Brevet FR2518569A1 — publié le 19830624

La présente invention concerne des microsupports pour la croissance de cultures de cellules dépendant d'un ancrage Plus particulièrement, l'invention concerne des micro- sphères creuses en verre spécifiquement destinées à servir de tels microsupports, et des procédés de fabrication de telles microsphères Un aspect particulièrement important, et encore plus spécifique de l'invention,concerne des procédés pour ajus- ter ou adapter à chaque cas la masse volumique de microsphères creuses en verre pour une utilisation avantageuse à titre de microsupports de cellules. Dans le domaine des cultures de tissus de cellules dépendant d'un ancrage, il a été déjà proposé de remplacer les flacons cylindriques et bottes de Petri normalisés par ce que l'on appelle des microsupportsen vue de présenter une plus grande surface spécifique de contact pour la fixation des cellules Le brevet US-A-4 189 534 (Levine et al) propose, par exemple, d'utiliser des microsupports en forme de perles de matière plastique massive Il a cependant été trouvé qu'il faut modifier des parties de surface électriquement chargées de microsupports de matière plastique de ce typepour favoriser une fixation des cellules Cette modification est difficile à régler quantitativement dans une production en série et elle est toxique pour certains types de cellules cultivées si elle n'est pas réglée de façon appropriée Il est difficile également d'enlever certains types de cellules des perles de matière plastique Il a été également été proposé d'utiliser, à titre de microsupports de cellules, des perles de verre massif ou plein Le domaine des microsupports pour des cultures de cellu- l' les animales en général est passé en revue dans 3rd General Meeting of ESACT ( 3 e réunion générale de ESACT), Oxford 1979, Develop biol Standard, 46,paqes 109-294 (S Karger, Bâle, 1980). En plus de ce qui précède, un inconvénient important des microsupports antérieurement proposés, notamment,en parti- culier, des perles massives de matière plastique ou de verre, consiste en la difficulté ou la quasi-impossibilité de régler ou d'adapter à chaque cas la masse volumique du microsupport à celle du milieu de culture choisi Des milieux classiques pour des cultures de cellules sont de nature aqueuse et possè- dent des masses volumiques comprises entre 1,03 et 1,09 g/cm 3. Il n'est cependant pas possible de régler la masse volumique de perles de matière plastique, fabriquées selon le brevet précité ou selon d'autres techniques utilisées jusqu'à présent pour la fabrication de microsupports, de manière que cette masse volumique se situe dans cette gamme, ni même pour qu'elle corresponde exactement à la masse volumique d'un milieu spéci- fique Des perles de verre ont typiquement, selon la composi- tion du verre, une masse volumique de l'ordre de 2,3 g/cm 3. Pour éviter un dépôt et un compactage des microsupports dans le milieu de culture, ce qui tend à inhiber la croissance des cellules, il est nécessaire de remuer ou d'agiter conti- nuellement d'une autre façon le milieu de culture Or, une agitation vigoureuse est en soi capable de détruire de nombreux types de cellules. Un objet de la présente-invention consiste à proposer, pour la culture de tissus de cellules dépendant d'un ancrage, un microsupport qui évite une partie ou-la totalité des incon- vénients précités des microsupports antérieurement proposés. En particulier, un objet de la présente invention consiste à proposer un microsupport du type décritqui correspond étroi- tement à la masse volumique d'un milieu choisi de culture de manière à pouvoir être facilement mis en suspension dans ce milieu avec une agitation minimale et/ou qui ne nécessite pas de faire appel à un sel d'amine ou à d'autres formes de traitement de surface en vue de former des agents de couplage de surface ou des fragments de surface chargée pouvant être potentiellement toxiques. Un autre objet de l'invention consiste à proposer un microsupport du type décrit et dont on peut facilement enlever, sans dommages importants, la culture de cellules. Selon un premier aspect de la présente invention, il a été reconnu et établi que des enveloppes sphériques creuses en verre, ou des microsphères d'une composition de silicate, peuvent avantageusement servir de microsupport dans des cultures de cellules animales dépendant d'un ancrage. En particulier, il a été trouvé que des microsphères en verre au silicate, fabriquées en utilisant des techniques, qui seront décrites selon l'invention, de formation d'un gel organique comportant une partie minérale (métallique ou métalloîdique) n'exigent pas d'agents de liaison ou de couplage avec une surface électriquement chargée et produisent en fait-, dans les cul- tures testées, des quantités de cellules comparables à celles produites lorsqu'on utilise des perles de matière plastique chargées, telles qu'antérieurement décrites De plus, les cultures de cellules peuvent être facilement enlevées,à l'aide de techniques classiques, des surfaces des enveloppes en verre. On a mis au point pour d'autres applications l'art de la fabrication de microsphères creuses en verre, comportant une paroi d'enveloppe homogène, continue et essentiellement isotrope, ayant une épaisseur bien définie. En particulier, on a proposé jusqu'à présent un certain nombre de techniques, comprenant en particulier des techniques de formation d'un gel organique comportant une fraction minérale, pour fabriquer des enveloppes de verre destinées à servir de récipients de combustible dans des applications impliquant une fusion par laser Ces enveloppes ont généralement un diamètre de l'ordre de quelques millimètres ou dixièmes de millimètres et un coefficient d'allongement ou un rapport nominal d'aspect, c'est-à-dire un rapport du diamètre à l'épaisseur de paroi, de l'ordre de 100:1 Cela implique une masse volumique d'enveloppe de l'ordre de quelques dixième de gramme par centimètre cube-pour des verres typiques au silicate, ce qui ne conviendrait pas pour des applications à titre de microsupport dans des cultures aqueuses Pour autant que la Demanderesse le sache, la pratique n'a pas encore proposé, pour réaliser des microsphères creuses en verre au silicate d'une seule pièce ou isotropes, un procédé utilisant des techniques de formation d'un gel organique comportant une partie minérale et pouvant produire des enve- loppes ayant une masse volumique supérieure à 1 g/cm 3 et comprise notamment entre 1,03 et 1,09 g/cm 3, qui est la gamme caractéristique des masses volumiques des milieux classiques de cultures de cellules Donc, un autre objet de l'invention consiste à proposer un tel procédé, et l'invention englobe les microsphères ainsi produites. En outre, un autre objet plus-spécifique de l'inven- tion consiste à proposer un procédé de réalisation de micros- phères creuses en verre, ayant un coefficient d'allongement de l'ordre de 12, en comparaison des coefficients d'allonge- ment de l'ordre de 100 résultant des techniques de l'art antérieur de formation d'un gel organique -comportant une partie minérale. -Un autre objet apparenté de l'invention consiste à proposer un procédé pour ajuster et adapter à chaque cas la masse volumique d'enveloppes de verre préformées. En bref, selon un autre aspect important de l'inven a tion, on réalise les objets immédiatement précédents et d'autres encore de l'invention, en formant initialement des enveloppes ayant une densité excédant la densité vouluepuis en soumettant les enveloppes ainsi préformées à une attaque de décapage en surface jusqu'à obtention de la masse volumi- -que voulue- Plus particulièrement, on immerge les enveloppes préformées dans une solution d'attaque chimique ayant une masse volumique égale à la masse volumique voulue pour les enveloppes, et on les retire de la solution lorsqu'elles commencent à y flotter Dans son application particulière à des microsupports pour cellules, la solution d'attaque chi- mique peutqêtre une solution aqueuse dont la masse volumique est égale à celle du liquide dans lequel les microsupports sont destinés à être utilisés. Comme exemples de description de l'état actuel de la technique concernant la fabrication des microsphères creuses isotropes en verre, on peut citer-les brevets US- A-3 030 215-(Veatch et ai), US-A-3 365 315 (Beck et al) et US-A-4 017 290 (Budrik et al) (Le terme "isotrope" est destiné à désigner des enveloppes formées sous forme d'une structure homogène continue ou d'une seule pièce, pour les distinguer par exemple d'enveloppes formées par collage de deux hémisphères ou de deux demi-enveloppes) Voir également Souers et al:"Fabrication of the Glass Microballoon Laser Target" (fabrication de microbilles en verre comme cibles pour rayon laser), UCRL-51609, 26 septembre 1974, et le Rapport Annuel 1977 de "Laser Fusion Research" (recherche sur la fusion à l'aide du laser), KMS Fusion, nc, pages 1- 12 à 1-15 Pour la fabrication de microsphères en silicate à partir d'un gel organique comportant une partie minérale et de la poudre de gel, le brevet US-A-4 021 253 (Budrick et al) et la demande de brevet des EtatsUnis d'Amérique N O 178 266 (déposée le 15 août 1980) sont particulièrement intéressants et donnent des renseignements complémentaires - En général, le procédé de formation d'un gel organi- que comportant une partie minérale pour fabriquer des micro- sphères en verre envisage la formation d'un gel qui comprend des constituants minéraux oxydables, métalliques et/ou métalloi- diques, capables de former du verre, comme du silicium, du bore, du potassium, du sodium, etc, et un agent de gonflement. (L'expression "verre au silicate" sert ici à-désigner un verre qui comprend des oxydes de silicium avec ou sans autres oxydes minéraux, de métaux ou métalloides) On sèche le gel et on le concasse pour former des particules de gel Généra- lement,et également dans la pratique de la présente invention, on peut séparer les particules de gel d'après leurs dimensions en utilisant une opération de tamisage La dimension que les particules de gel ont alors et qui présente des corrélations avec la dimension finale des enveloppes et avec d'autres critères, n'est pas fondamentale pour la présente invention, qui concerne davantage la masse volumique de l'enveloppe finale. Selon des techniques connues, on donne ensuite aux particules concassées et tamisées de gel la forme de micros- phères creuses au cours d'une opération de gonflement, que l'on peut réaliser par exemple en laissant tomber les parti- cules dans un four en forme de tour ou fourtunnel du type décrit dans la demande de brevet précitée ou dans US-A-4 021 253, par exemple Le four est maintenu à une température élevée, supérieure à la température de ramollissement du gel et à laquelle l'agent de gonflement se volatilise pour former les enveloppes à mesure que les particules de gel poursuivent leur trajet de chute dans le four Selon la présente invention, cependant, pour diminuer le coefficient d'allongement des enve- loppes finales, on soumet tout d'abord -le gel concassé et tamisé à une opération de dégazage pour chasser une partie de l'agent de gonflement. Plus particulièrement, on place tout d'abord une certaine quantité des particules de gel, concassées et tamisées, dans un four et on les fait fondre pour former un agrégat ana- logue à une mousse On concasse à nouveau l'agrégat et on le tamise à nouveau, en une opération simultanée, en pla çant l'agrégat dans un ensemble de tamis empilés comportant un certain nombre de roulements à billes sur chaque couche de tamis On pense qu'une opération de reconcassagé "ménagé" de ce type est importante pour empêcher la formation d'une pous- sière fine sans intérêt aucun On fait ensuite tomber dans le four-tunnel vevrtîcal les particules reconcassées et reta- misées, pour former des enveloppes constituant un produit inter- médiaire On détermine empiriquement la température de fusion et la durée de l'opération de dégazage, selon la valeur finale ou maximale voulue du coefficient d'allongement des enveloppes. constituant lé produit intermédiaire, pour une composition particulière quelconque de verre Dans l'exemple particulier qui sera décrit ici, la masse volumique finale voulue pour les enveloppes se situe entre 1,0 et 1, 04 g/cm 3 ce qui, pour une masse volumique de composition de verre de 2,3 g/'cm 3 -, implique un coefficient d'allongement égal ou inférieur à 12 environ Il a été trouvé par tâtonnements qu'une température de dégazage de 900 'C et une durée de 15 minutes donnent des résultats satisfaisants Dans un exemple, la dimension ou granulométrie des particules de gel reconcassées, qui ont été placées dans le four ( 1 500 C) se situe entre 90 et 180 microns Les enveloppes constituant le produit intermédiaire dans le présent exemple ont une dimension se situant entre et 250 microns et un coefficient d'allongement compris entre 8 et 44. On trie ensuite les enveloppes constituant un produit intermédiaire provenant de l'opération de gonflement, afin d'identifier les enveloppes devant 8 tre soumises à l'opération, d'ajustement de masses volumiques ou opérations d'adaptation à un cas particulier Plus spécialement, on immerge tout- d'àbord les enveloppes dans une solution présentant une masse volumique se situant à l'extrémité inférieure de la gamme- voulue, dans ce cas, de l'eau ayant une masse volumique de- 1,0 g/cm 3 On écarte les enveloppes qui flottent et ont une masse volumique inférieure à 1,0 g/cm 3 On soumet ensuite le reste à une opération de classement par tamisage pour garder les enveloppes ayant la dimension voulue, dans ce cas 106 à microns, et on les immerge dans une seconde solution ayant une masse volumique se situant à l'extrémité supérieure de la gamme voulue Dans ce cas, une solution aqueuse à 5 % d'acide sulfurique, présentant une masse volumique de 1,04 g/cm 3, convient bien Les enveloppes qui flottent possè- dent, bien entendu, déjà une masse volumique se situant dans la gamme voulueet on les sépare. On soumet les enveloppes qui se sont enfoncées dans la solution de masse volumique 1,04 g/cm 3 à une opération d'attaque par décapage-selon l'invention, afin d'en réduire la masse volumique à 1,04 g/cm 3 Plus particulièrement, on immerge tout d'abord les enveloppes dans du tétrachlorure de carbone pur ( 1,59 g/cm 3) On met à part ou jette les enveloppes qui s'enfoncent et dont la masse volumique est supérieure à 1, 59 g/cm 3 Puis on immerge les enveloppes, qui flottaient dans du tétrachlorure de carbone, dans une solution à 15 % d'acide sulfurique ( 1, 10 g/cm 3) et 4 % d'acide fluorhydrique, ce dernier étant un agent d'attaque chimique Lorsque les enve- loppes commencent à flotter, ce qui indique un enlèvement du verre superficiel et une diminution de la masse volumique jusqu'à 1,10 g/cm 3, on enlève les enveloppes et on les immerge dans une solution à 5 % d'acide sulfurique ( 1; 04 g/cm 3) et 2 % d'acide fluorhydrique Dans ce cas également, on enlève les enveloppes lorsqu'elles deviennent flottantes, c'est-à-dire quand elles atteignent une masse volumique de 1,04 g/cm 3 - On lave dans de l'acétone et sèche -les enveloppes résultantes pour former le produit final dont la dimension se situe entre 81 et 200 microns et qui ont une masse volumique comprise dans la gamme ou fourchette voulue de 1,0 à 1,04 g/cm 3. Le produit résultant a servi avec succès de micro- supports dans la culture des cellules suivantes: fibroblaste de prépuce humain et fibroblaste d'embryon de poulet dans du milieu DMEM (milieu de Eagle modifié par Dulbecco) avec 5 % de sérum de foetus de bovins, et du fibrosar-come de souris et du carcinosarcome de Walker dans du milieu RPMI avec 10 %- -de sérum de foetus de veau Les enveloppes destinées à servir de microsupports flottent sensiblement dans le milieu de cul- ture et peuvent être facilement maintenues à l'état de suspen sion par une agitation ménagée, par exemple par une introduc tion ménagée d'un courant gazeux en utilisant des-bulles de dioxyde de carbone qui servent par ailleurs à régler le pl du milieu On peut traiter par des sels- d'amine les enveloppes de verre destinées à servir de microsupports, afin d'y former des charges superficielles, bien que l'on ne considère pas que ce traitement soit dans ce cas indispensable ni même nécessaire Les enveloppes peuvent également être facilement revêtues d'une matière voulue, par application de techniques classiques Bien entendu, il faut tenir compte de l'épaisseur et de la masse volumique d'un revêtement quelconque pendant l'opération d'adaptation de la masse volumique à chaque cas particulier. En cas de production en grandes quantités ou grands volumes des enveloppes de verre à rôle de microsupports selon l'invention, on prévoit et envisage de rendre entièrement, ou au moins partiellement, automatiques les diverses étapes opératoires décrites ci- dessus Par exemple, un appareil "d'écrémage" peut être associé à chaque étape de tri ou d'atta- que pour un enlèvement automatique des enveloppes flottantes. Selon la précision du réglage au cours des diverses opérations et selon la tolérance de la gamme finale voulue de masse volu- mique, l'opération d'attaque chimique en deux étapes ici décrite à titre d'exemple peut être remplacée par une seule étapesou bien le nombre des étapes peut être porté à trois ou davantage pour cette opération La concentration de l'agent chimique d'attaque en solution et, donc, le temps nécessaire à l'attaque ont été, dans l'exemple décrit, choisis pour permettre le meilleur réglage discontinu, et cette concentration peut varier selon les circonstances On peut utiliser d'autres agents d'attaque chimique et/ou d'autres opérations permettant un tri. On comprendra que la masse volumique finale de-s enveloppes peut être réglée de façon-plus étroite que dans le cas de la gamme, décrite ici à titre d'exemple, et quli se situe entre 1,0 g/cm 3 et 1,04 g/cm 3 Par exemple, si l'on désire produire des enveloppes ayant des masses volumiques étroitement groupées autour de 1,04 g/cm' environ, l'étape initiale de tri dans l'eau pourrait être abandonnée, et les enveloppes constituant le produit intermédiaire pourraient être immergées dans la solution aqueuse à 5 % d'acide sulfuri- que Les enveloppes flottantes, dont la masse volumique est- inférieure à 1,04 g/cm 3, seraient rejetées et l'on soumettrait les enveloppes tombées au fond de la solution à l'opération d'attaque chimique On comprendra à cet égard que l'étape de flottaison dans du tétrachlorure de carbone de l'exemple ci- dessus ( 1,59 g/cm 3) a servi à rendre plus étroite la gamme des masses volumiques à soumettre au processus-d'attaque chimi- que et à améliorer ainsi le contrôle de qualité d'un lot dis- continu Il a été trouvé, dans le cas particulier d'applica- tions à des microsupports pour cultures de cellules, qu'il suffit de régler la masse volumique des enveloppes dans une gamme relativement large, d'une amplitude de 0,04 g/cm 3. On comprendra en outre que les aspects d'adaptation de la masse volumique à chaque cas, selon l'invention, peuvent trouver unie application avantageuse dans d'autres domaines que la culture des cellules Voir, par exemple, Wehrenberg et al "Shedding Pounds in Plastics: Microsr 5 hères are Moving" (pertes de poids dans des matières plastiques; les micro- sphères bougent), Mechanical Engineering, octobre 1978, pages 58-63 A cet égard, la masse volumique de l'enveloppe finale peut largement s'écarter de la gamme de 1,0 à 1,04 g/cm 3, indiquée à titre d'exemple, et elle' peut également s'écarter de la gamme de 1,03 à 1,09 g/cm 3 correspondant à des milieux typiques de cultures de cellules On peut facile- ment obtenir des masses volumiques plus élevées en réglant la masse volumique de la solution d'agent chimique d'attaque et en ajustant cette masse volumique pour qu'elle corresponde à la valeur supérieure voulue de masse volumique Gomme mentionné antérieurement, on détermine empiriquement les para- mètres de l'opération de dégazage du gel (ce qui diminue le coefficient d'allongement des enveloppes), en se fondant sur le coefficient d'allongement voulu après l'opération de gonfle- ment, que l'on déterminé mathématiquement à son tour en se fondant sur la masse volumique de la composilion de verre que l'on utilise et les valeurs finales voulues de masse volumique et de dimension des enveloppes. Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'inven- tion, de nombreuses modifications peuvent être apportées aux enveloppes creuses en verre, aux microsupports, formés par de telles enveloppes, pour la croissance de culture de cellules, et au procédé de fabrication de telles enveloppes ou de tels microsupports, décrits ci-dessus REVENDICATIONS 1 Microsupport destiné à servir de site de crois- sance pour des cellules dépendant d'un ancrage, dans un milieu de culture de cellules ayant une masse volumique déterminée à l'avance, ce microsupport étant caractérisé en ce qu'il est constitué par une enveloppe sphérique creuse ayant une paroi d'enveloppe, homogène et continue, en une composition dé verre au silicate et ayant une masse volumique sensiblement égale à la masse volumique prédéterminée du milieu de culture de cellules. 2 Microsupport selon la revendication 1, caractéri- sé en ce que la masse volumique de l'enveloppe sphérique creuse se situe entre 1,03 et 1,09 g/cm 3. 3 Microsupport selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que l'enveloppe présente un coefficient d'allonge- ment, ou rapport du diamètre externe à l'épaisseur de paroi, non supérieur à 12. 4 Procédé perfectionné de culture de cellules dépen- dant d'un ancrage, dans un milieu de culture de cellules pré- sentant une masse volumique prédéterminée, procédé caractérisé en ce qu'on utilise pour l'ancrage des microsupports constitués d'enveloppes sphériques creuses en une composition essentielle- ment homogène de verre au-silicate, la masse volumique moyenne des enveloppes étant sensiblement égale à la masse volumique prédéterminée du milieu de culture de cellules. Procédé de culture de cellules, dépendant d'un ancrage, dans un milieu de culture ayant une masse volumique prédéterminée excédant 1 g/cm 3, avec utilisation de plusieurs microsupports constituantdans le milieu de culture des sites d'ancrage des cellules, procédé caractérisé en ce que les micro- supports sont constitués par de multiples enveloppes sphériques creuses en une composition de verre au silicate essentiellement isotrope ayant une masse volumique moyenne, déterminée par la composition de l'enveloppe, l'épaisseur de paroi et le dia- mètre, sensiblement égale à la masse volumique prédéterminée du milieu de culture. 6 Procédé de fabrication d'enveloppes creuses en silicate, à partir d'un gel-organique comportant une fraction minérale, ce procédé comportant les étapes consistant à (a) préparer un gel organique comportant une partie minérale en y incorporant des constituants minéraux formateurs de verre ainsi qu'un agent de gonflement, (b) concasser ce gel pour former des particules de gel, et, (c) soumettre les particules. du gel à une température élevée, supérieure à la température de ramollissement des constituants formateurs de verre pour favoriser une volatilisation de l'agent de gonflement afin de donner aux particules la forme d'enveloppes sphériques creuses, ce procédé étant caractérisé en ce que, pour diminuer le coefficient d'allongement ou le rapport du diamètre à l'épaisseur de paroi et pour augmenter ainsi la masse volumi- que des enveloppes, le procédé comporte les étapes consistant, avant l'étape (c), à (d) soumettre les particules de gel prove- nant de l'étape (b) à une opération de dégazage par fusion desdites particules pour chasser une partie de l'agent de gonflement et former un agrégat intermédiaire analogue à une- mousse; (e) concasser cet agrégat pour reformer des particu- les individuelles, puis (f) soumettre les particules ainsi reformées à l'opération (c) 7 Microsphère creuselcaractérisée en ce qu'elle consiste en une enveloppe close en une composition continue et essentiellement homogène de verre au silicate dont la masse volumique est supérieure à 1 g/cm 3. 8 Microsphère selon la revendication 7, caractéri- sée en ce que sa masse volumique se situe entre 1,03 et 1,09 g/cm 3. 9 Procédé pour ajuster la masse volumique de micro- sphères creuses préformées dont la masse volumique, à l'état préformé, est supérieure à une masse volumique finale voulue, procédé caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à soumettre les microsphères préformées à une opération d'attaque chimique en surface dans une solution dont la masse volumique est égale à la masse volumique finale voulue et à enlever de cette solution-les microsphères lorsque celles- ci y sont devenues flottantes. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la solution est une solution aqueuse dont la masse volumique, égale à la masse volumique finale voulue, excède un gramme par centimètre cube. 11 Procédé selon la revendication 9 ou 10, caracté- risé en ce que les microsphères préformées sont en une comp Q- sition de verre au silicate. 12 Microsphère creuse en verre au silicate, fabri- quée selon la revendication 9 et caractérisée en ce que sa masse volumique excède un gramme par centimètre cube. 13 Procédé pour fabriquer des enveloppes sphériques creuses en une composition de verre au silicate, et ayant une masse volumique voulue prédéterminée, procédé caractérisé en ce qu'il comporte les 4 tapes consistant à (a) former un gel organique comportant une partie minérale, qui inclut des constituants formateurs d'un verre et un agent de gonflement. (b) sécher et concasser ce gel-pour former de multiples parti- cules de gel; (c) provoquer la dilatation des enveloppes, dans une opération de gonflement, pour former des enveloppes sphériques creuses dont une partie au moins présente une masse volumique excédant la masse volumique voulue prédéterminée; (d) soumettre cette partie à une opération d'attaque chimique en immergeant la partie dans une solution d'un agent chimique d'attaque, ayant une masse volumique égale à la masse volumique voulue prédéterminée; et (e) enlever de la solution les enve- loppes lorsque celles-ci deviennent flottantes dans ladite solution. 14 Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comporte, avant l'étape (d), l'étape supplémen- taire (f) consistant à soumettre les enveloppes sphériques creuses à une opération de tri de manière à séparer parmi lesdites enveloppes la partie ayant une masse volumique excé- dant la masse volumique voulue prédéterminée et que l'on soumet auxdites étapes (d) et (e). 15 Procédé selon la revendication 13 ou 14, carac- térisé en ce que la solution est une solution aqueuse dont la masse volumique excède un gramme par centimètre cube. 16 Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que-la masse volumique voulue prédéterminée et la masse volumique de ladite solution se situent entre 1,0 et 1,09 g/cm 3. 17 Microsphère creuse en verre, fabriquée-selon le procédé de la revendication 9 ou 13 et caractérisée en ce qu'elle présente une masse volumique excédant un gramme par centimètre cube.