Brevet FR2525223A1 — publié le 19831021

La présente invention concerne la préparation d'acides diphosphoniques et de leurs sels L'invention concerne éga- lement des compositions pharmaceutiques convenables pour le traitement de l'urolithiase et pour l'inhibition de la réab- sorption osseuse. On sait depuis longtemps que de faibles concentrations de phosphates condensés peuvent prévenir le dépôt du carbo- nrate de calcium des solutions; outre cet effet, les phospha- tes condensés et parmi ceux-ci le pyrophosphate, sont capables d'inhiber la précipitation du phosphate de calcium lorsqu'ils sont ajoutés, même en faible concentration aux solutions de phosphate de calcium Cette action inhibitrice se manifeste aussi bien en présence qu'en l'absence de cristaux d'apatite. Les phosphates condensés ralentissent en outre la trans- formation du phosphate de calcium de sa phase amorphe à sa phase cristalline sans cependant influencer la formation de la phase amorphe. L'effet marqué in vitro du pyrophosphate (PP) sur le phosphate de calcium, à des concentrations voisines de celles constatées dans les fluides biologiques, a suggéré que le pyrophosphate pourrait protéger les tissus mous contre la minéralisation Dans l'os le PP pourrait régler le développe- ment de la calcification et en outre influencer le métabolisme du calcium et du phosphate. Le PP au niveau de l'os déjà minéralisé a une influence sur le mouvement du calcium et du phosphate vers l'intérieur et l'extérieur de l'os Malgré toutes les connaissances acqui- ses sur le PP, son emploi thérapeutique est impossible à cause de l'hydrolyse rapide qu'il subit quand il est administré soit par voie orale soit par voie systémique. Etant donné le grand intérêt que présente le PP, on a effectué des recherches tendant à réaliser des substances ayant des effets analogues mais résistant à l'hydrolyse. Ce but a été partiellement atteint par la synthèse de diphosphonates c'est-à-dire de composés caractérisés par um liaison P-C-P au lieu de p-op Les effets des diphosphonates sur les sels de calcium ressemblent étroitement à ceux du PP en effet, déjà à basse concentration: ils inhibent la précipitation du phosphate de calcium des solutions; ils bloquent la transformation du phosphate de calcium amorphe dans la phase cristalline sans cependant inhiber la formation de la phase initiale; ils bloquent l'agrégation des cristaux d'hydroxy- apatite; ils retardent le degré de dissolution des cristaux d'hydroxyapatite, après que ceux-ci aient absorbé à partir des solutions des diphosphonates. Les nombreuses études pharmacologiques et cliniques dé- crites dans la littérature scientifique démontrent cependant que, malgré certaines analogies d'activités, les divers di- phosphonates appliqués jusqu'à maintenant dans le traitement des ostéopathies, présentent des inconvénients plutôt graves en ce qui concerne le degré de toxicité chez les animaux et la tolérance ou l'induction d'effets secondaires négatifs chez l'homme. On a trouvé surprenant que certains acides diphosphoni- ques de formule générale I PO 3 Hl J R-C-R' (I) PO 3 H 2 3 H 2 dans laquelle R est un atome de fluor ou un résidu alkyle, linéraire ou ramifié, contenant de 1 à 5 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants tels que des groupes amino et/ou des atomes de fluor et R' est un groupement hydroxyle ou le fluor, et leurs sels de métaux alcalins,avec des bases organiques et des acides aminés basiques sont parfaitement adaptés pour le traitement de l'urolithiase et comme inhibiteurs de la réabsorption osseuse, parce qu'ils présentent une activi- té élevée non accompagnée par les effets secondaires précé- demment décrits à propos du pyrophosphate (PP). Divers acides diphosphoniques ont été décrits dans la littérature En particulier des acides diphosphoniques de formule générale I dans laquelle R est un groupement alkyle non substitué et R' est un groupement hydroxyle, peuvent être préparés en faisant réagir un halogénure d'acyle ou l'anhy- dride d'un acide sur l'acide phosphoreux ou le trichlorure de phosphore Bien que ce procédé donne de bons résultats dans le cas o R est un groupement éthyle, il est moins adapté pour obtenir des produits analogues contenant un résidu alkyle plus long et pratiquementirréalisable quand le résidu R est un groupement alkyle substitué par des groupements fonctionnels. En outre, il n'est pas évidemment adapté pour obtenir des composés de formule 1, dans lesquels R et/ou R' sont des atomes de fluor on a trouvé maintenant que l'on peut obtenir des composés de formule générale I dans laquelle R est un groupement amino-alkyle et R' est un groupement hydroxyle, avec des rendements excellents et à l'état de pureté élevé lorsque l'on fait réagir un acide aminé sur l'acide phospho- reux (dans le but de bloquer la fonction amine réactive), fait réagir le produit résultant avec du trichlorure de phosphoi puis hydrolyse le produit intermédiaire de réaction et isole le produit d'une façon convenable. Au lieu du mélange d'acide phosphoreux et de trichlorure de phosphore on peut utiliser seulement du trichlorure de phosphore, en ajoutant la quantité stoechiométrique d'eau pour former l'acide phosphoreux correspondant. Lorsque cela est possible, l'acide aminé peut être rempla- cé parlun de ses précurseurs de façon à former l'acide aminé par hydrolyse, tel que le valérolactame ou le polyamide corres- pondant dans le cas de l'acide 5-aminovalérianique ou la pyrro- lidone dans le cas de l'acide-4-aminobutyrique. La réaction s'effectue de préférence dans des solvants organiques aprotiques tels que les hydrocarbures aliphatiques et aromatiques et les hydrocarbures chlorés, mais elle peut être effectuée également en l'absence de solvant. Pendant la réaction il se forme un solide pâteux dont la composition n'est pas définie, et duquel, par hydrolyse avec l'eau ou l'H Cl aqueux, on obtient l'acide aminodiphosphonique désiré. Le procédé décrit se prête facilement à la production industrielle des acides de formule I. La préparation des acides diphosphoniques de formule gé- nérale I o R et R' sont tous deux des atomes de fluor peut être effectuée aisément et avec des rendements élevés en hydrolysant les esters correspondants de formule générale II: F 2 CCPO (OR") 2 7 (II) dans laquelle R" est un résidu alkyle, linéraire ou ramifié contenant de 1 à 4 atomes de carbone Les esters II s'obtien- nent en faisant réagir l'ester correspondant de l'acide bromo- difluorométhanephosphonique (que l'on peut obtenir à son tour en partant du dibromodifluorométhane et d'un trialkylphosphi- te) sur un dialkylphosphite d'un métal alcalin tel que le sodium, suivant le schéma: CF 2 Br 2 + P(OR")3 Br-CF PO(OR")2 Na PO(OR") I 2 L'hydrolyse de l'ester I Ienl'acide diphosphonique cor- respondant est effectuée avec de l'eau et un acide minéral. Les composés préférés que l'on peut obtenir par le pro- cédé de la présente invention sont: l'acide 5-amino-1-hydroxypentane-l,ldiphosphonique; l'acide 4-amino-1-hydroxybutane-l,l-diphosphonique l'acide difluoro-méthanediphosphonique et leurs sels de sodium, d'aniline ou de lysine. A titre d'illustration, mais sans que cela représente une limitation du procédé, on fournit ci-après les exemples suivants: Exemple 1: On prépare un mélange constitué par 117 g ( 1,0 mole) d'acide 5-aminovalérianique, 123 g ( 1,5 mole) d'acide phosphoreux et 500 ml de chlorobenzène anhydre On chauffe au moyen d'un bain d'eau bouillante jusqu'à 100 C de façon à solubiliser presque complètement le solide En maintenant la température à 100 C et sous une vigoureuse agitation, on addi- tionne lentement 206 g ( 1,5 mole) de trichlorure de phosphore. Environ 30 minutes après la fin de l'addition commence la formation d'une phase dense qui tente à augmenter et à durcir avec le temps On maintient pendant trois autres heures à C puis on laisse refroidir sous agitation De cette façon le solide se brise en petits morceaux et peut être filtré et lavé par du chlorobenzène. On dissout le solide hygroscopique obtenu dans 500 ml d'eau et on chauffe jusqu'à reflux pendant une heure Après refroidissement, traitement de la solution par du carbone actif et filtration, on précipite l'acide brut au moyen de l'addition d'un excès de méthanol chaud et après séparation on cristallise dans un litre d'eau à 100 C. On obtient 165 g ( 63 % du poids théorique) d'acide -amino-1hydroxypentane-1,1-diphosphonique sous forme d'une poudre blanche cristalline avec p f = 235 C. Analyses élémentaires Trouvé: C = 22,69; H = 5,71; N = 5,14; P = 23,70 Calculé d'après la formule C 5 H 15 NO 7 P 2: C = 22,82; H = 5,75; N = 5,32; P = 23,54. Spectre I R. -1 Bande d'absorption à 3220, 1600 et 1510 cm 1 Spectre H-R M N (TMS comme référence) 6 = 1,8 ppm ( 6 H); 6 = 3,0 ppm ( 2 H). Exemple 2: Dans un réacteur vitrifié de 150 1 on introduit 9,4 kg d'acide 5aminovalérianique, 9,9 kg d'acide phosphoreux et 1 de chlorobenzène anhydre On chauffe sous agitation jusqu'à 90-100 C et l'on ajoute en 30 minutes 16,5 kg de trichlorure de phosphore Après avoir maintenu le mélange de réaction à 110 C pendant 3 heures on refroidit jusqu'à C et l'on ajoute 50 1 d'eau, de façon à solubiliser le solide On laisse refroidir et l'on sépare la phase organique de la phase aqueuse Après traitement de la phase aqueuse par le carbone actif et filtration, on ajoute du méthanol en excès sous agitation de façon à faire précipiter l'acide aminodiphosphonique brut On filtre et l'on cristallise dans 1 d'eau bouillante On obtient 12,4 kg de produit cristal- lin formé par l'acide-5-amino-1-hydroxypentane-1,1-diphospho- nique pur. Exemple 3: Un mélange d'acide 4-aminobutyrique ( 1 mole), d'acide phosphoreux ( 1,5 mole) et de chlorobenzène anhydre ( 500 ml) est chauffé à 100 C et en le maintenant à cette température, on le traite sous agitation énergique par du trichlorure de phosphore ( 1,5 mole) On agite pendant 3,5 heures à 100 C jusqu'à l'achèvement de la formation de la phase dense et puis on laisse refroidir on filtre le solide, on le lave avec un peu de chlorobenzène et on le dissout dans l'eau On chauffe jusqu'à ébullition pendant une heure, on laisse refroidir et on ajoute du carbone actif On filtre ensuite et l'on préci- pite le produit de la réaction avec un excès de méthanol à chaud Le matériel brut ainsi obtenu est chauffé à reflux pen- dant 8 heures dans de l'acide chlorhydrique à 20 % (dans l'eau). L'acide chlorhydrique est retiré par distillation etle rési- du est cristallisé dans l'eau. On obtient l'acide 4-amino-1-hydroxybutane-,11-diphospho- nique sous forme d'une poudre blanche cristalline dont la struc- ture,comme le démontrent les données exposées ci-dessous,est: (CH 2) 3 NH 2 H 203 P-PO 3 H 2 OH Analyses élémentaires: Carbone Hydrogène Azote Phosphore % % % % Trouvé 17,88 5,62 4,93 23,94 Calculé pour 1 'ABDP 19,28 5,26 5,64 24,86 Calculé pour l'ABDP H 20 17,98 5,66 5,24 23,19 Détermination de la teneur en humidité: L'échantillon examiné suivant la méthode Karl Fischer présente une teneur en humidité d'environ 3,9 % en poids. Titrage potentiométrique La courbe de titrage potentiométrique est obtenue par addition de Na OH 0,1 N à une solution de 203 mg d'échantillons dissous dans 75 ml d'eau Le profil de cette courbe est carac- térisé par de nets points d'inflexion à p H 4,4 et 9,0 au mo- ment de l'addition de 7,5 et 15,2 ml respectivement de lasubsta de titrage En partant des valeurs trouvées, on calcule un poids équivalent de 270 pour la première neutralisation et de 264 pour la seconde et un poids équivalent moyen de 267 Le poids moléculaire de ABDP H 20 est de 267,114. Titrage complexométrique Le titrage complexométrique effectué avec du nitrate de thorium sur 41,47 mg de composés montre un point de virage net pour une addition de 5,4 ml d'agent titrant De cette valeur il est possible d'obtenir pour le composé examiné un poids équi- valent de 134, en accord avec la présence de deux groupes phosphoniques par molécule monohydratée. Absorption infra-rouge Le spectre infra-rouge enregistré sur une pastille de K Br présente des bandes caractéristiques à: -1 3600-2500 cm 1 bande complexe due à la superposition des élongations des groupes OH acides et alcooliques, des groupes NH 3 et CH aliphatiques. 1650, 1605, 1500 bandes dues à la déformation du groupe NH 2 partiellement salifié par les groupes phosphoniques. élongation de la liaison P= O 1040 élongation de la liaison C-O 960, 930 élongation de la liaison p-O 600-400 bandes du squelette intéressant essentiellement la partie de la molécule contenant les atomes de phosphore. Résonnance magnétique nucléaire du proton ( 1 H-RMN) Le spectre 1 H-RMN enregistré dans D 2 O/D 2 SO 4 présente deux signaux élargis à 62,6 ppm (CH 2-P et CH 2-Y du groupe NH 2) et 3,5 ppm (CH 2-a du groupe NH 2) ayant une intensité relative 2:1. ÀRésonnance magnétique nucléaire du carbone ( 13 C-RMN) Le spectre 13 CRMN enregistré dans D 20/D 2504 présente des signaux à 620 ppm (CH 2-p du groupe NH 2), 28 ppm (CH 2-Y du groupe NH 2), 39 ppm (CH 2-a du groupe NH 2) et un triplet centré à 72 ppm (C-6 du groupe NH 2, JC-P 156 Hz) Résonnance magnétique nucléaire du phosphore ( 31 P-RMN) Le spectre 31 PRMN enregistré dars D 2 O/D 2 SO 4 présente un signal unique à 9 ppm indiquant que les deux atomes de pho$- phore sont chimiquement et magnétiquement équivalents. Exemple 4: Le diisopropylphosphite de sodium et le bromodifluoro- méthanephosphonate diisopropylique sont mis en réaction suivant des techniques habituelles pour donner l'ester tétraisopropy- lique de l'acide difluorométhanediphosphonique sous forme de liquide incolore et inodore qui bout à 1170 C ( 0,2 torr). Spectre 19 F-R M N: 8 = 21,6 (triplet, CF 2, J Fp= 86,67) Spectre 31 P-R M N: 6 = 16,1 (triplet, JF p= 14,6); H 3 PO 4 85 % comme l'étalon externe. L'ester ainsi obtenu est hydrolysé en acide di- fluorométhanediphosphonique qui est obtenu sous forme cris- talline et maintenu dans un dessicateur sur P 205 et sous vide C'est un solide hautement hygroscopique qui fond à C. La courbe de titrage acide/base présente 2 points d'inflexion nets à p H 3,9 et 10,1, correspondant, respecti- vement, aux sels disodique et tétrasodique, et un point d'in- flexionunique apparaissant à p H= 6,8 et correspondant au sel trisodique. Le poids moléculaire correspondant auxdits points est de 210,3 (théorique 211,99). Exemple 5: A une suspension de 263 g d'acide 5-amino-1-hydroxypen- tan-l,l-diphosphonique dans 1 litre d'eau, on ajoute, en re- froidissant, une solution formée par 40 g d'hydroxydedesodium dans 500 ml d'eau on obtient une solution limpide qui, après traitement par du carbone actif, filtration et concentration, est maintenue sous une lente agitation en la refroidissant pendant 3 jours On filtre le solide cristallin obtenu, on lave avec un peu d'eau froide et ensuite au méthanol. Après dessication à 110 C on obtient 199 g de sel monosodi- que de l'acide 5-amino-1-hydroxypentan-l,1-diphosphonique. Exemple 6: A partir de l'acide difluorométhanediphosphonique on obtient en opérant selon les techniques habituelles, le difluorométhane- diphosphonate trisodique sous forme de poudre cristalline blanche soluble dans l'eau. Par le titrage acide/base on obtient un poids moléculai- re de 274,0 (théorique 277,9). La solution aqueuse 0,1 M a un p H de 6,8. Analyses élémentaires Trouvé: C = 4,30; H = 0,52; P = 23,01; F = 12,90 Calculé pour CHF 2 Na 306 P 2: C = 4,32; H = 0,36: P = 22,29; F = 13,67. Exemple 7: En partant de l'acide difluorométhanediphosphonique on obtient en opérant suivant les méthodes habituelles, le difluorométhanediphosphonate d'aniline qui, après recristal- lisation dans l'éthanol, fond à 163 165 C. Analyses élémentaires Trouvé: C = 50,88; H = 6,02; N = 9,19; P = 9,90 Calculé pour C 25 H 32 F 2 N 406 P 2 H 20 (sel tétraanilinique monohydraté): C = 50,80; H = 5,57; N = 9,11; P = 10,08. Spectre UV (en solution aqueuse): maximum d'absorption à 279 nm; _- 3241. Exemple 8: A partir de l'acide difluorométhanediphosphonique on obtient, suivant la méthode de l'exemple 7, le difluorométhanediphos- phonate de lysine Le sel dilysinique obtenu dans l'eau se présente sous la forme d'une poudre blanche amorphe très soluble dans l'eau, hygroscopique La solution 0,1 M a un p H de 4,0. Analyses élémentaires Trouvé: C = 30,03; H = 6,42; N = 10,87; P 13,01 Calculé pour C 13 H 32 F 2 N 4010 P 2: C 30,96; H = 6,39; N = 11,11; P = 12,28. ETUDE TOXICOLOGIQUE L'étude a été effectuée sur les substances suivantes de l'invention: acide 4-amino-1-hydroxybutane-1,1-diphosphonique (AH Bu BP) acide 5-amino1-hydroxypentan-1,1-diphosphonique (AHPEBP) acide difluorométhanediphosphonique (sel de Na) (F 2 MBP). A titre de comparaison, on a utilisé les acides sui- vants: acide 6-amino-1-hydroxyhexane-1,1-diphosphonique (AH Ex BP) (demande de brevet italien n 19673 A/81); acide dichlorométhanediphosphonique (sel de Na) (C 12 MBP) (connu). Toxicité aiguë On a utilisé pour l'étude des souris Swiss (mâles et femelles) de notre propre élevage: pendant l'expérience les animaux ont été alimentés comme cela est de règle avec de l'Altromine en pastilles Pour l'administration orale et intrapéritonéale on a utilisé des solutions degomrne arabique à 5 %, tandis que des solutions salines à p H = 4,0 ont été utilisées pour les injections i v. Les valeurs préliminaires de DL 50 ont été calculées sui- vant une méthode graphique. Le tableau 1 indique les valeurs de la DL 50 chez les souris Swiss en mg/kg. TABLEAU 1: DL 50 Souris Swiss mg/kg Après l'administration par voie orale, même aux doses élevées, on n'a observé aucune altération du comportement de l'animal, il n'a pas été noté de mortalité et on observe seu- lement un certain ramollissement des fèces L'autcps ie des animaux morts a montré une légère modification des reins qui sont d'une couleur claire et anémiques. Après l'injection i v les animaux meurent immédiate- ment aux doses les plus élevées avec convulsions et os i p i v. AHBUBP > 2 000 85 AHPEBP 1 500 75 85 AHEXBP) 2 000 125 75 F 2 MBP > 2 000 450 70 c 2 MBP > 2 000 750 130 C 12 MBP > 2 000 750 130 dyspnée A des doses inférieures à la léthalité, les convulsions sont moins accentuées et persistent pendant deux heures; après retour à la normale, on observe des cas de décès après 2-4 jours avec dyspnée, érection des poils et activité motrice réduite L'autopsie montre des reins rosés et jaunatres avec des foyers hémorragiques Les femelles présentent des ovaires hypertrophiés et hyperémi- ques On en déduit que les nouveaux diphosphonates présen- tent une toxicité aiguë et chronique modérée. Inhibition de la formation des cristaux On a utilisé un système modèle pour évaluer la capacité des phosphonates à inhiber la formation des cristaux dans des solutions inorganiques. Trois solutions de base ont été préparées suivant la méthode Fleisch. 1) KH 2 PO 40 0107 M; KC 1 0,117 M; acide barbiturique 0,01 M. 2) Ca C 120 0056 M; KC 1 0,138 M; acide barbiturique 0,01 M. 3) KC 1 0,155 M, acide barbiturique 0,01 M. Le p H a été porté à 7,4 par de la KOH La concentration de Ca++ était de 6,7 mg%, niveau analogue à celui du cal- cium dans le sang d'ultrafiltration et la concentration du phosphate inorganique, Pi, a donné un produit-Ca++ x Pl = 80. La solution a été analysée pour doser C++ et Pl et distribuée dans des erlenmeyes, 12 ml pour chacun. Les erlenmeyers ont été divisés en groupes comme suit: a)témoins b) AHEXBP 0,05 PM c) AHEXBP 0,25 p M d) AHEXBP 0,5 PM e) AHEXBP 2,5 p M f) AHEXBP 5,0 p M g) C 12 MBP 0,5 p M h) C 12 MBP 2,5 p M i) C 12 MBP 5,0 PM 1) F 2 MBP 0,5 M m) F 2 MBP 2,5 p M m) F 2 MBP 2,5 IIM n) F 2 MBP 5,0 p M o) AHPEBP 0,05 p M p) AHPEBP 0,25 Ii M q) AHPE BP 0,5 p M r) AHPEBP 2,5 p M s) AHPEBP 5,0 p M t) AH Bu BP 0,5 p M u) AHBUBP 2,5 p M v) AH Bu BP 5,0 p M et leurs contenus sont incubés et agités à 37 C pendant 2 jourt A la fin de l'incubation, les solutions ont été passées à travers des filtres millipores pour retenir les cristaux formés pendant l'incubation: le filtrat a été ersuite analysé pour doser le Ca++ et le Pi Les résultats sont in- diqués sous la forme du produit Ca++ x Pl dans la solution à la fin de l'expérience dans le tableau 2. Les données montrent que les diphosphonates de l'inven- tion induisent une nette activité inhibitrice sur la forma- tion et la croissance des cristaux d'apatite suivant un schéma fonction de la dose. TABLEAU 2 Valeurs du produit Ca++ x Pl dans la solution Substance Concent Avant Après en p M l'incubation l'incubation Contrôle 0,0 114,7 29 C 12 MBP 0,5 " 44,0 C 12 MBP 2,5 " 60,4 C 12 MBP 5,0 " 73,6 F 2 MBP 0,5 " 44,6 F 2 MBP 2,5 " 58,5 F 2 MBP 5,0 " 72,0 AHE BP 0,05 " 30,0 x AH Ex BP 0,25 " 37,5 AH Ex BP 0,5 59,6 AH Ex BP 2,5 " 92,6 AHE BP 5,0 " 95,3 x AHPEBP 0,05 " 36,7 AHPEBP 0,25 " 37,1 E *AHP BP 0,5 " 68,6 E AHPEBP 2,5 " 94,0 E AHPEBP 5,0 " 97,5 E AH Bu BP 0,5 " 53,2 AHBUBP 2,5 " 88,6 AH Bu BP 5,0 " 93,5 ESSAI PHARMACOLOGIQUE Le but de cette étude a été de déterminer l'effet d'une série de nouveaux diphosphonates sur des cellules de la voûte crâ- nienne en culture et sur la réabsorption osseuse et la miné- ralisation in vivo. Méthodes 1 Expérience sur les cellules de la voûte crânienne Culture cellulaire: les cellules ont été cultivées comme indiqué par Fast et coll (Biochem J 172, 97-107 ( 1978)) Autrement dit, brièvement, les cellules étaient prélevées sur des rats Wistar d'un jour et digérées par de la collagénase Les cellules libérées étaient mises sur plaques à la concentration de 200 000 cellules par ml de milieu dans des disques "cluster" de culture à 24 évidements de 1,6 cm de diamètre contenant 0,5 ml de milieu Les cellules étaient cultivées dans le milieu minimal essentiel contenant % de sérum de veau foetal,sous une atmosphère de CO 2 à 5 % à 37 C jusqu'au 8 ème jour. Les diphosphonates ont été ajoutés au premier jour jusqu'à la fin de l'expérience En moyenne, ils étaient renouvelésaux jours 1, 4 et 7. Comptage cellulaire Les cellules ont été comptées à l'aide d'un compteur Coulter après avoir été sorties des disques par digestion avec un mélange de collagénase et de trypsine Détermination du lactate Au 7 ème jour le milieu était changé et les cellules incubées pendant 16 heures Le lactate produit pendant cette période était mesuré dans un extrait dans HC 104 du milieu en utilisant la lactato-déhydrogénase. 2 Expériences sur la réabsorption osseuse et sur la calcification in vivo Des groupes de 5 rats Wistar pesant 180 à 200 g ont été traités pendant sept jours par 0,1, 1,0 et 10 mg de P/kg des acides diphosphoniques suivants: acide difluorométhanediphosphonique (F 2 MBP) (sel de Na); acide 4-amino-1-hydroxybutanediphosphonique (AHBUBP); acide 5-amino-1hydroxypentanediphosphonique (AHPEBP); acide 6-amino-1hydroxyhexanediphosphonique (AHEXBP); acide dichlorométhan diphosphonique (C 12 MBP) (sel de Na) ( 1 mg de P/kg). Les témoins ont reçu le solvant avec Na Cl Tous les traitements ont été effectués par voie sous-cutanée Les composés ont été dissous dans le Na Cl pour les deux concen- trations inférieures et dans l'eau pour la concentration supérieure et administrés en un volume de 0,2 ml/100 g. Les animaux ont été alimentés avec de l'Altromine 1314 contenant 1,1 g/100 g de Ca, 1,2 g/100 g de P et 250 IU/100 g de vitamine D 3 Le huitième jour les animaux étaient sacrifiés et les tibias prélevés et fixés dans de l'éthanol à 50 % Les tibias ont été ensuite déshydratés dans des concentrations croissantes d'éthanol et noyés dans du méthyl- métacrylate avec addition de Plastoid N Les coupes frontales ont été effectuées et polies à une épaisseur de 70-80 pm et on a effectué des microradiographies. Ce procédé a permis l'estimation de la densité minérale dans la métaphyse trabéculaire (Schenk et coll Calc Tiss. Res 11, 196-214, 1973). Résultats 1 Expérience sur les cellules de la voûte crânienne Comme l'indique le tableau 3, C 12 MBP provoque une diminu- tion du nombre de cellules Par contre, F 2 MBP a un effet nul ou très faible à ce point de vue Les dérivés aminés présentent une différence en ce sens que les composés avec un nombre impair d'atomes de carbone diminuent le nombre de cellules beaucoup plus que ceux ayant un nombre pair d'atomes de carbone. TABLEAU 3 Effet sur le nombre de cellules + S E M (n) (Ecart-type> Composé Iu témoin 2,5 25 250 ci 2 MBP 103,0 + 0,7 ( 4) 86,4 + 2,1 ( 12)***54,5 -i 1,9 ( 12)*** F 2 MB? 88,1 + 1,4 ( 12)*** 92,4 + 1,9 ( 12)**99,3 12,0 ( 16) AKE B? 100,5 + 1,6 ( 8) 101,0 + 1,5 ( 7 74,2 + 4,7 ( 15)*** Ah-?_BP 102,7 + 2,8 ( 8) 42, 6 + 5,1 ( 16)***Cel 1 l UIEM Orte S AI EB PB 93,3 + 3,0 ( 8)* 95,2 + 2,2 ( 8) 87,0 -1 3,4 ( 20)* j Nombre de cellules du témoin 0,5548 10 6/disque + 0,05 ( 55 > 7-X + Ecart type d'effet Les dérivés aminés provoquent tous une augmenta- tion de la production de lactate, plus prononcée avec les composés à nombre impair d'atomes de carbone. Les données sont fournies dans le tableau 4. TABLEAU 4 Effet sur la production de lactate + Ecart-type (n) composéf du témoin Icomposé concentration) 2,5 25 250 C 2 M 87,5 4,0 ( 4)* 67,1 + 2,8 ( 12)*** 16,9 2,2 ( 12)** F 2 MBP? 112,1 + 4,4 ( 12)* 106,2 + 3,9 ( 12) 99,7 + 4,7 ( 16) AHBU ?P 88,0 + 1,5 ( 8)* 79,6 + 4,1 ( 7)*** 179,8 + 18,6 ( 15)** AHPBP g 93,4 + 3,0 ( 8) 354,1 + 27,7 ( 16)*** cellulmot I_:3 F 109 t,4 + 6,0 ( 8) 108,3 + 4,5 ( 8) 164,7 + 7,7 ( 20)*** X, -' + Dans une expérience le nombre de cellules expériences de 1 à 3 % Cette concentration cellules meurent. était de 51,2 % de celles du témoin, dans trois représente la limite pour laquelle les Production de lactate: 3,83 Mol/ cellules 0, ( 55) (x 6 Ecart-type (n)) Production de lactate 3,83 ii Mol/10 cellules + 0,10 ( 55) (x + Ecart-type indiquées dans le tableau 5. Tableau 5 Effet sur la réabsorption osseuse et sur la minéralisation des os COMPOSE Dose Réabsorption Minéralisation en mg F 2 MBP 10 0,1 AHB BP 10 + U t de ++à/+++umnaind 'niiind arasrto 0,1 + AHPEBP 10 Expérience interrompue pour toxicité aigu i 0,1 AH Ex BP 10 1 ++ 0,1 Ci 2 MBP 1 +/++ = aucune inhibition de la réabsorption ou de la minéralisa- tion de + à +++ = augmentation de l'inhibition de la réabsorp ion ou de la minéralisation * = effet non établi par suite de l'inhibition de la miné- ralisation. Il apparaît que le AHPEBP est le composé le plus puissant dans l'inhibition de la réabsorption osseuse Il se mani- feste cependant une toxicité aux doses les plus élevées. AHBUBP et AHE XBP sont également actifs sur la réabsorption avec un effet légèrement supérieur à C 12 MBP Une différence intéressante concerne la minéralisation étant donné que AHEXBP induit une forte inhibition de la minéralisation à la dose de 10 mg de P/kg tandis que AHBUBP n'a pas cet effet ou ne l'a que dans une très faible mesure. Ces résultats mettent en évidence que les composés aminés à nombre impair d'atomes de Carbone sont légère- ment plus toxiques mais présentent un effet bien supérieur dans l'inhibition de la réabsorption osseuse Ceux ayant un nombre pair d'atomes de carbone ont une activité légèrement supérieure à celle du C 12 MBP Un autre aspect est que le AHBUBP n'induit pas ou presque pas d'inhibition de la minéralisation aux fortes doses tandis que l'AHEXBP présente une inhibition élevée Par conséquent AHBUBP semble plus approprié pour l'usage dans des maladies à réabsorption osseuse accrue chez l'homme Enfin, il est intéressant de noter que le F 2 MBP n'a pas d'effet sur la réabsorption osseuse ou sur la minéralisation osseuse et étant donné qu'il inhibe la croissance in vitro des cristaux d'apatite il peut être utilisé avec succès dans l'urolithiase. En effet, depuis longtemps on cherchait un diphosphonate qui inhibe la croissance des cristaux sans influencer les os. On en conclut que le AHBUBP et le AHP BP sont destinés à que UE devenir des médicaments de choix pour inhiber la réabsorption osseuse et que F 2 MBP sera utile pour le traitement de l'urolithiase. Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent être préparées sous forme de comprimés, granulés, dragées, sirops, solutions, émulsions, etc pour l'administration par voie orale ou parentérale. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être utilisées, soit à l'état de produit pur, soit en présence des diluents inertes, des lubrifiants, des agents émulsionnants, des colorants, des substances aromatisantes, des excipients, etc, qui sont tous des composés communément employés en technique pharmaceutique. Les composés selon la présente invention peuvent être admi- nistrés par voie orale à des doses de 25-3000 mg/jour ou par voie parentérale à des doses de 15-300 mg/jour. Le traitement est effectué durant 7 jours ou par cycles de 3 mois, le cas échéant en les répétant. REVENDICATIONS 1 Compositions pharmaceutiques utiles pour le traitement de l'urolithiase et pour inhiber la réabsorption osseuse, caractérisées en ce que, à titre de principe actif, elles contiennent un acide diphosphonique de formule générale I | 3 H 2 R-C-R' PO 2 dans laquelle R est un atome de fluor ou un résidu alkyle linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 5 atomes de carbone, éventuellementsubstitué par un ou plusieurs substituants tels que des groupes amino et/ou des atomes de fluor et R' est un groupement hydroxyle ou du fluor, et leurs sels de métaux alcalins, avec des bases organiques et des aminoacides basiques. 2 Compositions pharmaceutiques selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont formulées pour l'admi- nistration par voie orale. 3 Compositions pharmaceutiques selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont formulées pour l'administra- tion par voie systémique. 4 Procédé de préparation d'acides diphosphoniques de formule générale I selon la revendication 1, dans laquelle R est un résidu aminoalkyle et R' est un groupement hydroxyle, caractérisé en ce que l'on fait réagir un aminoacide ou l'un de ses précurseurs avec de l'acide phosphoreux et du trichlo- rure de phosphore dans un solvant inerte et que l'on hydro- lyse le produit de la réaction. 2525 Z 23 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'aminoacide, l'acide phosphoreux et le trichlorure de phosphore sont mis en réaction dans un rapport de 1:1,5:1,5. 6 Acide 5-amino-l-hydroxypentane-1, 11-diphosphonique. 7 Acide 4-amino-1-hydroxybutane-1,1-diphosphonique. 8 Acide difluorométhanediphosphonique.