Brevet FR2518407A1 — publié le 19830624

2.5184071 La présenteinvention a trait à un nouvel antigène toxoplasmique pour la recherche de l'immunité toxo- plasmique par tests, et à son-procédé de préparation. La toxoplasmose est une maladie à laquelle l'ensemble de la population tend à devenir de plus en plus sensible Elle présente une gravité particulière pour le foetu et la détection prénuptiale de l'immunité toxoplasmique a maintenant été rendue obligatoire. La recherche de l'immunité peut être effectuée par des tests sérologiques mais,pour des raisons de simplicité et de coût, on a cherché à mettre au point des tests cutanés pour la détection de l'hypersensibilité retardée. Déjà en 1948, J K FRENKEL a mis au point des antigènes toxoplasmiques, désignés "toxoplasmins,", pour la dé tion de l'hypersenbilité retardée (Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1948, 68, 634-639) Les antigènes étaient constitués par un broyat brut de parasites contenus dans l'exsudatpéritonéal d'animaux tels que souris ou hamsters, du phénol à 0,25 % étant utilisé comme préservati contre d'éventuelles contaminations du réactif au cours du stoc kage Un réactif de ce genre a ensuite été mis sur le marché et a été largement utilisé (voir les publications de W F Mc CULLOCH Public Health Reports 1963, 78, n 8, 689-698; et de J.L KRAHENBUHL Infection and Immunity 1971, 3, n 2, 260-26 Une telle préparation ne satisfait cependant pas aux normes ac- tuelles d'innocuité à cause de la présence éventuelle de con- taminants de l'exsudat de souris. On a ensuite essayé d'obtenir des préparations d'antigènes par culture de Toxoplasma gondii sur des lignées de cellules de reinsde singe L'antigène était obtenu par congélation et décongélation des parasites recueillis (voir S D CHAPARAS et al Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1966, 121, 734-739) Ces préparations antigeniques utilisées par intra-dermoréaction à la seringue, comme le réactif mis au point à partir des travaux de J K FRENKEL, présentent cependant l'inconvénient de contenir de nombreuses particules provenant des parasites. On a ensuite pu mettre en évidence,dans des cultures sur des lignées de cellules diploides d'origine hu- maine ou sur des lignées de cellules de reins de singe, que les toxoplasmes libèrent dans le milieu de culture des exo- antigènes (P T DESGEORGES, X BILLIAULT, P AMBROISE-THOMAS, et M BOUTTAZ, Lyon Médical 30, 06, 80 243, 12, 737-740). On a ainsi pu montrer qu'il devenait envisageable d'utiliser de tels exo-antigènes toxoplasmiques pour la recherche de l'im- munité toxoplasmique Ces antigènes présentent en effet l'a- vantage d'être pratiquement exempts de matériaux particulaires provenant des toxoplasmes et de ne pas contenir de contaminant d'origine cellulaire Néanmoins, les préparations antigéniques ainsi décrites ne sont pas adaptées à une utilisation dans le domaine humain. L'objectif de l'invention est donc de fournir un tel antigène toxoplasmique, pour la recherche de l'immunité toxoplasmique, quiprésente un grand degré de pureté et qui soit dépourvu de contaminants à haut risque de sensibilisation pour les humains - Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel antigène qui permette la recherche de l'immunité toxo- plasmique par tests cutanés par multipuncture. Un autre objectif de L'invention est de fournir un tel antigène qui soit également susceptible d'être utilisé dans des tests sérologiques Un autre objectif encore de l'invention est de fournir un tel antigène ne présentant pas de risques de conta- mination virale. L'invention a pour objet un antigène toxoplas- mique, pour la détection de l'immunité toxoplasmique chez l'homme, caractérisé-en ce qu'il est composé d'exo-antigène exempt de débris pariétaux et de sérum, ledit antigène ayant été concentré à un titre d'au moins 500 unités toxoplasmiques HSR Mérieux d'hypersensibilité sur-cobaye, et inactivé. Une telle unité HSR est définie comme la quantité d'antigène qui, injectée par voie intradermique sous un volume de 0,1 ml à un cobaye spécifiquement sensibilisé, donne une réaction de 100 mm en 18 heures ou 24 heures. De préférence, l'antigène présente une concentration de l'ordre de deux cents fois à partir de la récolte initiale. ,1840 ? L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un antigène toxoplasmique pour la recherche de l'immunité toxoplasmique, dans lequel on inocule une culture de cellules dans un milieu approprié, à l'aide de Toxoplasma gondii, et l'on recueille le milieu de culture, dépourvu de cellules et de toxoplasmes et contenant des exo-antigènes toxoplasmiques, caractérisé en ce que l'on effectue la cultur en présence de toxoplasmes dans un milieu dépourvu de sérum animal, tel que notamment le sérum de veau, que l'on élimine les toxoplasmes et les débris pariétaux en provenance des cellules ou des toxoplasmes par filtration stérilisante, que l'on traite l'antigène soluble obtenu après filtration par un processus d'inactivation des particules virales éventuellemen présentes, de préférence au formol, et que l'on concentre l'an tigène soluble après inactivation. La culture de cellules peut être une culture de ce lules primaires de différentes espèces, telles que cellules d reins de singe, de porc, cellules de poulet mais, de préférenc on utilise soit des lignées humaines diploïdes, soit des ligr animales hétéroploldes. De préférence on utilise, comme lignée de cellules diploides humaines, la lignée cellulaire MRC 5 Cette lignée est décrite par J P JACOBS et al Nature 1970, 227, N O 525 168-170 et par exemple disponible auprès de National Institut for Medical Research Holly Hill London NW 3 GrandeBretac Comme lignée de cellules animales hétéroploides, c utilise de préférence des lignées non tumorigènes telles que lignée VERO décrite par B J MONTAGNON et coll Intern Symp. on Reassessment of Inactived Poliomyelitis Vaccine, Bilthover 1980, Develop Biol Standard, 47, p 55-64 (S Karger, Basel 1981). Dans un mode de réalisation particulièrement préfÉ on effectue une concentration suffisante, au moins de 190 foi et de préférence d'environ deux cents fois, pour obtenir un antigène titrant au minimum 160 unités au test ELISA, ce qui correspond sensiblement à 500 unités HSR Mérieux, puis l'on met l'antigène en suspension dans du glycérol pour pouvoir 1 ' tiliser par la méthode de scarification, notamentpar multipuncture Le titre ELISA,pour un antigène, est le log 10 de l'inverse de la dilution correspdant à 50 % de la densité optique ma- ximale estimée sur la plaque en excès d'antigène L'activité de l'antigène inconnu est expriméepar rapport à celle d'un antigène, standard titré dans les mêmes conditions On calcule une puis- sance relative égale à l'anti log de la différence du titre ELISA de l'antigène inconnu avec celui de l'antigène standard. Le titre final de l'antigène à tester est donné par le produit de sa puissance relative par le titre du standard en unités par millilitre. De façon avantageuse, la culture cellulaire après inoculation est poursuivie environ six jours à 37 C. L'étape de filtration peut avantageusement comporter une première filtration stérilisante, suivie d'une dialyse ultra-filtrante, puis-d'une nouvelle filtration stérilisante. L'inactivation est effectuée de préférence au formol à un pour mille pendant environ vingt-quatre heures à température ambiante sous agitation permanente. Selon un mode de réalisation préféré, l'antigène ainsi concentré est mis en suspension dans du glycérol ou un autre vecteur, pour être utilisé par une méthode de scarifi- cation, notamment par multipuncture. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaitront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. On effectue une culture de cellules MRC 5 dans un BME milieu EAGLE/additionné de 10 % de sérum de veau Cette culture est effectuée dans des flacons de 500 cm de surface environ. La culture s'effectue à 37 C pendant une durée de 3 jours avec une concentration initiale de cellules de 20 mil- lions par flacon dans du milieu EAGLE BME, plus 10 %-de sérum de veau Au troisième jour, le milieu est remplacé par du milieu EAGLE BME additionné de 2 % de sérum de veau Les flacons sont remis à 37 C pendant 4 jours Ensuite, après élimination du milieu, on procède à 3 Iavages du tapis cellulaire par de l'eau physiologique et on remet les cellules en milieu EAGLE BME dépourvu de sérum de veau Vingt-quatre heures après ces lavages, on effectue un nouveau changement de milieu BME sans sérum de veau avant l'introduction des parasites Les toxoplasmes entre- tenus sur souris femelle type Swiss sont inoculés à raison de 2,4 105 toxoplasmes par ml de milieu de culture. On effectue alors une culture pendant six jours à 37 C. Après le sixième jour, le surnageant de la cultur est récolté Celui-ci subit une première filtration stérili- sante (préfiltre AP 20 AW 06 filtres 0,22 g stériles Millipore). Ensuite, on procède à l'adjonction de formol à un pour mille et la solution est maintenue à la température am- biante sous agitation permanente pendant vingt-quatre heures Cette phase d'inactivation est suivie d'une dialyse ultrafil trante et d'une concentration d'au moins 200 fois avec du ma riel (colonne et cellules) Amicon sur membrane PM 10. Le concentrat subit ensuite une refiltration stér lisante sur filtres Millipore successifs (AP 20, S y 0,45 0,22 y). A ce stade, la solution d'antigène obtenue présen un titre en hypersensibilité retardée sur cobaye d'au moins 500 + 20 % unités toxoplasmiques HSR Mérieux. L'antigène soluble purifié, concentré et inactivé est ensuite titré sérologiquement in uvitto par un test ELISA puis calibré pour son activité d'hypersensibilité retardée à l'aide d'un titrage in vivo sur des cobayes préalablement sensibilisés par un extrait particulaire de Toxoplasma gondi: Enfin, l'antigène est mis en suspension dans du glycérol à 70 %, la préparation étant destinée à être appliqi sur les pointes d'un dispositif de multipuncture. Les études précliniques ont permis de donner les résultats suivants: Sur cobayes Dilution Antigènes pur 1/3 e 1/10 e 1/30 e 1/100 e Lot Y 5,8 mm 4, 2 3,2 2,8 1 =======_ === ============== ============== Lot X 5,5 mm 4,2 -2,5 O O O Sérologie Antigène X Pur Antigène X 1/3 Antigène X 1/10 e Temps de par imuno 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h Lecture f 1 UOPI-5- cence Sujet A 160 U i 4,15 vn 4,5 mn 3,5 mnO 3 m 3 m 2 m 2 mn 2 m Sujet B 80 u i O 3 mn 3,5 m O O O O O O sujet C 8 U i O 2 m 2,5 rrn Sujet D O O O O O O O O O ==== === 251840 7 ' Sur humains REVENDICATION S 1 Antigène toxoplasmique, pour la détection de l'immunité toxoplasmique chez l'homme, caractérisé en ce qu'il est composé d'exo-antigène exempt de débris pariétaux et de sérum, ledit antigène ayant été concentré à un titre d'au moir 500 unités toxoplasmiques HSR Mérieux d'hypersensibilité sur cobaye, et inactive. 2 Antigène toxoplasmique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en suspension dans un vecteur tel que du glycérol pour être utilisé par une méthode de mul- tipuncture. 3 Procédé de préparation d'un antigène toxoplas- mique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2,dans' lequel on inocule une culture de cellules dans un milieu appro- prié, à l'aide de Toxoplasma gondii, et l'on recueille le mi- lieu de culture, dépourvu de cellules et de toxoplasmes et contenant des exo-antigènes toxoplasmiques, caractérisé en ce qu'on effectue la culture en présence de toxoplasmes dans un milieu dépourvu de sérum animal tel que notamment le-sérum de veau, que l'on élimine les toxoplasmes et les débris pariétaux en provenance des cellules ou des toxoplasmes par filtration stérilisante, quç l'on concentre l'antigène soluble obtenu apri filtration, et que l'on traite l'antigène par un processus d'inactivation des particules virales. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé e: ce que l'on effectue une concentration d'au moins deux cents fa Procédé selon l'une quelconque des revendicatio: 3 et 4, caractérisé en ce qu'on utilise une lignée de cellules diploides humaines et notamment la lignée cellulaire MRC 5. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendicatio 3 et 4, caractérisé en ce que l'on utilise une lignée de cel- lules animales hétéroploldes et notamment la lignée VERO. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendicatio 3 et 4, caractérisé en ce que l'on utilise une culture de cel- lules primaires. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendicatio 3 à 7, caractérisé en ce que l'on met l'antigène en suspension dans du glycérol. e Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisé en ce qu'on effectue la culture cellulaire après inoculation pendant six jours à 37 C. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que la filtration comporte une étape de filtration stérilisante suivie d'une dialyse ultra-filtrante, puis d'une nouvelle filtration stérilisante. 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lion effectue l'inactivation au formol. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'inactivation au formol est effectuée pendant environ vingt-quatre heures au formol à un pour mille à température ambiante.