Brevet FR2522266A1 — publié le 19830902

La présente invention se rapporte à un nouvel agent fibrinolytiquement actif ainsi qu'à un procédé pour sa préparation Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un nouvel agent fibrinolytiquement actif extrait de versde terre ainsi qu'au procédé pour sa préparation par l'extraction des vers de terre avec un agent d'extraction aqueux. Ces dernières années, lattention est dirigée par les médecins et les pharmaciens, vers divers types de maladies dues à la coagulation du sang qui se produit - dans de nombreux cas d'adultes dans la force de l'âge et agéspdu point de vue gériatrie Plusieurs des maladies bien connues d'un tel type sont par exemple l'infarctus du myocarde, la thrombose cérébrale, le syndrome de la coagulation intravasculaire disséminée et analogues et, comme on le sait bien, on utilise, comme médicament thérapeutique dans ce cas, l'urokinase d'origine humaine et la streptokinase. Cependant, ces médicaments ne sont pas tout à fait satisfaisants à plusieurs points de vue Par exemple, l'urokinase d'origine humaine est préparée à partir d'urine humaine comme matière première, donc la fourni- ture, est limitée par la disponibilité de cette matière première en grands volumes La streptokinase est défec- tueuse du fait de son antigénécité De plus, ces médica- ments doivent être utilisés-par instillation donc le patient sous traitement souffre inévitablement de douleurs importantes. Par conséquent, il est depuis longtemps souhaitable de développer un nouvel agent fibrinolytiquement actif pouvant être utilisé comme médicament thérapeutique des maladies ci-dessus mentionnées sans les problèmes posés par les médicaments conventionnels En effet, l'un des problèmes récents en pharmacie a été de développer un nouvel agent fibrinolytiquement actif exempt des limites dues à la disponibilité de la matière première en grandes quantités et pouvant être administré au patient non pas par instillation mais par d'autres moyens, avantageusement par voie orale, sans lui faire subir de douleur:. La présente invention a par conséquent pour objet un nouvel agent fibrinolytiquement actif utile comme médicament thérapeutique pour les maladies dues à la coagulation du sang, exempt des limites de disponibilité de la matière première en grandes quantités et adapté à une administration non par instillation Avec l'objectif ci-dessus, les inventeurs ont entrepris des recherches intensives avec une grande variété de ressources naturelles pour l'ingrédient effectif souhaité et sont arrivés à la découverte que les tissus des vers de terre contiennent une telle substance à une bonne teneur, ce qui a conduit à l'accomplissement de la présente invention. Ainsi, l'agent fibrinolytiquement actif selon l'invention est un matériau extrait des vers de terre appartenant à la famille deslo mbricidées avec un agent aqueux d'extraction, de préférence avec ensuite purifica- tion et le procédé selon l'invention pour la préparation d'un tel agent fibrinolytiquement actif consiste à disperser des tissus finement broyés de vers de terre dans un agent aqueux d'extraction pour extraire l'ingré- dient efficace dans l'agent d'extraction, à séparer la solution de l'extrait contenant l'ingrédient efficace de la matière insoluble et à concentrer ou à déshydrater l'ingrédient efficace contenu dans la solution extraite. Le concentré ou matière déshydratée ci-dessus obtenu est, bien que toujours à l'état brut, efficace tel quel mais il est préférable que le produit brut soit encore purifié par un moyen approprié comme une adsorption, une précipitation fractionnée avec un solvant organique polaire, un dessalement, une ultrafiltration, une chromatographie par échange d'ions, une filtration sur gel, une chromatographie par affinité, une chromatographie hydrophobe et analogues. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaitront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels: la figure 1 est un graphique illustrant la condition de la séparation de l'ingrédient fibrinolytique- ment actif selon l'invention dans la focalisation iso- électrique, le nombre de fractions étant indiqué sur l'axe des abscisses (chacune de 2,5 ml de volume), en a en ordonnées est indiquée l'activité fibrinolytique, mm 2 avant dialyse (courbe III)et après dialyse (courbe IV), en b est indiquée la densité optique à 750 nm (courbe II) et en c est indiqué le p H (courbe I) la figure 2 est un graphique illustrant les augmentations de l'activité fibrinolytique de sang périphérique de trois patients souffrant d'hypertension, le temps après administration orale, en heures, étant indiqué sur l'axe des abscisses et l'activité fibrinolytique en fractions d'erglobuline, en mm étant indiquée sur l'axe des ordonnées; la figure 3 montre l'activité fibrinolytique et la densité optique des fractions obtenues dans le fraction- nement par chromatographie en colonne de l'extrait de ver de terre de l'exemple 14, le nombre de fractions (chacune de 20 ml de volume) étant indiqué sur l'axe des abscisses, l'activité fibrinolytique, mm 2/l pl (courbe I) en a la densité optique à 280 nm (courbe II) en b et la conductivité, en m S (courbe III) en c; et les figures 4 a et 4 b montrent le temps de dissolution denglobuline et l'activité fibrinolytique, respectivement, sur l'axe des ordonnées, en fonction du temps après administration orale, sur l'axe des abscisses, respectivement, du sang périphérique d'hommes ayant reçu une administration orale des agents fibrinolytiquement actifs obtenus à l'exemple 14, en un certain temps (voir exemple 16). Comme on le sait, les vers de terre appartenant à la famille des lombricidées ont été utilisés depuis des temps immémoriaux, dans les pays orientauxcomme sorte de médicament légendaire pour un diurétique anodin et anti- pyrétique Cependant, rien n'est révélé ou suggéré dans les littératures selon l'art antérieur concernant la possibilité que les tissus des vers de terre puissent conteniru ioertainingrédient fibrinolytiquement actif capable de présenter l'effet souhaité d'augmenter l'acti- vité fibrinolytique du sang périphérique de l'homme lorsqu'il est administré à un patient, en particulier, par voie orale Par conséquent, il a été tout à fait inattendu que le matériau extrait des vers de terre avec un agent d'extraction aqueux puisse présenter une telle activité fibrinolytique. Dans ce qui suit, on décrira en détail le processus de préparation de l'agent fibrinolytiquement actif à partir de vers de terre. La matière première est obtenu des tissus des vers de terre et des corps frais de vers de terre vivants et les corps des vers de terre d'o les entrailles ont été retirées ainsi que les entrailles elles-mêmes sont tous appropriés comme matière première La sorte zoologique des vers de terre n'est pas particulièrement limitative dans la famille des lombricidées et des vers de terre de toute sorte sont sensiblement également appropriés compre- nant, par exemple, Lumbricus rubellus, Lumbricus terrestris, Eisenia foetida et analogues Les corps des vers de terre sont utilisés comme homogénat en les broyant finement. Il est facile que les tissus des vers de terre soient séchés à l'avance en les chauffant, en les séchant sous videouenles lyophilisant pour être ensuite pulvérisés en une poudre fine que l'on peut utiliser telle quelle ou après avoie été dégraissée La matière première tout à fait préférée est une poudre lyophilisée de tissus frais de vers de terre avec ou sans dégraissage. L'agent d'extraction aqueux, avec lequel les tissus finement broyés de vers de terre sont extraits, doit avoir un p H compris entre 5 et 10 ou de préférence entre 6 et 8 L'agent d'extraction aqueux approprié dans ce but n'est pas limité à l'eau pure mais peut comprendre des solutions salines physiologiques, des solutions tampons et des solutions préparées de sel ci-dessous mentionnées, qui peuvent de plus contenir une petite quantité d'un solvant organique polaire miscible avec l'eau comme l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, l'alcool propylique, l'acétone, le diéthyl éther, le dioxane et analogues Les agents d'extraction aqueux tout à fait préférés sont les solutions salines physio- logiques et les solutions tampons ayant un p H de 5 à 10 ou de préférence de 6 à 8 Des solutions de tampons de phosphate, d'acétate, de borate, de citrate et d'acide tris/chlorhydrique sont également appropriées La solution de sel préparée ci-dessus est une solution aqueuse diluée préparée avec mélange d'un acide organique ou inorganique soluble dans l'eau comme de l'acide chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, lactique, citrique et succinique et un alcali comme des hydroxydes et carbonates d'un métal alcalin et d'ammoniaque pour avoir un p H de 5 à 10 ou de préférence de 6 à 8 La proportion appropriée de l'agent d'extraction aqueux par rapport à la matière première est comprise entre 1 et 100 fois en poids ou de préférence entre 5 et 30 fois en poids en se basant sur le poids sec de la matière première L'extrac- tion est accomplie à une température ne dépassant pas 600 C ou de préférence, entre 5 et 400 C pendant un temps suffisant pouvant atteindre 500 jours ou de préférence de 30 minutes à environ 30 jours. L'extraction des tissus finement broyés de vers de terre avec l'agent d'extraction aqueux est accomplie en agitant ou en secouant le mélange en bouillie ou en faisant passer l'agent d'extraction aqueux à travers un lit de la matière première en poudre Il est préférable que les tissus de vers de terre soient homogénéisés en utilisant un homogénéiseur, mélangeur, désintégrateur à ultrasons, destructeur de cellules sous pression, broyeur ou analogue en un homogénat, c'est-à-dire dans une suspension aqueuse des constituants des cellules afin de détruire les cellules des tissus des vers de terre avant que le mélange aqueux en bouillie ne soit inçubé pour effectuer l'extraction. Quand l'extraction des ingrédients efficaces dans les tissus des vers de terre est accomplie, le mélange aqueux en bouillie est filtré et le filtrat limpide, c'est-à-dire la solution de l'extrait est éventuellement combiné aux produits de lavage du résidu dans la filtra- tion ci-dessus et maintenu pendant un temps approprié à une température appropriée,concentré par une méthode connue appropriée comme une évaporation avec chauffage sous pression réduite et/ouuaeultrafiltration ou déshydraté par évaporation du solvant aqueux sous pression réduite ou par lyophilisation en un matériau solide Il est préférable qu'une petite quantité d'un antiseptique ou conservateur soit ajoutée au mélange aqueux en bouillie des tissus de vers de terre en incubation ou bien à la solution de l'extrait aqueux pendant le traitement de concentration ou de déshydratation Pour empêcher la dénaturation, l'addition du solvant organique polaire ci-dessus mentionné dans l'agent d'extraction aqueux est efficace en plus de l'effet d'améliorer ou d'accélérer l'extraction des ingrédients sefficaces La concentration du solvant organique dans l'agent d'extraction aqueux doit être déterminée selon la sorte du solvant et d'autres paramètres bien que la concentration du solvant organique ne doive pas dépasser 50 % en volume dans l'agent d'extraction aqueux. La solution de l'extrait aqueux ci-dessus obtenue avec ensuite concentration ou déshydratation contient les ingrédients fibrinolytiquement actifs souhaités à l'état brut, donc leur purification doit de préférence suivre. La purification ou fractionnement des ingrédients efficaces est entreprise avec la solution aqueuse concentrée de l'extrait telle quelle ou avec le matériau déshydraté tel que dissous dans un petit volume d'eau Le procédé de purification peut être un procédé conventionnel de purifi- cation pour des substances polymériques en général On donnera ci-après une description de plusieurs méthodes de purification ou de fractionnement des ingrédients fibrinolytiquement actifs obtenus ci-dessus. Les méthodes pouvant s'appliquer à la purification ou au fractionnement des ingrédients efficaces à un état brut comme dans une solution aqueuse comprennent des traitements en utilisant un agent adsorbant ou un solvant organique polaire, un dessalement, une ultrafiltration, une chromato- graphie par échange d'ions, une filtration sur gel, une chromatographie par affinité, une chromatographie hydrophobe et analogues Chacune des méthodes ci-dessus peut être suffisante dans certains cas mais il est habituel d'en utiliser deux ou plus en combinaison dans un ordre approprié pour retirer les impuretés non souhaitables. L'agent adsorbant utilisable ici est représenté par le charbon de bois activé, l'argile acide, l'argile activée et un agent adsorbant à base de résine synthétique, par exemple vendu sous la dénomination commerciale Amberlite XAD Le solvant organique polaire utilisé pour la précipitation fractionnée des ingrédients effectifs est représenté par l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, l'alcool propylique, l'acétone, le diéthyl éther, le dioxane et analogues, parmi lesquels on préfère l'alcool éthylique, l'acétone et l'alcool propylique. Le sel approprié pour le dessalement est repré- senté par le sulfate d'ammonium, le sulfate de sodium, le sulfate de magnésium, le phosphate de potassium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le citrate de sodium et analogues, parmi lesquels on préfère le sulfate d'ammonium L'échangeur d'ions approprié pour la chromatographie par échange d'ions est représenté par ceux basés sur les polysaccharides hydrophiles comme la cellulose, le dextrane, l'agarose et analogues, parmi lesquels on préfère la diéthylaminoéthylcellulose (appelée ci-après DEAE-cellulose), la triéthylaminoéthylcellulose (appelée ci-après TEAE-cellulose), 1 'aminoéthylcellulose (appelée ci- après AE-cellulose), la carboxyméthylcellulose (appelée ci-après CM- cellulose), la phosphocellulose (appelée ci-après P-cellulose), la phosphométhylcellulose (appelée ci-après PPM-cellulose), la diéthylaminoéthyl- cellulofine (appelée ci-après DEAE-cellulofine) et analogues. La chromatographie par échange d'ions peut être effectuée également en utilisant une résine échangeuse d'ions conventionnelle comprenant des résines échangeuses de cations faiblement acides comme celles vendues sous les dénominations commerciales Amberlite IRC-50, Amberlite IRC-75, Amberlite IRC-84, Dowex CCR-2 et analogues et des résines échangeuses d'anions faiblement basiques comme celles vendues sous les dénominations commerciales Amberlite IR-4 B, Amberlite IR-45, Amberlite IRA-400, Dowex 3 et analogues. La filtration sur gel peut être accomplie en utilisant ceux vendus sous les dénominations commerciales de Sephadex, Sephalose, Biogel, Toyopearl Ultragel, Cellulofine et analogues La phase stationnaire utilisée dans la chromatographie par affinité peut être formée de divers agents adsorbants comme Sephalose et Toyopearl comme véhicule Par ailleurs, la chromatographie hydro- phobe peut être effectuée en utilisant un agent adsorbant tel que ceux avec un polysaccharide hydrophile, comme agarose et cellulose en tant que base o des groupes hydrophobes ont été introduits en utilisant un composé aliphatique, alicyclique ou aromatique ayant de 2 à atomes de carbone dans une molécule et ayant un groupe amino. Les schémas 1 à 16 qui suivent donnent plusieurs exemples préférables des processus du procédé selon l'invention donnéssous la forme d'un organigramme. Schéma 1 combinaison de la solution de l'extrait e- des produits de lavage séchage sous vide> par lyophilisation ou éclair Schéma 2 agent d'extraction aqueux à p H 6-8 combinaison de la - solution de l'extrait et des produits de lavage agent d'extr, aqueux à p H 6 il Schéma -3 solvan organique polaire Schéma 4 substance úfibrinolytiu puiie Schéma 5 Schéma 6 Schéma 8 Schéma 7 substance fibrinolytique brute déshydratée du schéma 1 ou 2 solvant organique polaire échange d'ions et/ou filtratic sur gel / Schéma 9 màa-tériau fractionné du schéma 7 ou 8 ichroma ographiel 1-arafni-it I Schéma 10 substance f ibrinolytiqu purifiée Schéma 11 Schéma 12 solution concentrée du schéma 1 ou 2 décoloration adsorption avec un agent adsorbant synthétique ubstance ibrinolytiqu urifiée Schéma 13 Schéma 14 substance fibrinolytique brute déshydratée du schéma 1 ou 2 substance fibrinolytique brute déshydratée du schéma 1 ou 2 Sch 6 ma 15 S Lchéma 16 solvantr organique substance fibrinolytiqu purifiée On décrira ci-après un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention pour la préparation d'un agent fibrinolytiquement actif à partir de vers de terredonné en plus de détail, ainsi que la caractérisa- tion des produits ainsi obtenus. I Préparation des agents fibrinolytiquement actifs Une poudre dégraissée de vers de terre lyophilisés est dispersée dans 10 fois en poids une solution d'un tampon de phosphate à 50 m M ayant un p H de 7,0 et est soumise à une incubation à 37 C pendant 200 heures pour extraire les ingrédients fibrinolytiquement actifs dans la phase aqueuse La solution aqueuse de l'extrait est concentrée par ultrafiltration et la solution extraite concentrée est mélangée à un volume suffisant d'alcool éthylique pour précipiter par fractions, les ingrédients efficaces Les précipités sont dissous dans de l'eau distillée et fractionnés en utilisant de la DEAEcellulose en trois fractions fibrinolytiquement activeappelées ci-après F-I, F-II et F-III, respectivement. Chacune des fractions F-I et F-II est soumise à un dessalement avec du sulfate d'ammonium avec ensuite traitement avec Sephadex G-75 et lyophilisation de la fraction active La troisième fraction F-III est soumise à un dessalement tel quelle avec ensuite lyophilisation pour donner un produit purifié. II Propriétés caractéristiques communes aux fractions F-I à F-I It et procédé de détermination de l'activité ( 1) Activite: chacune d'entre elles a une activité pour solubiliser la fibrine. ( 2) Spécificité du substrat: chacune d'entre elles a une forte activité pour décomposer la fibrine. ( 3) p H optimal et p H de stabilisation: le p H optimal de la substance fibrinolytique est de l'ordre de 8-10 tandis que le p H de stabilisation est de l'ordre de 5-10. ( 4) Détermination de l'activité: le fibrinogène est dissous dans une solution de tampon de borate à 0,17 M ayant un p H de 7,8 et contenant 0, 01 M de chlorure de sodium à une concentration telle que la concentration de la protéine coagulable soit de 0,15 % en poids et on prend 10 ml de la solution dans une coupelle en verre stérilisée de 80 mm de diamètre avec un mélange de 0,5 ml d'une solution à 20 unités/ml de thrombine avec ensuite repos pendant I heure à la température ambiante avec la coupelle couverte. L'essai de la plaque standard de fibrine est accompli en faisant tomber 0, 03 ml de la solution d'essai ci-dessus préparée sur une plaque standard de fibrine préparée avec 10 ml d'une solution à 0,15 % de fibrinogène et, après avoir maintenu pendant 10 minutes avec un papier filtre inséré sous le couvercle de verre, en la plaçant dans un thermostat à 37 C pour y être maintenue pendant 18 heures pour effectuer la réaction L'activité fibrinolytique est exprimée par le produit en mm des longueurs des axes majeur et mineur de la surface sur la plaque de fibrine standard formée par dissolution. ( 5) Stabilité: au moins 92 % de l'activité résiduelle sont obtenus avec les ingrédients fibrinolytiquement actifs selon l'invention dans une solution aqueuse ayant un p H de 7,5 ou 9,0 au bout de 30 minutes à 50 C. ( 6) Inhibiteurs: l'activité de la substance fibrinolytique est inhibée par l'aprotinine (Trasylol, produit de Baeyer Co), l'acide tranexamique (Transamine, produit de Dai-ichi Seiyaku Co) et l'inhibiteur de la trypsine du soja (commercialisé par Miles Laboratories, Inc) et le sérum. ( 7) Activité fibrinolytique: l'agent fibrinolyti- quement actif selon l'invention a une activité de l'activa- tion du plasminogène, donc la fibrine est solubilisée indirectement en plus de la réaction directe de celle-ci pour effectuer la solubilisation Par ailleurs, une activité semblable est également présentée par une solution d'extrait préparée par incubation à 37 C pendant Jours d'un homogénat de 300 g de poudre lyophilisée de tissus de vers de terre dans 3 litres d'une solution saline physiologique ou bien le matériau lyophilisé de la solution de l'extrait. Dans une focalisationiso-électrique entreprise avec une solution d'extrait obtenue à la façon ci-dessus décrite après filtration, la courbe de gradient de p H et la courbe de densité optique à 750 nm en utilisant le réactif de cuivre-Folin des fractions chacune dans un volume de 2,5 ml sont comme représentées sur la figure 1 par les courbes I et II, respectivement Ces résultats indiquent la présence de substances protéinées ou quasi- protéinées ayant les points iso-électriques aux valeurs du p H de 1,5, 3,4 et 5,6. La figure 1 montre également les résultats de la détermination de l'activité fibrinolytique des fractions dans la focalisation isoélectrique de la solution de l'extrait ci-dessus obtenue telle que filtrée ou après dialyse par les courbes III et IV, respectivement Ces résultats indiquent la présence d'une substance très fibrinolytique dans les fractions de la solution de l'extrait sans dialyse à ou près du point iso-électrique à p H 3,4 et la présence de substances fibrinolytiquement actives ayant une activité quelque peu plus faible que ci-dessus dans les fractions obtenues à ou près des points iso-électriques de p H 1,5 et p H 4,0 Contrairement à cela, les fractions obtenues à ou près dupoint iso- électrique de p H 5,6 n'ont pas d'activité fibrinolytique. Par ailleurs, la dialyse de la solution de l'extrait a un effet pour retirer la substance fibrinolytiquement active apparaissant dans les fractions de la solution de l'extrait avant la dialyse à ou près du point iso- électrique de p H 1,5 tandis que l'activité des fractions obtenues à ou près du point iso-électrique de p H 3,4 est conservée même après la dialyse Ainsi, on peut conclure des résultats de la figure 1 que l'ingrédient actif a un point iso-électrique à environ p H 3,4 tandis que la substance ayant un point iso-électrique de l'ordre de p H 5,6 n'est pas en rapport avec l'activité fibrinolytique du matériau extrait de vers de terre. III Essai d'activité in vivo de la substance fibrinolytique selon l'invention Dans l'utilisation de l'agent fibrinolytiquement actif selon l'invention comme médicament thérapeutique pour un patient humain par administration orale, les produits bruts ou partiellement purifiés en tout stade intermédiaire de purification dans les schémas indiqués ci- dessus pour la purification peuvent être utilisés mais il est inutile de dire que le produit final très purifié est la formé tout à fait préférable par le fait qu'il présente une efficacité tout à fait excellente en tant que médicament thérapeutique par administration orale. Le produit purifié obtenu à l'exemple 1 qui suit a été administré par voie orale à trois patients mâles de , 73 et 59 ans, souffrantdlartériosclérose, chacun à une dose de 600 mg sous forme lyophilisée, et le sang périphérique de chaque patient a été prélevé périodiquement à des intervalles d'une heure, pour lesquels l'activité fibrinolytique dans 1 mm 2 a été examinée par le fraction- nement &'erglobuline pour donner les résultats indiqués à la figure 2 par les courbes I, II et III pour les trois patients ci-dessus, respectivement Les cercles blancs et les cercles noirs sur chacune des courbes correspondent à une solubilisation complète et incomplète de la fibrine respectivement La conclusion dérivée de ces résultats est que l'activité fibrinolytique dans le sans périphérique commence à augmenter 2 heures après administration pour atteindre la valeur maximum 4 à 6 heures après adminis- tration de l'agent fibrinolytiquement actif selon l'invention. Exemple 1 Une bouillie aqueuse de 1 kg de tissus lyophilisés et finement pulvérulents de vers de terre de l'espèce Lumbricus rubellus, après dégraissage à l'acétone, dispersés dans 10 litres d'une solution à 50 m M de tampons de phosphate à un p H de 7,0, a été agitée pendant heures à 370 C pour effectuer l'extraction des ingré- dients solubles dans l'eau avec ensuite filtration Le résidu de la filtration a été lavé avec 3 litres de la même solution de tamporset les produits de lavage ont été combinés au filtrat pour donner un volume total de 12,8 litres d'une solution d'extrait limpide L'activité fibrinolytique de cette solution d'extrait était de 490 mm 2/ml après une dilution à 10 fois avec de l'eau distillée. La solution d'extrait ci- dessus obtenue a été concentrée par ultrafiltration pour donner un volume de 1,75 litres de la solution d'extrait concentréeayant une activité fibrinolytique de 550 mm 2/ml après une dilution à 60 fois Les ingrédients efficaces contenus dans cette solution d'extrait concentrée ont été précipités par fractionnement, en ajoutant d'abord 1,75 litres d'alcool éthylique à la solution d'extrait puis en ajoutant 7,0 litres d'alcool éthylique au filtrat de la précipitation de la première dtape Les précipités recueillis à la précipitation en deux étapes ci-dessus ont été combinés et dissous dans 1,1 litres de la même solution de tampons La solution ainsi obtenue avait une activité fibrinolytique de 694 mm/ml après une dilution à 60 fois La solution a encore été soumise à un fractionnement chromatographique en utilisant DEAE- Sephalose (produit de Pharmacia Co) en trois fractions de F-I, F-II et FIII Chacune des fractions F-I et F-II a été soumise à un dessalement par saturation à 60 % avec du sulfate d'ammonium avec ensuite traitement avec Sephadex G-75 et lyophilisation pour donner 625 mg d'un matériau pulvérulent déshydraté ayant une activité fibrinolytique de 12 300 mm 2/mg et 665 mg d'un matériau pulvérulent ayant une activité fibrinolytique de 10.700 mm 2/mg, à partir des fractions F-I et F-II, respectivement La troisième fraction F-III a été lyophilisée, après dessalement et concentration, pour donner 1 200 mg d'un matériau pulvérulent ayant une activité fibrinolytique de 11 500 mé /mg. Exemple 2 Des vers de terre vivants de la même espèce qu'à l'exemple 1, pesant 84 g ont été ajoutés à une solution saline physiologique pour donner un volume total de 300 ml et broyés en une suspension homogène, que l'on a incubée pendant 100 heures à 370 C avec ensuite séparation centri- fuge en une solution d'extrait et un résidu insoluble. Le résidu a été lavé avec 150 ml de la solution saline physiologique etles produits de lavage ont été combinés avec la solution de l'extrait pour donner un volume total de 400 ml de la solution combinée ayant une activité fibrinolytique de 375 mm 2/ml après dilution à fois Le matériau déshydraté obtenu de cette solution combinée par lyophilisation avait une activité fibrino- lytique de 142 mm 2/mg. Exemple 3 Des vers de terre vivants pesant 84 g ont été ajoutés à 500 ml d'eau distillée contenant 0,3 g de phénol et on les a broyés dans une suspension homogène que l'on a incubée pendant 76 heures à 300 C avec ensuite filtration pour retirer le résidu insoluble de la solution de l'extrait aqueux Le résidu a été lavé avec 200 ml d'eau distillée et les produits de lavage ont été combinés avec la solution de l'extrait pour donner un volume total de 650 ml de la solution combinée ayant une activité fibrinolytique de 220 mm 2/ml après une dilution à 10 fois. Exemple 4 Des vers de terre vivants pesant 84 g ont été ajoutés à un mélange aqueux de 400 ml d'eau distillée et ml d'alcool éthylique et broyés en une suspension homogène, que l'on a incubée pendant 240 heures à 250 C avec ensuite séparation centrifuge pour donner une solution d'extrait limpide ayant une activité fibrinolytique de 350 mm 2/ml après dilution à 10 fois. Exemple 5 Une suspension aqueuse a été préparée en mélangeant 50 g d'une poudre de vers de terre séchés sous vide avec 400 ml d'une solution saline physiologique et 100 ml d'une solution de sel ayant un p H de 6,5, préparée avec une solution aqueuse à 1,8 % d'acide phosphorique et 1,8 % d'eau ammoniaquée et on a incubé la suspension pendant 100 heures à 380 C avec ensuite filtration pour donner une solution de l'extrait limpide ayant une activité fibrinolytique de 725 mm 2/ml après une dilution à 10 fois correspondant à une activité de 72,5 mmi 2/mg de la poudre sèche de vers de terre. Exemple 6 On a préparé une suspension aqueuse en dispersant 50 g d'une poudre de vers de terre lyophilisés dans un mélange de 250 ml d'une solution diluée de sel ayant un p H de 6,3, préparée avec une solution à 2 % d'acide acétique aqueux et une solution à 2 % de soude aqueuse, ml d'une solution saline physiologique et 50 ml d'eau distillée avec adjonction de 0,5 g d'azide de sodium et on a incubé la suspension pendant 72 heures à 37 C avec ensuite filtration pour donner une solution limpide de l'extrait ayant une activité fibrinolytique de 460 mmi 2/ml après dilution à 10 fois. Exemple 7 On a préparé une suspension aqueuse en dispersant g d'une poudre dégraissée de vers de terre lyophilisés dans un mélange de 200 ml d'une solution de tampons d'acétate ayant un p H de 7,0, 200 ml d'une solution de tampons de borate ayant la même valeur de p H que ci-dessus, ml d'eau distillée, 10 ml d'alcool propylique et 10 ml de dioxane et la suspension a été incubée pendant 240 heures à 320 C avec ensuite filtration pour donner une solution d'extrait limpide ayant une activité fibrinolytique de 772 mm 2/ml après dilution à 10 fois. Exemple 8 On a préparé une suspension aqueuse en dispersant g de poudre dégraissée de corps de vers de terre lyophilisés avec les entrailles retirées dans un mélange aqueux de 250 ml d'une solution diluée de sel ayant un p H de 6,8 préparée avec un mélange acide aqueux contenant 1,8 % d'acide phosphorique et 3,5 % de chlorure d'hydrogène et une solution aqueuse à 2 N de potasse, 225 ml d'une solution saline physiologique et 25 ml d'acétone et on a incubé la suspension pendant 96 heures à 251 C avec ensuite filtration avec aspiration pour donner une solution d'extrait limpide ayant une activité fibrinolytique de 600 mm 2/ml après dilution à 10 fois. Exemple 9 On a préparé une suspension aqueuse en dispersant g d'une poudre dégraissée de vers de terre déshydratés par séchage-éclair à haute température dans un mélange aqueux de 50 ml d'une solution de tampons de phosphate ayant un p H de 6,4 et 50 ml d'une solution de tampons de citrate ayant un p H de 6,5 et on a incubé la suspension pendant 7 heures à 370 C avec ensuite filtration pour donner une solution d'extrait limpide Le résidu a été lavé avec une solution saline physiologique et les produits de lavage ont été combinés avec la solution d'extrait ci- dessus pour donner un volume total de 120 ml de la solution combinée Cette solution combinée a été mélangée à 0,1 g d'azide de sodium et encore incubée pendant heures à 371 C La solution résultante avait une activité fibrinolytique de 280 mm 2/ml après dilution à 10 fois. Exemple 10 On a préparé une suspension aqueuse en dispersant g d'une poudre dégraissée de vers de terre lyophilisés dans un mélange aqueux de 50 ml d'une solution de tampons de phosphate ayant un p H de 7,4 et 50 ml d'une solution saline physiologique et on a agité la suspension pendant 4 heures à 220 C pour effectuer l'extraction des ingrédients solubles dans l'eau dans la solution aqueuse avec ensuite séparation centrifuge pour donner une solution d'extrait limpide L'activité fibrinolytique de cette solution était, après mélange de 0,07 g d'azide de sodium et incubation pendant 5 heures à 370 C, de 190 mm 2/ml après dilution à 10 fois. Exemple 11 Des vers de terre vivants pesant 10 g ont été ajoutés à un mélange aqueux de 70 ml d'une solution de tampons d'acétate ayant un p H de 7,0 et 30 ml d'eau distillée, et on les a broyés en une suspension aqueuse homogène que l'on a agitée pendant 2 heures à 200 C pour effectuer l'extraction des ingrédients solubles dans l'eau dans la solution aqueuse avec ensuite séparation centrifuge pour donner une solution d'extrait limpide Le résidu a été lavé avec de l'eau et les produits de lavage ont été combinés à la solution d'extrait pour donner un volume total de 180 ml de la solution combinée ayant une activité fibrinolytique, après mélange de 0,1 d'azide de sodium et incubation pendant 7 heures à 371 C, de mm 2/ml après dilution à 10 fois. Exemple 12 Une suspension aqueuse préparée en dispersant 1 kg de poudre lyophilisée de vers de terre dans 10 litres d'une solution aqueuse contenant 0,1 % en poids de benzoate de sodium et 0,9 % en poids de chlorure de sodium a été agitée pendant 96 heures à 320 C pour extraire les ingrédients solubles dans l'eau avec ensuite filtration. Le résidu de la filtration ci-dessus a été lavé avec 3 litres de la même solution aqueuse de benzoate de sodium et de chlorure de sodium que cidessus et les produits de lavage ont été combinés avec le filtrat pour donner 12,5 litres d'une solution d'extrait limpide ayant une activité fibrinolytique de 480 mm 2/ml après dilution à 10 fois. La solution d'extrait ainsi obtenue a été concentrée à un volume total de 0,5 litre par ultrafiltratioe et la solution concentrée a été soumise à une précipitation fractionnée en ajoutant d'abord 0,5 litre d'alcool éthylique pour obtenir des précipités puis en ajoutant un autre volume d'alcool éthylique, dans le filtrat, de la première précipitation pour donner une concentration finale en alcool éthylique de 80 % afin d'obtenir une quantité supplémentaire de précipités Les précipités obtenus dans la précipitation en deux étapes ci-dessus ont été combinés et lavés avec de l'alcool éthylique avec ensuite séchage sous vide pour donner 40,5 g d'une poudre sèche ayant une activité fibrinolytique de 1 285 mm 2/mg. La poudre obtenue ci-dessus a été dissoute dans 1 litre d'une solution de tampons de phosphate à 10 m M ayant un p H de 8,0 et on a fait passer la solution à travers une colonne remplie d'hexyl-Sepharose préparé par la réaction d'hexylamine avec de l'agarose activé avec de l'épichlorohydrine (Sepharose, produit de Pharmacia Fine Chemicals Co) pour avoir les ingrédients actifs adsorbés Après lavage avec la même solution de tampons que ci-dessus, l'élution de la colonne a été entreprise avec la même solution de tampons que ci-dessus mais contenant du chlorure de sodium à une concentration de 0,25 Mcomme éluant pour donner 1 litre d'une solution d'éluat. La solution d'éluat a été déshydratée, après dialyse, par lyophilisation pour donner 5,75 g d'un matériau déshydraté ayant une activité fibrinolytique de 7 241 mm 2/mg. Exemple 13 Le processus jusqu'à la précipitation fractionnée avec de l'alcool éthylique et ensuite séchage sous vide était sensiblement le même qu'à l'exemple 12 ci-dessus et on a dissous 47 g de la poudre séchée ayant une activité fibrinolytique de 1 100 mm 2/mg, dans 1 litre d'une solution de tampons de phosphate à 20 m M ayant un p H de 7,0. On a fait passer cette solution à travers une colonne remplie de ETI (inhibiteur de la trypsine de l'albumen,)- Sepharose préparée en combinant un inhibiteur de la trypsine de l'albumen(produit de Sigma Co) à l'agarose activé avec de l'épichlorohydrine pour avoir les ingrédients actifs adsorbés Après lavage d'abord avec la même solution de tampons que ci-dessus puis avec une solution de tampons d'acétate à 0,1 M ayant un p H de 5,0, l'élution de la colonne a été entreprise avec la même solution de tampons d'acétate que ci-dessus mais contenant du chlorure de sodium et de l'alginine à des concentrations de 1 M et 0,5 M, respectivement, comme éluant pour donner 0,8 litre d'une solution d'éluat. La solution d'éluat a été déshydratée, après dialyse, par lyophilisation pour donner 255 mg d'un matériau déshydraté ayant une activité fibrinolytique de 70 960 mm 2/mg. Exemple 14 Une dispersion aqueuse de 1 kg d'une poudre de vers de terre lyophilisés dans 10 litres d'une solution aqueuse de sel contenant 0,1 % de benzoate de sodium et 0,9 % de chlorure de sodium a été agitée pendant 72 heures à 300 C pour effectuer l'extraction des ingrédients solubles dans l'eau dans la solution aqueuse avec ensuite filtra- tion pour donner une solution d'extrait limpide Le résidu a été lavé avec 3 litres de la même solution de sel que ci-dessus et les produits de lavage ont été combinés à la solution d'extrait pour donner un volume total de 13 litres de la solution limpide combinée ayant une activité fibrinolytique de 450 mm 2/ml après dilution à 10 fois. La solution aqueuse obtenue ci-dessus a été concentrée par ultrafiltration en un volume de liquide de 0,71 litre puis mélangée à un volume égal d'alcool éthylique pour précipiter la matière solide qui a été recueillie par filtration Le filtrat a encore été mélangé avec de l'alcool éthylique pour donner une concentration finale d'alcool éthylique de 80 % afin de donner d'autres précipités qui ont été recueillis et lavés avec de l'alcool éthylique avec ensuite séchage sous vide en une poudre sèche Le rendement total des produits pulvérulents et secs dans la précipitation des étapes ci-dessus était de 42 g et leur activité fibrinolytique était de 1 322 mm 2/mg. Le produit pulvérulent obtenu ci-dessus a été dissous dans 1 000 ml d'eau distillée et soumise à un fractionnement par chromatographie en colonne en utilisant un agent adsorbant de DEAE-Cellulofine (produit de Chisso Co.) pour donner trois fractions F-I, F-II et F-III. La figure 3 donne les résultats de l'activité fibrino- lytique en mm 2 et la densité optique à 280 nm des fractions de l'éluat chacune à un volume de 20 ml obtenues dans la chromatographie en colonne ci-dessus par les courbes I et II respectivement La ligne en pointillé sur la figure 3 indique la concentration du chlorure de sodium dans les fractions de l'éluat donnée par la conductivité électrique en m S Chacune des fractions F-I à F-III a été soumise à un traitement de dessalement par saturation à 60 % avec du sulfate d'ammonium et les précipités ont été dissous dans un petit volume d'une solution de tampons de phosphate à 10 m M ayant un p H de 8,0 La solution a été soumise en succession à une filtration sur gel avec Sephacryl S-200 et à une concentration avec dessalement par ultrafiltration avec ensuite lyophilisation pour donner 629 mg, 879 mg ou 1.070 mg du produit déshydraté ayant une activité fibrino- lytique de 13 780 mm 2/mg, 9 290 mm 2/mg ou 17 620 mm 2/mg, respectivement, à partir des fractions F-I, F-II et F-III. L'activité de l'activateur du plasminogène a été examinée pour chacun des produits déshydratés obtenus ci-dessus Ainsi, le produit déshydraté a été dissous dans l'eau à une concentration de 0,1 mg/ml et on a mélangé 20/ c 1 de cette solution à 10 ' 11 du plasminogène ayant une activité de 5 unités/ml (produit de Sigma Co) et 30 / d'une solution de tampons de borate à 0,17 M ayant un p H de 7,8 et contenant du chlorure de sodium à 0,01 M et, après repos pendant 10 minutes à 37 C, on a fait tomber goutte à goutte verticalement 0,03 ml de la solution mélangée sur une plaque de fibrine exempte de plasminogéne (produit de Miles Laboratories, Inc) La surface en mm 2 de la partie dissoute a été déterminée sur la plaque au bout de 18 heures de réaction à 37 C Quand la surface obtenue ci-dessus est prise pour A et que la surface correspondante en mm 2 que l'on obtient en utilisant ml de la solution de tampons de borate à 0,17 M à la place du plasminogène est prise pour B, alors l'activité d'activateur du plasminogène est exprimée par A-B Les valeurs de l'activité d'activateur du plasminogène ainsi déterminée étaintde 2 025 mm 2/mg, 1 721 mm 2/mg et 1.283 mm 2/mg pour les produits déshydratés obtenus des fractions F-I, F-II et F-III, respectivement. Exemple 15 Les produits fibrinolytiquement actifs obtenus à l'exemple 14 ont été examinés à la recherche de la réactivité avec la fibrine et le fibrinogène Ainsi, on a mélangé 0,18 ml de plasma sanguin d'homme, 0,02 ml d'une solution aqueuse à 250 m M de chlorure de calcium et 0,02 ml d'une solution aqueuse de l'un des produits fibrinolytique- ment actifs à une concentration variée et on a déterminé la valeur de FDP (peptide de décomposition de la fibrine) produite par la réaction pendant 30 minutes à 37 C dans le mélange ci-dessus par l'essai de coagulation du latex en utilisant un ensemble pour l'essai de thrombo-Wellco (fabriqué par Wellcome Co) Les résultats sont indiqués au tableau 1 dans les colonnes sous l'en-tête de Ca C 12 (+) pour cinq concentrations différentes de 10-4 à 10-1 ng/ml Les matques (+), (++), et (+++) du tableau indiquent la formation de FDP à partir de fibrine, l'augmentation du nombre de marques + corres- pondant à l'augmentation de la formation de FDP tandis que la marque (-) indique l'absence de formation de FDP à partir de fibrine pour chaque concentration. Par ailleurs, le même essai que ci-dessus a été répété en l'absence de chlorure de calcium, c'est-à-dire en utilisant une solution saline physiologique à la place de la solution aqueuse de chlorure de calcium, pour trouver qu'il ne se formait pas de FDP malgré la fraction des produits fibrinolytiquement actifs et leur concentra- tion comme le montrent les colonnes du tableau 1 sous l'en-tête de Ca C 12 (-) Ces résultats supportent la conclusion que l'agent fibrinolytiquement actif selon l'invention a une réactivité avec la fibrine et non pas avec le fibrinogène. TABLEAU 1 Fraction F I F -I II oncentratio C Cl 1 de la substanc e 2 de la substance (+) (-) fibrinolytique 104 ng/ml + +++ - 103 +++ +++ - 102 +++ +++ - + +++ + - 1 + +++ + - -1 + ++ + - _ Exemple 16 Chacun des produits purifiés et lyophilisés des fractions F-I à F-III de l'exemple 14 a été administré par voie orale à des hommes en bonne santé à une dose de I /-g/kg de poids corporel et le sang périphérique des sujets & été prélevé périodiquement pour donner les fractions d'emglobuline, avec lesquelles des mesures ont été entreprises à la recherche du temps de dissolution complète de l'euglobuline en heures, et l'activité de dissolution de la fibrine en mm 2 par l'essai de plaque standard de fibrine Les résultats sont illustrés sur les figures 4 a et 4 b, respectivement. Comme le montre la figure 4 a, le temps pour la solubilisation de l'euglobuline avait remarquablement diminué environ 2 heures après administration orale des agents fibrinolytiquement actifs purifiés obtenus à partir des fractions F-I (courbe I) et F-III (courbe III) et la diminution du temps de la solubilisation de l'euglobuline a continué de façon soutenue Par ailleurs, le temps pour la solubilisation de l'euglobuline a commencé à diminuer graduellement environ 6 heures après administration orale de l'agent fibrinolytiquement actif obtenu à partir de la fraction F-II (courbe II) Ces résultats supportent la conclusion que chacun des agents fibrinolytiquement actifs purifiés obtenus des fractions F-I à F-III a un effet pour améliorer l'activité fibrino- lytique du sang périphérique de l'homme lors d'une administration par voie orale. Par ailleurs, la figure 4 b indique que, bien qu'avec des différences considérables entre individus, l'activité fibrinolytique des fractions d('globuline obtenues par le sang périphérique était au maximum à 2 à 7 heures après administration orale des agents actifs obtenus à partir des fractions F-I à F-III (courbes I à III respectivement) aux sujets et leur activité fibrinolytique était maintenue de façon entretenue même 10 heures après administration. R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé de préparation d'un agent fibrino- lytiquement actif, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) extraire les tissus de vers de terre apparte- nant à la famille des lombricidées avec un agent d'extrac- tion aqueux pour donner une solution aqueuse d'extrait contenant les ingrédients actifs, et (b) concentrer ou déshydrater la solution aqueuse d'extrait. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les tissus de vers de terre soumis à l'extraction à l'étape (a) ont la forme d'une poudre lyophilisée. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent d'extraction aqueux est une solution saline physiologique ou une solution de tampons ayant un p H compris entre 5 et 10. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extraction à l'étape (a) est accomplie à une température comprise entre 5 et 40 WC pendant au moins 30 minutes. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité de l'agent d'extraction aqueux est comprise entre 1 et 100 fois en poids en se basant sur le poids sec des tissus des vers de terre. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent d'extraction aqueux contient un solvant organique polaire en mélange avec lui à une concentration pour ne pas dépasser 50 % en volume. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de plus l'étape de purification des ingrédients actifs soit avant ou après l'étape (b). 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la purification des ingrédients actifs est accomplie par un processus choisi dans le groupe de procédés comprenant l'adsorption sur et la désorption d'un adsorbant, la précipitation fractionnée avec un solvant organique polaire, le dessalement, l'ultrafiltration, une chromatographie par échange d'ions, une filtration sur gel, une chromatographie par affinité et une chromato- graphie hydrophobe. 9. Agent fibrinolytiquement actif, caractérisé en ce qu'il est préparé par un procédé comprenant l'extraction de tissus de vers de terre appartenant à la famille des lombricidées avec un agent d'extraction aqueux pour donner une solution d'extrait et la concentration ou la déshydratation de ladite solution d'extrait.