Brevet FR2530818A1 — publié le 19840127

PROCEDE DE PREPARATION D'UN OLIGOPEPTIDE TERMINAL SPECIFIQUE DE L'ANTIGENE DE SURFACE D'UN GERME INFECTIEUX, DETERMINATIONDE CE GERME ET DISPOSITIF POUR SON IDENTIFICATION. La présente invention a pour objet un procéde de preparation d'un oligopeptid terminal de type Fab spécifique de l'antigène de surface dun germe infectieux Elle se rapporte également à une méthod pour la détermination de la présence d'un immunocomplexe spécifique d'un germe infectieux dans un liquide physiologique Elle se rapporte en outre à un dispositif pour I 'identification d'un immunocomplexe circulant spécifique infectieux dans un liquide physiologique. Les interactions specifiques globales entre une molécule protéique, tel un anticorps, et une substance présentant des sites actifs ayant une affinité pour la proteine, tel antigene ou haptène, sont bièn connues. Le complexe ré- sultant de ces interactions, ainsi qu'il est connu, peut être caractérisé par fixation sur un support solide de l'anticorps ou d'une molecule portant un site antigenique. La combinaison du complexe forme avec une autre molécule spécifique portant un marqueur enzymatique ou radioactif permet de mettre en évidence ou de déterminer la molécule initiale recherchée. Les procedés décrits jusqu'à présent mettant en oeuvre ces interactions, exploitent l'affinité globale entre une protéine de type anticorps et les sites antigèniques correspondants d'une molécule particulière (antigène totaux ou haptènes). L'une des molécules etant fixée chimiquement sur un support solide l'immunocomplexe forme est "revole" par combinaison avec une autre protéine, d'activité anticorps vis-à-vis du complexe, sur laquelle on a substitué un marqueur actif (enzyme ou isotope radioactif), la molecule ou le complexe à caractériser sont ainsi pris en "sandwich" entre une molécule piège fixée sur le support solide et une molécule de révélation portant le marqueur. Ce procédé général présente de nombreux inconvénients: - les complexes ainsi réalisés font intervenir des protéines totales de type anticorps, dont il est connu que leurs molécules sont constituées d'un ensemble non specifique, appele Fc, et de régions très précises, appelées Fab, correspondant aux seuls sites actifs responsables de l'in teraction spécifique avec les sites antigeniques correspondant. L'utili sation de la protéine totale dans le sandwich introduit donc nécessairemeni des risques nombreux et régulièrement constatés d'intéractions parasites entre les fractions Fc des anticorps intervenant dans le complexe et la protéine totale utilisée comme marqueur (anticorps total conjugué avec l'enzyme ou l'isotope radioactif).Cet inconvénient se trouve considéra blement renforcé dans le cas où le procédé est utilisé pour détecter un immunocomplexe soluble, qui est constitué d'une fraction anticorps pré existante. I1 s'ensuit donc de faux résultats par interactions non spe cifiques qui conduisent souvent à de fausses réactions croises. - I1 est également établi que le greffage (par voie chimique ou par simple adsorption physique) de la molécule totale utilisée comme piège ne per met pas d'éviter de très nombreuses interactions physicochimiques non specifiques entre la surface même du support solide et les protéines solubles qui doivent être complexées, ainsi que vis-à-vis des marqueurs (anticorps conjugues avec l'enzyme ou l'iostope radioactif). Ces interac tions non spécifiques du support vis- -vis à la fois des fractions solu bles à complexer et des anticorps marqueurs introduisent également de nombreuses erreurs d'interprétation dans les résultats. - Les procédés connus jusqu'alors utilisent enfin couramment des extraits non purifiés correspondant à des mélanges hétérogènes de molécules pre- sentant des interactions immunochimiques diverses, parmi lesquelles la protéine d'activité anticorps spécifique du site antigénique recherché se trouve en concentration faible et en mélange avec de nombreuses autres molecules de structures voisines apportant de grands risques de réactions croisées et d'interactions physicochimiques non spécifiques. -- Pour le diagnostic de nombreuses maladies provoquées par des germes pa thogènes infectants, la réponse immunitaire se caractérise par la pré sence dans le sérum des malades, d'immunocomplexes circulants, formes entre des- antigènes solubilises provenant des membranes du germe et des anticorps formes par la reaction de l'individu. I1 est donc important de pouvoir disposer d'un procedé rigoureusement spécifique permettant de mettre en évidence ces immunocomplexes solubles sans risques de réactions croisées ou d'interactions non specifiques. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un oligopeptide terminal de type Fab spécifique de l'antigène de surface d'un germe infectieux, suivant lequel on extrait de la membrane du germe des antigenes de surface, on purifie les antigenes par toute méthode connue, on provoque la formation d'anticorps, on hydrolyse ces anticorps par des enzymes puis isole la fraction oligopeptide terminale de type Fab. Selon une forme d'exécution de ce procédé, le germe infectieux est le Trypanosoma Cruzi. La présente invention a également pour objet une méthode de détermination de la présence d'un immunocomplexe soluble spécifique d'un germe infectant contenu dans un liquide physiologique préleve sur un malade, cette méthode consistant à traiter ledit liquide par un oligopeptide terminal de type Fab spécifique de l'antigène d'un germe infectieux déterminé, obtenu par le procédé précité, puis à isoler, fixer ou mettre en évidence le produit résultant de la réaction si le liquide physiologique précité contient l'immunocomplexe spécifique du Fab employé. De preference, l'oligogeptide terminal d.e type Fab a etc fixé préalablement sur uns proteine non spécifique du complexe (la sérumalbumine,p.e.ci-apresdésignée SAH). Selon une autre forme d'exécution de l'invention, l'oligopeptide de type Fab est préalablement fixé sur une masse réactionnelle, par exemple une toile de nylon: une plaquette à microcupule(s), etc. De préférence, dans le cas ou l'immunocomplexe fixé sur la fraction terminale Fab est présent dans le liquide physiologique, il est isolé par précipitation. Il peut également être révélé par des anti-IgG, par la fraction C1.q ducomplément, par de la protéine A ou par- un polytryptophane marquespar un enzyme-et conduisant à Une réaction colorée selon des moyens connus. Selon un mode de réalisation de l'invention, la précipitation de lrimmunocom. plexe est effectuée par réaction de Fab-SAH et d'anti-IgG marque à la peroxydase. Selon un autre mode de realisation, 1 'immunocomplexe est fixe sur du polytryptophane insolubilisé puis révélé par l'ogigopeptide terminal de type Fab marque Selon une autre variante encore, l'immunocomplexe est révélé par immunoprécipitati' en présence du mélange de l'oligopeptide terminal de type Fab et du polytryptophan marqué. L'invention a également pour objet un dispositif pour l'identification d'un germe infectieux dans un liquide physiologique consistant en un support en un matériau inerte, au moins semi-rigide et en masse réactionnelle fixée sur une, par tie au moins de ce support, ladite masse réactionnelle étant formée d'une toile de nylon ou d'une plaquette à microcupules sur laquelle est immobilisé par un procédé connu l'oligopeptide terminal de type Fab spécifique de l'antigène de surface d'un germe infectieux. D'autres buts et avantages de l'invention apparaitront à la lecture de la description suivante donnée à titre non limitatif. En fait, sont décrits ci-dessous differentes variante permettant de résoudr le problème exposé. Selon une premiere variante de l'invention, l'immunocomplexe à mettre en évidence réagit par sa partie antigénique avec 1 'oligopeptide terminal de type Fab, prépare par dégradation enzymatique récurrente d'un anticorps spécifique obtenu par des moyens immunologiques connus, à partir d'un antigène ou d'un déterminant haptênique caractéristique du germe infectant, extrait à partir de la membrane dudit germe. Les caractéristiques Smnunologiques de la fraction antigénique de membrane sont identiques à celle de l'antigène circulant présent dans l'immunocomplexe.L'oligopeptide terminal de type Fab peut indifféremment être conjugue chimiquement, par des moyens connus, avec une molécule non antigénique, qu'elle soit solide ou soluble; on peut en particulier greffer le peptide terminal de type Fab par les fonctions carboxyliques libres sur une protéine homologue des proteines du sérum dans lequel se trouve l'immunocomplexe à déterminer.Dans le cas d'un sérum humain, par exemple, on utilise avantageusement un greffage avec la sérum albumine humaine (SAH); le complexe Fab-SAH pourra alors, à l'aide de moyens connus, soit être fixé par covalence sur de nombreux types connus de support solide, soit être réticulé entre les résidus de SAH à l'aide d'agents bifonctionnels connus, comme par exemple le glutaraldéhyde, pour former un revêtement actif non antigenique sur un support solide, de quelque type que ce soit. L'immunocomplexe pourra alors se fixer-sur le support solide ainsi activé, grace à une interaction rigoureusement spécifique entre sa partie anti géni que et les fractions Fab, à l'exclusion de toute autre interaction non spécifique. Selon une autre variante de l'invention > 1 'oligopeptide terminal de type Fab peut etre conjugue par l'intermediaire de ses fonctions carboxyliques avec une molécule marquée (enzyme ou isotope radioactif); l'immunocomplexe pourra ainsi être révélé par le marquage rigoureusement spécifique de sa fraction antigénique; la fraction Fab marquée sera alors utilisée en phase soluble, pour l'identification spéci- fique de 1 'immunocomplexe soluble. Selon encore une autre variante de l'invention, on peut également utiliser avantageusement une forme soluble du type Fab-SAx, pour réaliser une combinaison spécifique en.phase soluble à l'aide d'une sérum albumine d'une espèce differente X de celle du sérum contenant l'immunocomplexe (sérum albumine de lapin, par exemple, pour un immunocomplexe d'origine humaine). Par une voie immunoprépa rative,à l'aide de supports substitués par des anticorps anti-SAx, on pourra ainsi isoler spécifiquement 1 'immunocomplexe circulant, permettant avantageusement l'obtention d'anticorps spécifique à une échelle préparative. L'utilisation, selon les variantes ci-dessus, des fractions Fab obtenues 5 partir des sites antigéniques de membrane permet d'éliminer les risques d'interactions non spécifiques (aussi bien celles des supports que celles des fragments Fc de l'anticorps total) et d'accroître l'activité et la sensibilité en augmentant de façon importante la densité des sites spécifiques accessibles. Les expérimentations démontrent, par ailleurs, qu'il est nécessaire de greffer la fraction Fab par les fonctions carboxyliques accessibles, afin de laisser les groupements aminés libres; cette condition est nécessaire pour préserver les interactions spécifiques entre la fraction Fab et la partie antigénique de 1 'immunocomplexe. De façon combinée avec les variantes précédemment décrites, l'immunocomplexe à mettre en évidence peut réagi-r par sa partie anticorps, avec différents types de molécules qui pourront avantageusement être utilisées selon les différentes variantes de l'invention. On pourra ainsi réaliser une interaction globale entre la fraction anticorps de l'imiuunocomplexe et les anti-lg G du sérum correspondant, les anti-Ig G pouvant indifféremment être fixés sur un support ou être conjugués avec des molécules solubles ou des marqueurs (enzymatiques ou radioactifs). En relation avec les points particuliers précisés dans les variantes ci-dessus, la combinaison des anti-Ig G avec la fraction anticorps de l'immunocomplexe supprime les risques d'interactions non spécifiques qui auraient pQ intervenir sur les fractions Fc qui sont absentes du côté antigenique du fait de 1 'utili- sation de l'oligopeptide de type Fab. Dans une autre variante, on peut avantageusement utiliser la fraction Ci.q du complément qui se combine sélectivement avec les anticorps engagés dans l'immunocomplexe; ladite fraction Ci.q pourra être mise en-oeuvre selon les cas, soit sous forme soluble, conjuguée ou non avec un marqueur (enzymatique ou radioactif), soit sous forme fixee sur un support solide ou une macromolécule de quelque nature qu'elle soit. Dans une autre variante encore, les éléments décrits dans les variantes cidessus rendent possible sans risque d'interactions parasites non spécifiques du côte antigénique, la reconnaissance directe de la fraction anticorps de l'immunocomplexe par une molécule du type de la protéine A (fixée sur un support ou conjuguée avec An marqueur enzymatique ou radioactif), de telles molécules étant capables de se combiner avec les Ig G, engagés ou non dans un immunocomplexe (Ig G = immunoglobuline G). Selon encore une autre variante, il a été établi expérimentalement dans le cadre de l'invention que l'interaction spécifique par un fragment Fab telle qu'ell-e est decrite dans les variantes ci-dessus pour le côté antigénique de l'immunocomplexe, rend possible tres avantageusement sans risques d'interactio non spécifiques parasites, la combinaison spécifique de la partie anticorps de l'immunocomplexe avec un polypeptide de synthèse présentant des enchaîne- ments d'acides amines aromatiques et, plus particulièrement, d'enchaînements polytryptophane. Les expérimentations ont, en effets démontré que des enchaine- ments peptidiques polyaromatiques présentent des interactions sélectives du type transfert de charges avec les Ig G, engagées ou non dans un immunocomplexe. En association avec les variantes décrites ci-dessus, 1 'immunocomplexe peut donc être combiné avantageusement avec un peptide de synthèse polyaromatique, en particulier, riche en polytryptophane, qu'il soit greffé sur un support ou employé sous forme soluble conjuguée avec un marqueur enzymatique ou radioactif. En fait, l'invention fournit donc des moyens à employer en association qui permettent l'isolement ou la mise en évidence et la détermination rigoureusement spécifique d'un immunocomplexe antigène-anticorps grâce à une double reconnaissance éliminant les risques d'interactions parasites. On utilise, pour la partie antigenique du complexe, un oligopeptide de type Fab préparé à partir des anticorps spécifiques des si tes antioeniques de surface, caractéristiques du germe infectant; l'oligopeptide Fab est conjugue avec une molécule non anti génique qui peut, indifféremment, être déposée en revêtement ou être greffée sur un support solide, ou encore être utilisé sous forme soluble, conjuguée ou non avec un marqueur.L'absence de fragments non specifiques de type rc sur la partie antigénique du complexe permet de reconnaitre la partie anticorps dudit complexe sans risques d'interactions parasites, en utilisant (sous forme greffée sur un support solide, ou sous forme soluble conjuguée ou non avec un marqueur) soit des anti Ig G, soit des fractions Ci.q du complément (carac éristique des anticorps complexés) soit des fractions de type protéine AX soit des polypeptides de synthese, riches en enchaînements polytryptophane. Différentes variantes du procédé permettent des utilisations soit pour l'identification et le dosage d'immunsérum circulants provoqués par des germes infectants (diagnostic) soit pour l'isolement à des fins preparatives des immunocomplexes (fabrication de vaccins ou d'hyperimmunosérums). On peut en fait considérer que l'invention décrit les moyens permettant de réaliser la mise en évidence et la détermination d'un immunocomplexe par une double reconnaissapce rigoureusement spécifique qui porte d'une part sur la partie antigénique ét, d'autre part, sur la partie anticorps du complexe, en excluant l'utilisation de protéines totales d'activité anticorps.Le procédé se caractérise par la mise en oeuvre sous différentes formes d'une fraction peptidique préparée à partir d'anticorps spécifiques du site antigénique des membranes du germe infectant (reconnaissance de la partie antigène circulant de l'immunocomplexe) et de molécules reconnaissant spécifiquement la fraction complexée de l'anticorps soluble, en excluant les interactions non specifiques avec les supports solides éventuels ou avec l'anticorps complexant la partie antigénique de 1 'immunocomplexe. A titre d'exemple et sans qu'en aucun cas cela puisse être considéré comme limitatif, on décrira ci-dessous différentes variantes du procédé appliqué pour le cas des immunocomplexes spécifiques du Trypanosoma Cruzi, agent pathogène de la maladie de Chagas. EXEMPLE 1. Préparation de la fraction Fab, spécifique de la partie antigénique de l immunocomplexe soluble présent dans les sérums de patients affectés de La maladie de Chagas: La fraction Fab est préparée à partir d'anticorps obtenus par l'immunisatior de chèvres à l'aide d'injections de préparations d'extraits antigéniques, obtenue à partir de membranes de Trypanosoma Cruzi. La succession des opérations est la suivante: 1.1. Production de Biomasse de Trypanosoma Cruzi et extraction des sites antigéniques de membrane. Des cultures en masse de T. Cruzi, souche Tehuantepec, sont réalises sur milieu GLSH, par une transposition des conditions préalablement décrites par AFCHAIN et al (J. of Parasitology, 1979, 65, 507). Les cellules sont lavées en solution de Hanks Wallace, puis désintégrées par passage entre -25 et -30 > C amans une X - Press (appareil fabriqué par la société suédoise A.B. Biose à Járfalla, 'es cellules passent à l'état congelé, sous forte pression, à travers un trou -d'environ 1 mm de diamètre) fonction nant sous 1960 bars.Les membranes sont récupérées par centrifuga tion à 20000 g et les membranes sont solubilisées par le diisosali cylate de lithium (LIS) dans les conditions décrites par MARCHESI et ANDREWS (Science9 1971, 174, 1247). L'extrait soluble des membranes est fractionné dans les conditions décrites par BOT et al (cf.Affinity Chromatography, J.M. EGLY ed, INSERM, 1979, 86, 63); après extraction phénolique et gel filtration sur Sephadex G. 25, on obtient une fraction glycoprotéidique totale, dénommée .T. Une chromatographie d'affinité sur PNA (lectine des la cacahuète) fixé Sepharose permet d'isoler, par solution avec le galactose une fraction majeure glycopeptidique de comportement cathodique denommée MCA (Major Cathodic Antigen). Les caractéristiques moléculaires et immunologiques de cette fraction montrent qu'elle correspond à un glycopeptide antigenique de membrane spécifique des trypanosomes ricains et ne présentant pas de réactions croisées avec les antigènes de plusieurs Leishmanioses et due Trypanosomiases africaines.Les tests immunochimiques conduisent enfin à des identités réactionnelle entre le site antigenique de membrane et les antigènes circulants présents dans les sérums de patients atteints de la maladie de Chaga 1.2. Préparation d anti-MCA. Les extraits MCA sont injectes à des chevres par voie- intramusculair en quatre injections hebdomadaires successives. Les teneurs maximales en anticorps sont obtenus après 8 à 10 semainE Les anticorps sont homogènes vis-à-vis de la fraction MCA;Ellesréagissent spécifiquement avec les immunocomplexes solubles presents dans les sérums de patients atteints de la maladie de Chagas et ne donnent pas de réactions croisées avec les extraits antigéniques totaux de T. Rangeli, T. Dionisii, T. Gambiense, T. Brunet, L-. Donovani et L. Braziliensis. 1.3. Preparation d oligopeptide de type Fab-SAH à partir d-anti-MCA. Des solutions d'anti-MCA, ajustées à des teneurs en protéines de l'ordre de 370, sont soumises à une première hydrolyse partiel le par la papaïne, des 90 mon à 37"C; l'hydrolysat est passé sur Séphadex G.25 et la fraction macromoléculaire exclue est soumise à plusieurs hydrolyses successives identiques jusqu'à épuisement de la fraction macromoléculaire exclue.Les trois fractions recueillies par gel filtration sur Séphadex G.25 sont rassemblées -et soumises à une nouvelle hydrolyse ménagée de 15 mn à 250C par la Trypsine dans un rapport enzyme-substrat de l'ordure de 1/5.et On isole les fractions peptidiques par passage sur Sephadex G.10, les fractions exclues étant epuisees comme précédemment par de nouvel les hydrolyses successives. Le mélange des fractions peptidiques isolées par gel filtration est passé sur une colonne de Sephadex G.25-MCA ou sur une colonne contenant des membranes de T. Cruzi (préparées comme au 1.1.) réticulées par le glutaraldéhyde selon le principe de LAWNY et al (cf. "Affinity Chromatography, HOFFMAN-OSTENHOF éd., Pergamon Press, N.Y., 1978, p. 299). On isole la fraction peptidique spécifique ment retenue sur la colonne, qui correspond à l'extrait peptidique de type Fab. L'oligopeptide de type Fab,d'un poids moléculaire moyen compris entre 2000 et 5000, se combine spécifiquement avec la fraction MCA ou l'extrait GT décrit au 1.1. L'extrait est acétyle par la méthode classique de N-acetylation; le peptide Fab N-acétyle est classique ment condensé par ses fonctions carboxyliques avec la serum albumine humaine et l'on obtient, après désacetylation le complexe Fab-SAH par plusieurs précipitations éthanoliques à froid, à partir des conditions classiques de COHN.On verifie les interactions spécifiques de la fraction Fab-SAH vis-à-vis des sites antigéniques de membranes (à l'aide de dérivés fluorescents), vis-à-vis des extraits GT et MCA (à l'aide de Fab-SAH marqués à la peroxydase, contre des extraits GT et MCA immobilisés sur des toiles de nylon 6.6! et vis- -vis des immunocomplexes circulants, par des immunoélectrophorèses classiques. Une fraction Fab-SAH prépare dans les mêmes conditions, sans une N-acétylation préalable de l'extrait Fab, ne présente aucune interaction spécifique avec les fractions antigéniques correspondantes. EXEMPLE 2. Mise en évidence et détermination spécifique d immunocomplexes circu liants à laide de plaquettes à revêtements de type Fab-SAH. Des plaquettes à microcupules, du modèle classiquement employé pour les microtitrations en hématologies sont utilisées pour une des variantes de mise en oeuvre du procédé. On introduit dans le fond de chaque microcupule 5Q microlitres d'une solution de Fab-SAH, additionnée de 0,3% de glutaraldehyde comme agent de rétîculation; les plaquettes sont placées horizontalement sur un plateau animé d'un mouvement rotatif9 on laisse sécher spontanément sous agitation pour former un revêtement en film mince sous l'action de la réticulation. Des cupules temoins sont réalisées à partir de SAH pure. On peut avantageusement ajouter de la gélatine chaulée à la solution de Fab-SAH, à une concentration comprise entre 5 et 10 g pour 100 ml. On introduit dans les cupules des dilutions d'extraits GT, d'extraits MCA et de sérums de patients atteints de la maladie de Chagas. Après 10 à 15 mn d'incubation, on élimine les solutions à tester, on lave par un tampon classique et on ajoute.des solutions d'anti GT marqués à la péroxydase pour les extraits GT et,MCB et d'anti Ig G humaines marquées à la péroxydase pour les sérums chagasiques. Les révelations-colorees classiques permettant de vérifier les déterminations et les témoins SAH pure ne montrent aucune adsorption non spécifique.Des tests comparatifs à partir de différentes dilutions de sérums chagasiques, utilisant des Anti Ig humaines marquées à la péroxydasea des fractions Ci.q marquées à la péroxydase, des extraits de protéine A marqués à la péroxydase ou des polytryptophanes marqués à la péroxydase montrent, après coloration, des corrélations strictes entre les différents tests. EXEMPLE 3. Caractérisation de l immunocomplexe spécifique de T. Cruzi par fixation sur des toiles de nylon substituées par du poLytryptophane, par le Ca ou par la protéine A et par révélation à L aide d Ig G spécifique du site antigénique de membrane. Sur une toile de nylon 6.6, on greffe de façon covalente à l'aide de moyens connus (dicyano-1,6-hexane, carbodiitnides, etc.) du polytryptophane, une prëparation de fraction C1.q ou de protéine A. La toile de nylon est formée d'un fil de 40 de diamètre; elle présente un pourcentage de vide de 30% et con- porte 100 fils au centimètre linéaire, l'épaisseur du tissu étant de 70 .Après lavage et séchage, la toile peut être conditionnée pour être indifféremment utilisée soit sous forne de pastilles ou de disques à introduire dans des tubes réactionnels, soit sous forme de bandelettes montées par thermosoudage sur des supports unitaires utilisables par trempage ou sur des plaquettes comportant des cupules reactionnelles. La toile réactionnelle est mise au contact du sérum à tester; après 10 à 15 mn de contact, on effectue trois lavages successifs. L'irnnunocomplexe, foxé sur la toile de nylon par son extrémité anticorps, est ensuite révélé spécifiquement à l'aide d'anti-MCA, ou d'oligopeptide de type Fab-SAH, préparé dans les conditions décrites à l'exemple l (1.1. et 1.2.) et conjugue avec de la péroxydase. EXEMPLE 4. Révélation directe de l'immunocomplexe par immunoprécipitation en pré sence d'un mélange d oligopeptide de type Fab-SAH et d'Anti-Ig G marqué à la péroxydase. Pour des dilutions du sérum à tester placées dans des tubes à hémolyse, on introduit directement un mélange en solution d'oligopeptide de type Fab-SAH préparé dans les conditions de l'exemple 1 et d'anti-Ig G humaine, marqué à la péroxydase Les tubes sont incubés sur plateau vibrant pendant 10 mn à la température ordinaire. Cn centrifuge 15 mn à 2000g et on lave plusieurs fois le préci- pite par de l'eau physiologique. On révèle ensuite classiquement l'immunocomplexe marque à la péroxydase. Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés; elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans que l'on ne s'écarte de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1.- Procéde de préparation d'un oligopeptide terminal de type Fab spécifique de l'antigène de surface d'un germe infectieux, caractérisé en ce qu'on extrait de la membrane du germe des antigènes de surface, on purifie les antigènes par toute méthode connue, on provoque la formation d'anticorps, on hydrolyse ces anticorps par des enzymes puis on isole la fraction oligopeptide de type Fab. 2.- Procéde selon la revendication 1, caracterisë en ce que le germe infectieux est le Trypanosoma Cruzi. 3.- Méthode de détermination de la présence d'un immunocomplexe spécifique d'un germe infectieux, solubilise dans un liquide physiologique prélevé sur un malade, cette méthode étant caractérisée en ce que l'on traite ledit liquide par un oligopeptide terminal de type Fab spécifique de l'antigène d'un germe infectieux determiné, puis en ce qu'on isole, fixe ou met en évidence le produit résultant de la réaction, si le liquide physiologique précité contient l'immunocomplexe ses cifique du Fab employe. 4.- Methode selon la revendication 39 caractérisée en ce que l'oligopeptide terminal de type Fab a été, fixé préalablement sur une protéine non spécifique du complexe. 5.- Méthode selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que l'oligo- peptide de type Fab est préalablement fixé sur une masse réactionnelle, par exemple une toile de nylon, une plaquette à microcupule(s) 6.- Méthode selon une quelconque des revendications 3 à 5 > caracterisee en ce que l'immunocomplexe fixé sur la fraction terminale Fab est isolé par précipi- tation. 7.- Méthode selon une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que l'immunocomplexe fixe sur la fraction terminale Fab es-t révélé par des anti-IgG marqué par un enzyme. 8.- Methode selon une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que l'immunocomplexe fixé sur la fraction terminale Fab est révélé par la fraction C1.q du complément marque par un enzyme. 9.- Méthode selon une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que l'immunocomplexe fixé sur la fraction terminale Fab est révélé par de la protéine A marque par un enzyme. 10.- Methode selon une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que l'inmunocomplexe fixé sur la fraction terminale Fab est révélé par un polytryptophane. 11.- Methode selon une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que l'immunocomplexe fixe sur la fraction terminale Fab est révélé par immuno précipitatiwn en presence du mélange de l'oligopeptide terminal de type Fab et du polytryptophane marque 12.- Procedé selon une quelconque des revendication 3 à 6, caractérisé en ce que l'immunocomplexe est fixé sur du polytryptophane insolubilisé puis révélé par l'oligopeptide terminal de type Fab marqué. 13.- Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la precipita- tion de l'immunocomplexe est effectuée par réaction du Fab-SAH et d'anti-IgG marqué à la péroxydase. 14.- Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'immunocomplexe à mettre en évidence reagit par sa partie antigénique avec l'oligopeptide terminal de type Fab, préparé par degradation enzymatique récurrente d'un anticorps spécifique obtenu, par des moyens immunologiques connus, à partir d'un antigène ou d'un determinant hapténique caractéristique du germe infectant, extrait à partir de la membrane dudit germe. 15.- Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'oligopeptide terminal de type Fab peut être conjugué chimiquement, par des moyens connus, avec une molecule non antigénique, qu'elle soit solide ou soluble. 16.- Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que ltolisopeptide terminal de type Fab est greffé par les fonctions carboxyliques libres sur une protéine homologue des protéines du sérum dans lequel se trouve l'immunocomplexe à déterminer. 17.- Methode selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'oligopeptide de type Fab peut être conjugue par l'intermédiaire de ses fonctions carboxyliques avec une molécule marquée, enzyme ou isotope radioactif, de sorte que l'immunocomplexe soit revélé par le marquage rigoureusement spécifique de sa fraction an tigénique, la fraction Fab marquée etant utilise en phase soluble, pour l'iden tification spécifique de 1 'immunocomplexe soluble. 18.- Méthode selon la revendication 3 ou 8, caractérisée en ce qu'on utilise la fraction C1.q du complément qui se combine sélectivement avec les anticorps engagés dans l'immunocomplexe, ladite fraction C1.q étant mise en oeuvre selon les cas, soit sous forme soluble, conjuguée ou non avec un marqueur (enzymatique ou radioactif), soit sous forme fixée sur un support solide ou une macromolécule de quelque nature qu'elle soit. 19.- Procedé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'oligo- peptide terminal du type Fab est préparé à partir des -anticorps obtenus par immunisation de chèvres à l'aide d'un glycopeptide spécifique du germe infectant extrait de la membrane dudit germe par solubilisation, protéolyse t chromatographie d'affinité. 20.- Dispositif pour l'identification d'un immunocomplexe circulant spécifique d'un germe infectieux dans un liquide physiologique consistant en un support en un matériau inerte, au moins semi-rigide et une masse réactionnelle fixée sur une partie au moins de ce support, Support, ladite masse réactionnelle étant formée d'une toile de nylon ou d'une plaquette à microcupules sur laquelle est immobilisé par un procédé, connu l'oligopeptide terminal de type Fab spécifique de l'antigène de surface d'un germe infectieux, obtenu selon le p-rocédé des revendications 1 ou 2.