Brevet FR2514511A1 — publié le 19830415

La présente invention concerne un dispositif et un procédé pour déterminer la présence d'antigènes dans des fluides biologiques. Les essais de diagnostic immunologiques sont largement utilisés pour la détection d'antigènes, d'hor- mones, d'agents infectieux et d'anticorps sériques dans les fluides du corps Les dosages immunologiques se ré- partissent généralement en deux catégories La première comprend les essais de précipitation anticorps-antigène tels que l'immunodiffusion radiale, l'hémaglutination et l'agglutination avec particules de latex revêtues. La seconde comprend les essais avec réactifs marqués tels que le dosage radioimmunologique et le dosage immunologique avec liaison à une enzyme. Les essais du type précipitation présentent l'avantage d'être effectués manuellement et d'être disponibles dans le commerce sous forme de trousses à utilisation unique, qui sont lues visuellement et qui ne nécessitent pas d'instrument La lecture d'un dosage immunologique du type précipitation est habituellement exprimée en tant que présence ou absence de réaction d'agglutination pour chacune d'un ensemble de dilutions connues de l'échantillon d'essai ou de l'antigène com- pétitif Les inconvénients des essais du type précipita- tion sont qu'ils sont beaucoup moins sensibles que les dosages avec réactif marqué, qu'ils nécessitent des opérations d'incubation prolongées et qu'ils sont sen- sibles à des erreurs subjectives lors de l'identification visuelle d'une réaction de précipitation. Les dosages immunologiques avec réactif marqué sont quantitatifs et très sensibles, mais ils présentent néanmoins certains inconvénients Les dosages radio- immunologiques utilisent des traceurs radioactifs et nécessitent, par conséquent, l'utilisation d'un détecteur de rayonnement gamma Les traceurs radioactifs ont une courte durée de vie au stockage, ils constituent un danger pour la santé du technicien et ils ont été soumis à une législation restrictive Les dosages avec immunoabsorbant lié à une enzyme (méthode ELISA) utilisent des réactifs marqués avec une enzyme L'enzyme est détectée par sa réaction avec un substrat en donnant un produit pouvant être facilement mesuré (par exemple par réaction colorée). La méthode ELISA ne nécessite pas de produits radioactifs et utilise des réactifs à longue durée de vie au stockage. Le dosage ELISA commence par la liaison d'un réactif de référence avec un support en phase solide, tel que le fond d'un puits en matière plastique On fait réagir le fluide testé, mélangé au réactif marqué par une enzyme, avec le réactif de référence lié Au bout d'un certain nombre d'opérations de dilution, d'incubation et de lavage (pouvant aller jusqu'à 14), les réactifs liés et libres sont séparés et une réaction colorée s'amor- ce L'intensité de la couleur qui se forme à différents taux de dilution successifs fournit la mesure quantita- tive La méthode ELISA normale demande 4 à 12 heures. En conséquence, les principaux inconvénients de la métho- de ELISA sont le grand nombre d'opérations de dilution, d'incubation et de lavage qu'elle nécessite, qui demandent beaucoup de temps et qui sont sujettes à des erreurs. Le dispositif de l'invention est utilisé pour surmonter les difficultés associées au type de dosage décrit ci-dessus Plus précisément, son utilisation conduit à une méthode ELISA améliorée n'exigeant pas d'opérations de dilution et de lavage et nécessitant une courte pério- de d'incubation Le dosage s'utilise sous forme d'un ruban d'essai, multicouches, sec, qui donne lieu à une réaction colorée lorsqu'il est exposé directement au liquide testé Le ruban réalise automatiquement les opé- rations de dilution nécessaires à la mesure quantitative et sépare l'anticorps lié de l'anticorps libre La réac- tion colorée peut être lue visuellement ou à l'aide d'un instrument tel qu'un spectrophotomètre En outre, le dispositif de l'invention peut être fabriqué sous la forme de ruban et être utilisé sous forme d'un bâtonnet à immerger permettant de détecter rapidement la présence d'un antigène tel qu'un médicament ou une hormone dans l'urine Comme exemple d'applications particulières, on pourrait citer la détection rapide d'un surdosage de médicament en salle d'urgences, un test de grossesse. à domicile La présente invention peut être utilisée pour déterminer la présence d'antigènes tels que le virus de la rubéole. Selon l'un de ses aspects, l'invention concerne un dispositif pour déterminer la présence d'antigènes, comprenant une première zone contenant des antigènes et des anticorps liés à une enzyme, qui sont capables de réagir immunologiquement avec lesdits antigènes, lesdits anticorps étant situés dans ladite première zone de telle manière qu'ils soient éliminés de cette première zone lorsqu'ils ont réagi avec des antigènes traversant cette première zone, mais qu'ils ne soient pas éliminés de cette première zone en l'absence de tels antigènes, et une seconde zone contenant une substance capable de réagir avec lesdits anticorps liés à une enzyme pour produire une réaction colorée révélant la présence des- dits anticorps. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé unique pour déterminer la présence d'antigènes dans un fluide biologique, consistant à mettre en contact ledit fluide avec un dispositif ou une matrice comportant une première zone contenant des antigènes et des anticorps liés à une enzyme, qui sont capables de réagir immunologiquement avec lesdits antigènes, lesdits anticorps étant situés dans cette première zone de telle manière qu'ils soient éliminés de cette première zone lorsqu'ils réagissent avec des antigènes traversant cette première zone, mais qu'ils ne soient pas éliminés de cette première zone en l'absence de tels antigènes, et une seconde zone contenant une substance capable de réagir avec lesdits anticorps liés:a une enzyme pour produire une réaction colorée qui indique la présence desdits anticorps à à laisser ledit fluide imprégner ce dispositif ou cette matrice; et à observer 1 a prégsen- ce ou l'absence de variations de couleur dans cette seconde zone pour ainsi déterminer la présence ou l'absen- ce dans ledit fluide de l'antigène à doser. La figure l est un diagramme illustrant le dispositif 10 de l'invention qui est constitué de 3 couches distinctes 12, 14 et 16 Les couches 12 et 14 constituent la première zone 18 La couche 16 constitue la seconde zone 20 Le dispositif 10 est représenté placé sur un élément de support 22 La couche 12 est faite d'un matériau poreux dans lequel sont dispersés des antigènes solubles 24 liés à une enzyme La couche 14 est également formée d'un matériau poreux et des antigènes 26 y sont liés La couche 16 est aussi cons- tituée d'un matériau poreux et contient un réactif lié 17 capable de développer une couleur, c'est-à-dire une substance qui réagit avec une enzyme en produisant une couleur. La figure 2 est un diagramme illustrant le procédé de l'invention utilisant le dispositif de la figure 1 Plus précisément, un fluide indiqué globalement par la référence 28, est appliqué sur la surface 30 de la couche 12 A mesure que le fluide diffuse dans la matrice, l'antigène libre 32 vient au contact des anti- corps 24 liés à une enzyme et se combine avec ceux-ci. Après une courte période d'incubation, les anticorps liés à une enzyme présentant des sites de reconnaissance saturés diffusent librement dans la première zone 18 et atteignent la seconde zone 20 (ou couche 16) o l'enzyme réagit avec le réactif capable de développer une couleur pour produire une couleur distincte qui révèle la présen- ce d'antigène dans le fluide appliqué. La figure 3 est un diagramme illustrant le procédé de l'invention utilisant le dispositif de la figure 1 et montrant ce qui se produit lorsque le fluide d'essai est exempt d'antigènes Plus précisément, un fluide indiqué globalement en 34 est appliqué sur la surface 30 de la couche 12 A mesure que le fluide diffuse dans la couche 12 de la matrice, les anticorps 24 liés à une enzyme se solubilisent et passent dans la couche 14 o ils entrent en contact avec les antigènes liés 26 et se fixent sur ceux-ci En conséquence, aucun anticorps lié à une enzyme n'atteint le réactif 17 capable de développer une couleur dans la couche 16 (se- conde zone 20) et on n'observe aucune variation de cou- leur Cela indique bien sûr qu'aucun antigène n'était présent dans le fluide 34. La figure 4 illustre un autre mode de réalisa- tion de l'invention dans lequel le dispositif ou la matrice il est constitué de deux couches distinctes 36 et 38 Dans ce cas, la couche 36 est la première zone 40 contenant l'antigène de référence lié 44 qui est combiné à l'anticorps 46 lié à une enzyme La couche 38 est la seconde zone 42 et contient le réactif 17 capable de développer une couleur. Comme le montre la figure 5, lorsque le fluide d'essai 48 contient suffisamment d'antigène libre 50 pour qu'il entre en compétition avec l'antigène lié 44, l'anticorps lié à une enzyme passe dans la zone 42 et diffuse vers le bas de celle-ci pour produire une réaction colorée 52. Inversement-, comme le montre la figure 6, lorsque le fluide d'essai 54 est exempt d'antigène, aucune com- pétition n'a lieu et par conséquent, aucun anticorps lié à une enzyme ne diffuse dans la seconde zone 42 et il ne se produit aucune réaction colorée. La présente invention est basée sur le principe de la compétition entre les antigènes liés et libres pour atteindre un nombre déterminé' de sites de reconnais- sance sur un anticorps marqué par une enzyme Elle four- nit un procédé amélioré pour réaliser l'essai du type ELISA Les réactifs du dosage sont imprégnés sur un ruban d'essai à plusieurs zones On laisse l'échantillon liqui- de à tester diffuser passivement dans le ruban d'essai. Les antigènes liés et libres se séparent automatiquement au cours de la diffusion Cette séparation résulte du fait que l'antigène de référence de la phase solide est immobilisé dans une première zone séparée d'une seconde zone contenant le substrat d'enzyme On laisse l'anticorps soluble lié à une enzyme qui présente des sites de recon- naissance, se mélanger à l'échantillon d'essai et diffuser à travers les couches Les antigènes solubles dans l'échan- tillon d'essai entrent en compétition avec l'antigène de référence immobilisé pour se combiner à l'anticorps lié à une enzyme Par conséquent, la quantité finale d'anti- corps lié à une enzyme ayant atteint la seconde zone con- tenant le substrat dépend de la concentration de l'anti- gène à doser dans l'échantillon Le substrat présent dans le ruban d'essai réagit avec l'enzyme en produisant une réaction colorée. Pour obtenir une mesure quantitative, le ruban d'essai comporte plusieurs régions séparées contenant chacune une quantité différente d'antigène de référence immobilisé La position du point de virage de la couleur sur le ruban d'essai dépend par conséquent de la concentration de l'antigène dans l'échantillon d'essai. Comme mentionné précédemment, le dispositif de l'inven- tion comprend une première zone qui contient un antigène lié et un anticorps spécifique lié à une enzyme et une seconde zone qui contient un réactif capable de dévelop- per une couleur ou un substrat Les anticorps liés à une enzyme sont placés dans la première zone de telle manière qu'ils puissent en être éliminés lorsqu'ils ont réagi avec de l'antigène non lié pénétrant ou tra- versant celle-ci mais qu'ils ne soient pas éliminés de la première zone en l'absence de tels antigènes. Selon une mise en oeuvre préférée de l'inven- tion, le dispositif de dosage immunologique est un stra- tifié de trois couches de matrice poreuses (voir figure 1) La première couche poreuse est imprégnée d'un anti- corps spécifique lié à une enzyme La seconde couche poreuse contient un antigène de référence immobilisé (lié) L'antigène est du type reconnu spécifiquement par l'anticorps dans la première couche poreuse La troi- sième couche contient un substrat produisant une couleur qui réagit avec l'enzyme liéeà l'anticorps La mise en oeuvre du dispositif s'effectue de la façon suivante (voir figures 2 et 3). On met en contact l'échantillon de fluide contenant l'antigène à doser avec la première couche. L'antigène libre dans l'échantillon d'essai diffuse dans la seconde couche puis dans la troisième couche L'anti- gène libre dans l'échantillon entre en compétition avec l'antigène de référence lié immobilisé dans la seconde couche pour se combiner à l'anticorps lié à une enzyme. Si l'anticorps lié à une enzyme se combine à l'antigène libre, il diffusera librement dans la troisième couche et produira une réaction colorée Si l'échantillon de fluide ne contient pas d'antigène, tous les anticorps liés à une enzyme posséderont des sites de liaison libres et se combineront avec l'antigène immobilisé présent dans la seconde couche L'anticorps lié à une enzyme qui se combine à l'antigène immobilisé dans la seconde couche, ne diffusera pas dans la troisième couche et aucune réaction colorée ne se produira La différence de quantité de substrat dégradé (et l'in- tensité de la couleur produite) est proportionnelle à la concentration en antigène de l'échantillon d'essai. Pour une quantité donnée d'anticorps marqué par une enzyme dans la première couche, la sensibilité du dis- positif est déterminée par la quantité d'antigène de référence présente dans la seconde couche D'une manière générale, un dispositif de dosage contient une série de composites stratifiés, contenant chacun une quantité différente d'antigène de référence La série de concen- trations en antigène de référence devra être déter- minée préalablement de façon à couvrir une gamme de sensibilité appropriée à la solution à doser On notera que dans le ruban d'essai de type ELISA, une réaction colorée positive indique la présence de l'antigène à doser. Les substances utilisées pour fabriquer le dispositif de l'invention sont bien connues dans la technique Cependant, on a trouvé dans la pratique qu'il était souhaitable de fabriquer les zones ou les couches du dispositif préféré à partir de fibres tissées telles que du papier de nitrocellulose ou de diazobenzyloxy- méthyle (DBM) Le papier de nitrocellulose fixe direc- tement les protéines et on a pu montrer qu'il était utilisable pour immobiliser des antigènes Les matrices de DBM fixent l'ADN, l'ARN et les protéines par des liaisons covalentes avec le groupe diazonium On peut en outre utiliser un gel poreux tel que le polyacryla- mide, ltagarose, ou le collagène L'antigène peut être piégé dans les pores du gel, ou être réticulé avec le gel par l'intermédiaire des groupes amino du ligand et des groupes carboxyliques se trouvant sur la matrice. On peut également employer des particules ou des billes contenant le ligand lié piégé à l'intérieur d'une matri- ce de cellulose ou d'une matrice de fibres de matière plastique Comme exemple satisfaisant, on peut citer des billes de polyacrylamide de 5-10 microns de diamètre:, à la surface desquelles l'antigène est lié par l'intermé- diaire d'une liaison peptidique Les billes sont piégées dans une matrice de filtre de cellulose d'une taille de; pores de 1-2 microns. Les substrats ou les réactifs développant une couleur appropriée sont bien connus dans la technique. A cet égard, un certain nombre de types divers d'enzymes purifiés sont couramment utilisés comme réactifs marqués dans les dosages immunologiques tels que le test ELISA. Parmi ceux-ci on citera la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, et la béta-galactogidase Cependant, la présente invention ne se limite pas à l'utilisation de ces enzymes pour marquer l'anticorps ou l'antigène. L'enzyme utilisé pour marquer l'anticorps peut produire une couleur dans la seconde zone du dispositif de dosage en réagissant directement ou indirectement avec le réac- tif capable de développer une couleur A titre d'exemple, des substrats bien connus dans la technique tels que la diaminobenzidine ou le pnitrophénylphosphate réagissent avec la peroxydase de raifort en présence d'eau oxygénée en produisant une couleur marron à noire Selon un mode de réalisation de l'invention, on ajoute de l'eau oxygé- née par voie exogène lorsqu'on utilise le dispositif. En variante, la zone de formation de couleur lyophilisée peut contenir de la glucose oxydase liée et la première zone peut contenir du glucose Lors de l'utilisation du dispositif, le glucose se trouvant dans la première zone diffuse dans la seconde zone et donne naissance à de l'eau oxygénée par réaction avec la glucose oxydase. L'enzyme liée à l'anticorps peut produire une couleur dans la seconde zone par voie indirecte, en rendant par exemple perméable cette zone A titre d'exem- ple, de ce procédé entrant dans le cadre de l'invention, on peut utiliser une collagénase à haut degré de purifi- cation comme enzyme lié à l'anticorps- Cet enzyme dégra- de le collagène en peptide de petite dimension Pour déceler la collagénase de marquage, on sépare 2 réactifs qui se combinent en donnant une couleur au moyen d'une barrière constituée d'une matrice de collagène La pré- sence de l'anticorps marqué par la collagénase est décelée du fait que la collagénase dégrade la barrière de collagène et permet aux réactifs séparés de se mélanger et d'engendrer une couleur Comme collagénase appropriée, on citera celle obtenue à partir de clostridium histoly- ticium purifié par des moyens bien connus dans la tech- nique Comme matrice de collagène appropriée, on citera celle obtenue à partir de collagène bovin de type I en triple hélice (natif) ou dénaturé (gélatine). Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. EXEMPLE 1. Test: mode de réalisation de l'invention à trois couches pour la, détection de grossesses. Substances utilisées: a) antigène gonadotrophine chorionique humaine (h CG) b) anticorps antisérum de lapin agissant sur la h CG humaine c) enzyme liée à l'anticorps: peroxydase de raifort d) substrat d'enzyme produisant une réaction colorée diaminobenzidine e) substance de matrice constituant les couches poreuses nitrocellulose. Mode opératoire: Stade 1 Préparation d'une couche contenant le réac- tif, capable de développer une couleur: on découpe des feuilles de matrice de nitrocellulose d'une épaisseur de 0,2 mm en ruban de 2 cm de large et de 10 cm de long. On trempe les feuilles pendant 30 min dans une solution à 0,1 mg/ml de diaminobenzidène dans de l'eau distillée. On congèle ensuite les feuilles en les recouvrant de pastilles de glace carbonique On lyophilise les feuil- les congelées dans un lyophilisateur classique. Stade 2 Préparation d'une couche contenant l'antigène: on solubilise Ilantigène dans' une solution saline tamponnée par du phosphate (PBS) à une concentra- tion de 5,0 U I /ml et complétée de façon à obtenir la série de dilutions suivante: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, et 1:100. Huit groupes de feuilles de nitrocellulose sont chacune trempées dans une dilution différente de la solution d'antigène pendant 30 min à 4 C Toutes les feuilles sont ensuite trempées dans une solution à 1 % d'albumine sérique bovine dans une solution saline tamponnée par du phosphate pendant 2 heures à 4 C pour saturer tous les sites libres de liaison des protéines sur la nitrocellulose (Tobin et al Proc Natl Acad of Sci 76 4350-4354, 1979). Stade 3 On lyophilise ensuite les feuilles comme décrit ci-dessus pour préparer la couche contenant l'anticorps lié à l'enzyme: on conjugue la peroxydase avec l'anticorps par le procédé classique au périodate de Wilson et Nakane ( 1978 dans W Knapp etal (éd) Immu- nofluorescence and Related Techniques, Elsevier Co, Amsterdam, p 215-225) Apres avoir purifié le conjugué par des procédés classiques, on le met en solution saline tamponnée au phosphate à une concentration de 1 mg/ml. On détermine la concentration d'anticorps lié à une enzyme à imprégner dans la couche en diluant la solution d'anticorps lié à une enzyme jusqu'à ce qu'une goutte- lette de 20 microlitres appliquée sur la surface de la feuille de nitrocellulose contenant l'antigène immobi- lisé à une dilution de 1:32, présente une liaison complète de tous les anticorps à l'antigène immobilisé (préparation d'une courbe de dilution étalon) On imprègne des rubans de papier buvard de cellulose de cette concentration d'an- ticorps lié à une enzyme et on les lyophilise de la façon décrite ci-dessus au stade 1. Stade 4 Préparation d'un stratifié à 3 couches: on découpe à partir des rubans des carrés de i cm de chacu- ne des couches lyophilisées Le support solide est un ruban de matière plastique transparente de polycarbonate de 10 cm x 1 cm d'une épaisseur de 0,1 mm On colle sur le support de plastique 8 carrés de nitrocellulose conte- nant le substrat produisant la couleur au moyen d'une colle à base de latex Par dessus ces carrés, on colle les feuilles contenant l'antigène en appliquant la colle au latex sur le pourtour On utilise les 8 concentrations d'antigène différentes Enfin, on colle par-dessus les couches d'antigène, les couches d'anticorps lié à l'enzy- me. Stade 5 Pour effectuer le dosage, on applique microlitres de la solution d'essai à la surface de la couche supérieure La solution d'essai est constituée d'un antigène étalon dans une solution saline tamponnée au phosphate à p H 7,4 avec 0,1 % d'eau oxygénée La sen- sibilité du dosage est de 0,3 UI de h CG et produit une réaction colorée pour la dilution 1:32 de l'antigène immobilisé. Résultats. On compare la sensibilité du ruban d'essai de type ELISA fabriqué de la façon décrite ci-dessus à celle d'une réaction d'hémagglutination étalon L'échan- tillon d'essai est constitué par de l'urine humaine mise en commun provenant de 6 patientes chez qui on avait préalablement décelé une grossesse. Dilution de Quantité a Dilution deQuantité Ruban Hémagglutination 1 'échantillon estidétectée ELISA classique d'urine h CG détectée 1:1 2,5 UI (+) + 1 1:2 1,2 UI (+) (+ 1:4 0,6 UI (+) (-) 1:8 0,3 UI (+) (-Y 1:16 0,01 UI (-) ()? La sensibilité du ruban ELISA est supérieure à celle de la réaction d'hémagglutination classique. EXEMPLE 2. Essai: a) pour déterminer l'instant de formation d'une couleur pour diverses concentrations d'anticorps lié à une enzyme imprégnant la première couche du mode de réa- lisation à trois couches. b) pour déterminer la possibilité de réaliser la détection de l'antigène de l'hépatite B humaine (HBA). Mode opératoire. Le ruban d'essai est réalisé par des procédés identiques à ceux de l'exemple 1 La première couche contient la matrice de cellulose lyophilisée imprégnée d'anti-HBA conjugué avec de la peroxydase aux dilutions suivantes: 1/2, 1/5, 1/50, 1/225, 1/625, 1/3125 Dans l'expérience a), la seconde couche ne contient pas d'an- tigène Dans l'expérience b), la seconde couche contient du HBA lié à une concentration de 500 nanogrammes par cm 2 La troisième couche contient un substrat de DAB préparé de la façon décrite dans l'exemple 1 pour détec- ter la h CG. Résultats. Expérience a). L'échantillon d'essai est constitué par du sérum humain normal dilué à 1/10 dans une solution saline tamponnée par du phosphate contenant 0,1 % d'eau oxygénée. Réaction colorée Dilution 1/2 1/5 1/50 1/225 1/625 1/3125 Temps: 10 sec M très foncé N M très foncé N M-N M M clair pas de couleur sec id. id. id. M foncé M M très clair Abréviations: M = marron N = noir. Conclusion: la concentration optimale de l'anticorps lié à une enzyme est de 1/625 lorsque la seconde couche contient 500 nanogrammes de HBA par cm 2. La possibilité de réaliser la détection de HBA est démon- trée par le fait que l'antigène libre entre en compéti- tion avec l'antigène de référence lié à une concentration de 1/625. Expérience (b) l Détermination de la concentration optimale maximale d'anticorps lié à une enzyme dans la première couche et totalement lié à l'antigène de référence dans la seconde couche lorsque l'échantillon d'essai est exempt d'antigène. Dilution de l'anti HBA conjugué avec une enzyme dans la première couche Réaction colorée à 1 min M M clair M très clair Pas de couleur (liai- son complète à l'anti- gène de référence). Pas de couleur 1 min id. id. id. id. M clair l 4 clafr 1/5 1/50 1/225 1/625 1/3125 Expérience (b) 2 On choisit une dilution de 1/625 (à partir du tableau (b) l ci-dessus) de conjugué pour détecter le HBA à 100 nanogrammes/ml. Echantillon d'essai Réaction colorée sec l min HBA présent M clair M HBA absent pas de couleur pas de couleur La technique de l'invention peut aussi bien s'appliquer à la détection d'anticorps qu'à celle des antigènes Il suffit pour cela d'inverser les rôles de l'antigène et de l'anticorps Pour détecter des anticorps, l'antigène est marqué par une enzyme et l'an- ticorps de référence est immobilisé dans la première zone L'antigène marqué par une enzyme se lie à l'anti- corps immobilisé dans la première zone en l'absence d'anticorps compétitif dans l'échantillon d'essai, et ne diffuse pas dans la seconde zone pour donner une couleur Si des anticorps sont présents dans l'échan- tillon d'essai, ils entrent en compétition avec les anticorps de référence immobilisés Dans ce cas, une réaction colorée positive indique la présence d'anticorps dans l'échantillon d'essai. * Lorsque la présente invention est appliquée à la détection d'anticorps, on utilise un dispositif qui comprend une première zone contenant des antigènes liés à une enzyme et des anticorps qui sont capables de réagir immunologiquement avec lesdits antigènes, les- dits antigènes étant situés dans ladite première zone de telle manière qu'ils soient éliminés de cette premiè- re zone lorsqu'ils réagissent avec des anticorps péné- trant ou traversant cette première zone, mais qu'ils ne soient pas éliminés de cette première zone en l'ab- sence de tels anticorps; et une seconde zone contenant une substance capable de réagir, soit directement, soit indirectement, avec lesdits antigènes liés à une enzyme en produisant une réaction colorée qui indique la pré- sence desdits antigènes. REVENDICATIONS 1 Dispositif pour déterminer la présence d'antigènes, caractérisé en ce qu'il comprend: une première zone contenant des antigènes et des anti- corps liés à une enzyme, qui sont capables de réagir immunologiquement avec lesdits antigènes, lesdits anti- corps étant situés dans ladite première zone de telle manière qu'ils soient éliminés de cette première zone lorsqu'ils réagissent avec des antigènes traversant cette première zone, mais qu'ils ne soient pas éliminés de cette première zone en l'absence de tels antigènes, et une seconde zone contenant une substance capable de réagir avec lesdits anticorps liés à une enzyme en - produisant une réaction colorée qui indique la présence desdits anticorps. 2 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la première et la seconde zones sont contig Ues. 3 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première zone contient des anticorps liés à une enzyme qui sont combinés à des antigènes spécifiques. 4 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première zone est constituée d'au moins deux couches individuelles, l'une de ces couches contenant des anticorps liés à une enzyme et l'autre couche contenant l'antigène spécifique immobilisé dans cette couche. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première zone est fabriquée à partir de nitrocellulose. 6 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première zone est fabriquée à partir d'un gel de polymère poreux. 7 Dispositif selon la revendication 1,. caractérisé en ce que ladite première zone est fabriquée à partir de particules contenant de l'antigène ou de l'anticorps immobilisé piégé dans une matrice fibreuse. 8 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite seconde zone est fabriquée à partir de nitrocellulose. 9 Procédé pour déterminer la présence d'anti- gènes dans un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il consiste: à mettre en contact un fluide dans lequel on veut déterminer la présence ou l'absence d'antigène, avec un dispositif comportant une première zone contenant des antigènes et des anticorps liés à une enzyme qui sont capables de réagir immunologiquement avec lesdits antigènes, lesdits anticorps étant situés dans cette première zone de telle manière qu'ils soient éliminés de cette première zone lorsqu'ils réagissent avec des antigènes traversant cette première zone, mais qu'ils ne soient pas éliminés de cette première zone en l'absen- ce de tels antigènes, et une seconde zone contenant une substance capable de réagir avec lesdits anticorps liés à une enzyme en produisant une réaction colorée qui indique la présence desdits anticorps; à laisser ledit fluide imprégner le dispositif; et à observer la présence ou l'absence d'une variation de couleur dans cette seconde zone pour ainsi déterminer la présence ou l'absence de l'antigène à doser dans ledit fluide. Procédé selon la revendication 9, carac- térisé en ce que lesdites première et seconde zones sont contig Ues. 11 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite première zone contient des anticorps liés à une enzyme qui sont combinés à des antigènes spécifiques. 12 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite première zone est constituée d'au moins deux couches individuelles, l'une de-ces couches contenant des anticorps liés à une enzyme, et l'autre couche contenant l'antigène spécifique immo- bilisé dans cette couche. 13 Procédé selon la revendication 9, carac- térisé en ce que ladite première zone est fabriquée à partir de nitrocellulose. 14 Procédé selon la revendication 9, carac- térisé en ce que ladite seconde zone est fabriquée à partir de nitrocellulose. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'antigène présent dans ce dis- positif est la gonadotrophine chorionique humaine. 16 Procédé selon la revendication 9, carac- térisé en ce que l'antigène présent dans ce dispositif est l'antigène de l'hépatite. 17 Procédé selon -la revendication 9, carac- térisé en ce que l'antigène présent dans ce dispositif est une protéine du virus de la rubéole. 18 Dispositif pour déterminer la présence d'anticorps, caractérisé en ce qu'il comprend: une première zone contenant des antigènes liés à une enzyme et des anticorps qui sont capables de réagir immunologiquement avec lesdits antigènes, lesdits anti- gènes étant situés dans ladite première zone de telle manière qu'il soient éliminés de cette première zone lorsqu'ils réagissent avec des anticorps traversant cette première zone, mais qu'ils ne soient pas éliminés de cette première zone en l'absence de tels anticorps; et une seconde zone contenant une substance capable de réagir avec lesdits antigènes liés à une enzyme en produisant une réaction colorée qui indique la présence desdits antigènes. 19 Procédé pour déterminer la présence d'anticorps dans un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact un fluide dans leque I on veut. déterminer la présence ou l'absence-d'antigènes, avec un dispositif comportant une première zone contenant des antigènes liés à une enzyme et des anticorps qui sont capables de réagir immunologiquement avec lesdits antigènes, lesdits antigènes étant situés dans ladite première zone de telle manière qu'ils soient éliminés de cette première zone lorsqu'ils réagissent avec des anticorps traversant cette première zone, mais qu'ils ne soient pas éliminés de cette première zone en l'ab- sence de tels anticorps, et une seconde zone contenant une substance capable de réagir avec lesdits antigènes liés à une enzyme en produisant une réaction colorée qui indique la présence desdits antigènes; à laisser ledit fluide imprégner ce dispositif; et à observer la présence ou l'absence d'une variation de couleur dans ladite seconde zone, pour ainsi déter- miner la présence ou l'absence des anticorps à doser dans ledit fluide.