Brevet FR2523311A1 — publié le 19830916

La présente invention concerne un produit de couplage entre une albumine et un ligand spécifique, son obtention et ses applications dans les techniques biologiques, notamment de localisation, de mise en évidence et de dosages d'anticorps ou d'antigènes. Le produit de couplage selon l'invention est particulièrement approprié comme réactif universel dans les différents types de dosages biologiques et notamment immunologiques. En immunologie, on a déjà utilisé, notamment, des produits de couplage d'anticorps ou d'antigènes avec difféç,tes substances, à titre de marqueurs, telles qu par exemple, les enzymes, les radioisotopes, la ferritine, les globules rouges, les fluorochromes. De tels produits de couplage sont utilisés a titre de réactifs selon divers procédés immunologiques pour la localisation, la mise en évidence ou le dosage des constituarts humoraux ou cellulaires. Pour plus de détails sur ces produits de couplage connus, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : "Handbook of experimental immunology", 3 vol. 3 Ed. D.M. Weir (1978) Blackwell Scientific. Les dosages immunoenzymatiques sont de plus en plus utilisés. Cependant ils sont très coûteux dans la mesure où ils requierent des quantités importantes d'eftzymefe On a également proposé l'utilisation, conne rëac- tifs de dosage, de produits de couplage entre une lectine e' un ligand spécifique.A cet effet on pourra se référer à demande de brevet FR 80.11.470 (déposée le 24 Mai 1980) auxnoms des demandeurs, intitulée : "Produit de couplage enTre une lectine et un ligand spécifique, obtenton et applicatioals dans le domaine biologique". On a maintenant trouve une nouvelle série de pro duits de couplage qui peuvent être utilisés dans un grand nombre de domaines, il s'agit des produits de couplage entre une albumine et un ligand spécifique. On notera que l'on a déjà proposé lutilisaton de l'albumine comme agent de stabilisation dans de réactifs de dosages immunoenzymatiques. A cet effet on peut citer le brevet US 4.002.532 qui décrit des conjugués enzvmatí- ques constitués d'une enzyme, d'un agent de couplage polyfonctionnel, d'une polyamine, telle qu'une albumine et d'une macromolécule protéine non-enzymatique. Dans ce con jugué, la polyamine, par exemple l'albumine, joue le rôle d'agent de conditionnement pour stabiliser le complexe macromolécule-enzyme. Cette polyamine ntintervient pas directement dans le dosage immunoenzymati(ue dans lequel est mis en oeuvre un tel conjugué. La présente invention concerne, à titre de produit nouveau, un produit de couplage entre une albumine et un ligand spécifique, approprie comme réactif de dosage, dans lequel l'albumine intervient- directement dans le conjugué. Par ligand spécifique os désigne dans la présente description toute substance soluble qu peut réagir de fa çon spécifique avec une autre substance biologique ou particulaire. Par substance soluble, on désigne toute substance soluble dans les milieux couramment utilises pour les réactions biologiques. I1 peut s'agir de milieux aqueux, tels que des milieux physiologiques, ou de mélanfjes de milieux aqueux et organiques. De plus, le ligand spécifique mis en oeuvre selon l'invention doit être tel que le produit de couplage albu mine-ligand selon l'invention soit soluble en milieu aqueux. Par milieu aqueux" on insigne selon l'invention les milieux aqueux, tarnponnés ou non, couramment utilisés dans le domaine biologique, tels que les solutions tampon phosphate; les solutions tampon contenant un détergent, tel que le "Tween", ou de la gélatine, la lactalbumine bovine et autres substances habituellement mises en oeuvre dans de tels domaines. Les ligands spécifique répondant à une telle définition sont notamment les anticorps, les antigènes macromoléculaires ou les haptènes, les hormones et leurs récepteurs, les enzymes et leurs Inhibiteurs, les lectines et substances similaires. Parmi les ligands spécifiques cités ci-dessus, on utilise le plus communément les anticorps et les antigènes. Aux fins de l'invention on utilise en général une albumine sérique (protéine principale présente dans le sérum), qui peut provenir de différentes espèces animales (boeuf, mouton, lapin, homme, etc...). Avantageusement on utilise de l'albumine sérique bovine. Le produit selon l'invention est obtenu par couplage d'une albumine avec le ligand par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié, tel que par exemple le glutaraldéhyde et la benzoquinone. Le couplage est avantageusement réalisé par liaisons covalentes. Le couplage albumine-ligand spécifique est réalisé selon un procédé analogue à ceux utilisés pour le couplage de protéines. Par exemple, on peut réaliser le couplage albumine-ligand spécifique par un procédé similaire à celui décrit pour l'obtention de conjugués anticorps-enzyme par S. Avrameas et al. dans Scand. 3. Immunol., vol. 8 suppl.7, pages 7-23, 1978. Un tel procédé de couplage consiste à mettre en contact, en une ou plusieurs étapes, un agent de couplage avec les substances à coupler. Lorsqu'on utilise la benzoquinone comme agent de couplage on peut indifféremment activer en premier l'albumine ou le ligand spécifique. A titre de document illustrant la technique de couplage à la benzoquinone on peut également citer le brevet FR 75.37.392 (publication NO 2.334.107). Lorsqu'on utilise le glutaraldéhyde comme agent de couplage, on mélange avantageusement l'albumine et le ligand spécifique et on ajoute audit mélange le glutaraldéhyde en quantités appropriées pour réaliser le couplage. On peut cependant également réaliser ce couplage en deux temps, en mettant en contact avec le glutaraldéhyde l'un des réactifs,en élimitant le glutaraldéhyde en excès et en ajoutant l'autre réactif. Dans de nombreux cas, le glutaraldéhyde convient comme agent de couplage, par exemple avec des antigènes ou des anticorps. Le tableau qui suit illustre la préparation de conjugués albumine-ligand spécifique (antisérum, immunoglobulines,anticorps) en utilisant le glutaraldéhyde comme agent de couplage. Cependant ces exemples ne sont pas limitatifs. TABLEAU 1 ligand spécifique quantité quantité d'albumine concentration de glutaraldéhyde Antisérum 50 1 5 mg 0,2 X Immunoglobulines 2,5 mg 5 mg 0,2 X Anticorps 2,4 mg 6 mg 0,2 % L'albumine et le ligand spécifique sont dissous dans un tampon phosphate pH 6,8 0,1 M; à ce mélange on ajoute le glutaraldéhyde à une concentration de 0,2%. Le volume total du milieu de réaction est de 1 ml. Lors du couplage entre l'albumine et le ligand spécifique il est possible d'utiliser un fort excès d'al- bumine de façon à obtenir une valeur élevée du rapport molaire albuminelligand. Il n'est pas indispensable d'utiliser une forme hautement purifiée du ligand. Par exemple on pourra utiliser le sérum total, tout aussi bien que le sérum purifié par des moyens classiques appropriés, tels querelarqaqes salins, colonnes échangeurs d'ions,chromatographie d'affinité. Le produit de couplage albumine-ligand spécifique selon l'invention peut être caractérisé par sa capacité à réagir avec une substance spécifique et en même temps avec un marqueur spécifique de l'albumine, tel qu'un anticorps anti-albumine. Par exemple, si le produit de couplage albumine-ligand spécifique est un produit albumine-an- tigène,il pourra être caractérisé par sa capacité à réagir avec la substance spécifique correspondante, à savoir l'an ticorps correspondant. Si le produit de couplage albumine-ligand spécifique est un produit albumine-anticorps,il pourra être caractérisé par sa capacité à réagir avec la substance spécifique, à savoir l'antigène correspondant. Dans tous les cas, ces conjugués doivent réagir avec l'anticorps anti-albumine marqué par un marqueur adéquat comme une enzyme, une substance fluorescente, radioactive ou globules rouges couplés par des moyens appropriés comme décrit dans "Handbook of experimental immunology" D.M. Weir 1978, Blackwell Scientific. Le produit de couplage selon l'invention peut être avantageusement conservé en solution aqueuse à basse température, par exemple à 40C après addition d'un volume adéquat de glycérol. Le produit de couplage albumine-ligand spécifique selon l'invention convient comme réactif dans divers procédés immunologiques de localisation,de mise en évidence et de dosage de substances biologiques,tels que le-s dosages immunologiques du type non compétitif, à double anticorps ou par compétition. I1 est avantageusement mis en oeuvre sous la forme d'une solution aqueuse,tamponnée ou non. Le produit de couplage albumine-ligand, selon l'invention,sous la forme d'une solution aqueuse convient particulièrement bien à titre de réactif dans les techniques immunologiques, pians lesquelles l'un des réactifs ou la substance à identifier est insoluble ou immobilisée sur un support insoluble.Il convient donc en particulier dans tous les types de dosages mettant en oeuvre un support insoluble.Mais le produit de l'invention peut aussi être utilisé en phase so- luble. A titre d'exemple illustratif, on a indi qué sur la figure unique annexée, le schéma d'un procédé de mise en évidence d'un antigène immobilisé (schéma A). Pour mettre en évidence l'antigène (2) immobilisé sur un immunoadsorbant (1) spécifique,on ajoute le produit de couplage albumine-ligand(3) selon l'invention, dissous dans le milieu aqueux, le ligand étant dans ce cas particulier un anticorps. La partie anticorps du produit de couplage (3) réagit avec l'antigène immobilisé, tandis que l'albumine dudit produit de couplage reste accessible. Après lavage de ltinmunoadsorbant pour éliminer l'excès de conjugué anticorps-albumine, on ajoute un composé (4) constitué d'anticorps anti-albumine liés avec un marqueur, c'est-à-dire une substance facile à mettre en évidence. Dans le procédé de dosage d'un antigène décrit ci-dessus, l'albumine joue le rôle d'accepteur de marqueur. Par "marqueur" on désigne, selon l'invention, toute substance de nature quelconque, qui permct de faire une identification ou un dosage. A titre d'exemples de marqueurs1 on citera les enzymes, les dérivés fluorescents (fluorochromes), les éléments radioactifs, les globules rouges, les lectines, les substances particulaires et produits similaires. L'anticorps anti-albumine utilisé dans le procédé de dosage est obtenu par des moyens classiques. L'anticorps anti-albumine est lié avec la substance qui Joue le rôle de marqueur par des moyens appropriés classiques de couplage.Il constitue un autre aspect de l'invention étant un moyen pour la mise en oeuvre du procédé de dosaqe selon l'invention. A chacun des marqueurs ci-dessus correspond une technique immunologique qui est respectivement la technique immunoenzymatique (dosage immunoenzymatique ou détection histochimique), l'immunofluorescence (dosage immunofluorimétrique ou détection histochimique) la technique radioimmunologique, l'hémagglutination ou llérythroadsorption, telle qu'elle est définie par exemple dans la demande de brevet FR 80.15.293 au nom des demandeurs et intitulée "Procédé de détection et de dosage d'une substance biologique par érythroådsorption" déposée le 9 Juillet 1980. A titre d'exemple non limitatif, on décrira ci-après un procédé de dosage mettant en oeuvre un produit de couplage albumine-ligand selon l'invention. Ce procédé de dosage pour la détermination d'une substance biologique donnée, consiste 1) à immobiliser une substance ayant une affini té de fixation vis-à-vis de la substance bio logique à doser; 2) à faire incuber cette substance avec le milieu contenant la substance biologique à doser; 3) à faire incuber, après lavage, le milieu ré actionnel résultant avec un produit de coupla ge albumine-ligand spécifique, en solution dans un milieu aqueux, ledit ligand étant ca pable de réagir de façon spécifique avec ladi te substance ayant une affinité pour la sub stance biologique à doser ou avec ladite sub stance biologique elle-même; 4) à laver le milieu réactionnel résultant et à le faire incuber avec un anticorps anti-al bumine portant un marqueur; 5) à révéler le marqueur par un moyen approprié. Ce procédé est approprié pour doser des antigènes, des anticorps, des immunoglobulines et autres substances d'intérêt biologique. La substance ayant une affinité de fixation visà-vis de la substance biologique à doser peut être toute substance capable de se fixer de façon spécifique avec ladite substance biologique. Par exemple, si la substance biologique à doser est un anticorps, la substance ayant une affinité de fixation sera alors un antigène et réciproquement. On peut utiliser selon ce procédé un marqueur quelconque, tel que ceux cités ci-dessus, notamment les enzymes et les globules rouges, auquel cas l'étape 5), est une étape de détermination enzymatique ou d'érythroadsorption. On utilise avantageusement des microplaques pour immobiliser l'antigène ou l'anticorps mis en oeuvre selon le procédé ci-dessus, par exemple des microplaques en polystyrène. On peut également utiliser des supports sous forme de gels, de préférence des gels magnétiques, tels que ceux décrits dans le brevet FR 75.36.889 (publié sous le NO 2.334.106) et dans la demande de brevet FR 79.21.343. A titre de support, on peut utiliser n'im porte quel support insoluble présenté sous une forme défi nie, telle qu'une plaque ou une feuille, ou sous une forme particulaire. A titre de substance constitutive de tels sup ports, on peut utiliser la cellulose et ses dérivés, le po lyacrylamide, les polyméthacrylates d'alkyle et autres po lymères d'origine naturelle ou synthétique ainsi que le ver re. On notera que le produit de couplage selon l'invention, utilisé sous la forme de solution, procure des avantages considérables dans le domaine des dosages immuno logiques en ce sens que sa mise en oeuvre ne requiert aucune étapes de séparation, centrifugation, filtration, autre que celle imposée par lé support d'immobilisation de l'un des réactifs, par exemple, lavage du support ou séparation à l'aide d'un aimant dans le cas de gels magnétiques. La sensibilité du procédé de dosage défi ni ci-dessus est amplifiée par rapport à celle des procédés de dosages immunologiques classiques, en effet pour le même temps de réaction enzymatique, la sensibilité du procédé de ,l'invention est de l'ordre de 3 à 5 fois plus grande que celle des procédés classiques. On pense que l'amplification est provo quée par l'albumine, car on peut fixer plus de marqueur étant donné que l'albumine à plusieurs sites disponibles pour fixer ledit marqueur. Le produit de couplage selon l'invention permet de réaliser des dosages avec plus de sensibilité sans utiliser des quantités importantes d'enzy mes par exemple. L'invention a également pour obJet un cof fret pour dosage immunologique, comprenant 1) un produit de couplage entre une albu mine et un ligand spécifique, 2) un anticorps anti-albumine portant un marqueur, 3) des moyens pour révéler le marqueur. L'invention va être maintenant décrite plus en détail dans les exemples illustratifs mais non limitatifs ci-après EXEMPLE 1 : Préparation du produit de couplage albumine-anticorps à l'aide de glutaraldéhyde. On a utilisé des anticorps de mouton anti Ig de lapin purs isolés par chromatographie d'affinité. Les anticorps et l'albumine (sérum albumine bovine) ont été dialysés contre du tampon phosphate 0,lM pH 6,8 pendant 1 nuit à 40C. Les anticorps (3mg) et albumine (6 mg) dialysés, ont été mélangés dans une solution tampon phosphate 0,1 M pH 6,8 . Le volume total était égal à 1 ml, 0,2 ml d'une solution aqueuse de glutaraldehyde à 1% ont été aJoutés au mélange, qui a ensuite été incubé pendant 3 heures à température ambiante. EXEMPLE 2 Dosage d'antigène Dans cet exemple on a utilisé comme produit de couplage de l'invention de la sérum albumine bovine (BSA) couplée avec des anticorps anti IgE selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Ce produit de couplage sera dénommé ci-après : anti IgE-BSA, L'anticorps anti-albumine portant le marqueur utilisé dans ce produit était le conjugué anti-BSA-P- galactosidase, obtenue par couplage de la -galactosidase avec l'anticorps anti BSA au moyen de glutaraldéhyde. Dosage des IgE humaines Le dosage des IgE humaines a été effectué par une technique "sandwich" en suivant le protocole ci-dessous : Adsorption des anticorps anti IgE sur une plaque en polystyrène (type Elisa); Lavage de la plaque; Incubation (une nuit à 40C) avec le sérum standard (0 - 100 UI/ml) et avec les sérums des malades; Lavage de la plaque; Incubation (deux heures à 370C) avec le conjugué anti IgE - BSA (obtenue selon l'exemple 1); Lavage de la plaque; Incubation (deux heures à 370C) avec le conjugué anti BSA - * galactosidase; Lavage de la plaque; Réaction enzymatique (30 minutes);; arrêt de la réaction enzymatique et mesure de la densité optique à 405 m. .Les résultats obtenus en suivant ce protocole sont donnés dans le tableau 2 comparativement avec les résultats obtenus par la technique classique utilisant un conjugué anti IgE- g galactosidase. Les résultats montrent clairement que la sensibilité du dosage est meilleure lorsque l'on remplace le conJugué anti IgE- galactosidase par le conjugué anti IgE - BSA selon l'invention. EXEMPLE 3 Dosage d'un haptène Le dosage de l'haptène a été réalisé en utilisant la technique de compétition et un conjugué haptène BSA. On a utilisé comme modèle expérimental le dosage de 1'Adenosine - Mono - Phosphate cyclique (AMPc) Le protocole ci-dessous a été suivi Adsorption passive des anticorps anti AMPc sur une plaque de polystyrène ; Lavage de la plaque ; Incubation (une heure à 370C) de la solution standard contenant des concentrations connues dlAMPc ou de la solution à titrer; Addition du conjugué AMPc-BSA; Incubation (deux heures à 370C) du mélanue Lavage de la plaque;; Incubation (trois heures à 370C) avec le conJugué anti BSA - t galactosidase; Lavage de la plaque; Réaction enzymatique (16 heures à 200C); Arrêt de la réaction enzymatique et mesure de la densité optique à 405 nm. Le résultat d'une gamme d'étalonnage d'AMPc obtenue en suivant ce protocole est donnée dans le tableau 3. EXEMPLE 4 : Titrage des anticorps anti-streptocoque type III groupe B Le titrage s'effectue de la façon suivante Adsorption de l'antigène polyosidique sur une plaque de polystyrène; Lavage de la plaque; Incubation avec le sérumà titrer; Lavage de la plaque; Incubation avec le conjugué anti IgC-BSA; Lavage de la plaque; Incubation avec le conJugué anti BSA-Bga- lactosidase; Lavage de la plaque; Réaction enzymatique; arrêt de la réaction enzymatique et mesure de la densité optique à 405 nm. Les résultats du titrage rapportés dans le tableau 4 montrent que le procédé selon l'invention donne de meilleurs résultats. En effet on constate que la sensibilité est nettement accrue par rapport au procédé classique (méthode 2). EXEMPLE 5 Titrage des anticorps anti-Echinococcus granulosus 60 sérums de malades atteints d'hydatidose ont été testés par la méthode décrite ci-dessus, et les résultats ont été comparés avec ceux obtenus par la méthode Elisa classique. I1 découle de cette étude qu'il existe une bonne corrélation entre les deux méthodes et que les résultats sont obtenus plus rapidement avec la technique utilisant le conjugué anti IgG-BSA (réaction enzymatique 20 minutes) qu'avec la technique utilisant le conjugué anti IgG-phospatase (réaction enzymatique 18 heures). A titre d'exemple, le tableau 5 donne le. résultat du titrage d'un sérum de malade et d'un sérum normal. TABLEAU 2 Dosage des I9E humaines. Le dosage est effectué de la même façon soit en utilisant le conJugué anti IgE-BSA de l'invention (méthode 1), soit en utilisant le conjugué anti IgE- pga- lactosidase (méthode 2). (IgE Densité optique en UI/ml méthode 1 méthode 2 100 2,08 0,59 50 1,47 0,36 25 0,80 0,15 13 0,34 0,04 6 0,15 0,02 3 0,07 0,00 TABLEAU ss Dosage d'AMPc en utilisant un conjugué AMPc-BSA (AMPc) Densité Pourcentage en nM optique d'activité 10,000 0,084 11 3,333 0,237 32 1,111 0,379 51 0,370 0,525 70 0,123 0,670 90 0,041 0,700 94 0,014 0,783 105 0,000 0,745 100 TABLEAU 4 Titrage d'un sérum anti stretocoque type III groupe B. Le titrage est réalisé soit avec le conjugué anti IgG-BSA (méthode 1) soit à titre de comparaison, avec le conjugué anti IgG- p galactosidase (méthode 2). Densité optique Dilution du sérum méthode 1 méthode 2 1/200.000 1,25 0,32 1/400.000 0,88 0,20 1/800.000 0,60 0,14 1/1.600.000 0,33 0,06 1/3.200.000 0,20 0,03 1/6.400.000 0,13 0,03 1/12.800.000 0,07 0,01 1/25.600.000 0,04 0,00 TABLEAU 5 Titrage des anticorps humains anti-Echinococcus granulosus en utilisant le conjugué anti IgC-BSA Densité optique Dilution du sérum sérum normal sérum de malade 1/1600 0,109 1,106 1/3200 0,070 0,983 1/6400 0,024 0,840 1/12.800 0,031 0,670 1/25.600 0,014 0,483 1/51.200 0,000 0,281 1/102.400 0,000 0,159 1/204.800 0,000 0,057 I1 va sans dire que les exemples ci-dessus sont purement illustratifs. Les produits de l'invention sont applicables dans les techniques de dosage les plus variées. Si nécessaire l'homme de l'art peut se référer aux ouvrages ci-après. - Affinity techniques : E myme Purification W B 3acoby and M. Wilchek, eds Methods in Enzymology - Vol 34, part B - Academic Press N.Y. 1974, - Affinity chromatography and Molecular Interactions, 3.M. Egly ed. INSERM - Vol. 86. lesquels décrivent des techniques utilisables pour les besoins de l'invention. REVENDICATIONS 1. A titre de produit nouveau, le produit de couplage entre une albumine et un ligand spécifique, ledit produit étant soluble dans un milieu aqueux. 2. Produit de couplage selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'albumine est d'origine animale ou humaine. 3. Produit selon l'une des revendications 1 ou'2, caractérisé en ce que le ligand spécifique est un antigène ou un haptène, un anticorps, une hormone ou son récepteur, une enzyme ou son inhibiteur, une iectine. 4. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est obtenu par couplage à l'aide de glutaraldéhyde. 5. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est obtenu par couplage à l'aide de benzoquinone en deux étapes, la première consistant à activer l'albumine ou le ligand avec la benzoquinone et la seconde à faire incuber le produit résultant avec le second produit à coupler. 6. Réactif de dosage immunologique, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un produit de couplage d'une albumine avec un ligand spécifique, ledit produit de couplage étant soluble dans un milieu aqueux. 7. Réactif de dosage selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'albumine est la sérum albumine bovine et en ce que le ligand spécifique est un antigène ou un anticorps. 8. Application du produit de couplage selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la lo calisation, la mise en évidence et le dosage d'un antigène ou d'un anticorps par fluorimétrie, radioimmunologie, immunoenzymologie, érythroadsorption. 9. Procédé de dosage immunologique d'une substance biologique, caractérisé en ce qu'il -consiste 1) à immobiliser une substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique à doser; 2) à faire incuber ce-tte substance avec le milieu contenant la substance biologique à doser; 3) à faire incuber, après lavage, le milieu réactionnel résultant avec un produit de couplage albumine-ligand spécifique, en solution dans un milieu aqueux, ledit ligand étant capable de réagir de façon spécifique avec ladite substance ayant une affinité pour la substance biologique à doser ou avec ladite substance biologique elle-même; 4) à laver le milieu réactionnel résultant et à le faire incuber avec un anticorps anti-albumine portant un marqueur; 5) à révéler le marqueur par un moyen approprié. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le marqueur est une enzyme, une substance portant un isotope radioactif ou un fluorochrome ou une substance particulaire couplée avec un anticorps antialbumine. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le marqueur est constitué par des globules rouges. 12. Moyen pour la mise en oeuvre du procédé selon llune quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il est constitué par un anticorps anti-albumine couplé avec un marqueur. 13. Moyen selon la revendication 12, caractérisé en ce que le marqueur est une enzyme, une substance portant un isotope radioactif ou un fluorochrome ou une substance particulaire. 14, Coffret de réactif pour le dosage immunologique, caractérisé en ce qu'il comprend 1) un produit de couplage entre une albumine etun ligand spécifique 2) un anticorps anti-albumine portant un marqueur 3) des moyens pour révéler le marqueur.