Brevet FR2524315A1 — publié le 19831007

Nouvel antigène pour la recherche de l'hypersensibilité cutanée brucellique, notamment chez l'homme, et son procédé de préparation. La présente invention a trait à un nouvel antigène brucellique pour la recherche de l'hypersensibilité cutanée par test intradermique, notamment chez l'homme, et à son procédé de préparation. On sait que la brucellose, zoonose majeure affectant plus particulièrement les ruminants, peut être à l'origine d'infections humaines. En raison des nombreuses sources de contamination existant dans les zones géographiques infectées, il existe de véritables foyers endémiques dans lesquels se trouve particulièrement atteinte une population à haut risque constituée de professionnels tels qu'agriculteurs, vétérinaires, bouchers, équarrisseurs. En dehors de l'importance médicale de l'infection brucellique et de sa possible évolution vers la chronicité, l'hypersensibilité retardée qu'elle engendre constitue par elle-même une entité pathologique en même temps qu'un facteur aggravant du pronostic évolutif de la maladie. I1 est donc hautement souhaitable de disposer de moyens permettant de révéler l'hypersensibilité retardée,et par là l'infection brucellique, ces moyens pouvant en outre permettre de suivre un traitement de désensibilisation ou encore de tester le statut immunitaire des sujets devant être vaccinés, la liste des applications potentielles de ces moyens ne pouvant être a priori considérée comme restrictive. On a déjà proposé de diagnostiquer la brucellose humaine et animale par révélation d'un état d'hypersensibilité du type retardé au moyen d'antigènes ou allergènes constitués de fractions de Brucella telles que des lysats. Ces préparations, dénommées par exemple mélitines, présentent cependant des inconvénients en induisant une réponse sérologique aux épreuves classiques de diagnostic, en provoquant des réactions douloureuses ou même en sensibilisant des sujets n'ayant jamais été en contact avec Brucella. La présente invention se propose de remédier à ces inconvdnients et de fournir un nouvel antigène pour la recherche de l'immunité brucellique, notamment chez l'homme, qui soit de mise en oeuvre extrêmement facile et sûre, exempte d'effets secondaires et qui permette, dans la pratique, de détecter rapidement l'existence éventuelle d'une infection ancienne ou récente, clinique ou non, à base de Brucella, quel que soit par ailleurs le type des souches pathogènes. Un autre objectif encore de l'invention est de fournir un antigène qui soit susceptible d'être utilisé à la fois par la méthode traditionnelle dite de MANTOUAN utilisant la seringue intradermique, ou par des méthodes plus rapides de multipuncture. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de préparation d'un tel antigène qui soit simple, peu onéreux et qui n'entrasse pas de risques pour le personnel affecté aux opérations de préparation. L'invention a pour objet un nouvel antigène brucellique pour la détection de l'immunité brucellique, notamment chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comporte la fraction phénolo-soluble de corps bactériens délipidés de Brucella abortus, de préférence de souche B19. De préférence, l'antigène provient de Brucella abortus en phase lisse ou S. Dans un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, l'antigène est concentré à un titre d'au moins 5000 unités biologiques par ml. De façon particulièrement préférée, l'antigène selon l'invention est additionné de glycérine pour obtenir une forme utilisable par multipuncture sur les sujets humains. Toutefois, l'antigène selon l'invention peut également être aoiUtionné, par mise en solution isotonique, pour être injectable par voie intrdeemique à la seringue. L'invention a également pour objet un procédé pour la préparation d'un tel antigène, caractérisé en ce que l'on cultive des bactéries Brucella abortus, notamment B19, de préférence en phase lisse, que l'on délipide le concentré bactérien obtenu, de préférence dans un mélange au qu l'on .au moins alcool-éther, que l'on effectue/une extraction au phénol, que l'on récupère la phase phénolo-soluble et qu'on traite ladite phase pour préparer un antigène purifié et concentré. De préférence, on effectue la délipidation sur des bactéries entières. Dans un mode de mise en oeuvre avantageux, la fraction solide obtenue après délipidation est soumise à une extraction au phdnol, de préférence saturé d'eau, et à une température de l'ordre de 600C, et la phase phdnolosoluble est recueillie. De façon avantageuse, la phase phénolo-insoluble peut être utilisée pour la préparation d'un vaccin selon le procédé de la demande de brevet français 81 10789, déposée le 1er juin 1981 par la déposante. La délipidation est effectuée de préférence dans un mélange alcool-éther, en volumes sensiblement égaux, à raison d'un volume de concentré de bactéries pour un volume de mélange, la délipidation pouvant être poursuivie après filtration par reprise de la fraction solide délipidée dans un nouveau mélange alcool-éther. Cependant, on comprend que d'autres moyens de détoxification peuvent être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention, tels que par exemple un mélange alcoolacétone. De façon avantageuse, on peut procéder à deux extractions phénoliques et mélanger les phases extraites. La phase phénolo-soluble est ensuite avantageusement dialysée et le dialysat centrifugé. Le surnageant obtenu est ultra-filtré pour être concentré de 20 à 50 fois et le rétentat est recueilli et stérilisé. Après avoir soit être subi les contrôles d'usage, le concentré obtenu peut/amené à la concentration nécessaire et suffisante pour inoculation par voie intradermique , soit être additionné de glycérine, la préparation ainsi obtenue étant déposée à la surface de dispositifs de multipuncture. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Souche utilisée. Brucella abortus St19 culture Original SEED (lyophilisé) Serial 15202 produit en février 1971, par Biological Reagents, Section Animal Health Diagnostic APHIS NADL, Ames Iowa 50010 U.S.A. La souche est en phase lisse. Avec cette souche, on prépare tout d'abord un lot de semence en reprenant la souche en tube à milieu trypticase soja, puis, après repiquage et nouvelle culture, on récolte la suspension bactérienne et, après adjonction d'un substrat de lyophilisation, on la répartit en ampoules et on la lyophilise. Culture des bactéries. On prépare ensuite un inoculum reprenant le contenu d'une ampoule du lot de semence dans quelques millilitres du milieu et on le repique dans un tube. Après culture dans le tube,on ensemence un erlen de 100 ml contenant toujours le milieu trypticase soja et on met en culture pendant 24 heures. A partir de l'erlen, on ensemence un flacon-contenant 100 ml de milieu et on effectue une nouvelle culture, toujours de 24 heures à 370C sous agitation. A partir de la culture du flacon, on ensemence par transfert, un préfermenteur de 40 litres de volume utile. La culture est poursuivie pendant 24h à 370C sous agitation, puis la totalité de la suspension du préfermenteur est introduite dans un fermenteur de 400 litres de volume. Le milieu utilisé dont la composition est à la portée de l'homme de l'art, comporte les produits suivants dans de l'eau déminéralisée Peptone, trypticase, extrait de levure, chlorure de sodium, glutamate de sodium, thiosulfate de sodium, sulfate de magnésium, sulfate ferreux, sulfate de manganèse, vitamines B1, B5, PP, B12, glucose anhydre, phosphate disodique et phosphate monopotassique. La culture dans le fermenteur est effectuée pendant 24 à 48 heures puis, lorsque la concentration en germes est satisfaisante, le contenu de la cuve est centrifugé à basse température, puis le culot bactérien est lavé. Il est ensuite remis en suspension dans du soluté physiologique tamponné de façon à obtenir un concentré bactérien. Par exemple,à partir de 20 1 de culture de Brucella abortus B19, on peut obtenir environ 1 kg de corps bactériens(en poids humide). Préparation de la fraction phénclo-soluble. Le concentré bactérien en solution physiologique est repris dans un mélange alcool-éther (en volumes égaux) à raison d'un volume de concentré pour un volume de mélange et maintenu sous agitation à + 40C pendant 48 heures. Après filtration, on poursuit la délipidation en reprenant la fraction solide dans un mélange alcooléther identique à raison de 125 g de fraction solide par litre de mélange, à la température ambiante. La fraction solide est ensuite filtrée et séchée. A titre d'exemple, à partir d'un kg de corps bactériens en poids humide, on peut obtenir environ 500 g de corps bactériens délipidés (poids sec). L'extrait sec ainsi délipidé est repris à raison de 60 g pour 300 ml d'eau distillée. La suspension est réchauffée à 600C, puis additionnée d'une volume égal de solution aqueuse saturée de phénol, portée à la même température. Le mélange est maintenu sous agitation pendant 15 mn, puis centrifugé. Le culot de centrifugation est soumis à une deuxième extraction phénolique dans les mêmes conditions et le mélange est maintenu sous agitation pendant 15 mn,puis également centrifugé. Les phases phénoliques obtenues au cours des deux extractions, lesquelles ont provoqué la lyse bactérienne, sont prélevées avec soin en évitant toute contamination par les phases aqueuse, intermédiaire et phénolo-insoluble. A titre d'exemple, 500 g de corps bactériens délipidés (poids sec) permettent d'obtenir 4 litres de phase phénolo-soluble. La fraction phénolo-insoluble peut ensuite être traitée, par exemple pour la préparation d'un vaccin. Le mélange des phases phénoliques est ensuite soumis à une dialyse contre de l'eau distillée pendant 72 heures, puis contre une solution de chlorure de sodium 0,15 M pendant une durée de 48 heures. Le surnageant obtenu est filtré sur membrane de porosité 0,45 ir, puis ultra-filtré sur membrane de point de coupure égal à t05, Le permet est récolté puis soumis à une nouvelle ultra-filtration sur membrane de point de coupure égal à 104 et concentré 20 à 50 fois. Le rétentat est recueilli puis stérilisé par filtration. Préparation de l'antigène. Après détermination de ses propriétés physicochimiques comprenant notamment le dosage des protéines totales et précipitables, et biologiques essentiellement par révélation de l'hypersenEibilité retardée sur sur des cobayes par infection sensibilisés notammenthpar Brucélla abortus, l'antigène est amené. à la concentration optimale (par exemple de 6500 unités biologiques par ml). Après les contrôles d'usage de stérilité, innocuité..., la préparation obtenue peut soit être utilisée directement en inoculation par voie intradermique, soit être additionnée de glycérine à 70 %. Le mélange glycériné est alors déposé à la surface du dispositif d'application de multipuncture. A titre d'exemple, On a pu obtenir, à partir d'un kg de corps bactériens (poids humide), 8000 dispositifs de multipuncture. Le titrage, qui permet l'obtention de la concentration optimale voulue, peut avantageusement être effectué sur cobayes sensibilisés par exemple par infection par la souche Brucella abortus 544. Les cobayes sont soumis, 60 jours au minimum après la sensibilisation, à l'épreuve d'injection par voir intradermique de dilutions de l'antigène en suspension. La lecture des réactions cutanées d'hypersensibilité retardée est faite 24 heures plus tard par mesure des diamètres d'induration. Les résultats figurent sur le tableau ci-après, les diamètres d'induration étant exprimés en mm Diamètres d'induration en mm 4 points d'inoculation par cobaye correspondant à 4 dilutions décroissantes de 2 en 2. 1ère dil. 2ème 3ème 4ème Cobaye nO 1 14 12 11 9,5 2 13 Il 10 8 3 17 14 12 10 4 14 12 11 10 Total 58 49 44 37,5 moyenne 14,5 12,3 11 9,4 Par rapport à un standard de référence, le titre d'activité établi dans cet exemple est 3000U/ml (U = Unité biologique d'hypersensibilité retardée correspondant à un diamètre moyen d'induration de 10 mm). On a également titré un lot d'antigène selon l'invention sur des cobayes sensibilisés les uns par Brucella melitensis, souche Rev. 1, les autres par Brucella suis souche 1330. Les résultats représentent la moyenne obtenue sur cinq cobayes par groupe Diamètres moyens d'induration en mm 1ère dii. 2ème 3ème Ciqye sensibilisé B. melitensis 12,8 8,5 1,8 Cobaye sensibilisé B. suis 12,2 8,4 0 L'étude clinique a montré que l'utilisation du nouvel antigène selon l'invention par multipuncture présente une très bonne corrélation avec les autres indicateurs de l'infection brucellique. De plus, l'antigène selon l'invention, obtenu à partir de la phase phénolo-soluble, n'induit pas de réaction d'hypersensibilité chez le sujet indemne de Brucella. En outre, l'antigène selon l'invention permet de tester l'hypersensibilité retardée induite par différents types de Brucella, et notamment par d'autres types que celui utilisé pour sa préparation : B. melitensis, B. abortus et B. suis. REVENDICATIONS 1. Nouvel antigène pour la détection de l'hypersensibilité cutanée brucellique, notamment chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comporte la fraction phénolo-soluble de corps bactériens délipidés de Brucella abortus, notamment de souche B19. 2. Nouvel antigène brucellique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est concentré à un titre d'au moins 5000 Unités biologiques par ml. 3. Nouvel antigène brucellique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que, mis en solution isotonique , il est directement utilisable par injection intradermique à la seringue. 4. Nouvel antigène brucellique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'additionné de glycérine, il est utilisable par multipuncture. 5. Procédé pour la préparation d'un antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, carac térisé en ce que l'on cultive des bactéries Brucella abortus, notamment de souche B19, que l'on délipide le concentré bacté- -rien obtenu, que l'on effectue au moins une exb > eticn au phknol, que l'on recupère la piiase phinalo-soluble et que l'on traite ladite phase parer l'antigène purifié et concentre. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on effectue une extraction au phénol saturé d'eau à une température de l'ordre de 60 C. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendica tions 5 et 6, caractérisé en ce que l'on effectue une délipidation sur des bactéries entières. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l'on effectue la délipidation dans un mélange alcool-éther en volumes sensiblement égaux. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on utilise un mélange alcool-éther à raison d'un volume de concentré de bactéries pour un volume de mélange. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 d 9, caractérisé en ce qu'après avoir recueilli la phase phénolo-soluble, on soumet celle-ci à une dialyse et que l'on ultrafiltre le dialysat pour le concentrer de 20 à 50 fois avant de le stériliser.