Brevet FR2515827A1 — publié le 19830506

Nouveaux tubes revêtus d'un deuxième anticorps hautement purifié, prêts à l'emploi, pour les dosages immunologiques, et leur procédé de préparation. L'invention a pour objet de nouveaux tubes destinés à des dosages immunologiques d'un antigène ou d'un haptène, dont le revêtement fixé, par adsorption ou liaison covalente, sur la paroi du tube en matière plastique est un deuxième anticorps (c'est-à-dire un anticorps dirigé contre le premier anticorps) hautement purifié par chromatographie d'affinité; l'invention a également pour objet un procédé de préparation de ces tubes Ceux- ci, qui peuvent être fournis numérotés et disposés sur des portoirs de manière à être prêts à l'emploi, sont stables au moins 15 jours à 37 C et 6-mois à + 4 C dans leur emballage. Ils permettent de simplifier la réalisation des dosages immunologiques d'antigènes et d'haptènes. Dans de nombreuses méthodes de dosage immunologique et plus particulièrement radio-immunologique, on utilise un deuxième anticorps dirigé contre le premier anticorps et donc réagissant avec lui, pour séparer l'antigène libre de celui lié au premier anticorps. Dans les méthodes immunoprécipitantes, le deuxième anticorps est utilisé à l'état libre (Morgan et Lazarow-1962, Utiger et Col 1962). Dans les méthodes d'immunoprécipitation accélérée, un accélérateur de précipitation (polyéthylèneglycol, éthanol, sulfate d'ammonium etc) est ajouté au deuxième anticorps, de manière à réduire la durée de l'immunoprécipitation à 15 ou 30 minutes (Martin et Landon 1974). Dans les méthodes utilisant un immunoadsorbant microparticulaire, le deuxième anticorps est soit: préincubé à un premier anticorps; couplé à de la cellulose microcristalline ou à du Sépharose 4 B (DASP) selon WIDE, à du gel d'acrylamide, à des particules de latex etc; couplé à des polymères associés à de l'oxyde de fer (Nye et col 1976). A ce type de méthode doivent être assimilées les techniques faisant appel à la protéine A du staphylocoque doré qui joue un rôle comparable au deuxième anticorps (Jonsson et Kronvall 1973). Toutes ces méthodes présentent deux inconvénients essentiels le pipetage d'un réactif en suspension constitue souvent une source d'hétérogénéité dans les dosages Seules les méthodes immunoprécipitantes simples ne présentent pas ce premier inconvé- nient; la nécessité de faire appel à une étape de centrifugation ou de microfiltration pour séparer la fraction d'antigène libre de celle liée Seule la méthode utilisant des particules d'oxyde de fer évite cet inconvénient en réalisant la séparation dans un champ magnétique; cela implique par contre la nécessité de se procurer des équipements supplémentaires. La transposition des méthodes en phase solide selon Catt et Tregear ( 1967) au couplage du deuxième anticorps supprime ce deuxième inconvénient. Dans la méthode RIA, le deuxième anticorps (Ab) est fixé sur la phase solide, et celle-ci est incubée avec une solution du premier anticorps (Ab) et la solution contenant l'antigène à doser (Ag) à laquelle on ajoute ensuite l'antigène marqué (Ag) Il se forme des complexes Ab-Ag et Ab-Ag* qui se fixent au Ab 2 sur la phase solide, l'antigène (marqué et non-marqué) non-combiné restant dans la phase liquide. Le deuxième anticorps est habituellement obtenu par injections répétées du plasma ou du sérum sanguin d'un animal ou de l'homme à un animal d'une autre espèce: le sérum de celui-ci contient un anticorps (gamma-globulines) dirigé contre les gamma- globulines du premier animal ou de l'homme Les gamma-globulines (Ab) du sérum de l'animal immunisé doivent être séparées et purifiées avant d'être fixées sur la phase solide. Dans la méthode de ZIOLA B R et col ( 1977), les gamma- globulines du deuxième anticorps (sérum de mouton, anti-gamma- globuline de lapin) sont purifiées seulement par une précipitation au sulfate de sodium suivie d'une filtration moléculaire sur gel Sephadex G-200 avant d'être adsorbées sur des billes de polystyrène. Cependant, la manipulation des billes manque de praticabilité par rapport à celle des tubes De plus, elles représentent un réactif supplémentaire à manipuler. Dans la méthode de Cocola F et col ( 1973), les gamma- globulines du deuxième anticorps (sérum de chèvre, anti-gamma- globuline de lapin) sont purifiées seulement par une précipitation au sulfate d'a=monium suivie d'une chromatographie sur DEAE cellulose avant d'être adsorbées sur des tubes en polystyrène Ces tubes ont servi uniquement pour le dosage de l'hormone chorionique somatotrope (HCS) selon un mode opératoire caractérisé par des incubations à 370 C et une addition séquentielle des réactifs (pipetage successif du sérum anti-HCS et des échantillons à doser, suivie de 4 heures d'incubation à 370 C puis d'une addition de HCS marqué à l'iode 125, suivie d'une incubation de 14 heures à 370 C). La stabilité de ces tubes ne dépasse pas 2 mois à + 40 C De plus, ce travail n'a pas permis le développement de réactifs commerciaux. Dans la méthode selon l'invention, les gamma-globulines du deuxième anticorps sont purifiées par chromatographie d'affinité avant d'être fixées sur les tubes qui sont de préférence en polyéthylène Il en résulte l'obtention de tubes beaucoup plus performants se prêtant lors des dosages: à l'addition en une seule étape, sans incubation intermédiaire, de tous les réactifs successivement, le premier anticorps étant ajouté en dernier en tant que réactif déclanchant à une incubation durant de quelques heures (méthode en cinétique) à 24 heures (méthode à l'équilibre) à la température du laboratoire, ou autre température. Le procédé de préparation des tubes revêtus d'un deuxième anticorps, selon l'invention, comprend donc deux étapes: 1) Obtention des gamma- globulines du deuxième anticorps hautement purifiées par chromatographie d'affinité sur une colonne constituée par un gel sur lequel ont été fixées les gamma-globulines contre lesquelles est dirigé l'anticorps à purifier; 2) fixation de ces gamma-globulines sur les tubes en polymères (polyéthylène, polystyrène et autres). Première étape: Exemple de purification de gamma-globulines de sérum de mouton anti-gamma-globulines de lapin: On utilise, pour la chromatographie d'affinité, un gel (de préférence un gel de Sepharose 4 B ou d'Ultragel ACA 22) sur lequel ont été fixés des gamma-globulines de lapin. La chromatographie d'affinité proprement dite s'effectue alors de la façon suivante: On introduit le sérum de mouton ( 100 ml par exemple) anti-gamma-globulines de lapin dans la colonne et on élue par un tampon phosphate de sodium à p H 7,4 jusqu'au retour de la ligne de base du chrpmatogramme Les gamma-globulines de mouton anti-gammaglobulines de lapin sont ensuite éluées par un tampon apportant une variation brutale de p H et de conductivité de la colonne (par exemple, un tampon glycine-soude de p H 2,8). Apres équilibrage de l'éluat à p H 7,4, on le fixe sur les tubes. Deuxième étape: Exemple de fixation par adsorption sur des tubes en polyethylene de gamma-globulines de mouton anti-gammablobulines de lapin purifiées par chromatographie d'affinité: On fait incuber l'éluat obtenu précédemment ( 30 à Pl/ml) dans chacun des tubes; ceux-ci sont ensuite rincés successivement par une solution de chlorure de sodium à 9 %/o - et par une solution protéique Les tubes ainsi traités sont séchés par lyophilisation ou tout autre procédé avant d'être conditionnés en sachet en présence d'un déshydratant. L'originalité de ces tubes tient: à leur stabilité dans leur conditionnement au moins 15 jours à 37 C et 6 mois à + 4 C; à leur performance de reproductibilité dans les dosages. Les tubes revêtus d'un deuxième anticorps, selon l'invention, sont utilisés pour les dosages immunologiques et plus particulièrement radio-immunologiques, d'hormones telles que l'hormone folliculo- stimulante humaine (h FSH) et l'hormone lutéinisante humaine (h LH). Premier exemple d'application des tubes selon l'invention au dosage radioimmunologique de la h FSH: 2 flacons 7 flacons Le système de réactif de réactif 2 flacons de réactif 2 portoirs de 48 tub E I flacon I flacon de réactif F de réactif T de réactifs contient RI: 125 I h FSH ( es selon l'invention de réactif R 4: (gamma- globulines de mouton anti-gamma-globulines de lapin) R 5: diluant (sans h FSH) R 6: tampon PBS-BSA ph 7,4 - 50 ml I flacon de réactif R 7 1 I flacon de réactif R 8 sérums de contrôle humain Deuxième exemple d'application des tubes selon l'invention au dosage radio-immunologique de la h LH: Le système de réactifs contient: 2 flacons de réactif RI: 125 I-h L Ui ( 2 portoirs de 48 tubes selon l'invention de réactif R 4: (gamma- globulines de mouton anti-gamma-globulines de lapin) I flacon de réactif R 5: diluant (sans h LH) 1 flacon de réactif R 6: tampon PBS-BSA p H 7,4 - > 50 ml I flacon de réactif R 7 1 flacon de réactif R 8 sérums de contrôle humain L'originalité de ces deux systèmes de réactifs tient: à la simplicité de leur mode opératoire: tous les réactifs sont ajoutés successivement en une seule étape, sans incubation intermédiaire, le premier anticorps (anti-h LH ou anti-h FSH) étant ajouté en dernier; l'incubation est de quelques heures à 24 heures à la température du laboratoire Il n'y a pas d'étape de centrifugation. à la conception du dosage: le fait d'ajouter le premier anticorps en dernier, contrairement au protocole de Cocola permet à ce réactif de jouer un rôle de réactif déclenchant: ainsi, les réactions immunologiques du dosage démarrent au même moment dans tous les tubes Le dosage peut ainsi être fait en cinétique ou à l'équilibre Cet avantage existe de la même manière vis-à-vis des méthodes en tubes revêtus pour lesquelles un premier anticorps et non un deuxième anticorps est fixé au fond des tubes; 125 l'absence d'adsorption des traceurs I-h LH ou I-h FSH dans les tubes coat RIA dans les conditions du dosage ainsi que l'aspiration du milieu réactionnel en fin d'incubation suivie d'un rinçage permet d'obtenir des "non-spécifiques" inférieurs à 1 %. L'emploi des tubes selon l'invention peut être étendu au dosage radioimmunologique, enzymo-immunologique, calorimétrique ou fluorescent de produits tels que: les haptènes: stéroïdes, vitamines, médicaments, etc. les macromolécules: protéines telles que des hormones (prolactine, hormone thyréostimulante) des protéines sériques (protéines liantes, anticorps) des protéines tissulaires dans les matériaux biologiques tels que le sérum, le plasma, l'urine, des virus végétaux, etc. Pour faciliter l'emploi des tubes selon l'invention, ils- peuvent être regroupés dans les systèmes de réactifs ou "kits" (pour les dosages immunologiques), sur des portoirs réalisés en matériaux plastiques, de préférence thermoformés. Une forme de réalisation d'un portoir de tubes selon l'invention est représentée dans les figures 1, 2 et 3 ci-après. La figure 2 représente une vue de dessus, la figure 3 une vue transversale et la figure 1 une coupe longitudinale selon l'axe I-I. Le portoir est constitué d'une base 1 présentant des alvéoles contiguës, circulaires, ayant un fin canal de haut en bas destiné à faciliter l'introduction des tubes, et d'un couvercle 2 également réalisé en matériaux plastiques, de préférence thermoformés, venant s'enclipser dans la base, grâce aux joncs d'enclipsage 3. On constitue ainsi un ensemblecompact ayant les avantages suivants a) les tubes étant jointifs sont parfaitement alignés dans le portoir, facilitant ainsi les opérations de pipetage et de lavage. b) La bonne tenue de ces tubes permet leur manipulation aisée et notamment retournement pour toute opération de vidange et égouttage. c) Le couvercle disposable peut être maintenu en position haute pour permettre le séchage par lyophilisation ou tout autre moyen Le clipsage peut alors se faire dans la machine même par rapprochement des plateaux supports De plus, un gaz neutre peut être introduit dans l'emballage afin de protéger le produit jusqu'à sa mise en conditionnement étanche définitif. d) La forme de coque du couvercle offre la possibilité d'operculer au moyen d'un film barrière thermosoudable Un blister étanche est ainsi réalisé. e) Les tubes, au nombre de 48, sont numérotés et prêts à l'emploi. Ce sont des tubes à hémolyse en polyéthylène, polystyrène ou toute autre matière plastique - f) Le modèle de portoir est applicable à toute forme de tube, ou contenant, destiné à des répartitions et lavages en série. En résumé, on obtient ainsi selon l'invention des tubes prêts à l'emploi, c'est-à-dire secs, numérotés et disposés en portoirs, ce qui améliore de manière considérable la mise en oeuvre des dosages immunologiques. REVENDICATIONS ______________ 1 Tubes en matière plastique revêtus d'un deuxième anticorps, pour les dosages immunologiques, caractérisés en ce que le revêtement est constitué par un deuxième anticorps hautement purifié par chromatographie d'affinité, fixé par adsorption sur un polymère, de préférence un polyéthylène. 2 Tubes selon la revendication 1, caractérisés en ce que le deuxième anticorps est une gamma-globuline du sérum d'une espèce animale, anti-gamma-globulines du sérum d'une autre espèce animale ou de l'homme, purifiée par chromatographie sur des gamma-globulines de la deuxième espèce animale ou de l'homme. 3 Tubes selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisés en ce que le deuxième anticorps est une gamma-globuline de mouton anti-gamma-globuline de lapin. 4 Procédé de préparation de tubes selon l'une des revendica- tions 1 à 3, caractérisé en ce qu'on traite le sérum immun contenant le deuxième anticorps par chromatographie d'affinité sur des gamma- globulines contre lesquelles est dirigé l'anticorps à purifier et que le deuxième anticorps purifié ainsi obtenu est fixé par adsorption sur la paroi des tubes en une matière plastique telle que polyéthylène ou polystyrène. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, pour la chromatographie d'affinité, on utilise une colonne remplie d'un gel sur lequel sont fixées des gamma-globulines contre lesquelles est dirigé l'anticorps à purifier, et on fait passer sur cette colonne le sérum immun contenant l'anticorps à purifier, puis on élue par un tampon phosphate à p H 7,4 jusqu'au retour de la ligne de base du chromatogramme; on élue ensuite les gamma-globulines du deuxième anticorps par un tampon apportant une variation brutale de p H et de conductivité de la colonne. 6 Procédé selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que l'éluat contenant les gamma-globulines du deuxième anticorps est équilibré à p H 7,4, dilué et incubé dans les tubes o il se fixe par adsorption sur le polymère constituant la paroi du tube. 7 Procédé de dosages immunologiques utilisant un deuxième anticorps en phase solide, caractérisé en ce qu'on utilise les tubes selon l'une des revendications I à 3, et qu'on ajoute successivement les autres réactifs dans les tubes, en une seule étape, le premier anticorps étant ajouté en dernier et servant de réactif déclenchant. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on dose l'hormone folléculo-stimulante et l'hormone lutéinisante humaines. 9 Procédé selon la-revendication 8, caractérisé en ce qu'on réalise le dosage aussi bien à l'équilibre qu'en cinétique. Dispositif de présentation ou portoir pour les tubes selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué par une matière plastique thermoformée et comprend une base ( 1) présentant des alvéoles contiguës, circulaires, ayant un fin canal de haut en bas pour l'introduction des tubes et un - couvercle ( 2) venant s'enclipser dans la base grâce à deux jo Dcs d'enclipsage ( 3) qui permettent au couvercle d'être maintenu en position haute pour le séchage des tubes ou l'introduction d'un gaz de protection ou en position basse pour operculer les tubes et permettre leur retournement. Il Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend 48 tubes numérotés et prêts à l'emploi.