Brevet FR2521147A1 — publié le 19830812

-1- Il y a trois étapes générales impliquées dans la production d'une protéine par utilisation de techniques de génie génétique La première étape comprend la production en laboratoire ou l'isolement et la purification du gène désiré qui gouverne la synthèse d'une protéine particulière. La deuxième étape est la recombinaison du gène avec un vecteur de transfert approprié tel qu'un plasmide La troisième étape comprend le transfert du vecteur recombiné dans un microorganisme particulier et l'induction du micro- organisme à produire le produit correspondant au gène particulier. La présente invention concerne un procédé pour l'exécution de la première étape La méthodologie courante pour la production in vitro de gènes par addition successive de nucléotides consiste à utiliser des techniques chimiques (Itakura, K et Riggs, A, Science 209:1401 ( 1980), (Khorana, H G, Science 203:614 ( 1979), des techniques enzymatiques (S Gillam, P Jahnke, C Astell, S Phillips, C.A Hutchingon, M Smith, Nucleic Acids Res 6,2973 ( 1979) et des techniques en phase solide pour produire les molé- cules désirées d'ADN ou d'ARN Les techniques chimiques de synthèse d'ADN sont fastidieuses parce que les réactions impliquées sont non-spécifiques, de sorte qu'une purifi- cation poussée du produit désiré est nécessaire après chaque étape opératoire Ainsi, la synthèse d'ARN ou d'ADN par des techniques chimiques est notablement moins avantageuse que des systèmes enzymatiques parce que de plus grandes quan- tités de matière de départ sont nécessaires pour l'obtention de productions comparables, ce qui augmente les coûts, les techniques de purification sont longues et entraînent de grandes pertes de matière, un peu de produit étant perdu à chaque étape, et le grand nombre d'étapes impliquées dans le blocage et le déblocage des sites réactifs entraîne de nombreuses occasions d'erreurs et un risque de contamination par des enzymes dégradantes qui détruisent le produit formé par synthèse. -2- La synthèse enzymatique d'ARN en utilisant de la polynucléotide phosphorylase et de la T 4 ARN ligase a été rapportée La méthode utilisant la polynucléotide phospho- rylase est limitée à la production d'oligodésoxynucléotides. Dans des conditions contrôlées, la polynucléotide phospho- rylase ajoute principalement un seul nucléotide à un oligodésoxynucléotide court qui est ensuite isolé par des techniques chromatographiques Les techniques en phase solide sont mises en oeuvre en liant la chaîne du nucléotide à une matière solide de support et en utilisant la méthodologie chimique cidessus pour ajouter des nucléotides d'une manière échelonnée. La présente invention enseigne la composition et le procédé de production d'un composé utile dans la synthèse d'une séquence prédéterminée d'ARN en utilisant l'enzyme T 4 ARN ligase Des procédés pour la transcription de l'ARN formé par synthèse en ADN de manière que le gène obtenu par synthèse puisse être incorporé dans un plasmide, inséré dans un microorganisme et exprimé sont connus dans la technique. L'existence, la purification et le mécanisme de l'enzyme T 4 ARN ligase qui est isolée à partir d'Escherichia coli infecté de bactériophage T 4 ont été décrits (Silber, R., Malathi, V G et Hurwitz, J Proc Natl Acad Sci. ( 1972) 69:3009) Cette enzyme catalyse la formation d'une liaison phosphodiester entre le groupe phosphate sur l'extrémité 5 ' d'un nucléotide donneur et le groupe hydroxyle sur l'extrémité 3 ' de l'oligonucléotide receveur comme indiqué ci-dessous. ARN O 3 ' 5 ' ligase, i OH + H 203 PO P-li > OPO + H 20 OH La demande de brevet japonais 1980-19003 (publiée le 9 janvier 1980) enseigne l'utilisation de la T 4 ARN ligase -3- pour l'élongation d'un polynucléotide par attachement d'un seul monocléoside diphosphate (p Np) sur l'extrémité 3 ' d'une séquence de nucléoside sans groupes phosphate ter- minaux Cette méthodologie exige comme substrat de départ un trinucléotide, que l'on doit se procurer dans le com- merce ou préparer par synthèse par des techniques chimiques, et exige du triphosphate d'adénosine (ATP) comme source d'énergie pour la réaction De plus, l'invention enseigne seulement l'addition d'une base unique et n'est pas capable de produire des oligo ou polynucléotides pour lesquels des additions successives sont nécessaires. Ho Ap Ap AOH + p Cp + ATP > Ho Ap Ap Ap Cp + AMP + P Pl Les abréviations utilisées pour des raisons de com- modité dans la présente demande de brevet sont indiquées dans le Tableau 1. Abréviation A(d A) C (d C) G (d G) U (d U) I(d I) T N,X,Y,Z ADN ARN BAP VPD App Np >p kt 1 nm TEAB Tableau 1 Définition Adénosine (désoxyadénosine) Cytidine (désoxycytidine) Guanosine (désoxyguanosine) Uridine (désoxyuridine) Inosine (désoxyinosine) Thymidine Ribonucléotide ou désoxyribo- nucléotide quelconque Acide désoxyribonucléique Acide ribonucléique Phosphatase alcaline bactérienne Phosphodiestérase de venin A 5 p 5 p N 3 p (voir texte pour explication complémentaire) liaison de phosphodiester cyclisé en 2 ' 3 ' Microlitre Nanomètre Tampon bicarbonate de triéthyl- ammonium -4- p A Adénosine -5 ' monophosphate On utilise ici la forme normale de représentation de groupes 5 '-phosphate d'un nucléotide comme précédant l'abréviation du nucléotide et de groupes 3 '-phosphate comme suivant l'abréviation du nucléotide. La présente invention enseigne la composition et des procédés de production des composés pl-adénosine, p 2 _ ( 3 ' nucléotide monophosphate)-5 ' pyrophosphate de la forme A 5 'p 5 p N 3 p (App Np) o N est n'importe quel ribo- nucléotide ou désoxyribonucléotide choisi dans le groupe adénosine, guanosine, cytosine, uridine, thymidine et inosine La structure chimique de la forme ribonucléotide du composé est indiquée ci-dessous: OH o H CH. O I O IH o o H (H) o- Comme décrit dans la demande de brevet au nom de la Demanderesse intitulé "procédé de production de polyribonucléotides prédéterminés", la réaction du composé App Np avec un oligonucléotide de la forme p Xp Yo H en présence de T 4 ARN ligase donne un oligo- nucléotide de la séquence p Xp Yp Np: XY +A N +ARN ligase A p Xp YOH + App Np p Xp Ypp p p Cette méthode pour l'addition successive de nucléotides simples a l'avantage d'être rapide et spécifique, ce qui signifie que les coûts de production sont plus bas, la durée de production d'un produit utile est moindre et les rendements sont plus élevés avec moins de risque d'erreur. Les étapes utilisées pour la synthèse de composés de la forme App Np sont résumées dans le Tableau 2 La première étape est la transformation d'adénosine-5 '-mono- phosphate, qui est disponible dans le commerce, en un sel organique Dans la deuxième étape, un nucléotide-2 '( 3 '), 5 ' diphosphate (p Np), également disponible dans le commerce, est transformé en un nucléotide-5 '-phosphate 2 '-3 ' phosphate cyclique (p N>p) par une technique décrite par Khorana, H.G, Tener, G M, Moffatt, J G, Pol, E H Chem Ind. (Londres) 1956, page 1523 Par réaction de A 5 p avec p N>p en utilisant des moyens chimiques, App N>p est produit avec un rendement élevé La réaction d'App N>p avec la R Nase T 2 qui coupe la liaison oxygènephosphore donne le produit App Np désiré. Tableau 2 pyridine ( 1)p A A (pyridinium) ( 2) Np) p N>p ( 3) p A + p N> p > AN pp N p ( 4)A N R Nase TN>A N On utilise des méthodes similaires pour produire App Cp, App Gp, App Up, App Ip, App Tp, Appd Ap, Appd Cp, Appd Gp et Appd Up La plupart des nucléotide diphosphates néces- saires pour la production des composés App Np sont dispo- nibles dans le commerce. La pureté de chacun des composés App Np peut être déterminée en utilisant diverses expériences de clivage enzymatique qui sont décrites plus en détail ci-après et -6- on peut identifier les produits de réaction de ces essais en utilisant l'électrophorène et l'absorption ultraviolette par comparaison à des étalons connus. Le dessin est une représentation d'un tracé électro- phorétique sur papier sous irradiation ultraviolette d'études de clivage enzymatique effectuées sur la compo- sition de P -adénosine, p 2-( 3 ' adénosine monophosphate)- ' pyrophosphate (App Ap). La présente invention fournit une nouvelle composition utile, le composé chimique P l-adénosine, p 2-_( 3 ' nucléotide monophosphate)-5 ' pyrophosphate (App Np) o nucléotide et N représentent n'importe quel ribonucléotide ou désoxyribo- nucléotide La présente invention fournit aussi des procédés de production de cette famille de composés Le procédé selon la présente invention va être divisé en étapes comme suit: 1 Formation du sel organique de p A; 2 Formation du composé p N>p; 3 Enchaînement chimique du sel organique de p A et du composé p N>p; et 4 Coupure de la liaison phosphate cyclisée. Pour préparer le sel organique de p A, l'adénosine 5 ' phosphate qui est disponible sous diverses formes en prove- nance de sources commerciales est purifié par chromato- graphie d'échange d'ions ou par d'autres techniques de séparation capables d'éliminer les impuretés La matière purifiée est ensuite séchée, dissoute dans de la pyridine ou d'autres solvants organiques comme le benzène ou le toluène et le sel organique est formé par addition de tri-n- octylamine ou d'une autre base organique comme la tri-n-butylamine Finalement, le sel de p A est séché par dissolution et évaporation répétées dans de la pyridine anhydre. Le nucléotide 5 '-phosphate 2 ',3 ' phosphate cyclique (p N>p) est préparé sous la forme d'un sel de 4- morpholine 7- N, N' dicyclohexylcarboxamidium du nucléotide 2 '-3 '- phosphate cyclique 5 '-phosphoromorpholidate Les formes pipéridate et panisidate peuvent être utilisées à la place du morpholidate, bien que des rendements plus bas soient à prévoir, en utilisant des techniques décrites antérieurement (Moffatt, J G et Khorane, H G, J Amer. Chem Soc, 83:649 ( 1961)). L'étape suivante consiste à faire réagir le sel orga- nique de p A avec le sel de p N>p pour former le composé App N>p Chaqun des corps en réaction est séché séparément par dissolution et évaporation sous vide répétées dans de la pyridine anhydre Les sels de p N>p et de p A sont ensuite combinés de préférence dans un rapport de 1:3, dissous et évaporés dans de la pyridine anhydre plusieurs fois et mis en suspension dans un petit volume de pyridine anhydre On laisse incuber la matière en réaction à la température ambiante, bien que l'on envisage que des températures de -45 C seraient efficaces, pendant 3 à 9 jours Apres l'incubation, le mélange de réaction est séché sous vide et remis en suspension dans l'eau et fractionné par chromato- graphie sur colonne Pour purifier encore la fraction combinée, on traite le mélange de réaction par une phos- phatase qui élimine les groupes phosphate terminaux, mais pas le phosphate cyclique dans la position N>p, permettant ainsi une séparation en utilisant une chromatographie sur colonne échangeuse d'ions. Le mode opératoire préféré dans cette technique de laboratoire consiste à fractionner le produit de réaction sur DEAE Sephades A-25 en utilisant un gradient linéaire de 0,1 M à 1,0 M de tampon TEAB, mais on envisage que n'importe quel tampon volatil serait efficace Le quatrième pic majeur qui contient le produit App Np peut être con- centré et traité par la phosphatase, de préférence BAP F (Worthington Biochemical) dans des conditions connues dans la technique et fractionné en utilisant une colonne de DEAE Sephadex A-25. -8- Dans l'étape finale, la liaison phosphodiester cyclique 2 '-3 ' du composé App N>p est coupée, laissant le produit final App Np, par traitement du ribonucléotide cyclique par l'enzyme qui ouvre la liaison 2 '-3 ' phospho- diester à la position 2 ' Dans la méthode préférée, on utilise la R Nase T 2 pour tous les composés App Np, bien que la R Nase Tl puisse être utilisée pour clivage dans la synthèse de App Gp Les conditions de réaction pour ces enzymes sont connues dans la technique Pour inactiver ces enzymes, on ajoute du phénol au mélange de réaction qui est ensuite fractionné sur une colonne de DEAE Sephadex On applique le mélange à la colonne et le phénol est enlevé par lavage avec un tampon de faible concentration ionique tel que 0,1 M TEAB Le produit de réaction, le composé App Np, est ensuite enlevé avec un tampon de forte concen- tration ionique tel que 1,0 M TEAB. On soumet ensuite le produit de réaction à des essais en utilisant diverses expériences de clivage enzymatique afin de déterminer sa structure réelle. Dans toutes les étapes de purification dans lesquelles la description ci-dessus prévoit un fraction- nement par chromatographie sur colonne de DEAE Sephadex, on envisage que des méthodes telles que la chromatographie sur DEAE, la chromatographie en phase liquide à haute pression, l'électrophorèse, la filtration sur gel, la chromatographie sur couche mince ou n'importe quelles autres techniques de séparation similaires peuvent être utilisées sans qu'on sorte pour autant du cadre général de la présente invention. Exemple On va maintenant décrire le procédé préféré pour la production du composé App Np. p A p A (sel de pyridinium) Le 5 '-adénosine monophosphate est transformé en son sel de tri-n-octyl ammonium par la méthode suivante. -9- On ajoute 200 mg de p A (forme H en provenance d'Aldrich) à un mélange d'environ 3 cm 3 de mélange H 20:méthanol ( 1:1) et d'assez de pyridine pour dissoudre le p A On fractionne ensuite la solution s Ur une colonne de Dowex 50 x 2 (Dow Chemical) de 0,8 cm 2 x 10 cm qui a été prélavée à la pyridine On forme des taches de 5 gl de chaque fraction sur du papier de 3 mm humide, on rince avec CC 14 et on vérifie l'absorption dans l'ultraviolet Les fractions contenant une matière capable d'absorption dans l'ultra- violet (p A) sont combinées et évaporées à sec à la tempé- rature ambiante On ajoute 2 cm de pyridine anhydre avec 400 g 1 de tri-noctylamine La matière est évaporée à sec 3 fois et ensuite remise en suspension dans 1 ml de pyridine anhydre p Ap > p A>p On prépare de l'adénosine 5 '-phosphate 2 ',3 ' phosphate cyclique (p A>p) en opérant comme suit On fait passer 10 mg ( 0,02 mmole) de 3 ', 5 ' adénosine diphosphate (sel de sodium) à travers une colonne ( 0,2 cm x 7 cm) de Dowex 50 x 8 (forme morpholine) On élue la colonne avec de l'eau et on recueille des fractions de 1 ml Le pic unique trouvé est combiné et séché sous vide On dissout le résidu dans 1 de H 20 o on ajoute un mélange de morpholine ( 6,9 1, 0,2 mmole) dans 190 g 1 d'alcool t-butylique Le mélange est chauffé au reflux A la matière mélangée chauffée au reflux, une solution de dicyclohexylcarbodiimide ( 15,7 mg, 0,76 mmole) dans 285 g 1 d'alcool t-butylique est ajoutée par portions de 50 1 en une période de trois heures Le mélange réactionnel est chauffé au reflux toute une nuit (ou pendant encore trois à vingt-quatre heures) à 65-80 C. Les solvants sont évaporés sous vide et le résidu est mis en suspension dans 1 cm 3 de H 20 On filtre la solution aqueuse pour éliminer tous cristaux insolubles en utilisant un filtre en verre fritté Le filtrat est évaporé à sec et on dissout le résidu gommeux dans 50 1 de méthanol On 10- ajoute 1 ml d'éther et on secoue énergiquement la matière. La solution d'un blanc laiteux résultante est ensuite cen- trifugée pendant 5 minutes à 1000 xg dans un rotor Beckman JA 21 (Beckman Instruments) et on décante la couche éthérée claire L'addition d'éther frais précipite une matière solide gommeuse On ajoute 1 ml d'éther, on gratte les côtés et une poudre blanche se forme au fond du tube On centrifuge le tube et on sépare l'éther par écoulement On ajoute de l'éther frais, on gratte de nouveau les côtés et le produit, le sel de 4-morpholine N,N'-dicyclohexyl- carboxamidium d'adénosine 2 ',3 '-phosphate cyclique 5 ' phosphoromorpholidate, est ensuite séché à l'air. Le produit de réaction (p A>p) est rendu anhydre par des opérations répétées de dissolution dans de la pyridine anhydre et d'évaporation sous vide Le sel de tri-n-octyl ammonium d'adénosine 5 '-phosphate ( 0,06 mole) est séché de la même manière Les deux sels de nucléotide anhydres sont combinés et sont deux fois dissous dans de la pyridine anhydre et évaporés sous vide On utilise 400 il de pyridine anhydre pour mettre la matière en suspension, et on laisse incuber la suspension à la température ambiante ( 20 C) Apres 6 jours, le mélange de réaction est séché sous vide et on dissout le résidu dans 1 ml de H 20 Une colonne de DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia, 0,2 cm x 25 cm) est mise en équilibre avec 100 ml de 100 m M triéthylamine bicarbonate (TEAB), p H 7,6 L'échantillon est appliqué à la colonne, lavé avec 10 ml de 100 m M TEAB et ensuite fractionné par ml de gradient linéaire de 0,1 M à 1,0 M TEAB On recueille des fractions de 1 ml et on mesure le facteur d'absorption à 260 nm Le quatrière pic contenant le produit de réaction App A>p est combiné et lyophilisé La matière lyophilisée est dissoute dans 1 ml de H 20 o on a ajouté 460 il de 1 M Tris-H Cl, p H 8,1, et 75 il ( 15 unités) de phosphatase alcaline bactérienne (BAP F, Worthington) et on fait incuber le mélange à 65 C pendant 1 heure Le -11- mélange traité par BAP est dilué deux fois, appliqué à une colonne de DEAE Sephadex A-25 ( 0,2 cm x 25 cm), lavé et élué comme décrit précédemment. Pour transformer le composé App A>p en App Ap, le mélange de 250 il d'App A>p ( 1,91 m M), de 50 il de solution 1 M d'acétate de potassium (p H 4,8) , de 20 il ( 20 unités) de R Nase T 2 (SIGMA, GRADE VI) et de 180 il de H 20 est mis à incuber à 37 C pendant 1 heure On ajoute 500 il de phénol au mélange de réaction et on secoue doucement le tube pendant 10 minutes On dilue ensuite l'échantillon avec 1 ml de 100 m M TEAB, p H 7,6, on l'applique à une colonne de DEAE Sephadex A-25 ( 0,2 cm 2 x 5 cm) et on le lave avec 100 m M TEAB, p H 7,6, jusqu'à ce que le phénol soit enlevé par lavage Le produit final est ensuite élué de la colonne avec 10 ml de 1,0 M TEAB, p H 7,6 Le produit App Np est ensuite traité par diverses enzymes pour caractérisation. Essais La phosphodiestérase de venin (VPD)(Worthington Biochemical) est une exonucléase qui coupe les liaisons phosphodieter partant de l'extrémité 3 ' des ARN et ADN. La phosphatase alcaline bactérienne (BAP) a été décrite ci-dessus Les conditions de réaction pour ces enzymes sont connues dans la technique Les réactions suivantes ont été conduites sur le produit final, que l'on pensait. être le composé App Ap, afin de déterminer la structure réelle du produit final. Dans la première réaction, le produit final a été traité par VPD et soumis ensuite à une électrophorèse. Deux taches ont été détectées au rayonnement ultraviolet et identifiées comme étant Ap et p Ap par comparaison avec des étalons connus. Dans la seconde réaction, le produit final a été traité par BAP et une seule espèce a été détectée à l'ultraviolet par électrophorèse Le produit de cette réaction a été identifié comme étant App A par comparaison à un étalon connu. -12- Dans la troisième réaction, le produit final a été traité par BAP et ensuite par VPD, ce qui a entratné la formation d'une seule espèce détectable, A, Les essais enzymatiques décrits ci-dessus sont présentés dans le Tableau 3, Tableau 3 ( 1) App ApVPD Ap + p Ap ( 2) App ApBAP App A ( 3)App Ap BAP Appa -PD > 2 p A (si BAP résiduel) A Des échantillons des réactions ci-dessus ont été soumis à une électrophorèse sur papier dans du citrate de sodium au p H 5, 0 pendant une heure Les résultats de cet essai sont représentés sur le dessin Dans la colonne C, on a déterminé les taches correspondant à un mélange de 3 étalons, AMP, ADP et ATP Pans la colonne V, on a déterminé les taches correspondant au produit final traité par VPD (Essai 1) Dans la colonne B, on a déterminé les taches correspondant au produit final traité par BAP (Essai 2) La colonne B/V contient le produit de l'Essai ( 3)-ci-dessus dans lequel le produit final a été traité d'abord par BAP et ensuite par VPD. L'examen à l'ultraviolet des résultats de l'électro- phorèse montre trois taches de témoins représentant AMP, ADP et ATP dans l'ordre ascendant à partir de l'origine. Dans la colonne B, une seule espèce App A est détectée Dans la colonne BV, une seule tache correspondant à A est présente La colonne App Ap montre la migration du produit final Enfin, la colonne V montre deux taches qui corres- pondent à Ap et à p Ap. -13- REVENDICATIONS 1 Un composé pl-adénosine, p -( 3 ' nucléotide mono- phosphate)-5 ' pyrophosphate ayant la formule OH o H A o I cal o l O-P=G O o HH o c-P= ou le nucléotide est choisi parmi l'adénine, la cytosine, la guanine, l'uracile, l'hypoxanthine, la thymidine, la désoxyadénine, la désoxycytosine, la désoxyguanine, la désoxyuridine et la désoxyhypoxanthine. 2 Un procédé de production du composé difini dans la revendication 1, comprenant les étapes qui consistent à (a) transformer l'adénosine-5 'monophosphate (p A) en un sel organique; (b) transformer le 3 ', 5 ' nucléoside diphosphate en nucléoside 5 '-phosphate, 2 '-3 ' phosphate cyclique (p N>p); (c) faireréagir -la forme sel organique de p A avec le composé p N>p dans des conditions convenables pour former un composé en reliant le groupe 5 ' phosphate du p A dans une liaison diester au groupe 5 ' phosphate du composé p N>p (d) isoler le composé App N>p; (e) traiter le composé App N>p par une enzyme qui coupe la liaison 2 ' phospho-oxy laissant App Np avec le -14- groupe phosphate terminal sur le carbone 3 ' du nucléoside. 3 Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le sel organique de p A est un sel de pyridine. 4 Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape (d) est constituée des étapes qui consistent à (a) fractionner le mélange de réaction par chromato- graphie sur colonne; (b) traiter les fractions contenant le composé App N> p par une enzyme qui élimine les phosphates terminaux libres; (c) séparer le produit résultant de la fraction traitée par chromatographie sur colonne. Un procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'enzyme qui élimine les groupes phosphate terminaux est la phosphatase alcaline bactérienne. 6 Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la liaison 2 ' phospho-oxy est couple par l'enzyme T 2 R Nase. 7 Un procédé de production du composé défini dans la revendication 1, comprenant les étapes qui consistent à: (a) dissoudre de l'adénosine-5 'monophosphate dans une solution contenant de la pyridine de manière à former le sel de pyridine du p A; (b) isoler ce sel de pyridine de p A; (c) évaporer et remettre en suspension le sel de pyridine de p A dans de la pyridine; (d) chauffer au reflux un nucléoside diphosphate de manière à former un nucléoside 5 '-phosphate-2 '-3 '-phosphate cyclique (p N>p); (e) triturer le p N>p; (f) faire réagir le p N>p trituré avec le sel de pyridine de l'adénosine monophosphate dans des conditions convenables pour former App N>p; -15- (g) séparer le composé App N>p des impuretés; (h) couper la liaison 2 '-3 ' cyclisée pour former App Ap; N et le nucléotide étant des ribonucléosides simples choisis parmi les suivants: adénine, cytosine, guanine, uracile, hypoxanthine, thymidine, désoxyadênosine, désoxycytosine, désoxyguanine, désoxyuridine et désoxy- hypoxanthine. 8 Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape de chauffage au reflux est conduite en présence de dicyclohexylcarbodiimide et de morpholine. 9 Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la réaction du nucléotide cyclique (p N>p) avec le sel de pyridine est conduite dans une solution organique. 10 Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on effectue la séparation du composé App A>p des autres impuretés de réaction en traitant le mélange de réaction par une enzyme qui élimine le phosphate terminal, cela étant suivi d'une séparation faisant usage de tech- niques chromatographiques. 11 Un procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'enzyme est la phosphatase alcaline bactérienne. 12 Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape pour couper la liaison 2 '-3 ' cyclisée est effectuée en traitant le composé App N>p par la T 2 R Nase.