Brevet FR2524471A1 — publié le 19831007

NOUVEAU PROCEDE D'OBTENTION DE COUCHES HOMOGENES DE COLLA- GENE NATIF, SON APPLICATION A L'ENROBAGE OU AU REVETEMENT DE SUPPORTS DIVERS ET SUPPORTS AINSI ENROBES OU REVETUS L'invention concerne un nouveau procédé d'obtention de couches homogènes de collagène natif; son application a l'enrobage ou au revêtement de supports divers ainsi que les supports ainsi enrobés ou revêtus. Erhmann et Grey (J. Natal. Cancer Inst.16, 13751403)ont été les premiers en 1956 a comparer la croissance de nombreuses cellules et d'esplants tissulaires sur le collagène avec celle obtenue sur le verre. Ils ont observé que, dans de nombreux cas, les gels de collagène favori~ saient la croissance cellulaire. Depuis, d'une manière plus générale, il s'est avéré que les substrats de collagène augmentaient la crois sance ainsi que la différentiation de nombreuses cellules par rapport à d'autres substrats tels que le verre ou le plastique. Un certain nombre de cellules peuvent être maintenues en vie plus longtemps sur un support collage nique et il apparait même que si les cellules sont déposées sur des collagènes spécifiques, les facteurs de croissance peuvent ne pas être nécessaires. L' adhésion des cellules à leur substrat en en particulier à la matrice collagénique s'effectue grâce à des glycoprotéines spécifiques dont la mieux décrite est la fibronectine. On a montré que certaines cellules utilisant ces glycoprotéines peuvent adhérer à des collagènes spécifiques.Par exemple, les fibroblastes adhé- rent bien à tous les types de collagènes, les chondrocytes s'attachent préférentiellement au collagène de type II et les cellules épithéliales et endothéliales au type IV. Cette seule propriété amène à concevoir des objets enrobés de cette protéine pour la culture cellulaire "in vitro". Le collagène présente en outre une autre carac téristique qui est sa faible antigénicité, celle-ci pouvant être encore réduite par coupure des télopeptides par traitement chimique ou enzymatique. C'est pourquoi, cette protéine native, ou débarassée de ses télopeptides, pour ra servir de protection à des matériaux synthétiques des tinés à séjourner dans l'organisme. Les propriétés antigéniques de ces matériaux seront ainsi masquées et de plus le collagène favorisera @@ @@@@@@@@@@@@@@ de l'implant par les cellules qui pourront synthétiser un nouveau tissu. Enfin le collagène peut etre un support d'en- zymes. Coulet et Coll. (brevets français 2 235 133) ont en effet mis au point une méthode permettant de fixer par liaisonscovalentes de nombreuses enzymes au collagène, celles-ci conservant leurs activltôs. L'efficacité de ces enzymes fixées sera fonction de la surface de leur support par rapport au volume réactionnel; plus cette surface par rapport à ce volume sera grande, plus les enzymes seront efficaces. Il est donc nécessaire d'utili ser pour les réacteurs enzymatiques soit des films au-dessus desquels s'écoulera une très faible épaisseur de milieu, soit des billes très fines placées dans une colonne. Le problème de la fabrication d'un film de collagène est aujourd'hui résolu (B.F. i 596 789 et i 595 790) mais l'on n'est pas arrive jusqu'alors à préparer des billes ou autres supports non plans enrobés de collagène. La préparation de ces objets ou supports enro bés de collagène revêt donc un intérêt tout particulier pour des applications dans les domaines du laboratoire, de la médecine et de l'industrie chimique. Jusqu'à maintenant, cette préparation était soit difficile et onéreuse, soit même impossible du fait que les solutions de collagène utilisées pour l'enrobage sont des solutions aqueuses. Le sèchage des objets recouverts de solution collagénique ne peut être effectué a une température su périeure à celle de la dénaturation du collagène en solution qui est comprise entre 30 et 400C. Une dénaturation entramerait en effet une diminution considérable des propriétés mécaniques de la protéine et empêcherait celle-ci d'adhérer à l'objet à recouvrir.A une température inférieure à 300C, ltévaporation de liteau est très lente par suite de sa tension de vapeur saturante et de son affinité pour le collagène. Cette faible vitesse d'évaporation rend donc impossible l'obtention de surfaces homogènes de collagène sur nombre d'objets ou de supports. En effet, et en particulier sur des objets non plans, la solution s'écoule et entraîne la protéine vers les parties les plus bassesoû apparaît une accumu lation de matière. La présente invention s'est donné pour but de pallier ces inconvénients en proposant un procédé permet tant l'obtention de couches homogènes de collagène natif servant notamment à l'enrobage de tous objets ou sup ports, quelle que soit leur forme et ceci beaucoup plus rapidement, et donc plus économiquement qu'avec les procédés connus jusqu'alors qui sont de plus limites à l'enrobage ou au revêtement d'objets plans. Dans une étude publiée en 1969 (Biochim. Bio phys. Acta, 194 (1969) 325-328) Herbage et coll. ont montré qu'il était possible de dissoudre du collagène acidosoluble purifié dans des solvants organiques. Ces travaux ont permis de mettre au point un procédé de pré- paration industrielle de solutions alcooliques de colla gène eton a trouvé qu'il était possible d'utiliser ces solutions pour déposer des couches uniformes de collagène et notamment revêtir ou enrober de façon uniforme tous objets ou supports. C'est ainsi que l'invention a pour objet un nouveau procédé d'obtention de couches homo gènes de collagène natif et ses applications notamment pour le revêtement ou l'enrobage de supports de toute forme. Le procédé d'application consiste à préparer une solution alcoolique de collagène natif et à la dé poser par pulvérisation ou par trempage/écoulement sur les objets ou supports à enrober. L'alcool est choisi parmi les monoalcools aliphatiques et est de préférence le méthanol, la faible tension de vapeur de ce composé lui permettant de s'évaporer rapidement a des tempéra tures inférieures à la température de dénaturation du collagène, assurant ainsi un enrobage uniforme des objets ou supports que lton désire revêtir. La présente invention sera mieux comprise d'ailleurs et ses avantages ressortiront bien de la description qui suit d'un exemple de préparation de so- lutions alcooliques de collagène et de l'application de ces solutions à l'enrobage de différents objets ou supports. Préparation de la solution alcoolique de collagène Le collagène acido-soluble purifié lyophilisé est préparé par exemple selon la technique décrite par Herbage et coll.-(réf. ci-dessus). On vérifie d'abord sa composition chimique afin de vérifier qu'elle est bien celle du collagène et en particulier que le produit contient environ 333 résidus de glycine et 100 résidus d'hydroxyproline pour îOOOre- sidus totaux d'acides aminés. La détermination de la masse moléculaire ne doit pas laisser apparaître de valeurs inférieurs à 100 000 daltons dans la solution aqueuse de la protéine après chauffage à 400C. Enfin,les examens en diffraction aux rayons X et en calorimétrie différentielle programmée doivent confirmer que la protéine possède toute la structure native en triple hélice du collagène. On dissout 3 g de ce collagène dans t litre d'une solution 0,5 M d'acide ascétique et on agite l'en- semble pendant au moins deux heures, puis on centrifuge à 14 000 g pendant une heure. Le surnageant est alors versé dans de l'acétone à raison d'un litre pour cinq litres de solvant. Le collagène précipite et on sépare le précipité par centrifugation à 3 000 t/mn dans une essoreuse type Robatel CF 200. Le précipité est ensuite repris par un mélange méthanol/solution aqueuse 0,5 M d'acide acétique (50/50). Après une heure d'agitation, l'ensemble est versé dans un bain d'acétone à raison d'un litre de solution pour cinq litres de solvant. Le précipité est récupéré comme dit plus haut puis remis en solution dans un mélange méthanol/solution aqueuse 0,5 M d'acide acétique i80/20). Après une heure d'agitation, l'ensemble est versé dans un bain d'acétone à raison d'un litre de solution pour cinq litres de solvant. Le précipité est repris et mis en solution dans du méthanol pur à raison de 2 g/litre. Après centrifugation à 30 000 g pendant une heure, la solution est placee dans le réservoir d'alimentation d'un pistolet pulvérisateur type fremlin J.M. travaillant cons une pression d'air de 100 g. Obtention de billes ou autres supports sphériques enrobés de collagène : - Traitement préalable du support : Des billes de verre sont lavées par tros séjours successifs de 24 h sous agitation dans trois solutions différentes de détergent. Elles sont ensuite rincées abondamment à l'eau permutée et séchées sous vide à 1000C. - Enrobage proprement dit : On place 200 cc de billes traitées comme dit plus haut dans un dragéifieur du type ERWEKA de 10 litres, en acier inoxydable, tournant à la vitesse de 60 t/mn. La solution du collagène dans le méthanol est appliquée par pulvérisation sur les billes en mouvement dans le dragéifieur ; on effectue trois pulvérisations de quinze secondes chacune, séparées chaque fois par un sèchage de trente minutes dans le dragéifieur. Les billes ainsi enrobées sont soumises à un traitement thermique sous vide à 100C pendant 24 h, ce qui assure la réticulation du collagène, rendue nécessaire par l'utilisation de ces billes en milieu aqueux. La quantité de collagène déposée peut être déterminée comme suit : on place une quantité connue de billes dans une solution d'acide chlorhydrique 6N à 1050C pendant 24 heures. On dose ensuite l'hydroxyproline obtenue par la méthode de Stegemann. La quantité de collagène déposéeest égale à la quantitée d'hydroxyproline multipliée par 7,46. Dépat d'unfilm de collagène sur plaquettes de verre ou sur boîtes de Pétri : Les plaquette ou les boîtes de Pétri sont tut d'abord soigneusement dégraissées dans un mélange chlo- roforme-méthanol. Les plaquettes sont ensuite posées sur une plaque de Té lion puis vaporise avec la solution d collagène dans le méthanol préparée comme mentionné plus haut ; on effectue trois pulvérisations de quinze secondes chacune, séparées chaque fois par un séchage d'une heure â l'air libre. Les boîtes de Pétri sont placées sur un tapis et l'on dépose dans chacune d'elles, à l'aide d'une seringue automatique, un volume donné (variable suivant l'épaisseur désirée) de la-solution du collagène dans le méthanol. Les boites ont ensuite entrainées par le tapis dans un tunnel de sechage porté à une tempéra ture de 300C et dans lequel l'air est filtré et renouvelé ; elles y séjournent environ une heure. Il est également possible, si on l'estime néee- saire, de soumettre ces supports plans ainsi revêtus au traitement de réticulation du collagène décrit ci-avant. Comme il va de soi et comme il ressort de ce quiprécède, la présente invention ne se limite pas aux seuls modes de réalisation décrits ci-avant à titre d'exemple non limitatif ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes, quelles que soient notamment la nature ou la forme de l'objet ou du support revêtu de couches homogènes de collagène natif. - REVENDICATIONS 1 - Procédé d'obtention de couches homogènes de collagène natif, caractérisé en ce que les dites couches homogènes sont obtenues à partir d'une solution alcoolique de collagène acido-soluble. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution alcoolique est obtenue à partir de monoalcools aliphatiques légers. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la solution alcoolique est obtenue à partir du méthanol. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la solution alcoolique est appliquée par pulvérisation. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la solution alcoolique est appliquée par trempage-écoulement. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à g, caractérisé en ce que les couches homogènes sont appliquées sur des supports plans tels que des films, des lamelles ou des boites de Pétri. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les couches homogènes sont appliquées sur des supports non plans, tels que ceux constitués par des billes. 8 - Supports revêtus de couches homogènes de collagène natif, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications i à 7.