Brevet FR2524487A1 — publié le 19831007

Fragments d'ADN codant pour des polypeptides contenant au moins un déterminant antigénique des papillomavirus, notam- ment du type HPV la et polypeptides correspondants. L'invention concerne des fragments d'ADN codant pour des polypeptides contenant au moins un déterminant antigénique des papillomavirus, notamment du type HPV la. Elle est également relative aux produits de transformation de tels polypeptides, tels que ceux résultant de la con- jugaison par l'intermédiaire de liaisons covalentes de ces polypeptides à des macromolécules support et présentant des propriétés immunogènes permettant leur utilisation, notam- ment soit comme moyen de diagnostic de la présence ou non de papillomavirus dans des échantillons biologiques, soit comme principe actif de vaccins susceptibles d'immuniser un hôte contre ces papillomavirus. On sait que les papillomavirus sont susceptibles d'infecter un grand nombre d'espèces vivantes, parmi les- quelles l'homme Ils sont responsables de la production de tumeurs bénignes, notamment de verrues au niveau de l'épithélium qu'ils colonisent Ces tumeurs qui présentent le plus souvent un caractère régressif peuvent néanmoins dans un certain nombre de cas donner lieu à une transforma- tion maligne D'ailleurs les papillomavirus ont sur le plan morphologique été considérés comme apparentés à des virus de polyome, tels que les virus connus sous les désignations SV 40,BKV etc Ces différents types de virus -ont en effet en commun une structure de capside icosahédrique renfermant une double hélice d'ADN associée avec des histones Malgré l'impossibilité reconnue de cultiver ces papillomavirus sur des cellules épithéliales ou autres cellules,au sein d'une culture de tissu, O DANOS et al ont récemment réussi à cloner le génome entier du virus de papillome humain, du type la, dans une souche d'Escherichia co Zi (Eur J. Biochem, 109, 457-461 ( 1980)). La présente invention résulte de la découverte de certaines des séquences du génome de ce papillomavirus, qui sont susceptibles de coder pour des peptides ou poly- peptides susceptibles de contenir des déterminants antigé- niques permettant d'envisager leur utilisation comme prin- cipe actif de vaccins, le cas échéant après couplage avec des macromolécules support, du moins pour les plus petits d'entre eux. Il est à cet égard significatif que ces séquences sont tout à fait distinctes de toutes séquences contenues dans lesgénomesdes virus de polyomes mentionnés plus haut. Ces séquences se révèlent en fait être portées par un seul des brins du génome du papillomavirus, comme en témoignent les analyses de séquences du génome entier du papilloma- virus. Le fragment d'ADN selon l'invention peut être redéfini de la façon la plus générale, comme consistant en celui dont le produit d'expression dans un micro- organisme approprié contient au moins l'un des déterminants antégniques des papillomavirus humains, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence de nucléotides, elle-même contenue ou analogue à celle contenue, soit dans la région LI, soit dans la région L 2, soit encore pour partie dans la région LI et pour partie dans la région L 2 de celui des brins du génome du papillomavirus du type la (HPV la) qui les comporte et qui sont capables de coder pour des protéines de structures de HPV la. Pour la commodité de l'exposé, il sera ci-après fait référence aux dessins dans lesquels: les fig la,lb et le sont représentatives de la structure d'une partie de l'un des brins du génome de HPV la, plus particulièrement de celui dont la séquence se lit de l'extrémité 5 ' à l'extrémité 3 ' correspondante; les fig 2 a et 2 b sont des représentations schématiques des parties qui, dans les brins respectifs du génome du HPV 1, sont susceptibles d'être exprimées sous forme de polypeptide et la fig 2 c est une représentation schéma- tique du génome d'un papillomavirus bovin BPV 1; la fig 3 est représentative des structures comparées d'un fragment d'ADN préféré, conforme à l'invention, issu de HPV la et d'un fragment correspondant du génome de papillomavirus bovin du type BPV 1. Les figures la, d'une part, et lb,lc, d'autre part, font appa- raître les structures des régions LI et L 2 de celui des brins du gé- nome du papillomavirus EV la qui le porte Ces figures font également apparaître les résidus aminoacyle codés par les triplets successifs que définissent les nucléotides du brin en question, ces protéines correspondant à des phases de lecture distinctes des séquences de nucléotides correspondantes C'est notamment ce que fait apparaître clairement la fig la, plus particulièrement au niveau des nucléotides numérotés 1870 à 1881, à compter de l'ex- trémité 5 ' (non représentée dans la fig 1) Les positions relatives des régions LI et L 2 sur le brin correspondant, dans la direction de lecture s'étendant de l'extrémité 5 ' à l'extrémité opposée 3 ' de ce même brin, résultent de l'examen de la fig 2 a, laquelle fait apparaître les dis- tributions des régions susceptibles de donner lieu à l'ex- pression, notamment lorsque les fragments d'ADN correspon- dants, préalablement insérés dans un vecteur, sont utili- sés pour transformer des micro-organismes appropriés. La fig 2 a correspond aux trois phases de lec- ture possible du brin correspondant, dont l'extrémité 5 ' serait située à la gauche et l'extrémité 3 ' à la droite de la fig 2 a Les codons sont examinés par groupes de dix, chaque barre noire correspondant à ceux desdits groupes qui, dans la phase de lecture considérée, comportent un codon d'arrêt. Les barrres verticales en pointillé correspondent au premier codon ATG présentdans chacune des séquences qui s'ensuivent et qui sont dépourvues de codons d'arrêt Les deux sites Eco RI aux positions 4237 et 5240 visent à faciliter l l'orientation schématique des séquences résultant des trois phases de lecture possibles, repérées dans la gauche de la figure par les chiffres 3, 2 et 1 La fig 2 a rend compte des positions relatives des régions LI et L 2 dont il a été question plus haut. La fig 2 b rend compte des possibilités de lec- ture dans les mêmes conditions du brin complémentaire de l'ADN du génome de HPV la On constate la présence d'un nombre considérable de codons d'arrêt s'étendant sur la quasi- totalité du brin correspondant, quelle que soit la phase de lecture envisagée. Comme il a été indiqué plus haut, l'invention concerne entre autres des fragments d'ADN susceptibles de contenir une zone commune à la région LI et à la ré- gion L 2, une telle situation pouvant se présenter à l'oc- casion de l'épissure qui peut se produire entre les deux régions, à l'occasion des opérations de transcription de ces régions, au sein même des cellules transformées. Cependant, de préférence, '-'invention concerne des fragments d'ADN ayant des séquences communes de nucléo- tides avec la susdite région LI de HPV la. La localisation plus spécifique de celles des séquences contenues dans les régions LI et L 2 sus- indiquées, qui sont susceptibles de porter un déterminant antigénique caractéristique des papillomavirus, plus parti- culièrement de HPV la, peut s'opérer de toute façon en soi connue, notamment comme suite à la fragmentation des sé- quences d'ADN correspondantes, que ce soit par des enzymes de restriction appropriées ou par clivage chimique, par intégration des fragments obtenus dans un vecteur et transformation d'un micro-organisme approprié à l'aide des vecteurs obtenus et permettant l'expression, par sépara- tion des peptides obtenus, ceux-ci étant ensuite, le cas échéant après couplage avec une macromolécule support, utilisés pour induire la production d'anticorps dans un hôte vivant Sont alors retenus au titre des fragments selon l'invention ceux qui sont susceptibles de produire des anticorps capables de neutraliser le HPV la dans son entier. Une séquence de nucléotides préférée selon l'in- vention consiste en celle qui code pour le peptide de for- mule: Leu-Asp-Gln-Phe-Pro-Leu-Gly-Arg-Lys-Phe-Leu. Ce peptide est en particulier codé par la séquence de nu- cléotides: TTA GAC CAA TTT CCA CTA GGA AGG AAA TTT CTA. Cette séquence de nucléotides correspond à ceux qui s'étendent des positions 3148 à 3180 dans la fig lb. Un autre fragment préféré selon l'invention con- tient un fragment codant pour le peptide Ala-Lys-Arg-ArgArg-Lys. Ce peptide est en particulier codé par la séquence de nu- cléotides: GCC AAG CGC AGG CGT AAG Font également partie de l'invention les séquences d'ADN dont les triplets se distinguent de ceux qui ont été évoqués ci-dessus par une structure nueléotidique différente, dans la mesure cependant o ils codent soit pour des acides aminés identiques ou encore des acides aminés "équivalents", étant entendu que l'expression "équivalents" vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cepen- dant modifier essentiellement les propriétés immunogéniques des peptides correspondants En d'autres termes, les acides aminés équivalents seront ceux qui permettent l'obtention d'une séquence peptidique modifiée, qui, le cas échéant après couplage avec un support macromoléculaire adéquat, permet l'induction in vivo d'anticorps qui restent capables de neutraliser soit le peptide de base, soit encore plus généralement le papillomavirus correspondant HPV la. Ces aminoacyles équivalents peuvent être déter- minés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure, soit sur les résultats des essais d'immunogénicités croi- sées auxquels les différentes séquences de peptides obte- nus sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibi- lités de substitutions susceptibles d'être souvent effec- tuées, sans qu'il en résulte une modification approfondie de l'immunogénicité des peptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de glutamine par 1 ' asparagine, de l'arginine par la lysine, etc, les substitutions inverses étant naturellement envisagea- bles dans les mêmes conditions. A cet égard, il est intéressant de relever la présence dans le génome de papillomavirus bovin du type BPV 1, de séquences présentant un certain niveau d'homo- logie avec des séquences correspondantes de HPV la, comme il résulte notamment de l'examen de-la fig 3. La fig 3 fait en effet apparaître des homolo- gies qui peuvent être relevées entre la zone d'extrémité 3 ' (s'étendant du nucléotide numéroté 3246 à partir de l'extrémité 5 ' du génome de HPV la jusqu'au mnucléotide 3476) de la région L 1 selon le code de lecture correspondant, et par ailleurs une région correspondante du génome de BPV 1 Cette dernière région a été définie par analyse séquentielle d'un recombinant obtenu entre le vecteur M 13 décrit par ROTHSTEIN et WU (Gen 15, 1981, 167-176) et/ou MESSING J et al (Nucl Acids Res ( 1981) 9, 309- 321) et un fragment de BPV 1 délimité par des extrémités Bgl II débutant environ 10 nucléotides avant l'extrémité du site Hind III de BPV i (schématiquement représenté à la fig 2 c) Les points placés entre les lettres en regard d'une séquence nucléotidique représentée visent à souligner le caractère identique desnueléotidesen ques- tion, les intervalles blancs laissés libres dans chacune des séquences n'ayant d'autre fin que celle de faire appa- raître de façon plus nette encore les homologies exis- tantes Les séquences peptidiques communes codées par les séquences correspondantes contenues à l'intérieur des frag- ments considérés à la fig 3 apparaissent dans les enca- drés représentés. Font donc également partie des fragments d'ADN particuliers de l'invention, ceux qui codent pour les pep- tides: Leu-Asp-Gln-Phe-Pro-Leu-Gly-Arg-Arg-Phe-Leu et Ala-Lys-Lys-Lys-LysLys. Au titre des fragments nucléotidiques particu- liers entrant dans le cadre de l'invention, on mentionne- ra naturellement également ceux qui sont contenus dans le fragment susmentionné de BPV 1, plus particulièrement TTA GAT CAA TTT CCC TTG GGA AGA AGA TTT TTA, GCA AAA AAA AAA AAA AAA. L'invention concerne naturellement également tous fragments d'ADN équivalents, dans les conditions telles qu'elles ont été définies plus haut. Les différentes séquences d'ADN telles qu'elles ont été décrites cidessus, peuvent être obtenues,comme il a déjà été indiqué, notamment par fragmentation du génome et récupération des fragments appropriés corres- pondants, contenant les enchaînements de nucléotides cor- respondant aux séquences contenues dans les susdites ré- gions LI et L 2 ou encore à des régions plus petites conte- nant néanmoins des déterminants antigéniques spécifiques à l'égard du virus entier En ce qui concerne les fragments les plus petits, notamment ceux qui codent pour un nombre limité d'acides aminés, tels qu'ils ont été illustrés par les exemples, on peut également avoir recours à la syn- thèse chimique des nucléotides correspondants, selon des méthodes à ce jour bien connues, les séquences obtenues pou- vant alors être utilisées comme insérats susceptibles d'être incorporés dans un vecteur permettant la transforma- tion des micro-organismes appropriés à leur expression. En ce qui concerne les peptides eux-mêmes, on peut également avoir recours, surtout lorsqu'il s'agit de pep- tides ne comprenant qu'un nombre limité de résidus amino- acyles,à des techniques elles-mêmes connues de synthèse chimique A cet égard, on pourra avoir recours au mode de synthèse en solution homogène décrit par HOUBEN- WEYL dans l'ouvrage intitulé "Methodem der Organischen Chemie" (Méthode de la chimie organique) édité par E W Unsch, vol 15-I et II, THIEME, Stuttgart 1974. Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux à deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des frag- ments préalablement formés et contenant déjà plusieurs résidus aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plu- sieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant enten- du que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments à l'exception des fonctions amine de l'un et carboxyle de l'autre ou vice versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, no- tamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des protéines. En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la 1-éthyl-3- ( 3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction amine supplémentaire (cas de la lysine par exemple) ou une autre fonction acide (cas par exemple de l'acide glutamique), ces fonctions seront par exemple protégées, par des groupes carbobenzoxy ou tbutyloxycarbonyle, en ce qui concerne les fonctions amine, ou par des groupes t-butylester, en ce qui concerne les fonctions carboxyliques Il en ira de même de la pro- tection de toute autre fonction réactive Par exemple lors- que l'un des aminoacyles considérés contient une fonction SH (par exemple le cystéine), on pourra avoir recours à un groupe acétamidométhyle ou formamidométhyle. Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'amino acide C-terminal avec l'amino- acide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal Selon une autre technique préfé- rée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D MERRIFIELD dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis" (J Am Chem Soc, 45, 2149-2154). Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de MEERIFIELD, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier aminoacide C-terminal de la chaîne Cet aminoacide est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle. Lorsque le premier aminoacide C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide. Dans le cas ou le groupe protecteur de la fonc- tion amine est le groupe t-butyloxycarbonyle, il peut être éliminé par lavage de la résine à l'aide d'acide tri- fluoroacétique. On fait ensuite réagir le deuxième aminoacide qui fournit le second aminoacyle de la séquence recherchée, à partir du résidu aminoacyle C-terminal sur la fonction amine déprotégée du premier aminoacide C-terminal fixé sur la chaîne; De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième aminoacide est activée, par exemple par la dicyclohexyl- carbodiimide, et la fonction amine est protégée, par exemple par le t-butyloxycarbonyle. On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux aminoacides, et dont la fonction amine terminale est protégée Comme précé- demment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du deuxième aminoacide C-terminal. On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés, qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine. Lorsque la totalité de la chaîne peptidique dé- sirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents aminoacides constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorhydrique. 1.0 L'invention concerne également les produits obtenus par la conjugaison (par liaison covalente) entre les peptides, tels qu'ils ont été définis plus haut, et un support macromoléculaire du genre de ceux qui peuvent être utilisés pour la constitution de principes actifs immunogènes. De tels supports sont bien connus des spécia- listes Il peut s'agit de supports naturels, tels que des sérums albumines, de préférence humaines lorsqu'il s'agit de vaccins destinés à l'homme, ou animales, lorsqu'il s'agit de vaccins -destinés à l'usage vétérinaire On mentionnera encore à titre d'exemple de supports macro- moléculaires naturels les ovalbumines, la toxine tétanique, etc ayant des poids moléculaires de préférence supérieurs à 20 000. On peut également avoir recours à des supports macromoléculaires synthétiques tels que des polypeptides synthétiques A titre d'exemple, on mentionne des poly- lysines, portant le cas échéant des chaînes latérales de polyalanine (les motifs alanyles étant dextrogyres et/ou 2.0 lévogyres) On peut encore avoir recours aux chaînes syn- thétiques, telles que celles décrites par exemple dans la demande de brevet français na 79 00819. Les principes actifs selon l'invention sont uti- lisables notamment pour protéger des sujets contre les papillomavirus, par exemple préalablement à la réalisation d'un traitement immunosuppresseur. Une importante application réside dans la produc- tion de sérums ou d'anticorps davantage purifiés, en vue de réaliser des réactifs de diagnostic de papillomavirus qui peuvent être utilisés dans des tests de routine, notam- ment à l'occasion d'examens de frottis vaginaux, ou autres examens gynécologiques, par exemple dans le cas de dépis- tage de certains types de cancer du col utérin Ils peuvent encore servir à des tests de diagnostic préventif en dermatologie. L'invention concerne naturellement aussi toutes les compositions de vaccins, dans lesquelles les susdits principes actifs sont associés à des véhicules pharmaceutiques permettant leur administration par voie il parentérale, orale ou autre Ces compositions contiennent éventuellement également un adjuvant immunologique du type muramyl-peptide, permettant le renforcement de la réaction immunitaire à l'égard du principe vaccinant. Ces compositions peuvent être utilisées en médecine humaine ou vétérinaire, les séquences immuno- gènes de papillomavirus mises en oeuvre étant alors,le cas échéant originaires,notamment en ce qui concerne celles qui comportent un nombre de résidus aminoacyle élevé, des papillomavirus colonisant préférentiellement les tissus des espèces auxquelles le vaccin est destiné. D'une façon générale, l'invention concerne na- turellement tout fragment d'ADN dont le produit d'expres- siondans un micro-organisme approprié contient au moins l'un des déterminants antigéniques d'un papillomavirus, humain ou animal, ce fragment étant caractérisé en ce qu'il comporte une séquence de nucléotides, elle-même contenue ou analogue à celle contenue soit dans la région LI, soit dans la région L 2, soit encore pour par- tie dans la région Li et pour partie dans la région L 2 de celui des brins du génome de papillomavirus qui les com- porte et qui sont capables de coder pour des protéines de structure du virus ou pour des polypeptides ayant en commun avec ces protéines une séquence contenant au moins un déterminant antigénique caractéristique des papilloma- virus. Il est entendu que les revendications qui sui- vent couvrent non seulement les fragments d'ADN et les fragments de peptides correspondants, mais également tous les équivalents susceptibles d'être réalisés, notamment mais non exclusivement en conformité avec les indications qui ont été formulées dans la présente description. L'invention concerne également toutes séquences d'ADN extraites du génome des papillomavirus, autres que celles qui ont été évoquées ci-dessus, notamment les sé- quences El (nucléotides 5473-6919) et E 2 (nucléotides 6863-16) (sur la fig 2 a au niveau des phases de lecture 1 et 2) Les peptides exprimés par ces séquences peuvent induire in vivo la formation d'anticorps utilisables pour détecter des lésions provoquées par des papillo- mavirus (et contenant des fragments de protéines et le DNA viral) dans des réactions classiques d'antigènes anticorps dépistables par les réactions classiques d'immunofluorescence ou d'immunoenzymatiques, etc. REVENDICATIONS 1 Fragment d'ADN dont le produit d'expression dans un micro-organisme approprié contient au moins l'un des déterminants antigéniques des papillomavirus, carac- térisé en ce qu'il comporte une séquence de nucléotides, elle-même contenoeou analogue à celle contenue soit dans la région LI, soit dans la région L 2, soit encore pour partie dans la région LI et pour partie dans la région L 2 de celui des brins du génome de papillomavirus qui les comporte et qui sont capables de coder pour des protéines de structure du virus ou pour des polypeptides ayant en commun avec ces protéines une séquence contenant au moins un déterminant antigénique caractéristique des papilloma- virus. 2 Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence de nucléotides est con- tenue ou analogue à celle contenue dans le génome d'un papillomavirus humain, notamment du type la (HPV la), no- tamment dans la région Li de HPV la. 3 Fragment d'ADN selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence de nucléotides codant pour le peptide Leu-Asp-Gln-Phe-Pro-Leu-Gly-Arg-Lys-Phe-Leu, ou pour le peptide Leu-Asp-Gln-Phe-Pro-Leu-Gly-Arg-Arg-Phe-Leu. 4 Séquence d'ADN selon la revendication 3, ca- ractérisée par la séquence de nucléotide TTA GAC CAA TTT CCA CTA GGA AGG AAA TTT CTA ou du nucléotide TTA GAT CAA TTT CCC TTG GGA AGA AGA TTT TTA. Séquence d'ADN selon la revendication i ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'il comporte une séquence de nucléotides codant pour le peptide Ala-Lys-Arg-Arg-Aig-Lys ou pour le peptide Ala-Lys-Lys-Lys-LysLys. 6 Séquence d'ADN selon la revendication 5, ca- ractérisée en ce qu'il comporte l'une des deux squences de nucléotides suivantes: GCC AAG CGC AGG CGT AAG ou GCA AAA AAA AAA AAA AAA. 7 Les peptides tels que codés par les fragments de nucléotides définis dans l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6, plus particulièrement: Leu-Asp-Glu-Phe-Pra-Leu-Gly-Arg-LysPhe-Leu Leu-Asp-Glu-Phe-Pro-Leu-Gly-Arg-Arg-Phe-Leu Ala-Lys-Arg-Arg-ArgLys Ala-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys. 8 Un peptide immunogène capable d'induire in vivo la production d'anticoprs actifs à l'égard des papillomavirus, notamment de celui du type HPV la, ca- ractérisé en ce qu'il contient l'une au moins des sé- quences peptidiques susceptibles d'être codées par l'une au moins des fragments d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou l'une au moins des séquences d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, le cas échéant conjuguées à un support macromoléculaire. 9 Peptide immunogène selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il contient une séquence pepti- dique correspondant au moins à l'une de celles des pep- tides identifiés dans la revendication 7. Les compositions de vaccin contenant à titre de principe actif immunogène l'un des peptides immunogènes tels que définis dans la revendication 8 ou dans la revendication 9. Il Les anticorps tels qu'induits in vivo par les peptides immunogènes selon la revendication 8 ou selon la revendication 9. 12 Compositions utiles en tant que réactif biologique ou en tant que réactif de diagnostic in vitro des produits d'expression des papillomavirus, notamment de ceux du type HPV la.