Brevet FR2536997A1 — publié le 19840608

Médicaments cytotoxiques comportant au moins une immunotoxine et de la méthylamine. La présente invention concerne des médicaments cyto- toxiques comportant au moins une immunotoxine et de la méthylamine. Dans les demandes de brevets français antérieurs, portant notamment les numéros 78 27 838, 79 24 655, 81 07 596 et 81 21 836, on a décrit la préparation de produits anticancéreux dits conjugués obtenus par couplage, par liaison covalence, de la chaîne A de la ricine avec des anticorps ou fragments d'anticorps dirigés contre un antigène porté par une cellule à détruire Les produits de ce type sont désignés dans la présente demande sous le nom géné- rique d'immunotoxines. Dans la demande française 81 21 836 on a décrit en outre la propriété des ions ammonium (sous la forme d'un quelconque de leurs sels et en particulier le chlorure) de potentialiser de façon efficace l'action cytotoxique de ces immunotoxines. Dans la demande de brevet française 82 02 091, du 9 février 1982, la demanderesse a décrit la propriété des substances appartenant à la classe des ionophores carboxyliques de potentialiser l'activité des immunotoxines et d'accélérer leur cinétique d'action. La présente invention a pour objet la préparation de médicaments cytotoxiques puissants utilisant la potentialisation des effets cytotoxiques sélectifs des immunotoxines décrites dans les demandes de brevets antérieures; il a été trouvé en effet que la méthylamine utilisée sous la forme d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptable et à des doses o elle ne présente elle-même aucune cyto- toxicité propre pour les lignées étudiées était un potentialisateur extrêmement puissant (facteur de l'ordre de 13000) et un accélérateur de l'effet cytotoxique des immunotoxines. L'exemple suivant non limitatif permet de mieux com- prendre la portée de l'invention. Exemple Cet exemple démohtre la potentialisation de la cytco- toxicité sélective de l'immunotoxine anti-T 65 (telle que décrite das la demande n 81 21 836 de la demanderesse) vis-à-vis des cellules lymphoblastotdes T humaines de la lignée CEM portant l'antigène T 65. Dans ces expériences, la cytotoxicité a été évaluée par la mesure de l'incorporation de 14 C-leucine par les cellules après 18 h d'incubation à 37 C en présence de quantités connues de l'immu- notoxine étudiée, ou de substances cytotoxiques de référence, en absence ou en présence de méthylamine, 1 Potentialisation de l'effet cytotoxique par la méthylamine. Les résultats de ces expériences sont présentés sous la forme de courbes dose/effet présentant en ordonnée l'effet cyto- toxique évalué comme indiqué ci-dessus par l'incorporation du traceur, calculée en % de la valeur obtenue sur les cellules témoins sans substance cytotoxique et en abscisse les concentrations molaires en sous-unité toxique des substances cytotoxiques étudiées La méthyl- amine a été testée à la concentration de 10 millimolaires Il a été préalablement vérifié que la méthylamine n'est pas spontanément cyto- toxique pour les-cellules employées à la concentration indiquée. La figure 1 montre l'effet de la méthylamine sur la cytotoxicité propre de la ricine et de la chaîne A isolée, prises comme substances de référence Les valeurs des concentrations molaires (CI 50) correspondant à 505 % d'inhibition d'incorporation du traceur sont indiquées dans le tableau I. T A B L E A U I Substances testées Avec méthylamine 10 m Mi Sans méthylamine Ric ine-13 12 Richne A 1510 M 2,6 10 8 M Chatne A 1 M 10 'M 2,6 10 = M Ces résultats démontrent un très faible effet poten- tialisateur de la méthylamine sur la cytotoxicité de la ricine (fac- teur de potentialisation de 2,4) et de la chatne A (facteur de poten- tialisation de 2,6). La figure 2 montre l'effet potentialisateur comparé de l'ion NH 4 ( 10 m M) et de la méthylamine ( 10 m M) sur la cytotoxicité de l'immunotoxine anti-T 6-5 vis-a-vis des cellules de la lignée CEM. Les valeurs des concentrations molaires (CI 50) correspondant à 50 % d'inhibition d'incorporation du traceur sont rappelées dans le tableau II. T 3 BLA T A B L E A U II Ces résultats montrent que l'effet potentialisateur de la méthylamine est voisin de celui de l'ion ammonium et de l'ordre d'un facteur de 13000 Ce facteur est considérablement plus élevé que ceux observés avec la ricine ou la chaîne A isolée Ceci signifie qu'en présence de méthylamine, l'immunotoxine anti-T 65 est, vis-à-vis de sa cible spécifique, un agent cytotoxique près de 3 fois plus puissant que la ricine elle-même. En outre, la méthylamine présente la propriété rémar- quable, non seulement de potentialiser l'activité, mais aussi d'aug- menter la sélectivité de l'immunotoxine Si l'on prend en effet comme critère de sélectivité d'action de l'immunotoxine le rapport des CI 50 de la chaîne A libre et de l'immunotoxine, ce rapport est de l'ordre de 5 en l'absence de méthylamine et voisin de 65000 en présence de méthylamine. 2 Accélération des cinétiques de cytotoxicité par la méthyl- amine. L'effet de la méthylamine ne se limite pas à accroitre d'une façon considérable l'activité cytotoxique des immunotoxines. Cette substance permet aussi d'accélérer de façon très importante la cinétique de cytotoxicité des immunotoxines, comme le montre l'expê- rience suivante: Dans cette expérience, on a mesuré commeprécédemment l'incorporation de traceur radioactif dans les cellules mais cette fois en fonction du temps d'incubation des cellules avec l'immuno- toxine, en absence et en présence de méthylamine 10 m M comme poten- tialisateur Cette expérience a été réalisée sur le modèle cellulaire constitué par la lignée lymphoblastotde humaine CEM avec l'immuno- toxine anti-T 65 à la concentration de 50 m M Les résultats son L pré- sentés dans la figure 3. Substances potentialisatrices testées CI 50 -9 Aucune 5 10 M NH 4 + 10 m M 3 10 M 4 -13 méthylamine 10 m M 1,5 10 M ,5 101 M 253699 ? Pour cette lignée, il apparaît qu'en l'absence de potentialisation la cinétique de cytotoxicité est très lente comme le montre la courbe a D'autres expériences dans les mêmes conditions ont montré que le temps nécessaire à obtenir 50 Q% de réduction de l'incorporation du traceur était de l'ordre de 20 h Par contre, en présence de méthylamine une accélération spectaculaire de la cinétique se manifeste (courbe b) puisque le temps nécessaire à obtenir 5 07/ d'inhibition d'incorporation est alors de l'ordre de 1,5 h seulement. Un tel effet d'accélération est de la plus haute impor- tance pour toutes applications des immunotoxines et en particulier pour les applications thérapeutiques in vivo car la rapidité d'action du médicament est toujours un facteur très favorable à l'efficacité du traitement - On peut donc utiliser en tant que médicament en théra- peutique humaine l'association constituée par une immunotoxine et la méthylamine sous la forme de l'un quelconque de ses sels Il peut être utilisé pour le traitement des affections, cancéreuses ou non, qui seraient sensibles à l'anticorps utilisé pour la préparation de l'immunotoxine. Visant à éliminer la totalité des cellules cancéreuses le traitement devra être effectué avec une dose suffisante d'immuno- toxine associée avec une quantité de méthylamine pouvant varier de mg à 2 g (exprimés en base) à chaque administration d'immuno- toxine La durée du traitement devra être déterminée dans chaque cas en fonction du sujet et de la nature de l'affection à traiter. Les nouveaux médicaments selon l'invention sont condi- tionnés pour être utilisés par voie injectable et de préférence par voie intraveineuse. De préférence les constituants de l'association seront conservés séparément et mélangés, seulement au moment de l'emploi, dans la seringue ou le solvant de perfusion. 2536997. R E V E N D I CATIONS - 1 Médicaments cytotoxiques, caractérisés en ce qu'ils contiennent en association au moins une immunotoxine et de la méthyl- amine ou un sel pharmaceutiquement acceptable de la méthylamine. 2 Médicaments selon la revendication 1, caractérisésen ce qu'ils sont conditionnés pour être administrés par voie injectable,de préférence par voie veineuse.