Brevet FR2531101A1 — publié le 19840203

La première application thérapeutique de cortico- stéroïdes a été illustrée en 1950 avec l'avènement du traitement de l'arthrite rhumatoide par l'acétate de cortisone D'autres études ont démontré que l Vintroduc- tion d'une insaturation dans les positions 1,2 de l'hydro- cortisone et de la cortisone conférait une plus grande puissance aux stéroïdes résultants, à savoir la predni- solone et la prednisone, et entrainait une moindre réten- tion de sel sous l'effet du médicament Par la suite, la plupart des autres stéroides utilisés pour le traite- ment de maladies sensibles aux corticoïdes ont été synthétisés de telle manière qu'ils renferment une double liaison dans les positions 1,2 de la molécule de stéroideo Deux brevets des Etats-Unis d'Amérique publiés en 1977 représentent de nouvelles voies d'accès à la synthèse de corticostéroides à partir de stérols précurseurs Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 035 236 protège un procédé de préparation de 9 ahydroxyandrostènedione par fermentation du sitostérol, du stigmastérol ou du cholestérol Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 041 055 fait connaître un procédé général de synthèse de corticostéroïdes médicalement utiles à partir de cet androstène Des composés intermédiaires englobés dans cette chimie peuvent présenter une configuration 3-céto- A 4,9 ( 11) à On indique ci-après des procédés de l'art anté- rieur qui décrivent la biotransformation de stérôldes saturés en positions 1,2 en leurs 1,2-déshydrostéroides correspondants: - brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2 837 464 intitulé "Process for Production of Dienes by Coryne- bacterium" Description de la 1-déshydrogénation de stéroides dans des bouillons de fermentation par Arthrobacter (Corynebacteîium) simplex. Brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 360 439 intitulé "Process for Preparing 1-dehydro Steroids". Description de la 1-déshydrogénation de stéroïdes au moyen de cellules de A simplex préalablement traitées avec un alcanol inférieur ou une alcanone inférieure telles que l'acétone avant mélange avec le substrat et avec un support d'hydrogène. W Charney et H Herzog, 1967, Microbial Trans- formation of Steroids, Academic Press, Inc, New York, pages 4-9, 236-261. Historique des biotransformations de stéroides et énumération taxonomique des micro-organismes connus pour leur aptitude à effectuer la 1-déshydrogénation. T Yamané, H Nakatani, E Sada, T Omata, A. Tanaka et S Fukui, Biotechnology and Bioengineering, 21, 1979. Les auteurs ont effectué une étude de la 1-déshy- drogénation de la 4-androstène-3,17-dione par Nocardia rhodocrous dans un mélange formé de 50 % de benzène et d'heptane L'avantage mentionné de l'addition de ce sol- vant à des mélanges pour la biotransformation a été d'élever la vitesse de réaction d'un facteur 180 Toute- fois, le benzène est un cancérigène connu L'accepteur d'électrons préconisé pour l'activité de Nocardia rhodo- crous a été le méthosulfate de phénazine Cet accepteur d'électrons est trop coûteux et trop instable pour rendre cette activité microbienne pratique ou utile dans un procédé industriel de biotransformation L'enzyme de Nocardia rhodocrous n'a pas été actif en présence de ménadione, qui constitue l'accepteur d'électrons de choix pour Arthrobacter simplex L'enzyme de N rhodocrous doit être différent de celui qui est produit par A simplex. La réaction a été conduite à un taux de solvant organique saturé de stéroïde à 20 % seulement Il a été démontré que l'élévation de la concentration du stéroïde entraînait une baisse de la vitesse de réaction L'oxygène est un réactif essentiel de la réaction de 1-déshydrogénation Le solvant ( 50 % de benzène-heptane) est inflammable en présence d'oxygène Le mode d'introduction de l'oxygène dans le réacteur sans produire d'atmosphère explosive n'est pas commenté. K Sonomoto, I Jin, A Tanaka et S Fukui, Agric. Biol Chem, 44, 1119-1126, 1980. Le même laboratoire a étudié la 1-déshydrogénation de l'hydrocortisone par A simplex Deux solvants non miscibles, le n-butanol et l'alcool namylique, ont été expérimentés, mais la réaction de biotransformation ne s'est pas développée en présence de ces solvants Des solvants miscibles à l'eau tels que du méthanol à 10 % dans l'eau et du propylène-glycol à 10 % dans l'eau ont été choisis en tant que solvants préférés. L'art antérieur ne révèle ni ne suggère les pro- cédés perfectionnés de l'invention. En utilisant des cellules microbiennes séchées à l'air ou séchées à la chaleur qui sont capables de catalyser la 1-déshydrogénation de stéro Ides, on obtient une transformation de stéroides saturés en positions 1, 2 en leurs dérivés 1,2-déshydro correspondants plus efficace que ne permet de l'obtenir le meilleur procédé antérieur connu en milieu aqueux, notamment en présence d'un accep- teur d'électrons exogène. L'invention fait connaître également un procédé qui implique l'addition d'un hydrocarbure aromatique en tant que solvant non miscible à l'eau à une suspension aqueuse de cellules de A simplex, d'un accepteur exogène d'4 lectrons et du stéroide à déshydrogéner La suspension est agitée et de l'oxygène est rendu disponible de manière que la teneur en oxygène dans l'espace rempli de gaz soit inférieure au minimum d'oxygène pour la combustion; ou bien la réaction est conduite au-dessous du point d'éclair du solvant organique. Ces procédés sont supérieurs à la technologie de l'art antérieur pour la déshydrogénation de stéroides par des micro-organismes, pour les raisons suivantes a la biotransformation a pour résultat de plus faibles taux de substrat stéroidique non converti; b ce procédé peut être mis en oeuvre à des concentrations élevées en stéroïde; c une plus faible quantité de cellules micro- biennes, par exemple A simplex, est nécessaire pour convertir une quantité donnée de stéroïde; d ce procédé tolère davantage les impuretés organiques solubles présentes dans le stéroïde, les impuretés présentes dans les cellules micro- biennes ou les impuretés produites à partir des stéroïdes par les cellules; e la réduction ou l'élimination totale des enzymes de dégradation du stéro Ede présents dans les cellules microbiennes permet d'obtenir des rendements élevés en le produit désiré. En outre, le procédé au solvant est supérieur à la technologie connue pour les opérations de déshydrogéna- tion de stéroides avec d'autres activités microbiennes telles que Nocardia rhodocrous, du fait que la réaction catalysée par A simplex peut être conduite avec des accepteurs d'électrons stables et moins coûteux tels que la ménadioneo Micro-organisme Les micro-organismes qui peuvent être utilisés dans le procédé de l'invention comprennent tous les nom- breux micro-organismes bien connus en tant que 1-déshydro- génants Ces micro-organismes sont énumérés dans l'ouvrage de W Charney et H Herzog intitulé Microbial Transforma- tion of Steroids, 1967, Academic Press, Inc, New York. Les bactéries qui déshydrogènent les stéroïdes en position 1 rentrent dans deux groupes généraux établis dans le Bergey's Manual of Determinative Biology, 8 ème édition Le procédé décrit dans le présent mémoire a été mis en application avec succès pour des espèces apparte- nant aux genres Arthrobacter et Corynebacterium qui sont inclus dans "Part 17 ", Actinomycetes & Related Organisms". Les espèces, effectuant la déshydrogénation en position 1, de plusieurs autres genres de la partie 17, par exemple Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces et Bacterium, sont vraisemblablement utiles. Il a été démontré que deux micro-organismes accessibles au public, qui sont connus pour leur aptitude à déshydrogéner des stéroides en position 1, se prêtaient à ce type de procédé Bacterium cyclooxydans ATCC No 12673, inclus dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 3 065 146 comme micro-organisme effectuant la déshydrogénation en position 1, a été examiné en tant que micro-organisme utile. Une bactérie qui a été utilisée beaucoup plus largement pour la déshydrogénation de stéroides en position 1 est Arthrobacter simplex ATCC 6946 qui est décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N' 2 837 464 Ainsi, il sera beaucoup fait usage de ce micro-organisme dans ce qui suit pour illustrer le procédé de l'invention Toute- fois, il y a lieu de remarquer que le procédé de l'inven- tion couvre également l'utilisation de tout micro-organisme effectuant la déshydrogénation en position 1. Croissance du micro-organisme Les micro-organismes sont cultivés dans un milieu nutritif aqueux contenant: - a) des composés inorganiques tels que des nitrates ou des sels d'ammonium ou des composés azotés organiques (extrait de levure, peptone, extrait soluble de mais-, etc) pour apporter l'azote nécessaire à la croissance. b) Une source de carbone et d'énergie telle que des glucides et des dérivés de sucres, une huile, des acides gras et leurs esters méthyli- ques, des alcools, des amino-acides ou des acides organiques. c) Des ions et des oligo-éléments tels que sodium, potassium, magnésium, phosphate, sulfate, man- ganèse, cuivre, cobalt, molybdène, etc aux taux introduits par l'eau de ville ou par les ingrédients les moins raffinés du milieu (tels que l'extrait soluble de mais). Les organismes ont besoin de l'oxygène présent dans l'atmosphère pour leur croissance La plage de la température de développement va de 10 à 450 C avec un optimum de 28 à 370 C pour A simplex Le p H optimal pour la croissance est voisin de la neutralité. Production de la stéroide-1-déshydrogénase L'activité de stéroide-1déshydrogénase est induite chez les cellules par l'addition d'un 3cétostéroide saturé en positions 1,2 tel que l'androsta-4-ène-3,7-dione ou l'acétate de cortisone à un taux de 0,005 % en poids/volume du milieu ou davantage En présence de l'inducteur, l'incu- bation est poursuivie pendant une période d'au moins 6 heures avant que les cellules ne soient récoltées en vue d'être séchées. L'inducteur peut être ajouté à un moment quelcon- que au cours du cycle de croissance Des cultures dévelop- pées sur des substances nutritives telles que l'huile de lard amorcent rapidement la synthèse de la stéroide-1- déshydrogénase, tandis que les cultures développées sur glucose nécessitent l'épuisement du substrat avant que la synthèse de l'enzyme n'ait lieu L'incubation est pour- suivie pendant une période de 6 heures ou davantage après l'addition de l'inducteur, puis les cellules sont récoltées en vue de leur utilisation dans le procédé au solvant ou en vue de leur séchage. Mode opératoire pour recueillir les cellules en vue de leur séchage Les cellules sont séparées du milieu nutritif et concentrées par des moyens classiques, par exemple par centrifugation ou floculation et par filtration et ultra- filtration On sèche ensuite les cellules séparées en les plaçant sour des pressions réduites à 1-850 C (de préfé- rence 55-75 ), par séchage à l'air à la chaleur ou par séchage par pulvérisation, ou par séchage au tambour jus- qu'à une teneur en humidité comprise dans l'intervalle d'environ 1 à environ 10 % Une teneur en humidité d'en- viron 5 % est appréciée Les cellules sont conservées à C jusqu'au moment de leur utilisation pour des biotrans- formations Des cellules séchées actives peuvent aussi être préparées par immobilisation de cellules séchées par des techniques classiques, par exemple par emprisonnement dans un gel de polyacrylamide et dans du collagène ou couplage par covalence des cellules avec un support poly- électrolytique comme décrit dans Methods in Enzymology, volume XLIV, 1976, Academic Press, Inc, New York, pages 11-317. Procédé de biotransformation La biotransformation est effectuée par exposi- tion des cellules préparées au substrat stéroidique Par exemple, les cellules et le stéroide sont mis en suspen- sion dans une solution aqueuse faiblement tamponnée à un p H compris dans l'intervalle de 6 à 10, avec une plage optimale de 7,25 à 8,5 La quantité de cellules peut aller de 0,1 à 50 g/l, le stéromde est ajouté dans un rapport en poids de 0,05 à 5,0 (stéroide:cellules) Des taux de cellules de 8 à 10 g/l avec 5-10 g/1 de stéroide sont préconisés lorsque la biotransformation est conduite dans un milieu aqueux Un support d'électrons exogène est ajouté en quantités catalytiques (par exemple 5 x 10-4 M de ménadione) pour stimuler la réactiono Des composés utiles comprennent la ménadione ( 2-méthyl-1,4-naphtoquinone), le méthosulfate de phénazine, le dichlorophénol-indophénol, la 1,4-naphtoquinone, le bisulfite de ménadione, des ubiquinones (coenzyme Q) et des composés du type de la vitamine K Les mélanges sont incubés pendant O à 14 jours à une température comprise dans l'intervalle de 5 à 45 Co Pendant l'incubation, le mélange peut entrer en contact avec de l'oxygène moléculaire et il est de préférence agitéo La vitesse de 1-déshydrogénation décroît normale- ment avec le temps La biotransformation peut atteindre un taux de 98-100 % en moins de 24 heures lorsqu'on utilise 10 g/l de substrat. Des exemples des divers procédés que l'on peut utiliser comprennent les suivants: a) Mise en suspension du stéroïde et de la ména- dione dans une solution aqueuse faiblement tamponnée, suivie de l'addition des cellules séchées Des surfactants tels que "Tween 80 " peuvent être ajoutés à faible concentration, par exemple 0-5 %, pour faciliter la mise en suspen- sion du stéroïde. b) Mise en suspension des cellules dans un tampon aqueux, suivie de l'addition du support d'élec- trons dissous dans de l'éthanol, du méthanol, de l'acétone (pas plus de 5 % du volume final). Le substrat stéroidique peut être ajouté à l'état de poudre anhydre ou en solution (sus- -pension) dans un solvant organique miscible tel que le diméthylformamide, l'éthanol, le méthanol, l'acétone, le diméthylsulfoxyde ou un solvant organique non miscible tel que le toluène. c) Réhydratation des cellules séchées dans un petit volume de tampon, suivie de l'addition d'une plus grande quantité de tampon ou de solvants organiques De l'éthanol, de l'acétone, du xylène, de l'acétate de butyle, du chlorure de méthylène ou du toluène, stc est ajouté de manière qu'il y ait une teneur finale en sol- vant organique de 0-95 % (volume/volume) La quantité d'hydrocarbure aromatique que l'on utilise peut aller d'environ la moitié de la quantité nécessaire pour dissoudre le plus soluble entre le stéroïde de départ et le produit stéroidique, à environ 4 fois la quan- tiré nécessaire pour dissoudre le moins soluble entre le stéroïde de départ et le produit stéroldique Le stéroïde et le support d'élec- trons sont ajoutés pour déclencher la réaction. L'hydrocarbure aromatique est avantageusement ajouté avec le stéroide Toutefois, il peut être ajouté plus tard ou plus tôt. d) Mise en suspension d'un gâteau cellulaire humide ou dilution d'un bouillon de fermentation avec une solution aqueuse faiblement tamponnée, suivie de l'addition d'un support d'électrons exogène, de stéroïde et d'un hydrocarbure aromatique. Plage de substrat Des composés qui sont utiles à la mise en oeuvre de l'invention appartiennent aux séries de stéroides des 3-céto-A 4-androstènes et des 3-céto-A 4-prégnènes Il est reconnu que des substrats pour la stéroide-1-déshydro- génase présentent une saturation entre les atomes de carbone C 1 et C 2 du noyau A, et qu'ils portent un groupe hydroxyle ou un groupe céto dans la position 3 du noyau A Des représentants de la série des androstènes compren- nent les suivants: 1) androsta-4-ène-3,17-dione et 2) androsta-4,9 ( 11) diène-3,17-dione et ses dérivés 6 a-fluoro-, 6 a-méthyle ou 16-méthyle; 3) 11 -hydroxyandrosta-4-ène-3 17-dione et ses dérivés. Parmi les stéroïdes de la série des 3-céto-A 4- pregnènes que l'on peut utiliser, on mentionne 1 la 17 a-hydroxyprégn-4ène-20-yne-3-one et ses dérivés 16-méthyliques; 2 la 11 i,21dihydroxyprégn-4, 17 ( 20)-diène-3-one et son dérivé 6 a-méthylique; 3 la 20-chloroprégn-4,9 ( 11),17 ( 20)-triène-21-al- 3-one; -4 4 divers groupes de 3,20-dicéto-A 4-prégnènes, comprenant a) des composés 11,17,21-trihydroxyliques tels que l'hydrocortisone et son dérivé 6 a-méthylique; b) des composés 98,11 -époxy-17,21-dihydroxyli- ques tels que la 9,11 B-époxy-17,21-dihydroxy-16 -méthyl- prégn-4-ène-3,20-dione; c) des 3,20-dicéto-4,9 ( 11)-prégnédiènes tels que la 17 a,21-dihydroxyprégn-4,9 ( 11)-diène-3,20-dione et ses dérivés 16 a-méthylique, 17 a-méthylique ou 16 a- hydroxylique ou son ester 17 a-acétique; d) des 3,20-dicéto-4,9 ( 11),4,9 ( 11),16-prégné- triènes tels que la 21-hydroxyprégn-4,9 ( 11),16-triène- 3,20-dione et son dérivé 6 a-fluoré. Les 21-esters des stéroides portant un groupe 21-hydroxyle (N 2 et N 4) servent également de substrats. Les 21-esters préconisés comprennent des groupes alkyle inférieurs ou aryle tels que des esters d'acides gras infé- rieurs, par exemple l'acide acétique et d'acides carboxyli- ques monocycliques, par exemple l'acide benzoique. Les produits de biotransformation et le substrat non converti peuvent être séparés des mélanges par des moyens classiques Des stéroides sont normalement recueil- lis par filtrationsuivie d'une extraction du résidu du filtre avec un solvant organique tel que l'acétone ou le chlorure de méthylène A titre de variante, le mélange de biotransformation entier peut être extrait par mélange avec un solvant non miscible à l'eau tel que l'acétate de butyle ou le chlorure de méthylène Le produit est ensuite isolé du solvant organique. On donne ci-après les résultats de différentes biotransformations qui démontrent la supériorité du procédé de l'invention sur les procédés de l'art antérieur Les biotransformations ont été conduites dans les conditions indiquées en détail ci-dessus. Exemple 1 Préparation de cellules séchées: Bacterium cyclooxydans (ATCC 12673) a été inoculé dans des fioles agitées par secousses contenant un milieu formé de cérélose, de peptone et d'extrait soluble de mais ( 6 g/l de chaque ingrédient) à p H 7,0 On a fait incuber les cultures sur une secoueuse rotative à 28 C jusqu'à ce que le glucose ait été épuisé De l'acétate de corti- sone ( 0,5 g/l) a été ajouté à ce moment et on fait incuber les fioles pendant encore 16 heures Les cellules ont été récoltées par centrifugation, lavées deux fois à l'eau, puis placées dans une étuve sous faible vide à 45 C jus- qu'à ce qu'elles soient sèches. Biotransformation de la 6 a-méthylhydrocortisone On a réhydraté 0,5 g de cellules séchées, préparées comme décrit ci-dessus, dans 50 ml de tampon au phosphate m M à p H 7,5 sous agitation De la ménadione a été ajoutée à la suspension de cellules sous la forme d'une solution éthanolique ( 8,6 mg/ml d'éthanol) à un taux de 0,025 ml/50 ml. Le substrat a été ajouté en solution dans le diméthylfor- mamide (DMF) ( 100 mg de 6 a-méthylhydrocortisone/ml de DMF) jusqu'à une concentration finale de biotransformation de 0,5 g/lo On a fait incuber le mélange à 28 C sous agita- tion Après incubation pendant 4 heures, le stérorde était converti à 91 %o La 6 a-méthylprednisolone a été recueilli par des moyens classiques. Exemple 2 Production d'androsta-1,4,9 ( 11)-triène-3,17-dione a) Préparation du biocatalyseur On a cultivé Arthrobacter simplex (ATCC 6946) dans des fioles agitées par secousses dans un milieu contenant 6 g/l de glucoses 6 g/l d'extrait soluble de mais et 6 g/l d'extrait aqueux de lard séché par pulvéri- sation On a fait incuber les cultures à 28 C sur une secoueuse rotative jusqu'à ce que le glucose ait été épuisé A-ce stade, on a ajouté de l'acétate de cortisone ( 0,15 g/l) pour déclencher la synthèse de la stéroide-1- déshydrogénase Après incubation pendant la nuit, les cellules ont été récoltées par centrifugation à faible vitesse Les culots de cellules ont été placés dans une étuve à 550 C sous faible vide pendant 24 heures, pour effectuer leur séchage 24 heures plus tard, la matière séchée a été transférée dans un récipient étanche à l'air et conservée à 5 C jusqu'à ce qu'on en ait besoin pour une biotransformationo b) Biotransformation de l'androsta-4,9 ( 11)-diène-3,17- dione Des cellules séchées ( 10 g/l) ont été déshydratées dans un tampon au phosphate-50 m M à p H 7,5 sous agitation pendant 30 minutes De la ménadione a été ajoutée ensuite à la suspension de cellules sous la forme d'une poudre sèche jusqu'à une concentration finale de 86 mg/l De l'androsta-4,9 ( 11)-diène-3,17-dione micronisée a été mise en suspension dans du diméthylformamide et la sus- pension a été ajoutée à un mélange pour biotransformation à un taux de 2, 5 g de stéroide/litre avec 2 % (en volume/ volume) de DMF On a fait incuber le mélange à 31 'C sous agitation en présence d'air pendant 24 heures Une fois l'incubation terminée, on a recueilli l'androsta-1,4,9 ( 11)- triène-3,17-dione par des moyens classiqjues. Exemple 3. Les composés stéroïdiques suivants ont été exposés à l'action de cellules séchées de A simplex, conformément aux conditions décrites dans le paragraphe précédent en vue d'obtenir les dérivés 1,2-déshydro correspondants Numéro Nom 1 androsta-4-ène-3,1 i 7-dione 2 Gci-fluoro-androsta-4,9 (ll)-diène3,1 7- dione 3 6 c,-méthyl-androsta-4,9 (ll)-diène-3,17- dione 4 16 -méthyl-androsta-4,9 (ll)-diène-3,17- dione S 17 ca-hydroxyprég-n4-ène-20-yne3-one' 6 i 17 a-hydroxvprégn-4,9 (ll)-diène-20-yne -3-one 7 1 7 a hydroxyi 16 ç 3-méthylprégn-4, 9 (l) -diène- O-yne-3-one 8 il, 21-dihydroxyprégn-4,17 ( 20) diène-3-one 9 21 ' acétoxy-lle -hydroxyprégn-4, 11720) -diène- 3-one 6 cu-méthyl-11 le,21-dihydroxyprégn-4,17 ( 20)- diène-3-one il 20-chloroprégn-4,9 (il),17 3-one 12 hydrocortisone 13 6 a-méthylhydrocortisone 14 21-acétoxy-11 f 3,17-dihydroxy-16 g-méthyl- prégn-4-ène-3, 20-dione 21-acétoxy-9 cx-fluoroi 115,1 i 7-dihydroxy-16 e- méthy'lprégn-4-ène-3, 20-dione 16 21-acétoxy-9 3,il-époxy-17-hydr-oxy-1 6 e- méthylprégn-4-ène-3,20-dione 17 21-acétoxy-i 17-hydroxyprégn-4,19 ( 11) -diène- 3, 20-dione 18 21-acétoxy-16 a,17-dihydroxyprégn-4,9 diène-3, 20-dione 2 531101 Numéro Nom 19 21 -acétoxzy-17-hydroxy-16 a-méthylprégn- 4,9 ( 1 ll)-diène-3,20-dione 21 -benzoylo-xy-1 i 7-hydroxy=-16 -méthylprégn- 4,9 (ll)-diène-3,20 dione 21 21 -acétoxy-17-hydroxy-i 16 f-méthylprégn- 4,9 22 21-acétoxyprégn-=-4,9 ( 1),16 ( 17)-triène-3,20- dione 23 -21-acétoxy-6 a-fluoroprégn-4,9 (ll),16-triène- 3, 20-dione. Les produits correspondants obtenus par les trans-, formations sont les suivants Numéro la 2 a 3 a 4 a a 6 a 7 a 8 a 9 a i Oa li 1 a 12 a 13 a l 4 a Produits androsta-i 1,4-diène-3, 17-dione 6 c,-fluoro-androsta-1,4,9 dione 6 ca-méthyl-androsta-1,4,9 (ll)-triène-3, 17- dione i 16 a-méthyl-androsta-i 1,4,9 ( 11) -triène-3,17- dione 1 7 a-hydroxyprégn-1, 4 diène= 20-yne-3-one 1 7 "-hydroxyprégn 1,4,9 (ll) -triène= 20-yne-3- *one 17 a-hydroxy- 116 e-méthylprégn-i 1,4,9 {i 1) - triène-20-yne-3-one lle,21-dihydroxyprégn-1,4,17 one 21 -acétoxy-11 i t-hydroxyprégn-1,4,17 ( 20 >)- triène-3-one et 1 1,21-dihydroxyprégn-1,4,17 ( 20-triène-3 one 6 a-méthyl-11 f 3,21-dihydroxy-prégn-1,4,17 ( 20)- triène 3-one -chloroprégn-1,4,9 ( 11),17 ( 20)-tétraène-21- al-3-one prednisolone 6 a -méthylpredni sol one 21-acétoxy-1 1, 17-dihydroxy-i 16 -méthyl- prégn-i 1,4-diène-3,20-dione et lle,1 i 7,21-trihydroxy-16,-méthylprégn-1,4- diène-3, 20-dione Numéro a 16 a 17 a 18 a 19 a a 21 a 22 a 23 a Exemple 4 Produits 21 -acétoxy-9 a-fluoro-1 1 3, 17-dihydroxy-1 6 - méthylprégn-1,4-diène-3,20-dione et 9 o fluoro-1 1,17,21 -trihydroxy-1613-méthyl- pré gn-1 i, 4-dièhe-3, 20-dione 21-acétoxy-9,ille-époxy-17-hydroxy- 116 - méthylprégn-1,4-diène-3,20-dione et 9,1 il -époxy 17,21 i-dihydroxy 16 -méthyl- prégn 1,4-diène-3,20-dione 21-acétoxy-17-hydroxyprégn-1,4,9 ( 11 >)- triène-3,20-dione et 17,21 -dihydroxyprégn- 1,4,9 (ll)-triène-3,20-dione 21 -acétoxy-16 ca,17-dihydroxyprégn-1,4,9 ( 11) - triène-3, 20-dione et 1 Ea,17,21-trihydroxyprégn-1,4,9 (ll)-triène- 3,20-dione 21 -acétoxy-17-hydroxy-16 a-méthylprégn- i 1,4,9 (ll)-triène-3,20-dione et 17121 -dihydroxy-16 c-méthylprégn-1,4,9 (ll) - triène-3,20-dione 21 -benzoyloxy-17-hydroxy-16 -méthylprégn- i 1,4,9 (ll)-triène-3,20-dione 21 -acétoxy-17-hydroxy-16 e-méthylprégn- 1,4,9 (ll)-triène-3,20-dione et 17, 21-dihydroxy-i 16 -méthylprégn-1,4,9 (ll)- triène-3, 20-dione 21-acétoxyprégn-1,14,9 (ll),16-tétraène-3,20- dione et 21-hydroxyprégn-1,4,9 ( 11),16-tétraène-3,20- dione 21-ac 6 toxy-6 cc-fluoroprégn-1,4,9 ( 11 l),16- tétraène-3, 20-dione et 6 ca-fluoro-21-hydroxyprégn-1,4,9 (ll),16 - tétraëne-3, 20-dione. Deux stéroides différents ont été biotransformés avec des cellules de A simplex dans un bouillon de fermen- tation et avec des cellules de A simplex séchées Après que chaque biotransformation a été considérée comme terminée (comme indiqué par le fait qu'il n'y a plus d'abaissement des taux résiduels de substrat), le stéroide contenu dans le mélange a été extrait et isolé avec les rendements indi- qués pour chaque condition Le tableau suivant reproduit certains résultats. Comparaison des rendements d'isolement obtenus dans différents types de biotransformations Substrat Type de bio- transfo Ima- tion Rendement chimique en stéroide utile (a) Ca Lmosé Résidu, Comnien- t' % taires Fenoentaticn 77,2 %, 1 ère récolte 2,8 %, 2 ème récolte 2,6 87,4 mauvaise 1-déshy- drogéna- tion ,4 89,6 g/litre Cellule séchée 82,6 %, 1 ère récolte 9,9 %, 2 ème récolte Fermentation 18,1 %, 1 ère récolte pas de 2 ème récolte obtenue 8 g/litre Cellules 79,6 %, 1 ère séchées récolte pas de 2 ème récolte obtenue (a) Le stéroïde utile est considéré 59,1 40,9 97,8 (b) 2,1 comme étant le composé AV qui peut être utilisé dans la synthèse subséquente ou le substrat 1,2-dihydro qui peut être recyclé dans une autre biotransformation pour former le produit. (b) Des quantités considérables d'autres molécules stéroidi- ques indésirables ont aussi été recueillies. Exemple 5 On a cultivé Arthrobacter simplex dans un fermen- tateur "Microferm" de 5 litres, de manière à induire la synthèse de stéroide-1-déshydrogénase, et on a récolté les cellules par centrifugation Des portions de la pâte cellu- laire recueillie ont été soumises à deux procédés de pré- paration différents Le premier était le procédé décrit dans le présent mémoire, qui a consisté à sécher les cellu- ,0 ,0 ,0 les sous pression réduite à 55 C Le second procédé était le procédé recommandé dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 360 439 pour la préparation de cellules déshydratées à l'acétone Les cellules ont été mélangées avec de l'acétone, récoltées et séchées à 5 C sous pression réduite Les préparations de cellules séchées ont ensuite été utilisées pour la biotransformation de A 9,11 _ androstènedione dans des fioles agitées par secousses, à 10 g/l de cellules et à 10 g/l de stéroide. Comparaison de la capacité de bio- transformation de cellules de A simplex séchées par des procédés différents Type de Temps de Substrat Activité+ de bio- cellule prélèvement résiduel, % transformation des échan- tillons (h) (g de produit formé) h/g de cellules séché à 1 ' acétone 98,7 ,5 84, 1 * 0,013 0,011 0,007 séché à la chaleur 1 85,1 0,149 4 23,2 0,192 24 7,2 * 0,039 (+) L'activité de biotransformation se calcule comme suit: % de produit formé x g de substrat ajouté = g de produit formé g de produit formé/heures d'incubation/g de cellules ajoutées = activité (*) Les taux résiduels ne se sont pas abaissés lorsqu'on a poursuivi l'incubation. Exemple 6 En remplaçant la 6 a-méthylhydrocortisone de l'exemple 1 ou l'androsta-4, 9 ( 11)-diène-3,17-dione de l'exemple 2 par les substrats énumérés ciaprès, on a obtenu les produits correspondants: 1 7 Substrats 1 21-acétoxy-9 a-fluoro-11 ,16 a,17-trihydroxy- prégn-4-ène-3,20-dione; 2 21-acétoxy-6 a,9 a-difluoro-11 ,16 a,17-trihydroxy- prégn-4-ène-3,20-dione-16,17-acétonide 3 21-acétoxy-6 a-fluoro-11 -hydroxy-16 a-méthyl- prégn-4-ène-3,20-dione; 4 21-acétoxy-Ga-fluoro-11 ,17-hydroxyprégn-4- ène-3,20-dione 5 21-acétoxy-6 a,9 a-difluoro-lle,17-dihydroxy- -16 a-méthylprégn-4-ène-3,20-dione 6 21-acétoxy-9 a-fluoro-110,16 a,17-trihydroxv- prégn-4-ène-3,20-dio ne-16,17-acétonide; - 7 21-acétoxy 79 ,lle-époxy-6 a-fluoro-16 a,17- dihydroxyprégn-4-ène-3,20-dione-16,17-acétonide; 8 21-acétoxy-9 e,ll-époxy-16 a-hydroxyprégn-4- ène-3,20-dione; 9 21-acétoxy-9 ell$-époxy-16 a,17-dihydroxyprégn- 4-ène-3,20-dione-16,17-acétonide. Produits 1 21-acétoxy-9 a-fluoro-lle,16 a,17-trihydroxy- prégn-1,4-diène-3,20-dione et 9 a-fluoro-1 1 e,16 a,,17,21- tétrahydrowprègn -1,4-diène-3,20-dione 2 21-acétoxy-6 a,9 a-difluoro-11 ,16 a,,17-tr L'iç 7 dro, 7-,Drégn- 1,4 dièr-e-3,20-dione-16,17-acétonideet 6 o&,9 ci-fluoro-11 ,16 a,17,1 '21- tdtrahydroxyprégn-1,4-diène-3,20-dione-16,17-acétonide-; 3.'21-acéto 11-Y-6 u,-fluoro-lle-hydroxy-16 a-méthyl- prégn-1,4-diène-3,20-dione et 6 a-fluoro-lle,21-dihydroxy- 16 a-méthylprégn-1,4-diène-3,20-dione; 4 21-acétoxy-6 a-fluoro-11 ,17-hydroxyprégn-1,4- diène-3,20-dione et 6 a-fluoro-11 ,17,21-trihydroxy-1,4- diène-3,20-dione; 21-acétoxy-6 a,9 a-difluoro-11 ,17-dihydroxy- 16 a-méthylprégn-1,4-diène-3,20-dione et 6 a,9 ( 1-difluoro- il,17,21-trihydroxy-1,4-diène-3,20-dione 6 21-acétoxy-9 u-fluoro-11 ,16 a,17-trihydroxy- prégn-1,4-diène-3,20-dione-16,17-acétonide 7 21-acétoxy-9 B,118-époxy-6 a-fluoro-16 a,17- dihydroxyprégn-1,4-diène-3,20-dione-16,17-acétonide; 8 21-acétoxy-9 i,11 -époxy-16-hydroxyprégn-1,4- diène-3,20-dione et 93,11 i-époxy-16 a,21-dihydroxyprégn- 1,4-diène-3,20-dione; 9 21-acétoxy-9 t,11 $-époxy-16 a,17-dihydroxyprégn- 1,4-diène-3,20-dione-16,17-acétonide. Exemple 7 Biotransformation de la 11 i-hydroxvandrosta-4-ène-3,17- dione Un granmme de cellules séchées de A simplex, préparées comme décrit dans l'exemple 2, a été remis en suspension dans 100 ml de tampon au phosphate 50 m M à p H 7,5 De la ménadione dissoute dans de l'éthanol 3 A a été ajoutée jusqu'à une concentration finale de 86 mg/1. Un demi-gramme de 11-hydroxyandrostènedione a été ajouté à la fiole On a fait incuber le mélange sur une secoueuse rotative à 31 C Lorsque des échantillons ont été prélevés après incubation pendant 1 jour, on a observé deux pro- duits par chromatographie sur couche mince d'un extrait chlorométhylénique Environ 95 % du stéroïde étaient pré- sents sous forme de 11 i-hydroxyandrosta-1,4-diène-3,17- dione Le reste consistait en substrat non converti. Exemple 8 En suivant les conditions de l'exemple 7, les dérivés d'androstènedione suivants qui sont modifiés en position C-11 peuvent être déshydrogénés en position 1 en donnant les produits ci-après: Substrat Produit ( 1) i 113hydroxy-16 e 3-méthylandrosta-4-ène-3,1 i 7-dione i 113-hydroxy-16 f 3méthylandrosta-i 1,4-diène-3,17-dione ( 2) i 13-hydroxy-16 améthylandrosta-4-ène-3,1 i 7-dione+ 11 li-hydroxy-16 ci-mnéthylandrosta-1, 4-dièhe 3,17-dione ( 3) 6 a-fluoro 1 1 f-hydroxyandrosta-4-ène-3,1 i 7-dione - 6 ca-fluoro-11 i -hydroxyandrosta-1, 4-diène-3,1 i 7-dione ( 4) 6 a,méthyl-1 ff 3-hydroxyandrosta-4-ène-3,1 i 7-dione -+ 6 a-mnéthyl-11 i hydroxyandrosta-1,4-diène-3,1 i 7-dione ( 5) llao-hydroxyandrosta-4-ène-3, -17-dione illa-hydroxyandrosta-i 1,4-diène-3,1 i 7-dione ( 6) androsta-4-ène-3, 11,17-trione - androsta-1,4-diène-3,1 il, 17-trione. Exemple 9 1) Mélanger dans un récipient de réaction (sur la base d'un litre) a) 0,9 litre de tampon au KPO 4 50 m M, p H 7,5 b) 3,66 g de cellules sèches de A siîmplex c) 0,08 g de ménadione d) 8 g de 21-acétoxyprégn-4,9 (ll),16-triène- 3,20 '-dione e) 100 ml de toluène. 2) Agiter à 15 cal/i O min. 3) Ajouter de l'air en quantité nécessaire pour maintenir une concentration d'environ 3 à G % d'oxygène dans l'espace rempli de gaz du récipient de réaction. 4) Maintenir la température à 2800 C 100, ) Au bout de 25 heures, recueillir la phase toluénigue. Pour cet exemple, le stéroide présent dans la phase toluénique consistait en 94,3 % de 21-acétoxyprép'gn-'1,4,9 (ll),16-tétraènie- 3, 20-dione 4,2 % de 21-hydroxyprégn-1,4,9 (ll),16-tétraène- 3, 20-dione 1,5 % de 21-acétoxyprégn-4,9 (ll),16-triène-3,20- aione. La plage de variables suivantes peut être utilisée pour les étapes ci-dessus. Etape 1) a) Le p H du tampon peut être compris dans la plage de 6 à 10. b) La quantité de A simplex est réduite à un niveau juste suffisant pour que la réaction soit achevée. Des niveaux représentatifs vont de 0,05 à 1, 0 g par g de stéroïde Source microbienne de l'enzyme: Arthrobacter (Corynebacterium) simplex (ATCC 6946) ou Bacterium cyclo- oxydans (ATCC 12673). Préparation du micro-organisme Les cellules de A simplex peuvent être utilisées dans le bouillon de fermentation ou modifiées par le fait qu'elles sont recueillies, séchées, traitées à l'acétone ou immobilisées par des procédés bien connus dans l'art antérieur. c) L'accepteur d'électrons peut être choisi entre les suivants: ménadione ( 2-méthyl-1,4-naphtoquinone), bisulfite de ménadione, 1,4-naphtoquinone et autres com- posés du type de la vitamine K. La concentration de l'accepteur d'électrons est déterminée par des considérations de co t et de vitesse de réaction La vitesse de réaction est directement pro- portionnelle à la concentration de la ménadione Des concentrations représentatives vont d'environ 5 à environ 40 g/kg de stéroïde. d) La concentration en stéroide doit être aussi élevée que possible, du moment qu'il y a une transforma- tion efficace. Le stéroide appartiendrait à la série des 3- céto-A 4-androstènes ou à la série des 3-céto-A -prégnènes et il doit de préférence avoir une solubilité dans le solvant organique de plus de 5 g/l. e) L'hydrocarbure aromatique peut être choisi entre le toluène, le benzène et le xylène Ces solvants peuvent être utilisés seuls ou dilués avec un autre sol- vant non miscible à l'eau tel que l'heptane ou le chlorure de méthylène. La quantité d'hydrocarbure aromatique peut aller d'environ la moitié de la quantité nécessaire pour dis- soudre le plus soluble du stéroïde de départ ou du stéroide obtenu comme produit jusqu'à environ 4 fois la quantité nécessaire pour dissoudre le moins soluble du stéroïde de départ ou du stéroide obtenu comme produit. Dans cet exemple, du toluène a été ajouté en quantité juste suffisante pour dissoudre le stéroïde à la fin de la réaction. L'hydrocarbure aromatique est avantageusement ajouté avec le stéroide Toutefois, l'hydrocarbure aroma- tique peut être ajouté plus tard ou plus tôt. Etape 2) Agiter à une puissance d'agitation aussi grande que possible La vitesse d'agitation est grandement fonc- tion de la puissance d'agitation. Etape 3) La réaction a besoin d'oxygène comme accepteur final d'hydrogène (électrons et protons) Toutefois, du fait de la présence de l'hydrocarbure aromatique, une atmosphère explosive existe dans l'espace rempli de gaz du réacteur Pour écarter ce risque, la concentration en oxygène dans l'espace rempli de gaz est avantageusement maintenue bien au- dessous de la concentration minimale d'oxygène nécessaire pour la combustion Pour le benzène, la concentration minimale d'oxygène est de 11, 2 % Pour les xylènes, il est également possible de conduire la réaction au-dessous du point d'éclair Le point d'éclair pour le m-xylène, le o- xylène et le p-xylène est égal, respectivement, à 290 C, 320 C et 390 C. Etape 4) La température de la réaction peut aller d'envi- ron O à environ 450 C. Etape 5) La réaction est normalement conduite pendant 2 jours Elle pourrait être conduite pendant une période allant de quelques heures à quelques semaines. Exemple 10 Comparaison des modes opératoires en milieu toluénique et en milieu aqueux (A) Mode opératoire: Réunir 0,4 g de cellules de A simplex ml de tampon au KPO 4 50 m M, p H = 7,5 Agiter pendant 2 heures ou jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène. Prélever des fractions de 2 à 25 ml et les ajouter à des fioles de 125 ml. Ajouter à chaque fiole 0,25 ml de ménadione 5 m M en alcool 3 A 0,2 g d'androsta-4,9 ( 11)-diène-3,17-dione. Ajouter 2 ml de toluène à l'une des fioles bouchées et Agiter sur secoueuse à mouvement alternatif pendant 4 jours. Au bout de 4 jours, extraire avec 25 ml de toluène. Analyser les extraits. (B) Résultats: Mode opératoire Aqueux Toluène (Substrat) Androsta-4,9 ( 11)-diène-3,17- dione 17,7 % 0,00 % (Produit) Androsta-4,9 ( 11)-triène- 3,17-dione 82,3 % 100,00 % Exemple 11 l Les composés stéroidiques suivants ont été exposés à l'action de cellules séchées de A simplex conformément aux conditions décrites dans l'exemple 9 en vue d'obtenir les dérivés 1,2-déshydro correspondants: Numero Nom 1 androsta-4 ène-3,17 dione 2 6 ca-fluoroandrosta-419 ( 11) -diène-3, 17dione 3 6 a-méthylandrosta4,9 (ll) -diène-3,i 7-dione 4 16 f 3niéthylandrosta-4,9 (ll)-diène- 3,17- dione 1 7 a-hydroxyprégn-4-ène-20yne-3-one 6 1 7 c-hydroxyprégn-4,19 ( 11) -diène-20-yne-3- one 7 1 7 a-hydroxy-1 6 t 3-xrtthylprégn-4,9 (ll) -diène- -yne-3-one 8 21 -acétoxy-l'l e-hydroxyprégn-4,117 ( 20)-diène- 3-one 9 20-chloropr 6 gn-4,9 (ll),1 7 ( 20)-triène-21 -ai- 3-one 21-acétoxy-17-hydroxyprégn-4,9 { 1 l) -diène- 3, 20-diorie il 21-acétoxy-17-hydroxy-1 Gca-mnéthylprégn- 4,9 (ll)-diène 3,20-dione 12 21 -benzoyloxcy-17-hydroxy-16 e-méthylprégn- 4,9 ( 1 ll)-diène-3,20-dione, 13 21 -acétoxy-17-hydroxy-160-méthylprégn- 4,9 ( 11 l)-diène-3,20-dione 14 21-acétoxryprégn-4,9 (ll)-,16-triène-3,20- dione 21-acétoxy-Ga-fluorôprégn-4,9 (ll),1-6 ( 17) - triène-3, 20 =dione. Les produits correspondants obtenus par les trans- *formations sont les suivants- Numéro Produits la androsta-1,4-d'iène-3,17-dione 2 a 6 a-fluoroandrosta-1,14,9 ( 11 l)-triène-3,17- dione 3 a 6 a-méthylandrosta-1,4,9 ( 11) -triène-3,17- dione 4 a 16 e-méthylandrosta-I,4,9 ( 1 1)-triène-3,17- dione a 17 a-hydroxyprégn-1,4-diène-20-yne-3one 6 a 1 7 a-hydroxyprégn-1,; 4,9 ( 11) -triène-20-yne- 3-one 7 a 17 a,-hydroxy-16 -méthylprégn-1,4,9 (l) - trine-20-yne-3-one 2 531101 Numéro Produits 8 a 21-acétoxy-1 1 i-hydroxyprégn- 11,4,17 ( 20) - tti 4 ène-3-one et ils,,21-dihydroxyprégn-1,4,17 ( 20)-triène- 3-one 9 a 20-chloroprégn- 11,4,9 {ll),17 ( 20)-tétraène- 21 -al-3-one i Qa 21-acétoxy 17-hydroxyprég-n-1,4,9 ( 11)- triène-3, 20-dione et 17,21-dihydroxyprégn-1,4,9 (ll)-triène-3,20- dione lia 21 -acétoxy-17-hydrox-,y1 6 o-méthylprégn- i 1,419 17,21-dihydroxy-16 oa-méthylprégn-i 1,4,9 (ll)- triène-3,20-dione i 2 a 21 -benzovloxy-i 17-hydroxy-161-méthylprégn- i 1,4,9 (ll)-triène-3,20-dione i 3 a 21 -acétoxy-i 17-hiydroxy-i 16 -méthylprégn- 1,4,9 (ll)-triène 3,20-dione et 17,21-dihydroxy-165-méthylprégn-1,4,9 (ll)- triène-3, 20-dione 14 a 21-acétoxyprégn-1,4,9 (ll),16tétraène2,20- dione et 21-hydroxyprégn-i 1,4,9 ( 11 l),16-tétraène-3,20- dione a, 21-acétoxy-6 afluoroprégn-1,4,9 (ll),16- tétraène-3, 20-dione et 6 ci-fluoro-21-hydroxyprégn-1,4,9 (il),16- tétraène-3, 20-dione L'utilité des 1,2-déshydrostéroides est bien connue On renvoie par exemple au brevet des Etats-Unis d'Amérique N' 3 284 447 qui fait connaître l'utilité de I 14,911-prégne-triènes dans la synthèse de cortico- stéroïdes diurétiques substitués sur l'atome de carbone 16 Le brevet des Etats-U nis d'Amérique No 4 041 055 fait connaître un procédé de synthèse de corticostéroïdes à partir de dérivés de,4 androstènedlione, démontrant l'utilité de 1,2-déshydro-androstènes comme composés intermédiaires importants dans la préparation de stéro 5 des d'intérêt médical. REVENDICATIONS 1 Procédé pour convertir des 3-cétostéroides saturés en positions 1,2 en 1,2-déshydrostéroïdes, carac- térisé en ce qu'il consiste à exposer lesdits stéroïdes saturés en positions 1,2 à l'action de cellules séchées à l'air ou séchées à la chaleur de micro-organismes de déshydrogénation en position 1- 2 Procédé pour convertir des stéroides saturés en positions 1 et 2 en 1,2déshydrostéroides, caractérisé en ce qu'il consiste à exposer lesdits stéroides saturés en positions 1,2 à l'action de cellules bactériennes, séchées à l'air ou séchées à la chaleur, de micro-organismes effectuant la déshydrogénation en position 1 en présence d'un support d'électrons exogène, choisi de préférence entre la ménadione, le méthosulfate de phénazine, le di- chlorophénol-indophénol, la 1,4-naphtoquinone, le bisulfite de ménadione, des ubiquinones (coenzyme Q) ou des composés du type de la vitamine K. 3 Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les cellules microbiennes séchées à l'air ou séchées à la chaleur ont une teneur en humidité d'environ 1 à environ 10 %o 4 Procédé suivant l'une des revendications I et 2, caractérisé en ce que le micro-organisme de déshydrogéna- tion en position 1 est Arthrobacter simplex ou Bacterium cyclooxydans. Procédé perfectionné pour convertir des stérol- des saturés en positions 1,2 en 1,2-déshydrostéroides, caractérisé en ce qu'il consiste à exposer lesdits stéroides saturés en positions 1,2 à l'action d'Arthrobacter simplex ou de Bacterium cyclooxydans en présence d'un support d'électrons étant de préférence la ménadione, la 1,4-naphto- quinone, le bisulfite de ménadione ou des composés du type de la vitamine K et ledit hydrocarbure aromatique étant de préférence le toluène ou le xylène. 6 Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le solvant non miscible à l'eau représenté par ledit hydrocarbure aromatique est présent en une quantité allant d'environ la moitié de la quantité nécessaire pour dissoudre le plus soluble du substrat stéroidique ou du stéroide formé comme produit à environ 4 fois la quantité nécessaire pour dissoudre le moins soluble du substrat stéroidique ou du stéroide obtenu comme produit. 7 Procédé perfectionné pour convertir des stérol- des saturés en positions 1,2 en 1,2-déshydrostéroldes, caractérisé en ce qu'il consiste à exposer lesdits stérol- des saturés en positions 1,2 à l'action d'Arthrobacter simplex ou de Bacterium cyclooxydans en présence d'un sup- port d'électrons exogène et d'un solvant non miscible à l'eau comprenant un hydrocarbure aromatique, de l'oxygène étant ajouté de telle manière que la concentration en oxygène soit maintenue au-dessous de la concentration mini- male nécessaire pour la combustion, ledit support d'élec- trons étant la ménadione, la 1,4-naphtoquinone, le bisul- fite de ménadione ou d'autres composés du type de la vitamine K et ledit hydrocarbure aromatique étant le ben- zène, le toluène ou un xylène. 8 Procédé perfectionné pour convertir des stérol- des saturés en positions 1,2 en 1,2-déshydrostéroides, caractérisé en ce qu'il consiste à exposer lesdits stéroï- des saturés en positions 1,2 à l'action d'Arthrobacter simplex ou de Bacterium cyclooxydans en présence d'un support d'électrons exogène et d'un solvant non miscible à l'eau comprenant un hydrocarbure aromatique, la réaction étant conduite au-dessous du point d'éclair du solvant organique, ledit support d'électrons étant de préférence la ménadione, le méthosulfate de phénazine, la 1,4-naphto- quinone, le bisulfite de ménadione ou d'autres composés du type de la vitamine K et ledit hydrocarbure aromatique étant le'xylène. 9 Procédé suivant l'une quelconque des revendi- cations 5, 7 et 8, caractérisé en ce que le solvant non miscible à l'eau est dilué avec un autre solvant non mis- cible à l'eau.