Brevet FR2528715A1 — publié le 19831223

La présente invention concerne un appareil de filtration permettant de réaliser cette opération dans un minimum de temps Ce dispositif de filtration rapide s'applique plus particulièrement au domaine biolo- gique, notamment à deux types d'études très répandues eni biochimie et en bioénergétique: les études de méca- nisme enzymatique et les mesures de flux ioniques à travers les membranes cellulaires. L'étude détaillée des réactions enzymatiques ainsi que celle des mécanismes contrôlant les flux ioniques nécessitent l'élaboration d'outils perfec- tionnés permettant de résoudre les évènements transi- toires du processus étudié Le plus souvent, les réac- tions catalysées par des enzymes se produisent à très grande vitesse et nécessitent des techniques permettant une résolution temporelle de l'ordre de quelques milli- secondes On constate en fait que les progrès dans no- tre connaissance des mécanismes de l'action enzymatique ont suivi en général une amélioration de la technique utilisée et en particulier la résolution en temps obte- nue Ainsi, on sait que: 1) la durée d'un cycle enzymatique est en général bien inférieure à la seconde Dans un cycle peu- vent être en général identifiés un assez grand nombre d'états intermédiaires Des méthodes de mé- lange rapide ont été développées dans le passé dans le but d'étudier ces états transitoires Dans leur principe, ces méthodes sont relativement sim- ples: l'enzyme E est mélangé très rapidement (quelques millisecondes) avec son substrat S, la réaction suit ensuite son cours et est achevée lors de la libération du produit P ( 1) E+S, E SE - Q S-E P-,+ L'analyse des étapes intermédiaires (ici l'état E.+S) s'effectue en procédant à un second mélange rapide (quelques millisecondes à quelques secon- des après le"%élange initial) avec un réactif Q stabilisant l'espèce E+S Cette espèce est ensuite analysée par des techniques biochimiques classi- ques mais pouvant être lentes. Une autre technique consiste à substituer au subs- trat naturel S un analogue chimique ayant des pro- priétés optiques (fluorescence, absorbance) per- mettant de suivre les progrès de la réaction ( 1) en fonction du temps Le pouvoir de résolution en temps des méthodes de mélange rapide et des métho- des optiques se situe autour de 10 msec. 2) Les mesures de flux ioniques ont été, par le pas- sé, presque exclusivement effectuées en utilisant des méthodes de filtration (ex: filtres "Milli- pore") En bref, le principe de ces mesures est le suivant: une suspension de cellules ou de vésicu- les membranaires est diluée dans un milieu conte- nant le substrat devant être transporté dans la cellule En général ce substrat est marqué par un isotope radioactif Après un temps d'incubation plus ou moins long, la suspension est soumise à une filtration Les membranes ou les cellules sont retenues par le filtre et le transport est évalué en mesurant la radioactivité du filtre à l'aide d'un compteur à scintillation Cette technique est assez lente, mais c'est la seule disponible ac- tuellement Elle est donc très utilisée car les mesures de flux ont une très grande importance pour les recherches sur la physiologie et l'éner- gétique des cellules ainsi qu'en pharmacologie mo- léculaire. L'appareil faisant l'objet de la présente in- vention autorise une filtration très rapide, ce qui permet de suivre les différentes étapes des réactions au sein d'un liquide biologique, notamment en biochimie et en bioénergétique. Dans ce but, l'invention propose un appareil de filtration comportant: un dispositif d'injection muni d'un réservoir fermé à sa base par une pastille poreuse et à son sommet par un piston déplaçable en translation dans le réservoir par tout moyen mécanique approprié, ledit réservoir renfermant la phase liquide à filtrer; un dispositif support de filtre comprenant une cham- bre fermée à sa partie supérieure par une pastille poreuse servant de support à la matière filtrante proprement dite et communiquant par sa base avec des moyens de pompage permettant de créer une dépression dans ladite chambre; un dispositif de mise en contact rapide et temporaire du dispositif d'injection et du dispositif support de filtre; un ensemble électronique de commande qui contr 8 le chaque opération de filtrage en agissant simultané- ment sur le dispositif de mise en contact et sur les moyens mécaniques de translation du piston et en pro- voquant, au moment souhaité, l'arrêt de l'injection et la désolidarisation du dispositif d'injection et du dispositif support du filtre. Selon un premier mode de réalisation de l'in- vention, les pastilles poreuses sont en verre fritté. Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, les moyens mécaniques de déplacement du piston en translation sont constitués par un moteur pas à pas. Enfin, selon un dernier mode de réalisation de l'invention, Le dispositif de mise en contact rapide et temporaire du dispositif d'injection et du disposi- tif support de filtre se compose d'un solénoïde alimen- té électriquement par l'ensemble électronique de com- mande et actionnant un levier capable de provoquer la translation verticale du support de filtre en le rap- prochant ou en l'éloignant du dispositif d'injection. De toute façon, l'invention sera mieux com- prise en se référant à la description qui suit, donnée à titre illustratif et non limitatif. La figure 1 représente en coupe élévation l'appareil conforme à l'invention tandis que la figure 2 illustre une mesure de la cinétique de liaison des ions Ca++ sur une protéine membranaire. Sur la figure 1, ôn a représenté le disposi- tif d'injection 1 qui comporte, maintenu en place sur un support 2 par une vis de maintien 3, un réservoir cylindrique 4 fermé à sa base par une pastille poreuse A sa partie supérieure, le réservoir cylindrique 4 est fermé par un piston 6 déplaçable en translation verticale dans le réservoir cylindrique 4 et dont les déplacements sont commandés par un moteur pas à pas 7 agissant directement sur la tête 8 du piston 6. L'appareil de filtration rapide, objet de l'inven- tion, comprend également un dispositif support de fil- tre 9 muni en son centre d'une chambre cylindrique 10 fermée à sa partie supérieure par une autre pastille poreuse 11 La pastille poreuse Il sert de support à la matière filtrante proprement dite représentée en 12 et qui peut être constituée de façon connue d'un filtre, de gel, de microbilles de verre ou de tout autre sup- port en matière synthétique Une pompe 13 permet le moment venu de créer une dépression dans la chambre cylindrique 10 Des moyens en guidage en translation 14, d'un type en soi connu, permettent de rendre le dispositif support de filtre 9 mobile en translation axiale dans l'axe du dispositif d'injection 1 sous l'effet du dispositif de mise en contact rapide et tem- poraire 15 Ce dispositif 15 est susceptible d'agir à distance, par action électromagnétique par exemple, sur un levier 16 mobile autour d'un axe horizontal 17 et dont l'extrémité 18 commande par l'intermédiaire de la rotule 19 le mouvement de translation du dispositif support de filtre 9 le long de son axe Un ensemble électronique de commande 20 permet d'agir simultanément par la ligne 21 sur le moteur pas à pas 7 et par les lignes 22 et 23 sur le dispositif de mise en contact rapide 15 1 Dans la réalisation décrite sur la figure 1, le dispositif de mise en contact rapide et temporaire se compose d'un solénoide alimenté électriquement par l'ensemble électronique de commande 20 et capable de créer un champ magnétique d'intensité suffisante pour provoquer l'attraction de la palette ferro-magné- tique 24 et le basculement du levier 16 autour de son axe 17 comme indiqué par les flèches FF'. Le fonctionnement de l'appareil de filtra- tion rapide décrit sur la figure 1 est le suivant. La phase liquide que l'on désire filtrer est préalablement introduite dans le réservoir cylindrique 4 du dispositif d'injection 1 La matière de filtra- tion, par exemple un filtre "Millipore", est déposée à la surface de la pastille poreuse 11 et l'appareil est alors prêt à fonctionner Sous l'effet de la commande électronique 20, le dispositif de mise en contact rapi- de et temporaire 15 du dispositif d'injection 1 et du support de filtre 9 agit sur le levier 16 qui bascule autour de son axe 17 provoquant le rapprochement rapide à l'aide des moyens de guidage en translation 14 du support de filtre 9 vers le dispositif d'injection 1 qui, lui, reste fixe Dès que le contact entre les deux parties précédentes de l'appareil est établi, un détec- teur non représenté sur la figure transmet l'informa- tion de contact à la commande 20 qui agit immédiate- ment par la ligne 21 sur le moteur pas à pas 7 pour introduire d'une quantité déterminée le piston 6 dans la chambre 4 et provoquer la filtration très rapide d'une partie de cette phase liquide contenue dans 4 au travers des deux pastilles poreuses 5 et 11 et de la matière filtrante à proprement parler 12 En même temps les moyens de-pompage 13 sont mis en action par l'ensemble électronique de commande 20 et, par créa- tion d'une dépression dans la chambre cylindrique 10, aident à accélérer la filtration ainsi que l'évacua- tion de la phase liquide ayant traversé le filtre. Au bout d'un temps prédéterminé ou dès que la quantité de phase liquide voulue a été filtrée au tra- vers de l'appareil de filtration rapide, la commande 20 agit en sens inverse sur le dispositif de mise en con- tact temporaire 15 pour séparer à nouveau les deux moi- tiés de l'appareil constituées par le dispositif d'in- jection 1 et le support de filtre 9 Cette façon de procéder permet, notamment lorsque le produit à filtrer est radioactif, de limiter au strict minimum le temps de contamination du filtre. A titre d'exemple on va décrire ci-après une application de l'appareil de filtration rapide selon l'invention. Les protéines ou les vésicules membranaires sont déposées sur un support qui possède les caracté- ristiques appropriées pour les retenir après élimina- tion de l'excès d'eau Le filtre contenant le matériel biologique est ensuite rapidement lavé par une solution contenant le substrat radioactif La réaction avec le substrat et son échange avec le milieu filtrant se poursuit pendant tout le temps de filtration La fil- tration terminée, la radioactivité contenue dans le filtre est mesurée et permet de rendre compte de l'état de la réaction au moment de l'arrêt de la filtration. Le dispositif mis au point permet d'ajuster très préci- sément le temps de passage du liquide ainsi que le vo- lume filtré Il a été possible d'obtenir des temps de filtration aussi courts que quelques dizaines de milli- secondes, c'est-à-dire une résolution temporelle infé- rieure de deux ordres de grandeur au moins à celle ob tenue avec les méthodes de filtration usuelles ( 2-5 sec au moins). Cette caractéristique fait de cet appareil un outil extrêmement intéressant pour les mesures de transport ionique à travers les membranes cellulaires. Cela permet également d'envisager des mesures de ciné- tiques enzymatiques tout à fait originales, en-particu- lier cet appareil permet d'aborder l'étude des com- plexes enzymes-substrat non covalents Une telle mesure est décrite en détail ci-après se rapportant à une me- sure de la cinétique de liaison d'ions Ca++ sur une protéine membranaire (AT Pase-Ca + du Reticulum Sarco- plasmique). Chaque mesure est effectuée comme suit: un filtre "Millipore" (HAWP 0,45 1 j m) est déposé sur le support de filtre, les vésicules membranaires contenant la protéine sont déposées sur le filtre ( 200 à 300 lig de protéines par filtre), le support de filtre est placé sous le dispositif d'injection rempli d'une solution contenant du 45 Ca, la réaction est déclenchée par le système électroni- que de contrôle qui met en contact le filtre et le dispositif d'injection pendant un temps prédéterminé ( 20 msec à plusieurs secondes) Pendant ce temps, le dispositif d'injection est actionné et la solution contenant le 45 Ca est injectée à travers le filtre ( 0,2 à 1 ml). La quantité de liquide filtré est également prédéterminée. la réaction et la filtration se terminent par la sé- paration physique du filtre et du dispositif d'injec- tion, la radioactivité du filtre est mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation, cette séquence est répétée pour chaque temps de fil- tration désiré et le résultat obtenu est la cinétique de liaison montrée sur la figure 2 ci-après, montrant la quantité de Ca 2 + fixée par les vésicules membra- naires en fonction du temps de contact de ces derniè- res avec la solution de 45 Ca Chaque point ( 0) cor- respond à une mesure différente et donc chaque fois à un nouveau filtre contenant la protéine à étudier. Les points (O) correspondent à des mesures effectuées avec des filtres ne contenant pas de protéine et cor- respondent donc à une mesure de la radioactivité pié- gée dans l'eau de mouillage du filtre. La cinétique de liaison des ions Ca 2 + obtenue dans cette série d'expériences est ensuite analysée et permet de vérifier certains détails de fonctionnement de cette protéine. REVENDICATIONS 1 Appareil de filtration rapide notamment pour liquides biologiques, caractérisé en ce qu'il com- prend en combinaison: un dispositif d'injection ( 1) muni d'un réservoir ( 4) fermé à sa base par une pastille poreuse ( 5) et à son sommet par un piston ( 6) déplaçable en translation dans le réservoir ( 4) par tout moyen mécanique appro- prié, ledit réservoir ( 4) renfermant la phase liquide à filtrer; un dispositif support de filtre ( 9) comprenant une chambre ( 10) fermée à sa partie supérieure par une pastille poreuse ( 11) servant de support à la matière filtrante proprement dite ( 12) et communiquant par sa base avec des moyens de pompage ( 13) permettant de créer une dépression dans ladite chambre ( 10); un dispositif ( 15) de mise en contact rapide et tem- poraire du dispositif d'injection ( 1) et du disposi- tif support de filtre ( 9); un ensemble électronique de commande ( 20) qui contr 8- le chaque opération de filtrage en agissant simulta- nément sur le dispositif de mise en contact ( 15) et sur les moyens mécaniques ( 7) de translation du pis- ton ( 6) et en provoquant, au moment souhaité, l'arrêt de l'injection et la désolidarisation du dispositif d'injection ( 1) et du dispositif support du fil- tre ( 9). 2 Appareil de filtration selon la revendica- tion 1, caractérisé en ce que les pastilles poreuses ( 5, 11) sont en verre fritté- 3 Appareil de filtration selon l'une quel- conque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les moyens mécaniques de déplacement du piston ( 6) en translation sont constitués par un moteur pas à pas ( 7). 4 Appareil de filtration selon l'une quel- conque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le dispositif ( 15) de mise en contact rapide et tempo- raire du dispositif d'injection ( 1) et du dispositif support de filtre ( 9) se compose d'un solénoïde alimen- té électriquement par l'ensemble électronique de com- mande ( 20) et actionnant un levier ( 16) capable de pro- voquer la translation verticale du support de filtre ( 9) en le rapprochant ou en l'éloignant du dispositif d'injection ( 1).