Brevet FR2526040A1 — publié le 19831104

La présente invention concerne des molécules d'ADN recombinant et des procédés de production de protéines par ces molécules Elle concerne en particulier des molécules d'ADN recombinant qui sont synthétisées dans des bactéries de souche Bacillus et sont connues comme ayant un ADN qui code pour des exoenzymes excrétées par elles, et qui sont présentes à des dizaines d'exemplaires dans les bactéries de souche Bacillus; ainsi que des molécules d'ADN recombi- nant modifiées à partir des molécules d'ADN recombinant ci- dessus, qui sont-connues pour avoir un ADN qui contient des signaux de régulation et d'excrétion du gène de l'a-amylase de B amyloliquefaciens, auxquels signaux on peut unir un gène de n'importe quelle protéine Comme il sera décrit ci- après, ces molécules d'ADN recombinant peuvent être utilisées par exemple pour intensifier la production d' a-amylase dans des bactéries de souche Bacillus, et leurs variantes pour produire n'importe quelle protéine dans des bactéries de souche Bacillus. Un développement récent de la biologie moléculaire a créé de nouvelles possibilités de production de protéines dans des bactéries par des techniques d'ADN recombinant. En plus de la possibilité de produire des protéines de cellu- les eukar yotes dans des bactéries par des techniques d'ADN recombinant, la synthèse des protéines des bactéries elles- mêmes peut être améliorée de façon importante en augmentant le nombre des exemplaires du gène désiré dans la cellule. Le nombre des exemplaires du gène dans une cellule de bacté- rie peut être augmenté en unissant le gène à un plasmide ou une molécule d'ADN de virus telle que celle trouvée dans la cellule à plusieurs exemplaires, habituellement 10 à 100. L'augmentation du nombre d'exemplaires du gène dans une cel- lule conduit habituellement aussi à une augmentation corres- pondante de la synthèse des protéines exprimées par le gêne. Bien que plusieurs expériences de ce type aient été effectuées en utilisant E Coli et'd es molécules de plasmide ou d'ADN de virus se reproduisant dans celle-ci en tant que bactérie hôte, l'utilisation de bactéries de la souche Bacillus comme hôtes ne fait que commencer (Cryczan et al, Molecular General Genet 177, 459-467, 1979; Ieggins et al, Proc Natl Acad Sci USA 75, 1423-1427, 1978; Yoneda -et ai, Biochem Biophys Res Commun, 91, 1556-1564, 19791. Aucun des procédés publiés jusqu'à présent ne concerne l'aug- mentation de la production de l'exoenzyme d'une bactérie de souche Bacillus dans des bactéries de souche Bacillus d'une manière qui permettrait au codage du gêne pour l'exoenzyme d'être reproduit en l'unissant au plasmide qui est présent dans la bactérie de la souche Bacillus à plusieurs exemplai- res (Partie I de l'invention), de même aucun des procédés publiés ne concerne la production de protéines par un procédé dans lequel les signaux de régulation et de sécrétion du gêne de l'enzyme sécrétée par les bactéries de souche Bacillus ont été unis au gêne de la protéi ne que l'on désire produire (Par- tie II de l'invention) Comme exemple de la première partie de l'invention, par laquelle la production d'exoenzymes d'une bactérie de souche Bacillus peut être intensifiée en augmentant le nombre des gênes de l'exoenzyme désirée dans la cellule, on citera le transfert du gêne de l'a-amylase du Bacillus. La figure 1 montre l'exécution de la première partie de l'invention Le gênome de la bactérie entière est isolé de la bactérie de souche Bacillus produisant l'a-amylase, et coupé par un enzyme de restriction Des séquences d'ADN de longueur désirée sont unies à la molécule de plasmide coupée par l'enzyme de restriction Conformément à l'invention, le gênome de'la bactérie peut être coupé par l'enzyme de res- triction Mbol, et p UBîl O peut être utilisé comme le plasmide qui peut être coupé par l'enzyme de restriction Bam HI Il est à noter qu'une molécule d'ADN recombinant correspondante peut également être préparée en utilisant d'autres enzymes de restriction ou plasmides, et un scientifique expérimenté peut choisir entre diverses combinaisons enzyme de restriction/ plasmide, tout en demeurant dans le cadre de la présente invention. Après avoir uni les séquences d'ADN aux molécules de plasmide, les molécules d'ADN recombinant obtenues sont transférées dans la bactérie hôte, et, dans la population de bactéries hôtes, on sélectionne les cellules bactériennes qui ont reçu un codage de gêne pour l'a-amylase, uni au plasmide La sélection est basée sur la capacité obtenue des cellules transformées de produire de l'a-amylase - La souche Bacillus subtilis est utilisée comme bactérie hôte dans l'invention Lorsque la molécule d'ADN recombinant ci-dessus a été transférée dans la souche, le codage de gène pour 1 ' a-amylase est présent dans celle-ci à environ 50 exem- plaires Ceci augmente la production d'a-amylase de la souche d'environ 500 fois, par rapport aux souches de B subtilis normales L'augmentation de 500 fois de la production d'a- amylase est d e d'une part au fait que le signal de régulation du gêne de l'a-amylase de la souche B amyloliquefaciens uti- lisé comme souche initiale est environ dix fois plus efficace que celui du gêne de l'amylase de B subtilis, et d'autre part au fait que le nombre de gênes de l'a-amylase a augmenté de 50 fois Dans les conditions du laboratoire, une souche de B. subtiles contenant une molécule d'ADN recombinant produit 3 à 5 fois plus d'a-amylase que la souche de B amylolique- faciens utilisée dans l'isolement du gêne. La molécule d'ADN recombinant est isolée de la souche de B subtilis et caractérisée par des enzymes de restriction et par la définition de l'ordre de base La figure 2 montre le p KTH 10 de la molécule d' ADN recombinant obtenue, les emplacements exclusifs de coupure par l'enzyme de restriction dans le gêne de l'a-amylase ou son signal de régulation, et la structure générale de la molécule de DNA recombinant La figure 3 montre une partie de l'ordre de base du gêne de l'a-amylase en partant de l'emplacement de coupure de l'enzyme de restriction Eco RI. La molécule d'ADN recombinant dont il est question dans la présente invention, se compose des signaux de régu- lation et d'excrétion du gène de l'a-amylase de la souche Bacillus, et de molécules de plasmide, qui sont présentes dans les bactéries de la souche Bacillus à plusieurs exem- plaires, de manière à permettre au gène de n'importe quelle protéine d'être uni à l'extrémité du signal d'excrétion du gène de l'a-amylase, ce qui conduit à la production de la protéine désirée dans la bactérie de souche Bacillus La préparation de cette molécule d'ADN recombinant est repré- sentée à la figure 4. La plus grande partie du gène de structure de l'a-amylase est d'abord éliminée par traitement par l'enzyme de restric- tion Eco RI de la molécule d'ADN recombinant contenant le gène de l'aamylase La molécule d'ADN obtenue est coupée par l'enzyme de restriction et raccourcie par l'exonucléase III et par la nucléase Si pour éliminer le gène de structure de l'a-amylase restant, après quoi on s'assure au moyen d'une enzyme transcriptase réverse que les extrémités de la molé- cule sont à deux brins Une molécule de lieur d'ADN contenant l'emplacement de coupure par l'Eco RI est ensuite unie à la molécule coupée et racourcie L'emplacement de la molécule de lieur d'ADN dans la molécule d'ADN recombinant est déter- miné en définissant l'ordre de base de l'ADN à l'emplacement d'assemblage Les derniers nucléotides dans le gène de structure de l'a-amylase sont éliminés par traitement par la l'ADN polymérase 1, et le nouveau lieur d'ADN est uni à l'extrémité du signal de sécretion du gène de l'a-amylase. A cet emplacement de coupure par l'enzyme de restriction de la molécule de lieur d'ADN, il est possible d'unir le gène de structure de n'importe quelle autre protéine, par exemple la S-lactamase de E Coli, ou la séquence d'ADN ou une partie de celle-ci de n'importe quel codage de l'interféron a, ou y pour les amino-acides La protéine codée par le gène uni sera ensuite produite dans la bactérie de souche Bacillus à l'aide des signaux de régulation et d'excrétion du gène de l'a-amylase. On expose ci-après en détail la mise en oeuvre de la première partie de l'invention. Isolement, purification et coupure du génome provenant de bactérie de souche Bacillus. Une souche B amyloliquefaciens est utilisée comme sou- che de bactérie La souche est cultivée une nuit dans une solution de milieu nutritif riche, les cellules sont récoltées et lavées dans un tampon de citrate de sodium 0,0015 M et d'Na Cl 0,015 M Les cellules lavées sont mises en suspension ( 2 x 1011 cellules, c'est-à-dire une culture de 200 ml) dans 2 ml d'une solution à 20 % en vol de saccharose Tris H Cl m M (p H 8,0) On ajoute 20 mg de lysozyme, 20 mg de pronase et 2 ml d'une solution de Sarkosyl à 1 % en vol et d'3 DTA 0,1 M (p H 8,0) et on fait incuber la solution pendant 15 heures à 37 C On ajoute 6,5 ml de H 20 et une quantité de Cs Cl solide suffisante pour amener l'indice de réfraction du lysat à 1,4100, et on centrifuge le lysat (rotor Beckman Ti 50, 36 000 tours/ minute, 48 heures, 10 C) On divise le lysat centrifugé en fractions, et les fractions qui sont supposées contenir le génome bactérien sur la base de leur viscosité sont recueillies et dialysées pendant 30 heures contre un tampon Tris HC 1 m M EDTA 1 m M Na Cl 0,1 M (p H 8,0) à 4 C). On extrait trois fois la préparation de génome obtenue par du phénol, et on élimine le phénol par extraction à l'éther. On purifie 1 ' ADN par centrifugation dans un gradient linéaire saccharose, 15 à 30 % en vol Na Cl 0,1 M Tris HC 1 50 m M - EDTA 1 m M, lauryl sulfate de sodium 0,1 % (p H 8,0); rotor Beckman SW 27, 22 000 tours/minutes, pendant 16 heures à 220 C, après quoi on fractionne le gradient, on recueille les frac- tions dont les séquences d'ADN sont> 15 x 10 dalton, et on précipite l'ADN par l'éthanol. La préparation de génome de B amyloliquefaciens ainsi isolé est coupée incomplètement par l'enzyme de restriction Mbol, et les séquences d'ADN coupées sont assorties suivant leur taille dans le gradient de saccharose ci-dessus (Rotor Beckman SW 27, 22 000 tours/minute, 16 heures à 22 C) Les fractions dont les séquences d-ADN sont de 1,5 à 5 x 106 dal- ton, sont récoltées et l'ADN est précipité par l'éthanol. Isolement et coupure du vecteur de transfert par l'enzyme de restriction. Le plasmide p UB 1 110 est utilisé comme vecteur de trans- fert Le plasmide est isolé et purifié à partir de la souche de Bacillus subtilis SB 202 comme il a été décrit précédemment (Cryczan et Coll, J Bacteriol 134, 318-329, 1978) La pré- paration de plasmide purifié est coupée par l'enzyme de res- triction Bam HI, qui possède un seul emplacement de coupure dans la molécule de plasmide La linéarité de la molécule de plasmide est contrôlée par électrophorèse sur gel. Combinaison des brins du génome de B amyloliquefaciens au vecteur de transfert. Les brins du génome de B amyloliquefaciens qui ont été coupés par l'enzyme Mbol et choisis sur la base de leur di- mension, sont mélangés au plasmide p UB 1 110 coupé par l'enzyme Bam HI dans le tampon Tris-H Cl 10 m M EDTA 1 m M (p H 8,0) dans un rapport de concentration de l'ADN de 1:3, le volume total étant de 120 pl et la concentration totale de l'ADN de 180 pg/ml On chauffe la solution pendant 5 minutes à 65 C, et on ajoute à la solution refroidie 13 pil de tampon Tris-H Cl 66 m M - Mg C 12 6,6 m M dithiothreitol 100 m M ATP 10 m M (p H 7,8) et p 1 de ligase T 4-ADN ( 20 unités Weiss) On fait incuber la solution de ligase pendant 3 heures à 23 C, et le résultat de la ligature est contrôlé par électrophorèse sur gel. Transfert de la molécule d'ADN recombinant dans la bactérie hôte. On utilise comme bactérie hôte une souche de B subtilis 1 A 197 avec le génotype sac A 321, met B 5, arol 1907, amy La souche a été fournie par le Bacillus Genetic Stock Center (Université de l'Etat d'Ohio, USA), et la carte de son phéno- type Amy a été dressée par des procédés bactériogénétiques en tant que mutations dans le gène de structure du codage de l'enzyme pour l'aamylase La souche a été rendue compétente, c'est-à-dire capable de recevoir l'ADN de la manière décrite précédemment (Anagnostopoulos et coll, J Bacteriol 81,741/ 746, 1961) Les molécules d'ADN recombinant préparées par li- gature comme il a été décrit ci-dessus, sont mélangées aux bactéries hôtes compétentes, et le mélange est maintenu pendant minutes à 370 C Le mélange est ensuite répandu sur des pla- ques de bactéries avec de la kanamycine antibiotique pour empêcher le développement de toutes les bactéries n'ayant pas reçu de plasmide Les plaques sont maintenues à 37 a C pendant heures, au cours desquelles les bactéries hôtes auxquelles un plasmide ou un brin de génome de B amyloliquefaciens a été uni, se sont développées en petites colonies. Détection des bactéries hôtes dans lesquelles le codage du-gène de B amyloliquefaciens pour l'a-amylase est uni au plasmide p UB 1 IO. Les colonies bactériennes décrites ci-dessus sont repro- 2.0 duites sur de nouvelles plaques de milieu nutritif qui sont cultivées pendant 30 heurels à 370 C Les cultures bactériennes obtenues sont traitées par une solution l-Kl en utilisant un procédé précédemment décrit (J Bactériol 119, 416-424, 1974), ce qui conduit à la formation d'un anneau blanc autour des colonies bactériennes qui ont reçu une molécule d'ADN recom- binant contenant un codage de gènes pour l'a-amylase Les - colonies correspondantes sont recueillies sur les boites de bactéries initiales et les bactéries sont soumises à plusieurs développements de purification successifs. Isolement et caractérisation de la molécule d'ADN recom- binant. On isole la molécule d'ADN recombinant et on la purifie de la bactérie hôte par un procédé qui a été décrit précédem- ment (Cryczan et Coll, J Bacteriol 134, 318-329, 1978) La molécule est caractérisée par diverses enzymes de restriction et l'emplacement du codage des gènes pour l'a-amylase fait l'objet d'une détermination préliminaire en suivant l'inacti- vation du gène lorsqu'on unit des séquences extra ADN en divers emplacements de la molécule d'ADN recombinant L'ordre de base du codage des gènes pour l'a-amylase est ensuite déterminé par un procédé qui a été décrit précédemment (Maxam, A et Gilbert, W, Proc Natl Acad Sci USA 74, 560-564 1977). Détermination de l'activité de l'-amylase. La bactérie hôte B subtilis IHO 6064 (sac A 321, met B 5), modifiée, qui a un codage de gène pour l'a-amylase dans le plasmide p U B 110, est cultivée dans milieu nutritif liquide (bouillon de Luria) par aération à 37 "C On prélève des échan- tillons du liquide de culture à des intervalles de 2 heures, sur lesquels on détermine l'activité de l'a-amylase au moyen de comprimés de Phadebas. On expose ci-après en détail la mise en oeuvre de la deuxième partie de l'invention. Elimination du fragment Eco RI du plasmide p KTH 10. On coupe le plasmide p KTH 10 à l'emplacement de coupure Eco RI (Fig 2) Les séquences d'ADN obtenues (environ 1 pg) sont à nouveau liées ensemble dans un tampon Tris HC 1 66 m M Mg C 12 6,6 m M dithiothreitol 100 m M ATP 10 m M (p H 7,8), et on ajoute 0,5 pil de ligase T 4-ADN ( 2 unités Weiss) La solu- tion de ligature est mise à incuber pendant 3 heures à 23 "C, après quoi la souche de B subtilis IHO 6064 compétente est transformée par elle de la manière décrite ci-dessus Les cellules sont répandues sur les boîtes de bactéries contenant de la kanamycine et cultivées pendant une nuit à 37 C On sélectionne une colonie a-amylase-négative des transformants obtenus par la méthode I-KI en utilisant des plaques d'amidon et on isole un plasmide de la colonie de la manière décrite antérieurement (Cryczan et Coll, J Bacteriol 134, 318-329, 1978) Le fragment Eco RI Kpn I Hind III Eco RI manquant dans la préparation de plasmide obtenu p KTH 29 est contrôlé par électrophorèse sur gel. Raccourcissement du plasmide p KTH 29 par traitement à l'exonucl 6 ase. ' On coupe le plasmide p KTH 29 ( 100 pi, 500 pg/ml) au moyen de l'enzyme de restriction Eco RI Après ce traitement, on ajoute à la-solution 0,5 pl de dithiothreitol 1 M et 10 pl 'd'exonucléase III ( 0,25 unités, Biolabs) On fait incuber la solution pendant 1 à 3 minutes à 37 C, et on stoppe la réac- tion dans un bain-marie à 70 C On précipite l'ADN de la so- lution avec de l'éthanol et on le dissout dans un tampon Na Cl 0,3 M acétate de sodium 0,03 M Zn C 12 3 m M (p H 4,5) On ajoute 10 pl de Slnucléase ( 25 unités/ml, Boehringer Mannheim) et on fait incuber la solution pendant 30 minutes à 37 C et pendant 10 minutes à 4 C Après les incubations, on extrait la préparati on avec du phénol, on élimine le phénol par extrac- tion à l'éther et on précipite l'ADN-par i'éthanol On dissout l'ADN desséché dans 40 pil dé tampon Tris H Cl 10 m M EDTA 1 m M (p H 8,0), et on ajoute 10 p 1 i de tampon Tris 150 m M KC 1 m M Mg C 12 40 m M dithiothreitol 3,0 m M (p H 8,3), et 5 pl d'un mélange de d NTP dans lequel à chaque nucléotide-tri- phosphate on mélange 10 m M de la solution dans un rapport équimolaire, et on ajoute 2 pl d'enzyme transcriptase réverse ,'Beard, 13 unités/pl) On fait incuber la solution pendant minutes à 37 C et on stoppe la réaction par incubation à -65 C pendant 7 minutes On purifie l'ADN par électrophorèse sur agarose préparative (LTG, Low Gelling Temperature), et on découpe dans le gel les zones de plasmide qui ont été teintes par du bromure d'éthidium On extrait l'ADN de l'agarose par -* le phénol 4 65 C, on répète l'extraction par le phénol à 20 e C et on élimine le phénol par l'extraction à l'éther On préci- pite i'ADN par l'éthanol, on lave le précipité par de l'éthanol à 70 C et on le sèche. Phosphorylation de la molécule de lieur Eco RI et sa com- binaison au plasmide. A 10 pil de solution de molécule de lieur Eco RI (Eco RI linker, Collaborative Research, 50 ig/ml), on ajoute 5 i 1 de / 32 Py ATP ( 10 m Ci/ml, 3000 Ci/mol), 1,7 pi de tampon Tris-H Cl 600 m M Mg C 12 66 m M dithiothreitol 10 m M (p H 8,0) et 0,5 pi de T 4-polynucléotidekinase On fait incuber la solution pen- dant 30 minutes à 370 C, après quoi on ajoute 5 pl d'ATP 10 m M et on poursuit l'incubation pendant 30 minutes à 37 e C. La préparation de p KTH 29 desséchée qui a été traitée par l'exonucléase est dissoute dans 5 pi de la solution contenant de la molécule de lieur Eco RI phosphorylé décrite ci-dessus. On ajoute à la solution 0,5 pi d'ATP 10 m M, 0,5 pl de spermi- dine 1 m M et 0,5 pl de T 4 ADN-ligase ( 2 unités Weiss) On fait incuber la solution pendant 3 heures à 23 C, après quoi on la dilue à 20 pl dans du tampon Tris H Cl 40 m M Na Cl m M Mg Cl 2 10 m M (p H 7,6) On ajoute 15 unités d'enzyme Eco RI (Biolabs), et on fait incuber la solution pendant 12 heures à 37 C On stoppe la réaction par incubation à 65 C pendant 10 minutes La préparation traitée par Eco RI est fixée sur gel à travers une colonne de 1 ml de Sépharose 4 B. On utilise comme tampon d'élution dans la filtration, du Tris- H Cl 2 m M EDTA 0,1 m M (p H 7,5) On recueille le filtrat par fractions de 35 pl, et on identifie les fractions contenant un plasmide par leur radio-activité, on les recueille et on les sèche On dissout l'ADN séché dans 20 pl de tampon Tris- H Cl 66 m M Mg C 12 6,6 m M dithiothreitol 10 m M (p H 8,0), et on ajoute 1,5 pl d'ATP 10 m M et 0,3 pl de T 4 ADN-ligase. On fait incuber la solution pendant 3 heures à 23 C, après quoi la souche de B subtilis IHO 6064 compétente est trans- formée par la préparation de plasmide, et les cellules sont cultivées sur des boites à bactéries contenant de la kanamy- cine. On isole les plasmides des transformants par un procédé décrit précédemment (Cryczan et Coll, J Bacteriol -134, 318- 329, 1978), et on caractérise d'abord les plasmides par élec- trophorèse sur gel, après quoi on détermine leur séquence de base d'ADN aux deux extrémités de la molécule de liant Eco RI. De cette façon, on obtient le plasmide p KTH 38 à partir du il iplasmide p KTK 29 Dans le plasmide p KTH 38, la molécule de -": ieur est-située 90 paires de nucleotides après l'emplacement d o' oupure du signal d'excrétion dans la région du gêne de la structurede 1 'c-amylase Pour unir la molécule de lieur à _ 1 '1 fiuplacement de liaision-du signal d'excrétion ou à sa proxi- m " îé immédiate, on coupe le plasmide p KTH 38 avec de l'Eco RI. Ot met en suspension trois portions de 10 pg du plasmide coupé : d 1 a's 115 p 1 de tampon Tris 20 m M, Na Cl 600 m M, Mg C 12 12 m M, Cu Ci 2 12 m M, EDTA 1 m M (p H 8,1) On ajoute à chaque portion -de-plasmide 10 ' U 1 d'enzyme BAL-31 (Bethesda Research Labora- tories, BRL, 40 U/ml) et on fait incuber les tubes pendant 6 6 et 7 minutes dans un bain-marie à 30 C On stoppe la "; action par addition de EDTA 0,5 M, p H 8,0 de façon à obtenir u '/econcentration finale de 12 m M On rassemble les portions d'ADN'traitees par le BAL-31, on les extrait deux fois par du ph noî et on les précipite par l'éthanol Le précipité par P',éthanol est mis en suspension dans 75 p 1 de tampon Tris * 63 m M, Mg C 12 6,3 m M (p H 8,0), et on ajoute à la solution 5 pl :-de d ATP l- am M, d GTP 1 m M, d CTP 1 m M et d TTP 1 m M, et finalement 2. '$ phlde:T 4 polymérase (PL-Biochemicals, 5 U/'il) On fait incu- i -b:r la solution pendant 80 minutes à 11 C On stoppe la réac- tion en ajoutant du EDTA 0,5 M comme ci-dessus, et on extrait -?;la-solution par du phénol, puis on précipite 1 'ADN par l'étha- :1 Le précipité par l'éthanol est dissout dans 250 p 1 de tampon Tris 10 m M, EDTA 1 m M (p H 8,0) A 55 p 1 de cette solu- -ion, on ajoute 50 p 1 de molécules de lieur Hind III phospho- -ryl, (BRL, 75 pmole), 5 p 1 de Tris 660 m M, Mg C 12 100 m M, dithiothreitol 50 m M (p H 7,5) et 10 p 1 de T 4 ADN ligase (BRL, 2 U/pl) On-fait incuber le mélange pendant 15 heures à 15 C 30." et;psndant 10 minutes à 65 C On précipite l'ADN en ajoutant *, - de l'isopropanol, on lave le précipité d'ADN avec de l'éthanol ,% et, après séchage sous vide, on le met en suspension dans '100 p 1 de tampon Tris 10 m M, Na Cl 50 m M, Mg C 125 m M, _dithiothreitol 5 m M (p H 8,0) On ajoute à la suspension 3 p 1 -d'enzyme de restriction Hind III (BRL, 10 U/pl) et on fait _ o'^ S;* F y r E$o |_ J #-/-1 > 4 _S u,, k Wb _ ",, t 5 , , F w / do >', ti 5,' *;, Xç, 5 L"l, e *q S: fi r L ' *; _> +s s , _ " -i s Li, * X ' rt ça; : i >, r 1 i' t Ln N L J , to Nv,;, ': JA, " N' r 4:L ' s_, , Sy ts _ ; l b 3;e S Ag' W _;, x a gj Xy ,E y -.5 Sy*, ^ ç * _ S *; e " "t ' ,,, h 4 _ > e;il F V " N 9 q : 'a F'tg Se+'= ' r, ' ;'9;fi EJ 1, ' 4; 5 %rfihr _', K,, ,', u r ' _i# -t -3; oi N,n 1 l' S, " r ,e, i > ,,, t ;, t>-Mn; -u P X i tr-r,1 :.,^o' ' o A z h 5 ffi S i 1 A 6 > I X,vj^}s si RX ' iS rg,, é-i 5 >' * '" 't /, 'h. 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Le précipité par l'éthanol est dissout dans 35 pl de tampon Tris 66 m M, Mg C 1210 m M, dithiothreitol 5 m M (p H 7,5) auquel on a ajouté 1,5 pl de r ATP 10 m M et 1,5 pl de T 4 ADN ligase (BRL, 2 U/pil) On fait incuber le mélange pendant 3 heures à 22 C et on le transforme en B subtilis compétent, souche IHO 6135, et on cultive les cellules sur des boites de milieux nutritifs contenant de la kanamycine On isole les plasmides à partir des transformants conformément à une méthode qui a été décrite précédemment, et on détermine l'emplacement de la molécule de lieur Hind III dans les plasmides par séquencement de l'ADN De cette façon, on obtient une série de plasmides dans lesquels la molécule de lieur Hind III est située immé- diatement après lesignal d'excrétion ou dans diverses posi- tions après l'emplacement de coupure du signal d'excrétion dans la région du gène de structure de l'a-amylase. Le codage de la séquence d'ADN pour les amino-acides de n'importe quelle protéine désirée peut être uni aux emplace- ments de coupures formés par ces molécules de lieur Hind III, de telle sorte que, comme il ressort des exemples ci-dessus, une bactérie de la souche Bacillus produira et excrétera cette protéine sur son substrat. CD C) NO ODD viv IYI 001 YVO Ili Itvi DU DILV DID DDV DDO lvy vire oâo val VDV YVD liv D Ly 65 Nid Cu Ln tu l)g VVD ml l VI DVD DIV oli l):)%r DDO ivv VID zàl) vu V 1 v VYD Ljv o Ly as Nid -31 -1 O liz IVI DYD D LY Di 3 DDY DDD ILVV V,19 030 Vil VDV VVD IIV DIY CS Hixj ODY:)Dg lvv vio iio vu YDY VVD Z LV Div gr, nimd prr M-ffl Ly 7-p-a a Dz V:)DO ivv VID DDD val VDV Vv:) Ilv Dlv ss H L 4 a Ij 15 jj z>)VVM DZV J 99 LVV VID Mo VDIL VDV Vva 11 Y DIV bç mi Md ci 1 -4 DV DDD IVII VID JDD Vil VDV vvz ilv DIV úç Rixd 0 3 9 Vil v Dv vv D liv D Lv ?S II Lxd DDO VDI VDV VVD IIV DIV Ic il-,xd Dg vil viv VYD UV DIV oç H L",d AN DDZ DDY IVI Doi Vvr, lll 114 j f)VD DIV 013 Dav DDO tvv VM IMD Val VDV VVI Ltv DIV 01 RI-Md usvojd j 4 j, j Al dil n ID v Yd 2 A L UID IDF; n Ol 241 AID Ur V tu A IVIV 20 S -Itt-L Ui D Otid -4 Dii -2526040 Exemple 1. Production de l'enzyme e-lactamase de E Coli à partir de la souche Bacillus substitus. Le plasmide p KTH est ouvert par l'enzyme Hind III et, a l'emplacement de la coupure, on assemble un codage de gènes pour la B-lactamase de E Coli, dont les régions des signaux promoteurs et d'excrétion ont été éliminées On transforme le plasmide hybride obtenu en la souche B subtilis IHO 6140 compétente, en choisissant des cellules qui avaient reçu le plasmide, sur la base de la résistance à la kanamycine, et on cultive les cellules sur des bottes de milieux nutritifs contenant de la kanamycine On sélectionne les transformants sous l'angle du rendement en mettant en suspension chaque co- lonie dans 100 Pil d'une solution de nitroséphine 0,1 m M, phosphate de K 0,1 M (p H 7,0) On prépare des cultures liqui- des des colonies qui donnent un résultat positif aux tests à lanitroséphine -(la couleur de la solution vire au rouge) pour la détermination de l'activité de l'enzyme lactamase pro- duite La souche de B subtilis IHO 6140 qui a été transformée par le plasmide p KTH 50 est utilisée comme témoin On cultive les souches dans une solution SMS (Spizizen minimal salts) à laquelle on a ajouté 0,5 % de glycérol, 1 % d'amidon soluble, et 5 pg/ml de kanamycine On fait développer les cultures à 37 C en agitant Environ 5 heures après une période de crois- sance logarithmique (Klett 67 250), on centrifuge les cultures à 10 000 g pendant 5 minutes et on recueille le liquide sur- nageant On met en suspension les cellules dans un tampon phosphate de potassium 0,1 M (p H 7,0) à leur volume de déve- loppement initial On détermine l'activité de la $-lactamase dans la cellule et les fractions surnageantes en suivant spectrophotométriquement la désintégration de la céphalotine. Les résultats suivants sont obtenus à partir de la détermina- tion: ' Activité de la e-lactamase {U/ml)* t,,: B utÀs IHO 60 p K, 5 Cellules liquide surnageant B subtilis IHO 6140/p KTH 50 lactamase 60 3000 B subtilis IHO 6140/p KTH 50 'une minute à 37 C. Y Exemple 2. Production d'interféron de leucocytes dans la souche de Baci Llus subtilis. On coupe le plasmide p KTH 53 avec l'enzyme Hind III, et on unit à l'emplacement de la coupure le codage de séquence d'ADN pour l'interféron de leucocytes (a-2) dont on a élimi- né rla partie codage pour le signal d'excrétion Le plasmide - hybride obtenu est transformé en la souche de B subtilis IHO ' 6140 compétente en choisissant les cellules qui ont reçu le plasmide, sur la base de la résistance à la kanamycine On sélectionne les transformants par une méthode d'hybridisation : ' des colonies (Grunstein, M et Hogness, D S, Proc Natl. Acad Sci (US) 72, 3961-3965, 1975) en utilisant comme sys- -ô: tème de sondage le codage d'ADN pour l'interféron, marqué à 1 '125 I On cultive les colonies de bactéries contenant de l'ADN-interféron dans du bouillon de Luria auquel on a ajouté i- 2 % d'amidon soluble et 5 pg/ml de kanamycine, tout en agi- tant à 37 C On centrifuge la culture pendant 4 heures après la période de développement logarithmique (Klett 67300) 10.000 g, 5 minutes On recueille le liquide surnageant et * .: -on met les cellules en suspension dans leur volume de dévelop- pement initial dans une solution de Na Cl à 0,9 % On détermine l'activité de l'interféron dans la cellule et les fractions surnageantes La souche de B subtilis IHO 6140/p KTH 53 est utilisée comme témoin dans les déterminations Les détermi- nations donnent les résultats suivants: Activité de l'interféron (I U /ml) B subtilis IHO 6140/ p KTH 53/IF B subtilis IHO 6140/ p KTH 53 Cellules _&'EM 31 4 rlt 2526040- 1 Procédé d'amélioration de la production de protéines dans des bactéries de souche Bacillus, caracté- risé en ce que le gène de la protéine excrétante d'une bac- térie de la souche Bacillus est uni par des techniques d'ADN recombinant à une molécule de plasmide présente dans des bactéries de souche Bacillus à plusieurs exemplaires, en ce que la bactérie hôte de la souche Bacillus est trans- férée avec la molécule d'ADN recombinant obtenue et en ce que les bactéries transformées sont cultivées pour produire la protéine excrétante. 2 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le gène de la protéine excrétante uni au plasmide est un gène d' -amylase. 3 Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce que le gène de la protéine excrétante uni au plasmide est le gène de 1 ' -amylase de Bacillus amyloliquefaciens. 4 Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé en ce que le plasmide est p UB 110. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisé en ce que la bactérie hôte est le Bacillus subtilis. 6 Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la protéine choisie est l'une des suivantes': A/ Protéines antigènes de microbes et de protozoaires Toxines protéiniques produites par les bactéries suivantes: Staphylococcus aureus Clostridium spp. M-protéine de la bactérie Streptococcus pyogène Enzymes excrétées de Streptococcus mutans Membrane protéinique des microo 6 ganismes suivants: Protéine contagieuse de Streptococcus spp. Protéine contagieuse de Staphylococcus aureus B,/ Enzymes industrielles: Enzymes: o amy I ase Arnino acidacylase / -glucanase Glucose-isomérase Hemicellulase Collagènase Xylanase Lactase Pénicillinamidase Pénicillinase Protease Ribonuclease Streptokinase 15. (B subtilis, malt, A oryzae) (Bacillus spp) (B subtilis, Aspergillus sp) (L brevis, P notanum, Strepto- myces sp) (A niger, Trichoderma reesei, Bacillus spp) (Clostridium histolyticum) (A niger, Trichoderma reesei, Bacillus spp) (S fragilis, S lactis, E coli, Aspergillus sp) (Bacillus spp) (Bacillus spp) (A oryzae, B subtilis) (B subtilis, Mould, A niger) (Streptococcus hemolyticus) 7 Molécule d'ADN recombinant, caractérisée en ce que le gène de l'enzyme excrétante de la souche Bacillus ou une partie de celui-ci est uni à une molécule de,plasmide présente dans la bactérie de souche Bacillus à plusieurs exemplaires. 8 Molécule d'ADN recombinant suivant la revendica- tion 7, caractérisée en ce que le gène pour le dodage de l'0-amylase isolé d'une bactérie de souche Bacillus ou une partie de celui-ci est uni à une molécule de plasmide présente dans la bactérie de souche Bacillus. 9 Molécule d'ADN recombinant suivant la revendica- tion 8, caractérisée en ce que le gène pour le codage de l'(-amylase uni à la molécule de plasmide, provient d'une bactérie de l'espèce B amyloliquefaciens. 1 9 Molécule d'ADN recombinant suivant la revendication 9, caractérisée en ce que le gène pour le codage de l'ct-amylase contient la séquence de base suivante ou une partie de celle- ci: 4 O 50 go GACTGC;CTCA AAACATTGAG CCTTTGATGA CTGATGATTT CTGACCGACT TTTGTAACTC GGVACTACT GACTACTAAA 100 1,10 120 TGTTTGAGAA PJGAAGAAGA CCATAAAAAT ACCTTGTCTG ACAAACTCTT TTCTTCTTCT GGTATTTTTA TGGAACAGAC 160 170 180 TATOCTG'-r CC AGACTGTCCG CTGTGTA, AA A 7 AAGGAATA ATACCACAGG TCTGAC, GGC GACACATTTT TATTCCTTAT 21.0 220 230 240 TACTGATATG TAAAATATAA TTTGTATAAG AAAATGAGAG AT-GACTATAC ATTTTATAT-T AAACATATTC TTTZACTCTC 270 280 290 300 A;, CGA- AGC GGACA- T-TC G'-r TCLGACTT Gl CCM-TAT'-T TTTG 7 TCG CCTGTCAAAG CAAGTCTGAA CACGAATACA 330 340 350 360 7 GCCGATTA CAAAAACATC AGCCGTA Ait T GGCACGCTGA G 77 TTVG AG '- 'CGGCATITA CCC-Tt CGACT -O 410 w I 400 420 AC;ZCG-ACG ACGGCCAGCA TTGGAAACGA TTGCAC-:,ATG TSCGGCTTGC TCCCGGTCGT A; CCTTTGCT AACGTCT- AC 450 1160 470 480 C-G CCG CTG G; TTCC-CCC GC;L V '- C Z AAG :Z j CC TAGT GACGGCAGAC CTA-; GGAGGG CG-i A':G-l TTC 510 520 530 540 GGATAC'-GAC-CTT zTG TTT GTATG;t TITA G GA G,L, ATTCC CC ATGZC-TG GAATACTAAA CA 7 ACTA; -:T CCT'CTTAAGG 570 580 590 600 ACGAAATACG GCACAA TGC' TTATGC CGTGI T o 20 elti,%Gc CCCGA CATAC GrAAA TTCGGGGCGT GTATGCTTTT 80 GGCTGAAGAA GTGGATCGAT CCGACTTCTT CACCTAGCTA i 3 o 140 TCATCAGACA GGG Tl Lm-TTTT AGTACTCTGT CCCAAAAAA i 9 o i O o A;GGGGGGTT GTTATTATTT TTCCCCCC - A CAA-AATAAA 250 260 GGAGAGGZAA C Tr ZA A CC-C 7 ZC 7-'TT GTACTAAGTT 1 5 31 O ?o G C ', C 7 G " T A 7-G C; GT 7 Z.AACAGT:A 2-D 7 GC:n-Z,7 TT A C C 7 C A II -:A z 7 -, C Iz AA " 120 4- O 7 GCGG;-jCA T 7 A-CGG-'7 = 00 GATTGAGCCA ATCCGA Tt-AC C-l k AC':CGGT TA G G C TA T G 550 Eo AGCAA 11,,AAGG GP CGGTCAGA TCGTTTTTCC C-,GCCAGTCl 11 Molécule d'ADN recombinant suivant l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce que l'a molécule de plasmide utilisée est p UB 110.