Brevet FR2516652A1 — publié le 19830520

La présente invention concerne un dispositif de trans- fert pour l'extraction de coupes lyophilisées hors de la chambre de refroidissement d'un microtome pour coupes congelées en particulier d'un cryo-ultramicrotome. Les objets biologiques destinés à des fins hystochimi- ques, en particulier pour l'exécution d'une microanalyse aux rayons X en microscopie électronique, sont souvent coupés après une congélation rapide, dite "cryofixation", à l'état congelé dans des chambres de refroidissement, c'est-à-dire tl des chambres de "cryomicrotomie" ou de "cryo-ultramicro- tomie" Dans la mesure o de tels types de cryo-coupes hydratées ne peuvent être irradiées et analysées au microscope électronique qu'avec difficulté, on a eu recours jusqu'à present au procédé de lyophilisation de manière à augmenter la transparence des coupes dans le faisceau Mlectronique et à simplifier le transfert des coupes entre la chambre de refroidissement et le microscope électronique. Pour ce faire, la coupe qui est déposée sur une grille porte-objet, par exemple dans l'atmosphère d'azote anhydre de la chambre de refroidissement, est chauffée depuis la température à laquelle elle était congelée à des températu- res de l'ordre de 8 -30 CLa plus grande partie des molécules d'eau présentes dans la coupe sont donc trans- férées dans le gaz de refroidissement de la chambre qui balaye constamment les coupes et entraîne ces molécules d'eau vers l'atmosphère ambiante Les brevets des Etats-Unis né 3 328 571, 4 284 894 et 4 302 450 donnent des exemples de cryo-ultramicrotomes ayant la structure générale à laquelle on se réfère On peut se reporter au brevet des Etats-Unis n 3 924 500 pour ce qui est de la représentation d'une grille classique 10 adaptée à supporter une coupe Il est cependant difficile d'extraire les coupes sèches de la chambre après la lyophilisation sans qu'il se forme de condensats ou de sublimats d'eau sur les surfaces froides de 3; la coupe lorsqu'elle pénètre dans l'atmosphère ambiante, humide De tels précipités d'eau sur les coupes sèches conduisent momentanément à une distribution alternée d'ions et de petites molécules et donc ont tendance à fausser toute micro-analyse ultérieure des coupes On s'est donc efforcé jusqu'ici d'enfermer les coupes déposées sur des grilles porte-objet dans la chambre de refroidissement, dans des supports formant enceince, par exemple de petites capsules de résine synthétique, avant d'extraire ces coupes de la D chambre de refroidissement Malheureusement, cette étape demande des capsules très épaisses qui ne peuvent être manipulées que très difficilement dans la chambre de refroidissement à des températures inférieures à -1 OO O C. Cela est également vrai en ce qui concerne les essais tendant à envelopper les grilles porte-objet dans *des feuilles en métal ou en matière plastique avant l'extraction hors de la chambre de refroidissement. La présente invention a pour but principal -d'apporter un dispositif de transfert de structure relativement simple qui soit sûr et fiable dans son mode de fonctionnement et qui élimine nombre des difficultés liées au transfert de coupes hydratées congelées à des températures cryogéniques. Le dispositif selon la présente invention est construit de telle manière que les grilles porte-objet peuvent être déplacées depuis la plaque de chauffage prévue pour la lyophilisation vers une plaque support qui constitue le fond d'une tête de transport sous vide, laquelle tête, après le déplacement des grilles sur la plaque, peut être enlevée pour permettre l'extraction, hors de l'espace de la chambre, de la coupe lyophilisée portée par la grille La température de la tête de transport et de la plaque support, pendant l'extraction des coupes lyophilisées; hors de la chambre de refroidissement, est maintenue à une valeur sensiblement supérieure à celle de la chambre de refroidissement. En outre, dans une forme d'exécution préférée, le dispositif de transfert est réalisé au moins partiellement en un matériau transparent Il est prévu des moyens formant soupape pour le rétablissement de la pression à l'intérieur de la tête de transport, ce qui élimine le risque de courant de convection lié à ce rétablissement de pression dans la tête Des évidements sont également prévus dans la plaque support pour la réception et l'extraction des grilles portant les coupes et, de préférence, il existe une plaque de couverture de la grille La plaque support du réceptacle E 2 16652 peut être chauffée au moyen d'un élément de chauffage iendant le transfert ou avant l'ouverture de la tête de transport de telle manière que la précipitation de l'eau sur les bio-colloides des coupes lyophilisées soit évitée A cet égard, il est prévu des moyens de régulation thermostatique de l'élément de chauffage pour commander la température de la plaque support et éviter que la chaleur endommage le specimen. L'invention est décrite ci-après en détail par réfé- rence aux dessins annexés dans lesquels: la figure 1 est une représentation schématique d'une chambre de refroidissement de construction connue montrant un dispositif de transfert selon la présente invention avant l'extraction des coupes lyophilisées hors de la chambre de refroidissement; la figure 2 est une représentation schématique du dispositif de transfert fermé, sous pression réduite, après l'extraction de la chambre de refroidissement et comprenant une pompe à vide actionnable manuellement et un système à soupape; la figure 3 a est une représentation schématique, en coupe transversale, d'une forme d'exécution modifiée du dispositif de transfert selon la présente invention avec une plaque de base formant support chauffable thermostatiquement et comprenant des évidements pour la mise en place et l'enlèvement des grilles porte-objet ainsi qu'un couvercle pour la protection des coupes pendant le transfert et le rétablissement de la pression; et la figure 3 b est une vue de dessus de la plaque de base 3 support de la figure 3 a montrant également les évidements pour la réception des grilles porte-objet. Si l'on se réfère à la figure 1, on voit une chambre de refroidissement classique comprenant une paroi de chambre à multicouches 1 qui est refroidie par de l'azote liquide ou gazeux à une température sensiblement inférieure à 00 C, par exemple, telle que -1700 C, et qui est maintenue dépourvue de givre par un courant continu d'azote gazeux froid et sec en parcourant l'intérieur Pour la production de coupes congelées 2 à analyser, l'échantillon biologique congelé 3 _ est tranché par l-'arête d'un couteau 4 Les coupes 2 enlevées par l'arête de couteau sont transférées, au-moyen de dispositifs classiques convenables non représentés, vers l'intérieur de la chambre 5 sur des grilles porte-objet 6 en forme de disques circulaires couramment utilisées à cette fin Ces grilles 6 peuvent avoir un diamètre de 2,3 ou 3 zm et les grilles munies des coupes sont amenées sur une plaque de lyophilisation 7 sur laquelle elles peuvent être aplaties à l'aide d'un moyen convenable non représenté et séchées à une température) -800 C. Selon la présente invention, les grilles 6 munies des coupes pressées et séchées sont déplacées depuis la plaque support 7 sur une plaque 8 dont l'emplacement rend possible, de manière simple, un tel déplacement des grilles A cette fin, la surface de la plaque support 8 est disposée légèrement plus bas que la surface de la plaque 7 La plaque 8 est, de préférence, introduite dans la chambre 5 immédiatement avant le transfert des grilles grâce à quoi la plaque 8 est plus ou moins à la température ambian te On évite un échange thermique trop rapide entre la plaque 8 et sa surface support, par exemple, au moyen d'une couche 9 en un matériau alvéolé ayant des propriétés, d'isolation thermique, laquelle couche contribue, avec la manipulation rapide des grilles porte-objet, à empêcher la condensation 2-5 sur les coupes Après le déplacement des grilles porte-objet sur la plaque 8, la- tête de transport 10 qui est également à la température ambiante, est placée sur la plaque 8 et soumise à une pression réduite telle que la plaque 8 se trouve momentanément collée à la tête de transport 10 par une différence de pression qui permet l'extraction de la plaque 8 sur laquelle reposent les grilles hors de l'espace de la chambre sans risque d'exposition à l'atmosphère ambiante Entre la tête de transport 10 et la plaque de base 8, est disposé un moyen d'étanchéité qui, dans la forme d'exécution donnée à titre d'exemple, est une bague en O il isolant l'espace intérieur de -la tête 10 La tête 10 est pourvue d'une tubulure d'évacuation 12 sur laquelle est monté un tuyau 13 permettant la liaison à la pompe - La figure 2 montre un dispositif de transfert complet selon la présente invention, avec une simple pompe manuelle 14 munie d'un manomètre 15 et d'une soupape d'entrée d'air 16 L'entrée de l'air peut se faire au travers d'un agent de déshydratation qui est prévu d'une manière connue en soi, dans un petit tube 17 entre la soupape 16 et le tuyau 13 pour empêcher l'introduction d'air humide dans les coupes lyophilisées lorsqu'on laisse pénétrer l'air dans l'inté- rieur de la tête de transport 10 pour libérer la plaque support 8 Selon la présente invention, la plaque de base_ 8 1 o avec sa face inférieure plane peut être placée sur une plaque chauffée 18 et, de cette manière, être chauffée à une température supérieure à la température ambiante telle que le risque d'introduction d'air humide lors de l'ouverture du dispositif de transport -puisse généralement être évité Un -avantage supplémentaire de la structure du dispositif selon l'invention est que la tête de transport 10 a peut être réalisée en verre ou en résine synthétique transparente, ce qui rend possible l'observation continuelle de la position des grilles porte-objet 6. La figure 3 montre une représentation schématique d'une autre forme d'exécution du dispositif de transfert selon la présente invention La plaque de base 8 a comporte, dans ce cas, trois pieds 19 pourvus d'extrémités pointues et dont deux seulement sont visibles, ces pieds réduisant au minimum le contact entre la plaque 8 a et une surface de support donnée et, de cette manière, l'échange thermique entre elles De même, selon cette forme d'exécution de linven- tion, l'échange thermique entre la plaque Sa et le gaz ambiant de la chambre peut être réduit au moyen d'une couche isolante 9 a Des moyens de chauffage thermostatiques, constitués d'un chauffage de type à cartouches 20 et d'une sonde de température 21, qui sont réunis par un câble multiconducteur 22 à un dispositif de commande non représenté, sont disposés dans la plaque 8 a Le câble multi-conducteur 22 est pourvu d'une poignée 23 d'isolation thermique qui se projette depuis la chambre de refroidis- sement Un autre avantage peut résider dans le fait d'avoir des grilles 6 dimensionnées de manière à pouvoir être reçues dans des évidements 8 b de taille complémentaire qui sont réunis au moyen d'une gorge de façon à faciliter l'extrac- tion des grilles au moyen d'une pince Un autre avantage réside dans le fait de munir les évidements individuels d'indices, par exemple de chiffres et/ou de lettres pour les différentes grilles qui y sont reçues De préférence, il est prévu une plaqué de couverture de grilles 24 de telle sorte que les troubles liés au transfert ou aux courants de convection se produisant lors de la circulation de l'air dans la tête 10 ne modifie par la position des coupes -ou 1.0 celles des grilles De cette manière, la position spaciale du couvercle 24 sur la plaque de base 8 a-, telle que représentée à la figure 3 a, peut être déterminée et localisée au moyen de gougeons non représentés. Les formes d'exécution représentées et décrites aux figures 1 à 3 ne font que montrer quelques unes des variantes préférées de mise en pratique du concept de l'invention D'autres formes d'exécution sont bien entendu possibles Ainsi, par exemple, l'étanchéité entre la tête 10 et la plaque support 8 peut être obtenue en donnant à leurs surfaces opposées un fini de précision au lieu d'utiliser une bague en O Le type, l'installation et le mode de fixation du système de mise sous vide de l'équipement et de rétablissement de la pression, ainsi que le type et la disposition des moyens de chauffage ou d'isolation de la plaque support peuvent être modifiés en ayant recours à des variantes techniquement équivalentes connues sans affecter le mode de fonctionnement selon l'invention De même, on peut faire varier les matériaux employés pour la construc- tion de ce dispositif ainsi que les gammes de température. La pompe, les Mpoyens de chauffage, la tête de transport, la plaque support, etc comprennent des éléments appartenant à l'invention mais peuvent être réalisés de toute manière appropriée En tout état de -cause, les formes d'exécution décrites et représentées ne l'ont été qu'à titre d'exemples. REVENDICATIONS 1 Dispositif de transfert pour l'extraction de coupes lyophilisées hors de la chambre de refroidissement d'un microtome pour coupes congelées, caractérisé en ce qu'il comprend une tête de transport ( 10) généralement creuse et fermée adaptée à être mise en communication avec une source de vide ( 14), ladite tête de transport ( 10) étant dimension- née de manière à pouvoir être introduite-dans la chambre de refroidissement ( 5) et étant pourvue d'une ouverture et d'une surface d'étanchéité entourant ladite ouverture, une plaque support ( 8) étant adaptée à supporter des coupes lyophilisées à extraire -de la chambre de refroidissement ( 5), ladite plaque support ( 8) étant dimensionnée de manière à pouvoir fermer, de manière étanche aux fluides, l'ouver- ture de la tête de transport ( 10) pour protéger les coupes ( 2) de l'atmosphère ambiante, grâce à quoi, après mise sous pression réduite de la tête de transport ( 10) généralement creuse par la source de vide, les coupes lyophilisées ( 2) peuvent être extraites de la chambre de refroidissement tout en étant protégées de l'atmosphère ambiante. 2 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce que la tête de transport ( 10) est en forme de cloche et en ce que la plaque de support ( 8) forme une plaque de fond fermant l'ouverture de ladite tête de transport ( 10). 3 Dispositif de transfert selon la revendication 1, combiné à une chambre de refroidissement ( 5) comprenant une plaque de pression et de chauffage ( 7), caractérisé en ce qu'il comporte une base d'appui juxtaposée pour la plaque support ( 8), ladite plaque de pression et de chauffage ( 7) étant disposée de telle manière qu'une surface supérieure de la plaque de support ( 8) soit généralement à la même hauteur qu'une surface supérieure de la plaque de pression et de chauffage ( 7). 4 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens formant pompe à vide ( 14) réunis opérativement à l'intérieur généralement creux de la tête de transport ( 10) et des moyens formant conduit ( 13) pour la mise en communication de la pompe à vide ( 14) et de-la tête de transport ( 10) qui comporte une poignée ( 23) pour la plaque support ( 8). Dispositif de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est prévu des moyens ( 16) pour rétablir la pression dans l'intérieur creux de la tête de transport ( 10). 6 Dispositif de transfert selon la revendication 5, caractérisé en -ce qu'il est prévu des moyens ( 17) pour sécher -le fluide utilisé pour rétablir la pression dans la tête de transport ( 10). 7 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce que la tête de transport ( 10) est construite, au moins partiellement, en un matériau transpa- rent. 8 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce que la surface supérieure de la plaque de support ( 8) est pourvue d'au moins un évidement ( 8 b) récepteur de grilles ( 6) de support de coupes lyophilisées et en ce qu'elle présente des indices ( 1-2-3-4) pour l'identification de la coupe supportée par la grille. 9 Dispositif de transfert selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'un au moins des évidements ( 8 b) est dimensionné de manière complémentaire à la taille de la grille porte-objet ( 6) et en ce qu'il comprend au moins une rainure latérale pour faciliter la saisie de la grille porte-objet ( 6) au moyen d'une pince. Dispositif de transfert selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte un couvercle ( 24) pour l'un au moins des évidements ( 8 b), ledit couvercle ( 24) étant dimensionné de manière à pouvoir pénétrer dans la tête de transport ( 10) sans pouvoir être -déplacé pendant le mouvement de ladite tête de transport ( 10). 11 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce que la plaque de support ( 8) est isolée sur sa face inférieure. -12 Dispositif de transfert -selon la revendication 3, caractérisé en ce que la base-d'appui pou la plaque support ( 8) prévue dans la chambre de refroidissement ( 5) est isolée thermiquement. 13 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce que la plaque support ( 8) comprend des moyens de chauffage ( 20) commandés thermostatiquement. 14 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce que la plaque support ( 8) comprend une poignée isolante ( 23) ayant une portion pouvant être saisie manuellement depuis l'extérieur de la chambre de refroidis- sement ( 5). 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