Brevet FR2529787A1 — publié le 19840113

L'invention couvre les domaines pharmaceutique, transfusionnel et génie biologique tel que, par exemple les cultures cellulaires, et les sciences biologiques. La solution, objet de la présente invention se propose de conserver à des suspensions cellulaires toutes leurs qualités pendant la conservation in vitro. Dans la description ci-après sont utilisées les abréviations suivantes SAG saline, adenine, glucose, SAG-MANNITOL saline, adenine, glucose, mannitol PAGG.S Phosphate, adénine, glucose, guanosine, saline PAGGS4ORSTOL Phosphate, adénine, glucose, guanosine, salint, sorbitol ATP adenosine, triphosphate 2.3 DPG 2.3 diphosphoglycerate Hb hémoglobine mg milligramme MOL/G/Hb micromoles par gramme d'hémoglobine. 51 Cr chrome 51 CE charge énergétique Les modèles choisis pour les exemples sont des suspensions d'hématies humaines et en particulier des hematies humaines ayant subi un cycle de congélation-décongélation, le cryoprotecteur employé lors de la congélation étant le glycérol en concentration finale de 17,4 %. Des solutions de conservation ont été proposées pour des suspensions de cellules fraîches. Dans le cas d'une suspension d'hématies humaines franches, les solutions suivantes ont déjà e été étudiées SAG S S A G-mannitol P P A G G.S P P A G G S-sorbitol Ces solutions permettent une bonne conservation des hématies franches. Appliquées à des hématies décongelées prises comme exemple, elles ont cependant, un tres médiocre pouvoir protecteur qui ne permet pas la conservation de toutes les qualites des cellules étudiées. Le S A G et le S A G-Mannitol assurent un bon bilan énergétique (mesure de 1'ATP et de la charge énergetique) mais, par contre, le bilan fonctionnel est rapidement déficitaire (15 s de 2.3 DPG au Seme jour). Le taux d'Hémoglobine, ou Hb libre est trop élevé dès le ler jour de conservation (valeur ; > 200 mg %). Le P A G G S et le P A G G S-sorbitol assurent un meilleur bilan fonctionnel, mais lthémolyse est encore trop élevé > 200 mg %) dès le 3ème jour de conser- vation. D'autre part une solution de saccharose tamponné a e été mise au point par WOLFDIETRICH TOURSEL pour la conservation des suspensions d'hématies humaines décongelées. Le milieu a e été étudié pendant 7 jours et ses résultats sont les suivants : jours Hb libre AT P 2.3. DPG x S x S x S 0 34 9 3.5 0.6 14.8 1.3 1 41 8 3.4 0.4 13.6. 1.1 2 48 8 3.2 0.8 12.1 2.1 3 60 11 2.6 0.5 8.4 3.2 7 104 19 1.7 0.6 2.1 0.8 Si on accepte la limite de 2 u mol/g Hb que DERN fixe à 1'ATP pour assurer une recirculation de 70 % d'hématies marquées au 51 Cr 24 heures après transfusion, on voit que la conservation ne peut pas excéder 3 jours. Par contre, au jour 3, le 2.3 DPG conserve encore un taux correct. TOURSEL propose d'ailleurs de conserver 3 jours les suspensions d'hématies décongelées protegées par son milieu. La présente invention a pour but de pallier les inconvénients des solutions existantes. Elle a, en effet, pour objet une solution protectrice pour la conservation de cellules fonctionnielles, contenant de l'-adénine, du glucose; et un tampon phosphates, caractérisée en ce qu'elle contient, en outre, du saccharose, et le tampon phosphates présente une concentration élevée, I'osmolarité de la solution étant de 330 + 10 mOsm et son pH de 7,3 + 0,2. Le pouvoir tampon de la solution est élevé et ses constituants sont mélangés en proportions non toxiques. Après mélange de la solution avec des hématies humaines décongelées, les paramètres suivants ont e été étudiés : - le pouvoir oxyphorique des suspensions hématies décongelées et leur variation en fonction du temps, mesurée par le 2.3 DPG. - la viabilité mesurée par - ATP - charge énergétique - taux d'Hb libre du surnageant - taux de survie des hématies marquées au 51 Cr - variation de l'ammonium - résistance globulaire Les fonctions biologiques sont toutes très bien conservées comme le montrent les graphiques des dessins annexés, dans lesquels la figure 1 représente la variation du 2.3 DPG et du pH en fonction du temps la figure 2 montre la variation en pourcentage de 1'ATP en fonction du temps la figure 3 représente la variation de la charge énergétique la figure 4 représente la variation de l'ammonium, et la figure 5 montre la courbe du taux de survie des hématies marquées au chrome 51, 3 jours après décongélation. Dans les figures 1 à 3, la première colonne designée par Avt représente le sang frais avant congélation. Au jour 5 les normes fixées par la Commission des Contrôles de qualité de la Société Nationale de Transfusion Sanguine pour le sang décongelé au jour O sont largement dépassées. Actuellement le délai de conservation du sang décongelé est au maximum de 24 heures. La solution objet de la présente invention, permet une conservation d'au moins une semaine des hématies décongelées prises comme exemple. Cette longue conservation permet, pour cet exemple, une transfusion différée en cas de transport, support de banque, décongélation à l'avance en vue d'opérations programmées. Une gestion plus aisée de la banque de sang congelé permettrait de faire dtim- portantes économies de travail et d'argent. Tous les histogrammes et courbes concernant ce travail sont présentés dans les dessins annexés et montrent les valeurs élevées de tous les paramètres étudiés avant congélation et pendant 5-jours après la décongélation. Les hématies sont congelées selon la technique de KRIJNEN, conservées à - 155 en phase gazeuse d'azote, décongelées à + 42 et lavées en machine lave-globule automatique. En fin de lavage, le sang décongelé se présente en concentres globulaires ayant un hématocrite moyen de 78 yO. Les hématies sont alors mises en suspension dans un demivolume de solution protectrice et les divers contrôles de qualité sont pratiqués chaque jour à ltexception de la mesure de l'Hb libre qui est pratiquée à partir du jour 1 sur le surnageant après sédimentation spontanée des hématies conservées à + 40. L'étude des contrbles de qualité effectuée pendant les 5 jours qui suivent la décongélation montre - 2.3. DPG très bonne conservation de ce métabolite essentiel, qui n'est diminué que de 30 % par rapport au sang frais au jour 5 (figure 1) - A T P après une chute moyenne au jour 1, le taux d'ATP monte régulièrement pour atteindre des valeurs de 177 % du sang frais au jour 5 (figure 2) - charge énergétique : conservée dans le milieu protec teur présenté, la charge énergétique est remarquable ment stable et voisine de 0.90, pratiquement comme le sang frais (figure 3) - l'hémoglobine libre reste également très stable pendant la durée de l'étude donnant des valeurs 4 fois infé rieures à la barre limite de 200 mg par unité. - le dosage de l'ammonium montre des valeurs basses au 5ème jour, indiquant un très faible catabolisme des protéines membranaires (figure 4) - la résistance globulaire est augmentée - la survie radio-isotopique 24 heures après transfusion des hématies marqués au 51 Cr au 3ème jour de conser vation montre des chiffres analogues à ceux du jour 0, la demi-vie est de 27 jours, ce qui est un chiffre normal (figure 5) Quelles que soient la technique de congélation et la température de stockage, les concentrés érythrocytaires décongelés pris comme exemple, qu'ils soient conservés ou non, doivent répondre aux critères définis par la Commission de Contrôles de qualité de la Société Nationale de Transfusion Sanguine.Ces critères ont été comparés avec les valeurs trouvées - au jour O sur du sang décongelé simple, - au. jour 5 sur du sang décongelé protégé par la solution objet de la présente invention. Le tableau suivant montre que les chiffres trouvés restent très largement dans les normes = = avec solution protectrice Un concentré globulaire normes sang décongelé contient officielles J.O J.5** Hb totale 34 g 47.6 g. 47.5 Hématocrite 80 % 75 % 60 ffi Hb libre totale 200 mg 15 mg 49 mg Leucocytes résiduels 1.108 0.6.108 0.2.108 Stérilité nég. nég. nég. Des mesures effectuées au 20ème jour ont montré - des taux d'Hb libre de 154 mg par unité en moyenne, donc encore au-dessous de la barre des 200 mg fixée par les normes ministérielles, - des-taux d'ATP de 2.6umol/gr.Hb en moyenne donc as surant en principe la recirculation de 70 % des hématies transfusées. I1 est certain que la solution de conservation proposée assure une très bonne protection des hématies décongelées prises comme exemple, pendant une semaine. REVENDICATION Solution protectrice pour la conservation de cellules fonctionnelles, contenant de l'adénine, du glucose, et un tampon phosphates, caractérisée en ce qu'elle contient, en outre, du saccharose, en ce que le tampon phosphates présente une concentration élevée, l'osmolarité de la solution étant de 330 + 10 mOsm et son pH de 7,3 + 0,2, et en ce qu'elle peut être mélangée avec des hématies d'origine humaine ou animale ou d'autres cellules sanguines et avec des suspensions cellulaires provenant de divers organes, soit pour leur conservation de longue durée, de l'ordre d'une semaine, sur place après décongélation, ou lors d'un transport.