Brevet FR2528071A1 — publié le 19831209

Procédé d'identification de microorganismes par chroma- tographie ". L'invention concerne un procédé d'identification de microorganismes par chromatographie ". Jusqu'à présent, le procédé habituel d'identifica- tion des microorganismes était basé sur l'observation de leurs propriétés morphologiques, de culture, physiologi- ques et biochimiques ou sérologiques, et autres Dans le cas d'une bactérie et de microorganismes similaires qui sont difficiles à distinguer d'un point de vue mor- phologique, leur identification se base essentiellement sur la détermination de leurs propriétés physiologiques et biochimiques dans une culture pure de l'organisme Ce procédé prend beaucoup de temps, généralement plus d'une semaine, et demande beaucoup de travail Pour la détermi- nation exacte, selon les normes internationales actuel- les, il est alors nécessaire d'effectuer jusqu'à 70 tests danys divers milieux de culture. Ces inconvénients ont incité à essayer d'utiliser des instruments analytiques modernes pour résoudre le problème ainsi posé Des tentatives ont été faites pour distinguer entre elles deux ou plusieurs souches dans un groupe de microorganismes, ou de distinguer grossièrement des groupes de microorganismes n'ayant pas de parenté entre eux Cependant, un traitement systématique de l'en- semble de la famille, sa différenciation d'avec d'autres familles similaires la différenciation mutuelle de clas- ses et espèces singuliers, et simultanément de l'ordre inférieur de cette famille, n'ont pas été jusqu'à présent effectués La détermination de microorganismes par pyro- lyse présente beaucoup d'exigences pour la reproductibi- lité et l'interprétation des résultats obtenus Parmi les méthodes d'identification connues jusqu'à présent, celle -donnée par le brevet US N O 3 891 508 (s Merrick), selon laquelle certains groupes de bactéries gram négatives se distinguent par la détermination de saccharides qui ne sont pas spécifiés plus précisément présents dans les lipopolysaccharides des parois de cellules du microorga- nisme, ressemble à la méthode d'identification selon l'invention Le procédé présenté dans la spécification du brevet U S permet de déterminer les groupes de micro- organismes suivants: 1 Intestinal entérobactéria 2 Pseudomonas 3 Vibrio 4 Haemophylus Bordetella 6 Pasteurella 7 Brucella 8 Neisseria Pour chacune des classes présentées, l'auteur demande cependant dans la spécification l'utilisation de différents milieux de culture, ce qui signifie que dans la pratique, il est nécessaire de déterminer grossière- ment à l'avance lequel des groupes présentés ci-dessus est présent dans l'échantillon donné Suivant ce procédé, il sera donc difficile de déterminer différents micro- organismes présents les uns à coté des autres et d'effec- tuer leur classification détaillée jusqu'aux espèces et sérotypes individuels. Les inconvénients mentionnés sont éliminés par un procédé suivant l'invention, qui consiste en ce que la culture pure de -microorganismes est cultivée dans des conditions constantes jusqu'à ce que la phase station- naire de croissance soit atteinte, que la biomasse obte- nue est séparée par centrifugation, lavée, séchée, et l'échantillon obtenu est hydrolysé en milieu acide, par exemple avec HCI, ou estérifié par exemple avec du méthoxyde de sodium, et après extraction, les acides organiques produits ou leurs esters sont déterminés par chromatographie, et les résultats de la détermination sont comparés avec d'autres résultats obtenus avec des standards de microorganismes. Ce procédé se base sur le phénomène selon lequel pour chaque groupe taxonomique de microorganismes, aussi bien que pour les sous-groupes inférieurs comme les espè- ces ou sérotypes, respectivement, une certaine occurrence et un certain rapport mutuel des acides organiques pré- sents directement dans la cellule du microorganisme sont caractéristiques Ces acides sont surtout représentés par des hydroxy-acides, des acides avec des cycles cyclo- propane, des acides gras saturés et insaturés La déter- mination peut être étendue aussi à d'autres types d'aci- des organiques, par exemple aux céto-acides, aux acides possédant plus de groupes carboxy et hydroxy et aux aci- des aminés Les résultats obtenus par détermination chro- matographique présentent un dessin caractéristique (em- preinte digitale) qui est typique pour certains micro- organismes, de sorte que, si l'on considère la reproduc- tibilité des résultats obtenus dans des conditions cons- tantes, il n'est pas indispensable de connaître la compo- sition chimique exacte mais de déterminer spatialement les similitudes des résultats des différentes détermina- tions chromatographiques Cette détermination peut s'effectuer en utilisant un ordinateur, o l'on a préala- blement déposé dans une banque de données les résultats des déterminations des organismes standards. Ce procédé d'identification de microorganismes permet, sans classification préliminaire, de déterminer sur un seul type de milieu, simultanément, non seulement la plupart des microorganismes gram-négatifs présents, mais aussi la plupart des microorganismes organotrophi- ques gram-positifs, et en même temps de réduire le temps nécessaire pour leur identification. Les dessins caractéristiques (empreintes digitales) de différents types de microorganismes se différencient clairement, et pour certains d'entre eux, la présence de certains acides organiques est caractéristique Par exem- ple, la prédominance d'acides ayant le même temps d'élu- tion que l'acide oléique est caractéristique pour la famille des Pseudomoradacées et la prédominance d'acides ayant le même temps d'élution que l'acide palmitique est caractéristique pour la famille des Entérobactériacées. Les dessins annexés présentent des enregistrements graphiques standardisés d'ordinateur Le temps d'élution relatif est porté sur l'axe des x et la hauteur relative des pics est portée sur l'axe des y. la figure 1 représente une culture caractéristi- que de descendance de Pseudomonas aeruginosa. Le pic 1 correspond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide palmitoléique Le pic 2 cor- respond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide palmitique Le pic 3 correspond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide oléique. la figure 2 représente l'enregistrement caracté- ristique de Vibrio Cholerae Le pic 4 correspond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide palmito- léique, le pic 2 correspond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide palmitique, le pic 3 corres- pond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide oléique. la figure 3 représente un enregistrement typique d'Edwardsiella tarda Le pic 4 correspond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide myristique, le pic 2 correspond à des acides ayant le même temps d'élu- tion que l'acide palmitique, le pic 5 correspond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide méthylène hexadécanoique. la figure 4 représente un enregistrement typique de Bacillus Thuringiensis kurstaki Le pic 4 correspond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide isomyristique, le pic 6 correspond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide méthyle tétradécanoi- que, le pic 2 correspond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide palmitique, le pic 7 correspond à des acides ayant le même temps d'élution que l'acide méthyle hexadécano Ique. La réalisation concrète de l'identification d'un microorganisme est la même pour toutes les espèces Une culture pure inconnue, ayant proliféré par exemple pen- dant la détermination habituelle des indicateurs de contamination fécale, est réinoculée à la surface du milieu de culture ayant la composition suivante: Extrait de viande (matière sèche) 10 g/l, peptone bactériologique 10 g/l, chlorure de sodium 5 g/1, agar- agar 15 g/l, sont placés dans une boîte de Petri de cm de diamètre, de façon à permettre la croissance et à obtenir une quantité suffisante de biomasse Au bout du temps de culture nécessaire pour atteindre une phase stationnaire de croissance des microorganismes étudiés, par exemple 24 h, la biomasse est enlevée par lavage de la surface de l'agar-agar et introduite dans une cellule de centrifugation, ayant un volume de 10 ml, en utili- sant 5 ml de solution isotonique de Na CI Après centrifu- gation, la matière pure surnageant est éliminée, la sus- pension cellulaire est lavée, avec 5 ml de solution iso- tonique de Na CI et soumise à nouveau à la centrifugation. L'opération de lavage est répété trois fois La suspen- sion de cellules concentrée est ensuite séchée par lyophi- lisation 20 mg de la préparation sèche sont estérifiés par le méthylate de sodium Les esters obtenus sont ex- traits à l'hexane, et, après concentration par évapora- tion de l'hexane jusqu'à un volume total de 10 ml, il est introduit îljî dans l'injecteur d'un appareil de chromato- graphie gazeuse, muni d'une colonne de 3 m de long, de 1,5 mm de diamètre, avec une phase non polaire. Le débit d'azote servant de gaz vecteur est établi à 19 ml par minute, en utilisant un détecteur à ionisa- tion de flammes La température de départ est de 100 IC, le gradient de température est de 1 C par minute, la tem- pérature finale est de 2601 C Les résultats obtenus peu- vent être transformés en diagramme normalisé, en utili- sant un intégrateur et un ordinateur, ou ils peuvent être directement traités sur un ordinateur Le temps nécessaire pour effectuer l'opération complète d'identi- fication est d'environ 32 h, la culture proprement dite demandant 24 heures. Ce procédé d'identification de microorganismes permet de déterminer avantageusement des microorganismes qui prennent part au cycle biogénique élémentaire dans le processus d'auto-purification de l'eau, ou dans les opérations de traitement biologique des eaux usées, d'au- tres microorganismes ayant une importance clinique ou hygiénique, et des microorganismes présentant de l'impor- tance pour l'industrie alimentaire. Le procédé suggéré est également approprié pour d'autres domaines de la microbiologie industrielle. Ce procédé présente une importance particulière pour les études théoriques en taxonomie et en génétique des microorganismes. R E V E N D I C A T I O N Procédé d'identification de microorganismes utilisant la chromatographie, ou une culture pure de microorganismes est cultivée dans des conditions cons- tantes jusqu'à obtention de la phase stationnaire de croissance ou la biomasse obtenue est séparée par cen- trifugation, lavée et séchée, procédé caractérisé en ce que l'échantillon obtenu est hydrolysé en milieu acide par exemple en milieu acide chlorhydrique, ou est esté- rifié par exemple avec du méthylate de sodium, respecti- vement, et après extraction, les acides organiques pro- duits ou leurs esters sont déterminés par chromatographie, après quoi les résultats obtenus sont comparés avec des résultats obtenus avec des souches standards de micro- organismes.