Brevet FR2537157A1 — publié le 19840608

Procédé de propagation in vitro de la vigne La présente invention concerne un procédé de propagation clonale de certains angiospermes et en particulier, le cultivar hybride "Seyval" du genre Vitis (vignes). L'art antérieur concernant la propagation de l'espèce Vitis par des procédés de culture de tissus est peu répandu D'une manière courante, il existe une publication qui traite de la production de la vigne à partir de sommets de pousses fragmentés; M Barlass et K G M Skeen ( 1978), "In vitro propagation of grapevine (Vitis vinifera L) from fragmented shoot apices " Vitis 17:335-340 Il existe deux publi- cations qui démontrent la faisabilité de la production de sarments par embryogenèse somatique, Krul et Worley, "Formation of Adventitious Embryo in Callus Cultures of "Seyval"", J Amer Soc Hort Sci 102:360-363; et Mo Go Mullins et coll ( 1976), Somatic Embryos and Plantlets from an Ancient Clone of the Grapevine (cv Cabernet-Sauvignon) by apomixis in vitro J Expt Bot 27:1022-1030 Il est possible que la propagation de la vigne par multiplication des sommets de pousses puisse exiger une légère modification ou non des méthodes mises au point et en fait on n'en trouve pas de description Voir To Murashige ( 1974), Plant Propagation Through Tissue Cultures, Annu Rev Plant Physiol 25:135-166. Dans le cadre de la propagation végétale par embryo- genèse somatique, la production de structures embryonnaires (identiques à celles des semences) à partir de cellules végétales isolées, a été décrite à la fin des années 1950 par F C Steward et coll ( 1958), Growth and Organized Development of Cultured Cells; I Io Organization in cultures grown from freely suspended cells Amer J Bot 45:705-708; et J Reinert, Uber die Kontrolle der orphogenese und die Induktion von Adventivembryonen an Gewebekulturen aus Karotten, Planta 53:318-333. Des embryoïdes de vigne comme ceux d'autres végétaux naissent à partir de masses proembryonnaires noyées dans des cellules calleuses Les facteurs mis en jeu dans le déclenchement du développement des masses proembryonnaires ne sont pas connus La transformation des masses proembryonnaires en embryoides dans la vigne se produit lorsqu'elles sont transférées d'un milieu contenant une auxine active à un autre contenant une auxine moins active, ou lorsque le taux de cytokinine du milieu est abaissé On a isolé une callosité de "Seyval" fortement embryogénique qui n'exige pas de régulateurs de croissance pour se développer Une formation embryoide se produit dans cette callosité lorsqu'on la fait croitre sur auxine pendant un court intervalle de temps, puis on la cultive sur des milieux exempts d'auxine, lorsque la concentration en calcium est la moitié de celle de la formulation de Murashige-Skoog, ou lorsqu'on fait croître les cultures pendant de longs intervalles de temps sans sous- culture La plupart des vignes -régénérées à partir de la callosité de "Seyval" initiale ont semblé normales Toutefois, une sous-population de ces embryoïdes ne s'est pas développée normalement, mais a produit des embryons somatiques de vigne secondaires à la jonction de la racine et de la pousse. Le développement de vignes normales à partir de ces embryoides secondaires de vigne étiolés est compliqué par des dormances des racines, de l'hypocotyle, des cotylédons et des sommets de pousses, dont chacun répond à des stimuli physiques et chimiques différents. Les processus de la production réussie des embryoides et du développement normal de la vigne sont apparus mutuellement antagonistes Par exemple, des embryoldes qui produisent eux-mêmes des embryoides subissent généralement une sénescence et meurent peu de temps après la formation de l'embryoide Au contraire, des embryoides qui développent des cotylédons verts séparés aplatis ou des racines normales perdent généralement leur capacité de production d'embryoldes secondaires Par suite, des traitements qui activent la production d'embryoides ne favorisent pas un développement normal de la vigne, et inversement des traitements qui favorisent le développement normal de la vigne limitent une embryogenèse somatique. La production de vignes ou autres végétaux à partir de cellules isolées par embryogenèse somatique est essentielle pour le progrès des modifications génétiques prévues pour l'amélioration des végétaux Ces stratégies peuvent impliquer des manipulations pour la sélection de cellules tolérantes à des stress ou contraintes physiques (le froidou la chaleur) ou des stress ou contraintes chimiques (par des herbicides, d'origine bactérienne et par des toxines fongiques) ou la prise en charge de vecteurs géniques par des protoplastes à partir de cellules embryo- géniques L'utilisation de l'embryogenèse somatique comme méthode différente pour la productionmassive de végétaux, en particulier de vignes, présente des possibilités, sans que toutefois des procédés aient été développés jusqu'à présent pour la plupart des cultivars. Les techniques de base pour la propagation clonale en masse de certains végétaux à partir de cellules épidermiques d'embryons somatiques sont exposées dans la publication "In Vitro Propagation of Grape",-W R Krul et Myerson ( 1980); Journal Article Number 1932 Rhode Island Agricultural Experimental Station On trouve également une discussion détaillée dans ce domaine, dans une thèse intitulée "Adventitious Embryo-genesis and Plantlet Development in Cultures of Vitis Vinifera L "Seyval"", Judith Myerson, thèse soumise à l'Université de Rhode Island actuellement enregistrée à la Bibliothèque de l'Université de Rhode Island, Kingston, Rhode Island. Conformément à la présente invention, on a maintenant découvert un procédé de production végétale et des végétaux produits par ce procédé, dans lesquels des embryons somatiques peuvent suivre un mode de développement par autoréplication ou un mode de développement de la vigne. Avant l'invention, lorsqu'on utilisait un procédé qui donnait de bons résultats dans la production d'embryons pouvant subir une autoréplication, le développement de plantes normales à partir de ces embryons se produisait à une fréquence d'environ 5 % L'invention permet un 2537157 ' développement de plantes fonctionnelles à partir de tels embryons à une fréquence supérieure à 90 % Grâce à l'invention, il est possible de maintenir un certain nombre de plantes dans le mode réplicatif et d'induire le développement de plantes fonctionnelles à des époques convenables pour un programme de production L'invention sera déCrite à titre d'exemple dans le cas de la propagation clonale de la vigne par l'intermédiaire de cellules épidermiques d'embryons somatiques du cultivar Vitis, spécifiquement l'hybride "Seyval". D'une manière générale, le processus de clonage consiste à prélever des embryons somatiques à partir d'une plante-"mère" (voir dessin annexé, cycle A) On cultive ces embryons pendant un premier intervalle de temps sur un milieu (milieu M/S sans régulateurs de croissance) Dans ce milieu, les embryons subissent une autoréplication. Ensuite, on transfère les embryons qui sont Choisis pour le développement de la vigne (voir dessin, cycle B) dans le même milieu comportant un régulateur de croissance ayant une activité cytokininique et on les maintient dans ledit milieu pendant un intervalle de temps fixé jusqu'à ce que le niveau de développement embryonnaire désiré soit atteint A ce stade, on transfère les embryons dans le même milieu *sans régulateur de croissance en les laissant se développer jusqu'à-permettre leur transplantation dans la terre. Le dessin annexé représente un schéma du cycle de vie d'un embryon somatique secondaire. On décrit ci-après le mode de réalisation préféré de l'invention en référence au développement embryonnaire suivant des modes d'autoréplication et de développement de la vigne. L'entretien des plantes mères et le prélèvement des embryons à partir d'une plante mère sont décrits dans la thèse précitée "Adventitious Embryogenesis and Plantlet Development in Cultures of Vitis Vinifera L ", 1 'Seyval", cette thèse étant par suite intégrée dans sa totalité dans la 2537157 ' description, à titre de référence. Une embryogenèse adventicielle, à savoir le déclenchement de la formation d'embryons directement à partir des cellules somatiques ou d'un autre embryon ou jeune plant en culture, n'est pas courante Dans l'exemple particulier, non limitatif, décrit ci-après, on cultive des embryons adventiciels, formés sur la surface de la zone de transition entre racine et pousse de jeunes plants "Seyval" en cours de développement, régénérés à partir d'une callosité Ces embryons engendrent d'autres embryons qui produisent également à leur tour des embryons, c'est-à-dire qu'ils passent par un processus de clonage Typiquement, une plante mère contient un nombre quelconque entre O à 100 de ces embryons Comme on le sait, il n'est en général pas nécessaire de détacher physiquement des embryons adventiciels de la zone de transition de la plante mère, car la plupart des embryons germent et se séparent spontanément de la plante mère. On a représenté sur le dessin le cycle de vie d'un embryon somatique secondaire de l'espèce "Seyval" du genre Vitis Le cycle A, à savoir le mode d'autoréplication, illustre la progression d'un embryon au stade torpide, en passant par son stade d'expansion pour parvenir finalement à son stade "reproducteur" Ce cycle exige 30-40 jours pour s'achever De tels embryons, une fois cultivés sur un milieu de Murashige et Skoog ( 1962), à base de sels minéraux et de vitamines additionnés de saccharose et exempt de régulateurs de croissance végétale, demeurent indéfiniment dans le mode "reproducteur" Pour obtenir un développement normal de vigne, (selon le parcours B) l'embryon au stade torpide est transféré dans le milieu M + S (défini ci-dessus) additionné de 2,5 g M de benzyladénine (BA) pendant une durée de 7 jours. Lorsque les cotylédons sont devenus verts et commencent à se séparer, on retire l'embryon de ce milieu et on le place dans le même milieu (M + S sans BA) jusqu'à ce qu'il soit prêt à être transplanté dans un mélange de terreau (environ 30 jours). Bien que l'on ait décrit un exemple particulier en référence à l'espèce "Seyval" dans lequel une embryogenèse adventicielle se produit spontanément à partir de la zone de transition radiculaire des embryons végétaux, sans intervention d'une phase calleuse, l'invention vise également l'embryogenèse ou développement végétal par les méthodes suivantes de déclenchement d'une formation d'embryons, par exemple d'autres types d'embryogenèse somatique compris dans le cadre de l'invention et qui sont effectués à partir d'une callosité, de cultures d'anthères ou de pollens, à partir de cellules tumorales ou de cellules transformées par l'addition de gènes étrangers ' Les embryons somatiques de Vitis Ep "Seyval" produisent des embryons somatiques secondaires à partir de cellules épidermiques à la zone de transition entre la racine et la pousse Ce processus de multiplication d'embryons (parcours A) se produit lorsqu'on cultive des embryons sur des milieux M additionnés de substances organiques et de 3 % de saccharose (milieux exempts d'hormones) Par transfert d'embryons produits sur des embryons mères dans des milieux exempts d'hormones, une embryogenèse somatique secondaire se déroule indéfiniment La plupart ( 95 %) des embryons produits ne se développent pas en vignes normales mais s'arrêtent au contraire à un stade de développement qui favorise la production d'embryons secondaires au lieu d'un développement normal des pousses (parcours A, dessin) Dans la phase de multiplication embryonnaire, les embryons ont d'une manière caractéristique des cotylédons non expansés, vrillés et blancs (au lieu de lisses et verts) et un sommet de pousse dormant Environ 5 % de ces embryons se développent en vignes normales par un processus qui passe tout d'abord par un verdissement des cotylédons, puis par la croissance du sommet de la pousse (parcours B) -Il serait désirable d'avoir un moyen de renforcer le développement normal de vignes de façon que des plants puissent être multipliés en utilisant le parcours (A) de multiplication embryonnaire et d'obtenir des vignes normales en soumettant les embryons somatiques à 2537157 ' un traitement spécifique. Les résultats de l'expérimentation suivante (EXEMPLE) révèlent un procédé qui augmente le développement normal de vigne à partir d'embryons somatiques (parcours B) L'expérimentation avait pour but de rechercher les effets de la benzyl adénine sur le développement d'embryons somatiques en vignes normales (parcours B) On utilise dans ce cas des embryons somatiques de troisclassesde dimensions différentes pour déterminer si la taille de l'embryon affecte sa susceptibilité au traitement par la benzyl adénine Les embryons de petite taille au stade torpide tardif sont caractérisés par leur dimension ( 2 mm), leur couleur (blancs), et leur absence de racine ou de sommet de pousse en cours d'expansion Des embryons de taille moyenne ( 2-6 mm) sont caractérisés par leur petite racine primaire, leur petite tige verte et leurs cotylédons vrillés, fusionnés blancs Des embryons dé grande taille sont morphologiquement similaires aux embryons de taille moyenne, mais sont plus gros ( 6-10 mm) On transfère des embryons somatiques (cycle A) de la zone de transition entre racine et hypocotyle d'embryons mères, dans des milieux MS additionnés de vitamines, de 3 -% de saccharose et de 2,5 AM de benzyl adénine (milieux BA) ou dans des milieux MS additionnés de vitamines et de 3 % de saccharose (milieux exempts d'hormones) Après une semaine de croissance sur des milieux BA ou des milieux exempts d'hormones, on transfère-des embryons dans des milieux exempts d'hormones Pendant ladite semaine, des cotylédons d'embryons développés sur BA verdissent, tandis que le développement des pousses commence. Toutefois, les cotylédons des embryons non traités restent blancs et les sommets de leurs pousses sont dormants (Tableau I) Le traitement par BA est le plus efficace sur des embryons de petite taille (Tableau I) Une fois que les embryons traités par BA sont-transférés dans des milieux exempts d'hormones, il se produit un développement normal des pousses et l'on obtient des vignes normales sans traitement ultérieur par BA Si l'on utilise des embryons de taille plus grande pour le traitement par BA, on obtient moins de 2537157. vignes normales (Tableaux I, II et III) Si l'on fait croître des embryons sur des milieux BA pendant un temps supérieur à une semaine, les cotylédons se développent d'une façon anormalement grande en devenant feuillus, et des vignes normales ne sont pas obtenues (résultats non représentés). Les embryons non traités par BA subissent une embryogenèse somatique secondaire et produisent jusqu'à 70 embryons par embryon mère après 38 jours Des embryons traités par BA pendant une semaine produisent également des embryons secondaires, mais généralement non pas au même degré que des embryons non traités. EXEMPLE On prélève des embryons à partir de plantes mères et on les cultive dans des milieux exempts d'hormones racine et de pousse) étant constitués par des-embryons de 2- 6 mm, et les grands embryons (embryons plus anciens avec racines et cotylédons divisés blancs) étant constitués par des embryons de 6-10 mm On-maintient 60 embryons, à savoir petits, 20 moyens et 20 grands, pendant sept ( 7) jours et respectivement 10 petits, 10 moyens et 10 grands embryons dans des milieux exempts d'hormones tandis que l'on maintient petits, 10 moyens et 10 grands embryons dans des milieux BA dans des tubes de 25 x 150 mm (fermés par des capuchons). Les milieux BA comprennent 10-ml de milieux de Murashige et Skoog, renfermant des additifs vitaminés, avec 3 % de saccharose, 0,8 % de gélose, 2,5 g M de BA, leur p H étant amené à 6 avec KOH; (milieu de culture le même que pour la culture de la plante mère) Les milieux exempts d'hormones sont identiques, excepté qu'ils ne contiennent pas BA. Après autoclavage, le p H final des milieux est de 5,7 On place les tubes sur des râteliers inclinés à 450 sous lumière fluorescente ( 10 x 25 u E), 25-1) pendant un temps d'exposition à la lumière de 16 heures suivi d'une obscurité pendant 8 heures, à dés températures ambiantes comprises entre 21 VC 270 C. Pendant les sept ( 7) jours, les embryons commencent à germer, c'est-à-dire qu'ils se développent avec de minuscules racines, pousses, et autres Le Tableau I ci-après montre les caractéristiques des embryons après une semaine de culture dans des milieux exempts d'hormones et des milieux BA. Ensuite, on laisse les 10 petits-, 10 moyens et 10 grands embryons maintenus dans les milieux exempts d'hormones, poursuivre leur culture dans des milieux exempts d'hormones pendant sept ( 7) jours supplémentaires, tandis que les 10 petits, 10 moyens et 10 grands embryons maintenus dans les milieux BA sont transférés dans des milieux exempts d'hormones comme décrit ci-dessus Le Tableau II montre le développement des plantes à partir des embryons maintenus dans le milieu à activité cytokininique comparé avec celui des embryons maintenus dans un milieu sans activité cytokininique. TABLEAU I Effet de BA sur le développement d'embryons secondaires semi-dormants après une semaine de traitement Incubateur 280 C 16 h à la lumière; 8 h à l'obscurité milieux de traitement Dimension des embryons initiaux' 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PD Embryons au stade q 4 2 GO-O GC-O GO-O GC-0 GO-O WC-O WC-O WO-O w O-O w O-O wc-O wc-O w O-O wc-O wc-O Wqc-o Milieux de traitement wc-O w O-O w O-O wc-O GO-O wc-0 GO-O wc-0 GO-O wc o w O-0 wc o GO-O w O-O w O-0 WC-2 w O-O w O-1 GO-O w O-0 w O-O w O-0 WC-2 GO-O GO-O w O-O w O-O GC-O w O O GO-O w O O w O-O GC 10 WC WC GC 60 OWC WC GC 80 WC WC Développement des plantes (PD) GO = Cotylédon vert WC = Cotylédon blanc N) - %ff w -Y b tn BA HF BA HF BA HF Petite Petite Moyenne Moyenne Grande Grande BA = Benzyl adénine HF = Exempts d'hormones CD TABLEAU II Effet du traitement par BA sur le développement des embryons somatiques semi-dormants après une semaine de traitement et une semaine dans des milieux exempts d'hormones de croissance Milieux de Dimension des traitement embryons avant le traitement 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PD Embryons au stade 420 WC-0 GOA-O GCA-0 w C-O w C-O w O-O WC-5 GO-i WC-O WC-O WC-3 WC-i GO-O WîC-0 WO-O w O-0 w O-3 wc-1 P-O WC-2 w O i w O-2 GO-i 1 WC 2 GO-O' wc i w O-3 ' w OO GO-O w O-O GO-O WC 2 w O-O w O-O i F 3 Go A 5 G O 1 WOA i GOA 3 G O 2 G O8 w C Milieu de traitement Développement des plantes BA = Benzyl adénine HF = Exempts d'hormones W = Cotylédon blanc GO = Cotylédon vert A = Sommet entr e GO et w O, P,= Plante % -.4 t tn BA HF BA HF BA HF 1 Petite Petite Moyenne Moyenne Grande Grande GCA-0 w O-0 GCA-5 wc-0 w O-0 wq C-0 GO-O w O O WCA-6 wc-O GO-O w O-O GC-1 i w C-O wc-O wc-O WC-2 w O-O GC-O w O-0 wc-0 w O-0 wc i NOMBRE 1 w O i O Wo WC i O Wo (PD) TABLEAU III Effet du traitement par BA sur le développement normal de la plante après une semaine de traitement et quatre semaines de croissance sur des milieux exempts d'hormones Milieu de traitement Dimension des embryons (mm) avant traitement % de plantes normales (après une semaine de traitement et trois semaines de croissance sur des milieux exempts d'hormones Petite ( 2537157. On laisse les embryons maintenus dans les milieux contenant la cytokinine poursuivre leur culture dans des milieux exempts de cytokinine comme mentionné ci-dessus Ils se développent finalement en plantes normales Ceci est montré dans le Tableau III. On peut utiliser d'autres cytokinines, naturelles et synthétiques, pour permettre la transition du mode de réplication des embryons en mode de développement de la vigne C'est-à-dire que grâce à l'invention, si l'on désire maintenir la plante dans le mode d'autoréplication, on ne la transfère pas dans le milieu à activité cytokininique, mais on la laisse au contraire poursuivre son développement, ce développement n'entrainant qu'un développement médiocre à inexistant de la plante, mais fournissant une multiplication embryonnaire très satisfaisante Lorsque l'on désire que les embryons passent au mode de développement de la vigne, on les transfère alors dans le milieu ayant l'activité cytokininique qui vient d'être décrit. L'invention a été décrite en référence à l'activité cytokininique de 2,5 "M de benzyl adénine Dans le cadre de l'invention, d'autres cytokinines naturelles et synthétiques qui permettent une transition du mode de réplication de l'embryon au mode normal de croissance et de développement de la vigne comprennent la zéatine et ses riboside et ribotide; l'isopentényl adénine et ses riboside et ribotide; la kinétine; l'éthoxyéthyladénine; la 2-2-hydroxyzéatine; la N,N 1-diphénylurée et la 8-azakinétine Bien que l'on ait décrit l'invention en référence à une concentration d'activité cytokininique de 2,5 ^M, il est entendu que dans le cadre de ladite invention on peut utiliser différentes concentrations de cytokinine qui favorisent l'activité désirée Les cytokinines peuvent être utilisées seules ou en combinaisons. Il est admis que deux facteurs jouent un rôle important dans le développement de plantes normales à partir de ces embryons, à savoir-la taille de l'embryon qui est transféré dans le milieu à activité cytokininique et la durée pendant laquelle on laisse la plante demeurer dans le milieu à activité cytokininique Plus particulièrement, la régulation de la croissance des embryons en tout milieu convenable jusqu'au moment o les embryons révèlent des signes de germination, à savoir de développement des racines, pousses et autres, se produit au cours du premier stade Le moment o l'embryon doit être physiquement retiré en vue de son transfert dans des milieux à activité cytokininique, peut être déterminé par les caractéristiques générales suivantes de l'embryon: (a) il doit avoir une longueur inférieure à 2 mm, être constitué de cotylédons, d'un hypocotyle et d'une racine visibles La couleur de l'embryon est dans la plupart des cas un blanc ivoire opaque avec. la zone radiculaire caractérisée par un tissu translucide jaunâtre Les cotylédons sont pressés les uns contre les autres et n'ont pas encore atteint une expansion complète etn'ont pas encore pris leur forme finale Environ 1/3 de la masse embryonnaire est constituée par un tissu cotylédonaire La zone radiculaire paraît être au stade primaire, par exemple encore au stade de division cellulaire, car aucun allongement cellulaire n'est évident La masse radiculaire est d'environ 1/4 (ou moins) de celle de l'embryon total Le descripteur morphologique correct de l'embryon à ce stade du développement est le stade torpide tardif. Une fois que le développement embryonnaire a atteint le stade décrit cidessus, si l'on désire que les embryons poursuivent leur développement en mode autoréplicatif (c'est-à-dire qu'ils produisent davantage d'embryons), on les laisse alors simplement demeurer dans le même milieu ou dans un milieu similaire Si l'on désire que les embryons passent au mode de développement de la vigne, on les transfère alors dans un milieu à activité cytokininique L'intervalle de temps pendant lequel les embryons demeurent dans le milieu à activité cytokininiqixe pendant une durée fixe est critique. Cet intervalle de temps fixe est suffisant pour assurer qu'au moment de la germination les embryons ne deviennent ni 2537157. sous-développés ni surdéveloppés, ce qui aurait pour conséquence que le développement normal de la vigne ne se produirait pas Le stade de développement auquel les embryons doivent être prélevés peut être décrit comme suit cotylédons divisés et verts le sommet peut être ou non visible. Bien que l'on ait décrit l'invention en référence à l'hybride "Seyval", d'autres plants de la catégorie ou classification suivante sont compris dans le cadre de l'invention: tous les genres pouvant former potentiellement les embryons somatiques à partir de cellules isolées. REVENDICATIONS 1 Procédé de régulation de la croissance d'embryons végétaux suivant des modes de développement par autoréplication ou des modes de développement de la vigne, caractérisé par le fait que: (a) on déclenche une embryogenèse somatique en plaçant des embryons somatiques dans un milieu favorisant une autoréplication des embryons pendant un premier intervalle de temps pendant lequel les embryons germent et sont caractérisés par un état torpide tardif avant leur allongement sous forme de racines et de pousses; (b) on cultive en vue du développement de vigne au moins certains des embryons du stade (a) dans un milieu présentant une activité cytokininique pendant un second intervalle de temps à la fin duquel les embryons sont caractérisés par des cotylédons verts divisés; (c) on transfère les embryons du stade (b) dans un milieu exempt d'activité cytokininique pendant un temps tel qu'ils se développent suffisamment pour être transférés dans un milieu formant un substrat de croissance non gélosé. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les embryons végétaux sont choisis parmi des plants qui sont susceptibles de former des embryons somatiques à partir de cellules isolées dudit plant. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les embryons dont on déclenche le développement sont choisis dans le groupe comprenant: des callosités, des cultures d'anthères ou de pollens et/ou des cellules tumorales. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on confère l'activité cytokininique au milieu du stade (b) par l'addition d'une quantité efficace d'une cytokinine choisie parmi le groupe comprenant la zéatine et ses riboside et ribotide, l'isopentényl adénine et ses riboside et ribotide; la kinétine; l'éthoxyéthyl- adénine; la 2-2 hydroxyzéatine; la N,N-diphénylurée, la benzyl adénine et/ou la 8-azakinétine. 37157 i Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que la cytokinine est la benzyl ad-nine. 6 Plant produit par le procédé selon la revendication 1. 7 Plant selon la revendication 6, caractérisé par le fait qu'il est constitué par le cultivar hybride "Seyval".