Brevet FR2531975A1 — publié le 19840224

La présente invention se rapporte à l'acide désoxyribonucléique (ADN) MD-OIl dénaturé thermiquement,qui présente une activité antitumorale; elle comprend également un procédé d'obtention de cet ADN à partir de bactéries du genre Myco- bacterium. L'invention comprend en outre des applications thérapeutiques de l'acide en question. Ti est bien connu que le bacille de Koch possède une forte activité antitumeur et adjuvant. A la suite de recherches sur des cellules contenant des substances qui présentent ces activités, on a indiqué précédemment que,parmi les substances provenant des parois cellulaires et du squelette de ses parois, l'adjuvant hydrosoluble, la cire D et autres sont des fractions actives; parmi les substances cytoplasmiques,les fractions actives sont l'arabinomannane, l'ARN et autres. Par contre, la présente invention est basée sur la découverte que des substances à activité antitumorale peuvent être obtenues à partir du bacille de Loch. Un fait inattendu réside en ce que,selon l'invention, de telles substances,actives par l'intermédiaire d'un hôte, sont obtenues par la dénaturation de l'ADN. Suivant l'invention, l'extrait du bacille de Koch, exempt de cellules, présente une forte activité antitumeur une fraction-active peut être obtenue sous la forme de précipité, à partir de cet extrait, par l'emploi d'un floculant de l'acide nucléique; par chauffage de ce précipité, non seulement l'activité n'est pas inhibée, mais elle est même renforcée. Le procédé suivant l'invention consiste donc à dénaturer thermiquement un ADN à un seul brin,obtenu à partir d'un extrait exempt de cellules du bacille de Koch et floculation. La substance active, obtenue, est purifiée par une des méthodes connues,tele que précipitation,chromatographie, électrophorèse,etc. il est à noter que les seules indications de l'art antérieur,touchant l'activité antitumeur de l'acide nucléique, sont celles de Youmans (Infection and Immunity 14,929,1976) qui se rapportent à l'acideribonucléiqueet celles de Sciences 149, 997 de 1965,qui signalent cette activité pour l'ADN. Cependant, il s'agit là d'effets faibles, spécifiques de l'es- pèce et inhibés par chauffage. On a considéré que l'action de l'ADN réside dans la modification du métabolisme de la cellule tumorale ou dans le changement du contrôle génétique:autrement dit,il'agirait d'une action toxique, directe,sur la cellule tumorale.(Cancer Research 27,2342,1967,Proceedings of the Nation Academy of Science 61,207,1968). Par contre, les auteurs de la présente invention,dans leurs recherches sur le spectre antitumeur de la substance suivant l'invention, ont trouvé les résultats suivants.L'activité de cette substance ntest pas moindre que celle des cellules de départ de matières contre les tumeursttelles que Ligne 10 hépatome syngénéique de la tumeur du cochon d'Inde, carcinome TMG, carcinome du poumon de Lewis ('il), cellules de leucémie EL-4, et autres, notamment des tumeurs synégéiques de la souris.En outre, les substances suivant l'invention ont une toxicité et une antigénicité remarquablement faibles. D'autre part, il apparaît que les substances suivant l'invention exercent leur action antitumeur par un effet immunitaire de l'hôte; elles n'ont guère d'influence inhibitrice sur la croissance de cellules, même lorsqu'elles sont incubées ensemble avec des cellules tumorales in vitro. D'autres recherches sur l'activité immunologique de la substance suivant l'invention ont montré -que cette substance exerce un effet de potentialisation de l'activité des cellules tueuses T, qu'elle active les macrophages et exalte l'action des cellules tueuses naturelles; cette dernière action constitue une preuve du mécanisme d'action de la substance suivant l'invention. On a trouvé également que la substance suivant l'invention ne conduit à des transformations ni de cellules normales ni de cellules tumorales. A noter que cette substance dérive d'un microorganisme dont les cellules ont une taxonomie très différente des cellules animales. Dans la réalisation du procédé suivant l'invention, la fraction d'acide nucléique, que l'on soumet au chauffage, est de préférence obtenue par centrifugation de cellules éclatées d'une ou de plusieurs bactéries appartenant au genre mycobacterium. L'acide nucléique est séparé de la solution surnageante qui est obtenue par la dialyse contre de l'eau ou contre une solution saline du précipité formé par la floculation mentionnée plus haut. C'est cette solution surnageante qui est ensuite chauffée, en général à une température de 800 à 1200C. En ce qui concerne les bactéries du genre mycobacterium employées,conviennent en particulier les espèces: bovis BCG,ATCC 19 015;tuberculosis H37RA,ATCC 25 177;smegmatis, A!I!CC 607;smegmatis, IFO,3 153. Ces espèces sont citées a' titre d-'exemple, mais il est possible d'en employer d'autres. La culture des bactéries et ensuite la rupture de leurs cellules peuvent être effectuées par des procédés classiques. Par exemple, une culture convenable peut être préparée sur du milieu de Saut on ou sur du bouillon glycériné dans le cas du mycôbacterium bovis.La culture peut avoir lieu à environ 3?00,pendant 1 à 8 semaines. Les cellules sont récoltées par centrifugation ou filtration, pour être ensuite mélangées avec de l'eau,de préférence en présence d'un tampon de pH approprié; le mélange est ensuite soumis aubroyage par exemple à l'aide d'un Dyno-Mili ou d'une presse française,avec refrqidissement à la glace; on obtient ainsi une suspension de cellules éclatées.La centrifugation de cette suspension donne l'extrait exempt de cellules. La centrifugation peut être effectuée par exemple à 5 000 g pendant 10 minutes ou plus. La solution séparée ne contient plus de cellules éclatées, partiellement éclatées ou des fragments des parois cellulaires. La fraction voulue d'acide nucléique peut être obtenue à partir de la solution,ainsi préparée, par une des méthodes suivantes. La solution peut être traitée directement avec un solvant,comme dans le cas de la méthode de Marmur ou la méthode au phénol; le précipité contenant l'acide nucléique est obtenu par l'addition d'un floculant dans la solution d'extrait exempt de cellules. La méthode directe au solvant convient à l'obtention de la substance,suivant l'invention, à une faible échelle,notamment de 1 g ou moins. Cette méthode conduit à une fraction d'acide nucléique,désignée ci-après par D,qui contient des impuretés telles que polysaccharides, protéines et autres, dont certaines présentent de l'antigénicité. On procède donc à une purification, dans le cadre de la présente invention, par centrifugation par gradient de densité, ou par un autre procédé,avant le chauffage de la fraction ADN purifiée.On peut éventuellement d'abord chauffer la fraction D et ensuite éliminer les impuretés, par centrifugation ou précipitation,du produit ayant été chauffé. Le but du chauffage de l'ADN,suivant l'invention, est le reglage de la distribution des masses moléculaires dans la substance; un autre but estlaccroissement de l'efficacité de l'élimination des impuvetés,tandis que la structure est double brin de l'BDN est en: change e à double brin de l'ADN/en la structure à brin unique;cela rend aisée la préparation de l'agent antitumeur;un autre but est l'augmentation de la solubilité pour accroître l'activité antitumorale,tout en diminuant la toxicité et les effets secondaires. Le procédé, dans lequel le floculant des acides nucléiques est ajouté à l'extrait exempt de cellules, convient à l'obtention de la substance suivant l'invention à grande échelle,parce qu'il permet de concentrer la fraction d'acide nucléique. Bien que tous les floculants classiques puissent convenir,il est préférable doles choisir parmi ceux dont les masses moléculaires sont faibles et par conséquent plus facilement éliminés par la suite. Des agents de coagulation appropriés sont des composés à cation métallique polyvalent, tels que chlorure de calcium ou de manganèse,sulfate d'aluminium,etc., les antibiotiques basiques,hydrosolubles,comme streptomycine ou kanamycine ou autres, et des sels de tels anti biotiques.La proportion des floculants est choisie selon la nature de celui-ci;;ainsi emploie-t-on par exemple 0,1 à 10, et de préférence 0,1 à 3%, de cations métalliques polyvalents, tandis que dans le cas des antibiotiques,les proportions peuvent être de 0,01 à 10% et de préférence 0,1 à 1% par rapport à la quantité d'extrait. L'addition du floculant à l'extrait exempt de cellules produit une précipitation: le précipité est séparé par centrifugation ou filtration, et il est mis en suspension que l'on soumet à la dialyse pour éliminer le floculant. De préférence,la solution aqueuse pour dialyse présente une force ionique convenable pour améliorer l'élimination du floculant; le meilleur pH se situe au voisinage de la neutralité. A titre d'exemples non Iimitatifs,les solutions tampon sont telles que:phosphate renfermant 0,1 à 1 M de NaCl, citrate avec 0,1 à 1 DE KCl, carbonate avec, 0,1 à 1 M NaCl,tris(hydroxyméthyl)aminométhane renfermant 0,1 à I M NaCl; bien entendu, d'autres solutions tampon peuvent être employées. S'il le faut,la suspension d'acide nucléique,après dialyse saline,est dialysée contre de l'eau,pour éliminer le sel. Dans la suite de la description on désigne par N-l la fraction d'acide nucléique de la suspension dialysée. Toutes les opérations,en vue de l'obtention de N-1,sont effectuées à froid,notamment entre 0 et 1000, afin d'éviter la décomposition et la dénaturation de l'ADN. Deux méthodes peuvent être employées pour la préparation de la substance suivant l'invention à partir de la fraction N-1. La méthode A,dans laquelle l'acide nucléique est séparé de N-l et ensuite chauffé. Méthode 13: la fraction N-l elle-même est chauffée, après quoi, on en sépare la substance suivant l'invention. Dans la méthode A,certains paramètres doivent être bien réglés. Ainsi la concentration du soluté dans N-l,appro- priée, est de 1 à 15 mg/ml, quand la fraction soluble a été séparée.Le pH convenable est aux alentours de la neutralié, il est ajusté avec un acide,une base ou un tampon à 5 à 8. La force ionique du solvant aqueux a une influence sur l'efficacité d'élimination du précipité,lorsqu'on emploie la centrifugation ou un autre traitement; sa valeur convenable est en général de 0,1 ou plus; son ajustement peut être effectué par l'addition de NaCl ou KCl. La fraction N-l,ainsi ajustée, est centrifugée généralement à 20 000 g pendant 5 minutes ou plus,pour donner une fraction soluble, claire,contenant l'acide nucléique comme solution surnageante. De là, l'ADN peut être séparé par précipitation à la streptomycine,au chlorure de manganèse ou au bromure de cétyl-triméthyl-ammonium ou à l'aide d'un autre coagulant. La séparation peut également être effectuée dans une colonne chromatographique sur Sépharose,etc. par électrophorèse,notamment avec un copolymère chlorure et acétate de vinyle, ou par un autre procédé. Toutes ces opé- rations sont de préférence effectuées entre 0 et 100 C. L'ADN ainsi obtenu est soumis au traitement thermique après un traitement à la ribonucléase,ou bien traité avec celle-ci,après le chauffage: on obtient alors la substance suivant l'invention. Dans le cas de la méthode B, la fraction N-1 est chauffée avant la suite des traitements. Cela dénature convenablement l'acide nucléique ainsi que les impuretés, ce qui rend les opérations subséquentes plus aisées. Les conditions de chauffage ont une influence sur l'activité antitumorale de la substance suivant l'invention. Les autres facteurs influants sont les mêmes que pour la méthode A. Les concentrations préférées du soluté, dans la méthode B,sont également de 1 à 15 mg/ml. Lorsque le solvant est l'eau ou une solution aqueuse saline,telle que NaCl ou autres, avec une force ionique préférée de 0,1 à 0,5, la température convenable est de 800 à 1200C,pour une durée de 5 à 120 minutes. Si l'on opère dans une solution tampon, les conditions de chauffage sont fortement influencées par le pH: en règle générale,pour des pH voisins de la neutralité, des températures élevées et des durées de chauffage longues sdnt recommandables; par contre, avec des pH acides'ou basiques, on préfère les températures basses et les durées courtes. Ainsi,aelon la méthode B, la fraction N-1,ayant été chauffée,puis refroidie et soumise à la séparation du précipité par centrifugation et filtration ou autre moyen, on obtient une solution claire,contenant la substance suivant la présente invention. De cette solution, la substance active est aisément extraite par une des méthodes classiques,signalées plus haut à propos de la méthode A. La substance peut être mise par lyophilisation à l'état d'une poudre sèche. La substance suivant l'invention présente une distribution de masses moléculaires d'approximativement 30 000 à 1 000 000.Sa teneur totale en guanine et cytosine est d'envi- ron 60%. La substance n'a pas de température de transition. Lorsqu'on la fractionne par chromatographie sur hydroxyapatîte, on constate que la substance de l'invention est constituée par de l'ADN monobrin. Obtenue par le procédé décrit, la nouvelle substance contient extrêmement peu d'impuretés telles que ARN,protéines, polysaccharides,etc., dans certains cas; cependant, il ne s'agit là que de traces qui peuvent être éliminées par purifiée cation. Sur les dessins annexés, on a tracé des diagrammes caractéristiques de la nouvelle substance. Fiv.1 est un diagramme de l'élution de la substance suivant l'invention d'une colonne chromatographique au sépharose, le nombre des tubes à essai étant porté en abscisses et la densité optique à 260 nm en ordonnées; en haut du même diagramme, des flèches montrent la distribution des masses molaires M.W Fig.2 donne la densité optique (ordonnées) en fonction des longueurs d'ondes ultraviolettes. Fig.3 est le diagramme de la transmittance * en infrarouge en fonction du nombre d'onde (cm 1). Des propriétés physico-chimiques du produit M-5, obtenu dans l'exemple 5 donné plus loin,ont été examinées et on a trouvé les résultats suivants, les mêmes que pour les produits W1-1 à M-4 et M-6 préparés suivant les autres exemples, c'est-à-dire l'ÂDN MED-011 dénaturé thermiquement. Ces propriétés, indiquées ci-après, concernent le sel de sodium de cet ADN. (1) Analyse élémentaire: C 25,57 - 30,75; H 3,80-4,75; N 12,67-14,36; P 7,30-8,59; Na 3,59-5,0. (2) Masse moléculaire: 30 000 - 1 000 000 avec la distribu tion,selon fig.1. (3) il n'y a pas de point de fusion net. (4) Spectre d'absorption UV - voir fig.2. (5) Spectre d'absorption IR - voir fig.3 (6) Soluble dans l'eau,insoluble dans l'éthanol,dans le méthanol, dans l'éther et dans l'acétone. (7) Réactions colorées: (a) Orcinol: négative pour la fraction obtenue par la méthode STS. (b) Diphényl-amine: positive sur la fractionob- tenue par la méthode STS. (c) Ninhydrine: négative pour une concentration de 10 Âjg/ml. (d) Ânthrone: n ' " " (8) Ph 6,5 à 7,5 pour la solution aqueuse du sel de sodium. (9) Couleur: poudre blanche. (10)Propriétés spécifiques:le chauffage procure la solubilité et une haute activité antitumorale,tandis qu'il diminue considérablement la toxicité et l'antigénicité. (11) Composition des bases: guanine 30,4, adénine 16,9, cytosine 30,8, thymine 21,9 (par analyse chimique) (12) Réactions enzymatiques: activité antitumeur inhibée par la désoxyribonucléase I ( DNase I); activité inchangée par la ribonucléase T2 (RNase T2) (13) Chromatographie: sur l'hydroxyapatite, structure monobrin. (14) Température de transition Tm: ne peut pas être déter minée clairement. Il résulte du point (12) que l'entité de la substance suivant l'invention,qui confère à celle-ci l'activité antitumorale,est l'ADN dénaturé par la chaleur. La substance suivant l'invention peut être employée par injection, seule ou conjointement avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables, à l'état liquide ou lyophilisé. De tels véhicules sont par exemple les mantitol,sorbitol, maltose,dextrane, squalèneGLa substance peut être employée en émulsion du type huile/eau ou eau/huile. Les doses de la substance antitumorale peuvent varier largement selon les cas,notamment de 0,01 à 100 mg/kg de corps du patient. l'administration peut être intra ou souscutanée, intraveineuse, intrapéritonéale,intra-tumorale ou orale. L'activité antitumeur de la nouvelle substance est indiquée plus haut, et à la page 2; on peut y ajouter le cas du P-815 mastocytome. L'essai de cette activité est effectué par injection à l'animal d'une solution de la substance active dans du sérum physiologique; l'injection peut être effectuée directement dans la lésion tumorale. Dans le cas de la ligne 10 de la tumeur syngénique du cobaye, l'émulsion eau/huile de la substance suivant l'invention a non seulement inhibé le développement de la tumeur primaire,mais elle a également exercé une action contre la métastase de la tumeur vers les nodules lymphatiques correspondants. En outre,en solution dans du sérum physiologique (solution saline) la nouvelle substance a eu une action antitumorale contre le carcinome h--C lorsque l'ad-minitration a eu lieu dans une partie lu corps éloignée de la tumeur elle-même. La toxicité aigrie de la substance suivant l'invention est extrêmement faible: en effet, la dose létale LD50 est de 1 000 mg ou plus par kilo de souris, par voie intraveineuse. La nouvelle substance est aussi remarquablement inoffensive au point de vue antigénique comme l'a montré lefiest d'anaphylaxie et celui de l'allergie retard sur le cobaye En outre,il s'est révélé qu'au point de vue de la pyrogéncité, de l'induction de la douleur, de l'inflammation, de la formation de granulomes,etc., la substance suivant l'invention est de beaucoup meilleure que les cellules qui constituent la matière de départ; il en résulte que cette substance est applicable à la médecine courante. Ainsi, apportet-elle des résultats remarquables dans le traitement de différentes tumeurs, telles que celles du mélanome maligne,cancer du poumon, de l'estomac, de l'intestin, du colon et du rectum,de la leucémie, de la prostate, du sein, du sarcome,etc. Les exemples de la préparation et les essais d'application qui suivent illustrent non limitativement la présente invention. EXEMPLE 1 Préparation par la méthode de kiarmur. On a préparé 1 litre d'un bouillon glycériné, en ajoutant de l'eau à un mélange de 50 ml de glycérine, 2 g d'acide citrique, 15 g d'extrait de viande, 0,05 g de citrate d'ammonium,1 g g de 2HP04 et 1 g de MgS04.7H20, le pH du milieu est ajusté à 7,0-7,2 Dans ce milieu, n a effectué la culture du mycobacterium bovis BCG,ATCC 19 015 à 370C pendant 3 semaines. La culture obtenue fut centrifugée.Les 500 g des cellules humides, ainsi obtenues furent suspendues dans du tampon de phosphate 10 mTYI de pH 7, d'un volume 7 fois celui des cellules; La suspension fut ensuite broyée dans un appareil Dyno-Mili sous refroidissement avec de la glace,puis centrifugée à 20 000 g pendant 20 minutes, pour séparer l'extrait exempt de cellules. Ai partir de cet extrait,de l'ADN brut fut obtenu par la méthode susindiquée (M-armur,Journal of Molecular Biology 3,208, 1961). En faisant passer cette fraction d'ADN dans une colonne de sépharose 6B (Pharmacia Fine Chemicals Cy), on a éliminé les fractions dépourvues d'ADN, et la fraction d'ADN obtenue fut concentrée puis purifiée par centrifugation à gradient de densité avec du chlorure de césium, solution d'ADN, ainsi partiellement purifiée,fut dialyséespuis additionnée de NaGl jusqu'à une concentration finale de 0,9* de sel; la solution fut alors chauffée à 1000C pendant 60 minutes. Après refroidissement et nouvelle dialyse avec de l'eau distillée,puis lyophilisation, on récolta 8,4 mg de matière sèche. Cette matière fut redissoute dans 2 ml de tampon acétate à 0,05 M (pH 4,5) auquel on ajouta 20 U de ribonucléase T2 (Sankyo Co). Après 22 heures de ce traitement en%ymatique à 370C, on ajouta au mélange réactionnel un mélange de chloroforme-alcool isoamylique (24:1 v/v), à volume égal: après agitation et centrifugation, on sépara la phase aqueuse. Celle-ci fut ensuite passée dans une colonne de 20 cm de long et de 1 cm de diamètre,chargée de séphadex G 100 (Pharmacia Fine Chemicals Co), préalablement équilibré avec une solution de bicarbonate d'ammonium 0,05 M; l'élution de la colonne fut effectuée avec la même solution tampon pour donner une fraction contenant l'ADN. Cette fraction fut dialysée contre de l'eau et neutralisée avec de la soude,puis lyophilisée, ce qui a conduit à 5,6 mg de substance suivant 1' invention. Dans la suite de la description, ce produit est désigné par M-1. Par la méthode à la diphénylamine(Biochem.Journ.62,315,1956), après hydrolyse avec de l'acide perchlorique à 5%,l'analyse quantitative a révélé la présence de 97,5* d'ADN dans le produit Z-1. EXEMPLE 2 Préparation avec l'emploi de streptomycine. De la même façon qu'à l'exemple 1, on a préparé, par culture du mycobacterium bovis, 3,3 kg de cellules humides qui ont été broyées comme dans l'exemple précédent. Aux 21 litres d'extrait exempt de cellules,ainsi obtenu, on a ajouté 63 g de sulfate de streptomycine; la solution a étésoigneusement agitée et laissée au repos à 40C durant une nuit. Le précipité formé, séparé par centrifugation, a été mis en suspension dans une solution tampon (pH 7) de phosphate 10 mM renfermant 0,5 X NaCl. La suspension a été placée dans un tube en cellophane et dialysée contre le même tampon que plus haut, puis contre de l'eau distillée,ce qui a fourni 8 litres de suspension d'acide nucléique. Cette suspension, appelée NB-1 avait une concentration en solide de 10 mg/ml; le rendement était de 12* par rapport aux cellules sèches. A 200 ml 13-1, on a ajouté 200 ml d'une solution de NaCl à 1,8%; la solution résultante a été agitée et ensuite centrifugée à 20 000 g pendant 30 minutes. Au surnageant obtenu, on a ajouté du NaCl pour avoir une concentration finale en ce sel de 0,4 M. On y a ensuite ajouté du bromure de cétyl-triméthylammonium (GTAB de Tokyo Kaséi Kogyo Cy) à raison de 0,2% poids/volume;après agitation soigneuse,la solution a été abandonnée pour 30 minutes à la température ambianté. il s'est formé un pré -cipité que l'on a séparé par centrifugation et dissous dans 60 ml d'une solution de NaCI 1,M, On a ensuite appliqué le traitement au mélange chloroforme-alcool isoamylique de la même manière qu'à l'exemple 1. Ce traitement a été répété deux fois. A 3 volumes de phase aqueuse obtenue, on a ajouté 1 volume d'éthanol à 99,5 ' et, après agitation, la solution a été abandonnée pour une nuit à 4 C. Le précipité formé, séparé par centrifugation, a été dissous dans de l'eau distillée et dialysé contre de l'eau distillée pour la purification de la solution de l'acide nucléique. La suite des opérations a été effectuée comme indiqué plus haut,page 11,lignes 10 à 30,sauf que la quantité de matière sèche obtenue était de 93 mg et était dissoute dans 10 ml de tampon acétate , la colonne chromatographique mesurait 90 cm de long pour un diamètre de 2,5 cm. On a obtenu 62 mg de substance lyophilisée,appelée M-2. Sa teneur en ADN était de 97*. EXEMPLE 3 Préparation à partir de la fraction soluble provenant du M;srcobacterius smegmatis ATTO 607. La culture est effectuée comme dans l'exemple 1,mais pendant 4 semaines Les 500 g de cellules humides, obtenues,sont traitées comme dans l'exemple 2 pour donner 1 litre de suspension;celle-ci est ajusté à 10 mg/ml par addition d'eau. Le rendement était de 15* sur les cellules sèches. Cette suspension est désignée ci-après par NS-1; elle est traitée de la même façon que la suspension NB-1 de l'exemple 2,ce qui conduit à 70 mg de substance suivant la présente invention. Cette substance est appelée M-3. EXEMPLE 4 Préparation par traitement du surnageant par électro phorèse. kl litre de NB-1, obtenu dans l'exemple 2,on ajoute 1 litre de solution de NaCl à 1,8*;après agitation soigneuse,on chauffe cette solution à 100 C, Dendant 60 minutes,et on la centri fuge ensuite à 10 000 g durant 20 minutes. Le surnageant séparé est appelé 5-3. Ce surnageant est dialysé contre de l'eau distillée et lyophilisé, ce qui fournit 44 mg de matière sèche. Celle-ci est dissoute dans une solution tampon de borate 0,05 m (pH 7,4),refroidie et soumise à l'électrophorèse avec du copolymère chloro-acétate de vinyle (BDH Chem. Cy). Après ltélectrophorèse, le copolymère est découpé et,sur un bloc de 1 cm de large, on effectue l'élution avec une solution ae aCl 0,1 M pour examen en W de 260 nm. La fraction obtenue est dialysée contre de l'eau distillée et lyophilisée, ce qui donne 19 mg de matière sèche. Celle-ci est dissoute dSí 2 ml de solution tampon d'acétate 0,05 M (pH 4,5), additionnée de 40 U de ribonucléase T2. Ce traitement enzymatique dure 22 h à 370C,après quoi on effectue une extraction au chloroforme-alcool isoamylique comme plus haut, page 11,lignes 20 à 30, y compris une chromatographie sur Sephadex. On obtient ainsi 13,1 mg d'une substance lyophilisée, désignée par M-4;elle contient 98,4% d'ADN. EXEMPLE 5 PréParation à partir des bactéries BCG au moyen du CTAB. A 1 litre de NB-1 de l'exemple 2, on ajoute 1 litre de solution à 1,8% Nazi. On agite et l'on chauffe à 1000C pendant 60 minutes. Le liquide est ensuite refroidi et centrifugé à 10 000 g pendant 20 minutes: le surnageant est recueilli et additionné de NaCl jusqu'à une concentration de 0,4 M et de CTAB dont la teneur finale est de 0,2* en poids/volume. On agite convenablement, puis on laisse reposer pendant 30 minutes, à la température ambiante. Le précipité formé est recueilli après centrifugation et sissous dans 400 ml de solution de NaC1 1 M. La solution obtenue est soumise au même traitement aux solvants et à la précipitation comme dans l'exemple 2. La solution traitée est dialysée contre de- l'eau distillée, puis lyophilisée,ce qui donne 104 mg de matière sèche, que l'on désigne par C-B-1. Cette matière contient 86,6* d'ADN. Ensuite elle est traitée par de la ribonucléase T2, à la mnière indiquée a l'exemple 2, et purifiée: on obtient ainsi 70 mg de substance suivant l'invention. Cette substance, désignée par M-5, contient 99,6% d'ADN,toujours par la méthode d'analyse selon l'exemple 1. EXEMPLE 6 Préparation à partir de MycoMacterium tuberculosis. 1 litre de milieu modifié de Sauton est préparé par l'addition de l'eau à un mélange de 50 ml de glycérine, de 2 g d'acide citrique, 2 g d'acide L-aspartique, 0,05 g de citrate de fer ammoniacal, 1 g E2HP04, 1 g MgS04.7 aq, 0,01 g Zn.S04.7aq, 0,5 mg CaCl2.2aq et 0,1 mg CuS04.Saq, avec ajustement du pH à 7;0-7,2. Dans ce milieu, on cultive du Mycobacterium tuberculosis H37Ra, ANCC 25 177 à 370C durant 4 semaines. Dans la culture obtenue,on introduit du phénol jusqu'à la concentration de 5%. Le mélange est agité, puis lassé au repos une nuit,avant d'être centrifugé. Les cellules humides, récoltées, sont lavées avec la solution-saline physiologique, 100 gde cellules lavées sont traitées comme dans la préparation de NB-1 à l'exemple 2, pour produire 200 ml de suspension contenant de l'acide nucléique. Après ajustement de la concentration en solides de cette suspension à 10 mg/ml, celle-ci est traitée comme dans la préparation de M-5 à l'exemple 5. On obtient ainsi 205 mg de substance suivant l'inventionsdésignée par M-6 et contenant 96,3 /S d'ADN. EXEMPLE 7 Agent liquide. 10 mg de M-5 sont dissous dans 10 ml de solution de PBS(-) fournie par EIKEN CHEMICAL Co Ltd. La solution est filtrée aseptiquement sur du Nuclepore N0 20 (NUCLEPORE C ) et le filtrat est aseptiquement versé dans des ampoules de 1,5 ml chacune, constituant ainsi un agent liquide desubstance suivant l'invention. EXEMPLE 8 Produit lyophilisé. Dans 10 ml d'eau distillée pour injections, on dissout 10 mg de M-5 (préparation de l'exemple 5) et 500 mg de maltose; la solution obtenue est filtrée aseptiquement sur Nuclepore N0 20, puis on la verse dans des ampoules, à raison de 1 ml dans chacune, et on lyophilise. EXEMLE 9 Produit en émulsion. Dans 0,5 ml de solution saline physiologique, on dissout 4 mg de M-5, puis on ajoute 0,5 ml de mélange de 8,5 parties de Drakeol 6-VR (Pennsylvania Refining C ) avec 1,5 parties d'Arlacel A(Atlas Chemical Industries C ) produisant ainsi une émulsion eau-dans l'huile. ESSAI D'APPLICATION 1 Effet antitumeur contre le carcinome IMC de la sourie. L'essai est effectué sur des femelles CDF1 auxquelles on a inoculé 500 000 cellules de carcinome IMC par voie cutanée. Un jour sur deux, après l'inoculation, on administre dans la tumeur 0,1 ml du produit obtenu selon l'exemple 7,soit au total 6 fois, à 1005g par injection. Le 35e jour après l'inoculation, les tumeurs sont extraites et pesées. Le tableau 1 ci-après indique les poids P des tumeurs, les rapports % de P au poids C de la tumeur du témoin et les rapports R du nombre de souris guéries à celui des animaux traités. TABLEAU 1 N Agent P moyen en g P/C R 1 Témoin 2,84 + 0,7 100 0/10 2 M-1 0,28 + 0,53* 10 7/10 3 M-2 0,22 + 0,23* 8 7/10 4 M-4 0 0 10/10 5 C-B-1 0,01 + 0,02* 0 8/10 6 X-5 0 0 10/10 7 mn-6 0,01 + 0,03* 0 8/10 8 BCG 1,05 + 1,1* 37 1/10 * correspondent à p s0,01 Pour l'analyse des différences marquées dans les poids moyens des tumeurs et pour l'incidence des souries guéries, on a employé respectivement le test de Student et celui de Fis cher.Le vaccin BCG était fourni par JAPAN BCG BABORATORY. Pour l'essai témoin, on a utilisé la solution saline physio logique. ESSAI 2 Effet antitumeur sur le fibrosarcome Meth A de souries BALB/C femelles. 200 000 cellules de ce fibrosarcome sont inoculées par la peau dans le flanc des animaux. A partir du 4è jour, après l'inoculation, on administre dans la lésion tumorale, deux fois par semaine 0,1 ml de produit préparé comme dans l'ex- emple 7,soit au total 6 fois. Au 25e jour, la tumeur est enlevée et pesée. - Au Tableau 2 ci-dessous, les valeurs P, P/C et R ont la même signification que dans l'essai 1. TABLEAU 2 Nq Agent P moyen en g P/C R 1 Témoin 0,97 + 0,65 100 0/9 2 M-5- 0* 0 8/8 3 BCG 0,08 + 0,11* 8 3/8 * correspondent à p pCO,O1 Pour les n 1 et 3 les mêmes matières sont-employées que dans l'essai 1. ESSAI 3 Effet antitumeur dans le cas du carcinome du poumon de Lewis chez la souris femelle C 57BL/6. 500 000 cellules de ce carcinome sont inoculées par voie intra-cutanée. Le 1er, 8ème 11ème 15ème et 18ème jour après l'inoculation, on introduit dans la lésion tumo rale, chaque fois, 0,1 ml de l'agent préparé selon l'exemple 7. Les tumeurs sont retirées le 26ème jour et l'on compte le nombre de métastases pulmonaires. TABLEAU 3 N0 Agent Dose par injection( g) R 1 témoin 0 0/8 2 C-B-1 100 1/8 3 l 250 4/8 4 " 500 4/8 5 M-5 500 5/8 6 BCG 100 0/8 7 " 500 0/8 suite, sur les mêmes échantillons:: N P P/C Nombre moyen N N de métastases par 35,1 souris ~~~~~~~ 1 3,34 + 0,88 100 35,1 + 8,9 100 2 1,42 + 0,91 42,5 6,3 + 6,4 17,9 3 1,20 + 1,32 35,9 7,0 ±8 ,2 19,9 4 0,85 + 0,93 25,4 5,2 + 7,3 14,8 5 0,75 + 0,82 22,4 5,5 + 6,2 15,6 6 4,78 + 1,08 143,1 11,1 + 11,0 31,6 7 3,75 + 2,19 112,3 8,0 + 8,8 22,8 Les valeurs de P des Nos 2 à 5 et les N des Nos 2 à 7 cor respondent à p ( 0,01; pour P du n 6 à p ,0S. ESSAI 4 Essai antitumeur dans-la leucémie EL-4 chez la souris femelle C 57 BL/6. 0,5 ml de solution-saline de Hank, ayant en suspension 106 cellules leucémiques EL-4 par ml,est mélangée avec 0,5 ml de solution saline physiologique,dans laquelle un agent antitumeur est dissous à raison de 2 mg/ml. 0,1 ml du mélange,ainsi formé,est inoculé par voie intracutanée. Après 37 jours, on détermine le temps moyen de survie des souris, comme indiqué au tableau 4 ci-après (R même signification qu'aux essais précédents. TABLEAU 4 N Agent Dose en g R 1 Témoin O 0/10 2 C-B-1 100 G/10 3 1 200 1/10 4 " 400 4/10* 5 " 800 9/10** 6 M-3 400 4/10* 7 M-5 400 5/10* 8 " 800 9/10** 9 BCG 400 1/10 * p ESSAI 5 Effet antitumeur contre l'hématome Ligne 10 du cobaye (souche 2). 1 000 000 de cellules de cet hépatome sont inoculées dans la peau. Au 7ème jour après, on administre dans la lésion tumo- rale 0,1 ml de l'agent préparé selon l'exemple 9. 80 jours après l'inoculation, on compte les nombres d'animaux survivants et guéris,ainsi que le nombre de métastases du ganglion lymphatique correspondant. "Met" désigne le rapport du nombre d'animaux sans métastase au nombre total d'animaux traités. TABLEAU 5 Survie moyenne N Agent Dose g R Met jours 1 Témoin 0 0/6 0/6 46;2 + 2,6 22 M-4 400 4/6 4/6 79,5 + 3,5 3 C-B-1 400 6/6 6/6 > 80 4 M-5 400 6/6 6/6 > 80 Les survies des Nos 22,3 et 4 correspondent à p 80,01 ESSAI 6 Effet antitumeur de la substance traitée par des nucléases. Les produits C-B-1 et M-5 ont été traités par de la désoxyribonucléase (DN ase I de SIGMA CHEMICALS CO) ou par de la ribonucléase -(RNase T2 du même fournisseur). Des substances, ainsi décomposées,on a éliminé les enzymes avec du chloro norme,puis on les a désalifiées dans une colonne de Sephadex 10, et finalement lyophilisées. L'activité antitumeur de l'agent obtenu a été déterminée comme dans l'essai 1. Les résultats de l'action contre le carcinome IMC sont réunis dans les tableaux 6-1 et 6-2. TABLEAU 6-1 N Agent Dose par injection v g) 1 Témoin 0 3,82 + 1,55 100 0/10 2 C-B-1 100 0,13 + 0,35 3 8/10 3 C-B-1 traité par DNase 100 2,28 + 0,74 60 0/10 4 C-B-1 traité par RNase 100 0,11 + 0,23 3 8/10 5 RNase 0,5 U 2,98 + 1,22 78 0/10 6 BCG 100 0,47 + 0,76 12 1/10 La quantité de RNase du n 5 est celle des 100 g de C-B-1 du n 4. Les valeurs de P et R n02 et 4 correspondent à p TABLEAU 6-2 N Agent Dose par injection ( g) - 1 Témoin 0 3,12 + 1,01 100 1/10 2 M-5 100 0 0 10/10 3 . M-5 traité 100 0 10/10 avec RNase 4 M-S traité avec DNase 100 2,25 + 1,86 72 0/10 Les valeurs de P et R des N 2 et 3 correspondent à p 40,01 Les doses pour n 3 et 4 s'entendent en équivalent de 100 g de M-5. ESSAI 7 Potentialisation de l'activité des cellules tueuses naturelles (NK) chez la sourie femelle C57BL/6. Lesexpérien- ces portaient sur des souris de 8 semaines d'âge. Les agents employés sont: une solution saline physiologique; une telle solution renfermant par ml 1 mg de C-B-1; une telle solution renfermant par ml 1 mg de M-5 L'agent est admihistré intrapéritonéalement à raison de 0,3 ml par souris. Après 48 heures à partir de l'administration, on récolte les cellules exsudées par le péritoine, et l'on ajuste l'exsudat à 2x106 cellule/ml par l'addition de milieu RPMI 1640 à 10% de sérum foetal de veau. La suspension de cellules est alors introduite dans des boites de Pétri et mise à incuber à 370 C, pendant 90 mn, dans une atmosphère d'air à 5% de C02, en vue de l'obtention de cellules adhérentes et non adhérentes. 500 000 cellules adhérentes ou non adhérentes sont incubées avec des cellules leucémiques YAC-1 marquées au 51Cr, à 370C, dans de l'air a 5% de C02,pendant 4 heures avec du milieu RPMI 1640 renfermant 10% de sérum foetal du veau. La radioactivité du 51Cr libéré dans le surnageant de la culture est mesurée au moyen d'un auto-compteur des gamma(Packard CO) pour détecter l'effet cytotoxique des cellules de ltexsu- dat péritonéal vis-à-vis des cellules YAC-1. Le Tableau 7 en résume les résultats. TABLEAU 7 Potentialisation de l'activité des cellules NK Agents Cellules *51 Or libéré Solution saline physio- non adhérentes 15,6 logique " Il " li adhérentes 1,8 C-B-1 non adhérentes 40,1 adhérentes 3 , 6 M-5 non adhérentes 4-6,2 " adhérentes 2,1 ESSAI 8 Effet inhibiteur direct sur la croissance cellulaire. Cet effet est déterminé par rapport aux cellules leucémiques YAC-1 de souris,aux cellules cancéreuses, mammaires de la souris FM3A, ou aux cellules du fibrosarcome Meth A de souris. Pour cela, 8,4 x 104 de cellules YAC-1, 15,4 x 104 cellules FM3A, ou 10 x 104 cellules Meth A sont mises en suspension dans du milieu RPilI 1640 renfermant 10% de sérum foetal du veau, et incubées à 370C,durant 24 heures, dans de l'air à 5* de 002. Chaque culture est additionnée de M-5 à raison de I mg/ml, et de nouveau incubée dans les mêmes conditions. Toutes les 24 heures après l'addition de C-5, on compte le nombre de cellules viables, par exclusion du colorant bleu de Trypan. Les résultats sont réunis au Tableau 8. TABLEAU 8 Heures après Nombre xI04 de Agent l'addition de cellules par Rapport l'agent ml A/N * Témoin N ~ ~~~~~ ~~~~~~ Axent A (1) YAC-1 0 19,3 19,3 100 24 56,0 54,3 97 48 109,0 102,5 94 (2) FM3A 0 34,9 34,9 100 24 57,8 58,1 100,5 48 114,5 1.10,8 96,8 (3) Meth A 0 1,64 1,64 100 24 3,32 3,29 99,1 48 5,92 -5,78 97,6 ESSAI 9 Toxicité aigue. Essais effectués sur des groupes de 10 souris femelles de poids moyen 23 g, 5 semaines d'âge. La solution physiologique de i1-5 est administrée par voie intraveineuse à la dose de 1 g de M-5 par kg d corps. Après 1 semaine, on ne constate pas d'effet inhibiteur sur le gain de poids des animaux et aucune sourie n'est morte. La DL50 de la substance suivant l'invention est donc considérée comme étant de 1 g ou plus par kg, pour l'adminis- tration intraveineuse. ESSAI 10. Antigénicité. On opère sur des groupes de 6 cobayes Hartley femelles. On les sensibilise par injection intracutanée de M-5 en 6 fois, à raison de 3 par semaine, avec la dose totale de 1 mg M-5 par animal. Deux semaines après la sensibilisation finale, la solution saline physiologiques de M-5 est administrée dans la veine, à la dose de 10 mg ou 2 mg M-5 par kg d'animal. L'observation des cobayes avant et après ce traitement conduit à la conclusion qu'il n'y a aucun choc anaphylactique avec 2 ni avec 10 mg/kg. ESSAI 11. Effets sur la croissance de cellules normales. Une culture primaire de cellules foetales de la peau et du muscle(fibroblast) est obtenue à partir de 6 souris d'une portée de 19 jours de souche SHN. La monocouche de cellules de cette culture est soumise à-la trypsinisation,après quoi, on ramène le nombre de cellules viriles par ml à 6s2 x 104 avec du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum foetal de veau. La seconde culture est alors effectuée à 370C dans l'air renfermant 5% de 002. Après 5 heures, le milieu est remplacé par du milieu RPMI 1640 frais; dans la culture témoin, ce milieu est tel quel, dans celles des essais, il contient 500,cl g ou 50%g de M-5 par ml. Ensuite les cultures sont continuées pendant 15 jours. La croissance des cellules et des changements éventuels de forme de celles-ci sont observés au microscope9alors que le milieu de culture est renouvelé 3 fois par périodes de 15 jours. On n'a trouvé aucune différence entre les cultures renfermant 500 g ou 50 g de M-5 par ml et les cultures témoins;aucun changement de forme des cellules-n'a été remarque. Revendications l. Nouveau produit biochimique, constitué par de l'acide désoxyribonucléique, ou par un sel de cet acide, dénaturé par la chaleur, caractérisé en ce que son sel de sodium présente à l'analyse élémentaire 25,5 à 30,75% de carbone, 3,8 à 4,75% d'hydrogène, 12,6 à 1-4,4%'azote, 7,3 à 8,6% de phosphore et 3,6 à 5% de sodium, qu'il a une masse moléculaire de 30 OQO à l 000 000, une réaction d'orcinol, de ninhydrine et d'anthrone négatives, et une réaction positive à la diphénylamine. 2. Produit suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les bases dru sel de sodium se composent de 30,4% de guanine 16 9% d'adénine, 30,8% de cytosine et 21,9% de thymine. 3. Produit suivant la revendication l ou 2, caractérisé en ce que , à la chromatographie sur hydroxyapatite, l'acide nucléique présente une structure mono-brin. 4. Produit suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le sel de sodium est soluble dans l'eau et insoluble dans lethanol, le méthanol, éther et l'acétone. 5. Produit suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente un spectre d'absorption UV selon figure 2 et un spectre d'absorption IR montré sur la figure 3. 6. Procédé de préparation d'un produit suivant une des revendications l à 5, caractérisé en ce que l'on prépare un extrait exempt de cellules à partir d'une culture d'une bactérie du genre Mycobactérium, on sépare l'acide nucléique de cet extrait et on le chauffe, de préférence entre 80 et 120çC. A , 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la séparation de l'acide nucléique est effectuée par floculation, en particulier au moyen de cations d'un métal polyvalent ou d'un antibiotique basique, hydrosoluble, notamment streptomycine ou kanamycine 8. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la séparation de l'acide nucléique est'effectuée à l'aide d'un solvant organique, en particulier d'un mélange de chloroforme avec de l'alcool isoamylique. 9. Procédé suivant une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le chauffage dénaturant de l'acide nucléique a lieu avant ou après la séparation de cet acide. 10. Procédé suivant une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que le Mycobactérium est de l'espèce bovis, tuberculosis ou smegmatis. 11. Application du produit suivant une des revendications l à 5 entant qu'agent antitumeur. 12. Composition pharmaceutique renfermant de l'ADN, caractérisée en ce qu'elle contient de l'acide désoxyribonucléique, ou un de ses sels, dénaturé thermiquement.