Brevet FR2528865A1 — publié le 19831223

PROCEDE D'OBTENTION IN VITRO DE CHAMPIGNONS ENDOMYCORHIZIENS A VESICULES ET A ARBUSCULES La présente invention a trait à un procédé d'obtention in vitro, de champignons endomycorhiziens à vésicules et à arbuscules (VAM). Les récents développements de la recherche sur les mycorhizes endotrophes (endomycorhizes) ont montré que leur utilisation en agriculture et en horticulture est potentiellement très importante. Ces champignons endophytes sont de très loin les plus fréquents et entrent en symbiose avec pratiquement toutes les plantes cultivées Ils se caractérisent par au moins trois propriétés fondamentales. I leur association avec une plante est obligatoire, pour le développement, 2 ils possèdent un large éventail d'hôtes et jusqu'à présent aucune spécificité n'a été signalée, 3 ils stimulent la croissance des plantes qu'ils infectent. L'effet favorable est un fait bien établi, et est dû à une augmentation de l'absorption des ions minéraux par la plante mycorhizée et tout spécialement des ions peu mobiles principalement les ions phosphore. On a montré que les hyphes du champignon endomycorhizogène sont capables d'absorber, de transporter et de transférer à la plante le phosphore soluble; ces processus aboutissent à une meilleure croissance de la plante mycorhizée (GIANINAZZI S ( 1976 Physiol Vég 14 733-741). De plus, un certain nombre d'observations ont montré que l'in- fection par un champignon endomycorhizien peut protéger les'racines de la plante mycorhizée contre les pathogènes du sol (BALTRUSCHAT H, 1975: Plytopathol 84, 172-188). Mais en dépit de nombreux travaux effectués jusqu'à ce jour, (RHODES L H, 1980, Outlook Agricult, 10, 275-281; HAYMAN D S, 1980, Nature, 287 487490) la principale difficulté d'application des mycorhizes endotrophes est que l'on ne sait pas les produire en grande quantité pour une application commerciale A la connaissance de la demanderesse on n'a jamais pu les cultiver en milieu stérile sans la plante hôte. Contrairement à la plupart des micro-organismes connus symbio- tiques parasites ou saprophites, les champignons VAM ne peuvent pas être cultivés in vitro. (BARRET J T, 1947 Phytopathol, 37, 359; MOSSE B, 1962, J gen. microbiol, 27, 509-520; HARLEY J L, 1965, in Ecology of soil- borne plant pathogens, Baker and Snyder Eds, Univ California Press, 218-229 HEPPER C M, 1979, Soil Biol Biochem, 11, 269-277; HEPPER C M, 1981, New Phytol, 88, 641-647). Les très nombreux essais de mycorhization réalisés à ce jour ont consisté à utiliser des inoculums préparés à partir de plantes entières cultivées en pot ou en serre. L'inoculation s'effectue presque toujours avec les racines mycorhizées fraichement récoltées ou parfois avec une suspension de spores. JACKSON et al ( 1972, Proc Soil Sci Soc Am 36, 64-67) utilisent des racines lyophilisées tandis que HALL ( 1979, Soil Biol. Biochem 11, 85-86) préconise l'emploi de boulettes de sol mélangées avec-des racines infectées. Dans tous les cas l'une des objections faites est la possibilité d'introduire des contaminants dans les sols par l'inoculation des VAM, notamment quand il est nécessaire pour des raisons phytosani- taires de procéder à une désinfection du sol avant plantation (qui a pour conséquence de détruire les VAM naturellement présentes). La période nécessaire pour produire un inoculum est de 2 à 4 mois, ce qui est suffisant pour produire de nombreux contaminants. Ces risques ont géné la commercialisation des inoculums De plus le coût de ces inoculums est au moins égal ou supérieur à celui d'engrais nécessaires pour obtenir le même rendement. Par conséquent, l'utilisation à grande échelle, d'endomycorhizes n'est pas encore passée à la pratique agricole, puisqu'elle se heurte à un problème majeur qui est la production d'un inoculum abondant, non contaminé, facile à stocker et à manipuler au champ. Pour résoudre ce problème, différentes études ont été entrepri- ses sur le comportement in vitro des champignons VAM, associé à des plantes entières ou à des racines Si ces méthodes sont très utiles pour étudier le métabolisme des VAM, elles paraissent cependant aléatoires comme moyen de production du champignon en culture pure du fait d'un développement très lent des racines (HEPPER C H 1975, in Endomycorrhizas, Sander F E, Mosse B and Tinker P B Eds, Acad Press London, 67-86; MOSSE B and HEPPER C M, 1975, Physiol Pl. Pathol, 5, 215-223; HEPPER C M, 1981, New Phytol, 88, 641-647, MACDONALD R M, 1981, New Phytol, 89, 87-93; ST JOHN T.V and REID C P P, 1981, New Phytol, 89, 81-86). On sait par ailleurs, que la transformation génétique des racines par insertion d'un fragment d'ADN étranger (appelé T DNA) provenant du plasmide Ri (Root inducing) d'Agrobacterium rhizogenes, permet d'établir des cultures aseptiques de racines présentant une croissance rapide et indéfinie sur milieu simple. (TEPFER D A 1981 C R Acad Sc PARIS, t 292 Série III, 153). L'Agrobacterium rhizogenes est l'agent d'une maladie, le hairy- root dont le symptome se manifeste par la prolifération d'un abondant chevelu racinaire au point d'inoculation de la bactérie. Ainsi, on s'est aperçu que l'on pouvait résoudre le problème posé en mettant en oeuvre les facultés nouvelles conférées aux racines transformées sous l'action d'Agrobacterium rhizogenes, en inoculant des cultures de ces racines transformées par des spores d'Endomycorhizes. L'objet de la présente invention est un procédé pour l'obtention d'endomycorhizes in vitro, notamment en fermenteur. Ainsi, l'invention a trait à un procédé de production in vitro de champignons endomycorhiziens à arbuscules et à vésicules (VAM), caractérisé par le fait que l'on produit des racines de dicotylédones transformées génétiquement par insertion dans le génome desdites racines de gènes du plasmide Ri, puisque l'on inocule lesdites racines par des spores d'endomycorhizes. Les gènes du plasmide Ri peuvent être apportées de plusieurs manières, soit directement par la bactérie Agrobacterium rhizogenes, virulente porteuse du plasmide, soit indirectement par une bactérie dans laquelle on a transféré le plasmide Ri, par conjugaison ou dans laquelle on a transféré le T DNA par transformation Le concept de la présente invention s'étend également au cas ou l'on produit des racines de dicotylédones transformées génétiquement par insertion dans le génome, desdites racines de gènes du plasmide Ti (Tumor inducing) provenant d'Agrobacterium tumefaciens, puis que l'on inocule, lesdites racines par des spores d'endomycorhizes. Les gènes du plasmide Ti peuvent également être apportées de plusieurs manières, soit directement par la bactérie Agrobacterium tumefaciens, virulente porteuse du plasmide, soit indirectement par une bactérie dans laquelle on a transféré le plasmide Ti, par exemple, par conjugaison ou dans laquelle on a transféré le T DNA par transformation. Dans le premier cas (plasmide Ri), l'agent inducteur, qui est le plasmide, peut être transféré de la souche d'Agrobacterium rhizogenes à une souche d'Agrobacterium tumefaciens, c'est le cas par exemple du transconjugant C 58 C 1 (p Ti 8196) (CHILTON M D. Nature, 1982, 295, 432). Dans le deuxième cas (plasmide Ti), l'agent inducteur, qui est le plasmide, peut être transféré de la souche d'Agrobacterium tumefaciens virulente à une souche Agrobacterium tumefaciens non virulente, c'est le cas par exemple du transconjugant K 57, (p Ti C 58) (KERR A, 1977, Nature, 265, 560), ou encore à une souche de Rhizobium, c'est le cas par exemple du transjugant Rhizobium trifolis souche 5 (p Ti B 63) (HOOYKAAS P J J, 1977, J Gen. Microbiol 98, 477-484), ou encore à une souche d'Escherichia coli, c'est le cas par exemple du transconjugant K 12 (p Ti RP 4) (HOLSTERS M 1978, Molec Gen Genet 163, 335-338), seulement dans le dernier cas cité, on ne contr 8 le pas à ce jour l'expression de l'agent inducteur transféré chez Escherichia coli (E Coli). Les racines transformées peuvent notamment être péparées par la technique décrite par TEPFER ( 1981), qui consiste à en induire la formation à partir d'une graine ou d'un explant tels que tubercules, fragments de tige ou de racines On peut aussi utiliser une jeune plantule comme décrit par JAYNES (J M 1981, in Biology of Rhizobiaceae Eds KENNETH L GILLES, Acad Press LONDON, p 109). A la connaissance de la demanderesse, peu de plantes ont été testées, mais on peut citer comme plantes sur lesquelles on a induit des racines transformées, la carotte, la pomme de terre, le soja, le haricot, le trèfle, le kalenchoe, le gingembre, le liseron, toutes des plantes appartenant à la famille des dicotylédones. Après inoculation des graines ou des explants et après l'appari- tion des racines, on développe les racines transformées en culture aseptique sur un milieu nutritif simple sans la bactérie inductrice. La capacité des racines transformées à croître reste stable et permanente en l'absence de la bactérie inductrice. La physiologie de ces racines transformées est différente de celles des racines non induites Les modifications apportées sont dues à l'insertion d'un fragment d'ADN provenant du plasmide Ri et Ti d'A rhizogenes ou des transconjugants utilisés) (CHILTON M D. and al 1982, Nature, 295, 432). A la suite de l'introduction dans le génome de la racine, des gênes étrangers portés par le plasmide Ri ou Ti, le potentiel de l'hôte est modifié. Les racines transformées, contrairement à la plupart des essais réalisés sur culture de racines non transformées, ne montrent aucune auxotrophie vis-à-vis des composés phytohormonaux, forment de nom- breuses ramifications secondaires et ont un potentiel de croissance élevé Il est en effet nécessaire d'utiliser des composés hormonaux type auxine pour contrôler la formation de racines latérales des racines non transformées). Les racines transformées développées en culture aseptique constituent donc un partenaire symbiotique privilégié pour le cham- pignon endomycorhizien dont on sait notamment que le nombre de points d'infection est augmenté par l'apparition de nombreuses racines secondaires (SMITH S E and WALKER N A,1981, 89, 225-240, New Phytol). L'inoculation se fait par des spores d'Endomycorhizes que l'on fait germer sur un milieu adéquat et qui peut être constitué par un milieu de culture tel que gélosé ou liquide à p H proche de la neu- tralité, ne contenant pas d'éléments toxiques pour la germination, tels que des traces de zinc, de manganèse ou de cuivre par exemple. Le milieu de culture de la bactérie Agrobacterium rhizogenes ou de la bactérie porteuse du plasmide inducteur peut être de tout type adéquat connu, tel que milieu Yeast Extract Mannitol (VINCENT, 1970, A Manual for practical study of root nodule bacteria IBP Handbook N O 15), ou milieu Sucrose, Nutrient Broth, Yeast Extract (ANAND V.K 1977, American Journal of Botany, 64 ( 2) 153-158). Les milieux de culture de racines transformées peuvent se définir comme suit, Il s'agit généralement de milieu synthétique aseptique gélosé ou liquide, contenant les usuels macro et micro- éléments, un sucre, avantageusement le saccharose et une ou plusieurs vitamines et de préférence la thiamine. Ce milieu ne contient pas de composés phytohormonaux. Pour le cas des milieux liquides, le p H est avantageusement régulé Le milieu peut aussi être avantageusement renouvelé au cours de la culture. Le milieu de culture doit être correctement aéré afin d'éviter l'anoxie des racines transformées Ainsi les racines transformées peuvent être mises en culture sur milieu minéral de Monnier (Rev. Cyt Biol vég 39, 1976, p 1), saccharose, vitamines de Morel (GOLDMANN A Ann Sc Nat Bot PARIS, 11, 1970, p 223). On peut utiliser le milieu de MURASHIBE T et SKOOG F (Physiol. Plant, 15, 473-497, 1962). Pour certaines plantes telles que le liseron, des milieux adéquats ont été décrits, comme le milieu de BONNER, modifié TORREY J.G ( 1958, Plant physiol 33, 258-263). Il est nécessaire au cours de la culture de maintenir les concentrations en N et en P à des niveaux faibles pour obtenir une réponse maximale de la croissance mycorhizienne. Pour éliminer la bactérie inductrice afin d'obtenir des cultures de racines transformées aseptiques, on opère par exemple en utilisant un antibiotique, inhibant la croissance de la bactérie, tel que la carbénicilline décrit par NEISH G A, 1975, Mycologia 67), en tenant compte du fait que le système racinaire se développe plus rapidement que la bactérie, et que les nouvelles racines se développent sans la bactérie, et il devient alors possible d'isoler ces racines sans l'agent inducteur. Pour obtenir des spores d'Endomycorhizes stériles, on peut utiliser tout système capable d'éliminer les agents contaminants et ne détruisant pas les spores Pour cela, on peut utiliser le mélange décrit par MOSSE B chloramine T et streptomycine ( 1959, Trans. Brit mycol Soc 42, 273-286). Pour la stérilisation des graines ou des explants, on peut utiliser tout mélange stérilisant à base de chlorure mercurique ou d'eau de javel (ANAND V K 1977, Amer J Bot 64 ( 2) 153-158). Les individus régénérés à partir d'une racine transformée constituent un cl Sne de racines ayant subi un changement physiologi- que permanent et stable, et l'élément transformant, constitué par l'insertion de gênes étrangers, est répliqué au cours des mitoses cellulaires. Tout cl Sne de racines n'est pas nécessairement le plus adapté à la culture et à la mycorhization, vu que l'on considère actuellement que le T-DNA est capable de s'insérer dans des parties différentes du génome des cellules végétales, et de donner ainsi des clones de racines différents. A la connaissance de la demanderesse, on ignore à la fois les mécanismes d'insertion et les sites de cette insertion, mais on sait que chaque cl Sne obtenu sera potentiellement plus ou moins favorable à la réalisation d'un système de culture de racines transformées et mycorhizées. On doit aussi sélectionner le système végétal ayant les capaci- tés intrinsèques de croissance les plus favorables. Un système de culture de racines transformées génétiquement par insertion de DNA étranger, constitue un partenaire symbiotique bien plus favorable qu'un système de racines non transformées pour le développement des Endomycorhizes Ces avantages sont résumés ci- dessous: I Le système de culture de racines transformées est simple et ne fait intervenir pour sa réalisation que l'effet inducteur de la bactérie Agrobacterium rhizogenes, ou des bactéries porteuses du plasmide inducteur, 2 Le développement des racines transformées est possible sur un milieu de culture simple, en conditon aseptique, et ne montre aucune auxotrophie vis-à-vis de composés hormonaux, 3 Les racines transformées stimulent la germination des spores du champignon mycorhizien et le développement des filaments mycéliens, 4 Les points d'entrée du champignon VAM sont plus nombreux sur une racine transformée que sur une racine non transformée. On sait que les points d'entrée sur la racine sont limités à des zones bien définies et que les jeunes régions de la racine vers l'apex sont 10 fois plus infectibles que le reste de la racine. Une des caractéristiques des racines transformées est la formation en culture de nombreuses racines secondaires; la probabilité d'apparition de nouveaux points d'entrée secondaires est donc augmentée dans le cas des racines transformées. Le potentiel de développement élevé et indéfini des racines transformées permet d'obtenir en culture une production en masse de racines mycorhizées. 6 Les potentialités nouvelles de racines transformées par introduction de gènes procaryotiques, favorables à l'infection et au développement d'un champignon endomycorhizien sont permanentes et stables. Mais la présente invention sera plus aisément comprise à l'aide des exemples suivants, donnés à titre indicatif mais nullement limitatif: EXEMPLE 1 a) Agrobacterium tumefaciens, GRAM négative appartient à la famille des rhizobiacées la souche utilisée est la souche C 51 (souche de collection PHABAGEN COLLECTION, Department of Molecular Cell Biology section Microbiology Transitorium III Padualaan 8 De Uithof 3584 CH Utrecht the Netherlands). b) L'Agrobacterium rhizogenes, GRAM négative appartient à la famille des Rhizobiacées La souche utilisée est la souche 8196. (Souche collection NCPPB, National, Collection of plant Pathogenic Bacteria, Plant Pathology Laboratory, Ministry of Agriculture Fisheries and Food, Hatching Green, Harfenden, Herts, ENGLAND). Les deux souches sont cultivées en milieu liquide YEM. L'induction racinaire Des tubercules de pomme de terre ou des carottes sont stérilisées par immersion dans une solution de chlorure mercurique ( 0,1 %) ou d'hypochlorite de sodium ( 1,05 %) pendant 5 mn, puis rincées avec de l'eau stérile ( 10 fois) On découpe stérilement à l'emporte-pièce des disques de 10 mm de diamètre sur 4 mm de hauteur que l'on dispose sur un milieu gélosé (Agar DIFCO 1 %). Les disques sont inoculés avec 0,1 ml de culture actérienne (à 109/ml) Environ deux semaines après l'inoculation, des racines sont apparues sur la plupart des explantats inoculés avec la souche 8196, et sur quelques explantats avec la souche C 58 Des segments de racines sont séparés du disque de pomme de terre ou de carotte, rincés par plusieurs trempages dans l'eau stérile -et placés sur le milieu MONNIER-MOREL auquel on a incorporé de la carbénicilline ( 600 mg/l) Les racines qui continuent à se développer sur le milieu forment de très nombreux poils absorbants qui donnent l'aspect d'un feutrage blanc et duveteux aux racines Celles-ci sont à nouveau rincées avec de l'eau stérile et transférées sur le milieu nutritif sans l'antibiotique. Dès que les racines se sont développées sur le milieu gelosé ou liquide, les cultures sont repiquées à intervalles d'environ 2 semaines. Composition du milieu de culture Le milieu est composé du milieu minéral de MONNIER, d'une solution de vitamines de MOREL et de saccharose ( 3 Z), le p H est ajusté à 6,0. * MILIEU MINERAI DE MONNIER * Macro-éléments Micro-éléments Sels:Mg/i m M/i Sels mg/i :NH 4 NO 3: 1650: 20,8 :H 3 BO 3: 8,2 :KNO 3: 1900 : 18,8: Mn SO 4,4 H 20:22,3 :Ca Cli 2 2 H 2 O 440:3,0: Zn SO 4, 4 HR, 8,6 :Mg SO 4, 7 H 20: 370:1,5:KI:0,83 :KH 2 PO 4:170: 1,2 :Na Mo O 4,2 R 2 O 0,25 :Na 2 EDTA:37,3 : 0,1:Cu SO V,5 H 20: 0,025 :Fe SO 497 H 2 O: 27,8: 0,1: Cu Cl 2, H 20:0,025 m M = millimole Vitamines de MOREL Pantothénate de calcium: 1 mg/i; inositol: 100 mg/i biotine: 0,01 mg/i; acide nicotinique: 1 mg/i pyridoxine: i mg/i et thiamine i mg/i. On a utilisé pour la culture de racines transformées de liseron le milieu BONNER modifié THOREY. en mg/i Ca (NO 3)2 4 H 20 242, Mg SO 4 7 H 2 P 42 mg; KNO,385; KC 1 61, K 2 P 4 20, Fe Cl 3 1,5, Thiamine H Cl 0,1, acide nicotinique 0,5, Zn SO,4 1, 5, Mn SO 4 4,5 Na 2 04 H 2025 p H 5,0 H 3 BO 3 1,5, CS 0,004 et sucrose 40 000. i 1 EXEMPLE 2 L'obtention de spores de Glomus mosseae stériles L'Endogonacée utilisé est une souche de Glomus mosseae provenant du laboratoire de B MOSSE (Rothmamsted) (Department of soil microbiology Rothmamsted experimental station HARPENDEN HERTFORDSHIRE ENGLAND AL 5 2 JQ) Des souches de Glomus sont disponibles à ABBOT LABORATORIES CHEMICAL AND AGRINULTURAL PRODUCTS DIVISION 1400 SHERIDAN ROAD N CHICAGO ILLINOIS 60064 U S A. Des oignons mycorhizés avec Glomus mosseae et bien développés sont dépotés Sous la loupe binoculaire, les sporocarpes mesurant 0,5 à 1 mm de diamètre sont prélevés directement à l'aide d'une pipette et placés dans une boîte de Pétri sur papier filtre humide. Les spores formées à l'intérieur des sporocarpes sont ensuite extraites avec une aiguille, chaque sporocarpe fournit 1 à 100 spores environ Les spores sont conservées à 4 C. Stérilisation des spores: On utilise le mélange stérilisant composé de streptomycine, de dichloramine T ( 2 %) et de quelques gouttes de Tween 80. Pour la stérilisation des spores, on procède en deux étapes. Dans un premier temps on place un filtre grillagé ( O stérilisant sur les spores. Dans un deuxième temps, on remplace le filtre grillagé par un papier MILLIPORE (référence AW 03 04 700) dans la colonne Millipore montée sur une fiole à vide. On fait passer 500 ml du mélange stérilisant sur les spores en suspension dans le haut de la colonne en maintenant le niveau du liquide à environ 2 cm au-dessus de papier Millipore, en agitant constamment Après ce traitement, les spores sont rincées six fois à l'eau stérile Au dernier rinçage, le papier Millipore est asséché par un pompage plus long; les spores sont prélevées stérilement et transférées sur le milieu nutritif riche pour contr 8 le de la stérilité Les spores sont ensuite transférées sur le milieu choisi Les spores sont mises à germer en milieu gelosé AGAR DIFCO 0,7 % en présence d'eau distillée. EXEMPLE 3 Methode d'observation des VAM Des fragments de racines transformées de 2 cm de longueur sont prélevés et éclaircis par une solution de KOH à 20 p 100 pen- dant 1 heure à l'étuve à 90 C Un blanchissage total des échan- tillons est obtenu dans une solution aqueuse à 5 p 100 de H 202 à 30 volumes Les échantillons sont colorés soit par une solution à 0,05 p 100 de bleu trypan dans le lactophénol d'Amann pendant 5 mn à chaud, soit dans une solution d'acide fuschique à 0,1 p 100 dans un mélange eau-acide acétique (Iv/10 v) pendant 2 mn La deuxième méthode a tendance à altérer sensiblement les structures fongiques mais permet par contre une meilleure différenciation champignon-cellules racinaires Après coloration, les échantillons sont lavés et montés au lactophénol. Culture en fermenteur de 2 litres La culture des racines transformées en milieu liquide a été effectuée en fermenteur Biolafitte autoclavable de 2 litres, type culture cellulaire de la façon suivante: milieu: milieu de MONNIER MOREL ajusté à p H 5,8 remplissage: 750 ml stérilisation de l'unité de fermentation à l'autoclave durant 30 mn à 1150 C; p H après stérilisation de 5,3. après refroidissement, le milieu est ensemencé par une préculture en botte de Pétri de racines transformées de Convolvulus (liseron) Le milieu est agité à l'aide d'une turbine type culture cellulaire tournant à 50 t/mn et aéré par un débit d'air de 80 1/h sous pression de 0,1 105 Pa; la température de fermentation est régulée à 250 C. On peut procéder de façon similaire en supprimant la turbine, l'aération étant assurée par le seul bullage de l'air. Dans les deux cas, le volume du fermenteur est colonisé par les racines transformées en 2 à 3 semaines. L'ensemencement des milieux de culture a été réalisé avec des racines transformées conservées en boite de Pétri pendant plusieurs mois à 40 C. FIGURES ET RESULTATS La figure 1 représente le pourcentage de germination des spores placées sur un milieu gelosé (AGAR DIFCO 0,7 %, p H 6,6) en présence de racines transformées en fonction du temps exprimé en jours (le lot témoin placé sur le même milieu gelosé, mais sans racines transformées-n'a pas donné de spores germées) Seules les spores o les globules lipidiques sont bien distingués ont germé. On considère que la spore a réellement germé lorsque le processus de germination est le suivant: Un filament mycélien émerge de ce qui subsiste de l'ancienne hyphe d'attachement, puis se ramifie et apparaissent des micro- spores végétatives sur les hyphes Le schéma de ce processus est illustré sur la figure 2. La figure 2 montre une spore A ayant germé à proximité d'une racine transformée (m S = microspore végétative, h hyphe, s = spore). une spore B placée sur milieu gelosé sans racines transformées. La figure 3 montre un filament mycélien ramifié en deux branches, l'une des branches (a) passe sous la racine transformée, l'autre branche (b) infecte la racine. REVENDICATIONS ) Procédé de production in vitro de champignons endomycorhi- ziens à arbuscules et à vésicules (VAM), caractérisé par le fait que l'on produit des racines de dicotylédones transformées génétiquement par insertion, dans le génome desdites racines, de gèpes du plasmide Ri, puis que l'on inocule lesdites racines par des spores d'endomycorhizes. 2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les gènes du plasmide Ri sont apportées directement par la bactérie Agrcbacterium rhizogenes virulente, porteuse dudit plasmide. ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les gênes du plasmide Ri sont apportés indirectement par une bactérie dans laquelle on a transféré le plasmide Ri. 4 ) Procédé de production in vitro de champignons endomycorhi- ziens à arbuscules et à vésicules (VAM), caractérisé par le fait que l'on produit des racines de dicotylédones transformées génétiquement par insertion, dans le génome desdites racines, gênes du plasmide Ti, puisque l'on inocule lesdites racines par des spores d'endomycor- hizes. ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que les gênes du plasmide Ti sont apportés directement par la bactérie Agrobacterium tumefaciens virulente, porteuse dudit plasmide. 6 ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que les gênes du plasmide Ti sont apportés indirectement par une bactérie dans laquelle on a transféré le plasmide Ti. 7 ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'endomycorhize est un Glomus mosseae. 8 ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que les racines transformées sont obtenues en induisant des formations de racines à partir d'une graine de dicotylédone par insertion de gênes du plasmide Ri contenu dans une bactérie induc- trice et en développant les racines ainsi formées en culture asepti- que sur un milieu nutritif simple sans la bactérie inductrice. 9 ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que les racines transformées sont obtenues en induisant la formation de racines à partir d'un explantat de dicotylédones par insertion du plasmide Ti contenu dans une bactérie inductrice et en développant les racines ainsi formées en culture aseptique sur milieu nutritif simple sans la bactérie inductrice. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que les racines transformées sont cultivées aseptiquement sur u" milieu simple, sans composés hormonaux, comprenant un sucre, avantageusement le saccharose, des macro-éléments et oligo-éléments et au moins une vitamine et de préférence la thiamine. 11 ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que les racines transformées sont cultivées sur milieu gélosé. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que les racines transformées sont cultivées dans un milieu liquide. 13 ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que les racines transformées sont cultivées en fermenteur en milieu aéré et régulé. 14 ) Procédé selon l'une des revendications I à 10, caractérisé par le fait que les spores de Glomus mosseae sont mises à germer sur un milieu à p H proche de la neutralité, sans composés toxiques par la germination tels que traces de zinc, cuivre et fer.