Brevet FR2520235A1 — publié le 19830729

1. La présente invention est relative à un procédé de séparation d'immunoglobulines à partir du colostrum. Le colostrum est la sécrétion mammaire des mammi- tère Z temelle 1 e dans les jours q Sz J, vle Sa composition et son aspect Ont d necux Mlait et rcc u 5 SES Qi 2 Qi ^Su aa T t Y autres, par sa richesse en protéines, notamment en immunoglobulines; le taux de ces dernières protéines varie de 6 à 10 % à la première traite à 0,09 %, qui est le taux contenu dans le lait Or, ces protéines, et notamment les immunoglobulines, sont d'un grand inrérêt, notamment dans le domaine médical et pharmaceutique Elles peuvent, en particulier, être incorporées aux aliments du veau nouveau-né et servir à sa protection immunitaire, ou être utilisées en médecine, pharmacie ou alimentation humaine, notamment pour les produits de l'enfance On a calculé que la quantité d'immunoglobulines contenuesdans le colostrum produite au cours des sept traites consécu- tives équivalait à celle contenue dans-le sang rejeté par les abattoirs. Il est donc important de trouver un procédé per- mettant de séparer les immunoglobulines présentes dans le colostrum. Dans la demande de brevet FR 2 321 932, et son certificat d'addition FR 2 359 634, on a proposé un procédé de séparation de protéines par chromatographie d'échange d'ions On utilise, à cet effet, des échangeurs d'ions constitués par des particules poreuses à la surface des- quelles sont greffés des groupements échangeurs d'ions. En particulier, on a décrit dans la demande de brevet FR 2 321 932 la séparation d'immunoglobulines à partir de sérum humain délipidé sur un échangeur anionique (cons- titué par des particules de silice revêtues d'un polymère ayant des sites anioniques), les immunoglobulines étant récupérées dans l'effluent,"à l'état électrophorétiquement 2. pur", tandis que les autres protéines sont fixées. Or, lorsqu'on cherche à opérer de la même façon avec un sérum de colostrum, on n'obient dans l'effluent qu'une fraction enrichie en immunoblogulines, qui comprend encore une proportion importante d'autres protéines. La Demanderesse a découvert qu'il était possible de séparer les immunoglobulines présentes dans le colos- trum si, avant d'effectuer la chromatographie d'échange d'ions, on soumet un lait de colostrum ou un sérum de colostrum à un fractionnement par électrophorèse. Ainsi, la présente invention a pour objet un pro- cédé de séparation des immunoglobulines présentes dans le colostrum, caractérisé en ce que l'on soumet un lait de colostrum ou un sérum de colostrum à un fractionnement par électrophorèse, on récupère la fraction enrichie en immunoglobulines, puis l'on soumet cette fraction enri- chie en immunoglobulines à un fractionnement par chroma- tographie d'échange d'ions. La matière première utilisée est, de préférence, un colostrum de vache, mais peut être tout colostrum issu de n'importe quel mammifère. Le fractionnement ne s'effectue pas sur un colos- trum entier, mais sur un lait de colostrum, auquel cas le colostrum original aura subi un écrémage ou, de pré- férence, sur un sérum de colostrum, auquel cas le colos- trum aura subi un écrémage et une coagulation, afin d'é- liminer la caséine Cette coagulation peut être effec- tuée par adjonction de présure d'une force de 1/10000, à raison d'environ 0,1 ml/l ou par précipitation acide. Le premier fractionnement utilisé dans la pré- sente invention est un fractionnement par électrophorèse. Ce type de fractionnement consiste, d'une manière générale, à fractionner une solution comprenant au moins deux groupes de substances dissoutes dans un liquide, en vue d'obtenir au moins deux fractions liquides contenant l'une le premier groupe de substances avec une richesse relative supérieure à celle de la solution initiale, l'autre le deuxième groupe avec une richesse 3. relative supérieure à celle de ladite solution; pour cela, on délivre la solution initiale dans au moins une chambre de fractionnement délimitée sur deux grandes faces oppo- sées par deux membranes semi-perméables, on applique un champ électrique dans ladite chambre, de façon à engen- drer une migration des groupes de substances dépendant de leurs caractéristiques électriques et physiques pro- voquant par l'effet des gradients de concentration une convection naturelle avec la création de flux liquides ascendants et descendants, et on soutire le liquide en au moins deux zones de prélèvements différentes de la chambre en vue de recueillir lesdites fractions. Ce fractionnement peut, en particulier, être réa- lisé selon le procédé décrit dans le brevet FR 80/23 952 1; et la thèse de Docteur-Ingénieur de la Faculté des Scien- ces de Toulouse: Préparation de fractions protéiques du sérum ou du plasma sanguin par électrophorèse, P Espenan,1980. Dans ce procédé, on utilise un champ électrique pour réaliser à travers au moins une des membranes semi-per- méables un échange ionique à vitesse élevée entre la solution initiale contenue dans la ou les chambres de fractionnement et une solution auxiliaire disposée de l'autre côté de ladite membrane et contenant des ions de- nature appropriée pour passer à travers ladite membrane et accentuer les différences de migrations des substances de la solution initiale. Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de ce procédé, la solution initiale est admise dans une série de chambres de fractionnement accolées séparées les unes aux autres par les membranes semi-perméables, la solution auxiliaire étant disposée de part et d'autre des deux chambres extrêmes dans deux compartiments de garde, sé- parés chacun par une membrane semi-perméable de la cham- bre de fractionnement extrême voisine, les échanges io- niques s'effectuant à vitesse élevée sous l'effet du champ électrique, à partir desdits compartiments de garde, de proche en proche dans les diverses chambres de frac- tionnement. Ainsi, ce procédé conduit à réaliser en une seule 4. opération, dans le même dispositif, d'une part, une adaptation de la solution initiale pour lui conférer des propriétés appropriées de nature à accentuer les diffé- rences de migration des substances, d'autre part, l'opé- ration de fractionnement proprement dit desdites subs- tances Le champ électrique servant au fractionnement sert également à engendrer des échanges ioniques rapides à travers les membranes entre la solution initiale con- tenue dans les diverses chambres de fractionnement et la solution auxiliaire contenue dans les compartiments de garde On supprime ainsi radicalement les opérations de préparation préalables, notamment de dialyse qui sont nécessaires dans les procédés classiques, ainsi que tous les inconvénients afférents; de plus, la solution ini- tiale n'a plus à être diluée et le procédé peut s'appli- quer à des solutions naturelles dans l'état o elles sont produites ou recueillies. Ce procédé a déjà été utilisé pour le fraction- nement et la récupération des immunoglobulines du plasma en vue de séparer une fraction riche en albumine et une fraction riche en y-globulines. Dans la présente invention, la séparation par électrophorèse est effectuée avantageusement à un p H de 6 à 7, de préférence à p H 6,3-6,4 (c'est-à-dire en pratique généralement sans modification du p H) et à une température de 40 C à 250 C, de préférence à 40 C On récupère, à la partie supérieure du dispositif d'électrophorèse, à l'état natif que la concentration initiale et, à sa partie inférieure, une fraction relativement plus riche en albumines A titre d'exemple, si on a une solution ayant la composition suivante (en % en poids): teneur en immunoglobulines 77 % E" a-lactaibumine 4,5 % "-lactoglobuline 14,4 % sérum-albumines 3,0 % on obtient, respectivement, la composition suivante (en % en poids) dans les fractions relativement plus riches en immunoglobulines et en albumines. 5. La quantité récupérée d'immunoglobulines en haut du dispositif dépend des conditions opératoires et, notam- ment, du débit de soutirage; elle peut atteindre 70 à %. Le second fractionnement utilisé dans la présente invention est un fractionnement par chromatographie d'é- change d'ions Il consiste à soumettre à une chromato- graphie d'échange d'ions la fraction riche en immunoblo- bulines obtenue par le premier fractionnement. A cet effet, on fait percoler sur une colonne rem- plie de particules échangeuses d'ions la fraction riche en immunoglobulines. Comme particules échangeuses d'ions, on utilise avantageusement des particules poreuses vendues sous le nom de "Sphérosil" par la Société RHONE-POULENC et dé- crites dans les brevets FR 2 321 932 et FR 2 359 634, appartenant aux types suivants: Sphérosil, Q MA, échangeur d'ions basique fort, Sphérosil, C, échangeur d'ions acide très faible, Sphérosil, S, échangeur d'ions acide fort, Sphérosil, X OB O 15, échangeur d'ions acide très faible. Les Sphérosil Q MA, C et S sont obtenus par fixa- tion de résines échangeuses d'ions sur des billes de si- lice poreuses (X OB O 15). Fraction riche en Fraction riche en immunoglobulines albumines (haut du dispositif) (bas du dispositif) Immunoglobulines 83 67 a-lactalbumine 1,2 6,4 0-lactoglobuline 8,0 20,0 Sérumalbumines 5,6 ________________________________________________ __________________________________________________ _______________________________________ - 6. Tout autre type d'échangeur d'ions permettant la fixation sélective des protéines peut être utilisé, par exemple des celluloses greffées, telles que les résines Trisacryl échangeuses d'anions vendues par I B F. On utilise, de préférence, des échangeurs anio- niques, tels que des échangeurs Sphérosil Q MA, qui per- mettent de traiter directement la fraction riche en im- munoglobulines obtenue au premier stade, sans modifica- tion du p H (entre 6 et 7),et d'obtenir, avec un rendement élevé, les immunoglobulines dans l'effluent sortant de la colonne Ceci présente l'avantage d'éviter tout risque de dénaturation des immunoglobulines par fixation sur les échangeurs d'ions. On peut ainsi obtenir une solution de protéines comprenant de 98 à 100 % d'immunoglobulines. La chromatographie peut être effectuée à une tem- pérature de 4 à 250 C et, avantageusement, à 4 C 0. La solution d'immunoglobulines peut ensuite être post-traitée, par séchage, concentration, dialyse ou ul- trafiltration, par exemple en vue de l'utilisation ulté- rieure. La présente invention est illustrée par les exem- -ples suivants. EXEMPLE 1 A Fractionnement par électrophorèse On part d'un sérum de colostrum ayant un p H de 6,3 et ayant la composition suivante (en g/l) Immunoglobulines 65,5 a-lactalbumine 8,7 $-lactoglobuline 15,2 Sérumalbumines 6,3 On soumet ce sérum de colostrum à un fractionnement par électrophorèse en utilisant le dispositif décrit dans le brevet FR 80/23 952 On opère à une température de 40 C Ce dispositif comprend cinq chambres de fraction- nement séparées par des membranes semi-perméables en cellophane Chaque membrane a une surface active de 60 cm 2. 7. Chaque chambre a une épaisseur de 3 mm et comprend un cadre délimitant onze canaux verticaux contre lesquels s'appuient les membranes. La solution auxiliaire circulant dans les com- partiments de garde latéraux est un mélange de Na 2 HPO 4 et KH 2 PO 4 à une concentration saline de 0,05 M et à un p H de 6,25 Dans les compartiments d'électrodes adjacents circule également une solution de Na 2 HPO 4 et KH 2 PO 4, mais à une concentration de 0,2 M. On a fait trois essais dont les conditions opé- ratoires sont données dans le tableau I. TABLEAU I Pour chaque essai, deux litres de sérum de co- lostrum sont traités par électrophorèse. Dans le tableau II, on donne la quantité de chaque protéine récupérée en haut et en bas du dispositif, ainsi que le volume de la solution recueillie. Différence de Débitrae souirage entre les 2 Intensité sortie haut sortie bas membranes du extrêmes courant (ml/h) (ml/h) des chambres de soutirage Essai I 105 105 6 V 0,8 A Essai II 70 70 6 V 0,8 A Essai III 105 35 6 V 0, 77 A TABLEAU II vi) La' wi Essai I Essai II Essai III Haut Bas Haut Bas Haut Bas imrm noglobulines68 63 75 52 102 27 a-lactalbumnine 6 11,4 4,8 12,2 7 10 lactag 11 cbu 1 ine6 24,4 5,3 25,0 7 22, 2 Sérumalbumd nes 0,6 11,9 0,5 11,8 1 11,2 Volumterecueilli11111,5 0,5 (en litres) 9. On constate que la fraction recueillie en haut du dispositif est plus concentrée en immunoglobulines que la fraction initiale. La quantité d'immunoglobulines récupérées en haut du dispositif dépend des conditions expérimentales Dans le troisième essai, elle approche 80 %. Une analyse d'immunodiffusion radiale (méthode Mancini) montre que la dénaturation est très faible Par immunoélectrophorèse, on constate que l'on recueille toutes les immunoglobulines présentes dans le colostrum d'alimentation (Ig G 1, Ig A et Ig M). B Fractionnement par chromatographie d'échange d'ions On fait percoler 200 ml de liquide obtenu dans l'essai I à la sortie "haut" du dispositif et enrichi en immunoglobulines sur une colonne de Sphérosil Q MA échangeuse d'anions, contenant 64 g de Sphérosil Q MA à p H 6,3 et à une température de Sphérosil de 4 WC Le débit est de 300 ml/h. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau III. TABLEAU III L'effluent ne contient que des immunoglobulines. De plus, l'analyse d'electroimmunouiffusion indique que ce sont exclusivement des Ig G 1 et, plus spécifiquement, la fraction des Ig G 1 dont le point isoélectrique est le plus Alimentation Fixation colonne Effluent sur colonne Grammes de grammes de Grammes de protéines protéines protéines Immunoglobulines 13,6 8 à 10 3,6 à 5,6 a-lactalbumine 1,2 O 1,2 e-lactoglobuline 1,2 O 1,2 Sérumabummines 0,12 O 0,12 10. élevé Cette fraction devrait également contenir les lactotransferrines dont le point isoélectrique est de 7,8. Par élution avec HC 1 0,1 N, on récupère les al- bjumines, ainsi que les autres immunoglobulines Ig G 1, Ig A et Ig M. Des résultats analogues sont obtenus avec le liquide sortant en haut de la cellule d'électrophorèse dans les essais II et III. La capacité de fixation moyenne des sphérosils Q MA est, dans le cas présent, de 110 mg/g. EXEMPLE COMPARATIF On part d'un échantillon de 250 ml de sérum de colostrum (provenant de la première traite), quia une teneur totale en protéines de 104 g/l et la composition suivante en immunoglobulines et en sérum-albumines. On fait percoler directement ce sérum de colos- trum sur une colonne de Sphérosil Q MA échangeuse d'a- nions contenant 64 g de résine (identique à celle uti- lisée à l'exemple 1) La capacité de fixation est de 96 mg/g à p H 6,3 à 4 C et le débit de 300 ml/h. L'effluent et l'éluat obtenu avec une solution HC 1 O, 1 N ont la composition suivante: soit en grammes en % de protéines traitées Immunoglobulines 77,7 19,4 a lactalbumine 2,4 0,6 e-lactaglobuline 15,4 3, 8 Sérum-albumines 3,0 0,8 11. On constate que l'effluent s'est enrichi en immu- noglobulines, mais contient encore une fraction importante d'autres protéines. Effluent Eluat Grammes Grammes i % récupérés % récupérés I Immunoglobulines 89,6 15,4 45,4 2,5 I -lactalbumine 1,5 e-lactaglobuline 8,2 1,6 54,6 3,0 Sérumalbulines 0,7 1, 12. REVEND ICATIONS 1 Procédé de séparation des immunoglobulines pré- sentes dans le colostrum, caractérisé en ce que l'on sou- met un lait de colostrum ou un sérum de colostrum à un fractionnement par électrophorèse, on récupère la fraction enrichie en immunoglobulines, puis on soumet cette frac- tion enrichie en immunoglobulines à un fractionnement par chromatographie d'échange d'ions. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matière traitée est un sérum de colostrum. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que l'on effectue le fractionnement par électrophorèse à un p H de 6 à 7. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on effectue le frac- tionnement par électrophorèse à un p H de 6,3-6,4. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que l'on effectue le fractionnement par électrophorèse à une température de 4 à 250 C. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que l'on effectue le fractionnement par chromatographie d'échange d'ions par percolation sur une colonne de particules échangeuses d'anions et on recueille les immunoglobulines dans l'ef- fluent sortant de la colonne. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on effectue le fractionnement par chromato- graphie d'échange d'ions à un p H de 6 à 7 8 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que l'on effectue le fractionnement par chromatographie d'échange d'ions à une température de 4 à 25 'C.