Brevet FR2544167A1 — publié le 19841019

La présente invention concerne la préparation d'hybrides somatiques de luzernes par fusion de protoplastes de deux espèces de luzernes, notamment de Medicago falcata avec Medicago sativa, la luzerne cultivée. Les produits de fusion de ces deux espèces permettent d'introduire une variabilité génétique chez la luzerne conduisant à la sélection de nouvelles variétés industriellement intéres- santes. Bien que l'on sache régénérer des plantes à partir de protoplastes de M sativa, il n'existe aucun exemple de régénéra- tion après le traitement de fusion sur M sativa et aucun exemple connu de fusion suivie de régénération chez les légumineuses. La présente invention propose un procédé d'obtention d'hybrides somatiques de luzernes, caractérisé en ce que: a) on isole les protoplastes de deux espèces de luzerne, b) on fait fusionner les protoplastes obtenus, c) on effectue une régénération des plantes après l'opération de fusion. Ce procédé peut également s'appliquer à la fusion de protoplastes de deux génotypes de la même espèce. Un élément important de ce procédé est l'utilisation de chlorure de calcium comme agent fusionnant. Les protoplastes de chaque génotype ou espèce sont préparés séparément par digestion enzymatique à l'aide de cellulase, hémi-cellulase et pectinase dans un milieu de culture dérivé de celui de Kao. Après centrifugation, les protoplastes issus de l'opéra- tion de fusion sont incubés à l'obscurité pendant une dizaine de jours. Les protoplastes sont ensuite cultivés sur un milieu de culture dérivé de celui de Kao par apport régulier de milieu frais. Les embryoides obtenus sont alors cultivés sur papier filtre puis repiqués sur milieu solide. On obtient ainsi, après un délai d'environ 6 mois, aes plantules qui sont soumises à l'étude pour rechercher les caractéristiques les différenciant des parents. EXEMPLE 1 On utilise comme parents deux espèces de luzerne: Medicago sativa, et Medicago falcata. Les protoplastes sont obtenus par une incubation lente de 15 à 16 heures à l'obscurité à 26 C, dans une solution enzymatique contenant: cellulase, hémi-cellulase et pectinase, diluée avec du milieu de culture, dérivé de celui de Kao (Molec. Gen Genet 150, 225-230, 1977). NH 4 NO: 600,00 mg/1 4 NO 3 KNO 3: 1 900,00 Ca C 12,2 H 20: 600,00 Mg SO 4,7 H 20: 300,00 KH 2 PO 4 KH 2 P:4 170,00 KC 1: 300,00 KI H 3 B Mn 54, H 20 Zn 504 7 H 20 Na 2 Mo O 4 2 H 20 Cu SO 4, 5 H 20 Co C 12, 6 H 20 Pour EDTA:8 ml/i. Inositol Nicotinamide Pyridoxine H Cl Thiamine H Cl D-Ca pantothénate Acide folique Acide p-aminobenzoique Biotine Chlorure de choline Riboflavine Acide ascorbique Vitamine A Vitamine D 3 Vitamine B 12 Glucose Saccharose Fructose Ribose Xyiose Mannose Rhamnose Cellobiose Sorbitol Mannitol- :-0,75 mg/i 3,00 ,00 2,00 0,25 0,025 0,025 ,00 mg/i 1,00 1,00 ,00 0,50 0, 20 0,01 0,005 mg/i 0,50 0,10 1,00 0,005 0,005 0,01 -: 110 400,00 mg/i , 100 ,'00 ,00 ,00 ,00 ,00. ,00- ,00 ,00 -25 -4 2544167 Acides organiques (p H = 5,5): Pyruvate de sodium: 5 mg/1 Acide citrique 10 Acide malique: 10 Acide fumarique 10 2,4 D: 0,2 mg/l Zéatine: 0,5 A.N A: 1,0 N.Z amine: 125 mg/l Eau distillée: 1000 ml (p H = 5,7 / Na OH filtré). La solution enzymatique est 8 tée puis les protoplastes sont lavés une fois avec du milieu de culture et mis en suspen- sion à 250 000 protoplastes/ml. Les suspensions sont alors réparties comme suit: 1 tube avec 2 ml de protoplastes de M sativa 1 tube avec 2 ml de protoplastes de M falcata (témoins de viabilité des protoplastes) 1 tube avec 4 ml de protoplastes de M sativa 1 tube avec 4 ml de protoplastes de M falcata (témoins de viabilité après l'opération de fusion) 4 tubes avec 2 ml de protoplastes de M sativa + 2 ml de protoplastes de M falcata (destinés à l'opération d'allofusion). Tous les tubes, sauf les témoins de viabilité des proto- plastes, sont centrifugés à 100 g pendant 4 minutes; le surnageant est ôté Puis, on ajoute dans chaque tube 2 ml de solution de fusion: Ca C 12 2 H 20: 0,74 g Mannitol: 9,5 g dans 100 ml de tampon glycine à 0,375 g de glycine pour 100 ml. Le p H est ajusté à 10,4 et la solution est stérilisée par filtration. Les protoplastes sont remis en suspension dans cette solution à la pipette Pasteur; puis les tubes sont mis dans un bain-marie à 320 C pendant 15 minutes. Les tubes sont ensuite centrifugés pendant 5 minutes à 60 g Les protoplastes sont alors lavés une fois avec une solution saline (sels de Frearson, Frearson et al, Dev Biol. 33, 130-137 ( 1973): KH 2 P 04 27,2 mg/L KNO 3: 101,0 Ca C 1212 H 20: 1480,0 Mg SO 4,7 H 20 246,0 KI 0,16 Cu 504:5 H 20 0,025 - et une fois avec du milieu de culture puis mis en suspension à 000 protoplastes/ml à raison de 3,5 ml par boite, dans des boîtes de Pétri prétraitées (de 5 cm de diamètre) scellées au parafilm. Les protoplastes sont cultivés à 26 C, à l'obscurité pendant 10 jours, puis en lumière diffuse. A 7 jours de culture, on observe des divisions dans toutes les boites, on dilue alors de la façon suivante: Les 4/5 du contenu de chaque boîte sont transférés dans une boite neuve, on réajuste alors la quantité de liquide dans les boîtes par adjonction de milieu frais; (ce procédé limite les pertes dues à la production de phénols en cours de culture) Les cultures sont ensuite mises en lumière diffuse et entretenues en ajoutant du milieu frais tous les 7 jours jusqu'à l'obtention de petits embryoides de 1 mm qui sont alors cultivés sur papier filtre jusqu'au repiquage en milieu solide. Le pourcentage de fusion, délicat à observer du fait que la manipulation s'effectue en tube, peut être estimé entre et 10 %. Les plantes régénérées sont étudiées pour un certain nombre de marqueurs: cytoplasmiques (la stérilité mâle), nucléaires (marqueurs enzymatiques, biométrie de la plante, coloration des fleurs) Il est ainsi possible de détecter les produits d'allofusion. L'un des hybrides somatiques suffisamment développé a pu être identifié comme étant un produit de fusion par le zymogramme des peroxydases qui cummule les bandes des deux génotypes parentaux et par la bigarrure des fleurs qui carac- térise les hybridations entre M sativa et M falcata. REVENDICATIONS 1) Procédé d'obtention d'hybrides somatiques de luzernes, caractérisé en ce que: a) on isole les protoplastes de deux génotypes ou de deux espèces de luzerne, b) on fait fusionner les protoplastes obtenus, c) on effectue une régénération des plantes après l'opération de fusion. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise comme agent fusionnant à l'étape b) le chlorure de calcium. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les deux espèces de luzerne parentes sont Medicago sativa et Medicago falcata.