Brevet FR2527928A1 — publié le 19831209

De façon générale, l'invention concerne des anticorps monoclonaux conjugués avec un chélate métallique L'invention concerne également un precédé pour ie traitement des affections des cellules, en particulier du cancer, qui utilise un anti- corps monoclonal conjugué avec un chélate de métal radioactif. Des procédes thérapeutiques efficaces pour le traitement des affections des cellules tels que le cancer ont fait l'ob- jet d'une recherche intensive La thérapie classique utilise la chirurgie, les radiations et la chimiothérapie Chacun de ces procédés souffre d'un sérieux inconvénient en ce qu'il n'est pas très sélectif vis-à-vis des cellules saines et des cellules can- céreuses Pour être efficaces, ces procédés tuent ou éliminent des quantités importantes de tissu sain De plus, la chiminthé- rapie affecte de manière néfaste le système immun, de sorte que la mort ou une maladie sérieuse provient souvent à partir d'in- fections fongiques, bactériennes ou virales. Le développement des anticorps monoclonaux a ouvert la possibilité defournir sélectivement des agents thérapeutiques ou des agents de diagnostic à des cellules cibles spécifiques. Les anticorps monoclonaux sont des immunoglobulines de struc- ture chimique bien définie Une caractéristique importante des anticorps monoclonaux est la reproductibilité de la fonction et la grande spécificité. Pour les diagnostics et la thérapie, on a utilisé de l'iode radioactif fixé directement sur des anticorps monoclo- naux L'iode-131 a eu quelques succès thérapeutiques vis-à-vis de grosses tumeurs, mais les anticorps marqués à l'iode radio- actif se sont montrés inefficaces dans le traitement de foyers de petites tumeurs ou de métastases En outre, des anticorps fixés de manière spécifique sont relativement rapidement cata- bolisés par la cellule cible Le catabolisme conduit donc à l'incorporation d'iode métabolisé dans les organes excréteurs, c'est-à- dire le rein, la vésicule biliaire et l'estomac En outre, des essais effec±'s er -oie de transporter des toxines vers des cellules tumorales au moyen d'anticorps mnnoclonaux n'ont nas D 2 rmnis d'établir un procédé thérapeutique satisfai- s ant. rn a indiqué dans la littératur que l'acide diéthylène triariine pentaacétique (DTPA) pourrait former des complexes m 5 talliques stables lorsqu'ils sont fixés sur une protéine, z rejcarek et ai, Biochem, & Biophys les Commun 77, 581 (l 9 Y 77)7 La visualisation des sites cibles in vivo avec des anticorps polyclonaux conjugués -avec un métal radioactif- DTPA préparés selon le procédé de Krejcarek a été rapportée par lhaw et al, Science 2 9, 295 ( 1980) Malgré la séparation, par chromatographie sur gel et dialyse, de métal libre et ché- laté à partir des anticorps polyclonaux conjugués avec un ché- late métallique, les images gamma incluses dans l'article mon- trent qu'une forte proportion du métal radioactif est loca- lisée dans le foie. L'invention a pour but de fournir des procédés thérapeu- tiques perfectionnés. L'invention a également pour but de fournir un moyen ef- ficace pour le traitement des affections cellulaires, utili- sant des anticorps monoclonaux. L'invention a encore pour but de fournir un procédé de distribution sélective de doses léthales de radiations a des cellules affectées, qui n'entraîne pas ou seulement très peu de destruction des cellules saines. L'invention a encore pour but de fournir un moyen de traitement sélectif des foyers de petites tumeurs et des mé- tastases. :Snfin, l'invention a encore pour but de fournir un pro- cédé d'introduction de métaux radioactifs "projetés" sélecti- 3 N vement in vivo, qui évite de manière appréciable l'incorpora- tion de métal radio-actif dans les organes sains du corps. Selon un de ses aspects, l'invention fournit un moyen de traitement des affections cellulaires, comprenant le con- tact d'une cellule cible avec des anticorps monoclonaux con- jugués avec un chélate métallique, dans lequel le métal radio- :3 actif est un nucléide métallique émettant une particule alpha. Dans un autre mode de mise en oeuvre, l'invention concerne un procédé comprenant l'introduction dans un fluide corporel d'anticorps monoclonaux conjugués avec un chélate métallique, dans lequel le chélate conjugué est un dérivé de l'acide dié- thylène triamine penta-acétique, le conjugat étant pratique- ment exempt d'ions dudit métal accidentellement fixés, et re- tenant pratiquement toute l'activité et la sélectivité de l'anticorps Une telle technique est désirée à la fois pour des buts de diagnostic et de thérapeutique L'invention four- nit également un procédé pour la production d'un anticorps monoclonal conjugué avec un chélate métallique, le métal ra-, di(actif émettant des particules alpha; procédé dans lequel l'anticorps conjugué avec un chélate métallique traverse une colonne de chromatographie constituée d'une ou de plusieurs couches choisies parmi des résines retardant les ions, des résines échangeuses d'anions, des résines échangeuses de ca- tions et une résine échangeuse d'ions chélatants, et d'une couche finale comprenant une matrice de classement. L'invention utilise des anticorps monoclonaux conjugués avec un chélate métallique pour des techniques thérapeutiques, en particulier in vivo. L'invention fournit également des anticorps monoclonaux conjugués avec un chélate métallique, qui conservent leur ac- tivité biologique et leur spécificité, et qui sont pratique- ment exempts de métaux fixés de manière accidentelle Les mé- taux fixés de manière accidentelle ne sont pas stables et sont la cause de la pénétration de métal libre dans le sang Les métaux qui sont libérés dans le sang, peuvent être fixés par la transferrine ou d'autres protéines fixant les métaux (par exemple la ferritine) qui sont présentes dans le sang Ces mé- taux fixés sont retenus dans le système circulatoire pendant de longues périodes de temps et sont évacués par le système réticuloendothélial (RES) Une telle évacuation (clearance). se traduit par une concentration du métal dans le foie et la rate i 1 est évident qu'une circulati-n long terme, au ha- sard, de nétaux radi-acti S dans le crros ou une concentration d( metaux ra dinactifs dans le foie et la rate sont Darfaite- nt indésirables La mise en oeuvre d 2 l'invention peut évi- ter ces s Crieux problèmes. Les anticorps nonoclonaux sont des immunoglobulines de structure chimique bien définie, contrairement au: anticorps polyclonaux qui sont des mélanges hétérognes d'immunoglobu- lines Une caractéristique importante des anticorps monoclo- e naux est la reproductibilité de la fonction et la spécificité, et ces anticorps peuvent être, et ont été développés pour une grande variété d'antigènes cibles, comprenant Ies cellules tu- morales Des procédés pour l'obtention d'anticorps monoclonaux ont fait l'objet de sérieuses discussions et sont bien connus dans la technique Comme texte utile, on citera "ononnclonal Antibodies" P H Kennett, T J Mic Kearn et K 9 Bechtol, éds. lg'), vnir également Koprowski et al, brevet US 4 196 265. Le choix d'un anticorps monoclonal pour la mise en oeuvre de l'invention dépend de l'usage final auquel l'anticorps mono- clonal conjugué avec un chélate métallique est destiné. Les anticor Ds sont généralement conservés dans une solu- tion aqueuse qui contient un composé ionique Une solution sa- line physiologique, normale, est très souvent utilisée et est très facilement disponible Mais on peut également utiliser d'autres solutions ioniques, telles que celles contenant du phosphate de sodium ou de potassium, du carbonate de sodium et autres, bien connues dans la technique. Une grande variété d'agents chélatants ou de ligands or- ganiques peut être conjuguée avec des anticorps monoclonaux. 3 e Les ligands organiques a conjuguer avec des anticorps nmono- clonaux peuvent être choisis parmi les amines naturelies ou synthétiques, les porphyrines, les acides aminocarboxyliques, les acides iminocarboxyliques, les éthers, les thiols, les phénols, les glycols et les alcools, ou bien parmi les p Dlya- mines, les acides polyaminocarboxyliques, les acides polyimino- carboxyliques, les acides aminopolycarboxyliques, les acides iminopolycarboxyliques, les acides nitrilocarboxyliques, l'a- cide dinitropolycarboxylique, les acides polynitrilopolycar- boxyliques, les éthylène diamine tétraacétates, les diéthy- lène triamine penta ou tétraacétates, les polyéthers, les polythiols, les cryptands, les polyétherphénolates, les pol:- ôtherthiols, les éthers de thioglvcols ou d'alcools, les po- lyaminephénols, tous les ligands acycliques, macrocycliques, cycliques, nmacrobicycliques ou polycycliques ou autres sembla- bles qui produisent des chélates ou cryptates métalliques très stables Naturellement, le choix des ligands dépend du métal à chélater et est laisse au spécialiste. Le ligand utilisé dans certains modes de mise en oeuvre de l'invention possède un groupe fonctionnel organique qui n'est pas fixé à un métal, capable de se fixer sur l'anticorps monoclonal Les groupes fonctionnels peuvent être choisis par- mi les groupes acide carboxylique, les groupes amine diazota- bles, les esters de succinimide, les anhydrides, les anhydri- des mixtes, les benzimidates, les nitrènes, les isothiocyanates, les azides, les sulfonamides, les bromoacétamides, les iodoacé- tamides, les carbodiimides, les chlorures de sulfonyle, les hy- drazides, les thioglycols ou tout groupe fonctionnel réactif connu dans la technique comme agent de conjugaison ou de cou- plage biomoléculaire. L'invention utilise de préférence un dérivé de l'acide diéthylène triamine pentaacétique (DTPA) On a trouvé que les ligands de DTPA fixent solidement les ions métalliques et que le dérivé de DTPA (appelé ci-après "chélate") forme un anti- corps monoclonal conjugué avec un chélate, très stable, tant du point de vue de la fixation du chélate métallique que du con- jugat chélate-anticorps Ces propriétés revêtent une grande im- portance particulièrement dans les applications in vivo Par exemple, si le chélate libère l'ion métallique après l'intro- duction dans le sang, c:s ion U ert à être fixés par la transferrine ou autre, et à être répartis de façon générale dans o l 1 s'sacre circulatoire du corps De plus, les ions ont ten- lance finalement à se rassembler et à rester dans des organes tels que le foie et la rate Ces effets ont de graves consé- quences selon la toxicité cu nétal et sa radioactivité En D outre, si le chélate ne forme pas un conjujat très stable avec l'anticorps, on observe une diminution significative de la quantité de métal fournie au site cible et une réduction cor- respondante de l'efficacite. Lors de la préparation des anticorps monoclonaux conju- gués avec un chélate métallique selon l'invention, il est im- portant d'éviter une contamination métallique provenant de sources extérieures Le matériel de laboratoire doit être en matière plastique ou en verre, débarrassé de tout métal exo- gène Toutes les solutions de réserve doivent être débarras- sées des traces métalliques, par exemple par chromatographie sur colonne avec une résine appropriée. Pour en faciliter la présentation, l'invention sera dé- crite sur la base du chélate de DTPA Le chélate préféré est préparé A partir d'un sel d'amine de DTPA On utilise le ter- 2 N me amine dans le sens large et il englobe les amines primaires, secondaires et tertiaires qui éliminent totalement les protons du DTPA Le choix d'une amine appropriée est laissé au spécia- liste de la technique et l'efficacité d'une amine quelconque (comprenant l'ammoniac) peut être facilement déterminée Une 23 anine particulièrement préférée est la triéthylamine On ajou- te au moins 5 équivalents de l'amine à une solution aqueuse de DTPA et on chauffe pour compléter la réaction La réaction produit un sel de pentakis(amine)DTPA selon l'équation suivan- te dans laquelle l'amine est la triéthylamine: (CH 3 C t)3 N + DP 4 \ (CI 13 C Hi)3 N 7;)TPA Le sel snlide de DTPA-amine peut être récupèré par évaporation ou linphilisat Ln de la solution pour chasser l'eau et l'excès d' amine. Le chc'late réel est un dérivé d 2 DTPA On ajoute un grou- pe foncticnnel au DPTFA et on fi:e le D Ti A aux groupes amine sur l'anticorps monoclonal, par l'irinerfnédiaire de ce groupe fonctionnel On fait réagir les esters d'un acide haloformi- que avec le sel de DTPA-amine pour obtenir le chélate utilisé dans l'invention Par ester d'un acide haloformique, on en- tend un ester de formule générale XC(O)-O-R dans laquelle X est un halogène, de préférence le chlore, et R est un groupe fonctionnel approprié, contenant avantageusement un maximum d'environ 6 atomes de carbone Le choix de R et de X et lais- sé au spécialiste qui doit considérer la stabilité du chélate et l'empêchement stérique lorsque le chèlate est amené à réa- gir avec l'anticorps monoclonal Un ester préféré est le chlo- roformiate d'isobutyle. Dans un exemple de préparation, on dissout des quanti- tés approximativement équimolaires de l'ester d'acide halo- formique et du sel de DTPA-amine dans un solvant organique polaire tel que l'acétonitrile sec, pur On doit éviter tout excès d'ester d'acide haloformique pour ne pas bloquer le si- te de chélation avec le métal sur le ligand de DTPA modifié. La température de la réaction n'est-généralement pas critique et peut être choisie de manière à obtenir un sel qui est par- tiellement ou pratiquement précipité La réaction est conduite de préférence à une température suffisamment faible pour pré- cipiter pratiquement la totalité du sel d'halo-amine, sous- produit de la réaction Lorsque l'amine utilisée est la trié- thylamine et l'ester est un ester de l'acide chloroformique, la température doit être comprise entre environ -20 C et -70 C Le maintien de la température dans cette gamme déplace la réaction d'équilibre vers la droite, donnant un rendement élevé en un anhydride carboxycarbonique mixte de DTPA selon l'équation suivante: X-C(O)-O-R + l(CH 3 CH 2)3 N 75 DTPA Z= 0 O' Il Il l(CH 3 CH 2) 3 N 74 DTPA-C, o,,C-O-R + P(CH 3 CH 2)3 NHX n conduisant ia réaction ci-dessus dans la gamme de températures spécifiée, on peut obtenir une concentration éle- vée en chélate, pratiquement exempt du sel d'halnami:e sous- produit Par exemple, on peut dissoudre environ 0,25 m M du sel de pentakis(triéthylamine)DTPA dans 0,5 ml d'acétnnitrile et on fait réagir avec 35 p 1 de chloroformiate d'isobutyle. Après environ 45 minutes à -70 C, la solution peut être cen- trifugée pour séparer le précipité, laissant un liquide sur- nageant contenant le chélate recherché à une concentration d'environ 0,5 M Le chélate est introduit de manière désirable dans la réaction de conjugaison chélate-anticorps à une con- centration d'au moins environ 0,25 M dans le solvant organique. De telles concentrations de chélate permettent l'emploi de quantités relativement faibles de solvants organiques dans le mélange réactionnel de conjugaison Des quantités excessives de solvant organique dans le mélange réactionnel doivent être évitées, car le solvant peut avoir des effets contraires quant à l'activité biologique et la spécificité de l'anticorps. La conjugaison chélate-anticorps a lieu en ajoutant le chélate dans le solvant organique à une solution aqueuse sali- ne de l'anticorps Il est important de conduire la réaction du DTPA modifié et de l'anticorps à un p H au plus égal à 7,2 en- viron La réaction chélate-articorps implique la décomposition du chélate, due à sa réaction avec l'eau Si le p H est trop faible, le chélate subit alors une décomposition catalysée par un acide et l'activité biologique et la spécificité de l'anti- corps sont réduites Le p H est avantageusement compris entre environ 6,0 et 7,2, de préférence aussi proche que possible de 7,0 Dans cette gamme, la réaction du chélate de DTPA avec l'eau nuit moins à la réaction chélate-anticorps. Bien que la discussion ci-dessus soit centrée sur le DTPA, la technique permet également de former des conjugats avec d'autres liganus voir, par exemple, Proc Natl Acad. Sci USA 73, 3803 (Nov 1976). Pour préserver l'activité biologique maximale de l'anti- corps, il faut éviter d'utiliser des acides forts ou des ba- ses fortes pour ajuster la valeur du pli dans la préparation de tout chélate-anticorps L'emploi d'un acide fort ou d'une base forte peut provoquer une dénaturation localisée dans la solution Le pi peut être ajusté dans la solution aqueuse de l'anticorps monoclonal en incorporant un tampon approprié Par exemple, on peut utiliser Nal ICO 3 à une concentration d'envi- ron 0,1 Mr D'autres tampons tels que le MES (acide 2-(N-morpho- lino)éthane sulfonique) sont connus dans la technique et peu- vent également être utilisés Le choix d'un tampon approprié est laissé au spécialiste. Lorsqu'on ajoute la solution du chélate à la solution aqueuse de l'anticorps, les deux solutions doivent être à une température voisine de O OC La température de la solution ne doit généralement pas pouvoir dépasser environ 4 OC pendant le cours de la réaction L'application de températures compri- ses entre environ O et 4 O C a tendance à éviter une décomposi- tion de l'anticorps et réduit donc également la décomposition du chélate La durée de la réaction n'est pas critique dans la mesure o la réaction peut être totale et la solution peut être laissée au froid pendant la nuits Le rapport molaire chélate anticorps peut varier dans de larges limites selon l'usage auquel est destiné le conju- gat Le rapport molaire chélate anticorps peut varier d'envi- ron 0,1 à 10 ou plus, de préférence d'environ 0,25 à 5 Dans bien des cas, le rapport molaire du chélate à l'anticorps est compris entre environ 0,5 et 3. De manière générale, on utilise un excès de chélate dans la réaction, car le chelate se décompose à un certain degré dans la solution aqueuse Le nombre de chélates fixés par molé- cule d'anticorps est fonction de la concentration du chélate et de la concentration de l'anticorps dans le mélange réaction- nel, des concentrations élevées ayant tendance à fournir plus de chélates par anticrps Si La qu? tité d art-ic,)ps utilisé est relativement faible et si on utilise une solution relative- 1.(' n-2 nt diluée, un excès substantiel de chélate peut être néces- saire Par exenple, un excès molaire d'environ 6 ':1 do ché- lat peut s'avérer nécessaire pour réagir avec une solution d'anticorps avant une concentration en protéine d'environ 5 A 1 O ng/nl, de manière à fournir environ 1,5 chélate fixé par molécule d'anticorps L'addition d'un trop grand nombre de mo- lécules de chélate par molécule d'anticorps peut réduire l'ac- tivité biologique et la spécificité de l'anticorps. Lorsque l'addition du chélate à l'anticorps est achevée, des quantités substantielles de chélate décomposé peuvent être présentes dans la solution Ceci ùt se produire pour n'impor- te quel conjugat chelate-anticorps Le chélate décomposé doit être éliminé tout en maintenant l'activité biologique et la spécificité de l'anticorps On peut utiliser par exemple la dialyse ou la chromatographie Si cela s'avère souhaitable, une première dialyse contre l'acide ascorbique dilué et une solution d'EDTA peut être effectuée pour éliminer tout le fer résiduel qui pourrait être présent dans le chélate ou dans la protéine Un anticorps conjugué avec un chélate purifié peut 2 être obtenu par dialyse du mélange réactionnel pendant 48 heu- res contrè 3 fois un litre d'une solution aqueuse à environ 4 C et à un p H de 6 environ, contenant 50 m M de citrate et m M de chlorure de sodium avec 1 ml de résine Chelex 100 (Bio-Rad) dans la cuve de dialyse Une dialyse finale dans i litre de solution contenant 10 m IM de MIS et 200 m M de chlorure de sodium Aà 4 C et A un p H de 6 complète la purification de la protéine Des variantes des procédés de dialyse sont connus et applicables par les spécialistes. La chélation métallique est effectuée en solution aqueu- se et, de nouveau, il faut éviter d'utiliser des acides forts ou des bases fortes La chélation métallique pour tout conjugué chélate-anticorps est effectuée à un p H qui ne réduit pas de manière significative l'activité biologique ou la spécificité de l'anticorps le manière génrale, la gamme acceptable du p HI se situe entre environ 3,2 et 9, mais pour certains anti- 1 l corps particuliers cette gamme peut être plus étroite A une valeur de p H inférieure environ à 3,5, une fixation acciden- telle des ions métalliques sur les anticorps est substantiel- lement réduite pour de nombreux métaux Une gamme de p H pré- férée est d-nc souvent comprise entre 3,2 et 3,5 environ. Mais, des facteurs particuliers aux solutions du métal utilisé, peuvent permettre un p H supérieur à 3,5 Le choix du p H ap- proprié dans la gamme ci-dessus est laissé au spécialiste. Dans l'invention, on utilise avantageusement un acide ou une base ayant peu de pouvoir de chélation, comme tampon. L'acide citrique ou la glycine sont des tampons utiles D'au- tres tampons sont, naturellement connus dans la technique. L'invention comprend une solution d'anticorps conjugués avec * un chélate, ajustée au p H désiré avec un tampon acide ou ba- sique à faible pouvoir chélat-ant et sans l'addition d'un aci- de fort ou d'une base forte A cette solution on ajoute un sel métallique Si le sel métallique est en solution, le p H de cet- te solution est également ajusté avec un tampon chélatant Le p H de la solution métallique peut cependant être ajusté avec des acides forts ou des bases fortes avant l'addition à la so- lution d'anticorps conjugué avec un chelate. Tout sel métallique acceptable peut être utilisé pour préparer les anticorps monoclonaux conjugués avec un chélate métallique Comme sels typiques, on citera des halogénures (par exemple des chlorures), des nitrates, des perchlorates ou similaires Le sel métallique est utilisé à une concentra- tion aussi élevée que possible L'exposition aux radiations des individus manipulant la préparation fixe généralement une limite inférieure à un équivalent de métal par site de fixa- tion du chélate. La durée de la réaction n'est pas critique à moins que le p H ne soit proche des limites extrêmes de p H acceptables pour l'anticorps A ces limites ou à proximité de ces limites de p H, les temps de réaction doivent généralement être infé- rieurs à 1 heure et de préférence de 30 minutes environ ou moins 3 N fait, du point de vue économie de temps, des temps de réaction dans ces limites sont désirés On préfère égale- ment conduire la chélation en présence d'un agent réducteur soluble dans l'eau, incapable d'être chelaté, biologiquement inoffensif, tel que l'acide ascorbique pour éviter la chéla- tion de toute trace de fer La réaction est normalement ache- vée en ajoutant du citrate trisodique en quantité suffisante pour que le p H de la solution augmente à un point auquel le conjugué métallique n'est plus labile On a déterminé que la plupart des complexes de DTPA sont particulièrement stables à un p H d'environ 6 D'autres bases ou acides faibles, lorsque la réaction a un p H supérieur à 6, peuvent être utilisés dans la mesure o ils ne nuisent pas aux anticorps Leur choix est laissé au spécialiste. La solution de réaction exige généralement une purifica- tion avant son utilisation in vivo, et peut également demander une purification avant d'être utilisée in vitro Tout métal non-fixé et tout métal accidentellement fixé doivent être éliminés La discussion concerne ici des ions métalliques ac- cidentellement fixés Mais, une partie du métal peut être rete- nue de manière non sûre par les chélates et agir de la meme manière que des ions métalliques accidentellement fixés. Lorsqu'on utilise un métal radioactif qui a une courte période de demi-vie, il est particulièrement important que l'o- pération de purification soit aussi rapide que possible, L'in- vention comprend une purification relativement rapide par chro- matographie et cette caractéristique de l'invention est appli- cable aux conjugués chélate-anticorps en général En utilisant une ou plusieurs résines échangeuses d'ions, de retardement ou chélatentes conjointement avec une matrice de classement (par exemple un gel), les anticorps monoclonaux conjugués avec un chélate métallique selon l'invention peuvent être rapidement et convenablement purifiés. On peut utiliser différentes résines échangeuses d'ions seules, ou toute combinaison d'une résine retardant les ions, d'une résine échangeuse de cations, d'une résine échangeuse d'anions ou d'une résine échangeuse d'ions chélatants Le choix d'une ou de résines appropriées, de leur degré de réti- culation de leur forme chimique et de leur dimension granu- l-métrique est laissé au spécialiste. Les résines échangeuses de cations utilisées dans l'in- vention sont souvent des résines de type gel de polystyrène fortement acides (par exemple Dowex 50 WX) ou d'autres résines fortement acides, mais qui ne sont pas un polystyrène, telles que le 7 eocarb 215 (Permutit Co) Comme autres résines d'aci- dité appropriée, on citera des résines de gel de polystyrène faiblement acide, des résines de gel de polystyrène macropo- reuses, ou des résines échangeuses de cations d'acide carboxy- lique macroréticulées Les résines échangeuses d'anions peu- vent être des résines de type gel de polystyrène fortement ba- siques (par exemple Dowvex 1 X 8) ou d'autres résines moins basi- ques telles que des résines du type polymère de pyridinium ou du type polyamine phénolique Les résines chélatantes peu- vent ttre le Chelex 100 ou toute résine du type copolymère de styrène-divinyl benzène contenant des ions iminodiacétate ap- pariés (par exemple Dowvex A-1) Des résines de retardement uiti- les sont des résines contenant des sites d'échange d'anions et de cations appariés (par exemple Pio-Iad AG 11-A 8) Ces rési- nes sont normalement obtenues en polymérisant leacide acryli- que à l'intérieur d'une résine fortement basique telle qu'une résine contenant des groupes ammonium quaternaires dans un ré- seau de copolymères styrène-divinyl benzène La discussion ci- dessus ne concerne que des exemples représentatifs de chaque résine; bien d'autres résines sont également connues dans la technique Une liste de résines commercialisées avec une brè- ve description de leurs propriétés et applications est contenue, entre autres, dans "Bio-Rad Laboratories 1982 ", Price List H. Le choix et la combinaison des résines dépendent des problèmes de séparation pa-ticiliers rencontrés et sort laissés au spé- cialiste Une référence utile est J Khym, "Analytical Ion-Ex- change Procedures in Chemistry and: iology" ( 1974). Les matrices de classement sont égalenent bien connues dans la technique Elles comprennent des pnlyacrylanides, agarnses, polvsaccharoses ou similaires Une matrice de clas- S semient particulirmennt utile est un gel de polysaccharide (par exemole gel de Sephadex G-5 n) Comme exemple de gels de polvacrylamide on citera les Séries 31 o-Gel P (in-2 'ad Labs). Le ch-ix de la matrice de classement dépend de la orotéine à purifier et est laissé au spécialiste. Dans la mise en oeuvre de l'invention, les différentes resines peuvent être déposées en forme de couches dans une co- lonne et la solution a purifier peut ftre chargée de haut en bas dans la colonne ou de bas en haut dans la colonne Une ali- mentation de haut en bas est une technique de laboratoire pré- 13 férée lorsqu'on utilise des composés radioactifs, car l'écou- lement par gravité ne requiert que peu ou pas d'équipement ou instrument supplémentaire Le choix des hauteurs de lit, des débits et autres est facile à faire par un spécialiste. Il semble que des métaux très chargés soient fixés ac- cidentellement, parfois, par l'anticorps sur les sites ioni- ques le long de la surface de la protéine Dans d'autres cas, des métaux fixés accielitellement semblent être inclus avec les replis de la protéine de l'anticorps Ces métaux peuvent être libérés en solution mais peuvent également être réabsor- bés à partir de la solution c ians un procédé de type en équili- bre Les résines de retardement ou échangeuses d'ions utili- sées dans la purification selon l'invention sont utilisées pour déplacer l'équilibre et permettre au métal d'être sépare de l'anticorps Par exemple, lorsque l'anticorps passe à tra- -3 vers une résine retardant les ions, le passage des ions nétal- liques dans la solution est ralenti, mais celui de la protéine ne l'est pas Les ions métalliques très chargés (+ 3 ou plus), fixés accidentellement, sont alors libérés dans la solution pour rétablir l'équilibre Lorsque ces ions sont libérés dans la solution, ils sont à leur tour retardés par la résine pour provoquer une libération continue d'ion métallique par l'anti- corps. On peut utiliser un taux de résine échangeuse d'ion in- férieur à celui de la résine retardant les ions pour fixer fermement les ions séparés, très chargés, et continuer le pro- cessus de séparation Lorsque la résine épuise la solution de protéine en ions libres, très chargés, l'équilibre est de nou- veau rétabli entre les ions métalliques libres et accidentel- lement fixés Cependant, durant ce processus, des ions métal- liques à l'intérieur du chélate sont retenus avec l'anticorps. On a cependant déterminé qu'une simple utilisation d'une résine retardant les ions ou d'une résine échangeuse d'ions n'est pas satisfaisante pour fournir une élimination efficace de pratiquement la totalité des ions métalliques fixés acciden- tellement Pour faire en sorte de compléter la purification, on utilise une matrice de classement La solution d'anticorps qui pénètre dans la matrice est déjà partiellement épuisée en ions métalliques libres, très chargés Dans la matrice de-clas- sement, un autre épuisement se produit Lorsque la solution traverse la matrice, les anticorps ne sont pas retardés, alors que les ions le sont La solution résultante à la sortie de la matrice de classement est pratiquement exempte de métaux fixés accidentellement Ces métaux fixés de manière lâche peuvent être réduits à moins d'environ 6 %o de la teneur totale en mé- tal du conjugat, de sorte qu'au moins environ 94 % du métal entrant dans le conjugat sont fixés de manière stable par le chélate De façon désirable, au moins environ 97 %o des métaux totaux sont fixés par le chélate Il est possible d'obtenir des taux de métaux dans lesquels 98 % ou plus du métal sont fixés par le chélate Une dialyse peut être utilisée pour dé- terminer la teneur en métal fixé de manière stable. Un procédé de purification préféré utilise une résine re- tardant les ions (Bio-Rad AG 11-18) sur une résine échangeuse de cation (Bio-Rad AG 50 MX 8) et un gel (Pharmacia Sephadey G-50). Dans la purification d'anticorps monoclonaux conjugués avec un chûlate de technicium pour l'invention, la colonne préférée contient une résine retardant les ions (Bio-Rad AG 11-18) sur une résine échangeuse de catinns (Bio-Rad 501 v X 8), sur une ré- sine échangeuse d'anions (Bio-Rad AG IX 53) et une matrice de classement sous forme de gel (Pharmacia Sephadex G-50). Dans le procédé de l'invention, l'anticorps est retenu sous une forme non-agrégée L'agrégation des anticorps, par agglutination ou réticulation, se traduit par une perte de spécificité de l'anticorps qui, naturellement, est indésira- ble L'agrégation peut être due à des concentrations excessi- ves d'anticorps dans un véhicule, ou au contact avec des pro- duits chimiques qui entra Snent une réticulation de la protéine, tels que par exemple des carbodiimides Des essais de sédimen- tation classiques, avec des matrices de classement ou autres, peuvent être utilisés pour déterminer si les anticorps sont agrégés En fait, les tests de spécificité des anticorps dis- cutés ici reflètent l'agrégation comme une perte de spécifi- cité. L'activité et la spécificité des anticorps conjugués de l'invention sont maintenues à un taux d'au moins environ 80 % et de préférence d'au moins 90 % de l'activité et de la spé- cificité de l'anticorps utilisé pour produire le conjugat Les solutions particulièrement préférées sont caractérisées par une activité et une spécificité d'anticorps d'au moins environ 95 %, et en fait, on a obtenu des produits qui retiennent l'ac- tivité et la spécificité de l'anticorps original virtuellement inchangées L'activité et la spécificité des anticorps sont me- surées ordinairement dans la technique par fixation des anti- corps, in vitro, sur un épitope Le degré d'activité et de spé- 3 o cificité de l'anticorps final produit peut être facilement dé- terminé en répétant simplement le test initial avec le produit conjugué final. L'invention concerne un processus thérapeutique in-vivo dans lequel des anticorps monoclonaux conjugués avec un chélate de métal radioactif sont introduits dans le corps et amenés à se concentrer dans la région cible Il existe une variété d'i- sotopes de métaux radioactifs qui forment des complexes de DTPA stables et émettent des particules alpha cytotoxiques. L'effet thérapeutique se produit lorsque les conjugats sont proches de, ou en contact avec les cellules visées et se fi- xent sur elles On pense que la mort des cellules est un ré- sultat direct ou indirect de l'irradiation due au métal radio- actif localisé à proximité de la cellule. Les avantages de cet aspect de l'invention sont multiples. 1 C Tout d'abord, la grande spécificité de l'anticorps monoclonal conjugué minimise la dose totale de radiation On n'utilise que la quantité suffisante de radiation pour les cellules cibles. De plus, les chélates de métaux radioactifs sont généralement rapidement évacués à partir du corps dans le cas ou l'anticorps conjugué est rompu L'isotope peut avoir une courte période de vie et la constante d'affinité par laquelle l'isotope est re- tenu dans le chélate de DTPA est très élevée, d'o un métal fixé de manière stable Enfin, étant donné que la quantité de métal radioactif utilisé est minimisée, le risque d'irradiation du personnel préparant et administrant l'anticorps conjugué a- vec un chélate métallique, est réduit de façon significative. En raison des propriétés de l'anticorps monoclonal con- jugué avec un chélate de DTPA métal radioactif, selon l'in- vention, la dégradation des tissus ou la dose corporelle tota- le pendant la thérapie est considérablement réduite par rap- port à celle résultant des processus thérapeutiques par rayon- nement, actuellement appliqués, tels que des implbnts d'isoto- pes, une thérapie par rayonnement externe et une immunoradio- thérapie utilisant des anticorps polyclonaux ou autologues mar- qués à l'iode-131 De plus, les demi-périodes biologiques et physiques des produits radiobiologiques fournis aux cibles peuvent être maintenant vérifiées, minimisant les effets des radiations sur tout le corps Etant donné que les radiations visent spécifiquement des types de cellules (nar exemple des cellules néoplastiques), une dose thérapeutique est fournie spécifiquement aux cellules malignes, soit localisées, soit dispersées sous forme de métastases L'aptitude d'un anticorps mon-clonal conrucuê avec un chélate de métal radioactif a four- nir spicifiq',ernent une dose efficace de rayonnement thérapeu- tique à des cellules dispersées sous forme de métastases est également remarquable et particulièrement utile dans la thé- rapie au cancer. L'invention utilise i'anticorps monoclonal conjugué avec un chélate métallique contenant un métal radioactif émettant des particules alpha, pour traiter les affections des cellules. Dans la plupart des applications, il est souhaitable que le métal radioactif ait une demi-période inférieure à environ 4 jours et se désintègre rapidement en un isotope stable dès que les particules alpha ont été émises Les isotopes préférés utilisés dans l'invention sont le bismuth-211, le bismuth-212, le bismuth-213 et le bismuth-214 Le bismuth-212, avec une de- mi-période de 60,6 minutes est particulièrement préféré. L'anticorps monoclonal utilisé est spécifique pour la cellule malade qui doit etre détruite La destruction d'une cel- lule est causée par la désintégration du métal radioactif et peut se produire de deux facons différentes Si la particule alpha est émise en direction de la cellule malade, un simple coup dans le noyau cellulaire peut être cytotoxique L'isotope qui résulte de la désint Agration du métal radioactif après l'émission de la particule alpha, est éjecté du chélate sur une trajectoire opposée à celle de la particule alpha La cellule fixée peut donc encore fitre atteinte même lorsque la particule alpha est émise sur une trajectoire éloignée de la cellule. Un simple coup dans la membrane cellulaire par l'isotope désin- tégré peut provoquer un préjudice irréparable à la cellule, en- tra Tnant la mort de la cellule Llefficacité relativement ele- vée de la particule alpha implique l'utilisation d'une moindre quantité de métal radioactif La sélectivité de l'anticorps monoclonal et la courte amplitude(de quelques diamètres de cel- lules) des particules alpha minimisent la destruction de tissu sain sur un niveau cellulaire. Le bismuth-212 se désintègre selon deux voies différen- tes Environ 64 % du bismuth-212 se désintègrent par une émis- sion de particule béta en polonium-212 qui a une demi-période de 0,3 microseconde Le polonium-212 se désintègre en du plomb- 203 stable, après avoir émis une particule alpha de l'ordre de 90 microns Les autres 36 o du bismuth-212 se désintègrent en thallium-208 en émettant une particule alpha de l'ordre de à 50 microns Le thallium-208, avec une demi-période de 3 minutes, se désintègre alors par émission de particule béta en du plomb-208. Des générateurs pour le Bi-212 ont été décrits dans la littérature par Gleu et al, Z Anorg Allg Chem 290, 270 ( 1957) et par Zucchini et al, Int J Nucl Med & Biol (Juin 1982) (le résumé du manuscrit a été distribué au Congrès ACS d'Août 1981 à New York) Un générateur utile consiste en Th- 228 à l'état tétravalent absorbé sur un lit de 3 x 5 mm de ti- tanate de sodium contenu dans une colonne de quartz au-dessus d'un disque en verre grossièrement fritté scellé dans la colon- ne Le titanate retient hermétiquement le Th-228 et sa fille le Ra-224 Lorsque de l'eau traverse le titanate, le Rn-220 fille de l'isotope Ra224 se dissout dans l'eau, traverse le disque fritté et est recueilli dans un réservoir en verre de cm rempli d'eau La solution aqueuse de Rn- 220 s'écoule du réservoir dans une colonne de 10 mm de diamètre contenant en- viron 1 ml d'une résine échangeuse d'ions fortement acide tel- le que la résine échangeuse de cations Bio-Rad AG-50 WX 8 Le Rn-220 se désintègre pratiquement en 5 minutes dans le réser- voir, en Pb-212 qui est absorbé lors du passage sur la résine. 3 N A un débit d'environ 1,5 ml/mn à travers la résine, environ % du Pb212 produit sont recueillis dans la colonne ou il se désintègre en sa fille le Bi-212. Lorsque la quantité désirée de Bi-212 a été formée sur la résine, il peut être élué par un acide selon des modes opéra- toires bien connus des spécialistes Un procédé utile d'élution 2 e pour le Pb-212 et le Bi-212 consiste à faire passer 5 ml ae IC 1 2 N à travers la résine Ou bien, si on ne désire que le Bi-212, on fait passer 1,5 ml de HC 1 0,5 Ml à travers la résine. Bien que des métaux qui émettent des particules bêta ou des électrons d'Auger, puissent être utilisés pour une théra- pie, on préfère des métaux radioactifs émettant des particules alpha, pour plusieurs raisons Tout d'abord, la radiation du nucleotide alpha a de manière caractéristique une courte am- plitude dans les tissus et un transfert d'énergie linéaire très élevé par rapport aux radiations béta ou d'Auger La ra- diation alpha peut tuer une cellule avec seulement un coup sur le noyau et tue pratiquement toute cellule avec 10 coups ou moins De plus, la désintégration émet également un isotope (par exemple TI-208 ou Pb-208 dans le cas de Bi-212) qui peut également provoquer la destruction des cellules L'amplitude des particules alpha est normalement inférieure à environ 150 microns dans les tissus Au contraire, les particules béta ou d'Auger exigent des-centaines de coups dans le noyau avant de provoquer la mort d'une cellule et ont des amplitudes dans les tissus de l'ordre de dizièmes de millimètres à des centimètres. Lorsqu'on utilise des particules béta, une dose plus importan- te est nécessaire, et la désintégration d'anticorps substan- tiellement plus marqués radioactivement est nécessaire pour ob- tenir la mort d'une cellule C'est ainsi que des anticorps fi- xés d'une manière spécifique sont catabolisés, libérant des métaux radioactifs émettant des particules béta dans le sang. Les métaux radioactifs émettant des particules alpha tuent re- lativement rapidement, de sorte que moins d'anticorps sont ca- tabolisés. Les anticorps conjugués avec un chélate métallique selon l'invention peuvent être administrés in vivo dans tout véhicule pharmaceutiquement acceptable Comme indiqué précédemment, une solution saline physiologique, normale, peut être utilisée de manière appropriée Souvent, le véhicule contient une quantité mineure d'une protéine support telle que de l'albumine sérique humaine pour stabiliser l'anticorps La concentration des anti- corps conjugués avec un chélate métallique dans la solution est une question de choix Des taux de 0,5 mg/ml peuvent être facilement obtenus, mais les concentrations peuvent varier considérablement en fonction de la spécificité de toute ap- plication déterminée Des concentrations appropriées de maté- riaux biologiquement actifs dans un véhicule sont déterminées par voie de routine dans la technique. La dose efficace de radiations ou la teneur en métal à utiliser pour une application quelconque dépend également des particularités de l'application Par exemple dans le traite- ment de tumeurs, la dose dépend, entre autres, de l'importance, de l'accessibilité de la tumeur, et autres Un peu de la même manière, l'utilisation d'anticorps conjugués avec un chélate métallique dans un but de diagnostic dépend, entre autres, de l'appareil sensible utilisé, de l'emplacement du site à exami- ner et autres Dans le cas o le patient a un antigène circu- lant en plus de ceux localisés sur le site, les antigènes en circulation peuvent être éliminés avant le traitement Une tel- le élimination d'antigènes peut se faire, par exemple, en uti- lisant des anticorps non-marqués ou par une plasmaphorèse dans laquelle le sérum du patient est traité pour séparer les anti- gènes. Les exemples non limitatifs suivants sont donneas à titre d'illustration de l'invention. Exemple 1 On pèse 100 mg de DTPA dans un ballon et on ajoute 1 ml d'eau On fait réagir cette solution avec O,125 g de triéthyl- amine redistillée On chauffe la solution de réaction pour ter- miner la réaction et, par lyophilisation, on recueille un pro- duit solide. On dissout le produit lyophilisé dans 0,5 ml d'acétoni- trile pur, sec et on ajoute 35 "l de chloroformiate d'isobu- tyle à une température d'environ -20 'C, puis on refroidit à environ -70 C Après environ 45 minutes, on centrifuge la so- lution dans une fiole d'Eppendorf (n recueille le liquide sur- nageant qui contient l'anhydride carbocxycarbonique de DTPA mixte désiré, à une concentration d'environ 0,5 M. L'anticorps monnclonal utilisé est désioné par 103 A 5 et en l'obtient en fusionnant des cellules de myelone de souris P 3. 3 Ag 3 avec des cellules de rate isolées de souris C 56 B 1/6 innunises avec de la glycoprotéine de retrovirus puriffiée, de O; O daltons (gp 70) obtenue selon le procédé décrit par M Strand et J T August, J Biol Chem 251, 559 ( 1976) Cn effectue le fusionnement tel que décrit par M Strand, Proc. Natl Acad Sci USA 77, 3234 ( 1980). On prépare 114 ul d'une solution contenant 2 mg d'anti- corps monoclonal 103 A 5 dans Na HCO 3 0,1,l à un p H c'environ 7,2 et 150 m M de chlorure de sodium et au moyen d'une pipette on transfère dans une fiole de Nunc Puis dans la fiole, on ajou- te 33 Pl d'une solution de Na HCO 3 0,1 M a un p H de 7,0 Enfin, après avoir refroidi les solutions de chélate et d'anticorps vers O C, on ajoute 26,4 pl de l'anhydride carboxycarbonique de DTPA mixte ( 0,5 M dans l'acétonitrile) On laisse la réac- * tion se poursuivre pendant une nuit. On dialyse d'abord le produit à 4 C, contre un litre contenant 30 m M d'acide ascorbique, 5 m M dt EDTA, 200 m M de Na Cl et 20 mrl de citrate de sodium (p H de 7,O) On dialyse la solution résultante à 4 C contre trois fois un litre conte- nant 50 me de citrate, 200 m M de chlorure de sodium à un p H ce 6,0 et 1 ml de résine Chelex 100 (Bio-Rad) pendant 48 heu- res Finalement, on dialyse la solution résultante pendant S heures contre un litre d'une solution ayant une concentration de 10 m 1 de MES et 200 m M de chlorure de sodium à un p H de 6,0. On recueille environ 1,7 mg d'anticorps monoclonal conjugué au chélate Des essais analogues utilisant du DTPA marqué au car- bone-14, analysés par comptage par scintillation, montrent une teneur d'environ 1,5 chélate par molécule d'anticorps. On ajuste 40 51 d'une solution de chlorure d'indium 111 (New England Nuclear Corp) à un p H de 3,0 par addition de 11,4 1 l d'acide citrique 0, 4 M z un p H de 5,0 On prépare une solution séparée contenant 250 pg d'anticorps conjugué au chélate dans un volume total de 21,6 1 l La solution a une concentration de 200 m M de chlorure de sodium et 10 mil de MES à un p H de 6,0 On ajuste la solution un p H de 4,6 par ad- dition de 6 il d'acide citrique 0,25 M à un p H de 3,0. On prépare l'anticorps monoclonal conjugué avec un ché- late métallique en combinant les solutions de chlorure d'in- dium et d'anticorps conjugué au chélate et on laisse réagir pendant environ 30 minutes à la température ambiante On ter- mine la réaction en ajoutant 25 pl d'une solution saturée de citrate de sodium pour ajuster le p H a une valeur d'environ 6. On purifie l'anticorps conjugué avec le chélate par chro- matographie sur une colonne de 9 cm contenant 1,0 ml d'une ré- sine retardant les ions (AG 11-A 8 commercialisée par Bio-Rad) sur 1,0 ml d'une résine échangeuse de cations (AG-5 C O VWXS, for- + me H, de 0,037 à 0,074 mm, commercialisée par Bio-2 ad), sur 7 ml de gel de Sephadex G-50 (Pharmacia) Comme éluant on uti- lise une solution avec des concentrations de 200 m M de chlo- rure de sodium et 10 m M de MES à un p H de 6,0, cette solution servant également à pré-équilibrer la colonne. On recueille l'éluat par fractions de 0,5 ml Les deux fractions avec la plus grande partie de la protéine s'avèrent contenir 150 pg d'anticorps monoclonal marqué avec 157,1 micro- curies d'Indium-11 l Une dialyse à 4 C contre un litre d'une solution aqueuse de 20 m M de MES et 200 m M de chlorure de so- dium à un p H de 6,0 révèle moins de 6 % de perte en indium Il apparaît que l'anticorps retient pratiquement 100 % de son ac- tivité biologique et de sa spécificité dans des tests in vitro. Une visualisation in vivo chez les souris leucémiques fait res- sortir le site tumoral dans la rate Lorsqu'on administre le produit à des souris normales, il n'y a pas de fixation par la rate. Exemple I Il On prépare un hybridome en fusionnant des cellules de myè 1 ome de souris P 3 653 avec des cellules de rate isolées de souris C 56 81/6, immunisées avec de la ferritine associée à une tumeur purifiée, isolée à partir de rate humaine On isole un hybridome qui produit un anticorps antiferritine appelé 263 D 5 L'anticorps est spécifique pour la ferritine humaine et ne réagit pas avec la ferritine d'autres espèces mammifères. On répète le mode opératoire de l'exemple I pour fournir un anticorps monoclonal conjugué avec du DTPA contenant de l'indium-11 l On injecte une solution saline physiologique normale contenant l'anticorps monoclonal conjugué-avec le ché- late métallique à des souris normales et à des souris leucémi- ques Chez les souris normales et les souris leucémiques, une visualisation radiographique montre qu'il n'y a aucune concen- tration de métal radioactif Ces tests démontrent que le ché- late est stable in vivo quant à la conjugaison chélate-anti- corps et à la rétention du métal radioactif Ni la rate, ni le foie ne sont mis en évidence dans les images. Exemple III L'exemple suivant utilise un isotope émettant des parti- cules gamma pour démontrer la localisation sélective de métaux radioactifs (comprenant des isotopes émettant des particules alpha) obtenue par l'invention. On prépare des anticorps monoclonaux conjugués avec un chélate d'indium11 l, a partir d'un anticorps spécifique pour la tumeur du sein humaine On prépare l'hybridome qui produit l'anticorps par fusionnement d'un myèlome de souris avec des cellules de rate de souris L'hybridome et l'anticorps sont dé- crits dans Proc Natl Acad Sci 78, 3199 ( 1981). Le mode opératoire utilisé est pratiquement le même que les modes opératoires des exemples I et II, à l'exception de ce qui suit Tout d'abord, on supprime l'opération de dialyse de l'anticorps monoclonal conjugué avec le chélate contre l'ascorbate-EDTA Puis, on ajoute 10 Pl d'ascorbate 0,1 M à un pi{ de 4 à la solution d'indium-lll, avant son addition à la solution aqueuse saline de l'anticorps monoclonal conjugué avec le chélate. L'efficacité de marquage est triple par rapport aux pro- cédés des exemoles I et 1 l- Le produit final est marqué avec environ 2,1 microcuries par 9. On dilue 10 Fg de l'anticorps monoclonal conjugué avec le chélate d'indium-lll, recueilli à la sortie de la colonne de purification, à 100 Pl avec une solution aqueuse saline tamponnée avec un phosphate On injecte l'anticorps conjugué avec de l'indium-lll, dilué, dans la veine caudale d'une sou- ris dénudée, athymique dans laquelle on a développé une tu- meur du sein humaine Les cellules de la tumeur du sein hu- maine expriment un antigène pour l'anticorps 72 heures après l'injection, une visualisation avec une caméra gamma à bonne définition démontre une forte localisation de l'indium-lll dans le tissu tumoral On n'observe aucune localisation simi- laire de l'indium-lll dans le foie ou la rate. Exemple IV Les tableaux suivants démontrent qu'un chélate de DTPA- métal radioactif, contrairement à un métal radioactif libre, ne se localise pas dans le foie, ni dans la rate, et est rapi- dement excrété par les reins et l'estomac La fixation lu m 6- tal radioactif dans les organes de souris normales et leucé- miques est déterminée par le procédé suivant A des souris normales de 6 semaines et à des souris de même âge rendues leucémiques 8 jours avant par l'injection du virus leucémique de Rauscher, on injecte par voie intrapéritonéale 5 ig ( 5 mi- crocurie/pg) de Bi-207 libre, de Bi-207 chélaté avec du DPTA et de Sc-46 chélat 6 avec du DTPA 18 à 24 heures plus tard, on sacrifie les souris, on pèse leurs organes et on détermine la quantité de radioactivité associée aux organes Pour faire en sorte de normaliser les différences dans les injections, dans les poids corporels et dans les temps d'excision des organes, on divise la quantité de radioactivité par gramme de tissu par la quantité de radioactivité par gramme de sang, et on expri- me les résultats par ce rapport Les résultats sont rapportés 2 à Cdzzns legs Tableaux 1, 2 et 3. TAIIMSAL: :*:o 1 cnnes et erreurs standards de la mo-enne du rapport/san'j ci ornaînes de souris leucémiques depuis 14 jours et de sou,,r:s normales 13 et 42 heures anr 's l'inéction de 20 18 heures IISSU l 1-eucemiguas Norriales Cr-cur 2,35 f 0, 65 4,+ 0, 301 Foie 31,3 + 7,50 ' 29, o 33 t\ Iate 7 > 18 + 20 03 d 1 +Oà Rein 69,4 + 43,7 612, 6 + 4718, Estomac 1335 + 0,35 6,95 + r,65 a = dose injectée 7 x 1 143 + 0,) -33 2, - s i 70 + C' 6 o c 9,3 + 9-,18 ,n 1 + C' 43 TABLEAU 2 Moyense erreurs standards de la moyenne du rapport/sang de 5 organes de souris leucémiques et normales 18 heures , anrès l'injection avec un chélate Bi-207-DTPA Bi -207 -DT P Aa Tissu Leucémiques 'Normales Coeur 2, 60 0,33 b 2,45 N 2 Foie 19,12 + 6,32 c 10,93 + 1,24 Rate 13,1 J 2,6 124 + 2 e, Rein 94 + 370 281,0 + -26,0 lStomac 7,52 + 2,44 7,20 + 2, u-0 a dose injectée 3,8 X 106 cpmn par scruris b = environ 0,003 du cpm total dans le coeur ' c = environ 0,21 du cbr total dans le foie d = environ 0, 06 du cpn t-tal dans la rate TABLEAU 3 Moyennes et erreurs standards de la moyenne du de 5 organes de souris normales et leucémiques après l'injection avec un chélate Sc-46-DTPA. Sc-46-DTP Aa Tissu Leucémiques Coeur 3,66 O 021 b Foie 9,96 0,57 c Rate 3,17 + 0,39 d Rein 42,1 + 0, Estomac 12,45 i 5,43 a = b = c = d = rapport/sang 18 heures Normales 4,49 + 7,23 + ,69 + 29, 5 + 7,76 + ( 0,84 1,O 4 0,28 ,5 2,06 dose injectée = 5,4 x 10 cpm par souris environ 0,006 % du cpm total dans le coeur environ 0,14 % du cpm total dans le foie environ 0,08 % du cpm total dans la rate Les données des tableaux ci-dessus démontrent que le bis- muth et le scandium chelatés avec du DTPA ne se concentrent pas dans le foie, ni dans la rate des souris contrairement au bis- muth libre De fortes concentrations de métal chélaté dans les reins montrent qu'il est évacué par l'urine La variation des concentrations dans le rein entre des souris leucémiques et des souris normales est attribuable à une évacuation fréquente par les souris leucémiques due à la contrainte. Exemple V Les essais suivants ont pour but de déterminer l'effet des radiations alpha du bismuth sur des cellules de mammifères. On fait proliférer des cellules leucémiques F-46 dans un milieu d'Eagle modifié de Dulbacco contenant 10 % de sérum fêtal de veau inactivée à la chaleur pour fournir une population cellu- laire de 1 x 10 cellules dans chaque puits On expose les po- pulations cellulaires à du bismuth-212 en ajoutant des dilu- tions en série (tel qu'indiqué dans le Tableau 4) dans le mi- lieu de développement On cultive les cellules pendant 96 heures et on détermine le nnmbre de cellules tats sont rapportés dans le Tableau 4 survivantes Les résul- ci-dessous. TABLEAU 4 Dose a (rads) on 0,2 0,4 0,8 1,5 3,1 6,2 12,3 24,6 49,2 98,4 Nombre moyen de cellules survivantes ( 10 >) 6,9 s, r' 6,1 6,7 6,0 6,0 ,0 2,9 2,2 1,1 0,6 Déviation standard 1,4 0,5 1, 7 1,4 2,3 0,6 0,6 0,4 0,4 0,4 0,1 A partir des données du Tableau 4 cidessus, en utilisant des méthodes de calcul normalisées, D ( 37 % de survie) est-éva- luée a 38,5 rads Ceci montre que le bismuth-212 émet des radia- tions très ionisantes, fortement cytotoxiques Par comparaison, il faut 900 rads de radiations peu ionisantes d'une source de cobalt-60 pour obtenir les memes résultats Pour une discussion des doses de radiation: voir les-Brochures nm/mird nul (révisée) et 10. t de survie R E V E N D I C A T I O N S 1 Procé é de préparation d'anticorps monoclonaux con- jugués avec un chélate métallique, caractérisé en ce que: a) on fournit des anticorps monoclonaux conjugués avec S un chélate; b) on ajoute un sel métallique à une solution aqueuse des anticorps monoclonaux conjugués à un chelate ain- si recueillis, et un tampon de manicre à former des anticorps conjugués avec un chélate métallique, le métal étant un métal radioactif émettant des parti- cules alpha; c) on fait passer la solution aqueuse contenant les anti- corps monoclonaux conjugués avec le chélate métalli- que à travers une colonne chromatographique, la co- lonne comportant une ou plusieurs couches choisies parmi une résine retardant les ions, une résine échan- geuse a'anions, une résine échangeuse de cations et une résine échangeuse d'ions chélatants, et une cou- che finale comprenant une matrice de classement; et d) on récupère à partir de la colonne une solution d'an- ticorps monoclonaux conjugués avec un chélate métal- lique dont au moins 80 5 du métal contenu dans la so- lution sont complexés par le chélate conjugué avec les anticorps monoclonauxo 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal conjugué avec un chélate est pre- paré en mettant un anhydride carboxycarbonique de l'acide dié- thylène triamine penta-acétique en contact avec une solution aqueuse d'anticorps monoclonaux. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'anhydride carboxycarbonique de l'acide diéthylène tria- mine pentaacétique est le produit de réaction d'un sel d'amine de l'acide diéthylène triamine penta-acétique avec un ester d'un acide haloformique dans un sclvrnt crganique à une tem- p 2 rature inférieure a environ -20 C. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'ester d'un acide haloformique est le chloroformiate d'isobutvle. D 5 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le métal radioactif émettant des particules alpha est choisi Parmi Bi-211, BI-212 et Bi-213. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le métal radioactif émettant des particules alpha est 3 i-211. 7 Solution aqueuse utilisable notamment pour le trai- tement d'affections des cellules, caractérisée en ce qu'elle contient des anticorps monoclonaux conjugués avec un chélate métallique, spécifiques pour une cellule cible, le métal radioactif émettant des particules alpha. 8 Solution aqueuse d'anticorps monoclonaux conjugués avec un chélate métallique suivant la revendication 7, carac- terisée en ce qu'au moins environ 94 % du nmétal sont comple- xes par la partie chélate du conjugat et le métal est un mé- tal radioactif émettant des particules alpha. 9 -Solution selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'au moins environ 97 % du métal sont complexés par la partie chélate du conjugat. Solution selon la revendication 8, caractérisée en ce que les anticorps conjugués conservent au moins environ % de leur activité et spécificité. 1 i Solution selon la revendication 8, caractérisée-en ce que les anticorps conservent au moins environ 95 % 3 de leur activité et spécificitéo 12 Solution selon la revendication 9, caractérisée en ce que les anticorps conservent au moins environ 97 5 de leur activité et spécificité. 13 Solution selon la revendication 9, caractérisée en ce que le métal radioactif émettant des particules alpha est choisi parmi Bi-211, Bi-212 et Bi-213. 14 Solution selon la revendication 13, caractéris 6 e en ce que le métal radioactif émettant des particules alpha est Bi-212.