Brevet FR2523960A1 — publié le 19830930

La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de stilbène radioactifs marqués à l'iode, leur procédé de préparation et leur application aux dosages radioismunologi- ques. Elle a pour objet les dérivés de stilbène de formule générale I dans laquelle A et B représentent chacun de l'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison et R représente le reste d'un acide aminé RNH2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier, ce reste étant accepteur d'iode. L'invention a plus particulièrement pour objet, les dérivés de stilbène radioactifs marquées à l'iodle de formule générale I dans laquelle R représente le reste d'un acide aminé RNHa oule reste d'un dérivé de ce dernier,- choisi dans le groupement constitué par l'histidine, la tyrosine, l'histamine, la tyramine et le tyrosimate de méthyle marqués à l'iode 125 ou 131. Parmi les produits de formule générale I , on citera notamment - le dienestrol 4-0-monocarboxypropyl, couplé à 1 (125 I) histamine de formule dans laquelle le signe * indique qu'il s'agit d'iode 125 radioactif, lequel iode 5 peut être en position 2 ou 5 - l'hexestrol4-O-monocarboxypropyl , couplé à 1' (125 I) histamine de formule dans laquelle le signe * indique qu'il s'agit d'iode 125 radioactif, lequel iode 1?5 peut être en position 2 ou 5. L'invention a également pour objet, un procedé de préparation répondant à la formule généralè I ci-dessus. Ce procédé est caractérisé en ce que - on fait réagir un produit de formule générale II dans laquelle et dans ce qui suit, A et B ont les-significations précitées, avec un haloge'no butyrate d'alcoyle, en présence d'une base, - et obtient l'éther de formule générale III dans laquelle R1 représente un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone, dont on saponifie la fonction ester, - puis fixe la la acide surla du produit résultant de for- mule III dans laquelle R1 représente de l'hydrogène, un groupement activateur de la fonction carbonyle et obtient le produit de formule générale III dans laquelle R1 représente un groupement activateur de la fonction carbonyle - que l'on fait réagir avec un acide aminé accepteur d'iode ou avec un dérivé d'un tel acide et obtient le produit cherché de formule générale I. Ce procédé est encore caractérisé en ce que - l'acide aminé accepteur diode ou le dérivé d'acide aminé est choisi dans le groupe constitué par l'histidine, la tyrosine, l'histamine, la tyramine ou le tyrosinate de méthyle. - on fixe sur la fonction acide du produit de formule générale III; dans laquelle R1 représente de l'hydrogène, un groupement activateur de la fonction carbonyle, en faisant réagir le produit de formule III avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte et obtient le produit de formule générale III dans laquelle R1 est un groupement activateur de la fonction carbonyle représenté par un radical de formule -CO-0-ALK, ALK étant un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone. Dans les conditions préférentielles de mise en oeuvre, -le procédé de l'invention est caractérisé par les points suivants - l'halogénobutyrate d'alcoyle que l'on fait réagir sur le produit de formule générale II est le bromobutyrate d'éthyle et on opère en présence de carbonate de potassium. - on saponifie la fonction ester du composé de formule générale III, dans laquelle R1 représente un radical alcoyle, au moyen de la soude méthanolique. -lthalogénoformiate d'alcoyle que lton fait réagir avec le produit de formule générale III, dans laquelle R1 représente de l'hydrogène, est le chloroformiate d'isobutyle et l'on opère en présence de tri-n-butylamine, dans le dioxane anhydre et sous atmosphère inerte. - l'acide aminé ou son dérivé que l'on fait réagir avec le produit de formule générale III dans laquelle R1 représente un groupement activateur de la fonction carbonyle,-est l'histamine marquée à l'iode 125 ou 131,sous atmosphère inerte. La fixation de la fonction carbonyle du produit de formule générale III, dans laquelle R1 représente de 1 'hydrogène, peut aussi être réalisée en faisant agir sur celui-ci le N-hydroxy succinimide ou le dicyclohéxylcarbodiimide, générateur des groupements activateurs de ladite fonction carbonyle. Le procédé décrit permet d'obtenir au départ du dienestrol: - le dienestrol 4 0-monocarbosypropyl couplé à 1'(125I)- histamine de formule dans laquelle le signe * indique qu'il s'agit d'iode125 radioactif, lequel iode 25 peut être en position 2 ou 5. - au départ de l'hexestrol - l'hexestrol 4-0-monocarboxypropyl couplé à 1i(125I) - histamine de formule dans laquelle le signe * indique qu'il stagit d'iode 125 radioactif, lequel iode 125 peut être en position 2 ou 5. L'invention a également pour objet l'application des produits de formule générale I, objet de l'invention, aux dosages radioimmunologiques du diénestrol, de l'hexestrol ainsi que du diéthylstilbestrol, dans la bile, l'urine les féces, le plasma et les tissus des animaux ou de l'homme, ainsi que dans les aliments des animaux ou de l'homme. L'invention a également pour objet à titre de produits industriels nouveaux et notamment à titre de produits intermédiaires nécessaires à l'exécution du procédé de l'invention, les produits de formule générale III dans laquelle A et B représentent chacun de l'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison et Ri représente de l'hydrogène, un radical alcoyle inférieur ou un groupement activateur de la fonction carbonyle. Ce groupement activateur de la fonction carbonyl peut être un radical de formule -CO-O-ALK, dans laquelle ALE représente un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone. Parmi ces produits, on citera les produits suivants - le diénestrol 4-O-monocarbéthoxypropyl de formule et l'hexestrol 4-O-monocarbéthoxypropyl de formule - le diénestrol4~Smonocarboxypropyl de formule et l'hexestrol4-O-monocarboxypropyl de formule - l'anhydride mixte du diénestrol 4-0-monocarboxypropyl avec le formiate d'isobutyle de formule - l'anhydride mixte d'hexestrol 4-Omonocarboxypropyl avec le formiate d'isobutyle de formule Les. produits de formule générale III, notamment ceux dans lesquels R1 représente de l'hydrogène, sont des produits de départ utiles pour la préparation d'antigènes,nécessai- res également aux dosages radioimmunologiques du diéthylstilbestrol,du diénestrol et d'hexestrol. Leur-application en tant que telle fait également l'objet de la présente invention et est caractérisée en ce que l'on conjugue un.de ces produits avec de l'albumine sérique bovine (3SA)- ou avec de l'albumine sérique humaine (HsA) et obtient l'antigène cherché. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre l'application des produits de formule générale III, dans laquelle R1 représente de l'hydrogène, est caractérisée par les points suivants - On fait réagir un produit de formule générale III, dans laquelle, et dans ce qui suit, A et B ont des significations déjà citées, et Ri représente de l'hydrogène en vue de l'activation de la fonction carbonyle avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte, - Obtient ltanhydride mixte de formule III dans laquelle R1 représente un radical de formule -CO-O-Alk, Alk étant un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone, - Que l'on conjugue avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) et obtient l'antigène cherché. L'application des produits de formule générale III, notamment de ceux dans laquelle R1 représente de l'hydrogène est encore caractérispar les modes d'éxécution suivants - lthalogéno formiate d'alcoyle que l'on fait réagir avec le produit de formule générale III, dans laquelle Ra représente de l'hydrogène, est le chloroformiate d'lsobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine, dans le dioxane anhydre et sous atmosphère inerte vers + 4 C. - on fait reagir ltanhydride mixte de formule générale III, dans laquelle R1 représente un radical de formule -CO-O-Alk, avec 1 'albumine séria ue bovine ou humaine en ayant -préala- blement dissout cette dernière dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte. L'application décrite permet d'obtenir respectivement au départ - du dienestrol 4-0-monocarboxypropyl de formule - les antigènes de formules dans laquelle n = 20 à 40 ; et dans laquelle n - 20 à 40. - et au départ de l'hexestrol 4-0-monocarboxypropyl de for- mule ou les antigènes de formule dans laquelle n = 20 à 40 dans laquelle n = 20 à 40 L'invention à également pour objet, à titre des produits industriels nouveaux, les antigènes obtenus lors de l'application décrite ci-dessus, et notamment les produits de. formules générales IV, V, VI.. et VII précités L'invention a également pour objet l'application des antigènes ci-dessus, à la préparation des anticorps. Les produits de formule générale I, objet de l'invention et notamment le dienestrol-O-monocarboxypropyl (125I) histamine et l'hexestrol-O-monocarboxypropyl (1251) histamine sont utilisés comme déjà dit, lors du dosage radioimmunologique du die'nestrol, de l'hexestrol, ainsi que du diéthylstilbestrol. Ils permettent le dosage.de ces stilbbtes dans les liquides et tissus biologiques et dans l'alimentation humaine et animale. Le dosage radioimmunologique a été effectué selon la méthode décrite par S.A. Bergson et R.S. Yalow HORMONE 4 p. 557 (1964) et G.E. Abraham "Journal of Chemical endocrinonal métal 29 p. 866 (1969). Les antigènes de formule IV, V, VI.etjVIÎ précité s, également objet de ltlnvention, sont utilisés au développement d'anticorps. Injectés chez l'animal en présence d'un adjuvant, ils permettent en effet d'obtenir chez celui-cides sérums contenant des anticorps contre l'hexestrol, le diénestrol ainsi que contre le diéthylstilbestrol. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. ExemPle I : 4-O-monocarboxvoroyl didnestrol couplé à l'(125I) histamine. Stade A : Diénestrol-4-O-monoéthoxycarbonylpropyl On prépare une solution de 20 g de dienestrol, 7 g. de bromobutyrate d'éthyle et 4,6 g de carbonate de potassium sec dans 300 ml d'acétone, porte cette solution au reflux pendant 17 heures environ, la laisse refroidir ensuite à température ambiante, la verse dans l'eau, extrait à ltacétate d'éthyle, lave les phases organiques réunies, à l'eau, les sèche, traite au charbon actif, évapore le solvant et sèche sous pression réduite. On recueIlle 24,4 g d'un résidu semi cristallisé que l'on purifie par chromatographie sur silice sous pression, avec élution par le mélange : chlorure de méthylène/méthanol (95/5) et obtient 6,36 g de produit cherché, P.F. vers 860 C. Spectre IR (chloroforme) OH vers 3590 ca - C = O vers 1728 cm -1 Aromatique vers 1610 bm -1 1590 cm -1 1573 cm 1510 cm -1 Stade B : Dienestrol 4-O-monocarboxvoroi,vl. On introduit dans 155 ml de méthanol 6,15 g de produit obtenu au stade précédent et 31 ml de soude 2N, porte la solution résultante au reflux pendant 1 heure, après refroidissement à température ambiante, on amène le pH à 5-6 par addition de 7 ml d'acide acétique, verse le mélange réactionnel dans l'eau, extrait à l'acétate d'éthyle, réunit les phases organiques, les lave à l'eau, les sèche , traite au charbon actif, évapore le solvant concentre à sec sous pression réduite et obtient 5,48 g de produit brut attendu. On purifie ce produit par le passage au sel de sodium et le retour à L'acide libre et obtient 5,16 g de produit cherché ; P.F. = 158 C Analyse : C22H2404 C % H % Calculé 74,98 6,86 Trouve .74,7 7,0 Stade C : Anhydride mixte de formiate d'îsobutyle et diénestrol-4-0-monocarboxyrropyl On mélange succéssivement 2,5 mg de produit préparé au stade précédent, 50 l de dioxane, 10 pl d'un mélange dioxane-tri-n-butylamine (5 : 1) et 10 pl-de mélange dioxane -chloroformiate d'isobutyle (10 : 1). La solution est agitée pendant 30 minutes sous atmosphère- inerte, puis on ajoute 3,4 ml de dioxane.On obtient une solution du produit cherché que l'on utilise telle quelle pour le stade suivant de la synthèse. Stade D : Dienestrol 4-0-monocarboxopropYl couplé à l,(125I) histamine. Location de l'histomine : On prépare 10 l d'une solution d'histamine 10-4M dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,5 M de pH 8, puis on ajoute successivement 1 m Ci de iodure 125de sodium (activité spécifique 2000 Ci/m mol) dans 5 l d'eau distillée et 50 > g de chloramineT dans 10 pl d'eau distillée. On agite le mélange réactionnel pendant 75 secondes, ajoute une solution de 300 g de métabisulfite de sodium dissous dans 10 Al d'eau distillée, et obtient une solution aqueuse du produit cherché, Rf = 0,1 (chromatographie sur silice, système de solvant méthanol-triéthylamine 98 : 2) Condensation On ajoute à cette solution 50 l de-la solution d'anhydride mixte obtenue au stade précédent, agite et laisse à l'obscurité pendant deux heures à une tempSrature proche de 40 C.On dilue ensuite le mélange réactionnel dans 0,3 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 10-1 M, extrait par 1,5 ml de chlorure de méthylène, évapore la phase organique sous atmosphère inerte, reprend le résidu par 100 l de chlorure de méthylène, chromatographie sur silice et en éludant par le mélange dibroforme-méthanol (97 : 3) et réunit les fractions contenant le produit. Le produit obtenu présente une activité totale de 100 Ci. Exemple Il : Hexestrol 4-O-monocarboxyproyi couplé à 1' (125I) histamine. En procédant comme décrit dans l'exemple I et au départ de l'hexestrol on obtient - 6,7 g d'hexestrol 4-0-monoéthoxycarbonyl propyl. PF vers 1100 C Spectre IR (chloroforme) OH vers 3590 cm-1 C = O vers 1725 cm-1 Aromatique 1610 cm 1594 cm 1 1580 cm-1 1508 cm - 4,5 g d'hexestrol 4-0-monocarboxypropyl. PF vers 1830 C Analyse pour C22H2804 Calculé C % H,' Calculé 74,13 7,92 Trouvé 74,4 8,1 - l'anhydride mixte de l'hexestrol 4-0-monocarboxypropyl avec le formiate d'isobutyle. 125 - de l'hexestrol 4-0-monocarboxypropyl couplé à l'( I) histamine, présentan-t: uneactlvité totale de 100 p Ci. Exemple III : PréDaration d'antigène ear conjugaison du dienestrol 4-O-monocarboxypropyl et d'albumine sérique bovine (BSA). Stade A : L'anhydride mixte du dienestrol 4-0-mono- carboxypropyl avec le formiate d'isobutyle. On dissout 352 mg de diénestrol 4-0-monocarboxypropyl dans 10 ml de dioxane, puis ajoute 0,46 ml de tri-n-butylamine et agite le mélange sous atmosphère inerte. On abaisse la température à 120 C et ajoute 0,126 ml de chloroformiate dtisobutyle et maintient l'agitation pendant 30 minutes à 12O C. On obtient la solution du produit cherché que l'on utilise telle quelle pour le stade suivant. Stade 3 :Dissolution de la BSA. On prépare un mélange de 44 ml d'eau glacée et de 4 ml de dioxane, puis ajoute, sous agitation et à une' température voisine de 0 C, 1,54 g d'albumine sérique bovine. On transverse ensuite la solution résultante dans un dispositif à dialyse et laisse pendant 72 heures en dialyse à une température située entre 10 et 50 C, avec un contre-courant de 30 1 d'eau. On extrait ensuits le dialysat obtenu (pH 7,9) par le chloroforme glacé, sépare les phases organiques, les lave à l'eau, On réunit les phases aqueuses, les congèle, puis les lyophilise pendant 20 heures sous vide de 0,01 mm Hg, et obtient 1,4 g de produit. Stade C : Conjugaison: On dissout à 0 C ce résidu dans 40 ml de dioxane glacé, puis ajoute 1,35 ml de NaOH N et aussit8t l'anhydride mixte préparé au stade A . On ajuste le pH à 8,9 par addition d'acide chlorhydrique N/10, abandonne le mélange réactionnel pendant 4 heures sous agitation, à une température proche de 0 C. On le soumet ensuite à la dialyse pendant 18 heures, à une température comprise entre 10 et 50 C, à contre-courant d'eau. Après le passage de 30 1 d'eau le dialysat est transvasé, acidifié à pH 4,1 par l'acide chlorhydrique N puis N/1O, congelé pendant une nuit vers -184 C, puis dégelé lentement sans dépasser + 5d C. Un précipité se forme et la solution surnageant est éliminée par filtration. Le précipité est repris par 100 ml d'une solution de bicarbonate de sodium à 1 ,', et la solution est soumise à la dialyse pendant 72 heures dans les conditions précitées. On extrait ensuite le dialisat par le chloroforme glaçé, et lave la phase organique à l'eau, les phases aqueuses réunies sont congelées, puis lyophilisées pendant 20 heures sous un vide de 0,01 mm Hg pour donner 1,4 g d'antigène cherché. Ce produit contient 37 à 38 groupes diénestrol. liés par mole. Exemple IV : Prénaration d'antigène par conjugaison d'hexes trol-4-0-monocarboxyDropyl et d'albumine sérique bovine (BSA). En procédant comme décrit à l'exemple III, en partant due 356 mg d'hexestrol-4-O-monocarboxypropyl et de 1,54 g d'albumine sérique bovine (BSA), on obtient 1,3 g d'antigène cherché. Ce produit contient 31 à 32 groupes d'hexestrol par mole. Exemple V : Préparation d'antigène par conjugaison d'hexestrol -4-0-monocarboxypropyl et d'albumine sérique humaine (HSA). En procédant comme décrit à l'exemple III, en partant de 356 mg d'hexestrol-4-0-monocarboxypropyl et 1,54 g d'albumine sérique humaine (HSA) on obtiènt 1,17 g de l'antigène cherché. Ce produit contient21 groupes dEexestrol liés par mole. REVENDICATIONS 1) Produits industriels de formule générale III dans laquelle A et B représentent chacun de l'hydrogène ou representent ensemble une double liaison et R1 représente de l'hydrogène, un radical alcoyle inférieur ou un groupement activateur de la fonction carbonyle. -2) Produits selon la revendication 1 , à savoir - le diénestrol 4-C-monscarbetho yproptl de formule et l'hexestrol 4-O-monocarbéthoxypropyl de formule 3) Produits selon la revendication 1 , à savoir - le diénestrol4-O-monocarboxypropyl de formule et l'hexestrol4-O-monocarboxypropyl de formule 4) Produits selon la revendication 1 , à savoir - l'anhydride mixte du diénestrol 4-O-monocarboxypropyl avec le formiate d'isobutyle de formule - l'anhydride mixte d'hexestrol 4-O-monocarboxypropyl avec le formiate d'isobutyle de formule 5) Procédé de préparation des produits définis aux revendications 1, 2, 3 ou 4, caractérisé en ce que l'on fait réagir un produit de formule générale II dans laquelle et dans ce qui suit, A et B ont les significations précitées, avec un halogeno butyrate d'alcoyle, en présence d'une base ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ et obtient l'éther de formule générale III dans laquelle R1 représente un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone, dont on saponifie si désiré la fonction ester, puis fixe, si désiré, sur la fonction acide du produit résultant de formule III dans laquelle R1 représente de l'hydrogène, un groupement activateur de la fonction carbonyle et obtient le produit de formule générale dans laquelle R1 représente un groupement activateur de la fonction carbonyle. 6) Procédé sein la revendlcation 5, caractérisé en ce que l'on fixe sur la fonction acide du produit de formule générale III, dans laquelle R1 représente de l'hydrogène, un groupement activateur de la fonction carbonyle, en faisant réagir ce produit de formule III avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte et obtient le produit de formule générale III dans laquelle Ri est un groupement activateur de la fonction carbonyle représenté par un radical de formule -CO-O-ALK, ALK étant un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone. t Procédé suivant l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que l'halogénobutyrate d'alcoyle que l'on fait réagir sur le produit de formule générale Il est le bromobutyrate d'éthyle et on opère en présence dé carbonate de potassium. 8) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 5 7, caractérisé en ce que l'on saponifie la fonction ester du composé de formule générale III, dans laquelle R1 représente un radical alcoyle, au moyen de la soude méthanolique. g) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que .I'halogénoformiate d'alcoyle que l'on fait réagir avec le produit de formule générale III, dans laquelle R1.représente de l'hydrogene, est le chloroformiate d'isobutyle et l'on opère en présence de tri-n-butylamine, dans le dioxane anhydre et sous atmosphère inerte. i0) Application des produits de formule générale III telle que définie à la revendication 1, dans laquelle R1 représente de lthydrogènè, à la préparation d'antigènes, caractérisée en ce que l'on conjugue un de ces produits avec de l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec de l'albumine sérique humaine (HSA) et obtient l'antigène cherché. 11) Application selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'on fait réagir un produit de formule générale III dans laquelle, et dans ce qui suit, A et B ont des significations déjà citées, et R1 représente de l'hydrogène en vue de l'activation de la fonction carbonyle avec un. halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte, - Obtient l'anhydride mixte de formule III dans laquelle R1 représente un radical de formule -CO-O-Alk, Alk étant un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone, ~ que lton conjugue avec l'albumine .serique bovine (BSA) ou humaine (HSA) et obtient l'antigène cherché. 12) Application selon la revendication 11, caractérisée en ce que e -- l'halogéno formiate d'alcoyle que l'on fait réagir avec le produit de formule générale III, dans laquelle Rj représente de l'hydrogène, est le chloroformiate dtisobutyN et on opère en présence de tri-n-butylamine, dans le dioxane anhydre et sous atmosphère inerte vers + 40 C. on fait réagir l'anhydride mixte de formule générale III, dans laquelle Ri représente un radical de formule -CO-O-Alk, avec l'albumine sérique bovine ou humaine en ayant préalablement dissout cette dernière dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte.