Brevet FR2547057A1 — publié le 19841207

i Procédé pour fixer d'une façon stable des antigènes et des allergènes sur des supports solides et supports destinés a cet usage ". L'invention concerne un procédé pour fixer d'une façon stable des antigènes et des ailergènes sur des supports solides et concerne aussi des supports nécessaires à cet effet. Plus particulièrement, l'invention se 10 réfère à un procédé pour fixer d'une façon stable des antigènes et des allergènes sur des surfaces de polystyrène, d'une façon qui soit propre à faire ressortir les anticorps spécifiques avec des techniques radioimmunologiques ou immunoenzymatiqueso Comme on le sait, c'est une technique commune aujourd'hui dans la radioimmunologie que d'employer des phases solides, réalisées en fixant les antigènes sur des substrats insolubles dans l'eau, pour faciliter les manipulations, par exemple des lavages, pour éliminer les anticorps non-spécifiques, et la mesure de la radioactivité associée. Suivant la demande de brevet italien n O 4568 A/68 du 22 Mai 1968, ces phases solides peuvent être constituées par de la cellulose ou de la sépharose 25 activées avec des halogénures de cyanogène, par exemple avec du bromure de cyanogène. On sait aussi que l'on peut employer à cet effet des particules de latex. Ces dernières, cependant présentent l'inconvenient de nécessiter une centrifugation pour permet5 tre leur séparation de la suspension Pour ce motif, on préférera les phases solides qui ne sont pas en particules, par exemple les polyamide, polyéthylène, polyvinyle, polystyrene: ces phases solides peuvent se présenter sous la forme d'éprouvettes d'essai, de sphères, de micropla10 quettes, etc Suivant le brevet US 3 646 346, les antigènes et les allergènes peuvent être fixés sur la phase solide par simple adsorption superficielle. Ce type de liaison, cependant présente 15 des inconvénients, soit parce que la stabilité n'est pas suffisamment garantie dans le temps, ni en cas de contraintes mécaniques et thermiques, parce que la quantité d'antigènes ou d'allergènes fixée est très faible Cette faiblesse de la quantité fixée constitue un graveinconvé20 nient surtout quand l'antigène ou l'allergène est de composition hétérogène, ce qui est par exemple le cas de la majorité des allergènes des pollens, des mycophytes, des acares Dans ces cas, en fait, il est nécessaire de fixer sur la phase solide une quantité importante d'allergènes 25 si on veut avoir la certitude que tous les allergènes qui ont un intérêt clinique sont représentés Un autre inconvénient que l'on peut vérifier avec ce type de liaisons est qu'une certaine phase solide a la propriété de fixer d'une façon non-spécifique des protéines du sérum soumis 30 à l'examen, par exemple des gammaglobulines Ce phénomène, qui rend, en pratique, le matériau inutilisable peut être vérifié d'une façon prononcée, par exemple avec des allergènes conjugués avec du polyamide par l'intermédiaire de glutaraldéhyde et essayés dans un système RAST, pour le 35 relevé des anticorps Ig E spécifiques En outre, si l'on utilise des allergènes fixés sur la cellulose au moyen par exemple de la trichloro-S-triazine, on obtient des résultats élevés avec les sérums des patients positifs, mais aussi des taux inacceptables de liaisons non-spéci5 fiques avec les sérums de contrôle négatifs. Un autre aspect négatif de ces techniques de liaison est la procédure chimique Comme on le sait, on cherche dans ces techniques à stabiliser une liaison chimique la plus stable possible, par exemple covalente, 10 entre l'antigène ou l'allergène et la phase solide. Suivant le brevet GB n 1 257263, un réactif particulièrement adapté à cet effet est le glutaraldéhyde, que l'on utilise, par exemple à une concentration de 0,2 %, à p H 6,8, pendant une durée de 12 heures. 15 Un inconvénient de cette façon de procéder est que l'exposition des antigènes, et surtout des allergènes avec le glutaraldéhyde en provoque une modification chimique partielle Comme il est bien connu, en fait la modification des allergènes par le glutaraldéhyde a été utilisée pour 20 préparer des "allergoides", c'est-à-dire des allergènes qui ont perdu, dans une large mesure, la capacité de réagir avec les anticorps spécifiques de la classe Ig E (V Patterson R et al, 3 Allergy clin Immunl 63, 47, 1979) Les allergènes ainsi modifiés peuvent avoir des applications utiles dans la thérapeutique, comme vaccins, mais ils ne peuvent certainement pas être utilisés pour établir des diagnostics. L'invention a pour but de réaliser un procédé pour fixer, d'une façon stable, les antigènes ou 30 les allergènes sur une phase solide, par exemple, du polystyrène, tout en évitant les inconvénients mentionnés cidessus. Plus particulièrement, l'objet de l'invention est de réaliser un procédé qui permette de fixer, d'une façon stable et résistante aux contraintes mécaniques et thermiques, et d'une façon spécifique, les antigènes ou les allergènes sur une phase solide, sur du polystyrène par exemple, sans provoquer une dénaturation complète, ni même partielle de ces substances. Conformément à l'invention, ces objectifs sont atteints par un procédé qui consiste à faire réagir un aldéhyde polyfonctionnel avec la phase solide du substrat, à éliminer l'excès d'aldéhyde par lavage, à faire incuber la phase solide ainsi obtenue avec les antigènes ou les allergènes, et à stabiliser la liaison entre l'aldéhyde et les antigènes ou les allergènes, au moyen d'un traitement avec des substances réduisant la liaison aldéhyde, comme par exemple l'hydrure boro-sodique, le borohydrure cyanosodique ou autres analogues. Comme aldéhyde polyfonctionnel, on préférera le glutaraldéhyde. La phase solide est constituée de préférence de polystyrène sous forme de sphères ou de microplaquettes. Des essais faits par la Demanderesse ont mis en évidence le fait qu'en opérant dans les conditions du procédé décrit ci-dessus, il ne se produit aucune dénaturation des antigènes, ni des allergènes, car, l'aldéhyde étant fixé sur la phase solide n'a pas la possibilité 25 de créer des liaisons intra, ni intermoléculaire entre des molécules diverses d'antigènes ou d'allergènes La liaison qui se forme dans les conditions du présent procédé est seulement une liaison covalente entre l'aldéhyde et un des groupes aminés des antigènes ou des allergènes En fait, 30 il est connu qu'à peu près tous les antigènes et allergènes non synthétiques (par exemple dérivés de pollens, de mycophytes, d'acares, d'aliments, de parasites), sont de nature protéique ou glycoprotéique et par suite possèdent de nombreux groupes aminés (-NH 2) disponibles pour 35 une telle liaison. Les phases solides, préparées suivant le procédé qui fait l'objet de l'invention, ont été essayées dans le système RAST pour révéler les anticorps Ig E spécifiques dans le sérum des patients allergiques Les résul5 tats obtenus ont été semblables à ceux que l'on obtient avec des plaquettes de cellulose, activées avec du bromure de cyanogène, avec cet avantage, par rapport aux plaquettes de cellulose, que l'on peut alors rendre les opérations automatiques. En particulier, la liaison spécifique, c'est-à-dire celle qui se présente par exemple dans les sérums de contrôle normaux se montre en général suffisamment basse et dans certains cas est totalement absente. En ce qui concerne le support de poly15 styrène à utiliser, les meilleurs résultats ont été obtenus avec des matières solides dont les surfaces ont été traitées de façon à devenir rugueuse De cette façon, il est possible d'augmenter la surface de réaction et en conséquence la quantité d'antigènes ou d'allergènes fixés. 20 Avant le traitement, on a avantage à laver la matière spécialement si elle est rugueuse, comme par exemple les sphères, avec de l'eau ou mieux avec des solutions salines, afin d'éliminer totalement les résidus pulvérulents du travail qui pourraient avoir une influence négative sur 25 les opérations suivantes. Toutefois, on peut utiliser aussi, avec des résultats satisfaisants, des surfaces-de polystyrène lisses, par exemple des éprouvettes ou des microplaquettes Ces surfaces lisses, si elles sont traitées convena30 blement peuvent aussi se prêter à la lecture colorimétrique de la densité optique avec des instruments appropriés: cette possibilité se montre particulièrement avantageuse pour l'exécution de dosages immunoenzymatiques Après les lavages et avant le traitement avec l'aldéhyde, le support 35 est séché sous un courant d'air. En dehors du glutaraldéhyde, on peut encore utiliser d'autres aldéhydes polyfonctionnels, possédant de 4 à 12 atomes de carbone. La concentration du glutaraldéhyde ou en 5 général de l'aldéhyde polyfonctionnel n'a pas une importance critique et peut être choisie dans un large intervalle, par exemple de 0,01 M à 1 M On préférera les concentrations comprises entre 0,1 et 0,5 M. Le glutaraldéhyde peut être dissous dans 10 une solution tampon, par exemple une solution tampon de borate ou encore de phosphate de sodium, à un p H alcalin compris entre 7, 1 et 9 La durée de réaction entre le polystyrène et le glutaraldéhyde n'est pas critique et peut être choisie dans de larges limites; une durée de 15 quelques heures s'est montrée suffisante pour obtenir le maximum d'activation Il est recommandé de maintenir les réactifs sous agitation pendant la réaction La réaction avec le glutaraldéhyde terminée, le support sera lavé soigneusement et à plusieurs reprises avec la solution tampon du type employé dans la préparation de la solution de glutaraldéhyde. Le support de polystyrène ainsi lavé est mis à incuber avec les antigènes ou les allergènes qui doivent être prélevés d'une façon covalente par la matière 25 plastique La concentration de ces antigènes ou allergènes varie, d'un cas à l'autre et sera déterminée par des essais préliminaires Généralement la concentration optimale peut varier de 0,1 microgramme/ml à 2 milligrammes/ml. Le p H optimum de la réaction de liaison 30 est habituellement faiblement alcalin et sera compris entre 7,1 et 9 Déjà au bout de quelques minutes d'incubation, la liaison des antigènes ou allergènes avec le substrat est suffisante pour l'exécution des tests radioimmunologiques ou immunoenzymatiques subséquents; tou35 tefois, on préférera prolonger la réaction de liaison pendant quelques heures, ou même pendant toute une nuit. Dans certains cas, et pour certains antigènes ou allergènes, il est à conseiller d'ajouter à leur solution une protéine inerte, par exemple de l'albumine bovine, ou encore des acides aminés, par exemple de la lysine, ou encore des amines organiques, de la monoéthanolamine par exemple; cette mesure a pour objet d'obtenir un espacement des molécules d'antigène ou d'allergène sur la matière plastique et par suite d'améliorer leur disponi10 bilité stérique, et par suite leur réactivité immunologique Quand la réaction de liaison entre les antigènes ou allergènes et le substrat est terminée, on lave soigneusement, et à plusieurs reprises, le support de polystyrène avec une solution tampon pour éliminer l'excès non fixé. 15 Comme solution tampon, on utilisera de préférence la même solution tampon dans laquelle on aura dissous le glutaraldéhyde. Suivant l'invention, la liaison entre le glutaraldéhyde et les antigènes ou allergènes est stabili20 sée par un traitement avec de l'hydrure borosodique Ce traitement de stabilisation permet aussi d'éviter que des sites réactifs, restés éventuellement disponibles, puissent réagir ensuite avec les protéines du sérum. Des quantités même faibles d'hydrure boro25 sodique sont suffisantes pour obtenir l'effet recherché. On peut utiliser, par exemple, des concentrations d'hydrure boro-sodique comprises entre 0,1 et 1 g/1 à un p H légèrement alcalin comme par exemple entre 7,1 et 8 et pendant une durée d'environ une heure. Après des lavages répétés avec la même solution tampon que précédemment, le support est traité avec une solution tampon contenant une protéine inerte par exemple de l'albumine humaine, de l'albumine de sérum bovin ou de sérum de cheval Ce traitement a pour but de 35 créer sur la matière plastique un revêtement hydrophile immunologiquement inerte qui diminue au cours des travaux successifs la liaison non-spécifique d'une partie des protéines et des anticorps du sérum Les phases solides ainsi préparées, portant, fixés sur elles d'une façon sta5 ble l'allergène ou l'antigène, peuvent être conservées, immergées dans une solution tampon, telles quelles, ou additionnées d'une protéine inerte et d'un agent tensioactif non-ionique, par exemple celui qui est connu dans le commerce sous la désignation Tween 20 ou Tween 80 En 10 variante, elles peuvent être conservées à l'état sec. Dans ce dernier cas, le séchage pourra s'opérer par lyophilisation, ou encore sous un courant d'air, en étant dans les deux cas précédé par un lavage à l'eau distillée ou déminéralisée pour éliminer les sels et Ies protéines 15 éventuellement présentes. Les phases solides obtenues suivant le procédé de l'invention donnent des produits très stables dans le temps, qu'ils soient conservés à l'état humide ou à l'état sec Des stabilités d'une année et plus peu20 vent être obtenues. Ces phases solides peuvent être utilisées pour déceler les anticorps des classes Ig E, Ig G, Ig A ou encore Ig M spécifiques des antigènes ou allergènes Les dosages-peuvent être appliqués à des sérums humains ou d'animaux domestiques, soit aux fins de diagnostiquer une maladie allergique ou infectieuse en cours, soit pour vérifier un état d'immunité, par exemple à la suite de vaccinations prophylactiques. L'invention est expliquée ci-après à 30 l'aide de quelques exemples qui ont un caractère uniquement illustratif, sans idée de limitation. Dans les exemples, toutes les parties s'entendent en poids sauf indication contraire. Exemple 1: Préparation de phases solides pour le dosage, 35 avec le système RAST, d'anticorps Ig E spécifiques pour les allergènes des pollens de graminées. On lave pendant 24 heures 300 sphères de polystyrène rugueux d'un diamètre de 6,4 mm, avec une solution abondante de Na Cl 0,1 M, puis avec de l'eau démi5 néralisée, et on les sèche sous un courant d'air Les sphères sont transférées dans un récipient à fermeture hermétique et traitées, pendant 5 heures, avec 200 ml de glutaraldéhyde 0,2 M, dilué dans une solution tampon de phosphate trisodique à p H 7,2 ( 0,15 M) sous agitation continue par renversement La solution de glutaraldéhyde est éliminée et les sphères sont lavées trois fois avec la même solution tampon de phosphate trisodique On aspire l'excès de liquide, et on ajoute 200 ml d'allergène de graminées, contenant 0,4 mg de protéine/ml, dissous dans 15 une solution tampon de phosphate à p H 7,2, dosé par la méthode de Lowry, et on agite pendant 16 heures Les sphères sont lavées trois fois en changeant la solution tampon On aspire l'excès de liquide et on ajoute 400 ml de solution à 0,37 % en poids d'hydrure borosodique On 20 laisse au repos pendant une heure On lave les sphères en changeant deux fois la solution tampon indiquée plus haut et enfin on remet en suspension dans la même solution tampon contenant 0,2 % d'albumine bovine et 0,4 % de Tween 20, et conservée à 4 C. Au moment de l'utilisation, les sphères sont distribuées dans des éprouvettes de 12 mm de diamètre et on les fait incuber d'abord avec le sérum du patient soumis à l'examen, et ensuite avec un anticorps anti-Ig E, marqué avec 125, suivant la méthode RAST déjà 30 connue et mise au point avec des phases solides constituées de cellulose activée avec du bromure de cyanogène, comme il est décrit dans Falagiani P et al Folia Allergol Immunol Clin 25, 579, 1978. Quand les opérations prévues par la 35 méthode RAST sont terminées, on mesure la radioactivité -10 des éprouvettes et ainsi des sphères qu'elles contiennent avec un compteur gamma, et on procède à l'élaboration des résultats selon les critères décrits dans la publication indiquée cidessus On peut utiliser la même procédure 5 pour doser les anticorps Ig E spécifiques pour d'autres allergènes, provenant par exemple d'acares, de mycophytes, de pollens, d'aliments, de parasites. La concentration des antigènes peut être modifiée en se basant sur les informations obtenues au 10 cours des essais préliminaires. Exemple II: Préparation d'une phase solide constitué par un antigène de Micropolyspora faeni, fixé sur une microplaquette de polystyrène pour le dosage des anticorps Ig G spécifiques par la méthode immunoenzymatique. On utilise une microplaquette de polystyrène rigide du type PBI "Elisa", dans laquelle sont estampées 96 pochettes en U Dans chaque pochette, on dépose à la pipette 0,3 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 3 %, ce qui correspond à une proportion de 0,3 molaire, diluée dans une solution tampon de phosphate à p H 8, et on laisse incuber sous une légère agitation pendant 4 heures On aspire la solution avec une pompe à vide, on remplit, puis vide par renversement les pochettes, 5 fois, avec la solution tampon de phosphate On 25 élimine la solution tampon et on introduit par pipette dans les pochettes, 0,3 ml d'antigène de Micropolyspora faeni, ayant un titre en protéine de 1,1 mg/ml On couvre les plaques avec une feuille de Parafilm, et maintient sous une faible agitation pendant 18 Heures On aspire l'antigène et on lave la plaquette en la remplaçant et la vidant 5 fois de la solution tampon indiquée plus haut. On vide la plaque et remplit les pochettes de 0,4 ml d'une solution à 0,5 % d'hydrure borosodi35 que dans une solution tampon de phosphate trisodique à 1 t p H 7,2 et on laisse reposer pendant 2 heures On lave la plaque avec la solution tampon de phosphate trisodique et enfin avec la meme solution tampon contenant 0,2 % d'albumine bovine. Les plaques peuvent être conservées jusqu'au moment de l'utilisation à une température comprise entre + 4 et 20 C, ou encore être lavées avec de l'eau déminéralisée, laissées sécher et conservées à la température ambiante Ces phases solides peuvent être utilisées 10 pour éxécuter le dosage des Ig C par la méthode immunoenzymatique, comme il est décrit dans Voller A et al dans "Manuale of Clinical Immunology, eds N R Rose and H. Friedman, p 506 American Society for Microbiology, 1976 ". Dans chaque pochette, on introduit par pipette 200 micro15 litres de sérum dilué proportionnellement, on laisse incuber pendant 2-heures, lave trois fois avec la solution tampon de phosphate trisodique indiquée plus haut, contenant 0,4 % de Tween 20 On ajoute 200 microlitres d'anticorps anti Ig G conjugué avec des peroxydases, on laisse 20 incuber pendant une nuit à + 40 C, lave trois fois avec la solution tampon de phosphate trisodique contenant 0,4 % de Tween 20 On ajoute 200 microlitres d'une solution contenant 34 mg d'orthophénylènediamine à 100 ml d'une solution tampon de phosphate-citrate à p H 5 On 25 laisse à l'obscurité pendant 30 minutes, on bloque la réaction avec 50 ml d'acide sulfurique 12,5 % poids/ volume, et l'intensité de la couleur qui s'est développée est déterminée avecvle colorimètre réglé à la longueur d'onde de 492 mm. La petite plaque préparée ci-dessus peut être utilisée aussi pour la détermination d'une solution de protéine A de Staphylococcus aureus, toujours marqué avec des peroxydases. L'enzyme peroxydases peut aussi être remr 35 placé par des phosphatases alcalins ou encore par des bétagalactoxydases. Si, au lieu d'utiliser les plaquettes décrites, on utilise des pochettes détachées de polystyrène du type PB 1 "Cellules Indiwell", il est possible, 5 avec une procédure analogue, d'exécuter des radioimmunodosages Dans un cas de ce genre, après l'incubation avec l'anticorps anti-Ig G ou encore avec la protéine A du Staphylococcus aureus, marquée par exemple avec 125 I, et les lavages décrits, les pochettes seront insérées dans 10 des tubes à essai, et leur radioactivité sera déterminée avec un compteur gamma. RE VE N D I C A T I O NS ) Procédé pour fixer d'une façon stable des antigènes et des allergènes sur des supports solides, en particulier sur du polystyrène, caractérisé en ce qu'il comprend les phases suivantes: faire réagir un aldéhyde polyfonctionnel avec la phase solide du support, éliminer l'excès d'aldéhyde par lavage, faire incuber la phase solide ainsi traitée avec les antigènes ou les allergènes, et finalement stabiliser la liaison entre l'aldéhyde et les antigènes ou les allergènes par un traitement avec des substances réduisant la liaison ald-iminée. 2 ) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la substance réduisant la liaison ald-iminée est l'hydrure boro-sodique ou le borohydrure 15 eyanosodique. 3 ) Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'aldéhyde polyfonctionnel est le glutaraldéhyde. 4 ) Procédé suivant l'une des revendica20 tions 1 et 2, caractérisé en ce que l'aldéhyde po Iyfonetionnel contient de 4 à 12 atomes de carbone. ) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 a 4, caractérisé en ce que le support solide se présente sous la forme de sphères ou de plaquet25 tes. 6 ) Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la surface du support solide est rugueuse. 7 ) Procédé suivant l'une quelconque des 30 revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la concentration de l'aldéhyde polyfonctionnel est comprise entre 0,01 M et 1 M, de préférence entre O,1 et 0,5 M. 8 ) Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que l'aldéhyde polyfonctionnel est dissous dans une solution tampon de borate de sodium ou de phosphate de sodium dont le p H est compris entre 7,1 et 9. 9 ) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on enlève l'excès d'aldéhyde polyfonctionnel, après la réaction, par lavage avec la même solution tampon que l'on a utilisée pour la préparation de la solution d'aldéhyde. ) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que, à la solution contenant les antigènes ou les allergènes, on ajoute une 10 protéine inerte, ou des aminoacides, ou encore des amines organiques. 11 ) Procédé suivant l'une quelconque des revendications i à 10, caractérisé en ce que le traitement de stabilisation est effectué avec une solution d'hydrure 15 boro-sodique dont la concentration est comprise entre 0,1 et i g/l, le p H entre 7,1 et 8, pendant une durée d'environ une heure. 12 ) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le support est traité avec une solution tampon contenant une protéine inerte telle que l'albumine humaine, l'albumine du sérum bovin ou l'albumine du sérum de cheval. 13 ) Support solide obtenu suivant l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce 25 qu'il porte fixé, d'une façon stable et résistante aux traitements mécaniques et thermiques, et d'une manière spécifique, des antigènes ou des allergènes. 14 ) Support solide caractérisé en ce qu'il peut être utilisé pour déceler les anticorps des classes 30 Ig E, Ig G, Ig A ou Ig M, spécifiques pour des antigènes ou des allergènes, soit aux fins de diagnostiquer une maladie allergique ou infectieuse, soit pour vérifier un état d'immunité.