Brevet FR2519649A1 — publié le 19830718

-1- La présente invention concerne un procédé de pro- duction de tyramine oxydase par une méthode de fermen- tation Plus particulièrement, elle concerne un procédé de production de tyramine oxydase qui comprend la culture d'un micro-organisme producteur de tyramine oxydase appartenant au genre Arthrobacter et l'isolement de la tyramine oxydase à partir du bouillon de culture. La tyramine oxydase a une action spécifique sur la tyramine (phydroxyphényléthylamine) et catalyse une réaction qui produit une mole de p-hydroxybenzaldéhyde, une mole d'eau oxygénée et une mole d'ammoniac à partir d'une mole de tyramine, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau Cette enzyme n'agit pas sur la L-leucyltyramine, et donc est préférable pour diagnostic clinique de l'activité de leucine aminopeptidase (LAP) dans le sérum C'est-à-dire qu'on traite le substrat synthétique Lleucyltyramine par LAP pour libérer la tyramine, qui est oxydée par la tyramine oxydase, puis on mesure l'oxygène consommé ou l'eau oxygénée ou l'ammoniac produits, par des méthodes électriques, colorimétriques ou fluorimétriques classiques, pour déterminer LAP La tyramine oxydase n'agit pas sur le substrat synthétique et agit sur la tyramine seulement et donc on peut mesurer exactement l'activité de LAP. Des procédés de production de tyramine oxydase ont été rapportés dans J Bacteriol, 127 ( 1), 24 31 ( 1976), Igaku to Seibutsugaku (Sciences Médicales et Biologiques, en japonais), 91 ( 4), 233 236 ( 1975), J Bacteriol. ( 2), 796 802 ( 1981) et Agr Biol Chem 31 ( 8), 897 901 ( 1967). La demanderesse a trouvé que la souche de micro- organisme B-0813 appartenant au genre Arthrobacter isolée à partir d'un échantillon de terre recueilli à l'instal- lation d'épuration des eaux d'égout de Kanogawa, Toyo Jozo K.K, Ohito-Cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken, Japon, produit de la tyramine oxydase, et est parvenue à la présente invention. -2- Les propriétés taxonomiques d'Arthrobacter sp B-0813 FERM-P N O 6240 sont les suivantes (I) Propriétés morphologiques L'observation sur une plaque de gélose au bouillon cultivée à 30 'C pendant 6 24 heures est la suivante Les cellules juvéniles après culture pendant 6 heures sont des bâtonnets droits ou légèrement courbes ou des bâtonnets courts avec des bouts ronds, à chaîne unique, double ou courte et ayant des dimensions de 0,4 x 0,5-1,2 Lim. Les cellules âgées après culture pendant 24 heures sont globeuses ou en forme de bâtonnet court avec des bouts ronds, à chaîne unique, double ou courte et ayant des dimensions de 0,4 x 0,4 0,5 gm Les cellules sont à flagelles polaires ou à flagelles subpolaires avec motilité, pas de formation de spores, Gram-positives, quelquefois Gram-négatives selon la durée de culture, et négatives à la coloration d'acido-résistance. (II} Développement sur divers milieux Les observations sur divers milieux après culture à 30 'C pendant là 7 jours sont les suivantes Plaque de gélose au bouillon: Colonie circulaire, à périphérie lisse, plane, humectée, d'un blanc grisâtre à un jaune pâle après culture pendant quelques jours. Culture sur gélose au bouillon inclinée: Bon développement, développement filiforme, d'un blanc grisâtre à un jaune pâle, pas de production de pigment soluble. Milieu au lait BCP: Culture pendant 14 jours avec addition de bleu de bromocrésol; faiblement alcalin, pas de peptonisation coagulante. (III) Propriétés physiologiques Réduction de nitrate: + Réaction de dénitrification - Essai MR: - Essai VP: - Formation d'indole - -3- Formation de H 25: - Hydrolyse de l'amidon: + Utilisation du citrate: Milieu de Simons: + Milieu de Chrystenssen: + Utilisation du nitrate: + Utilisation de l'ammonium: + Formation de pigment soluble: - Uréase: Milieu SSR: - Milieu de Crystenssen: - Oxydase: - Catalase: + p H de développement: 5,5 9,5 1 T Température de développement: 10 42 C Nature: aérobie Essai OF (milieu de Hugh et Leifson: NT (alcalin) Essai OF (milieu modifié): O Milieu modifié: NH 4 H 2 PO 4 1 g, K Cl 0,2 g, Mg SO 4 7 H 20 0,2 g, extrait de levures 1 g, gélose 3 g, BTB (bleu de bromothymol, 10 %) 10 cm, eau distillée 1000 cm 3, p H 7,0. Formation d'acide à partir de sucre (on utilise tant un milieu de base q'un milieu modifié; on n'a pas observé de formation de gaz): Formation d'acide: Cellobiose, D-fructose, D-glucose, glycérol, maltose, D-mannose, mélézitose, tréhalose. Pas de formation d'acide: adonitol, L-arabinose, dulcitol, méso-érythritol, fucose, D-galactose, inositol, inuline, lactose, D-mannitol, raffinose, L-rhamnose, salicine, L-sorbose, sorbitol, amidon, saccharose, D-xylose. Décomposition de l'esculine: - Décomposition de la cellulose: - Les teneurs en guanine et en cytosine dans l'ADN sont de 62,7 % (méthode Tm). -4- D'après les propriétés taxonomiques ci-dessus, la souche B-0813 est: positive à la coloration Gram, mobile par flagelles polaires ou flagelles subpolaires, les cellules juvéniles (culture de 6 heures environ) sont en forme de bâtonnets ou bâtonnets courts avec bords arrondis, droits ou courbes, ayant des dimensions de 0,4 x 0,5 1,2 gm, les cellules âgées (culture de plus de 24 heures) sont en forme de bâtonnets courts ou globeuses, avec des dimensions de 0,4 x 0,4 0,5 Nm, décomposition par oxydation du sucre dans un milieu contenant de la peptone, catalyse positive, oxydase négative et pas d'auxotrophie Comme résultat, par consultation du Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 ème édition ( 19-74), la souche B-0813 appartient au genre Arthrobacter dans les bactéries du groupe des Corynébactéries En conséquence, la souche B0813 est appelée Arthrobacter sp B-0813 et a été déposée à l'Institut de Fermentation, Agence de Technologie Industrielle et de Science, MITI, Japon, sous le N FERM-P 6240 de la collection de cultures permanentes. La souche qui peut être utilisée dans la présente invention est, par exemple, Arthrobacter sp B-0813 FERM-P N 6240 L'invention n'est pas limitée à cette souche, toutefois, car on peut utiliser d'autres souches produc- trices de tyramine oxydase appartenant au genre ci-dessus. Dans un mode de mise en oeuvre préférable de la présente invention, on utilise un milieu comprenant 0,8 % d'huile de soja, 1,0 % de liqueur de macération de mais, 1,0 % d'extrait de viande, 0,5 % de polypeptone, 0,3 % de Na Cl et 0,15 % de bêta-phényl-éthylamine (p H 7,5) et la souche est soumise à des conditions de culture immergée aérobie à 30 C pendant 20 heures La tyramine oxydase s'accumule dans les cellules cultivées. Les propriétés biochimiques de l'enzyme sont les suivantes. ( 1) Action enzymatique: Action sur la tyramine et pas sur la L-leucyltyramine. L'enzyme catalyse une réaction qui forme une mole de phydroxybenzylaldéhyde, une mole d'eau oxygénée et une mole d'ammoniac à partir d'une mole de tyramine, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau. ( 2) Méthode de détermination de l'enzyme: On ajoute une solution d'enzyme ( 0,05 cm 3) à un mélange réactionnel constitué des matières suivantes ( 0,5 cm 3) et on complète à 1,0 cm 3 en ajoutant de l'eau et on fait incuber le mélange à 37 C pendant 10 minutes. On ajoute du chlorure de cétylpyridinium à 1 % ( 2,0 cm, p H 7,0) pour arrêter la réaction. tampon phosphate 0,2 M (p H 7,5) 0,1 cm phénol à 0,2 % 0,1 cm 4aminoantipyrine à 0,3 % 0,1 cm 3 peroxydase (raifort) ( 500 U/cm) 0,1 cm 3 tyramine lm M 0,1 cm 3 ( 0,1 m M) On ajoute de l'eau à la place de la solution d'enzyme comme témoin On mesure le mélange réactionnel à 490 nm. L'activité d'enzyme est calculée par la relation suivante: U/cm 3 A 490 nm x 3 x 1 x f U/cm- x xf 12 x 2 0,05 (cm) 10 (min o A 490 nm estla valeur de l'absorption à A 490 nm pendant 10 minutes et f est le rapport de dilution. ( 3) Poids moléculaire: 48 000 (méthode de filtration sur gel en utilisant Sepharose CL-6 B (nom commercial). ( 4) Point iso-électrique p H 4,23 (électrophorèse en utilisant un ampholyte comme véhicule). ( 5) Valeur de Km: 2,7 x 10-5 M (tyramine) -6- ( 6) p H optimal: On détermine le p H optimal en déterminant l'activité d'enzyme dans un tampon acétate, un tampon glycine-H Cl, un tampon diméthylglutarate-Na OH, un tampon Tris-H Cl, un tampon phosphate et un tampon glycine-Na OH Le p H optimal de l'enzyme est représenté sur la figure 1, o la valeur optimale du p H se trouve approximativement au p H 7,0. ( 7) Température optimale: Le p H du mélange réactionnel dans la méthode de déter- mination est réglé à 7,5 et on effectue la détermination à diverses températures Les résultats sont présentés sur la figure 2, o la température optimale est d'environ 45 C. ( 8) Stabilité-au p H: La solution d'enzyme est ajoutée à des tampons de divers p H de tampon acétate, tampon diméthylglutarate- Na OH, tampon phosphate et tampon Tris-H Cl, mise à incuber à 37 "C pendant 60 minutes et on détermine l'activité restante Le résultat est présenté sur la figure 3, o l'enzyme est stable à un p H de 6 à 8. ( 9) Stabilité à la chaleur: On chauffe l'enzyme au p H 7,5 à 30-70 C pendant 5 minutes dans le mélange réactionnel utilisé dans la méthode de détermination et on détermine l'activité enzyma- tique restante Le résultat est présenté sur la figure 4, o l'enzyme est stable jusqu'à 45 C. ( 10) Effet de diverses substances: L'effet de diverses substances sur l'activité de la tyramine oxydase est présenté dans le tableau suivant. Substance Quantité Activité ajoutée relative (%) Na N 3 5 m M 98,3 Na Mo O 4 " 39,7 KCN " 100,0 NH 4 C 1 " 96,6 Li Cl " 82,8 Co C 12 " 86,2 -7- Substance Quantité Activité ajoutée relative (%) Mn C 12 5 m M 82,8 Ca C 12 " 86,2 Ba C 12 " 96,6 pchloromercuribenzoate (PCMB) 0,2 m M 79,3 EDTA 5 m M 100,0 FMN 0,01 m M 108,8 FAD 0,1 m M 75,4 Chlorure de cétylpyridinium 0,025 m M 0,0 Chlorure de cétyltriméthylammonium 0,025 m M 0,0 Cation FB (nom commercial) 21,3 Laurylbenzène sulfonate (LBS) 0,05 m M 63,9 Bridge 35 (nom commercial) 0, 025 m M 96,7 Triton X-100 (nom commercial) 0,025 m M 96,7 Témoin (pas d'addition) O 100,0 Comme montré ci-dessus, l'addition de flavine mono- nucléotide augmente l'activité de l'enzyme. ( 11) Spécificité pour les substrats: On a mesure la spécificité pour les substrats en ajoutant divers substrats dans le mélange réactionnel. Le résultat est présenté dans le tableau suivant. Substrat Activité relative (%) Tyramine 100,0 Bêta phényléthylamine 54,7 p-chlorophényléthylamine 47,9 n-butylamine 45,3 Méthylamine 0,0 Ethylamine 0,0 Benzylamine 0,0 Amino-acides* 0,0 *Amino-acides: L- tryptophane, valine, phénylalanine, arginine, lysine, histidine, alanine, isoleucine, thréo- nine, sérine, acide aspartique, acide glutamique, méthionine, '19649 -8- tyrosine, acide D-glutamique, D-phénylalanine, D-alanine, DL-isoleucine, DL-valine, DL-tryptophane. Comme montré ci-dessus, l'enzyme de l'invention présente une activité spécifique sur la tyramine, une activité sur la bêta-phényléthylamine, la p-chlorophényl- éthylamine ou la n-butylamine et pas d'activité sur les autres amines et les amino-acides. Les exemples suivants illustrent la présente invention. Exemple 1 Un milieu ( 100 cm, p H 7,5) comprenant 0,8 % d'huile de soja, 1,0 % de liqueur de macération de mais, 0,1 % d'extrait de viande, 1,0 % de polypeptone, 0,3 % de Na C 1 et 0,15 % de bêta-phénylalanine est placé dans un erlenmeyer de 500 cm 3 et stérilisé à 120 C pendant 20 minutes On y inocule Arthrobacter sp B-0813 FERM-P N 6240 et on cultive à 30 C pendant 20 heures pour préparer une culture d'ensemencement Un milieu contenant les mêmes constituants ( 20 litres) avec addition de 0,2 % d'agent antimousse (silicone AF-145, Asahi Chem) est versé dans un fermenteur de 30 litres et on y inocule les deux flacons ci-dessus de culture d'ensemencement, puis on cultive dans des conditions aérobies avec agitation à 250 tpm, aération à 20 litres par minute pendant 20 heures L'activité de tyramine oxydase du bouillon de culture est de 1,3 U/cm 3. Quand on ajoute de la tyramine ou de la butylamine au milieu, on observe une production d'enzyme environ 200 fois plus grande que sans l'addition de ces amines. La quantité de ces amines est de 0,1 0,2 %, de pré- férence 0,15 % La température de culture est généralement de 25 35 C et la durée de culture est de 10 30 heures. Exemple 2 Du bouillon de culture (environ 20 litres, 26 000 U) de l'exemple 1 est centrifugé à 5000 tpm pendant 15 minutes. La matière séparée est lavée avec du tampon phosphate( 20 m M -9- de façon qu'on obtienne des cellules bactériennes On ajoute les cellules dans du tampon phosphate 20 m M (p H 7,5, 4 litres) contenant EDTA ( 5 m M) et de la lysozyme ( 1 mg/cm 3) pour lyse des cellules Après la bactériolyse, le lysat est centrifugé à 5000 tpm pendant 15 minutes de façon qu'on obtienne la solution surnageante On ajoute une solution saturée de sulfate d'ammonium à raison de % en volume à la solution surnageante et on sépare le précipité On ajoute encore de la solution saturée de sulfate d'ammonium de façon à arriver à 90 % en volume par rapport à la solution surnageante initiale Le précipité ainsi formé dans la solution est versé sur une couche de terre d'infusoires (Radiolite, nom commercial), la terre d'infu- soires en suspension dans la solution saturée de sulfate d'ammonium est séparée par filtration à travers un papier- filtre sur un entonnoir de façon qu'on obtienne une couche de terre d'infusoires d'environ 2 cm d'épaisseur et on recueille le précipité en raclant la surface de la couche. On dissout le précipité dans du tampon phosphate 20 m M (p H 7,5, 500 cm), on centrifuge à 5000 tpm pendant 15 minutes La solution surnageante est concentrée au moyen d'une membrane à ultrafiltration XM-50 (Amicon Co) et dépouillée des sels à travers une colonne de Sephadex G-25. L'éluat est chargé sur une colonne ( 7 x 34 cm) de DEAE- Sepharose CL-6 B et élué avec un gradient linéaire de tampon phosphate 20 m M (p H 7,5, 1 litre) et de tampon phosphate 1,0 M (p H 7,5, 1 litre) Les fractions éluées à la concentration de 0,5 0,7 M sont recueillies et con- centrées au moyen d'une membrane à ultrafiltration XM-50. La solution concentrée est dépouillée des sels par fil- tration sur gel à travers une colonne de Sepharose CL-6 B avec du tampon phosphate 20 m M (p H 7,5) On lyophilise l'éluat pour obtenir de la poudre de tyramine oxydase ( 6,7 g, 0,5 U/mg). -10- Les dessins annexés représentent Figure 1: le p H optimal Figure 2: la température optimale Figure 3: la stabilité au p H Figure 4: la stabilité à la température -11- REVENDICATIONS 1 Procédé de production, de tyramine oxydase, caractérisé en ce qu'on cultive un micro-organisme pro- ducteur de tyramine oxydase appartenant au genre Arthrobacter et on isole la tyramine oxydase à partir du bouillon de culture. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est Arthrobacter sp B-0813 FERM-P N 6240. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient de la bêta-phényl- éthylamine.