Brevet FR2527771A1 — publié le 19831202

La présente invention concerne un dispositif pour la manipulation de coupes minces et, en particulier, de coupes congelées, dites "cryocoupes" L'invention a également pour objet un procédé pour la lyophilisation de coupes de cette nature. Pour examiner, au microscope électronique, des prépara- tions organiques sous la forme de coupes minces (cryo-coupes) qui sont conservées à de basses températures et obtenues au moyen d'ultramicrotomes, il est nécessaire de soumettre les cryo-coupes à un traitement préliminaire qui est conçu pour les rendre adaptées à l'examen Ce traitement préliminaire demande une opération de pressage, suivie d'une opération de lyophilisation et d'un réchauffement précau- tionneux à la température ambiante A cette fin, les cryo-coupes doivent tout d'abord être transférées de la chambre froide de l'ultramicrotome dans une installation de pressage d'o elles sont ensuite évacuées vers une chambre de lyophilisation Après l'opération de lyophilisat Ion et de réchauffage à la température ambiante, elles sont ensuite reprises et fixées dans le microscope électronique au moyen d'un dispositif de maintien On utilise de petites grilles supports pour transporter les cryocoupes, lesquelles grilles sont faites de carbone ou de béryllium Les cryo-coupes, enlevées directement du couteau de l'ultrami- crotome, par exemple, au moyen d'un cheveu, sont transférées sur ces grilles supports qui, en raison de leur petite taille, doivent être manipulées au moyen d'outils du type pince L'opération de pression des cryo-coupes contre les grilles supports est accomplie à l'aide de poids présentant des surfaces polies. Lorsque l'on emploie ce procédé connu, il est impos- sible, durant les diverses opérations, d'empêcher que des cryo-coupes soient perdues, deviennent inutilisables ou, tout au moins, qu'elles soient endommagées à un point tel que leur adaptation à l'examen au microscope électronique est limité Tout d'abord, pendant l'opération d'enlèvement de la grille support hors de la chambre froide du microtome, avec la cryo-coupe reposant sur cette grille, le danger existe que la cryo-coupe tombe de la grille support par suite du courant d'air accompagnant cette opération En outre, en raison de sa très faible masse, la grille support se réchauffe très rapidement au cours de son bref transport jusqu'à l'outil de pressage, par suite de quoi la cryo-coupe se réchauffe prématurément et peut en être détérioriée. Pendant l'opération de montage des grilles support dans le dispositif de pressage et, également plus tard dans le dispositif de fixation récepteur d'échantillons du micros- cope électronique -opérations qui suivent la lyophilisation et le réchauffage-, le danger existe toujours que des produits contaminants atteignent la préparation par suite de la manipulation En outre, les outils de pressage doivent être maintenus scrupuleusement propres de manière qu'ils ne contaminent pas les cryo-coupes et les rendent inutilisa- bles Enfin, pendant l'opération de séchage, il est pratiquement impossible d'empêcher que les cryo-coupes perdent leur forme initialement plate et se bombent. Ces inconvénients débouchent sur le fait qu'en dépit de l'existence de très bons ultramicrotomes de fonctionnement facile, la préparation de cryo-coupes destinées à la microscopie électronique n'est pas encore devenue une opération de routine mais doit être confiée à du personnel hautement spécialisé et, même avec de tels spécialistes, le taux de perte de cryo-coupes est relativement grand. En conséquence, la présente invention a pour objet d'apporter un dispositif grâce auquel la préparation des cryo-coupes pour examen au microscope électronique peut être effectuée d'une manière qui ne demande pas un soin exceptionnel. Un autre but de l'invention est de réduire le taux de perte tout à fait considérable des cryo-coupes et, d'une manière générale, les préparations gâchées. Ces buts sont atteints selon l'invention en ce sens qu'elle apporte un dispositif pour la manipulation de coupes minces, comprenant une grille support adaptée à recevoir une coupe mince et un dispositif de maintien pour la grille support, ledit dispositif de maintien comprenant une plaque de base, une plaque couvercle guidée qui peut être amenée sur ladite plaque de base et des moyens pour serrer la plaque couvercle contre la plaque de base et donc contre une coupe mince présente sur la grille support. Le dispositif peut être mis en place dans la chambre froide de l'ultramicrotome dans laquelle une cryo-coupe est produite, de manière que la cryo-coupe qui adhère au-couteau de l'ultramicrotome puisse être transférée directement sur la grille support La plaque couvercle est alors guidée contre la plaque de base et maintenue contre cette dernière de sorte que la cryo-coupe qui est présente sur la grille support y est fermement pressée Le dispositif, à l'état fermé, peut ensuite être enlevé de la chambre froide, éliminant ainsi tout risque de perte de la cryo-coupe. Par suite du serrage de la plaque couvercle sur la plaque de base, la cryo-coupe est déjà pressée à plat de sorte qu'il devient inutile de la transférer dans un dispositif de pressage séparé Au contraire, la coupe mince peut être immédiatement placée dans une chambre de lyophili- sation Pour cette raison, et du fait que le dispositif de maintien, comparé à la grille support, possède une capacité thermique considérablement supérieure, il ne se produit aucun réchauffement nuisible de la coupe mince car la grille support est substantiellement protégée des effets de la température ambiante. Une caractéristique importante et indépendante de l'invention est que, dans le dispositif de maintien selon l'invention, l'opération de lyophilisation de la cryo-coupe est effectuée tandis que celle-ci est à l'état pressé Du fait qu'il est comparativement facile de stocker le support complet dans la chambre de lyophilisation d'une manière telle que le transfert thermique ne se fasse que très lentement, il est possible de régler l'élévation de température de la cryo-coupe d'une manière qui ne produise aucun effet nuisible De plus, pour cette raison, la cryo-coupe conserve sa forme plate, même après que la plaque couvercle ait été enlevée de sorte que l'examen au microscope électronique n'est pas gêné. Selon une forme d'exécution particulièrement avantageu- se de l'invention, la grille support, ou les grilles supports, sont fixées à demeure à la plaque de maintien qui est logée de manière amovible dans un évidement de la plaque de base Cette plaque de maintien correspond, de préférence, en ce qui concerne ses dimensions et sa forme, au dispositif de fixation récepteur du support de specimen du microscope électronique, de telle manière qu'elle puisse être insérée directement dans ce dispositif En conséquence, il est inutile, à la suite de la lyophilisation et du réchauffage, de manipuler la petite grille support sur laquelle repose la cryo-coupe Dans le passé, cette manipulation a donné lieu à des difficultés et fréquemment à des contaminations Selon l'invention, il est possible de monter la plaque support comparativement grande directement sur le dispositif de fixation récepteur du microscope électronique sans manipula- tion de la grille support ou de la cryo-coupe qui y repose. Au cours de la mise en oeuvre du procédé connu, il se produit souvent des pertes de cryo-coupes du fait qu'elles ne sont pas restées sur la grille support pendant l'opéra- tion ayant pour objet de les presser à plat mais ont adhéré à l'outil de pressage et, soit elles sont ensuite tombées de cet outil, soit elles ont été endommagées tandis qu'on les en détachait. Selon une autre forme d'exécution de l'invention, il est également possible d'éliminer cette source de perte. Cela est obtenu par un dispositif grâce auquel une plaque de maintien identique munie à demeure d'une grille support est disposée dans la plaque couvercle du dispositif de telle manière que, lorsque ce dernier est à l'état fermé, la coupe mince est maintenue entre deux grilles supports Le dispositif presse donc la coupe mince à plat, entre les-deux grilles, de sorte qu'il importe peu sur laquelle de ces deux grilles la coupe mince demeure car, leur configuration étant identique, il est possible d'insérer, dans le microscope électronique, celle des deux plaques de maintien qui comporte la grille support sur laquelle adhère la coupe mince. Selon une forme d'exécution spéciale, la grille support est fixée, par exemple, au moyen d'un adhésif sur une ouverture qui s'étend au travers de la plaque de maintien et un.élément de pression est disposé dans un évidement prévu dans la plaque de base La plaque de maintien peut être prévue dans l'évidement et l'élément de pression se projette dans une ouverture et est en contact avec la surface inférieure de la grille support Cette configuration favorise la lyophilisation du fait que la coupe mince est en communication avec le milieu ambiant au travers de la grille support Si, en outre, la hauteur de l'élément de pression est réglable, comme cela est prévu selon une autre forme d'exécution, il est possible de déterminer une pression optimale définie pour l'opération de pressage à plat de la coupe minice. L'invention apporte également un neédé de lyophilisa- tion de coupe mince qui consiste à produire une coupe mince à l'aide d'un microtome, à transférer cette coupe sur une grille support, à presser à plat ladite coupe, à transférer ladite coupe et ladite grille support dans une chambre de lyophilisation et à lyophiliser ladite coupe dans ladite chambre. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention ressortiront de la description qui va suivre faite en référence aux dessins annexés dans lesquels la figure I représente une première forme d'exécution d'un dispositif de manipulation selon l'invention, à l'état ouvert, prête à recevoir une cryo-coupe; la figure 2 représente une plaque de maintien à l'état isolé; la figure 3 représente le dispositif de manipulation de la figure 1 dans l'état o il agit comme dispositif de pressage; la figure 4 montre une plaque de maintien, à l'état isolé, qui est montée dans un microscope électronique, cette figure montrant l'accessibilité améliorée d'une coupe mince présente sur la plaque de maintien, par comparaison au procédé connu; et les figures 5 et 6 représentent une seconde et une troisième formes d'exécution du dispositif de manipulation selon l'invention. La première forme d'exécution du dispositif de manipu- lation selon l'invention, représentée aux figures 1 à 3, comprend essentiellement une plaque de base 1 et une plaque couvercle 2 qui sont couplées au moyen d'une charnière 3 pour former un ensemble ressemblant à une paire de mâchoires Les deux plaques 1 et 2 sont essentiellement symétriques par rapport à leurs surfaces supérieures qui se font face, ont une forme rectangulaire allongée (dirigée perpendiculairement au plan du dessin) et ont, sur leurs deux faces d'extrémités opposées, des vis de serrage 4 qui permettent de les serrer l'une contre l'autre. Chacune des deux plaques L et 2 possède un évidement rectangulaire, respectivement, 5 et 6 dans lequel est fixée une plaque de maintien 7 d'une manière permettant son détachement facile Des vis peuvent être employées pour fixer les plaques de maintien 7 ou elles peuvent être immobilisées en les introduisant à force derrière des ressorts (non représentés) qui se projettent à partir des parois latérales des évidements 5 et 6. Chacune des plaques de maintien 7 comporte, au centre, au moins une ouverture 8 qui s'étend au travers de la plaque de maintien et s'élargit en direction du fond de l'évidement associé 5, 6 Chaque ouverture S est recouverte à son extrémité supérieure par une grille support 9 en carbone ou béryllium La grille support 9 est collée sur la surface supérieure de la plaque de maintien L'épaisseur de la plaque de maintien 7 est choisie, par rapport aux évidements associés 5 et 6, de telle sorte que les grilles de support 9 viennent précisémment en contact l'une avec l'autre lorsque le dispositif est à l'état fermé (voir figure 3) et portent l'une contre l'autre sous une pression prédéterminée On préfère utiliser du graphite spectroscopiquement pur comme matériau pour la réalisation de la plaque de maintien 7. Le dispositif représenté aux figures 1 à 3 est utilisé comme suit. A la suite de l'opération au cours de laquelle une cryo-coupe est tranchée par un ultramicrotome dans un bloc de préparation solide, la cryo-coupe est transférée du couteau de l'ultramicrotome sur le dispositif selon l'inven- tion qui est immédiatement placé à côté de l'ultramicrotome. Plus précisément, la cryo-coupe est transférée sur la grille support 9 de la plaque de base 1, cette opération de transfert étant effectuée, par exemple, à l'aide d'un cheveu ou de tout autre moyen connu A la figure 2, la cryo-coupe est indiquée par 10 Ensuite, la plaque couvercle 2 est pivotée vers le bas autour de la charnière 3 de sorte que la grille support supérieure 9 est pressée contre la cryo-coupe qui se trouve emprisonnée entre les deux grilles supports 9 En resserrant les vis 4, qui sont supportées par les plaques 1 et 2, le cas échéant au moyen de ressorts non représentés, il est possible de créer une force de serrage qui exerce une pression définie sur la cryo-coupe 10 entre les grilles support 9 Il est possible de resserrer ces vis 4 tandis que le dispositif est encore à l'intérieur de la chambre froide de l'ultramicrotome ou, en variante, une fois qu'il a été enlevé de cette chambre Il est maintenant possible d'introduire le dispositif, avec la cryo-coupe, dans la chambre de lyophilisation sans élévation nuisible de la température La cryo-coupe, à l'état pressé à l'intérieur du dispositif, est lyophilisée dans la chambre de lyophili- sation et réchauffée à la température ambiante selon une courbe définie température/temps dont les détails bien connus de l'homme de métier ne seront pas donnés ici A la suite de l'opération de lyophilisation, le dispositif est réouvert en relevant la plaque couvercle 2 de la plaque de base 1 et la plaque de maintien 7 dont la grille support 9 q porte La coupe 10 est enlevée duit dispositif. Du fait que, comme on l'a indiqué pluis haut, la plaque de maintien 7 correspond, en ce qui concerne tes formes et ses dimensions, au dispositif de maintien de specimen du microscope électronique d'une manière qui permet de la fixer directement dans ce support, il n'est pas besoin d'enlever la cryo-coupe 10 des grilles de support 9 Au contraire, la plaque de maintien 7 est elle-même transférée directement sur le dispositif de maintien de specimen du microscope électronique. A la suite de cette opération, on constate que, pratiquement dans tous les cas, la cryo-coupe 10 est plate du fait que l'opération de lyophilisation a été effectuée tandis que la cryo-coupe était à l'état pressé La possibilité d'effets nuisibles résultant de la déformation du fond, ou de l'obstruction du rayonnement X par des parties de la préparation qui se sont bombées, est ainsi évitée. Le procédé de manipulation décrit ci-dessus montre que le dispositif selon l'invention est un dispositif multi-fonctionnel qui transfère, comprime et maintient la cryo-coupe D'un côté, le dispositif possède des dimensions qui permettent sa mise en place à l'intérieur de la chambre froide de l'ultramicrotome, au voisinage du couteau, de manière à recevoir la cryo- coupe tombant dudit couteau D'un autre côté, ses dimensions sont telles qu'il peut être directement manipulé à la main et sans soin particulier. Dans la forme d'exécution représentée, les plaques de maintien 7 sont introduites dans des évidements corres- pondant 5, o des plaques 1, 2 d'une manière telle qu'un élément de pression 11 ou 12 se projette à partir du fond de l'évidement correspondant dans l'ouverture conique 8 La hauteur de cet élément de pression 11, 12 est choisie de telle sorte que sa surface supérieure porte directement contre la surface inférieure de la grille support 9 Durant l'opération de pressage, chacune des deux grilles support 9 est, en conséquence, supportée contre l'élément de pression associé de sorte qu'une pression définie est exercée sur la cryo-coupe 10 emprisonnée entre elles Dans la forme d'exécution représentée, les éléments de pression 11, 12 sont pressés fixement dans les plaques associées 1, 2. Cependant, au lieu de ces éléments 11, 12, on pourrait utiliser des vis de règlage Les vis de règlage pourraient être manoeuvrées de l'extérieur permettant ainsi d'effectuer un règlage. La figure 4 montre la disposition d'une plaque de maintien 7 dans le microscope électronique Au cours d'une analyse aux rayons X dans le microscope électronique, il se produit des ombres par suite de la disposition latérales du détecteur de rayons X et du dispositif spécial 13 de maintien de la grille support, ce dispositif, qui est nécessaire jusqu'à présent, étant représenté comme il- lustration de la technique antérieure en trait tiretés Par suite de cette formation d'ombres, il a été nécessaire jusqu'à présent de décaler le dispositif pour maintenir la cryo-coupe selon un angle qui correspond à la ligne brisée 14 Selon l'invention, le dispositif 13 de maintien de la grille support devient inutile Grâce à cela, l'angle de décalage qui est nécessaire pour obtenir un signal convena- ble s'avère considérablement plus petit et correspond à la ligne brisée 15. Les figures 5 et 6 montrent des formes d'exécution modifiées du dispositif selon l'invention dans lequel la charnière 3, entre les plaques 1 et 2, est supprimée, la plaque couvercle 2 ' étant montée coulissante sur la surface externe de la plaque de base 1 ' (figure 5) ou, en variante, au moyen d'une liaison à goupilles et trous, dans laquelle des goupilles de positionnement 16 pénètrent dans des trous de positionnement 17 pendant le mouvement de fermeture Le guidage positif des plaques l'une vers l'autre élimine tout mouvement relatif excessif parallèle de la grille support 9 pendant l'opération de pressage, un tel mouvement étant susceptible d'endommagenr la cryo-coupe 10 portée par la grille support. Le dispositif selon la présente invention présente, en conséquence, non seulement l'avantage de permettre l'accom- plissement de la préparation de cryo-coupes pour examen au microscope électronique simplement et sans qu'il soit-besoin d'y apporter un soin excessif mais également permet d'augmenter considérablement le nombre de cryo-coupes pouvant être utilisées pour l'examen du fait qu'il n'y a pas de danger que les grilles support délicates soient endomma- gées ou contaminées et que le réchauffement des cryo-coupes à la température ambiante peut se faire de manière contrôlée pendant l'opération de lyophilisation depuis une température qui est par exemple de -1200 C Cela est effectué, par exemple, en montant la plaque de base 1 sur des pointes qui réduisent au minimum le contact thermique avec le support et empêchent que des changements gênants se produisent dans les cryo-coupes par suite d'un réchauffage excessivement rapide. Au lieu de moyens de serrage directement mis en place sur les plaques 1 et 2, et qui génèrent la pression de contact sur la cryo-coupe 10, il est également possible d'insérer les plaques 1 et 2, en particulier celles selon les figures 5 et 6, dans un dispositif de serrage séparé et de les presser l'une contre l'autre. il REVENDICATIONS 1 Dispositif pour la manipulation de coupes minces comprenant une grille support adaptée à recevoir une coupe mince et un dispositif de maintien pour ladite grille support, caractérisé en ce que ledit dispositif de maintien comprend une plaque de base ( 1), une plaque couvercle guidée ( 2) qui peut être amenée sur ladite plaque de base ( 1), et des moyens ( 4) pour serrer ladite plaque couvercle ( 2) contre ladite plaque de base ( 1), donc contre une coupe mince ( 10) présente sur ladite grille support ( 9). 2 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit dispositif de maintien comprend, en outre, une plaque de maintien ( 7) logée de manière amovible dans un évidement ( 5) prévu dans ladite plaque de base ( 1), ladite grille support ( 9) étant fixée à demeure à ladite plaque de maintien ( 7). 3 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit dispositif de maintien comprend, en outre, une première plaque de maintien ( 7) logée de manière amovible dans un évidement ( 5) prévu dans ladite plaque de base ( 1), ladite grille support ( 9) étant fixée à demeure à ladite première plaque de maintien ( 7), et une seconde plaque de maintien ( 7) à laquelle est fixée, à demeure, une seconde grille support ( 9), ladite seconde plaque de maintien ( 7) étant disposée dans ladite plaque couvercle ( 2) de manière telle que, lorsque ledit dispositif de maintien est à l'état fermé, la coupe mince ( 10) est maintenue entre lesdites première et seconde grilles supports ( 9). 4 Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite grille support ( 9) est fixée au-dessus d'une ouverture ( 8) qui s'étend au travers de ladite plaque de maintien ( 7), et en ce qu'un élément de pression ( 11) est disposé dans l'évidement ( 5) de ladite plaque de base ( 1), ledit élément de pression ( 11) se projetant dans ladite ouverture ( 8) et étant en contact avec la surface inférieure de ladite grille support ( 9). Dispositif selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'élément de pression ( 11) comprend des moyens de réglage permettant de régler la hauteur dudit élément de pression ( 11) par rapport à ladite plaque de base ( 1). 6 Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite plaque de maintien ( 7) est dimensionnée et disposée de manière à pouvoir être reçue dans le dispositif récepteur d'échantillon d'un microscope électronique. 7 Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite plaque de maintien -( 7) est en graphite de grande pureté. 8 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une charnière ( 3) réunissant ensemble ladite plaque de base ( 1) et ladite plaque couvercle ( 2). 9 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, des moyens de guidage pour permettre le guidage coulissant de ladite plaque ( 1) par rapport à ladite plaque couvercle ( 2). Procédé de lyophilisation de coupes minces, caractérisé en ce qu'il consiste à produire une coupe mince à l'aide d'un ultramicrotome, à transférer ladite coupe sur une grille support ( 9), à presser à plat ladite coupe, à la transférer avec la grille support ( 9) dans une chambre de lyophilisation et à lyophiliser ladite coupe dans ladite chambre. 11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste, en outre, à réchauffer ladite coupe lyophilisée.