Brevet FR2512058A1 — publié le 19830304

La présente invention concerne de nouveaux plasmides synthétiques améliorant les capacités d'oxydation des bactéries, notamment du genre Thiobacillus, les plasmides ainsi obtenus, les souches bactériennes transformées par ces plasmides et leur application à la lixiviation des métaux. Les bactéries Thiobacillus ferroxidans sont les principaux microorganismes lixiviant les sulfures métalliques : pyrites et CuS, par exemple, ainsi que les minerais diura- nium. Ce sont des bactéries autotrophes lorsqu'elles croissent en présence d'ions Fe et hétérotrophes lorsqu'elles croissent sur un-milieu organique (par exemple le glucose). I1 existe déjà quelques installations industrielles mettant en oeuvre cette technique de lixiviation bactérienne, essentiellement pour le cuivre (USA) et pour l'uranium (Afrique du Sud, Canada). Les techniques industrielles de lixiviation de l'uranium ont pour but de transformer l'uranium qui est présent dans les minerais sous forme d'oxyde insoluble en sel d'uranium soluble dans l'eau. Le minerai d'uranium contient fréquemment de la pyrite (FeS2) et l'action de Thiobacillus ferroxidans s'exerce de la façon suivante FeS2 + 3/2 02 + H20 FeS04 + H2S04 (1) 2 FeS04 + 1/2 2 + H2S04 T-ferroxidans Fe2(S04)3+H20 (2) et U02 + Fe2(S04)3 U02S04 + 2FeS04 (3) U02S04 est soluble dans l'eau. Iv L'oxydation de UIV à VI L'oxydation de U à U étant plus rapide en présence des bactéries qu'en présence d'ions Fe 3+ seuls, des études récentes suggèrent une action directe de Thiobacillus ferrox-dans sur UIV 2 U02 + 2 + 2 H2 SO4 T-ferroxidans 2 uO2SO4 +2H2O (4) En utilisant les capacités oxydantes de cette bactérie 85% de l'uranium d'un minerai pauvre (200 à 300 ppm d'uranium) peuvent être lixiviés en 20 semaines. Si le minerai est plus finement broyé, (dimension particulaire : 0,8 à 1,2mm) en 9 semaines 60 à 70 % de l'uranium peuvent être lixiviés par les bactéries. La réaction (2) est la base du procédé de lixiviation bactérien de l'uranium. De façon à rendre ce procédé économiquement plus intéressant, la phase de latence dans l'oxydation de Fe en Fe doit être aussi courte que possible, et le temps de demi-vie de la réaction doit être aussi bref que possible. En utilisant le procédé Bacfox, (E. Livesey-Goldbatt, T.H. Tunley, at I.F. Nagy : Bacterial Leaching, Proc. of a Conference held in Brunschweig-Stockheim, ed. W. Schwartz, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1977, pp. 175-190) il est possible d'obtenir une oxydation rapide Fe 2+ de Fe2+ après un temps de latence de 48 h. Dans ces conditions en 6 jours, on peut obtenir une vitesse d'oxydation de 7,5 g de Fe2+/m2 de surface bactérienne par heure. L'objet de l'invention est d'améliorer les capacités oxydantes des T-ferroxidans en diminuant le temps de latence et en augmentant la vitesse d'oxydation. La présente invention repose sur la découverte que les capacités d'oxydation des bactéries T-ferroxidans sont codées par un ou plusieurs gènes qui se trouvent disposés sur un plasmide. Ces gènes seront dénommés ci-après "gènes codants pour l'activité d'oxydation des métaux. Le plasmide en cause a été nommé pBPl et il présente une dimension de l'ordre de 5 KB. La présente invention concerne des plasmides synthétiques incorporant tout ou partie des genes codants pour l'activité oxydante et qui sont portés notamment par le plasmide pBPl mentionné précédemment. C'est pourquoi la présente invention concerne un plasmide synthétique susceptible d'augmenter l'activité oxydante pour les métaux d'une bactérie en particulier du genre Thiobacillus caractérisé en ce qu'il comporte - au moins un fragment d'ADN bactérien provenant d'un plasmide vecteur susceptible de se multiplier dans ladite bactérie et d'un fragment d'ADN comportant les genes codants pour l'activité d'oxydation des métaux. Parmi les plasmides vecteurs utilisables dans le procédé selon la présente invention, il faut mentionner plus particulièrement les plasmides susceptibles de se multiplier dans les bactéries du genre Thiobacillus tels que pTL 12 et pHV 23 décrits respectivement dans T. Tanaka and N. Kawano : Gene 10, 131-136, 1980, et B. Michel, E. Palla, B. Niaudet, a. S.D. Ehrlich : gene 12, 147-154, 1980. Par plasmide synthétique on entend désigner un plasmide non naturel obtenu par des techniques de génie génétique en particulier par ligation des fragments d'ADN adéquats. La technique de ligation utilisée peut être l'une quelconque de celle utilisée en génie génétique. Elle consiste en général à lier - les fragments d'ADN préalablement obtenus par digestion d'un plasmide portant les gènes codants pour l'activité d'oxydation des métaux par une endonuclease de restric tion, et - les fragments d'ADN obtenus par digestion d'un plasmide vecteur, en présence d'une ligase. Les plasmides selon l'invention peuvent être séparés par une "sélection" à partir des mélanges de ligation en mettant en oeuvre la capacité oxydante de bacilles transformés par les plasmides obtenus. La présente invention concerne également les bactéries transformées par les plasmides selon l'invention et en particulier les Thiobacillus, notamment T.ferroxidans transformés. L'invention concerne également l'application de ces bacilles à l'oxydation des métaux et en particulier au lessivage des minerais notamment de cuivre, d'uranium et de manganèse. Les exemplés suivants sont destinés à illustrer certaines caractéristiques et avantages de la présente invention mais ne la limitent en aucune façon. EXEMPLE 1 : Préparation des plasmides selon l'invention. Des échantillons de plasmide pBP1 isolés d'une souche de Thiobacillus ferroxidans sont mis à digérer séparément avec sept enzymes de restriction Bam HI, Eco RI, Hpa I, Kpn I, Pst I, Sal I et Xba I. D'un autre côté, des échantillons des plasmides avec les mêmes enzymes, les enzymes en question ont été choisies car les plasmides vecteurs ne possèdent qu'un seul rite de restriction correspondant pour chacune de ces enzymes. Avant ligation les morceaux de restriction sont traités avec du phosphate de sodium On effectue ensuite la ligati9n des différents fragments d'ADN de pB1 et des plasmides vecteurs par les procédés connus du génie génétique. On obtient ainsi un ensemble de plasmides qu'il faut sélectionner. EXEMPLE 2 : Isolation de cellules transformées. On effectue la transformation, par des procédés connus, d'une souche E. Coli rec A-600. Les souches E. Coli transformées sont sélectionnées sur plaque d'agar LB contenant de l'ampicilline (les plasmides pTL 12 et pHV 23 confèrent le phenotype Amer). L'identification des clones bactériens est effectuée par hybridation en utilisant une sonde marquée au p32. Chaque clone E. Coli est purifié et les plasmides hybrides des différents clones sont comparés l'un à l'autre en utilisant "l'essai rapide pour l'isolation des plasmides" décrits dans H.C. Birnboisn et J. Doly Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523, 1979. Chacun des plasmides est utilisé, après purification dans CsC12, pour transformer une souche de T.ferroxidans. La sélection des transformants de T.ferroxidans est effectuée sur milieu minimum (comme indiqué dans l'article de E. Livesey-Goldblatt et al) contenant de l'ampicilline et un indicateur de pH (rougecresol ; pH : 0-1,7). EXEMPLE 3 : Détermination de l'activité oxydante. Le procédé mis en oeuvre pour déterminer l'activité oxydante est celui décrit par Livesey-Goldblatt et col. Les souches de T.ferroxidans sont cultivées sur solution de Silverman 9K (Silverman M.B. et Lungden D.G, Journal of Bacteriology 77, 642 - 1959), contenant 30 g/l de (NH 2 8,5 g/l de Fe à pH 1,7. Les souches sont incubées à 340C. La figure annexee représente les résultats du pourcentage d'oxydation de Fe2+ en Fie3+ en fonction du temps en heure. La courbe a) représente l'activité de la souche sauvage de T.ferroxidans et également de souches transformées avec pTL 12 et pHV 23, qui donnent des résultats équivalents. La courbe b) représente l'activité d'une souche de T.ferroxidans transformée par un plasmide selon la présente invention comportant l'ADN du plasmide vecteur pTL 12 nommé pNH1. La courbe c) représente l'activité d'une souche de T.ferroxidans transformée par un plasmide selon l'invention comportant 1'ADN du plasmide vecteur pHV 23 nommé pNH2. La courbe b) montre un temps de latence diminuée (20 heures) par rapport à la souche sauvage. Mais le courbe c) qui ne montre pas de reduction significative du temps de latence (35 heures) montre par contre une oxydation beaucoup plus rapide que celle de la souche sauvage. Ainsi, on constate une amélioration très nette de l'oxydation de Fe2+ grâce aux souches selon la présente invention. REVENDICATIONS 1. Plasmide synthétique caractérisé en ce qu'il comporte au moins un fragment d'ADN bactérien provenant d'un plasmide vecteur et un fragment d'ADN comportant les gènes codants pour l'activité d'oxydation des métaux. 2. Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le plasmide vecteur est un plasmide se multipliant dans les souches bacteriennes du genre Thiobacillus. 3. Plasmide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le fragment d'ADN du plasmide vecteur porte un gène de résistance à un antibiotique. 4. Plasmide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le fragment d'ADN comportant les gènes codants pour l'activité d'oxydation des métaux est obtenu par clivage enzymatique du plasmide naturel pBP1. 5. Plasmide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le plasmide vecteur est choisi parmi pTL 12 et pHv 23. 6. Plasmide synthétique selon la revendication 5, choisi parmi pNHl et pNH2. 7. Bactérie transformée par un plasmide selon l'une des revendications 1 à 6. 8. Bactérie selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un Thiobacillus. 9. Bactérie selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un T.ferroxidans. 10. Application des bactéries selon l'une des revendications 7 à 9 à l'oxydation des métaux. 11. Application selon la revendication 12 à la lixiviation des minerais métalliques. 12. Application selon la revendication 11, caractérisée en ce que les minerais sont des minerais de cuivre ou d'uranium et de manganèse.