Brevet FR2540251A1 — publié le 19840803

APPAREIL ET PROCEDE DE DIAGNOSTIC. La présente invention concerne un appareil de diagnostic servant à détecter une hémorragie masquée dans les excréments. La présence du sang dans les excréments peut être l'indice de lésions intestinales, fréquemment d'un carcinome. Une détection précoce de saignement intestinal est donc utile pourdépister le cancer colorectal, l'une des maladies les plus mortelles dans les pays industrialisés. Le dépistage s'est largement répandu quand Greegor a montré qu'un carcinome colorectal précoce asymptomatique pouvait être diagnostiqué par des tests systématiques des excréments pour rechercher une hémorragie masquée, et aussi par une étude ultérieure de ceux qu'on trouvait être positifs. On a donc préparé des trousses de diagnostic vendues dans le commerce et elles ont été utilisées aussi bien par des pathologistes que par des généralistes Le fonctionnement d'une trousse d'un type facilement disponible est fondé sur une réaction chimique qui est catalysée par l'hémoglobine, c'est-à-dire la principale protéine contenue dans le sang. Bien que d'usage simple, ces trousses présentent plusieurs inconvénients La sensibilité et la spécificité sont les principaux problèmes et l'absence de l'une ou de l'autre aboutit à des négatifs faux et des positifs faux. Dans certaines études, on a démontré que les résultats faux pouvaient atteindre 75 % L'absence de sensibilité, et les faux résultats négatifs obtenus, dépendent de l'incapacité d'un certain test à détecter de faibles niveaux d'hémoglobine. Les agents tels que la vitamine C interviennent également et provoquent de fausses réactions négatives Les faux résul- tats négatifs ont des conséquences graves puisqu'un diagnostic précoce du cancer est critique pour la survie. Le manque de spécificité et les faux positifs sont un problème technique beaucoup plus important Dans les tests mentionnés plus haut, ceci est provoqué par des réactions chimiques similaires qui ne sont pas dues à l'activité de l'hémoglobine humaine D'une part, les protéines végétales et l'hémoglobine ou la myoglobine dérivée de la viande animale ingérée peuvent interférer avec la réaction Dans d'autres cas, l'activité de la flore bactérienne provoque une réaction similaire Les instructions diététiques sont peu commodes et ne sont pas faciles à suivre rigoureusement. En outre, il est impossible de régler la réaction des bacté- ries et son interférence. Ces problèmes et certains autres problèmes mineurs associés aux trousses classiques du commerce ont encouragé différentes façons d'aborder les recherches On a donc imaginé un certain nombre de titrages immunochimiques pour améliorer la sensibilité et en particulier la spécificité des examens. Un titrage d'immunodiffusion radiale a été créé avec utilisation des anticorps pour l'hémoglobine On pré- pare ces derniers chez les lapins et ils sont absorbés de façon poussée afin de purifier la fraction monospécifique qui ne réagit qu'avec l'hémoglobine humaine La préparation est élaborée et on doit estimer chaque lot en ce qui concerne sa réactivité croisée et sa sensibilité avant emploi En outre, le procédé du test lui-même n'est pas simple, il implique un certain nombre de stades délicats et nécessite 24 heures pour la lecture Il est donc peu probable que ce test puisse être appliqué à des programmes étendus de dépistage. On a également conçu un autre titrage immunochimique sous forme d'un test immunofluorescent Il utilise un sérum de lapin anti-hémoglobine humaine marquée à la fluorescéine qu'on mélange avec la suspension des matières fécales et on lit ultérieurement les résultats sur un fluoromètre Comme la préparation des anti-sérums, en raison de la nécessité de tester de façon poussée chaque lot obtenu, est une opéra- tion qui prend du temps, dans une production à grande échelle, ce facteur jouera sur le prix Le test lui-même est automa- tisé et tacile à effectuer Cependant, la sensibilité peut poser un problème pour autant que l'estimation quantitative basée sur un titrage d'inhibition n'est pas précise au dessous de 5 mg d'hémoglobine par gramme d'excréments,-ce qui est bien au-dessus de la limite normale supérieure de 1,8 mg/g. Un troisième titrage immunochimique a également été conçu et il est basé sur le titrage d'un Immunosorbant lié par Enzymes (Enzyme Linked Immunosorbant Assay ou ELISA) qui est très sensible Sa spécificité dépend de l'anti-sérum utilisé et est satisfaisante quand les anti-sérums sont traités suffisamment pour devenir monospécifiques Le test lui-même est très élaboré et ne se prête pas à une utilisa- tion courante par des généralistes. Finalement, un procédé manuel immuno-néphélométrique pour le titrage quantitatif d'hémoglobine libre dans le plasma et l'urine a été décrit dans la littérature. En général, les titrages immuno-chimiques, bien qu'ils représentent un perfectionnement par rapport aux tests chimiques couramment disponibles, nécessitent eux-mêmes une amélioration par l'utilisation d'anti-sérums plus fiables et par la simplification des techniques En outre, ces titrages ne sont pas encore disponibles sous forme de trousses de tests. La présente invention a pour objet un appareil facilitant la détection d'hémorragie masquée dans la matière fécale, dont l'efficacité est tributaire d'une technique de titrage qui est différente de celles décrites plus haut. L'invention fournit un appareil facilitant les diagnostics utilisable dans la détection d'une hémorragie masquée dans la matière fécale, constitué par un support qui lie les protéines, et dont la surface est au moins par- tiellement revêtue d'un anti-corps monoclonal qui est spéci- fique à l'hémoglobine humaine. Le support peut être une matière plastique synthé- tique telle que par exemple le chlorure de polyvinyle, le polystyrène ou le "Nylon"; les pellicules en verre et en nitrocellulose conviennent également Une tige d'immersion (ou plongeur) représente un simple support hygiénique pour absorber l'hémoglobine des excréments Le plongeur peut être en polystyrène qui est une matière, parmi d'autres, capable de fixer les protéines On enduit donc le plongeur avec l'anti-corps spécifique anti-hémoglobine humaine selon l'invention qui, lors de son contact avec une suspension du liquide fécal, va absorber spécifiquement l'hémoglobine humaine, si elle est présente, à la surface du plongeur Le stade d'absorption dans ce titrage est important puisque tous les autres composés qui interfèrent sont enlevés par lavage On résout en un seul stade les problèmes de sensibilité et de spécificité, ce qui permet de poursuivre le restant du test dans des conditions simples, pratiques pour l'opérateur Ce stade unique permet donc une simplification parfaite du reste du test Il en est ainsi par suite des qualités fines de l'anti- corps monoclonal qui couvre le plongeur Une fois que l'hémo- globine humaine présente dans les excréments est absorbée par le plongeur, on peut appliquer une réaction chimique simple ou une réaction enzymatique plus complexe. La préparation de l'anti-corps monoclonal par la technique de KohlerMilstein consiste (a) à immuniser des souris Balb/C avec de l'hémoglobine humaine purifiée, (b) à hybrider une cellule de rate immunisée avec une ligne de cellules de myelome NSI, (c) à cultiver les hybrides, (d) à filtrer les produits surnageants de culture par un appareil ELISA muni d'un ordinateur, (e) à poursuivre la culture des clones des cellules hybrides positives, spécifiques, et (f) à préparer un fluide ascitique d'un titre élevé La principale réalisation de cette technologie est que l'anti-corps spéci- fique final peut être préparé en grosses quantités en un temps bref On répond au besoin d'une production à grande échelle par la combinaison de fluides extrêmement concentrés et de l'uniformité des produits dérivés de clones On peut produire des lots qualitativement identifiés d'une façon virtuellement illimitée Le développement des clones hybrides spécifiques était complexe, long et certainement pas moins élaboré que la préparation des anti-sérums purifiés à affinité classique Cependant, la différence notable réside dans la production industrielle ultérieure: dans le cas des anti- sérums classiques, le procédé tout entier devait être répété à chaque fois, alors que pour les anti-sérums monoclonaux, une fois qu'une ligne de cellules produisant des anti-corps spécifiques a été développée, la production de l'anti-corps est continue L'avantage de l'utilisation de l'anti-corps monoclonal plutôt que d'anti-sérums classiques est donc une économie de temps et d'argent et une spécificité exclusive. Le développement de l'anti-corps monoclonal a impliqué la production de grands nombres d'anti-corps mono- clonaux contre l'hémoglobine, et le choix de ceux qui ne réagissent pas avec les hémoglobines provenant d'une viande quelconque consommée ordinairement (par exemple, la viande de boeuf, de mouton, de cheval, de lapin, de poulet, de porc et de kangourou) D'autre part, puisqu'on sait que l'hémo- globine subit des changements de conformation en réagissant avec l'oxygène, les nitrates, les sufures et les médicaments qui peuvent être présents dans la matière fécale, il fallait choisir les anti-corps pouvant réagir avec l'hémoglobine après son incubation avec la matière fécale Ces problèmes ne sont pas apparents avec un sérum polycolonal classique qui peut contenir certains anti-corps pouvant réagir avec toute conformation de l'hémoglobine Les auteurs de la présente invention ont produit des anti-corps monoclonaux spécifiques humains appropriés aux deux sous-unitésc(et P de l'hémoglobine humaine permettant à ce test de prendre la forme d'un "sandwich" avec l'anti-corps pour la sous-unité de l'hémo- globine sur le support pour absorber l'hémoglobine qui peut ensuite être détectée avec un second anti-corps monoclonal pour un autre déterminant antigène sur l'hémoglobine L'anti- corps préféré selon l'invention pour revêtir les supports, qu'on appelle "H Hb 45 ", réagit spécifiquement avec la sous- unité de l'hémoglobine humaine L'anti-corps H Hb 45 est une immunoglobuline de souris de la catégorie Ig Gl et donne plusieurs bandes de focalisation isoélectriques formant un faisceau autour de p H 5,9 (+ 0,2). Deux modes de réalisation de l'invention vont main- tenant être décrits, dont l'un en se référant au dessin annexé, sur lequel la figure 1 est une vue en perspective du plongeur et du récipient de test; et la figure 2 est une vue partielle de l'extrémité de prélèvement d'échantillon du plongeur. Un flacon à essai 2 en verre comprend un dessus fileté 4 qui reçoit un capuchon fileté 6 à partir duquel s'étend une tige pleine en polystyrène 8 dont l'extrémité présente une cavité 10 de section conique La surface externe de la tige et de la cavité est revêtue avec l'anti-corps spé- cifique 12 Des excréments sont percés avec le plongeur afin de remplir la cavité d'un échantillon en forme de tampon qu'on élimine de la cavité par lavage en secouant avec de l'eau à l'intérieur du flacon L'anti-corps attire toute hémoglobine humaine présente dans l'échantillon tout en per- mettant 1 ' évacuation par lavage des autres composés. On transfère ensuite le plongeur dans un second tube à essai contenant une solution de lavage Au cours d'un stade ultérieur, on transfère le plongeur lavé dans un autre tube à essai o l'hémoglobine fixée au plongeur catalyse une réaction chimique qui, si elle est positive, est détectée par un changement de couleur. Pour renforcer la sensibilité, on peut remplacer la réaction chimique par une réaction immunochimique par laquelle l'hémoglobine absorbée est détectée au moyen d'un second anti-corps pour l'hémoglobine humaine, marqué avec une enzyme, un produit radiochimique, la fluorescéine, la biotine ou luminol Le second anti-corps peut être soit un anti-corps monoclonal,soit un sérum polyclonal pour l'hémoglobine, étant donné que la spécificité du test est assurée par la spécifi- cité de l'anti-corps sur le support. Dans un autre mode de réalisation, une bande ou un disque d'une membrane de nitrocellulose, revêtu d'un anti- corps monoclonal anti-hémoglobine humaine, est placé dans une enveloppe en carton comportant une fenêtre en papier filtrant pour l'application d'un échantillon d'excrément Le papier filtrant retient les matières solides des excréments mais laisse les liquides être absorbés par la membrane par action capillaire Après le procédé d'absorption, on peut conserver l'enveloppe contenant l'échantillon à l'état sec ou bien l'envoyer à un laboratoire central pour traitement Au labo- ratoire, on transfère la membrane de nitrocellulose dans un autre récipient, on lave et on détecte l'hémoglobine au moyen d'une réaction chimique ou d'une réaction plus complexe du type enzymatique avec ufi second anti-corps. Les auteurs de la présente invention ont trouvé que les avantages de l'exemple ci-dessus sont comme suit Un plongeur enduit d'un anti-corps monoclonal anti-hémoglobine humaine permet une absorption sensible et spécifique de cette protéine de sang humain sur le plongeur qu'on peut employer librement dans une réaction calorimétrique sans se préoccuper autrement des problèmes de sensibilité et de spécificité qui se posent couramment avec les trousses chimiques En outre, ce procédé permet un test simple avec une matière régulière qui est facile à produire. REVENDICATIONS 1 Appareil de diagnostic pour utilisation dans la détection des hémorragies masquées dans les excréments, caractérisé en ce qu'il comprend un support ( 8) qui lie les protéines, la surface de ce support étant au moins partielle- ment revêtue d'un anti-corps monoclonal ( 12) qui est spécifique à l'hémoglobine humaine. 2 Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins la partie du support ( 8) qui est destinée à l'immersion pendant le test de diagnostic est construite en une matière plastique. 3 Appareil de diagnostic selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins la partie du support ( 8) qui est destinée à l'immersion pendant le test de diagnostic est construite en une matière fibreuse qui lie les protéines. 4 Appareil de diagnostic selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins la partie du support ( 8) qui est destinée à l'immersion pendant le test de diagnostic est construite en une pellicule qui lie les protéines. 5 Appareil de diagnostic selon la revendication 2, caractérisé en ce que le support ( 8) est une tige d'immersion dont l'extrémité immersible est enduite avec l'anti-corps. 6 Appareil de diagnostic selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le support est une surface plate qui est fixée à une poignée et au moins partiellement enduite avec l'anti-corps. 7 Appareil de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend un accessoire plein pour insertion dans un récipient à essai contenant le liquide devant être titré pour la présence d'un composant suspecté, ledit accessoire comprenant une partie formant poignée ( 6) et une partie immersible ( 8), au moins cette dernière partie étant constituée en une matière qui lie les protéines, la partie immersible étant enduite d'un anti-corps monoclonal ( 12) qui est spécifique à l'hémoglobine humaine. 8 Appareil de diagnostic selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support de l'anti-corps est fabriqué en forme d'un tube, d'une gaine creuse ou d'un récipient dans lequel on place l'échantillon ou l'homogénat de l'excré- ment. 9 Procédé de détection d'hémorragie masquée dans les excréments, caractérisé en ce qu'il consiste à absorber l'hémoglobine d'une suspension liquide des excréments au moyen d'un anti-corps monoclonal anti-hémoglobine humaine disposé sur un support, à éliminer par lavage la suspension résiduelle du support et à effectuer un autre test qui est spécifique à l'hémoglobine sur l'hémoglobine restant sur le support.