Brevet FR2533229A2 — publié le 19840323

FR 2533229 A2 19840323 FR 8215845 A 19820921 La présente invention a trait au domaine des matériaux anorganiques utilisés comme supports insolubles pour-l'immpobilisation de micro-organismes et concerne des perfectionnements a l'utilisation des supports visés dans la demande de brevet principal N 82007205 du 27 Avril 1982. On a décrit dans cette demande susvisée des supports céramiques constitués par des silico-aluminates de granulométrie moyenne très faible avec un intervalle tel que le diamètre des plus gros grains soit au maximum deux fois celui des plus petits ; comme par exemple du type cordiérite synthétique à grains fins de 100 à 200 microns. Comme exemple non limitatif d'application de tels supports, on a relate la réalisation d'un bio-réacteur pour la production de tryptophane par immobilisation de bactéries d'Echerichia coli. Un des buts de cette Addition est d'illustrer d'autres cas d'utilisation des supports; selon l'invention5 notamment pour l'immobilisation d'organismes monocellulaires comme par exemple des trypanosomes ou des leishmanias ou, mieux encore, pour l'immobilisation d'hybridomes en vue de la production d'anticorps monoclonaux qui, comme on le sait, servent notamment à l'élaboration de sérums. On connait la fragilité et les contraintes de diffusion des cellules d'hybridomes qui résultent de la fusion de lymphocytes et de cellules myélomateuses et permettent la préparation d'anticorps monoclonaux très précieux en immunothérapie humaine (voir par exemple la revue " Pour la Science " novembre 1981 p.38-39). La culture de ces cellules peut se faire de diverses façons pour les phases de croissance puis de production d'anticorps, par exemple par:injection intrapéritonéale d'hybridomes dans la cavité abdominale d'une souris ou par culture en discontinu sur des microbilles d'un support en lit fluidisé. I1 a maintenant été trouvé que ges procédés de fractionnement et de purification de molécules biologiques pouvaient être notablement sinip,lif5Ês grâce à la mise en oeuvre, comme supports de cellules, des materiaux granulaires anorganiques selon l'-invention. En effet, grâce aux travaux effectués en collaboration avec l'institut de Technologie des Surfaces Actives de-CONlPIEGNE (France), i7 a pu être mis au point une technique de fixation d'hybridomes et de fabrication d'anticorps monoclonaux par l'utilisation de colonnes en lit fixe de support selon l'invention et fonctionnant en continu.Cette technique presente de nombreux avantages tels que, en particulier : la séparation du milieu de culture, plus simple que dans les cas classiques ; la plus grande facilité de maintenir la stérilité du milieu ; et bien entendu la production en continu d'anticorps monoclonaux. L'invention sera mieux eomprise- par la description de l'exemple de réalisation ci-après dans lequel on a utilisé comme support d'immobilisation de cellules, dans un réacteur cylindrique à lit fixe, le produit dénommé A dont toutes les caractéristiques sont fournies dans le brevet principal. On a utilisé comme matériel un réacteur cylindrique thermostate de 20cm de hauteur et 1 cm de diamètre, rempli du support A (20 grammes) et connecté, par l'intermédiaire d'une pompe peristaltique, a un échangeur de gaz ou colonne d'aération apte à fournir au milieu de culture un gaz contenant approximativement : 74 % d'azote, 20 % d'oxygene et 6 % de gaz carbonique. Avant opération, le support A a été lavé à l'Hcl puis séché et pasteurisé à 80-90"C dans la colonne pendant 2 heures, avec circulation à cette température d'une solution tampon de phosphate alcalin donnant un pH de 7,2 à 7,4. Les hybridomes étaient obtenus par fusion de lymphocytes de souris type BALB/C avec des cellules de myélome type SP2 et le concentrat de matière active était introduit dans 150 ml d'un milieu de culture connu RPMI 1640 contenant 10 % de sérum fétal de veau. Le milieu actif était alors introduit dans le réacteur avec un débit d'environ 1 ml/minute correspondant à une vitesse linéaire de 1,3 cm/minute. Les mesures d'anticorps obtenus (immunoglobulines G) étaient faites sur plaques de nylon hydrolysé et acétylé (avec comparaison d'etalons sur différentes plaques) puis comptage dans une chambre de THOMA et mesure d'ATP (adenosine triphosphate) par luminescence. Le tableau 1 ci--dessous montre le métabolisme énergique du milieu de culture au cours du processus d'immobilisationdes cellules sur le support utilisé Tableau 1 A l'entrée du A la sortie du milieu de culture milieu de culture Concentration en cellules 105/ml 4,6 0 ATP (PG/ml) 8,6 x 103 O L'absence de cellules et d'ATP dans le milieu sortant du réacteur montre clairement que la totalité de la biomasse a ete im mobilisée dans ce dernier, par un seul passage, ce qui a été confirmée par utilisation du microscope électronique. Par ailleurs, l'activité des cellules d'hydridomes immobilisées sur le support de l'invention a montré une sécrétion continue d'anticorps monoclonaux selon une phase stationnaire comme cela ressort de la courbe (1) annexée ou l'abscisseTcorrespond au temps en heures alors que l'ordonnée représente la concentration C des immunoglobulines (exprimees en microgrammes par ml). Ces essais ont donc montré la possibilité d'utilisation, en phase continue, d'un réacteur à lit fixe de support selon l'invention, pour la production d'anticorps et, partant de là, de diverses macromolécules secretées par des organismes vivants. REVENDICATION Utilisation du support, selon le brevet principal, a l'immobilisation de cellules de microorganismes, caracterisee en ce que l'application est faite sur des cellules d'hybridomes pour la production en continu d'anticorps monoclonaux par passage desdites cellules, en milieu de culture approprié, dans un réacteur -à lit fixe dudit support.