Brevet FR2530639A1 — publié le 19840127

La présente invention concerne de nouvelles bléomycines susbtituées sur l'azote du groupe amido, leurs sels et un procédé permettant de les préparer. Les bléomycines sont une famille de substances antibiotiques carcinostatiques découverte en 1966 par Ume- zawa, l'un des inventeurs de la présente inventions et ses collaborateurs /Journal of Antibiotics, 19 A,page 200 ( 1966)/. Elle est produite par Streptomyces verticillus, un Actinomy- cète, et c'est un glycopeptide hydrosoluble basique capable O 10 de chélater facilement un atome de cuivre divalent Dans une culture ordinaire, 16 éléments de la famille des bléo- mycines sont produits et sont chacun isolés /:par exemple, Umezawa et coll, Journal of Antibiotics, 19 A, page 210 ( 1966)_ 7 Parmi ces bléomycines, A 1, A 2, A 5, B 2 et déméthyl- A sont actuellement largement utilisées sous la forme de mélanges exempts de cuivre (qu'on appelera ci-après complexes de bléomycine) dans les domaines cliniques de la thérapie du cancer; plus particulièrement, elles sont utilisées avec succès dans le traitement du carcinome à cellules squameuses comme application principale, le cancer de la peau, le can- cer de la tête et du cou, le cancer du poumon et le lymphome malin Diverses bléomycines sont également décrites dans le brevet des EtatsUnis d'Amérique n 3 922 262 et le brevet des Etats-Unis d'Amérique Re 30 451. Les bléomycines sont généralement produites sous la forme contenant du cuivre dans la fermentation or- dinaire La forme exempte de cuivre est obtenue en éliminant le cuivre de la forme contenant du cuivre Le terme " bléo- mycine ", tel qu'il est utilisé dans le présent mémoire, englobe à la fois la forme:contenant du cuivre et la forme exempte de cuivre, sauf indication contraire. Les bléomycines sont représentées par la formu- le générale (II): CONH 2:2 CH NH - Cà CN CH CH 2 C-NH 2 I O à O y, _ _ _FCHO N H 2 i C O CE C CH; N H 'H 3 /N\ o CHN C CH O CH C 2 j H CH N \CH HO *CH \CH S H 1 i 3 3 2 CH H 2 C H C I C H N IL t HC 2, HP \l H i i H / x j/o H I*i HOCH c I O O NH 2 I dans laquelle R est un reste amine terminal de bléomycine; et le cuivre chélaté est omis dans le cas de la forme conte- nant du cuivre. Cependant, on a constaté que les bléomycines étaient inactivées par l'action d'une enzyme d'inactivation de la bléomycine f-qu'on désignera ci-après plus brièvement par enzyme d'inactivation; Umezawa et coll, Journal of Antibiotics, volume 27, page 419 ( 1974)2 On a encore cons- taté que les bléomycines étaient relativement moins inacti- vées dans la peau et le poumon o elles déploient une grande activité, tandis qu'elles sont facilement inactivées dans l'estcmac o elles sont supposées ne pas avoir d'action et que ce phénomène d'inactivation est moins marqué dans le carcinome à cellules squameuses de la souris que dans le sarcome de la souris, tous deux étant induits par le 20- methylcholanthrène t Umezawa et coll Journal of Antibiotics, Volume 25, page 409 ( 1972), Volume 27, page 419 ( 1974)/. En outre, on a constaté que l'action d'inactivation de bléo- mycine se manifestait en cas de carcinome à cellules squa- meuses de la tête et du cou des êtres humains, en particu- lier ceux du type à faible différentiation contre lesquels les bléomycines sont supposées ne pas être si efficaces Z Mueller et coll, Cancer, Volume 40, page 2787 ( 1977)3. Comme on le comprendra d'après les documents ci-dessus, les bléomycines sont incapables d'exercer une ac- tivité suffisante contre les carcinomes contenant une enzy- me d'inactivation de la bléomycine de grande activité C'est une des raisons de la nécessité d'améliorer davantage les bléomycines La Demanderesse envisage que s'il est possible de découvrir un dérivé de bléomycine difficilement sensible à une inactivation enzymatique, il deviendrait possible de traiter plus efficacement, par exemple, le cancer de la tête et du cou, le cancer de l'oesophage, le cancer du poumon et lescarcinomes à cellules squameuses dans d'autres régions et de traiter des adénocarcinomes tels que le cancer de l'estomac qui ne sont pas sensibles au traitement par des bléomycines classiques De ce point de vue, la Demanderesse a effectué des recherches poussées qui ont abouti à la décou- verte que les bléomycines étaient inactivées à un moindre degré lorsqu'un substituant (-X) est introduit sur l'atome d'azote de la liaison amide de la structure partielle, NH 1) le 2,3-diaminopropanamide (-NH-C Hi 2-CH-COH 3 N 2), des bléomyci- nes La présente invention est basée sur cette découverte. La présente invention se propose principale- ment de fournir de nouvelles bléomycines qui sont difficile- ment inactivées par l'enzyme d'inactivation et de fournir un procédé pour leur préparation. D'autres buts et avantages de l'invention res- sortiront de la description qui va suivre. selon la présente invention, on fourni= des bléomycines substituées sur l'azote du groupe amido ou leurs sels, des in-term édiaires pour leur préparation, et un procé- dé pour leur pra-paration, lesdites biéomycines substituées sur l'azote du groupe amide étant représentées par la formu- le générale: i 2 C:-> E;CH CH 4 CH 2 C (I) N I CO-R S'"il dans laquelle 3 M représente un fragment de squelette de bléomycine; X représente ( 1) un groupe alkyle de 1 à 18 ato- mes de carbone, ( 2) un groupe aminoalkyle de 1 à 12 atomes de carbone, ( 3) un groupe alkyle inférieur portant comme substituant (a) de 1 à 3 atomes d'halogène, (b) 1 ou 2 grou- pes phényle, (c) un groupe indolyle, ou (d) un groupe hété- rocyclique à cinq ou six chaînons contenant un atome d'oxy- gène, de soufre ou d'azote (parmi les groupes substituants, le groupe phénryle ou indolyle peut encore être substitué par un atome d'halogène ou un groupe alcoxy inférieur), ( 4) un groupe X (alkyle inférieur) /'o X 1 représente: X 2 2 -N-X ou N-X, X 2 est un atome d'hydrogène, un groupe al- 3 2 -4 kyle inférieur ou benzyle, X 3 est (a) un groupe alkyle infé- rieur, (b) un groupe phényl(alkyle inférieur), ou (c) un groupe mono cu di-(alkyle inférieur)amino (alkyle inférieur) qui peut être substitué par un groupe phényle ou halogénophé- nyle, X 4 est (a) un groupe alkyle inférieur ou (b) un groupe phényl(alkyvle inférieur), ( 5) un groupe naphtyle, ( 6) un grou- pe thiazolyle, ou ( 7) un groupe N-phényl(alkyle inférieur)- pipérazinvle; et R représente un reste amino terminal de la bléomycine ' Le fragment de squelette e bléomycine repré- senté par BM est la portion d'une molécule de bléomycine dé- limitée par les pointillés dans la for-ule générale (II) des bléomycines et englobe aussi bien _a forme contenant du cuivre que la forme exempte de cuivre, sauf indication con- traire Les groupes alkyle inférieurs sont des groupes al- kyle de i à 6 atomes de carbone, par exemple méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, n-pentyle, 3- méthylbutyle, 3-méthylpentyle et n-hexyle. Des exemples de groupes individuels représentés par X dans le formule générale (I) sont les suivants: ( 1) Des groupes alkyle de 1 à 18 atomes de carbone; méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, tertio- butyle, n-pentyle, 3-méthylbutyle, néopentyle, n-heptyle, 3-méthylpentyle, n-hexyle, 1,5-diméthylhexyl'e, isohexyle, n-octyle, n-décyle, lauryle, myristyle, cétyle et stéaryle. ( 2) Des groupes aminoalkyle de 2 à 12 atomes de carbone,: 2-aminoéthyle, 3-aminopropyle, 4-aminobutyle, 6-aminohexyle, 12-aminododécyle, et 4-amino-4-méthyl-1 l-diméthylpentyle. ( 3) Des groupes alkyle inférieurs ayant comme substituant (a) de 1 à 3 atomes d'halogène, (b) 1 ou 2 groupes phényle, (c) un groupe indolyle, ou (d) un groupe hétérocyclique à cinq ou six chaînons contenant un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote (parmi les groupes substituants, le groupe phény- le ou indolyle peut encore être substitué par un atome d'ha- logène ou un groupe alkoxy inférieur): 2,2,2-trifluoroêthyle, 2,2,2trichloréthyle, 2,2-difluoréthyle, 2,2-dichloréthyle, benzyle, diphénylméthyle, 2-phényléthyle, 2,2-diphényléthy- le, 1-phényléthyle, 1,2-diphényléthyle, 3-phénylpropyle, 2- phénylisopropyle, 1,3-diphénylpropyle, 3,3-diphénylpropyle, 4-phénylbutyle, 4,4-diphénylbutyle, chlorobenzyle, dichloro- benzyle, bromobenzyle, méthoxybenzyle, diméthoxybenzyle, éthoxybenzyle, méthylènedioxybenzyle, propoxybenzyle, p-chlo- rophényléthyle, p-méthoxyphényléthyle, p-benzyloxybenzyle, furylméthyle, 2-furyléthyle, 2-thiazolylméthyle, 2-pyrazolyl- méthyle, 2-imidazolylméthyle, 4-imidazolylméthyle, 2-thiényl- méthyle, 2-pyridylméthyle, 3-pyridylméthyle, 4-pyridylméthy- le, 3-indolylméthyle, 2-( 3-indolyl)éthyle, -m thoxy-3-indolyl- méthyle, 2-pyrimidylmnéthyle, 2-pyrirnidyléthyle, 4-pyrixnidyluié- &.l,4-pyrimidvléthylel 2-piperidylméthyle, 3-pipéridylmé&- z' vle, 4-pipéridylméthyle, 2 ( 2-piperidyl) -éthyle, 2 r Ldvyl)éthyle, 2 ( 4-pi Lpéridyl) éthyle, 1-( 2-pipéridyl) éthyle, 1 '-( 3 pipéridyl-éthyle, 1 ( 4-pipàr-idyl) éthyle, 2 (pipéridi- nc-aêth-vle, 2-pipérazylméthyle, 2 ( 2-pipérazyléthyle), 2 (pi- piêridi 4 no) éthyle, 3-pipéridinopropyle, 2 (morpholino) éthyle, 3 I (rorpholino) propyle, 2-morpholinylméthyle, 3-mnorpholinyl- méthyle, 2-(mnorpholinyl-éthyle, et 3-(mnorpholinyl)propyle. 3 X-aiyl (-I x (lkleinférieur) (o X est -N-k 2 ou -h-x 3 x 4 di'Lméth ylamninoéthyle, diéthylaminoëthyle, dîpropylamiinoéthy- le propylaminoéthyle, dimnéthylaminopropyle, diéthylamino- propyle, dipropylaminopropyle, pro pylaminopropyle, dibutyl- aziinopropyle, butylaminopropyle, benzylamninopro-Pyle, 2-plhé- rnléthylamhinopropyle, 1-phényléthvlamninopropyle, 3-phényl- promylamninopropy 1 e, 4-phénylbutylamuinopropyle, méthylamïino- éthylaminopropyle, éthylaminopropylaminopropyle, propylami- nopropylamuinopropyle, butylaminopropylamninopropyle, N (butyl- a inopropy 1 e) -N-inéthylamninopropyle, dibutylamninopropylamino- propyle, pentylaxninopro pylamiinopropyle, éthylamïinobutylami- nopropyle, propylaminobutylaminopropyle, éthylaminopropyla- ininobutyle, butylarninopropylaminobutyle, benzylaminoéthyla- ininoéthyle, benzylaminoéthylam-inopropyle, benzylamuinopropyl- 245 a-ninôtropyle, benzylamninobutylarninopropyle, phényléthylanmino- propylaminopropyle, N (phényléthylaminopropyle) -N-mnéthylamni- noprotpyle, N (chlorobenzylaminopropyle) -N-méthylpropyle, N- (bromobenzylamninopropyle) -N-Inéthylpropyle, N (chiorophénylé- tb-yla Tninopropyle) -N-miéthylpropylee benzylaminopropyle-N,N- diméthylaminopropyle, dibenzylaminopropyle-N,N-diéthylamnino- propyle, et dibenzylaminopropyle-N-méthyle-N-benzylaminopro- pyle. ( 5) des groupes naphtyle J -naphtyle et 1) naphtyle. ( 6) des groupes thiazolyle 2-thiazolyle, 3-thiazolyle et 36 14-thiazolyle. ( 7) des groupes N-phényle(alkyle inférieur)pipéridyle:N b-enzyl-4-pipéridyle, N-phényléthyl-4-pipéridyle, N-benzyl- 3-pipéridyle et N-benzyl 2-pipéridyle. Le reste amino terminal des bléomvcines repré- sent=es par R peut être l'un quelconcue des groupes amino a: zaz- ues substitués ou non substitués, mais c'est géné- rlemen t un groupe amino primaire alipnatique de nature basi- que representé par la formule générale (III)o R 2 R 1 NH (III) cans laquelle R est ( 1) une chaîne de groupes alkylène qui weuvenz presenter un atome d'azote intercalé entre les grou- Pes a 2;é e de la chaîne / des exemples d'un tel groupe sont ceux représentés par les formules -R 12-Y -R 3 et -R 12-Y 1-R 13 R 12 l R 13 '2 i 1 -2-R 1-, o R 12,R 13 et R 14 sont des groupes alkylène et Y 1 e: Y 2 représentent chacun un groupe de formule i R t 3 P 3 -N ou -N- R 4 (o R 3 et R 4 sont des atomes d'hydrogène ou des groupes al- kyle inférieurs qui peuvent porter des substituants)J, ( 2) -' N-, ou ( 3) un groupe phénylène; et R 2 est l'un quelcon- que des groupes de nature basique _-des exemples d'un tel groupe sont ceux représentés par la formule R 6 R 7 6 17 -S-R 5, -N-R 8, R NH 2 i I -N O -N-R 6, -NH-C=NH,, d È -N N-R 2 _ Ri H ou JL il dans laquelle R 4 est comme défini ci-dessus; R 5, R 6 et R 9 représentent chacun un groupe alkyle inférieur qui peut por- ter un substituant; et R 7 et R 8 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbone pouvant porter un substituant 7 e Le groupe alkylène du grou- pe amino ci-dessus est celui ayant I à 8 atomes de carbone, tel que, par exemple: CH CH 131 3 -CH 2 (CH 2)2-, -CH-, -(CH 2)3-, -CH 2-CH-, -(CH 2)4- -(CH 2)5-' -(CH 2)6-' et -(CH 2)3-, bien que les groupes alkylène ayant de 2 à 4 atomes de car- bone soient le plus souvent utilisés Les substituants des groupes alkyle ci-dessus comprennent les groupes hydroxyle, alcoxy ( par exemple méthoxy, éthoxy, propoxy et butoxy), phényle /qui peut porter un ou plusieurs substituants choi- sis entre des halog 3 nes, des groupes cyano, alkyle inférieurs, benzyloxy, et des groupes benzyloxy substitués (par exemple par un groupe alkoxy, phénoxy ou un halogène) /, et des grou- pes cycloalkyle de 5 à 13 atomes de carbone. Des exemples des groupes amino ci-dessus compren- nent les suivants: 2-aminoethylaminino, 3-aminopropylamino, 2-diméthylaminoéthylamino, 2-diethylaminoéthylamino, 3-dimé- thylaminopropylamino, 3-diéthylaminopropylamino, 3-( 3-butyl- aminopropylamino)-propylamino, 3-( 2-oxypropylamino)propyla- mino, 3-pipéridinopropylamino, 3-(i-phényléthylamino)propyl- amino, 2-aminopropylamino, 3-méthylaminopropylamino, 3-butyl- aminopropylamino, 3-( 6-aminohexylamino)propylamino, 3-trimé- thylaminopropylamino, 3-( 3-diméthylaminopropylamino)propyl- amino, 3-( 3-aminopropylamino)-propylamino, 3 '-/N-méthyl-N- ( 3-aminopropyl)amino/-propylamino, 3-pyrrolidinylpropylami- no, 3-pipéridinylpropylamino, 3-morpholinopropylamino, 3-pi- pérazinylpropylamino, 3-/4-( 3-aminopropylpipérazinyl /7 pro- pylamino,3-( 3-pyrrolidinylpropylamino)propylamino, 3-( 3-pi- péridinylpropylamino)propylamino, 3-( 3-morpholinylpropyla- mino)-propylamino, 3-( 3-oxypropylamino)propylamino, 3-( 3- méthoxypropylamino)propylamino, 3-benzylaminopropylamino, m-aminométhylbenzylamino, p-aminométhylbenzylamino, 2-cyclo- pentylaminoéthylamino, 3-cyclohexylaminopropylamino, 4-cy- clohexylaminobutylamino, cycloheptylaminopropylamino, 3-cy- clooctylaminopropylamino, 3-ZN-méthyl -N-( 3-cyclooctylméthyl- aminoropyl) arnino/propylamino, 3-cyclodécanylméthylamino- Drc Dp%-1 amino, 3 LN-méthyl -N-/3 ( 2-p-chlorophényléthylami- ncpropyl /amninoj propylîamino, 3 IN-rnéthyl -N-/3 (i, p- r 4 J -er zvloxybenzyl)aminopropyl 7 amino L propylamino,3-N ié-zh':l -N/3 (p-cyanobenzylamino)propyl amn Lpoymi rno, -1 {-N-méthyl -N-/3(cycloundècanylméthylamino)propyl 1 am-4 10 -propylamino, 3 > N-méthyl -N-/bis(ra,p-dibenzyloxy- ber zv I >-aminopropyl /amino J propylamino, 3 N,N-dirméthy 1 N, '3 (dibenzylamino) propyl_ 7 amino Lipropylamino, 3 N,N-di é- zhl /3 (dibenzylaminopropyl) /amino) propylamino, 3 { Nj,N-diméthyl -N-7 (N,N-diméthyl -N ( 3-dibenzylaminopro- pyl -N-( 3-dibenzylaminopropyl amn prylio,3 N'N din&zhyl -N-Z-3 anmlnc)propyl j 7 amino propylamino, 3 N,N-diméthyl -N-13- (N,N-diméthyl -N ( 3-cyclooctylmnéthylaminoprop Dyl) amino) pro- py-l 7 aminolj propylamino, 3-/i' ( 3-dibenzylaminopropyl)pi- Déridyll-propylamino et 3-J 4-/j (cyclooctylméthylamnino) _rp 7 pipéridy J propylamino. Comme composés avantageux, on peut citer ceux dans lesquels R est un groupe 3-7-(S)-1 '-phényléthyl 7 amino- propylamino ou 3 '-(n-bu-tylaminopropyl)aminopropylamino et ceux présentant un reste amine représenté par la formule (IV) -NH-(CH)3 A-(CH) -B (IV) R 1 R O R R 00 o Aes't-N-, -Nu D(H) R 1 R R il il, dans laquelle Rl, R 101, R 11 et R,11,qui peuvent être iden- ticues ou différents,représentent chacun un groupe alkyle inférieur, benzyle ou -un groupe benzyle halogéné et B re- :Drêesante R -N-R 12 -ô 12 représente ( 1) un groupe phényl (alkyle inférieur), (,2) un groupe phényl (alkyle inférieur) portant sur le noyau phényle un ou plusieurs substituants choisis parmi (a) des halogènes, (b) des groupes alkyles inférieurs, (c) des grou- pes alcoxy inférieurs,(d) un groupe cyano, (e) un groupe trifluorométhyle, (f) un groupe benzyloxy qui peut porter sur le noyau phényle des substituants tels que des halogè- nes, un groupe alcoxy et phénoxy, (g) des groupes di(alkyle inférieur) amino, et (h) un groupe phényle, ( 3) un groupe cyclohexyle, ( 4) un groupe triphénylméthyle, ( 5) un groupe naphtylméthyle, ( 6) un groupe furylméthyle, ( 7) un groupe. thiophéneméthyle, ( 8) un groupe alkyle inférieur substitué par un groupe cycloalkyle de 5 à 13 atomes de carbone, ou ( 9) un groupe norbornène-2méthyle; et R 13 représente ( 1) un atome d'hydrogène, ( 2) un groupe benzyle, ou ( 3) un grou- * pe benzyle portant sur le noyau phényle un ou plusieurs ha- logènes ou groupes benzyloxy comme substituant 7 Ces compo- sés sont avantageux en raison de leur toxicité pulmonaire relativement faible Dans les formules ci-dessus, les grou- pes alkyle inférieur comprennent les groupes méthyle, éthy- le et butyle; les groupes phényl (alkyle inférieur) compren- nent les groupes benzyle, 2-phényléthyle, 1-phényléthyle, 3-phénylpropyle, 2,2-diphényléthyle, et dibenzylméthyle; les groupes phényle(alkyle inférieur) portant des substi- tuants sur le noyau phényle comprennent les groupes 2-p- chlorophényléthyle, p-chlorobenzyle, o-chlorobenzyle, m- chlorobenzyle, 1-(p-chlorophényl)-éthyle, o,p-dichloroben- zyle, m,p-dichlorobenzyle, p-bromobenzyle, p-fluorobenzyle, pentafluorobenzyle, m-trifluorométhylbenzyle, p-méthylben- zyle, p-diéthylaminobenzyle, p-méthoxybenzyle, o,p-dimétho- xybenzyle, m,p-dibenzyloxybenzyle, p-cyanobenzyle et p-phé- nylbenzyle; et les groupes alkyle inférieurs substitués par un groupe cycloalkyle de 5 à 1 il atomes de carbone compren- nent les groupes cyclopentylméthyle, cyclohexylméthyle, cy- cloheptylméthyle, cyclooctylméthyle, cycloundécanylméthyle et 2-cyclohexyléthyle. Des composés particulièrement avantageux sont ceux représentés par la formule générale (I) dans laquelle R est un groupe 1-phényléthylaminopropylamino, butylamino- propylamino ou un groupe amino représenté par la formule générale (V): -NH-(CH 2)3-A 1 (CH 2) 3-B 1 (V) dans laquelle A 1 représente -N N (o R et R 1 Rll. représentent chacun un groupe alkyle inférieur ou benzyle) St represente R t 13 ' -N-R 12, o R 12, représente ( 1) un groupe ph 6 nyl-(alkyle inférieur) Fui peut porter sur le noyau phényle un ou deux substituants comprenant (a) des halogènes, (b) un groupe cyano, et (c) un groupe benzyloxy, ou ( 2) un groupe alkyle inférieur subs- titué par un groupe cycloalkyle de 5 à 13 atomes de carbone; L O et R 13, est l'hydrogène ou un groupe benzyle qui peut porter un ou deux groupes benzyloxy comme substituants Jo Les combinaisons de X et R, qui présentent une toxicité pulmonaire particulièrement basse, sont les suivan- tes: Les bléomycines substituées sur l'azote du grou- pe amido dans lesquelles X est le groupe isopropyle, (S)-1- phényléthylet diéthylaminol-1-méthylbutyle, dibutylaminopro- Dyle, ou n-butylaminopropylaminopropylamino et R est un grou- pe 1-phényléthylamino ou N-(alkyle inférieur)-N-(halogéno- benzylaminopropyl)aminopropylamino; leurs sels; les bléomy- cines substituées sur l'azote du groupe amido dans lesquel- les X est un groupe alkyle de 3 à 8 atomes de carbone, les groupes 1,5-diméthylhéxyle, benzyle, 1-phényléthylaminopro- pyle, di-n-butylaminopropyle, n-butylaminopropylaminopropyle, N-méthyl-Nbenzyi-N-(dibenzylaminopropyl)aminopropyle, ou N-méthyl-N(halogénophényléthylaminopropyl)aminopropyle et R est un groupe N-méthylN-(halogénophényléthylaminopropyl) aminopropylamino, N-méthyl-N-benzyl-N(dibenzylaminopropyl) aminopropylamino, N-méthyl-N-/bis(mp-dibenzyloxybenzyl)ami- nopropyl/aminopropylamino, N-méthyl-N-méthyl-N-i(dibenzylami- nopropyl)aminopropylamino, N-éthyl-N-éthyl-N-(dibenzylamino- propyl)aminopropylamino, N-méthyl-N-(cyclooctylméthylamino- propyl)aminopropylamino, ou N-méthyl-N-(cyanobenzylaminopro- pyl)aninopropylamino; et leurs sels. 253063-9 Comme exemples des composés de la présente inven- tion, on peut citer ceux indiqués sur le Tableau I Sur le Tableau I, "BLM" figurant dans le nom du composé représente "bléomycine'" et le composé représenté par la formule géné- raie (I) est désigné par "nom de R (reste amino)-(amido)- N-/nom de X/-BLM". TABLEAU 1 Nom du compose 2 ( 4 '-Imidazolyl)éthylamino (amido)N hnéthyli-IBLM 2 ( 4 -Imidazolyl)'thylamino (amido)N léthyll-BLM 2 ( 4 -Imidazolyl) éthylamino 2 ( 4 '-Imidazolyl)j t hylamino (amnido) N l 3-"(S)-il -phényléthyl) - aminopropyll -BLM 2 ( 4 '-Imidazolyl)éthylamino (amido) N l 2-aminoéthyll -BLM 4-Guanidinobutylamino (amido) N lisopropyll -BLM 4Guanidinobutylamino (amido)N l 11,6 '-diméthylheptyll-BLM 4Guanidinobutylamino (amido)N l 2 ',2 ',2 1 trifluoréthyll-BLM 4Guanidinobutylamino (amnido) N loctyll -BLM 4-Guanidinobutylamino (amido) N l 3-"(S) -l -phényléthyl>)amino- propyll-BLM 4-Guanidinobutylamino (amido) N l 3 (di-n-butylamino) propyl I-BLM 4-Guanidinobutylamino (amido) N llauryll -BLM 4-Guanidinobutylamino (amido')N lbenzyîll-BLM Ab ré 6 v 11- i I N 1 di I-MMA dl H-MEA d H-IPA d H-BA d H-PEP d IH-EDA d B 2-IPA d B 2 -DHA d B 2 -TFEA d B 2 -OCT d B 2-PEP d B 2 -BPA d B 2 -LAA d B 2-BA Composé N o J- il k-' w io Ln TABLEAU 1 (Suite) 4-Guanidinobutylainino(amido)N-ldiph'nylin'tliyll e C -13 LM 4-Guan d -Lnobutylamino-(amido)N-l 11,21-diphényléthyll-131,M 4-Guanidinobutyl amino-(ami do)N-l-naphtyll 13 LM 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-l 2-furylméthyll-BLM 4Guanidinobutylamino-(amido)N-l 3-pyridylméthyll-BLM 4-Guanidinobutylamino(amido)N-l 2-tbiazolylmthyll-BLM 3-"S)-ll-phénylétliyl)aminopropylamino(amido)N-lisopropyll-BLM 3-"S)-ll-pheenyl'éthyl)aminopropylamino-(amido)N"l 3-"S)-il- phényleethyl)aminopropyll-BLM 3-"S)-il-phényléthyl)aminopropylamino(amido)N-lbenzyll-BLM 3-"S)-ll-phényléthyl)aminopropylamino-(amido)N-lp-chlorobenzyll- BLM 3-( (S)-ll-phényleethylainino)propylamino-(amido)N-ls Lêaryll-Ill',M 3-"S)-ll-ph'ényléthylamino)propylamino-(artiido)N-llauryll-BLM 3-"S)-llphényléthylamino)propylamino-(ai, iido)N-lOctyll-BLM 3-"S)-ll-phényléthylamino)propylamino-(amido)N-l 5-m'éthoxyindol- 3-yléthyll-BLM 3-"S)-ls-phényléthylamino)propylamino-(amido)N-l 12-aminôdo- décanyll-BLM ( 1112-ADVM d B 2-DPE d P,2-NA d B 2-PPA d B 2-AMPY d B 2-ATZ d PEP-IPA d PEP-PEP d PEP-BA d PEP-CBA d PEP-STE d PEP-LAA d PEP-OCT d PEP-MTA d PEP-DAD M (A t N C> 1 O % W % O TABLEAU 1 (Suite) 3-"S)-ll-phényléthylamiiio)propylamino-(amido)N-l 11,21 diph'ényl- thyll-BLM 3-"S)-ll-phényléthylamino)propylamino-(amido)N-ldiphênylméthyll- BLM 3-"S)-ll-phnyléthylamino)propylainino-(amido)N-l 1,6-dimthyl- heptyll-BLM 3-"S)-ll-phényléthylamino)propylamino-(ainido)N-l 2-(I- pipérazinyl)éthyll-BLM 3-"S)-ll-phényléthylamino)propylamino-(amido)N-l 3-(di-n- butylamino)propyll-BLM 3-"S)-ll-phényléthylamino)propylamino-(amido)N-lN-benzyl- pipirazin-4-ylj-BLM 3-"S)-ll-phényléthylamino)propylamino-(amido)iq-l 4-diethylamino- 1-méthylbuty 11-BLM 3-lN-méthyl-i\l-( 3-n-butylaminopropyl)aîainolpropylamino- (amido)N-lisopropyll-BLM 3-lN-mithyl-N-( 3-n-butylaminopropyl)amii-iolpropylamino- (amido)N-{ 3-lN-mthyl-N-( 3-n-butylaminopropyl)aminolpropyll BL Pl 3-{N-mti-thyl-N-l 3-(p-chlorobenzyl)aminopropyllami tiol- propylamino-(amido)N-l 3-(S)-ll-phényléthyl)aminopropyll-BLM 3-IN-méthyl-N-l 3-(p-chlorobenzyl)aminopropyllaminol- propylamino-(amido)N-loctyll-BLM F 37 d PEP-DPE d PEP-ADPM d PEP-DIIA d PEP-APZ d PEP-BPA d PEP-ABP d PEP-ADP d BAPP-IPA d BAPP-BAPE d MCLBZ-PEI d MCLBZ-OCI (n m Ln w 1 C> 1 0 % La 1 % O TABLEAU 1 (Suite) 41 3-{N-métliyl-N-l 3-(p-chlorobenzyl)arninopropyllàminolpropyl d MCLBZ- amino-(aiiiido)N-l 1,2-dipliényléthyll-Bim DPE, 42 3-{N-métliyl-N-l 3-(p-clilorobenzyl)aininopropyl laminolpropyl dmcla 13 z- amino-(amido)N-l 1,5-diméthylhexyll-BLM DIIA 43 3-f N-méthyl-N-l 3-( 2-(p-chlorophnyl'),thyl)aminopropyllaminol d MCLPÉ- propylamino-(amido)N-l 3-"S)-ll-phi-nyl&thyl)aniinopropyll-BLM PEP 44 3-{N-méthyl-N-l 3-( 2-(p-chlorophnyl)éthyl)aminopropyllamino} d MCLPE- propylamino-(amido)N-loctyll-BLM OCT 3-{N-methyl-N-l 3-( 2-(p-cl-ilorophényl)éthyl)aminopropyllami no} d MCLPE- propylamino(autido)N-{ 3-lN-méth 1-N-l 3-( 2-(p-chlorophényl) DICLPE éthyl)aminopropyllaminolproyl}-BLM 3-{N-méthyl-N-l 3-( 2-(p-chlorophényl)'éthyl)aniinopro'yllamino} d MCLPE- 46 p propylariiino-(amido)N-et 3-(di-n-butylaminc)propyll-BLM BPA 47 3-{N-mtliyl-N-benzyl-N-l 3-(dibenzylamino)propyllaminol d MTBZ- propylamino-(amido)N-l 3-"S)-ll-phényléthyl)aminopropyll-BLM PEP 48 3-{N-méthyl-N-benzyl -N-l 3-(dibenzylaraino)propyllaminol d MTBZ- propylamino-(amido)N-loctyll-BLM OCT 3-{N-m-ethyl-N+benzyl-N-l 3-(dibenzylamino)propyllamino}- 49 propylamino-(amido)N-( 3-{N-méthyl-N-benzyl-N-l 3-(dibenzyl d MTBZ- amino)propyllamino}ptopyll-BLI 4 MTBZ 3-{N-me 5th 1-Nibenzyl-N-l 3(dibenzylamino)propyllamino) d MTBZ Ln propylamino-(amido)N-l 3-lN-methylN-( 3-n-butylaminopropyl)l BAPP aminopropyll-BLM TABLEAU i 3-{N-m Tléthyl-N-benzyl-N l 3 (dibenzylamino)propyllaminohl- propylamino 3-{N,N-diméthyl-N-l 3 propylamino (amido)N'-l 3-" 3-{N,N -diméthyl-N- l 3 (dibenzylamino)propyllamino}- propylamino 3-{N,N-diméthyl-N l 3 (dibenzylamino)propyliamino}- propylamino (amido)N l 3 3-{N,N-diéthyl-N l 3 (dibenzylamino)propyllaminol-propyl- amino (amido) N -l 3-"(S) -l -ph-enyléthy 1 >)aminopropyll -BLM 3-{N,N-di'éthyl-N l 3 (dibenzylamino)propyll aminoipropylarnino- (amido) N loctyll -BLM 3-{N,N-diéthyl-N l 3 (amido) N l 3 3 {N-mthyl-N l 3 (cyclooctylmethylamino) propyll amino} 1- propylamino- 3 {N-méthyl-N l 3: cyclooctylmnethylamino) propyl Iamino Ipropyl- amino (amido)N loctyll-BLM 3 {N-méthyl-N l 3 (cyclooctylméthyl) aminopropyll aiino}J- propylamino (amido)N l 3-"(S) -l -phenylgthylamino)propyll -BLM 3 {N-m'éthyl-N l 3 (p-cyanobenzylamino) propyll aminol- propylamirno (amido)N l 3 (di-n-butylamino) propyll -BLM si d MT 3 Z - BA d MMDBZ - PEP d MMDBZ - OCT d MMDBZ - BPA d EEDBZ - PEP d EEDBZ- OCT d EEDBZ- BPA d MCO- BPA d MCO- OCT d MCO-PEP d MCNBZ - BPA -1- -J w' o T.ABTJEAU 3 (Suite) _______ J 3-{N-m thyl-'N l 3 (p-cyaniobenzylamino)propyil amino}propylamino- (amido)N loctyll-BLM 3-{N-méthyl N l 3 (p-cyanobenzylamvino)propyllaminlo}propylamilo- (amido) N l 3-"(S) -1 '-phényléthylamino)propyll -BLM 3-{N-méthyl-N l 3-bis (m,p-dibenzylo:ybenizyl) aminopropyllamino}- propylamino (ani-do)N l 3-"(S) -l -phényléthyl) aminiopropyll -BLM 3-{N-méthyl-N l 3-bis (m,p-dibenzyi oxybenzyl) aminopropyll aminol- propylamino (amido)N ln-octyll -BLM d MCNBZ- OC Ti d MCNBZ- p EI Ip d MDDBZOBZ - PE P d MDDBZOBZ - OCT ri LN o. formule générale (I) sont séparés comme décrit ci-après. Un composé représenté par la formule (VI) suivante ou un dérivé réactif de son groupe carboxyle est condensé avec une amine (décrite ci-après): CONH NH CH 2 NH /CH N XN/x \CH CH 2 CO-X (VI) N CO-Ro BONS H dans laquelle BM représente un fragment de squelette de bléomycine, R représente un groupe hydroxyle ou un reste amino terminal de bléomycinev X représente un groupe hydroxyle ou un groupe de formule -NH-X, au moins l'un des IO symboles Ro et Xo représentant le groupe hydroxyle, et X représente ( 1) un groupe alkyle de 1 à 18 atomes de carbone, ( 2) un groupe aminoalkyle de 1 à 12 atomes de carbone, ( 3) un groupe alkyle inférieur portant comme subs- tituant (a) de 1 à 3 atomes d'halogène, (b) 1 ou 2 groupes I 5 phényle, (c) un groupe indolyle, ou (d) un groupe hétéro- cyclique à cinq ou six chainons contenant un atome d'oxy- gène, de soufre ou d'azote (parmi les groupes substituants, le groupe phényle ou indolyle peut encore être substitué par un atome d'halogène ou un groupe alcoxy inférieur), ( 4) un groupe Xl-alkyle inférieur /_a X 1 représente x v Il 12 -N-X 3 ou -N-X 3, X 2 est un atome d'hydrogène, un groupe X 4 alkyle inférieur ou benzyle, X 3 est (a) un groupe alkyle inférieur, (b) un groupe phényl (alkyle inférieur), ou (c) un groupe mono ou di-(alkyle inférieur)amino(alkyle infé- rieur) qui peut être substitué par un groupe phényle ou halogénophényle, X 4 est (a) un groupe alkyle inférieur ou (b) un groupe phényl(alkyle inférieur)/, ( 5) un groupe naphtyle, ( 6) un groupe thiazolyle, ou ( 7) un groupe N(phényl(alkyle inférieur)pipérazinyle Lorsque XO O de la formule (VI) est le groupe hydroxyle 1 une amine de formule i O H 2 N-X (VII) (dans laquelle X a la définition ci-dessus) est utilisée dans la condensation, tandis que lorsque RO de la formule (VI) est le groupe hydroxyle et X est -NH-X (o X est comme défini ci-dessus, on utilise une amine de formule I 5 H-R (VIII) (dans laquelle R est comme défini ci-dessus) Si nécessai- re, le produit de condensation est débarrassé du cuivre en donnant une bléomycine substituée sur l'azote du groupe amino de formule générale ( 1) En outre, si nécessaire,un sel de la bléomycine substitue sur l'azote du groupe amido est préparé d'une manière usuelle. La condensation d'un composé de formule (VI) ou d'un dérivé réactif de son groupe carboxyle avec une amine de formule (VII) ou (VIII) est réalisée selon le processus connu de formation d'une liaison amide, en particulier ce- lui utilisé dans la chimie des peptides On fait réagir un composé de formule (VI) avec une amine de formule (VII) ou (VIII) en présence des ractifs d'activation du groupe car- boxyle qui sont utilisés dans la chimie des peptides En variante, le composé de formule (I) est obtenu par réac- tion d'une amine de formule (VII) ou (VIII) avec un dérivé réactif pour le groupe carboxyle d'un composé de formule (VI) Les dérivés sont, par exemple, un dérivé obtenu par réaction d'un réactif d'activation du groupe carboxyle et du composé de formule (VI) ou d'un ester 3- aminopropylique du groupe carboxyle du composé de formule (VI) Comme exem- ples des réactifs d'activation, on peut citer les suivants: 6-chloro-l-p-chlorobenzènesulfonyl-oxybenzotriazole, 3 '- sulfonate de N-éthyl-5-phénylisooxazolium, perchlorate de N-tertio-butyl-5-méthyl-isooxazolium, N-éthoxycarbonyl-2- éthoxy-l,2-dihydroquinoléine (FEDQ), sulfite de di-p-nitro- phényle, phosphite de tri-p-nitrophényle, trichloracétate de p-nitrophényle, dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-éthyl- 3-( 3-di-méthylaminopropyl)carbodiimide, l-cyclohexyl-3- ( 2 morpholinoéthyl)carbodiimide, diphénylcarbodiimine, di- p-toly Jcarbodiimide, diisopropylcarbodiimide, phosphorazi- IO date de diphényle (DPPA), et phosphorocyanurate de diéthyle (DEPC). Comme exemples des dérivés réactifs du groupe car- boxyle des composés de formule (VI), on peut citer les dérivés réactifs obtenus par réaction des réactifs d'acti- I 5 vation ci-dessus avec le groupe carboxyle; les dérivés réactifs du groupe carboxyle que l'on obtient par l'utili- sation simultanée des réactifs d'activation et des additifs de condensation, comme par exemple le p-nitrophénol, le o,p-dinitrophénol, le pentachlorophénol, le 2,4,5-trichlo- rophénol, le pentafluorophénol, le N-hydroxysuccinimide, le 1-hydroxybenzotriazole, le N-hydroxy-5-norbornène-2,3- dicarboximide; l'ester 3-aminopropylique du groupe carbo- xyle de formule (IV), et les esters 3-aminopropyliques monosubstitués tels que, par exemple, l'ester 3-acétylami- nopropylique, l'ester 3-succinylaminopropylique, l'ester 3benzoylaminopropylique, l'ester 3-benzylaminopropylique, l'ester 3-p-toluènesulfonylaminopropylique, l'ester 3-( 2,4- dinitrophényl)aminopropylique, l'ester 3-( 3,5-diméthyl-3- oxocyclohexène-l-yl)aminopropylique, l'ester 3-(tertio- butoxycarbonyl)aminopropylique, et l'ester 3-(salicylidène) iminopropylique. La condensation est effectuée d'une façon générale dans un solvant Le solvant peut être n'importe lequel de ceux qui n'affectent pas la réaction, mais il est préféra- -ble d'utiliser un solvant polaire qui dissout le composé de formule (VI) utilisé comme matière de départ Des exem- ples de tels solvants sont l'eau, le diméthylformamide, le 22 diméthylacétamide, l'acétonitrile, et leurs mélanges Le rapport molaire de l'amine de formule (VII) ou (VIII) au composé de formule (VI) est généralement d'environ 0,5 à , de préférence d'environ 1 à 10 Bien que la température de réaction dépende du type de solvant et d'autres conditions, elle est cependant en général de -15 à 45 C, de preférence de 10 à 30 C La durée de réaction est de 1 à heures Le procédé selon la présente invention est dé- crit en détail ci-après. IO La forme contenant du cuivre du composé de formule (VI) et, si nécessaire, l'additif susmentionné sont dissous dans l'eau, le diméthylformamide, l'acétonitrile, ou un mélange de ceux-ci On ajoute à la solution le réactif d'activation susmentionné tout en agitant entre -5 et 15 C. I 5 Si nécessaire, on ajuste le p H du mélange à une valeur convenant pour l'activation avec un acide ou une base inor- ganique comme l'acide chlorhydrique ou l'hydroxyde de so- dium ou avec une base organique telle que la triéthylamine ou la Nméthylmorpholine On ajoute ensuite au mélange le composant amine tel quel ou en solution à p H ajusté Le mélange résultant est agité et, si nécessaire, son p H est ajusté d'une manière analogue à celle décrite ci-dessus. L'agitation est poursuivie pendant l à 70 heures pour obte- nir le composé recherché selon la présente invention. L'isolement du dérivé ainsi formé est réalisé de la manière suivante Un solvant organique tel que l'acé- tone ou l'éther est ajouté au mélange réactionnel pour précipiter le produit désiré Le précipité est dissous dans l'eau distillée, puis ajusté à p H 6 et, à des fins d'éli- * mination de sels, on le fait passer à travers une colonne garnie d'une résine d'adsorption telle que, par exemple, Amberliteo XAD-2 (Rohm and Haas Co) dans l'eau distillée pour effectuer l'adsorptiondi produit désiré sur la résine. La colonne est lavée à l'eau distillée pour éliminer le sel, et éluée avec du méthanol aqueux acidifié tel qu'un mélange d'acide chlorhydrique 1/50 N et de méthanol ( 1:4 volume/volume) pour recueillir les fractions ayant un maximum d'adsorption aux environs d'une longueur d'onde 290 mûu La fraction combinée est neutralisée avec Dowex t 44 (une résine échangeuse d'anions du type OH de Dow Chemical Co), puis concentrée sous pression réduite et lyophilisée en donnant une poudre brute du dérivé Dans certains cas,' le stade d'élimination des sels peut être omis et la solu- tion du précipité dans l'eau distillée peut être directe- ment soumise au second stade du traitement. Dans le second stade, la solution de poudre brute IO dan,eau distillée passe à travers une colonne garnie de CM 1 C-25 (type Na+; Pharmacia Fine Chemicals Co), qui a été équilibrée avec une solution tampon 1/20 M d'acide acétique-acétate de sodium (p H 4,5), pour effectuer l'ad- sorption du produit désiré La phase adsorbée est ensuite éluée par la technique du gradient linéaire de concentra- tion qui est appliquée en ajoutant en continu du chlorure de sodium à la solution tampon ci-dessus pour augmenter la concentration de chlorure de sodium graduellement jus- qu'à 1,0 M Dans ce stade, les réactifs n'ayant pas réagi et les sous-produits tendent à être élués à un stade préma- turé et peuvent être séparés au moyen d'un'sélecteur à adsorption d'ultraviolets Si l'on constate que la fraction du produit désiré est contaminée par des impuretés, la chromatographie est répétée pour éliminer la totalité de ces impuretés. En variante, à la place de la chromatographie ci- dessus, un'autre procédé de purification chromatographique peut être mis en oeuvre en utilisant une résine adsorbante Amberlite XAD-2, par exemple La solution aqueuse du pro- duit brut est amenée à traverser la colonne garnie de la résine dans une solution tampon, telle que par exemple une solution aqueuse à 1 % d'acétate d'ammonium pour effectuer l'adsorption du produit désiré La phase adsorbée est éluée par la technique du gradient linéaire de concentration dans laquelle du méthanol est ajouté en continu à la solution tampon pour augmenter graduellement la concentration de méthanol Etant donné que les réactifs n'ayant pas réagi ont tendance à être élués à un stade prématuré et les sous- produits principaux à un stade avancé, ils peuvent être séparés par utilisation d'un sélecteur à ultraviolets Si l'on constate que les fractions désirées sont contaminées par des impuretés, elles peuvent en être complètement débarrassées en répnétant la chromatographie. Les deux -types ci-dessus de chromatographie sont réalisés seuls ou en combinaison La fraction purifiée contenant le produit désiré est dessalée en utilisant une IO résine adsorbante telle que par exemple Airberlite XAD-2, et lyophilisée en donnant une poudre amorphe bleue d'une bléomycine substituée sur i:azote du groupe amido contenant du cuivre La forme exempte de cuivre est obtenue en éli- minant le cuivre de la forme contenant du cuivre par un I 5 procédé connu tel que celui utilisant EDTA comme décrit dans le brevet japonais N O 31 875/77 Un exemple du proces- sus d'élimination du cuivre est décrit ci-après. Le produit contenant du cuivre est dissous dans l'eau distillée et la solution résultante et amenée à traverser une colonne garnie de Amberlite t XAD-2 dans l'eau distillée pour effectuer l'adsorption du produit contenant du cuivre La résine est ensuite lavée avec une solution aqueuse contenant du chlorure de sodium et 5 % de sel disodique de l'acide éthylènediaminetétraacétique (abrégé par EDTA 2 Na) pour faire transporter l'ion cuivre par EDTA-2 Na, en laissant la bléomycine substituée à l'azote du groupe amino exempte de cuivre, adsorbée sur la résine La résine est ensuite lavée avec une solution de chlorure de sodium pour éliminer EDTA 2 Na, puis avec de l'eau distillée, et enfin éluée avec du méthanol aqueux acidifié, tel que par exemple un mélange acide chlorhydri- que aqueux 1/50 N-méthanol ( 1:4 volume/volume) pour recueil- lir les fractions qui présentent un maximum d'adsorption aux environs de 290 nu La fraction combinée est ajustée à p H 6,0 avec Dowex R 44 (type OH; Dow Chemical Co), concen- trée sous pression réduite, et lyophilisée en donnant une poudre amorphe blanche de chlorhydrate de bléomycine substituée sur l'azcze du groupe amido exempte de cuivre. Si l'on utilise du sulfate de sodium et une solution aqueuse d'acide sulfurique à la place du chlorure de so- dium et de la solution aqueuse d'acide chlorhydrique, on obtient un sulfate Ainsi, on peut obtenir tout sel désiré par un choix de sel et de l'acide utilisés au stade d'élu- tion Comme exmples de sels obtenus de cette manière, on peut citer l'acétate, la tartrate, le citrate, le maleate et le lactate en plus du chlorhydrate et du sulfate. IO Lorsque la bléomycine substituée sur l'azote du groupe amido préparée comme décrit ci-dessus est soumise à une hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique aqueux 6 N à C pendant 20 heures, on décèle, hormis l'amine R-H et X-NH 2 ou un produit de décomposition de ladite amine dans I 5 certains cas, des produits de décomposition qui sont com- muns aux bléomycines, comprenant la L-thréonine, l'acide e-amino-p -( 4amino-6-carboxy-5-méthyl-pyrimidin-2-yl) propionique, l'acide 4-amino-3-hydroxy-2-méthyl-n-penta- noique, la 9 -hydroxy-L-histidine, la f -amino-L-alanine et l'acide 2 '-( 2-aminoéthyl)-2,4 '-bithiazole-4-carboxyli- que Ce fait confirme que la bléomycine substituée sur l'azote du groupe amido a la structure chimique représentée par la formule (I) mentionnée ci-dessus. Dans la formule générale (VI) des composés utilisés comme matière de départ, lorsque X est un groupe hydroxyle et RO est un reste amino terminal des bléomycines, on ob- tient une déamidobléomycine (forme contenant du cuivre) de formule CONH 2 NH 2 1 I CH 2 LNH CH CH C: CO-OH (VI-l) NN CO-R N il S H B S H 253063 g dans laquelle BM et R ont la définition donnée précédemment. On la prépare en hydrolysant des bléomycines exemptes de cuivre de formule générale (II) avec une enzyme d'inactiva- tion de rat ou celle extraite de façon similaire de foie de bovin ou de porc. Par exemple, un foie de bovin est homogénéisé dans une solution tampon au phosphate et centrifugé à 8000 tr/ min La liqueur surnageante est dialysée contre un tampon au phosphate en donnant une solution d'enzyme brute On IO ajoute à cette solution d'enzyme une solution de bléomyci- nes dans un tampon au phosphate On laisse le mélange réa- gir à 37 C pendant 5 à 48 heures et on débarrasse le mélan- ge réactionnel des protéines par un moyen approprié /Ia protéine peut être éliminée-par exemple en ajoutant de I 5 l'acide trichloracétique (abrégé en TCA) à une concentra- tion de 5 % pour précipiter la protéine, en séparant le précipité par centrifugation, et en lavant le précipité trois fois avec une solution à 5 % de TCA pour recueillir les liqueurs de lavage 7 Le mélange exempt de protéine est neutralisé, mélangé avec de l'acétate de cuivre en excès pour transformer le produit désiré en un chélate de cuivre. A des fins d'élimination de sels, on fait passer le chélate de cuivre à travers une colonne garnie d'une résine adsor- bande, Dowexe HO 40, dans de l'eau distillée pour effec- tuer l'adsorption du produit désiré Les sels sont éliminés par lavage avec de l'eau distillée et la phase adsorbée est éluée avec un mélange acide chlorhydrique 1/50 N-méthanol ( 1:4 volume/volume) pour recueillir les fractions qui présentent un maximum d'absorption aux environs de 290 mâ. La fraction recueillie est neutralisée avec une résine d'échange d'anions, Dowex 44 (type OH, Dow Chemical Co), concentrée sous pression réduite, et lyophilisée La poudre résultante est dissoute dans l'eau distillée, et amenée à traverser une colonne garnie de CM-Sephadex R O C-25 (type Na+; Pharmacia Fine Chemicals Co) qui a été équilibrée avec une solution tampon 1/20 M d'acide acétique et d'acéta- te de sodium de p H 4,5 pour effectuer l'adsorption La phase adosrbée est éluée par la méthode du gradient linéai- re de concentration dans lequel du chlorure de sodium est ajouté en continu à la solution tampon ci-dessus pour augmenter graduellement la concentration en sodium jusqu'à 1,0 M Les fractions d'éluat, de couleur bleue, contenant le produit désiré sont recueillies, dessalées par le pro- cédé d'élimination de sels utilisant Diaion O HP 40 comme décrit cidessus, et lyophilisées en donnant une poudre amorphe bleue de déamidoblémycines contenant du cuivre. Lorsque Xo O est -NH-X (X a la définition donnée ci- dessus) et R est OH dans la formule générale (VI) des composés utilisés comme matières de départ, la formule devient celle d'un acide bléomycinique à substitution sur l'azote du groupe amido. CONH 2 NH 2 I 12 CH 2NH CH CH C Hi CO-NH-X C 2 (VI-2) N, COOH N S HR BM dans laquelle BM est comme défini plus haut Un exemple de son procédé de synthèse est donné ci-après. En utilisant l'enzyme d'inactivation susmentionnée, la bléomycine B 2, qui est un composé connu, est transformée en déamidobléomycine B 2, une déamidobléomycine de formule (VI) dans laquelle RO est l'agmantine Cette déamidobléo- mycine est amenée à réagir avec une amine de formule (VII) comme décrit ci-dessus pour former une bléomycine B 2 substituée sur l'azote du groupe amido dans laquelle Ro est l'agmantine, et en hydrolysant le composé résultant en utilisant un mycéliim de champignon connu /par exemple IFO 8502 déposé à 1 ' "Institute for Fermentation'", Osaka 7 pour obtenir le produit désiré. L'acide déa idobléomycinique représenté par la for- mule CONH 2 NH. CH 2 NH CH \CH CH COQE 2 -(VI-3) N COOH BM 4 tk S S est une matière de départ de formule générale (VI) dans laquelle X O et RO sont des groupes hydroxyle On l'obtient IO en hydrolysant un acide bléomycinique connu (voir brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 886 133) avec l'enzyme d'inactivation susmentionnée On l'obtient également par hydrolyse de déamidobléomycine B 2 de formule générale (VI-1) dans laquelle R est l'agmantine, en utilisant la I 5 cellule de champignon susmentionnée. Comme exemples des ainesde formule générale (VII), on peut citer les suivantes:méthylamine, éthylamine,n-pro- pylamine, isopropylamine, n-butylamr Line, isobutylamine, tertiobutylamine, n-pentylamine, 3-méthylbutylamine, néopentylamine, n-heptylamine, 3-méthylpentylamine, n-hexy- lamine, 1,5-diméthylhexylamine, isohexylamine, n-octylamine, n-décylamine, laurylamine, myristylamine, cétylamine, stéarylamine, 2-amninoéthyla mine, 3-amninopropylamine, 4-ami- nobutylamnine, 6-arminohexylamine, 12-aminododêcylamiine, 4- amino-4-méthyl-1-diméthylpentylamnine, 2,2, 2-trifluoréthlyl- amine, 2,2, 2-trichloroéthylamine, 2, 2-difluoréthylamine, 2, 2dichloréthylamine, benzylamine, diphénylméthylamine, 2-phényléthylamine, 2, 2-diphényléthylamine, 1-phényléthy- lamine, 1, 2-diphényléthylamine, 3-phénylpropylamine, 2-phê- nylisopropylamine, 1, 3-diphénylpropylamine, 3,3-diphényl- propylamine, 4-phénylbutylamine, 4,4-diphénylbutylamine-, IO chlorobenzylamine, dichlorobenzylamine, bromnobenzylamine, méthoxybenzylamine, diméthoxybenzylamine, éthoxybenzylamnine, méthylènedioxybenzylamine, propoxybenzylamnine, p-chlorophé- nyléthylamine, p-méthoxyphényléthylamine, p-benzyloxybenzy- lamine, furylméthylamine, 2-furyléthylamine, 2-thiazolylmé- I 5 thylamnine, 2-pyrazolylméthylamnine, 2-imnidazolylmnéthylamihe, 4-imidazolylméthylamine, 2-thiènylméthylamine, 2 -pyridylmé- thylamine, 3-pyridylméthylamine, 4-pyridylméthylamine, indolylméthylamine, indolyléthylamine, 4-méthoxyindolylmé- thylamine, 2-pyrimidylméthylamine, 2-pyrimidyléthylamine, 4-pyrimidylméthylamine, 4-pyrimidyléthylanmine, 2-pipéri- dylméthylamine, 3-pipéridylméthylamine, 4) pipéridylméthyl- amine, 2 ( 2-pipéridyl)êéthylamine, 2 2-( 4-pipéridyl) éthylamin-e, 1 ( 2-pipéridyl) éthyilamine, 1-( 3- pipéridyl) éthylamine, 1 ( 4-pipéridyl) éthylamine, 2- (pipé- ridino) éthylamine, 2-pipérazylméthylamine, 2 ( 2-pipérazyl- éthyl) amine, 2 (pipéridino) éthylamine, 3-pipéridinopropyl- amine, 2 (morpholino) éthylamine, 3 2-mor Rholinylméthylamine, 3-morpholinylméthylamine, 2 (mor- pholinyl) éthylamine Y 3 (morpholinyl) pro Dylamine, diméthyl- aminoéthylamine, -diéthylamàinoéthylamtine, dipropylaminoéthyl- amine, propylaminoéthylamine, diméthylaminopropylaminer- diéthylaminopropylamine, dipropylaminopropylamine, propyl- aminopropylamine, dibutylaminopropylamine, butylaminopro- pylamine, benzylaminopropylamine, 2-phényléthylaminopro- pylamine, 1-ph-ényléthylaminopropylamine, 3-phénylpropyla- minopropylamine, 4-ph énylbutylaminopropy lamine, méthylami- noéthylaninopropy lamine, éthylaminopropylaminopropylamine, 2530639- propylaminopropylaminopropylamine, butylaminopropylamino- propylamine, N (butylaminopropyl) -N-méthylaminopropylamine, dibutylarniinopropylaminopropylamine, pentylanminopropylamnino- propylamine, éthylarninobutylaminopropylamine, propylamino- butylamino-Propylamine, éthylaminipropylaminobutylamine, butylaminopropylaminobutylamine, benzyla minoéthylaminoéthyl- amine, benzylaminoéthylaminopropylamine, benzylaminopropyl- aminopropylamirne, benzylaminobutyl aminopropylamine, phényl- éthylaminoprouylamino-propylamine, N (phényléthylaminîo- IO propyl) -N-méthylaminopropylamine, N -(chlorobe nzvlaminopro- pyl) -N-xnéthylarainopropyla-inine, N) (broimobeinzylaminopropyl)- N-méthylamînopropylamine, N (chlorophényléthylaminopropyl) - N-méthylaminopropylamine, dibenzylaminopropyl-N, N-diméthyl- aminopropylamine, dibenzylaminopropyl-N N-diéthylaminopropyl- amine, dibenzylaminopropyl-N-miéthyl-N--benzylaminopropyla- mine, ( 4-naphty 2 tamine, /J -naphtylamine, 2-thiazolylamine, 3-thiazolylamine, 4-thiazolylamine, N-benzyl-4 -pipéridyl- amine, N-phényléthiyl-4-pipéridylamine, N-benzyl-3-pipéri- dylamine et N-benzyl-2-pipéridylamnine. Des amines avantageuses de formule (VIII) sont les amines aliphatiques primaires qui J ont un groupe basique en plus du groupe amino participant à la réaction Comîme exem- ples de telles amines, on oeut citer les suivantes: 2-amino- éthylamine, 3-amainopropylamine, 2-diméthylaminoéthylamine, 2-diéthylaminoéthylamine, 3-diméthylaminopropylamine, 3-dié- thylaminopropylamine, 3 ( 3-butylaminopropylaminj-propyla- mine, 3 ( 2-hydroxypropylamino)propylamine, 3-pipéridinopro- pylamine, 3 (l-phényléthylamino) propylamine, 2-aminopropyl- amine, 3-méthylaniinopropylamine, 3-butylaminopropylamine, 3 ( 6-aminohexylamino) propylamine, 3-triméthylaminopropyl- amine, 3-( 3)diméthylaminopropylamino)propylamine, 3-0 (-ami- nopropylamino) propylamine, 3 '-/-méthyl-N ( 3-amiriopropyl) amino 7 propylamine, 3-pyrrolidinylpropylamine, 3-pipéridi- nylpropylamine, 3-morpholinopropylamine, 3-pipérazinylpro- pylamine, 3-/T ( 3-aminopropyl)pipérazinyl 7/propylamine, 3- propylamino) -propylamine, 3 ( 3-morpholinylpropylamino) pro- 3 1 pylamine, 3-( 3-hydroxypropylan Lino)propylamine, 3-( 3-métho- xypropylamino)-propylamine, 3-benzylaminopropylamine, m- a--n inométhy-lbenzylam-ine, p-aminométhylbenzylamine, 2-cyclo- pentylaminoéthylamins, 3-c-vlcohexylaminopropylamine, 4- cyclohexylaminobutylamine, cyc'loheptylan,-inopropylamine, 3-cyclooctylarainoprouylamine, 3--N-ma-thyl-3-N(cyclooctylmé- thvlaminopropyl)amino/propylamine, 3-cyclodécanylméthyla- minopropylainine, 3-/N métliyl-1,1-/-3-( 2-p-chloroi Dhényléthyla- mino)-propy 17 amino/prop% 71 amine, 3-_ méthyl-N-/U-(m,l- dibenzyloxybenzyl)amino Dropy 17 amino 7 propylamine, 3-/N- rc, -N-F 3-(-p-cyaiiobe-eizylamino)pr py 17 amino/propylamine, 3-/ no)propyl - /N-méthyl-N-/U-(cycloundécanylméthylami 7 aiaino 7- propylamine, 3-/Ii-méthyl-N-/Uis(m,p-dibenzyloxybenzyl)-ami- nopropy 17 amino 7 propylamine, 3-/UN-diméthyl-N-/-3-(diben- zylarilino)prouyl/amiro 7 propylamirie, 3-/ 4,N-diéthyl-N-/U-(di- benzylamino)7 amilO/Propylamine, 3-/-NN-diméthyl-N-/3-(NN- diméthyl-N-( 3-dibenzylaminopropyl)amino)propy 17/-aniino 7 pro- pylamine, 3-/-NN-diméthyl-N-2-3-(NN-diméthyl-N-( 3-cyclooctyl- méthylaminopropyl) amino) -pro-,pyj 7 aniiro 7-propylamine, 3-/-4-( 3- dibenzylaminopro-,oylàmino)pipéridyi 7 propylamine, et 3-/-4-( 3- cyclooctylméthylaminopropyl)pipéridy 17 propylamine. Parmi les amines de formule générale (VIII), celles qui sont représentées par la formule générale suivante sont des composés nouveaux dont la synthèse a été déjà réalisée pour la première fois par la Demanderesse NH 2-(CH 2)3-A'-(CH 2)3-B (IX) R O R 10,' ' dans laquelle A' représente -N ou -N + (dans laquelle R 11 R 10, et R 1 l, représentent chacun un groupe alkyle inférieur ou benzyle et B' représente un groupe diúphényl(alkyle in- férieur)7-amino, cyanophérnyl(alkyle inférieur)amino, cyclo- alkyl(C 5-C 13) (alkyle inferieur)amino, ou bisaibenzylo- xyphényl(alkyle inférieur)-ainino La synthèse de ces com- posés est effectuée par l'hydrolyse du composé représenté par la formule généraleY-(CH 2)3-A'(CH 2)3-B' (X) (dans laquelle A' et B' sont comme définis ci-dessus et Y est un groupe amino protége) pour éliminer le groupe pro- tecteur Bien que l'hydrolyse ait lieu en présence d'un acide ou d'une base, on préfère cependant un acide tel que l'acide chlorhydrique. Parmi les matières de départ de formule générale (X), celles qui sont représentées par la formule R ' R 10 ' R 12 ILI (xi) Y-(CH 2) 3-G-(CH 2)3 (XI) Rll' R 13 ' aans laquelle Rl O,, Rll, et Y sont comme défini ci-dessus et R 12,, et R 13,, représentent chacun un groupe phényl(alkyle inférieur)7 sont préparées de la façon suivante. Une 3-aminopropyl-N,N-dialkylamine de formule géné- rale 1 O ' (XII) NH 2 (CH 2)3-N-Rl dans laquelle R 10, et Ril, sont comme défini ci-dessus) est soumise à une condensation réductrice avec le benzal- déhyde ou un phényl(aldéhyde inférieur) Le mélange réac- tionnel est rendu alcalin et extrait avec un solvant or- ganique en donnant une N',N'-dibenzylaminopropyl-N,N- dialkylamine de formule générale R R( R 10 -N-(CH 2)93-N-R 13 (dans laquelle R 10,, Rll, R 12, et R 13, -sont comme défini ci-dessus) L'amine résultante est amenée à réagir avec une 3-halogéno-propyl-amine protégée à l'azote pour for- mer un sel quaternaire de formule '10 12 Y (CH 2) 3 (CH 2) (XIV) R 1 l' R 13 "' dans laquelle Y, Rl O,, Rll,, R 12 et R 13 ", sont comme dé- fini ci-dessus Le sel quaternaire est hydrolysé en pré- sence d'un acide, par exemple l'acide chlorhydrique 6 N à une température comprise entre la température ambiante et 200 C, par exemple à 110 C, pendant 8 heures Après élimination des sous-produits tels qu'un acide, le mélange réactionnel est concentré en donnant un chlorhydrate d'un composé de formule (XI). * Une amine de formule générale alkyle inférieur I Y-(Ci H 2)3-N-(CH 2)3-B,, (XV) dans laquelle Y est comme défini ci-dessus et B" est un groupe di/phényl(alkyle inférieur)_amino, p-cyanophényl (alkyle inférieur)amino, cycloalkyl(C 5-Cll)-(alkyle in- férieur) amino, ou bis-/dibenzyloxyphényl(alkyle inférieur)l amino, est préparée par acylation d'une bis( 3-aminopropyl) (alkyle inférieur) amine avec un équivalent ou moins d'un agent acylant tel que, par exemple, le chlorure de ben- zoyle, le chlorure d'acétyle, l'anhydride acétique, le car- benzoxy-chlorure, la S-tertio-butoxycarbonyl-4,6-diméthyl- 2-mercaptopyrimidine, ou le N-carbéthoxyphtalimide pour former un dérivé monoacylé, en soumettant le dérivé résul- tant à une condensation réductrice avec un équivalent d'un aldéhyde lorsque B" est un groupe amino monosubstitué ou avec 2 ou plus, de préférence 3 à 6, équivalents d'un aldé- hyde lorsque B" est un groupe amino disubstitué, et en hy- drolysant le groupe acyle avec l'acide chorhydrique. Les propriétés physicochimniques des dérivés de bléomycines substituées sur l'azote du groupe amido,typiques de la présente invention sont indiquées sur le Tableau 2. Composé N O Abréviation Tableau 2 Maximumn d 'absorp- tion UV de la forme exempte de i -j L OO Ni'e-de la forme con tenan b du cuivre Rf Electrophorèse + 2 de la f Lorrne contenant Ou, Rm (Rm d'alanine 1,0)' dl H-MMA d If-MEA dli IPA d Hi-BA d H- PEP d Hi-EDA d B 2- IPA d B 2-DHA d B 2 -TFEA d B 2-OCT d B 2-PEP d 132-BPA d B 2 -LAA d B 2- BA d B 2-ADPM d B 2-DPE d B 32-NA d B 2 -FFA 291 ( 111) 291 ( 107) 291 ( 105) 291 ( 98) 291 291 ( 100) 291 ( 89) 291 ( 94) 291 ( 93) 291 ( 85) 291 ( 79) 292 ( 79) 291 ( 82) 291 ( 78) 291 ' C 89) 291 C 81) 291 C 85) 292 ( 115) w u Ln "I% t J c Y uji i s il 0,62 * 0156 8 0153 * o 187 0 Q 39 * O 77 0148 * 0,92 0,85 0)75 0,96 1,04 0,87 O85 1 y 02 0,y 70 O 78 0,176 O 176 0, 82 IDO-ZUIDWP dsd-Zg UDNP ddvg-ddvgp Vdi-advgp dav-dsdp dev-dsdp Vdg-dsdp 0 % 1 M % O go m VIT C%à 8 O & 1 9 1 11 LT t 1 i 1 1 1 T o Ti 1 00 i T 9 z i 1 t,8 10 L 8 ( O L a i O Eoi 1 18 40 P 8 L O SL L O 81 i O 6 L O L 8 O 8 6 O L 8 L O 8 L ï O L 1 os 10 Es % O 9 z ( O G 8 t O 08 L O EL t O EL 4 O 8 L 10 ú 9 L O 69 L O ; 91 O 8 Lto 9 L& O T 9 O ú út O J' O P LL O 8 Li O L Li O S 10 9 8 i O' *L tt O ( 88) ( 06) (ES) ( 16) (GL) (BL) (ES) ( 98) (T 6) ( CG 8) ( 88) (P 6) ( 001) (ES) (ES) ( 89) ( 18) (T 6) ( 68) ffl) (LET) ( 118) 06 E 68 Z 16 Z 16 Z 16 Z T 6 z 16 Z 16 E T 69 T 6 z 16 71 16 E ssz 16 Z IGZ 16 Z 16 Z 16 Z 16 Z 16 Z z 6 z z 6 z 01, 6 ú SE LE 9 E Gú tlú Zú TE Oú 6 E BE LE SE t, z ú z z E 1 z 0 z "O ri (Oi Tns) z avau Rvl TABLEAU 2 (Suite) d MCLBM 4-DPE d MCLBZ -DIIA d MCLPE-PE P d MCLPE-'OCT d MCLPEMCLPE d MCLPE BPA d MT BZ -PEP d MTBZ-OCT d MTBZ -MTBA d MTBZ-BAPP d MTBZBA d MMDBZ -PEP d M 4 MDBZ -OCT d MMDBZ -BPA d EEDBZ-PEP d EEDBZ -OCT d EEDBZ -BPA d MCO-BPA d MCO-OCT d MCO-PEP d MCNBZ -BPA d MCNBZ-OCT 291. ( 78) ( 80) (: 75) ( 76) ( 79) 76) ( 78) ( 73) ( 87) ( 83) 89) 81) ( 94) o 52 o)25 0 24 O'50 0 735 0, 49 0,48 0,148 0 53 0, 70 0,59 0,190 i 120 Q 192 1 Â 07 Qi 79 1,0 i 130 1.112 i 14 1,100 0 % W i w -1 TABLEAU 2 (Suite). d MCNBZ -PEP d MDDBZOBZ-PEP d MDDBZOBZ -OCT 291 285 ( 74) 285 ( 76) Rtemarques * 1 =I Silica Gel 601 " 254 Silanised R' (Nverck Go); méthanol ac 6 tate d'ammonium à 6 % ( 60:40 volume/volume, ecepté pour les valeurs Rf marquées d'un astérisque qui sont mesurées dans un autre mélange ( 65:34 volume/volume-). Avicel SF(FM O Go); acide formique-acide acétique-eau ( 27:75:900 volume/volume), 800 V, 15 minutes. 0,9 0,09 1, 10 0,93 0 64 LY CK. Les propriétés biologiques, comme déterminé sur les composés typiques de la présente invention, sont décrites ci-après. 1 Essai de résistance contre l'enzyme d'inactivation. ( 1) Extraction de l'enzyme d'inactivation. Le foie de rats males de souche Donryu est mélangé avec deux fois son poids d'une solution tampon au phosphate 1/15 M de p H 7 et broyé pour préparer une émulsion de tissu. L'émulsion résultante est centrifugée à 105 000 g (cons- tante de gravité) pendant 60 minutes La liqueur surnageante est dialysée et la fraction à grosses molécules résultante est utilisée comme extrait d'enzyme à effet d'inactivation. ( 2) Détermination de la réaction d'inactivation. On ajoute à 1 ml de l'extrait ci-dessus, 1 ml d'une solution de substrat contenant 800 ig d'un dérivé de bléo- mycine On laisse le mélange réagir à 37 C pendant 40 mi- nutes Une portion ( 0,3 ml) du mélange réactionnel est séparée de la protéine et testée pour déterminer son acti- vité résiduelle contre Mycobacterium smegmatis ATCC 607 e Dans les mêmes conditions, la bléomycine B 2, utilisée comme témoin, présente une diminution de 50 % d'activité. Les résultats des essais sont indiqués sur le Tableau III. Comme il ressort des résultats d'essai, comparativement aux bléomycines, les dérivés de bléomycine substitués sur l'azote du groupe amido de la présente invention sont gé- néralement moins affectés par l'enzyme d'inactivation des bléomycines. 2 Activités antimicrobiennes contre Mycobacterium smegmatis ATCC 607 et Bacillus subtilis. L'activité antimicrobienne est testée contre les microorganismes d'essai en cause par le procédé du cylindre à plaque de gélose L'activité est enregistrée en supposant que l'activité d'un échantillon normalisé de bléomycine A 2 (forme exempte de cuivre) a un pouvoir de 1000 Pm/mg/ Les résultats d'essai sont indiqués sur le Tableau 3. 3 Activité inhibitrice de croissance contre des cellules cultivées de He La 53 Des cellules de He La 53 sont inoculées dans un milieu (MEM avec 10 % de sérum de bovin) placé dans une boite de Pétri en matière plastique Deux jours plus tard, on ajoute une bléomycine à la boîte Au bout de 3 jours de culture, on dénombre les cellules Le pourcentage d'inhi- bition de croissance est calculé en utilisant l'équation suivante: Pourcentage d'inhibition (%) = 100 x (B-A)/(B-C) o A est le nombre final de cellules 3 jours après l'addi- tion de l'échantillon d'essai, B est le nombre final de cellules du témoin sans addition de l'échantillon d'essai et C est le nombre de cellules au moment de l'addition de l'échantillon d'essai La valeur DI 50 (concentration don- nant 50 % d'inhibition) est estimée d'après le graphique obtenu en traçant la concentration de l'échantillon d'essai en fonction du pourcentage d'inhibition Les résultats ob- tenus sont indiqués sur le Tableau 3. Tableau 3 i ConnosâN O Arévition Pouvoir antimicrobien j Concentration donnant Résistance du compos Cé coniosô N'Abrviaion du composé exempt de Ou 50 co d'inhibition de exeinpt de Ou à (pouvoir e /mg croissance du composé l'enzyme d'inactiva- Contre Contre exempt de Cu contre tion 4-1 ______________ ycobacteriumj Bacillus des cellules cultivées __________e______ 60 ? C sub tij i S de Hac La S (DI,)0 il d H-MMA d H-MEA d Hl-IPA dif-BA d H-PEP d H-EDA d B 2IPA d B 2-DHA d B 2-TFEA d B 2-OCT d B 2 -PEP d B 2-BPA d B 2-LAA d B 2BA d B 2-ADPM 1, 2 0,98 1,0 0,62 0, 34 0,171 0, 39 0,73 0, 39 + ++ + + + ++ F-. hj 1 Ln w C> 1 Cr% 1 W 1 %a TABLEAU 3 (Sgilite) d B 2-DPE d B 2 -NA d B 2-FFA d B 2-AMPY d B 2 ATZ d PEP IPA d PEP-PEP d PEP BA d PEP-CBA d PEP STE d PEP-ILAA d PEP-OCT d PEP-MTA d PEP-DAD d PEP-DPE d PEP-ADPM d PEP-DIHA d PEP-APZ d PEP BPA d PEP-ABP d PEP-ADP d BAPP-IPA o +++I ++ 44 +i +±F + + + 0 y 67 0 58 0,183 0,y 73 0 1 7 0 80 0, 28 0, 36 0,43 11 02 0,y 83 1,50 2 70 0,90 C> 1 0 % W t CI% CD O 1 o 8199 s Tt IZ 9 vag-ODNP 89 M Ln i vaia-zeassp LS Cu 1 TEST PE 69 E 09 io Ozs OSETV IDO-Zaalisp 99 OO&T OSTE ffloz aga-zecissp 99 Oslo ú 99 Z úú 9 zú Vaúl-ZúIGMP ts 71 O Gs úOLO J'DO-ZGGWWP ú s aga- ZúlCINNP ZG GG O ZLúZ ILETZ LL O Oit? 19 tri 7 z vu-MI 114 P Tg ziz 9 LE L Itr I ddvúl-zúijlwp os Oi Ti T OEZ zeilw-zgjlwp 6 SL i 1 OET osez V cn 081 0069 9 P ot, O 069 ú 0691 E Oú O OLZ O 9 9 T 7 úZ O 868 T OGLSE t, p LE O L 9 Zt, ú 69 T E I ++++ 6 t, O úú 6 t'ESTú z tr 98 LO Tzg ZPúúZ 1 t, à O v U O 8081 OUSE 06 sz 08st IT CISCT-Zúl,IDWP 6 ú 6 Lto 0099 OOTS CICIVG-JC Ivqp TABLEAU 3 ( suito), d MCO-OCT d MCO-PEP d MCNBZ-BPA d MCNBZ -OCT d MCNBZ-PEP d MDDBZOBZ-PEP d MDDBZOBZ-OCT 0,33 11 10 0 ? 60 O 30 +±t ++ * _ _ _ _ _ _ i _ _ _ _ _ _ _ I _ _ _ _ _ J _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ I _ _ _ _ Remarques: * 1 La résistance est evaluee d'après le degré d'inactivation d ans les conditions dans lesquelles le degrÈ d'inactivat Thn de la bléomycine B 2 est de 50 9 %. Estimation +r +i ++ Degré d' inactivation % ou Plus à 44 % à 1 34 % a 24 % à 14 ,, moins de 5 % Indéterminable en raison de l'adsorptionl sur la protéine enzymatique Ln cg 0 % Lm Q -IF 4 Toxicité pulmonaire (fibrose pulmonaire) chez la souris. Des souris de souche ICR (mâles, âgées de 15 semai- nes) en groupes de 9 membres sont utilisées Chaque prépa- ration d'essai est administrée par injection intrapérito- néale une fois par jour pendant 10 jours consécutifs à une dose de 5 mg/kg A la fin de l'administration, les souris sont maintenues pendant 5 semaines sous observation, puis sacrifiées et autopsiées pour examiner l'apparition et le degré de la fibrose pulmonaire L'évaluation est réalisée en comparant le nombre de souris ayant reçu l'administra- tion et souffrant de fibrose pulmonaire et le degré de la maladie Les résultats sont indiqués sur le Tableau 4 Le degré est donné par l'échelle de cotation suivante Nombre de points: O: pas-de -fibrose 1: accumulation d'exsudat dans l'alvéole et modification analogue à la fibrose dans la paroi alvéolaire. 2: fibrose dans plusieurs régions. 4: fibrose diffuse. 6: fibrose dans plus des deux tiers de la zone totale. Le "rapport" du Tableau 4 est calculé par comparaison avec le "Complexe de bléomycine". Compose úNO b ia ti on TABLEAU 4 Incidence Nombre de souris atteintes de fibrose pulmonairej Degré Cotation totale de fibrose puilmonaire/nombre totail I fapport d' e chantilion S (>) d PEP IPA d PEP-PEP d PEP-APZ d PEP-BPA d BAPP IPA d BAPP-BAPP d MCLBZ -PEP di 4 CLPE-PEP d MCLPE-MCLPE d MTB Zr PEP d MTBZ - OCT d MTBZ -MTBZ d MTBZ-BA d MMDBZ-PEP d MMDBZ -OCT 3/8 1/8 /9 0/8 3/9 /7 2/9 0/1 0/9 0/8 Cf/ 8 0/3 0/8 0/9 0/9 0 ( 46 0, 32 0, 07 o O o o o o o O o.' r#3 Ln % O TABLEAU 4 (Suite) 54 d MMDBZBPA 0/9 0) 0/27 0) O d EEDBZ-PEP 0/9 0) 0/27 0) O 56 d EEDBZ-OCT 0/9 0) 0/27 0) O 57 d EEDBZ-BPA 0/9 0) 0/27 0) O 58 d MCO-BPA 0/9 0) 0/27 0) O 59 d MCO-OCT 0/9 0) 0/27 0) O d MCO-PEP 0/9 0) 0/27 0) O 62 d MCNBZ-OCT 0/9 0/27 0) O 64 d MDDBZOBZ-PEP 0/9 0) 0/27 0) O d MDDBZOBZ-OCT 0/9 0) 0/27 0) O CN DL 50 chez la souris, comme déterminée par administration pendant 10 jours consécutifs. Des souris mâles de souche CDF 1/SLC (âgées de 6 se- maines, 7 membres par groupe) reçoivent une injection sous- cutanée de doses variables de dérivés de bléomycine une fois par jour pendant 10 jours consécutifs A partir de la mortalité pendant la période d'administration, on détermine la DL 50 (dose journalière) par le procédé Behrens-K Urber. Les résultats sont indiqués sur le Tableau 5. TABLEAU 5 Composé Abréviation DL 50 pendant la période n O d'administration de 10 jours consécutifs (mg/kg/jour) 52 d MIDBZ-PEP 13,9 53 d MDBZ-OCT 15,0 64 d MDDBZOBZ-PEP > 81,4 65 d MDDBZOBZ-OCT > 75,7 Comme il ressort de la description ci-dessus, les composés de la présente invention résistent à une enzyme d'inactivation de la bléomycine, ont une grande activité d'inhibition de croissance contre des cellules cultivées de He La 53 ainsi qu'une nette activité antimicrobienne, et ils ont une très faible toxicité pulmonaire, ce qui suggère clairement leur utilité en clinique. Lorsqu'on les utilise comme médicament, les compo- sés de la présente invention sont mélangés avec un exci- pient de la manière habituelle et préparés sous la forme d'injections, comprimés, onguents, suppositoires, etc Des excipients appropriés comprennent l'eau, des sucres tels que le mannitol, et d'autres matières généralement utilisées dans les préparations pharmaceutiques. Bien que la dose varie selon la forme d'adminis- tration, une dose unique de 2 à 10 mg par personne est administrée une à quatre fois par semaine, la dose cumu- lative étant de 2 à 200 mg/personne/semaine. L'invention est illustrée en détail en se référant aux exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 Stade A On homogénéise du foie de bovin frais, pesant 200 g, dans 400 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M de p H 7,2 et on le centrifuge à 8000 tr/min pendant 30 mi- nutes La liqueur surnageante est dialysée contre un tam- pon au phosphate 0,05 M pour préparer une solution d'enzyme brute On ajoute à 10 g de bléomycine B 2 400 ml de la solu- tion d'enzyme brute On laisse le mélange réagir à 37 C pendant 24 heures On ajoute au mélange réactionnel 40 ml d'une solution à 55 % d'acide trichloroacétique (abrégé par TCA) pour précipiter la protéine On sépare le préci- pité par centrifugation et on le lave trois fois avec une solution à 5 % de TCA La liqueur surnageante et les li- queurs de lavage sont réunies, neutralisées avec une solu- tion d'hydroxyde de sodium 4 M, et mélangées avec 3,2 g ( 2,4 équivalents de bléomycine) d'acétate de cuivre pour former un chélate de cuivre du produit désiré A des fins d'élimination de sels, on fait passer la solution de ché- late de cuivre à travers une colonne, d'un volume de 1 li- tre, garnie d'une résine adsorbante Diaion @ HP 40 (Mitsubishi Chemical Co) dans l'eau distillée, pour effec- tuer l'adsorption du produit désiré Après avoir séparé les sels par lavage avec 1,5 litre d'eau distillée, la phase adsorbée est éluée avec un mélange d'acide chlorhy- drique aqueux 1/50 N et de méthanol ( 1:4 volume/volume) pour recueillir les fractions qui présentent un maximum d'absorption à une longueur d'onde d'environ 90 pm La fraction combinée est neutralisée avec Dowex- 12 44 (type OH, Dow Chemical Co) et concentrée sous pression réduite. On fait passer le concentré à travers une colonne de 1 litre de volume, garnie de CM-Sephadex e C-25 (type Na+, Pharmacia Fine Chemicals Co) qui a été équilibrée avec une solution tampon 1/20 M d'acide acétique et d'acétate de sodium de p H 4,5 pour effectuer l'adsorption La phase adsorbée est éluée par la méthode du gradient liné- aire de concentration dans laquelle du chlorure de sodium est ajouté en continu à la solution tampon ci-dessus pour augmenter graduellement la concentration de sodium jusqu'à 1,0 M Les fractions bleues éludes à une concentration de sodium d'environ 0,3 M sont recueillies, puis dessalées en utilisant Diaion R HP 40 comme décrit ci-dessus, et lyophilisées en donnant 8,5 g (rendement 83 %) d'une poudre amorphe bleue de déamido-bléomycine B 2 contenant du cuivre. La poudre bleue présente des maxima d'absorption (E 1 %/1 cm) à 242 mp ( 138) et 291 mp ( 115), comme déter- miné dans l'eau distillée Les maxima d'absorption dans l'infrarouge (en nombre d'onde, cm 1), comme déterminé dans une pastille de K Br, sont de 3425, 2975, 2940, 1720, 1640, 1575, 1460, 1420, 1400, 1375, 1280, 1260, 1240, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 760 D'autres propriétés physicochimi- ques sont indiquées sur le Tableau 6. D'une manière analogue à celle décrite ci-dessus, en utilisant la bléomycine A 2,-C, la 3- ((S)-l'-phényléthyl) aminopropylaminobléomycine, et la 3-( 3-n-butylaminopropy- lamino)-propylaminobléomycine, on obtient respectivement la déamidobléomycine A 2,-C, la 3-((S)-l'-phényléthylamino) propylamino-déamidobléomycine et la 3-( 3-n-butylaminopro- pylamino) propylaminodéamidobléomycine Les propriétés physicochimiques de ces composés sont celles indiquées sur le Tableau 6. Tlableau 6 Déamidobléoniycinesynthétisée Maximumi d'ab CON * 1 la El ectrophor( nc*l sorption Ui V forme conte deo lu forme con Lu- de la nant du cunvo nn du cui vre, h forme contenant;, R f ( i'm:il a:1,n i NO) du cilivrej (E i 11/l cm) L___________ ______ __ Déamidobléomycine B 2 ( 138) ( 115) 0,95 0 y 64 * 0, 72 Déamidobléomycine A 2 4 12,506 2 292( 110) 0 46 * 3- 0,55 * u-i j-. Reir arques: 141 l Slia e 160 F 25 Sîlanised Q'(Merck Co); mesure dans un mélange de solution de méthanol acétate d' inraonîum à 6 %i ( 6 '0: 40 volume/volume) excepté pour les valeurs de Rf munies d'un astérisque qui sont mesurées dans un autre mélange ( 65:34 volume/volume) + 2 Avicel Z 3 F O(FMO Go); acide formique-acide acétique - eau( 27:'? 5:C,,0 C volume/volume); 800 V, 15 minutes. r'> un (AJ Co o' LY C Stade B A une solution de 1 g de déamidobléomycine B 2 contenant dil cuivre obtpnup au stade A et de 1,77 g de 1-hy- droxybenzotriazole (abrégé par HOBT) dans 10 ml de diméthyl- formamide, maintenue à O C et sous agitation on ajoute 1,35 g ( 10 équivalents de bléomycine) de dicylohexylcarbodiimide labrégé par DCC) Cinq minutes plus tard,on ajoute au mélange 840 mg ( 5 équivalents de bléomycine) de chlorhydrate de 3-(S)- l'phényléthylamirno) propylamine et 0,72 ml de N-méthylmorpho- line On laisse le mélange résultant réagir sous agitation à la température ambiante pendant 16 heureso On ajoute au mélange réactionnel 10 fois son volume d'acétone pour précipiter le produit désiré Après levage minutieux à 7 'acétone le îrécipité lest disqous dans l'eau distillée et on lui fait traverser une colonne de 100 ml de volume,garnie de CM-Sep Dhadex%-25 (type Na+,Pharmacia Fine Chemicals C ) qui a été éauilibrée avec une solution tampon 1/20 M d'acide acétique et d'acétate de sodium de p H 4,5 Dour effectuer l'adsorption La phase adsorbée est éluée par la méthode du cradient linéaire de concentra- * tion dans laquelle du chlorure de sodium est ajouté en continu à la solution tampon ci-dessus Pour auqmenter graduellement la concentration en sodium jusqu'à 1,0 M Les fractions bleues éluées à une concentrat ion de sodium '1 environ 0,6 M s-nt re- cueillies La fraction combinée es dessalée en utilisant 100 ml de Diaione HP-40 nomme décrit ci-dessus,et lyophilisée en don- nant 880 mg (rendement de 76 %) d'une poudre amorphe bleue d'amido (N 3((S)-l'phényléthylamino)-propyl -bléomycine B 2 contenant du cuivre Elle présente des maxima d'absorption (E 1 % 1 cm) à 243 mm ( 125) et 292 mj ( 96),t el 5 qu me 5 uras dans l'e Du distillee L'absorption des rayons infrarouges (en nombre d'onde,cm-1) mesurée dans une pastille de K Br, sont de 3425,2975,2930,1720,1640,1580,1575,1550,1455,1430,1400,1370, 1290,1240,1190,1130,1095,1060,1005,980,875,760 D'autres pro- priétés physicochimiques sont indiquées sur le Tableau 2. D'une manière analogue à celle décrite ci-dessus, on effectue la synthèse de formes contenant du cuivre des bléomycines B 2 substituées sur l'azote du groupe amido r C 7 à 20 indiquées sur le Tableau 2 par réaction de déamidobléo- mycines-B 2 contenant du cuivre avec des amines correspondant aux produits désirés. De même,on effectue la svnthèse des composés n 1,6,21-38 et 65 indiqués sur le Tableau 2 par réaction de déamidobléomycine A 2 '-C, de 3-((S)-l-pbényléthyl) aminopropylami- no-déamidobléomycine et de 3-( 4-n-butylamincpropylamino) rpropylamrinodsamidobléomycine (chaque déamidobléomycine sous la forme contenant du cuivre) avec les amines correspondant aux produits désirés. Stade C- Dans 20 ml d'eau distillée,on dissout 880 iha du commosé contenant du cuivre obtenu au stade BA des fins d'élimination de sels on fait masser la solution à travers une colonne,de 100 ml de volumeqarnie de Amberlite RXAD-2 dans l'eau distillée,tour effectuer l'adsorption du compose contenant du cuivre La résine est lavée successivement avec 300 ml d'une solution aqueuse contenant du chlorure de sodium et 5 % de EDTA 2 Na,100 ml de solution aqueuse a 2 % de chlorure de sodium,et 250 ml d'eau distillée La résine est ensuite élue avec un mélange acide chlorhydrique 1/50 N-méthanol ( 1:4 volume/ volume) pour recueillir les fractions qui présentent un maximum d'absorption à une longueur d'onde d'environ 290 mpo La frac- tion combinée est ajustée à p H 6,0 avec Dowex 44 (type OH, Dow Chemical C ),puis concentrée sous pression réduite et lyo- philisée en donnant 790 mg (rendement de 93 %) d'une poudre amor- phe blanche de chlorhydrate de (amido)N 3-((S)-l'-phénylé- thylamino)propyl -bléomycine B 2 exempte de cuivre Le maxi- mum d'absorption des ultraviolets (E 1 % 1 cm) sont de 291 mr et ( 79) respectivement Les maxima d'absorption des infrarouges (en nombre d'onde cm-1),mesurés dans une pastille de K Br,sont de 3425,2950,1720,1640,1555, 1450,1400,1360,1320,1260,1190, 1060,880,910,805,770 et 700 D'autres propriétés physicochimiques sont indiquées sur le Tableau 2. Exemple 2 - Etape A - Un mycélium de champignon,pesant 400 g,obtenu par culture de Fusarium roseum IFO 7189 déposé à " Institu- te for Fermentation",Osaka,est homogénéisé dans 4 litres d'eau d'une solution 1/20 M de phosphate de p H 7,5 On ajou- te au mélange homogénéisé une solution de 10 g de amido)N- 3-((S)-l'-phényléthylamino)propyl -bléomycine B 2 contenant du cuivre dans I litre de la même solution de tampon au phos- phate que celle utilisée ci-dessus On laisse réagir le mélan- ge à 37 C pendant 20 heures On le mélange avec un adjuvant de filtration et on le filtre avec aspiration On lave le résidu avec la même solution tampon que ci-dessus On combine le fil- trat et les liqueurs de lavage et on les fait traverser une colonne garnie de 1 litre d'une résine adsorbante Amberlite XAD-2 dans l'eau distillée,pour effectuer l'adsorption du pro- duit désiré Aprês avoir éliminé par lavage les sels avec 2 litres d'eau distillée,la phase adsorbée est élu 6 e avec du méthanol en solutionaque:use à 50 % pour recueillir 5 litres de fractions vert bleuâtre ou bleues La fraction combinée est concentrée sous pression réduite,puis dissoute dans 350 ml de méthanol à 80 %,et amenée à traverser une colonne garnie de 70 ml d'alumine dans du méthanol à 80 % O N lave la colonne avec 100 ml de méthanol à 80 % et on la développe avec du mé- thanol à 40 % pour recueillir 350 ml de fractions d'éluat bleues. La fraction combinée est concentrée sous pression réduite, puis dissoute dans l'eau distillée,et on lui fait traverser une colonne,de 600 ml de volume,garnie de CM-Sephadex C-25 (type Na+,Pharmacia Fine Chemicals C ) qui a été équilibrée avec une solution tampon 1/20 % d'acide acétique et d'acéta- te de sodium de p H 4,5 pour effectuer l'adsorption du produit désiré La phase adsorbée est éluée par la méthode du gradient linéaire de concentration dans laquelle du chlorure de sodium est ajouté en continu à la solution tampon ci-dessus pour augmenter graduellement la concentration de sodium jusqu'à 1,0 M Les fractions bleues éluées à une concentration de sodium d'environ 0,2 M sont recueillies,puis dessalées en utilisant Diaion R HP 40,et lyophilisées en donnant 7,1 g (rendement de 79 %) d'une poudre amorphe bleue d'acide (amido)N 3-((S)-l'- phényléthylamino)propyl -bléomycinique contenant du cuivre Les maxima d'absorption des ultraviolets et (E 1 % 1 cm) mesurés dans l'eau distillée sont de 245 m F ( 121) et 293 m A ( 119),respectivement Les maxima d'absopr- tion des infrarouges (en nombre d'onde cm -1) mesurés dans une pastille de K Br sont de 3450,2975,2940,1720,164541580, 1555,1460,1370,1300,1190, 1140,1095,1060,1005,980,880,765 et 700 D'autres propriétés physicochimiques sont indiquées sur le Tableau 7. D'une manière analogue à celle décrite ci-des- sus,on obtient l'acide (amido)N-octyl-bléomycinique et l'acide (amido)N-3dibutylaminopropyl)-bléomycinique à partir de (amido)N-n-octylbléomycine B 2 et de (amido)N-( 3-dibutylamino- propyl)blécmycine B 2 respectivement Les propriétés physicochi- miques de ces acides sott comme indiqué sur le Tableau 7. TABLEAU 7 Acide bléomycinique synthétisée Maximum d'absorption CCM e de la Electrophorèse k substituée sur l'azote du groupe des UV de la forme forme conte de la forme conte- amido contenant Cu mp nant Cu, Rf nant Cu, l Rm (E 1 %/i cm) (Rxn d'alanine= 1,0) Acide propyl) bléomycinique 294 ( 123) 0,62 - Acide 293 ( 128) 0, 20 '-' Remarques * 1 I 153 ilica Gel 60 F 254 Silanised(D' (Nverck Go); mesuré dans uni mélange de solution de méthanol-acétate d'ammonium à 6 % 6 (b O:40 VOI urflk V/ volume) excepté pour les valeurs (le, RJ;uic d'lun,, JS On t mesurées dans un autre mélange ( 65:34 volume/volume) * 2 Avicel SFR (FMC Go); acide formique-acide actique-eau ( 27:75:900 volume /volume); 800 V, 15 minutes. 0 % w ul a' Stade B - Dans 10 ml de DMF,on dissout 1,0 g d'acide (adido)N 3-((S)-l'phényléthylamino)propyl -bléomycinique contenant C_ préparé au stade A et 1,71 g de HOBT D'une ma- nitre analocue à celle du stade de l'Exemple 1,en utilisant 1,31 g de DCC, on laisse la solution ci-dessus réagir avec 340 ml de 3 N-( 3 'cyclooctylméthylamino)propyl-N-méthylami- no propylamine pendant 3 heures pour former un produit de condensation Comme dans l'Exemple 1,on traite le mélange réactionnel avec de l'acétone,puis on le purifie par chro- matographie sur CM-Sephadex,et on lui fait traverser une colonne de 100 ml de Amberlite RXAD-2 pour effectuer l'adsorp- tion La phase adsorbée est éluée par la méthode du gradiaht linéaire de concentration dans laquelle 500 ml de méthanol sont ajoutés en continu à 500 ml d'une solution d'acétate tampon de p H 4,5 pour augmenter linéairement la concentra- tion en méthanol Le produit désiré est élué à une concen- tration en méthanol de 40 à 50 % L'éluat est dessalé en utilisant une colonne ( 10 Oml) de Diaion P 40,comme dé- crit ci-dessus,et lyophilisé en donnant 980 mg (rendement de 83 %) d'une poudre amorphe bleue de 3 N-3 '-(cyclooctyla- mino)propyl-N-méthylamino propylamino-(amido)- N 3-((S)-i'-phényléthylamino)propyl -bléomycine (forme con- tenant du cuivre. Dans 22 ml d'eau distillée,on dissout 980 mg de 3 N-( 3 '-cyclooctylméthylamino)propyl-N-méthylamino propyl- amino (amido)N 3-((S)-l'-phényléthyl)aminopropyl -bléomyci- ne contenant du cuivre préparée au stade B La solution est soumise au traitement d'élimination du cuivre,comme dans l'Exemple l,en utilisant Amberlite AD-2 et une solution aqueu- se a 5 % de EDTA 2 Na L'effluent de la colonne est lyophi- lisé en donnant 870 mg (rendement de 92 %) d'une poudre amor- phe incolore de chlorhydrate de 3 N-( 3 '-cvclooctylméthylamino) propyl-N-méthylamino propylamino (amido)N 3-(S)-l'phényl- amino)propyl -bléomycine exempte de cuivre Le maximum d'ab- soprtion des ultraviolets et la valeur (E 1 % 1 cm) comme mesuré dans l'eau distillée sont de 291 mu et ( 89),respec- tivement Les maxima d'absorption des infrarouges (en nom- bre d'ondecm 1 mesurés dans une pastille de K Br,sont de 3400,2925,1720,1650,1550,1520,1480,1460,1450,1405,1385,1360, 1320,1255,1190,1130,1100,1055,1020,980; 960,880,805,760,725 et 695 D'autres propriétés physicochimiques sont comme in- dique sur le Tableau 2. D'une manière analogue à celle décrite ci- dessus,on obtient les formes exemptes de cuivre des compo- sés n 20 à n 63 indiqués sur le Tableau 2 à partir des ma- tières de départ correspondantes. Exemple 3 - Stade A - D'une manière analogue à celle décrite dans l'exemple 2,on mélange 1,5 g de la déamidobléomycine B 2 contenant du cuivre préparée dans l'exemple 1 avec un mélan- ge homogénéisé de 60 g de culture de mycélium de Fusarium roseum et de 750 ml d'une solution tampon de 1/20 M de phosphate de p H 7,5 On laisse le mélange réagir à 37 C pendant 21 heures On traite le mélange réactionnel commre dans l'exemple 2 et on lui fait traverser une colon- ne ( 500 ml de volume) de Amberlite XADE-2 pour effectuer l'adsorption de la substance désirée On lave la colonne avec 750 ml d'eau distillée, et on l'élue avec un mélange d'eau et de méthanol ( 4:1) pour recueillir des fractions vertes ( 750 ml au total) qui sont concentrées sous pression réduite On fait passer le concentré à travers une colonne, de 60 ml de volume, garnie de CM-Sephadex C-25 (type Na+, Pharmacia Fine Chemicals Co) qui a été équilibrée avec une solution tampon 1/20 M d'acide acéti- que et d'acétate de sodium de p H 4,5 On lave la colonne à l'eau distillée et on recueille les fractions bleues d'effluent ( 80 ml au total) Après avoir répété la chromatographie sur CM-Sephadex on concentre la frac- tion bleue purifiée, et on lui fait traverser une colonne, de 1 litre de volume,garnie de Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals Co,) dans un mélange eau-méthanol ( 1:4). La colonne est développée avec un mélange eau-méthanol ( 1:4) pour recueillir des fractions bleues La fraction bleue combinée est concentrée sous pression réduite et lyophilisée en donnant 890 mg (rendement 87 %) d'une poudre amorphe bleue d'acide déamidobléomycinique conte- nant du cuivre Le maximum d'absorption des ultraviolets et la valeur (E 1 %/1 cm), comme mesuré dans l'eau distil- lée, sont de 254 mu ( 143)et 292 du ( 144) respectivenent Les maxima d'absorption des infrarouges (nombre d'onde, cm) mesurés dans une pastille de K Br sont de 3450, 2975, 2940, 1720, 1640, 1560, 1465, 1420, 1380, 1280, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 990, 880, 810 et 775 Dans les conditions indiquées sur le Tableau 7, la valeur Rf dans la chromatographie en couche mince est de 0,91 et la valeur Rm dans l'electrophorèse est de 0,49. Stade B. Dans 5 ml de diméthylformamide, on dissout 500 mg du composé contenant du cuivre obtenu au stade A et 2010 mg de HOBT La solution résultante et de la 3-((S)-l'phényléthylamino) propylamine sont soumises à une condensation pendant 21 heures, comme dans l'exemple 1, en utilisant 770 mg de DCC Comme dans l'exemple 2, le mélange réactionnel est traité à l'acétone, purifié par chromatographie sur CM-Sephadex et chromatographie sur Amberlite t D-2, dessalé en utilisant Diaion %P-40 et lyophilisé en donnant 280 mg (rendement 42 %) d'une poudre amorphe bleue de 3-((S)-1 ' -phényléthylamino) propylamino (amido) N-/3 ((S)-l' phenyléthylamino)propyll -bléomycine contenant du cuivre. D'une manière analogue à celle décrite ci- dessus, on obtient la 3-( 3-n-butylaminopropylamino) propylamino-(amido) N ( 3-n-butylaminopropylamino) propyi-bléomycine et la 3 N-3-/ -tpchlorophënyl) éthylamin Q 7 propyl-N-méthylamino -propylamino-(amido) N-/3-{ 2-(p-chlorophényl) éthylamino) propyl-N-méthyl- aminopropyl_-bléomycine en utilisant respectivement la 3-( 3-n-butylaminopropylamino) propylamine et le N-/F-( 3- aminopropyl)-N méthylaminopropyl/-N-/2-(p-chlorophényl) éthyl/ amine. Dans 8 ml d'eau distillée, on dissout 280 mg de la 3-((S)-l'-phényléthylamino)-propylamino-(amido)N- /3-((S)-l'-phényléthyl) aminopropyl/-bléomycine contenant du cuivre obtenue au stade B La solution est soumise au traitement d'élimination du cuivre comme dans l'exemple 1 en utilisant Amberlite *XAD-2 et une solution aqueuse à 5 % de EDTA 2 Na L'effluent de la colonne est lyophi- lisé en donnant 250 mg (rendement de 92 %) d'une poudre amorphe blanche de 3-((S)-1 '-phényléthylamino)phénylamino- (amido)N-/3-((S)-l'-phényléthylamino)propy 17-bléomycine exempte de cuivre Les maxima d'absorption des infrarouges (en nombre d'onde, cm 1), mesurés dans un comprimé de K Br, sont de 3370, 2975, 2940, 1715, 1660, 1565, 1500, 1455, 1385, 1320, 1255, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 970, 920, 253 0639 880, 805, 760, 730 et 695 D'autres propriétés physicochi- miques sont comme indiqué sur le Tableau 2. D'une manière analogue à celle décrite ci- dessus, d'autres composés énumérés au stade B sont chacun transformés en la forme exempte de cuivre Les propriétés physicochimiques de ces composés sont comme indiqué sur le Tableau 2. Exemple 4. Une solution de 10,22 g de 3-aminopropyl- diméthylamine dans 100 ml de méthanol est neutralisée avec 12 ml d'acide acétique cristallisable et mélangée avec 100 g de benzaldéhyde On ajoute au mélange sous agitation, par portions, 8,38 g de cyanoborohydrure de sodium On laisse le mélange réagir à la température am- biante pendant 16 heures On ajuste le p H du mélange réactionnel à 1 avec de l'acide chlorhydrique concentre, et on le débarrasse du méthanol par distillation sous pression réduite Le résidu est traité avec 200 ml d'eau et 200 ml de chloroforme La phase aqueuse est séparée et extraite avec 200 ml de chloroforme pour éliminer le benzaldéhyde La phase aqueuse est ajustée à p H 12 avec de l'hydroxyde de sodium et extraite deux fois avec ml de chloroforme L'extrait chloroformique est séché sur sulfate de sodium et débarrassé du solvant par dis- tillation sous pression réduite en donnant 26 g (rende- ment 92 %) de l 3-(N,N-diméthylamino)propyll-dibenzylamine. L'amine obtenue ci-dessus est dissoute dans ml d'acétonitrile On ajoute goutte à goutte à la solution sous agitation une solution de 22,25 g de N- ( 3-bromopropyl) phtalimide dans 100 ml d'acétonitrile. On agite le mélange à la température ambiante pendant 18 heures jusqu'à ce que l'halogénure ait disparu, comme mis en évidence par chromatographie sur couche mince. Le mélange réactionnel est débarréssé de l'acétonitrile par distillation sous pression réduite Le résidu est dissous dans 200 ml d'acide chlorhydrique 6 N et hydrolysé par chauffage à 110 C pendant 8 heures La solution d'hydrolysat est refroidie, débarrassée de l'acide phtalique précipité par filtration, évaporée à sec, dissoute dans l'eau distillée, et amenée à traverser une colonne de résine échangeuse d'ions Dowexi -1 (type Cl, 279 ml de volume) L'effluent est évaporé à sec sous pression réduite en donnant 43,7 g de trichlo- rhydrate de N 3-/N-( 3-aminopropyl)-N,N-diméthylaminoj- propyldibenzylamine Le spectre de résonance magnétique -J des protons de ce composé, comme déterminé dans l'eau lourde, présente les signaux suivants: (ppm) = 2,0 - 2,7, 4 H (m); 2,9 3,8, 8 H (m); 3,3, 6 H (s); 4,6, 4 H (m); 7,7, 10 H (s) (ou m et S indiqués entre parenthèses représentent respectivement "multiplet" et "singulet"). Ces signaux indiquent la structure chimique telle que donnée ci-dessus D'autres propriétés physicochimiques sont indiquées sur le Tableau 8. D'une manière analogue à celle décrite ci- dessus, on obtient le trichlorhydrate de N-3-N-( 3- aminopropyl)-N, N-diéthylamino Jpropylj dibenzylamine à partir de la 3aminopropyldiéthylamine utilisée comme matière de départ Les propriétés physicochimiques sont comme indiquéessur le tableau 8. Exemple 5. Dans 180 ml d'eau, on dissout 150 g de bis ( 3-aminopropyl)-méthylamine, puis 53 g de triéthylamine. On ajoute par portions à la solution, tout en la refroi- dissant à la glace et en l'agitant, une solution de 83 g ( 1/3 équivalent) de 4,6-diméthyl-2-tertiobutoxycarbonyl- thiopyrimidine dans 200 ml de dioxanne On laisse le mélange réagir à la température ambiante pendant 5 heures. On débarrasse le mélange réactionnel du dioxanne et de la triéthylamine par distillation sous pression réduite On ajuste le p H du résidu à 2 avec de l'acide chlorhydrique 6 N et on le lave au chloroforme On ajuste le p H de la phase aqueuse à 13,5 avec de l'hydroxyde de sodium et on l'extrait au chloroforme On sèche la phase chloroformi- que sur du sulfate de sodium et on la débarrasse du solvant par distillation sous pression réduite pour obtenir 60 g (rendement 24 %) de ( 3-tertio-butoxy- carbonylaminopropyl)-( 3-aminopropyl)méthylamine (BOC-APMP). Dans 130 ml de méthanol, on dissout le BOC-APMP obtenu ci-dessus On ajoute à la solution, tout en la refroidissant à la glace et en l'agitant, 69 g ( 2 équivalents) de cyclooctanecarboxyaldéhyde et une solution de 10 g de cyanoborohydrure de sodium (Na BH 3 CN) dans 20 ml de méthanol On agite le mélange à la température ambiante pendant 24 heures A la fin de la réaction, on ajoute au mélange réactionnel 30 ml d'acide chlorhydrique 6 N pour décomposer l'agent réducteur en excès ainsi que pour éliminer le groupe tertio-butoxy Le mélange est débarrassé du méthanol par distillation sous pression réduite, mélangé avec 400 ml d'eau distillée, et extrait avec 300 ml de chloroforme pour éliminer l'aldéhyde résiduel La phase aqueuse est ajustée à p H 13,5 avec de l'hydroxyde de sodium et extraite deux fois avec 200 ml de chloroforme. La phase chloroformique contenant le produit désiré est séchée sur du sulfate de sodium et débarrassée du chloroforme par distillation sous pression réduite. Le résidu est mélangé avec 100 ml d'eau distillée et ml d'acide chlorhydrique concentré et évaporée à sec en donnant 66 g (rendement 71 %) de trichlorhydrate de N { 3-/N-( 3-aminopropyl)-N-méthylamino 7 propy 13 cyclo- octylamine. Le spectre de résonance magnétique des protons du produit cidessus, comme déterminé dans l'eau lourde, présente les signaux suivants:9 (ppm) = 1,2 2,3, 15 H (m); 2,0 2,8, 4 H (m); 3,0 3,9, 10 H (m); 3,25, 3 H (s) (o m et S ont la signification donnée plus haut) Ces signaux indiquent que la structure chimique du composé est comme indiqué ci-dessus D'autres propriétés physicochimiques sont indiquées sur le Tableau 8. D'une manière analogue à celle décrite ci-dessus, on obtient le trichlorhydrate de N t 3-/N-( 3- aminopropyl)-N-méthylamino 7 propylj -pcyanobenzylamine (rendement 81 %) et le trichlorhydrate de N 3-/N-( 3- aminopropyl)-N-méthylamino 7 propyl 3 -2-(p-chlorophényl)- éthylamine (rendement 51 %) à partir du p-cyanobenzaldéhyde et du pchlorophénylacétaldéhyde, respectivement Les propriétés physicochimiques de ces composés sont comme indiqué sur le Tableau 8. Exemple 6 Le p H d'une solution de 14,90 g de BOC-APMP obtenu dans le premier stade de l'Exemple 5 dans 300 ml de méthanol est ajusté à 6,4 avec de l'acide acétique cristallisable On ajoute à la solution refroidie à la glace 77,30 g ( 4 équivalents) de 3,4-dibenzyloxy- benzaldéhyde puis 5,0 g de Na BH 3 CN On porte le mélange à la température ambiante, puis on l'agite pendant 96 heures, et on le débarrasse du méthanol par distillation sous pression réduite Le résidu est dilué avec 200 ml d'eau distillée et extrait deux fois avec chaque fois ml de chloroforme Les phases chloroformiques sont réunies, séchées sur du sulfate de sodium, concentrées à 100 ml, et amenées à traverser une colonne de gel de silice de 1200 ml de volume, qui a été lavée avec du chloroforme au préalable, pour effectuer l'adsorption du composé désiré sur la colonne La phase adsorbée est éluée avec un mélange de chloroforme et de méthanol tout en augmentant par paliers la concentration en méthanol. Le produit désiré est élué au moment o le rapport chloroforme/méthanol atteint 97:3 Les fractions d'éluat contenant le produit désiré sont réunies et concentrées sous pression réduite en donnant 31,43 g de 1-/N-( 3-tertio-butoxycarbonylaminopropyl)-N-méthylamino/- 3-/bis( 3,4-dibenzyloxybenzylamino 7 propane sous forme huileuse A une solution de l'huile dans 78,6 ml de dichlorométhane, tout en refroidissant à la glace et en agitant, on ajoute 78,6 ml d'acide trifluoracétique (TFA) goutte à goutte en une période de 30 minutes On laisse le mélange réactionnel réagir pendant 1,5 heure à O C On élève ensuite la température du bain à 25 C et on chasse le solvant par distillation sous pression réduite On mélange le résidu avec 200 ml d'eau distillée et 50 ml de solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 5 N, et on l'extrait avec 500 ml de chloroforme pour recueillir la 3 {N N-méthyl-N-/3 '-bis(m,p-dibenzyloxybenzyl)- aminopropy 17 amino}Ypropylamine (abrégée par MDD-amine). La phase aqueuse est de nouveau extraite avec 100 ml de chloroforme Les phases chloroformiques sont réunies, séchées sur du sulfate de sodium et débarrassées du chloroforme sous pression réduite pour obtenir 26,30 g d'une huile brute de MDD-amine A des fins de purifi- cation, l'huile brute est soumise à une chromatographie sur colonne de Amberlite T XAD-2 ( 2000 ml de volume) qui a été conduite de la façon suivante L'huile brute est dissoute dans 75 ml de méthanol et la solution est mélangée avec 750 ml de solution tampon formée d'une solution aqueuse à 4 % d'acétate de potassium et de solution aqueuse à 2 % d'acide acétique ( 1:1) La suspension résultante est amenée à traverser la colonne pour adsorber le produit désiré sur la colonne On laisse la solution tampon circuler à travers la colonne et on ajoute du méthanol au tampon de manière à augmenter par paliers la concentration de méthanol On constate que le produit désiré (MDD-amine) est élué lorsque le rapport tampon-méthanol devient 15:85 La fraction contenant le produit désiré est débarrassée du méthanol Z 530639 par distillation sous pression réduite, puis ajustée à p H 13 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 5 N, et extraite trois fois avec chaque fois 300 ml de chloroforme Les phases chloroformiques sont réunies, séchées sur du sulfate de sodium, débar- rassées du chloroforme par distillation sous pression réduite, et séchées sur du pentoxyde de phosphore en donnant 21,08 g (rendement 46,2 %) de MDD-amine (base libre) sous la forme d'une huile Les propriétés physicochimiques sont indiquées sur -le Tableau 8. TABLEAU 8 Aminef synthétisée 1 N fraroiif:e (cin 1 ') (pastille de Kir) j t Prichlorhydrate de, N f 3-lN-aminopropyî) -N,N-diméthylaminoi j propyl 1dibenzylaminc 3425, 2000, 1460, 1220, 1060, 850, 2975, 1640, 1420, 1190, 1030, 2750, 1600, 1350, 1160, 960, 2600, 1480, 1300, 1120, 920, clesp rr> ton; *#*(p; pin)1 I I I un i ",Oliizi,) 20) 1 1, 32 j Or 72 2,0 - 4,6 7 77 2,7 411 3, 8 811 990, 960, 900, 800, 740, -680 Trichlorhydrate de 3425, 2950, 2875, 2775, 112 -2,3 15 H 1 (m) N-ú 3-LN-( 3-amfinfo 2700, 2050, 1600, 1480, 2 O 2 8 411 (m) 1 7 0,30 propyl) -Nméthyl 10,10,17,14,3 01 m amino Ipr:opy 12 cyclo 10,10,17,140,-391 H Il octylméthylamnine 1070, 990, 970, 950, 3,25 3 Hi (m) 850, 770 Ln 0 % LW t TABLEAU 8 (Suite) Trrichlorhydrate de N-{ 3-lN ( 3-amiinopropyl)-N- midthy 11 ami io j propyl 1 p cydmn O lbenzy I) zimii m Ie 3425, 2675, 1.840, 1300, 1060, 900, 2975, 2250, 1700, 1220, 1030, 860, 2800, 2000, 1600, 1170, 990, 830, 2750, 1960, 1.520, 1120, 970, 3,0 3 t 8 3 y 1 777 8,1 411(im) 811(li) 311(s) 211(s) 411(mn) Il 86 O 38 a Trichlorhydrate de 3425, 2975, 2800, 2650, 2,1 278 411 m N-{ 3-lN-( 3-am Rinolpropyl)-N 2500, 2000, 1600, 1500, 2,9 3 F 921 m m&th Iylamii nol propyl J-2-140 140 31, 20 P 11 s) 7 027 (p-clilorophéCnvl) éthylami-niie 160 140 130 12, 3231178 O 1160, 1100, 1070, 1027, 7, 4 7 18 411 (Cm) 960, 860, 810, 760, 720, 650 690, 730, 7901 805, 3-{N-{N-mi Cthyl-N-l 3-bis(m,p' 850, 905, 1020, 1085, 1,2 1 9 611 Cmn) dibenzyloxybenzyl)ainiiio-110 110115 120, 2 -29 1 I() propyllamino) llpropylariuine 110 10 15 20 1 * 4111 m 1265, 1380, 1425, 1455, 3,43 411 (s) 0,78 0,244 1510, 1590, 1610, 1650, 5 r 16 811 1760, 1815, 1880, 1960, 6,6 777 2611 (m) 2800, 2870, 2940, 3040, 3075, 3375, 3660 L Ji C.A C O % CA i o Imrgic 8 1 ni, t et ni entre parenthôIses reprsesnt; ont nu t ilet u mul tiplet, respectivement "'2 Mobilité relative lorsque celle de l'alanine est de 1,0 dans l'électro- phorèse en couche mince /Avicel SF R (FMP Co), acide formique-acide acÈtique-eau ( 27:75:900 volume/volume), 800 V, E 6 minutes/. Chroînatographie en couche mince: ilica Cel ()O Fi 254 (Morck Go), méthanol(solution aqueuse à 10 % d'acétate d'ammoniumn ammoxîiaque aqueux à 10 96 ( 1:1:1 volume/volume), réaction colorée à la ninhydrine M éthanol-solution aqueuse à 10 96 d'acétate d'ammonium-ammoniaque aqueux à 10 Op 6 ( 10:1:1 volume/volume). NY tw REVENDICATIONS 1 Acide bléomycinique substitué sur l'azote du groupe amino représenté par la formule suivante: CONH 2 NH CH 2 NH CH \c HX c H 2 CL- \Ct/ \Ce / \co H-x N -COOH N S H BM H dans laquelle BM représente un fragment de squelette de bléomycine; X représente ( 1) un groupe alkyle de 1 à 18 atomes de carbone, ( 2) un groupe aminoalkyle de 1 à 12 atomes de carbone, ( 3) un groupe alkyle inférieur portant comme substituant (a) de 1 à 3 atomes d'halogène, (b) 1 ou 2 groupes phényle, (c) un groupe indolyle ou (d) un groupe hétérocyclique à cinq ou six chaînons contenant un atome d' oxygène, de soufre ou d'azote (parmi les groupes substituants, le groupe phényle ou indolyle peut encore être substitué par un atome d'halogène ou un groupe alcoxy inférieur), ( 4) un groupe Xl-(alkyle inférieur) Lot X 1 est 12 X 2- -N-X 3 ou -N-X 3, X 2 est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle inférieur ou benzyle, X 3 est (a) un groupe alkyle inférieur, (b) un groupe phényl(alkyle inférieur), ou (c) un groupe mono ou di-(alkyle inférieur)amino(alkyle inférieur) qui peut être substitué par un groupe phényle ou halogénophényle, X 4 est (a) un groupe alkyle inférieur ou (b) un groupe phényl(alkyle inférieur)l/, ( 5) un groupe naphtyle,_ ( 6) un groupe thiazolyle ou ( 7) un groupe - N-phényl (alkyle inférieur)pipérazinyle; ou un de ses sels. 2 Acide bléomycinique ou un de ses sels selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone ou un groupe alkyle inférieur ayant comme substituant (a) de 1 à 3 atomes d'halogène, (b) de 1 ou 2 groupes phényle, (c) un groupe indolyle, ou (d) un groupe hétérocyclique à cinq ou six chaînons contenant un atome de soufre ou d'azote (parmi les groupes substituants, le groupe phényle ou indolyle peut être encore substitué par un atome d'halogène ou un groupe alcoxy inférieur). 3 Acide bléomycinique ou un de ses sels, selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe trihalogéno- (alkyle inférieur), un groupe aminoalkyle de 2 à 12 atomes de carbone, un groupe phényl(alkyle inférieur), un groupe halogénophényl(alkyle inférieur), un groupe diphényl- (alkyle inférieur), un groupe méthoxyindolyle, un groupe pyridyl (alkyle inférieur), un groupe pipérazinyl(alkyle inférieur), un groupe Xl-(alkyle inférieur) -o X 1 est 2 12 -N-X 3 ou -N-X 3, X 2 est un atome d'hydrogène, un groupe 4 alkyle inférieur ou benzyle, X 3 est (a) un groupe alkyle inférieur, (b) un groupe phényl(alkyle inférieur), ou (c) un groupe mono ou di-(alkyle inférieur)amino(alkyle inférieur) qui peut être substitué par un groupe phényle ou halogénophényle, et X 4 est (a) un groupe alkyle infé- rieur ou (b) un groupe phényl(alkyle inférieur)7, un groupe thiazolyle, ou un groupe N-phényl(alkyle infé- rieur)pipérazinyle. 4 Acide bléomycinique ou un de ses sels selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupe Xl-(alkyle inférieur) est un groupe mono ou di-(alkyle inférieur)-amino(alkyle inférieur) amino(alkyle inférieur), un groupe phényl(alkyle inférieur)amino(alkyle inférieur), un groupe di(alkyle inférieur)-amino(alkyle inférieur), un groupe N-/halogénophényl(alkyle inférieur)amino(alkyle inférieur)7-N(alkyle inférieur)amino(alkyle inférieur), ou un groupe N-(alkyle inférieur)-N-phényl(alkyle infé- rieur)-N-/diphényl(alkyle inférieur)amino(alkyle inférieur)7- amino(alkyle inférieur).