Brevet FR2515046A1 — publié le 19830429

La présente invention a trait à la détection de tumeurs Selon un autre aspect, elle concerne des anti- corps monoclonaux marqués avec des isotopes radio-actifs. On a longtemps cherché à mettre au point une technique fiable pour détecter des tumeurs avec spécificité vis-à-vis du site Des méthodes ont été décrites pour détecter, par exemple, l'antigène carcinoembryennaire (ACE) associé au carcinome humain circulant dans le courant sanguin (voir brevets des Etats-Unis d'Amérique No 3 663 684 et N 03 697 638 Evidemment, ces méthodes ne peuvent pas être utilisées pour localiser la tumeur Plus récemment, il a été proposé d'utiliser des anticorps mar- qués avec des isotopes radio-actifs d'iode pour détecter une substance antigénique associée à une tumeur Ainsi, le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 3 927 193 décrit un procédé qui utilise des anticorps spécifiques de l'anti- gène carcinoembryonnaire marqués avec 125 I et 131 I Con- formément à ce brevet, dans des expériences conduites sur des mâles de hamsters de Syrie dans l'organisme desquels le carcinome humain à cellules annulaires avait été intro- duit, l'injection d'anti-ACE de chèvre marqué, suivie de l'examen des organes des animaux, a démontré que le radio- isotope était localisé dans la tumeur En conséquence, on a émis l'hypothèse que le site d'une tumeur chez un être humain pouvait être déterminé par l'administration in vivo d'une solution parentérale de l'anticorps, suivie d'un examen photoscanographique de l'hôte. L'utilisation réelle d'anticorps marqués aux radio-iodes n'a pas répondu aux espérances que les premiers travaux avaient fait naître Par exemple, Goldenberg et collaborateurs, N Eng J Med, 298, 1384-1388 ( 1978), ont rapporté en 1978 un certain succès obtenu dans la scanographie d'êtres humains avec l'anti-ACE marqué par l'iode radio-actif Toutefois, à cause du fond de réacti- vité rémanente, le succès limité rapporté a dépendu de l'utilisation de techniques de soustraction Mach et collaborateurs, N Eng J Med, 303, 5-10 ( 1980), ont rapporté un succès encore moindre et déterminé la locali- sation dans la tumeur de 0,1 % de la dose administrée seulement Toutefois, dans des cas particuliers, une visualisation de la tumeur a encore été possible. Il est bien connu que la purification par affinité d'antisérums hétérologues pour obtenir les anti- corps utilisés dans les procédés antérieurs de visualisa- tion de tumeurs a ordinairement pour résultat la perte d'anticorps de grande affinité et que les anticorps obtenus, qui sont un mélange d'anticorps spécifiques pour différents déterminants de l'antigène, comprennent en grande partie des anticorps de faible affinité et des anticorps qui donnent des réactions non spécifiques En revanche, on peut choisir des anticorps monoclonaux de manière qu'ils montrent une grande affinité pour des sites sélectionnés de l'antigène et une faible liaison non spécifique Toutefois, on a découvert le fait sur- prenant que des anticorps monoclonaux spécifiques d'anti- gènes tumoraux marqués avec des isotopes radio-actifs de l'iode conformément à des méthodes bien connues mon- traient encore une médiocre localisation sur le site de la tumeur malgré le fait qu'une immunoréactivité in vitro pouvait être mise en évidence Cela peut résulter, et résulte même vraisemblablement, de la perte d'iode radio- actif par l'anticorps marqué En conséquence, il demeure nécessaire de trouver une technique fiable pour détecter in vivo le site précis d'une tumeur. Conformément à la présente invention, un anti- corps ou fragment d'anticorps monoclonal spécifique d'un antigène tumoral est marqué, soit directement avec un radionucléide métallique, soit avec un radionucléide lié à un chélate, par exemple 111 In lié au DTPA, par conju- gaison d'un agent chélateur avec l'anticorps, suivie de la formation d'un complexe entre l'agent chélateur et le radionucléide Lorsque l'anticorps marqué résultant, ou son fragment, est injecté à un hôte présentant une tumeur, il se localise rapidement et avec une grande spécificité dans la tumeur Dans quelques cas, une localisation dans des métastases éloignées peut de même avoir lieu en indi- quant un essaimage de la tumeur Le site de la tumeur peut être détecté par des techniques photoscanographiques. On peut de même utiliser des mélanges d'anticorps mono- clonaux marqués. En conséquence, l'un des buts de la présente invention est d'obtenir des anticorps monoclonaux spéci- fiques d'antigènes associés à des tumeurs, marqués avec des radionucléides métalliques. Un autre but de l'invention est de trouver un procédé perfectionné pour visualiser des tumeurs chez un hôte infecté. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins annexés sur les- quels: la figure 1 est un groupe de graphiques illus- trant la distribution dans des tissus de 111 In et de 125 I, comparativement à la distribution de 67 Ga en fonction du temps après injection chez des souris "nude", auxquelles le cancer du colon humain a été inoculé, d'anti-ACE marqué avec les radionucléides 111 In et 125 I et le citrate de 67 Ga,; la figure 2 est un groupe de graphiques illus- trant la quantité de 111 In, de 125 I et de Ga excrétée par des souris "nude" en fonction du temps après l'injec- tion d'anti-ACE marqué par les radionucléides 111 In et I et le citrate de 67 Ga; la figure 3 est un groupe de graphiques illus- trant la distribution dans les tissus de 111 In et de 125 I chez des souris "nude" 48 heures après l'injection de l'anti-ACE marqué avec 111 In et 125 I, comparativement à de l'albumine humaine marquée avec le citrate de i 11 In et le radionucléide 125 I; et la figure 4 est un groupe de graphiques illus- trant les rapports tumeur/tissu de 111 In et de 125 I, com- parativement à 67 Ga, après injection d'anti-ACE marqué avec les radionucléides 111 In et 125 I et le citrate de 67 Ga à des souris "nude", en fonction du temps. Comme indiqué, conformément à la présente inven- tion,des anticorps ou fragments d'anticorps monoclonaux spécifiques d'antigènes associés à des tumeurs sont mar- qués directement avec des radionucléides métalliques ou avec des radionucléides liés à des chélates Les anti- corps monoclonaux utiles dans la présente invention sont des produits de la technologie des hybridomes qui est à présent bien connue On pourra se référer, par exemple, au travail original de Milstein et Kohler publié dans Nature, 256, 495-497 ( 1975) Le procédé implique fondamen- talement l'injection à une souris ou à un autre animal convenable, d'un immunogène, dans ce cas un antigène asso- cié à une tumeur tel que l'ACE La souris immunisée est ensuite sacrifiée et des cellules prélevées de sa rate sont fusionnées avec des cellules de myélome pour produire des cellules hybrides appelées "hybridomes" qui peuvent être reproduites in vitro La population de cellules pro- duisant des anticorps est cultivée sélectivement et sou- mise à un examen systématique pour isoler des clones in- dividuels, sécrétant chacun une seule espèce d'anticorps spécifique d'une région particulière ("déterminant") de la surface de la molécule d'antigène. Les clones individuels peuvent encore être soumis à un examen systématique de manière à déterminer ceux qui produisent des anticorps de la plus grande affi- nité pour l'antigène et qui font preuve d'une faible liai- son non spécifique L'anticorps choisi pour le marquage radio-actif (normalement isolé de l'ascite) est amené à réagir avec le radionucléide métallique ou bien il est conjugué avec un agent chélateur convenable qui est ensuite utilisé pour fixer le radionucléide L'agent chélateur peut être lié à l'anticorps par des moyens très divers. En général, puisque l'anticorps est un polypeptide, on peut utiliser un agent chélateur portant un groupe réactif du type réputé capable d'introduire un fragment de molé- cule dans un substrat protéinique Parmi des groupes réactifs convenables, on peut mentionner les suivants -915046 o Ch C N) Ch O O * F F Ch C-0 O\ F F Ch-N Ch-N Zs C CE 23 r Ch SO 2 C 1 C.h-C-O-N Oj Ch O -S CT=c%,2 Ch-N 2 ' (venant de Ch-H 2) Ch C O C-o E c:-a (CH 3) n 3 o o o Ch est le résidu de l'agent chélateur. Des agents chélateurs convenables comprennent une grande variété d'agents chélateurs polycoordonnés dont les groupes de coordination se complexent avec des radionucléides métalliques Parmi ces agents, on peut mentionner les acides polyaminocarboxyliques de formule ?)V (CI 12,-Co 2 H\ N CH {CH ' N CI C N 2) (C 2) Y' Co 21 (CH 2)V Co 2 H. ( 1) Ch NCS HO 2-(CH'. HO 2 f CH. dans laquelle x est un nombre entier pouvant être égal à 0 (x = O ou x = 1 étant appréciés), Z est égal à 1 ou à 2 (y = 1 étant apprécié) et z est un nombre entier de 1 à 7 (z = 1 ou 7 étant apprécié) et R est l'hydrogène ou un groupe par lequel l'agent chélateur est conjugué avec l'anticorps ou un groupe qui affecte la constante de liai- son de l'agent chélateur pour le radionucléide Parmi les groupes R utiles, on peut mentionner en particulier le groupe: dans lequel A est le groupe par lequel la conjugaison est accomplie Par exemple, A peut être -N 2, que l'on obtient par diazotation du groupe -NH 2, lequel peut lui-même être obtenu par réduction d'un groupe nitro (-NO 2) qui, à son tour, peut être obtenu par nitration du noyau phényle Le groupe A peut aussi être un groupe de formule: -NH-C-CH 2 L obtenu par acétylation du groupe -NH 2 par des procédés connus, dans lequel L est un groupe partant déplacé pen- dant la conjugaison, tel qu'un halogène, par exemple Cl, Br ou I (Br étant apprécié). Dans d'autres cas, R peut être -CH 3 ou -CH 2 C 6 H 4 OCH 2 CO 2 H. Dans le cas d'acides polyaminocarboxyliques, la conjugaison peut être effectuée par l'intermédiaire du groupe acide carboxylique lui-même par formation, par exemple, d'un anhydride d'acide intermédiaire comme enseigné par Krejcarek et Tucker dans Biochemical and Biophysical Research Communications, 77, 581 ( 1977). Parmi les acides polyaminocarboxyliques, on préconise les acides polyamino-acétiques Des exemples d'acides polyaminocarboxyliques que l'on peut utiliser com- prennent l'acide éthylènediaminotétra-acétique (EDTA) et ses dérivés tels que l'acide diéthylènetriaminopenta- acétique (DTPA), l'acide p-bromacétamidophényl-(éthylène- dinitrilotétra-acétique) et l'acide 1-(p-aminophényl)- éthylènediaminotétra-acétique, ce dernier étant converti en un sel de diazonium pour permettre la conjugaison. Parmi ces agents chélateurs, on apprécie le DTPA. Parmi les autres agents chélateurs convenables, on mentionne des acides polyamino-(alkylènephosphoriques), notamment ceux qui répondent à la formule: 0 0 0 o o o o-P CH 2)^ y (CH 2 TP-OH (Cn 2,v =-On. OH OH OH N-CH CH 2 (N CH {CE 23 N 0/,R R lci 2 ? HOP i CE 2)y (CH 2 ';T; OH OH OH ( 2) dans laquelle x, y, z et R ont les définitions données ci-dessus De préférence, x est égal à O ou à 1, y est égal à 1 et z est égal à 1 Des exemples représentatifs d'acides polyamino-(méthylènephosphoriques) (y = 1) comprennent l'acide éthylènediaminotdtra-(méthylènephos- phorique), l'acide hexaméthylènediaminetétra-(méthylène- phosphorique) et l'acide diéthylènetriaminepenta-(méthylène- phosphorique), qui peuvent être utilisés dans la présente invention. D'autres agents chélateurs sont les polyamines de formule: H N-c H CE C, I N 2 Nce t CB t( 2 2 /2 *E 2 ZC 22 -l B C 2 'z N-CH Ciy 7 N H 2 {CH 2 z CH 2 C- 'CC x CHC N _ 2 2 E 2C 2 -z C 22 /x CZC 2 r-2 ( 3) dans laquelle x, z et R ont les définitions données ci- dessus. Une autre classe d'agents chélateurs comprend les composés de formule: OH n O i& CH 2 CH 2 &jb N-CH CH 2 N OH / O HO-?-CH 2 CH 2 P-OH OH OH ( 4) dans laquelle R a la définition donnée ci-dessus, excepté que lorsque R n'est pas un groupe qui permet une conjugai- son, l'un au moins des groupes phénol est un groupe de formule: OE dans laquelle A a la définition donnée ci-dessus. Les porphyrines représentent une autre classe particulièrement utile d'agents chélateurs Des porphy- rines qui peuvent être utilisées dans la présente inven- tion comprennent des porphyrines synthétiques et naturelles telles que celles qui répondent à la formule: Ri R 1 ( 5) dans laquelle R a la définition donnée ci-dessus et R 1 est l'hydrogène ou un substituant apparaissant comme partie d'une molécule de porphyrine naturelle ou un groupe intro- duit pendant la synthèse, par exemple pour permettre la conjugaison ou pour affecter la constante de liaison de la porphyrine Des porphyrines appréciées sont la tétra- phénylporphyrine (R = phényle, R 1 = H) ou la tétrapyridyl- porphyrine (R = 4-pyridyle, R 1 = H) Un ou plusieurs des groupes phényle ou pyridyle sont substitués avec -NH 2 ou o -NH-C-CH 2 L, o L a la définition donnée ci-dessus, ou avec d'autres groupes pour permettre la conjugaison avec l'anticorps. La substitution est normalement effectuée en position para d'un groupe phényle et en position 2 ou en position 4 d'un groupe pyridyle. D'autres agents chélateurs qui peuvent être utilisés dans la présente invention sont les éthers en couronne et leurs analogues macrocycliques de formules générales: R R ( 6) R R N N R \ et R / S g R -, _R N N R R ( 7) dans lesquelles R a la définition donnée ci-dessus A titre de variante, le groupe qui est utilisé pour permettre la conjugaison est incorporé directement à l'éther en couronne ou à la structure macrocyclique comme illustré par la for- mule suivante: A dans laquelle A a la définition donnée ci-dessus. Des dérivés de desferrioxamine B peuvent aussi être utilisés comme agent chélateur Ils répondent à la formule: R 0 OH O OH t* * *, l R-CH 2-C-N ICH 2-'5 NH-C {C 22 C-N OHO O IIo Il -2 'N'EC"-l'N-c''-'-B '(C:, À '"' ' 2 v 2 5 Ncc 2 2 c c 2 5 ( 8) dans laquelle R a la définition donnée ci-dessus. Des dérivés d'entérobactine constituent égale- ment des agents chélateurs utiles On apprécie ceux qui répondent à la formule: O O =OHOH 2 O -o o If n _ on C H -CH-C NH C=O OH OF ( 9) dans laquelle A a la définition déjà donnée. Des analogues carbocycliques de l'entérobactine conviennent également Parmi eux, on peut mentionner des composés de formule: OH OH O OH OH cs t j 12 /C-LnC-,i-CI H H 2 2 NIH OH ( 10) dans laquelle A a la définition donnée ci-dessus. p D'autres systèmes carbocycliques utiles comme agents chélateurs comprennent ceux qui répondent à la for- mule HO Ho / 4; o -CH 2 0 OHïOH Ot CH 2 OH (il) et les anilides correspondants dans lesquels A a la défini- tion déjà donnée. Il est évident pour l'homme de l'art que le noyau représenté pour l'entérobactine et les analogues carbocycliques peut encore être substitué par des substi- tuants qui n'altèrent pas notablement leur aptitude à la liaison de radionucléides métalliques et que ces substi- tuants peuvent être introduits de manière à créer des sites de conjugaison à l'anticorps. Un autre groupe d'agents chélateurs utiles comprend les siloxanes de formule: OH OH' CHR CHR -R OH OR \ / Cd 2-3 -Si 0-Si si-R4 cs CEH 3 (CH 2)3 CH 3 { OH d 2 -( 12) dans laquelle R a la définition donnée ci-dessus, excepté que lorsque R n'est pas un groupe qui permet la conjugai- son, l'un au moins des groupes catéchol est un groupe de formule: A OH OH dans laquelle A a la définition donnée ci-dessus. Il est évident pour l'homme de l'art que la liste d'agents chélateurs donnée ci-dessus n'est pas exhaus- tive mais ne fait que donner des exemples d'agents chéla- teurs convenables. Le marquage direct d'anticorps avec des radio- nucléides métalliques peut être effectué par des procédés connus d'introduction d'un ion métallique sur un anticorps par sa fixation à un site existant sur l'anticorps lui-même. Dans quelques cas, le radionucléide métallique peut être incorporé par exposition de l'anticorps, habituellement en solution, au radionucléide dans son état approprié d'oxy- dation Par exemple, une technique préconisée implique la métallation directe de l'anticorps avec 103 Ru+ 3 par mise en contact de l'anticorps avec un sel de ruthénium con- venable, par exemple le trichlorure de ruthénium, dans une solution tamponnée Parmi les agents tampons qui peu- vent être utilisés, on mentionne l'acétate de potassium, le bicarbonate de sodium et la trihydroxyéthylamine (Tris). Une autre technique convenable implique la métallation directe de l'anticorps avec le chrome Des radionucléides du chrome peuvent être introduits par mélange d'un chromate du radionucléide, par exemple le chromate de sodium ou de potassium, avec l'anticorps en solution. Dans d'autres circonstances, l'anticorps peut être tout d'abord modifié chimiquement pour recevoir le radionucléide, puis amené à réagir avec lui Par exemple, des groupes disulfure de l'anticorps peuvent être réduits et leur réduction peut être suivie de la formation d'un groupe -S-M ou -S-M-S dans lequel M est le radionucléide. Par exemple, des groupes disulfure peuvent être réduits au moyen du dithiothréitol, pour former tout d'abord un groupe thiol qui peut être amené à réagir avec des ions métalliques appropriés, par exemple des ions de mercure, d'argent, de zinc, de plomb ou de cadmium, sous leur forme d'oxydes ou de sels. Des radionucléides qui peuvent être utilisés dans la présente invention sont ceux qui forment des' com- plexes stables avec des agents chélateurs polycoordonnés ou, dans des conditions convenables, qui se combinent directement avec l'anticorps Les radicaux nucléides sont choisis de manière qu'ils aient une période et d'autres caractéristiques radio-actives qui permettent avec sécurité leur élimination et leur introduction dans l'organisme d'êtres humains Un grand nombre de radionucléides ont été étudiés en vue de leur utilisation conformément à l'inven- tion dans l'organisme d'êtres humains On peut les grouper comme suit: Les agents chélateurs du type porphyrine (formule ), éther en couronne (formule 6) et macrocycle (formule 7) sont très utiles pour la liaison de radionucléides ayant le degré d'oxydation + 2 Par exemple, 195 m Pt, 57 Ni, 57 Co, Ag, 67 Cu et 52 Mn forment des complexes stables au degré d'oxydation + 2. Les agents chélateurs des formules 1-5 et 9-12 forment des complexes stables avec des radionucléides ayant le degré d'oxydation + 3 Parmi les radionucléides qui for- ment des complexes stables au degré d'oxydation + 3, on mentionne 52 Fe, 11 In, 113 m In, 99 m Tc 68 Ga, 67 Ga, 169 Yb, Co, 167 T 4, 166 Tm, 146 Gd, 157 Dy, 95 M Nb, 103 Ru, 7 RU, 99 Rh, 101 m Rh et 201 Tl Les agents chélateurs porteurs de groupes catéchol, de formules 9-12, sont particulièrement aptes à être utilisés avec des radionucléides qui sont très mobi- les in vivo, notamment des radionucléides de fer tels que 52 Fe. Des radionucléides qui peuvent être liés direc- tement à des anticorps comprennent les suivants: 203 Hg, * 197 Hg 105 Ag 203 Pb, 97 Ru, 103 Ru, 99 Rh, 101 m Rh et Cr. Les radionucléides qui conviennent le mieux sont des émetteurs de rayon gamma d'énergie comprise entre 1,6 10 il à 6,41 x 10-11 J, dont les périodes sont com- prises dans la plage d'environ 5 heures à 5 jours. Pour des raisons qui ne sont pas encore claire- ment élucidées, certains anticorps monoclonaux individuels spécifiques d'antigènes tumoraux résistent à une métalla- tion directe Par conséquent, pour l'incorporation du radio-isotope par cette voie, il est nécessaire de choisir soigneusement des anticorps spécifiques En conséquence, on préconise de lier un radionucléide à un anticorps en utilisant la voie d'accès la plus souple consistant à conjuguer tout d'abord un agent chélateur avec l'anticorps, puis à former un complexe avec le radionucléide A ce pro- pos, on apprécie particulièrement l'utilisation de 111 In (T 1/2 = 2,8 jours) comme radionucléide conjointement avec le DTPA comme agent chélateur. Le procédé de la présente invention peut être appliqué à la détection de tumeurs en utilisant des anti- corps monoclonaux spécifiques d'antigènes associés à des tumeurs en général En plus de l'ACE, des antigènes asso- ciés aux mélanomes, l'aféto-protéine, la ferritine, la gonadotropine chorionique humaine, un indicateur au glyci- nate de zinc et la phosphatase acide prostatique (PAP) peuvent, par exemple, être utilisés comme immunogènes pour stimuler la production des anticorps monoclonaux désirés, comme décrit ci-dessus Lors de l'utilisation réelle, l'anticorps marqué, dans une solution parentérale conve- nable, est injecté au patient Lorsqu'une période suffi- sante s'est écoulée, le patient est photoscanographié en vue de détecter tout site de radiation localisée indiquant une tumeur et/ou l'une de ses métastases. Les expériences suivantes conduites avec l'anti- corps monoclonal spécifique de l'ACE marqué avec 125 I et 111 In démontrent l'avantage de l'utilisation d'anticorps monoclonaux marqués avec des radionucléides liés à un chélate en vue de la visualisation de tumeurs conformé- ment à la présente invention, comparativement à des procédés basés sur des anticorps marqués par l'iode. 1 Préparation d'anti-ACE à marquage radio-actif Un anti-ACE monoclonal de la firme Hybritech, Inc, La Jolla, Ca, a été marqué au 125 I par la méthode décrite par Bolton et Hunter dans Biochem J, 133, 529-39 ( 1973) On a fait passer le produit sur une colonne de "Sephadex G-25 ",et la matière finale contenait moins de 0,5 % d'iode libre La fixation de l'anticorps monoclonal à marquage radio-actif a été supérieure à 80 % avec l'anti- corps de cheval anti-souris lié au sépharose et supérieure à 75 % avec l'ACE lié au sépharose. Le même anti-ACE monoclonal a été marqué au 111 In en utilisant le DTPA conjugué comme agent chélateur conformément à la méthode de Krejcarek et Tucker, Biochemical and Biophysical Research Communications, 77, 581 ( 1977). Le produit réactionnel a été purifié par passage sur une colonne de "Sephadex G-75 " La liaison de l'antigène a été comparable à celle que présentait l'anticorps marqué au I Le procédé de marquage n'a pas affecté la constante d'affinité Ka de l'anticorps, comparativement à l'anticorps non chélaté, comme déterminé par titrage à l'ACE. Les stabilités in vitro des anticorps anti- ACE marqués ont été déterminées par incubation d'une por- tion de la matière dans une solution parentérale compre- nant une solution de sel normale stérile, U S P, à 370 C pendant 72 heures et dosage par chromatographie du radio- nucléide libre Des gouttes des solutions d'anticorps ont été déposées sur des bandes d'alumine 1 B Baker et dévelop- pées dans de l'acétone aqueuse à 50 % Le radionucléide lié à la protéine reste à l'origine, tandis que le radio- nucléide libre subit une migration Après la période d'in- cubation, la matière marquée à l'iode radio-actif a montré moins de 3 % d'activité présente sous la forme d'iode libre Un séjour à 40 C a réduit cette valeur de 50 %. Dans les mêmes conditions, l'anti-ACE marqué au 111 In a montré une stabilité comparable. 2 Etudes de distribution chez des souris "nude" Des études de distribution dans les tissus d'anticorps anti-ACE monoclonaux de souris, à marquage radio-actif, ont été effectuées chez des souris nude" porteuses de 0,5-1,0 g de tumeurs du colon humain La plage de poids des souris allait de 17 à 28 g (moyenne d'environ 23 g) Les tumeurs ont été induites par injec- tion sous-cutanée d'un hachis de cellules d'adénocarcinome du colon humain produisant l'antigène ACE Des études de distribution ont été entreprises trois semaines plus tard. Deux expériences ont été effectuées Dans la première, 19 animaux ont été répartis en quatre groupes de 4 à 6 et on leur a injecté par voie intraveineuse (IV) 0,1 ml d'une solution stérile normale de sel U S P contenant 0,5 microcurie d'anticorps anti-ACE marqué au 125 I (envi- ron 0,3 microgramme d'anticorps) et, à titre de témoin, du citrate de 67 Ga sans support, agent non spécifique connu de visualisation de tumeurs du colon humain Des injections ont été effectuées sans anesthésie en utilisant une seringue Hamilton de 100 microlitres pour garantir la précision Des animaux chez lesquels la dose a été introduite partiellement par infiltration dans la queue ont été exclus de cette étude Après l'injection, on a placé des souris dans des cages métaboliques stériles dont le fond en toile métalli- que est surélevé pour permettre de recueillir les urines et des matières fécales Au-dessous du fond, de la gaze stérile 4 x 4 a été tassée de manière à ne pas pouvoir être rongée par les animaux Les souris, maintenues dans un local propre à 4,40 C, avec de la nourriture et de l'eau stérilisées à volonté, ont été sacrifiées par groupes 4, 24, 48 et 72 heures après l'injection d'indicateur. Les souris ont été anesthésiées à l'éther et des échantillons de sang ont été recueillis par ponction cardiaque directe Les souris ont ensuite été sacrifiées par luxation cervicale Au cours de la dissection subsé- quente, la tumeur, le foie, le rein, le muscle, le coeur, le poumon, le fémur et la rate ont été prélevés, rincés deux fois à l'eau, une fois à la formaline à 10 %, séchés au papier-filtre et pesés à l'état humide sur une balance analytique L'estomac intact et les intestins ont égale- ment été prélevés et soumis à un comptage On a admis que le sang, les muscles et les os représentaient, respective- ment, 7 %, 40 % et 10 % du poids corporel total, dans les calculs totaux d'absorption par les organes Les autres organes ont été pesés dans leur intégrité Un comptage de radio-activité a été effectué dans un compteur gamma automatique à puits comportant des fenêtres réglées au-delà du photopic de 4,32-5,61 10 12 J de 125 I et du photopic de 1,49 10 il J de 67 Ga Le compteur a été programmé de manière qu'il y ait rejet à partir de 10 minutes ou d'un nombre de chocs de 106 afin de parvenir à une significa- tion statistique pour les échantillons ayant les niveaux d'activité les plus bas On a effectué des corrections pour tenir compte du fond et de la contribution réciproque d'activité isotopique entre les réglages des fenêtres, en utilisant des sources préparées et en résolvant des équa- tions simultanées L'activité des échantillons a ensuite été comparée à des étalons de la matière injectée, les résultats étant exprimés en pourcentages de dose injectée par gramme et en pourcentages de dose injectée par organe. Les rapports tumeur/tissu ont été calculés d'après les valeurs de pourcentages de dose par gramme L'activité dans les intestins, l'urine et les matières fécales a été calculée en pourcentage de la dose injectée totale. Dans la seconde étude, 37 souris "nude" por- teuses de tumeurs développées à partir du même cancer du colon humain ont été réparties en cinq groupes de 7 à 8 animaux Un groupe a servi de témoin et on lui a injecté simultanément par voie intraveineuse une microcurie de sérum-albumine humaine marquée au 125 I ( 0,01 mg de sérum- albumine humaine) et 3 microcuries de citrate de In dépourvu de support ( 0,01 mg de citrate) et on a sacrifié les souris 48 heures après l'injection Dans les quatre groupes restants, les animaux ont reçu des injections simultanées de 3 microcuries d'anticorps anti-ACE marqués au 111 in ( 1,5 microgramme d'anticorps) et 5 microcuries de citrate de 67 Ga dépourvu de support Les souris ont été sacrifiées, respectivement, après 4, 24, 48 et 72 heures. La dissection des tissus, la préparation des échantillons en vue de l'épreuve radio-isotopique, les comptages et les calculs ont été effectués comme décrit ci-dessus Dans le cas de 1 1 n, le spectromètre a été réglé de manière à compter le photopic de 3,96 10 11 J en utilisant une fenêtre de 6,41 10 12 J ( 3,36-4,00 10-11 J), tandis que le 67 Ga a été compté avec une fenêtre de 4,8 10 12 J recouvrant le photopic de 1,49 1011 J Ces réglages ont eu pour résultat moins de 10 % de contributions réciproques de radio-activité. Comme le fait apparaître la figure 1, les con- centrations d'anti-ACE marqué au 111 In se localisant dans la tumeur ont augmenté constamment sur toute l'échelle de temps de l'expérience 23 % de la dose injectée se sont accumulés en 72 heures et les résultats donnent à penser que ce niveau aurait été encore plus haut si l'on avait 15046 tenté un échantillonnage ultérieur En revanche, le taux sanguin s'est abaissé pendant toute la période d'essai. Le foie a montré une absorption rapide après 4 heures, suivie d'une période sans grand changement, puis une croissance jusqu'à 72 heures Les autres tissus ont pré- senté peu de variation pendant la période étudiée. Le taux de 67 Ga dans la tumeur est resté assez constant pendant l'essai, sa valeur étant approximative- ment le quart de celle de l'anti-ACE marqué au 111 N après- 72 heures Le taux sanguin de 67 Ga a baissé constamment, tandis que la concentration dans le foie a présenté une configuration semblable à celle de l'anticorps marqué au 111 indium La concentration en 67 Ga dans le muscle s'est abaissée jusqu'à la 48 ème heure, puis elle s'est stabili- sée, tandis que la concentration dans les os est restée toujours la même. La quantité d'iode dans la tumeur a culminé au bout de 4 heures, étant initialement un peu plus forte que les quantités de 111 indium, puis elle a baissé irré- gulièrement pendant toute la période restante de l'essai, n'étant que le 1/10 de celle de 111 In au bout de 72 heures. A ce moment, il est apparu deux fois autant de 67 Ga que de 1251 dans la tumeur Le nombre de chocs de 125 I dans tous les tissus a diminué rapidement à partir des valeurs maximales au bout de 4 heures, et dans quelques cas, les niveaux de fond ont été atteints au bout de 48 heures. Les informations concernant l'excrétion (figure 2) montrent une élévation constante du taux urinaire de 111 In entre 24 et 72 heures, atteignant un maximum de 14 % de la dose injectée La concentration en 111 In dans les matières fécales est restée assez constante entre 24 et 48 heures, puis elle s'est élevée à 17 % après 72 heures, tandis que la quantité dans l'intestin est restée relativement constante pendant toute la période, ne dépassant jamais 5 % de la dose. Le diagramme d'excrétion de 67 Ga a été assez semblable à celui de 111 In, montrant, cependant, davantage d'indicateur dans l'intestin et dans les matières fécales qu'on n'en avait observé pour 111 In, et moins dans l'urine. La radio-activité de 125 I a été éliminée en proportion de presque 60 % dans l'urine pendant les 24 premières heures et de 75 % après 48 heures Une autre fraction de 5 % du 1251 a été perdue dans les matières fécales Par conséquent, au bout de 72 heures, environ % du 125 I initialement injecté avaient été excrétés par l'animal La chromatographie du 125 I dans l'urine a montré que la majeure partie de ce radio-isotope consis- tait en iode libre, avec une seconde forme représentant vraisemblablement du 125 I libre complexé avec quelque chose d'autre qu'une protéine. La figure 3 reproduit les résultats concernant l'anticorps anti-ACE marqué au ill In après 48 heures, et compare ces résultats au citrate de 111 indium et à la sérum-albumine humaine marquée au 125 I ( 125 IHSA) Le citrate de i 11 in a été utilisé comme témoin pour tout indium qui pouvait s'être dissocié de l'anticorps, tandis que le 125 IHSA a été utilisé comme témoin protéinique non spécifique L'anti-ACE marqué au 111 In a montré un diagramme de distribution très différent de celui du citrate de 111 In, se concentrant plus efficacement dans la tumeur d'un facteur 10 Les absorptions des deux indi- cateurs par les autres tissus ont aussi été différentes. Les concentrations de 125 IHSA dans la tumeur ont atteint % de celles de l'anti-ACE marqué au 111 In, mais elles ont encore été supérieures de 50 % à celles de l'anti-ACE marqué au 125 I La distribution de 125 IHSA dans le tissu non tumoral est également très différente de celle du produitanti-ACE marqué au i 11 In Il est particulièrement important de constater que le 125 IHSA, longtemps considéré comme une protéine iodée stable, a montré une excrétion de presque 60 % ( 43 % dans l'urine) au bout de 48 heures, ce qui concorde remarquablement avec la découverte indi- quée ci-dessus selon laquelle l'anti-ACE marqué au 125 I a été trouvé également dans l'urine La fraction urinaire représente vraisemblablement de l'iode libre. Les rapports tumeur/tissu (figure 4) montrent que l'anti-ACE marqué au 111 In est supérieur à 67 Ga vis-à- vis de tous les tissus, excepté le sang, étant à peu près les mêmes que 67 Ga dans ce cas Les rapports obtenus pour l'anti-ACE marqué au 125 I, apparemment meilleurs que ceux que présentent 111 In et 67 Ga dans certains tissus, sont cependant trompeurs, attendu qu'ils proviennent de faibles taux de 125 I dans les tissus normaux plutôt que d'une localisation dans la tumeur. D'après les expériences décrites ci-dessus, l'anti-ACE marqué au 125 I est nettement inapproprié comme -agent de localisation tumorale La déshalogénation rapide et accentuée abaisse la concentration d'indicateur dans la tumeur et élève le bruit de fond dans le sang, en empê- chant son utilisation dans la visualisation sans des techniques sophistiquées de soustraction En effet, au bout de 72 heures, la tumeur contient deux fois la quantité non spécifique de 67 Ga comparativement à I, sur une base rapportée au gramme En outre, les rapports tumeur/sang sont meilleurs pour l'isotope 67 Ga qu'ils ne le sont pour l'anticorps iodé Si l'on consi- dère que le 67 Ga est jugé inapte à la visualisation d'un adénocarcinome du colon, les obstacles rencontrés par Mach et collaborateurs, N Eng J Med, 303, 5-10 ( 1980) s'expliquent aisément Ces résultats obtenus en utilisant I démontrent de façon non équivoque qu'en l'absence de techniques de soustraction, si l'on utilisait l'iso- tope 131 I, de très fortes doses de matière marquée au 131 I devraient être administrées pour atteindre les con- centrations nécessaires dans les tumeurs pour une visua- lisation efficace Cela aurait pour conséquence que le patient recevrait une forte dose d'irradiation à cause de la période radio-active de 8 jours et de la composante bêta de 9,74 10 11 J de 131 I. En revanche, le fort pourcentage de la dose injectée d'anti-ACE marqué au 111 In acquis par la tumeur, et la caractéristique physique plus favorable de 111 In, permettent l'injection de plus faibles quantités de substance 15046 radiopharmaceutique, tout en améliorant l'image et en minimisant la dose d'irradiation à laquelle le patient est exposé Les rapports de la tumeur au bruit de fond qui sont établis par l'anti-ACE marqué au 111 In se situent tout à fait dans la plage nécessaire aux fins de la visualisation, à cause de la grande quantité de radionucléide localisé dans la tumeur En outre, les résultats suggèrent que la tumeur acquiert un marquage radio-actif qui avait auparavant été incorporé à d'autres tissus ou qui avait adhéré à ces tissus. Des souris individuelles ont été photoscano- graphiées 4, 24, 48 et 72 heures après l'injection de l'anti-ACE marqué au 111 In en utilisant une chambre gamma Phogam H P Anger Après 48 heures, la tumeur a été bien délimitée sans recourir à des techniques de soustraction. Au bout de 72 heures, la délimitation de la tumeur était encore meilleure. La stabilité in vivo et, par conséquent, l'apti- tude à la visualisation d'une tumeur d'un anticorps mono- clonal directement marqué sont démontrées par les expé- riences suivantes qui ont été effectuées en utilisant un anticorps monoclonal anti-mélanome marqué au 103 Ru, com- parativement au même anticorps marqué au 125 I. 1 Préparation de l'anticorps anti-mélanome marqué au 103 Ru Une solution aqueuse de 220 il de 103 Ru Cl (procuré par la firme New England Nuclear, Inc) a été ajoutée à 100 gl d'une solution saturée d'acétate de potas- sium Le p H a été ajusté à 5,3 avec 70 il de Na OH 10 M. Cette solution de radionucléide a été ajoutée à 500 Al d'une solution à 0,5 gg/gl d'anticorps anti-mélanome de souris et on a fait incuber le mélange pendant 1 heure à la température ambiante Le p H a été ajusté à 7,2 par addition de 20 il de Na OH 10 M et la préparation a été conservée pendant environ 18 heures à la température am- biante Le métal non lié a été séparé du métal lié à l'anti- corps en chargeant le mélange réactionnel sur une colonne de "Sephadex G-50 " et en effectuant l'élution avec la solu- tion de sel tamponnée au phosphate à p H 7,2 Les fractions contenant la protéine ont été recueillies et rassemblées en vue d'études in vivo chez la souris. 2 Etudes de répartition chez des souris normales Des études de répartition dans les tissus ont été effectuées chez des souris BALB-C normales, en utili- sant un anticorps anti-mélanome marqué au 103 Ru préparé conformément au mode opératoire ci-dessus et un anticorps anti-mélanome marqué au 125 I préparé selon le mode opéra- toire indiqué ci-dessus à propos du marquage de l'anti- corps anti-ACE. Les souris ont été réparties en deux groupes qui ont reçu par injection intraveineuse, respectivement, l'anticorps marqué au 125 I et l'anticorps marqué au 103 Ru. Les souris ont été sacrifiées 4, 24, 48, 72 et 96 heures plus tard, disséquées,et la radio-activité des organes a été déterminée comme décrit ci-dessus à propos des études effectuées avec l'anti-ACE monoclonal La distri- bution de 125 I et de 103 Ru dans les tissus est reproduite sur le tableau ci-après. Distribution comparative de I-125 et Ru-103 dans les tissus après injection d'anticorps anti-mélanome marqué, à diverses périodes, chez des souris BALB-C normales* 4 heures Dose %/Organe I-125 Ru-103 SANG+ +e.t. FOIE X +e.t. RATE X +e.t. REIN X +e.t. COEUR X +e.t. MUSCLE+ +e.t. FEMUR X +e.t. POUMON X +e.t. INTESTIN X +e.t. POIDS DE L'ANIMAL X PLAGE (g) n = 46,4 4,17 12,6 1,87 1,27 0,181 1,94 0,135 0,792 0,161 ,2 2, 56 0,360 0,040 2,58 0,736 23,8 4,24 28,3 3,32 48,1 6,63 3,38 0,467 7,11 0, 284 0,629 0,119 7,61 1,02 0,346 0,027 2,01 0,464 7,72 0,646 17,96 + 3,88 12,1 22,2 24 heures Dose %/Orcane I-125 Ru-103 11,7 ,8 ,22 0,864 0,520 0,053 0,784 0,091 0,403 0,075 12,5 2,34 0,189 0,046 1,13 0,271 ,61 3,16 12,5 1,74 42, 9 4,84 2,64 0,498 ,15 0,352 0,327 0,049 8,64 1,55 0,253 0,045 0,817 0,133 6,11 0,817 16,3 + 1,68 14,6 19,8 48 heures Dose %/Or ane I-125 Ru-103 13,0 6,66 ,27 0,904 0,340 0,049 0, 641 0,073 0,340 0,036 11,6 2,48 0,163 0,035 0,878 0,131 6,04 0,704 6,97 0, 550 47,2 6,42 1,95 0,248 4,21 0,284 0,301 0,017 8,17 1,88 0,241 0,041 0, 612 0,079 ,51 0,460 14,8 + 1,79 11,6 17,1 72 heures Dose %/Organe 1-125 Ru-103 11,8 6,88 4,54 1,03 0,284 0,025 0, 542 0,063 0,263 0,060 9,56 1,00 0,150 0,019 1,17 0,281 ,22 0,501 ,54 0, 678 41,2 4,14 1,94 0,311 3,68 0,203 0,236 0,051 6,98 0,906 0,252 0,030 0, 585 0,082 4,70 0,523 14,95 + 1,80 13,1 18,2 96 heures Dose %/Organe 1-125 Ru-103 13,2 3,30 0,929 0,244 3,86 39,3 0,395 4,34 0,252 1,98 0,022 0,263 0,460 3,21 0,034 0,188 0,220 0,207 0,037 0,015 8,05 6,66 0,641 0,482 0,106 0,200 0,014 0,015 0,855 0,475 0,159 0,075 3,94 4,01 0,129 0,296 ,95 + 1,21 14,0 17,5 * Les valeurs représentent la moyenne (X) de N animaux + un écart type (e t) + Le sang est estimé à 7 %, le muscle à 40 % du poids de l'animal. ub n MI Ln t Ln Do 0 % Les résultats reproduits sur le tableau démon- trent que l'anticorps anti-mélanome marqué au 125 I s'est rapidement déshalogéné, tout comme l'anti-ACE marqué au I, tandis que l'anticorps anti-mélanome marqué au 103 RU s'est montré stable Ces observations sont confirmées par le fait que le taux de 125 I dans le sang est très élevé 4 heures après l'injection et s'abaisse à des niveaux faibles mais constants de la 24 ème à la 96 ème heure En revanche, le taux de 103 Ru s'abaisse relativement vite dans le sang et se concentre dans le foie, comme on doit s'y attendre chez un hôte non atteint de tumeur Les taux dans la rate et dans le rein pour les souris traitées par injection avec l'anticorps anti-mélanome marqué au 103 Ru, concordent également avec la stabilité in vivo. Il est bien connu que l'ACE et certains autres antigènes associés à une tumeur sont sécrétés ou répandus par la tumeur Dans quelques cas, l'apparition d'un rayon- nement de fond résultant de ce que l'antigène circulant dans le sang ou dans un autre tissu se combine avec l'anticorps marqué, peut être réduite par l'administration initiale d'anticorps non marqué destiné à se combiner avec l'antigène en circulation Cela tendrait également à réduire la forte absorption d'anticorps marqué dans le foie Après une période convenable, de l'anticorps marqué est ajouté et le patient est photoscanographié pour déter- miner le site de la radiation localisée. Bien qu'il se dégage des indications données ci-dessus l'utilisation d'un seul anticorps monoclonal marqué avec un radionucléide, il est conforme à l'inven- tion d'utiliser deux ou mêmes plus de deux anticorps mono- clonaux marqués, pour différents déterminants antigéniques. Les anticorps différents sont choisis de manière qu'ils n'interfèrent pas avec la liaison à l'antigène d'un autre anticorps En utilisant plusieurs anticorps marqués n'interférant pas, l'image de la tumeur peut être rendue meilleure, attendu que l'antigène est doué d'une plus grande capacité envers l'anticorps marqué L'utilisation de plusieurs anticorps est particulièrement utile pour la visualisation d'une tumeur dont l'antigène associé est présent à une faible concentration. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre illustratif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y &tre appor- tées sans sortir de son cadre. 15046 REVENDICATIONS 1 Un anticorps monoclonal relatif à un antigène associé à une tumeur, auquel un radionucléide métallique est lié directement ou par l'intermédiaire d'un agent chéla- teur conjugué avec l'anticorps. 2 Anticorps monoclonal suivant la revendica- tion 1, caractérisé en ce que l'agent chélateur est choisi entre des acides polyaminocarboxyliques, des acides poly- amino-(alkylènephosphoriques), des polyamines, des por- phyrines, des éthers en couronne, des miacrocycles, la des- ferrioxamine B et ses dérivés et des entérobactines et leurs analogues carbocycliques. 3 Anticorps monoclonal suivant la revendica- tion 2, caractérisé en ce que l'agent chélateur est un acide polyaminocarboxylique de formule: C C_" q Co,,_ ? ( CH 2: 02 C C 22 2) 2 '_ 2 2)v C 22 N-c C: s-C C NY :O C e CE 2) 2 y dans laquelle x est un nombre entier pouvant être égal à 0, y est égal à 1 ou 2, z est un nombre entier de 1 à 7 et R est l'hydrogène ou un groupe par lequel l'agent chéla- teur est conjugué avec l'anticorps ou un groupe qui affecte la constante de liaison de l'agent chélateur du radio- nucléide. 4 Anticorps monoclonal suivant la revendica- tion 2, caractérisé en ce que l'acide polyamino-(alkylène- phosphorique) répond à la formule: o o O* Il n È;-C; CE 2 Z Z \ N C: ' {:C2)c v c y C ',c H O CC dans laquelle x est un nombre entier pouvant être égal à 0, y est égal à 1 ou 2 et z est un nombre entier de 1 à 7, et R est l'hydrogène ou un groupe par lequel l'agent chéla- teur est conjugué avec l'anticorps ou un groupe qui affecte la constante de liaison de l'agent chélateur pour le radio- nucléide. Anticorps monoclonal suivant la revendica- tion 3 ou 4, caractérisé en ce que R est l'hydrogène, le groupe méthyle, -CH 2 C 6 H 40 CH 2 Co 2 H ou -C 6 H 4-A, o A est un sel de diazonium ou son précurseur, ou un groupe H -NH-C-CH 2 L dans lequel L est un nombre déplacé pendant la conjugaison. 6 Anticorps monoclonal suivant la revendica- tion 5, caractérisé en ce que x est égal à 0 et R est le groupe o O ll -C 6 H 4-NH-C-CH 2 Br. 7 Anticorps monoclonal suivant la revendica- tion 5, caractérisé en ce que l'agent chélateur est un acide polyaminocarboxylique et x est égal à 1, et R est le groupe o Vl -C 6 H 4-NH-C-CH 2 Br. 8 Anticorps monoclonal suivant la revendica- tion 2, caractérisé en ce que l'agent chélateur est choisi dans le groupe comprenant l'acide éthylènediaminotétra- acétique, l'acide p-bromacétamidodiphényl-(éthylènedinitri- lotétra-acétique), l'acide 1-(p-aminophényl)-éthylènediamino- tétra-acétique et l'acide diéthylènetriaminopenta-acétique. 9 Anticorps monoclonal suivant l'une quelcon- que des revendications précédentes, caractérisé en ce que le radionucléide est un émetteur gamma de périodes com- prises entre 5 heures et 5 jours et dont les émissions gamma ont une énergie de 1,60-6,41 10 11 J. Anticorps monoclonal suivant l'une quelcon- que des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le radionucléide est choisi entre 195 m Pt, 57 Ni, 7 Co, 105 Ag, 67 Cu, 52 Mn, 52 Fe, 111 In, 113 m In 99 m Tc 67 Ga 68 Ga, 169 b, 166 Tm, 167 Tm'146 Gd, 157 Dy, 95 m Nb, 103 Ru, 97 Ru, 99 Ru, 101 m Rh, 201 Tl 203 Hg 197 Hg 105 Ag, 203 pb, 99 Rh et 48 Cr. 11 Anticorps monoclonal suivant l'une quelcon- que des revendications 1 à 7, 9 et 10, caractérisé en ce que l'antigène associé à la tumeur est l'un des antigènes du groupe suivant, antigène carcinoembryonnaire, a-féto- protéine, ferritine, gonadotropine chorionique humaine, indicateur au glycinate de zinc, phosphatase acide prosta- tique et antigènes associés au mélanome. 12 Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend une solution, pour l'administraton parentérale, d'un anticorps monoclonal relatif à un antigène associé à une tumeur suivant l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13 Composition suivant la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de deux ou plus de deux desdits anticorps monoclonaux. 14 Procédé de visualisation d'une tumeur, carac- térisé en ce qu'il consiste: a) à administrer à un être humain une composi- tion parentérale comprenant un anticorps monoclonal relatif à un antigène associé à la tumeur, l'anticorps monoclonal portant un radionucléide lié directement ou par l'intermé- diaire d'un agent chélateur conjugué avec l'anticorps; et b) à photoscanographier le patient pour déter- miner le site de localisation de l'anticorps chez ce patient comme indiqué par l'émission d'une radiation par le radio- nucléide. Procédé suivant la revendication 14, carac- térisé en ce que l'anticorps monoclonal répond à la défini- tion donnée dans l'une quelconque des revendications 1 à 13.