Brevet FR2539757A1 — publié le 19840727

2539757. La présente invention concerne un procédé de production de bilirubineoxydase par culture d'une souche appartenant au genre Schizophyllum de la classe des basidiomycètes. La bilirubine est une substance jaune produite dans le sang par dégradation de l'hémoglobine Une détec- tion rapide et précise de la bilirubine dans le sérum est très importante pour le diagnostic médical de maladies de l'homme (par exemple la jaunisse) Chez les patients atteints de jaunisse, le taux de bilirubine dans le sérum croit anormalement, si bien que le degré de jaunisse peut être diagnostiqué par le dosage de la bilirubine dans le sérum. La bilirubine-oxydase a été rapportée pour la première fois par R Brodersen et P Bortels, et la bilirubine a été oxydée en biliverdine par la bilirubine- oxydase insoluble isolée du cerveau de cobaye /European Journal of Biochemistry, volume 10, 468 ( 1968) 7 Toute- fois, au cours des dernières années, il a été rapporté que la souche MT-1 de Myrothecium verrucaria appartenant au genre Myrothecium produisait de la bilirubine-oxydase, et que l'enzyme purifié tiré du filtrat de culture oxydait la bilurubine en biliverdine /Agricultural and Biological Chemistry, volume 45, 2385 ( 1981) 7. Dans l'analyse de substances autres que la bilirubine dans le sérum, la bilirubine-oxydase est également utile pour éliminer la bilirubine qui est une cause d'erreur dans la mesure En fait, pour le dosage du glucose- ou du cholestérol dans le sérum, on utilise le plus souvent comme méthode classique d'inspection une méthode colorimétrique dans laquelle la glucose-oxydase ou la cholestérol-oxydase est amenée à réagir avec le sérum,et le peroxyde d'hydrogène formé est fixé par la peroxydase En particulier, une méthode de développement à la 4-amino-antipyrine et au phénol est devenue-une partie importante de la méthode enzymatique, en ce qui concerne sa simplicité et sa rapidité de même que la stabilité du réactif Cette méthode calorimétrique implique la mesure à 500 nm de colorants quinoniques rouges formés, mais la présence de bilirubine dans le sérum produit une erreur négative En conséquence, en faisant réagir la bilirubine-oxydase avec le sérum à l'avance pour éliminer la bilirubine, puis en faisant réagir la glucose-oxydase ou la cholestérol-oxydase avec le sérum, on peut obtenir un taux correct de glucose ou de cholestérol dans le sérum. La Demanderesse a fait des études poussées sur la bilirubine-oxydase produite par une souche appartenant à la classe des basidiomycètes autre que les micro- organismes producteurs de bilirubine-oxydase mentionnés ci-dessus et elle a trouvé qu'un certain type de souches appartenant à la classe des basidiomycètes produisait une bilirubine-oxydase très active dans une liqueur de culture. La souche utilisée dans la présente invention est une souche appartenant au genre Schizophyllum de la classe des basidiomycètes, par exemple Schizophyllum commune K-17 Cette souche a été isolée des corps repro- ducteurs se développant en colonies sur les arbres morts dans l'Iwakura de Kyoto City, Japon. Les caractéristiques du corps reproducteur et des spores de cette souche sont les suivantes Chapeau: 10 30 mm de diamètre, densément recouvert de poils grossiers en surface, donnant une couleur blanche, grise, chair ou brune Lamelles: de couleur blanche, grise ou chair pâle; fendues longitu- dinalement dans la région marginale, les parties fendues semblant se chevaucher Chair: coriace et tenace; se rétrécit lorsqu'on la sèche, mais reprend sa forme ini- tiale lorsqu'on la mouille Spores: lisses, blanches en masse; forme cylindrique de 4 6 x 1,5 2 Dam En comparant les caractéristiques ci-dessus avec la descrip- tion donnée dans les ouvrages suivants: Seiya Ito: Mycological flora of Japan, volume 2, N O 5, 1955 (publié par Yoken-do, Tokyo, Japon) et Rokuya Imazeki et Tsugio Hongo: Colored Illustrations of Fungi of Japan, volumes 1 et 2, il apparaft que cette souche est Schizophyllum commune K- 17 Cette souche a été déposée au Fermentation Research Instituie, Agency of Industrial Science and Technology, Japon, sous la référence FERM BP- 306, le 17 Mai 1982 Cette souche a la faculté, par sa constitu- tion, de produire de la bilirubine-oxydase. La présente invention sera expliquée avec de plus amples détails ci-après, en partie en regard des dessins annexés sur lesquels: la figure 1 illustre la relation entre le p H et l'activité de la bilirubine-oxydase obtenue par la présente invention; la figure 2 illustre la relation qui existe entre la température et l'activité v lla figure 3 montre une relation existant entre le p H et l'activité après traitement de la bilirubine- oxydase à 40 C et à divers p H pendant 7 jours; la figure 4 montre une relation existant entre la température et l'activité après traitement de la bilirubine-oxydase à un p H de 6,0 et à des températures variables pendant 10 minutes; la figure 5 montre une variation du spectre d'absorption lorsque l'enzyme de l'invention a été amené à réagir avec le produit "OMEGA-chemistry Control Serum Elevated Bilirubin" la figure 6 montre le chromatogramme sur couche mince du produit de réaction de l'enzyme de l'invention avec la substance "OMEGA-chemistry Control Serum Elevated Bilirubin"; et la figure 7 présente une variation du spectre d'absorption lors de la réaction de l'enzyme de l'inven- tion avec la biliverdine. Dans la culture du micro-organisme devant être utilisé dans la présente invention, toute source nutritive bien connue peut être ajoutée au milieu de culture, si elle peut être utilisée par la souche choisie Comme source de carbone, on peut utiliser, par exemple, du glycérol, du glucose, de l'amidon, du saccharose, du'maltose, du lactose, de la dextrine, des huiles et des graisses, des mélasses, etc Comme source d'azote, on utilise avanta- geusement un extrait de levure, de la peptone, un extrait soluble de mais, du soja dégraissé, du soja en poudre, un extrait de viande, etc De même, des substances inor- ganiques et des sels métalliques tels que des phosphates, des sels de potassium, des sels de magnésium, des sels de fer, des sels de zinc, etc, peuvent aussi être ajoutés, de même qu'on peut ajouter également d'autres vitamines et des activateurs de croissance. Dans la culture de la souche appartenant à la classe des basidiomycètes, la quantité de bilirubine- oxydase pouvant être produite varie grandement selon les conditions de la culture En général, la température de la culture est de préférence de 20 à 350 C, le p H du milieu de culture est de préférence de 4 à 7 et la production de bilirubine-oxydase atteint un maximum par culture sous aération/agitation pendant 3 à 10 jours Dans ce cas, il est naturel que les conditions de la culture soient déter- minées de manière obtenir une production maximale de bilirubine-oxydase conformément aux souches et aux com- positions du milieu de culture que l'on utilise. La bilirubine-oxydase produite par la souche de la présente invention est présente dans le filtrat de culture et elle peut être séparée sous la forme-d'un précipité par-addition de 50 à 80 % en volume/volume d'un solvant organique (par exemple alcool, acétone) ou de 20 à 80 % en poids/volume d'un agent précipitant (par exemple sulfate d'ammonium, chlorure de calcium) au filtrat de culture Le précipité obtenu est débarrassé du sel par dialyse ou par traitement sur "Sephadex" pour obtenir une solution de l'enzyme brut Pour purifier la solution d'enzyme brut, on peut effectuer une filtration sur gel de la solution sur une colonne de "Sephadex G-75 " préalablement tamponnée avec un tampon au phosphate 0,1 M (p H 7,0) pour recueillir une fraction active Ensuite, la fraction active est adsorbée sur une colonne de "DEAE- Sephadex A-50 " préalablement tamponnée avec un tampon au 2539757. phosphate 0,1 M (p H 7,0) et la matière adsorbée est ensuite éluée avec un tampon au phosphate 0,3 M (p H 7,0) pour recueillir une fraction active Cette fraction active est ensuite dialysée contre un tampon au phosphate 0,01 M (p H 7,0) et le solvant interne de dialyse est concentré avec une membrane de collodion et lyophilisé pour obtenir une poudre de l'enzyme purifié. Les propriétés caractéristiques de la bilirubine- oxydase obtenue par la présente invention sont les sui- vantes: ( 1) Action: Lorsque l'enzyme de la présente invention agit sur la bilirubine, de la biliverdine est formée, et il oxyde également la biliverdine en,une substance inconnue de couleur violet pale En fait, il catalyse la réaction en deux étapes suivantes: bilirubine + 1/2 02 biliverdine + H 20 ( 1) biliverdine ±1/2 02 substance violet pale + H 20 ( 2) ( 2) p H optimal et stabilité au p H: Un p H optimal de l'enzyme de l'invention se situe au voisinage de 5,5 à 6,0, o l'enzyme montre une activité extrêmement grande comme le fait apparaître la courbe de la figure 1 La stabilité au p H de l'enzyme de l'invention lorsqu'on le traite à 40 C et à des p H variables pendant 7 jours est illustrée sur la figure 3 Comme le fait apparaître la figure 3, l'enzyme de l'invention est stable à un p H égal à 8. ( 3) Température optimale et thermostabilité: Une température optimale pour l'enzyme de l'inven- tion est d'environ 500 C comme le montre la courbe de la figure 2 La thermostabilité de l'enzyme de l'invention lorsqu'on l'a traité à un p H de 6,0 et à des températures variables pendant 10 minutes est représentée sur la figure 4 L'enzyme de l'invention s'est montré stable jusqu'à C. 2539757, ( 4) Poids moléculaire: Le poids moléculaire de l'enzyme de l'invention obtenu par filtration sur gel de "Sephadex G-100 " a été d'environ 58 000. ( 5) Point iso-électrique: Le point iso-électrique de l'enzyme de l'inven- tion obtenu par concentration iso-électrique a été de 6,0 à 6,1. ( 6) Inhibiteur L'enzyme de l'invention a été inhibé par Fe 2 + Na N 3, KCN, l'ascorbate de sodium, Cu 2 +, la o-phénanthro- line, l'a,a'-dipyridyle, le glutathion réduit, etc, à la concentration de 1 m M chacun. ( 7) Détermination de l'activité enzymatique: L'activité enzymatique a été déterminée en mesu- rant une diminution de l'absorption de bilirubine à 460 nm. En fait, la réaction a été conduite à 37 C pendant 10 minu- tes en utilisant 3,0 ml d'un mélange réactionnel contenant 8 mg de substance "OMEGA-chemistry Control Serum Elevated Bilirubin" (produit de la firme Hyland Co, des Etats-Unis d'Amérique), 300 gmoles de tampon au phosphate (p H 6,0) et 0,1 ml de solution d'enzyme correctement diluée, et on a mesuré une diminution de l'absorption à 460 nm à cause de la bilirubine Une unité d'activité en bilirubine- oxydase a été définie comme étant la quantité d'enzyme qui abaisse l'absorption à 460 nm de 1,00 par minute à 370 C. La méthode concrète de production de bilirubine- oxydase conformément à la présente invention sera illustrée par les exemples suivants qui ne doivent toutefois pas être interprétés comme limitant l'invention. Exemple 1 Un milieu de culture inclinée comprenant 2 % de glucose, 0,5 % de "Ebios" et 1,5 % de gélose (milieu "Ebios") a été inoculé avec Schizophyllum commune K-17 (FERM BP-306) et la culture a été effectuée en maintenant le milieu au repos à 25 C pendant une semaine pour obtenir un champignon destiné à l'ensemencement Par ailleurs, 2539757: ml d'un milieu de culture contenant 3 % de glycérol, 0,3 % d'extrait de levure, 1 % de peptone, 0,3 % de KH 2 PO 4 et 0,1 % de Mg SO 4 7 H 20 a été introduit dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml et après stérilisation-à 120 C pendant 20 minutes, is milieu a éue retroldi et inoculé avec le champignon d'ensemencement ci-dessus. Ensuite, on a conduit une culture sous agitation par secousses à 27 C pendant 7 jours, à 120 tours/minute. Une fois la culture terminée, le mycélium a été enlevé par filtration pour obtenir un filtrat de culture. L'activité en bilirubine-oxydase de ce filtrat de cul- ture a été de 1,5 unité/ml. Exemple 2 ml d'un milieu de culture comprenant 3 % de glycérol, 0,3 % d'extrait de levure, 1 % de peptone, 0,3 % de KH 2 PO 4 et 0,1 % de Mg SO 4 7 H 20 ont été chargés dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml, stérilisés à C pendant 20 minutes et inoculés avec Schizophyllum commune K-17 cultivé dans le milieu de culture "Ebios" de l'exemple 1 Ensuite, la culture a été conduite à 27 C pendant 5 jours pour préparer une liqueur de culture d'ensemencement Par ailleurs, 15 litres d'un milieu de culture comprenant 3 % de glycérol, 0,3 % d'extrait de levure, 0,5 % de peptone, 1 % d'extrait soluble de mais, 1 % de soja dégraissé, 0,3 % de KH 2 PO 4, 0,1 % de Mg SO 4 7 H 20 et 0,03 % d'un agent anti-mousse ("CB-442 " de la firme Nippon Yushi Co) ont été charges dans un appareil de fer- mentation à cuve de 30 litres et stérilisés à 120 C pen- dant 20 minutes Après refroidissement, le milieu de culture a été inoculé avec 100 ml de la liqueur de cul- ture d'ensemencement ci-dessus et la culture a été con- duite à 27 C pendant 6 jours dans des conditions impli- quant une vitesse d'aération de 10 litres par minute et une vitesse d'agitation de 200 tours/minute Une fois la culture terminée, le mycélium a été enlevé par filtra- tion pour obtenir un filtrat de culture L'activité en bilirubine-oxydase de ce filtrat de culture a été de 6,5 unités/ml Du sulfate d'ammonium a été ajouté à 13 litres de ce filtrat de culture dans un premier temps jusqu'à saturation à 50 % pour éliminer les impuretés par précipitation Du sulfate d'ammonium a encore été ajouté à la liqueur surnageante jusqu'à saturation à 70 %, et après avoir laissé reposer le mélange pendant une journée et une nuit entières, le précipité de sulfate d'ammonium résultant a été dialysé pendant une journée et une nuit entières contre une grande quantité d'eau distillée La solution de dialyse interne a été lyophilisée et la poudre sèche obtenue a été dissoute dans un tampon au phosphate 0,1 M (p H 7,0) Une filtration sur'gel de la solution résultante a été effectuée sur une colonne ( 5,0 x 70 cm) de "Sephadex G-75 " tamponnée avec le même tampon pour recueillir une fraction active La fraction active a été adsorbée sur une colonne ( 5, 0 x 20 cm) de "DEAE-Sephadex A-50 " préalablement tamponnée avec un tampon au phosphate 0,1 M (p H 7,0) et la matière adsorbée a été éluée avec un tampon au phosphate 0,3 M (p H 7,0) Cette fraction active a été dialysée contre un tampon au phosphate 0,01 M (p H 7,0) et la solution interne de dialyse a été concen- trée avec une membrane de collodion et lyophilisée pour obtenir 320 mg de l'enzyme purifié en poudre L'activité spécifique de cette poudre a été de 23 unités/mg. Dans la réaction de cet enzyme purifié avec la substance "OMEGA-chemistry Control Serum Elevated Bilirubin", on a étudié une relation entre la durée de réaction (quantité d'enzyme purifié utilisée 0,2 g) et la concentration de l'enzyme (temps de réaction 10 minu- tes) entraînant une réduction de l'absorption à 460 nm due à la bilirubine (AA 460 nm). Durée de réaction AA 460 nm Concentration AA 460 nm (minutes) de l'enzyme (mg) 0,048 0,2 0,047 0,093 0,4 0,0912 30 0,135 0,6 0,135 0,168 0,8 0,170 Comme le montre ce qui précède, l'enzyme purifié a la propriété de réduire l'absorption due à la bilirubine 2539757. lorsqu'on le fait réagir avec cette dernière Ensuite, d'après le résultat du spectre d'absorption (figure 5), lorsque l'enzyme purifié a été amené à réagir avec la substance "OMEGA-chemistry Control Serum Elevated Bili- rubin" ainsi que d'après le résultat de la chromatographie sur couche mince (figure 6) avec comme solvant un mélange chloroforme/méthanol à 1:1, on a observé la formation d'un produit d'oxydation de la bilirubine, à savoir la bili- verdine En conséquence, on a trouvé que l'enzyme de l'invention était la bilirubine-oxydase qui oxyde la bilirubine en biliverdine De même, l'enzyme de l'inven- tion a la propriété d'oxyder également la biliverdine en une substance inconnue de couleur violet pâle (dont le spectre d'absorption apparaît sur la figure 7). REVENDICATIONS 1 Procédé de production de bilirubine-oxydase, caractérisé en ce qu'un micro-organisme producteur de bilirubine-oxydase appartenant au genre Schizophyllum est cultivé et la bilirubine-oxydase est recueillie dans le bouillon de culture. 2 Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que le micro-organisme producteur de bilirubine- oxydase est Schizophyllum commune K-17 (FERM BP-306).