Brevet FR2528070A1 — publié le 19831209

La présente invention se rapporte à un vecteur d'expression, à sa production et à son utilisation Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un vecteur d'expression ayant une forte expression génétique qui porte un codage génétique pour une protéine liant les phosphates, à un procédé pour sa production et à un procédé pour la production d'un polypeptide souhaité par l'expression génétique en utilisant ledit vecteur d'expression. Le terme "expression génétique" utilisé ici est destiné à signifier la translation, en polypetide, d'un codage génétique pour la séquence du polypqtide Dans l'expression génétique, un codage de la chaîne de l'acide désoxyribonucléique pour la séquence du polypeptide est d'abord transcrit en un acide ribonucléique complémentaire appelé acide ribonucléique messager et ensuite, l'acide ribonucléique messager ainsi transcrit est translaté en polypeptide ci-dessus mentionné. En 1970, la technique de transformation de Escherichia coli a été établie lM Mandel et A Higa, Journal of Molecular Biology, 53, 159-162 ( 1970)3, et on a trouvé un enzyme de restriction EH O Smith et K.W Wilcox, Journal of Molecular Biology, 51, 379-391 ( 1970)l Ces découvertes ont amené des progrès rapides dans la science génétique et la technologie des cellules. Par exemple, la technique fondamentale de la recombinaison génétique révélée dans le brevet US NO 4 237 224 a été établie en se basant sur ces découvertes Par ailleurs, de nouveaux vecteurs ont été produits et des méthodes de production de substances utiles par science génétique ont été proposées Les nouveaux vecteurs ci-dessus sont révélés par exemple, dans la publication du brevet germanique NI 2 712 615, la description du brevet français NO 2 441 659, la description du brevet US NO 4 273 875, la publication du brevet PCT NI WO 79/01169, la description du brevet britannique NO 2 052 516 et la description du brevet EPC NI 32 238 Les procédés ci-dessus mentionnés de production de substances utiles sont révélés, par exemple, dans la description du brevet US No 4 375 514. Cependant, toutes les publications ci-dessus révèlent uniquement le fait que des substances utiles souhaitées peuvent être produites par l'expression génétique Les techniques des publications de l'art antérieur ci-dessus mentionnées présentent l'inconvénient que le rendement des substances utiles souhaitées n'est pas suffisamment élevé Par conséquent, le développement d'un vecteur d'expression capable de produire des substances utiles à un haut rendement est tout à fait souhaité dans le technique. En conséquence, du point de vue application industrielle de la science génétique et la réduction du prix pour la production de substances utiles, il est souhaitable, dans la technique, de développer un vecteur d'expression ayant une excellente puissance d'expression génétique Les techniques fondamentales de la recombinaison génétique sont révélées dans Proceedings of the National Academy of Science, E U A, 70, 3240-3244 ( 1973) et idem, 71, 1743-1747 ( 1974), mais aucune méthode générale n'est proposée pour isoler un gène ayant une excellente puissance d'expression génétique dans un grand nombre de gènes présents dans la nature, ce qui conduit à des difficultés pour résoudre le problème ci-dessus. Les présents inventeurs ont fait des études extensives et intensives pour résoudre le problème ci-dessus mentionné Par suite, on a trouvé qu'un codage génétique d'une protéine liant les phosphates pouvait donner un vecteur d'expression ayant une expression génétique extrêmement forte en comparaison au cas des vecteurs conventionnellement connus Les présents inventeurs ont alors réussi à préparer un tel vecteur d'expression porteur d'un codage génétique pour une protéine liant les phosphates par la technique des clones, à une forte efficacité La présente invention a été faite en se basant sur une telle découverte et un tel succès. Par conséquent, la présente invention a pour objet un vecteur d'expression excellent par sa puissance d'expression génétique. La présente invention a pour autre objet un procédé de préparation d'un vecteur d'expression excellent par sa puissance d'expression génétique. La présente invention a pour autre objet un procédé de production de polypeptides à un haut rendement au moyen de l'expression génétique en utilisant un vecteur d'expression de la sorte ci-dessus mentionnée. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant un mode de réalisation de l'invention et dans lesquels: la figure 1 illustre les cartes de restriction de plasmides p SN 401, p SN 507,p SN 508 et p SN 518; et la figure 2 illustre l'organigramme du procédé de préparation du plasmide p SN 2507, illustré avec les cartes de restriction des plasmides p KN 402 A, p SH 101 et p SN 2507. Sur les figures 1 et 2, le symbole pho S désigne un codage génétique pour une protéine liant les phosphates d'Enterobactériacées (concernant lesquelles une explication détaillée sera donnée ci-après) Les symboles pho T, pst A et pho U désignent chacun des gènes qui sont groupés sur l'acide désoxyribonucléique chromosomique de E coli avec pho S (dont une explication détaillée sera donnée ci-après). Les symboles qui suivent sont utilisés pour dénoter des séquences de reconnaissance pour les enzymes de restriction: Eco RI, Iàpa I, Pst I, E&MI, Mlu I Hind III, Ava I, Hinc II et Sma I (les chiffres en suffixe au symbole ci-dessus, comme on peut le voir sur les figures 1 et 2 sont utilisés pour identifier les sites respectifs de reconnaissance d'un enzyme de restriction). D'autres abréviations sont respectivement les suivantes: Tn 3 (Ap R) (indiqué par É 2): transposon porteur du codage génétique de résistance à l'ampicilline Rep: gène de réplication ori: origine de la réplication Kb: 1 000 paires de nucléotides X I 1: partie abandonnée. Selon un aspect de l'invention, on prévoit un vecteur d'expression qui comprend un fragment d'acide désoxyribonucléique comprenant un codage génétique pour une protéine liant les phosphates et un réplicon choisi parmi les plasmides et les bactériophages, ledit fragment d'acide désoxyribonucléique étant lié audit réplicon. Le terme "réplicon" utilisé ici est destiné à signifier un vecteur qui peut être reproduit et qui a un gène pour un trait phénotypique et un site de restriction a&téàylioaioer un fragment d'acide désoxyribonucléique donneur. Un réplicon est un porteur de l'information génétique que l'on connaît comme unité de réplication d'une chaine de nucléotides de façon que, quand la réplication commence, la réplication soit ensuite effectuée jusqu'à la fin de la séquence des nucléotides Pour un tel réplicon, on peut mentionner les plasmides, les bactériophages, les virus et analogues Les réplicons comprennent des réplicons de l'acide désoxyribonucléique et des réplicons de l'acide ribonucléique, mais dans la présente invention, les réplicons de l'acide ribonucléique ne sont pas préférés d'un point de vue pratique Pour les réplicons de l'acide désoxyribonucléique, on peut mentionner les plasmides et les fragments d'acide désoxyribonucléique pouvant être reproduits dérivés de virus de l'acide désoxyribonucléique, des cellules procaryotiques et des cellules eucaryotiques Parmi ceux-ci, comme réplicon à utiliser dans la présente invention, on préfère les plasmides et les bactériophages Convention- nellement, les réplicons de l'acide désoxyribonucléique portant un gène conférant une résistance antibiotique sont largement utilisés pour produire un clone de divers gènes La méthode largement utilisée de formation d'un clone d'un gène comprend la digestion de l'acide désoxy- ribonucléique chromosomique avec un enzyme de restriction pour obtenir un fragment d'acide désoxyribonucléique portant le gène souhaité, la ligature dudit fragment d'acide désoxyribonucléique audit réplicon de l'acide désoxyribonucléique, la transformation d'un organisme unicellulaire avec ledit réplicon de l'acide désoxy- ribonucléique comprenant ledit fragment d'acide désoxy- ribonucléique pour former des transformants, l'isolement des transformants de l'organisme unicellulaire parent au moyen de la résistance antibiotique impartie par ledit réplicon de l'acide désoxyribonucléique, et l'incubation des transformants isolés, ainsi est produit le clone du réplicon de l'acide désoxyribonucléique comprenant ledit fragment d'acide désoxyribonucléique. Le codage génétique pour une protéine liant les phosphates est respondable du système de transport des phosphates et du système de métabolisme des phosphates et, par évolution, il existe largement dans les cellules procaryotiques et les cellules eucaryotiques unicellulaires. Entre autres, le codage génétique pour une protéine liant les phosphates d'Escherichia coli a été comparativement bien étudié en détail et en particulier le gène d'Escherichia coli est appelé pho S gène Le pho S gène existe non seulement dans Escherichia coli mais également dans des bactéries appartenant à Enterobactériacées En conséquence, le pho S gène de toute bactérie appartenant àEnterobactériacées peut être utilisé dans la présente invention Le pho S de Escherichia coli est groupé avec pho T, pst A et pho U à 83 minutes sur la carte génétique r standard de E Culi Blachkl, B J et K B Low, Microbiol Rev 44, 1-56 ( 1980)l Pho T, pst A et pho U sont des gènes dont la fonction se rapporte au transport des phosphates et au métabolisme des phosphates Comme on l'a mentionné cidessus, les gènes pho S, pho T, pst A et pho U sont groupés sur un chromosome de E coli et par conséquent lorsqu'un fragment d'acide désoxyribo- nucléique portant le gène pho S est préparé à partir d'acide désoxyribonucléique chromosomique de E coli au moyen d'un enzyme de restriction, les gènes pho T Qst A et pho U sont également incorporés dans le fragment d'acide désoxyribonucléique Le codage génétique pour une protéine liant les phosphates de À,glm S phase a également été étudié et peut être utilisé dans la présente invention. Par ailleurs, des gènes, dont la fonction se rapporte au système de transport des phosphates et au système de métabolisme des phosphates, de la levure et d'une bactérie autre qu'une bactérie appartenant à Entérobactériacées peuvent être utilisés Dans ce cas, il est nécessaire de choisir un réplicon et un hÈte approprié pour les gènes, dont la fonction se rapporte au système de transport des phosphates et au système de métabolisme des phosphates, de la levure et d'une bactérie autre qu'une bactérie appartenant à Entérobactériacées. Selon un autre aspect de l'invention, on prévoit un procédé de préparation d'un vecteur d'expression qui comprend: - ( 1) la préparation d'un acide désoxyribonucléique chromosomique contenant un codage génétique pour une protéine liant les phosphates à partir d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées; ( 2) la scission de l'acide désoxyribonucléique chromosomique avec un enzyme de restriction pour produire des fragments d'acide désoxyribonucléique; ( 3) la ligature desdits fragments d'acide désoxyribonucléique à un réplicon choisi parmi des plasmides et des bactériophages; ( 4) la transformation des cellules d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées avec ledit réplicon ayant le fragment d'acide désoxyribonucléique qui lui est ligaturé pour former des transformants comprenant ceux qui contiennent un vecteur recombinant comprenant les fragments d'acidedésoxyibonucléique portant un codage génétique pour une protéine liant les phosphates; ( 5) le choix de transformants contenant le vecteur recombinant comprenant les fragments d'acide désoxyribonucléique portant un codage génétique pour une protéine liant les phosphates, desdits transformants; et ( 6) l'isolement du vecteur recombinant comprenant les fragments d'acide désoxyribonucléique portant le codage génétique d'une protéine liant les phosphates, des transformants choisis. A l'étape ( 1) du procédé de la présente invention, l'acide désoxyribonucléique chromosomique contenant un codage génétique pour une protéine liant les phosphates (appelé ci-après simplement "pho S gène") est préparé à partir d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées par une technique habituelle d'isolement comme une lyse, une centrifugation ou analogue. A l'étape ( 2), l'acide désoxyribonucléique chromosomique préparé à l'étape ( 1) ci-dessus, est scindé avec un enzyme de restriction pour produire des fragments d'acide désoxyribonucléique contenant un fragment d'acide désoxyribonucléique portant le pho S gène. A l'étape ( 3) du procédé de la présente invention, comme on l'a mentionné ci-dessus, on peut utiliser, pour le réplicon, tous plasmideet bactériophages La ligature des fragments d'acide désoxyribonucléique au réplicon peut être accomplie en utilisant une ligase selon la méthode habituelle (voir par exemple la description du brevet US N 4 237 224) Au moins l'un des fragments d'acide désoxyribonucléique portant un pho S gène et un réplicon a un gène pour un trait phénotypique. A l'étape ( 4) ci-dessus, les cellules d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées sont transformées avec le réplicon portant le fragment d'acide désoxyribo- nucléique préparé à l'étape ( 3) Comme bactérie apparte- nant à Entérobactériacées, on peut mentionner Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia et Shigella Par ailleurs, outre les bactéries ci-dessus, on peut utiliser des cellules mutantes de chacune des bactéries ci-dessus Il est bien entendu nécessaire de choisir la bactérie appropriée, en considérant la réplicabilité du réplicon dans les cellules d'une bactérie Par exemple, on peut avantageusement utiliser pour l'hôte, les espèces Escherichia coli, Serratia oul'espèce Salmonella, lorsque l'on utilise, pour le réplicon, un plasmide bien connu du type relaxé comme p BR 322, p BR 325, p ACYA 177 ou p KN 410. A l'étape ( 5) ci-dessus, les transformants sont d'abord isolés des cellules parentes d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées au moyen du trait phénotypique comme une résistance aux médicaments imparti par le réplicon ayant un gène pour un trait phénotypique. Alors, les transformants contenant le vecteur recombinant comprenant le fragment d'acide désoxyribonucléique portant le pho S gène sont choisis parmi les transformants isolés ci-dessus en utilisant comme critère, la quantité de protéine liant les phosphates dans les transformants. La quantité de la protéine liant les phosphates dans chacun des transformants est déterminée comme suit. D'abord, la protéine liant les phosphates est isolée du transformant et est purifiée par une technique conven- tionnelle comme une lyse, une centrifugation ou un dessalage Alors, la quantité de protéine purifiée liant les phosphates est déterminée par une technique habituelle comme une électrophorèse sur gelagarose-SDS La quantité de la protéine liant les phosphates dans chacun des transformants est comparée à la quantité de la protéine liant les phosphates produite à partir d'une cellule parente d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées non transformée avec le réplicon portant le fragment d'acide désoxyribonucléique Les transformants ayant une plus grande quantité de protéine liant les phosphates que la cellule parente de la bactérie appartenant à Entéro- bactériacées sont choisis. Dansle cas o une cellule mutante qui produit une phosphatage alcaline non seulement en condition de manque de phosphate mais également en condition riche en phosphate est utilisée pour la cellule d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées à l'étape ( 4) ci-dessus, le choix des transformants contenant le réplicon comprenant le fragment d'acide désoxyribonucléique portant le phôS gène à l'étape ( 5) ci-dessus peut être effectué très facilement sans détermination de la quantité de la protéine liant les phosphates dans chacun des transformants La raison en est la suivante Lorsqu'une telle cellule mutante est transformée avec le réplicon portant le fragment d'acide désoxyribonucléique préparé à l'étape ( 3) ci-dessus, la cellule mutante produit de la phosphatage alcaline en condition de manque de phosphate mais ne produit pas de phosphatase alcaline en condition riche en phosphate au moyen de la fonction du pho S gène contenu dans le fragment d'acide désoxyribonucléique ligaturé au réplicon. Par conséquent, quand la transformation est effectuée en condition riche en phosphate, des transformants négatifs à la phosphatage alcaline sont choisis. A l'étape ( 6) ci-dessus, le vecteur recombinant comprenant le fragment d'acide désoxyribonucléique portant le pho S gène est isolé des transformants choisis à l'étape ( 5) par une technique conventionnelle comme une lyse, une centrifugation ou analogue. Par ailleurs, il faut noter qu'un vecteur d'expression qui porte un gène, dont la fonction se rapporte au système de transport des phosphates et au système de métabolisme des phosphates, de la levure ou d'une bactérie autre qu'une bactérie appartenant à Entérobactériacées peut être préparé sensiblement selon la même méthode que celle ci-dessus décrite Par ailleurs, il faut noter qu'au lieu du fragment d'acide désoxy- ribonucléique préparé selon l'étape ( 1) et ( 2) de la méthode ci-dessus, un fragment d'acide désoxyribonucléique préparé à partir de phages comme > -glm S phage peut être utilisé. Le vecteur recombinant préparé selon la méthode ci-dessus mentionnée peut être partiellement laissé, par rapport à la portion de fragment d'acide désoxyribonucléique et/ou la portion du réplicon, en utilisant un enzyme de restriction tout en retenant le pho S gène et en soumettant le vecteur recombinant laissé résultant à une religatura- tion au moyen d'une ligase, pour préparer ainsi un vecteur recombinant reconstruit ayant une dimension réduite Le vecteur recombinant reconstruit devient plus facile à manipuler parce que le nombre de sites de restriction du vecteur recombinant reconstruit diminue en comparaison à celui du vecteur recombinant d'origine. Par ailleurs, lorsqu'un codage génétique d'un certain polypeptide est ligaturé au vecteur recombinant reconstruit, le rapport de la longueur du codage génétique pour le polypeptide à la longueur totale du vecteur recombinant devient supérieur à celui dans le cas o le codage génétique pour le polypeptide est ligaturé au vecteur recombinant d'origine qui n'est pas reconstruit Il est concevable qu'avec un rapport plus élevé de la longueur du codage génétique pour un polypeptide à la longueur totale du vecteur recombinant, la quantité de la protéine produite par cellule devienr 2 plus importante et la quantité dessous-produits par cellule devienne plus faible. Par conséquent, lorsque le vecteur recombinant reconstruit ci-dessus est utilisé pour produire un certain polypeptide souhaité, non seulement on peut atteindre une forte productivité du polypeptide mais également on peut obtenir facilement la purification du polypeptide obtenu. Un fragment d'acide désoxyribonucléique portant un pho S gène peut être coupé du vecteur recombinant préparé selon le procédé de la présente invention et ligaturé à une sorte différente de réplicon par rapport à la sorte du réplicon du vecteur recombinant d'origine pour préparer un autre type de vecteur recombinant reconstruit Un tel autre type de vecteur recombinant reconstruit peut avantageusement être utilisé lorsque l'on souhaite un choix facile des transformants en changeant un trait phénotypique du réplicon et/ou que l'on souhaite une augmentation du nombre de copies d'un vecteur recombinant L'utilisation d'un tel autre type de vecteur recombinant reconstruit est souhaitable lorsque les transformants obtenus au moyen du vecteur recombinant d'origine sont ceux parmi lesquels les transformants souhaités sont difficiles à choisir et/ou la réplicabilité du vecteur recombinant d'origine dans les transformants est faible. La reconstruction du vecteur recombinant ci-dessus mentionnée est effectuée par une technique conventionnelle (voir par exemple descriptions des brevets US N O s 4 340 674, 4 349 629 et 4 356 270). Le vecteur d'expression préparé selon le procédé de la présente invention peut être identifié en construi- sant la carte de restriction comme suit Le vecteur d'expression est partiellement ou totalement digéré avec divers enzymes de restriction pour obtenir des fragments d'acide désoxyribonucléique Les fragments obtenus sont soumis à une électrophorèse sur gel-agarose, afin de déterminer ainsi la dimension et le motif de restriction du vecteur d'expression La position du pho S gène sur le vecteur d'expression ci- dessus mentionné est déterminée en construisant une grande variété de vecteurs d'expression d'abandon de la présente invention au moyen d'une digestion partielle ou complète avec un enzyme approprié de restriction et une auto-ligature subséquente, en examinant lesdits vecteurs d'expression d'abandon par des essais de complémentation en utilisant le mutant négatif au pho S gène comme hôte. Le vecteur d'expression portant le rho S gène de la présente invention présente les avantages qui suivent lorsque le codage génétique pour un polypeptide souhaité est ligaturé audit vecteur d'expression en sa partie en aval de la séquence de l'acide désoxyribonucléique d'un promoteur du pho S gène et la production du polypeptide souhaité est entreprise par des techniques génétiques: ( 1) Le rendement du Polypeptide souhaité cidessus mentionné atteint 1 x 10 -10 molécules/cellule ce qui est de plusieurs fois à 100 fois celui obtenu en utilisant le vecteur couramment employé. ( 2) L'expression génétique du vecteur d'expression de la présente invention peut être librement contrôlée en ajustant la concentration du phosphate dans le milieu de culture Par conséquent, la production du polypeptide souhaité peut égalementêtre contrôlée en ajustant la concentration du phosphate dans le milieu de culture. ( 3) Le polypeptide souhaité peut être sécrété en même temps que la portion de protéine liant le phosphate dans le périplasme de l'hôte Par conséquent, le polypeptide souhaité ci-dessus mentionné peut facilement être isolé de l'hôte. Par conséquent, le vecteur d'expression de la présente invention peut être largement utilisé dans un domaine d'application industrielle Un exemple du procédé de production d'un polypeptide souhaité en utilisant le vecteur d'expression de la présente invention sera maintenant expliqué Le codage génétique pour le poly- peptide souhaité est préparé à partir des gènes de cellules eucaryotiques, de cellules procaryotiques ou de virus, et le gène ainsi préparé est ligaturé au vecteur d'expression de la présente invention Alors, l'hôte est transformé avec le vecteur d'expression ci-dessus obtenu pour former des transformants Subséquemment, les transformants ainsi obtenus sont incubés à une grande échelle, pour produire ainsi le popypeptide souhaité à un rendement extrêmement élevé. Ainsi, selon un autre aspect de la présente invention, on prévoit un procédé de production d'un polypeptide par l'expression génétique en utilisant le vecteur d'expression de la présente invention qui consiste à: ( 1) ligaturer un fragment d'acide désoxyribo- nucléique portant un codage génétique pour un popypeptide audit vecteur d'expression en sa portion en aval de la séquence de l'acide désoxyribonucléique d'un promoteur du codage génétique pour une protéine liant le phosphate; ( 2) transfbrmer les cellules d'une bactérie appar tenant à Entérobactériacées avec ledit vecteur d'expression ayant le codage génétique pour un polypeptide qui lui est ligaturé pour former des transformants; ( 3) choisir lesdits transformants de cellules parentes d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées; ( 4) incuber lesdits transformants,en foaiant lesdits transformants à exprimer le codage génétique pour le polypeptide et à produire le polypeptide; et ( 5) isoler le polypeptide des transformants incubés. Dans la mise en pratique du procédé ci-dessus mentionné, un fragment d'acide désoxyribonucléique porteur d'un codage génétique pour un polypeptide est d'abord préparé par synthèse organique, ou est isolé d'organismes par une technique habituelle comme une lyse, un centri- fugation, une digestion avec un enzyme de restriction ou analogue Il est également possible de préparer un fragment d'acide désoxyribonucléique porteur d'un codage génétique pour un polypeptide souhaité à partir d'un fragment d'acide ribonucléique préparé à partir d'acide ribonucléique messager et de virus d'acide ribonucléique en convertissant un fragment d'acide ribonucléique porteur d'un gène souhaité en fragment d'acide désoxyribonucléique complémentaire en utilisant la transcriptase inverse bien connue Le fragment a'acỉe désoxyribonucléique porteur d'un codage génétique pour un polypeptide est ligaturé à un vecteur d'expression porteur du pho S gène de la présente invention en sa partie en aval de la séquence de l'acide désoxyribonucléique d'un promoteur du pho S gène. Au moins le fragment d'acide désoxyribonucléique porteur d'un codage génétique pour un polypeptide, ou le fragment d'acide désoxyribonucléique porteur du pho S gène du vecteur d'expression et le réplicon du vecteur d'expression a un gène pour un trait phénotypique comme une résistance aux médicaments, une activité enzymatique ou analogue. La partie à laquelle le fragment d'acide désoxyribonucléique porteur d'un codage génétique pour un polypeptide est ligaturé au vecteur d'expression peut être disposée entre la partie proximale et la partie distale du fragment d'acide désoxyribonucléique porteur du pho S gène, de façon à pouvoir produire une protéine de fusion Cette partie peut également être disposée en aval du fragment d'acide désoxyribonucléique porteur du pho S gène, afin de pouvoir produire une protéine hybride Le processus de ligature ci-dessus et effectué en utilisant une ligase par une technique conventionnelle (voir par exemple description du brevet US No 4 237 224). A l'étape ( 2) ci-dessus, des cellules d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées sont transformées avec le vecteur d'expression ayant le codage génétique pour un polypeptide quilviest ligaturé par une méthode habituelle (voir par exemple description du brevet US NO 4 237 224) Comme bactérie appartenant à Entérobacté- riacées, on peut mentionner Erwinia, Enterobacter, Eschirichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia et Shigella. A l'étape ( 3) ci-dessus, le transformant est choisi parmi des cellules parentes de la bactérie apparte- nant à Entérobactériacées par un trait phénotypique, comme une résistance aux médicaments imparti par le vecteur d'expression. A l'étape ( 4) ci-dessus, les transformants sont incubés en conditions nutritives appropriées aux transformants, forçant les transformants à exprimer le gène et à produire le polypeptide souhaité. A l'étape ( 5) ci-dessus, l'isolement du polypeptide souhaité des transformants et la purification du polypeptide sont accomplis par une technique habituelle comme une lyse, un dessalage, une chromatographie en colonne ou analogue. Dans le cas o le codage génétique pour un poly- peptide souhaité est ligaturé au vecteur d'expression en sa partie située en aval du codage de la séquence de l'acide désoxyribonucléique pour le peptide du signal d'un pho S gène à l'étape ( 1) ci-dessus, le polypeptide souhaité produit dans les transformants à l'étape ( 4) ci-dessus est sécrété dans le périplasme des transformants. La raison en est la suivante Le peptide de signal ci- dessus mentionné est codé dans le pho S gène du côté de la séquence de l'aminoacide N-terminal d'une protéine liant le phosphate et est exprimé avec une protéine liant le phosphate Le peptide du signal est requis pour l'interaction avec et la sécrétion par la membrane interne d'une cellule En d'autres termes, le peptide du signal joue un rôle pour la sécrétion d'une protéine liant le phosphate dans le périplasme d'une cellule à travers la membrane interne Par conséquent, quand le transformant contenant le vecteur d'expression auquel le codage génétique pour un polypeptide souhaité est ligaturé en sa partie en aval du codage de la séquence d'acide désmribonucléique pour le peptide du signal du pho S gène est incubé, le polypeptide souhaité produit dans le transformant est sécrété dans le périplasme du transformant par la fonction du peptide du signal Le polypeptide sécrété dans le périplasme peut être isolé sans lyser le transformant et par conséquent, l'isolement du polypeptide produit sécrété dans le périplasme est très facile en comparaison à celui du polypeptide qui n'est pas sécrété dans le périplasme. Le vecteur d'expression ayant un codage génétique pour un polypeptide qui lui est ligaturé obtenu à l'étape ( 1) ci-dessus peut être reconstruit sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit précédemment par rapport à la reconstruction du vecteur d'expression de la présente invention Par exemple, le vecteur d'expression ayant un codage génétique pour un polypeptide qui lui est ligaturé en une partie telle que cela donne une protéine hybride, peut être changé pour un vecteur d'expression ayant un codage génétique pour un polypeptide qui lui est ligaturé en une partie telle que cela donne une protéine de fusion. Il faut noter que le pho S gène peut être ligaturé au codage génétique viral pour un polypeptide souhaité, afin que le polypeptide souhaité codé par le gène viral puisse être efficacement produit. Comme on l'a décrit, le vecteur d'expression peut être utilisé pour la production de substances physiologi- quement actives, d'enzymes, d'antigènes, de toxines, d'aminoacides, de métabolites secondaires et analogues. Comme peptides physiologiquement actifs, on peut mentionner des hormones comme la somatostatine, l'insuline, l'ACTH, l'hormone de croissance et analogues, la calmoduline, des facteurs de croissance des cellules, les interférones et analogues Comme enzymes, on peut mentionner l'urokinase, la mutanase, l'amylase, la glucoseisomérase, lthyaluroni- dase, la transcriptase inverse, des enzymes concernant la fixation de l'azote et analogues Pour les antigènes, on peut mentionner l'antigène HA du virus de la grippe ou de l'influenza, l'antigène de surface de l'hépatite B et analogues Pour les toxines, on peut mentionner la toxine Bordetella Dertussis, le venin de serpent et analogues Pour les aminoacides, on peut mentionner l'acide L-glutamique, la L-lysine, la Lméthionine et analogues Comme métabolites secondaires, on peut mentionner des antibiotiques, des mycotoxines et analogues Pour les protéines autres que les substances ci-dessus mentionnées, on peut mentionner des peptides opioldes, l'ovalbumine et analogues Par conséquent, la présente invention est très utile pour produire des aliments, des médicaments, des substances nutritives, des produits fermentés, des sources d'énergie et analogues. La présente invention sera illustrée en plus de détail en se référant aux exemples qui suivent qui ne doivent pas être pris comme en limitant le cadre. Les milieux de culture, les solutions tampons, les procédés d'extraction de l'acide désoxyribonucléique et les procédés de purification de l'acide désoxyribo- nucléique utilisés dans les exemples seront résumés ci- après. A: Composition du milieu T Bacto-tryptone 10 g Na Cl 5 g *À Les ingrédients ci-dessus ont été dissous dans 1.000 ml d'eau. B: Extraction rapide aux alcalis d'acide désoxyribonucléique plasmide On a ajouté 0,1 ml d'une solution de lysozyme 2 mg/ml lysozyme, 50 m M glucose, 100 m M CDTA (tétra- acétate de cyclohexanediamine), 25 m M de tris-HC Ol (p H 8,0), dans la boulette de cellulesbactériennesobtenue d'une culture de 1,5 ml par centrifugation, laquelle culture avait été incubée pendant une nuit On a incubé la suspension résultante à O C pendant 30 minutes Alors, on a ajouté, à la suspension, 200 A 1 d'une solution de SDS alcaline r 0,2 N Na OH, 1 poids/poids% de SDS (dodécyl- sulfate de sodium) J, et on a agité. Après l'incubation à O C pendant 5 minutes, on a ajouté, à la suspension, 150 l d'acétate de sodium à 3 M (p H 4,8) et on a doucement mélangé On a maintenu la suspension résultante à O C pendant 60 minutes et ensuite on l'a soumise à une centrifugation à 5 000 t/mn pendant 5 minutes pour retirer les précipités De la partie supérieure du liquide surnageant, on a retiré, à la tipette, une portion de 0,4 ml La portion a été mélangée à 1 ml d'éthanol absolu froid pour précipiter l'acide désoxyribonucléique. Le mélange résultant a ôté centrifugé pendant 2 minutes et ensuite le liquide surnageant résultant a été évacué et dans la boulette résultante on a ajouté 100 pal d'une solution d'acétate de sodium ú acétate de sodium à 0,1 M, 0,05 M de tris-H Cl (p H 8,0)l La solution résultante a été mélangée à 2 fois son volume d'éthanol absolu froid pour effectuer une reprécipitation de l'acide désoxy- ribonucléique L'acide désoxyribonucléique précipité a été dissous dans un tampon approprié Les particularités des processus ci-dessus sont décrites dans Nucleic Acid Research, volume 7 N 6, pages 1513-1523 ( 1979) L'acide désoxyribonucléique plasmide brut préparé selon le processus ci-dessus mentionné peut être utilisé pour des analyses physiques sur carte et pour une transformation. C: Enlèvement du bromure d'éthidium de l'acide désoxyribonucléique La fraction d'acide désoxyribonucléique après centrifugation gradientdensité Cs Cl a été mélangée à un volume égal d'une solution d'isopropanol saturée de M Na Cl 10 m M tris-H Cl 1 m M Na 3 EDTA aqueux (p H 8,3). Le processus ci-dessus a été répété jusqu'à ce que la phase aqueuse contenant l'acide désoxyribonucléique soit décolorée On a ajouté, dans la phase aqueuse résultante, deux volumes d'eau puis 6 volumes d'éthanol absolu On a laissé le mélange au repos à -20 C pendant 1 heure jusqu'à plusieurs jours pour précipiter l'acide désoxy- ribonucléique L'acide désoxyribonucléique précipité a été recueilli par centrifugation et séché pour obtenir un échantillon d'acide désoxyribonucléique ou ADN. L'échantillon de ADN a été dissous dans 100 l d'une solution tris-EDTA l 10 m M tris-H Cl, 1 m M Na 3 EDTA (p H 7,5) (EDTA = acide éthylènediaminetétraacétique) 3 et mis en utilisation Les particularités des processus ci-dessus sont décrites dans Advanced Bacterial Genetics, page 126, Cold Spring Harbor Laboratory ( 19801 D: Composition du tampon d'enzyme de restriction Eco RI (concentré 5 fois) Na Cl 500 m M Tris-HOC 250 m M (p H 7,4) Mg SO 4 50 m M E: Composition du tampon de ligase TrisH Cl 66 m M (p H 7,6) Mg C 12 6,6 m M Dithiothréitol 10 m M ATP 0,5 m M F: Centrifugation de gradient-densité du bloc Cs Cl On a placé I ml d'une solution à 5,0 M de Cs Cl ,0 M de Cs Cl, 10 m M de Mg 504, 10 m M de trisHC Ol (p H 8,0), 0,1 m M de Na 2 EDTA (densité flottante = 1,60)l, au fond d'un tube de centrifugation de nitrate de cellulose d'un diamètre de 12,7 mm et d'une longueur de 50,8 mm (fabriqué et vendu par Beckman Instruments Inc, Etats Unis d'Amérique) Sur la solution dans le tube, on a déposé 3 ml d'une solution à 3,0 M de Cs Ci L 3,0 M Cs Cl, 10 m M de Mg SO 4, 10 m M de tris-H Cl (p H 8,0), 0,1 m M de Na 2 EDTA (densité flottante = 1,40)l Alors, on a encore placé I ml d'une suspension de phage sur la couche de solution de Cs Cl et on a centrifugé à 30 000 t/mn dans un rotor SW 50 1 (fabriqué et vendu par Beckman Instruments Inc, Etats Unis d'Amérique) à 20 C pendant I heure Alors, on a retiré moins de 0,5 ml de la fraction phage,du c 8 té du tube avec une seringue de I ml et une aiguille de ,87 mm, jauge 25 Les particularités des processus ci-dessus sont décritesdans Advanced Bacterial Genetics, pages 80-81, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1980). G Centrifugation de gradient-densité à l'équilibre Cs Cl La fraction phage obtenue à l'article F ci-dessus a été mélangée à une solution à 4,0 M de Cs Cl t 4,0 m Cs Cl, 10 m M Mg SO 4, 10 m M tris-HC 1 l (p H 8,0), 0, 1 m M Ed TAl, et on a centrifugé à 30 000 t/mn dans un rotor SW 50 1 pendant 20 heures L'on n'a pas retiré plus de 0,5 ml de la fraction phage, du côté du tube avec une seringue de 1 ml et une aiguille de 15,87 mm, jauge 25 Les particula- rités des processus ci-dessus sont décrites dans Advanced Bacterial Genetics, page 81, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1980). H: Composition du milieu LB * Bacto-peptone 10 g Extrait de levure 5 g Na Cl 5 g Les ingrédients ci-dessus ont été dissous dans ml d'eau et le p H a été ajusté à 7,2 par addition de Na OH. I: Composition du mélieu d'agar T * Bacto-triptone 10 g Na Cl 5 g Agar 15 g Les ingrédients ci-dessus ont été dissous dans l'eau et de l'eau a encore été ajoutée au point que tout le volume de la solution soit de 1 000 ml. * îNotel Après avoir fait passer le milieu à l'autoclave pour sa stérilisation, on y a ajouté 1/1 000 volume d'une solution aqueuse à 10 mg/ml de tétracycline ou bien une solution aqueuse à 40 mg/ml d'ampicilline Les milieux contenant des antibiotiques ont été utilisés pour choisir les transformants résistant aux antibiotiques et garantir le maintien du vecteur recombinant résistant aux anti- biotiques dans les cellules bactériennes. EXEMPLE 1 Etape 1: Préparation de l'acide désoxyribo- nucléique plasmide p BR 322 et scission de l'acide désoxyribonucléique plasmile p BR 322 par l'enzyme de restriction Eco RI On a inoculé 1 litre du milieu T avec 10 ml d'une semence d'Eschirichia coli K-12 souche C 600 lB J Bachmann, Bacterial Rev, 36, 525-557 ( 1972)l (portant le plasmide p BR 322), et on a mis en culture à 37 C tout en agitant jusqu'à ce que la turbidité du bouillon de culture atteigne 0,6 A à 600 nm On a ajouté du chloram- phénicol dans le bouillon de culture jusqu'à une concen- tration finale de 250/g/ml Le bouillon de culture a alors été incubé à 37 C pendant 15 heures et soumis à une centrifugation pour recueillir les cellules Les cellules ainsi recueillies ont été lavées une fois avec 100 ml d'une solution tris-EDTA L contenant 1 O Om M de tampon tris-H Cl (p H 7,5) et 1 m M de EDTA j, et ont été soumises à une extraction rapide aux alcalis pour obtenir un ADN plasmide brut Dans l'ADN plasmide brut ainsi obtenu, on a ajouté la solution de tris-EDTA ci-dessus mentionnée en une quantité telle que le volume total soit de 15 ml. On a ajouté, dans la solution, 16 g du cristal Cs Cl et 2 ml de bromure d'éthidium à 5 mg/ml, et la densité d du mélange a été ajustée à 1,39 en ajoutant de l'eau ou du Cs Cl cristallin Le mélange résultant a alors été soumis à une centrifugation à 33 000 t/mn à 200 C pendant heures La position de la bande de l'ADN plasmide a été déterminée par la lumière ultraviolette avec une grande longueur d'onde, et l'ADN plasmide a été recueilli par fractionnement Le bromure d'éthidium a été enlevé de la fraction d'ADN plasmide par la méthode décrite à l'article C A 0,2 ml de la solution d'ADN p BR 322 ( 100 pug/ml) on a ajouté 0,05 ml du tampon d'enzyme de restriction pour Eco RI et au résultat, on a ajouté l'enzyme de restriction Eco RI en une quantité telle que l'activité de l'enzyme de restriction Eco RI devienne: 4 une unité par p&g du ADN plasmide La réaction enzymatique a été effectuée à 37 C pendant 60 minutes, Ensuite, on a chauffé le mélange à 650 C pendant 5 minutes pour inactiver l'enzyme de restriction Le mélange a alors été dialysé avec une solution de trisEDTA lcontenant 10 m M de tris-H Cl (p H 8,0) et 1 m M de EDTA 3 A la fin de la dialyse, on a ajouté, dans le mélange, 4 unités d'une phosphatase alcaline de Escherichia coli (fabriquée et vendue par Sigma Chemical Co, Etats Unis d'Amérique), avec ensuite incubation à 65 WC pendant 30 minutes On a ajouté, au mélange, une quantité égale d'une solution de phénol (préparée par saturation de la solution de tris-EDTA ci-dessus mentionnée avec du phénol), &vc en Lvut_ agitation Le résultat a été soumis à une centrifugation lente, et séparé en phase aqueuse et phase de phénol. La phase aqueuse a été recueillie Les étapes ci-dessus mentionnées de centrifugation et de recueillement ont été répétées deux fois Ensuite, on a ajouté un volume égal de la solution I ( 24:1 en volume d'un mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique) à la phase aqueuse recueillie Le résultat a été bien mélangé et la phase aqueuse a été recueillie Cette opération a été répétée 4 lois et la phase aqueuse recueillie a été dialysée avec un tampon de ligase pour la réaction de ligature subsé- quente, et ainsi on a obtenu une solution d'acide désoxyribonucléique scindé pour p BR 322. Etapes 2: Préparation de fragments d'ADN contenant un fragment d'ADN porteur du pho S gène de la souche K-12 d'Escherichia coli On a inoculé 1 litre du milieu T de 10 ml d'une semence d'Escherichia coli souche K-12 KLF 48/KL 159 (CGSC N 4302) lE coli Genetic Stock Center (CGSC), Université de Yale, Connecticut, Etats Unis d'Amériquej et on a mis en culture à 37 C tout en agitant Le bouillon de culture en phase de croissance logarithmique (turbidité 0,6 A à 600 nm) a été soumis à une centrifugation pour recueillir les cellules Les cellules ainsi recueillies ont été mises en suspension dans 10 ml d'une solution de lysozyme (contenant 2 mg/ml de lysozyme, 100 m M de EDTA et 0,15 M de Na Cl) et on a laissé la suspension au repos à 37 C pendant 15 minutes La suspension a été alors rapidement congelée sur un bain de neige carbonique/acétone à -20 C Dans la suspension ainsi gelée, on a ajouté 50 ml d'un tampon tris-SDS lcontenant 0,1 M de tris-H Cl (p H 9,0), 1 poids/volume% de SDS (dodécyl sulfate de sodium) et 0,1 M de Na Cl 3 et le résultat a été soumis à une fusion à 60 C Les étapes ci-dessus mentionnées de congélation sur un bain de neige carbonique/acétone et de fusion à 60 C ont été répétées 5 fois, ainsi les cellules ont été totalement lysées Dans la solution résultante o les cellules ont été lysées, on a ajouté une quantité égale d'une solution de phénol (préparée par saturation du tampon de tris-SDS ci-dessus mentionné avec du phénol redistillé), avec ensuite agitation Le résultat a alors été soumis à une centrifugation lente, et il s'est séparé en phase aqueuse et phase phénol La phase aqueuse a été recueillie La phase aqueuse ainsi recueillie a été mélangée avec 2 fois son volume d'éthanol absolu Le mélange résultant aalors été soumis à une centrifugation à 12 000 t/mn pendant 20 minutes et des boulettes ont été recueillies Les boulettes ainsi recueillies ont été dissoutes dans 20 ml d'un mélange de Na Cl et d'acide citrique (contenant 0,15 M Na Cl et 0,015 M de citrate de sodium, p H 7,0), pour obtenir ainsi une solution contenant ADN Dans 10 ml de la solution contenant ADN ainsi obtenue, on a ajouté une quantité égale de la solution I (mentionnée à l'étape 1), avec ensuite agitation La phase aqueuse a été recueillie du résultat. Par ailleurs, la phase aqueuse ainsi recueillie a été mélangée à 2 fois son volume d'éthanol, et l'ADN précipité a été dissous dans 5 ml d'une solution de tris-EDTA lcontenant 10 m M de tris-H Cl (p H 7,5) et 1 m M de Na 2 EDTAl La précipitation avec de l'éthanol absolu comme on l'a mentionné ci-dessus a été répétée, et on a préparé 5 ml d'une solution d'ADN A 0,2 ml de la solution d'ADN ainsi obtenue ( 200 ptg/ml), on a ajouté 0,05 ml du tampon d'enzyme de restriction et, au résultat, l'enzyme de restriction Eco RI a été ajouté en une quantité telle que l'activité de l'enzyme de restriction Eco RI soit d'une unité par /Lg d'ADN Alors, on a incubé le mélange à 370 C pendant 60 minutes avec ensuite traitement thermique à 650 C pendant 5 minutes pour inactiver l'enzyme de restriction Le mélange a alors été dialysé avec le tampon de ligase, pour obtenir ainsi une solution de E Coli ADN. Etape 3: Ligature des fragments d'ADN p BR 322 et ADN E coli contenant un pho S gène La solution d'ADN p BR 322 préparée à l'étape 1 a été diluée à 30 /tg/ml en concentration d'ADN avec un tampon de ligature La solution d' ADN E coli telle que préparée à l'étape 2 a été diluée à 100 "g/ml de concentration d'ADN avec le même tampon que celui qui vient d'être mentionné On a mélangé 50 p-l de la solution d'ADN p BR 322 et 100 LÀ-l de la solution d'ADN E coli La ligase T 4 a été ajoutée au mélange résultant en une quantité d'une unité de ligase T 4 par pg d'ADN à ligaturer La réaction enzymatique pour la ligature des ADN a été entreprise à 8 C pendant 8 heures A la fin de la ligature, la solution résultante a été dialysée avec une solution de tris DTA t contenant 10 m M de tris-H Cl (p H 7,5) et I m M de EDTAl Etape 4: Choix des plasmides porteurs du pho S gène A: Souche C 75 E coli La souche C 75 E coli lGaren, A, et N Otsuji, J Mol Biol, 8, 841-852 ( 1964) j a été mise en culture dans le milieu LB tout en agitant jusqu'à ce que la turbibité du bouillon de culture soit de 0,6 A à 600 nm. Alors, on a soumis 2,5 ml du bouillon de culture à une centrifugation lente pour recueillir les cellules Les cellules recueillies ont été mises en suspension dans 2,5 ml d'une solution aqueuse à 0,1 M de Mg C 12 La suspension des cell'Rs a alors été soumise à une centrifugation lente pour recueillir les cellules Les-cellules ont été mises en suspension dans 1,2 ml d'une solution aqueuse à 0,1 M de Ca C 12 et on a laissé la suspension résultante des cellules au repos à O OC pendant 30 minutes, avec ensuite centrifugation lente pour recueillir les cellules Les cellules recueillies ont été mises en suspension dans 0,1 ml d'une solution aqueuse à 0,1 M de Ca C 12 A la suspension résultante des cellules, on a ajouté 10 /l de la solution d'ADN ligaturé préparée à l'étape 3. On a laissé le mélange résultant au repos sur de l'eau glacé pendant 30 minutes et a chauffé dans un bain d'eau à 40 C pendant 5 minutes On a ajouté,au mélaigedmuffé,1,0 mli du milieu LB préchauffé à 37 C avec ensuite incubation à 37 C pendant 90 minutes Alors, on a étendu 0,1 ml du bouillon de culture obtenu et 0,1 ml du bouillon de culture dilué dix fois avec le milieu LB sur des plaques d'agar T contenant de la tétracycline ou de l'ampicilline et on a incubé à 37 C ou 30 C pendant une nuit pour former des colonies de transformants résistant à la tétracycline ou à l'ampicilline Les colonies formées de transformants ont été pulvérisées d'une solution de coloration détectant la phosphatase alcaline |contenant 2 mg/ml d' c -naphtyl- phosphate et 20 mg/ml de sel B Bleu rapide (o-dianisidine tétrazotée) l dissoute dans 0,5 M de tris-H Cl (p H 8,0). Les colonies blanches de transformants qui n'avaient pas changé en marron par pulvérisation de la solution de coloration ont été choisies comme cellules portant les plasmides o le pho S gène de E coli était ligaturé à l'ADN p BR 322. B: Souche E coli C 2 On a répété sensiblement les mêmes processus que ceux ci-dessus mentionnés pour choisir des colonies blanches de transformants contenant des plasmides o un pho S gène de E Coli était ligaturé à p BR 322 ADN à l'exception que la transformation de la souche C 2 de E coli l Morris, H, M J Schlesinger, M Bracha, et E Yagil, J Bacteriol 119, 583-592 ( 1974) l a été utilisée comme indicateur de la sélection des plasmides. Etapes 5: Construction des cartes de restriction des plasmides (p SN 401 et p SN 402) porteurs d'un pho S gène Les transformants choisis aux étapes 4 ci-dessus ont été mis en culture dans le milieu LB Alors, des ADN plasmides ont été extraits des cellules en culture obtenues puis purifiés comme suit Les ADN plasmides ont été extraits des cellules en culture ci-dessus selon une méthode d'extraction alcaline rapide Alors, les solutions brutes d'ADN plasmide ont été purifiées par centrifugation au gradient de densité à l'équilibre de la même façon qu'à l'étape 1 Le bromure d'éthidium a été retiré des solutions d'AD Nllasmideaisi purifiées et ADN a précipité (voir figure 1) Les ADN plasmides ainsi obtenus ont été digérés avec divers enzymes de restriction et ensuite, les longueurs des fragments d'ADN ont été déterminées par électrophorèse sur du gel agarose Les cartes de restriction des plasmides ont été construites. Par suite, on a trouvé que deux sortes de plasmides porteurs du pho S gène avaient été préparés L'un des plasmides sera appelé ci-après "p SN 401 " et l'autre "p SN 40211. La carte de restriction du plasmide p SN 401 est représentée sur la figure 1 Dans le plasmide p SN 402, le fragment Eco Rk Eco RI 2 de p SN 402 a été inséré à l'orientation opposée à celle du plasmide p SN 401. EXEMPLE 2 Etape 1: Préparation de fragments d'ADN >glm S bactériophage contenant le pho S gène On a inoculé 150 ml du milieu T de 1,5 ml d'une semence d'Escherichia coli de souche KY 7388 l T Miki, Annu Rep Inst Virus Res, 21, 1-26 ( 1978)1, qui est un lysogène de bactériophage àglm S et on 'a mis en culture à 37 C tout en agitant A la phase moyenne de croissance logarithmique, de la mytomycine C a été ajoutée à la culture à la concentration finale de 0,5 /g/ml. On a continué la culture pendant encore 2 heures jusqu'à la lyse La culture a été refroidie sur de la glace et du chloroforme a été ajouté goutte à goutte (plusieurs gouttes) Ensuite, de l'air a été introduit, à la pipette, dans le bouillon de culture pour forcer ce bouillon à produire des bulles et les cellules dans le bouillon de culture ont été totalement lysées Le lysat de phage résultant a alors été soumis à une centrifugation lente. Le liquide surnageant a été recueilli tandis que le produit précipité consistant en débris de cellulesa été rejeté Le liquide surnageant obtenu a été soumis à une centrifugation rapide à 25 000 t/mn pendant 90 minutes pour recueillir les particules de Àglm S phage précipitées au fond du tube de centrifugation Les particules de phage recueillies ont été mises en suspension dans 4,0 ml de diluant i lcontenant 10 m M de tris-H Cl (p H 7,5), m M de Mg SO 4 et 1,0 m M de Na 2 EDTA l La suspension résultante des particules de phage a été soumise à une centrifugation avec gradient de densité en bloc Cs Cl avec ensuite centrifugation avec gradient de densité à l'équilibre de Cs Cl pour obtenir une fraction ne contenant que les particules de X glm S phage glm S ADN a été extrait des particules de Xglm S phage ci-dessus en utilisant du formamide à la façon décrite ci-dessous. * Plus particulièrement, à 0,5 ml de la fraction des particules de Xglm S phage on a ajouté 0,05 ml d'une sli- tien de tris-EDTA lcontenant 2 M de tris-H Cl (p H 8,5) et 0,2 M de Na 2 EDTA puis 0,5 ml de formamide On a laissé le mélange résultant au repos à la température ambiante pendant environ 3 heures Alors, on a ajouté en succession 0,5 ml d'eau distillée et 3 ml d'éthanol absolu, dans le mélange, et on a mélangé pour précipiter ADN Xglm S phage L' ADN À glm S phage précipité a été recueilli par centrifugation, lavé avec 70 volume /volume% d'éthanol et séché sous vide pour obtenir un ADN A glm S séché L'ADN A glm S séché a été dissous dans 5 ml d'une solution tris-EDTA t contenant 10 m M de tris-HC 1 (p H 7,5) et 1 m M de Na 2 EDTA 1 et ensuite scindé par un enzyme de restriction Eco RI et dialysé de la même façon qu'à l'étape 2 de l'exemple 1 Ainsi, on a préparé une solution contenant des fragments d'ADN porteurs du pho S gène. Etape 2: Ligature des fragments d'ADN p BR 322 et d'ADN phage c "tqe dupho S ne On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 3 de l'exemple 1 pour préparer une solution d'ADN ligaturé, à l'exception que la solution d'ADN _Àlm S phage préparée à l'étape 1 ci-dessus a été utilisée au lieu de la solution de E coli ADN. Etape 3: Choix des plasmides porteurs du pho S gene A: Souche C 75 de E coli On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 4-A de l'exemple 1 pour choisir des colonies blanches de transformants portant les plasmides contenant le pho S gène préparé à partir de f ilm S phage, à l'exception que la solution de l'ADN ligaturé préparée à l'étape 2 cidessus a été utilisée au lieu de la solution ligaturée préparée à l'étape 3 de l'exemple 1. B: Souche C 2 de E coli On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 4-B de l'exemple 1 pour choisir des colonies blanches de transformants contenant des plasmides o le pho S gène préparé à partir de Xglm S phage était ligaturé à l'ADN p BR 322, à l'exception que la solution d'ADN ligaturé préparée à l'étape 2 a été utilisée au lieu de la solution ligaturée préparée à l'étape 3 de l'exemple 1. Etape 4: Construction des cartes de restriction des plasmides (p SN 401 et p SN 402) porteurs du pho S gène On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 5 de l'exemple 1 pour construire des cartes de restriction des plasmides, à l'exception que les plasmides obtenus à l'étape 3-A et à l'étape 3-B ci-dessus ont été utilisés au lieu des plasmides obtenus à l'étape 4-A et à l'étape 4-B de l'exemple 1 Par suite, on a trouvé que les plasmides obtenus aux étapes ci-dessus étaient p SN 401 et p SN 402. EXEPE 3 Etape 1: Construction du plasmide p SN 507 porteur du pho S gène de p SN 401 L'ADN p SN 401 obtenu à l'étape 5 de l'exemple 1 a été partiellement digéré avec l'enzyme de restriction Hind III et ensuite, religaturé en utilisant la ligase T 4 sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 3 de l'exemple 1 En utilisant la solution du plasmide religaturé ainsi obtenue, on a tranformé E coli, souche C 75 et souche C 90 t Garen, A et N Otsuji, J Mol Biol, 8, 841-852 ( 1964) l en tant que récipients,sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 4 de l'exemple 1 pour obtenir des souches porteuses des plasmides pho S+ Alors, les ADN plasmides ont été extraits des cultures des divers transformants indépendants et purifiés sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 5 de l'exemple 1 et on a construit une carte de restriction des plasmides Le plasmide purifié religaturé est appelé ci-après "p SN 507 " dont la carte physique est illustrée sur la figure 1. Etape 2: Construction du plasmide p SN 508 porteur du pho S gène de p SN 507 L'ADN p SN 507 obtenu à l'étape 1 ci-dessus a été digéré avec l'enzyme de restriction Mlu I et ensuite, la religature du plasmide et la transformation de la souche C 75 de E coli et de la souche C 90 de E coli avec le plasmide religaturé ont été effectuées sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 3 de l'exemple 2 pour obtenir des souches porteuses du plasmide reconstruit résultant (ci-après "p SN 508 ") Alors; l'ADN p SN 508 a été extrait des cellules en culture des souches ainsi obtenues et on a purifié sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 5 de l'exemple 1 Une carte de restriction du plasmide p SN 508 a été construite Le résultat est montré sur la figure 1. Etape 3: Construction du plasmide p SN 518 porteur du pho S gène de p SN 508 L'ADN p SN 508 obtenu à l'étape 2 ci-dessus a été digéré avec l'enzyme de restriction pst I et alors, la religature du plasmide et la transformation de chacune des souches C 75 de E coli et C 90 de E coli avec le plasmide religaturé a été effectuée sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit ci-dessus à l'étape 2 pour obtenir des souches ayant le plasmide reconstruit (appelé ci-après "p SN 518 ") Alors, ADN p SN 518 a été extrait des cellules en culture des souches ainsi obtenues et on l'a purifié sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 5 de l'exemple 1 Une carte de restriction du plasmide p SN 518 a été construite Le résultat est montré sur la figure 1. EXEMPLE 4 Construction des plasmides p SN 407 et p SN 408 porteurs du pho S gène à partir de p SN 402 L'ADN p SN 402 obtenu à l'étape 5 de l'exemple 1 a été reconstruit sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 1 de l'exemple 3 Le plasmide résultant sera appelé ci-après "p SN 407 " Alors, une carte de restriction du plasmide p SN 407 a été construite La carte de restriction de p SN 407 était sensiblement la même que celle de p SN 507, à l'exception que l'orientation du fragment Eco RI 1-Eco RI 2 de p SN 407 était opposée à l'orientation pour p SN 507. Le p SN 407 ci-dessus obtenu a été reconstruit de la même façon qu'à l'étape 2 de l'exemple 3 Le plasmide résultant sera appelé ci-après "p SN 408 " La carte de restriction de p SN 408 a été construite La carte de restriction de p SN 408 était sensiblement la même que celle de p SN 508, à l'exception que l'orientation du fragment Eco RI 1-Eco RI 2 de p SN 408 était opposée à l'orientation de celui de p SN 508. EXEMPLE 5 Construction de plasmid Ep SN 1507 et p SN 1508 porteurs du pho S gène à partir de p SN 507. Sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'exemple 1, le plasmide p BR 325 lBolivar, F et autres, Gene, 4, 121 ( 1978) 3 et le plasmide p SN 507 ont chacun été scindés avec l'enzyme de restriction Eco RI Alors, le p BR 325 scindé a été ligaturé au p SN 507 scindé sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit àl'étape 3 de l'exemple 1 Alors, sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 4 de l'exemple 1, un tamisage de l' ADN ligaturé obtenu a été effectué en utilisant la souche ANCC 75 de E coli úproduit de transduction Pl: souche C 75 de E coli x souche CSH 57 de E coli (Miller, J H, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y pages 13-23 ( 1972) en tant que récipient. On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 5 de l'exemple 1 pour extraire et purifier les plasmides ci-dessus obtenus Les cartes de restriction des plasmides ont été construites Par suite, on a trouvé que l'on avait obtenu deux sortes de plasmides contenant le pho S gène L'un des plasmides sera appelé ci-après "p SN 1507 " et l'autre "p SN 1508 " 1 On a également trouvé que le fragment Eco RI 1-Eco RI 2 de p SN 507 avait été inséré dans le site Eco RI de p BR 325 pour former PSN 1507. EXEMPLE 6 Construction du plasmide p SN 2507 porteur du pho S gène et construction d'une carte de restriction du plasmide p SN 2507 L'ADN plasmide p KN 402 AVJB EUhlin et autres, Gene, 6, 91-106 ( 1979)1 dont la carte de restriction est illustrée sur la figure 2 a été partiellement digéré avec l'enzyme de restriction Hinc II et religaturé avec la ligase T 4 Des souches ayant des plasmides religaturés (appelés ci-après "p SH 101 ") ont été obtenues sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 4 de l'exemple 1 et à l'étape 5 de l'exemple 1 et on a construit une carte de restriction du p SH 101 La carte de restric- tion est représentée sur la figure 2 PSH 101 et p SN 507 ont été digérés avec Eco RI Les fragments obtenus de p SH 101 et p SN 507 ont été ligaturés en utilisant la ligase T 4 Le plasmide ligaturé obtenu a été soumis à un tamisage pour obtenir des colonies blanches de transformants ayant des plasmides porteurs du pho S gène et formés par ligature du fragment de p SN 507 au p SH 101 Les colonies obtenues de transformants ont été mises en culture et les ADN plasmide ont été extraits des transformants en culture et purifiés sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 5 de l'exemple 1 Une carte de restriction du plasmide p SN 2507, l'un des plasmides ainsi obtenus,a été construite sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 5 de l'exemple 1 L'emplacement du pho S gène dans p SN 2507 a été déterminé La carte de restriction de p SN 2507 est montrée sur la figure 2 On a trouvé qu'un plasmide o l'orientation du fragment Eco RI 1-Eco RI 2 porteur du pho S gène était inséré à l'orientation opposée à celle du p SN 2507 avait été préparé également dans la ligature ci-dessus du fragment p SN 507 au p SH 101. EXPERIENCE 1 La puissance de l'expression génétique du vecteur d'expression de la présente invention a été déterminée en calculant le nombre de molécules de la protéine liant les phosphates produite par cellule hôte Le mécanisme de la production d'une protéine liant les phosphates au moyen de l'expression du pho S gène sera expliqué rapidement ci-après Le précurseur de la protéine liant les phosphates est d'abord produit par l'expression du pho S gène Le précurseur a un peptide de signal à l'extrémité N de la protéine mûre liant les phosphates Le peptide de signal est requis pour une interaction avec etune sécrétion à travers la membrane interne Par conséquent, le précurseur de la protéine liant les phosphates est d'abordtransporté à la membrane interne par la fonction du peptide du signal. Alors, la portion du peptide du signal de la protéine est scindé lors de son passage à travers la membrane interne et la protéine scindée et mûre liant les phosphates est sécrétée dans le périplasme de la cellule. La détermination du nombre de molécules de la protéine liant les phosphates produite par cellule a été effectuée comme suit. La souche 75 de E coli ANCC a été transformée avec le plasmide p SN 507 et on l'a fait incuber pendant une nuit dans un fluide de Tris/glucose qui est une solution de sel minimumtampcnnée avec Tris/H Cl (p H 7,2) contenant 0,2 % (poids/volume) de glucose et complété de 0,64 m M de KH 2 PO 4 (ci-après fluide à forte teneur en phosphate) Après incubation, les cellules hôtes ont été recueillies et mises en suspension dans deux sortes de milieucde culture, c'est-à-dire le milieu ci-dessus mentionné à forte teneur en phosphate et le même milieu de Tris/glucose que celui ci- dessus décrit à l'exception que la concentration en KH 2 P 04 était de 0, 064 m M (ci-après "milieu à faible teneur en phosphate"), avec ensuite incubation à 370 C tout en agitant pendant 6 heures La densité des cellules de chaque culture a été estimée à partir de l'absorbance à 600 nm Par suite, on a trouvé que le nombre de cellules dans chaque culture était de 1,3 x 109 Alors, les cellules de chaque culture ont été recueillies par centrifugation à 2 000 x g pendant minutes. Les cellules recueillies ont été lavées une fois avec 1 ml d'une solution de tampons contenant 10 m M de Tris-H Cl (p H 7,2) et 30 m M de Na Cl, et remises en suspension dans 0,1 ml de 33 m M de Tris-Hcl (p H 7,5) dans un tube de centrifugation On a ajouté 0,1 ml d'une solution de tampons contenant 33 m M de Tris-H Cl (p H 7,5), 40 % (poids/volume) de saccharose et 0,1 m M de EDTA, dans la suspension ci-dessus mer;ioir ên c e cellules, *:- iden'rt mélangé et on a incubé à 370 C pendant 10 minutes Les cellules ont été recueillies par centrifugation à 8.000 x g pendant 3 minutes et immédiatement remises en suspension dans 0,1 ml d'une solution aqueuse à 0,5 m M de Mg Cl La suspension des cellules a été vigoureusement agitée dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes avec ensuite centrifugation à 8 000 x g pendant 5 minutes. Au liquide surnageant ainsi obtenu (appelé ci-après "fraction périplasmique"),on a ajouté 20 l d'une solution de tampons échantillons pour l'électrophorèse du polyacrylamide lcontenant 1 ml de Tris-HC 1 à 0, 5 M (p H 6,8), 1 ml de dodécyl sulfate de sodium à 10 poids/ volume% (SDS) , 0,1 ml de P -mercaptoéthanol, 1 ml de glycérol, 2,5 ml d'une solution aqueuse à 0,1 poids/poids% de bleu de bromophénol et 4,4 ml d'eau l, avec ensuite traitement thermique à 100 C pendant 5 minutes La boulette (appelée ci-après "fraction intracellulaire") obtenue dans la centrifugation ci-dessus a été lavée deux fois avec 1 ml d'une solution aqueuse à 0,5 m M de Mg C 12 et remise en suspension dans 20,Pl de la solution de lysozyme Lcontenant 2 mg de lysozyme dans 1 ml d'eau, 50 m M de glucose, 10 m M de EDTA et 25 m M de Tris-HC 1 (p H 8,0) l, avec ensuite incubation à 37 C pendant 30 minutes La suspension ainsi obtenue a été diluée avec 180 fr 1 d'une solution aqueuse à 0,5 M de Mg C 12 et le mélange a été suffisamment agité. Alors, au mélange, on a ajouté 120,,ul de la solution de tampons échantillons ci-dessus pour l'électrophorèse du polyacrylamide, avec ensuite traitement thermique à 100 C pendant 5 minutes. Les fractions ci-dessus préparées ont été soumises à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS selon le processus décrit dans Laemmli, U K, Nature, 227, 680-685 ( 1970), et on a déterminé le rendement de la protéine liant les phosphates dans les cellules Les résultats sont indiqués au tableau qui suit. Tableau Quantité (M g/cellule) milieu à faible milieu à forte teneur en teneur en phosphate phosphate Protéine liant les phosphates 8,0 x 10 8 1,0 x 10 i Comme cela est apparent par le tableau ci-dessus, la production de la protéine liant les phosphates et du précurseur, en d'autres termes, l'expression du codage génétique pour une protéine liant les phosphates du vecteur d'expression de la présente invention est contrôlée en ajustant la concentration du phosphate dans le milieu de culture. Alors, le nombre de molécules de la protéine liant les phosphates par cellule a été calculé par l'équation qui suit: Nombre de molécules par cellule = A x C B o A est le rendement de la protéine liant les phosphates (g/cellule); B est le poids moléculaire de la protéine liant les phosphates ( 35 000) et C est le nombre d'Avogadro ( 6 x 1023). Le nombre de molécules de la protéine liant les phosphates était de 1,3 x 106 par cellule lors d'une mise en culture dans un milieu à faible teneur en phosphate. EXEMPLE 7 Production de /3-galactosidase en utilisant le plasmide p SN 508 porteur de pho S gène Le plasmide p SN 508 préparé à l'étape 2 de l'exemple 3 a été scindé en utilisant Eco RI, afin de préparer ainsi un fragment d'ADN Eco RI-Eco RI portant un pho S gène Au fragment d'ADN ainsi préparé porteur du pho S gène-, on a ligaturé le fragment d'ADN préparé en scindant le plasmide p MC 1403 contenant un codage génétique pour la f galactosidase t par rapport au plasmide p SN 1403, on peut se référer au Journal of Bacteriology, 143, 971-980 ( 1980) l au moyen de Eco RI, afin de former ainsi un vecteur recombinant. Alors, le vecteur recombinant (ciaprès appelé "p SN 5081 ") a été choisi et isolé sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit à l'étape 4 et à l'étape 5 de l'exemple 1. Subséquemment, le plasmide p SN 5081 a été partiel- lement abandonné en utilisant Hpa I Alors, les deux extrémités du fragment d'ADN résultant du plasmide p SN 5081 ont été partiellement digéréesen utilisant la Nucléase BAL 31 (dénomination commerciale de la désoxyribonucléase fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories Inc; Etats Unis d'Amérique) et sumises à une scission en utili- sant Sma I Le fragment d'ADN scindé du plasmide a été religaturé en utilisant la ligase T 4. Alors, la souche CSH 26 de E coli lon peut se référer à J H Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, page 17 ( 1972), qui est un mutant Lac incapable d'utiliser le lactose dans un milieu de culture a été transformée dans une plaque de tétrazolium additionnéede lactose en tant que milieu de culture avec le vecteur recombinant obtenu ci-dessus porteur d'un codage génétique pour la P galactosidase pour former des transformants Le phénotype Lac de la souche CSH 26 de E coli est devenu Lac+ par transformation avec le vecteur recombinant et par conséquent, les transformants ci-dessus obtenus ont été changés de façon qu'ils soient capables d'utiliser le lactose dans la plaque de tétrazolium additionnéede lactose En conséquence, les transformants ont été facilement choisis de cellules parentes de la souche CSH 26 de E coli en utilisant, comme critère, la dimension et la couleur des colonies formées sur la plaque de tétrazolium additionnéede lactose sensiblement de la même façon qu'on l'a décrit dans les expériences de Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, page 49 et pages 52-54 ( 1972) Le plasmide religaturé sera appelé ci-après "ps N 5084 ". Dans le plasmide p SN 5084, le fragment d'ADN porteur du codage génétique pour la /-galactosidase a été ligaturé au fragment d'ADN porteur du pho S gène en sa partie en aval de la séquence d'ADN d'un promoteur du pho S gène, afin que la /e-galactosidase puisse être produite sous la forme d'une protéine de fusion. Alors, la souche CSH 26 de E coli a été transformée avec le plasmide p SN 5084 pour former les transformants. Le choix des transformants de cellules parentes de la souche CSH 26 de E coli a été effectué de la même façon qu'on l'a décrit ci-dessus Les transformants choisis ont été incubés dans un milieu à faible teneur en phosphate, afin de produire ainsi de la f 2 -galactosidase sous forme de la protéine de fusion Alors, l'activité spécifique de A-galactosidase dans les transformants a été déterminée selon le processus décrit dans Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 352-355 ( 1972) Le nombre de molécules de la /3-galactosidase produite sous la forme d'une protéine de fusion par cellule a été calculé en comparant l'activité spécifique de la y 3-galactosidase produite sous la forme de la protéine de fusion à l'activité spécifique d'une /galactosidase standard ayant un poids moléculaire de 000 Par suite, on a trouvé que le nombre de molécules de /3-galactosidase produite sous la forme de la protéine de fusion par cellule était de I x 105. R E V E N D I CATIONS 1. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment d'ADN comprenant un codage génétique pour une protéine liant les phosphates et un réplicon choisi parmi des plasmides et des bactériophages, ledit fragment d'ADN étant ligaturé audit réplicon. 2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment d'ADN comprenant un codage génétique pour une protéine liant les phosphates est un fragment d'ADN comprenant un pho S gène d'Entérobactériacées. 3. Procédé de préparation d'un vecteur d'expres- sion, caractérisé en ce qu'il consiste à: ( 1) préparer un ADN chromosomique contenant un codage génétique pour une protéine liant les phosphates à partir de bactéries appartenant à Entérobactériacées; ( 2) scinder l'ADN chromosomique avec un enzyme de restriction pour produire des fragments d'ADN; ( 3) ligaturer lesdits fragments d'ADN à un réplicon choisi parmi les plasmides et les bactériophages; ( 4) transformer les cellules d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées avec ledit réplicon ayant le fragment d'ADN qui lui est ligaturé pour former des transformants comprenant ceux qui contiennent un vecteur recombinant comprenant le fragment d'ADN porteur d'un codage génétique d'une protéine liant les phosphates; ( 5) choisir des transformants contenant le vecteur recombinant comprenant le fragment d'ADN porteur d'un codage génétique pour une protéine liant les phosphates desdits transformants; et ( 6) isoler le vecteur recombinant comprenant le fragment d'ADN porteur du codage génétique pour une protéine liant les phosphates>des transformants choisis. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le codage génétique précité d'une protéine liant les phosphates est un pho S gène d'Entérobactériacées. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste de plus à laisser partiellement le vecteur recombinant isolé comprenant le fragment d'ADN porteur d'un codage génétique pour une protéine liant les phosphates tout en retenant le codage génétique pour une protéine liant les phosphates, et à soumettre le vecteur recombinant partiellement délaissé résultant à une religature au moyen du ligase pour préparer un vecteur d'expression reconstruit. 6 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste de plus à découper le fragment d'ADN porteur d'un codage génétique pour une protéine liant les phosphates, du vecteur recombinant isolé, et à ligaturer le fragment d'ADN découpé à une sorte différente de réplicon par rapport à la sorte du réplicon dudit vecteur recombinant isolé. 7. Procédé de production d'un polypeptide au moyen de l'expression génétique en utilisant un vecteur d'expression tel que défini à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à: ( 1) ligaturer un fragment d'ADN porteur d'un codage génétique pour un polypeptide, audit vecteur d'expression en sa partie en aval de la séquence d'ADN d'un promoteur du codage génétique pour une protéine liant les phosphates; ( 2) transformer les cellules d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées avec ledit vecteur d'expression ayant le codage génétique pour un polypeptide qui lui est ligaturé pour former des transformants; ( 3) choisir lesdits transformants de cellules parentes d'une bactérie appartenant à Entérobactériacées; ( 4) incuber lesdits transformants, en forçant lesdits transformants à exprimer le codage génétique pour le polypeptide et à produire le polypeptide; et ( 5) isoler le polypeptide des transformants incubés. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'à l'étape ( 1), ladite partie est disposée entre la partie proximale et la partie distale du fragment d'ADN porteur d'un codage génétique pour une protéine liant les phosphates. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'à l'étape ( 1), la partie précitée est disposée en aval du fragment d'ADN porteur d'un codage génétique pour une protéine liant les phosphates.