Brevet FR2519146A1 — publié le 19830701

La présente invention concerne le dépistage de la toxoplasmose; elle concerne plus particulièrement la dé- tection de la toxoplasmose reposant sur une agglutination di- recte des toxoplasmes. Parmi les tests connus de dépistage de la toxo- plasmose, l'agglutination directe est un des plus répandus. Son principe est connu depuis 1965;il consiste à visualiser la présence éventuelle d'anticorps anti-toxoplasmes par l'ag- glutination d'une suspension de parasites dans une cupule de microtitrage En présence d'anticorps, les parasites, re- liés par un réseau de gamma-globulines, forment un voile qui tapisse le fond de la cupule En l'absence d'anticorps, par contre, ils sédimentent en bouton La technique correspondan- te est décrite par exemple dans "Agglutination Directe des Toxoplasmes" P COUGINEAU et H BAUFINE-DUCROCQ-Ann Biol Clin. 28, 411-415 ( 1970). L'inconvénient majeur de cette réaction très spé- cifique est de fatiguer la vue des personnes qui effectuent ces tests Les toxoplasmes sont pratiquement transparents et les voiles d'agglutination sont pratiquement invisibles Les boutons de sédimentation exigent un éclairage rasant pour e- tre bien visibles. De ce fait, nombre de biologistes préfèrent uti- liser des hématies sensibilisées avec un extrait antigénique de toxoplasmes L'hémagglutination ou la sédimentation peut alors être constatée sans aucune fatigue visuelle Cependant, pour être spécifique, la réaction nécessite qu'on épuise au préalable les sérums en anticorps anti-hématies, de façon à ne laisser subsister que les anticorps antitoxoplasmose Cette technique présente également un autre inconvénient: comme el- le fait appel à un antigène figuré, réalisé en greffant chimi- quement une fraction antigénique solubilisée sur une hématie, la réponse de la réaction d'hémagglutination est moins paral- lèle à la technique de référence (dite "dyestest") que-l'ag- glutination directe. La présente invention a pour but de procurer un moyen de dépistage de la toxoplasmose qui allie la spécifi- cité à la lisibilité et permette ainsi de procéder à des tests sûrs, sans fatigue visuelle excessive. On y parvient selon l'invention en facilitant la préparation du test et en rendant l'agglutination directe très facilement lisible grâce à la mise en oeuvre d'un tampon de dilution coloré, c'est-à-dire d'un tampon de dilution auquel on a incorporé une substance ou un système procurant à ce tam- pon une coloration dans la gamme du spectre visible. On a certes déjà décrit dans la demande de brevet FR 81 15 219 du 5 Août 1981 au nom de la même demanderesse l'u- tilisation de toxoplasmes colorés, préparés en suspension sta- ble dans un milieu liquide, pour le dépistage de la toxoplas- mose Cependant, avant même la mise en oeuvre des toxoplasmes dans un test d'agglutination directe et la lecture des résul- tats, la préparation des puits ou cupules de microtitrage re- quiert une attention soutenue de la part du technicien qui l'ef- fectue. La réalisation d'un test d'agglutination directe comprend comme étape essentielle la préparation d'une plaque de microtitrage, qui se fait en trois temps: 1 er temps: répartition dans tous les puits d'une plaque de microtitrage du tampon de dilution (milieu liqui- de), 2 ème temps: dilution de sérum selon une série de raison 1/2 dans ces puits de microtitrage. 3 ème temps: addition d'une suspension en milieu liquide d'an- tigènes, qui permettent de visualiser la présence ou l'absence d'anticorps anti-toxoplasmose par for- mation d'un voile d'agglutination ou d'un bouton de sédimentation sur le fond de la cupule de micro- titrage. Les milieux sont des milieux liquides, entière- ment aqueux ou à base d'eau et d'au moins un autre solvant, tel que du glycérol ou autres. On a maintenant trouvé qu'on peut améliorer sur plusieurs plans les tests de détection de la toxoplasmose aussi bien par agglutination directe conventionnellec'est- 251914 d à-dire sans aucune coloration spéciale dusystème, que par la technique d'agglutination directe avec coloration des to- xoplasmes décrite dans la demande de brevet susdit, en incor- porant au tampon de dilution introduit dans les cupules de microtitrage dans le premier temps de ce procédé une substan- ce ou un système procurant à ce tampon une coloration, avan- tageusement mais non exclusivement dans la gamme du spectre visible. La présente invention a pour premier objet un sys- 1 O tème ou un ensemble pour la détection de la toxoplasmose par agglutination directe, comprenant un tampon de dilution et une suspension d'antigènes ou toxoplasmes, caractérisé en ce que le tampon de dilution comprend au moins une substance ou un système lui procurant une coloration. Le colorant ou le système de coloration (qui peut, par exemple, comprendre un précurseur de colorant et un révé- lateur de ce dernier) dénommé dans tous les cas ci-après pour simplifier "colorant" peut être choisi par l'homme de métier parmi les colorants ou mélanges de colorants connus au moment o il a à les utiliser, après un simple test de compatibilité. Avant de mettre en oeuvre un colorant déterminé conformément à l'invention, il convient si cela n'a pas déjà été fait, de vérifier-que par un test préalable si ce colo- rant est approprié ou non, le test à effectuer est double et peut se définir comme suit: le colorant ne doit pas fausser l'analyse en induisant de fausses sédimentations ou une fausse agglu- tination; on doit obtenir en sa présence et sans colorant le même titre d'agglutination pour le même sérum positif et les sérums négatifs ne doivent pas donner d'agglutina- tion en présence de ce colorant. le colorant ne doit pas réagir avec les anti- corps anti-toxoplasmes du sérum à doser. En variante, le système ainsi défini peut égale- ment comporter une coloration des toxoplasmes conformément à la demande de brevet FR 81 15 219 du 5 Août 1981 aunom de la même demanderesse, intitulée "Procédé amélioré pour le dépistage de la toxoplasmose et toxoplasmes colorés en sus- pension stable" et à laquelle il convient de se référer pour plus de détail à ce propos. L'invention a donc également pour objet un sys- tème ouun ensemble pour la détection de la toxoplasmose par agglutination directe, tel que défini plus haut, caractéri- sé en ce que les toxoplasmes comprennent en outre eux-mêmes un colorant. Ce colorant des toxoplasmes doit également'satis- faire aux tests susdits. Pour tirer le meilleur profit de cette variante, il est judicieux de recourir à des colorants sensiblement différents, et avantageusement complémentaires, respective- ment pour le tampon et pour l'antigène. Dans la technique d'agglutination directe, l'u- tilisation d'un tampon de dilution coloré selon l'invention facilite grandement le travail du technicien; celui-ci peut ainsi savoir immédiatement quels sont les puits garnis et ceux quine le sont pas, alors que cette constatation est as- sez malaisée avec des tampons non colorés De plus, l'uti- lisation complémentaire de toxoplasmes colorés permet d'ob- tenir des images très contrastées: par exemple, toxoplasmes bleu marine avec un tampon coloré en rose. L'invention a donc pour autre objet un procédé pour le dépistage de la'toxoplasmose par agglutination direc- te, mettant en oeuvre successivement la distribution dans des réceptacles appropriés d'un tampon de dilution, la dilution des sérums à tester à des concentrations selon une série de progression déterminée dans ce tampon, et l'addition d'une suspension de toxoplasmes, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre un tampon de dilution comportant un colorant comme défini plus haut. En variante on peut également mettre en oeu- vre dans ce procédé des toxoplasmes qui sont en suspension sta- ble en milieu liquide et qui sont eux-mêmes pourvus au préala- ble d'un colorant ou d'un système de coloration comme décrit dans la demande de brevet FR 81 15 219 susdite. En variante, aussi bien dans le cas o les toxo- plasmes sont eux-mêmes colorés que dans le cas o ils ne le sont pas, il est avantageux que le p H du milieu de mise en suspen- sion des toxoplasmes soit différent de celui du tampon de dilu- tion et que le colorant (au sens large défini plus haut) donne lieu à un virage, révélant une couleur ou modifiant la couleur initiale du colorant du tampon, dû au changement de p H du milieu après l'addition de la suspension de toxoplasmes On ajoute ainsi à la visualisation des puits garnis une visualisation de ceux o des toxoplasmes ont été ajoutés On a cependant également constaté que, pour autant que le colorant du tampon de dilution soit convenablement choi- si, ce colorant est lui-même susceptible de s'adsorber sur des toxoplasmes non colorés et fournir une image très contrastée des toxoplasmes colorés (ou foncés) dans un tampon clair, voire devenue incolore. Cette opération d'adsorption est suffisamment ra- pide pour se dérouler pendantle laps de temps classiquement né- cessaire à la réaction d'agglutination directe, c'est-à-dire en quelques heures à température ambiante Les toxoplasmes non préalablement colorés sédimentent ainsi en quelques heures en adsorbant partiellement ou totalement le colorant du tampon. Tout se passe comme si l'on avait utilisé des an- tigènes colorés, alors que l'on s'est évité la peine de les préparer. Cela représente une variante tout particulière- ment préférée de la présente invention. L'invention a donc également pour objet un sys- tème ou un ensemble pour la détection de la toxoplasmose par agglutination directe, comprenant un tampon dedilution et une suspension d'antigènes ou toxoplasmes, caractérisé en ce que le tampon de dilution comprend une substance ou un système de coloration apte à s'adsorber, dans les conditions de la ré- action d'agglutination, partiellement ou totalement sur les toxoplasmes et procurant à ceux-ci une coloration. Là encore, avant de mettre en oeuvre un tel colorant, il convient, si cela n'a pas déjà été fait, de s'assurer par un test préalable si ce colorant, choisi par- mi ceux dont l'homme de métier peut disposer, est approprié ou non. Le test à effectuer dans ce cas comprend le test double détaillé plus haut, mais ajoute à celui-ci les deux conditions suivantes le colorant doit être suffisamment adsorbé par l'antigène pour permettre un bon contraste de lectu- re, le colorant ne doit pas modifier, par cette adsorption,les caractéristiques antigéniqu*es des toxoplas- mes. Si ces deux critères, ainsi que les deux pré- cédents, sont satisfaits, le colorant testé peut être rete- nu. Des exemples de substances colorantes qui peuvent ainsi être mises en oeuvre sont d'une manière générale tous les colorants des protéines, des lipides, des lipo-protéines, des mucopolysac- charides, des glycoprotéines et/ou des acides nucléiques, plus particulièrement tous les colorants du cytoplasme, des vacuoles, du noyau et autres organites -intra- cellulaires ou des mebranes cellulaires; et plus spécifiquement, mais à titre d'exemples concrets uniquement: le Noir Soudan B(qui est actuellement le colo- rant qu'on préfère à tous les autres) le Bleu Evans, le vert Malachite, etc Un autre objet encore de l'invention est par con- séquent un procédé pour la réalisation d'essais de détection de la toxoplasmose par agglutination directe, mettant en oeuvre successivement la distribution dans des réceptacles ap- propriés d'un tampon de dilution, la dilution des sérums à tester à des concentrations selon une série de progression 251914 déterminée dans ce tampon, et l'addition d'une suspension de toxoplasmes, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre un tampon de dilution comportant un colorant ou un système de coloration susceptible de s'adsorber sur les toxoplasmes dans les conditions de réalisation de l'essai d'agglutina- tion directe et on effectue la lecture après qu'une adsorp- tion partielle ou totale du colorant initialement contenu dans le tampon de dilution sur les toxoplasmes est interve- nue. L'invention a également pour objet des coffrets de détection de la toxoplasmose renfermant un tampon colo- ré et des toxoplasmes, eux-mêmes éventuellement colorés, qui sont tels que décrits plus haut. Lesexemples concrets ci-après sont donnés à ti- tre d'illustration de l'invention, mais ne limitent en au- cune mapière celle-ci. EXEMPLE 1 On a préparé un tampon composé d'une solution aqueuse de: Na Cl 7,012 g/l HB 03 3,092 g/l Na N 3 1 g/l Na OH en pastilles q s p p H 9,0 Albumine bovine 4 g/l. A ce tampon, on a ajouté de l'éosine en poudre à raison d'une concentration comprise entre 25 et 250 mg/l de tampon. Sur un sérum à tester du point de vue de la pré- sence éventuelle d'une infection par toxoplasmose, on a ré- alisé un test d'agglutination directe, suivant les règles de l'art, avec des toxoplasmes colorés en bleu marine par du Noir Soudan B. La coloration du tampon permettait de savoir immédiatement quels puits avaient bien été remplis et les- quels ne l'étaient pas. L'image obtenue était bien contrastée et n'é- tait pas perturbée par rapport à une réaction témoin sur le même sérum aux mêmes dilutions, sans colorant du tampon. EXEMPLE 2 On a opéré comme dans l'exemple 1, mais en uti- lisant des toxoplasmes non colorés. On a obtenu les mêmes avantages et l'image ob- tenue n'était pas perturbée par rapport-à une réaction té- moin sans colorant du tampon, faite sur le même sérum. EXEMPLE 3 On a reproduit le mode opératoire de l'exemple 1, mais en testant, comme colorant du tampon, du cristal violet à 2 g/l. On a constaté de fausses agglutinations par com- paraison avec un essai témoin. EXEMPLE 4 Ce colorant doit donc être écarté. A un tampon préparé comme indiqué dans l'exemple 1, on a ajouté du Noir Soudan B en poudre à une concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l de tampon. On a réalisé un test d'agglutination directe avec une suspension de toxoplasmes non colorés. Quatre heures plus tard, l'antigène avait sédi- menté et on a constaté qu'il avait adsorbé une grande partie du colorant initial; le tampon était en effet beaucoup plus clair et, au contraire, les toxoplasmes apparaissaient en bleu marine. Après 16 heures, la décoloration du tampon et la coloration de l'antigène étaient maximales. Le test d'agglutination directe effectué sur ce système ne donnait pas de résultats différents d'une ré- action témoin réalisée sans colorant. La lisibilité de la plaque était très supérieu- re à celle de la plaque témoin, ce qui confère une sécurité accrue dans le résultat. REVENDICATIONS 1 Système pour la détection de la toxoplasmose par agglutination directe, comprenant un tampon de dilution et une suspensiond'antigènes ou toxoplasmes, caractérisé en ce que le tampon de-dilution comprend au moins une substan- ce ou un système lui procurant une coloration. 2 Système selon la revendication 1, caractéri- sé en ce que les toxoplasmes comprennent eux-mêmes un colo- rant. 3 Système selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que le tampon de dilution comprend une sub- stance ou un système de coloration apte à s'adsorber, dans les conditions de la réaction d'agglutination, sur les to- xoplasmes et procurant à ceux-ci une coloration. 4 Procédé pour le dépistage de la toxoplasmose par agglutination directe, caractérisé en cequ'il comprend la mise en oeuvre d'un système selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 3. Procédé selon la revendication 4, caractéri- sé en ce que le p H du milieu de mise en suspension des toxo- plasmes est différent de celui du tampon de dilution et le colorant donne lieu à un virage dû au changement de p H du milieu après l'additionde la suspension de toxoplasmes. 6 Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce qu'on met en oeuvre un tampon de dilution com- portant un colorant ou un système de coloration suscepti- ble de s'adsorber sur les toxoplasmes dans les conditions de réalisation de l'essai d'agglutination directe et-on effectue la lecture après qu'une adsorption partielle ou totale du colorant initia- lement contenu dans le tampon de dilution sur les toxoplasmes est interve- nue. 7 Coffret de détection de la toxoplasmose, caractérisé en ce qu'il renferme un système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.