Brevet FR2518096A1 — publié le 19830617

La présente invention concerna un procédé et des réactifs pour déterminer des ligands dans les liquides biologiques tels que le sérum, le plasma, le liquide spinal, le liquide amnio- tique et l'urine En particulier, l'invention concerne un procédé de détermination immunologique par polarisation de fluorescence et des marqueurs utilisés comme réactifs dans ces modes opératoires. Le mode opératoire de détermination immunologique par polarisation de fluorescence selon l'invention combine la spécificité d'une détermination immunologique avec la rapidité et la commodité des techniques de polarisation de fluorescence pour fournir un moyen de détermination de la quantité d'un ligand spécifique présent dans un échantillon. Les déterminations immunologiques par fixation compétitive pour la mesure de ligands reposent sur la compétition entre un ligand dans un échantillon d'essai et un réactif marqué, dénommé marqueur, pour un nombre limité de sites de fixation du récepteur sur des anticorps spécifiques du ligand et du marqueur. La concentration du ligand dans l'échantillon détermine la quantité de marqueur qui se fixe de manière spécifique sur un anticorps La quantité de conjugué marqueur-anticorps produite peut ttre mesurée quantitativement et elle est inversement proportionnelle à la quan- tité de ligand dans l'échantillon d'essai. En général, les techniques de polarisation de fluores- cence reposent sur le principe d'après lequel un marqueur fluorescent, excité par de la lumière à polarisation linéaire, émet de la lumière de fluorescence ayant un degré de polarisation qui est en relation inverse de son taux de rotation Donc, lorsqu'une molécule telle qu'un conjugué marqueur-anticorps ayant un marqueur fluorescent est excitée avec de la lumière à polarisation linéaire, la lumière émise reste fortement polarisée parce que la rotation du fluorophore est limitée entre l'instant d'absorption de la lumière et l'instant d'émission Lorsqu'un marqueur "libre" (c'est-à-dire non fixé sur un anticorps) est excité par de la lumière à polarisation linéaire, sa rotation est beaucoup plus rapide que le conjugué marqueur-anti- corps correspondant et les molécules sont davantage orientées statis- tiquement, donc la lumière émise est dépolarisée Donc, la polarisation de fluorescence fournit un moyen quantitatif pour la mesure de la quantité de conjugué marqueur-anticorps produite dans une déterii- nation immunologique par fixation compétitive. La présente invention concerne un procédé pour la détermination de ligands dans un échantillon consistant à mélanger avec ledit échantillon un sel biologiquement acceptable d'un marqueur de formule générale OH R-HX N 1-X) (I) dans laquelle X représente un groupe oxalyle de formule Il Il -CC- un groupe sulfonyle de,formule 0 o -S - Il ou un groupe carbamidosulfonyle de formule O HO il l Il -C-N-S- ll et R est un analogue du ligand ayant au moins un épitope commun avec ledit ligand de manière à être spécifiquement reconnaissable par un anticorps commun; et un anticorps capable de reconnaltre spécifiquement ledit ligand et ledit marqueur; et à déterminer ensuite la quantité de conjugué marqueur-anticorps par des techniques de polarisation de fluorescence comme mesure de la concentration dudit ligand dans l'échantillon. L'invention concerne en outre une nouvelle classe de marqueurs de formule (I) et leurs sels biologiquement acceptables, qui sont intéressants comme réactifs dans le procédé décrit ci-dessus. Les procédés et marqueurs selon l'invention sont particulièrement intéressants pour le contrôle quantitatif de concentrations de médi- caments thérapeutiques dans le sérum et le plasma. Le terme "ligand" s'entend dans la présente descrip- tion pour désigner une molécule, en particulier un haptène de bas poids moléculaire auquel on peut obtenir ou former un récepteur, normalement un anticorps Les haptènes sont des corps sans protéine, généralement de bas poids moléculaire, qui ne provoquent pas de formation d'anticorps lorsqu'on les injecte à un animal, mais sont réactifs vis-à-vis des anticorps Les anticorps ou haptènes sont généralement formés en conjuguant d'abord les haptènes à une pro- téine et en injectant le produit conjugué à un animal Les anticorps résultants sont isolés par des techniques classiques d'isolement des anticorps. Les ligands déterminables par le procédé de l'inven- tion varient dans une large gamme de poids moléculaires Bien que l'on puisse déterminer des ligands de haut poids moléculaire, il est généralement préférable,pour de meilleurs résultats,d'utiliser les procédés de l'invention pour déterminer les ligands de bas poids moléculaire, généralement dans un intervalle de 50 à 4 000 On pré- fère encore déterminer des ligands ayant un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2 000. Les nouveaux marqueurs selon l'invention comprennent des composés de formule (I) dans laquelle l'analogue du ligand re- présenté par R comprend des radicaux ayant un poids moléculaire dans la gamme de 50 à 4 000 Les nouveaux marqueurs préférés compren- nent des composés de formule (I) dans laquelle les analogues du ligand représentés par R comprennent des radicaux ayant un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2 000. Des exemples représentatifs de ligands pouvant être déterminés par les procédés de la présente invention comprennent les stérotdes tels qu'oestrone, oestradiol, cortisol, testostérone, pro- gestérone, acide chénodésoxycholique, digoxine, acide cholique, digitoxine, acide désoxycholique, acides lithocholiques et leurs esters et amides; les vitamines telles que B-12, acide folique, thyroxine, triiodothyronine, histamine, sérotonine; les prosta- glandines telles que PGE, PGF, PGA; les médicaments antiasthmatiques tels que la théophylline; les médicaments antinéoplasiques tels que doxorubicine et méthotrexate, les antiarythmiques tels quediso- pyramide, lidocaine, procainamide, propranlol, quinidine, N-acétyl- procainamide; les anticonvulsivants tels que phénobarbital, phény- toine, primidone, acide valproique, carbamazépine et éthosuximide; les antibiotiques tels que les pénicillines, les céphalosporines, l'érythromycine, la vancomycine,-la gentamicine, l'amikacine, le chloramph 6 nicol, la streptomycine et la tobramycine; les antiarthri- tiques tels que les salicylates; les antidépresseurs, y compris les composés tricycliques tels que nortriptyline, amitriptyline, imi- pramine et désipramine; et les analogues, ainsi que leurs métabolites. En outre, les médicaments donnant lieu à l'accoutumance tels que morphine, hérolne, hydromorphoneoxymorphone, métapon, codéine, hydrocodone, dihydrocodéine, dihydrohydroxycodéinone, pholcodine, dextrométhorphan, phénazocine et déonine et leurs métabolites, peuvent être déterminés selon les procédés de l'invention. Les marqueurs selon l'invention existent généralement en équilibre entre leurs formes acide et ionisée et, à l'état Lonisé, ils sont efficaces dans le procédé de l'invention La présente inven- tion comprend donc les marqueurs soit sous la forme acide, soit la forme ionisée et, pour la commodité, les marqueurs de l'invention sont représentés structurellement dans la présente description sous leur forme acide Lorsque les marqueurs de l'invention sont présents à l'état ionisé, les marqueurs existent sous la forme de sels biolo- giquement acceptables L'expression "sels biologiquement acceptables" désigne des sels tels que les sels de sodium, potassium, ammonium, etc, qui permettent aux marqueurs de l'invention d'exister à l'état ionisé lorsqu'on les utilise dans le procédé de l'invention Géné- ralement, les marqueurs selon l'invention existent en solution à l'état de sels, le sel spécifique résulte du tampon utilisé, c'est-à- dire que, en présence d'un tampon au phosphate de sodium, les marqueurs de l'invention existent généralement à l'état ionisé sous forme d'un sel de sodium. Le terme "analogue du ligand" s'entend dans la pré- sente description pour désigner un radical mono ou polyvalent dont une proportion notable a la même organisation spatiale et polaire que le ligand pour définir un ou plusieurs sites déterminants ou épitopes capables d'entrer en compétition avec le ligand pour les sites de fixation d'un récepteur Une caractéristique d'un tel analogue du ligand est qu'il possède une ressemblance structurale suffisante avec le ligand intéressant pour être reconnu par l'anti- corps pour le iigand Pour la plupart, l'analogue du ligand a une structure etuïr distribution de charges identique ou sensiblement identique (organisation spatiale et polaire) à celles du ligand intéressant pour une portion significative de la surface moléculaire. Comme le site de fixation pour un haptène est fréquemment le même dans la préparation de l'antigène pour la production d'anticorps, que celui utilisé pour la fixation du ligand, la même portion de l'analogue du ligand qui fournit le modèle de l'anticorps est exposée par l'analogue du ligand dans le marqueur. Lorsque X est un groupe sulfonyle o -S- ll o les analogues du ligand représentés par R sont dérivés du ligand cor- respondant par élimination d'un hy rogène aromatique, c'est-à-d re un hydrogène fixé à un carbone aromatique, de préférence un carbone de phényle, ou par la formation d'un dérivé phényle ou phênyle subs- titué du ligand En outre, un ligand peut être structurellement modifié par l'addition ou l'enlèvement d'un ou plusieurs groupes fonctionnels pour former un analogue du ligand tout en conservant les sites épitopes nécessaires pour la fixation à un anticorps. Cependant, on préfère que ces analogues du ligand modifiés soient fixes au reste sulfonylaminofluorescéine par un carbone aromatique. Lorsque X est un groupe oxalyle -C-C- les analogues du ligand représentés par R dérivent du ligand corres- pondant par enlèvement d'un atome d'hydrogène lié à une amine réac- tive, c'est-à-dire un atome d'hyerogène lié à une amine primaire ou 18096 secondaire ou par la formation d'un dérivé amino du ligand dans lequel un groupe -Nl I remplace un ou plusieurs atomes initialement présents dans le ligand, au site de fixation à un reste d'oxalylaminofluores- céine Des exemples de ligands qui, par enlèvement d'un hydrogène lié à une amine réactive, forment un analogue du ligand représenté par R comprennent, par exempie, la procainamide, la thyroxine, la quinidine et les antibiotiques du type aminoglucoside Des exemples de ligands dont les dérivés amino sont intéressants comme analogues du ligand comprennent la théophylline, l'acide valproique, le phéno- barbital, la phenytoine, la primidone, la disopyramide, la digoxine, le chloramphênicol,, les salicylates, l'acétaminophène, la carbamazé- pine, la désimpramine et la nortriptyline En outre, un ligand peut être structurellement modifié par l'addition ou l'enlèvement d'un ou plusieurs groupes fonctionnels pour former un analogue du ligand, tout en conservant les sites épitopes nécessaires pour la fixation à un anticorps Cependant, on préfère que ces analogues du ligand soient liés au reste d'oxalylaminofluorescéine par un groupe imino. Lorsque X est un groupe carbamidosulfonylamino 0 H 0 -C-N-S- o les analogues du ligand représentés par R sont dérivés du ligand correspondant par élimination d'un atome d'hydrogène réactif, c'est-à- dire d'un atome d'hydrogène lié à un oxygène d'hydroxy ou une amine réactive (primaire ou secondaire) ou par la formation d'un dérivé amino du ligand dans lequel un groupe imino H -N- remplace un ou plusieurs atomes initialement présents dans le ligand, sur le site de fixation à un reste de carbamidosulfonylaminofluores- céine Des exemples de ligands qui, par enlèvement d'un hydrogène réactif, peuvent former un analogue du ligand représenté par R comprennent, par exemple, la procainamide, la thyroxine, la quinidine et les antibiotiques de la classe des aminoglucosides Des exemples de ligands dont les dérivés amino sont utiles comme analogues du ligand comprennent la théophylline, l'acide valpro Yque, le phéno- barbital, la phénytoine, la primidone, le disopyramide, la digoxine, le chloramphénicol, les salicylates, l'acétaminophène, la carbamazé- pine, la désimpramine et la nortriptyline En outre, un ligand peut être structurellement modifié par l'addition ou l'enlèvement d'un ou plusieurs groupes fonctionnels pour former un analogue du ligand tout en conservant les sites épitopes nécessaires pour la fixation à un anticorps Cependant, on préfère que ces analogues du ligand modifiés soient liés à un reste de carbamidosulfonylaminofluores- céine par un groupe imino ou oxy. Les marqueurs de l'invention peuvent être préparés selon des techniques connues Lorsque X est un groupe sulfonyle o O -S- o les marqueurs de l'invention sont préparés par réaction d'un composé de formule R-Y (II) dans laquelle R est tel que défini ci-dessus et Y est un hydrogène aromatique, de préférence lié à un noyau phényle, avec l'acide chlorosulfonique pour produire un dérivé chlorosulfonyl de l'ana- logue du ligand de formule o R-S-Cl (III) On fait réagir le dérivé chlorosulfonyl de l'ana- logue du ligand avec une aminofluorescéine de formule OH H- H-N \ p (IV) dans laquelle le groupe amino est lié à la position (IV) ou (V) du noyau acide benzoique, en présence d'un solvant inerte, pour donner un marqueur de l'invention de formule générale O-H Il 1 R-S-N, O O (v) Lorsque X est un groupe oxalyle OO Il Il -C-c- on prépare les marqueurs de l'invention par réaction d'un composé de formule R-Z (vi) dans laquelle R est tel que défini ci-dessus et Z est un hydrogène lié à un azote réactif (amine primaire ou secondaire), avec le chlorure de méthoxyoxalyle pour donner un dérivé méthoxyoxalyl d'analogue du ligand qui est hydrolyse en présence d'une base pour donner un dérivé hydroxyoxalyl d'analogue du ligand de formule 0 O I il R-C-C-OH (VII). On fait réagir le dérivé hyd roxyoxalyl d'analogue du ligand avec une aminofluoresceine de formule (IV) en présence d'un agent de condensation,tel que le chlorhydrate de l-éthyl-3-( 3 '-di- méthylaminopropyl)-carbodiimide,dans un solvant inerte pour donner un marqueur de l'invention de formule OOH il il t R-C-C-N, (VIII) Lorsque X est un groupe carbamidosulfonyle, O H O il y Il -C-N-S Il les marqueurs de l'invention sont préparés par réaction d'un composé de formule R-W (IX) dans laquelle R est tel que défini ci-dessus et W est un hydrogène iié à un azote réactif (amine primaire ou secondaire) ou à un oxygène hydroxy, avec l'isocyanate de chlorosulfonyle pour donner un dérivé chlorosulfonamidocarbonyl d'analogue de ligand de formule O H O R-C-N-SCl (X) t' o On fait réagir le dérivé chlorosulfonamidocarbonyl d'analogue de ligand avec une aminofluoresceine de formule (IV) pour donner les marqueurs de l'invention de formule générale OH 0 H OH O R-C-N-S-N o (xi) o La température à laquelle se déroule la réaction pour la préparation des marqueurs de l'invention n'est pas essentielle La température doit être suffisante pour amorcer et maintenir la réaction En général, pour la commodité et l'économie, la température ambiante est suffisante Dans la préparation des marqueurs selon l'invention, le rapport des réactifs n'est pas strictement essentiel Par exemple, on doit utiliser deux moles d'acide chlorosulfonique par mole de composé de formule (II) pour obtenir un rendement raisonnable On préefère utiliser un excès - d'acide chlorosulfonique pour la facilité de la réaction et de la récupération des produits de reaction. Les composés de formule (IV, utilisés comme matières premières dans la production des marqueurs selon l'invention sont soit disponibles dans le commerce, soit préparés selon des techniques connues. Pour la facilité de la manipulation et de la récupération du produit, la préparation des marqueurs de l'invention est effectuée en présence d'un solvant inerte Des solvants inertes appropriés comprennent les solvants qui ne réagissent pas notable- ment avec les matières premières et sont suffisants pour dissoudre les matières premières Ils comprennentpar exemplel'acétone, le chloroforme, la pyridine, etc Pour obtenir des rendements maxi- maux e N produit, la réaction se déroule de préférence en condi- tions neutres ou basiques Des bases appropriées comprennentpar exemple,la triéthylamine, la pyridine, etc Les produits de réaction sont généralement purifiés par chromatographie,soit en couche mince, soit sur colonne,avant l'application dansles procêdés de l'invention. Selon le procédé de l'invention, on mélange un échantillon contenant le ligand à déterminer avec un sel biolo- giquement acceptable d'un marqueur de formule (I) et un anticorps spécifique du ligand et du marqueur Le ligand présent dans l'échan- tillon et le marqueur sont en compétition pour un nombre limité de sites de l'anticorps conduisant à la formation de complexes ligand- anticorps et marqueur-anticorps En maintenant constante la concentra- tion de marqueur et d'anticorps, le rapport du complexe ligand-anti- corps au complexe marqueur-anticorps qui est formé est directement proportionnel à la quantité de ligand présent dans l'échantillon. Donc, par excitation du mélange en lumière fluorescente et mesure de la polarisation de la lumière de fluorescence émise par un marqueur et par un complexe marqueur-anticorps, on est capable de déterminer quantitativement la quantité de ligand dans l'échantillon. En théorie, la polarisation de fluorescence d'un marqueur non complexé par un anticorps est faible et voisine de zéro. Par formation de complexe avec un anticorps spécifique, le complexe marqueur-anticorps ainsi formé subi t la rotation de la molécule d'anticorps qui est plus faible que celle de la molécule de marqueur relativement petite, augmentant ainsi la polarisation observée Donc, 11. lorsqu'un ligand est en compétition avec le marqueur pour les sites de l'anticorps, la polarisation de fluorescence du complexe marqueur- anticorps observée prend une valeur comprise entre celle du mar- queur et du complexe marqueur-anticorps Si un échantillon contient une concentration élevée d'un ligand, la valeur de la polarisation observée est plus proche de celle du ligand libre, c'est-à-dire faible. Si l'échantillon d'essai contient une faible concentration en ligand, la valeur de polarisation est plus proche de celle du ligand lié, c'est-àdire élevée En excitant successivement le mélange de réaction d'une détermination immunologique avec de la lumière polarisée ver- ticalement et ensuite horizontalement et en n'analysant que la composante verticale de la lumière émise, on peut déterminer avec précision la polarisation de fluorescence du mélange de réaction. La relation précise entre la polarisation et la concentration du ligand à déterminer est établie par mesure des valeurs de polari- sation de substances étalons à des concentrations connues La concen- tration du ligand peut être extrapolée à partir d'une courbe d'éta- lonnage préparée de cette manière. Le pl auquel on met en oeuvre le procédé de l'invention doit être suffisant pour que les marqueurs de formule (I) puissent exister à l'état ionisé Le p H peut être compris entre envi- ron 3 et 12, plus couramment dans la gamme de 5 à 10, de préférence d'environ 6 à 9 On peut utiliser divers tampons pour obtenir et maintenir le p H pendant la détermination Des tampons caractéris- tiques comprennent les tampons au borate, au phosphate, au carbo- nate, au tris, au barbital, etc Le tampon particulier utilisé n'est pas essentiel pour l'invention, mais, dans une détermination indivi- duelle, on peut préférer un tampon spécifique pour l'anticorps utilisé et le ligand à déterminer La portion cation du tampon détermine généralement le cation du sel du marqueur en solution. Les techniques de l'invention sont mises en oeuvre à des températures moyennes et, de préférence, à température constante La température varie normalement entre O et 500 C, plus couramment entre environ 15 et 400 C. La concentration du ligand qui peut être déter- minée varie généralement d'environ 10-2 à 10 113 M, plus couramment d'environ 104 à 10 1 OM Des concentrations plus élevées de ligand peuvent être déterminées par dilution de l'échantillon initial. Outre la gamme de concentrations du ligand intéressant, d'autres considérations déterminent normalement la concentration des marqueurs et de l'anticorps à utiliser, par exemple selon que la détermination est qualitative, semi-quantitative ou quantitative, l'appareillage u t ilisé et les caractéristiques du marqueur et de l'anticorps Bien que la concentration du ligand dans l'échantillon détermine la gamme de concentrations des autres réactifs, c'est-à-dire marqueur et anticorps, les concentrations individuelles des réactifs sont normalement déterminées de manière empirique pour optimiser la sensibilité de la détermination Les concentrations du marqueur et de l'anticorps sont facilement dé- terminées par l'homme de l'art d'une habilité courante. Comme on l'a mentionné précédemment, les marqueurs préfÉrés de l'invention sont préparés à partir de la -aminofluorescéine ou de la 4aminofluorescéine et existent de préférence sous forme d'i oomères de formules OH H R-;X 4 \ N OXII) O OH l et H H -N (XIII) il " C\ O OH dans lesquelles R et X sont tels que définis ci-dessus. Les exemples non limitatifs suivants servent à illustrer encore pour l'homme de l'art la préparation de marqueurs spécifiques entrant dans le cadre de l'invention Le symbole lAFl, apparaissant dans les formules développeesillustrant les composés prépares dans les exemples suivants, représente un reste de formule OH H -N t / \ (XIV) 0 OH 9 dans laquelle l'azote du reste imino est lié à la position 4 ou 5 dans la formule ci-dessus,selon l'isomère spécifique d'aminofluores- ceine utilisé comme matière première. EXEMPLE 1 A 0,71 g de lidocaine, on ajoute 2,8 g d'acide chlorosulfonique et on chauffe le mélange résultant à 60 C pendant 1 h On refroidit le mélange de réaction et on ajoute au mélange de la glace pilée et de l'eau pour éliminer l'acide chlorosulfonique n'ayant pas réagi On neutralise la solution aqueuse résultante à p H 7 en utilisant l'hydroxyde de sodium On extrait le produit résultant par deux portions de 10 ml de chlorure de méthylènes On réunit les extraits de chlorure de méthylène, on sèche sur sulfate de sodium et on filtre On évapore à siccité pour obtenir 100 mg d'un melange de méta et parachlorosulfonyllidocainessous forme d'une huile gommeuse A une solution contenant 5 mg de 4-amino- fluoresceine dans 0,5 ml de pyridine, on ajoute 5 mg du mélange de chlorosulfonyllidocanes ci-dessus Après 10 min, il se forme un produit brut On purifie le produit brut par chromatographie sur couche mince en utilisant le gel de silice et le chloroforme, puis un mélange chloroforme-acetone ( 1:1) et enfin un mélange chloroforme- méthanol ( 1:1) comme solvants de développement,pour obtenir un mélange de conjugués sulfonyllidocaine-aminofluoresceine de formule générale CH O 3 a N-CHI 2-CN d O H 5 C 2 1 ' Cii 3 EXEMPLE 2 A 1,2 g de phénobarbital, on ajoute lentement 4,5 g d'acide chlorosulfonique et on chauffe le mélange résultant à 60 C pendant 1 h On refroidit le mélange de réaction et on ajoute au mélange de la glace pilée et de l'eau pour éliminer l'acide chl 3 rosulfonique n'ayant éventuellement pas réagi On filtre ensuite le mélange de réaction pour obtenir un précipité blanc que l'on rince à l'eau et on sèche dans un dessiccateur à vide pour obtenir 0,8 g d'un mélange de méta et para-chlorosulfo- nylphénobarbitals ayant un point de fusion de 190-195 C A une solution contenant 5 mg de 5-aminofluorescéine dans 0,5 ml de pyri- dine, on ajoute 5 mg du mélange ci-dessus de chlorosulfonylphéno- barbitals Après 10 min, il s'est formé un produit brut et on le purifie deux fois par des techniques de chromatogr phie sur couche mince en utilisant le gal de silice et un mélange chloroforme- méthanol 2:1 comme solvant de développement pour obtenir un conjugué sulfonylphénobarbital-aminofluorescéine de formule H O CH H 5 O O=C C 2 -l-AF N Cv H O EXEMPLE 3 A 2 g d'a-phênéthyl-a-méthylsuccinimide, on ajoute goutte à goutte 2,5 g d'acide chlorosulfonique et l'on agite le m-lange résultant à 26 C pendant 1 h On ajoute aumélange de la glace pilée et de l'eau pour éliminer l'acide chlorosulfonique n'ayant pas réagi éventuel On extrait le produit de réaction-formé par deux portions de 10 ml de chloroforme On réunit les extraits chloroformiques, on séche sur sulfate de sodium et on évapore pour obtenir une huile visqueuse On cristallise l'huile dans un mélange 18096 de toluène et d'éther de pétrole pour obtenir 0,29 g d'un mélange d'a(méta et para chlorosulfonylphénéthyl)-n-méthylsuccinimide ayant un point de fusion de 145-150 C A une solution contenant 5 mg de 4aminofluorescéine dans 0,5 ml de pyridine, on ajoute 5 mg du mélange cidessus d'a-chlorosulfonylphénéthyl)-u-méthylsuccinimides. Après 10 min, il s'est formé un produit brut que l'on purifie deux fois par des techniques de chromatographie sur couche mince en utilisant le gel de silice et un mélange chloroforme-mêthanol ( 2:1) comme solvant de développement pour obtenir un mélange de conjugués a-(sulfonylphénéthyl)ac-méthylsuccinimide-aminofluorescéine de formule O=C CH 2 CH 3 I \^C/ H-N C CH CH / O O À S -FAFl EXEMPLE 4 A une solution contenant 2 g d'iminostilbène et 2 ml de triéthylamine dans 50 ml de chloroformes on ajoute 1,5 g de chlorure de méthoxyoxalyle On chauffe le mélange résultant au reflux pendant 1 h et ensuite on l'évapore à siccité On reprend le résidu dans 50 ml de chloroforme et on extrait ensuite par 50 ml d'eau On évap're à siccité la couche chloroformique On ajoute au résidu ml d'hydroxyde de sodium 2 N et on chauffe le mélange résultant au reflux pendant 30 min On refroidit le mélange à la température ambiante et ensuite on l'extrait par 50 ml de chloroforme On acidifie la couche aqueuse à pli 1 en utilisant de l'acide chlorhydrique concen- tré,et ensuite on extrait par 100 ml d'éther On sèche l'extrait organique sur sulfate de sodium et on l'évapore à siccité On reprend le résidu dans 50 ml de méthanol et on triture avec de l'eau pour obtenir un jet de cristaux On filtre le mélange et on refroidit les cristaux pendant 16 h pour obtenir 2,4 g d'un N-hydroxyoxalyl- iminostilbène (point de fusion 162-163 C). A 5 mg du N-hydroxyoxalyl-iminostilbène, on ajoute une solution contenant 5 mg de 4-aminofluorescéine dans 0,5 ml de pyridine On laisse la réaction se poursuivre pendant 2 h à 26 C * pour obtenir un produit brut On purifie le produit brut par chro- matographie sur couche mince en utilisant le gel de silice et un solvant de développement consistant en un mélange chloroforme- acétone ( 1:1) pour obtenir un conjugué N-oxalyl-iminostilbèneaminofluoresceine de formule O Q N-C-C AFl On prépare également les marqueurs suivants selon les modes opératoires ci-dessus. EXEMPLE 5 Conjugués sulfonylprimidone-aminofluoresceine H " o 2 5 O H O q Il AF N _C O \ 60 EXEMPLE 6 Conjugué para-méthyl-méta-sulfonylprimidone-aminofluoresceine HN C __ H 2 C / H/ O O^ il CH EXEMPLE 8 Conjugué 5-sulfonvlphényl-5-éthylhydantoine-aminofluorescéine H il c CH CH O 2 3 il S -+AF C 1 1 N O H EXEMPLE 9 Conjugué u-(sulfon,lphényl)-a -méthylsuccinimide-aminofluorescéine \ c CH 2 le EXEMPLE 10 Conjugué 0-sulfonaniidocarbonylpropranolol-aminofluorescéine H O H O 1 Il yIl 0-CH 0-C-N-S EAFl 2 il H CH 3 -11 î, -H CH 3 H N O=C '1 CI C 2 H 5 1 1 C ' I- N C, H AFl Il 0 CH Il \\C _ 3 Il -AFl H-N' 18 096 1 7 EXEMPLE 7 Conjuguë para-méthyl-méta-sulfonylph Cnobarbital-aminofluorescéine is EXEi LE Il e CcLlju,-,ué N-sulionami-docarb,)nyl-imi-nostilb,ie- aminofluoresc 4-ine 0 H O N-C -N-S-+AFI EXEMPLE 12 Conjugué N-sulfonamidocarbonyl-procainartide-aminofluorescéine H 5 C 2 Il O H O H O N-CH CH -N-C N-C-N-S EAFl C 2 2 il H 5 2 O EXEMPLE 13 Conjugué 0-sulfonamidocarbonyl-chloramphénicol-aminofluorescéine H H O H O 1 t ily il 0 N C-C-CH -0-C-N-S EAF-1 2 2 Il H O H C-CH Cl EXEIMPLE 14 Conjugué N-sillfonamidocarbonyl-disopyramide-aminofluorescéine H-C H 3 H O H O CH 3 il Vit 1 fi N-CH CH -C-C-N C-N-S E-AFI CH / 2 2 i Il \ 3 O H-C i CH 3 L)1 EXEMPLE 15 Conjugué 0-sulfonamidocarbonyl-quinidine-aminofluorescéine H CHCH x 2 N 0 H H O-C-N-S-FEAFl OC Hil EXEMPLE 16 Conijugué 0-oxalyl-propranolol-aminofluorescéine H 0 00 I ilil \ / OC? -C-O-C-C -fr AFl 21,,CH CH -N-C-H 2 y, - H CH 3 EXEMPLE 17 Conjugué N-oxalyl-proca Tnamide-aminofluorescéine H 5 C 2 H O H N-CH CH -N-C -' " " 2 2 \ NCC AFI H C EXEMPLE 18 Conjugué Ni-acét yl-N'-déséthivl-N'-oxaly 11-procai Cnamideaminofluorescêine O H H C H C-N C N-CH CH -N 3 C-C -l-Arl i Q Oi EXEMPLE 19 Conjugué N oxalyl-nortriptyline-aminofluorescéine /A \ i / CH 3 C=CHCH 2 -CH -N 2 2 \ C-C-+AFl 0 \ EXEMPLE 20 Conjugué N-oxalyl-iminodibenzyle-aminofluorescéine A 00 zi i | N-C-C FAFl Comme précédemment mentionné, les marqueurs selon l'invention sont des réactifs efficaces pour l'utilisation dans les déterminations immunologiques par polarisation de fluorescence Les exemples suivants illustrent l'intérêt des marqueurs selon l'invention dans les déterminations immunologiques utilisant des techniques de polarisation de fluorescence Ces déterminations sont effectuées selon le mode opératoire général suivant: 1) On place dans un tube à essais un volume mesuré d'échantillon étalonné ou de sérum d'essai et on dilue par le tampon; 2) on ajoute ensuite dans chaque tube une concentration connue d'un marqueur de l'invention contenant facultativement un tensio-actif; 3) on ajoute dans les tubes une concentration connue des antisérums; 4) on fait incuber le mélange de réaction à la tempé- rature ambiante et ) on mesure la quantité de marqueur lié à l'anti- corns par des techniques de polarisation de fluorescence, comme mesure de la quantité de ligand dans l'échantillon. EXEMPLE 21 Determination de la lidocaine Produits: 1) Tampon: phosphate 0, 1 M, p H 7,5, contenant 0,01 % 7 en poids par volume d'azide de sodium et 0,01 % en poids par volume de y-globuline de boeuf (ci-après dénommé "tampon GGB") 2) Marqueur: conjugué sulfonyllidocalne-amino- fluorescéine (préparé à l'exemple 1) à une concentration de 2,34 10-7 M dans le tampon chlorhydrate de tris 0,IM, p H 7,8, contenant 0,1 % en poids par volume de dodécylsulfate de sodium, 0,01 % en poids par volume de y-globuline de boeuf et 0,01 % en poids par volume d'azide de sodium 3) Anticorps serum de lapin anti-lidocaine dilué 1 à 80 fois dans le tampon GGB 4) Etalons et échantillons inconnus: sérum humain (ou autre liquide biologique) contenant de la lidocaine dans une gamme de concentrationsde O à 10 P g/ml ) polarimètre de fluorescence: instrument capable de mesurer la polarisation de fluorescence d'une solution de fluores- _g ceine 10 M à + 0,001 unité de polarisation. Mode opératoire: 1) A 20 /ul d'étalons ou d'échantillons inconnus, ajouter 200 p 1 de tampon GGB 2) A 20 /ul de chaque étalon ou échantillon inconnu dilué dans un tube de culture, ajouter 200 u 1 de tampon GGB 3) A chaque tube de culture contenant l'étalon ou l'échantillon inconnu dilué, ajouter 40 ml de marqueur et 1000 ml de tampon GGB 4) Ajouter ensuite 40 ml d'anticorps et 1000 ml de tampon GGB à chaque tube de culture 5) Mélanger les réactifs et faire incuber les tubes de culture contenant les étalons et les échantillons inconnus pendant environ 15 min à 23 C 6) Mesurer la polarisation de fluorescence de tous les tubes Des résultats caractéristiques des échantillons étalons sont representés dans le tableau I ci-après. TABLEAU I Concentration de lidocaine (,u/ml) Polarisation 0 0,224 0,5 0,186 1,0 0,162 2,5 0,124 ,0 0,094 ,0 0,071 Les valeursde polarisation diminuent à mesure que la concentration de lidocaine augmente, ce qui permet de tracer une courbe d'étalonnage Des Échantillons inconnus traités de manière identique peuvent être quantifiés par référence à la courbe d'éta- lonnage. EXEMPLE 22 Détermination du phénobarbital Produits: 1) Tampon GGB 2) Marqueur: conjugué (para-méthyl-méta-sulfonyl)- phénobarbital-aminofluorescéine (préparé à l'exemple 7) à une concen- tration de 5,75 10-8 M dans le cholate de sodium à 5,75 % 3) Anticorps: sérum de lapin anti-phénobarbital dilué 1 à 78,3 fois dans le tampon GGB 4) Etalons ou échantillons inconnus: sérum humain (ou autre liquide biologique)contenant du phénobarbital dans une gamme de concentrationsde O à 80 /ug/ml 5) Polarimètre de fluorescence: instrument capable de mesurer la polarisation de fluorescence d'une solution de fluores- ceine 10-9 M à + 0,001 unité de polarisation. Mode opératoire 1) A 20 Pl d'étalons ou d'échantillons inconnus, ajouter 200 1 ul de tampon GGB 2) A 20 /ul de chaque étalon ou échantillon inconnu dilué dans un tube de culture, ajouter 200 /ul de tampon GGB 3) Chaque tube de culture contenant un étalon ou un échantillon inconnu dilué, ajouter 40 ml de marqueur et 1000 ml de tampon GGB 4) Ajouter ensuite 40,1 l d'anticorps et 1000 /u 1 l de tampon GGB à chaque tube de culture ) Mêlanger les réactifs et faire incuber les tubes de culture contenant les étalons et les échantillons inconnus pendant environ 15 min à 23 C 6) Mesurer la polarisation de fluorescence de tous les tubes Des résultats caractéristiques pour des échantillons étalons sont représentés dans le tableau II ci-après. TABLEAU II Concentration de phénobarbital (ug/ml) Polarisation O 0,155 10 0,108 0,092 0,074 0,060 Les valeurs de polarisation diminuent à mesure que la concentration de phénobarbital augmente, ce qui permet de tracer une courbe d'étalonnage Les échantillons inconnus traités de manière identique peuvent être quantifiés par référence à la courbe d'étalonnage. EXEMPLE 23 Détermination de la carbamazépine Produits: 1) Tampon GGB 2) Marqueur: conjugué N-oxaliminostilbène-amino- fluorescéine (préparé à l'exemple 4) à une concentration de 2 n M dans le tampon BGG contenant 0,2 % en poids par volume de cholate de sodium 3) Anticorps: sérum de lapin anti-carbamazépine diluée 1 à 3040 fois dans le tampon GGB 4 j Etalons ou échantillons inconnus: sérum humain (ou autre liquide blologique)contenant de la carbamazépine dans une gamme de concentrationsde O à 20 /ug/ml 5) Polariraètre de fluorescence: instrument capable de mesurer la polarisation de fluorescence d'une solution de fluoresceine 109 M à + 0,001 unité de polarisation. Mode opératoire 1) A 10 /ul d'étalons ou d'échantillons inconnus, ajouter 300 /ul de tampon GGB 2) A 10 /11 de chaque étalon ou dchantillon inconnu dilué dans un tube de culture, ajouter 300 X 1 de tampon GGB 3) Ajouter 1 ml de marqueur à chaque tube de culture 4) Ajouter ensuite à chaque tube de culture 1,0 ml d'anticorps 5) Mélanger lesréactifs et faire incuber les tubes de culture contenant les étalons et les échantillons inconnus pendant environ 15 min à 23 D O C. 6) Mesurer la polarisation de fluorescence de tous les tubes Des résultats caractéristiques pour les échan- tillons étalons sont représentés dans le tableau III ci-après. TABLEAU III Concentration de carbamazêpine (/ug/ml) Polarisation 0 0,224 2 0,108 4 0,135 8 0,105 12 0,088 0,077 Les valeurs de polarisation diminuent à mesure que la concentration de carbamazépine augmente, ce qui permet de tracer une courbe d'étalonnage Les échantillons inconnus traités de manière identique peuvent être quantifiés par référence à la courbe d'étalonnage. Le tableau suivant résume les diverses déter- minations immunologiques par polarisation de fluorescence qui ont été effectuées selon les modes opératoires décrits ci-dessus en utilisant des marqueurs préparés dans les exemples précédents. Les marqueurs utilisés sont identifiés par le numéro d'exemple et le o les ligands spécifiques déterminés sont indiqués. Marqueur (exemple de préparation) Ligand(s) déterminé(s) Lidocalne Phénobarbital Ethosuximide Carbamazépine Primidone Primidone Marqueur (Exempie de préparation) Ligand(s) déterminé(s) 7 Phénobarbital 8 Phénytoine 9 Ethoxysuximide Propanolol 11 Carbamazêpine 12 Procainamide 13 Chloramphénicol 14 Disopyramide Quinidine 16 Propanolol 17 Procainamide 18 N-acêtyl-procainamide 19 Désipramine, Imipramine Nortriptyline, Amitriptyline Comme il est évident d'après les résultats ci-dessus, les marqueurs selon l'invention sont des réactifs efficaces dans les déterminations immunologiques par polarisation de fluorescence. Outre les propriétés mentionnées ci-dessus, les marqueurs de l'inven- tion possèdent une stabilité thermique élevée, un degré élevé de polarisation à l'état fixé, des rendements quantiques élevés et sont faciles à produire et à purifier. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustra- tion et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. R E V E N D I C A T I O N S 1 Nouveaux dérivés de sulfonylaminofluorescéine, caracté- risés en ce qu'ils répondent à la formule générale __,OH / 0, R-S \ v È = \ lo o H dans laquelle R est un analogue de ligand ayant un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un épitope commun avec ledit ligand de manière à être spécifiquement reconnaissable par un anticorps commun et ledit analogue de ligand ayant un carbone aromatique par lequel il est fixé au reste de sulfonamidofluorescéine; et leurs sels biologiquement acceptables. 2 Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce- qu'ils répondent à la formule générale OH OH R-S-N O - / \ OU 0 v BH À_ ou OH O R-S-N, / / ' 0 l O et leurs sels biologiquement acceptables. 3 Composés selon la revendication 2, caractérisés en ce que R est dérivé d'un ligand choisi parmi les stéroides, les hormones, les antiasthmatiques, les antineoplasiques, les antiarythmiques, les anticonvulsivants, les antibiotiques, les antiarthritiques, les antidépresseurs et les glucosides cardiaques. 4 Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce que R est dérive d'un antiarythmique. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que R est dérivé de la lidocaïne. 6 Composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que R est un groupe de formule CH 0 H CH CH 3 t N-CH 2-C-N CH.CÉ 2 CH 3 Composé selon la revendication dérivé d'un anticonvulsivant. Composé selon la revendication dérivé de la phénytoine. Composé selon la revendication un groupe de formule 3, caractérisé en ce que 7, caractériseen ce que 8, caractérisé en ce que H% Il N C -1 C ci CH 3 I' / 2 3 1 1 / Composé selon la revendication 7,caractérisé en ce que R est dérivé de la primidone. 11 Composé selon la revendication 7, caractérisé en ce que R est un groupe de formule LI r% LN _C' CH 2 N C Hl N O V dans laquelle R' est un groupe alkyle en Cl-C 4- 7. R est 8. Rest 9. R est 12 Composé selon la revendication 7, caractérisé en ce que R est dérivé de l'éthosuccinimide. 13 Composé selon la revendication 12, caractérisé en ce que R est un groupe de formule a? CH 3- H-NC -C -'CH 2 dans laquelle N est un entier de O à 3. 14 Nouveaux dérivés de carbamidosulfonylaminofluorescéine, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale OH OH OH / tg I Il y R-C-N-S-N I O H O dans laquelle R est un analogue de ligand ayant un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un épitope commun avec ledit ligand de manière à être spécifiquement reconnaissable par un anticorps commun et ledit analogue de ligand étant fixé au reste carbamidosulfonylaminofluorescéine par un oxygène de groupe hydroxy ou une amine réactive; et leurs sels biologiquement acceptables. Composés selon la revendication 14, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale OH O HO H Il I '1 I R-C-N-S-N ou O HO O 11 l Il R-C-N-S- O et leurs sels biologiquement acceptables. 16 Composés selon la revendication 15, caractérisés en ce que R est dérivé d'un ligand choisi parmi les stéroides, les hormones, les antiasthmatiques, les antinéoplastiques, les anti- arythmiques, les anticonvulsivants, les antibiotiques, les anti- arthritiques, les antidépresseurs et les glucosides cardiaques. 17 Composé selon la revendication 16, caractérisé en ce que R est dérivé d'un anticonvulsivant. 18 Composé selon la revendication 17, caractérisé en ce que R est dérivé de la carbamazépine. 19 Composé selon la revendication 18, caractérisé en ce que R est un groupe de formule \ - \ ce que R est dérivé d'un antiarythmique. 21 Composé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R est dérivé de la procainamide. 22 Composé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R est dérivé du propranolol. 23 Nouveaux dérivés d'oxalylaminofluorescéine, carac- térisés en ce qu ils répondent à la formule générale OH O O H 'd R-C-C-N o' OH if Y/i dans laquelle R est un analogue deligand ayant un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un épitope commun avec ledit ligand de manière à être spécifiquement reconnaissable par un anticorps commun et ledit analogue de 'ligand ayant un azote réactif par lequel il est fixé au reste oxalylamino- fluorescéine, et leurs sels biologiquement acceptables. 24 Composés selon la revendication 23, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale OH O O Hv il Il I R-C-C-N OOH \Co ou OH O O H Il Il I R-C-C-N 0 ' OH \ O et leurs sels biologiquement acceptables. 2 518096 Composés selon la revendication 24, caractérisés en ce que R est dérivé d'un ligand choisi parmi les stéroides, les hormones, les antiasthmatiques, les antineoplasiques, les anti- arythmiques, les anticonvulsivants, les antibiotiques, les anti- arthritiques, les antidépresseurs et les glucosides cardiaques. 26 Composé selon la revendication 25, caractérisé en ce que R est dérivé d'un antidépresseur. 27 Composé selon la revendication 26, caractérisé en ce que R est dérivé d'un médicament tricyclique. 28 Composé selon la revendication 27, caractérisé en ce que R est dérivé de la nortriptyline, de l'amitriptyline, de l'imi- pramine ou de la désipramine. 29 Composé selon la revendication 28, caractérisé en ce que R est dérivé d'un anticonvulsivant. 30 Composé selon la revendication 29, caractérisé en ce que R est dérivé de la carbamazepine. 31 Composé selon la revendication 30, caractérisé en ce qu R est un groupe de formule e 32 Procédé pour la détermination de ligands dans un échan- tillon, caractérisé en ce que l'on mélange avec ledit échantillon un sel biologiquement acceptable d'un marqueur de formule générale OH OH / R-S-N ol 18096 dans laquelle R est un analogue de ligand ayant un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un épitope commun avec ledit ligand de manière a être spécifiquement reconnaissable par un anticorps commun et ledit analogue de ligand ayant un carbone aromatique par lequel il est fixé au reste de sulfonamidofluoresceine; et un anticorps capable de reconnaître spécifiquement ledit ligand et ledit marqueur et on détermine ensuite la quantité de marqueur fixée à l'anticorps par des techniques de polarisation de fluores- cence comme mesure de la quantité de ligand dans l'échantillon. 33 Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce que le groupe sulfonamido lié au groupe R est également lié à la position 4 ou 5 du reste fluoresceine. 34 Procédé selon la revendication 33, caractérisé en ce que ledit ligand est choisi parmi les stéroides, les hormones, les antiasthmatiques, les antineoplasiques, les antiarythmiques, les anticonvulsivants, les antibiotiques, les antiarthritiques, les antidépresseurs, les glucosides cardiaques et leurs métabolites. Procéde selon la revendication 34, caractérisé en ce que R a un poids moléculaire dans la gamme de 50 à 4000. 36 Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que R a un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2000. 37 Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que ledit ligand est un antiarythmique. 38 Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que ledit antiarythmique est la lidocaine. 39 Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que ledit ligand est un anticonvulsivant. Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que ledit anticonvulsivant est la phénytoine. 41 Procéde selon la revendication 39, caractérisé en ce que ledit anticonvulsivant est la primidone. 42 Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que ledit anticonvulsivant est l'éthosuccimide. 43 Procédé pour la détermination de ligands dans un échan- tillon, caractérisé en ce que l'on mélange avec ledit échantillon un sel biologiquement acceptable d'un marqueur de formule générale OH O H O / R-C-N-S-N \_ o "O dans laquelle R est un analogue de ligand ayant un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un épitope commun avec ledit ligand de manière à être spécifiquement reconnaissable par un anticorps commun et ledit analogue de ligand étant fixé au reste carbamidosulfonylaminofluorescéine par un oxygène de groupe hydroxy ou une amine réactive; et un anticorps capable de reconnaître spécifiquement ledit ligand et ledit marqueur et on détermine ensuite la quantité de marqueur fixee à l'anticorps par des techniques de polarisation de fluores- cence comme mesure de la quantité de ligand dans l'échantillon. 44 Procédé selon la revendication 43, caractérisé en ce que le groupe carbamidosulfonylamino lié au groupe R est également lié à la position 4 ou 5 du reste fluorescéine. 45 Procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que ledit ligand est choisi parm i les stéro Tdes, les hormones, les antiasthmatiques, les antineoplasiques, les antiarythmiques, les anticonvulsivants, les antbiotiques, les antiarthritiques, les anti- dépresseurs, les glucosides cardiaques et leurs métabolites. 46 Procédé selon la revendication 45, caractérisé en ce que R a un poids moléculaire dans la gamme de 50 à 4000. 47 Procédé selon la revendication 46, caractérisé en ce que R a un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2000. 48 Procédé selon la revendication 47, caractérisé en ce que ledit ligand est un anticonvulsivant. 49 Procédé selon la revendication 48, caractérisé en ce que ledit anticonvulsivant est la carbamazèpine. Procédé pour la détermination de ligands dans un échan- tillon, caractérisé en ce que l'on mélange avec ledit échantillon un sel biologiquement acceptable d'un marqueur de formule générale OH 0 0 H il il 1 R-C-C-N / o dans laquelle R est un analogue de ligand ayant un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un épitope commun avec ledit ligand de manière à être spécifiquement reconnaissable par un anticorps commun et ledit analogue de ligand ayant un azote réactif par lequel il est fixe au reste oxalylamino- fluorescéine; et un anticorps capable de reconnaître spécifiquement ledit ligand et ledit marqueur et on détermine ensuite la quantité de marqueur fixée à l'anticorps par des techniques de polarisation de fluores- cence comme mesure de la quantité de ligand dans l'échantillon. 51 Procédé selon la revendication 50, caractérisé en ce que le groupe oxalylamino lié au groupe R est également lié à la position 4 ou 5 du reste fluoresceine. 52 Procéde selon la revendication 51, caractérisé en ce que ledit ligand est choisi parmi les stéroldes, les hormones, les anti- asthmatiques, les antineoplasiques, les antiarythmiques, les anti- convulsivants, les antibiotiques, les antiarthritiques, les anti- dépresseurs, les glucosides cardiaques et leurs métabolites. 53 Procéde selon la revendication 52, caractérisé en ce que R a un poids moléculaire dans la gamme de 50 à 4000. 54 Procédé selon la revendication 53, caractérisé en ce que R a un poids moléculaire dans la gamme de 100 à 2000. Procédé selon la revendication 54, caractérisé en ce que ledit ligand est un anticonvulsivant. 56 Procédé selon la revendication 55, caractérisé en ce que ledit anticonvulsivant est la carbamazépine.