Brevet FR2522680A1 — publié le 19830909

-1- La présente invention concerne l'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) ayant une activité de substrat pour l'acide Lglutamique ou un L-glutamate (que l'on appelle généralement ci-après simplement "acide L- glutamique ou "L-glutamate") et une action enzymatique catalysant une réaction qui forme une mole d'acide alpha- cétoglutarique, une mole d'ammoniac et une mole d'eau oxygénée à partir d'une mole d'acide L-glutamique, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau, un procédé pour la production d'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) et une méthode d'analyse utilisant l'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202). Comme oxydase connue antérieurement ayant une spéci- ficité de substrat sur l'acide L-glutamique, il y a seu- lement la L-(+)-glutamate oxydoréductase ayant une action enzymatique catalysant une réaction qui forme 2 moles d'acide alpha-cétoglutarique, 2 moles d'ammoniac et une mole d'eau à partir de 2 moles d'acide Lglutamique, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau /Biochim Biophys. Acta, 368, 158 172 ( 1974)7. De plus, on connalt déjà une oxydase de L-amino-acide ayant une spécificité de substrat sur le L-amino-acide et une action enzymatique catalysant une réaction qui forme une mole d'alpha-céto-acide, une mole d'ammoniac et une mole d'eau oxygénée à partir d'une mole d'amino-acide, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau / Methods in Enzymology, Vol II, 204 211 ( 1955) et autres 7. Dans ces techniques antérieures, la L-(+)-glutamate oxydoréductase catalyse la réaction indiquée ci-dessus et ne produit pas d'eau oxygénée De plus, l'oxydase de L- amino-acide est une enzyme qui catalyse une réaction telle qu'indiquée cidessus, et donc de l'eau oxygénée est produite Toutefois, parmi les oxydases de L-amino-acides connues antérieurement, aucune enzyme agissant sur un substrat acide L-glutamique n'a été rapportée /M-ethods in -2 2522680 Enzymology, Vol II, pages 204 211 ( 1955)7. La demanderesse a trouvé que la souche A 7700 de Streptomyces isolée à partir d'un échantillon de terre d'un champ de Saku-shi, Nagano-ken et la souche A 8063 de Streptomyces isolée à partir d'un échantillon de terre d'un champ de patate de Naganohara-cho, Azuma-gun, Gunma-ken, Japon, produisent l'enzyme ayant une spécificité de substrat sur l'acide Lglutamique et catalysant une réaction qui forme une mole d'acide alphacétoglutarique, une mole d'ammoniac et une mole d'eau oxygénée à partir d'une mole d'acide L-glutamique, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau, et elle a purifié cette enzyme sous la forme d'une seule protéine Elle a appelé cette enzyme oxydase d'acide I L-glutamique (productrice de H 202) Elle a aussi complété la nouvelle méthode de détermination d'un échantillon de liquide contenant de l'acide L-glutamique par utilisation de cette nouvelle enzyme. Les propriétés taxonomiques de la souche A 7700 et de la souche A 8063 de Streptomyces sont les suivantes (A) Souche A 7700 de Streptomyces I Observations microscopiques Les observations morphologiques par culture sur un milieu de gélose à l'amidon et aux sels inorganiques à 30 'C après culture pendant 10 15 jours sont les suivantes On arrive aussi à peu près aux mêmes observations sur un milieu de gélose à la farine d'avoine et sur un milieu de gélose à l'extrait de levures-extrait de malt. Les mycéliums de support sont courbes, ramifiés, de 0,5 0,6 g de diamètre, et n'ont pas d'oidium mycénien et ne portent pas de spores. Les mycéliums aériens développés sur les mycéliums de support sont courbes, avec des ramifications simples, de 0,6 0,8 M de diamètre, et forment de nombreuses spores en chaîne Les chaînes de spores sont en spirale avec 2 3 spires et quelquefois en boucle ou accrochées. -3- Les spores sont en forme d'ellipsoides ou de bâtonnets courts avec des dimensions de 0,6-0,8 x 0,8-1,0 et une surface lisse. Il n'y a pas de formation de spores flagellaires ni de sporanges. II Composition de l'acide diaminopimélique: On trouve de l'acide Ldiaminopimélique et on ne détecte pas de type méso dans l'analyse complète des cellules. III Observation macroscopique: Les observations sur divers milieux à 30 C pendant 14 jours sont présentées dans le Tableau I. Les indications de couleur sont effectuées en consultant le "Color Harmony Manual, 4 ème édition, 1958 (Container Corp of America)". IV Propriétés physiologiques: ( 1) Température de développement: 20 40 C. ( 2) Besoin d'oxygène: aérobie. ( 3) Liquéfaction de la gélatine: positive (très faible). ( 4) Hydrolyse de l'amidon: positive. ( 5) Lait écrémé: Peptonisation; positive (faible); Coagulation; négative. ( 6) Formation de pigment de mélanine: Gélose à la tyrosine: négative Gélose peptonée à l'extrait de levures et au fer: positive ( 7) Utilisation de sources de carbone: Positive: L-arabinose, D-fructose, Dglucose, inositol, D-mannitol, raffinose, L-rhamnose, sucrose et D-xylose. Comme illustré ci-dessus, la souche A 7700 a les pro- priétés taxonomiques de formation de mycénium aérien avec de nombreuses chaînes de spores à partir de mycélium de support vrai, d'acide diaminopimélique de type L, pas de formation de spores flagellaires ni de sporanges, et Milieu Développement Gélose sucrosée nitratée Gélose glucosée à l'asparagine Gélose glycérolée à 1 'asparagine Gélose à l'amidon et aux sels inorganiques Gélose à la tyrosine Gélose à la farine d'avoine Gélose à l'extrait de levures et l'extrait de malt Gélose de Bennett Gélose d'Emrarson Gélose nutritive Gélose peptonée à l'extrait de levures et au fer bon modéré bon bon bon modéré bon bon bon modéré à médiocre modéré à médiocre Tableau 1 Couleur du mycélium de support cannelle ( 31 e) ivoire clair ( 2 ca) topaze ( 3 ne) topaze ( 3 ne) à cannelle ( 31 e) cannelle ( 31 e) bambou ( 2 fb) ambre clair ( 3 ic) à cannelle ( 31 e) brun adobe ( 31 g) cannelle ( 31 e) ambre clair ( 3 ic) incolore Mycélium Pigment aérien soluble médiocre: perle ( 3 ba) tan rouille à rose pâle ( 5 ba) ( 51 e) non modéré: blanc (a) à perle ( 3 ba) modéré à bon: perle ( 3 ba) modéré:perle ( 3 ba) modéré: blanc (a) à perle ( 3 ba) modéré à bon: perle ( 3 ba) modéré: perle ( 3 ba) médiocre: blanc (a) à perle ( 3 ba) peu: blanc (a) non non non non non non non topaze ( 3 ne) ambre clair ( 3 ic) non brun doré ( 3 pi) à brun chêne ( 4 pi) tn ru> o O % Co - un développement aérobie, et on a conclu qu'elle appartient au genre Streptomyces Cette souche est appelée Streptomyces sp A 7700 et a été déposée au Fermentation Institute, Agency of Industrial Science and Technology, M I T I, Japon, sous le N de dépôt FERM P-6241. Cette souche a été déposée aussi à l'Agricultural Research Service, sous le numéro de dépôt NRRL 15267. (B) Souche 18063 de Streptomyces I Observations microscopiques: Les observations morphologiques par culture sur gélose à l'amidon et aux sels inorganiques à 30 C pendant 15 jours sont les suivantes On observe aussi presque les mêmes résultats sur la gélose glycérolée à l'aspara- gine, la gélose à la tyrosine et un milieu de gélose à l'extrait de levures-extrait de malt. Les mycéliums de support sont courbes, ramifiés, de 0,5 0,6 g de diamètre, et n'ont pas d'oidium mycélien et ne portent pas de spores. Les mycéliums aériens développés sur les mycéliums de support sont courbes, avec des ramifications simples, de 0,6 0,8 g de diamètre et portent de nombreuses spores en chaîne. Les chaînes de spores sont nombreuses avec des boucles, des crochets ou de doubles spirales, et peu nom- breuses avec des spirales à trois spires ou plus. Les spores sont globeuses et de 0,6 0,8 g de diamètre avec une surface couverte d'épines Pas de for- mation de spores flagellaires ni de sporanges. II Composition de l'acide diaminopimélique: On trouve de l'acide Ldiaminopimélique et on ne détecte pas de type méso dans l'analyse complète des cellules. Observation macroscopique: Les observations sur divers milieux à 30 C pendant 14 jours sont présentées dans le Tableau 2 Les indications de -6- couleur sont effectuées en consultant le "Color Harmony Manual, 4 ème édition, 1958 ". IV Propriétés physiologiques: ( 1) Température de développement: 15 43 C. ( 2) Besoin d'oxygène: aérobie. ( 3) Liquéfaction de la gélatine: positive (faible). ( 4) Hydrolyse de l'amidon: positive. ( 5) Lait écrémé: peptonisation: positive, coagulation: négative. ( 6) Formation de pigment du type mélanine: milieu de gélose à la tyrosine et milieu de gélose peptonée à l'extrait de levures et au malt: positive. ( 7) Utilisation de sources de carbone: Positive: D-fructose, G-glucose, D-mannitol, L-rhamnose et sucrose. Faiblement positive: L-arabinose, inositol, raffinose et D-xylose. Comme illustré ci-dessus, la souche A 8063 a les pro- priétés taxonomiques de formation de mycélium aérien avec de très nombreuses cha Tnes de spores à partir du mycélium de support vrai, d'acide diaminopimélique de type L, pas de formation de spores flagellaires ni de sporanges et dévelop- pement aérobie, et on a conclu qu'elle appartient au genre Streptomyces Cette souche est appelée Streptomyces sp. A 8063 et a été déposée au Fermentation Institute, Agency of Industrial Science and Technology, M I T I, Japon, sous le No de dépôt FERM P-6242. Cette souche a été déposée aussi à l'Agricultural Research Service, E U A, sous le numéro de dépôt NRRL 15268. Milieu Gélose sucrosée nitratée Gélose glucosée à 1 'asparagine Gélose glycérolée à 1 'asparagine Gélose à l'amidon et aux sels inorganiques Gélose à la tyrosine Gélose à la farine d'avoine Gélose à l'extrait de levures et extrait de malt Gélose de Bennett Gélose d'Emarson Gélose nutritive Tableau 2 Développement Couleur du mycélium de support bon brun chocolat ( 5 pn) médiocre brun épice foncé ( 4 pl) bon brun épice foncé ( 4 pl) à brun chocolat ( 4 pn) bon brun épice foncé ( 4 pl) bon brun chocolat ( 5 pn) modéré chameau ( 3 ie) à brun adobe ( 31 g) bon brun épice foncé ( 4 pl) à brun chocolat ( 4 pn) bon brun chocolat ( 4 pn) à brun épice foncé ( 4 pl) modéré brun chêne ( 4 pi) múdiocre cannelle ( 31 e) Mycélium aérien bon: gris argenté ( 3 fe) à beige ( 3 ge) peu: naturel ( 3 dc) bon: bisque ( 3 ec) à beige ( 3 ge) bon: gris argenté ( 3 fe) à beige ( 3 ge) bon: bisque ( 3 ec) à beige ( 3 ge) bon: bisque ( 3 ec) à beige ( 3 ge) bon: bisque ( 3 ec) à beige ( 3 ge) bon: bisque ( 3 ec) à beige ( 3 ge) médiocre: blanc huître (b) peu: blanc Pigment soluble brun cuivré ( 5 pi) à brun foncé ( 5 pl) brun chine ( 4 pi) brun chêne ( 4 pi) non brun cuivré ( 5 pi) à brun foncé ( 5 pl) non brun c$ne ( 4 pi) brun chêne ( 4 pi) brun chêne ( 4 pi) cannelle ( 31 e) I -41 I pu ru oe ro o O La nouvelle enzyme oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) selon la présente invention est une enzyme catalysant une réaction qui forme une mole d'acide alpha-cétoglutarique, une mole d'ammoniac et une mole d'eau oxygénée à partir d'une mole d'acide L-glutamique, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau La demanderesse a trouvé une méthode pour détecter la présence d'acide L-glutamique et/ou pour déterminer sa quantité dans un échantillon contenant de l'acide L-glutamique en mettant en contact un échantillon liquide contenant de l'acide L-glutamique avec l'oxydase d'acide L-glutamique (produc- trice de H 202) et en mesurant quantitativement l'oxygène consommé, ou l'eau oxygénée, l'ammoniac ou l'alpha-céto- glutarate produits correspondant à une quantité de L- glutamate dans ce système de réaction enzymatique. Un but de la présente invention est de fournir une nouvelle enzyme oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) ayant au moins les propriétés biochimiques suivantes: Spécificité du substrat: acide L- glutamique, Action de l'enzyme: catalyse d'une réaction qui forme une mole d'acide alpha-cétoglutarique, une mole d'ammoniac et une mole d'eau oxygénée à partir d'une mole d'acide L-glutamique, une mole d'oxygène et une mole d'eau, comme représenté par la formule (I) suivante: COOH COOH l l CH 2 CH 2 CH + O + H 20 CH 2 + NH 3 + H 20 2 2 2,2 H-C-NH C = O COOH COOH Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé pour la production d'oxydase d'acide L-gluta- mique (productrice de H 202) selon lequel on cultive un microorganisme producteur d'oxydase d'acide L- glutamique (productrice de H 202) appartenant au genre Streptomyces dans un milieu nutritif et on isole l'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) ainsi produite. Un autre but de la présente invention est de fournir une méthode de détermination de l'acide L-glutamique selon laquelle on met en contact un échantillon liquide contenant de l'acide L-glutamique avec l'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) ayant une spécificité de substrat pour l'acide L-glutamique et catalysant une réaction qui produit une mole d'acide alpha-cétoglutarique, une mole d'ammoniac et une mole d'eau oxygénée à partir d'une mole d'acide L-glutamique, une mole d'oxygène et une mole d'eau et on détermine quantitativement l'oxygène consommé ou l'acide alpha-cétoglutarique, l'ammoniac ou l'eau oxygénée produits. En ce qui concerne la nouvelle oxydase d'acide L- glutamique (productrice de H 202) Lappelée ci-après oxydase d'acide Lglutamique (H 202)7 selon la présente invention, elle est suffisamment caractérisée comme ayant la spécifi- cité de substrat et l'action enzymatique ci-dessus, et toutes enzymes ayant les mêmes caractéristiques et des propriétés différentes telles que le point isoélectrique, la valeur de Km, le p H optimal, la stabilité à la chaleur, la stabilité au p H et l'inhibition ou l'activation par des additifs doivent naturellement être incluses dans la présente invention. Les microorganismes ci-dessus sont seulement des exemples de microorganismes qui produisent la nouvelle oxydase d'acide L-glutamique (H 202), et les microorganismes appartenant au genre Streptomyces producteurs d'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) peuvent être inclus dans les microorganismes utilisés dans la présente invention D'une façon générale, les souches de microorganismes mutent facilement naturellement ou artificiellement et ceux de ces mutants qui ont une activité de production d'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) peuvent être utilisés dans la -10- présente invention. Un mode de mise en oeuvre du procédé de production d'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) par les micro- organismes producteurs de cette enzyme appartenant au genre Streptomyces est le suivant. Les microorganismes producteurs d'oxydase d'acide Lglutamique (H 202) appartenant au genre Streptomyces sont cultivés de manière classique dans un milieu nutritif pour production d'antibiotiques ou d'enzymes On peut utiliser une culture sur milieu solide ou liquide, toutefois une culture immergée avec aération est préférable pour une production industrielle de l'enzyme. Des sources nutritives pour les microorganismes sont des milieux classiques pour la culture de microorganismes. Comme sources d'azote, on peut utiliser une source d'azote assimilable, par exemple de la liqueur de macération de mais, de la poudre de soja, de la peptone, divers extraits de viande, des extraits de levures, du sulfate d'ammonium, du chlorure d'ammonium ou des amino-acides comme l'acide L- glutamique En ce que concerne les sources de carbone, on peut utiliser une source de carbone assimilable comme du sucrose, du glucose, du fructose, de la mélasse, de l'extrait de, malt ou de l'hydrolysat d'amidon De plus, on peut utiliser éventuellement divers sels inorganiques comme du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du sulfate de magnésium, du phosphate de potassium ou du dihydrogéno- phosphate de potassium, ou des agents antimousse. La température de culture peut varier dans les inter- valles de production d'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) et de développement des microorganismes, et est habituel- lement de 20 35 C, de préférence d'environ 260 C. On peut faire varier le temps de culture suivant les conditions et il est habituellement-de 50 120 heures, et on doit naturellement arrêter la culture au moment de la production maximale d'enzyme. -11- L'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) selon la présente invention est une endo-enzyme et est incluse dans les cellules. On peut isoler l'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) de la présente invention en séparant les cellules cultivées du bouillon de culture, en mettant en suspension les cel- lules humides dans une solution tampon comme un tampon phosphate, un tampon Tris-H Cl ou un tampon diméthyl- glutarate-Na OH, et en traitant au moyen d'une presse française, par ultrasons, par traitement au broyeur ou traitement par lysozyme pour obtenir une solution brute d'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) On traite ensuite la solution par la méthode connue d'isolement et de puri- fication pour protéines et enzymes afin d'obtenir l'oxydase d'acide Lglutamique (H 202) purifiée Par exemple, on soumet la solution d'enzyme à une précipitation par un solvant organique en ajoutant un solvant organique comme l'acétone, le méthanol, l'éthanol ou l'isopropanol, ou à un relargage en ajoutant du sulfate d'ammonium, et à une chromatographie en utilisant un échangeur d'ions comme de la diéthylaminoéthyl cellulose ou de la diéthylaminoéthyl Sepharose, et à une chromatographie par filtration sur gel en utilisant du gel de dextrane ou du gel de polyacryl- amide On peut obtenir de l'enzyme pulvérisée purifiée en combinant les modes opératoires ci-dessus et finalement en lyophilisant la solution d'enzyme. La méthode de détermination et les propriétés bio- chimiques de l'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) de la présente invention sont les suivantes. ( 1) Méthode de détermination: 0,3 % 4-aminoantipyrine 0,3 cm peroxydase ( 50 U/cm 3) 0,1 cm 3 0,2 M tampon phosphate (p H 7,0) 0,6 cm 0,2 % N,Ndiméthyl-m-toluidine 0,3 cm 3 0,2 M acide/L-glutamique (p H 7,0) 1,6 cm 3 eau distillée 0,2 cm 3 total 3,0 cm -12- On remplit avec le mélange cidessus ( 3,0 cm 3) une cellule en quartz à 37 C, on ajoute immédiatement et on mélange la solution d'enzyme- ( 50 gl), et place la cellule dans le porte-cellule à température constante ( 37 C) d'un spectrophotomètres, on fait incuber pendant exactement 5 minutes après 2 minutes de mélange avec la solution d'enzyme et on mesure la variation de l'absorption (densité optique àA 545) à 545 nm. On calcule l'activité de l'enzyme en utilisant la relation suivante: Activité de l'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) en unités/cm 3 A 545 1 3,05 It x éc x 0,05 x rapport de dilution 32 x ( 2) Spécificité du substrat: On a mesuré les activités relatives (%) d'enzymes oxydases d'acide L-glutamique (H 202) produites par Streptomyces sp A 7700 (appelée ci-après enzyme A 7700) et par Streptomyces sp A 8063 (appelée ci-après enzyme A 8063), respectivement, sur divers substrats, par rapport à l'acide L-glutamique. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 Les deux enzymes ont une activité spécifique sur l'acide L- glutamique et n'ont pas d'activités sur les autres amino- acides comme indiqué dans le tableau. Tableau 3 Substrat Enzyme A 7700 Enzyme A 8063 Acide L-glutamique 100 100 Ltyrosine O O L-méthionine O O L-phénylalanine O O L-arginine O O L-lysine O O L-histidine O O L-alanine O O L-isoleucine O O -13- L-valine O O Lthréonine O O L-sérine O O acide D-glutamique 0 0 méthylamine O O éthylamine 0 0 butylamine 0 O propylamine O O benzylamine O O hydroxylamine O O tyramine 0 O ( 3) Action de l'enzyme: On utilise l'acide L-glutamique ( 0,5 gmole) comme substrat On mesure la quantité d'oxygène consommée et les quantités produites d'acide alpha-c 6 toglutarique, d'am- moniac et d'eau oxygénée Les résultats sont présentés dans le Tableau 4. Tableau 4 Enzyme A 7700 Enzyme A 8063 Acide L-glutamique ajouté (gmoles) 0,50 0,50 Oxygène consommé ( méthode à l'indophénol /_J Biol Chem, 102, 499 ( 1933)7. L'eau oxygénée est mesurée par la méthode de titrage colorimétrique au moyen de peroxydase-4-aminoantipyrine- phénol. Les deux enzymes catalysent une réaction qui forme une mole d'acide alpha-cétoglutarique, une mole d'ammoniac -14- et une mole d'eau oxygénée à partir d'une mole d'acide L-glutamique, une mole d'oxygène et une mole d'eau (formule de réaction (I)). COOH COOH l CH 2 CH 2 H + O+ H 20 CH + NH 3 + H 22 (I) CH 2,2 3 H 22 H-C-NH 2 C = COOH COOH Acide L-glutamique Acide alpha-cétoglutarique ( 4) Point iso-électrique On détermine le point iso-électrique de l'enzyme A 7700 et de l'enzyme A 8063 par la méthode de concentration iso-électrique en utilisant un ampholyte vecteur, p H 3,5 6,0 (LKB Inc) Le point iso-électrique de l'enzyme A 7700 se trouve aux environs du p H 4,3 et celui de l'enzyme A 8063 aux environs du p H 4,1. ( 5) Valeur de Km La valeur de Km des deux enzymes contre l'acide L- glutamique est d'environ 5,6 x 10 4 pour l'enzyme A 7700 -3 et environ 1,1 x 10 3 pour l'enzyme A 8063. ( 6) p H optimal On utilise un tampon glycine-H Cl (p H 2,5 4,5), un tampon diméthylglutarate-Na OH (p H 4 7), un tampon phos- phate (p H 6 8)j un tampon Tris-H Cl (p H 7 9) et un tampon glycine-Na OH (p H 9 9,5) pour déterminer le p H optimal de l'enzyme. Les résultats sont présentés sur la figure 1 pour l'enzyme A 7700 et sur la figure 2 pour l'enzyme A 8063 Sur la figure 1: *: tampon glycine-H Cl,-x: tampon diméthyl- glutarate-Na OH, A: tampon phosphate, *: tampon Tris-H Cl et +: tampon glycine-Na OH Sur la figure 2: o: tampon glycine-H Cl, x: tampon diméthylglutarate-Na OH, A: tampon phosphate,: tampon Tris-HC 1 et O: tampon glycine-Na OH. Le p H optimal des deux enzymes est un p H 5 7,5. -15- ( 7) Stabilité à la chaleur: Les enzymes A 7700 et A 8063 dissoutes dans du tampon phosphate 20 m M (p H 7,0) sont mises à incuber à diverses températures pendant 10 minutes et immédiatement refroidies dans de l'eau glacée, puis on détermine les activités restantes. Les résultats sont présentés sur la figure 3, o e: enzyme A 7700 et o: enzyme A 8063 Les deux enzymes sont stables jusqu'à 55 C et dénaturées à 70 C. ( 8) Stabilité au p H: On mesure la stabilité au p H de l'enzyme A 7700 (figure 4) et de l'enzyme A 8063 (figure 5) dans diverses solutions tampon. On dissout les enzymes à une concentration de 40 m M dans chaque solution tampon, on les fait incuber à 37 C pendant 60 minutes et mesure les activités Solution tampon (p H 2,5 4,5, o sur glutarate-Na OH (p H 4 tampon phosphate (p H tampon Tris-H Cl (p H 7 tampon glycine-Na OH L'enzyme A 7700 immédiatement on les refroidit et on restantes à chi pour chaque pi les figures 4 e 7,5, * sur le 6 8, a sur le 9, & sur les (p H 9 9,5, O est stable aux aque p H. H: tampon glycine-H Cl et 5), tampon diméthyl- es figures 4 et 5), es figures 4 et 5), s figures 4 et 5) et, sur les figures 4 et 5). p H 4,5 7,5 (figure 4) et l'enzyme A 8063 est stable aux p H 4 7,5 (figure 5). ( 9) Effet des ions de métaux: L'effet des ions de métaux est indiqué dans le Tableau 5, o on voit que les ions autres que Cu++ n'ont pas d'effet sur les enzymes. Tableau 5 Sel Concentration Activité relative (%) métallique (m M) Enzyme A 7700 Enzyme A 8063 Témoin 100 100 Mn C 12 1,0 108,6 105,7 Mg C 12 -1,0 102,5 103,4 Ca C 12 1,0 98,8 103,0 -16- Ba C 12 1,0 102,5 103,7 Ni C 12 1, 0 101,8 102,3 Co C 12 1,0 99,4 98,0 Zn C 12 1,0 106,1 110,7 Cu C 12 1,0 50,3 62,1 Fe C 13 1,0 109,2 103,0 ( 10) Effet d'agents tensio-actif et d'autres substances: L'effet de diverses substances sur l'activité des enzymes est indiqué dans le Tableau 6 Il n'y a pas d'effet de EDTA, ce qui montre que les enzymes ne sont pas des métallo-enzymes Les enzymes ne sont pas inhibées non plus par Na N 3 et KCN et ne sont pas affectées par FAD et FMN. Tableau 6 Additif Concentration activité relative (%) -_ _ _A 7700 A 8063 Témoin 100 100 EDTA 10 m M 93,8 100,7 Na N 3 10 m M 101,4 102,6 KCN 10 m M 103,5 102,9 PCMB 0,002 % 107,6 98,2 FAD 0,01 m M 100,7 100,7 FMN 0,01 m M 88,9 97,1 Brij 35 0,5 % 65,3 86,9 LBS 0,1 % 131,9 110,2 SDS 0,1 % 106,3 93,1 cholate de sodium 0,1 % 104,2 ,0 Cation FB 0,5 % 104,2 101,8 CTAC 1 0,1 % 98,6 94,2 Comme illustré ci-dessus, l'enzyme A 7700 et l'enzyme A 8063 ont une spécificité de substrat pour l'acide L-gluta- mique et catalysent une réaction qui forme une mole d'acide alphacétoglutarique, une mole d'ammoniac et une mole d'eau oxygénée à partir d'une mole d'acide L-glutamique, une mole -17- d'oxygène et une mole d'eau, et sont une nouvelle enzyme oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202). Une nouvelle enzyme oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) peut être utilisée pour analyse d'un échantillon liquide contenant de l'acide L-glutamique par détermination d'une quantité d'oxygène consommée ou d'une quantité produite d'acide alpha-cétoglutarique, d'ammoniac ou d'eau oxygénée. Un échantillon liquide à analyser selon une méthode de la présente invention peut être un échantillon liquide contenant de l'acide L-glutamique Par exemple, des échan- tillons de réactif acide L-glutamique, de liqueur de fermen- tation d'acide L-glutamique, de boisson contenant de l'acide L-glutamique, et des échantillons pour déterminer l'activité enzymatique ou pour déterminer le substrat dans un système de réaction enzymatique qui forme ou produit de l'acide L-glutamique, ou qui consomme de l'acide L-gluta- mique comme substrat, peuvent être mentionnés. Des exemples de ce système de réaction enzymatique sont les suivants, o a-KG est l'acide î-cétoglutarique et L-CA est l'acide L-glutamique. * Glutamate-pyruvate transaminase (GPT): L-alanine + a-KG GPT> pyruvate + L-GA * Glutamate-oxaloacétate transaminase (GOT): Acide L-aspartique + aKG GOT > acide oxoloacétique:+ L-GA * Cystéine-aminotransférase (CA Tase) : L-cystéine + ac-KG CA Tase acide a-mercaptopyruvique + L-GA * Tyrosineaminotransférase (TA Tase): L-tyrosine + a-KG TA Tase acide phydroxyphénylpyruvique + L-GA * Leucine aminotransférase (LA Tase): Lleucine + -KG LA Tase acide 2-oxoisocaprique + L-GA * Kynurénine aminotransférase (KA Tase) L-kynurénine + -KG KA Tase acide oaminobenzylpyruvique + L-GA -18- *Aminobutylate aminotransférase (AA Tase): acide 4-aminobutanoique + a-KG AA Ta S semi-aldéhyde succinique + L-GA * y-glutamyl transpeptidase 4 y-GPT): L-glutamyl-X + L-GA YGPT glycylglycyl-X + L-GA (X: groupe de transfert tel que glutamyl amino-acide) * Glutamate racémase (G Rase): Acide D-glutamique G Rase > 1-GA Ces systèmes de réaction d'enzymes sont illustratifs seulement et ne sont pas limités pour la méthode de déter- mination de la présente invention De plus, on peut effectuer la détermination de l'activité enzymatique ou de la quantité de substrat en déterminant la quantité d'acide L-glutamique produit ou libéré. * Amino-acide acétyltransférase (AAA Tase): acétyl-Co A + L-GA AAA Tase > Co ASH + N-acétyl-L-GA * Glycine aminotransférase (GLA Tase): GLA Ta se acide glyoxalique + L-GA glycine + a-KG * Glutamate décarboxylase (G Dase) : L-GA G Dase > acide 4-aminobutanoique + C 02 * y-glutamylcystéine synthétase (y-GLC Sase): ATP + L-GA + L-cystéine y-GLC Sase > -glutamyl-Lcystéine + ADP + Pu Les systèmes de réaction enzymatique ci-dessus sont illustratifs seulement et ne sont pas limités pour l'échan- tillon à analyser Dans ces réactions enzymatiques, l'acide L-glutamique consommé comme substrat est mesuré pour déter- mination de l'activité enzymatique. Dans la méthode de détermination de la présente invention, l'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) est mise à réagir avec l'échantillon liquide contenant de l'acide L-glutamique L'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) peut être une solution d'enzyme dans le tampon à p H stable, une forme d'enzyme emprisonnée ou microencapsulée maintenant -19- l'enzyme sans dénaturation au moyen, par exemple, d'une liaison covalente avec une résine, un polysaccharide ou un verre inorganique. La quantité d'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) peut varier suivant la quantité d'échantillon liquide et la durée de réaction, et est de préférence de 2-10 unités Une assez haute activité spécifique de l'enzyme utilisée est préférable, toutefois une très haute pureté de l'enzyme n'est pas toujours nécessaire. La quantité d'échantillon liquide contenant de l'acide L-glutamique n'est pas limitée, et l'échantillon est préparé éventuellement avec ou sans dilution. Selon cette méthode, on fait réagir l'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) avec l'échantillon liquide et on fait incuber le mélange réactionnel pendant un temps constant à température constante, par exemple pendant 5 20 minutes à environ 370 C pour consommer une mole d'oxygène et produire une mole d'acide alpha-cétoglutarique, une mole d'ammoniac et une mole d'eau oxygénée par mole d'acide L-glutamique. * On détermine la quantité d'oxygène, d'acide alpha- cétoglutarique, d'ammoniac ou d'hydrogène L'oxygène est de préférence détecté par des mesures électriques au moyen d'une électrode à oxygène L'acide alpha-cétoglutarique est détecté de préférence par la méthode calorimétrique de détermination de l'hydrazine avec la 2,4-dinitrophényl- hydrazine (absorption à 415 nm ou 530 nm I L'ammoniac peut être détecté par des méthodes électriques au moyen d'une électrode à ammoniac, ou d'une électrode à ions après trans- formation en ion ammonium, ou par la méthode à l'indophénol. On mesure l'eau oxygénée au moyen d'une électrode à eau oxygénée ou d'un indicateur qui réagit avec l'eau oxygénée pour former une composition détectable Des exemples de l'indicateur sont un indicateur colorant qui est produit sous la forme de changements visibles, un indicateur fluo- rescent qui forme une fluorescence par rayonnement -20- ultraviolet ou une composition luminescente Un exemple de l'indicateur colorant est une composition comprenant une substance active peroxydase et un progéniteur de pigment. On utilise de préférence la raifort peroxydase et la com- binaison d'un accepteur d'électrons, d'un dérivé de phénol et d'un dérivé d'aniline Des exemples d'accepteurs d'électrons sont la 4-aminoantipyrine, le 4-amino-3- hydrazino-5-mercapto-l,2,4-triazole, le 2-hydrazinobenzo- thiazole, la 3-méthyl-2-benzothiazolonehydrazone et le 2aminobenzothiazole Des exemples de dérivés de phénol ou de dérivés d'aniline sont le phénol, le p-hydroxy- benzoate de sodium, le p-chlorophénol, le 2,4-dichloro- phénol, le 4,6-dichloro-o-crésol, le 2,4-dibromophénol, la N,N-dométhylaniline, la N,N-diéthylaniline, la N,N- diméthyl-m-toluidine, la N,N-diéthyl-m-toluidine, la N,N- diméthyl-m-méthoxytoluidine, la N,N-diéthanol-m-toluidine, la 3-méthyl-N-éthyl-N-hydroxyéthylaniline, la N-éthyl-N- ( 3-méthylphényl)-N-acétyléthylènediamine, la N-éthyl-N- hydroxyéthyl-m-toluidine sodique, la N-éthyl-N-sulfopropyl- m-toluidine, la N-éthyl-N-( 2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m- toluidine sodique ou la m-acétoamino-N,N-diéthylaniline. Un complexe colorant de 4-aminoantipyrine et de dérivé de phénol peut être mesuré à 500 520 nm et un complexe de 4-aminoantipyrine et de dérivé d'aniline peut être mesuré à 535 580 nm Des exemples de substrats fluorescents en fluorométrie et en luminométrie sont l'oxalate de bis- ( 2,4,6-trichlorophénol), la phénylthiohydantolne, l'acide monovanillique, l'acide 4-hydroxyphénylacétique, la vanillylamine, la 3-méthoxythiramine, la phlorétine, l'hordénine, le luminolmonoanion, la lucigénine ou la waffine Ces substances peuvent éventuellement être uti- lisées en même temps qu'un accepteur d'électrons et une substance active peroxydase pour la détermination de l'eau oxygénée Dans le réacteur indicateur qui se change en une substance détectable par réaction avec l'eau oxygénée, par -21- exemple, la quantité de peroxydase utilisée est de plus de 0,1 unité par essai, de préférence 10 unités. Comme on fait réagir l'accepteur d'électrons tel que la 4-aminoantipyrine ou des dérivés de phénol ou des dérivés d'aniline et qu'on en consomme une mole pour deux moles d'eau oxygénée, ces substances doivent être utilisées en excès par rapport à la quantité d'eau oxy- génée produite et de préférence à raison de plus de cinq moles par mole d'eau oxygénée. Ces réactifs sont de préférence mélangés et préparés en solution, ou mélangés avec une solution d'oxydase d'acide L-glutamique (H 202), ou peuvent être préparés sous la forme d'une phase solide qui est déposée en couches sur une pellicule de résine synthétique ou du papier-filtre. De plus, une électrode à enzyme attachée à l'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) immobilisée peut de préférence être utilisée comme moyen électrique de détection. La quantité d'acide L-glutamique dans un échantillon peut être calculée d'après la courbe d'étalonnage de la quantité ainsi déterminée d'oxygène, d'acide alpha-céto- glutarique, d'ammoniac et d'eau oxygénée - Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais ne doivent pas être considérés comme la limitant. Exemple 1 Un milieu ( 100 cm, p H 7,0) comprenant 0,5 % de peptone, 0,3 % d'extrait de viande, 0,1 % d'extrait de levures et 0,5 % d'extrait de malt dans un erlenmeyer de 500 cm 3 a été stérilisé à 1200 C pendant 20 minutes On y a inoculé une culture de quatre jours de Streptomyces sp. A 7700 FERM P-6241 et on a effectué la culture à 260 C pendant 4 jours Les cellules de culture obtenues par centrifugation ont été broyées avec du sable de quartz dans un mortier On a extrait l'enzyme en ajoutant du tampon phosphate 2 p O m M (p H 7,0) et on a recueilli l'extrait On a -22calculé que la quantité d'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) dans le bouillon résultant de la culture était de 0,13 u/cm. Exemple 2 Dans l'exemple 1, on a remplacé Streptomyces sp. A 7700 FERM P-6241 par Streptomyces sp A 8063 FERM P-6242. On a calculé que la quantité d'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) dans le bouillon résultant de la culture était de 0,59 u/cm. Exemple 3 3 3 Deux erlenmeyers de 500 cm contenant chacun 100 cm de milieu comprenant 0, 5 % de peptone, 0,3 % d'extrait de viande, 0,1 % d'extrait de levures et 0,5 % d'extrait de malt ont été stérilisés à 120 C pendant 20 minutes On a inoculé Streptomyces sp A 8063 FERM P-6242 dans ce milieu et On l'a culvivé à 26 C pendant 3 jours. On a inoculé ces cultures d'ensemencement ( 200 cm 3) dans un milieu ( 20 litres, p H 7,0) comprenant 0,5 % de peptone, 0,3 % d'extrait de viande, 0,1 % d'extrait de levures et 0,5 % d'extrait de malt dans un fermenteur de litres préalablement stérilisé à 120 C pendant 20 minutes et on a conduit la culture à 26 C, aération 20 1/min, agitation à 300 tpm pendant 96 heures Le bouillon résultant de la culture a été centrifugé à 5000 tpm pendant 5 minutes pour donner des cellules de culture Les cellules ont été mises en suspension dans du tampon phos- phate 20 m M ( 3 litres, p H 7,0) et broyées au moyen d'un Dyno-Mill (nom commercial, Dyno-Mill, Willy A Bachofen Manufact Engineers, Suisse) Les cellules broyées ont été centrifugées à 5000 tpm pendant 15 minutes pour donner 2,82 litres de solution surnageante ( 11 200 unités). On a ajouté du sulfate d'ammonium à la solution sur- nageante et on a recueilli les fractions précipitées à une saturation de 0,4 0,53 Le précipité dissous dans du tampon phosphate 20 m M (p H 7,0) a été tassé dans un tube de cellulose régénérée et dialysé contre du tampon -23- phosphate 20 m M (p H 7,0, 12 litres) pendant 20 minutes. Le dialysat a été chargé sur une colonne ( 50 x 400 mm) garnie de DEAEsepharose CL-6 B et élué avec un gradient linéaire de O 0,7 M K Cl dans du tampon phosphate 20 m M (p H 7,0) Les fractions éluées avec 0,5 M K Cl ( 130 cm, 6690 unités) ont été dialysées dans un tube en cellulose régénérée contre 6 litres de tampon phosphate 20 m M pendant 18 heures Le dialysat a été concentré sous vide (à 15 cm 3) Le concentré a été chargé sur une colonne de Sepharose CL-6 B et élué avec du tampon phosphate 10 m M (p H 7,0) pour donner l'éluat ( 80 cm 3, 5900 unités). L'éluat a été concentré par ultrafiltration à 8 cm 3 et chargé de nouveau sur une colonne de Sepharose CL-6 B, puis élué par la même solution tampon que ci-dessus pour donner l'éluat ( 60 cm 3, 4890 unités) L'éluat a été lyophilisé pour donner de l'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) ( 78,9 mg, 58,2 U/mg, 4595 unités). Exemple 4 - Un milieu (p H 7,0, 20 litres) comprenant 0,5 % de peptone, 0,3 % d'extrait de viande, 0,1 % d'extrait de levures et 0,5 % d'extrait de malt a été introduit dans un fermenteur cylindrique de 30 litres et stérilisé à 120 C pendant 20 minutes Une culture d'ensemencement ( 200 cm) de Streptomyces sp A 7700 FERM P-6241 obtenue par culture pendant 3 jours dans le même milieu a été inoculée dans le milieu ci-dessus et la culture a été conduite à l'état immergé à 26 C pendant 96 heures, avec aération aseptique à 20 litres par minute, agitation à 300 tpm Le bouillon de culture a été séparé par centrifugation à 5000 tpm pendant 5 minutes et les cellules obtenues ont été mises en suspension dans du tampon phosphate 20 m M (p H 7,0, 3 litres), puis broyées au moyen d'un Dyno-Mill Les cellules broyées ont été centrifugées à 5000 tmp pendant 15 minutes pour donner la solution surnageante ( 2,84 litres, 2950 unités) On y a ajouté du sulfate d'ammonium et on a -24- recueilli le précipité à une saturation de 0,47 0,61 On a dissous le précipité dans du tampon phosphate 20 m M (p H 7,0) et on l'a dialysé dans un tube en cellulose régé- nérée contre du tampon phosphate 20 m M (p H 7,0) pendant 20 heures On a chargé le dialysat sur une colonne de DEAE-sepharose CL-6 B et on l'a élué par élution à gradient linéaire avec O 0,7 M KC 1 dans un tampon phosphate 20 m M 1080 unités). Exemple 5 (Détermination quantittative d'acide L-glutamique): tampon phosphate 40 m M (p H 6,5) 0,03 % de 4-aminoantipyrine 0,04 % de N,N-diméthyl-mtoluidine 2 u/cm 3 de peroxydase 2 U/cm 3 d'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) Le mélange réactionnel ci-dessus ( 3,0 cm 3) a été mélangé avec une solution ( 50 il) d'acide L-glutamique 10 m M diluée à 1/1, 3/4, 1/2, 1/4, 1/5 et 1/10, respectivement, et mis à incuber à 37 C pendant 10 minutes Apres incubation, le mélange de réaction a été mesuré colorimétriquement à 545 nm. Le résultat est représenté sur la figure 6 Sur la figure, o représente l'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) obtenue dans l'exemple 3 et A représente l'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) obtenue dans l'exemple 4 Les résultats pour les deux enzymes sont absolument identiques et on obtient une bonne linéarité entre la quantité d'acide -25- L-glutamique et le rapport d'absorption. On utilise pour les exemples suivants l'oxydase d'acide L-glutamique (H 202) obtenue dans l'exemple 3. Exemple 6 (Détermination de la GPT du séium): N,N-diéthyl-m-toluidine 3 m M 4-aminoantipyrine 1,5 m M peroxydase 5 unités/cm 3 L-alanine 200 m M acide alphacétoglutarique 10 m M tampon Tris-H Cl (p H 7,5) 50 m M oxydase d'acide Lglutamique (H 202) 6 unités/cm 3 2 2 3 Le mélange réactionnel ci-dessus ( 1,0 cm) a été recueilli dans de petits tubes à essai et mis en pré- incubation à 37 C On a ajouté du sérum ( 50 gl, dilution 1/1, 3/4, 1/2, 1/4, 1/10, respectivement) et on a fait incuber le mélange pendant exactement 20 minutes à 37 C. On y a ajouté du tampon de McIlvain 0,1 M (p H 5,5, 2,0 cm 3) et le mélange a été mesuré colorimétriquement à 545 nm. Comme témoin, on a utilisé le mélange réactionnel ci-dessus sans la Lalanine Les résultats sont présentés sur la figure 7, o on peut déterminer exactement la GPT du sérum. Exemple 7 (Détermination de la GOT du sérum): N,N-diéthyl-m-toluidine 3 m M 4-aminoantipyrine 1,5 m M peroxydase 5 u/cm 3 acide L-aspartique 200 m M acide alpha-cétoglutarique 10 m M tampon Tris-H Cl (p H 7,5) 50 m M oxydase d'acide L-glutamique (H 202) 6 u/cm 3 Le mélange réactionnel ( 1,0 cm) constitué de la composition ci-dessus a été recueilli dans de petits tubes à essai et mis en pré-incubation & 37 C On y a ajouté du sérum (dilution 1/1, 3/4, 1/2, 1/4, 1/10)( 50 il) et on a -26- fait incuber le mélange à 37 C pendant exactement 20 minutes On a ajouté du tampon de McIlvain 0,1 M (p H 5,5, 2,0 cm 3) et on a effectué des mesures colorimétriques à 545 nm On a utilisé comme témoin un mélange réactionnel identique au mélange ci-dessus, mais sans acide L- aspartique. Les résultats sont représentés sur la figure 8, o on peut déterminer exactement la GOT du sérum. Exemple 8 (Détermination de la GPT du sérum)): (réactif I) N-éthyl-N-sulfopropyl-mtoluidine 3 m M peroxydase 5 u/cm 3 L-alanine 200 m M acide alphacétoglutarique 10 m M tampon Tris-HC 1 (p H 7,5) 50 m M oxydase d'acide Lglutamique (H 202) 5 u/cm oxydase d'acide ascorbique 5 u/cm 3 (réactif II) 4-amino-antipyrine 15 m M On a introduit le réactif I ( 1 cm 3) dans une cellule en quartz On y a ajouté du sérum ( 50 il) et on a fait incuber le mélange à 37 C pendant 5 minutes On y a ajouté le réactif II, après préincubation à 37 C, et on a fait incuber le mélange à 370 C pendant divers laps de temps, puis on a effectué des mesures colorimétriques à 550 n M. Les résultats sont représentés sur la figure 9, d'après laquelle on voit qu'il n'y a pas de temps de retard dans la détermination de la GPT du sérum et que l'on obtient une' bonne courbe d'étalonnage linéaire passant par l'origine. Dans cette méthode de détermination, toute réaction non-spécifique et tout temps de retard sont supprimés de la première étape de réaction et on n'a donc pas besoin de détermination de contrôle. -27- Exemple 9 (Détermination de la GOT du sérum): (réactif I) N-éthyl-N-sulfopropyl-mtoluidine 3 m M peroxydase 5 u/cm 3 acide L-aspartique 200 m M acide alpha-cétoglutarique 10 m M tampon Tris-H Cl (p H 7,5) 50 m M oxydase d'acide L-glutamique (H 202) 5 u/cm 3 oxydase d'acide ascorbique 5 u/cm 3 (réactif II) 4-amino-antipyrine 15 m M On a introduit le réactif I ( 1,0 cm 3) dans une cel- lule en quartz et on y a ajouté le sérum ( 50 1 l), puis on a fait incuber le mélange à 37 C pendant 5 minutes Le réactif II ( 0,1 cm 3), après pré-incubation à 37 C, a été ajouté au mélange de réaction et on a fait incuber l'en- semble à 37 C pendant divers laps de temps, puis on a effectué des mesures colorimétriques à 550 nm. Les résultats sont présentés sur la figure 10, o on n'observe pas de temps de retard et aucune expérience de contrôle n'est nécessaire Comme on le voit sur la figure , on obtient une bonne courbe d'étalonnage linéaire pour la détermination de GOT, passant par l'origine. Exemple 10 Dans l'exemple 8, on a utilisé les mêmes réactifs I et II et on a remplacé l'échantillon de sérum par 40 échan- tillons de sérum (de chacun 50 1 l) pour déterminer l'acti- vité de GPT des sérums. On a analysé aussi les mêmes échantillons en utilisant une méthode connue antérieurement (méthode UV, Wako Chem. Co., nécessaire pour analyse GPT-UV WAKO). La corrélation calculée d'après les résultats des deux méthodes est la suivante: -28- = 0,998 y = 1,03 x + 1,6 o on obtient une bonne corrélation Une courbe de corré- lation est représentée sur la figure 1. Exemple 11 On détermine l'activité de GOT dans le sérum selon la méthode de l'exemple 9 avec 40 échantillons de sérum (de chacun 50 1). On analyse les mêmes échantillons en utilisant une méthode de détermination de GOT connue antérieurement (méthode UV, Wako Pure Chem Co, nécessaire GOT-UV WAKO). La corrélation d'après les deux résultats est: y = 0,997 v = 1,01 x + 1,1 o on obtient une bonne courbe de corrélation comme repré- senté sur la figure 12. Les dessins représentent: Fig 1: Courbe de p H optimal, enzyme A 7700, Fig 2: Courbe de p H optimal, enzyme A 8063, Fig 3: Courbe de stabilité à la chaleur des enzymes A 7700 et A 8063, Fig 4: Courbe de stabilité au p H de l'enzyme A 7700, Fig 5: Courbe de stabilité au p H de l'enzyme A 8063, Fig 6: Courbe d'étalonnage de l'acide L-glutamique en utilisant les enzymes A 7700 et A 8063, Fig 7: Courbe d'étalonnage de GPT du sérum, Fig 8: Courbe d'étalonnage de GOT du sérum, Fig 9: Courbe d'étalonnage de GPT du sérum, Fig 10: Courbe d'étalonnage de GOT du sérum, Fig 11: Courbe de corrélation pour l'activité de GPT du sérum, Fig 12: Courbe de corrélation pour l'activité de GOT du sérum. -29- REVENDICATIONS 1 Nouvelle oxydase d'acide L-glutamique (produc- trice de H 202) caractérisée en ce qu'elle a au moins les propriétés biochimiques suivantes: 1) Spécificité du substrat: acide L-glutamique 2) Action de l'enzyme: Catalyse une réaction qui forme une mole d'acide alpha-cétoglutarique, une mole d'ammoniac et une mole d'eau oxygénée à partir d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau, selon la formule (I) suivante: COOH COOH l I CH CH CH 2 + 02 + H 20 CH 2 + NH 3 + H 202 H-C-NH 2 C = O COOH COOH 2 Oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) selon la revendication 1, caractérisée en ce que cette enzyme a: ( 1) un point isoélectrique à un p H d'environ 5,3 (mesuré par ampholyte vecteur p H 3,5 6, 0), ( 2) une valeur de Km pour un L-glutamate d'environ ,6 x 10-4 M, ( 3) un p H optimal d'environ 5 7,5, ( 4) une stabilité à la chaleur jusqu'à environ 55 C et ( 5) une stabilité au p H à des p H d'environ 4,5 7,5. 3 Oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) selon la revendication 1, caractérisée en ce que cette enzyme a ( 1) un point isoélectrique à un p H d'environ 4,1 (mesuré par ampholyte vecteur p H 3,5 6, d), ( 2) une valeur de Km pour un L-glutamate d'environ 1,1 x 10 3 M, ( 3) un p H optimal d'environ 5 7,5, ( 4) une stabilité à la chaleur jusqu'à environ 55 C et -30- ( 5) une stabilité au p H à des p H d'environ 4 7,5. 4 Un procédé pour la production d'une nouvelle oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) carac- térisé en ce qu'on cultive des micro-organismes pro- ducteurs d'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) appartenant au genre Streptomyces dans un milieu nutritif et on isole l'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) ainsi produite. Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le microorganisme producteur d'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) appartenant au genre Streptomyces est Streptomyces sp A 7700 FERM P-6241. 6 Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme producteur d'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) appartenant au genre Streptomyces est Streptomyces sp A 8063 FERM P-6242. 7 Une méthode pour détecter l'acide L-glutamique ou un L-glutamate, caractérisée en ce qu'on met en contact dans un milieu aqueux un échantillon de l'acide L-gluta- mique à analyser et de l'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) qui a une spécifité de substrat pour l'acide L-glutamique, et catalyse une réaction qui forme une mole d'acide alpha-cétoglutarique, une mole d'ammoniac et une mole d'eau oxygénée à partir d'une mole d'acide glutamique, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau et on détermine quantitativement l'oxygène consommé ou l'acide alpha- cétoglutarique, l'ammoniac ou l'eau oxygénés produits. 8 Une méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que la détermination quantitative de l'eau oxygénée esteffectuée par un indicateur qui subit une modification détectable par réaction avec l'eau oxygénée. 9 Une méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'indicateur est une composition d'un réactif colorant, d'un réactif fluorescent ou d'un réactif -31- luminescent. Une méthode selon la revendication 7, caracté- risée en ce l'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) est une enzyme obtenue à partir d'un organisme pro- ducteur d'oxydase d'acide L-glutamique (productrice de H 202) appartenant au genre Streptomyces. 11 Une méthode selon la revendication 7, caracté- risée en ce qu'un échantillon liquide contenant de l'acide L-glutamique est un échantillon liquide d'un système de réaction enzymatique qui libère ou produit de l'acide L-glutamique. 12 Une méthode selon la revendication 11, caracté- risée en ce que l'échantillon liquide de système de réaction enzymatique est un échantillon pour détermination de l'activité de glutamate-pyruvate transaminase. 13 Une méthode selon la revendication 11, caracté- risée en ce que l'échantillon liquide de système de réaction enzymatique est un échantillon pour détermination de l'activité de glutamate-oxoloacétate transaminase. 14 Une méthode selon la revendication 11, caracté- risée en ce que l Aéchantil 11 N liquide de système de réàaction enzymatique est un échantillon pour détermination de l'activité de peptidase.