Brevet FR2532319A1 — publié le 19840302

Procédé pour l'immobilisation de composés comprenant des groupements nucléophiles. La présente invention concerne un procédé pour l'immobilisation de composés comprenant des groupements nucléophiles Plus particulièrement elle se rapporte à un procédé pour l'immobilisation de composés comprenant des groupements nucléophiles (par exemple des acides aminésv des peptides, des protéines, des carbohydrates, etc) au moyen de polymères qui contiennent des groupements amides d'acides carboxyliques activés par une quinone. Ces dernières années plusieurs procédés ont été mis au point pour l'immobilisation de composés ayant des poids moléculaires plus faibles ou de biopolymères (par exemple des protéines) sur un support en phase solide /Zaborsky, O R /1973/"Immobilized Enzymes"/West, R C, ed /, CRC Pres S, Cleveland, Ohio; Chibata, I /1978/"Immobilized Enzymes"/Chibata, I, edo/, pp 9-107, Kodansha, Ltd, Tokyo; Goldstein, L, Manecke, G /1979/"Applied Biochemistry and Bioengineering"/Wingard, L B, Katclalski- Katzir, E and Goldstein, L, eds /, Vol 1, pp 23-126, Academic Press, Inc, New-York_ 7. Les inconvénients généraux des procédés connus ci-dessus peuvent être résumés comme suit des conditions spéciales de réaction sont requises dans certains procédés la liaison entre le support et le ligand est formée à l'aide d'agents de couplage spéciaux; certains agents de couplage sont des composés fortement toxiques (par exemple le phosgène) et par conséquent des mesures de sécurité onéreuses doivent être prises. La présente invention a pour objet de surmonter les inconvénients des méthodes connues et de fournir un procédé pour l'immobilisation de composés comprenant des groupements nucléophiles par des liaisons covalentes, ledit procédé étant facilement réalisable dans des conditions simples au moyen d'agents d'activation significativement moins toxiques et sur des supports avantageux, aisément disponibles qui peuvent être fabriqués à une échelle indus- trielle. La présente invention est basée sur le fait qu'on s'est aperçu avec surprise que les polymères comprenant des groupements amido entrent en réaction avec les quinones et que les polymères actives ainsi formés sont capables de fixer des composés qui comprennant un groupement nucléophile par des liaisons covalentes La constatation ci-dessus est d'autant plus inattendue qu'il est connu que les amides - d'acides carboxyliques sont des composés plutôt moins réactifs et en s'appuyant sur l'état de la technique antérieure l'homme de l'art expérimenté ne se serait pas attendu à ce que lesdits composés réagissent avec les quinones. Selon le procédé de la présente invention l'immo- bilisation des composés comprenant un groupement nucléophile est menée en deux étapes: 1/ Le polymère comprenant le groupement amido est gonflé dans un tampon ayant une valeur de p H de 3 à 11, de préférence de 6 à 8 N'importe quel polymère peut être utilisé dans le procédé de la présente invention N'importe quel tampon convient pour les objectifs de la présente invention également, sous réserve qu'il ne contienne pas de composés comprenant un groupement amino, sulfhydryle et/ou hydroxy. La solution de la quinone formée avec n'importe quel solvant organique convenable miscible à l'eau est ensuite ajoutée. On peut utiliser comme quinone de préférence la p-benzoquinone et comme solvant organique de préférence l'éthanol ou le - dioxane Dans la solution la concentration finale de p-benzo- quinone s'élève à 2-100 millimoles, de préférence 40-60 milli- moles L'activation est réalisée à 0-70 C et la durée de la réaction est de 0,5 à 48 heures, de préférence 24 heures. L'excès de p-benzoquinone qui n'a pas réagi est enlevé par lavage avec un mélange d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau de préférence à 20 % de dioxane et ensuite avec un tampon Le support activé peut être conservé à l'état humide ou à l'état lyophilisé. 2/ L'immobilisation des composés comprenant un groupement nucléophile est réalisée dans un intervalle de p H de 3 à 11, de préférence entre 6 et 8, qui dépend de la stabilité du composé Au gel activé on ajoute une solution du composé comprenant un groupement nucléophile Les composés de bas poids moléculaire sont ajoutés sous la forme d'une solution 0,001-1,0 molaire de préférence 0,01 molaire, tandis que la concentration de la solution des composés macromoléculaires s'élève à 3-100 mg/ml, de préférence 20 mg/ ml La réaction de couplage est effectuée à 0-40 C, de préférence de - 13 à + 7 C La durée de la réaction s'-élève à 24 heures. Le composé non lié comprenant un groupement nucléophile est enlevé en lavant plusieurs fois avec un tampon et un tampon comprenant 1,0 mole de chlorure de sodium, respectivement. Les avantages du procédé de la présente invention sont les suivants: une liaison stable est formée; le procédé peut être réalisé en utilisant des substan- ces aisément disponibles; le procédé marche bien avec une grande variété de supports; le procédé est applicable dans un large intervalle de p H. De plus amples détails de la présente invention vont être trouvés dans les exemples sans limiter le cadre de l'invention auxdits exemples. Exemple 1 - g de Akrilex P-100 xérogel/copolymère acryl- amide-N,N '-méthylène-bis-acrylamide) sont mis en suspension dans 1200 ml d'un tampon de phosphate de sodium et de potassium 0,1 molaire (p H = 8), après quoi une solution de 0,25 mole de p-benzoquinone dans du dioxane à 20 % ( 300 ml) est ajoutée et on laisse la suspension reposer à 50 C pendant 24 heures Le gel gonflé est récupéré et lavé par la suite avec 3 litres de dioxane à 20 % et 10 ml d'eau-distillée. On obtient ainsi 24,3 g d'un support activé. Exemple 2 - 0,1 g de Akrilex P-100 xérogel (copolymère acrylamide-N,N '-méthylène-bis-acrylamide) sont mis en suspen- sion dans 4,0 ml d'un tampon de phosphate 0,1 molaire (p H 8,0), après quoi une solution de 0,25 mole de p-benzoquinone dans du dioxane à 20 % ( 1,0 ml) est ajoutée et on laisse la solution reposer à 50 C pendant 24 heures Le gel gonflé est séparé et lavé par la suite avec 70 ml de dioxane à 20 % et 70 ml d'eau distillée. Le gel activé est filtré sous vide et on ajoute 2,0 ml d'une solution d'acide y-amino-butyrique 0,01 molaire. Pour la solubilisation de l'acide y-amino-butyrique on utilise un tamponde phosphate de sodium et de potassium 0,1 -molaire (p H 7,5) La suspension est mise en incubation à 4 C pendant 24 heures, le gel est séparé et l'acide y-amino-butyrique non lié est enlevé par lavage avec un tampon d'acétate de sodium 0,1 molaire comprenant 1,0 mole de chlorure de sodium ( 5,0) et une solution de carbonate acide de sodium 0,1 molaire (p H 8,5) Ainsi 4 micromoles d'acide y-amino-butyrique sont liées ce qui correspond à 20 % de la quantité d'acide y-amino- butyrique ajoutée au mélange réactionnel. Exemple 3 - 0,1 g de Akrilex P-100 xérogel (copolymère acryl- amide-N,N'-méthylène-bis-acrylamide) sont mis en suspension dans 4,0 ml d'un tampon de phosphate 0,1 molaire (p H 8,0), après quoi une solution de 0,25 mole de p-benzoquinone dans du dioxane à 20 % ( 1,0 ml) est ajoutée et on laisse la suspen- sion reposer à 50 C pendant 24 heures Le gel gonflé est séparé et lavé par la suite avec 70 ml de dioxane à 20 % et ml d'eau distillée. Le gel activé est filtré sous vide, après quoi on ajoute 2,0 ml d'une solution -à 20 mg/ml d'albumine de sérum bovin Dans le but de renforcer la dissolution de l'albumine de sérum bovin on utilise un tampon de formiate de sodium 0,1 molaire (p H 3,0) La suspension est mise en incubation pendant 24 heures à 4 C, le gel est séparé et l'albumine du sérum non liée est enlevée par lavage avec un tampon d'acétate de sodium 0,1 molaire comprenant 1,0 mole de chlorure de sodium (p H 5,0) et une solution de carbonate acide de sodium 0,1 molaire ( 8,5) Ainsi 10 mg d'albumine de sérum sont liés ce qui correspond à 25 % de la quantité d'albumine de sérum ajoutée au mélange réactionnel. Exemple 4 - 0,1 g de Akrilex P-100 xérogel (copolymère' acrylamide-N,N Lméthylène-bisacrylamide) est mis en suspension dans 4; O ml d'un tampon phosphate 0,1 molaire (p H 8,0), après quoi une solution de 0,25 mole de p-benzoquinone dans du dio- xane à 20 % ( 1,0 ml) est ajoutée et on laisse la suspension reposer à 50 C pendant 24 heures Le gel gonflé est séparé et lavé par la suite avec 70 ml de dioxane à 20 % et 70 ml d'eau distillée. Le gel activé est filtré sous vide, après quoi on ajoute 2,0 ml d'une solution d'albumine de sérum bovin à mg/ml Un tampon de phosphate de sodium-potassium 0,1 molai- re (p H 6,0) est utilisé pour faciliter la dissolution de l'albumine de sérum bovin La suspension est mise en incuba- tion à 4 C pendant 24 heures, le gel est séparé et l'albumine de sérum non liée est enlevé par lavage avec 0,1 mole d'un tampon d'acétate de sodium 0,1 molaire comprenant 1,0 mole de chlorure de sodium (p H 5,0) et une solution de carbonate acide de sodium 0,1 molaire (p H 8,5) Ainsi 4,5 mg d'albumine de sérum de bovin sont liés ce qui correspond à 11,25 % de l'albumine de sérum ajoutés au mélange réactionnel. Exemple 5 - 0,1 g de Akrilex P-100 xérogel (copolymère acrylamide-N,N '-métliylènebis-acrylamide) est mis en suspension dans 4,0 ml d'un tampon de phosphate 0,1 molaire (p H 8,0), après quoi une solution de 0,25 mole de p-benzoquinone dans du dioxane à 20 % est ajoutée ( 1,0 ml) et on laisse la suspen- sion reposer à 50 C pendant 24 heures Le gel gonflé est séparé et lavé par la suite avec 70 ml de dioxane à 20 % et 70 ml d'eau distillée. Le gel activé est filtré sous vide, après quoi 2,0 ml d'une solution d'albumine de sérum bovin sont ajoutés Un tampon 0,1 molaire de carbonate de sodium - carbonate acide de sodium (p H 9,0) est utilisé pour faciliter la dissolution de l'albumine de sérum bovin La suspension est mise en incubation à 4 C pendant 24 heures, le gel est séparé et l'albumine de sérum non liée est enlevée par lavage avec un tampon d'acétate de sodium 0,1 molaire comprenant 1,0 mole de chlorure de sodium (p H 5,0) et une solution de carbonate acide de sodium 0,1 molaire (p H 8,5). Ainsi 5,0 mg d'albumine de sérum sont liés ce qui correspond à 12,5 % de l'albumine de sérum ajoutés au mélange réactionnel. Exemple 6 - 0,1 g de Akrilex P-100 xérogel (copolymère acrylamide-N,N -méthylêne-bisacrylamide) est mis en suspension dans 4,0 ml d'un tampon de phosphate 0, 1 molaire (p H 8,0), après quoi une solution de 0,25 mole de pbenzoquinone dans du dioxane à 20 % est ajoutée et la suspension est laissée reposer à 50 C pendant 24 heures Le gel gonflé est séparé et lavé par la suite avec 70 ml de dioxane à 20 % et 70 ml d'eau distillée. Le gel activé est filtré sous vide et 2,0 ml de solution de glucooxydase à 20 mg/ml sont ajoutés La dissolu- tion de la glucooxydase est facilitée par un tampon de phosphate de sodium potassium 0,1 molaire (p H 7,5) La suspen- sion est mise en incubation à 4 C pendant 24 heures, le gel est séparé et la protéine non liée est enlevée par lavage avec un tampon d'acétate de sodium 0,1 molaire comprenant 1,0 mole de chlorure de sodium (p H 5,0) et une solution de carbonate acide de sodium 0,1 molaire (p H 8,5). La quantité de la protéine liée au gel est de 4,5 mg, l'activité étant 7,2 unités/g de xérogel 1 unité correspond à la quantité-d'enzyme qui est capable de cataly- ser l'oxydation de 1,0 micromole de B-D-glucose à 7,0 et 25 C par minute L'activité spécifique de l'enzyme liée s'élève à 8 % de celle de l'enzyme dissoute. Exemple 7 - i 0,1 g de Akridex P-100 xérogel (copolymère acryl- amide-N,N'-méthylène-bis-acrylamide) est mis en suspension dans 4,0 ml de tampon de phosphate 0,1 molaire (p H 8,0), après quoi une solution de 0, 25 mole de p-benzoquinone dans du dioxane à 20 % ( 1,0 ml) est ajoutée et on laisse reposer la suspension à 50 C pendant 24 heures Le gel gonflé est séparé et lavé par la suite avec 70 ml de dioxane à 20 % et 70 ml d'eau distillée - Le gel activé est filtré sous vide et 2,0 ml d'une solution à 20 mg/ml de catalase sont ajoutés La disso- lution de la catalase est accrue en utilisant un tampon de phosphate de sodium et de potassium 0,1 molaire (p H 7,5) o La suspension est mise en incubation à 4 C pendant 24 heures, le gel est séparé et la protéine non liée est enlevée par lavage avec un tampon d'acétate de sodium 0,1 molaire compre- nant 1,0 mole de chlorure de sodium (p H 5,0) et une solution de carbonate acide de sodium 0,1 molaire (p H 8,5). La quantité de protéine liée au gel est de 5,3 mg, l'activité étant de 2100 unités/g de xerogel 1 unité corres- pond à la quantité d'enzyme qui est capable de catalyser la décomposition de 1 micromole d'eau oxygénée par minute à 25 C. L'activité spécifique de l'enzyme liée s'élève à 2 % de celle de l'enzyme dissoute. Exemple 8 - 0,1 g de Akrilex P-100 xérogel (copolymère acryl- amide-N,N'-méthylène-bis-acrylamide) est mis en solution dans 4,0 ml d'un tampon de phosphate 0,1 molaire (p H 8,0), après quoi une solution de pbenzoquinone dans du dioxane à 20 % ( 1,0 ml) est ajoutée et on laisse reposer la suspension à C pendant 24 heures Le gel gonflé est séparé et lavé par la suite avec 70 ml de dioxane à 20 % et 70 ml d'eau distillée. Le gel activé est filtré sous vide et 2,0 ml de solution de glucose 0,01 molaire sont ajoutés La dissolution du glucose est facilitée en utilisant un tampon de phosphate de sodium et de potassium 0,1 molaire (p H 7,5) La suspension est mise en incubation à 4 C pendant 24 heures, le gel est séparé et le glucose non lié est enlevé par lavage par la suite avec un tampon d'acétate de sodium 0,1 molaire compre- nant 1,0 mole de chlorure de sodium (p H 5,0) et une solution de carbonate acide de sodium 0,1 molaire (p H 8,5) Ainsi 6 micromoles de glucose sont liées ce qui correspond à 30 % de la quantité du glucose ajouté au mélange réactionnel. REVENDICATION Procédé pour l'immobilisation de composés compor- tant des groupements nucléophiles caractérisé en ce qu'on fait gonfler un polymère qui contient un groupement amido dans un tampon ayant une valeur de p H comprise entre 3 et 11, de préférence entre 6 et 8, et ne contenant pas de groupements amino, sulfhydryle et/ou hydroxy; on ajoute une solution d'une quinone, de préférence la p-benzoquinone, dans un solvant organique miscible à l'eau en quantité telle que la concentra- tion finale de la quinone est de 2 à 100 millimoles, de préférence 40 à 60 millimoles; on soumet le mélange à activa- tion pendant 0,5 à 48 heures, de préférence pendant 24 heures, à 0-70 C; on enlève la quinone qui n'a pas réagi par lavage avec un mélange d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau et ensuite avec de l'eau distillée et/ou un tampon; on ajoute au gel à une valeur de p H comprise entre 3 et 11, de préférence entre 6 et 8, une solution 0,001 à 1,0 molaire d'une substance comportant un groupement nucléophile et ayant un faible poids moléculaire ou une solution à 3-100 mg/ml d'une substance macromoléculaire comprenant un groupement nucléophi- le; on met la suspension en incubation entre O et 40 C, de préférence de -13 à + 7 C, pendant 24 heures et ensuite on sépare le gel et on sépare le composé non lié comprenant un groupement nucléophile par lavage.