Brevet FR2519762A1 — publié le 19830718

SUPPORT POUR L'ANALYSE DE SUBSTANCES HYDROPHILES DE FAIBLE MASSE MOLECULAIRE. La présente invention se rapporte à un support poreux pour l'analyse de substances hydrophiles de faible poids moléculaire ainsi qu'à son procédÉ de préparation Plus particulièrement, l'invention se rapporte a un support poreux, pour l'analyse de substances hydrophiles de faible masse moléculaire constitué d'un copolymère réticulé-possédant des groupes méthylols préparés à partir d'un monomère des séries de styrène et d'un agent de réticulation copolymérisable avec le monomère La surface externe du support est hydro- phile du fait de la présence d'un polymère hydrosoluble fixé sur elle et la surface interne des pores du support est hydrophobe ou moins hydrophile que la surface externe du support. Récemment, on a mis au point un support capable d'interagir spécifi- quement avec une substance se trouvant dans les organismes vivants, par exemple, dans la chromatographie liquide-liquide à grande vitesse souvent utilisée pour analyser des substances qui se rencontrent dans les organisme vivants, en particulier, dans l'urine, le sérum ou similaires D'autre part un support susceptible d'être dispersé dans le sérum, l'urine ou similaires et d'interagir avec une substance particulière présente dans ces milieux, peut être appliqué à une séparation par affinité des substances considérées et/ou à des réactions antigène-anticorps. On sait qu'il est possible de préparer un polymère réticulé poreux du styrène par polymérisation en suspension dans l'eau, du styrène et d'ur agent de réticulation copolymérisable avec le styrène, en présence d'un "régulateur" de pore. 2 ' Ainsi il est par exemple possible entre autre de trouver une description detaillée d'un copolymère styrène/divinylbenzène dans la revue "J Polymer Sci " Part 2-A,835 ( 1964) Bien qu'on puisse obtenir dans ce procédé de petits grains en utilisant un polymère hydrosoluble en tant qu'agent de suspension principal, le polymère hydrosoluble adhère à la surface des petits grains et il est difficile d'éliminer total- ment le polymère, même par lavages à plusieurs reprises Les petits grains ne peuvent pas être employés pour la chromatographie sur gel utili- sant un solvant organique, car la pression augmente du fait de la visco- sité du polymère fixé et ainsi, certains réactions indésirables se produi- sent. Par ailleurs, on peut obtenir des polymères du styrène réticulés relativement purs si,,en tant qu'agent de suspension, on emploie un phosphate difficilement soluble dans l'eau comme les phosphates de calcium et de magnésium, car il est possible d'éliminer facilement le phosphate par lavage, des petits grains obtenus, à l'aide d'un acide ou similaire. Toutefois, on ne peut pas disperser facilement le polymère obtenu dans l'eau, les tampons, le sérum, l'urine, etc, en raison de leur surface hydrophobe. La présente invention a pour objet un support destiné à l'analyse de substances hydrophiles de faible masse moléculaire. La présente invention a en outre pour objet un support dont la surface externe est fortement hydrophile et dont la surface interne des pores est moins hydrophile que sa surface externe. L'invention se rapporte également à la préparation de ces supports. Le support poreux de la présente invention est constitué d'un copo- lymére réticulé comportant des groupes méthylols Le copolymère s'obtient à partir d'un monomère de la série du styrène et d'un agent de réticulation copolymérisable avec ce monomêre La surface externe du support est hydro- phile grâce au polymère hydrosoluble fixé sur elle La surface interne des pores du support est hydrophobe ou moins hydrophile que la surface externe du support. Le procédé de l'invention est caractérisé en ce que l'on soumet un mélange de monomère de la série du styrène et un agent de réticulation, copolymérisable avec le monomére, à une polymérisation en suspension dans l'eau en présence d'un régulateur de pore et d'un polymère hydrosoluble, l'on sèche le copolymère réticulé obtenu et fixe des groupes méthylols sur le copolymère. D'autres buts et avantages de l'invention apparaltront à la lecture de la description suivante. On obtient le copolymére réticulé poreux par polymérisation en sus- pension d'un monomère de la série du styrène et d'un agent de réticulation copolymérisable avec le monomère, dans une solution de polymère hydrosoluble, en présence d'un régulateur de pore Par monomère de la série du styrène, on entend ici les styrène, a-méthylstyrène, chlorométhylstyrêne, ainsi que leurs combinaisons En tant qu'agent de réticulation copolymérisableavec' monomère, on peutemployer di-ou trivinylbenzene,isocyanurate de trallyle, dimé- thacrylate d'alcool polyhydroxylé, diacrylate d'alcool polyhydroxylé ou phtalate de diallyle Parmi ces agents, il est tout particulièrement préfé- rable d'utiliser le divinylbenzène car, en ce cas, il est facile d'intro- duire les groupes méthylols La proportion d'agent de réticulation est de préférence comprise entre 30 et 70 % de la somme des poids de monomère et d'agent de réticulation Dans la présente invention, le copolymère préféré est le copolymère styrène/divinylbenzène. On fait subir une polymérisation radicalaire au monomère et à l'agent de réticulation, en présence d'un polymère hydrosoluble à haute concentra- tion de la présente invention, tel qu'oxyde de polyéthylène, alcool poly- vinylique, acétatessaponifiés de polyvinyle, à divers taux de saponifica- tion, polyvinyl pyrrolidone, méthyl cellulose, ou similaires La proportion de polymère hydrosoluble est de préférence de 5 à 60 % et, plus particuliè- rement, 10 à 40 % du poids de mélange monomère/agent de réticulation afin de conférer une bonne hydrophilie au copolymère résultant Avec moins de 5 % en poids de polymère hydrosoluble, on n'obtient pas une hydrophilie suffi- sante, tandis qu'avec plus de 60 % en poids, on n'obtient pas de petits grains parfaitement sphériques et on a quelques problèmes pour introduire les groupes méthylols dans les petits grains résultants car la viscosité du système est trop grande On peut ajouter une petite quantité d'un agent de suspension du phosphate tel que l'hydroxyapatite ou similaire ou un agent tensioactif anionique, à la solution aqueuse de polymère hydrosoluble. On peut régler le diamètre du copolymère, selon l'invention, en jouant sur la nature et les proportions de polymère hydrosoluble, les proportions relatives de monomère et d'eau, la vitesse d'agitation, la quantité d'agent tensioactif et similaires Le support préféré de l'invention se présente sous la forme de grains sphériques d'un diamètre de l'ordre de 1 à 30 p. On emploie le régulateur de pore pour régler la dimension de pore du support; il peut être un solvant organique inerte insoluble dans le monomère En tant qu'exemples de régulateurs de pores, on peut citer 4- les hydrocarbures aromatiques tels que benzène, toluène, xylène, les hydro- carbures chlorés tels que trichloroéthylène, chloroforme, tétrachlorure de carbone, les hydrocarbures aliphatiques tels que n-hexane, n-heptane, n-octane, n-dodécane et similaires ainsi que leurs combinaisons. Dans la présente invention, on peut régler facilement la dimension des pores en jouant sur la nature et/ou les proportions de régulateur de pore. En général, on utilise de préférence 20 à 300 parties en poids de régulateur de pore pour 100 parties en poids de mélange monomère/agent de réticulation. On peut faire varier les dimensions des pores des supports de l'in- vention en fonction des usages Pour analyser des substances hydrophiles de faible masse moléculaire sans absorption des protéines de masse moléculaire élevée, la masse moléculaire d'exclusion des supports de la présente inven- tion doit être inférieure à 30 000, c'est-à-dire, à la masse moléculaire des protéines sériques D'autre part, pour absorber les protéines d'une masse moléculaire égale ou supérieure à 30 000 lorsqu'on analyse des substances hydrophiles de faible poids moléculaire, il est préférable qu'elle soit d'au moins 30 000. L'initiateur de polymérisation peut être tout initiateur classique employé dans la polymérisation radicalaire en suspension des monomères vinyliques, comme par exemple, un peroxyde organique tel que le peroxyde de benzoyle ou le perbenzoate de butyle, un dérivé azo tel que l'azobis- isobutyronitrile, et similaires On utilise de préférence le peroxyde de benzoyle carlepolymère hydrosoluble peut alors se greffer facilement. Si on utilise, en tant que support, le copolymêre poreux réticulé à la surface duquel le polymère hydrosoluble est fixé ou greffé, la substance hydrophile a du mal à diffuser dans les pores car l'hydrophilie n'est pas suffisamment grande, bien qu'il soit possible de disperser le copolymère dans l'eau En outre, le copolymère est extrêmement visqueux du fait de la présence du polymère hydrosoluble à sa surface et la pression croit à l'élution du fait de la faible vitesse d'écoulement de l'éluant et de la médiocre reproductibilité de l'élution, lorsqu'il est tassé dans la colonne. C'est pour cela que dans la présente invention, on introduit des groupes méthylols dans le copolymère afin de remédier à ces inconvénients. Les méthodes d'introduction des groupes méthylols sont bien connues; on peut par exemple, chlorométhyler le copolymére puis, hydrolyser. On peut citer, par exemple, les méthodes de chlorométhylation qui con- sistent à employer le formaldéhyde, ou l'un de ses dérivés et l'acide chlorhydrique, en présence, de Zn Cl 2 comme catalyseur; employer le chloro- méthyl niéthyl éther en présence d'Al Cl 3 ou de Sn CI 4 comme catalyseur ou similaire Dans la réaction de *chlorométhylation, le polymère hydrosoluble à la surface du copolymère peut aussi réagir et le copolymère se colore davantage qu'en l'absence de polymère hydrosoluble, ce qui provoque l'apparition d'une coloration brune à la surface du support Le polymère hydrosoluble ayant réagi chimiquement est partiellement décroché de la surface, ce qui permet d'obtenir un support de faible viscosité. Si on utilise, par exemple, le chlorométhyl méthyl éther, on l'emploie à raison de 2 à 20 parties en poids par partie, en poids, de copolymère réticulé et, de préférence, de 3 à 10 parties en poids, afin de permettre une agitation homogène et de tenir compte des pertes de chlorométhyl méthyl éther par évaporation au cours de la réaction. Le rapport pondéral, le plus particulièrement préférable, du chlorométhyl méthyl éther au copolymère réticulé est d'environ 5/1 Le catalyseur utilisé de préférence est Sn C 14 en raison de son pouvoir catalytique At de la facilité du traitement après la chlorométhylation La quantité de catalyseur est habituellement de l'ordre de 0,5 à 30 parties en poids pour 100 parties en poids de chlorométhyl méthyl éther et on le choisit convenablement en fonction du taux de chlorométhylation recherché. On effectue, en général, la réaction à une température de O à 580 C (point d'ébullition du chlorométhyl méthyl éther). Le taux de chlorométhylation du copolymère est, de préférence, de 20 groupes chlorométhyles pour 10 unités aromatiques. Au terme de la chlorométhylation, on convertit les groupes de chlorométhyles en groupes méthylols (-CH 20 H) par hydrolyse en milieu alcalin à la température ambiante ou plus élevée Dans le système H 20/Na OH, la vitesse de réaction est faible et l'addition de méthanol accélère la réaction On choisit la concentration en alcalin, la quantité de méthanol, la température et le temps de réaction en fonction du taux d'introduction des groupes méthylols. Les supports selon la présente invention ont leur surface externe fortement hydrophile par conséquent, ils peuvent se disperser facilement dans un milieu aqueux La surface interne des pores du support est éga- lement hydrophile, mais à un degré moindre que la surface externe et donc, les substances hydrophiles de faible masse moléculaire peuvent pénétrer librement dans les pores La surface interne des pores ne porte que des groupes méthylols mais fixés par un polymère non-hydrosoluble et elle est moins hydrophile que la surface externe. Le degré d'hydrolyse des groupes chlorométhyls est de préférence d'environ % ou plus Le nombre de groupes méthylols introduit dans le substrat est par conséquent de 0,1 à 0,5 par unité aromatique. La viscosité des supports de l'invention est si faible qu'on peut obtenir une grande vitesse d'écoulement dans une colonne garnie du support pour la chromatographie liquide à grande vitesse En outre, dans la chromato- graphie liquide à grande vitesse, on obtient une bonne reproductibilité et un bon fractionnement des substances hydrophiles de faible masse moléculaire. Lessupportsde la présente invention capablesd'exclure les substances de masse moléculaire inférieure à 30 000 et qui présentent un diamètre de 1 à 30 p, s'utilisent de préférence pour l'analyse de substances hydrophiles de faible masse moléculaire, en particulier, celles qui se trouvent dans des échantillons renfermant ainsi des substances de masse moléculaire élevée, comme, par exemple, les protéines sériques, car ils ne peuvent pas absorber ces substances de masse moléculaire élevée et donc, ils peuvent servir à l'analyse en continu de tels échantillons. D'autre part, les supports de l'invention, capables d'exclure les substances d'une masse moléculaire au moins égale à 30 000 peuvent s'utiliser dans divers domaines, par exemple en tant que supports pour la séparation de substances hydrophiles de faible masse moléculaire, pour l'élimination des protéines avant l'entrée dans la colonne, pour les réactions antigène-anticorps et similaires, car ils sont capables d'absorber totalement des substances de masse moléculaire élevée comme les protéines hydrophiles En ce cas, le diamètre de ce support peut être compris entre 1 et 300 p, bien qu'il soit préférable que ce diamètre soit compris entre 1 et 30 si on souhaite l'utiliser dans les colonnes des- tinées à l'analyse de substances hydrophiles de faible masse moléculaire. L'invention sera d'ailleurs mieux comprise à la lecture des exemples suivant donnés à titre illustratif mais non-limitatif. EXEMPLE 1 On introduit une solution de 12,5 g de méthyl cellulose dans 625 g d'eau contenant 0,125 g de sodium lauryl sulfate dans un autoclave et après addition de 21,8 g de styrène, 18,2 g de divinylbenzène et 60 g de toluène, en tant que régulateur de pore, dans l'autoclave, on amorce la polymérisation par addition de peroxyde de benzoyle et on effectue la polymérisation à 600 C pendant 17 h sous agitation vigoureuse. On lave le polymère soignement à l'eau puis à l'acétone On sèche le polymère lavé à 400 C sous pression réduite Le diamètre du polymère sec est de l'ordre de 3 à 20 p En soumettant le polymère à un tamisage, 19762 on recueille des grains de 10 à 20 p de diamètre La masse moléculaire exclue par ces polymèresest de l'ordre de 7 000; on la détermine au moyen de polystyrène de poids moléculaire connu en utilisant le tétrahydrofuranne en tant qu'éluant. On ajoute 5 g de grains et 1,5 mlde tétrachlorure d'étain anhydre à 35 mni de chlorométhyl méthyl éther, et on chauffe le mélange sous condenseur à reflux pendant 6 h à 50-60 C La couleur des grains devient plus foncée, jusqu'à brun-noiratre avec l'avancement de la réaction Lorsque la réac- tion est finie, on lave les grains à plusieurs reprises dans du méthanol chargé d'acide chlorhydrique, puis à l'acétone jusqu'à ce qu'ils prennent une couleur jaune ocre Le taux de chlorométhylation des grains est d'environ 62 groupes chlorométhyles pour 100 groupes aromatiques; ce taux est déterminé par comparaison des bandes d'absorption infrarouges(I. à 1600 cm-1 dues aux groupes aromatiques et à 1260 cm dues aux groupes chlorométhyliques, à une courbe d'étalonnage obtenue à partir de mélanges de cumène et de chlorure de p-iso-propyl benzyle en différentes proportions. On chauffe les grains chlorométhylés dans une solution aqueuse à 10 % d'hydroxyde de sodium à 60 C pendant 9 heures pour effectuer l'hydrolyse. L'intensité de la bande d'absorption I R à 1260 cm-' des grains hydrolysés, due au groupe chlorométhyle, est diminuée et il apparalt, d'autre part, une bande d'absorption à 1090-1100 cm-' du groupe CO D'après la diminution d'intensité de la bande à 1260 cm-', on déduit qu'on a transformé environ % des groupes chlorométhyle en groupes méthylols, c'est-à-dire qu'on a introduit dans les grains 34 groupes méthylols pour 100 unités aromatiques. Les grains obtenus selon la présente invention se dispersent extrêmement bien dans l'eau et dans diverses solutions tampons sans coagu- lation ni agglomération apparentes. Après avoir garni un tube en acier inoxydable, de 4 mm de diamètre t 500 mm de long, du support de l'invention, on soumet 20 pt d'un mélange d'acide p-aminobenzoique, de créatinine et d'acide urique à une chromato- graphie sur cette colonne en utilisant une solution tampon aqueuse phosphor que 1/20 N comme éluant On effectue la chromatographie dans les conditions suivantes: détecteur ultraviolet et réglé à 250 nm, vitesse d'élution 1 ml/min et pression de 20 bars Le temps d'élution est de 10,4 min pour l'acide p-aminobenzoique, 7,5 min pour la créatinine et 5,5 min pour l'acide urique. Par ailleurs, on effectue une chromatographie sur un mélange d'albumine de sérum de boeuf et des trois composés ci-dessus, sur la même colonne L'albumine s'élève en premier et on sépare parfaitement les quatre substituants les uns des autres (cf la Figure 1, qui donne 19762 la courbe d'élution) Lorsqu'on répète la chromatographie, on n'observe qu'un peu d'adsorption de l'albumine au cours de la première et de la seconde répétition et plus du tout ensuite Par conséquent, on obtient presque les mêmes résultats par la suite. On constate donc que le support de la présente invention est tout à fait approprié à l'analyse de substances hydrosolubles de faible masse moléculaire et qu'il n'adsorbe pas les protéines de masse moléculaire élevée. EXEMPLE COMPARATIF No 1 - Après avoir garni le même tube en acier inoxydable du polymère préparé selon le procédé de l'Exempte 1, mais non encore chlorométhylé, on soumet le même échantillon que dans l'Exempte 1, à une chromatographie. La pression s'élève au-dessus de 80 bars pour un débit de 1 ml/min, ce qui indique un effet important de la viscosité de la méthyl cellulose fixée sur la surface interne des pores du polymère Les quatre constituants de l'échantillon ne se séparent presque pas les uns des autres et ils s'éluent très vite. EXEMPLE COMPARATIF No 2 - On soumet 59 de polymère de l'Exempte 1 à une chlorométhylation selon le protocole de l'Exempte 1, sauf que le temps de réaction est de 24 h au lieu de 6 et on obtient des grains ayant un taux de chlorométhylation de 64 % environ On hydrolyse les grains dans une solution de 25 g de Na OH dans 100 g de méthanol, à 60 % pendant 15 h pour obtenir un support ayant environ 58 (en moyenne) groupes méthylols pour 100 groupes aromatiques. Après avoir garni le même tube en acier inoxydable que dans l'Exempte 1 avec le support, on soumet un mélange d'albumine de sérum de boeuf, d'acide p-amino-benzoique, de créatinine et d'acide urique à une chromatographie sur cette colonne, avec le même éluant à un débit de 1 ml/min; on trouve les temps d'élution suivants: acide p-amino- benzo&que 6,4 min; créatinine 5,9 min et acide urique 4,8 min. Donc, le temps d'élution est plus court que dans l'Exempte 1 et on ne peut pas séparer l'acide p-aminobenzoique de la créatinine. La courbe d'élution de cette chromatographie est représentée Figure 2. Ces résultats montrent que l'interaction entre les substances hydrophiles de faible masse moléculaire et la surface interne des pores du support est plus importante dans le support de l'invention que dans le support de cet Exemple Comparatif No 2. EXEMPLE 2 En opérant selon le protocole de l'Exempte 1, on polymérise 21,8 g de styrène et 18,2 g de divinylbenzène en présence de 56,4 g de toluène et de 3,6 g de n-dodécane en tant que régulateur de pore pourobtenir un copolymère styrène/divinylbenzène pour lequel le poids moléculaire exclu est de l'ordre de 16 000 On soumet le copolymère à une chloro- méthylation dans les mêmes conditions que dans l'Exempte 1, sauf qu'on adopte un temps de réaction de 2 h au lieu de 6, pour obtenir un copolymère chlorométhylé dont le taux de chlorométhylation est d'environ 42 groupes chlorométhylés pour 100 unités aromatiques On soumet le copolymère à une hydrolyse dans une solution aqueuse à 10 % d'hydroxyde de sodium à 60 C pendant 5 h environ; on obtient un support qui comporte, en moyenne, environ 20 groupes méthylolspour 100 unités aromatiques. La même colonne que dans l'Exempte 1, garnie de ce support, se trouve sous une pression d'environ 25 bars pour un débit d'élution de 1 ml/min de tampon phosphorique aqueux M/20 On soumet la même quantité, 20 p, d'un mélange d'acide urique, de créatinine et d'acide p-aminobenzolque a une chromatographie sur cette colonne Les trois constituants se séparent parfaitement Un essai effectué sur un mélange d'albumine du sérum de boeuf et de ces trois constituants montre que l'albumine n'est pas du tout adsorbé. EXEMPLE 3 On dissout 2 g de méthyl cellulose dans 125 g d'eau et on ajoute 0,025 g de lauryl sulfate de Na Après avoir introduit ce mélange dans un ballon de 300 ml, on lui ajoute 3,27 g de styrène, 2,73 g de divinyl- benzène et 6,75 g de toluène et 2,25 g de n-dodécane comme régulateur de pore puis, on agite le mélange à 60 C pendant 17 h en présence de peroxyde de benzoyle pour amorcer la réaction On lave les grains obtenus à l'eau, puis a l'acétone et on les sèche à la température ambiante sous pression réduite Le diamètre des grains sphériques est pratiquement uniforme et de 20 environ. Le poids moléculaire exclu par ces grains est de l'ordre de 100 000; cette valeur a été établie en éluant du polystyrène de poids moléculaires variés sur une colonne garnie de ces grains. On place 5 g de ces grains dans un ballon, on ajoute 35 ml de chloro- méthyl méthyl éther et 1,5 ml de Sn C 14 anhydre On reflue le mélange à 60 C pendant 6 h afin de chlorométhyler les grains Les grains se coloren progressivement en brun foncé avec l'avancement de la réaction. Au terme de la réaction, on lave les grains à l'aide de méthanol renfer- mant de l'acide chlorhydrique, à plusieurs reprises, puis à l'acétone. La couleur finale des grains est jaune-brunâtre Il apparaît de nouvelles bandes d'absorption à 1260 et 670 cm-1 dans le spectre infrarouge des grains après chlorométhylation Le taux de chlorométhylation est d'environ groupes chlorométhyle pour 100 unités aromatiques. Oh verse les grains dans une solution de 259 de Na OH dans 100 ml de méthanol et on laisse réagir ce mélange à 60 C pendant 15 heures. On voit apparat-re unenouvelle bande d'absorption infrarouge à 1090 cm-1 due à l'introduction des groupes CH 20 H On introduit ainsi 30 groupes méthylols pour 100 unités aromatiques. On disperse soigneusement les grains dans l'eau, diverses solutions tampons, l'urine, etc, sans noter d'agrégation. On garnit de ces grains une colonne en acier inoxydable de 4 mm de diamètre et 500 mm de long pour chromatographie liquide à grande vitesse. On soumet dans cette colonne une solution d'albumine de sérum de boeuf dans un tampon phosphorique M/20 à une chromatographie liquide à grande vitesse; on élue à l'aide de ce tampon phosphorique selon un débit de 1 ml/min On n'observe pas d'élution de l'albumine De plus, on n'observe pas l'élution de l'albumine même après avoir fait passer 50 pú d'albumine de sérum de boeuf à 10 % cinquante fois de suite. On fait passer un échantillon de 20 pz d'une solution d'acide urique, de créatinine, d'acide p-amino-benzo 7 que et d'albumine dans un tampon phosphorique M/20 dans la colonne On sépare parfaitement l'acide urique, la créatinine et l'acide p-amino-benzoîque les uns des autres sans éluer l'albumine La Figure 3 représente un enregistrement des pics d'élution pour une vitesse de déroulement du papier de 10 cm/3 min, mesuré à une longueur d'onde de 250 nm La pression est de 25 bars pour un débit de 1 ml/min. EXEMPLE 4 On prépare un copolymére styrène-divinylbenzène comme dans l'Exempte 1 sauf qu'on emploie 459 de toluene et 15 g de n-dodécane comme régulateur de pore, au lieu de 60 g de toluène Le poids moléculaire exclu par le polymère obtenu est de l'ordre de 100 000 On introduit ensuite des groupes méthylols dans le polymère comme dans l'Exempte 1; le taux final est d'environ 40 groupes méthylols pour 100 unites aromatiques. 19762 Après avoir garni le tube comme dans l'Exempte 1 avec le support obtenu, on soumet de l'albumine à une chromatographie L'albumine est absorbée par la colonne et elle n'est pas éluée. EXEMPLE COMPARATIF No 3 - On prépare un copolym'ère styrène/divinylbenzène selon le protocole de l'Exempte 3, sauf qu'on utilise 13,9 g de phosphate de calcium et 4,07 mg de n-dodécylbenzènesulfonate de sodium au lieu de la méthyl cellulose et du lauryl sulfate de sodium de l'Exempte 3 Après lavage à l'au, on tamise le copolymère pour obtenir des grains d'un diamètre de 10 à 20 p. Toutefois, l'éventail des diamètres est large La masse moléculaire exclue est de l'ordre de 100 000. On lave soigneusement les grains à l'acide chlorhydrique pour éliminer le phosphate de calcium Les grains ne se dispersent pas du tout dans l'eau et ils restent agglutinés. Apres séchage des grains, on effectue la chlorométhylation comme dans l'Exempte 3 Les grains sont légèrement colorés en jaune clair. Les groupes chlorométhyles sont convertis en groupes méthylols comme dans l'Exempte 3 Les grains obtenus sont moins hydrophiles que ceux de l'Exemp Le 3 et ils ne se dispersent pas bien dans l'eau ni dans l'urine L'albumine n'est pas totalement adsorbée sur colonne garnie de ces grains et on obtient un très large pic d'albumine On pense que c'est parce que les grains sont moins hydrophiles que ceux de l'Exempte 3 et que les protéines ne peuvent pas pénétrer dans les pores. EXEMPLE 5 On prépare des petits grains de copolymère styrène-divinylbenzene, capables d'exclure des masses moléculaires de 300 000, comme dans l'Exempte mais en utilisant 4,5 g de toluène et 4,5 g de n-dodécane pour régulariser les pores On traite les grains comme dans l'Exempte 3 pour obtenir des supports comportant des groupes méthylols Le support obtenu sedisperse bien dans du sérum et dans de l'urine On n'observe pas l'élution de l'albumine avec une colonne garnie de ces grains même lorsqu'on fait passer 50 fois des échantillons de 50 p Z de solution à 10 % d'albumine de sérumde boeuf. REVENDICATIONS 1. Support poreux pour l'analyse de substances hydrophiles de faible masse moléculaire, caractérisé en ce qu'il est constitué de copolymére réticulé compontant des groupes méthylols, ce copolymére étant obtenu à partir de monomères de la série du styrène et d'un agent de réticulation copolymérisable avec le monomère, en ce que sa surface externe est hydro- phile et en ce que la-surface interne des pores est hydrophobe. 2. Support selon la revendication 1, caractérisé en ce que le monomére est l'V-méthylstyrène, le chlorométhylstyrène,le styrène et leurs combinaisons. 3 Support selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent de réticulation est le divinylbenzène, trivinylbenzène, l'isocyanurate de triallyle, les diméthacrylates et diacrylates d'alcools polyhydroxylés et le phtalate de diallyle. 4. Support selon la revendication 1, caractérisé en ce que le copo- lymère est un copolymère styrène-divinylbenzène. 5. Support selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caracté- risé en ce qu'il est constitué de grains sphériques d'un diamètre de 1 à p environ. 6. Support selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, carac- térisé en ce que la masse moléculaire exclue par ces supports est infé- rfeure à 30 000. 7. Support selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caracté- risé en ce que la masse moléculaire exclue est supérieure à 30 000, et en ce qu'il est capabled'adsorber les protéines. 8 Support selon l'une quelconque des revendications i à 7, caracté- risé en ce qu'il comporte 10 à 50 groupes méthylols pour 100 unités aromatiques. 9. Support selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caracté- risé en ce qu'on l'utilise pour la chromatographie liquide. 10 Procédé de préparation d'un support poreux pour l'analyse de substance hydrophobes de faible masse moléculaire, caractérisé en ce que l'on soumet un mélange d'un monomère de la-série du styrène et d'un agent de réticulation copolymérisable avec ce monomére, à une polyméri- sation en suspension dans l'eau en présence d'un régulateur de pore et d'un polymère hydrosoluble, et en ce que l'on fixe des groupes méthylols sur le copolymère réticulé résultant. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le monomère est le styrène, l'a-méthylstyrène, le chlorométhylstyrène et leurs combinaisons. 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que l'agent de réticulation est le divinylbenzène, le trivinylbenzène, l'isocyanurate de triallyle, les diméthacrylates et diacrylates d'alcools polyhydroxyles et le phtalate dediallyle. 13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le monomère est le styrène et l'agent de réticulation est le divinylbenzène. 14 Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, carac- térisé en ce que la proportion d'agent de réticulation est de 30 à 70 % du poids total de mélange de monomère et d'agent de réticulation. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, carac- térisé en ce que le polymère hydrosoluble est un oxyde de polyéthylene, polyvinyl acétates saponifiés, polyvinyl alcool, polyvinyl pyrrolidone et méthyl cellulose. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, carac- térisé en ce que la proportion de polymère hydrosoluble est de 5 à 60 parties en poids pour 100 parties en poids du mélange de monomère et d'agent de réticulation. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la pro- portion de polymère hydrosoluble est comprise entre 10 et 40 parties en poids pour 100 parties en poids de mélange de monomère et d'agent de réticulation. 18 Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 17, caractérisé en ce que le régulateur de pose est un solvant organique inerte soluble dans le monomère. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le régulateur de pores est un hydrocarbure aromatique tel que benzène, toluene et xylène, hydrocarbure chloré tel que trichloroéthylène, chloroforme et tétrachlorure de carbone, un hydrocarbure aliphatique tel que n-hexane, n-heptane, n-octane et n-dodécane. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 19, caractérisé en ce que la proportion de régulateur de pores est comprise entre 20 et 300 parties en poids pour 100 parties en poids de mélange de monomère et d'agent de réticulation. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 20, caractérisé en ce que le copolymère réticulé obtenu reçoit des groupes méthylols par chlorométhylation du copolymère suivie d'une hydrolyse. 22. Support selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 21.