Brevet FR2526442A1 — publié le 19831110

Un procédé de préparation de la L-carnitine par réduction asymétrique de la 3-déshydrocarnitine a été décrit dans le brevet français N 2398046 Le procédé consiste à soumettre la 3-déshydrocarnitine, dont la synthèse chimique a été décrite par exemple par Aurich et coll, Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 349 1310 ( 1968), ou un de ses sels, à l'action simultanée en milieu aqueux des éléments suivants: a) La carnitine déshydrogénase b) Un coenzyme utilisable par la carnitine déshydrogénase pour la réduc- tion de la déshydrocarnitine,ce coenzyme étant le nicotinamide adénine dinucléotide, lequel peut exister sous forme oxydée (NAD+) ou sous forme réduite (NADH) c) Un système (ou agent) chimique ou enzymatique de réduction de la forme oxydée du nicotinamide adénine dinucléotide Ce système com- porte dans tous les cas un réducteur (R) et, en outre, dans le cas d'un système de réduction enzymatique, un enzyme (E). Les conditions de mise en oeuvre de la réaction de préparation de la L-carnitine sont décrites dans le brevet français précité. Divers systèmes de réduction du NAD+ (encore appelés systèmes de régénération du NADH) ont été décrits dans le brevet français déjà cité notamment des systèmes enzymatiques (composés alors d'un réduc- teur R et d'un enzyme E) Les résultats les meilleurs ont été obtenus avec un système o le réducteur est le glucose et l'enzyme la glucose déshydrogénase (E C 1 1 1 47). La réaction de réduction du NAD+ s'écrit alors: + glucose déshydrogénase Glucose + NAD > gluconolactone + NADH + H+ (R) (E) Cependant les bonnes performances obtenues en utilisant ce système avaient nécessité l'emploi d'une glucose déshydrogénase purifiée Ces conditions ne sont pas utilisables industriellement, le coût de la purification d'un enzyme, en l'occurence la glucose déshydrogénase, étant généralement très élévé L'emploi d'un extrait brut ou très peu purifié contenant l'activité enzymatique de la glucose deshy- drogénase est donc susceptible d'abaisser considérablement ce coût. Malheureusement, dans de nombreux cas, cet emploi s'avère impossible du fait de la trop faible activité des extraits bruts qui exige la mise en oeuvre de trop grandes quantités d'extraits bruts ainsi que du fait de la présence dans ces extraits de composés divers, qui peuvent être eux-mêmes des enzymes, et qui exercent d'une façon ou d'une autre une action défavorable sur la synthèse considérée. Les origines possibles de cette action défavorable sont diverses et parfois cumulatives et ne sont pas toujours connues On peut citer par exemple l'inactivation trop rapide des enzymes et coenzymes utilisés dans la réaction par suite de la présence de l'extrait brut, la synthèse de produits différents à partir des substrats présents et l'inhibition de la synthèse de la L-carnitine par les produits contenus dans l'extrait. Un autre inconvénient de l'emploi d'extraits enzymatiques bruts réside dans la difficulté de purification de la L-carnitine par suite de la présence des impuretés contenues dans l'extrait brut utilisé. Le demandeur a découvert les conditions permettant la préparation d'un extrait brut stable et actif de glucose déshydrogénase et son utilisa- tion pour la synthèse de L-carnitine. Les expériences qui ont conduit à la découverte du procédé de l'in- vention sont résumées ci-après: L'activité de la glucose déshydrogénase a été mesurée dans des extraits enzymatiques provenant de diverses souches de bactéries appartenant à l'espèce Bacillus subtilis On a constaté que certains mutants de sporulation (mutants formant, à la fin de la croissance, des spores incomplètement développées) avaient une activité glucose déshydrogénase beaucoup plus élevée que celle de la souche sauvage Des résultats ana- logues ont été observés avec des souches appartenantà d'autres espèces de Bacillus telles que Bacillus cereus Dans de nombreux cas cependant, la stabilité des extraits enzymatiques était mauvaise, la glucose déshydrogénase perdant une grande partie de son activité en quelques heures, alors que la stabilité du même enzyme après purification était beaucoup meilleure La raison de cette instabilité n'a pas été élucidée mais il est possible qu'elle soit dûe au moins en partie à la présence de protéases qui inactivent les enzymes tels que la glucose déshydrogénase en hydrolysant certaines des liaisons peptidiques de ces enzymes On a maintenant découvert que, chez un mutant de sporulation particulier de Bacillus megaterium, la glucose déshydrogénase dans les extraits bruts a une activité élevée et une stabilité meilleure que dans le cas pré- cédent Ce mutant a été obtenu à partir de la souche de la collection du laboratoire, Bacillus megaterium IFP 180 Cette souche est une bactérie aérobie en forme de bâtonnets formant des endospores résistantes à la température dont les caractéristiques correspondent à l'espèce Bacillus megaterium telle que décrite dans le "Bergey's manual of déterminative bacteriology" 8 ème édition ( 1974), The Williams & Wilkins Company, Baltimore, p 529 On a effectué des repiquages successifs sur des milieux glucosés neufs, de cultures de B megaterium IFP 180 ayant terminé leur croissance et effectué leur sporulation On a constaté que l'activité glucose déshydrogénase des extraits enzymatiques obtenus à partir des cultures ayant subi plusieurs repiquages successifs était considérablement augmentée Ainsi, par exemple, après douze repiquages successifs, on a purifié la culture par isolement d'une colonie après étalement sur milieu solide La nouvelle souche obtenue, dénommée Bacillus megaterium IFP 188, présente des caractères semblables à ceuxde la souche mère B megaterium IFP 180 mais s'en distingue par un taux de sporulation beaucoup plus faible et une activité glucose déshydrogénase nettement plus élevée On en a conclu que les repiquages effectués, qui sont connus pour favoriser la sélection de mutants as- porogènes lJ P Aubert, J Millet, E Pineau et G Milhaud, Biochim. Biophys Acta, 51, ( 1961) 529-537 l avaienteffectivement conduit à l'obten- tion d'un tel mutant qui présente par ailleurs la propriété de posséder une activité glucose déshydrogénase élevée La souche IFP 188 porte le numéro ATCC 39 118. On a également observé que la composition du milieu nutritif employé pour la culture des souches de Bacillus a une influence considérable sur l'activité glucose déshydrogénase des préparations enzymatiques obtenuesà partir de ces cultures La présence de glucose dans le milieu à une concentration -comprise entre 1 et 40 g/l s'est avérée indispensa- ble pour l'obtention d'une bonne activité glucose déshydrogénase D'une façon générale l'addition d'une source d'aminoacides telle que peptone de soja, hydrolysats de caséine, liqueur de macération de mais ("corn steep liquor"), extrait de viande, par exemple, est avantageusement pratiquée pour l'obtention d'une bonne croissance et d'une activité enzymatique élevée. L'addition de glucose dans le milieu peut être effectuée en une seule fois au début de la culture Dans certains cas, des activités enzyma- tiques plus élevées ont été obtenues par addition progressive de glucose au cours de la fermentation. La proportion de glucose, dans la culture, est de préférence de 1 à 40 g/l Un milieu préféré renferme au moins 1 g/l de glucose et au moins 1 g/l de liqueur de trempe de mais. A partir des cultures de Bacillus megaterium IFP 188, on prépare des extraits enzymatiques bruts ayant une activité glucose déshydrogénase élevée en récoltant les bactéries par centrifugation puis en cassant des suspensions de ces bactéries dans un tampon par les techniques connues telles que le traitement avec les ultra-sons, le broyage avec des billes de verre etc Après centrifugation de suspensions bactérien- nes cassées pour éliminer les débris cellulaires, on obtient les ex- traits enzymatiques bruts de glucose déshydrogénase utilisés pour la synthèse de la L-carnitine. On a étudié la stabilité de la glucose déshydrogénase dans les extraits bruts obtenus à partir de la souche IFP 188 et constaté qu'elle est bonne et nettement supérieure à celle des extraits obtenus à partir des espèces de Bacillus précédemment étudiées On a,de plus, observé que cette stabilité est nettement améliorée par la présence de glucose à une concentration entre 0,1 et 1 M D'autres sucres et polyols tels que le saccharose, le fructose, le mannitol ou le glycérol ont un effet stabilisant très inférieur Enfin, on a constaté que la stabilité de l'enzyme est bonne à un p H compris entre 6 et 7, mais moins bonne à p H 7,5 A des p H plus alcalins tels que p H 8 et au delà la stabilité est mauvaise Les conditions de stabilité qui viennent d'être décrites sont avantageusement utilisées pour la synthèse de la L-carnitine. La présente invention ne se limite pas à l'utilisation d'extraits enzy- matiques bruts de glucose déshydrogénase car on peut également,si on le désire, utiliser pour cette synthèse de la L-carnitine, des extraits purifiés de glucose déshydrogénase, obtenus à partir des extraits bruts qui viennent d'être décrits par utilisation des méthodes connues de purification des enzymes, telles que précipitation sélective avec le sulfate d'ammonium, chromatographie de divers types (échange d'ions, perméation sur gel, affinité) etc. Exemple 1 On a cultivé une souche de Bacillus megaterium (souche IFP 180) sur un milieu contenant par litre 2,5 g de glucose, 2,5 g de phosphate bipotas- sique,5 g de chlorure de sodium, 17 g d'hydrolysat tryptique de caséine et 3 g de peptone papa Ynique de soja et ajusté à p H 7,0 après stérilisa- tion 30 minutes à 1151 C Après 24 h de culture à 301 C les cellules ont été récoltées, suspendues dans un tampon phosphate de potassium 100 m M p H 7,5 puis un extrait enzymatique a été préparé par traitement aux ultra-sons ( 10 fois 15 seq à froid (O à 100 C) des suspensions cellu- laires, suivi d'une centrifugation pour éliminer les débris cellulaires. L'activité enzymatique de la glucose déshydrogénase a été mesurée dans l'extrait ainsi obtenu et trouvée égale à 0,085 unité par mg de protéi- nes de l'extrait Une unité enzymatique (u) est défini comme la quanti- té d'enzyme permettant la transformation d'une micromole de glucose par minute dans les conditions de l'essai. A partir de la souche IFP 180, des mutants de sporulation naturels ont été sélectionnés par repiquages successifs sur le milieu qui vient d'être décrit Après cinq repiquages, on a constaté que l'activité glucose déshydrogénase des cultures était améliorée On a poursuivi les repiquages jusqu'à vingt et obtenu des colonies isolées par étale- ment sur milieu solide des différentes cultures successives effectuées. Ces colonies ont ensuite été cultivées et traitées dans les mêmes condi- tions que la souche initiale IFP 180 et les activités enzymatiques de la glucose déshydrogénase ont été mesurées dans les extraits obtenus La meilleure activité enzymatique, égale à 0,50 u par mg de protéines, a été obtenue à partir d'une culture de l'une de ces colonies désignée sous le nom de souche IFP 188 On a de plus constaté que la souche IFP 188 a un taux de sporulation très faible (inférieur à 0,4 %) et constitue donc un mutant de sporulation Le mutant B megaterium IFP 188 a été retenu pour la production de glucose déshydrogénase dans les essais ultérieurs. La stabilité de la glucose déshydrogénase a été mesurée dans les ex- traits enzymatiques de cette souche IFP 188 Dans ces essais, les ex- traits ont été stérilisés par filtration et conservés à 300 C dans un tampon phosphate de potassium à p H 7,0 La mesure périodique des acti- vités glucose déshydrogénase des extraits conservés dans ces conditions a fourni des temps de demi-vie (temps requis pour la perte de la moitié de l'activité enzymatique) d'environ 15 heures. L'addition de glucose 0,6 M augmente considérablement la stabilité de l'enzyme dans les extraits bruts puisque aucune perte d'activité n'a été observée en 21 jours dans les conditions ci-dessus L'effet de stabilisation du glucose est dépendant de la concentration en glucose. A une concentration de 0,2 M le temps de demi-vie est de 40 à 50 h il est d'environ 12 jours à 0,4 M. A titre de comparaison, l'extrait de glucose déshydrogénase obtenu avec Bacillus subtilis n'avait qu'une activité de 0, 045 unité/mg de protéines de l'extrait. L'activité des meilleurs mutants de Bacillus subtilis n'a pas dépassé 0, 085 u/mg de protéines La souche sauvage de Bacillus subtilis et ses mutants avaient tous des temps de demi-vie compris entre 2 et 6 heures. Exemple 2 On a cultivé la souche de Bacillus megaterium IFP 188 dans un fermenteur de 20 1 renfermant un milieu contenant 30 g/l de peptone papaînique de soja La stérilisation initiale était faite comme dans l'exemple 1 Le p H était maintenu à 7,3 par addition d'ammoniaque 10 N Le milieu était aéré par injection de 0,5 1 d'air par 1 de milieu par minute Après h les cellules étaient récoltées et des extraits enzymatiques prépa- rés comme dans l'exemple 1 Une activité glucose déshydrogénase de 0,002 u par mg de protéines a été mesurée dans de tels extraits. La même souche a été cultivée dans les mêmes conditions sauf que le milieu contenait 10 g/l de glucose en plus de la peptone papainique de soja. Les extraits enzymatiques préparés comme précédemment avec les cellules bactériennes obtenues dans cette culture avaient une activité glucose déshydrogénase de 0,42 u par mg de protéines. Exemple 3 Une autre culture de la souche IFP 188 a été effectuée comme dans l'exem- le 2 sauf que le milieu de culture d'un volume de 16 1 était constitué par de l'eau de ville dans laquelle on injectait tout au long de la cul- ture une solution contenant 100 g/kg de liqueur de trempe de mais ("corn steep liquor") et 400 g/kg de glucose La vitesse d'injection de ce mélange était de 50 ml/heure Les extraits enzymatiques préparés avec les cellules obtenues récoltées après 20 h de croissance avaient une acti- vité glucose déshydrogénase égale à 0,60 u par mg de protéines. Exemple 4 Les extraits enzymatiques de glucose déshydrogénase-préparés dans l'exem- ple 3 ont été utilisés pour effectuer la synthèse de la L-carnitine dans les conditions suivantes: on a utilisé un réacteur de 2 1 thermo- statéà 25 C et contenant 500 ml d'un milieu contenant les composants sui- vants aux concentrations indiquéesen millimoles par litre (m M): phos- phate d'ammonium 50 m M p H 7,0, NAD+ 1 m M, glucose 600 m M, carnitine déshydrogénase (préparée comme décrit dans l'exemple 1 du brevet fran- çais N 2398046) 450 unités (soit 10 ml d'extrait enzymatique) et glucose déshydrogénase 150 unités (soit 10 ml d'extrait enzymatique brut). On injectait alors une solution contenant 800 millimoles par litre de bromhydrate de déshydrocarnitine (amenée à p H 0,5 par addition d'acide chlorhydrique concentré) La vitesse d'injection était de 5 ml/h Le p H était maintenu à 7,0 par addition d'ammoniaque 2 N, contrôlée au moyen d'un p H-mètre-titrateur automatique La quantité de L-carnitine formée, dosée par méthode enzymatique était après 48 heures de 30,5 g. REVENDICATIONS 1 Procédé de production de glucose déshydrogénase consistant à cul- tiver une souche de Bacillus dans un milieu de culture et à ex- traire l'enzyme obtenu, caractérisé en ce que la souche de Bacillus est le mutant IFP 188 de Bacillus megaterium (ATCC 39 118). 2 Procédé selon la revendication 1, dans lequel la culture est effec- tuée en présence de glucose à une concentration comprise entre 1 et 40 g/l. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la culture est effectuée dans un milieu de culture qui renferme à la fois au moins 1 g/l de glucose et au moins 1 g/l de liqueur de trempe de mais. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le glu- cose a été introduit progressivement au cours de la culture. Utilisation de l'enzyme glucose déshydrogénase obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans la réac- tion de synthèse enzymatique de la L-carnitine qui consiste à soumettre la 3-déshydrocarnitine à l'action simultanée, en milieu aqueux, des éléments suivants a) carnitine déshydrogénase b) nicotinamide adénine dinucléotide, et c) glucose et glucose déshydrogénase.