Brevet FR2527223A1 — publié le 19831125

Anticorps anti-tréhalase, réactif et procédé de détermination immuno-enzymatique de la tréhalase. La présente invention concerne un nouveau anticorps anti-tréhalase. La tréhalase est une enzyme qui hydrolyse le disaccharide tréhalose en deux molécules de glucose. Jusqu'ici on a trouvé cette enzyme dans les bactéries, les moisissures, les levures, les insectes, les poissons, les plantes supérieures et les animaux supérieurs. Parmi ces bio-organismes, la tréhalase chez les animaux supérieurs se trouve particulièrement dans les deux tissus des intestins et des reins ainsi que dans le sang, l'urine et les excréments. On suppose que chez les animaux supérieurs, la tréhalase prend part au mécanisme du transfert du glucose comme rôle physiologique si on n'en juge d'après les diverses découvertes (Kagaku to Seibutsu, vol. 18, nO 12 p.809). En tenant compte des découvertes ci-dessus, cet inventeur a découvert que la détermination de la tréhalase dans l'urine humaine est valable pour un diagnostic clinique, particulièrement pour le diagnostic du diabète sucre. Jusqu'à présènt, comme méthode pour a détermination de la tréhalase urinaire humaine et de la tréhalase du sérum, on ne connaît qu'un seul procédé pour déterminer cette enzyme qui consisteàl'hydrolyser en utilisant un substrat tréhalose, et en dosant le glucose libéré. Toutefois, dans l'urine,il il existe une petite quantité de tréhalase et de nombreuses substances qui interfèrent dans la détermination de l'activité de la tréhalase dans l'urine et le sérum. Ainsi, il est essentiei de concentrer l'urine et de la dialyser pour éliminer les substances à bas poids moléculaire, afin de déterminer la tréhalase dans un fluide corporel avec le procédé décrit précédemment. Notamment, l'urine est dialysée pendant un jour ou plus d'un jour contre un milieu approprié (eau désionisée ou saline tamponnée, etc.) pour éliminer les substances qui interfèrent sur le procédé de détermination de l'activité. Ensuite,l'urine est concentrée avec un appareíl de concentra tion (Minicon B - 15; Amicon Co.) échantillon par échantillon. Par conséquent, le premier procédé est extrêmement compliqué. Compte tenu de ces considérations, ce procédé n'est pas applicable aux diagnostics cliniques où il faut prélever un grand nombre d'échantillons en un temps court. Généralement, pour mesurer une petite quantité de composés dans un fluide du corps, un procédé immunodiffusion et un procédé de dosage par liaison d'un complément qui mesurent antigène du point de vue immunologique, sont utilisés. Toutefois, ces procédés ne sont pas bons en ce qui concerne la sensibilité. Ainsi, le procédé de dosage radioimmunologique courant est appliqué pour le dosage de composés dans les fluides du corps. Cependant, la méthode de dosage radio--immunologique pollue ltenvironnement et nécessite d'utiliser des équipements et des instruments de dosage chers. Par conséquent, cette méthode n'est pas satisfaisante pour être utilisée pour les diagnostics cliniques. Un objet de la présente invention est la fourniture d'un nouvel anticorps anti-tréhalase. Un autre objet de la présente invention, est la fourniture d'un anticorps antitréhalase qui est utilisé comme réactif permettant de doser la tréhalase urinaire humaine et la tréhalase de sérum par une méthode de dosage immunoenzymatique rapide et simple. La présente invention est réalisée en se basant sur les découvertes que la méthode de dosage immuno-enzymatique est la meilleure façon pour détecter la tréhalase en ce qui concerne la sensibilité, la sûreté, les équipements et les instruments nécessaires pour le dosage, et qu'un anticorps anti-tréhalase qui est produit par la tréhalase purifiée laquelle provient d'animaux supérieurs sous forme d'antigène, est un nouvel anticorps qui est essentiel pour le fonctionnement du dosage immuno. Cet anticorps a les propriétés immunologiques suivantes. L'anticorps anti-tréhalase réagit par une réaction antigène-anticorps avec la tréhalase intestinale, renale, urinaire et du sérum provenant de la même espèce d'animaux mais non avec la tréhalase provenant d'espèces différentes d'animaux. L'anticorps anti-tréhalase susmentionné, peut mesurer rapidement et simplement la tréhalase avec une réaction antigène anticorps entre l'antigène tréhalase et l'anticorps. C'est-à-dire que l'anticorps anti-tréhalase est une substance essentielle pour mesurer la tréhalase dans un fluide du corps et dans un extrait de tissu par la méthode d'immu nodiffusion, d'immunoélectrophorese, radio-immunologique et immuno-enzymatique etc. et également pour mesurer la tréhalase dans les tissus par la technique immunohistochimique. Cet anticorps anti-tréhalase est produit par immunisation d'animaux appropriés avec la tréhalase purifiée comme antigène. Les procédés de purification précédents de la tréhalase sont basés sur la filtration sur gel, la chroma- tographie avec échange d'ions, la chromatographie par adsorption, la chromatographie par affinité et l'électrophorèse de gel préparative. La tréhalase obtenue par ces procédés ntest pas homogène au point de vue électrophorétique ni extremement pure, et les procédés de purification sont alors compliqués. Selon la présente invention, la tréhalase purifiée provenant d'animaux supérieurs qui est utilisée comme antigène pour l'anticorps anti-tréhalase, est obtenue par un procédé qui consiste à effectuer plus d'une chromatographie,comprenant une filtration sur gel, une chromatographie avec échange d'ions ou une chromatographie d'adsorption pour les fluides du corps ou les extraits de tissu des animaux supérieurs (sauf les tissus humaines), en effectuant la chromatographie par affinité ou la chromatoconcentration pour la fraction de tréhalase active résultante et,si nécessaire, en effectuant la filtration sur gel > la chromatographie par affinité ou la chromatoconcentration pour la fraction contenant la tréhalase. On peut réaliser la filtration sur gel en utilisant des résines telles que "Sephacryl S-300", "Sephacryl 5-200", "Sephadex G-200","Sephadex G-150", "Sephadex G-100", "Ultrogel ACA-34", "Sepharose 6B",hSepharose 4B", "Bio-Gel P-300", "Bio-Gel P-200", etc., et réaliser la chromatographie par adsorp tion en utilisant des résines telles que lthydroxyapatite, le gel d'alumine et le gel de phosphate de calcium etc., et réaliser une chromatographie avec échange dtions en utilisant des résines telles que DEAE-celulose, CM-cellulose, ECTEORAcellulose, DEAE-"Sephacel", DEAE-"Sephadex", CM - "Sephadex", QAE-"Sephadex" etc., et effectuer la chromatographie par affinité en utilisant des résines telles que Phényl-"Sepharose", Octyl-"Sepharose", Con A-"Sepharose", Tris-"Sepharose", Trehalose-1,Sepharose", Lectin-"Sepharose", Epoxy-"Sepharose", etc. et la chromato-concentration en utilisant des résines telles que PBE-94, PBE-118, etc. Un tampon utilisé dans la chromatographie mentionnée ci-dessus est approprié et on utilise par exemple le tampon phosphate, le tampon Tris-HCl, le tampon histidine HCl etc. En outre, il n'y a aucune difficulté à ce que ce tampon contienne plus d'un réactif tel qu'un détergent non ionique (Tween 80, Triton X-100, etc.), du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, du chrorure de manganèse et du sulfate d'ammonium etc. On peut utiliser le tampon susmentionné ainsi que l' z-méthyl glucopyranoside, la tréhalase et le Poly tampon etc. comme tampon d'élution. L'anticorps anti-tréhalase est obtenu par immunisation avec un mélange émulsionné d'adjuvants(adjuvant complet de Freund ou adjuvant incomplet de Freund, etc.) et une tréhalase extrêmement pure qui est obtenue par les méthodes susmentionnées à partir de l'urine humaine, du sérum humain, des reins de lapins, des intestins de rats, des reins de porcs etc., et un animal approprié qui est d'espèce différente pour les sources d'antigène telles que lapin, cobaye,chèvre, chien,vache, cheval, etc. est choisi et immunisé par injection souscutanée et par injectIon à l'interface entre les griffes et les coussinets plusieurs fois à intervalle d'une semaine à deux semaines. Puis 10 à 14 jours après la dernière injection, les animaux sont saignés et la fraction du sérum est obtenue. Après linactivation du complément dans le sérum, on peut obtenir l'anticorps anti-tréhalase (anti-tréhalase IgG) en effectuant une précipitation au sulfate et une chromato graphie avec échange d'ions (DEAE-cellulose, DEAE-Sephacel, etc.) ou par filtration sur gel (Sephadex G-200, Sephacryl S-300, etc.). On va maintenant décrire les dessins sur lesquels la figure 1 et la figure 2 montrent la ligne de précipitation de la méthode de double immunodiffusion (méthode Oucbterlony) de l'anticorps anti-tréhalase de la tréhalase urinaire humaine et de l'anticorps anti-tréhalase de la tréhalase rénale du lapin, respectivement, vis-à-vis de divers antigènes purifiés. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après dans lescuels sauf indi- cation contraire, les pourcentages sont exprimés en poids. EXEMPLE DE PREPARATION 1 2 litres d'urine humaine sont concentrés jusqu'à 100 fois par ultrafiltration (marque déposée : Diaflo, membrane PM-10 fabriquée par Amicon Cà.) et du désoxycholate est ajouté dans le liquide concentré jusqu'à ce qu'il y en ait 0,5%, et une quantité aliquote est centrifugée à 1000xG pendant 10 miroites. Le liquide surnageant ainsi obtenu, est placé en haut d'une colonne (2,6 x 90 cm) d'un gel filtrant (marque déposée : Sephacryl S - 300 fabriqué par Pharmacia, InC.) qui est équilibré avec 5mM d'un tampon phosphate contenant 0,18 de Tween 80 (marque déposée;fabriqué par Sigma Chemicals Co.) et 0,9% de chlorure de sodium, et est élué avec le même tampon.La fraction contenant la tréhalase ainsi obtenue est concentrée par ultrafiltration (marque déposée : Diaflo, membrane PM - 10 fabriquéepar par Amicon Co.) à 20 ml, et placée en haut d'une colonne (2,6 x 10 cm) de chromatographie par affinité (marque déposée:Phényl Sepharose CL - 4B fabriqué par Pharmacia, Inc.) qui est équilibréavec 5 mM de tampon Tris-HCl (pH 7,2) contenant 0,8 M de sulfate d'ammonium,et élué avec un tamponTriS4rl 5j(Ph 7,2) contenant 0,8 M de sulfate d'ammonium mais pas de détergent jusqu'S un tampon Tris-HCl 5 mM (Ph 7,2) contenant 0,2% de Tween 80 mais pas de sulfate d'ammonium, qui est le tampon final (chaque volume de tampon initial et Je tampon final est de 150 mi et le volume total est de 300 ml), et on obtient une fraction contenant la tréhalase. En outre, une autre fraction contenant la tréhalase est éluée avec un tampon Tris-lEl 5 mM (pH 7,2) contenant 0,2% de Tween 80. Chaque fraction de ces fractions contenant la tréhalase est placée sur une colonne (0,9 x 20 cm) de chroma toconcentration (marque déposée : PBE-94 fabriqué par Pharmacia, Inc.) qui est équilibrée avec 25 mM d'un tampon histidine-HCl (pH 6,4) contenant 0,1 t de Tween 80 et qui est éluéeavec 300 ml d'un Poly tampon-llCl (pH 4) (marque déposée : Poly tampon 74 fabriqué par Pharmacia, Inc).Ensuite la fraction tréhalase active est concentrée et placée en haut d'une colonne (1,6 x 70 cm) d'un gel filtrant (marque déposée: Sephacryl S - 300 fabriqué par Pharmacia., Inc.) qui est équilibre avec un tampon phosphate 5 mM contenant 0,1t de Tween 80 et 0,95 de chlorure de sodium, et élué avec le même tampon ce qui permet d'obtenir la tréhalase urinaire humaine purifiée. La récupération et l'activité spécifique de la tréhalase urinaire humaine purifiée sont indiquées dans le tableau 1,et et les propriétés enzymatiques sont indiquées dans le tableau 2. Une électrophorèse analytique sur gel, sur gel de polyacrylamide à 7,5t est effectuée vis-à-vis de la tréhalase purifiée résultante, les gels étant colorés avec un réactif colorant pour protéine (Coomassie bleu, etc.) et montre une bande protéique homogène. La fraction tréhalase avant la chromatoconcentration n'est pas homogènemaiséleestdêtectée par d'autres bandes protéiques avec l'électrophorèse analytique sur gel Tableau 1 Récupération et activité spécifiques de la tréhalase urinaire humaine purifiée Brute Purifiée Protéine totale (mg 1400 12 Activité totale (unité) 348 248 Activité spécifique (unité/mg 0,25 21 de protéine) Tableau 2 Propriétés enzymatiques de la tréhalase purifiée provenant de l'urine humaine Point isoélectrique pH 4,8 Poids moléculaire 45 000 Valeur Km (tréhalose) 0t91 mM Valeur Ki (Tris-(hydroxyméthyl) aminométhane) 18 mM Valeur Ki (chlorure mercurique) 8 mM EXEMPLE DE PREPARATION 2 Un lapin mâle (poids 2 à 2,5 kg ,blanc, japonais) est tué par anesthésie (Nembutal,etc.) et les reins sont prélevés et lavés à fond avec de la saline physiologique. Le cortex des reins est recueilli et homogénéisé avec le tampon phosphate 10 mM (pH 7,2) contenant 5 mM d'EDTA, 0,95 de chlorure de sodium et 1 mM de chlorure de magnésium. Le produit homogénéisé est centrifugé à 300xG pendant 10 minutes. Le liquide surnageant ainsi obtenu est centrifugé à 110 000go pendant 60 minutes et le précipité est mis en suspens ion dans le tampon phosphate susmentionné, puis de la papalne est ajoutée dans la suspension jusqu ta ce qu'on ait.une concentration finale de 0,01t, et la quantité aliquote est mise en incubation à 37"C pendant 30 minutes puis centrifugée à 110 000xG pendant 60 minutes. Le précipité ainsi obtenu est mis en suspens ion dans le tampon phosphate 10 mM (pH 7,2) puis du Triton X-100 (marque déposée fabriqué par Sigma Chemicals Co.) et du désoxycholate sont ajoutés dans la suspension pour avoir une concentration finale de 0,5% de chaque produit, et la suspension est centrifugée à 110 000G pendant 60 minutes. Le liquide surnageant clair obtenu est placé sur le sommet d'une colonne (2,6 x 30 cm) de chromatographie avec échange d'ions (marque déposée : DEAE - Sephacel fabriqué par Pharmacia Inc.) qui est équilibrée avec un tampon Tris - HCl 5 mM contenant 0,2 % de Triton X - 100 (pH 7,2), et est élut avec un gradient linéaire de chlorure de sodium allant de 0 à 0,5 M dans le même tampon. La fraction contenant la tréhalase est concentrée par ultrafiltration (Diaflo, PM - 10 Amicon Co.) jusqu'à 15 ml et est additionnée de sulfate d'ammonium pour avoir une conlentration finale de 0,8M. Ensuite, la solution d'enzyme est place sur une colonne (2,6x20cm) de chromatograp;zie par affinité (marque déposée: Phenyl Sépharose CL-4B fabriqué par phannacia, Inc.) qui est équilibrée avec ulltamlzon Tl'IS-liCl 5 mx! (pH 7,9) contenant 0,8M de sulfate d'azmonium, et éluée avec un gradient linéaire de 0,8 M de sulfate d'ammonium sans détergent jusqu'à (',2 de Triton X - 100 sans sulfate d'ammonium dans le tampon Tris - HCl 5 mM (pH 7,2), et une autre fraction contenant la tréhalase et éluée avec un tampon Tris-HCl 5 mM contenant 0,25 de Triton X-100.La dernière fraction contenant tréhalase est placée sur le sommet d'une colonne (2,6 x 20 cm) de chromatographie par adsorption (hydroxyapatite : fabriquée par Seikagaku Kogyosha Co.) qui est équilibrée avec un tampon Tris-HCl 5 mM (pH 7,2) contenant 0,1 % de Triton X - 100 et éluée avec un gradient linéaire de tampon phosphate de 0 à 0,2 M contenant 0,1 % de Triton X -100. La première fraction de chromatographie par affinité (marque déposée : Phényl - Sepharose CL - 4B fabriqué par Pharmacia Inc.) et la fraction active de chromatographie par adsorption (hydroxyapatite : fabriquéepar par Seikagaku Kogyosha Co.) sont placées sur le sommet d'une colonne (1,6 x 15 cm) de chromatographie par affinité (marque déposée : Con A Sepharose fabriqué par Pharmacia, Inc.) qui est équilibrée avec un tampon Tris F.C1 - 5 ruz contenant 0,15 de Triton X-100, 1 mM de chlorure de calcium, 1 mM de chlorure de manganèse et 0,25 M de chlorure de sodium, et est éluée avec le même tampon, et une autre fraction contenant la tréhalase est éluée avec le même tampon contenant 20 mM d' -méthylgluco- pyranoside. Chacune des fractions contenant la tréhalase ainsi obtenue (4 fractions) est placée sur le sommet d'une colonne (0,9 x 25 cm) de chromatoconcentration (marque déposée PBE - 94 : fabriqué par Pharmacia, Inc.) qui est équilibrée avec un tampon d'histidine 25 mM (PH 6,4) contenant 0,1 % de Triton X -100, et élue avec un Poly tampon - HCl (pH 4) (marque déposée : Poly tampon 74 fabriqué par Pharmacia Inc.). Finalement le Poly tampon dans la solution de tréhalase purifiée est purifié avec une colonne (1,6 x 70 cm) de filtration sur gel (marque déposée : Sephacryl S - 200 fabriqué par Pharmacia Inc.)qui est é-quilibréeavec un tampon Tris 5m- HCl contenant 0,18 de Triton X - 100 et 0,9 t de chlorure de sodium, et éluSeavec le même tampon ce qui permet d'obtenir la tréhalase purifiée à partir du rein de lapin. La récupération et l'activité spécifique de la tréhalase rénale du lapin purifiée et les propriétés enzymatiques de la tréhalase purifiée sont indiquées dans le tableau 3 et dans le tableau 4 respectivement. TABLEAU 3 Récupération et activité spécifique de la tréhalase rénale du lapin purifiée. Brute Purifiée Protéine totale (mg) 3 250 4,1 Activité totale (unité) 5 390 603 Activité spécifique (unité/mg de protéine) 1,38 142 TABLEAU 4 Propriétés enzymatiques de la tréhalase rénale du lapin purifiée Propriétes enzymatiques Poids moléculaire 180 000 pH optimum pH 5,9 Valeur Km (tréhalose) 2,54 mM Valeur Ki (chlorure mercurique) 43,1 M " (phlorizine) 1,65 mM (Tris(hydroxyméthyl) 8,20 mM aminométhane) EXEMPLE DE PREPARATION 3 1 litre d'urine humaine est précipité par saturation de sulfate d'ammonium (saturation à 90t),et et mis en suspension dans le tampon phosphate 10 mM (pH 7,2) dans lequel du désoxycholate a été ajouté jusqu'à avoir une concentration finale de 0,5 %, le liquide clair surnageant étant obtenu par centrifu gation.Le liquide surnageant ainsi obtenu est placé sur sommet d'une colonne (2,6 x 30 cm) de chromatographie avec échange d'ions (marque déposée : DEAE - cellulose fabriquée par Bio Rad Laboratories) qui est équilibrée avec un tampon phosphate 5 mAt (pH 7,2) contenant 0,2t de Triton X - 100, et élué avec un gradient linéaire de chlorure de sodium allant de 0 à 0,5 M dans le meme tampon, La fraction contenant la tréhalase ainsi obtenue est placée sur le sommet d'une colonne (2,0 x 10 cm) de chromatographie par affinité (Trehalose - Sepharose) qui est équilibrée avec un tampon Tris 1(11 -5S1 (pH 7,2) contenant 0,1 % de Triton X - 100 puis est éluéeavec le même tampon contenant 0,1 M de Tréhalose. La fraction contenant la tréhalase est placée sur le sommet d'une colonne (2,6 x 70 cm) de filtration sur gel (marque déposée : Ultrogel ACA - 34 fabriqué par Bio-Rad Laboratories) qui est équilibrée avec un tampon Tris FCl-5 M1 contenant 0,1t de Triton X - 100 et 0,9% de chlorure de sodium, puis éluée avec le même tampon. La tréhalase urinaire humaine purifiée ainsi obtenue est homogénéisée par électrophorèse avec I'électrophorèse analytique sur gel comme dans l'exemple de préparation 1. EXEMPLE 1 La solution de tréhalase purifiée (0,5 mg/ml) préparée à partir d'urine humaine est mélangée avec un adjuvant complet de Freund à volume égal pour obtenir une émul eau sion du type ou/dans l'huile (E/H) Deux millitres de l'émulsion sont injectés ins l'interface des griffes et des coussi nets des pattes de lapin, chaque injection étant de 100,ul et le reste de cette émulsion est injectée par voie souscutanée dans le dos des lapins. L'injection de l'émulsion est répétée trois fois à intervalle de deux semaines après la première injection. Dix jours après la dernière injection les lapins sont mis à jeun toute la nuit puis saignés à partir du muscle auriculaire et la carotide. Le sang ainsi obtenu est traité à 370C pendant 120 minutes et centrifugé à 3000tours/minute pendant 10 minutes, ce qui donne un liquide clair surnageant (antisérum). Un volume égal d'une solution de chlorure de sodium à 0,98 est ajouté dans l'antisérum dans lequel le complément est inactivé par traitement thermique à 56"C pendant 30 minutes. Ensuite1 après diminution de la solubilité avec du sulfate d'ammonium (saturation 0~"33%) le sérum est centrifugé à 11 000 tours/minute pendant 30 minutes. Le précipité obtenu est dissous dans le tampon phosphate 20 mM (pH 8) et dialysé une nuit contre le même tampon. La fraction de sulfate d'ammonium ainsi obtenue est placée sur le sommet d'une colonne (1,6 x 10 cm)de chromatographie avec échange d'ions (marque déposée : DEAE-cellulose fabriquéepar Brown Co.) qui est équilibrée avec un tampon phosphate 20 mM et éluée avec le même tampon. L'anticorps anti-tréhalase (anti-tréhalase IgG) est obtenu sous forme de la fraction ayant traversé la colonne de DEAE-cellulose. L'anti-tréhalase IgG ainsi obtenue est trouvée être homogène à en juger par la ligne de précipitation sur l'essai immunologique, c'est-à-dire par la méthode double d'immunodiffusion (méthode Ouchterlony) par rapport aux diverses tréhalases purifiées décrites ci-dessous. EXEMPLE 2 Une solution de tréhalase purifiée (0,5 mg/ml) provenant du rein de lapin est mélangée avec un volume egal d'adjuvant complet de Freund pour fabriquer une émulsion. Deux ml de l'émulsion sont injectés à raison de 0,2 ml par injection sous-cutanée dans chacun des cobayes. L'émulsion susmentionnée est injectée encore dix jours après la première injection. Dix jours après l'injection les cobayes sont saignés à partir de l'aorte ventrale. Le sang est traité selon le même procédé que dans l'exemple 1 jusqu'au stade où l'on obtient la fraction sulfate d'ammonium. La fraction sulfate d'ammonium ainsi obtenue est placée sur le sommet d'une colonne (2,6 x 90 cm) de filtration sur gel (marque déposée : Sephacryl S - 300 fabriqué par Pharmacia, Inc.) qui a été équilibrée avec un tampon phosphate 10 mM (pH 7,2) contenant 0,9t de chlorure de sodiums et éluée avec le même tampon, ce qui donne l'anticorps anti-tréhalase (antitréhalase IgG). L'anticorps anti-tréhalase ainsi obtenu est reconnu comme étant homogène avec la méthode de double immunodiffusion (méthode Ouchterlony). La méthode de Ouchterlony est appliquée à l'anticorps anti-tréhalase de la tréhalase urinaire humaine, qui a été obtenue par la procédé décrit dans l'exemple 1, une tréhalase urinaire humaine purifiée qui est une matière de départ pour un anticorps, une tréhalase urinaire de lapin purifiée et une tréhalase rénale de lapin purifiée pour obtenir respectivement une ligne de précipitation et les résultats obtenus sont indiqués sur la figure 1. La méthode de Ouchterlony est effectuée en creusant des trous sur une plaque de gel d'agar à 1% comme le montre la figure, puis l'antigène et l'anticorps sont versés dans ces trous et maintenus à 40C pendant 48 heures dans une chambre humide. Pendant cette incubation à la fois l'antigène et l'anticorps qui sont des protéines diffusent dans l'agar et réagissent entre eux en un endroit approprié. Si l'antigène et l'anticorps réagissent entre eux, (si l'antigène et l'anticorps engagent le même pouvoir antigénique, ils réagiront entre eux) le complexe antigèneanticorps (complexe immune) apparaîtra sous forme d'une lignede précipitation blanche sur la plaque d'agar. Par conséquent l'apparition de la précipitation indique la production d'un complexe antigène-anticorps. Notamment, comme le montre la figure 1, l'anticorps anti-tréhalase de la tréhalase urinaire humaine, produit la ligne de précipitation vis-à-vis de la tréhalase urinaire humaine purifiée,de de la tréhalase rénale humaine purifiée mais pas vis-à-vis de la tréhalase urinaire du lapin purifiée et de la tréhalase rénale du lapin purifiée. Ceci indique que la tréhalase urinaire humaine a le même pouvoir antigénique que la tréhalase rénale humaine,mais a un pouvoir antigénique différent vis-à-vis de la tréhalase provenant de l'urine du lapin et du rein du lapin. La figure 2 montre la caractérisation de l'antitréhalase de la tréhalase rénale du lapin, qui a été réalisée comme sur la figure 1. Notamment, la figure 2 montre que l'anticorps anti-tréhalase rénal du lapin a le même pouvoir antigénique que la tréhalase urinaire du lapin et que la tréhalase rénale du lapin, mais elle a un pouvoir antigénique différent vis-àvis de la tréhalase urinaire humaine. Les réalisations de la présente invention dans lesquelles les propriétés ou les avantages exclusifs sont caractérisés dans les revendications ci-jointes. REVENDICAT1ONS 1. Anticorps anti-tréhalase qui est produit ltellcontre de la tréhalase-purifiée provenant d'animaux supérieurs sous forme d'un antigène. 2. Anticorps anti-tréhalase selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'un anticorps anti-tréhalase produit à l'encontre de la tréhalase d'animaix- supérieurs purifié est préparé par un procédé qui consiste à placer des fluides du corps ou des extraits de tissu -(exccpté des tissus humains) provenant d'animaux supérieurs sur au moins une colonne de filtration sur gei,de de chromatographie par adsorption et de chromatographie avec échange d'ions, puis à placer la fraction contenant la tréhalase obtenue sur une colonne de chromatographie par affinité et/ou de chromatoconcentration, et ensuite, si nécessaire > à placer la fraction contenant la tréhalase ainsi obtenue sur au moins une colonne de filtration sur gel, de chromatographie par adsorption,de chromatographie avec échange d'ions et de chromatographie par affinité. 3. Anticorps anti-tréhalase selon les revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'animal supérieur est l t homme. 4. Réactif pour la détermination de la tréhalase urinaire humaine ou de la tréhalase de sérum,caractérisé par le fait que l'on utilise l'anticorps anti-tréhalase tel que dé- fini dans l'unequelconque des revendications 1 à 3. 5. Procédé de détermination immuno-enzymatique de la trehalase, caractérisé par le fait que l'on utilise l'anticorps anti-tréhalase tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3. 6. Procédé de mesure de la tréhalase dans le fluide du corps,dans un extrait de tissu par les méthodes d'immuno diffusion, d'immunoélectrophorèse, radiooimmunologique, immunotenzymatique, caractérlsé par le fait que l'on utilise l'anticorps anti-tréhalase tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3. 7. Procédé de mesure de la tréhalase dans les tissus par la technique immunohistochimique, caractérisé par le fait que l'on utilise l'anticorps anti-tréhalase tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3.