Brevet FR2512460A1 — publié le 19830311

Procédé de préparation de sphingomyélinase. La présente invention est relative à un pro- cédé de préparation de sphingomyélinase par un pro- cessus de fermentation et, plus particulièrement, à un procédé de préparation de sphingomyélinase en cultivantun microorganisme produisant de la sphingo- myélinase et appartenant au genre Streptomyces dans un milieu et en recueillant la sphingomyélinase obte- nue dans le milieu de culture. On connait jusqu'ici, comme bactéries produi- sant de la sphingomyélinase, Staphylococcus aureus et Bacillus cereus qui agissent sur la sphingomyéline pour donner du céramide et de la phosphorylcholine. On a recherché des microorganismes produisant la sphingomyélinase mentionnée ci-dessus et on a trouvé que parmi les microorganismes du sol, Strepto- myces sp A 9107, un type d'actimomycetes, produit l'enzyme suivant l'invention. Streptomyces sp A 9107 est une souche sépa- rée du sol d'un champ de radis, à Heda Mura, Tagata Gun, Département de Shizuoka, Japon, et ses caracté- ristiques mycologiques sont les suivantes: (I) Forme. L'observation à l'oeil nu montre que le mycelium aérien, ayant des spores mûrs, est brun à gris, et que le mycelium du substrat est jaune à brun jaunâtre et ne produit pas de matières colorantes solubles. Les résultats de l'observation, après culture dans des milieux amidon-sel minéralgélose à 30 C pendant 10 jours, sont les suivants, bien que l'on observe également la même forme quand on utilise des milieux farine d'avoine-gélose, et des milieux ex- traits de levure-extrait de malt-gélose. Le mycélium aérien a une forme linéaire à on- dulée d'un diamètre de 0,8 à 1,0 micron, et croit en branches simples pour former des chaînes de nombreux spores La chaîne de spores a une forme linéaire'à ondulée, sans former de spirales Le spore est consti- tué d'une colonne courte, d'une dimension de 1,0 à 1,2 x 1,5 à 2,0 microns, et sa surface est lisse Le- mycélium du substrat, d'un diamètre de 0,5 à 0,7 micron, croît suivant des ondulations ou des courbes qui forment des branches et on n'observe pas de sépa- ration du mycélium et de générations de spores Il ne se forme ni spore de flagellés, ni sporange. (II) Formation d'acide diaminopimélique. On détecte l'acide L-diaminopimélique. (III) Culture. Les résultats de l'observation après une cul- ture à 300 C pendant 20 jours sur divers milieux sont consignés au tableau La couleur est indiquée suivant la classification des couleurs décrites dans Color Harmony Manual 4 ème édition, 1958, Container Corpora- tion of America. Conditions sur divers milieux Couleur Matière Nom du milieu Croissance du mycélium Mycélium aérien colorante de substrat soluble Milieu saccharose Faible Incolore Faible Aucune nitrate gélose blanc d'huitre (b) Milieu glucose Modérée Or moutare Modéré à médiocre Aucune asparagine gélose Or moutblanc (a) Milieu glycérine Modérée Or moutarde ( 2 pe)Modéré à bon: Aucune asparagine gélose à bonne nacré ( 2 ba) Milieu amidon Sel Modérée Modéré à bon: minéral gélose à bonne Brun doré ( 3 pg) gris argent ( 3 fe) Aucune à naturel ( 3 dc) Milieu tyrosine Modérée Brun doré ( 3 pg) Modéré à bon Aucune gélose a bonne nacré ( 3 ba) Milieu farine Modérée Or mouta Médiocre: blanc Aucune Or moutarde ( 2 pg), Aucune d'avoine gélose à bonne (a) à nacré ( 3 ba) Milieu extrait de Milieu extrait de Bonne Or moutarde ( 2 pg)Bon: gris argent maltvuegéext dobrun doré ( 3 pg) ( 3 fe) à naturel ( 3 dc)Aucune malt gélose Milieu glycérine Modérée Milieu glycérine Modérée Or moutarde ( 2 pg)Médiocre: nacré ( 3 ba)Aucune nitrate gélose à médiocre w ul Ln %) 0 % CD Conditions sur divers milieux (suite 1) r%) as o Couleur Matière Nom du milieu Croissance du mycélium Mycélium aérien colorante de substrat soluble Milieu gélosé de Modérée Modéré: nacré ( 2 ba)e Bennett à bonne Or moutarde ( 2 pg) à crème ( 1 1/2 ca), Aucune partiellement sable ( 3 cb) Milieu gélosé Bonne Or moutarde Faible: blanc (a) Aucune d'Emerson ( 2 pe à 2 pg) Milieu gélosé Médiocre Froment clair Aucun Aucune nutritif ( 2 ea) (IV) Propriétés physiologiques. ( 1) Gamme de température de croissance 10 à 40 C ( 2) Liquéfaction de la gélatine positif ( 3) Hydrolyse de l'amidon: positif ( 4) Lait écrémé: positif tant pour la peptonisa- tion que pour la coagulation. ( 5) Formation de substances colorantes semblables à la mélanine: négatif ( 6) Utilité des sucres: positif vis-à-vis du L-arabinose, du D-fructose, du D-glucose, et du D-xylose; négatif vis-à-vis de l'i-ino- sitol, du D-mannitol, du raffinose, du L- rhamnose et du saccharose. Comme décrit ci-dessus, la souche A 9107 pro- duit des mycélium aériens ayant des chaînes de nom- breux spores à partir de vrais mycélium de substrat ne provoquant pas de séparation, et contient également de l'acide L-diaminopimélique A partir de ces faits, ainsi que du diamètre du mycélium et de la dimension du spore, la souche A 9107 doit appartenir à Strepto- myces sp En conséquence, on a désigné la souche A 9107 par Streptomyces sp A 9107 et on l'a déposée à l'Institut de Recherche pour la Fermentation, Agen- ce de la Science Industrielle et de la Technologie au Japon, sous la désignation FERM-P 4978, et au Service de la Recherche en Agriculture au Département de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique, sous la dési- gnation NRRL 15100. A titre de microorganismes utilisés suivant l'invention, on peut utiliser non seulement le Streptomyces sp A 9107 mentionné ci-dessus, mais également n'importe quelle moisissure appartenant au genre Streptomyces et produisant de la sphingomyéli- nase. Comme milieu de culture utilisé, suivant l'in- vention, on préfère celui contenant, en poids, de 1 à % de protofroment, 0,5 à 3 % de l'amidon de mais, de 0,1 à 0,5 % de K Cl, de 0,1 à 0,5 % de Ca CO 3 et de 0,1 % de Disfoam BC-51 Y, ayant un p H de 7,0 On effectue la culture entre 24 et 28 C pendant 40 à 50 heures, sous aération et en agitant On prépare ainsi de la sphingomyélinase qui s'accumule dans la solution de culture. En recueillant la sphingomyélinase dans la solution de culture, après achèvement de celle-ci, et en la purifiant, de la sphingomyélinase sécrétée des mycélium peut être obtenue sous la forme d'une prépa- ration enzymatique,seule à l'analyse électrophorétique, par diverses opérations, telles qu'un relargage par des sels minéraux (par exemple du sulfate d'ammonium), une précipitation fractionnée par les solvants organi- ques (par exemple l'acétone, l'éthanol), par chromato- graphie par adsorption sur des supports échangeurs de cations (par exemple cellulose-CM, Sepharose, Sepha- dex, Sephadex-SP), par chromatographie avec tamis moléculaire sur des agents de filtration de gel (par exemple Sephadex G-75, G-100, Biogel P100), etc. Les propriétés de l'enzyme obtenu sont les suivantes: ( 1) Action. Cet enzyme agit sur la sphingomyéline pour catalyser la réaction produisant du céramide et de la phosphorylcholine. ( 2) Mesure de l'activité enzymatique. Après avoir préincubé 0,45 ml du mélange ré- actionnel suivant à 37 C, on ajoute 50 pl d'une solu- tion enzymatique pour faire démarrer la réaction. Juste 10 minutes après, on ajoute 0,1 ml d'acide éthylène-diaminetétracétique 0,1 M pour arrêter la réaction. Tampon de Tris-H Cl 0,2 M (p H 8,0) 0,2 ml Mg C 12 10 m M 0,05 ml Emulsion de sphingomyéline 10 m M 0, 05 ml Triton X-100 à 5 % 0,05 ml H 20 0,10 ml. La phosphorylcholine formée est envoyée à un système de développement des couleurs par H 202, en utilisant le mélange réactionnel suivant, et on mesu- re l'absorbance à 500 nm. COD ( 50 p/ml) 0,1 ml Phosphatase alcaline ( 40 p/ml) 0,1 ml POD ( 45 p/ml) 0,1 ml 4-aminoantipyrine à 0,3 % 0,1 ml Phénol à 0,2 % 0,1 ml H 20 1,9 ml. L'indication de l'activité enzymatique est calculée par l'équation suivante, avec une activité pour produire 1 pmole de phosphorylcholine pendant 1 minute servant d'unité: Unité/ml = AA 500 nm x 0,25 x 20 x 1/10 dans laquelle AA 500 nm signifie la différence d'ab- sorbance à 500 nm entre le début de la réaction et minutes après la réaction. ( 3) p H optimum. On mesure les activités enzymatiques en utili- sant un tampon diméthylglutarate-Na OH 0,2 M (p H de 5 à 7), un tampon Tris-H Cl 0,2 M (p H de 7,2 à 9) et un tampon glycine-Na OH 0,2 M (p H de 9,5 à 10) au lieu du tampon Tris-H Cl dans le mélange réactionnel utili- sé pour la mesure de l'activité enzymatique Les ré- sultats sont illustrés à la figure 1 L'enzyme agit au mieux à un p H de 7 à 8. ( 4) Stabilité du p H. On dissout une liqueur enzymatique dans 100 m M de divers tampons, tels que le tampon diméthyl- glutarate-Na OH (p H de 5 à 7), le tampon Tris-H Cl (p H de 8 à 9) et le tampon glycine-Na OH (p H 10) de ma- nière à ce que la concentration soit de 26 p/ml On mesure l'activité résiduelle des solutions enzymati- ques obtenues après traitement à 40 C pendant 60 minu- tes Comme le montre la figure 2, la liqueur enzyma- tique est stable dans une gamme de p H allant de 6 à 9. ( 5) Stabilité thermique. On prépare une solution enzymatique de maniè- re à ce que sa concentration dans un tampon de Tris- HC 1 100 m M (p H 7,0) soit de 23 p/ml et on mesure l'activité résiduelle, après l'avoir chauffée pendant minutes à chaque température représentée en abscis- ses à la figure 3 La liqueur reste stable jusqu'au traitement à 40 C pendant 10 minutes. ( 6) Effet d'ions métalliques. Additif Activité relative Additif () (%) Pas d'addition 100 1 m M de Mg C 12 232 " de Ca C 12 48 " de Mn C 12 236 " de Zn C 12 3 " de Ni Cl 2 12 " de Ba C 12 89 " de Co Cl 35 " de Cu C 12 19 m M de Na Cl 73 " de K Cl 90 " de NH 4 Cl 79 ( 7) Effet d'agent tensio-actif. ( 8) Masse moléculaire. Elle est déterminée par le procédé d'électro- phorèse dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide en utilisant l'enzyme purifié La valeur obtenue est de 36.000. ( 9) Point isoélectrique. Il est déterminé par le procédé d'électropho- rèse en utilisant comme support de l'ampholite Le p H obtenu est de 8,6. Additif Activité relative (%) Pas d'addition 100 0,1 % de Triton X-100 358 "d'Adekatol SO-145 367 "d'Adekatol PC-8 426 "d'Adekatol L-61 267 "de désoxycholate 16 de sodium "de laurylsulfate 13 de sodium " de laurylbenzène sulfonate de 8 sodium ( 10) Spécificité du substrat. La figure 1 est un graphique représentant les résultats de la mesure du p H optimum de la sphingomy- élinase obtenue par la présente invention La figure 2 est un graphique représentant les résultats de la mesure de la stabilité du p H de la sphingomyélinase et la figure 3 est un graphique représentant les ré- sultats de mesure de la stabilité thermique de la sphingomyélinase. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 On stérilise sous pression, à 120 C pendant 20 'minutes, vingt litres d'un milieu (p H 7,0) compre- nant, en poids, 1,0 % de protofroment, 2 % d'amidon de mais, 0,3 % de K Cl, 0,4 % de Ca CO 3 et 0,1 % de Disfoam BC-51 Y Aprèus avoir ajusté la température à 26 C, on transplante dans un fermenteur à agitation de 30 litres de capacité, 400 ml d'une solution de culture de Streptomyces sp A 9107,cultivée au préa- lable pendant 3 jours,dans le milieu ayant la compo- sition mentionnée ci-dessus On effectue une culture sous aération et sous agitation à 300 tours par minu- te et à raison de 20 litres par minute, et 43 heures Additif Activité relative (%) Sphingomyéline 100 Léthicine O Lysolécithine O Phosphatidyléthanol amine Phosphatidylsérine O Phosphatidylinositol O après, le titrage enzymatique du mycélium atteint la valeur maximale ( 4, 6 p/ml) En enlevant le mycélium par centrifugation à 5000 tours par minute, pendant minutes, on obtient 15 litres d'une solution brute de sphingomyélinase. EXEMPLE 2 On concentre à 3 litres sous pression réduite, quinze litres de la solution enzymatique obtenue par le procédé illustré à l'exemple 1 On ajoute cinq li- tres d'acétone refroidie à -20 C à cette solution concentrée pour faire se déposer l'enzyme On dissout ce précipité dans 1 litre de tampon Tris-H Cl 10 m M (p H 7,5), on dialyse jusqu'à obtenir 20 litres de tampon TrisH Cl 10 m M (p H 7,5) et on lyophilise pour obtenir 8,4 grammes de poudre ( 3,8 p/mg). EXEMPLE 3 On dissout 2,0 grammes de la poudre obtenue par le procédé de l'exemple 2 dans 50 ml d'un tampon d'acétate 10 m M (p H 5,5) et on fait passer dans une colonne SP-Sephadex C-25 ( 1,8 x 20 cm) tampohnée par le même tampon pour absorber l'enzyme Ensuite, on effectue l'élution par le procédé du gradient lineai- re de concentration en utilisant 250 ml d'un tampon d'acétate 10 m M et 250 ml du tampon contenant du KC 1 0,2 M (débit 20 ml/heure) On mesure l'activité de chaque fraction et on recueille les fractions ayant de l'activité (numéros 48 à 58, 95 ml), on les concentre par une membrane d'ultrafiltration XM-50 (fournie par la Société Amicon Co), puis on les fait passer dans une colonne de Sephadex G-75 ( 3,0 x cm, tampon au diméthylglutarate 10 m M) On recueil- le les fractions ayant de l'activité (numéros 21 à 28, 52 ml) et on les lyophilise pour obtenir 5,0 mg d'un enzyme purifié (masse volumique 1,050 p/mg). REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation de sphingomyélinase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une bacté- rie produisant de la sphingomyélinase et appartenant au genre Streptomyces, dans un milieu et à recueillir la sphingomyélinase obtenue dans le produit de culture. 2 Procédé de préparation suivant la revendi- cation 1, caractérisé en ce que la bactérie produi- sant de la sphingomyélinase appartenant au genre Streptomyces est la souche Streptomyces sp A 9107.