Brevet FR2527443A1 — publié le 19831202

COMPOSITION CONTENANT DE L'ENDOTOXINE RAFFINEE ET MEDICAMENT LA CONTENANT. La présente invention concerne une composition pharmaceutique con- tenant une endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité (RDE), un sque- lette de paroi de cellule (CWS) et du tréhalose dimycolate (TDM) Le RDE utilisé dans la présente composition est caractérisé en ce qu'il ne con- tient pas de 2-céto-3-désoxyoctanoate détectable, qu'il possède entre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2.000 nmoles/mg d'acides gras La composition est efficace pour obtenir une rémission et/ou une régression des tumeurs cancéreuses dans les ani- maux à sang chaud. On connaît des extraits endotoxiques obtenus à partir des Entéro- bactériacées comprenant des organismes apparentés et des mutants Ces extraits ont été utilisés en immunothérapie de diverses tumeurs immunogé- niques (voir, Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al, Cancer Immunol Immunother. Vol 7, pages 43-58 ( 1979) incorporé ici à titre de référence) Cependant, les extraits d'endotoxines sont connus pour être hautement toxiques et de ce fait d'une utilisation limitée dans le traitement des tumeurs can- céreuses On a fait des efforts pour "débarrasser de leur toxicité" les endotoxines tout en retenant leur capacité de faire régresser les tumeurs. Comme indiqué dans Ribi et al, des méthodes chimiques connues pour débar- rasser les endotoxines de leur toxicité tout en retenant leur pouvoir de servir conmme adjuvant, telles que la succinylation et la phtalylation ont eu comme résultat de leur faire perdre à la fois leur endotoxicité et leur pouvoir de régression des tumeurs De ce fait, les tentatives da l'état de la technique d'obtenir un produit d'endotoxine ayant un pouvoir élevé de régression des tumeurs et peu ou pas de toxicité n'ont jusqu'à mainte- nant pas été couronnées de succès. La combinaison d'un squelette de paroi de cellule et de tréhalose 2527443 ' dimycolate est connue dans l'état de la technique (voir, Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls II Supression and Regression of Strain-2 Guinea Pig Hepatoma; Meyer, et al, Journal of the National Cancer Institute, Vol 52, N 1, January, 1974; et Mycobacterial Cell Wall Components in Tumor Supression and Regression; Ribi, et al, National Cancer Institute Monograph N 39, pages 115-120, October 1972). Un squelette de paroi de cellule est essentiellement une paroi de cellule dont beaucoup de la protéine et des lipides que l'on trouve normalement dans la paroi de la cellule ont été enlevés C'est un mucopep- tide d'arabinogalactane et d'acide mycolique polymère contenant des restes de mycolate de tréhalose ("P 3 ") et de tuberculoprotéines non digérées. Le squelette de paroi de cellule est obtenu à partir de mycobactéries quelconques comprenant mais sans y être limité M smegmatis, M phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium parvum, M kansasii, M tuberculosis (souche H 37 RV et Ayoma B), et M bovis souche BCG. En outre, un squelette de paroi de cellule peut être obtenu à partir de non-mycabactéries telles que E coli, B abortus et Coxiella burnettii. Un squelette de paroi de cellule est produit tout d'abord par culture et récolte de bactéries telles que M bovis, souche BCG (bacille CalmetteGuerin) Le résidu de cellule entière qui en résulte est traité à l'aide d'un appareil à fractionner les cellules {Ribi Cell Fractionator (Sorvall, Model RF-1)} qui brise les cellules en séparant l'enveloppe extérieure ou la paroi de la cellule des impuretés protoplasmiques Les parois de cellule qui en résultent sont alors soumises à une série d'ex- tractions aux solvants et de traitements enzymatiques (par exemple trypsine et/ou chymotrypsine) pour donner un squelette de paroi de cellule purifié. Le dimycolate de tréhalose (TDM) peut être obtenu à partir des organismes suivants tels que par exemple M avium, M phlei, M tuberculosis (souche H 37 RV et Ayoma B), M bovis BCG, M smegmatis, M kansasii, Nocardia rubra et Corynebacterium diphtheriae. Des bactéries telles que M avium sont cultivées, récoltées et ensuite tuées à la chaleur La masse de la cellule est extraite avec plu- sieurs solvants et ensuite on extrait une fraction active soluble dans un solvant Cet extrait est purifié ultérieurement par une série d'extrac- tions aux solvants pour donner le TDM brut (voir, Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls I Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P 3; Azuma, et al, Journal of the National Cancer Institute, Vol 52, pages 95-101, 1974, indiqué ici à titre de référence) Comme décrit dans Azuma et al, le TDM brut peut encore être purifié par chromatographie sur gel de silice microparticulaire centrifuge pour donner du TDM purifié. Le CWS et le TDM produits et décrits ci-dessus peuvent être utili- sés sous forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile pour obtenir une composition antitumorale convenant à l'injection (voir, Immunotherapy With Non-Viable Microbial Components; Ribi et Al; Annals of the New York Academy of Science, Vol 227, pages 228-238, Sept 20, 1976). C'est donc un objet de la présente invention que de procurer une composition pharmaceutique contenant une endotoxine débarrassée de sa toxicité et raffinée, un squelette de paroi de cellule et du dimycolate de tréhalose qui soit efficace dans le traitement des tissus cancéreux des animaux à sang chaud et des êtres humains. C'est un autre objet de l'invention que de procurer une composition pharmaceutique contenant ces composants sans les effets secondaires nuisi- bles normalement associés aux endotoxines. Les extraits d'endotoxines du type utilisé comme matière première pour produire une endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité (RDE) comme décrit ci-dessus, peuvent être obtenus à partir des entérobactériacées quelconques comprenant des organismes apparentés et des mutants A titre d'exemple, les genres suivants illustrent le type de micro-organismes qui peuvent être utilisés: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetalla, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella et Serratia. On emploie typiquement les espèces suivantes: S minnesota, S typhi- murium, B pertussis, B abortus, S enteritidis, E coli, S typhi, S marcescens, S.typhosa, Shigella flexni, et S abortus equi. Les extraits endotoxiques utilisés comme matériau de départ peuvent être préparés par l'une de ces quelques méthodes connues (voir, par exemple, 1 Webster, M E, Sagin, J F, Landy, M, and Johnson, A G, J Immunol. 1955, 744,55. 2. Westphal, O, Luderitz, O, and Bister, F, Z Naturforsch, 76 148 ( 1952). 3. Westphal, O, Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr Second Macy Conference (George F Springer, ed), Madison, N J Madison printing Co., 1957, 115. 4. Galanos, C, Luderitz, O, Westphal, O, Eur J Biochem, 9 245 ( 1969). 5. Chen, C H, Johnson, A G, Kasai, N, Key, B A, Levin, J, Nowotny, A, J Infect Dis 128 543 ( 1973). 6. Ribi, E, Haskins, W T, Landy, M, Milner, K C, The Journal of Experimental Medicine 114 647 ( 1961). 7 Leive, L, Biochem Bi-phys Res Comm 21 290 ( 1965). 8. Ribi, E, Milner, K C, and Perrine, T, J Immunol 82 75 ( 1959). La méthode préférée pour obtenir l'extrait endotoxique est celle décrite par Chen et al, à savoir la précipitation au méthanol et au chlo- roforme. Le précipité au méthanol et au chloroforme (MCP) est alors mis en réaction avec un acide organique ou minéral et ensuite lyophilisé pour produire un lipide A brut hydrolysé possédant une toxicité et une pyrogé- nicité réduites par comparaison avec celles du matériau d'endotoxine de départ Ce matériau est alors traité avec un solvant capable de dissoudre spécifiquement les acides gras et d'autres impuretés sans dissoudre le lipide A brut La teneur en phosphate du lipide A raffiné débarrassé de sa toxicité est d'environ la moitié de celle observée pour l'endotoxine toxique% ce qui suggère que la teneur en phosphate est liée aux effets toxiques des endotoxines. Les acides minéraux que l'on préfère utiliser pour réagir avec le MCP sont l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique et les acides organiques que l'on préfère sont l'acide toluène sulfonique ou l'acide trichloroacétique La réaction peut convenablement être con- duite à une température entre environ 90 et 130 'C pendant un temps suffi- sant pour effectuer l'hydrolyse habituellement entre-environ 15 et 60 mi- nutes. La préparation d'une endotoxine débarrassée de sa toxicité brute peut être accomplie en faisant réagir le matériau de départ avec l'acide en présence d'un solvant organique tel que le chloroforme, le méthanol et l'éthanol ou des combinaisons de ceux-ci. Le lipide A brut qui en résulte est dissous dans l'acétone qui est le solvant préféré pour dissoudre les acides gras et d'autres impuretés. Le solvant est alors éliminé pour produire une endotoxine brute débar- rassée de sa toxicité L'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité est alors dissoute dans un solvant et on fait passer la solution à travers une colonne chromatographique convenable telle qu'une colonne chromato- graphique d'exclusion moléculaire pour séparer les fractions de RDE qui sont alors rassemblées après élimination du solvant Dans un mode-de réalisation, la solution d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité est passée à travers une colonne Sephadex en présence d'un solvant tel que le chloroforme, le méthanol, l'acétone, la pyridine, l'éther ou l'acide acétique ou des mélanges de ceux-ci La pression de la colonne peut va- rier mais elle se situe typiquement dans la gamme entre environ la pression atmosphérique et 100 lbs/inch 2 ( 6,86 bars) et le débit est compris entre environ 0,1 et 10 ml/minute. Dans un autre mode de réalisation, on fait passer la solution d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité à travers une colonne de cellulose-DEAE dans les mêmes conditions de pression que celles mentionnées ci-dessus pour la colonne Sephadex Le débit est maintenu entre environ 2 et 15 ml/minute Les solvants utilisés sont aussi les mêmes que ceux utilisés pour la colonne Sephadex bien que l'on puisse ajouter à tous les mélanges de l'eau et/ou de la diéthylamine à une concentration allant jus- qu'à environ 1 %. D'autres méthodes de production du RDE à partir d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité comprennent le passage de la solution à travers une colonne 60 de gel de silice à basse pression ayant une taille de par- ticule entre environ 25 et 63 microns et l'utilisation d'un solvant cons- titué de chloroforme, de méthanol, d'eau et d'hydroxyde d'ammonium Le rapport en volume préféré des composants du solvant est d'environ 50:25:4: 2. Le RDE, le CWS et le TDM sont rassemblés pour produire une compo- sition ayant une puissante activité anti-tumorale Les cancers que l'on peut traiter par la présente composition comprennent les tumeurs animales, telles que les carcinomes de cellules squameuses des bovins, les fibrosarcomes bovins, les sarcoides équins, les mélanomes équins, les carcinomes de cel- lules équines squameuses, des tumeurs mammaires canines, des adénomes et méla- nomes canins et des tumeurs humaines telles que les tumeurs du sein, les tumeurs du poumon, les tumeurs coléo-rectales, les mélanomes malins, des carcinomes des cellules squameuses et des tumeurs ovariennes La composition est administrée par injection dans un ii lieu pharmaceutiquemient acceptable tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile et elle est administrée de préférence directement dans la tumeur dans des conditions décrites plus particulièrement ci-après * * La composition peut être stabilisée par exemple par une méthode de lyophilisation et ensuite reconstituée sans perte de puissance. La quantité de RDE dans une seule injection pour le traitement des animaux est comprise entre environ 6,25 et 250 microgrammes/mi La quanti- té de CWS est comprise entre environ 125 et 750 microgrammes/ml La quan- tite de TDM est aussi comprise entre environ 125 et 250 microgrammes/mi. Le nombre de millilitres du produit biologique à injecter dans la tumeur est déterminé par la taille de la tumeur en accord avec le tableau sui- vant: Dosage animal suivant la taille de la tumeur Diamètre de tumeur (cm) Quantité de produit biologique à injecter 0 1 cm jusqu'à 0,5 ml i 2 cm de 0,5 à 2,5 ml 2 3 cm de 2,5 à 5 ml 3 5 cm de 5 à 10 ml 5 8 cm de 10 à 15 ml supérieur à 8 cm de 15 à 20 ml La dose maximum par injection est d'environ 1 500 microgrammes pour le RDE, environ 4 500 microgrammes pour le CWS et environ 1 500 micro- grammes pour le TDM Le cours du traitement comprend jusqu'à 5 injections administrées à une semaine d'intervalle. La composition RDE-CWS-TDM dans un milieu injectable convenable tel qu'une émulsion de gouttelettes d'huile peut être administrée direc- tement dans les tumeurs humaines La quantité de RDE et de CWS dans une simple injection est respectivement comprise entre environ 50 et 1 000 microgrammes La quantité de TDM pour une injection simple peut se situer entre environ 50 et 300 microgrammes Le niveau de dosage simple préféré pour le RDE et le TDM se situe dans la gamme entre environ 125 et microgrammes tandis que le niveau de dosage simple préféré pour le CWS se situe dans la gamme entre environ 275 et 325 microgrammes Tous les niveaux de dosage mentionnés ci-dessus pour le RDE, le CWS et le TDM sont basés sur l'administration à un patient adulte typique de 70 kg Les injections sont administrées environ 1 fois par semaine jusqu'à un total de 15 injections Généralement, il est recommandé d'administrer la compo- sition contenant entre environ 50 et 500 microgrammes/ml de RDE, entre environ 50 et 500 microgrammes/ml de CWS et entre environ 50 et 150 micro- grammes/ml de TDM par injection. Comme décrit ci-dessus, la composition pour le traitement des ani- maux à sang chaud et des humains peut être utilisée sous la forme d'une émulsion de gouttelettes d'huile La quantité d'huile utilisée se situe 252-77443 dans la gamme entre environ 0,5 et 3,0 % en volume basé sur le volume total de la composition On préfère utiliser entre environ 0,75 et 1,5 % en volume d'huile Des exemples de ces huiles comprennent une huile minérale légère, le squalane, le 7-n-hexyloctadecane, l'huile supérieure Conoco et l'huile minérale Drakeol 6 VR (produites par la Compagnie Pennreco, Butler, Pennsylvania). Le mélange contenant l'huile homogénéisée est alors combiné avec un détergent qui peut éventuellement être dissous dans une solution sa- line préalablement au mélange La quantité de détergent se situe typique- ment entre environ 0,02 et 0,20 % en volume et de préférence entre 0,10 et 0,20 % en volume basé sur le volume total de la composition On peut uti- liser un matériau détergent quelconque commun y compris le Tween-80, et Arlacel (produits par la Atlas Chemical Company). Le mélange résultant de l'addition du détergent est alors homogé- néisé pour former une suspension qui contient un pourcentage élevé de gouttelettes d'huile revêtue de RDE et de CWS tel que le détermine l'obser- vation sous un microscope. Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention seule- ment et n'entendent pas limiter d'une façon quelconque l'invention telle que revendiquée dans les revendications jointes. EXEMPLE 1 Préparation d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité. Un échantillon de 650 mg d'un précipité méthanol-chloroforme préparé selon la méthode décrite par Chen, et al J Infect Dis. 128 543 ( 1973) est mis en suspension dans 150 ml de H Cl 0,1 N, dans un bal- lon à fond rond à trois tubulures équipé d'un condenseur et immergé dans un agitateur sonique Après agitation sonique, l'appareillage en verre est abaissé dans un bain d'huile maintenu à 1200 C, ce qui permet à la température intérieure du ballon d'approcher ou de dépasser le point d'é- bullition de la solution Une surchauffe de la solution est minimisée en équipant le ballon d'un tube capillaire raccordé à une source d'azote gazeux par l'une des tubulures Un débit continu d'azote gazeux est main- tenu pendant tout le processus d'hydrolyse. On continue l'hydrolyse pendant 30 minutes et ensuite on refroidit la solution au bain de glace, on procède à une agitation sonique pour disperser le matériau solide et on le distribue dans des tubes de corex. Le ballon est lavé avec de l'eau distillée pour enlever toute la matière solide adhérant aux parois du ballon et le produit du lavage est ajouté à la suspension se trouvant dans les tubes de corex Une centrifugation est mise en oeuvre à 12 000 tr/mn pendant 80 minutes Ce qui surnage est décanté et jeté Le résidu solide est remis en suspension dans l'eau dis- tillée, soumis à une agitation sonique jusqu'à ce que la suspension soit bien dispersée et recentrifugé Le processus de centrifugation est alors répété Le résidu est repris à l'eau distillée, congelé sous forme d'écaille et lyophilisé, ce qui donne 382 mg de lipide A brut 150 mg de ce matériau sont traités à l'acétone froide ( 00 C) pour éliminer les acides gras, soumis à une agitation sonique et filtrés sur un appareil de filtration par gravité Whatman no 1 à 50 C Après séchage, il subsiste 100 mg d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité. EXEMPLE 2 Préparation d'une endotoxine brute débarrassée de sa toxicité. Un échantillon de 120 mg de MCP (précipité de méthanol-chloroforme) est mis en suspension dans 12 ml de méthanol absolu, soumis à une agita- tion sonique pour disperser les matières solides et distribué dans six fioles à bouchon vissé ( 1 x 10 cm) Dans chaque tube, on ajoute 2 ml d'H Cl 0,2 N et la suspension qui en résulte est conservée dans un bain d'eau bouillante pendant 45 minutes Après hydrolyse, on refroidit les tubes dans un bain d'eau glacée et on centrifuge pendant environ 10 minutes à 2. 500 tr/mn Ce qui surnage est décanté et l'on ajoute 5 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 2/1 au résidu pour en effectuer la dissolution On ajoute 2 ml d'eau par tube et on mélange la solution La solution bipha- sique est recentrifugée à 2 500 tr/mn pendant 10 minutes La phase aqueuse supérieure est jetée et on ajoute 1 ml d'un mélange chloroforme/ méthanol 4/1 à chaque tube ce qui a comme résultat de donner une solution claire Les solutions sont rassemblées et le solvant est évaporé sur un évaporateur rotatif Le résidu est séché sous vide poussé et liophylisé, ce qui donne 45 mg de lipide A brut 20 mg de ce matériau sont traités avec de l'acétone froide ( 00 C), soumis à une agitation sonique, et filtrés sur un appareil de filtration par gravité Whatman N O 1 à 5 %C Après sé- chage, il subsiste 13 mg d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité. EXEMPLE 3 Préparation d'une endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité. g de LH-20-100 (taille de particule 25 à 100 microns: Pharmacia) sont combinés avec 600 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 2/1 que l'on laisse au repos pendant 30 minuets La bouillie qui en résulte est introduite dans une colonne de chromatographie en verre de 25 x 1 000 mm (BRL Laboratories) équipée de raccordssous pression Après achèvement du garnissage, la colonne est raccordée au moyen d'un tubage sous pression en téflon à une pompe ISCO modèle 132 On pompe 400 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 à travers la colonne au débit de 3 ml/mn 150 mq d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité préparés selon l'exemple 1, sont appliqués à la colonne dans 2,5 ml d'un mélange chloro- forme/méthanol 4/1 par une boucle d'échantillonnage Le débit est réduit à 1 ml/mn et après que l'on ait rassemblé 150 ml d'éluant, l'effluent est raccordé à un collecteur de fraction Des fractions de 4 ml sont re- cueillies et l'on détermine les fractions d'endotoxinesraffinéesdébarras- sées de leur toxicité par analyse chromatographique en couche mince des fractions {E Merck, 0,25 mm d'épaisseur, chloroforme/méthanol/H 20/NH 40 H ( 50/25/4/2) comme éluanti. Les fractions d'endotoxin esraffihéesdébarrassées de leur toxicité sont combinées et l'évaporation du solvant laisse 30 mg d'endotoxine raf- finée débarrassée de sa toxicité sous forme de poudre blanche. EXEMPLE 4 Préparation d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité. 33 g de cellulose-DEAE (Whatman DE-32) sont mis en suspension dans ml d'acide acétique glacial et agités doucement pendant 10 minutes pour obtenir une poudre en bouillie Le mélange est laissé de côté pen- dant la nuit La bouillie est versée dans une colonne de 25 x 400 mm, on laisse se déposer tout en égouttant et l'acide en excès est ensuite évacué La colonne est lavée avec 2 000 ml de méthanol et ensuite avec ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 Un échantillon de 100 mg d'endotoxine brute débarrassée de sa toxicité produite selon l'exemple 1, est introduit dans la colonne dans 3 ml d'un mélange chlorofornne/méthanol 4/1 ou un mélange 80/20/1 de chloroforme/méthanol/eau La colonne est éluée avec 350 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 4/1 et ensuite avec 300 ml d'un mélange 99/1 méthanol/eau En utilisant un appareil à gradient linéaire, la colonne est éluée avec 2 000 ml d'un gradient linéaire en démarrant avec du méthanol à 100 % et en terminant avec de l'acide acétique 0,2 M dans le méthanol La colonne est éluée au débit de 6 ml/mn et l'on recueille des fractions de 15 ml Chaque fraction successive est analysée pour en déterminer la teneur totale en phosphore suivant la façon de procéder de Bartlett, G R, J Biol Chem 234, 466-471 ( 1959) Les frac- tions sont rassemblées et évaporées sur un évaporateur rotatif presque jusqu'à siccité et reprises dans 10 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 2/1 et 40 ml d'acide acétique 0,001 M dans un entonnoir séparateur La couche inférieure est séparée, filtrée sur papier filtre Whatman n 2 et évaporée à siccité, ce qui donne 19,2 ml d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité. O O EXEMPLE 5 A sept cobayes souche 2 ayant des croissances de tumeur ligne-10 d'environ 9 mm, on injecte une fois directement dans le tissu de la tumeur 0,4 ml d'une émulsion stérile de gouttelettes d'huile c'est-a-dire, huile minérale Drakeol 6 VR (Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania) d'un milieu d'injection contenant 50 microgrammes de chacun'de RDE, CWS et TDM. Après une période de trois mois, les animaux sont examinés et dans chaque cas on constate une régression totale de la croissance de la tumeur. A titre d'expériences de contrôle, à deux groupes de six cobayes souche 2 ayant des croissances de tumeur ligne-10 dans la gamme de 9 à 12 mm, on injecte une fois directement dans le tissu de la tumeur 0,4 ml d'un milieu injectable contenant 50 microgrammes de RDE et 50 microgrammes de RDE et de TDM respectivement. Au bout de trois mois, on examine les animaux Aucun des cobayes de chacun des groupes d'animaux témoins ne manifeste aucun signe de régression du tissu de la tumeur. REVENDICATIONS 1. Composition thérapeutique comprenant une quantité thérapeutique- ment efficace de: (a) endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité ne contenat pas de 2-céto-3-désoxyoctanoate détectable et contenant entre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2 000 nmoles/ mg d'acides gras; (b) un squelette de paroi de cellule; (c) du dimycolate de tréhalose; et un vecteur pharmaceutiquement acceptable. 2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la quantité thérapeutiquement efficace de l'endotoxine raffinée débarras- sée de sa toxicité et de dimycolate de tréhalose atteint jusqu'à environ 1.500 microgrammes et la quantité thérapeutiquement efficace de squelette de paroi de cellule atteint jusqu'à environ 4 500 microgrammes par injec- tion. 3. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la composition est sous la forme lyophilisée ou sous la forme d'une émul- sion de gouttelettes d'huile. 4 A titre de médicament nouveau pour le traitement du cancer d'un animal à sang chaud la composition suivant une quelconque des reven- dications 1 à 3. 5. Médicament suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ladite composition-contenant entre 6,25 et 250 microgrammes/ml d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité et entre environ 125 et 750 microgram- mes/ml de squelette de paroi de cellule et entre 125 et 250 microgrammes/ ml de dimycolate de tréhalose et est destinéea être administré par injec- tion directementdans le tissu de la tumeur. 6. A titre de médicament nouveau pourle traitement du cancer chez les êtres humains, la composition suivant une quelconque des revendications 1 à 3, ladite composition contenant entre environ 50 et 1 000 pg d'endotoxine raffinée débarrassée de sa toxicité et de squelette de paroi de cellule, de préférence entre environ 125 et 175 microgrammes de ladite endotoxine, de préférence entre environ 275 et 325 microgrammes de squelette de paroi de cellule, entre environ 50 et 300 microgramnimes de dimycolate de tré- halose et de préférence entre 125 et 175 microgrammes dudit dimycolate de tréhalose.