Brevet FR2521302A1 — publié le 19830812

252130: La présente invention concerne des compositions de fixation et de préservation pour des préparations histologiques, cytologiques, immunologi- ques et protéinées ainsi que des dispositifs nouveaux et des procédés de tests qui deviennent possibles en raison des propriétés remarquables des compositions. L'utilisation d'agents de fixation pour préserver des compositions histologiques et cytologiques est évidemment bien connue et courante Dans tous les cas, ce sont des compositions liquides qu'on applique à l'échantillon ou dans lesquels on plonge l'échantillon Dans le brevet US 3 546 334, une solu- tion de fixation cytologique d'un polyalkylène-glycol, d'eau, d'un alcool en C 1-C 10 et d'une cétone est pulvérisée sur une lamelle sur laquelle on a pré- cédemment déposé un frottis de cellules du corps Selon ce brevet, l'alcool, l'eau et la cétone s'évaporent en laissant une pellicule protectrice de poly- éthylène-glycol sur le frottis. Le brevet US 3 997 656 décrit un procédé de coloration histologique selon lequel on commence par immerger le tissu dans une solution aqueuse de fixation formée d'acide trichloracétique, de chlorure de zinc et de formaldé- hyde Une cire telle que le polyéthylène-glycol peut être incorporée dans la solution de fixation à titre d'agent lubrifiant et obturant. Dans le brevet US 3 389 052, on énumère différentes méthodes de fixa- tion de frottis cytologiques, toutes ces méthodes impliquant l'application d'un agent liquide de fixation qui est fréquement l'éthanol et l'éther éthyli- que Ce même brevet décrit également l'emploi d'une composition perfectionnée sous forme d'un aérosol, d'un alcanol inférieur, d'un mélange d'un polyéthylène- glycol solide et d'un liquide et aussi d'un agent propulseur, qu'on pulvérise sur le frottis. La présente invention constitue un perfectionnement aux techniques mentionnées en ce sens qu'elle fournit un agent de fixation qui est préalable- ment appliqué sur une lamelle ou tout autre surface d'essai et qui présente une surface non fluide pratiquement sèche sur laquelle est appliqué l'échan- tillon Un simple contact entre la surface et l'échantillon assure la fixation et la préservation de sorte que seul un transfert de l'échantillon à la sur- face d'essai est nécessaire Il n'est pas nécessaire de perturber l'échantil- lon comme cela avait lieu antérieurement lors d'une application séparée de l'agent de fixation. Les avantages qui découlent de cette façon de procéder sont nombreux. En premier lieu, on peut produire des lamelles pré-enduites aux praticiens individuels On peut ensuite appliquer directement des frottis cytologiques. On peut soumettre la lamelle aux tests de diagnostic qui sont nécessaires ou bien on peut conserver cette lamelle pour des essais ultérieurs, sans avoir à effectuer d'opérations supplémentaires de fixation ou de préservation. En outre il est inutile de se conformer rigoureusement à un protocole précis de fixation comme c'est souvent le cas avec des agents de fixation liquides ou pulvérisés On peut donc assurer une meilleure uniformité des résultats étant donné qu'une application préalable de la matière de fixation convient admirablement à la normalisation. Par ailleurs, en raison du caractère essentiellement "sec" de la préparation et des avantages spéciaux qui découlent de l'emploi de lamelles ln en matière plastique, on peut expédier les lamelles à peu de frais par la poste Ainsi on ne simplifie pas seulement grandement les déterminations cliniques mais on ouvre la possibilité d'un examen microscopique centralisé pour les divers médecins qui demeurent en des endroits très éloignés les uns des autres. Les propriétés de fixation et de préservation de la composition per- mettent également la préparation de dispositifs de diagnostic qui utilisent des entités biologiques instables telles que des antigènes et certains anti- corps. D'autres buts et avantages de l'invention ressortiront de la descrip- tion qui va suivre. La composition de base comprend,â titre de son composant principal de fixation et de préservation, un mélange de quatre ingrédients: une pyrrolid-2-one, un polyol, au moins une urée et un sel de zinc d'un acide organique ou minéral non oxydant Dans ce mélange, les proportions relatives des quatre ingrédients peuvent varier entre de larges limites dans certaines gammes très étendues selon l'emploi spécifique auquel on destine la composi- tion globale En général, la pyrrolid-2-one représente environ 10 à 75 % en poids du mélange, le poiyol représente environ 10 à 50 % en poids du mélange, l'urée représente environ 1 à 20 % en poids du mélange et le sel de zinc repré- sente environ I à 10 % en poids du mélange Les pourcentages relatifs réels sont choisis dans des gammes respectives de manière que leur somme soit de % du mélange. Le polyol est normalement un polyalkylène-glycol tel que le poly- éthylène-glycol ou le polypropylène-glycol bien qu'on puisse utiliser d'autres polyols tels que la glycérine Un polyol qui s'est révélé le plus satisfaisant est le polyéthylène-glycol ayant un poids moléculaire d'environ 200. Le sel de zinc peut être le sel d'un acide non oxydant quelconque, notamment d'un acide minéral fort tel que l'acide chlorhydrique (c'est-àdire le chlorure de zinc) ou d'un acide organique plus faible tel que l'acide acétique (c'est-à-dire l'acétate de zinc). Sans vouloir lier l'invention à une théorie quelconque, il semble que les compositions qui utilisent le mélange indiqué ne fonctionnent pas suivant un principe de déshydratation Ceci est en opposition avec les com- positions fixatives connues qui utilisent des matières telles que le formaldé- hyde et des alcools Il semblerait plutôt que le mélange "fixe" les molécules d'eau à l'intérieur de la cellule ou de la matière, en préservant à la fois les caractéristiques-cellulaires et les caractéristiques immunologiques. Comme on le verra plus loin, le mélange peut être présenté sous diverses formes compositionnelles Par exemple, les ingrédients du mélange peuvent être sous forme d'une solution aqueuse Selon la concentration, on peut utiliser ces solutions elles-mêmes commes des compositions de fixation ou bien comme solutions de réserve servant à la préparation de lamelles pré- enduites Par exemple, une solution aqueuse à 0,005 % d'un mélange d'environ 40 à 45 % de pyrrolid-2-one, environ 40 à 45 % de polyéthylèneglycol, environ 9 à 10 % d'urée et environ 4 à 5 % d'acétate de zinc constitue un agent de pré- servation convenable pour l'antigène UCG porté par un latex de lait En variante on peut appliquer une solution de même mélange sur une lamelle et laisser sécher pour présenter ainsi une surface fixante. Outre les ingrédients mentionnés du mélange, ce dernier peut contenir divers autres ingrédients La présence ou l'absence de tels ingrédients dépend de l'application particulière Par exemple, des préparations immunologiques et protéinées sont fréqumment incorporées de façon avantageuse déposées sur un support, tel qu'un latex de lait, un charbon de bois de coprah, etc Quand ces ingrédients doivent être combinés avec le mélange de base, il est souhai- table d'incorporer un ou plusieurs agents de protection colloïdale tels que, par exemple, un dérivé de polysaccharide comme la dextrine, le carragheen ou un sucrose réticulé par l'épihydrine, un acétate de polyvinyle, un acrylamide, une composition de choline et de cholestérol ou similaire En outre, dans des compositions colloïdales de ce genre, l'addition d'une petite quantité d'un agent tensio-actif tel'qu'un alkylaryl polyéther alcool, un sulfonate ou un produit analogue est souvent avantageuse. Dans les cas o l'on désire un degré plus important de fixation par complexation pour des préparation tissulaires et autres préparation protéinées, l'addition d'une petite proportion pouvant aller jusqu'à environ 1 % d'un dialhéhyde, tel que le glyoxal ou le glutatraldéhyde, est efficace De même, d'autres agents complexants tels que l'acide trichloracétique peuvent être ajoutés Normalement quand l'acide trichloracétique est incorporé, sa propor- tion correspond à environ 10 à 15 % du poids total du mélange précité des quatre ingrédients de base. Pour des lamelles pré-enduites, il est aussi fréquement souhaitable pour améliorer l'adhérence de l'échantillon fixé, d'ajouter une certaine quantité d'un adjuvant filmogène tel que l'alcool polyvinylique, la méthyl- éthylcellulose, un collagène ou un produit analogue à la préparation La pro- portion de cet adjuvant peut aller d'environ 10 à 20 % du poids total du mé- lange défini des quatre ingrédients, cette addition se faisant en général après l'achèvement des autres opérations de mélange. Selon un mode de réalisation de l'invention, on utilise une solution de réserve pour pré-enduire des lamelles ou d'autres surfaces de test On utilise une bande de base en une matière qui n'absorbe pas l'eau et qui est insoluble dans-l'eau, comme par exemple une lamelle de microscope classique en verre ou bien une bande ou lamelle en matière plastique Les matières plas- tiques appropriées sont notamment le polystyrène, les polyacrylates, les poly- méthacrylates, les polyéthylènes, les polypropylénes, les polycarbonates, le chlorure de polyvinyle, la nitrocellulose, etc La surface porte au moins une zone de dépôt pouvant s'étendre sur toutesa surface ou pouvant être limitée à une ou plusieurs zones de la surface Plus particulièrement, lorsqu'il s'agit d'une matière plastique, les zones peuvent être définies par des encoches appro- priées. Sur chaque zone, est placé le résidu d'évaporation de la composition particulière de fixation et de préservation Ainsi une solution de la composi- tion est appliquée sur la surface et on la laisse s'évaporer sous chauffage doux, par exemple à 40 C, jusqu'à élimination d'une quantité suffisante de liquide (principalement d'eau) et il reste un résidu sensiblement sec mais légèrement poisseux Une telle surface d'essai ou lamelle pré-enduite est alors prête à recevoir un échantillon histologique, cytologique, immunologique ou protéiné qui est fixé lors de l'application. Une observation particulièrement étonnante implique l'utilisation des compositions selon l'invention en combinaison avec des surfaces plastiques o il semble que la pré-enduction tend à rendre la surface relativement imper- méable aux solvants organiques puissants utilisés en chimie médicale Ainsi la pré-enduction d'une surface en polystyrène ou en polyméthacrylate, comme il est décrit, donne une surface enduite qui résiste au xylène, au toluène et à des solvants analogues. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, la bande de base pré-enduite sert comme un dispositif de test pour diagnostic On combine avec la composition selon l'invention un système réactif pour diagnostic du type histologique, cytologique, immunologique ou protéine et on-dépose cette com- binaison sur la bande de base, puis on sèche comme il a été précédemment expliqué Le système réactif contient des colorants d'un type classique tels que le bleu de méthylène N, l'acétate de crésyl violet, l'hématoxyline, etc, ainsi que des colorants de contraste tels que la rosaniline, le magenta II, l'acide picrique, etc (voir d'une façon générale les brevets US 3 997 656 et 4 070 495), ainsi que des colorants mitocondriaux tels que l'actoflavine. De façon encore plus intéressante, le système réactif pour diagnostic peut contenir des matières d'une nature biologique qui ordinairement ne sont pas utilisables pour former des préparations préalables et des produits stockables. Dans cette catégorie, on citera de façon représentative, des agents immunologi- ques tels que les sérums, les anticorps purs et les antigènes Alors qu'on a déjà décrit des lamelles ou d'autres surfaces de test contenant certains composants immunologiques séchés (voir par exemple le brevet US 3 666 421), ces systèmes ont été limités aux matières immunologiques ou protéinées de haute stabilité En outre, ces systèmes exigeaient plusieurs zones pour empêcher une réaction prématurée aussi bien physique que chimique, leur contenu devant etre mélangé lorsqu'on exécute un test particulier Enfin ces systèmes ou dis- positifs de test sont dépourvus d'un degré quelconque de permanence après développement. Le système selon l'invention assure la préservation (et pe"met ainsi l'utilisation) des réactifs biologiques autrement instables tels que des antigènes Il s'agit entre autres des antigènes à certains anticorps et substances analogues aux anticorps comme RF (arthrite), réagine de plasma rapide (syphilis) Ig G, IM, S-UCG et similaires De même des anticorps, notamment des antisérums et des anticorps monocloniques peuvent être incorporés dans la composition et peuvent servir à préenduire les lamelles ou les surfaces des substrats de diagnostic Lors du séchage, le réactif biologique particulier est préservé mais conserve toujours son activité biologique En fait, on peut préserver le réactif dans une zone unique même en présence d'autres composants réactifs qui ne sont pas activés jusqu'à humidification de l'échantillon, par exemple par application d'un échantillon de test Une fois le test terminé, le système peut être préservé par suite de la présence permanente de la composition de préservation et de fixation, ce qui permet une étude future et comparative. Les exemples suivants dans lesquels toutes les proportions sont en poids sauf stipulation contraire, servent à illustrer l'invention sans aucune- ment en limiter la portée. EXEMPLE 1 Ingrédient Quantité Pyrrolid-2-one 15 g Urée 1,65 g 1,3-diméthyl-urée, 1, 65 g Acétate de zinc 1,5 g Polyéthylène-glycol (P M 200) 6,25 ml On mélange les ingrédients avec 500 ml d'eau distillée et on ajoute g d'un mélange 1:1 de "Gelvatol" G 40/o 10 et G 20/60 On règle le p H de la solution finale à 6,6 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium On com- bine 1 partie de cette préparation avec 9 parties de charbon/antigène RPR et on applique ensuite 0,5 mg du mélange sur une lamelle en polystyrène et on sèche à 40 C L'unique zone de test est stable à la température ambiante et peut ser- vir pour la détection sérologique de la syphilis L'antigène RPR avec particules de carbone détecte la "réagine", c'est-a-dire une substance analogue à un anti- corps qu'on trouve dans les sérums de personnes souffrant de syphilis (et parfois aussi dans les sérums de personnes souffrant d'autres états aigus ou chroniques). quand un spécimen contient l'anticorps, une floculation a lieu avec une coag- glutination des particules de carbone qui se traduit par l'apparition d'agglo- mérats noirs Cette coagglutination peut être lue par voie macroscopique Les échantillons non réactifs ont une couleur gris clair. EXEMPLE 2 Ingrédient Quantité Pyrrolid-2-one à 98 % 15,0 g Urée 3,5 g Polyéthylèneglyçol (P M 200) 6,25 ml Acétate de zinc 1,0 g On mélange ces ingrédients dans 500 ml d'eau distillée On chauffe selon les besoins pour faciliter la dissolution On applique la solution sur des lamelles en verre et on évapore cette solution à une température modérée (environ 40 C) ce qui donne une surface sèche et transparente Les échantillons cytologiques places sur cette surface sont rapidement fixés et préservent toutes leurs caractéristiques cellulaires et toute l'aptitude à la coloration. EXEMPLE 3 Au mélange de base des quatre composants décrits dans l'exemple 2, on ajoute les ingrédients suivants: 25213 Ingrédient Quantité (% du mélange) Acide trichloracétique 12,8 % ( 3,3 g) Glyoxal 0,4 % ( 0,2 ml d'une solu- tion à 40 %) Après mélange intime de tous les ingrédients, on ajoute 1,6 g d'alcool polyvinylique ("Gelvatol" 40/10) On utilise la composition comme dans l'exem- ple 2. EXEMPLE 4 A la composition de l'exemple 3, on ajoute 2 gouttes (environ 0,06 ml) de l'agent tensio-actif "Triton 405 " On chauffe la composition à 40 C, on l'applique sur une feuille de poly (méthacrylate de méthyle) lPlexiglasl et on sèche à 40 C. Outre la fixation des composition histologiques, cytologiques et protéinées, la lamelle en matière plastique préenduite devient résistante aux solvants tels que le xylène et le toluène qu'on utilise fréquemment pour préparer les lamelles. EXEMPLE 5 Ingrédient Quantité Pyrrolid-2-one à 98 % 14,5 ml Urée 3,15 g Polyéthylène-glycol (P M 200) 10,5 ml Sulfate de zinc 1,25 g On mélange 7 ml de pyrrolidone, 1,5 g d'urée, 0,5 g d'acétate de zinc et 3,0 ml de polyéthylène-glycol avec 500 ml-d'eau distillée. A 100 ml de cette solution, on a Joute la composition protectrice colloida ci-après: Dextrine ("Codex") 2 g Agent tensio-actif ("Triton 405 ") 0,005 mg "Gelvatol" G 20/60 4 g Composition d'acrylamide (*) 6,7 ml (*) préparée en d ssolvant 72 g d'acrylamine dans 20 ml de glycérol, 40 ml d'acide acétique et 75 ml d'acétone. Le reste, c'est-à-dire 7,5 ml de pyrrolidone, 1,65 g d'urée, 0,75 g d'acétate de zinc et 7,5 ml de polyéthylène-glycol, est mélangé avec 500 ml d'eau et on ajoute à ce mélange 5 g de "Gelvatol" G 20/60 et 0,025 mg de "Triton 405 ". On combine un certain nombre de parties en poids de la première solution qui contient la composition protectrice colloïdale avec le même nombre de parties en poids de la seconde solution avec 16,7 parties d'antigène e-UCG enduit de latex de lait On applique sur les lamelles de poly (métha- crylate de méthyle) 0,280 mg de ce mélange On sèche le mélange à 40 C pour laisser un résidu de l'antigène stabilisé qui reste stable à la température ambiante et réagit avec l'anti-corps de l'hormone gonadotrope. REVENDICATIONS 1 Composition de fixation et de préservation pour préparations histologiques, cytologiques et protéinées, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de composant actif principal de fixation et de préservation, un mélange d'environ 10 à 75 % en poids de pyrrolid-2-one, environ 10 à 50 % en poids d'un polyol, environ 1 à 20 % en poids d'une urée et environ 1 à 10 % en poids d'un sel de zinc d'un acide organique ou minéral non oxydant, les pourcentages relatifs de ces ingrédients étant choisis dans les intervalles respectifs de manière que leur somme représente 100 % dudit mélange. 2 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le sel de zinc est l'acétate de zinc. 3 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le sel de zinc est le chlorure de zinc. 4 Composition selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisée en ce que le polyol est un polyéthylene-glycol. 5.Composition selon la revendication 4, caractériséeen ce que le poly- éthylène-glycol présente un poids moléculaire d'environ 200. 6 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la pyrrolid-2-one représente environ 40 à 60 % du poids du mélange. 7 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polyol est un polyéthylène-glycol qui représente environ 20 à 40 % du poids du mélange. 8 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'urée représente environ 5 à 15 % du poids du mélange. 9 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le sel de zinc est l'acétate de zinc et en ce qu'il représente de 3 à 5 % du poids du mélange. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la pyrrolid2-one représente environ 55 à 60 % du mélange, en ce que le polyol est le polyéthylène-glycol ayant un poids moléculaire d'environ 200 et repré- sente environ 20 à 25 % du mélange, en ce que l'urée représente environ 10 à % du mélange et en ce que le sel de zinc est l'acétate de zinc et représente environ 3 à 5 % de ce mélange. 11 Solution d'une composition selon la revendication 1, dans une quantité d'eau au moins suffisante pour solubiliser ledit mélange. 12 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en plus du mélange, de l'acide trichloracétique à raison d'environ à 15 % du poids total dudit mélange. 13 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en plus du mélange un alcool polyvinylique à raison d'environ 10 à % du poids total dudit mélange. 14 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en plus du mélange un dialdéhyde en une quantité pouvant atteindre jusqu'à 1 % du poids total dudit mélange. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit dialdéhyde est le glyoxal mis en oeuvre a raison d'environ 0,5 % du poids total du mélange. 16 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en plus du mélange, de 10 à 15 % d'acide trichloracétique, de 10 à % d'un alcool polyvinylique et jusqu'à 1 % d'un dialdéhyde, ces proportions étant basées sur le poids total dudit mélange. 17 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'un système réactif pour diagnostic histologique, cytologique, immunologique ou protéiné, est combiné avec ledit mélange. 18 Dispositif de fixation et de préservation des préparations histo- logiques, cytologiques et protéinées, caractérisé en ce qu'il comprend une bande de base en une matière qui n'absorbe pas l'eau et qui est insoluble dans celle-ci et comportant au moins une zone de dép 8 t dans laquelle est disposé le résidu d'évaporation d'une composition de fixation et de préservation selon l'une quelconque des revendications 1, 10 ou 16. 19 Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que la bande de base est en verre. Dispositif selon la revendication i 8, caractérisé en ce que la bande de base est en matière plastique. 21 Dispositif selon la revendication 20, caractérisé en ce que la matière plastique est un polystyrène. 22 Dispositif selon la revendication 20, caractérisé en ce que la matière est un polyacrylate ou polyméthacrylate. 23 Dispositif de diagnostic et de test, caractérisé en ce qu'il com- prend une bande de base en une matière qui n'absorbe pas l'eau et qui est inso- luble dans l'eau, comportant au moins une zone de dépôt dans laquelle est dis- posé un résidu d'évaporation d'une composition selon la revendication 17. 24 Dispositif selon la revendication 23, caractérisé en ce que la bande de base est en verre. Dispositif selon la revendication 23, caractérisé en ce que la bande de base est en matière plastique. 26 Dispositif selon la revendication 25, caractérisé en ce que la matière plastique est un polystyrène. 27 Dispositif selon la revendication 25, caractérisé en ce que la matière plastique est un polyacrylate ou polyméthacrylate.