Brevet FR2522681A1 — publié le 19830909

Solution de présure stabilisée par la méthionine. La présente invention concerne une solution stabilisée de présure. En raison de -son dosage olus facile, la présure est souvent commercialisée à l'état de solution. Cependant, une solution de présure n'est généralement pas aussi stable qu'une poudre de présure, en ce qui con- cerne l'activité de la orésure Particulièrement à des temn'yratures relativement élevées On neut ajouter desagents stabilisateurs à la solution de présure afin d'améliorer la stabilité; un agent stabilisateur utilisé dans le commerce est le sorbitol qui est généralement additionné en une quantité d'environ 50 % en poids calculée sur la solution. La majeure partie d'un tel agent stabilisateur ajoutée à la solution de présure est absorbée par la phase de petit lait Camne, oenendant, une faible partieest aussi absorbée par la phase decaillé, l'agent stabilisateur se retrouvera dans le fromage finalement produit. Dans le cas par exemple du sorbitol qui est une substance étrangère, ceci est particulièrement indésirable et, de ce fait, l'usage du sorbitol n'est pas accepté dans certains pays En outre, le sorbitol est une substance assez chère et étant donné qu'il faut ajouter environ % de sorbitol pour obtenir une stabilisation raison- nable, le prix de la solution de présure stabilisée est considérablement plus élevé que celui de la solution de présure non stabilisée. Ainsi, il existe un besoin de disooser d'une solution stabilisée de présure dans laquelle l'agent stabilisateur ne présente pas le caractère d'une substance étrangère et dans laquelle l'agent stabilisateur n'augmente pas de beaucoup le prix de la solution de présure. L'invention réside dans la découverte surprenante que de faibles quantités de méthionine exercent un effet de stabilisation puissant sur l'activité enzymatique de la présure. Suivant l'invention, on fournit une solution stabilisée de présure dans laquelle l'agent stabilisateur est la méthionine ajoutéeen une quantité correspondant à une concentration comprise entre 0,1 % (en poids) calculée sur la base du poids total de la solution et celle d'une solution saturée. Suivant un mode d'exécution particulièrement préféré de la présente invention, on ajoute une quantité de méthionine correspondant à une concentration comprise, 19 entre 0,2 % (en poids) calculée sur la base du poids total de la solution et celle d'une solution saturée. L'activité de la présure dans sa solution est d'au moins 5 000 UP/ml et, de préférence, au moins 10.000 UP/ml (UP = unités de présure). L'activité de la présure indiquée en UP/ml (UP = unités de présure) est mesurée conformément au British Standard 3624: 1963 (Method for the determina- tion of the milk coagulating power of rennet) (Procédé pour la détermination de la force de coagulation du lait de la présure). Une solution de présure saturée en méthionine est normalement une solution à 2-3 % (en poids) selon les autres constituants de la solution et la tem Déra- ture Dans le cas, par exemple, d'une présure déstabili- sée comme décrit plus bas, un résidu de l'agent déstabi- lisateur réagit avec la méthionine en laissant moins de méthionine à disposition pour le but de l'invention et, par conséquent, il faut plus de méthionine pour obtenir une solution saturée. Cependant, comme il apparaîtra dans les exemples suivants, on utilise la méthionine en une quantité tel- lement faible comparée avec le sorbitol utilisé dans le commerce, qu'on obtient une réduction remarquable des prix. De préférence, on ajoute la méthionine en une quantité correspondant à une concentration comprise entre 0,1 et 2, et plus particulièrement entre 0,5 et 1,5 % {en poids) calculée sur la base du poids total de la solution. Comme la méthionine est un acide aminé essentiel qui est déjà contenu dans le fromage, on n'introduit aucune substance étrangère dans le fromage en utilisant la méthionine en tant qu'agent stabilisa- teur En outre, on n'ajoute qu'une faible quantité de méthionine par rapport à ce qui est déjà contenu dans le fromage. Dans le brevet us n 3 051 627 et dans le brevet r B N O 866 423, on indique que l'on peut utiliser, parmi un groupe de différents acides aminés, la méthionine en tant qu'agent stabilisateur pour des solutions de chymotrypsine La présente invention est cependant spécifiquement limitée à la méthionine et concerne spécifiquement la présure. En outre, il apparait du tableau D des brevets cités ci-dessus que les acides aminés testés, y compris la D,L-méthionine,présentent tous pratiquement le même effet. Par conséquent, il est tres surprenant de voir que la méthionine utilisée en tant qu'agent stabilisateur dans une solution de présure suivant la présente invention soit apparue comme le seul agent stabilisateur efficace parmi ungrand groupe d'autres acides aminés. Suivant le brevet GB no 900 115, on peut utiliser la D,L-méthionine en tant qu'agent stabi- lisateur pour des solutions de trypsine Cependant, la D,L-méthionine n'est citée qu'en tant qu'exemple d'acide aminé possible dans la partie générale du mémoire descriptif du brevet, aucun effet nayant été signalé dans la partie expérimentale De plus, les acides aminés sont considérés comme devant être utilisés en combinaison avec un sel de calcium (voir page 1, lignes à 39). Un mode de réalisation nréféré de la solution stabi- lisée de présure suivant l'invention comporte le fait que la méthionine est utilisée sous sa forme D,L. Un autre mode de réalisation préféré de la solution stabilisée de présure selon l'invention comporte le fait que la méthionine est utilisée sous sa forme L. Un autre mode de réalisation encore préféré de la solution stabilisée de présure selon l'invention comporte le fait que la présure est une présure microbienne. Les présures suivantes peuvent être utilisées en tant que présures microbiennes: présure de Mucor miehei, présu- re de Mucor pusillus et présure d'Endothia parasitica, et un mode de réalisation préféré de la solution stabilisée de présure selon l'invention comporte le fait que la pré- sure est dérivée de Mucor miehei. Un autre mode de réalisation préféré de la solution stabilisée de Drésure selon l'invention comprend le fait que la présure est dérivée de Mucor miehei et que la pré- sure de Mucor miehei est déstabilisée thermiquement. Un autre mode de réalisation préféré de la solution stabilisée de présure selon l'invention comprend le fait que la présure est dérivée de Mucor miehei, que la présure de Mucor miehei est déstabilisée thermiquement et que le procédé de déstabilisation est mis en oeuvre conformément au brevet US n 4 255 454 ou aux brevets BE n 882 689 ou 882 690. Si on utilise un oxydant en tant qu'agent déstabili- sateur thermique, l'utilisation de la méthionine suivant la présente invention constitue un autre avantage, étant donné que la méthionine qui est un réducteur réduit de faibles résidus possibles de l'oxydant et élimine ainsi de tels constituants indésirables du produit. 252268 1 La présente invention sera décrite plus en détail en référence aux exemples ci-dessous et à la figure annexée. Normalement; on ajoute la méthionine à l'une des étapes finales de récupération lors de la préparation de la présure microbienne et, si la présure microbienne est déstabilisée thermiquement avec un oxydant, la méthionine doit être ajoutée après le processus de déstabilisation. La teneur en enzyme active des solutions de présure est réglée à 0,2 4, de préférence à 0,25 3 % (en poids) par exemle par addition d'une solution de chlorure de sodium. En se référant à la figure, le graphique illustre l'activité résiduelle d'une présure de Mucor miehei (Rennilase 50 L type TL) à 40 'C après 2 et 4 semaines. Il apparaît que l'effet stabilisant de la L-méthionine est supérieur à celui de la D,L-méthionine, particu- lièrement à des concentrations assez basses. L'invention est décrite plus en détail au moyen des exemples suivants, non limitatifs. Exemple 1 La préparation de présure utilisée dans cette expérience est une présure commerciale de Mucor miehei déstabilisée (Rennilase 50 L type TL) produite suivant l'exemple 3 (dose approximative: 1,6 % en volume par volume de Na O Cl 2,25 M) du brevet BE N O 882 689. Cette préparation est standardisée avec une solution de chlorure de sodium à 18 % en poids jusqu'à une teneur d'environ 11 % d'enzyme active. On a testé deux réparations de cette Rennilase 50 1 type TL en ce mui concerne la stabilité au stockage à un n H de 6,5, les essais ayant été effectués avec un témoin ne contenant aucun agent stabilisateur et un échantillon contenant 1 % en poids de D,L-méthionine Les essais de la stabilité au stockage ont été effectués en tant qu'essai de stabilité "normal" à 25 C et en tant qu'essai accéléré à 40 QC Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant. Tableau I Il en résulte que l'addition d'l % D,L-méthionine fournit une amélioration de la stabilité au stockage. en poids de remarquable Exemple 2 Afin de comparer l'effet stabilisant de la méthionine avec celui de quelques autres acides aminés, on a ajouté 1 % en poids de différents acides aminés à une rennilase 50 L type TL (Dréparation PRN 4518 préparé selon l'exemple 1) On a utilisé un échantillon ne contenant aucun ajout d'acide aminé en tant que témoin On a réglé le p H de tous les échantillons à 6,5 Les échantillons ont été stockés à 40 C pendant 2 semaines et on a déterminé les activités résiduelles, cf tableau II. Pouroentaqe d'activité résiduelle Température d'incubation 25 C 40 C Durée d'incubation 4 18 2 semaines semaines semaines Prépa témoin sans 95,3 81,3 74,3 ration ration stabilisant PRN 4519 avec 1 %de 102,0 97,9 89,5 D, L-méthionine Préca témoin sans 97,1 81,0 75,5 Préoa- ration stabilisant PRN ' 4520 avec 1 % de 102,8 94,4 88,4 D, L-méthionine Tableau II Des chiffres ci-dessus, il résulte que seule la méthionine fournit une stabilisation efficace de la préparation d Ae résure. Exemple 3 Dans cet exemple, on a comparé l'effet stabilisant de la méthionine avec celui d'encore l'autres acides aminés. On a ajouté 2 % en poids des acides aminés à une Rennilase 50 L-type TL (f Dr Aoaration PRN 4516 obtenue suivant l'exemple 1) Un échantillon ne contenant aucun ajout d'acide aminé a été utilisé à titre de témoin On a réglé le p H de tous les échantillons à 6,5 et on les a stockésà 40-C pendant 2 semaines Les activités rési- duelles sont indiquées dans le tableau suivant: Pourcentagc d'activité résiduelle Rennilase 50 L Type TL après 2 semaines à 40 C Témoin sans ajout d'acide aminé 69,8 Avec 1 % dDL-méthionine 88,1 Avec 1 % de Lasparagine 72,2 Avec 1 % de L-histidine, HC 1 74,5 Avec 1 x de L-arginine 74,1 Avec 1 % de L-lysine 72,0 Avec 1 % de L glutairinate de Na 71,7 Tableau IV Rennilase 50 L type TL Pourcentage d'activité résiduelle Température d'incubation 25 C 40 C Durée d'incubation 26 2 4 semaines semaines semaines Témoin sans ajout d'acide aminé 63 66 53 Avec 0,25 % de D,Lméthionine 70 71 58 Avec 0,50 % de D,L-méthionine 76 77 65 Avec 1,0 % de D,L-méthionine 84 83 74 Avec 2,0 % de D,L-méthionine 90 90 85 Avec 0,25 % de L-méthionine 78 84 70 Avec 0, 50 % de L-méthionine 83 88 75 Avec 1,0 % de L-méthionine 89 92 81 Avec 2,0 % de L-méthionine 96 94 81 Avec 1,0 % de D,L-méthioninesulfoxyde 67 74 60 Avec 2,0 % de L-cystéine 60 67 57 I Il résulte des chiffres ci-dessus que la L-n'thionine fournit une meilleure stabilisation de la préparation de présure que la D,L- méthionine La L-cystéine n'a aucun effet et le sulfoxyde de D,L- méthionine n'a qu'un effet médiocre sur la stabilité. 5. Tableau III Exemple 4 Dans cet essai, on a comparé l'effet stabilisant de la D,L-méthionine avec celui de la L-méthionine. En outre, on a étudié l'effet d'un dérivé de la méthio- nine, le sulfoxyde de D,L-méthionine et un autre acide aminé, la Lcystéine On a ajouté des -ronortions variables des différents acides aminés à une Rennilase 50 L type TL (mélangesde parts égales de PRN 4526, PRN 4527 et PRN 4528). On a utilisé un échantillon ne contenant aucun ajout d'acide aminé à titre de témoin On a réglé le p H de tous les échantillons à 6,5 et on a stocké les échantil- lons à 40 C pendant 2 et 4 semaines et à 25 C pendant 26 semaines Le tableau suivant indique les activités résiduelles. Pourcentae d'activité résiduelle Rennilase 50 L type TL après 2 semaines à 40 C Témoin sans ajout d'acide aminé 74 Avec 2 % de D,L-méthionine 96 Avec 2 % de glycine 77 Avec 2 % de D, L-alanine 78 Exemple 5 On a examiné l'effet stabilisant de la D,L- méthionine dans une solution à 10 % en poids d'une présure commercialede Mucor pusillus, Nourylab 1: 220 000 (charge n 75 I 1 22) contenant 18 % en poids de chlorure de sodium ajouté pour la conservation On a réglé le p H des échantillons à 4,7 et on a fait incuber un échantillon témoin et un échantillon contenant 1 % de D,L-méthionine à 40 C, 25 C et 4 C et on a mesuré lest activités résiduelles au caillement. Tableau V Témoin sans ajout d'acide aminé 34 25 55 93 76 Avec 1 % de D,L- méthionine 51 39 73 96 88 Il en résulte que la D,L-méthionine fournit également une amélioration remarquable de la stabilité au stockage de la présure de Mucor ousillus. Exemple 6 La substance de départ pour cet essai a été un concentré de présure préparé comme indiqué dans " 2nd Pilot Plant Experiment" du brevet GB n 1 108 287 On n'a concentré que le liquide de culture pour obtenir une activité correspondant à une solution à environ 1 % de l'enzyme pure. Cette substance a ensuite encore été purifiée et concentrée par précipitation au moyen de 40 % poids par % en poids de Nourylab ?ourcentaae d'activité résiduelle Températured'incubation 40 C 25 C 4 C Durée d'incubation 2 4 4 4 26 sem sem sem sem semaines volume de sulfate d'ammonium et par lavage à l'eau de robinet pendant l'ultrafiltration ultérieure Le concentré de présure obtenu (erénaration PRB 1031) contenait environ 4 % d'enzyme active après addition de 18 % en poids de chlorure de sodium pour la conservation. L'essai à la stabilité avec deux teneurs de méthionine et avec un échantillon témoin a été effectué à 40 C et à p H 6,8. Tableau VI P)urcentage d'activité résiduelle Concentré de présure PRB 1031 après 4 après 13 après 26 semaines semaines semaines Témoin sans méthionine 88,1 72,1 59 Essai avec 1 % de D,L-méthionine 98,8 88,7 80 Essai avec 2 % de D, L-méthionine 98,9 92,1 84 REVENDICATIONS 1 Solution stabilisée de présure, caractérisée en ce que l'agent stabilisateur est la méthionine ajoutée en une quantité correspondant à une concentration comprise entre 0,1 % (en poids) calculée sur la base du poids total de la solution et celle d'une solution saturée. 2 Solution stabiliséede présure suivant la revendication 1 carat^ 4 sée en ce que la méthionine est ajoutée en quantité correspondant à une concentration comprise entre-0,2 % (en poids) calculée sur la base du poids total de la solution et celle d'une solution saturée. 3 Solution stabilisée de présure suivant la revendication 4 caractérisée en ce que la méthionine est ajoutée en quantiti correspondant à une concentration comprise entre 0,5 et 1,5 % (en poids) calculée sur la base du poids total de la solution. 4 Solution stabilisée de présure suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisée en ce que la méthionine est la D,L-méthionine. Solution stabilisée de présure suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisée en ce que la méthionine est la L-méthionine. 6 Solution stabilisée de présure suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la présure est une présure microbienne. 7 Solution stabilisée de présure suivant la revendication 6,caractérisée en ce que la présure microbienne est dérivée de Mucor miehei. 8 Solution stabilisée de présure suivant la revendication 7, caractérisée en ce que la présure microbienne de Mucor miehei est déstabilisée thermi- quement. 9 Solution stabilisée de présure suivant la revendication 8, caractérisée en ce qu'on a effectué la déstabilisation thermique au moyen d'un oxydant, notamment Na O Cl.