Brevet FR2529462A1 — publié le 19840106

Composition pharmaceutique et procédé pour le traitement de tumeurs. La présente invention vise un extrait soluble dans la pyri- dine d'un micro-organisme qui, combiné avec un dimycolate de tréhalose et un dérivé précipité par l'acétone de glycolipides endotoxiques extrait au chloroforme et au méthanol (ACP), fournit une composition pharmaceutique possédant des propriétés anti-tumeurs. Les bactéries telles que Corynebacterium parvum ont fait l'objet de travaux expérimentaux pour les isoler et caracté- riser le composant auquel on doit l'inhibition de la crois- sance des tumeurs (voir par exemple Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C parvum; Cantrell, et al, Cancer Research 39, pp 3554-3563 (septembre 1979)) En dehors de son acti- vité anti-tumeur, C parvum s'est révélé être un stimulateur puissant du système lymphoréticulaire, conduisant à une aug- mentation indésirable des poids de la rate et du foie et à la blastogénèse La Demanderesse a découvert qu'un extrait de micro-organisme soluble dans la pyridine possède des pro- priétés anti-tumeur puissantes sans les effets toxiques in- désirables associés aux produits de la technique antérieure. On peut obtenir les dimycolates de tréhalose à partir des organismes tels que par exemple M avium, M phlei, M.tuberculosis (souches H 37 RV et Ayoma B), M bovis BCG, M.smegmatis, M kansasii, Nocardia rubra, M bovinis et Corynebacterium diphteriae. On cultive, on récolte, puis on tue par la chaleur des bactéries telles que M avium On extrait alors la masse cellulaire par plusieurs solvants puis on extrait une frac- tion active soluble dans les solvants On pousse la purifi- cation de cet extrait par une série d'extractions par sol- vant pour obtenir un DMT brut (voir biologically active components from mycobacterial cell walls I isolation and composition of cell wall skeleton and component p 3; Azuma, et al, Journal of the National Cancer Institute, Volume 52, pp 95-101, 1974) incorporé ici par référence. Comme décrit dans Azuma et al, on peut encore purifier le DMT brut par chromatographie centrifuge sur gel de silice microparticulaire pour obtenir du DMT purifié. Un dérivé précipité par l'acétone de glycolipides endotoxiques extraits au chloroforme et au méthanol (ACP) ne possède pas de propriétés régressives pour les tumeurs quand on l'utilise seul ou en combinaison avec un dimyco- late de tréhalose Pour une discussion plus complète de l'ACP, de ses propriétés et de ses procédés d'obtention, on se référera à Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al, Cancer Immunol Immunother, Volume 7, pp 43-58 ( 1979) incorporé ici par référence On peut préparer l'ACP à partir de n'importe quelleentérobactériacée, y compris, mais non exclusivement, les genres suivants: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomnas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella et Serratia, On peut notamment employer les espèces suivantes: S minneso- ta, S typhimurium, B pertussis, B abortus, S enteritidis, E.coli, S typhi, S marcescens, S typhosa, Shigella flexni et S abortus equi. Le but de l'invention est donc de fournir une composition pharmaceutique contenant un extrait soluble dans ja pyridine d'un micro-organisme en combinaison avec un dimycolate de tréhalose et un dérivé précipité par l'acétone de glycolipides endotoxiques extraitsau chloroforme et au mé- thanol (ACP). Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de traitement des tumeurs chez les animaux à sang chaud et les humains, utilisant la composition contenant l'extrait soluble dans la pyridine d'un microorganisme, le DMT et i'ACP. La présente invention concerne des compositions pharmaceu- tiques comprenant un extrait soluble dans la pyridine d'un microorganisme, contenant entre environ 7 et 20 % en poids de protéine, environ 10 à 16 % en poids de sucre et environ à 55 % en poids d'acides gras, en combinaison avec un DMT et un ACP L'extrait contient, de préférence, environ 12 % en poids de protéine, autant de sucre et environ 45 % en poids d'acides gras. On peut utiliser n'importe quel micro-organisme pour obtenir l'extrait soluble dans la pyridine, y compris par exemple M bovis BCG, M phlei, M smegmatis, M kansasii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphteriae et Corynebacterium parvum. Corynebacterium parvum est spécialement préféré. On mélange à la pyridine les cellules entières du micro- organisme, de préférence sous forme d'une pâte On sépare le mélange résultant pour obtenir une fraction surnageante qui contient l'extrait soluble dans la pyridine et un résidu En option, on peut soumettre le résidu à des procédures répétées de séparation comme décrit ci-dessus en utilisant de la pyridine pour retirer des quantités supplémentaires de l'extrait désiré. 2529462 - On élimine ensuite la pyridine de l'extrait et on dialyse l'extrait séché face à un liquide convenable tel que l'eau distillée L'absence de cellules entières ou de fragments de cellules constituant des contaminants est confirmée par microscopie électronique L'extrait purifié résultant peut alors être lyophilisé par des procédés connus pour obtenir un produit stable. L'extrait soluble dans la pyridine produit conformément à l'invention peut être combiné avec le DMT et l'ACP pour fournir une composition ayant une puissante activité anti- tumeur sans stimuler l'hypertrophie de la rate et du foie. Les cancers qui peuvent être traités par cette composition comprennent des tumeurs animales telles que le carcinome à cellule squameuse bovin, le fibrosarcome bovin, la sarcolde équine, le mélanome équin, le carcinome à cellule squameuse équin, les tumeurs mammaires canines, l'adénome canin et le mélanome canin, et des tumeurs humaines telles que les tumeurs du sein, les tumeurs du poumon, les tumeurs du colon, le mélanome malin, les carcinomes à cellule squameuse et les tumeurs ovariennes. La composition est, de préférence, administrée par injection, dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile, directement dans la tumeur, dans des conditions décrites plus particulièrement ci-après. La composition susdite peut être stabilisée, par exemple par une procédure de lyophilisation, et reconstituée ensuite sans perte d'activité. La quantité d'extrait soluble dans la pyridine dans une seule injection pour le traitement des animaux est comprise entre environ 375 et 2500 microgrammes/millilitre Les quantités de DMT et d'ACP sont chacune comprises entre environ 375 et 1250 microgrammes/millilitre. Le nombre de millilitres injectésdans la tumeur est déterminé par la taille de la tumeur conformément au tableau suivant Posologie animale en fonction de la taille de la tumeur. Diamètre de la tumeur (cm) quantité injectée (ml) 0-1 jusqu'à 0,5 1-2 0,5 à 2,5 2-3 2,5 à 5 3-5 5 à 10 -8 10 à 15 supérieur à 8 15 à 20 La dose maximale par injection est d'environ 40 milligrammes pour l'extrait soluble dans la pyridine, environ 6 milli- grammes pour le DMT et environ 20 milligrammes pour l'ACP. Le déroulement du traitement comprend jusqu'à six injections administrées à environ deux semaines d'intervalle. La présente composition dans un milieu d'injection convenable tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile est administrée directement dans les tumeurs humaines La quantité d'extrait soluble dans la pyridine dans une seule injection est compri- se entre environ 200 et 5000 microgrammes, de préférence entre environ 800 et 1200 microgrammes La quantité de DMT est comprise entre environ 50 et 1000 microgrammes, et la quantité d'ACP entre environ 150 et 1000 microgrammes La posologie unitaire préférée tant pour le DMT que pour l'ACP est comprise entre environ 475 et 525 microgrammes Toutes les posologies mentionnées ci-dessus sont basées sur un patient adulte représentatif pesant 70 kilogrammes Les injections sont administrées environ une fois par semaine et jusqu'à un total de quinze injections. Comme décrit ci-dessus, la composition pour le traitement des animaux à sang chaud et des humains peut être utilisée sous forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile La quan- tité d'huile utilisée est dans le domaine allant d'environ 0,5 à 3,0 % en volume basée sur le volume total de la compo- sition On préfère utiliser entre environ 0,75 et 1,5 % en volume d'huile Des exemples de telles huiles comprennent l'huile minérale, le squalane, le squalène, le 7-n-hexyloc- tadécane, l'huile supérieure Conoco et l'huile minérale Drakeol 6 VR (produites par Penreco Company, Butler, Pennsyl- vanie). Le mélange contenant l'huile, homogénéisé, est ensuite com- biné avec un détergent qui peut facultativement être dissous dans une solution saline avant mélange La quantité de dé- tergent est de façon caractéristique comprise entre environ 0,02 et 0,25 % en volume et, de préférence, entre environ 0,10 et 0,20 % en volume basé sur le volume total de la com- position On peut utiliser n'importe quel détergent courant, y compris Tween-80 et Arlacel (produits par Atlas Chemical Company). On homogénéise ensuite le mélange résultant de l'addition de détergent pour former une suspension présentant un pour- centage élevé de gouttelettes d'huile revêtues par les composants actifs comme on s'en est rendu compte par obser- vation au microscope. Les exemples suivants sont donnés seulement à titre illus- tratif et n'ont pas pour but de limiter ou de redéfinir en aucune façon l'invention telle que revendiquée dans les revendications annexées. Exemple 1 Préparation d'un extrait soluble dans la pyridine à partir de Corynebacterium Parvum. On a cultivé et récolté Corynebacterium Parvum (P acnes, souche 4182) à 370 C dans un bouillon de thioglycolate de NIH pendant 48 à 72 heures pour obtenir une pâte de cellules entières On a ensuite lavé la pâte avec 500 millilitres d'eau distillée On a mélangé 90 grammes (poids humide) de pâte lavée avec 200 millilitres de pyridine sèche et on a centrifugé à 1700 g pendant une heure à 40 C On a retiré un extrait soluble dans la pyridine sous forme de fraction surnageante On a extrait le résidu restant de nouveau à la pyridine dans des conditions identiques à celles décrites ci-dessus Après filtration au moyen de papier Whatman No 1, on a réuni les extraits à la pyridine et éliminé le solvant par évaporation à 500 C dans un-Rotavapor de Buchi (Brinkmann Instruments, Westbury, New York) L'extrait à la pyridine séché a été dialysé de façon poussée vis-à- vis d'eau distillée puis lyophilisé L'extrait à la pyridine purifié résultant contenait environ 12 % en poids de protéine, environ 12 % en poids de sucre et environ 45 % en poids d'acides gras On a examiné l'extrait au microscope électronique et on a constaté qu'il était exempt de contamination par des cellules entières et des fragments de parois cellulaires Le rendement de l'extrait soluble dans la pyridine était 9 % ( 8,1 grammes). Exemple 2 Préparation d'extrait soluble dans la pyridine à partir de M bovis souche BCG On a cultivé et récolté M bovis souche BCG dans le bouillon de Sautons à 370 C pendant environ trois à quatre semaines pour obtenir une pâte de cellules entières lavée On a alors traité 50 grammes (poids humide) de pâte lavée de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir un rendement en extrait soluble dans la pyridine de 7 % ( 3,5 grammes) L'ex- trait contenait 15 % en poids de protéine, 10 % en poids de sucre et 52 % en poids d'acides gras. L'extrait soluble dans la pyridine en combinaison avec le DMT et l'ACP dans un milieu pharmaceutiquement acceptable est d'une efficacité significative dans le traitement des tumeurs pour obtenir dans la majorité des cas une régression totale de la tumeur. Revendications. 1 Composition pharmaceutique comprenant une quantité thé- rapeutiquement efficace d'un extrait soluble dans la pyri- dine purfié obtenu à partir d'un micro-organisme, ledit extrait contenant entre environ 7 et 20 % en poids de protéine, entre environ 1 È et 16 % en poids de sucre et entre environ et 55 % en poids d'acides gras, un dimycolate de tréhalose et un dérivé précipité par l'acétone de glycolipides endotoxiques extraits au chloroforme et au méthanol et un support pharmaceutiquement acceptable. 2 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le microorganisme est M bovis BCG, M phlei, M smegmatis, M Kansasii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphteriae ou Corynebacterium parvum et, de préférence, Corynebacterium parvum. 3 Composition selon l'une des revendications 1 et 2, carac térisée en ce que l'extrait contient environ 12 % en poids de protéine, environ 12 % en poids de sucre et environ 45 % en poids d'acides gras, que la quantité d'extrait peut at- teindre environ 40 milligrammes, la quantité de dimycolate de tréhalose peut atteindre environ 6 milligrammes, que la quantité dudit dérive précipité à l'acétone peut atteindre environ 20 milligrammes, et que la composition est sous forme lyophilisée ou sous forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile. 4 Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'huile est une huile minérale légère, le squalane, le squalène, le 7-nhexyloctadécane, l'huile supérieure Conoco ou l'huile minérale Drakeol 6 VR, la quantité d'huile pré- sente étant comprise entre environ 0,5 et 3,0 % en volume sur la base du volume total de la composition,et qu'un détergent peut être présent dans la composition pour une quantité comprise entre environ 0,02 et 0,25 % en volume sur la base du volume total de la composition. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la quantité d'extrait est comprise entre environ 200 et 5000 microgrammes, la quantité de dimy- colate de tréhalose entre environ 50 et 1000 microgrammes et la quantité de dérivé précipité par l'acétone entre environ 150 et 1000 microgrammes. 6 Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient entre environ 375 et 2500 microgrammes/millilitre du produit d'extraction soluble dans la pyridine, de préférence entre environ 200 et 500 microgrammes de l'extrait, entre environ 375 et 1250 micro- grammes/millilitre de dimycolate de tréhalose et entre environ 375 et 1250 microgrammes par millilitre de dérivé précipité par l'acétone.