Brevet FR2513881A2 — publié le 19830408

FR 2513881 A2 19830408 FR 8118647 A 19811002 Dans le brevet principal a été décrit un procédé de préparation de nouvelles substances biologiquement actives obtenues, après traitement de la caséine humaine délipidée et solubilisée, par fractionnement des produits hydrosolubles, en fonction de leur poids moléculaire moyen, par filtration sur un support approprié. Plus particulièrement, le procédé selon le brevet principal permet d'obtenir notamment une substance hydrosoluble active, désignée par "fraction V" dont le poids moléculaire moyen est voisin de 2200. Cette "fraction V" est obtenue après filtration sur une colonne de Sephadex G 50 de la fraction hydrosoluble provenant du traitement de la caséine humaine délipidée et solubilisée par la trypsine pendant 24 heures à 370C. I1 a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente addition que la "fraction V" peut être purifiée par filtration, dans des conditions appropriées, sur une colonne de DEAE-Sephadex A-25. Cette filtration supplémentaire permet d'isoler différents produits et de sélectionner ceux dont les propriétés immunologiques sont améliorées par rapport à celles de la "fraction V" elle-même. Ainsi en fonction de la composition et du pH du solvant d'élution, sont isolées - une substance de caractère "basique ou neutre" appelée "MJH-24" en utilisant comme éluant une solution tampon à un pH voisin de 8 - puis des substances de caractère "acide", appelées MJH-63 et MJH-65 en utilisant comme éluant une solution tampon à un pH voisin de 3,5. De préférence, on utilise comme solution tampon une solution de tampon "TRIS" / tris (hydroxyméthyl)amino méthane7 à différents pH éventuellement additionnée d'un sel minéral tel que le chlorure de sodium. La filtration sur colonne DEAE-Sephadex A-25 est suivie en mesurant l'absorption à 280 nm des fractions recueillies. Les substances actives selon la présente addition sont isolées, par exemple, après dialyse puis lyophilisation de leur solution aqueuse. On a déterminé que la substance MJH-24 est un pentapeptide qui contient les acides aminés ci-après : sérine, proline, leucine, phénylalanine et histidine. Les substances MJH-24, MJH-63 et MJH-65, obtenues selon le procédé de la présente addition, présentent à un degré plus élevé, les propriétés des substances hydroSOlubles actives du brevet principal. In vitro elles favorisent la production d'anticorps et accélèrent le phénomène de phagocy t ose. De plus, les substances MJH-24, MJH-63 et MJH-65 font preuve, chez la souris, d'une activité remarquable dès la dose de 0,05 mg/kg i.v. vis-à-vis de l'infection expérimentale à Klebsiella pneumoniae. L'exemple suivant illustre la présente addition EXEMPLE 1. 467 mg de la "fraction V", obtenus selon le procédé décrit dans l'exemple 1 du brevet principal, sont filtrés sur une colonne de DEAE-Sephadex A-25 (hauteur : 127 cm; diamètre 1,9 cm) en recueillant des fractions de 2,3 cm La filtration est conduite de la manière suivante a) élution par une solution tampon TRIS, HCl 0,01 M à pH 8 : on recueille 276 fractions, parmi lesquelles les fractions 120 à 132 fournissent la substance MJH-24 b) élution par une solution tampon TRIS, HC1 0,01 M à pH 3,5 et 0,1 N en chlorure de sodium : on recueille 164 fractions qui sont éliminées (fractions 276 à 440) c) élution par une solution tampon TRIS, HC1 0,01 M à pH 3,5 et 0,5 N en chlorure de sodium : on recueille 220 fractions (fractions 440 à 660) parmi lesquelles les fractions 543 à 553 et les fractions 571 à 604 fournissent respectivement les substances actives MJH-63 et MJH-65. Le diagramme de filtration est représenté par la figure 1 dans laquelle figurent en abscisses les numéros des fractions et en ordonnées les densités optiques à 280 nm. La présente addition concerne également les compositions utilisables en thérapeutique qui contiennent une substance selon la présente addition en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutique ment acceptables. Ces compositions peuvent être utiliséés comme adjuvants de vaccins (par exemple vaccin antigrippal composé de sous-unités hémagglutinantes, vaccin antipoliomyélitique à virus inactivé, vaccin antimalarique) en injection simultanée avec l'antigène (viral, bactérien, parasitaire, fongique, tumoral) à l'égard duquel on souhaite augmenter la production d'anticorps ou la réactivité cellulaire spécifique. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être également employées comme immunostimulants non spécifiques en vue d'augmenter la résistance de l'hôte (homme ou animal domestique) vis-å-vis des infections ou en immunothérapie anti t umorale. En tant qu'adjuvants, les produits peuvent être administrés soit en solution aqueuse, soit en émulsion huileuse, soit encore sous forme de liposomes avec l'antigène à l'égard duquel on souhaite obtenir une réponse immunitaire augmentée ou améliorée par la voie utilisée pour cet antigène et dans des proportions variant entre 0,01 et 10 fois la quantité d'antigène avec lequel ils sont mélangés avant d'être injectés. Pour l'application comme immunostimulant non spécifique ces produits peuvent être utilisés par voies intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intranasale, éventuellement orale ou rectale, soit en solution aqueuse, soit en émulsion huileuse, soit encore sous forme de liposomes. Dans ce cas, la dose de composé selon l'invention qui est administrée est généralement comprise entre 0,01 et 25 mg/kg. En thérapeutique humaine, les doses journalières dépendent de l'effet recherché. Elles peuvent être comprises entre 0,1 et 10 mg pour un adulte. Les compositions solides pour administration orale peuvent être des comprimés, des pilules, des poudres ou des granulés. Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops ou des élixirs. Les compositions pour administration parentérale ou intra-nasale peuvent être des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou des émulsions. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique ou en incorporant des agents stérilisants. Les compositions solides rendues stériles par irradiation (rayon p) peuvent être dissoutes dans l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable éventuellement au moment de l'emploi. Les compositions pour administration rectale sont des suppositoires. L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre une composition selon la présente addition. EXEMPLE 2. On prépare selon la technique habituelle une composition liquide administrable par voie intraveineuse ayant la composition suivante - substance MJH-63 obtenue à l'exemple i .... 50 mg 3 - soluté injectable .... 5 cm REVENDICATIONS 1. Procédé pour ltobtention de nouvelles substances biologiquement actives consistant à traiter à l'aide de trypsine de la caséine humaine délipidée et solubilisée,le rapport enzyme/substrat étant voisin de l/lOO,pendant 24 heures à 370C et à fractionner,après centrifugation,les produits hydrosolubles par filtration sur Sephadex G 50 en éluant avec de l'acide acétique à 30%, puis à isoler les substances actives, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste à purifier la substance active dont le poids moléculaire moyen est de 2200 par filtration de ladite substance sur une colonne de DEAE Sephadex A-25 en éluaat avec une solution tamponnée dont le pH va en décroissant et/isoler une substance de caractère basique appelée M3H-24 et des substances de caractère acide appelées M3H-63 et M3H-65. 2. Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce que la substance de caractère basique est isolée après élution par une solution tampon TRIS, HC1 0,01 M à pH 8 et que les substances de caractère acide sont isolées après élution par une solution tampon TRIS, HC1 0,01 M à pH 3,5 qui est 0,1 N en chlorure de sodium puis par une solution tampon TRIS, HC1 0,01 M à pH 3,5 qui est 0,5 N en chlorure de sodium. 3. Les substances, appelées M3H-24, M3H-63 et M3H-65 lorsqu'elles sont obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 ou 2. 4. Substance M3H-24, caractérisée en ce qu'elle est un pentapeptide contenant les acides aminés ci-après:sérine, proline,leucine,phénylalanine et histidine. 5.Composition pharmaceutique,caractérisée en ce qu'elle contient au moins une substance selon l'une des revendications 3 ou 4 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles.