Brevet FR2526443A1 — publié le 19831110

La présente invention concerne un activateur de plasminogène humain correspondant à celui que l'on ren- contre dans le sérum et/ou dans des tissus humains, et des formes et des compositions nouvelles de cet activateur et notamment des moyens et des procédés permettant sa produc- tion jusqu'à l'obtention d'un état homogène en quantités importantes du point de vue thérapeutique. La présente invention provient en partie de la découverte de la séquence d'ADN et de la séquence déduite d'amino-acides de l'activateur du plasminogène humain Cette découverte a permis la production d'un activateur de plasminogène humain par l'application de la technologie de recombinaison de l'ADN, ce qui a permis à son tour de produire une matière de qualité et en quan- tité suffisantes pour entreprendre et effectuer des essais portant sur des animaux et des essais cliniques en tant que conditions préalables à l'approbation en vue de la vente, sans empêchement créé par les restrictions néces- sairement inhérentes aux procédés d'isolement 4 tilisés jusqu'à présent, impliquant la production et l'extraction à partir d'une culture cellulaire existante La présente invention est axée sur ces formes de réalisation associées, sous tous leurs aspects. Les publications et les autres documents utili- sés pour éclairer le fond de l'invention, et dans des cas particuliers, pour apporter d'autres détails concernant sa mise en pratique, sont incorporés ici à titre biblio- graphique et, par commodité, on les a affectés de réfé- rences numériques dans la description qui suit et on les a groupés en fin de description sous le titre " biblio- graphie'. A Activateur de plasminogène de tissu humain Le système fibrinolytique est en équilibre dyna- mique avec le système de coagulation, maintenant une couche vasculaire intacte et inobstruée Le système de coagulation dépose de la fibrine formant une matrice qui sert à réta- blir un état hémostatique Le système fibrinolytique élimine le réseau de fibrine une fois que l'état hémostatique est réalisé Le processus fibrinolytique est mis en action par l'enzyme protéolytique appelé plasmine qui est engendré par un précurseur protéinique plasmatique appelé plasmino- gène Le plasminogène est converti en piasmine par acti- vation sous l'effet d'un activateur. On trouve habituellement dans le commerce deux activateurs appelés streptokinase et urokinase Tous deux sont indiqués pour le traitement de troubles vasculaires aigus tels que l'infarctus du myocarde, l'attaque cardia- que, l'embolie pulmonaire, la thrombose des veines pro- fondes, l'occlusion artérielle périphérique et d'autres thromboses veineuses Ces maladies sont tenues collective- -ment pour responsables des principaux dangers pour la santé. La base étiologique sur laquelle reposent ces maladies amène à penser à une occlusion partielle ou, dans des cas graves, à une occlusion totale d'un vaisseau san- guin par un caillot de sang thrombus ou thromboembolus. Le traitement traditionnel avec des anticoagulants tels que l'héparine et'la coumarine ne fait rien pour favoriser directement la dissolution de thrombi ou de thromboemboli. Les agents thrombolytiques mentionnés ci-dessus tels que streptokinase et urokinase ont fait l'objet d'une utili- sation pratique et efficace Toutefois, chacun présente de graves inconvénients Aucun d'eux n'a une grande affi- nité pour la fibrine; en conséquence, tous deux activent le plasminogène en circulation et le plasminogène lié à la fibrine, de façon relativement dépourvue de discrimina- tion La plasmine formée dans le sang en circulation est neutralisée plutôt rapidement et est perdue pour une thrombolyse utile La plasmine résiduelle dégrade plusieurs protéines facteurs de coagulation, par exemple le fibrino- gène, le facteur V et le facteur VIII en créant un risque d'hémorragie En outre, la streptokinase est fortement antigénique, et des patients présentant des titres d'anti- corps élevés répondent inefficacement au traitement et ne peuvent pas rester sous traitement continu Un traitement par l'urokinase est coûteux, du fait que cet enzyme doit être isolé de l'urine humaine ou d'une culture de tissu humain et ce traitement n'est donc généralement pas admis dans la pratique clinique L'urokinase a fait l'objet de nombreuses recherches (voir, par exemple, les références 1-6). Des substances appelées activateurs de plasmino- gène ont été isolées de divers tissus humains, par exemple le tissu de l'utérus, le sang, le sérum voir d'une façon générale les références 7-11 et d'une culture cellulaire (référence 94) Des compositions de ces activateurs ont également été décrites voir références 12, 13 Voir également références 14-18 Les activateurs de plasmino- gène provenant de ces sources ont été divisés en deux groupes principaux: activateurs de plasminogène du type urokinase (u-PA) et activateurs de plasminogène du type tissulaire (t-PA) sur la base de différences résidant dans leurs propriétés immunologiques (Les abréviations t-PA et u- PA sont celles qui ont été proposées lors du 28 ème Congrès du Comité International d'Etude de la thrombose et de l'hémostase, qui s'est tenu à Bergame en Italie le 27 Juillet 1982). Récemment, on a identifié une lignée de mélanome humain qui sécrète du tPA La caractérisation de cet activateur de plasminogène de mélanome a montré qu'on pouvait le distinguer tant sur le plan immunologique que sur celui de la composition des amino-acides, de l'acti- vateur de plasminogène isolé d'un tissu humain normal (références 19, 88). Le produit a été isolé sous une forme relative- ment pure, il a été caractérisé et s'est révélé être un agent fibrinolytique de haute activité ( 20). Plusieurs études (voir, par exemple, les réfé- rences 95 à 98) dans lesquelles il a été fait usage d'un t-PA purifé provenant d'une lignée de cellules de mélanome, ont démontré sa très grande affinité pour la fibrine, com- parativement à des activateurs de plasminogène du type urokinase Toutefois, une étude plus poussée du t-PA humain, en tant qu'agent thrombolytique potentiel, a été gênée par sa concentration extrêmement faible dans le sang, dans des extraits de tissus, dans des produits de perfusion vascu- laire et dans des cultures cellulaires. On s'est rendu compte que l'application de la technologie de recombinaison de l'ADN et de technologies annexes constituerait un moyen très efficace d'obtention des grandes quantités désirées d'activateur de plasmino- gène de type tissulaire humain de haute qualité (précédem- ment appelé activateur de plasminogène humain), essen- tiellement dépourvu d'autre protéine humaine De telles matières posséderaient vraisemblablement une bio-activité permettant leur utilisation clinique dans le traitement de divers états ou divers troubles cardiovasculaires. Le t-PA humain est produit en quantités satis- faisantes par des cultures cellulaires; toutefois, des perfectionnements apportés en utilisant une séquence de codage secondaire permettent d'améliorer encore davantage les niveaux de production La séquence de codage secon- daire comprend la dihydrofolate-réductase (DHFR) qui est affectée par un paramètre sous influence externe, tel. que le méthotréxate, permettant ainsi d'influencer l'ex- pression par le réglage de la concentration en méthotréxate (MTX). B Technologie de recombinaison de l'ADN La technologie de recombinaison de l'ADN est parvenue à l'âge d'une certaine sophistication Les spécia- listes de biologie moléculaire sont capables de recombiner diverses séquences d'ADN avec une certaine facilité, en créant de nouvelles entités d'ADN capables de produire des quantités abondantes d'un produit protéinique exogène dans des bactéries et des cultures cellulaires transformées. On dispose des moyens et des procédés généraux pour la ligation in vitro de divers fragments d'ADN à extrémités tronquées ou extrémités "collantes", en produisant ainsi de puissants véhicules d'expression utiles à la transfor- mation d'organismes particuliers, en dirigeant ainsi la synthèse efficace par ces organismes du produit exogène désiré Toutefois, sur la base des produits individuels, le chemin reste quelque peu tortueux et la science n'a pas progressé jusqu'à un stade permettant d'effectuer des prédictions normales de succès En fait, ceux qui augurent le succès des résultats sans le support d'une base expé- rimentale, courent un risque considérable d'inefficacité. La recombinaison des éléments essentiels de l'ADN, c'est-à-dire une origine de réplication, une ou plusieurs caractéristiques de sélection phénotypique, un promoteur d'expression, une insertion de gène hétérologue et un vecteur constituant le reste, est en général effectuée en dehors de la cellule-hôte Le véhicule d'expression répli- quable recombinant, ou plasmide, qui en résulte est intro- duit dans des cellules par transformation et de grandes quantités du véhicule recombinant sont obtenues par crois- sance du transformant Lorsque le gène est convenablement inséré par rapport à des portions qui régissent la trans- cription et la traduction du message d'ADN codé, le véhi- cule d'expression résultant est utile pour produire réelle- ment la séquence polypeptidique pour laquelle code le gène inséré, processus qui est appelé expression Le produit résultant peut être obtenu par lyse, si nécessaire, de la cellule-hôte dans des systèmes microbiens et isolement du produit des autres protéines par purification appropriée. Dans la pratique, l'utilisation de la technologie de la recombinaison de l'ADN peut exprimer des polypeptides entièrement hétérologues c'est ce qu'on appelle l'expres- sion directe ou bien, à titre de variante, elle peut exprimer un polypeptide hétérologue soudé à une portion de la séquence d'amino-acides d'un polypeptide homologue. Dans ces derniers cas, le produit bio-actif désiré est parfois rendu bioinactif au sein du polypeptide homologue/ hétérologue soudé jusqu'à ce qu'il soit clivé dans un envi- ronnement extracellulaire (voir les références ( 21) et ( 22)). De même, la technique des cultures de cellules ou detissus pour l'étude de la génétique et de la physio- logie cellulaire est bien établie On dispose de moyens et de méthodes pour entretenir des lignées cellulaires per- manentes, préparées par des transferts successifs en série depuis des cellules normales isolées En vue de leur uti- lisation dans la recherche, ces lignées cellulaires sont entretenues sur un support solide dans un milieu liquide, ou par développement dans une suspension contenant des substances nutritives d'entretien L'adaptation à des pré- parations de plus grande portée semble ne poser que des problèmes d'ordre mécanique Pour de plus amples détails, on renvoie aux références ( 23) et ( 24). De même, la biochimie des protéines est un com- plément utile et même nécessaire en biotechnologie Des cellules produisant la protéine désirée élaborent égale- ment des centaines d'autres protéines, produits endogènes du métabolisme cellulaire Ces impuretés protéiniques, ainsi que d'autres composés, peuvent se montrer toxiques lors- qu'elles sont administrées à un animal ou à un être humain au cours d'un traitement thérapeutique avec la protéine désirée, si elles ne sont pas enlevées de cette dernière. Par conséquent, les techniques de biochimie des protéines viennent en renfort, en permettant de concevoir des méthodes de séparation qui conviennent au système particulier que l'on considère et en offrant un produit homogène sans t danger pour le but recherché La biochimie des protéines prouve également l'identité du produit désiré, en le carac- térisant et en apportant la garantie que les cellules l'ont produit fidèlement sans aucune altération ni mutation Cette branche de la science est également impliquée dans la con- ception d'épreuves biologiques, d'études de stabilité et d'autres méthodes nécessaires à appliquer avant que des succès ne puissent être remportés par les études cliniques et la commercialisation. La présente invention est basée sur la découverte selon laquelle la technologie de la recombinaison de l'ADN peut être utilisée avec succès pour produire l'activateur de plasminogène de tissu humain (t-PA), avantageusement sous une forme directe et en quantités suffisantes pour entreprendre et conduire des essais sur des animaux et des essais cliniques en tant que conditions préalables pour l'admission à la vente Le t-PA humain est un produit avantageux à utiliser, sous toutes ses formes, dans le traitement prophylactique ou thérapeutique d'êtres humains pour divers états ou troubles cardiovasculaires En consé- quence, la présente invention, selon un aspect important, est axée sur des méthodes utilisant le t-PA pour traiter les troubles vasculaires chez- les êtres humains, et sur des compositions pharmaceutiques convenables renfermant ce produit. La présente invention concerne en outre l'acti- vateur de plasminogène de tissu humain essentiellement pur Le produit obtenu par des micro-organismes ou des cultures cellulaires manipulés génétiquement offre la possibilité d'obtenir un activateur de plasminogène de tissu humain d'une manière bien plus efficace que cela n'a été possible, en permettant une exploitation commer- ciale qui a été jusqu'à présent intangible En outre, selon la cellule-h 8 te, son activateur plasminogène tissu- laire humain peut renfermer une glycosylation associée à un degré plus o moins grand comparativement à la matière naturelle En tout cas, le t-PA est dépourvu des substan- ces contaminantes qui l'accanagnent normalement dans son environnement cellulaire non recombinant. La présente invention concerne également des véhicules d'expression d'ADN répliquables qui abritent des séquences de gènes codant un activateur de plasmino- gène de tissu humain sous une forme se prêtant à l'expres- sion, des souches de micro-organismes ou des cultures cellulaires transformées avec eux et des cultures micro- biennes ou cellulaires de ces souches ou cultures trans- formées, capables de produire l'activateur de plasminogène de tissu humain Selon d'autres de ses aspects, la présente invention est axée sur divers procédés utiles à la prépa- ration desdites séquences de gènes, desdits véhicules d'expression d'ADN, desdites souches de micro-organismes et cultures cellulaires, et leurs formes de réalisation par- ticulières L'invention concerne en outre la préparation de cultures par fermentation desdits micro-organismes et desdites cultures cellulaires. Sur les dessins annexés: la figure 1 illustre l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 % de SDS de protéines marquées au 355 précipitables avec une Ig G anti t-PA extraite de cellules de mélanome avec et sans inhibiteur de protéase; la figure 2 illustre l'électrophorèse des pro- duits de traduction immunoprécipités de fractions de m ARN dérivées de cellules de mélanome; la figure 3 illustre le diagramme d'hydridation de 96 colonies transformées avec le c ADN en utilisant l'ensemble du 14monomère marqué au 32 p comme échantillon préparé sur la base d'une séquence de 5-amino-acides de t-PA humain; la figure 4 est une carte d'endonucléase de restriction de la longueur totale de c ADN de t-PA humain; les figures 5 a, 5 b et 5 c montrent la séquence des nucléotides et la séquence déduite d'amino-acides de la longueur totale du c ADN de tPA humain; la figure 6 est une représentation schématique de la construction du plasmide d'expression p ARIPA ; la figure 7 montre les résultats d'une épreuve d'activité fibrinolytique sur plaque de fibrine de cellu- les transformées avec le plasmide p ARIPA O; la figure 8 est un diagramme des peptides, établi par chromatographie en phase liquide sous haute pression, d'un produit de digestion par la trypsine de t-PA humain; la figure 9 illustre la construction d'un plas- mide codant pour l'expression directe de t-PA humain à maturité dans E coli; la figure 10 montre les résultats d'une épreuve d'activité fibrinolytique sur plaque de fibrine du t-PA humain produit par E coli transformé avec pt-P Atrp 12; la figure 11 montre la construction de plasmides de codage de DHFR (type mutant ou sauvage)/t-PA aptes à la transformation en cellules de cultures de tissus de mammi- fères; et la figure 12 est un schéma illustrant l'activa- teur de plasminogène de tissu humain tel que préparé par le procédé illustré en E 1 dans le présent mémoire. A Définitions L'expression "activateur de plasminogène de tissu humain" ou "t-PA humain" ou l'abréviation "t-PA", utilisée dans le présent mémoire désigne un activateur de plasminogène (de type tissulaire) extrinsèque humain produit par des systèmes de cultures microbiennes ou cellulaires, sous des formes bio-actives comprenant une portion protéase et correspondant aux activateurs de plasminogène tissulaire autrement naturels pour un tissu humain L'activateur protéinique de plasminogène de tissu humain produit selon l'invention a été défini par forma- l 5 tion de la séquence d'un gène d'ADN déterminé et de la séquence par déduction des amino-acides Il y a lieu de remarquer qu'il existe des variations alléliques naturel- les et qu'elles apparaissent d'un individu à un autre. Ces variations peuvent être démontrées par une ou plu- sieurs différences-d'amino-acides dans la séquence globale ou par des délétions, des substitutions, des insertions, des inversions ou des additions d'un ou plusieurs amino- acides dans ladite séquence En outre, le site et le degré de glycosylation dépendent de laonature de l'envi- ronnement cellulaire de l'hôte. Il existe la possibilité, lorsqu'on utilise la technologie de recombinaison de l'ADN, de préparer divers dérivés d'activateur de plasminogène tissulaire humain, modifiés de diverses façons par des substitutions, des délétions, des additions ou des remplacements résultants d'un ou plusieurs amino-acides, par exemple au moyen de la mutagénèse orientée en fonction du site de l'ADN qui se trouve à la base On considère également la préparation de dérivés conservant la région annulaire essentielle et la région de sérine-protéase généralement caractéristiques de l'activateur de plasminogène de tissu humain décrit en particulier dans le présent mémoire, mais autrement modifié de la manière indiquée ci-dessus Toutes ces varia- 1 O tions et modifications alléliques donnant des dérivés de l'activateur de plasminogène de tissu humain entrent dans le cadre de la présente invention, ainsi que d'autres activateurs de plasminogène (de type tissulaire) extrin- sèque humain apparentés, similaires du point de vue physi- que et biologique, du moment que l'activité essentielle caractéristique d'activateur de plasminogène de tissu humain reste non affectée quant à sa nature. On prépare l'activateur de plasminogène de tissu humain ( 1) ayant la méthionine comme premier amino-acide (présent en raison de l'insertion du codon de signal de départ ATG en face du gène structural) ou ( 2) lorsque la méthionine subit un clivage intracellulaire ou extra- cellulaire, ayant normalement son premier amino-acide, ou ( 3) conjointement avec son polypeptide de signal ou une protéine conjuguée autre que le polypeptide de signal classique, le polypeptide de signal ou le conjugué pou- vant être clivé de façon spécifique dans un milieu intra- cellulaire ou extracellulaire (voir référence 21), ou ( 4) par expressiondirecte sous la forme mûre sans qu'il soit nécessaire d'éliminer par clivage tout polypeptide étranger superflu Ce dernier point est particulièrement important lorsqu'un hôte donné ne peut pas éliminer ou n'élimine pas efficacement un peptide de signal o le véhicule d'expression est destiné à exprimer l'activateur de plasminogène de tissu en même temps que son peptide de signal En tout cas, le t-PA humain ainsi produit, sous ses diverses formes, est recueilli et purifié à un degré le rendant apte à être utilisé dans le traitement de divers états ou troubles vasculaires. En outre, le t-PA comporte des formes qui com- prennent la protéine monocaténaire (à une seule chaîne) et la protéine bicaténaire Cette dernière est dérivée par protéolyse du composé monocaténaire On considère que la protéine bicaténaire est associée à de la fibrine pro- duite et que le passage de la matière monocaténaire à la matière bicaténaire par transformation protéolytique s'effec- tue sur le lieu de transformation du plasminogène en plasmine. La présente invention permet l'administration de la pro- téine monocaténaire en vue de la transformation in vivo de la manière qui vient d'être décrite, ou bien l'adminis- tration de la protéine bicaténaire, qui s'est également révélée active La protéine bicaténaire peut être préparée par transformation protéolytique in vitro après que la matière monocaténaire a été produite Une aire dite "annu- laire" est située en amont de la portion de S 6 rine-protéase et l'on considère qu'elle joue un rôle important en liant l'activateur de plasminogène de tissu de l'invention à une matrice de fibrine; de là résulte l'activité spéci- fique observée de l'activateur de plasminogène de tissu de l'invention envers des thrombi existants tangibles. L'activateur de plasminogène de tissu de l'invention qui est produit contient la portion douée d'activité enzyma- tique correspondant à la matière naturelle et l'expression activateur de plasminogène de tissu humain définit des produits comprenant cette portion seule ou conjointement avec d'autres séquences d'amino-acides jusqu'à la molé- cule de longueur totale. Pour résumer la présente invention, le t-PA humain a par conséquent une définition fonctionnelle; il est capable de catalyser la transformation de plasmi- nogène en plasmine, il fixe la fibrine et il appartient à la catégorie d'un t-PA sur la base de propriétés immuno- logiques comme indiqué ci-dessus. L'expression "forme essentiellement pure" uti- lisée pour définir l'état du t-PA humain produit par la présente invention signifie l'absence de protéine ou d'autres matières normalement associées à un t-PA humain lorsqu'il est produit par des cellules non recombinantes, c'est-à-dire dans son environnement "naturel". L'expression "protéine DHFR" s'adresse à une protéine qui peut faire preuve d'activité en relation avec la dihydrofolate-réductase (DHFR) et qui, par conséquent, doit être produite par des cellules qui sont capables de survie sur un milieu déficient en hypoxanthine, en glycine et en thymidine (milieu -HGT) En général, des cellules manquant de protéine DHFR sont incapables de se développer sur ce milieu et des cellules qui contiennent la protéine DHFR sont capables de le faire avec succès. L'expression "cellules sensibles au MTX" s'adresse à des cellules qui sont incapables de se développer sur des milieux qui contiennent du méthotréxate (MTX) inhibi- teur de DHFR Ansi, des "cellules sensibles au MTX" sont des cellules qui, à moins qu'elles ne soient modifiées génétiquement ou supplémentées d'une autre façon, ne par- viennent pas à se développer dans des conditions ambiantes et dans des conditions de milieu qui conviennent au type de cellules lorsque la concentration en MTX est de 0,2 ag/ml ou davantage Certaines cellules telles que des bactéries, ne parviennent pas à faire preuve de sensibilité au MTX 159 en raison de leur inaptitude à admettre du MTX à l'inté- rieur de leurs limites cellulaires, bien qu'elles contien- nent de la DHFR qui serait autrement sensible à ce médi- cament En général, des cellules qui contiennent, comme protéine DHFR, une DHFR du type sauvage sont sensibles au méthotréxate si elles sont perméables au MTX ou suscep- tibles d'absorption vis-à-vis de ce dernier. L'expression "DHFR de type sauvage" désigne la dihydrofolate-réductase telle qu'on la rencontre ordinai- rement dans l'organisme particulier en question La DHFR du type sauvage est en général sensible in vitro à de faibles concentrations de méthotréxate. L'expression "protéine DHFR à faible affinité de liaison pour le MTX" a une définition fonctionnelle. Il s'agit d'une protéine DHFR qui, lorsqu'elle est élaborée dans des cellules, permet la croissance de cellules sensi- bles au MTX dans un milieu contenant 0,2 gg/ml ou davan- tage de MTX Il est reconnu qu'une telle définition fonc- tionnelle dépend de la facilité avec laquelle l'organisme produit la "protéine DHFR à faible affinité de liaison pour le MTX" ainsi que de la protéine elle-même Toutefois, tel qu'on l'utilise dans le contexte de l'invention, cet équilibre entre ces deux mécanismes ne doit pas être gênant. L'invention intervient en conférant l'aptitude à survivre à ces taux de MTX, et si l'aptitude à procéder ainsi se traduit par une expression accrue en plus de la nature innée de la DHFR produite, cela reste sans conséquence. Une protéine DHFR convenable qui correspond à cette défini- tion est décrite dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 459 151 déposée le 19 Janvier 1983. * Un "vecteur d'expression" appartient à des vecteurs qui sont capables d'exprimer des séquences d'ADN qui y sont contenues, lorsque ces séquences sont en liai- son opérationnelle avec d'autres séquences capables d'effectuer leur expression Cela implique, bien que la mention n'en soit pas toujours faite explicitement, que ces vecteurs d'expression doivent pouvoir être répliqués dans les organisme-hôtes, soit comme épisomes, soit comme partie intégrante de l'ADN chromosomique Manifestement, un manque d'aptitude à la réplication les rendrait inopé- rants En somme, un "vecteur d'expression" reçoit une définition fonctionnelle, et toute séquence d'ADN qui est capable d'effectuer l'expression d'un code d'ADN bien défini qui y est disposé est incluse dans cette expression telle qu'elle s'applique à la séquence spécifiée En géné- ral, des vecteurs d'expression intéressants à utiliser dans des techniques de recombinaison de l'ADN sont sou- vent sous la forme de "plasmides", c'est-à-dire de boucles circulaires d'ADN à double brin qui, sous leur forme vec- torielle, ne sont pas liées au chromosome Dans le présent mémoire, lestermes 'plasmide" et "vecteur" sont utilisés indifféremment, attendu que le plasmide est la forme de vecteur que l'on utilise le plus couramment Toutefois, l'invention couvre d'autres formes de vecteurs d'expres- sion qui assument des fonctions équivalentes et qui, de ce fait, sont connues dans l'art antérieur. L'expression "cellules-hôtes recombinantes" désigne des cellules qui ont été transformées avec des vecteurs construits selon des techniques de recombinaison de l'ADN Comme défini dans le présent mémoire, le t-PA est produit en les quantités obtenues en raison de cette transformation, plutôt qu'en les quantités moindres ou, plus souvent, en les quantités moins que détectables qui pourraient être produites,par l'hôte non transformé Le t-PA produit par ces cellules peut être appelé "t-PA re- combinant". B Cultures de cellules-hôtes et vecteurs Les vecteurs et les procédés décrits dans le présent mémoire peuvent être utilisés avantageusement dans des cellules-hôtes dans une large gamme d'organismes procaryotiques et eucariotiques. En général, naturellement, des procaryotes sont préconisés pour le clonage de séquences d'ADN dans la construction des vecteurs utiles dans la présente inven- tion Par exemple, la souche 294 de E coli K 12 (ATCC N O 31446) est particulièrement utile D'autres souches microbiennes qui peuvent être utilisées comprennent des souches de E coli telles que E coli B et E coli X 1776 (ATCC N O 31537) Ces exemples sont naturellement donnés à titre non limitatif. Des procaryotes peuvent être utilisés en vue de l'expression Les souches mentionnées ci-dessus, de même que E coli W 3110 (F-, À-, prototrophe, ATCC N O 27325), des bacilles tels que Bacillus subtilis et d'autres Enterobacteriaceae telles que Salmonella typhi- murium ou Serratia marcescens et diverses espèces du genre Pseudomonas peuvent être utilisés. En général, des vecteurs plasmidiques contenant des séquences de réplicon et des séquences témoins qui sont dérivées d'espèces compatibles avec la cellule-hôte sont utilisés conjointement avec ces hôtes Le vecteur porte ordinairement un site de réplication, de même que des séquences de marquage qui sont capables d'offrir une sélection phénotypique dans des cellules transformées. Par exemple, E coli est normalement transformé au moyen de p BR 322, plasmide dérivé d'une souche de E coli (Bolivar et collaborateurs, Gene 2:95 ( 1977)) Le plasmide p BR 322 contient des gènes pour la résistance à l'ampicil- line et à la tétracycline et offre donc un moyen commode d'identifier des cellules transformées Le plasmide p BR 322 ou un autre plasmide microbien doit aussi contenir, ou doit être modifié de manière à contenir, des promoteurs qui peuvent être utilisés par l'organisme microbien pour l'expression de ses propres protéines Les promoteurs utilisés le plus couramment dans l'édification d'ADN recombinant comprennent les systèmes promoteurs de B- lactamase (pénicillinase) et de lactose (Chang et colla- borateurs, Nature, 275:615 ( 1978); Itakura et collabora- teurs, Science, 198:1056 ( 1977); (Goeddel et collabora- teurs, Nature 281:544 ( 1979)) et un système promoteur de tryptophane (trp) (Goeddel et collaborateurs, Nucleic Acids Res, 8:4057 ( 1980); demande de brevet européen publiée sous le numéro 0036776) Bien qu'il s'agisse là des promoteurs utilisés le plus couramment, d'autres pro- moteurs microbiens ont été découverts et utilisés, et des détails concernant leurs séquences nucléotidiques ont été publiés, permettant à l'homme de l'art d'en effec- tuer fonctionnellement la ligation avec des vecteurs plas- midiques (Siebenlist et collaborateurs, Cell 20:269 ( 1980)). Outre des procaryotes, on peut aussi utiliser des micro-organismes eucaryotiques tels que des cultures de levure Parmi les micro-organismes eucaryotiques, Saccharomyces cerevisiae, qui est la levure de boulangerie commune, est celui que l'on utilise le plus couramment, bien qu'on dispose ordinairement de nombreuses autres souches Pour l'expression dans Saccharomyces, le plasmide Y Rp 7, par exemple, est couramment utilisé (Stinchcomb et collaborateurs, Nature, 282:39 ( 1979); Kingsman et colla- borateurs, Gene, 7:141 ( 1979); Tschemper et collaborateurs, Gene, 10:157 ( 1980)) Ce plasmide contient déjà le gène trpl qui constitue un marqueur de sélection pour une souche mutante de levure qui n'est pas capable de se développer dans le tryptophane, par exemple ATCC N 44076 ou PEP 4-1 (Jones, Genetics, 85:12 ( 1977)) L'existence de la lésion de trp 1 comme caractéristique du génome de la cellule-hôte de levure constitue alors un environnement efficace pour la détection d'une transformation par croissance en l'absence de tryptophane. Des séquences activatrices convenables dans des vecteurs de levures comprennent les promoteurs relatifs à la 3-phosphoglycérate-kinase (Hitzeman et collaborateurs, J Biol Chem, 255:2073 ( 1980) ou d'autres enzymes glyco- lytiques (Hess et collaborateurs, J Adv Enzyme Reg, 7:149 ( 1968); Holland et collaborateurs, Biochemistry, 17:4900 ( 1978), tels que l'énolase, la glycéraldéhyde-3-phosphate- déshydrogénase, l'hexokinase, la pyruvate-décarboxylase, la phosphofructokinase, la glucose-6-phosphate-isomérase, la 3-phosphoglycérate-mutase, la pyruvate-kinase, la trio- sephosphate-isomérase, la phosphoglucose-isomérase et la glucokinase Dans la construction de plasmides d'expres- sion convenables, les séquences de terminaison associées à ces gènes sont également liées au vecteur d'expression 3 ' de la séquence que l'on désire exprimer pour effectuer la polyadénylation du m ARN et la terminaison D'autres promoteurs, qui présentent en outre l'avantage d'une transcription influencée par les conditions de croissance, comprennent les promoteurs localisés pour l'alcool déshydro- génase 2, l'isocytochrome C, la phosphatase acide, des enzymes de dégradation liés au métabolisme de l'azote, et la glycéraldéhyde-3phosphate-déshydrogénase mentionnée ci-dessus, et des enzymes responsables de l'assimilation du maltose et du galactose (Holland, ibid) On peut uti- liser tout vecteur plasmidique contenant un promoteur, une origine de réplication et des séquences de terminaison compatibles avec la levure. Outre des micro-organismes, on peut aussi uti- liser comme hôtes des cultures de cellules dérivées d'orga- nismes multicellulaires En principe, on peut mettre en oeuvre toute culture cellulaire de ce genre, qu'il s'agisse d'une culture de vertébré ou d'une culture d'invertébré. Toutefois, les cellules de vertébrés ont présenté le plus grand intérêt, et la propagation de cellules de vertébrés en culture (culture de tissu) est devenue une méthode classique au cours des dernières années / Tissue Culture, Academic Press, éditions Kruse et Patterson ( 1973) 7 Des exemples de ces lignées cellulaires d'hôtes utiles sont les cellules VERO et He La, les lignées cellulaires d'ovaires de hamster de Chine (CHO) et les lignées cellulaires W 138, BHK, COS-7 et MDCK Des vecteurs d'expression pour ces cellules comprennent ordinairement (lorsque cela est néces- saire) une origine de réplication, un promoteur situé en regard du gène à exprimer, en même temps que tous sites de liaison ribosomiques nécessaires, sites d'épissage d'ARN, site de polyadénylation et séquences de terminaison de transcription. Les fonctions exerçant leur influence sur les vecteurs d'expression dans le cas de cellules de mammifères sont souvent assumées par une matière virale Par exemple, des promoteurs couramment utilisés sont dérivés de virus de polyome, d'adénovirus 2 et le plus souvent de virus simien Simian Virus 40 (SV 40) Les promoteurs anciens et récents du virus SV 40 sont particulièrement utiles parce que tous deux sont aisément tirés du virus sous la forme d'un fragmenp qui contient aussi l'origine virale SV 40 de réplication (Fiers et collaborateurs, Nature, 273:113 ( 1978), cité à titre bibliographique) On peut aussi uti- liser des fragments de SV 40 plus petits ou plus grands, à condition que soit incluse la séquence d'environ 250 paires de bases allant du site Hind III au site Bgl I localisé dans l'origine virale de la réplication En outre, il est également possible et souvent désirable d'utiliser des séquences de promoteurs ou des séquences de régulation normalement associées à la séquence du gène désiré, à con- dition que ces séquences de régulation soient compatibles avec les systèmes cellulaires de l'hôte. Une origine de réplication peut être réalisée par construction du vecteur de manière qu'il renferme une origine exogène, comme cela est possible à partir de SV 40 ou d'une autre source virale (par exemple Polyoma, Adeno, VSV, BPV, etc), ou bien elle peut être réalisée par le mécanisme de réplication chromosomique de la cellule-hôte. Si le vecteur est intégré au chromosome de la cellule-hôte, cela est souvent suffisant. Dans le choix d'une cellule-hôte avantageuse pour la transfection par les vecteurs de l'invention qui com- prennent des séquences d'ADN codant à la fois le t-PA et la protéine DHFR, il convient de choisir l'hôte conformé- ment au type de protéine DHFR utilisée Si l'on utilise une protéine DHFR de type sauvage, il est préférable de choisir une cellule-hôte qui est déficitaire en DHFR, ce qui permet donc l'utilisation de la séquence codant pour la DHFR comme moyen de imarquage pour le succès de la trans- fection dans un milieu sélectif qui manque d'hypoxanthine, de glycine et de thymidine Une cellule-hôte avantageuse à utiliser dans ce cas est la lignée cellulaire d'ovaire de hamster de Chine (CHO) dont l'activité en DHFR est - déficitaire, préparée et propagée de la manière décrite par Urlaub et Chasin, Proc Natl Acad Sci (Etats-Unis d'Amérique) 77:4216 ( 1980), incorporé ici à titre documen- taire. En revanche, si l'on utilise une protéine DHFR à faible affinité de liaison pour le MTX comme séquence de régulation, il'n'est pas nécessaire d'utiliser des cellules DHFR résistantes Du fait que la DHFR de mutant est résistante au méthotréxate, des milieux contenant du MTX peuvent être utilisés comme moyen de sélection, à condition que les cellules-hôtes soient elles-mêmes sen- sibles au méthotréxate La plupart des cellules d'eucaryo- tes qui sont capables d'absorber le MTX se montrent sen- sibles au méthotréxate Un exemple de lignée cellulaire utile est une lignée CHO, à savoir la lignée CHO-K 1,ATCC N O CCL 61. Des exemples qui sont donnés ci-dessous décrivent l'utilisation de E coli avec le système promoteur trp et l'utilisation de cellules CHO comme cellules-hôtes, et des vecteurs d'expression qui renferment comme promoteur l'origine SV 40 de réplication Toutefois, il est tout à fait de la compétence de l'homme de l'art d'utiliser des techniques analogues pour construire des vecteurs d'expres- sion destinés à exprimer des séquences protéiniques désirées dans des cultures de cellules-hôtes procaryotiques ou euca- ryotiques alternées. C Méthodes utilisées Si l'on utilise comme cellules-hôtes des cellules sans barrières considérables formées par leur paroi, on effectue une transfection par la méthode de précipitation au phosphate de calcium décrite par Graham et Van der Eb, dans Virology, 52:546 ( 1978) boutefois, d'autres méthodes d'introduction d'ADN dans des cellules, par exemple une méthode par injection nucléaire ou une méthode par fusion de protoplastes, peuvent aussi être utilisées. Si l'on utilise des cellules procaryotiques ou des cellules qui renferment des structures importantes de paroi cellulaire, la méthode de transfection préconisée est la méthode de traitement au calcium utilisant le chlorure de calcium, telle que décrite par F N Cohen et collaborateurs dans Proc Natl Acad Sci (Etats-Unis d'Amérique), 69:2110 ( 1972). La construction de vecteurs convenables renfer- mant les séquences désirées de codage et de régulation emploie des techniques classiques de ligation Des plas- mides ou des fragments d'ADN isolés sont clivés, adaptés et reçoivent la forme désirée par une nouvelle ligation, pour constituer les plasmides recherchés. On effectue le clivage par traitement avec un ou plusieurs enzymes de restriction dans un tampon conve- nable En général, on utilise environ 1 gg de plasmide ou de fragments d'ADN avec environ 1 unité d'enzyme dans environ 20 gl de solution tampon (Des tampons et des quantités de substrat qui conviennent pour des enzymes de restriction particuliers sont précisés par le fabri- cant) On peut utiliser des durées d'incubation d'environ 1 heure à 37 *C Après les incubations, la protéine est éliminée par extraction au phénol et au chloroforme, et l'acide nucléique est isolé de la fraction aqueuse par précipitation à l'éthanol. Si l'on désire des extrémités tronquées, on traite la préparation pendant 15 minutes à 150 avec unités de Polymérase I (Klenow), on l'extrait au phénol et au chloroforme et on la précipite à l'éthanol. On effectue la séparation par longueurs des fragments clivés en utilisant du gel de polyacrylamide à 6 % décrit par D Goeddel et collaborateurs dans Nucleic Acids Res, 8:4057 ( 1980) dont la publication est citée à titre documentaire. En vue de la ligation, des quantités à peu près équimolaires des composants désirés, dont les extrémités sont convenablement façonnées pour permettre une adapta- tion correcte, sont traitées avec environ 10 unités d'ADN-ligase de T 4 pour 0,5 gag d'ADN (Lorsque des vec- teurs clivés sont utilisés comme composants, il peut être utile d'empêcher une re-ligation du vecteur clivé par un traitement préalable avec une phosphatase alcaline bactérienne). En vue de l'analyse pour confirmer l'existence des séquences correctes dans des plasmides construits, les mélanges exposés à la ligation sont utilisés pour transformer la souche 294 de E coli K 12 (ATCC 31446), et des transformants satisfaisants sont sélectionnés par résistance à l'ampicilline lorsque cela est opportun Des plasmides dérivés des transformants sont préparés, analysés par restriction et/ou séquencés par la méthode de Messing et collaborateurs, Nucleic Acids Res, 9:309 ( 1981) ou par la méthode de Maxam et collaborateurs, Methods in Enzymology, 65:499 ( 1980). L'amplification de séquences de codage de la protéine DHFR est effectuée par développement de cultures de cellules-hôtes en présence de concentrations d'environ 20-500 000 n M en méthotréxate, qui est un inhibiteur com- pétitif de l'activité en DHFR La plage efficace de con- centrations dépend naturellement à un haut degré de la nature du gène de DHER, de la protéine et des caractéris- tiques de l'hôte Il est évident qu'on ne peut générale- ment pas établir de limites supérieure et inférieure bien définies Des concentrations convenables d'autres analogues de l'acide folique ou d'autres composés qui inhibent la DHFR pourraient aussi être utilisées Toutefois, le MTX lui-même est commode, facile à obtenir et efficace. D Description générale de formes de réalisation avantageuses L'activateur de plasminogène de tissu humain a été obtenu conformément au protocole suivant: 1 Des cellules de mélanome humain produisant activement l'activateur de plasminogène de tissu ont été cultivées jusqu'au stade de confluence. 2 Des culots cellulaires provenant de ces cul- tures de cellules ont été extraits en présence d'inhibiteurs de ribonucléase pour isoler la totalité de l'ARN cytoplasmique. 3 Une colonne oligo-d T a isolé l'ARN messager (m ARN) total sous la forme polyadénylée Ce m ARN a été fractionné en fonction des dimen- sions par électrophorèse sur gel d'agarose -additionné d'acide et d'urée. 4 La fraction de gel contenant l'ARN spécifique de l'activateur de plasminogène de tissu a été identifiée de la manière suivante: L'ARN provenant de chacune des fractions de gel a été traduit dans un système de lysat réticulo- cytaire de lapin in vitro, additionné de microsomes de pancréas de chien Les produits de traduction résultants ont ensuite été expo- sés à une immunoprécipitation avec l'anticorps Ig G spécifique de l'activateur de plasminogène de tissu humain. L'ARN approprié ( 21 à 24 S) a été converti en l'ADN complémentaire à brin unique (c ADN) cor- respondant à partir duquel le c ADN double brin a été produit Après terminaison poly-d C, il a été inséré dans un vecteur tel qu'un plas- mide portant un ou plusieurs marqueurs phéno- typiques. 6 Les vecteurs ainsi préparés ont été utilisés pour transformer des cellules bactériennes procurant une bibliothèque de c ADN clone. Un ensemble de déoxy-oligonucléotides syn- thétiques marqués par la radio-activité, complémentaires de codons pour des séquences connues d'amino-acides dans t-PA, par exemple l'ensemble de 8 14-mères, 'd TC(A)CA (GA)TA T)TCCCA-3 ' (complémentaires vis-à-vis de séquences codant pour la séquence connue voir ci-dessous d'amino-acides: tryptophane-acide glutamique-tyrosine-cystéine- acide aspartique (W-E-Y-C-D), a été préparé et utilisé pour mettre à l'épreuve la biblio- thèque de colonies. 7 L'ADN de plasmides a été isolé des clones positifs de c ADN et il a été séquencé. 8 L'ADN séquencé a ensuite été façonné in vitro en vue de son insertion-dans un véhicule - d'expression approprié qui a été utilisé pour transformer une cellulehôte appropriée à laquelle on a donné,à son tour,la possibilité de se développer dans une culture et de pro- duire l'activateur de plasminogène de tissu humain désiré. 9 L'activateur de plasminogène de tissu humain ainsi produit comporte environ 251 amino-acides dans sa portion enzymatique de sérine-protéase et, en amont de cette portion, une séquence contenant une "boucle", que l'on tiendra pour responsable de la liaison de la fibrine La protéine mûre, avec sa préséquence de signal, totalise 562 amino-acides. Le mode opératoire ci-dessus est en lui-même satisfaisant pour la production de t-PA pur Les procédés de l'invention utilisant une autre séquence de codage sensible au méthotréxate permet la production dans des cultures de cellules-hôtes de protéine de t-PA à activité antigénique en quantités supérieures à 0,1 pg par cellule par jour Avec l'application convenable de conditions d'amplification, on peut obtenir des quantités supérieures à 20 pg Autrement dit, les niveaux d'expression de gènes entraînant la production de plus de 9 x 10 6 unités Plough ou, avec une amplification convenable, plus de 18 x 10 4 unités Plough d'activité en t-PA, sont réalisés. Selon cet aspect de l'invention, on tire avantage du méthotréxate en tant que médicament qui, bien que nor- malement fatal à des cellules capables de l'absorber, per- met à des cellules de se développer en présence de pro- portions réglées de MTX par amplification du gène codant pour la séquence de codage de DHFR (Robert T Schimke et collaborateurs, Science, 202:1051 ( 1978); J L Biedler et collaborateurs, Cancer Res 32:153 ( 1972); S E Chang et collaborateurs, Cell, 7:391 ( 1976)). Il importe pour cet aspect de l'invention de démontrer que l'amplification du gène pour DHFR peut provoquer une amplification de séquences associées qui codent pour d'autres protéines Il semble en être ainsi lorsque la protéine associée est l'antigène de surface de l'hépatite B (H Bs Ag) (J Christman et collaborateurs, Proc Natl Acad Sci, 79:1815 ( 1982)); la protéine XGPRT de E coli (Ringold, Gordon et collaborateurs, J. Molec and Appl Gen, 1:165 ( 1981)); et une séquence endogène dérivée d'une association plasmidique DHFR/SV 40 (R.F Kaufman et collaborateurs, J Molec Biol, 159:601 ( 1982)). D'autres mécanismes conférant la résistance au méthotréxate comprennent la réduction de l'affinité de liaison de la protéine DHFR, de manière qu'elle soit moins sensible au méthotréxate (W F Flintoff et collaborateurs, Somat Cell Genet, 2:245 ( 1976)), mais dans ce cas, une amplification semble avoir lieu tout autant. Il semblerait que les gènes,aussi bien pour la DHFR de type sauvage que pour la DHFR qui résiste au MTX en raison de la propre réduction de capacité de liaison, soient amplifiés par la présence de MTX En conséquence, cet aspect de la présente invention concerne en principe l'utilisation de l'impact de l'amplification de la séquence de DHFR sur des séquences associées de codage de la pro- téine pour offrir un mécanisme de régulation qui permet de meilleurs niveaux d'expression de séquences de t-PA en présence de MTX ou en raison d'un traitement antérieur de cellules transformées avec MTX. E Exemples Les exemples suivants illustrent l'invention à titre non limitatif Dans les exemples en question, une culture hôte de E coli et une lignée cellulaire CHO qui conviennent pour le type de séquence de codage de la pro- téine DHFR devant être introduite ont été utilisées comme culture de cellules-hôtes Toutefois, d'autres cellules eucaryotiques et procaryotiques conviennent tout aussi bien pour le procédé de l'invention. E.1 Expression du gène de t-PA humain dans E coli E.1 A Légendes des figures La figure 1 est un autoradiogramme d'un gel d'acrylamide à 10 % de SDS faisant apparaître la ou les protéines immunoprécipitées marquées à la /f 35 S 7-méthionine, sécrétées par des cellules de mélanome humain pendant une exposition de 3 heures in vivo, en présence (travée b) ou en l'absence (travée a) de l'inhibiteur de protéase appelé aprotinine Après l'immunoprécipitation avec l'Ig G spéci- fique de l'activateur de plasminogène tissulaire, on a observé trois bandes (travée a) ayant des poids moléculaires d'environ 65 000, 63 000 et 35 000 Toutefois, en présence de l'inhibiteur de protéase, aucune espèce d'un poids molé- culaire de 35 000 n'a été observée Aucun produit n'a été immunoprécipité en cas d'utilisation du sérum pré-immun (travée c) Les migrations et les poids moléculaires d'étalons protéiniques marqués au 14 C sont représentés à gauche de la travée a. La figure 2 illustre l'électrophorèse des pro- duits de traduction immunoprécipités de fractions d'ARN isolées d'un gel d'agarose à l'acide et à l'urée Une bande dominante a été observée dans les fractions portant les numéros 7 et 8 après traduction en présence de micro- somes de pancréas de chien, suivie d'une précipitation immunitaire avec l'Ig G spécifique de l'activateur de plasminogène de tissu Cette bande a un poids moléculaire d'environ 63 000 daltons La dimension du m ARN migrant dans les fractions 7 et 8 est d'environ 21 à 245 Les positions de marqueurs d'ARN ribosomique qui ont été déterminées après électrophorèse sur le gel à l'urée con- tenant l'ARN et visualisées par coloration au bromure d'éthidium sont marquées au-dessus des travées correspon- dantes du gel. La figure 3 illustre le diagramme d'hybridation de 96 colonies avec un échantillon de 32 P-dt C(A)CA(A)TA(C)TCCCA (W-E-Y-C-D) 96 transformants G G T individuels ont été cultivés dans une plaque de micro- titrage, des répliques ont été transplantées et elles ont été cultivées sur une membrane de nitrocellulose Les colonies ont ensuite été lysées, l'ADN bactérien a été fixé et les filtres ont été hybridés avec des échantil- lons de 32 P-14-mète (W-E-Y-C-D) Les filtres ont été lavés pour enlever l'échantillon non hybridé et ils ont été exposés à un film radiographique Cet autoradiogramme est représentatif des diagrammes obtenus avec 48 filtres indi- viduels ( 4600 colonies indépendantes) Un exemple de clone positif de c ADN d'activateur de plasminogène de tissu sur le filtre N 25 porte la référence E 10 (flèche). La figure 4 est une carte, établie avec une endo- nucléase de restriction, de la longueur totale du c ADN d'activateur de plasminogène de tissu humain Le nombre et la longueur des fragments produits par clivage par l'endonucléase de restriction ont été estimés par électro- phorèse sur des gels d'acrylamide à 6 % Les positions des sites ont été confirmées par la séquence des acides nucléiques (présentée sur les figures 5 a à Sc) La région de codage du plus grand cadre de lecture ouvert est encadrée et la région hachurée représente la séquence présumée du peptide de signal, tandis que la région en pointillés représente la séquence présumée de l'activateur de plasmino- gène tissulaire à maturité ( 527 amino-acides) L'extrémité ' du m ARN se trouve à gauche, tandis que l'extrémité 3 ' se trouve à droite. Les figures 5 a, 5 b et 5 c illustrent la séquence des nucléotides et la séquence des amino-acides déduits de la longueur totale du c ADN d'activateur de plasminogène de tissu humain Les 35 amino-acides (-35 à -1) qui précè- dent la séquence mûre sont représentés sous la forme d'une séquence ininterrompue On admet que cette séquence de 35 amino-acides est formée d'une séquence "pro" hydrophile, précédant la sérine (+ 1) de la protéine mûre, d'environ 12 à 15 amino-acides, elle-même précédée d'un signal hydro- phobe "classique" (s'étendant de 5 ' à -35) Ce type de structure pré-pro sur des protéines sécrétées a été décrit antérieurement, par exemple dans le cas de la pré-pro- albumine Si l'on admet cette théorie, toutes les molécules sécrétées de l'activateur de plasminogène tissulaire par- tent de la sérine (+ 1) constituant l'extrémité amino Une seconde théorie est que la séquence hydrophile pourrait comporter la fonction d'activateur de plasminogène de tissu d'une manière analogue à celle que l'on observe avec le plasminogène, o un peptide de 10 000 daltons peut être clivé de la portion amino terminale du plasminogène naturel (Glu- plasminogène, nommé d'après le résidu amino terminal), en donnant une molécule plus petite, avec une extrémité amino nouvelle, appelée Lys-plasminogène Le Lys-plasmino- gène est plus facilement activé en plasmine, et il a égale- ment une plus grande affinité pour la fibrine que le Glu- plasminogène Il a été montré que la plasmine catalysait la transformation de Glu-plasminogène en Lys-plasminogène. Ce type de mécanisme de régulation constitue un mécanisme de "réaction positive" Les premières quantités de plasmine formée, outre le fait qu'elles dégradent la fibrine, entraî- nent également la production de molécules de plasminogène qui sont plus facilement activées et qui se fixent aussi plus solidement à leur substrat que ne le fait le plasmino- gène naturel Il en résulte une dégradation plus rapide de la fibrine Le peptide hydrophile de l'activateur de plasmi- nogène de tissu pourrait être impliqué dans un mécanisme similaire, son clivage entraînant une modification de la liaison de l'enzyme à la fibrine En tout cas, la séquence de 35 amino-acides est considérée comme une préséquence de la protéine mûre. La figure 6 est une représentation schématique de la construction d'un plasmide p ARIPA d'expression d'un activateur de plasminogène de tissu Le plasmide de départ p PA 25 E 10 a tout d'abord été digéré avec l'enzyme Pst I pour isoler un fragment de 376 paires de bases qui a ensuite été digéré de la manière représentée sur la figure. La figure 7 montre le résultat d'une détermina- tion sur plaque de fibrine de l'activité fibrinolytique du produit d'expression obtenu au moyen de p ARIPA dans des cellules transformées. * La figure 8 montre le chromatogramme en phase liquide sous haute pression de peptides provenant du produit de digestion par la trypsine de l'activateur de plasminogène tissulaire de l'invention (absorption à 210 nm) La flèche identifie le pic correspondant au peptide utilisé pour concevoir l'échantillon de nucléotide utilisé avec la bibliothèque de colonies On a trouvé que ce pic avait la séquence entière: L-T-W-E-Y-C-D-V-P-S-C-S-T-C-G-L. Les autres pics principaux ont été séquences de la même façon et on a trouvé qu'ils confirmaient la séquence correcte d'amino-acides de l'activateur du plasminogène de tissu humain Le code alphabétique à une seule lettre des peptides concernant la désignation des amino-acides est le suivant: Asp D Acide aspartique Ile I Isoleucine Thr T Thréonine Leu L Leucine Ser S Sérine Tyr Y Tyrosine Glu E Acide glutamique Phe F Phényl- Pro Gly Ala Cys Val Met P G A C V M Proline Glycine Alanine Cystéine Valine Méthionine His Lys Arg Trp Gln Asn alanine H Histidine K Lysine R Arginine W Tryptophane Q Glutamine N Asparagine La figure 9 illustre la construction d'un plasmide codant pour l'expression directe d'activateur de plasmino- gène de tissu humain à maturité dans E coli On a fait digérer 50 gg de plasmide p PA 17 avec les enzymes Sau 3 AI, Hinc II et Hha I et on a effectué l'électrophorèse sur un gel à 6 % de polyacrylamide On a recueilli environ 0,5 ug du fragment Sau 3 AI-Hha I de 55 paires de bases De même, on a purifié environ 3 gg du fragment Hha I-Nar I de 263 paires de bases à partir de 80 gg de clone p PA 25 E 10 en isolant tout d'abord un fragment Pst I-Nar I de 300 paires de bases, puis en faisant digérer ce fragment par Hha I. Toutes les digestions ont été effectuées à 37 pendant 1 heure, et les produits réactionnels ont été séparés et électro-élués à partir de gels de polyacrylamide à 6 %. Les deux désoxyoligonucléotides indiqués, 'd AATTCATGTCTTATCAAGT (I) et 5 ' GATCACTTGATAAGACATG (II) ont été synthétisés par la méthode au phosphotriester en phase solide ( 51) On a phosphorylé 100 pmoles d'oligo- nucléotide II dans un volume de 30 gl de mélange réaction- nel contenant 60 nt M de tris (p H 8), 10 m M de Mg C 12, 15 m M de emercapto-éthanol et 50 g Ci de / y 32 p 7 ATP (Amersham, 5000 Ci mmol 1), on a ajouté 12 unités de polynucléotide- kinase de T 4 et on a laissé la réaction s'effectuer à 37 pendant 15 minutes On a ensuite ajouté 1 il d'ATP 10 m M et 12 unités de T 4-kinase et on a laissé la réaction s'effectuer pendant encore 30 minutes Après extraction avec un mélange de phénol et de chloroforme, on a mélangé l'oligomère phosphorylé II et l'oligomère 5 '-hydroxylé I avec 0,5 gg du fragment élué Sau 3 AI-Hha I de 55 paires de bases et 2 gg du fragment Hha I-Nar I de 263 paires de bases et on a effectué une précipitation à l'éthanol Ces fragments ont été attachés par ligation pendant 4 heures à la tempé- rature ambiante dans 60 il de chlorhydrate de tris 20 m M (p H 7,5), 10 m M de Mg C 12, 10 m M de dithiothréitol, 0,5 m M d'ATP et 1000 unités d'ADN-ligase de T 4 On a fait digérer le mélange pendant 1 heure avec 48 unités de Nar I, 20 uni- tés de Eco RI et 40 unités de Bgl II (pour empêcher la poly- mérisation par ligation d'extrémités cohésives de Sau 3 AI) et on a effectué l'électrophorèse sur un gel à 6 % Le produit à 338 paires de bases (environ 0,1 gg) a été recueilli par électro-élution Le reste des séquences de codage de t-PA (amino-acides 111-528) a été isolé sur un fragment de 1645 paires de bases par digestion du plasmide p PA 25 E 10 avec Nar I et Bgl II Le plasmide p Le IF Atrp 103 est un dérivé du plasmide p Le IFA 25 ( 52) dans lequel le site Eco RI le plus éloigné du gène Le IFA a été enlevé ( 53) Trois Fg du plasmide p Le IF Atrp 103 ont été digérés par 20 unités de Eco RI et 20 unités de Bgl II pen- dant 90 minutes à 37 C, traités par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 6 % et le grand fragment de vecteur (environ 4200 paires de bases) a été recueilli par électro-élution Pour la construction finale, on a effectué la ligation de 80 ng du plasmide p Le IF Atrp 103 digéré par Eco RI-Bgl II avec 100 ng du fragment Nar I-Bgl II de 1645 paires de bases et 20 ng du fragment Eco RI-Nar I de 338 paires de bases pendant 10 heures à la température ambiante Le mélange exposé à la ligation a été utilisé pour transformer la souche 294 de E coli K 12 De l'ADN de plasmide a été préparé à partir de 38 de ces transfor- mants et digéré par Eco RI Dix de ces plasmides contenaient les fragments désirés de Eco RI de 600 paires de bases et de 472 paires de bases L'analyse de la séquence d'ADN a permis de vérifier que l'un de ces plasmides (pt-P Atrp 12) avait la séquence de nucléotides désirée aux jonctions entre le promoteur de trp, l'ADN synthétique et le c ADN. La figure 10 montre le résultat d'une détermi- nation sur plaque de fibrine de l'activité fibrinolytique d'un produit d'expression de l'activateur de plasminogène de tissu selon l'invention Une culture de la nuit de E coli W 3110/pt-P Atrp 12 en bouillon Luria contenant 5 g ml -1 de tétracycline a été diluée au centième dans le milieu M 9 contenant 0,2 % de glucose, 0,5 % de casamino- acides et 5 gg m 1 1 de tétracycline On a fait croître les cellules à 37 jusqu'à une valeur A 550 de 0,2 et on a ajouté de l'acide indoleacrylique à une concentration finale de gg/ml Des échantillons ont été recueillis par centri- fugation à A 550 = 0,5-0,6 (environ 2 x 108 cellules ml-1) et on les a immédiatement congelés Les culots cellulaires ont été mis en suspension dans du chlorhydrate de guani- dine 6 M à 5 x 108 cellules/ml, traités aux ultrasons pen- dant 10 secondes, par incubation pendant 30 minutes - 24, puis par dialyse pendant 4 heures vis-à-vis d'une solution de chlorhydrate de tris 25 m M à p H 8,0 contenant 250 m M de Na Cl, 0,25 m M de EDTA et 0,01 % de Tween 80. Après dialyse, les échantillons ont été centrifugés à 13 000 x g pendant 2 minutes et 10 il des liquides sur- nageants ont été analysés en vue de déterminer l'activité de l'activateur de plasminogène de tissu En suivant la méthode de Granelli-Piperno et Reich ( 87), on a fait incu- ber la plaque pendant 3,5 heures à 37 C et on a mesuré les zones de lyse Les résultats quantitatifs ont été déterminés par comparaison à des dilutions d'une solution d'activateurde plasminogène de tissu de mélanome purifié. E.1 B Source de m ARN d'activateur-de plasminogène de tissu On a utilisé des cellules de mélanome humain (Bowes) Les cellules de mélanome ont été cultivées jus- qu'à l'obtention de monocouches confluentes dans 100 ml de milieu essentiel minimal de Earles additionné de bicarbonate de sodium (concentration finale 0,12 %), de 2 m M de glutamine et de 10 % de sérum de foetus de veau inactivé à la chaleur Pour confirmer le fait que les cellules de mélanome produisaient activement l'activateur de plasminogène de tissu humain, des cellules de mélanome humain ont été cultivées jusqu'à la confluence dans une boite de microtitrage à 24 alvéoles En présence ou en l'absence de 0,33 g M de l'inhibiteur de protéase appelé aprotinine, les cellules ont été lavées une fois avec de la solution physiologique de sel tamponné au phosphate et additionnées de 0,3 ml de milieu sans sérum et sans méthionine On a ajouté 75 g Ci de / 35 S_ 7- méthionine et on a marqué les cellules à 37 pendant 3 heures A la fin de la période de marquage de 3 heures, le milieu a été séparé des cellules et traité avec l'Ig G spécifique de l'activateur de plasminogène de tissu ou un sérum pré- immunitaire en vue de l'immunoprécipitation ( 54) Les produits immunoprécipités ont été mis en évidence par électrophorèse sur un gel d'acrylamide à 10 % de SDS. Le gel en plaque a été fixé, séché et soumis à la fluoro- graphie. E.1 C Isolement de l'ARN messager et fractionnement par longueurs L'ARN total de cultures de cellules de mélanome a été extrait en suivant essentiellement les indications données par Ward et collaborateurs ( 55) Les cellules ont été centrifugées et les culots de centrifugation ont été remis en suspension dans une solution contenant 10 m M de Na Cl, 10 m M de chlorhydrate de tris à p H 7,5 et 1,5 m M de Mg C 12 Les cellules ont été lysées par l'addition de NP-40 (concentration finale 1 %), et les noyaux ont été isolés par centrifugation La liqueur surnageante conte- nait l'ARN total qui a encore été purifié par des extrac- tions multiples au phénol et au chloroforme La phase aqueuse a été additionnée de Na Cl à une concentration de 0,2 M, puis l'ARN'total a été précipité par l'addition de 2 volumes d'éthanol La chromatographie sur oligo-d T- cellulose a été utilisée pour purifier le m ARN provenant des préparations totales d'ARN ( 51) A partir de 10 g de cellules de mélanome cultivées, des rendements représen- tatifs ont été de 5 à 10 mg d'ARN total et de 50 à 200 microgrammes de m ARN de poly(A) Le fractionnement du m ARN de poly A+ ( 200 gg) ( 56) a été effectué par électrophorèse au moyen de gels d'agarose à l'urée La plaque de gel d'agarose ( 57, 58) se composait de 1,75 % d'agarose, 0,025 M de citrate de sodium à p H 3,8 et 6 M d'urée L'électrophorèse a été effectuée pendant 7 heures sous intensité de 25 milli- ampères à 4 C Le gel a ensuite été fractionné avec une lame de rasoir Les tranches individuelles ont été fon- dues à 70 et extraites deux fois avec du phénol et une fois avec du chloroforme Des fractions ont ensuite été précipitées à l'éthanol, puis titrées par traduction in vitro dans un système consistant en un lysat réticulo- cytaire de lapin, de la firme Bethesda Research Lab. ( 59, 60), additionnées de microsomes de pancréas de chien comme indiqué ci-après: les traductions ont été effec- tuées en utilisant 25 g Ci de / -35 S_ 7-méthionine et 500 nano- grammes d'ARN de chaque tranche de gel, dans un volume final de 30 gl contenant 25 m M de HEPES, 48,3 m M de chlo- rure de potassium, 10 m M de phosphate de créatine, 19 amino-acides à la concentration de 50 m M chacun, 1,1 m M de chlorure de magnésium, 16 m M de EDTA, 0,16 m M de dithio- thréitol, 8,3 m M d'hémine, 16,6 gg/ml de créatine-kinase, 0,33 m M de chlorure de calcium, 0,66 m M de EGTA, 23,3 m M de chlorure de sodium. Les incubations ont été conduites à 30 C pendant minutes Des membranes de microsomes de pancréas de chien préparées à partir de microsomes bruts en utilisant 1 'EDTA pour éliminer les ribosomes ( 61) ont été traitées avec une nucléase comme décrit en ( 62) et ont été présentes dans le mélange exposé à la traduction à une concentration finale de 7 unités A 260/ml Les produits de traduction ou les produits de traduction immunoprécipités ont été ana- lysés par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide à 10 % dans du dodécylsulfate de sodium comme décrit ci- dessus ( 63) Les gels en plaque non colorés ont été fixés, séchés et soumis à la fluorographie ( 64). Les produits de traduction résultants provenant de chaque fraction de gel ont été immunoprécipités avec l'Ig G spécifique de lapin anti-activateur de plasminogène de tissu humain On a observé une bande polypeptidique immunoprécipitée principale dans la traduction des frac- tions d'ARN N 7 et 8 (migration de 21 à 24 S), ayant un poids moléculaire d'environ 63 000 daltons Cette bande n'a pas été observée lorsque de l'Ig G pré-immune a été utilisée pour l'immunoprécipitation, ce qui donne à penser que ces polypeptides étaient spécifiques de l'acti- vateur de plasminogène de tissu. 2526443 ' E.1 D Préparation d'une bibliothèque de colonies contenant des séquences d'activateur de plasminogène de tissu On a utilisé 5 gg de m ARN fractionné sur gel (m ARN de la tranche de gel N 7) pour la préparation du c ADN double-brin par des méthodes classiques ( 52, 65, 66). Le c ADN a été fractionné selon les longueurs sur un gel de polyacrylamide à 6 % Le c ADN d'une longueur supérieure à 350 paires de bases ( 125 ng) a été électro-élué On a allongé 30 ng de c ADN avec des résidus déoxy(C) en utili- sant la déoxynucléotidyl-transférase terminale ( 67) et on les a fixés avec 300 ng du plasmide p BR 322 ( 68) qui avait été allongé de la même façon avec des résidus déoxy(G) au niveau du site Pst I ( 67) Le mélange fixé a ensuite été transformé en la souche 294 de E coli K 12 (ATCC NO 31446) On a obtenu environ 4600 transformants. E.1 E Préparation d'un échantillon d'ADN L'activateur purifié de plasminogène de tissu humain a été obtenu conformément à la méthode décrite dans les références indiquées ( 19, 20). La molécule a été explorée en vue de localiser les régions le mieux adaptées à la préparation d'échan- tillons synthétiques, comme indiqué ci-après: Pour rendre les protéines sensibles à une diges- tion par la trypsine, on les a réduites et carboxyméthylées. Un échantillon de 2 mg d'activateur de plasminogène de tissu a tout d'abord été dialysé vis-à-vis de "Tween 80 " à 0,01 % pendant la nuit à la température ambiante La protéine lyophilisée a ensuite été dissoute dans 12 ml de tampon au chlorhydrate de tris 0,56 M (p H 8,6), à 8 moles d'urée et 5 mmoles d'EDTA Les liaisons disulfure ont été réduites par l'addition de 0,1 ml de $-mercapto- éthanol Cette réaction a été conduite sous atmosphère d'azote pendant 2 heures à 45 C Les disulfures réduits ont été alkylés en le dérivé carboxyméthylique par l'addi- tion de 1,0 ml d'acide iodacétique 1,4 M dans de l'hydroxyde de sodium 1 N Après 20 minutes à la température ambiante, la réaction a été arrêtée par dialyse vis-à-vis de 0,01 % de "Tween 80 " pendant 18 heures à la température ambiante, et le mélange a été lyophilisé. La protéine carboxyméthylée lyophilisée résul- tante a été redissoute dans 3 ml de tampon au phosphate de sodium 0,1 M (p H 7,5) De la trypsine (TPCK) a été ajoutée (rapport 1:50) et la digestion a été conduite à 370 C Des portions aliquotes ( 0,1 ml) ont été prélevées après 3 heures, 6 heures et 12 heures Une seconde addi- tion de trypsine a été effectuée après 12 heures La réaction a été arrêtée au bout de 24 heures par congéla- tion de l'échantillon jusqu'à ce qu'il puisse être injecté dans l'appareil de chromatographie en phase liquide sous haute pression La progression de la digestion a été déterminée par des gels additionnés de SDS sur les por- tions aliquotes Tous les gels n'ont rien présenté d'autre qu'une faible bande sur la portion aliquote corres- pondant à 3 heures Cela a indiqué que la digestion était totale au bout de 24 heures et qu'il ne restait pas de grands peptides. Un échantillon (environ 0,5 ml) a été injecté dans une colonne dlultrasphères de 5 M Altex C-8 à grande résolution permettant d'effectuer deux essais On a pré- paré un gradient d'acétonitrile ( 1 % à 5 % en 5 minutes, % à 35 % en 100 minutes, 35-50 % en 30 minutes) Dans l'un des deux essais préliminaires, l'éluant a été con- trôlé à deux longueurs d'ondes ( 210 nm et 280 na) Le rapport des absorptions aux deux longueurs d'ondes a été utilisé pour indiquer les peptides contenant du trypto- phane. Les pics des peptides risquant le plus de con- tenir du tryptophane, ou qui ont été jugés utiles pour d'autres raisons, ont été séquences les premiers Cela a permis la détermination de la séquence autour de la plupart des tryptophanes Après avoir formé la séquence d'environ 25 des meilleurs pics peptidiques possibles, toutes les données concernant la séquence qui ont pu être alignées ont été rasserblées en vue d'obtenir un modèle préliminaire de la structure primaire de l'activateur de plasminogène de tissu D'après ces données et ce modèle, on a localisé plusieurs échantillons possibles. E.1 F Identification de clones bactériens contenant des séquences de c ADN d'activateur de plasminogène de tissu Les colonies ont été inoculées individuellement dans des alvéoles de plaques de microtitrage contenant LB ( 93) + 5 gg/ml de tétracycline et elles ont été conser- vées à -20 C après l'addition de DMSO jusqu'à une concen- tration de 7 % Deux copies de la bibliothèque de colonies ont été développées sur des filtres de nitrocellulose et l'ADN de chaque colonie a été fixé au filtre par la méthode de Grunstein Hogness ( 69). L'échantillon de TC(A)CA(A)TA(C)TCCCA marqué au 32 P a été préparé à partir de l'ensemble des 14-mères oligomères synthétiques (W-E-Y-C-D) comme décrit ci-dessus. Des filtres contenant 4600 transformants ont été pré- hybridés pendant 2 heures à la température ambiante dans du phosphate de sodium 50 m M à p H 6,8, du SSC 5 X ( 80), gg/ml d'ADN de sperme de saumon traité aux ultrasons, la solution de Denhardt 5 X ( 85), du formamide à 10 %, puis hbridés avec 50 X 106 chocs par minute de l'échantil- lon marqué dans la même solution Après une incubation d'environ 16 heures à la température ambiante, les filtres ont été lavés trois fois à la température ambiante dans SSC 6 X, dans du SDS à 0,1 % pendant 30 minutes, une fois dans du SSC 2 X, puis exposés à un film radiographique Kodak XR5 avec des écrans renforçateurs Lightning Plus Dupont, pendant 16 heures. L'ADN de plasmide a été isolé par une méthode rapide ( 71) de toutes les colonies montrant une réaction positive d'hybridation Les insertions de c ADN venant de ces clones ont été séquencées ensuite après sub- clonage de fragments dans le vecteur mp 7 de M 13 ( 73) et par la méthode chimique de Maxam Gilbert ( 74) La figure 3 met en évidence le filtre N 25 montrant le diagramme d'hybridation d'un clone d'activateur de plasminogène de tissu positif Il a été démontré que l'insertion de c ADN dans le clone 25 E 10 était l'ADN codant pour l'activateur de plasminogène de tissu par comparaison de sa séquence d'amino-acides avec la séquence peptidique (voir ci-dessus) obtenue à partir d'un activateur de plasminogène de tissu purifié et par son produit d'expression élaboré dans E. coli comme décrit de façon plus détaillée dans ce qui suit Le clone 25 E 10 avait une longueur de 2304 paires de bases, le cadre de lecture ouvert le plus long codant une protéine de 508 amino-acides (poids moléculaire 56 756) et contenant une région 3 '-non traduite de 772 paires de bases Ce clone de c ADN ne présentait pas les séquences de codage de l'extrémité N. E.1 G Expression directe d'un clone d'activateur de plas- minogène de tissu humain dans E coli Conformément à la figure 6, on a fait digérer 50 gg de p PA 25 E 10 (voir ci-dessus) avec l'enzyme Pst I et on a isolé le fragment de 376 paires de bases par électrophorese sur un gel de polyacrylamide à 6 % Environ 3 gg de ce fragment ont été isolés du gel par électro- élution, digérés avec 30 unités de Dde I pendant 1 heure à 37 , le produit'-digéré a été extrait au phénol et au chloroforme et le produit extrait a été précipité à l'éthanol Les extrémités collantes de Dde I résultantes ont été allongées en extrémités tronquées par l'addition de 5 unités d'ADN-polymérase I (fragment de Klenow) et de d ATP, de d CTP, de d GTP et de d TTP ( 0,1 m M chacun) au mélange réactionnel et incubation à 4 C pendant 8 heures. Apres extraction au phénol et au chloroforme, l'ADN a été digéré avec 15 unités de Nar I pendant 2 heures, et le mélange réactionnel a été soumis à l'électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 6 % On a recueilli environ 0,5 Fg du fragment désiré de Nar I à extrémités tronquées, de 125 paires de bases Ce fragment code pour les amino- acides N 69 à 110 de la protéine de l'activateur de plasminogène de tissu de longueur entière à l'état mûr. Pour l'isolement du fragment Nar I Bgl II de 1645 paires de bases, on a fait digérer 30 gg de p PA 25 E 10 avec 30 unités de Nar I et 35 unités de Bgl II pendant 2 heures à 37 et on a effectué l'électrophorèse du mélange réactionnel sur un gel de polyacrylamide à 6 % On a recueilli environ 6 gg du fragment désiré Nar I Bgl II de 1645 paires de bases. Le plasmide pdelta RISRC est un dérivé du plasmide PSR Cex 16 ( 79) dans lequel les sites Eco RI le plus proches du promoteur de trp et le plus éloignés du gène SRC ont été éliminés par réparation avec l'ADNpolymérase I ( 28), et 1 'oligodésoxynucléotide autocomplémentaire AATTATGAATTCAT (synthétisé par la méthode au phosphotriester ( 75)) a été inséré dans le site Eco RI restant immédiatement adjacent au site Xba I 20 gg de pdelta RISRC ont été digérés totale- ment avec l'enzyme Eco RI, extraits au phénol et au chloro- forme et précipités à l'éthanol Le plasmide a été digéré ensuite à 100 unités de nucléase Sl à 16 C pendant 30 mi- nutes dans de l'acétate de sodium 25 m M (p H 4,6), du chlorure de zinc 1 m M et du chlorure de sodium 0,3 M pour créer une extrémité tronquée avec la séquence ATG Après extraction au phénol et au chloroforme et précipitation à l'éthanol, l'ADN a été digéré avec l'enzyme Bam H 1, traité par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 6 % et le grand fragment de vecteur ( 4300 paires de bases) a été recueilli par électro-élution. Le plasmide d'expression a été assemblé par ligation conjointe de 0,2 gg de vecteur, 0,06 gg du fragment allant de l'extrémité tronquée à Nar I de 125 paires de bases et 0,6 gg du fragment Nar I Bgl II de 1645 paires de bases avec 10 unités d'ADN-ligase de T 4 pendant 7 heures à la température ambiante et il a été utilisé pour transformer la souche 294 de E coli (ATCC N 31446) pour la rendre résistante à l'ampicilline. L'ADN de plasmide a été préparé à partir de 26 des colonies et il a été digéré avec Xba I et Eco RI Douze de ces plasmides contenaient les fragments Xba I Eco RI de 415 paires de base et Eco RI de 472 paires de bases désirés. L'analyse de la séquence d'ADN a permis de vérifier que plusieurs de ces plasmides avaient un codon d'initiation ATG correctement placé au début de l'amino-acide N 69 (sérine) L'un de ces plasmides, p ARIPA , a été testé et a produit l'activateur de plasminogène de tissu désiré (figure 7). E.1 H c ADN d'activateur de plasminogène de tissu de longueur intégrale a) Préparation d'une bibliothèque de colonies contenant des séquences d'activateur de plasminogène de tissu à terminaison N On a utilisé 0,4 gg de l'oligonucléotide syn- thétique 5 ' TTCTGAGCACAGGGCG 3 ' pour l'amorçage de 7,5 jg de m ARN de la fraction de gel N 8 (ci-dessus) afin de préparer du c ADN double brin par des procédés classiques ( 65, 66) Le c ADN a été fractionné selon les longueurs sur un gel de polyacrylamide à 6 % Une fraction de longueur supérieure à 300 paires de bases ( 36 ng) a été électro-éluée 5 ng de c ADN ont été allongés avec des résidus déoxy(C) en utilisant la déoxycytidyl-transférase terminale ( 67) et ils ont été fixés avec 50 ng du plasmide p BR 322 ( 68) qui a été allongé de la même façon avec des résidus déoxy(G) au niveau du site Pst I ( 67) Le mélange fixé a été transformé ensuite en souche 294 de E coli K 12 On a obtenu environ 1500 transformants. b) Hybridation Southern d'ADN de génome humain Attendu que la réaction d'amorçage de c ADN a été effectuée en utilisant un fragment synthétique qui hybridait 13 paires de bases de l'extrémité N du clone p PA 25 E 10, aucun fragment de restriction commode n'a été disponible dans cette région de 29 paires de bases (qui comprend la séquence 16-mérique) pour la sélection des clones de c ADN Par conséquent, il a été nécessaire d'isoler un clone génomique d'activateur de plasminogène de tissu humain en vue d'identifier tous clones de c ADN allongés par amorçage, contenant des séquences de codage de l'activateur de plasminogène de tissu à extrémité N. La première étape de ce procédé a impliqué l'établissement du fait qu'un unique gène homologue d'activateur de plasminogène de tissu est seul présent dans l'ADN de génome humain Pour déterminer ce fait, on a effectué une hybridation selon Southern Dans cette méthode ( 77), on a fait digérer 5 gg d'ADN lymphocytaire humain de haut poids moléculaire (préparé comme indiqué en 80) jusqu'à épuisement avec diverses endonucléases de restriction, on a procédé à l'électrophorèse sur des gels d'agarose à 1,0 % ( 81) et on a effectué l'absorption sur un filtre de nitrocellulose ( 77) Un échantillon d'ADN marqué au 32 p a été préparé ( 76) à partir de l'ex- trémité 5 ' de l'insertion de c ADN du clone de c ADN p PA 25 E 10 (fragment Hpa II RSA I de 230 paires de bases) et on l'a hybridé ( 82) avec le filtre de nitrocellulose. L'échantillon a été hybridé en quantité de 35 x 106 chocs par minute pendant 40 heures, puis il a été lavé comme décrit ( 82) Deux modèles de digestion par endonucléase donnent un seul fragment d'ADN d'hybridation: Bgl II ( 5700 paires de bases) et Pvu II ( 4200 paires de bases). Deux fragments d'ADN d'hybridation ont été observés avec Hinc II ( 5100 paires de bases) et 4300 paires de bases. Ces données, prises ensemble, suggèrent la présence d'un unique gène d'activateur de plasminogène tissulaire dans le génome humain, et que ce gène contient au moins une séquence intermédiaire. c) Sélection de la bibliothèque de phage X humain pour des gènes d'activateur de plas- minogène tissulaire La stratégie utilisée pour identifier les recom- binants du phage X portant des gènes d'activateur de plas- minogène tissulaire a consisté à détecter l'homologie des nucléotides avec un échantillon radio-actif préparé à partir du clone p PA 25 E 10 de l'activateur de plasminogène tissulaire Un million de recombinants de phage X ont été déposés sur DP 50 Sup F à une densité de 10 000 pfu/plaque de 15 cm et des répliques sur filtre de nitrocellulose ont été préparées pour chaque plaque par la méthode de Benton et Davis ( 78) On a préparé unéchantillon d'ADN marqué au 32 p par des méthodes normalisées ( 83) à partir d'un fragment Hpa II Rsa I de 230 paires de bases situé à une distance de 34 paires de bases de l'extrémité 5 ' du clone p 25 E 10 Chaque filtre de nitrocellulose a été pré-hybridé à 42 pendant 2 heures dans du phosphate de sodium 50 m M (p H 6,5), du SSC 5 X ( 77), 0,05 mg/ml d'ADN de sperme de saumon traité aux ultrasons, la solution de Denhardt 5 X ( 84), du formamide à 50 %, puis hybridé avec 50 x 106 chocs par minute de l'échantillon marqué dans la même solution contenant 10 % de dextrane-sulfate de sodium ( 85) Après incubation pendant une nuit à 42 C, les filtres ont été lavés quatre fois à 50 dans du SSC 0,2 X, du SDS à 0,1 % pendant 30 minutes, une fois dans du SSC 2 X à la température ambiante, puis ils ont été exposés à un film radiographique Kodak XR-5 pendant la nuit, avec des écrans renforçateurs Cronex de la firme Dupont On a obtenu un total de 19 clones qui se sont hybridés avec l'échantillon L'ADN phagique a été pré- paré comme décrit ci-dessus ( 86) à partir de 6 recombi- nants Le clone C de À a été choisi pour la préparation d'un fragment de Pvu II pour la sélection des colonies. On a fait digérer 30 gg d'ADN avec l'enzyme Pvu II pen- dant 1 heure à 37 et on a procédé à l'électrophorèse sur des gels d'agarose à 1,0 % Un fragment de 4200 paires de bases, dont on avait montré au préalable qu'il con- tenait des séquences d'activateur de plasminogène tissu- laire, a été électro-élué et purifié Un échantillon mar- qué au 32 p a été préparé par des méthodes classiques ( 83) pour des hybridations de colonies, comme décrit ci-dessous. d) Sélection d'une bibliothèque de colonies pour des séquences d'activateur de plasmi- nogène tissulaire à extrémité 5 ' Les colonies ont été transférées de plaques sur des filtres de nitrocellulose sur lesquels elles se sont développées et l'ADN de chaque colonie a été fixé au filtre par la méthode de Grunstein-Hogness ( 69) Un échantillon marqué au 32 p a été préparé par amorçage au thymus de veau ( 83) d'un fragment de Pvu II de 4200 paires de bases provenant d'un clone génomique X isolé d'activateur de plasminogène tissulaire Des filtres contenant les 1500 transformants ont été hybridés avec 112 x 10 o 6 chocs par minute de fragment de Pvu II génomique marqué au 32 P L'hybridation a été effectuée pendant 16 heures, dans les conditions décrites par Fritsch et collaborateurs ( 82) Les filtres ont été lavés abondam- ment, puis exposés à un film radiographique Kodak XR-5 avec des écrans renforçateurs Lightning-Plus de la firme Dupont, pendant 16-48 heures Dixhuit colonies se sont nettement hybridées avec l'échantillon génomique De l'ADN plasmidique a été isolé de chacune de ces colonies et a été lié à des filtres de nitrocellulose et hybridé avec l'oligonucléotide synthétique marqué au 32 p ( 16- mère) utilisé pour la réaction initiale d'amorçage Sur les 18 clones, sept se sont hybridés avec le 16-mère ayant subi l'action de la kinase Lors de l'analyse de la séquence après sub-clonage de fragments en le vecteur mp 7 de m 13 ( 73), il a été démontré qu'un clone (p PA 17) contenait la région terminale N 5 ' correcte de l'activa- teur de plasminogène de tissu, une séquence de direction de signal et une région non traduite en 5 ' de 84 paires de bases La séquence totale des nucléotides (figures 5 a, b et 5 c) et la carte de restriction (figure 4) d'un clone d'activateur de plasminogène tissulaire de longueur intégrale ont été déterminées d'après les deux clones p PA 25 E 10 et p PA 17. La molécule d'activateur de plasminogène de tissu naturel a la possibilité d'être stabilisée par 17 ponts disulfure sur la base de l'homologie avec d'autres sérine -protéases Il y a quatre sites potentiels de N-glycosylation, trois situés dans les régions "annu- laires" en ASN 117, ASN 184 et ASN 184 et un site potentiel dans la région de la chaîne légère, en ASN 448 Des varia- tions de structures des ligands oligosaccharidiques peuvent être responsables des différences de formes moléculaires (espèces de poids moléculaires 65 000 et 63 000). E 1 I Expression directe du clone de c ADN d'activateur de plasminogène de tissu à longueur intégrale dans E coli Une nouvelle construction de la séquence de codage entière a été possible en utilisant le site d'endonucléase de restriction Hha I partagé par les deux clones partiels p PA 17 et p PA 25 E 10 Un fragment de restriction Sau 3 AI-I Hha I de 55 paires de bases correspondant aux amino- acides 5-23 a été isolé du plasmide p PA 17 Le site de restriction Sau 3 AI était localisé au niveau du codon quatre de la séquence de codage mûre présumée et il a été utilisé pour éliminer la région de codage du peptide de signal. Un fragment Hha I-Nar I de 263 paires de bases (codant pour les aminoacides 24-110) a également été isolé du plasmide p PA 25 E 10 On a conçu deux désoxyoligonucléotides synthéti- ques qui rétablissent les codons pour les amino-acides 1-4, incorporent un codon d'initiation de traduction ATG et créent un terminus cohésif Eco RI Ces trois fragments ont ensuite été reliés ensemble par ligation pour former un fragment de 338 paires de bases codant pour les amino- acides 1-110 Ce fragment et un fragment Nar I-Bgl II de 1645 paires de bases du plasmide p PA 25 E 10 a été attaché ensuite entre les sites Eco RI et Bgl II du plasmide p Le IF Atrp 103 ( 53) pour donner le plasmide d'expression pt-P Atrp 12 Le gène de t-PA cloné est transcrit sous l'influence d'un fragment de 300 paires de bases de l'opé- ron trp de E coli qui contient le promoteur trp, l'opéra- teur et la séquence de Shine-Dalgarno du peptide directeur trp, mais n'a pas le codon d'initiation ATG du peptide directeur ( 52). On a cultivé la souche W 3110 (ATCC N 27325) de E coli K 12 contenant le plasmide pt-P Atrp 12, et on a préparé les extraits en vue de déterminer l'activité fibrinolytique Une méthode utilisée pour mesurer l'acti- vité de l'activateur de plasminogène de tissu est l'épreuve sur plaque de fibrine ( 87) Cette méthode mesure la pro- portion de formation de plasmine en déterminant le degré de digestion de la fibrine par la plasmine dans une pla- que d'agarose contenant du plasminogène et de la fibrine. La plasmine produit dans la plaque de fibrine une zone de lyse bien visible, et l'aire de cette zone peut être mise en corrélation avec la quantité d'activateur de plasminogène de tissu dans l'échantillon Lorsque des extraits de clones de pt-P Atrp 12 sont testés en vue de déterminer l'activité de l'activateur de plasminogène de tissu d'après l'épreuve sur plaque de fibrine, une zone lysée claire est évidente Cette activité fibrinolytique est inhibée par une Ig G anti t-PA, mais non par l'Ig G pré-immunitaire ou Ig G anti-urokinase et aucune activité n'apparaît dans un extrait préparé à partir de cellules contenant comme témoin le plasmide p Le IF Atrp 103 d'inter- féron leucocytaire L'utilisation d'une courbe étalon de t-PA purifié montre qu'il est possible d'estimer qu'environ 20 unités d'activité extraite pour 109 cellules sont obtenues (pour le t-PA purifié, 90 000 unités Plough 1 mg) (figure 10). E.1 J Analyse de la séquence L'analyse de la séquence a été basée sur la dégradation selon Edman ( 83 b) L'échantillon a été intro- duit dans la cuve de l'appareil séquenceur à cuve tournante Beckman 890 B ou 890 C On a utilisé le produit de marque déposé"Polybrene"(diacétate de N,N,N 1,N 1-tétraméthyl-N- triméthylènehexaméthylène-diammonium) comme support dans la cuve ( 63 C) Le séquenceur a été modifié par adaptation d'un piège froid et avec certains changements de programme pour réduire les pics du bruit de fond Les réactifs étaient le tampon Quadrol décimolaire pour séquence Beckman, l'iso- thiocyanate de phényle et l'acide heptafluorobutyrique. Les cycles d'Edman recueillis ont été convertis manuellement en dérivés de 2-anilino-5-thiazolinone Le 1-chlorobutane a été séché sous atmosphère d'azote Ensuite, on a ajouté une solution aqueuse de H Cl 1,0 N à la 2- anilino-5-thiazolinone et on a chauffé le mélange à 70 C pendant 10 minutes pour convertir le composé en la 3- phényl-2-thiohydantoine (dérivé PTH) Le résidu d'amino- acide de PTH a été dissous ensuite dans de l'acétonitrile à 50 % et de l'eau et la solution a été injectée dans un chromatographe en phase liquide à haute pression à phase inversée Chaque amino-acide de PTH a ensuite été identifié par comparaison aux temps de rétention d'un mélange de PTH-amino-acides de référence qui a été intro- duit dans la fiole de transformation et traité de la * même façon qu'un cycle provenant du séquenceur. E.1 K Epreuves de détection de l'expression de l'activateur de plasminogène de tissu 1 Epreuve directe de formation de plasmine a Théorie Une épreuve sensible de détection de l'activa- teur de plasminogène de tissu peut être obtenue par le contrôle de la transformation, catalysée par l'activateur de plasminogène de tissu, du plasminogène en plasmine. La plasmine est un enzyme pour laquelle il existe des épreuves sur substrat chromogénique Ces épreuves sont basées sur la séparation protéolytique par clivage d'un tripeptide d'un groupe chromophore Lavitesse de clivage est directement proportionnelle à la spécificité et à la concentration de la protéase en cours d'essai La base de l'épreuve est la détermination de la quantité de plasmine formée après incubation de la solution contenant l'acti- vateur de plasminogène de tissu avec une solution de plasminogène La quantité de plasmine formée est d'autant plus grande que la quantité d'activateur est plus forte. On dose la plasmine en contrôlant son clivage du substrat chromogénique 52251 (produit de la firme Kabi Group, Inc, Greenwich,CT). b Mode opératoire On mélange une portion aliquote de l'échantillon avec 0,10 ml de plasminogène à 0,7 mg/ml (dans du chlorhy- drate de tris 0,05 M à p H 7,4 contenant Na Cl 0,012 M) et on ajuste le volume à 0,15 ml On fait incuber le mélange à 37 C pendant 10 minutes, on ajoute 0,35 ml de 52251 (solution 1,0 m M dans le tampon ci-dessus) et on poursuit la réaction pendant 30 minutes à 37 C On ajoute de l'acide acétique cristallisable ( 25 u 1) pour achever la réaction. On centrifuge les échantillons et on mesure l'absorption à 405 nm L'expression quantitative de l'activité s'obtient par comparaison avec une solution d'urokinase de référence. Les conditions expérimentales pour la détection de l'acti- vateur de plasminogène de tissu à longueur intégrale ont été modifiées par l'addition de fibrinogène ( 0,2 mg) à la solution Le fibrinogène entraîne une stimulation de l'activité de l'activateur de plasminogène de tissu obser- vée, et il en résulte donc un niveau d'activité légèrement élevé L'activité a été notée en unités Plough, 90 000 unités Plough étant égales à l'activité que présente 1 mg d'activateur de plasminogène de tissu purifié. 2 Epreuve indirecte de formation de plasmine a Théorie On a mis au point ( 87) une épreuve sensible de détermination de l'activité de l'activateur de plasmi- nogène tissulaire L'épreuve est basée sur la détermina- tion de la formation de plasmine par mesure du degré de digestion de la fibrine par la plasmine dans une plaque de gélose contenant de la fibrine et du plasminogène. La plasmine produit une zone lysée claire dans la plaque de fibrine L'aire de cette zone de lyse peut être mise en corrélation avec la quantité'd'activateur de plasmino- gène de tissu contenue dans l'échantillon. b Mode opératoire En suivant le mode opératoire de Granelli-Piperno et Reich ( 87), on a fait incuber les plaques pendant 3,5 heures à 37 C et on a mesuré les zones de lyse L'expres- sion quantitative a été effectuée par comparaison avec une solution normalisée d'urokinase. E.1 L Détection de l'activité d'activateur de plasminogène de tissu 1 Croissance bactérienne et préparation de l'échantillon Une colonie de E coli contenant le plasmide (p ARIPA ) a été inoculée dans un tube à essai contenant ml de milieu de croissance LB contenant 20 gg/ml d'am- picilline Les cellules se sont développées pendant la nuit à 37 C Une portion aliquote de cette culture a été diluée à 1:100 dans 300 ml de milieu M 9-contenant gg/ml d'ampicilline Les cellules ont été cultivées dans une fiole agitée par secousses à 37 C pendant 4 heures, et il en est résulté une absorption à 550 nm de 0,419 De l'acide indole-acrylique, analogue du tryptophane, a été ajouté à une concentration de 30 gg/ml On a fait incuber les cellules pendant 90 minutes et il en est résulté une absorption à 550 nm de 0,628 Les cellules ont été récol- tées par centrifugation et remises en suspension dans 0,8 ml de tris 0,01 M à p H 8,0 contenant de l'EDTA 0,01 M. La suspension résultante a été agitée rapidement à la température ambiante pendant 18 heures L'échantillon a été centrifugé et la liqueur surnageante a été titrée en vue de déterminer l'activité de l'activateur de plasmino- gène de tissu. Pour l'expression de pt-P Atrp 12, voir la des- cription détaillée à propos de la légende de la figure 10. 2 Détection de l'activité Les tableaux I et II montrent les résultats de l'activation du plasminogène par des extraits respectifs de E coli lorsqu'ils ont été éprouvés L'activité engendrée dépend de la présence de plasminogène (tableau I) Cette activité n'est-pas-affectée par le sérum pré-immunitaire d'un lapin, mais elle est nettement inhibée par l'anti- sérum qui a été produit contre l'activateur purifié de plasminogène de tissu dérivé de cellules de mélanome ( 88) (tableaux I et II) Cela démontre que les extraits de E coli produisent une activité influençant le plasminogène qui est inhibée par des anticorps contre l'activateur de plasminogène de tissu. La figure 7 illustre le résultat d'une épreuve sur plaque de fibrine pour la détermination de l'activité fibrinolytique Une quantité normalisée d'urokinase a été ajoutée à la rangée centrale à des concentrations, de gauche à droite, de 0,24, 0,14, 0,10, 0,05 et 0,02 unité Plough La rangée inférieure correspond à des échantillons d'activateur naturel de plasminogène de tissu, avec la même quantité d'enzyme dans chaque alvéole Les alvéoles contiennent, de gauche à droite, l'activateur de plasmino- gène de tissu, l'anti-activateur de plasminogène de tissu addi- tionné de sérum pré-immun et l'activateur de plasminogène de tissu additionné d'anticorps contre ledit activateur. Les alvéoles de la rangée supérieure contiennent chacun 8 gl des extraits d'activateur de plasminogène tissulaire recombinant de E coli Le premier alvéole représente l'extrait seul, le deuxième est additionné du sérum pré- immun et le troisième est additionné des anticorps contre l'activateur de plasminogène de tissu Il est évident que le sérum préimmun n'affecte pas l'activateur naturel ou recombinant de plasminogène de tissu, et que les anti- corps contre l'activateur de plasminogène de tissu inhibent l'activité des extraits naturels ainsi que des extraits de E coli Sur la base des étalons d'urokinase, des extraits contiennent un peu moins de 2,5 unités Plough par ml Cela supporte favorablement la comparaison avec la valeur de 1,3 unité Plough/ml obtenue sur le tableau I. Les tableaux I et II reproduisent les résultats d'épreuves effectuées comme décrit ci-dessus en E 1 K 1 b: TABLEAU I Activation du plasminogène par des extraits de E coli de cultures contenant le plasmide p ARIPA Echantillon A 405 Activité,1 Unités Plough % calculées par ____ml Extrait (sans plasminogène) 0,043 ( 0) Extrait 0, 451 ( 100) 1,3 Extrait plus sérum pré-immun 0,477 106 Extrait plus anicorps anti t-PA 0,079 9 1 Pourcentage d'activité calculé en retranchant le blanc ( 0,043) des valeurs obtenues et en divisant par la valeur obtenue pour l'extrait. TABLEAU II Activation du plasminogène par des extraits de E coli des cultures de ptP Atrp 12 Echantillon A 405 Activité, % Extrait 0,657 ( 100) Extrait plus sérum pré-immun 0,665 101 Extrait plus anticorps anti t-PA 0,059 9 La figure 10 illustre les résultats d'une épreuve sur plaque de fibrine effectuée avec des extraits de cultures par fermentation, d'un volume de 10 litres, de E coli contenant un plasmide exprimant l'activateur de plasminogène de tissu L'activité fibrinolytique de l'extrait contenant l'activateur de plasminogène est représentée par l'alvéole A sur la figure 10 Cette acti- vité fibrinolytique est inhibée par l'Ig G anti t-PA (alvéole C) mais non par l'Ig G pré-immunitaire (alvéole B) ou l'Ig G anti-urokinase (alvéole D), et aucune activité n'est observée de la part d'un extrait préparé à partir de cellules contenant comme témoin le plasmide p Le IF Atrp 103 de l'interféron leucocytaire (alvéole H). E.2 Production de t PA en utilisant la protéine DHFR à faible affinité de liaison pour MTX E 2 A Construction du vecteur La séquence codant l'activateur de plasminogène de tissu humain (t-PA) est insérée dans un plasmide d'expression contenant une protéine DHFR mutante à faible affinité de liaison pour MTX, décrite dans la demande de brevet des EtatsUnis d'Amérique N 459 151 déposée le 19 Janvier 1983, incorporée ici à titre documentaire, par la méthode suivante (voir figure 11): Trois fragments de plasmides de t-PA à recouvre- ment, à savoir p PA 25 E 10, p PA 17 et p ARIPA (ci-dessus), ont été préparés comme suit: le plasmide p PA 17 a été digéré avec l'enzyme Dde I, assemblé en utilisant l'ADN- polymérase Klenow I, et sectionné secondairement avec Pst I; le fragment d'environ 200 paires de bases contenant la séquence t-PA à extrémité 5 ' ainsi engendrée a été isolé. Le second fragment de t-PA a été obtenu par digestion de p ARIPA O avec Pst I et Nar I et isolement d'une fraction d'environ 310 paires de bases Le troisième fragment de t-PA a été obtenu par digestion de p PA 25 E 1 O avec Nar I et Bgl Il et isolement du fragment d'environ 1645 paires de bases qui contient, en plus d'une grande partie de la région codant t-PA, quelques séquences non traduites à extrémité 3 '. Le plasmide p E 342 qui exprime l'antigène de surface HBV (également appelé p H Bs 348-E) a été décrit par Levinson et collaborateurs dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique N' 326 980 déposée le 3 Décembre 1981, que l'on mentionne ici à titre documentaire (En bref, l'origine du virus simien SV 40 a été isolé par diges- tion d'ADN de SV 40 avec l'enzyme Hind III et transformation des extrémités Hind III en extrémités Eco RI par addition d'une séquence de transformation (AGCTGAATTC) Cet ADN a été coupé avec Pvu II, et des liaisons RI ont été ajou- tées Après digestion avec Eco RI, le fragment de 348 paires de bases recouvrant l'origine a été isolé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et électro-élution, et cloné dans p BR 322 Le plasmide d'expression PH Bs 348-E a été construit par clonage du fragment de 1986 paires de bases résultant de la digestion par Eco RI et Bgl II de HBV (Animal Virus Genetics, (chapitre 5), Acad Press, N Y ( 1980)) (qui recouvre le gène codant H Bs Ag) en le plasmide p ML (Lusky et collaborateurs, Nature, 293:79 ( 1981) au niveau des sites Eco RI et Bam HI (p ML est un dérivé de p BR 322 qui présente des séquences éliminant la délétion qui sont inhibitrices pour la réplication de plasmides dans des cellules de singe) Le plasmide résultant (p RI-Bgl) a été ensuite linéarisé avec Eco RI, et le fragment de 348 paires de bases représentant la région originelle de SV 40 a été introduit dans le site Eco RI de p RI-Bgl Le fragment ori- ginel peut s'insérer dans une orientation quelconque. Attendu que ce fragment code à la fois les promoteurs du début et de la fin de SV 40 en plus de l'origine de répli- cation, des gènes de HBV pourraient être exprimés sous le contrôle d'un promoteur quelconque selon cette orientation (p HB 5348-E représentant H Bs exprimé sous le contrôle du promoteur de début) p E 342 est modifié par digestion par- tielle avec Eco RI, assemblage dans le site clivé au moyen d'ADNpolymérase Klenow I et fermeture du plasmide sur lui-même par ligation, en éliminant ainsi le site Eco RI précédant l'origine SV 40 dans p E 342 Le plasmide résul- tant, appelé p E 342 AR 1, est digéré avec Eco RI, assemblé au moyen d'ADN-polymérase Klenow I et coupé secondairement avec Bam HI Après électrophorèse sur gel d'acrylamide, le fragment d'environ 3500 paires de bases est électro- élué, extrait au phénol et au chloroforme et précipité à l'éthanol comme ci-dessus. Le vecteur de p 342 E de 3500 paires de bases ainsi préparé et les fragments de t PA décrits ci-dessus comprenant environ 2160 paires de bases ont été assemblés par ligation par des techniques normalisées Un plasmide contenant les trois fragments codant t PA dans l'orienta- tion correcte a été isolé, caractérisé et appelé p E 342-t-PA. Ce plasmide a ét'é digéré avec l'enzyme Sac II et traité avec la phosphatase alcaline bactérienne (BRL) Pour réa- liser la fréquence DHFR (en même temps que les séquences de contrôle pour son expression), un fragment d'environ 1700 paires de bases a été engendré par digestion de p EHER par l'enzyme Sac II (p EHER est un plasmide exprimant la protéine DHFR de mutant, décrit dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 459 151 précitée) Ce fragment a été introduit par ligation dans le plasmide p E 342-t-PA pour créer le plasmide p Ed PAER 400, qui est analogue au plasmide p EHER, à la différence que la région codant H Bs Ag a été remplacée par les séquences de c ADN venant de t-PA. E.2 B Expression et amplification de la séquence t-PA Le plasmide t ETPAER 400 (p ETPER) a été introduit dans des cellules CHO-DUX dhfr et dans des cellules CHO-K 1 (ATCC CCL 61) DHFR+ par le procédé décrit par Graham et Van der Eb (voir ci-dessus) Des cellules dhfr transformées ont été choisies par croissance en milieu déficient en glycine,hypoxanthine et thymidine Les cellules DHFR+ transformées ont été choisies par croissance en milieu ayant une concentration en MTX supérieure ou égale à 100 n M Les colonies qui sont apparues sur le milieu de sélection approprié ont été isolées au moyen d'anneaux de clonage et propagées dans le même milieu jusqu'à l'obtention de plusieurs générations. En vue de l'amplification, des cellules prove- nant des colonies sont divisées dans des milieus conte- nant 5 x 104, 105, 2,5 x 105, 5 x 105 et 106 n M de MTX et les passages sont répétés plusieurs fois Des cellules sont reproduites à de très faibles densités cellulaires ( 102 _ 103 cellules/plaque) dans des bottes de 10 cm et les colonies résultantes sont isolées. E.2 C Méthodes d'analyse L'expression de t-PA dans les colonies amplifiées transférées peut être analysée avantageusement par les méthodes semblables à celles qui sont indiquées en D 1 K 1 b ci-dessus. La coamplification des séquences DHFR et t-PA est analysée par isolement d'ADN de monocouches confluentes de colonies amplifiées comme indiqué ci-après: des mono- couches confluentes en bottes de 150 mm sont lavées avec 50 ml de PBS stérile et lysées par addition de 5 ml de solu- tion à 0,1 % de SDS, 0,4 M en Ca C 12 et 0,1 M en EDTA, à p H 8 Au bout de 5 à 10 minutes, le mélange est séparé, extrait au phénol, extrait au chloroforme et précipité à l'éthanol L'ADN est remis en suspension dans 1 ml (par boite de 150 mm) de chlorhydrate de tris 10 m M à p H 8, 1 m M en EDTA (TE), de l'AR Nase est ajoutée à une concen- tration de 0,1 mg/ml et la solution est maintenue sous incubation pendant 30 minutes à 37 Du SDS est ensuite ajouté en proportion de 0,1 % et de la pronase (Sigma) est ajoutée en proportion de 0,5 mg/ml Après incubation à 37 pendant 3 à 16 heures, la solution est de nouveau extraite au phénol, extraite au chloroforme et précipitée à l'éthanol Le culot d'ADN est remis en suspension dans 0,5 mil d'eau et digéré avec des enzymes de restriction. Une quantité d'environ 5-10 gg d'ADN digéré est traitée par électrophorèse en gel d'agarose /1 % d'agarose dans un tampon d'acétate de tris ( 40 m M de tris, 1 m M d'EDTA, p H ajusté à 8,2 avec de l'acide acétique)-7; Crouse et collaborateurs, J Biol Chem, 257:7887 ( 1982)> Après que le bleu de bromophénol utilisé comme colorant a émigré sur les deux tiers du trajet en pénétrant dans le gel, ce dernier est retiré et coloré au bromure d'éthidium. Après visualisation de l'ADN en lumière ultraviolette, l'ADN est transféré du gel à des filtres de nitrocellulose conformément à la méthode de Southern (J Mol Biol 98:503 ( 1975)) Les filtres sont ensuite hybridés avec un échan- tillon traduit par coupures, formé à partir du fragment Sac Il de p EHER de 1700 paires de bases (préparé et hybridé comme décrit ci-dessus) ou à partir du fragment Bgl II de p ETPER d'environ 1970 paires de bases. E.3 Production de t-PA conjointement avec la protéine DHFR de type sauvage E 3 A 'Construction du vecteur Par un mode opératoire analogue à celui qui a été utilisé dans la construction de p ETPER, on a construit un plasmide contenant la séquence d'ADN p ETPFR codant la protéine DHFR de type sauvage La construction a été telle que décrite dans l'exemple C 1 A, à la différence qu'on a remplacé le plasmide p EHER comme source de séquence du gène de protéine DHFR par le plasmide p E 342 HBV E 400 D 22 décrit dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique - Le plasmide p E 342 HBV E 400 D 22 est le même que le plasmide p EHER, excepté une différence d'une seule paire de bases entre la protéine DHFR de type sauvage et de type mutant. Par conséquent, le plasmide p ETPFR résultant est analogue en tout point au plasmide p ETPER, sauf que la séquence d'ADN codant pour la protéine DHFR de type sauvage remplace celle de la forme mutante. E.3 B Expression de la séquence t-PA Le plasmide p ETPFR a été utilisé pour la trans- fection de cellules CHO déficientes en DHFR (Urlaub et Chasin (ci-dessus>) en utilisant la méthode de précipita- tion au phosphate de calcium de Graham et Van der Eb. Vingt et une colonies qui avaient été produites sur le milieu sélectif (-HGT) ont été éprouvées par détection de la formation de plasmine, comme mis en évidence par la digestion de fibrine dans une plaque de gélose contenant de la fibrine et du plasminogène, comme décrit par Granelli- Piperno et collaborateurs dans J Exp Med, 148:223 ( 1978). Quatre des meilleurs clones positifs ont ensuite été soumis à un dosage quantitatif de la formation de plasmine sur une base rapportée à lacellule, conformément à la méthode décrite en D 2 C. Lors de ce dosage quantitatif, on a trouvé que les quatre clones testés présentaient la même sécrétion de t-PA ou une sécrétion comparable dans le milieu, déter- minée en unités/cellule/jour On a préparé des sous-clones en transférant des inoculums de deux des clones dans des bottes séparées contenant le milieu -HGT Deux des sous- clones résultants, 18 B et 1, ont été utilisés en vue d'une analyse subséquente. E 3 C Amplification et taux de production de t-PA Les sous-clones cidessus ont été développés à la densité de 2 x 105 cellules/bolte de 100 mm dans du MTX r M pour favoriser l'amplification Lorsque les cellules survivantes ont été titrées de la manière décrite ci-dessus, elles ont donné dans tous les cas environ dix fois la quan- tité non amplifiée d'activité de l'activateur de plasmino- gène de tissu Deux de ces clones ont été choisis pour des études complémentaires et ont été nommés 1-15 et 18 B-9. Le sous-clone 1-15 a encore été amplifié par inoculation de 2 x 105 cellules dans des bo 5 tes de 100 mm contenant du MTX 500 n M Le titrage des cellules ainsi amplifiées a donné un nouvel accroissement (d'un facteur 3 environ) de la production de t-PA; lorsqu'elles ont été titrées quantitativement par la méthode du paragraphe C 1 C, les taux ont été de l'ordre de 7 x 10-4 unités/cellule/jour. Une portion de ces cellules amplifiées a ensuite été trans- férée et entretenue en présence de MTX 10 000 n M Les sous- clones 1-15 et 18 B-9 ont encore été testés après avoir été maintenus pendant environ 1 à 2 mois dans les condi- tions précisées sur le tableau 1 '. TABLEAU 1 ' 0 Lignée cellulaire Conditions de crois ng de t-PA/cel- sance lule/jour* 1-15500 MTX 500 n M 28,5 x 10-3 1-15500 MTX 500 n M 26,0 x 10 1-15500 (milieu -HGT, pas de MTX) (milieu -HGT, pas de MTX) 1-15500 8,3 x 10-3 18,0 x 10-3 1-1510 000 1-1510 000 18 B-9 18 B-9 MTX 10 i M MTX 10 M MTX 50 n M MTX 50 n M (milieu -HGT, pas de MTX) (milieu -HGT, pas de MTX) (milieu MTX) (milieu MTX) -HGT, pas de -HGT, pas de 14,3 x 10-3 14,4 x 103 1,0 x 10-3 0,7 x 10-3 * L'activateur t-PA dans le milieu de culture a été titré quantitativement dans une épreuve radio- immunologique comme indiqué ci-après Du t-PA purifié et du t-PA purifié marqué à l'iode, dérivé de cellules de mélanome, ont été dilués en série dans la plage de concen- trations de 12,5 à 400 ng/ml dans une solution physiologi- que de sel tamponné par un phosphate, à p H 7,3,contenant 29,3 49,0 18 B-9 18 B-9 x 10-3 x 10-3 x 10-3 x 10-3 14,3 14,4 0,5 % de sérum-albumine de boeuf, 0, 01 % de "Tween 80 " et 0,02 % de Na N 3 Des dilutions appropriées d'échantil- lons de milieu à titrer ont été ajoutées aux protéines marquées par la radio-activité On a fait incuber les antigènes pendant la nuit à la température ambiante en présence d'une dilution à 1:10 000 de la fraction d'Ig G d'un antisérum de lapin anti t-PA Le complexe anticorps- antigène a été précipité par absorption sur des perles immunologiques à l'Ig G de chèvre anti-lapin (Bio Rad) pen- dant 2 heures à la température ambiante Les perles ont été clarifiées par l'addition de solution physiologique de sel comme diluant suivie d'une centrifugation pendant minutes à 2000 x g à 4 C Les liqueurs surnageantes ont été jetées et la radio-activité dans les précipités a été contrôlée Les concentrations ont été attribuées par comparaison avec l'étalon de référence. Les lignées cellulaires sont les suivantes: la lignée cellulaire " 1 " est un clone non amplifié provenant du groupe de quatre originel La lignée " 1-15500 " est un sous-clone amplifié de la lignée cellulaire " 1 " qui a été amplifié initialement en MTX 50 n M en donnant la lignée 1-15, puis transféré en vue de son amplification subsé- quente en MTX 500 n M La lignée 1-1510 o 000 est un sous- clone de la lignée 1-15500 qui a encore été amplifé en présence de MTX 10 000 n M La lignée cellulaire 18 B-9 est un sous-clone de l'un des quatre sous-clones originels détectés, qui a été amplifié en milieu MTX 50 n M. Toutes les cellules amplifiées montrent des taux élevés de production de t-PA par rapport à ceux que présente la culture cellulaire non amplifiée La culture non amplifiée produit même des quantités de t-PA supérieu- res à 0,5 pg/cellule/jour; l'amplification atteint des niveaux s'approchant de 50 pg/cellule/jour. F Compositions pharmaceutiques Les composés de la présente invention peuvent être formulés conformément à des méthodes connues pour préparer des compositions pharmaceutiquement utiles, en associant l'activateur de plasminogène de tissu humain de l'invention avec un véhicule de support pharmaceutiquement acceptable Des véhicules convenables et leur formulation, y compris d'autres protéines humaines, par exemple de la sérum-albumine humaine, sont décrits, par exemple, dans Remington's Pharmaceutical Sciences par E W Martin, que l'on incorpore ici à titre documentaire Ces compositions contiennent une quantité efficace de la protéine de l'in- vention conjointement avec une quantité convenable de véhicule en vue de préparer des compositions pharmaceuti- quement acceptables qui peuvent être administrées efficace- ment à l'hôte. Par exemple, l'activateur de plasminogène de tissu humain de l'invention peut être administré par voie parentérale à des patients atteints de maladies ou présen- tant des troubles cardiovasculaires La dose et la poso- logie peuvent être semblables à celles que l'on utilise habituellement dans les investigations cliniques d'autres agents thrombolytiques cardiovasculaires, par exemple envi- ron 440 unités internationales par kg de poids corporel comme première dose intraveineuse suivie d'une infusion intraveineuse continue à environ 440 unités internationales par kg par heure pendant 12 heures chez des patients atteints d'embolie pulmonaire. A titre d'exemple de forme posologique apprcpriée d'activateur de plasminogène de tissu humain essen- tiellement homogène sous une forme parentérale utilisable selon l'invention, une fiole contenant 25 000 unités inter- nationales d'activité d'activateur de plasminogène de tissu, mg de mannitol et 45 mg de Na Cl, peut être reconstituée avec 5 ml d'eau stérilisée pour injectables et le produit reconstitué peut être mélangé avec un volume convenable de chlorure de sodium à 0,9 % ou de dextrose à 5 % pour injectables en vue de l'administration intraveineuse. G Description détaillée du t-PA humain recombinant La structure de la forme de réalisation particu- lière de t-PA humain préparée dans les exemples de l'inven- tion a été étudiée par élucidation de la séquence de codage du gène et par des techniques de biochimie des protéines. L'interprétation admise de la structure de la protéine est illustrée sur la figure 12. Il a aussi été démontré antérieurement par Collen et collaborateurs ( 88) que du t-PA humain bicaté- naire est formé par clivage protéolytique de la molécule monocaténaire en deux polypeptides attachés par une liai- son disulfure La présente étude permet de conclure que la chaine lourde (poids moléculaire 30882) est dérivée de la partie terminale à groupe NH 2 et que la chaîne légère (poids moléculaire 28126) comprend la région ter- minale à groupe COOH L'établissement de la séquence N- terminale de la molécule bicaténaire suggère que la forme bicaténaire est engendrée par clivage d'une seule liaison arginyl -isoleucine (figure 12; flèche indiquée). La structure primaire d'une portion de la région constituant la chaîne lourde de t-PA humain (figure 12) révèle un haut degré d'homologie de séquence avec les régions "annulaires" du plasminogène ( 89) et de la pro- thrombine ( 40, 41) Une région "annulaire" (kringle) se réfère à une structure caractéristique de triple disulfure initialement découverte dans le fragment "pro" de la pro- thrombine, décrit en détail pour la première fois par Magnusson et collaborateurs ( 91, 92) Deux régions dites "annulaires" de 82 aminoacides chacune,qui partagent un haut degré d'homologie avec les cinq régions "annulaires" du plasminogène, ressortent de la séquence primaire de t-PA Les 91 amino-acides à terminaison N restants ont peu d'h=mlogie avec la région "annulaire" classique Toute- fois, on peut émettre l'hypothèse selon laquelle cette région peut aussi présenter une structure qui renferme de multiples liaisons disulfure, attendu qu'on y trouve 11 autres résidus de cystéine. Le site catalytique de la chaîne légère de t-PA humain, que l'on appelle région de sérine-protéase, comme dans les autres enzymes concernant la sérine, est très vraisemblablement formé par les résidus d'histidine 322, d'acide aspartique 371 et de sérine 478 En outre, les séquences d'aminoacides entourant ces résidus sont très homologues vis-à-vis des parties correspondantes d'autres sérine-protéases telles que la trypsine, la prothrombine et le plasminogène. BIBLIOGRAPHIE 1 Brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 355 361. 2 Brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 926 727. 3 Brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 029 767. 4 Brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 258 030. Brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 271 150. 6 Demande de brevet européen publiée sous le N 0037687. 7 D C Rijken,"Plasminogen Activator from Human Tissue," Krips Repro Meppel, 1980. 8 Brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 555 000. 9 Brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 998 947. 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REVENDICATIONS 1 Activateur de plasminogène de tissu humain, caractérisé en ce qu'il est essentiellement dépourvu d'autres protéines d'origine humaine. 2 Activateur de plasminogène de tissu humain, caractérisé en ce qu'il n'est pas accompagné de glycosy- lation naturelle associée. 3 Activateur de plasminogène de tissu humain, caractérisé en ce qu'il est produit par des cellules- hôtes recombinantes. 4 Activateur de plasminogène de tissu humain, caractérisé en ce qu'il est sous une forme essentielle- ment pure. Activateur de plasminogène de tissu humain suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce qu'il contient une séquence d'un polypeptide s'étendant depuis le terminal N de l'amino-acide ordinai- reinent le premier dudit activateur de plasminogène de tissu humain. 6 Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence codant pour un activateur de plas- minogène de tissu humain. 7 Vecteur d'expression susceptible de réplica- tion, caractérisé en ce qu'il est capable,dans une cul- ture de micro-organismes ou de cellules transformants, d'exprimer une séquence d'ADN suivant la revendication 6. 8 Le plasmide p ARIPA ou pt-P Atrp 12. 9 Culture de micro-organismes ou de cellules, caractérisée en ce qu'elle est transformée avec le véhi- cule suivant l'une des revendications 7 et 8. Micro-organisme suivant la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est obtenu par transformation d'une souche de E coli. 11 Composition destinée notamment au traitement de troubles vasculaires, caractérisée en ce qu'elle com- prend une quantité thérapeutiquement efficace d'activateur de plasminogène de tissu humain suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 en mélange avec un support phar- maceutiquement acceptable. 12 Composition suivant la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est sous une forme propre à l'administration parentérale. 13 Procédé, caractérisé en ce qu'il consiste à exprimer un ADN codant l'activateur de plasminogène de tissu humain dans une cellule-hôte recombinante. 14 Procédé de production de t-PA humain, carac- térisé en ce qu'il consiste: a à préparer un vecteur d'expression susceptible de réplication, capable d'exprimer la séquence d'ADN codant le t-PA humain dans une cellule-hôte convenable b à transformer une culture de cellules-hôtes pour obtenir une cellule-hôte recombinante; c à cultiver lesdites cellules-hôtes recombi- nantes dans des conditions permettant l'expression de ladite séquence d'ADN codant le t-PA pour produire du t-PA humain; d à recueillir ledit t-PA humain.