Brevet FR2524891A1 — publié le 19831014

La présente invention concerne un procédé pour purifier une substance protéine physiologiquement active possédant une activité antitumorale. Il existe de nombreux rapports sur l'existence de substances ayant des activités physiologiques telles que l'aptitude à tuer les cellules tumorales, des exemples caracteristiques de ces substances sont indiquées brièvement dans ce qui suit Currie et collaborateurs ont découvert qu'un facteur qui inhibe la profilération de diverses cellules tumorales est induit par l'administration d'endotoxine à des cellules d'exsudat de peri- toine de rat normal (J. Exp. Med., Vol. 142, p. 1600-1605 (1975)) et des recherches ultérieures sur ce facteur ont permis de trouver que le principedufacteur est l'arginase comme indiqué dans Nature (Londres), vol. 273, p. 758-759 (1978). Reed et collaborateurs ont également découvert une substance protéine ayant un poids moléculaire de 45 oxo qui est capable de tuer les cellules tumorales cultivées telles que les cellules L de cellules cultivées ou de liquide surnageant de mono culéaires cultivés de rat normal et d'humain par application d'un traitement à l'endotoxine, mais le principe de ladite substance n'a pas encore été isolé et identifié (J. Immunol., Vol. 115, p. 395404 (1975)). Carswell et collaborateurs ont découvert que le sérum de souris CD-1 Swiss infectées par le bacille de Calmette-Guérin (BCG) et après injection intraveineuse d'endotoxine après deux semaines, a une activité cytotoxique contre les cellules L cultivées et é g a 1 e m e n t q u ' i 1 induit une nécrose hémorragique du sarcome Meth A BALB/c chez la souris (EALB/c x C57BL/6)F1, et ils ont donné le nom de TNF (Tumor Necrosis Factor) à la substance active du sérum (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 79 n"9, p. 3666-3670 (1975)). En outre ils ont effectué une purification partielle du TNF å partir dudit sérum et obtenu en conséquence des fractions de TNF purifiées 20 à 30 fois par rapport au sérum, en indiquant que la suitance active est une glucoprotéine ayant un poids moléculaire d'environ 150 000, qui my > avec les o-globulines dans l'électrophorèse sur acétate de cellulose (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 73 n02, p. 381385 (1976)). Sdnnel et collaborateurs ont étudié. les proprietés du facteur cytotoxique en utilisant le sérum de souris obtenu par la méthode de Carswell et collaborateurscomme mentionné ci-dessus et ils ont trouvé que, dans la nitration sur gel, les fractions éluées douées d'activité cytotoxique varient selon la concentration de sel dans le tampon et que le poids moléculaire du facteur cytotoxique est de 55 000 à 60 000 dans un tampon à forte concentration en sel, tandis qu'il est de 125 000 à 150 000 par agglutination dans un tampon à faible concentration de sel ou dans le sérum (Infect. lixinun., Vol. 28 n" 1, p. 204-211 (1980)). Ils ont indiqué que le point isolélectrique (valeur pI) de ce facteur est de 4,8.Mais, l'activité de ce facteur n'a pas été évaluée chez un animal (par exemple l'évaluation utilisant le sarcome Meth A transplante chez la souris) et on ne peut pas vérifier la présence de son activité in vivo. Il est par conséquent impossible d'estimer si le facteur est identique au TNF de Carswell et collaborateurs. En outre, ils n'ont presque rien mentionné concernant sa purification et son isolement, bien que certaines de ses propriétés aient été étudiées sur la base de l'activité cytotoxique contre les cellules L. Matthews et collaborateurs ont induit le TNF chez un lapin, étudié les propriétés du TNF de lapin contenant du sérum et indiqud que le TNF de lapin a un poids moléculaire dans l'intervalle de 40 000 à 50 000 > mesure par filtration sur gel en utilisant du "Sephadex G-200" (Br. J. Cancer, Vol. 38, p. 302-309 (L978j). Cependant, ils ont également indiqué que le poids moléculaire est de 67 000 par électrophoràse sur gel de polyacrylamide avec gradient de concentration,ou ou de 39 000 par filtration sur gel avec "Ultrogel AcA 44" (Br. J. Cancer, Vol. 42, p. 416-422 (1980)). Nais, comme ils n'ont pas utilisé d'échantillon isolé et purifié, il n'est pas certain que le TNF soit ou non une substance unique. Ruff et collaborateurs ont indiqué que le TNF de lapin est purifié 2000 fois par rapport au sérum et qir son poSb moléculafre est estimé à 68 000 par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide, de 55 000 par filtration sur gel en utilisant le "Sephacryl-200" et-de 52 000 par centrifugation avec gradient de glycérol (J. Immunol., Vol. 125 n04, p. 1671-1677 (1980)). Kull et collaborateurs ont obtenu trois types de fractions de cytotoxine de celluloetumoralesà partir du sérum de souris obtenu par la méthode de Carswell et collaborateurs comme mentionné ci-dessus et ont effectue des essais en utilisant le sarcome Meth A transplanté chez la souris en indiquant que la fraction de poids moléculaire 160 000 induit la nécrose de la tumeur, tandis que les fractions de poids moléculaires de 225 000 et de 50 000 n'induisent pas de nécrose de la tumeur (J. Immunol., Vol. 126 n"4, p. 1279-1283 (1981)). Comme décrit ci-dessus, malgré un certain nombre de rapports sur l'existence de divers facteurs physiologiquement actifs, on ne les obtient pas, dans la plupart des cas en quantité suffisante pour un examen approfondi de leun propriétés. En outre, comme on n'effectue pas d'isolement, il n'est pas certain dans les circonstances présentes que ce soient des substances connues ou nouvelles. En utilisant divers types de mammifères, la demanderesse a étudié la productivité et la purification d'une substance physiologiquement active ayant une activité antitumorale qui est induite par administration à un mammifère d'une substance qui est capable de stimuler le système réticuloendothélial et injection d'endotoxine au mammifère, et trouvé qu'un lapin est tout à fait approprié pour l'application pratique de la substance physiologiquement active comme médicament. La présente invention a pour objet un procédé très intéressant dans la pratique pour purifier une substance physiolo giquement active ayant une activité antitumorale,qui qui est induite par administration à un lapin d'une substance capable de stimuler le système réticuloendothélial et injection d'endotoxine au lapin. L'invention a également pour objet une nouvelle substance physiologiquement active ayant une activité antitumorale, qui est induite par administration à un lapin d'une substance capable de stimuler le système réticuloendothélial et injection d'endothoxine au lapin. La présente invention concerne un procédé pour purifier une substance protéinée physiologiquement active ayant une activité antitumorale, qui est induite par administration à un lapin d'au moins une substance capable de stimuler le système réticuloendothélial et ensuite injection au lapin de ltendotoxine provenant d'une bactérie à gram négatif, caractérisé en ce que l'on met en contact une solution brute de ladite substance protéinée physiologiquement active avec un échangeur d'anionsbasique pour adsorber ladite substance physiologiquement active sur l'echan- geur d'anions,on élue la substance physiologiquement active adsorbée et on soumet l'éîuat contenant ladite substance physiologiquement active à la filtration sur gel avec un gel approprié pour la séparation d'une substance ayant un poids moléculaire dans la gamme de 30'000 à 70 000. Pour induire la substance physiologiquement active selon l'invention (dénommée ci-après substance active de }'invention), on injecte d'abord par voie intraveineuse ou intrapéritonéale à un lapin au moins une substance capable de stimuler le système réticuloendothélial, selon la méthode de Carswell et collaborateurs (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 72 n"9, p. 3666-3670 (1975)). Comme substances capables de stimuler le système rétlculoendothelial, on utilise généralement des bactéries à gram positif, des protozoaires ou des levures, qui sont administrés au lapin soit à l'état de micro-organismes vivants soit de micro-organismes morts (par exemple, après traitement par la chaleur ou par une solution de formaldéhydeX soit d'extrait de cellules de micro-organlame. Des exemples de bactéries à gram positif comprennent les propionibactéries telles que Propionibacterium acnes (Corynebacteriun paru3) ou Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), les mycobactéries telles que bacille de Calmette-Guérin (BCG) ou Myco bacterium amegmatis et les nocardia tels que Nocardia arythropolis ou Nocardia gardneri. Comme protozoaires, par exemple, on peut utiliser Plasmodium ou Toxoplasma. Comme levure, on utilise généralement le zymosanne (facteur anticomplémentaire) extrait de Saccharomyces Cerevisiae,ou d'autres.On peut également utiliser des composés synthétiques de haut poids moléculaire tels que des copolymbreg de pyranne. Entre 7 et 14 jours après l'adminiotration, on injecte au lapin par voie intraveineuse l'endotoxine d'une bactérie b gram négatif, par exemple un lipopolycaccharide dérivé d'Escherichia colt, de Pseudomonas seruginosa ou de Salmonella typhosa. Ensuite, 1 h 30 min à 2 h après l'injection, on prélève des fluides de l'organisme (par exemple ascite lymphe,etc.) et/ou du sérum du plasma dudit lapin ou on homogénéise des organes internes tels que foie, rate; etc.) et on extrait par une solution de sérum physiologique.On peut utiliser ces humeurs de I'organisme, ce sérum, ce plasma et/ou cet extrait d'organe interne comme solution brute de la substance active de l'invention, mais on utilise généralement le sérum ou le plasma. L'évaluation de l'activité physiologique de la substance active de J'invention s'effectue selon les méthodes suivantes a) Evaluation utilisant les cellules L Celle-ci est effectuée selon la méthode de Carswell et collaborateurs (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 72 n09, p. 36663670 (1975)). Comme récipient de culture, on utilise une plaque produite par la société Lymbor Chemical Co., Inc. (EUA) et on cultive des cellules L (S) dans un milieu essentiel minimal de Eagle (milieu MEM) contenant des aminoacides non essentiels et 10% de sérum de foetus de veau inactivé par la chaleur, en outre 100 unités par ml de pénicilline et 100 > ig/ml de streptomycine. On mélange des 5 volumes égaux d'une suspension de cellules L (1 x 10 cellules) et d'un échantillon dilué en série et on fait incuber à 370C pendant 48 heures dans l'air contenant 5% de dioxyde de carbone.On détermine l'activité en portant sur un graphique la dilution en fonction du nombre de cellules L viables et en calculant à partir de la dilution correspondant à 50% de cytotoxicité l'aptitude à tuer 50E de cellules L. L'activité physiologique nécessaire pour tuer 50% des cellules L est définie comme une unité. b) Evaluation utilisant le sarcome Meth A transplanté chez la souris. Selon la méthode de Carswell et collaborateurs (même référence bibliographique que ci-dessus), on transplante par voie intradermique 2 x 10S cellules de sarcome Meth A BALB/c dans l'aisselle d'une souris (BALB/c x C57BL/6)F1 et 7 jours après on choisit pour l'évaluation les souris ayant des tumeurs de 7-8 mm de diamètre, une bonne vascularisation et pas de nécrose centrale spontanée. On injecte dans la veine caudale un échantillon de 0,5 ml dilué par une solution de sérum physiologique. L'activité de l'échantillon est évaluée après 24 heures selon les critères suivants (-) pas de changement (+) légère nécrose hémorragique (++) nécrose hémorragique moyenne (nécrose centrale s'étendant sur environ 50X de la surface de la tumeur (li*) nécrose hémorragique marquée (nécrose massive laissant un petit bourrelet viable le long de la périphérie de la tumeur. On décrit en détail ci-après le procédé de purification selon l'invention. Avant la première étape de mise en contact avec un échangeur d'anions basique, on peut dialyser une solution brute de la substance active de l'invention contre une solution tampon à utiliser au moment de la mise en contact avec une résine échangeuse d'anions,ou bien on peut la diluer avec une solution tampon ayant une faible concentration en sel. La-mise en contact de la solution brute de la substance active de l'invention avec l'échangeur d'aniooebasique peut être effectude soit par une méthode sur colonne, soit par une méthode discontinue. Cette étape est effectuée en mettant en contact la solution brute avec l'échangeur d'anions basique en utilisant une solution tampon à pH 6,0-9,0 et une concentration en sel de 0,2 M ou moins pour adsorber la substance active de l'invention sur l'échangeur d'anions, en lavant ensuite ledit échangeur d'anions avec la mEme solution tampon pour éliminer les protéines non adsorbées, et ensuite en éludant la substance active de l'invention en utilisant une solution tampon ayant une concentration plus élevée en sel (étape de purification 1). Des exemples caractéristiques d'échangeu d'anions basiques utilisés comprennent les dchangeurs d'anions contenant des groupes diéthylamino tels que-"DEAE-Sephadex A-50", 'ZEAE- Sepharose CL-6B", DEAE-Sephacel" (tous produits par la société Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) et "AIEC DE 52" (produit par la société Whatman Lad., Angleterre), les échangeurs d'anions contenant des groupes aminoéthyles tels que "Servacel AE" (produit par la société Serva Entwicklungslabor, République Fédérale d'Allemagne) et les échangeurs d'anions contenant des groupes aminoéthyles quater nisés tels que'AE-Sephadex A-50" (produit par la société Pharmacia) et "Cellex QAE" (produit par la société Bio-Rad Laboratories, EUA). Les solutions tampons utilisées comprennent un tampon "Tris"-acide chlorhydrique dilué, un tampon au phosphate dilue, etc. On ajoute de préférence du chlorure de sodium ou du chlorure de potassium pour ajuster la concentration en sel de la solution tampon. La teneur en protéine dans l'élut est déterminée par la densité optique à 280 nm. La concentration de la substance active de l'in vention est mesurée par l'activité cytotoxique contre les cellules L corme décrit ci-dessus. Bien que l'etape ci-dessus puisse être effectuée avec un seul contact avec l'échangeur d'anions, il est parfois préférable dans le cas de la méthode sur colonne d'utiliser la re-chromatographie. L'éluat contenant la substance active de l'invention obtenu dans l'étape précédente est concentré par un procédé classique tel qu'ultrafiltration ou lyophilisation. Le concentrat ainsi obtenu est soumis à la filtration sur gel en utilisant un gel convenable pour la séparation d'une substance ayant un poids moléculaire de 30 000 à 70 000 (etape de purification 2). On utilise comme éluant une solution tampon ayant un pH généralement compris entre 6,0 et 9,0. La concentration en sel n'est pas essentiel1 mais elle est de préférence de 0,15 à 2,0 M.Les gels pour la filtration sur gel comprennent Sephadex G-75, 100, 150 ou 200 (produits par Pharmacia) , Sephacryl S-200 ou 300 (produits par Pharmacia), Bio-Gel P-30, 601 100, 150 ou 200 (produits par Bio-Rad), CPG-10 (350 A, 240A, 170 A ou 120 A) produit par la société Electro-Nucleonics, IncsEUA), etc. Les exemples de solutions tampons et de ses sont les mêmes que ceux décrits ci-dessus dans l'étape de contact avec un échangeur d'anions. On réunit et on concentre les fractions contenant la substance active de l'invention par un procédé classique tel qu'ultrafiltration ou lyophilisation. La dialyse du concentrat de la substance active de l'invention contre les solutions de sérum physiologique donne une solution de ladite substance purifiée environ 5 000 à 10 000 fois par rapport au sérum ou plasma. La récupération totale d'activité des deux étapes est d'environ 65 à 98% d'après l'évaluation utilisant les cellules L. On ajuste la solution purifiée de substance active de l'invention ainsi préparée à un pH et une concentration en sel appropriés par dialyse ou filtration sur gel, on stérilise par filtration et si nécessaire on chauffe et on lyophilise pour obtenir une préparation purifiée de la substance active de l'invention. On trouve que la préparation purifiée en quantité d'environ 3000 unités présente une activité (++) dans l'évaluation utilisant le sarcome Meth A comme décrit ci-dessus. On trouve egale- ment que la préparation purifiée de la substance active de ltinven- tion présente une activité cytotoxique contre diverses sérier de cellules cancéreuses humaines cultivées. La cytotoxicité 48 heure. après l'administration dé 800 unités de la préparation purifiée est indiquée en % dans le tableau I ci-après. TABLEAU I Souches de cellule cancéreuse Cytotoxicité (X) Milieu t PC 10 69,1 a KATO-III 67,9 b MK-7 65,8 a Rca 66,8 c W-2 75,9 a GOTO 61,3 Z b SEKI 70,0 b Kym-l 51,9 d MRK-l-nu 75,1 d * a: 80% de RPMI 1640 + 20% de FCS b: 40% de RPMI 1640 + 40% de MEM + 205 de FCS c: 80Z de MEM + 20% de FCS d: 80% de DM160 + 20% de FCS Par contre , on trouve que la préparation purifiée de la substance active de l'invention ne présente pas d'activité cytotoxique contre les cellules normales telles que les fibro blastes cultivés de l'homme et de la souris,meme à une dose de 2 x 106 unités. En outre, dans les essais où l'on administre la préparation purifiée de la substance active de l'invention à une souris BALB/c ayant un adénocarcinome Colon 26 transplante et une souris A/Jax ayant un neurobXu bme Neuro-2a, on observe une inhibition de croissance et une régression des tumeurs appréciables par rapport au groupe témoin (groupe auquel on a administre la solution de serum physiologique). Les tumeurs qui ont poussé régressent ou disparaissent sans provoquer de nécrose hémorragique chez certains animaux. La préparation purifiée de la substance active de l'invention aune excellente activité antitumorale,qui a une moindre spécificité vis- -vis des espèces, et on peut l'utiliser comme agent antitumoral pour le traitement des tumeurs malignes chez un mammi fère y compris l'homme. La préparation purifiée de la substance active de l'invention est généralement administrée par voie parentérale ou locale sous la forme d'une solution aqueuse à laquelle on peut facultativement ajouter un agent isotonique tel que chlorure de sodium ou/et un agent tampon tel qu'un phosphate. La dose clinique de la préparation purifiée de la substance active de l'invention, qui peut varier selon la voie d'administration, les conditions, et le poids corporel du patient, est généralement d'environ 104 à 108 unités pour une administration chez l'homme adulte. La pré- psration purifiée de la substance active de l'invention-peut également entre utilisée en combinaison avec d'autres agents antitumoraux tels que cyclophosphamide, mitomycine C > adriamycine et bléomycine. La préparation purifiée de la substance active de l'invention obtenue comme décrit ci-dessus peut encore etre soumise aux étapes indiquées ci-dessous, permettant d'isoler la substance active de l'invention (3) Chromatographie d'affinité sur "Cibacron Blue F3G-A" immobilisé. (4) Filtration sur gel; (5) Chromatographie d'affinité sur concanavaline A immobilisée (6) Electrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide; et (7) Filtration sur gel. Chacune de ces étapes est décrite en détail ci-dessous. Etape de purification 3 Le concentrat de la substance active de l'invention obtenu dans l'étape 2 est soumis à la chromatographie draffinité sur Cibacron Blue FEG-A immobilisé (colorant produit par la société Ciba Geigy Corp.). L'immobilisation du Cibacron Blue F3G-A sur un support peut Outre effectué selon un procédé connu comme décrit par Bbhme et collaborateurs dans J. Chromatogr., Vol. 69, p. 209 214 (1972) ou bien on peut encore utiliser un adsorbant du conmerce par exemple "Blue Sepharose CL-6B" (produit par la société Pharmacia) "Affi-Gel Blue"(produit par la société Bio-Rad), etc.Après avoir dialyse le concentrat de la substance active de l'invention contre une solution tampon diluée à pH 7,0-8,0 (par exemple tampon au phosphate ou tampon Tris-acide chlorhydrique), on l'applique sur le Cibacron Flue FEG-A immobilisé ci-dessus. Dans cette opération, les protéines contaminantes telles que l'albumine sont adsorbées sur le Cibacron Blue FEG-A immobilisé et la substance active de l'invention est éluée dans les fractions non adsorbées. Ls récupé- ration d'activité dans cette étape est d'environ 70 à 95% avec une augmentation de pureté d'environ 3 fois. La récupération globale d'activité dans les étapes de purification 1 à 3 est: d'environ 56 à 93% avec une pureté d'environ 1,5.104 à 3.104 fois. Etape de purification 4 Les-fractions non adsorbées dans l'étape 3 sont concentrées et le concentré est soumis à la filtration sur gel dans les memes conditions que dans l'étape 2. On peut utiliser comme support pour la filtration sur gel le Sephadex G-75, 100, 150 ou 200 (produits par la société Pharmacia) le Bio-Gel P- 30, 60, 100, 150 ou 200 (produits par la société Bio-Rad), etc. On réunit les fractions actives, on les concentre et on dialyse contre un tampon au phosphate ou un tampon Tris-acide chlorhydrique dilué à pH 7,0-8,0. la récupération d'activité dans cette étape est d'environ 70 à 95 avec une augmentation de pureté de 3 à 4 fois. La récupération globale d'activité dans les étapes de purification 1 à 4 est d'environ 47 à 88% avec une pureté de 4,5.104 à 9.104 fois. Etape de purification 5 La solution purifiée obtenue dans l'étape 4 est ensuite soumise à la chromatographie d'affinité en utilisant la concanavaline A immobilisée. La concanavaline A peut être immobilisée par un procédé connu, ou encore on peut utiliser une concanavaline A immobilisée du commerce (produite par la société Sigma Chemical Cc. > EUA) ou la "Con A-Sepharose CL-6B" (produite par la société Pharmacia). La solution purifiée obtenue dans l'étape 4 est concentrée et appliquée sur la concanavaline A immobilisée en utilisant une solution diluée de tampon à pH 7,0 à 8,0 comme celui utilisé dans la même étape, et ensuite après avoir lavé vigoureusement la colonne avec la même solution de tampon, on effectue l'éluvion avec la même solution de tampon contenant de 1'a-méthyl-d-mannoside 0,1 M ou de concentration supérieure. La substance active de l'invention est concentrée dans les fractions non adsorbées.La récupération d'activité dans cette étape est d'environ 60 à 80y avec une augmentation de pureté de 2 à 4 fois. La récupération globale d'activité dans les étapes de purification 1 à 5 est d'environ 33 à 70%, avec une pureté d'environ 9,0.1 l0 à 3,6.105 fois. Etape de purification 6 La solution contenant la substance active de l'invention obtenue dans l'étape 5 est concentrée et soumise à l'électrophorèse sur plaque de polyacrylamide. Le concentré de la substance active de l'invention est appliqué sur un gel à 8% de polyacrylamide prépare en utilisant l'appareil d'électrophorèse sur plaque Model 221 (280 x 140 x 1,5 m) produit par la société Bio-Rad Laboratories. L'électrophorèse est effectuée en maintenant le courant à environ 70-100 ma. Après migration, on découpe le gel en bandes de chacune 3 mm de large et on extrait chaque bande de gel par une solution diluée de tampon à pH 7,0-8,0 contenant du chlorure de sodium 1,0 M et on réunit et on concentre les fractions actives. La récupération d'activité dans cette étape est d'environ 5 à 10% avec une augmentation de pureté d'environ 15 à 20 fois. La récupération globale d'activité dans les étapes 1 9 6 est d'environ 2,5 à 7,0%, avec une pureté d'environ 1,4.106 à 5,4.106 fois. Etape de purification 7 Dans la filtration sur gel de cette étape, on peut utiliser le même tampon, le meme sel et le mème gel que dans l'étape 2. Mais la colonne à utiliser dans cette étape est plus longue et de plus petit diamètre que celle utilisée dans l'étape 2. Les fractions actives sont réunies, concentrées, dialysées, stérilisées par filtration et si nécessaire lyophilisées pour donner la nouvelle substance active de l'invention. La récupération d'activité dans cette étape est d'environ 50 A 80% avec une augmentation de pureté de 1,5 à 2,0 fois. La récupération globale d'activité dans les étapes de purification 1 à 7 est d'environ 1,6 à 5,6% avec une 6 6 activité de 2,8.10 à 8,1.10 fois. Les caractéristiques de la substance active de l'invention ainsi préparée sont mesurées pour obtenir les résultats indiqués ci-dessous a) Poids moléculaire 39 000 + 5 000 (par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide et filtration sur gel) b) Point isoélectrique pI 3,9 + 0,3 c) Mobilité dans l'électrophorèse sur acétate de cellulose à à10'6 cm2 /V.s d) Activité spécifique dans l'évaluation utilisant les cellules L au moins 0,5.109 unités/mg de protéine. De plus, on transplante 2.10 cellules de sarcome Meth A par voie intradermique dans l'aisselle d'une souris (BALB/c x C57BL/6)F1 et on laisse proliférer suffisamment pour former des tumeurs solides et ensuite on administre la substance active de l'invention par voie intraveineuse (d une dose correspondant à 0,11 ng de protéine par souris) et on trouve des activités de (+) ou plus. Parmi les caractéristiques ci-dessus, on mesure les paramètres a) à c) selon les procédés suivants : Détermination du poids moléculaire (i) Selon la méthode de Segrest et collaborateurs tMethods in Enzymology Vol. 28-B, p. 54-63 (1972B on applique 5 r d'échantillon sur un gel de SDS (dodécylsulfate de sodium)-poly acrylamide et on effectue l'électrophorèse dans un tampon SDS/Trisglycine (pH 8,3). On effectue l'étalonnage du poids moléculaire en utilisant un nécessaire de produit de poids moléculaire étalon (fabriqué par la société Pharmacia). (ii) En utilisant une colonne de 0,9 x 120 cm de "Sephadex G-200" (produit par la société Pharmacia), on effectue la filtration sur gel avec une solution tampon de chlorure de sodium 0,7 M/tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,8) et on effectue l'étalonnage des poids moléculaires en utilisant des protéines étalons (ribonucléase A, chymotrypsinogène A, ovalbumine, aldolase, fabriqués par la société Pharmacia). b) Détermination du point isoélectrique On détermine le point isoélectrique en utilisant l'appareil pour l'électrophorèse isoélectrique, avec l'Ampholine (gamme de pH 2,5 à 4,5) et l'Ultrodex à 36% (tous fabriqués par la société LKB Productor AB, Suède). La formation d'un gradient de pH est effectuée à 340 volts et 23 mA pendant 5 à 7 heures et on applique ensuite l'échantillon sur la plaque. On effectue la migration jusqu'à 660 volts et 120 mA pendant 5 à 7 heures. On prépare des bandes de 1 mm de large et on les extrait par une solution de sérum physiologique et on mesure l'activité cytotoxique contre les cellules L. c) Mobilité dans l'électrophorèse En-utilisant une membrane d'acétate de cellulose Separax-S (fabriquée par la société Fuji Photo Film Co., Ltd, Japon), on effectue l'électrophorèse à pH 8,6 et à une force ionique de 0,06 à 0,07. Lorsque la migration est terminee, on prépare des bandes de 1 mm de large, on les extrait par une solution de sérum physiologique et on évalue l'activité cytotoxique contre les cellules L pour déterminer la mobilité. On étudie l'activité cytotoxique de la substance active de l'invention contre diverses lignées de cellules cancéreuses humaines cultivées. Le tableau II ci-après montre les résultats correspondants exprimes par la quantité de protéine nécessaire pour une cytotoxicité de 50% après 48 heures. TABLEAU Il Souches de cellules cancéreuses Quantité nécessaire pour Milieu * une cytotoxicité de 50Z (pg) ~~~~~~~~ PC 10 5 . 102. a KATO-III 9 e 2 b 10 MK-7 9 . 102 a Rca 6 . 10 c W-2 8 . 10 a GOTO 1.103 b SEKI 3 . 10 b Kvm-l 1 . 103 d MRK-l-nu 7 . 10 d * a : 80% de RPMI 1640 + 20% de FCS b : 40% de RPMI 1640 + 40% de MEM + 20% de FCS c : 80% de MEM + 20% de FCS d : 80% de DM160 + 20% de FCS Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 On injecte à des lapines pesant 2,5 a 3 kg par la veine de l'oreille 50 mg de Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; fourni par la société Wellcome Research Laboratories, Angleterre) tué par une solution de formaldéhyde. 8 jours plus tard, on injecte à nouveau dans la veine de l'oreille 100 y d'endotoxine (lipopolysaccharide d'Escherichia coli 026:B6, fabriqué par la société Difco Laboratories, EUA) et deux heures plus tard on recueille le sang entier du coeur. On centrifugre le sang recueilli à 5 000 tr/min pendant 30 minutes pour séparer les cellules sanguines et les solides insolubles. A partir de 20 lapines, on obtient 1200 ml de sérum ayant une activité de 12800 unités par ml. On dilue le sérum par 600 ml de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,8) et on l'applique lentement sur une colonne de 6 x 36 cm de 'tEAE-Sepharose CL-6B" (société Pharmacia) équilibrée avec le tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,8) contenant du chlorure de sodium 0,1 M. Ensuite, après lavage de la colonne avec 1 000 ml de tampon d'equilibrage (tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,8) contenant du chlorure de sodium 0,1 M), on effectue l'élution avec le gradient linéaire de NaCl produit par un appareil de production de gradient, en utilisant 1,5 1 de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,8) contenant NaCl 0,1 M et 1,5 1 de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,8)contenant NaC1 0,3 M.Le débit est de 60 ml/h et on recueille des fractions de 18 ml chacune. On réunit et on concentre les fractions actives. La récupération d'activité dans cette étape est de 92% avec une augmentation de pureté de 150 fois. On dialyse ensuite le concentré contre le tampon au phosphate 0,005 M (pH 7,4) contenant NaCl 0,15 M pendant une nuit et on filtre sur gel. On équilibre suffisamment avec le meme tampon une colonne de 5 x 80 cm de "Sephacryl S-200" (société Pharmacia) et on applique le concentré sur la colonne et on effectue l'élution avec le même tampon. Le débit est de 60 ml/h et on recueille des fractions de 10 ml chacune. On concentre par ultrafiltration les fractions actives obtenues immédiatement après la fraction d'albumine pour obtenir une préparation purifiée de la substance active de l'invention. Dans cette étape la récupération d'activité est de 92% avec une augmentation de pureté de 52 fois. La récupération globale d'activité dans toutes les étapes est de 85% avec une pureté de 7800 fois.On trouve que la préparation purifiée de la substance active de l'invention a une activité spécifique d'environ 1,4.10 îo6 unités par mg de protéine Les figures 1 et 2 du dessin annexé représentent les diagrammes de chromatographie sur colonne de DEAE-Sepharose CL-6B dans la première étape et de filtration sur gel sur colonne de Sephacryl S-200 dansla seconde étape respectivement. Exemple 2 Après dilution de 2 200 ml d'un sérum de lapin contenant la substance active de l'invention avec 1200 ml de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,2), on applique lentemant la solution résultante sur une colonne de 8 x 26 cm de DEAE-Sepharose CL-6B équilibré avec le tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,2) contenant NaCl 0,1 N.On lave ensuite la colonne avec 1 000 ml de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,2) contenant NaCl 0;13 M et on effectue l'élution avec le gradient linéaire de NaCl produit par un appareil de formation de gradient, en utilisant 2,0 1 de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,2) contenant NaCl 0,15 M et 2,0 1 de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 N.(pH 7,2) contenant NaCl 0,3 M. Le débit est de 90 ml/h et on recueille des fractions de 18 ml chacune. On réunit les fractions actives et on les dialyse contre le tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,2) contenant NaCl 0,1 M et on soumet à la rechromatographie sur une colonne de 2,5 x 30 cm de DEAE-Sepharose CL-6B équilibrée avec le même tampon. On élue la substance active de l'invention adsorbée avec le gradient linéaire de NaCl obtenu par un appareil de production de gradient en utilisant 350 ml de tampon d'équilibrage et 350 ml de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,2) contenant NaCl 0,3 M.Le débit est de 25 ml/h et on recueille des fractions de 7 ml .:.cune On réunit, et on concentre les fractions actives. Dans l'étape suivante, on applique le concentré sur une colonne (A, x 80 cm) de Sephacryl S-200 équilibrée avec le tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01M (pH7,8)contenant NaCl 1,0 M et on effectue l'élution avec le même tampon. Le débit est de 30. ml/h et on recueille des fractions de 8 ml chacune. On recueille les fractions actives réunies et on les lyophilise pour obtenir une préparation purifiée de la substance active de l'invention ayant une pureté 10 000 fois plus élevée que celle du sérum. La récupération d'activité dans toutes les étapes est de 80%. Exemple 3 On dialyse le concentré purifié obtenu à l'exemple 1 contre le tampon au phosphate 0,02 M (pH 7,1) pendant une nuit et on l'applique sur une colonne de 0,7 x 10 cm de Blue Sepharose CL-6B équilibrée avec le même tampon. On lave la colonne à fond et on élue les substances adsorbées avec 50 ml de tampon au phosphate 0,02 M (pH 7,1) contenant NaCl 1,5 M. Le débit est de 2,5 ml/h et on recueille des fractions de 3 ml chacune. On ne décèle pas d'activité dans les fractions adsorbées mais on récupère toute l'activité dans les fractions non adsorbées. On recueille et on lyophilise les fractions actives. Dans cette étape la récupération d'activité est de 95% avec une augmentation de pureté de 3 fois. Les valeurs globales dans toutes les étapes sont de 81% pour la 4 récupération d'activité et 2,3 . 10 fois pour la pureté. Dans l'étape suivante on dissout le produit lyophilisé dans 1 ml de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,02 M (pH 7,8) contenant NaCl 0,7 M et on applique la solution sur une colonne de 2,6 x 95 cm de "Sephadex G-75" (société Pharmacia) équilibrée avec le même tampon. Le débit est de 20 ml/h et on recueille des fractions de 10 ml chacune. On réunit et on concentre les fractions actives. Dans cette étape la récupération d'activité est de 95% avec une augmentation de pureté de 3 fois. Les valeurs globales dans toutes les étapes sont de 77% pour la récupération d'activité et 6}9.10 fois pour la pureté. On dialyse ensuite le concentré contre le tampon au phosphate 0,02 M (pH 7,2) contenant MgC12 4 M et on applique la solution sur une colonne de 0,3 x 10 cm de concanavaline A-Sepharose CL-6B (société Pharmacia) équilibrée avec le même tampon, à un débit de 2,5 ml/h. Après lavage à fond de la colonne avec le même tampon, on effectue l'élution avec le tampon au phosphate contenant de l'a-méthyl-d-mannoside 0,1 M. On récupère l'activité dans les fractions non adsorbées et on ne décèle pas d'activité dans les fractions adsorbées. On concentre les fractions non adsorbées et on dialyse contre le tampon au phosphate contenant NaC1 0,15 M. Dans cette étape la récupération d'activité est de 70% avec une augmentation de pureté de 2 fois. La récupération globale d'activité est de 54% avec une pureté de 1,4 . 105 fois. On applique ensuite la solution dialysée sur un gel à 8Z de polyacrylamide préparé au moyen d'un appareil d'électrophorèse sur plaque Bio-Rad Model 221 (280 x 140 x 1J5 mn) et on effectue l'électrophorèse à un courant constant de 80 mA. Après l'électrophorèse on découpe le gel en bandes de 3 m chacune, on extrait chaque bande par le tampon Tris-acide chlorhydrique 0,05 M (pH 7,8) contenant NaCl 1,0 M pendant 24 heures et on recueille et on concentre les fractions actives. Dans cette étape la récusé ration d'activité est de 8% avec une augmentation de pureté de 15 foie. La récupération globale d'activité est de 4,3X avec une pureté de 2,1 . 106 fois. On réunit plusieurs lots de la substance active de l'invention purifiée jusqu'à cette étape et on applique la solution sur une colonne mince de 0,9 x 120 cm de Sephadex G-200 équilibrée avec le tampon Tris-acide chlorhydrique 0,05 M (pH 7,8) contenant NaCl 0,5 M. Le débit est de 3,5 ml/h et on recueille des fractions de 0,3 ml chacune. On réunit les fractions actives, on les concentre et on dialyse contre une solution de sérum physiologique pour obtenir une solution de la substance active de l'invention. Dans cette étape, la récupération d'activité est de 705 avec une augmentation de pureté de 1,5 fois. La récupération globale d'activité dans les sept etapes est de 3,0X avec une pureté de 3,2 . 196 fois. On trouve que la substance active de l'invention a une activité spécifique d'environ 0,57 . 109 unitds/mg de protéine. I1 est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus & titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour purifier une substance protéide physiologiquement active douée d'activité antitumorale, qui est induite par administration à un lapin d'au moins une substance capable de stimuler le système réticuloendothélial et ensuite injection au lapin de l'endotoxine provenant d'une bactérie à gram-négatif, caractérisé en ce qu'il consiste (1) & mettre en contact une solution brute de ladite substance protéinée physiologiquement active avec un échangeur d'anions basique pour adsorber ladite substance physiologiquement active sur l'échangeur d'anions, (2) à eluer la substance physiologiquement active adsorbée et (3) à soumettre à la filtration sur gel l'éluat contenant ladite substance physiologiquement active avec un gel approprié pour la réparation d'une substance ayant un poids moléculaire dans la gamme de 30 000 à 70 000. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'éluant dans la filtration sur gel est une solution à pH 6,0 - 9,0. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met en contact la solution brute avec l'échangeur d'anions basique en utilisant une solution tampon pH 6,0 - 9,0 et une concentration en sel de pas plus de 0,2 M. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on met an contact la solution brute avec l'échangeur d'anions basique en utilisant une solution tampon à pH 6,0 - 9,0 et une concentration en sel de pas plus de 0,2 M. 5. Substance protéinée physiologiquement active qui est induite par administration à un lapin d'au moins une substance capable dé stimuler le système réticuloendothélial et ensuite injection au lapin de 1'endotoxine d'une bactérie à gram-ndgatif, caractérisée en ce qu'elle présente les propriétés suivantes a) poids moléculaire : 39 000 + 5 000; b) point isoblectrique : pi 3,9 + 0,3; c) mobilité dans l'électrophorèse (pH 8,6) :l04à L0'6 cm2/V.s d) activité spécifique d'après l'évaluation utilisant les cellules L : au moins 0,5.109 unités/mg de protéine; et e) activité d'après l'dvaluation biologique utilisant le sarcome Méth A transplanté chez la souris (BALB/c x C 57BL/6)F1, lorsqu'on l'administre par voie intraveineuse à une dose correspondant à 0,1 à 1 ng de protéine par souris : (+) ou plus.