Brevet FR2512459A1 — publié le 19830311

L'invention est relative à un procédé et à un dispositif de dilacération des tissus pour l'obtention de cellules isolées. Elle trouvera notamment son application en neurobiologie pour la culture de cellules de systèmes nerveux. La présente invention a été conjointement réalisée par Madame JOUBERT Raymonde et Monsieur BISCONTE Jean-Claude du Laboratoire de Neurologie Quantitative de BOBIGNY et Monsieur BUYS Bruno et Monsieur MOSCHETTO Vives du Centre de Technologie Biomédicale INSERM de LILLE. Actuellement, il existe trois méthodes principales qui permettent une dispersion cellulaire des tissus qui malheureusement bouleverse profondément les relations intercellulaires, ces méthodes sont basées sur - les traitements enzymatiques, - les agents chélateurs, - les forces mécaniques. Les deux premières méthodes emploient diverses substances chélatrices des métaux lourds tels que l'acide éthylène Diamine Tetra Acétique (EDTA) ou des enzymes protéolytiques (papaïne, pepsine, trypsine) et d'autres types d'enzymes : pronase, hyaluronidase, neuraminidase, collagenase, etc.... Les propriétes dissociantes de ces enzymes ont eté commises à la dispersion de tissus ou d'organes depuis 1916 par ROUS et JONES mais ce n'est qu1à partir de 1952, par les travaux de DULBECCO et de MOSCONA, que l'emploi de la trypsine va se généraliser. L'utilisation de ces techniques est actuellement si répandue qu'une liste exhaustive ne peut guère en entre adressee. Les alterations membranaires causées par les digestions enzymatiques ont fait l'objet de très nombreux travaux. Dès 1959, MONIER et al. demontrent un changement de la mobilité électrophorétique de cellules traitees par les enzymes, puis SEA'N et C00K (1965) signalent une perte des composants internes de la cellule due à la dénaturation profonde de la surface cellulaire ; enfin LILIEN (1968) et POSTE (1971) mettent en évidence la destruction ou la modification de la membrane peri-cellulaire et des macromolecules impliquées dans les phénomènes d'adhésion intercellulaire. Cette adhésion, apres traitement enzymatique, apparait liée à la régénération des molécules touchees par l'enzyme, et le temps de reconstitution des propriétes physico-chimiques de la périphérie cellulaire influence l'attachement au substrat et l'adhésion cellule-cellule (WEISS et KAPES, 1966). C'est alors que STEINBERG et al (1973), dans une étude consacrée au recouvrement des propriétes d'adhésion de cellules neurales de retine (poulet E 6-7) dissociées par de la trypsine, montrent qu'il existe un retard dans l'aggrégation de ces cellules après incubation, avec l'enzyme, sans toutefois pouvoir en expliquer les causes. Ils constatent que ce retard est atténué et parfois supprimé par la jonction de "EDTA" sans Ca ++ni Mg++. KOPPEL et al (1974) rapportent également une inhibition de l'aggrégation par la destruction des sites de liaison lors de la protéolyse. Ces notions s'accordent avec l'hypothèse de KEMP et al. (1973) sur la participation des glycoprotéines à l'aggrégation cellulaire. Ce concept est étayé par les études de DEMAN et al. (1974) qui montrent que l'adhésion intercellulaire est augmentée (Cel Hela) par la suppression de l'acide sialique terminal, alors que la trypsinisation en diminue le taux. Ainsi, le réagencement de certaines particules pré-existantes sur la membrane semble être causé par une augmentation de la mobilité des molécules de surface des cellules liées à la trypsinisation (POLAK CHARCON et al., 1978). L'action de la trypsine peut être modifiée par la présence de cations divalents (AMSTERDAM et JAMIESON, 1974 - AOYAMA et OKADA, 1977 - TAKEICHI, 1977). En 1978, VOGEL met l'accent sur l'effet primaire de la trypsine sur le cytosquelette de cellules fibroblastiques embryonnaires d'origine humaine (HLM 18). Il en resulte également des traitements proteoly- tiques des modifications d'ordre métabolique telles que l'augmentation de "l'uptake" d'oxygène comme l'a montré PHILIPS en 1967. Quant aux méthodes de dispersion mécanique pourtant très employées, elles n'ont pas suscité le même intérêt d'étude que lestraitements chimiques. Il faut souligner que leur point d'impact est plus difficile à cerner. Toutefois, dans le cas des techniques faisant appel à l'aspiration-refoulement à travers l'orifice d'une pipette PASTEUR, il semble que les cellules soient soumises tout d'abord à un effet de "filière" puis à un gradient de vitesse dans le tube capillaire se traduisant par un cisaillement et une rupture des liaisons. Ce mode de dissociation s'il n'est pas suivi de filtrations, provoque des artefacts par la présence de fragments tissulaires n'ayant pas subi la dispersion et réalisant de véritables explants. Cependant, les répercussions de ce type de dissociation sur la cellule ont été décrites soit en comparaison avec celles des enzymes, soit dans le cadre de double-dissociation. Parmi ces methodes mécaniques, citons les ultrasons, en fait fort peu utilisés pour une remise en culture. En 1970, HEMMINKI et al. décrivent une méthode appliquant une dispersion mecanique par ultrasons et une digestion enzymatique à des cerveaux de rat adulte. Ces auteurs considèrent que la structure complexe du tissu cérébral adulte est davantage endommagee par l'action mécanique seule, et préconisent cette double dissociation. Mais les principaux travaux scnt ds à SENSENBENNER et al. (1969), démontrant que la mise en oeuvre d'une dissociation mécanique par passage du tissu à travers les mailles d'un filtre en nylon se révèle meilleure pour l'étude biochimique et morphologique de SN périphérique de jeunes embryons de poulet que la dispersion par les enzymes. Cependant, en 1977, NADERSPACH et SENSENBRENNER notent dans une étude comparative de deux modes de dispersion sur du SNC embryonnaire de poulet, que la dissociation enzymatique semble produire des populations cellulaires plus riches en neurones après une longue période de culture. Les effets de la trypsine semblent changer les possibilités de croissance et de différenciation en causant une dédifférenciation cellulaire au moment de la dissociation. Ce dernier point a également été souligne par Mc LEAN et al., (1975), sur des cellules de muscle cardiaque. En conclusion, il n'existe actuellement aucune méthode de dissociation cellulaire qui donne entièrement satisfaction. Le but principal de la presente invention est de proposer un procédé et un dispositif d'application du procéde, pour la dissociation des cellules à partir d'un tissu tel que les cellules isolées obtenues soit intactes tant sur le plan morphologique que métabolique afin qu'elles puissent se reproduire ultérieurement. Un autre but de la présente invention est de proposer un dispositif de dilacération des tissus qui permet de traiter de petits échantillons et qui répond aux normes de non-contamination et de stérilisation nécessaires en cultures. De plus, le dispositif propose peut etre adapté à une production en continu nécessaire dans une phase industrielle d'utilisation du dispositif. D'autres buts et avantages de la présente invention apparai tront au cours de la description qui va suivre, qui n'est cependant donnee qu'à titre indicatif et qui n'a pas pour but de limiter l'inven tion. Le procédé de dilacération des tissus pour dissocier les cellules sans les agresser afin de garder leur morphologie et leur métabolisme intacts pour autoriser une culture ultérieure des cellules, est caractérisé par le fait que l'on introduit le tissu cellulaire dans une chambre remplie de fluide et que l'on provoque un brassage complet dans la chambre pour creer des turbulences dans le fluide et un laminage dans une zone de la chambre qui crée des effets de cisaillement dans le fluide, afin de provoquer la dissociation des cellules. Le dispositif de dilacération des tissus pour en dissocier les cellules, sans les agresser afin de garder leur morphologie et leur métabolisme intacts pour autoriser une culture ultérieure des cellules, est caractérisé par le fait qu'il présente une chambre contenant un fluide dans lequel baignent les tissus en suspension, et des moyens pour brasser le fluide dans la chambre et provoquer des effets de cisaillement du fluide dans la chambre. L'invention sera mieux comprise si l'on se réfère à la description ci-dessous, ainsi qu'aux dessins en annexe qui en font partie intégrante. La figure 1 schématise, le dispositif de l'invention. La figure 2 illustre la distribution des gradients de vitesse dans la chambre de dissociation. La figure 3 représente un mode préférentiel de réalisation du dispositif selon l'invention. La figure 4 schématise le principe de fonctionnement de l'électronique de commande du dispositif selon l'invention. La figure 5 schematise la disposition des pôles d'excitation du rotor du dispositif de l'invention. La figure 6 schématise le principe de fonctionnement de l'entraînement en rotation du rotor du dispositif de l'invention. La figure 7 représente un mode préférentiel de réalisation du dispositif de support et dtentraînement du dispositif de l'invention. La figure 8 illustre à titre- d'exemple, le dispositif de l'invention sur son support. La figure 9 représente un diagramme d'utilisation du dispositif selon l'invention. Le procédé, selon l'invention, a pour but de dilacérer les tissus, formés d'amas cellulaires pour en dissocier les cellules qui deviennent ainsi isolées. Le principe de dissociation utilisé ici est mécanique, il s'agit d'appliquer des contraintes de cisaillement variées dans leur intensité et dans leur point d'application sur le tissu afin que les forces élastiques de liaison des cellules soient vaincues. Toutefois, afin que les cellules conservent leur morphologie et leur métabolisme intacts, il est nécessaire que les contraintes appliquées à la masse cellulaire le soient de façon non traumatisantes, et pour cela, selon le procedé, ces contraintes seront appliquées par l'intermédiaire d'un fluide. Les tissus sont préalablement plongés dans ce fluide contenu dans un volume appele chambre de dissociation. Dans la chambre de dissociation, on provoque un brassage complet du fluide afin d'homogénéiser son état et des effets de cisaillement qui provoqueront la dissociation des cellules. Au sein du liquide, les effets de cisaillement pourront par exemple être le resultat de l'utilisation d'une pièce mobile dans la chambre. En effet, il est connu, par la mécanique des fluides, que creer des vitesses différentes dans un fluide provoque un laminage de ce fluide en des couches limites sujettes à des vitesses relatives différentes. Ainsi, des effets de cisaillement pourront être produits au niveau des couches limites animées de vitesses relatives différentes et des vitesses propres du tissu par rapport au fluide. Selon le procéde de l'invention, le brassage et le laminage du fluide pourront être simultanes, en utilisant par exemple une pièce mobile, qui d'une part formera une serie de couches limites et d'autre par qui sera dotee de moyens provoquant une turbulence à l'intérieur du fluide pour le brasser. Les turbulences ainsi que les effets de cisaillement seront ajustables afin de s'adapter à la nature du tissu échantillonné. Ce réglage pourra par exemple être obtenu en modulant la vitesse de déplacement de l'objet dans le fluide. Dans une phase industrielle, il sera possible d'introduire en continu du fluide dans la chambre de dissociation et d'en soutirer également en continu les cellules isolées mélangées au fluide. Un filtre sera alors placé dans le conduit d'evacuation de la solution afin de ne recueillir que les cellules et non pas les amas cellulaires. Le fluide utilise pourra par exemple etre un liquide de culture. Il sera préférable que le temps passe entre le prelèvement des tissus et leur traitement selon le procédé soit très court afin que les tissus ne subissent aucune détérioration préalable àu traitement. Il sera également possible, selon le procédé de l'invention, de provoquer une di lacération fractionnée des tissus. En effet, la technique utilisée provoque d'abord la dissociation des couches superficielles du tissu ainsi, en limitant la durée du traitement, il est possible de ne dissocier uniquement que les cellules situées en surface des tissus. Les quantités énergétiques mises en jeu pour provoquer tant le brassage que le laminage sont tres faibles, ce qui engendre un très faible échauffement de l'échantillon. De plus, il serait égaiement envisageable de contrôler la température du fluide par une source de chauffage ou de refroidissement extérieure s'appliquant par exemple aux parois de la chambre de dissociation. La figure 1, schematise, à titre d'exemple, unerealisation d'un dispositif selon l'invention utilisable pour appliquer le procédé de dilacération des tissus. Ce dispositif comprend une chambre 1 dite de dissociation à l'intérieur de laquelle est placé un rotor 2. Dans le-mode préférentiel de réalisation présenté ici, le rotor assure la double fonction à savoir provoquer un brassage complet du fluide et du tissu cellulaire contenu dans la chambre 1 et créer des effets de cisaillement dans le dit fluide afin de provoquer la dissociation des cellules du tissu en suspension dans le fluide. Le rotor 2 sera animé d'un mouvement vis-à-vis des parois de la chambre 1.Ce mouvement pourra être quelconque comme par exemple linéaire, alternatif ou de rotation, toutefois, ce mouvement devra être tel qu'il ne provoque aucun choc qui aurait pour conséquence de broyer les tissus et d'endommager ainsi les cellules. Pour cela, le mouvement pourra être ajusté de façon à s'adapter à la nature des tissus échantillonnés. Dans un mode préférentiel de réalisation, la chambre de dissociation 1 sera de forme cylindrique et le rotor 2 sera également de forme cylindrique et lui sera sensiblement coaxial avec un diamètre extérieur sensiblement inférieur au diamètre intérieur de la chambre 1. Le rotor sera entraîné en rotation autour de son axe sensiblement paral lèle à celui de la chambre cylindrique 1. Chaque face latérale du rotor sera équipée de palettes 3 qui ont pour but de provoquer un brassage complet dans la chambre 1 pour créer des turbulences dans le fluide contenu dans cette chambre afin d'en homogénéiser le contenu. Le rotor sera placé sensiblement au centre de la chambre cylindrique 1 qui sera avan tageusement placée horizontalement. Afin de ne créer aucune dissymétrie dans les deux parties de la chambre 1 séparées par le rotor 2, les palettes 3 seront identiques sur chaque face latérale du rotor 2.Les surfaces des palettes 3 seront placées sensiblement transversalement au déplacement du rotor afin de provoquer un mouvement tourbillonnaire axial à la chambre, les palettes 3 pourront être disposées sous la forme de croisillons comme cela est illustré en figure 1. Le rotor présentera une surface extérieure, comprise entre les deux faces latérales, en déplacement, lors de la rotation du rotor 2, par rapport à la paroi voisine correspondante de la chambre cylindrique 1. Au repos, la face extérieure du rotor 2 reposera sur la paroi de la chambre 1, par contre, aussitôt que le rotor sera en mouvement, il se decollera selon la théorie des paliers fluides et il sera ainsi créé une série de couches laminaires entre la paroi extérieure du rotor 2 et la paroi voisine de la chambre 1. La figure 2 schematise la distribution des vitesses en différents endroits de la chambre de dissociation 1. La figure 2a illustre la distribution des vitesses dans la zone A à proximité d'une des faces circulaires latérales de la chambre cylindrique 1. Le rotor 2 provoquant un mouvement tourbillonnaire du fluide dans la chambre 1, ce fluide sera animé d'une vitesse de deplacement importante, illustree par la flèche 4 lorsque l'on s'écarte de la paroi circulaire 5 de la chambre 1. Par contre, à proximite immédiate de la paroi 5, la vitesse du fluide est pratiquement nulle. Il est ainsi créé un gradient de vitesse important qui engendre des effets de cisaillement dans le fluide. La figure 2b ill-ustre la distribution des vitesses dans la zone B supérieure du rotor comprise entre sa face exterieure et la paroi voisine de la chambre 1. A proximité immédiate du rotor, le fluide sera entrainé par celui-ci pratiquement à une vitesse ci rconférentiel le identique illustrée par la fleche 6. Par contre, à proximité immédiate de la paroi de la chambre 1, la vitesse du- fluide sera pratiquement nulle. Ce qui créée un gradient de vitesse et donc des contraintes de laminage à l'intérieur du fluide. Ces contraintes seront modulables en fonction de l'écart dimensionnel entre le diamètre du rotor 2 et le diamètre intérieur de la chambre 1. La figure 2c illustre le diagramme des vitesses du fluide dans la zone C inférieure du rotor 2 comprise entre celui-ci et la paroi de la chambre 1. En fonction du poids du rotor et de sa vitesse circonférentielle, il pourra être crée , sensiblement dans cette zone, des couches limites très faibles et par conséquent des effets de cisaillement importants. En effet, la distance séparant le rotor 2 de la paroi 1 peut être faible avec une vitesse de rotor importante. La figure 2d illustre la distribution des vitesses dans la zone D de la chambre de dissociation 1 à proximité de la paroi de cette chambre situee entre le rotor 2 et la face latérale circulaire 5. Le tourbillon créé par le rotor 2 provoque un brassage du fluide avec des fortes vitesses de déplacement dans la zone située entre la paroi de la chambre 1 et son axe. A ces différents mouvements, il s'additionnera des mouvements de translation axiale du fluide causes par le remous général. La figure 3 illustre un mode de réalisation preferentiel du dispositif selon l'invention. La chambre de dilaceration 1 est formée d'un cylindre 7 à l'intérieur duquel peut se placer un piston 8. Ce piston 8 pourra se déplacer à l'intérieur du cylindre 7 de façon ainsi à ajuster le volume de la chambre -1 en fonction de la quantité de fluide additionnée de tissu à dissocier. La fermeture de l'autre extrémité du cylindre 7 pourra par exemple être réalisée à l'aide d'une culasse 9 qui sera rapportée sur le cylindre 7. L'étanchéité de la culasse 9 sur le cylindre 7 pourra par exemple être réalisée à l'aide d'un joint torique 10 situé dans une gorge intérieure à la culasse 9 et placé sur le pourtour de la paroi extérieure du cylindre 7.Un conduit d'amenée 11 des tissus ou du liquide dans la chambre 1 se presentera sous la forme d'un puits réalisé dans le cylindre 7. Ce puits 11 sera isolée de la chambre 1 après l'opération de remplissage. Ainsi, le piston 8, lors du remplissage, sera ramené en arrière par l'intermédiaire de l'axe 12 qui forme une bielle au piston 8 et qui debouche à l'extérieur du cylindre 7, dans cette position, il sera possible d'introduire par le puits d'acces 11, le fluide en quantité suffisante ainsi que les tissus à échantillonner. Puis, l'axe 12 est repoussé entrainant ainsi le piston 8 qui réduit le volume de la chambre 1 jusqu'à ce que le liquide introduit occupe sensiblement tout le volume de la chambre 1.Alors, le rotor 2 présent dans la chambre 1 pourra être entraîné en rotation afin de brasser et laminer le fluide jusqu'à obtenir une dissociation des cellules du tissu en suspension dans le fluide. Une fois l'opération terminée, la culasse 9 est munie d'un canal d'évacuation 13 par lequel il est possible de recueillir les cellules isolées. Le rotor 2 sera avantageusement muni d'un aimant intérieur, l'ensemble pouvant être ainsi entraîné en rotation par l'intermédiaire d'un champ magnétique tournant engendré depuis l'extérieur. Lors de l'évacuation des cellules dissociées traitées, il sera préferable de placer le canal d'évacuation 13 à la verticale de la chambre 1 afin de récupérer le maximum des solutions. Pour cela, il est possible d'introduire par exemple un gaz par le canal 11 en reculant légèrement le piston 8, ou bien lorsqu'on désire avoir un dosage calibré de la solution sortante, il est possible d'utiliser une seringue doseuse 14 par l'intermédiaire de l'axe creux 12 l'aiguille 15 de la seringue doseuse 14 pouvant pénétrer a travers le piston 8 réalise dans une matière adaptée analogue à celle utilisée pour les septums. En injectant alors des quantités de gaz dosées, il est possible d'obtenir en sortie de canal 13 des doses de solutions. De même, il est également envisageable, durant le traitement même, d'introduire de façon analogue à la seringue 14 du fluide dans la chambre 1, en continu, afin de recueillir également en continu par l'intermédiaire du canal d'évacuation 13 de la solution traitee. La face de la culasse 9 qui fait office de paroi de la chambre 1 sera avantageusement recouverte d'une trame 15. Cette trame permettra de limiter artificiellement le volume de la chambre 1 afin que les fragments de tissu non dissociés ne puissent pénétrer dans le canal d'évacuation 13 puisqu'en effet son contenu n'est que faible ment brassé par rapport au volume de la chambre 1 et par conséquent il y aurait des risques d'accumulation de fragments de tissu non traités a l'intérieur. La paroi de la culasse 9 sur laquelle est étendue la trame 15 sera avantageusement bombée afin de faciliter la mise sous tension de la trame lors de sa mise en place. Afin de limiter le volume mort de la chambre 1 lors de la récupération de la solution traitee, la face de la culasse 9 formant la paroi de la chambre 1 sera avantageusement munie d'un ensemble de canaux circulaires concentriques munis d'un canal radial 16 de récupé ration. Ainsi, le volume situé dans la chambre 1 à l'extérieur de la trame 15 sera réduit. L'axe 12 pourra avantageusement etre guidé par l'intermédiaire d'une bague 17 située à l'entrée du cylindre 7. La parfaite étanchéité de l'ensemble permettra d'effectuer toutes les operations sans risque de contamination de la solution. Dans la zone du cylindre 7 située à proximite du rotor 2, la paroi du cylindre sera de préférence faible afin de pouvoir placer à proximité les bobines d'excitation 18 du rotor 2. La chambre posterieure 19 créée par les canaux concentriques entre la trame 15 et la culasse 9 permet à la trame d'être intégralement rincée par le liquide de la chambre et ainsi la récupération de cellules isolées totale. Néanmoins, le volume postérieur au filtre ne sera pas purgé en fin de récupération car l'air ne pourra s'y introduire pour des problèmes de capillarité de la trame humidifiee. Toutes les pièces utilisées pour la réalisation du dispositif de dilaceration seront réalisées dans un matériau susceptible d'être stérilisé. Les figures 4 à 7 illustrent le dispositif d'entraînement du rotor selon l'invention. Le rotor étant muni d'un barreau aimanté intérieur, l'entraînement est réalisé au moyen d'un champ magnétique tournant créé par des bobine-s placées à l'extérieur de la chambre 1. Dans le mode de réalisation choisi, le champ magnétique tournant est créé par trois bobines situées à 90 degrés, laissant ainsi une possibilité de placer le dispositif entre les bobines par l'espace opposé à la bobine centrale 19. Les bobines 19, 20 et 21 seront couplées en serie comme il est représenté à la figure 5. Le fil de liaison entre les bobines 19 et 21 sera relié a la masse, par contre, les fils d'arrivée d'excitation des bobines 19 et 20 seront alimentés à partir d'un organe de commande électronique représenté à la figure 4. Le dispositif de commande électronique 22, représenté à la figure 4, est notamment composé d'un micro-processeur 23 qui, à partir d'informations fournies par l'opérateur, engendre une serie de pulsations eventuellement modifiées par des circuits logiques 24 qui sont amplifiés avant d'être envoyes aux bobines afin de les exciter. La figure 6 schématise les differentes étapes de la rotation. La figure 6a représente le cas ou seules les bobines 20 et 21 sont excitées de façon inverse afin que le barreau aimante s'oriente dans leur alignement. Ensuite, la figure 6b represente l'étape suivante durant laquelle seule la bobine 19 est excitée de telle sorte que le barreau s'aligne avec elle et se place ainsi transversalement par rapport a la position précedente. La figure 6c schématise l'etape suivante durant laquelle a nouveau les bobines 20 et 21 sont excites mais de façon inverse à la figure 6a de telle sorte que le barreau aimante du rotor s'aligne avec elles en ayant parcouru un demi-tour par rapport à la figure 6a. Puis, la figure 6d schématise l'étape suivantedurant laquelle seule la bobine 19 est excite provoquant à nouveau un quart de tour supplémentaire par rapport à la figure 6c preparant ainsi le barreau aimanté à subir à nouveau la phase de la figure 5a afin d'effectuer un tour complet. Le fonctionnement du rotor 2 est ainsi analogue à celui des moteurs synchrones et de même que ces derniers, il est nécessaire de ne pas accélérer trop rapidement la fréquence d'utilisation lors de son démarrage afin que celui-ci ne decroche pas. Par ajustement de la fréquence, il est ainsi possible de modifier la vitesse de rotation du rotor et ainsi de l'adapter à la nature de l'échantillon testé. La figure 8 schématise l'étrier 25 de fixation du dispositif de l'invention. Cet étrier dispose d'une part d'une tige recourbée 26 qui s'engage dans un orifice 27 prévu à cet effet dans la culasse 9, et d'un support 28 venant s'adapter sur un rebord prévu à cet effet de la bague 17. Par basculement de l'étrier 25, il est possible ainsi de dégager le dispositif de l'invention. EXEMPLE On prélève stérilement le système nerveux central (SCN) d'embryons de souris (OFI) à 14,5 jours de gestation. Les embryons sont enlevés stérilement de leurs enveloppes et lavés dans une solution saline de Hanks pH 7,2 . Ils sont disséques dans 2 ml de solution saline. Les méninges sont entièrement retirées. Le cerveau est laissé entier. Il est rince et conservé dans du MEM supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal + 5 g/l de glucose + 2 mM de glutamine. On ajoute 1 % du mélange antibiotique pénicilline-streptomycine (500.000 U + 0,5 g). La dissociation a lieu dans un milieu identique. Le cerveau entier est introduit dans la chambre de dissociation, 2 ml de milieu sont rajoutés à l'aide d'une pipette. Le piston est repoussé et vient obturer le canal d'amenée. On chasse l'air. L'ensemble de la cellule est placé dans le stator pour subir la dissociation. Ensuite l'orifice de récupération est placé au-dessus d'un tube récepteur stérile de 10 ml. Par une entrée d'air obtenue en débouchant le puits d'acces par remontée du piston, on entraine l'écoulement du milieu contenant les cellules dissociees de taille inférieure à 50 microns. Le reste du tissu est retenu par la trame et peut être redissocié ultérieurement après avoir rajouté du milieu de culture. Les cellules isolées seront ensuite réparties dans des pipettes graduées dans des boîtes de pétri de 35 mm de diamètre ; ces boîtes contiennent des lamelles de verre de 22 x 22 mm traitées avec du collagène préparé à partir de tendons de queues de rat (BORSTEIN, 1970) et de la polylysine PM 83.000 selon la technique décrite par YAVIN ( 1974). A la mise en culture et pendant toute la durée des cultures, on pratique des tests de viabilité au bleu-trypan. Toutes ces opérations sont conduites stérilement sous hotte à flux laminaire horizontal. Durant la dissociation d'un cerveau entier comme il a été décrit ci-dessus, après une minute d'agitation, le milieu contenant les cellules est récupéré et un comptage est fait sur cellule de Malassez. La dissociation étant incomplète, on remet 2 ml de milieu et la dissociation est continuée pendant une minute. Un nouveau comptage est réalisé. Ceci est poursuivi jusqu'à quatre minutes. Au-delà, les cellules comptées sont en nombre inférieur à 1.000/mm3. Chaque vitesse est testée de la même manière. On remarque que pour les vitesses inférieures à 300 tours/minute, aucune dissociation supplémentaire n'est obtenue après cinq minutes. La plus grande vitesse donnant le maximum de dissociation, il est nécessaire de tester le traumatisme causé aux cellules par cette derniere. On répète donc les expériences de dissociation aux differentes vitesses. Les cellules sont mises en culture sur lamelle pendant six jours à 37 degrés en atmosphère air (95 %) + C02 (5 %). Des tests de viabilité au bleu-trypan sont faits à la mise en culture, après 24 heures, 48 heures, 3 jours et 6 jours de culture. Un témoin dissocié à la pipette PASTEUR sert de référence. Il faut toutefois noter que seulement environ 60 des cellules sont encore viables après la mise en culture quelle que soit la vitesse de dissociation utilisée ou le mode de dissociation. Au cours de l'expérience, le sacrifice de la mère a eu lieu au début de la manipulation. Les embryons sont laissés vivants dans leurs enveloppes mais la duree de la dissection et de la dissociation peut vraisemblablement suffire à expliquer que seulement 60 à 70 des cellules soient viables à la mise en culture, et d'autre part, le pour centage de viabilité le plus faible à la mise en culture a toujours été obtenu sur le dernier embryon disséqué. Il faut donc choisir le temps de dissociation le plus court sachant que in vivo la lyse cellulaire par libération des lysosomes dans les cellules nerveuses intervient très rapidement, environ 3 minutes après la mort de l'animal. La vitesse de 1.000 tours/minute semble la plus optimum, la dissociation est totale après 2 minutes sans traumatisme. Les cellules obtenues, selon le procédé de dissociation de l'invention, sont toutes isolées au moment de la mise en culture. La figure 9 illustre le diagramme d'utilisation d'un dispo sitif selon l'invention ayant un rotor d'environ 14 mm de diamètre. Lemode de realisation qui vient d'être décrit ici n'est donné qu'à titre indicatif, et d'autres modes de réalisation de l'in vention, à la portée de l'Homme de l'Art, pourraient être adoptés sans pour autant sortir du cadre de celle-ci. En particulier, une combinaison du procédé de l'invention avec un fluide actif peut être envisagé afin de cumuler leurs effets. REVENDICATIONS 1. Procédé de dilacération des tissus pour dissocier les cellules sans les agresser afin de garder leur morphologie et leur métabolisme intacts pour autoriser une culture ultérieure des cellules, caractérisé par le fait que l'on introduit le tissu cellulaire dans une chambre remplie de fluide et que l'on provoque un brassage complet dans la chambre pour créer des turbulences dans le fluide et un laminage dans la chambre qui crée des effetsde cisaillement dans le fluide, afin de provoquer la dissociation des cellules. 2. Procede de dilacération des tissus selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le brassage et le laminage sont réalisés simultanément. 3. Procéde de dilacération des tissus selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on introduit en continu du fluide dans la chambre et que, conjointement, on soutire de la chambre'la solution filtrée. 4. Dispositif de dilaceration des tissus pour en dissocier les cellules, sans les agresser afin de garder leur morphologie et leur métabolisme intacts pour autoriser une culture ultérieure des cellules, selon le procédé de la revendication 1, caractérise par le fait qu'il présente une chambre (1) contenant un fluide dans lequel baignent les tissus en suspension, et des moyens pour brasser le fluide dans la chambre (1) et provoquer des effets de cisaillement du fluide dans la chambre. 5. Dispositif de dilacération des tissus selon la revendication 4, caractérisé par le fait que les moyens pour brasser le fluide et pour provoquer des effets de cisaillement du fluide sont combinés et se présentent sous la forme d'un rotor (2) mobile dans la chambre (1). 6. Dispositif de dilaceration des tissus selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le laminage du fluide est notamment réalise entre la périphérie du rotor (2) et les parois de la chambre (1). 7. Dispositif de dilacération des tissus selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le brassage est réalisé au moyen de palettes (3) disposees sur le rotor (2)teTlesque leur surface est orientée sensiblement perpendiculairement au déplacement du rotor (2). 8. Dispositif de dilacération des tissus selon la revendication 4, caractérisé par le fait que la chambre (1) se présente sous la forme d'un cylindre dont le volume est réglable. 9. Dispositif de dilacération des tissus selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'il présente un organe de filtration à la sortie du fluide, sous la forme d'une trame (15). 10. Dispositif de dilacération des tissus notamment composé d'une chambre cylindrique formée par un cylindre obturé d'une part par un piston et d'autre part par une culasse selon la revendication 4, caractérisé par le fait que la culasse (9) présente une paroi intérieure à la chambre (1), bombée et munie d'un ensemble de canaux circulaires concentriques. 11. Dispositif de dilacération des tissus, notamment composé d'une chambre formée par un cylindre obturé d'une part par un piston et d'autre part par une culasse selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le piston (8) est réalisé dans une matière perforable, analogue au septum. 12. Dispositif de dilacération des tissus, selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le rotor (2) présente intérieuremenl un barreau aimanté. 13. Dispositif de dilacération des tissus selon la revendication 9, caractérisé par le fait que les-effets de cisaillement provoque par le laminage sont ajustables par modification de la vitesse de rotation du rotor ou par.modification des dimensions géométriques du rotor et/ou de la chambre cylindrique.