Brevet FR2519023A1 — publié le 19830701

La présente invention est relative à un procédé microbiologique pour préparer des bouillons de fermentation qui contiennent soit pratiquement uniquement de la nébra- mycine-5 ', soit un mélange de nébramycine-2 et de nébramycine- 5 ' selon un rapport quelconque désiré préétabli et de la nébramycine-4. I 1 est connu que la nébramycine, un mélange comple- xe de plusieurs antibiotiques, est un métabolite biosynthé- tique de Streptomyces tenebrarius (Stark, Hoehn and Knox, Antimicrobial, Agents and Chemotherapy, 1967, p 314; brevet britannique N 1 178 489 et brevet U S N 3 691 279). Le mélange antibiotique est composé, à côté de plusieurs facteurs mineurs, des principaux composants suivants: nebramycine-2 (apramycine); nébramycine-4 ( 6 "-O-carbamoyl- kanamycine B), et nébramycine-5 ' ( 6 "-O-carbamoyl-tobramy- cine) (Koch, Davis and Rhoades, J Antibiotics 26, 745, 1973) Dans le brevet U S N 3 853 709 on décrit un micro- organisme produisant de la nébramycine-7 en plus de la nébramycine-2 Les auteurs japonais dans le brevet US. N 4 032 404, coproduisent de la nébramycine-2 et de la nébramycine-5 ' en cultivant du Streptoalloteichus hindus- tanus Selon le brevet hongrois N 176 103, les Streptomyces tenebrarius MNG 169 et 170, cultivés dans des conditions submergées et aérées, produisent des bouillons de fermenta- tion contenant soit de la nébramycine-2; de la nébramycine-5 ' et de la nébramycine-4, soit de la nébramycine-2 et de la nébramycine-5 ', respectivement; Ces antibiotiques sont isolés selon la technique décrite dans le brevet hongrois N 174 315. La nébramycine-2 inhibe la croissance de micro- organismes phytopatogènes et zoopathogènes (brevets U S. N 3 691 279, 3 853 709 et 3 876 763, tandis que la kanamycine B, obtenue par hydrolyse de la nébramycine-4 et la tobramycine (Brulamycine), obtenue par l'hydrolyse de la nébramycine-5 ', sont toutes deux des antibiotiques industriels à large spectre, jouant un grand rôle en théra- pie humaine pour le traitement d'infection provoquée par des bactéries polyrésistantes (par exemple Prestonand Wick, Ar.timicrobial Agents and Chemotherapy 1970, p 322). En appliquant le procédé décrit dans le brevet hongrois N 176 106, on obtient un mélange antibiotique ayant la composition suivante tableau I): Tableau 1 Souche Nébramycine-2 Nébramycine-4 Nébramycine-5 ' MNG 169 77 2 21 MNG 170 91 traces 9 # Déposée le 28 DECEIBRE 1977 à la National Collection of Microorganisms, National Institute for Public Health, Budapest et accessible au public depuis le 28 Février 1980. {* Déposée le 5 avril 1978 dans la même collection; accessi- ble au public depuis le 28 Février 1980. Il est apparent que la nébramycine-2 constitue le principal produit de la biosynthèse dans les deux souches, tandis que la nébramycine-5 ' doit être séparée des autres composants prédominants au prix d'une procédure hautement sophistiquée et coûteuse. La composition d'un complexe antibiotique, biosyn- thétisé par un microorganisme est déterminée principalement par l'ensemble des informations génétiques cellulaires et seulement en une mesure beaucoup plus faible, par les condi- tions de fermentation. Dans les procédés connus jusqu'à maintenant, le rapport des composants dans le bouillon de fermentation ne peut pas être modifié conformément aux nécessités industriel- les réelles De plus, si la production de nébramycine-5 ' est requise, celle-ci doit être séparée de la nébramycine-2 prédominante par des procédures extrêmement coateuses Avec de tels svstèmes à multicom Dosants, l'avaluation des expé- riences de sélection des souches qui tendent à accroître la productivité de la souche, demande plutôt beaucoup dé travail et de temps Après séparation chromatographique sur couche mince, chaque composant est déterminé en quantité, séparément par un titrage biologique Il serait avantageux d'effectuer ces sélections de souches avec un système à un comnosant permettant des procédures de titrage simples De plus, l'augmentation de productivité dans une souche bio- svnthétisant un antibiotique unique, est plus prometteuse, muisaue dans ce cas, les cellules peuvent utiliser leur capacité biosynthétique entière pour former un seul composé. La présente invention a pour but de développer un procédé de fermentation simple et nouveau, pour préparer des bouillons de fermentation qui contiennent, soit uniquement de la nébramycine-5 ', soit un mélange de nébramycine-2 et de nébramvcine-5 ' selon un rapport quelconque désiré préétabli. La Demanderesse a constaté avec surprise que le Streptomyces tenebrarius MNG 169, traité avec du bromure d'éthi- dium (bromure de 2,7-diamino-10-éthyl-phénvl-phénanthridinium) fournit une souche mutante qui ne produit pas de nébramycine- 2, mais donne de la nébramycine-5 ' à titre de principal composant à côté de traces de nébramycine-4 Ce phénomène est plutôt inattendu et surprenant dans la mesure o, jusqu'à maintenant, le bromure d'éthidium n'avait pas du tout été appliqué à titre d'agent mutagène. Pour réaliser l'isolation d'une souche mutante bio- synthétisant un complexe antibiotique présentant un rapport de composants modifié, on cultive les spores du Streptomyces tenebrarius MNG 169 dans un milieu nutritif liquide La culture développée est divisée en cinq parties et des quantités de O; 0,05; 0,5; 5,0 et 50,0 pq/lk de bromure d'éthédium sont resnectivement ajoutées La culture est poursuivie pendant 24 heures, puis une portion de la culture est étalée sur de l'agar en botte après dilution, tandis que l'autre portion sert à inoculer des milieux liquides contenant des quantités égales de bromure d'éthidium et leur culture est poursuivie pendant 24 heures supplémentaires Ensuite, la procédure ci-dessus de dépôt sur de l'agar en boite et d'inoculation est répétée Les nouvelles cultures liquides obtenues sont remises sur de l'agar à nouveau après 24 heures, les bottes d'agar sont incubées, certaines colonies distinctes sont isolées et leur productivité est évaluée selon une procédure décrite dans les exemples. A partir de plusieurs centaines d'isolats prove- nant du Streptomyces tenebrarius MNG 169, deux souches mutantes ne réussissent pas à produire de la nébramycine-2, mais produisent des quantités relativement petites de nébramy- cine-5 ' et des traces de nébramycine-4 Pour améliorer la productivité de ces deux souches mutantes produisant de la nébramycine-5 ', on effectue des expériences de sélection de souches et d'optimisation du milieu Au cours de celles-ci, une mutante est perdue, tandis que la capacité de production de la seconde augmente d'un facteur cinq et peut être main- tenue à ce niveau Cette souche a été déposée le 2 septembre 1981 à la National Collection of Microorganisms (National Institute for Public Health, Budapest, Hongrie), o le numéro matricule MNG 204 lui a été attribué De plus, la présente invention est relative à un procédé pour préparer des bouillons de fermentation contenant un mélange de nébramycine-2 et de nébramycine-5 selon un rapport quelconque désiré préétabli, par mélange des spores ou de mycéliums végétatifs de la souc In Streptomyces tene- brarius MNG 169 d'origine et de ceux de la souche Streptomyces tenebrarium 204 ne produisant pas de nébramycine-2, selon un rapport requis, puis culture de ceux-ci dans une culture mixte On a constaté avec surprise, qu'au cours de cette fermentation effectuée avec une culture mixte, les deux souches produisent de plus fortes quantités d'antibiotiques que dans des fermentations dans lesquelles chaque souche est cultivée séparément. A partir de ces données, l'invention est relative à un procédé pour préparer des bouillons de fermentation qui contiennent, soit pratiquement uniquement de la nébramycine-5 ', soit un mélange de nébramycine-2 et de nébramycine-5 ', selon un rapport quelconque désiré Dréétabli et de nébramycine-4 Conformément au procédé de la nrésente invention: a) pour préparer des bouillons de fermentation contenant pratiquement uniquement de la nébramycine-5 ', on utilise la souche MNG 204 de Streptomyces tenerarius, ou b) pour préparer des bouillons de fermentation qui contiennent de la nébramycine-2 et de la nébramycine-5 ' en un rapport quelconque désiré préétabli et de la nébramy- cipe-4, on utilise les spores ou des mycéliums végétatifs d'un Streptomyces tenebrarius quelconque produisant un complexe de nébramycine, de préférence la souche MNG 169 et ceux d'un quelconque Streptomyces tenebrarius produisant pratiquement uniquement dé la nébramycine-5 ', de préférence la souche MNG 204 et on les mélange selon un rapport requis puis, on les cultive dans un milieu contenant des sources d'azote et de carbone organiques, des sels minéraux, des oligoéléments, des huiles et/ou des graisses d'origine animale et/ou végétale dans une culture submergée, aérée à 33 40 C, de préférence à 37 C. Conformément à un procédé préféré de la présente invention, la production des bouillons de fermentation contenant de la nébramycine-5 ' à côté de traces de nébra- mycine-4, est effectuée par la culture de la souche de Streptomyces tenebrarius MNG 204 ou d'une de ses souches mutantes, variantes ou de recombinaison Au cours de la fermentation, 10 à 180 pg/ml de nébramycine4 s'accumulent dans le bouillon de fermentation à côté de 2100 à 2600 pg/ ml de nébramycine-5 ', en fonction des conditions de culture. La nébramycine-5 ' est isolée du bouillon de fermentation et séparée de la nébramycine-4 et de diverses impuretés au cours d'une seule étape de chromatographie, puis elle est hydrolysée en tobramycine selon des méthodes connues. en elles-mêmes Eventuellement, la nébramycine-5 ' peut être convertie en tobramycine déjà dans la culture et isolée ensuite de celle-ci. Conformément à une autre procédé préféré de la présente invention pour produire des bouillons de fermen- tation contenant à côté de la nébramycine-4, un mélange de nébramycine-2 et de nébramycine-5 ' selon un rapport quel- conque désiré préétabli, les spores et les mycéliums végé- tatifs de Streptomyces tenebrarius MNG 169 et ceux de Streptomyces ténébrarius MNG 204 sont mélangés en un rapport requis et cultivés dans une culture mixte Les antibio- tiques produits sont isolés selon des méthodes connues en elles-mêmes, de préférence conformément à la méthode décrite dans le brevet hongrois No 174 315 Le rapport de la quantité de nébramycine-2 et de nébramycine-5 ' bio- synthétisées est à peu près proportionnel aux nombres de cellules des souches de Streptomyces tenebrarius MNG 169 et MNG 204, mélangées à des phases identiques de dévelop- pement. Il est évident pour le spécialiste, que les considérations cidessus ne sont valables que dans des systèmes de fermentation dans lesquels les cellules mélan- gées prolifèrent à des vitesses pratiquement identiques et o les conditions de fermentation sont favorables à la biosynthèse des deux composants Autrement, le rapport peut être déplacé dans l'une ou l'autre direction Pour un spé- cialiste, la détermination du rapport de mélange ne pose aucun problème. Conformément à la présente invention, les micro- organismes sont cultivés dans un milieu nutritif contenant une source organique de carbone, c'est-à-dire de l'amidon, du glycérol, du fructose ou d'autres composés analogues, de préférence du glucose; une source organique d'azote, c'est-à-dire de la farine de noix, de la liqueur de macé- ration de blé, de la peptone, de l'extrait de levure ou autres préparations similaires, de préférence de la farine de soja ou de la caséine, des aminoacides, de préférence l'acide glutamique; une source minérale d'azote, de préférence du chlorure d'ammonium, du nitrate d'ammonium ou du sulfate d'ammonium; des sels minéraux, de préférence le sulfate de magnésium, le sulfate de zinc, le nitrate de cobalt ou le carbonate de calcium; des huiles et/ou graisses d'origine animale et/ou végétale, c'est-à-dire huile de palme, l'huile de lin, l'huile de tournesol, l'huile de colza, la graisse de porc ou autres, de préfé- rence un mélange 1:1 d'huile de palme et d'huile de lin et de plus, des oligoéléments essentiels à la croissance du microorganisme dans des conditions de fermentation submergée et aérée, à une température assurant le dévelop- pement du microorganisme, de préférence entre 330 et 40 'C jusqu'à ce que d'importantes quantités d'antibiotiques se soient accumulées Les antibiotiques sont isolés selon des méthodes connues en elles-mêmes. Les digoéléments peuvent, soit être présents sous forme d'impuretés dans d'autres ingrédients nutritifs du milieu, soit être ajoutés séparément au milieu. L'intensité du courant d'air est régulée en fonction de la composition du milieu, du rendement du rotor de ventilation et d'autres caractéristiques techniques du fermentateur Il est généralement avantageux de contrôler l'entrée d'oxygène, qui assure que la teneur en C 02 du mélange gazeux sortant'ne dépasse pas 1,0 % et que la teneur en sucre réducteur devienne nulle entre la 96 ème et la l Oème heure dans le milieu. La stérilisation du milieu par la vapeur est effectuée entre 121 et 1230 C pendant 30 à 60 minutes Le p H du milieu est de préférence ajusté entre 7,2 et 7,4 avant stérilisation. Au cours de la fermentation, aucun agent antimousse n'est ajouté dans la mesure o les huiles et/ou les graisses d'origine animale et/ou végétale, ajoutées à titre d'éléments nutritifs dans le milieu, peuvent simultanément empêcher la formationde mousse dans le milieu. La culture elle-ibême peut être réalisée dans des flacons secoueurs, des cuves de fermentation de laboratoire, d'usine-pilote ou industrielles - La composition antibiotique des cultures est titrée par une bioautographie suivant une chromatographie sur couche mince sur gel de silice Des quantités de 0,1 à 0,5 pg/ml du complexe antibiotique sont déposées sur les plaques en couche mince de gel de silice (Merck, Darmstadt) et soumises à une chromatographie dans un système composé d'êthanol-méthyléthvlcétone-hydroxyde d'ammonium à 25 % selon un rapport de 1:1:1 Après un séchage soigneux, un milieu contenant du Bacillus subtilés ATCC 6633 est étalé sur la surface de la plaque et incubé à 370 C pendant 16 heures. La dimension des zones d'inhibition est ensuite comparée à celle des zones observées sur des témoins Cette procédure est convenable pour un titrage qualit tif et quantitatif, l'écart standard étant de + 10 %. Les principaux avantages offerts par le procédé conforme à la présente invention, sont les suivants: La souche de Streptomyces tenebrarius MNG 204, produisant pratiquement un seul composant, fournit des niveaux antibiotiques supérieurs à ceux que donne la souche apparentée précédente Des travaux de sélection supplémentaires qui peuvent être réalisés sur cette nouvelle souche, promettent un succès rapide, dans la mesure o cette souche pourrait être libre d'utiliser toute sa capacité de biosynthèse pour former un composant antibiotique unique Le titrage biolo- gique de ces bouillons de fermentation contenant un seul composant antibiotique est rapide, simple et exact, l'isolation de l'antibiotique ne nécessite pas de procédures de purification conteuses En mélangeant les cellules des deux souches différentes et en les cultivant dans une culture mixte, on peut produire des bouillons de fermentation contenant de la nébramycine-2 et de la nébramycine-5 ', selon un quelconque rapport désiré préétabli, en fonction des situations de coût et des besoins industriels réels De plus, on observe un avantage supplémentaire, en ce qu'au cours de cette fermen- tation mixte, aucune des souches ne perd une partie importante quelconque de sa productivité et toutes deux synthétisent un niveau global supérieur d'antibiotiques. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Exemple 1 a) Production de bouillons de fermentation contenant de la nébramycine-5 ' dans des cuves de fermentation de laboratoire. On dispose de milieux de gélose nutritive inclinée, préparée à partir d'eau distillée et ayant la composition suivante: dextrine 1,0 % extrait de levure 0,1 % hydrolysat ( 10 %)+ de caséine 2,0 % extrait de viande 0,1 % dichlorure de cobals hexahydraté 0,001 % agar 2,5 % X hydrolysé enzymatiquement Ces systèmes sont inoculés avec les spores ou des mycéliums végétatifs de Streptomyces tenebrarius MNG 204. On ajuste le p H du milieu avec une solution aqueuse d'hydro- xyde de sodium à 7,2 avant stérilisation, puis on stérilise à 121 C pendant 20 minutes. Les cultures sont incubées à 37 C pendant 4 jours, puis les spores sont enlevées de la surface du milieu par lavage avec de l'eau distillée stérile et la suspension de spores résultante est utilisée pour inoculer deux milieux de 100 ml d'inoculum, préparé avec de l'eau du robinet et stérilisé dans des Erlenmeyers de 500 ml L'inoculum présente la composition suivante: farine de soja 2,0 % hydrolysat ( 10 %) * de caséine 3,0 % nitrate d'ammonium 0,1 % chlorure d'ammonium 0,3 % carbonate de calcium 0,3 % sulfate de magnésium heptahydraté 0,5 % mélange 1:1 d'huile de palme et d'huile de lin 0,5 % glucose (stérilisé séparément sous forme d'une solution à 50 %) 2,0 % e Hydrolysé enzymatiquement Le p H du milieu est ajusté à 7,2 à l'aide d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium, puis le milieu est stérilisé à 121 C pendant 20 minutes, dans un récipient sous pression. Les cultures inoculées sont cultivées pendant 14 à 18 heures à 37 C, dans un appareil secoueur rotatif (dia- mètre 2,4 cm, 280 tpm). On utilise 20 ml de cet inoculum complètement développé pour inoculer une cuve de fermentation de labora- toire de 10 litres de volume utile, contenant 5 1 du milieu principal de fermentation, préparé à partir d'eau du robinet, stérilisé à 121 C pendant 45 minutes et ayant la composition suivante: farine de soja 3,0 % hydrolysat ( 10 %)4 de caséine 5,0 % nitrate d'ammonium 0,1 % chlorure d'ammonium 0,5 % acide L-glutamique 0,8 % sulfate de magnésium heptahydraté 0,5 % dinitrate de cobalt hexahydraté 0,001 % mélange 1:1 d'huile de palme et d'huile de lin 3,0 % glucose (stérilisé séparément sous forme d'une solution à 50 %) 4,2 % *hydrolysé enzymatiquement. Le p H est ajusté à 7,2 à l'aide d'hydroxyde d'am- monium avant stérilisation. La culture est effectuée à 37 C avec une vitesse du rotor de ventilation de 360 tpm et un débit d'air stérile de 3 litres/minute. A la 144 ème heure de culture, on titre 260 mg de nébramycine-5 ' et 9 mg de nébramycine-4 dans 100 ml de bouillon Aucune nébramycine-2 n'est détectée. D'autres milieux nutritifs, présentant une diffé- rente composition, peuvent aussi être utilisés pour la fermen- tation principale Ainsi, en procédant selon la méthode a) cn obtient des résultats analogues en utilisant le milieu suivant: Farine de soja 3,3 % Chlorure d'ammonium 0,6 % Sulfate de magnésium heptahydraté 0,7 % carbonate de calcium 0,5 % dinitrate de cobalt hexahydraté 0,001 % huile de palme 2,5 glucose (stérilisé séparément sous forme d'une solution à 50 %Y* 2,1 % * En fonction de la configuration géométrique et des acces- soires de la cuve de fermentation utilisée pour la culture et de facteurs influençant le métabolisme cellulaire, la concentration du glucose peut être accrue jusqu'à 4 %. A la 144 ème heure de culture, 100 ml de bouillon de fermentation contiennent, à part des traces de nébramycine-4 ( 3 mg pour le niveau le plus élevé), 180 mg de nébramycine-5 '. Aucune nébramycine-2 ne peut être détectée. b) Production de bouillons de fermentation conte- nant de la nébramycine-5 ' dans une cuve de fermentation de 1000 litres d'une unité pilote. Pour produire des bouillons de fermentation conte- nant de grandes quantités de nébramycine-5 ', on applique la procédure qui est décrite dans a) On inocule 100 ml du milieu d'inoculum avec les spores ou les mycéliums végétatifs de Streptomyces tenebrarius MNG 204, on cultive pendant 14 à 18 heures, puis on inocule 100 litres d'un milieu stérile d'inoculum avec cette culture et on le cultive à 37 C avec un débit d'air de 100 litres/minutes et une agitation de 360 tpm/ Apres 16 heures, 1000 litres du principal milieu de fermentation stérilisé (composition indiquée en a), sont inoculés dans une cuve de fermentation en acier inoxydable, avec 50 litres de cet inoculum La principale fermentation est effectuée à 37 C avec un débit d'air de 500 1/minute en agitant de 200 tpm Les changements de la teneur en produits antibiotiques sont indiqués dans le Tableau 2. Tableau 2 Durée de la fermer Composant Nébramycine tation (ig/ml) heures 2 4 5 ' 24 O O 50 48 O O 400 72 0 5 1200 96 O 30 1740 O 40 2320 144 O 60 2650 c) Décarbamoylation de la nébramycine-5 ' et isolation de la tobramycine. On ajoute 22 g d'hydroxyde de sodium à 3,0 1 d'un bouillon de fermentation contenant 2600 kg/ml de nébra- mycine-5 ' et 90 pg/ml de nébramycine-4; on chauffe le bouillon sous agitation constante à 90 100 C et l'on main- tient cette température pendant 25 minutes Lorsque la réac- tion est achevée, le mélange est refroidi à la température ambiante et son p H est ajusté à 2,0 avec une solution aqueuse à 50 % d'acide sulfurique, Ce bouillon de fermentation acide est additionné de 6 g d'acide oxalique sous agitation constante et son p H est ensuite ajusté à 7,0, puis le mélange est agité pendant 30 minutes supplémentaires, filtré et le mycilium est lavé deux fois avec 600 ml d'eau Le filtrat et les eaux de lavage sont réunis et la solution résultante débarassée d'ion calcium, est soumise à une chromatographie échangeuse d'ion sur une colonne préparée à partir de 200 ml d'Amberlite CG-50 (NH 4 +) (Rohm et Hass Co, Philadelphie, USA). La colonne est lavée avec 400 ml d'eau déionisée et éluée d'abord avec 1000 ml de solution d'hydroxyde d'ammonium, 0,05 N puis avec 2000 ml d'une telle solution 0,1 N et enfin, avec 3000 ml d'une solution 0,15 N d'hydroxyde d'ammonium. Au cours de l'élution, on collecte des fractions de 250 ml Les fractions 13 à 18, conttenant la tobramycine sont rassem- blées, le p H de la solution est ajusté à 7,0 avec une solution aqueuse à 50 % d'acide sulfurique et soumise à une chromato- graphie échangeuse d'ion sur 120 ml d'Amberlite CG-50 (NH 4). La colonne est lavée avec 200 ml d'eau déionisée et l'anti- biotique est élué d'abord avec 1000 ml de solution 0,05 N, puis avec 2000 ml de solution 0,1 N et 2000 ml de solution 0,15 N et enfin 2000 ml d'une solution 0,2 N d'hydroxyde d'ammonium Des fractions de 60 ml sont collectées Les frac- tions 45 à 56 sont rassemblées et évaporées sous pression réduite Le résidu, séché sur pentoxyde de phosphore, fournit un produit contenant 0, 7 g ( 70 %) de kanamycine B, 12 % de composant N-13 ( 6 '-N-carbamoyltobramycine), 10 % d'un composant inconnu et 8 % de tobramycine On évapore les fractions 57 à 58 et recueille un résidu contenant 0,2 g ( 60 %) de tobramycine, près de 40 % de kanamycine B et 0,1 à 0,2 % de composant N-13 La distillation des fractions 59 à 69 fournit 5,7 g de tobramycine contenant 0,1 à 0,15 % de composant N-13 En recristallisant cette tobramycine brute dans de l'éthanol aqueux à 96 %, on obtient 4,2 g de tobra- mycine pure. Exemple 2 Production de bouillons de fermentation contenant de la nébramycine-2 et de la nébramycine-5 ' selon un rapport préétabli. En appliquant la procédure de a) de l'exemple 1, on inocule 10 portions de 100 ml d'un milieu d'inoculement tel que décrit là-haut, avec une suspension de spores de Strep- tomyces tenebrarius MNG 204 et 10 autres portions de 100 ml du même milieu d'inoculum avec la suspension de spores du Streptomyces tenebrarius MNG 169 Les microorganismes sont cultivés selon la méthode a) de l'exemple 1, puis des portions de 100 ml d'un milieu stérilisé dans des Erlenmeyers de 500 ml et des portions de 5 litres d'un milieu principal de fermentation stérilisé dans une cuve de fermentation de 10 litres et ayant la composition indiquée dans a) de l'exemple 1 sont inoculées séparément avec les deux souches ou bien après leur mélange selon un rapport déterminé ci-après. La culture est poursuivie pendant 144 heures dans les conditions de fermentation décrites dans l'exemple 1. Ensuite, la teneur en composants antibiotiques est titrée par chromatographie sur couche mince, bioautographie consé- cutive et comparaison avec un témoin Les résultats sont rassemblée dans le tableau 3. OP 22: Ol M lui GLI lui 9 x 1 op, 091 086 lui M 1 itu 09 IIIA OCZ OO W t, 1 lui 31 lui ç L IIA M T-Z Ot O 71 3 Ira 001 lui 001 IA O 9 l o?, z OC-1 2 ila 9 L TW 9 ?, 1 A O -9 T Ot 1 Oç Oç lui 09 IIU Oç T AI Oç-il O 3 O 8 Tm foin o Nx Tu' L-l 69-1 ONN ooç_z 06 O IW 00 ? O 9 01 M II OL 8 Oi?, OOK nul OOZ 691 ONVI I UOT-4 -Qquaw 2 ad ap a An D 0 71 6 M î: uu iw "O il 091 OLIV -Lui O" t, T Eu O 'T 01 O 7, O 71 Ozl lm 91, TEU 6 0991 0101 OI -3 T-W O " T-tu O 7, 9 Otel OLI Ob' 2 2 Tw ç 'F T-LU 9 i el L 0691 O 3 Otiç Tw 9 2: lm oliç_ 9 0-19 T ORT On-V tw 9 J-E ILU llç OUI 6 l O 1 llui 0111 lui Oi 09 ?,T 5 LI O-v 9 lia 9 "O O?, '91 \zqlui 691 Dizi ç Ogi?, 09 O IW 9 -Voz ciel 71 Oli 091 Ot 1 O lui 69 i oim 1 gnooas uooe-lj TW) (Ttu) aulo Atut-aqq 4 uesodwo D Z -a UISEU 7 C XOOJDTW 1,,a Wcj TU'e Ld IOOZDTW eanq-En D sú M 9 L 0 L a lqujj 2 ZO 6 LSZ s 1 Les données du Tableau 3 montrent clairement que des bouil- lons de fermentation contenant de la nêbramycine-2 et de la nébramycine-5 ' selon un quelconque rapport préétabli désiré, peuvent être produits par application de Streptomyces tenebrarius MNG 204 et de Streptomyces tenebrarius MNG 169. Les antibiotiques peuvent être isolés des bouillons de fermentation selon la technique qui est décrite dans le brevet hongrois N O 174 315. La bioautographie des bouillons obtenus dans les cuves de fermentation I à IX est représentée dans la figure 1. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en eouvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 Procédé pour préparer des bouillons de fermenta- tion contenant soit pratiquement uniquement de la nébramycine- ', soit un mélange de nébramycine-2 et de nébramycine-5 ' selon un quelconque rapport désiré préétabli et de la nébra- mycine-4, caractérisé en ce que: a) pour préparer des bouillons de fermentation contenant pratiquement uniquement de la nébramycine-5 ' on utilise la souche MNG 204 de Streptomyces tenebrarius, ou b) pour préparer des bouillons de fermentation contenant un mélange de nébramycine-2 et de nébramycine-5 ' selon un quelconque rapport désiré préétabli, on utilise les spores ou les mycéliums d'une quelconque souche de Strepto- myces tenebrarius, produisant un complexe de nébramycine, de préférence la souche MNG 169 (déposée le 29 Décembre 1980) à la National Collection of Microorganisms, Budapest) et ceux d'une quelconque souche de Streptomyces tenebrarius produisant pratiquement uniquement de la nébramycine-5 ', de préférence la souche MNG 204 (déposée le 2 septembre 1981 à la National Collection of Microorganisms, Budapest) que l'on mélange selon le rapport requis et cultivé dans un milieu contenant des sources organiques de carbone et d'azote, des sels minéraux, des oligoé 3 éments, des huiles et/ou des graisses d'origine animale et/ou végétale, dans une culture submergée, aérée, entre 33 et 40 C et à 37 C de préférence. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source organique de carbone utilisée comprend l'amidon, du glycérol, du fructose et de préférence du clucose et que la source organique d'azote comprend la farine de noix, la liqueur de macération de blé, une peptone un extrait de levure, de préférence de la farine de sojà ou de la caséine, des amino acides, de préférence de l'acide glutamique. 3 Bouillon de fermentation contenant de la nébramycine-5 ' ou un mélange de nébramycine-2 et de nébramy- cine-5 ' selon un quelconque rapport désire préétabli et de la nébramycine-4, caractérisé en ce qu'il est préparé confor- mement au procédé décrit dans l'une quelconque des reven- dications 1 ou 2. 4 Nébramycine-5 ' ou mélange de nébramycine-2 et de nébramycine-5 ' selon un quelconque rapport désiré préétabli et de nébramycine-4, caractérisé en ce qu'ils sont préparés conformément au procédé des revendications 1 ou 2.