Brevet FR2533220A1 — publié le 19840323

Nouveaux disaccharides formés de motifs à structure acide Dglucuronique et D- glucosamine et procédé pour leur préparation L'invention est relative à de nouveaux disaccharides formés de motifs à structure acide D-glucuronique et Dglucosamine et à un procédé pour leur préparation. Elle concerne plus particulièrement des disaccharides formés de motifs à structure acide D- glucuronique et N-acyl D-glucosamine. Ces disaccharides répondent à la formule (I) suivante dans laquelle les différents substituants présentent les significations suivantes R représente un radical acyle, en particulier un radical acétyle, R1 un radicalaliphatique ou aromatique. notamment alcoyle, de 1 à 4 atomes de carbone, en particulier un radical méthyle, A un atome d'hydrogène, un radical alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone, en particulier un radical méthyle,0u un cation métal 'que, en particulier -un métal alcalin, plus spéciaIe ment du sodium, R2 et R3 représentent un anion, éventuellement sous forme de sel avec un cation organique ou minéral et, dans ce dernier cas, en particulier un groupe sulfate salifié par un cation d'unmétal alcalin, plus spécialement du sodium. Dans une famillé préférée de disaccharides de l'invention, les radicaux R2 et R3 représentent des groupes - S03 Na+ et A représente Na+. D'une manière avantageuse, la séquence disaccharidique de l'invention se retrouve dans des fragments ou des fractions d'héparine ou d'héparanne-sulfate possédant notamment une activité spécifique anti-Xa (Yin et Wessler) plus élevée que celle de l'héparine et une activité anticoagulante globale, mesurée selon le titre USP, plus faible. On rappelle que les titres Yin et Wessler et USP sont définis notamment dans la demande de brevet FR n" 78 31857 du 6 novembre 1978 au nom de la Demanderesse. Les produits de l'invention sont donc particulièrement intéressants en tant qu'intermédiaires de synthèse pour l'obtention de produits doués d'activité dans des tests de coagulation spécifiques de certains facteurs et plus spécialement du facteur Xa. Ils sont également avantageusement utilisables comme produits de référence pour l'étude de ce type de structure. Conformément au procédé de l'invention, les disaccharides définis ci-dessus sont préparés par reaction d'un monosaccharide à structure acide D- glucuronique avec un monosaccharide à structure N-acyl-D-glucosamine répondant aux caractéristiques suivantes. Dans ces composés de départ, toutes les positions sont bloquées excepté celles devant intervenir pour l'établissement de la liaison glycosidique. Pour l'établissement d'une liaison 1,4 g, on a recours à un monosaccharide possédant un groupe réactif en position 1 et à un autre monosaccharide comportant en position 4 un groupe capable de réagir avec le groupe réactif ci-dessus. Les halogénures du composé à structure acide glucuronique étant aisément accessibles, on base avantageusement la condensation sur la réaction entre l'halogénure du composé en question et l'alcool du disaccharide à structure D-glucosamine. Les autres positions de ces monosaccharides sont bloquées par des groupements n'intervenant pas dans la réaction de condensation, compatibles entre eux et éli- minables soit à la fois, soit par séquence pour introduire les groupements fonctionnels désirés ou libérer certains groupements -OH. Les positions destinées à être substituées par des anions, en particulier Par des groupes sulfate, sont avantageusement substituées par des groupes benzyle et celles qui seront occupées par des groupes -OH sont alors substituées par des groupes acétyle. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on fait réagir les monosaccharides de formules (II) et (III) dans lesquelles A représente un groupe alcoyle R1 et R présentent les significations - données ci-dessus, Ac représente un groupe acétyle et X un atome d'halogène, les conditions mises en oeuvre, en particulier de concentration en réactif, de durée et de température étant choisies pour réaliser la condensation désirée. On traite ensuite le disaccharide résultant afin d'introduire tout d'abord les anions souhaités en positions 3 et 6 du motif à structure glucosarnine. Lorsque ces anions sont en place, on procède alors à l'élimination des groupements acétyle en positions 2, 3 et 4 du motif à structure acide glucuronique, avantageusement en utilisant une base forte, ce qui permet également, au cours de la meme étape, de salifier les groupes anioniques en positions 3 et évoqués ci-dessus et le groupe carboxyle du motif acide glucuronique. Les produits intermédiaires mis en oeuvre dans ce procédé sont nouveaux et en tant que tels entrent dans le cadre de l'invention. Ces produits présentent l'avantage de constituer des précurseurs de séquence de base de lihéparine ou de lthéparanne-sulfate. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples qui suivent. Les formules des composés dont question dans ces exemples sont représentées sur 1 a figure unique dans laquelle les numéros indiqués correspondent à ceux utilisés dans les exemples pour désigner les mêmes composés. Les symboles utilisés dans ces figures ont les significations suivantes: Ac = acétyle Me = méthyle, Ts = tosyle. EXEMPLE 1 Synthèse du monosaccharide 5 ou méthyl 2-acétamido-36-di-O-benzyl-2-désoxy- a 0-glucopyranoside. Cette synthèse est effectuée selon les 4 étapes suivantes à partir du monosaccharide 1 préparé selon la technique de A. Neuberger, Journal of Chemical Society 1941, pages 50-51 1 - benzylation du groupe -OH en position 3. 2 - élimination du radical benzylidène aux fins de libéra tion des groupes -OH en positions 4 et-6. 3 - tosylation du groupe -OH en position 6. 4 - benzylation du groupe -OTs en position 6. Etape 1 : réaction debenzylation. A une solution du composé 1 (6,5 g, 20,10 mM) dans le diméthylformamide (120 ml), on ajoute de l'hydroxyde de baryum octa-hydrate (3,6 g) et de l'oxyde de baryum (16 g) Après 10 minutes d'agitation à température ambiante, du bromure de benzyle (4,5 ml) est ajouté gouttez goutte. La réaction se poursuit pendant toute une nuit. Après dilution par du chloroforme (100 ml), le mélange réactionnel est filtré sur Célite. Le filtrat est concentré à sec, on obtient ainsi un résidu blanc dont l'analyse en chromatographie sur couche mince indique qu'il contient un seul produit, à savoir le dérivé 2, qui sera engagé tel quel, dans l'étape suivante. Etape 2 : élimination du groupe benzylidène. Le résidu obtenu ci-dessus est dissous dans un mélange de méthanol (370 ml) et d'eau (130 ml). A cette solution, on ajoute de l'acide paratoluène sulfonique monohydrate (3 g), puis on porte le mélange à reflux pendant une heure. Après refroidissement, la majeure partie du méthanol est évaporée, puis de l'eau (250 ml) est ajoutée. Après lavage par une faible quantité de chloroforme (100 ml), la phase aqueuse est soumise au traitement suivant 10) précipitation des sels de baryum avec de l'acide sulfurique ; 20) filtration du sulfate de baryum formé ; 30) élimination de l'excès d'acide à l'aide d'une résine IRA 45 (QH-). près élimination de la résine et concentration, on obtient un résidu légèrement jaune (5,7 g), à savoir le dérivé 3. Ce dérivé est engagé tel quel dans la préparation du composé 4. Etape 3 : réaction de tosylation. Ce dérivé 3 est dissous dans un mélange de dichlorométhane (150 ml) et de DMF (10 ml). A cette solution1 on ajoute du chlorure de tosyle (5,6 g, 30 mM), puis de la diméthylaminopyridine (121 mg) et enfin de la triéthylamine (5 ml). La réaction évolue à l'abri de l'humidité et sous courant d'azote sec. Après 18 heures de réaction, on ajoute de l'eau glacée puis on abandonne le mélange sous agitation pendant 14 heures environ. Le mélange réactionnel est ensuite dilué avec du di chiorométhane puis la phase dichiorométhane est lavée successivement avec de l'acide chlorhydrique 2M, du bicarbonate de sodium saturé, puis avec de l'eau jusqu'à pH neutre. Après séchage sur sulfate de sodium et filtration, le solvant est évaporé. Le résidu obtenu est purifié sur une colonne de gel de silice (200 g) dilué avec un mélange acétate d'éthyle-hexane (4/1, v/v). Les fractions contenant le dérivé 4 pur sont regroupées. Après élimination des solvants, on obtient un résidu solide (4,6 g) qui est engagé directement dans la synthèse du composé 5. Etape 4 : réaction de benzylation. Le dérivé 4 obtenu ci-dessus est dissous dans du diméthylformamide anhydre (50 ml). A cette solution, on ajoute une solution molaire de benzylate de sodium dans l'alcool benzylique (30 ml). Le mélange est ensuite chauffé à 900C pendant une heure. Après refroidissement à température ambiante, le mélange est ensuite concentré à sec. Il est ensuite repris par du chloroforme (400 ml), la phase chloroformique est lavée avec de l'eau, du chlorure de sodium saturé, séchée, puis concentrée à sec. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (200 g, ghloroforme/acétate d'éthyle, 1/i, v/v). On obtient ainsi le dérivé 5 (2,3 g). Le rendement par rapport au composé 1 est de 27,6%. O Le composé 5 est cristallin, PF 149-1509C, (C)20= 870 (c=1, chloroforme). L'analyse du spectre infrarouge et l'analyse élémentaire confirment la structure attendue pour le produit 5. o Exemple 2 Synthèse du disaccharide 10. Cette synthèse comporte (1) La condensation des dérivés 5 et 6 conduisant au disaccharide 7. (2) L'élimination des groupes benzyle conduisant au dérivé 8. (3) La sulfatation des groupes -OH du dérivé 8, conduisant au dérivé 9, suivie de la salification des groupes anioniques et de l'élimination des groupes acétyle. 10) Synthèse du disaccharide 7. Cette synthèse est effectuée à partir des monosaccharides 5 et 6. L'halogénure 6 est préparé selon la technique de G.N. Bollenback et val., Journal of American Chemical Society, 77 (1955), p. 3312. A une solution de monosaccharide 5 (450 mg, 1,1 mM), dans le dichloroéthane (30 mol), on ajoute du bromure mercurique (400 mg, 1,1 mM). Après distillation d'environ 10 ml de dichloroéthane, on ajoute au mélange réactionnel des tamis moléculaires en poudre (4 a). L'halogénure 6-(1,1 g, 2,75 mM) dans du dichloroéthane (10 ml) est alors ajouté. Après distillation de 10 ml de dichloroéthane, le mélange réactionnel est abandonné à reflux pendant environ 14 heures à une température de 90-100 C. Après refroidissement, le mélange réactionnel est dilué par du dichlorométhane (100 ml), puis les solides sont éliminés par filtration sur filtres plissés. La phase organique est lavée avec une solution de iodure de potassium à 10% (2 x 25 ml), puis avec une solution de bicarbonate de sodium à 5% (2 x 25 mî) et enfin avec de l'eau jusqu'à pH neutre.Après séchage sur sulfate de sodium, filtration et concentration, le résidu est purifié sur une colonne de gel de silice (150 g), dilué, successivement, avec-trois mélanges acétone-éther (1/5 puis -1/4, puis 1/2, v/v). On obtient ainsi le d,isaccharide 7 pur (390 mg) sous forme forme de cristaux. FF = 189-190 C ; (a)20 = -+ 60 (c=0,4 chloroforme). Le spectre infrarouge, de même que le spectre RMN et l'analyse élémentaire, confirment la structure attendue. 20) Synthèse du disaccharide 8. A une solution du dérivé -7 (100 mg) dans le méthanol (20 ml), on ajoute du catalyseur (Pd/C, 5%, 100 mg) et on agite la suspension ainsi obtenue sous courant d'hydrogène pendant 3 jours. Le catalyseur est ensuite éliminé par 'filtration. Après évaporation, on obtient un résidu (73 mg, 97%) constitué par le disaccharide 8. Le spectre de RMN confirme la structure attendue pour ce composé. On notera que le disaccharide 8 est le précurseur du motif de base de l'héparanne -sulfate. Il suffit pour le déprotéger de le soumettre à une réaction de saponification, comme rapportée ci-après pour l'obtention du dérivé 10 à partir du dérivé 9. 30) Synthèse du disaccharide 10. A une solution du composé 8 (70 mg) dans le diméthylformamide (2 ml), on ajoute l'agent de sulfatation (complexe triméthylamine-sulfure-trioxyde) (75 mg). Après une nuit, on procède à une nouvelle addition de complexe (35 mg). Après 6 heures, la réaction est terminée, le mélange est évaporé à sec, repris par du chloroforme, neutralisé avec de la triéthylamine et évaporé. Une chromatographie sur colonne de gel de silice (20 g, méthanol/chloroforme, 1/2, v/v) permet d'isoler le dérivé 9 sulfaté pur qui se présente sous forme de poudre blanche. Ce dérivé est engagé directement dans la synthèse du disaccharide déprotégé 10. A une solution du dérivé 9 (71 mg) dans le méthanol (9 ml), on ajoute de l'eau (4 ml) puis,goutte à goutte, une solution de soude 1 M (1 ml). Après 4 heures d'agitation à températu-re ambiante, le mélange réactionnel est passé sur une colonne d'Amberlite IR 120 H+. La solution ainsi obtenue est neutralisée puis les sels sont éliminés par passage sur une colonne de Sephadex G25 diluée avec de l'eau. Les fractions contenant le disacchari,de sulfaté sont regroupées. Après lyophilisation, on obtient le dérivé 10 sous D forme d'une poudre blanche (46 mg) ()2DO = 34,50 (c=1, eau). L'analyse conductimétrique indique pour ce dérivé un rapport sulfate/carboxyle égal à 2. L'analyse élémentaire, de même que l'analyse en RMN du carbone 13, confirment la structure attendue pour ce produit. REVENDICATION Disaccharides formés de motifs à structure acide D-glucuronique et D-glucosamine, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule dans laquelle les différents substituants présentent les significations suivantes R représente un radical acyle, en particulier un radical acétyle, a R1 un radical alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone, en parti culier un radical méthyle, ou encore aryle, A un atome d'hydrogène, un radical alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone, en particulier un radical méthyle,ouun cation metallique,en perticulier; ; un métal alcalin, plus spéciale ment du sodium, R2 et R3 représentent un anion, éventuellement sous forme de sel avec un cation organique ou minéral et, dans ce dernier cas, en particulier un groupe sulfate salifié par un cation d'unmétal alcalin, plus spécialement du sodium.