Brevet FR2531100A1 — publié le 19840203

Procédé de préparation d'inosine et/ou de guanosine. La présente invention concerne un procédé de prépa- ration d'inosine et/ou de guanosine. L'inosine et la guanosine sont des matières de départ importantes pour la préparation synthétique de condiments, notamment l'acide 5 '-inosinique et l'acide 5 '-guanyliquer il est commercialement important de les préparer en grandes quantités Pour la préparation de l'inosine et/ou de la guanosine par voie de fermentation, il a été considéré avantageux,du point de vue industriel, d'utiliser une souche de mutant dans laquelle une ou plu- sieurs de ces propriétés telles que la résistance à l'adénine/ et la résistance à l'adénosine, le manque de réductase GMP, et le manque de nucléotide-phosphorylase a ou ont été obtenue(s). Les recherches poussées entreprises par les auteurs de la présente invention en vue d'améliorer la préparation classique de l'inosine et/ou de la guanosine par fermenta- tion a amené la découverte que l'accumulation de l'inosine et/ou de la guanosine par un micioorganisme produisant l'inosine et/ou la guanosine du genre Bacillus exigeant de l'adénine pour se développer peut être remarquablement améliorée en amenant le micro-organisme à acquérir une résistance aux antifolates tels que le méthotrexate, l'aminoptérine, la pyriméthamine, la triméthoprime, etc. La présente invention concerne par conséquent un procédé de préparation de l'inosine et/ou dela guanosine qui consiste à cultiver une souche de mutant du genre Bacillus qui nécessite de l'adénine pour se développer et qui est résitant aux antifolates et qui peut produire de l'inosine et/ou de la guanosine, qui est cultivé dans un milieulet à récupérer l'inosine et/ou la guanosine élaborée ainsi accumulée à partir du bouillon de culture résultant. Le micro-organisme utilisé selon la présente invention est une souche du genre Bacillus produisant de l'inosine et/ou de la guanosine qui nécessite de l'adénine pour se développer et aui possède une résistance aux antifolates. Les antifolates (antagonistes de l'acide folique) utilisés dans la présente invention sont des drogues qui montrent une activité inhibitoire d'une façon antagoniste à la dihydrofolate-réductase ou à une des réactions de transfert du carbone dans laquelle l'acide folique participe. Comme antifolates de ce genre, on peut citer le méthotrexate, l'aminoptérine, la triméthoprime ou la pyriméthamine, etc. Les mutants utilisés dans la présente invention peuvent provenir d'un large domaine de parents comprenant non seulement les souches sauvages de Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, etc, mais également les souches produisant 1 'inosine et/ou la guanosine du genre Bacillus bar exemple Bacillus pumilus n 158-A-11 (IFO 12476) décrit dans la publication du brevet japonais n 46839/1976 l La dérivation et l'isolement du micro-organisme utilisable selon la présente invention peuvent être facilement réalisées par des procédés établis Ainsi, la souche de mutant désiré peut être obtenue en soumettant un micro- organisme du genre Bacillus, par exemple Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, à un traitement classique tel que l'irradiation par les ultra- violets, le traitement à la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso- guanidine (NTG), etc puis en cultivant le micro-organisme traité sur un milieu plat contenant un antifolate dont la concentration ne permet pas le développement de la souche parente, puis en sélectionnant la colonie résultante. Dans le milieu plat ci-dessus, la concentration d'antifolate varieientre autreslavec le type de micro- organismes parents ou la composition du milieu Par exemple, dans le cas o le milieu(A)mentionné ci-dessous contenant de l'agar est utilisé, le méthotrexate, l'aminoptérine, la triméthoprime ou la pyriméthamine y sont ajoutés en la concentration suivante: méthotrexate: aminoptérine: triméthoprime: pyriméthamine plus de 1 Ojug/ml, de préférence plus de ug/ml, plus de 20,Pg/ml,de préférence plus de pg/ml, plus de 0,2 jig/ml, de préférence plus de ug/ml, - plus de 10 pg/ml, de préférence plus de /ug/ml o Le degré de résistance du mutant dérivé aux anti- folates peut être évalué par le procédé suivant Un tube à essai contenant 5 ml d'un milieu (B) préparé en ajoutant un antifolateen une concentration prédéterminée au milieu (A) indiqué dané le tableau 1, est inoculé avec environ 106 cellules/ml de la souche d'essai développée au préa- lable sur un plan incliné d"agar nutritif (Difco) et on effectue la culture sous agitation à 37 'C pendant 24 heures. Le bouillon résultant est dilué 10 fois avec de l'eau et on mesure l'absorbancede la dilution à 590 nm pour trouver le degré de développement (B 590) Avec le degré de dévelop- pement (A 590) de la même souche sur un milieu (A) exempt d'acide folique, priscomme la référence 100, le dévelop- pement relatif sur le milieu contenant de l'antifolate peut être exprimé par (B 590/A 590) x 100 o Tableau 1 Composition du milieu Glucose Sulfate d'ammonium Glutamate de sodium c=alanine Sulfate de magnésium Phosphate dipotassique Sulfate de manganèse Sulfate de zinc Biotine Thiamine Adénosine Histidine Concentration ,0 % 0, 3 % 1,0 % 0,5 % 0,01 % 0,1 % 2 mg/l 2 mg/l pg/l ug/l ug/1 /g/l Le terme "souche résistante" utilisé dans cette spé- cification désigne toute souche de mutant qui donne te-le c"ueleun degré relatif de développement supérieur à celui de la souche parente dans un milieu contenant de l'anti- folate Comme exemples de mutants qui peuvent être utilisés dans la praticue de la présente invention, on peut citer Bacillus pumilus NA-1101 (IFO 14184 S FERM P-6639), Bacillus pumilus NA-1102 (IFO 14185, FERM P6640), Bacillus pumilus NA-1103 (IFO 14186, FERM P-6641), Bacillus subtilis NA-6011 (IFO 14189, FERM P-6642) et Bacillus subtilis NA-6012 (IFO 14190, FERM P-6643). Les nombres IFO ci-dessus sont les nombres déposés attribués aux souches par l'institute for Fermentation, Osaka (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2chome, Yodogawa-ku, Osaka, Japon Les cultures types des micro-organismes sus- mentionnés ont été déposées avec le nombre IFO depuis le 13 juillet 1982. Les sous-cultures de cesmicro-organismes qui ont été déposées le 22 juillet 1982 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japon (FRI), sous les numéros d'attribution de FERM P comme indiqué cidessus, le dépôt étant converti en un dépôt dans les conditions du traité de Budapest,ontété stockées au FRI sous les numéros d'attribution du FERM BP de la façon suivante Numéro d'attribution selon le traité de Budapest Bacillus pumilus NA-1101 FERM BP-288 Bacillue pumilus NA-1102 FERM BP-289 Bacillus pumilus NA-1103 FERM BP-290 Bacillus subtilis NA-6011 FERM BP291 Bacillus subtilis NA-6012 FEPM BP-292 Les souches susmentionnées NA1101, NA-1102 et NA-1103 dérivent de la souche Bacillus pumilus N O 158-A11 (IFO 12476) comme souche parente, et 'es souches NA-6011 et NA-6012 proviennent du Bacillus subtilis no 115 (IFO 14187) comme souche parente. Les caractéristiques microbiologiques de ces sources de mutants sont similaires à celles des souches parentes respectives. Les caractéristiques microbiologiques des souches parentes respectives sont les suivantes. Bacillus pmilus No 158-A-11 I(IFO 12476) Bacillus subtilis No 115 (IFO 14187) a Morphologie 1) Forme et dimension 2) Polymorphisme 3) Motilité 4) Sporulation Forme des spores Souplement du sporange Position des spores ) Coloration de Gram 6) Résistances aux acides b Caractéristiques de la culture 1) Bouillon agar plaque 2) Bouillon agar plan incliné- 3) Bouillon liquide - 4) Lait de tournesol Bâtonnets 0,6 x 3 p Seul ou rarement en chaines Difficile à se mouvoir Oui Ellipsodidale Non Centrale ou para- centrale Positive Négative Bâtonnets 0,3 x 3 p Seul ou rarement en paires Difficile à se mouvoir Oui Ellipso Ldale Non Centrale ou para- centrale Positive Negative Rond ou ondulé Amorphe et convexe,lenticulaire, diffusé, surface opaque et blanc à rugueuse, plats jaune pâle o opaque et blanc à brun clair. Convexe à soulevé, plat, opaque et opaque et blanc à blanc à brun clair. jaune pâle. Pellicule cohérente, Pellicule cohérente, pas de trouble, pas de trouble. rarement sans dévelop- pement en surface avec un certain trouble. Alcalin, peptonisa Alcalin, peptoni- tion, réduction sation, réduction c Propriétés physio- logiques 1) Réduction des nitrates 2) Réaction V-P 3) Hydrolyse de l'amidon 4) Utilisation de citrate 5) Utilisation de propionate 6) Utilisation de sels d'ammonium 7) Uréase 8) Catalase Demande d'oxygène 9) Demande d'oxygène Bacillus pumilus Bacillus subtilis No 158-A-il No 115 (IFO 12476) (IFO 14187) Négative Positive Négative Positive Négative Positive Faiblement positive Positive Aérobie, Pas de développeent dans des condi- tions anaérobies Positive Positive Positive Positive Négative Positive Faiblement positive Positive Aérobie, pas de développaient dans des onditions anaérobies ) Développement dans le chlorure de sodium à 7 % 11) Développement dans les milieux, p H 5,7 12) Demande en biotine Positif Positif Positive Positif Positif Négative La coaparaison des propriétés ci-dessus entre les touches IFO 12476 et IFO 14187 avec les descriptions comparables dans le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, R E. Buchanan et N E Gibbons (ed), Edition 8, 1974 montre- qu'elles appartiennent au Bacillus pumilus et au Bacillus subtilis. Le milieu utilisé pour la culture d'une telle souche produisant l'inosine et/ou la guanosine pour produire l'inosine et/ou la guanosine peut être un quelconque des milieuxcommunément utiliséspour la fermentation de l'inosine et/ou de la guanosine En ce qui concerne la composition du milieu, les sources de carbone peuvent être des sucres tels que glucose, maltose, hydrolysat d'amidon, etc; des mono- alcools ou des polyalcools tels que glycérine, éthanol, sorbitol, etc, et des acides gras tels que les acides acétique, propionique,stéarique, oléique, etc, et ces sources de carbone sont utilis-s soit seules, soit en combinaison Les sources d'azote-comprennent,entre autres,des sources d'azote organique telles que la peptone, farine de soja, liqueur de macération du mais, levure, extrait de viande, urée, etc, des sels d'ammonium de l'acide sulfurique, de l'acide nitrique, de l'acide chlorhydrique, de l'acide carbonique, etc, et des sources d'azote minéral telles que le gaz ammoniac, l'ammoniaque aqueuse etc, et ces sources d'azote peuvent être utilisées seules ou en combinaison. Comme autres sources nutritives, on peut utiliser divers sels minéraux nécessaires pour le développement de la souche tels que les sulfates, les chlorhydrates, les carbonates, les nitrates, les phosphates, les acétates, etc de calcium, potassium, sodium, magnésium, manganèse, fer, cuivre, zinc, etc ainsi que les amino-acides, les vitamines, etc, nécessaires pour le développement de l'organisme Ces sources nutritives peuvent être utilisées seules ou en combinaison Comme sources d'adénine, on peut utiliser non seulement l'adénine, l'adénosine, l'acide adénylique, l'acide ribonucléique, etc, mais également des matières naturelles telles que les cellules microbiennes les contenant, des extraits de celles-ci, des extraits de viande, etc En outre, des agents anti-mousses et des tensio-actifs tels que l'huile de silicone, le polyalkylène- glycoléther, etc, peuvent être également incorporés dans le milieusi nécessaire. La culture est généralement effectuée dans des conditions aérobies, par exemple par culture agitée ou par culture immergée aérée Le milieu est maintenu de préférence dans la gamme de p H comprise entre 4 et 9 S'il y a un changement de p H au cours de la fermentation, il peut être corrigé en ajoutant une solution ou une suspension aqueuse d'hydroxyde alcalin, de carbonate de calcium, d'ammoniaque ou produits analogues ou de gaz ammoniac de temps à autres. La température de la culture est comprise généralement entre et 450 C et la température optimum pour le développement du micro-organisme et pour l'accumulation de l'inosine et/ou de la guanosine est sélectionnée La culture est continuée jusqu'à ce que l'accumulation de l'inosine et/ou de la guanosine atteigne un niveau maximum,et il est géné- ralement suffisant d'effect Uer la fermentation pendant 24 à 144 heures. La séparation et la récupération de l'inosine et/ ou de la guanosine à partir du bouillon de fermentation peut être effectuée par les méthodes classiques, par exemple précipitation, résine échangeuse d'ions ou chromatographie sur charbon actif, etc. Selon la présente invention, l'inosine et/ou la guanosine peuvent être produites avec des rendements beaucoup plus grands comparativement aux procédés connus. La présente invention est illustrée en détail par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. Exemple 1 Le Bacillus pumilus No 158-A-11 (IFO 12476) propriétéshéréditaires: exige de l'adénine, résiste à l'adénine/guanosine, manque de réductase de l'acide guani- lique, et exige de l'histidinejest traité avec de la nitrosoguanidine (NTG) de façon classique, puis étalé en bandessur une plaque préparée en ajoutant 50 g/ml de méthotrexate et 25 g/1 d'agar au milieu A du tableau 1. Le milieu inoculé est mis en incubation à 37 C pendant 3 jours et le Bacillus pumilus NA-1101 (IFO 14184, FERM BP-288) est sélectionné parmi les colonies La résistance au méthotrexate (développement relatif) de cette souche ainsi que celle de la souche parente est déterminée par la méthode décrite ci-dessus Les résultats sont indiqués dans le tableau 2 Tableau 2 Développement relatif Souche MIéthotrexate ajouté (pg/ml) 0 1 2 4 8 15 NA-1101 100 100 100 100 100 88 No 158-A-11 100 80 65 43 40 18 Ensuite, une fiole conique de 200 ml contenant ml du milieu de culture ensemencé du tableau 3 est inoculée avec une boucle de Bacillus pumilus NA-1101 développée sur une plaque d'agar nutritif (Difco) et la culture agitée est effectuée à 37 C pendant 18 heures. Une partie ( 1 ml) de la culture est transférée dans une fiole à bosselage-de 200 ml contenant 20 ml du milieu principal de fermentation indiqué dans le tableau 3 tet la culture est effectuée sur une secoueuse rotative à 37 C' pendant 4 jours La production de guanosine est de 23 mg/ml. Tableau 3 Culture ensemencée Milieu principal de fermentation Composition du milieu Concentration Composition du milieu Concentration Sorbitol 2,0 % Glucose 15,0 % Levure séchée 1,5 % Sulfate d'ammonium 2,0 % Phosphate monopotassique 0,1 % Urée 1,0 % Glutamate de sodium 1,0 % Phosphate dipotassique 0,3 % Liqueur de macération du mals 2,0 % Histidine 0,01 % Acide nucléique brut 0,2 % Chlorure de calcium 0,5 % Sulfate de magnésium 0,2 % Chlorure de potassium 0,05 % Carbonate de calcium 3,0 % Biotine 200 opg/1 Sulfate de manganese 2,5 mg/l O ro %-I- PO un N o H- Le procédé cidessus a été effectué sur un total d'environ 50 fioles pour obtenir 1 litre de bouillon Ce bouillon est réglé à p E 11 avec-de l'hydroxyde de sodium pour dissoudre les cristaux de guanosine, puis centrifuge pour éliminer les cellules Le liquide surnageant résultant est neutralisé et refroidi pour donner 21 g de cristaux bruts de guanosine Ces cristaux sont dissous dans 900 ml d'eau chaude, décolorés avec du charbon actif et laissés déposés à froid pour précipiter la guanosine 18,4 g de cristaux purs de guanosine sont obtenus La culture de la souche parente No 158-A11 dans les mêmes conditions entraîne l'accumulation de guanosine seulement avec une production de 4,5 mg/ml Exemple 2 Le Bacillus pumilus No 158-A-11 est soumis à l'irradiation aux ultraviolets et au traitement par la NTG de façon classique et comme décrit dans l'exemple let est cultivé en bandessur le milieu plat préparé en ajoutant /ug/ml d'amino-ptérine et 25 g/l d'agar au milieu A puis en sélectionnant une colonie de Bacillus pumilus NA-1102 (IFO 14185, FERM BP289) o Cette souche est cultivée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 Les productions d'inosine etde guanosine dans le bouillon sont,respectivement/ de 18 mg/ml et de 6 mg/ml. Exemple 3 Le Bacillus subtilis No 115 (souche sauvage) (IFO 14187) est soumis au traitement classique par la NTG pour obtenir un mutant NA-6001 (IFO 14188)exigeant de l'adénine. Cette souche est ensuite traitée avec la NTG trois fois pour obtenir le Bacillus subtilis NA-6011 (IFO 14189, FERM BP-291), une souche qui peut se développer sur le milieu plat préparé en ajoutant 100/lg/ml d'aminoptérine et 25 g/l d'agar au milieu A La résistance à l'aminoptérine et l'aptitude à produire l'inosine/guanosine de chacune de ces souches est déterminée par le procédé décrit dans l'exemple 1 Les résultats sont indiqués dans les tableaux 4 et 5 respectivement. Tableau 4 -Développement relatif Souche Aminoptérine ajoutée 9 Ug/ml) 0 4 8 15 30 60 NA-6001 100 100 97 95 89 52 NA-6001 100 85 75 55 22 13 Tableau 5 Accumulation de Accumulation de Souche l'inosine la guanosine NA-6011 18 mg/ml 5 mg/ml NA-6001 1 - A Le Bacillus pumilus No 158-A-11 est soumis au traitement classique par la NTG pour donner le Bacillus pumilus NA-1103 (IFO 14186, FERM BP-290), une souche de mutant capable de se développer sur le milieu plat préparé en ajoutant 10/ug/ml de triméthoprime et 25 g/1 d'agar au milieu A La résistance à la triméthoprime de cette souche est indiquée dans le tableau 6. Tableau 6 Souche Développement relatif Souche__ Triméthoprime ajoutée (g/ml) O 0,1 0,25 0,5 1,0 NA-1103 100 100 100 100 89 NA-158-A 11 100 36 17 10 7 - Quand cette souche est cultivée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, la guanosine s'accumule à raison de 22 mg/ml. Exemple 5 Le Bacillus subtilis NA-6001 (IFO 14188) est traité avec la NTG quatre fois pour obtenir le Bacillus subtilis NA 6012 (IF O 14190, FERM BP-292), unesouche de mutant capable de se développer sur le milieu plat préparé en ajoutant ug/ml de pyriméthamine et 25 g/l d'agar au milieu A - La résistance à la pyriméthamine de ce mutant est indiquée dans le tableau 7. Tableau 7 Développement relatif Souche Pyriméthamine (g/ml) O 0,5 -1,5 3,0 6,0 12 25 50 NA-6012 100 100 86 76 66 52 49 26 NA-6001 100 85 56 26 6 2 2 2 Quand ce mutant est cultivé dans les conditions de l'exemple 1, l'inosine et la guanosine s'accumulent à raisonrespectivementde 9 mg/ml et de 14 mg/ml. REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'inosine et/ou de guanosine qui consiste à cultiver une souche de mutant du genre Bacillus, qui exige de l'adénine pour se développer et qui est résistant à un antifolate et capable de produire de l'inosine et/ou de la guanosine, dans un milieu pour obliger la même souche à élaborer et accumuler de l'inosine et/ou de la guanosine dans le bouillon de culture, et à récupérer dudit bouillon l'inosine et/ou la guanosine ainsi accumulée. 2 Procédé selon par le fait que le mutan- 3 Procédé selon par le ait que le mutant 4 Procédé selon par le fait que le mutant Procédé selon par le fait que le mutani 6 Procédé selon par le fait que le mutant 7 Procédé selon par le fait que le mutant 8 Procédé selon par le fait que le mutant la revendication 1, caractérisé t est résistant au méthotrexate. la revendication 1, caractérisé est résistant à la revendication t est résistant à la revendication t est résistant à la revendication t est de l'espèce la revendication t est de l'espèce la revendication l'aminoptérine. 1, caractérisé la pyriméthamine. 1, caractérisé la triméthoprime. 1, caractérisé Bacillus pumilus. 1, caractérisé Bacillus subtilis. 1, caractérisé t est le Bacillus pumilus NA-1101 (FERM BP-288), Bacillus pumilus NA-1102 (FERM BP-289) ou le Bacillus pumilus NA-1103 (FERM BP-290). 9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le mutant est le Bacillus subtilis NA-6011 (FERM BP-291) ou le Bacillus subtilis NA-6012 (FERM BP-292). 10 Culture biolociquement pure du micro-organisme appartenant au genre Bacillus ayant les propriétés identi- fiables avec celles du FERM BP-288, FERM BP-289, FERM BP-290, FERM BP-291 ou FERM BP-292, ladite culture étant capable de produire dans un milieu de culture contenant des sources de carbone assimilables et des sources d'azote digestibles, une quantité récupérable d'inosine et/ou de guanosine. Il Micro-organisme de Bacillus pumilus NA-110 il (FERM BP-288), Bacillus pumilus NA-1102 (FERM BP-289), Bacillus subtilis NA-1103 (FERM BP-290), Bacillus subtilis NA-6011 (FERM BP-291) ou de B Sacillus subtilis NA-6012 (FERM BP-292) qui manifeste une résistance à un antifolate et est capable de produire de l'inosine et/ou de la guanosine.