Brevet FR2526808A1 — publié le 19831118

A PROCEDE PERFECTIONNE DE PREPARATION DE L-LYSINE. La présente invention a pour objet un procêde perfectionné de pré- paration de L-lysine et se rapporte plus particulièrement à un procédé d'obtention d'une masse métabolisable contenant de la L-lysine, cette masse étant destinée a servir d'additif alimentaire pour l'alimentation animale. On sait qu'il est nécessaire de compléter la nourriture des ani- maux par apport de protéines lorsque la quantité de protéines fournie aux animaux est trop faible, ce qui est notamment le cas d'une alimenta- tion essentiellement basée, par exemple, sur des graines de céréales qui on le sait, présentent une teneur faible en protéines. La qualité des protéines est en fait surtout définie par leur te- neur en acides aminés et notamment en L-lysine, aussi utilise-t-on cou- ramment de la L-lysine à titre d'additif pour améliorer la valeur ali- mentaire de certains aliments destinés aux animaux Cette L-lysine est, en général, mise sur le marché de l'alimentation animale sous la forme d'une poudre formée d'un mélange contenant environ 10 % de lysine asso- ciee a des charges et autres produits métabolisables, ladite poudre étant formée par mélange des divers constituants. La L-lysine employée à cette fin a été jusqu'à présent essentiel- lement préparée par synthèse chimique,hydrolyse protéique ou fermentation. La production de lysine par synthèse chimique est basée surtout sur l'utilisation des dérivés cycliques Ainsi à cette fin connaît-on des modes de production partant du caprolactame, du dihydropyrane ou encore du cyclohexane L'inconvénient de ces méthodes chimiques toute- fois est de ne conduire qu'a un mélange racémique de D et L-lysine, et comme la D-lysine ne constitue pas un aliment assimilable, il est neces- saire d'effectuer des opérations supplémentaires, soit de séparation des isomères D et L de la lysine, soit de transformation de l'isomère D enl' isomère L Cette transformation est en général effectuée par une racémase d'Achromobacter obae suivie d'une aminohydrolase de Cryptococcus lauren- tii et conduit à la conversion de 99,8 % du racémique en L-lysine. Cette liethodc, en deux itapes est complique et onéreuse. La prodct 1 i ie -lysine par hyiiroly 3 e des protéines ne s'est pas non plus montrée rentable industriellement, le rendement étant faible et le prix de revient élevé. En fait, ces méthodes pas synthèse chimique ou hydrolyse protéique se sont révélées trop onereuses, aussi a-t-on développe, ces dernières années, des méthodes basees sur un processus fermentatif. Ainsi Davis (dans la revue Nature, Londres 169, 534 ( 1952) a mis en évidence chez E Coli,auxotrophe, une accumulation de l'acide diaminopimé- i 0 lique (DAP) dans un milieu de culture, dont la conversion en lysine a été réalisée, avec un rendement de 100 % par Acrobacter aérogénes. De même, Haskins (USP 2902409) a obtenu un rendement de production de L- lysine de 0,2 à 0,3 g/l en utilisant deux souches de U Maydis En fait, U Mayais est la meilleure souche sauvage excrétrice de L-lysine ( 1 g/l); cependant, des productions meilleures du point de vue industriel ont été obtenues par utilisation de mutants auxotrophes et de mutants de régula- tion de bactéries Corynèformes (article de Sano et Shiio dans la revue J Gen App Microbiol 13,349, ( 1967) En fait la fermentation est le procéde industriel présentement le plus rentable économiquement. Tous les procédes ainsi décrits conduisent à des lysines de grande pureté dont le prix de revient est relativement élevé Ils impliquent, en effet, un grand nombre d'opérations pour parvenir a la purification et & l'isolement de la lysine puis à sa combinaison avec les diverses charges et produits métabolisables précités pour former les masses alimentaires constituant l'additif alimentaire précité. L'idée de base qui a conduit à la présente invention a été d'obte- nir une L-lysine à l'aide d'un procédé ne nécessitant ni les opérations de séparation et d'isolement, ni les opérations de recombinaison que né- cessitent les procédes mis en oeuvre jusqu'à présent. A partir de cette idée, les demandeurs ont recherché un procédé nouveau de préparation de lysine à partir d'un substrat pouvant constituer lui- même un aliment et donnant lieu à des produits d'hydrolyse qui soient eux-mêmes des aliments. Les demandeurs ont pensé partir de lactoserumet dejuslactosé (ultraflltrat); cependant, compte tenu de ce que les souches susceptibles de produire les mutants de Escherischia Coli se developpent sur lactose, on a tenté de produire des mutants de Escherischia Coli qui secretent de la L-lysine. On est en effet arrivé à produire de la lysine grace à l'emploi de ce mutant sur lactose, mais cette méthode n'est pas satisfaisante car la quantité de L-lysine secrétéé est trop faible. En fait, les recherches et développements qui ont conduit à la pré- sente invention ont permis d'obtenir un additif à base de lysine, suscep- tible d'être utilisé pour complémenter les régimes alimentaires animaux, ne nécessitant pas de purification lors de leur préparation et contenant à côté de la lysine des constituants résultant de l'hydrolyse ou de l'as- similation du mélange de départ qui sont eux-mêmes des aliments. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de ly- sine destinée à des usages alimentaires,notamment pour l'alimentation animale, qui consiste à partir de lactosérum ou jus lactosé que l'on soumet à une hydrolyse enzymatique, acide ou catalytique en présence d'une souche pro- ductrice de lysine puis à sécher le mélange obtenu. On rappelle que le lactosérum est la fraction liquide du lait qui subsiste après séparation du caillé destiné à la préparation du fromage. La composition du lactosérum est fonction du lait lui-même et également de la nature du fromage fabriqué. La composition moyenne d'un lactosérum est: à 85 % de lactose, 5 à 6 X de protéines, à 10 % de sels minéraux. Ce procédé présente l'avantage: que la vitesse de formation de lysine est relativement grande du fait que la souche productrice de lysine consomme le glucose ré- sultant de l'hydrolyse enzymatique, c'est-à-dire-de la réaction: lactose + glucose + galactose qu'il est aisément reproductible et conduit à des rendements cons- tants. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'hydrolyse enzymatique est mise en oeuvre par l'intermédiaire d'enzymes, de préférence du type s-galactosidase. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la souche produc- trice de lysine est l'une des souches appartenant au groupe des Corynebac- térium glutamicum (= micrococcus glutamicus), Brevibactérium, Arthrobac- ter sp, Corynebactérium lilium. La présente invention a également pour objet une masse métabolisa- ble contenant de la lysine obtenue à l'aide d'un procédé précité, ladite lysine formant 5 à 30 de ladite masse, le reste étant constitué de char- ges ou produits métabolisables et de préférence au moins en partie de bio- masse constituée par les résidus sécréteurs de lysine. La présente invention présente l'avantage de permettre la valorisa- tion dulactosérum, produit souvent séché mais dont la valorisation est irrégulière et faible, et qui est souvent encore rejeté en tant que déchet. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaitront A la lecture de la description suivante et des exemples donnés à titre non limitatif. Exemple 1 Exemple de production en fiole agitée: le milieu de culture est prépare à partir d'une solution de lactoserum ( 10 U 9/l) hydrolysée par action de la o-galactosidase (concentra- tion finale en glucose 45 g/l) à laquelle on ajoute: (NH 4)2 SO 4 13,4 9/1 KH 2 PO 4 2,2 g/l Mg SO 4 0,8 g/1 extrait de levure 5 g/l thiamine 5 10 g/1 biotine 5 10 g/1 Apres un traitement de stérilisation de 30 minutes à 1050 C, le mi- lieu de culture est ensemencé par une souche de Corynebactérium. Les fioles sont incubées sur un agitateur rotatif ( 200 rpm) a la température de 30 C pendant 72 heures. On obtient, après broyage éventuel, à partir de 1 litre de milieu de culture, soit 103 g de poudre séche contenant: lysine 17,5 % biomasse 5,8 % galactose 42,7 % lactose 9,7 % sels minéraux 24,3 % La lysine est dosée selon la méthode de Chinard et Work (JL BIOL. Chem 51,199 ( 1952). La souche de Corynebactérium employée présente les caractéristiques suivantes: gram positif, aérobie, immobile, ne sporulant pas, résistante à l'AEC ( 0,5 g/1), résistante a l'acide nalédixique ( 30 pg) antibiotique agissant sur la réplication, pigmentation jaune des clones, le plus souvent en vieillissant. Exemple 2 Exemple de production en fermenteur: le même milieu préparé à partir de jus lactosé hydrolysé (concen- tration en glucose de 50 g/l) est introduit dans un fermenteur Biolafitte de 20 litres ensemencé par la souche de Corynebactérium précitée On opère dans les conditions expérimentales suivantes: température 30 C p H 6,8 aération 60 v/v/h et obtient 20 g/l de lysine en 48 heures. Dans les mêmes conditions expérimentales mais avec 80 g 9/1 de gli- cose, on a pu obtenir 28 g/l de lysine. En fait, on obtient 154 g/ de poudre sèche contenant: L-lysine 18,2 % biomasse 9,7 % galactose 45,5 % lactose 13,0 % sels minéraux 13,6 % Le fermenteur Biolafitte employé est équipé d'un cylindre directeur permet- tant une recirculation du milieu,îlest régulé en température, p H, con- centration d'oxygène dissous et équipé d'un système mécanique contre la mousse Ce fermenteur comporte un agitateur consistant en un dis- que avec des palettes légèrement inclinées (angle de l'ordre de 30 ) de sorte que le milieu de culture soit propulsé de la périphérie du tube cylindrique vers une position circumaxiale. Exemple 3 Exemple de production en fermenteur Biolafitte: dans un fermenteur Biolafitte semblable à celui de l'exemple pré- cédent, on emploie le milieu suivant: (NH 4)2 SO 04 20 g /l Fe S 4 32 10 / *FeS Oq 2 10 g/1 *Mn 5 04 si 5 * @sts 3 oa 9 v*e a MS 04, , , , ,, o solution biotine vitamine Bl extrait de levure et la fermentation est effectuée sur glucose de celui-ci avec le temps. On parvient aux résultats suivants: accumulation finale de lysine sucre consomme sucre résiduel production de biomasse -rendement lysine/sucre -3 7,7 1 O g/1 0,37 9/1 ml 500 g 9/1 500 pg/l g/1 à 50 9 g/l avec apport 27,6 o O g/1 g g g i 5 Exemple 4 Fermentation avec jus lactosé hydrolisé, démineralisé ne contenant que 5 % de cendre: matière sèche 600 g/kg % hydrolise 90 % matière azotée 23 g/kg À cendre 50 g/kg citrate 10 g/kg lactate 5 g/kg En utilisant comme milieu le même milieu que celui qui est indiqué dans l'Exemple 3, on parvient après fermentation à une poudre ayant la composition suivante: accumulation finale de lysine 19 % lactose 5,5 % galactose 49,5 % glucose résiduel 10,3 % production de biomasse (poids sec) 15,7 % ce qui correspond a un rendement sur sucre consommé de 38,3 %. Exemples 5 et 6 On effectue une fermentation sur jus lactosé en poudre auquel est ajouté du glucose employé à raison de 40 g/1 et 62 g/1 respectivement et sans apport dans le temps On utilise le même milieu que dans l'Exem- ple 3, à la teneur en glucose près On parvient aux résultats suivants: T lactose 8,8 g/1 14 g/1 galactose 40 g/l 62,5 g/1 glucose consommé 40 g/l 45,2 g/l glucose résiduel O 17,3 g/1 production de biomasse (poids sec) 13 g/1 16 g/1 rapport (%): lysine/sucre consommé 28,75 24,3 activité spécifique globale de production de lysine 0,91 0,69 (biomasse/2 + lysine) produite rendement = X 100 = 29,5 % 42 % glucose consommé Dans ces conditions: 40 g/1 de glucose et sans apport dans le temps de celui-ci, on note: la fin de la croissance bactérienne ainsi que la fin de la produc- tion de lysine sont atteintes au bout de 30 heures de culture. la croissance bactérienne est régulière, c'est-à-dire qu'il n'y a pas eu de rupture de pente. le phénomène d'alcalinisation apparait au court des premières heu- res de fermentation. Par contre, pour 62 g/1 de glucose au départ, la courbe de croissance bacterienne est diphasique (deux phases de croissance) La première débute à deux heures de culture et se termine à 22 heures et la deu- xième commence à 22 heures et prend fin à 40 heures de culture La consonmmation de glucose est incomplète (glucose résiduel: 17,3 g/1). On constate, par ailleurs, que la consommation de glucose devient linéaire à partir de la phase de latence de la deuxième phase de croissance. Exemples 7 et 8 exemples de production en fermenteur Biolafitte sur un lactosérum GLUCOSE F 40 % g/l 62 % g/1 accumulation finale de lysine 11,8 g/1 11 g/1 252680. déproteiné hydrolyse par voie catalytique (donc déminéralisé) d'une part, et hydrolyse par voie enzymatique d'autre part, ayant les compositions suivantes: matières sèches totales matières minérales matières azotées (totales) % hydrolyse lactose glucose galactose - p H La fermentation est effectuée à 68 apport de celui-ci dans le temps. On parvient aux résultats suivants: lactosérum hydrolisé par voie par voie catalytique enzymatique exemple 7 exemple 8 g/100 g traces 0,3 g/100 g % 11,7 g/100 g 24,0 g/100 g 24,0 g/100 g 7,5 ,7 2,7 ,8 ,8 g/100 g 9/100 g g/100 g % g/100 g 9/100 g g/100 9 J I 9/1 de glucose au départ et sans Exemple 7 Exemple 8 voie voie catalytique Enzymatique lysine produite 16 g/1 11 g/1. biomasse produite (poids sec) 14 g/l 16,5 g/1 lactose 34 g/l 20 g/1 glucose consommé 68 g/1 33 g/1 glucose résiduel O 17,4 g/1 galactose 68 g/1 51 g/1 9 2526808 La figure 1 représente une installation dans laquelle le procédé selon l'invention est susceptible d'être mis en oeuvre. Cette installation comporte une conduite 1 d'arrivée du lactoserum dans un réacteur 2 d'hydrolyse acide ou d'hydrolyse enzymatique, la masse ainsi traitée étant amenée par une conduite 3 dans un bac de fermentation 4. Le mélange de la souche et de la base alimentaire de la souche (glucose) est préparé dans l'enceinte 5 et introduit par la conduite 6 dans ledit ba: de fermentation 4. La'masse fermentée est amenée par la conduite 7 dans une zone de préconcerr- tion comprenant plusieurs préconcentrateurs et de là la masse préconcentr- obtenue est conduite par la conduite 9 dans une zone d'atomisation 10 dont on retire en cuve le lactoserum enrichi en L-lysine par la conduite 11. Le procédé de sechage par atomisation peut être remplacé par tout autre procédé de sechage. Bien entendu, la présente invention n'est pas limitée aux modes de r'a. tion décrits et représentés; elle est susceptible de nombreuses variante accessibles à l'homme de l'art sans que l'on ne s'écarte pour cela de l'V de l'invention. 1 ' REVENDlCATIONS 1. Prxci de préparation de lysine destinée à des usages alimen- airies, qui consiste à partir de lactosérum ou jus lactose que l'on soumet une hydrolyse enzymatique, acide ou catalytique en présence d'une souche productrice de lysine puis à sécher le mélange obtenu. 2. Procéde selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydro- ?yse enzymatique est mise en oeuvre par l'intermédiaire d'enzymes. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'hydrolyse enzymatique est mise en oeuvre par l'intermédiaire de e-galac- tosidase. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que hyidrolyse est mise en oeuvre par voie catalytique sur resines échan- euses d'ions. 5. Procédé selon une quelconque des revendications i à 4, caracté- l -isé en ce que la souche productrice de lysine est l'une des souches ap- partenant au groupe Ces Coryneb turium 'iutamicum (= micrococcus gluta- wicus), Brevibactérium, Arthrobacter Sp, Corynebactérium lilium. 6. Masse métabolisable contenant de la lysine obtenue à l'aide du procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite lysine forme 5 à 30 % de ladite masse, le reste étant constitué de charges ou produits métabolisables. 7. Masse métabolisable selon la revendication 6, caractérisée en ce que le reste précité est formé au moins en partie de biomasse constituée par les résidus secréteurs de lysine. 8 Masse métabolisable selon une quelconque des revendications 1 à 7,caractérisée en ce que le lactosérum est un lactosérum déminéralisé. 9. Masse métabolisable selon une quelconque des revendications 1 à 8,caractérisée en ce que le lactosérum est un lactosérum non déminéralisé, la concentration en glucose dans le milieu de fermentation étant de préfé- rence de l'ordre de 40 g/l.