Brevet FR2522678A1 — publié le 19830909

La présente invention concerne des microsupports pour la croissance de cultures de cellules dépendant d'un ancrage. Plus particulièrement, l'invention concerne des microsphères à surface en verre, spécifiquement destinées à servir de tels microsupports, et les procédés de fabrication de telles microsphères. Dans le domaine des cultures de tissus de cellules dépendant d'un ancrage, il a déjà été proposé de remplacer les flacons cylindriques et les bottes de Pétri normalisés par ce que l'on appelle des microsupports, en vue de présen- ter une plus grande surface spécifique de contact pour la fixation des cellules Le brevetdes US-A-4 189 534 (Levine et al) propose, par exemple, d'utiliser des microsupports en forme de perles de matières plastiques massives Il a cependant été trouvé que, pour favoriser la fixation des cellules, il faut modifier des parties de surface électrique- ment chargées de microsupports de matières plastiques de ce type, modification qu'il est difficile de maîtriser quan- titativement en production industrielle et qui est toxique pour certains types de cultures de cellules si cette modifi- cation n'est pas régulée et/ou maîtrisée de façon appropriée. Il est difficile également d'enlever certains types de cellu- les de la surface des perles de matière plastique Il a été proposé d'utiliser des perles en verre massif comme microsupports de cellules En plus des problèmes préci- tés, un inconvénient important des microsupports antérieure- ment proposés, y compris spécifiquement des perles massives en matière plastique ou en verre, réside en une difficulté à maîtriser ou ajuster la masse volumique des microsupports à celle du milieu de culture choisi Les milieux classiques pour la culture des cellules sont par nature aqueux et ils possèdent des masses volumiques se situant généralement entre 1,03 et 1,09 g/cm 3 Des perles en verre de silice, qui possè- dent d'intéressantes propriétés de surface, ont typiquement, selon la composition du verre, une masse volumique de l'ordre de 2,3 g/cm 3 Pour éviter un dépôt de sédimentation et un compactage des microsupports dans le milieu de croissance, ce qui tendrait à inhiber la croissance des cellules, il est nécessaire d'agiter continuellement, d'une façon ou d'une autre, le milieu de culture Cependant, une agitation vigou- reuse est en elle-même destructrice de nombreux types de cellu- les Le domaine des microsupports pour des cultures de cellu- les animales en général est passé en revue dans " 3rd General Meeting of ESACT" ( 3 e réunion générale de Esact), Oxford 1979, Develop biol Standard, 46, pages 109 à 294 (S Karger, Bâle, 1980). Dans la demande de brevet français n' 82 21 358 du décembre 1982, déposée au nom de la Demanderesse, on a essayé de remédier aux difficultés cidessus et à d'autres encore rencontrées en pratique en formant des microsphères creuses en une composition de verre au silicate constituant des précurseurs, puis en ajustant la masse volumique de telles microsphères, au cours d'une opération d'attaque chimique de formage ultérieur, pour que les microsphères correspondent étroitement à la masse volumique du milieu aqueux de croissan- ce que l'on désire utiliser Cette technique s'est avérée résoudre avec succès les problèmes de l'art antérieur concer- nant aussi bien les charges superficielles que la flottabilité ou masse volumique Cependant, le nombre des opérations séparées que cela implique rend souhaitable une diminution des prix de revient. La présente invention vise donc à proposer un microsupport dont la masse volumique correspond étroitement à celle de milieux typiques de cultures de cellu- les et qui comporte les intéressantes caractéristiques de surface du verre au silicate, mais est moins onéreux à fabri- quer que des microsupports antérieurement proposés et qui offrent des avantages semblables un microsupport pouvant être facilement enlevé des milieux de culture et qui convient particulièrement bien pour un enlèvement rapide lorsqu'on utilise des procédés automa- tisés; et un procédé de fabrication de tels microsupports. En bref, on peut indiquer que l'on fabrique les micro- supports selon un aspect important de la présente invention en réalisant un précurseur sphérique en une matière polymère ayant une masse volumique apparente sensiblement identique à celle du milieu aqueux de croissance que l'on désire uti- liser (environ 1 g/cm 3), puis en revêtant le précurseur poly- mère à l'aide d'une mince couche de verre au silicate La mince couche de verre ne modifie pas beaucoup la masse volumi- que réelle du précurseur tout en lui conférant les avantages importants, en termes de toxicité et de facilité avec laquelle on peut enlever les cellules des culturessans dégâts importants, d'une surface de verre pour la fixation des cellu- les Le microsupport selon l'invention comprend donc, et consiste de préférence essentiellement en, un précurseur poly- mère sphérique neutre du point de vue flottabilité (masse volumique d'environ 1 g/cm 3) et un revêtement superficiel continu mince (pas plus d'l Pm) de verre au silicate. Selon un autre aspect important de la présente inven- tion, celle-ci propose des microsupports dont la composition consiste en partie en un matière magnétique, de sorte que le microsupport puisse être attiré par un champ magnétique et facilement enlevé du milieu de culture De préférence, une telle matière magnétique comprend un mince revêtement d'une matière magnétique déposée sur le précurseur polymère décrit cidessus, avant le dépôt de la couche externe de verre au silicate. On va maintenant décrire plus en détail quelques formes préférées de réalisation. Le précurseur polymère sphérique peut être formé par n'importe quelle technique classique Par exemple, un polymère filmogène peut être dissous dans un solvant convenable puis projeté par pulvérisation, sous forme de gouttelettes atomi- sées, dans la partie supérieure d'une chambre chauffée ou d'un four Pendant que les gouttelettes tombent par gravité dans la chambre chauffée, le solvant s'évapore rapidement et il se forme une peau ou enveloppe polymère Le brevet US-A-2 797 201 (Veatch et al) décrit un tel procédé et un appareil pour sa mise en oeuvre La dimension et la masse 4 2522678 volumique nominales du précurseur sont réglées en fonction de la concentration du polymère par rapport au solvant, de la température de séchage et de la dimension des gouttelettes. La dimension des gouttelettes peut typiquement se situer entre 5 et 500 Pm Les températures de séchage peuvent se situer entre 200 C et 5000 C Le précurseur du produit voulu peut être collecté sec au bas de la chambre, nettoyé et tamisé pour retenir la coupe ou fraction des particules cor- respondant à la gamme des dimensions voulues, par exemple une gamme comprise entre 106 et 200 jim. Le précurseur polymère peut également être mis sous forme de perles massives, par projection de pulvérisation et refroidissement de polymères fondus, en dirigeant les gouttelettes engendrées par un générateur ou par un autre appareil classique de ce genre dans une zone de pleine liber- té de manière que les gouttelettes se refroidissent et se solidifient pendant la chute libre et soient collectées. En variante, des morceaux massifs prédimensionnés ("fritte") de matières polymères peuvent être introduits dans un four tubulaire vertical pour y être fondus et remis sous forme de perles sphériques pendant une chute libre. La matière polymère du précurseur est choisie de manière à donner la masse volumique voulue dans la gamme des dimensions souhaitées et de manière à présenter une apti- tude à du revêtement par du verre Du polystyrène et du polyéthylène constituent des exemples de matières qui conviennent bien Le précurseur peut être massif, creux ou poreux Selon la matière servant de précurseur et le procédé de revêtement à utiliser, il peut s'avérer souhaitable de traiter la surface du précurseur de manière à la rendre plus apte à recevoir un revêtement de verre au silicate On pré- fère un diamètre de précurseur compris entre 50 pm et 500 Hm et une masse volumique comprise entre 1,00 et 1,10 g/cm 3. On réalise de préférence le revêtement, par du verre au silicate, du précurseur polymère en appliquant un dépôt de pulvérisation cathodique sous haute fréquence (L'expres- sion "verre au silicate", telle qu'elle sert ici, désigne un verre qui comprend des oxydes du silicium, avec ou sans autres oxydes métalliques) Encore mieux, on utilise une unité de pulvérisation cathodique sous haute fréquence à commande magnétique pour obtenir un revêtement uniforme autour de la surface sphérique externe du précurseur sans surchauffer le substrat polymère Une épaisseur de revêtement O de l'ordre de 300 A à 1 pm exerce peu d'effet mesurable sur la masse volumique globale et convient bien Une unité conve- nable de pulvérisation cathodique sous haute fréquence à commande magnétique ("magnétron") est fabriquée par Sloan Manufacturing Co et est appelée "Modèle n' S 310 " Une autre technique de revêtement utilisable est le dépôt de vapeur chimique. On place les perles de polymère dans une coupelle ou un récipient en aluminium peu profond fixé à une plate- forme à l'intérieur du dispositif de pulvérisation catho- dique De préférence, on introduit les perles par un sas à vide afin de minimiser le temps de pompage nécessaire pour réaliser un vide Le dispositif de pulvérisation cathodique consiste en une chambre à vide qui loge la source de pulvéri- sation cathodique et dans laquelle il faut faire un vide correspondant à une pression inférieure ou égale à 0,4 x 10 3 Pa avant de pouvoir commencer le dépôt; des pressions supé- rieures vont conduire à l'obtention de pellicules d'une qualité médiocre se manifestant principalement par l'inapti- tude des enveloppes ainsi revêtues à supporter un chauffage par de la vapeur d'eau en autoclave Lorsque la pression de base requise a été atteinte, on introduit dans le système le gaz pouvant constituer l'atmosphère de pulvérisation cathodique (argon) jusqu'à une pression d'environ 1,33 Pa. Lorsqu'on a utilisé le dispositif de pulvérisation cathodique Sloan Modèle 5310, le récipient peu profond contenant les perles avait un diamètre de 7,5 à 10 cm. Avant et pendant le dépôt, la plate-forme sur laquelle la coupelle est fixée est soumise jà vibrations dans un plan horizontal La vibration de la plate-forme fait tourner et rebondir au hasard les perles polymères, ce qui permet un 6 2522678 revêtement uniforme de ces perles Un revêtement uniforme est généralement nécessaire si un revêtement mince doit sup- porter longtemps un traitement de chauffage à la vapeur d'eau en autoclave Il a été trouvé que l'uniformité du revêtement des perles d'une dimension donnée est sensible à la fréquence et à l'amplitude des vibrations Pour des perles polymères dont les diamètres se situent entre 100 pm et 200 pm, les valeurs optimales de la fréquence et de l'amplitude des vibrations sont de 37 Hz et environ 1,5 mm, respectivement. Pour obtenir un débit maximal, il est souhaitable de rendre maximale la vitesse de dépôt par pulvérisation catho- dique La vitesse maximale de dépôt que l'on peut obtenir dépend principalement de la température maximale à laquelle on peut chauffer le substrat sans dégrader les surfaces de perles polymères Il a été trouvé que,sur des perles en polystyrène ayant des diamètres d'environ 150 ym, une vitesse de 0,05 pmfh va donner un revêtement lisse lorsqu'on utilise une cible en "Pyrex" ou en silice Pour le dispositif parti- culier de pulvérisation cathodique sous haute fréquence décrit, on a obtenu cette vitesse ou ce taux à une pression d'argon de 1,33 Pa et une puissance utile de 0,75 k W Pour obtenir une couverture complète de la surface, il faut une épaisseur minimale de revêtement d'environ 0,03 pm Pour réutiliser les perles de polymère revêtues de verre, il faut que ces perles puissent être lavées à nouveau et traitées à nouveau en autoclave Une épaisseur de revêtement de 0,1 pm s'est avérée survivre à au moins 2 cycles de lavage et de traitement en autoclave, et entretenir encore une croissance active de cellules KB (Bacille de Koch), de cellules MRC-5, de cellules de carcinosarcome de Walker 256, et des cellules de fibrosarcome de souris. Tels qu'ils ont été décrits ci-dessus, les microsup- ports selon la présente invention offrent un certain nombre d'avantages importants En premier lieu, il y a la possibi- lité de fabriquer de tels microsupports de façon bien moins onéreuse que dans le cas des microsupports entièrement en verre de la demande précitée de brevet français, tout en conservant les avantages liés de manière inhérente à une sur- face en verre pour l'ancrage des cellules, et unemasse volumi- que globale permettant la mise en suspension dans le milieu de culture, c'est-à-dire que ce microsupport présente une flottabilité moyenne ou neutre dans le milieu choisi En outre, la technique préférée de revêtement par pulvérisation catho- dique sous haute fréquence permet de faire facilement varier la composition du verre, bien que l'on envisage actuellement du verre à haute teneur en silice ou de la silice pure pour la plupart des applications à des cultures de cellules Bien entendu, le substrat sphérique polymère, présentant la masse volumique fondamentale d'environ 1 g/cm 3 peut être fabriqué (ou acheté) en diverses dimensions, à peu de frais. Selon un second aspect important de la présente inven- tion, une couche intermédiaire de matière magnétique, comme un revêtement de nickel, peut être déposée sur le substrat polymère avant le dépôt de la couche externe de verre au silicate Cela se réalise de préférence au cours d'une opéra- tion de pulvérisation cathodique sous haute fréquence, comme décrit cidessus La couche de matière magnétique n'exerce aucun effet important sur la masse volumique du microsupport. On peut donc facilement enlever, par exemple en insérant un aimant permanent dans le milieu, des microsupports en suspen- sion dans un milieu de culture Selon cet aspect de l'inven- tion dans ses formes les plus larges, la matière magnétique peut être incluse d'une autre façon dans le microsupport, par exemple par inclusion ou occlusion dans le substrat poly- mère. Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées aux micro- supports pour la croissance de cultures de cellules, et à son procédé de fabrication. 2522678- REVENDICATIONS 1 Microsupport destiné à servir de site de croissance pour des cellules dépendant d'un ancrage, dans un milieu aqueux de culture de cellules, microsupport caractérisé en ce qu'il comprend un substrat sphérique en une matière poly- mère ayant une masse volumique d'environ 1 g/cm 3, substrat entouré d'un mince revêtement de verre au silicate. 2 Microsupport selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente un diamètre compris entre 50 pm et 500 Pm et'une masse volumique comprise entre 1,00 g/cm 3 et 1,10 g/cm 3, et en ce que le revêtement présente une épaisseur comprise O entre 300 A et 1 pm. 3 Microsupport selon la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce qu'il comporte, sous le revêtement de verre au silicate, un second revêtement de matière magnétique qui entoure le substrat. 4 Procédé de fabrication d'un microsupport pour des cultures de cellules dépendant d'un ancrage, procédé caracté- risé en ce qu'il consiste à revêtir d'une couche de verre au silicate un précurseur sphérique en une matière polymère ayant une masse volumique d'environ 1 g/cm'. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le revêtement est réalisé au cours d'une opération de pulvérisation cathodique sous haute fréquence. 6 Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que, avant d'effectuer le revêtement à l'aide d'une couche de verre au silicate, on revêt le précurseur à l'aide d'une couche de matière magnétique et l'on place par dessus cette couche de matière magnétique la couche de verre au silicate. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le revêtement à l'aide d'une couche de matière magné- tiqueest réalisée au cours d'une opération de pulvérisation cathodique sous haute fréquence. 8 Microsupport destiné à servir de site de croissance pour la culture de cellules dépendant d'un ancrage dans des milieux aqueux, caractérisé en ce que la composition de la matière du microsupport consiste, en partie, en une matière magnétique.