Brevet FR2534030A1 — publié le 19840406

i 2534030 La présente invention est relative au domaine biologique et plus particulièrement à la mise en évidence, par érythroadsorption, d'une substance biologique immobilisée sur un support. Elle concerne notamment des perfectionnements au procédé de détection et de dosage d'une substance biologique par érythroadsorption décrit dans la demande de brevet FR 80 15 293. Dans cette demande de brevet FR 80 15 293 on a déjà décrit un procédé de mise en évidence et de dosage d'une substance biologique par érythroadsorption Ce procédé met en oeuvre, à titre de réactif de dosage, le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes, et des érythrocytes à titre de révélateur. Ce procédé de détection et de dosage d'une subs- tance biologique par érythroadsorption consiste: 1) à immobiliser sur un support une substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique à doser; 2) à faire incuber cette substance avec le milieu liquide contenant la substance biologique à doser; 3) à faire incuber, après lavage, le milieu réactionnel résultant avec le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des éry- throcytes 4) à ajouter des érythrocytes; et ) à déterminer l'érythroadsorption. Ce procédé est approprié pour doser, à titre de substances biologiques, des antigènes, des anticorps, des haptènes, des hormones, des immunoglobulines et autres substances d'intérêt biologique. Selon les enseignements de ce brevet FR 80 15 293 la détermination de l'érythroadsorption peut se faire de plusieurs façons. Par exemple, on peut constater visuellement que les globules rouges sont adsorbés à la surface du support sur 2 2534030 lequel a été immobilisée la substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique à doser Dans ce cas, le procédé permet d'identifier dans un liquide biologique donné une substance biologique particulière Si, au contraire, le liquide biologique ne contient pas la substance biologique particulière, les érythrocytes ne sont pas adsorbés et forment un culot au fond du récipient, par exemple des puits de la microplaque Le procédé de dosage par érythroadsorption selon ce brevet FR 80 15 293 permet aussi de déterminer quantitativement une substance biologique donnée A cet effet, on élimine les globules rouges n'ayant pas réagi, par exemple par aspiration à la pipette Puis on lyse les érythrocytes adsorbés, par exemple à l'eau distillée, et on dose par spectrophotométrie les substances libérées par les globules rouges, par exemple l'hémoglobine ou les substances artifi- ciellement introduites par l'expérimentateur. L'hémoglobine peut également être dosée par une réaction enzymatique Par exemple, on peut utiliser un des substrats de la peroxydase, tels que l'ortho-dianisidine ou l'ortho-phénylène-diamine La lecture se fait aussi par spectrophotométrie à 400 nm pour l'ortho-dianisidine et à 492 nm pour l'ortho-phénylène-diamine. La quantité de substances libérées par les globules rouges, par exemple la quantité d'hémoglobine libérée, est proportionnelle à la quantité de la substance à doser, ce qui permet d'obtenir, par exemple, le dosage d'un antigène ou d'un anticorps présent dans l'échantillon en se référant à une gamme étalon d'hémolyse des globules rouges établie dans les rmêmes conditions. La détermination quantitative de l'érythroadsorption définie ci-dessus nécessite donc l'élimination des globules rouges n'ayant pas réagi et le dosage des substances libérées par les globules rouges ou des substances artificiellement introduites par l'expérimentateur. Dans ce procédé, la substance biologique à doser est immobilisée sur un support par fixation spécifique, c'est-à-dire par l'intermédiaire d'une substance ayant une 3 2534030 affinité de fixation pour la substance biologique à déter- miner. On peut également déterminer par érythroadsorp- tion, selon le même mode opératoire, des substances fixées sur un support par tout autre moyen, par exemple par adsorp- tion passive ou par liaison chimique. On a maintenant trouvé que la détermination de l'érythroadsorption peut être effectuée sans mettre en oeuvre une étape de dosage des substances libérées par les globules rouges ayant été adsorbés ou des substances introduites par l'expérimentateur Cette détermination s'effectue d'une manière plus simple et permet une meilleure quantification que celle décrite dans le brevet FR 80 15 293. Ainsi, la présente invention concerne un procédé de détection et/ou de dosage, par érythroadsorption, d'une substance biologique immobilisée sur un support qui consiste à déterminer l'érythroadsorption après avoir, d'une part éliminé les globules rouges n'ayant pas réagi et d'autre part-fixé chimiquement sur l'immunoadsor- bant les globules rouges adsorbés, uniquement par mise en oeuvre d'une solution d'un agent fixateur. Sous son aspect le plus général, le procédé de l'invention consiste: 1) à faire incuber, après lavage, la substance immobilisée sur un support avec le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes; 2) à ajouter des érythrocytes 3) à plonger l'ensemble dans une solution d'un agent fixateur, 4) à mesurer l'érythroadsorption, après avoir retourné le support afin de permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas réagi. A l'aide de la solution d'agent fixateur mise en oeuvre dans le procédé de l'invention, on fixe chimiquement les érythrocytes adsorbés à la surface du support sur lequel a été immobilisée la substance biologique à mettre en 4 2534030- évidence et on permet l'élimination rapide des érythrocytes n'ayant pas réagi Ainsi il se forme sur le support un tapis homogène d'érythrocytes adsorbés et fixés chimiquement, dont la densité est fonction de la concentration de la substance à mettre en évidence. Par "agent fixateur" selon l'invention on désigne tout agent capable de fixer les érythrocytes sur le support tout en évitant l'hémolyse de ceux-ci. On réalise fréquemment des fixations de cellules vivantes en histologie pour l'étude de celles-ci Les agents fixateurs mis en oeuvre à cet effet doivent être tels qu'ils permettent la fixation desdites cellules avec un minimum de perturbations des structures cellulaires (voir Histochemistry, PEARSE Churchill Livingstone 3 e ed 1968 et "La Cellule" 1 1 DURAND et B FAVARD Collection Hermann Paris 1967). Dans le cas présent, il importe peu qu'il y ait ou non des perturbations des structures cellulaires, mais il est impératif que la fixationlorsqu'elle a lieulsoit faite dans des conditions qui évitent l'hémolyse des érythrocytes. La plupart des agents fixateurs monofonctionnels ou plurifonctionnels couramment utilisés dans le domaine de l'histologie conviennent aux fins de l'invention, en particu- lier les aldéhydes, tels que le formaldéhyde, le glutaraldéhyde, ce dernier étant préféré. La concentration de la solution en l'agent fixa- teur doit être suffisante pour permettre la fixation chimique des érythrocytes ayant réagi,-mais elle ne doit pas atteindre la concentration qui provoquerait une fixation en masse de tous les érythrocytes. A titre d'exemple, on indiquera que, lorsque l'agent fixateur est le glutaraldéhyde, la concentration de la solution doit être comprise entre 0,1 et 0,5 % en poids. Le produit de couplage mis en oeuvre à titre de réactif dans le procédé selon l'invention est le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes. Par "ligand" spécifique on désigne dans la 2534030 présente description toute substance soluble qui peut réagir de façon spécifique avec la substance ayant une affinité pour la substance biologique à doser ou avec la substance biologique elle-même. Par "substance soluble"on désigne dans la présente description toute substance soluble dans les milieux couramment utilisés pour les réactions biologiques Il peut s'agir de milieux aqueux, tels que les milieux physiologiques, ou des mélanges de milieux aqueux et organiques. De plus, le ligand spécifique mis en oeuvre doit être tel que le produit de couplage ligand spécifique-ligand capable de réagir avec des érythrocytes soit soluble en milieu aqueux. Par"milieu aqueux", on désigne selon l'invention les milieux aqueux, tamponnés ou non, couramment utilisés dans le domaine biologique, tels que les solutions tampon phospha- te, les solutions tampons contenant un détergent, tel que le Tween ou de la gélatine, la sérumalbumine bovine, la lactal- bumine bovine et autres substances habituellement mises en oeuvre dans de tels domaines. Les ligands spécifiques répondant à une telle définition sont notamment les anticoprs, les antigènes macromoléculaires, les haptènes, les hormones et leurs récepteurs et substances similaires Parmi les ligands spécifiques cités ci-dessus, on utilise le plus communément les anticorps et les antigènes. Le ligand capable de réagir avec des érythrocytes est une substance qui possède des sites de reconnaissance de déterminants spécifiques des érythrocytes ou des substances fixées sur des érythrocytes. A titre de tels ligands, on peut citer les anticorps anti-globules rouges, l'avidine, la biotine et produits analogues On peut également utiliser une lectine. Ainsi, le produit de couplage d'un ligand spécifique avec un ligand capable de réagir avec des érythrocytes peut être le produit de couplage entre une lectine et un ligand spécifique,tel que décrit dans le brevet FR 80 11 470, cité à 6 2534030 titre de référence Le produit de couplage d'un ligand spécifique avec un ligand capable de réagir avec des érythro- cytes peut également être le produit de couplage entre une albumine et un ligand spécifique, tel que décrit dans la demande de brevet FR 82 04 247 cité à titre de référence. La détermination de l'érythroadsorption peut être effectuée soit visuellement, soit avec un photomètre réglé à 414 nm,une loupe binoculaire ou un microscope inversé. Le procédé de l'invention est approprié pour mettre en évidence, soit de manière quantitative,soit de manière qualitative, toute substance immobilisée sur un support d'une façon quelconque. A titre de support, on peut utiliser n'importe quel support insoluble plat, présentant ou non des cavités, tel que par exemple des feuilles ou bandes, des microplaques ou des tubes. A titre de substance constitutive de tels supports, on peut utiliser la cellulose et ses dérivés, le polyacryla- mide, les polyméthacrylates d'alkyle et autres polymères d'origine naturelle ou synthétique ainsi que le verre. On utilise avantageusement des microplaques pour immobiliser la substance biologique à doser, par exemple des microplaques en polystyrène, ayant des puits en forme de U ou de V ou des puits à fond plat On peut également utiliser des tubes individuels ainsi que des supports plats, par exemple des feuilles de nitrate de cellulose. Par exemple, lorsque le support est une feuille de nitrate de cellulose, la substance à mettre en évidence peut y être fixée ou déposée directement ou indirectement, par exemple par empreinte après une électrophorèse De cette manière, on peut mettre en évidence des Ig G humaines. Le procédé de l'invention convient également pour la détection des clÈnes d'hybridomes qui synthétisent des anticorps spécifiques des antigènes ayant servi à la fabrica- tion desdits hybridomes Dans ce cas, on prélève les surna- geants des clanes, on fixe les surnageants sur le nitrate de cellulose en feuille et on révèle la présence de l'anticorps 7 2534030 en ajoutant un antigène spécifique marqué avec un ligand capable de réagir avec les érythrocytes. Selon le procédé de l'invention, on peut mettre en évidence aussi bien une substance isolée, qu'une substance contenue dans un milieu impur, étant donné que l'on met en oeuvre un réactif spécifique de la substance à déterminer. Selon une autre variante du procédé de l'invention la substance biologique à mettre en évidence peut être immobilisée sur le support d'une manière spécifique, c'est-à- dire par l'intermédiaire d'une substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique considérée. Dans ce cas particulier, on immobilise tout d'abord sur le support une substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique à doser, puis on fait incuber cette substance ainsi immobilisée avec le milieu liquide contenant la substance biologique à déterminer; on peut alors effectuer une détermination quantitative ou dosage. Sous cet aspect, le procédé de l'invention concerne un perfec- tionnement au procédé de détection et de dosage, par érythro- adsorption d'une substance biologique décrit dans la demande de brevet FR 80 15 293. Selon cette variante, le procédé de l'invention consiste: 1) à immobiliser sur un support une substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique à doser 2) à faire incuber cette substance avec le milieu liquide contenant la substance biologique à doser; 3) à faire incuber, après lavage, le milieu réactionnel résultant avec le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes; 4) à ajouter des érythrocytes ) à plonger l'ensemble dans une solution d'un agent fixateur. 6) à mesurer l'érythroadsorption, après avoir retourné le support afin de permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas réagi. 8 2534030- La substance ayant une affinité de fixation vis-à-vis de la substance biologique à doser peut être toute substance capable de se fixer de façon spécifique avec ladite substance biologique Par exemple, si la substance biologique à doser est un anticorps,la substance ayant une affinité de fixation sera alors un antigène et réciproquement. La substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique à doser est immobilisée sur un support quelconque par des techniques classiques. Les supports, par exemple ceux constitués de feuilles de nitrate de cellulose sur lesquels est fixée la substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique à doser constitue un moyen pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Les premières étapes du procédé ci-dessus, à savoir les étapes 1 à 3 sont réalisées conformément au brevet FR 80 15 293 Si besoin est, l'homme de l'art pourra se référer à la description de ce brevet. Cependant, on rappellera ci-après le mode-opéra- toire général pour le dosaqe des anticorps, sans pour autaht en limiter la portée de l'invention à ce seul type de dosage. Au cours de la première étape du procédé de l'invention on immobilise sur un support des antigènes (Ag). L'immobilisation des antigènes, qui-constituent dans ce cas particulier la substance ayant une affinité pour la substance biologique à doser, à savoir l'anticorps, est réalisée par exemple par adsorption passive ou, si nécessaire, par liaison covalente selon la nature du support. L'étape ( 2) consiste en une incubation de l'anti- gène immobilisé avec le liquide biologique contenant l'anti- corps (Ac) à doser, par exemple le sérum à titrer Après cette étape d'incubation, au cours de laquelle l'antigène (Ag) interagit avec l'anticorps (Ac) correspondant, s'il est présent dans le sérum à tester, on lave le support à l'aide d'une solution tampon, par exemple-une solution de tampon phosphate contenant éventuellement un détergent tel que le "Tween" dénommé ci-après PBS ou PBS-Tween. 9 2534030 ' L'étape ( 3) du procédé de l'invention consiste à incuber le support résultant de l'étape ( 2) avec un produit de couplage ligand spécifiqueligand capable de réagir avec des érythrocytes Dans ce cas particulier,le ligand spécifique est un anticorps dirigé contre les immunoglobulines de l'espèce humaine ou animale du sérum à titrer Après cette incubation, on lave le système résultant comme décrit ci- dessus pour éliminer le produit de couplage n'ayant pas réagi. Puis, on ajoute des érythrocytes, qui sont adsorbés par le produit de couplage seulement si le sérum à titrer contient l'anticorps correspondant à l'antigène immobilisé, sinon les érythrocytes ne sont pas fixés et tombent au fond du récipient. Quel que soit le mode d'immobilisation de la substance biologique à déterminer, on ajoute, selon un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, suffisamment d'érythrocytes pour remplir jusqu'à débordement les puits de la microplaque utilisée comme support, afin d'éviter la forma- tion de bulles d'air dans les puits de ladite plaque On recouvre ensuite ladite plaque, par exemple avec un film souple en matière plastique Ainsi revêtue, la microplaque est plongée dans la solution d'agent fixateur, par exemple une solution de glutaraldéhyde, puis retournée le fond vers le haut, La plaque flotte à la surface de la solution et le film est retiré En opérant de cette façon, les globules rouges non adsorbés spécifiquement sont éliminés de la plaque, parce qu'ils tombent dans le fond du récipient contenant la solution de l'agent fixateur. L'action de l'agent fixateur, tel que le glutaral- déhyde a deux effets: 1) les globules rouges traités par le glutaral- déhyde décantent plus rapidement que les globules rouges non traités; 2) les globules rouges liés de façon spécifique sur la phase solide sont alors fixés chimiquement par le glutaraldéhyde, de sorte que, la stabilité est augmentée. Lorsque les globules rouges non liés sont éliminés, la plaque est retournée en évitant que les bulles d'air 2534030 pénètrent dans les puits Les puits,ayant reçu un échantillon négatif, sont vides Les foncb des puits ayant reçu l'échantil- lon positif sont recouverts par un tapis de globules rouges dont la densité est fonction de la concentration de la substance à doser. Le résultat final peut être lu à l'oeil nu, avec un photomètre réglé à 414 nm ou à l'aide d'une loupe-bino- culaire ou d'un microscope inversé. Lorsqu'on utilise un support plat pour l'immobili- sation de la substance biologique à mettre en évidence, par exemple une feuille, on le fixe dans le fond d'un récipient avant l'addition des érythrocytes et on opère comme ci-dessus. Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on met en oeuvre une suspension d'érythrocytes dont la concentration n'a pas une importance critique Il suffit dans la pratique de choisir une concentration capable de fournir l'érythroadsorption optimale Grâce à l'opération de retourne- ment du support, qui constitue une caractéristique essentielle du procédé de l'invention, les érythrocytes éventuellement en excès ne gênent absolument pas la lecture, puisqu'ils sont éliminés En général, des concentratiom de l'ordre de 0,5 % sont convenables On peut, cependant, sans inconvénient, utiliser des concentrations de 1 ou 2 % On notera qu'en des- sous de 0,5 %, on n'est pas sûr que l'érythroadsorption soit optimale Ceci constitue un avantage important, car on n'a pas besoin d'étalonner de façon précise la valeur des concen- trations des suspensions d'érythrocytes. Le procédé de l'invention permet d'étendre l'uti- lisation de la technique d'érythroadsorption aux méthodes immunochimiques qui nécessitent l'utilisation d'un procédé de visualisation Ainsi, les procédés d'autoradiographie, de coloration enzymatique, de fluorescence peuvent être remplacés avantageusement par ce nouveau procédé qui consiste à visualiser une substance en utilisant successivement un conjugué réalisé en couplant le ligand spécifique de la substance recherchée avec une lectine ou un anticorps anti- globules rouges, et une suspension de globules rouges. il 2534030 La présente invention concerne également un coffret pour la détection d'une substance biologique, ledit coffret comprenant: -des anticorps anti-substance biologique à doser couplés à un ligand susceptible de réagir avec des érythrocytes -du tampon PBS; -une solution d'agent fixateur; -un support -un support de référence. Le support de référence mis en oeuvre dans le coffret selon l'invention est obtenu par le procédé de détection de l'invention Pour la réalisation de ce support de référence on immobilise une substance biologique donnée avec le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes,on ajoute ensuite des érythrocytes de préférence frais et on plongellen- sembledansuneselution d'un agent de fixation, on retourne le support afin de permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas réagi et on obtient ainsi un support de référence, c'est-à-dire un support sur lequel sont fixés des érythrocytes en une quantité correspondant à la substance biologique donnée. Pour illustrer mais sans aucunement limiter le perfectionnement selon l'invention, on donne les exemples ci-après: 1 2 2534030 EXEMPLE 1: Détection qualitative d'Ig G humaines adsorbées sur une feuille de nitrate de cellulose. On a déposé 2 pil d'un tampon borate, 0 1 te p H 8,0 contenant des concentrations variables d'Ig G humaines (de 100 pg/ml à 1 Vg/ml) sur une feuille de nitrate de cellulose. Après évaporation ( 15 minutes à température ambiante) et saturation avec de la gélatine, la feuille de nitrate de cellulose a été incubée avec un conjugué réalisé en couplant des anticorps anti-Ig G humaines avec des anticorps anti- globules rouges Deux heures plus tard, la feuille a été lavée, attachée physiquement au fond d'un récipient Le récipient a ensuite été rempli avec une suspension ( 0,5 %) de globules rouges de mouton Après une heure, les globules rouges ont été éliminés en renversant doucement le récipient dans une solution physiologique tamponnée contenant 0,2 % de glutaraldéhyde Quand tous les globules rouges ont été élimi- nés, on a retourné la feuille De cette façon, il a été possible de voir un dépôt de globules rouges lorsque la quantité d'Ig G humaines fixées sur la feuille de nitrate de cellulose était égale ou supérieure à 2 ng. EXEMPLE 2: dosage d'Ig E humaines Grâce à ce-procédé d'élimination des érythrocytes n'ayant pas réagi, on peut établir des courbes d'étalonnage en utilisant des quantités données d'anticorps et d'antigènes, telles que celles représentée sur la figure annexée, sur laquelle on a porté en abscisses la concentration en I Ug E en Ul/ml de solutions connues d'Ig E et en ordonnées le pourcenta- ge d'érythroadsorption par rapport au plateau 100 % défini pour une concentration en Ig E de 100 UI/ml. Pour établir cette courbe,on a procédé de la manière suivante: les puits d'une plaque à fonds plats ont été-remplis par 100 V Id'anticoprs anti Ig E ( 1 pg/ml) La plaque a été incubée pendant 2 heures à 370 C et une nuit à 40 C, puis lavée avec du PBS contenant 0,1 % de Tween 20. Les puits ont reçu alors 100 pl d'une dilution du sérum de référence contenant une quantité connue d'Ig E La plaque a ensuite été incubée 4 heures à 37 %C et 1 nuit à 41 C Après l'incubation, la plaque a été de nouveau lavée et chaque puits a reçu 100 pl d'une solution d'anticorps anti Ig E couplés avec des anticorps anti-globules rouges de mouton. Après l'incubation ( 2 heures à 37 C) et lavage de la plaque, les puits ont été remplis par 400 Vl d'une suspension de globules rouges de mouton ( 0,5 %) Une heure plus tard, les globules rouges non adsorbés de façon spécifique ont été éliminés selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1 et l'absorption de la lumière à 414 nm a été mesurée avec un photomètre Titertek Multiskan MC Les puits ayant reçu la solution d'Ig E à 100 UI/ml ont servi de référence ( 100 % d'érythroadsorption)pour calculer le pourcentage d'érythro- adsorption. EXEMPLE 3 Avec une bandelette de nitrate de cellulo- se préparée selon le procédé décrit à l'exemple l,on peut doser les Ig G présentes dans un échantillon de sérum L'in- tensité des taches d'érythrocytes ayant réagi avec les anti- corps anti Ig G-lectine est comparée à celles présentes sur la bandelette de référence et permet la détection et le dosage des Ig G présentes dans ledit échantillon. 14 2534030 REVENDICATIONS 1 Procédé de détection d'une substance biologique immobilisée sur un support, caractérisé en ce qu'il consiste 1) à faire incuber, après lavage, la substance immobilisée sur un support avec le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes; 2) à ajouter des érythrocytes 3) à plonger l'ensemble dans une solution d'un agent fixateur, 4) à mesurer l'érythroadsorption, après avoir retourné le support afin de permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas réagi. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution d'agent fixateur est une solution tamponnée de glutaraldéhyde, par exemple à une concentration de 0,1 à 0,5 % en poids. 3.Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on utilise un support plat comme support pour immobiliser la substance biologique à détecter. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le support plat est une feuille ou une bande, par exemple en nitrate de cellulose. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le support est une microplaque dont les puits présentent un fond plat ou sont en forme de U ou de V. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, caractérisé en ce qu'on remplit jusqu'à déborde- ment les puits de la microplaque avec les érythrocytes, on recouvre la plaque d'un film plastique souple, on plonge la plaque ainsi revêtue dans une solution d'un agent fixateur tel que le glutaraldéhyde, on retourne la plaque et on enlève le film plastique, après quoi on mesure l'érythroadsorption après décantation des érytrhocytes n'ayant pas réagi. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 6,caractérisé en ce que la substance est immobilisée sur ledit support par adsorption passive par liaison chimi- que ou par fixation spécifique. 8.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 7,caractérisé en ce que la substance biologique à détecter est immobilisée sur le support par 5 l)immobilisation sur ledit support d'une substance ayant une affinité de fixation pour ladite substance biolo- gique; 2)incubation dudit support avec le milieu liquide contenant la substance biologique à détectero 9.Procédé de détection et de dosage d'une substance biologique par érythroadsorption consistant à immobiliser sur un support une substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique à doser, à faire incuber ladite substance avec le milieu liquide contenant la subs- tance biologique à doser, à faire incuber, après lavages le milieu réactionnel résultant avec le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes, à ajouter les érythrocytes et à déterminer l'érythroadsorptionledit procédé étant carac- térisé en ce queaprès avoir ajouté les érythrocytes, on plonge l'ensemble dans une solution d'un agent de fixation et on mesure l'érythroadsorption après avoir retourné le support afin de permettre la décantation des globules rouges n'ayant pas réagie 10.Moyen pour la mise en oeuvre du procédé de détection et de dosage selon la revendication 9,caractérisé en ce qu'il est constitué par un support à base de nitrate de cellulose se présentant sous la forme d'une feuillesur lequel est fixé la substance ayant une affinité de fixation, pour la substance biologique à doser. 11 Coffret pour la détection d'une substance biologique par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9,caractérisé en ce qu'il - comprend: 36 2534030 -des anticorps anti-substance biologique à doser couplés à un ligand susceptible de réagir avec des érythrocytes -du tampon PBS; -une solution d'agent fixateur; -un support, -un support de référence. 12.Coffret selon la revendication llcaractérisé en ce que le support de référence est obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.