Brevet FR2518091A1 — publié le 19830617

23-dehydro-25-hydroxyvitamine D 3, son procédé de prépa- ration et composition pharmaceutique la renfermant. La présente invention concerne un nouveau dérivé de vitamine D, spécifiquement un dérivé de 25-hydroxyvitamine D 3 I ( 25hydroxycholécalci-ferol) contenant une double liaison dans la chaîne latérale,et ses dérivés acylés ou silylés. La vitamine D 3 est un agent bien connu pour le maintien de l'homéostasie du calcium et du phosphore chez les animaux ou les hommes et est largement utilisée du point de vue thérapeutique pour la prévention du rachitisme et d'autres maladies osseuses. Il est maintenant fermement établi que l'efficacité biologique de la vitamine D dépend de sa conversion métabolique in vivo en dérivés hydroxylés Un certain nombre de ces dérivés hydroxylés biologiquement actifs sont connus comprenant la 25-hydroxyvitamine D 3, la 1,25dihydroxyvitamine D 3, la 24,25-dihydroxyvitamine D 3, et la 25,26-hydroxyvitamine D 3. Un nouveau dérivé d'hydroxyvitamine D a maintenant été découvert selon la présente invention Ce nouveau composé est caractérisé par un substituant hydroxyle sur le carbone 25 et par une double liaison entre les carbones 23 et 24, caractéristique qui n'a pas été rencontrée précédemment dans les dérivés ou métabolites de vitamine D connus jusqu'ici Ce composé a la formule ci-dessous; c'est la 23-dehydro-25-hydroxyvitamine D 3 ou le 23déhydro-25-hydroxycholécalciferol C ( 113 1 \t H-d Ha-CI 1 CH-y -ô/J 3 O 9 HI i-i O I Z 51809 t Ce composé peut être obtenu à partir du sang de poulets ayant reçu des doses élevées de vitamine D 3. Exemple Obtention du Plasma et extraction 60 poulets Leghorn blancs, âgés de 12 semaines (Northern Hatcheries, Beaver Dam, WI) élevés avec une alimentation industrielle (Ralston Purina, St Louis, MO) ont reçu chacun quotidiennement pendant 3 jours une dose intramusculaire de 105 U I de vitamine D 3 (Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI) dans 50 1 d'éthanol On trouve que la pureté de la vitamine est de 99,9 % par chromatographie en phase liquide à rendement élevé (HPLC) Le quatrième jour, chaque poulet reçoit une dose intramusculaire totale de 1,5 x 107 U I. de vitamine D 3 Quatre jours après cette dose, le sang est recueilli par ponction cardiaque Ce sang est centrifugé pour éliminer les globules et le plasma résultant est extrait avec 3 volumes d'un mélange méthanol/chloroforme ( 2:1) pendant toute une nuit à environ 4-10 C, temps au bout duquel un'autre volume de chloroforme est ajouté, et la phase organique est séparée. La phase aqueuse est encore extraite avec un demi-volume de chloroforme, et les phases organiques combinées sont évaporées pour être chromatographiées ultérieurement. Purification chromatographique du métabolite L'extrait de 1160 ml de plasma est chromatographié sur une colonne de 3 x 30 cm garnie de "Sephadex LH-20 " (Pharmacia, Piscataway,NJ) éluée avec un mélange hexane/méthanol/chloroforme ( 9:1:1) On recueille 80 fractions de 23 ml La présence des métabolites de vitamine D est décelée en utilisant le dosage par combinaison compétitive de protéines décrit par Shepard et col (Biochem. J 182, 55, 1979) On recueille l'élution dans la région de la 25hydroxyvitamine D 3 ( 25-OH-D 3) représentée par le pic de combinaison Cet échantillon est ensuite chromatographié sur une colonne de 2 x 57 cm garnie de "Lipidex 5000 " (Packard Instrument Co, Downers Grove, IL) éluée avec un mélange hexane/ chloroforme ( 92:8) Soixante fractions de 16 ml sont recueillies et dosées comme ci-dessus Les fractions dans la région de la -OH-D 3 sont rassemblées et le solvant est chassé par évaporation sous vide. L'échantillon est ensuite purifié par HPLC en utilisant un instrument "Waters" modèle ACP-GPC 204 (Waters Associates,Inc. Milford, MA) équipé d'un détecteur variable de longueurs d'onde modèle 450 et d'un accessoire à commande de longueurs d'onde, et utilisant une colonne de 0,45 x 25 cm garnie de silice micro- particulaire ("ZorbaxSIL", Dupont, Inc, Wilmington, DE), éluée avec du 2-propanol à 2 % dans l'hexane Sur ce système, la -OH-D 3 normale est éluée à environ 36 ml La matière réactive dans le dosage par combinaison de protéine et l'élution juste O 10 avant la 25-OH-D 3 normale sont rassemblées pour isoler le métabolite 23-dehydro Cette matière recueillie est ensuite chromatographiée sur HPLC en utilisant une colonne de 0,45 x 25 cm à phase inversée (octadécylsilane fixé sur la- silice; "Zorbax-ODS"; Dupont, Inc, Wilmington, DE), éluée avec 15 % d'eau dans le méthanol La 25-OH-D 3 est éluée à environ 28 ml de ce système On recueille le métabolite 23- déhydro-25-hydroxyvitamine D 3 qui manifeste une activité dans le dosage par combinaison de protéine Le composé montre un maximum d'absorptions UV à max = 265 nm. max 2 O La purification finale du composé est effectuée par HPLC en utilisant une colonne de 0,45 x 25 cm garnie de silice microparticulaire, éluée avec 4 % de 2-propanol dans l'hexane, et le produit désiré est recueilli pour caractériser sa struc- ture Bien entendu, il peut être facilement obtenu à l'état cristallisé si on le désire. Identification du produit Le maximum de 265 nm dans le spectre ultraviolet montre la présence du groupe chromophore ,6-cis-triène typique de la vitamine D Dans le spectre de masse, les ions importants et leur intensité relative sont: m/z 398, 11 %, M; 380, 5 %, M -H 20; 271, 2 %, M chaîne latérale; + 253, 5 %, 271-H 20; 136, 100 % (noyau A + C 6 + C 7); 118, 74 %, 136-H 20 Les pics importants à m/z 136 et 118 ( 136-H 20), qui s'élèvent du noyau A plus des carbones 6 et 7 de la molécule de vitamine D, montrent que le fragment noyau A de la vitamine D est inaltéré En outre, la présence des pics t m/z 271 et 253 ( 271-H 20), qui s'élèvent par la disparition de toute la chaîne latérale, montre que toutes les altérations métaboliques se sont produites dans la chaîne latérale L'ion moléculaire de m/z 398 est en accord avec l'incorporation d'un atome d'oxygène et d'une insaturation dans la chaine latérale De même, les modifications de la chaine latérale sont en accord avec ces résultats qui comprennent a) la formation d'une fonction car- bonyle, b) la formation d'un éther cyclique (par exemple époxyde), et c) la présence d'un groupe hydroxyle et de la double liaison. Pour vérifier la présence d'une fonction carbonyle ou d'une fonction éther, le composé est traité avec un excès de Na BH 4 (solution dans le méthanol à la température ordinaire pendant minutes) puis est triméthylsilylé (par traitement du produit recueilli avec un excès de N,O-bis-triméthylsilyl-trifluoro- acétamide contenant une solution à 1 % de chlorure de triméthyl- silyle dans la pyridine) L'éther triméthylsilylique résultant (TMS-éther) obtenu montre le spectre de masse suivant: m/z 542, 22 %, M+; 527, 8 %, M±CH 3; 452, 18 %, M±HOTMS; 437, 8 %, 452-CH 3; 208 60 % (TMS-noyau A + C 6 + C 7); 131,56 %, C 3 H 60 TMS+; 118, 100 %, 208-HOTMS L'ion moléculaire à m/z 542 indique la formation d'un dérivé ditriméthylsilyléther, d'un diol de poids moléculaire 398 (c'est-à-dire le poids moléculaire du métabolite initial) Ce résultat élimine les structures cétoniques et d'éthers cycliques et indique une chaîne latérale monohydroxylée insaturée La position C-25 du groupe hydroxyle peut être - déduite à partir de l'ion principal à m/z 131 (qui représente + l'ion (CH 3)2 C=O-Si(CH 3)3 et qui provient des carbones 25,26 et 27 de la chaîne latérale), tandis que les ions à 208 (noyau A + C 6 + C 7) et à 118, sont des fragments caractéristiques des dérivés de vitamine D-3 P-OTMS et confirment de nouveau le fragment intact noyau A. La présence et la position de la double liaison dans la chaine latérale sont établies par ozonolyse du composé et l'ana- lyse par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse du produit de l'ozonolyse en utilisant l'ionisation chimique du méthane L'ozonolyse est effectuée en traitant une solution dans le chlorure de méthylène du métabolite à -78 C avec une solution de chlorure de méthylène saturée d'ozone, et en ajoutant après 2 minutes une solution de triphénylphosphine dans le chlorure de méthylène Le mélange est ensuite chauffé à la température du laboratoire et, après évaporation du solvant, le produit d'ozonolyse est directement analysé par chromato- graphie en phase gazeuse-spectrométrie de masse combinées en utilisant un chromatographe à phase gazeuse-spectromètre de masse "Finnigan" modèle 4000 (Finnigan Corp, Sunnyvale, CA) fonctionnant selon la méthode d'ionisation chimique avec le méthane gazeux, et en utilisant une colonne de chromatographie ( 2 m x 2 mm, 3 % OV-1) avec du méthane comme gaz véhicule/réactif à raison de 30 ml/minute Le produit d'ozonolyse donne un ion moléculaire protoné (M+H)+ à m/z 223, et des ions de produit d'addition à intensité faible à m/z 251 (M X C 2 H 5) et 263 (M + C 3 H 5) Ce résultat donne un poids moléculaire de 222 pour ce produit d'ozonolyse comme l'exige le céto-aldéhyde ayant la structure indiquée ci-dessous: C 20 pr o Cuitt-adhiupoelivaeozo Ce produit céto-aldéhydique provient du clivage ozo- nolytique attendu d'un C-7,8,et d'une double liaison C-23,24, et prouve ainsi la présence d'une double liaison dans la chaine latérale entre les carbones 23 et 24 du métabolite. Par conséquent, ce nouveau composé est identifié comme étant la 23-déhydro-25-hydroxyvitamine D 3. Ce composé peut être acylé ou alkylsilylé, pour donner les dérivés avec un ou deux groupes hydroxyle protégéé)corres- pondants, par des procédés bien connus dans la technique Les dérivés acylés qui peuvent être facilement préparés comprennent les dérivés acétyle, propionyle, butyryle, trifluoro-acétyle, trichloracétyle, benzoyle, nitrobenzoyle ou halogénobenzoyle. Ces dérivés peuvent être préparés en traitant le composé avec l'anhydride d'acide ou l'halogénure d'acyle appropriés Par exemple, le traitement du composé avec l'anhydride acétique à la température du laboratoire donne les dérivés 3-mono-acétyle tandis que le traitement à températuresélevées( 50-100 C) donne les produits 3,25-diacétyle Lesproduits diacëtylés à leurt tour peuvent être désacétylé sélectivement (par exemple 5 % de KOH/Me OH) pour donner le dérivé 25-mono-0-acyleet les analogues C-3-ou C-25- monoacyle peuvent ensuite être encore acylés sur la fonction hydroxyle libre avec des groupes acyle différents ou peuvent être alkylsilylés par des procédés bien connus, par exemple par traitement avec un chlorure d'alkylsilyle réactif dans la pyridine; le terme alkyle désigne un radical hydrocarboné ayant de 1 àldisons,5 atomes de carboneltel qu'un radical méthyle, éthyle, propyle, butyle ou tert-butyle De cette façon, les dérivés de la 23-d&hydro-25-hydroxyvitamine D 3 avec des groupes O- acyle ou O-alkylsilyle différents sur C-3 et C-25 et/ou des groupes acyle et alkylsilyle mixtes peuvent facilement être obtenus. Par suite de sa relation structurelle avec la 25-hydroxy- vitamine D 3, le composé de la présente invention est un remplaçant de la 25-hydroxyvitamine D 3 tou de la vitamine D 3/dans diverses applications thérapeutiques ou autres applications De plus, à cause de la présence de la double liaison 23,24, le composé a moins tendance à subir in vivo l'hydroxylation sur le carbone 24 connu de la 25-hydroxyvitamine D 3 qui diminue l'efficacité biologique de ce dernier composé; il peut ainsi représenter un produit analogue préféré pour des applications médicales. REVENDICATIONS 1 Composé ayant la formule: Ctt 3 t il 4 Q" 1-C 1 -= CH C -7 Pz c 1 11 Hj O c lia o Vchacun des R 1 et R 2 estlindépendammentjde l'hydrogène, un groupe acyle ou alkylsilyle. 2.Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que chacun des R 1 et R 2 est indépendamment/un groupe acétyle ou benzoyle. 3 La 23-dehydro-25-hydroxyvitamine D 3. 4 Le composé de la revendication 3 à l'état cristallin. Procédé pour préparer un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'on isole le composé hydroxyle du sang de poulets qui ont été alimenté avec une dose élevée de vitamine D 3 et/qu'éventuellement, on procède à l'acylation ou à l'alkylsilylation du produit. 6 Composition pharmaceutique comprenant un véhicule ou un diluantiinertes, caractériseepar le fait qu'elle comprend un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.