Brevet FR2534271A1 — publié le 19840413

Extrait de micro-organisme soluble dans la pyridine et procédé pour son obtention. La présente invention vise un extrait soluble dans la pyri dine d'un micro-organisme qui, combiné avec un squelette de paroi cellulaire (SPC), fournit une composition pharma- ceutique possédant des propriétés anti-tumeur. Les bactéries telles que Corynebacterium parvum ont fait l'objet de travaux expérimentaux pour les isoler et caracté- riser le composant auquel on doit l'inhibition de la crois- sance des tumeurs (voir par exemple Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C parvum; Cantrell, et al, Cancer Research 39, pp 3554-3563 (septembre 1979) ) En dehors de son activité anti-tumeur, C parvum s'est révélé être un stimulateur puissant du système lymphoréticulaire, conduisant à une augmentation indésirable des poids de la rate et du foie et à la blastogénèse La Demanderesse a découvert qu'un extrait de micro-organisme soluble dans la pyridine possède des propriétés anti-tumeur puissantes sans les effets toxi- ques indésirables associés aux produits de la technique antérieure. Le squelette de paroi cellulaire est essentiellement une paroi cellulaire dont on a éliminé une grande partie de la protéine et des lipides qui s'y trouvent normalement C'est un mucopeptide polymère acide mycoliquearabinogalactane contenant des restes de mycolates de tréhalose ("P 3 ") et des tuberculoprotéines non digérées On obtient le squelette de paroi cellullaire à partir de n'importe quel micro- organisme, y compris, mais non exclusivement, M smegmatis, M.phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacte- rium diphteria, Corynebacterium parvum, M kansasii, M tuber- culosis (souches H 37 RV et Ayoma B), et M bovis souche BCG. On peut en outre obtenir le squelette de paroi cellulaire à partir d'autres micro-organismes tels que E coli, B abortus et Coxiella burnettii. On peut produire le squelette de paroi cellulaire en cultivant d'abord et en récolant des bactéries telles que M bovis souche BCG (Bacille Calmette Guérin) On fait passer le résidu cellulaire entier résultant dans un fractionnateur de cellu- les (Ribi Cell Fractionator (Sorvall, Model RF-A)) qui rompt les cellules, séparant l'enveloppe extérieure ou paroi cellu- laire des impuretés protoplasmiques On soumet ensuite les parois cellulaires résultantes à une série d'extractions par solvant et de traitementsenzymatiques (par exemple trypsine et/ou chymotrypsine)pour arriver au squelette de paroi cellulaire purifié. Le but de l'invention est donc de fournir une composition pharmaceutique contenant un extrait soluble dans la pyridine d'un micro-organisme en combinaison avec un squelette de paroi cellulaire. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé d'ob- tention de l'extrait soluble dans la pyridine d'un micro- organisme. Encore un autre but de l'invention est de fournir un procédé de traitement des tumeurs chez les animaux à sang chaud et les humains, utilisant la composition contenant l'extrait soluble dans la pyridine d'un micro-organisme et le squelette de paroi cellulaire. La présente invention concerne des com- positions pharmaceutiques comprenant un extrait soluble dans la pyridine d'un micro-organisme, contenant entre environ 7 et 20 % en poids de protéine, environ 10 à 16 % en poids de sucre et environ 35 à 55 % en poids d'acides gras en combinaison avec le squelette de paroi cellulaire (SPC). L'extrait contient, de préférence, environ 12 % en poids de protéine, autant de sucre et environ 45 % en poids d'acides gras. On peut utiliser n'importe quel micro-organisme pour obtenir l'extrait soluble dans la pyridine, y compris par exemple M bovis BCG, M, phlei, M smegmatis, M kansasii, Nocardia- rubra, Corynebacterium'diphteriae et Corynebacterium' parvum. Corynebacterium parvum est spécialement préféré. On mélange à la pyridine les cellules entières du micro- organisme, de préférence sous forme d'une pate On sépare le mélange résultant pour obtenir une fraction surnageante qui contient l'extrait soluble dans la pyridine et un résidu ' En option, on peut soumettre le résidu - à des procédures répétées de séparation comme décrit ci-dessus en utilisant de la pyridine pour retirer des quan- tités supplémentaires de l'extrait désiré. On élimine ensuite la pyridine de l'extrait et on dialyse l'extrait séché face à un liquide convenable tel que l'eau distillée L'absence de cellules entières ou de fragments de cellules constituant des contaminants est confirmée par microscopie électronique L'extrait purifié résultant peut alors être lyophilisé par des procédés connus pour obtenir un produit stable, L'extrait soluble dans la pyridine produit conformément à l'invention peut être combiné avec le SPC pour fournir une composition ayant une puissante activité anti-tumeur sans stimuler l'hypertrophie de la rate et du foie Les cancers qui peuvent être traités par cette composition comprennent des tumeurs animales telles que le carcinome à cellule squameuse bovin, le fibrosarcome bovin, la sarcolde équine, le mélanome équin, le carcinome à cellule squameuse équin, les tumeurs mammaires canines, l'adénome canin et le méla- nome canin, et des tumeurs humaines telles que les tumeurs du sein, les tumeurs du poumon, les tumeurs du colon, le mélanome malin, les carcinomes à cellule squameuse et les tumeurs ovariennes. La composition est, de préférence, administrée par injection, dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile, directement dans la tumeur, dans des conditions décrites plus particulièrement ci-après. La composition susdite peut être stabilisée, par exemple par une procédure de lyophilisationet reconstituée ensuite sans perte d'activité. La quantité d'extrait soluble dans la pyridine dans une seule injection pour le traitement des animaux est comprise entre environ 375 et 2500 microgrammes/millilitre La quantité de SPC est comprise entre environ 125 et 375 microgrammes/ millilitre. Le nombre de millilitres injectésdans la tumeur est déterminé par la taille de la tumeur conformément au tableau suivant Posologie animale en fonction de la taille de la tumeur. t 30 Diamètre de la tumeur (cm) Quantité injectée (ml) 0-1 jusqu'à 0,5 1-2 0,5 à 2,5 2-3 2,5 à 5 3-5 5 à 10 -8 10 à 15 supérieur à 8 15 à 20 La dose maximale par injection est d'environ 40 milligrammes tant pour l'extrait soluble dans la pyridine que pour le SPC. Le déroulement du traitement comprend jusqu'à six injections administrées à environ deux semaines d'intervalle. La présente composition dans un milieu d'injection convenable tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile est administrée directement dans les tumeurs humaines La quantité d'extrait soluble dans la pyridine dans une seule injection est compri- se entre environ 200 et 5 000 microgrammes, de préférence entre environ 800 et 1 200 microgrammes, tandis que la quan- tité de SPC est comprise entre environ 50 et 2 000 micro- grammes La posologie unitaire préférée pour le $PC est comprise entre environ 475 et 525 microgrammes Toutes lès posologies men- tionnées ci-dessus sont basées sur un patient adulte repré- sentatif pesant 70 kilogrammes Les injections sont adminis- trées environ une fois par semaine et jusqu'à un total de quinze injections. Comme décrit ci-dessus, la composition pour le traitement des animaux à sang chaud et des humains peut être utilisée sous forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile La quantité d'huile utilisée est dans le domaine allant d'environ 0,5 à 3,0 % en volume basée sur le volume total de la composition. On préfère utiliser-entre environ 0,75 et 1,5 % en volume d'huile, Des exemples de telles huiles comprennent l'huile minérale, le squalane, le squalène, le 7-n-hexyloctadécane, l'huile supérieure Conoco et l'huile minérale Drakeol 6 VR (produites par Penreco Company, Butler, Pennsylvanie). Le mélange contenant l'huile, homogénéisé, est ensuite com- biné avec un détergent qui peut facultativement être dissous dans une solution saline avant mélange La quantité de détergent est de façon caractéristique comprise entre envi- ron 0,02 et 0,25 % en volume et, de préférence, entre envi- ron 0,10 et 0,20 % en volume basé sur le volume total de la composition On peut utiliser n'importe quel détergent courant, y compris Tween-80 et Arlacel (produits par Atlas Chemical Company), On homogénéise ensuite le mélange résultant de l'addition de détergent pour former une suspension présentant un pourcen- tage élevé de gouttelettes d'huile revêtues par les compo- sants actifs comme on s'en est rendu compte par observation au microscope. Les exemples suivants sont donnés seulement à titre illus- tratif et n'ont pas pour but de limiter ou de redéfinir en aucune façon l'invention telle que revendiquée dans les revendications annexées. Exemple 1 Préparation d'un extrait soluble dans la pyridine à partir de Corynebacterium Parvum. On a cultivé et récolté Corynebacterium Parvum (P acnes, sou- che 4182) à 370 C dans un bouillon de thioglycolate de NIH pendant 48 à 72 heures pour obtenir une pâte de cellules entières On a ensuite lavé la pâte avec 500 millilitres d'eau distillée On a mélangé 90 grammes (poids humide) de pâte lavée avec 200 millilitres de pyridine sèche et on a centrifugé à 1700 g pendant une heure à 40 C On a retiré un extrait soluble dans la pyridine sous forme de fraction surnageante On a extrait le résidu restant de nouveau à la pyridine dans des conditions identiques à celles décrites ci-dessus Après filtration au moyen de papier Whatman No 1, on a réuni les extraits à la pyridine et éliminé le solvant par évaporation à 500 C dans un Rotavapor de Buchi (Brinkmann Instruments, Westbury, New York) L'extrait à la pyridine séché a été dialysé de façon poussée vis-à-vis d'eau distillée puis lyopohilisé L'extrait à la pyridine purifié résultant contenait environ 12 % en poids de protéine, environ 12 % en poids de sucre et environ 45 % en poids d'acides gras On a examiné l'extrait au microscope électronique et on a constaté qu'il était exempt de contamination par des cellules entières et des fragments de parois cellulaires Le rendement de l'extrait soluble dans la pyridine était 9 % ( 8,1 grammes). Exemple 2 Préparation d'extrait soluble dans la pyridine à partir de M bovis souche BCG On a cultivé et récolté M bovis souche BCG dans le bouillon de Sautons à 370 C pendant environ trois à quatre semaines pour obtenir une pate de cellules entières lavée On a alors traité 50 grammes (poids humide)de pâte lavée de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir un rendement en extrait soluble dans la pyridine de 7 % ( 3,5 grammes). L'extrait contenait 15 % en poids de protéine, 10 % en poids de sucre et 52 % en poids d'acides gras. Exemple 3 Essai sur des tumeurs de rfnl 10 de cobayes. On a injecté une fois à sept cobayes de souche 2 présentant des grosseurs tumorales de rang 10 d'environ 9 millimètres de diamètre, 0,4 millilitre d'une émulsion stérile de goutte- lettes d'huile, à savoir l'huile minérale Drakeol 6 VR (Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania), conte- nant 300 microgrammes de l'extrait soluble dans la pyridine préparé conformément à l'exemple 1 et 50 microgrammes de squelette de paroi cellulaire, directement dans le tissu tumoral, On a examiné les animaux après trois mois, et chez six des sept animaux une régression totale s'était produite. Dans une expérience de contrôle, on a injecté une fois à six cobayes de souche 2 ayant des grosseurs tumorales de rang 10 d'environ 9 millimètres de diamètre 0,4 millilitre de l'émul- sion stérile de gouttelettes d'huile décrite ci-dessus sans extrait à la pyridine ni squelette de paroi cellulaire Les injections ont été faites directement dans le tissu tumoral. Aucune des six tumeurs ne présentait de signe de régression après trois mois. Revendications. 1 Procédé pour produire un extrait soluble dans la pyridine, purifié d'un micro-organisme, comprenant: (a) la préparation d'une pâte de cellules entières de la- dite bactérie; (b) le lavage de ladite pâte; (c) la réaction de ladite pâte avec la pyridine pour pro- duire un extrait et un résidu; (d) l'élimination de la pyridine dudit extrait; et (e) la dialyse dudit extrait séché pour obtenir l'extrait soluble dans la pyridine purifié. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on lyophilise ledit extrait soluble dans la pyridine purifié. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le micro-organisme est M bovis BCG, M phlei, M smegmatis, M Kansasii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphtheriae ou Corynebacteriumparvum et, de préférence, Corynebacterium parvum. 4 Procédé selon l'une des revendications précédentes, carac- r 30 térisé en ce qu'on fait réagir le résidu avec la pyridine pour obtenir des quantités supplémentaires d'extrait soluble dans la pyridine. Produit d'extraction soluble dans la pyridine obtenu à partir d'un microorganisme, comprenant entre environ 7 et % en poids de protéine, entre environ 10 et 16 % en poids de sucre et entre environ 35 et 55 % en poids d'acides gras. 6, Produit selon la revendication 5, caractérisé en ce que chacune des quantités de protéine et de sucre est d'environ 12 % en poids et que la quantité d'acides gras est d'environ % en poids. 7 Composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace du produit selon la revendication en combinaison avec le squelette de paroi cellulaire et un support pharmaceutiquement acceptable. 8 Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est sous forme lyophilisée et que le support est une émulsion de gouttelettes d'huile, la quantité d'huile présente étant comprise entre 0,5 et 3,0 % en volume sur la base du volume total de la composition. 9 Composition selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisée en ce que l'huile est le squalane, l'huile minérale légère, le squalène, le 7-n-hexyloctadécane, l'huile supérieure de Conoco ou l'huile minérale Drakeol 6 VR et qu'un détergent est également présent dans la compo- sition pour environ 0,02 à 0,25 % en volume sur la base du volume total de la composition. 10 Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que les quantités dudit produit d'extraction soluble dans la pyridine et du squelette de paroi cellulaire peuvent atteindre chacune environ 40 milligrammes, la quantité de produit d'extraction soluble dans la pyridine étant avanta- geusement comprise entre environ 200 et 5000 microgrammes et la quantité de squelette de paroi cellulaire entre envi- ron 50 et 2000 microgrammes. 11 Procédé de traitement des tumeurs chez les animaux à sang chaud, caractérisé en ce qu'on administre aux animaux à sang chaud la composition selon la revendication 7 en effectuant jusqu'à six injections, à des intervalles d'environ deux semaines, de la composition directement dans la tumeur, la composition contenant avantageusement entre environ 375 et 2500 microgrammes par millilitre du produit d'extraction soluble dans la pyridine et entre environ 125 et 375 milli- grammes par millilitre de squelette de paroi-cellulaire. 12, Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on injecte dans la tumeur la composition contenant entre environ 200 et 5000 microgrammes, de préférence entre envi- ron 800 et 1200 microgrammes, du produit d'extraction soluble dans la pyridine et entre environ 50 et 2000 microgrammes de squelette de paroi cellulaire, de préférence entre environ 475 et 525 microgrammes.