Brevet FR2534029A1 — publié le 19840406

La présente invention se rapporte d'une manière générale au dosage d'anticorps et plus précisément à un procédé nouveau pour déterminer les concentrations d'immunoglobulines dans des liquides physiologiques. Il existe un besoin en un procédé et un réactif simples et commodes pouvant être utilisés sur-place ou au laboratoire pour la détermination de la présence de concentrations adéquates d'immuno- globulines dans des échantillons prélevés sur des animaux et des humains nouveaux-nés ou dans la nourriture qu'ils ingèrent, ceci sans faire appel à une connaissance spécialisée ou à une expérience médicale Contrairement au procédé selon l'invention qui permet de résoudre ce problème, les procédés antérieurs sont limités techni- quement au diagnostic fait au laboratoire ou à l'hôpital. La source principale d'immunoglobuline pour le nouveau-né est le colostrum qui, naturellement,est apporté par la mère au cours de l'allaitement Malheureusement, les produits d'allaitement ne contiennent pas toujours des quantités d'immuno- globulines suffisantes pour atteindre ou dépasser les exigences de seuil Si ces déficiences ne sont pas constatées prématurément, au cours des quelques premières heures de la vie du nouveau-né, et si l'on n'y remédie pas par des additifs appropriés à l'alimen- tation, le nouveau-né peut succomber à la maladie Malheureusement, il n'existe pas d'essai simple permettant de déterminer les concen- trations d'immunoglobulines dans le colostrum, le lait ou leur petit-lait, sur place ou au laboratoire. La présente invention a pour objet un procédé semi- quantitatif pour la détermination des immunoglobulines dans des liquides physiologiques Ce procédé se caractérise en ce que: (a) on forme un mélange de réaction à partir d'un liquide physio- logique et d'une quantité appropriée d'un aldéhyde approprié; (b) on note la durée qui s'écoule jusqu'à ce que la réaction de l'aldéhyde conduise à la formation d'un gel; et (c) on compare la vitesse de réaction du mélange à la vitesse de réaction connue d'un mélange connu du même aldéhyde et d'un liquide physiologique contenant une quantité connue d'une immunoglobuline. Parmi les liquides physiologiques auxquels le procédé s'applique, on citera le colostrum, le petit-lait du colostrum, le lait, le petit-lait du lait et leurs mélangesainsi que le sang entier contenant ou non un anticoagulant, le sérum sanguin, le plasma, l'urine, le liquide cérébrospinal et les liquides analogues. Il est du plus grand intérêt de pouvoir déterminer les concentrations d'immunoglobulines sans avoir à séparer le liquide en composants; et, dans le cas du sang, sans avoir à utiliser un anticoagulant L'aldéhyde préféré est l'aldéhyde glutarique, mais tout spécialiste peut trouver un autre aldéhyde qui convienne dans le procédé selon l'invention. On notera que certains fluides physiologiques comme le lait de vache doivent être débarrassés d'un excès d'immunoglobulines et que le procédé selon l'invention peut être utilisé pour la détec- tion des immunoglobulines ou pour vérifier leur absence. L'expression "mélange de réaction",telle qu'elle est utilisée dans la présente demande,s'applique à un mélange dont le p He la température, les concentrations des réactifs et autres para- mètres permettent de réaliser la réaction envisagée lorsqu'il contient une quantité suffisante d'une immunoglobuline Comme on le verra ci-après, le procédé peut être appliqué aux liquides physio- logiques tels que sécrétés ou excrétés directement par l'individu ainsi qu'à des composants séparés à partir de ces liquides. Conformément à l'invention, on peut déterminer la concentration d'immunoglobulinesà partir de la vitesse de réaction de certains aldéhydes avec des liquides physiologiques variés Lorsque l'aldéhyde réagit avec les protéines du liquide physiologique, il se forme un produit de réaction conduisant à une gélification à une vitesse déterminée. La principale protéine conduisant à la gélification est l'immunoglobuline de sorte que, lorsque l'on fait réagir une concentration déterminée d'aldéhyde avec un volume déterminé du liquide physiologique, la durée de gélification est en relation inverse avec la concentration d'immunoglobulineset peut donc être utilisée pour estimer la concentration en immunoglobulines Comme on l'a déjà signalé, les sources principales d'immunoglobulines pour un animal nouveau-né sont le colostrum et le petit-lait du colostrum sécrétés par la mère à l'allaitement Par conséquent, la détermination des taux d'immunoglobulines par exemple dans le produit d'allaitement par la mère donne une mesure des taux-qui existeront par la suite dans l'organisme du nouveau-né Un autre moyen consiste à soumettre à la mesure le sang du nouveau-né et à corriger éventuellement le défaut. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples, les indica- tions de parties et de pourcentages s'entendent en poids sauf mention contraire Ces exemples montrent que la durée nécessaire pour qu'il se forme un gel par réaction d'une immunoglobuline avec un aldéhyde approprié constitue une indication rapide et significa- tive du point de vue clinique de la quantité d'immunoglobulines présente. EXEMPLE 1 On recueille le colostrum d'environ trente-cinq vaches laitières On conserve le tout par congélation à -20 OC On prépare le petit-lait du colostrum en soumettant 10 ml de ce dernier à incubation à 370 C pendant 1 h après addition de 0,1 ml d'une solution de présure à 10 % On élimine la caséine et la matière grasse par centrifugation du colostrum pendant 20 min à 3000 tr/min La masse de colostrum contient 69 % de petit-lait et la quantité d'immunoglo- bulines déterminée au réfractomètre et à l'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose -est de 8,2 g/100 ml de petit-lait. La quantité totale d'immunoglobulines déterminée par immunodiffusion radiale unique est de 9,44 g/dl de petit-lait. On place 2 ml de colostrum à température ambiante dans un tube à essais de 10 ml et on ajoute 100 microlitres d'une solution de glutaraldéhyde à 25 % obtenueauprès de la Firme Eastman Kodak Company, Rochester, New York, ce qui correspond à 25 mg d'aldéhyde glutarique Immédiatement après l'addition de la solution d'aldéhyde glutarique, on bouche le tube et on l'inverse rapidement à trois reprises pour provoquer le mélange des solutions La fin du mélange est prise pour temps zéro On bascule ensuite le tube toutes les 30 S et on l'inverse toutes les 60 s On note une durée de gélification positive de 2,5 min La "durée de gélification positive" est la durée nécessaire pour atteindre un état dans lequel aucune partie du liquide ou de la masse ne se déplace lorsqu'on renverse le tube Lorsque la réaction est terminée et après centrifugation, la teneur totale en protéine de l'échantillon de colostrum est de 3,8 g/dl. EXEMPLES 2 à 7 En opérant comme décrit dans l'exemple 1, on prépare des mélanges de réaction variés contenant des quantités différentes d'aldéhyde glutarique Les résultats obtenus dans ces exemples sont rapportés dans le tableau I ci-dessous. TABLEAU I Exemple N 2 3 4 5 6 7 Aldéhyde glutarique à 257 e, /ul -25 50 75 150 200 300 Concentration d'aldéhyde glutarique, mg 6,25 12,5 18,75 37,5 50 75 Colostrum, ml 2 2 2 2 2 2 Durée de gélification, min > 30,0 6,0 3,5 2,0 1, 5 1,0 Protéine totale, g/dl > 15,0 3,1 3,4 4,0 4,5 5,0 Les résultats rapportés dans le tableau I montrent que la concentration de l'aldéhyde glutarique dans le mélange de réaction a un effet marqué sur la vitesse de réaction ou durée de gélification; lorsque la concentration est de 12, 5 mg ou moins, la vitesse de réaction diminue considérablement Ainsi donc, la concen- tration minimale efficace d'aldéhyde glutarique est de 12,5 mg et on obtient les meilleurs résultats à une concentration de 25 mg ou plus. Dans des essais effectués sur le sang, on constate non seulement une diminution importante de la durée de gélification-mais une augmentation considérable de la capacité de l'aldéhyde à agir en tant qu'anticoagulant et à désactiver le fibrinogène, et les résultats sont très analogues à ceux obtenus ci-dessus pour le colostrum Les essais effectués sur le sang en l'absence d'anticoagulant ont été réalisés dans un délai de 1 min après prélèvement sur l'animal et donc avant la coagulation. EXEMPLES 8 à 14 On opère comme décrit dans les exemples 1 à 7 mais à une température de 13 'C; on prépare des mélanges de réaction variés avec une quantité de colostrum constante de 2 ml mais en faisant varier la quantité de l'aldéhyde glutarique Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU Il Exemple n' 8 9 10 11 12 13 14 Aldéhyde glutarique à 250 C à 25 %, /ul 25 50 75 100 150 200 300 Concentration d'aldéhyde glutarique, mg 6325 12,5 18,75 25 37,5 50 75 Colostrum, ml 2 2 2 2 2 2 2 Durée de gélification, min 120 10 8 6 4 3 2 Protéine totale, g/dl > 15,0 3,1 3,4 3,8 4,0 4,6 5,0 Les résultats obtenus dans les exemples 1 à 14 ci- dessus montrent que la quantité efficace d'aldéhyde glutarique en poids par rapport au colostrum en volume est d'environ 6,25 mg/ml à environ 37, 5 mg/ml dans le mélange de réaction Des concentrations effectives totales dépassant 37,5 mg/ml, quoique accélérant considé- rablement la réaction ou la durée de gélification, ne permettent pas d'établir une distinction exacte entre les échantillons à forte teneur et faible teneur en immunoglobulines On notera que la teneur en immunoglobulines du colostrum utilisé dans les exemples 1 à 14 convient pour une nutrition correcte d'un veau nouveau-né Ainsi donc, une durée de gélification généralement équivalente à celle trouvée dans les exemples 1 à 14 pour le colostrum d'une mère nour- ricière met en évidence que les produits de nutrition conviennent pour l'animal nouveau-né On a trouvé que la température à laquelle on procédait aux essais n'avait pas une importance critique pour autant qu'elle ne tombe pas au-dessous de 12 'C environ ou ne monte pas au- dessus de 75 C environ Toutefois, les résultats rapportés dans les tableaux-I et II ci-dessus montrent que la durée de géli- fication est affectée par la température Par conséquent, lorsqu'on compare des résultats d'essais à des résultats d'étalonnage,il est nécessaire de s'assurer qu'on a observé des températures et d'autres variables semblables Pour ce qui concerne le p H du mélange de réaction, celui-ci ne constitue pas un facteur critique pour autant qu'il se situe dans l'intervalle d'environ 3 à 12 On sait que le p H des liquides physiologiques se situe dans cet intervalle mais les conditions de réaction optimales se situent à un p H de 3,9 à 5,7. EXEMPLES 15 à 20 Dans ces exemples, on décrit la réaction entre l'aldéhyde glutarique et le petit-lait du colostrum; on fait réagir le petit-lait de colostrum obtenu comme décrit dans l'exemple 1 et combiné avec du sérum physiologique à des concentrations variées avec 50/ul de la solution d'aldéhyde glutarique 50/ul de la solution d'aldéhyde glutarique à 25 % équivalent à 12,5 mg d'aldéhyde glutarique. Les résultats de ces essais sont rapportés dans le tableau III ci- dessous. TABLEAU III Exemple n 15 16 17 18 19 20 Petit-lait, ml 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 Sérum physiologique, ml 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 Protéine totale, g/dl 1,5 2,3 3,7 5,4 7,1 8,5 Durée de gélification, min 120 10 9 6 5 4 Les résultats rapportés dans le tableau III ci-dessus montrent que les quantités efficaces d'aldéhyde glutarique, en poids par rapport au petitlait de colostrum en volume, varient d'environ 6,25 mg/ml à environ 25,0 mg/ml dans le mélange de réaction Comme dans le cas du colostrum des exemples 1 à 14, le petit-lait 4 e colostrum non dilué ou le colostrum correspondant des exemples 15 à convient pour la nutrition d'un veau nouveau-né Ainsi donc, des durées de gélification d'une manière générale équivalentes trouvées dans les produits de nutrition provenant de la mère permettront de vérifier rapidement que l'animal nouveau-né reçoit une nourriture adéquate du point de vue immunologique. EXEMPLES 21 et 22 On a déjà signalé que certains liquides physiologiques, tels que le lait vendu dans le commerce,-ne devaient pas contenir un excès d'immunoglobulines Par conséquent, s'il y a des immunoglobu- lines, leur dosage a une très grande importance On trouvera dans le tableau IV ci-dessous les résultats obtenus dans l'exemple 21 par addition d'aldéhyde glutarique à du lait contenant des traces d'immunoglobulines Dans l'exemple 22, on a ajouté l'aldéhyde glutarique à un mélange lai-t/colostrum, le colostrum en question étant celui obtenu dans l'exemple 1. TABLEAU IV - Exemple N O 21 22 Aldéhyde glutarique à 25 %,,ul ( 25 mg) 100 100 Colostrum, ml O 0,50 Lait, ml 2 1,50 Durée de gélification > 30 min 4 min Les résultats rapportés dans le tableau IV montrent que l'addition d'aldéhyde glutarique à un produit laitier permet de vérifier rapidement la présence ou l'absence d'immunoglobulines. On ne connaît pas la nature exacte de la réaction entre l'aldéhyde et l'immunoglobuline Toutefois, la plupart des spécialistes pensent que les groupes amino de la molécule d'immuno - globuline, c'est-à-dire la molécule de protéine, interviennent dans la réaction Les protéines dont les points isoélectriques sont en milieu basique réagissent rapidement et celles dont les points isoélectriques sont en milieu acide entrent également en concurrence pour la réaction avec l'aldéhyde Lorsqu'on fait réagir des fortes concentrations d'aldéhyde glutarique par exemple avec des immuno- globulines dans des conditions déterminées, les immunoglobulines 2534029- polymérisent, conduisant à une solidification ou gélification du liquide biologique aqueux à une vitesse constante Cette vitesse dépend en premier lieu des concentrations de l'aldéhyde et de l'immunoglobuline Toutefois, la vitesse de réaction est affectée par la température, le p H, le volume de la solution, la concentration de l'immunoglobuline et la concentration des autres protéines contenues dans l'échantillon, la teneur en humidité de celui-ci, le volume du récipient dans lequel on procède à l'essai, le type de liquide biologique et l'âge et la nature de la source de l'échantillon soumis à l'essai Par conséquent, il est important de se rapprocher de la composition d'un mélange connu auquel on compare le mélange soumis à l'essai Le procédé selon l'invention pour déterminer la présence d'une immunoglobuline a pour but le contrôle de la présence générale de taux anormaux d'immunoglobulines Son but principal réside dans la vitesse et dans la commodité plus que dans la recherche de résultats quantitatifs précis. En plus de la mesure des concentrations d'immuno-. globulines dans les liquides physiologiques sécrétés, le procédé selon l'invention peut être appliqué à la détermination des taux d'immunoglobulines dans du sang entier, du sérum et du plasma sanguin. Du fait qu'il se produit une réaction entre les immunoglobulines et un aldéhyde approprié, on peut vérifier la présence d'immunoglobulines dans d'autres liquides physiologiques tels que l'urine et le liquide cérébrospinal en ajoutant un aldéhyde approprié, par exemple l'aldéhyde glutarique à ce liquide, comme décrit dans les exemples 21 et 22 Les exemples 23 à 25 ci-après rapportent les résultats de travaux expérimentaux effectués respectivement sur du sang entier, du sérum et du plasma sanguin. EXEMPLE 23 En opérant le mélange comme décrit dans l'exemple 1, on place 2 ml de sang entier provenant d'un veau hypergammaglobuliné- mique dans un tube et on place dans un second tube 2 ml de sang entier provenant d'un veau hypogammaglobulinémique A chacun de ces tubes, on ajoute 0,1 ml de solution d'aldéhyde glutarique à 25 %, ce qui correspond à 25 mg d'aldéhyde glutarique Le tube contenant le sang hypergammaglobulinémique gélifie en 2 min; le tube contenant le sang hypogammaglobulinémique ne gélifie pas en 30 min. EXEMPLE 24 On opère comme décrit dans l'exemple 23, mais on remplace le sang entier par du sérum: 1 ml de sérum provenant d'un veau à niveau suffisant d'immunoglobuline gélifie en 2 min; 1 ml de sérum provenant d'un veau à immunoglobuline insuffisante ne gélifie pas en 30 min. EXEMPLE 25 -On opère comme dans l'exemple 23, mais on opère sur du plasma à la place du sang entier; 1 ml de plasma provenant d'un veau à immunoglobuline suffisante gélifie en 1,5 min; 1 ml de plasma provenant d'un veau à immunoglobuline insuffisante ne gélifie pas en 30 min. Les résultats obtenus dans les exemples 23 à 25 montrent que le procédé selon l'invention permet de déterminer rapidement les teneurs en immunoglobuline des liquides physiologiques décrits En outre, et en relation avec la-détermination des immuno- globulines dans le sang entier et le plasma sanguin, on a trouvé que 1,25 mg d'aldéhyde glutarique par ml de sang agissait en tant qu'anticoagulant Toutefois, concurremment, cette réaction avec désactivation du fibrinogène des protéines coagulantes apparentées ne provoque pas de gélification en l'absence d'une quantité suffi- sante d'immunoglobulines Ainsi donc, lorsqu'on applique le procédé selon l'invention sur le sang entier, il n'est pas nécessaire de traiter au préalable le sang par un anticoagulant séparé Mais la réaction peut également tre effectuée sur du sang contenant un anticoagulant car elle n'est pas sérieusement affectée. On peut donc constater que le procédé selon l'invention permet de déterminer par des essais simples et rapides sur place l'existence de teneurs anormales en immunoglobulines dans des liquides physiologiques Il suffit de prélever un petit échan- tillon et de le placer dans un récipient approprié tel qu'un tube à essais, puis d'introduire une concentration déterminée d'aldéhyde glutarique Les résultats rapportés dans les tableaux et les exemples cidessus montrent que la concentration optimale pour un échantillon de 1 ou 2 ml de liquide physiologique est de l'ordre de 25 % dans 100/ul de solution d'aldéhyde glutarique; en d'autres termes, la quantité optimale est de 25 mg d'aldéhyde glutarique pour le mélange avec un échantillon de 1 ou 2 ml On mélange la solution et l'échantillon dans le tube à essais en secouant rapi- dement ou en renversant le tube puis en notant le temps qui s'écoule. Le tube est basculé toutes les 30 S et renversé toutes les min pendant quelques minutes ou jusqu'à gélification On note la durée de gélification positive en minuteslorsque aucune partie du liquide ou de la masse ne se déplace plus lorsqu'on renverse le tube On peut extrapoler la durée de gélification ou la comparer avec les résultats obtenus dans des essais sur étalon et en déduire la teneur en immunoglobuline du liquide. Dans les exemples 26 à 31 qui suivent, on a mis en évidence les caractéristiques principales de résultats d'essais positifs avec étalonnage sur place et en laboratoire avec utili- sation de 25 ml d'aldéhyde glutarique Les résultats statistiques sont nettement différents de ceux des négatifs. TABLEAU V Exemple n 26 27 28 29 30 31 Echantillon Colos Petit Sang Sérum Sérum Plasma trum lait de dans le colos sang trum Volume de l'échantillon, ml 2 1 2 1 1 Durée de gélifi- cation, min 7,7 > 12,1 > 3,1 > 5,0 > 5,2 > 4,6 Globuline immune, g/dl > 5,3 > 8,4 > 0,5 > 0,8 > 1,1 > 0,6 Immunoglobuline, g/dl > 5,9 >-10,4 > 0,9 > 1,6 > 2,2 > 1,4 Protéine du plasma, g/dl > 14,0 > 3,4 > 5,4 > 5,7 > 5,2 Comme les concentrations en protéine diffèrent dans les divers liquides physiologiques, l'utilisation de l'essai sur des liquides différents a un intérêt potentiel pour le diagnostic de maladies. Parmi les réactions qu'on peut utiliser pour la détermination des concentrations d'immunoglobulines, il existe un certain nombre de modifications physicochimiques y compris les modifications réfractométriques, turbidimétriques, par précipitation, de volume surnageant, de viscosité, électrophorétiques, immunoélec- trophorétiques, colorimétriques, de protéines totales, de p H et autres modifications La gélification qui est l'une de ces modifi- cations fonction du temps a été préférée en raison de son uniformité, de sa stabilité et de sa simplicité. Il est clair que l'invention n'est nullement limitée auxmodesde réalisation préférésdécrits ci-dessus à titre d'exemples et que l'homme de l'art peut y apporter des modifications sans pour autant sortir de son cadre, R E V E N D I C A T I O N S 1 Procédé pour déterminer les concentrations en immunoglobulines dans un liquide physiologique provenant d'un mammi- fère, caractérisé en ce que (a) on forme un mélange de réaction consistant en le liquide physiologique et une quantité efficace d'un aldéhyde approprié; (b) on note le temps durant lequel l'aldéhyde et le liquide physiologique réagissent jusqu'à formation d'un gel; et (c) on compare la vitesse de réaction du mélange de réaction à la vitesse de réaction connue d'un mélange connu du même aldéhyde et d'un liquide physiologique contenant une quantité connue d'une immunoglobuline. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'aldéhyde est l'aldéhyde glutarique. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le liquide physiologique est choisi dans le groupe formé par le colostrum, le petitlait du colostrum, le lait, le petit-lait du lait et leurs mélanges. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le liquide physiologique est le colostrum et en ce que la quantité efficace d'aldéhyde glutarique en poids par rapport au colostrum en volume est d'environ 6,25 mg/ml à environ 37,5 mg/ml dans le mélange de réaction. 5 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le liquide physiologique est le petit-lait du colostrum et en ce que la quantité efficace d'aldéhyde glutarique en poids par rapport au petit-lait du colostrum en volume est d'environ 6,25 mg/ml à environ 25,0 mg/ml dans le mélange de réaction. 6 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le liquide physiologique est choisi dans le groupe consistant en le sang entier, le sérum sanguin le plasma, l'urine et le liquide cérébrospinal. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le liquide physiologique provient d'un animal. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la concentration efficace d'aldéhyde glutarique en poids par rapport au liquide physiologique en volume dépasse environ 6,25 mg/ml. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la concentration efficace d'aldéhyde glutarique est de l'ordre de 12,5 mg/ml à 25,0 mg/ml.