Brevet FR2521589A1 — publié le 19830819

me La présente invention se rapporte à un procédé pour la détermination quantitative de composants physiolo- giques dans des fluides biologiques Plus particulièrement, elle se rapporte à un procédé pour la détermination quanti- tative de composants physiologiques spécifiques contenus dans des fluides biologiques en utilisant de la bilirubine oxydase seule ou en supplément La présente invention se rapporte, en outre, au même procédé que cidessus mais en utilisant la laccase. La bilirubine oxydase mentionnée ci-dessus est une nouvelle enzyme En conséquence, l'enzyme est d'abord expliquée avec quelques détails. La bilirubine (C 33 H 36 N 406) est un pigment présent dans des fluides biologiques tels que le sérum du sang, l'urine, etc On a indiqué jusqu'à présent qu'une enzy- me présente dans le cerveau de rats ou de cochons d'Inde et une enzyme produite par-un champignon du genre Agaricus agissaient sur la bilirubine Cependant, les propriétés enzymologiques de ces enzymes n'ont pas encore eté expli- quées. Durant une recherche pour trouver des microorga- nismes qui produisent une enzyme capable d'agir sur la bi- lirubine, la demanderesse a trouvé que certains microorga- nismes appartenant aux genres Myrothecium et Coprinus pro- duisaient une enzyme qui oxydait la bilirubine Ces micro- organismes du genre Myrothecium comprennent, par exemple, le Myr verrucaria MIT-1 (FERM-P 5918), qui a nouvellement été isolé par la demanderesse, et des cultures types telles que le Myr verrucaria IFO 6113, IFO 6133, IFO 6351 et IFO 9056; le Myr cinctum IFO 9950; le Myr roridum IFO 9531 etc, Ces microorganismes du genre Coprinus comprennent, par exemple, des cultures types telles que le Cop cinereus IFO 8371, le Cap lagopides IFO 30120, etc. Pour préparer l'enzyme en utilisant un microorga- nisme du genre Myrothecium ou Coprinus, le microorganisme est cultivé d'une manière routinière par culture immergée et le filtrat de bouillon de culture est relargué par addi- tion de sulfate d'ammonium Les précipités ainsi formés sont dissous dans de l'eau désionisée, cette solution étant alors dialysée La solution à dialyse interne est, après décolo- ration avec du charbon activé, soumise à la chromatographie sur colonne et ses fractions actives rassemblées sont lyo- philisées pour obtenir une préparation pulvérulente Par ana- lyse par électrophorèse sur disque, on a montré que, d'après la préparation, la protéine enzymatique formait une seule bande qui coïncidait, par sa position, avec l'activi- té d'enzyme. La préparation d'enzyme ainsi obtenue a été recon- nue comme étant de la bilirubine oxydase qui oxydait la bili- rubine en biliverdine (C 33 H 34 N 406) par un accepteur d'élec- trons d'oxygène moléculaire L'enzyme est aussi caractéri- sée par le fait qu'il n'y a pas de formation d'eau oxygénée au cours de l'oxydation Les propriétés enzymologiques de la bilirubine oxydase sont décrites ci-dessous, en prévoyant que les autres valeurs qui sont jointes, avec des parenthè- ses,représentent celles de l'enzyme ayant pour origine le genre Coprinus, ( 1) Spécificité de substrat: en plus de la bilirubine, l'enzyme agit sur la chlorophylline et l'hémine, mais n'agit pas sur l'hémoglobine, la chlorophylle et la vitamine B 12. 2. ( 2) Stabilité à la température: une activité de plus de 90 % est conservée à 50 C,alors que l'activité à % est perdue à 70 C. ( 3) Température optima: 40 C ( 30 C) ( 4) Stabilité de p H: p H 6-10 (p H 5-9) ( 5) p H optimum: p H 8 ( 6) Poids moléculaire: approximativement 52 000 ( 7) Point isoélectrique: 4,1 ( 3,8) ( 8) Effet des ions métalliques: Inhibée nettement par Fe++ mais pas affectée par les autres ions métalliques ( 9) Inhibiteurs z cyanure de potassium, azothydrure de so- dium et thiourée. ( 10) Absorption de lumière visible: une solution d'enzyme à 1 % ne présente pas de maximum d'absorption au voisi- nage de 375 nm et de 460 nm ( 11) Teneur en sucre: approximativement 7,8 % sous forme de glucose ( 12) Teneur en cuivre: 1 mole de cuivre par mole d'enzyme. En plus de la bilirubine oxydase comme expliqué ci- dessus, la demanderesse a réalisé, en outre, des études sur un grand nombre d'enzymes classiques Ainsi, elle a examiné si les enzymes avaient ou non l'aptitude à oxyder la biliru- bine en biliverdine sans formation d'eau oxygénée Par sui- te, elle a trouvé que la laccase, la tyrosinase et l'ascor- bate oxydase avaient cette aptitude à l'oxydation, et, parmi elles, la laccase a été préférée Des préparations actuel- lement disponibles de laccase comprennent celles provenant d'une plante dite laqueur (Rhus verniciflua) et de matières cultivées d'un basidiomycete,par exemple Polypores versi- color IFO 9791 lvoir Biochimica et Biophysica Acta, 30, 44 ( 1959); Acta Chemica Scandinavica, 21, 2367 ( 1967)l ces deux genres de préparations ayant l'aptitude à oxyder la bi- lirubine en biliverdine. La présente invention concerne maintenant un pro- cédé pour la détermination quantitative de composants phy- siologiques spécifiques contenus dans des fluides biologi- ques en utilisant la bilirubine oxydase ayant été préparée comme ci-dessus ou la laccase classique Les composants phy- 3. siologiques qui peuvent être déterminés par le procédé de la présente invention comprennent la bilirubine, le gluco- se, le cholestérol, des graisses neutres, des acides gras libres, des phospholipides et l'acide urique Plus spécifi- quement, selon une caractéristique de la présente inven- tion, on prévoit un procédé pour la détermination quantita- tive de bilirubine contenue dans des fluides biologiques en utilisant la bilirubine oxydase ou la laccase Selon une autre caractéristique de la présente invention, on prévoit un procédé pour la détermination quantitative de composants physiologiques tels que le glucose, le cholestérol, les graisses neutres,les acides gras libres, les phospholipi- des et l'acide urique, tous contenus dans les fluides bio- logiques, en utilisant la bilirubine oxydase ou la laccase, ainsi que les réactifs pour l'emploi dans le procédé clas- sique pour la détermination de ces composants physiologi- ques. La présente invention sera maintenant expliquée en relation avec les dessins ci-joints dans lesquels: La figure 1 illustre la courbe de calibrage obte- nue dans l'exemple 1, qui sera donné ultérieurement, la courbe représentant la relation entre la concentration de bilirubine et la capacité d'absorption (diminution de ca- pacité d'absorption); La figure 2 illustre la courbe de calibrage obte- nue dans l'exemple 4, qui sera donné ultérieurement, la courbe représentant la relation entre la concentration de glucose et la capacité d'absorption; La figure 3 illustre la courbe de calibrage obte- nue dans l'exemple 6,qui sera donné ultérieurement, la courbe représentant la relation entre la concentration de cholestérol et la capacité d'absorption; La figure 4 illustre la courbe de calibrage obte- nue dans l'exeple 7 qui sera donné ultérieurement, la courbe représentant la relation entre la concentration de trioléine et la capacité d'absorption; La figure 5 illustre la courbe de calibrage obte- nue dans l'exemple 9, qui sera donné ultérieurement, la 2521589 courbe représentant la relation entre la concentration d'acide oléique et la capacité d'absorption; et La figure 6 illustre la courbe de calibrage obte- nue dans l'exemple l O,qui sera donné ultérieurement, la courbe représentant la relation entre la concentration de chlorure de choline et la capacité d'absorption. En premier lieu, comme décrit ci-dessus, selon une caractéristique de la présente invention, on prévoit un procédé pour la détermination quantitative de bilirubi- lo ne dans des fluides biologiques Ce procédé est expliqué ci-dessous. La bilirubine n'est pas présente de manière inhé- rente à l'état libre dans les fluides biologiques, mais pré- sente sous la forme de bilirubine dite conjuguée (c'est-à- dire bilirubine combinée à l'acide glucuronique,à l'acide sulfurique, à l'acide chlorhydrique ou analogues) ou de bilirubine dite non conjuguée du foie et analogues En conséquence, on considère comme né- cessaire de déterminer différentiellement la bilirubine à la fois conjuguée et non conjuguée par suite de la médeci- ne clinique. La détermination différentielle de bilirubine a, jusqu'à présent, été conduite par un procédé chimique dans lequel la bilirubine est mise à réagir avec un réactif dia- zolque pour former l'azobilirubine dont la coloration vio- let-rougeâtre est alors déterminée par voie colorimétrique. Cependant, le procédé a les inconvénients d'exiger des pérations ennuyeuses et manquant de précision. La demanderesse a étudié la réactivité de la bi- lirubine oxydase, ainsi que celle de la laccase avec la bilirubine présente dans les fluides biologiques et a trou- vé que ces enzymes,quand on les utilisait seules, pouvaient agir principalement sur la bilirubine conjuguée, alors qu'elles n'avaient pas d'effet ou un faible effet sur la bilirubine non conjuguée Plus spécifiquement, la bilirubi- ne oxydase, ayant été produite par un microorganisme du gen- re Myrothecium, n'a pas d'effet sur la bilirubine non con- juguée, alors que la bilirubine oxydase produite par un mi- croorganisme du genre Coprinus et la laccase ont un faible effet sur la bilirubine non conjuguée. D'autre part,la demanderesse a aussi trouvé que, lorsque-la réaction des enzymes avec la bilirubine dans un fluide biologique a été réalisée en présence d'au moins un additif choisi parmi des agents tensio-actifs, des acides carboxyliques aromatiques, des produits pharmaceutiques à ba- se de sulfamides et des protéases, ces enzymes pouvaient agir non seulement sur la bilirubine conjuguée mais aussi sur la bilirubine non conjuguée, probablement parce que la liaison entre l'albumine et la bilirubine dans la bilirubine non conjuguée aurait été affaiblie. Par suite des découvertes mentionnées ci-dessus de la demanderesse, on indique que la bilirubine conjuguée pré- sente dans un fluide biologique pourra être déterminée en utilisant la bilirubine oxydase produite par un microorga- nisme du genre Myrothecium seul, alors que la bilirubine to- tale, c'est-à-dire la somme de la bilirubine conjuguée et non conjuguée, toutes deux présentes dans le fluide biologi- que,pourra être déterminée en utilisant la bilirubine oxyda- se ou la laccase avec l'additif Le niveau de bilirubine non conjuguée peut facilement être calculé en soustrayant le premier du dernier. Le présent procédé pour la détermination différen- tielle de bilirubine dans les fluides biologiques est-plus spécifiquement expliqué dans ce qui suit; d'abord, sensi- blement, de la même manière que dans le procédé chimique classique en utilisant un réactif diazolque, chacune des solutions aqueuses debilirubine cristalline disponible dans le commérce,ayant diverses concentrations, est mise à réagir avec de la bilirubine oxydase produite par un micro- organisme du genre Myrothecium Pour chacun des mélanges réac- tionnels résultants, la diminution de capacité d'absorption à une longueur d'onde de 440 nm ou l'augmentation de capa- cité d'absorption à une longueur d'onde de 330 ou 380 nm est mesurée Les valeurs mesurées sont portées graphique- ment en fonction des concentrations correspondantes des solutions de bilirubine pour construire une courbe dite de calibrage représentant la relation entre elles Alors, un échantillon de fluide biologique ayant-une concentration inconnue en bilirubine, est amené à réagir avec la biliru- bine oxydase produite par un microorganisme du genre Myro- thecium,et la diminution ou l'augmentation de capacité d'absorption du mélange réactionnel résultant est mesurée. La concentration de bilirubine conjuguée dans l'échantil- lon peut être calculée en comparant la valeur mesurée avec la courbe de calibrage. Les mêmes modes opératoires que ci-dessus sont conduits, sauf que la bilirubine oxydase ou la laccase avec l'additif sont utilisés à la place de la bilirubine oxyaase seule produite par un microorganisme du genre Myro- thecium Ainsi, on construit de manière semblable la cour- be de calibrage, et la concentration totale de bilirubine dans l'échantillon peut être calculée à partir de la va- leur mesurée de capacité d'absorption et la courbe de cali- brage. Dans le procédé de détermination de la bilirubine totale selon la présente invention, on peut utiliser la bilirubine oxydase d'origine du genre Myrothecium ou d'ori- gine du genre Coprinus De manière semblable, la laccase provenant de la plante dite laqueur ou de matières culti- vées d'un basidiomycete peut être utilisée Des exemples spécifiques de l'additif comprennent des agents tensio- actifs, tels que des esters d'acides gras de saccharose,le cholate de sodium, l'acide taurocholique, le dodécylsul- fate de sodium, l'acide p-toluènesulfonique, le chlorure de cétylpyridinium, l'éthoxylate de nonylphénol et un con- densat polyéthylène-polyoxypropylène; des acides carboxy- liques aromatiques tels que l'acide salicylique et l'acide sulfosalicylique; des produits pharmaceutiques à base de sulfamides, tels que la sulfanilamide et le sel de sodium 7, 2.2521589 d 3 acétosulfamine; et des protéases telles que le produit dit Pronase P (marque déposée; fabriqué par la société di- te Kaken Chemical Co) Parmi ces composés, le cholate de so- dium, l'acide taurocholique, le dodécylsulfate de sodium, l'acide ptoluènesulfonique, l'acide salicylique et llaci- de sulfosalicylique sont préférés Dans le procédé de dé- termination différentielle de hilirubine selon la présente invention, on peut encore utiliser des tampons, des stabili- sants d'enzyme et analogues, si cela est nécessaire. La quantité d'enzyme pour l'utilisation dans le procédé pour la détermination différentielle de bilirubine est telle que sa concentration dans le mélange réactionnel soit égale à 0,003 à 0,40 U/ml pour la bilirubine oxydase ou 0,06 à 7,0 U/ml pour la laccase comme expliqué par l'activité de bilirubine oxydase dont la définition sera donnée ultérieurement Les quantités d'additifs à utiliser sont comme suit: le dodécylsulfate de sodium est utilisé en quantité telle qu'il donne une concentration de 0,5 à 10 m M dans le mélange réactionnel et le cholate de sodium est uti- lisé en quantité telle qu'il donne une concentration de 2 à m M dans le mélange réactionnel. L'unité d'activité de bilirubine oxydase est défi- nie comme suit: cinq mg de cristaux de bilirubine sont dis- sous dans 250 ml d'une solution tampon tris-H Cl 0,2 M (p H 8,4) contenant de l'acide éthylènediaminetétracétique ( 1 Mm). Une partie de 2 ml de cette solution est mélangée avec 0,2 ml d'une solution d'enzyme, Le mélange est soumis à l'incu- bation à 371 C et sa diminution de capacité d'absorption à 440 nm est alors mesurée Ainsi, la quantité d'enzyme qui oxyde une micromole de bilirubine par minute est définie comme étant une unité. Ensuite, comme décrit ci-dessus, selon une autre caractéristique de la présente invention, on prévoit un pro- cédé pour la détermination quantitative de composants physio- logiques tels que du glucose, du cholestérol, des graisses neutres, des acides gras libres, des phospholipides et de l'acide urique, tous étant contenus dans des fluides biologi- ques Ce procédé est expliqué ci-dessous. Des procédés analytiques pour la détermination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques en utilisant une enzyme d'oxydation (par exem- ple la glucose oxydase, la cholestérol oxydase, l'uricase, l'acylcoenzyme A oxydase, la choline oxydase, la glycérol- 3-phosphate oxydase ou analogues) ont été jusqu'à présent suivis dans le domaine de la chimie clinique Selon ces pro- cédés, l'eau oxygénée produite à partir d'un composant phy- siologique intéressant est décomposée et la capacité d'ab- sorption du mélange réactionnel est alors mesurée La va- leur mesurée est comparée à la courbe de calibrage qui a été préalablement construite en utilisant le composant physiologique sous forme pure, et, de ce fait, la concentra- tion du composant physiologique dans le fluide biologique est calculée Cependant, ces procédés pour la détermination des composants physiologiques ont été soumis à une interfé- rence par les composants physiologiques autres que celui indiqué cidessus coexistant dans le fluide biologique La bilirubine est une de ces substances interférantes pour ces 2 Q procédés, et' bien que sa concentration dans le sérum san- guin ne soit pas supérieure à 1 mg/dl dans les hommes en bon- ne santé,elle augmente jusqu'à une valeur s'élevant à 20 mg/ dl dans des états pathologiques Ainsi, on a proposé jus- qu'à présent un certain nombre de procédés pour empêcher la bilirubine d'interférer avec la détermination de composants physiologiques A titre d'exemple, ceci a été effectué en ajoutant au système réactionnel un ferrocyanate, de l'acide ascorbique, un complexe d'EDTA-(acide éthylènediaminetétra- cétique)-fer ou une préparation dite d'enzyme fongique spé- cifique bilirubine (voir demande de brevet japonais pu- bliée N O 25840/80; brevet japonais mis à la disposition du public N O 29718/80, N O 71398/82 et N O 151193/79) Cependant, ces techniques antérieures avaient respectivement leurs pro- pres inconvénients et ne pouvaient pas être considérées com- me étant totalement satisfaisantes. La demanderesse a maintenant trouvé que, dans les procédés classiques pour la détermination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques en 9,. 2.521589 10. utilisant des enzymes oxydantes comme décrit ci-dessus, l'addition de bilirubine oxydase ou de laccase, ainsi que de l'additif, au système réactionnel amenait la bilirubine conjuguée et non conjuguée coexistant toutes deux dans des fluides biologiques à être totalement oxydée en une subs- tance non nocive, c'est-à-dire la biliverdine, sans forma- tion d'eau oxygénée, et qu'on empêchait ainsi la bilirubine d'interférer avec la détermination de composants physiolo- giques On a cependant vu ainsi que les substances dites productrices de couleur (par exemple la 4-aminoantipyrine, le phénol) contenues dans les réactifs pour l'utilisation dans les procédés classiques pour la détermination de compo- sants physiologiques réagissaient suivant une certaine pro- portion avec la bilirubine oxydase ou la laccase ajoutée, entraînant un certain inconvénient dans l'étape de mesure de la capacité d'absorption Pour ces inconvénients, la de- manderesse a trouvé, en outre, qu'on pouvait les supprimer en ajoutant:du fluorure de sodium, de la phénanthroline ou de l'hydroxylamine au système réactionnel. Le présent procédé pour la détermination quantita- tive de composants physiologiques, c'est-à-dire le glucose, le cholestérol, les graisses neutres, les acides gras libres, les phospholipides et l'acide urique) dans des fluides bio- logiques est plus spécifiquement expliqué dans ce qui suit d'abord, sensiblement de la même manière que dans le prodédé classique pour la détermination d'un composant physiologi- que intéressant, chacune des solutions du composant sous forme pure (cristaux, poudre ou huile), ayant diverses con- centrations,est mise à réagir avec les réactifs (comprenant une enzyme d'oxydation) pour l'utilisation dans le procédé classique de la détermination du composant, en présence de bilirubine oxydase ou de laccase avec l'additif ainsi que, si cela est nécessaire, du fluorure de sodium, de la phénén- throline ou de l'hydroxylanine Ensuite, la capacité d'ab- sorption de ce mélange réactionnel est mesurée Les valeurs mesurées sont portées graphiquement en fonction des concen- * trations correspondantes du composant pour construire une courbe de calibrage représentant la relation entre elles. 11. Ensuite, un échantillon de fluide biologique ayant une concentration inconnue en composant est soumis à une réaction de la même manière que ci-dessus et la capaci- té d'absorption du mélange réactionnel est mesurée La concentration du composant dans l'échantillon peut être cal- culée en comparant la valeur mesurée avec la courbe de cali- brage. Parmi les composants physiologiques à évaluer dans le présent procédé,les graisses neutres, les acides gras libres et les phospholipides sont exprimés, comme on le verra dans les exemples suivants, sous forme de trioléine, d'acide oléique et de chlorure de choline, respectivement, comme cela est courant dans ces cas là Les composants phy- siologiques à évaluer dans le présent procédé sont tous dis- ponibles dans le commerce sous n'importe quelle forme de cristaux, de poudre ou d'huile, et ces préparations commer- ciales ont été utilisées pour la construction des courbes de calibrage respectives dans les exemples. Dans les procédés pour la détermination de omposants phy- siologiqoes selon la présente invention, on peut utiliser la bilirubine oxydase ayant pour origine le genre Myrothecium ou ayant pour origine le genre Coprinus De manière semblable, la laccase ayant pour ori- gine une plante dite laqueur ou des matières cultivées d'un basidiomycete peut être utilisée Les exemples spéàifi- ques de l'additif sont les mêmes que ceux préalablement énu- mérés en relation avec le procédé pour la détermination de la bilirubine totale dans les fluides biologiques La quan- tité de bilirubine oxydase ou de laccase, ainsi que les quantités d'additif, toutes deux pour l'utilisation dans le présent procédé, peuvent être également les mêmes que cel- les préalablement décrites en relation avec le procédé pour la détermination de bilirubine totale dans les fluides bio- logiques Le fluorure de sodium, la phénanthroline ou l'hy- droxylamine est utilisé en quantité qui donnera une concen- tration de 0,5 à 10 m M dans le mélange réactionnel. La présente invention est en outre illustrée par les exemples suivants Cependant, ces exemples ne doivent pas être interprétés comme limitant le domaine de protec- 12, tion de l'invention. EXEMPLE 1 Détermination de bilirubine conjuguée A 0,1 ml de chacune des solutions aqueuses de 0, 2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 15,0 et 20,0 mg % de bilirubine (cristaux), on a ajouté 3 nml d'une solution tampon de tris-H Cl 0,1 M (p H 8, 4) contenant de la bilirubine oxydase d'origine Myrothecium ( 0,1 U/ml) Les mélanges résultants ont été soumis à l'incubation à 37 'C pendant 30 minutes et leurs diminutions de capacité d'absorption à 440 nm ont été mesu- rées Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement en fonction des concentrations correspondantes des solutions de bilirubine pour obtenir une courbe de calibrage (figure 1). Alors, 0,1 ml d'un échantillon de sérum sanguif* ayant une concentration inconnue en bilirubine (tombant dans la gamme de O à 20 mg %; ci-après, c'est toujours la même chose), a été mis à réagir de la même manière que celle dé- crite ci-dessus, et la diminution de capacité d'absorption du mélange réactionnel résultant a été mesurée En compa- rant la valeur mesurée à la courbe de calibrage de la figu- re 1, la concentration de bilirubine (conjuguée) dans l'échantillon a été calculée à 2,8 mg %. EXEMPLE 2 -Détermination de bilirubine totale A 0,1 ml de chacune des solutions aqueuses de 0, 2,5, 5,0, 7,5, 10,0,15,0 et 20,0 mg % de bilirubine (cris- taux), on a ajouté 3 ml d'une solution tampon contenant de la bilirubine oxydase d'origine Myrothecium ( 0,1 U/ml) et du cholate de sodium ( 14 m M) Les mélanges résultants ont été soumis à l'incubation à 37 C pendant 30 minutes et leurs diminutions de capacité d'absorption à 440 nm ont été mesu- rées Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement en fonction des concentrations correspondantes des solutions de bilirubine et, de ce fait on a obtenu une courbe de calibra- ge tout à fait semblable à celle de la figure 1. Ensuite, 0,1 ml d'un échantillon de sérum sanguin, ayant une concentration inconnue en bilirubine, a été mis à 13. réagir de la même manière que décrite ci-dessus,et la dimi- nution de capacité d'absorption du mélange réactionnel ré- sultant a été mesurée En comparant la valeur mesurée à la courbe de calibrage de la figure 1, la concentration (to- tale) de bilirubine dans l'échantillon a été calculée à ,2 mg %. EXEMPLE 3 Détermination de bilirubine totale Le mode opératoire de l'exemple 2 a été répété, sauf o 10 que de la bilirubine oxydase d'origine Coprinus ( 3 m U/ml), de la laccase d'origine Polyporus ( 0,1 m U/ml) ou de la lac- case provenant de la plante dite laqueur ( 1 m U/ml) a été utilisée à la place de la bilirubine oxydase d'origine My- rothecium Par suite, une courbe de calibrage semblable à ce 11 j Vde la figure 1 a été obtenue dans tous les cas La quantité de bilirubine totale dans l'échantillon de sérum sanguin était estimée respectivement à 5,3 mg %, 5,2 mg % et 5,1 mg %. EXEMPLE 4 Détermination de glucose dans le sérum sanguin A 0,02 ml de chacune des solutions aqueuses de 0, , 200 et 400 mg % de glucose, on a ajouté 3 ml d'une solution de tampon phosphaté 0,1 M (p H 7,5) contenant les réactifs pour l'utilisation dans le procédé classique pour la détermination de glucose dans les fluides biologiques, c'est-à-dire la 4-aminoantipyrine ( 0,4 m M), le phénol ( 15 m M), la glucose oxydase ( 17 U/ml) et la peroxydase ( 0,3 U/ml),ainsi que de la bilirubine oxydase d'origine Myrothe- cium ( 0,1 U/ml) et du cholate de sodium ( 14 m M) Les mélan- ges résultants ont été soumis à l'incubation à 37 C pendant minutes et leur capacité d'absorption à 505 nm ont été mesurées Les valeurs mesurées ont été portées graphique- ment en fonction des concentrations correspondantes des so- lutions de glucose pour obtenir une courbe de calibrage (figure 2). Ensuite, 0,02 ml d'un échantillon de sérum sanguin ayant une concentration inconnue -n glucose (et une concen- tration totale en bilirubine de 12,5 mg %) a été soumis à la réaction de la même manière que celle décrite ci-dessus, et la capacité d'absorption du mélange réactionnel résul- tant a été mesurée En comparant la valeur mesurée à la cour- be de calibrage de la figure 2, la concentration de gluco- se dans l'échantillon a été calculée à 96,1 mg % Comme test de contr 81 e, le mode opératoire ci-dessus a été répété, sauf que l'addition de bilirubine oxydase et de cholate de sodium a été supprimée et, de ce fait, la quantité de glu- cose dans l'échantillon a été estimée à 90,2 mg % Le mode opératoire a été répété une fois de plus, mais du fluorure de sodium ( 1 m M) a été utilisé comme réactif supplémentaire dans ce cas Bien que la forme de la courbe de calibrage et la quantité estimée de glucose dans l'échantillon soient non modifiées par rapport à celles obtenues dans le présent exemple; la valeur expérimentale du témoin était si faible que cela était convenable pour la mesure des capacités d'absorption des mélanges réactionnels. EXEMPLE 5 Détermination de glucose dans le sérum sanguin Le mode cpératoire de l'exemple 4 a été répété,sauf que de la bilirubine oxydase d'origine Coprinus ( 3 m M/ml), de la laccase d'origine Polyporus ( 0,1 m U/ml), ou de la lac- case ayant pour origine la plante dite laqueur ( 1 m U/ml) a été utilisée à la place de la bilirubine oxydase d'origine Myrothecium Par suite, une courbe de calibrage semblable à celle de la figure 2 a été obtenue dans tous les cas La quantité de glucose dans l'échantillon de sérum sanguin a été estimée a 95,8 mg %, 96,2 mg % et 95,9 mg %, respectivement. EXEMPLE 6 Détermination de cholestérol total dans le sérum sanguin A 0,02 ml de chacune des solutions, dans le dioxa- ne, de 0, 100, 200 et 400 mg % de cholestérol (cristal), on a ajouté 3 ml d'une solution de tampon phosphaté 0,1 M (p H 7,5) contenant les réactifs pour l'utilisation dans le procédé classique pour la détermination de cholestérol to- tal dans les fluides biologiques, c'est-à-dire la 4-amino- antipyrine ( 0,4 m M), le phénol ( 15 m M), la cholestérol esté- r.ase ( 1 U/ml), la cholestérol oxydase ( 2 U/ml), la peroxyda- 14. 15. se ( 6,0 U/ml) et le produit dit Triton X-100 lmarque dépo- sée; fabriqué par la société dite Wako Pure Chemical Industries Ltd l ( 0,1 %), ainsi que de la bilirubine oxyda- se d'origine Myrothecium ( 0,1 U/ml), du d 6 décylsulfate de sodium ( 2,5 m M) et du fluorure de sodium ( 2,5 m M) Les mé- langes résultants ont été soumis à l'incubation à 370 C pen- dant 20 minutes et leurs capacités d'absorption à 505 nm ont été mesurées Les valeurs mesurées ont été portées gra- phiquement en fonction des concentrations correspondantes des solutions de cholestérol pour obtenir une courbe de ca- librage (figure 3). Ensuite, 0,02 ml d'un échantillon de sérum sanguin ayant une concentration totale en cholestérol inconnue (et une concentration totale en bilirubine de 15,2 mg %) a été soumis à la réaction de la même manière que celle indiquée ci-dessus, et la capacité d'absorption du mélange réaction- nel résultant a été mesurée En comparant la valeur mesu- rée avec la courbe de calibrage de la figure 3, la concen- tration totale de cholestérol dans l'échantillon a été cal- culée à une valeur de 163 mg % Comme test de contrôle, le mode opératoire ci-dessus a été répété, sauf que l'addition de bilirubine oxydase, de dodécylsulfate de sodium et de fluorure de sodium a été supprimée, et, de ce fait, la quan- tité de cholestérol total dans l'échantillon a été estimée à 145 mg %. EXEMPLE 7 Détermination de cholestérol total dans le sérum sanguin Le mode opératoire de l'exemple 6 a été répété, sauf que de la bilirubine oxydase d'origine Coprinus ( 3 m U/ml) de la laccase d'origine Polyporus ( 0,1 m U/ml) ou de la laccase ayant pour origine la plante dite laqueur ( 1 m U/ml) a été utilisée à la place de la bilirubine oxydase d'origine Myrothecium Par suite, une courbe de calibrage semblable à celle de la figure 3 a été obtenue dans tous les cas La quantité totale de cholestérol dans le sérum d'échantillon sanguin a été estimée respectivement à 160 mg %, 163 mg % et 160 mg %. 16. EXEMPLE 8 Détermination de graisses neutres (sous forme de trioléine) dans le sérum sanguin A 0,02 ml de chacune des solutions acétoniques de 0, 100, 200, 300 et 400 mg % de trioléine (huile), on a ajouté 3 ml d'une solution de tampon tris 0,1 M (p H 7,5) contenant les réactifs pour l'utilisation dans le procédé classique pour la détermination de graisses neutres dans des fluides biologiques, c'est-a-dire la 4-aminoantipyrine ( 0,4 m M), le phénol ( 15 m M), la lipoprotéine lipase ( 200 U/ml), la glycérol kinase ( 0,3 U/ml), la glycérol-3- phosphate oxydase ( 4 U/ml), la peroxydase ( 2 U/ml), le tri- phosphate d'adénosine ( 0,8 m M) et le produit dit Triton X-100 ( 0,1 %), ainsi que la bilirubine oxydase d'origine Coprinus ( 0,05 U/ml), le cholate de sodium ( 14 m M) et la phénanthroline ( 2,5 m M) Les mélanges résultants ont été soumis à l'incubation à 37 'C pendant 20 minutes et leurs capacités d'absorption à 505 nm ont été mesurées Les va- leurs mesurées ont été portées graphiquement en fonction des concentrations correspondantes des solutions de triolé- ine pour obtenir une courbe de calibrage (figure 4). Ensuite, 0,02 ml d'un échantillon de sérum san- guin ayant une concentration inconnue en graisses neutres (et une concentration totale en bilirubine de 14,2 mg %) a été soumis à la réaction de la même manière que celle dé- crite ci-dessus, et la capacité d'absorption du mélange réactionnel résultant a été mesurée En comparant la valeur mesurée à la courbe de calibrage de la figure 4, la concen- tration de graisses neutres dans l'échantillon a été cal- culée à 78,0 mg %, comme exprimé par la trioléine Comme test de contrôle, le mode opératoire ci-dessus a été répé- té, sauf que l'addition de bilirubine oxydase, de cholate de sodium et de phénanthroline a été supprimée, et, de ce fait, la quantité de graisses neutres dans l'échantillon a été estimée à 68,6 mg %. 17 2521589 17. EXEMPLE 9 Détermination d'acides gras libres (sous forme d'acide oléi- que) dans le sérum sanguin A 0,02 ml de chacune des solutions éthanoliques de 0, 250, 500 et 1000 p Eq/1 d'acide oléique (huile), on a ajouté 3 ml d'une solution tampon (p H 6,75) contenant les réactifs pour l'utilisation dans le procédé classique pour la détermination des acides gras libres dans des fluides biologiques,c'est-â-dire l'acylcoenzyme A synthétase ( 0,4 U/ml), l'acylcoenzyme A oxydase ( 5 U/ml), la peroxydase ( 5 U/ml), le triphosphate d'adénosine ( 4 p M), la coenzyme A ( 0,5 p M), le produit dit Color Former MMX lmarque déposée, fabriqué par la société dite Kyowa-Medix Co l ( 50 p M) et le produit dit Triton X-100 (O,1 %), ainsi que la bilirubine oxydase d'origine Myrothecium ( 0,1 U/ml), le cholate de so- dium ( 14 m M) et le fluorure de sodium ( 2,5 m M) Les mélan- ges résultants ont été soumis à l'incubation à 37 C pen- dant 10 minutes et leurs capacités d'absorption à 660 nm ont été mesurées Les valeurs mesurées ont été portées graphique- ment en fonction des concentrations correspondantes des so- lutions d'acide oléique pour obtenir une courbe de calibrage (figure 5). Ensuite, 0,02 ml d'un échantillon de sérum sanguin ayant une concentration inconnue en acides gras libres (et une concentration totale en bilirubine de 10,8 mg %) a été soumis-à la réaction de la même manière que celle décrite ci-dessus, et la capacité d'absorption du mélange réaction- nel résultant a été mesurée En comparant la valeur mesurée à la courbe de calibrage de la figure 5, la concentration d'acides gras libres dans l'échantillon a été calculée à 210 p Eq/l, comme exprimé par l'acide oléique Comme test de contrôle, le mode opératoire décrit ci-dessus a été répété sauf que l'addition de bilirubine oxydase, de cholate de sodium et de fluorure de sodium a été supprimée, et, de ce fait,la quantité d'acides gras libres dans l'échantillon a été estimée à 182 p Eq/1. 18. EXEMPLE 10 Détermination de phospholipides (sous forme de chlorure de choline) dans le sérum sanguin A 0,02 ml de chacune des solutions aqueuses de 0,150, 300, 450,600 et 900 mg % de chlorure de choline (poudre), on a ajouté 3 ml d'une solution de tampon phospha- té 0,1 M (p H 7,0) contenant les réactifs pour l'utilisa- tion dans le procédé classique pour la détermination de phospholipides dans des fluides biologiques, c'est-à-dire la 4-aminoantipyrine ( 0,4 m M) , le phénol ( 15 m M), la phospholipase D ( 800 U/ml), la choline oxydase ( 1 U/ml) et la peroxydase ( 2 U/ml); ainsi que la bilirubine oxydase d'origine Coprinus ( 0,05 U/ml), le dodécylsulfate de so- dium ( 2,5 x M) et la phénanthroline ( 2,5 m M) Les mélanges résultants ont été soumis à l'incubation à 370 C pendant 20 minutes et leurs capacités d'absorption à 500 nm ont été mesurées Les valeurs mesurées ont été portées graphique- ment en fonction des concentrations correspondantes des solutions de chlorure de choline pour obtenir une courbe de calibrage (figure 6). Alors, 0,02 ml d'un échantillon de sérum sanguin ayant une concentration inconnue en phospholipides (et une concentration totale en bilirubine de 14,1 mg %) a été sou- mis à la réaction de la mnême manière que décrit ci-dessus, et la capacité d'absorption du mélange réactionnel résul- -' tant a été mesurée En comparant la valeur mesurée avec la courbe de calibrage de la figure 6, la concentration de phospholipides dans l'échantillon a été calculée à une va- leur de 277 mg %,comne exprimé par le chlorure de choline. Comme test de contr 1 ôle, le mode opératoire ci-dessus a été répété, sauf que l'addition de bilirubine oxydase, de dodé- * cylsulfate de sodium et de phénanthroline a été supprimée, et, de ce fait, la quantité de phospholipides dans l'échan- tillon a été estimée à 262 mg %. * 35 La présente invention n'est pas limitée aux exem- ples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront x l'homme de l'art. 19 2521589 1 REVENDICATIONS 1 Procédé pour la détermination quantitative de bilirubine conjuguée dans des fluides biologiques, caracté- risé en oe qu'il consiste (a) à faire réagir chacune des solutions aqueuses de bilirubine, ayant diverses concentra- tions, avec la bilirubine oxydase ayant été produite par un microorganismne du genre Myrothecium pour construire une courbe de calibrage représentant la relation entre la capa- cité d'absorption du mélange réactionnel et la concentra- tion de la bilirubine; (b) à amener un fluide biologique, ayant une concentration inconnue en bilirubine, à réagir avec la bilirubine oxydase produite par un microorganisme du genre Myrothecium et à mesurer la capacité d'absorption du mélange réactionnel résultant, et (c) à calculer la con- centration de bilirubine dans le fluide biologique en compa- rant la valeur mesurée,obtenue dans l'étape (b), à la courbe de calibrage. 2 Procédé pour la détermination quantitative de bilirubine totale dans des fluides biologiques, caractérisé en ce qu'il consiste (a) à faire réagir chacune des solu- tions aqueuses de bilirubine, ayant diverses concentrations, avec la bilirubine oxydase ou la laccase en présence d'au moins un additif choisi dans le groupe se composant d'agents tensio-actifs, d'acides carboxyliques aromatiques, de pro- duits pharmaceutiques à base de sulfamides, et de protéases, pour construire une courbe de calibrage représentant la relation entre la capacité d'absorption du mélange réaction- nel et la concentration de bilirubine; (b) à amener un flui- de biologique, ayant une concentration inconnue en bilirubi- ne,à réagir avec la bilirubine oxydase ou la laccase en pré- sence de l'additif et à mesurer la capacité d'absorption du mélange réactionnel résultant, et (c) à calculer en biliru- bine dans le fluide biologique en comparant la valeur mesu- rée, obtenue dans l'étape (b), à la courbe de calibrage. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la bilirubine oxydase est une enzyme produite par un microorganisme du genre Myrothecium ou Coprinus. 4 Procédé selon la revendication 2, caractérisé 20. en ce quela laccase est une enzyme provenant d'une plante dite laqueur ou de matières cultivées d'un basidiomycete. Procédé selon la revendication 1 ou la reven- dication 2, caractérisé en ce que la quantité d'enzyme pour l'utilisation est telle que sa concentration dans le mélan- ge réactionnel soit 0,003 à 0,40 U/ml pour la bilirubine oxydase ou 0,06 à 7,0 m U/ml pour la laccase. 6 Procédé selon la revendication 2, caractéri- sé en ce que l'additif est au moins un composé choisi dans le groupe se composant de cholate de sodium, d'acide tauro- cholique, de dodécylsulfate de sodium, d'acide p-toluènesul- foniqcue, d'acide salicylique et d'acide sulfosalicylique. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le dodécylsulfate de sodium est utilisé en quanti- té telle qu'elle donne une concentration de 0,5 à 10 m M dans le mélange réactionnel. 8 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le cholate de sodium est utilisé en quantité telle qu'elle donne une concentration de 2 à 30 m M dans le mélange réactionnel. 9 Procédé pour la détermination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques dans lequel un composant physiologique, choisi dans le groupe se composant de glucose,de cholestérol, de graisses neutres, d'acides gras libres, de phospholipides et d'acide urique, tous contenus dans des fluides biologiques est déterminé en utilisant les réactifs comprenant une enzyme oxydante, caractérisé en ce qu'on combine les étapes suivantes: (a) la réaction de chacune des solutions d'un composant physio- logique ayant des concentrations variables avec les réactifs (y compris une enzyme d'oxydation) pour utilisation dans le procédé classique de détermination dudit composant, en présence de la bilirubine oxydase ou de la laccase avec au moins un additif choisi dans le groupe constitué d'agents tensio-actifs, d'acides carboxyliques aromatiques, de pro- duits pharmaceutiques à base de sulfamides, et de protéases, pour construire une courbe de calibrage représentant la re- lation entre la capacité d'absorption et la concentration 21. des solutions du composant; (b) le fait de soumettre un fluide biologique, ayant une concentration inconnue en com- posant, à la réaction de la même manière qu'en (a) ci-des- sus et de mesurer la capacité d'absorption du mélange réac- tionnel résultant, et (c) le calcul de la concentration du composant dans le fluide biologique, en comparant la valeur mesurée, obtenue dans l'étape (b), à la courbe de calibra- ge. Procédé selon la revendication 9,caractéri- sé en ce que, dans les étapes (a) et (b), un composé choi- si dans le groupe se composant de fluorure de sodium, de phénanthroline et d'hydroxylamine est ajouté au système réac- tionnel. 11 Procédé selon la revendication 9 ou la reven- dication 10, caractérisé en ce que l'enzyme oxydante com- prise dans les réactifs pour la détermination du composant est un imbre choisi dans le groupe se composant de glucose oxydase, de cholestérol oxydase, d'uricase, d'acylcoenzyme A oxydase, de choline oxydase et de glycérol-3-phosphate oxydase. 12 Procédé selon la revendication 9 ou la reven- dication 10, caractérisé en ce que la bilirubine oxydase est une enzyme produite par un microorganisme du genre Myro- thecium ou Coprinus. 13 Procédé selon la revendication 9 ou la re- vendication 10, caractérisé en ce que la laccase est une enzyme provenant d'une plante dite laqueur ou de matières cultivées d'un basidiomycete. 14 Procédé selon la revendication 9 ou la reven- dication 10, caractérisé en ce que la quantité de bilirubine oxydase ou de laccase pour l'utilisation est telle que sa concentration dans le mélange réactionnel soit 0,003 à 0,40 U/ml pour la bilirubine oxydase ou 0,06 à 7,0 m U/ml pour la laccase. 15 Procédé selon la revendication 9 ou la reven- dication 10,caractérisé en ce que l'additif est au moins un composé choisi dans le groupe se composant de cholate de sodium, d'acide taurocholique, de dodécylsulfate-de sodium, d'acide p-toluènesulfonique, d'acide salicylique et d'aci- de sulfosalicylique. 16 Procédé selon la revendication 15, caracté- risé en ce que le dodécylsulfate de sodium est utilisé en quantité qui donnera une concentration de 0,5 à 10 m M dans le mélange réactionnel. 17 Procédé selon la revendication 15, caracté- risé en ce que le cholate de sodium est utilisé en quanti- té qui donnera une concentration de 2 à 30 m M dans le mélan- ge réactionnel. 18 Procédé selon la revendication 10, caracté- risé en oequ'un composé choisi dans le groupe se composant de fluorure de sodium, de phénanthroline et d'hydroxylamine est utilisé en quantité qui donnera une concentration de 0,5 à 10 m M dans le mélange réactionnel 22.