Brevet FR2521590A1 — publié le 19830819

La présente invention concerne les cycles enzymatiques amplificateurs; elle concerne également la réalisation de dosages imunochimiques, en particulier dans des fluides biologiques. L'élaboration de systèmes amplificateurs enzymatiques et leur utilisation pour des dosages sont connues, notamment d'après Lowry O.H. et al., J. Biol, Chem., (1961), 236 (10), pp. 2746-2755, et Lowry O.H. et ai., Analytical Biochem., (1973), 53, pp. 86-97. I1 a également été signalé que l'on a intéret à avoir le maximum de réactions irréversibles de manière à augmenter le pouvoir amplificateur du cycle (voir J.C. Nicolas, J. Chaintreuil B. Térouanne, B. Descamps, A. Crastes de Paulet, Ann. Biol. olin., (1978), 36, pp.205-208. Plusieurs cycles enzymatiques amplificateurs permettant des dosages de faibles quantités de NAD+ ou de NADP+ ont ainsi été décrits. Les cycles enzymatiques amplificateurs de NAD+ reposent sur le schéma suivant: où E1 et E2 sont les deux enzymes respectivement mises en oeuvre, et S1 et S2 les substrats correspondants. Les produits P1 et p2 sont accumulés et peuvent ensuite être dosés à l'aide d'une réaction spécifique de P1 ou ae P2, telle que où E3 et E4 sont les enzymes utilisées, qui conduisent aux produits p3 ou P4 respectivement avec formation de NAD+ ou de NADH mesuré par fluorimétrie. Pour la bonne marche de ce type d'emplifi- cation, plusieurs éléments doivent hêtre pris en considéra tion - les étapes du cycle (1) doivent être, autant que possible, irréversibles ; comme il s'agit d'étapes faisant intervenir des désh6ydrogénases, on a intérêt à les faire fonctionner dans le sens le plus favorable; - il paratt Judicieux, pour rendre ces réactions irréversi- bles, de piéger les produits P1 et p2 Cependant, il ne faut pas perdre de vue que l'un au moins des deux produits P1 ou P2 doit encore pouvoir etre dosé; - étape de révélation (2) ou (3) doit également présenter le maximum d'irréversibilité;; - la mesure finale de NADH peut se faire directement par fluorescence. par contre, pour NAD+, il convient de se trouver en milieu alcalin concentré. On a donc intérêt à terminer un dosage de NADH (3) de manière à limiter le blanc et les interférences. A ce jour, aucun cycle connu pour NAD+ n1 utilise des reactions enzymatiques totalement irréversibles. C'est le cas des cycles LDH-G1DH et ADH-NDH connus, rappelés ci-après. 1, Cyclo LDH-GLDH, Ce cycle a été décrit par Lowry O.H. et al. dans J. Biol. Chem. (1961), op. cité. I1 repose sur le principe suivant Lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + #-cétoglutarate + NADH + N114+ Glutamate + NAD+, la réaction de révélation pouvant être pyruvate + NADH + Lactate + NAD+. ce cycle permet de doser 1.10-13 mole de NAD+, soit une solution de départ de 10 8M (sur 10 /ul d'échantillon) : mais il présente de nombreux désavantages - aucune étape nTest irréversible; - la LDH intervenant dans le cycle fonctionne dans le sens défavorable. Il faut alors utiliser une très forte concentration en lactate qui donne des blancs très élevés (contamination du lactate par du pyruvate); - la lecture finale est réalisée en milieu NaO?i 4M. Les blancs sont élevés et les interférences sont difficilement maîtrisables; - l'amplification de cycle varle avec la concentration en NAD+ et on obtient une courbe fluorcanenne/comoentration qui n1 est pas linéaire. 2. Cycle ADH-MDH ce cycle, décrit par Lowry O.H. et al. dans Ann. Biochem. (1973), op. cité, est le suivant NAD+ + Ethanol Acétaldéhyde + NADH + H+ (4) Oxaloacétate + NADH + Malate + NAD+ (5) Trois réactions de révélation sont possibles Malate + NADP+ Pyruvate + CO2 + NADPH + H+(6) Malate + NA+ MDH > Oxaloacétate + NADH + TGO (7) Oxaloacétate + Glutamate TGO Aspartate + -Cétoglutaratej Malate + NA3+ - MDH b Oxaloacétate + NADH + H+ (8 Oxaloacétate + Hydrazine - wOxaloacétate 'nydrazone La réaction (4) présente un certain caractère d'irréversibilité dû à le formation d'acétaldéhyde volatil. Mais la réaction (5) 'est que relativement favorale. Le dosage final est un dosage de NAD(P)H, pour lequel les blancs sont faiLles et les interférences peu importantes. On a maintenant trouvé un cycle enzymatique original, reposant sur une réaction totalement irréversible. ce cycle enzymatique amplificateur de NAD selon l'invention est le suivant Glucone-6-Phosphate + 6-phosphogluconate (9) + NADH + 2O2 + NADH + H 2 H20 + NAD+ (lo) Lors du fo.lctionnement du cycle, il y a accumulation de 6-phosphogluconate, qu'on peut doser selon la réaction classique NA0p+ 6-PGtH 6-piiospl;ogluconate + NADp+ 6 ~GDH w Riurl Riwulose-5-pnosp:ate3(55) + co + NADPH++ 2 L'invention a pour premier objet une composition pour la réalisation d'un cycle enzymatique ô- plificateur de NAD+, caractérisée en ce quelle comprend, associés en des proportions appropriées, les composés réalisant les réactions (9) et (10) ci-dessus. La réaction (10) est totalement irréversi ble. Toutefois, pour la bonne marche du cycle, il convient de favoriser thermodynamiquement la réaction (9) qui est réversible. Ceci est obtenu en choisissant pour la réalisation du cycle une zone de pE où la réaction inverse (6-phosphogluconate # glucose-6-phosphate) a une constante d'équiliore très défavorable, d'autant plus que l'on se trouve en présence d'un grand excès de glucose-6-pnosphate par rapport au 6-phosphogluconate formé lors de l'inoubation. [6-phosphogluconate] [NADH] [H] [nad+] [glucose-6-phosphate] o La réaction de révélation est également irréversible, ce qui la rend très sensible. La mesure finale consiste en une mesure de la fluorescence du NADPH formé- [voir l'ouvrage intitulé "Methods of Enzymatic Analysis", H.V. Bergmeyer, (1976), pp. 2059-2072, Verlag Cnemie GmbH (2è éd. anglaise)]. On a pu établir que l'utilisation de ce cycle selon l'invention permet de doser 25 femtomoles de ou ou de NADH ou d'un dérivé d'une de ces deux substances. ce cycle a, de plus, une linéarité qui s1 étend sur une zone de concentrations allant de 25 à 1000 x 10-15 moles de NAD+. L'invention concerne donc en outre l'appli cation du cycle amplificateur susdit à des dosages enzyma tiques de substances présentes dans des liquides biolo- giques, comme par exemple les substances connues sous les acréviations (dont la signification sera rappelée plus loin) T3, T4, E1, E2, ED, F, Testo et autres. Les dosages mettant en oeuvre un tel système de cycle enzymatique amplificateur de NAD+ présentent pour avantages de ne nécessiter - ni radioisotopes pour marquer la substance à doser ; le "marqueur" est alors une substance stable; - ni séparation nlibre-lié". En pratique, on réalise le cycle amplificateur décrit en laissant incuber les différents réactifs et enzymes mis en oeuvre et dans les proportions appropriées. Etant donné les caractéristiques thermodynamiques des deux enzymes utilisées, une zone de pH proche du pH optimum de la G-6-PrH est souhaitable, mais non indispensable. Après un temps que l'homme de l'art se fixe (temps qui est celui au bout duquel 11 accumulation de 6-phosphogluconate est au moins égale au minimum décelable et qui peut titre aisément déterminé après quelques essais de routine, si nécessaire), les réactions enzymatiques sont bloquées par tout moyen approprié et on ajoute les réactifs permettant la révélation ou le dosage du 6-phospno- gluconate formé. Lorsque cette réaction est terminée, on mesure la fluorescence des solutions cotre un blanc. L'invention a par conséquent pour second objet un procédé pour la réalisation de dosages enzymatiques, en particulier dans des fluides biologiques, carac térisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre de la composition susdite, apte à réaliser un cycle enzymatique, le NAD+ à doser étant contenu dans le fluide biologique, avec incucation des différents réactifs et enzymes à un pH intermédia ire entre les pH optimaux des deux enzymes utilises, et pendant un temps suffisant pour former du 6-phosphogluco nate en une quantité dépassant le minimum décelable, et ensuite le blocage du cycle et la révélation ou le dosage du 6-phosphobluconate formé. En variante, on peut appliquer le cycle enzymatique amplificateur (9-10) à des dosages immunoenzymatiques. Pour réaliser de tels dosages, on ajoute, à un liquide biologique contenant la substance à doser, une quantité donnée de 12 meome sucatance, mais liée de ,ma- nière covalente au NAD+, on met les deux substances en compétition avec une quantité donnée d'anticorps dirigés contre la substance à doser. Les réactions de compétition peuvent avoir lieu et il suffit alors de doser le N3+ qui est resté libre ou le NAD+ fixé à l'anticorps.Il n'est pas impérativement nécessaire de prévoir une étape intermé diaire de séparation "lihre-lié", car le NAD+ peut être inactivé lorsqu'il est lié à l'anticorps par l'intermédiai re de la substance à doser. Pour la mise en oeuvre du cycle enzymatique amplificateur de NAD+ selon 11 invention, on préconise la NADH-peroxydase de Streptococous faccalis (EC 1.11.1.1) ou tout autre enzyme catalysant la réaction entre NADH et H202 et donnant lieu à la formation de NHD+ utilisacle dans la seconde réaction. De manière générale, on choisira une glucose-6-phosphate désnydrogénase NAD-dépendante afin d'éviter l'interférence avec toute enzyme NADP-dépendante présente dans le milieu contenant la substance à doser (en pratique, le plus souvent un sérum), comme par exemple la glucose-6-phosphate désnydrogénase de Leuconostoc mesenteroides (EC 1.1.1.4g). I1 convient d'autre part de rendre le blanc le plus faile possible pour améliorer les dosages. Ce blanc représente en fait le NAD+ présent dans les enzymes utilisées; laquantité de NAD+ "endogène" doit donc entre, dans toute la mesure du possible, rendue minimale. Cela s'obtient classiquement par traitement des enzymes avec du charcon de bois, qui entraine malheureusement des pertes importantes d'enzymes. On est maintenant parvenu à améliorer considérablement cette purification au moye d'une chromatographie par filtration sur gel. Les blancs fournis par une telle méthode sont semblables à ceux que procure la méthode au chardon de bois, mais le mode opératoire est beaucoup plus simple et surtout la perte d'enzyme est presque nulle: Les exemples suivants illustrent plus con crètement l'invention, sans en limiter la portée. Les abréviations utilisées dans le présent texte, tant dans ce qui précède que dans les exemples ciaprès, ont les significations suivantes ADH : alcool-déshydrogénase GLSH : glutamate déshydrogénase LDH : lactate déshydrogénase MDH : malate désnydrogénase NAD+ : nicotinamide-adénine-dimueléctide NADH : 1dem, forme réduite NADH-POD : NADH-peroxydase NADP+ : nicotinamide-adénine-dinueléctide-phosphate NADPH : idem, forme réduite DC-6-PDH : glucose-6-phosphate-déshydrogénase 5-RADH : 6-phosphogluconate-déshydrogénase NAD(P)H : NADH ou NADPH T3 : trilodothyronine T4 : thyroxine El: oestrone : bestradiol 3 : oestriol F : cortisol Testo : testostérone EXEMPLE 1 cet exemple concerne la réalisation d'un cycle conforme à l'invention.On a préparé un tampon Tris 0,1 M et KAc (où Ac désigne le groupement acétate) 0,14 M à pH 8,5 contenant du glucose-6-phosphate 1 mM et du H202 l:mM. Avant 12 réalisation du cycle, on a abouté à ce tampon 100 g/ml de MADH-POD (EC 1.11.1.1) et 100 ug/ml de G-6-PDH (EC) 1.1.1.49); ces deux enzymes avaient au préalable été débarrassées du NAD+ ou du NADH qu'elles pouvaient contenir par filtration sur gel. A 100 /ul du réactif de cycle ainsi réalisé, on a ajouté 10/ul de la solution contenant le NAD+ à doser. On a laissé incuber pendant 1 heure à 37 C. On a ensuite bloqué les réactions en chauffant pendant 5 minutes à 100 C environ. Après refroidissement, on a ajouté 1 ml du réactir de révélation, dont la composition étai; la suivante: tampon Tris 20 mM et NH4Ao 30 mM (pH 7,7) contenant de l'EDTA C,1 mM, de la sérumalbumine bovine 0,02 %, du NADP+ 20 M et 0,45 /ug/ml de 6-PGDH.On a laissé la réaction se dérouler pendant 30 minutes à température ambiante, après quoi, on a lu la fluorescence contre un blanc obtenu conformément au mode opératoire ci-dessus, mais avec addi- tion, au départ de 10 ul de solution dépourvue de au lieu des 10 l de la solution contenant le NAD+ à doser. On a ainsi pu doser 25 fM (femtomoles) de NAD+ ou de dérivé de NAD+ I1 convient de noter que l'ampli- fication du cycle ainsi réalisé est linéaire dans un grand domaine de concentration, qui va d'environ 25 à 1000 femto moles. EXEMPLE 2 cet exemple concerne la purification préala ble des enzymes utilisées. Les enzymes utilisées 'dans le cycle amplificateur selon l'invention doivent contenir le moins possible de NAD+ ou de NADH ; on a donc purifié les préparations commercialement disponibles de NADH-POD et de G-6-PdH mises en oeuvre ensuite conformément au mode opéra toire décrit dans l'exemple 1. On a procédé à une filtration sur gel des enzymes concernées, en pratique sur du gel de Sephadex G 25 > dans un tampon Tris 0,1 M, pH 8,5. Les pertes en activité enzymatique sont nulles et on peut conserver les enzymes ainsi purifiées à + 40C et les utiliser ensuite directement dans un cycle tel que celui décrit dans l'exemple 1. Les blancs obtenus par cette méthode sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus par la méthode classique de purification au charDon de cois. EXEMPLE 3. cet exemple concerne le calcul ae l'amplifi- cation du cycle, par référence aux signaux donnés en fluorescence par des quantités connues de 6-phosphogluconate révélées selon exemple 1. On a pu ainsi doser 0,5 nM/ml de 6-phospho- gluconate. Ceci permet de calculer l'amplification du cycle, qui est alors de 6.000 par heure suivant exemple 1. Lors de la réalisation d'un cycle en vue de doser du NAD+ dans des milieux biologiques, il n'est pas nécessaire de réaliser une courbe de révélation du 6-phosphogluconate. I1 surfit de réaliser quelques standards NAD+ qui serviront à tracer une courbe d'étalonnage. Le choix de la valeur et du nombre ae ces standards dépena de la précision à obtenir et de la zone de concentration explorée. Il est conseillé également d'inclure un blanc, comme décrit ci-dessus, dans chaque série. REVENDICATIONS 1. Composition pour la realisation d'un cycle enzymatique amplificateur à NAD+ utilisant une réaction irreversible, en vue d'undosage, caracterisee en ce qu'elle comprend, associés en des proportions apptopriées, les composes permettant de réaliser les reactions : Glucose-6-phosphate + NAD+ 6-phosphogluconate + NADH + + H H202 + NADH + H 2 H20 + NAD+, où G-6-PDH et NADH-POD designent respectivement une glucose-6phosphate-deshydrogenase et une NADH-peroxydase, qui font accumuler du 6-phosphogluconate qui est la substance dosable. 2. Procédé pour la realisation de dosages enzymatiques, en particulier dans des fluides biologiques, caracterise en ce qu'il comprend la mise en oeuvre de la composition apte à réalisé ser un cycle enzymatique selon la revendication 1, le NAD+ etant celui contenu dans le milieu doser, l'incubation des differents réactifs et enzymes à un pH intermédiaire entre les pH optimaux des deux enzymes utilisees, et pendant un temps suffisant pour former du 6-phosphogluconate en une quantite depassant le minimum decelable., et ensuite le blocage du cycle et la reve- lation ou le dosage du 6-phosphogluconate forme. 3. Procede selon la revendication 2, caracterise en ce qu'il met en oeuvre une NADH-peroxydase de Streptococcus faecalis (EC 1.11.1.1) et une glucose-6-phosphate deshydrogenase NAD-dependante et n'interférant pas avec toute enzyme NADP-de- pendante présente dans le milieu contenant la substance a doser. 4. Procede selon la revendication 3, caracterise en ce qu'on utilise de la glucose-6-phosphate-déshydrogénase de Leuconostoc mésentéroides (EC 1.1.1.49). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu 'on purifie au préalable les enzymes en les soumettant à une chromatographie de filtration sur gel. 6. Procédé de dosage immunoenzymatique, caractérise en ce qu'il comprend l'addition, à un liquide biologique conte nant la substance à doser, d'une quantité donnée de la meme substance, mais liée de maniere covalente à du NAD+, la mise en compétition des deux substances avec une quantité donnée d'anticorps dirigés contrela substance à doser, et la mise en oeuvre du procédé de dosage enzymatique . selon rune quelconque des revendications 2 à 5. 7. Composition selon la revendication 1, caractérisé ence que la révélation du 6-phosphogluconate met en oeuvre une conversion en ribulose-5-phosphate au moyen de NADP et en presen- ce de 6-phosphogluconate-déshydrogénase.