Brevet FR2530953A1 — publié le 19840203

i " Emulsion perfluoro-chimique utilisable comme sang arti- ficiel et procédé pour sa préparation L'invention concerne une émulsion perfluorochimique que l'on peut utiliser comme sang artificiel pour le transport d'oxygène. L'alimentation en sang naturel entier est déficien- te et ce déficit augmentera probablement De nouvelles méthodes pour prolonger la conservation du sang à l'état congelé, et des perfectionnements dans le stockage du sang à l'état liquide, ont eu pour résultat une plus grande efficacité de l'utilisation du sang disponible dans certains domaines, mais les besoins de sang à l'échelle mondiale pour des transfusions excède de loin la collecte Comme il est peu probable qu'il se produise une augmentation appréciable de cette collecte, ces besoins devront être satisfaisants au moyen de substances autres que le sang naturel ou ses dérivés Un sang arti- ficiel, disponible en quantités illimitées et exempt d'agents infectieux et d'antigènes serait un agent théra- peutique extrêmement utile. Les émulsions de composés perfluorés semblent main- tenant être très utilisables avec succès comme sang arti- ficiel Les sangs artificiels à base d'émulsions de pro- duits chimiques perfluorés sont exempts d'agents infec- tieux et d'antigènes (on utilisera indifféremment, dans ce qui suit les termes composé perfluoro, et produit chimique perfluoré) On n'a pas besoin de tenir compte du groupe sanguin du récepteur Toutefois, ces sangs artificiels sont dépourvus de facteurs de -coagulation, de plaquettes, d'immunoglobulines et d'anticorps. Les émulsions de produits chimiques perfluorés ont été utilisées avec succès comme substituts des globules rouges du sang dans la perfusion d'organes isolés d'ani- maux et pour la fourniture d'oxygène aux tissus d'animaux intacts Récemment, une émulsion de produits chimiques perfluorés a été utilisée pour le traitement de patients humains. Bien que les composés perfluorés soient chimique- ment inertes, ils peuvent affecter défavorablement les plaquettes du sang et les facteurs de coagulation, ce qui aurait pour résultat une thrombocytopénie (c'est-à-dire, une diminution du nombre absolu des plaquettes du sang) et des troubles dans la coagulation du sang On a trouvé que les effets sur les plaquettes sont probablement dûs aux propriétés de surface inhabituelles des composés per- fluorés, notamment une tension superficielle très faible. Cet effet peut être surmonté en revêtant les particules de composé perfluoré avec une substance qui masque son activité superficielle. L'efficacité des émulsions de produits chimiques perfluorés comme sangs artificiels est limitée par la durée relativement courte de la rétention des particules émulsionnées dans la circulation Il est en conséquence souhaitable de réaliser des particules en émulsion qui puissent rester pendant une longue durée dans la circula- tion, et qui n'aient pas d'effet défavorable sur l'agré- gation des plaquettes ni sur les facteurs de coagulation. On connaît déjà dans la technique des compositions de sang artificiel comprenant des composés perfluorés dans des émulsionnants phospholipidiques Toutefois ces émulsions de l'art antérieur contiennent sensiblement moins de composé perfluoré et sensiblement moins d'émul- sionnant que dans la présente invention Elles sont aussi sensiblement moins stables. Le brevet U S N 3 958 014 décrit la préparation d'une émulsion de perfluorocarbone dans la lécithine. Les concentrations de perfluorocarbone et de lécithine sont de 25 à 30 % (w/v) et 3 à 5 % (w/v) respectivement. Ici et dans la suite, "% w/v" signifie la quantité de matière mesurée en grammes, contenue dans 100 ml d'émul- sion; "% (v/v)" signifie le volume de matière mesurée en ml, contenue dans 100 ml d'émulsion. Le brevet U S N 3 962 439 décrit la préparation d'émulsions de composés perfluorés dans la lécithine con- tenant 10 à 40 % (w/v) de perfluorocarbone et 2 à 6 % (w/v) de lécithine Les émulsions de ce brevet sont insta- bles. Le "FLUOSOL-DC" est une émulsion préparée par Creen Cross Corporation (voir brochure datée du 15 Mai 1975 "Technical Information Ser N 1, pages 3 '8 et 39) Le "FLUOSOL DC" doit être stabilisé par pasteurisation à C pendant une heure, trois jours successivement, car la stérilisation à 100 C détruit 1 'émulsion I 1 doit être stérilisé dans des conditions relativement douces, chauffage répété à 60 C Dans les six jours qui suivent l'injection faite à un patient récepteur, la couche de phospholipide enrobant la particule de perfluorocarbone disparaît Les particules de perfluorocarbone, maintenant nues, disparaissent de la circulation. Le brevet U S N 4 105 798 décrit une émulsion de composé perfluoré dans la lécithine contenant 10 à 30 % (v/v) de perfluorocarbone et 1 à 5 % (v/v) de lécithine. On a récemment constaté qu'on obtient une émulsion dont la stabilité est améliorée en combinant deux compo- sés perfluorés L'émulsion qui fait l'objet du brevet U.S N 4 252 827 est une émulsion de deux perfluorocar- bone ( 10 à 50 % w/v au total), dans un émulsionnant tensio-actif nonionique à haut poids moléculaire ( 2 à % w/v) un "adjuvant émulsionnant" phospholipidique ( 0,1 à 1 % w/v) et un acide gras ( 0,0004 à 0,1 % w/v). Cdtte composition, bien que plus stable que les autres compositions est d'une utilité limitée Elle est préparée et stockée en trois composants séparés qui doivent rester congelés jusqu'immédiatement avant le moment de l'injec- tion L'injection doit se faire dans les 24 heures qui suivent la décongélation et le mélange La décongélation provoque une perte de la stabilité de l'émulsion Un point plus important est que cette émulsion ne peut pas être stérilisée à l'autoclave par les techniques habi- tuelles Cette stérilisation est effectuée à 1150 C pen- dant 12 minutes dans un stérilisateur rotatif spéciale- mentconçu Les émulsions du brevet U S N 4 252 827 sont isotoniques, mais hyperioniques. Le "PLURONIC F-68 ", produit tensio-actif non-ioni- que à haut poids moléculaire est l'émulsionnant utilisé dans le "FLUOSOLDA", composition préparée suivant le brevet U S N 4 252 827, et qui est un produit de la Green Cross Corporation du 3 apon Les examinateurs ont constaté que le "PLURONIC-F-68 " inhibe la coagulation du sang et l'agrégation des plaquettes. Résumé de l'invention: L'invention propose une composition contenant des particules d'un composé perfluoré émulsionnées dans un milieu aqueux physiologiquement acceptable, les particu- les de produit perfluoré étant enrobées avec un lipide non-antigénique, La proportion de composé perfluoré dans l'émulsion est de préférence de 15 à 40 % (v/v) ce qui correspond à environ 30 à 75 % (w/v) La proportion de lipide dans l'émulsion est de préférence d'environ 7 à 9 % (w/v) Ce chiffre est sensiblement plus élevé que dans les émulsions de composés perfluorés de la technique antérieure L'émulsion peut aussi contenir différents sels acceptables physiologiquement. La perfluorodécaline est le composé perfluoré pré- féré Un lipide recommandé est un phospholipide tel que la lécithine, que l'on peut obtenir sous la forme de phospholipide du jaune d'oeuf La lécithine est aussi - présente dans les phospholipides des grains de soja. L'émulsion de composé perfluoré de l'invention est préparée par addition du composé perfluoré au lipide dispersé dans un milieu aqueux par traitement aux ultra- sons On continue à faire agir les ultra-sons et centri- fuge Les grosses particules sont éliminées en rejetant la fraction de fond de l'émulsion. L'invention donne la première émulsion stable d'un produit perfluoré unique, utilisable comme sang artifi- ciel, qui soit non-hémolytique, stérilisable à l'auto- clave par les techniques courantes, et stockable aux tem- pératures normales de réfrigération La composition peut même être stockée à la température ambiante pendant des durées importantes Enfin, la présente composition est à la fois isotonique et iso-ionique par rapport au plasma de sang naturel. Description détaillée de l'invention La présente invention donne une émulsion de composés perfluorés dont la stabilité est améliorée L'émulsion contient de préférence environ 15 à 40 % (v/v) de composé perfluoré, ce qui correspond à environ 30 à 75 % (w/v). L'émulsion contient de préférence environ 7 à 9 % (w/v) de lipides qui peuvent agir à la fois comme agent d'enro- bage et comme émulsionnant Le composé perfluoré préféré est la perfluorodécaline Le lipide préféré est la léci- thine. La concentration en composé perfluoré peut s'écarter légèrement de ces limites Toutefois les émulsions conte- nant sensiblement plus de 75 % (w/v) de composé perfluoré seraient trop visqueuses pour être utilisées comme sang artificiel Les émulsions contenant sensiblement moins de 15 % (w/v) de composé perfluoré seraient si diluées qu'il faudrait une quantité trop grande d'émulsion pour assurer un transport d'oxygène convenable. Les composés perfluorés ont la possibilité d'absor- ber et de libérer l'oxygène Toutefois, l'utilisation des composés perfluorés dans les préparations de sang arti- ficiel est limitée dans une large mesure par l'effet des composés perfluorés sur les plaquettes Cet effet est surmonté par l'enrobage des particules de composé per- fluoré avec une matière d'enrobage qui masque l'activité de surface du composé perfluoré tout en imitant l'appa- rence extérieure (dans le système circulatoire) d'un globule rouge normal du sang. L'invention se sert du lipide pour enrober les par- ticules de composé perfluoré Les lipides préférés sont les phospholipides tels que la lécithine Les particules enrobées sont contenues dans une émulsion L'émulsionnant peut être la même substance qui enrobe les particules, c'est-à-dire un phospholipide, ou, il peut être une subs- tance différente La lécithine a l'avantage d'être par elle-même un émulsionnant acceptable; de ce fait on n'a pas besoin d'avoir recours à un émulsionnant supplémen- taire. On ne peut pas utiliser tous les composés perfluorés dans les préparations de sang artificiel Les composés perfluorés ont tendance à s'accumuler dans les tissus du corps, notamment dans le foie et la rate Certains compo- sés perfluorés ne s'émulsionnent qu'avec difficulté On a trouvé que la perfluorodécaline est le meilleur composé perfluoré si l'on considère la vitesse d'élimination par le foie et la rate La perfluorotripropylamine s'émulsion- ne plus facilement que la perfluorodécaline, mais sa -2530953 vitesse d'élimination par le foie et la rate est beaucoup plus faible Comme autres composés perfluorés que l'on a utilisés, on peut citer les perfluorométhyldécaline et la perfluorotributylamine Les émulsions de perfluorobutyl tétrahydrofuranne ont été trouvées inacceptables dans les sangs artificiels. Suivant l'invention, les particules de composé perfluoré sont enrobées avec un lipide adhérent qui ne sera pas rejeté par le récepteur mais qui apparaitra, dans la circulation, comme la membrane d'un globule rouge normal du sang On a constaté que-le phospholipide est acceptable, le phospholipide du jaune d'oeuf ou la léci- thine étant préférés La lécithine étant un composant des cellules naturelles du sang ne simule pas seulement la membrane des érythrocytes naturels, mais elle est non- toxique (non antigénique pour le récepteur) De plus, on a constaté *que la lécithine n'a pas d'effet sur la coagu- lation du sang La source préférée de lécithine est le phospholipide du jaune d'oeuf La lécithine peut aussi être obtenue sous une forme moins pure dans le phospholi- pide du soja. Dans un mode de réalisation recommandé de l'inven- tion, le lipide est utilisé à la fois comme enrobage pour la particule, et comme émulsionnant, ce qui dispense de l'utilisation d'un émulsionnant supplémentaire Toutefois, si on le désire, on peut utiliser un émulsionnant toléra- ble, par exemple, un des tensio-actifs non-ioniques que l'on peut trouver dans le commerce sous la marque de fa- brique "PLURONIC" de la BASF-Wyandotte Corp. Dans le mode de réalisation préféré, les particules de composé perfluoré sont enrobées avec une lécithine adhérente dans la proportion d'environ 50 à 70)> mol/ml de produit perfluoré L'augmentation de la concentration en lécithine ( 7 à 9 % (w/v)) a pour résultat que l'émul- sion de particules enrobées de lécithine est sensiblement plus stable, les particules restant dans la circulation jusqu'à quatre jours Les particules perfluorées enrobées de lécithine de la technique antérieure telles que le "Fluosol DC", ( 3,6 % (w/v)) restent stables dans la cir- culation pendant environ six heures seulement. Les particules plus grosses que les érythrocytes naturels qui ont un diamètre d'environ 7 à 10 > 44 ne pas- sent pas dans les petits capillaires De plus les grosses particules sont chassées de la circulation p-lus rapide- ment que les plus petites Les particules plus grosses que 0,6 YLIL sont considérées comme toxiques La dimension optimale des particules est d'environ 0,1 / Les particules de l'émulsion de l'invention ont un diamètre moyen d'environ 0,1 f" Les sangs artificiels préférés de l'invention montrent, quand on les examine par microscopie sur champ obscur, plus de 95 % de parti- cules dont le diamètre est inférieur a 0,2 fr En micros- copie sur champ obscur, les particules de 0,2 ' et plus grosses sont visibles sous la forme de structures dis- crêtes; les particules inférieures à 0,2,& de diamètre ne sont pas visibles, mais font apparaître une luminosité diffuse sur le champ. Les émulsions de l'invention sont préparées dans des milieux aqueux, physiologiquement acceptables Le milieu doit contenir les électrolytes nécessaires à la concentration voulue pour rendre l'émulsion à la fois isotonique et isoionique par rapport au plasma du sang. Les émulsions constituant un sang artificiel de la techni- que antérieure sont hyperioniques et, par suite, sont moins stables dans le plasma du sang. On a constaté que la solution Tyrode est un milieu acceptable La solution Tyrode est une solution aqueuse contenant les composants suivants: Na Cl, KC 1, Ca Ci 2, Mg C 12, Na H 2 P 04, Na HCO 3 et glucose Les concentrations en électrolytes doivent être choisies de façon à rendre l'émulsion obtenue isotonique et iso-ionique par rapport au plasma du sang. le p H de l'émulsion obtenue est ajusté pour qu'il soit entre 7,2 et 7,6 Une émulsion à p H 7,4, le p H du plasma du sang, est la meilleure La pression osmotique est idéalement de 300 m Osm/ 11 Les électrolytes et les concentrations respectives des électrolytes d'un mode de réalisation préférées sont indiquées dans le tableau 1. Tableau 1 Electrolytes Electrolyte Concentration de l'électrolyte __( Les émulsions de sang artificiel suivant l'inven- tion sont préparées en ajoutant un composé perfluoré à un lipide dispersé dans un milieu aqueux acceptable physio- logiquement, suivi d'un traitement par des ultra-sons et d'une centrifugation Ce procédé diffère nettement des procédés de la technique antérieure qui reposent sur une homogénéisation mécanique Le procédé de l'invention est décrit comme suit Un lipide purifié est dispersé dans un milieu phy- siologiquement acceptable dont le p H est approximative- ment de 7,4 Un traitement aux ultra-sons est préféré à l'homogénéisation mécanique Ce traitement aux ultra-sons peut être répété, après un court intervalle de temps, pour assurer une dispersion adéquate On ajoute alors une quantité d'un composé perfluoré, suivi de répétitions du traitement aux ultra-sons à basse température jusqu'à ce qu'il se forme une émulsion d'un blanc laiteux La quantité de composé perfluoré ajoutée peut varier suivant la concentration en composé perfluoré que l'on désire dans l'émulsion finale. Les grosses particules sont éliminées de l'émulsion obtenue par une centrifugation prolongée à faible vitesse, à basse température Comme les composés perfluorés ont une densité relativement forte (gravité spécifique 1,9 à 2), une centrifugation à faible vitesse donne satisfaction. Il est recommandé d'opérer une centrifugation à 00 C et sous 100 xg La fraction de fond de l'émulsion qui con- tient les particules suffisamment grosses pour être toxiques est écartée, Au bout de 20 semaines de stockage à 40 C, les par- ticules ont été réexaminées sous microscopie sur champ obscur On n'a constaté aucun changement de la dimension des particules De plus, lors d'une centrifugation après stockage, on n'a observé aucun changement de la vitesse de sédimentation L'absence d'un changement quelconque de la dimension des particules ou de la vitesse de sédimenta- tion indique la persistance de la stabilité de l'émulsion de particules. La présente émulsion peut être stérilisée par les procédés courants dans les hopitaux, à l'autoclave à des températures supérieures à 1201 C sous une pression de vapeur de 1 kg/cm 2, sans séparation de phase, ni change- ment de dimension des particules De plus, la présente émulsion peut être stérilisée à l'autoclave avant stockage et être reprise du stockage pour être utilisée immédiate- ment sans autre stérilisation C'est là un progrès impor- tant sur la technique antérieure des émulsions de compo- sés perfluorés qui exige encore un mélange de solutions avant que la composition puisse être utilisée après sto- ckage. * 11 L'invention est illustrée plus en détail avec réfé- rence aux exemples non-limitatifs suivants: Exemple 1: Préparation de l'émulsion de composé perfluoré: A 7 ml d'une solution de Tyrode (p H 7,4) froide déposés dans une cellule de Rosette, on ajoute 960 mg' de lécithine purifiée (tirée du jaune d'oeuf) Ce mélange est soumis aux ultra-sons pendant 15 secondes sous 110 watts Ce traitement aux ultra-sons est répété une fois après un intervalle de temps de 1 minute On ajoute à cette lécithine dispersée, dans la cellule de Rosette à 0 C, 4 ml d'un composé perfluoré (perfluorotripropylamine ou perfluorodécaline), et soumet le mélange aux ultra- sons comme précédemment pendant huit périodes de 15 sec avec un intervalle de 1 min après chaque période On cen- trifuge l'émulsion blanc laiteux obtenue à 4 C pendant min, à 100 x g, pour faire sédimenter toutes les gros- ses particules Le fond, soit 5 % de l'émulsion, est écarté L'émulsion contient 35 à 40 % (v/v) soit 67 à 76 % (w/v) de composé perfluoré dispersé, et son p H se situe entre 7,35 et 7,40 Les particules de composé per- fluoré émulsionnées ont un diamètre d'environ 0,1 e et contiennent 50 à 70 mol de lécithine par ml de composé perfluoré (environ 7 à 9 % (w/v) de l'émulsion). La teneur en lécithine des particules perfluorées a été mesurée en lavant deux fois les particules sédi- mentées à partir d'une partie aliquote de l'émulsion avec la solution de Tyrode, en extrayant deux fois la lécithine avec un mélange de chloroforme et de méthanol, et en déterminant la teneur en phosphore de l'extrait. La quantité de lécithine présente, mesurée en micromoles, est calculée ( 1) en divisant la teneur en phosphore en microgrammes par le facteur 31 (poids atomique du phos- phore) Ce calcul donne les micromoles de lécithine car une molécule de lécithine contient un atome de phosphore. La préparation présentée dans l'exemple 1, qui fait usage d'un émulsionnant par les ultra-sons diffère nettement des procédés de la technique antérieure de pro- duction d'émulsions de perfluorocarbone, qui utilisent des homogénéiseurs mécaniques. Les émulsions de perfluorodécaline et de perfluoro- tripropylamine préparées suivant l'exemple 1 sont admi- nistrées à deux groupes séparés de rats de laboratoire comme il est décrit dans l'exemple 2. Exemple 2: Injection d'émulsion de composés perfluorés à des rats Des rats mâles Sprague-Dawley ( 200 à 250 g) anesthé- siés au pentobarbital ( 30 mg/kg) reçoivent 8 à 10 mi d'émulsion par rat, injectée par une pompe dans la veine fémorale à raison de 0,2 ml/min On retire un volume de sang approximativement égal pendant l'injection On a prélevé des échantillons de sang, par intervalles, après l'injection pour mesurer l'hématocrite, la concentration en composé perfluoré, et compter les plaquettes La con- centration du composé perfluoré dans le sang des rats à la fin de l'injection était de l'ordre de 19 à 22 % (v/v) Dans un groupe de rats, ces chiffres étaient de l'ordre de 24 à 28 % (v/v). Tous les rats-qui avaient reçu des injections d'émulsions de perfluorodécaline (plus de 100 rats) ou des émulsions de perfluorotripropylamine (plus de 100 rats) sont restés en bonne santé pendant plus d'une an- née Le compte des plaquettes du sang de ces rats n'a pas été sensiblement modifié après l'injection de l'une ou de l'autre de ces émulsions; cette constatation contraste avec celle de diminution des plaquettes du sang que l'on observe après injection de la plupart des autes émulsions de composés perfluorés. L'invention peut être réalisée sous d'autres formes spécifiques sans sortir de son esprit ou de ses attributs essentiels et l'on se référera, à ce sujet, aux revendi- cations annexées plutôt qu'à la spécification qui précède comme indiquant le champ dkaction de l'invention. R E VE N D I C A T I O N S 1 ) Emulsion stable de particules de composés per- fluorés, caractérisée en ce qu'elle est constituée par environ 30 à 75 % (w/v) de composé perfluoré, environ 7 à 9 % (w/v) d'un lipide nonantigénique qui enrobe les particules de composé perfluoré, et un milieu aqueux phy- siologiquement acceptable. 2 ) Emulsion suivant la revendication 1, caracté- risée en ce qu'elle contient un émulsionnant différent de la substance qui enrobe les particules de composé per- fluoré 3 ) Emulsion suivant la revendication 1, caracté- risée en ce qu'elle contient un composé perfluoré choisi dans le groupe formé par les perfluorodécaline, perfluoro- méthyldécaline, perfluorotripropylamine et perfluorotri- butylamine. 4 ) Emulsion suivant la revendication 1, caracté- risée en ce qu'elle contient, comme lipide, un phospho- lipide. 5 > Emulsion suivant la revendication 4, caracté- risée en ce qu'elle contient de la lécithine comme phos- pholipide. 6 ) Emulsion suivant la revendication 5, caracté- risée en ce qu'elle contient 67 à 76 % (w/v) d'un composé perfluoré choisi dans le groupe formé par les perfluoro- * décaline et perfluorotripropylamine, environ 7 à 9 % (w/v) de lécithine et un milieu physiologiquement accep- table. 7 ) Emulsion suivant la revendication 6, caracté- risée en ce qu'elle contient, en émulsion stable, des particules d'environ 0,1)' de diamètre moyen, 95 % environ de ces particules ayant un diamètre inférieur à 0,2 8 ) Emulsion suivant la revendication 6, caracté- risee en ce qu'elle contient de la solution de Tyrode comme milieu physiologiquement acceptable. 9 ) Emulsion suivant la revendication 6, caracté- risée en ce qu'elle présente'un p H se situant entre 7,2 et 7,6 et contient un milieu aqueux, physiologiquement acceptable, formé par une solution aqueuse des produits suivants: environ 0,75 % (w/v) K Cl,environ 0,02 % (w/v) Ca C 12, environ 0,007 % (w/v) Mg C 129 environ 0, 004 % (w/v) Na H 2 P 04, environ 0,07 % (w/v) Na HC 03 environ 0,07 % (w/v) glucose. ) Emulsion suivant la revendication 6, caracté- risée en ce qu'elle peut être stérilisée à l'autoclave par les procédés courants, à environ 122 à 1270 C, et sous une pression d'environ 1,05 k Ig/cm 2 - ) Procédé pour la préparation d'une émulsion stable, caractérisé en ce que, a), on disperse un lipide purifié dans un milieu physiologiquement acceptable par traitement aux ultra-sons, b), ajoute des particules d'un composé perfluoré à la dispersion formée en a), c), sou- met à un traitement ultra-sonique le mélange lipide-com- posé perfluoré formé en b) de façon à former une émulsion de particules de composé perfluoré enrobées de lipide, et, d), centrifuge l'émulsion formée en c) pour séparer les particules de trop grandes dimensions 12 ) Procédé suivant la revendication 11, caracté- risé en ce que le composé fluoré est choisi dans le groupe formé par les perfluorodécaline, perfluorométhyl- décaline, perfluorotripropylamine, et perfluorotributy I- amine. 13 ) Procédé suivant la revendication 11, caracté- risé en ce que, comme lipide, on utilise la lécithine. 14 ) Procédé suivant la revendication 11, caracté- risé en ce que, comme milieu physiologiquement acceptable, on utilise la solution; de Tyrode (p H 7,4) ) Procédé suivant la revendication 11, caracté- risé en de qu'on soumet à des traitements répétés aux ultra-sons, séparés chaque fois par un intervalle de temps, le mélange de lipide-composé perfluoré en parti- cules pour former une émulsion de ce mélange.