Brevet FR2522968A1 — publié le 19830916

Médicament cytotoxique formé de l'association d'au moins une immuno- toxine et de la chloroquine. La présente invention concerne les médicaments com- portant, en association, au moins une immunotoxine et de la chloro- quine. Dans les demandes de brevets français antérieurs, portant notamment les numéros 78 27 838, 79 24 655, 81 07 596 et 81 21 836, on a décrit la préparation de produits anticancéreux dits conjugués obtenus par couplage, par liaison covalente, de la chaîne A de la ricine avec des anticorps ou fragments d'anticorps dirigés contre un antigène porté par une cellule à détruire Les produits de ce type sont désignés dans la présente demande sous le nom générique d'immunotoxines. Dans la demande française 81 21 836 on a décrit en outre la propriété des ions ammonium (sous la forme d'un quelconque de leurs sels et-en particulier le chlorure) de potentialiser de façon efficace l'action cytotoxique de ces immunotoxines. Dans une autre demande antérieure déposée en France sous le N O 82 02 091, la demanderesse a décrit la propriété des substances appartenant à la classe des ionophores carboxyliques de potentialiser l'activité des immunotoxines et d'accélérer leur ciné- tique d'action, selon des modalités similaires à celles déjà décrites pour les ions ammonium. Toutes ces substances potentialisatrices et accéléra- trices peuvent être utilisées pour améliorer l'efficacité des imitiu- notoxines, soit in vitro, soit in vivo chez l'homme ou l'animal, dans un but thérapeutique. La présente invention a pour objet la préparation de médicaments cytotoxiques puissante utilisant la potentialisation des effets cytotoxiques sélectifs des immunotoxines décrites dans les demandes de brevet ci-dessus mentionnées. Après que de nombreuses autres substances ont été étudiées sans succès, il a été trouvé que la chloroquine utilisée sous la forme de l'un quelconque de ses sels pharmaceutiquement accep- tables était une substance particulièrement intéressante pour poten- tialiser et accélérer l'effet cytotoxique sélectif des inmunotoxines. En effet, et en particulier pour les applications thérapeutiques in vivo, la chloroquine possède l'avantage d'avoir été utilisée comme médicament chez l'homme depuis de nombreuses années Ses modalités d'utilisation en thérapeutique sont donc très bien connues C'est un médicament bien toléré jusqu'à des doses relativement élevées (de l'ordre de 2 g en une seule prise chez l'homme adulte) et qui présente des caractéristiques pharmacocinétiques particulièrement intéressantes dues à une élimination urinaire lente, pour 705 de la dose sous forme inchangée et à une demi-vie sérique très longue ( 40 à 70 heures). Dans la présente invention, il a été trouvé que,de façon surprenante, la chloroquine utilisée à des doses o elle ne présente elle-même aucune cytotoxicité propre pour les lignées étu- diées, potentialise de façon extrêmement importante (facteur de 2500) la cytotoxicité spécifique des immunotoxines. L'exemple suivant non limitatif permet de mieux com- prendre la portée de l'invention. Exemple Cet exemple démontre la potentialisation de la cyto- toxicité sélective de l'immunotoxine anti-T 65 (telle que décrite dans la demande né 81 21 836 de la demanderesse) vis-à-vis des cellules lymphoblastotdes T humaines de la lignée CEM portant l'antigène T 65. Dans ces expériences, la cytotoxicité a été évaluée par la mesure de l'incorporation de C-leucine par les cellules après 18 h d'incubation à 370 C en présence de quantités connues de l'immuno- toxine étudiée, ou de substances cytotoxiques de référence, en absence ou en présence de chloroquine. 1 Potentialisation de l'effet cytotoxique par la chloroquine. Les résultats de ces expériences sont présentés sous la forme de courbes dose/effet présentant en ordonnée l'effet cyto- toxique évalué comme indiqué ci-dessus par l'incorporation du traceur, calculée en 7 de la valeur obtenue sur les cellules témoins sans substance cytotoxique et en abscisse les concentrations molaires en sous-unité toxique des substances cytotoxiques étudiées La chloro- quine a été testée-à la concentration de 60 micromolaires Il a été préalablement vérifié que la chloroquine n'est pas spontanément cyto- toxique pour les cellules employées, à la concentration indiquée. La figure 1 montre l'effet de la chloroquine sur la cytotoxicité propre de la ricine et de sa chalne A isolée, prises comme substances de référence Les valeurs des concentrations molaires (CI 50) correspondant à 50 % d'inhibition d'incorporation du traceur sont indiquées dans le tableau I. T A B L E A U I Substances testées Avec chloroquine 60 ?i Sans chloroquine ,, Ricine 1,2 10 12 M '1,9 10 12 M -8 -8 chaine A 3,5 108 M 5 10 M Ces résultats démontrent qu'il n'y a pratiquement pas d'effet potentialisateur de la chloroquine sur la cytotoxicité de la ricine (facteur de potentialisation de 1,6) et de la chaîne A (fac- teur de potentialisation de 1,4). La figure 2 montre l'effet pocentialisateur comparé de l'ion NH 4 ( 10 m MI) et de la chloroquine ( 60 PM) sur la cytotoxi- cité de l'immunotoxine anti-T 65 vis-à-vis des cellules de la lignée CEM Les valeurs des concentrations molaires (CI 50) correspondant à % d'inhibition d'incorporation du traceur sont rappelées dans le tableau II. Ces résultats montrent que l'effet potentialisateur de la chloroquine sur l'activité de l'immunotoxine vis-à-vis de sa cible spécifique est voisin de celui de l'ion ammonium et de l'ordre d'un facteur de 2500 Ceci signifie qu'en présence de chloroquine, l'immunotoxine anti-T 65 est visà-vis de sa cible spécifique un agent cytotoxique plus puissant que la ricine elle-même. En outre, la chloroquine présente la propriété remar- quable, non seulement de potentialiser l'activité mais aussi d'aug- menter la sélectivité de l'immunotoxine Si l'on prend en effet comme critère de sélectivité d'action de l'immunotoxine le rapport des CI 50 de la chaîne A libre et de l'immunotoxine, ce rapport est de 10 en l'absence de chloroquine et voisin de 44000 en présence de chloro- quine. T A B L E A U II 2 Accélération des cinétiques de cytotoxicité par la chloro- quine. L'effet de la chloroquine ne se limite pas à accroître d'une façon considérable l'activité cytotoxique et la sélectivité des immunotoxines Cette substance permet aussi d'accélérer de façon très importante la cinétique de cytotoxicité des immunotoxines, comme le montre l'expérience suivante: Dans cette expérience, on a mesuré comme précédemment l'incorporation de traceur radioactif dans les cellules mais cette fois en fonction du temps d'incubation des cellules avec l'immuno- toxine, en absence et en présence de chloroquine 60 pbi comme poten- tialisateur Cette expérience a été réalisée sur le modèle cellulaire constitué par la lignée lymphoblastotde humaine CEM avec l'immuno- toxine anti-T 65 à la concentration de 50 n M Les résultats sont pré- sentés dans la figure 3. Pour cette lignée, il apparait quien l'absence de potentialisation, la cinétique de cytotoxicité est très lente comme le montre la courbe a D'autres expériences dans les mêmes conditions ont montré que le temps nécessaire à obtenir 50; de réduction de l'incorporation du traceur était de l'ordre de 20 h Par contre, en présence de chloroquine, une accélération spectaculaire de la ciné- tique se manifeste (courbe b) puisque le temps nécessaire A obtenir % d'inhibition d'incorporation est alors de l'ordre de 1,5 h seule- ment. Un tel effet d'accélération est de la plus haute importance pour toutes applications des immunotoxines et en parti- culier pour les applications thérapeutiques in vivo car la rapidité d'action du médicament est toujours un facteur très favorable à l'efficacité du traitement. Substances potencialisatrices testées CI 50 Aucune 5 109 M NH 4 + 10 m M 3 -1013 M 4 hloroquin 6 -0 M 13 Chloroquine 60 PM 8 10 M On peut donc utiliser en tant que médicament en thérapeutique humaine l'association constituée par une immunotoxine et la chloroquine (sous la forme de la base ou d'un quelconque de ses sels pharmaceutiquement acceptables) Il peut être utilisé pour le traitement des affections, cancéreuses ou non, qui seraient sen- sibles à l'anticorps utilisé pour la préparation de l'immunotoxine. Visant à éliminer la totalité des cellules cancéreuses, le traitement devra être effectué avec une dose suffisante d'immuno- toxine associée avec une quantité de chloroquine pouvant varier de 10 mg à 2 g (exprimés en base) à chaque administration d'immunotoxine. La durée du traitement devra être déterminée dans chaque cas en fonc- tion du sujet et de la nature de l'affection à traiter. Les nouveaux médicaments selon l'invention sont condi- tionnés pour pouvoir être utilisés dans les conditions adaptées à leur emploi L'immunotoxine sera administrée par voie injectable et de préférence par voie intraveineuse La chloroquine sera de préfé- rence administrée par voie injectable sauf si son emploi par voie orale présentait des avantages thérapeutiques. R E V E N D I CA T ION ____ ____________________ Médicaments cytotoxiques caractérisés en ce qu'ils comportent en association au moins une immunotoxine et la chloro- quine ou un sel pharmaceutiquement acceptable de la chloroquine.