Brevet FR2528322A1 — publié le 19831216

La présente invention concerne un produit à activité ionophorique spécifique vis-à-vis des cations bivalents en particulier du calcium et son procédé d'obtention. On connaît l'intérêt que représentent les ionophores dans le domaine de la recherche biologique, intérêt dû à l'aptitude de ces composés à faciliter le transport des ions à travers les membranes artificielles ou biologiques. Les ionophores utilisés dans ces recherches sont des ionophores de synthèse. Or la présente invention fournit un produit à activité ionophorique spécifique vis-d-vis des cations bivalents obtenus à partir de milieux naturels. De façon particulière, le produit selon l'invention est obtenu à partir de moyennes molécules urémiques (wMu). On entend, dans la présente description, par "moyennes molécules urémiques", les substances de poids moléculaires compris entre 300 et 2000 daltons qui se trouvent accumulées dans le plasma des sujets souffrant d'insuffisance rénale chronique (IRC) traités par hémodialyse ou dans l'urine de sujets sains. Défini de façon très générale, le produit selon l'invention résulte de la séparation et de l'isolement d'une sous-fraction de MMU préalablement fixée sur de l'hydroxy- apatite. L'invention fournit également un procédé permettant d'obtenir ce produit, ce procédé consistant à séparer de plasmas d'IRC ou d'urines de sujets sains la fraction correspondant aux MMU telles que définies ci-dessus, à mettre ces MMU en contact avec de l'hydroxyapatite, puis à séparer et isoler la sous-fraction qui a été fixée sur l'hydroxyapatite. Avantageusement, la mise en oeuvre de ce procédé se fait par une succession d'opérations chromatographiques : ainsi, suivant un mode de réalisation particulier A - On soumet à la température ambiante les sérums d'IRC ou les urines de sujets sains à une chromatographie sur colonne de tamisage moléculaire ; on sépare par élution et recueille la fraction MMU désirée B - On soumet à la température ambiante la fraction recueillie à une seconde chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite C- On élue au moyen d'une solution de phosphate puis D - On procède à une opération de dessalage et on recueille le produit résultant. De façon plus particulière - L'élution dey'étape A est avantageusement réalisée au moyen d'eau bidistillée ou d'une solution tampon - La fraction éluée résultant de ce tamisage moléculaire est éventuellement soumise à un dessalage - L'hydroxyapatite dont il est fait usage dans l'étape B est de préférence en milieu tampon phosphate de sodium - L'élution constituant l'opération C est de préférence réalisée au moyen d'une solution tampon de phosphate de sodium et enfin - L'opération de dessalage des opérations A et/ou D se fait avantageusement par tamisage moléculaire. On signalera que les tamis moléculaires utilisés dans les opérations A et D peuvent être choisis parmi les tamis moléculaires connus correspondant aux poids moléculaires et grosseurs de molécules auxquelles on s'intéresse. C'est ainsi que l'on pourra faire appel, pour l'opération A, à un tamis du type que l'on trouve sous le nom de "SEPHADEX G.15" et pour l'opération D à un tamis du type que l'on trouve sous le nom de "SEPHADEX G.10". Les Sephadex sont des macromolécules de dextran réticulées à réseau tri-dimensionnel de chaînes de polysaccharides. D'autres caractéristiques de l'invention ressortiront de la description qui va suivre donnée à titre illustratif et nullement limitatif. a) Préparation des colonnes de tamis moléculaires Les tamis moléculaires utilisés sont du type "SEPHADEX G.15 et G.10". Conformément à l'invention, la séparation et l'isolement des MMU brutes se fait par tamisage moléculaire. Le "SEPHADEX G.15" choisi pour cette opération est mis à gonfler dans de l'eau bidistillée pendant 24 heures à température ambiante. Le gel est dégazé puis coulé dans une colonne de 1 mètre de hauteur sur 2,6 cm de diamètre. L'étalonnage est fait à l'aide de molécules de poids moléculaire voisin de 1000 : vitamine B12 et hypertensine. Le dessalage des MMU brutes ou des fractions de MMU s'effectue sur le "SEPHADEX G.10" choisi pour cette opération. Il est gonflé dans de l'eau bidistillée, dégazé puis coulé dans une colonne de 1 mètre de hauteur et de 1,5 cm de diamètre. b) Colonne d'hydroxyapatite (HAP) On utilise de l'HAP Ultrogel constitué de perles d'agarose réticulées dans lesquelles sont emprisonnés des microcristaux d'hydroxyapatite. Le gel fourni à l'état hydraté est mis en suspension dans une solution tampon de phosphate de sodium 1 mM, pH = 6, dégazé puis coulé dans une colonne de 36 cm de hauteur et de 1,6 cm de diamètre. Avant d'utiliser la colonne et entre chaque séparation, la colonne est régénérée par passage d'un demivolume de NaOH 0,1 M (32 ml) suivi de 60 ml de solution tampon de phosphate de sodium 0,5 M, pH 6. La colonne est ensuite équilibrée par la solution tampon de départ (phosphate de sodium 1 mM, pH 6). Le débit est de 30 ml par heure. c) Obtention des MMU brutes Pour obtenir les MMU brutes nécessaires à la mise en oeuvre du procédé de l'invention et à l'isolement du produit final désiré, on part d'urines de sujets sains ou d'ultrafiltrats de plasmas d'IRC traités par hémodialyse. Les ultrafiltrats sont prélevés au début d'une séance de dialyse, avant que soit branchée la circulation du dialysat. De ce fait, une différence de pression entre les deux compartiments permet le passage de solutés à travers la membrane. C'est l'ultrafiltrat qui est recueilli à la sortie du compartiment de dialyse. Le volume prélevé peut atteindre deux litres et dépend de l'état d'hydratation du malade. L'ultrafiltrat est concentré environ cinq fois par lyophilisation, puis l'on procède à la séparation des MMU. d) Séparation des MMU brutes Cette séparation se fait à température ambiante et de façon connue en soi dans la colonne de "SEPHADEX G.15" préalablement préparée comme décrit ci-dessus en utilisant comme éluant soit de l'eau bidistillée soit une solution tampon de tris(hydroxyméthylamino)méthane (Tris) et un débit de 100 ml/heure. Dans le cas de l'éluvion au Tris, les MMU brutes résultantes sont dessalées sur une colonne de "SEPHADEX G.10" (préalablement préparée comme décrit cidessus) avec un débit de 25 ml/heure. On obtient ainsi la fraction désirée de MMU brutes qui est ensuite lyophilisée. e) Traitement sur colonne d'hydroxyapatite (HAP) 1. Suivant un premier mode opératoire possible, on procède de la façon suivante - La colonne de HAP est équilibrée avec une solution tampon de phosphate de sodium 5 mM, pH 6. Une quantité des MMU précédemment obtenues comme décrit ci-dessus, (environ 50 mg de MMU dans 100 ml de solution tampon de phosphate 5 mM) est injectée sur la colonne. La colonne est lavée au moyen de 100 ml du même tampon afin d'éluer la fraction non adsorbée sur HAP dans ces conditions. L'élution des substances adsorbées s'effectue par un gradient linéaire de phosphate (volume total 100 ml, molarité de 5 mM à 1 M). 2. Suivant un second mode opératoire possible, on procède de la façon suivante - la colonne de HAP est équilibrée avec une solution tampon de phosphate de sodium 1 mM, pH 6. L'injection des MMU se fait dans de l'eau bidistillée, pour éviter une augmentation de force ionique qui pourrait modifier d'adsorption des MMU sur la colonne. Cette dernière est ensuite lavée au moyen de 100 ml de solution tampon de phosphate 1 mM, puis au moyen d'un gradient linéaire de phosphate (1 mM à 1 M). Des mesures de conductivité permettent de connaître la molarité exacte de phosphate nécessaire à l'élution des différents pics détectés eux-mêmes par absorption ultra-violette. La concentration en phosphate est déduite de la conductivité par une courbe étalon comme le comprendra aisément l'homme de l'art. f) Dessalage Les fractions recueillies provenant du traitement sur la colonne de HAP sont ensuite dessalées après lyophilisation sur colonne de "SEPHADEX G.10" et on recueille un produit dont les propriétés et caractéristiques ressortiront ci-après. Ce produit est détecté par absorption ultra-violette à 230 nm. Des mesures de conductivité permettent de vérifier l'efficacité des dessalages. Lors des chromatographies, on assure le débit constant au sommet des colonnes par tout moyen approprié. Par une analyse densitométrique des MMU brutes injectées sur la colonne de HAP et des MMU éludes de cette colonne grâce au gradient de phosphate, on détermine le rendement de l'opération. Selon les MMU utilisées, on constate que ce rendement varie de 15 à 30 %, suivant l'origine des MMU brutes dont la composition diffère selon les malades. On peut procéder de la même manière en partant d'urine de sujets sains. On notera à ce sujet que l'on a pu évaluer la concentration plasmatique du produit de l'invention à 75 #g/ml chez les IRC traités par hémodialyse. La concentration a pu également être évalueedans l'urine de sujets sains ; l'excrétion journalière est environ de 1,75 g. La substance adsorbée, dessalée, recueillie et lyophilisée selon l'invention présente les caractéristiques particulières : Ces caractéristiques ont pu être mises en évidence grâce à l'utilisation de mitochondries animales. Ces mitochondries ont, in vitro, un comportement qui peut être suivi grâce à l'enregistrement de la consommation d'oxygène par un oxygraphe. Les altérations de ce comportement ont permis de définir la nature ionophorique du produit de l'invention. Les essais ont montré qu'à la concentration de 50 microgrammes par milligramme de protéine mitochondriale, ledit produit permet une augmentation de la vitesse d'oxydation du succinate correspondant au découplage des mitochondries. Cette augmentation de la vitesse d'oxydation est potentialisée par l'ajout de calcium dans le milieu expérimental :elle est inhibée par la présence d'acide éthylène-glycol-bis-2-amino-éthyl- tétracétique (substance chélatrice du calcium), par le rouge de ruthénium (inhibiteur du transporteur mitochondrial de calcium) et enfin par le magnésium. Ces trois dernières substances s'opposent donc au découplage des mitochondries provoqué par le produit selon l'invention. Ainsi, pour que le produit selon l'invention soit un ionophore 'spécifique des cations bivalents, il doit agir notamment en équilibrant la concentration du calcium intramitochondrial avec celle du calcium externe par transport passif. De ce fait, la présence permanente de calcium dans le milieu extra-mitochondrial augmenterait, ce qui est le cas, la vitesse d'oxydation du succinate (car comme on le sait, la présence de calcium libre dans le milieu externe induit une vitesse de respiration forte nécessaire à l'accumulation de cet ion dans les mitochondries, l'activité du transporteur mitochondrial de calcium étant couplée à l'activation de la respiration). Or, les faits expérimentaux confirment bien l'activité du produit de l'invention - L'acide éthylène-glycol-bis-2-amino-éthyl-tétraacétique, en empêchant la présence de calcium libre dans le milieu externe, inhibe l'activation de la respiration. En effet, en l'absence de cation bivalent libre, un ionophore ne peut jouer son rôle de transporteur de cation. Or le produit selon l'invention joue ce rôle. - Le rouge de ruthénium, en inhibant le transporteur mito chondrial de calcium, inhibe l'activation de la respiration. En effet, l'activation de la respiration est due au trans port actif par les mitochondries du calcium présent dans le milieu externe. La présence de calcium dans le milieu externe est rendue possible par un ionophore qui, par transport passif, équilibre le calcium de part et d'autre de la membrane mitochondriale. L'effet du rouge de ruthénium valide donc l'hypothèse suivant laquelle le produit de l'invention agit en facili tant le transport du calcium à travers la membrane (activité ionophorique) donc en permettant la présence de calcium dans le milieu externe. - Le magnésium, en tant que cation bivalent, est également actif ; il agit simplement en complexant une substance ionophorique (compétition entre le calcium et le magnésium pour la liaison) et de ce fait l'inactive. C'est le cas avec le produit selon l'invention. Ainsi ce dernier présente bien une activité ionophorique vis-à-vis des cations bivalents, en particulier du calcium. Il va du reste de soi que la présente invention n a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toutes modifications utiles pourront y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Produit à activité ionophorique spécifique vis-à-vis des cations bivalents, en particulier du calcium, caractérisé par le fait qu'il résulte de la séparation et de l'isolement d'une sous-fraction des moyennes molécules urémiques (MMU) de poids moléculaire compris entre 300 et 2000 daltpns qui sont accumulées dans le plasma des sujets souffrant d'insuffisance rénale chronique (IRC) traités par hémodialyse ou dans l'urine de sujets sains, sous-fraction préalablement fixée sur de l'hydroxyapatite. 2. Procédé d'obtention du produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste à séparer de plasmas d'IRC traités par dialyse ou d'urines de sujets sains, la fraction correspondant aux MMU, à mettre ces MMU en contact avec de l'hydroxyapatite puis à séparer et à isoler la sous-fraction qui a été fixée sur l'hydroxyapatite.. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que A - On soumet à la température ambiante les ultrafiltrats de plasmas de sujets IRC traités par dialyse ou les urines de sujets sains à une chromatographie sur colonne de tamisage moléculaire ; on sépare par élution et recueille la fraction MMU désirée B - On soumet à la température ambiante la fraction recueillie à une seconde chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite C - On élue au moyen d'une solution de phosphate puis D - On procède à une opération de dessalage et on recueille le produit résultant. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'élution de l'étape A est avantageusement réalisée au moyen d'eau bidistillée ou d'une solution tampon. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le fraction éluée résultant de ce tamisage moléculaire est éventuellement soumise à un dessalage. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'hydroxyapatite dont il est fait usage dans l'étape B est de prdférence en milieu tampon phosphate de sodium. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'élution constituant l'opération C est de préférence réalisée au moyen d'une solution tampon de phosphate de sodium. 8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'opération de dessalage des opérations A et/ou D se fait avantageusement par tamisage moléculaire.