Brevet FR2515828A1 — publié le 19830506

Procédé de mesure in vitro, a partir d'un prélevement de suc duodénojéjunal, de l'insuffisance pancréatique externe, et réactifs pour la mise en oeuvre du procédé. I1 existe de nombreuses méthodes d'exploration fonctionnelle du pancréas exocrine. Les méthodes directes sont basées sur des dosages d'enzymes (amylase, lipase, enzymes protéolytrques) dans les liquides biologiques : le sang, les selles, les urines, le liquide intestinal, le suc pancréatique. Parmi les methodes indirectes, certaines font appel aux connaissances sur le transport intraluminal de la vitamine B12. Des travaux récents realisés par l'équipe du Professeur ALLEN (DENVER-COLORADO) et également d'autres études réalisées in vivo, ont mis en évidence le rôle important des protéases pancréatiques dans le transit intraluminal de la vitamine B12 et de ses accepteurs. En effet, il apparaît maintenant, clairement, que la vitamine B12 est combinée préférentiellement aux protéines R lors de l'étape gastrique de son transit digestif. Dans le duodénum distal et dans le jejunum proximal, les protéines R sont dégradées par les protéases pancréatiques, ce qui libère la vitamine B12 et permet son transfert secondairement sur les sites accepteurs du facteur intrinsèque : ainsi la vitamine B12 pourra etre normalement absorbée au niveau iléal. Au contraire, dans les insuffisances pancréatiques externes, il existe un défaut de dégradation des protéines R, ce qui empêche le transfert de la vitamine B12 sur les sites accepteurs du facteur intrinsèque. La vitamine B12 est donc séquestree et les protéines R ntayant aucune activite perméasique, la vitamine B12 ne pourra être absorbée au niveau iléal. Ceci explique l'existence de malabsorptions chez les insuffisants pancréatiques externes. Pour mesurer l'insuffisance pancréatique externe, BRUGGE, ALLEN et col., en se basant sur le défaut de dégradation des protéines R, ont mis au point un test de Schilling modifié. Il faut rappeler que le test de Schilling explore l'absorption intestinale de la vitamine B12 (non la fonction pancréatique externe). Son principe est le suivant : après ingestion d'une faible dose de vitamine B12 radioactive, l'organisme est saturé par injection intramusculaire d'une forte dose de vitamine B12 non radioactive. Dans ces conditions, la vitamine B12 radioactive absorbée est éliminée dans les urines. En cas de non-absorption, l'élimination est inférieure à 5 Z de la dose ingérée. Dans ce cas, on peut compléter le test en faisant ingérer au malade de la vitamine B12 marquée et du facteur intrinsèque (60/ut). Si le trouble est corrigé, le défaut d'absorption est dû au déficit en facteur intrinsèque caractérisant l'anémie de Biermer. Si l'élimination reste anormalement basse, on peut conclure à un défaut d'absorption non lié à un déficit en facteur intrinsèque. Le test de Schilling ne doit pas être effectué en cas d'atteinte rénale avec trouble de la filtration glomérulaire. Dans le cas d'une insuffisance pancréatique externe, les protéines R qui ne sont pas dégradées séquestrent la vitamine B12 qui, n'étant pas transférée sur les sites accepteurs du facteur intrinsèque au cours de son transit intestinal, ne pourra être absorbée au niveau iléal. Le test de BRUGGE, ALLEN et col. consiste à faire ingérer 57 une association de 57Co-cyanocobalamine couplée avec le facteur 58 intrinsèque et de Co-cyanocobalamine couplée avec la protéine 58 R. On compte ensuite l'activité béta du Co et 1 activité gamma 57 du Co dans les urines de 24 heures et exprime les résultats en rapport des deux activités 58Co/57Co. Il est de tordre de 0,03 à 0,09 % chez les patients insuffisants pancréatiques et de 9,1 à 18,7 % chez les témoins normaux. Toutefois, l'étude préliminaire montre des résultats intermédiaires possibles dans les deux groupes de sujets étudiés, notamment des résultats intermédiaires chez les sujets témoins qui présentent d'autres affections concernant le transit intestinal (modifiçation du pH, déséquilibre de la flore intestinale, etc.). Ce test présente donc les mêmes inconvénients que les autres tests indirects : il ne tient pas compte des conditions du transit intestinal. En résumé, chaque méthode d'exploration de la fonction pancréatique exocrine, qu'elle soit directe ou indirecte, n'est pas suffisante, lorsqu'elle est utilisée isolément, pour affirmer le diagnostic d'insuffisance pancréatique externe. Cependant, la fiabilité des méthodes directes est beaucoup plus grande que celle des méthodes indirectes. Ces méthodes, outre la réalisation de tubage, nécessitent-, pour etre valablement interprétables, le recours à la mesure de plusieurs paramètres et à une stimulation. Il serait donc tres intéressant pour le médecin clinicien hospitalier de disposer d'un seul paramètre direct ne nécessitant pas de stimulation ; il serait plus facilement interprétable et cela simplifierait considérablement la réalisation d'un tubage pancréatique, lequel serait mieux supporté par le patient. Le test radioenzymologique selon l'invention répond à ces objectifs, car il rend compte d'un phénomène de digestion pancréatique physiologique et il est très discriminatif. Le test selon l'invention est un test in vitro effectué à partir d'un prélèvement de suc duodéno-jéjunal. Le principe en est le suivant Après centrifugation et ajustement du pH à 8, le surnageant du suc duodéno-jéjunal est mis à incuber en présence d'un mélange de facteur intrinsèque de porc sous forme libre et de protéine R de porc couplée avec de la 57Co-cyanocobalamine. La radioactivité totale (T)du flacon est comptée (On peut également utiliser un facteur intrinsèque et des protéines R autres que de porc). Durant l'incubation et la période de comptage, les enzymes pancréatiques et intestinales dégradent les protéines R ; la vitamine B12 marquée libérée se fixe sur les sites accepteurs du facteur intrinsèque. L'addition de sérum anti-protéine R de proc en présence de sulfate de sodium permet une immunoprécipitation accélérée du complexe non dégradé protéine R-vitamine B12. Après centrifugation et comptage de la radioactivité du surnageant (S) le pourcentage (P) de la vitamine B12 transférée des protéines R sur les sites accepteurs du facteur intrinsèque est calculé : S x 100 T Le suc duodéno-jéjunal est prélevé de la façon suivante Les patients étudiés sont intubés à l'aide d'une sonde naso-gastro-intestinale à 3 tubes décrite par le Professeur NATUCHANSKI (C.H.U. Poitiers), et modifiée afin de prelever du suc intestinal au niveau de la deuxième anse jéjunale. Les patients ont été mis à jeun dans les 24 heures qui ont précédé l'intubation. La progression de la sonde est assurée par un sac ballast de mercure. Le liquide duodéno-jénunal pourrait également être obtenu par aspiration au cours d'une endoscopie explorant le duodénum jusqu'à l'angle de Thy. On donne ci-dessous un exemple de mode opératoire du procédé selon l'invention Les différents échantillons de sucs intestinaux prélevés sont immédiatement placés dans de la glace, puis centrifugés ; le pH est ensuite amené à 8. Les réactifs utilisés pour le test sont les suivants a) un réactif R1 (un flacon par test) contenant du facteur intrinsèque de porc lyophilisé, sous forme libre (UB 12 BC = 7 ng de vitamine B12 par exemple) et des protéines R de porc, lyophilisées (UB 12 BC = 3 ng de vitamine B12 par exemple) couplées avec la 57Co-cyanocobalamine (par exemple 2 ng > radioactivité 10.000 cpm) ; b) un réactif R2 (un flacon par test) contenant un sérum anti-protéine R de porc, lyophilisé et capable de se combiner à une certaine quantité de protéines R de porc (ayant par exemple une activité UB 12 BC de 20 ng de vitamine B12) et de la globuline sérique 12 bovine (par exemple 5 mg) utilisée comme transporteur c) un réactif R3 constitué par un tampon phosphate 0,3 M à pH = 7,4 ; d) un réactif R4 constitué par une solution de Na2S04 à 20 %. Le mode opératoire du test est le suivant On pipette du liquide duodénojéjunal (3 ml) préalablement centrifugé et ajusté à pH 8, directement dans le flacon contenant le réactif R1 ; on met à incuber à la température ambiante pendant 1 heure, puis on compte la radioactivité totale (T) dans le flacon. On pipette ensuite successivement dans le flacon ci-dessus le réactif R2 (1 ml) le réactif R4 (6 ml) On agite, attend 15 minutes puis centrifuge. On compte alors la radioactivité (S) contenue dans le surnageant (2,5 ml). On calcule le pourcentage (P) de la vitamine B12 marquée transférée des protéines R sur le facteur intrinsèque S x 100 T Résultats Dans les insuffisances pancréatiques externes, il existe une diminution de la dégradation des protéines R, voir même une abolition de cette dégradation et ainsi il n'y a pas de transfert ou un transfert peu important de la vitamine B12 des protéines R sur les sites accepteurs du facteur intrinsèque. C'est pourquoi le pourcentage P de ce transfert est compris entre O et 20 % (O %P Chez les sujets normaux, les protéines R ont été soumises à la dégradation enzymatique pancréatique et la vitamine B12 est transférée massivement sur le site accepteur du facteur intrinsèque, c 'est pourquoi le pourcentage de transfert est supérieur à 60 Z (60 Z C P Le procéde de mesure selon l'invention permet ainsi une étude de l'activité enzymatique protéolytique globale, tenant compte de la synergie enzyme-protéine, et mesurée sur un substrat protéique physiologique. De plus, le paramètre mesuré (pourcentage de protéines R dégradées) est spécifique de la fonction exocrine du pancréas. REVENDICATIONS 1. Procédé de mesure in vitro, effectué sur un prélèvement de suc duodénojéjunal, de l'insuffisance pancréatique externe, caractérisé en ce qu'un prélèvement de suc duodénojéjunal préalablement clarifié par centrifugation ou autre moyen classique, est mis à incuber en présence d'un mélange de facteur intrinsèque sous forme libre et de protéine R couplée avec de la 57Co-cyanocobalamine et que la radioactivité totale (T) du mélange est comptée ; une fois l'incubation terminée, on ajoute au mélange du sérum antiprotéine R et du sulfate de sodium, ce qui provoque une immunoprécipitation accélérée de la fraction de protéine R couplée avec la vitamine B12 non-dégradée, on sépare le précipité par centrifugation et compte la radioactivité (S) du surnageant ; le calcul de P = S xT100 permet de déterminer le pourcentage de vitamine B12 transféré des protéines R sur les sites accepteurs du facteur intrinsèque, qui constitue une mesure de la fonction pancréatique externe. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les échantillons de suc duodénojéjunal ont été prélevés en utilisant une sonde naso-gastro-intestinale à 3 tubes décrite par MATUCHANSKI et modifiée de façon à prélever du suc intestinal au niveau de la deuxième anse jéjunale. 3. Ensemble de réactifs pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend a) un réactif R1, sous forme de doses pour un test, constitué par un mélange de facteur intrinsèque de porc lyophilisé et de 57 protéine de porc lyophilisée couplée à de la Co-cyanocobalamine b) un réactif R2, sous forme de doses pour un test, constitué par du sérum anti-protéine R de porc, lyophilisé, capable de se combiner à la protéine R de porc, et de la globuline sérique bovine c) un réactif R3 constitué par un tampon phosphate 0,3 M à pH = 7,4 ; d) un réactif R4 constitué par une solution à 20 % de Na2SO4. 4. Ensemble de réactifs selon la revendication 3, caractérisé en ce que chaque dose de réactif R1 contient un mélange de facteur intrinsèque de porc ayant une activité UB 12 BC : 7 ng de vitamine B12 > et de protéine R de porc ayant une activité UB 12 BC : 3 ng de vitamine B12, couplée avec 2 ng de 57Co-cyanocobalamine dont la radioactivité est de 10.000 c.p.m. 5. Ensemble de réactifs selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que chaque dose de réactif R2 contient du sérum anti-protéine R capable de se combiner avec une quantité de protéines R ayant une activité UB 12 BC de 20 ng de vitamine B12 et 5 mg de globuline sérique bovine.