Brevet FR2527444A1 — publié le 19831202

COMPOSITION THERAPEUTIQUE CONTENANT UNE ENDOTOXINE RAFFINEE DEBARRASSEE DE SA TOXICITE L'invention concerne une composition pharmaceutique contenant trois composants Le premier composant est une endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité (RDE) caractérisée en ce qu'elle ne possède pas de 2-céto3-désoxyoctanoate détectable et qu'elle possède entre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2 000 nmoles/ mg d'acides gras Le second composant est le dimycolate de tréhalose (TDM) Le troisième composant de la composition est un sous-produit pré- cipité par l'acétone de glycolipides endotoxiques extraits au chloroforme- méthanol (ACP) La composition précédente est une composition anti-tumeur extrêmement puissante utile dans le traitement des tumeurs cancéreures des animaux et des êtres humains. Des extraits endotoxiques obtenus à partir des Entérobactériacées comprenant des organismes apparentés et des mutants sont connus Ces ex- traits ont été utilisés en immunothérapie de diverses tumeurs immunogéniques (voir, Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al, Cancer Immunol Immunother. Vol 7, pages 43-58 ( 1979) indiqué ici à titre de référence) Cependant, les extraits d'endotoxines sont connus pour être extrêmement toxiques et de ce fa d'une utilisation limitée dans le traitement des tumeurs cancéreuses Des efforts ont été faits pour "débarrasser de leur toxicité" les endotoxines tout en retenant leur pouvoir de régression des tumeurs Comme indiqué dans Ribi et al, les méthodes chimiques connues pour débarrasser les endotoxines de leur toxicité tout en retenant leur pouvoir de servir comme adjuvant, telles que la succinylation et la phtalylation ont eu comme résultat la perte à la fois de l'endotoxicité et de leur pouvoir de ré- gression des tumeurs De ce fait, les tentatives de l'art antérieur pour obtenir un produit d'endotoxine ayant un haut pouvoir de régression des tumeurs et peu ou pas de toxicité n'ont jusqu'à maintenant pas connues de succès. Le sous-produit précipité à l'acétone des glycolipides endotoxiques extraits au chloroforme-méthanol (ACP) ne possède pas de propriétés de régression des tumeurs lorsqu'il est utilisé seul ou en combinaison avec le dimycolate de tréhalose Pour une discussion plus complète de l'ACP, de ses propriétés et des modes de fabrication, on fait référence à la pu- blication mentionnée ci-dessus de Ribi et al. C'est donc un objet de la présente que de procurer une composition pharmaceutique contenant un produit d'endotoxine débarrasséede sa toxicité en combinaison avec l'ACP et le TDM qui possède un pouvoir de régression des tumeurs important sans effets secondaires toxiques normalement asso- ciés aux produits d'endotoxines. C'est un autre objet de l'invention que de procurer des méthodes de traitement des animaux et des êtres humains avec la composition ci- dessus mentionnée pour obtenir une régression ou une rémission de la crois- sance des tumeurs. La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un RDE ne contenant pas de 2 céto-3-désoxyoctanoate détectable, contenant entre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1.700 et 2 000 nmoles/mg d'acides gras en combinaison avec du TDM et de l'ACP La composition est efficace dans le traitement des tumeurs cancé-. reuses des animaux et des êtres humains. Des extraits d'endotoxines du type utilisé comme matière première pour produire une endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité telle que décrite ci-dessus peut être obtenue à partir d'entérobactériacées quelconques comprenant des organismes apparentés et des mutants A titre d'exemple, les genres suivants illustrent le type de micro-organismes que l'on peut utiliser: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella et Serratia. Les espèces suivantes sont typiquement employées: S.minnesota, S typhimurium, B pertussis, B abortus, S enteritidis, E.coli, S typhi, S marcescens, S typhosa, Shigella flexni et S abortus equi. Les extraits endotoxiques utilisés comme matière première peuvent être préparés par l'une quelconque des nombreuses méthodes connues {voir, par exemple Webster, M E, Sagin, J F, Landy, M, and Johnson, A G, J Immunol 1955, 744, 55; Westphal, O, Luderitz, O, and Bister, F, Z Naturforsch, 76 148 ( 1952); Westphal, O, Pyrogens, in Polysaccharides in Biology, Tr Second Macy Conference (George F Springer, ed); Madison, N.J Madison Printing Co, 1957, 115; Galanos, C, Luderitz, O, Westphal, 0., Eur J Biochem 9, 245 ( 1969); Chen, C;H, Johnson, A G, Kasai, N, Key, B A, Levin, J, Nowotny, A, J Infect Dis 128 543 ( 1973); Ribi, E, Haskins, W T, Landy, M, Milner, K C, The Journal of Experimental Medicine 114 647 ( 1961); Leive, L, Biochem Biophys Res Comm 21 290 ( 1965); and Ribi, E, Milner, K D, and Perrine, T, J Immonul 82 75 ( 1959)}". La méthode préféree pour obtenir l'extrait endotoxique est celle décrite par Chen et al, à savoir la précipitation au méthanol-chloroforme. Le précipité au méthanol-chloroforme (MCP) est mis en réaction avec un acide organique ou minéral et ensuite lyophilisé pour donner un lipide A brut hydrolysé ayant une toxicité et une pyrogénicité réduites par com- paraison avec celles du matériau d'endotoxine de départ Ce produit est alors traité avec un solvant qui dissout les acides gras et les autres impuretés sans dissoudre la masse de lipide A brut La teneur en phosphate du lipide A raffiné débarrasse de sa toxicité est d'environ la moitié de celle que l'on observe pour l'endotoxine toxique, ce qui suggère que la teneur en phosphate est liée aux effets toxiques des endotoxines. Les acides minéraux que l'on préfère utiliser pour réagir avec le MCP sont l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique et les acides organiques que l'on préfère sont l'acide toluène-sulfonique ou l'acide trichloroacetique La réaction peut être convenablement con- duite à une température entre environ 90 et 130 C pendant un temps suffi- sant pour achever l'hydrolyse, habituellement entre environ 15 et 60 mi- nutes. La préparation d'une endotoxine brute débarrassée de sa toxicité peut aussi être accomplie en faisant réagir le matériau de départ avec l'acide en présence d'un solvant organique tel que le chloroforme, le méthanol et l'éthanol ou des combinaisons de ceux-ci. Le lipide A brut qui en résulte est dissous dans un solvant qui peut dissoudre les acides gras sans dissoudre le lipide A brut L'acetone convient particulièrement à cette fin Le solvant est alors éliminé pour produire l'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité L'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité est alors dissoute dans un solvant et passée dans une colonne chromatographique convenable telle qu'une colonne chromatographique d'exclusion moléculaire pour séparer les fractions de RDE qui sont alors rassemblées après élimination du solvant Dans un mode de réalisation, la solution d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité est passée sur une colonne Séphadex en présence d'un solvant tel que le chloroforme, le méthanol, l'acétone, la pyridine, l'éther ou l'acide acé- tique ou des combinaisons de ceux-ci La pression dans la colonne peut varier mais elle se situe typiquement dans la gamme d'entre environ la pression atmosphérique et 100 lbs/inch 2 ( 6,86 bars) et le débit est com Dris entre environ 0,1 et 10 ml/minute. Dans un autre mode de réalisation, la solution d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité est passée sur une colonne de cellule-DEAE dans les mêmes conditions de pression que mentionnées ci-dessus pour la colonne Séphadex Le débit peut être maintenu entre environ 2 et 15 ml/mi- nute Les solvants utilisés sont aussi les mêmes que ceux utilisés pour la colonne Séphadex bien que l'on puisse ajouter de l'eau ou de la diéthylamine à tous les mélanges à une concentration allant jusqu'à envi- ron 1 %. D'autres méthodes de préparation de RDE à partir d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité consistent à faire passer la solution à travers une colonne 60 de gel de silice à basse pression, ayant une taille de particules entre environ 15 et 63 microns et à utiliser un solvant constitué de chloroforme, méthanol, eau et hydroxyde d'ammonium dans un rapport volumique préféré d'environ 50/25/4/2. Le second composant de la présente composition, le dimycolate de tréhalose (TDM) peut être obtenu à partir des organismes suivants tels que par exemple: M avium, M phlei, M tuberculosis (souche H 37 RV et Ayoma B), M bovis BCG, M smegmatis, M kansasii, Nocardia rubra, et Corynebacterium diphtheria. Des bactéries telles que M avium sont cultivées, récoltées et ensuite tuées à la chaleur La masse de cellule est alors extraite avec plusieurs solvants et ensuite on extrait une fraction active soluble dans les solvants Cet extrait est en outre purifié par une série d'extractions au solvant pour donner le TDM brut (voir, Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls I Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P 3; Azuma, et al, Journal of the National Cancer Institute, Volume 52, pages 95-101, ( 1974) cité ici à titre de référence) . Comme décrit dans Azuma et al, le TDM brut peut encore être purifié par chromatographie sur gel de silice microparticulaire centrifuge pour donner le TDM purifié. Le troisième composant de la composition est un sous-produit -27444 précipité à l'acétone de glycolipides endotoxiques extraits avec un mé- lange chloroforme-méthanol (ACP) Comme exposé auparavant, la publication de Ribi et al décrit plus particulièrement sa composition et ses méthodes de préparation et elle est indiquée ici à titre de référence L'ACP peut être préparé à partir de n'importe laquelle des entérobactériacées indi- quées ci-dessus sous la description de RDE. Le RDE, le TDM et l'ACP sont combinés pour former une composition ayant une puissante activité anti-tumorale Les cancers que l'on peut trai- ter avec la composition RDE-ACP-TDM comprennent les tumeurs animales telles que les carcinomes des cellules squameuses bovines, les fibro- sarcomesdes bovins, les sarcoides équins, les mélanomes équins, les car- cinomes des cellules équines squameuses, les tumeurs mammaires canines, les adénomes et les mélanomes canins et les tumeurs humaines telles que les tumeurs du sein, les tumeurs des poumons, les tumeurs coléo-rectales, mélanomes malins, les carcinomes des cellules squameuses et les tumeurs ovariennes. La composition est administrée par injection dans un milieu phar- maceutiquement acceptable tel qu'une émulsion* de gouttelettes d'huile directement dans la tumeur dans des conditions plus particulièrement dé- crites ci-dessous. La quantité de RDE dans une injection unique pour le traitement des animaux est comprise entre environ 6,25 et 250 microgrammes/ml La quantité d'ACP se situe entre environ 375 et 750 microgrammes/ml et la quantité de TDM est comprise entre environ 125 et 250 microgrammes/ml. Le nombre de millilitres de produit biologique injecté dans la tumeur est déterminé par la taille de la tumeur en accord avec le tableau sui- vant: Dosage pour les animaux en fonction de la taille de la tumeur Diamètre de la tumeur (cm) Quantité de produit biologique à injecter 0 1 cm jusqu'à 0,5 ml 1 2 cm 0,5 à 2,5 ml 2 3 cm 2,5 à 5 ml 3 5 cm 5 à 10 ml 8 cm 10 à 15 ml supérieur à 8 cm 15 à 20 ml * la composition peut être stabilisée par exemple par une méthode de lyophilisation et ensuite reconstituée sans perte de puissance. La dose maximum par injection est d'environ 4 500 microgrammes pour le RDE, environ 4 500 microgrammes pour V'ACP et environ 1 500 micro- grammes pour le TOM Le cours du traitement comprend jusqu'à cinq injec- tions administrées à une semaine d'intervalle. La combinaison RDE-ACP-IDM dans un milieu injectable convenable tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile peut être administrée direc- tement dans les tumeurs humaines La quantité de RDE et de ACP respective- ment dans une seule injection est comprise entre 50 et 1 000 microgrammes. La quantité de TOM qui peut être administréedans une seule injection est comprise entre environ 50 et 300 microgrammes Le niveau de dosage simple préféré pour le RDE et le TOM est compris entre environ 125 et microgrammes tandis que le niveau de dosage simple préféré pour V'ACP se situe entre environ 275 et 325 microgrammes chacun sur la base d'un patient adulte typique de 70 kg Les injections sont administrées environ 1 fois par semaine pour aller jusqu'à un total de 15 injections Généra- lement il est recommandé d'administrer la composition contenant entre environ 50 et 500 microgrammes/ml de RDE, entre environ 50 et 500 micro- grammes/ml d'ACP et entre environ 50 et 150 microgrammes/ml de TOM par injection. Comme décrit ci-dessus, la composition pour le traitement des animaux à sang chaud et des êtres humains peut être utilisée sous la forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile La quantité d'huile utilisée se situe dans la gamme de entre environ 0,5 et 3,0 % en volume basé sur le volume total de la composition On préfère utiliser entre environ 0,75 et 1,5 % en volume de l'huile Des exemples de ces huiles comprennent l'huile minérale légère, le squalane, le 7-n-hexyloctadecane, l'huile supérieure Conoco et l'huile minérale Drakeol 6 VR (produites par la Pennreco Company, Butler, Pennsylvania). Le mélange contenant l'huile homogénéisée est alors combiné avec un détergent qui peut être éventuellement dissous dans une solution sa- line préalablement au mélange La quantité de détergent se situe typique- ment entre environ 0,02 et 0,20 % en volume et de préférence entre environ 0,10 et 0,20 % en volume basé sur le volume total de la composition Tout matériau détergent classique peut être utilisé, y compris le Tween-80 et le Arlacel (produits par la Atlas Chemical Company). Le mélange résultant de l'addition d'un détergent est alors homogé- néisé pour former une suspension qui possède un pourcentage élevé de gouttelettes d'huile revêtues de RDE et de CWS tel que le détermine l'ob- servation sous un microscope. Les exemples suivants sont donnés uniquement à des fins d'illustra- tion et n'entendent pas en limiter la portée ou redéfinir en quelque sorte l'invention telle que revendiquée dans les revendications jointes. EXEMPLE 1 Préparation d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité Un échantillon de 650 mg d'un précipité au méthanol-chloroforme préparé en accord avec la façon de procéder de Chen et AI, J Infect Dis. 128 543 ( 1973) est mis en suspension dans 150 ml d'H Cl O,1 N, dans un ballon à fond rond à trois tubulures équipé d'un condenseur et immergé dans un dispositif d'agitation sonique Après agitation sonique, l'appa- reillage en verre est alors abaissé dans un bain d'huile maintenu à C ce qui amène la température intérieure du ballon à approcher ou à dépasser le point d'ébullition de la solution Une surchauffe de la solu- tion est diminuée en équipant le ballon d'un tube capillaire raccordé à une source d'azote gazeux à travers l'une des tubulures Un débit conti- nu-d'azote est maintenu pendant tout le processus d'hydrolyse. On poursuit l'hydrolyse pendant 30 minutes, ce après quoi la solu- tion est refroidie dans un bain de glace, traitée par agitation sonique pour disperser la matière solide et distribuée dans des tubes de corex. Le ballon est lavé avec de l'eau distillée pour enlever toute la matière solide adhérant aux parois du ballon et le produit du lavage est ajouté à la suspension dans les tubes de corex La centrifugation est mise en oeuvre à 12 000 tr/mn pendant 80 minutes Ce qui surnage est décanté et jeté Le résidu solide est remis en suspension dans l'eau distillée, traité par agitation sonique jusqu'à ce que la suspension soit bien dis- persée et recentrifugé Le processus de centrifugation est alors répété. Le résidu est repris dans l'eau distillée, congelé en écaille et lyophi- lisé, ce qui donne 382 mg de lipide A brut 150 mg de cette matière sont traités avec de l'acétone froide ( 00 C) pour éliminer les acides gras, traités par agitation sonique et traités sur un appareillage de filtration par gravité Whatman N O 1 à 50 C 100 mg d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité subsiste après séchage. EXEMPLE 2 Préparation d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité Un échantillon de 120 mg de MCP (précipité au méthanol-chloroforme) est mis en suspension dans 12 ml de méthanol absolu, traité par agitation sonique pour disperser les matières solides et distribué dans six fioles ( 1 x 10 cm) à bouchon vissé On ajoute 2 ml d'H Cl 0,2 N dans chaque tube et la suspension qui en résulte est portée au bain d'eau bouillante pendant minutes Après hydrolyse, les tubes sont refroidis dans un bain d'eau glacée et centrifugés pendant environ 10 minutes à 2 500 tr/mn Ce qui surnage est décanté et l'on ajoute 5 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 2/1 au résidu pour en effectuer la dissolution On ajoute 2 mi d'eau par tube et on mélange la solution La solution biphasique est recentrifugée à 2 500 tr/iiin pendant 10 minutes La phase aqueuse supérieure est jetée et l'on ajoute 1 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 à chaque tube, ce qui donne une solution claire Les solutions sont rassemblées et le solvant est évaporé sur un évaporateur rotatif Le résidu est séché sous vide poussé et lyophilisé, ce qui donne 45 mg de lipide A brut 20 mg de ce matériau sont traités à l'acétone froide ( O C), soumis à une agitation sonique et filtrés sur un appareil de filtration par gravité Whatman N O 1 à 50 C 13 mg d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité subsistent après séchage. EXEMPLE 3 Préparation d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité 110 9 de LH-20-100 (taille de particules 25 à 100 microns: Pharmacia) sont combinés avec 600 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 2/1 que l'on laisse séjourner pendant 30 minutes La bouillie qui en résulte est intro- duite dans une colonne de chromatoghaphie en verre de 25 x 1 000 mm (BRL Laboratories) équipée de raccords sous pression Après achèvement du garnissage, la colonne est raccordée au moyen d'un tubage sous pression en téflon à une pompe ISCO modèle 132 On pompe 400 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 dans la colonne au débit de 3 ml/mn 100 mg d'en- dotoxine brute débarrassée de sa toxicité, préparée selon l'exemple 1, sont introduits dans la colonne dans 2,5 ml d'un mélange chloroforme/ méthanol 4/1 par une boucle d'échantillonnage Le débit est réduit à 1 ml par minute et après que l'on ait recueilli 150 ml d'éluant, l'effluent est raccordé à un collecteur de fraction On recueille des fractions de 4 ml et les fractions d'endotoxine raffinée débarrassée de leur toxi- cité sont déterminées par analyse chromatographique en couche mi nce des fractions {E Merck, épaisseur 0,25 mm, éluant: chloroforme/méthanol/H 20/NH 4 OH Les fractions d'endotoxine raffinée débarrassée de leur toxicité sont rassemblées et l'évaporation du solvant laisse 30 mg d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité sous la forme d'une poudre blanche. EXEMPLE 4 Préparation d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité 33 g de cellulose-DEAE (Whatman DE-32) sont mis en suspension dans ml d'acide acétique glacial et agités doucement pendant 10 minutes pour obtenir une poudre en bouillie Le mélange est laissé de côté pendant Z 5; 7444 la nuit. La bouillie est versée dans une colonne de 25 x 400 mm, on laisse décanter tout en égouttant et l'excès d'acide est ensuite évacué La colonne est lavée avec 2 000 ml de méthanol et ensuite avec 200 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 Un échantillon de 100 mg d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité produite selon l'exemple 1, est intro- duit dans la colonne dans 3 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 ou un mélange de chloroforme/méthanol et eau, 80/20/1 La colonne est éluée avec 350 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 et ensuite avec 300 ml d'un mélange méthanol/eau 99/1 En utilisant un appareillage à gradient linéaire, la colonne est éluée avec 2 000 ml d'un gradient liné- aire au début avec du méthanol à 100 %, puis ensuite avec de l'acide acétique 0,2 M dans le méthanol La colonne est éluée au débit de 6 ml/mn et l'on recueille des fractions de 15 ml Chaque fraction est successi- vement analysée pour en déterminer sa teneur en phosphore selon la méthode de Bartlett, G R, J Biol Chem 234, 466-471 ( 1959) Les frac- tions sont rassemblées et évaporées sur un évaporateur rotatif presque jusqu'à siccité et reprises dans 10 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 2/1 et 40 ml d'acide acétique 0,001 M dans un entonnoir de séparation La couche inférieure est séparée, filtrée sur papier filtre Whatman N O 2 et évaporée à siccité, ce qui donne 19,2 mg d'endotoxine raffinée débarras- sée de sa toxicité. EXEMPLE 5 A 8 cobayes souche-2 ayant des croissances de tumeur ligne-10 d'environ 9 mm, on injecte une fois dans le tissu de la tumeur 0,4 ml contenant 150 microgrammes de RDE et 150 microgrammes d'ACP et 50 micro- grammes de TDM. A la conclusion de la période d'administration, chacun des cobayes est examiné pour déterminer les effets de la thérapeutique d'injection sur la croissance de la tumeur Quatorze des quinze animaux expérimentaux manifestent une régression totale de la croissance de la tumeur. Des expériences de contrôle sont organisées sur deux groupes de six cobayes souche-2 ayant des croissances de tumeur ligne-10 de la même taille que celle décrite ci-dessus Au premier groupe de six cobayes, on injecte en une fois 0,4 ml contenant 50 microgrammes de RDE et 50 micro- grammes de TDM Au deuxième groupe de six cobayes, on injecte en une fois 0,4 ml contenant 50 microgrammes de RDE seul A la conclusion du test, chacun des cobayes est examiné pour déterminer les effets du contrôle sur 2527444 ' la croissance de la tumeur Chez aucun des douze cobayes, il n'y a évi- dence de régression ou de rémission des croissances des tumeurs. 2527 4 4 4 REVENDICATIONS 1 Composition comprenant une quantité thérapeutiquement effi- cace de: (a) endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité ne contenant pas de 2-céto-3-désoxyoctanoate détectable, contenant entre 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre 1 700 et 2 000 nmoles/mg d'acides gras; (b) un sous-produit précipité à l'acétone de glycolipides endo- toxiques extraits avec un mélange de chloroforme et de mé- thanol; (c) dimycolate de tréhalose; et (d) un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 2 Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la quantité thérapeutiquement efficace d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité atteint jusqu'à environ 4 500 microgrammes, la quantité thé- rapeutiquement efficace dudit sous-produit précipité à l'acétone va jusqu'à environ 4 500 microgrammes et la quantité thérapeutiquement efficace de dimycolate de tréhalose va jusqu'à environ 1 500 microgrammes. 3 Composition suivant la revendication 1 ou 2,caractérisée en ce que la composition est sous forme lyophilisée ou sous la forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile. 4 Nouveau médicament pour le traitement du cancer d'un ani- mal à sang chaud, caractérisé en ce qu'il contient la composition suivant une quelconque des revendications 1 à 3. Médicament suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ladite composition contient entre environ 6,25 et 250 microgrammes/ml d'en- dotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité, entre environ 375 et 750 micro- grammes/ml de dimycolate de tréhalose et est destinée à être administrée directement dans le tissu de la tumeur. 6 Médicament pour le traitement du cancer chez les êtres humains, caractérisé en ce qu'il contient la composition suivant une quelconque des revendications 1 à 3, ladite composition contenant entre environ 50 et 1.000 microgrammes de l'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité et dudit sous-produit précipité à l'acétone, et entre environ 50 et 300 micro- grammes de dimycolate de tréhalose et en ce que la quantité d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité et de dimycolate de tréhalose se situe de préférence entre environ 125 et 175 microgrammes et la quantité dudit sous-produit précipité à l'acétone se situe de préférence entre environ 275 et 325 microgrammes. 7 Médicament suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la dite composition contient entre environ 50 et 500 microgrammes/ml d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité, entre environ 50 et 500 microgrammes/ml dudit sous-produit précipité à l'acétone et entre environ 50 et 150 micro- grammes/ml de dimycolate de tréhalose, ladite composition étant destinée à être injectée directement dans le tissu de la tumeur.