Brevet FR2517315A1 — publié le 19830603

La présente invention concerne un procédé de prépara- tions de formes nouvelles de collagène, natif ou déréticulé, A structure hélicoïdale préservée, associées A des mucopo- lysaccharides, ainsi que les-compositions obtenues par mise en oeuvre dudit procédé et leurs applications notamment dans les domaines cosmétologiques, pharmaceutiques, ana- lytiques et autres. Les tissus conjonctifs, et la peau en particulier, sont constitués principalement de collagène Cette pro- téine est donc responsable en grande partie de l'état de la peau Au cours du vieillissement, le collagène se ré ticule -on dit qu'il se polymérise et la peau se ride, tout en perdant son élasticité L'apport de collagène jeune, à structure hélicoldale préservée, peut pallier, du moins en partie, à ce processus de vieillissement. Par ailleurs, le derme de la peau renferme deux autres types de macromolécules, qui sont l'alastine et les pro- t 4 oglycanes Alors que la première remplit un rôle qui lui est propre en ne réagissant pas avec le collagène, les secondes peuvent avoir une influence sur les propri 6 tôs de la peau par l'interm 6 diaire de leurs interactions avec le collagène. Les protéoglycanes sont des macromolécules consti- tu 6 es d'acide hyaluronique et de substances protéiques, sur lesquelles sont branchés les glycosaminoglycanes, poly- mères de masse moléculaire d'environ 50 000 constitués d'acide uronique et d'héxosamines, que l'on appelle 6 ga- lement mucopolysaccharides. D'après " O BRINK, COLSTON PAP, 26 (Struct Fibrous Biopolym), 1975, 81-92 ", les interactions des prot 6 ogly- canes avec le collagène sont de deux types: exclusion stérique et liaisons électrostatiques La première in- téraction est due à la taille importante des prot 6 ogly- canes et elle n'apparait pratiquement pas dans le cas des glycosaminoglycanes La deuxième intéraction, par contre, due aux charges électrostatiques, existe aussi bien avec les prot 6 oglycanes qu'avec les glycosaminogly- canes D'autres auteurs-ont également 6 tudiés le méca- nisme de ces interactions:ITC LAURENT, COLSTON PAP, 26 (Struct Fibrous Biopolym), 1975, 27-34,f A HUC, P MAN- SCHOTT, D HERBAGE et M WEISS ( 1975) in Protides of Biological Fluids, 22nd colloquium (H PEETERS éd), p 91, Pergamon Press, OXFORD and NEW-YORK, È HERBAGE, J M. LUCAS, A HUC, Biochim Biophys Acta, 336 ( 1974) o 108-116. Certains auteurs ont mis en évidence leur influence sur les propriét 6 S mécaniques des tissusl(JACKSON et BENTLEY ( 1968) in Treatise on collagen, (GOULD B S éd), vol 2 A, p. 189, Academic Press, NEW-YORK 3 Enfin, les glycosaminogly- canes comportant de nombreux groupements chargés sont entourés d'une grande quantité d'eau, qui confère au tissu une partie de sa souplesse L'action des glycosaminogly- canes sur la peau peut ainsi être r 6 sumée selon les trois critères suivants: Protection de la structure native du collagène, Influence sur les propriétés mécaniques des tissus, Hydratation de la peau. On voit donc l'int 6 rêt de l'association des glycosamino- glycane avec le collagène pour de nombreuses applications. On sait par ailleurs que le collagène a la propriété de passer partiellement en solution aqueuse, sous l'action d'agents organiques ou minéraux Néanmoins, sa solubilité reste faible et il n'est possible de mettre en solu- tion qu'une fraction relativement faible de collagène, en gén 6 ral en milieu acide. De nombreuses méthodes ont été proposées dans le but, non seulement d'extraire les fractions solubles du colla- gène, mais aussi d'augmenter la solubilité de la partie insoluble Ces méthodes sont gén 6 ralement basées sur le prétraitement des matières premières à l'aide d'agents chimiques ou d'enzymes plus ou moins spécifiques. D'autres solutions préconisées consistent à utiliser, par exemple, l'action de la chaleur en milieu aqueux, mais dans ce cas, il se produit une dénaturation du col- lagène en gélatine, voire même une certaine hydrolyse 17315 du collagène, aboutissant à la rupture des liaisons trans- versales de la molécule et à la destruction de la struc- ture hélicoïdale du collagène. En règle générale, les fractions solubles du colla- gène en milieu aqueux ont des valeurs de p H inférieures ou égales à 4 Dans certains cas cette acidité peut présenter des inconvénients majeurs pour l'utilisation du collagène soluble, dans la mesure o ces valeurs de p H sont inférieures au p H physiologique Cela peut être le cas pour des applications cosmétiques, dermatologiques et même thérapeutiques. Or, on sait que le collagène a un point isoélectrique voisin du p H physiologique et que la neutralisation de frac- tions solubles du collagène provoque généralement une précipitation Seulesde très faibles quantités peuvent rester solubilisées dans des solutions tampons, diminuant d'autant l'intérêt de leur utilisation. De même, lorsque des mucopolysaccharides comme par exem- ple de l'aeide chondroltine-4-sulfate ou de l'acide chondrol- tine-6-sa Mte sont ajoutésen quantités assez importantes à une solution aqueuse de collagène natif, la protéine collagéni- que précipite, du fait des interactions physiques qui s'établissent entre les deux composés. On a déjà proposé d'associer le collagène à des mu- copolysaccharides pour certains traitements dermatologiques. C'est ainsi que le brevet français 2 362 632 propose d'in- corporer à du sérum une certaine quantité de glycoamino- glycanes et de collagène, en même temps que des agents facilitant la lipolyse des tissus adipeux, mais aucune indication ne permet de réaliser cette association colla- gène/glycoaminoglycanes sous forme de solutions lim- pides ou de gels homogènes, toutes les proportions étant indiquées en "principe actif sec". On a également proposé (brevet français 2 332 863) de réaliser la première couche d'une membrane multicouche destinée à la réalisation de peaux synthétiques à l'aide d'un composite réalisé par mise en contact intime de collagène et d'un mucopolysaccharide suivie d'une r 6 ticu- lation de l'ensemble Il est toutefois précisé que le pro- duit de réaction coprécipite dans le milieu aqueu Cdans le- quel il se forme ce qui, bien évidemment, ne permet pas de disposer de solutions limpides ou de gels homogènes. La présente invention vise à pallier ces inconvénients en proposant un procédé qui permet de r 6 aliser sous forme de solutions limpides ou de gels homogènes l'association des glycosaminoglycanes avec du collagène déréticulé ou O 10 natif tout en conservant la structure hélico;dale et les propri 6 tés physiques et chimiques dudit collagène. C'est ainsi que l'invention a pour objet un procéd 6 de préparation de compositions résultant de l'association de collagène et de mucopolysaccharides et dont l'origina- lit 6 consiste en ce que l'on met en présence du collagène, 6 ventuellement d 6 r 6 ticu 16, sous forme de suspension homo- gène ou de solution avec une solution de glycosaminoglycane et que l'on porte le p H du mélange à 7. Selon un mode de réalisation de l'invention, le colla- r gène est tout d'abord déréticulé par contact prolongé du tissu collagénique avec une solution de soude à p H 14 et l'association est obtenue sous forme de solution limpide. Selon un autre mode de réalisation, le collagène utilisé est du collagène natif sous forme de gel obtenu à-partir de fibres déshydrat&es, et l'association est obtenue sous forme de gel homogène. La concentration en collagène est de préférence le double de la concentration en glycosaminoglycane. L'invention concerne également les compositions ob- tenues par mise en oeuvre du proc 6 dé selon l'invention ainsi que leurs différentes formes de présentations telles que solutions, poudres, éponges, films, tubes, crins, etc ainsi que leurs applications notamment dans les domaines cosmétiques,pharmaceutiques, vétérinaires et thérapeuti- ques, telles qu'en paradontologie et chirurgie osseuse, et en tant que pansements hémostatiques et cicatriciels,aisi que dans les domaines analytiques et notamment comme supports de molécules actives telles que des enzymes. La présente invention sera mieux comprise d'ailleurs et ses avantages ressortiront bien des exemples suivants de deux modes de réalisation qui l'illustrent sans toute- fois la limiter. Exemple I Préparation d'une solution limpide d'une composition à base de collagène déréticulé et de chondroi- tine-4-sulfate a) Préparation de l'acide chondroitine-4-sulfate à partir des cloisons nasales de bovins Les cloisons nasales fraiches sont tout d'abord la- vées soigneusement dans une solution de chlorure de sodium 9 pour 1000 Elles sont ensuite hachées et broyées. Le broyat est alors placé à raison de 1 kg par litre dans une solution de potasse 0,5 N Apres agitation,l'ensemble est laissé au repos à température ambiante pendant 24 h. Au bout de ce laps de temps, le surnageant est séparé des matiares insolubles par centrifugation à 30 000 g pendant mn De l'acide acétique pur est ajouté au surnageant pour nmtraliser la soude La solution est alors concentrée cinq fois par évaporation sous vide Le concentrat est verse dans un volume trois fois supérieur d'éthanol Le précipité récupéré par décantation est dissous dans l'eau permutée L'acide chondroltine-4-sulfate est obtenu par lyophilisation de cette solution. b) Préparation du collagane déréticulé Des peaux de veaux provenant d'animaux fraîchement abattus sont tout d'abord lavées à l'eau du robinet par brassage pendant une heure dans un foulon. Le système pileux et le tissu sous-cutané sont sépa- rés du derme à l'aide d'une refendeuse à bande rotative. Le derme récupéré est haché et broyé Le broyat est lavé par trois bains successifs de tampon phosphate (p H 7,8). Entre chaque bain, le broyat est séparé de la solution par centrifugation en continu à 4000 t/mn Le résidu est alors rincé par deux bains successifs d'eau permutée et le li- quide est séparé du broyat de la même façon que dans les opérations précédentes Ces premiers traitements servent à éliminer les substances non collagéniques Le tissu est alors placé dans une cuve contenant une solution de soude à p H 14 Après agitation pendant une demi-heure environ, l'ensemble est laissé au repos pendant huit jours Le milieu est ensuite acidifié par l'acide chlorhydrique jusqu'à obtention d'un p H de 2 Dans le mélange obtenu, du chlorure de sodium est ajouté jusqu'à obtention d'une concentration de 10 % Le collagène précipité est dia- lyse contre de l'eau permutée stérile. c) Préparation de la solution limpide d'une composition selon l'invention. Le gel de collagène dialysé a une concentration de 1,2 %, est dilué à raison de deux fois par une solution contenant 0,6 % de l'acide chondroitine-4-sulfate préparé en a), additionnée de 0,4 % d'un produit conservateur tel que celui commercialisé sous la dénomination Phénonip On ajou- te à ce mélange une solution de soude 0,1 N jusqu'à ce que le p H dcmélange soit égal à 7 X ce moment, on obtient une solution limpide dans laquelle la concentration en collagène est de 0,6 % et celle de glycosaminoglycane de 0,4 %. La solution ainsi obtenue peut être incorporée par exemple dans une crème cosmétique. D'autres applications cosmétiques (masques pour le visage), pharmaceutiques ou thérapeutiques (paradontolo- gie, chirurgie osseuse) analytiques (supports de mo- lécules actives et notamment d'enzymes) imposent toute- fois de disposer de la composition selon l'invention sous forme de gel homogène pouvant être ensuite facilement transformé en formes facilement utilisables telles qu'é- ponges, comme décrit dans l'exemple 2. Exemple 2 Préparation d'un gel homogène selon l'inven- tion a) Préparation de l'acide chondroltine-6-sulfaté On prépare cet acide à partir d'ailerons de requins selon le processus décrit en a) dans l'exemple 1. b) Préparation d'une suspension homogène de collagène On prépare une pâte de collagène à partir de peaux d'origine animale par broyage suivi de malaxage en pré- sence d'acides organiques chlorés selon le processus d 6- crit dans le brevet français N O 1 568 829 de la deman- deresse Cette pâte est diluée à l'eau de façon à obtenir une concentration de 1 % en collagène La pro- téine contenue dans la solution est précipitée par du chlorure de sodium à 10 % Les fibres obtenues sont séparées du surnageant par centrifugation en continu à 4000 t/mn Elles sont ensuite déshydratées par séjour dans trois bains successifs d'acétone Le séchage des fibres est effectué par chauffage à 301 C dans une étuve ventilée. Ces fibres sont placées dans un bain d'eau permutée à une concentration de 2 g/l Après agitation pendant une heure, un gel est obtenu. c) Préparation d'un gel homogane de la composition selon l'invention On ajoute au gel un volume égal d'une solution à lg/l d'acide chondroltine-6sulfate préparé en a) Le gel à tendance à se casser et une dispersion est obtenue Une solution de soude 0,1 N est alors versée sous agitation dans le mélange jusqu'à obtention d'un p H égal à 7 La dispersion se transforme alors à nouveau en un gel ho- mogène. On peut ensuite transformer ce gel par exemple en éponge. On place le gel dans un plateau en quantité telle que son épaisseur soit inférieure à 10 mm. Une opération de lyophilisation ultérieure permet d'obtenir une éponge sur le plateau. Les éponges ainsi obtenues ayant une composition assez voisine du tissu de soutien de l'os favorisent l'ostéogénèse quand elles sont placées dans des cavités osseuses en facilitant la réhabilitation de ces cavités par les ostéocytes Elles trouvent donc des applications en paradontologie et en chirurgie osseuse. Comme il va de soi et comme il ressort de ce qui précède, la présente invention ne se limite pas aux deux seuls modes de réalisation présentés à titre d'exemples elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes, quelle que soit notamment la forme de présentation des compositions obtenues par mise en oeuvre du procédé poudres, éponges, films, tubes, crins ou autres REVENDICATIONS - l Procédé de préparation de compositions résultant de l'association de collagène et de mucopolysaccharides, caractérisé en ce que l'on met en présence du collagène éventuellement déréticulé, sous forme de suspension ho- mogène ou de solutionavec une solution de glycosaminogly- cane et que l'on porte le p H du mélange à 7. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en collagène est le double de la concentration en glycosaminoglycane. 3 Procédé selon les revendications l et 2, caracté- risé en ce que le collagène est tout d'abord déréticulé par contact prolongé du tissu collagénique avec une solu- tion de soude à p H 14 et que l'association est obtenue sous forme de solution limpide. 4 Procédé selon les revendications i et 2, caracté- ris& en ce que le collagène utilisé est du collagène na- tif sous forme de gel obtenu à partir de fibres deshy- dratées et que l'association est obtenue sous forme de gel homogène. Compositions obtenues par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications l à 4 ainsi que leurs différentes formes de présentations telles que solutions, poudres, éponges, films, tubes, crins, etc 6 Applications des compositions selon la revendi- cation 5 notamment dans les domaines cosmétiques, phar- maceutiques, vétérinaires et thérapeutiques, telles que par exemple en paradontologie, en chirurgie osseuse et en tant que pansements hémostatiques et cicatriciels, ainsi que dans les domaines analytiques et notamment comme supports de molécules actives telles que des enzymes.