Brevet FR2532548A1 — publié le 19840309

La présente invention est relative à un nouveau procédé de production de vaccins à partir de virus du type à enveloppe, tels que les togaviridae, et notamment de production de vaccins anti-amarils, ainsi que de vaccins à partir des virus de la rougeole ou de la rubéole, permettant l'obtention de vaccins présentant un haut degré de pureté et un titre de virus élevé. Le vaccin de la fièvre jaune est actuellement préparé partir d'oeufs de poule embryonnés auxquels sont inoculés des germes d'une souche de virus de la fièvre jaune (la souche Rockefeller 17D), qui diffusent dans l'oeuf et l'infectent, y compris l'embryon, lequel est recueilli pour être broyé et mis en suspensions utilisables en tant que vaccins après traitements de congélation-décongélation, puis dilution et lyophilisation. Les vaccins anti-amarils obtenus de la sorte présentent l'inconvénient de nécessiter la manipulation d'un nombre important d'oeufs pour leur préparation et de requérir une quantité spéciale d'oeuf s, à savoir les oeufs "avian leucose free" dont le coût est très élevé. De plus, les vaccins ainsi obtenus, du fait même de leur origine, sont riches en protéine-s d'oeufs qui constituent un facteur allergisant et sont à l'origine de réactions allergiques au vaccin anti-amaril.A ceci s'ajoute que le rendement d'un tel mode de production est faible et peu fiable, puisque le titre de virus de ces vaccins peut varier de 1000 à 20 000 DL50 (souris) pour une dose vaccinante de 0,5 ml, ce qui est d'autant plus préjudiciable que ces virus ne sont pas thermostables et que les vaccins subissent une perte de titre aux températures ambiantes d'utilisation. La présente invention a pour but de pourvoir à un nouveau procédé de production de vaccins à partir de virus du type à enveloppe, tels que les virus de la fièvre jaune ou de la rougeole, notamment, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés proposés conformément à l'Art antérieur, notamment en ce que ce procédé qui est très économe en matière première puisqu'il permet d'obtenir avec 10 fois moins d'oeufs "avian leucose free" qu'auparavant, une quantité identique de vaccin, dont la qualité est très supérieure à celle des vaccins obtenus conformément à l'Art antérieur, puisque les vaccins obtenus par le procédé conforme à la présente invention sont très purifiés et dépourvus de facteur allergisant et présentent un titre de virus plus de 10 fois supérieur à celui des vaccins obtenus par les procédés de l'Art antérieur. La présente invention a pour objet un procédé de production de vaccins à partir de virus du type à enveloppe, tels que les togaviridae et en particulier le virus de la fièvre jaune, les virus de la rougeole ou de la rubéole, notamment, caractérisé en ce que lesdits vaccins sont obtenus par culture des virus susdits sur des cellules d'embryons de poulets. Selon un mode de réalisation préféré du procédé objet de la présente invention, les cellules d'embryons de poulet sur lesquelles lesdits virus sont cultivés, sont obtenues à partir d'oeufs "leucose free" embryonnés, dont les embryons sont soumis à l'action de la trypsine pour permettre l'obtention d'une importante quantité de cellules, supérieure à 108 par oeuf, destinées à être utilisées pour la culture des virus susdits. Selon une modalité avantageuse de ce mode de réalisation, les cellules recueillies après trypsinisation sont mises en suspension dans un milieu de culture cellulaire convenable dont la concentration minimum en cellules est de 5.105 cellules/ ml, dans lequel les cellules sont cultivées jusqu'à confluence. Selon une autre modalité avantageuse de ce mode de réalisation, les cellules d'embryons de poulets utilisées pour la culture de virus sont obtenues après incubation d'oeufs "avian leucose free" pendant 9 à 11 jours à 380C + 0,50C en atmosphère humide et sont constituées par des fibroblastes d'embryons de poulet. Selon encore une autre modalité avantageuse de ce mode de réalisation, le virus destiné à être cultivé sur lesdites cellules est constitué par une suspension virale dont la teneur en virus est telle que la multiplicité d'infection des cellules est de l'ordre de 0,01, ce qui signifie que l'infection des cellules par le virus est effectuée par un virus pour 100 cellules. Conformément à l'invention, la culture cellulaire dudit virus est maintenue pendant 90 heures + 20 % à une température de l'ordre de 36"C + 10C, après quoi le surnageant résultant de la culture cellulaire du virus est soumis à un traitement de congélation-décongélation, puis centrifugé, filtré sur un filtre dont la porosité n'est pas supérieure à 0,80 et stabilisé au moyen d'agents stabilisants appropriés, puis congelé jusqu'à sa répartition sous forme de doses vaccinantes dont le titre de virus, par dose de 0,5 ml, est supérieur à 106 UFP. Selon une modalité avantageuse de l'invention, le milieu de culture des cellules dans lequel les cellules d'embryons de poulets sont cultivées jusqu a confluence, est un milieu de culture de baseoconvenable additionné de sérum de veau foetal ou nouveau-né, dans une proportion comprise entre 2 et 8 % en volume, d'hydrolysat de lactalbumine dans une proportion comprise entre 5 et 15 % en volume et d'un antibiotique antibactérien à large spectre du type de la gentamycine, dans une proportion comprise entre 20 et 60 mg/litre. Selon une autre modalité avantageuse de l'intention, le virus en suspension est cultivé sur les cellules, en présence d'un milieu de maintenance et de production de virus comprenant avantageusement le même milieu de culture de base que celui utilisé pour développer la culture cellulaire, additionné dtun tampon approprié tel que Hépès de 10 à 40 mMfi- nal pli 7 à 7,6 et/ou bicarbonate 1 à 30/oxo, de 0,5 à 1,50/oxo de gélatine ou dsalbumine humaine 0,1à 0,30/o et d'un antibiotique antibactérien à large spectre choisi en particulier parmi la gentamycine, la streptomycine et la kanamicinej présent à raison de 10 à 60 mg/litre. Selon encore une autre modalité avantageuse de l'invention, les agents stabilisants ajoutés au surnageant de la culture cellulaire du virus sont avantageusement constitués par une solution contenant au moins un sucre, au moins un acide aminé, au moinsun polyalcool tel que le sorbitol et contenant éventuellement en outre une protéine non sensibilisante telle que la gélatine. Conformément à l'invention, l'agent stabilisant est avantageusement constitué par une solution contenant, en con centratlon finale, 3 à 5 % de lactose ou de saccharose, 1,5 à 2,5 % de sorbitol et 1 à 20/o o d'acides aminés tels que histidine , lysine ou alanine, ou par une solution contenant1 en concentration finale, 3 à 5 % de lactose ou de saccharose, 1 à 2,5 % de sorbitol et 1,5 à 3 % d'albumine humaine, et auxquelles peut être ajoutée de la gélatine en concentration fi- nale 0,4 à 1 t. Selon une modalité avantageuse de l'invention, l'agent stabilisant est ajouté au surnageant de culture virale à raison de 50 % en volume. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple de mise en oeuvre, est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont il ne constitue en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1. Incubation des oeufs 10 oeufs de poule "avian leucose free" sont incubés à38,50C en atmosphère humide durant 9 à 11 jours. 2. Trypsinisation Les oeufs sont alors nettoyés par immersion tout d'abord dans une solution aqueuse à 1 % de formol à 370C pendant dix minutes, puis dans une solution aqueuse à 10/oo d'alcool iodé, pendant 15 secondes. Un tel nettoyage évite la contamination des embryons lors de l'ouverture des oeufs. Les oeufs sont alors ouverts pour en extraire les embryons qui sont débarassés de leurs pattes et de leur tête et sont découpés en petits fragments. Après lavage dans une solution de Hanks, les fragments sont soumis durant 30 minutes à l'action d'une solution de trypsine à 0,25 % additionnée d'EDTA à 0,20/00, dans du liquide de Hanks. Le surnageant est recueilli, après filtration sur gaze stérile, dans un tube à centrifuger placé dans de la glace et contenant 5 ml de sérum de veau. Après centrifugation de ce surnageant à 3000 g pendant 15 minutes, on recueille le culot de centrifugation constitué par les cellules : on obtient 108 cellules par oeuf. 3. Culture cellulaire Les cellules sont reprises dans 20 ml de milieu de culture constitué par du MEM (Minimum Eagle Medium)-ou un autre milieu équivalent tel que le milieu de LEIBOwITZ, par exempleadditionné de 5 e de sérum de veau foetal de 10 % d'hydrolysat de lactalbumine et de gentamycine à raison de 40 mg/litre pour obtenir une suspension cellulaire comprenant 5.105 cellules/ ml. Cette suspension cellulaire est placée dans des flacons Roller de 850 cm2 et les cellules sont incubées pendant 3 à 5 jours à 370C. 4. Production de virus Le milieu de culture est alors retiré. Les cellules sont lavées une fois avec une solution de Hanks, puis infectées avec une suspension de virus de la fièvre jaune de souche Rockefeller 17D, déposée auprès de la Collection Nationale de Micro-organismes de l'institut Pasteur (CNCM) le 1er mars 1982 sous le nO I.186, pour avoir une multiplicité d'infection égale à 0,01, c'est-à-dire une multiplicité d'infection égale à un virus pour 100 cellules. Après 90 minutes de contact à 36"C, les cellules sont lavées deux fois avec de la solution de Hanks, après quoi on leur ajoute 150 ml d'un milieu de maintenance et de production de virus constitué par du MEM tamponné par de l'Hépès, 25 mM pH 7,2 et contenant 1O/oo de gélatine et 40 mg/litre de gentamycine. Après 72 heures à 360C, les flacons avec leur contenu sont rapidement congelés dans un bain de carboglace et alcool, puis décongelés. Le contenu des flacons est centrifugé à 3000 g, puis filtré sur un filtre de porosité 0,45p, tel qu'un filtre "Millipore" par exemple, préalablement traité par du milieu présentant la composition du milieu de maintenance et de production de virus mentionné ci-dessu, un tel traitement préalable ayant pour effet d'éviter que les virus n'adhèrent au filtre et n'entraînent, de ce fait, une perte de virus. Le surnageant de filtration est additionné d'un agent stabilisant qui a pour rôle de maintenir le titre de virus du vaccin finalement obtenu, même si celui-ci est conservé dans de mauvaises conditions. L'agent stabilisant mis en oeuvre peut être choisi parmi les agents stabilisants proposés dans l'Art antérieur, ou peut présenter l'une des compositions suivantes Saccharose ou lactose 5 % Lactose ou saccharose 5 % Gélatine 0,5 nO Sorbitol 2 % Sorbitol 2 % Albumine humaine 1 % Lysine 1 /oo Gélatine 1 % Alanine î0/oo Le surnageant ainsi stabilisé est congelé jusqu'à sa répartition en doses de 0,5 ml par ampoule, chaque dose présentant un titre de virus supérieur à 106 UFP ; le contenu de ces ampoules est traité selon les processus usuels, c'est-àdire lyophilisé, avant d'être éventuellement dilué par de l'eau saline (chlorure de sodium 2 à 90/oxo) au moment de l'emploi. Alors que par la méthode traditionnelle de production de vaccin anti-amaril à partir d'oeufs embryonnés, 250 oeufs sont nécessaires pour préparer 100 000 doses, le nouveau procédé conforme à la présente invention, de production de vaccin par culture de virus sur des cellules, et plus particulièrement sur des fibroblastes, d'embryons de poulet, permet de préparer la même quantité de vaccin en partant de 5 oeufs "avian leucose free" seulement ;; de plus, alors que le procédé classique d'inoculation du virus à l'embryon, qui consiste à inoculer du virus dans la cavité allantoidienne d'oeuf s, au moyen d'une aiguille à injection, le virus diffusant dans l'oeuf y compris dans l'embryon, est un procédé à l'aveugle, d'une reproductibilité très aléatoire, puisque les quantités de virus qui diffusent dans l'embryon utilisé pour la production de vaccin sont éminemment variables d'un oeuf à l'autre, étant donné qu'une telle diffusion est laissée à la nature, contrairement à cela, le nouveau procédé conforme à l'invention assure une reproductibilité parfaite de la production du vaccin, puisque l'inoculation du virus est réalisée sur une culture de cellules d'embryons de poulet parvenue à confluence et utilise une suspension virale qui permet d'assurer une multiplicité d'infection homogène à la culture cellulaire et, partant, une reproductibilité parfaite du titre de virus des vaccins obtenus. Le titre de virus du vaccin obtenu est contrôlé par la méthode des plages sur cellules de rein de porc en plaque Linbro : les cellules mises en contact avec différentes dilutions sont maintenues 5 jours à 370C sous une couche de carboxyméthylcellulose à 1,6 Ó dans un milieu de culture, puis colorées,'le titre est exprimé en unités formant plage (UFP) par millilitre. Les titrages ont, en outre, permis de mettre en évidence que la multiplicité d'infection intervient peu sur la courbe de croissance de la culture virale, ainsi que cela ressort du dessin annexé. Les titrages sont réalisés comme suit 5 ml d'une suspension de cellules à 4.105 cellules/ml sont placés dans 5 flacons de 25 cm2 et sont maintenues durant trois jours à 370C, après quoi on trypsinise un flacon et on compte les cellules : 2.106 cellules/flacon.On infecte alors les cellules avec une multiplicité d'infection de 0,01 0,03 0,06 O,1 en procédant comme suit - on lave les cellules une fois avec 5 ml de solution de Hanks, - on place sur les cellules lavées, 1 ml de la solu tion virale mise au titre désiré, - on laisse en contact une heure à 36"C. On lave ensuite les cellules 2 fois avec 5 ml de solution de Hanks et une fois avec le milieu de culture suivant NEM 887 ml Hépès 250 mM, pH 7,2 100 ml Gélatine 10 % (Difco) 10 ml Gentamycine (20 mg/ml) 2 ml "Fungizone" (inhibiteur de croissance de champi gnons) 5 m.g/ml 0,4ml On introduit ensuite 5 ml de ce milieu de culture dans la culture virale sur cellules. A des temps différents après l'infection, le matin et le soir jusqu'à apparition de l'effet cytopathogène, on prélève 0,1 ml du surnageant et on le place dans 0,9 ml de milieu PS (cellules de rein de porc). On congèle aussitôt à -700C jusqu'au titrage qui donne les résultats représentés au dessin dans lequel : - la courbe IV donne les résultats pour une multiplicité d'infection de 0,03 - la courbe III donne les résultats pour une multiplicité d'infection de 0,06 ; - la courbe II donne les résultats pour une multiplicité d'infection de 0,01 et, - la courbe I donne les résultats pour une multiplicité d'infection de 0,1. Il ressort bien de ces courbes que la croissance virale est similaire pour les courbes II, III et IV, ce qui signifie que la multiplicité d'infection n'a qu'une influence réduire sur la courbe de croissance virale. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni.de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de vaccins à partir de virus du type à enveloppe, tels que les togaviridae et en particulier le virus de la fièvre jaune, les virus de la rougeole, et de la rubéole, notamment, caractérisé en ce que lesdits vaccins sont obtenus par culture des virus susdits sur des cellules d'embryons de poulets. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules d'embryons de poulets sur lesquelles lesdits virus sont cultivés, sont obtenues à partir d'oeufs "leucose free" embryonnés, dont les embryons sont soumis à l'action de la trypsine pour permettre l'obtention d'une importante quantité de cellules, supérieure à 108 par oeuf, destinées à être utilisées pour la culture des virus susdits. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules recueillies après trypsinisation sont mises en suspension dans un milieu de culture cellulaire convenable, dont la concentration minimum en cellules est de 5.105 cellules/ml dans lequel les cellules sont cultivées jusqu'à confluence. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les cellules d'embryons de poulets utilisées pour la culture de virus sont obtenues après incubation d'oeufs "avian leucose free" pendant 9 à 11 jours à 380C + 0,50C en atmosphère humide, et sont constituées par des fibroblastes d'embryons de poulets. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le virus destiné à être cultivé sur lesdites cellules, est constitué par une suspension virale dont la teneur en virus est telle que la multiplicité d'infection des cellules est de l'ordre de 0,01, ce qui signifie que l'infection des cellules par le virus est effectuée par un virus pour 100 cellules. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la culture cellulaire dudit virus est maintenue pendant 90 heures + 20 % à une température de l'ordre de 35 + 20C, après quoi le surnageant résultant de la culture cellulaire du virus est soumis à un traitement de congélation-décongélation, puis centrifugé, ou filtré sur un filtre dont la porosité n'est pas supérieure à 0,80 ss et stabilisé au moyen d'agents stabilisants appropriés, puis congelé jusqu a, sa répartition sous forme de doses vaccinantes dont le titre de virus, par dose de 0,5 ml est supérieur à 106 UFP. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1à 4, caractérisé en ce que le milieu de culture des cellules dans lequel les cellules d'embryons de poulets sont cultivées jusqu'à confluence, est un milieu de culture de base convenable additionné de sérum de veau foetal ou nouveau-né, dans une proportion comprise entre 2 et 8 % en volume, d'hydrolysat de lactalbumine dans une proportion comprise entre 5 et 15 % en volume et d'un antibiotique antibactérien à large spectre du type de la gentamycine dans une proportion comprise entre 20 et 60 mg/litre. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le virus en suspension est cultivé sur les cellules, en présence d'un milieu de maintenance et de production de virus comprenant avantageusement le même milieu de culture de base que celui utilisé pour développer la culture cellulaire, additionné dsun tampon approprié tel que Hépès de 10 à 40 mM final pH 7,0 à 7,6 et/ou bicarbonate i à 30/oxo,, de 0,5 à 1,5zoo de gélatine ou d'albumine humaine 0,1 à 0,3 % et d'un antibiotique antibactérien à large spectre choisi en particulier parmi la gentamycine et la kanamycine, présent à raison de 10 à 60 mg/litre. 9. Procédé selon Dune quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la stabilisation de la culture cellulaire de virus est réalisée par addition à cette dernière, d'un agent stabilisant avantageusement constitué par une solution contenant au moins un sucre,.au moins un acide aminé et au moins un polyalcool tel que le sorbitol. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérise en ce que l'agent stabilisant est avantageusement constitué par une solution contenant, en concentration finale, 3 à 5 % de lactose ou de saccharose, 1,5 à 2,5 % de sorbitol et 1,5 à 3% d'acides aminés tels que histidine, lysine ou alanine, présents à raison de 1 à 2 %, à laquelle peut éventuellement être ajoutée de la gélatine : 0,4 à 1 %. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'agent stabilisant est avantageusement constitué par une solution contenant, en concentration finale, 3 à 5 t de lactose outre saccharose, 1,5 à 2,5 % de sorbitol, 1,5 à 3 % d'albumine humaine et 0,4 à 1 % de gélatine. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que l'agent stabilisant est ajouté au surnageant de culture virale à raison de 50 g en volume. 13. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la culture virale recueillie est filtrée sur un filtre dont la porosité est égale ou supérieure à 0,80 , préalablement traité par une solution de même composition que le milieu de maintenance et de production de virus susdit. 14. Composition vaccinante purifiée et non allergisan ee présentant un titre de virus supérieur à 106 UFP/0,5 ml, obtenue en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.