Brevet FR2521998A1 — publié le 19830826

La présente invention concerne de nouveaux déri- vés du psoralène Elle est plus particulièrement relative à des dérivés mono-fonctionnels du psoralène consistant en des pyrido( 3,4-c)psoralènes L'invention a également pour objet un procédé d'obtention de tels composés L'invention concerne aussi l'application desdits composés en cosméto- logie, notamment pour stimuler la pigmentation de la peau, ainsi qu'à titre de médicaments, en particulier pour le traitement des affections cutanées L'invention est aussi relative à des compositions cosmétiques et pharmaceutiques contenant, à titre d'agent actif, lesdits composés. La photochimiothérapie, qui repose sur l'activa- tion par les ultraviolets A, dans la peau humaine, de molécules photoactives de la famille des furocoumarines, les psoralènes, se développe rapidement en dermatologie. Il s'agit en effet d'une technique thérapeutique particu- lièrement efficace et commode dans le traitement des derma- toses inflammatoires chroniques bénignes, comme le psoria- sis qui touche 2 à 3 % de la population mondiale, et dans le traitement de dermatoses malignes, comme le mycosis fongolde, lymphome cutané malin, rare mais d'évolution particulièrement sévère Cette technique thérapeutique est également employée avec un certain succès dans le trai- tement de nombreuses maladies inflammatoires chroniques de la peau, comme l'eczéma atypique, le lichen plan, le para - psoriasisen goutte, le prurit des hémodialysés, ainsi que dans les photodermatoses et dans les maladies dépigmentan- tes comme le vitiligo. On a déjà proposé de préparer des dérivés du psoralène et de les utiliser pour le traitement des affec- tions cutanées, particulièrement du psoriasis A titre de référence bibliographique illustrant l'art antérieur dans ce domaine, on peut citer la demande de brevet FR 78 24754 (publication 2 405 067) déposée le 25 août 1978 au nom de l'AGENCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA RECHERCHE (ANVAR) ayant pour titre "Compositions pharmaceutiques contenant des dérivés mono-fonctionnels du psoralène pour le traitement des affections cutanées" Cette demande de bre- vet, à laquelle l'homme de l'art pourra se référer si besoin est, expose d'une manière détaillée les connaissan- ces de l'époque relatives aux dérivés du psoralène et à leur application comme médicament. D'une manière résumée, les psoralènes sont utili- sés en association avec la lumière ultraviolette pour la pho- tothérapie des maladies cutanées, telles le psoriasis Ce traitement est connu sous le nom de PUVA-thérapie Des tra- vaux récents ont cependant montré que certains psoralènes bi-fonctionnels, tels que le 8-méthoxypsoralène, connu sous l'abréviation 8-MOP, et le 5-méthoxypsoralène, en abrévia- tion 5-MOP, sont cancérigènes chez la souris après exposi- tion à de la lumière se situant dans le proche ultraviolet aux alentours de 365 nm Au contraire, le 3-carbéthoxypso- ralène, qui est un dérivé mono-fonctionnel du psoralène, est totalement inoffensif de ce point de vue, tout en conservant une activité thérapeutique vis-à-vis des malades atteints de psoriasis. Les psoralènes actuellement utilisés en thérapie, tels le 8méthoxypsoralène ou le 5-méthoxypsàralène, sont des agents capables de réaliser des pontages dans 1 'ADN, pontages biologiquement difficiles à réparer et capables d'introduire des erreurs dans la réplication génétique. Cette propriété explique sans doute leur haute activité mutagène et leur propriété carcinogène chez l'animal Il s'agit donc de médicaments efficaces mais peut-être non dénués de risques en utilisation chronique chez l'homme. C'est pourquoi, la photochimiothérapie est interdite chez les enfants jusqu'à l'âge de 18 à 20 ans et l'on essaye de l'utiliser le moins possible avant la cinquantaine. En cosmétologie, on connait aussi des produits qui stimulent la pigmentation et sont constitués de déri- vés du psoralène, tels que le 5-méthoxypsoralene ou 5-MOP. Ils trouvent application dans des compositions cosmétiques pour le brunissage de la peau et/ou pour la protection de celle-ci contre le soleil L'inconvénient de tels produits est d'être mutagènes. L'invention a pour objet de nouveaux dérivés mono-fonctionnels du psoralène Ces composés sont utiles à titre de médicaments, notamment dans le domaine du traite- ment des affections cutanées et plus spécialement pour le traitement des dermatoses inflammatoires bénignes et mali- gnes, à savoir le psoriasis, le mycosis fongolde, les eczémas constitutionnels et de contact, les parapsoriasis en plaques et en gouttes, les pelades, les prurigo s, les lichens plans, les urticaires pigmentaires ainsi que les troubles de la pigmentation et les photodermatoses. Les composés de l'invention qui possèdent l'apti- tude de stimuler la pigmentation de la peau, sont également utiles dans le domaine cosmétique. Les nouveaux composés de l'invention sont des pyrido-( 3,4-c)-psoralènes ou pyrido( 3,4-c) furo( 3,2-g) coumarines répondant à la formule générale I 1 3 2 O ' O ( R formule dans laquelle le radical R représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle inférieur en C 1-C 4, de préfé- rence un radical méthyle ou un groupe alcoxy inférieur en C 1-C 4, de préférence le radical méthoxy. Pour obtenir les composés de formule I, on fait réagir un acétate d'hydroxy-6 ou un acétate d'hydroxy-6- alkyl-7 (ou alcoxy-7) dihydro-2,3 benzofuranne sur une carbéthoxy-3 pipéridone-4, ce qui conduit à une hexahydro- 1,2,3,4,9,10 pyrido( 3,4-c) furo( 3,2-g) coumarine, pouvant être substituée en position 3 et en position 7, et on soumet cette dernière à une réaction d'aromatisation au 252 1998 cours de laquelle on réalise à la fois la déshydrogénation et l'enlèvement du groupement substituant en 3. Le procédé de l'invention sera davantage illus- tré dans la description qui suit. A titre de produit de départ on utilise un com- posé de formule II 3 5 (II) 2 6 7 OCOCH 1 i 3 R dans laquelle R a la signification mentionnée précédemment. Un tel composé peut être obtenu conformément au procédé décrit par E C HORNING et al dans J Am Chem Soc 70 ( 1948) page 3619 sous le titre "Furocoumarins Synthesis of 2,3-dihydropsoralen " D'une manière résumée, ce procédé consiste à faire réagir sur la résorcine, éventuellement alkyl ou alcoxy-substituée en 2, du chloroacétonitrile en présence d'acide chlorhydrique et de chlorure de zinc, à traiter l'intermédiaire par de l'acétate de sodium ou de potassium, ce qui fournit une hydroxybenzofuranone, laquelle est ensuite acétylée par l'anhydride acétique puis réduite par voie catalytique, par exemple en présence de charbon palladié, pour donner respectivement l'acétate d'hydroxy-6 ou l'acétate d'hydroxy-6-alkyl-7 (ou alcoxy-7) dihydro-2,3 benzofuranne de formule II L'autre produit de départ est une carbéthoxy-3 pipéridone-4 qui est disponi- ble sur le marché Pour le procédé de l'invention on peut utiliser la carbéthoxy-3 pipéridone-4 elle-même ou un dérivé substitué en position 1 par exemple par un groupe méthyle,ou de préférence, la benzyl-l-carbéthoxy-3 pipéri- done-4 de formule III A 7 CH 2-C 6 H 5 | (III) La première étape du procédé de l'invention consiste à faire réagir le composé de formule II sur la carbéthoxy-3 pipéridone-4, en particulier celle représen- tée par la formule III Cette réaction est connue de l'homme de l'art sous le nom de réaction de VON PECHMANN (Organic Reactions T 7, page 1). Il s'agit d'une réaction de synthèse des couma- rines consistant à condenser un béta-cétoester sur un phé- nol, en particulier un polyphénol La réaction est réali- sée en milieu acide Dans le cas de la présente invention, on utilise avantageusement un milieu d'acide acétique contenant du gaz chlorhydrique Le milieu acide préféré est constitué d'acide acétique contenant environ 6 % en poids d'acide chlorhydrique gazeux sec La réaction est réalisée de préférence à la température ordinaire Il n'y a pas intérêt à augmenter la température car cela occasionne généralement une baisse des rendements La réaction est donc poursuivie sous agitation pendant plusieurs jours. On obtient alors un rendement de l'ordre de 75 % ou davan- tage Cette première étape conduit à une hexahydro-1,2,3, 4,9,10 pyrido ( 3,4-c)-furo-( 3,2-g)coumarine substituée en 7 et pouvant être substituée en 3, de préférence par un groupe benzyle Dans ce dernier cas le produit intermé- diaire peut être représenté par la formule IV CH 2-C 6 H 5, H Cl (IV) O v R Dans les conditions précitées, on obtient directement le produit sous forme de chlorhydrate et il n'est pas nécessaire d'isoler la base correspondante Au contraire, le procédé permet de traiter directement le chlorhydrate avec un rendement amélioré La deuxième étape du procédé de l'invention consiste en une réaction d'aromatisation au cours de laquelle il y a à la fois déshydrogénation et enlèvement du groupement substituant en 3 La réaction est réalisée dans un solvant en présence d'un agent de déshyàrogénation ayant une forte activité, de préférence le palladium sur charbon, par exemple à 10 %. Le solvant doit être capable de travailler au reflux tout en restant inerte vis-à-vis des réactifs en présence Les solvants qui ont donné de bons résultats sont le diphényl- éther ou la décaline. On obtient ainsi les pyrido( 3,4-c) psoralènes de formule I. L'homme de l'art trouvera dans les exemples 1 à 4 ci-après les détails sur les modes opératoires permettant de préparer les nouveaux dérivés du psoralène de formule I. Les nouveaux composés de formule I sont des médicaments utiles pour le traitement des affections cutanées et plus spécialement pour le traitement des dermatoses inflamma- toires bénignes et malignes, à savoir le psoriasis, le mycosis fongolde, les eczémas constitutionnels et de contact, les parapsoriasis en plaques et en gouttes, les pelades, les prurigos, les lichens plans, les urticaires pigmentaires ainsi que les troubles de la pigmentation et les photodermatoses. Ils possèdent des propriétés photobiologiques très favorables dans le traitement par PUVA-thérapie des maladies de la peau Le traitement des affections cutanées avec les composés selon la présente invention consiste à administrer par voie orale ou topique une quantité effi- cace d'un composé de formule I et à soumettre le patient à de la lumière dans le proche UV. Il a été constaté à présent que, pour l'appli- cation topiquedes pommades ou des solutions contenant environ 0,1 % à environ 2 % (en poids) du composé thérapeuti- quement efficace peuvent être utilisées Des concentrations d'environ 0,5 % en poids sont préférées. Comme excipients pour les solutions ou les pom- mades selon l'invention, on peut utiliser tous les exci- pients couramment employés qui sont bien connus de l'homme de l'art Des exemples de tels excipients sont cités par Schaefer et al dans Archiv of Dermatology ( 1976), ce document étant mentionné ici à titre de référence. Il est bien entendu possible également d'incor- porer les composés de la présente invention dans d'autres compositions, solutions ou pommades ou d'ajouter des par- fums, des colorants, des filtres solaires ou des agents de conservation, ainsi que tous autres composés couramment utilisés Il est également possible de combiner deux ou plusieurs agents photosensibilisateurs ou photoprotecteurs. Pour l'administration orale, on préfère en par- ticulier des quantités comprises entre 0,5 et 2 mg/kg. Ainsi qu'il est mentionné plus haut, le traite- ment des affections cutanées avec les composés selon l'in- vention comprend l'irradiation par de la lumière dans le proche ultraviolet (UVA) avec un spectre comprenant essen- tiellement des longueurs d'onde comprises entre 320 et 380 nm Ainsi qu'on l'expliquera plus loin, la dose d'irradiation à chaque séance peut être d'emblée de J/cm 2 à 10 J/cm 2 Néanmoins, des doses allant jusqu'à J/cm 2 peuvent être utilisées pendant une courte période de temps. Les composés de l'invention trouvent également application en cosmétologie, en raison de leur propriété de stimuler la pigmentation de la peau L'invention a donc pour objet des compositions cosmétiques contenant une quantité d'au moins un composé selon l'invention efficace pour réaliser la pigmentation de la peau, en association avec un véhicule convenant à l'application externe Les véhicules de telles compositions sont bien connus de l'homme de l'art et n'ont pas besoin d'être décrits plus en détails Pour les composés de l'invention on peut uti- liser des véhicules semblables à ceux déjà proposés pour les compositions cosmétiques contenant du 5-MOP Les com- positions cosmétiques de l'invention se présentent sous forme de crème, lait, huile, aérosols (sprays) et tous autres produits à usage externe Les composés de l'inven- tion peuvent, au sein de telles compositions, être asso- ciés ou non à des filtres ou écrans solaires La quan- tité de composé actif à mettre en oeuvre dans les composi- tions cosmétiques de l'invention n'est pas critique et peut varier selon la destination de celles-ci En général des quantités de 0,01 à 0,5 % en poids par rapport à la composition sont convenables. Les nouveaux composés de l'invention présentent l'ensemble despropriétés suivantes: une photoréactivité appréciable avec les acides nucléiques 2 produisant un effet antiprolifératif; l'absence d'induction de pontages dans l'ADN; une induction dans l'ADN de mono-additions uniquement, ayant pour conséquence l'arrêt des synthèses d'ADN et d'ARN; de faibles effets phototoxiques, donc provo- quant peu ou pas d'érythème; un faible pouvoir mutagène, ce qui contraste avec les furocoumarines bi-fonctionnelles actuellement employées en PUVAthérapie, qui portent un risque cancérigène appréciable. On donnera maintenant des exemples de prépara- tion des composés de l'invention. EXEMPLE 1 Hexahydro-l,2,3,4,9,10 benzyl-3-pyrido ( 3,4-c} furo ( 3,2-g) coumarine (formule IV, R = H) Un mélange du composé II avec R = H ( 2,5 g, 14 mmoles) et du chlorhydrate de benzyl-l-carbéthoxy-3- pipéridone-4 (formule III) ( 4 g, 13; 5 mmoles) en solution dans 25 ml d'acide acétique glacial contenant 6 % d'acide chlorhydrique sec est agité à température ambiante pendant 5 jours Le précipité formé est essoré, lavé à l'acide acétique, et séché On obtient 3,78 g ( 76 %) du chlorhydrate (IV) avec R = H, F = 234-236 C. 310 mgde ce chlorhydrate en suspension dans ml d'eau sont neutralisés par une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium Apres 0,50 heure d'agita- tion, le précipité est essoré, lavé à l'eau, séché et recristallisé dans l'éthanol pour donner 206 mg de cris- taux, F = 163-165 C. RMN (CDC 13, 6 ppm, 60 M Hz) 2,73 ( 4 H, S large, CH 2 en 1 et 2); 3,15 ( 2 H, t, J = 8,5 Hz, CH 2 en 10); 3,4 ( 2 H, S large, CH 2 en 4); 3,65 ( 2 H, s, CH 2-C 6 H 5); 4,56 ( 2 H, t, J = 8,5 Hz, CH 2 en 9); 6,53 ( 1 H, s, H 7); 7,16 ( 6 H, S large, C 6 H 5-CH 2 et H 11). Analyse % calculé pour C 21 H 19 N 03: C 75,65 H 5,74 N 4,20 Trouvé: 75, 29 5,65 4,16 EXEMPLE 2 Méthyl-7-hexahydro-1,2,3,4,9,10 benzyl-3-pyrido ( 3,4-c) furo ( 3,2-g} coumarine (formule IV R = CH 3) Ce composé est préparé selon le mode opératoire décrit ci-dessus à l'exemple 1 A partir de 3,90 g ( 20 mmoles) du composé (II) avec R = CH 3 et de 5,9 g ( 20 mmoles) de la pipéridone (III) on obtient 5,85 g ( 15 mmoles, 75 %) du chlorhydrate (IV) avec R = CH 3, F = 260 C. La base libérée est cristallisée dans l'éthanol, F = 2080 C RMN (CDC 13, 6 ppm, 60 M Hz) 2,25 ( 3 H, s, CH 3 en 7); 2,77 ( 4 H, S large,CH 2 en 1 et 2); 3,23 ( 2 H, t, J = 8,5 Hz, CH 2 en 10); 3,5 ( 2 H, S large CH 2 en 4); 3,70 ( 2 H, s, CH 2- C 6 H 5); 4,66 ( 2 H, t, J = 8,5 Hz, CH 2 en 9); 7,16 ( 1 H, s, Hll); 7,35 ( 5 H, s, C 6 H 5-CH 2). Analyse % calculé pour C 22 H 21 NO 3: C 76,06 H 6,05 N 4,03 Trouvé: 75, 92 6,12 4,22 EXEMPLE 3 Pyrido ( 3,4-c) furo ( 3,2-g)coumarine (formule (I) R = H, composé la 2, 33 g ( 6,31 mmoles) du chlorhydrate obtenu à l'exemple 1 en suspension dans 30 ml de diphényléther sont chauffés à reflux pendant 5 heures en présence de 2,1 g de Pd/C à 10 % (Pd/C = charbon palladié). Le charbon palladié est filtré à chaud, lavé avec 5 ml de diphényléther chaud Après refroidissement on ajoute 500 ml d'hexane Le précipité formé ( 573 mg) est essoré, lavé à l'hexane et séché. Après deux cristallisations d'un mélange chlo- rure de méthylène/alcool on obtient 375 mg ( 25 %) d'aiguil- les incolores, F = 284-288 C. Le lavage du charbon palladié avec du chlorure de méthylène et de l'alcool chaud fournit encore 95 mg de produit brut. RMN (CDC 13, 6 ppm, 100 Hz) 6,90 ( 1 H, dxd, J = 2,3 Hz, J = 0,2 Hz,H 10); 7,54 ( 1 H, d, J = 1 Hz, H 7); 7,73 ( 1 H, d, J = 2,3 Hz, Eb); 7,95 ( 1 H, d, J = 5,5 Hz, H 1); 8,30 ( 1 H, d, J = 0,4 Hz, Hll); 8,95 ( 1 H, d, J = 5,5 Hz,H 2); 9,75 (H, S, H 4). Analyse % calculé pour C 14 H 17 NO 3: C 70,89 H 2,97 N 5,91 Trouvé: 70, 79 3,06 5,91 EXEMPLE 4 Méthyl-7-pyrido ( 3,4-c) furo ( 3,2-g) coumarine (formule I, R = CH 3, composé lb) Le pyridopsoralène du titre est préparé comme décrit cidessus à l'exemple 3 A partir de 3 g ( 7,83 mmoles) du chlorhydrate préparé à l'exemple 2, on obtient 928 mg de produit brut qui, après deux cristallisations du mélange CH 2 C 12/C 2 H 5 OH fournissent 487 mg ( 25 %) de base, F = 272-274 C. RMN (CDC 13, e ppm 100 M Hz) 2,65 ( 3 H, s, CH 3 en 7), 6,87 ( 1 H, d, J = 2,2 Hz, H 10); 7,74 ( 1 H, d, J= 2,2 Hz, Hg); 7,93 ( 1 H, d, J = 5,5 Hz, H 1); 8,15 ( 1 H, s, Hl,); 8,92 ( 1 H, d, J = 5,5 Hz, H 2); 9,56 ( 1 H, s, H 4). Analyse % calculé pour C 15 Hg NO 3: C 71,71 H 3,61 N 5,57 Trouvé: 71,58 3,69 5,63 Les nouveaux composés de l'invention ont été soumis à des essais permettant d'apprécier leur activité en cosmétologie et à titre de médicament. La structure mono-fonctionnelle des composés, qui constitue une propriété importante vis-à-vis de leur utilisation thérapeutique et cosmétique, a été vérifiée par deux séries d'expériences photochimiques et photo- biologiques. Les composés la et lb possèdent des propriétés spectroscopiques voisines, lesquelles diffèrent notablement de celles du psoralène La première transition d'absorption (Àmax = 330 nm) présente notamment un coefficient d'absorp- tion moléculaire plus élevé à 365 nm. Le composé la libre en solution, possède une bonne stabilité photochimique sous irradiation ultravio- lette jusqu'à une dose incidente de 27 k J/m 2 Des preuves d'une complexation importante du composé la avec 1 ' ADN ont été obtenues par spectroscopie d'absorption et d'émis- sion La solubilité de ce composé dans 1 ' ADN est la nettement supérieure à celle du même composé dans un mélange alcool-eau (facteur au minimum supérieur à 10). Des expériences de dénaturation-renaturation thermique effectuéessur de 1 'ADN modifié par le composé la en présence d'UV-A (dose incidente allant jusqu'à 27 k J/m 2) conduisent à des valeurs de fraction non renaturante de % Il est donc clair que ce composé ne peut pas induire de biadditionssur 1 ' ADN. 1) Utilisation de mutants de levure bloqués spécifiquement dans la réparation des pontages interbrins de l'ADN: On sait que la photoaddition de furocoumarines bi-fonctionnelles induit à la fois des pontages interbrins et des mono-additions sur les bases de l'ADN Celle de furo- coumarines mono-fonctionnelles produit uniquement cette dernière réaction Pour les expériences, on a utilisé un mutant de levure, pso 2, qui a les propriétés suivantes: a) Il est beaucoup plus sensible que le type sauvage dont il dérive à l'effet létal de la photo-addition des psoralènes bi- fonctionnels (Isolation and characterization of pso mutants sensitive to photo-addition of psoralen derivatives in Saccharomyces cerevisiae J A P HENRIQUES and E MOUSTACCHI. Genetics 95, 273-288 ( 1980)), ainsi qu'à d'autres agents de pontage, tels que les moutardes azotées bi-fonctionnelles 4 utagenesis induced by mono and bifunctional alkylating agents in yeast mutants sensitive to photoaddition of furoçoumarins (pso) O CASSIER et E MOUSTACCHI Mutation Res 84, 37-47 ( 1981)), ou la mitomycine C b) Ii est rela- tivement très peu sensible par rapport au type sauvage d la photoaddition de psoralènes mono-fonctionnels du type 3-Carbéthoxypsoralène ou aux moutardes mono-fonctionnelles. De même pso 2 présente la même sensibilité que le type sau- vage aux ultraviolets de 254 nm ou aux radiations ionisan- tes qui sont connus pour produire essentiellement des lésions des brins et des ruptures de l'ADN sans production de pontages aux doses biologiquement significatives, c) on a démontré biochimiquement qele mutant pso 2 est bloqué dans la réparation des pontages interbrins de l'ADN,(The fate of 8-methoxypsoralen photo-induced cross- links 7 nuclear and mitochondrial yeast DNA Comparison of wild type and repair-deficient strains N MAGANA- SCHWENCKE, J A P HENRIQUES, R CHANET and E MOUSTACHI Proc Natl Acad Sci (USA),( 1981)) Ce blocage est spécifi- que car le mutant pso 2 répare comme le type sauvage les mono-additions photo-induites sur l'ADN. Autrement ditsi le mutant pso 2 se montre plus sensible que le type sauvage à l'effet létal d'un agent, on peut en déduire que cet agent est capable de produire des pontages interbrins de l'ADN, de sorte qu'il s'agit d'un composé bi-fonctionnel En revanche, si le mutant po 2 a la même sensibilité que le type sauvage à un agent donné, on en conclut que cet agent ne provoque pas de pontages et qu'il est par conséquent de type mono-fonctionnel. On constate que le mutant pso 2 a la même sensibi- lité que le type sauvage à la photo-addition des produits la et lb Le mutant ayant la même capacité que le type sauvage à réparer les lésions de mono-addition, il est clair que ces nouveaux produits sont de type mono-fonctionnel. On confirme par ailleurs sur les souohes de levure que ces nouveaux produits sont très photo-réactifs. 2) Vérification biochimique directe de l'absence de pon- tage dans l'ADN de cellules traitées par les produits la, lb plus une irradiation à 365 nm. La validité des conclusions précédentes est confirmée par l'analyse biochimique in vivo En effet l'ADN de cellules de type sauvage a été extrait immédiatement après le traitement avec les produits la, lb à concentra- tion 10-5 M plus une irradiation par deux doses de radia- tions de 365 rnm ( 30 % et 5 % de survie) Après séparation de l'ADN nucléaire de l'ADN mitochondrial en gradient de densité de chlorure de Cesium, l'ADN est cassé de manière à avoir des segments de taille homogène ( 1 pontage en moyenne par molécule pour le 8-Méthoxypsoralène), il est 2521 9 9 8 dénaturé puis renaturé Si l'ADN contient des ponts inter- brins, il se renature et se retrouve sous la forme double chaîne séparable en gradient de densité de l'ADN simple chaîne Par contre quand l'ADN ne contient pas de ponta- ge, il reste sous forme simple chaîne après renaturation. C'est cette dernière situation que l'on observe expérimen- talement avec les produits la, lb Les expériences de contrôle avec le 8méthoxypsoralène effectuées dans les mêmes conditions mettent en évidence de l'ADN ponté en double brin Pour les détails de la technique utilisée voirl The fate of 8-methoxypsoralen photo-induced cross-links in nuclear and mitochondrial yeast DNA Comparison of wild type and repair-deficient strains N MAGANA-SCHWENCKE, J.A P HENRIQUES, R CHANET and E MOUSTACCHI Proc Natl. Acad Sci (USA), ( 1981). * Absence de pontages intercha Ines dans l'ADN traité par le 3-carbéthoxypsoralène et une irradiation à 365 nm N MAGANA- SCHWENCKE, D AVERBECK, J A P HENRIQUES et E MOUSTACCHI. C.R Acad Sci Paris 291, 207-210 ( 1980). En résumé l'utilisation du mutant pso 2 et l'examen direct de l'ADN de cellules traitées in vivo montrent clairement que les produits la, lb sont bien de type mono-fonctionnel. Pour la détection de l'activité photobiologique, le système eukaryote unicellulaire de la levure Saccharo- myces cerevisiae s'est révélé très utile Cette activité photobiologique a en effet été définie par l'induction d'effets létaux, l'induction de mutations cytoplasmiques "petite colonie" (dommages dans l'ADN mitochondrial) et l'induction de mutations nucléaires (réverses et aller) Les expériences ont été faites selon les méthodes habituel- lement utilisées et conformément aux références bibliogra- phiques ci-après: AVERBECK, D, BISAGNI, E, MOUSTACCHI, E. ( 1978) Biochim Biophys Acta 518, 464. AVERBECK, D, MOUSTACCHI, E ( 1979) Mutation Res 88, 133. AVERBECK, D, MOUSTACCHI, E ( 1980) Photochem. Photobiol 31, 475. AVERBECK, D, AVERBEC/,S, DALL'ACQUA;F ( 1981) ILFARMACO 36, 492. Dans les essais sur l'induction des effets létaux chez la levure (c'est-àdire sur l'induction de l'inhibition de la capacité des cellules de former une colonie) on a observé qu'en présence de radiation à 365 nm (UVA) et à des concentrations équimolaires ( 5 10 M) le composé la, (exemple 3) montre une activité voisine de celle du 8-méthoxypsoralène ( 8-MOP), agent bifonctionnel largement utilisé en PUVA-thérapie. Les courbes de survie établies à une concentra- tion de 5 10-6 M ont montré que les composés la (exemple 3) et lb (exemple 4) sont respectivement 2,5 et 5 fois plus actifs sur la survie cellulaire que le 8-MOP Ainsi, la dose d'UVA doit être 2,5 et 5 fois plus faible dans le cas des composés la et lb que dans le cas du 8-MOP pour attein- dre la même survie A des concentrations équimolaires ( 5 10 6 M) le composé lb a montré une activité voisine de celle du 4,5 ',8triméthylpsoralène ( 4,5 ',8-T Me P) utilisé en photochimiothérapie du vitiligo et du psoriasis (voir PATHAK, M A, PARRISH, J A, FITZPATRICK, T B ( 1981) Il Farmaco Ed Sc 36,479-491) D'ailleurs la solubilité dans l'eau des composés la et lb est semblable à celle du 4,5 ', 8triméthylpsoralène. Il est important de signaler que les deux compo- sés la et lb n'exercent pas chez la levure d'activité pho- todynamique due à la présence d'oxygène sur l'induction des dommages létaux Ils sont en cela comparables aux furocou- marines comme le 8-MOP et le 4,5 '-diméthylangélicine ( 4,5 '-DMA) mais différents du 3-carbéthoxypsoralène ( 3-C Ps). La photoaffinité des composés la et lb pour l'ADN in vivo est environ, respectivement, 10 et 20 fois plus forte que celle du 8-MOP, donc nettement plus élevée que celle de la furocoumarine monofonctionnelle 3-C Ps. Si l'on considère l'induction de mutations cytoplasmiques en fonction des survivants,les composés la, lb, dérivés monofonctionnels du psoralène, montrent à % de survivants un taux d'induction de mutations cyto- plasmiques supérieur à 50 %. L'induction de mutations nucléaires (réversions et muta- tions "aller") a été déterminée selon le protocole décrit dans les articles susmentionnés En présence de composés la ou lb à une concentration de 5 10 6 M les réversions His+ dans la souche haploïde de la levure Saccharomyces cerevisiae sont induites à une fréquence inférieure à celle observée après traitement avec le 3-C Ps,donc à une fréquence très inférieure à celle observée après traitement avec les agents bifonctionnels 8-MOP et 4, 5 ',8-T Me P au même taux de survivants. L'analyse du pouvoir d'induction de mutations aller, c'est-à-dire de mutations vers la résistance à la canavanine aboutit à la même conclusion:en fonction des doses d'UVA,on obtient avec les composés la et lb) 5 10 6 M des résultats comparables à ceux obtenus avec le 3-C Ps à 5 10 M En fonc- tion des fractions de survivants,les composés la et lb sont nettement moins mutagènes que le 3-C Ps et les composés bifonctionnels 8-MOP et 4,5 ',8-T He P. L'effet thérapeutique des nouvelles furocoumarines a été encore apprécié d'après leur capacité à inhiber les synthèses cellulaires comme l'avait déjà montré BORDIN et al en 1972 avec d'autres furocoumarines (Bordin,F,Baccichetti, F and Musa Jo,L ( 1972) Experientia 28, 148). On a mesuré dans deux lignées fibroblastiques humaines en culture (GM 1603 et Ja)l'effet photosensibilisateur des composés la et lb comparativement à celui du 8-méthoxypso- ralène ( 8-MOP)et du 3-carbéthoxypsoralène ( 3-C Ps) sur la synthèse de l'ADN, de l'ARN et des protéines. Les cellules cultivées en bottes de Petri en milieu minimum de Eagle, additionné de 10 % de sérum embryonnaire de veau, ont été marquées par des précurseurs spécifiques en phase exponentielle de croissance Les taux des synthèses ont été estimés en mesurant l'incorporation des précurseurs radioactifs dans du matériel acido-précipi- table (voir Nocentini S ( 1978) Biochim Biophys Acta 521, ). Les résultats indiquent que la phototensibilisa- tion de fibroblastes humains par ces différentes furocouma- rines diminue la synthèsede l'ADN et de 'ARN en fonction de la dose d'UV-A( 365 nm) Les composés la et lb ont une effi- cacité d'inhibition du même ordre Ils sont légèrement plus puissants que le 8-MOP et beaucoup plus que le 3-C Ps dans les conditions expérimentales utilisées Pour tous les pro- duits, l'inhibition de la synthèse de l'AR Nest légèrement plus faible que celle de l'ADN à une dose d'irradiation identique La synthèse des protéines est par contre peu affectée. En conclusion, les résultats cidessus indiquent que les composés la et lb ont une photoaffinité, vis-àvis de l'ADN nettement plus grande que celle du 8-MOP et une photoréactivité qui avoisine celle du 4,5 ',8-triméthylpso- ralène Les résultats sur l'induction de mutations cyto- plasmiques "petites" (dommages dans l'ADN mitochondrial) et sur l'induction de mutations nucléaires montrent que les deux composés photoréagissent de façon monofonctionnelle avec l'ADN, c'est-à-dire qu'ils sontincapables de former des pontages dans l'ADN. Les résultats ci-dessus ont encore été confirmés par des essais destinés à mesurer sur des cultures cellu- laires l'effet antiprolifératif des nouveaux composés de l'invention. L'activité photobiologique des deux composés monofonctionnels la et lb a été étudiée dans des cellules de mammifères in vitro, afin de déterminer leur effet anti- prolifératif Cet effet a été comparé avec celui du 8-méthoxypsoralène ( 8-MOP), furocoumarine bifonctionnelle. Une lignée diploïde de cellules de hamster chinois V 79 a été utilisée. On a déterminé l'action des composés sur la survie cellulaire (effet antiprolifératif) en mesurant leur pouvoir d'inhiber la capacité des cellules à former des colonies La technique utilisée est celle décrite par C F Arlett ( 1977) (C F ARLETT "Mutagenicity testing with V 79 chinese hamster cells" In Handbook of Mutageni- city Test Procedure, edited by B J Kilbey, Elsevier/North Holland Biomedical Press, 1977, p 175-192). L'effet antiprolifératif des composés la et lb -6 a été déterminé pour une concentration de 5 10 M Les doses de rayonnement UVA de 365 nm s'échelonnaient entre 200 et 3200 J m 2 En absence de rayonnement, on n'a observé aucune diminution de la survie cellulaire pour chacun des deux composés. Dans le but de comparer les effets antiprolifé- ratifs des composés étudiés, on a déterminé les doses LD 10 qui laissent 10 % de survivants Ces valeurs LD 10 sont respectivement de 540 et 1800 J m 2 pour 11 et 1 l Le composé lb est donc nettement plus efficace que le com- posé la, les deux représentant un effet de photosensibili- sation considérable. En ce qui concerne la comparaison avec la furo- coumarine bifonctionnelle, 8-MOP, largement utilisée actuellement en PUVAthérapie, on peut noter que, pour la m'me concentration ( 5 10-6 M}, la dose LD O est 3800 J m Ceci permet d'affirmer que les deux nouveaux composés la et lb, tout en étant monofonction- nels, ont comparativement au 8-MOP, une action antiproli- férante plus forte En comparaison avec les furocoumarines actuelle- ment utilisées en photochimiothérapie (PUVA) à savoir le 8-Mo P et le 4,5 ',8-T Me P la capacité antiproliférative des nouveaux produits la et lb est comparable à celle des furocoumarines bifonctionnelles tout en comportant moins de risques mutagènes et cancérigènes Ces nouveaux composés possèdent donc une activité photothérapeutique plus inté- ressante que celle des composés analogues connus et utilisés. L'activité clinique et thérapeutique des composés la et lb a été encore mesurée sur la peau humaine. On a dilué 10 mg des composés la et lb dans 2 g d'hydrocérine ROC (lanoline purifiée) rendue liquide par un chauffage à 60 'C. Dans un premier temps cette préparation topique a été testée sur la peau humaine normale (avant-bras) Une quantité dé 10 microgrammes/cm des produits la et lb a été appliquée sur une surface cutanée circulaire de 3 cm de diamètre Les deux produits ont été laissés sur la peau pen- dant 2 heures, afin d'assurer une pénétration cutanée suf- fisante Après ces 2 heures, une irradiation aux ultravio- lets A à 5 J/cm 2 a été appliquée sur les deux zones testées et aucun érythème précoce ni retardé n'a été observé avec ces doses d'irradiation Dans un second temps, la même expérience a été répétée mais avec une irradiation de J/cm 2 pratiquée à travers une plaque de verre afin de supprimer tout effet des ultraviolets B Dans ces condi- tions, un léger érythème est apparu, 72 heures après l'irra- diation Cet érythème, à la limite du visible, a persisté 18 jours Les photographies ont été prises au 6 e jour mais également une étude photopléthysmographique par réflexion a pu être réalisée et a permis d'objectiver un doublement de l'impulsion systolique des capillaires au niveau des zones érythémateuses L'érythème ainsi que les résultats de la photopléthysmographie par réflexion ont été exacte- ment identiques avec les produits la et lb Il n'y a eu, en particulier, aucune desquamation ni aucune douleur locale au cours de l'évolution de ces érythèmes On peut conclure de ces tests que les produits la et lb sont très discrètement érythématogènes dans des conditions o le 3-carbéthoxypsoralène ne l'est pas L'érythème n'appa- rait que pour des doses d'irradiation qui sont le double de celles habituellement utilisées pour une, séance en thé- rapeutique. Les produits la et lb ont été également testés dans le même excipient sur une plaque de psoriasis très inflammatoire Ces deux produits ont été appliqués sur des surfaces de 3 cm de diamètre Sur une troisième surface, l'excipient seul a été appliqué Les doses de produit la et lb appliquées ont été de 30 microgrammes/cm L'appli- cation a été faite, ainsi que celle de la lanoline seule, 2 heures avant les séances d'irradiation Les doses d'irra- diation ont été d'emblée de 5 J/cm 2 et les séances se sont répétées tous les deux jours, soit plus précisément chaque lundi, mercredi et vendredi matin Dès la 4 e séance on observait une discrète diminution des squames au niveau des zones o étaient appliqués les produits la et lb ainsi qu'une diminution palpable de l'infiltration A cette date, les photographies ne permettaient pas d'objectiver de dif- férence Le blanchiment complet des zones traitées par les produits la et lb a été obtenu à la 10 e séance, soit après une dose totale d'irradiation de 50 J/cm 2 Ce blanchiment a été pratiquement aussi rapide sur les zones traitées par les produits la et lb La zone traitée par la lanoline est restée absolument sans modification Au cours de ce traite- ment aucun érythème ni effet secondaire n'ont été observés au niveau des zones traitées par les produits la et lb; cependant on observe une hyperpigmentation au niveau de ces deux zones en particulier pour lb. Ce test thérapeutique a été pratiqué sur 3 patients et a donné des résultats identiques dans chaque cas On notera l'excellente action des composés la et lb sur les zones atteintes par lepsoriasis lesquelles blan- chissent en 10 séancesce qui est exceptionnellement court. En conclusion, les composés la et lb sont aussi efficaces ou plus efficaces que les psoralènes bi-fonction- nels, moins mutagènes que le 3-carbéthoxypsoralène et ne provoquent pas d'effets secondaires de type érythématogène dans les conditions thérapeutiques Ils sont pigmentogènes. Les meilleurs résultats ont été obtenus jusqu'à présent avec le composé lb Ces nouveaux composés peuvent être utilement mis en oeuvre dans la photochimiothérapie, même sur des sujets d'âges compris entre 18 et 50 ans et même pour le traitement des psoriasis de l'enfant,pour lesquels il n'existe pas actuellement que peu de thérapeutique efficace. En raison de leur effet pigmentogène,clairement démontré, les nouveaux composés trouvent également application en cosmétique. REVENDICATIONS 1 Pyrido ( 3,4-c)-psoralènes ou pyrido( 3,4-c) furo( 3,2-g) oeumarines répondant à la formule générale I 1 k N 3 (t) 8 6 R formule dans laquelle le radical R représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle inférieur en C 1-C 4, de pré- férence un radical méthyle ou un groupe alcoxy inférieur en C 1-C 4, de préférence le radical méthoxy. 2 Procédé pour l'obtention des pyrido( 3,4-c)- psoralènes selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir un acétate d'hydroxy-6 ou un acétate d'hydroxy-6-alkyl-7 (ou alcoxy-7) dihydro-2,3 benzofuranne sur une carbéthoxy-3 pipéridone-4, ce qui conduit à une hexahydro-1,2,3,4,9,10 pyrido( 3,4-c)furo( 3,2-g) coumarine pouvant être substituée en position 3 et en position 7 et on soumet cette dernière à une réaction d'aromatisation au cours de laquelle on réalise à la fois la déshydrogénation et l'enlèvement du groupement substituant en 3. 3 Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce que, à titre de produit de départ, on utilise un composé de formule II -3 OC 5 6 (II) OCOCH R dans laquelle R a la signification mentionnée précédemment. 4 Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que, à titre de réactif de départ, on utilise la benzyl-1 carbéthoxy-3 pipéridone-4 de formule III r/CH 2-C 6 H 5 (III) o ce qui conduit à un produit intermédiaire de formule IV N 5 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 2 à 4, caractérisé en ce que la première étape est réalisée en milieu acide, en particulier d'acide acétique contenant du gaz chlorhydrique. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 2 à 5, caractérisé en ce que la réaction d'aromatisa- tion de la deuxième étape est conduite en milieu solvant, par exemple le diphényléther ou la décaline, en présence d'un agent de déshydrogénation, tel que le palladium sur. charbon. 7 Application des pyrido( 3,4-c) psoralènes selon la revendication 1 ou obtenus par le procédé selon l'une 252 1 998 quelconque des revendications 2 à 6, à titre de médicaments, en particulier pour le traitement des affections cutanées. 8 Application selon la revendication 7, pour le traitement des affections cutanées et plus spécialement pour le traitement des dermatoses inflammatoires bénignes et malignes à savoir le psoriasis, le mycosis fongolde, les eczémas constitutionnels et de contact, les parapsoriasis en plaques et en gouttes, les pelades, les prurigos, les lichens plans, les urticaires pigmentaires ainsi que les troubles de la pigmentation et les photodermatoses. 9.Composition pharmaceutique contenant, à titre d'agent actif, au moins un des pyrido( 3,4-c) psoralènes selon la revendication 1 ou obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, notamment convenant à l'administration locale ou orale, en particu- lier sous forme de pommade ou solution. Composition selon la revendication 9, carac- térisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutique- ment efficace d'au moins un desdits pyrido( 3,4-c) psoralènes, en particulier environ 0,1 à 2 % en poids, et spécialement d'environ 0,5 % dudit agent actif, par rapport à la composi- tion totale. 11 Composition cosmétique contenant, à titre d'agent actif, au moins un des pyrido( 3,4-c) psoralènes selon la revendication 1 ou obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, en association avec un véhicule convenant à l'application externe. 12 Composition selon la revendication 11, caractérisén ce qu'elle contient une quantité efficace pour stimuler la pigmentation de la peau, d'au moins un desdits pyrido( 3,4-c) psoralènes, en particulier environ 0,01 à 0,5 % en poids par rapport à la composition totale.