Brevet FR2518755A1 — publié le 19830624

Sonde contenant un acide nucléique modifié et reconnais- sable par des anticorps spécifiques et utilisation de cette sonde pour détecter et caractériser une séquence d'ADN homologue ___________________________________________________________ L'invention est relative à une sonde contenant un acide nucléique modifié et reconnaissable par des anticorps spécifiques et à l'utilisation de cette sondé pour détecter et caractériser une séquence d'ADN homo- logue dans un échantillon susceptible de le contenir. Plus particulièrement l'invention concerne une sonde modifiée chimiquement de telle sorte qu'elle puisse, après hybridation avec la séquence d'ADN homologue recherchée, être détectée par des anticorps spécifiques à l'égard de la sonde elle même. Il est connu que des ADN sont susceptibles de réagir dans des conditions appropriées avec des substances carcinogènes, tlles que le N-acétoxy-N-2-acétylaminofluo- rènepour former un produit susceptible d'être reconnu par des anticorps formés,d'une part,contre le N-2 (guanosine- 8-yl)-acétylaminofluorène et,d'autre part contre les m&mes ADN modifiés par le N-acêtoxy-N-2-acétylaminofluorène. Ces techniques ont notamment été décrites dans un article de Gilbert de MURCIA et collaborateurs intitulé "Visuali- sation par microscopie électronique des sites de fixation du N-acétoxy-N2-acétylaminofluorène sur un ADN de Col E 1 au moyen d'anticorps spécifiques"(Proc Natl Acad Sci USA, tome 76,N 12, 6 076 6 080 Dec 1979) ' Dans les conditions décrites par ces auteurs il est possible de modifier de 0,07 à 0,15 % des bases de 1 'ADN traité par le N-acétoxy-N-2acétylaminofluorène, les points de fixation de cette dernière substance chimique sur l'ADN pouvant ensuite être repérés par microcospie électronique, après réactdion préalable de l'ADN ainsi modi- fié avec des anticorps du genre sus-indiqué préalablement formés chez le lapin, puis avec des anti-immunoglobulines de lapins marqués à la ferritine La technique décrite permet par conséquent de distinguer des ADN natifs sains 2 - et des ADN ayant été soumis à l'action de substances carcinogènes. L'invention repose sur la découverte que la modification d'une séquence d'ADN par le N-acétoxy-N-2- acétylaminofluorène n'altérait pas, après dénaturation pré- alable de cet ADN modifié, sa capacité de s'hybrider avec une séquence complémentaire d'ADN ne portant pas de tels groupes de modification, lorsque ces séquences sont pla- cées dans des conditions permettant une telle hybridation. L'invention tire profit de cette découverte pour proposer un procédé perfectionné de détection de la présence éven- tuelle et de la caractérisation d'une séquence ou d'un fragment déterminé d'acide nucléique, notamment-d'un gène au sein d'une composition susceptible de le contenir. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on met en contact avec la composition présumée contenir une séquence ou un fzagment déterminé d'acide nucléique, une sonde contenant un acide nucléique complé- mentaire susceptible de s'hybrider avec la séquence d'acide nucléique ou le gène recherché, la sonde étant plus parti- culièrement caractérisée en ce qu'elle porte au moins un croupe N-2 acétylamninofluorène fixé de façon covalente à au moins l'une des bases de cette sonde, l'éventuelle présence de la séquence d'acide nucléique ou de gène recherché étant ensuite révélable par action d'anticorps efficace vis-à- vis de la N-2-(g quanosine -8-yl 4 acétylaminofluorène ou préa- lablement préparésvis-à-vis de la sonde portant des résidus- d'acétylaminofluorène (ci-après dénommés DNA-AAF). Il va de soi que le procédé revendiqué dans le cadre de la présente demande s'étend à l'utilisation de tout autre groupe chimique fixable sur un ADN dans les conditions décrites par de MURCIA et coll. Naturellement, il va de soi que le DNA-AAF utilisé comme sonde est mis en présencede l'ADN à étudier dans des conditions permettant le réappariment de séquences complémentaires, ce qui implique naturellement une dénatura- -3- tion préalable dans des conditions bien connues des ADN sus- ceptibles de s'hybrider mutuellement. Après hybridation, l'ADN-AAF non hybridé- de façon spécifique est de préférence éliminé par rinçage avant que l'on ne procède à la détection des hybrides formés, notamment par leur mise en présence avec des anti- corps anti-DNA-AAF,cui peuvent alors se fixer sur la sonde à la fois modifiée et hybridée avec la séquence de ADN recherchéelorsque celle-ci était présente dans la composition utilisée. Après rinçage des anticorps excédentaires encore présents, les anticorps fixés peuvent être, soit précipités, soit révélés. De préférence, la révélation est faite au moyen d'un anticorps anti DNAAAF, avantageusement marqué par une enzyme dont on peut ensuite détecter ou doser l'activité vis-à-vis d'un aibstrat spécifique Avantageusement on utilisera celles des enzymes qui sont susceptibles d'in- duire une réaction colorée au niveau des substrats corres- pondants. La révélation à l'aide d'enzymes donnant des réactions colorées est très rapide. La méthode est très sensible, surtout si on utilise des systèmes amplificateurs (chapelets, arbres ou boules d'anticorps associés à des enzymes)-, de sorte qu'elle permette de localiser des gènes après hybridation in situ sur des chromosomes, par exemple dans le cas'de diagnostics prénatals La méthode peut être quantitative, par mesure de l'intensité de la coloration. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la descrip- tion qui suit d'un exemple type de mise en oeuvre du procédé selon l'invention. -4- On a fait usage des matières et méthodes suivantes: Les A D N: ADN de phage p BR 322 portant une séquence de gène de ribosome de hamsterde 6,6: kb insérée au site Eco RI (clône PWE 6) ADN distinct de phage X 57 comme témoin négatif. L'A D N traité à l'A A F (DNA-AAF) De l'ADN du clone PWE 6 a été linéarisé (par l'en- zyme de restriction Sal I) et traité à l'AAF selon la technique décrite par G de MURCIA et al (PNAS vol 76 N 12 p 6 076 6 080 1979) Le nombre des guanines mo- difiées a été estimé à 2 % du nombre de paires de bases par mesure de la densité optique à 305 rinm et 260 nm. Les anticorps sérum DNA-AAF obtenu par -immunisation d'un lapin anticorps anti Guo-AAF de lapin purifié sur colonne d'affinité, anticorps de chèvre anti Ig G de lapin liés à de la peroxydase Les anticorps ont été obtenus dans les conditions décrites dans l'article susdit. Essai de détection du DNA-AAF Des quantités variables de DNA-AAF ont été dépo- sées sur des filtres de nitrocellulose (Schleicher et Sch Ull, type BA 85) de 5 mm de diamètre. L'ADN a préalablement été dilué dans une solution 2 x SSC et dénaturé à 100 C, pendant 5 minutes. Après dépôt,les membranes ont été mises au four à C pendant 2 heures. -Les membranes ont ensuite été traitées avec une solution 3 % albumine bovine (SIGMA ref A 7888), 1 SSC, à 40 C pendant une heure, puis incubées 30 minutes à température ambiante dans la même solution en presence d'anticorps anti-DNA-AAF ou anti-Guo-AAF de l Xapin à 2 ageml final. Après incubation, les membranes ont été lavées - 7 fois avec du PBS, à température ambiante, puis mises à incuber 30 minutes dans une solution 3 % albumine bovine, 1 SSC contenant des anticorps de chèvre anti Ig G de lapin liés à de la peroxydase à 2 pg/ml final. Après lavage 7 fois avec du PBS, la réaction colorée a été faite par addition de la solution suivante, préparée extemporanément: 2 mg de 3-amino 9 éthylcarbazol (SIGMA ref. A 5754) dissous dans 0,5 ml de N-N' diméthyl formamide, 9,5 ml de tampon acétate acétique 0,05 M p H 5,1, pl d'H 202 (Merk ref 7209) Test d'hybridation avec du DNA-AAF utilisécomrme sonde Dépôt de quantités variables de DNA PWE 6: 1) 100 ng 2) 10 nq 3) 1 ng 4) 100 pg Après dépôt, les filtres sont mis à 80 C pendant 2 heures, puis Dréhybridés 4 heures à 68 C dans une solution 6 x SSC et 10 x Denhardt. ( 1 x Denhardt contenant: 0,02 % de Polyvinyl pyrollidone,, 0,02 % du réactif commercialisé sous la désignation FICOLLE 400 par la Société"Pharmacia fine Chemicals". 0,02 % d'albumine bovine) Ils sont ensuite hybridés dans une solution 2 x SSC 1 x Denhardt en présence de 200/ul par membrane de solution de ENAAAF préalablement dénaturé contenant respectivement: ng/ml final 1 ng/ml final et pg/ml final Après hybridation, les filtres ont été iavés minutes dans 2 x SSC 1 Denhardt " " N 1 x SSC 1 Denhardt t " "O 0,5 x SSC 1 Denhardt " " " 0,2 x SSC 1 Denhardt l'heure 0,1 x SSC 1 Denhardt puis incubés pendant 1 heure à 400 C dans une solution contenant 3 % d'albumine à 1 x SSC La suite des opérations a été faite comme précédemment (mise en présence avec des anticorps anti-DNA-AAF ou anti Guo-AAF, lavage PBS, anticorps + peroxydase, lavage PBS et révélation). Après révélation on observe des taches colorées dont l'intensité (plus forte pour les concentrations élevées, plus faible pour des concentrations basses d;ADN) dépend de la quantité d'ADN hybridé. La méthode de détection sus-indiquée a conduit à des résultats entièrement négatifs au terme d'essais d'hybridation réalisés-entre le témoin négatif (utilisé en des quantités atteignant jusqu'à 90 nanogrammes) et le DNA-AAF. L'invention ne se limite évidemment pas aux modes de réalisation décrits ci-dessus à titre d'exemples et l'homme de l'art peut y apporter des modifications sans- pour autant sortir du cadre des revendications ci-après. Au titre des variantes utilisables au niveau de laà détection des hybrides formés avec la sonde selon l'in- vention, on citera la révélation des hybrides formés par la radio- activité, par exemple grâce à l'utilisation d'anticorps anti-DNA-AAF rendus radioactifs par de l'iode 125 ou 131 ou de protéine A radioactive, qui va se fixer sur les anticorps Enfin, au titre des variantes d'applications - possibles, on citera l'application de la sonde selon l'invention à la purification d'un ADN complémentaire contenu dans une composition initiale, notamment au moyen de protéine A-associée à un support solide (par exemple constitué de billes d'agarose), d'anticorps précipitants associés ou non à un support-solide (billes d'agar ose, -de latex, etc), pour assurer la précipitation sélective de l'hybride formé. Enfin fait partie des modifications restant dans le cadre des revendications la substitution possible de 1 'AAF par toute molécule équivalente carcinogène ou ana- 7 - logue susceptible de se fixer dans les mêmes conditions sur certaines au moins des bases des nucléotides dont est constituée la sonde. 8- REVENDICATIONS 1 Procédé de détection de la présence d'une séquence d'acide nucléiquetelle qu'un gène ou fragment de gène dans une composition ou échantillon présumé la contenir, caractérisé en ce que l'on met en contact cette composi- tion avec ure sonde contenant un acide nucléique complémen- taire de la séquence d'acide nucléique ou du gène recher- ché dans des-conditions permettant notamment cette hybri- dation, ladite sonde portant au moins un groupe N-2- acétylaminofluorène-fixé de façon covalente à au moins l 0 l'une des bases de cette sonde, l'éventuelle présence de la séquence d'acide nucléique ou de gène recherché étant ensuite révélable par'action d'anticorps efficaces vis- à-vis de la N-2-(guanosine-8-yl)-acétylaminofluorène ou préalablement prépara vis-à-vis de-la sonde portant des résidus d'acétylaminofluorène. 2 Procédé selon la revendication 1 comprenant en outre la séparation de l'hybride formé, en vue de la pu- rification de ladite séquen Qe d'acide nucléique, notam- ment par précipitation.