Brevet FR2533704A1 — publié le 19840330

Dosage immunologique dans le sérum de l'apolipoprotéine 1 B des lipoprotéines de basse densité. L'invention a pour objet un procédé permettant le dosage immunologique d'une seule espèce protéique au sein d'une famille de protéines ou de complexes protéiques présentant un déterminant antigénique commun, mais de tailles différentes. Le procédé selon l'invention permet d'effectuer succes- sivement, en une seule opération utilisant un nouveau système électro- phorétique, une séparation des protéines selon leur taille dans un milieu de réticulation contrôlée, et un dosage par électro-immunp- diffusion selon la méthode de LAURELL, C B Anal Biochem 15 -52 ( 1966) Le milieu de réticulation contrôlée dans lequel s'effectue la migration électrophorétique préalable permet le blocage des protéines de taille supérieure à celle de la protéine à doser, de façon que ces protéines ne puissent interférer dans le dosage par électro-immunodiffusion ultérieur L'invention a en particulier pour objet un procédé de dosage dans le sérum, de l'apolipoprotéine B (désignée ci-après apo-B) se trouvant dans des lipoprotéines de faible densité (ci-après LDL). L'apolipoprotéine B (apo B) est une protéine constitutive de différents complexes lipoprotéines sériques: les lipoprotéines de très faible densité (VLDL), les lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL) et les lipoprotéines de faible densité (LDL), complexes de tailles, de compositions chimiques, de structures et de rôles physiopathologiques très différents. GOLDSTEIN J L et BROWN M So 9 Ann Rev Biochem 46 897-930 ( 1977) ont montré que l'apo B des LDL règle le métabolisme cellulaire des lipoprotéines sériques et ont suggéré qu'elle jouerait ainsi un rôle clef dans la survenue du processus athéroscléreux Des études cliniques récenteslSNIDERMAN A et al, Proc Nat, Acad Sci. Uo S A 77 604-608 ( 1980) lont confirmé ces données expérimentales en montrant le caractère discriminant de la concentration sérique de l'apo B des LDL dans le diagnostic et le pronostic des coronopathies. Il est à noter de plus que les LDL forment une famille moléculaire hétérogène dans laquelle il est possible d'individualiser plusieurs fractionslKRAUSS R M et BURKE D J J Lipid Res 23 97-104 ( 1982)l et notamment la lipoprotéine Lpa de constitution particulière et dont la responsabilité dans le développement précoce de l'athérosclérose a été suspectéelKOSTNER G M et al Atherosclerosis t 5 38 51-61 ( 1981)l. Les méthodes de dosage de l'apo B actuellement proposées dosent toutes l'apo B sérique totale sans différencier l'apo B selon son origine et donc sa signification physiopathologique Un dosage de l'apo B des différentes fractions lipoprotéiques a bien été proposé par SNIDERMAN et al (cités ci-dessus), mais il repose sur la séparation des lipoprotéines par ultracentrifugation préparative, méthode longue, coûteuse et non réellement quantitative. Le procédé selon l'invention permet le dosage de l'apo B des LDL totales sans interférence des autres lipoprotéines Une variante du procédé permet d'éliminer du dosage l'apo B liée à la fraction Lpa. Sous l'action d'un champ électrique sont effectués successivement, en une seule opération: une séparation des LDL des autres lipoprotéines contenant de l'apo B; un dosage de l'apo B des LDL par électro- immunodiffusion selon la méthode de LAURELL C B (cité ci-dessus). La première étape, séparative, est réalisée par migration électrophorétique des échantillons dans un gel de polyacrylamide ou d'un polymère équivalentjdont la réticulation est telle qu'il y ait passage des LDL et rétention des autres lipoprotéines à apo B, en particulier les VLDL qui ont toutes une taille supérieure à celle des LDL On contr 8 le donc la réticulation du gel au cours de sa préparation de façon que le gel obtenu bloque toute protéine étalon d'un diamètre supérieur à 30 nm. La deuxième étape de dosage est réalisée par migration électrophorétique des LDL dans un gel d'agarose contenant des anticorps anti-apo B. L'étape séparative rend compte de la spécificité du dosage Elle améliore également sa précision et sa linéarité. En effet, ce qui limite les performances des techniques d'électro- immunodiffusion est l'existence, avant toute migration électro- phorétique, d'une diffusion passive des échantillons dans l'agarose, diffusion variable d'un dép St à l'autre, qui retentit sur la hauteur des arcs de précipitation des immuns complexes et qui de ce fait entra Tne des défauts de reproductibilité et de linéarité Il a parfois été proposé de pallier à cet inconvénient en pratiquant les dép Sts alors que la plaque est sous tensionlAYRAULT-JARRIER M Ann. Biol Clin 40 187-194 ( 1982)l, ce qui n'est ni parfaitement efficace, ni compatible avec les règles de sécurité Dans le procédé selon l'invention, les échantillons sont déposés à l'intérieur de puits pratiqués dans le gel d'acrylamide ce qui rend toute diffusion impossible et supprime les défauts signalés. Selon une variante du procédé selon l'invention, on exclut du dosage l'apo B liée à la lipoprotéine Lpa en introduisant un gel supplémentaire entre le gel de séparation et le gel d'électro- immunodiffusion Il s'agit d'un gel d'acrylamide contenant des - anticorps spécifiques de la lipoprotéine Lpa Lors de la migration des LDL dans ce gel, les lipoprotéines Lpa forment, avec les anticorps correspondants, des immuns complexes de taille telle que leur migration devient impossible Seules les autres LDL continuent leur migration en direction du gel d'électro-immunodiffusion. Le procédé selon l'invention est mis en oeuvre par l'emploi d'un nouvel élément analytique composé d'une plaque (ou d'un film) constituée pour une partie, d'un gel d'acrylamide-agarose et pour une autre partie, d'un gel d'agarose La plaque (ou film) utilisée comme support horizontal de la migration électrophorétique, comprend: a)-Du c 8 té cathodique, uneipremière partie constituée d'un gel de polyacrylamide contenant une faible proportion d'agarose ayant pour but d'assurer la tenue mécanique du gels et qui peut Varier de 0,05 à 5 % en poids du gel. Pour la préparation de ce gel, on utilise, au cours de la polymérisation, des agents de réticulation classiques, tels que le méthylène-bisacrylamide ou le di-allyl-tartar-diamide, de façon à obtenir un gel qui ne laisse pas passer les protéines étalon d'un diamètre supérieur à 30 nm. Si, par exemple, on part d'un mélange à 30 g/litre d'acrylamide et 7 g/litre d'agarose, on ajoute l'agent de réticulation à raison de 10 % en poids par rapport à l'acrylamide Des puits destinés au dépôt des échantillons sont ménagés dans ce premier gel à une distance de quelques millimètres, 2 mm par exemple, de l'interface des deux gels. b)-Du c 8 té anodique, une seconde partie, constituée d'un gel d'agarose (par exemple 10 g/l) contenant l'anticorps anti-apo B. En vue de suivre la migration et la précipitation des lipoprotéines, les échantillons sont mélanges volume à volume à une solution de Noir Soudan ( 5 g/1 l dans l'éthylèneglycol), colorant des lipides. Un microlitre de chaque mélange est déposé dans le puits réservé à cet effet. Une différence de potentiel de 100 V est maintenue pendant 3 heures entre Ies extrémités de la plaque. On mesure ensuite les hauteurs ou les surfaces des arcs de précipitation des immuns complexes Les concentrations en apo B des échantillons sont calculées par comparaison avec les hauteurs obtenues avec des préparations de concentrations connues en apo B des LDL. La figure unique ci-après représente un élement analytique selon l'invention, comportant un gel I assurant le blocage des VLDL et un gel 2 contenant l'antisérum anti-apo B; les échantillons sont déposés dans les puits 3 et on voit en 4 les arcs de précipitation des immuns complexes. Selon une variante du procédé selon l'invention, on exclut du dosage la lipoprotéine Lpa: Entre les deux gels précédemment décrits est disposé un troisième gel d'acrylamide-agarose (par exemple, acrylamide: 30 g/l, agarose:7 g/l) contenant des anticorps anti-Lpa. Le mode opératoire est par ailleurs identique à celui décrit ci-dessus. Le procédé selon l'invention permet de doser l'apo B des LDL avec une bonne reproductibilité: cov inférieur à I % sur une même plaque (n = 20) La linéarité dépend du sérum anti-apo B utilisé dans le gel d'électroimmunodiffusion Avec un anti-sérum d'origine commerciale, la linéarité s'étend de 0,3 à 1,8 g/l d'apo B. Le procédé de dosage selon l'invention présente également une bonne spécificité: des surcharges croissantes en VLDL du sérum à doser n'ont pas entraîné de modifications significatives des hauteurs de pics. Le procédé décrit pour le dosage spécifique de l'apo B d'une seule fraction lipoprotéique peut être appliqué au dosage d'une seule espèce protéique au sein d'ensembles protéiques dont les constituants possèdent un déterminant antigénique commun, mais sont de tailles différentes. REVENDICATIONS 1 Procédé de dosage de l'apolipoprotéine B (apo B) des lipoprotéines de basse densité (LDL) dans le sérum, caractérisé en ce qu'on réalise en une seule opération, par électrophorèse, successivement une séparation des LDL des autres lipoprotéines contenant de l'apo-B, et un dosage de l'apo- B des LDL ainsi séparées par un procédé connu en soi d'électro-immunodiffusion. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'électrophorèse est réalisée sur une plaque ou un film mixte comprenant du côté cathodique une partie constituée par un gel de polyacrylamide ou d'un polymère équivalent, dont la réticulation est telle qu'il bloque la migration des VLDL et laisse passer les LDL, et du côté anodique une autre partie constituée par un gel d'agarose contenant des anticorps anti-apo B provoquant, avec l'apo-B, la forma- tion d'arcs de précipitation dont on mesure la hauteur ou la surface. 3 Procédé selon l'une des revendications l et 2, caractérisé en ce que la réticulation du gel de polyacrylamide est contrôlée de façon que ce gel bloque toute protéine étalon d'un diamètre supérieur à 30 nm. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gel de polyacrylamide est réticulé par des agents tels que le méthylène-bis-acrylamide et le di-allyl-tartar-diamide. Procédé selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce qu'on évite la diffusion passive des échantillons en déposant ceuxci dans des puits pratiqués dans le gel de polyacrylamide et situés à quelques millimètres de l'interface des deux gels. 6 Procédé selon l'une des revendications I à 5, caractérisé en ce que le gel de polyacrylamide, constituant une partie de la plaque d'électrophorèse, contient une proportion d'agarose suffisante pour assurer la tenue mécanique du gel, et en particulier une proportion de 0,05 à 5 % en poids du gel. 7 Procédé selon l'une des revendications I à 6, caractérisé en ce que, pour exclure du dosage l'apo B liée à la lipoprotéine Lpa, on introduit, dans la plaque d'électrophorèse, entre le gel de séparation et le gel d'électro-immunoprécipitation, un gel supplémentaire constitué par un polyacrylamide de rgticulation contr 8 lée contenant des anticorps spécifiques de la lipoprotéine Lpa. 8 Plaque ou film d'électrophorèse destiné à mettre en oeuvre le procédé de dosage selon l'une des revendications I à 7, caractérisé en ce qu'il comprend, du côté cathodique, un gel de polyacrylamide ( 1), de réticulation contr 8 lée de façon qu'il bloque toute protéine d'un diamètre supérieur à 30 nm, et du c 6 té anodique un gel d'agarose ( 2) contenant des anticorps anti-apo B.