Brevet FR2527631A1 — publié le 19831202

La présente invention concerne un procédé micro- biologique pour convertir facilement les stérols connus en produits intermédiaires utiles pour la synthèse d'hormones stéroïdes plus difficiles à obtenir, et plus particulièrement, elle concerne un procédé pour dégrader sélectivement les stérols d'origine naturelle sur la position C-17 sans ouverture simultanée du noyau. L'utilisation de stérols de soja, de sitostérol, de campestérol et de stigmastéroi comme source économique de produits intermédiaires pour la fabrication de stéroides a été longtemps considérée pour compléter ou remplacer les procédés industriels partant de diosgénine obtenue à partir de la racine de Barbasco et d'autres sources. Plusieurs procédés microbiologiques sont maintenant disponibles pour la conversion des phytostérols ou des phytostérols modifies (oxygénés sur la position 19) en stéroides androstanes utiles. D'une façon plus étendue, la présente invention fournit un procédé pour augmenter l'efficacité de la coupure des stérols possédant des chaînes ramifiées sur la position C-24 L'auteur de la présente invention a maintenant découvert que ceci peut être réalisé par l'addition de l'icn bicarbonate au milieu de fermentation Plus spécifiquement, il a main- tenant découvert que les rendements de la dégradations mi- crobiologique des chaînes latérales du sitostérol et du campestérol, du stigmastérol ou de leurs dérivés modifiés sont généralement améliorés si une source exogène d'ions HCO 3 est incorporée dans le milieu Des exemples de micro- organismes qui réagissentà l'iin CO 03 pendant la coupure de la chaîne latérale du phytostérol sont ceux du genre Nocardia, Mycobacterium, Arthrobacter et Corynebacterium, en particulier du genre Mycobacterium s D NRRL B 3805 ou -3683 ou du genre Mycobacterium phlei NRRL B-15050 (Voir par exemple brevet US no 3 507 749). Bien que la présente invention ne soit pas limitée à une théorie particulière, on suppose que dans la fermen- tation, les micro-organismes fonctionnement pour dégrader le composé stéroïde d'abord par oxydation sur la position C-26, par introduction d' insaturation sur les positions C-24-C-25, par incorporation de HCO 3 sur la position C-28 avant que se produise une quelconque rupture de liaison carbone-carbone de la chaîne latérale hydrocarbonée (voir ci-dessous) Apres hydratation sur la position C-24, la chaine latérale du phytostérol de la classe du sitos- térol est transformée en acide 3-oxo-chol-4-èn-24-oique et en deux moles d'acide propionique Dans le cas du campestérol, celui-ci est converti en acide 3-oxo-chol-4- ên-24-oique et en une mole d'acide acétique et une mole d'acide propionique La transformation ultérieure de l'acide 3-oxo chol-4-èn-24olque en stéroides 17-céto est bien connue (C J Sih et al, Biochemistry, 7, 808, 1968). R à, P > Ai >R 1 R 1 = H Chmpesterol R =H 3 Sitostrol R 2 = Coenz -rie A CH sitosterol 03 o un rendement maximum, particulièrement quand les phyto- stérols ou leurs dérivés sont présents à des concentrations élevées Pour la dégradation, afin d'opérer avec le ren- dement maximum, il faut fournir une source exogène de l'ion HCO 3- Celuici peut être fourni sous de nombreuses formes telles que Na HCO 3, NH 4 HCO 3, Ca CO 3, C 02, H 2 C 03 c'est-à-dire un composé chimique à un seul carbone qui puisse être transformé par le micro-organisme (par les enzymes élaborés par le micro-organisme) en l'ion bicarbonate ou en CO 2. Il faut bien faire ressortir que la forme sous laquelle le HCO 3 est fourni, n'est pas critique ou n'est pas limitée tant que la forme en solution exigée par le micro-organisme pour l'incorporation sur la position C-24 est une forme activée de l'kin bicarbonate (par exemple bicarbonate lié à une coenzyme) Un des moyens les plus efficaces d'appro- visionnement en ion bicarbonate consiste à introduire simplement (par barbotage)du C 02 à travers le milieu de fermentation pendant que la fermentation est encours. Les micro-organismes qui sont -caractérisé par leur aptitude à dégrader la chaîne latérale des phytostérols sont bien connus dans la technique(voir Martin, Adv in Appl Microbiol, 22, 28, 1977 et brevet US N O 3-507 749) Un quelconque des genres de micro-organismes décrits dans cette documentation peut être utilisé dans le procédé de la présente invention La matière de départ, le stérol, peut être incorporée dans un milieu nutritif de composition normalisée dans lequel ces micro- organismes sont cultivés et les conditions usuelles de fermentation peuvent être ensuite utilisées pour effectuer la conversion du stérol, particulièrement dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobiesimmergées D'une autre façon, le principe actif peut être éliminé de la culture en développement du micro-organisme,par exemple par une lyse des cellules pour libérer les enzymes,ou par suspension des cellules dans un système aqueux frais, ou par immobilisation des cellules. Dans une quelconque de ces techniques, la chaine latérale sur la position 17 du stérol sera rompue sélectivement aussi longtemps que le principe actif élaboré par le micro-organisme sera présent dans le milieu Bien entendu, les conditions de température,de temps et de pression dans lesquelles le contact du dérivé phytostérol avec le principe de dégradation est réalisé, sont interdépendantes comme le sait bien le technicien Par exemple, en chauffant doucement et à la pression atmosphérique, le temps nécessaire pour réaliser la conversion du stérol sera inférieur au temps exigé à la température ordinaire dans des condi- tions différentes de celles susmentionnées-Bien entendu, ni la température, ni la pression, ni le temps, ne devront être suffisants pour que le stérol soit ainsi dégradé Si une culture en développement de l'organisme est utilisée, les conditions du procédé devront être naturellement suffisam- ment douces pour que l'organisme ne soit pas tué prématu- rément, c'est-à-dire avant qu'il ait élaboré une quantité suffisante d'enzymes Généralement parlant, la température peut aller par exemple de 10 'C à 370 C et la durée peut aller par exemple de 12 heures à 12 jours. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. EXEMPLE 1 A) Fermentation Développement en surface à partir d'un plan incliné d'agar vieux de une semaine de Microbacterium sp NRRL B-3805 développé sur de l'agar ayant la composition suivante: Milieu solide glucose-agar Grammes Agar 20 Glucose 10 Extrait de levure 2,5 K 2 HPO 4 1 Eau distillée, q s pour 1 litre (stérilisée 15 minutes à 20 psi; 1,4 bar) miseen suspension dans 5 ml d'une solution saline à 0,85 %. Des portions de 1 ml de cette suspension sont utilisées pour ensemencer 60 ml d'un milieu soja-dextrose (MSD) contenu à chaque fois dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml (stade F-1),ce milieu ayant la composition suivante: Milieu soja-dextrose (MSD) Grammes Farine de soja 5 Dextrose 20 Extrait de levure 5 K 2 HPO 47 H 20 8,7 Sitostérol (contenant du campestérol) 0,1 Eau du robinet, q s pour 1 litre, réglée à p H 7,8 (stérilisée 20 minutes à 30 psi; 2,1 bars) Les fioles sont placées en incubation à 25 C sur un secoueur rotatif ( 200 cycles/min rayon 2 " ( 5 cm)) pendant 48 heures après quoi un transfert par volume de 10 % est réalisé dans une succession de fioles Erlenmeyer de 250 ml (stade F-2) contenant chacune 60 ml du milieu ci-dessus Après 48 heures, 120 mg de sitostéroll mis en suspension dans 5 mlde ='een 80 à 1 %, sont ajoutés dans chaque fiole entraînant une concentration en substrat final de 2 mg/ml En même temps, des quantités diverses de Na HCO 3 en poudre sont ajoutées à chaque fiole pour obtenir les concentration en HCO 3 indiquées Les fioles sont mises en incubation dans les mêmes conditions que les fioles du stade F-1 Le p H est maintenu à 7,6 + 0,1 en ajoutant quotidiennement une solution de KH 2 PO 4 1 M stérile. B) Analyse quantitative de l'androst-4-ène-3,17-dione 48 heures après l'addition du sitostérol, chaque fiole est extraite séparément avec de l'acétate d'éthyle ( 50 x 3) Les extraits combinés sont lavés avec de l'eau, séchés sur Na 2504, et évaporés à sec sous vide Une partie du résidu est dissoute dans l'acétone et est chromatographiée sur une plaque pour couches minces de 10 x 20 cm (EM - épaisseur 0,5 mm, silicagel contenant l'indicateur PF 254, Brinkmann) et développée dans un système constitué par acétate d'éthyle-hexane ( 1:1) Le sitostérol a une Rf = 0,49; l'androst-4-ène-3,17-dione a une Rf = 0,27 La bande d'absorption des UV correspondant à l'androst- 4-ène-3,17-dione éluée jusqu'à épuisement avec l'acétate d'éthyle et l'absorbance des UV à 240 nm (≤ 15 000) sont mesurées Les résultats sont indiqués ci-dessous: Concentration de m moles d'androst-4- HCO 3 (m M) ène-3,17-dione O O 55,7 99,0 91,1 94,2 ; 7631 EXEMPLE 2 A) Fermentation Développement en surface à partir d'un plan incliné d'agar vieux d'une semaine du Mycobacterium sp NRRL-3683, cultivé sur le milieu solide glucose-agar, et mis en suspension dans 5 ml d'une solution saline à 0,85 % Des portions de 1 ml de cette suspension sont utilisées pour ensemencer 60 ml du milieu soja-dextrose (MSD) contenus à chaque fois dans une fiole Erlenmeyer de 250 ml (stade F-l) Les fioles sont mises en incu- bation à 25 C sur un secoueur rotatif ( 200 cycles/min- rayon 2 "( 5 cm) pendant 48 heures,après quoi un transfert par volume de 10 % est réalisé dans une succession de fioles Erlenmeyer de 250 ml (stade F-2) contenant chacune 60 ml du milieu MSD Apres 48 heures d'incu- bation (la même que le stade F-l) 120 mg de sitostérol (contenant du campestérol), mis en suspension dans ml de Tween 80 à 1 %, sont ajoutés à chaque fiole. En même temps, des quantités variables de Na HCO 3 en poudre sont ajoutées dans chaque fiole pour obtenir la concentration en HCO 3-désirée Les fioles sont mises en incubation sur le secoueur rotatif (le même que pour le stade F-l) et au bout de 48 heures et de 116 heures, des échantillons sont analysés pour déterminer l'andro- sta-l,4-diène-3,17-dione. B) Analyse quantitative de l'androsta-1,4-diène3,17-dione (ADD) A des intervalles de temps mentionnés ( 48 heures et 116 heures), le contenu de chaque fiole est réglé à p H 3 et extrait séparément avec de l'acétate d'éthyle ( 50 ml x 3) Les extraits combinés sont lavés avec de l'eau, séchés sur Na 2 SO 4 et évaporés à sec sous vide. Une partie du résidu est dissoute dans l'acétone et chromatographiée sur une plaque pour couche mince de x 20 cm (EM épaisseur 0,5, gel de silice contenant l'indicateur PF 254, Brinkmann) et développée dans un système constitué par le mélange acétate d'éthyle-hexane ( 1:1) Le sitostérol a une Rf = 0,49; l'androsta-1,4- diène-3,17 dione (ADD) a une R = 0,16 La bande d'ab- sorption conrrespondant à l'androsta-l,4-diène-3,17- dione qui a été éluée à fond avec l'acétate d'éthyle et l'absorbance UV à 244 nm ( = 15 000), sont mesurées. Les résultats sont indiqués ci-dessous. m moles d'ADD HC 03 (m M) 48 h 116 h. O 39,4 78,6 56,0 105,8 142,1 51,6 102,8 59,7 100,9 EXEMPLE 3 A) Fermentation Le développement en surface à partir d'un plan incliné d'agar vieux d'une semaine du Mycobacterium Phlei NRRL-B-15050, cultivé sur un milieu solide glucose- agar est mis en suspension dans 5 ml d'une solution saline à 0,85 % Des portions de 1 ml de cette suspension sont utilisées pour ensemencer 60 ml du milieu ci-dessous contenu à chaque fois dans une fiole Erlenmeyer de 250 ml (stade F-l). Glycérol-milieu A Grammes Bouillon nutritif (Difco) 8 Extrait de levures 1 Glycérol 5 K 2 HPO 4 ' 7 H 20 8,7 Sitostérol(contenant du campestérol) 0,1 Eau du robinet,q s pour 1 litre, réglée à p H 7,8 (stérilisée 20 min à 30 psi; 2,1 bars) Apres 48 heures d'incubation (la même que pour le stade F-l), 120 mg de sitostérol (contenant du campestérol) mis en suspension dans 5 ml de Tween à 1 % sont ajoutés dans chaque fiole En même temps, des quantités variables de Na HCO 3 en poudre sont ajoutées dans chaque fiole pour obtenir les concen- trations en HCO 3 désirées Les fioles sont mises en incubation sur le secoueur rotatif (le même que pour le stade F-l) et au bout de 48 et 96 heures, les échan- tillons sont analysés pour déterminer l'androsta-1,4- diène-3,17-dione (ADD)). m moles d'ADD HCO 3-(m M) 48 h 96 h O 18,4 40,8 42,7 67,3 46,0 69,4 42,4 64,8 Dans les exemples précédents, des concentrations en ion bicarbonate aussi élevées que 200 m M peuvent être utilisées avec des résultats comparables, bien que la gamme préférée aille de 25 m M à 150 m M ou 200 m M En tout cas, les concentrations à utiliser sont celles qui augmentent l'efficacité de la coupure sélective des chaînes latérales sur la position 17 des stérols possédant des chaînes ramifiées sur la position C- 24 mais qui n'affectent pas défavorablement cette coupure. Il doit être bien entendu que tout micro-organisme du genre Nocardia, Mycobacterium, Arthrobacter et Corynebacterium (brevet US n 3 507 749) jqui réagit à l'ion HCO 3 pendant la coupure de la chaîne latérale du phytostérolpeut être facilement substitué à ceux des micro-organismes spécifiés dans les exemples particuliers précédents et qu'on peut obtenir une production comparable du produit désiré androsta-l,4-diène-3,17-dione ou androst- 4-ène-3,17-dione. RÉPUBLIQUE FRAN AISE INSTITUT NATIONAL DE LA PROPRIÉTE INDUSTRIELLE PARIS 2 527 632 BREVET D'INVENTION CERTIFICAT D'UTILITÉ CERTIFICAT D'ADDITION Aucun titre n'est publié sous ce numéro REVENDICATIONS 1 Procédé pour préparer un stéroïde d'androstane à partir d'un phytostérol possédant une chaîne ramifiée sur la position C-24, caractérisé par la coupure sélective de la chaîne latérale sur la position 17 dudit phytostérol en l'exposant à une enzyme élaborée par un micro-organisme du genre Nocardia, Mycobacterium, Arthrobacter ou Corynebacterium,en présence d'un composé chimique à un seul carbone,qui peut être converti par le micro-organisme en l'icn bicarbonate, ou en CO 2 et en récupérant le stéroïde androstane désiré. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'exposition à l'enzyme élaborée par le micro-organisme est réalisée pendant la culture du micro- organisme dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobiesimmergée. 3 Procédé selon les revendications 1 ou 2, carac- térisé par le fait que l'ion bicarbonate est fourni en introduisant du gaz carbonique dans le milieu pendant la culture. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'il est réalisé à une température allant de 10 C à 37 C pendant 12 heures à 12 jours. 5 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la source exogènede l'ion bicarbonate (HC 03-) est suffisante pour accélérer la coupure de la chaîne latérale sur la position 17 du phytostérol mais insuffisante pour affecter défavo- rablement l'élaboration de l'enzyme par le micro-organisme. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que la source exogène de l'ion bicarbonate (HC 03-) fournit une concentration en ions bicarbonate comprise entre 25 m M et 200 m M. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'exposition à l'enzyme élaborée par le micro- organisme est réalisée dans un milieu nutritif dans lequel ladite enzyme a été incorporée après avoir été enlevée d'une culture du micro-organisme en cours de développement et récupérée. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le phytostérol est le sitostérol ou le campestérol. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que le micro-organisme est du genre Mycobacterium, en particulier du genre Mycobacterium sp NRRL B-3805, Mycobacterium sp NRRL - 3683, ou Mycobacterium phlei NRRL B-15050.