Brevet FR2527901A1 — publié le 19831209

La présente invention concerne l'application biologique d'alcools polyvinyliques au conditionnement de matériaux et tissus biologiques. Par "conditionnement" on désigne selon l'invention d'une part la conservation des matériaux ou tissus biologiques et d'autre part leur traitement pour la coupe à congélation. L'invention a plus précisément pour objet l'utilisation de solutions tamponnées d'alcools polyvinyliques à titre d'agents conservateurs biologiques,notamment pour la conservation immunologique de matériaux biologiques. Très souvent on effectue des prélèvements de tissus sur les malades et on procède à l'analyse de ces tissus pour déterminer la maladie et le-traitement approprié pour la soigner. En général,les laboratoires pour l'analyse de ces tissus ne sont pas à proximité des lieux de prélèvements (salles d'opération)et il est nécessaire de transporter ces tissus du lieu de prélèvement au lieu d'analyse. Généralement, le transport de ces prélèvements est effectué dans de l'azote liquide de manière à les conserver intacts et à les préserver de toute contamination. Cependant ce mode de transport est délicat et il est soumis à des réglementations très strictes. Par ailleurs,pour certains examens immunologiques,il est indispensable de disposer de tissus porteurs de sites antigéniques spécifiques de certaines affections. De manière courante on obtient ces tissus à partir d'animaux porteurs de l'antigène considéré;ces tissus sont utilisés franchement prélevés et aussitôt coupés à congélation. De tels examens immunologiques nécessitent donc la récolte et le sacrifice fréquent d'animaux pour avoir de tels tissus frais ou la conservation de ces tissus dans des conditions délicates,notamment par le froid. On a maintenant trouvé un moyen pour conditionner les tissus ou autres matériaux biologiques,notamment du point de vue immunologique , sans faire appel à des techniques élaborées de conservation. La présente invention consiste à utiliser des alcools polyvinyliques comme agents conservateurs de matériaux ou tissus biologiques. De façon avantageuse ces alcools sont utilisés en solution aqueuse tamponnée. Les alcools polyvinyliques qui conviennent à la présente invention doivent être inertes vis-à-vis des matériaux biologiques à conserver. Ils ne doivent pas provoquer une lyse tonique desdits matériaux biologiques traités, préjudiciable à leur analyse. A titre d'exemples d'alcools polyvinyliques qui conviennent aux fins de l'invention on citera les alcools polyvinyli- ques qui présentent en solution aqueuse à la concentration de 550 gîl un indice d'ester de 90 à 180, par exemple de 120 à 150. Parmi les alcools polyvinyliques de cette classe on peut citer notamment les produits connus sous la dénomination commerciale "RHODOVIOL" mis sur le marché par RQNE-POULENC. Un composé particulièrement préféré aux fins de l'inven- tion est le produit connu sous le dénomination commerciale "RHODOVIOL 14/135", dont les caractéristiques données, à la concentration de 550 g/l sont les suivantes - indice d'ester de 120 à 150, - pH compris entre 5 et 7, - richesse en C00H et en NazO inférieure respectivement à 0,2% et 0,5%. Les alcools polyvinyliques sont principalement utilisés dans l'industrie comme agents démoulants de la meme manière que les alginates, et à la place des silicones, lorsque ceuxci altèrent les colorations ulterieures. Cependant on n'a jamais proposé l'utilisation de ces alcools polyvinyliques à titre d'agents de conditionnement au sens de la présente invention. On notera cependant que le RHODOVIOL 14/135 a été proposé comme agent de conservation morphologique. A cet effet on pourra se référer à la these de Jean CALLIER, soutenue le 9 Janvier 1975 à l'Université de Clermont Ferrand "Etude du vestibule osseux et membraneux humain sur pièces anatomiques" (thèse pour le doctorat en médecine). Au cours des travaux qui ont fait l'objet de cette thèse, on a montré que le RHODOVIOL 14/135, en phases aqueuses convenables, diffuse facilement à travers les tissus très hydratés, qui s'en imprègnent et qui acquièrent alors une résistance à la dessication. Les labyrinthes membraneux humains, friables dès l'écoulement de la périlymphe, supportent alors la dissection. Cependant, rien ne laissait supposer ni suggérait à l'homme de l'art, qu'un tel produit approprié pour maintenir l'anatomie d'un organe, pouvait également être utilisé pour la conservation du point de vue immunologique. En effet, on connatt des agents de conservation morphologique qui ne conviennent pas à titre d'agents de conservation immunologique. On peut citer par exemple l'éthanol, qui est un moyen classique de conservation des pièces anatomo-pathologiques. On peut également citer les aldéhydes qui sont couramment utilisés comme fixateurs mais qui ne conviennent pas comme conservateurs de sites antigéniques. Les solutions aqueuses tamponnées d'alcools polyvinyliques qui conviennent aux fins de l'invention sont des solutions tamponnées à pH d'environ 5 à 8, ayant une viscosité comprise entre 5 et 80 mPa.s (milliPascal-seconde) à 200C, une osmolalité comprise entre 50 et 100 milliosmoles et un indice d'ester entre 7 et 14. Une solution aqueuse tamponnée particulièrement préférée aux fins de l'invention a un pH compris entre 6,5 et 7,4, une viscosité comprise entre 60 et 75 mPa.s à 200C, une osmolalité comprise entre 80 et 100 milliosmoles et fla indice d'ester entre 9 et 10,5. Une telle solution constitue une solution standard à partir de laquelle on peut préparer d'autres solutions tamponnées selon l'invention par dilutions adéquates. Les tampons utilisés pour préparer les solutions selon l'invention sont des tampons classiques appropriés en biologie parmi lesquels on peut citer les tampons histologiques, tels que tampons phosphatés, les tampons au trismaléate, le tampon au véronal sodique-acétate de soude, le tampon au cacodylate etc..... Pour la conservation des matériaux biologiques selon l'invention dans les solutions tamponnées-d'alcools polyvi nyliques, on immerge ledit matériau dans une solution tamponnée d'un tel alcool polyvinylique On peut maintenir l'ensemble à des températures positives par exemple à la température ambiante. L'invention permet de supprimer la chaine de froid à températures fortement négatives, utilisée jusqu'a' présent pour la conservation de certains matériaux biologiques. Par "matériaux ou tissus biologiques" on désigne aux fins de l'invention des êtres vivants dans leur entier ou leurs parties, par exemple les parasites entiers, les tissus superficiels (peau) ou les tissus profonds (myocarde, rein, etc....). Les matériaux biologiques ainsi conservés sont ensuite soit analysés (prélèvements de tissus, soit utilisés dans des tests immunologiques à titre de référence. Dans l'un ou l'autre des cas, ces matériaux seront généralement coupés. Dans la pratique courante les matériaux biologiques conservés, par exemple dans l'azote liquide, sont ensuit débités au cryostat en coupes congelées aussi étendues et aussi fines que possible. Mais, si elles sont trop importantes et trop hétérogènes les pièces incluses à l'eau, de par leur consistance, réservent au couteau une épreuve proportionnelle à leur surface celles qui sont enrobées se décollent et provoquent des vibrations quand leur consistance interne n'est pas homogène. Pour réaliser ces coupes on utilise actuellement des produits synthétiques d'enrobage et non d'inclusion, tels que les produits connus sous les dénominations commerciales - CRYOFORM (International Equipement Co Needham Heights Massachussets vendu en France par RUA Instruments), - LIPSAW EMBEDDING MATRIX (commercialisé en France par BLOCK & Cie) et - la carboxyméthylcellulose. Tous ces produits de l'art antérieur se comportent comme des enrobages formant simplement une gangue autour des blocs à couper. Ainsi existe-t-il dans la masse d'ensemble à soumettre au rasoir une hétérogénéité dès qu'il s'agit de tis sus mous. Cette consistance disparate : - soit ne permet pas la coupe de pièces volumineuses ou réduit la fourchette des températures négatives utilisables, - soit expose au décollement des blocs. Enfin, il s'agit de matières visqueuses qui rendent souvent difficile l'orientation des pièces de petites ou moyennes dimensions. On a trouvé que les alcools polyvinyliques mis en oeuvre selon l'invention conviennent également comme masse d'inclusion pour les coupes à congélation. I1 est donc inutile de changer le matériau biologique de milieu pour la coupe. Cette propriété améliore et facilite considérablement les manipulations de ces matériaux biologiques avant leur analyse. En effet, des essais ont montré par exemple que le RHODOVIOL 14/135 permet d'effectuer sur Cryostat sans enceinte réfrigérée des coupes d'yeux, organes vastes, cavitaires, riches en scléro-protéines et en tissus très hydratés, porteur en outre de prothèses,voire de cataracte. Malgré cela, des coupes d'environ 6 om d'épaisseur ont pu être confectionnées. Le RHODOVIOL 14/135 constitue une véritable masse d'inclusion, qui acquiert à partir de -50C une viscosité rappelant celle de la paraffine. Comme elle, il adhère fortement au porte-objet et ménage le fil des rasoirs. Ainsi des alcools polyvinyliques, tels que le RHODOVIOL 14/135 conviennent à la fois comme agent de conservation immunologique et comme masse d'inclusion. On notera que de tels alcools peuvent également etre utilisés à titre de masse d'inclusion lorsque l'on désire procéder à la coupe de tissus frais. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation des alcools polyvinyliques définis ci-dessus à titre de masse d'inclusion. Contrairement aux produits de l'art antérieur, les solutions tamponnées d'alcools polyvinyliques selon l'invention pénètrent suffisamment dans les tissus à examiner pour former un bloc homogène, ceci à des consistances assez fluides qui ne sont pas gênantes, et pour permettre une adhérence fiable sur une échelle de température négatives. La présente invention va être maintenant décrite en détail dans les exemples illustratifs mais non limitatifs ci-après. Dans ces exemples on a utilisé le RHODIVIOL 14/135 en solution aqueuse tamponnée préparée de la façon suivante On a préparé la solution mère ci-après : RHODOVIOL 14/135 14Q g phénol 0,04 g - 0,05 g eau distillée : q.s.p. 1000 cc Le phénol joue le rôle d'antiseptique, n' altérant pas les structures immunologiques. On a dilué au 1/2 la solution mère ci-dessus dans le tampon ci-après cacodylate de Na 42,8 g eau bidistillée 1000 ml HC1 0,2 M 54 ml ta solution ainsi obtenue est tamponnée à pH 6,8. Ainsi préparée, la solution tamponnée de RHODOVIOL 14/135 n'a pas montré les limites de conservation particulières jusqu'à ce jour. EXEMPLE 1 conditionnement des antigènes parasitaires A - Sérodiagnostic de diastomatoses Dans cet exemple on a testé 45 sérums de malades infestés ou supposés infestés par une douve hépatique : (Fas ciola hépética), c'est-à-dire atteints d'une distomatose hépatique. Ces sérums, au cours du test, ont été, avec des protocoles rigoureusement identiques, confrontés successivement et comparativement a) à des coupes de douves (Fasciola hépatica) ayant été conservées huit mois dans la solution de Rhodivil décrite ci-dessus, b) à des coupes de mêmes parasites fratchement prélevées, et aussitôt coupées à congélation. Ces coupes représentent l'antigène auquel réagissent les anticorps présents dans le sérum. Ces essais de sérodiagnostic ont été réalisés par la technique classique d'immunofluorescence. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau I ci-après. Les résultats de ce tableau montrent qu'il n'y a pas de différence entre les tests d'immunofluorescence faits avec des coupes de douves conservées dans la solution tam- ponnée de RHODOVIOL 14/135 telle que définie ci-dessus et les tests d'immunofluorescence réalisés avec des douves franches et congelées. B - Sérodiagnostic d'echinococcoses De la même façon on a effectué des essais de sérodiagnostic d'echinococcoses (Echinococcus granulosus). On a également obtenu sensiblement les memes résultats avec des tissus portant les antigènes spécifiques conservés selon l'invention ou frais et congelés. L'agent de conditionnement selon l'invention permet donc de conserver les antigènes sur leur support naturel, de façon à permettre, après conservation, des réactions immunofluorescentes comparables à celles développées sur tissus frais. EXEMPLE 2 conditionnement de tissus de mammifères Des coupes de divers tissus, (coeur : myocarde, rein, peau, oeil) provenant de souris ou de prélèvements médicaux humains ( biopsies de reins affectés de glomérulonéphrite membrano proliférative dont on examine les dépôts sous épithiliaux d'Ig et de C3) ont été étudiées en immunofluorescence afin de tester le comportement des anticorps et des immunoglobulines (Ig). L'examen optique des tissus frais et des tissus conditionnés pendant 48 heures à la température du laboratoire dans la solution tamponnée de RHODOVIOL 14/135 n'a pas permis de déceler de différences. La densité des réponses après passage dans l'agent de conditionnement selon l'in- vention apparaît identique à celle des tissus frais immédiatement traités. Une étude sur des biopsies cutanées a montré la me chose après 10 jours de conservation dans l'agent de conditionnement selon l'invention à 40C. TABLEAU I A - Sérodiagnostic de diastomatoses Sérum nO Antigène après 8 mois Antigène témoin dans le Rhodoviol frais-congelé 1 + 1/160 + 1/160 2 + 1/160 + 1/160 3 + 1/80 + 1/80 4 + 1/160 + 1/160 5 + 1/80 + 1/80 6 + 1/160 + 1/160 7 + 1/160 + 1/160 8 + 1/40 + 1/40 9. + 1/320 + 1/160 10 + 1180 + 1/80 11 + 1/80 + 1/40 12 + 1/160 + 1/160 13 + 1/80 + 1/80 14 1/80 + 1/80 15 + 1/160 + 1/160 16 (-) (-) 17 + 1/80 + 1/80 18 + 1/160 + 1/160 19 + 1/80 + 1/80 20 + 1/80 + 1/40 21 + 1/160 + 1/160 22 + 1/80 + 1/80 TABLEAU I (suite) A - Sériodiagnostic de diastomatoses Sérum NO Antigène après 8 mois Antigène témoin dans le Rhodoviol frais - congelé 23 + 1/80 + 1/80 24 + 1/320 + 1/160 25 + 1/80 + 1/80 26 + 1/160 + 1/160 27 + 1/80 + 1/80 29 douteux 1/40 douteux 1/40 31 + 1/80 + 1/80 38 + 1/40 + 1/40 49 + 1/40 + 1/40 50 + 1/40 + 1/40 58 + 1/40 + 1/40 59 + 1/40 + 1/40 62 + 1/40 + 1/40 63 + 1/40 + 1/40 65 + 1/160 + 1/160 66 + 1/160 + 1/160 67 + 1/80 + 1/40 68 + 1/80 + 1/40 69 + 1/160 + 1/160 70 douteux 1/40 douteux 1/40 71 + 1/380 + 1/160 72 + 1/80 + 1/80 74 + 1/160 + 1/80 REVENDICATIONS 1. Agent de conditionnement pour matériaux ou tissus biologiques, caractérisé en ce qu'il contient à titre d'ingrédient actif un alcool polyvinylique qui présente en solution aqueuse à la concentration de 550 g/l un indice d'esters de 90 à 180. 2. Agent selon la revendication 1, caractéri sé en ce que l'alcool polyvinylique est le RHODOVIOL 14/ 135. 3. Agent selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une solution aqueuse tamponnée. 4. Agent de conditionnement selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est une solution aqueuse tamponnée à un pH compris entre 5 et 8, ayant une viscosité comprise entre 5 et 80 mPa.s à 200C, une osmolalité comprise entre 50 et 100 milliosmoles, et un indice d'ester entre 7 et 14. 5. Agent selon la revendication 4, caractéri sé en ce qu'il est une solution tamponnée à un pH compris entre 6,5 et 7,4 ayant une viscosité entre 60 et 75 mPa.s à 200C, une osmolalité comprise entre 80 et 100 milliosmoles, un indice d'ester entre 9 et 10,5. 6. Agent selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la solution aqueuse tanponnée contient un tampon au cacodocylate de fla, un tampon au phosphate, un tampon au tris-maléate ou autre tampon similaire. 7. Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la conservation immunologique de matériaux ou tissus biologiques. 8. Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, à titre de masse d'inclusion pour coupe à congélation. 9. Procédé pour le conditionnement de matériaux ou tissus biologiques, caractérisé en ce qu'on met en contact lesdits matériaux ou tissus avec un agent à base d'alcool polyvinylique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 10. Procédé selon la revendication 9, carac térisé en ce qu'on opère complémentairement de façon connue une congélation, notamment en vue d'une coupe de matériaux ou tissus.