Brevet FR2532309A1 — publié le 19840302

253230-9 L'invention concerne de nouvelles perfluo- rocycloamines utilisables comme constituantstranspor- tant de l'oxygène ainsi que des émulsions contenant ces composés. Elle concerne plus précisément des perfluoro- cycloamines répondant à la formule générale t {I dans laquelle n'importe quelle position peut, si on le désire, être remplacée par un groupe perfluorométhyle, ainsi que des émulsions fluorocarbonées thérapeutiques capables de transporter de l'oxygène, contenant ces composés comme constituants transportant l'oxygène, utilisables pour secourir des malades atteints d'hémor- ragies massives, pour le stockage d'organes à trans- planter, etc. Il a déjà été signalé que les émulsions de fluorocarbures peuvent être util Lsées comme substi- tuts des globules rouges chez les mammifères, et comme perfusats de stockage des organes pour la transplanta- tion des organes, en particulier comme transfusions pour jouer le rôle de transporteurs d'oxygène (Leland C Clark, Jr, Becattini, Fo, Kaplan, S, The Physiology of Sinthetic Blood, Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, Vol 60, p 757 773, 1970; Geyer, R Pig Fluorocarbon Polyol Artificial Blood Substitutes, New Engl J Med Vol 289, p o 1077 1082, 1973). Cependant, les émulsions de fluorocarbures connues jusqu'à présent ne sont pas pratiques d'utili- sation en raison de leur instabilité pharmaceutique, et il était nécessaire de mettre au point une prépara- tion stable dans laquelle le diamètre des particules ne change pas pendant une durée prolongée pour pou- voir utiliser les émulsions de fluorocarbures dans la pratique comme globules rouges artificiels. Dans les émulsions de fluorocarbures, la taille des particules joue un rûle important sur la toxicité et l'efficacité des émulsions (Yokoyama, K, Yamanouchi, K, Watanabe, M, Murashima, R, Matsumoto. T., Hamano, T, Okamoto-, H, Suyama, T, Wa tanabe, R ^ Naito, R, Preparation of Perfluorodecalin Emulsion, an Approach to the Red Cells Substitute, Federation Proceeding, Vol 34, p 1478 1483, May, 1975) En d'autres termes, une émulsion ayant un fort diamètre de particules possède une toxicité élevée, et le temps de rétention des particules dans le courant sanguin est court Par conséquent, lorsqu'on utilise une émulsion de fluorocarbures comme globules rouges artificiels pour une transfusion chez un malade souf- frant d'hémorragies massives, le diamètre de parti- cules de l'émulsion doit être de 0,3 micron ou moins, de préférence de 0, 2 micron ou moins (demande de brevet japonais n 22 612/1973) En dehors du diamètre de particules, pour utiliser un fluorocarbure comme globules rouges artificiels, le fluorocarbure administré dans la veine doit être rapidement éliminé du corps lorsqu'il a rempli sa mission initiale de transport de l'oxygène (brevet des E U A n 3 911 138, Leland C Clark, Jr). Le Dr Clark a nommé ces composés des composés organiques fluorés RESphobes (RES = système réticuloendothélial), et il distingue ces composés des domposés RES-philes, qui sont caractérisés par la présence d'un atome tel que l'oxygène ou l'azote dans leur structure ou par leur nature hétérocyclique. La demanderesse a effectué des études pous- sées pour trouver des composés perfluorocarbonés satis- faisant aux exigences ci-dessus, et elle a réussi à obtenir des composés qui sont nommés RES-philes par le Dr Clark, à savoir les perfluorocycloamines répon- dant à la formule générale: t N F C I); dans laquelle n'importe quelle position peut, si on le désire, être substituée par un groupe perflxorométhylae, et elle a trouvvé que cee, compaosé peuvent donner des émulsions stables à long terme, ayant des particules extrêmement fines, et en outre que ces composés pos- sedent des propriétés d'élimination excellentes et inattendues Telle est l'origine de la présente inven- tion. Un des buts de la présente invention est de fournir de nouvelles perfluorocycloamines ainsi qu'une préparation d'émulsion de flu 6 rocarbures thérapeutiques capable de transporter de l'oxygène, contenant un composé représenté par la formule générale (I ci- dessus comme constituant transportant l'oxygèneo D'autres buts et avantages de la présente invention ressortiront de la description ci-aprèso En ce qui concerne la formule générale ( 1) bien que la position de substitution du groupe perfluo- rométhyle ne soit pas particulièrement limitée, on préfère qu'il n'y ait qu'un seul substituant Le composé répondant à la formule générale (I) peut se préparer en fluorant un composé perhydro correspondant Comme procédés de fluoration, on peut- citer par exemple des procédés de fluoration connus- tels que le procédé de fluoration directe, le procédé. de fluoration au cobalt, le procédé de fluoration électrolytique, etc. Dans la préparation du composé (I), l'uti- lisation du procédé de fluoration électrolytique est préférable Le procédé peut être effectué par exemple en ajoutant dans une cellule électrolytique de l'acide fluorhydrique anhydre et un composé perhydro comme matièrespremiêres, en les mettant en solution en les mélangeant, puis en soumettant la solution à une élec- trolyse Normalement, la tension utilis C-e dans l'élec- trolyse est de 3 à-9 V, la densité de courant anodique est de 1 à 300 A/dra 2, et la température de la cellule. est de 4 à 10 C. Le composé répondant à la formule générale (I) ainsi formé, étant insoluble dans l'acide fluorhy- drique anhydre, précipite dans la couche inférieure de la cellule électrolytique. L'isolement et la purification du composé répondant à la formule générale (I) du précipité s'ef- fectuent par exemple en ajoutant au précipité recueilli un mélange d'un volume égal d'une solution d'alcali aqueuse et d'un composé aminé, en soumettant la tota- lité du mélange à un chauffage sous reflux, puis en séparant le composé (I) de la couche inférieure (â ce moment, les composés partiellement fluorés sont dissous dans la couche aminée), en lavant le composé ( 1) avec une quantité appropriée d'une solution aqueuse d'acé- tone contenant de l'iodure de potassium pour éliminer les composés ayant des atomes d'azote combinés à des atomes de fluor, puis en effectuant une distillation fractionnée pour recueillir le composé répondant à la formule générale (I). Les émulsions de perfluorocarbures thérapeu- tiques capables de transporter de l'oxygène sont connues en soi dans la technique, et par conséquent, la carac- téristique de la présente invention réside dans le choix de composés perfluoro particuliers, c'est-à-dire les composés répondant à la formule générale (I), comme composés perfluorocarbonés Par conséquent, comme préparations d'émulsion de perfluorocarbures de la -2532309 présente invention, on peut envisager des émulsions semblables aux produits précédemment connus C'est-à- dire des émulsions huile-dans-l'eau dans lesquelles un composé perfluoro est dispersé dans de l'eau, et la proportion du composé perfluoro à ïncorporer est de 5 à 50 % (P/V), de préférence de 10 à 40 % (P/V). Pour préparer l'émuls ion, on utilise un agent tensioactif non ionique polymère, un phospho&- lipide, etc, seul ou en mélange, comme agent de mise en émulsion, et la quantité à ajouter est de 1 à 5 % (P/V). L'agent tensioactif non ionique polymère - utilisé ici a une masse moléculaire de 2 000 à 20 000 on citera comme exemples de celui-ci des copolymères polyoxyéthylène-polyoxypropylène-, des esters d'acides gras de polyoxyéthylène, des dérivés polyoxyéthylène huile de ricin, etc Comme exemples du phospholipide, on citera le phospholipide de la vitelline, le phospho- lipide du soja, etc. En outre, si nécessaire, on peut également ajouter comme agent de mise en émulsion, par exemple un acide gras en C 8 a C 22, en particulier en C 14 à C 20, ou un sel physiologiquement acceptable de celui-ci (par exemple un sel de métal alcalin tel que le sel de sodium, le sel de potassium, etc, ou des mono- glycérides de celui-ci) Comme exemples de l'acide gras ci-dessus, on citera l'acide caprylique, l'acique caprique, l'acide laurique, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'a Gide stéarique, l'acide éhénique, l'acide palmitoléique, l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide arachidonique, leurs sels de sodium et de potas- sium, leurs glycérides, etc La quantité de celui-ci à ajouter est de 0,001 à 0,01 % (P/V). Comme milieu, on peut utiliser une solu- tion aqueuse physiologiquement acceptable, par exemple une solution saline physiologique, une solution de Ringer additionnée d'acide lactique, etc. Si nécessaire, on peut ajouter une quantité isotonisante d'un agent d'isotonisation tel que le glycérol poux isotoniser l'émulsion, et un substitut du plasma tel que l'am'don hydroxyéthylê, 1 e dextrane-, etc pour ajuster la pression osmotique colloidale de l'émulsion. Les émulsions de l'invention peuvent se pré- parer en mélangeant les constituants respectifs dans un ordre quelconque, en les émulsionnant grossièrement et en homogénéisant au moyen d'un émulsionneur appro- prié (par exemple un émulsionneur du type Manton - Gaulin) jusqu'à ce que le diamètre des particules soit de 0,3 micron ou moins. Les préparations d'émulsion de perfluoro- cycloamines de l'invention sont capables de transpor- ter l'oxygène, et sont par conséquent utilisées par exemple dans des transfusions pour le transport d'oxy- gène ("substituts des globules rouges"),dans des per- fusats de stokage des organes, etc. Lorsque la préparation d'émulsion de per- fluorocycloamines de l'invention est utilisée par exemple comme transfusion pour le transport d'oxygène, elle est généralement administrée par voie intravei- neuse, et la posologie pour un adulte humain est de à 2 000 ml par dose. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustrations de l'invention. EXEMPLE 1 Comme cellule électrolytique, on utilise un récipient (en métal Monel" d'une capacité de 1,5 Q, contenant des électrodes de nickel (pureté: 99,6 % ou davantage) (six anodes et sept cathodes)' disposées alternativement, avec un intervalle entre les élec-. trodes de 1,7 à 2 ',Q amm, et unsurface o-d e ffec- tive de 10,5 dm 2, équipée en suitre d'un condenseur à reflux en cuivre au-dessus du récipient. Dans cette cellule électrolytique, on intro- duit 1,2 ? d'acide fluorhydrique anhydre, et on élimine les impuretés {eau et acide sulfurique) présentes en très faibles quantités par une électrolyse-prgléminaire o On dissout ensuite 0,85 mole ( 130 g) de N 1-cyclohexyl- pyrrolidine dans l'acide fluorhydrique anhydre, et tout en faisant passer de l'hélium sous un débit de 100 ml/ min par la partie inférieure de la cellule, on effec- tue l'électrolyse avec une dfnsité de courant anodique de 1,0 a 2,0 A/dm 2, un voltage de 4,0 à 6,2-V et une température de bain de 4 à 10 'Co On poursuit l'électro- lyse pendant 1 051 A'h jusqu'à ce que le voltage élec- trolytique atteigne 9,0 V On introduit ensuite de l'acide fluorhydrique anhydre à raison de 200 ml par 24 heures Le gaz formé-pendant l'électrolyse est envoyé dans un tube de fer garni de granules de fluo- rure de sodium pour éliminer l'acide fluorhydrique anhydre entraîné, puis conduit dans un piège refroidi avec un mélange glace sèche-acétone pour le liquéfier et le piéger, et l'on obtient 9,5 g d'un liquide inco- lore D'autre part, la solution du bain présente dans la cellule électrolytique se sépare en deux phases, la couche supérieure contenant de l'acide fluorhydrique et la couche inférieure, le composé fluor o La couche inférieure est séparée et elle pèse 263 go. Le liquide recueilli par refroidissement du gaz formé ci-dessus et le liquide la couche infé- rieure de la cellule électrolytique sont combinés, on y ajoute une solution aqueuse de KOH à 70 % et de la diisobutylamine à volumes égaux, et on effectue le chauffage sous reflux pendant sept jourso Le composé perfluoré est séparé avec une ampoule à décantation, lavé avec une so Iution aqueuse d'acétone à 90 % f P/V) contenant 10 % (P/V) d'iodure de potassium, puis sou- mis à une distillation fractionnée en utilisant un appareil de distillation fractionnée équipé d'une colonne à bande tournante, et l'on obtient 44 g (ren- dement: 8 %) de perfluoro-N-cyclohexylpyrrolidine (Eb 145 152 C/760 mm de Hg) Par absorption infra- rouge, résonance magnétique nucléaire de F et spectre de masse, on confirme que le composé obtenu est la perfluoro-N-cyclohexylpyrrolidine désirée. EXEMPLES 2 à 6 On prépare les composés perfluoro suivants de la m 8 me manière qu'à l'exemple 1. Perfluoro-N-( 3 '-méthylcyclohexyl)pyrrolidine (Eb 156 165 C/760 mm de Hg); Perfluoro-N-cyclohexyl-2-méthylpyrrolidine (Eb 156 165 C/760 mm de Hg); Perfluoro-N-cyclohexyl-3-méthylpyrrolidine (Eb 156 165 C/760 mm de Hg); Perfluoro-N-( 2 '-méthylcyclohexyl)pyrrolidine (Eb 156 165 C/760 mm de Hg); Perfluoro-N-( 4 '-méthylcyclohexyl)pyrrolidine (Eb 156 165 C/760 mm de Hg). EXEMPLE 3 On ajoute 400 g de phospholipide de la vitelline à 8,5 ú de solution de Ringer additionnée d'acide lactique, et on agite avec un mélangeur pour' préparer une émulsion grossière, puis on y ajoute 2,5 kg de perfluoro-N-cyclohexylpyrrolidine et on agite éner- giquement à nouveau avec le m 4 langeur pour prwparer- une émulsion grossière On place cette émulsion gros- sière dans le réservoir à liquide d'un émulsionneur à jet (fabriqué par la Manton-Gaulin Co) et on la fait circuler tout en maintenant la température du liquide. à 50 5 C pour effectuer l' mulsification La concentra- tion de la perfluoro-N-cyclohexylpyrrolidine dans. l'émulsion obtenue est de 27,3 % (P/V) Le diamètre de particules, mesuré par la méthode de sédimentation centrifuge, est de 0,5 à 0,25 micron Cette émulsion est répartie dans des flacons pour injection, bouchés et thermiquement stérilisés dans un stérilisateur rota- tif, mais on n'observe aucune augmentation importante du diamètre des particules. EXEMPLE 4 Une émulsion est obtenue par des procédés semblables à ceux de l'exemple 1, excepté que la per- fluoro-N-cyclohexylpyrrolidine est remplacée par la perfluoro-N-( 3 '-méthylcyclohexyl)pyrrolidineo Le dia- mètre de particules de l'émulsion ainsi obtenue est de 0,5 à 0,25 micron. Exemple expérimental 1 Stabilité des émulsions On ajoute de l'eau à 20 g de chacune des perfluorocycloamines choisies dans la présente inven- tion, 4 g de phospholipide de la vitelline pour faire un volume total de 200 ml, et on effectue l'émulsifi- cation en utilisant un émulsionneur Manton-Gaulin comme ci-dessus sous un courant d'azote, sous 19 600 à 58 800 k Pa, tout en maintenant la température du liquide à 40-45 C Chacune des émulsions obtenues est filtrée à travers un filtre à membrane de 0,65 micron, répartie dans des flacons d'une capacité de 20 ml, et, après- remplacement de l'atmosphère par de l'azote, traitée thermiquement à 100 OC pendant 30 minutes, puis par stockage à 4 C ou à la température ambiante, pour examiner la stabilité Le diamètre de particule de I'émulsion est mesuré par la méthode de sédimentation centrifuge selon Yokoyama et Coll (Chem Phare Bull. 22 ( 12) 2966 ( 1974)), et à partir des données obtenues, on calcule la répartition des diamètres de particules moyens en utilisant un microcalculateur. Ainsi, les répartitions des diamètres de particules de chaque émulsion de perfluorocarbure avant et après chauffage, et après chauffage et stockage à 4 C et à la température ambiante ( 15 -28 C) sont données dans les tableaux 1 et 2 Comme il res- sort des résultats, les émulsions de la présente inven- tion sont très stables vis-à-vis du chauffage, et on n'observe aucune influence sur le diamètre moyen de particules En outre, lorsqu'elles sont stockées à 4 C après chauffage, il ne se produit aucune augmen- tation du diamètre moyen de particules de l'émulsion, même au bout de cinq mois. TABLEAU 1 Stabilité de l'émulsion de perfluoro-N-=cyclohexylpy rrolidine Avant chauffage Aussitôt après chauffage Au bout de 2 semaines à 4 W à la tenpprature arbiante Au bout de 4 semaines à 40 C à la terrpérature amrbiante Au bout de 5 mois à 40 C Diamètre moyen de particules il 0 114 0,115 0,114 0,122 0,113 0,122 0, 114 Répartition isesi-inêtres de particules (%en poids) ,1 39, 1 , 3 39,6 39,0 33, 1 ,3 j, 140,2 il 52, 7 56,9 58,4 58,6 58,1 e 9 57 e 4 9,2-0,3 14 7,2 4,0 1, 3 1, 8 *,9 e 2, 3 > O,3 il o o o o o o o 1 H Fi rla C'> 1 TABLEAU 2 Stabilite de l'1 émulsion, de perf luoro-N ( 3 ' -mêthylcyc 1 oheeyl) pyrrolidine Diamètre Répartitic>n'descla 15 tîe"e de particules moyen de ______ (% en poids particules , Avant chauffage 0, 133 28,0 6279,3 O Aussitôt après chauffage 0,132 28,5 63,4 8,1 O Au bout de 2 semaines à 40 C 0,131 28,1 64,2 * 7,7 la tenr é; ature axtbiante0,133 27,5 65,3 7, Au bout de 4 seriaines à 40 C 0,132 27,8 64,3 7,9 O A la terrpêrature an'biante0,135 26,8 66,3 6,9 O Au bout de 5 mois C 0, 133 27,0 65,1 7,9 O F-a LM ta. o> NO 2532309 ' Exemple expérimental 2 i Essai de toxicité aiguë o L'essai de toxicité aiguë sur les prépara- tions de l'invention a été effectué en utilisant les préparations de la présente ivention indiquées dans le tableau 3 qui ont été% physiologiquement isotonisees. Les animaux d'essai utilisés étaient des rats males de souche Wister (pesant 10 O à 120 g) L 'émulsion a ' été administrée par -voie int Eaveineuse et les ani- maux ont été observés pendant une semaine après l'ad- ministration. Les résultats montrent que tant l'émulsion contenant la perfluoro-Ncyclohexylpyrrolidine que celle contenant la perfluoro-N-( 3 'méthylcyclohexyl) pyrrolidine ne donnent lieu a aucun cas de mort à la dose de 100 ml/kg de poids du corps, et que par consé- quent leur toxicité est très faible. TABLEAU 3 Composition Rapport __,_ % _(P/v) Composé perfluoré 30 Constituant huileux ( 9 vol) Agent Phospholipide émulsion de la 4 D O nant vitelline Na Cl i 6,00. Na HCO 3 2,1 Electrolyte KC 1 0,336 ( 1 vol) Mg C 12 -6 H 20 0, 427 Ca C 12 ' 2 H 20 0, 356 D-Glucose 1 802 p H 8,0 Exemple expérimental 3 Répartition du composé per- fluoro dans les organes En utilisant des rats mâles de souche Wister pesant 120 à 130 g, on a administré l'émulsion préparée dans l'exemple 1 dans la veine de la queue (à raison de 4 g/kg,calculé en perfluoro-N-hexylpyrrolidine), et pen- dant une durée de trois mois apres l'administration, on a mesuré la teneur de ce compas 6 dans le foie, la rate et les tissus adipeux résultant de la fixation, par chromatographie en phase gazeuse. La teneur en perfluoro-N-hexylpyrrolidine fixée dans chaque organe une, deux et quatre semaines et trois mois après l'administration est indiquée dans le tableau 4 Le composé est fixé en quantités plus importantes par les organes réticulo-endoth J iens peu après l'administration, mais il disparaît rapidement. Il n'y a aucun signe d'un effet nocif sur le foie ou sur la rate. Ces essais montrent que la demi-vie de la perfluoro-N-hexylpyrrolidine est de seize jours. TABLEAU 4 Taux résiduel Organe Temps après de composé l'administration perfluoré (%> Foie Rate 1 semaine 2 semaines 4 semaines 3 mois 1 semaine 2 semaines 4 semaines 3 mois 21,23 13,63 4,98 0,24 12,33 ,49 8,52 0,51 Exemple expérimental 4 -Remarques anatomiques A des rats males de souche Wister pesant- à 130 g, on administre 4 g/kg de l'émulsion de perfluorocycloamine préparée dans l'exemple 1 ou. l'exemple 2, et on observe les organes diss squés pen- dant trois mois après l'administration, en outre on pèse les organes (foie et ra te), pour déterminer leur poids par rapport an poids du coarps. Une, deux et quatre semaines, et trois mois après l'administration de l'émulsion, on examine les organes importants, par exemple le poumon, le foie et la rate, et on ne trouve aucun signe de l'influence sur les organes de l'un quelconque de ces composés en raison de leur éliminateur rapide. REVENDICATIONS 1 Perfluorocycloamines répondant à la for- mule générale: F N F dans laquelle l'une quelconque des positions peut, si on le désire, être substituée par un groupe perfluoro- méthyle. 2 Perfluoro-N-cyclohexylpyrrolidine. 3 Perfluoro-N-( 3 '-méthylcyclohexyl)pyrro- lidine. 4 Perfluoro-N-cyclohexyl-2-méthylpyrrolidine. Perfluoro-N-cyclohexyl-3-méthylpyrrolidine. 6 Perfluoro-N-( 2 '-méthylcyclohexyl)pyrro- lidine. 7 Perfluoro-N-( 4 '-méthylcyclohexyl)pyrro- lidine. 8 Préparation d'émulsion de perfluorocyclo- amine capable de transporter l'oxygène, comprenant 5 à 50 % (P/V) de perfluorocycloamine répondant à la formule générale: N dans laquelle une position quelconque peut, si on le désire, être substituée par un groupe perfluorométhyle, comme constituant transportant l'oxygène, 1 à 5 % (P/V) d'un agent d'émulsification et le reste,d'une solution aqueuse physiologiquement acceptable, l'émulsion ayant un diamètre de particules de 0,3 micron ou moins. 9 Préparation suivant la revendication 8, caractérisée en ce que la perfluorocycloamine est la perfluoro-N-cyclohexylpyrrolidine, la perfluoro-N- ( 3 '-méthylcyclohexyl)pyrrolidine, la perfluoro-N- cyclohexyl-2-méthylpyrrolidine, la perfluoro-N-cyclo- hexyl-3-méthylpyrrolidine, la perfluoro-N-( 2-méthyl- cyclohexyl)pyrrolidine ou la perfluoro-N-( 4 '-méthyl- cyclohexyl)pyrrolidine. Préparation suivant la revendication 8, caractérisée en ce que l'agent d'émulsification est un agent tensioactif non ionique polymère et un phos- pholipide. 11 Préparataion suivant la revendication 8, caractérisée en ce qu'on ajoute comme agent de mise en émulsion 0,001 à 0,01 % (P/V) d'un acide gras en C 8 àC 2 C ou un sel physi lcgiiuement a=ceptable de celuici 12 Préparation suivant la revendication 8, caractérisée en ce que l'on ajoute une solution'iso- tonisante d'un agent isotonisant. 13 Préparation suivant la revendication 8, caractérisée en ce que l'on ajoute un substitut du plasma.