Brevet FR2528581A1 — publié le 19831216

L'invention a pour objet un dispositif pour le dosage d'un composé biologique, son procédé de fa- brication et son utilisation dans un procédé de dosage par un traceur non radioactif. Ce dispositif peut s'appliquer à l'analyse de solutions contenant des composés biologiques tels que des antigènes, des anticorps, des hormones, des vitamines, des protéines, et des enzymes en utilisant les réactions antigène-anticorps, les réactions hor- mone-protéine, les réactions vitamine-protéine ou les réactions enzymesubstrat Généralement, dans le cas de la réaction antigène-anticorps, le dosage de ces composés biologiques est effectué, soit par radioimmu- nologie, soit par immunologie en utilisant un traceur non radioactif. Dans le cas du dosage d'antigènes ou d'anti- corps, la méthode radioimmunologique consiste à étu- dier la réaction antigène-anticoprs à l'aide d'un tra- ceur radioactif obtenu en marquant l'antigène ou l'an- ticorps par une substance radioactive telle que l'iode Plusieurs modes opératoires sont possibles On utilise fréquemment la méthode dans laquelle on fait réagir par exemple l'antigène à déterminer avec un ex- cès d'anticorps, puis dans une étape ultérieure, on ajoute de l'anticorps marqué qui se lie à l'antigène se trouvant en quantité limitée par rapport à la quan- tité totale d'anticorps On sépare ensuite lescomplexes antigène-anticorps du reste de la solution et on dé- termine la radioactivité des complexes antigène-anti- corps, ce qui, par comparaison avec une courbe stan- dard, permet de déterminer la quantité d'antigène pré- sente dans l'échantillon Dans un procédé de ce type, il est donc nécessaire de séparer les complexes anti- gène-anticorps de la solution et ceci peut être effec- tué en phase solide par utilisation d'un support en matériau approprié susceptible par exemple, de fixer B 7656-3 MDM l'anticorps et le complexe formé ensuite par réaction de l'antigène avec l'anticorps, comme cela est décrit dans la demande de brevet français EN 7805040 du 22 février 1978 Dans ce but, on a déjà utilisé des tubes sur la paroi desquels est fixé l'un des réac- tifs, ou bien des billes ou d'autres pièces chargées de réactif que l'on introduit dans le tube ou s'effec- tuent les réactions. Dans cette méthode de dosage radioimmunolo- gique, il est donc nécessaire de déterminer la radio- activité des complexes formés et cette mesure peut être effectuée en fin d'opération directement dans le tube o l'on réalise les différentes réactions. Parmi les méthodes de dosage utilisant un traceur non radioactif, on connaît des méthodes de do- sage immunoenzymatique Dans ce cas, lorsque le compo- sé biologique à doser est un antigène, entre autres techniques, on met en contact l'échantillon contenant l'antigène avec un anticorps spécifique fixé en quan- tité déterminée sur un support solide de façon à for- mer le complexe antigène-anticorps et à le retenir sur le support, puis on élimine la partie non réactive de l'échantillon, et on met en contact le support sur lequel est fixé le complexe anticorps-antigène avec une solution d'un composé conjugué d'un anticorps spé- cifique de l'antigène et d'une enzyme de façon à for- mer et à fixer sur le support ce conjugué par l'anti- gène du précédent complexe entre l'anticorps sur le support et l'antigène ayant réagi Après formation de ce dernier complexe et élimination de la solution du composé conjugué n'ayant pas réagi, on met en contact le support avec un substrat de l'enzyme du composé conjugué de façon à réaliser une réaction enzymatique que l'on arrête au bout d'un certain temps, puis on mesure la densité optique de la solution pour en dé- terminer l'activité enzymatique. Comme précédemment, on peut utiliser des tu- B 7656-3 MDT bes revêtus d'anticorps ou contenant une pièce sur la- quelle est fixé l'anticorps pour réaliser les diffé- rentes réactions Cependant, pour mesurer en fin d'o- pération la densité optique de la solution, il est nécessaire de transvaser le contenu du tube dans la cuve d'un spectrophotomètre, ce qui nécessite des ma- nipulations et des opérations de lavage complémen- taires par rapport au dosage radioimmunologique o l'on peut déterminer directement la radioactivité dans le tube o ont été effectuées les différentes réac- tions. La présente invention a précisément pour ob- jet un dispositif pour le dosage d'un composé biologi- que capable de réagir avec un composé antagoniste spé- cifique dudit composé biologique, qui peut être utili- sé en particulier dans les procédés de dosage par tra- ceur non radioactif nécessitant la détermination d'une caractéristique optique. Selon l'invention, le dispositif pour le do- sage d'un composé biologique susceptible de réagir avec un composé antagoniste spécifique dudit composé biologique se caractérise en ce qu'il est constitué par un tube transparent, sensiblement cylindrique de section circulaire, fermé à sa base et comportant suc- cessivement depuis sa base une première zone de réac- tion dans laquelle est engagée et immobilisée une piè- ce en matériau susceptible de fixer ledit composé bio- logique ou le composé antagoniste spécifique dudit composé biologique, et une seconde zone permettant de déterminer directement les caractéristiques optiques d'une solution présente dans ledit tube, les surfaces interne et externe de la paroi dudit tube étant cen- trées l'une par rapport à l'autre au moins dans ladite seconde zone. Dans le dispositif de l'invention, la secon- B 7656-3 MDT de zone que nous dénommerons, ci-après, zone de lectu- re présente ainsi les qualités optiques nécessaires pour obtenir une bonne reproductibilité et une bonne précision des mesures En effet, en s'assurant que les surfaces interne et externe de la paroi du tube sont parfaitement centrées, on obtient dans la zone de lec- ture des épaisseurs de paroi constantes et de ce fait, quelle que soit la position du tube par rapport à un faisceau lumineux, l'absorption du faisceau par la pa- roi est identique dans tous les cas. Selon une caractéristique du dispositif de l'invention, la pièce engagée et immobilisée dans la première zone de réaction a la forme d'un manchon cy- lindrique plein muni d'ailettes longitudinales dont les bords externes sont en contact avec la surface interne de la paroi dudit tube De préférence, l'ex- trémité inférieure du manchon est en contact avec le fond dudit tube. Généralement, la pièce est en matériau élas- tique insoluble dans les différentes solutions utili- sées, par exemple, en polyamide. Selon une caractéristique préférentielle du dispositif de l'invention, le fond du tube est pres- que plat, ce qui permet de réaliser dans de meil- leures conditions le lavage du tube et de limiter, par ailleurs, les quantités de réactif mises en jeu En effet, pour obtenir la réaction entre le composé bio- logique à analyser et le composé fixé sur la pièce engagée et immobilisée dans la zone de réaction du tube, il suffit d'utiliser une quantité de solution permettant l'immersion de la pièce Lorsque le tube est à fond arrondi, les ailettes ne peuvent être enga- gées au niveau du fond du tube et de ce fait il reste un volume perdu à la base de celui-ci. Selon l'invention, le tube est réalisé en un B 7656-3 MDT matériau transparent, par exemple en matériau thermo- plastique transparent tel que le polystyrène, le poly- méthacrylate de méthyle, les polyacryliques, les copo- lymères acryliques, etc L'invention a également pour objet un procé- dé de fabrication d'un tube transparent à fond plat sensiblement cylindrique de section circulaire pré- sentant la qualité optique voulue pour être utilisé dans le dispositif de l'invention. Ce procédé consiste à réaliser ledit tube par moulage par injection d'un matériau thermoplasti- que en utilisant un moule en plusieurs parties compor- tant des évents sur sa partie qui correspond à l'em- preinte de fond dudit tube et en réalisant l'injection par injection capillaire sous-marine en deux points du moule qui correspondent à deux points diamétralement opposés de la surface externe du tube à mouler. Avantageusement, la partie du moule qui cor- respond à l'empreinte de fond dudit tube est consti- tuée par un empilement de pièces disposées les unes à c 8 té des autres avec un faible jeu pour former les évents. L'invention a encore pour objet un procédé de dosage d'un composé biologique susceptible de réa- gir avec un composé antagoniste spécifique dudit com- posé biologique, utilisant le dispositif de l'inven- tion. Ce procédé de dosage qui comporte plusieurs étapes de réaction et de lavage et une étape de déter- mination d'une caractéristique optique d'une solu- tion, se caractérise en ce que l'on réalise toutes les étapes dans le dispositif de l'invention et en ce que l'on détermine directement dans ledit tube la caracté- ristique optique de ladite solution. Généralement la caractéristique optique à B 7656-3 MDT déterminer est la densité optique de la solution Ce- pendant, on peut aussi utiliser le dispositif de l'in- vention pour déterminer d'autres caractéristiques op- tiques, mettant en jeu des phénomènes d'absorption, de diffusion, de transmission ou d'émission de rayonne- ments, par exemple la luminescence de la solution. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la des- cription qui suit donnée bien entendu à titre illus- tratif et non limitatif en référence au dessin annexé sur lequel: la figure 1 représente schématiquement en coupe verticale un dispositif de dosage selon l'inven- tion, l S la figure 2 illustre la réalisation d'un tube par moulage par injection selon l'art antérieur, la figure 3 illustre la réalisation d'un tube par moulage par injection selon l'invention, la figure 4 représente la progression de la matière dans le moule de la figure 3, et la figure 5 illustre la réalisation d'un tube par moulage par injection avec une seule alimen- tation du moule. Sur la figure 1, on voit que le dispositif de l'invention est constitué par un tube transparent l presque cylindrique de section circulaire qui est fermé à sa base par un fond plat 3 Ce tube comprend successivement depuis sa base une première zone de réaction A dans laquelle est engagée et immobilisée une pièce 5 destinée à fixer le composé biologique ou le composé antagoniste spécifique du composé biologi- que à doser. Cette pièce comprend un manchon cylindrique plein 5 a dont l'extrémité inférieure repose sur le fond 3 du tube 1 et des ailettes longitudinales 5 b B 7656-3 MDT dont les bords externes viennent en contact avec la surface interne la du tube 1, ce qui permet d'assurer l'immobilisation de la pièce dans le tube puisque cet- te pièce est réalisée en matériau élastique, par exem- ple, en polyamide La hauteur de cette pièce 5 déter- mine la hauteur de la zone de réaction A du tube 1. Comme on peut le voir sur le dessin, le fait d'avoir un fond plat 3 permet de limiter les quantités de réactif à utiliser, qui doivent être juste suffi- santes pour immerger totalement la pièce 5 Au-dessus de la première zone de réaction A, le tube comporte une seconde zone de lecture B, puis une zone C de hauteur plus importante permettant de réaliser les étapes de lavage Dans la seconde zone de lecture B, le tube présente une très bonne qualité optique qui est obtenue en particulier grâce au fait que la surfa- ce interne la et la surface externe lb de la paroi du tube 1 sont bien centrées l'une par rapport à l'autre, tout au moins dans cette zone Ainsi, dans cette zone du tube, l'épaisseur e de la paroi est homogène et constante. Le tube 1 est réalisé en matière plastique, par exemple en polyméthacrylate de méthyle et il est obtenu de préférence par moulage par injection selon le procédé de l'invention, car les techniques classi- ques de moulage des matières thermoplastiques ne per- mettent pas l'obtention d'un tube à fond plat présen- tant la qualité optique voulue pour qu'on puisse mesu- rer directement dans le tube la densité optique d'une solution. On rappelle que la technique d'injection des matières thermoplastiques consiste à remplir la cavité d'un moule avec une matière en fusion à l'état généra- lement pâteux et sous pression, afin d'obtenir après refroidissement une pièce de forme voulue Habituelle- B 7656-3 MDT ment, comme on peut le voir sur la figure 2, on réali- se des pièces creuses fermées à leur base en utilisant un moule en plusieurs parties comprenant l'empreinte ( 21) de la surface externe de la pièce, le noyau in- terne ( 23) et une pièce ( 25) permettant l'ouverture du moule en fin d'opération au niveau du plan de joint J. Dans ce cas, on alimente généralement le moule par le fond ( 27) Cependant, dans ces condi- tions, la progression préférentielle de la matière qui devient de plus en plus pâteuse, pousse le noyau 23 qui flambe et se décentre Ainsi, on obtient un tube dont la surface interne la est décentrée par rapport à la surface externe lb et la qualité optique de ce tube ne permet pas de réaliser des mesures optiques dans de bonnes conditions car les variations d'absorption de la paroi sont élevées lorsqu'on fait tourner le tube autour de son axe et que l'on modifie ainsi sa posi- tion par rapport à un faisceau lumineux. Aussi, selon l'invention, on utilise un pro- cédé d'injection différent qui est illustré sur la fi- gure 3. Dans ce cas, on utilise comme précédemment un moule en plusieurs parties mais la partie du moule qui correspond à l'empreinte de fond du tube est cons- tituée par un empilement de petites pièces ( 29 a, 29 b, 29 c,) disposées les unes à cÈté des autres avec un faible jeu pour former des évents ( 31) Par ailleurs, au lieu de réaliser l'injection par le fond du tube, on réalise une injection capillaire sous-marine, c'est-à-dire une injection en-dessous du plan de joint J du moule, en deux points ( 33, 35) diamétralement opposés de la surface externe du tube à mouler. Grâce à la présence des évents ( 31), l'air présent dans le moule est chassé rapidement, ce qui permet d'obtenir une bonne homogénéité de la paroi du B 7656-3 MDT tube sans inclusion de bulles d'air Par ailleurs, le fait d'alimenter le moule en deux points diamétrale- ment opposés permet d'obtenir comme cela est représen- té sur la figure 4, une progression homogène de la matière M dans la cavité du moule Par ailleurs, grâce aux injections latérales, on peut obtenir un bon degré de pureté de la matière thermoplastique sur la paroi du tube car la matière injectée en début d'opération constitue le fond du tube. En revanche, si l'on réalisait l'injection capillaire sous-marine en un seul point du tube, par exemple en 35, comme représenté sur la figure 5, il se produirait également un flambage du noyau, car la pro- gression de la matière M dans le tube ne serait pas homogène comme on peut le voir sur la figure 5 De ce fait, malgré la présence des évents ( 31) qui permet- tent d'évacuer l'air emprisonné dans le moule et d'éviter la formation de bulles et de brûlure de la matière plastique, le tube obtenu n'aurait pas une épaisseur de paroi uniforme. Pour l'opération de moulage par injection, la température et la pression d'injection sont choi- sies en fonction de la matière thermoplastique utili- sée Généralement les pressions se situent entre 40 et 200 M Pa. On décrit, ci-après, un exemple de réalisa- tion d'un dispositif de dosage selon l'invention, réa- lisé en polyméthacrylate de méthyle. On sèche le polyméthacrylate de méthyle à 80 WC dans une étuve, puis on l'introduit directement dans la machine d'injection o il est porté à une tem- pérature de 2750 C Pour l'opération d'injection, on introduit la matière sous une pression d'injection de M Pa, dans le moule qui a été porté en début d'opé- ration à une température de 800 C Les dimensions du B 7656-3 MDT moule sont telles que le tube obtenu ait une hauteur d'environ 70 mm et un diamètre externe de 11,4 mm tout en étant légèrement conique pour faciliter son démou- lage Après refroidissement et solidification du poly- méthacrylate de méthyle, on arrache les deux carottes d'injection et on démoule le tube. Après cette opération, on introduit dans le tube la pièce en forme d'ailette qui est réalisée en polyamide et elle est immobilisée dans le tube par engagement des ailettes sur la surface interne du tu- be. Le tube ainsi préparé peut être utilisé pour différents types de dosages, par exemple pour le dosa- ge enzymo-immunologique de l'a-foetoprotéine, pour la détection de l'Ag H Bs, pour la détection de l'antigène carcino-embryonnaire (CEA) ou pour déterminer le taux d'Ig E totales circulant dans les échantillons de sang. On décrit, ci-après, l'utilisation du dis- positif de l'invention pour le dosage immuno-enzymati- que de l'a-foetoprotéine AFP qui est une glycoprotéine ayant un poids moléculaire de 70 000, synthétisée par les cellules du foie foetal et du sac vitellin C'est un constituant majeur du sérum foetal avec un taux maximum atteignant 3 mg/ml vers la 13 e semaine et on la trouve dans le liquide amniotique à un taux maxi - mum de 20 à 50 1 Lg/ml, vers la 15 e semaine, et dans le sérum maternel, vers la 34 e semaine, à un taux de 200 à 500 ng/ml. On fixe tout d'abord sur l'ailette immobili- sée dans le tube une quantité suffisante de l'anti- corps anti-AFP obtenu chez le mouton en immergeant l'ailette pendant 18 h, à la température ambiante, dans une solution de sérum de mouton anti-AFP humaine On introduit alors dans le tube 100 iil de l'échantillon contenant l'a-foetoprotéine (AFP) Puis, on complète à B 7656-3 MDT il 500 iil par une solution contenant des protéines séri- ques de mouton On porte ensuite le tube dans un bain- marie dont la température a été ajustée à 37 1 C, afin de réaliser l'incubation pendant 2 h On vide alors le tube de son contenu et on le lave 2 fois au moyen de 3 ml d'eau distillée On ajoute alors dans le tube 500 il du composé conjugé d'anti-AFP couplé à l'Horse radish peroxydase (HRP) et après une légère agitation pour s'assurer que les bulles sont évacuées, on porte le tube dans une étuve maintenue à 370 1 C et on laisse incuber pendant 1 h 30 Après cette opé- ration, on vide le tube de son contenu et on le lave deux fois par 3 ml d'eau distillée On ajoute alors dans le tube 500 Fil d'une solutionsubstrat qui a été préparée en introduisant 16 ml de tampon substrat, (tampon au citrate contenant 0,02 % de H 202) dans un flacon contenant 32 mg de chromogènes OPD (O phénylène diamine-2 H Cl) à l'état lyophilisé On laisse incuber le tube pendant 30 min à la température ambiante, à l'abri d'une lumière trop vive, et on arrête alors la réaction enzymatique en ajoutant dans le tube 2 ml d'acide oxalique i N On agite modérément puis on in- troduit les tubes contenant la solution colorée dans un spectrophotomètre pour en déterminer la densité op- tique à 492 nm, cette mesure étant effectuée dans les deux heures qui suivent l'arrêt de la réaction enzyma- tique. En se reportant à la figure 1, on peut voir la disposition du tube 1 dans le spectrophotomètre 2 et l'on voit que le faisceau lumineux L traverse le tube 1 au niveau de la zone de lecture B du tube 1. * Pour vérifier que le tube obtenu présente une bonne homogénéité de paroi, on réalise trois mesu- res sur le même tube après avoir effectué une rotation de 120 WC par rapport à l'axe du tube pour obtenir B 7656-3 MDT 3 positions différentes du tube par rapport au fais- ceau lumineux On répète ces opérations avec d'autres échantillons ayant des concentrations différentes en AFP. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 1 qui suit: TABLEAU 1 Concentration en lère 2 ème 3 ème AFP (ng/ml) position position position 0 0,096 0,102 0,096 3 0,129 0,134 0,131 12 0,216 0,217 0,216 0,598 0,598 0,599 0,958 0,960 0,960 Pour vérifier que ces résultats sont confor- mes aux résultats obtenus lorsqu'on transfère la solu- tion dans la cuvette du colorimètre, on verse les so- lutions des tubes dans les cuvettes en polystyrène et on lit les densités optiques sur le même appareil que précédemment Dans un second temps, on effectue la lecture avec un colorimètre automatique à microcuve en quartz à faces parallèles (colorimètre Seroa- Saitron) Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 2 qui suit. B 7656-3 MDT TABLEAU 2 Concentration en Transvasement et Transvasement par cuvette en aspiration et mi- AFP (ng/ml) polystyrène crocuve de quartz O 0,123 0,118 3 0,163 0,160 12 0,262 0,251 40 0,693 0,670 1,098 1,087 Ces résultats montrent un accord suffisant entre les trois mesures, la calibration des appareils et la nature des cuvettes étant les causes principales des faibles différences mesurées Par ailleurs, on note que le dispositif de l'invention a un bruit de fond faible à 492 nm. Ainsi, le dispositif de l'invention pré- sente de nombreux avantages pour la réalisation de do- sages au moyen de traceurs non radioactis, nécessitant par exemple une mesure de densité optique. Bien entendu, on peut également utiliser le dispositif de l'invention pour des dosages au moyen de traceurs radioactifs nécessitant en fin d'opération une mesure de la radioactivité, qui peut être effec- tuée elle aussi dans le dispositif de l'invention. B 7656-3 MDT REVENDICATIONS 1 Dispositif pour le dosage d'un composé biologique susceptible de réagir avec un composé anta- goniste spécifique dudit composé biologique, caracté- risé en ce qu'il est constitué par un tube ( 1) trans- parent, sensiblement cylindrique de section circulai- re, fermé à sa base et comportant successivement de- puis sa base une première zone de réaction, (A) dans laquelle est engagée et immobilisée une pièce biologique, et une seconde zone terminer directement les caractérisiques optiques d'une solution présente dans ledit tube, les surfaces interne (la) et externe (lb) de la paroi dudit tube étant centrées l'une par rapport à l'autre au moins dans ladite seconde zone (B). 2 Dispositif selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que le fond 3 Dispositif pour le dosage d'un composé biologique susceptible de réagir avec un composé anta- goniste spécifique dudit composé biologique, caracté- risé en ce qu'il est constitué par un tube ( 1) trans- parent, sensiblement cylindrique de section circulai- re, fermé à sa base pour former un fond plat et com- portant successivement depuis sa base une première zone de réaction (A) dans laquelle est engagée et im- môbilisée une pièce fixer ledit composé biologique ou le composé antago- niste spécifique dudit composé biologique, et une se- conde zone (B) dans laquelle les surfaces interne (la) et externe (lb) de la paroi dudit tube sont centrées l'une par rapport à l'autre. 4 Dispositif selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit tube est réalisé en matériau thermoplastique transparent. B 7656-3 MDT Dispositif selon la revendication 4, ca- ractérisé en ce que le matériau transparent est du polyméthacrylate de méthyle. 6 Dispositif selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 5, caractérisé en ce que la pièce ( 5) engagée et immobilisée dans la première zone de réac- tion dudit tube, a la forme d'un manchon cylindrique plein interne (la) de la paroi dudit tube. 7 Dispositif selon la revendication 6, ca- ractérisé en ce que l'extrémité inférieure du manchon ( 5 a) est en contact avec le fond ( 3) dudit tube. 8 Dispositif selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite pièce ( 5) est en matériau élastique. 9 Dispositif selon la revendication 7, ca- ractérisé en ce que ladite pièce ( 5) est en polyamide. Procédé de fabrication d'un dispositif pour le dosage d'un composé biologique selon l'une quel- conque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste à préparer un tube à fond plat de section circu- laire par moulage par injection d'un matériau thermoplas- tique transparent en utilisant un moule en plusieurs parties ( 21, 23, 25) comportant des évents ( 315 sur sa partie qui correspond à l'empreinte de fond dudit tube et en réalisant l'injection par injection capillaire sous- marine en deux points ( 33, 35) du moule qui correspon- dent à deux points diamétralement opposés de la surface externe de la paroi du tube à mouler, et à fixer et engager dans le fond dudit tube une pièce en matériau susceptible de fixer ledit composé biologique ou un composé antagoniste spécifique dudit composé biologique. B 7656 MDT 11 Procédé selon la revendication 10, ca- ractérisé en ce que la partie du moule qui correspond à l'empreinte de fond dudit tube est constituée par un empilement de pièces ( 29 a, 29 b, 29 c) disposées les unes à côté des autres avec un faible jeu pour former les évents ( 31). 12 Procédé de dosage d'un composé biologi- que, comportant plusieurs étapes de réaction et de la'- vage et une étape de détermination d'une caractéristi- que optique d'une solution, caractérisé en ce qu'on réalise toutes les étapes dans le dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et en ce que l'on détermine directement dans le tube la carac- téristique optique de ladite solution. Nouvelles revendications dépos-es après notification du 2//2 B 7656 MDT