Brevet FR2517966A1 — publié le 19830617

" PROCEDE DE PRODUCTION D'UN VACCIN BIOCHIMIQUE ANUI-PESTEUX Invention de Philippe GIRARDON, Yves GOUGES et Jean AMEN Au nom de la Société dite : L'AIR LIQUEIDE, SOCIETE ANONYME POUR L'ETUDE ET L'EXPLOITATION DES PROCEDES GEORGES CLAUDE. La présente invention concerne la production d'un vaccin biochimique contre la peste t'existence sur les continents asiatique, africain et américain de foyers de peste humaine, conjuguée avec le développement des transports aériens ne met pas la population du globe à l'abri d'une épidémie de peste. Par ailleurs, même si l'efficacité d'un traitement de la maladie par les antibiotiques ou les sulfamides n'est pas à mettre en doute, des mutants résistant à ces remèdes peuvent apparaitre. L'immunisation demeure par conséquent le seul moyen préventif; elle peut être obtenue par des vaccins issus de microorganismes pathogènes tués ou de souches atténuées. Le vaccin tué (USP) consiste en une suspension de bactéries pathogènes tuées par le formol (2.109 organismes par ml de NaCl à 0,85 % et phénol à 0,5 %). Si l'efficacité de ce vaccin sur l'homme a été démontrées notamment sur les militaires américains au Vietnam, il n'en reste pas moins que les statistiques sont incomplètes et que ce vaccin provoque des réactions secondaires gênantes telles hypothermie, vertiges, douleurs gastro-intestinales... L'efficacité du vaccin vivant Yersinia pestS souche EV de Girard et Robic ne peut être contestée mais la virulence résiduelle de la souohe SV, sa toxicité variable selon les organismes: rat, cobaye, homme, ses difficultés de conservation - seulement 50 % de survie après conservation à - 230C pendant un an - constituent des obstacles à son acceptation. Des travaux effectués au cours des années récentes ont montré un certain pouvoir protecteur dans les surnageants de culture de Yersinia pestis souche EV 40 après fermentation. Pour toutes ces raisons on a recherché dans le cadre d'un procédé par fermentation, extraction et purification d'un vaccin biochimique le moyen d'extraire l'antigène protecteur dans le microorganisme atténué Yersinia pestis souche EV, de le purifier et de produire un vaccin très efficace, présentant de plus d'excellentes qualités de conservation. Sachant que toutes les bactéries peuvent être considérées comme des "mosaïques d'antigènes", chez Yersinia pestis (gram ) c'est la membrane externe de la paroi ectoplasmique qui apparait comme le support anatomique de l'antigène recherché, il a été trouvé un moyen d'extraction préférentielle de cet antigène vaccinant oontre la peste. tes biochimistes utilisent divers tampons en de de l'extrac- tion de substances biologiquement actives à partir de cellules microbiennes ou animales. Au titre de solvant extractif de l'antigène vaccinant contre la peste, on a essayé le mélange solvant tampon tri avec EDTA [tri (hydroxyméthyl)aminométhane + acide éthylène diamine tétraacétique], ainsi que le SDS (sodium laurylaulfate à 0,25 %) et ;e si;fate d'ammonium. Dans la trois oas les résultats furent négatifs; les fractions extraites n'ayant eu aucune action vaccinante. Il a été découvert une technique d'extraction des antigènes membranaires de Yersinia pestis par un solvant sélectif déterminé, dans des conditions de pu et de temps bien précis, et de purification de l'extrait brut. Selon l'invention,le procédé de production d'un vaccin biochimique contre la peste à partir de Yersinia pestis souche EV,est caractérisé par une séquence préparative. Dans un premier stade on conduit une culture par fermentation en milieu liquide de Yersinia pestis souche EV, à pH légèrement supé- rieur à la neutralité,en aérobiose moyenne, à une température compri- se entre 29 et 30 C, pendant une durée fonction de l'importance de l'inocyulum; Puis,on procède à une centrifugation à faible vitesse , une lyse du culot bactérien, afin de faciliter ultérieurement la lib6- ration des antigènes membranaires, et à une centrifugation à vitesse élevée du lysat, à la limite de l'ultrafiltration pour récupérer un culot contenant toutes les mioropartioules. Le culot de membranes cellulaires est ensuite soumis à une extraction des antigènes membranaires vaccinants dans le chlorure de sodium à quelques pourcents de concentration en solution aqueuse,de préférence entre 2 à 3 %, sous agitation permanente, à température réfrigérée, de préférence entre O et + 4 C, à pH régulé entre 7,5 et 8,5, de préférence à pH8, et pendant une durée d'au moins une soixantaine d'heures, de préférence aux environs de de 70 heures. Le rendement de l'extraction est contrôlé par mesure de l'absorption à 206 nanomètres. On a observé le passage du rendement d'extraction par un maximum à pH 8. La régulation doit être très précise, à pH 7,5 le pourcentage de diminution du rendement est de 23 , et à pH 8,5 il est de 4 % par rapport au rendement à pH 8,régulé par NaOH. Après décantation de l'extrait brut des antigènes membranaires par oentrifugation à faible vitesse, on effectue une purification du surnageant de cet extrait brut par ultrafiltration et par chromatographie d'exclusion sur gel. L'ultrafiltration du surnageant est mise en oeuvre sur des membranes de seuils de coupure choisis en fonction de la fraction de poids moléculaire recherché. Les seuils de coupure sont décroissants de 300.000, 100.000, 50.000 daltons. Enfin pour éliminer les sels restants on soumet à une dialyse les fractions de poids moléculaire les plus faibles, et on lyophilise la fraction antigénique vaccinante. Selon une variante avantageuse qui améliore le rendement d'extraction de l'antigène vaccinant, on ajoute au solvant d'extraction un tensio-actif de la famille des polyoxyéthjylènes, tels le polyoxyéthylène sorbate, vendu sous la marque commerciale "Tween", le polyoxyéthylène laurylester commercialisé notamment sous la marque "Bridj; et le pclyéthoxyéthanol commercialisé sous la marque "Triton". Le tensio-aotif est employé à faible concentration de quelquespourcents, de préférence 1 %. La fraction antigénique vaccinante de poids moléculaire supérieur à 300.000 possède une efficacité supérieure à celle du vaccin EV vivant, Cette fraction lyophilisée constitue un excellent vaccin contrs les épidémies de peste humaine. Il est donné ci-après des exemples qui illustrent l'invention à titre non limitatif. Exemple 1 On a conduit la fermentation de Yersinia pestis souche EV 40, en fermenteur de 15 litres de volume utile, dans le milieu de culture approprié s hydrolysat de caséine 15 g peptone trypsique de viande 15 g glucose 30 g citrate de sodium 350 mg CaCl2 1,5 mg H2S04,H20 1,7 mg MgSO4,7H2O 250 mg K2HPOss 2,6 g FeSO4@H2O 150 mg H2Oqsp 1 1 et à une température de 300 C, pendant une durée de 48 heures, avec aération moyenne de 0,5 VVN, le pH étant régulé à 7,4 par NaOH,2N. après une centrifugation à faible vitese, lavage et pesée on a obtenu un culot bactérien de 60 g poids humide. On lyse le culot bactérien dans 320 ml d'eau déminéralisée par un appareil à ultrasons développant 10 Kcycles sous 20.000 psi pendant 15 minutes. Le lysat est centrifugé à vitesse élevée à 39.000g etl'on obtient un culot de membranes cellulaires. A partir de 15 g de culot de membranes cellulaires on extrait des antigènes dans 220ml de solvant constitué par NaCl 2,5 % dans H20. Pendant toute la durée de l'extraction le pH est régulé à 8(NaOH) l'agitation est maintenue en permanence et la température à + 4 C. Le rendement de l'extraction contrôlé par mesure de l'absorption à 260 nanomètres est maximum au bout d'un temps de 67 heures. On décante par centrifugation à faible vitesse, puis soumet le surnageant à une ultrafiltration sur des membranes d'ultrafiltratien de seuils de coupure décroissants : 300.000, 100.000, 50.000 daltons. On dialyse l'extrait purifié et lyophylise les diverses fractions dans les conditions classiques pour les vaccins. On obtient les fractions suivantes 2 PI > 300.000 3,74 g 100.000 PM On procède à la vaccination de souris par 3 injections souscutandes de 200 g d'extrait. 15 jours après la vaccination on inocule une dose épreuve de 40 bactéries Y pestis 6/69 Madagascar. On a observé les résultats suivants s fractions antigéniques % souris vivantes PM > 300.000 35 100.000 EV vivant 32 animaux non vaccinés - 10 Exemple 2 Selon un protocole identique à l'exemple 1, on conduit une fermentation de Yersinia pestis souche EV40. Puis on procède à la centrifugation et à la lyse du culot dans des conditions semblables. L'on extrait des antigènes du culot de membranes cellulaires par le solvant d'extraction NaCl à 2,5 % + du "Tween 80" à 1% dans 220ml H20, le pH est régulé à 8, et soumet l'extrait brut aux opérations de décantation, et d'ultrafiltration du surnageant sur des membranes d'ultrafiltration de seuils de coupure décroissants: 300.00, 100.000 et 50.000 daltons. On dialyse et lyophilise les fractions antigéniques de poids moléoulaire supérieur à 300.000 et compris entre 100.000 et 300.000. Les résultats de vaccination sur souris par injection sous cutanée de 3 x 220 g d'extrait pur, 15 jours de latence, et inoculation d'une dose épreuve 40 bactéries Y.pestis 6/69 Madagascar. fractions antigéniques % souris vivantes PX > 300.000 40 100.000 (PM EV vivant 32 animaux non vaccinés 10 De la lecture des résultats ci-dessus, on constate que l'emploi de tensio-actif améliore le rendement d'extraction de l'antigène vaccinant. A la suite d'une séparation plus poussée par chromatographie d'exclusion sur gel de la fraction vaccinante de poids moléculaire supérieur à 300.000, on a constaté que cette dite fraction serait en partie au moins constituée d'agrégats moléculaires de plus faible poids. Il a notamment été isolée une fraction de poids moléculaire compris entre 6.ooo et 10.000. Les tests de vaccination et d'épreuve effectués dans les memes conditions que précédemment ont montré une survie de 25 % des souris. Ce résultat intéressant est à rapprocher d la survie à 40 % avec une fraction antigénique de poids moléculaire supérieur à 300.000. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'un vaccin biochimique anti-pesteux à partir de Yerainia pestis, souche SV9 caractérisé par la séquence préparative suivante fermentation en milieu liquide de Yersinia pestis souche EV, à pH légèrement supérieur à la neutralite, en aérobiose moyenne, à une température comprise entre 29 et 31 C, pendant une durée fonction de l'importance de l'inoculum; centrifugation à faible vitesse, lyse du culot bactérien, puis centrifugation à vitesse élevée du lysat, séparation du culot de membranes cellulaires;; extraction des antigènes membranaires vaccinants par mise en contact du culot de membranes cellulaires avec une solution aqueu- se de chlorure de sodium à quelques pourcents de concentration, sous agitation permanente, à température réfrigérée, à pH régulé entre 7,5 et 8,5, pendant une durée d'au moins une soixantaine d'heures; décantation de l'extrait brut des antigènes membranaires par centrifugation à faible vitesse, purification du surnageant de l'extrait brut par ultrafiltration sur membranes de seuils de coupure choisis en fonction de la fraction de poids moléculaire recherché; dialyse des fractions de poids moléculaires les plus faibles, lyophylisation de la fraction antigénique vacoinante. 2. Procédé de production d'un vaccin biochimique anti-pesteus selon la revendication 1 caractérise en ce que la concentration du solvant d'extraction des antigènes membranaires vaccinants est comprise entre 2 et 3 %, le pH régulé à 8, la température entre O et +4 C et l'agitation permanente maintenue aux environs de soixante dix heures. 3. Procédé de production d'un vaccin biochimique anti-pesteux selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'ultrafiltration du surnageant de l'extrait brut des antigènes membranaires est mise en oeuvre sur des membranes de seuils-de coupure décroissants de 300.000, 100.000 et 50.000 daltons. 4. Procédé de production d'un vaccin biochimique anti-pesteux selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'opération d'ultrafiltration est suivie d'une chromatographie d'exclusion sur gel. 5. Procédé de production d'un vaccin biochimique anti-pesteux selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on ajoute au solvant d'extraction un tensio-actif introduit à faible concentration de l'ordre de quelques pourcents. 6. Procédé de production d'un vaccin biochimique anti-pesteux selon la revendication 5, caractérisé en ce que le tensio-actif est un composé de la famille des polyoxyéthylènes et polyéthoxyéthanol. 7. Procédé de production d'un vaccin biochimique anti-pesteux selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que le tensio-actif est employé à une concentration de 1 fio. 8. Vaccin biochimique lyophilisé anti-pesteux obtenu selon une quelconque des revendications1 à 7. 9. Vaccin biochimique lyophilisé anti-pesteux selon la revendilation 8, caractérisé en ce que la fraction antigénique vaccinante a un poids moléculaire supérieur à 300.000. 10. Vaccin biologique anti-pesteux selon la revendication 8, caractérisé en ce que la fraction antigénique vaccinante est au moins en partie constituée par des agrégats moléculaires de plus faible poids.