Brevet FR2525902A1 — publié le 19831104

La présente invention concerne la médecine et a notamment pour objet un procédé de préparation d'un vaccin chimique méningococcique à composants multiples ou "poly- composant", qui trouve une application notamment dans l'immunoprophylaxie vis-à-vis des affections dues à la méningite cérébro-spinale méningococcique et aux méningosepticémies, affections provoquées par les méningocoques de tous les séro-groupes connus : A, B, C, D, X, Y, Z, 29 E, W-135, ainsi que le vaccin obtenu par ledit procédé. On connait à l'heure actuelle des procédés de préparation de vaccins méningococciques chimiques, par exemple un procédé de fabrication d'un vaccin méningococcique à polysaccharides (brevet Etats-Unis NO 3636192), dont l'action est dirigée contre les méningocoques des séro-groupes A et C. Le principe actif de ce vaccin est constitué par les polysaccharides antigènes à groupements spécifiques des méningocoques des groupes A et C. Le procédé de préparation consiste à cultiver sur un milieu nutritif liquide une culture de méningocoques, en qualité de laquelle on utilise les souches Neisseria meningitidis A-l, Neisseria meningitidis C-11, puis on la précipite par un détergent cationique, le bromure d'hexadécyltriméthylammonium.On isole le demi-produit brut par centrifugation, puis on sépare l'agent précipitant et le demi-produit brut et on soumet celui-ci à une épuration préliminaire en le débarrassant des acides nucléiques par précipitation avec l'éthanol. Ensuite on concentre le demi-produit brut par précipitation avec de l'éthanol, après la précipitation on purifie le demi-produit en en éliminant la protéine par ultracentrifugation, on malaxe le centrifugat avec un mélange de chloroforme-butanol et on recueille la phase aqueuse. On effectue au moins 6 cycles d'une telle purification.Puis on précipite plusieurs fois le polysaccharide avec de lléthanol, on dissout le résidu dans une solution saturée d'acétate de sodium, on le reprécipite par ltéthanol, on dissout le résidu dans l'eau et on le soumet à un ultracentrifugeage , on recueille le centrigugat, on le précipite par l'éthanol. On obtient le polysaccharide méningococcique purifié des séro-groupes A et E. Le vaccin obtenu par ce procédé possède une stricte spécificité du groupe A et/ou C et ne protège pas contre les méningocoques d'autres séro-groupes, particulièrement du séro-groupe B. L'extension du diapason sérologique de l'action du vaccin exige une introduction complémentaire des médicaments d'autres antigènes des méningocoques, dont l'obtention nécessite l'utilisation de méthodes spéciales et un accroissement approprié de la dose par introduction de composants additionnels. De plus, les anticorps formés après l'introduction du vaccin ne sont dirigés que contre les polysaccharides en capsules à groupes spécifiques A et/ou C, mais ils n'agissent pas contre les autres substances de la paroi cellulaire des méningocoques. On connatt aussi un procédé de préparation d'un vaccin méningococcique protéique du séro-type 2 (Jour. Expérim. Med. 1978, 147, 629-644), contenant une substance active, la protéine de la membrane externe des méningocoques du séro-type 2, des séro-groupes B, C, Y, W-135. L'action de ce vaccin est dirigée contre les méningocoques du séro-type 2 des séro-groupes B, C, Y, W-I 35. Le procédé de préparation du vaccin consiste à cultiver une culture de méningocoques sur un milieu nutritif liquide exempt de protéine. On utilise les souches N.meningitidis M-986 et M-986-NCV-I. On effectue la culture sous secouage, on recueille la masse microbienne sous forme de précipité à la suite de la centrifugation du milieu liquide .On extrait la masse microbienne , on recueille ensuite le centrifugat par ultracentrifugation, on soumet le centrifugat à une filtration sur gel et on récolte une fraction macromoléculaire # 7000000 daltons. Puis on additionne le désoxycholate de sodium jusqu'à la concentration de 5% et on chauffe à la température de 560C pendant 30 minutes, ou on ajoute le prouit connu sous la décomSSS comerclale "Triton X-100" et on mairtient 30 minutes à la température ambiante, ou on ajoute le produit connu sous la dénominaüon commerclale "Emulphogère BC-720".On centrifuge le mélagne du dami-produit et l'un des dCtergents, on précipite avec l'éthanol, on dissout et on sépare de la solution une fraction de volume libre pendant la filtration sur gel à travers le séphadex G-150. On précipite avec l'éthanol la fraction macromoléculaire. La préparation obtenue de protéine séro-typique protège seulement contre les méningocoques du type homologue. Le vaccin indiqué est doté d'une spécificité stricte typique et ne forme pas des anticorps contre les polysaccharides de groupe.L'extension du diapason sérologique de l'action du vaccin exige une introduction additionnelle d'autres antigènes des méningocoques, dont l'obtention nécessite l'utilisation de méthodes spéciales et une augmentation appropriée de la dose par administration de composants additionnels. Les anticorps formés après l'introduction du vaccin ne sont dirigés que contre la protéine du séro-type 2 de la membrane externe des méningocoques et n'agissent pas contre les autres substances de la paroi cellulaire des méningocoques. On connait également un procédé de préparation d'un vaccin méningococcique, contenant en tant que principe actif un composé hydrophobe du polysaccharide méningococcique du groupe B et de la protéine principale du sérotype 2 de la membrane externe des méningocoques (Jour.Clin. Invest. 1979, 63, N05, 836-848). L'action du vaccin est dirigée contre les méningocoques du séro-groupe B des séro-types 2, 4, 6, 7, 11, 14. Le procédé de préparation du vaccin consiste à réaliser une culture des souches N.meningitidis M îooe (B:Pi1:L3,4,7,8); M 981 (B:P 14:L5); M 136 (B:P 4,7:L4), sur un milieu liquide sans protéine sous secouage.On isole le polysaccharide du groupe B par la méthode de Gotschlich, suivant laquelle la culture liquide est additionnée de 0,1,' de bromure dthexadécyl- triméthylammonium, on recueille le résidu par centrifugation, on sépare l'agent précipitant et le demi-produit brut, on effectue une purification préalable par précipitation à l'éthanol, on dissout le précipité, on reprécipite, on lave à l'éthanol, on dissout et on obtient un produit de polysaccharide du groupe B. On isole la protéine de la membrane externe par traitement de la masse microbienne au phénol à 0,5 % pendant 2 heures.On recueille le précipité microbien par centrifugation-du milieu liquide, on le suspend dans la solution tampon, on centrifuge trois fois le mélange, on recueille le centrifugat, qu'on soumet à l'ultracentritu- geage, et on recueille le précipité qu'on dissout et élimine par des lipopolysaccharides par filtration sur gel à travers le produit connu sous la dénomination commerciale "Séphadex G-lOO", puis on centrifuge, on isole par filtration sur gel une fraction macromoléculaire d'un volume libre du centrifugat, qu'on précipite avec de l'éthanol, on lave à l!éthanol et on dissout dans l'eau. On obtient une solution de protéine des séro-types 2, 4, 6, 7, 11, 14.On prépare le vaccin par combinaison d'un polysaccharide du groupe B et une protéine des séro-types 2, 4, 6, 7, 11, 14 de la membrane externe des méningocoques. Le vaccin obtenu n'est pas capable de former les anticorps à gard d'un composant important de la paroi cellulaire des méningocoques tel que le lipopolyvaccharide. Le vaccin ne provoque pas la formation d'anticorps contre les méningocoques du séro-groupe A, et exige par conséquent l'introduction de composants additionnel pour l'extension du diapason de son action, en particulier l'introduction de polysaccharide du groupe A. Le mélange obtenu de polysaccharide du groupe B et de protéine des sero-types 2, 4, 6, 7, 11, 14 n'est pas une combinaison naturelle, mais une combo naison artificielle secondaire hydrophobe non covalent dè préparations individuelles. On connait également un procédé de préparation d'un vaccin ménkypcoccique, renfermant à titre de principe actif la protéine de la membrane des méningocoques du séro-groupe B, du séro-type 2 (brevet R.F.A. N 2848965). L'action du vaccin est dirigée contre les méningocoques du séro-groupe 2. Le procédé consiste à cultiver la souche N.meningitidis B-986 sur un milieu nutritif liquide. On traite la masse microbienne par un détergent, en qualité duquel on utilise le désoxycholate de sodium ou l'urée à 4 M, ou l "'Emulphogèner (dénomination commerciale) à 1 46, ou le Tween (dénomination commerciale)à 1 %, ou le (dénomination commerciale) "Triton X-1OO" à 1 %. On centrifuge la suspension defnicrobes dans une solution de détergent, on recueille le centrifugat, on traite le résidu microbien une seconde fois pour augmenter le rendement.On soumet la solution à 1 'ultra-centrifugation, on recueille le précipité, qu'on dissout encore une fois dans une solution tampon de détergent par traitement aux ultrasons. On clarifie la solution par centrifugation. On précipite la protéine et on lave à l'éthanol. On dissout le précipité protéique dans le raffinose à 5 %, on prépare le vaccin de la solution obtenue. On prépare le vaccin seulement à la protéine du séro-type 2, c'est pourquoi le vaccin ne protège pas contre l'infection méningococcique du séro-groupe A, ainsi que contre d'autres séro-types, sauf le séro-type 2. Le vaccin ne provoque pas la formation d'anticorps à l'égard de certains facteurs pathogéniques importants des méningocoques, tels que les polysaccharides et les lipopolysaccharides de groupe. Dans tous les procédés indiqués de préparation du vaccin méningococcique, on utilise des milieux nutritifs liquides, qui crient des conditions favexables pour la culture aesméningocoques, c'est pourquoi les microbes sont doués de propriétés physiologiques de valeur requise et sont plus toxiques. Cela nécessite l'utilisation, dans le procédé de préparation du vaccin, d'une séquence de procédures technologiques de purification vis-à-vis des lipopolysaccharides. L'emploi, dans les procédés indiqués, de détergents pour l'isolement des principes actifs du vaccin, rend la technologie complexe, puisqu'il exige l'introduction d'opérations additionnelles pour l'élimina- tion du détergent.De plus, l'isolement, par les procédés indiqués, du principe actif consistant en un seul produit parmi l'ensemble des substances contenues dans la paroi cellulaire des méningocoques exige des opérations supplémentaires de purification, ce qui rend plus compliqué le processus et nécessite l'utilisation d'un équipement plus complexe. On s'est donc proposé, en modifiant les opérations technologiques, de créer un procédé permettant d'obtenir un vaccin méningococcique chimique polycomposant à action dirigée contre les méningocoques de tous les séro-groupes connus, inoffensif, faiblement réactogène, qui trouverait application dans la vaccination aussi bien des adultes que des enfants et permettrait également de simplifier la technologie du processus et de l'équipement. La solution consiste en ce que dans le procédé de préparation d'un vaccin méningococcique chimique polycomposant, par culture de méningocoques sur un milieu nutritif exempt de protéines, avec isolement subséquent d'une fraction macromoléculaire polymère, suivant l'invention on effectue séparément les cultures de méningocoques des séro-groupes A, B et C sur un milieu nutritif solide exempt de protéines, on élue séparément la masse microbienne obtenue de chaque séro-groupe avec une solution isotonique de chlorure de sodium à pH de 7,0 à 7,6, on neutralise la liqueur ds culture obtenue par l'acétone, on dissout le précipité sec indiqué dans une solution tampon à pH = 7,6, non supérieure à 0,2 M, et on le soumet à une filtration sur gel avec isolement d'une fraction polymère à masse moléculaire d'au moins 100000 daltons, on traite la fraction obtenue par l'acétone, on lave le précipité formé et on sèche à l'acétone; on mélange les résidus secs des fractions de chacun des séro-groupes A, B, C dans des rapports pondéraux de 14:13:13, respectivement. En qualité de cultures de méningocoques on utilise de préférence les souches des séro-groupes A, B, C Neisseria meningitidis, la souche A-208; la souche B-13090, ou la souche B-23247, ou la souche B-C5; la souche C-0638. Toutes les souches indiquées sont déposées dans la collection de cultures de l'institut d'Etat de standardisation et de contre L.A. Tarasevich. En qualité de milieu nutritif solide, exempt de protéines, il est rationnel d'utiliser un milieu nutritif de composition suivante milieu sec 199 17,5 g eau de viande 400 ml pâte d'amidon (1,5%) 100 ml eau distillée 500 ml agar-agar 20 g chlorure de soude 10 g solution à 20% de soude jusqu'à un pH de 7,4 à 7,6. Pour une dissolution plus complète des substances de la paroi cellulaire on ajoute à la suspension de culture obtenue, après neutralisation, une solution à 20% de soude Jusqu'à un pH de 8,2 à 8,4. Le procédé proposé permet d'obtenir un vaccin chimique méningococcique polycomposant à action dirigée contre les méningocoques de tous les séro-groupes connus - A, B, C, D, X, Y, Z, 29 E, W-I 35. Le vaccin est inoffensif et peu réactogène, grace à quoi il peut être utilisé pour l'immunisation tant des adultes que des enfants. L'utilisation, dans le procédé, de milieux nutritifs solides exempts de protéines, permet d'obtenir un microbe de méningocoque à l'étant faiblement toxique, étant donné que sa culture se déroule dans des conditions défavorables. Cela permet de conserver dans la substance active du vaccin le lipopolysaccharide de la paroi cellulaire, vu sa faible toxicité. Les conditions défavorables de culture sur le milieu nutritif solide sont la cause de la formation d'une paroi cellulaire friable de méningocoques, facilement soluble par lavage avec une solution physiologique,et n'exige pas l'utilisation de détergents. Tout cela simplifie la technologie du processus, étant donné que certaines opérations pour la purification du principe actif, qui doivent être exécutées dans les procédés connus de préparation du vaccin, sont éliminées. De plus, l'isolement du principe actif du vaccin suivant l'invention n'exige pas des opérations de purification supplémentaires, comme dans les procédés connus, vu que le principe actif est un complexe naturel de toutes les substances de la paroi cellulaire des méningocoques. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, détails et avantages de celle-ci apparattront mieux à la lumière de la description qui va suivre de différents modes non limitatifs de réalisation de l'invention. En qualité de souches de vaccin A, B, et C, il est rationnel d'utiliser les souches Neisseria meningitidis, la souche A-208; la souche B-13090 ou la souche B-23247, ou la souche B-C5; la souche C-0638. Pour obtenir la culture d'ensemencement des souches de vaccin de méningocoques, on ouvre l'ampoule contenant la culture sèche dans des conditions stériles et on dissémine dans deux bottes de Pétri avec un milieu nutritif solide contenant 20 de sérum sanguin. On réalisé la culture à la température de 370C dans une chambre humide étanche pendant 18-20 heures. Pour obtenir des cultures de production, les cultures d'ensemencement sont enlevées de dessus les bottes de Pétri avec une solution de Hanks réchauffée préalablement jusqu'à la température de 370C. On obtient une suspension contenait 1 milliard de corps microbiens dans 1 ml. On ensemence 5 ml de cette suspension de méningocoques dans chaque matras contenant le milieu nutritif solide de composition précitée. On conduit la culture de production (de chaque souche séparément) sur un milieu nutritif solide de composition suivante milieu sec 199 (préparation Casamino acids "Difco") 17,5 g eau de viande 400 ml pâte d'amidon (1,5 ) 100 ml eau distillée 500 ml agar-agar 20 g chlorure de soude 10 g solution à 20% de soude jusqu'à un pH de 7,4 à 7,6. On stérilise le milieu dans un autoclave à la température de 1150C à raison de 30 minutes par jour pendant trois jours. On réalise la culture à la température de 37 C pendant 18-20 heures. Une fois la culture achevée, on examine les matras. La culture de production doit croitre sous forme de colonies rondes, lisses, aplaties, légèrement opalescentes, jusqu'à 3 mm de diamètre, ayant à la lumière une couleur bleuâtre. Le matras est mis au rebut s'il contient des colonies atypiques. On prélève une prise à partir de chaque matiras, qu'on colore par la méthode de Gram. La microscopie doit détecter dans la prise seulement les cocus gram-négatifs. On lave la culture de production de méningocoques avec une solution à 0,9% de NaCl, à pH de 7,0 à 7,6, on ajoute à la culture lavée du merthiolate jusqu'à une concentration de 0,01%.Pour une neutralisation complète de la suspension, on la maintient à la température ambiante pendant deux heures, sous agitation. Pour une dissolution plus complète des substances de la paroi cellulaire, on ajouteàlasuspension de culture obtenue après la neutralisation une solution à 20% de soude jusqu'à un pH de 8,2 à 8,4. On centrifuge la suspension de la culture de production afin d'éliminer le résidu microbien. On recueille le centrifugat limpide. On refroidit le centrifugat jusqu'à une temperature de +4 à +60C et on ajoute de l'acétone. On maintient le mélange obtenu à ladite température de +4 à +60C pendant 18 à 20 heures. On sépare par centrifugation le précipité formé, on lave et on sèche à l'acétone. On obtient un précipité sec se présentant sous forme d'une poudre jaune ou brun clair. On obtient le précipité sec de la culture de production séparément à partir de chaque souche. On dissout séparément le précipité sec de chaque souche dans une solution tampon, par exemple dans des solutions tampons 01 Mtris, 0,01 M HCl, 0,15 M NaCl avec 0,01% de NaN3, à pH de 7,6. On centrifuge la solution obtenue pour clarification et on la soumet à une filtration sur gel avec isolement d'une fraction polymère à masse moléculaire d'au moins 100000 daltons. On refroidit la fraction recueillie, contenant la matière vaccinale, jusqu a une température de +4 à +60C et on y ajoute de l'acétone. On maintient le mélange pendant 18 à 20 heures pour précipitation. On sépare le précipité par centrifugation, on lave et on sèche à l'acétone. On obtient une poudre sèche pulvérulente de couleur blanche ou jaunâtre. Les précipités secs de chaque fraction des séro-groupes A, B et C sont soumis à un contrôle de poids moléculaire.On soumet au contrôle le poids moléculaire des précipités secs des fractions par filtration dans une colonne remplie de gel Séphadex G-I 00. On conduit ltélution avec une solution 0,14 M de chlorure de soude contenant une solution 0,05 M de tris-hydroxyméthylaminométhane, et une solution 0,001 M de sel disodique d'acide éthylènediamine-tétra-acétique, et ayantn pH de 7,5.On recueille pendant ltélution des portions de 3 à 3,5 ml. La vitesse d'élution est de 15 à 20 ml/heure. On détermine d'abord le volume libre et le volume final (interne) du gel dans la colonne.Pour cela, on introduit dans la colonne 3 ml d'éluant contenant 5 mg de dextrane bleu (masse moléculaire de 2 millions de daltons) et 5 mg de merthiolate, on réalise une filtration sur gel et on soumet à la spectrophotométrie à 280 nm les portions de 3 à 3,5 ml recueillies. Le volume d'élution du premier pic sortant, coloré en bleu, correspond au libre volume de la colonne. Le volume d'élution du deuxième pic incolore correspond au volume final (interne) de la colonne. On dissout la préparation sèche à étudier dans la solution éluante à raison de 15 mg dans 3 ml, on centrifuge pour clarification, on introduit dans la colonne et on effectue une filtration sur gel. On recueille les portions d'éluat de 3 à 3,5 ml, qu'on soumet à la spectrophotométrie à 280 nm. Le volume d'éluat total analysé doit correspondre au volume final de la colonne. La préparation analysée de la fraction de vaccin doit sortir de la colonne d'un seul pic dont le volume d'élution doit correspondre au libre volume de la colonne. Si la préparation contient des fractions formant des pics avec un volume d'élution dépassant le volume libre de la colonne, cette préparation ne peut pas titre utilisée pour l'obtention du vaccin, elle doit subir une purification supplémentaire. Les précipités secs de fractions de chaque séro-groupe l, B et C sont mélangés dans des conditions stériles dans des rapports pondéraux de 14:13:13, respectivement. Le mélange constitué par les précipités de trois souches et uniformément brassé est mis en flacons dans des conditions stériles. On bouche les flacons et on conserve à une température de à 0 à +40C à l'abri de la lumière. Le vaccin est dissous avant utilisation dans une solution isotonique injectable de chlorure de soude. La quantité totale de substance sèche de la paroi cellulaire des méningocoques des groupes A, B et C dans le vaccin doit être de 400 g/ml. le vacoin peut etre préparé tent à l'état sec qu'à l'état liquide. Le vaccin obtenu est une solution de substances de la paroi cellulaire des méningocoques des séro-groupes A, B, C consistant en un ensemble de mucopolysaccharides de séro-groupe, de protéine typique, de lipopolysaccharides, de protéines de toutes espèces des méningocoques, qui se trouvent sous forme de composés macromoléculaires polymères (à masse moléculaire d'au moins 100.000 daltons), provoquant chez l'homme, après la vaccination, la formation d'anticorps bactéricides vis-à-vis des méningocoques des séro-groupes A, B ,C. Le vaccin fini est soumis à diverses méthodes de contrôle. On réalise le contrôle des propriétés physiques du vaccin par inspection des ampoules contenant le vaccin. Le vaccin doit se présenter sous forme d'une solution incolore limpide ou légèrement opalescente, ne contenant pas d'inclusions, de précipité ou de traces de trouble. Les ampoules dans lesquelles le vaccin ne correspond pas aux conditions requises sont mises au rebut. On effectue un contrôle de la qualité du soudage des ampoules, un contrôle d'étiquetage correct, un contrôle de la stérilité du vaccin. On réalise le contrôle de l'innocuité du vaccin pour les souris blanches. On réalise l'expérience sur 5 souris blanches mises en quarantaine (avant l'expérience) pendant 5 jours. Le poids de chaque animal doit être de 12-14 g au début de l'essai. On injecte à chaque souris 1 ml de vaccin, c'est-à-dire deux doses humaines, par voie intrapéritonéale. Pour cela , on prend avec la seringue le contenu de deux ampoules. On observe ces souris pendant 7 jours. Aucune perte de souris ne doit se produire dans le groupe étudié pendant cette période. On effectue le contrôle de l'innocuité du vaccin pour les cobayes. On réalise l'expérience sur 5 cobayes de 350-400 g chacun, qu'on met en quarantaine avant l'expérience. On injecte à chaque cobaye 5 ml de vaccin, ctest-à-dire 10 doses humaines, par voie intrapéritonéale. On observe les cobayes vaccinés pendant 7 jours. Aucun sacrifice de cobayes ne doit se produire dans le groupe étudié pendant cette période. On effectue le contrôle des propriétés pyrogènes pour les lapins. Le vaccin ne doit pas être pyrogène pour les lapins après introduction intraveineuse en dilution de 1:40000 dans le volume de 1 ml par kg de poids du lapin. On réalise l'étude sur des lapins sains des deux sexes, de 1,5 à 2,5 kg chacun, maintenus a des rations de valeur requise. On choisit les lapins 5 jours avant l'essai. On les pèse au moins 3 fois tous les deux jours, Les lapins ne doivent pas perdre de poids pendant la période qui précède l'essai (5 jours) On mesure la température des lapins expérimentaux pendant les 3 jours qui précèdent l'essai. La température initiale doit titre dans des limites de 38,5 à 39,50C. Vingt-quatre heures avant l'essai, on place les lapins dans un local, dans lequel on réalise l'épreuve de pyrogénéité. Avant et au cours de l'essai, les lapins ne reçoivent pas de nourriture, mais on leur donne de l'eau sans restriction. La pyrogénéité du vaccin a été contrôlée sur 5 lapins. La solution a étudier sur chaque lapin est préparée à partir d'une ampoule distincte contenant le vaccin. On utilise pour la dilution du vaccin une solution isotonique à 0,9,' de chlorure de soude pour injections. On injecte à chacun des 3 lapins la solution préparée de vaccin dilué à 1:40.000, à raison de 1 ml par kg de poids, par voie intraveineuse. On considère l'épreuve de pyrogénéité du vaccin comme satisfaisante si, après son introduction, on n'observe chez aucun des 3 lapins expérimentaux et dans aucune des trois mesures effectuées (à des intervalles d'une heure), une augmentation de plus de 0,60C par rapport à celle de départ, et si l'augmentation totale de la température chez les trois lapins ne dépasse pas 1,40C. Si la température chez l'un ou chez deux des lapins augmente de plus de O,C Cet au total de plus de 1,45 on repète l'essai sur 5 lapins. Le vaccin est considéré comme correspondant aux exigences de l'épreuve de pyrogénéité si on observe une augmentation individuelle de la température de 0,60Cau plus chez 3 des 8 lapins, et si la somme des augmentations de température chez les 8 lapins ne dépasse pas 3,70cyon réalise également un contrôle de l'activité sérologique du vaccin et de l'aptitude du vaccin à provoquer la formation d'anticorps bactéricides chez l'homme. Le vaccin est considéré comme capable de provoquer la formation d'anticorps bactéricides chez l'homme si chez au moins 4 sur 5 personnes vaccinées on observe dans les sérums obtenus après la vaccination, la formation d'anticorps bactéricides pour chacune des trois souches étudiées dont le titre dépasse de quatre fois le titre des anticorps bactéricides des sérums prélevés avant l'immunisation. Si on observe une augmentation quadruple du titre des anticorps bactéricides, pour chacune des souches utilisées pour l'essai, chez moins de 4 personnes parmi les 5 vaccinées, on répète l'expérience. Pendant cette répétition on effectue l'expérience sur 10 volontaires. Une augmentation quadruple du titre des anticorps bactéricides doit être observée chez au moins 8 personnes pour chacune des 3 souches, comparativement au titre avant la vaccination. Le vaccin suivant l'invention a été soumis à un essai d'innocuité vis-à-vis de sujets humains. L'essai d'innocuité du vaccin a une importance particulière étant donné que le principe actif du vaccin contient 12 à 18% de lipopolysaccharides, considérés comme des endotoxines provoquant des réactions secondaires nuisibles après l'inoculation. Dans les conditions cliniques (avec hospitalisation pour examens précis) l'innocuité du vaccin a été vérifiée chez 20 volontaires ayant reçu une dose du vaccin de 0,5 ml contenant 200/ccg de principe actif de la paroi cellulaire des méningocoques. Les volontaires examinés étaient âgés de 18 à 48 ans. Les sujets vaccinés ont subi dans les conditions cliniques un examen de leur état général, une détermination détaillée et régulière de la réaction de température, un contre des réactions locales, un examen systématique par les médecins-cliniciens. On a réalisé une électrocardiographie et une électroencéphalographie, on a déterminé systématiquement l'hémogramme, on a effectué des analyses systématiques de l'urine, on a déterminé les indices de l'équilibre acido-basique du sang. Tous les indices obtenus se trouvaient dans les limites des réactions physiologiques normales et ont témoigné de l'innocuité clinique du vaccin proposé pour les adultes. L'innocuité et les propriétés réactogènes du vaccin ont été déterminées dans les conditions ambulatoires chez des volontaires agés de 18 à 22 ans, s'occupant de travaux physiques lourds sous le climat torride de la zone géographique des steppes sèches, sans acclimatation et adaptation suffisantes à ces conditions. Quatre groupes de sujets ont été vaccinés (110 sujets par groupe). A chaque groupe de volontaires on a injecté par voie souscutanée et à l'aide de seringues : 1) 0,25 ml de vaccin (100/tg de principe actif); 2) 0,5 ml de vaccin (200yLg de principe actif); 3) 1,0 ml de vaccin (400/reg de principe actif); 4) dans le groupe de contrôle-0,5 ml de solution physiologique injectable. Chez les personnes inoculées avec le vaccin méningococcique on a observé de faibles réactions de température (jusqu'à 37,50), pas plus fréquents que dans le groupe de contrôle (50,0%).Des réactions de température moyennes (jusqu'à 38,50) ont eu lieu,dans des cas isolés, avec des doses de vaccin de 0,5 ml et 1,0 ml , chez 5 et 2 sujets respectivement, dans chaque groupe de 110 sujets. Ces réactions n'ont pas eu lieu avec une dose de 0,25 nil. Chez 3 sujets inoculés avec 0,5 ml de vaccin s'est manifestée une rubéfaction allant jusqu'à 2,5 cm de diamètre, sans infiltration. Les indices de l'examen du sang (avec détermination des hémogrammes), de l'urine, de l'électro- cardiographie et de l'inspection médicale ont témoigné de l'-innocuité du vaccin après son introduction aux adultes à des doses allant jusqu a 1,0 ml par vois sous-cutanée. La détermination de l'innocuité et du caractère réactogène du vaccin dans les conditions de champ a été réalisée chez 5.000 sujets de 18 à 22 ans, à qui on a injecté 0,5 ml de vaccin (2OOg g de principe actif) à l'aide d'un injecteur sans aiguille. Les sujets vaccinés s'occupaient de travaux physiques lourds sous le climat torride de la zone géographique des steppes sèches, sans acclimatation et adaptation suffisantes. Tous les sujets vaccinés se trouvaient sous observation médicale constante. Chez aucun de ces sujets on n'a observé une altération de la santé ou une diminution de la capacité de travail, ce qui témoigne de l'innocuité du vaccin après son introduction par voie sous-cutanée à l'aide d'un injecteur sans aiguille à une dose de 0,5 ml (200 g de principe actif). L'innocuité et le caractère réactogène du vaccin pour les enfants ontété étudiés par injections sous-cutanées de 0,2 ml (80 g g de principe actif) chez des enfants agés de 6 mois à 2 ans, et de 0,25 ml (100/cg de principe actif du vaccin) chez des enfants agés de 3 à 7 ans. Les données de l'observation clinique des enfants, ainsi que les examens de laboratoire instrumentaux et allergologiques ont permis de conclure que les doses utilisées (0,2 ml et 0,25 ml) sont absolument inoffensives et tolérables. L'efficacité immunologique du vaccin a été étudiée par détermination des anticorps bactéricides chez des sujets agés de 18 à 22 ans inoculés par voie sous-cutanée à l'aide d'une seringue à des doses de 0,25 ml (100 g) (56 sujets), de 0,5 ml (200 g) (55 sujets), et de 1,0 ml (400+ g) (57 sujets). Une augmentation quadruple et davantage des titres des anticorps bactéricides à l'égard des méningocoques des séro-groupes A, B et C a été observée 22 à 30 jours après l'inoculation chez 152 sujets parmi les 168 inoculés (c'est-à-dire chez 90,4%).On a réalisé des études de l'efficacité épidémiologique du vaccin : 400 sujets âgés de 18 à 22 ans et se trouvant dans des conditions de morbidité élevée due à des formes généralisées d'infection méningococcique ont été inoculés avec le vaccin chimique méningococcique polycomposant par voie sous-cutanée. Centdix sujets ont été inoculés avec des doses de 0,25 ml (100/ > g de principe actif), 110 sujets avec des doses de 1,0 ml (400 g de principe actif), et 180 avec des doses de 0,5 ml (200 g de substance sèche).Pendant les trois mois d'observation (à compter du jour de vaccination), on n'a pas enregistré chez les vaccinés d'affections par des formes généralisées d'infection méningococcique, tandis que chez les sujets non vaccinés se trouvant dans les mêmes conditions et en contact de vie et de travail étroit avec les sujets inoculés, on a observé, comme auparavant, des indices élevés de morbidité due à des formes généralisées d'infection méningococcique. Plusieurs exemples concrets mais non limitatifs de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention sont décrits ci-après. Exemple 1 Des souches vaccinales de méningocoques des séro-groupes A, B et C sont conservées à l'état lyophilisé dans des ampoules soudées. La préparation du médicament faisant partie de la composition du vaccin se fait séparément à partir de chaque souche de trois séro-groupes. Le séro-groupe A-Neisseria meningitidis, souche A-208, le séro-groupe B-Neisseria meningitidis, souche B-1309O, le séro-groupe C-souche C-0638. Pour obtenir la culture d'ensemencement, le contenu d'une ampoule est ensemencé dans deux bottes avec un milieu nutritif solide contenant 20% de sérum sanguin. On effectue la culture à la température de 370C dans une chambre humide, dans une atmosphère contenant 1096 de C02, pendant 18-20 heures. Pour obtenir les cultures de production, on élue les cultures d'ensemencement de dessus de boites de Pétri pour obtenir une suspension contenant 1 milliard d'anticorps microbiens dans 1 ml. Cette suspension est ensemencée dans des matras contenant un milieu nutritif semi-synthétique exempt de protéines,dense , de composition suivante milieu sec 199 (Casamino acides 11Difco") 17,5 g eau de viande 400 ml pâte d'amidon (1,5%) 100 ml eau distillée 500 ml agar-agar 20 g chlorure de soude 10 g solution à 2096 de soude ajoutée jusqu'à pH = 7,4 à 7,6. On stérilise le milieu dans un autoclave à la température de 1150C à raison de 30 minutes quotidiennement, pendant 3 jours. Chaque matras est ensemencé avec 5 ml de suspension. La suspension de méningocoques de chacun des trois séro-groupes est ensemencée dans 100 matras. On effectue la culture de production à la température de 370C dans une chambre humide, dans une atmosphère contenant 10% de C02, pendant 18-20 heures. Une fois la culture achevée, on élue la culture de production avec une solution à 0,996 de chlorure de soude à pH de 7,2-7,4, en l'ajoutant dans les matras à raison de 15-20 ml. On réunit les éluats des matiras, en obtenant 1000-2000 ml de suspension de chacun des différents sérogroupes de méningocoques. Chaque suspension est additionnée de thiomersal (merthiolate) à raison de 10 mg par 100 ml de suspension, c'est-à-dire jusqu la concentration de 0,01%. On maintient les suspensions pendant deux heures à la température ambiante, en les agitant toutes les 20-30 minutes. On ajoute une solution à 2096 de soude jusqu'à un pH de 8,2-8,4, immédiatement après ltélution des matras et l'addition de merthiolate dans la suspension. On centrifuge la suspension pour une précipitation complète des microbes, on recueille le centrifugat limpide et on rejette le résidu. On refroidit le centrifugat de la culture de production jusqu'à une température de +4 à +60C et on ajoute 2 volumes d'acétone préalablement refroidie jusqu'à cettEtempérature , on maintient le mélange à ladite température de +4 à +60C pendant 18-20 heures pour former le précipité. On sépare par centrifugation le précipité formé, on lave trois fois à l'acétone refroidie (+h à +60C), et on sèche dans un bécher centrifuge dans un courant d'air. On obtient une préparation sèche de centrifugat de culture de production, se présentant sous forme d'une poudre jaunâtre. On conserve cette préparation dans des flacons fermés hermétiquement avec des bouchons de caoutchouc, dans un local sec à la température ambiante. Le rendement en préparation sèche obtenue dans 100 matras est de 10 à 20 g. L'isolement de la fraction vaccinale de la préparation sèche de chaque séro-groupe de méningocoques est réalisé par filtration sur gel à travers du Séphadex G-100. Le fractionnement est effectué dans des conditions stériles. Par filtration sur gel, on recueille une substance éluable dans le volume libre de la colonne. On effectue l'élution avec une solution stérile à 0,9% de chlorure de soude à pH de 7,4-7,6. La substance recueillie par filtration sur gel, éluable dans le volume libre de la colonne et contenant la matière vaccinale, est refroidie jusqu'à une température de +4 à +60C, et on y ajoute deux volumes d'acétone refroidie. On maintient le mélange à une température de+4 à +60C pendant 18-20 heures pour former le précipité. On sépare par centrifugation. le préclplte forme, on lave trois fois à l'acétone refroidie et on sèche dans le courant d'air. On obtient une matière pulvérulente sèche de couleur blanche ou jaune. Le rendement en préparation sèche de la fraction vaccinale est de 150 à 200 mg dans 100 matiras. On mélange les précipités secs obtenus des fractions de chaque séro-groupe A, B, C dans des conditions stériles et dans des rapports pondéraux de 14:13:13. La quantité totale de substance sèche de la paroi cellulaire des miningocoques des séro-groupes A, B et C dans le vaccin constitue 400 otfg/ml. Le mélange sec obtenu est conditionné en atmosphère stérile dans des flacons de 10 doses chaque (à raison d'une dose de 200 Ig de principe actif sec), calculée pour la dilution dans 0,5 ml de solution isotonique de chlorure de soude à injecter. Le rendement en vaccin fini dans 300 matras (à raison de 100 matras pour chaque séro-groupe) constitue 1200-1500 doses. La durée de validité du vaccin est un an à partir du jour de sa préparation. Exemple 2 On réalise la préparation du vaccin d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 1. En qualité de souche du séro-groupe B on utilise Neisseria meningitidis, souche B-23247. On dissout les précipités secs des fractions de chacun des séro-groupes A, B, C dans une solution isotonique de chlorure de soude à injecter, de façon que 1 ml de vaccin contienne la quantité de substance sèche suivante, en préparation de méningocoques du séro-groupe A;140 préparation de méningocoques du séro-groupe B:130 préparation de méningocoques du séro-groupe C:13O. Immédiatement après la dissolution des précipités secs des fractions de chacun des séro-groupes A, B, C dans la solution isotonique de chlorure de soude à injecter, on soumet la solution obtenue à une filtration stérilisante à travers des filtres à dimensions de pores supérieures à 0,22 micron, on remplit stérilement les ampoules de 0,5 mlet on les soude. Une dose de vaccin de 0,5 ml contient 200 de principe actif sec. Le rendement en vaccin fini obtenu dans 300 matras (à raison de 100 matras pour chacun des sérogroupes) constitue 1200-1500 doses. On conserve les ampoules contenant le vaccin à une température de +4 à +6 C jusqu'au jour de l'injection. La durée de validité du vaccin est d'uné année à compter du jour de la préparation de la solution de fractions vaccinales. Exemple 3 On réalise la préparation du vaccin comme dans l'exemple 1. En qualité de souche du séro-groupe B on utilise N.meningitidis, souche B-C5. On conditionne le vaccin sec obtenu par 100 doses (à raison d'une dose de 200) g de principe actif sec). Le rendement en vaccin fini obtenu dans 300 matras est de 1200-1500 doses. La dure'e d* validité du vaccin est d'une année à compter du jour de sa préparation. REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation d'un vaccin chimique méningococcique à plusieurs composants, par culture de méningocoques sur un milieu nutritif exempt de protéines, suivie de l'isolement d'une fraction polymère macromoléculaire et de l'obtention du vaccin, caractérisé en ce qu'on effectue séparément les cultures méningococciques des séro-groupes A, B et C sur un milieu nutritif solide exempt de protéines, on élue séparément la masse microbienne obtenue de chacun des séro-groupes avec une solution isotonique de chlorure de soude à pH de 7,0 à 7,6, on neutralise la suspension de culture obtenue, on en élimine le résidu microbien, on traite la liqueur de culture obtenue avec de l'acétone, on sépare le précipité formé, après quoi on le lave et on le sèche à l'acétone; on dissout ledit précipité sec dans une solution tampon 0,2 M au maximum, à pH de 7,6, on le soumet à une filtration sur gel avec isolement d'une fraction polymère à masse moléculaire d'au moins 100.000 daltons, on traite la fraction obtenue avec de l'acétone, on lave et on sèche à l'acétone le précipité formé; on mélange les précipités secs de fractions de chacun des séro-types A, B, C dans des conditions stériles et dans des rapports pondéraux de 14:13:13, respectivement. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'en qualité de cultures de méningocoques on utilise des souches des séro-groupes A, B, C Neisseria meningitidis, souche A-208; souche B-13090 ou souche B-23247, ou souche B-C5; souche C-0638. 3.- Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'en qualité de milieu nutritif solide exempt de protéines, on utilise un milieu nutritif de composition suivante milieu sec 199 17,5 g eau de viande 400 ml pate d'amidon (1,596) 100 ml eau distillée 500 ml agar-agar 20 g chlorure de soude 10 g solution à 20% de soude jusqu'à pH de 7,4 à 7,6. 4.- Procédé suivant l'une des revendications 1, 2 et 3, caractérisé en ce que pour assurer une dissolution plus complète des substances de la paroi cellulaire des méningocoques, on ajoute à la suspension de culture obtenue, après sa neutralisation, une solution à 20% de soude jusqu'à un pH de 8,2 à 8,4. 5.- Vaccin chimique méningococcique à plusieurs composants, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé faisant l'objet de l'une des revendications 1 à 4.