Brevet FR2523976A1 — publié le 19830930

La présente invention concerne un nouveau produit consistant en une protéine Elle est également relative à un procédé permettantl'isolement d'une telle protéine L'inven- tion a encore pour objet l'application de ce nouveau produit comme médicament, en particulier immunorégulateur et antial- lergique Sous l'un de ses aspects, l'invention appartient donc au domaine de l'immunologie ainsi que de l'allergie. On sait que les manifestations allergiques sont très fréquentes et qu'elles sont dues à un grand nombre de facteurs Les maladies allergiques sont tenaces, en raison même de la présence constante ou occasionnelle des facteurs déclenchant les réactions allergiques Il est donc souhaita- ble d'augmenter les réponses immunitaires de l'organisme pour lui permettre de mieux résister aux agressions extérieures et notamment aux facteurs responsables des réactions allergiques. Parmi les causes d'allergie, on cite souvent des pollens des plantes L'homme de l'art pourra à cet égard se repporter à l'article très documenté de Raymonde BARREAU et Jean-René MALLET dans "Journal de Médecine de Bordeaux",1958, 135,1379-1389 Cette référence bibliographique rappelle tout d'abord l'importance sociale des affections allergiques, en particulier celles qui sont dues au pollen Il existe de nom- breuses plantes dont les floraisons accompagnées de produc- tion de pollen, provoquent des réactions allergiques pendant des périodes relativement longues de l'année L'article en question ainsi que les publications mentionnées à la fin de celui-ci sont introduits à titre de référence dans la présen- te description. La présente invention a pour objet une protéine possédant des propriétés immunologiques particulières Cette protéine est utile dans le domaine de la lutte contre les affections et manifestations allergiques. Ainsi l'invention concerne un nouveau produit con- sistant en une protéine ayant un poids moléculaire de 14 000 environ et un point isoélectrique de 4,6 environ, son spec- tre d'absorption présentant une absorption de ú = 0,12 uni- tés de densité optique D O à 280 nm pour une solution aqueu- 2 2523976 se de 1 mg (poids sec) par ml d'eau. L'invention a également pour objet un procédé permettant d'isoler ladite protéine à partir du poller d'u- ne graminée, le dactyle. Ainsi l'invention a encore pour objet un procédé pour l'obtention d'un nouveau produit protéique caractérisé en ce qu'on met en contact du pollen de dactyle ou Dactylis glomerata avec un milieu aqueux, en ce qu'on recueille le surnageant, en ce qu'on soumet la fraction extraite soluble a un traitement de fractionnement et en ce qu'on isole la protéine ayant une masse molaire de 14 000 g environ (poids moléculaire: 14000 daltons) et un point isoélectrique de 4,6 environ. Le matériel végétal de départ dans le procédé de l'invention est une graminée dénommée Dactylis glomerata Le pollen de cette plante est mis en contact avec un milieu a- queux de manière à fournir une fraction soluble Le mode de réalisation le plus simple consiste à placer le pollen dans de l'eau et à laisser incuber jusqu'à ce que la frac- tion soluble soit extraite On peut travailler avantageuse- ment à la température ambiante La durée d'incubation dé- pend du volume du milieu réactionnel mis en oeuvre Dans la pratique, à température ambiante, des durées d'incubation de l'ordre de une heure se sont avérées convenables Les quan- tités relatives du milieu aqueux, en particulier d'eau dis- tillée et de pollen de dactyle peuvent varier dans de larges limites Le poids de pollen proportionnellement au volume d'eau peut être de 10 à 200 parties en poids, par exemple de l'ordre de 100 parties en poids, par volume d'eau. Une fois l'incubation terminée, on sépare le sur- nageant des parties solides encore présentes dans le milieu réactionnel et l'on procède alors au fractionnement de la fraction soluble, de manière à isoler la protéine ayant les caractéristiques définies précédemment. Pour la caractérisation de la nouvelle protéine, on peut faire appel à la technique d'isoélectrofocalisa- tion préparative décrite par RADOLA, B J ( 1973) Biochim. Biophys Acta, 295, 412-428 Cette technique est connue de l'homme de l'art qui pourra, si nécessaire, se repor- ter à cette dernière référence bibliographique pour en con- naltre les détails d'exécution La technique de fraction- nement en question permet, en faisant varier le p H, de re- cueillir les fractions purifiées en couche mince de gel gra- nuleux (Sephadex ou Biorad, par exemple) Lorsqu'on traite la fraction soluble extraite du pollen de dactyle, par la technique en cause, on constate la présence de plus de 60 bandes entre les p H 3,8 et 9 La protéine selon l'invention est séparée à p H 4,6. En variante, on peut isoler la nouvelle protéine par la technique dite de chromatofocalisation, telle que décrite par exemple dans le fascicule dénommé "Chromato- focusing" distribué par Pharmacia Fine Chemicals AB Box 175 Uppsala Suède; voir également "Chromatofoeusing: isoélec- tric focusing on ion exchange columns page 17-44 3 Chroma- togr 150 ( 1978). La protéine de l'invention possède des propriétés immunologiques particulières grace à son activité immunoré- gulatrice En effet, au lieu d'induire la synthèse d'Ig E et d'Ig G homocytotropes (pour la définition de cette expres- sion, voir par exemple page 1010 de l'ouvrage Immunologie de Paul Bordet ( 1972) Edit Flammarion), immunoglobulines spé- cifiques de la réponse allergénique, elle inhibe fortement la synthèse de cette classe d'immunoglobulines et ne dimi- nue que peu celle des Ig A, Ig M et autres Ig G Les études réalisées ont montré notamment que la nouvelle protéine était capable d'inhiber la synthèse d'Ig E et d'Ig G homocy- totropes après sensibilisation d'un organisme receveur au pollen du dactyle -Ces résultats démontrent l'activité spé- cifique de la protéine immunorégulatrice selon l'invention. La protéine selon l'invention est donc utile com- me médicament des maladies allergiques en particulier des pollinoses Ainsi l'invention concerne un médicament con- tenant, à titre d'agent actif, la protéine ci-dessus défi- nie Plus particulièrement, l'invention concerne un médica- ment immunorégulateur de même qu'un médicament antialler- gique contenant, à titre d'agent actif, ladite protéine. L'invention a également pour objet des composi- tions pharmaceutiques contenant une quantité efficace de la nouvelle protéine en association avec un véhicule phar- maceutiquement acceptable et convenant à l'administration considérée En vue de l'administration, diverses voies sont possibles, notamment la voie orale, parentérale par inhalation ou encore par injection Il va sans dire que les véhicules devront être choisis différemment dans chacune de ces voies Les formes galéniques peuvent être déterminées aisément par l'homme de l'art en fonction du mode d'admi- nistration choisi. La nouvelle protéine de l'invention est très so- luble dans l'eau On dissout facilement 5 mg de protéine dans 1 ml d'eau Elle se prête à la lyophilisation La pou- dre lyophilisée conserve l'intégralité des propriétés de la poudre ordinaire. L'homme de l'art comprendra donc que le produit de l'invention peut être utilisé dans des compositions phar- maceutiques très variées Sans que les indications ci-après aient un caractère limitatif, on peut présenter les compo- sitions sous forme de solutés injectables Le produit peut aussi être présent sous forme de poudre sèche ou lyophili- sée par exemple pour les préparations aptes à l'inhalation, notamment sous forme d'aérosol Le produit solide peut aus- si être adsorbé sur un adjuvant et être ainsi utilisé en injection On peut aussi prévoir des compositions à base aqueuse ou huileuse pour des administrations par instilla- tion nasale ou orale, ou par inhalation D'autres formes galléniques traditionnelles pour l'administration orale peu- vent également convenir, telles que gélules, capsules, com- primés et autres formes analogues. Les propriétés thérapeutiques de la nouvelle pro- téine s'exercent à des doses faibles et l'on a constaté au- cun effet secondaire indésirable. On notera que pour les applications envisagées, la protéine de l'invention possède un ensemble de proprié- tés très avantageuses Elle est issue du fractionnement d'un produit d'origine anturelle le pollen d'une graminée. Elle est active à faible dose Sa toxicité est inexistante dans les conditions normales d'application Ainsi, injec- tée à la dose de 100 g/souris soit 50 mg/kg de poids chez l'homme, on n'a trouvé aucune toxicité, alors que la dose la plus efficace se situe à des valeurs 1000 fois in- férieures ( 0,1 + g au lieu de 100 "> 9 g chez la souris) Cet- te dernière propriété est très importante, car on connaît les dangers d'une utilisation d'allergènes non modifiés, par exemple d'un extrait total de pollen Des accidents très sérieux, voire mortels, ont eu lieu dans le passé, lorsque de tels produits ont été injectés à des sujets souf- frant d'allergie dans le cadre d'un traitement de désen- sibilisation. Il est intéressant également que la protéine exerce un effet sélectif dans l'inhibition des anticorps formés lors des réactions allergiques Le domaine préféré d'utilisation est celui de la lutte contre les réactions allergiques provoquées par les pollens de graminées. Chez l'homme adulte une posologie convenable pour le traitement des pollinoses peut s'étendre de 0,05 mg à 5 mg, de préférence être de l'ordre de 0,5 mg, à prendre en une seule injection. Par voie orale, des doses jusqu'à 10 mg sont possibles;Par voie locale les doses admissibles peuvent aller jusqu'à 100 mg. L'invention sera maintenant illustrée sans être aucunement limitée par la description ci-après qui donne un exemple d'isolement de la nouvelle protéine à partir du pollen de dactyle ainsi que les résultats de certaines é- tudes de pharmacologie. EXEMPLE On utilise le pollen provenant de la graminée Dactylis glomerata On incube 50 Mg de ce pollen dans 0,5 6 2523976 ml d'eau distillée pendant une heure à température ambian- te On sépare le surnageant et l'on fractionne les consti- tuants de la fraction soluble de pollen par la technique d'isoélectrofocalisation préparative (voir article de RADOLA précité) Par cette technique, entre les p H 3,8 et 9, la fraction soluble du pollen se sépare en plus de 60 bandes On récupère la bande dont la masse molaire est de 14000 g (poids moléculaire 14000 daltons) et le point iso- électrique de 4,6 Les résultats du fractionnement sont illustrés à la figure 1 qui est un diagramme dans lequel on a porté en abscisses les valeurs du p H et en ordonnées les produits fractionnés La protéine selon l'invention est isolée à p H 4,6. La partie caractéristique du spectre d'absorp- tion de la nouvelle protéine présente une absorption ú de 0,12 unités de D O à 280 nm pour une solution aqueuse de 1 mg (poids sec) par ml d'eau. Dans une première série d'essais on a évalué la réponse antipollen sur des animaux de laboratoire Ceux-ci sont des souris femelles Balb/c Cette souche a été choi- sie parce qu'elle est une bonne répondeuse en Ig E Pour me- surer la quantité d'anticorps de type Ig E, on a utilisé le test d'anaphylaxie cutanée passive, en abréviation PCA dé- crit par OVARY, Z, STEVEN, S, CAIAZZA and SOMEI KOPINA ( 1975) Int Archs Allergy Appln Imm, 48, 16-21 Pour le dosage des anticorps de type Ig M, Ig G, Ig A on a utilisé la technique communément dénommée test ELISA, abréviation de l'expression anglaise "Enzyme Linked Immunosorbent Assay", qui est notamment décrit dans l'article de ENGVALL, E and PERLMANN, P ( 1971) Immunochemistry, 8,871 Dans ce qui suit et par commodité, on désignera ces méthodes de mesure par leurs abréviations respectives PCA et ELISA. De même la fraction soluble totale de pollen de dactyle est désignée par l'abréviation FS on a appré- cié la réponse immunitaire de type Ig E mesurée par PCA et de type non Ig E mesurée par ELISA obtenue par deux injec- tions par voie intrapéritonéale et à 21 jours d'intervalle de O 1 fg de FS absorbés sur 1 mg de Al PO 4 Ce protocole d'immunisation s'est révélé optimal pour l'induction d'Ig E antipollen de dactyle Après les injections de FS aux jours O et 21, on a injecté la protéine (P) de l'invention au jour 28 Le tableau I se trouvant en fin de description rassemble les résultats obtenus Le sous-tableau la con- cerne l'inhibition de la réponse antipollen de type Ig E, le sous-tableau lb est relatif à l'inhibition de la répon- m se antipollen de type Eg G 1 homocytotropes, et le sous- tableau lc illustre la réponse antipollen de type Ig A, Ig M et autres Ig G. Dans le sous-tableau la, plus le titre révélé par PCA est élevé, plus la concentration d'anticorps Ig E anti-FS de pollen de dactyle est élevée On voit que la protéine (P) à des doses de 1 /Lg/souris et 0,1 Wkg/souris inhibe la concentration d'Ig E anti-FS de pollen de dac- tyle. Dans les sous-tableaux lb et lc, plus le titre d'Ig mesuré par ELISA est élevé, plus la concentration d'anticorps de la classe considérée est élevée On voit que la protéine (P) à des doses de l Mg/souris et O,l g/ souris inhibe le taux d'Ig Gl, anticorps homocytotropes (sous tableau lb) mais pas de façon significative le taux des an- ticorps de classes Ig A, Ig M et les autres Ig G (voir sous- tableau le). Ainsi, les résultats du tableau 1 montrent que l'injection de la protéine (P) en présence d'Al P 04 à des souris ayant reçu 2 injections de FS à 10 "g induit une inhibition aussi bien de la réponse Ig E que de la réponse Ig G homocytotrope ainti-FS De plus, il n'y a pas d'inhi- bition significative des autres classes d'immunoglobulines. On constate aussi que la protéine de l'invention est effi- cace à des doses faibles. On a également trouvé que la protéine (P) n'in- duit aucune réponse anticorps aux doses allant de O,01)Lg à 100,Lg par souris même après deux injections de rappel. On constate donc que la protéine de l'invention est exempte d'effet secondaire indésirable dans de telles conditions d'utilisation. Dans une deuxième série d'essais, on a éva- lué l'absence d'inhibition réalisée par la protéine de l'invention de la réaction allergique provoquée par une injection d'ovalbumine Les animaux d'essais étaient du même type que ceux utilisés dans la première série L'oval- bumine a été injectée à raison de 1 "pg par souris au jour 0 La protéine (P) a été injectée le 15 ème jour Les ré- sultats obtenus sont rassemblés dans le tableau II qui suit. TABLEAU I INHIBITION DE LA PRODUCTION D'IGE ANTI-POLLEN DE DACTYLE et D'Ig G, A ET M ANTI-POLLEN DE DACTYLE PAR LA PROTEINE (P) DE L'INVENTION la Inhibition de la réponse anti-pollen de type Ig E par PCA chez la souris (P) t I I I I I 42 49 56 FS ,lu/souris Test PCA après injection de (P) 1 Ig/s 0,1}g/s 0,01 >g/s o) ig/s FS fkg/souris o lb Inhibition de la réponse anti-pollen du type Ig G 1 par ELISA (résultats exprimés en D O à 405 nm (P) l I I I I I I I II o 7 14 21 28 35 42 49 56 63 Test ELISA après injection de (P) 1 14 g/souris 0,23 0,075 0,105 0,11 0,06 0,07 0,1 &g/souris 0,23 0,1 0,15 0,18 0,08 0,1 0,01 Jg/souris 0,23 0,12 0,21 0,32 0,22 0,25 O À g/souris 0,23 0,25 0,25 0,27 0,21 0,24 r'O _.4 "o TABLEAU I (suite) INHIBITION DE LA PRODUCTION D'Ig E ANTI-POLLEN DE DACTYLE ET D'Ig E, A ET M ANTI-POLLEN DE DACTYLE PAR LA PROTEINE (P) DE L'INVENTION le Réponse anti-pollen de type Ig A, Ig M et autres Ig G (P) I I I I I1 I, I l I, I 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 FS FS g/souris 10 g/souris o Test ELISA après injection de (P) 1 g/s O 0,15 0, 47 0,47 0,35 0,41 0,39 0,33 0,1 g/s O 0,15 0,47 0,48 0,37 0,42 0,33 0,27 0,01 g/s O 0,15 0,47 0,49 0,35 0,40 0,33 0,32 O g/s O 0,15 0,47 0,43 0,46 0,40 0,41 0,31 t'o o ot il TABLEAU II -(p) 2 1 jours I TI - OVA 1 /ig/souris dans Al P 04 (P) 1 pg/souris 30 270 270 (P) 0,1 ug/s 30 270 270 iiiu,i,,,=i,i O (témoin) Dans la présente description, on a dénommé "protéi- ne", le produit de l'invention, ceci dans un but de simpli- fication Cependant le nouveau produit contient à la fois des acides aminés et des sucres et il constitue donc une glycopro- téine. REVENDICATIONS 1 Nouveau produit consistant en une protéine ayant un poids moléculaire de 14 000 daltons environ et un point isoélectrique de 4,6 environ, son spectre d'ab- sorption présentant une absorption de ú = 0,12 unités de densité optique D O à 280 nm pour une solution aqueuse de 1 mg (poids sec) par ml d'eau. 2.Procédé pour l'obtention d'unnouveau produit protéique caractérisé en ce qu'on met en contact du pol- O 10 len de dactyle ou Dactylis glomerata avec un milieu aqueux, en ce qu'on recueille le surnageant, en ce qu'on soumet la fraction extraite soluble à un traitement de fractionnement et en ce qu'on isole la protéine ayant un poids moléculaire de 14 000 daltons environ et un point isoélectrique de 4,6 environ. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on incube le pollen de dactyle dans l'eau distil- lée. 4 Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce qu'onopére à la temperature ambiante ou à son voisinage. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 2 à 4, caractérisé en ce qu'on réalise le fraction- nement de la fraction soluble (F S) par la technique d'i- soélectrofocalisation ou de chromatofocalisation prépara- tive. 6 Médicament contenant à titre d'agent actif, la protéine selon la revendication 1 ou le produit protéi- que obtenu par le procédé selon l'une quelconque des re- vendications 2 à 5. 7 Médicament immunorégulateur selon la reven- dication 6. 8 Médicament antiallergique selon la revendica- tion 6. 9 Médicament selon l'une quelconque des reven- dications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il induit l'inhibi- tion de la synthèse des Ig E et Ig G homocytotropes. Composition pharmaceutique contenant une quan- tité efficace de la protéine selon la revendication 1 ou du produit protéique obtenu par le procédé selon l'une quel- conque des revendications 2 à 5, en association avec un vé- hicule pharmaceutiquement acceptable adapté à l'administra- tion orale, parentérale, par injection ou par inhalation.