Brevet FR2524886A1 — publié le 19831014

-1 2524886 La présente invention concerne des substances nouvelles physiologiquement actives SS 12538, un procédé de production de ces substances et un microorganisme nouveau produisant ces substances. Lba Demanderesse a isolé de nombreux micro-organismes à partir de terres naturelles et a effectué des études poussées concernant leurs produits En résultat, on a trouvé qu'une souche S 12538 isolée d'un échantillon de sol recueilli à Satsukigaoka, Préfecture de Chiba, Japon était un microorganisme nouveau qui était capable de produire des substances nouvelles physiologiquement actives SS 12538 répondant à la formule ci-après (I) O R i H CH 3 OH CH 30 E CH 3 CH 3 CH 3 C'H 3CH 3 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radicalméthyle ou un radical éthyle On a constaté que ces substances possèdent un excellent effet vasodilatateur et une action actibiotique contre certaines bactéries gram positives et les dermatophytes. La présente invention a été réalisée en se basant sur les découvertes cidessus. En conséquence, l'invention a pour objet des substances nou- velles physiologiquement actives SS 12538, leur préparation et un micro-organisme nouveau les produisant. Sur les dessins annexés: La figure 1 est un spectre d'absorption UV (solvant: méthanol) d'une substance physiologiquement active SS 12538 A selon l'invention; La figure 2 est un spectre d'absorption IR (procédé de la pel- licule liquide) d'une substance physiologiquement active S 512538 A selon l'invention; La figure 3 est un spectre RMN 1 (solvant: deutérochloroforme) de la substance physiologiquement active SS 12538 A' selon l'inven- tion La figure 4 est un spectre d'absorption UV (solvant: méthanol) de la substance physiologiquement active SS 12538 B selon l'invention; -1- La figure 5 est un spectre d'absorption IR (procédé de la pel- licule liquide) de la substance physiologiquement active SS 12538 B selon l'invention; La figure 6 est un spectre RMN 1 H (solvant: deutérochloroforme) de la substance physiologiquement active SS 12538 B selon l'invention La figure 7 est un spectre d'absorption UV (solvant: méthanol) d'une substance physiologiquement active SS 12538 C selon l'inven- tion; La figure 8 est un spectre d'absorption IR (procédé de la pel- licule liquide) de la substance physiologiquement active SS 12538 C selon l'invention; La figure 9 est un spectre RIN 1 H (solvant: deutérochloroforme) de la substance physiologiquement active SS 12538 C selon l'invent- ion, et La figure 10 est une photographie prise au microscope électronique d'un micro-organisme selon l'invention, Streptomyces 2 actum S 12538. Une souche capable de produire les substances physiologiquement actives SS 12538, selon l'invention, possède les caractéristiques suivantes: 1 Morphologie Les mycéliums de sporulation dérivent simplement des mycéliums aériens, la pointe étant de forme spiralée On ne constate aucun tourbillonnement Dix ou plus conidies ayant atteint la maturité sont liées ensemble avec des spores ayant une forme cylindrique courte ellipsoldale et une dimension de 0,5 0,8 x 0,8 1,5 mi- cron Les spores ont une surface poilue On ne trouve pas de spo- ranges, de spores flagellaires ou de scleroties On ne détecte aucune fragmentation du mycélium de substrat. 2 Caractéristiques de croissance sur des milieux variés (cultivés à 27 C pendant 14 jours). -2- Milieu Croissance Mycélium aérien Couleur du Pigment solu. formation couleur ycelium ble à substrat inversé Agar médiocre rare et gris incolore néant nitrate mince brun Atre saccharose clair Agar bonne rare et blanc jaune pile néant glucose mince gris asparagine clair Agar _ bonne rare et blanc orange néant glycérine mince gris jaun tre asparagine bleu Atre terne clair Agar _ bonne bonne gris rane brun jauntr sel minéralb moyen 3 aunatre léger amidon terne Agar bonne bonne blanc olive néant tyrosine gris brunitre clair Agar nutri bonne non Jaune pile néant tif formé Agar bonne asses blanc brun néant extraits de bonne gris Jaun Atre levure bleuatre clair extraits de clair malt Agar bonne bonne gris Jaune pale néant farine moyen d'avoine Agar bonne rare et blanc jaune pale néant nitrate mince jaun Atre glycerine Agar d médiocre rare et gris incolore néant maléate de mince brunetre calcium clair Nota: les noms des couleurs indiquées sont déterminés selon "Concise Manual of Color Names" (Japan Color Investigation K.K 1981) -4-2 2486 3 Caractéristiques morphologiques ( 1) Gamme des températures pour croissance: température de croissance possible 16 39 C température de croissance optimale 26 35 C ( 2) Liquéfaction de la gélatine positive ( 3) Hydrolyse de l'amidon positive ( 4) Coagulation du lait écrémé positive ( 5) Peptisation du lait écrémé positive ( 6) Formation du pigment mélano Ide négative ( 7) Réduction du nitrate positive ( 8) Décomposition de la cellulose négative ( 9) Utilisation des sources de carbone D-Glucose + L-Arabinose - Saccharose - D-Xylose L-Inositol - D-Mannitol - D-Fructose - Rhamnose - Raffinose + Cellulose Galactose + Salicine Lactose + D-Sorbitol + DMannose + Inuline Nota: + signifie utilisé signifie non utilisé En considérant les caractéristiques ci-dessus et la présence de l'acide Ldiaminopimélique à titre d'une composition de la paroi cellulaire, il est évident que la souche SS 12538 appartient au genre Streptomyces Lorsque l'on se reporte aux caractéristiques mycologi- ques de la souche mentionnées dans "The Actinomycetes", Vol 2 ( 1961) par Waxman, ISP report "International Journal of Systematic bacteriology", Vol 18, pages 69 et 279 ( 1968), par Shirling et Gotlieb, ISP report Vol 19, page 391 ( 1969) et Vol 22, page 265 ( 1972) et "Bergey's Manualof Determinative Bacteriology" 8 ème édition ( 1974), les souches du type dans lesquelles les mycéliums aériens présentent une série de couleurs grises, les chaines de spores sont spiralées, la structure superficielle des spores est poilue, aucun pigment mélanolde n'est produit et la gamme d'uti- lisation des sources de carbone est étroite comme dans la souche considérée S 12538, comprennent notamment Streptomyces karnatakensis et Streptomyces pactum Dans le tableau suivant on indique les résultats des comparaisons de ces deux souches avec la souche S 12538. e ej O p N Il P" -l il Nc: (D & O &q (b k-' CY él ej CD z " CI a ce CY luO >r C' FI Id çi + I-01 9 CD O to C eFI 0 Pb el Pb O r -0 O & O a, t O + ki cr ki > 9 M, 4 O CD Cb tu O:j C) Cr tn m CD 93 P M th ti e$CD cj CD 1-1 ui F (il c p -J r CD, O 1 lj Fi ItP O CD IV O 0 > to O P. fb CL m CD 0 19 m O lu 4 > 1 0 - Fi 1- 0 r a S ce CD, (D t- gl, F'0 r p z 0 e a, e F j k O 0) 0 go O e + F P O r > e P, Pl CD Ft FI P) p t CD w ci 0 lz FI 9 CD taz &Fi Fi 09, - W.4 04. 0 f D kl- m) (DZ En p n CD,0 4 r- >)-l CD CD tg r. ce bi lla CD O e 1-1 r- m cn cn O= P ti ti L'i b m ït: I - cp 00 te p,, 1 p F k" l F-b f d x k O tg :j O O O O > -O m O CD O O. CD CD bi i + Cr ++ + + 4 be O CD Ol r. l ? k- q+ ti 0 m 0 vm F-1 9 P)::5 91 z O > e:30 Fi (D d O e Fi p O ti th Fi O a' Cr O FI P I-10 0) CD e P. O Fr p e 'r P o sz + 1 O l m cq CD l èl b s Ca m I Fi P) 1- 1 CD li KI .r (X 1 + 1 + 1 à 8 1 1 8 + 8 1 1 m Ln m L- Co CN Foi FOI op14 DDon"O coqjICDDcar DFQ- M-+ Mt l P) lu O e a O O Fj Fi + >O O CDte, FI e 00 O a te ci 1-1+ e e Co th OId O a es ceFi 0 O e e 5 Coth 4 Fi CD fo 0) Ioth a p fb Il ressort à l'examen de ce tableau que la souche S 12538 diffère grandement de Streptomyces karnatakensis ISP 5345 en ce qui concerne la couleur des mycéliums aériens, la réduction du ni- trate et l'utilisation du raffinose D'autre part, la souche selon l'invention diffère de Streptomyces pactum ISP 5530 en ce qui concerne la réduction du nitrate et l'utilisation du raffinose, mais les caractéristiques mycologiques sont presque similaires. En conséquence, la souche S 12538 a été identifiée comme une souche de Streptomyces pactum. Afin d'effectuer une distinction entre la souche S 12538 et la souche connue, la Demanderesse a identifié la première comme Streptomyces pactum S 12538 et l'a déposée le 8 mars 1982 auprès du Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology( 1-3, Higashi 1 Chome Yatabe-machi Tsukuba-gun Ibaraki- ken 305 Japon) sous forme d'un dépôt international,sous le numero de dépôt FE Ri BP-265 Les substances physiologiquement actives SS 12538 selon l'in- vention peuvent être préparée par inoculation avec cette souche d'un milieu contenant des agents nutritifs et culture aérobie. Bien entendu, on peut utiliser pour la préparation des sub- tances SS 12538 toutes les souches, notamment la souche ci-dessus, mais aussi des mutants ou des variétés de caractère artificiel ou naturel. Les milieux servant à la culture peuvent être synthétiques, semi-synthétiques ou naturels à la condition de contenir des agents nutritifs que les bactéries peuvent utiliser. Parmi les agents nutritifs qu'on peut incorporer dans les milieux, on citera les sources de carbone, par exemple glucose, glycérol, dextrine, amidon, blé et mélasses, l'huile de soja et leurs mélanges; parmi ressources d'azote, on citerapar exemple, la farine de soja, lesgermesde blé, les extraits de viande, la pep- tone, la levure sèche, la farine des graines de coton, la farine de poisson, la liqueur de macération du mals, le sulfate d'ammonium, le nitrate de sodium et leurs mélanges. Eventuellement, on ajoute des sels minéraux tels que le carbonate de calcium, le chlorure de sodium, les phosphates etc pour promouvoir la croissance des bactéries et faciliter la production des substances SS 12538 On peut aussi ajouter des matières orga- niques, des matières minérales et des anti-moussants ordinaires tels que les huiles siliconiques ou "Adecanol" (marque déposée). -8 2524886 On effectue la culture par une technique de culture liquide et surtout de culture en profondeur comme cela se pratique lors de la production d'antibiotiques ordinaires On effectue la culture dans des conditions aérobies et à des températures appropriées pour la culture normalement comprises entre 23 et 30 OC et, le plus sou- vent, aux alentours de 27 %C Les substances physiologiquement ac- tives SS 12538 atteignent un maximum quantitatif pendant 2 à 7 jours quand on les produit par la culture avec agitation ou par la culture en profondeur. Le produit de culture résultant contient un mélange de la substance physiologiquement active SS 12538 A répondant à la formule (I) dans laquelle R représente le radical méthyle, SS 12538 B de la même formule dans laquelle R représente un atome d'hydrogène et SS 12558 C de la mtme formule dans laquelle R représente le radical éthyle Pour isoler ces substances les unes des autres, on doit employer judicieusement certaines techniques en combinaison, compte tenu des propriétés physico-chimiques des substances SS 12538 A, B et C comme on le verra plus en détail dans les exemples. Plus précisément, ces substances physiologiquement actives sont habituellement présentes dans les mycéliums et dans le filtrat de culture En conséquence, on sépare les mycéliums du bouillon de culture par séparation centrifuge ou par filtration On soumet les mycéliums et le filtrat de culture à des techniques ordinaires de séparation qu'on emploie en combinaison, par exemple l'extraction par un solvant, la précipitation, le traitement par une résine échangeuse d'ions, la filtration sur gel, la chromatographie par adsorption ou distribution, ou bien encore la dialyse, pour isoler et purifier les substances physiologiquement actives SS 12538. On va décrire ci-après l'une des techniques préférées d'iso- lement et de purification. On sépare un bouillon de culture en mycéliums et bouillon surnageant par centrifugation ou une technique analogue On extrait ensuite le gâteau de mycéliums humide et le bouillon surnageant, respectivement, avec par exemple du méthanol, de l'acétate d'éthyle ou un composé analogue On combine les extraits provenant du gâteau de mycéliums humide et du bouillon surnageant, puis on distille le solvant On dissout le résidu dans un peu d'eau et on extrait à plusieurs reprises avec de l'acétate d'éthyle, puis on évapore à siccité sous pression réduite et on obtient une sub- stance huileuse de couleur brun foncé On soumet cette substance huileuse à une chromatographie par adsorption en utilisant du gel de silice Par chromatographie sur gel de silice, on obtient successive ment et dans cet ordre, une fraction contenant SS 12538 c, puis une fraction contenant SS 12538 A et enfin une fraction conte- nant SS 12538 B On recueille ces fractions actives respectives et on les concentre sous pression réduite, de sorte que SS 12538 A, S 1255 d et SS 12538 C sont respectivement isolées sous forme d'huiles incolor E Les substances physiologiquement actives ainsi isolées SS 12538 possèdent les propriétés physico-chimiques et biologiques ci-après: i O I SS 12538 A 1 Propriétés physico-chimiques ( 1) Couleur et nature de la substance: huile incolore ( 2) Poids moléculaire (déterminé par le spectre de masse d'un acétate de SS 12538 A): 400 ( 3) Chromatographie en couche mince Support: plaquettes de gel de silice F 254 (Merck Inc) ( 4) Réactions colorées La substance présente une couleur jaune avec le réactif 2,4-dinitrophénylhydrazine et une couleur pourpre foncé avec anisal- déhyde-acide sulfurique On n'obtient aucune couleur caractéristique avec une solution de chlorure ferrique. ( 5) Solubilités dans les solvants Soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone l'éther éthylique, l'éthanol, le méthanol, la pyridine, le benzène et le diméthylsulfoxyde, mais modérément soluble dans l'eau. ( 6) Spectre d'absorption UV Me OH239 E 1 % 845 (figure 1) Me OH 239 El 1 cm max ( 7) Spectre d'absorption IR (procédé par pellicule liquide) voir figure 2 ( 8) Spectre RMN 1 H ( 60 M Hz) Mesuré dans une solution de deutérochloroforme en utilisant TMS comme substance de référence Voir figure 5. Mélanges de solvants de développement Valeurs Rf Chloroforme/méthanol ( 100: 1) 0,42 Benzène/acétate d'éthyle ( 1:1) 0,33 Benzène/acétone ( 10: 3) 0,31 -9- -10- ( 9) spectre Ki: 13 C mesuré dans une solution de deutérochloroforme en utili- sant T' S comme substance de référence. (ppm) 181,0, 162,1, 156,8, 138,0, 136,5, ,9, 13571, i 34,0, 125,0, 12219, 117,9, 117,8, 99,3, 82,6, 55 r 1, 42,8, 36,8, 29,9, 17,4, 16,5, 13,0, 13,0, 10,6, 9,8, 6,8 ( 10) Formule moléculaire (par analyses RMN et spectre de mas- se) C 5 H 3604 ( 11) Formule structurale En se basant sur les propriétés physicochimiques ci-dessu on détermine que la structure de SS 12538 A est représentée par la formule suivante: CH 3 O CH 3 O CH 3 II CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 2 Propriétés biologiques ( 1) Activité vaso-dilatatrice On a utilisé comme animaux de laboratoire 4 chiens bâtards, i 30 mâles, pesant de 15 à 25 kg et on les a anesthésiés avec du pento- barbital de sodium ( 30 mg/kg i v) On a ensuite exposé l'artère coronaire circonflexe gauche sous respiration artificielle et on a raccordé une sonde d'un débitmètre électromagnétique On a intro- duit une canule en polyéthylène dans l'artère fémorale gauche. On a dissous les composés à tester dans une petite quantité de diméthylsulfoxyde et on a dilué avec une solution saline physio- logique stérilisée pour injection, puis on a introduit le produit dans la veine. On a mesuré le sang coronaire à l'aide du débitmètre électro- magnétique et on a déterminé la tension sanguine à partir de la canule en polyéthylène au moyen d'un transducteur de pression. On a également mesuré le rythme cardiaque à l'aide d'un sphygmographe instantané à partir des intervalles RR d'un élec- trocardiogramme On a enregistré chaque paramètre sur un polygraphe. On a observé les changements de ces paramètres avant et apres l'administration de chaque compose. Les résultats apparaissent dans le Tableau I. Tableau I Débit de sang coronaire Augmentation Durée (X) (m) Tension sanguine Réduot Durée (%) (un) Rythme cardiaque Réduction (%) 3 17,1 10 4,9 7 2,3 SS 12538 A10 168,6 20 12,6 10 2,9 441,3 40 28,7 30 1,8 )i- pyridamol300 135,7 20 13,2 16 O ( 2) Activité antibactérienne On a représenté dans le tableau II la concentration inhibitrice minimum (CIM) de la substance physiologiquement active SS 12538 A contre divers micro-organismes. omposé Dose pg/kg -12- Tableau II Concentration Organismes inhibitrice minimum CIM (pg/ml) _ _ Bacillus subtilis ATCC 6633 > 100 Bacillus cereus IID 871 12,5 Micrococcus lysodeikticus IFO 3333 25 Staphylococcus aureus ATCC 6538 P > 100 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 100 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 > 100 Pseudomonas aeruginosa IFO 13736 > 100 Candida albicans ATCC 10231 > 100 Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 > 100 Aspergillus niger ATCC 9642 > 100 Trichophyton mentagrophytes QM 248 > 100 Microsporum gypseum IFO 8231 II SS 12538 B 1 Propriétés physico-chimiques ( 1) Couleur et nature de la substance: huile incolore ( 2) Poids moléculaire (déterminé par le spectre de masse d'un acétate de SS 12538 B): 386 ( 3) Chromatographie en couche mince Support: plaquettes de gel de silice F 254 (Merck Inc) -13 2524886 c Mélanges de solvants de développement valeur Rf Acétate d'éthyle 0,29 Benzène/acétate d'éthyle ( 1: 1) 0,11 Benzène/acétone ( 1: 1) 0,13 ( 4) Réactions colorées La substance présente une couleur jaune avec le réactif 2,4-dinitrophénylhydrazine et une couleur pourpre foncé avec anisal- déhyde acide sulfurique On n'obtient aucune couleur caracté- ristique avec une solution de chlorure ferrique. ( 5) Solubilités dans les solvants Soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acéton l'éther éthylique, l'éthanol, le méthanol, la pyridine, le benzène et le dimythylsulfoxyde, mais modérément soluble dans l'eau. ( 6) Spectre d'absorption UV Me OH 1 % MH 239 nm E 1010 (figure 4) max 1 cm ( 7) Spectre d'absorption IR (Procédé par pellicule liquide) voir figure 5 ( 8) Spectre RMN 1 H ( 90 M Hz) Mesuré dans une solution de deutérochloroforme en utili- sant TMS comme substance de référence Voir figure 6 ( 9) Spectre RMN 13 C Mesuré dans une solution de deutérochloroforme en uti- lisant TMS comme substance de référence. 6 (ppm) 181,5, 167,2, 159,1, 138 t 1, 136,4, 135,9, 135; 2, 133,9, 125,2, 122,9, 118,4, 117,8, 88,4, 82,6, 55,8, 42,9, 36,8, 30,2, 17,4, 16 t 5, 13,1, 13,1, 10,6, 9,4 -14- À ' 2524886 ( 10) Formule moléculaire (par analyses RMN et spectre de masse) C 24 H 34 C 4 ( 11) Formule structurale En se basant sur les propriétés physicochimiques ci-dessu on détermine que la structure de SS 1 ú 538 B est représentée par la formule suivante: O CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 2 Propriétés biologiques ( 1) Activité vaso-dilatatrice Par le même procédé que celui utilisé pour SS 12538 A, on a déterminé l'activité vaso-dilatatrice de SS 12538 B Les résul- tats apparaissent dans le Tableau III ci-après: Tableau III Débit de sang coronaire Tension sanguine Rythme cardiaque Composé Dose _ - Mg/kgugmentationDurée Réduct Durée Réduction (%) )( n) (%) mn) SS 12538 B3,0 103,3 10 7,5 6 2,0 ,0 143,8 15 27,7 20 13,0 Di- pyridamol 300,0 135,7 13,2 O -15 2524886 ( 2) Activité antibactérienne La CIM de la substance physiologiquement acive SS 12538 B contre divers micro-organismes est indiquée dans le Tableau IV ci-après: Tableau IV Concentration Organismes inhibitrice minimum CIM (fg/ml) Bacillus subtilis ATCC 6633 50 Bacillus cereus IID 871 50 Micrococcus lysodeikticus IFO 3333 25 Staphylococcus aureus ATCC 6538 P 25 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 25 Escherichia coli 0-1 > 100 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 > 100 Pseudomonas aeruginosa IFO 13736 > 100 Candida albicans ATCC 10231 > 100 Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 > 100 Aspergillus niger ATCC 9642 > 100 Trichophyton mentagrophytes QM 248 25 Microsporum gypseum IFO 8231 100 III SS 12538 C 1 Propriétés physico-chimiques ( 1) Couleur et nature de la substance: huile incolore ( 2) Poids moléculaire (déterminé par le spectre de masse d'un acétate de SS 12538 C): 414 ( 3) Chromatographie en couche mince Support: plaquettes de gel de silice F 254 (Merck Inc) ( 4) Réactions colorées La substance présente une couleur jaune avec le réactif 2,4-dinitrophénylhydrazine et une couleur pourpre foncé avec anisal- déhyde acide sulfurique On n'obtient aucune couleur caractéri- stique avec une solution de chlorure ferrique. ( 5) Solubilités dans les solvants Soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éther éthylique, l'éthanol, le méthanol, la pyridine, le benzène et le diméthylsulfoxyde mais modérément soluble dans l'eau. ( 6) Spectre d'absorption UV 1 % Me OH 239 nm E 1 cm840 (figure 7) max ( 7) Spectre d'absorption IR (Procédé par pellicule voir figure 8 ( 8) Spectre RMN H ( 90 M Hz) Mesuré dans une solution de deutérochloroforme sant TMS comme substance de référence Voir figure 9 ( 9) Spectre RMN 13 C Mesuré dans une solution de deutérochloroforme sant TMS comme substance de référence. liquide) en utili- en utili- Mélanges de solvants de développement Valeur Rf Acétate d'éthyle 0,77 Benzène/acétate d'éthyle ( 1: 1) 0,57 Benzène/acétone ( 1: 1) 0,44 -16- a -17- d(ppm) 180,4, 162,2, 156,9, 138,0, 136,5, 135,8, ,3, 134,0, 125 r 3, 123 t 1, 118,4, 118,0, 105,3, 82,7, 55,2, 42,9, 3618, 30,1, 17,5, 16,5, ,3, 13 r,1, 13,1, 12,9, ,6, 9; 8 ( 10) Formule moléculaire (par analyses RMN et spectre de masse) C 26 H 3804 ( 11) Formule structurale En se basant sur les propriétés physicochimiques ci-dessu on détermine que la structure de SS 12538 C est représentée par la formule suivante: C 3 CH 2 C 3 OH OH 3 CH 30 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 2 Propriétés biologiques ( 1) Activité vaso-dilatatrice Par le même procédé que celui utilisé pour SS 12538 A, on a déterminé l'activité vaso-dilatatrice de SS 12538 C Les ré- sultats apparaissent dans le Tableau V ci-après: TABLEAU V Débit de sang coronaire Au Mrnntatior Durée (Mn) Tension sanguine f Rythme cardiaque Réduct. ( 9 L Durée (Mn) Réduction ( 50 SS 12538 C10,0 30,0 5 O O o ,0 60,0 10 2,9 10 G ,0 130,0 15 8,5 15 10,1 ,7 13,2 o ( 2) Activité anti-bactérienne La CIM de la substance physiologiquement active SS 12538 C contre divers organismes est indiquée dans le Tableau VI ci-après Do se ug/kg 1 py rideinol 00,0 -_ 19- Tableau VI Concentration inhibitrice Organismes minimum minimum CIM (pg/ml) Bacillus subtilis ATCC 6633 > 100 Bacillus cereus IID 871 25 Micrococcus lysodeikticus IFO 3333 12,5 Staphylococcus aureus ATCC 6538 P 100 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 25 Escherichia coli 0-1 > 100 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 > 100 Pseudomonas aeruginosa IFO 13736 > 100 Candida albicans ATCC 10231 > 100 Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 > 100 Aspergillus niger ATCC 9642 > 100 Trichophyton mentagrophytes QM 248 50 Microsporum gypseum IFO 8231 > 100 Bien que les propriétés des composés selon l'invention décrites * plus haut aient été comparées avec celles des composés physio- logiquement actifs connus, les composés selon l'invention ne cor- respondent pas à ceux qui sont connus et on peut donc les consi- dérer comme des substances nouvelles physiologiquement actives. Toutes les substances physiologiquement actives SS 12538, selon l'invention, ne font pas seulement preuve d'une action d'hypo- tenseur, mais augmentent aussi fortement le débit sanguin dans les coronaires artérielles En outre, les substances SS 12538 A et SS 12538 B présentent un titre aussi élevé qu'environ 30 fois le di- pyridamol et même le titre de SS 12538 C est d'environ 3 fois celui du dipyridamol. En conséquence, on considère les substances comme efficaces en tant que médicament permettant de soigner les maladies car- diaques ischémiques ou encore en tant qu' hypotenseur Les substances physiologiquement actives SS 12538 possèdent une acti- vité antimicrobienne contre certaines bactéries gram-positives et contre certains dermatophytes et on peut donc les utiliser comme agents antimicrobiens. Les exemples suivants, dans lesquels toutes les proportions sont en poids sauf stipulation contraitre, servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée: Exemple 1: Test d'isolement d'un micro-organisme pur et de reproductibilité ( 1) On dilue un échantillon de sol avec de l'eau stérilisée à raison de 1 / 1000 et on mélange 1 ml de la dilution avec 9 ml d'un milieu d'agar d'isolement (I) ayant la composition ci-après, dans une botte de Petri stérilisée et on incube à 27 C pendant plusieurs jours. Milieu d'agar d'isolement (I) Farine d'avoine 20 g (on fait bouillir 20 g defarine d'avoine dans 1000 ml d'eau distillée pendant 20 minutes et on filtre à travers une étamine, la perte d'eau étant compensée par des additions d'eau fr Aiche distillée). Extrait de levure 4 g Glucose 2 g Solution à faible quantité de sels 1 ml Fe SO 4 7 H 20 0,1 g Mn C 12 4 H 20 0,1 g Zn SO 4 7 H 2 0,1 g Eau distillée 100 ml Agar 20 g p H 7,2 -20- 21- On transfère des colonies produites par cette culture dans un milieu de culture d'agar incliné (II) en utilisant une louche en platine, après quoi on cultive à 270 C pendant 14 jours. Milieu d'agar incliné (II) Farined'avoine 20 g (on fait bouillir 20 g de farine d'avoine dans 1000 ml d'eau distillée et on filtre à travers une étamine, la perte d'eau étant compensée par des additions d'eau fraîche distillée) Solution à faible quantité de sels 1 ml Fe 504 7 H 20 0,1 g Mn Cl 2 4 H 20 0,1 g Zn 504 7 H 20 0,1 g Eau distillée 100 ml Agar 18 g p H 7,2 On dilue une louche en platine de la culture produite sur le milieu avec une solution physiologique sa- line à 1: 10 000 On mélange 1 ml avec 9 ml du milieu d'agar d'isolément (I) dans une botte de Petri stérilisée et on incube à 270 C pendant 14 jours On constate visuellement et au microscope que les nombreuses colonies résultantes ne sont pas différentes les unes des autres. Sur la pluralité de colonies, on en utilise dix qu'on inocule sur le milieu d'agar incliné(II), puis on cultive à 270 C pendant 14 jours La culture sur les dix milieux inclinés(II) est confirmée par des examens visuels microscopiques comme étant la même culture En outre, la nature et les caractéristiques physio- logiques de la culture sur les dix milieux sont confirmées comme étant les mêmes Cette nature et ces caractéristiques physiologiques sont exactement celles qui ont été étudiées plus haut. Les résultats des tests révèlent que les cultures sur les dix milieuxcultivés sont identiques à celle isolée du champ naturel. ( 2) A la culture sur le milieu d'agar incliné(II) obtenue par la culture pure, on ajoute un agent de protection (solution aqueuse contenant 10 % de lait écrémé et 19 t de glutamate de sodium) pour préparer une suspension de spores sur le milieu d'agar incliné (II) Des aliquotes d'environ 0,5 ml de la suspension de spores sont introduits dans des ampoules delyophilisation et sont lyophilisés On effectue la lyophilisation en congelant rapidement les ampoules contenant les suspensions des spores dans un mélange de neige carbonique et d'acétone, en disposant les ampoules dans un ap- pareil de lyophilisation et en établissant dans cet appareil un vide inférieur à O 03 10 Après fermeture hermétique sous vide en utilisant un brûleur à gaz, on stocke la culture lyophilisée à 40 C On conseive pendant 3 mois la culture lyophilisée ainsi obtenue (échantillon) après quoi on ouvre les ampoules et on trans- fère la culture dans un tube à essai stérilisé à l'aide d'une mini- spatule stérilisée On introduit dans ce tube un renaturateur (eau stérilisée), puis on laisse au repos pendant 1 heure pour déterminer la nature et les caractéristiques physiologiques de la culture sur divers milieux dans des conditions du type décrit On confirme ainsi que les cultures ne sont pas différentes de la culture (échantillon) avant la lyophilisation. Exemple 2: (I) Streptomyces Pactum S 12538 (FERM BP-265), c'est à dire la culture produisant SS 12538 sont inoculés dans un milieu compre- nant 2,0 % de glycérol, 2,0 % de dextrine, 1,0 % de soyton, 0,39 t d'extrait de levure, 0,2 % de sulfate d'amwnium et 0,2 % de carbonate de calcium dans de l'eau ordinaire (p H 7,0), puis on agite à 270 C pendant 48 heures pour obtenir une culture d'ensemencement On place ensuite 15 litres du milieu de production ayant la même composition que celui qui a été décrit dans un bac de fermentation de 30 litres. On inocule le milieu avec 300 ml de la culture d'ensemencement, puis on cultive dans des conditions d'aération de 16 litres par minute, un nombre de révolutions de 400 tours/mn et une température de culture de 270 C Après 96 heures de fermentation, on soumet le bouillon de culture à la centrifugation et on extrait le surnageant à trois reprises avec une quantité égale d'acétate d'éthyle D'autre part, on ajoute 5 litres de méthanol au gàteau de mycéliums humide, on agite et on filtre On répète ces opérations à deux reprises. On distille le méthanol de l'extrait sous pression réduite et on extrait la solution aqueuse du résidu à trois reprises en utilisant à chaque fois un litre d'acétate d'éthyle On combine les extraits résultants avec les extraits du surnageant du bouillon, puis on distille le solvant sous pression réduite et on obtient un mélange de SS 12538 A, B et C bruts. (II) On dissout le mélange obtenu dans (I)dans une petite quan- tité de chloroforme et on soumet à une chromatographie sur colonne (dimensions de la colonne: 3 x 30 cm) en utilisant du chloroforme et du gel de silice ("Kiesel Gel 60, Merck Inc) On élue d'abord -22- une fraction contenant le SS 12538 C brut, puis les fractions contenant SS 12538 A et SS 12538 B tous les deux bruts et dans cet ordre. (III) On recueille la fraction contenant SS 12538 C d'o on distille le solvant pour obtenir environ 0,6 g d'un produit gros- sièrement purifié SS 12538 C sous forme d'un produit huileux de cou- leur jaune clair On dissout environ 0,6 g de ce produit grossière- ment purifié dans une petite quantité de benzène/acétate d'éthyle ( 4: 1) et on soumet à une chromatographie sur colonne (colonne 2 x 30 cm) en utilisant le même solvant et le même gel de silice ("Kiesel Gel 60 ") On recueille la fraction éluée de SS 12538 C et on distille le solvant pour obtenir environ 0,15 g de la substance huileuse incolore de SS 12538 C pur. (IV) On recueille la fraction de SS 12538 A provenant de (II) et on distille le solvant pour obtenir 4 g de produit grossière- ment purifié SS 12538 A qui est de couleur jaune clair et d'une consistance huileuse On dissout environ 4 g de ce produit dans une petite quantité de benzène/acétate d'éthyle ( 3: 1) et on ef- fectue une chromatographie sur colonne ( 2 x 30 cm) en utilisant le même solvant et le même gel de silice ("Kiesel Gel 60 ") On recueille la fraction éluée de SS 12538 A, on distille le solvant et on obtient environ 2 g de SS 12538 A sous forme dun produit pur qui est une substance huileuse incolore. (V) On recueille la fraction SS 12538 B provenant de (II) et on distille le solvant pour obtenir environ 0,5 g de produit grossièrement purifié de SS 12538 B sous forme d'une substance hui- leuse jaune clair On dissout environ 0,5 de ce produit dans une petite quantité de benzène/acétate d'éthyle ( 1: 1) et ensuite on effectue une chromatographie sur colonne ( 2 x 30 cm) en utilisant le même solvant et le même gel de silice ("Kiesel Gel 60 ") On re- cueille la fraction éluée de SS 12538 B et on distille le solvant pour obtenir environ 0,12 g de la substance huileuse incolore de SS 12538 B pur. -23- -_?_ REVENDI CATIONS 1 Substance physiologiquement active SS 12538, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule générale (I): O I 1 R CH 3 OH 3 IOH RCH 30 CH CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical méthyle ou un radical éthyle. 2 Substance SS 12538 selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance de formule (I) dans laquelle R représente un radical méthyle est désignée par SS 12538 A et possède les propriétés physico-chimiques suivantes: ( 1) couleur et nature de la substance: huile incolore; ( 2) poids moléculaire (déterminé par le spectre de masse d'un acétate de SS 12538 A): 400; ( 3) chromatographie en couche mince: support: plaquettes en gel de silice F 254 (Merck inc) mélanges de solvants de développement valeurs Rf chloroforme/méthanol ( 100:1) 0,42 benzène/acétate d'éthyle ( 1:1) 0,33 benzène/acétone ( 10:3) 0,31; ( 4) réactions coloxrées couleur jaune avec le réactif 2,4- dinitrophénylhydrazine et couleur pourpre foncé avec arnisaldé- hyde-acide sulfurique, et absence d'une couleur caractéristique avec le réactif chlorure ferrique; ( 5) solubilités dans les solvants: soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acé- tone, l'éther éthylique, l'éthanol, le méthanol, la pyridine, le benzène et le diméthylsulfoxyde, mais modérément soluble dans l'eau; ( 6) spectre d'absorption UV: ÀMe OH 239 nm E 1 845 (voir la figure 1); max lcm ( 7) spectre d'absorption IR (procédé de la pellicule liquide) voir la figure 2; ( 8) spectre Ri N 1 H ( 60 l Hz) mesuré dans une solution de deutérochlor Oforme en utili- sant TMS comme substance de référence, les résultats étant indiqués sur la figure 3; ( 9) spectre RN 13 C mesuré dans une solution de deutérochloroforme en utilisan TMS comme substance de référence, les résultats étant comme suit: d(ppm) 181,0, 162,1, 156,8, 138,0, 136,5, ,9, 135,1, 134,0, 125,0, 122,9, 11719, 117,8, 99,3, 82,6, 5511, 42,8, 36,8, 29,9, 17,4, 16,5, 13 O,0, 13,0, 10,6, 9,8, 6,8. ( 10) formule moléculaire (par analyses Ri MN et du spectre de masse) C 25 H 3604. 3 Substance SS 12538 selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance de formule (I) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène est désignée par SS 12538 B et possède les propriétés physico-chimiques suivantes: ( 1) couleur et nature de la substance: huile incolore; ( 2) poids moléculaire (déterminé par le spectre de masse d'un acétate de SS 12538 B): 386; ( 3) chromatographie en couche mince: support: plaquettes de gel de silice F 254 (Merck Inc) mélanges de solvants de développement valeurs Rf acétate d'éthyle 0,29 benzène/acétate d'éthyle ( 1:1) 0,11 benzène/acétone ( 1:1) 0,13 ( 4) réactions colorées couleur jaune avec le réactif 2,4- dinitrophénylhydrazine et couleur pourpre foncé avec anrisaldé- hyde-acide sulfurique, et absence de couleur caractéristique avec le réactif chlorure ferrique; ( 5) solubilités dans les solvants soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acé- -25- -26 2524886 tone, l'éther éthylique, l'éthanol, le méthanol, la pyridine, le benzène et le diméthylsulfoxyde, mais modérément soluble dans l'eau; ( 6) spectre d'absorption UV ,Ple GH 93 Qnm 15 1010 (voir la figure 4); max lcm ( 7) spectre d'absorption TR (procédé de la pellicule liquide) voir la figure 5; ( 8) spectre RMN 1 H ( 90 M Hz) mesuré dans une solution de deutérochloroforme en utili- sant TMS comme substance de référence, les résutats étant indiqués sur la figure 6; ( 9) spectre RMN 13 C mesuré dans une solution de deutérochloroforme en utili- sant TMS comme substance de référence, les résultats étant comme suit: 6 (ppm) 181,5, 167,2, 159,1, 138,1, 136,4, 13519, 135,2, 133 t 9, t 2, 122 X 9, 118,4, 117,8, 88,4, 82,6, 55,8, 42,9, 36,8, 30,2, 17,4, 16,5, 13,1, 1311, 1016, 9 t 4. ( 10) formule moléculaire (par analyses RMN et du spectre de masse) C 24 H 3404 4 Substance SS 12538 selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance de formule (I) dans laquelle R représente un radical éthyle est désignée par SS 12538 C et possède les propriétés physico-chimiques suivantes: ( 1) couleur et nature de la substance: huile incolore; ( 2) poids moléculaire (déterminé par le spectre de masse d'un acétate de SS 12538 C): 414; -27 2524886 ( 3) chromatographie en couche mince: support: plaquettes en gel de silice F 254 (Merck Inc) mélanges de solvants de développement valeurs Rf acétate d'éthyle 0,77 benzène/acétate d'éthyle ( 1:1) 0,57 benzène/acétone ( 1:1) 0,44; ( 4) réactions colorées couleur jaune avec le réactif 2,4- dinitrophénylhydrazine et couleur pourpre foncé avec anisaldé- hyde acide sulfurique, et absence d'une couleur caractéristique avec le réactif chlorure ferrique; ( 5) solubilités dans les solvants: soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acé- tone, l'éther éthylique, l'éthanol, le méthan Gl, la pyridine, le benzène et le diméthylsulfoxyde, mais modérément soluble dans l'eau; ( 6) spectre d'absorption UV A Me OH 239 nm E 1 m 840 (voir la figure 7); max lem ( 7) spectre d'absorption IR (procédé de la pellicule liquide) voir la figure 8; ( 8) spectre RMN 1 H ( 90 M Hz) mesuré dans une solution de deutérochloroforme en utili- sant TMS comme substance de référence, les résultats étant indiqués sur la figure 9; ( 9) spectre RMN 13 C mesuré dans une solution de deutérochloroforme en utili- sant TMS comme substance de référence, les résultants étant comme suit: 6 (ppm) 180,4, 162,2, 156,9, 138,0, 136,5, 135,8, ,3, 134,0, 125,3, 123,1, 118,4, 118,0, t 3, 82,7, 55,2, 42,9, 36,8, 30,1, 17,5, 16,5, t 3, 13,1, 13,1, 12,9, ,6, 9,8. -28 2524886 ( 10) formule moléculaire (par analyses RMN et du spectre de masse) 26 38 4 5 Procédé de production d'une substance physiologiquement active SS 12538, caractérisé en ce qu'on cultive une souche produisant une substance physiologiquement active SS 12538, ap- partenant au genre Streptomyces et on recueille du bouillon de culture un composé de formule (I) telle que définie dans la re- vendication 1. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la souche appartenant au genre Streptomyces est celle sous le numéro FERM BP-265. 7 Culture conçue pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle comprend un milieu nutritif et une souche microbienne du genre Streptomyces déposée sous le N O FER BP-265.