Brevet FR2531963A1 — publié le 19840224

La présente invention concerne un procédé de synthèse de désoxyribo- oligonucléotides et de ribo-oligonucléotides sur un support solide. Au cours des dernières années, les savants ont mis au point des procédés de synthèse d'oligonucléotides ayant des séquences bien définies, que l'on peut utiliser pour manipuler l'ADN et 1 'ARN A titre d'exemple, des morceaux synthétiques d'ADN de 10 à 14 unités de long peuvent être assemblés par des techniques enzymatiques spécifiques pour former des gènes en- tiers, ou bien peuvent servir de sondes pour faciliter-l'identi- fication d'une séquence d'ADN voulue Des chaines d'oligonucléo- tides synthétiques peuvent servir de liens pour faciliter l'as- semblage bout à bout de morceaux d'ADN, ou la reconstruction de molécules d'ADN recombinantes. Les oligonucléotides ont tout d'abord été préparés par synthèse par Khorana et al au moyen d'une synthèse de diesters, J Molec Biol 72:251 ( 1972) Narang et al, J Biological Chemistry 250:4592 ( 1975) ont développé ce mode opératoire en mettant au point une synthèse de triesters Ces procédés anté- rieurs étaient difficiles et demandaient beaucoup de temps Il fallait longtemps pour réussir à assembler les nucléotides, pour préparer les réactifs nécessaires à la condensation et pour pu- rifier les produits apres chaque étape de condensation, ainsi que pour isoler et purifier la séquence de nucléotides finale. Letsinger, et al, J Am Chem Society 97:3278-79 ( 1975), ont amélioré les procédés de synthèse des oligonucléotides en révélant le procédé dit "des triesters de phosphite" Ce procédé triester de phosphite a été étendu ultérieurement à la synthèse en phase solide des oligonucléotides Les procédés de synthèse 2 2531963 en phase solide, ou sur "support de polymère", ont l'avantage de faciliter les opérations de séparation et de purification On utilise souvent comme support le gel de silice,colloide rigide et non gonflant Dans le procédé en phase solide, on fait réa- gir un nucléoside protégée avec un agent phosphitylant tel que la méthoxydichlorophosphine On fait ensuite réagir le phos- phomonochloridite de nucléoside résultant avec un second nucléo- side protégé fixé à un support Ensuite, par oxydation douce avec de 1 ' iode dans du tétrahydrofuranne, de la lutidine et de l'eau, on transforme le phosphite en un phosphate Ce procédé est beaucoup plus rapide que ceux qui le précédaient, mais il se forme une quantité considérable d'isomère 3 '-3 ', même quand on mène la réaction à -78 C et que l'on règle soigneusement le rapport du nucléoside à l'agent phosphitylant Un autre inconvénient de ce procédé réside dans l'instabilité des intermédiaires réactifs vis-à-vis de l'hydrolyse et de l'oxydation par l'air. Caruthers et al, J Am Chem Soc 103:3185-3191 ( 1981) ont modifié ce procédé en introduisant un dérivé "tétrazolide" du phosphite de nucléoside Mais cet intermédiaire n'est pas très stable et la préparation du dérivé introduit une étape sup- plémentaire qui doit être réalisée à -78 C. Caruthers et al, Tetrahedron Letters 22, 1859-62 ( 1981) ont également modifié le procédé fondamental de telle sorte que la méthoxydichlorophosphine utilisée comme agent phosphitylant soit transformée en un dérivé N,N'-dialkylaminé qui produit un "phosphite de nucléoside" relativement stable quand on le traite par un nucléoside On traite ensuite ce produit par un gel de silice portant un nucléoside, en présence de tétrazole Ce procé- dé permet d'obtenir un intermédiaire ayant une plus grande sta- bilité qu'auparavant, mais cet avantage est contre-balancé par la longueur du procédé de préparation du produit de départ. Ainsi, il existe encore un besoin pour un procédé de syn- thèse d'un oligonucléotide sur un support solide, qui soit rela- tivement simple et facile à mettre en oeuvre et qui permette d'éviter les problèmes décrits ci-dessus C'est par conséquent un objectif de la présente invention de mettre au point un procédé de synthèse en phase solide d'oligonucléotides, qui puisse être mis en 3 -2531963 oeuvre facilement et économiquement et qui fournisse un produit stable. Il a été découvert que l'on pouvait facilement synthétiser des oligonucléotides sur un support solide par un procédé qui consiste àtraiter le support solide par un agent phosphitylant, puis à traiter le produit résultant par le nucléoside Cela va à l'encontre des procédés en vigueur qui consistent à traiter le nucléoside par l'agent phosphitylant, puis à traiter le produit résultant par le support. La présente invention concerne un procédé original de syn- thèse d'oligonucléotides sur un support en phase solide, princi- palement du gel de silice On combine un nucléoside avec le sup- port en phase solide au niveau de son groupement 3 '-hydroxyle. Le groupement 5 '-hydroxyle du nucléoside est protégé par un grou- pement protecteur On enlève le groupement protecteur et le grou- pement 5 '-hydroxyle libre réagit alors avec un agent phosphitylant bifonctionnei On traite ensuite le support par un nucléoside pro- tégé On oxyde les groupements phosphite en phosphates, et on en- lève du second nucléoside le groupement protecteur du groupement 'hydroxyle On procède ensuite à un allongement de chaine par le même cycle de réactions: traitement par l'agent phosphitylant, traitement par un autre nucléoside et oxydation A la fin de la synthèse, on coupe l'oligonucléotide du support, on Supprime son blocage et on le purifie. Par ce procédé, il est possible de synthétiser les oligonu- cléotides à des températures modérées La synthèse peut avoir lieu dans un réacteur unique et être facilement adaptable à l'automa- tisation De plus, un grand excès des produits réagissants peut être utilisé et être facilement récupéré après la réaction. Conformément à la présente invention, des oligonucléotides peuvent être synthétisés sur un support en phase solide Tel qu' il est utilisé ici, il est entendu que le terme "oligonucléotides" englobe aussi bien les ribo-oligonucléotides que les désoxyribo- oligonucléotides. Dans les premières étapes du proèdéd selon la présente in- vention, on combine un nucléoside avec un support solide En règle générale, on peut utiliser comme support, dans le procédé selon la présente invention, un support solide qui permet aux molécules de diffuser librement en son intérieur et qui n'absorbe pas de manière irréversible les réactifs Un support préféré est le gel de silice La combinaison se fait entre le groupement 3 '- hydroxyle du nucléoside et le support Le groupement 5 '-hy- droxyle est protégé par un groupement protecteur tel que le groupement monométhoxytrityle ou le groupement diméthoxytrityle, le groupement diméthoxytrityle ayant la préférence On enlève ce groupement protecteur et on traite le nucléoside par un agent phosphitylant bifonctionnel de façon à former un phosphomonochlo- ridite de nucléoside fixé au support N'importe quel alkyl ou aryl phosphodichloridite peut être utilisé comme agent phosphi- tylant, la méthoxydichlorophosphine ayant la préférence. Cet agent phosphitylant bifonctionnel peut soit être ajou- té directement au-nucléoside, soit être d'abord modifié par transformation en un dérivé de tétrazole En modifiant de la sorte l'agent phosphitylant, il est possible d'empêcher la for- mation éventuelle d'une réticulation 5 '-5 ' entre deux chaînes d'oligonucléotide adjacentes On ne pense pas qu'une telle réticu- lation constitue un problème sérieux lorsque l'incorporation de nucléosides sur le support solide est relativement limitée ( 30 >moles/g environ), mais le problème peut devenir non négligeable lorsque l'incorporation-de nucléosides devient plus importante. On peut réaliser la transformation de l'agent phosphitylant soit en le faisant réagir directement avec le tétrazole avant de l'a- jouter au nucléoside, soit en ajoutant le tétrazole au nucléo- side avant de traiter le nucléoside par l'agent phosphitylant. Le rapport molaire du nucléoside à l'agent phosphitylant est généralement de 1:10 environ à 1:20 environ, et de préfé- rence égal à 1:15 environ On peut éventuellement secouer et centrifuger rapidement le mélange réactionnel et enlever l'ex- cès de phosphodichloridite La durée totale de la réaction se situe généralement entre 2 minutes environ et 10 minutes envi- ron. Lorsque l'agent phosphitylant est modifié par du tétrazole, le rapport molaire de l'agent phosphitylant au tétrazole s'éta- blit généralement entre 1:2 environ et 1:10 environ, et est de préférence égal à 1:3 environ Les conditions de réaction, dans cette forme de réalisation de la présente invention, comprennent généralement une durée totale de réaction de-15 minutes environ à une température de O C environ. /, 255 z 9 3 Après le traitement par l'agent phosphitylant, on fait réagir le support avec un excès d'un second nucléoside On laisse généralement la réaction se faire pendant 10 à 15 mi- nutes environ à 27 C environ Après la réaction avec le second nucléoside, on oxyde les liaisons phosphite internucléotide en phosphates, conformément à des techniques classiques, comme par exemple avec de l'iode dans une solution aqueuse de tétra- hydrofuranne et de lutidine Un rapport tétrahydrofuranne-luti- dine-eau préféré est de 2:1:1 environ. On élimine ensuite le groupement protecteur du second nu- cléoside On peut éventuellement couper ledimère du support, supprimer son blocage, et le purifier Le rendement de cette réaction est généralement de 95 % environ. On peut procéder à un allongement de chaîne en suivant le même cycle de réactions que celui décrit ci-dessus: traite- ment du nucléoside par un agent phosphitylant, traitement par un autre nucléoside et oxydation des groupements phosphite A la fin de la synthèse, on a avantage à couper l'oligonucléotide du support, à supprimer son blocage et à le purifier. L'opération intermédiaire de centrifugation visant à éli- miner l'excès d'agent phosphitylant risque d'introduire de l'hu- midité dans le mélange réactionnel Il a été découvert qu'il n'était-pas nécessaire de centrifuger le mélange réactionnel con- tenant la silice et l'agent phosphitylant pour s'assurer de bons rendements de l'oligonucléotide final voulu o On peut mettre en oeuvre le procédé de la façon décrite ci-dessus, en supprimant l'opération de centrifugation Ensuite, après avoir oxydé l'oli- gonucléotide par une technique d'oxydation classique, il est pos- sible de laver soigneusement le support plusieurs fois avec des solvants organiques Dans une forme de réalisation préférée, on lave le support avec du tétrahydrofuranne aqueux à 50 %, puis avec du tétrahydrofuranne pur et enfin avec de l'éther Comme précédemment, le rendement du dimère voulu est de 90 à 100 % en- viron Ces rendements élevés indiquent que, même s'il y a un ex- cès de l'agent phosphitylant, il est possible d'obtenir le cou- plage 5 '-3 ' voulu en utilisant un excès de nucléoside Par ail- leurs, une analyse de chromatographie en couche mince (CCM) du surnageant des mélanges réactionnels laisse supposer qu'au moins 6 2531963 % environ du nucléoside ajouté restent intacts et peuvent ainsi être récupérés et réutilisés le cas échéant. Comme indiqué ci-dessus, ce mode opératoire présente un certain nombre d'avantages par rapport à ceux qui sont révélés par la technique antérieure Le procédé ne nécessite aucun pro- duit de départ préparé d'avance, il peut être mis en oeuvre à des températures beaucoup plus modérées que cela h'était pos- sible jusqu'à présent et il peut être réalisé dans un seul et même réacteur Il est facilement adaptable à l'automatisation. Aussi bien des ribo-oligonucléotides que des désoxyribo-oligo- nucleotides peuvent être synthétisés par ce procédé Enfin, l'excès de nucléoside peut être récupéré une fois que la réac- tion est achevée, ce qui rend ce procédé très économique. Les exemples suivants illustrent le procédé selon la pré- sente invention mais ne doivent pas être considérés comme la li- mitant. Exemple I Préparation dudimère par traitement direct par l'agent phosphitylant On a traité de la silice ("Vydak TP", 100 mg) portant de la désoxythymidine ( 4 moles) par de la méthoxydichlorophosphine ( 60 pmoles) dans de la pyridine anhydre ( 0,2 ml) à la température ambiante On a secoué et centrifugé rapidement le mélange réac- tionnel (la durée totale de la réaction, centrifugation comprise, était de 2 minutes à la température ambiante) On a séparé le surnageant et on a ajouté à la silice un excès ( 10 fois) de 5 '- diméthoxytritylcytidine dans de la pyridine ( 0,2 ml) Apres 10 minutes à la température ambiante, on a oxydé le mélange réac- tionnel avec de l'iode dans un mélange ( 2:1:1) de tétrahydrofu- ranne, de lutidine et d'eau On a constaté que le rendement de la réaction, estimé par élimination du groupement trityle et chromatographie liquide à haute performance (HPLC), après suppres- sion du blocage, était égal à 95 %. 2 53 1963 2 513 9. Exemple II Préparation du dimère par traitement direct par l'agent phosphitylant On a traité de la silice ("Vydak TP", 100 mg) portant de la désoxythymidine ( 4 ymoles) par de la méthoxydichlorophos- phine ( 60 pmoles) dans de la pyridine ( 0,2 ml) pendant 10 mi- nutes à O C ou pendant 1 à 2 minutes à la température ambiante. On a ensuite ajouté au mélange réactionnel, sans centrifuga- tion, de la 5 '-diméthoxytritylcytidine ( 200 moles) dans de la pyridine ( 0,2 à 0,25-ml) Après 10 minutes à la température am- biante, on a procédé à une oxydation avec de l'iode dans un mé- lange ( 2:1:1) de tétrahydrofuranne, de lutidine et d'eau On a ensuite lavé soigneusement la silice avec du tétrahydrofuranne aqueux à O %, avec du tétrahydrofuranne pur et enfin avec de l'éther On a estimé le rendement à 95 %, d'après l'absorption du cation trityle à 498 nmo Le rendement a également été confir- mé par analyse HPLC en phase inverse après suppression du blo- cage ( 12 à 16 heures à 50 C avec de l'ammoniaque concentrée, puis traitement avec de l'acide acétique à-80 %) On a recueil- li le pic du dimère au cours de l'analyse HPLC et on a constaté que le spectre UV concordait très bien avec le spectre engendré par l'ordinateur. Exemple III On a préparé d'autres dimères par le procédé de l'exemple II Le rendement isolé de chaque dimère est donné dans le ta- bleau suivant: Tableau 1 Composé Rendement isolé (%) d-Cp C 96 d-Gp T 87 d-Cp T 95 8 2531963 d-Gp G 98 d-Cp G 84 d-Gp A 81 Exemple IV Synthèse du dimère C-T en utilisant un agent phos- phitylant bifonctionnel modifié On a fait subir à de la silice ("Vydac TP", 100 mg), portant de la N-benzoyldésoxycytidine ( 4,2 imoles) et du tétra- zole ( 630 ymoles) une distillation azéotropique avec de la py- ridine On a traité la silice et le tétrazole par de la métho- xydichlorophosphine ( 63 moles) dans de la pyridine ( 0,3 ml) pendant 10 minutes à O C On a ensuite ajouté au mélange réac- tionnel de la 5 '-diméthoxytrityl thymidine ( 210 jmoles) A- près 15 minutes à la température ambiante, on a oxydé le mé- lange réactionnel avec de l'iode dans un mélange 2:1:1 de té- trahydrofuranne, de lutidine et d'eau On a lavé soigneusement la silice avec du tétrahydrofuranne aqueux à 50 %, puis avec du tétrahydrofuranne pur et enfin avec de l'éther On a estimé le rendement à 98 %, d'après l'absorption des cations trityle -à 498 nm. Exemple V Synthèse de pentamère en utilisant un agent phos- phitylant modifié On a fait subir à de la silice ("Vydac TP", 100 mg) por- tant de la N-benzoyldésoxycytidine ( 4,2 imoles) et du tétrazole ( 630-moles) une distillation azéotropique avec de la pyridine. On a ensuite traité la silice et le tétrazole par un excès ( 15 fois) de méthoxydichlorophosphine ( 63 "moles) dans de la pyri- dine ( 0,3 ml) pendant 10 minutes à O C On a ensuite ajouté au mélange réactionnel un excès ( 50 fois) de 5 '-diméthoxytritylthy- midine dans de la pyridine ( 0,3 ml) Après 15 minutes à la tem- pérature ambiante, on a procédé à l'oxydation avec de l'iode dans un mélange 2:1:1 de tétrahydrofuranne, de lutidine et d'eau. On a ensuite lavé la silice comme dans l'Exemple IV On a éliminé le groupement trityle par traitement par de l'acide trichlora- cétique à 5 % dans du chloroforme On a ensuite lavé soigneuse- ment la silice avec du chloroforme. On a ensuite répété ce cycle d'opérations de façon à al- longer la chaîne à la séquence pentamère T-T-T-T-C On a fait en sorte que le rapport entre les réactifs reste constant tout au long de la synthèse On a ajusté dans la mesure du nécessaire le volume de pyridine. Le rendement global de la synthèse du pentamère T-T-T-T-C était égal à 53 %. Exemple VI On a synthétisé l'octamère C-A-A-G-C-T-A-G par le procédé de l'Exemple V, avec un rendement global de 24 %. Exemple VII On a fait subir à de la silice ("Vydac TP", 100 mg) portant de la Nisobutyldésoxyguanosine ( 2,9 pmoles) et un excès ( 45 fois) de tétrazole ( 130 pmoles) une distillation azéotropique avec de la pyridine On a ajouté de la pyridine anhydre ( 0,1 ml) au mélange de silice et de tétrazole avant de traiter la silice par un excès ( 15 fois) de méthoxydichlorophosphine ( 43 ymoles) pendant 10 minutes à O C On a ensuite ajouté de la 5 '- diméthoxytrityl -N-benzoyldésoxyadénosine dans 0,2 ml de py- ridine Apres 15 minutes à la température ambiante, on a proce- dé à l'oxydation avec de l'iode dans un mélange 2:1:1 de tétra- hydrofuranne, de lutidine et d'eau On a ensuite lavé la silice avec du tétrahydrofuranne aqueux à 50 %, puis avec du tétrahy- drofuranne pur, et enfin avec de l'éther On a estimé le rende- ment à 100 % environ, d'après l'absorption du cation trityle à 498 nm. Exemple VIII On a traité de la silice (Vydac TP, 100 mg) portant de la Nisobutyryldésoxyguanosine ( 2,9 ymoles) par 0,2 ml de pyridine contenant de la méthoxydichlorophosphine ( 43,5 ymoles) et du 2531963 tétrazole ( 130 Pmoles) pendant 15 minutes à O C On a ensuite ajouté au mélange réactionnel de la 5 '-diméthoxytrityl -N- benzoyladénosine dans 0,2 ml de pyridine Après 15 minutes à la température ambiante, on a oxydé et lavé le mélange réac- tionnel comme dans les exemples précédents On a estimé le ren- dement à 100 % environ. Exemple IX Synthèse de A-T-G-C-A-C-A-C-A-A-G-A-G On a séché de la silice ("Vydak TP", 500 mg) portant de la N-isobutyryldésoxyguanosine ( 14,5 imoles) par lavage avec de la pyridine anhydre ( 2 fois 10 ml) et avec de l'éther dié- thylique anhydre ( 10 ml) On a fait subir à la silice un sé- chage plus poussé dans un dessicateur à vide jusqu'au moment de son utilisation. On a dissous un excès ( 45 fois) de tétrazole ( 652 imoles) dans 1 ml de pyridine à O C On a ajouté à la solution de té- trazole et de pyridine un excès ( 15 fois) de méthoxydichloro- phosphine ( 217 pmoles), et on a ajouté cette solution à la si- lice Apres 15 minutes à O C, on a ajouté un excès ( 50 fois) de 5 '-0 (diméthoxytrityl)-N-benzoyldésoxyadénosine dans 1,0 ml de pyridine On a laissé la réaction se poursuivre pendant 15 minutes à la température ambiante, puis on a oxydé et lavé le mélange réactionnel selon le procédé des exemple précédents. On a traité la silice par de l'acide trichloracétique à 5 % dans du chloroforme pour éliminer le groupement diméthoxytri- tyle Apres lavage avec du chloroforme, de la pyridine anhydre et de l'éther anhydre, la solution était prête pour l'addition du nucléoside suivant. On a ajouté les 11 autres nucléosides exactement comme in- diqué ci-dessus La quantité et la concentration des réactifs restaient les mêmes tout au long de la synthèse. On a obtenu une estimation qualitative du rendement après chaque addition à partir de la couleur orange résultant du traitement par l'acide trichloracétique à 5 % Dans tous les cas, le rendement apparaissait comme excellent. On a obtenu des estimations quantitatives du rendement en traitant une quantité, pesée avec précision, de silice par de l'acide benzènesulfonique à 2 % dans de l'acétonitrile, et. en observant les absorptions des cations trityle à 498 nm. Le rendement global aux différents stades est donné ci-des- sous Longueur de l'oligonucléotide Rendement (%) 2 100 90 9 78-83 *13 60-70 12 2531963 REVENDICATIONS 1 Procédé de synthèse d'un oligonucléotide sur un sup- port solide, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) à fixer un premier nucléoside, dont le groupement '-hydroxyle est protégé par un groupement protecteur, sur un support en phase solide, par l'intermédiaire du groupement 3 '- hydroxyle dudit premier nucléoside, (b) à éliminer ledit groupement protecteur porté par le groupement 5 '-hydroxyle dudit premier nucléoside, (c) à faire réagir ledit groupement 5 '-hydroxyle avec un groupement phosphitylant bifonctionnel, (d) à fixer un autre nucléoside, dont le groupement 5 '- hydroxyle est protégé par un groupement protecteur, audit sup- port, en accouplant le groupement 3 '-hydroxyle dudit autre nu- cléoside avec le groupement 5 '-hydroxyle dudit premier nucléo- side, (e) à oxyder la liaison phosphite formée entre lesdits nucléosides, (f) à répéter les opérations (b) à (e) ci-dessus jus- qu'à ce que le nombre voulu de nucléosides ait été ajouté au dit support, (g) à couper ledit oligonucléotide dudit support et (h) à supprimer le blocage et à purifier ledit oligo- nucleotide. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on transforme ledit agent phosphitylant bifonctionnel de l'étape (c) en un dérivé du tétrazole avant de le faire réagir avec ledit groupement 5 '-hydroxyle dudit nucléoside. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on mélange ledit nucléoside avec du tétrazole avant de le traiter avec ledit agent phosphitylant bifonctionnel. 4 Procédé selon la revendication 1, 2, ou 3, caractérisé en ce que ledit support solide est la silice. 5 Procédé selon la revendication 1, 2, ou-3, caractérisé en ce que ledit groupement protecteur est le groupement mono- méthoxytrityle. 6 Procédé selon la revendication 1, 2, ou 3, caractérisé en ce que ledit groupement protecteur est le groupement dimé- thoxytrityle. 7 Procédé selon la revendication 1, 2, ou 3, caractérisé en ce que-ledit agent phosphitylant bifonctionnel est un alkyl ou aryl phosphodichloridite. 8 Procédé selon la revendication 1, 2, ou 3, caractérisé en ce que ledit agent phosphitylant bifonctionnel est la métho- xydichlorophosphine. 9 Procédé selon la revendication 1, 2, ou 3, caractérisé en ce que le rapport molaire du nucléoside à l'agent phosphity- lant s'établit entre 1:10 environ et 1: 20 environ. Procédé selon la revendication 1, 2, ou 3, caractérisé en ce que le rapport molaire du nucléoside à l'agent phosphity- lant est égal à 1:15 environ. 11 Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le rapport molaire de l'agent phosphitylant au tétrazole s'établit entre 1:2 environ et 1:10 environ. 12 Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le rapport molaire de l'agent phosphitylant au tétrazole est égal à 1:3 environ. 13 Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on:mène les réactions à une température de O C environ à 27 C environ. 14 Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on mène les réactions à la température de O C. , Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on récupère le nucléoside en excès par des méthodes d'extraction et on le réutilise.