Brevet FR2515208A1 — publié le 19830429

La présente invention concerne des hybridomes sous- cultivables de cellules T humaines producteurs de lymphokine et un procédé pour leur fabrication Plus particulièrement l'invention concerne des hybridomes sous-cultivables de cellules T' humaines producteurs de lymphokine obtenus par la fusion de cellules de leucémie aiguë humaine traitées par un inhibiteur de synthèse de protéines et/ou par un inhibiteur de synthèse d V'ARN et de cellules T humaines activées par un mitogène ou un antigène en présence d'un accélérateur de fusion, et un procédé pour leur' fabrication. Le phénomène de fusion cellulaire a été découvert par Y Okada par l'utilisation de virus Sendai OÂVJ)(Y Okada, Biken J, 1, page 103 ( 1958) Depuis la découverte de la fusion des cellules à médiation par le virus Sendai, cette méthode a été largement utilisée dans le développement du domaine de la génétique des cellules somatiques. En 1975, Kohler et Milstein ont réussi à utiliser la technique de fusion des cellules dans le domaine de l'immunologie. Autrement dit, ils ont indiqué pour la première fois dans Nature 256, page 495 ( 1975) que la fusion des cellules de rate obtenues sur des souris immunisées par des cellules de myélome de souris sensibles au HAT (hypoxanthine-aminoptérine-thymidine) conduit à la formation d'hybridomes capables de produire de manière permanente un anticorps spécifique d'antigène monoclonal. Les lymphocytes contenus dans les systèmes immuns humains et animaux sont divisés en gros en cellules du thymus (cel- lules T) et cellules de moelle osseuse (cellules B). Les cellules B sont des cellules sécrétant un anticorps. La fusion de cellules indiquée par G Kohler et col a lieu entre des cellules B dérivées de la souris et des cellules de myélomne de souris sensibles au HAT Par contre, les cellules T sont formées par différenciation et maturation de cellules souches de la moelle osseuse dans le thymus En outre, les cellules T circulent dans le courant sanguin à travers les organes périphériques, tels que les noeuds lymphatiques et la rate. Les cellules T jouent un rôle important dans le contrôle de la réponse immune d'un organisme vivant Il est bien connu que la fonction de contrôle de la réponse immune des cellules T est produite par un médiateur soluble généralement dénommé lymphokine qui est libéré par les cellules T (H G Kunkel et F J Dixon, Advances in Immunology 29, page 56 ( 1980), Academic Press). Diverses tentatives ont été effectuéesjusqu'à présent pour guérir diverses maladies, telles que cancer, allergie et maladies infectieuses, par contrôle de la réponse immune de l'orga- nisme La lymphokine qui est spécifique de diverses cellules immunes peut être utilisée comme agent immunotherapeutique plus efficace et on s'attend qu'elle soit largement utilisée dans le domaine médical comme moyen de diagnostic clinique (Bernstein, I D, D E Thor, B.Zbar et H J Rapp: Science, 172, page 729 ( 1971) et Piessens, W F, et W H Churchill: J Immunol, 114, page 293 ( 1975)) La lymphokine est donc une substance médicament très importante. Il est cependant impossible de préparer par des techniques classiques une grande quantité de lymphokine et la pureté de la lymphokine qui a été préparée de manière classique était donc faible dans le passé L'utilisation de la lymphokine dans te domaine médi- cal a donc été sérieusement retardée. Les lymphokines sont des groupes de facteurs protainiques n'appartenant pas aux anticorps,qui sont produits par les lymphocytes sous l'effets par exemple,'d'un stimulus spécifique d'un antigène ou d'un stimulus mitogène En outre, les lymphokines sont produites principalement par les cellules T On indique ci-dessous des lympho- kines caractéristiques et leurs types d'action: I Lymphokines agissant sur les macrophages ( 1) Facteur inhibiteur de migration (FIM) Action é vite la migration des macrophages in vitro ( 2) Facteur activant les macrophages (FAM) Action: stimule la phagocytose, l'action bactéricide, etc. des macrophages ( 3) Facteur chimiotactique des macrophages monocytes (FCM) Action: provoque la chimiotaxie des macrophages monocytes 2 Lyoephokines agissant sur les leucocytes polymorphonucléaires (I) Facteur inhibiteur de migration des leucocytes (LIF) Action: évite la migration des leucocytes polymorphonuclêaires in vitro ( 2) Facteur chimiotactique Action: provoque la chimiotaxie des leucocytes neutrophiles, éosinophiles et basophiles 3 Lymphokines agissant sur les lymphocytes ( 1) Interleukine II (IL-II) Action: stimule la division et la prolifération des cellules T activées par un antigène ou un mitogène 4 Lymphokines agissant sur d'autres cellules ( 1) Lymphotoxine (LT) Action: altère et détruit la membrane ("peel's") dscellules L et des cellules Re La in vitro ( 2) Interféron y (IFN-y) Action: intervient dans la pathogénicité du virus ( 3) Facteur stimulant la colonie (FSC) Action: agit sur les cellules précurseurs de lymphocytes de la moelle osseuse (GFU-C), en accélérant leur différen- ciation et leur prolifération en granulocytes ou macrophages L'activité des lymphokines décrites ci-dessus est mesurée in vitro Il est indiqué cependant qu'il existe des lympho- kines dont on reconnaît que l'activité, qui est présentée in vitro, correspond a celle in vivo Par exemple, on suppose que les FIM inhibent la migration des macrophages (voir Takeo Kuroyanagi et coll. "Lymphokine" Shin Meneki Kagaku Sosho vol 6, page 33, Igakushoin'Co, Ltd Tokyo ( 1979). En outre, dans l'oedème téleangiectatique provoqué par un médiateur chimique, par exemple dans le domaine d'une réaction de la tuberculine, on observe une forte accumulation de macrophages. Ceci est d à ce que les macrophages qui migrent et sont recueillis par suite du FCM dérivé de cellules T sensibilisées sont encore fixes par le FIM Ceci montre la corrélation entre le FCM et le FIM avec les défenses immunologiques de l'organisme et permet ainsi un traitement efficace de substances étrangères par accumulation efficace et activation des macrophages. Les lymphokines dont on peut attendre l'utilisation comme médicaments dans le futur comprennent le FAN, la lymphotoxine, l'interleukine I Tl l'TFN-i et le FSC, ainsi que le FCM et le FINM. Des procédés caractéristiques de préparation des lymphokines sont les suivants: ( 1) un procédé de culture de lympho- cytó de sang périphérique sensibilisées par un antigène avec l'anti- gène (D J Cameron et W H Churchill: J Clin Invest 63 page 977 ( 1979); ( 2) un procédé de culture de lymphocytes de sang périphérique ou de cellules de rate avec un mitogène (Weiser, W Y, Greineder, D K, Remold, K G et coll: J Immunol 126, page 1958 ( 1981); et ( 3) un procédé d'établissement d'un clone de cellules T spécifique de l'anti- gène par lutilisation du facteur de croissance des cellules T (IL-II) et culture du clone (Green, J A, S R Cooper-band et S Kibrick: Science 164 page 1415 ( 1969). Les procédés ( 1) et ( 2) ci-dessus nécessitent une grande quantité de sang et ne permettent de préparer qu'une quantité limitée de lymphokine Il est donc difficile de préparer une grande quantité de lymphokine pure selon les procédés ( 1) et ( 2) Selon le procédé ( 3), on peut préparer des lymphokines spécifiques en présence de IL-II Cependant, le procédé ( 3) présente les inconvé- nients que la production de lymphokines à partir de cellules T est mauvaise et qu'il est difficile et co teux d'obtenir l'IL-II humaine. On rencontre les problèmes décrits ci-dessus lorsqu'on utilise les procédés classiques parce que les cellules T productrices de lymphokine ne peuvent pas être sous-cultivées et leur croissance est mauvaise, même si on les cultive en présence d'un facteur de croissance tel que l'IL-Il Il est donc très difficile actuellement de produire une quantité suffisante de lymphokine pour l'utilisation clinique. Conmme moyen de résoudre les problèmes décrits ci-dessus en utilisant la technique d'hybridation cellulaire, on a déjà mis au point des hybridomes de cellules T pour les souris (Taniguchi, M, Saito, T et Tada, T: Nature 278 pages 555-558 ( 1979) Il est donc possible maintenant d'analyser les lymphokines produites par ces cellules Cependant, ces lymphokines produites par les hybridomes surins de cellules T ne peuvent pas être utilisées pour les appli- cations cliniques humaines Du point de vue de l'immunologie humaine et de la nécessité de l'application clinique, on a souhaité mettre au point des hybridomes de cellules T humaines producteurs de lymphokine, qui soient sous-cultivables. Il est raisonnable de s'attendre que l'on puisse appliquer à la fusion des cellules T humaines le même procédé que pour la fusion de cellules T murines Bien entendu, il existe un procédé dans lequel on a effectué la fusion de cellules T produc- trices de lymphokine (non cultivables) et de cellules tumorales humaines de lignée T sensibles au HAT (hypoxanthine-aminoptérine- thymidine) (sous-cultivables) en présence d'un accélérateur de fusion Ensuite, on sélectionne seulement les cellules qui pourraient pousser sur un milieu HAT et on les clone pour obtenir les hybridomes de cellules T producteurs de lymphokine recherchés (voir G Cath*rúne et col, Nature, 292, page 842 ( 1981)) Cependant, un procédé très compliqué et difficile est nécessaire pour conférer la sensibilité au HAT à des cellules tumo- rales humaines de lignée T. L'invention a donc pour objet un procédé pour préparer des hybridomes de cellules T humaines qui sont sous-cultivables et produisent des lymphokines. Par suite de recherches approfondies pour mettre au point un procédé de préparation d'hybridomes de cellules T humaines producteurs de lymphokine sous-cultivables, -la demanderesse a découvert selon l'invention que ces hybridomes de cellules T humaines peuvent être obtenus par la fusion cellulaire de cellules de leucé- mie aiguë humaine traitées par un inhibiteur de synthèse des protéines ou par une combinaison d'un inhibiteur de synthèse des protéines et d'un inhibiteur de synthèse d'ARN avec des cellules T humaines activées par un mitogène ou un antigène en présence d'un accélérateur de fusion. La présente invention propose donc un procédé pour préparer un hybridome de cellules T humaines producteur de lymphokine et sous-cultivable, qui consiste à traiter des cellule de leucémie aiguë humaine avec un inhibiteur de synthèse des protéines ou avec une combinaison d'un inhibiteur de synthèse des protéines et d'un inhibiteur de synthèse d'ARN, tandis que l'on active indépendamment des cellules T humaine avec un mitogêne ou un antigène, à effectuer la fusion des cellules de leucémie aiguë humaine ainsi traitées avec les cellul E T humainesainsi activées en présence d'un accéléra- teur de fusion et à isoler ensuite les hybridomes ainsi formés. Le procédé selon l'invention comprend généralement les étapes (A), (B), (C), (D) et (E) suivantes. Etape A On active par un mitogène ou un antigène des lymphocytes séparés du sang périphérique humain et de la rate ou du thymus qui 15208 ont été excisés aseptiquement dans une opération Ensuite, on sépare le mitogène ou l'antigène fixe aux cellules de manière que la teneur en mitogène ou en antigène présent soit aussi faible que possible. On peut utiliser selon l'invention n'importe quel antigène ou mitogène pour autant que ce soit une substance capable d'induire la transformation descellules T humaines et choisie de manière convenable selon le type de lymphokine désirée Des exemples de ces mitogènes comprennent la phytohêmagglutinine-P (PHA-P) et la concanavaline A (Con A) Des exemples d'antigènes intéressants comprennent le PPD (dérivé de protéine purifié, c'est-à-dire protéine de tuberculine purifiée), le toxotde bactérien, les antigènes viraux et la SK-SD (streptokinase-streptodornase). Etape B On traite des cellules de leucémie aiguë humaine par un inhibiteur de synthèse des protéines ou par une combinaison d'un inhi- biteur de synthèse des protéines et d'un inhibiteur de synthèse d'ARN. On sépare ensuite par centrifugation l'inhibiteur contenu dans le milieu de culture. Les cellules de leucémie aiguë humaine que l'on peut utiliser selon l'invention comprennent les cellules tumorales de lignée T telles que CEM (ATCC n CCL-119), TALL (Pharmaceutical Department de l'Université de Tokyo, Japon) et MOLT-4 (Pharmaceutical Department de l'Université de Tokyo, Japon). Comme inhibiteurs de synthèse des protéines, on peut utiliser les inhibiteurs de synthèse desprotéines connus pour les cellules eucaryotiques qui peuvent inhiber de manière irréversible la synthèse des protéines Le chlorhydrate d'émétine et la pactamycine sont des inhibiteurs de synthèse desprotéines préférés à utiliser selon l'invention Les inhibiteurs de synthèse des protéines peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec des inhibiteurs de synthèse d'ARN Des exemples de ces inhibiteurs de synthèse d'ARN comprennent l'a- amanitine, l'adriamycine, etc Un inhibiteur de synthèse d'ARN préféré à utiliser selon l'invention est l'actinomycine D. Le traitement des cellules de leucémie aiguë humaine par les inhibiteurs de synthèse des protéines ou de 1 'ARN est effectué dans des conditions o la division et la croissance des cellules sont à la fois totalement empêchées Par exemple, lorsque L'on traite des GEM ( 2 106 cellules/ml) à 370 C pendant 2 h avec le chlorhydrate d'émétine seul, la concentration du sel est de 10 14 à 105 M, etlorsque le sel est utilisé en combinaison avec l'actinomycine D, les concentrations du sel et de l'actinomycine D sont de préférence de 10-4 à 10 5 M et de 0,05 & 2 a O/ug/mlt respec- tivement. Etape C On effectue la fusion des cellules T bhucaines produc trices de lymphokine et des cellules de ieucémie aigue humaine dont la croissance a été inhibée par un inhibiteur de synthèse des protéines ou une combinaison d'un inhibiteur de synthèse des pro- teines et d'un inhibiteur de synthèse de 'ARN en présence d'un accélérateur de fusion convenable. Le rapport du nombre des cellules T humaines au nombre des cellules de leucémie aiguë humaine dans l'étape de fusion est de 1:1 à 20:1 et de préférence de 2:1 à 15:1. Les accélérateurs de fusion que l'on peut utiliser selon l'invention comprennent le polyéthylèneglycol (PEG), l'alcool polyvinylique et les virus ayant une capacité de fusion cellulaire, en particulier le paramyxovirus auquel appartient le virus Sendai (HVJ), et ses produits d'inactivation En général, on utilise un PEG ayant un poids moléculaire de 1000 a 4000. Etape D On concentre les cellules fusionnées vivantes obtenues 6 ci-dessus à 105-2 106 cellules/ml et on les fait incuber sur une plaque de culture a 96 puits contenant un milieu nutritif additionné d'une "couche de substrat" ("feeder layer"). On utilise comme couche de substrat des cellules humaines dont la croissance a été inhibée par des antibiotiques tels que la mitomycine C ou par irradiation par les rayons X. On peut utiliser n'importe quel milieu nutritif pour autant que des cellules de leucémie aiguë humaine puissent y pousser Par exemple, un milieu préparé par addition de 10 % de sérum de foetus de veau (FCS), de 2-mercaptoéthanol 5 10-5 M et de glutamine 2 m M au milieu RPMI 1640 (produit par la Société Nissui Seiyaku Co, Ltd) est approprié pour l'utilisation selon l'invention. Une semaine après la culture, les cellules de leucémie aiguë humaine et les cellules de substrat traites avec l'inhibiteur 15208 meurent complètement et les cellules fusionnées restent, c'est-à-dire qu'elles continuent à pousser. Pour confirmer la formation de cellules fusionnées, on utilise des techniques connues pour ( 1) une analyse des antigènes de surface des cellules et ( 2) l'analyse des caryotypes cellulaires. Etape E On analyse le liquide surnageant de la culture d'un puits dans lequel on a fait pousser les cellules fusionnées pour confirmer la production de la lymphokine recherchée. Les cellules fusionnées ainsi préparées peuvent être sous-cultivées pendant une longue durée tout en conservant l'acti- vité de la lymphokine En outre, le clonage permet d'obtenir une sous-lignée produisant efficacement la lymphokine. Les lymphokines peuvent être produites par sous- culture de la sous-lignée soit in vitro, soit in vivo Cette culture peut être effectuée par des techniques connues Des exemples de procédés de culture in vitro comprennent un procédé de culture agitée et un procédé de culture stationnaire utilisant une botte de Petri et une fiole de Roux. Des exemples de procédés de culture in vivo compren- nent:un procédé dans lequel on inocule à des souris rasées, des rats rasés,ou des animaux autres que des humains, sur lesquels on peut transplanter des cellules tumorales humaines, des hybridomes pour former une tumeur solide ou une tumeur à ascite et, après une période de croissance convenable, on recueille les ascites et/ou le sang; et un procédé comme décrit dans le brevet des Etats- Unis d'Amérique no 4 276 282, dans lequel on inocule un hamster dont la réponse immune a été affaiblie avec les hybri- domes qui se multiplient alors dans le hamster. Les hybridomes de cellules T humaines producteurs de lymphokine souscultivables sont intéressants pour la production en grande quantité de lymphokines et, en outre, conme les cellules productrices de lymphokines recherchées peuvent être obtenues en grande quantité, on peut les utiliser comme sources d'extraction pour les gènes concernant la production de lymphokines (par-exemple ARN messager ou AR Nm qui y sont contenus) Il est également possible, après la préparation d'ADN complément ou AD Nc à partir de l'AR Nm extrait par l'utilisation d'une transcriptase inverse, de préparer les Lymphokines en utilisant des micro- organismes (par exemple t bactéries, levures, actinomycètes et champignons) selon des techniques classiques de recombinaison génétique. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 ( 1) Préparation d'hybridomes de cellules T humaines producteurs des lymphokine On active des lymphocytes de sang périphérique humain (LSP) (HLA-A 2, -Aw 24, -B 7, -Bw 35, -0 C 3, -d) ( 16 cellules/ml) avec -w)( O cellsm)ae 5/ug/ml de PHA-P (produit par la Société Difco Co) dans un milieu RPMI-1640 (Nissui Seiyaku Co Ltd) contenant 10 % de sérum foetal de veau, du 2-mercaptoéthanol 5 10 '5 Met de la glutamine 2 m M (ci-après dénommé simplement "milieu RPMI") pendant 2 j Ensuite, on sépare le PHA-P fixé aux cellules de manière que la teneur en PHA-P présent soit aussi faible que possible. On ajoute du chlorhydrate d'émétine 10-5 M à des cellules de leucémie aigué humaine CEM (HLA-Al, -Aw 30, -B 8, -B 40) ( 2.10 cellules/ml) que l'on a fait pousser sur un milieu RPMI-1640 (contenant 10 % de sérum de veau nouveau-né) Apres traitement à 37 C pendant 2 h, on sépare par centrifugation le chlorhydrate d'émétine contenu dans le milieu. On mélange l LSP et les CEM préparés ci-dessus dans un rapport de 10:1 et on centrifuge ensuite le milieu pour obtenir des pellets de cellules. On effectue la fusion cellulaire a 37 C pendant 45 s par addition de 0,5 ml de polyethylèneglycol à 46 % (PEG-1540 de la Société Wako Chemical Co Ltd), 15 % de diméthylsulfoxyde (Wako Chemical Co Ltd) et 5/ug/ml de polyL-arginine (PM 60 000; Société Sigma, Saint-Louis, MO) Ensuite, on ajoute lentement 10 ml de milieu MEM contenant du tampon à l'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-NI-2-éthane- sulfonique 25 m M (HEPES, Société Wako Chemical Co, Ltd, Tokyo, Japon), et on centrifuge le milieu résultant et on le remet en suspension avec du milieu RPMI jusqu'à une concentration en cellules de 2 10 cel- lules/ml. Apres la fusion cellulaire, on concentre les cellules vivantes à 2 105 cellules/ml et on les cultive sur une plaque de culture à 96 puits contenant 0,2 ml de milieu RPMI par puits> le milieu RMI contenant comme couche de substrat des CEM ( 8 104 cel- lulesfml) que l'on a traites par 25/ug/ml de mitomycine C à 37 C pendant 30 min Pendant une semaine après le début de la culture, on change journellement le milieu pour modérer les influences exercées par les substances libérées par les CEM. L'activité de la lymphokine est mesurée par le procédé décrit ci-dessous en ( 2) par l'utilisation d'hybridomes contenus dans un puits dans lequel on a observé leur prolifération. Les CEM traitées & l'émétine et les CEM traitées à la mitomycine utilisées comme témoins meurent complètement en une semaine. ( 2) Culture d'hybridomes et activité de la lymphotoxine On cultive les hybridomes obtenus en ( 1)> ci-dessus dans le milieu RPMI pendant 1 jour en présence de 20 /ug/ml de PHA-P. La mesure de l'activité de la lymphotoxine dans le liquide surnageant avec des L-P 3 (sous-lignée de cellules L) comme cellules cibles montre que deux hybridomes (E-10, F-8) possèdent l'activité Cette activité est conservée pendant plus de trois mois On mesure l'acti- vité de lymphotoxine en utilisant le procédé décrit par Y Kobayashi, dans J Immunology, 122, page 791 ( 1979) Autrement dit, on ajoute un échantillon ( 25/ul) et 25/ul d'actinomycine D ( 4/ug/ml) A 50/ul de L-P 3 ( 3 10 cellules) qui ont été formées à l'avance sur une microplaque et on cultive à 37 C pendant 20-24 h Ensuite, on fixe les cellules par le glutaraldèhyde et on les colore, et on compte les cellules qui sont morphologiquement normales. ( 3) Caractéristiques des hybridomes E-10 et F-8 A Analyse de l'antigène de surface de cellules ( 1) On sait, par une analyse utilisant un dispositif de triage des cellules activé par fluorescence, que les CEM ne réagissent pas avec l'anticorps monoclonal OKT 3, mais que les cellules T humaines réagissent avec l'OKT 3 En utilisant ces décou- vertes, on étudie la réactivité vis-à-vis de lt'OKT 3 des hybridomes de cellules T humaines (E-10 et F-8) par la détermination par fixa- tion en deux étapes et l'essai d'immunofluorescence utilisant la 125 Iprotéine A On trouve que les CEM n'ont pas de réactivité, tandis que les E-10 et les F-8 ont des réactivités qui sont presque égale et égale à environ 50 %, respectivement, de celle des cellules T de LSP. ( 2) On examine l'antigène HLA pour les cellules E-10 et F-8 par la détermination par fixation en deux stades utilisant la I-protéine A On trouve que les LSP sont positifs à HLA-A 2 et -Bw 35, les CEM sont positifs à HLA-A 1 et -B 8, mais que les E-10 et F-8 sont tous deux positifs a HLA-A 1, -A 2 et -B 8. B Analyse du cariotype On mesure le nombre de chromosomes dans les CEM, les E-10 et les F-8 dans 50 a 80 noyaux de métaphase Les CEM contiennent 84,3 0,9 (valeur moyenne -+ écarttype) chromosomes (valeur médiane de 85) Les E-10 contiennent 95,5 -+ 1,7 chromosomes (valeur médiane de 94) Les F-8 contiennent 91,5 + 1,7 chromosomes (valeur médiane de 93) On observe donc une augmentation du nombre de chromosomes d'environ 10 à la fois dans les E-10 et F-8. EXEMPLE 2 On cultive sur milieu RPMI pendant 1 jour la lignée E-10 d'hybridomes producteurs de lymphokine ( 106 cellules/ml) obtenue à l'exemple 1 On dilue ensuite quatre fois le liquide surnageant On mesure ensuite l'activité de FIM de la solution diluée quatre fois par la méthode de Harrington décrite par J T Harrington, Jr et col. dans J Immunology, 110, page 752 ( 1973) On trouve que le taux d'inhibition de migration des macrophages est de 29,9 % pour les E-10. On n'observe pas d'activité pour le liquide surnageant de culture de CEM après culture dans les mêmes conditions Le liquide surnageant obtenu par culture de LSP ( 107 cellules/ml) sur milieu MEM contenant du tampon HEPES contenant de la Con A ( 10/ug/mrl) pendant 1 jour présente un taux d'fnhibition de migration des macrophages de 25,2 %. Les E-10 conservent l'activité de FIM pendant plus de six mois. EXEMPLE 3 On ajoute du chlorhydrate d'émétine 5 105 M et 01 /ug/ml d'actinomycine D à des GEM à 37 C pendant 2 h On effectue la fusion des CEM ainsi traités avec des LSP que l'on a préparés de la même manière qu'à l'exemple 1 et on cultive de la même manière qu'à l'exemple 1 Les CEM traités par le chlorhydrate d'lmétine et par l'actinomycine D meurent complètement et on observe seulement la multiplication des cellules hybrides. On cultive la lignée d'hybridomes ainsi obtenue de la même manière que décrit à l'exemple 1-( 2) et on mesure l'activité de lymphotoxine du liquide surnageant résultant On observe que deux lignées d'hybridomes (C5 et D-9) ont une activité de LT. EXEMPLE 4 On sous-clone des hybridomes producteurs de lymphokine de lignée E-10, obtenus comme à l'exemple 1, par la méthode de dilution limitée ( 0,5 cellule/puits) dans un milieu RPMI-1640 conte- nant comme couche de substrat des CEM ( 2 105 cellules/ml) qui a été traité par la mitomycine C comme à l'exemple 1 et contenant également % de liquide surnageant de LSP activés par la concanavaline A pour obtenir une sous-lignée E 10-20. On cultive les cellules E 10-20 ainsi obtenues sur un milieu RPMI ( 106 cellules/ml) pendant 1 jour et on précipite le liquide surnageant résultant par le sulfate d'ammonium (à 50-100 % de la saturation) et on dialyse contre du tampon au phosphate de sodium contenant Na Cl 0,15 M (PBS, p H 7,2) pour obtenir un échantillon d'essai On mesure l'activité de FIM de l'échantillon de la même manière qu'à l'exemple 1 On trouve que le taux d'inhibition de migration des macrophages est de 29,9 %. En outre, on mesure l'activité de FAM de l'échantillon selon un procédé décrit ci-dessous qui est une modification de la méthode de H W Murray et coll décrite dans J Exp Mfed, 153, page 1690 ( 1981), c'est-a-dire un procédé dans lequel on fait réagir des cellules de lignée U 937 du type macrophage humain (Pharmaceu- tical Department de l'Université de Tokyo) avec le FAM et on décèle la libération de l'acide peroxyde 02 Autrement dit, on répète sensiblement le même mode opératoire que la méthode de Murray et coll, sauf que l'on fait incuber 100/ul de cellules de lignée U 937 du type macrophage humain ( 5 10 cellules/ml) pendant 48 heures en présence ou en absence de l'échantillon d'essai On observe que 30 % du total des cellules U 937 libèrent l'anion 02 ce qui montre que l'échantillon d'essai contient du FAM. De la même manière que ci-dessus, on cultive une lignée de cellules CEM et on précipite le liquide surnageant de la culture par le sulfate d'ammonium (à 50-1 OO% de la saturation) et on dialyse contre le tampon PBS pour obtenir un autre échantillon d'essai On mesure l'activité de FIM de cet échantillon de la mwme manière que ci-dessus et on trouve qu'elle est de 9,9 % On mesure également l'activité de FAM de la même manière que ci-dessus et on trouve que 21 % du total des cellules U 937 libèrent 02. 2515 ? 08 R E V E N D I C A T IONS 1 Procédé pour préparer un hybridome de cellules T humaines producteur de lymphokine, sous-cultivables, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on traite une cellule de leucémie aigué humaine avec un inhibiteur de synthèse de protéines ou avec une combinaison d'un inhibiteur de synthèse de protéine et d'un inhibiteur de synthèse d'ARN, de manière à inhiber complètement la croissance de la cellule de leucémie aigté humaine; b) on active indépendamment une cellule T humaine avec un mitogène ou un anti- gène,de manière à produire la transformation de la cellule T humaine avec production de la lymphokine recherchée; c) on effectue la fusion de la cellule de leucémie aiguë humaine ainsi traitée avec la cellule T humaine ainsi activéeen présence d'un accélérateur de fusion et d) on isole l'hybridome ainsi produit. 2 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit inhibiteur de synthèse de protéines est capable d'inhiber la synthèse des protéines de cellules eucariotiques. 3 Procédé selon la revendication I 1 caractérisé en ce que ledit inhibiteur de synthèse de protéines est choisi parmi l'émétine ou ses dérivés ou leurs chlorhydrates et la pactamycine. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit inhibiteur de synthèse d'ARN comprend au moins un composé choisi parmi l'actinomycine D, l'c-amanitine et L'adriamycine. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit inhibiteur de synthèse de protéines est l'témétine ou un de ses dérives ou son chlorhydrate et ledit inhibiteur de synthèse d'ARN est l'actinomycine D. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite lignée de cellules de leucémie aiguë humaine est une lignée de cellules tumorales de lignée T. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdites cellules de leucémie aiguë humaine consistent en une lignée de cellules CEM, TALL ou MOLT-4. 15208 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mitogène est la phytohémagglutinine P ou la concanavaline A. 9 Procédé selon la revendication 1, 6 ou 7, caractérisé en ce que l'on traite 106 à 107 cellules/ml de ladite lignée de cellules de leucémie aigué humaine par ledit inhibiteur de synth$se de protéines 10-4 à 105 M. Procédé selon la revendication 1 ou 5, caractérisé en ce que l'on traite 106 à 107 cellules/ml de ladite lignée de cellules de leucémie aigul humaine par ledit inhibiteur de synthèse de protéines 104 à 10 '5 M et 0,05 à O 02/ug/ml d'actinomycine D. 11 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit accélérateur de fusion cellulaire est un polyéthylène- glycol ayant un poids moléculaire de 1000 a 4000. 12 Procédé selon la revendication 1, 10 ou 11, caracté- risé en ce que, après la fusion cellulaire, on mélange ladite cellule T humaine traitée par l'antigène ou le mitogène avec ladite lignée de cellules de leucémie aiguié humaine dans un rapport des nombres de cellules de 1:1 à 20:1. 13 Procédé selon la revendication 1, 10 ou 11, caracté- risé en ce que, après la fusion cellulaire, on mélange lesdites cellules T humaines traitées par l'antigène ou le mitogène avec ladite lignée de cellules de leucémie aigtié humaine dans un rapport des nombres de cellules de 2:1 à 15:1. 14 Procédé selon la revendication 1, 11 ou 13, caracté- risé en ce que, après la fusion cellulaire, on cultive les cellules d'hybridomes dans un milieu qui permet la prolifération de la lignée de cellules de leucémie aiguë humaine traitées par l'inhi- biteur non-protéines seul ou avec l'inhibiteur de synthèse d'ARN, ce qui permet l'isolement des cellules d'hybridomes. 15 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit accélérateur de fusion cellulaire est le virus Sendai (HVJ) ou un de ses produits d'inactivation. 16 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lymphokine produite par l'hybridome ainsi formé est le facteur d'inhibition de migration (FIM). 17 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lymphokine produite par l'hybridome ainsi formé est la lymphotoxine (LT). 18 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridome ainsi formé est ensuite sous-cultivé in vitro ou in vivo. 19 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridome résultant est une lignée de cellules choisie parmi E-1 OJ, F-8, C-5 et D-9. 20 Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'hybridome est une lignée de cellules E-10.