Brevet FR2532431A1 — publié le 19840302

L'invention concerne un procédé et un appareil pour distinguer de multiples sous-populations de parti- cules, et elle a trait plus particulièrement à un procédé et à un appareil pour distinguer et dénombrer simultané- ment de multiples sous-populations de cellules ayant été marquées au moyen de différents fluorochromes. Des cytomètres actuellement connus et dispo- nibles, travaillant au défilé, et les appareils analogues de détection de particules comprennent communément deux canaux pour la détection de deux sous-populations de cellules dans un mélange Par exemple, -on connait des appareils qui comportent deux canaux à fluorescence pou- vant détecter des cellules marquées spécifiquement par deux agents fluorescents associés aux canaux à fluores- cence respectifs Dans ces types d'appareils, un canal complet à fluorescence, comprenant le circuit électrique et les détecteurs de fluorescence, doit être associé à chaque cellule, traitée au fluorochrome, devant être détectée dans le mélange de cellules de l'échantillon à analyser -Par conséquent, pour détecter de multiples sous-populations de cellules dans un échantillon par* cytométrie au défilé, il faut utiliser, dans les appareils connus et classiques, un nombre équivalent de canaux à fluorescence Une autre limitation est que la nature des caractéristiques d'excitation et d'émission des fluoro- chromes rend difficile d'obtenir plus de deux fluoro- chromes, pouvant être fixés à une protéine, qui produisent des émissions sur des longueurs d'ondes suffisamment séparées Certains appareils représentatifs utilisant la cytométrie classique au défilé sont décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N O 4 198 160, N O 3 738 759 et NO 3 864 571, et dans l'ouvrage "A Proposal for an Automatic Multiparameter Analyzer for Cells (AMAC)", de Robert C Leif, Automated Cell Identification and Cell Sorting, édité par George L Wied, Academic Press, New York 1970, pages 131-159. Il existe de nombreux cas dans lesquels il est souhaitable de pouvoir détecter de multiples sous- populations de cellules à partir d'un mélange d'échantil- lons Cependant, comme indiqué précédemment, l'un des inconvénients présentés par un équipement classique est qu'il faut utiliser plusieurs fluorochromes pour marquer les cellules, ainsi qu'un nombre équivalent de canaux à fluorescence pour surveiller les caractéristiques spec- trales spécifiques associées aux fluorochromes individuels. De plus, on ne dispose pas actuellement d'un nombre suffi- sant de fluorochromes Ceci pose donc deux gros problèmes. Bien qu'il soit souhaitable de pouvoir détecter et égale- ment de dénombrer de multiples sous-populations de cellu- les à partir d'un mélange échantillon, il est encore plus souhaitable de minimiser le nombre de fluorochromes utilisés ainsi que le nombre de canaux à fluorescence et de circuits associés Compte tenu de ceci, l'invention a pour but de résoudre le problème précité tout en satis- faisant le besoin de déterminer de multiples sous- populations de cellules à partir d'un mélange échantillon. Conformément à l'invention, un procédé pour distinguer de multiples souspopulations de particules à partir d'un échantillon unique departicules de divers types consiste à marquer des substances réceptives au moyen d'au moins deux agents marqueurs, utilisés dans plusieurs proportions différentes, choisies à l'avance. Les proportions peuvent être comprises entre O % et 100 % de chaque agent présentant une caractéristique de marquage identifiable et quantifiable Ce procédé consiste en outre à mélanger les substances marquées différemment avec des particules que l'on suspecte d'avoir des récep- teurs spécifiques pour les substances marquées différem- ment Chaque particule est analysée pour déterminer la proportion des deux caractéristiques identifiables de marquage associées à cette particule Ensuite, chaque particule peut être classée dans une catégorie de sous- population si son rapport de caractéristiques de marquage est en relation avec l'un des rapports ou l'une des pro- portions choisis à l'avance des agents de marquage. Dans la forme préférée de cet aspect de l'in- vention, le procédé consiste à marquer des protéines d'anticorps à l'aide de deux fluorochromes, dans plusieurs rapports ou proportions différents, choisis à l'avance. Chaque fluorochrome possède un spectre d'émission distinct. Une énergie d'excitation est fournie aux cellules par des techniques de cytométrie au défilé afin d'exciter les deux types de fluorochromes Chaque cellule est soumise à une analyse visant à déterminer la fluorescence émise par les deux fluorochromes excités pour établir ainsi le rapport des émissions de fluorescence Ensuite, chaque cellule est classée par catégorie de souspopulations si elle correspond à l'une des proportions choisies à l'avance de protéines d'anticorps marquées Une numéra- tion simultanée des sous-populations de cellules peut également être réalisée par la présente invention. Un autre aspect de la présente invention réside dans un appareil destiné à distinguer de multiples sous- populations de particules à partir d'un échantillon de particules s'écoulant par un circuit liquide Les parti- cules sont marquées d'au moins deux agents de marquage- différents possédant des caractéristiques identifiables- et quantifiables L'appareil comporte des moyens destinés à détecter séparément les caractéristiques quantifiables associées à chaque particule et à déterminer un rapport ou une proportion de deux, quelconques, de ces caracté- ristiques quantifiables Il est prévu des moyens destinés à enregistrer les rapports afin que les particules puis- sent être classées entre plusieurs catégories de sous- populations. Dans une forme préférée de réalisation de cet aspect de l'invention, l'appareil distingue et dénombre simultanément de multiples souspopulations de cellules qui ont été marquées avec au moins deux fluorochromes différents Des moyens sont prévus pour exciter les fluoro- chromes portés par chaque cellule lorsque ces cellules s'écoulent dans un circuit liquide L'appareil préféré comporte en outre des moyens destinés à détecter séparé- ment la quantité de fluorescence émise par les deux fluoro- chromes différents associés à chaque cellule et à déterminer le rapport des quantités de fluorescence des deux fluoro- chromes En outre, il est prévu des moyens destinés à afficher les rapports ou proportions afin que les cellules puissent être classées parmi plusieurs catégories de sous- populations et qu'elles puissent être dénombrées. Il entre également dans le cadre de l'inven- tion de déterminer des rapports de particules rendues fluorescentes, ayant des caractéristiques d'émission simi- laires, mais des caractéristiques d'excitation différentes Des sources lumineuses différentes peuvent être nécessaires pour l'excitation, tandis qu'un seul détecteur de fluores- cence suffit De plus, on peut déterminer des rapports, conformément à l'invention, en utilisant des particules rendues fluorescentes ayant à la fois des caractéristiques d'excitation différentes et des caractéristiques d'émis- sion différentes. Les principes de la présente invention permet- tent d'obtenir un certain nombre d'avantages et d'atteindre certains objectifs En premier lieu, la présente invention permet l'analyse et la détermination de multiples sous- populations de particules ou cellules, en quantité supé- rieure à celle du nombre de fluorochromes utilisés En outre, on peut déterminer un nombre de sous-populations de cellules supérieur au nombre de canaux de détection à fluorescence et au nombre de circuits électroniques associés utilisés Dans la présente invention, un instru- ment construit de façon simple nécessite seulement deux canaux à fluorescence capables de détecter des spectres d'émission distincts de deux fluorochromes différents. Lors d'une analyse effectuée dans un appareil tel que celui décrit cidessus, des sous-populations de cellules sont distinguées par détermination du rapport ou de la proportion des deux fluorochromes distincts associés à chaque cellule en utilisant uniquement deux canaux à fluorescence, dirigés chacun de façon à détecter le spectre d'émission distinct des fluorochromes En utilisant un rapport, on peut déterminer de nombreuses sous-populations de cellules-marquées par seulement deux fluorochromes ou autres agents marqueurs identifiables De plus, dans les techniques de cytométrie au défilé prévues dans la pré- sente invention, de multiples sous-populations de cellules peuvent être détectées en ordre rapide à partir d'un échan- tillon unique de cellules Non seulement l'invention permet la détection de multiples sous-populations de cellules, mais elle permet également la numération simultanée des cellules ainsi détectées En outre, en faisant appel à un rapport de signaux détectés pour chaque particule ou cellule, les cellules ou particules sont distinguées d'après le paramètre de rapport ou de proportion, qui est indépen- dant de la quantité d'agents marqueurs à fluorescence liés à une cellule; de plus, les répartitions de sous- populations de cellules ne se recouvrent pas, ce recouvre- ment entraînant des résultats erronés ou imprécis Un autre avantage est qu'il est possible de détecter-la liaisoi non spécifique dvagents rendus fluorescents sur des particuleso L'invention sera-décrite plus en détail en regard des dessins annexés à titre-d'exemple nullement limitatif et sur lesquels g la figure 1 est une représentation schématique d'un appareil de cytométrie destiné à détecter deux carac- téristiques de fluorescence de particules individuelles parcourant un circuit d'écoulement à partir d'une source d'échantillons; et la figure 2 est une représentation graphique de multiples sous-populations-de particules déterminées par une technique de distinction de rapports conformément au principe de la présente invention. Les dessins, et plus particulièrement la figure 1, représentent schématiquement un appareil 10 de cytométrie destiné à détecter des cellules ou d'autres particules ayant des paramètres particuliers Avant que toutes parti- cules soient analysées dans l'appareil 10 de détection, elles sont traitées au moyen de plusieurs agents de mar- quage présentant des caractéristiques de marquage quanti- fiables, de préférence différentes les unes des autres. Par exemple, au cours de tests dans lesquels des cellules doivent être classées, ii est très avantageux de travailler avec des protéines d'anticorps En général, ces protéines d'anticorps sont marquées par deux agents de marquage, de préférence des fluorochromes, bien qu'il soit possible d'utiliser trois ou plus de ces agents Chaque fluoro- chrome possède des spectres distincts d'émission et/ou d'excitation dans des bandes de couleurs définies de façon spécifique Les fluorochromes sont liés aux protéines d'anticorps de manière que les nombres de ces protéines marqués par les fluorochromes forment un rapport connu. En marquant différentes protéines d'anticorps, spécifiques chacune à des récepteurs d'un certain type de cellules, avec des rapports différents de fluorochromes, plusieurs de ces anticorps marqués différermment peuvent être mélangés ensemble et mis en réaction avec une population de cellules dans un mélange témoin Chaque anticorps, auquel sont fixés des fluorochromes dans un rapport connu# se lie ensuite aux cellules ayant des récepteurs spécifiques à ce rapport, marquant ainsi des sous- populations de cellules Une fois que ce traitement a été réalisé et que les sous-populations de cellules spécifiques ont été marquées, l'échantillon de cellules est placé dans une source 12 d'échantillons associée à l'appareil 10 de détection tel que montré sur la figure 1. Avant d'expliquer le fonctionnement de l'appa- reil 10 de détection, d'une manière générale, les deux fluorochromes ou autres agents de marquage,s'ils sont utilisés avec la présente invention, peuvent être appli- qués sur les substances réceptives, telles que des protéines d'anticorps, dans des rapports ou proportions différents, choisis à l'avance Ces rapports s'étendent entre O % et % de chaque fluorochrome; c'est-à-dire qu'une protéine d'anticorps peut ne pas porter de fluorochrome du premier type et que l'on peut trouver 100 % d'un fluorochrome du second type sur cette même protéine d'anticorps Il est évident que les divers rapports des deux fluorochromes, compris entre les valeurs extrêmes de O % et de 100 %, sont inclus dans le cadre de l'invention En outre, les techniques cytométriques actuelles et les équipements les mettant en oeuvre doivent permettre la détection d'au moins cinq sous-populations différentes de cellules à l'aide du procédé et de l'appareil tels que décrits dans le pré- sent mémoire Il convient cependant de noter que plus de cinq souspopulations de cellules peuvent être distinguées par le procédé et l'appareil selon l'invention, mais la qualité du signal peut ne pas être aussi bonne qu'avec une mesure portant sur cinq rapports En outre, l'utilisa- tion de trois fluorochromes ou plus accroît notablement le nombre de rapports ou proportions pouvant être identi- fi éspar la présente invention En ce qui concerne à présent les caractéris- tiques particulières de l'appareil 10 de détection de la figure 1, une source 12 d'échantillon contient les substan- ces, par exemple des cellules, qui ont été traitées avec des agents de marquage différents, tels que des fluoro- chromies, en plusieurs proportions ou rapports différents, choisis à l'avance Dans la description qui suit, deux de ces fluorochromes sont utilisés pour traiter les cellu- les uniquement à titre d'exemple et pour faciliter la description Les cellules traitées 14 sont introduites dans un courant fluide, de préférence individuellement, de manière à être dirigées vers une zone 15 de détection qu'elles traversent, par exemple un orifice permettant de détecter les aspects optiques des cellules Les para- mètres de détection sont bien connus dans les dispositifs de cytométrie au défilé, et un tel dispositif de détection est décrit dans un article de Thomas, Ro A et collabora- teurs "Combined Optical and Electronic Analysis of Cells with the AMAC Transducers", The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, volume 25, N 7, pages 827-835, 1977. Lorsque chaque cellule traitée 14 traverse la zone sensible , elle reçoit la lumière provenant d'une source 16 Cette dernière transmet de la lumière aux cellules et elle peut comprendre des lasers, des-lampes à mercure ou au xénon ou autres, capables d'émettre un certain nombre de raies sur une large bande des zones de couleurs De plus, la lumière provenant de la source 16 de la forme de réalisation décrite doit être suffisante pour provoquer une excitation des deux fluorochromes différents utilisés pour traiter les cellules 14 Ainsi, lorsque la lumière atteint chaque cellule 14, les fluorochromes qui sont liés à cette der- nière sont excités, ce qui déclenche un mécanisme permet- tant de distinguer les caractéristiques de fluorescence de chaque cellule Il convient de noter que lorsque l'on choisit des fluorochromes ayant des plages d'excitation différentes, il peut être nécessaire d'utiliser plus d'une source de lumière pour couvrir les longueurs d'ondes dis- parates de l'excitation. Après avoir traversé la zone sensible, chaque cellule est recueillie dans un récipient 18 Bien que cela ne soit pas représenté, les cellules peuvent être triées suivant des techniques de tri connues par lesquelles des sous-populations de cellules peuvent être recueillies séparément La lumière fluorescente provenant de chaque cellule, y compris la fluorescence provenant de jusqu'à deux fluorochromes ayant des spectres d'excitation dis- tincts, est alors dirigée vers un miroir dichroique 19. La fonction du miroir dichroique 19 est de séparer deux couleurs différentes suivant le trajet de lumière renvoyée, produite par les caractéristiques de fluorescence de chaque cellule De cette manière, les deux couleurs différentes peuvent être analysées séparément pour que l'on obtienne ainsi un rapport tel que décrit ci-après. Le miroir dichroique 19 doit être choisi pour séparer, par exemple, la région verte de la région rouge du spectre des couleurs Les longueurs d'ondes de la région de la première couleur sont réfléchies le long d'un trajet optique 20, tandis que les longueurs d'ondes de la région de la seconde couleur sont transmises à travers le miroir dichroique 19 suivant un trajet optique 21 Chaque trajet lumineux, réfléchi par ou transmis à travers le miroir dichroique, est ensuite capté par des détecteurs 22 et 24, respectivement, de fluorescence prévus pour recevoir - l'énergie lumineuse répartie entre les deux régions Les détecteurs 22 et 24 de fluorescence peuvent être des tubes photomultiplicateurs-classiques qui convertissent des signaux optiques en signaux électriques Ces signaux élec- triques sont ensuite transmis à des circuits électroniques respectifs 25 et 26 de traitement d'impulsions, dans les- quels les signaux électriques sont traités à des fins d'analyse Dans le cadre de cette analyse, et de préfé- rence dans les circuits électroniques de l'appareil décrit dans le présent mémoire, un rapport-des signaux électriques est déterminé Dans le dispositif 27 de détermination de rapport, le signal de fluorescence provenant des détecteurs 22 de fluorescence est mis en relation; sous la forme d'un rapport, avec le signal de fluorescence provenant du détecteur 24 de fluorescence, ou vice versa Le dis- positif 27 de détermination de rapport constitue donc,un mécanisne permettant de déterminer la fluorescence émise par les deux fluorochromes excités, associés à chaque- cellule, et d'établir le rapport de leurs émissions fluores- centeso Cette information de rapport est ensuite trans- mise à un visuel 28 L'association des circuits électroni- ques 25 et 26, du dispositif 27 de détermination de c 25 rapport et du visuel 28 est de préférence constituée en totalité de circuits électriques qui produisent divers affichages, diverses présentations d'informations, divers cumuls ou enregistrements du rapport des signaux de fluorescence associés à chaque cellule analysée Les com- posants électriques réalisant une analyse du signal électrique concernant la fluorescence peuvent être con- formes à la technologie actuelle et peuvent varier suivant le niveau de sophistication de l'analyse et de la présen- tation des donnéeso Un tel-dispositif électrique de déter- mination de fluorescence est décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 826 364 Le visuel 28 comporte de préférence un écran permettant d'observer visuellement, sous forme graphique, le classement de chaque cellule par catégorie de sous- population De plus, l'appareil 10, ainsi que les circuits électroniques et le visuel, peuvent être conçus pour la pro- grammation préalable d'une information de rapport dans le circuit Par exemple et comme indiqué sur la figure 2, les circuits électroniques et le visuel peuvent être pro- grammés à l'avance de façon à contenir des rapports de fluorescence définis de façon spécifique et indiqués le long de l'axe X de l'écran Ces rapports peuvent comprendre les mêmes rapports de fluorochroimes choisis à l'avance pour traiter les protéines d'anticorps, que ceux spécifi- ques à certains types de cellules L'axe Y de l'écran peut être programmé à l'avance pour indiquer le nombre de cellules associées aux rapports définis spécifiquement le long de l'axe X De cette manière, un histogramme ou représentation graphique des sous-populations de cellules classées en catégoriesspécifiques peut être visualisé et enregistré, si cela est souhaité Ainsi qu'on peut le voir sur la figure 2, cinq sous- populatiàns de cellules, ayant des rapports spécifiques de fluorescence, sont identifiées, les rapports spécifiques de fluorescence étant 10/1 L'aire s'étendant au-dessous de chacune des crêtes A à E, associées chacune à un type de cellules, donne le nombre compté de cellules de ce type Si cela est souhaité, le circuit électronique de l'appareil peut être conçu pour calculer le nombre approximatif de cellules classées dans chaque sous- population. Il convient de noter que l'appareil selon l'invention établit donc le classement de sous-populations de cellules et les nombres de cellules de chaque sous- population en une détermination simultanée, ce classement et cette numération pouvant ensuite être présentés visuel- lement à l'opérateur De plus, étant donné qu'un rapport est utilisé, les cellules sont distinguées par cette technique de rapport, indépendamment de la quantité d'anticorps traitésaux fluorochromes, liée à une cellule; comme on peut le voir sur la figure 2, les répartitions des souspopulations de cellules ne se recouvrent pas en raison de l'effet de normalisation du rapport Lors de l'établissement de ces classements de sous-populations de cellules, des fenêtres 30 sont établies autour de chaque rapport choisi à l'avance afin de'former une plage pour l'établissement des classements spécifiques A l'analyse, les cellules qui tombent dans des fenêtres- de l'échelle des rapports sont considérées comme étant marquées de façon spécifique;-les cellules auxquelles des'fluorochromes ou d'autres agents de marquage ne sont pas liés de façon spécifique présentent-des rapports extérieurs aux fenêtres-admises,-par exemple des rapports' se trouvant dans les creux 31 compris entre les crêtes de la courbe, ainsi qu'on peut le voir sur la représen- tation graphique de la figure 2 Par conséquent, les cellules extérieures aux fenêtres 30, localisées dans les creux 31, sont considérées comme n'étant pas marquées de façon spécifique et sont rejetées par le circuit électronique Cependant, des cellules marquées de façon non spécifique présentent des rapports extérieurs aux fenêtres des rapports admis, ce qui permet une numéra- tion séparée de ces cellules. Bien que le graphique de la figure 2 et l'appareil décrit, d'une manière générale, permettent de distinguer et de classer cinq sous-populations diffé- rentes de cellules, le nombre de types de cellules pou- vant être distingués ou identifiés par le procédé et l'appareil selon l'invention peut être supérieur à cinq. Cependant, la forme du signal doit convenir à la résolu- tion de rapports plus rapprochés, c'est-à-dire 9/1, 8/1, 7/1, etc Il convient également de noter que le procédé selon l'invention est le plus efficace en l'absence de réactions mutuelles, c'est-à-dire lorsque chaque protéine d'anticorps ne marque qu'un type de cellules et que chaque typede cellules n'accepte, à des fins de liaison, qu'un type-de protéinesd'anticorpso Les exemples suivants décrivent à titre illus- tratif,-mais non limitatif,'de la présente invention, le mécanisme permettant de détecter et de distinguer de multiples sous-populations de particules. Exemple 1 On synthétise un polymère fluorescent ayant des proportions, pouvant être choisies à l'avance, de' deux monomères fluorochromatiques, dans ce cas de la fluorescéine et de la rhodamine La fluorescéine, lors- qu'elle est excitée, émet une fluorescence dans la zone bleue du spectre des couleurs; par ailleurs, lorsqu'elle est excitée, la rhodamine émet une zone jaune du spectre des couleurs. de polymère sont synthétisées de la Préparation de polymère 1 100 % dc 0 % d Préparation de polymère 2 75 % di 25 %o d Préparation de polymère 3 50 % d E % d E Préparation de polymère 4 25 % d E % de Préparation de polymère 5 O % d % d E Des protéines d'anticori fluorescence dans la Cinq préparations manière suivante: e fluorescéine, e rhodamine. e fluorescéine, e rhodamine. e fluorescéine, e rhodamine. e fluorescéine, e rhodamine. a fluorescéine, e rhodamine. ps, qui sont spécifi- ques pour un certain type de cellules désigné ici type A de cellules, sont ensuite marquées de la préparation de polymère 1; des protéines d'anticorps spécifiques au type B de cellulessont marquées à l'aide de la préparation de polymère 2; des protéines d'anticorps spécifiques au type C de cellules sont marquées avec la préparation de polymère 3; des protéines d'anticorps spécifiques au type D de cellules sont marquées à l'aide de la pré- paration de polymère 4; et des protéines d'anticorps spécifiques au type E de cellulessont marquées avec la préparation de polymère 5. Tous les anticorps conjugués (marqués) sont mélangés, puis le mélange est ajouté à un échantillon de cellules L'échantillon comprend des cellules qui sont supposées posséder des récepteurs spécifiques pour les anticorps marqués différemment Des cellules du type A sont alors marquéesuniquement par les fluorochromes de la préparation de polymère 1, les cellules de type B par les fluorochromes de la préparation de polymère 2, les cellules de type C par les fluorochromes de la préparation de polymère 3, les cellules de type D par les fluoro- chromes de la préparation de polymère 4 et les cellules de type E par les fluorochromes de la préparation de polymère 5. Lors d'une analyse effectuée dans un appareil tel que celui décrit en regard de la figure 1, chaque cellule traitée est analysée et son signal de fluorescéine vert et son signal de rhodamïne rouge sont détectés et traités électriquement pour former un rapport comme indi- qué dans la description précédente de l'appareil 10 Pour des cellules de type A, ce rapport est supérieur à 10/1 pour des cellules du type B, le rapport est de 3/1; pour des cellules du type C, le rapport est de 1/1; pour des cellules du type D, le rapport est de 1/3 et pour des cellules du type E, le rapport est quent, en déterminant le rapport des fluorescences jaune/ bleu de chaque cellule à son passage à travers l'appareil de détection, on peut classer cette cellule comme appar- tenant à l'un des cinq types Une représentation graphique de ce classement est similaire à celle illustrée sur la figure 2. Exemple 2 On utilise deux préparations de polymère, l'une contenant uniquement de la fluorescéine et l'autre contenant uniquement de la rhodamine On réalise les préparations suivantes Préparation 1 100 % de protéine d'anticorps marquée avec un polymère contenant de la fluorescéine. Préparation 2 75 % de protéine d'anticorps marquée avec un polymère contant de la fluorescéine, et 25 % de la protéine d'anticorps marquée avec un polymère contenant de la rhodamine. Préparation 3 -50 % de protéine d'anticorps marquée avec un polymère contenant de la fluorescéine, et 50 O de protéine d'anticorps marquée avec un polymère contenant de la rhodamine. Préparation-4 25 % de protéine d'anticorps marquée avec un polymère contenant de la fluorescéine, et 75 % O de protéine d'anticorps marquée avec unx polymère contenant de la rhodamine. Préparation 5 100 % de protéine d'anticorps marquée avec un polymère contenant de la rhodamine. Lorsqu'un mélange de ces cinq préparations d'anticorps est ajouté à une population de cellules mélangées (que l'on suspecte de posséder des récepteurs spécifiques pour les protéines d'anticorps marquées différemment), des cellules du type A n'acceptent que des anticorps mar- qués de la préparation 1; des cellules du type B acceptent des anticorps marqués de la préparation 2; des cellules du type C acceptent des anticorps marqués de la préparation 3; des cellules du type D acceptent des anticorps marqués de la préparation 4 et des cellules du type E acceptent des anticorps marqués de la préparation 5 Une analyse effectuée dans un cytomètre au défilé, tel que l'appareil de la figure 1, donne les données analogues à celles indi- *quées dans l'exemple 1. Exemple 3 On produit de nouveau les préparations de l'exemple 2, sauf que des anticorps marqués à l'isothio- cyanate de fluorescéine et à 1 ' isothiocyanate de rhodamine sont utilisés à la place des polymères contenant de la fluorescéine et des polymères contenant de la rhodamine. L'analyse de ces cellules dans un cytomètre à fluorescence double, travaillant au défilé, donne des résultats sensi- blement analogues à ceux indiqués dans l'exemple 1. Exemple 4 On produit des microsphères qui contiennent des rapports choisis à l'avance de deux fluorochromes ayant des caractéristiques d'émission différentes Les microsphères peuvent être produites conformément au brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 790 492 Les préparations de microsphères sont ensuite substituées aux préparations de polymère de l'exemple 1 Une analyse au défilé donne des résultats analogues à ceux indiqués dans l'exemple 1. Exemple 5 On prépare des microsphères analogues à celles de l'exemple 4, des microsphères contenant de la fluores- céine et des microsphères contenant de la rhodamine étant substituées aux deux types de polymèresindiqués dans l'exemple 2 Une analyse effectuée dans un cytomètre au défilé donne les résultats sensiblement similaires à ceux indiqués dans l'exemple 1. L'invention concerne donc un procédé et un appareil de détection et de distinction de multiples sous- populations de particules dans une population plus impor- tante de particules Un avantage de l'invention est que le nombre de souspopulations pouvant être distinguées est très supérieur au nombre d'agents fluorescents et de canaux à fluorescence utilisés dans l'invention En uti- lisant un rapport des signaux de fluorescence, on peut détecter et classer des sous-populations de particules, en même temps que l'on peut dénombrer les particules classées dans chaque sous-population. Il va de soi que de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé et à l'appareil décrits et représentés sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 Procédé pour distinguer de multiples sous- populations de cellules ( 14), caractérisé en ce qu'il consiste à marquer des protéines d'anticorps avec deux fluorochromes, en plusieurs rapports différents desdits fluorochromes, choisis à l'avance et compris entre O % et 100 % de chaque fluorochrome, les deux fluorochromes possédant des spectres d'émission distincts, à former un mélange desdites protéines d'anticorps marquées différem- ment, à combiner le mélange à un échantillon de cellules que l'on suppose avoir des récepteurs spécifiques pour lesdites protéines d'anticorps marquées différemment à appliquer une énergie d'excitation aux cellules par des techniques de cytométrie au défilé afin d'exciter les deux types de fluorochromes, à analyser chaque cellule pour déterminefr la fluorescence émise par les deux fluoro- chromes excités et pour établir le rapport des émissions fluorescentes, et à classer chaque cellule par catégorie de sous-population si elle correspond à l'un des rapports choisis à l'avance des protéines d'anticorps marquées. 2 Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'au moins un type de protéine d'anticorps est marqué avec 100 % du premier fluorochrome et O % du second fluorochrome. 3 Procédé selon la revendication 2, carac- térisé en ce qu'au moins un type de protéine d'anticorps est marqué avec 100 % du second fluorochrome et O % du premier fluorochrome. 4 Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que les protéines d'anticorps sont marquées par des fluorochromes polymèresayant des proportions pouvant être choisies à l'avance de monomères fluoro- chromatiques Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que les protéines d'anticorps sont marquées par combinaison de ces protéines avec chacune de plusieurs microsphères contenant des rapports, choisis à l'avance, de deux fluorochromes conçus pour se combiner avec lesdites protéines d'anticorps. 6 Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il consiste en outre à déterminer le nombre approximatif de cellules classées dans chaque sous-population. 7 Procédé selon la revendication 6, carac- térisé en ce qu'il consiste en outre à déterminer le nombre approximatif de cellules qui ne sont pas marquées de façon spécifique et qui ne tombent pas dans une sous- population quelconque définie. 8 Procédé selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce-que le classement des sous- populations de cellules et les nombres de cellules dans chaque sous-population ou à l'extérieur de chaque sous- population sont déterminés simultanément et affichés visuellement pour l'opérateur. 9 Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'au lieu d'avoir des spectres d'émission distincts, les fluorochromes présentent des spectres d'excitation distincts, mais le rapport des émissions fluorescentes reste utilisé pour l'analyse des cellules marquées. Procédé selon l'une des revendications 1 et 9, caractérisé en ce que les protéines d'anticorps sont marquées par plus de deux fluorochromes, ayant des caractéristiques différentes et utilisées dans des rap- ports prédéterminés de deux quelconques des deux fluoro- chromes. 11 Procédé pour distinguer des sous- populations multiples de particules ( 14) à partir d'un échantillon unique ( 12) de particules de divers types, caractérisé en ce qu'il consiste à marquer des particules réceptives à l'aide d'agents de marquage en plusieurs rapports différents, choisis à l'avance, desdits agents, compris entre 0 % et 1005 N de chaque agent, chaque agent possédant des caractéristiques de marquage distinctives et quantifiables, à mélanger lesdites particules marquées différemment à des substances que l'on suspecte de posséder des récepteurs spécifiques pour lesdites particules mar- quées différemment, et à analyser chaque particule pour déterminer lerapport de deux caractéristiques-de marquage identifiables quelconques, associées à chaque particule, afin que chaque particule puisse être classée dans une catégorie de sous-population si son rapport de caractéris- tiques de marquage est en relation avec l'un des rapports, choisis à l'avance, des agents de marquage. 12 Appareil pour distinguer de multiples sous-populations de particules ( 14) qui ont été marquées avec des fluorochromes différents, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens ( 16) destinés à exciter les fluoro- chromes portés par chaque particule lorsque cette dernière s'écoule dans un circuit liquide, des moyens ( 22, 24, 25, 26, 27) destinés à détecter la quantité de fluorescence émise par les fluorochromes différents associés à chaque particule et à déterminer-le rapport des quantités de fluorescence de deux fluorochromes quelconques, et des moyens destinés à classer les particules-en plusieurs catégories de sous-populations en fonction desdits rapports. 13 Appareil selon la revendication 12, caractérisé en ce que les moyens d'excitation compren- nent une source-de lumière ( 16) et en ce que les moyens de détection comprennent des photodétecteurs ( 22, 24) conçus chacun pour détecter une énergie lumineuse située dans des zones de couleurs définies de façon spécifique. 14 Appareil selon la revendication 12, caractérisé en ce que les rapports des quantités de fluorescence sont déterminés électriquement et transmis aux moyens de classement. Appareil pour distinguer des sous- populations multiples de particules ( 14) d'un échantillon ( 12) de cellules s'écoulant dans un circuit liquide, les particules ayant été marquées avec des agents de marquage différents présentant des caractéristiques quantifiables, l'appareil étant caractérisé en ce qu'il comporte des moyens ( 22, 24, 25, 26, 27) destinés à détecter les carac- téristiques quantifiables associées à chaque particule et à déterminer un rapport de deux caractéristiques quanti- fiables quelconques de ces particules, et des moyens des- tinés à distinguer lesdits rapports afin que les particules puissent être classées en plusieurs catégories de sous- populations. 16 Appareil selon l'une des revendications et 15, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens destinés à déterminer le nombre approximatif de particules classées dans chaque souspopulation, en même temps que les catégories de sous-pbpulations des parti cules sont détectées. 17 o Appareil selon la revendication 16, carac- térisé en ce qu'il comporte en outre des moyens destinés à déterminer le nombre approximatif de particules qui ne sont pas marquées de façon spécifique et qui ne tombent pas dans une sous-population quelconque définie. 18 Appareil selon la revendication 17, carac- térisé en ce que les moyens de détermination-du nombre de particules comprennent un visuel ( 28) destiné à indi- quer le nombre de particules classées dans chaque sous- population ou à l'extérieur de chaque sous-population.