Brevet FR2527222A1 — publié le 19831125

La présente invention est relative à un nouveau procédé de séparation et de purification desprotéases et des antiprotéases de la coagulation sanguine Zet notamment de la thrombine (T) et de l'antithrombine (AT)/, ainsi que du complexe thrombine-antithrombine T-AT. L'étude et la connaissance des mécanismes de la coagulation du sang nécessite de disposer de quantités impor- tantes de thrombine et de l'antithrombine à l'état pur. Les Demandeurs qui ont acquis une grande expérien- ce dans la préparation des polymères doués de propriétés anti- coagulantes (cf notamment le Brevet français 2 461 724 ou ANN BIOMED ENG 1979) ontmis en évidence des lois d'affinité entre ces polymères et certaines protéines commeles protéaseset les antiprotéases de la coagulation sanguine Aussi ils se sont fixes pour but de pourvoir à un procédé de séparation et de purification des protéases et des antiprotéases (telles que la T et l'AT) qui soit simple, économique et d'une grande fiabilité. La présente invention a pour objet un procédé de séparation et de purification des protéases (T) et des anti- protéases (AT) de la coagulation sanguine ainsi que de leur complexe (TAT), caractérisé en ce que l'on met en contact un polymère réticulé insoluble comportant dans sa chaîne le groupe -503 R 1 et/ou le groupe 502 R 2 dans lesquels R 1 désigne un atome d'hydrogène ou de métal et R 2 désigne le reste d'un acide aminé lié au pont -SO 2 par sa fonction amine -NTI-, avec une solution contenant les protéases ou les anti- protéases ou leur complexe, en ce que l'on sépare le polymère ayant adsorbé la protéine désirée, en ce qua'on le lave soi- gneusement au tampon, en ce que l'on désorbe la protéine adsorbée par une solution d'un composé polycationique dans le cas de la T ou par une solution d'albumine dans le cas de l'AT ou du complexe T-AT,et en ce que l'on isole la protéine, si on le désire, par des moyens connus, tels que la lyophilisation, notamment Selon un mode de réalisation avantageux de l'objet de l'invention, le polymère réticulé est le poly- styrène. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'objet de l'invention, le polymère avant sa mise en contact avec les solutions contenant les protéines est équi- ibrré à un p H compris entre 7,3 et 7,5 par lavages successifs avec un tampon approprié. Conformément à l'invention, le polymère réticulé insoluble mis en oeuvre l'est dans la proportion comprise entre 50 et 2500 mg par mg de protéine présente et, de pré- frence, entre 50 et 80 mg pour 1 mg de T, entre 200 et 2000 mc pour 1 mg de AT et entre 220 et 2000 mg pour 1 mg du complexe T-AT. Selon un mode de réalisation avantageux de l'objet de l'invention, le composé polycationique est pris dans le groupe qui comprend le bromure d'hexadiméthrine et la polylysine, et la quantité de ce composé mise en oeuvre est comprise entre 10 et 15 mg par mg de protéine T. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'objet de l'invention, la quantité d'albumine mise en oeuvre pour la désorption est comprise entre 750 et 2500 mg par mg de protéine recherchée adsorbée, et de préférence, entre 800 et l 200 mg pour 1 mg d'AT, et entre 1000 et 2000 mg pour 1 mg du comrpexe T-AT. Conformément à l'invention, le tampon utilisé pour l'équilibraae du polymère avant l'adsorption et pour le lavage après l'adsorption, est pris dans le groupe qui comprend le tam Dorn Michaelis et ie tampon Tris. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES DE SEPARATION EXEMPLE 1 - Séparation de la thrombine lg de polymère conforme à l'invention est préa- lablement équilibré à p H 7,4 par plusieurs lavages successifs avec le tampon Tris On mélange ensuite le polymère pendant une demi-heure à 4 C avec une solution contenant 18,75 mg de thrombine Au bout de ce temps, on sépare le polymère (soit par centrifugation, soit sur du verre fritté), et on le lave u 10 par 5 fois son volume du même tampon On mélange ensuite le polymère (pendant une demi-heure à 4 C)avec 10 ml d'une solu- tion à 10 mg/ml de bromure d'hexadiméthrine Le polymère complexé avec le bromure d'hexadiméthrine est alors séparé de la solution contenant la thrombine désorbée Celle-ci est isolde par lyophilisation On obtient 15 mg de thrombine,soit un rendement de 80 %. EXEMPLE 2 SéEparation de l'antithrombine g de polymère sont préalablement équilibrés à p H 7,4 par plusieurs lavages successifs avec du tampon Michaelis Le polymère est ensuite mélangé avec 30 ml de plasma pendant une demi-heure à 4 C Le gel est ensuité séparé du du plasma par centrifugation (ou filtration sur verre fritté). Le polymère est alors lavé avec 5 fois son volume du tampon Michaelis, puis mélangé pendant une demi-heure à 4 C avec 30 ml de même tampon contenant 100 mg/ml d'albumine (bovine ou humaine) La solution résiduelle contenant l'antithrombine désorbée et l'albumine en excès est alors récupérée par filtration (ou centrifuqation) Elle est ensuite injectée sur une colonne d'héparine-sépharose pour séparer les deux protéines On obtient 3 mg d'antithrombine, soit un rendement de 60 %. EXEMPLE 3 - Searation d'antithrombine sur colonne La colonne de séparation est préparée avec le polymère préalablement gonflé et équilibré dans le tampon Tris. On fait alors passer le plasma sur le gel de polymère On élue le plasma non adsorbé par lavage du tampon On passe alors sur la colonne une solution à 100 mg/ml d'albumine et on récupère la solution contenant l'antithrombine et l'albumine en excès Cette solution est ensuite passée sur héparine- sépharose comme indiqué dans l'Exemple 2. On obtient 3 mg d'antithrombine Rendement: 60 %. EXEMPLE 4 Eéparation du T-AT g de polymère sont préalablement équilibrés à p H 7,4 par plusieurs lavages successifs avec du tampon Tris. Le polymère est ensuite mélangé avec 30 ml de plasma contenant le complexe thrombine-antithrombine à raison de 300 n Moles/ litre Apres une demi-heure à 4 C, le polymère est séparé du plasma par centrifugation Le polymère est alors lavé avec -fois son volume du tampon, puis avec 5 volumes du même tampon contenant 100 g/ml d'albumine pendant une demiheure à 4 C Le polymère est alors introduit dans une colonne et le complexe T-AT est élué par du tampon contenant 250 mg/ml d'albumine, jusqu'à l'élution totale (la mesure est effectué par un radio-immuno essai spécifique) Le complexe est séparé de l'albumine par passage de l'éluat sur une colonne de Concanavaline A-sépharose (ou héparine- sépharose) On récupère mg du complexe, soit un rendement d'environ 50 %. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVEND ICATIONS 1 Procédé de séparation et de purification des protéases (T) et des antiprotéases (AT) de la coagula- tion sanguine ainsi que de leur complexe (T-AT>, caracté- risé en ce que l'on met en contact un polymère réticulé insoluble comportant dans sa chaîne le groupe -SO 3 R 1 et/ou le groupe -SO 2 R 2 dans lesquels Ri désigne un atome d'hydro- gène ou de métal et R 2 désigne le reste d'un acide aminé lié au pont -SO 2 par sa fonction amine -NH-, avec une solution contenant les protéases ou les antiprotéases ou leur complexe, en ce que l'on sépare le polymère ayant adsorbé la protéine désirée, en ce qu'on le lave soigneuse- ment au tampon, en ce que l'on désorbe la protéine adsorbée par une solution d'un composé polycationique dans le cas de la T ou par une solution d'albumine dans le cas de l'AT ou du complexe T-AT, et en ce que l'on isole la protéine, si on le désire, par des moyens connus, tels que la lyophilisation notamment. 2 Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le polymère réticulé est le polystyrène. 3 Procédé selon l'une quelconque des Revendica- tions 1 et 2, caractérisé en ce que le polymère avant sa mise en contact avec les solutions contenant les protéines est équilibré à un p H compris entre 7,3 et 7,5 par lavages succes- sifs avec un tampon approprié. 4 Procédé selon l'une quelconque des Revendica- tions 1 à 3, caractérisé en ce que le polymère réticulé inso- luble mis en oeuvre l'est dans la proportion comprise entre et 2500 mg par mg de protéine présente et de préférence, entre 50 et 80 mg pour 1 mg de T, entre 200 et 2000 mg pour 1 mg de AT et entre 220 et 2000 mg pour 1 mg du complexe T-AT. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le composé polycationique est pris dans le groupe qui comprend le bromure d'hexadiméthrine et la polylysine et la quantité de ce composé mis en oeuvre est comprise entre 10 et 15 mg par mg de protéine T. 6 Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la quantité d'albumine mise en oeuvre pour la désorption est comprise entre 750 et 2500 mg par mg de protéine recherchée adsorbée, et de préférence entre 800 et 1200 mg pour 1 mg d'AT et entre 1000 et 2000 mg pour 1 mg du complexe T-AT. 7 Procédé selon l'une quelconque des Revendica- tions 1 à 6, caractérisé en ce que le tampon utilisé pour l'équilibrage des polymères avant l'adsorption et pour le lavage après l'adsorption, est pris dans le groupe qui comprend le tampon Michaelis et le tampon Tris.