Brevet FR2529571A1 — publié le 19840106

La présente invention concerne des procédés enzy- matiques pour transformer le glucose (dextrose) en fructose (lévu- lose). La majeure partie du glucose de qualité alimen- taire est fournie sous forme d'hydrolysat enzymatique de l'amidon de mais, c'est-5-dire du sirop (liqueur de trempage) de maïs du commerce Le glucose est généralement noté comme ayant un caractère sucré de 60 à 80 % de celui du saccharose et se vend donc à un prix plus faible correspondant On sait depuis longtemps isomériser le glucose en fructose (qui est même plus sucré que le saccharose) en utilisant une enzyme douée d'activité de glucoseisomérase, de pré- férence une enzyme qui a été immobilisée sur un support inerte tel que diéthylaminoéthylcellulose, verre poreux ou chitine On pourra trouver des descriptions détaillées de la conversion enzymatique du glucose en fructose utilisant la glucoseisomérase dans Hamilton et coll. "Glucose Isomerase a Case Study of Enzyme-Catalysed Process Technology", Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson et coll, Plenum Press, New York ( 1974), pages 94-106, 112, 115-137; Antrim et coll, "Glucose Isomerase Production of High-Fructose Syrups", Applied Biochemistry and Bioengineering, vol 2 Academic Press ( 1979); Chen et coll, "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem ( 1980), pages 3035; Chen et coll "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem, ( 1980), pages 36-41; Nordahl et coll, "Fructose Manufacture from Glucose by Immobiled Glucose Isomerase", Chem Abstracts, vol 82 ( 1975), Abs No 110316 h; et Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem Abstracts, Vol 82, ( 1975), Abs No 110316 h; et Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem Abstracós Vol 81: ( 1974), Abs No 76474 a. ll existe en outre de nombreux brevets concernant l'isomérisation du glucose; on citera à titre d'exemples les brevets des Etats-Unis d'Amérique N O 3 616 221; Reissue 28 885 (initialement 3 623 953); 3 694 314; 3 708 397; 3 715 276; 3 788 945; 3 826 714; 3 843 442; 3 909 354; 3 960663; 4144 127 et 4 308 349. Les teneurs en fructose que l'on peut obtenir par 'l'isomérisation du glucose avec la glucoseisomérase sont limitées par l'équilibre de la réaction d'isomérisation A 650 C, l'équilibre de réaction s'établit à environ 51 % en poids de fructose à partir d'un substrat de départ de dextrose pur Lorsqu'on utilise une liqueur de glucose raffinée comme substrat (contenant jusqu'à environ 6 % en poids de sucres qui ne sont pas des monosaccharides) et en tenant compte d'une durée de séjour raisonnable dans le réacteur enzymatique, la teneur en fructose la plus élevée que l'on peut obtenir (exprimée en poids de matière sèche) avec les techniques antérieures mentionnées est celle d'un sirop à 48-52 % Pour obtenir des sirops à teneur plus élevée en fructose, on doit utiliser des systèmes de fractionnement qui augmentent fortement le prix de revient du produit final A des températures supérieures, cependant, l'équilibre devient plus favorable Par exemple, un procédé enzy- matique à la glucoseisomérase pouvant fonctionner à des tem- pératures d'environ 90-140 'C a pu être utilisé pour donner directe- ment des sirops de mais à teneur élevée en fructose (HFCS) conte- nant 53-60 % en poids de fructose, en matière sèche, ce qui élimine la nécessité d'un fractionnement et d'un recyclage La tendance des systèmes connus à la glucoseisomérase à subir une dénaturation thermique s'accompagnant d'une forte réduction d'activité a donc jusqu'à présent fait échouer les tentatives d'utiliser des régimes à température plus élevée pour déplacer davantage l'équilibre de l'isomérisation en faveur du fructose De plus, le glucose et spé- cialement le fructose sont des sucres réducteurs sensibles qui ont une tendance nette à former des sous-produits indésirables, tels que le psicose, des produits colorés, des précurseurs de produits colorés, des dianhydrides de fructose, du mannose, du tagatose, et des acides, lorsqu'on les chauffe aux températures nécessaires pour l'isomérisation selon l'invention. La demanderesse a maintenant découvert de façon surprenante qu'en mettant en oeuvre une technique d'isomérisation du glucose dans certaines limites essentielles de p H et de temps de séjour dans un réacteur enzymatique, telles que définies ci-après, on peut utiliser effectivement des températures d'isomération d'en- viron 90 à environ 1400 C pour donner directement des sirops HFCS de qualité élevée (c'est-à-dire avec une formation de sous-produits acceptable) contenant d'environ 52 à environ 60 %-en poids de fructose, éliminant ainsi la nécessité d'opérations coûteuses et complexes de fractionnement et de recyclage qui sont nécessaires avec les procédés connus d'isomérisation du glucose pour obtenir la gamme ci-dessus de teneurs en fructose. Selon l'inventions le glucose est isomérisé en fructose par le procédé qui consiste à mettre en contact une liqueur contenant du glucose avec la glucoseisomérase chimiquement stabi- lisée à une température d'environ 90 'C à environ 140 'C et à un p H d'environ 3 à environ 8 pendant une durée de contact suffisante pour obtenir une teneur finale dans ladite liqueur d'au moins envi- ron 53 à environ 60 % en poids de fructose, par rapport à la teneur totale en hydrates de carbone, sans formation notable de psicose et/ou de sucres n'appartenant pas aux séries du fructose et du glucose. Le glucose qui est isomérisé en fructose selon l'invention peut dériver de n'importe quelles sources connues de ce sucre Pour des raisons d'économie le glucose dérive ordinairement dû l'hydrolyse de la cellulose ou de l'amidon utilisant un acide et/ou une enzyme, de préférence cette dernière, selon des techniques connues Les liqueurs contenant du glucose obtenues de cette manière contiennent de manière caractéristique de faibles quantités de poly- saccharides, de sucres oligomères, etc, selon la source d'hydrate de carbone utilisée et la méthode d'hydrolyse employée Des graines de céréales, telles que mars, milo, blé, seigle, et analogues et des racines et tubercules amylacées telles que pommes de terre, igname, carottes, cassave (manioc) et analogues sont d'excellentes sources d'amidon pour la conversion en glucose de départ de l'invention. Aux Etats-Unis d'Amérique, l'amidon de mais est spécialement oréféré en raison de son prix relativement faible et de sa facilité d'obten- tion Comme la production de glucose de qualité alimentaire favorise l'utilisation de techniques d'hydrolyse enzymatique de l'amidon, ces techniques sont préférées dans l'invention Des méthodes d'hydro- lyse enzymatiques sont décrites dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N O 4 017 363, 3 912 590, 3 922 196, 3 922 197-201 et 4 284 722, dont les descriptions sont incorporées à titre de référence dans la présente description - La glucoseisomérase utilisée dans l'invention comme source d'enzyme pour la stabilisation chimique peut être isolée à partir de n'importe lequel des micro-organismes connus producteurs de glucoseisomérase, tels que Streptomyces flavovirens, Streptomyces achromogenes, Stre Dtomyces Sehinatut ryce albul S, Streptormyces wedmorensis, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomvces venezuelae, Aerebacter aero Aenes Aerobacter cloacae Bscillus coa 2 ulans, Bacillus megaterium, Bacillus fructosus, Brevitacterium pentaamino- acidicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroiîdes et Paracolobactrum aerogenoides En outre, on peut utiliser les glucose- isomérases fabriqués par les genres Nocardia Micromonospora, Microbispora, Microellobospora et Arthrobacter Une excellente scurce de glucoseisomérase à utiliser dans le procédé de l'inven- tion est Streptomyces sp ATCC 21 175 Comme indiqué précédemment, il peut être avantageux d'utiliser une glucoseisomérase stable aux températures d'isomérisation relativement élevées utilisées dans l'invention, par exemple la glucoseisomérase produite par Bacillus stearothermophilus, en particulier les souches choisies parmi Bacillus stearothermophilus ATCC 21 365, NRRL B-3680, NRRL B-3681 et NRRL B-3682 comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 826 714; la glucoseisomérase produite par un micro-organisme du genre Ampullariella, tel qu'Ampullariella digitata, Ampullariella lobata, Ampullariella campanulata et Ampullariella regularis (brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 308 349); la glucoseisomérase pro- duite par Bacillus licheniformis (demande de brevet européen 41213); et la glucoseisomérase produite par les thermophiles des genres décrits dans la publication de brevet japonais 74/30588. Outre les micro-organismes ci-dessus mentionnés, l'invention concerne l'utilisation de leurs mutants et variants ainsi que les micro-organismes transformés génétiquement qui en dérivent par introduction dans les micro-organismes de gènes à muta- tion glucoseisomérase, y compris les micro-organismes mésophiles et thermophiles Les gènes à mutation glucoseisemérase choisis pour cette utilisation sont ceux qui donnent une glucoseisomérase qui est stable à températures élevées, spécialement à environ 90 C et de préférence jusqu'à environ 140 C Ces gènes peuvent atre préparés par les techniques habituelles utilisées pour la mutation de micro- organismes comme les techniques d'irradiation ou aux mutagènes chi- miques On peut également produire la mutation in vitro de gènes de glucoseisomérase isolés qui produisent une glucoseisomérase de stabilité thermique moyenne, comme celle produite, par exemple, par certaines souches de Streptomyces Le choix des gènes mutés appro- priés s'effectue par réintroduction du gène muté soit dans l'orga- nisme père, soit dans un autre organisme, suivie de croissance et reproduction de l'organisme et détermination de la stabilité ther- mique de la glucoseisomérase résultante. On considère également que l'on peut utiliser des techniques à l'ADN recombinant pour donner une glucoseisomérase de stabilité thermique améliorée convenant pour la stabilisation chi- mique et l'utilisation dans l'invention Argos et coll (Biochemistry 18 ( 25),5698-5703 ( 1979)) indiquent que l'on trouve dans les enzymes correspondantes d'organismes thermophiles certaines remplacements de restes alanyles par des restes glycyles, séryles, valyles et lysyles Perutz (Science 201, 1187-91 ( 1978)) indique que les enzymes de bactéries thermophiles doivent leur stabilité supérieure pour la plupart à des ponts salins supplémentaires à la surface de la protéine Zuber (dans "Biochemistry of Thermophily", Friedman, S.M, ed, pages 267-285, Academic Press, New York,1978) donne des renseignements supplémentaires sur la structure d'enzymes thermo- stables Ainsi donc, si l'on connaît l'enchaînement d'aminoacides et la structure tridimensionnelle (tertiaire) d'une glucoseisomérase, il est possible d'obtenir une stabilité améliorée au moyen de muta- tions spécifiques du site dans le gêne d'isomérase pour donner des enzymes conçues et fabriquées de manière à contenir des quantités accrues des aminoacides qui donnent des structures plus stables. Après avoir déterminé l'enchaînement d'ADN de la glucoseisomérase, on peut utiliser un agent de synthèse des gènes pour produire de nouveaux enchaînements, augmentant ainsi la thermostabilité de la glucoseisomérase produite par ces gènes fabriqués par l'homme On considère que ces enzymes fabriquées seraient spécialement intéres- santes pour la mise en oeuvre de l'invention. Comme la glucoseisomérase est produite par voie intra- cellulaire par ces micro-organismes et par d'autres on peut fournir une source de glucoseisomérase en récoltant simplement les cellules et l'enzyme peut être séparée des cellules par des techniques connues de l'homme de l'art, par exemple autolyse des cellules, broyage par ultrasons et l'utiliser dans un réacteur enzymatique de conception connue et classique De préférence, la glucoseisomérase chimiquement stabilisée peut être immobilisée sur un support inerte selon des techniques connues et classiques si elle n'est pas insolubilisée par suite de la stabilisation chimique Des matériaux et modes opératoires utilisés pour l'immobilisation d'enzymes sont bien connus et décrits dans un certain nombre de publications, par exemple: Wang et coll, Fermentation i Enzyme Technology, John Wiley k Sons, Inc, New York ( 1979), pages 318-338,et Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3 e édition, John Wiley b Sons, Inc, New York ( 1980) volume 9, pages 148-172, dont les descriptions sont incorporées ici à titre de référence La présence de faibles quantités de'cations cobalt, manganèse et magnésium et/ou d'un sel hydrosoluble de l'acide sulfureux, tel que sulfite de sodium, bisulfite de sodium, sulfite de magnésium, et/ou bisulfite de magnésium, telle qu'elle est préco- nisée dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique Reissue n 28 885, pour réduire ou inhiber la dénaturation de la glucoseisomérase pen- dant la mise en oeuvre du procédé, est également considérée dans l'invention. Il est nécessaire que la concentrationd'hydrates de carbone dans la liqueur d'alimentation contenant du glucose soit comprise dans l'intervalle d'environ 20 à 85 % en poidset de pré- férence d'environ 30 à 50 % en poids, pour obtenir les résultats désirés. Il est également nécessaire que l'isomérisation soit effectuée à un p H d'environ 3 à 8, de préférence d'environ 4 à 7 et plus spécialement de 5 à 6,5 La mise en oeuvre de l'iso- mérisation à un p H notablement inférieur ou supérieur à la gamme indiquée ci-dessus conduit à la formation de trop fortes quantités de sous-produits indésirables, tels que psicose, acides organiques, produits colorés, précurseurs de produits colorés, dianhydrides de fructose et analogues. La demanderesse a découvert que le p H pour l'activité optimale de la glucoseisomérase diminue nettement aux températures élevées Donc, pour la glucoseisomérase de Streptomyces rubigenosus, on obtient l'activité optimale à p H 8,6-9,2 à 25 C, à p H'6,9-7,5 à à 750 C et à p H 5,6-6,2 à 1250 C Donc, lorsque l'on augmente la température d'isomérisation, le p H d'isomérisation peut être dimi- nué pour maintenir l'activité enzymatique maximale et en outre pour éviter une formation excessive de sous-produits. Une autre condition nécessaire de l'invention réside encore dans la durée de contact de la liqueur d'alimentation conte- nant du glucose et de la glucoseisomérase chimiquement stabilisée. Ce contact doit être maintenu dans l'intervalle d'environ 1 S à environ 5 h, de préférence d'environ 30 S à environ 1 h et mieux encore d'environ 2 min à 30 min pour donner un sirop de glucose de qualité acceptable. La durée de contact préférée entre la glucoseisomérase chimiquement stabilisée et la liqueur contenant le glucose dépend dans une grande mesure du pli auquel est effectuée la réaction d'iso- mérisation A l'extrémité inférieure de la gamme de p H, une durée de contact plus longue peut être tolérée sans provoquer une dégradation excessive du glucose par formation de psicose et d'autres produits de dégradation indésirables A l'extrémité supérieure de la gamme de pli, une durée de contact plus courte est nécessaire pour éviter la formation de psicose et de produits colorés Dans la pratique, la durée totale au bout de laquelle le sirop contenant le glucose est à la température finale de réaction ou à une température voisine est calculée comme durée de contact efficace puisque les réactions de dégradation du sucre qui ont lieu rie sont pas enzymatiques et se produisent que la liqueur soit ou non en contact avec la glucose- isoraérase Par conséquent, dans la mise en oeuvre d'isomérisations audessus de 90 C, il est important de réduire la durée nécessaire pour amener la liqueur de glucose à la température d'isomérisation désirée (par exemple en mélangeant la liqueur avec de la vapeur juste avant ou pendant le contact avec l'isomérase) et, une fois que la teneur en fructose désirée a été atteinte, de séparer ensuite rapidement la liqueur de l'isomérase active et de refroidir ensuite la liqueur aussi rapidement que possible au-dessous de 90 C et, de préférence à moins de 700 C Si l'on utilise une forme soluble de glucoseisomérase chim Lquement stabilisée, il sera nécessaire d'inactiver celle-ci (par exemple par réduction du p H dans une gamme de valeurs inactivant l'isomérase) avant l'étape de refroi- dissement pour éviter une éventuelle reconversion en glucose du fructose formé pendant l'étape d'isomérisation à température éle- vée, puisque la réaction d'isomérisation estbien entendu,réver- sible. Le degré de conversion maximal du glucose en fruc- tose que l'on peut obtenir est comm andé par l'équilibre thermo- dynamique entre le glucose et le fructose,qui dépend à son tour de la température à laquelle est effectuée l Uisomérisation Une analyse très soigneuse des mélanges a l'équilibre de glucose et de fructose a établi la relation suivante F = 100 K/(K+l) ( 1) ln K =_ + 755+ 2,3005 ( 2) T+ 273 o F est le pourcentage de fructose à l'équilibre, par rapport au poids total de glucose et de fructose, T est la température ( C) à laquelle est effectuée l'isomérisation et K est la constante d'équi- libre glucose/fructose. La durée de contact réelle entre le sirop contenant le glucose et l'isomérase dans un réacteur peut généralement être calculée au moyen de la formule suivante lorsque l'on utilise un réacteur contenant une forme immobilisée d'isomérase. r F -F CV In F F t = ( 3) o t est la durée de contact réelle C est la concentration de glucose et fructose V est le volume libre de liquide dans le lit de garnissage (volume du lit diminué du volume occupé par les particules d'enzyme mobilisée) F est la fraction de fructose dans le mélange glucose/fructose à e l'équilibre quand il se trouve à la température d'isomérisation F est la fraction de fructose (par rapport à G + F) à l'entrée o dans le lit de garnissage F est la fraction de fructose (par rapport à G + F) dans la solu- tion sortant du lit de garnissage k est la constante de vitesse de réaction pour l'isomérisation dans les conditions d'isomérisation et A est l'activité de l'isomérase dans le lit de garnissage. Les valeurs de k pour l'isomérase immobilisée préparée selon les exemples suivants varient d'environ 0 07 à environ 5 g h IGIU à des températures de 90 à 1400 C, respectivement Cette relation montre la nécessité de réduire la durée de contact à température élevée par l'utilisation de lit de garnissage d'activité élevée par unité de volume Les lits de garnissage formés selon les modes opé- ratoires indiqués dans les exemples suivants peuvent contenir jusqu'à 2 000 IGIU/ml, ce qui permet d'atteindre une teneur en fructose de 99,5 % de la teneur à l'équilibre en moins de 1 min dans un réacteur à température élevée lorsque l'on utilise des réacteurs étagés à des températures différentes et que la charge entrant dans un pre- mier réacteur est isomérisée à basse température avant l'isomérisa- tion à température élevée dans un second réacteur Lorsque l'on utilise un système à réacteurs étagés, on préfère utiliser un pro- cédé qui consiste à mettre en contact une liqueur d'alimentation cm tenant du glucose à environ 20-85 % en poids de glucose avec la glucoseisomérase à une température d'environ 20 à 806 C, à un p H d'environ 6,0 à 9,0 et pendant une durée de contact d'environ 0,5 à 2 h, pour transformer de 40 à environ 45 % en poids du glucose présent dans ladite liqueur en fructose, à augmenter la tempéra- ture du milieu d'isomérisation à environ 90-140 OC, à régler le p H du milieu d'isomérisation si nécessaire dans la gamme d'environ 3 à 8, à mettre en contact la liqueur contenant le fructose avec la glucoseisomérase pendant une durée supplémentaire d'environ 1 s à environ 5 h pour augmenter le degré de conversion jusqu'à environ 53 % a 60 % en poids du glucose présent dans la liqueur d'alimentation intiale contenant le glucose, sans qu'il n'y ait de formation notable de psicose ou d'autres sucres n'appartenant pas au séries du fructose et du glucose Donc, l'utilisation de lits de garnissage à pouvoir élevé peut conduire à des durées de contact efficaces très faibles, ce qui réduit à son tour la dégradation du fructose qui a lieu aux températures élevées nécessaires pour l'invention. Dans le choix des techniques d'immobilisation de la lucoseisomérase, il est préférable d'utiliser des procédés pouvant donner de petites particules de catalyseur poreux, sensible- ment incompressibles, de manière a réduire au minimum la limitation de la vitesse dlisomérisation par les effets de diffusion. L'isomérase peut également être imobilisée dans les pores d'une membrane à travers laquelle on fait passer la solu- tion de glucose en circulation forcée pendant l'isomérisation à- température élevée, comme dispositif pour favoriser un bon contact entre l'enzyme et le substrat, minimisant les limitations par diffu- sion Le support utilisé pour l'immobilisation est de préférence totalement insoluble et inerte, pour éviter une contamination ou une dégradation excessives des composants glucose et fructose des solu- tions de substrat. Dans la pratique industrielle, cependant, les sirops contenant du fructose ne sont pas fabriqués à partir de glucose pur. On utilise plutôt des hydrolysats d'amidon (préparés dans les références mentionnées ci-dessus) comme sourcesde glucose et ceux-ci contiennent invariablement des saccharides n'appartenant pas aux séries du glucose et du fructose (ci-après dénommés polysaccharides) dérivés de l'hydrolyse incomplète de l'amidon et de l'inversion du glucose Ceux-ci constituent de manière caractéristique de, à 8 % du poids total à sec en saccharides dérivés de l'hydrolyse de l'ami- don Il est donc nécessaire, lorsque l'on calcule la température à laquelle l'isomérisation doit être effectuée, de tenir compte des polysaccharides éventuellement contenus dans la liqueur de glucose, ainsi que d'autres facteurs, tels que la teneur totale en fructose, en poids sec, à atteindre et la formation de psicose et d'autres pro- duits n'appartenant pas aux séries du glucose et du fructose pendant la durée de contact efficace de la liqueur de glucose et de l'iso- mérase Les relations pour le calcul de la température d'isomérisa- tion sont indiquées ci-dessous. T = 755 -273 ( 4) 2 > 3005-ln K ill F -10 o-I ( 5) -F F 10 000 (M 6) Q( 100-P) T = température d'isomérisation ( C). F = teneur en fructose à l'équilibre (% par rapport au total glucose + fructose) à la température T. Ml fructose, %/ en poids sec, nécessaire dans le produit isomérisé. C sicose + autre produit de dégradation, %, formés pendant la durée de contact d'isomérisation efficace. Q = ' de l'équilibre atteint pendant la réaction d'isomérisation, 1 O P v=eneur en polysaccharides, %, dans la liqueur de glucose. De manière caractéristique, il se forme moins de 1 %, et de préférence moins de 0,5 %,de psicose et d'autres produits de dégradation et on peut atteindre 99,5 % de l'équilibre Donc, pour reparer des sirops à 55,5 % de fructose (en matières sèches), les termpératures d'isomérisation suivantes sont nécessaires pour des liqueurs de glucose ayant les teneurs en polysaccharides indiquées. Polysaccharides dans la Température d'iso- liqueur de glucose mérisation ( C) (% en matière sèche) O 95,7 1 99,1 2 104,3 3 108,9 4 113 8 6 124,3 8 136,1 Le produit du commerce accepté contient en moyenne ,5 % de fructose, en matière sèche Cela tient à ce que, à cette teneur en fructose, un sirop de mais à teneur élevée en fruetose (HFCS) atteint un goût sucré égal à celui du saccharose, à poids égaux de matière sèche Cependant, le HFCS à 55,5 % de fructose est solidement établi comme produit commercial que l'on utilise pour le remplacement de tout ou partie du saccharose dans de nombreux produits alimentaires et spécialement dans les boissons sucrées au gaz carbo- nique On s'attend à ce que la consommation de ce type de HFCS aux EtatsUnis d'A:mérique soit de 1,3 billion de kg en 1982 avec une croissance à 1,8 billon de kg en 1983 En raison de la complexité propre aux opérations de fourniture, stockage, mesure et forr mula- tion du PFCS dans les produits alimentaires, il y a une demande universelle d'uniformité du produit d'un fabricant de 'FCS à un autre, afin que l'on puisse utiliser de manière interchangeable et simultanément des produits de différentes origineso Une teneur en fructose de 55-56 %, en matière sûche, a acquis une importance spé- ciale ccmrne teneur visée dans la technologie associée à la fabri- cation du IFCS. Le procédé de l'invention fournit des teneurs en fructose d'au moins 53 %, de préférence au moins 54 % 7, et mieux encore d'au moins 55 % Si on le désire, au lieu d'utiliser une solution con tenant seulement du glucose comme substrat pour le procédé de l'invention, il est également faisable d'utiliser une solution de glucose dans laquelle une partie du glucose est déjà isomérisée en fruetose Par exemple, on peut traiter par le procédé de l'inven- tion une solution de glucose isomérisée contenant jusqu'à 50 de fructose pour augmenter la concentration en fructose aux teneurs plus souhaitables de plus de 50 %, et aux teneurs préférées de 55-56 % et plus. Les solutions de glucose contenant du fructose en quantités de moins de 50 en poids des hydrates de carbone peuvent être préparées par des techniques connues, En gardant présentes à l'esprit les conditions pré- cédentes de concentration de glucose, p H et durée de contact on peut adapter convenablement des procédés connus d'isomérisation du glucose pour opérer entre environ 90 et 110 o C, de préférence entre environ 100 et 110 C, pour fournir les sirops à teneur élevee en glucose-fructose de l'invention. La thermostabilité de la glucoseisomérase peut être notablement accrue par un ou plusieurs traitements chimiques, l'enzyme conservant encore une activité appréciable, comme discuté ci-dessous L'enzyme ainsi traitée est dénommée "isomérase chimique- ment stabilisée" pour les but de la présente description. La stabilisation chimique de l'isomérase est effec- tuée par un certain nombre de techniques différentes qui peuvent aboutir à une stabilité thermique accrue L'approche fondamentale est d'introduire dans la molécule d'enzyme des éléments de struc- ture, de telle sorte que l'enzyme résiste au dépliage (déplissement) lorsqu'elle est chauffée au-delà de son point normal de dénaturation thermique Un procédé préféré pour y parvenir est de modifier l'enzyme parsubstitution chimique au moyen de portions de molécules contenant des groupes vinyles polymérisables, de sorte que ces derniers soient solidement fixés sur la surface de la molécule d'enzyme en plusieurs points Ensuite, l'enzyme modifiée est mélan- gée avec un ou plusieurs composés vinyliquespolymérisablesen solu- tion aqueuse et on copolymérise le mélange pour former l'enzyme chimiquement stabilisée, dans laquelle l'enzyme est solidement fixée en de nombreux points à une matrice polymère tridimensionnelle qui a formé une structure dont la forme est complémentaires de celle de l'enzyme. Des exemples de ce type de stabilisation sont décrits par Martinek et coll dans Biochem Biophys Acta 485 pages 1-12 ( 1977) et par Kulys et coll dans Biokhimiya, 42, n 3, pages 453-459 ( 1978). Il est essentiel, lorsque l'on met en oeuvre les réactions ci-dessus, d'éviter des conditions qui puissent conduire à la dénaturation de l'isomérase avec la perte d'activité qui s'ensuivrait Par exemple, on doit éviter des valeurs extrêmes de p H et de température pendant n'importe laquelle et la totalité des manipulationsnécessaires pour mettre en oeuvre la réaction ci- dessus. Des exemples de réactifs qui sont utilisés pour modifier l'isomérase par substitution avec des groupes vinyliques polymérisables sont le chlorure d'acryloyle, le chlorure de métha- cryloyle, l'acroléine, le crotonaldéhyde, l'anhydride maléique, le 3,4-époxybutène, l'acrylate de 2,3-époxypropyle, l'acrylate de 2,3- thioglycidyle, le l-allyloxy-3-(N-éthylèneimine)-2-propanol, le 0succinamide ester d'acide acrylique, l'anhydride chloromaléique, l'azide d'acide maléique, le 3-bromopropène, et l'isothiocyanate d'allyie Ces composés sont capable de réagir avec les groupes amino libres de l'isomérase, par exemple, le groupe epsilon-amino des restes lysine. D'autres composés capables de réagir avec les groupes acides carboxyliqueslibres de l'isomérase peuvent être uti- lisés pour la substituer facilement avec des restes vinyle poly- mérisables, comme il est évident pour l'homme de l'art, Des exemples de composés vinyliques qui peuvent être copolymérisés avec l'isomérase modifiée sont l'acrylate de sodium, le méthacrylate de sodium, l'acrylamide, le méthacrylate d'hydroxyéthyle, l'acryloylpipéridine-4-spiro-2 '-( 1 ',3 '-dioxacrylo- pentane), la l-acryloyl-4-pipéridone et l'acryloylméthoxyamine. On préfère généralement des monomères ou mélanges de monomères solubles dans l'eau qui conduisent à des polymères solubles dans l'eau (si on polymérise en l'absence d'agents réticulants). De manière caractéristique, des composés vinyliques difonctionnels sont incorporés dans le mélange de monomères ( 0,1-5 % du total des monomères) pour donner des centres de réticulation qui conduisent Z un réseau polymère tridimensionnel Des composés appropriés sont le N,N'-méthylènebis-acrylamide et le diméthacrylate d'éthylèneglycol Lorsqu'on utilise ceux-ci, le mélange polymérisé forme un gel insoluble qui conduit à l'immobilisation de l'isomérase. Les systèmes inducteurs couramment utilisés dans les polymérisations vinyliques, tels que persulfate d'ammonium + bisulfite de sodium, peroxyde d'hydrogène + sulfate ferreux, sulfate de potassium +,N,N',N'tétraméthyléthylènediamine et riboflavine (% lumière) sont appropriés - Une fixation non covalente à la matrice polymère tridimensionnelle peut aussi être suffisante pour conférer à la molé- cule d'isomérase la rigidité désirée et provoquer donc une augmenta- tion notable de stabilité thermique Ceci peut se produire lorsque l'isomérase est mécaniquement enrobée dans un gel polymère réticulé. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire que l'isomérase soit modifiée par fixation d'un composé vinylique avant l'étape de polymérisation. Cependant, la concentration du gel doit être supérieure à environ % en poids avant que ne se produise une stabilisation notable et on préfère des gels d'une concentration d'environ 50 % On a besoin de monomères capables de donner des gels polymères pouvant former des liaison électrostatiques et des liaisons hydrogènes avec l'iso- mérase, par exemple acrylate de sodium, méthacrylate de sodium, et mdthacrylate d'h-ydroxydthyle. Des exemples de stabilisation par incorporation dans des gels sont donnés par 'Martinek et coll, dans Biochem. Biophys Acta 485, pages 13-28 ( 1977 > et par Kulys et coll dans J Solid Phase ohe, 3 pages 95-105 ( 1978). Unie troisième technique de rigidification de l'iso- mérisc ast la réiuainintramoléculaire qui est capable de lui o frrunie î ai::h r:mique supplémentaire. Les excemples de cette stabilisation sont discutés O par ah li et coil' dans Biochemn B 3 iophys, Acta, 522, p Z. 277-283 ( 197 gi Hj tne et coll dans J Solid Phase Bloit-eri pag-es 3 ' 3-385 ( 1977) et Torchilin et coîl dans Biochem. 3 iophys pcaages 1- 10 ( 1979). T. -ge-nt:s réticulants convenables pour 1 'utili:sa- ti on r Uins la ërr I Ii J_ vent-ion comprennent les composés difonc- uc=auels ciul:7 ont 'i-nbles de réagir avec les groupes fonctionnels ît Irau;de li d J',onzyrme Le plus courariment, ce groupes toi sait*f 4 'fj S op a ino, géënéralement des groupes amino i) -1 N li N i eu'c' agir avec une grande variété de groupements a"O h s'iecarboxylique, halogénure de sulfonyle, aidci Ide S 1 c'hs propiolates et le-s analogues. Les agents réticulants comprennent donc les anhydrides d' cdsicro;lîus els qu'aphydride succinique et anhydride aidipique; les dui aldtéhydes correspondants, tels que glyoxal, succi- Z 5 nalde'hyde et -lutaraldtêhyde; les composés insaturés, tels qu'acro- * L Thine et crotona Idéhyde, les propiolates de diols, tels que bispro- ?iollat e d'éthylèneglycol, bispropiolate de propylèneglycol et bispropiolate d'Fe> am,éthylèneglycol; et les halogénures de disul- fsoniyle, tels caue chlorure de bernz-,ne-1, 3-disulfonyle, chlorure de nptie-,5 îsfoyeet chloiure de tolyl-2,4-disulfonyle. En- outre, comme l'enzyme contient des groupes acides réactifs avec 1 e,3 araînes, ou-bien peuit étre modifiée de M 2 Luire à contenir ces groupes, les amines difonctionnelles peuvent êtr e uti- lisées comme agentsréticulantspour la présente invention Celles- ci contiennent par exemple des diamines jusqu'en C 12, par exemple phénylènediamine, butylènedi amine, hezylènediamine, octylènediamine, pentylènediamine, éthylnediamine et dodécylènediamine. 2529571- La quantité d'agent réticulant peut varier consi- dérablement, le rapport de l'enzyme à l'agent réticulant variant d'environ 0,1 à 0,0001 La technique pour réaliser la fixation nécessaire est déterminée dans une certaine mesure par la nature de l'agent réticulant choisi et l'enzyme En général, les réactifs sont dissous dans un solvant inerte convenable et la réaction doit s'effectuer à des températures raisonnablement basses pour éviter des effets nuisibles sur l'enzyme qui peut être sensible aux tempé- ratures élevées On préfère ordinairement des réactions & la tempé- rature ambiante ou à une température voisine et on utilise comme milieu de réaction l'eau ou des solvants aqueuo Outre la substitution de la molécule d'enzyme par des groupes vinyliques polymérisables suivie de polymérisation par les méthodes décrites précédemment, un autre mode de mise en oeuvre comprend la condensation d'un polymère préformé avec l'isomérase par formation de liaisons covalentes intermoléculaires pour former une molécule stabilisée Par exemple, on peut faire réagir des poly- peptides, tels que des protéines naturelles et leurs produits d'hydrolyse, en utilisant des techniques connues de formation de liaisons peptidiques, avec la glucoseisomérase pour former une enzyme stabilisée Les produits ainsi obtenus peuvent être solubles dans l'eau, mais peuvent être rendus insolubles dans l'eau par l'utilisation d'agen tsréticulant telsque le glutaraldéhyde et le système enzymatique réticulé résultant est ordinairement encore plus stable Les réactions de formation de peptides sont effectuées par des techniques connues, par exemple par l'utilisation de carbodi- imides. Si on le désire, on peut former un dérivé de l'enzyme initiale pour introduire dans la molécule les fonctions désirées en vue de la condensation avec la molécule préformée Ainsi donc, pour une fonctionnalité carboxy, on peut faire réagir l'enzyme contenant des groupes amino libres avec un acide dicarboxylique pour la transformer en enzyme contenant des groupes carboxy. Les polymères préformés t utiliser dans le mode opé- ratoire précédent peuvent être n'importe lesquels de ceux contenant le type et la quantité nécessaires de groupes fonctionnels, par exemple amino ou carboxy, pour les réactions envisagées On préfère les polypeptides, tels que les protéines naturelles, par exemple chitosan e, protéine de levure et les analogues, ainsi que leurs mélanges; et les polymères contenm t des groupes amino, tels que la polyéthylèneimine Ordinairement, le polymère préformé préféré forme des produits solubles dans l'eau et on préfère rendre ceux-ci insolubles par réaction avec des agents réticulants, par exemple le gluaraldéhyde et d'autres agents comme décrits précéderment. Dans toutes les techniques précédentes de modifi- cation de l'enzyme, il est essentiel d'assurer qu'un nombre suffi- sant de fonctionschimiquq par exemple des groupes amino ou carboxy, soient présents pour obtenir le résultat désiré à un degré notable. Par exemple, lorsque l'on choisit le polymère pré- formé à faire réagir avec l'enzyme, il est nécessaire que le poly- mère contienne des groupes réactifs vis-à-vis des groupes dispo- nibles sur la molécule d'enzyme Ainsi, une protéine comportant des groupes carboxy en chaîne latérale doit être choisie pour la réac- tion avec les groupes amino en chaîne latérale de l'enzyme De plus, il doit y avoir un nombre raisonnable de groupes réactifs sur les réactifs choisis pour assurer une fixation en plusieurs points des réactifs pour réaliser une stabilisation notable La détermination de la nature et du nombre de ces groupes réactifs pour des réactifs donnés est bien entendu connue de l'homme de l'art. Une autre technique encore permettant d'augmenter la stabilité thermique des enzymes est de modifier chimiquement la structure de surface sans provoquer de perte appréciable d'activité. Ainsi, les groupes amino de surface peuvent être transformes en amidines (Ludwig, M L et Hunter, M J, Meth Enzymol ll, pages 595-604 ( 1967)) ou en guanidines (Kimmel, J R, l Neth, Enzymol 11 pages 585-589 ( 1967)) pour former des substituants ressemblant étroitement a l'argi- nine La lacticodéshydrogénase et plusieurs autres protéines ont été stabilisées (voir Tlengler, F et Pfleiderer, G, Biochem Biophys. Acta, 284, pages 1-8 ( 1977)); Niiotani N et coll Biochim Biohys. Acta, 581, pages 334-341 ( 1979); et Cupo, P, et col J Biol Chem, 255, pages 10828-10833 ( 1980)). L'activité de la préparation d'isomérase soluble a été déterminée comme décrit par Lloyd et coll dans Cereal Chemistry, 49, n 5, pages 544-553 ( 1972) Une unité IGIU est la I 8 quantité d'isomêrase qui convertit une micromole de glucose en fructose par minute dans une solution contenant 2 moles de glucose par litre, 0,02 mole de Mg 504 par litre et 0,001 mole de Co CI 2 par litre à un p H de 6,85 (maléate de sodium 0,2 M) et à une tempéra- ture de 60 C, la détermination étant faite par la méthode ci- dessus. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Cet exemple illustre l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose, constituée principalement d'un hydrolysat d'amidon de mais raffiné, pour obtenir une composition à ,5 % de fructoseen poids sec, en utilisant un procédé d'isomérisa- tion en deux stades On effectue d'abord une isomérisation à basse température à 70 C, le produit de cette réaction étant utilisé comme charge d'alimentation d'un second réacteur à température élevée ( 105,2 C) contenant une isomérase chimiquement stabilisée L'iso- mérase chimiquement stabilisée est du type dans lequel l'enzyme est fixée par covalence sur un polynmère soluble et ensuite insolubilisée pour former un catalyseur immobilisé. L'hydrolysat est préparé à partir d'amidon de mais par les procédés décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amériqie 3 644 126 (liquéfaction) et le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 280 006 (saccharification) La liqueur saccharifiée est raffinée selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 834 940 pour donner un produit contenant 95,3 % de glucose, en poids sec On ajoute suffisam- ment de glucose cristallisé pour amener la teneur totale en glucose à 97,6 %, en poids sec La solution résultante a la composition sui- vante: Substance sèche totale (%) 50,2 Glucose (% en poids sec) 97,6 Fructose (% en poids sec) 0,0 Polysaccharides (% en poids sec) 2,4 Psicose (% en poids sec) 0,0 Na HSO 3 (n Im) 50,0 Ig So 4 (MM) 5,0 Co C 12 (ho) p H 0, 1 6,8 L'isomérisation à basse température-est effectuée C en pompant la solution de substrat ci-dessus à travers le réacteur à basse temrpérature, à un débit de 3,2 ml/min Le réacteur d'isc-rrase à basse température ( 70 C) est construit par garnissage d'une colonne en verre de 2,54 cm de diamètre munie d'un orifice d'entrée et d'un orifice de sortie et d'une enveloppe pour la cir- culation d'eau proenant d'un thermostat, avec l'isomérase immobi- N O lisée sur DEAE-ceilulose (préparée selon le brevet des Etats-Unis d'Anêrique 3 788 945) L'espace en tâte de colonne au-dessus du garn isage contient;An thermomètre et il est autrement rempli de billes de verre poun -éduire l'espace mort autant qu'il est pratique. Le réacteur aontient suffisamment d'isomérase immobilisée pour four- nir 20 000 unités i GIU et le lit de garnissage a une hauteur d'en- viron 15 cin On jette les 1 000 premiers ml sortant du réacteur. effluent est ensuite recueilli pour l'utilisation dans la seconde isomerisaeion à température éleve. LT_ catalyseur stabilisé chimiquement utilisé dans le réacteur haute termpérature est préparé de la manière suivante. On fait pousser une espèce de Streptomyces rubi-enosus der ivée de S rubigenosus ATCC 21175 en fermentation aérobie submergé sur un milieu de composition suivante: / en poids 1 De:trose 9,0 Liqueur de Crempage de mas (solides) 106 Phosphate de diaî-aoniumi 0,08 Sulfate de manganèse 0, 06 Antimousse ("Pluronic PL-61 ") 0,003 On stérilise le milieu à 121 C pendant 45 min, on refroidit et on ajuste g p H 6,8-7,0 On inocule avec 14 % en volume d'un inoculum comprenanz le contenu d'un fermenteur d'ensemencement, préparé avec la variante S ubigenous mentionnée cidessus La fermentation est effectuée en conditions aseptiques à 30 C pendant environ 60 h, avec aération à O, 65 vnvm (min) On peut aussi utiliser S rubigenosus ATCC 21175 pour l'inoculation et la production d'iso- mérase; dans ce cas, on utilise la composition suivante: % en poids Dex trose 0,24 Liqueur de trempage de mais (solides) 1,5 Sorbitol 1,6 Chlorure cobalteux 0,02 Phosphate de diammmonium 0,56 Xylose 1,0 On extrait la glucoseisomérase de S rubigenosus en ajoutant 0,35 % de 'Maquat MC 1412 " (de la Société Mason Chemical Co) et 0,001 % de lysozyme d'oeuf de poule et en agitant pendant 5 h à 40 C à p H 6,3-6,6 On filtre ensuite le mélange pour obtenir une solution de glucoseisomérase brute non purifiée. On purifie l'isomérase brute par adsorption sur DEAE-cellulose (fabriquée selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 823 133), filtration et lavage du produit adsorbé avec une solu- tion de Na Cl 0,1 M pour éliminer les impuretés et ensuite désorp- tion de l'isomérase par mise en contact avec une solution de Na Cl 0,45 M 1 Le p H de toutes les solutions est maintenu à 7,5 pendant les étapes de purification On mélange la solution d'isomérase par- tiellement purifiée ainsi obtenue avec 3 volumes d'éthanol à 95 % à 0 C pour précipiter l'isomérase On ajoute de la perlite comme auxiliaire de filtration, on recueille les solides par filtrati on et on sèche à l'air pour obtenir une préparation d'isomérase soluble contenant 2 500 IGIU/g. On dissout 'isomérase purifiée dans In CI 2 1 ml pour donner une solution contenant 10 mg d'isomérase par ml à la température ambiante et on filtre le mélange pour séparer l'auxi- liaire de filtration L'activité spécifique de cette préparation est de 37,3 IGIU par mg de protéine. On obtient une solution de polymère soluble de polyamine en dissolvant 39, 0 g de chitosane lproduit "Kytex" de la Société Hercules Inc, Wilmington, Delaware 19899) dans 13 1 de HC 1 0,08 N Après dissolution, on ajuste la solution de chito- sane à Na Cl 0,5 M par addition de 380 g de Na Cl et on ajuste la solu- tion résultante à p H 6,15 par Na OH 8 N Enfin, on filtre la solution de chitosanne sur un papier-filtre"t'natman n 3 " pour séparer la matière insoluble Aux 13 1 de chitosanne à 0,3 % dans Na Cl 0,5 M à pli 6,15, on ajoute ce qui suit: 100 ml d'isomérase soluble cmn tenant 100 000 IGIU d'activité, 197, 6 g de xylitol (de la Société Sigma Chemical Co) et 0, 619 g de Co C 12 6 H 20 On agite cette solution pendant 2 h, après quoi on ajoute 6,24 g de 1-éthyl- 3-diméthylaminopropylcarbodiimide (de la Société Sigma Chemical Co) pour fixer par covalence en plusieurs points les groupes carboxyles de l'isomérase aux groupes amino du chitosanne Après 2 h à la température ambiante, on ajoute au mélange de réaction 15,6 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 50 % en poids (de la Société Eastman Kodak) ajustée à p H 6,0 par Na OH 8 N, pour insolu- biliser le complexe isomérase-chitosanne lié par covalence Après min, on ajoute 2 1 d'une solution de phosphate 1 M à p H 8,0 pour faciliter l'écrasement du gel après sa formation par l'addition de glutaraldéhyde On lave l'isomérase-chitosane insolubilisé résultant par l'eau déminéralisée sur filtre Buchner sous vide On laisse :ensuite sécher à l'air cette préparation pendant une nuit à la tem- pérature ambiante, on la broie et on la tamise dans l'intervalle de grosseursde particulesde 0,25-1,68 mm Le catalyseur sec a une activité exprimée de 384 IGIU/g. On prépare de la manière suivante le réacteur fonc- tionnant à 105,2 C On met en suspension 13 g du catalyseur dans le substrat et on désaère sous le vide du laboratoire à la tempéra- ture ambiante pendant 60 min On utilise la suspension désaérée pour préparer un lit de 1,5 x 20 cm dans une colonne de verre à enveloppe. Le lit de garnissage contient 4 992 IGIU. On ajuste à p Hli 7,75 le substrat préparé à partir de la première étape d'isomérisation à 70 C et on le dilue à 42,0 % de substance sèche On envoie ensuite ce substrat par pompage à travers le réacteur à colonne à haute température sous une pression manométrique de 0,7 bar et à un débit de 1,96 ml/min à 60 C pendant min On contrôle la température à l'intérieur de la colonne au moyen d'un thermomètre situé directement audessus du lit et entouré de billes de verre de 0,5 cm pour réduire autant que possible le volume mort au minimum On augmente ensuite rapidement la tempéra- ture de la colonne en faisant circuler à travers l'enveloppe de l'huile provenant d'un bain thermostaté à 106 C. On contrôle l'effluent de la colonne au moyen d'un polarimètre enregistreur étalonné entre 50 et 58 % de fructose. Lorsque la température de la colonne a atteint 105,2 C et lorsque la teneur en fructose de l'effluent a atteint la valeur recherchée, on recueille l'effluent et on le refroidit immédiatement dans un bain de glace On ajuste le pli à 4,90 par addition d'acide citrique 1 M On recueille l'effluent jusqu'à ce que la teneur apparente en fructose tombe au-dessous de 55 %. On analyse les solutions isomérisées obtenues à partir des réacteurs à 70 et 105,2 C pour déterminer la composition en hydrates de carbone et la couleur et les résultats obtenus sont comparés dans le tableau I suivant avec les valeurs obtenues sur la solution de substrat non isomérisé. Les résultats obtenus montrent que l'on atteint 55,5 % de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0,4 % en poids, en matière sèche, et la couleur EXEMPLE 2 Le présent exemple illustre l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose (consistant en un hydrolysat d'amidon de mais raffiné plus du glucose cristallisé) à température élevée pour obtenir une composition contenant 55,2 % de fructose, en poids de matière sèche, dans laquelle on utilise une isomérisa- tion en deux stades, le second stade utilisant une isomérase chimi- quement stabilisée composée de glucoseisomérase complexée par la polyéthylèneimine, le complexe étant insolubilisé par traitement p= le glutaraldéhyde. Préparation de l'isomérase stabilisée. On prépare une glucoseisomérase soluble comme décrit à l'exemple 1 On dissout l'isomérase purifiée dans Mn C 12 1 m 1 N pour obtenir une solution contenant 6 mg d'isomérase par ml à la tempé- rature ambiante et on filtre le mélange pour éliminer l'auxiliaire de filtration On ajoute 60 ml de polyéthylèneimine de poids molé- culaire 600, p H 8, à 10 % en poids par volume (produit "PEI-6 " de la Société Dow Chemical Co) et 3 g de xylitol à 300 ml de la solution d'enzyme et on agite la solution résultante pendant 15 min On ajoute 10 ml de glutaraldéhyde 2,5 M et on agite le mélange à la température ambiante pendant 2 h On recueille par filtration l'enzyme insolubilisée, on lave à l'eau et on sèche pendant une nuit dans un four à convection à 37 C On récupère après séchage 12,8 g-d'isomérase immobilisée contenant environ 775 IGIU/g On met en suspension 12 g de l'enzyme immobilisée dans le substrat. On désaère sous vide pendant 60 min à température ambiante et on utilise pour préparer un réacteur à haute température de 1,5 cm de diamètre. On prépare le substrat du réacteur dans la première étape de l'isomérisation en deux stades comme décrit à l'exemple 1. Ce substrat a la composition suivante: Substance sèche totale (%) 42,6 Glucose ( 7en poids de matière sèche) 46,4 Fructose (% en poids de matière sèche) 51,3 Polysaccharides (d en poids de matière sèche) 2,3 Psicose ( 7 % en poids de matière sèche) 0,0 Na ISO 3 (r M) Mg SO 4 (m I) 50 Co Ci 2 (m N) O,1 CI 2 ' Oe p H 6,75 On fait circuler le substrat par pompage à travers le réacteur à 60 C pendant 45 min à environ 5 ml/min On augmente ensuite la température de la colonne à 10116 C et on réduit le débit à 2 ml/min On applique une contre-pression de 0,84 bar sur la colonne pour éviter l'ébullition du substrat On contrôle l'effluent au moyen d'un polarimètre enregistreur étalonné entre et 58 % de fructose On recueille l'effluent qui dépasse 55/ dans un bain de glace et on l'ajuste à p H 4,0 par l'acide citrique 1,0 M. On détermine par analyse la composition en hydrates de carbone et la couleur de l'effluent du réacteur à haute tempé- rature, du substrat du réacteur de premier étage et de la solution initiale contenant du glucose utilisée comme substrat pour le réac- teur de premier étage Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau II ci-après. Les résultats montrent que l'on atteint 55,2 % de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0,2 % an poids, en matière sèche. EXEMPLE 3 Cet exemple illustre l'isomérisation directe du glucose en fructose à 57, 2 % 5 par un procédé d'isomérisation en deux stades dans lequel le premier réacteur est de 70 C et le second réacteur (haute température) est à 110,40 C L'isomérase chimiquement stabilisée utilisée dans la réaction à haute température est une isomérase dans laquelle l'enzyme est fixée par covalence à un poly- mère soluble et insolubilisée ensuite pour former un catalyseur immobilisé. Le substrat et sa conversion dans le réacteur de premier étage à 70 C ont été décrits à l'exemple 1. Le catalyseur immobilisé utilisé dans le réacteur à haute température à 110,4 C a également été décrit à l'exemple 1. On prépare de la matière suivante le réacteur à 110,4 C On met en suspension 28,4 g du catalyseur dans le substrat et on désaère sous le vide du laboratoire à la température ambiante pendant 60 min On utilise la suspension désaérée pour préparer un lit de 2,5 x-12,4 cm dans une colonne de verre munie d'une enveloppe chauffante Le lit de garnissage contient 10 885 IGIU. On règle à p Hi 6,47 le substrat préparé dans le premier stade d'isomérisation à 70 C et on le dilue à 42,0 î, de matière sèche On fait ensuite circuler ce substrat par pompage à travers la colonne du réacteur à haute température, sous une pres- sion de 0,84 bar et à un débit de 3,38 ml/min, à la température de 60 C pendant 30 min On contrôle la température dans la colonne par un thermomètre situé directement au-dessus du lit;et entouré de billes de verre de 0,3 cm pour réduire autant que possible le volume mort On augmente ensuite rapidement la température de la colonne en faisant circuler dans l'enveloppe chauffante une huile provenant d'un bain thermostaté à 111 C. On contrôle l'effluent de la colonne au moyen d'un polarimètre enregistreur étalonne entre 50 et 58 % de fructose. Lorsque la température de la colonne a atteint 110,40 C et lorsque la teneur en fructose dans l'effluent a atteint la valeur recherchée, on recueille l'effluent et on le refroidit immédiatement au bain de glace On règle le p H à 4,0 par addition d'acide citrique 1 M. -29571 On détermine la composition en hydrates de carbone et la couleur des solutions isomérisées obtenues dans les réacteurs à 700 C et à 110,40 C et on compare les résultats avec ceux obtenus sur une solution de substrat non isomérisée, comme indiqué dans le tableau III ci-après. Les résultats obtenus montrent que l'on atteint 57,2 % de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0,4 % en poids, en matière sèche, et la couleur (CIRFXIOO) au-dessous de 20. EXEMPLE 4 Cet exemple illustre l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose consistant principalement en hydro- lysat d'amidon de maïs raffiné pour atteindre une composition de 56,3 % de fructose, en matière sèche, en utilisant un procédé d'iso- mérisation en deux stades, On effectue d'abord l'isomérisation à basse température à 700 C, le produit de cette réaction étant utilisé comme charge d'alimentation d'un second réacteur à haute température ( 103,30 C) contenant une isomérase chimiquement stabilisée Dans l'isomérase chimiquement stabilisée, l'enzyme a été mise à réagir avec une protéine protectrice (comme celle dérivée de la levure). L'étape d'isomérisation à basse température, y compris la description du substrat et les conditions expérimentales, est décrite dans l'exemple 1. On prépare de la maniere suivante la glucoseisomérase chimiquement stabilisée utilisée dans le réacteur à haute tempéra- ture On prépare la glucoseisomérase soluble pour la stabilisation chimique et on la purifie comme décrit à l'exemple 1 L'activité spécifique de cette préparation est d'environ 40 IGIU/mg de protéine. On obtient de la manière suivante une protéine protectrice à partir de levure de boulanger A 1229 g de tourteau humide de levure de boulanger, on ajoute 1 000 g d'eau et 50 g de toluène On agite le mélange à température ambiante pendant une nuit, puis on chauffe à 850 C et on maintient à cette température pendant environ 30 min. On filtre le mélange sur un Buichner La presque totalité du toluène reste avec les débris cellulaires insolubles, tandis que le filtrat aqueux contient l'extrait de levure soluble On réduit le volume du filtrat aqueux à 276 g (évaporateur rotatif à 40 C), puis on ajoute en agitant 41 g d'acide trichloroacétique On recueille la protéine de levure précipitée, puis on la redissout dans le tampon au phosphate de sodium 0,1 M (p H 7,) Apres clarification par filtration, on traite la solution par 900 ml (environ 3 volumes) d'acétone On recueille le précipité> on le dissout dans le tampon au phosphate de sodium O, 01 M (p H 7,0) et on dialyse la solution résultante contre le tampon au phosphate de sodium 0,01 M Le produit résul- tant ( 150 ml) est la protéine protectrice marquée obtenue à partir de levure de boulanger On prépare une solution à O 6 % de chitosanne en dissolvant 24 g de chitosanne ("Kytex" de la Société Hercules Inc, Wilmington, Delaware) dans 4 litres de HC 1 0,08 N On ajuste la solution à p H 6,2 par Na OH 8 N, on filtre sur papier filtre Whatman n 3, puis on dialyse contre 16 1 d'eau déminéralisée Dans un bécher de 400 ml, on place environ 100 000 IGIU de glucoseisomé- rase soluble (en mélange avec l'auxiliaire de filtration), 1 g de xylitol et 100 ml ( 2/3) de la protéine protectrice dérivée de levure de boulangerie On ajoute à ce mélange 2,4 mg de Mg 50417 H 20 et 24,1 de solution de chlorure de cobalt molaire On filtre le mélange pour séparer l'auxiliaire de filtration, puis on concentre la solution (en évaporateur rotatif à environ 40 C) presque jusqu'à siccité, dans un ballon à fond rond de 2 1 On ajoute ensuite au ballon 800 ml de chitosanne (p H 6,2) On concentre ensuite le mélange (en évaporateur rotatif à environ 40 C) presque jusqu'à siccité et on ajoute 6401 pl de solution de glutaraldéhyde à 50 % (ajustée à p H 6,5) On conserve le mélange en chambre froite pen- dant une nuit On retire ensuite le gel du ballon et on le fait passer à force à travers un tamis de 0,59 mm (U S n 30) et on sèche en étuve à environ 37 C On tamise la préparation d'enzyme séchée pour séparer les fines (tamis de 0,177 mm), puis on l'uti- lise ( 8,9 g de produit final) pour l'isomérisation à température élevée. On prépare de la manière suivante le réacteur à 103,3 C On met en suspension dans le substrat la préparation de glucoseisomérase ci-dessus ( 8,9 g) et on désaère sous le vide du laboratoire à la température ambiante pendant environ 30 min On utilise la suspension désaérée pour préparer un lit de 1,5 x 29 cm dans une colonne de verre munie d'une enveloppe chauf- fante. On règle à p H 6,75 et on dilue à 42,0 % de substance sèche le substrat préparé dans la première étape d'isomérisation à 70 C On fait ensuite circuler ce substrat par pompage à travers la colonne du réacteur à haute température à un débit d'environ I 1/2 ml/min, à la temperature de 60 C pendant 30 min On contrôle la température dans la colonne au moyen d'un thermomètre situé juste au-dessus du lit et entouré de billes de verre de 0,5 cm de diamètre pour réduire au minimum le volume mort On augmente ensuite rapidement la température de la colonne en faisant circuler dans l'enveloppe chauffante une huile provenant d'un bain thermo- staté à 104 C. On contrôle l'effluent de la colonne avec un polari- mètre enregistreur étalonné entre 50 et 58 % de fructose On recueille les fractions (environ 5 ml) jusqu'à la production de 55 % de fructose ou plus; à ce moment l'expérience est terminée Tandis que l'on recueille les échantillons, l'effluent est immédiatement refroidi au bain de glace et le p H est ajusté à environ 4,0 par addition d'acide citrique molaire ( 0,1 ml), puis de HC 1 dilué. On détermine la composition en hydrates de carbone et la couleur des solutions isomérisées obtenues dans les réacteurs à 70 C et à 103,3 C Les résultats sont comparés dans le tableau IV ci-après avec ceux obtenus de manière analogue sur la solution de substrat non isomérisée. Les résultats obtenus montrent que l'on atteint 56,3 % de fructose en maintenant le psicose au-dessous de 0,2 % en poids de matière sèche. EXEMPLE 5 Cet exemple illustre l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose consistant principalement en un hydro- lysat d'amidon de rmas raffiné à faible concentration saline pour atteindre une composition à 55,4 % de fructose, en matière sèche, en utilisant un procédé d'isomérisation en deux stades On effectue d'abord une isomérisation à basse température à 70 C et le produit de cette réaction est utilisé comme charge d'alimentation d'un second réacteur à température élevée ( 112,6 C) contenant une iso- mérase chimiquement stabilisée Dans l'isomérase chimiquement sta- bilisée, l'enzyme est liée par covalence à un polymère soluble,par fixation en plusieurs points, puis insolubilisée pour former un catalyseur immobilisé. L'hydrolysat est préparé à partir d'amidon de mais par les procédés décrits dans les brevets des Etats-Unis d'.Amérique 3 644 126 (liquéfaction) et 3 280 006 (saccharification). La liqueur saccharifiée est raffinée selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 834 940 pour donner un produit contenant 93,8 % de glucose en matière sèche On ajoute suffisammnent de glucose cris- tallisé pour amener la teneur totale en glucose à 96,9 %, enmatière sèche La solution résultante a la composition suivante: Substance sèche totale (%) 50,3 Glucose (% en matière sèche) 96,9 Fructose (% en matière sèche) 0,1 Polysaccharides (% en matière sèche) 3,1 Psicose (% en matière sèche) 0,0 Na HSO 3 (rm N) 2,5 -g SO O (m') 2,5 Co C 112 (m-) O, 1 ' p H 6,8 On effectue l'isomérisation à basse température à C en faisant circuler par pompage la solution de substrat ci- dessus à travers le réacteur à basse température qui a été décrit à l'exemple 1, à un débit de 2,5 ml/min On jette les 1 000 premiersml sortant du réacteur On recueille ensuite l'effluent pour l'utilisa- tion dans la seconde isomérisation à température élevée. On prépare de la manière suivante le catalyseur chimiquement stabilisé utilisé dans le réacteur à haute température. On prépare et on purifie la glucoseisomerase soluble par le procédé décrit à l'ex>emple 1 L'activité spécifique de cette préparation est d'environ 40 IGIU/mg de protéine On obtient une solution de polymère soluble, du type polyamine, en dissolvant 48,4 g de chitosanne ('Kytes'de la Société Hercules Inc, Wilmington, Delaware 19899, E U A) dans 15 1 de H Cl 0,08 N Après dissolution, on ajuste la solution à 0,5 il en Na Cl par addition de 438 g de Na Cl et on ajuste la solution résultante à p H 6,1 par Na OH 8 N On filtre ensuite la solution de chitosanne sur un papier-filtre Wathman n 3 pour séparer la matière insoluble Aux 15 1 de solution de chitosanne à 0,3 % dans Na Cl 0,5 M à p H 6,1, on ajoute: 520 ml d'isomêrase soluble contenant environ 602 000 IGIU d'activité, 236 g de xylitol (de la Société Sigma Chemical Co) et 3,07 g de n Cl 2,4 H 20 On agite cette solution pendant 2 h, après quoi on ajoute 7,44 g de l-éthyl-3- diméthylarninopropylcarbodiimide (de la Société Sigma Chemical Co) pour lier par covalence en plusieurs points les groupes carboxyles de l'isomérase aux groupes amino du chitosanne Après 2 h -à la tem- pérature ambiante, on ajoute au mélange de réaction 15,5 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 50 % en poids (de la Société Eastman Kodak Chem Co) réglée à p H 6,0 par Na OH 8 N pour insolubiliser le complexe de covalence isomérase-chitosanne Après 15 min, on mélange avec le complexe insoluble isomérase-chitosanne 4 1 d'une solution de phosphate 1 M à p H 8,0 On lave l'isomérase-chitosanne immobilisée par l'eau déminéralisée en filtrant sous vide dans un B Uchner conte- nant du papier filtre Whatman n 3 On sèche la préparation à l'air, on broie et on tamise dans la gamme de 0,250-1,60 mm Le catalyseur sec a une activité exprimée de 803 IGIU/g. On prépare de la manière suivante le réacteur à 112,6 C On met en suspension 7,0 g du catalyseur dans le substrat et on désaère sous le vide du laboratoire à la température ambiante pendant 60 min On utilise la suspension désaérée pour préparer un lit de 1,0 x 40 cm dans une colonne de verre a enveloppe chauffante. Le lit de garnissage contient 5621 IGIU. On ajuste à p H 6,55 le substrat préparé dans la première étape d'isomérisation à 70 'C et on le dilue par l'eau démi- néralisée à 42,0 % de matière sèche, ce qui abaisse également les concentrations en self% 2,1 m M pour Na HS% et 2,1 m M pour Mg SO 4 On fait ensuite circuler par pompage ce substrat à travers la colonne du réacteur à haute température, sous une pression manométrique de 0,84 bar pendant 10 min à un débit de 8 ml/min, à la température de ,0 C On contrôle la température de la colonne au moyen d'un ther- momètre situé juste au-dessus du lit et entouré de sable jusqu'aux graduations de température pour réduire autant que possible à un mini- mum le volume mort On élève ensuite rapidement la température de la colonne par circulation d'une huile provenant d'un bain thermo- staté à environ 1140 C La température de la colonne est augmentée jusqu'à 112,60 C et le débit diminué à 1,89 ml/min. L'effluent de la colonne est contr 5 lé avec un pola- rimâtre enregistreur étalonné entre 50 et 58 % de fructose Lorsque la température de la colonne a atteint 112,60 C et lorsque la teneur en fructose de l'effluent atteint la valeur désirée, on recueille l'effluent on ajuste immédiatement le p H à 4,0 par addition d'acide citrique 1 M On recueille l'effluent jusqu'à ce que la teneur appa- rente en fructose tombe au-dessous de 55 %. On détermine la composition en hydrates de carbone et la couleur des solutions isomérisées obtenues dans les réacteurs à 70 C et à 112,60 C et on compare les résultats obtenus dans le tableau V ci-après avec ceux obtenus de manière analogue sur la solution de substrat non isomérisée. Les résultats obtenus montrent que l'on atteint ,4 % de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0,2 % en poids, en matière sèche, et la couleur EXEMPLE 6 Cet exemple illustre l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose consistant principalement en un hydrolysat d'amidon de mals raffiné à faible teneur en sels pour atteindre une composition de 54,8 % de fructose, en matière sèche, avec une très faible teneur en psicose ( première étage à 70 C sont décrits à l'exemple 5. Le catalyseur immobilisé utilisé dans le réacteur à haute température à 105,80 C est comme décrit à l'exemple 5. * On prépare de la manière suivante le réacteur à ,80 C On met en suspension 5,63 g du catalyseur dans le substrat et on désaère sous le vide du laboratoire à la température ambiante pendant 60 min On utilise la suspension désaérée pour préparer un lit de 1,0 x 32 cm dans une colonne de verre à enveloppe chauffante. Le lit de garnissage contient 4521 IGIU. Le substrat préparé à partir de la première étape d'isomdrisation à 70 C est réglé à p H 6,5 et dilué par l'eau démi- néralisée à 42,0 % de matière sèche, ce qui abaisse également la concentration en sels à 2,1 n-I pour Mg SO 4 et 2,1 NI pour Na H 503. On fait ensuite circuler ce substrat par pompage A travers la colonne du réacteur à haute température sous une pression manométrique de 0,7 bar et à un débit de 8 ml/min pendant 10 min, à la température de 60,0 C La température dans la colonne est contr 8 ôlée au moyen d'un thermomètre situé juste au-dessus du lit et entouré de sable jusqu'au début des graduations de températures, pour réduire autant que possible au minimum le volume mort On augmente ensuite rapidement la température de la colonne en faisant circuler dans- l'enveloppe chauffante une huile provenant d'un bain thermostats à environ 107 C. On contrôle l'effluent de la colonne au moyen d'un polarimrètre enregistreur étalonné entre 50 et 58 % de fructose. Lorsque la température de la colonne a atteint 105,8 C et que la teneur en fructose dans l'effluent a atteint la valeur désirée, on recueille l'effluent On ajuste immédiatement le p H à 4,90 par addition d'acide citrique 1 M. On détermine la composition en hydrates de carbone et la couleur des solutions isomérisées provenant des réacteurs à 7 Q O C et à 105,8 C et on compare les résultats obtenus avec ceux obtenus de manière analogue avec la solution de substrat non isomérisé. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau VI. Les résultats montrent que l'on atteint 54,8 % de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0,1 % en poids en matière sèche et la couleur (CIR Fxl OO) au-dessous de 2. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. T A B LZ A U I Composition de solutions de substrats isomérisees à 70 C et 105,2 C Traitement de la solution non isomerisee isomérisée à 70 C isomérisée à 105,2 C Composition en hydrates de carbone (% en poids, en matière sèche sans cendre) Fructose Glucose Psicose Polysaccharides o O 51,3 ,5 97,6 46, 4 41,6 o O 0,3 2,4 2,3 2,6 Couleur (CIRF X 100) 0,5 0,7 14,1 w ro ui T A B LEAU II Compositions des solutions des ler et 2 e stades d'isomérisation Traitement de la solution Fructose Composition en poids, en Glucose en hydrates de carbone matière sèche sans cendre) Psicose Polysaccharides non isomèrisée isomérisée à 700 C isomérisée à 101,60 C o 51,3 ,2 Couleur (CIRF XIOO) 97, 6 46,4 42, i o o o 2,4 2,3 2,7 (J, 0,5 0,7 51,7 vil VI y'. ) TABLEAU III Compositionsde solutions de substrats isomèrisées à 700 C et 110,400 Traitement de la solution Composition en hydrates de carbone ( 7 en poids, en matière sèche sans cendre) Fructose Glucose Psicose Polysaccharides non isomérisée isoméris(-e à 700 C isomêrisée à 110,40 C 52,3 57,2 Couleur (CIRF X 100) 99,2 46,9 41,5 o o 0,3 0,8 0,8 l'o 0, 6 0,7 19,8 N VI m'a T A BL EAU IV Compositions de solutions de substrats isomèrisées à 7 O'C et 103,30 C Traitement de la solution (%E Fructose Composition mn poids, en Glucose en hydrates de carbone matière sèche sans cendre) Psicose Polysaceharides non isomêrisée isoméI ErisêP, à 7 Q O isomérisée à 103,30 C o 51,3 56,3 Couleur (CIRF X 100) 97, 6 46,4 41,5 o o 0,1 2,4 2,3 2,2 L-n 0,5 0,7 34,0 r 11) ui N) % O ui - 4, -à T AB L EAU V Compositions de solutions de substrats isomérisees à 700 C et 112,60 C Traitement de la solution Composition ( 7 % en poids, Fructose en hydrates de carbone en matière sèche sans Glucose Psicose Couleur endre> (CIRF Po'lysacchari des X 100) o' nnn isomérisée isomérisée à 7 00 W isoméêris Qe à 112,60 C 51,4 ,4 96, 9 ,9 42,0 o o o'l 3,1 2,7 2,5 o 8,5. N) (J 1 o T A BL EAU VI Compositions de solutions de substrats isomnêrisées à 70 'C et 105,80 C Traitementl de la solution Composition en hydrates de carbone Couleur (%en poids, en matière sèche sans cendre) (CIRF Fructose Glucose Psicose Polysaccharides XIOO) non isomèrisée isomêrisée à 7 O'C isomérisee à 105, 80 C 1 51,4 54,8 96, 9 ,9 42,3 o o 1 3, 1 2,7 2,8 o o 1,8 -J N N o R E V E N D I C A T I O N S 1 Procédé pour isomériser le glucose en fructose, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une liqueur d'alimentation contenant du glucose avec la glucoseisomérase chimi- quement stabilisée à une température d'environ 90 à environ 140 'C à un pli d'environ 3 à environ 8, pendant une durée de contact suffi- sante pour obtenir dans ladite liqueur une teneur finale d'au moins environ 53 à 60 % en poids de fructose, par rapport 2 la teneur totale en hydrates de carbones sans formation notable de psicose ou d'aitres sucres n'appartenant pas aux séries du fructose et du glucose, ou leurs mélanges. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la liqueur contenant du glucose est obtenue par hydrolyse d'amidon de mais. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite liqueur d'alimentation de glucose est obtenue par isomérisation d'un hydrolysat d'amidon de mais jusqu'à une teneur en fructose d'environ 52 % par rapport à la teneur totale en hydrates de carbone. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé en ce que la source de la glucoseïsomérase est un micro-organisme choisi parmi l'espèce Streptomyces et ses mutants, variants et modifications génétiques. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la source de glucoseisomérase est un microorganisme choisi parmi Streptomyces sp ATCC 21175, ses mutants, variants et modifications génétiques. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la source de glucoseisomérase est un microorganisme dans lequel on a introduit un gène de mutation de glucoseisomérase, ledit gène de mutation produisant une glucose- isomérase de stabilité thermique élevée. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la glucoseisomérase est une glucose- isomérase thermiquement stable. 8 Procédé selon la revendication 6 ou 7, carac- térisé en ce que la glucoseisomérase thermiquement stable est obte- nue à partir de Bacillus Stearothermophilus. 9 Procédé selon la revendication 6 ou 7, carac- tèrisé en ce que la _lucoseisomérase thermiquement stable est obte- nue à partir de Bacillus licheniformis. Procédé selon la revendication 6 ou 7, carac- térisé en ce que la glucoseisorérase thermiquement stable est obte- nue à partir d'un thermophile appartenant auggenres Thermoactinomvyces, Tlermopol-s Dora, Thermomonospora ou Pseudonocardia. Il Procédé selon la revendication 6 ou 7, carac- térisé en ce que la glucoseisomérase thermiquement stable est obte- nue à partir d'un micro-organisme du genre Ampullariella. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 11, caractérisé en ce que le milieu d'isomérisation contient une quantité d'un sel hydrosoluble d'acide sulfureux inhibant la dénaturation de l'enzyme. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tiens 1 à 12, caractérisé en ce que la liqueur d'alimentation contenant du glucose contient d'environ 30 à 50 % en poids d'hydrates de carbone. 14 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 13, caractérisé en ce que la liqueur d'alimentation contenant du glucose est mise en contact avec la glucoseisomérase chimiquement stabilisée à environ 100-110 C. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 14, caractérisé en ce que le milieu d'isomérisation est maintenu à environ p H 5-6,5. 16 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 15, caractérisé en ce que la durée de contact est d'environ 2 min à environ 30 min. 17 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 16, caractérisé en ce que lqglucoseisomérase chimiquement stabilisée est utilisée sous une forme immobilisée. 18 Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la glucoseisomérase chimiquement stabilisée est immobilisée sur diéthylaminoéthylcellulose. 19 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 18 caractérisé en ce que, dans une lère étape, la liqueur d'alimentation contenant du glucose est mise en contact avec la glucoseisomércse à une température d'environ 20 à 80 C, un p Hl d'environ 6 à 9 et pendant une durée de contact d'environ 0,5 à 2 h, pour atteindre une teneur en fructose dans ladite liqueur allant jusqu'à environ 52/ en poids, par rapport aux hydrates de carbone totaux dans ladite liqueur de fructose, etdans une 2 ème étape, la température du milieu d'isomérisation est élevée à envi ron 90-140 C, le p H étant réglé si nécessaire dans l'intervalle d'environ 3 à 8; et la liqueur contenant le fructose est mise en contact avec la glucoseisomérase chimiquement stabilisée pendant une nouvelle durée suffisante pour augmenter la teneur en fructose à environ 53-60 % en poids. 20 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 19, caractérisé en ce que le sirop de fructose-glucose obtenu est refroidi à une température inférieure à 80 C; 21 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 20, caractérisé en ce que le mélange d'isomérisation est refroidi à une température d'environ 20 à 80 C après élimination de l'enzyme en contact avec le mélange d'isomérisation.