Brevet FR2544331A1 — publié le 19841019

Procédé pour immobiliser l'enzyme cyclodextrineglycosyl-transf'érase L'invention concerne un procédé pour l'immobi- lisation de l'enzyme cyclodextrineglycosyl-transférase. Lors du traitement d'un amidon partiellement hydrolysé avec une enzyme cyclodextrineglycosyl-transférase (dénommée ci-après CG Tase), il se forme des noyaux molécu- laires formés par des unités 6, 7 ou 8- glucopyranose (qu'on appelle cyclodextrines,et plus exactement a-, B et y-cyclo- dextrines)qui sont capables d'encapsuler des molécules d'autres composés Ce processus qui est dénommé "encapsu- lation moléculaire" peut être utilisé pour l'amélioration des propriétés de certaines substances sensibles, volatiles, facilement oxydables ou difficilement solubles. Par mise en oeuvre d'une enzyme CG Tase solubili- sée, on ne peut réaliser qu'un procédé discontinu Dans le cas d'une mise en oeuvre continue, on immobilise l'enzyme avantageusement sur un support solide Un tel procédé a été décrit dans la publication Biotechnol -Bioeng 19, 87 ( 1977) D'après cette publication, on Deut immobiliser une forme succinée de l'enzyme CG Tase sur un échangeur anionique copolymère de vinylpyridine, et ce par des liai- sons ioniques Bien que dans le cas de cette méthode, la succination Préalable accroit la force des liaisons io- niques, on doit compter avec une désorption progressive de l'enzyme La désorption peut être évitée en fixant l'en- zyme sur le support par des liaisons covalentes; dans ce cas, il se forme un catalyseur solide nouveau qui maintient l'activité catalytique de l'enzyme et qui est moins sensi- ble à l'égard des conditions réactionnelles. Le but de l'invention réside dans la fabrication d'une enzyme CG Tase immobilisée qui est fixée sur un sup- port solide par des liaisons covalentes. Conformément au procédé selon l'invention, on fabrique une telle préparation d'enzyme CG Tase immobilisée qui est appropriée à une utilisation durable et qui main- tient l'enzyme liée à un support relativement stable du point de vue chimique ou inerte, résistant partiellement ou de façon illimitée à l'influence de microorganismes,qui possède des propriétés mécaniques favorables et qui garan- tit un débit élevé Une autre exigence réside dans le fait que l'enzyme doit être liée au support sous des conditions réactionnelles ménageantes. Il a été trouvé que les substances suivantes répondent complètement aux exigences susmentionnées: A) Les dérivés polysaccharidiques contenant des groupements aminoprimaires et contenant au moins 0,1 mequv /g avantageusement 1-2 mequv /g de groupement fonctionnel-NH 2; et/ou B) Les polymères obtenus à partir de monomères d'acide acrylique et/ou méthacrylique et d'acrylamide et/ ou de méthacrylamide avec mise en oeuvre d'un agent de réticulation du type acrylique ou allylique (par exemple le N,N'-méthylène-bis-acrylamide, le diacrylate d'éthylène ou le N,N'-diallyl -tartramide), ces polymères contenant ' au moins 0,1 mequv /g avantageusement 2-8 mequv /g de groupement fonctionnel -COOH. Les supports susmentionnés peuvent-être prépares par mise en oeuvre de procédés en soi connus. Dans le cas des supports polysaccharidiques con- tenant des groupements aminoprimaires, on transfère les groupements carboxyle des différentes chaînes latérales asparagyle ou glutamyle de l'enzyme par traitement avec du carbodiimide en dérivésd'O-acyl-isourée, qui réagissent avec les groupements amino disposés sur le support Dans l'utilisation de supports polymères contenant des groupe- ments carboxy fonctionnels, on active les groupements car- boxy de façon en soi connue avec du carbodiimide et on les rend ainsi capables à la fixation de l'enzyme CG Tase La mise en oeuvre de carbodiimidesen tant qu'agents d'activa- tion présente l'avantage que la réaction d'activation peut être mise en oeuvre sous conditions ménageantes ( 0-4 C, p H = 6,0-8,0). L'invention a pour objet un procédé pour l'immo- bilisation de l'enzyme cyclodextrineglycosyl-transférase, caractérisé par le fait que: a) on active l'enzyme cyclodextrineglycosyl- transférase avec-un dérivé de carbodiimide soluble dans l'eau ou soluble dans des solvants organiques à une tempé- rature inférieure à O C, on amène ensuite l'enzyme ainsi traitée au sein d'une solution ayant une valeur de p H de 4,5-8,5 sur un dérivé de polysaccharide contenant au moins 0,1 mequv /g de groupement NH 2 et que l'on lave le produit et qu'on le sèche enfin éventuellement ou b) on amène l'enzyme cyclodextrineglycosyl- transférase au sein d'une solution ayant un p H de 4,5-8,5 sur un support polymère qui a été préparé à partir d'un monomère acide acrylique et/ou méthacrylique, acrylamide et/ou méthacrylamide sous l'influence d'un agent de réti- culation du type acrylique ou allylique, qu'on active en- suite le polymère contenant au moins 0,1 meauv /g de groupe- ment fonctionnel-COOH avec un dérivé de carbodiimide solu- ble dans l'eau ou soluble dans les solvants organiques à une température inférieure à O Ct qu'on lave le produit ainsi obtenu et qu'on le sèche éventuellement en fin de compte. En tant que polymère, on peut utiliser de façon particulièrement avantageuse les dérivés aminopropyliques de la cellulose et des dextranes (cellulose A ou Moiselect A) et des copolymères acrylamide-N,N'-méthylène-bis-acryla- mide-acide acrylique (Akrilex C). Dans le procédé- conforme à l'invention, on peut utiliser en tant qu'enzyme toute enzyme CG Tase quelconque isolée d'une manière quelconque et d'origine quelconque. On peut utiliser comme dérivé carbodiimide activant par exemple le sulfonate de N-cyclohexyl-N'-/2-( 4-morpholi- nyl)-éthyl J-carbodiimide-méthyl-p-toluène ou le chlorhydra- te de N-éthyl-N-( 3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide On peut utiliser avantageusement en tant que dérivé de carbo- diimide des substances solubles dans l'eau Parmi les dé- rivés de carbodiimide solubles seulement dans des solvants organiques, on peut utiliser dans le cadre du procédé conforme à l'invention ceux qui sont solubles dans des solvants organiques indiqués à froid (c'est-à-dire à une température inférieure à O C). L'enzyme CG Tase ou le dérivé d'O-acyl-isourée de celle-ci est amenée sur le support au sein d'une solu- tion ayant une valeur de p H de 4,5-8,5 avantageusement 6,5 - Le milieu réactionnel peut avantageusement être constitué par une solution tampon d'acétate de sodium (p H 6,5) Les préparations enzymatiques formées par la réaction de couplage sont lavées de façon en soi connue et si nécessaire séchées Les préparations enzymatiques peuvent toutefois être également conservées en suspension aqueuse ou stockées à des températures de O à 4 C. L'activité des préparations enzymatiques,obte- nues selon le procédé conforme à l'invention, immobilisées, est de 13-450 unités Kitahata/g de Xerogel, ce qui peut être considéré comme très favorable du point de vue appli- cabilité pratique-(l'unité en question correspond à une quantité d'enzyme qui occasionne à 40 C par minute une élévation de transmission,linéaire,de 1 %). L'enzyme CG Tase immobilisée conformément au procédé selon l'invention sur un copolymère d'acrylamide- N,N'-méthylène-bis-acrylamide-acide acrylique (Akrilex C) fait preuve d'une stabilité plus élevée en milieu faible- ment acide (c'est-à-dire pour une valeur optimale de p H de l'application de 5,5) que l'enzyme dissoute Cet avantage est d'une importance particulièrement grande dans le cas d'une mise en oeuvre durable. D'autres détails relatifs à la présente invention résultent des exemples qui suivent sans toutefois limiter la portée de l'invention à cesoexemples. Exemple 1. On ajoute 55 ml d'une solution de CG Tase sans sels d'une teneur en protéines de 9,9 mg/ml à un support du type cellulose A l 3 g; teneur en substance sèche 17 %; capa- cité de fixation teneur en-NH 2 1,86 mequv /g 7 Pour la dissolution et la dialyse de l'enzyme, on a recours à un tampon d'acétate de sodium 0,05 molaire (p H 6,5) Le mélange est agité dans un bain d'eau ayant la température de la glace pendant 10 minutes, après quoi on ajoute une solution de 1 g de N-cyclohexyl-N'-/2-( 4-morpholinyl)-éthylj 7- carbodiimide-méthyl-p-toluène sulfonate dans 20 ml d'un tampon froid (+ 4 C) La réaction est mise en oeuvre à 0-4 C pendant 48 heures, et pendant cette durée, on agite le mé- lange réactionnel deux fois pendant 6 heures La phase solide est séparée par filtration, puis lavée trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon à l'acétate de sodium (p H 6,5) 0,05 molaire contenant 1 mole de chlorure de sodium, puis trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5) La substance est en- suite lavée trois fois avec chaque fois 120 ml d'eau dis- tillée jusqu'a être exempte de sel puis filtrée, puis re- prise dans 40 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de so- dium (p H 6,5) puis conservée au réfrigérateur ( 4 C) Le rendement est de 758 mg (par rapport à la substance sèche) en enzyme CG Tase immobilisée L'activité est de: 26,5 unités Kitahata/g de substance sèche. Exemple 2. Un support du type Molselect A ( 1,5 g; teneur en substance sèche 33 t; capacité de fixation teneur en -NH 2 1,27 mequv /g), on ajoute 55 ml d'une solution de CG Tase exempte de sels et contenant 9,9 mg/ml de protéines. Pour la dissolution et la dialyse de l'enzyme, on utilise un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5) Après une agitation de 10 minutes sur bain d'eau à la température de la glace, on ajoute à la suspension une solution de 0,5 g de N-cyclohexyl-N'-/2-( 4-morpholinyl)-éthyl 7-carbodiimide- méthyl-p-toluène sulfonate dans 5 ml d'un tampon 0,05 mo- laire (p H 6,5) d'une température de 4 C La durée de la réaction est de 48 heures à 0-4 C; entretemps, on agite la suspension deux fois pendant chaque fois 6 heures Le gel est éliminé par filtration, puis lavé trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5) et trois fois avec 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5) contenant 1 mole de chlorure de sodium, puis trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon OO 5 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5) Le gel est ensuite lavé deux fois avec chaque fois 120 ml d'eau jusqu'à être exempt de sels,puis filtré, puis repris dans 40 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5) et conservé au réfrigérateur à une température de 4 C Le rendement est de 861 g (par rapport à la substance sèche) en enzyme CG Tase immobilisée L'activité: 13,6 uni- tés Kitahata/g de substance sèche. Exemple 3. On met en suspension 0,4 g d'un Xerogel du type Akrilex AH-C 4 (capacité de fixation teneur en-COOH - 3,08 mequv /g) dans 8 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acé- tate de sodium (p H 6,5) A cette solution, sur bain d'eau à la température de la glace, et avec agitation constante, on ajoute une solution de 0,8 g de N-cyclohexyl-N'-2-( 4- morpholinyl)-éthyl 7-carbodiimide-méthyl-p-toluène sulfonate dans 100 ml de tampon froid (+ 4 C) Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes, après quoi on ajoute 40 ml d'une solution de CG Tase l 10 mg/mll Pour la dissolution et la dialyse de l'enzyme, on utilise une solution de tam- pon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5) Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C, entretemps le mé- lange est agité deux fois pendant chaque fois 6 heures. Le gel est séparé par filtration, puis lavé successivement trois fois avec chaque fois 50 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5), trois fois avec chaque fois ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium conte- nant 1 mole de chlorure de sodium, et trois fois avec cha- que fois 100 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de so- dium (p H 6,5) Le gel est ensuite lavé deux fois avec cha- que fois 250 ml d'eau distillée pour éliminer le sel, puis lyophilisé Le rendement est de 0,2 g d'enzyme CG Tase immo- bilisée L'activité: 80 unités Kitataha/g Xerogel. Exemple 4. On met en suspension 0,13 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation teneur en-COOH 6,2 mequv / g; taille des particules 100-320 pm) dans 5 mi d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 5,0), après quoi sous agitation constante et à O C, on ajoute 0,25 g de N-cyclo- hexyl-N'-/2-( 4-morpholinyl)-éthyl 7-carbodiimide-méthyl-p- toluène sulfonate dans 5 ml de tampon 0,05 molaire d'acé- tate de sodium froid (+ 4 C)(p H 5,0) Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes Apres addition de 11 ml d'une solution de CG Tase ( 11, 4 mg/ml), on fixe la valeur de p H du mélange réactionnel à 5,0 Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-40 C et le mélange est entretemps agité deux fois pendant chaque fois 6 heures Au début de la réaction, on contrôle la valeur du p H toutes les demi- heures, puis plus tard toutes les heures, et on la corrige si nécessaire Après la fin de la réaction, on élimine le gel par centrifugation et on le lave successivement trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acé- tate de sodium (p H 5,0), trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 5,0) con- tenant 1 mole-de chlorure de sodium, puis trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon d'acétate de sodium (p H 5,0). Le gel est ensuite lavé trois fois avec chaque fois 60 ml d'eau distillée jusqu'à élimination des sels, puis lyophi- lisé Rendement: 0,2 g d'enzyme CG Tase immobilisée Acti- vité: 147 unités Kitahata/g-de Xerogel. Exemple 5. On met en suspension 0,13 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation teneur en-COOH 6,2 mequv / g; taille des particules 320 pm) dans 5 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 5,5), après quoi on ajoute à O C sous agitation constante 0,25 g de N-cyclo- hexyl-N'-Z 2-( 4-morpholinyl)-éthyl 7-carbodiimide-méthyl-p- toluene sulfonate dans 5 ml de tampon 0,05 molaire d'acé- tate de sodium (p H 5,5) froid (+ 4 C) Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C et entretemps, on agite deux fois la suspension pendant chaque fois 6 heures Au début de la réaction, on contrôle la valeur du p H toutes les demi-heures, puis plus tard toutes les heures, et on la corrige si nécessaire Apres la fin de la réaction, on éli- mine le gel par centrifugation et on le lave trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 5,5), puis trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 5,5) con- tenant 1 mole de chlorure de sodium, puis trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon d'acétate de sodium (p H 5,5). Le gel est lavé ensuite trois fois avec chaque fois 60 ml d'eau distillée jusqu'à élimination des sels et lyophilisé. Rendement: 0,2 g de CG Tase immobilisée Activité: 235 uni- tés Kitahata/g de Xerogel. Exemple 6. On met en suspension 0,13 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation: teneur en-COOH 6,2 mequv / g, taille des particules 100-320 pm) dans 5 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,0), après quoi on ajoute à O C sous agitation constante une solution de 0,26 g de N-cyclohexyl-N' -Z 2-( 4-morpholinyl)-éthyl 7-carbodiimide- méthyl-ptoluène sulfonate dans 5 ml de tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium froid (+ 4 C) et à p H 6,0 Après une agitation supplémentaire de 10 minutes, on ajoute au mélange réactionnel 13 ml-d'une solution de CG Tase ( 10 mg/ml), après quoi on règle la valeur du p H du mélange réactionnel à 6,0 Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C et entretemps, on agite la suspension deux fois pendant chaque fois 6 heures Au début de la réaction, on contrôle la valeur du p H toutes les demi-heures, puis plus tard toutes les heures et on la corrige si nécessaire Après fin de la réaction, on isole le gel par centrifugation et on le lave successivement trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,0), trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire (p H 6,0) contenant 1 mole de chlorure de sodium, puis trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon d'acétate de sodium (p H 6,0) Le gel est ensuite lavé trois fois avec chaque fois 60 ml d'eau distillée pour l'élimination des sels, puis lyophilisé Rendement: 0,2 g d'enzyme CG Tase immobilisée. Activité: 380 unités Kitahata/g de Xerogel. Exemple 7. On met en suspension 0,13 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation: teneur en-COOH 6,2 mequv / g; taille des particules 100-320 pm) dans 5 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium(p H 6,5), après quoi on ajoute à 0 C et sous agitation constante une solution de 0,26 g de N-cyclohexyl- N' -l 2-( 4-morpholinyl) -éthyll-carbodiimide-méthyl-p-toluène sulfonate dans ml de tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium froid (+ 40 C) de p H 6,5. Après agitation supplémentaire de 10 minutes, on ajoute au mélange réactionnel 13 ml d'une solution de CG Tase ( 10 mg/ml) et on fixe la valeur du p H du mélange réaction- nel à 6,5 Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C; entretemps, on agite-la suspension deux fois pendant chaque fois 6 heures Au début de la réaction, on contr 11 e le p H toutes les demi-heures, puis plus tard toutes les heures et on la corrige si nécessaire Apres fin de la réac- tion, on isole le mélange par centrifugation, puis on le lave trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5), puis trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5) contenant 1 mole de chlorure de sodium, puis trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon d'acé- tate de sodium (p H 6,5) Le gel est ensuite lavé trois fois avec chaque fois 60 ml d'eau distillée jusqu'à l'élimina- tion des sels, puis lyophilisé Rendement: 0,2 g d'enzyme CG Tase immobilisée Activité: 450 unités Kitahata/g de Xerogel. Exemple 8. On met en suspension 1 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation: teneur en-COOH 6,2 mequv /g; taille des particules 100-320 pm) dans 24 ml d'un tampon 0; 05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,0), après quoi on ajoute à O C et sous agitation constante une solution de 2 g de N-cyclohexyl-N'-l 2-( 4-morpholinyl)-éthyll-carbodiimi- ' de-méthyl-p-toluène sulfonate dans 15 ml d'une solution 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,0) froide (+ 4 C). Apres une agitation supplémentaire de 10 minutes, on ajoute au mélange réactionnel 113 ml d'une solution de CG Tase ( 12 mg/ml) et on fixe la valeur du p H du mélange réactionnel à 7,0 La durée de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C; entretemps, on agite le mélange deux fois pendant chaque fois 6 heures Au début de la réaction, on contrôle la va- leur du p H toutes les demi-heures, et ensuite toutes les heures et on la corrige si nécessaire Apres fin de la réaction, on sépare le gel par centrifugation et on le i I lave trois fois avec chaque fois 300 ml d'une solution 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,0), puis trois fois avec chaque fois 300 ml d'une solution 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7, 0), puis trois fois avec chaque fois 300 ml d'une solution 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,0) contenant 1 mole de chlorure de sodium, puis trois fois avec chaque fois 300 ml d'une solution 0,05 molaire d'acé- tate de sodium (p H 7,0) Le gel est ensuite lavé trois fois avec chaque fois 300 ml d'eau distillée pour éliminer les sels, puis lyophilisé Rendement: 1,5 g de CG Tase immobilisée Activité: 366 unités Kitahata/g de Xerogel. Exemple 9. On met en suspension 0,2 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation: teneur en-COOH 6,2 mequv /g; taille des particules: 100-320 pm) dans 5 ml d'une solution d'acétate de sodium (p H 7,5), après quoi sous agitation constante et à O C, on ajoute une solution de 0,4 g de N- cyclohexyl-N'-l 2-( 4-morpholinyl)-éthy 17-carbodiimide-méthyl- p-toluene sulfonate dans 5 ml de tampon 0,05 molaire d'acé- tate de sodium (p H 7,5) froid (+ 4 C) Apres une agitation supplémentaire de 10 minutes, on ajoute au mélange réaction- nel 21,6 ml d'une solution de CG Tase ( 12 mg/ml) et on règle le p H à 7, 5 Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C et la suspension est entretemps agitée deux fois pen- dant chaque fois 6 heures Au début de la réaction, on con- trôle la valeur du p H toutes les demi-heures, puis plus tard toutes les heures, et on la règle si nécessaire Apres fin de la réaction, on isole le gel par centrifugation et on le lave trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,5), trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,5) contenant 1 mole de chlorure de sodium, et trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon d'acétate de sodium (p H 7,5), puis deux fois avec chaque fois 200 ml d'eau distillée jusqu'à élimination des sels, puison lyophi- lise Rendement: 0,3 g d'enzyme CG Tase immobilisée Acti- vité: 370 unités Kitahata/g de Xerogel. Exemple 10. On met en suspension 0,26 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation: teneur en-COOH 6,2 mequv /g; taille des particules 100-320 pm) dans 10 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 8,0), après quoi on ajoute à O C sous agitation constante une solution de 0,52 g de N-cyclohexyl-N'-Z-( 4-morpholinyl)-êthy 7-carbodiimide- méthyl-p-toluène sulfonate dans 10 ml de tampon 0,05 molaire (p H 8,0) froid (+ 4 C) Apres une agitation de 10 minutes, on ajoute au mélange réactionnel 29 ml d'une solution de CG Tase ( 9,25 mg/ml) après quoi on fixe la valeur du p H du mélange réactionnel à 8,0 Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C, et entretemps, on agite le mélange réactionnel deux fois pendant chaque fois 6 heures Au dé- but de la réaction, on contrôle la valeur du p H toutes les demi-heures, puis plus tard toutes les heures et on la corrige si nécessaire Apres fin de la réaction, on élimine le gel par centrifugation et on le lave trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de so- dium (p H 8,0), trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0; 05 molaire d'acétate de sodium (p H 8,0) contenant 1 mole de chlorure de sodium et trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire (p H 8,0) d'acétate de sodium Le gel est ensuite lavé avec chaque fois 200 ml d'eau distil- lée jusqu'à élimination des sels et lyophilisé Rendement: 0,3 g d'enzyme CG Tase immobilisée Activité: 300 unités Kitahata/g de Xerogel. Exemple 11. On dissout 0,26 g de Xerogel Akrilex C-100 (ca- pacité de fixation: teneur en-COOH 6,2 mequv /g; taille des particules 100-320 vm) dans 10 ml d'une solution 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 8,5), après quoi on ajoute à O C et sous agitation constante une suspension de 0,52 g de N-cyclohexyl-N'-/2-( 4-morpholinyl)-éthyll-carbodiimide- méthyl-p-toluène sulfonate dans 10 ml de tampon 0,05 molai- re d'acétate de sodium (p H 8,5) froid (+ 4 C) Après une agitation de 10 minutes, on ajoute au mélange réactionnel 29 ml d'une solution de CG Tase ( 9,25 mg/ml), et on règle le p H à 8,5 Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C et entretemps, on agite le mélange réactionnel deux fois pendant chaque fois 6 heures Au début de la transfor- mation, on contrôle la valeur du p H toutes les demi-heures, puis plus tard toutes les heures, et on la corrige si né- cessaire Apres fin de la réaction, on élimine le gel par centrifugation et on le lave successivement trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de so- dium (p H 8,5), trois fois avec chaque fois 6 ml d'un tampon 0,05 molaire (p H 8,5) d'acétate de sodium contenant 1 mole de chlorure de sodium, et trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 8,5) Le gel est ensuite lavé deux fois avec chaque fois 200 ml d'eau distillée jusqu'à élimination des sels, puis lyophilisé. Rendement: 0,,4 g d'enzyme CG Tase immobilisée Activité: 173 unités Kitahata/g de Xerogel. T A B L E A U I Immobilisation de l'enzyme cyclodextrineglycosyl-transférase. Support Protéine Activité Activité Perte en Activité du immobilisée, immobilisée, récupérée activité produit, unités (%) (% à l'état () Kitahata/g de dissous substance sèche (%) Cellulose A 26,8 0,1 6,4 93,5 26,5 Molselect A 26,9 0,1 13,5 86,4 13,6 Akrilex AH-C 4 27,9 0,1 11,5 88, 4 80,0 Akrilex C-100 39,4 3,84 63,0 33,16 450,0 I.-, ru -4 T A B L E A U II Influence de la valeur du p H sur l'immobilisation de l'enzyme cyclodextrineglycosyl- transférase par mise er oeuvre d'un support Akrilex C. p H du mélange Protéine Activité Activité Perte en Activité du réactionnel immobilisée, immobilisée, récupérée activité produit, unités (%) (%) à l'état (%) Kitahata/g de dissous substance sèche (%) ,0 36,6 0,75 38,9 60,35 147 ,5 26,0 1,20 40,0 58,80 235 6,0 36,0 3,25 78,0 18,75 380 6,5 39,4 3,84 63,0 33,16 450 7,0 47,4 1,83 41,0 57,17 366 7,5 48,8 1,93 73,0 25,07 370 8,0 52,0 0,50 43,0 56,50 300 8,5 53,5 0,39 50,6 49,01 173 Ln ré) Ln -P t L L 4 % REVENDICATIONS 1 Procédé pour l'immobilisation d'enzyme cyclo- dextrineglycosyl-transférase, caractérisé par le fait que l'on active l'enzyme cyclodextrineglycosyl-transférase à l'aide d'un dérivé de carbodiimide soluble dans l'eau ou soluble dans les solvants organiques à une température inférieure à O C, et qu'on amène l'enzyme ainsi traitée au sein d'une solution ayant un p H de 4,5-8,5 sur des dérivés de polysaccharide contenant au moins 0,1 m équiv /g de groupement -NH 2 et que l'on lave le produit et qu'on le sèche éventuellement. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'en tant que support, on utilise des dérivés aminopropylés de cellulose ou de dextranes. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'on effectue l'activation avec du N-cyclohexyl-N'-/2-( 4-morpholinyl)-éthyl/-carbodi- imide-méthyl-p-toluène sulfonate ou avec du chlorhydrate de N-éthyl-N-( 3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on effectue la réaction d'immobilisation dans une solution de tampon avantageuse- ment 0,05-0,1 molaire d'acétate de sodium ayant un p H de 6,5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la réaction d'immobilisation est effectuée à une température de 0-4 C en un laps de temps de 45-55 heures, de préférence 48 heures. 6 Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le produit brut immobilisé est lavé avec une solution tampon d'acétate de sodium, un tampon contenant du chlorure de sodium et avec de l'eau distillée.