Brevet FR2519650A1 — publié le 19830718

La présente invention concerne des lignées cellulaires hybrides murines anti-Herpèsi et un procédé pour leur obtention Elle concerne également les anticorps monoclonaux anti-Herpès produits par ces lignées cellulaires hybrides ainsi que les applications de ces anticorps monoclonaux au diagnostic des affections virales 1 tel s causées par de/ virus notamment par les virus Herpès simplex chez 1 homme. Le traitement efficace des affections virales néces- site la mise au point, par les virologistes, de méthodes de diagnostic rapides, qui permettent d'une part d'affirmer, avec certitude et en un laps de temps court, la présence d'un virus dans les lésions observées et d'autre part, de déterminer le traitement approprié, alors que les lésions virales sont encore minimes C'est notamment le cas des virus Herpès simplex de type 1 et de type 2 (couramment dénommés par les abréviations HSV-1 et HSV-2), vis-à-vis desquels des médicaments, tels que la cytosine arabinoside ou l'acyclo- guanosine peuvent être prescrits Le diagnostic rapide des virus-Herpès simplex est particulièrement justifié dans les cas suivants: de l'herpès néo-natal, qui d'une simple éruption vésiculeuse, dégénère en une encéphalite généralement mortelle ou laisse des séquelles neurologiques définitives; de l'encéphalite herpétique qui, en l'absence de traitement, évolue soit vers la mort, soit vers des séquelles très graves; de la kérato-conjonctivite herpétique au cours de laquelle l'atteinte cornéenne entraîne généralement une cécité définitive. Dans ces trois cas, un traitement thérapeutique approprié, effectué dans les heures qui suivent l'apparition des premiers symptômes, est indispensable pour éviter les séquelles provoquées par ces affections virales Il est donc très important de pouvoir -rapidement déceler le virus responsable de l'affection pour déterminer le traitement thérapeutique approprié. D'autres applications du diagnostic rapide de l'Herpès 2 2519650 simplex sont également intéressantes, notamment dans le cadre de la prévention de l'Herpès néo-natal et dans le cadre des transplantations d'organes. En effet, la prévention de l'Herpès néo-natal nécessite l'éradiction de la transmission sexuelle de l'Herpès type 2: ce qui nécessite un dépistage facile de cette maladie en dermato-vénérologie, la détermination d'un groupe de femmes à haut risque, qui est réalisée par un dépistage systématique, par des techniques de haute sensibilité (par exemple par dosage immunoenzymatique), de la présence de l'Herpès simplex 1 ou type 2 dans les voies génitales D'autre part le p eu de spécificité des lésions pose également un problème aux dermatologistes, notamment dans le cadre des transplantations d'organes o la gravité de l'évolution clinique conduit à traiter précocement les patients. La gravité des affections herpétiques et les possi- bilités thérapeutiques actuelles exigent désormais le développement de méthodes de haute sensibilité et de grande rapidité pour le diagnostic de ce virus. Pour répondre à ces exigences on a Jusqu'à présent utilisé des sérums animaux (par exemple des sérums de lapins ou de cobayes), qui ont permis le développement de procédés rapides de dosage, tels que l'immunofluorescence, l'immuno- enzymologie et la radioimmunologie. Cependant, de tels sérums sont des mélanges d'anti- corps qui, en dépit d'absorptions répétées, révèlent de nombreux déterminants anti-géniques; des réactions croisées vis-à-vis d'autres virus (notamment du groupe Herpès) ainsi que de structures cellulaires (cellules nerveuses notamment) rendent parfois le diagnostic aléatoire. On a maintenant trouvé des lignées cellulaires hybrides murines produisant des anticorps monoclonaux anti- Herpès simplex, qui possèdent un titre élevé et une spéci- ficité rigoureuse De tels anticorps permettent, du fait de leur spécificité rigoureuse et de leur grande affinité, de détecter en l'espace de quelques heures, à moindre frais et en toute certitude, des quantités très faibles d'antigènes herpétiques. Les l'ignées cellulaires hybrides selon l'invention sont obtenues par fusion de splénocytes de souris immunisées contre le virus de l'Herpès simplex et de cellules de myélome de souris. La fusion de cellules de myélome de souris avec des lymphocytes de souris immunisées a été proposée pour la première fois en 1975 par KOHLER et MILSTEIN /Nature 256 495-497 ( 1975) 7 La technique de fusion, également dénommée "technique des hybridomes" a été depuis largement utilisée pour la production d'anticorps monoclonaux purs Cependant, Jusqu'à présent, on n'a iamais,à la connaissance de la deman- deresse, fabriqué des anticorps anti-Herpès simplex par une telle technique De plus, il faut noter que l'on ne peut pas savoir avec certitude si l'on obtiendra par cette tech- nique de fusion l'anticorps ayant la spécificité désirée, même si cette technique est connue dans son principe, du fati: notamment que chaque antigène a une constitution propre et un anticorps spécifique correspondant. 3 usqu'à présent, la technique de préparation d'antigènes viraux et la qualité des souches n'ont permis d'obtenir qu'un nombre relativement réduit de clones produisant les anticorps spécifiques recherchs pzus part cuilerement La présente invention concerne /des lignées cellulaires hybrides murines anti-Herpès simplex, également dénommés "hybridomes murins anti-Herpès simplex" qui produisent des anticorps monoclonaux anti-Herpès simplex. Sous son aspect général, le procédé selon l'invention pour l'obtention de lignées cellulaires hybrides murines anti-Herpès simplex comprend les étapes suivantes de: 1) immunisation de souris avec un virus Herpès simplex (voie IV et IP) 2) Prélèvement de la rate et des adénopathies mesentériques des souris immunisées et séparation de splénocytes; 4 2519650 3) fusion des splénocytes ainsi obtenus avec des cellules de myélome de souris en présence d'un promoteur de fusion; 4) culture des cellules hybrides obtenues, dans un milieu sélectif sur lequel ne se développe pas les cellules de myélomes non fusionnées, et en présence d'éléments nutri- tifs appropriés; ) sélection des cellules produisant l'anticorps désiré-et clonage de ces cellules. Les souches virales utilisées pour l'immunisation des souris sont des souches de virus Herpès simplex, telles que la souche VR 3 (ATCCVR 539) pour obtenir des anticorps 134) monoclonaux anti-Herpès simplex type 1 et la souche G(ATCC VW pour fournir des anticorps monoclonaux anti-Herpès simplex 1 et 2 types / Les souches VR 3 et G sont décrites dans les documents ci-après: souche VR 3: (MAC INTYRE) SCHMIDT and LENNETTE: 3 IMMUNOL 1961, 86, 137 souche G: E 3 ECITO, P M, KIEFF E D; ROIZMAN B 3 gen Virol 1968 2 357-364. Les souches virales sont cultivées sur un milieu nutritif approprié, par exemple des fibroblastes de lapin permettant d'obtenir un titre très élevé de particules virales. Après purification des virus en gradient de saccharose effectuée de manière classique les antigènes viraux ainsi obtenus sont stockés à 80 C par exemple selon la méthode de Ben-Porat T and KAPLAN AS Virology 1970 265-273. Le protocole d'immuntsation des souris et la quanti- té d'antigènes viraux utilisés doivent être suffisants pour obtenir une quantité appropriée de splénocytes immunisés. Avec des souris Balb/C on a trouvé que le protocole d'immunisation ciaprès était approprié: injection au jour 3 de 80 g d'antigène dans du sérum physiologique ( 0,5 ml) par voie intra-péritonéale; injection au jour 3 + 30 de 80 pg d'antigène dans du sérum physiologique ( 0,5 ml) par voie intraveineuse. Trois jours après le rappel, c'est-à-dire au jour 2519650 3 + 33, les souris sont sacrifiées et leur rate et ganglions mésentériques sont aussitôt prélevés, lavés dansdu liquide de Hanks et dilacérés Les splénocytes sont ensuite séparés des lymphocytes par des moyens classiques, par exemple par centrifugation, puis lavés avec le même milieu et numérés. Parallèlement, des cellules de myélome de souris Sp 2/o /-SHULMAN, M, C D WILDE and G KOLHER 1978 Nature 276, 269 7 cultivées en milieu DULBECCO (vendu par Flow Laboratories) sont lavées dans du milieu de Hanks et également numérées. La fusion des cellules, qui constitue la seconde étape du procédé de l'invention consiste à mélanger des cellules de la rate à savoir les splénocytes ainsi que les lymphocytes provenant des adénopathies mésentériques des souris immunisées contre les virus Herpès simplex avec des cellules de myélome de souris, avantageusement à raison de 1 splénocyte pour 2 cellules de myélome (rapport optimum). La fusion proprement dite consiste à mélanger dans un tube les splénocytes et les cellules de myélome dans les proportions indiquées ci- dessus, en présence d'un promoteur de fusion classique A titre de tel promoteur on peut citer les polyéthylèneglycols par exemple le polyéthylène-glycol 4000 qui possède un poids moléculaire de 4000 /- FAZEKAS de St GROTH S, D SCHEIDEGGER, 3 of IMMUNOLOGICAL METHODS 1980, 35 p 1 > 21 7. Après incubation pendant environ 1 minute à 37 C environ, on dilue le culot cellulaire résultant dans un milieu approprié, en opérant de manière à ne pas détruire les cellules, et on procède à la culture initiale des cellules hybrides résultantes dans un milieu sélectif qui n'est pas favorable aux cellules de myélome qui n'ont pas fusionné, c'est- à-dire aux cellules de myélome initiales, de telle sorte que seulement les cellules hybrides se rçproduiront alors que les cellules de myélome meurent. Les cellules'de myélome sont dépourvues de l'enzyme hypoxan- thine-guanine-phosphoribosyl transférase et ne supportent pas les milieux couramment dénommés milieux HAT, c'est-à- 6 2519650 dire les milieux contenant de 1 'hypoxanthine, de l'aminop- térine et de la thymidine. Aux fins de l'invention on utilise avantageusement comme milieu sélectif le milieu DULBECCO contenant 15 % de sérum de veau foétal et additionné de thymidine ( 1,6 10 5 M) d'hypoxanthine ( 10 M), d'aminoptérine ( 4 10 M) (Milieu DULBECCO HAT). Dans ce milieu sélectif sont ajoutés des éléments nutritifs appropriés pyruvate + 1-glutamine On utilise avantageusement selon l'invention les macrophages péritonéaux de souris non immunisées Les cultures sont réalisées à 37 %C environ dans une étuve contenant 10 % de C 02 Dans ces conditions on obtient au bout d'un certain temps uniquement des cellules hybrides; en effet, étant donné le milieu sélectif utilisé les cellules de myélome nonifusionnées ne survivent pas, pour les raisons indiquées cidessus D'autre part, les splénocytes qui n'auraient pas fusionné donnent seulement un nombre limité de générations, puis meurent Seules lés cellules hybrides, qui possèdent à la fois le caractère maligne des cellules de myélome et l'aptitude des splénocytes à se développer sur le milieu sélectif choisi se reproduisent. On procède ensuite à la sélection des cellules hybrides produisant l'anticorps désiré et on clÈne les cellules hybrides sélectionnées sur un milieu de culture approprié, DULBECCO + Hypoxanthine + Aminoptérine + Thymidine. On utilise avantageusement le milieu de culture utilisé pour la culture initiale des cellules hybrides Comme pour la culture initiale on opère à 371 C environ et en présence de 10 % de C 02. La sélection est effectuée par méthode immunoenzyma- tique et immunofluorescence indirecte à partir des surnageànts des cultures de cellules Seules sont retenues lors de chaque clonage, les cellules secrétant les anticorps caractéristiques détectés par les deux méthodes ci-dessus, qui seront décrites plus en détail ci-après au sujet de l'application des anti- corps monoclonaux obtenus. Selon le procédé de l'invention on obtient des lignées se cellules hybrides murines anti-Herpès simplex humains type 1 ou type 1 et 2, selon le virus utilisé pour immuniser les souris. Ces lignées de cellules hybrides ont été déposées le 8 janvier 1982 dans la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de L'INSTITUT PASTEUR à Paris sous les numéros I-182 et I-183 qui sont respectivement: n I-183 ( 08-01-82): lignée de cellules hybrides murines anti-Herpès simplex de type 1 n 1-182 ( 08-01-82): lignée de cellules hybrides murines anti-Herpès simplex de type 1 et 2 On les conserve par congélation dans 90 % de sérum foetal et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO). Ces lignées cellulaires hybrides secrètent des anticorps monoclonaux antiHerpès simplex type 1 ou communs aux types 1 et 2, qui peuvent être caractérisés de la façon suivante: ils sont spécifiques soit de l'Herpès simplex de type 1, soit des antigènes communs aux deux types d'Herpès. Ces anticorps monoclonaux font également partie de l'inven- tion On les conserve dans les conditions ci-après: congélation à 800 ou lyophilisation. On a trouvé que l'anticorps monoclonal anti-Herpès simplex de type I selon l'invention est capable par immuno- fluorescence indirecte ou par méthode immunoenzymatique de détecter de façon spécifique le virus Herpès simplex de type 1. Par contre, l'anticorps monoclonal anti-Herpès simplex de type 1 et 2 selon l'invention est capable de détecter, par ces deux mêmes méthodes, les deux types de virus Herpès simplex. Ces anticorps monoclonaux peuvent convenir parti- culièrement bien pour la détection de virus Herpès simplex notamment par les techniques d'immunofluorescence (directe ou indirecte) ou immunoenzymatique. Les anticorps selon l'invention peuvent également être utilisés dans d'autres techniques telles que les techniques radioimmunologiques. 8 2519650 On rappellera ci-après le mode opératoire de ces méthodes de dosage bien connues de l'homme de l'art Dosage par immunofluorescence Les cellules provenant du grattage des lésions (ou de l'empreinte de la biopsie) sont fixées à l'acétone sur une lame. L'anticorps est mis en contact avec les cellules, par exemple pendant 1/2 heure à 370 C. Après lavage, une anti Ig G de souris marquée à la fluoresceine est mise en contact avec les cellules, incubée comme précédemment puis lavée. La lame est examinée avec un microscope à U V, les cellules parasitées par l'Herpès apparaissent fluorescentes. En alternative on peut marquer directement l'anticorps spécifique antiHerpès simplex et supprimer l'utilisation de 1 ' anti-Ig G. Dosage immunoenzymatique Il consiste dans un premier temps à absorber les antigènes présents dans la lésion sur des anticorps spécifi- ques préalablement fixés sur un support (plaque, billes ou similaires), puis à mettre en présence ce support avec les anticorps spécifiques marqués par une enzyme, enfin à rechercher l'activité enzymatique par une réaction colorée lue soit à l'oeil, soit avec un photomètre La durée d'un tel dosage est d'environ quatre heures. L'invention concerne également les coffrets de diagnostic pour méthode de dosage par immunofluorescence ou immunoenzymatique. Le coffret de diagnostic par immunofluorescence directe selon l'invention contient: Au moins un anticorps monoclonal anti-Herpès simplex marqué avec un agent de fluorescence, tel que la fluorescéine, des lames pour observation au microscope des tampons. Ce coffret convient pour une détection par immuno- fluorescence directe On peut également réaliser avec les anticorps monoclonaux selon l'invention des dosages par immunofluorescence indirecte (dosage par double anticorps) c'est-à-dire en utilisant un second anticorps, généralement des anticorps anti-Ig G de souris marqués à la fluorescéine. Ainsi, l'invention a également pour objet un coffret de dosage par immunofluorescence indirecte qui contient: au moins un anticorps monoclonal anti-Herpès simplex un anticorps anti-Ig G de souris marqué avec un agent de fluorescence, tel que la fluorescéine, des lames pour observation au microscope des tampons. Le coffret de diagnostic par méthode immunoenzy- matique selon l'invention contient: au moins un anticorps monoclonal antiherpès marqué par une enzyme, un support immunoadsorbant, un agent révélateur de l'activité enzymatique des tampons. Les coffrets selon l'invention contiennent avantageu- sement deux anticorps monoclonaux anti-Herpès simplex, à savoir un anticorps monoclonal anti-Herpès simplex type 1 et.un anticorps monoclonal anti-Herpès simplex type 1 et 2. De tels coffrets permettent de détecter la présence dans une affection virale de l'un des virus Herpès simplex type 1 ou type 2. Les anticorps monoclonaux peuvent également être utilisés dans d'autres procédés de diagnostic, tels que par exemple les procédés ci-après 1) dosage par immuno-microscopie électronique o les particules virales sont concentrées par piégeage des anticorps monoclonaux et visualisées par coloration négative. La durée d'un tel dosage est d'environ une heure. 2) agglutination de staphylocoques dorés préala- blement sensibilisés par l'anticorps monoclonal La durée de cette détermination est d'environ 30 minutes. 2519650 Les anticorps monoclonaux selon l'invention sont un progrès très important pour la virologie clinique. De tels anticorps,du fait de leur spécificité rigoureuse et de leur grande affinité permettent de détecter en l'espace de quelques heures, à moindre frais et en toute certitude des quantités très faibles d'antigène un diagnostic aussi sur n'était pas réalisable jusqu'à présent avec les sérums hyperimmuns L'introduction des anticorps monoclonaux anti-Herpès simplex est donc une amélioration très nette pour la virologie médicale qui débouche sur de nombreuses applications cliniques (gynéco- obstétrique, néo-natalogie, dermatologie, neuro-chirurgie, ophtalmologie, etc). Ainsi, grâce aux anticorps selon l'invention on peut détecter rapidement la présence des virus Herpès simplex sur des prélèvements de vésicules (en dermatologie), une biopsie encéphalique (en neurochirurgie) les prélèvements faits par grattages conjonctivaux (en ophtalmologie), grattages au niveau du col (en gynécologie) et grattages des vésicules sur le nouveau-né (en néo-natalogie-). L'invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples illustratifs mais non limitatifs ci-après EXEMPLE 1: Fabrication de lignées de cellules hybrides murines anti- Herpès simplex type 1 et type 2. Les virus Herpès simplex type 1 et type 2 seront dénommés ci-après HSV-1 et HSV-2. 1) Protocole d'immunisation On a utilisé les souches virales suivantes a) souche VR 3 pour les cellules hybrides HSV-l souche G pour les cellules hybrides HSV-2 Les souches ont été cultivées sur fibroblastes de lapin. Après purification des virus en gradient de saccharose, les antigènes viraux ainsi obtenus ont été stockés à 80 C. b) Immunisation des souris Les souris Balb/C ont été immunisées soit vis-à-vis de HSV-1, soit vis-àvis de HSV-2 selon le protocole suivant: pg d'antigène par voie intrapéritonéale au Jour 3, yg en intra-veineuse au jour 3 + 30. 2) Protocole de fusion a) Les cellules 3 jours après le rappel (jour 3 + 33) les souris o ont été sacrifiées, la rate et les ganglions mésentériques ont été aussitôt prélevés, lavés dans du liquide de Hanks et dilacérés Les splénocytes et les lymphocytes ont été séparés par centrifugation puis lavés dans le même liquide et numérés. I 5 De même les cellules de myélome Sp 2/0 qui avaient été cultivées en milieu DULBECC O ont été lavées dans du Hanks et numérées. Parallèlement les macrophages péritonéaux ont été obtenus, par lavage du péritoine de souris Balb/C non immunisées avec du sérum physiologique. b) la fusion Pour obtenir la formation des cellules hybrides, les splénocytes et les Sp 2/0 ont été mélangés dans un tube à raison de 1 splénocyte pour 2 Sp 2/0, soit pour une plaque de micro-culture de 96 cupules 50 106 spénocytes pour i O O 106 Sp 2/10. Après centrifugation, le culot cellulaire a été remis en suspension dans 0,5 ml de polyéthylèneglycol 4000 à 50 % en H 20. Après une incubation de 1 minute à 37 C, 10 ml de Hanks ont été ra Joutés lentement: 1 goutte toutes les 10 secondes pendant 5 minutes, puis le reste du Hanks en agitant très doucement l'ensemble. 3) la culture initiale La culture initiale a été réalisée en plaque de micro-culture (Costar, 96 cupules) en présence de milieu le DULBECCO contenant 15 % de sérum de veau foetal et additionné 12 2519650 de thymidine ( 1,6 10 5 M), d'hypoxanthine ( 10-6 M), d'aminoptérine ( 4 10 7 M) (milieu DULBECCO HAT). Dans chaque cupule ont été successivement versés t d'une suspension contenant 3 103 macrophages péri- toneaux, puis 150 ri contenant 5 105 splénocytes et donc 106 Sp 2/O. Trois plaques o At ainsi été réalisées à partir de chaque souris testée. Les plaques ont été immédiatement mise à 37 C dans une étuve contenant 10 % de C 02. 4) Technique de sélection des cellules hybrides Au cours des différentes étapes de sélection des cellules hybrides, le protocole ci-après a été utilisé: Un volume de surnageant de culture a été prélevé stérilement ( 0, 15 ml) et remplacé par un même volume de milieu neuf. Chaque surnageant ainsi prélevé a été ensuite testé par la technique immunoenzymatique bien connue sous le nom de technique ELISA (qui est une technique de dosage immuno- enzymatique avec immunoadsorbant), en micro-technique, vis-à- vis de 3 antigènes différents: Herpès 1 (souche VR 3), Herpès 2 (souche G) et antigène témoin (cellules Hela ATCC CCL 2 3 ournal of Exp Med 1953 vol 97 p 695). Les surnageants ont été étudiés à une seule dilution ( 1/-4) La présence d'anticorps de souris a été recherchée par un Fab deiouton anti Ig G (H + L) de souris (Institut Pasteur Production). Parallèlement chaque surnageant positif a également été testé en immunofluorescence indirecte vis-à-vis de 4 souches d'Herpès de type connu: 2 HSV-1 et 2-HSV 2 provenant d'isolements à partir de lésions (dilution au 1/10). Seules ont été retenues lors de chaque clonage, les cellules secrétant des anticorps caractéristiques détectés par la technique ELISA et par immunofluorescence indirecte. Chaque clone a été répliqué lentement puis congelé dans 90 % de sérum de veau foetal et 10 % de DMSO. Des sous-clonages des hybrides ont été réalisés en plaque de micro-culture. Chaque cupule a d'abord reçu une suspension de 3.103 macrophages péritonéaux de souris (en DULBECCO HAT) puis statistiquement u T Ucellule d'hybridome dans le même milieu. Les plaques ont été alors incubées à 37 C en présence de 10 % de C 02. Les cupules contenant un clone ont été testées comme précédemment vis-àvis des antigènes HSV-1 et HSV-2 tant par technique immunoenzymatique que par imuno-fluores- cence. Deux clonages successifs ont ainsi été réalisés. EXEMPLE 2: Mise en évidence de la spécificité des clones HSV-1 et HSV-2 obtenus. A activité vis-à-vis des virus HSV-1 et HSV-2 Les deux clones obtenus ont été testés aux dilu- tins suivantes: 1/1, 1/10 et 1/100 par immunofluorescence indirecte vis-àvis des souches Herpès simplex type 1: souches VR 3, A 44 et B, Herpès simplex type 2: souches G et M S. D'autres souches provenant de malades et typées par immunofluorescence (sérums DAKO) /-Ref VESTERGAARD B F, THYBO H scand 3 of Infect Dis 1974, 6, 113 _ 7 ont été testées avec ces surnageants ( 8 souches étaient de type 1, et 8 souches de type 2). On a opéré de la façon suivante: Dans des lames spéciales stériles et avec des alvéoles, on a déposé une goutte d'un prélèvement viral; on a fait sécher sur ventilateur ( 30 C), puis on a plongé la lame dans de l'acétone à 20 C Les lames ainsi obtenues peuvent être soit stockées à 80 C jusqu'à utilisation ou utilisées immédiatement pour la détection. On a déposé 20 p 1 d'anticorps monoclonal (surna- geant) dans du PBS (solution tampon phosphate) dans chaque 14 2519650 alvéole et on a incubé 30 minutes à 37 C, puis on a lavé avec du PBS p H 7,4 trois fois On a ensuite incubé avec des anticorps anti-Ig G de souris marqués à la fluorescéine, minutes à 37 C On a ensuite lavé avec du PBS p H 7,4 trois fois, puis avec de l'eau distillée (en quelques secondes). On a monté les lames avec de la glycérine tamponnée avec PBS p H 7,4 et on a procédé à la lecture au microscope de fluorescence. Dans tous les cas des résultats comparables ont été obtenus: BK Clone HSV l, fluorescence positive vis-à-vis des seules souches HSV-l jusqu'à dilution 1/10, Clone HSV 2, fluorescence dans les mêmes conditions vis-à-vis des souches HSV-l et HSV-2. B Comportement vis-à-vis des virus non HSV On a opéré comme ci-dessus en utilisant des souches de virus non HSV,à savoir de grippe A, grippe B, adenovirus, respiratoire syncitial,cytomegalovirus. Aucune fluorescence n'a été observée avec les clones HSV-l et HSV-2 enon dilués. Ces résultats montrent que les anticorps monoclonaux secrétés par les cellules hybrides de l'invention présentent une haute spécificité vis-àvis des virus Herpès simplex 1 et 2. EXEMPLE 3: Dosage immunoenzymatique utilisant un anticorps monoclonal selon l'invention Pour effectuer un tel-dosage on a procédé de la façon suivante: Les anticorps monoclonaux ont été dilués dans du tampon TrisEDTA-Na Cl p H 9,6 On a coulé les anticorps monoclonaux sur une plaque NUNC ( 96 trous) 200 >l//trou, et incubé à 4 C 1 nuit ou plus On a ensuite lavé la plaque d'eau déminéralisée avec 0,05 % Tween 20 On a déposé la suspension à analyser, 200 rl/trou On a incubé pendant 3 heures à 37 C, puis lavé avec du tampon On a ensuite incubé 200 pl d'aiticorps monoclonaux marqués à la péroxydase, puis procédé à un lavage On a ensuite utilisé de l'ortho- phénylène diamine (OPD) dans le tampon citrate-phosphate p H 5,0 pour révéler l'activité enzymatique, que l'on observe à l'oeil nu ou au photomètre. REVENDICATIONS 1 Procédé pour l'obtention de lignées cellulaires hybrides murines produisant des anticorps monoclonaux anti- Herpès,caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer la fusion de splénocytes de souris immunisées contre un virus Herpès et de cellules de myélome de souris. 2 Procédé selon la revendication 1 pour l'obtention de lignées cellulaires hybrides murines produisant des anti- corps'monoclonaux anti-Herpès simplex humains,caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1)immunisation de souris avec un virus Herpès simplex, 2) prélèvement de la rate et des adénopathies mésen- tériques des souris immunisées et séparation de splénocytes; 3)fusion des splénocytes ainsi obtenus avec des cellules de myélome de souris en présence d'un promoteur de fusion; 4)oulture des cellules hybrides obtenues dans un milieu sélectif sur lequel ne se développe pas les cellules de myélome non fusionnées,et en présence d'éléments nutri- tifs appropriés. )sélection des cellules produisant l'anticorps désiré et clonage de ces cellules. 3.Procédé selon la'revendication 2,caractérisé en ce que: l) l'immunisation des souris est réalisée par deux injections à 30 Jours d'intervalle,la première par voie intra- péritonéale,la seconde par voie intraveineuse, 2)la fusion est réalisée en utilisant un splénocyte pour 2 cellules de myélome en présence de polyéthylèneglycol 4000, 3)la culture des cellules hybrides est réalisée sur un milieu sélectif contenant de l'hypoxanthine,de l'aminoptérine et de la thymidine à 37 C en présence de 10 % de C 02 et de macrophages péritonéaux de Fouris non immunisés comme éléments nutritifs. 4)la sélection des souches hybrides est effectuée par dosage par immunofluorescence indirecte et dosage immunoenzymatique. )le clonage est réalisé à 37 C en présence de -5 1 OO de C 02. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisé en ce que l'immunisation des souris est réalisée avec le virus Herpès simplex type 1,souche ATCC VR 539 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisé en ce que l'immunisation des souris est réalisée avec le virus Herpes simplex type 2,souche ATCC VR 734. 6.Lignées de cellules hybrides murines produisant des anticorps monoclonaux anti-Herpès simplex humains obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5. 7.Lignée de cellules hybrides murines anti-Herpès simplex type 1 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur-Paris sous le n I-183 08-01-82. 8.Lignée de cellules hybrides murines anti-Herpès simplex type 1 et 2, déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur-Paris- sous le n I-182 08-01-82. 9 Anticorps monoclonaux anti-Herpès simplex produits par la lignée de cellules hybrides murines anti-Herpès simplex obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. Anticorps monoclonaux anti-Herpès simplex type 1 produit par la lignée de cellules hybrides murines anti- Herpès type 1 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur-Paris,sous le n I-183 08-01-82. 11.Anticorps monoclonaux anti-Herpès simplex type 1 et 2,produit par la lignée de cellules hybrides murines anti-Herpès simplex type 1 et 2 déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur-Parissous le n I-182 08-01-82. 12 Application des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 9 àll,au diagnostic rapide des affections virales causées par les virus Herpès notamment par les virus Herpès simplex humains. 13.Application selon la revendication 12,caractérisée en ce que le diagnostic est réalisé par immunofluorescence ou par méthode immunoenzymatique. 14 Coffret de diagnostic des virus Herpès simplex par immunofluorescence directe,caractérisé en ce qu'il comprend s -au moins un anticorps monoclonalanti-Herpès simplex marqué avec un agent de fluorescence,tel que la fluoresceine, -des lames pour observation au microscope, -des tampons. 15.Coffret de diagnostic des virus Herpès simplex par immunofluorescence indirecte,caractérisé en ce qu'il comprend: -au moins un anticorps monoclonalanti-Herpès -un anticorps anti-Ig G de souris marqué avec un agent de fluorescence,tel que la fluorescéine, -des lames pour observation au microscope -des tampons 16.Coffret de diagnostic des virus Herpès simplex par méthode immunoenzymatique,caractérisé en ce qu'il comprend: -au moins un anticorps manoclonal anti-Herpès marqué par une enzyme, -éventuellement un support immunoadsorbant, -un agent révélateur de l'activité enzymatique. -des tampons. 17.Coffret selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 pour le diagnostic des virus Herpès simplex typel et type 2 caractérisé en ce qu'il contient: -un anticorps monoclonal anti-Herpès simplex type 1 selon la revendication 10, -un anticorps monoclonal antiHerpès simplex type 1 et 2 selon la revendication 11.