Brevet FR2532950A1 — publié le 19840316

La présente invention concerne un nouvel anti- biotique acmimycine ainsi que ses sels d'addition d'acide. Nous avons trouvé qu'une souche d'Actinomycetes de référence AC 4559 isolée à partir d'échantillons de sol de champs prélevés àAkiyoshi-machi, Miya-gun, Yamaguchi-ken, Japon, produit une substance active contre les bactéries de Gram positif et de Gram négatif o Ladite substance a été isolée à partir d'un bouillon de culture, purifiée et définie comme une nouvelle substance antibiotique. Un objet de la présente invention est de fournir un nouvel antibiotique acmimycine qui soit actif contre les bactéries de Gram positif et de Gram négatif Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé de production du nouvel antibiotique acmimycine ainsi que de ses sels d'addition d'acide. L'antibiotique acmimyçine est obtenu à partir d'une culture d'un microorganisme appartenant au genre Streptomyces et on préfère plus particulièrement une souche du genre Streptomyces AC 4559. Les caractéristiques taxonomiques de la souche AC 4559 sont les suivantes: a) caractéristiques morphologiques: les observations sur milieu agar-amidon-sels minéraux (ISP medium 4) lInt J System Bacteriolo, 16, 313 340 ( 1966)l étuvé à 27 C pendant 10 à 14 jours sont les suivantes Approximativement, la même observation morphologique a été faite sur milieu agar-farine d'avoine (ISP medium 3) ainsi que sur le milieu agar de Benett. Le corps du mycelium est souple,présente une croissance ramifiée, possède un diamètre de 0,4 x 0,5 pm. Aucune division du mycelium ni sporulation Les mycelia aériens obtenus sur substrat sont flexibles et poussent avec une arborescence simple, possèdent un diamètre de 0,4 x 0,6 pm et forment de nombreuses chaînes de spores. -2- Les chaînes de spores sont en spirale et possèdent en moyenne 2 à 4 spires relâchées La surface des spores est lisse On observe quelques courtes formes ovales ou en bâtonnets, les dimensions varient de 0,4 à 0, 6 pm par 0,6 à 1,0 im. Aucune formation de spores flagellées ou de sporanges n'est observée - b) croissance sur différents milieux Les observations effectuées sur différents milieux cultivés à 270 C pendant 14 jours sont rassemblées dans le Tableau 1. TABLEAU 1 À P imn Milieu Croissance Corps des mycélia Mycélia aériens Pigment soluble Agar-nitrate-sucrose Faible à Faibles à médiocres:eau 1 Incolore a médiocre trouble ( 18 ge X 18 ig) aucun Agar-asparagine Faible à Blancivoire ( 2 ca) à Faibles eau claire glucose médiocre blanc-blé ( 2 ea)( 18 e) aucun Agar-asparagine Faible à Incolore à glycérine médiocre blancivoire ( 2 ca) aucuns aucun Agar-amidon-sels BonneBambou ( 2 fb)ien développés eau Bonne Bambou ( 2 fb) minéraux trouble ( 18 ig) Moyenne d Légèrement ambré Agar-tyrosine Moyenne à Légèdiocrementambré Faibles: blancs (a) aucun médiocre ( 3 ic) Agar farine Blanc-ivoire ( 2 ca) à Moyens: ( 18 ig-eau d'avoine moyenne légèrement blé ( 2 ea) trouble 18 ge) aucun Agar-extrait de malt Cannelle ( 3 le) à extrait de levure Bonne légèrement ambré Moyens: blancs (a) aucun Blanc-ivoire ( 2 ca)à Agar nutritif Médiocre Blanc-ivore ( 2 ca) Aucuns aucun blanc -blé ( 2 ea) Médiocrès Agar d'Emerson Bonne Mairs ( 2 hb) b cs:aucun blancs (à) Agar de Bennett Bonne Topaze ( 3 ne) Moyens: ( 18 ig-eau de Bennett Bonne Topaze 3 n)trouble 18 ge) aucun B t O M tu 1 C> -n 0 o 4 - Les indications de couleur se rapportent à la classification: "Color Harmony Manual, 4th Ed, 1958 (Container Corp of America)". c) caractéristiques physiologiques ( 1) température de croissance: 16 à 33 C, ( 2) liquéfaction de la gélatine: positive, ( 3) hydrolyse de l'amidon: positive, ( 4) coagulation du lait écrémé: négative peptonisation du lait écrémé: positive, ( 5) formation de pigments tels que la mélanine: négative sur milieu agar tyrosine et sur milieu peptone- extrait de levure-fer-agar. d) assimilation de sources carbonées (+: positif;: négatif) L-arabinose: D-mannitol: - D-fructose: raffinose: - D-glucose: + L-rhamnose: - sucrose: D-xylose: + inositol: - e) composition des parois cellulaires Le type-LL de l'acide diaminopimélique est détecté par la méthode Becker et al l Appl Microbiol, 12, 421 423 ( 1964) Compte tenu des caractéristiques taxonomiques mentionnées ci-dessus, la souche AC 4559 est identifiée comme appartenant au genre Streptomyces en raison du mycelium aérien présentant des chaînes de nombreuses spores,du type-LL de l'acide diaminopimélique et en raison du fait qu'on n'observe aucune formation de spores flagellées ou de sporanges. Par conséquent, la souche AC 4559 est définie comme la souche Streptomyces sp AC 4559, et a été déposée à l'Institut: Fermentation Institute, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, Japan, n de dépôt: FERM P-6645. -5 Les caractéristiques taxonomiques-du genre Streptomyces sont,en général, facilement sujettes à muta- tion; les mutants obtenus par mutation naturelle ou bien par mutation artificielle au moyen de procédés habituels tels que l'irradiation par ultra-violets ou par d'autres rayonnements,ou traitements par agents mutagéniques tels que le N-méthyl-N-nitrosoguanidine ou le méthylsulfonate-éthyle, sont également couverts par la présente invention. Le procédé de production de l'antibiotique acmimycine est le suivant. L'antibiotique acmimycine est obtenu à partir d'une culture sur milieu convenable d'une souche de Streptomyces. Le milieu conseillé est celui utilisé habituel- lement pour la culture du genre Streptomyces Dans le milieu, on introduit des sources de carbone assimilables, des sources en azote, ainsi que si nécessaire, des sels minéraux Les sources de carbone assimilables sont par exemple le glucose, le fructose, le galactose, le mannose, le glycérol,les mélasses, l'amidon, la dextrine ou un acide organique Les sources d'azote assimilables sont par exemple de l'azote organique tel que "pharma-média", peptone, extrait de viande, extrait de levure, poudre de levure, poudre de soja, macérat de céréales, extrait de graine de coton, caséine, hydrolysat de protéines de soja, acides aminés ou urée; il peut s'agir également d'azote minéral tel que des nitrates ou de l'ammonium A titre de source azotée, on peut introduiredans le milieu soit de l'azote minéral ou de l'azote organique, soit un mélange d'azote minéral et organique Si nécessaire, des sels minéraux tels que le sel de sodium, potassium, calcium, magnésium ou phosphate peuvent être ajoutés Enfin, des traceurs ou facteurs de croissance peuvent également être ajoutés. -6- La culture est effectuée,en généra J en agitant et aérant continuellement le milieu de culture Pour une production industrielle, une aération du milieu de culture dans la masse est conseillée Le p H du milieu est de pré- férence neutre ou légèrement acide La température de culture se situe de préférence entre 22 et 320 C Le temps de culture est habituellement de 2 à 5 jours, mais il peut être arrêté quand la production maximale d'antibiotiques est atteinte Ces paramètres: composition du milieu, p H, vitesse d'agitation, volume d'aérationdoivent être évidemment déterminés et contrôlés en fonction de la nature du genre et des exigences de la souche de micro- organismes utilisée Des agents anti-moussants tels que l'huile de silicone, l'huile végétale ou un agent tensio-actif peuvent être ajoutés si nécessaire. L'antibiotique produit accumulé s'incorpore en grande partie dans le milieu de culture et doit être isolé préférentiellement à partir du filtrat de culture qui est obtenu par filtration du bouillon de culture à l'aide de Célite, parlite,Hyfro-supercel (noms commerciaux de terre de diatomées),ou par centrifugation. L'isolation dudit antibiotique peut être réa- lisée en utilisant le procédé d'isolation des antibiotiques aminoglycosides à partir des filtrats de culture Par exemple, la chromatographie au moyen de résines échangeuses d'ions ou d'autres supports peut être utilisée Les para- mètres préférés sont déterminés en fonction du filtrat de culture à p H 7 et soumis à une chromatographie utilisant une résine échangeuse d'ions faiblement acide telle que l'Amberlite IRC-50 ou CG-50 (nom commercial), on préfé- rera le type ammonium de celle-ci, une cellulose échangeuse d'ions telle que CM-cellulose, ou bien un gel de Séphadex échangeur d'ions tel que CM-Séphadex (nom commercial). -7- L'antibiotique adsorbé est ensuite élué au moyen d'un éluant faiblement basique tel que l'ammoniaque aqueuse diluée, si nécessaire, en concentrations variables. Les fractions éluées obtenues contenant la même substance sont réunies, concentrées, lyophilisées afin d'obtenir l'antibiotique acmymicine. Une purification ultime peut être conduite, en répétant les processus chromatographiquesci-dessus indiqués. L'antibiotique acmymicine est un antibiotique basique; on peut donc préparer ces sels d'addition d'acide. Un exemple de sel est un sel non toxique acceptable pharma- cologiquement, par exemple un sel minéral tel que l'hydro- chlorate, sulfate ou phosphate ou un sel organique tel que acétate, propionate, malate, succinate, tartrate, citrate L-glutamate ou L-aspartate. Les caractéristiques physico-chimiques et les caractéristiques biologiques sqnt les suivantes. Caractères physico-chimiques ( 1) Analyse élémentaire (C 15 H 26 N 27 O H 2) C 15 H 26 2 7 '2 H 2) C% H% N% Trouvé 48,36 7,32 7,86 Calculé 48,26 7,77 7,51 - ( 2) Poids moléculaire: 346-(pic de spectre de masse) ( 3) P F: 123 C (décomposition) ( 4) Pouvoir rotatoire: = + 44,2 C (c = 1, H 20) ( 5) Spectre UV: dans H 2 O, aucun pic spécifique d'absorption maximal à 220 360 nm, fin d'absorption ( 6) Spectre IR (K Br): Figure 1, -13400, 2900, 1675, 1455, 1350, 1235, 1060 cm 3400, 2900, 1675, 1455, 1350, 1235, 1060 cm -8 - ( 7) Spectre RMN ( 13 C, dans D 20, 25 M Hz, standard: dioxane): 150,5; 103,3; 95,3; 89,4; 71,6; 70,2; 66,8; 66,2; 62,0; 60,7; 59,4; 56,1; 31,5; 21,7 ppm ( 8) Spectre RMN ( H, dans D 20, 100 M Hz, standard: DSS): Figure 2 ( 9) Solubilité: soluble dans l'eau, légèrement soluble dans des alcools inférieurs tels que le méthanol, insoluble dans l'acétone, le benzène et l'acétate d'éthyle ( 10) Réaction colorée: positive: réaction à la ninhydrine et décoloration pour la réaction au permanganate de potassium négative: réaction d'Elson-Morgan et réaction de Sakaguchi ( 11) Nature: basique ( 12) Couleur: jaune pâle ( 13) Chromatographie sur couche mince de gel de silice (Merck, Art 5735): Rf = 0,73 lchloroforme-méthanol-14 % aq. ammoniaque ( 1: 2: 1)l Rf = 0,77 lchloroforme-méthanol-28 % aq. ammoniaque ( 2: 3: 2)l Parmi les antibiotiques connus, l'acmymicine est- semblable à l'actinospectacine (spectinomycine) (Antibiot. & Chemoth, 11, 118-122 ( 1961), Japan Pat Publ N 39- 2993, Japan Unexam Pat Publ N 48-18489) Compte tenu des caractéristiques physico-chimiques ci-dessus indiquées l'acmymicine apparaît comme un nouvel antibiotique La formule développée est la suivante: H H 3 C H o CH HO HO N HCH 3 O CH 3 N HCH 3 O CH 3 Microorganismes testés 1 clli 1 9 - II CARACTERES BIOLOGIQUES ( 1) Spectre antibactérien Les concentrations inhibitrices minimales (CMI en pg/ml) de l'antibiotique acmymicine par la méthode diluée dans l'agar sont répertoriées dans le tableau 2 S La 1)h au r eus ATCC 6- 3 JP / O () /Y / M S 2 7 0 / / 9 epidermidis sp-al-/ Y 31 ATCC 6633 J C 2 ' ' / O O > / O O s O 3 / 2 -- - O > / O C) > /-ô O / 2-1 2 - > / (; O /0 ( > / O U > / O O i O 1 5 S L r CI) L p y O ge Des 13 a C i 1 1 u ss u b t 1 1 j E ce 1 i N I H J E Co 1 i W 3 16 3 E Coli W 3 6 3 Ci L f r e und i -i G Kleb pneumoniae Saliq eitteritidiq s 1 ligella sonnei Proteus morg Rui rettger N. s o R G N / g N 3 e 6 A T C C 10031 i Gaortner E 3 i O 2 3 9 i A C R ' E ii L e r c b N c a e r o g tn N e a O 6 - S C 1 O -I c a e G N 3 3 é, S e r r a t i a m a r c c S c e D s P S O Il CI O a e r u g i N o sa I A M / O O S - L'exemple suivant illustre la présente inven- tion mais ne doit pas être considéré comme limitatif. EXEMPLE Un milieu (p H 7, 100 ml x 10 flacons) contenant du glucose à 1 %, du dextrane à 1 %, hydrolysat de caséine 0,5 %, extrait de levure à 0,5 %, et du carbonate de calcium à 0,5 % dans un Erlenmeyer de 500 ml est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes Chaque flacon est ensemencé par introduction d'une anse chargée d'une culture de Streptomyces sp AC 4559 FERM P-6645 et est mis à cultivera 30 C pendant 72 heures en vue de préparer la culture d'ensemencement. Un milieu liquide (p H 7,0; 20 litres) contenant du dextrine à 5 %, du glucose à 0,5 %, poudre de soja 3 %, carbonate de calcium 0,7 % et du chlorure de cobalt 1,3 ppm dans une jarre à fermentation de 30 litres est stérilisé par la vapeur La culture d'ensemencement ( 1 litre) est intro- duite à l'intérieur de ce milieu liquide et est mis à cultiver à 30 C pendant 96 heures, le milieu étant continuellement agité à 200 tours/minute (l'aération est ainsi de 15 litres/minute) afin d'obtenir le bouillon de culture ( 19 litres). Le filtrat de culture est introduit dans une colonne d'Amberlite IRC-50 (Rohm & Haas Co, nom com- mercial), type ammonium ( 1 litre), lavé à l'eau et éluté par de l'ammoniaque aqueuse 2 N ( 3 litres) L'ensemble de l'éluat est concentré à vide jusqu'à avoir un volume de ml, ajusté à p H 7,0 et introduit dans une colonne de gel de séphadex CM-séphadex ( 200 ml, Pharmacia Fine Chemicals, type ammonium) La colonne est lavée à l'eau et éluée au moyen d'une solution d'ammoniaque aqueuse de gradient de concentration linéaire 0-0,1 N ( 2 litres). L'éluat est fractionné par fractions de 20 ml, et est contrôlé par chromatographie de couche mince sur gel de 11 - silice (Merck, Art 5735) utilisant un mélange chloro- forme 7 méthanol-ammoniaque aqueuse à 14 % ( 1: 2: 1) pour détecter l'antibiotique acmimycine par réaction colorée à la ninhydrine Les fractions de n 35 à 45 contenant l'acmimycine sont réunies, concentrées à vide et lyophilisées afin d'obtenir l'antibiotique acmimycine ( 100 mg). Sur les dessins annexés: La Figure 1 représente: spectre IR de l'antibiotique acmimycine; La Figure 2 représente: spectre RMN ( 1 H) de l'antibiotique acmimycine. 12 - REVENDICATIONS 1. Antibiotique acmymicine de formule suivante H 3 H N H C H 3 O C H 3 ainsi que les sels d'addition d'acide correspondants. 2. Un procédé de production de l'antibiotique acmymicine et de ses sels comportant une phase de produc- tion dudit antibiotique à partir d'une culture de micro- organismes appartenant au genre Streptomyces et d'une phase d'isolation de l'antibiotique acmymicine à partir du bouillon de culture, et,si nécessaire, une phase de transformation en sel d'addition d'acide. 3 Un procédé selon la revendication 2, o le microorganisme produisant l'acmymicine est Streptomyces sp AC 4559 FERM P-6645. H 3 C HN