Brevet FR2532326A1 — publié le 19840302

La présente invention a pour objet un procédé de multianalyses enzymatiques sur un même échantillon biologi que par l'emploi d'un mélange de chromogènes compatibles. Jusqu'à présent, les techniques connues d'analyse médicale permettaient la mesure d'un seul paramètre à la fois dans une quantité utile d'un liquide biologique donné Par exemple, pour faire l'analyse de l'urée et du glucose présents dans le sang d'un patient, on prélevait deux échan tillons ou quantités utiles de sang du patient et on procé dait séparément sur chacun des échantillons à l'analyse de l'urée d'une part et du glucose d'autre part. La présente invention présente lVavantage important de fournir un procédé d'analyse qui permette de faire sur un même échantillon ou quantité utile la mesure de deux ou trois des constituants présents dans le liquide biologique. I1 en résulte une économie crès importante des quantités de liquide biologique à prélever sur le patient, ce qui prend notamment tout son interet quand il s'agit de prélèvements de sang pour la surveillance biologique des prématurés ou des opérés. Il en résulte également des gains de temps très appréciables au niveau du personnel qui fait les analyses, une réduction importante du nombre dè manipulations et une réduction en nombre du matériel utilisé, en particulier des cuves d'analyses. L'invention a pour objet un procédé de mesure succe sive, sur un même échantillon de liquide biologique, de la teneur en deux constituants différents consistant à utiliser pour ces deux mesures deux réactions enzymatiques indépendan tes et compatibles dans leur déroulement et pour lesquelles les cinétiques réactionnelles puissent être suivies successi vement à des dilutions croissantes et à des longueurs d'onde différentes, grâce à un mélange compatible de deux chromogènes appropriés. Selon le procédé de l'invention, on dilue un liquide biologique tel que le sérum sanguin dans un tampon convenable de pH voisin de 7, contenant le mélange des deux chromogènes détectables à des longueurs d'onde différentes, on déclenche une première réaction enzymatique par addition du réactif approprié et on lit le dosage du premier constituant grâce au chromogène convenable correspondant à une première longueur d'onde déterminée, puis on fixe une nouvelle longueur d'onde de lecture, on ajoute au milieu réactionnel un second réactif en solution dans ce même tampon, ce qui augmente la dilution du sérum sanguin et qui déclenche la deuxième réaction enzymatique et on lit le dosage du deuxième constituant grâce au second chromogène détectable à la nouvelle longueur d'onde. On peut notamment utiliser des chromogènes détectables, l'un a une longueur d'onde de 340 nm et l'autre à une longueur d'onde de 520 nm, tels que par exemple le .NADH (nicotinamideadénine dinucléotide) et la 4-amino-phénazone phénol. Les dilutions du sérum sanguin sont telles que la seconde est environ le double de la première Selon la présente invention on peut doser successivement sur le même échantillon de sérum sanguin l'urée et le glucose, de même que les triglycérides et le cho- lestérol, de même que la créatinine et l'acide urique. Les exemples de mise en oeuvre de l'invention qui sont donnés ci-après le sont à titre illustratif et non limitatif. Selon la présente invention on réalise dans une cuvette d'analyse, le dosage de l'urée et du glucose présents dans un échantillon de sérum sanguin. On procède à la préparation d'une solution en faisant la dilution du sérum au 1/600 dans un liquide tampon convenable, tel qu'un tampon TRIS ou phosphates, d'un pH voisin de 7, contenant les deux chromogènes utiles pour la lecture finale à des longueurs d'onde différentes, à savoir le chromogène NADH (nicotinamide-adenine-dinucléotide) et le chromogène amino-4 phénazone-phénol. On mesure en densité optique de la solution à une longueur d'onde de 340 nm. On procède au dosage de l'urée en ajoutant l'uréase et le glutamate déshydrogénase, ce qui declenche la réaction suivante uréase urée + H2O 2NH3 + CO2 glutamate déshydrogénase GLDH NH3 + alpha cétoglutarate + NADH glutamate + NAD + H2 O La mesure de la quantité d'urée hydrolysée se fait par la mesure de la variation de la densité optique entraînée par la consommation de NADH transformée en NAD (forme oxydée). Cette mesure de la chute de densité optique liée à l'absorption de NADH se fait à une longueur d'onde de 340 nm. Le dosage de liurée étant ainsi effectué, on change la longueur d'onde de lecture du spectrophotometre utilisé et on la fixe à 520 nm On ajoute une solution de glucose oxydase et de péroxydase dans le même tampon au milieu réactionnel7.ce qui fait passer la dilution du sérum sanguin dans le taepon.à 1/1200, et qui déclenche la deuxième réaction glucose oxydase glucose + 2 +H2O acide gluconique + H2O2 où la glucose oxydase catalyse l'oxydation du glucose en acide gluconique avec formation dteau oxygénée. L'eau oxygénée réagit sur le. Chromogène dêjà présent dans le milieu réactionnel la 4-amino-phénazone et le phénol péroxydase H202 + 4-amino phénazone + phénol monoimino p. benzoquinone-4-phénazone. Au moment de l'introduction de la glucose-oxydase, on mesure la densité optique initiale du mélange à une longueur d'onde de 520 nm, et quelques minutes après on mesure la nouvelle densité optique. La différence entre ces deux mesures est directement proportionnelle au taux de glucose contenu dans l'échantillon de sérum sanguin. Dans c-e procédé, les mesures du glucose et.de lturée sont possibles car il n'y a aucune gène ni interférence entre la réaction déclenchée dans le milieu réactionnel par l'addition d'urease et la réaction déclenchée par-l'addition de glucose-oxydase. De même il n'y a ni gène ni interférence entre les deux chromogènes différents qui sont détectables à des longueurs d'onde différentes. L'ordre des mesures est choisi également en fonction de la dilution convenable souhaitée pour le liquide biologique à analyser. Dans une cuvette d'analyse, on réalise le dosage des triglycérides et du cholestérol présents dans un échantillon de sérum sanguin. On-ajoute à ce dernier un mélange tampon renfermant la lipase à la cholestérol estérase et on laisse incuber (trois minutes). On ajoute ensuite à l'incubat (dilution au 1/50e du sérum sanguin) le mélange d'enzymes : glycérol kinase, pyruvate kinase, lactate déshydrogénase et le premier chromogène NADH (nicotinamide-adénine dinucléotide) qui déclenche les réactions suivantes lipase triglycérides + H2 O glycérol + acide gras glycérol kinase glycérol + ATP glycérol-3-phosphate + ADP pyruvate kinase ADP + PEP pyruvate + ATP + lactate déshydrogénase - pyruvate + NADH + H L-lactate + NAD qui conduisent à une consommation -de chromogène NADH directe mentçmesurable à- la longueur d'onde de 340 nm, par la-chute de densité optique. Cettè dernière étant proportionnelle à la quantité de triglycérides présente dans ce mélange réaction nel. Le dosage des-triglycérides etant ainsi effectué, on change la longueur d'onde de lecture du spectrophotomètre et on la fixe à 520 nm. On ajoute au mélange réactionnel le deuxième chromogène I'amino-.4-phénazone phénol et les enzymes : cholestérol oxydase péroxydase qui font passer la dilution du sérum sanguin dans ce tampon au 1/i00è et qui déclenchent- la deuxième série de réactions cholestérol estérase ester du cholestérol + H2 O cholestérol + acides gras cholestérol oxydase cholestérol cholestène-3-one + H207 2H 202 + amino-4-phénazone + phénol péroxydase monoimino-p-benzoquinone-4 phénazone + 4H2 O La différence de lecture de densités optiques initiale et finale, mesurées à 520 nm, est directement proportionnelle au taux de cholestérol contenu dans l'échantillon du sérum sanguin. Là encore, il nty a aucune gène ni interférence entre les deux réactions enzymatiques ni entre les deux chromogènes et les dilutions successives sont convenables. Dans une cuvette d'analyse, on réalise le dosage de la créatinine et de l'acide urique présents dans un échantillon de sérum sanguin. On procède à la dilution du sérum sanguin au 1/10 dans un liquide tampon tel qu'un phosphate d'un pH voisin de 7. On ajoute à cette solution les deux chromogènes utiles pour les lectures de densité optique à des longueurs d'onde différentes, à savoir le chromogène NADH (nicotinamide-adénine dinucléotide) et le chromogène amino-4-phénazone phénol. On mesure la densité optique du milieu réactionnel à une longueur d'onde de 340 nm. On procede au dosage de la créatinine en ajoutant la créatininase et la glutamate déshydrogénase, ce qui déclenche les réactions suivantes créatininase créatinine 2NH3 + C02 glutamate deshydrogénase acide 2-oxoglutarique + NH3 + NADH acide glutamique + NAD La mesure de la quantité de créatinine se fait par la mesure de la variation de densité optique entraînée par la consommation de NADH. Cette mesure de la chute de densité optique se fait à une longueur d'onde de 340 nm. Le dosage de la créatinine étant ainsi effectué, on règle le spectrophotomètre sur une longueur d'onde de 520 nm. On ajoute au mélange réactionnel une solution dans le même tampon d'uricase et de péroxydase ce qui fait passer la dilution du sérum sanguin dans le tampon à 1/200 et qui déclenche les reactions suivantes uricase acide urique + H20 allants me + H 202 péroxydase H202 + 4-aminophénazone + phénol mono imino -p- benzoquinone-4-phénazone On mesure les densités optiques avant et après ces réactions à une longueur d'onde de 520 nm.La différence est directement proportionnelle au taux d'acide urique contenu dans l'échantillon de sérum sanguin L'absence de gène et d'interférence entre les deux réactions enzymatiques et les deux chromogènes permet des dosages précis à des dilution-s convenables. On peut -imaginer l'association d'autres systèmes enzymatiques telle que le déroulement ou le signal de fin de réaction, caractérisant chaque système, puisse être détecté spécifiquement à des longueurs d'onde différentes. Sur ce principe deux dosages différents, portant sur le même échantillon à analyser (sérum sanguin, liquides biologiques, etc...) contenu dans le même cuvette ou appliqué à tout autre support unique, peuvent être opérés successivement sans ambiguité ni interférence. Le mode opératoire est indépendant de la nature du milieu réactionnel, de la forme de présentation du ou des enzymes et des autres constituants réactionnels, qu'ils soient solubles, immobilisés ou fixés au compartiment d'analyse. En tenant compte de l'ordre de dilution croissante, qui peut être calculee par système informatique, on peut réaliser selon le même mode opératoire plus de deux dosages sous condition que l'association de systèmes enzymatiques permette des détections à des longueurs d'onde différentes (chromogènes différents). De même, l'invention a pour objet un procédé de mesure simultanée, sur un même échantillon de liquide biologique, de sa teneur en- plusieurs constituants différents consistant à utiliser pour ces mesures plusieurs réactions enzymatiques indépendantes et compatibles dans leur déroulement et pour lesquelles les signaux de fin de réaction puissent être suivis simultanément à des dilutions croissantes et à des longueurs d'onde différentes grâce à des chromogènes appropriés. REVENDICATIONS 1. Procédé de mesure successive, sur un même échan- tillon de liquide biologique dans la même cuvette ou sur le même support d'analyse, de sa teneur- en deux ou plusieurs constituants différents, consistant à utiliser pour ces mesures successives deux ou plusieurs réactions enzymatiques indépendantes et compatibles dans leur & roulément et pour lesquelles les signaux de fin de réaction puissent être suivis successivement à des dilutions croissantes et à des lan- gueurs d'onde différentes grâce à un mélange compatible de chromogènes appropriés. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel tout liquide biologique peut être analysé (sérum,sanguín, liquide céphalorachidien, etc...). 3. Procédé selon les revendications I et 2, dans lequel on dilue le liquide biologique dans un tampon convenable de pH voisin de 7, on ajoute les deux chromogènes détectables à des longueurs d'ondes différentes, on déclenche une première réaction enzymatique par addition du réactif approprié et on lit le dosage du premier constituant grâce au chromogène convenable correspondant à une première longueur d'onde déterminée, puis on fixe une nouvelle longueur d'onde de lecture, on ajoute au milieu réactionnel un second réactif en solution dans le même tampon, ce qui augmente la dilution du liquide biologique et qui déclenche la deuxième réaction enzymatique, et on lit le dosage du deuxième constituant grâce au second chromogene détectable à la nouvelle longueur d'onde. 4. Procédé selon les revendications précédentes, dans lequel le premier chromogène est détectable à une longueur d'onde de 340 nm et le second est détectable à une longueur d'onde de 520 nm. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le premier chromogène est NADH (nic-otinamide-adénine dinucléotide) et le second chromogene-est la-4-amino-phénazone-phénol. 6. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la second dilution du liquide biologique est environ le double de la première dilution. 7. Procédé selon les revendications 1 à 6, dans lequel les constituants à doser sont l'urée et le glucose. 8. Procédé selon les revendications 1 à 6, dans lequel les constituants à doser sont les triglycérides et le cholestérol. 9. Procédé selon les revendications 1 à 6, dans lequel les constituants à doser-sont la créatinine et l'acide urique. 10. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la premiere réaction enzymatique est déclenchée par addition d'uréase et de glutamate déshydrogénase pour le dosage de l'urée et la deuxième réaction enzymatique est déclenchée par addition de glucose oxydase et de péroxydase pour le dosage du glucose. 11. Procédé selon la revendication 8,- dans lequel la première réaction enzymatique est déclenchée par addition de glycérol kinase, pyruvate kinase et lactate déshydrogénase pour le dosage des triglycérides et la deuxième réaction enzymatique est déclenchée par addition de cholestérol oxydase et péroxydase pour le dosage du cholestérol. 12. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la première réaction enzymatique est déclenchée par addition de créatininase et de glutamate déshydrogénas e pour le dosage de la créatinine, et la deuxième réaction enzymatique est déclenchée par addition d'uricase et de péroxydase pour le dosage de l'acide urique. 13. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le mélange compatible de chromogènes appropriés permet de suivre la cinétique des réactions différentes à des longueurs d'ondes différentes, aussi bien pour des mesures successives que pour des mesures simultanées. 14. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le mélange compatible de chromogènes appropriés permet la confection de tous systèmes réactifs répondant au mode opératoire déjà décrit. 15. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la mesure sur un meme échantillon d'analyse, s'applique aussi si lwéchantillon est contenu dans la même cuvette ou déposé sur n importe quel support.