Brevet FR2530814A1 — publié le 19840127

L'invention est relative à un procédé de dilutions stériles et à un dispositif de mise en oeuvre du procedé. Elle trouvera notamment son application dans le domaine du contrôle bactériologique de l'eau et des aliments. Actuellement, les méthodes traditionnelles de contrôle bacté- riologique nécessitent l'emploi d'une main d'oeuvre abofidante pour des travaux longs et fastidieux. En effet, les différentes dilutions succes sives~sont réalisées manuellement à l'aide de pipettes qui, en raison de la grande difficulté de leur stérilisation doivent être jetées après un usage unique ce qui rend l'opération très coûteuse. De plus, la précision des dosages est très relative du fait que ces dosages sont fonction de l'habileté et l'appréciation du manipulateur. Dans le domaine de la biochimie, il a été créé de nombreux automates qui permettent de réaliser automatiquement des dilutions, toutefois, ces appareils ne sont pas adaptés au domaine de la bactériologie qui pose deux difficultés importantes - une bacterie piégée peut, par une culture rapide, fausser complètement les résultats d'une manipulation ; - l'ensemble du dispositif doit se préserver de l'introduction de germes extérieurs et rester stérile. Ces deux obstacles ne peuvent être surmontés à l'heure actuelle avec les matériels adaptés à la biochimie qui ne presentent aucun moyen de stérilisation et aucune protection vis-à-vis des agents extérieurs. Le but principal de la présente invention est de présenter un procédé de dilution stérile qui soit parfaitement adapté pour être automatisé et donc pour l'obtention de stérilisations à faible ccût de revient. Contrairement aux usages actuels dans lesquels le matériel, en particulier, les pipettes doivent être éliminées à chaque opération, dans le procédé de l'invention, les équipements mis en oeuvre sont dotes de moyens qui empêchent toute contamination même locale et donc qui garantissent les résultats. Un autre but de la présente invention est de présenter un dispositif de mise en oeuvre de la présente invention qui a été conçu pour effectuer en automatique les différentes dilutions. Le dispositif est parfaitement adapté aux appareils existants sur lesquels il peut être adapté aisément. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaitront au cours de la description qui va suivre, qui n'est cependant donnee qu'a titre indicatif et qui n'a pas pour but de la limiter. Le procède de dilutions sriles successives pour cultures bactériennes dans lequel on prélève une certaine quantité de liquide du milieu bactérien primaire -l'aide d'une aiguille reliez à un diluteur, on injecte la quantité prélevée additionnée d'wi liquide de dilution dans une éprouvette secondaire, est caractérisé en ce que l'on stérilise la partie de l'aiguille oO est localisée la contamination avant de la réutiliser pour prélever un échantillon de liquide dans l'éprouvette secondaire et 1 'injecter dans une éprouvette tertiaire avec une addition de liquide de dilution. L'invention sera mieux comprise si l'on se réfère à la description suivante-ainsi qu'aux dessins en annexe qui en font partie integrante. La figure 1 schématise les differentes etapes d'une dilution successive. Les figures 2a à e représentent les différentes étapes d'un cycle du procédé de dilutions stériles successives de l'invention. a igure représente la localisation du milieu bactérien à l'intérieur de l'aiguille. La figure 4 représente une vue en coupe du four de l'invention selon un mode préférentiel de réalisation de celui-ci. La figure 5 représente le dispositif d'articulation de la potence qui supporte l'aiguille. La figure 6 représente une vue de dessus du collecteur de fraction équipé du dispositif d'articulation de l'aiguille. Le principe d'une dilution stérile est schématisé à la figure 1. I1 consiste à prélever dans un milieu bacterien primaire i une fraction 2 de la solution bacterienne 1 et de la placer dans une éprouvette secondaire 3 en y ajoutant un volume prédéterminé mais reglable de diluant 4 pour former un milieu bactérien 5 secondaire qui doit être homogène. Puis, on renouvelle l'opération en effectuant un prélèvement 6 dans la solution bactérienne secondaire 5, on introduit la quantité prélevée 6 dans une éprouvette tertiaire 7 en y additionnant un volume déterminé 8 de diluant pour former une solution bactérienne diluee tertiaire 9 homogène. On renouvelle ainsi successivement l'opération jusqutà obtenir généralement après neuf prélèvements, une solution bactérienne 10 très largement diluée puisque le rapport de dilution à chaque opération est généralement de l'ordre 1/fi, et qui peut donc. servir très facilement pour une opération de dénombrement ou qui peut être mis en culture par addition d'un milieu de culture. I1 faut noter, qu'en général, ignorant de façon précise la concentration du milieu bactérien primaire l,-on choisira parmi les différents milieux bactériens dilués obtenus, ceux qui sont les plus adapté à l'usage désiré, par exemple, pour une opération de dénombrement. Toutefois, une remarque importante s'impose, en effet, puisqu'il s'agit de milieux bactgriens, il est important que l'ensemble de ces opérations soit effectué stérilement. En effet, la moindre bactérie piégée qui serait introduite par accident dans un milieu bactérien pourrait, par un développement rapide, fausser complètement les résultats de la manipulation. Pour ce faire, actuellement, les opérations sont réalises au-dessus d'une flamme en utilisant une pipette qui est jetée apres chaque dilution unitaire, ce qui entrain une consommation importantede ce matériel. Selon le procédé de la présente invention, on sterilise entre chaque opération la partie de l'appareil qui a été contaminée lors des prélèvements. Ainsi, l'introduction éventuelle de germes est évitée par la stérilisation et d'autre part le matériel utilisé est conservé, ce qui minimise les coûts de revient et facilite l'automatisation du procédé. Les figures 2a à 2e schématisent le cycle d'une dilution sté- rile selon le procédé de l'invention. La figure 2a représente l'opération de prélèvement dans laquelle on preleve une certaine quantité du liquide du milieu bactérien 1 à l'aide d'une aiguille de prelevement fl qui est reliee à un diluteur 12 de type classique. Les diluteurs sont des pompes doseuses bi-directionnelles qui permettent d'aspirer ou de refouler dans un tube 13 une certaine quantité de liquide. Le refoulement dans le tube 13 peut être réalisé en injectant dans ce tube un liquide prelevé par un second capillaire lo qui trempe par exemple dans un liquide de dilution 15 contenu dans un récipient 16. Ainsi, durant l'étape de prélèvement, on aspire à l'aide de l'aiguille 11 une quantité de la solution bactérienne primaire 1 qui correspond. l'échantillon 2 de la figure 1. L'étape suivante, illustree à la figure 2b, consiste à injecter la quantité prélevée lors de l'étape précédente dans une éprouvette secondaire 3 en y additionnant une certaine dose de liquide de dilution prelevée dans le recipient 16. Le refoulement est actionné par le diluteur 12 relié à l'aiguille de prélèvement 11 par le tube 13. La solution bactérienne secondaire 5 ainsi obtenue devra pre- senter des qualités d'homogénéité. Ceci pourra être obtenu en choisissant de façon appropriée la hauteur de l'éprouvette. I1 pourra, par exemple, etre utilisé de l'eau physiologique lorsque la dilution doit être pratiquée sur une culture bactérienne elle-meme en suspension dans de l'eau. Dans certains cas, l'homogénéité de la solution secondaire 5 pourra être obtenue à l'aide d'agitateurs ou tout autre moyen approprié. L'aiguille de prélèvement 11 qui a eté en contact direct avec la solution bactérienne primaire 1 doit être stérilisée pour être utilisable dans la solution bactérienne diluée 5 et ainsi eviter tout risque d'introduction de bactéries qui resteraient piégées sur sa partie externe ou interne. Cette opération est réalisée telle qu'illustrée à la figure 2e en introduisant l'aiguille de prélèvement 11 dans un four 17 dont la température est largement superieure àTa limite de résistance des bactéries. En pratique, le four électrique chauffe à plus de 1.000 OC, ce qui permet de steriliser l'aiguille en quelques secondes. I1 faut noter que, durant cette étape de stérilisation, ce qui est stérilisé c'est la partie de l'aiguille 11 oû a été localisée la contamination. La figure 2d représente l'étape de rinçage suivante. Pour effectuer cette opération, le diluteur est actionné de façon à éjecter par l'aiguille de prélèvement 11 une certaine quantité de liquide de dilution prélevée dans le récipient 16. Ceci permet de rincer l'intérieur de l'aiguille en la nettoyant et, d'autre part, par la même occasion, cela refroidit l'aiguille et la rend donc susceptible d'être plongée dans un milieu bactérien sans en detruire les bacteries. A l'issue de cette étape, le dispositif de prélèvement est donc entièrement stérilise et peut donc à nouveau être utilisé pour effectuer une nouvelle dilution. C'est ce qui est illustré à la figure 2e dans laquelle on replonge l'aiguille de prelevement 11 dans le milieu bactérien secondaire 5 pour effectuer un prélèvement qui sera suivi des différentes opérations qui ont été énumérées précédemment pour effectuer une dilution tertiaire avec stérilisation à l'issue de cette dilution. Dans la pratique, il est généralement effectue des prélèvements de l'ordre de 1 mol avec des rejets dilués de l'ordre de 10 ml. Durant l'étape de stérilisation de l'aiguille de prélèvement 11 il a été utilisé un four mais il est évident que d'autres moyens de stérilisation tels que par exemple les ultra-sons peuvent également être utilisés. I1 faut remarquer, que le procédé de dilution tel qu'il vient d'être décrit n'est exploitable que dans la mesure où la contamination de l'aiguille a ete localisée, ce qui permet de la stériliser avec certitude. Pour cela, un certain nombre de précautions doivent être prises, et, en particulier, le mode opératoire suivant devra être, de préférence, utilisé. En ce qui concerne la partie extérieure de l'aiguille Il de prélèvement qui a été en contact avec le milieu bactérien, celle-ci peut etre déterminée avec précision et depend notamment de la profondeur avec laquelle l'éprouvette a été plongée dans la solution bactérienne. Par conséquent, en ce qui concerne la stérilisation de la partie externe de l'aiguille de prélèvement 11, 4,1 suffira de prendre la précaution de faire pénétrer dans le four 17 au moins cette partie. Par contre, en ce qui concerne la sterilisation de la partie interne de l'aiguille, celle-ci est plus delicate à réaliser étant dcnne que le milieu liquide contenu a l'intérieur de l'aiguille Il minimise son echauffement, en-se vaporisant partiellement. Et donc, la sterilisa- tion de la partie interne de l'aiguille est progressive au furet à mesure de la vaporisation de son contenu, ce qui nécessite un temps d'introduction dans le four 17 relativement long si l'on desire vaporiser et donc stériliser une longueur intérieure importante de l'ai- guille. Or, il est possible de minimiser la contamination interne de l'aiguille en localisant cette contamination uniquement dans la partie inférieure de l'aiguille ll. Les lois de la mécanique des fluides nous enseignent que, pour des écoulements de liquide en regime laminaire dans une conduite, la vitesse de circulation du fluide est beaucoup plus importante au centre de la conduite, qu'à proximité de sa bordure. Ce principe sera avanZa euserent irâs en application dans ;e procédé de la présente in vention lors du prélèvement pour obtenir une distribution du liquide préleve telle qu'illustrée à la figure 3. On règle le régime d'aspiration du diluteur et doncdansl'ai- guille 11 de telle sorte que l'écoulement du liquide dans l'aiguille i1 se fasse en regir,e laminaire. Dans ce cas, on retrouve une distribution de la solution bactérienne prélevée 1 en forme de cône très effilé dans l'aiguille 11, le cône étant enveloppé par la solution de dilution 15 qui était présente dans l'aiguille avant le prélèvement. La contamination de la paroi intérieure de l'aiguille 11 est ainsi lo calisée dans sa partie inferieure puisque, sur toute la hauteur, en forme de cône de la solution bactérienne prélevée, celle-ci n'est pas en contact avec la paroi qui est protégée par le liquide dilution qui forme un écran et évite ainsi toute contamination de la paroi intérieure de l'aiguille 11. Le prélèvement du liquide bactérien selon un écoulement laminaire dans l'aiguille minimise la contamination interne de l'aiguille et donc facilite la stérilisation en reduisant le temps de pénétration de l'aiguille dans le four puisque seule la partie inferieure de l'aiguille doit être stérilisee et donc l'évaporation du contenu de l'aiguille est limitée. Par contre, durant l'injection du prélèvement additionné du liquide de dilution dans l'éprouvette secondaire pour obtenir une solution diluée, l'écoulement dans l'aiguille serd avantayeusement réalisé selon un régime d'écoulement turbulent dans l'aiguille afin de nettoyer les parois de l'aiguille et en particulier la partie inférieure afin de rejeter le maximum de bacteries. I1 est en effet connu que, dans les écoulements turbulents, la couche limite de liquide en contact avec les parois est de très faible épaisseur. La figure 4 montre un mode de réalisation preferentiel- du four 17. Celui-ci est de forme cylindrique et dispose d'une ouverture centrale 18 par laquelle on introduit l'aiguille 11 à stériliser. La hauteur du four 17 sera au moins supérieure à la hauteur de l'aiguille qui doit être stérilisée. Le four 17 présente un corps annulaire 19 en fibre de céra mique autour duquel on a disposé un écran 20 de protection. Le conduit central est bordé par un tube de quartz 21 autour duquel a été bobine un fil résistant 22 qui assure le chauffage du four. Un dispositif de détection à infrarouge 23 mesure le rayonnement du fil résistant 22 et régule la température du four de façon à ce que celle-ci soit adaptée à une bonne stérilisation, généralement, la température intérieure du four sera superieure à 1.000 OC. La stérilisation pourra être réalisée en quelques secondes. Dans le cas de certaines bactéries thermophiles très résistantes à la chaleur, il sera nécessaire de procéder à une vidange de l'aiguille prealablement à son introduction dans le four. La vidange pourra être realisée tres simplement en introduisant un gaz, par exemple, de l'air à la partie supérieure de l'aiguille qui se videra ainsi de son contenu. L'aiguille vidée présente une inertie thermique beaucoup plus faible et réduit ainsi le temps de séjour dans le four. En ce qui concerne le dispositif de mise en oeuvre de l'invention, les figures 5 et 6 en montrent une réalisation préférentielle entièrement automatisée. La figure 5 représente le dispositif d'articulation de la potence 24 qui supporte l'aiguille 11. La potence 24 pourra être déplacée verticalement à l'aide d'un chariot 25 motorisé. La potence 24 pourra également être entraînée selon un mouvement rotatif à l'aide d'un moteur 26 qui fera pivoter l'aiguille 11 autour de l'axe 27. La figure 6 représente, en vue de dessus, un collecteur de fraction 28 équipé, dans son centre, d'un bras de prelevement'29 tel qu'illustré à la figure 5. Les éprouvettes formant un ensemble dans lequel seront opérées les différents dilutions successives sont regroupées dans des racks 30, ces racks sont animés d'un mouvement général tourant autour du bras de prélèvement 30. Le dispositif de dilution effectue un prélèvement dans la première éprouvette 31 et effectue des dilutions successives dans les éprouvettes 32 suivantes. Un module de détection 33 informe l'unité de commande de laprésence des éprouvettes 32 de dilution pour que l'opération soit effectuée. Lorsque le module de detection n'enregistre plus la présence d'une éprouvette de dilution 32, il commande alors l'évacuation du rack 30 et effectue une dilution des éprouvettes contenues dans le rack 34 suivant qui est amené en position. En ce qui concerne le dispositif de mise en oeuvre de la présente invention, et plus particulièrement l'aiguille, un certain nombre de caracteristiques de construction seront avantageusement adop tées. En particulier, dans le dimensionnement de l'aiguille, celle-ci disposera d'un volume intérieur apte à contenir la quantité de liquide préleve, sachant que celle- ci présentera une forme cônique élancee dans l'intérieur de l'aiguille. L'aiguille aura avantageusement un diametre de 3 à 4 mm et disposera d'une longueur suffisante pour contenir 2 à 3 fois le volume d'échantillon prélevé. Le régime laminaire de l'écoulement à l'aspiration dans l'aiguille sera réalisé de telle sorte que le nombre de reynolds soit inférieur à 2.000. Afin de minimiser les turbulences à l'intérieur de l'aiguille lors de l'aspiration, la section intérieure sera sensiblement constante au moins sur la longueur de l'aiguille et ne présentera aucune aspérite. Afin que toutes les opérations soient effectuées en milieu stérile, le dispositif de l'invention sera avantageusement recouvert par un capot, par exemple en plexiglass pour stisoler des bactéries de l'air. Chaque éprouvette sera fermée par un opercule qui isolera son contenu de l'air ambiant, l'aiguille 11 transpercera l'opercule lors des prélèvements mais cet opercule présentera des qualités elastiques qui lui permettront de se refermer etan-che apres que l'aiguille ait été retirée. D'autres mises en oeuvre de la présente invention, à la portée de l'Homme de l'Art, pourront être adoptees sans pour autant sortir du cadre de celle-ci. En particulier, diverses expériences ont montré que quelque soit le type d'écoulement utilisé lors de l'aspiration ou du refoulement du liquide présent dans l'aiguille, on peut localiser la contamination dans la partie inférieure de l'aiguille en etablissant un régime d'aspiration dans l'aiguille tel que la couche limite résultante soit supérieure à celle produite lors de l'éjection de ce me liquide. Ainsi, le volume de liquide proche de la paroi interne de l'aiguille et qui a été aspiré est chasse lors du refoulement et ne peut contaminer l'aiguille au moins dans sa partie supérieure. REVENDICATIONS 1. Procédé de dilutions stériles successives pour culture bactérienne dans lequel on prélève une certaine quantité (2) de liquide d'un mili-eu bactérien primaire (1) a l'aide d'une aiguille (11) reliée à un diluteur (12!, on injecte la quantité prélevée (2) additionnee d'un liquide de dilution (4) dans une éprouvette secondaire (3), caractérisé en ce que l'on effectue le prélèvement en localisant la contamination de l'aiguille (11) de préférence sur une faible longueur de celle-ci, on stérilise la partie contaminée de l'aiguille (11) avant de la réutiliser pour prélever un échantillon de liquide (6) dans l'éprouvette secondaire (3) et l'injecter dans une éprouvette tertiaire (7) avec une addition de liquide de dilution (8). 2. Procédé de dilutions selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on préleve la solution bactérienne selon une aspiration dans l'aiguille (11) telle que la couche limite sur les parois internes de l'aiguille soit plus épaisse que celle résultante lors de l'éjection. 3. Procédé de dilutions selon la revendication I, caractérisé en ce que l'on prélève, dans la solution bactérienne ( un échantillon (2) selon un ecoulement laminaire dans l'aiguille ( 4. Procédé de dilutions selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on injecte dans lteprouvette (3) l'échantillon (2t de li- quide prélevé additionné de liquide de dilution (4)~sous un régime d'écoulement turbulent dans l'aiguille (11). 5. Procédé de dilutions selon la revendication I, caractérisé en ce que l'on stérilise l'aiguille (11) en introduisant son extrémité contaminée-dans un four (17) ou tout autre moyen stérilisant. 6. Procédé de dilutions selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on rince la partie interne de l'aiguille en éjectant une certaine quantité de liquide de dilution (15). 7. Procédé de dilutions selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on purge l'aiguille (11) de son contenu en introduisant un gaz à sa partie supérieure. 8. Dispositif de dilutions stériles destiné à la mise-en oeuvre du procède selon la revendication 1, comprenant une série d'au moins deux éprouvettes dans lesquelles doivent être effettùées les dilutions successives d'un liquide bactérien primaire contenu dans la première éprouvette, une aiguille (11) manipulée par un bras (29) articulé et reliée à un diluteur (12), caractérisé par le fait que le volume intérieur de l'aiguille (14Z) est apte à contenir le volume total de la quantité de liquide prélevé (2). 9. Dispositif de mise en oeuvre du procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'aiguille est de section inte- rieure sensiblement constante sur sa longueur. 10. Dispositif de mise en oeuvre du procède selon la revendication 8, doté d'un four (17) de stérilisation de l'aiguille (11), carac térisé par le fait que la partie de l'aiguille (11) placée dans le four (17) est au moins égale à celle qui a été introduite dans l'éprouvette.