Brevet FR2523598A1 — publié le 19830923

La présente invention concerne un procédé d'immobilisation des cellules microbiennes à activité de glucose-isomérase selon lequel la polymérisation induite par l'aldéhyde glutarique s'effectue en présence d'un porteur protéinique. On connaît déjà des procédés d'immobilisation de cellules micorbiennes à activité de glucose-isomérase. Ainsi, selon le brevet du laboratoire Baxter (5), la polymérisation des cellules s'effectue par une liaison transversale en présence d'un composé de diamine diazoté, comportant de un à trois hétérocycles, tel que la 2,6-diaminopyridine, la 3,6-diaminoacridine etc. Lloyd et al (6) utilisent des cellules entières d'Arthrobacter, traitées thermiquement pour isomériser le glucose en fructose selon un procédé continu. Dans le brevet d'Amotz et al. (8) des cellules entières de Bacillus sp. NRLL 5656 sont traitées par l'aldéhyde glutarique et le produit polymérisé est utilisé pour l'isomérisation du glucose en fructose dans un réacteur à régime de fonctionnement continu. I1 est possible de retenir des cellules entières d'actinomycetes sur les échangeurs d'ions tels que la cellulose DEAE ou ECTEOLA (4,9) moyennant des liaisons ioniques. L'immobilisation peut également s'effectuer sur un gel de collagène avec transformation ultérieure du mélange obtenu en une substance insoluble à l'aide d'un traitement de surface avec l'aldéhyde glutarique (7). Le traitement thermique direct des cellules en vue de diminuer la perméabilité de la membrane cellulaire conduit en général à l'obtention de produits de basse activité et de courte durée de vie dans les conditions du procédé d'isomérisation. La rétention de cellules sur des échangeurs d'ions (par exemple cellulose DEAE) mène à l'solution de l'activité enzymatique par la solution du substrat. Le même processus a lieu en retenant les cellules dans une structure de gel comme le polyacrylamide ou le collagène. En général, on obtient les produits d'enzymes immobilises les plus stables dans le cas d'une liaison covalente entre groupes réactifs présents à la surface de la membrane cellulaire. Des procédés similaires ont été utilisés également pour l'immobilisation de cellules avec activité de glucose-isomérase. La polymérisation moyennant Ia réaction avec des diamines diazotés procure une bonne régénération de l'activite des cellules ; cependant son application est limitée à cause de la haute toxicité etdu caractère-cancériE-ene des réactifs utilisés (2,6-diaminopyridine, 3,6 diaminoacridine). La polymérisation directe des cellules moyennant le traitement avec l'aldéhyde glutarique produit un- bas degré de polymerisation en raison de la quantité insuffisante de groupes réactifs libres sur leur surface. Pour cette raison, on n'obtint pas à un degré suffisant la structure réticulaire qui seule pourrait procurer un meilleur contact du substrat utilisé avec l'enzyme immobilisé.Le procédé breveté ne permet pas d'atteindre une normalisation du produit final. On a cherché à lier des cellules à activité de glucose-isomérase sur des fractions de sang (fraction V d'après Con, fibrilles etc., mais il n'a pas été possibled'obtenirdes produits ayant une bonne activité (4,10). L'objectif de la présente invention est de fournir un procédé pour immobiliser des cellules microbiennes à activité de glucose-isomérase, en utilisant un porteur protéinique accessible en vue d'obtenir un produit stable de haute activité permettant l'obtention de sirops à haute teneur de fructose moyennant un procédé technologique continu. Ce procédé consiste plus précisément dans l'utilisation de la poly mérisation des cellules à activité de glucose-isomérase à l'aide de l'al- déhyde glutarique. On a constaté quel'activité de glucose-isomérase est conservée lorsque la polymérisation avec l'aldéhyde glutarique s'effectue en présence de sérum ou de plasma sanguin en tant que porteur protéinique. Le sérum ou le plasma sanguin obtenus à partir du bétail pour abattage en bonne santé (bêtes à cornes, menu bétail, porcs etc.) doit répondre aux exigences vétérinairo-sanitaires et est utilisé à l'étant congelé ou sèche. Dans les deux derniers cas, il faut dissoudre le sérum ou le plasma sanguin dans l'eau et amener la concentration de la solution résultante jusqu'a 1012 % de substance sèche. On lave le produit obtenu après la polymérisation avec de l'eau. Dans cet état ou après congélation durant 12 heures à des températures de -5 à -100C, on soumet le produit au pressage, on le granule et le sèche à des températures inférieures à 5O0C sous vide ou dans un courant d'air sec. Outre l'utilisation à l'état granulé, on peut utiliser le produit séché après son broyage et tamisage, en triant la fraction ayant une grosseur de grains de 10 à 30 mesh. Le produit immobilisé ainsi obtenu est utilisé pour charger la colonne réactionelle ou la batterie de colonnes sur lesquelles on fait couler une solution 2 à 3 M de glucose comportant des activateurs (ions de magnésium et de cobalt) à des concentrations optimales pour un enzyme donné, à des températures de 45 à 750C. Le débit du substrat est régulé en vue d'obtenir une transformation de 40 à 50 % du glucose en fructose (équilibre de la réaction d'isomérisation). L'activité de glucose-isomérase dans la colonne ou dans la batterie de colonnes ainsi que la durée de vie du produit enzymatique sont fonction du temps de contact de l'enzyme avec le substrat (débit d'écoulement de la colonne), de la température, de l'activité et la quantité du produit chargé et enfin de la présence d'activateurs (ions de magnésium et de cobalt). L'activité de glucose-isomérase est déterminée dans un réacteur selon le protocole décrit par Thompson et al. (4). La quantité de glucose transformé en fructose est déterminée par la méthode colorimétrique (de Disch et al.) ou polarométrique. Le dosage s'effectue à des intervalles de temps déterminé au cours du fonctionnement de la colonne.L'indice d'activité de la colonne est détermine d'après la formule suivante (8) A = RIE x log [0,504 (0,504 - )3 ou A = efficacité de la colonne I = quantité de glucose transformé en fructose (g) R = débit (cm3/min) E = nombre d'unités internationales d'activités de glucose-isomérase, se trou vant dans la colonne ou la batterie de colonnes. L'équilibre de la réaction d'isomérisation peut être atteint en présence d'un minimum de 2000 unités internationales de glucose-isomérase. On peut éliminer les produits secondaires de la réaction et les ions de cobalt et de magnésium par traitement avec du charbon actif et passage sur une résine cationique du type Wofatite, Duolites, Amberlite, Dowex etc. L'indice de couleur du sirop à haute teneur de fructose est déterminé par spectrophotométrie dans une cuvette de 1 cm pour une longueur d'onde de 450 et 600 nm.On détermine les unités de couleur du sirop à haute teneur en fructose d'après la formule (8) A A6000) A 109 ( 450 - 600) ou B C B = indice de couleur A450 et A600 = absorption de la lumière pour 450 et 600 nm C = concentration de la solution (g/100 cm Les produits enzymatiques immobilisés ainsi obtenus ont les avantages suivants en comparaison avec les produitsdéjà connus dans l'état antérieur de la technique:haute activité par gramme de produit immobilisé (150 à 200 GIU) (g) ; optimum de pH favorable (7,0) ; haut optimum de température (70-750C) considérable stabilité thermique à des températures de 45 à 650C. La productivité en produit obtenu est de 1,5 GIU pour 1 g de glucose pour un degré de conversion de 45 à 50 %. La présente invention est illustrée par les exemples donnés ci-après Exemple I Le liquide de culture obtenu après la fermentation de cellules microbiennes est centrifugé ou filtré. On lave la biomasse filtée, une fois à l'eau. Les cellules humides obtenues après la centrifugation ou la filtration doivent contenir de 10 à 12 ss de substance sèche. Dans le cas de déviation des valeurs indiquées, on procède à la correction respective de la quantité de sérum ou de plasma sanguin utilisé. La biomasse fraîche est mélangée avec du sérum sanguin ou du plasma sanguin fraîchement obtenu dans une proportion de 1:1 à 1:10 (poids/volume) afin que le produit contienne après la polymérisation une activité de glucose-isomérase de 150 à 200 EIU par g de substance sèche.On ajoute au mélange réactionnel 380 à 400 cm3 d'une solution aqueuse à 25 % d'aldéhyde glutarique par kg de substance sèche et on agite environ 1 heure à l'aide d'un agitateur mécanique à la température ambiante. Le produit polymérisé ainsi obtenu est filtré et lavé plusieurs fois à 1 1eau jusqu'à disparition de la coloration jaunâtre de l'eau de lavage. On sépare l'eau résiduelle par pressage puis on congèle le produit durant 12 heures à des températures de -5 à -100C. Après cette opération, on dégèle le produit, l'eau libérée est éliminée par pressage et la masse spongieuse ainsi obtenue est granulée et sèchée à des températures inférieures à 500C, sous vide ou dans un courant d'air sec.Outre l'utilisation sous sa forme de granulés on peut utiliser le produit après un broyage et tamisage (grosseur de grains de 10 à 30 mesh.) Exemple II On effectue la polymérisation de cellules entières ayant une activité de glucose-isomérase conjointement avec du sérum ou du plasma sanguin ainsi que décrit dans l'exemple 1. Après le pressage, on ne congèle pas le produit obtenu mais il est granulé directement et séché selon l'exemple 1. Exemple III On effectue la polymérisation de cellules ayant une activité de glucose-isomérase en présence d'un sérum ou d'un plasma sanguiq,séché par pulvérisation ou lyophylisé et dissous dans l'eau jusqu'à obtention d'une solution ayant une teneur en substance sèche de 8 à 12 %. Les opérations ultérieures ont lieu ainsi que décrit dans les exemples I et II. Exemple N On effectue la polymérisation de cellules entières ayant une activité de glucose-isomérase ainsi que décrit dans les exemples I, II et III ; cependant, on utilise du sérum ou plasma sanguin congelé. Dans ce cas, on fait fondre les blocs de sérum ou plasma sanguin congelé à une température inférieure à 550C, on détermine la teneur en substance sèche, on procède à la correction nécessaire et on opère ensuite comme dans les exemples I et II. Exemple V On trempe le produit sec obtenu, pendant 12 heures dans un sirop de glucose ayant une concentration 2 à 3 M et contenant des ions de cobalt et de magnésium à une teneur optimale pour l'enzyme donné, dans une proportion de 1:10 (poids/volume). On charge une colonne ou une batterie de colonnes avec le produit enzymatique gonflé en contrôlant que le chargement s'effectue de manière égale et uniforme sans inclusion d'air. La quantité nécessaire de produit enzymatique pour effectuer la réaction est déterminée d'après la formule I. Sur la colonne, on fait passer de manière continue un sirop de glucose ayant une concentration 2 à 3 M. La concentration en fructose à la sortie de la colonne est déterminée par colorimétrie ou par polarimétrie. La conversion du sirop de glucose est maintenue au niveau de 40 à 50 % moyennant l'utilisation d'une batterie de colonnes en remplaçant la colonne dont l'acti- vité baisse au-dessous de 20 %. Afin d'éviter la pollution microbienne de la colonne, il est recommandé de maintenir la température du processus d'isomérisation à 60 - 650C et de chauffer d'avance le sirop jusqu'à la température opérationnelle. La vitesse de passage sur la colonne ou la batterie de colonnes est contrôlée par une pompe appropriée et est fonction de la quantité et de l'activité du produit utilisé selon la formule 1 pour "A". La durée du fonctionnement d'une colonne unique (n'étant pas liée dans une batterie) dépend de l'activité initiale du produit immobilisé et de la thermostabilité de l'enzyme utilisé ainsi que du débit du substrat. BIBLIOGRAPHIE 1. Eaton, P.L. Messing R. Brevet US nO 3 705 08ri. 2. Vieth, W.R., Wang, S.S., Saini, R. Biotechnol.Bioeng. 15 565, 1973. 3. Miles Laboratory, Brevet US nO 1 280 396. 4. Thompson, C.M., Johnson, R.A., Lloid, N.E., Brevet US nO 3 788 945. 5. Baxter Laboratory, Brevet US nO 1 401 946. 6. Lloid, N.E. Lewis, L.T., Logan, R.M., Paten, D.M. Brevet US nO 3 694 319. 7. Kolarik, M.J., Chen, B.J., Emmery, A.H.Jr., Lin, H.C. - Imnobilized Enzymes in Food and Microbial Processes. Pergamon Press, 71-83, 1974. 8. Amotz, Sh, Kjaer, T., Nielsen N., Thiesen, 0. - Brevet danois nb 390 s21. 9. Sipos, T., Hill, M. - Brevet US n 3 708 397. 10. Messing, R. - Brevet US n 3 705 084. REVENDICATIONS 1. Procédé d'immobilisation de cellules microbiennes à activité de glucose-isomérase selon lequel la polymérisation induite par l'aldéhyde glutarique est effectuée en présence d'un porteur protéinique, caractérisé en ce qu'on utilise en tant que porteur protéinique du sérum ou du plasma sanguin. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise le sérum ou le plasma sanguin à l'état pulvérisé, lyophilisé ou congelé. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le rapport entre la quantité en poids de cellules microbiennes et la quantité cn volume du sérum ou plasma sanguin varie de 1:1 à 1:10.