Brevet FR2532656A2 — publié le 19840309

FR 2532656 A2 19840309 FR 8215114 A 19820906 La demande principale n 82 09564 décrit des vecteurs de clonage et d'expression dans des levures qui comportent au moins tout ou partie de l ADN du plasmide k 1 de Kluyveromyces lactis et un segment d'ADN incorporant le gène hétérologue ainsi que les séquences assurant l'expression dudit gène dans ladite levure. La présente addition concerne certains de ces vectenrs présentant des propriétés intéressantes. Il s'agit des vecteurs de clonage et d'expression d'un gène hétérologue selon la revendication 1 du brevet principal qui sont constitués par un plasmide circulaire com- portant à titre d'ADN du plasmide k 1 de Ko lactis, un fragment de restriction Cla I du plasmide k 16. Un tel plasmide peut être obtenu notamment à partir des transformants L 2 et L 3 décrits dans le brevet principal. On extrait 1 'ADN total des transformants L 2 et L 3 et on utilise cet ADN pour transformer une souche de E.coli pyr F (mutation complémentéepar le gène URA 3 de S cerevisiae) On sélectionne ensuite les transformants URA+ et Ampr sur les milieux appropriés et on obtient des transformants qui ont incorporé 'des plasmides selon l'invention. L'extraction des plasmides issus des souches E coli transformées par l'ADN de L 3 montre qu'il s'agit de plasmides conformes à la représentation de la figure annexée, ces plasmides sont dénommés p 3 Il s'agit de plasmides circulaires ayant une taille de l'ordre de 7,3 kb qui possèdent une extrémité de k 16 coupée par Cla I. La figure ci-annexée représente la carte de restric- tion du plasmide p 3 telle qu'elle a pu être déterminée par analyse. Ce plasmide comprend un fragment bactérien provenant du plasmide p BR 322 et un fragment de restriction Hind III correspondant au gène UPRA 3 + de la levure S cerevisiae, (ces deux fragments d'ADN proviennent de la restriction par Cla I du plasmide clone 6), et enfin un fragment de restriction Cla I du plasmide kl de K lactis. Il convient de remarquer que dans p 3 comme cela a été indiqué sur la figure l'un des sites Cla I a disparu au voisinage de l'ADN du gène UPA 3. Dans ces conditions, le plasmide p L 3 comporte un grand nombre de sites de restriction uniques Cla I, Eco RI, Bam HI, ce qui le rend particulièrement apte comme vecteur de clonage de gène dans K lactiso En outre ce plasmide présente l'énorme avantage de pouvoir être amplifié dans E coli et extrait facilement, ce qui en fait un plasmide particulièrement disponible. L Enfin, le plasmide p 3 extrait de E coli transforme les levures K lactis ura pour le caractère + ura avec une efficacité dix fois supérieure à celle obtenue avec les mélanges de ligationtel que cela est décrit dans le brevet principal. REVENDICATIONS 1) Vecteur de clonage et d'expression selon la revendication 1 du brevet principal caractérisé en ce. qu'il s'agit d'un plasmide circulaire comportant à titre d'ADN du plasmide k de K lactis un fragment de restric- tion Cla I du plasmide k 6 2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte un fragment de restriction Cla I du plasmide'clone 6 - 3) Vecteur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide p L 3 4) Souche de E coli transformée incorporant un vecteur selon l'une des revendications 1 à 3. ) Levure transformée incorporant un vecteur selon l'une des revendications 1 à 3.