Brevet FR2531338A1 — publié le 19840210

La présente invention concerne de nouvelles compositions thérapeutiques destinées au traitement et à la prévention des allergies de contact produites par les anacardiacées et les produits qui en dérivent. Approximativement 80% des Américains (E.U.A.) sont hyper sensibles au "poison ivy (Toxicodendron radicants) auDboi- son oak" (T. diversllobum) ou au"poison sumad' (T vernix) et 50 % d'entre eux ont une réaction clinique (allergie de contact) (WL. Epstein, Cutis, 13, 544-548 (1974). L'agent responsable de cette "Rhus dermatitis" (A.M. Kligman, Arch. Derm.., 77, 149-180 (1958)), est un mélange de catéchols possédant une chaîne droite à 15 ou à 17 atomes de carbone, plus ou moins insaturée. Le poison ivyl'contient en majorité des dérivés en C15 : pentadécyl 3 catéchol (PDC) pentadécène-8, yl-3 catéchol, pentadécadiène-8, 11 yl-3 catéchol et pentadé catriène-8, 11, 14 yl-3 catéchol , le PDC (composé saturé) ne constituant que 2 à 3 % du total appelé URUSHIOL. Le "poison oak"contient essentiellement des catéchols possédant une chaîne en 3 de 17 atomes de carbone heptadécyl-3 catéchol (HDC), heptadécène 8 yl-3 catéchol, heptadécadiène-8, il yl-3 catéchol, heptadécatriène-8, 11, 14 yl-3 catéchol (W.F. Symes, C.R. Dawson, J. Amer. Chem. Soc., 76, 2959-2963, (1954), M. Gross, H-. Baer, H.M. Fales, Phytochemistry, 14, 2263-2266, (1975), MD. Corbett, S. Billets, J. Pharm. Sci., 64, 175-1718 (1975). Les oléo- résines extraits des"poisons oak" et"ivy"donnent des réactions d!allergie croisée sur des malades sensibles à l'une ou l'autre (W.C. Spain, J.M. Newell, M.G. Meeker, J. Allergy, 5, 571-574 (1934). Les diènes et les triènes sont plus sensibilisants que les produits saturés PDC ou HDC (R.A. Johnson, H. Baer, CH. Kirkpatrick, C.R. Dawson, R.G. Khurana, J. Allergy Clin. Immunol, 49,2735 (1972). Cet "urushiol" est également présent dans un arbre japonais d'où est extraite la laque de Chine (ou du Japon), Rhus verniciflua (arbre à laque) d'où il a été isolé la première fois par Maxima (le nom "urushiol" est tiré du nom japonais de cet arbre le kiurushi). Toutes les plantes mentionnées font partie de la famille des Anacardiacées dont font également partie le manguier (Mangifera indica), le bhilawa (Semecarpus anacardium, Indian marking nut tree), l'arbre à noix de cajou (Anacardium occidentale, cashew nut tree) et bien d'autres encore. La dermite de contact à l'urushiol concerne donc non seulement les plantes elles-mêmes ('poison ivy';'boi- son oak' 'poison sumad') mais aussi leurs dérivés : fruits (mangue, noix de cajou), laque, "encre à marquer" (S. anacardium) etc. Des allergies croisées entre toutes ces plantes ou substances ont été largement décrites dans la littérature médicale (J.C. Mitchell, A. Rook, Botanical Dermatology, Greengrass, Vancouver, 1979). Le brevet US 4 002 737 décrit un procédé pour le traitement et la prévention de ce type d'allergies par application sur la surface de la peau susceptible de venir en contact avec les composés allergéniques d'une quantité efficace de catéchol 1,2-oxygdnase préparée à partirde.P.fluorescens.Ce brevet évoque également la possibilité d'utiliser dans ce type de traitement la catéchol 2,3-oxygénase préparée à partir de P. avila. Toutefois, selon ce brevet, compte tenu de la faible stabilité de cette enzyme, celle-ci ne paraît pas particulièrement appropriée et n'a, en conséquence, fait l'objet d'aucun essai particulier. Ces deux enzymes ont, en effet, la propriété de couper les cycles catéchol pour les transformer en dérivés acycliques non-allergisants, selon le schéma suivant pour la catéchol 2,3-oxygénase (ci-après dénommée C 2,3-O) : L'urushiol étant un mélange de composés de formule C 15 H31 -(CH)7 - CH = CH - (CH2)5 - CH3 27 - (CH2)7 - CH = CH CH2 - CH = CH - (CH2)2 - CH3 ( - (CH2)7 - CH = CH - CH2 - CH = CH - CH2 - CH-= CH2 celui-ci peut être détoxifié par les enzymes précé dentes qui coupent les cycles catéchols. Toutefois cette activité théorique se révèle très difficile à mettre en évidence in vivo, en effet l'urushiol étant un produit très difficilement soluble l'activité de l'enzyme est grandement réduite. Même en utilisant des agents tensioactifs les résultats de dégradation observés se révèlent très insuffisants. Or la demanderesse a découvert que l'on pouvait parvenir à une détoxification pratiquement totale -de l,urushiol en utilisant,en combinaison avec la catécol 2,3-oxygénase, une albumine. C'est pourquoi la présente invention concerne de nouvelles compositions, notamment des compositions thérapeutiques utiles dans le traitement et la prévention des allergies de contact provoquées par les plantes de la famille des anacardiacées et de leurs produits drivés, comportant à titre-de principe actif au moins une combinaison de la catéchol 2,3-oxygénase et d'une albumine. Les caractéristiques de l'enzyme catéchol 2,3-oxygén-ase et des procddés pour sa préparation sont décrites dans la demande de brevet français n" 82 01574 déposée le 1er février 1982 au nom de la Demanderesse. Le brevet des Etats-Unis précédent mentionne également d'autres modes de préparation de la C 2,3-O, notamment de provenance du P.- avila. Bien que dans le cadre de la présente description en ait utilisé à titre d'albumine essentiellement de ltal- humaine de sérum bovin, il est possible d'utiliser une albumine quelconque par exemple une albumine d'origine humaine éventuellement pour limiter les risques d'irrita tion locale. L'utilisation de cette protéine présente dans le cadre de compositions thérapeutiques destinées à l'u sage topique un grand nombre a'avantages, outre l'acti vité détoxifiante. En effet, il s'agit d'un produit présentant un caractère émulsifiant commun-à toutes les protéines et qui se prète particulièrement bien à la réalisation de crèmes ou de laibs Mais il s'agit en outre d'un produit très soluble dans l'eau qui peut être éliminé facilement par l'éthanol et qui se prète également bien à des prépara tions sous formes de spray, ou de lotion. Les compositions selon la présente invention peuvent également être utilisées pour la décontamination des objets, en particulier des vêtements, par exemple par lavage. Les concentrations en principe actif peuvent varier dans de larges gammes et dépendent notamment de l'action envisagée, à savoir action préventive ou curative, mais également de la quantité d'agent allergénique auquel le sujet pourra ou peut être exposé. De façon générale, il est possible d'utiliser des compositions selon la présente invention qui soient saturées en albumine, mais il est possible d'utiliser des quantités d'albumine beaucoup plus faibles pouvant aller jusqu'à 0,01 % en poids total de la composition. Pour ce qui concerne la concentration en catéchol 2,3-oxygénase, cette concentration peut varier largement; par exemple entre 20 et 0,01 % en poids de la composition, bien qu'il soit en général préférable d'utiliser des quantités plus faibles de lordre de 5 à 0,01 % compte tenu du coût de cette enzyme. Au niveau de son activité, il semble que lgal- bumine puisse jouer un rôle vis-à-vis des composés lipophiles, et bloquer les alkyles catéchol lorsque ceux-ci sont oxydés. En outre, il convient de remarquer qui s'agit là d'un produit ayant une faible toxicité en application sur la peau car il ne pénètre pas la barrière cutanée et cru'enfin il s'agit dsun produit bon marchE Les compositions selon la présente invention peuvent être utilisées tant à titre préventif quUà titre curatif. Les compositions selon la présente invention pourront se présenter sous une forme quelconque utilisable par voie topique, qu'il s'vagisse de crème, de lotion de spray, qui ne poseront pas de problème pour leur mise en forme puisque les principes actis utilisés sont so- lubles dans l'eau. I1 est également possible de réaliser des laits ou des poudres. Dans certains cas, il peut être intéressant de prévoir les préparations sous forme extempora née dans laquelle les principes actifs seront présents sous une forme assurant leur conservation; forme lyophi lisée par exemple, qui ne seront à mettre en contact avec le substrat destiné à leur application que -peu de temps avant 1 'utilisation. Bien que le procédé de préparation de la catéchol 2,3-oxygénase ne constitue pas l'un des éléments carac téristiques de la présente invention, il convient néan moins d'indiquer que dans la demande de brevet Français mentionnée précédemment, ladite enzyme peut être préparée à partir de Bacillus subtilis, alors que jusqu'à présent cette enzyme n'était préparée qu'à partir de Bactéries gram négatives telles que Psendomonas et Escherichia coli qui sont pathogçnes pour IOhomme. Il est évident que la possibilité de préparer une telle enzyme à partir d'un microorganisme non pathogene pour 1 'homme Bacillus subtilisfconstitue un avantage considérable dans l'application de cette enzyme dans le domaine thérapeutique. La catéchol 2,3-oxygénase peut être prépare à partir d'Escherichia coli selon le procédé décrit par Inouye Sachye, Nakazawa Atsuhi and Nakazawa Teruko, 1981, Journal of Bacteriology 145, 1137-1143 Z "Molecular Cloning of TOL Genes XylB and XylE in E. coli". La préparation de la même enzyme à partir de Bacillus subtilis a déjà été décrite dans le brevet Français mentionné précédemment. Les essais ci-après ont-été réalisés en utilisant une C 2,3-0 préparée à partir d'une souche d'E. coli BZî8 contenant le plasmide pTG203 qui porte le gène de la catéchol 2,3-oxygénase, cette souche est décrite dans le brevet Français mentionné précédemment. I1 convient toutefois de remarquer que le procédé de préparation de la C 2,3-0 ne constitue nullement une caractéristique de la présente invention et qu'il est possible de préparer cette enzyme en utilisant d'autres souches bactériennes. Les propriétés générales de la catéchol 2,3oxygénase ont déjà été largement étudiées dans la demande de brevet Français mentionnée précédemment. Pour l'essentiel, il faut retenir que l'enzyme est stable jusqu'à une température de l'ordre de 600C, et que l'acétone montre un effet stabilisant. En outre, le pH optimum d'activité de la C 2,3- 0 est de 6,75, quant à sa température optimum d'activité elle est voisine de 45 0C. Des essais de stockage de l'enzyme à différentes températures et dans différentes conditions ont montré que celle-ci pouvait être conservée sans difficulté pendant des durées de quelques mois. Lés- expérimentations suivantes mettent en evidence les propriétes remarquables des compo- sitions selon la présente invention. Les expériences sont conduites sur six cobayes albinos Hartley qui sont sensibilisés respectivement au pentylcatéchol, au pentadécylcatéchol et à 1 'urushiol. La sensibilisation des cobayes a été effectuée par la technique dite de "Freundis complete adjuvant test". Le protocole consiste à faire 3 injections intradermiques de 0,1 ml d'émulsion à 1 % en substance sensibili sante dans la région postnuquale respectivement aux jours 1, 3 et 5. Les émulsions sont faites d'adjuvant complet de Freund et d'eau physiologique 1/1 en volume. Le groupe témoin est traité de la même manière mais avec une émulsion ne contenant pas d'agent allergène. Pour ce qui concerne la sensibilisation à l'urushiol , celle-ci a éte effectuée par la voie naturelle c'est-à-dire la voie épicutanée en appliquant 0,1 ml d'une solution éthanoli que d'urushiol ' 0,1 % sur 8 cm2 de flanc-rasé et tondu de l'animal aux jours 1,3et5, ces ànimauxontété boostés par injectior 10) Testsde sensibilité apyres actïonde l'enzvme in vitro Dans ce premier groupe d'expériences l'allergène est préalablement incubé avec l'enzyme in vitro, on vérifie par des'méthodes spectroscopiques ou sur chromatoplaque que le substrat a été entièrement transformé.Ce milieu est ensuite appliqué sur le flanc des cobayes sensibles. Les animaux sont testés simultanément avec une solution d'allergène ne contenant pas d'enzyme (témoins positifs). Les résultats observés sont rassemblés dans le tableau ci-apres. -Substance Réaction 24 h Réaction 48 h Pentylcatéchol 18 mM 1.9 1.5 Pentylcatéchol/Enz/ BSA O O Urushiol 0.03 % 1.7 i 1.5 Urushiol 0.03-e/BSA 0.6 0.4 Urushiol 0.03%/BSA/ Enzyme O Les chiffres représentent le degré d'irritation moyenne observée chez les animaux d'après l'échelle de zéro = aucune irritation, à cinq = nécrose. Les résultats ci-dessus démontrent clairement l'activité remarquable des compositions selon la présente invention et en particulier l'activité tout à fait remar quable de l'albumine utilisée seule dans le traitement dece type de dermatoses. Par la mise en oeuvre des compositions selon la présente invention aucune réaction cutanée n' est visible ni à 24 heures ni à 48 heures. Les figures 1 à 5 ci-jointes rassemblent les photos de ces différentes expériences. Les protocoles expérimentaux sont rappelés ci-après. Figures 1 & 2 : Action de la 2,3 catéchol oxygénase en présence de Sérum albumine bovine.(BSA) sur l'effet alleraisant du pentvlcatéchol "PC" Surface A : allergène seul Surface B e allergène + BSA + C 2,3 0 Protocole : deux deux solutions sont préparées Solution 1 : PC 18 mM dans l'éthanol, Application de 25jul sur la surface . Solution 2 : PC O 18 mN C 2,3 0 : 300 U/ml BSA . demi-saturation Tampon phosphate 0 50 mM pH 6,8 Incubation 1 h à 370C, stockage pendant la nuit à température ambiante (22 C) Application de 25uI sur la surface B Figures 3,4 & 5 : Action de la C2,3-0 et de la BSA sur l'effet allergisant de l'urushiol Surface A Urushiol + C 2,3 0 + BSA Sur face 3 : Urushiol + BSA Sur face C Urushiol Protocole : 3 solutions sont préparées. Solution 1 0 Urushiol : 0,03 % C 2,3 0 : 350 umites/ml BSA : saturée au 1/3 TpShosphate : 50 mM pH 6,8 Incubation Ih à 370C, stockage pendant la nuit à température ambiante (220C) 25 l déposés sur la surface A de chaque animal Solution 2 : Urushiol : 0,03 % BSA : saturée au 1/3 TpPhosphate : 50 mM pH 6,8 Incubation 1 h à 370C Stockage pendant la nuit à temps rature ambiante (22bC) 25 l déposés sur la surface B de chaque animal. Solution 3 : Urushiol 0,03 % dans méthanol. 20) Test de sensibilité après action directe de de l'enzyme sur la peau Dans ces expériences on procède de la façon suivante : au temps O on applique 25 l d'une solution éthanolique d'allergène sur 2 cm2 de peau. Lorsque l'éthanol est évaporé on applique sur la même surface le milieu enzymatique sous forme d'une solution aqueuse. On sèche sous un courant d'air tiede après quelques minutes et on fait une deuxième application de 25 > u1 de milieu enzymatique 1 heure plus tard que l'on sèche dans les mêmes conditions. Les résultats sont lus après 24 et 48 h. On remarque tout d'abord que lors de la première application du milieu enzymatique au bout d'un temps de l'ordre de 1 minute une coloration-jaune se développe ce qui indique que l'oxydation des allergènes a déjà débuté. Lors de la deuxième application aucune coloration ne réapparait. Les résultats observés dans cette expérience sont rassemblés au tableau ci-après. Milieu enzymatique : C 2,3-O : 350 U/ml BSA.saturée au 1/3 TpPhosphate, pH-6,8 - 30 mM Substance Réaction 48 h 1) Pentylcatéchol 18 mM (0,3%) 0,5 2) Pentylcatéchol 18 mM/Enz/BSA 0,1 1) Urushiol 0,03% i 1;2 2) Urushiol 0,03% Enz.BSA 0,8 Les réactions cutanées bien que positives ont très nettement diminué après application des compositions selon l'invention. REVENDICATIONS 1) Composition utile dans le traitement et la prévention des allergies de contact comportant à titre de principe actif au moins une combinaison de la catéchol 2,3-oxygénase et d'une albumine. 2) Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'il s'agit d'une composition thérapeutique applicable par voie topique. 3) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition de décontamination. 4) Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait qu'il s'agit d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'une poudre ou d'un "spray". 5) Composition selon l'une des revendications i'à 4, caractérisée par le fait que lacatéchol 2,3-oxygénase est présentée sous forme lyophilisée. 6)- Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée par le fait que la concentration en catéchol 2,3-oxygénase est comprise entre 20 et 0,01 % en poids de la composition. 7) Composition selon la revendication 6, caractérisée par le fait que la concentration en catéchol 2,3-oxygénase est comprise entre 5 et 0,01 % en poids de la composition. 8) Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que la concentration en albumine est comprise entre 0,01 % en poids de la composition et la saturation. 9) Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que 11 albumine utilisée èst de l'albumine de sérum bovin. 10) Composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée par le fait que la catéchol 2,3-oxygénase est préparée à partir de Bacillus subtilis.