Brevet FR2526164A1 — publié le 19831104

La présente invention se rapporte d'une manière générale aux analyseurs optiques à écoulement continu et elle a trait plus particulièrement à un procédé pour étalonner un tel analyseur et à un échantillon de fluide pré-étalonné destiné à être utilisé dans un tel analyseur. Des progrès importants ont été réalisés dans le domaine de l'automatisation de la numération des globules sanguins dans un échantillon de sérum. L'instrument le plus connu pour effectuer des numérations globulaires est le compteur Coulter dans lequel les globules sanguins traversent un orifice en une unique file et sont détectés par la manière dont ils modifient les propriétés électriques val'orifice et sontcomptésjus- qu'd présent, cependant, aucun équipement n'a été disponible pour analyser et évaluer les multiples globules,tels que les globules normaux, les globules-cibles, les hématies falciformes,etc... qui peuvent se trouver dans un courant en écoulement continu d'un échantillon de sang donné.Ainsi, lorsqu'on désire obtenir des informations relatives aux multiples globules de ce type, la pratique normale des laboratoires pour les obtenir consiste à préparer une lamelle de microscope avec les globules fixés dans un plan image et à employer un opérateur humain ou une machine de reconnaissance de formes pour compter statistiquement des nombres siginficatifs de globules en observant un à un au microscope les globules portés par la lamelle. On renverra à ce sujet aux brevets des EUA nO 4.175.860 et nO 4.199.748. Diverses tentatives ont été effectuées au cours des dernières années en vue de permettre d'effectuer une analyse optique de particules qui s'écoulent dans un courant continu. Par exemple, Kay et autres ont décrit dans le "Journal of Histochemistry and Cytochemistry",volume 27, page 329 (1979) un dispositif qui comporte un orifice du type Coulter pour déplacer les globules en une seule file, les globules étant reproduits grossis sur un tube "Vidicon". De même, Kachel et autres ont décrit dans le "Journal of Histochemistry and Cytochemistry", volume 27, page 335, un dispositif pour déplacer les globules en une seule file à travers une zone de microscope dans laquelle ils sont photographiés. Bien que ces chercheurs aient fait progresser l'automatisation de l'analyse de particules en une seule file-, aucun travail ayant abouti qui permettrait d'effectuer l'analyse automatique des particules dans un courant continu sans la nécessité de-disposer les particules en un courant en une seule file n'a été publié.On renverra par exemple, à ce sujet, à l'ouvrage "Flow Cytometry and Sorting" de Melaned et autres, John Wiley & Sons, 1979, hapitre 1; on renverra également au brevet des EUA nO 3.819.270. Conformément à la présente invention ,il est prévu un procédé pour étalonner un analyseur à écoulement continu qui comporte une chambre ou cuve a circulation, un microscope agencé pour pouvoir être mis au point sur une zone d'observation d'image de la chambre ou cuve à circulation et des moyens capteurs pour capter des images tramées fixes des particules qui se trouvent dans la zone d'observation d'image. Le procédé consiste à injecter un échantillon de particules d'étalonnage dans la cnambre à circulation. Les particules ont des paramètres prédétermines. Une série d'images tramées fixes des particules contenues dans la zone d'observation d'image sont formées par les moyens capteurs d'images. Les images sont traitées pour calculer les paramètres. On étalonne ensuite l'analyseur sur la base des paramètres prédéterminés et des paramètres calculés. La présente invention vise également un échantillon de fluide pré-étalonné conçu pour être utilisé dans un système d'analyse à écoulement continu. L'échantillon de fluide préétalonné comprend un melange physique d'une série de particules d'étalonnage et d'un échantillon de fluide biologique contenant des particules microscopiques. Les particules d'étalonnage ont des paramètres prédéterminés. L'échantillon de fluide biologique doit être analysé par le système d'analyse à écoulement continu. D'autres caractéristiques de l'invention apparaitront à la lecture de la description qui va suivre et à l'examen des dessins annexés dans lesquels: la Fig. 1 est une vue en perspective d'un appareil pour examiner un courant continu selon la présente invention; la Fig. 2 est une vue de la cuve ou chambre à circulation de l'appareil de la Fig. 1; la Fig. 3 est une vue en coupe de l'appareil de la Fig. 2, prise suivant le plan de la ligne 3, 3 de la Fig. 2; la Fig. 4 est une représentation schématique du processeur électronique utilisé dans l'appareil de la Fig. 1. On se référera maintenant de manière plus détaillée aux dessins et, en particulier, à la Fig. 1 sur laquelle on a représenté un appareil qui comporte un corps 10 qui contient une chambre ou cuve à circulation munie d'un orifice d'entrée 12 pour un échantillon de fluide, tel que du sang ou de l'urine, et d'un orifice de sortie 14, entre lesquels s'étend un passage qui traverse une zone 18 d'observation d'image. Le passage 16 comporte un orifice d'entrée muni d'un conduit 20 destiné à être raccordé à un volume de solution saline 22. Comme représenté sur les Fig. 2 et 3, l'orifice d'entrée 12 de l'échantillon de fluide est formé par une aiguille 24 qui débouche dans le passage 16 en aval du conduit 20, l'aiguille 24 étant reliée à un récipient 26 prévu pour contenir l'échantillon de fluide qui doit être analysé. La surface de section transversale du passage 16 diminue progressivement depuis l'orifice d'entrée 12 en direction de la zone 18 d'observation d'image. L'épaisseur ou profondeur du passage diminue également depuis l'orifice d'entrée 12 jusqu'à la zone 18 d'observation d'image. La largeur diminue à partir de l'orifice d'entrée 12 puis s'accroît fortement jusqu'à la zone 18 d'observation d'image. Ainsi, comme représenté sur les Fig. 2 et 3, le passage 16 a une largeur et une profondeur d'environ 5000 sm à l'orifice d'entrée 12, une largeur et une profondeur d'environ 500 r, au milieu 28 et une profondeur de 100 rm avec une largeur supérieure à 5000 m au niveau de la zone d'examen 18. On comprendra que le courant continu qui s'écoule à travers la zone d'examen 18 peut etre de nombreuses fois plus profond que le plus grand globule ou cellule, sa la geur étant de r.cmbreuses fois supérieure à la largeur des plus larges particules, par exemple plus de cent fois supérieur à la largeur de la plus large cellule. Cependant, du fait que le passage est formé de la manière ci-dessus décrite, le courant qui ç Iénètr par l'ouverture 12 est limité à un trajet d'écoulement stable à cisaillement minimal dans la zone d'examen.De préférence, la surface de la section transversale à cisaillement minimal n'est pas beaucoup plus grande que la surface de la section transversale minimale des particules de sorte que les particules sont alignées dans le courant avec leur surface de section transversale minimale orientée transversalement à la direction d'écoulement et leur surface de section transversale maximale orientée parallèlement à la largeur (c1est-à-dire visible dans le plan de la Fig. 2). L'expression "cisaillement minimal" est utilisée ici dans le sens de "gradient de vitesse minimal" de sorte qu'une particule qui se déplace dans le courant a tendance à s'aligner avec la direction du courant exactement.comme une bûche flottant sur une rivière s'aligne d'elle-même avec la direction d'écoulement, lorsqu'il y a un gradient d'écoulement. On peut commander les caractéristiques d'écoulement dans le passage 16 en réglant la pression du fluide qui règne dans les récipients 22 et 26 soit automatiquement soit en réglant leur hauteur statique. Un microscope 30 est mis au point sur la zone d'examen 18 et la zone d'examen 18 est éclairée de dessous par un stroboscope 32 qui est, de préférence, un stroboscope Modèle 3018 de la société U.S. Scientific Instrunent Corporation contenant une lampe 2UP 1,5. L image de sortie du microscope est focalisée sur une caméra 34 à dispositifs à transfert de charge modèle nO TC1160BD fabriquée parla société RCA Corporation. Le signal de sortie de la caméra 34 à dispositifs à transfert de charge est converti en une série d'images tramées fixes et des processeurs électroniques appropriés sont utilisés pour évaluer ces images. Un processeur que l'on peut utiliser à cette fin est le processeur vendu sous la désignation Système d'analyse d'images modèle C-1285 par Hamamatsu Systems, Inc. Waltham, Massachusetts, EUA.De préférence, le signal de sortie de la caméra 34 à dispositifs à transfert de charge est appliqué à un processeur électronique 36 qui a été représenté de manière plus détaillée sur la Fig. 4 et qui comporte un écran de télévision de contrôle en noir et blanc 38 et un collecteur 40 d'images tramées qui met en mémoire des images tramées fixes de la scène observée par la caméra à dispositifs à transfert de charge. Le collecteur 40 d'images tramées est, de préférence, le collecteur d'images modèle FG08, fabriqué par la société Matrox Corporation, Montréal, Canada, dont le signal de sortie est appliqué à une mémoire de régénération vidéo 42 modèle RGB 256 fabriquée par Matrox Corporation qui sont tous deux couplés à un bus multiple 44 de l'unité de traitement 46 laquelle est, de préférence, un ordinateur Intel 80/20. Le bus multiple 44 est également couplé à une mémoire à accès sélectif de 48K (48x 1024 octets) vendue par la société Electronic Solutions Inc. et à une mémoire à accès sélectif 50 de 16K (16x1024 octets) à deux accès, modèle RM 117 de la société Data Cube Corporation. Le signal de sortie de la mémoire de régénération vidéo 42 est également transmis à un écran de télévision de contrôle en couleur 52 qui peut être utilisé pour fournir des images vidéo accentuées par un traitement numérique des images fixes individuelles en vue de leur examen par un opé- rateur humain. La seconde sortie de la mémoire à accès sélectif 50 à deux accès est connectée à un bus multiple 54 lequel est connecté à une unité de traitement 56 de la société Applied Micro devices, à une mémoire à accès sélectif 58 de 48K de la société Electronic Solutions, Inc., et à une mémoire amo vible constituée par une unité de commande 60 de disquettes, telle que le modèle 8/8 de la société Advanced Micro Devices et deux mémoires 62 à disquette de la société Shugart. On peut utiliser une grande divsersité de programmes pour traiter les images avec l'appareil de la Fig. 4 selon La tâche particulière que l'utIlisateur désire accomplir. Comme mentionne ci-dessous, on peut utiliser la programmation du Système 1285 de Hamamatsu. De préférence, cependant, la progration est effectuée de la manière suivante: Les taches sorjt tout d'abord divisées entrecelles qui doivent adxnsserchaque pixel d'une image donnée et celles qui adressent seulement un petit sous-ensemble du total. Etant donné que beaucoup de temps est consacré à la première catégorie de tâches, celles-ci sont programmées en langage assembleur dans le processeur d'interface 45 (le processeur Intel 80/20 de la Fig. 4). Les résultats de ces opérations sont alors transférées à l'ordinateur hôte 56 par l'intermédiaire de la mémoire à accès sélectif 50 à deux accès.En ce qui concerne l'ordinateur hôte,la quasi-totalité de la programmation est effectuée plus commodément dans un langage évolué, tel que le Pascal (le BASIC ou le FORTRAN pourrait être, en principe, également utilisé). Les types de tâche qui sont effectuées en langage assembleur sont notamment les transformations de l'échelle des gris, les convolutions et les calculs des histogrammes de l'échelle des gris. Les types de tâches effectuées par l'hôte comprennent la commande générale des autres dispositifs, l'identification et la segmentation d'objets présentant de l'intérêt qui se trouvent dans le champ visuel, le calcul de paramètres associés aux objets ainsi trouvés et la mise en forme des signaux de sortie représentant les résultats.Une autre manière de considérer la division des tâches effectuée de cette manière consiste à considérer que les tâches qui doivent être effectuées à des vitesses supérieures à celle d'un opérateur humain sont effectuées en langage assembleur. Les tâches qui sont compliquées ou qui peuvent être exécutées à une vitesse inférieure à la vitesse maximale peuvent être programmées en langage évolué. On trouve des objets dans un champ visuel principalement en réglant une fonctiqn de fenêtre d'échelle des gris pour des valeurs que l'on sait être caractéristiques de l'objet désiré. On peut établir ces valeurs à partir de connaissances préalables ou au moyen de techniques d'établissement d'histogrammes bien connues.Lorsqu'un pixel appartenant à un objet a été repéré dans le champ visuel,un programme de traçage de bord est appelé pour tracer le contour de l'ensemble de l'objet associé à ce pixel. Une fois que le bord a été trouvé, de nombreux paramètres utiles, tels que la position, la surface, la densité optique intégrée, peuvent être facilement calculés. La probabilité d'appartenance à des sous-groupes précédemment définis peut être déterminée à partir de ces paramètres calculés au moyen de théories de décision classiques. Des définitions de classification de morphologies de globules ou cellules sont établies par des observateurs expérimentés. Ces définitions sont alors utilisées comme base des algorithmes choisis. La précision du procédé est déterminée par une comparaison des résultats de la machine à ceux d'observateurs expérimentés qui examinent les mêmes échantillons.Les signaux de sortie réprésentant les résultats peuvent être programmés sous l'un quelconque des nombreux formats. Des histogrammes,des tracés linéaires et des tableaux récapitulatifs peuvent être produits à la demande pour répondre à des besoins particuliers. On voit ainsi que,dans la cuve ou chambre à circulation 10, le courant de particules qui se trouve dans la zone 18 d'observation d'image est bidimensionnel. Par conséquent, plusieurs particules peuvent être examinées dans un seul et même champ et différentes particules peuvent être distinguées optiquement, ce qui entraîne un certain nombre d'avantages importants. Par exemple, deux cellules ou globules qui s'écoulent ensemble peuvent être reconnus optiquement comme tels tandis qu'un compteur Coulter pourrait les reconnaitre comme un unique globule de grosseur double. En outre, on peut accentuer les images tramées fixes en utilisant les techniques d'accentuation numériques qui ont été mises au point pour les images transmises par satellites et on peut analyser les images individuelles pour obtenir des données sur les globules ou cellules individuels .Dans le cas d'un échantillon de sang, on peut obtenir des informations, telles que la taille, la surface de section transversale, la forme (globule circulaire, globule cible, hématiefalciforme, etc.) la densité optique, la teneur en hémoglobine, sur la base d'un globule, etc...Non seulement, il est possible d'analyser et de trier optiquement les globules ou cellules individuels de cette manière mais, en outre, lorsque les globules sont analysés et triés de cette manière, il est possible de compter individuellement les différents types de globules pour donner, automatiquement et en un unique passage,le nombre de globules rouges normaux par unité de volume d'échantillon, le nombre de globules rouges cibles par centimètre cube d'échantillon, le nombre de globules rouges falciformes par centimètre cube d'échantillon, le nombre de globules blancs, le nombre de plaquettes, etc... par centimètre cube d'échantillon. Une fois qu'une série d'images tramées fixes ont été prparées sous une forme numérique, on peut obtenir une très grande diversité d'informations très élaborées sur les particules contenues dans la série d'images selon la complexité du matériel et du logiciel d'ordinateur qui peuvent être utilisés pour l'analyse des images. De préférence, les informations obtenues à partir des images tramées fixes sont combinées pour fournir une information composite qui reflète le contenu de multiples images tramées fixes et/ou d'images de référence prédéterminées et l'information composite ainsi obtenue peut être utilisée de diverses manières. Ainsi, dans les systèmes simples, l'information peut être sortie sur imprimante, par exemple, pour porter à la connaissance d'un hématologue les résultats des mesures composites effectuées sur un échantillon de sang. Dans des systèmes plus complexes, les mesures composites peuvent être utilisées par une commande de processus,par exemple,pour commander la pression dans un homogénéisateur, la température dans un cristallisoir ou le débit de fourniture de substances nutritives à une culture microbienne dans le cas où le système contrôle la taille ou le nombre des particules. Ainsi, on peut noter que l'appareil peut être utilisé pour l'analyse d'une grande diversité de particules qui se déplacent dans un courant, aussi bien des particules biologiques, telles que les globules dans le sang ou les cellules, bactéries, cylindres et cristaux dans l'urine que des particules dans des analyseurs de gaz, etc.,et les signaux de sortie représentant les résultats de ces mesures peuvent être utilisés pour la commande de processus, par exemple la distribution de substances nutritives dans un courant contenant des micro-organismes comme mentionné cidessus, la commande de la croissance de polymères et de cristaux, etc... Pour assurer la précision et l'exactitude des informations obtenues au moyen de l'appareil décrit en se référant à la Fig. 1, il est nécessaire d'étalonner l'appareil de temps à autre. Selon le procédé de la présente invention, on injecte dans la cuve à circulation des particules d'étalonnage ayant des caractéristiques prédéterminées, telles que la taille, la forme, la couleur, l'intensité et le volume de chacune des particules d'étalonnage. En outre également, on peut injecter en même temps dans la cuve à circulation plusieurs types différents de particules ayant des caracté ristiquesprédéterminées différentes. Une série d'images tramées fixes des particules qui se trouvent dans la zone 18 d'observation d'image sont enregistrées par les moyens capteurs d'images34.Les images sont traitées pour calculer ces caractéristiques.Sur la base des données qui sont ainsi obtenues par le traitement des images, c'est-à-dire des caractéristiques calculées, et sur la base d'une connaissance à priori de ce que sont ces caractéristiques,on peut normaliser le système d'analyse à écoulement continu pour corriger les erreurs éventuelles. Les erreurs peuvent provenir d'un certain nombre de sources et être dues, notamment, sans que cette énumération soit limitative,à l'accumulation de poussière, au vieillissement de la lampe,etc.. Plus spécifiquement, on peut utiliser les particules d'étalonnage aux fins ci-après. En premier lieu, on peut utiliser les particules d'étalonnage pour normaliser le système optique pour la mesure des dimensions. Par exemple, si le processeur électronique 36 détermine qu'une particule de forme sphérique ayant un diamètre de 20 sm n'a que 19,0 ssm, un facteur de correction de 5% doit être appliqué à toutes les mesures (en admettant que l'erreur est linéaire sur tout l'intervalle de mesure). En second lieu, on peut utiliser les particules d'étalonnage pour déterminer l'orientation des particules dans le courant. Comme précédemment indiqué, une particule qui s'écoule à travers la cuve à circulation 10 est orientée approximativement avec sa surface de section transversale maximale parallèle à la largeur de la cuve et avec sa surface de section transversale minimale transversale à la direction d'écoulement. Par conséquent, une particule en forme de disque, telle qu'un globule rouge de sang humain, s'oriente d'ellemême dans le courant àvec le plan du disque approximativement parallèle au plan de la largeur et de la longueur de la cellule. On peut utiliser une particule ayant une forme géométrique particulière que l'on fait passer à travers la cuve à circulation 10. On peut utiliser l'orientation escomptée de la particule d'étalonnage pour confirmer l'orientation correcte des particules dans l'échantillon de fluide. L'orientation correcte des particules est le résultat d'un écoulement laminaire, c'est-à-dire qu'il n'y a pas de turbulence dans le courant. En troisième lieu, on peut utiliser les particules d'étalonnage comme éléments marqueurs pour indiquer la position du courant d'échantillon de fluide. Par exemple, si l'échantillon de fluide est un fluide spinal et si les particules sont des bactéries,le nombre de particules constituées par des bactéries sera extrêmement petit. Ainsi, l'opérateur et le système verront de nombreuses images sans particule. Pour garantir au système et à l'opérateur que l'échantillon de fluide passe effectivement dans le champ visuel, on peut ajouter des particules d'étalonnage à l'échantillon pour fournir une indication de la position du courant d'échantillon de fluide. Enfin, on peut utiliser le nombre des particules d'étalonnage pour quantifier le volume et la distribution de l'échantillon de fluide. D'une manière générale, on peut utiliser comme particule d'étalonnage une particule quelconque sous réserve qu'elle puisse être détectée par le système d'analyse comme étant différente des particules contenues dans l'échantillon de fluide. De préférence, on injecte les particules d'étalonnage à un taux connu. On peut injecter les particules d'étalonnage indépendamment dans la cuve à circulation 10 pour étalonner le système d'analyse à écoulement continu ou on peut également injecter les particules d'étalonnage dans la cuve à circulation 10 en même temps que l'échantillon de fluide biologique,tel que du sang ou de l'urine, s'écoule à travers la cuve à circulation 10. Dans ce dernier procédé d'utilisation, on peut utilisez les caractéristiques connues des particules d'étalonnage pour mesurer le même type de caractéristiques,bien qu'il s'agisse alors de la mesure de caractéristiques inconnues, des particules microscopiques contenues dans l'échantillon de fluide biologique.En outre, on peut utiliser la densité de la population de particules d'étalonnage pour calculer la densité de la population de particules contenues dans l'échantillon de fluide. On doit insister sur le fait que l'on peut mélanger les particules d'étalonnage avec l'échantillon de fluide biologique contenant des particules microscopiques avant d'injecter l'ensemble du mélange physique dans la cuve à circulation 10. On donnera ci-après des exemples des types de particules d'étalonnage qui peuvent être injectées dans la cuve à circulation 10 et de leurs utilisations. Exemple nO I Des particules d'étalonnage constituées par des microsphères carboxylées Fluoresbrite (marque de co.mrterce) qui ont une forme sphérique de 4,5 + 0,1 ssm de diamètre,de couleur jaunâtre-orange, ont la même taille que les globules rouges typiques et,ainsi,elles peuvent être utilisées pour servir de normes dans la mesure de la taille des globules rouges. On peut également compter les particules d'étalonnage indépenuamument des globules sanguins normaux pour fournir un étalonnage volumétrique afin de perinettre la détermi- nation de la concen4=ration des globules sanguins. Exemple nO II On peut utiliser des particules d'étalonnage constituées par des perles de latex de polystyrène teint de 5,5 ssm de diamètre, de forme sphérique et de couleur bleue, les injecter dans la cuve à circulation 10 pour normaliser les dimensions et les couleurs du système et on peut les utiliser également pour déterminer le volume de l'échantillon de fluide qui est examiné si l'on connait la concentration en perles par unité de volume de l'échantillon. En outre, on peut utiliser la distribution des perles pour indiquer la position et la distribution de l'échantillon dans le courant qui s'écoule à travers l'analyseur. Exemple nO III On utilise des particules de pollen d'ambrosia qui ont un diamètre d'approximativement 20 m, et qui peuvent être identifiées par leurs caractéristiques de taille, de densité optique et de bord avec un échantillon vaginal prélevé par aspiration pour effectuer un examen de cytologie exfoliative dans l'analyseur à écoulement continu afin de pouvoir repérer la position du courant d'échantillon et d'aider à déterminer la taille et le nombre des cellules épithéliales. Exemple n0 IV On utilise des globules rouges de sang humain ayant un diamètre d'approximativement 5,0 à 6,0 am qui sont identifiés par leur forme et leur densité optique dans un échantillon de levure pour vérifier l'orientation correcte des cellules dans l'analyseur à écoulement continu et pour mesurer la population de cellules de levure. Exemple nO V On utilise des perles de latex de polystyrène teint en rouge d'un diamètre de 1,0 t 0,1 ssm et de forme sphérique dans l'examen des fluides spinaux pour déterminer la présence de bactéries et pour servir de particules indicatrices dans un fluide qui ne contient,par ailleurs, que peu de particules. Exemple nO VI On utilise des globules rouges de sang d'oiseau, qui ont une section transversale elliptique dont le grand axe a une longueur d'environ 7,0 à 9,0 ssm dans une population de lymphocytes humains, dont ils peuvent être différenciés par la forme, la densité optique et la taille, pour déterminer les caractéristiques d'écoulement et la taille des lymphocytes. On constate ainsi qu'en injectant des particules ayant des caractéristiques prédéterminées, en ce qui concerne par exemple leurs dimensions, leur volume, leur forme et leurs caractéristiques spectrales,dans l'analyseur à écoulement continu, on peut normaliser l'analyseur et en commander le fonctionnement. On peut compenser et corriger les effets du vieillissement et de l'usure normale de l'dquipe- ment, tels que l'accumulation de poussière sur l'objectif du microscope, le bruit électronique, etc... à l'intérieur du système d'analyse, chaque fois que le système a besoin d'être normalisé. En outre, on peut injecter les particules d'étalonnage en même temps qu'on injecte l'échantillon biologique inconnu pour mesurer les particules microscopiques de l'échantillon biologique en les comparant à un étalon de référence. REVENDICATIONS 1 - Un échantillon de fluide pré-étalonné conçu pour être utilisé dans un système d'analyse d'image, cet échantillon étant caractérisé en ce qu'il comprend une série d'un type de particules d'étalonnage, ces particules ayant une caractéristique prédéterminée; un échantillon de fluide biologique contenant des particules microscopiques ayant des caractéristiques inconnues, qui doivent être analysées par le système; les lBarticules d'étalonnage et l'échantillon de fluide biologique Fiant mélangés en un mélange physique. 2 - Echantillon de fluide selon la revendication 1, caractérisé en ce que les > articlles d'étalonnage ont une caractéristique particulière en ce qui concerne leurs dimensions, leur volume, leur forme, leur couleur ou leur intensité. 3 - Echantillon de fluide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte plusieurs types de particules d'étalonnage. 4 - Echantillon de fluide selon la revendiation 1, caractérisé en ce que les particules d'étalonnage peuvent être dis tanguées des particules microscopiques par le système. 5 - Echantillon de fluide selon la revendication 4, caractérisé en ce que les particules microscopiques sont des globules sanguins. 6 - Echantillon de fluide selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'échantillon de fluide biologique est du sang. 7 - Echantillon de fluide selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'échantillon de fluide biologique est de l'urine. 8 - Echantillon de fluide selon la revendication 4, caractérisé en ce que les particules d'étalonnage ont une taille comprise entre 0,5 et 50 gm. 9 - Echantillon de fluide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on connait les proportions des particules d'étalonnage et d'échantillon de fluide biologique contenues dans le mélange physique. 10 - Un procédé d'étalonnage d'un analyseur à écoulement continu, ledit analyseur comprenant une cuve à circulation (10), un microscope (30) agencé de façon à être mis au point sur la zone (18) d'observation d'image de la cuve et des moyens (34) capteurs d'images pour capter des images tramées approximativement fixes des particules contenues dans la zone d'observation d'image, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste: à injecter un échantillon d'un type de particules d'étalonnage dans la cuve à circulation (10), ces particules ayant un paramètre prédéterminé; à former une série d'images tramées fixes des particules contenues dans la zone d'observation d'image au moyen des moyens capteurs d'images; à traiter les images pour calculer le paramètre; et à étalonner l'analyseur sur la base du paramètre prédéterminé et du paramètre calculé. 11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape d'injection consiste, en outre, à injecter l'échantillon à un taux connu. 12 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, les étapes qui consistent à faire écouler un échantillon de fluide biologique contenant des particules microscopiques à travers la cuve à circulation (10), et à mesurer le même paramètre des particules microscopiques que le paramètre prédéterminé des particules d'étalonnage. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape d'écoulement et l'étape d'injection sont effectuées simultanément. 14 - Procédé selon l'une des revendications 11 et 13, caractérisé en ce que le paramètre prédéterminé est le volume, la taille, la forme, la couleur ou l'intensité de chaque particule d'étalonnage. 15 - Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le paramètre prédéterminé est également la densité de population des particules d'étalonnage. 16 - Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'échantillon de fluide biologique est de l'urine. 17 - Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'échantillon de fluide biologique est du sang. 18 - Procédé selon la revendication 10, caracterisé en ce que les particules ont une taille comprise entre 0,5 et 50 ssm. 19 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape d'injection consiste à injecter plusieurs types de particules d'étalonnage.