Brevet FR2531952A1 — publié le 19840224

La présente invention concerne des analogues du fabteur libérant l'hormone lutéinisante et l'hormone follic Ulo-stimulante (HL+HFS), de formule générale I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 p Glu Has Trp Set Tyrr-D-Tle eu-rg-Pro-;t-Et (I X dans laquelle X représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur, de préférence un radical p-toluène- sulfonyle (tosyle) Les autres abréviations utilisées ont les significations classiques, par exemple Et repré- sente un groupe éthyle et les symboles suivants représen- tent: chacun respectivement un radical bivalent du composé correspondant p Glu acide pyroglutamique, His histidine, Trp tryptophane, Ser sérine, Tyr tyrosine, D-Tle acide 1-amino-3,3-diméthyl-D- butanoique (tertio-leucine), Leu leucine, Arg arginine, et Pro proline. Ces nouveaux nonapeptides biologiquement actifs ont une grande activité gonadotrope et on considère qu'ils peuvent être utilisés en médecine humaine et en médecine vétérinaire, notamment pour le réglage du cycle oestra L,pour le traitement de troubles de l'oestrus et comme contraceptifs non stéroidiques. Il est connu que le facteur (FLL) libérant l'hormone lutéinisante et l'hormone folliculo-stimulante est produit par l'hypothalamus et déclenche la libération des hormones HL+HFS dans le lobe antérieur de l'hypophyse. Les hormones HL+HFS libérées exercent une influence sur les taux d'hormones stéroidiques chez les êtres humains et les animaux des deux sexes Les récepteurs de FLL ont également été observés au voisinage immédiat des gonades. Des analogues de FLL à activité agoniste (c'est-à-dire dans le sens de la libération) sont utilisés en médecine humaine et en médecine vétérinaire, entre autres, pour le traitement de la stérilité fonctionnelle et des kystes de l'ovaire En outre, une action accentuée et prolongée de certains analogues du FLL peuvent produire l'effet inverse, c'est-à-dire supprimer l'ovulation et la sperma- togénèse. Le décapeptide du FLL naturel de formule 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 p Glu-Ris-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-I 2 subit une dégradation enzymatique rapide comme conséquence du clivage de ses liaisons p Glu-His, Tyr-Gly et Pro-Gly. C'est pourquoi on a tenté d'obtenir par différentes substi- tutions des radicaux d'aminoacides dans ces positions déterminantes, des analogues plus résistants qui possè- deraient une action modifiée ou accentuée et prolongée. Ainsi, le remplacement de Gly en position 6 par des D- aminoacides non protéinogènes différents, et par leurs dérivés, en particulier d'un certain caractère lipophile, a conduit à des substances d'une grande activité agoniste. Un remplacement simultané de Gly-NH 2 en position 10 par des radicaux alkyle convenables a offert, du fait d'une accentuation de l'activité de FLL, les analogues dits "suractifs" Lorsqu'ils sont administrés à faibles doses, ils sont utiles en particulier au traitement de troubles ovariens et au déclenchement de l'ovulation dans le régime de reproduction dirigé chez les vaches laitières De fortes doses de ces agents peuvent être utilisées, par exemple, pour l'interruption volontaire du cycle oestral chez les animaux de ferme, pour la contraception non stéroldique et pour le traitement de certaines tumeurs sous dépendance endocrine. -2531952 Une étude systématique ininterrompue des relations entre structure et activité faisant intervenir de nouvelles modifications structurales a conduit au développement d'analogues de FLL doués d'un grand pouvoir biologique et présentant une utilité thérapeutique poten- tielle Ainsi, conformément à la présente invention, le radical de la glycine en position 6 du FLL naturel a été remplacé par le radical bivalent d'un nouvel amino- acide à configuration D qui n'avait jamais -été décrit jusqu'ici à ce propos Il s'agissait du radical de l'acide 1-amino-3,3-diméthyl-Dbutanolque (tertio -leucine) La structure de sa chaîne latérale aliphatique est considé- rablement lipophile et elle est efficacement encombrée du point de vue stérique Ces deux caractéristiques exer- cent un effet avantageux sur les propriétés biologiques des analogues de FLL, notamment sur le degré et sur la durée de leur action L'analogue de FLL à radical 6-D- Tle résultant est supposé être considérablement plus stable envers les effets métaboliques et par conséquent d'une plus longue durée d'action que les analogues qui contiennent un radical O-tertio -butyl-D-sérine ou une chaîne latérale aromatique, par exemple de 3-( 2-naphtyl)-D-alanine Le radical 10-Gly-NH 2 a été remplacé de la meilleure façon par le radical NH Et. Les précurseurs analogues de FLL partiellement protégés conservent une partie notable de l'activité des composés respectifs non protégés; par conséquent, la présence d'un radical-Arg libre en position 8 n'est pas déterminante pour une grande activité agoniste Cette découverte a elle aussi son importance, attendu qu'elle offre une possibilité de produire l'effet biologique désiré, notamment en médecine vétérinaire, par l'utilisation de ces précurseurs synthétiques qui sont plus faciles à obtenir et qui coûtent moins cher Des découvertes similaires ont déjà été rapportées dans le cas opposé de certains analogues de FLL produisant un effet inhibiteur. Les analogues de FLL VI et VII (voir les exem- ples) ont été administrés in vivo à des génisses ovariectomisées, à des doses de 10 et 200 Fg L'épreuve radio-immunologique a été effectuée dans un système homologue de doubles anticorps (R Stupnicki, A Mladej: Endocroinology 68, 6 ( 1976)) La préparation de NIH-LER- 1716-2 de boeuf a été utilisée comme préparation de réfé- rence pour l'iodation; la sensibilité à l'épreuve radio- immunologique a été supérieure à 100 $g La réaction croisée STHprolactine a été de 1 % Les résultats des tests sont récapitulés sur le tableau I ci-après. TABLEAU I Taux de HL+HF et analogues Composé blanc FLL VI VII Composé blanc FLL VI VII après l'administration de 200 gg de FLL Déclenche- ment de l'action folliculo- stimulante, min. + 11,5 26,7 + 3,8 ,0 + 6,0 Déclenche- ment de Concentration moyen- Durée, ne de l'hormone min folliculo-stimulante; gg/ml + 26,7 43 + 20,4 230 + 32,1 l'action Durée, lutéinisante, min. min. 53,3 + 13,9 12,3 + 5,0 46,6 + 15,4 86,7 + 10,7 53,3 + 19,0 236,7 + 10 l composé VII, tel qu'il 31,2 + 1,9 108,4 + 16,1 72,4 + 10,9 ,9 + 11,7 Concentration moyen- ne de l'hormone lutéinisante, g/ml 0,26 + 0,04 - 7,43 + 1,6 3,88 + 1,3 11,24 + 1,59 a été administré aux deux doses testées, a exercé un effet agoniste très prononcé; ce composé a été plus actif que le composé VI, c'est-à-dire le dérivé de tosyle correspondant, et beaucoup plus actif que le FLL naturel, qui a servi de composé de référence à titre comparatif Le remplacement du radical Gly par le radical D-Tle conformément à l'in- vention a entraîné une nette élévation du degré et de la durée de l'action du FLL; ce résultat a été observé distinctement même à la dose de 10 gg par animal Le précurseur VI partiellement protégé a fait preuve d'une activité considérable; cette découverte confirme 11 effet important produit par la modification structurale men- tionnée-en position 6 sur la conformation (agencement stérique) de la molécule du peptide L'effet avantageux de ce remplacement a grandemnt prédominé sur l'effet défavorable de la tosylation de Arg en position 8 Le dérivé de 8-tosyle correspondant du FLL naturel a été en effet presque inactif. Les composés nonapeptidiques de formule I peuvent être préparés par des procédés qui impliquent des réactions de combinaison des radicaux d'aminoacides ou de peptides inférieurs respectifs selon les procédés de préparation de la chimie des peptides Un procédé avanta- geux à utiliser à cette fin implique des réactions de combinaison d'un dérivé hexapeptidique de formule générale II Y -Ser-Tyr-D-Tle-leu-Arg-Pro(H-EI) dans laquelle X a la même définition que dans la formule I et Y est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur éliminable par hydrogénolyse, de préférence un radical benzyloxycarbonyle, avec un dérivé réactif du tripeptide de formule III p Glu-His-Trp (III) et, le cas échéant, élimination des groupes protecteurs. Les réactions de combinaison peuvent être conduites en solution, ce qui constitue la technique classique de préparation de la chimie des peptides (E Schroeder, K Lfibke, The Peptides,volumes I et II, Acad Press, New York 1965) ou en phase solide (J M. Stewart, J D Young, Solid phase peptides synthesis, W.H Freeman Comp, San Francisco, 1969) La protection temporaire des groupes amino terminaux a été effectuée avantageusement par introduction d'un radical benzyloxy- carbonyle; les groupes fonctionnels des chaînes latérales - à l'exception de Arg seulement ne nécessitent pas de protection La protection du groupe guanidino de l'arginine a été effectuée à l'aide d'un groupe tosyle Son élimina- tion peut être effectuée par des procédés classiques, mais un procédé nouveau utilisant une solution d'acide trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoracétique en présence d'un agent protecteur convenable tel que l'acide thioglycolique (voir les exemples) s'est montré recommandable Ce procédé assure une élimination rapide du groupe tosyle sans détérioration simultanée du reste de la molécule sensible de peptide et, en conséquence, il donne de bien meilleurs rendements en produit désiré que les procédé connus. Après que le groupe protecteur a été éliminé, le produit résultant peut être immédiatement purifié par chromatographie en phase liquide; on obtient ainsi le nonapeptide de la présente invention avec un haut degré de pureté La phase dite inverse, c'est-à-dire du gel de silice (en particules de 10 à 30 Dam de diamètre) modifiée en surface par une couche d'hydrocarbures en C 8 à C 18 liée chimiquement, est utilisée avantageusement comme phase stationnaire L'élution a été effectuée à l'aide d'un mélange de méthanol ( 20 à 60 % en volume conformément au composé peptidique impliqué) et d'une solution aqueuse à 0,1-0,5 %,-de préférence à 0,2 % d'acide trifluoracétique comme phase mobile La présence d'acide trifluoracétique comme suppresseur d'ionisation dans la phase mobile a été nécessaire pour obtenir une séparation efficace Cette technique a rendu possible la purification des substances par une opération simple-sans processus additionnel d'éli- mination de sels. La chromatographie en phase liquide n'a jamais été utilisée jusqu'à présent pour la purification de composés peptidiques similaires La phase mobile mentionnée ci-dessus a été mise au point comme remplacement avanta- geux des systèmes mobiles décrits ci-dessus qui utilisaient des solutions tampons de p H différents pour influencer l'ionisation des substances traitées Lorsqu'on utilise de telles phases mobiles tamponnées, les produits séparés doivent être soumis à une opération supplémentaire d'éli- mination des sels, qui rend la séparation très laborieuse et qui prend du temps. D'autres détails du procédé de préparation des composés nonapeptidiques biologiquement actifs de la présente invention ressortent des exemples suivants (dans lesquels Z désigne un groupe benzyloxycarbonyle, Tos est un groupe tosyle, c'est-à-dire p-toluènesulfonyle et DCHA désigne la dicyclohexylamine) qui illustrent à titre non limitatif la portée de l'invention. Z-Pro-NH-Et (I) On dissout 50 g de Z-Pro ( 0,2 mole) dans 170 ml de diméthylformamide, -ôn y introduit en versant 21 ml de pyridine et on refroidit la solution à -40 C On ajoute du chlorure de pivaloyle ( 29 ml, 0,22 mole) et on agite le mélange pendant 10 minutes à une température de -30 C. Après refroidissement du mélange réactionnel à -40 C, on ajoute une solution de 10 g ( 0,21 mole) d'éthylamine dans ml de diméthylformamide Après repos pendant la nuit à O C, on évapore le diméthylformamide et on dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle, et on laisse la cris- tallisation s'effectuer Le rendement est de 50 g ( 91 %) du produit indiqué dans le titre, fondant à 125-130 Co Z-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (II) 4,5 g de Z-Pro-NH-Et ( 16,2 mmoles) sont débar- rassés du groupe protecteur par traitement avec une solu- tion de bromure d'hydrogène dans l'acide acétiqueo Après repos pendant 20 minutes à la température ambiante, on précipite le bromhydrate à l'éther et on le dissout immé- diatement dans 30 ml de diméthylformamide o On décompose 10 g de ZArg(Tos) DCHA ( 17,8 mmoles) avec de l'acide chlorhydrique 2 N et on extrait à l'acétate d'éthyle le Z-Arg(Tos) libéré Après évapora- tion du solvant, on obtient ce produit sous la forme d'une mousse On dissout la matière dans 60 ml de diméthyl- formamide et on refroidit la solution à -40 C puis on la traite à cette température successivement avec 1,4 ml de pyridine ( 20 mmoles), 2,2 ml de N-éthylpipéridine et 2,1 ml de chlorure de pivaloyle ( 18 mmoles) Après agita- tion à -30 C pendant 20 minutes, la solution de bromhydra- te de Pro-NH-Et mentionnée ci-dessus est versée et le p H du mélange réactionnel est ajusté à 7,5 par addition de N-éthylpipéridine, le mélange étant maintenu pendant la nuit dans un réfrigérateur Les portions volatiles sont ensuite évaporées, le résidu est extrait à l'acétate d'éthyle et l'extrait est lavé successivement avec de l'acide chlorhydrique 1 N, une solution à 5 % de bicarbonate de sodium et de l'eau Le solvant est ensuite chassé par distillation en même temps qu'il est exposé à une déshydra- tation azéotrope Le rendement est de 6,02 g ( 63 %) du produit indiqué dans le titre, sous la forme d'une mousse. Composition des aminoacides déterminée par l'analyse: Pro 0,91; Arg 1,09. 2 ' Z-Leu-Arg/Tos/-Pro-NH-Et (III) 6 g ( 8,7 mmoles) de Z-Arg(Tos)-Pro-NHEt sont débarrassés du groupe protecteur avec une solution de bromure d'hydrogène dans l'acide acétique Le bromhy- drate est précipité dans la solution avec de l'éther et il est dissous en une seule fois dans 25 ml de diméthyl- formamide La condensation subséquente est de nouveau effectuée par la méthode des anhydrides mixtes indiquée ci-dessus en utilisant 3,72 g ( 8, 7 mmoles) de Z-Leu DCHA, 1,2 ml ( 10 mmoles) de chlorure de pivaloyle, 0, 83 ml ( 8,7 mmoles) de pyridine et 1,19 ml ( 8,7 mmoles) de N- éthylpipéridine; du diméthylformamide est utilisé comme solvant Le produit est isolé de la même manière que le composé II de l'exemple précédent Le rendement est de 4,5 g ( 73 %) du produit indiqué dans le titre, sous la forme d'une mousse Composition des aminoacides déter- minée par l'analyse: Leu 0,98 '; Arg 1,09; Pro 0,93. Z-D-Tle-Leu-Arg/Tos/-Pro-NH-Et (IV) On traite 2,6 g ( 5,82 mmoles) de Z-DTle DCHA avec de l'acide sulfurique décinormal pour décomposer le sel et on extrait le Z-D-Tle libéré dans de l'acétate d'éthyle Apres évaporation du solvant, on obtient 2 g d'un produit huileux; la matière est dissoute dans 20 ml de chlorure de méthylène. 4 g ( 5,7 mmoles) du composé III ont été décar- bobenzoxylés avec du bromure d'hydrogène dans l'acide acétique Le produit est libéré du bromhydrate sur une colonne d'échangeur anionique sous la forme OH en solution méthanolique Le rendement est de 2,9 g de Leu-Arg(Tos)- Pro-NH-Et sous la forme d'une mousse Ce produit est homo- gène à l'électrophorèse à p H 2,5 et 5,7 (détection à la ninhydrine) On dissout en une seule fois l'amide tri- peptidique libre obtenu dans 15 ml de chlorure de méthylène et, en refroidissant à -20 C, on ajoute la solution de Z-D-Tle préparée cidessus et une solution de 2 g ( 9,7 mmoles) de dicyclohexylcarbodiimide dans 10 ml de chlorure de méthylène On laisse reposer le mélange réactionnel dans un réfrigérateur pendant 4 jours Le précipité de dicyclohexylurée est ensuite séparé par filtration, le filtrat est évaporé et le résidu est dissous dans de l'acétate d'éthyle Le produit indiqué dans le titre est isolé sous la forme d'une substance neutre après lavage répété de la solution dans l'acétate d'éthyle, successi- vement avec de l'acide chlorhydrique 1 N, une solution à 5 % de bicarbonate de sodium et de l'eau Le rendement est de 3,9 g ( 93 %) du peptide sous la forme d'une mousse. Le produit est homogène à la chromatographie, comme on le vérifie sur une couche mince de gel de silice dans un mélange de chloroforme et de méthanol à 9:1 Composi- tion des aminoacides déterminée par l'analyse: D-Tle 0,92; Leu 0,98; Arg 1,01; Pro 0,93. Z-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg/Tos/-Pro-_H-Et (V) Le composé IV ( 3,6 g) est débarrassé du groupe protecteur par hydrogénolyse sur un catalyseur au palla- dium On obtient un rendement de 3,0 g ( 4,4 mmoles) du tétrapeptide libre La condensation fragmentaire avec Z-Ser-Tyr-N 3 est effectuée dans un mélange de diméthyl- formamide et de chlorure de méthylène anhydre à -30 C en utilisant 1,9 g de Z-Ser-Tyr-N 2 H 3, 1,5 ml de solution de chlorure d'hydrogène 8 N dans le dioxanne et 0,9 ml de nitrite de n-butyle La neutralisation (à p H 8) est effectuée avec de la N-éthylpipéridine Le mélange réaction- nel est ensuite laissé au repos dans un réfrigérateur à 0 C pendant 3 jours Les portions volatiles sont évaporées et le résidu est dissous dans de l'acétate d'éthyle La solution est lavée plusieurs fois successivement avec de l'acide chlorhydrique 1 N, une solution à 5 % de bicar- bonate de sodium et de l'eau, puis elle est déshydratée et évaporée Le rendement est de 4,14 g ( 76 %) d'hexa- peptide non cristallin Le produit est homogène à la chro- matographie comme vérifié par chromatographie en phase liquide (colonne de 0,4 x 25 cm, phase stationnaire: gel de silice modifié; phase mobile: 70 % en volume de méthanol et 30 % en volume de tampon au phosphate, p H 4,4). Le produit contient 82 % de l'hexapeptide indiqué dans le titre; sa composition en aminoacides d'après l'analyse est la suivante: Ser 1,14; Tyr 1,05; D-Tle 0,98; Leu 1,03; Arg 1,04; Pro 1,00. p Gllu-Hi s-Tr-S e-Tyr-DTi Le =u-ArTos/-Pro O i Et (Vs &) L'hexapeptide V ( 3,8 g) ci-dessus est débarras- sé du groupe protecteur par hydrogénolyse sur un catalyseur au palladium dans une solution méthanolique On obtient un rendement de 3,2 g de la substance contenant 88 % de l'hexapeptide libre (comme déterminé par chromatographie en phase liquide, avec les mêmes dimensions de colonne et la même phase stationnaire que ci-dessus, la phase mobile étant formée de 50 % en volume de méthanol et de % en volume d'acide trifluoracétique avec de la triéthyl- amine comme tampon à p H 3,9, la détection étant effectuée dans l'ultraviolet à 220 nm). La condensation azidique est effectuée dans un mélange anhydre de diméthylformamide et de diméthyl- sulfoxyde à 1:1 en utilisant 1,6 g de p Glu-His-Trp-N 2 H 3, 3,2 g de l'hexapeptide précédent et 0,5 ml de nitrite de n-butyle; la réaction est conduite à -20 C, la forma- tion de l'azide dure 30 minutes à la même température. Le mélange réactionnel est ensuite ajusté à p H 8-9 et il est laissé dans un réfrigérateur pendant 4 jours avec contrôle intermittent du p H Après évaporation des solvants, le résidu est-dissous dans un petit volume d'éther et la solution huileuse obtenue est diluée avec 30 ml de méthanol Le produit est précipité par addition d'acétate d'éthyle, recueilli sur un filtre et lavé avec un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther Le rendement est de 3,65 g ( 87 %) du nonapeptide brut Comme l'indique la chromato- graphie en phase liquide (les dimensions de la colonne et la phase stationnaire sont les mêmes que ci-dessus, la phase mobile consiste en 60 % en-volume de méthanol et 40 % en volume d'un tampon au phosphate de p H 7,0, la détection étant effectuée dans l'ultraviolet à 210 nm), le produit obtenu contient 70 % du nonapeptide indiqué dans le titre et, en outre, une certaine quantité des composés de départ comme mis en évidence par les pics chromatographiques correspondants (identification effectuée par mélange de la charge avec des substances de référence) et par l'analyse de la composition des aminoacides de ce nona- peptide brut: Glu 1,43, His 1,41; Trp 1,10; Ser 1,09; Tyr 1,20; D-Tle 0,89; Leu 1,00; Arg 0,88; Pro 0,90. Pour l'évaluation de l'activité biologique, on purifie la substance par chromatographie préparative dans les conditions suivantes: dimensions de la colonne 2,5 x 30 cm, phase stationnaire: gel de silice modifié (diamètre des grains 10 gm), phase mobile; 60 % en volume de méthanol et 40 % en volume de solution aqueuse à 0,2 % d'acide trifluoracétique, détection à 210 nm Un échan- tillon ( 300 mg) de la matière nonapeptidique brute (injecté dans 3 ml de la phase mobile) offre 148 mg d'un produit de pureté Égale à 96 % Sa composition en aminoacides d'après l'analyse est la suivante: Glu 1,01; His 1,01; Trp 0,90; Ser 0,95; Tyr 1,01; D-Tle 0,95; Leu 1,00; Arg 0,99; Pro 1,01. p Gl-His rp-Se-yr e-eu Ag E I Un échantillon ( 30 mg) du composé VI purifié comme indiqué ci-dessus est dissous dans 0,6 ml d'acide trifluoroacétique De l'acide thioglycolique ( 0,5 ml) - est ajouté et le mélange est refroidi à O C, traité avec 0,4 ml d'acide trifluorométhanesulfonique et laissé au repos pendant 30 minutes dans un réfrigérateur Le produit est ensuite précipité à l'éther et recueilli sur un filtre. La poudre modérément hygroscopique obtenue est dissoute dans de l'acide acétique 1 M et la solution est lyophilisée. On obtient 25 mg du produit brut La matière est purifiée par chromatographie en phase liquide sur une colonne de 2,5 x 30 cm, en utilisant du gel de silice"modifié comme phase stationnaire et un mélange de 55 % en volume de méthanol aqueux à 45 % et de 45 % en volume d'acide tri- fluoracétique aqueux à 0,2 % comme phase mobile Un échan- tillon ( 25 mg) de la matière purifiée est dissous dans 0,5 ml de la phase mobile et la solution est injectée: l'enregistrement est effectué à 280 nm Les fractions contenant le produit pur indiqué dans le titre sont rassemblées et le méthanol est évaporé sous pression ré- duite à 30 C Le produit purifié est obtenu en un rendement de 10,5 mg et avec une pureté de 98 % par lyophilisation d'une solution dans l'acide acétique 1 M D'après l'analyse, la composition des aminoacides est la suivante: Glu 1,03; His 0,94; Trp 0,80; Ser 0,95; Tyr 0,96; D-Tle 0,90; Leu 0,99; Arg 1,06; Pro 1,01. REVENDICATIONS 1 Analogues du facteur de libération de l'hormone lutéinisarte et de l'hormone folliculo-stimulante doués:d'une grande activité gonadotrope, de formule générale I 1 2 5 4 5 6 7 8 dans laquelle X représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur, de préférence un radical p-toluènesulfonyle. 2 Procédé de préparation des composés suivant la revendication 1, qui comprend des réactions de combi- naison des radicaux respectifs des aminoacides ou des peptides inférieurs par des procédés de préparation utili- sés dans la chimie des peptides. 3 Procédé suivant la revendication 2, qui comprend des réactions de combinaison d'un dérivé hexa- peptidique de formule générale II Y-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-4 '1 H-Et I) x - J dans laquelle X a la même définition que dans la formule I et Y est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur éliminable par hydrogénolyse, de préférence un radical benzyloxycarbonyle, avec un dérivé réactif du tripeptide de formule III p Glu-His-Trp (III) et, le cas échéant, l'élimination des groupes protecteurs. 4 Procédé suivant la revendication 3, qui comprend l'élimination du groupe p-toluènesulfonyle pro- tecteur en position 8 avec une solution d'acide trifluoro- méthanesulfonique dans l'acide trifluoracétique en présence d'un agent protecteur, de préférence l'acide thioglyco lique, suivie de l'isolement et la purification du produit. Procédé suivant la revendication 4, qui comprend la purification des produits réactionnels par chromatographie liquide à phase inversée utilisant comme phase mobile une solution d'acide trifluoracétique dans du méthanol aqueux.