Brevet FR2526027A1 — publié le 19831104

PROCEDE POUR LA PURIFICATION DE DIMYCOLATES DE. TREHALOSE BRUT (TDM) ET PRODUIT AINSI OBTENU. La présente invention a pour objet un procédé pour la purification de dimycolates de tréhalose brut (TDM), et produit ainsi obtenu. 5 Le TDM est un isolat de bactérieetquandil est combiné au squelette de la paroi cellulaire (CWS), il forme une composition qui est efficace pour la suppression et la régression des cellules tumorales. La combinaison du squelette de la paroi cellulaire et du TDM est connue (cf l'article Biologically Active Components from Mycobacterial 10 Cell Walls II Suppression and Regression of Strain-2 Guinea Pig Hepatoma de Meyer et al dans la revue Journal of the National Cancer Institute, volume 52, n 1, janvier 1974 ; et l'article Mycobacterial Cell Wall Components in Tumor Suppression and Regression de Ribi et al dans la revue National Cancer Institute Monograph n 39, pages 115-120, octobre 1979. 15 Le squelette de la paroi cellulaire est essentiellement formé de la paroi cellulaire dont la plus grande partie des protéines et lipides qui se trouvent normalement dans la paroi cellulaire a été éliminée Il est un arabinogalactan mucopeptide d'acide mucolique polymère contenant des traces rémanentes de mycolates de tréhalose ("P 3 ") et de tuberculopro20 téines non digérées Le squelette de la paroi cellulaire est obtenu à partir de mycobactérie dont on peut notamment citer, à titre non limitatif, M.smegmatis, M phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacte- rium diphteriae, Corynebacterium parvum, Mkansasii, M tuberculosis (sou- che H 37 RV et Ayoma B), et M bovis souche BCG En outre, le squelette 25 de la paroi cellulaire peut être obtenu à partir d'organismes autres que les mycobactéries tels que E coli, B abortus et Coxiella burnettii. Le procédé de production du squelette de la paroi cellulaire prend beaucoup detemps Les bactéries telles que M bovis, souche BCG (bacille Calmette-Guerin) croientetdoivent êtrerecueillies Le résidu de cellules 30 totales résultant est traité dans un fractionneur de cellules {le frac- tionneur de cellules Ribi (fabriqué par Sorvall, modèle RF-1)} qui désagrège 2 les cellules et permet la séparation de l'enveloppe extérieure ou paroi cellulaire des impuretés protoplasmiques Les parois cellulaires résultantes sont alors soumises à une série d'extraction par solvant et de traitements enzymatiques (par exemple,à la trypsine et/ou àlachymotrypsine) 5 pour conduire à un squelette de paroi cellulaire purifiée. Le second constituant consistant en dimycolates de tréhaloses (TDM) des compositions précitées, peut être obtenu à partir de mycobactéries dont on peut, à titre d'exemple, citer M avium, M phlei, M tuberculosis (souche H 37 RV et Ayoma B), M bovis souche BCG, M smegmatis, M kansasii, 10 Nocardia rubra, M bovinis et Corynebacterium diphtheriae. Des bactéries telles que M avium, se développent, sont récoltées puis détruites par action de chaleur La masse cellulaire est extraite par différents solvants, puis une fraction active soluble dans un sol- vant, est extraite Cet extrait subit alors une purification supplémen- 15 taire par une série d'extraction à l'aide de solvant pour conduire au TDM brut (cf l'article Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls I Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Compo- nents P 3 ; d'Azuma et al, dans la revue Journal of the National Cancer Institute, volume 52, pages 95-101, 1974) Ainsi qu'il a été décrit dans 20 Azuma et al, le TDM brut peut alors subir une purification supplémentaire par chromatographie centrifuge dans un gel de silice microparticulaire pour conduire à l'obtention de TDM purifié. CWS et TDM ainsi produits peuvent être alors utilisés en tant qu'émulsion formée degouttelettes d'huile pour obtenir une composition 25 anti-tumorale susceptible d'être injectée (cf l'article Immunotherapy with Non-viable Microbial Components de Ribi et al publié dans la revue Annals of the New York Academy of Science, volume 227, pages 228-238, 20 Septembre 1976). Les émulsions connues de l'homme de l'art, cependant, présentent 30 un inconvénient majeur En effet, les impuretés restant dans le TDM pu- rifié affectent de façon sérieuse, le pouvoir de la composition et limi- tent son efficacité dans le traitement des tumeurs Des essais préalables ont été effectués afin de purifier TDM et ceux-ci ont impliqué, en-géné- ral, beaucoup de perte de temps résultant des élutions coûteuses devant 35 être effectuées dans les colonnes de gel de silice sous pression élevée. Les demandeurs ont constaté que l'emploi d'une colonne remplie - de particules de gel de silice opérant'sous basse pression (c'est-à-dire entre 0,7 et 2,1 bars) dont la dimension des particules de gel de silice 3 est comprise entre 15 et 63 microns conduit, de façon surprenante et efficace, à l'élimination virtuelle de toutes les impuretés contenues dans le TDM brut. La présente invention a, par conséquent, pour objet un procédé 5 permettant de purifier le TDM brut Elle a encore pour objet le TDM puri- fié obtenu ainsi que sa possible combinaison avec le CWS pour produire une émulsion d'huile dans une solution saline et efficace en tant qu'agent anti -tumorale. La présente invention a pour objet un procédé de purification de 10 TDM en vue d'en éliminer virtuellement toutes les impuretés normalement associées à TDM brut Ce procédé consiste à dissoudre le TDM brut dans un solvant, puis à soumettre la solution à un traitement dans une colonne de gel de silice sous basse pression dont les dimensions particulaires du gel de silice sont comprises entre environ 15 et 63 microns La pres- 15 sion employée dans la colonne est, en général, entre 0,7 et 2,1 bars et, de préférence, entre 0,21 et 0,56 bar. Une grande variété de solvants non polaires peut être utilisée pour dissoudre TDM brut Les solvants utilisés de préférence peuvent con- sister, par exemple, en chloroforme, éther, héxane, méthanol, éthanol, 20 tétrahydrofurane, éther de pétrole, heptane, chlorure de méthylène, li- groine, propanol, butanol, acétate d'éthyle, benzène, toluéne, acide acétique et similaires ainsi que leurs combinaisons. Des fractions de TDM purifié sont combinées et le solvant éliminé. Le produit résultant présente pratiquement aucune impureté détectable 25 (c'est-à-dire qu'il présente une pureté égale ou supérieure à 99,9 %). En utilisant le procédé décrit ci-dessus, il est possible de parvenir à un TDM de pureté élevée sans nécessiter des étapes de purification répé- titives requises par les méthodes connues Le produit peut être, de façon effective, combiné au CWS de façon conventionnelle pour conduire à l'obten- 30 tion d'une composition anti-tumorale puissante. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description suivante donnée à titre non limitatif. EXEMPLE 1 Préparation de TDM brut. 600 g (poids humide) de cellules totales de M phlei qui ont, au préa- 35 lable été tuées à la chaleur, sont agitées pendant une nuit sur un agita- teur magnétique dans 4 litres d'éthanol à 95 %, puis filtrées sous vide sur un entonnoir de type Buchner de 27 cim de diamètre pourvu d'un papier filtre Whatman N O 1 de 24,0 cm de diamètre dans un ballon de filtrage de 4 de 2 litres de capacité La solution éthanolique est éliminée Le résidu cellulaire est remis en suspension dans un ballon de 2 litres dans 1 500 ml d'une solution éther-thylique-éthanol 1/1 et agité pendant la durée d'une nuit sur un agitateur magnétique, puis filtré ainsi qu'il a été décrit 5 ci-dessus La solution éther-éthanol est éliminée et une deuxième extrac- tion éther-éthylique-éthanol est effectuée et suivie d'une filtration. Après élimination de la solution étheréthanol, le résidu cellulaire est remis en suspension dans 1 500 ml d'une solution chloroforme-méthanol 2/1 et agité pendant la durée d'une nuit sur un agitateur magnétique, puis 10 filtré sur un entonnoir Buchner ou centrifugé à 10 000 tr/mn pendant 30 secondes La solution chloroforine-iméthanol est éliminée et on repète à nouveau à deux reprises le procédé d'extraction et de filtration Le résidu cellulaire est séché à l'air et mis en flacon Les trois solutions dans le chloroforme-méthanol sont combinées et évaporées sur un 15 appareil dit-Buchi Roto-vapor dans un ballon à fond rond taré Le poids du résidu de la solution chloroforme-méthanol est de 13,0 grammes. Le résiduest dissous dans 500 ml d'une solution chloroforme-métha- nol 2/1 et agité pendant une heure à l'aide d'un agitateur magnétique, puis filtré dans un entonnoir de type Buchner en verre fritté (brut 300 ml). 20 Le solvant est évaporé sur l'appareil connu sous la dénomination de Buchi Roto-vapor dans un ballon taré à fond rond et est conduit à l'obtention d'un résidu pesant 12,5 grammes. Le résidu résultant est remis en suspension dans 400 ml d'éther-éthy- lique, puis agité à l'aide d'un agitateur magnétique durant une heure La 25 suspension est alors centrifugée dans deuxflacons centrifuges à bouchon vissabie dans un Rotor de type GSA à 5 000 tr/mn pendant 30 minutes La fraction soluble dans l'éther est alors laissée décanter On recueille alors, d'une part la fraction soluble dans l'éther et, d'autre part, la fraction insoluble dans l'éther. 30 La fraction insoluble dans l'éther est dissoute dans 200 ml d'une so- lution chloroformle-méthanol 2/1 et l'ensemble est filtré sur un entonnoir Buchner. La fraction soluble dans l'éther est évaporée sur l'appareil connu sous le noml de Roto-vapor Buchi, dans un flacon taré à fond rond, ce qui con- 35 duit à l'obtention d'un résidu soluble dans l'éther Ce résidu dissous dans 300 ml d'éther est précipité dans 900 ml de méthanol Le précipité est filtré sur un entonnoir de type Buchner à l'aide d'un papier filtre Whatman no 1 et l'ensemble est combiné dans une solution chloroforme méthanol 2/1 5 contenant la matière insoluble dans l'éther précité La solution résultante est évaporée sur un appareil Roto-vapor Buchi, dans un ballon taré à fond rond, ce qui conduit à l'obtention de 6,5 grammes d'un résidu. Le résidu est dissous dans 200 ml d'une solution chloroforme métha- 5 nol 2/1 et versé dans une ampoule à décanterpouren permettre la sépara- tion, ayant une capacité de 500 ml Cette solution est alors ajoutée goutte à goutte dans un ballon de 2 litres contenant 600 ml d'acétone agités à l'aide d'un agitateur magnétique Le précipité résultant est filtré sur un entonnoir Buchner, séché dans un courant d'air et placé dans un flacon. 10 On obtient ainsi 4,5 grammes de TDM brut. EXEMPLE 2 Purification de TDM brut. 2 g de TDM brut ainsi qu'obtenus dans l'Exemple 1 sont dissous dans 2 ml d'une solution chloroforme méthanol 2/1, puis introduits dans une poche à échantillon de 5 ml Le reste de la poche est rempli de solvant. 15 La solution est amenée par pompage sur une colonne de gel de silice 60 ( 25 x 1000 mm), la dimension particulaire est comprise entre 15 et 63 mi- crons à l'aide d'une pompe de type Isco modèle 132 La colonne est éluée à l'aide de 800 ml de chloroforme, puis ensuite 1 200 ml d'une solution chloroforme méthanol 98/2 sur un débit de 4 ml/mn (je débit est critique, 20 car on a constaté que la résolution est inférieure lorsque le débit est augmenté de façon sans contrôle) Par conséquent, l'élution est en général effectuée selon les débits variant entre 0,1 ml et 20 ml par minute et, en général selon des débits de l'ordre de 2 à 5 ml/mn). L'effluent provenant de la colonne est alors amené dans un collecteur de 25 fractions et des fractions de 8 ml par tube sont recueillies alors que la colonne subit une élution à l'aide de 3 500 ml d'une solution chloroforme méthanol 96/4 Les tubes contenant le TDM purifié sont analysés par introduction de parties aliquotes et des différentes fractions sur des plaques TLC (c'est-à-dire de chromatographie en couches minces, sur gel 30 de silice F-254, 5 x 10 cm, épaisseur 0,25 mm), en utilisant en tant qu'éluant une solution chloroforme-niéthanol 10/1 ; ces fractions sont comparées à du TDM pur préalablement isolé La visualisation des plaques de chromato- graphie en couches mincesestproduite par pulvérisation des plaques à l'aide de 10 % (poids/volume) d'acide phosphomolybdique dans l'éthanol Des frac- 35 tions contenant TOM purifié sont combinées et le solvant est évaporé sur un appareil connu sous le nom de Roto-vapor Buchi dans un -ballon taré à fond rond On obtient ainsi 358 mg de TDM purifié. 6 1 Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisa- tion décrits et représentés et elle est susceptible de nombreuses varian- tes accessibles à l'homme de l'art, sans que l'on ne s'écarte de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de purification de dimycolates de tréhalose brut, caractérisé en ce que: (a) on dissout des dimycolates de tréhalose brut dans un solvant, et 5 (b) on soumet la solution à un traitement dans unecolonne de gel de silice, sous basse pression, les particules de gel ayant une dimension comprise entre 15 et 63 microns. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la pression est comprise entre 0,7 et 2,1 bars et, de préférence, entre 0,21 10 et 0,56 bar. 3.' Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le solvant est un des composés appartenant à la liste formée par chloro-. forme, éther, héxane, éthanol, méthanol, tétrahydrofurane, éther de pétrole, heptane, chlorure de méthylène, ligroîne, propanol, butanol, acétate d'é- 15 thyle, benzène, toluène, acide acétique ou leurs mélanges. 4. Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, carac- térisé en ce que les dimycolates de tréhalose sont obtenus à partir de mycobactéries. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les 20 mycobactéries sont choisies dans le groupe comprenant M avium, M phlei, M.tuberculosis (souche H 37 RV et Ayoma B), M bovis (souche BCG), M.smegmatis, M kansasii, Nocardia rubra, M bovinis, ou Corynebacterium di phtheri ae. 6. Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5, carac- 25 térisé en ce que l'élution est effectuéeàundébit compris entre 0,1 ml et 20 ml/mn et, de préférence, entre 2 et 5 ml/mn. 7. A titre de produit industriel nouveau, les dimycolates de tré- halose obtenus à l'aide du procédé selon une quelconque des revendications 1 à 6.