Brevet FR2515352A1 — publié le 19830429

La présente invention se rapporte à un procédé pour analyser des particules contenues dans un échantillon de fluide et elle a trait plus particulièrement à un procédé pour analyser des échantillons de fluides biologiques, tels que de l'urine, qui sont dilués mais sans qu'il soit nécessaire de produire physiquement un échantillon concentré aux fins de l'analyse. Jusqu'à présent, le procédé utilisé pour effectuer l'examen des sédiments de l'urine a nécessité l'exécution des étapes suivantes: (i) l'urine doit être versée dans un tube et traitée dans un centrifugeur pour séparer le sédiment du fluide dispersant; (ii) la plus grande partie du fluide dispersant clarifié doit être jetée; (iii) le sédiment doit être remis en suspension dans le fluide restant; (iv) la suspension doit être transférée à une lamelle porte-objet de microscope et étalée sur cette lamelle; (v) un couvre-objet doit être placé au-dessus de la suspension portée par la lamelle; (vi) la lamelle doit être placée sous l'objectif d'un microscope et celui-ci doit être mis au point; et (vii) un certain nombre de champs de vision doivent être explorés et examinés afin de déterminer s'il existe des nombres anormaux de globules sanguins rouges et blancs, de cellules épithéliales, de calculs, de bactéries, de levures, de parasites,de filaments mucoides, de cristaux, etc... qui composent le sédiment de l'urine en diverses proportions selon qu'il existe ou non une maladie. Les étapes de centrifugation (i), de dé- cantation (ii) et de remise en suspension (iii) sont utilisées du fait que l'échantillon de fluide est dilué. Toutes ces étapes sont actuellement effectuées manuellement. Les manipulations nécessaires rendent fréquemment le procédé malpropre et désagréable à exécuter. L'étalement de la suspension de sédiment sur la lamelle du microscope est souvent inégal.Lorsqu'on examine de nombreux sédiments,l'observation prolongée dans les oculaires d'un microscope devient fatigante. Tous ces facteurs contribuent à 11 imprécision du procédé. L'un des autres appareils utilisés pour traiter des échantillons biologiques est le compteur appelé compteur "Coulter". Dans ce compteur,on fait passer les globules sanguins un à un par un orifice et ces globules sont détectés par la manière dont ils changent les propriétés électriques au niveau de l'orifice, et comptés. Cependant, l'information fournie par le compteur Coulter est limitée à l'analyse d'un unique type de mesure. Dans le cas oùl'ondésire obtenir une information comportant de multiples paramètres, la manière normale du commerce pour l'obtenir est de préparer une lamelle de microscope avec les globules et cellules fixés dans un plan image et de faire compter statistiquement par un opérateur humain ou par une machine de reconnaissance de configurations un nombre significatif des globules ou cellules observés un à un sur la lamelle à travers un microscope. D'autres tentatives ont été effectuées au cours de ces dernières années en vue d'effectuer une analyse optique de particules qui s'écoulent dans un courant. Par exemple, Kay et autres montrent dans le "Journal of Histochemistry and Cytochemistry", volume 27, page 329 (1979), un orifice du type Coulter utilisé pour déplacer les globules un à un, l'image des globules étant agrandie au moyen d'un tube Vidicon. De même, Kachel et autres montrent dans le "Journal of Histo chemistry and Cytochemistry" volume 27, p. 335, un dispositif pour déplacer des globules ou cellules un à un à travers une zone microscopique dans laquelle ils sont photographiés. On renverra également à ce sujet, par exemple, à l'ouvrage "Flow Çytometry and Sorting" de Melaney et autres, John Wiley & BR Sons, 1979, Chapitre 1. La demande de brevet des EUA nO 146.064 déposée le 2 mai 1980 décrit un appareil et un procédé pour l'analyse quantitative d'informations portant sur des particules. Cependant, aucun des documents ci-dessus cités n'enseigne ni ne suggère une solution au problème de~l'analyse des particules contenues dans un échantillon de fluide dilué, sans qu'il soit nécessaire de créer un échantillon concentré par centrifugation, décantation et remise en suspension. La présente invention a pour but d'éviter les inconvénients des appareils et procédés de la technique antérieure ci-dessus mentionnés et elle a trait notamment à un procédé pour analyser des particules à partir d'un échantillon de fluide contenant les particules qui comporte l'étape qui consiste à épandre l'échantillon sur une grande surface. On prend une série d'images optiques fixes de l'échantillon épandu sur la surface, chaque image optique représentant une partie différente de la surface. Chaque image optique est convertie en une image électronique. Les images électroniques sont combinées pour former une image électronique résultante. D'autres caractéristiques de l'invention apparaitront à la lecture de la description qui va suivre et à l'examen des dessins annexés dans lesquels: la Fig. 1 est une vue en perspective d'un appareil qui peut être utilisé avec le procédé de la présente invention; la Fig. 2 est une vue en plan de la chambre d'écoulement de l'appareil de la Fig. 1; la Fig. 3 est une vue en coupe de l'appareil de la Fig. 2, prise dans le plan indiqué par les lignes 3-3 de la Fig. 2; et la Fig. 4 est un schéma-bloc du processeur électronique utilisé par l'appareil de la Fig. 1. Le procédé de la présente invention comporte les étapes qui consistent à épandre un échantillon d'un fluide, tel que de l'urine, sur une surface étendue, par exemple, en étalant l'échantillon sur une lamelle porte-objet de microscope. On prend une série d'images optiques fixes de l'échantillon, chaque image représentant une partie différente de la lamelle. Ainsi, par exemple, on peut monter la lamelle portant l'échantillon sous un microscope et la changer de place de façon qu'une partie de la lamelle se trouve dans la région de prise de vues. Chaque image reproduit une partie différente de la lamelle. On convertit chaque image optique en une image électronique. On combine la série d'images électroniques pour former une unique image électronique. L'unique image électronique résultante peut être soumise à des traitements complémentaires. On peut mettre en oeuvre le procédé de la présente inven tion en utilisant un appareil 5 représenté sur la Fig. 1. L'appareil 5 comporte un corps 10 qui renferme une chambre d'écoulement ayant un orifice d'entrée 12 pour recevoir un échantillon d'un fluide, tel que de l'urine, et un orifice de sortie 14, un passage 16 s'étendant entre ces orifices devant une zone 18 de prise de vues. Le passage 16 comporte un orifice d'entrée muni d'un conduit 20 destiné à être raccordé à un volume de solution saline 22. Comme représenté sur les Fig. 2 et 3, l'orifice d'entrée 12 pour l'échantillon d'urine comporte une aiguille 24 qui pénètre dans le passage 16 jusqu'en aval du conduit 20, l'aiguille 24 étant raccordée à un récipient 26 destiné à contenir l'échantillon d'urine qui doit être analysé. L'échantillon d'urine s'écoule dans la direction qui va de l'orifice d'entrée 12 à l'orifice de sortie 14. La surface de la section transversale du passage 16 devient de plus en plus petite à mesure que le passage s'éloigne de l'orifice d'entrée 12 et se rapproche de l'orifice de sortie 14 tandis que,simultanément, le passage 16 devient bien moins profond et bien plus large. Ainsi, comme représenté sur les Fig. 2 et 3, le passage 16 a une largeur et une profondeur d'environ 5000 ssm à l'orifice d'entrée 12, une largeur et une profondeur environ 500 m au point intermédiaire 28 et une profondeur de 100 ssm et une largeur supérieure à 5000 ssm dans la région d'examen 18. On comprendra que l'échantillon de fluide qui s'écoule dans la région d'examen 18 a une profondeur de nombreuses fois supérieure à celle des plus gros globules ou cellules qui ont une dimension maximale d'environ 20 iim mais,du fait que le passage d'écoulement a la forme ci-dessus décrite, l'échantillon de fluide qui entre par l'orifice 12 est emprisonné dans un trajet d'écoulement stable de cisaillement minimal dans la région d'examen 18 et les particules contenues dans l'échantil- lon de fluide sont orientées dans cette région avec leur surface de section transversale maximale visible dans le plan de la Fig. 2. On peut régler les caractéristiques d'écoulement dans le passage 16 en réglant la pression du fluide des réci pients 22 et 26 soit automatiquement soit en modifiant leur hauteur statique. De préférence, l'échantillon de fluide qui s'écoule dans la zone d'examen 18 a une surface de section transversale de courant de cisaillement minimal qui n'est pas de beaucoup supérieure à la surface de section transversale minimale des particules. Par conséquent, les particules sont alignées dans l'échantillon de fluide qui s'écoule dans la région d'examen 18 avec leur surface de section transversale minimale orientée transversalement à la direction d'écoulement. L'expression "cisaillement minimal" dans le sens où elle est utilisée ici signifie gradient de vitesse minimal" de sorte qu'une particule qui se déplace dans le courant a tendance à s'aligner avec la direction du courant de même qu'un tronc qui flotte sur une rivière s'aligne avec la direction de 1 'é- coulement lorsqu'il y a un gradient d'écoulement. Un microscope 30 est mis au point sur la zone d'examen 18 et la région d'examen 18 est éclairée de dessous par un stroboscope 32 qui est, de préférence, le modèle 3018 de la société U.S. Scientific Instrument contenant une lampe 2UP 1,5. L'éclairage du stroboscope 32 est dirigé vers le microscope 30 dans une direction approximativement parallèle à l'épaisseur du corps 10. Le stroboscope 32 fonctionne de préférence avec des éclairs d'un soixantième de seconde, formant ainsi une série d'images optiques fixes dans le champ du microscope 30. L'image produite par le microscope est focalisée sur une caméra 34 à dispositifs à transfert de charge qui est, de préférence, une caméra à dispositifs à transfert de charge modèle n" TC1160BD fabriquée par la société RCA. La caméra 34 à dispositifs à transfert de charge convertit chaque image optique en une image électronique. La caméra 34 à dispositifs à transfert de charge segmente également l'image électronique en une série d'éléments d'image ou pixels,chaque pixel correspondant à une partie définie de chaque image . La série d'images électroniques (chaque image optique est convertie en une image électronique) est alors combinée afin de créer une unique image électronique résultante. Ce résultat peut être obtenu, par exemple, en additionnant tous les pixels qui correspondent à la même partie définie de chaque image. L'unique image électronique résultante est une image d'un échantillon de fluide apparemment concentré mais sans qu'il ait été nécessaire pour l'obtenir de produire physiquement un échantillon de fluide concentré.En outre, le degré de concentration apparente est déterminé par le nombre des images qui sont combinées. Ainsi, on obtient une image correspondant à une concentration apparente de dix fois en combinant dix images pour former une unique image résultante. Etant donné que le degré de concentration apparente est commandé électroniquement, il apparait clairement qu'avec le procédé de la présente invention, on peut modifier très facilement la concentration apparente de l'image de l'échantillon de fluide. L'unique image électronique résultante peut être soumise à des traitements électroniques supplémentaires et affichée. Selon une variante, chaque image électronique peut être soumise à un traitement électronique avant que les images soient combinées pour former l'unique image électronique résultante. Un processeur que l'on peut utiliser pour traiter électroniquement chacune des images électroniques ou l'unique image électronique résultante est le processeur commercialisé sous l'appellation de système d'analyse d'images modèle C-1285 par la société Hamamatsu Systems, Inc., Waltham, Mass. EUA. De préférence, cependant, la sortie de la caméra 34 à dispositifs à transfert de charge est connectée à un processeur électronique 36 qui a été représenté de manière plus détaillé sur la Fig. 4 et qui comporte un écran de télévision noir et blanc de contrôle 38 et un capteur d'images 40 qui met en mémoire les images électroniques fixes de l'objet photographié par la caméra 34 à dispositifs à transfert d'image.Le capteur d'images 40 est, de préférence, le capteur d'images modèle FG08 fabriqué par la société Matrox Corporation, Montréal, Canada, dont les signaux de sortie sont appliqués à une mémoire de ravivage des images vidéo 42 qui est, de préférence, le modèle RGB 256 fabriqué par la société Matrox Corporation, le capteur 40 et la mémoire 42 étant tous deux connectés au bus multiple 44 d'une unité centrale 46 qui est, de préférence, un ordinateur Intel 80/20. Le bus multiple 44 est également connecté à une mémoire 48 à accès sélectif de 48 K fabriquée par la société Electronic Solutions, Inc., et à une mémoire 50 à accès sélectif de 16 K à deux entrées/sorties qui est le modèle RM117 de la société Data Cube Corporation. La sortie de la mémoire 42 de ravivage des images vidéo est également connectée à un écran 52 de télévision en couleur de contrôle qui peut être utilisé pour fournir des images vidéo numériquement accentuées à partir des images fixes individuelles en vue de leur examen par un opérateur. La seconde sortie de la mémoire 50 à accès sélectif à deux entrées/sorties est connectée à un bus multiple 54 qui est connecté à une unité de traitement 56 de la société Applied Micro Devices, à une mémoire 58 à accès sélectif de 48 K de la société Electronic Solutions et à une mémoire amovible constituée par une unité de commande 60 de disques souples telle qu'un modèle 8/8 de la société Advanced Micro Devices et deux ensembles de mémoire à disque souple G2 de la société Shugart. Avec l'appareil représenté sur la Fig. 4, il est possilie d'utiliser un certain nombre de procédés pour la création de l'unique image électronique résultante. Dans un premier mode de réalisation, on introduit un échantillon d'un fluide, tel que de l'urine, par l'orifice d'entrée 12. Le fluide est éclairé par le stroboscope 32 et une série d'images optiques fixes de l'échantillon sont prises par le microscope 30. Du fait que le fluide est translucide et qu'il est éclairé par dessous,l'image optique représente des particules sombres sur un fond clair. Les images optiques sont converties en images électroniques qui sont ensuite converties en numérique et mises en mémoire dans la mémoire 48. L'unique image électronique résultante qui est la combinaison de la série d'images électroniques est formée en additionnant les données converties en numérique de chaque image électronique avec les données conservées dans la mémoire 48. Suivant une variante du procédé ci-dessus décrit, les données de fond de chaque image sont supprimées électroniquement avant que les données de l'image convertie en numérique soient entrées dans la mémoire 48. Les informations pertinentes provenant de chacune des images peuvent être rassemblées et mises en mémoire dans l'uniqueimage électronique résultante. Suivant encore un autre procédé, on injecte de l'urine dans l'orifice d'entrée comme dans l'exemple précédent. L'urine est éclairée par la stroboscope 32. Cependant, en utilisant la technique bien connue d'éclairage sur champ noir ou d'éclairage à contraste de phase, l'image optique produite par le microscope 30 représente des particules claires sur un fond noir. Chaque image optique est convertie en une image électronique par la caméra 34 à dispositifs à transfert de charge. Du fait de sa nature,la caméra 34 à dispositifs à transfert de charge conserve en mémoire 1 image électronique si celle-ci n'est pas lue. Ainsi, une image électronique ultérieure (produite à partir d'une image optique) se combine avec l'image électronique précédente.L'unique image électronique résultante peut, par conséquent, être formée par la caméra 34 à dispositifs à transfert de charge. De nombreux programmes différents peuvent être utilisés pour soumettre à un traitement supplémentaire l'unique image électronique résultante avec l'appareil de la Fig. 4 selon la tâche particulière que l'utilisateur désire exécuter. Par exemple, dans le cas de l'urine, suivant le procédé de la technique antérieure, si des particules chimiques, telles que des phosphates se trouvent dans la région de prise de vues et cachent à la vue les particules biologiques, on élimine les particules de phosphate chimiquement par addition d'acide chlorhydrique. Avec le procédé de la présente invention, cependant, les particules chimiques peuvent etre supprimées électroniquement, c'est-à-dire au moyen de techniques de traitement des images. Si l'on désire cacher à l'observateur les particules d'une grosseur,d'une couleur ou d'une forme particulière, on peut le faire électroniquement sans avoir à repréparer chaque fois l'échantillon.En outre, avec le procédé de la présente invention, les particules biologiques que l'on ne pouvait pas jusqu'à présent éliminer chimiquement peuvent être, de même, supprimées électroniquement de l'image. Ainsi, la présente invention offre un degré d'adaptabilité bien plus grand. On comprendra que le procédé de la présente invention offre de nombreux avantages. Le premier et le plus important est que l'analyse des particules d'un échantillon dilué peut être effectuée sans qu'il soit nécessaire de préparer physiquement un échantillon concentré avec les problèmes qui en découlent de centrifugation, décantation et remise en suspension. Le procédé de remise en suspension de la technique antérieure se traduit par un chevauchement des diverses particules ou il se traduit par une image présentant une erreur systématique. Avec le procédé de la présente invention, le fluide est plus représentatif statistiquement des particules avec une moindre probabilité de chevauchement des particules et il n'y a pas d'erreur systématique de l'image.Ensuite, on doit noter que le degré de concentration apparente peut être modifié électroniquement. En outre, la suppression des étapes de manipulation manuelle économise du temps, des sources d'erreur potentielles et elle offre une protection biologique (les échantillons qui peuvent être infectieux sont analysés avec des manipulations minimales par le personnel). En outre, également, on n'utilise pas d'éléments consommables,tels que des tubes, des pipettes et des lamelles porte-objet de microscope de sorte qu'on effectue ainsi des économies financières. Enfin, du fait que l'image est sous une forme électronique, on peut utiliser un certain nombre de techniques de traitement des images pour soumettre l'image à des étapes de traitement supplémentaires telles que notamment l'élimination électronique de particules chimiques et biologiques. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour analyser des particules à partir d'un échantillon de fluide contenant ces particules, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste: à épandre l'échantillon sur une surface étendue; à former une série d'images optiques fixesde l'échantillon présent sur ladite surface, chaque image optique représentant une partie différente de ladite surface; à convertir chacune des images optiques fixes en une image électronique; et à combiner les images électroniques pour former une unique image électronique résultante. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, les étapes qui consistent: à traiter l1u- nique image résultante; et à afficher l'image traitée résultante. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, les étapes qui consistent: à traiter chacune des images électroniques; et à afficher l'unique image électronique résultante. 4 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que l'étape de traitement consiste à éliminer électroniquement les particules que l'on ne désire pas voir apparaitre sur l'image affichée. 5 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre,lesétapes qui consistent: à segmenter les images électroniques en une série de pixels, chaque pixel correspondant à une partie définie de chaque image; et à additionner tous les pixels qui correspondent à la même partie définie de chacune des images. 6 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, les étapes qui consistent: à éliminer les données de fond de chaque image électronique; et à rassembler les informations pertinentes provenant de chaque image électronique pour former une unique image résultante. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de combinaison est formée par une caméra (34) à dispositifs à transfert de charge. 8 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon de fluide est de l'ui;ne et les particules sont des sédiments. 9 - Procédé pour analyser des particules, à partir d'un échantillon contenant lesdites particules, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste: à déplacer l'échantillon dans une direction d'écoulement; à épandre l'échantillon de fluide sur une surface étendue (18) ayant une largeur et une épaisseur, toutes deux mesurées perpendiculairement à la direction d'écoulement, telles que la largeur est de nombreuses fois supérieure à l'épaisseur; à éclairer le fluide à un emplacement prédéterminé dans la direction d'écoulement, l'éclairage étant orienté dans une direction approximativement perpendiculaire à la direction d'écoulement; à former une série d'images optiques fixes de l'échantillon de fluide à cet emplacement; à convertir chacune des images optiques fixes en une image électronique; et à combiner la série d'images électroniques pour former une unique image électronique résultante. 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, les étapes qui consistent: à traiter l'unique image résultante; et à afficher l'image traitée résultante. 11 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, les étapes qui consistent: à traiter chacune des images électroniques; et à afficher l'unique image électronique résultante. 12 - Procédé selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que l'échantillon de fluide est de l'urine et les particules sont des sédiments. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'éclairage de l'étape d'éclairage est un éclairage stroboscopique.