Brevet FR2525215A1 — publié le 19831021

La présente invention concerne des analogues de la vaso- pressine Les analogues de la vasopressine sont stabilisés contre le clivage enzymatique, ne comportent pas le reste de glycinamide de la position 9 de la vasopressine et ont des effets notables sur le système nerveux central. On sait que les hormones neurohypophysaires et certains de leurs analogues agissent sur la mémoire, le sommeil et l'apprentissage des animaux de laboratoire (D de Wied: Proc. Roy Soc B 210, 183 ( 1980) Cependant il est nécessaire pour l'emploi pratique que d'une part les composés utilisés ne pré- sentent pas les activités endocriniennes des hormones natu- relles et que d'autre part ils soient protégés contre le cli- vage enzymatique. La demanderesse a découvert que les conditions précitées sont remplies par les analogues selon l'invention qui, par rapport à l'hormone naturelle, ne comportent pas le reste glycinamide de la position 9 et dont la L-arginine de la po- sition 8 est remplacée par la forme stéréo-isomère ou par le reste ornithine Dans un des composés concernés, la liaison disulfure est remplacée par une liaison thio-éther. L'invention concerne les analogues de la vasopressine de formule I 2 CH 2 R CH 2 1 1 1 3 R -CH-CO-Tyr-Phé-Gln-Asn-NH-CH-CO-Pro-R dans laquelle: R est H, R est CH 2-S et R est D-Arg, ou 1 2 2 3 R est NH 2, R est S-S et R est D-Arg, ou R est NH 2, R est S-S et R est LOrn, et tous les autres amino-acides chiraux appartiennent à la série L. Dans la formule I ci-dessus: Tyr signifie tyrosyle, Phé signifie phénylalanyle, Gln signifie glutaminyle, Asn signifie asparaginyle, Pro signifie prolyle, D-Arg signifie D-arginine et L-Orn signifie L-ornithine. Le composé de formule I ou R 1 est H, R est CH 2-S et R 3 est D-Arg, est de plus indiqué comme le composé Ia; le composé de for- mule I o R est NH 2, R est S-S et R est D-Arg est indiqué comme le composé Ib; et le composé de formule I o R est NH 2, R est S-S et R est L-Orn est indiqué comme le composé Ic. Les activités biologiques endocriniennes (en U I /mg; pour les unités internationales voir "Handbook of Experimental Pharmacology", Vol XXIII: Neurohypophysial hormones and similar polypeptides (B Berde, Ed), p 131, Springer-Verlag, Berlin 1968) déterminées chez le rat figurent dans le tableau I Les valeurs de l'hormone naturelle qu'est l'arginine- vasopressine figurent à titre comparatif. TABLEAU I Activités biologiques Composé Utérotonique Galactogogue Pressive Antidiurétique a b Ia 0,09 inhibition 0,8 0,2 Ib 0,07 0,12 0,2 4,5 0,4 Ic 0,09 0,02 0,2 0,3 0,1 AV Pc 17 69 465 465 20 a Rats anesthésiés; brats non-anesthésiés; l'activité est exprimée en pourcentage de l'effet de la lD-arginine-8/7 désa- -minovasopressine pour le seuil d'efficacité; C/arginine-87 vasopressine. Les activités utérotonique, galactogogue et pressive ont des valeurs inférieures d'au moins trois ordres de gran- deur et l'activité antidiurétique a une valeur inférieure d'au moins deux ordres de grandeur par rapport aux activités cor- respondantes de l'hormone naturelle. Les analogues préparés ont été étudiés dans le test de la réaction de défence passive ou d'évitement passif selon lequel les effets favorables de la vasopressine naturelle sur les processus mnésiques ont été établis Le principe du test consiste en le fait que les rats évitent l'espace o ils su- bissent un choc électrique modéré dans les pattes On évalue la durée de la période d'évitement Si le composé administré prolonge cette réaction, cet effet peut être interprété comme un renforcement de la trace mnésique associée à cette situation expérimentale Les composés ont été administrés par voie sous- cutanée à la dose de 5 pg kg-1 soit immédiatement après que les animaux aient subi le choc dans les pattes, soit 20 heu- res avant l'essai de maintien de la réaction d'évitement Le fait qu'on observe l'effet méme 20 heures après l'application prouve l'action prolongée des analogues qui est très appréciée dans ce domaine. Méthodes analytiques utilisées dans les exemples pratiques: Les analyses des amino-acides ont été effectuées avec un dispositif automatique (Development Workshops, Czechoslovak Academy of Sciences, type 6020) Les échantillons des peptides ont été hydrolysés dans l'acide chlorhydrique 6 M à 105 C et Pa pendant 20 heures La chromatographie en couche mince a été effectuée sur des plaques de gel de silice (marque Silufol-Kavalier) dans les systèmes suivants: Si: butanol-2 HCOOH 98 % H 20 ( 75/13,5/11,5) 52: butanol-2 NH 4 OH à 25 % H 20 ( 85/7,5/7,5) 53: butanol-l CH 3 COOH H 20 ( 40/10/10) 54: butanol-l CH 3 COOH pyridine -H 20 ( 15/3/10/6) 59: benzène avec 20 % de méthanol 513: butanol-l CH 3 COOH H 20 ( 50/15/40) 523: acétate d'éthyle pyridine CH 3 COOH H 20 ( 5/5/1/3) L'analyse par électrophorèse a été effectuée sur du pa- pier Whatman 3 MM dans une enciente humide avec un gradient de potentiel de 20 V/cm Les composés ont été détectés avec de la ninhydrine ou selon la méthode de chloration. Le procédé pour produire les analogues selon l'invention est illustré dans les exemples pratiques. EXEMPLE 1 Préparation du composé Ia. Préparation des composés de départ (intermédiaires) Préparation de l'ester benzylique de l'o-nitro- G benzène-sulfénylprolyl-N -p-toluènesulfonyl-D- arginine. On agite pendant 40 heures à la température du laboratoi- re une solution de 2,5 g de l'ester trichloro-2,4,5-phénylique de l'onitrobenzènesulfénylproline et 2,5 g du bromhydrate de G l'ester benzylique de la N -p-toluènesulfonyl-D-arginine dans 5 ml de diméthylformamide On évapore sous vide le diméthylformamide, on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle eton extrait la solution dans l'acétate d'éthyle avec une so- lution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, de l'eau, une solution de KHSO 4/K 2 SO 4 à p H 2 et de l'eau Après séchage sur Mg SO 4, on évapore l'acétate d'éthyle et on cristallise dans l'acétate d'éthyle et l'éther de pétrole pour obtenir 3 g ( 90 %) du produit fondant à 90-92 C; ZJ 7 j D -40,4 (c= 0,4; méthanol); RF 0,88 ( 51), 0,75 ( 52), 0,75 ( 53), 0,83 ( 54), 0,60 ( 59) Pour C 31 H 36 N 60752 ( 668,8) calculée: 55,67 % C, , 43 % H, 12,56 % N, 9,59 % S; trouvée: 55,92 % C, 5,38 % H, 12,68 % N, 9,38 % S. Préparation de l'ester benzylique du lactame de la tyrosyl- phényl-alanyl-glutaminyl-asparaginyl-S ({-carboxypropyl) G cystéinyl-prolyl-N -p-toluènesulfonyl-D-arginine. On ajoute 1 ml de solution 2,6 M d'acide chlorhydrique dans l'éther à une solution de 177 mg de l'ester benzylique protégé décrit ci-dessus dans 1 ml de diméthylformamide et on abandonne le mélange réactionnel pendant 4 minutes à la température du laboratoire On précipite par l'éther le chlorhydrate formé et on le sèche: (EG 2 l Y 0,96; E Hls 0,70) 2,6 5,7 On ajoute de la N-éthylpipéridine à la solution du chlorhydrate dans le diméthylformamide ( 1 ml) de telle sorte que le p H soit d'environ 10 et on y verse une solution de mg d'acide désamino-l carbapressinoique-l (Brtnik F, Barth T, Jost K: Collect Czechoslovak Chem Commun 46, 278 ( 1981) et 23 mg de N-hydroxybenzotriazole dans 1,5 ml de diméthylformamide On refroidit le mélange réactionnel à -30 C, on ajoute 31 mg de dicyclohexylcarbodiimide dans 0,5 ml de diméthylformamide et on agite le mélange pendant 4 heures à -5 C puis pendant 20 heures à la température ambiante On sépare par filtration la dicyclohexylurée, on évapore le diméthylformamide et on triture le résidu avec de l'acide chlorhydrique (p H 2) et on lave sur le filtre avec de l'eau, une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, de l'eau et de l'éther On obtient 160 mg du produit brut et on le purifie par filtration sur gel dans le diméthylformamide On évapore les effluents contenant le composé pur et on cristal- lise le résidu dans le diméthylformamide et l'eau On obtient le produit ayant un p f de 152-154 C avec un rendement de mg ( 60 %): lXD= 34,0 (c= 0,45; diméthylformamide); RF 0,50 ( 51), 0,54 ( 53), 0,66 ( 54) Analyse des amino-acides: Pro 0,98, Arg 0,97, Cys(C 3 H 6 CO 2 H) 0,94, Gln 1,05, Asp 1,04, Tyr 0,92, Phé 1,08 Pour C 59 H 74 N 1201452 H 2 ( 1257) théorique: 56,36 % C, 6,09 % H, 13,37 % N, 5,10 % S; trouvée: 56,52 % C, 6,13 % H, 13,27 % N, 5,09 % S. Préparation du produit final: Lactame de la tyrosyl-phénylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S- (K-carboxypropyl)cystéinyl-prolyl-D-arginine. On refroidit à O C une solution de 30 mg du composé ci- dessus dans 300 p 1 d'acide trifluoroacétique, on ajoute 200 p 1 d'acide trifluorométhanesulfonique et 20 j 1 l d'anisole et on laisse reposer le mélange à la même température pendant 30 minutes On précipite le mélange avec de l'éther et on filtre sur une colonne d'échangeur d'anions sous la forme acétate On lyophilise les effluents et on purifie le produit lyophilisé par électrophorèse en écoulement libre ( 2 500 V, 135 m A) On obtient le produit ayant un pouvoir rotatoire spécifique _ 7 JD= -47 (c = 0,1; acide acétique 1 M) en une quantité de 6 mg; RF 0,34 ( 51), 0,57 ( 54), 074 ( 523) Gly 0,80. 0,57 ( 54) 74 ( 523); E 2,4 Composition des amino-acides: Arg 1,01, Pro 1,04, Gln 1,01, Asp 1,02, Phé 0,97, Tyr 0,94, Cys(C 3 H 6 CO 2 H) 0,98 Pour C 45 H 62 N 12012 S CH 3 COOH 3 H 20 ( 1109) théorique: 50,89 % C, 6,54 % H, 15,15 % N; trouvée: 50,68 %C, 6,45 %H, 14,92 % N. EXEMPLE 2 Préparation du composé Ic Préparation des composés de départ Ester benzylique de la Nbenzyloxycarbonyl-S-(triméthyl-2,4,6 benzyl)cystéinyl-tyrosyl-phénylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- S-(triméthyl-2,4,6 benzyl)cystéinyl-prolyl-N 6-benzyloxycarbo- -nylornithine. On ajoute une solution d'acide chlorhydrique 3 M dans 130 pl de dioxanne à une solution de 238 mg d'hydrazide de la N-benzyloxycarbonyl-S-(triméthyl-2,4,6 benzyl)cystéinyl- tyrozyl-phénylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(triméthyl-2,4, 6 benzyl) cystéine (Brtnfk F, Barth T, Krejcl I, Jost K: Collection Czechoslovak Chemical Communications; sous presse) dans 2 ml de diméthylformamide On refroidit la solution à -20 C et on ajoute 21 mg de nitrite de butyle dans 0,5 ml de diméthylformamide On agite le mélange réactionnel pendant minutes, on refroidit à 40 C, on neutralise avec de la N-éthylpipéridine (p H 7 sur un papier indicateur de p H humide) et on ajoute une solution préparée comme indiqué ci-après. On dissout 182 mg de l'ester benzylique de l'o-nitro- -benzènesulfénylprolyl-N -benzyloxycarbonylornithine (Brtn{k F., Barth T, Krejci I, Jost K: Collection Czechoslovak Chemical Communications: sous presse) dans 1 ml de diméthyl- -formamide et on ajoute à cette solution 0, 5 ml d'acide chlorhydrique 3 M dans l'éther Après 5 minutes on dilue le mélange réactionnel avec de l'éther, on décante le précipité séparé et on le lave avec de l'éther On dissout le chlorhy- -drate obtenu dans 2 ml de diméthylformamide, on ajuste le p H de la solution à 10 avec de la N-éthylpipéridine et on ajoute cette solution à l'azide dont la préparation est dé- crite ci-dessus Après 60 heures à O C, on évapore le mélange réactionnel et on triture le résidu successivement avec de 1 ' acide chlorhydrique 0, 5 M, de l'eau, une solution saturée d' hydrogénocarbonate de sodium et à nouveau de l'eau On purifie le produit par cristallisation à partir d'un mélange de diméthylformamide et d'eau et par filtration sur gel dans le diméthylformamide On obtient le produit fondant à 238-240 C avec un rendement de 300 mg ( 93 %), t 7 D -27,6 (c= 0,15; diméthylformamide); RF 0,86 (Si), 0,67 ( 52), 0,82 ( 53), 0,91 ( 54) Pour C 86 103 Nll O 16 52 2 H 20 ( 1617) Théorique: 63,88 % C, 6,67 % H, 9,53 % N, 3,97 % S; Trouvée: 64,00 % C, 6,38 % H, 9,57 % N, 3,95 % S. Préparation du produit final lOrnithine-8, désglycinamide-9 Jvasopressine On dissout 100 mg de l'octapeptide protégé décrit ci- dessus dans 1,25 ml d'acide trifluoroacétique, on ajoute 100 pl de thioanisole et on refroidit la solution à O C On ajoute au mélange réactionnel 1 ml d'acide trifluorométhanesulfonique refroidi à la même température Après 30 minutes à O C, on dilue le mélange avec de l'éther, on sépare par filtration le précipité séparé et on le dissout dans 300 ml d'eau On ajuste le p H de la solution à 6,8 avec de l'hydroxyde de so- dium 0,1 M et on oxyde le mélange réactionnel avec l'oxygène de l'air pendant une heure On ajuste ensuite le p H à 3,9 avec de l'acide acétique et on filtre la solution sur une colonne d'échangeur d'ions faiblement basique sous la forme acétate. On lyophilise les effluents ( 89 mg), on dissout le produit lyophilisé dans de l'acide acétique aqueux à 50 % et on purifie le produit par filtration sur gel On obtient 15,3 mg ( 24 %) de composé ayant un pouvoir de rotation spécifique C-JD = -15,1 (c = 0,2; acide acétique 1 M); E Gly 0,89, E Hls 0,34 2,4 5,7 03 RF 0,37 ( 54), 0,43 ( 513), 0,89 ( 523) Analyse des amino-acides: Phé 1, 01, Tyr 0,92, Gln 1,00, Asp 1,00, Pro 1,03, Orn 0,99, la quantité de cystéiné est déterminée sur un échantillon prépa- ré après oxydation en acide cystéique avec de l'acide perfor- mique: 1,92. Pour C 43 H 59 Nll O 252 2 CH 3 CO 2 H 2 H 20 ( 1142) théorique: 49,42 % C, 6,26 % H, 13,48 % N, trouvée: 49,18 % C, 5,95 % H, 13,30 % N. EXEMPLE 3 Préparation du composé Ib Préparation du composé de départ Ester benzylique de la N-benzyloxycarbonyl-S-(triméthyl-2,4,6 benzyl)cystéinyl-tyrosyl-ph Dnylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- S-(triméthyl-2,4,6 benzyl)cystéinyl-prolyl-N -p-toluènesulfo- nyl-D-arginine. On prépare une solution de l'azide de l'hexapeptide pro- tégé de la même façon que dans l'exemple 1. On prépare l'ester benzylique de l'o-nitrobenzènesulfonyl- -prolyl-NG-p-toluènesulfonyl-D-arginine selon le brevet tché- coslovque N (demande n 2099-81) On ajoute à une solution de 200 mg de ce composé dans 1 ml de diméthylfor- mamide, une solution 2 M d'acide chlorhydrique dans 0,5 ml d' éther On laisse le mélange réactionnel séjourner pendant 5 minutes à la température ambiante puis on dilue avec de 1 ' éther On sépare le chlorhydrate précipité en s'aidant du vide, on lave avec de l'éther, on dissout dans 2 ml de dimé- -thylformamide et on ajuste le p H de la solution à 10 avec de la Néthylpipéridine On ajoute cette solution à la solution de l'azide et on laisse le mélange réactionnel séjourner pen- dant 60 heures à O C On évapore le diméthylformamide et on traite et purifie le résidu selon le procédé décrit dans 1 ' exemple 1. On obtient le produit fondant à 230-232 C avec un rende- ment de 310 mg ( 93 %); -t KD= 28,6 (c= 0,5; diméthylforma- mide); RF 0,94 (Si), 0,75 ( 52), 0,90 ( 53), 0,96 ( 54) Pour C 86 H 105 N 1301653 H 20 ( 1691) théorique: 61,08 % C, 6,26 % H, ,77 % N, 5,69 % S; trouvée: 60,89 % C, 6,23 %H, 10,75 % H, ,42 % S. Préparation du produit final e-arginine-8, désglycinamide-97 vasopressine On clive les groupes protecteurs de 100 mg de l'octapep- -tide décrit ci-dessus et on oxyde de la même façon que décrit dans l'exemple 1 On effectue de façon semblable l'élimination des sels et la filtration sur gel On obtient le produit avec un rendement de 14 mg ( 23 %); 7 D= -17,7 (c= 0,27; acide acétique 1 M); E Gy EHI 0,3256; R 0,34 ( 54), 0,42 2,4 0,56, 5,7 F ( 513), 0,91 ( 523) Analyse des amino-acides: Phé 1,02, Tyr 0,91, Asp 1, 02, Gln 1,04, Pro 1,02, Arg 1,00, Cys(O 3 H) 1,92 (la valeur de l'acide cystéique a été obtenue à partir d'un échantillon séparé après oxydation avec de l'acide performi- que) Pour C 44 H 61 N 1301252 2 CH 3 COOH 2 H 20 ( 1124) théorique: 49,14 % C, 6,19 % H, 16,20 % N; trouvée: 49,02 % C, 5,98 % H, ,94 % N. REVENDICATION Nouveaux analogues de la vasopressine caractérisée en ce qu'ils répondent à la formule I CH R 2 CH 1 2 1 2 R -CH-CO-Tyr-Phé-Gln-Asn-NH-CH-CO-Pro-R 3 dans laquelle: R 1 est H, R 2 est CH 2-S et R 3 est D-Arg, ou 1 2 3 R est NH 2, R est S-S et R est D-Arg, ou R est NH 2, R est S-S et R est LOrn, et o tous les autres amino-acides chiraux appartiennent à la série L.