Brevet FR2527445A1 — publié le 19831202

Médicaments contenant au moins, une séquence de la sous unité Bide la toxine cholérique. La présente invention concerne un médicament contenant au moins une séquence de la sous unité Bl de la toxine cholérique. On sait que la toxine cholérique est constituée de deux sous unités A et B, B étant ellemême constituée de 5 sous unités dites B 1 On sait également que, lors de l'action de la toxine cholérique, ladite sous unité B joue le rôle de frag- ment de fixation de la toxine sur les membranes des cellules et que l'unité A -agit sur cette cellule pour y exercer une action nocive. On a déjà tenté de fractionner la toxine cholérique en ses deux sous unités mais cette opération est délicate et coûteuse Cependant elle a permis de mettre en évidence le fait que, dans le mécanisme de fixation de la toxine sur les parois des cellules, les arginines en 35, 67 et 73 de la sous unités Bl sem- blaient jouer, du fait de leur existence et de leur environnement, un rôle très important. Il a été trouvé et c'est là l'objet de la présente invention, que les médicaments contenant, comme principe actif, au moins une séquence de la sous unité Bl de la toxine cholérique contenant au moins une arginine en 35, 67 ou 73 avaient une effica- cité certaine contre l'infection de l'organisme par tout microorga- nisme sensible Selon l'invention on appelle "séquence de la sous- unité Bl de la toxine cholérique "l une suite d'acides aminés repro- duisant la suite des acides aminés rencontrés dans ladite toxine cholérique Compte tenu du rôle spécifique que l'on est amené à attribuer à l'arginine en 35, 67 ou 73 de ladite suite, ladite séquence doit reproduire aussi exactement que possible la configura- tion dans la suite des acides aminés que l'on rencontre, dans la sous unité B 1 de la toxine cholérique, au voisinage immédiat de ces arginines On peut admettre que pour les acides aminés situés assez loin, dans la chaine, desdites arginines certaines modifications, par exemple remplacement d'un acide aminé par un acide aminé considéré comme équivalent ou modification (par exemple estérification) des fonctions latérales des acides aminés, sont concevables. Il convient, selon l'invention, que la séquence utilisée soit suffisamment longue pourqu'elle reproduise les propriétés de fixation de la sous unité Bl mais cependant qu'elle soit suffisamment courte pour pouvoir être synthétisée dans des conditions acceptables Ainsi si l'on peut utiliser une séquence d'acides aminés correspondant à la séquence 20- 75 de la sous unité B 1, il peut être préférable d'utiliser une séquence - 50 ou une séquence 50-75 de cette sous unité On peut également employer simultanément, dans le même médicament, ces deux séquences. Les séquences préférées utilisables selon l'invention sont donc les suivantes: séquence 30-50. H 2 N Ser-Leu-Ala-Gly-Lys-Arg-Glu-Met-Ala-Ile-Ile-Thr-Phe-Lys-Asn- 35 40 Gly Ala-Thr-Phe-Glu-Val-COOH 50 et séquence 50-75 H 2 N Val-Glu-Val-Pro-Gly-Ser-Gln-His-Ile-Asp-Ser-Gln-Lys-Lys-Ala-Ile - 50 55 60 65 Glu-Arg-Met-Lys-Asn-Thr-Leu-Arg-Ile-Ala-COOH 75 On a pu montrer que le r 6 le de ces principes actifs était d'une part, en se fixant sur certaines cellules, de pouvoir entrer en compétition avec les autres molécules nocives qui présentent un mode de fixation voisin et d'éviter ladite fixation de ces molécu- les nocives et d'autre part, de provoquer la sécrétion de certains anticorps bloquants Le médicament selon l'invention sera donc actif vis-àvls de tout microorganisme dont l'action peut être combattue par l'un ou l'autre de ces mécanismes Il a été ttouvé notamment que de fagon tout à fait naturelle le médicament selon l'invention était utilisable comme médicament curatif ou, de préférence, comme vaccin pour la protection contre le choléra et contre les infections animales ou humaines provenant de l'action d'Echerischia Coli (entérotoxine LT). Le médicament peut être utilisé par voie orale, intrapéritonéale sous cutanée ou intraveineuse Dans le cas d'un vaccin le nombre total des acides aminés de la séquence sera de préférence de l'ordre de 15 à 20 unités lorsque le peptide est injecté sans porteur naturel ou synthétique d'immuni- sation. Les 6 quences selon l'invention ne sont pas toxiques aux doses normales puisque des souris ont pu recevoir sans présenter des signes graves des doses d'environ 100 microgrammes de produit actif par animal et que des lapins ont pu recevoir avec les mêmes résultats 1 milligramme, par animal, de principe actif. Les essais pharmacologiques laissent à penser que les médicaments selon l'invention devraient contenir, par prise unitaire, de 50 à 500 mg de principe actif pour un médicament et de 1 à 10 mg de principe actif pour un vaccin. Les exemples non limitatifs suivants illustrent l'invention. Exemple 1 Principe de synthèse des séquences selon l'invention On ne donne que les principes généraux de la synthè- se utilisée puisqu'il s'agit d'une application de méthode connue de synthèse des peptides. 1 Support solide. Pour obtenir les peptides sous forme de carboxy-terminal libre la chlorométhyle résine a été choisie. 2 Protection des fonctions des acides aminés. La fonction o( aminée est protdgee par le tertiobutyloxycarbonyle les fonctions latérales sont protégées par les groupes suivants: Nitro pour le guanidyle de l'Arginine, Ester benzylique pour les et y carboxyles des acides aspartique et glutamique, 2-chlorocarbo- benzoxy pour l' -amine de la Lysine, benzyl-éther pour les hydroxyles de la Serine et de la Thrdonine. 3 Agent de couplage. Chacun des acides aminés est couplé avec un mélange équimolécu- laire de dicyclohexylcarbodiimide et de l-hydroxybenzotriazole. La totalité du couplage est contrôlée par untest à la ninhydrine. 4 Coupure du peptide. A la fin de la synthèse le peptide est coupé du polymère par action de l'acide fluorhydrique liquide. Purification Les peptides sont purifés par filtration sur gel La purification est affinée par chromatographie échangeuse d'ions à l'aide d'un gradient de conductivité. 6 Q Contr 8 le de pureté. Elle est effectuée par analyse d'acides aminés après hydrolyse acide et par électrophorèse en milieu sodium dodécylsulfate sur gel de polyacrylamide. Exemple 2 Pour tester les produits synthétisés (séquences -50 et 50-75) on a réalisé les essais suivants: 1 Fixation sur les érythrocytes d'homme et de rat. La liaison des fragments 3 p-50, 50-75 et de trois peptides témoins radioactifs a été testée sur les globules rouges La mesure de la radioactivité libre dans le surnageant ou fixée sur les globules rouges a révélé que seul le fragment 30-50 se fixe de façon significative. 2 Compétition de fixation avec la toxine totale sur les souches (cellules de tumeur surrénales de souris). Le fragment 30-50 utilisé à raison de 10-6 moles inhibe totalement la production de corticoides induites par l'action de la toxine cholérique ( 10-9 molaire) sur ces cellules. 3 Propriétés antigéniques. La séquence 50-75 injectée par voie sous-cutanée à des lapins sans adjuvant ni porteur a entrainé rapidement la production d'anticorps qui procurent au sérum un pouvoir vibriolytique jusqu'à une dilution de 1/360 Cette même séquence injectée 3 fois à 4 jours de distance par voie intrapéritonéale ou buccale à des souris a induit des anticorps reconnaissant la toxine cholérique jusqu'à une dilution supérieure au 1/2000 (test ELISA) Le pouvoir vibrio- lytique des sérums des souris persiste jusqu'au 1/3000 chez les animaux immunisés par voie buccale et jusqu'au 1/6000 chez ceux immunisés par voie intrapéritonéale Tous les animaux immunisés possèdent une bonne protection contre l'action du vibrion cholérique toxinogène et contre la toxine cholérique dans l'épreuve de l'anse ligaturée. REVENDI CATIOMNS 1 Médicaments caractérisés en ce qu'ils comportent au moins une séquence de la sous unité B 1 de la toxine cholérique, ladite séquence comportant au moins une arginine en 35,67 ou 73 de ladite sous unité. 2 Médicaments selon la revendication 1, caractérisés en ce que ladite séquence est choisie parmi les séquences 30-50 et 50-75 de ladite sous unité. 3 Médicaments selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisés en ce qu'ils contiennent de 50 à 500 mg de ladite séquence.