Brevet FR2527613A1 — publié le 19831202

k ENDOTOXINE RAFFINEE DEBARRASSEE DE SA TOXICITE La présente invention concerne une endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité (RDE), produit qui, lorsqu'il est combiné avec un squelette de paroi de cellule (CWS) donne une compositionthérapeutiquement efficace pour le traitement de tumeurs cancéreuses sans produire les effets secon- daires nocifs normalement associés aux endotoxines La RDE utilisée dans la présente composition est caractérisée en ce qu'elle ne contient pas de 2-céto-3-désoxyoctanoatedétectable, qu'elle contiententre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1700 et 2000 nmoles/mg d'acides gras La présente invention concerne aussi des procédés de préparation de la RDE aussi bien que l'utilisation de la composition de RDE-CWS pour ob- tenir la régression et la rémission de tumeurs cancéreuses. On connait des extraits endotoxiques obtenus à partir des entérobac- tériacées y compris les organismes apparentés et les mutants Ces extraits ont été utilisés dans l'immunothérapie de diverses tumeurs immunogéniques {voir Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al, Cancer Immunol Immunother, Vol 7, pages 43-58 ( 1979) cité ici à titre de référence} Cependant, on sait que les extraits d'endotoxines sont extrêmement toxiques et de ce fait d'une utilisation limitée dans le traitement des tumeurs cancéreuses On a fait des efforts pour "débarrasser de leur toxicité" les endotoxines tout en retenant leur capacité à faire régresser les tumeurs Comme indiqué dans Ribi et al, des méthodes chimiques connues pour "débarrasser de leur toxicité" les endotoxines, tout en retenant leur capacité à servir d'ad- juvant, telles qu'une succinylation et une phtalylation, ont donné comme résultat à la fois la perte de leur endotoxicité et de leur pouvoir à faire régresser les tumeurs De ce fait, les tentatives de l'art antérieur d'obtenir un produit d'endotoxine ayant un pouvoir élevé de régression des tumeurs et peu ou pas de toxicité n'ont jusqu'à maintenant pas été couronnées de succès. 25276 1 3 Un squelette de paroi de cellule est essentiellement une paroi de cellule dont beaucoup de la protéine et des lipides que l'on trouve nor- malement dans la paroi de cellule ont été enlevés C'est un mucopeptide d'arabinogalact:,ni et d'acide mycolique polymère contenant des restes de mycolate de trehalose ("P 3 ") et de tuberculoprotéines non digérées Un squelette de paroi de cellule est obtenu à partir de mycobactéries quel- conques comprenant, mais sans y être limité, M smegmatis, M phlei, Nocardia rubra, Nocaroia asteroides, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium parvum, M kansasii, M tuberculosis (souche H 37 RV et Ayoma B), et M bovis, souche BCG En outre, un squelette de paroi de cellule peut être encore obtenu à partir de non-mycobactéries telles que E coli, B abortus, et Coxiella burnettii. Un squelette de paroi de cellule est préparé en faisant tout d'abord pousser et en récoltant une bactérie telle que M bovis, souche BCG (bacille Calmette-Guerin) Le résidu de cellule entière qui en résulte est traité sur un appareil à fractionner les cellules {appareil à fractionner les cellules de Ribi (Sorvall, modèle RF-1)} qui détruit les cellules sé- parant l'enveloppe extérieure ou la paroi de la cellule des impuretés protoplasmiques Les parois de cellule qui en résultent sont alors soumises à une série d'extractions aux solvants et de traitements enzymatiques (par exemple trypsine et/ou chymotrypsine) pour donner un squelette de paroi de cellule purifié. C'est donc un objet de la présente invention que de préparer un produit d'endotoxine raffiné débarrassé de sa toxicité supérieur ayant un pouvoir élevé de régression des tumeurs sans produire les effets secondaires toxiques qui y sont normalement associés C'est un autre objet de la pré- sente invention que de procurer une endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité en combinaison avec un squelette de paroi de cellule sous la forme d'une composition extrêmement puissante pour le traitement des tu- meurs cancéreuses. La présente invention concerne une endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité (RDE) et des procédés pour sa préparation L'invention con- cerne aussi la combinaison extrêmement puissante de RDE avec un squelette de paroi de cellule (CWS) qui peut être utilisé efficacement pour traiter des tumeurs cancéreuses La RDE utilisée danslaprésente invention, ne contientpas de 2-céto-3-désoxyoctanoate détectable,contient entre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2 000 nmoles/mg d'acides gras. Les extraits d'endotoxines du type utilisé comme matière première pour produire la RDE peuvent être obtenus à partir des entérobactériacées quelconques, y compris les organismes apparentés et les mutants A titre d'exemple, les genres suivants peuvent illustrer le type de micro- organismes que l'on peut utiliser: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella et Serratia. Les espèces suivantes sont typiquement employées: S minnesota, S typhimurium, B pertussis, B abortus, S enteritidis, E.coli, S typhi, S marcescens, S typhosa, Shigella flexni et S abortus eoji. Les extraits endotoxiques utilisés comme matière première peuvent être préparés par l'une quelconque des nombreuses méthodes connues {voir, par exemple, Webster, M E, Sagin, J F, Landy, M, et Johnson, A G, J Immunol 1955, 744, 55; Westphal, O, Luderitz, O, et Bister, F, Z Naturforsch, 76 148 ( 1952); Westphal, O, Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr Second Macy Conference (George F Springer, ed), Madison, N.J Madison Printing Co, 1957, 115; Galanos, C, Luderitz, O, Westphal, 0., Eur J Biochem 9, 245 ( 1969); Chen, C H, Johnson, A G, Kasai, N, Key, B A, Levin, J, Nowotny, A, J Infect Dis 128 543 ( 1973); Ribi, E., Haskins, W T, Landy, M, Milner, K C, The Journal of Experimental Medicine 114 647 ( 1961); Leive, L, Biochem Biophys Res Comm 21 290 ( 1965); et Ribi, E, Milner, K C, et Perrine, T, J Immunol 82 75 ( 1959)l. Le procédé préféré d'obtention de l'extrait endotoxique est celui décrit par Chen et al; à savoir la précipitation au méthanol-chloroforme. Le précipité au méthanol-chloroforme (MCP) est alors porté en réaction avec un acide organique ou mineral et ensuite lyophilisé pour donner un lipide A brut hydrolyse ayant une toxicité et une pyrogénicité réduites par comparaison avec celles du matériau d'endotoxine de départ. Le produit qui en résulte est alors traité avec un solvant qui est capa- ble de dissoudre de façon spécifique les acides gras et d'autres impure- tés sans dissoudre le lipide A brut Le solvant que l'on préfère à cette fin est l'acétone La teneur en phosphate du lipide A raffiné débarrassé de sa toxicité est d'environ la moitié de celle observée pour sa contre- partie toxique, ce qui suggère que la teneur en phosphate est liée aux effets toxiques des endotoxines. Les acides minéraux que l'on préfère utiliser pour les porter en réaction avec le MCP sont l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique et les acides organiques que l'on préfère sont l'acide toluène sulfonique ou l'acide trichloroacétique La réaction peut être convenablement conduite à une température entre environ 90 et 1300 C pendant un temps suffisant pour achever l'hydrolyse, habituellement entre environ 15 et 60 minutes. La préparation d'une endotoxine brute débarrassée de sa toxicité peut aussi être réalisée en faisant réagir le matériau de départ avec l'acide en présence d'un solvant organique tel que le chloroforme, le méthanol et l'éthanol ou des combinaisons de ceux-ci. Le lipide A brut qui en résulte est dissous dans l'acétone qui convient particulièrement pour éliminer les composants acides gras Le solvant est alors éliminé pour donner l'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité. L'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité est alors dissoute dans un solvant et passée à travers une colonne chromatographique conve- nable telle que par exemple une colonne chromatographique d'exclusion moléculaire, pour séparer les fractions de RDE qui sont alors rassemblées après élimination du solvant Dans un mode de réalisation, la solution d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité est passée sur une colonne Séphadex en présence d'un solvant tel que chloroforme, méthanol, acétone, -pyridine, éther ou acide acétique ou des combinaisons de ceux-ci La pres- sion de la colonne peut varier mais elle se situe typiquement dans la gamme entre environ la pression atmosphérique et 100 lbs/inch 2 ( 7 bars) et le débit se situe entre environ 0,1 et 10 ml/minute. Dans un autre mode de réalisation, la solution d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité est passée sur une colonne de cellulose-DEAE dans les mêmes conditions de pression que celles mentionnées ci-dessus pour la colonne Séphadex Le débit peut être maintenu entre environ 2 et ml/minute Les solvants utilisés sont aussi les mêmes que ceux utili- sés pour la colonne Séphadex bien que l'on puisse ajouter de l'eau et/ou de la diéthylamine à tous les mélanges à une concentration allant jusqu'à environ 1 %. D'autres méthodes de préparation de RDE à partir d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité comprennent le passage de la solution à travers une colonne de gel de silice 60 à basse pression ayant une taille de particule entre environ 15 et 63 microns et l'utilisation d'un solvant choisi parmi les chloroforme, méthanol, eau et hydroxyde d'ammonium Le rapport volumique préféré du mélange de solvants mentionnés ci-dessus est d'environ 50/25/4/2. La RDE telle que préparée en accord avec la présente invention et le CWS sont combinés pour produire une composition ayant une puissante activité anti-tumeur Les cancers que l'on peut traiter par la composition RDE-CWS comprennent les tumeurs animales telles que le carcinome des cellules du squame des bovins, les fibrosarcomes bovins, les sarcoldes équins, les mélanomes équins, les carcinomes des cellules du squame équin, les tumeurs mammaires canines, les adénomes canins et les mélanomes canins et les tumeurs humaines, telles que les tumeurs du sein, les tumeurs du poumon, une tumeur coléo-rectale, les mélanomes malins, les carcinomes des cellules du squame et les tumeurs ovariennes. La composition est de préférence administrée par injection dans un milieu pharmaceutiquement acceptable tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile directement dans la tumeur, dans des conditions que l'on décrira plus en détail ci-après La composition mentionnée ci-dessus peut être stabilisée par exemple par une méthode de lyophilisation et ensuite recons- tituée sans perte de puissance. La quantité de RDE dans une seule injection pour le traitement des animaux se situe entre environ 6,25 et 250 microgrammes/m I La quan- tité de CWS se situe entre environ 125 et 750 microgrammes/ml Le nombre de millilitres du produit biologique injecté dans la tumeur est déterminé par la taille de la tumeur en accord avec le tableau suivant: Dosage animal suivant la taille de la tumeur Diamètre de la tumeur (cm) Quantité de produit biologique à injecter 0 1 cm jusqu'à 0,5 ml 1 2 cm 0,5 à 2,5 ml 2 3 cm 2,5 à 5 ml 3 5 cm 5 à 10 ml 5 8 cm l à 15 ml supérieur à 8 cm 15 à 20 ml La dose maximum par injection est d'environ 1 500 microgrammes pour la RDE et d'environ 4 500 microgrammes pour le CWS Le cours du traitement comprend jusqu'à 5 injections administrées à une semaine d'intervalle. La composition de RDE-CWS dans un milieu convenant à l'injection tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile est administrée directement dans les tumeurs humaines Les quantités de RDE et de CWS respectivement dans une seule injection se situent entre environ 50 et 1 000 microgrammes avec un niveau de dosage unique préféré d'entre environ 275 et 325 micro- grammes pour chaque composant pour un patient adulte typique de 70 kg. Les injections sont administrées environ 1 fois par semaine pour aller jusqu'à un total de 15 injections Généralement, il est souhaitable d'ad- ministrer la composition contenant entre environ 50 et 500 microgrammes/ml de RDE et entre environ 50 et 500 microgrammes/ml de CWS par injection. Comme décrit ci-dessus, la composition pour le traitement des animaux à sang chaud et des êtres humains peut être utilisée sous la forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile La quantité d'huile utilisée se situe dans la gamme d'entre environ 0,5 et 3,0 % en volume par rapport au volume total de la composition On préfère utiliser entre environ 0,75 et 1,5 % en volume de l'huile Des exemples de ces huiles comprennent l'huile minérale légère, le squalane, le 7-n-hexyloctadécane, l'huile supérieure Conoco et l'huile minérale Drakéol 6 VR (produites par la Pennreco Company, Butler, Pennsylvania). Le mélange contenant l'huile homogénéisée est alors combiné avec un détergent qui peut éventuellement être dissous dans une solution saline préalablement au mélange La quantité de détergent se situe typiquement entre 0,02 et 0,20 % en volume et de préférence entre environ 0,10 et 0, 20 % en volume par rapport au volume total de la composition Tout matériau détergent commun peut être utilisé, y compris le Tween-80 et l'Arlacel (produits par la Atlas Chemical Company). Le mélange résultant de l'addition du détergent est alors homogé- néisé pour former une suspension possédant un pourcentage élevé de gout- telettes d'huile revêtue de RDE et de CWS tel que le détermine l'obser- vation au microscope. Les exemples suivants sont donnés à des fins d'illustration unique- ment et n'entendent pas limiter en aucune façon l'invention telle qu'elle est revendiquée dans les revendications ci-jointes. EXEMPLE 1 Préparation d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité Un échantillon de 650 mg d'un précipité au méthanol-chlororome préparé en accord avec la façon de procédé de Chen et al, J Infect Dis. 128 543 ( 1973) est mis en suspension dans 150 ml d'H Cl 0,1 N dans un ballon à fond rond à trois tubulures équipé d'un condenseur et immergé dans un appareil d'agitation sonique Après agitation sonique, l'appareil en verre est alors abaissé dans un bain d'huile maintenu à 1200 C, ce qui laisse la température intérieure du ballon approcher ou dépasser le point d'ébullition de la solution Une surchauffe de la solution est diminuée 25276 13 en équipant le ballon d'un tube capillaire raccordé à une source de gaz azote par l'une des tubulures Un débit continu d'azote est maintenu à travers tout le processus d'hydrolyse. On poursuit l'hydrolyse pendant 30 minutes, ce après quoi on refroi- dit la solution au bain de glace, on procède à une agitation sonique pour disperser le matériau solide et on le distribue dans des tubes de corex. Le ballon est lavé avec de l'eau distillée pour enlever tout le matériau solide adhérant aux parois du ballon et le produit du lavage est ajouté à la suspension dans les tubes de corex La centrifugation est effectuée à 12 000 tr/mn pendant 80 minutes Ce qui surnage est décanté et jeté. Le résidu solide est remis en suspension dans l'eau distillée, traité par agitation sonique jusqu'à ce que la suspension soit bien dispersée et recentrifugé Le processus de centrifugation est alors répété Le résidu est repris dans l'eau distillée, congelé en écailles et lyophilisé, ce qui donne 382 mg de lipide A brut 150 mg de ce matériau sont traités avec de l'acétone froide ( O C) pour éliminer les acides gras, soumis à une agitation sonique et filtrés sur un appareillage de filtration par gravité Whatman no 1 à 50 C, 100 mg d'endotoxine brute subsiste après séchage. EXEMPLE 2 Préparation d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité. Un échantillon de 120 mg de MCP (précipité au méthanol-chloroforme) est mis en suspension dans 12 ml de méthanol absolu, traité par agitation sonique pour disperser les matériaux solides et réparti dans six fioles à bouchon vissé ( 1 x 10 cm) On ajoute 2 ml d'H Cl 0,2 N dans chaque tube et la suspension qui en résulte est maintenue dans un bain d'eau bouillante pendant 45 minutes Après hydrolyse, les tubes sont refroidis dans un bain d'eau glacée et centrifugés pendant environ 10 minutes à 2 500 tr/mn Ce qui surnage est décanté et l'on ajoute 5 ml d'un mélange chloroformel méthanol 2/1 au résidu pour effectuer la dissolution On ajoute 2 ml d'eau par tube et la solution est mélangée La solution biphasique est recen- trifugée à 2 500 tr/mn pendant 10 minutes La phase aqueuse supérieure est jetée et l'on ajoute 1 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 à chaque tube, ce qui donne une solution claire Les solutions sont rassem- blées et le solvant est évaporé sur un évaporateur rotatif Le résidu est séché sous vide poussé et lyophilisé, ce qui donne 45 mg de lipide A brut. 20 mg de de matériau sont traités avec de l'acétone froide ( 00 C), traités par agitation sonique, et filtrés sur un appareil de filtration par gra- vité Whatman N O 1 à 50 C 13 mg d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité subsiste après sécha'ge. 25276 13 EXEMPLE 3 Préparation d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité g de LH-20-100 (taille de particule 25 à 100 microns: Pharmacia) sont combinés avec 600 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 2/1 que l'on laisse séjourner pendant 30 minutes La bouillie qui en résulte est ajou- tée à une colonne de chromatographie en verre de 25 x 1 000 mm (BRL Laboratories) équipée de raccords sous pression Après achèvement du gar- nissage, la colonne est raccordée au moyen d'un tubage sous pression en téflon à une pompe ISCO modèle 132 400 ml d'un-mélange chloroforme/métha- nol 4/1 sont pompés à travers la colonne au débit de 3 ml/mn 100 mg d'en- dotoxine brute débarrassée de sa toxicité préparée selon l'exemple 1, sont introduits dans la colonne dans 2,5 ml d'un mélange chloroforme/ méthanol 4/1 par l'intermédiaire d'une boucle d'échantillonnage Le débit est réduit à 1 ml/mn et après que l'on ait recueilli 150 ml d'éluant, l'effluent est raccordé à un collecteur de fraction Des fractions de 4 ml sont recueillies et les fractions d'endotoxines raffinées débarrassées de leur toxicité sont déterminées par analyse chromatographique en couche mince des fractions {E Merck, épaisseur 0,25 mm, chloroforme/méthanol/ H 20/NH 40 H ( 50/25/4/2) comme éluantl. Les fractions d'endotoxinesraffinées débarrassées de leur toxicité sont combinées et le solvant est évaporé, ce qui laisse 30 mg d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité sous la forme d'une poudre blanche. EXEMPLE 4 Préparation d'une endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité. 33 g de cellulose-DEAE (Whatman DE-32) sont mis en suspension dans 150 ml d'acide acétique glacial et agités doucement pendant 10 minutes pour obtenir une poudre en bouillie Le mélange est laissé de côté pendant la nuit. La bouillie est versée dans une colonne de 25 x 400 mm, on laisse séjourner tout en égouttant et l'acide en excès est après cela éyacué La colonne est lavée avec 2 000 ml de méthanol, et ensuite avec 200 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 Un échantillon de 100 mg d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité préparée selon l'exemple 1, est ajouté à la colonne dans 3 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 ou un mélange /20/1 de chloroforme/méthanol et eau La colonne est éluée avec 350 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 et ensuite avec 300 ml d'un mélange méthanol/eau 99/1 En utilisant un appareillage à gradient linéaire, la colonne est éluée avec 2 000 ml d'un gradient linéaire en partant avec du méthanol à 100 % et en terminant avec de l'acide acétique 0,2 M dans le 25276 1 3 méthanol La colonne est éluée au débit de 6 ml/mn et l'on recueille des fractions de 15 ml Chaque fraction successive est analysée pour en dé- terminer la teneur totale en phosphore selon la façon de procédé de Bartlett, G R, J Biol Chem 234, 466-471 ( 1959) Les fractions sont rassemblées et évaporées sur un évaporateur rotatif presque à siccité et reprises dans 10 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 2/1 et 40 ml d'acide acétique 0,OO 1 M dans un entonnoir de séparation La couche inférieure est séparée, filtrée sur papier filtre Whatman N 02 et évaporée à siccité, ce qui donne 19,2 g d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité. EXEMPLE 5 A treize cobayes souche 2 ayant des croissances de tumeur ligne-10 d'environ 9 mm, on injecte une fois 0,4 ml d'une émulsion en gouttelettes d'huile stérile, c'est-à-dire huile minérale Drakéol 6 VR (Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania) contenant 50 microgrammes de RDE et 50 microgrammes de CWS directement dans le tissu de la tumeur. A la fin d'une période de trois mois, on examine les animaux et, sur douze des treize animaux, s'est produite une totale régression de la croissance de la tumeur Dans une expérience de contrôle, à six cobayes souche 2 ayant des croissances de tumeur ligne-10 d'environ 9 mm, on injecte une fois 0,4 ml contenant 50 microgrammes de RDE seule Les in- jections faites directement dans le tissu de la tumeur Aucune des six tumeurs ne montre un signe quelconque de régression après trois mois. 25276 13 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité ne possédant pas de 2-céto-3-désoxyoctanoate détectable, possé- dant entre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore, et entre environ 1 700 et 2 000 nmoles/mg d'acides gras, consistant (a) hydrolyser un extrait d'endotoxine obtenu à partir de micro-organis- mes de la famille des entérobactériacées avec un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide toluène sulfonique ou l'acide trichloroacétique; (b) lyophiliser le produit hydrolisé pour obtenir le lipide A brut; (c) traiter le lipide A brut avec un premier solvant tel que l'acétone pour dissoudre les acides gras qui y sont contenus; (d) dissoudre le produit insoluble qui en résulte dans un second solvant tel que le méthanol, le chloroforme, l'acétone, la pyridine, l'éther et l'acide acétique ou un mélange de ces solvants; et, (e) faire passer la solution qui en résulte à travers une colonne chro- matographique pour obtenir le produit désiré. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction est conduite à une température entre 90 et 130 C. 3 Endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité ne possédant pas de 2côto-3-désoxyoctanoate détectable, possédant entre 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2 000 nmoles/mg d'acides gras. 4. Composition thérapeutique comprenant une quantité thérapeuti- quement efficace de produit d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité, suivant la revendication 3, en combinaison avec un squelette de paroi de cellule et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 5. Composition suivant la revendication 4, caractérisée en ce que la composition est sous forme lyophilisée ou sous la forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile. 6. Composition suivant la revendication 4, dans laquelle la quan- tité thérapeutiquement efficace d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité va jusqu'à environ 1 500 microgrammes par injection et la quan- tité efficace de squelette de paroi de cellule va jusqu'à environ 4 500 microgrammes par injection. 7. Composition selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite composition contient environ 6,25 à 250 microgrammes/ml d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité et environ 125 à 750 microgrammes/ml de squelette de paroi de cellule 8 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite composition contient entre environ 50 et 1 000 microgrammes d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité et de squelette de paroi de cellule et de préférence entre 275 et 325 microgrammes de chacun des matériaux cités ci-dessus. 9 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite composition contient entre environ 50 et 500 microgrammes/ml diendotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité et entre environ 50 et 500 microgrammes/ml de squelette de paroi de cellule.