairement avec la concentration d'urée. Il s'agit là, en effet, d'une condition importante pour réaliser des dosages d'urée dans le sang. Le dernier critère de sélection est que le dérivé phénolique soit stable en présence d'uréase. Pour cette raison on vérifie enfin que l'on obtient sensiblement les mêmes résultats après vieillissement des échantillons contenant simul tanément le dérivé phénolique et l'uréase. Il suffit pour cela de laisser par exemple vieillir l'échantillon à concentration optimale pendant 24 heures b 37 C. On sélectionne seulement les dérivés phénoliques qui permettent la conservation des performances à '.'issue de cette période de vieillissement. Grâce au procédé de l'invention, on a pu déterminer que de nombreux dérivés phénolîques peuvent etre selectionnés pour servir au dosage enzymatique de l'urée, en permettant de réduire à deux le nombre d'étapes et de réactifs, dès lors que cr dérivés phénoliques formaient un mélange stable avec l'u- réase. On peut ainsi constituer un coffret de réactifs de dosage de l'urée dans lequel le premier réactif coni @@ simul tanément le dérivé phénolique considéré, l'uréase et le catalyseur, en particulier le nitroprussiate. On a constaté égale- ment que certains phénols sélectionnés conformément au procédé de l'invention, fournissaient des résultats meilleurs que i'a- cide salicylique ou ses dérivés, lorsqu'on les utilise comme réactifs pour le dosage enzymatique de l'urée. Il en est ainsi notamment du thymol, du méta-crésol et du phényl-2-phénol. i'- autres phénols satisfaisants sont par exemple le 2-3-dichloro- phénol, et le tricrésol, qui fournissent des résultats au moins équivalents à l'acide salicylique. En revanche, le procédé de l'invention a permis de constater que certains dérivés phénoliques ne conviennent pas du tout pour le dosage enzymatique de l'urée. Par exemple, le 3-chlorophénol dénature l'uréase en quelques heures. D'autres phénols sont à écarter car ils ne produisent pas une coloration satisfaisante. C'est le cas par exemple du 3-4-dîchlorophénol ou du 3-5-dichlorophénol. On a indiqué dans un tableau annexe des exemples illustratifs de dérivés phénoliques qui ont été sélectionnés par le procédé de l'invention ou, au contraire. écartés par la mise en oeuvre dudit procédé. L'invention a également pour objet l'application du procédé de sélection de dérivés phénoliques, décrit précédemment, au dosage enzymatique de l'urée par la technique généra- le de colorimétrie. L'invention concerne en particulier une composition de réactifs comprenant un dérivé phénolique, autre qu'un dérivé portant au moins une fonction acide carboxylique sur le noyau, de l'uréase, un composé capable de faire fonction de catalyseur au cours de la réaction ultérieure avec des ions hypochlorites, et au besoin un tampon. Cette composition de réactifs est destinée à être mélangée avec le produit à analyser contenant de l'urée, pour etre ensuite additionnée d- hypochlorite de sodium ou de solution équivalente, par exemple de solution de dichloro-isocyanurate de sodium dans de l'hy- droxyde de sodium, ce qui donne naissance à une coloration qui peut être lue de manière connue par une technique photométri- que. Les conditions de mise en oeuvre d'un tel procédé de dosage enzymatique de l'urée n'ont pas besoin d'entre décrites plus en détail car elles sont bien connues de l'homme du mé- tie et accessibles à lui grace aux différentes références bibliographiques mentionnées au début du présent mémoire des criptif. L'invention sera illustrée sans être aucunement limitée par les exemples suivants. Dans ces exemples, le procédé de l'invention a été mis en oeuvre selon le protocole expérimen tal précis ci aprbs. Dans la suite de la description, les ex- pressions '1dérivés phénolés" et "dérivés phénoliques" ont été employées indifféremment et sont complètement interchangeables On prépare une gamme de concentrations en dérivés phé- nolés de 0,1 gZl à 10 g/l dans l'eau. Il se peut que certains dérivés ne soient pas solubles dans l'eau jusqu'à 10 g/1. Dans ce cas, on se limite à la concentration saturante à + 40C en j solution aqueuse.On tamponne chaque solution à un pH compris entre 7 et 8 par addition de sels de phosphates, en quantités simplement suffisantes pour assurer le pH. On ajoute alors 5000 unités d'uréase par litre de solution pour chaque point de la gamme. On prépare par ailleurs une solution de dichloro-iso cyanurate de sodium à 5 g/l dans de la soude 0,45 N. On prend 1 mi de chaque solution contenant de l'uréase et on porte à 37 C. On ajoute 10/ul de solution d'urée à 1 g/l. Deux minutes plus tard exactement, on ajoute 0,2 ml de dichloro-isocyanura- te. On apprécie, par rapport à un blanc échantillon, l'ap parition d'une coloration supérieure à 0,1 unité d'absorbance au sommet du pic d'absorption. On sélectionne, dans la gamme de concentrations, celle qui donne la plus forte absorbance. On vérifie alors, en utilisant le même mode opératoire (37 C, dilution de l'échantillon au 1/10 1, volume de dichlo ro-isocyanurate égal au 1/5 du volume du premier réactif), que la coloration obtenue est linéaire par rapport à la con centration d'urée de l'échantillon, au moins jusqu'à la con centration d'urée de 1 g/l dans l'échantillon. Le mélange à une concentration optimale contenant l'u réase est encore mis en vieillissement 24 h à 37 C. Seuls les dérivés phénols, mélangés à l'uréase et permettant la con servation des performances suivant le même mode opératoire a près 24 h à 37 C, sont sélectionnés pour être utilisables pour la constitution d'un coffret de dosage de l'urée. EXEMPLES 1 à 3. On a préparé les solutions suivantes Composants de la solution pour 1 litre Exemple 1 - Phosphate hydrogénodipotassique, anhydre ... 2,14 g - Thymol 0. 0,5 g - Nitroprussiate de sodium ................ 1 g - Uréase 0 5000 unités (1 unité d'uréase transforme i umole d'urée par minute à 250C). Exemple 2 - Phosphate hydrogénodipotassique, anhydre ... 1,05 g - Méta-crésol , 0,5 ml - Nitroprussiate de sodium .................. s g - Uréase .................................. 5000 unités Exemple 3 - Phosphate hydrogénodipotassique, anhydre ... 2,50 g - 3-chlorophénol ......................... 6,5 ml - Nitroprussiate de sodium .................... 1 g - Uréase .................................. 5000 unités On prépare par ailleurs la solution suivante (solution S) - Hydroxyde de sodium .................. 18 g/l - Dichloro-isocyanure de sodium 0. 5 g/l. On mélange 1 ml des solutions de chacun des Exemples I à 3 à 10/ul d'un échantillon d'urée à 1 g/l, et on incube 2 mn à 37 C. Puis on ajoute 0,2 ml de solution S à chacun des mélan- ges, et on incube 3 mn à 37 C. L'absorbance des mélanges est lue à 600 nm, et l'on obtient 1,02 (Ex. 1), 1,05 (Ex. 2), 1,1 (Ex. 3). Les solutions des Ex. 1, 2 et 3 sont conserves alors 24 h à 37 C et les essais sont recommencés dans les memes conditions. Les absorbances lues sont alors 1,05 (Ex. 1), 1,05 (Ex. 2), 0,2 (Ex. 3). On constate l'effondrement des performances de la solution de l'Ex. 3. le Tabieau I qui suit résume les constatations expérimentales relatives à divers dérivés phénolés, y compris ceux des Exemples 1 à 3 précédents. On a également comparé l'aptitude à la conservation des dérivés phénolés, sélectionnés selon l'invention, au salicylate de sodium. Chaque dérivé a été mélangé au nitroprus- siate de sodium et à l'uréase comme dans les Ex. 1 à 3 précé dents. On a effectué les mesures immédiatement (temps O)et après vieillissement de 72 heures à 37C Les résultats sont consignés dans le Tableau II qui suit. On voit que la plupart des dérivés phénols sélection nés selon l'invention sont supérieures au salicylate, en particulier le phényl-2-pbénol, le méta-crésol et le thymol Pour les essais dont les résultats sont rapportés dans le tableau II, on a opéré conformément au protocole précédent en utilisant une concentration d'urée de 1 g/l dans l'échan- tillon. La notation D.O. désigne l'absorbance. TABLEAU I. DERIVES PHENOLES TESTES OBSERVATIONS - 4-chlorophénol 10 g/l Couteur vert sale à rejeter - 4-chloro-3-méthyl phénol 10 g/l Couleur vert sale à rejeter - 3,4 dichlorophénol 10 g/l Couteur jaune c'est la couleur du "blanc" # - 3-5 dichlorophénol 10 g/l Couleur jaune # absence de coloration spécifique (Nota : il s'agit d'ine inhibi tion de l'uréase) - 2-3 dichlorophénol 10 g/l Couleur vert printemps - 3-5 dichloro-4-hydroxybenzène 10 g/l Couleur jaune non spécifique - Inhibition de sulfonate l'uréase - 3-5 dichloro-4-hydroxybenzène 1 g/l Couleur jaune non spécifique - Inhibition de sulfonate l'uréase - 2-3 dichlorophénol 0,5 g/l Résultat optimum a la con - 2-3 dichlorophénol 1 g/l centration de 2 g/1 - 2-3 dichlorophénol 2 g/l # Coloration verte Matheureusement l'urénse ne - 2-3 dichlorophénol 5 g/l se conserve pas 24 h à 37 C - 3-chlorophénol 6,5 g/l Couleur verte. Trouble du réactif après addiion de l'uréase, mais ce trouble dis paraît avec l'addition du dichlo roisocyanurate. Mache à temps 0 mais ne marche plus après 24 h à + 4 C. - 3-5 dichloro-4-hydroxybenzène 1 g/l sulfonyl chloride # Coloration jaune non spécifique - 3-5 dichloro-4-hydroxybenzène 2 g/l TABLEAU I (Suite) DERIVES PHENOLES TESTES a Thymol 0,2 g/l Bouue conservation de l'uréase - Thymol 0,5 g/l #Dose optimum # (jusqu'au moins 3 jours à 37'C) - Thymol 1 g/l Coloration verte, avec une teinte bleue de plus - Thymol 2 g/l # en plus pronoucés quand la dose de thymol croît - Thymol 5 g/l - Thymol 10 g/l #Apparition d'un trouble Tricrésol 0,2 ml/l 0,2 g/l Pas de dose optimale très nettement définie 0,5 ml/l 0,5 g/l Coloration verte avec angmentation de la 1 ml/l 1 g/l dominante bleue lorsque la dose s'accoît. 2 ml/l 2 g/l # Dose choisie. 5 ml/l 5 g/l Bonne conservation de l'uréase après 24 heures 10 ml/l 10 g/l à 37 C Amino 2 phénol 1 g/l Coloration verte noirâtre Phényl 2 phénol 0,5 g/l # Dose sélectionnée Dissolution préalable 1 g/l Coloration varte, mais apparition d'un trouble dans du méthanol 2 g/l dans le réactif econstitué (qui ne paraît pas 5 g/l # être un précipité). Ce trouble disparaît après Méte Crésol 0,1 ml/l 0,1 g/l addition des ions ClO-. 0,5 ml/l 0,5 g/l # Dose sélectionnée 1 ml/l 1 g/l # Coloration verte 2 ml/l 2 g/l Bonne conservation de l'uréas. 5 ml/l 5 g/l TABLEAU II. TABLEAU DE CONSERVATION DES DERIVES SELECTIONNES D.O. A 600 nm : D.O. à 600 nm du réactif au temps 0 : conservé 72 heures à 37 C Salicylate de sodium 0,900 : 0,149 Tricrésol ; 1,055 : 0,119 2-3 dichiorophénol : O,560 : 0-,202 Phényl 2 Phénol : 1,059 : 1,004 Méta crésol : 0,972 | 0,961 Thymol : 0,914 : 0,871 REVENDICATIONS 1. Procédé de sélection de dérivés phénoliques capables de former un mélange stable avec l'uréase en solution aqueuse caractérisé en ce qu'on prépare un certain nombre de solutions d'essai constituées chacune d'une solution aqueuse du dérivé phénolique à essayer,la gamme de solutions d'essai étant réalisée à diverses concentrations du dérivé phénolique à partir de 0,1 g/l, en ce qu'on ajuste le pH desdites solutions d'essai à une valeur faiblement basique,en ce qu'on ajoute aux solutions d'essai une quantité déterminée d'uréase, cette quantité étant la même pour chaque solution d'essai, en ce qu'on constitue des échantillons en prélevant un volume déterminé et identique de chaque solution d'essai, en ce qu'on ajoute à chaque échantillon une même quantité d'une solution d'urée à une concentration correspondant à celle habituellement rencontrée dans les fluides biologiquessen ce qu'on ajoute ensuite à chaque échantillon une meme quantité d'une solution capable de libérer des ions ClO dans le milieu aqueux et de provoquer la coloration de celui-ci,et en ce qu'on apprécie l'importance de la coloration par une technique colorimétrique connue, en ce qu'on sélectionne, dans la gamme d'échantillons de solutions d'essai, celui qui donne la plus forte absorbance et en ce que, en partant de cet échantillon sélectionné et en appliquant le même mode opératoire avec diverses concentrations d'urée, on ue vérifie/'intensité de la coloration obtenue varie linéa-irement avec la concentration d'urée,et en ce qu'on vérifie enfin que sensiblement les mêmes résultats sont obtenus après vieillissement des échantillons contenant simultanément le dérivé phénolique et l'uréase,après quoi on sélectionne le dérivé phénolique qui a satisfait à tous les essais précédents. 2.Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce qu'on utilise des solutions aqueuses d'essai,dont la concentration en dérivé phénolique varie de O,lg /1 à lOgil ou entre 0,1 g/l et la concentration de saturation à + 40C. 3.Procédé selon l'une des revendications 1 ou 29caracté- risé en ce qu'on ajuste le pH des solutions d'essais ; une valeur faiblement basique se situant entre 7 et 8 environ. 4.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisé en ce que chaque solution d'essai est additionnée d'une quantité d'uréase allant de 2000 à 10 000 unités et notamment voisine de 5000 unités par litre de solution. 5.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que,en vue de l'addition aux échantillons de solutions d'essai,on utilise des concentrations :durée de 0,2 gil à 5 g/l,par exemple de igli. 6.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,caractérisé en ce qu'on chauffe,notamment à 37 C,les échantillons contenant le dérivé phénolique et l'urease et additionnés d'urée. 7.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que, à titre de solution capable de libérer des ions C10-,on utilise de l'hypochlorite de sodium,par exemple à une concentration de 6 à 60 mmol/l,une solution de dichloroisocyanurate de sodium par exemple entre 3 et 30 mmol/l dans de l'hydroxyde de sodium en solution entre 150 et 750 mmol/l ou une solution équivalente. 8.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on sélectionne l'échantillon contenant le dérivé phénolique provouant,par rapport à un échantillon témoin,l'apparition d'une coloration supérieure à 0.1 unité d'absorbance au sommet du pic d'absorption pour un échantillon correspondant a' une concentration d'urée de lg/l. 9. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 à la sélection d'un dérivé phénolique destiné au dosage de l'urée par voie enzymatique. 10.Composition de réactifs présentée unitairement et comprenant: -un dérivé phénolique sélectionné par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et autre qu'un dérivé portant,en plus du groupement OH du phénol, au moins une fonction acide carboxylique sur le noyau, -un composé,tel que le nitroprussiate,capable de faire fonction de catalyseur au cours de la réaction ultérieure avec des ions hypochlorité, -et avantageusement un tampon. ll.Procédé de-dosage de l'urée par voie enzymatique, ledit procédé étant mis en oeuvre en deux étapes qui consistent à mettre successivement en contact avec le produit à analyser,contenant de l'urée, (1) une composition de réactifs conforme à la revendication 10 et (2) une solution d'hypochlorite de sodium ou équivalente,pour obtenir une coloration du milieu capable d'être- mesurée quantitativement d'une manière connue en soi par une technique photométrique. 12.Application du procédé selon la revendication 11 au dosage de l'urée dans le sérum du sang. 13.Coffret de réactifs pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 11 comprenant (lune composition de réactifs selon la revendication 10 et (2)une solution capable de libérer des ions ClO en milieu aqueux. 14.Dérivés phénoliques sélectionnés par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et destinés à la mise en oeuvre du procédé selon la revendication ll,notamment le thymol,le méta-crésol,le phényl-2 phénol, le 2,3 dichlorophénol ou le tricrésol.