Brevet FR2517697A1 — publié le 19830610

-1- La présente invention concerne de nouveaux amino- glycosides antibiotiques appelés Saccharocines et leur production. Les saccharocines antibiotiques sont représentées par la formule H HiC H 3 Cli H Scio OH OH XO -i R Ni 11 l H 2 dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle et, dans la présente invention, un antibiotique dans lequel R est un atome d'hydrogène est appelé saccharocine et un antibiotique dans lequel R est un groupe hydroxyle est appelé 3 '-oxysaccharocine, et les deux anti- biotiques sont appelés d'une manière générale saccharocines. On peut produire les saccharocines antibiotiques ci-dessus en cultivant un microorganisme producteur d'antibiotique saccharocine et/ou 3 'oxysaccharocine appartenant au genre Saccharopolyspora, par exemple Saccharopolyspora sp. AC 3440 FERM-P N 6238. Les propriétés physiques des saccharocines antibio- tiques sont les suivantes: 17697 2- Point de fusion Rotation optique Analyse éléroentaire calculé: trouvé Poids moléculaire (spectrographie de masse à distorsion de chanp) Spectre UV Spectre IR (pastille de X Br) RMZ 1 H (D 20, 100 M Hz, étalon interne D)SS): PM 13 C Saccharocine 1.88-1900 C (décoeposition) L Iq 7 D + 163,50 (C= 1,0, HP 0) C % H % N % 43,74 7,69 9,72 43,35 7,46 9,74 absorption entre 220 260 nim dans H 20 Fig 1, bande d'absorption à 3350, 2900, 1585, 1460, 1380, 1140, _l 1090, 990 an Fig 2 No i i 11 PçPn 101,4 96,5 ,1 87,6 78,1 76,7 73,5 73,4 71,4 71,0 ,2 67,9 67,4 (dioxane) 66,4 62 e 3 61,3 51, 1 ,2 49,8 3 ' -oxysaccharocine Ä> 2300 C 24 + 12 úL% 7 D 12 (c= 0,25, H 20) /'21 H 4 QN 4 O 13 2 H,27 C % H % N % 42,56 7,48 9,45 42,07 7,12 9,03 absorption entre 220 260 nin dan H 20 Fig 3, bande d'absorption à 3350, 2900, 1585, 1460, 1390, 1345, -1 1040, 1000 an Fig 4 No i 11 PPM 102,6 97,0 ,9 88,4 78,4 76,9 74,5 73,8 72, 4 72,0 71,1 ,4 67,4 (dioxane) 66,6 62,3 61,8 56,7 51,3 -3- 36,3 20 50,1 21 33,0 21 36,8 22 32,7 22 33,2 R Paction de couleur: ninhydrine positive positive décoloration de K Mn O 4: positive positive Elson-Mobrgan négative négative Sakaguchi: négative négative Couleur: poudre blanche poudre blanche Nature: basique basique Chromatographie sur couche mince: support: gel de silice, Merck Art 5735; révélateur: chloroforme méthanol ammoniac aqueux à 28 % ( 2-: 3: 2) Rf = 0,32 Rf = 0,24 révélateur: chloroforme méthanol ammoniac aqueux à 14 % ( 1: 2:1) Rf = 0,26 Rf = 0,17 Solubilité: soluble: eau soluble: eau insoluble: acétone, insoluble: acétone, benzène, acétate benzène, acétate d'éthyle d'éthyle D'après les propriétés physico-chimiques ci-dessus, on n'a jamais trouvé la saccharocine et la 3 '-saccharocine dans les informations publiées antérieurement, et on les désigne donc comme nouveaux antibiotiques saccharocine et 3 '-oxy- saccharocine. Les concentrations inhibitrices minimales (MIC) de saccharocine et de 3 '-oxysaccharocine par la méthode de dilution à la gélose sont indiquées dans le Tableau I. Tableau 2 MIC (r Organismes d'essai:sac Staphylococcus aureus ATCC 6538 P il M 527 IR 0119 Staphylococcus epidermidis ap-al'-1 Streptococcus pyogenes N Y 5 Bacillus subtilis ATCC 6633 Escherichia Coli NIHJ-JC 2 W 3630 W 3630 RGN 14 Citrobacter freundie GN 346 Kiebsiella pneumoniae ATCC 10031 Salmnonella enteritidis gaertnier Shigella sonnei E 33 Proteus morganii 0239 Proteus rettgeri ACR Enterobacter aerogenes 055 Enterobacter cloacae GN 336 Serratia mnarcescens Pseudomonas aeruginosa le il %XL I'r A r C I fi i i te il sr ML 4561 Rjn 3166 sr Mr 4561 Fo 3164- il ML 4561 RP 4 il 1946 le 2512 Pseudomnonas putida 1842 Pseudomonas martfiriae 1850 ncg/cni 3) charocine 12,5 12,5 6,3 6,3 0,8 6,3 1,6 3,1 6, 3 3,1 6,3 6,3 6,3 3,1 6,3 6,3 6,3 12,5 -1 25 12,5 > 100 > 100 3 ' oxysaccharocine 12,5 12,5 3,1 12,5 3,1 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,6 12,5 > 50 > 50 -5- Comme montré dans le Tableau 1, les saccharocines présentent une activité antibactérienne contre des bactéries Gram-négatives. Les saccharocines peuvent être prescrites sous la forme d'un sel d'taddition d'acide non-toxique physiologi- quement acceptable comme d'un acide inorganique ou orga- nique, par exemple les sels suivants: chlorhydrate, iodure, sulfate, phosphate, carbonate, acétate, fumarate, malate, citrate, mandélate, succinate, ascorbate, aspartate ou glutamate On peut préparer les saccharocines ou leurs sels non-toxiques sous la forme de préparations injectables à 20 100 mg/flacon ou à 20 100 mg/ampoule, ou sous la forme de suppositoires à 20 100 mg/suppositoire On peut aussi utiliser les saccharocines ou leurs sels pour la volaille, le bétail ou les poissons ou comme additifs pour la nourriture Bien que les saccharocines puissent être facilement dissoutes dans l'eau, on peut les préparer sous la forme d'un sel d'addition d'acide pour traitement ou stimulation de la croissance d'animaux On peut aussi préparer un "prodrug" des saccharocines pour des préparations médicamenteuses. Le microorganisme producteur de saccharocine et/ou de 3 '-oxysaccharocine, un Actinomycète, souche AC 3440, a été isolé à parir d'un échantillon de terre recueilli dans un champ à Ato-cho, Ato-gun, Yamaguchi-ken, Japon, et a été identifié comme appartenant au genre Saccharopolyspora. Cette souche a été appelée Saccharopolyspora sp AC 3440, et a été déposée au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, Japon, sous le numéro de dépôt FERM-P N 6238. Les propriétés taxonomiques sont les suivantes: 1 Propriétés morphologiques: Sur un milieu amidon-gélose inorganique (milieu ISP 4, Int J System Bacteriol, 16, 313 340 ( 1966)), à 37 C pour culture pendant 10 14 jours, on a observé les caractéristiques suivantes: -6- Le mycélium de substrat est à développement ramifié, ondulé ou droit, se divisant à la partie mycélium ou dans la culture ultérieure, diamètre 0,4 0,6 Dom. Pas de formation de spores. Le mycélium aérien se développant à partir du mycélium de substrat est ondulé ou droit, se ramifiant une seule fois, diamètre 0,5 0,7 gm, boucles ou spirales comprenant au moins 2 ou 3 spires, ou ondulées ou droites à la pointe. Des chaînes en forme de perles de spores (plus de 10 spores) sont formées par ramification à partir du mycélium aérien, et apparemment des parties entre les spores sont séparées par du mycélium vide. Les spores sont elliptiques ou cylindriques courtes, 0,5 0,7 X 0,7 1,3 Dm, et couvertes d'une peau en une substance à nombreux poils longs droits ou ondulés, en touffes. Pas de formation de sporanges, de sclérotes ou de spores à flagelles sur le mycélium de substrat ou aérien. II Coloration Gram: positive, Coloration d'acido-résistance: négative. III Composition du mycélium: 1) De l'acide diaminopimélique (DAP?) de type méso, analysé par la méthode de B Becker et autres L Appl. Microbiol, 12, 421 423 ( 1964)7 a été détecté. De l'arabinose et du galactose, analysés par la méthode de Lechevalier / J Lab Clin Med, 71, 934 944 ( 1968)7 ont été détectés. 2) Analyse des lipides: par la méthode de H - Mordarska et autres r J Gen Microb, 71, 77 86 ( 1972)7, on n'a pas trouvé de lipides LCN-A; et par la méthode de D.E Minnikin et autres r J Gen Microbiol, 88, 200 204 ( 1975)7, on n'a pas trouvé d'acide nocardomycolique ni d'acide mycolique. -7- IV Caractéristiques des cultures Des observations concernant des cultures sur divers milieux effectuées à 37 C pendant 14 jours sont présentées dans le Tableau 2 Les indications de couleurs sont - effectuées selon le Color Harmony Manual, 4 ème édition, 1958 (Container Corp America). Milieu Gélose sucrosée nitratéel) (Milieu de Waksman N 1) Gélose glucosée à l 'asparagine (Milieu de Waksman N 2) Gélose glycérolée à l'asparagine 2) (Milieu ISP 5)-' Gélose avec amidon et sels inorganiques (Milieu ISP 4) Gélose à la tyrosine (Milieu ISP 7) Gélose à la farine d'avoine (Milieu ISP 3) Gélose à l'extrait de levures - extrait de malt (Milieu ISP 2) Gélose nutritive (Milieu de Waksman N 4) Gélose glycérolée nitratée (Milieu de Waksman N 1) Tableau 2 Développement Couleur du mycélium de substrat bon modéré modéré- bon bon bon bon modéré bon ambrée ( 3 pe) - or moutarde ( 2 pe) ivoire clair ( 2 ca) - incolore blé clair ( 2 ea) - mais ( 2 hb) ambrée ( 3 pe) - or moutarde ( 2 pe) ambrée ( 3 pe) - or moutarde ( 2 pe) ivoire clair ( 2 ea) - incolore or moutarde ( 2 pe) - ambrée ( 3 pe) ivoire clair ( 2 ca) - incolore mnais ( 2 hb) Mycélium aérien Pigment soluble pas bon ou trace, blanc petite quantité, blanc (a) pas bon ou modéré, blanc (a) pas bon ou modéré, blanc (a) modéré, blanc (a) non petite quantité, blanc (a) petite quantité ou pas du tout, blanc (a) modéré, blanc (a) ambré ( 3 e) or *(a) moutarde ( 2 pe) non ambré ( 3 pe) petite quantité non non non or ( 21 c) non or ( 21 c) petite quantité i o O i ru Ln "o -' Gélose de Benett (Milieu de Wàk-sman N' 30) Gélose d'Emnason (Milieu de Wakcmian N' 28) Gélose d' Hickey-'fresner (Milieu de Waksman N O 32) bon bon bon Tableau 2 (suite) or mic>utarde ( 2 pe) - or brillant ( 2 pc) ambrée ( 3 pe) - or mtutarcle ( 2 pe) or moutarde ( 2 pe) petite quantité, blanc (a) petite quantité, blanc petite quantité, blanc (a) non ambré ( 3 pe) ou or mutarcle ( 2 pe) non 1) Wak-snian, S A, "The Actinamyoetes" Vol 2, 1961, p 327 334. 2) Inter J Systemn Bacteriol, 1-6, 313 340 ( 1966). à r%) tn -4 O %O 1-4 -10- V Propriétés physiologiques: Les observations ont été effectuées sur la culture à 37 C pendant 14 jours, à moins d'indication contraire. 1) Température de croissance: 22 53 C (température optimale de croissance: 30 45 C) (milieu ISP 2) 2) Liquéfaction de la gélatine: positive 3) Hydrolyse de l'amidon: positive 4) Lait écrémé: peptonisation, positive'; coagulation, négative 5) Formation de pigment du type mélanine: négative (milieux ISP 7 et 6) 6) Nature: aérobie 7) Formation de H 2 S: positive (papier contenant de l'acétate de plomb, milieu ISP 6) 8) Réduction de nitrate: négative (J Bacteriol, 73, 27 ( 1957)) 9) Résistance à la lysozyme: non-résistante (J. Microbiol, 45, 355 364 ( 1961)) ) Résistance au chlorure de sodium: développement: O 10 %; pas de développement: au-dessus de 11 % 11) Résistance aux antibiotiques: (J Antibiot, 32, 186 ( 1979) Antibiotique MIC (mcg/cm) Kanamycine > 100 Gentamicine > 100 Paromomycine 50 Streptomycine 25 Néomycine 100 Tobramycine > 100 Rifampicine 100 12) Décomposition de diverses substances: tyrosine + adénine + caséine + esculine + xanthine + kélatine - -11- hypoxanthine + xylane - cellulose élastine + (+ = positive, = négative) (T.R G Gray et autres éd "Ecology of Soil Bacteria, p 293-321, Liverpool Univ, Press, Liverpool, 1967 ", J Gen. Microbiol, 69, 33-80 ( 1971) et J Gen Microbiol, 88, 77-85 ( 1975))) 13) Utilisation de sources de carbone: a) sucres: L-arabinose D-ribose + D-fructose + tréhalose + D-galactose + sucrose + D-glucose + L-sorbose glycérol + D-sorbitol + i-ionsitol + dulcitol - D-mannose + xylose + D-mannitol + salicine + mélézitose cellobiose + mélibiose amidon + 1-lactose + adnitol + maltose + 6 rythritol + raffinose + a-D-méthylglycoside + L-rhamnose + (milieu ISP 9, + = positive, = douteuse, = négative) b) acides organiques: acétate de sodium + propionate de sodium + benzoate " " pyruvate " " + butylate" " + succinate " " + citrate " " + tartrate " " + fumarate " " + adipate " " + malate " " + sébacate " " + (d'après J Bacteriol, 73, 15 27 ( 1957)) Comme montré ci-dessus, les caractéristiques de la souche AC 3440 sont les suivantes: ( 1) dans les observa- tions morphologiques, mycélium aérien se développant par -12- division du mycélium de substrat avec en même temps formation de chatnes de spores en spirales non serrées et droites ou ondulées, et spores couverts d'une couche à longues touffes; ( 2) dans l'analyse des parois des cel- lules, détection d'acide méso-diaminopimélique, d'arabinose et de galactose, et pas de détection de lipides LCN-A, d'acide nocardomycolique ni d'acide mycolique; ( 3) dans les colorations, Gram-positive et négative à l'acido-résistance et ( 4) nature aérobie. En ce qui concerne les propriétés taxonomiques ci- dessus, la souche AC 3440 avait des caractéristiques presque identiques à celles du genre Saccharopolyspora Lacey Goodfellow (J Gen Microbiol, 88, 75 85 ( 1975)). Cette souche est donc appelée Saccharopolyspora sp. AC 3440. La souche qui peut être utilisée dans la présente invention est, par exemple, Saccharopolyspora sp AC 3440 FERM-P N 6238 L'invention n'est pas limitée à cette souche, toutefois, car on peut utiliser dans la présente invention d'autres souches productrices de saccharocine et/ou de 3 '-oxysaccharocine appartenant au genre ci-dessus et leurs mutants naturels ou artificiels. Dans un mode de mise en oeuvre de la présente invention, les microorganismes ci-dessus producteurs de saccharocines appartenant au genre Saccharopolyspora sont cultivés de manière anaérobie dans un milieu classique La culture des microorganismes peut être effectuée en utilisant un milieu liquide ou solide Une culture immergée avec aération est préférable pour une production industrielle. On peut utiliser de préférence un milieu de culture classique pour microorganismes Comme sources de carbone, on peut utiliser des sources de carbone assimilables comme le glucose, le sucrose, la dextrine, l'amidon ou la mélasse. On peut utiliser des sources d'azote assimilables comme la liqueur de macération de mais, la poudre de soja, la poudre -13- de graines de coton, la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levures, un sel d'ammonium ou un nitrate On peut utiliser éventuellement divers sels comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le phosphate de potassium ou le sulfate de magnésium. La température de culture peut être choisie dans les intervalles convenables pour le développement des microorganismes et la production de saccharocines, et est de préférence de 25 350 C La durée pendant laquelle on conduit la culture peut être choisie en fonction des con- ditions et est habituellement de 72 140 heures Naturel- lement, on doit mettre fin à la culture quand la production des saccharocines est sensiblement complète. Les saccharocines sont présentes dans le liquide de culture. L'isolement des antibiotiques à partir du bouillon de culture peut être effectué d'après la nature des amino- glycoside saccharocines basiques. Les saccharocines produites peuvent être détectées par la méthode classique sur plaque de gélose en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme d'essai. Un mode d'exécution de l'isolement de saccharocines à partir d'un bouillon de culture est le suivant. On cultive des microorganismes producteurs de saccharocine et/ou de 3 'oxysaccharocine et on filtre le bouillon de culture On règle le bouillon de culture à un p H acide en raison de la nature d'aminoglycoside des saccharocines, on le neutralise et on le filtre pour obtenir un filtrat de culture Les principes actifs sont adsorbés sur une résine échanaeuse d'ions comme celle dite Amberlite IRC-50 (type N Hi)(nom commercial) après passage du filtrat de culture Les principes actifs sont élués par une solution aqueuse 1 N d'ammoniac et on concentre l'éluat Apres réglage du p H, on fait passer le concentré à travers une colonne de -14- CM- Sephadex C-25 (type NH+) pour adsorber les principes actifs, on élue avec une solution aqueuse 0,03 N d'ammoniac, et ainsi on élue d'abord la 3 'oxysaccharocine et ensuite la saccharocine On concentre les éluats et on les lyophilise pour obtenir de la saccharocine et de la 3 '-oxysaccharocine sous une forme de base libre purifiée. Les produits ainsi obtenus présentent une seule tache en chromatographie sur couche mince. Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais ne doivent pas être considérés comme la limitant. Exemple 1 Un milieu aqueux ( 100 cm 3, p H 7,0) comprenant 1 % de dextrine, 1 % de glucose, 0,5 % d'hydrolysat de caséine, 0,5 % d'extrait de levures et 0,1 % de carbonate de calcium (les pourcentages sont en poids/volume) dans un erlenmeyer de 500 cm est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes On y inocule Saccharopolyspora sp AC 3440 FERM-P N 6238 et on cultive le mélange en le secouant à 30 C pendant 72 heures afin de préparer une culture d'ensemencement. Un milieu de culture principal ( 100 cm, p H 7,0) comprenant 0,2 % de glucose, 4 % de gl'ycrol, 5 % de peptone, 0,2 % d'amidon, 0,5 % de poudre de soja dégraissée, 0,5 % de levure sèche, 0,5 % de Na C 1 et 0,2 % de carbonate de calcium dans un erlenmeyer de 500 cm 3 est stérilisé A cent ballons du milieu de culture principal, on inocule 3 % de la culture d'ensemencement ci-dessus et on cultive en secouant à 30 C pendant 96 heures On combine la masse cultivée pour obtenir le bouillon de culture ( 10 litres). Exemple 2 On règle au p H 2,0 le bouillon de culture obtenu dans l'exemple 1 en ajoutant une solution 12 N de H 2504, on l'agite pendant 10 minutes,-puis on le règle au p H 7,0 en ajoutant une solution aqueuse concentrée d'ammoniac et -15- on le centrifuge pour obtenir la solution surnageante ( 9 litres) On charge la solution surnageante sur une colonne d'Amberlite IRC-50 (type NH+, 1 litre) (Rohm and Haas Co}, on effectue un lavage à l'eau et une élution avec une solution aqueuse 1 N d'ammoniac ( 2 litres). On concentre l'éluat sous vide'à un volume d'environ cm 3 On règle le concentré au p H 7,0 en ajoutant une solution 6 N de H 2 SO 4, on le charge sur une colonne (diamètre 3 cm) de CM-Sephadex C-25 (type NH 4, 300 cm 3, Pharmacia Fine Chem Co) et on l'élue avec une solution aqueuse 0,03 N d'ammoniac. On fractionne les éluats en fractions de 20 cm 3 On contrôle chaque fraction par chromatographie sur couche mince développée au moyen de chloroforme méthanol - solution aqueuse concentrée d'ammoniac ( 2: 3: 2) avec coloration à la ninhydrine I Les fractions N 98 109 contiennent de la 3 'oxysaccharocine et les fractions N 124 143 contiennent de la saccharocine Chaque fraction est recueillie, concentrée sous vide, lyophilisée pour donner une poudre blanche On sèche la poudre sous vide sur de l'anhydride phosphorique à 40 C pendant 48 heures pour obtenir sous forme de poudre blanche cristalline- purifiée la base libre saccharocine ( 100 mg) et la base libre 3 '-oxysaccharocine ( 30 mg). Les dessins représentent: Fig 1: Spectre IR de la saccharocine. Fig 2: Spectre de RMN de la saccharocine. Fig 3: Spectre IR de la 3 '-oxysaccharocine. Fig 4: Spectre de RMN de la 3 '-oxysaccharocine. REVENDICATIONS 1 Saccharocines antibiotiques de la formule: Ho H Jc c A,3 o OHO o H OH - N 2 NH H dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle, ou leurs sels d'addition d'acide. 2 Procédé de production de saccharocine et/ou de 3 '-oxysaccharocine antibiotiques ou de leurs sels, selon lequel on cultive dans un milieu un microorganisme producteur de saccharocine et/ou de 3 '-oxysaccharocine antibiotiques appartenant au genre Saccharopolyspora, on isole la saccharocine et la 3 '-saccharocine antibiotiques à partir du bouillon de culture et éventuellement on transforme ces antibiotiques en un sel d'addition d'acide. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le microorganisme producteur de saccharocine et/ou de 3 '-saccharocine antibiotiques est Saccharopolyspora sp AC 3440 FERM-P N 6238.