Brevet FR2531838A1 — publié le 19840224

AUTRE TISSU BIOLOGIQUE GREFFABLE ET PROCEDE POUR SA PREPARATION La présente invention concerne un tissu biologique greffable et un procédé pour sa préparation. La conservation par le glutaraldéhyde des tissus biologiques, en particulier des valvules cardiaques bioprothétiques porcines9 a permis de: a) éviter les mauvaises performances des tissus valvulaires greffés conser- ves par le formaldéhyde; b3 cesser de réaliser des homogreffes valvulaires; et c) éviter l'emploi indésirable des antioagulants nécessaires pour empêcher une thromboembolie associée à l'emploi des'valvules cardiaques non bioprothétiques (mécaniques) en particulier chez l'enfant.Cependant comme c'est le cas d'autres découvertes importantes semblablesg il sembleque les bioprothéses conservées par le glutaraldéhyde posent des problèmes qui leur sont propres. Bien que les valvules de Carpentier et autres conserves par le glutaraldéhyde, qui sont relativement inertes du point de vue biologique, présentent une excellente longévité dans la plupart des cas, leur emploi continu présente des inconvénients graves, tels qulune fatigue tissulaire et une tendance a la calcification. De plus on considérait au départ que les enfants et les adolescents seraient les sujets tirant le plus grand profit des valvules cardiaques bioprothétiques conservées par le glutaraldéhyde, grâce a la suppression des anticoagulants que nécessitent les prothèses mécaniques. Les resultats d'un nombre croissant d'études cliniques récentes montrent qu'une calcification grave de ces tissus s' accompagnant d'une défaillance relativement rapide, s'observe chez les enfants et les adolescents.Donc, malgré leur longévité prolongée et la fréquence globale réduite des complications, ces valvules conserves par le glutaraldéhyde sont considérées par certains comme inappropriées à l'emploi chez l'enfant. La calcification tissulaire demeure en grande partie mystérieuse; cependant on a précédemment montre que divers facteurs, tels que les anomalies du métabolisme du calcium, l'age, l'alimentation, la dégénéres- cence de composants tissulaires tels que le collagene et les turbulences, interviennent tous dans une certaine mesure. Récemment, l'existence d'un ami no-acide spécifique fixant le calcium, qui s'accumule après l'implantation des xénogreffes porcines conservées par le glutaraldéhyde, a été établie et on a pensé qu'il jouait un role dans la calcification.Bien que la calcification s'accompagne de dégradations des fibres de collagène du tissu greffé traite par le glutaraldéhyde, on ne sait pas si la calcification dystrophique est la cause ou le résultat de la dégénérescence tissulaire. Néanmoins, on a poursuivi les efforts pour elucider la source du problème de la calcification des tissus greffés en espérant y porter rapidement remède. A ce jour ni la source -ni la cause de la calcification des greffons biologiques ni des tissures appropriées pour éviter ou réduire la calcification des greffons biologiques n'ont été établies. Selon l'invention on a détermine une cause sous-jacente de la calcification des greffons biologiques et en particulier des bioprothèses valvulaires conservées par le glutaraldehyde. De plus on a simultanément mis au point des procédés permettant de réduire ou d'atténuer de façon efficace la calcification des tissus biologiques greffés. Une des causes sous-jacentes de la calcification des bioprothèses valvulaires, notée pour la première fois dans les études immédiates des demandeurs, est la présence de phosphate en contact avec les tissus avant la greffe en des quantités qui entretiennent la calcification après la greffe. Les teneurs en phosphate normalement observees dans les milieux d'expedition, tels que les solutions salées équilibrées (solution de Hanks, etc.), le plasma, et le tampon salé phosphate 0,01 à 0,10 M (PBS), utilisés classiquement dans les solutions de fixation à base de glutaraldéhyde, entretiennent tous à des degrés divers la calcification des tissus. A ce jour, les effets nuisibles du phosphate en contact avec les greffons biologiques, n'ont pas été appréciés et par conséquent les chercheurs, les eliniciens et les fabricants ignorent les consequences indésirables que provoque le traitement de ces greffons par des solutions phosphatées; en particulier du fait que des solutions phosphatées, telles que la solution de Hanks, le PBS et le glutaraldéhyde-PBS, ont été couramment utilisées et sont très recommandées. On comprend donc pourquoi on ait parfois recommandé, au lieu du tampon PBS, d'utiliser pour le stockage des tissus des tampons bicarbonate (ayant des capacités tampons et des gammes de pH semblables), l'emploi dans ce cas d'un milieu ne contenant pas de phosphate ne résultant- pas d'une intention délibérée.De plus,dans certains cas, même les milieux de conservation des tissus tamponnés au bicarbonate ont des teneurs elevées en phosphate. Comme les conséquences fâcheuses du maintien des greffons tissulaires en-contact avec un phosphate n'étaient pas connues., les cli niciens ou les fabricants des bioprothèses ne cherchaient pas délibérément a éviter le contact des tissus avec des solutions de phosphate. L'invention concerne des procédés qui reduisent de façon efficace la calcification des tissus biologiques greffés. Ces procédés réduisent de façon avantageuse la tendance a la calcification des bioprothèses et résolvent certains des problemes associés -a la longévité des xénogreffes de valvules cardiaques. L'invention concerne un procédé améliore pour traiter un tissu biologique avant la greffe qui atténue ou réduit la calcification après la greffe. Selon un mode de réalisation, le prpcédé comprend la mise en contact du tissu avec une quantite d'un cation divalent s'opposant par compétition a la fixation du calcium, efficace pour réduire la calcification du tissu après la greffe, et le maintien du tissu en contact avec ledit cation. L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée. L'invention a pour objet de rendre résistants à la calcification divers types de tissus biologiques greffables provenant de nombreuses sources animales et de nombreuses régions de l'organisme. Ainsi le tissu peut provenir entre autres de bovins, de porcins, de chevaux ou de lapins; et il peut être constitué de tendons, de ligaments, de valvules cardiaques ou de tissus utilisés pour réaliser des valvules cardiaques, tels que la duremère et le péricarde. Egalement l'invention peut s'appliquer à un tissu utilisé pour realiser des greffes en plaques, p. ex. des plaques cutanées; des plaque & éricardiques des plaques aortiques et des tympans.Selon l'invention on n'a pas observé de difference significative de la vitesse de calci-fication entre le péricarde de porc et les tissus des valvules aortique, tricuspide et mitrale de porc. Bien que l'on se soit principalement intéresse aux préparations tissulaires qui sont fixées ou tannées, telles que les valvules cardiaques traitées au glutaraldéhyde, les tissus conservés non fixés bénéficient de l'invention. Selon un mode de réalisation préféréde l'invention, des valvules cardiaques ou du tissu péricardique de porc fixes dans le glutaraldehyde et traités puis implantés sous la peau de rats et de lapins ont bénéficié d'une attenuation ou réduction prolongée inattendue de la calcification après -l 'im- plantation. Cette attenuation prolongée de la calcification constitue un procédé d'accroissement de la longévité du tissu greffé, en particulier des valvules cardiaques bioprothétiques. Selon un mode de réalisation de l'invention, un tissu biologique traité avec des cations divalents, avant la greffe et maintenu en contact avec lesdits ions, présente une réduction ou une atténuation avantageuse de la calcification après la greffe. Les ions divalents ajoutés au tissu semblent entrer en competition de façon efficacevis-à-visdes sites de fixation du calcium du tissu, en particulier après la greffe, lorsque dans certains cas des sites additionnels de fixation du calcium sont formés. L'accroissement de la quantité des ions divalents tels les ions magnésium dans le tissu après fixation dans du glutaraldéhyde-PBS, provoque une reduction ou une attenuation prolongée de la calcification, tandis qu'un tissu fixé dans du glutaraldéhyde-PBS avec des quantités accrues de cation divalent puis expose à des quantites additionnellesde phosphate entretenant la calcification, ne presente pas de diminution ou d'atténuation de la calcification.Donc selon l'invention il n'est pas nécessaire de maintenir le tissu traité par le cation divalent en contact avec une solution hypophosphatée avant ou pendant le traitement par l'ion, cependant on préfère maintenir le tissu dans une solution hypophosphatée après le traitement par l'ion divalent avant la greffe. Selon la présente invention, il est apparu que tout ion divalent qui entre. en compétition de façon efficace vis-à-vis des sites de fixation du calcium dans le tissu réduit la calcification. Par conséquent les cations divalents employes de préférence sont les ions Ba, Mg, Sr, Cu, Zn, Ag et Hg. On a constaté conformement à l'invention qu'un tissu traité par des ions Ba, Mg et Sr préalablement à l'implantation reduisent de façon efficace la calcification. L'ion Mg est employé de préférence dans le cadre de l'invention. Dans un mode de réalisation préfére de l'invention, les ions magnésium proviennent de solutions de sel de magnésium; on préfere particulièrement des solutions de sel soluble-dans l'eau tel que le chlorure de magnésium (MgCl2), le sulfate de magnésium (MgS04) et le carbonate de magnésium (MgC03). Dans le mode de réalisation que l'on préfère particulièrement, le sel de magnésium contient des ions magnésium en une quantité efficace pour reduire ou atténuer la calcification du tissu après la greffe. Bien que la concentration des ions magnésium et le moment de leur mise en contact avec le tissu puissent varier, il est préférable que le tissu soit pratiquement saturé de solutions contenant des quantités efficaces de cet ion. Selon l'invention, on considere que les quantités efficaces de cations divalents tels que les ions magnésium en contact avec le tissu sont des quantités supérieures aux quantités observées dans certains PBS, les solutions salées équi librées et le plasma. Les solutions classiques de PBS ont généralement une teneur en ions magnésium de l'ordre de 0,001% en poids, les solutions salées équilibrées une teneur de l'ordre de 0,002% en poids et la limite superieure dans la plasma est de l'ordre d'environ 0,003% en poids. La quantité préférée d'ions magnésium est supérieure à environ 0,003 à environ 0,004% en poids. La quantit maximale d'ions magnésium considérée comme utile dans l'invention-est celle ne saire à l'obtention d'une solution isotonique.La saturation du tissu avec des solutions contenant environ 0,03% d'ions magnésium réduit de façon efficace la calcification du tissu et constitue un procédé prefere. Pour effectuer cette s ration, on plonge le tissu dans une solution de chlorure de magnésium à 0,26% poids qui constitue une solution à 0,03% en poids d'ions magnésium. Des soluti consistant en des solutions salines équilibrées contenant plus d'environ 0,003 d'ions magnésium normalement presents dans le plasma conduisent un effet bénéfique et sont employées de préférence. Selon un mode de realisation de l'invention, un tissu valvulaire porcin prélevé, expédié dans une solution salee tamponnée a l'HEPES, fixe dans une solution salee tamponnée à 1 'HE?ES contenant 0,25% en poids de chlorure de magnésium et 09625% en poids de glutaraldéhyde, rincé dans une solution salee tamponnee à l'HEPES contenant 0s26% en poids de chlorure de magnésium, stérilisé dans une solution salée tamponnée à l'HEPES contenant 0,26% en poids de chlorure de magnésium et environ 4,0% en poids de formal- déhyde, rincé et conservé dans une solution salée tamponnée à 1'HEPES conte- nant 0,26% en poids de chlorure de magnésium et 0,625% en poids de glutaraldéhyde, jusqu'à un moment précédant immédiatement la greffe, présente de façon avantageuse une attenuation ou une réduction importante de la calcification après la greffe. Donc selon un mode de réalisation de l'invention on préfère particulièrement fixer le tissu biologique par le glutaraldéhyde dans une solution salée tamponnee à 1'HEPES contenant une quantite efficace de magnésium et maintenir la solution en contact avec ladite solution salee tamponnee à 1'HEPES et les ions magnésium jusqu'a un moment précédant immediatement la greffe. Egalement selon l'invention, le tissu biologique traité en l'absence de quantités efficaces de cations divalents tel que Mg peut entre rincé dans de solutions stériles, telles que des solutions de chlorure de magnésium, immédiatenient avant la greffe pour réduire la calcification ultérieure. Les tampons utilisés selon un mode de réalisation de l'invention sont de préférence stables, inertes vis-à-vis du processus de stabilisation et ont un pouvoir tampon suffisant pour maintenir un pH acceptable en particulier pendant la fixation des tissus. Le choix du tampon approprié et de sa concentration dépend des conditions particulières de préparation des tissus auxquelles plusieurs fabricants ont apporte des variantes. Les tampons préférés selon l'invention comprennent les tampons borate, carbonate, bicar- bonate, cacodylate (non toxiques chez l'animal) et d'autres tampons synthé tiques artificiels ou organiques tels que l'HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique). le MOPS I acide morpholinepropanesulEonique) et le PIPES (acide 1,4-pipérazinediéthanesulfonique).Les tissus préparés dans le tampon HEPES présentent de façon avantageuse une diminution importante de la calcification après la greffe et on préfère donc particulibrement ce tampon dans l'invention. De préférence. les solutions tamponnées ou non tamponnes utilisées selon l'inventisn doivent être inertes vis-à-vis du processus de stabilisa- tion des tissus que provoquent des agents fixateurs tels que le glubaralde- hyde. Ils ne doivent donc pas réagir avec l'agent fixateur ni empêcher lBaK gent fixateur de réaliser la fixation appropriée des tissus. On sait que des tampons contenant des amines primaires et secondaires, tels que le tris(hydroxyméthyl)aminométhane (TRIS), réagissent avec les groupes aldéhydes du glutaraldéhyde et génent ainsi le processus normal de stabilisation des tissus. Des tampons, tels que le TRIS, ben qu'ils soient pratiquement dépourvus de phosphate, nuisent à la stabilisation des tissus après la greffe et doivent donc être évités. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaitront à la lecture de la description suivante, donnée à titre non limitatif, à la lumière des exemples illustrant des modes de réalisation particuliers, mais en aucune façon susceptibles de constituer une quelconque limitation de la portée de l'invention. EXEMPLE 1 On rince à fond un tissu de valvule aortique porcine prélevé, on l'expédie, on le fixe avec du glutaraldéhyde a 0,625% en poids, on le stéri- lise dans du formaldéhyde à environ 4, on le conserve entre environ a et 25 C, le tout en présence d'une solution isotonique (285 + 15 millimoles) hypophosphatée contenant 0,885% en poids de chlorure de sodium a pH 7,3, on rince dans une solution salée pour eliminer le glutaraldéhyde residuel immédiatement avant l'implantation et on implante à des lapins en cours de croissance. On récupère le tissu valvulaire à des intervalles réguliers d'une semaine pendant une durée totale de 6 semaines.Après récupération, on évalue l'importance de la calcification tissulaire par determination quantitative du pourcentage pondéral de calcium dans le tissu sec par analyse par absorption atomique, et on l'évalue du point de vue histologi- que par observation du degré de calcification de coupes de tissu colorées selon la méthode de Von Kossa.De façon simultanée et identique, on évalue l'importance de la calcification d'un tissu de valvule cardiaque que l'on a rincé, expédié, fixé avec du glutaraldéhyde à 0,625% en poids, stérilisé dans du formaldéhyde a environ 4%, conservé entre environ 4 et 25"C, le tout en présence d'une solution isotonique 0,02 M en phosphate et à 0,885% en poids de chloruré de sodium à pH 7,3 (PBS 0,02 N), rincé dans une solution salée pour éliminer le glutaraldéhyde résiduel immédiatement avant l'implantation et implante à des lapins en cours de croissance. Les résultats histologiques et quantitatifs indiquent que le tissu valvulaire implanté traité avec la solution hypophosphatée présente une diminution nette de la calcification par rapport au tissu valvulaire traité avec du PBS 0,02M. EXEMPLE II Oieffectue des expériences identiques à celles de l'exemple I, si ce n'est que l'on implante le tissu à des lapins adultes et qu'on le récupère à des intervalles réguliers de un mois pendant une durée totale de six mois. De façon semblable, les résultats de l'examen histologique et du dosage quantitatif montrent que le tissu valvulaire implanté traité avec la solution hypophosphatée présente une diminution importante de la calcification par rapport au tissu valvulaire traité avec du PBS 0,02 M. EXEMPLE IIl On effectue des expériences semblables à celles due l'exemple IIesi ce n'est que la solution hypophosphatée contient de plus 0,54 g/l du sel de sodium de 1'HEPES lors du rinçage et de l'expédition et 5,83 g/l du sel de sodium de 1 'HEPES pendant la fixation, la conservation et la stérilisation, Dans ce cas également, les rasultats de l'examen histologique et du dosage quantitatif indiquent que le tissu valvulaire implante traite avec la solution hypophosphatee présente une calcification réduite par rapport au tissu valvulaire traite avec le PBS 0,02 M. EXEMPLE IV On effectue des expériences semblables à celles de l'exemple I, si ce n'est que les solutions hypophosphatées contiennent de plus 0,54 g/l du sel de sodium de 1'HEPES pendant le rinçage et l'expédition, 5,39 g/l du sel de sodium de l'HEPES pendant la fixation, le stockage et la sterilisation et 2,6 gll de MgCl2, 6H20 pendant la fixation, la conservation et la stérilisation. Dans ce cas également les résultats de l'examen histologique et des dosages quantitatifs montrent que le tissu valvulaire implante traité avec la solution hypophosphatee présente une diminution nette de la calcification par rapport au tissu valvulaire traité avec le PBS 0,02 M. EXEMPLE V On effectue des expériences identiques a celles de l'exemple IV, si ce n'est que l'on implante le tissu à des lapins adultes et qu'on le récupère à des intervalles réguliers de un mois pendant une durée totale de 6 mois. Les résultats de l'examen histologique et du dosage quantitatif montrent que les tissus valvulaires implantés traités avec la solution hypophosphatée, presentent une diminution nette et prolongée de la calcification par rapport aux tissus valvulaires traités avec du PBS 0,02 M. EXEMPLE VI On effectue des expériences semblables à celles de l'exemple I, si ce n'est que la solution hypophosphatée contient de plus du tampon cacodylate à la concentration de 0,5 M et que l'on récupère le tissu valvulaire uniquement apres une et deux semaines. De plus on évalue simultanement et de façon identique l'importance de la calcification observée lorsqu'avant la greffe on utilise une solution 0,012 M en phosphate et à 0,885% en poids de chlorure de sodium à pH 7,5 (PBS 0,012 M). Les résultats histologiques montrent que le tissu valvulaire implanté traité avec une solution hypophos phatée présente une légère diminution de la calcification apres une semaine par rapport au tissu valvulaire traité avec le PBS 0,012 M. Ensuite on observe une calcification modérée. EXEMPLE VII On effectue des expériences identiques à celles de l'exemple VI, si ce n'est que l'on remplace le cacodylate par du tampon borate 0,1 M. Les résultats histologiques sont semblables à ceux de l'exemple 6. EXEMPLE VIII On effectue des expériences identiques à celles de l'exemple VII, si ce n' est qu'aucune des solutions comparatives n'est hypophosphatée, les solutions utilisées pour la fixation, la conservation et-la stérilisation étant constituées de PBS 0,02 M au lieu de tampon HEPES. Les résul-tats de ltexamen histologique et du dosage quantitatif montrent que le tissu valvulaire implanté traité avec la solution de chlorure de magnesium phosphatée présente une reduction de la calcification par rapport au tissu valvulaire traité sans chlorure de magnésium. EXEMPLE IX On effectue des expériences semblables à celles de l'exemple III, pour évaluer l'intégrité du tissu après l'implantation. Les résultats des analyses indiquent qu'il n'y a pas de différence significative de la tempe rature de rétraction, des. valeurs de la réaction à la ninhydrine, de de la teneur en acide uronique lixiviable dans le produit de lixiviation acide des mucopolysaccharides,-de la stabilité du tissu soumis a une digestion par la pronase, de la coloration histologique, de l'analyse des aminoacides, de l'ultrastructure évaluée par microscopie électronique par transmission et de la teneur en humidité. EXEMPLES X à XXII On traite du tissu valvulaire cardiaque porcin prélevé, avec des solutions hypophosphatées ou des solutions contenant du phosphate à divers stades du traitement (avant fixation, pendant la fixation avec le glutaraldehyde et après la fixation) avant l'implantation à des rats pour évaluer le degré d'atténuation de la calcification obtenu pour chaque stade du traitement. Les résultats du tableau suivant résument les observations faites pendant une periode atteignant dans certains cas deux mois apres l'implantation.Dans le tableau, G p indique le tissu traité par le glutaraldéhyde dans du PBS 0,02 M; FH2O indique le tissu traite par du formaldéhyde aqueux; G eau indique le tissu traité par le glutaraldéhyde aqueux; F p indique le tissu traite par le formaldéhyde dans du PBS 0,02 M; GHEPES indique le tissu traite par le glutaraldéhyde dans de 1'HEPES 0,002 M; Gcarbonate indique le tissu traité par le glutaraldéhyde dans du tampon carbonate; solution salee/HEPES désigne la solution salée tamponnee par 1'HEPES à 0,002 M et BSS indique une solution salée équilibrée. TABLEAU ETUDE DE LA CALCIFICATION CHEZ LE RAT Avant fixation Traitement de Après fixation Degré de calcifi- fixation cation PBS Gp phosphatée important PBS FH2O hypophosphatée rèduit (degenerescence) PBS Fp phosphatée important (degenerescence) PBS Gwater hypophosphatée réduit PBS HEPES hypophosphatée réduit PBS Gcarbonate hypophosphatée legèrement réduit TANKS Gp phosphatée important (BSS) Solution salée Gp phosphatée important HEPES HANKS G solution hypophosphatée réduit (BSS) salée/HEPES PBS | G solution hypophosphatée réduit Solution salée salée/HEPES Solution salée G solution hypophosphatée réduit (prolongé) salée/HEPES PBS GP MgCl2hypophosphatée réduit (prolongé) PBS GP MgCl2-GP important EXEMPLE XXIII Des essais identiques a ceux de l'exemple IV sont mis en oeuvre si ce n'est que l'on remplaceMgCl2, 6H20 par BaCl2, 2H20 à une concentration de 2,2g/l. Les résultats obtenus montrent que Ba a un effet sur la calcification similaire àcelui du Mg EXEMPLE XXIV Des essais identiques à ceux de l'exemple IV sont mis en oeuvre si ce n'est que l'on remplace MgCl2, 6H20 par SrCl2, 2H2O a une concentration de 2,3g/R . Les résultats obtenus montrent que Sr a un effet sur la calcification similaire à celui du Mg. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et représentés et elle est susceptible de nombreuses variantes, accessibles à l'homme de l'art, sans que l'on ne s'écarte de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procedé pour traiter un tissu biologique avant la greffe, caractérisé en ce qutil comprend les stades de: a) mise en contact du tissu avec une quantite d'un cation divalent entrant en compétition vis-à-vis des sites de fixation du calcium, efficace pour reduire la calcification du tissu après la greffe; et b) maintien du tissu en contact avec ledit cation. 2. Procedé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le cation divalent est un ion magnésium ou un de ses -sels. 3: Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel de magnésium est choisi parmi MgCl2, f4gSO4, et MgCO3. 4. Procedé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le sel de magnésium est le chlorure de magnésium. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 4, caractérise en ce que le tissu est traite avec une quantité de cation divalent suffisante pour le saturer. 6. Procedé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le tissu biologique est utilise pour la préparation d'une valvule cardiaque. 7. Procedé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le tissu est utilisé pour la préparation d'une valvule cardiaque et la concentration du chlorure de magnésium est d'environ 0,26% en poids. 8. Procedé pour accroître la longevite d'un tissu biologique greffable, caractérise en ce qu'il-comprend les stades de a) accroissement de la quantité des cations divalents entrant en compétition vis-à-vis des sites de fixation du calcium à une valeur efficace pour reduire la calcification du tissu après la greffe et b) maintien du tissu en contact avec ledit cation. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le cation divalent est l'ion magnésium ou l'un de ses sels. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérise en ce que le sel de magnésium est choisi parmi MgCl2; MgSO4 et MgCO3. 11. Procedé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le sel de magnésium est le chlorure de magnésium. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8, 9 ou 11, caractérisé en ce que le tissu est traité avec une quantité de cation di valent suffisante pour le saturer. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8, 9 ou 11, caractérisé en ce que le tissu biologique est utilisé pour la preparation d'une valvule cardiaque. 14. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce gue le tissu est utilisé pour la préparation d'une valvule cardiaque et la concentration du chlorure de magnésium est d'environ 0,26 X en poids. 15. Bioprothèse stable ayant une tendance réduite à la calcification, caractérisée en ce qu'on l'a traitée avant la greffe avec une solution efficace pour réduire la calcification. 16. Bioprothèse selon la revendication 15, caractérisée en ce que le tissu est traité avec une quantité d'un cation divalent'efficace pour réduire la calcification du tissu après la greffe. 17. Bioprothèse selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisée en ce qu'on l'utilise pour des valvules cardiaques. 18. Bioprothèse selon l'une des revendications 15 ou 16, caractéri- sée en ce que le cation divalent est un ion magnésium ou un de ses sels.