Brevet FR2528069A1 — publié le 19831209

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs de clonage et d'expression dans les levures, ainsi que les levures transformées grâce à ces vecteurs et leur application a la synthèse de protéines. Certaines souches de levures de l'espèce Kluyveromyces lactis contiennent un couple de plasmides linéaires dont la présence confère a la cellule le caractère "killer", cette cellule produit une toxine qui empêche a croissance d'autres cellules dites sensibles. Parmi les cellules sensibles, il faut citer les cellules de K. lactis dépourvues de plasmides, mais également les cellules d'espèces différentes comme Saccharomyces cerevisiae. Ces plasmides ont d'abord été décrits par Gunge et coll. (J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981), 147, 155-166 (1981), puis indépendarament par H. Fukuhara et coll. (Current Genetics, sous presse). Il s'agit de deux plasmides d'ADN double brin linéaires appelés k1 (8,8 kb)et k2 (13,4 kb). Les études génétiques faites au Laboratoire de M. Fukuhara montrent une grande analogie avec le sys@@@@@@@@de S. cerevisiae, excepté le fait que celui-ci contient deux plasmides à APW. Le plasmide kl est indispensable pour l'expression du caractère"killer"et de l'immunité a la toxine car la perte de ce plasmide entrain la disparition de ces deux caractères. Il semble que le plasmide k2 soit nécessaire pour la maintenance de k1 dans la cellule. La réplication de ces ADN fait intervenir plusieurs gènes chromosomiques de la levure ; l'expression de la toxine dépend également de gênes nucléaires. Il y a donc des interactions entre les deux plasmides et entre plasmides et noyau. Or, on a découvert qu'il était possible d'utiliser le plasmide kl a titre de vecteur de clonage et d'expression. La présente invention propose donc un vecteur de clonage et d'expression d'un gêne hétérologue dans une levure, caractérisé en ce qu'il comporte au moins - tout ou partie de l'ADN du plasmide k1 de K. lactisr - un segment d'ADN incorporant le gène hétérologue ainsi que les séquences assurant l'expression dudit gène dans ladite levure. L'utilisation d'un tel vecteur de clonage et d'expression est particulièrement intéressante, tout d'abord parce qu'il existe peu de vecteurs utilisables dans les levures. En outre, le plasmide k1 présente plusieurs sites de restriction uniques, en particulier EcoRI, BamHI et ClaI, ce qui est particulièrement intéressant pour la construction d'hybrides recombinés. Enfin, on sait que les plasmides kl sont présents à un nombre élevé de copies par cellule, ce nombre de copies pouvant atteindre 100 à 150. Dans ces conditions, on peut espérer une amplification du gène qui sera inséré dans le vecteur. De préférence, le gène à clone et à exprimer est inséré dans l'un des sites de restriction uniques, notamment dans le site ClaI. Parmi les gènes qui peuvent être clonés et exprimés il faut citer notamment le gène URA3 de la levure, en particulier sous forme d'un segment d'ADN d'environ 1,1 kb limité par deux sites HindIII. Des expériences ont démontré que l'intégralité du plasmide kl n'était pas indispensable pour le clonage et l'expression. Ainsi, on a pu utiliser à titre de vecteur le plasmide k1 o qui provient d'un mutant de K. lactis NK2"non-killer"et qui est résistant à la toxine sécrétée. Ce plasmide k1# présente, par rapport au plasmide kl, une délétion de 2,9 kb entre les deux sites HindIII. La présente invention concerne également les levures transformées incorporant un vecteur selon la présente invention et en particulier, bien que non uniquement, les souches du genre Kluyveromyces et notamment K. lactis. Bien entendu, l'invention concerne l'application des levures transformées à l'expression de la protéine codée par le gène hétérologue porté par le vecteur. A titre d'exemple, on décrira ci-après le clonage et l'expression du gène URA3 de S. cerevisiae. I - Construction des plasmides hybrides k1-URA3 Les plasmides k1 et k1# ont déjà été décrits dans les articles mentionnés précédemment. Sur la figure 1 annexée, on a représenté la carte de restriction des plasmides kl et k1#. Comme on peut le constater, le plasmide kl porte trois sites de restriction uniques EcoRI, BamHI et ClaI alors qu'il porte un site de restriction double HindIII. Par contre, le plasmide k1#, qui porte une délétion de 2,9 kb, ne comporte qu'un seul site de restriction unique ClaI mais a conserve les deux sites de restriction HindIII. Ceci explique pourquoi, lorsque l'on voudra cloner un gène sur le site ClaI, on pourra effectuer une restriction totale alors que, lorsque l'on voudra effectuer une restriction par HindIII, il conviendra de n'effectuer qu'une restriction partielle. Afin d'éviter d'inactiver une région nécessaire à la réplication, le marqueur URA3 a été introduit dans différents sites de kl et de k.#. Premier mode de clonage : par HindIII On effectue une restriction partielle des plasmides kl et k1# par HindIII. Le gène URA3 est obtenu par restriction totale par HindIII du plasmide clone 6 (décrit par Bach et coll., 1979, PNAS, 76, 386-390). On obtient ainsi le gène URA3 entier porte par un fragment d'ADN de 1,1 kb. Ce fragment est traité par la phosphatase alcaline afin d'empêcher la recircularisation de ce dernier plasmide. Les ligations suivantes sont effectuées 1) k1 coupé par HindIII + clone 6 coupé par HindlII, 2) K16 coupé par HindIII + clone 6 coupé par HindIII. Deuxième mode de clonage : par ClaI Le site ClaI étant unique sur les deux plasmides utilisés, k1# et clone 6, on peut effectuer la restriction totale des deux plasmides. La ligation suivante est effectuée : 1) k1# coupé par ClaI + clone 6 coupé par ClaI. L'ensemble de ces mélanges de ligation contiennent une certaine proportion de plasmides hybrides. Afin de pouvoir mettre en évidence le clonage et l'expression du gène URA3, il convient de disposer d'une souche mutante de K. lactis uraA . En outre, afin d'assurer le maintien du vecteur selon l'invention, il est intéressant que cette souche réceptrice possède également le plasmidek2. Il - Construction d'une souche mutante de K. lactis uraA- sans k1 On est parti de la souche de K. lactis CBS 2360-6 uraA dépourvue d'activité OMP décase et qui a été obtenue par une mutagénèse aux W à partir de la souche CBS 2360. Le taux de réversion de la mutation est inférieur à l.10 8cellules. Cette souche est "killer" et résistante à la toxine. Elle possède les deux plasmides k1 et k2, elle est notée (k1+, k2+). De cette souche on a éliminé le plasmide kî par un croisement avec la souche VM2"non-killer"qui a été isolée par mutagénèse et qui présente le caractère k10, k2+. Le croisement suivant 2360-6 a ura X VM2 a lys (kl+, k2+) (kl , k2+) conduit a environ 1 % de cellules diploïdes ayant perdu kl par ségrégation mitotique et qui sont devenues "non-diller". On obtient,après sporulation de ces souches diploides, une souche haplolde"non-killer"ura dont on peut vérifier par extraction de l'ADN qu'elle a perdu kl et possède toujours k2. On a ainsi obtenu une souche uraA- "non-diller" (k10, k2+) qui sera utilisée pour mettre en évidence l'expression du gène cloné sur le vecteur selon la présente invention. III - Transformation de K. lactis La souche réceptrice construite précédemment est cultivée sur un milieu minimum (YNB 0,67 %, glucose 2 t) supplémenté en uracile, ujusqu'à une concentration de 1 à 2.108 cellules/ml. Après deux lavages, les cellules sont remises en suspension à la concentration de 109 cellules/ml dans un tampon de formation des protoplastes (KCl 0,6 M, pH 5). On ajoute de la zymolyase 5 000 (0,5 mg/ml) et on obtient les protoplastes en 5 a 10 minutes à 340C. Après deux lavages, on met en présence 2.108 cellules et 1 à 10 pg d'ADN des mélanges de ligation. On ajoute 2 ml de PEG 40 %, CaCl2 10 mM et on laisse à la température ambiante pendant 20 minutes. Après élimination du PEG on met en incubation 1 heure en milieu complet tamponné osmotiquement ; les protoplastes sont inclus dans de la gélose en surfusion et étalés sur un milieu minimum KCl. Les colonies apparaissent après une semaine d'incubation à 300C, elles sont de petites tailles et beaucoup ne poussent pas après repiquage sur milieu minimum. L'efficacité de transformation est de transformant par pg d'ADN et le taux de régénération des protoplastes est de 10 % environ. Les résultats observés sont les suivants TABLEAU I Nombre de colonies Stabilité AND transformant par g ADN poussant Nom des "Killer"résistant en milieu après repiquage transformants sélectif (%) k1# et clone 6 3 L1 "non-killer"sensible 0,13 par ClaI L2 " " 35 L3 " " 28 k1 et clone 6 4 L4 " " 35 par HindIII L5 " " 61 L6 " " 1,5 L7 " " 0,5 k1# et clone 6 1 L8 " " 50 par HindIII Tous les transformants figurant au tableau I sont UpA+ puisqu'ils poussent sur un milieu minimum sans uracile. Ceci démontre que le gêne URA3 de S. cerevisiae complémente la mutation uraA déficiente en OMP décarboxylase de K. lactis. Les transformants ainsi obtenus ont une stabilité variable - cultivés en milieu minimum sans uracile, ils ségrègent entre 40 et 99 % d'ura en 15 générations - cultivés pendant le même nombre de générations sur milieu minimum + uracile, ils ségrègent entre 94 et 99 % d'ure Il est toutefois possible de stabiliser le caractère URA+ par des repiquages successifs sur milieu minimum. La présence de plasmides portant kl et un ADN étranger, soit pBR322, soit URA3, a été confirmée par des résultats d'hybridation sur gel ou in situ. L'emploi de trois sondes radioactives, k1, pBR325 et URA3, a permis de montrer que: L4 porte un plasmide libre de 4,4 kb risible sur gel contenant une partie de kl et le gène URA3 ; L3 porte un plasmide libre de 9 kb contenant une partie de k1# et une partie de l'ADN de pBR322. Les modes opératoires ci-après sont destinés à illustrer la préparation détaillée de vecteurs selon l'invention sans pour autant la limiter. Les souches Les souches de levures K. lactis utilisées sont - la souche CBS 2360 a (k1+ k2+) sauvage et le mutant CBS 2360 a uraA obtenu par induction aux UV, dépourvu d'activité OMP décase ; - la souche VM2 a lys (k10, k2+) dérivée de la souche CBS 2359. La souche de Escherichia coli HB 101 ApR Tet5R contenant le plasmide clone 6 portant le fragment URA3 de S. cerevisiae de -1,1 kb. Les milieux Les levures sont cultivées en milieu minimum (glucose 2 %, "yeast nitrogen base"Difco dépourvu d'acides aminés 0,67 %, Agar Difco 2 %). Ce milieu peut entre supplémente en uracile (50 mg/D ou lysine (40 mg/l). Le milieu YPG contient du glucose 2 %, extrait de levure 1 %, bacto peptone 1 t. Le milieu de croisement et de sporulation est le milieu ME composé extrait de malt : 5 % et Agar Difco 2 t. Le test killer"se fait sur le milieu GAL : galactose 2 %, bacto peptone 1 %, extrait de levurel %, KH2PO4 0,05 M, Agar 2 %. Extraction de plasmides L'extraction du plasmide bactérien clone 6 se fait d'après Guerry et colt. 1973 (J. Bact. 116, 1064-1066). L'extraction et la purification des plasmides de K. lactis ont été mises au point par M. Wesolowski, P. Dumazert et H. Fukuhara, 1982, Current Genetics (sous presse). Les cellules d'une culture de 200 ml d'YPG en fin de phase exponentielle sont lavées une fois à l'eau, pesées et suspendues dans du sorbitol 1 M (2 ml/g cellules) avec de la zymolyase 60 000 (0,5 mg/g cellules). Après 45 minutes d'incubation a 300C, les cellules sont centrifugées et suspendues dans une solution deNaCl 0,15M,EDTA 0,10 M (2 ml/g cellules). On ajoute 0,5 mg/g cellules de pronase et du SDS l % final. Après 1 heure d'incubation à 370C et 1 heure a 500C, on refroidit le tout et on ajoute de l'acétate de potassium 0,5 M final. On laisse au froid pendant 1/2 heure au moins. Après centrifugation, le surnageant est traité à la RNase pendant 1/2 heure a 370C. Une extraction au Sevag (chloroforme : isoamyl alcool, 24:1, vol/vol) est suivie d'une précipitation a l'éthanol (1,2 vol). Les fibres d'ADN collectées a la pipette Pasteur sont dissoutes dans du TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). On reprécipite les fibres d'ADN avec 0,56 volume d'isopropanol redistillé et on les redissout dans du TE. Cette solution additionnée d'un colorant (bleu de bromophénol) est déposée sur un gel d'agarose a 0,6 %. Après 18 heures de migration a 60 V, on excise les bandes révélées au bromure d'éthidium correspondant a chaque plasmide. On les électro-élue pendant une nuit a 100 mA. L'ADN est passé ensuite sur colonne DEAEcellulose, lavé avec NaCl 0,3 M et élué avec NaCl 2 M. L'ADN est ensuite centrifugé en gradient de CsCl, dialysé et précipité à l'éthanol. Restrictions, ligations Les ADN sont restreints par les enzymes de restriction pendant 1 heure à 370C dans le tampon correspondant à chaque enzyme. Les restrictions partielles sont réalisées avec une quantité limitante d'enzyme, pendant 5 à 10 minutes à 370C. La déphosphorylation est réalisée à 600C pendant 1/2 heure avec la phosphatase bactérienne alcaline. La ligation se fait après- purification de 1'ADN au phénol et précipitation à llalcool, en présence de la ligase de T4 pendant. une nuit à 10 C. La transformation de K. lactis Nous nous sommes inspirés des travaux de Hinnen et coll. (1978) PNAS, 75, 1929-1933 et Gerbaud, Fournier, Blanc, Aigle, Heslot, Guérineau (1979) Gene 5, 233-253. Les cellules cultivées en milieu minimum + uracile jusqu'en phase exponentielle (1-2.1O8/ml)sont lavées une fois à l'eau distillée et une fois avec le tampon de protoplastisation (KCl 0,6 M pH 53. Les cellules sont resuspendues à 109 cellules/ml dans ce tampon avec 0,5 mg/ml de zymolyase 5000 et incubées un temps bref (5 à 10 minutes) à 34 Oc. On obtient plus de 90 % de protoplastes. On lave deux fois les protoplastes avec un tampon Tris HCl,pH 7,5, KCl 0,6 M,CaC12 10 mM en centrifugeant à 1800 g, 5 minutes et en resuspendant les cellules délicatement ; elles sont concentrées à 109 cellules/ml dans ce dernier tampon. On ajoute 1 à 10 g de mélange de ligation à 0,2 ml de cellules (2.108 cellules) et on mélange bien. Après 15 minutes d'incubation à la température ambiante, on ajoute 2 ml de PEG 4000 à 30 % (en poids/volume) et on laisse 15 minutes à température ambiante. Après centrifugation à 1800 g, 6 minutes, on resuspend dans 2 ml de KCi 0,6 M, glucose 6 g/l, Bacto peptone 6 g/l, extrait de levure 4 g/l, et on agite doucement à 300C pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite centrifugées et resuspendues dans 0,2 ml de tampon de protoplastisation. On ajoute 5 ml de gélose en surfusion à 460C (KC1 0,6 M, glucose 2 %, YNB "sans aminoacides Difco 0,67 %, Agar Difco qualité "purified" 30 g/l). Le tout est coulé sur une boite préchauffée à 550C contenant un milieu de même composition que la gélose ci-dessus mais avec un Agar Difco normal. L'hybridation 1) Préparation des filtres d'hybridation sur colonie (in situ), (Grünstein M. et Hogness D.S. (1975) PNAS 72, 3961-3965). Les colonies poussant sur W sont répliquées sur un filtre Schleicher et Schüll BA 85 posé sur une boîte de W et mises à incuber à 300C pendant 2 jours. La protoplastisation se fait en 1/2 heure à 300C avec de la zymolyase 60 000 (1 mg/ml), en KC1 0,6 M. Après séchage sur papier Whatman, les filtres sont transférés successivement sur papier Whatman imbibé de : - NaOH 0,5 N (5 minutes) - Tris HCl pH 7,5 1 M (2 x 2 minutes) - NaCl 1,5 M, Tris HC1 0,5 M pH 7,5 (2 x 5 minutes). Les filtres sont séchés sous vide a 8o0C pendant 3 heures. 2) L'hybridation sur gel est réalisée suivant Southern E.M. (1975) J. mol. Biol. 98, 503-517. 3) Les filtres sont traités à 650C dans différents bains la préhybridation se fait pendant 30 minutes dans du 3 x SSC (20 x SSC = 3 M NaCI 0,3 M Na citrate) puis pendant 3 heures dans le tampon 3 x SSC, 10 x Denhardt (Denhardt = Ficoll 400 0,2 %, serum albumine bovine 0,2 %, polyvinylpyrrolidone 0,2 %), enfin, pendant 2 heures dans le meme tampon additionné de 50 pg/ml d'ADN compétiteur, 0,1 % SDS, 0,1 M NaH2PO4 pH 5,6, 10 % dextrane sulfate. . Pour l'hybridation des filtres avec la sonde radioactive marquée au 32P par nich-translation, on ajoute la sonde dénaturée au dernier bain de préhybridation et on laisse incuber une nuit a 65*C La nick-translation est décrite par Cameron et coll. 1979, Cell, 16, 739-751 ainsi que par les données du Centre de Radiochimie d'Amersham. Les 6 premiers lavages des filtres se font dans du 3 x SSC,10 x Denhardt, 0,1 % SDS (avec 50 pg/ml d'ADN compétiteur lors du premier lavage seulement) puis les deux derniers lavages dans du 1 x SSC. Les filtres sont séchés et révélés par des films Kodak. REVENDICATIONS -1) Vecteur de clonage et d'expression d'un gène hétérologue dans une levure, caractérisé en ce qu'il comporte au moins - tout ou partie de 1'ADN du plasmide k1 de Kluyveromyces lactis, - un segment d'ADN incorporant le gène hétérologue ainsi que les séquences assurant l'expression dudit gène dans ladite levure. 2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le segment d'ADN du gène hétérologue est le segment d'ADN du gène URA3 de Saccharomyces cerevisiae. 3) Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que le segment d'ADN du gène URA3 est un segment d'ADN d'environ 1,1 kb limité par deux sites de restriction HindIII. 4) Vecteur selon l'une des revendications 1 a 3, caractérisé en ce que le segment d'ADN du gène hétérologue est inséré dans l'un des sites uniques du plasmide kl, EcoRI, BmmI ou ClaI. 5) Vecteur selon l'une des revendications 1 a 3, caractérisé en ce que le segment d'ADN du gène hétérologue est inséré dans l'un des sites HindIII du plasmide kl. 6) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il ne comporte qu'une partie de 1'ADN du plasmide kl correspondant à 1'ADN du plasmide k1# 7) Levure transformée incorporant un vecteur selon l'une des revendications 1 a 6. 8) Levure selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche Kluyveromyces. 9) Levure selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Kluyveromyces lactis. 10) Application d'une levure selon l'une des revendications 7 à 9 à la préparation d'une protéine codée par le gène hétérologue porté par le vecteur.