Brevet FR2535342A1 — publié le 19840504

Extrait de mycobactérie en tant que nouveau moyen de détection d'activités cancérigènes et procédé mettant en oeuvre ce moyen. La présente invention a trait a l'utilisation d'un extrait de mycobactérie en tant que nouveau moyen de détection d'activités cancérigènes. Elle concerne également le procédé de détection mettant en oeuvre ce moyen. Selon un ensemble de données expérimentales concordantes, on sait que l'effet cancérigène d'une substance est essentiellement le résultat de lésions de 12ADR. Pour mettre en évidence un potentiel d'altération de l'ADNS on sait que l'utilisation de micro-organismes présente d'incontestables avantages dus, en particulier, à la rapidité de la multiplication des dits microorganismes et à une certaine simplicité de leur organisation cellulaire.Parmi les méthodes connues de détection tenant compte des altérations des structures moléculaires, on contact deux- méthodes, celle dite de ANTES, qui repose sur la modification de la fréquence d'apparition de "revertants" dans des populations de mutants de Salmonella typbi-murius, typhi-murium, et et celle dite de KADA, qui est fondée sur un phénomène de recombinaison génétique chez Bacilles subtilis. On connatt par ailleurs de l'article de P.LAFONT et J. LAFONT, Can. J. Microbiol., 25, pages 462-474 (1979), un phénomène de modification héréditairement transmissible induite chez les mycobactéries par un extrait de mycobactérie intervenant en tant que moyen ou agent inducteur.Ce phénomène de modification bacterienne9 désigné ci-après sous l'appellation de "phénomène d'endométallaxie1,, intéresse les bacilles de Koch ; il est reproduit sous l'action de l'agent inducteurs mais il ne correspond pas à un transfert de caractères propres à la mycobactérie donatrice de l'agent inducteur de plus, dans le cas des bacilles tuberculeux, la modification en question peut se manifester sur la souche bactérienne-même à partir de laquelle cet agent est preparé. Selon l'invention on préconise une nouvelle solution pour la détection d'activités cancérigènes, qui repose sur la decotlverte que les substanees cancérigènes inhibent le phénomène d'endométallaxie. Cette nouvelle solution technique présente par rapport aux solutions connues un certain nombre d'avantages, notamment - une plus grande sensibilité, - une excellente fiabilité, - la possibilité de distinguer les propriétés mutagènes des propriétes cancérigènes, et - une simplification des manipulations. Le nouveau moyen selon l'invention de détection d'activités cancérigènes qui est obtenu è partir d'une souche de rnycobactérie, est caractérisé en ce qu'il s'agit d'un extrait d'une souche choisie parsi l'ensemble constitué par les souches de mycobactéries scotochromogènes, de Mycobacterium tuberculis et de Mycobacterium bovis, ledit extrait induisant chez les bacilles tuberculeux une modification héréditairement transsissibles l'induction de ladite modification étant inhibé par la présence d'une substance cancérigène. Ce moyen de détection est un extrait de mycobactérie renfejTnant une quantité supérieure ou égale à 70% en poids d'ADN par rapport au poids dudit extrait. Cet extrait est constitué par la fraction "S" décrite dans l'article précité, ou 1'ADN isolé de ladite fraction comme indiqué dans ledit article. En bref, la fraction "S" est obtenue à partir d'une souche de mycobactérie par broyage, sédimentation à travers une solution de 2,2 M de saccharose, ultracentrifugation et ultrafiltration. Parmi les souches de mycobactéries scotochromogènes, de Mycobacterium tuberculis et de Mycobacterium bovis qui conviennent pour l'obtention du mayen de detection selon l'invention, on peut utiliser notamment celles qui sont citées dans l'article précité, d'une part, et celles décrites dans J. LAFONT et P. LAFONT, Can. J. Mîcrobiol., 24, pages 261-267 (1978), d'autre part. Le phénomène d'endométallaxie se manifeste quand on met le moyen de détection selon l'invention constitué par la fraction "S" ou l'ADN isolé de celle-ci, en contact avec une suspens ion de bacilles tuberculeux humains ou bovins pendant 2 h puis ensemence le mélange résultant sur gélose nutritive glycérinée; en 24 à 48 heures d'incubation à 370C se développent des colonies à surface lisse, constituées de bactéries non acido-alcoolorésistantes, avirulentes. L'inhibition de l'endométallaxie se manifeste lorsque l'on met en contact la fraction "S" ou son ADN avec une solution ou suspension de la substance cancérigène. Aucune activation de la substance cancérigène par les microsomes n'est nécessaire. L'inhibition est totale : il n'y a aucun développement de colonies bacte- riennes sur gélose nutritive glycéuranée. En revanche, les substances mutagènes n'inhibent pas le phenomene d'endometallaxie. Le-procede de mise en oeuvre du moyen de détection de la présence d'une substance cancérigène, dans lequel ledit moyen intervient en tant qu'agent inducteur, est caractériséen-ce que l'on met en contact dans un solvant convenable ledit moyen, avec une substance à tester susceptible d'être cancérigène, et une suspension de bacilles tuberculeux, pour observer, après. ensemencement et incubation, le développement d'une culture ou l'absence d'une culture. En pratique, on met en contact l'agent inducteur, pendant 2 h entre-O et 40C, dans un solvant convenable, avec la substance à étudier susceptible d'être cancerigee, centrifuge le mélange résultant à au moins 5 OOOg pendant au moins 10 minutes, reprend le culot de centrifugation avec un solvant convenable, puis met en contact le mélange ainsi. obtenu avec un bacille tuberculeux pendant au moins 2 h à une température comprise entre 30 et-400C (de préférence entre 32 et 37 C), pour observer après ensemencement et incubation la présence ou l'absence de culture. I1 existe plusieurs variantes de mise en oeuvre'de ce procédé, par exemple celle des schémas A et B donnés à titre d'illustration ci-après, qui font intervenir un contrôle parallèle. Le solvant convenable est avantageusement un sérum physiologique constitué par une solution aqueuse de NaCl à 8 g/l . Quand la substance à étudier n'est pas soluble dans le sérum physiologique, on peut utiliser une préparation aqueuse renfermant 8 g/l de NaCl et au plus 50 gIl d'une substance choisie notamment parmi le DMSO et les mélanges DMSO-acétate d'éthyle / en particulier les mélanges DMSO-acétate d'éthyle de (1:4) v/v à (4:1 )v/v 7. Parmi les souches de mycobactéries soumises à l'agent inducteur, on fera appel aux bacilles tuberculeux, Mycobacterium tuberculis et Mycobacterium bovis. SCHEMA A Fraction "S" b en NaCl 0,8 z en NaCl 0,8 Z + substance 2 h / 20C à étudier 2 h I 2bC t lavage par centrifugation lavage par centrifugation s1 filtration sur membrane Millipore GS (R) contact avec une suspens ion contact avec une suspension de BCG (2 h l 320C) de BCG ( 2 h/320C) I t ensemencement ensemencement I I incubation (24-48 h/37 C) incubation (24-48 h/37 C) I t culture si la substance à pas de culture si la étudier n'est pas substance est cancérigène. cancérigène Note (*) uniquement dans le cas où la préparation de substance à étudier nwest pas stérile. SCHEMA B Fraction "S" 1 sérum physiologique ou substance à étudier (contact 2 h/2 C) centrifugation reprise avec sérum physiologique contact (2 h/2 C) avec contact avec substance cancérigène bacille de Koch connue (aflatoxine, (2 h /320C) benzopyrne-ou autre) t 5 Z centrifugation ensemencement s t reprise avec sérum incubation physiologique (24-48 hJ37 CX contact (2 h/32eC) avec bacilLe de Koch cL ensemencement culture absence de Si si la substance culture si la à étudier n'est substance à incubation pas cancérigène étudier est (24-48 h/370C) cancérigène 1 pas de culture D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. EXEMPLE 1 a) Obtention de la Praction ltst? Une souche de mycobactérie scotochromogène (référencée B 150 La et en-cours de dépit dans la collection de l'institut Pasteur) dépourvue de tout pouvoir pathogène expérimental chez le cobaye et obtenue à partir de Mycobacterium bovis par traitement avec du laurylsulfonate de sodium selon J. LAFONT et P. LAFONT, Can. J.Microbiol., 24, pages 261-267 (1978) est cultivée sur gélose nutritive glycérinée en fiole de Roux pendant 72 heures à 370C ; la culture bactérienne est prélevée et dispersée dansdu sérum physiologique (NaCl, 0,8 %) à raison de ig (poids humide) dans 10 ml ; cette suspension est broyée (broyeur MSK Braun, Melsungen ; perles de verre de 0,33 mm de diamètre ; vitesse angulaire : 3 400 cycles/minute ; température : 2 C); le broyat est déposé à la surface d'une solution 2,2M de saccharose (Analar) et soumis à une centrifugation à 75 OOOg pendant 30 minutes ; le culot inférieur est repris par 5 ml de sérum physiologique ; la suspension résultante est filtrée à travers une membrane Millipore type GS (diamètre moyen des pores 0,22 m). Le matériel biologique contenu dans cette suspension est la fraction "S". L'activité inductrice du phénomène d'endometalla- xie est conservée soit par lyophilisation, soit par congélation (-30 C) du culot de centrifugation à 5 OOOg, soit par précipitation par l'éthanol à 60% (dans ce dernier cas le matériel est, avant usage, séparé du solvant par centrifugation à 5 OOOg/10 minutes). b) Détection de l'activité cancérigène. On procède selon le schéma A pour déterminer en fonction de la présence ou l'absence d'une culture, si la substance à étudier est non cancérigène ou respectivement cancérigène. EXEMPLE 2 a) Obtention de la fraction ??S On procède comme indiqué par P.LAFONT et J.LAFONT Cen. J. Microbiol., 25, pages 462-474 (1979) à partir d'une souche de Mycobacterium tuberculis (référence H 37 Rv de la collection de l'institut Pasteur),en opérant selon les modalités décrites page 463, colonne de droite, lignes 9 - 27. b) Détection de l'activite canceriSène La fraction "S" ainsi obtenue est confrontée à une substance à étudier, selon le protocole du schéma B, pour déterminer si oui ou non ladite substance est cancérigène. EXEMPLE 3 A partir de la fraction "S" de l'exemple l, on recueille l1ADN selon la méthode d'Hotchkiss ou celle de Marmur. Après le temps de déprotéinisation, une seule précipitation par l'éthanol permet d'obtenir l'ADN biologiquement actif. L'ADN ainsi obtenu est confronté à une substance à étudier selon le schéma A ou le schéma B. Selon l'invention, on préconise un conditionnement unitaire renfermant, près à l'emploi,le moyen de détection, c1est-à- dire l'agent inducteur lyophilisé ou en suspension dans un liquide, une souche de mycobactérie notamment une souche BCG ou une souche avirulente, le ou les solvants tels que le sérum physiologique. REVENDICATIONS l. Nouveau moyen de détection d'activites cancérigènes obtenu à partir d'une souche de mycobactérie, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un extrait d'une souche choisie parmi l'ensemble constitué par les souches de mycobactéries scotochromogènes, de Mycobacterium tuberculis et de Mycobacterium bovis, ledit extrait induisant chez les bacilles tuberculeux une modification héréditairement transmissible, l'induction de ladite modification étant inhibée par la présence d'une substance cancérigène. 2. Nouveau moyen de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il renferme une quantité supérieure ou égale à 70 % en poids d'ADN. 3. Nouveau moyen de détection selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'une souche de mycobactérie choisie parmi les mycobactéries scotochromogènes, les Mycobacteriun tuberculis, et les Mycobacterium bovis, par broyage, sédimentation à travers une solution de 2,2M de saccharose, ultracentrifugation et ultrafiltration. 4. Nouveau moyen de détection selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'il s'agit de 1'ADN d'une mycobactérie isolé après broyage, sédimentation à travers une solution de 2,2M de saccharose, ultracentrifugation et ultrafiltration. 5. Procédé de mise en oeuvre du moyen de détection selon l'une quelconque des revendications I à 4, ledit procédé étant caractér-isé en ce que l'on met en contact dans un solvant convenable ledit moyen, avec une substance à tester susceptible d'être cancérigène, et une suspens ion de bacilles tuberculeux, pour observer, après ensemencement et incubation, le développement d'une culture ou l'absence d'une culture.