Brevet FR2530660A1 — publié le 19840127

L'acide 3-( 6-isocyano-3,7-dioxatricyclof 4 1 O O 2 '4 lhepta- 4-yl)-propénoique, un nouvel antibiotique, sa préparation et ses utilisations thérapeutiques. La présente invention se rapporte à un nouvel antibiotique, l'acide 3-( 6-isocyano-3,7-dioxatricyclo- /4.1 O O 2 '47 hepta-4-yl)-propénoique, à un procédé pour sa préparation à l'aide d'un microorganisme nouvellement isolé, appartenant au genre Penicillium, et à ses utilisa- tions thérapeutiques ou désinfectantes. On savait déjà que certaines moisissures appar- tenant au genre Penicillium produisaient des antibiotiques; c'est le cas par exemple de la pénicilline, de la griséo- fulvine, de l'antibiotique SL-3238, de la cyanéine, de la funiculosine, de la gliotoxine, de la janthinilline, de l'acide mycophénolique, de la néganilline, de la palitan- tine, de la viridicatine, de la wortmannine et de substan- ces analogues. On a maintenant trouvé qu'une moisissure nouvel- lement isolée, appartenant au genre Penicillium, produisait un antibiotique possédant des propriétés physicochimiques et un spectre antibactérien différents de ceux des anti- biotiques connus. L'invention a pour but de fournir une nouvelle substance antibiotique (en abrégé ci-après "antibiotique n 2188 "). L'invention vise également un procédé biologique pour préparer liantibiotique n 2188. L'invention a en outre pour but de fournir une souche nouvellement isolée appartenant au genre Penicillium et qui est capable de produire l'antibiotique n 2188. L'invention comprend également les applications thérapeutiques de l'antibiotique n 2188 ainsi que des compositions désinfectantes contenant cet antibiotique. La figure 1 des dessins annexés représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de l'antibiotique n 2188, la figure 2 représente le spectre d'absorption dans l'infrarouge de la même substance antibiotique, et les figures 3 et 4 représentent respectivement les spectres de résonance magnétique protonique et au car- bone-13 de l'antibiotique n 2188. L'antibiotique n 2188 selon l'invention est l'acide 3-( 6-isocyano-3,7-dioxatricyclof 4 1 O O 2 '4 Jhepta- 4-yl)-propénoique qui peut également être appelé acide 3-f 1-( 1,2,3,4-diépoxy-4-isocyanocyclopentyl)j-propénoique. Ce composé répond à la formule suivante: H H C XH COOH H o / H H H L'antibiotique n 2188 peut être obtenu à partir d'un milieu de culture d'une souche appartenant au Genre Penicillium Le procédé de préparation de l'antibiotique n 2188 entre également dans le cadre de l'invention. Conformément au procédé de l'invention, on sou- met à culture aérobie une moisissure appartenant au genre Penicillium sur un milieu approprié et on recueille le pro- duit recherché à partir du milieu de culture La moisissure qu'on utilise de' préférence dans l'invention est une souche nouvellement isolée du sol et qui a été déposée au Fermen- tation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japon, sous le n 142 (FERM-BP-142) Toutefois, les spé- cialistes en la matière savent qu'on peut également utili- ser avantageusement dans le procédé selon l'invention un mutant du microorganisme FERM-BP-142 ou un mycète apparen- té, s'ils sont capables de produire l'antibiotique n 2188. Le microorganisme nouvellement isolé constitue lui-même également un objet de l'invention Ses propriétés mycologiques sont indiquées ci-après: Croissance sur divers milieux gélose à l'extrait de malt bonne gélose au dextrose de pommes de terre bonne gélose de Sabouraud bonne gélose à la farine d'avoine bonne gélose Yp Ss bonne gélose au glucose et à la levure sèche bonne milieu synthétique pour mucor restreinte gélose de Czapek mauvaise La colonie est en général veloutée à 30 C et laineuse à 20 C; vert-jaune mat, vert clair, vert-gris clair ou gris-vert selon le type du milieu de culture; conidies vert sombre; mycéliums jaunes ou jaune orangé; l'envers de la colonie est orangé-jaune ou rouge-orangé; pas de croissance à 37 C. Morphologie conidiophore: croit directement à partir des hyphes ram- Penicillus Metula: Phialide: Conidium: pantes et des hyphes aériennes; 2, 5-3,0 x -300 microns; surface de la paroi lisse ou légèrement irrégulière; : symétrique biverticillé; 2,5-3,5 x 7,5-15 microns; un faisceau de 3 à 6 métulas; typiquement lancéolé; 2,0-3,8 x 7,5-13 microns; en grappes de 2 à 6 éléments dans le verticille; elliptique; 2,5-3 x 3-3,8 microns; vert; paroi lisse; chaînes emmêlées ou parallèles. La souche selon l'invention a ainsi été identi- fiée comme étant une souche de Penicillium rugulosum dé- crit dans "A Manual of the Penicillia" par K B Raper et C Thom, the Williams and Wilkins Company, 1949. Le microorganisme capable de produire l'anti- biotique no 2188 selon l'invention peut être soumis à sous- culture par transfert sur un milieu de culture comprenant 0,1 % d'extrait de levure, 0,1 % d' extrait de boeuf, 0,2 % de peptone, 1 % de glucose et 2 % de gélose par exemple. Comme technique de culture pour la moisissure dans le procédé selon l'invention, on peut faire appel à une technique quelconque classique de culture aérobie pour microorganismes, par exemple à une culture solide, à une culture sous secousses ou à une culture submergée Le mi- croorganisme produisant l'antibiotique n 2188 croit ordi- nairement à une température de 10 à 350 C, de préférence de à 300 C. On peut utiliser dans le procédé selon l'inven- tion une substance nutritive quelconque connue pour culture de mycètes ou d'autres microorganismes Ainsi par exemple, on peut utiliser du glucose, du maltose, de la dextrine, de l'amidon, du lactose, du saccharose ou de la glycérine comme sources de carbone On peut utiliser conformément à l'invention en tant que source d'azote une substance nutri- tive quelconque connue apportant cet élément, telle qu'une peptone, de l'extrait de boeuf, de la levure, de l'extrait de levure, de la farine de soja, de la farine d'arachide, de la lie de graines de coton, de la liqueur de macération de mais, du son de riz et de l'azote minéral. Un milieu de culture pour production de l'anti- biotique no 2183 peut contenir lorsque c'est nécessaire un sel minéral et/ou un sel métallique Il peut en outre contenir une petite proportion d'un métal lourd ou d'un autre additif tel qu'une autre substance nutritive ou une substance accélérant la croissance Le milieu peut égale- ment contenir un agent anti-mousse tel qu'une huile de si- licone et un agent tensio-actif s'il faut empêcher les formations de mousse. Le microorganisme est cultivé pendant une durée appropriée à une production substantielle et une accumula- tion de l'antibiotique N O 2188 en quantité suffisante dans le milieu On recueille le produit recherché à partir du milieu comme décrit dans les exemples ci-après, c'est-à- dire par une combinaison appropriée de techniques telles que l'extraction par un solvant organique, par exemple l'éther, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle ou le butanol, la dissolution dans un solvant polai- re, par exemple l'acétone ou l'alcool, l'élimination d'im- puretés à l'aide d'un solvant non polaire, par exemple l'é- ther de pétrole ou l'hexane, la filtration sur gel sur une colonne de Sephadex, la chromatographie par adsorption sur charbon actif ou gel de silice et la chromatographie d'é- change d'ions. Le composé selon l'invention, antibiotique n O 2188, présente une activité antibactérienne sur des bactéries variées à gram positif et à gram négatif D'au- tre part, l'antibiotique N O 2188, administré par voie in- trapéritonéale à des souris à une dose de 100 mg/kg, ne manifeste pas de toxicité aiguë. L'antibiotique N O 2188 peut être administré directement à des humains et des animaux en tant que médi- cament antibactérien et/ou désinfectant Mais le médicament consiste de préférence en une composition dans laquelle on a combiné un véhicule acceptable pour l'usage pharmaceuti- que avec le composé selon l'invention. Le véhicule utilisé dans l'invention est une substance organique ou minérale inerte convenant pour l'ad- ministration intra-intestinale, orale ou parentérale, par exemple de l'eau, de la gélatine, de la gomme arabique, du lactose, de l'amidon, du stéarate de magnésium, du talc, une huile végétale, un polyalkylèneglycol, de la vaseline jaune ou une substance analogue. La dose unitaire de la composition pharmaceu- tique selon l'invention peut prendre la forme solide et consister par exemple en un comprimé, un granulé revêtu de sucre, un suppositoire ou une capsule, une forme semi-so- lide telle que la forme de pommade ou une forme liquide telle que la forme de solution, de suspension ou d'émul- sion La composition peut en outre contenir un ou plusieurs adjuvants tels qu'un préservateur, un stabilisant, un agent mouillant, un agent émulsionnant, une solution tampon et un sel servant à régler la pression osmotique. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples, les indications de parties et de % s'entendent en poids sauf mention contraire. Exemple 1. On inocule une culture sur gélose inclinée d'une souche (FERM-BP-142) de Penicillium rugulosum sur ml de milieu de Bennett ( 0,1 % d'extrait de levure, 0,1 % d'extrait de boeuf, 0,2 % de N Z amine type-A (Sheffield Chemical Co, San Ramon, CA 94583, Etats-Unis) et 1 % de glucose, p H 7,2) dans un erlenmeyer de 300 ml. Les milieux de culture répartis dans 50 fioles sont cul- tivés à 24 WC pendant 72 heures sur l'appareil rotatif à secousses tournant à -180 tours/mn. La culture obtenue ( 5 litres au total) est sou- mise ensuite à culture à 24 C pendant 60 heures sur 100 litres de milieu stérilisé contenu dans un fermenteur de litres avec aération par de l'air purifié au débit de 50 litres/mn et agitation à 200 tours/mn La composition du milieu stérilisé est la suivante: amidon soluble 1,5 % glycérine 1,5 % lie de graines de coton 1,0 % farine de soja 1,0 % extrait de levure 1,O % K 2 HPO 4 0,7 % Mg SO 4, 7 H 20 0,05 % COC 12, 5 H 20 0,001 % agent anti-mousse (ADEKANOL LG 126, ASAHI DENKA KOGYO K K) 0,1 % On fait passer toute la culture ( 100 litres) sur un appareil Sharpless (type JP-U 122-1, Tomoe Engi- neering Co) et sur un appareil Delabal (type BRP X 309- 355-60, Suède) pour séparer le gâteau de mycélium On règle le liquide surnageant propre à p H 4 par l'acide chlorhydrique et on extrait par 1/5 de son volume d'acé- tate d'éthyle dans un appareil d'extraction centrifuge continue (type C-1333, Hitachi Ltd) On concentre l'ex- trait dans un condenseur et on soumet le concentré à ex- traction en retour à l'aide d'une solution aqueuse de bi- carbonate de sodium à 1 % On règle la phase aqueuse à p H 4,0 par l'acide chlorhydrique et on extrait par l'acétate d'éthyle On sèche l'extrait sur sulfate de sodium anhydre et on évapore sous vide à température inférieure à 40 C; on obtient ainsi un produit brut. On fait passer le produit brut sur une colonne de charbon actif placé en tête d'une colonne (de 4 cm de diamètre et 50 cm de hauteur) garnie de gel de silice (Wakogel Q 23 de la firme Wako Chemical Co) et on élue la fraction active par un mélange acetate d'éthyle/chlo- roforme, 1:19 en volume; l'addition de n-hexane à cette fraction donne 3 g d'une poudre blanche. Le produit obtenu possède les propriétés physi- cochimiques suivantes: analyse élémentaire: C 9 H 7 N 04 (%) C H N O trouvé 56,35 3,49 7,34 32,82 poids moléculaire estimé par spectrométrie de masse: 193 point de fusion: 135-136 C (déc) pouvoir rotatoire spécifique: let O = -128,8 (c = 1,0 % dans l'acétate d'éthyle) D spectre d'absorption dans l'ultraviolet (cf figure 1 des dessins annexes); méthanol mthanl = 215 nm (E = 14378) max spectre d'absorption dans l'infrarouge, dans K Br (cf. figure 2 des dessins annexés); 3450, 3000, 2150, 1700, 1665, 1425, 1330, 1090, 980, 900, 875 spectre de résonance magnétique nucléaire protonique dans l'acétone deutérée (cf figure 3 des dessins ann xés); 6 (ppm); 2,55 (d, d, 1 H, J = 16, J = 1,0) spectre dans le xés); 3,05 (d, d, 1 H, J = 16, J = 0,5) 3,98 (d, 1 H, J = 1,0) 4,45 (d, 1 H, J = 0,5) 6,11 (d, 1 H, J = 16) 6,71 (d, 1 H, J = 16) de résonance magnétique nucléaire au carbone-13 méthanol deutéré (cf figure 4 des dessins anne- 6 (ppm); 168,1 (s), 165,1 (s), 141,9 (d), 125,8 (d), 66,4 (d), 66,1 (d), 64,9 (s), 62,5 (s), 36,6 (t) soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, l'acé- tate d'éthyle, le chloroforme et le benzène insoluble dans l'hexane et l'éther de pétrole chromatographie sur couche mince de gel de silice (Kieselguhr G de la firme Merck); une tache seu Lement à Rf = 0,62 dans le mélange chloroforme/acétate d'éthyle acide acétique, 10:10:1, 0,44 dans le mélange chloroforme/acétate d'éthyle acide acétique, 10:10:0,2, 0, 79 dans le mélange n-butanol/acide acétique/eau e- e I 4:1:1. chromatographie sur couche mince inversée par KC-18 (Watmann); une tache seulement à Rf = 0,86 dans le mélange méthanol/eau, 4:1, 0,94 dans le mélange propanol/eau, 4:1. Exem Dle 2. Pour la détermination du spectre antibactérien du produit obtenu dans l'exemple 1, on a utilisé les micro- organismes suivants qu'on a soumis à des essais par la mé- thode de dilution de la gélose à l'aide d'un milieu nutri- tif à la gélose. Les résultats obtenus sont rapportés ci-après: Microorganisme CMI (microgrammes/ml) Staphylococcus aureus 209 p 6,25 Bacillus subtilis PCI 219 12,5 Streptococcus pyogenes IFO 3340 6,25 Micrococcus luteus PCI 1001 6,25 Corynebacterium faciens IAM 1079 12,5 Corynebacterium equi IFO 3730 6,25 Micrococcus lysodeikticus 6,25 Mycobacterium avium IFO 3082 12,5 Escherichia coli K-12 IAM 1264 12,5 Klebsiella pneumoniae IFO 12015 50 Citrobacter freundii IFO 12681 12,5 Proteus vulgaris IFO 3167 12,5 Proteus mirabilis IFO 3849 50 Proteus morganii IFO 3168 12,5 Proteus inconstans-IFO 12930 50 Pseudomonas aermginosa IFO 3080 100 Pseudomonas fluorescens IFO 3903 12,5 Pseudomonas putida T-2 6,25 Pseudomonas ovalis > 100 Vibrio metshnikov IAM 1039 1,6 Vibrio tyrogenes IAM 1080 3,1 Salmonella abortuseaui ATCC 9842 12,5 Salmonella anatum 1 12,5 Aerobacter aerogenes ATCC 8724 50 Erwinia aroidae IAM 1068 25 Xanthomonas oryzae IAM 1657 50 Serratia marcescens IAM 1065 > 100 Aspergillus niger IFO 6342 > 200 Aspergillus fumigatus IAM 2155 100 Aspergillus oryzae IAM 2732 > 200 Penicillium funiculosum IFO 6345 200 Saccharomyces cerevisiae > 200 Candida albicans IAM 4905 > 200 Trichophyton rubrum IFO 5467 50 Trichophyton interdigitale 100 Epidermophyton fluccosum IFO 9045 50 Microsporum gypseum IFO 5948 100 Bacteroides fragilis 50 Eubacterium aerofaciens > 200 Peptococcus aerogenes 25 Peptostreptococcus micros 25 Peptostreptococcus parvulus 50 Bifidobacterium adolescentis 200 Fusobacterium necrophorum 50 Lactobacillus acidophilus 200 Exemple 3. On stérilise sous pression 5 erlenmeyers de 300 ml contenant respectivement 100 ml d'un milieu à p H 7,2 contenant 1 % de glucose, 0,1 % d'extrait de levure, 0,1 % d'extrait de boeuf et 0,2 % de polypeptone On ino- cule le milieu contenu dans les fioles par des spores provenant de la culture sur gélose inclinée d'une moisis- sure (FERM-BP-142) et on cultive à 26 C pendant 70 heures sous secousses à 180 tours/mn On inocule la culture ob- tenue ( 500 ml) sur 15 litres d'un milieu stérilisé à p H 7,0 dans un fermenteur de 30 litres et on cultive à 26 C pendant 60 heures sous aération à l'air purifié au débit de 15 litres/mn et sous agitation à 300 tours/mn La com- position du milieu stérilisé est la suivante: Na NO 3 0,3 % K 2 HPO 4 0,1 % Mg 504, 7 H 20 0,05 % KC 1 0,05 % Fe 504, 7 H 20 0,001 % saccharose 3 % extrait de levure 1 % anti-mousse (Adekanol LG 109) 0,1 % On filtre la culture obtenue en utilisant de la Celite 545 comme agent filtrant On adsorbe le filtrat sur une colonne de 4 cm de diamètre et 50 cm de hauteur garnie de Diaion HP 20 (de la firme Mitsubishi Kasei Co Ltd), on lave à l'eau et on élue par du méthanol à 60 % On con- centre l'éluat sous vide à température inférieure à 40 C. On extrait le concentré par l'acétate d'éthyle et on sèche l'extrait sur sulfate de sodium anhydre puis on concentre à nouveau sous vide à une température inférieure à 40 C. On fait passer le liquide obtenu sur une coionne ( 1,5 cm de diamètre et 30 cm de hauteur) garnie de charbon actif On concentre la fraction active sous vide et on applique la matière concentrée sur une colonne ( 20 mm X 300 mm) de gel de silice (Wakogel C 200 de la firme Wako Chemicals Co) et on lave au chloroforme On élue la frac- tion active par le mélange acétate d'éthyle/chloroforme, 1:19 en volume; l'addition de n-hexane à l'éluat donne mg d'une poudre blanche qui présente les mêmes pro- priétés physicochimiques et biologiques que le produit de l'exemple 1 - REVENDICATIONS 1 L'acide 3-( 6-isocyano-3,7-dioxatricyclo- z 4.1 O 02 '47 hepta-4-yl)-propénoique. 2 Procédé de préparation du composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on soumet à cul- ture aérobie une moisissure appartenant au genre Penicil- lium et on recueille l'acide 3-( 6-isocyano-3,7-dioxatri- 2,4 cyclol 4 1 O 02 'hepta-4-yl)-propénoique à partir du mi- lieu de culture. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la moisissure est un microorganisme nouvellement isolé du genre Penicillium rugulosum, déposé sous n FERM-BP-142. 4 Microorganisme capable de produire l'acide 2,4 3-( 6-isocyano-3,7-dioxatricyclol 4 1 O 02 '47 hepta-4-yl)-pro- pénoique. Microorganisme selon la revendication 4, qui est un microorganisme nouvellement isolé, du genre Penicil- lium rugulosum, déposé sous n FERM-BP-142. 6 Nouvelle substance antibiotique, caractérisée en ce qu'il s'agitdu composé selon la revendication 1. 7 Composition pharmaceutique comprenant le composé selon la revendication 1 en tant que substance active avec un véhicule acceptable pour l'usage pharmaceu- tique. 8 Composition antibactérienne ou désinfectante contenant en tant que substance active le composé selon la revendication 1.