Brevet FR2521553A1 — publié le 19830819

GLYCINE 8-CALCITONINE. La présente invention a pour objet des calcitonines ayant une activité biologique et des peptides qui peuvent être convertis en calcitonines biologi- quement actives, ainsi que les procédés pour la préparation de tels peptides et calcitonines. Tous les peptides naturels connus de type calcitonines présentent une séquence de 32 acides aminés La calcitonine de saumon, par exemple, a la formule suivante: lo I H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Va l-Leu-G ty-LysLeu-Ser 11 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gtn-Gtu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-ThrPro-NH, 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Dans les brevets américains Nos 3 926 938, 4 062 815, 3 929 758, 4 033 940, et 4 217 268 sont présentées des synthèses perfectionnées de calcitonines in- cluant la calcitonine de saumon ci-dessus indiquée. Les calcitonines naturelles comprennent les calcitonines de saumon, les calcitonines d'anguilles,de bovins, de porcins et d'ovins et les calcitonines humaines Toutes ces calcitonines présentent de la valine en position 8 sauf la calcitonine humaine qui présente de la méthonine à cette position 8. La Demanderesse a découvert des peptides synthétiques de type calcitonines avec 32 acides aminés qui présentent une activité biologique plus importante que celle de même type de calcitonines connues Une différence particulièrement significative dans la structure est que dans ces nouveaux peptides la séquence d'acides aminés nqeprésentepas le motif valine ou méthonine en position 8 comme c'est le cas sur les séquences d'acides aminésdecalcitonines connues. Ce nouveau peptide présente en position 8 un motif glycine et de ce fait appelé 'Glycine 8-Calcitonine, en se référant au système de nomenclature IUPAC-IUB pour les modifications synthétiques des peptides lBiochim Biophys Acta, 133, 1-5 ( 1967)1 Ces nouveaux peptides présentent un grand pouvoir et une bonne qualité quand on les compare aux calcitonines connues. Plus généralement, la Demanderesse a recours a un type de synthèse en LO phase solide et part d'une résine appelée résine benzhydrylamine (ciaprès dénommnée résine BHA) Cette résine est dérivée de résinessous forme de granulés de polystyrène réticulé, fabriqués lui-même par copolymérisation de styrène et de divinylbenzene Des résines de ce type sont connues et leur préparation est décrite par Pietta et al lPietta, P S et Marshall, G R, Chem Commun, 650 L 5 ( 1970)l Cette résine BHA de polystyrène réticulé est disponible sur le marché. On utilise ci-après la formule: C 6 H 5 pour représenter la résine BHA, ()-CHNH 2 formule dans laquelle, ô représente la partie polystyrène de la résine. Dans cette synthèse, les acides aminéssont ajoutés l'un après l'autre à la résine insoluble jusqu'à ce que la séquence peptidique totale soit construite sur la résine Les groupes fonctionnels des acides aminés sont protégés par des groupes de blocage Le groupe a-amino des acides aminés est protégé par un groupe butyloxycarbonyle tertiaire ou l'un de ses équivalents. Ce groupe a-butyloxycarbonyle tertiaire est ci-après désigné par BOC. Les fonctions hydroxyles de la sérine et de la thréonine sont protégées par un benzyle ou un groupe dérivé du benzyle tel que le 4-méthoxybenzyle, le 4-méthylbenzyle, le 3,4-diméthylbenzyle, le 4-chlorobenzyle, le 2,6dichloro- benzyle, le 4-nitrobenzyle, le benzhydryle ou un de leurs équivalents. Ci-après, on utilisera les initiales BZ pour représenter le benzyle ou un groupe dérivé du benzyle. La fonction hydroxyle de la tyrosine peut ne pas être protégée ou peut être protégée par un benzyle ou un groupe dérivé du benzyle, comme décrit ci- dessus, appelé groupe BZ, ou peut être protégée par un benzyloxycarbonyle ou un dérivé du benzyloxycarbonyle tel que le groupe 2chlorobenzyloxycarbonyle ou 2-bromobenzyloxycarbonyle ou leurs équivalents Ci-après, l'initiale W repré- sente soit l'absence d'un groupe protecteursoit un groupe BZ, soit un groupe benzyloxycarbonyle, soit un groupe dérivé du benzyloxycarbonyle. La fonction thiol de la cystéine peut être protégée par un benzyle ou des groupes protecteurs benzylesci-dessus décrits et désignés par BZ oupar un groupe n-alkylthio tel que les groupes méthylthio, éthylthio, npropylthio, n-butylthio ou leurs équivalents On utilisera ci-après le symbole R 2 pour représenter un groupe n-alkylthio ou BZ, et le symbole R 1 pour représenter BZ lorsque R 2 est un n-alkylthio et pour représenter un n-alkylthio quand R 2 est un BZ. Dans une variante, R 1 peut être un autre groupe cystéine et quand ceci est le cas R 2 est un BZ La fonction guanidine de l'arginine peut étre protégée par un groupe nitro, un groupe tosyle ou leurs équivalents On utilisera ci-après la lettre T pour représenter, soit un groupe nitro, soit un groupe tosyle. La fonction a-amino de la lysine peut être protégée par un groupe benzyloxy- carbonyle ouparundérivé du benzyloxycarbonyle tel que le 2chlorobenzyloxy- carbonyle, le 3,4-diméthylbenzyloxycarbonyle, ou leurs équivalents. On utilisera ci-après la lettre V pour représenter le groupe benzyloxycarbonyle ou un groupe dérivé du benzyloxycarbonyle Les groupes protecteurs utilisés sur l'azote imidazole de l'histidine sont le groupe benzyloxycarbonyle et les- dérivés du benzyloxycarbonyle tels que décrits ci-dessus pour la lysine et désignés par V Le groupe acide Y-carboxylique de l'acide glutamique est pro- tègë par un benzyle ou un groupe dérivé du benzyle tel que décrit pour la protection de la fonction hydroxyle de la serine et de la thréonine. Ces groupes protecteurs sont représentés par le symbole BZ. La formule de la nouvelle calcitonine de saumon de type Gly-8 ayant une activité de même type que la calcitonine de saumon connue peut être représentée comme suit: H-Cls-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 His-Lys-Leu-Gtn-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH 2 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Comme on peut le voir sur cette formule, 32 acides aminés sont inclus dans cette formule et les positions sont numérotées selon le système admis commençant en position 1 pour la Cys à une extrémité de la chaîne et terminant avec Pro à la position 32 à l'autre bout de la chaîne. Pour la clarté de la description, le même système de numérotation sera utilisé pour désigner les motifs acides aminés dans tout le cycle, de la synthèse. L'assemblage des acides aminés commence avec le cycle 32 qui a trait au cou- plage de la proline et continue avec le cycle 31 qui a trait au couplage de la thréonine, etc. Les réactifs acides aminés préférés à utiliser dans chacun des 32 cycles pour la synthèse sont donnés dans le Tab Leau I suivant: TABLEAU I Numéro de Cyc te Acide aminé réactif 32 BOC-L-Droline 31 BOC-0-benzvl-Lthréonine BOC-glycine 29 BOC-O 0-benzylL-56 rine 28 BOC-glycîne 27 BOC-0benzyl-L-thréonine 26 BOC-L-asparagine p-nitrophényl ester BOC-O 0-benzylL-thréonine 24 BOC- a-nitro-L-arginine ou BOC-0-tosyl-L-arginine 23 BOC-L proline 22 BOC-O 0-benzyl-L-tyrosine, BOC-Ltyrosine, ou BOC-0-2 bromobenzyloxycarbonyl-L-tyro sine 21 BOC'-0-benzyl-L-thréonine BOC-Lglutamine p-nitrophgnyl ester 19 BOC-L-leucine 18 BOC-e-CBZ L-lysine ou BOC-c-2-chlorobenzyloxyca r- bonyl-L-lysine 17 BOC-N( im)-CBZ-L-histidine 16 BOC-L-leucine Ester ybenzyle de l'acide BOC-L-glutamique 14 BOC-L-glutamnine p-nitrophényl ester 13 BOC-L-benzyl-L sérine 12 BOC-L-leucine il BOC-c-CBZ-L-lysine ou BOC-z-2-ehlorobenzyloxycar- bonyl-L-lysine BOC-glycine 9 BOC-L-leucine 8 BOC-L-glycine 7 BOC-S-éthylthio-L-cystéine, BOC-S méthylthio-L- cystéine, BOC-S-n-propylthio-L-cystéine ou BOC-S n-butylthio-L-cystéine 6 BOC-O-benzyl-L-threonine BOC-O-benzyl-L-sérine 4 BOC-L-leucine 3 BOC-Lasparagine p-nitrophényl ester 2 BOC-O-benzyl-L-sérine 1 BOC-S-p-méthoxybenzyl-L-cystéine, BOC-S-benzyl-L- cystéine ou BOC-S-3, 4-diméthylbenzyl-L-cystéine Bis-BOC-cystine Chacun des dérivés d'acides aminés mentionnés au Tab Leau I est dispo- nible sur le marché. CYCLE 32 Couplage de La pro Line a la résine BHA Le réacteur utilisé à toutes les phases de la synthèse du peptide à base de résine peut être un récipient en verre équipé d'orifices d'admission en partie supérieure pour l'entrée des produits et un disque en verre fritté au fond pour l'extraction des mélanges réactionnels solubles et des solvants de lavage par filtration La filtration peut être effectuée soit sous vide ou sous pression d'azote Le contenu du réacteur peut être agité soit par agita- tion du réacteur dans son ensemble, soit par un agitateur mécanique intérieur. Pour le cycle 32, on introduit la résine BHA dans le réacteur et on la met en suspension dans un solvant tel que le chlorure de méthylene, le chloroforme, le diméthylformamide, le benzène ou leurs équivalents, dans des proportions d'environ 3 à 12 ml de solvant par gramme de résine. On ajoute a cet ensemble la BOC-L-proline en quantité d'environ 1 à 6 équiva- lents par équivalent d'amine libre de la résine BHA employée Apres un temps de mélange de 5 à 10 mn on ajoute un agent de couplage (CA) tel que le dicyclohexyl carbodiimide (DCC) ou l'on peut utiliser d'autres agents de couplage de type diimide L'agent de couplage diimide peut être utilisé en quantité de 0,5 à 2,0 équivalents par équivalent de BOC-L-proline utilisée. La BOC-L-proline peut être couplée en l'absence d'un réactif de cou- plage si son dérivé ester actif, son dérivé azide, son dérivé symétrique anhydride, ou un dérivé anhydride mélangé convenablement choisi sont utilisés. Les dérivés esters actifs qui peuvent être employés sont l'ester 2nitrophényle, l'ester 4-nitrophényle, l'ester pentafluorophényle, l'ester N-hydroxysuccinimide ou leurs équivalents Les esters actifs sont utilisés en quantités de 1 à 10 équivalents par équivalent d'amine libre de la résine BHA. 252 1 3 q Le mélange réactionnel constitué par la résine BHA, le solvant, la BOC-L-proiine, et le réactif de couplage ou l'ester actif de BOC-Lproline est agité ou secoué mécaniquement jusqu'à ce que la réaction soit complète comme indiqué par le test ô la ninhydrine lE Kaiser, et al, Anal Biochem, 34, 595-8 ( 1970)l, effectué sur un échantillon Une fois terminée la réaction de couplage, la résine BOC-L-proline peut être lavee avec dés solvants tels que le chlorure de méthylène, le chloroforme, l'alcool méthylique, le benzène, le diméthylformamide, ou l'acide acétique La quantité de solvant de lavage peut être de façon adéquate de 5 à 20 ml de solvant par gramme de O résine BHA utilisée au départ Si on le désire, on peut arrêter la réaction de couplage avant qu'elle soit terminée, le lavage pouvant être effectué et les groupes amino libres restant sur la résine BOC-L proline peuvent être bloqués par une réaction subséquente d'acetylation avec un excès de réactifs d'acé- tylation Cette acetylation peut être exécutée en agitant la résine BOC-L- proline avec une solution du réactif d'acétylation pendant un temps de 0, 5 a 12 heures Les réactifs d'acetylation tels que le N-acetylimidazole en solution dans le chlorure de méthylène ouunmélanged'anhydride acétique et de triéthylamine dans le chloroforme peuvent être utilisés Le réactif d'acetylation peut être utilisé en quantité de 0,5 à 5,0 équivalents par O équivalent d'amine libre titree sur la résine BHA de départ. La réaction de couplage pour produire la résine BOC-L-proline peut être représentee par la formule suivante: o AN c H DCC C H. il 11 6 5 H 6 5 CRA N + NH CH-NHCH' C- | N COOH CH 2 c L 2 -NH CH-Q OC(CH 3)3 OC(CH 3)3 Libératio d la protection de La résine BOC-L-proline La résine BOC-Lproline produite comme il a été décrit ci-dessus peut être lavée avec un solvant tel qu'indiqué et libérée de sa protection en agi- tant avec un agent tel qu'un mélange d'acide trifluoroacetique (TFA) dans un solvant tel que le chlorure de méthylene, le chloroforme, le benzène ou leurs équivalents La quantité de TFA dans le solvant peut varier de 10 à 100 % du mélange La quantité du mélange TFA-solvant peut varier de 3 à 20 ml par gramme de résine BHA utilisée au départ La durée de réaction peut être d'environ 252155 3 min à 4 heures La phase de libération de la protection est terminée par filtration pour extraire le mélange TFA-solvant Le TFA résiduel peut être extrait de la résine L-proline par lavage avec 3 à 20 ml par gramme de résine BHA, d'une solution de 5 à 30 % de triéthylamine dans un solvant tel que le chlorure de méthylène, le chloroforme, le benzène, ou leurs équivalents. D'autres amines organiques tertiaires ou secondaires peuvent être utilisées à la place de la triéthylamine, telles que la triméthylamine, la N-éthyl- pipéridine, la diisopropylamine, ou leurs équivalents La teneur en amine libre de la résine L-proline peut être déterminée par la méthode de titrage de Dorman (Dorman, L C, Tetrahedron Letters, 1969, 2319-21) La réaction de libération de la protection peut être représentée par la formule suivante: 0 r_ C 6 H 5 ( 1) TFA D C H. N m CNHCH % ( 2) (C 2 H 5)3 N c CH- C-N N' 23 H - OC(CH 3)3 CYCLE 31 La résine prolyle BHA obtenue à l'issue du cycle 32 peut être mise en suspension dans un solvant de couplage, le dérivé de BOC-O-BZ-L thréonine étant ajouté et le mélange équilibré de la même manière. -L'agent de couplage, le DCC, peut être ajouté, et après accomplissement de la réaction comme indiqué par le test à la ninhydrine, le mélange réactionnel peut être extrait de la résine BOC-O-BZ thréonylprclyle BHA par filtration. La résine peptidique peut être lavée avec des solvants Les quantités de réactifs et de solvants et les durées de réaction peuvent être les mêmes que cela a été décrit au cycle 32 Le groupe BOC peut être éliminé de la résine peptidique par le processus de libération de la protection décrit à propos du cycle 32 La résine résultante O-BZ-thréonylprolyl BHA est alors prête pour le cycle 30 Les réactions du cycle 31 peuvent être représentées par la formule ci-après: OBZ II O CH CH C NIICHCOH OCCH OC (CH 3)2 DCC ' + H N O C 6 H 5 HN / Il 16 CNHCH, ( 1) TFA NH. -_) ( 2) (CIH 5)3 N OBZ I O CH 3 CH | N)0 C 6 H 5 C NHCH-C- I O CNHCH-6) Ou ICH 3 J 3 Par commodité, on représentera la résine peptidique résultante en utili- sant la nomenclature abrégée suivante: BZ C 6 H 5 I I H-Thr-Pro-NHCHI-( CYCLE 30 Au cycle 30, la réaction de couplage et la réaction de libération de la protection peuvent être menées de la même manière qu'au cycle 31, à l'exception du fait que la BOC-glycine est utilisée à la place de la BOC-O-BZ-Lthréonine. La réaction par couplage et libération de la protection peut être représentée comme suit: BZ C 6 H 5 BOC-Gly + H-ihr-Pro-NHCH Q ( 1) DCC ( 2) TFA ( 3) (C 2 H 5) N i D BZ C 6 H 5 H-G Ly-Thr-Pro-NHCH CYCLE 29 Au cycle 30, les réactions de couplage et de libération de la protection peuvent être menées de la même manière qu'au cycle 31 en dehors de la substitu- tion par la BOC-O-BZ-L-sérine comme dérivé d'acide aminé Ceci peut être repré- senté par la formule suivante: BZ C 6 H BOC-BZ-Ser + H-Gty-thr-Pro-NHCH G L BZI 6 H 5 H-Ser-G ty-Thr-Pro-NHCH (i) CYCLE 28 Au cycle 28, les réactions de couplage et de libération de la protection peuvent être menées comme décrites au cycle 31 en dehors du fait que la BOC- glycine est substituée comme réactif acide aminé Ces réactions de couplage et de libération de la protection peuvent être représentées comme suit: BZ BZ C 6 H 5 BOC-G Ly + H-Ser-Gly-Thr-Pro-NHCH BZ BZ C H H Ly-Ser-G ly-Thr-Pro-NHCH R CYCLE 27 Dans ce cycle, les réactions de couplage et de libération de la protec- tion peuvent être exécutées comme au cycle 31 en utilisant le même réactif acide aminé, ce qui donne pour résultat le composé suivant: BZ BZ BZ C 6 H 5 I I I I t H-Thr-Gly-Ser-G Ly-Thr-Pro-NHCH-R( CYCLE 26 Au cycle 26, la réaction de couplage est conduite en utilisant un dérivé ester actif de la BOC-L-asparagine Le procédé à l'ester actif est utilisé au lieu de l'agent de couplage DCC avec la BOC-asparagine ou la BOCglutamine. La réaction peut être menée en utilisant le dérivé ester actif de la BOCL- 1 00 asparagine en quantité de 2 à 10 équivalents par équivalent d'amine libre de la résine BHA dans le diméthylformamide, des mélanges de diméthylformamide avec le benzène, le chlorure de méthylène ou le chloroforme, ou leurs équiva- lents en quantitéide 2 à 20 ml de solvant par granmmne de résine BHA utilisée au départ. I 5 -Les temps de réaction sont de l'ordre de 1 à 72 heures Le mélange réactionnel peut être extrait de la résine peptidique BOC par filtration une fois terminée la réaction telle qu'indiquée par le test par la ninhydrine. Les dérivés esters actifs employés peuvent être les esters de 2nitrophényle, de 4-nitrophényle, de pentafluorophényle, ou leurs équivalents. O Dans ce qui suit on utilise les lettres AE pour désigner les parties esters actives du dérivé La réaction de couplage peut s'écrire comme suit: Z BZ BZ C H fi BOC-Asn-AE + H-Thr-Gly-Ser-G Ly-Thr-Pro-NHCH-@- BZ BZ Z C 6 H 5 BOC-Asn-Thr-Gty-Ser-Gly-Thr-Pro-NHCH . La réaction de libération de la protection pour éliminer le groupe BOC est conduite commne au cycle 32. CYCLES 25 à 21 Dans chacun des cycles 25 à 21,1 es réactions de couplage et de libération de la protection peuvent être menées en utilisant les méthodes et les propor- tions de réactifs du cycle 31, en utilisant au cycle 25 la BOC-BZ-Lthréonine, au cycle 24 la BOC-w-T-L-arginine, au cycle 23 la BOC-Lproline, au cycle 22 la BOC-L-leucine, et au cycle 21 la BOC-O-BZ-L-thréonine. Le composé résultant à la fin du cycle 21 peut être représenté comme suit: BZ W T Z BZ BZ BZ C 6 H 5 H-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-G Ly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHCH G CYCLE 20 Au cycle 20, les réactions de couplage et de libération de la protection IP peuvent être menées en utilisant les méthodes et les proportions de réactifs du cycle 26, en utilisant un dérivé ester actif de la BOC-Lglutamine comme dérivé d'acide aminé, ce qui se traduit finalement par l'obtention du produit: l Z W T BZ BZ BZ 6 Z C 6 H 5 / I I Il/I ' H-G tnthr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-G ty-Ser-Gty-Thr-Pro-NHCH-l) CYCLE 19 Au cycle 19, les réactions sont menées comme au cycle 31 en utilisant la BOC-L-leucine comme dérivé acide aminé Le composé qui en résulte à la fin du cycle 19 est le suivant: BZ W T BZ BZ BZ BZ C H H-Leu-Gln-Th r-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-G Ly-Se r-G ly-Thr-Pro-NH CH-Q CYCLE 18 Au cycle 18, on peut utiliser conmme dérivé d'acide aminé la BOC-E-V-L- lysine En dehors de ce point, les procédés du cycle 18 peuvent être réalisés comme au cycle 31, ce qui aboutit au composé suivant: V BZ W T BZ B BZ BZ C 6 H H-Lys-Leu-G Ln-'hr-Tyr-Pro-Arg-'hr-Asn-Thr-Glu-Ler-G Ly-Thr-Pro-NHC CYCLES 17 à 15 Les cycles 17 à 15 peuvent être menés comme le cycle 31 en dehors du fait que l'on utilise au cycle 17 la BOC-N(im)-V-L-histidine, au cycle 16 la BOC-L-leucine et au cycle 15 l'ester BZ de l'acide BOC-L-glutamique (BZ représente les mêmes groupes que pour la sérine et la thréonine). A la fin du cycle 15, on obtient le composé suivant: V' V BZ W T BZ BZ BZ CH 7 Z,1 i i 1 6 5 H-G lu-Leu-H i s-Lys-Leu-G lu-Thr-Tyr-Pro-Arg-th r-Asn-Thr-G Ly-Ser-G lyThr-Pro-NHCH- CYCLES 14 à 8 Le cycle 14 peut être mené de façon identique au cycle 20 en utilisant la BOC-L-glutamine AE comme dérivé d'acide aminé Les cycles 13 à 8 peuvent être menés conmme le cycle 31 à l'exception du fait que l'on utilise au cycle 13 la BOC-O-BZ-t-sérine, au cycle 12 la BOC-L-leucine, au cycle 11 la BOC-c-V-L-lysine, au cycle 10 la BOC-glycine, au cycle 9 la BOC-Lleucine, au cycle 8 la BOC-L-glycine, ce qui se termine sur le composé suivant: V BZ BZ V V Z W T BZ H-6 ty-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Gtu-Leu-H i s-Lys-Leu-Gtu-fhr-Tyr-Pro-Argihr-Asn- BZ BZ BZ C 6 H thr-Gty-Ser-Gty-Thr-Pro-NHC 5 Q CYCLE 7 Le cycle 7 peut être conduit comme le cycle 31 à l'exception du fait que l'on utilise la BOC-S-L-cystéine ou unde ses dérivéscomme dérivé d'acide aminé Les composés qui résultent du cycle 7 sont représentés par la formule suivante: R 2 V BZ BZ V V I I I I I I H-Cys-G Ly-Leu-G Ly-Lys-Leu-Ser-G Ln-G Lu-Leu-His-Lys-Leu-G Ln- BZ W T BZ BZ BZ BZ C 6 H 5 I I II I I Il 6 Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gty-Thr-Pro-NHCH- formule dans laquelle: R 2 est un groupe alkylthio ou BZ. CYCLES 6 à 2 Les cycles 6 à 2 peuvent être conduits comme le cycle 31 en dehors du fait que la BOC-O-BZ-L-thréonine peut être utilisée comme dérivé d'acide aminé au cycle 6, la BOC-BZ-L-sérine au cycle 5 et au cycle 2, et la BOCL-leucine au cycle 4 Le cycle 3 peut être conduit de la même façon que le cycle 26 en utilisant l'ester actif de la BOC-L-asparagine Le composé résultant du cycle 2 peut être représenté par la formule suivante: BZ BZ BZ R 2 V BZ BZ I Il I I I I Hi-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gty-Leu-Gty-Lys-Leu-Ser-G Ln-G Lu-Leu- V V BZ W T BZ BZ BZ BZ l I I I I I I I I His-Lys-Leu-Gtn-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-G Ly-Ser-Gty-Thr- C 6 H 5 Pro-NHCH-Q CYCLE 1 Ce cycle peut être conduit de la même façon que le cycle 7 en utilisant des dérivés de la BOC-S-R-L-cystéine Le groupe R choisi pour la cystéine peut être le même qu'utilisé au cycle 7 ou peut être différent Par exemple, si le dérivé choisi pour le cycle 7 est la BOC-S-éthylthio-Lcystéine, le dérivé * au cycle 1 peut être la BOC-S-4-méthoxybenzyl-L-cystéine ou si la BOC-S-4- méthoxybenzyl-L-cystéine est choisie pour le cycle 7 alors ce dérivé peut être également utilisé au cycle 1 Les composés résultant du cycle 1 sont représentés par la formule suivante: R 1 BZ BZ R 2 V BZ I I I I I I H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gty-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Gtu-Leu-His- V BZ W T BZ BZ BZ BZ C 6 H 5 I I Il l I Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-G Ly-Ser-Gly-Thr-ProNHCH- formule dans laquelle: R 1 est un S-n-alkyle, Cys ou BZ, et 0 R 2 est un S-n-alkyle ou BZ, R 1 étant un alkyle ou Cys quand R 2 est BZ, et R 2 étant BZ quand R 1 est S-n-alkyle ou Cys. Le cycle 1 correspond à la fin de la réalisation de la résine peptidique, cette résine peptidique peut être extraite du réacteur et séchée sous vide. Le poids de résine peptidique peut être prévu de l'ordre de 2,0 à 3,5 fois le poids de la résine BHA utilisée initialement pour la synthèse. Shparation de ta résine et du eptide __ __ ___ __ ___ __ ___ __ __ ____d Le peptide est séparé à partir de la résine peptidique issue du cycle 1 par traitement avec de l'acide fluorhydrique liquide (HF) La réaction de 0 séparation à HF peut être menée en traitant un mélange de la résine peptidique et d'anisole ( 0,5 à 5 ml par gramme de résine peptidique) avec du HF liquide ( 2 à 20 ml par gramme de résine peptidique) pendant 0, 5 à 20 heures à des températures de -20 a + 15 C Apres la phase réactionnelle, le HF enexcès est éliminé par évaporation et le mélange résultant de peptide et de granulés de résine peut être extrait par un solvant organique tel que l'acétate d'éthyle, l'étherdiéthylique, le benzene ou équivalent pour éliminer l'anisole et les résidus de HF Le peptide peut être séparé des granulés de résine par extrac- tion à l'acide acétique aqueux Le peptide à cette étape n'est pas cyclique, mais est un produit non-cyclique sans la liaison cyclique disulfure entre les cystéines de positions i et 7 de la molécule. Le traitement à l'HF enlève tous les groupes bloquantsdu peptide, exceptés les groupes bloquant S-alkylthio sur la fonction thiol du motif cysteine soit en position 1, soit en position 7 Le motif S-n-alkylthio-L- cystéine est stable au processus de séparation au HF et reste intact au cours de cette séparation et de l'extraction Le motif S-BZ-L-cystéine est séparé au HF, ce qui donne un motif cystéine avec une fonction thiol libre. Les deux types de groupes bloquants ont été employes pendant la synthèse en combinaison l'un avec l'autre en positions i et 7. Ainsi, les peptides obtenus après la séparation au HF peuvent être l'un des trois types dépendant des groupes bloquants choisis pour la fonction thiol du dérivé de la cystéine utilisé au cours de la synthèse de la résine peptidique. Si les dérivés de la BOC-S-BZ-L-cystéine sont utilisés dans la synthèse de la résine peptidique au cycle 1 et si la BOC-S-n-alkylthio-L-cystéine est utilisée au cycle 7, le peptide résultant après séparation au HF serait du type 1 et aurait une fonction libre thiol en position 1 et aurait une fonction S-n-alkylthio sur le motif cystine en position 7 On appelle ici peptide de Type I celui qui est représenté par la formule suivante: S-n-a Lkylte H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-G Ly-Leu-Glu-Lys-Leu-Ser-G tn-G lu- Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gty-Ser-Gty- Thr-Pro-NH 2 En variante, si un dérivé de la BOC-S-n-alkylthio-L-cystéine est utilisé au cycle 1 et si des BOC-S-BZ-L-cystéinessont utilisées en position 7, le peptide résultant de la séparation serait de Type II et serait représenté par la formule suivante: S-n-a Lkyte H Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Gtu- Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-G Ly-Ser-Gly-Thr- Pro-NH 2 A la place du groupe protecteur S-n-alkyle en position 1, on peut utiliser un groupe cystéine (qui avec la cystéine à ladite position forme un groupe cystine) et quand on agit ainsi, on utilise un groupe BZ pur protéger la cystéine en position 7 Si la Bis-BOC-L-cystéine est utilisée comme réactif au cycle 1 et si la BOC-S-BZ-L-cystéine est utilisée comme réactif au cycle 7, le peptide résultant de la séparation sera du Type III et peut être représenté par la formule suivante: H-Cys I H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-G Ly-Leu-G Ly-Lys-Leu-Ser-G Ln- Gtu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser- 6 iy-Thr-Pro-NH 2 Si l'on utilise la BOC-BZ-L-cystéine comme réactif aussi bien en position 1 qu'en position 7, le peptide résultant de la séparation sera de Type IV et O représenté par la formule suivante: H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-G Ly-Leu-Glty-Lys-Leu-Ser-Gln- Gtu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser- Glty-Thr-Pro-NH 2 La conversion des peptides de Types I, II et III enpeptides disulfures cycliques peut être effectuée en diluant avec de l'eau distillée la solution o aqueuse d'acide acétique des peptides brutsrésultant de la séparation au HF, et ceci pour obtenir un volume final de 50 à 200 ml par gramme de résine peptidique séparée Le p H de cette solution peut être réglé à 5 à 10 par addition d'une solution d'ammoniaque et le mélange peut être agité dans un récipient fermé sous un courant de gaz inerte tel que l'azote pendant environ 2 à 48 heures Le temps de réaction peut être arrêté quand le courant de gaz sortant du récipient ne contient plus de n-alkylmercaptan Le p H du mélange réactionnel peut être abaissé à environ 3,5 à 5,5 par addition d'acide acétique glacial. La conversion des peptides de Types IV en peptides disulfures cycliques D peut être réalisée par tout procédé classique connu dans l'art antérieur dans lequel les peptides sont oxydés pour former la structure en anneau et inclure dans l'anneau les cystéines des positions 1 et 7. Quand les peptides intermédiaires sont de Types I, II, III ou IV, on peut synthétiser des peptides ayant des chaînes d'acides aminés correspondant à tous typesde calcitoninesconnus,excepté en ce qui concerne le fait que la glycine est en position 8, et de tels peptides synthétisés comme c'est le cas ici, peuvent être purifiés et se révèlent présenter le même type d'activité biologique que l'activité de la calcitonine connue Toute calcitonine peut être synthétisée et désignée par Gly 8-calcitonine, ceci selon les spécifi- O cations de nomenclature IUPAC-IUB. Purification de La G Ly 8 SCT brute Les solutions des peptides bruts à p H de 5,0 issus de la synthèse ci- dessus peuvent être concentrées en utilisant un procédé d'échange ionique. Le concentré peut être purifié par une combinaison de processus de filtration par gel et méthodes dechromatographie à échange ionique Le produit-final purifié peut être obtenu à partir de la solution par séchage-congélation, ce qui donne un solide blanc pelucheux. A l'analyse, le produit montre les acides aminés correspondant aux peptides désirés. Pour mieux faire comprendre les caractéristiques techniques et les avantages de la présente invention, on va en décrire un exemple de réalisation, étant bien entendu que celui-ci n'est pas limitatif quant à son mode de mise en oeuvre et aux applications qu'on peut en faire. EXEMPLE 1 Activation de La résine La résine BHA ( 5 g) avec une teneur en amine de 0,61 meq/g est placée dans un réacteur pour la synthèse peptidique commercialisée par Schwarz-Mann, INC d'Orangeburg, New-York La résine est traitée avec 25 ml des solvants suivants en filtrant après chaque traitement: chlorure de méthylène pendant 2 min, chloroforme, 2 fois 2 min, % de triéthylamine dans le chloroforme, 2 fois 5 min, chloroforme pendant 2 min, chlorure de méthylène, 3 fois 2 min. Cc te 32 Couúpage: La résine BHA, 25 ml de chlorure de méthylène et 2,589 ( 0,012 mole) de BOC-L-proline sont agités pendant 10 minutes. 12,0 ml d'une solution dans le chlorure de méthylène de dicyclohexylcarbo- diimide ( 1 milliéquivàlent de DCCI par millilitre de solution) sont ajoutés dans le réacteur et le mélange est agité pendant 6 heures Le mélange réac- tionnel est extrait du réacteur par filtration et la résine BHA BOCprolyle est soumise aux lavages suivants successifs de 2 min, à l'aide de 15 ml de solvant en éliminant-chaque fois-par filtration le solvant de lavage: chlorure de méthylène, 2 fois, alcool méthylique, 2 fois; chlorure de méthylène, 3 fois. 2521 553 Acétytation: La résine est agitée avec un mélange de 1,5 ml de triéthyl- amine (TEA), 1 ml d'anhydride acétique et 25 ml de chloroforme pendant 2 heures. Le mélange réactionnel est extrait par filtration et la résine soumise à une série de lavages de 2 min à l'aide de 25 ml de solvant: chloroforme, 3 rois, alcool méthylique, 2 fois, chlorure de méthylène, 3 fois. Libération de lta protection: La résine BOC-protégée est agitée pendant LO 5 min avec un mélange de 15 ml d'acide trifluoroacétique (TFA) et 15 ml de chlorure de méthylène Le mélange est extrait par filtration et la résine est agitée avec un second mélange de 15 ml de TEA et 15 ml de chlorure de méthylène pendant 30 min Le mélange réactionnel est extrait par filtration et la résine est soumise ensuite aux lavages suivants à l'aide de 25 ml de solvant: L 5 chlorure de méthylène, 2 fois 2 min, alcool méthylique, 2 fois 2 min, chloroforme, 2 fois 2 min, % de TFA dans le chloroforme, 2 fois 10 min, chloroforme-, 2 fois 2 min, 0 B chlorure de méthylène, 2 fois 2 min. La résine BHA L-proline est titrée pour établir la teneur en amine ou en proline La valeur trouvée est de 0,55 milliéquivalent d'amine ou de proline par gramme de résine. Cycle 31 Comup Lae: La résine L-prolyle, 25 ml de chlorure de méthylène et 3,49 ( 0,011 mole) de BOC-O-benzyl-L-thréonine sont agités pendant 10 minutes. On ajoute ensuite 11,0 ml d'une solution dans le chlorure de méthylène de DO dicyclohexylcarbodiimide ( 1 milliéquivalent de DCCI par ml de solution ou un total de 0,011 mole de DCCI) et le mélange ainsi obtenu dans le réacteur est agité pendant 2 heures Le mélange réactionnel est extrait du réacteur et la résine est soumise aux lavages successifs suivants de 2 min, à l'aide de 25 ml de solvant, en éliminant le solvant par filtration après chaque lavage: chlorure de méthylène, 2 fois, alcool méthylique, 2 fois, chlorure de méthylène, 3 fois, Le test à la ninhydrine se révèle négatif. Elimination de la protection: Le processus d'élimination de la protection décrit au cycle 32 est répété pendant ce cycle. Cycles 30 à 27 Les procédés de couplage et d'élimination de la protection utilisés dans ces cycles sont les mêmes qu'au cycle 31, excepté en ce qui concerne les dérivés d'acides aminés utilisés à la place du dérivé de thréonine: Au cycle 30: 1,92 g ( 0,011 mole) de BOC-glycine. Au cycle 29: 3,25 g ( 0,011 mole) de BOC-O-benzyl-L-sérine Au cycle 28: Le réactif utilisé est le même qu'au cycle 30. Au cycle 27: Le réactif utilisé est le même qu'au cycle 31. Cycle 26 Couelage: La résine peptidique obtenue à l'issue du cycle 27 est lavée deux fois avec 25 ml de diméthylformamide (DHF) La résine est alors agitée pendant 24 heures avec une solution de 5,82 g ( 0,0165 mole) d'ester p-nitrophényle de BOC-l-asparagine dans 35 ml de DMF Le mélange réactionnel est filtré et la résine peptidique est soumise à des lavages successifs de deux fois 2 min dans 25 ml des solvants suivants: DMF, chlorure de méthylène, méthanol, chlorure de méthylène Chaque solvant individuel est éliminé par filtration. Le test à la ninhydrine est négatif. Elimination de la protection: Le processus d'élimination de la protection utilisé au cycle 32 est répété. Cyce 25 Les réactions de couplage et d'élimination de la protection sont les mêmes qu'au cycle 31 en utilisant les mêmes réactifs et les mêmes quantités. Cycle 24 Coutage: La résine peptidique obtenue à l'issue ducycle 25 est lavée. avec deux doses successives de 25 ml de DMF La résine peptidique est alors agitée pendant 10 min avec un mélange de 7,06 mg ( 0,0165 mole) de BOC-Ny- tosyl-L-arginine et 25 ml de DMF On ajoute alors 16,5 ml de DCCI dans le chlorure de méthylène (équivalent de 0,0165 mole de DCCI), et le mélange est agité pendant 6 heures Le mélange réactionnel est extrait par filtration. La résine peptidique est soumise à des lavages de deux fois 2 min avec des doses de 25 ml des solvants suivants: DMF, chlorure de méthylène, alcool méthylique, chlorure de méthylène Le test à la ninhydrine est négatif. Etisination de la protection: L'élimination utilisée au cycle 32 est répétée. Cycle 23 Coutage: La résine peptidique issue du cycle 24 est agitée pendant min avec 3,54 g ( 0,165 mole) de BOC-L-proline et 25 ml de chlorure de méthylène On ajoute 16,5 ml de DCCI dans le chlorure de méthylène (équivalent de 0,0165 mole de DCCI-) et le mélange est agité pendant 6 heures. Le mélange réactionnel est extrait par filtration et la résine peptidique O est soumise à des lavages de deux fois 2 min avec des doses de 25 ml des solvants suivants: chlorure de méthylène, alcool méthylique, chlorure de méthylène Chaque solvant individuel est éliminé par filtration. Le test à la ninhydrine est négatif. Elimination de la protection: L'élimination utilisée au cycle 32 est répétée. Ccles 22 et 21 Les procédés de couplage et d'élimination de la protection utilisés au cours de ces cycles sont les mêmes qu'aux cycles 23, excepté en ce qui con- cerne leur réaction de couplage o les dérivés d'acides aminés suivants sont utilisés à la place de BOC-L-proline: Au cycle 22: 8,15 g ( 0,0165 mole) de BOC-W-L-tyrosine. Au cycle 21: 5,1 g ( 0,0165 mole) de BOC-O-benzyl-L-thréonine. Cyclte 20 La procédure est la même qu'au cycle 26, excepté que 6,05 g ( 0, 0165 mole) d'ester p-nitrophéryl de BOC-L-glutamine sont utilisés à la place du dérivé diasparagine. Cycles 19 à 15 La procédure est la méme qu'au cycle 31, excepté que les dérivés d'acides aminés suivants sont utilisés à la place du dérivé de thréonine: Au cycle 19: 2,54 g ( 0,011 mole) de BOC-L-leucine Au cycle 18: 4,55 g ( 0,011 mole) de BOC-E-2chlorocarbobenzyloxy-L-lysine Au cycle 17: 5,14 g ( 0,011 mole) de BOCN(im)-carbobenzyloxy-L-histidine Au cycle 16: Voir cycle 19 Au cycle 15: 3,70 g ( 0,11 mole) d'ester y-benzyle d'acide BOC-Lglutamique. 2 5 2 1 5 5 3 ycle 14 Le même qu'au cycle 20. Cycle 13 Le procéde utilisé est le même que celui utilisé au cycle 23, excepté que la réaction de couplage à l'aide de 4,86 g ( 0,0165 mole) de BOC-Obenzyl- L-sérine est utilisée à la place du dérivé de proline. Cycles 12 à 9 Les procédés utilisés sont les mêmes que ceux utilisés au cycle 31, excepté que les réactions de couplage sont effectuées avec les dérivés d'acides aminés suivants à la place du dérivé de thréonine: Au cycle 12: mêmes réactifs qu'au cycle 19. Au cycle 11: mêmes réactifs qu'au cycle 18. Au cycle 10: mêmes réactifs qu'au cycle 30. Au cycle 9: mêmes réactifs qu'au cycle 19. Cycle 8 Cou 2 plae: La résine peptidique issue du cycle 9 est agitée pendant 10 min avec 3,48 g ( 0,016 mole) de BOC-L-glycine et 25 ml de chlorure de méthylène. On ajoute ensuite 16,5 ml de DCCI dans le chlorure de méthylène (équivalent à 0,0165 mole de DCCI) et l'on agite le mélange pendant 16 heures. Le mélange réactionnel est extrait par filtration La résine peptidique est soumise à des lavages de deux fois 2 min avec des doses de 25 ml des solvants suivants: chlorure de méthylène, alcool méthylique, chlorure de méthylène Chaque solvant de lavage individuel est extrait par filtration. Elimination de la protection: Voir cycle 31. Cycle 7 Le processus est le même que celui utilisé au cycle 31, excepté que dans la réaction de couplage, on utilise 3,09 g ( 0,011 mole) de BOC-S- éthylthio-L-cystéine à la place du dérivé de thréonine. Cycle 6 Les réactifs et procédés utilisés sont les mêmes qu'au cycle 31. Cyc Le 5 Les réactifs et procédés utilisés sont les mêmes qu'au cycle 29. Cycle 4 Les réactifs et procédés utilisés sont les mnimes qu'au cycle 19. Cycle 3 Les réactifs et procédés utilisés sont les mêmes qu'au cycle 26. Cycle ___ Les réactifs et procédés utilisés sont les mêmes qu'au cycle 29. Cycle ____ Les réactifs et procédés utilisés sont les mêmes qu'au cycle 31, à l'exception du fait que l'on utilise 3,75 g ( 0,011 mole) de BOC-S-p- méthoxybenzyl-L-cystéine à la place du dérive de thréonine, En fin de cycle 1, la résine peptidique est lavée successivement avec deux doses de 25 ml de n-hexane Le matériau peptidique extrait du réacteur est séché dans un four électrique sous vide à 40 C et sous 0,1 mm de mercure pendant 24 heures. Sè 2 aration à L'acide f Luorhdrilgue La résine peptidique séchée ( 2 g) et 2 ml d'anisole sont placés dans un réacteur en Téflon Le réacteur est équipé d'un agitateur magnétique revêtu de Téflon et est placé dans un bain d'acétone et de glace sèche, et l'on condense dans le réacteur 10 ml d'acide fluorhydrique (fluorure d'hydrogène) gazeux dans le réacteur Le mélange est agité à O C dans le bain de glace pendant i heure L'acide fluorhydrique est éliminé par évapo- ration sous pression réduite Le résidu est trituré avec six doses de ml d'acétate d'éthyle Le peptide est extrait des granulés de résine avec 120 ml d'une solution aqueuse acétique 0,1 molaire. Cyccisation du peptide L'acide acétique aqueux extrait obtenu à la suite de la séparation à l'acide fluorhydrique est dilué jusqu'à 0,2 litre par addition de 80 ml d'eau distillée Le p H de la solution est ajusté à 7,5 par addition d'ammoniaque concentrée La solution est agitée en réacteur clos sous un courant d'azote pendant 24 heures On ne détecte alors aucune présence d'éthyl mercaptan dans le courant d'azote sortant du réacteur. La teneur en éthyl mercaptan du courant d'azote est mesurée en faisant passer le courant d'azote dans une solution de réactif d'Ellman lEllman, G L, Arch Biochem Biophys, 82, 70-07 ( 1969)l Le p H du mélange réactionnel est ajusté à 5,0 par addition d'acide acétique glacial. Purification de La G Ly-8 SCT brute Les 200 ml de solution issus de la synthèse ci-dessus à p H 5,0 est concentré en utilisant une colonne d'échange ionique "SP-Séphadex C-25 " . Le concentré de 25 ml extrait de la colonne avec une solution 0,7 molaire de chlorure de sodium est dessalé etpurifié enpassant à travers une colonne de filtration par gel de type "Séphadex G-25 "@ (filtration fine) et l'on extrait avec une solution aqueuse 0,03 molaire d'acide acétique. La fraction de Gly-8-SCT extraite de la colonne est ajustée au p H 6,0 par addition d'une solution ammoniacale La solution est ensuite purifiée par chromatographie à échange d'ions en utilisant une colonne "Whatman CM 52 " avec extraction par de l'acétate d'ammonium tampon La fraction Gly8-SCT extraite de la colonne est ajustée à un p H 5,0 par addition d'acide glacial acétique La solution est concentrée en utilisant une colonne d'échange ionique"SP-Séphadex C-25 "@ Les 30 ml de concentré extraits de la colonne avec une solution 0,7 molaire de chlorure de sodium sont dessalés dans une colonne de filtration fine par gel "Séphadex G-25 "@ La fraction de peptides purifiée est recueillie et séchée par congélation Le produit obtenu est un solide blanc pelucheux. L'analyse de l'acide aminé ainsi obtenu donne les rapports suivants par rapport aux valeurs théoriques données entre parenthèses: Asp 2,0 ( 2), Thr 5,0 ( 5), Ser 3,8 ( 4), Glu 3,3 ( 3), Pro 2,2 ( 2), Gly 3,8 ( 4), Leu 4,9 ( 5), His 0,9 ( 1), Tyr O,85 ( 1), Cys 1,9 ( 2), Lys 1,9 ( 2), Arg 0,8 ( 1). Ce produit titre 6200 unités MRC par mg. Bien que certains modes de réalisation de l'invention aient été ci- dessus décrits dans des détails particuliers, il est évident pour l'homme de l'art que l'on peut imaginer d'autres modes de réalisation pratiques sans sortir de l'esprit de l'invention et du cadre des revendications. On peut ainsi, dans ce cadre, obtenir les calcitonines suivantes: La formule de la Gly 8-calcitonine d'anguille peut être écrite comme suit: I I Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys- Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr- Pro-Arg-Thr-Asp-Va 1-G Ly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH 2 La nouvelle Gly 8-calcitonine humaine obtenue selon le procédé peut se présen- ter sous la formule suivante: cys-G ty-Asn-Leu-Ser-Th r-Cys-Gt Ly Leu-Gt Ly-Thr Tyr-Thr-Gtn-Asp-Phe-Asn Lys-Phe-His-Thr-Phe- Pro-G Ln-Thr-A La-I Le-Gty Va L-Gty-A La Pro-NH 12. REVENDICATIONS 1. Calcitonine caractérisée en ce qu'elle est une Gly 8-calcitonine. 2. Peptide caractérisé par sa structure suivante: H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-G ty-Leu Gty-Lys-Leu-Ser-G n-G tu-Leu- His-Lys-Leu-Gtn-Thr Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gty-Ser-Gty-Thr-Pro-NH 2 3 Peptide caractérisé par sa structure suivante: RI R 2 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-T-hr-Cys-Gt Ly-Leu-G Ly Lys- Leu-Ser-Gtn-G Itu-Leu-His-Lys-Leu-GI n-Thr-Tyr- Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gty-Ser-Gty-Thr-Pro-NH 2 formule dans laquelle: R 1 est un S-n-alkyle, Cys ou H et R 2 est un S-n-alkyle ou H, étant précisé que R 1 est H quand R 2 est S-n-alkyle, les groupes S-n-alkyles étant choisis parmi' les groupes suivants: méthylthio, éthylthio, n-propylthio, n-butylthio, et leurs équivalents. 4. Peptide caractérisé par sa structure suivante: 1 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gty-Leu-Gt Ly Lys- Leu-Ser-G Ln-G Lu-Leu-Hi s-Lys Leu-G Ln-Th r-Tyr- P ro-Arg-Th r-Asn-Va t-G ty-A La-G Ly-Thr-Pro-NH 2 5. Peptide caractérisé par sa structure suivante: Cys-G ty-Agn-Leu-Ser-Thr-Cys-G ty-Leu-G ty-Thr-Tyr-Thr-G Ln-Asp-Phe-Asn- Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gtn-Thr-Ata-It Le-Gty-Vat-Gty-Ata-Pro-NH 2 (de type humain) 6. Peptide caractérisé par sa structure suivante: RI R 2 I I Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-G Ly-Leu-G ly-Lys- Leu-Ser-G Ln-Gltu-Leu-His-Lys-Leu-G ln-Thr-Tyr- Pro-Arg-Thr-Asp-Va l-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH 2 ) formule dans laquelle: R 1 est un S-n-alkyle, Cys ou H, et R 2 est S-n-alkyle ou H, étant précisé que R 1 est'H quand R 2 est S-n-alkyle, les groupes S-n-alkyles étantchoisis parmi les groupes suivants: méthylthio, éthylthio, n-propylthio, n-butylthio, et leurs équivalents. 7. Peptide caractérisé par sa structure suivante: R 1 R 2 I I Cys-6 ty-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Thr- Tyr-Thr-G tn-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe- Pro-Gln-Thr-Ata-I le-Glty-Va L-Glty-A La-Pro-NH 2 (de type humain) formule dans laquelle: R 1 est un S-n-alkyle, Cys ou H, et R 2 est S-n- alkyle ou H, R 1 étant un S-n-alkyle,Cys ou H lorsque R 2 est H, et R 2 étant un S-n-alkyle ou H quand RI est H, R 2 étant H quand Rl est un S-n- alkyle ou Cys, les groupes S-n-alkyles étant choisis parmi les groupes suivants: méthylthio, éthylthio, n-propylthio, n-butylthio, et leurs équivalents.