Brevet FR2533583A1 — publié le 19840330

La présente invention concerne la préparation d'a-amylase. L'amidon,polymère du glucose,est constitué de deux fractions, l'amylose, un polymère linéaire contenant de 250 à 300 unités de glucose reliées par des liaisons a-1,4-glucosidiques, et l'amylopectine, un polymère de structure ramifiée dont les branches sont formées de liaisons a-i,6-glucosidiques mais dont la plupart des unités glucose sont unies par des liaisons a-1,4-glucosidiques. Sous le terme générique d'amylase, on désigne toute activité enzymatique capable dthydrolyser en totalité ou en partie l'amidon au niveau des liaisons a-1,4 et a-1,6. Les a-amylases fragmentent l'amidon en dextrines et les amylases libèrent le maltose. Dans la pratique industrielle, on utilise des enzymes hydrolytîques du type amylase pour dégrader l'amidon afin d'obtenir des produits de plus en plus solubles dont le terme ultime est le glucose. L'opération de solubilisation de l'amidon souvent appelée liquéfaction, peut être effectuée par des enzymes amylolytiques du type a-amylase. Les a-amylases sont caractérisées par le fait qu'elles exercent sur l'amylase et l'amylopectine une action essentiellement endohydrolytique qui se traduit par une coupure statistique des liaisons a-1,4. De nombreuses industries utilisent l'a-amylase, soit dans le but d'utiliser directement les produits d'hydrolyse de l'amidon ainsi obtenu, soit afin d'obtenir à partir de l'amidon un produit ayant une consistance liquide qui pourra etre traité facilement dans des étapes ultérieures. Parmi les industries utilisant 1' a-amylase, il faut citer notamment les industries alimentaires qui utilisent les hydrolysats d'amidon,directement ou après traitement ultérieur, comme agent épaississant de différentes préparations alimentaires, ainsi que les industries textiles qui utilisent ce type d'enzyme à différents stades de la préparation des fibres et des textiles. Actuellement, on prépare l'a-amylase par fermentation bactérienne de souches présentant une activité a-amylolytique, en particulier des souches de Bacillus licheniformis. Il a déjà été proposé dans la technique antérieure des souches bactériennes transformées permettant d'augmenter la production d'a-amylase. Ainsi, la demande de brevet européen nO 0 034 470 décrit un procédé utilisant un bactériophage X comme vecteur de clonage d'une amylase de Bacillus coagulens dans Escherichia coli, mais les propriétés de l'enzyme obtenue ne sont pas celles d'une a-amylase, à savoir - qu'elle est inactive sur les cyclodextrines, ce qui exclut toute activitd endomoléculaire, - qu'elle produit surtout du glucose et du maltose et peu d'oligosaccharides supérieurs ou maltotrioses, ce qui est plutôt caractéristique d'une amyloglucosidase ou d'une amylase. La demande de brevet européen nO 0 057 976 décrit un procédé pour préparer une a-amylase thermostable en incorporant le gène codant pour une a-amylase thermostable de Bacillus stearothermophilus dans un plasmide chimérique, lequel est utilisé pour transformer un E. coli ou un B. subtilis. Toutefois, l'a-amylase obtenue présente un domaine de pH d'utilisation très restreint, ce quiconstitue pour la mise en oeuvre au stade industriel un grave inconvénient. En effet, comme cela a été indiqué précédemment, l'a-amylase est une enzyme utilisée dans de nombreux domaines industriels et les pH ainsi que les températures auxquels elle doit être utilisée sont très variés, ce qui nécessite que cette enzyme ait, pour être commercialisable, un domaine de pH où elle est active-qui soit très large ainsi qu'une température d'inhibition qui soit très élevée. Actuellement, le produit industriel commercialisé sous la marque Termamyl est un produit obtenu par fermentation d'un B. licheniformis. L'a-amylase de B. licheniformis présente un spectre large de pH d'activité, de pH 4,5 à pH 8 à la température de 500C ; par contre l'a-amylase de B. stearothermophilus a un spectre d'activité relativement étroit, pH 5,4 à 6,1 à la température de 650C. En outre, des essais rapportés dans ce brevet européen, il ressort que l'a-åmylase préparée, en particulier à partir de E. coli, ne peut être récupérée qu'en lysant les souches à l'aide notamment d'un phage T4. Ceci constitue évidemment un inconvénient important au niveau industriel, tant pour ce qui concerne le coût de l'opération que pour ses répercusions éventuelles sur le produit ainsi obtenu, Enfin, les souches de B. subtilis transformées par le plasmide décrit dans le brevet européen en cause ne sont stables qu'en présence de chloramphdnicol ceci limite, bien entendu, considérablement les possibilités d'application de ces souches au niveau industriel. La présente invention a pour objet la préparation et la mise en oeuvre de souches a-amylolytiques susceptibles de produire une amylase ayant des caractéristiques très voisines ou identiques au produit industriel actuellement commercialisé sous le nom de Termamyl. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de l'a-amylase par fermentation d'une bactérie a-amylolytique, procédé dans lequel l' a-amylase localisée au voisinage de la périphérie cellulaire peut être récupérée dans le milieu en appliquant aux cellules bactériennes un simple choc osmotique. Pour ce faire, la présente invention propose un ADN recombinant comportant un gène codant pour une a-amylase thermostable caractérisé en ce qu'il comporte au moins - le fragment d'ADN d'une souche de B. licheniformis codant pour une a-amylase thermostable, et - un fragment d'ADN d'un plasmide, d'un phage X ou d'un dérivé de phage A. Dans un mode de réalisation préféré de ce type d'ADN recombinant, on utilisera à titre. de fragment d'ADN bactérien codant pour l'a-amylase thermostable, tout ou partie d'un fragment d'environ 3,3 kilobases limité par deux sites de restriction HindIII, et on utilise de préférence un fragment d'ADN bactérien provenant de la souche de B. licheniformis ATCC 6598 déposée à l'American Type Culture Collection. Lorsque l'ADN recombinant en cause est un plasmide, on peut utiliser l'ADN d'un plasmide quelconque apte à se répliquer et à assurer une amplification du gène codé dans la bactérie où 1'ADN recombinant doit être introduit. Ainsi, les plasmides dérivés du plasmide pBR322, tels que pHC79, sont particulièrement- intéressants dans le cadre de la présente invention. Lorsque l'ADN recombinant est un phage, on peut utiliser des fragments d'ADN du phage X L47 La présente invention concerne également les souches bactériennes transformées par l'ADN recombinant du type décrit précédemment et notamment les souches de E. coli transformées. La présente invention concerne, enfin, un procédé de préparation d' a-amylase, caractérisé en ce qu'on cultive sur un milieu approprié une souche bactérienne transformée telle que décrite précédemment, et on récupère 1' a-amylase après fermentation, de préférence par lyse à l'aide d'un choc osmotique. Enfin, l'invention concerne les a-amylases thermostables obtenues par la mise en oeuvre de ce procédé. Des recombinants selon la présente invention ont été préparés à partir de l' ADN de B. licheniformis, qui est un-organisme producteur d'une a-amylase thermostable, par purification ae 1'ADN sur un gradient au chlorure de césium. On traite ensuite par une enzyme de restriction 1'ADN ainsi obtenu et 1'ADN vecteur issu d'un- phage X L47 dérivé du bactériophage A. Les ADN ainsi obtenus sont mélangés et ligués sous l'action d'une ligase. Le mélange de ligation est ensuite encapsidé invitro afin d'obtenir des particules phagiques infectieuses qui sont utilisées ensuite pour infecter une souche de E. coli. On isole ensuite, par des techniques classiques, les bactériophages X amy qui pourront servir pour infecter diverses souches de E. coli en les rendant productrices d'a-amylases. De la même façon, mais en partant de 1'ADN des bactériophages X amy et d'un plasmide par exemple dérivé de pBR322, on obtiendra des plasmides qui pourront être utilisés pour transformer des souches bactériennes pour les rendre productrices d1-amylases. Bien entendu, le processus décrit précédemment peut être modifié afin d'obtenir des recombinants différents mais qui demeurent dans le cadre de la présente invention. Les procédés d'infection lytique ou de transformation des souches bactériennes sont connus et ne seront pas décrits en détail. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer divers aspects de la présente invention. EXEMPLE 1 Préparation d'un ADN recombinant de phage X L47 comportant l'ADN codant pour 1' &alpha;-amylase issue d'une souche de B. licheniformis Microorganisme crooranisme donneur Le microorganisme donneur est une souche de B. licheniformis déposée d l'ATCC sous le n 6598. Cette souche produit une a-amylase thermostable dont les caractéristiques sont très semblables à celles décrites par F.J. Morgan et F.G. Priest : Characterization of a thermostable amylase from B. licheniformis NCCB 6346 Journal of Applied Bacteriology (1981) vol. 50, pp107-114 et par N.Saito : A thermophilic extra cellular amylase from B. licheniformis ; Archives of Biochemistry and Biophysics (1973) 155, pp. 290-298. - Son poids moléculaire est-de 22 500 daltons - Son optimum de température est de 7-6 C à pH 9 - son optimum de pH est assez large, de 6 llà 25 C. L'ADN de B. licheniformis est purifié par centrifugation à l'équilibre en gradient de CsCl. Au lysat on ajoute une solution de ClCs saturée dans les proport-ions 1/3 et 2/3 respectivement. Le-mélange est centrifugé 36 heures à 45KRPM dans un rotor 70Ti Beckmann. Le tube est ensuite percé par le fond, la présence de 1'ADN est révélée par l'aspect visqueux du liquide qui s'écoule. Après dialyse de 24 heures contre du TE (10 mM tris 1 mM EDTA pH 7,5), l'ADN est soumis à l'action du phénol équilibré contre du TE pH 8 et dialysé une nouvelle fois pendant 24 heures. Par électrophorèse sur gel d'agarose 0,3 % avec comme étalon de taille de l'ADN du phage'À (49 kb), on vérifie la qualité de l'ADN dont la taille est supérieure à 120 kb. Restriction et ligation 20 1 l t2 ssg)- d'ADN de phage A L47 sont soumis à l'action de l'enzyme HindIII, la partie délétée peut être remplacée par un fragment d'ADN de 7,1 à 21,6 kilo paires de bases. 100 iil (8 ssg) d'ADN de B. licheniformis sont soumis à l'action de la même enzyme HindIII pendant 2 heures à 370C. La réaction enzymatique est stoppée par chauffage pendant 15 minutes à 650C. Les deux ADN sont ensuite mélangés et précipités à l'alcool absolu en présencede NaCl 0,3 M. Le précipité est repris dans 20 l de tampon de ligation et soumis à l'action de la T4 DNAligase en présence d'ATP et de dithiothréitol pendant la nuit à 100C. Un aliquot de chaque ADN et du mélange de ligation sont prélevés et analysés sur gel. Encapsdation du mé lange de ligation 2 iil (1 g) du mélange de ligation sont encapsidés selon le protocole de B. Hohn et J. Collins. Cosmids : A type of plasmid gene cloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage lambda leads; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, n 9, pp 4242-4246 (1978). -EXEMPLE Il Préparation d'une souche de E. coli productrice d'&alpha;-amylase et a-amylase obtenue Infection de la bactérie indicatrice La bactérie indicatrice infectée par le système d'encapsidation préparé précédemment est une souche de E. coli possédant un phage lysogène P2. Cette bactérie est cultivée en présence de maltose 0,4 % jusqu'en fin de phase exponentielle. Après centrifugation, les cellules sont reprises dans un volume de MgS04 10 mM. Résultats 4 Environ 2,5 x 10 particules phagiques ont été obtenues, quelques centaines ont été testées, deux plages de lyse se sont révélées positives X amy 1 et X amy 2. Les phages des deux plages de lyse positives sont repiqués et amplifiés par réinfection d'une souche sensible doue. coli. Afin d'étudier les caractéristiques de l'amylase une infection liquide est effectuée. La bactérie réceptrice est cultivée en milieu liquide en présence de maltose 0,4 % jusqu'S une densité optique de 0,4. La suspension de phages est ajoutée afin de réaliser une infection avec une multiplicite de 1 La lyse bactérienne se produit 4 à 5 heures après l'infection. Dosagede l' l'activíté amylolytigue Deux méthodes peuvent être utilisées pour effectuer ce dosage. a) Une méthode de dosage des sucres réducteurs apparus lors de l'hydrolyse de l'amidon, à l'acide dinitrosalicylique (DNS). Les resultats sont exprimés en Maltose Equivalent. b) Une méthode qui consiste à mesurer la densité optique à 620 nm d'une solution d'amidon en présence d'iode. Propriétés de lla-amylase ainsi produite par infection de E, coli Un aliquot de surnageant est soumis à l'action de la température pendant un temps donné et on mesure l'activité enzymatique résiduelle. 300 Rl de surnageant sont soumis pendant 10 minutes à des températures croissantes. On dose ensuite l'activité résiduelle. A ces 300 sslt on ajoute 1 ml de solution d'amidon soluble 1 % (tampon NaH2P04 Na2HPO4, pH 5,6) et on incube 10 minutes à 5O0C. On mesure ensuite la D O à 620 nm du mélange en présence de 2 ml de lugol. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l'activité d'un aliquot non traité (fig. 1). Résultats ++ En l'absence de tout protecteur (ion Ca et amidon), l'enzymeconserve 90 % de son activité après 10 minutes à 80 C. En présence d'ions Ca à 0,1 M, l'enzyme est stable à 100 % à 900C pendant 15 minutes (résultat obtenu par dosage au DNS). Ces propriétés sont identiques à celles de l'a-amylase de B. licheniformis décrites par Saito. Caractéristigues d'un hydrolysat d'amidon Un essai de liquéfaction d'amidon natif a été effectué --Concentration de l'amidon : 30 % - pH 6,2 (addition 1 O/oo Ca (OH)2) - Température : 95 C - Taux d'enzyme : équivalent en activité à 2 ml Termamyl 60 pour 1 kilo d'amidon D E obtenu - D E obtenu : 15,2. (équivalent dextrose). Repartition glucidigue -- D E 15,2 glucose 0,4 maltose 2,7 G3 5,5 G4 2,9 G5 5,4 G6 8,0 G7 6,5 G8 3,6 Gg 2,4 G10 1,8 G11 - G 18,5 G20 42,3 Résultats exprimés en pourcentage du produit sec. (L'abréviation G n indique des oligomères du glucose à n unités de glucose). Comparaison immunologigue Après précipitation au sulfate d'ammonium 65 % et concentration 100 fois d'un surnageant de lyse bactérienne, l'amylase produite par E. coli est comparée à l'a-amylase de B. licheniformis purifiée par la méthode d'immunoprécipitation d' Ouchterlony 5 ml d'agar purifié dans du tampon 1/15 M phosphate pH 7 + azide de sodium 0,01 % sont coulés dans une boite de Pétri de 5 cm de diamètre, des puits de 5 mm espacés de 1,5 cm sont remplis de 50 Fl d'antiserum et de 100 l des deux amylases. Les puits sont disposés de telle façon que l'antiserum puisse réagir avec les deux amylases à la fois. La boîte est laisse une nuit à l'étuve à 37 -C. Aucune différénce immunologique n'est décelable par cette méthode. Tous les déterminants antigéniques portés par l'a-amylase purifiée de B. licheniformis sont présents sur l'a-amylase produite par E. coli comme le montre l'absence d'éperon à la rencontre des deux précipités. EXEMPLE III Sous clonage dans un plasmide bactérien se répliquant dans Escherichia coli et identification d'un fragment de restriction contenant le gène de l'v-amylase Le plasmide bactérien pBR322 (commercialisé par Bethesda Research Laboratories) est capable de conférer à la bactérie qui le contient la résistance aux antibiotiques ampicilline et tétracycline. Ce plasmide contient un certain nombre de sites uniques de restriction permettant un clonage par insertion et inactivation d'un des gènes de résistance. C'est le cas pour l'enzyme HindIII qui est située dans le gène de résistance à la tétracycline. Les ADN du bactériophage X amy+ obtenu aux exemples précédents et du plasmide pBR322 sont soumis à l'action de l'enzyme HindIII durant 1 heure à 370C ; l'enzyme est ensuite détruite-par chauffage 15 minutes à 650C. 0,5 ssg d'ADN du bactériophage X amy et 1 ssg de plasmidepBR322traité.par l'enzyme HindIII sont mélangés et précipités à l'éthanol absolu en présence de NaCl 0,3 M. Le précipité est repris dans 15 iil de tampon de ligation et soumis à l'action de la T4 DNA ligase en présence d'ATP et de dithiothréitol pendant la nuit à 100C Le mélange de ligation est ensuite utilisé pour transformer une souche de E. coli compétente HB101. Les bactéries transformées sont sélectionnées sur milieu complet contenant 100 mg par litre d'ampicilline, puis les clones contenant un plasmide hybride ApRTcS sont identifiés sur un milieu contenant de la tétracycline 25 mg/l.- Les clones hybrides sont testés pour lieur capacité à produire de l'amylase en présence d'amidon soluble 1 %, après traitement au lysozyme. L'activité amylolytique est détectée par coloration à l'iode d'un lysat bactérien en présence d'amidon soluble après 30 minutes d'incubation à 45 C. Le plasmide des clones Amy+ Tus est est purifié après amplification en présence de chloramphénicol, sur gradient de CsCl en présence de BET Après dialyse et concentration ils sont analysés par différentes enzymes de restriction. Tous contiennent un fragment Hindili de 3,3 kb. La carte de restriction du plasmide obtenu est schematisée sur la figure 2. Sur ce fragment Hindili on trouve à partir d'une des extrémités Hindili, comme cela est schématisé sur la figure - un site SalI à environ 100 paires de bases - un site BglII à environ 450 paires de bases - un site EcoRI i 750 paires de bases - un site Psti à 1,7 kilopaire de bases - un site PvuII situé entre le site EcoRI et Psti. A partir de l'autre extrémité HindIII on trouve - un site SalI à environ 700 paires de bases - un site KpnI à environ 1,3 kilopaire de bases - un site SstI à environ 1,9 kilopaire de bases. Par contre, on ne trouve aucun site Xho, Soma, PvuI, HpaI et Sstii. Toutes ces enzymes coupent spécifiquement 1'ADN au niveau de sites à six nucléotides. Lorsque l'on tente de réduire le fragment HindIII à partir de ces deux extrémités, on constate que l'on peut déléter le fragment EcoRI-EcoRI sans altérer l'expression de l'activité amylolytique. Par contre, la délétion des fragments Pst-Pst et Sal-Sal inhibe l'activité amylolytique. La région contenant le gène de structure de l amylase s'étend donc sur au moins 1000 paires de bases entre les sites Sal et Psi et de part et d'autre de ces sites sur des zones non délimitées. Les plasmides obtenus par cette technique sont capables de conférer la résistance à l'ampicilline à une souche de E. coli compétente et de lui conférer une activité amylolytique. Cette activité amylolytique est repérable directement sur des boites de Pétri contenant de l'amidon à 1 t t ce qui suggère que l'activité amylolytique se trouve répartie à la périphérie des cellules sans doute dans l'espace périplasmique. Dans ces conditions, il est possible de libérer l'a-amylase par un simple choc osmotique des cellules bactériennes, ce qui sur le plan industriel constitue un avantage considérable. REVENDICATIONS 1) ADN recombinant comportant un gène codant pour une amylase thermostable, caractérisé en ce qu'il comporte au moins - le fragment d'ADN d'une souche de Bacillus licheniformis codant pour une amylase thermostable, et - un fragment d'ADN d'un plasmide, d'un phage A ou d'un dérivéde phage A. 2) ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment d'ADN bactérien codant. pour 1' a-amylase comporte tout ou partie d'un fragment d'environ 3,3 kb limité par deux sites de restrictions HindIII. 3) ADN selon l'une des revendications 1. et 2, caractérisé en ce que le B. licheniformis est la souche ATCC 6598. 4) ADN selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'ADN d'un phage A provient du phage X L47. 5) ADN selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'ADN de plasmide provient du plasmide bactérien pBR322 ou d'un plasmidedérivé de pBR322. 6) Souche bactdriènne transformée par un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 5. 7) Souche selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de E. coli. 8) Procédé de production d' a-amylase, caractérisé en ce qu'on cultive sur un milieu approprié une souche bactérienne selon l'une des revendications 6 et 7 et on récupère l'a-amylase. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'après croissance des cellules bactériennes, celles-ci sont lysées par un choc osmotique afin de libérer l'a-amylase dans le milieu. 10) amylase thermostable obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 8 et 9.