Brevet FR2518092A1 — publié le 19830617

' Composés de trihydroxyvitamine D 3, leur procédé de préparation et composition pharmaceutique les renfermant. La présente invention concerne de nouveaux composés de vitamine D. La vitamine D est largement utilisée du point de vue thérapeutique pour la prévention du rachitisme et d'autres maladies osseuses des hommeset est connue pour être importante pour le maintien des niveaux du calcium et du phosphore dans le sang chez les animaux et les hommes On sait également que la vitamine D subit in vivo une série de transformations métaboliques en dérivés hydroxylés et ce sont ces métabolites de l'hydroxy- vitamine D que l'on suppose être responsables de l'effet bio- logique donné par la vitamine D La vitamine D 3/par exemple/est transformée in vivo en métabolito biologiquement actifstelsque la 25hydroxyvitamine D 3, la 1,25-dihydroxyvitamine D 3, la 24,25dihydroxyvitamine D 3 et la 25,26-dihydroxyvitamine D 3 La vitamine D subit des transformations méboliques similaires. Il a été découvert maintenant que les nouveaux dérivés de la vitamine D 3 sont représentés par la formule I ci-dessous. La forme préférée de ces dérivés est caractérisée par trois groupes hydroxyle adjacents dans la chaîne latérale; c'est la 23,24,25-trihydroxyvitamine D 3. Oi 3 ( ffo R;R s I R 2 _ hydrogène, acyle ou alkylsilyle(indépendam- R 3 ment) R 4 251809 Z Le composé trihydroxylé peut être obtenu à l'état pur en l'isolant du sang de poulets qui ont reçu des doses -élevées de vitamine D 3. Exemple 60 poulets Leghorn blancs âgés de 12 semaines, provenant des Etablissements Northern Hatcheries (Beaver Dam, WI) sont soumis à une alimentation industrielle (Ralston Purina,St Louis, MO); chacun reçoit une dose quotidienne de 10 U I de vitamine D 3 pure (dissoute dans 0,05 ml de Et Or) par injection intra- musculaire pendant trois jours Le quatrième jour, chaque poulet reçoit une autre dose de 1,5 x 10 U I de vitamine D 3 par la même voie Quatre jours plus tard, du sang de chaque poulet est recueilli par ponction cardiaque On rassemble ces prélèvements sanguins et on centrifuge le tout et on extrait le plasma résultant. On effectue l'extraction en mélangeant un volume de plasma avec trois volumes d'une solution 2:1 de méthanol/ chloroforme et on laisse les phases se séparer pendant toute une nuit;au froid (environ 4-10 C) On ajoute un autre volume de chloroforme et on sépare la phase organique Après extraction de la phase aqueuse avec un autre demi-volume de chloroforme, on combine les phases organiques et on évapore le solvant pour obtenir un résidu qui est ensuite fractionné par chromatographie. On chromatographie l'extrait chloroformique provenant de 380 ml de plasma sur une colonne de Sephadex'TH-20 ayant 3 x 30 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ) et on l'élue avec un mélange hexane/chloroforme/méthanol ( 9:1:1) On recueille les fractions de 23 ml chacune et on dose les composés de vitamine D par la méthode de dosage par combinaison de Shepard et col. (Biochem J 182, 55, 1979) Les métabolites de vitamine-D provenant par élution de 1150-1472 ml, sont recueillis et soumis à une purification ultérieure par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). La première purification par HPLC est effectuée sur une colonne de silice microparticulaire/de 0,45 x 25 cm (Zorbax-SIL; Dupont, Inc, Wilmington, DE) éluée avec du 2-propanol à 12 % dans l'hexane La 1,25dihydroxyvitamine D 3 ( 1,25-(OH)2 D 3)est éluée à environ 18 ml par ce système L'élution de la matière à environ à 12 ml est recueillie pour purifier ensuite le métabolite désiré Ces fractions sont ensuite soumises à la HPLC sur une colonne à phase inversée, de 0,45 x 25 cm, (octadécylsilane fixé sur la silice, "Zorbax-ODS"; Dupont, Inc, Wilmington,DE) éluée avec 20 % d'eau dans du méthanol La 1,25-(OH)2 D 3 normale est éluée à 25 ml par ce système Le métabolite désiré est élué à 7-8 ml. On effectue la purification finale du composé trihydro- xylé sur une colonne de silice microparticulaire, de 0,45 x 25 cm, éluée avec du 2-propanol à 14 % dans l'hexane Le composé est élué à 7,5-9,5 ml. Cette série d'opérations fournit le composé désiré à l'état pur qui montre un maximum d'absorption dans l'ultra- violet à max = 265 nm Bien entendu, il peut être facilement obtenu à l'état cristallisé si on le désire. La structure du composé recueilli est établie par la spectroscopie de la façon suivante: L'absorption dans l'ultraviolet du composé trihydroxylé à 265 nm montre un chromophore vitamine D 5,6-cis-triène intact et sa polarité chromatographie évoque l'incorporation de trois groupes hydroxyle supplémentaires Pour déterminer le nombre de groupes hydroxyle et leur position, le composé est transformé en son dérivé triméthylsilyl (TMS)-éther par traitement avec le N,O-bis-triméthylsilyltrifluoroacétamide contenant 1 % de chlorure de triméthylsilyle dans la pyridine à 30-50 C, et le produit résultant est soumis à l'analyse spectrométrique de masse. Le spectre de masse montre un ion moléculaire à m/e 720 comme prévu pourle produit tétra-triméthylsilyléther d'un dérivé de trihydroxyvitamine D 3 La présence de pics à m/e 208 et 118 ( 208-HOTMS) qui sont les fragments caractéristiques du noyau A, du vitamine D 3-0-TMS- éther, confirment la présence du groupe C-3-hydroxyle et le fait que le noyau A typique de la vitamine D 3 et le système triène ne sont pas altérés La position des trois groupes hydroxyle supplémentaires dans la chaine latérale est apparente à partir des pics importants à m/e 131 et 487 Le pic à m/e 131 résulte du clivage entre le C 24 et le C 25 251809 Z 4 - représente l'ion lCH 3)2 C=O-Si (CH 3) + renfermant les carbones ,26 et 27 de la chaîne latérale Ce pic est caractéristique pour les dérivés 25-0-TMS et établit donc la présence d'un groupe hydroxyle sur le carbone 25,et également l'absence de toute substitution hydroxyle sur-les carbones 26 ou 27 Le pic à m/e 487 (ainsi que les pics à m/e 397 et 307 qui proviennent de l'élimination successive de HOTMS du pic 487)augmente par clivage de la liaison C-23,24, et nécessite la présence d'un substituant C-23-OTMS et l'absence de toute substitution hydroxyle sur les carbones 22, 21 ou 20 Ainsi, deux des groupes hydroxyle sont situés d'une façonoertaidne sur Js carbones 23 et 25, et puisque toutes les autres positions sont exclues, le troisième doit être alors situé sur le carbone 24. Par conséquent, ces résultats établissent la structure du composé trihydroxylé comme étant la 23,24,25-trihydroxyvitamine D 3 À 3 ' La 23, 24,25-trihydroxyvitamine D 3 peut être facilement transformée en d'autres dérivés utiles, par exemple en dérivés acyle ou alkylsilylepar traitement avec des réactifs d'acylation ou d'alkylsilylation appropriés dans des conditions normales. Des réactifs d'acylation appropriés comprennent les chlorures d'acyle ou les anhydrides d'acide et des réactifs d'alkylsily- lation appropriés comprennent les halogénures d' alkylsilyie ou des dérivés alkylsilyliques actifs analogues Ainsi, par exemple, le traitement avec l'anhydride acétique à 25-50 C dans la pyridine, donne les dérivés 3,23,24-triacétyle, tandis que la réaction effectuée à hautestempératures( 75-100 C)donne le produit tetra-acétyle D'autres dérivés acyle tels que les dérivés propionyle, butyryle, trihalogénoacétyle, benzoyle, nitrobenzoyle et halogénobenzoyle, peuvent être obtenus en passant par l'anhydride d'acide ou l'halogénure d'acyle;appro- priéspar des procédés analogues Les dérivés partiellement acylés peuvent être alors acylés ultérieurement par un groupe acyle différent ou peuvent être alkylsilylés par traitement avec desréactifshalogénuresd'alkylsilyle, of le groupe alkyle repré- sente un radical hydrocarboné ayant de 1 à dis=, 5 atmcs de carbone, par exemple un radical méthyle, éthyle, propyle, butyle ou tert- butyle. Etant donné que le composé trihydroxylé de la présente invention est un analogue de la 24,25-dihydroxyvitamine D 3, un métabolite de vitamine D ayant une activité biologique établie, on peut s'attendre par conséquent à ce que ce composé trihydro- xylé ait une activité in vivo analogue à celle de la vitamine D etpar conséquent, on peut l'utiliser comme un remplaçant de la vitamine D 3 ou d'autres mnétabolites de vitamine D hydroxylés sur la chaîne latérale dans le Es applicationsthérapeutiques connuet dans d'autres applications. 251809 Z REVENDICATIONS 1 Composé ayant la formule: o R dans laquelle chacun des R 1, R 2, R 3 et R 4 représente indépen- damment de l'hydrogène, un groupe acyle ou alkylsilyle. 2 Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que chacun des R 1, R 2, R 3 et R 4 représente un groupe acétyle ou benzoyle. 3 La 23,24,25-trihydroxyvitamine D 3. 4 Le composé de la revendication 3 à l'état cristallin. Procédé pour la préparation d'un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'on isole le composé trihydroxylé à partir du sang de poulet à qui on a injecté une dose élevée de vitamine D 3, et éventuel- lement qu'on soumet à l'acylation ou l'alkylsilylation le composé. 6 Composition pharmaceutique renfermant un véhicule ou un diluant inerte, caractérisée par le fait qu'elle renferme un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.