Brevet FR2535461A1 — publié le 19840504

Réactif pour la détermination des P-lipoprotéines. La présente invention concerne l'utilisation d'un "colorant pour tlipoprotéines dans l'identification des i-lipoprotéines Plus particulièrement,elle concerne l'utili- sation d'un colorant pour -11 poprotéienes dans une solution tampon et en présence de tensio-actifs cationiques ou non- ioniaues appropriés et de groupes anioniques provenant de sels métalliques ou d'acides minéraux, dans la déterminationsemi- quantitative ou auantitative des -lipoprotéines. Les lipoprotéines sont connues pour agir comme supports liquides dans le sang. Elles peuvent être divisées en quatre fractions principales qui se différencient par la composition des -15 liquides supportés, les protéines porteuses, leur taille, leur densité, leur mobilité électrophorétique et leurs carac- téristiques antigènes. Trois fractions lipoprotéiques peuvent être déter- minées dans le sérum prélevé à jeun, à savoir les lipopro- téines à très basse densité (VLDL), la lipoprotéine à basse densité (LDL) et la lipopritéine à haute densité (HDL) Dans le sérum post-prandial, une quatrième fraction est rencontrée, à savoir la chylomicra, dont la présence dans les sujets à jeun est pathologique. La détermination des diverses fractions de lipopro- téines est d'un intérêt cliniaue considérable du fait qu'elles sontentre autres 1 directement en rapport avec la pathologie de 1 ' artériosclérose Les procédés classiques pour déterminer les diverses fractions de lipoprotéines sont: 1) L'électrophorèse 2) L'ultracentrifugation 3) Les procédés immunologiques et immuno-électrophorétiques 4) Les procédés immunonéphélométriques. On connaît des procédés colorimétriques dans lesquels la concentration des protéines est obtenue plus ou moins approximativement par détermination du cholestérol et des lipides liés aux protéines. En particulier, en ce qui concerne les LDL, c'est-à-dire les protéines qui sont considérées couramment pour être directement en rapport avec la pathologie de l'artérios- clérose, on ne connaît pas de procédésdirectsspectrophoto- métriquespour leur détermination. Les auteurs de la présente invention ont découvert que les -lipoprotéines réagissent d'une façon spécifique avec un colorant pour P -lipoprotéines et ceci constitue une partie intégrale de la présente invention. Par conséquent, un premier objet de la présente invention est l'utilisation (dans l'identification des l 4-lipoprotéines) d'un colorant pour r-lipoprotéines qu'on appellera colorant -lipoprotéique choisi parmi les dérivés du triphénylméthane dans lesquels la présence constante des substituants de l'hydrogène indiqués dans la formule générale ( 1) est essentielle: H O XOOC C OOX (i) H C H " R 1 R 2 formule dans laquelle R 1 et R 2;qui peuvent être identiques ou différents,représentent des atomes d'halogène, et X peut être de l'hydrogène ou un cation monovalent etde plus, les hydrogènes du noyau aryle 1 qui ne sont pas montrésipeuvent également être substitués. Un second objet de la présente invention est une composition appropriée comprenant: i) un%"col Orant -lipoprotéique*en solution tampon; ii) un agent chélatantpouvant séquestrer les ions métalliques interférants présents dans l'échantillon;en vue d'obtenir une réaction plus spécifique; iii) des groupes minéraux et anioniques; iv) et éventuellement des tensio-actifs cationiques ou non- ionioues. Donc, la composition définitive peut comprendre: a) Un système tampon pouvant maintenir le p H entre 3 et 7. b) Un agent de chélation pouvant séquestrer les ions métal- liques et en particulier le fer. Les agents de chélation particulièrement apptopriés sont l'acide citrique et ses'sels/et l'acide éthylènediamino- tétracétique et ses sels qui peuvent agir également comme couples tampons. c) Un tensio-actif cationique ou non-ionique et>en particulier, des tensio-actifs cationiques tels que les sels de basa ammonium quaternaires dans lesquels les groupes non- hydrophobes sont des groupes alkyles Parmi ceux-ci, le bromure de cétyltriméthylammonium s'est montré particu- lièrement approprié. d) Des groupes anioniques tels que des halogénures, des nitrates, des sulfates, des phosphates, etc,qui peuvent être ajoutés au mélange sous forme de sels ou sous forme d'acide. L'efficacité du procédé selon la présente invention est déterminée en isolant par chromatographie les protéines d'un ensemble de sérumshumainsqui dans des conditions appro- priées donnent une réaction positive avec un colorant j-lipo- j, protéique"et en les identifiant par voie immunologique à l'aide d'anti-sérumsspécifiqu Es. En même temps, les auteurs de la présente invention ont vérifié que les autres protéines sériques fractionnées ne donnaient pas de réaction positive,dans des conditions analoguesavec le colorant p-lipoprotéique. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non-limitatifs ci-après. EXEMPLE 1 Compositionsréactivespour identifier les lipoprotéines A) Réactif: Tampon d'acétate de potassium 0,5 Bromure de cétyltriméthylammonium 270 mg/litre Bleu 1 pour Mordant 70 mg/l, Mg C 12 6 H 20 60 g/l Acide citrique 0,026 M, citrate de sodium tribasique 0,038 M. B) Réactif identique au précédent dans lequel le Bleu 1 pour Kordant est remplacé par le Bleu pour Mordant 29 avec une concentration de 80 mg/l. EXEMPLE 2 Identification des p-lipoprotéines dans un sérum humain A) 0,1 ml de sérum est ajouté à 2 ml du réactif A précité. Le spectre d'absorption du mélange réactionnel ainsi obtenu est lu avec un spectrophotomètre par rapport à un essai à blanc constitué par 2 ml de réactif et 0,1 ml de solution physiologique Un pic situé entre 640 et 590 nm avec un maximum d'absorption compris entre 600 et 610 nm indique la présence des P-lipoprotéines dans le sérum. B) 0,1 ml de sérum est ajouté à 2 ml du réactif B précité en opérant de la même façon que pour l'exemple 2 (A) Un pic situé entre 640 et 770 nm avec un maximum d'absorption entre 580 et 590 nm indique la présence de lipoprotéines dans le sérum. EXEMPLE 3 Composition réactive pour déterminer les lipoprotéines Le réactif est constitué par: Solution chromogène analogue aux réactifs de l'exemple 1. Solution pour essai à blanc identique à la solution chromogène mais sans colorant lipoprotéique. EXEMPLE 4 Détermination des L-lipoprotéines dans des sérums humains Les quantités ci-après sont introduits avec une pipette dans des tubes à essais selon le schéma indiqué: Echantillon Blanc 1 Echantillon Blanc 2 blanc Sérum ml 0,05 0,05 - Solution phvysiologiqueml 0,05 0,05 Solution chrcnogène ml 1,5 1,5 Solution pour essai à mi 1,5 1,5 blanc Après avoir laissé 20 minutes, la densité optique de l'échantillon est lue à 615-620 nm par rapport à l'essai à blanc 1 (A 1), et la densité optique de l'échantillon à blanc est lue à 615-620 nm par rapport à l'essai à blanc 2 (A 2). A, c'est-à-dire A 1 A 2 'est proportionnel à la concentration des -lipoprotéines dansle sérum. EXEMPLE 5 Comparaison sérums humains sont essayés par le procédé de l'exemple 4. Les @-lipoprotéines sont dosées dans les mêmes sérums par le procédé d'immunodiffusion radial, (plaques fournies par la Société BEHRINGWERKE AG). Le coefficient de corrélation des résultats obtenus par les deux procédés, rest 0,86. REVENDICATIONS 1 Réactif colorimétrique pour la détermination des -lipoprotéine$ comprenant comme réactif de base un dérivé du triphénylméthane dans lequel la présence constante des substituants de l'hydrogène indiqués dans la formule générale (I) est essentielle: HO O coox (I) H C H R 1 / X R 2 11, formule dans laquelle R et R,qui peuvent être identiques ou différentsasont des atomes d'halogène, et X peut être de l'hydrogène ou un cation monovalent et,de plusles hydrogènes du noyau aryle,qui ne sont pas montréspeuvent également être substitués. 2 Réactif colorimétrique selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le dérivé du triphénylméthane est de préférence le Bleu 1 pour Mordant (C I 43830) ou le Bleu 29 pour Mordant (C I 43825). 3 Réactif colorimétrique selon les revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comprend: a) au moins un composé de formule générale (I), tel que spécifié dans la revendication 1, en solution tampon; b) un agent de chélation pouvant séquestrer des ions métal- liaues qui interfèrent; c) des groupes anioniques minéraux; d) et éventuellement des tensio-actifs cationiques ou non- ioniques. 4 Utilisation du réactif colorimétrique selon l'une quelconque des revendications précédentespour identifier les P-lipoprotéines.