Brevet FR2525592A1 — publié le 19831028

Toxine synthétique ST son procédé de préparation et son application comme agent vaccinant L'invention concerne de nouveaux peptides synthétiques, leur procédé de préparation et leur appli- cation à la production d'anticorps susceptibles de neu- traliser l'activité biologique des entérotoxines stables à la chaleur, produites par les souches d'Escherichia coli. On sait que les souches d'E coli produisent des entérotoxines peptidiques responsables de diarrhées chez l'homme et l'animal On a identifié au moins deux classes d'entérotoxines peptidiques dont une classe est constituée par des entérotoxines de faible poids molécu- laire et stables à la chaleur, ci-après désignés par "entérotoxines ST" ou "entérotoxines ST naturelles" On sait que les entérotoxines ST se rencontrent sous des formes moléculaires multiples qui diffèrent par la tail- le moléculaire, la composition en acides aminés, la configuration due aux liaisons intramoléculaires, étc. La multiplicité des formes sous lesquelles les entérotoxines sont susceptibles de se présenter, a rendu leur identification difficile, ceci d'autant plus qu'il est nécessaire de travailler sur des entérotoxines purifiées. Les procédés de purification connus à ce jour ont permis de déterminer la séquence en acides aminés d'une entérotoxine ST provenant d'E coli de proc (SO M. et MC CARTHY B ( 1980) Proc Natl Acad Sci USA 77, 4 011-4 015) ainsi que la structure primaire d'une enté- rotoxine ST provenant d'E coli humain (CHAN S K et GIANELLA R A ( 1981) J Biol Chem 256, 7 744-7 746). On a pu ainsi établir que la séquence pepti- dique de l'entérotoxine ST humaine comportait 18 acides aminés, que l'activité biologique et la toxicité sont dues à la présence de ponts disulfures et que la sé- quence peptidique de l'entérotoxine ST porcine ne dif- férait de celle de l'homme que par deux acides aminés (STAPLES S J, ASHER S E et GIANELLA R A ( 1980) The Journal of Biological Chemistry, 255, n 10, 4 716-4 721) et (CHAN S K et GIANELLA R A ( 1981), The Journal of Biological Chemistry, 256, n 15, 7 744-7 746). On a également montré que les 4 premiers aci- des aminés de l'entérotoxine ST humaine et porcine n'étaient cas nécessaires à l'activité biologique, tan- dis que les quatorze derniers acides aminés de la sé- quence sont biologiquement actifs et responsables de la toxicité (CHAN S K et GIANNELLA R A ( 1981), The Journal of Biological Chemistry, 256, n 15, 7 744- 7 746). Ce procédé de purification orésente cependant l'inconvénient d'être long et complexe et ne permet d'obtenir que de très faibles quantités d'entérotoxines purifiées. La difficulté d'obtenir des entérotoxines ST purifiées explique la raison pour laquelle la nature antigénique de l'entérotoxine ST restait à ce jour mal connue On a longtemps cru que l'entérotoxine ST n'était pas immunogène Contradictoirement à cette hypothèse, des travaux récents ont permis de montrer que l'entéro- toxine ST, dans laquelle les ponts disulfures sont pré- sents, est susceptible d'induire des anticorps qui fi- xent l'entérotoxine ST et en neutralisent l'activité biologique (FRANTZ J C et ROBERTSON D C ( 1981) In- fect and Immunity, 33, 193-198), mais que ces mêmes anticorps ne sont pas susceptibles d'établir de liaison avec une entérotoxine ST dans laquelle les ponts disul- fures ont été détruits nar oxydation à l'acide perfor- mique (GIANNELLA R A, DRAKE K W et LUTTREL M ( 1981) Infect and Immunity 33, 186-192), de sorte que les ponts disulfures intramoléculaires paraissaient néces- saires à la conservation des propriétés immunogènes ainsi mises en évidence dans les toxines naturelles. Or, la société demanderesse a découvert des nouveaux peptides synthétiques, sans ponts disulfures intramoléculaires, et qui à la fois témoignent d'une innocuité relative remarquable et induisent des anti- corps capables d'établir des liaisons non seulement avec la séquence peptidique synthétique qui les a in- duites, mais de façon tout à fait inattendue et surpre- nante, avec l'entérotoxine ST naturelle porcine ou hu- maine, et en neutralisent la toxicité, en dépit du fait que l'entvrotoxine ST porcine ou humaine présente des ponts disulfures intramoléculaires. Par ponts disulfures intramoléculaires, on désigne les liaisons susceptibles de s'établir entre les atomes de soufre de deux résidus cystéyle apparte- nant au même enchaînement peptidique Mais cette expres- sion n'exclut bas la possibilité de l'existence, dans les peptides conformes à l'invention, d'une liaison di- sulfure entre l'atome de soufre d'un résidu cystéyle appartenant à une première chaine peptidique et l'atome de soufre d'un autre résidu cystéyle appartenant à une deuxième chalne peptidique. L'invention a pour but de fournir des peptides synthétiques, non toxiques, stables dans les conditions biologiques, et présentant des propriétés particulière- ment intéressantes vis-à-vis des entérotoxines ST natu- relles toxiques. L'invention a pour but de fournir des peptides synthétiques, non toxiques, capables d'induire des anti- corps qui reconnaissent d'une part les peotides à partir desquels ils ont été induits, et d'autre part, des enté- rotoxines ST naturelles humaines et animales, notamment porcines. L'invention a également pour but de fournir des peptides synthétiques non toxiques qui, en associa- tion avec diverses molécules porteuses appropriées, sont susceptibles d'induire des anticorps qui neutrali- sent la toxicité des entérotoxines ST humaines et ani- males, notamment porcines. L'invention a également pour but de fournir des peptides synthétiques utilisables comme déterminants antigéniques stables. L'invention a également pour but de fournir des peptides synthétiques non toxiques qui peuvent être utilisés dans la mise en oeuvre de tests radio-immuno- logiques ou de tests immuno-enzymatiques, tests d'agglu- tination par exemple des hématies ou du latex pour dé- tecter la présence d'entérotoxines ST humaines ou ani- males, notamment porcines. L'invention a également pour but de fournir des peptides synthétiques non toxiques permettant l'im- munisation de l'homme et des animaux vis-à-vis des enté- rotoxines ST humaines ou animales, notamment porcines. L'invention a pour but de fournir un procédé permettant d'obtenir directement des peptides non toxi- ques et par conséquent, utilisables en l'absence de tout recours nécessaire à des étapes de détoxification et de purification. L'invention a également pour but de fournir un procédé permettant d'obtenir, en grande quantité, des peptides synthétiques de structure déterminée. Dans l'un de ses premiers aspects, l'invention a pour objet un peptide (P) n, comportant au plus 18 n amino-acides et au moins 4 N amino-acides, caractérisé en ce que: N vaut 1 lorsque la séquence peptidique P ne comporte aucun résidu cystéyle; N vaut 1 ou 2, lorsque la séquence peptidi- que P comporte au moins un résidu cystéyl; et en ce que, lorsque N vaut 1, la séquence peptidique P est contenue dans l'enchainement peptidique suivant: Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu-Cys-Cys-A-Pro-Ala-Cys-Ala-GlyCys-T(I) (N-ter) (C-ter) dans lequel: soit A représente Asn et T représente Tyr, soit A représente Tyr et T représente Asn; et caractérisé en ce que les groupes thiols des éven- tuels résidus cystéyle présents dans la molécule ont été protégés par des groupements stables dans les con- ditions biologiques, l'un au plus des groupes thiols pouvant être sous forme de groupe SH libre ou pouvant être protégé par un groupe non stable dans les condi- tions biologiques; et en ce que lorsque N vaut 2, la séquence peptidique P-P est constituée Dar deux séquences peptidiques P identiques comportant chacune au plus 18 acides aminés et au moins 4 acides aminés, contenues dans l'enchalne- ment peptidique de formule (I) ci-dessus indiquée, les deux séquences peptidiques P étant reliées entre elles par l'intermédiaire d'une liaison disulfure établie entre l'atome de soufre de l'un quelconque des résidus cystéyle de l'une des deux séquences et l'atome de soufre de l'un quelconque des résidus cystéyle de l'au- tre séquence, et caractérisé en ce que les autres grou- pes thiols, éventuellement présents, non engagés dans la liaison disulfure des éventuels résidus cystéyle sont protégés par un groupement protecteur stable dans les conditions biologiques. D'une façon générale, l'invention concerne tout peptide contenant une ou plusieurs séquences P telles qu'elles ont été définies précédemment et sus- ceptibles d'induire in vivo des anticorps contre les entérotoxines ST, ces différentes séquences P pouvant d'ailleurs être reliées entre elles par des groupes de pontage, eux-mêmes peutidiques ou non, dans la me- sure o ces grouoes de pontage n'interfèrent pas avec les qualités immunogènes attribuables aux déterminants antigéniques que contiennent les séquences P en ques- tion. D'une façon générale, l'invention concerne tout peptide répondant à la susdite condition qui, le cas échéant, après fixation sur un support macromolé- culaire approprié, est capable d'induire in vivo la production d'anticorps actifs contre les peptides tels qu'ils ont été définis plus haut, en rapport avec l'un des premiers aspects de l'invention, ou plus particu- lièrement encore contre l'entérotoxine ST naturelle. A titre d'exemple de ponts peptidiques, on peut mentionner des oligomères de L-lysine, contenant par exemple jusqu'à 10 unités de lysine, de préférence , ou encore par exemple des groupes déri- vés d'adipimate reliant des fonctions amines portées par des séquences peptidiques P distinctes. D'une façon générale, on peut avoir recours, pour la constitution de tous ces groupes de pontage, de toute molécule comportant des groupes fonctionnels, tels qu'amine ou carboxylique, susceptibles de réagir avec des fonctions respectivement carboxylique et amine appartenant à des séquences P distinctes D'autres groupes de pontage peuvent précisément également faire intervenir des groupes SH entièrement libres des sé- quences P sus-définies, lorsqu'elles les contiennent. Le terme peptide englobe dans la suite les peptides qui seront désignés par monopeptides et ceux qui seront désignés par dipeptides. Les monopeptides correspondent au cas o n est égal à 1, c'est-à-dire à un enchaînement peptidi- que dans lequel chaque résidu amino-acyle est engagé avec le ou les résidus amino-acyle adjacents par une ou des liaisons peptidiques. Les dipeptides correspondent au cas o n est égal à 2, c'est-à-dire au cas o le peptide com- porte deux enchaînements peptidiques identiques, dans lesquels chacun des amino-acyles est engagé, avec les deux amino-acyles adjacents par une liaison peptidique, ces deux enchaînements peptidiques étant reliés entre eux par l'intermédiaire d'une liaison disulfure établie entre l'atome de soufre d'un résidu cystéyle quelconque de l'un des enchaînements avec l'atome de soufre d'un résidu cystéyle quelconque de l'autre enchaînement. Par groupe stable dans les conditions biolo- giques, on désigne les groupements protecteurs qui après avoir été fixés aux groupes thiols, y restent fixés même lorsque les peptides sont mis en présence d'un milieu biologique, en dépit des réactions métaboliques suscep- tibles d'intervenir ou toute autre réaction pouvant mo- difier les caractéristiques du peptide Ces groupes pro- tecteurs empêchent ainsi la formation de ponts disul- fures intramoléculaire qui, s'ils se formaient, confé- reraient au peptide des propriétés toxiques. Une classe préférée de peptides selon l'inven- tion est constituée par ceux dans lesquels les acides aminés sont lévogyres. Dans les peptides selon l'invention, tout groupement protecteur de la fonction thiol, dans la mesure o il est stable dans les conditions biologiques, convient. A titre d'exemples de groupes protecteurs de la fonction thiol et stables dans les conditions biolo- giques, on peut citer ceux qui sont mentionnés dans les pages 137 à 164 de l'article intitulé "Sulfhydryl group protection in peptide synthesis" de R G HISKEY, The Peptides, vol 3 ( 1981), et dans les pages 233 à 247 de l'article intitulé (Solid phase peptide synthesis" de G BARANY et R B MERRIFIELD, The Peptides, vol 3 ( 1981). A titre de groupes protecteurs, on peut éga- lement avoir recours aux groupes qui sont utilisés en biochimie pour la modification définitive des fonctions thiol sur les protéines. Dans la pratique, il faut que le groupement protecteur de la fonction thiol soit compatible avec les conditions de synthèse utilisées pour l'obtention des peptides selon l'invention et en particulier soit stable dans les conditions de synthèse, y compris celle de la déprotection finale. En effet, plusieurs paramètres interdépendants sont à prendre en considération dans le choix du groupe protecteur de la fonction thiol, puisque le type même de la synthèse mis en oeuvre détermine notamment la na- ture des groupes de protection des fonctions acide et amine à utiliser, qui eux-mêmes déterminent l'agent dé- protecteur final. Dans la pratique, on a avantageusement recours aux groupes suivants pour protéger la fonction thiol H C NH R o Dans ce cas, la fonction thiol protégée peut être représentée comme suit S C NHR o A titre de groupes protecteurs de la fonction thiol, sont avantageux lès composés de formule suivante RCNR'R" o dans laquelle R, R' et R" représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène, un radical alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone. Parmi ces composés, les composés de formule CH 3 CNHR', RCNHCH 3, R C N CH 2 O R' R" dans lesquels R et R' représentent un atome d'hydrogène, un radical alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone sont avantageux. Les fonctions thiol protégées par chacun des trois groupes protecteurs cidessus indiqués peuvent alors respectivement être représentées par: CH 3-C-N-S, R-C-NH-CH 2-S, R-C-N-CH-S- 3ili Il ' i 1I I O R' O O R'R" Dans la pratique, il est particulièrement avantageux d'utiliser l'acétamidométhyle ou le formami- dométhyle Ces deux groupements protecteurs de la fonc- tion thiol sont stables dans les conditions biologiques et présentent l'avantage de ne pas être déprotégés par les réactions de déprotection finale généralement utili- sés et qui servent d'une part à séparer le peptide syn- thétique du support sur lequel il a été généralement préparé et d'autre part, à éliminer les groupes de pro- tection des fonctions acides et amines généralement uti- lisés au cours de la synthèse. Une classe préférée de peptides selon l'inven- tion ci-après désignée par G 1, est constituée par les monopeptides. Ces monopepti"es selon l'invention comportent au plus 18 amino-acides et au moins 4 amino-acides et sont caractérisés en ce que leur enchainement peptidique est contenu dans la séquence peptidique suivante: Asn-Thr-PheTyr-Cys-Cys-Glu-Leu-Cys-Cys-A-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys-T (N-ter) (C-ter) dans laquelle, soit A représente Asn et T représente Tyr, soit A représente Tyr et T représente Asn; et en ce que les groupes thiols des éventuels résidus cys- téyle présents dans la molécule sont protégés par des groupements stables dans les conditions biologiques, l'un au plus des groupes thiols pouvant être sous forme de groupe SH libre ou pouvant être protégé par un groupe non stable dans les conditions biologiques. Parmi la classe G 1, une classe de monopeptides préférés selon l'invention est constituée par ceux dans lesquels tous les groupes thiols des éventuels résidus cystéyle ont été protégés par des groupements stables dans les conditions biologiques Cette classe sera dans la suite désignée par G 1 A. Une autre classe de monopeptides préférés se- lon l'invention est constituée par ceux dans lesquels tous les groupes thiols des éventuels résidus cystéyle, sauf un, ont été protégés par des groupements stables dans les conditions de déprotection Cette classe de monopeptides sera dans la suite désignée par Gl B. -* Dans le cas des peptides appartenant à G 1 B, le seul groupe thiol qui n'a pas été protégé par un groupement stable dans les conditions biologiques, peut être à l'état de groupe SH libre (ou peut avoir été protégé par un groupe non stable dans les conditions biologiques). Lorsque le groupement est non stable dans les conditions de la déprotection, au cours de cette étape, le groupement protecteur est éliminé et le groupe thiol se retrouve alors à l'état de groupe SH libre ou de di- sulfure mixte. A titre d'exemples de groupes protecteurs du groupe SH susceptibles de se libérer au cours de la dé- protection, on peut citer le groupement paraméthoxy- benzylique ou le groupement S-tertiobutylsulfényle. Dans les chaines peptidiques indiquées ci- après, à titre d'exemple, il est entendu que l'amino- acyle d'extrémité à la gauche des séquences indiquées, est un amino-acyle N-terminal et l'amino-acyle d'extré- mité à la droite de la formule, un amino-acyle C-termi- nal, sauf lorsqu'il sera spécifié autrement Par exemple, Asn-Thr-Phe-Tyr correspond à la chaîne oeptidique dans laquelle Asn est le groupe Nterminal et Tyr est le groupe C-terminal. Parmi les classes G 1, G 1 A et G 1 B, une classe préférée de peptides selon l'invention est constituée par les peotides qui comprennent l'une des séquences suivantes: - Asn-Thr-Phe-Tyr- -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys- -Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys- -Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys- -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu- -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-L Ieu- -Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys- -Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys- A l'intérieur de cette classe ci-dessus défi- nie, une sous-classe de peptides préférés selon l'in- vention est constituée par ceux qui répondent à la for- mule suivante: Asn-Thr-Phe-Tyr Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys Cys-Cys-Asn-Pro-AlaCys Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu Asn-Thr-Phe-TyrCys-Cys-Glu-Leu Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys CysCys-Gly-Leu-Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys Les trois peptides suivants sont particulière- ment préférés: Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-CysAla-Gly- sys-Tyr ( 1) Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Tyr-Pro-AlaCys-Ala-Gly-Cys-Asn ( 2) Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Gly-Gly-Gly ( 3) Une autre classe de peptides selon l'invention ci-après désignée par G 2 est constituée par les dipep- tides ci-dessus définis dans lesquels N vaut 2. Ces dipeptides P-P selon l'invention compor- tent au plus 18 x 2 acides aminés et au moins 4 x 2 acides aminés et sont caractérisés par le fait qu'ils sont constitués par deux séquences peptidiques P iden- tiques comportant chacune au plus 18 acides aminés et au moins 4 acides aminés, contenues dans l'enchalnement peptidique de formule (I) ci-dessus indiquée, les deux séquences peptidiques P étant reliées entre elles Dar l'intermédiaire d'une liaison disulfure établie entre l'atome de soufre de l'un des résidus cystéyle de l'une des deux séquences peptidiques et l'atome de soufre de l'un des résidus cystéyle de l'autre séquence peptidique, et caractérisés en ce que les autres groupes thiols -non engagés dans la liaison disulfure des éventuels résidus cystéyle sont protégés par un groupement protecteur sta- ble dans les conditions biologiques. A l'intérieur de cette classe G 2 de composés ci-dessus définis, une sous-classe préférée de dipepti- des selon l'invention est constituée par ceux dans les- quels la liaison disulfure entre les deux séquences peptidiques P est établie entre deux résidus cystéyle, occupant les mêmes positions sur chacune des séquences peptidiques P. A l'intérieur de la classe G 2 des dipeptides P-P selon l'invention, une classe préférée est consti- tuée par ceux dans lesquels la séquence peptidique P comprend l'un des enchaînements peptidiques suivants: -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys- _ Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys- _Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys _Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu- -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu- _Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys- -Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys- A l'intérieur de cette sous-classe, une classe avantageuse de dipeptides P-P selon l'invention est constituée par ceux dans lesquels la séquence peptidique P répond à la formule suivante: Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys Asn-ThrPhe-Tyr-Cys-Gly-Gly-Gly ( 3) Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys Cys-Cys-Tyr-Pro-AlaCys Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu Cys-CysGly-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-TyrPro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Asn-ProAla-Cys-Ala-Gly-Cys-Tyr ( 1) Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cysys-ys-TyrPro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys-Asn ( 2) Des dipeptides particulièrement appropriés selon l'invention ont pour formule, par exemple selon le modèle-: Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys Cys-Cys-Asn-ProAla-Cys Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-CysAsn-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys-Tyr Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-CysAsn-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys-Tyr Asn-Th-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-CysTyr-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly ys-Asn Asn-i Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-CysTyr-Po-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys-Asn L'invention concerne également les conjugués comportant un ou plusieurs peptides selon l'invention liés de façon covalente à une molécule porteuse, phy- siologiquement acceptable et non toxique. Les molécules porteuses entrant dans la cons- titution des conjugués selon l'invention sont de préfé- rence choisies parmi les molécules biologiques ayant un site d'action au niveau de l'intestin. A titre d'exemples de protéines naturelles, on peut citer la toxine tétanique, l'ovalbumine, des sérums albumines, etc. A titre de supports macromoléculaires synthé- tiques, on mentionnera par exemple des polylysines ou des poly(D-L-alanine)-poly(L-lysine). La littérature mentionne d'autres types de supports macromoléculaires susceptibles d'être utilisés, lesquels présentent en général un poids moléculaire supérieur à 20 000. A titre de molécule porteuse particulièrement * avantageuse, on peut avoir recours à une protéine por- teuse elle-même immunogène, pour autant que les immuno- génécités ainsi conférées à l'ensemble ne se nuisent pas mutuellement. Un exemple de protéine porteuse appropriée est la cytotoxine de Shigella (cf The Journal of Bio- logical Chemistry, vol 256, n 16, August, 25, 1981, p 8 732-8 738) ou des fragments de cytotoxine de Shigella comportant des déterminants antigéniques essentiels de la cytotoxine de la dysenterie. Un autre exemple de protéine porteuse parti- culièrement a D Dppropriée est le choléragénoide ou des fragments de choléragénoide comportant des déterminants antigéniques essentiels de la-toxine du choléra. Le choléragénoide, agrégat non toxique de la sous-unité B de la toxine du choléra, peut être purifié selon la méthode décrite dans Infection and Immunity, June 1977, p 789-795. L'avantage du choléragénoide est qu'il con- tient les déterminants antigéniques principaux de la toxine du choléra et se fixe à l'endroit approprié, à savoir sur la muqueuse intestinale pour qu'il v ait immunité efficace. Par conséquent, le conjugué moléculaire cons- titué par le choléragénoide, en association avec l'un quelconque des peptides selon l'invention semble parti- culièrement bien approprié en raison du fait que chacun des éléments du conjugué présente une activité immuno- gène locale se manifestant au meme endroit, à savoir au niveau de l'intestin. Une classe préférée de conjugués selon l'in- vention est constituée par ceux dans lesquels la molé- cule porteuse est le choléragénoide ou la cytotoxine de Shigella et le peptide selon l'invention comprend la séquence suivante: Asn-Thr-Phe-Tyr- Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys- -Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys- -Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys- _Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu- _Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu- _Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys- -Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys- Ala-Gly-Cys- Une autre classe avantageuse de conjugués se- lon l'invention est constituée par ceux dans lesquels la molécule porteuse est le choléragénoide ou la cyto- toxine de Shigella et le peptide selon l'invention ré- pond à la formule suivante: Asn-Thr-Phe-Tyr Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys -Asn-ThrPhe-Tyr-Cys-Gly-Gly-Cly Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu Cys-Cys-GlyLeu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Tyr-ProAla-Cys-Ala-Gly-Cys Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-AlaCys-Ala-Cys-Tyr Asn-Thr-Phe-'Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-CysAla-Cys-Asn SYNTHESE DES PEPTIDES SELON L'INVENTION On peut avoir recours à des procédés connus en soi, pour effectuer la synthèse des monopeptides selon l'invention Ces procédés sont résumés ci-après. La synthèse des peptides en solution homogène et en phase solide est bien connue. A cet égard, on pourra avoir recours au mode de synthèse en solution homogène décrit par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé "Methodem der Organischen Chemie" (Méthode de la chimie organique) édité par E. W Unsch, vol 15-I et II, THIEME, Stuttgart 1974. Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux à deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs résidus aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi pré- parés, étant entendu que l'on aura eu soin de Drotéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments à l'exception des fonctions amine de l'un et carboxyle de l'autre ou vice versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien con- nues dans la synthèse des peptides En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type car- bodiimide, tels que par exemple la 1-éthyl-3-( 3-diméthyl- aminopropyl)-carbodiimide Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction amine supplémentaire (cas de la lysine par exemple) ou une autre fonction acide (cas par exemple de l'acide glutamique), ces fonctions seront par exemple protégées, par des groupes carbobenzoxy ou tbutyloxycarbonyle, en ce qui concerne les fonctions amine, ou par des groupes t-butylester, en ce qui con- cerne les fonctions carboxyliques Il en ira de même de la protection de toute autre fonction réactive Par exemple, lorsque l'un des aminoacyles considérés con- tient une fonction SH (par exemple le cystéine), on Dourra avoir recours à un groupe acétamidométhyle ou paraméthoxybenzyle. Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'amino-acide C-terminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite oar R D MERRIFIELD dans l'article in- titulé "Solid phase peptide synthesis' (J Am Chem. Soc, 45, 2149-2154). Pour fabriquer une chaine peptidique selon le procédé de MEERIFIELD, on a recours à une résine poly- mère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier amino- acide C-terminal de la chaine Cet amino-acide est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxy- lique et sa fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle. Lorsque le premier amino-acide C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide. Dans le cas o le groupe protecteur de la fonc- tion amine est le groupe t-butyloxycarbonyle, il peut être éliminé par traitement de la résine à l'aide d'aci- de trifluoroacétique. On couple ensuite le deuxième amino-acide qui fournit le second aminoacyle de la séquence recherchée, à partir du résidu amino-acyle Cterminal sur la fonction amine déprotégée du premier amino-acide Cterminal fixé sur la chaine De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième amino-acide est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction amine est pro- tégée, par exemple par le t-butyloxycarbonyle. On obtient ainsi la première partie de la chaine peptidique recherchée, qui comporte deux amino- acides, et dont la fonction amine terminale est proté- gée Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du deuxième aminoacide C-terminal. On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés, qui vont constituer la chaine peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au Préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine. Lorsque la totalité de la chaîne pertidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents aminoacides constituant la chaîne pepti- dique et on détache le peptide de la résine par exemple à llaide d'acide fluorhydrique. Pour synthétiser les dipeptides selon l'inven- tion, on peut avoir recours aux monopeptides comportant respectivement un résidu-cystéyle dans lequel le groupe thiol est à l'état de SH non pro- tégé, notamment par oxydation au sein d'un milieu conte- nant les monopeptides selon l'invention, par exemple à l'aide d'oxygène moléculaire Ce milieu consiste par exemple en une solution aqueuse de p H d'environ 7. Cette oxydation permet à la liaison disulfure de s'établir entre les atomes de soufre des résidus cystéyle comportant le groupe thiol à l'état de SH non protégé. Pour préparer les dipeptides selon l'inven- tion, on peut également avoir recours aux indications de synthèse proposées aux pages 145 à 149, de l'article intitulé (Sulfhydryl group protection in peptide syn- thesis" de R G HISKEY, The Peptides, vol 3 ( 1981) et aux pages 240 à 243, de l'artiele intitulé "Solid phase oeptide synthesis", de G BARANY et R B MERRI- FIELD, The Peptides, vol 3 ( 1981). Dans la pratique, on peut opérer comme suit ou de façon équivalente. Après déprotection des peptides selon l'in- vention, on fait barbotter l'air dans la solution du peptide jusqu'à disparition des fonctions thiol libres. Pour synthétiser les conjugués selon l'inven- tion, on peut avoir recours à des procédés connus en soi, tel que celui décrit par FRANTZ et ROBERTSON dans Infect. and Immunity, 33, 193-198 ( 1981), ou celui décrit dans Applied and Environmental Microbiology, octobre 1981, vol 42, n 4, 611-614 par P E KAUFFMAN en utilisant le peptide et la molécule porteuse appropriée. Dans la pratique, on utilisera avantageusement comme agent de couplage les composés suivants, cités à titre non limitatif: aldéhyde glutarique, chloroformiate d'éthyle, carbodiimides hydrosolubles ZN-éthyl N'( 3-di- méthylamino-propyl) carbodiimide, HC 1 i, diisocyanates, bis-diazobenzidine, di et trichloro-5-triazines, bro- mures de cyanogène, benzaquinone, ainsi que les agents de couplage mentionnés dans Scand J Immunol, 1978, vol 8, p 7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON). On peut avoir recours à tout procédé de cou- plage faisant intervenir d'une part une ou plusieurs fonctions réactives du peptide et d'autre part, une ou plusieurs fonctions réactives des molécules supports. Avantageusement, il s'agit des fonctions carboxyle et amine, lesquelles peuvent donner lieu à une réaction de couplage en présence d'un agent de couplage du genre de ceux utilisés dans la synthèse des protéines, par exemple, le 1-éthyl-3-( 3-diméthylaminopropyl)-carbodii- mide, le N-hydroxybenzotriazole, etc On peut encore avoir recours àlaglutaraldéhyde, notamment lorsqu'il s'agit de relier entre eux des groupesaminés respecti- vement portés par le peptide et la molécule support. Les exemples qui suivent concernent des syn- thèses de peptides préférés selon l'invention, visant à en donner une meilleure illustration, sans pour autant être limitatifs. EXEMPLE 1. SYNTHESE DU MONOPEPTIDE DE FORMULE ( 1). Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Cly-Cys-Tyr (N-ter) (C-ter) Ce monopeptide synthétique présente la meme séquence peptidique que l'entérotoxine ST de porc Mais à la différence de l'entérotoxine ST naturelle de porc, dans ce monopeptide selon l'invention, tous les groupes thiols des résidus cystéyle sont protégés par l'acétami- dométhyle et il n'y a pas de pont disulfure intromolécu- laire Dans la suite, on désignera ce monopeptide par "Entérotoxine ST synthétique de porc". Pour préparer ce monopeptide de formule ( 1), on a recours à la synthèse peptidique mentionnée ci- dessus et on procède comme suit ou de façon équivalente. Les abréviations utilisées dans le cadre de cette synthèse ont la signification suivante: BOC: t-butylcarbonyloxy. Asp: acide aspartique Thr: thréonine Glu: acide glutamique Pro: proline Gly: glycine Ala: alanine Asn: asparagine Cys: cystéine Leu: leucine Tyr: tyrosine Phe: phénylalanine. On utilise comme amino-acides des N-alpha- amino-acides protégés uniquement avec le groupe t-butyl- oxycarbonyl (BOC). Les groupes fonctionnels latéraux sont proté- gés comme suit: la tyrosine est protégée par le 2,6-dichlo- robenzyle, la cystéine est protégée par l'acétamidomé- thyle, l'acide glutamique et'la thréonine sont pro- tégés par le benzyle. On distille CH 2 C 12 à partir de Na 2 CO 3 anhydre avant utilisation. Il est avantageux d'utiliser un support de ré- sine constitué par un copolymère chorométhylé de styrène et de divinylbenzène à 1 % (commercialisé par les labo- ratoires BIORAD. La N-alpha-t-butyloxycarbonyl-O-2,6-dichloro- benzyltyrosine est de préférence estérifiée sous forme de son sel de césium (GISIN B F ( 1973) Helv Chim. Acta 56, 1476). La synthèse est effectuée dans un synthétiseur automatique du type de celui commercialisé par BECKMAN sous la désignation 990 B. Chacun des acides aminés entrant dans la cons- titution du monopeptide ( 1) selon l'invention, est fixé à la chaîne peptidique déjà formée comme il est indiqué ci-après. a) On lave trois fois la résine pendant envi- ron 3 minutes avec du chlorure de méthylène pour la mettre en suspension. b) On lave ensuite une fois pendant environ trois minutes avec de l'acide trifluoroacétique à 40 pour imprégner la résine. c) On relave une fois pendant environ 30 minu- tes avec de l'acide trifluoroacétique pour déprotéger le groupe N-terminal de la chaîne peptidique déjà formée. d) On lave ensuite deux fois pendant environ 3 minutes avec du chlorure de méthylène pour éliminer l'acide trifluoroacétique. e) Puis on lave deux fois pendant environ 3 minutes avec de l'alcool isopropylique pour éliminer le chlorure de méthylène. f) Puis on réimprègne le milieu en lavant 4 fois pendant 3 minutes avec du chlorure de méthylène. g) On lave trois fois pendant environ 3 mi- nutes avec de la diisopropyléthylamine pour neutraliser la fonction amine, qui se trouvait salifiée sous forme de son sel avec l'acide trifluoroacétique. h) On lave quatre fois pendant environ 3 mi- nutes avec du chlorure de méthylène pour chasser la diisopropylamine en excès. i) On ajoute l'acide aminé à fixer sur la chaîne peptidique déjà formée, comme indiqué ci-dessous. j) On lave ensuite trois fois pendant environ 3 minutes avec du chlorure de méthylène. k) Puis on chasse le chlorure de méthylène en lavant deux fois pendant environ 3 minutes avec de l'al- cool isopropylique. 1) On lave enfin trois fois pendant environ 3 minutes avec du chlorure de méthylène, pour remettre le milieu réactionnel dans son solvant. En ce qui concerne la fixation de chacun des acides aminés à la chaine peptidique déjà formée, on a recours à un acide aminé (en excès par rapport à la chaine peptidique déjà formée, cet excès correspondant à environ trois fois la Charge de la chaine peptidique) dont la fonction amine est protégée par le groupe t-bu- tyloxycarbonyle et dont la fonction acide est activée par la dicyclohexylcarbodiimide, l'hydroxybenzotriazole ensuite additionné afin de minimiser les réactions se- condaires (ARENDT A, KOLODZIEJZKYK A M ( 1978) Tetra- hedron Lett 40, 3867), (MOJSOV S, MITCHELL A R ( 1980) J Org Chem 45, 555). Après chaque étape d'addition d'un acide ami- ne, on détermine la quantité d'acide aminé libre qui n'a Das été fixée sur la chaine peptidique, par le test à la ninhydrine (KAISER E, COLESCOTT R L et al ( 1976) Anal Biochem 34, 595), sauf lorsqu'on fixe l'asparagine (en position Il dans le peptide ( 1)) sur la proline (en position 12 dans le peptide ( 1)), la numéro- tation étant effectuée de gauche à droite Lorsqu'on fixe ces deux acides aminés, on a en effet recours au test à la chloranile (CHRISTENSEN T ( 1979) Acat Chem. Scand, 833, 763) A la fin de la synthèse, on élimine tous ies groupes protecteurs fixés sur le peptide porté par la résine, à l'exception du groupe acétamidométhyle qui est stable vis-à-vis de ce réactif (VEBER et al. ( 1972), J Am Chem Soc 94, 5456) On détanche le peptide de la résine à l'aide d'acide fluorhydrique anhydre à raison de 10 ml d'HF anhydre par gramme de résine, en présence d'anisol ( 1 ml/g) à la température d'environ OOC pendant environ 60 minutes. Après évaporation de l'acide fluorhydrique, le mélange réactionnel est lavé à l'éther et le peptide est séparé de la résine par extraction à l'aide d'acide acétique à 50 % Les extraits sont dilués à l'eau et lyophilisés. Le peptide brut obtenu est faiblement soluble dans l'eau Il est purifié par chromatographie sur une colonne du type de celle commercialisée sous le nom LH 20 en utilisant comme phase mobile le mélange dimé- thylformamide-acide acétique 0,1 M ( 3/1) On mesure une absorption à 254 nm Les différentes fractions du pic principal sont examinées sur le plan de leur homo- généité et rassemblées. On obtient le peptide purifié ( 97 mg, rende- ment global d'environ 10 %) présentant la composition en acides aminés suivante: Valeur expérimentale Valeur théorique Asp 2,22 2 Thr 0,85 1 Glu 1,13 1 Fro 1,21 1 Gly 1,20 1 Ala 2,07 2 Cys 4,68 6 Leu 1,13 1 Tyr 2, 27 2 Phe 1,12 1 La valeur de l'asparagine (Asn) est donnée en Asp car au cours de l'hydrolyse, la fonction amide primaire de Asn est coupée, ce qui la transforme en Asp. On mesure la pureté par chromatographie liqui- de sous haute pression en phase inversée sur une colonne du type de celle commercialisée sous le nom V Bondapack C 18 dans laquelle l'éluant est le mélange de solvants suivants: CH 3 OH 425 ml H 20 525 ml Tampon phosphate 0,05 M p H 2,5 50 ml avec contrôle à 210, 254 et 270 nm. EXEMPLE 2. SYNTHESE DU MONOPEPTIDE DE FORMULE ( 2). Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu -Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys Ala-Gly-Cys- sn (N-ter) (C-ter) Le monopeptide de séquence ci-dessus indiquée et dans lequel tous les groupes thiols sont modifies par - l'acétam-:dométhyle a été préparé selon le procédé ci- dessus indiqué. Dans la suite, ce peptide sera désigné par "Entérotoxine ST synthétique humaine", car il présente la même séquence d'acides aminés que l'entérotoxine ST naturelle humaine Mais à la différence de l'entéroto- xine ST naturelle humaine, dans le peptide selon l'inven- tion, tous les groupes thiols des résidus cystéyle sont protégés par l'acétamidométhyle, et il n'y a pas de pont disulfure intramoléculaire. EXEMPLES III A VI. Ils concernent la préparation de quatre conju- gués selon l'invention dans lesquels le peptide est soit l'entérotoxine ST synthétique de porc, soit l'entéroto- xine ST synthétique humaine, et la molécule porteuse est soit la toxine tétanique, soit l'ovalbumine. On désignera dans la suite par ST-TT les con- jugués dans lesquels le peptide selon l'invention est l'entérotoxine ST synthétique (de porc ou humaine) et la molécule porteuse est la toxine tétanique et par ST-OVA les conjugués dans lesquels le peptide selon l'invention est l'entérotoxine ST synthétique (de porc ou humaine) et la molécule porteuse est l'ovalbumine. La synthèse de ces conjugués peut être effec- tuée selon la méthode décrite par FRANTZ et ROBERTSON dans Infect and Immunity, 33, 193-198 ( 1981). Le mélange réactionnel contient un excès d'en- térotoxine ST (porcine ou humaine) synthétique corres- pondant à environ deux fois plus d'entérotoxine ST syn- thétique que de protéine porteuse Le couplage entre l'entérotoxine ST synthétique et les différentes pro- téines Porteuses est effectué en utilisant par exemple la 1-éthyl-3-( 3diméthyl-aminopropyl)-carbodiimide Le * mélange réactionnel est mis à incuber dans l'obscu- rité pendant environ 18 heures à température ambiante. On a ensuite recours à une dialyse extensive effectuée sur un tampon Pi Na, à p H 7,00, pour éliminer l'entérotoxine ST synthétique libre et l'agent de cou- plage qui n'a mas réagi. Le tampon Pi Na est un tampon phosphate de sodium dont la composition pour un litre d'eau distillée est la suivante: Na Cl 8 g Na HPO 4 12 H 20 2,8 g KH 2 P 04 0,2 g K Cl 0,2 g Les conjugués ST-OVA peuvent être utilisés directement pour effectuer les essais d'immunisation sur les animaux. Dans le cas des conjugués ST-TT, il est né- cessaire de détoxifier la préparation de l'aide de for- maldéhyde selon la méthode décrite par BLASS et al. dans Bull Soc Chim 10, 3 057-3 965 ( 1967). Avant d'utiliser le conjugué ST-TT selon l'in- vention, on détermine sa toxicité par injection intra- musculaire sur des souris. Les peptides selon l'invention présentent d'intéressantes propriétés visà-vis des entérotoxines ST naturelles humaines et animales. Les essais effectués sur les peptides selon l'invention sont décrits ciaprès notamment pour les peptides suivants: l'entérotoxine ST synthétique de porc con- forme à l'invention, obtenue comme il a été décrit pré- cédemment; le conjugué constitué par l'entérotoxine ST synthétique de porc et la toxine tétanique, ci-après désigné par STP-TT; le conjugué constitué par l'entérotoxine ST synthétique de porc et l'ovalbumine, ci- après désigné par STP-OVA. Pour ces essais, on a également recours à l'entérotoxine ST naturelle humaine, purifiée comme indiqué ci-a Drès. PURIFICATION D'ENTEROTOXINE ST NATURELLE HUMAINE. L'entérotoxine ST à purifier provient d'une souche humaine d'E coli qui ne produit qu'une entéro- toxine stable à la chaleur (souche fournie par le Dr Walter LAIRD de NIH USA) Les conditions de croissan- ce des bactéries et la purification de l'entérotoxine sont effectuées selon la méthode décrite par STAPLES et al dans J Biol Chem 255, 4 716-4 721. Une seconde préparation d'entérotoxine ST pure d'origine humaine fournie par le Dr R GIANNELLA est également utilisée dans l'étude présente. ETUDE DES PROPRIETES DES PEPTIDES SELON L'INVENTION. 1 Non toxicité. L'essai concernant la toxicité des peptides selon l'invention a été effectué sur des peptides ob- tenus selon la technique en phase solide décrite ci- dessus et dans laquelle les groupes SH des résidus de cystéine sont protégés par les acétamidométhyles. La toxicité des peptides selon l'invention est étudiée à l'aide du test des souriceaux décrit dans J Biol Chem 255, ( 1980), 4 716-4 721 par STAPLES et al Ce test consiste à déterminer l'effet de l'adminis- tration, à des souriceaux, d'un composé, sur l'accumu- lation du fluide intestinal. Pour ce faire, on injecte le composé à tester dans l'estomac de souriceaux ayant 3 ou 4 jours On met ensuite les souriceaux dans une étuve à 370 C pendant environ une heure puis on les anesthésie et on retire l'intestin Si l'intestin est gonflé, cela résulte d'une accumulation de fluide dans l'intestin provoquée par le composé injecté qui est donc biologiquement actif et par conséquent toxique De façon quantitative, on considère que le composé testé est biologiquement actif, lorsque le rapport entre le poids de l'intestin et le poids du corps est au moins égal à 0,08, étant indiqué que si on injecte de l'eau dans un essai témoin, le rapport poids de l'intestin/poids du corps est de 0,05 Dans les fi- gures mentionnées ci-après, chaque point expérimental correspond à la moyenne des résultats obtenus avec trois souriceaux. On a représenté, sur la figure 1, les résul- tats obtenus dans le cadre de l'étude de la toxicité de l'entérotoxine ST synthétique de Dorc On a représenté en ordonnées, le rapport poids de l'intestin/poids du corps et chaque colonne représente la moyenne de trois déterminations La colonne 4 correspond au résultat obtenu avec l'entérotoxine ST naturelle humaine admi- nistrée à raison de 9 ng La colonne 5 correspond au résultat obtenu dans l'essai contrôle, sans entérotoxine. Les trois colonnes blanches désignées par 1, 2 et 3, correspondent aux résultats obtenus avec l'entérotoxine ST synthétique administrée à raison de 50 pg (colonne 1), 500 ng (colonne 2) et 50 ng (colonne 3). De l'étude de ce graphe, on en déduit que l'entérotoxine ST synthétique de porc est incapable de provoquer l'accumulation de fluide dans le tractus intestinal des souris et par conséquent n'est pas toxi- que. La non toxicité des peptides selon l'invention est en accord avec le fait qu'ils ne présentent pas de ponts disulfures intramoléculaires, étant donné que les groupes SH des résidus cystéyle sont protégés par des groupes protecteurs, stables en milieu biologique Or, on a montré que les ponts disulfures intramoléculaires étaient indispensables à l'activité biologique de la toxine ST naturelle de porc et humaine (STAPLES et al. dans J Biol Chem 255, 4 716-4 721 ( 1980). Pro Driétés immunoqènes. Les peptides selon l'invention se révélant non toxiques, ils sont testés sur le plan immunologiquie. Les essais ci-dessous indiqués effectués sur les conjugués selon l'invention permettent de montrer: a) que les conjugués selon l'invention indui- sent des anticorps; b) que ces anticorps réagissent de façon spé- cifique avec les peptides selon l'invention; c) que ces anticorps reconnaissent l'entéro- toxine ST naturelle (porcine ou humaine); d) que ces anticorps neutralisent l'activité biologique de l'entérotoxine ST naturelle (porcine ou humaine) Dans les essais dont il est question ci- après, on utilise les deux conjugués suivants conformes à l'invention: 1 Conjugué constitué par l'entérotoxine ST synthétique de porc et l'ovalbumine (ci-après désigné par STP-OVA) 2 Conjugué constitué par l'entérotoxine ST synthétique de porc et la toxine tétanique (ci-après dé- signé par STP-TT); pour immuniser respectivement des lapins et des souris, selon le procédé préconisé par FRANTZ et ROBERTSON dé- crit dans Infect and Immunity, 33, 193-198 ( 1981) en remplaçant la toxine naturelle par les deux conjugués. a) Les conjugués selon l'invention induisent des anticorps. a)l Immunisation à l'aide du conjugué enté- rotoxine ST synthétique de porc-ovalbumine. Les préparations du susdit conjugué selon l'invention contenant 100 pg d'entérotoxine ST synthé- tique de porc par ml sont mélangées avec une quantité égale d'adjuvants de FREUND. On injecte par voie intradermique à des lapins BOUSCAT ( 6 mois), 1 ml de conjugué STP-OVA à des en- droits multiples, le long du dos. Des doses vaccinantes ( 50 pg d'entérotoxine ST synthétique de porc) en suspension dans l'adjuvant de FREUND incomplet sont effectuées à 4 semaines d'inter- vallependant 3 mois. On recueille le sérum de lapin, trois semaines après la dernière injection et on le stocke à -200 C jus- qu'à ce qu'il soit soumis à la méthode d'Elisa. a)2 Immunisation à l'aide du coniuqué enté- rotoxine ST synthétique de porc-toxine tdtanique. On immunise des souris (Balb/c) avec le con- jugué STP-TT selon le protocole suivant On mélange pl de conjugué STP-TT (contenant 10 pg d'entéroto- xine ST synthétique de porc) avec un volume égal d'ad- juvant complet de FREUND On injecte cette préparation de façon intrapéritonéale. Des injections vaccinantes sont faites sous forme d'injections intramusculaires ( 100 pl de conjugué selon l'invention et 10 p 1 d'adjuvant incomplet de FREUND), chaque mois, pendant deux mois On recueille le sérum de souris, 4 jours après la dernière injection Le sérum est stocké à -20 C jusqu'à ce qu'il soit soumis à la méthode d'Elisa. a)3 Détermination des anticorps par la mé- thode d'Elisa (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). La méthode d'Elisa est une technique en phase hétérogène (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) qui per- met de déterminer et de doser des anticorps au moyen d'une réaction antigène-anticorps. De façon générale, on a recours à des tubes en plastique que l'on recouvre d'un excès d'antigènes, puis on introduit le sérum contenant les anticorps à déterminer et on laisse incuber. Au cours de l'incubation, les anticorps s'as- socient avec leurs antigènes respectifs On effectue ensuite une deuxième incubation à l'aide d'anticorps anti-immunoglobuline marqués grâce à une enzyme. Plus précisément, l'essai concernant la déter- mination des anticorps contenus dans le sérum de lapin et de souris, respectivement immunisé avec les conjugués STP-OVA et STP-TT, comme indiqué ci-dessus, a été effec- tué comme il est décrit par VOLLER et al dans Enzyme linked immunosorbent assay, a guide with abstracts of microplates applications, Dynatech, Europe, Guernsey, p 1 ( 1979). Les entérotoxines ST synthétiques de porc ou les entérotoxines ST naturelles de porc ( 20 pg/ml dans m M de tamnon carbonate/bicarbonate à p H 9,0) (tampon de revêtement) sont déposées en excès sur les tubes des microplaques Elisa (commercialisés par Nunc Tnter-Med Denmark) pendant environ deux heures à environ 37 C. Anrès dépôt, on lave les tubes à l'aide d'une solution saline de tampon Dhosphate de sodium à p H 7,4 contenant 0,05 % de Tween 20 (agent mouillant obtenu par condensation des esters d'acides gras et de sorbitol avec l'oxyde d'éthylène, la fixation des chaînes poly- oxyéthyléniques s'effectuant sur les hydroxyles non es- térifiés du sorbitol et commercialisé par la société MERCK sous le nom de Tween 20)(Pi Na/Tween 20) Le même tampon (Pi Na/Tween 20) est également utilisé comme di- luant des sérums de latin et de souris à tester et comme diluant des anticorps anti-immunoglobulines marqués par l'enzyme. Ces anticorps antiimmunoglobulines sont d'une part des Ig G chèvre anti-lapin (produits par les labora- toires BIONETIC, USA), d'autre part des Ig G mouton anti- souris (INSTITUT PASTEUR, France), tous les deux couplés au même enzyme, qui est la peroxydase. Les sérums de lapin et de souris à tester sont ajoutés dans les tubes dans des dilutions appropriées et on laisse incuber mendant une heure à 37 C Anrès d'au- tres lavages avec Pi Na/Tween 20, on ajoute les anticorps antiimmunoglobulines respectifs ci-dessus définis et on laisse incuber pendant une heure à 37 C Après plusieurs lavages, la quantité d'enzymes liées aux tubes est dé- terminée en utilisant l'O-phénylène diamine ( 50 mg/100 ml) et 40 pl de peroxyde d'hydrogène dans 50 m M de tam- pon citrate/phosphate à p H 5, comme substrat On arrête la réaction 30 minutes apres, par addition de 50 pl de H 2 SO 4 à 12,5 % et on lit immédiatement les valeurs d'ab- sorption à 492 nm. b)1 Les anticor Ds induits oar les conjugus STP-OVA et STP-TT réagissent avec l'entérotoxine ST synthétique de porc. On étudie dans le sérum de lapin à tester, la possibilité qu'il a de se combiner avec l'entérotoxine ST synthétique de porc. La figure 2 représente la courbe de dosage (par la méthode Elisa) du sérum de lapin comportant des anticorps induits par le conjugué STP-OVA. On a représenté en ordonnées la variation de densité optique en fonction de l'inverse des dilutions de sérum. La ligne en points noirs concerne le dosage du sérum contenant les anticorps induits par le conju- gué STP-OVA. La ligne en points blancs concerne le sérum contenant les anticorps induits par le conjugué STP-OVA, préincubé pendant une heure, à la température de la piè- ce avec un excès d'entérotoxine ST synthétique de porc, avant la méthode Elisa. Comme il résulte clairement de cette figure lorsqu'un excès d'entérotoxine ST synthétique de porc est incubée avec le sérum avant l'addition à l'entéro- toxine ST synthétique liée aux parois plastiques du tube, on n'observe aucune réaction, ce qui indique que la liaison entre les anticorps induits par le conjugué STP-OVA et l'entérotoxine ST synthétique de porc est spécifique. b)2 Les anticorps induits Dar les conjueés STP-OVA et STP-TT réagissent avec l 'entérotoxine ST synthétique humaine. Lorsque le sérum de lapin contenant les anti- cords induits nar le conjugué STP-OVA est testé sur la toxine ST synthétique humaine, on observe une réaction croisée. La figure 3 représente la courbe de dosage (par la méthode Elisa) du sérum de lapin contenant les anticorps induits Dar le conjugué STP-OVA par l'entéro- toxine ST synthétique humaine. On a représenté en ordonnées la variation de densité optique et en abscisses l'inverse des dilutions de sérum. La courbe portant les triangles correspond aux résultats obtenus avec le sérum comportant les anti- corps induits par le conjugué STP-OVA. La courbe en points blancs correspond aux ré- sultats obtenus avec le sérum contenant les anticorps induits par le conjugué STP-OVA, préincubé pendant envi- ron une heure, à la température ambiante avec un excès d'entérotoxine ST synthétique humaine, avant d'effectuer la méthode Elisa. Il résulte clairement de cette figure que les anticorps induits par le conjugué STP-OVA, réagissent avec l'entérotoxine ST synthétique humaine qui est fixée sur les tubes. On remarque donc à nouveau que l'entérotoxine ST synthétique humaine en excès, incubée avec le sérum à tester, avant d'effectuer le test Elisa, bloque la liaison spécifique des anticorps induits par le conjugué STP-OVA. c) Les anticorps induits par le conjugué STP- OVA reconnaissent l'entérotoxine ST naturelle humaine. Afin de montrer que les anticorps fabriqués contre l'entérotoxine ST synthétique de porc sont capa- bles de réagir avec l'entérotoxine ST naturelle humaine, on dépose dans des cupules d'une microplaque Elisa de l'entérotoxine ST naturelle humaine et de l'entérotoxine ST synthétique humaine. On effectue le test Elisa dans ces conditions, et on observe que les susdits anticorps réagissent avec l'entérotoxine ST naturelle humaine. On peut montrer de la même façon que les anti- corps fabriqués contre l'entérotoxine ST synthétique de porc reconnaissent l'entérotoxine ST naturelle de porc. On en déduit donc que les peptides selon l'in- vention induisent des anticorps qui reconnaissent: l'entérotoxine ST synthétique de porc, l'entérotoxine ST synthétique humaine, l'entérotoxine ST naturelle de Dore, l'entérotoxine ST naturelle humaine. d) Les oeptides selon l'invention induisent des anticorps qui neutralisent l'entérotoxine ST natu- relie humaine. On teste les sérums de lapins et de souris qui ont été respectivement immunisés avec les conjugués STP-OVA et STP-TT, pour déterminer leur capacité à neu- traliser l'activité biologique de l'entérotoxine ST na- turelle humaine en ayant recours au test des souriceaux décrit dans J Biol Chem 255 ( 1980), 4 716-4 721 par STAPLES et al. Pour chaque essai, on effectue les six dilu- tions suivantes de sérum dans un tampon Pi Na, p H 7,00: 1 1/50 2 1/200 3 1/400 1/800 5 1/1600 60 1/3200 et on mélange le sérum à-tester avec l'entérotoxine ST naturelle humaine. d)10 Résultats obtenus avec les anticor Ds induits par le conijuaué STP-OVA. Sur la figure 4, on a représenté l'effet du sérum de lapin comportant les anticorps induits par le conjugué STP-OVA sur l'accumulation de fluide intestinal provoqué par 12,5 ng d'entérotoxine ST naturelle humaine ( 12, 5 ng d'entérotoxine ST représentant 5 unités de souris, cf GIANNELLA R A ( 1976) Infect and Immunity, 14, 95-99). On a porté en ordonnées le rapport poids de l'intestin/poids du corps, et en abscisses les six di- lutions de sérum. Pour chaque dilution de sérum, on mélange 12,5 ng d'entérotoxine ST naturelle humaine avec 20 il de sérum (volume total 100 pl) et on laisse incuber pen- dant une heure avant d'effectuer le test des souri- ceaux. Chacun des points de la courbe obtenue corres- pond à la moyenne de trois déterminations. La colonne 1 sert de témoin et correspond aux résultats obtenus avec 12,5 ng d'entérotoxine ST natu- relle humaine. La colonne 2 sert de témoin et correspond aux résultats obtenus avec 12,5 ng d'entérotoxine ST natu- relle humaine à laquelle on a additionné 20 pl de sérum de lapin non immunisé dilué à 1/50. La colonne 3 sert de témoin et correspond aux résultats obtenus sans entérotoxine. d)2 Résultats obtenus avec les anticorps in- duits Dar le coniugué STP-TT. La figure 5 représente l'effet du sérum de souris comportant les anticorps induits par le conjugué STP-TT sur l'accumulation du fluide intestinal Drovoqué par 12,5 ng d'entérotoxine ST naturelle humaine. La courbe de la figure 5 est établie comme il a été indiqué à propos de la figure 4 et les colonnes 1, 2 et 3 ont les significations indiquées à propos de la figure 4. Les anticorps induits par les conjugués selon l'invention présentent la remarquable propriété de neu- traliser, de façon spécifique, l'activité biologique de l'entérotoxine ST naturelle humaine. Les peptides selon l'invention qui peuvent etre obtenus par le procédé de synthèse en phase solide présentent l'avantage d'être prepares en grandes quan- tités et sous forme de matériaux homogènes, ce qui évi- te d'avoir recours aux méthodes compliquées consistant à faire croître des bactéries, suivie d'un nrocédé de nurification astreignant. Les pentides selon l'invention ne sont pas toxiques, meme en grande quantité comme les tests l'ont prouvé Ceci peut être ex Dliqué par le fait qu'il n'y a nas de ponts disulfures, puisque les groupes SH des résidus cystéyle sont protégés par des groupements sta- bles dans un milieu biologique. Les pentides selon l'invention présentent l'intéressante nropriété, lorsqu'ils sont cou Dlés à différentes Protéines porteuses, d'induire des anticorps qui reconnaissent l'entérotoxine ST naturelle, qui éta- blissent des liaisons avec cette entérotoxine et qui neutralisent son activité biologique. Ce résultat pourrait être expliqué par l'hypo- thèse que les quatre Dremiers résidus Asn-Thr-Phe-Tyr de l'extrémité N-terminale de la séquence des 18 amino- acides de l'entérotoxine ST ne sont probablement pas impliqués dans la configuration repliée induite par les ponts disulfures. Cette portion de l'entérotoxine ST Darait con- sister en un déterminant antigénique stable, qui est moins immunogène que dans l'entérotoxine ST naturelle repliée, mais qui provoque des anticorps lorsqu'il fait partie de l'entérotoxine ST naturelle dont les groupes thiols des résidus cystéyle ont été réduits ou lorsqu'il se trouve dans la séquence nentidique des pentides selon l * l'invention et notamment de l'entérotoxine ST synthéti- que, dont les groupes thiols des résidus cystéyle sont protéqés. Les anticorps qui sont dirigés vers cette ré- gion de la molécule se lient à l'entérotoxine ST natu- relle quelle que soit sa configuration. L'exemple décrit ci-dessous montre la mise en évidence de la toxine ST dans un système de culture. Exemole de mise en évidence de la toxine ST dans un système de culture. Les bactéries isolées du prélèvement sont cul- tivées pendant 12 heures dans un milieu nutritif liquide, par exemple un milieu extrait de levure, hydrolysat de caséine (désigné par CYE). Les bactéries, a Drès culture, sont centrifugées et le surnageant de la centrifugation est récupéré. On dose par procédé radio-immunologique clas- sique la toxinie contenue dans le surnageant Ainsi les anticorps induits par les peptides selon l'invention permettent de doser la toxine ST. Les peptides selon l'invention, seuls ou asso- ciés avec une molécule porteuse sont susceptibles d'in- duire, comme cela a été montré ci-dessus la synthèse d'anticorps neutralisants, ce qui permet d'utiliser les peptides comme agents vaccinants. A titre d'exemple, les peotides selon l'inven- tion (en association avec une molécule porteuse telle que la toxine tétanique) sont utilisés à raison d'envi- ron: pg pour des souris (souris Balb/c d'envi- ron 20 g); Pg pour des lapins de type Bouscat. L'invention vise également l'a Dolication des peptides à la mise au noint des tests radio-immunologiques eût immuno-enzymatiques (ELISA) pour détecter directement l'entérotoxine ST ainsi qu'à l'immunisation dans le domaine médical et vétérinaire contre l'entérotoxine ST naturelle. L'invention ne se limite naturellement pas aux peptides particuliers qui ont été envisages. Comme il est bien connu de l'homme de l'art, certains résidus amino-acyle contenus dans les séquences P peuvent éventuellement être remplacés par d'autres résidus amino-acyle, dans la mesure o ceux-ci ne modi- fient pas sensiblement les configurations de surface des peptides formés ou la capacité des anticorps: induits par les peotides ainsi modifiés à l'égard des peptides non modifiés ou dans le cas présent, contre les entéro- toxines ST naturelles A cet égard, on mentionnera par exemple les éventuelles substitutions du groupe alanyle par le groupe glycyl ou viceversa, la substitution possible des résidus iso-asparagiques nar des résidus aspartiques, glutamine ou isoglutamine, la substitution des groupes valine par les groupes alanine, leucine ou glycine, la substitution des groupes lysine par des groupes norleucine ou encore arginine, etc, sous ré- serve que soit chaque fois vérifiée la capacité des pentides modifiés d'induire des anticorps susceptibles de neutraliser les peptides tels qu'ils ont été définis plus haut, ou la toxine naturelle Il est naturellement entendu que tous ces équivalents possibles sont couverts par les peptides plus spécifiquement revendiqués ci- après - REVENDICATIONS 1 Peotide (P)n comportant au plus 18 N amino- acides et au moins 4 N amino-acides, de préférence lévo- gyres, caractérisé en ce que: N vaut 1 lorsque la séquence peptidique P ne comporte aucun résidu cystéyle; N vaut 1 ou 2, lorsque la séquence peptidique P com- porte au moins un résidu cystéyle; et en ce que lorsque N vaut 1, la séquence peptidique P est contenue dans l'enchaînement peptidique suivant: Ans-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu-Cys-Cls-A-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly- Cys-T(I) (N-ter) (C-ter) dans laquelle soit A représente Asn et T représente Tyr, soit A représente Tyr et T représente Asn; et caractérisée en ce que les groupes thiols des éven- tuels résidus cystéyle présents dans la molécule ont été protégés par des groupements stables dans les conditions biologiques, l'un au plus des groupes thiols pouvant etre sous forme de groupe SH libre ou pouvant être pro- tégé par un groupe non stable dans les conditions biolo- giques; et en ce que lorsque N vaut 2, la séquence pep- tidique P-P est constituée par deux séquences peptidi- ques P identiques comportant chacune au plus 18 acides aminés et au moins 4 acides aminés, contenues dans l'en- chainement peptidique de formule (I) ci-dessus indiquée, les deux séquences peptidiques P étant reliées entre elles par l'intermédiaire d'une liaison disulfure éta- blie entre l'atome de soufre de l'un quelconque des ré- sidus cystéyle de l'une des deux séquences et l'atome de soufre de l'un quelconque des résidus cystéyle de l'au- tre séquence, et caractérisé en ce que les autres groupes thiols non engagés dans la liaison disulfure des éven- tuels résidus cystéyle sont protégés par un groupement protecteur stable dans les conditions biologiques. 2 Peptide selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le groupe protecteur stable dans les con- ditions biologiques de la fonction thiol des résidus cystéyle a pour formule: RCNR'R" o dans laquelle R, R' et R" représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène, un radical alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence: CH 3 CNHR', RCNHCH et R-C-N-CH 31 ô} l 3 Il I 1 3 0 O O R'R" dans lesquels R et R' représentent un atome d'hydrogène, un radical alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone. 3 Peptide selon l'une quelconque des reven- dications 1 et 2, caractérisé en ce que le groupe pro- tecteur de la fonction thiol est constituée par l'acé- tamidométhyle ou le formamidométhyle. 4 Monooeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que leur en- chalnement peptidique est contenu dans la séquence oep- tidique suivante: Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu-Cys-Cys-A-Pro-Ala-Cysla-Gly-Cys-T (N-ter) (C-ter) dans laquelle soit A représente Asn et T représente Tyr, soit A représente Tyr et T représente Asn; et caracté- risés en ce que les groupes thiols des éventuels résidus cystéyle présents dans la molécule ont été protégés par des groupements stables dans les conditions biologiques, l'un au plus des groupes thiols pouvant être sous forme de groupe SH libre ou pouvant être protégé Dar un groupe non stable dans les conditions biologiques. 5 Monopeptides selon la revendication 4, ca- ractérisés en ce que tous les groupes thiols des éven- tuels résidus cystéyle ont été protégés par des groupe- ments stables dans les conditions biologiques. 6 Mononeptides selon la revendication 4, ca- ractérisés en ce que tous les groupes thiols des éven- tuels résidus cystéyle, sauf un, ont été protégés par des groupements stables dans les conditions biologiques. 7 Dipeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par deux séquences peptidiques P identiques comportant chacune au plus 18 acides aminés et au moins 4 acides aminés, contenues dans l'enchalnement peptidi- que de formule (I) ci-dessus indiquée, les deux séquen- ces peptidiques P étant reliées entre elles par l'inter- médiaire d'une liaison disulfure établie entre l'atome de soufre de l'un des résidus cystéyle de l'une des deux séquences peptidiques et l'atome de soufre de l'un des résidus cystéyle de l'autre séquence peptidique, et caractérisés en ce que les autres groupes thiols -non engagés dans la liaison disulfure des éventuels résidus cystéyle sont protégés par un groupement protecteur sta- ble dans les conditions biologiques. 8 Pentides selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 7, caractérisés en ce qu'ils comprennent l'une des séquences suivantes: -Asn-Thr-Phe-Tyr- -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys- -Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys- -Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala)Cys- -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu- -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu- -Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys- -Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys- 9 Monopeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisés en ce qu'ils répon- dent à la formule suivante: -Asn-Thr-Phe-Tyr- -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys- -Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys- -Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys- -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu- -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Glu-Leu- -Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala -Cys-Ala-Gly-Cys- -Cvs-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Tyr-Pro-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys- Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala- Cys-Ala)Gly-Cys-Tyr ( 1) Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Cys-Gly-Leu-Cys-Cys-Tyr-ProAla- Cys-Ala)Gly-Cys-Asn ( 2) -Asn-Thr-Phe-Tyr-Cys-Gly-Gly-Gly ( 3) Conjugués caractérisés en ce qu'ils sont constitués par un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, en association avec une molécule porteuse physiologiquement acceptable et non toxique de préférence une protéine avantageusement choisie par- mi l'ovalbumine, la toxine tétanique, le choléragénoide et la cytotoxine de Shigella. 11 Application d'un peptide selon l'une quel- conque des revendications 1 à 10, à la fabrication d'an- ticorps permettant la mise en évidence des toxines ST humaines ou animales, notamment porcines. 12.-Application d'un peptide selon l'une quel- conque des revendications 1 à 10, à la fabrication d'an- ticorps permettant la vaccination de l'homme et des ani- maux vis-à-vis des entérotoxines ST humaines ou animales notamment oorcines.