Brevet FR2521591A1 — publié le 19830819

La présente invention concerne les dosages par compétition avec marquage par un coenzyme et cycle enzymatique amplificateur, ainsi qu'un système enzymatique amplificateur lui-même nouveau. L'invention concerne plus particulièrement un procédé, ainsi qu'un système et un ensemble pour dosages dans des fluides biologiques par compétition avec marquage au NAD ou un de ses dérivés et cycle enzymatique amplificateur G-6-PDH/MDH. Le principe de la méthode de dosage selon l'invention repose sur la compétition entre un substrat à doser et un substrat marqué avec un coenzyme, ctest-à-dire un substrat auquel est fixé un coenzyme, vis-à-vis d'une substance ayant une affinité pour le substrat, telle que par exemple un anticorps spécifique dirigé contre le substrat et, dans ce cas, le dosage est un dosage immunochimique. L'élaboration de systèmes amplificateurs enzymatiques et leur utilisation pour des dosages sont connues, notamment d'après Lowry O.H. et al., J. Biol. Chem., (1961), 236 (10), pp. 2746-2755 et Kato T. et al., Analytical Biochem., (1973), 53, pp.86-97. I1 a également été signalé que l'on a intérêt à avoir le maximum de réactions irréversibles de manière à augmenter le pouvoir amplificateur du cycle (voir J.C. Nicolas, J. Chaintreuil, B. Térouanne, B. Descamps et A. Crastes de Paulet, Ann. Biol. Clin.,(1978), 36, pp. 205208). On a maintenant conçu et mis au point un sytème pour dosages par compétition avec "marquage" et cycle enzymatique amplificateur, qui repose sur un cycle enzymatique amplificateur nouveau et fait intervenir les réactions suivantes - compétition entre la molécule à doser (que l'on peut appeler "substrat") et cette molécule marquée au coenzyme (substrat-CEZ+), CEZ+ représentant NAD+ ou un de ses dérivés vis-à-vis d'une substance ayant une affinité pour la molécule à doser, telle que, par exemple, un anti corps spécifique dirigé contre la molécule à doser et désigné par M. substrat-CEZ+ + substrat + M - substrat + (substrat-CEZ+)M - Dosage du substrat-CEZ+ non lié. substrat-CEZ+ + glucose-6-phosphate substrat-CEZH + H+ + oxaloacétate substrat-CEZ+ + malate Lorsque ce système cyclique a amplifié suffisamment (c'est-à-dire produit suffisamment de malate et de 6phosphogluconate), il reste à arrêter les réactions enzymatiques par un système approprié et à mesurer le malate et/ou le 6-phosphogluconate formés par l'un quelconque des cinq systèmes suivants :: malate + ou pyruvate + CO2 + NADPH + malate + NAD+ oxaloacétate + NADH + a+ oxaloacétate + hydrazine - > oxaloacétate hydrazone ou malate + NAD+ oxaloacétate + NADH + oxaloacétate + glutamate aspartate + &alpha;;-cétoglutarate ou 6-phosphogluconate + ribuloso5-phosphate + CO2 + NADPH + ou 6-phosphogluconate + ribulose-5-phosphate + CO2 + NADPH + ribulos.-5-phosphate xylulose-5-phosphate xylulose-5-phosphate + ribose -5-phosphate sédoheptulose- 7-phosphate + glyciraldShyde-3-phosphate glyceraldihyde-3-phosphate + glycérate-3-pho.pbate + NADH + H Le coenzyme utilisé pour le marquage est le NAD+ ou un dérivé qui peut être dosé avec une grande sensibilité par un cycle enzymatique amplificateur.L'originalité du système selon l'invention tient à l'utilisation d'un nouveau cycle amplificateur et à la possibilité d'effectuer la mesure finale en spectrophototométrie ou en fluorimétrie. La présente invention a donc pour premier objet un procédé pour la réalisation de dosages par compétition, avec marquage et cycle enzymatique amplificateur, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation d'une molécule marquée avec un coenzyme qui peut être en pratique le NAD+ ou un dérivé du NAD+, la mise en compétition de la molécule à doser et de la molécule marquée avec le coenzyme vis-à-vis d'une substance ayant une affinité pour le substrat, la réalisation une fois l'équilibre de compétition atteint du cycle enzymatique amplificateur : substrat-CEZ+ + glucose-6-phosphate substrat-CEZH + H + oxaloacétate substrat-CEZ+ + malate, l'arrêt du cycle et la révélation du malate et/ou du 6-phosphogluocnate formés par un système choisi parmi l'un quelconque des 5 systèmes suivants malate + NADP+ oti pyruvate + C02 + NaDPH+ + balata + NAD oxaloacétato + NADH + oxaloacétate + hydrazine oxaloacêtate hydrazone ou malate + NAD+ oxaloacêtate + NPWE + a+ oxaloacétate + glutamate aspartate + a-cétcglutarate ou 6-phosphogluconate + ribulose-5-phosphate + CO2 + NADPH + 8+ ou 6-phosphogluconate + ribulos.-5-phosphate + C02 + NADPH * + ribulose-5-phosphate xylulose-5-phosphate xylulose-5-phosphate + ribose-5-pnosphate sEdoheptulose-7-phosphate + glycéraldéhyde-3-phosphate glycéraldéhyde-3-phosphate + glycérate- 3-phosphate + NADH + et la mesure finale du NAD(P) H formé en spectrophotométrie ou en fluorimétrie. De préférence, le coenzyme mis en oeuvre est du NAD+. En variante, on peut utiliser des dérivés du NAD+, tels que par exemple du N6-(2-carboxyméthyl)NAD ou du N6 (2-carboxyéthyl)NAD +, qui sont avantageusement en pratique des dérivés portant un groupement accessible, notamment un groupement carboxylique, destiné à permettre ou à faciliter la fixation sur la molécule à doser. La présente invention ne se limite pas à ces deux dérivés et d'autres dérivés peuvent être utilisés pour le marquage, suivant la nature des groupements réactionnels portés par la molécule à doser. Apres un temps que l'homme de métier est à mène de se fixer (temps qui est celui au bout duquel l'accumulation de 6-phosphogluconate et/ou de malate est au moins égal au immun décelable par le moyen utilisé, et qui peut être aisément deterainé après quelques essais de routine, si nécessaire), on bloque les réactions enzymatiques par tout moyen approprié et on procède à la révélation du malate et/ou du 6-phosphogluconate par l'un des systèmes susdits, et de préférence par le système oxaloacétate + hydrazinexaloacétate hydrazone, puis à une mesure finale du NAD(P) H formé en spectrophotometrie ou en fluorimétrie. L'homme du métier a simplement à choisir soit la fluorimétrie, soit la spectrophotométrie, en fonction de la gamme de sensibilité à explorer. En opérant selon l'invention, on peut atteindre en pratique une limite de détection de l'ordre de 5 à 10.10 8H en substrat dans le milieu biologique avec une mesure finale en spectrophotométrie, tandis que si l'on effectue la mesure finale en fluorimétrie, on peut atteindre une limite de détection de l'ordre de 2.5 à 10.10 9M. L'invention a également pour objet le système d'amplification susdit, caractérisé en ce qu'il comprend, asso ciés en des proportions appropriées, les produits et les enzymes réalisant les deux réactions suivantes substrat-CEZ+ - + glucose-6-phosphate. substrat-CEZH + H+ + oxaloacétate substrat-CEZ+ + malate En pratique, on réalise le cycle amplificateur décrit en laissant incuber les différents réactifs et enzymes mis en oeuvre, dans les proportions appropriées. L'invention a encore pour objet un système de dosage associant les moyens réalisant l'équilibre de compétition substrat-NAD + substrat + + (substrat NAD+)M, où M est tel que défini plus haut, le système d'amplification susdit, et des moyens de révélation du malate et/ou du 6-phosphogluconate formés et de mesure finale du NAD(P)H formé en spectrophotométrie ou en fluorimétrie. En variante, ce système peut faire intervernir, dans la constitution des moyens réalisant l'équilibre de comme pétition, non pas le NAD+ lui-même, mais des dérivés du NAD+, tel que par exemple du N6-(2-carboxyéthyl)NAD+ ; en pratique, on utilise comme dérivés du NAD+ des dérivés portant un groupement accessible, notamment un groupement carboxylique accessible. L'invention a en outre pour objet un ensemble ou "kit", pour la réalisation de dosages dans des fluides biologiques selon le procédé susdit, comprenant, dans des conteneurs appropriés - une substance ayant une affinité pour la molécule à doser, telle que par exemple un antisérum spécifique - cette molécule marquée au NAD+ ou avec un dérivé du NAD comme indiqué plus haut - un tampon du cycle amplificateur et les substrats spécifiques de ce cycle ainsi que les enzymes de ce cycle amplificateur ; - un tampon de révélation avec le(s) enzyme(s), le(s) coenzyme(s) de révélation et le(s3 substrat(s) de révélation s'il y a lieu - et éventuellement un (ou plusieurs) standard(s). Le procédé selon l'invention a été appliqué aux dosages sériques d'haptènes et on peut l'illustrer par les dosages de 3 antibiotiques : la gentamycine, la tobramycine et l'amikacin. Ce sont là de simples exemples d'application de l'invention ; ils ne limitent aucunement celle-ci, qui peut tout aussi bien s'appliquer par exemple à des dosages d'autres antibiotiques ou, en règle générale, de toutes subs- tances capables de former des anticorps, par exemple des médicaments, des hormones, des protides ou des substances xénobiotiques. On peut aussi envisager le dosage d'anticorps endogène au milieu biologique à l'åide de ce système. L'invention est décrite plus concrètement dans l'exemple ci-après, qui ne la limite aucunement et dans lequel les abréviations utilisées ont, de même que dans ladescription qui précède, les significations suivantes - Ac : anticorps - NAD : nicotinamide-adénine-dinucleotide - NADH : id., forme réduite - G-6-PDH : glucose-6-phosphate-déshydrogénase - MDH : maláte-deshydrogénase - NADP + : nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate - NADPH : id., forme réduite - ASAT : aspartate-aminotransferase - 6-PGDH : 6-phosphogluconate-déshydrogénase - GAPDH : glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase - NAD(P) H : NADH ou NADPH - CEZ :NAD ou dérivé de substitution EXEMPLE On a utilisé à titre d'exemple un antibiotique, et plus précisément la gentamycine. Le schéma de principe serait cependant rigoureusement le même pour chacun des deux autres aminoglycosides que sont l'amikacin et la tobramycine. 1. Synthèse de l'haptène marqué La gentamycine ne peut être couplée directement au NAD+. On a donc utilisé pour la synthèse du produit marque un dérivé convenable du NAD+ ; -en l'occurence un dérivé portant un groupement carboxylique accessible et plus précisément le N6-(2-carboxyéthyl)NAD . On a dissous 1 g de gentamycine base dans 5 ml de H20 et on a amené le pH aux environs de 7.0. On a ajouté alors 100 mg de N6-(2-carboxyéthyl)NAD+ et on a ajusté le pH à 4,7-. On a ensuite ajouté 500 mg de chlorhydrate de 1-éthyl-(3-diaminopropyl)carbodiimide dissous dans 2 ml de H20.Le pH a été maintenu à 4,7 pendant 3 heures, apures quoi il a été amené à 7,0 et la solution a été appliquée 1 a sur une résine échangeuse Dowex C1 (2,6 x 40 cm). On a élué avec H20 jusqu'a la sortie du volume mort. Le pic élué absor banda 254 nm à été récupéré et concentré sous pression réduite. Cette solution a ensuite été appliquée sur une colonne de Sephadex G15 (2,6 x 60 cm). On a élué avec de l'eau et on a récupéré la fraction absorbant à 254 nm. Cette fraction a été concentrée sous 0,5 mm de Hg à 30 C et appliquée sur une colonne Bio-Rex 70 (2,6 x 40 cm), prealablement équi librée avec de l'acétate ammonique 20mM. On a élué de la manière suivante - NH4OCOCH32O mn : jusqu'à la sortie du volume mort - NH40COCH320 mM à NH4OCOCH3 50mM : selon un gradient liné aire de 4 heures. Dans chaque fraction éluée absorbant à 254 nm, on a dosé le dérivé de NAD (activité coenzymatique) et la gentamycine (par dosage radioimmunologique) et on a récupéré le premier pic important absorbant à 254 nm et contenant du dérivé de NAD+ et de la gentamycine. La fraction a été de nouveau réduite de volume et appliquée sur du Biogel P4. On a obtenu 3 fractions absorbant à 254 nm et la deuxieme fraction, contenant du dérivé de NAD+ et de la gentamycine, a été récupérée et concentrée sous pression réduite jusqu'à un volume de + 5 ml. Cette solution de gentamycine dérive NAD+ a été conservée telle quelle à -300C. On a mesuré son contenu en dérivé de NAD+ en utilisant la réaction classique comme décrit par Bergmeyer dans Methoden der enzymatischen Analyse, 3ème édition, 1974, Verlag Chemie, Weinheim, RFA. 2. Cycle amplificateur MDH-G-6-PDH Pour realiser ce cycle permettant d'amplifier une faible quantité d'haptène-NAD +, on a utilisé de la MDH de coeur de porc et de la glucose-6-phosphate-déshydrogénase de Leucohostomésentéroides, mais on aurait aussi bien pu choi sir toute autre source d'enzyme convenable. 2.1. Purification des enzymes Les enzymes, étant contaminées par du NAD+ et/ou du NADR, ont dt être purifees par chromatographie de filtra tion sur gel (Sephadex G25) (toute autre méthode adéquate pouvant également convenir). Les contaminants seraient parti -culièrement gênant, car leur vitesse de cycle est beaucoup plus grange que celle de l'haptène-NAD+ et ils donneraient des blancs très importants. 2.2. Réalisation du cycle Le réactif de cycle avait la composition sui vante : tampon Tris 0,2 N, glucose-6-phosphate 12 mn, oxalo acétate 12 mM, mercaptoéthanol 12 BM (qui peut être remplacé par la. même concentration en dithiothréitol ou le glutathion réduit). Ce réactif peut être conservé à -30eC pendant plu sieurs mois. Juste avant son utilisation, on a ajouté au réactif refroidi dans un bain de glace la HDH et la G-6-PDH purifiées aux concentrations finales de 40 g/ml et 200 g/ml. A 50 pl de la solution ainsi préparee, on a ajouté 50 jil, d'haptène-NAD+ dont la concentration en NAD+ était comprise entre 3,10 8M et 7,10-7M. On a porté au bain marie à 300C pendant 1 heure. Les réactions enzymatiques ont été arrêtées par chauffage au bain marie bouillant pendant 3 minutes. Après refroidissement, on a pu révéler les produits formés par une des 5 réactions citées plus haut. Dans le domaine des concentrations utilisées, il a été plus aisé d'utiliser la révélation oxaloacétate + hydrazine-Boxaloacétate hydrazone. A 100 til de solution, on a ajouté 0,5 ml de solution de révélation comprenant : aminométhylpropanol O,1M, hydrazine 0,2. N, NAD+ 2 mM et MDH 20 g/ml (pH = 10,0). On a laissé réagir 30 minutes à température ambiante de manière ce que le malate ait réagi. On a alors lu l'absorbance au spectrophotomètre à 340 nm. L'absorbance était proportionnelle à la quantité d'haptène-NAD+ introduite dans le cycle. 3. Dosage (dans le cas présent, dosage immunochimique) 3.1 Inhibition du cycle par de l'antiserum I1 est raisonnable de penser que, lorsque l'haptène-NAD+ est lié à l'anticorps, la partie NAD+ du dérive perd une grande partie de son activité coenzymatique. On a vérifié cela en incubant une quantité constante d'hap tbne-NAD+ avec des quantités croissantes d'anticorps. Une aliquote a alors été reprise et introduite dans un cycle amplificateur. On a ainsi pu mettre en évidence l'inhibition du cycle par l'anticorps. A 50 jil de gentamycine-derive NAD+ 2,10 6H en dérivé de NAD+, on a ajouté 0, 10, 20, 30, 40, 50 d'antisérum anti-gentamycine (Atlantic Antibodies GEN 074 01), dilué 10 fois dans.du tampon Tris 50 mM, pH = 8,5. On a complété par 100, 90, 80, 70, 60, 50 p1 du même tampon Tris 50 mM, pH 8.5. Lorsque l'équilibre etait atteint, on a prélevé une aliquote de 50 pl que l'on a traitée selon le cycle amplificateur comme ci-dessus. On a porté l'absor bance finale à 340 nm en fonction de la quantité d'antisérum 1/10 ajoutée. Les résultats obtenus sont rapportés sous forme graphique sur la Figure 1 ci-annexée, qui représente la courbe d'inhibition pour la gentamycine-dérivé NAD+ considéré, à savoir : gentamycine couplée au N6 -(2-carboxyéthyl)NAD+ (courbe en trait continu). Ce dérivé a ete inhibé par un antisérum anti gentamycine. 3.2. Levée de l'inhibition par de la gentamycine Pour que ce système permette de réaliser un dosage quantitatif, il était nécessaire de lever l'inhibition par l'haptène libre ; pour ce faire, on a incubé une quantité fixe d'haptene libre et d'haptène-NAD+ avec des quantités croissantes d'anticorps et, une fois l'équilibre de compé tition atteint, on a réalisé le cycle amplificateur. On. a réalisé cela avec la gentamycine-dérivé NAD+ cité plus haut. Le milieu d'incubation avec l'antisérum contenait 0,17 pg/ml de gentamycine libre. A 50 l de gentamy cine-dérivé NAD+ 2,10-6 M en dérivé NAD contenant 0.5 g/ml de gentamycine, on a ajouté 0, 10, 20, 30, 40, 50 ?l d'anti sérum anti-gentamycine dilué 10 fois dans un tampon Tris 50 mM, PH 85. On a complété à 150 ul avec le meme tampon. Après 1 heure, on a prélevé 50 pl, que l'on a amplifiés à l'aide du cycle, comme indiqué plus haut. On a ensuite porté l'absorbance en fonction de la quantité d'antisérum (courbe en trait pointilé sur la Figure 1). Comme on le voit, la différence entre les 2 courbes est la meilleure, pour le dérivé de gentamycine obtenu par couplage au N6-(2-carboxyéthyl)NAD+, avec une quantité d'antisérum 1/10 de 30 l environ. 3.3 Réalisation du dosage On a réalisé une courbe d'étalonnage en haptène dans du sérum. Pour la gentamycine, on a utilisé une gamme de 1- & 20 mg/l. Avant le dosage, on a dilué 11 fois dans du tampon Tris 50 mM, pH 8,5, les standards et les échantillons inconnus. A 50 111 de gentamycine-dérivé NAD+ 2,10 6 M en dérivé de NAD+, on a ajouté 50 pl de standard ou d'échantillon dilué et 50 r1 d'antisérum dilué 12 fois dans du Tris 50 mN;, pH 8,5. Après 1 heure, on å prélevé 50 r1 que l'on a ajoutée à 50 rl de réactif de cycle. Après 1 h d'incubation, on a arrêté le cycle par chauffage, 3 minutes au bain-marie bouillant. Après refroidissement, on a ajouté 0,5 ml de réactif de révélation. Lorsque la révélation était terminée, on a mesuré l'absorbance à 340 nm. Les résultats peuvent se lire sur la figure 2 des planches de dessins ci-annexées, où est portée en ordonnée la différence As340 nm -A 340 nm représentant l'absorbance des'standards moins l'absorbance du zéro, en fonction de la concentration en gentamycine. Les échantillons inconnus sont ensuite mesurés par interpolation sur la courbe obtenue. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la réalisation de dosages par compétition, avec marquage et cycle enzymatique amplificateur, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation d'une molécule marquée par un coenzyme choisi parmi le NAD+ ou un dérivé du NAD+ (notésCEZ+), la mise en compétition de la molécule à doser (substrat) et de la molécule marquée avec le coenzyme (substrat-CEZ+) vis-à-vis d'une substance ayant une affinité pour le substrat, la réalisation, une fois l'équilibre de compétition atteint, du cycle enzymatique amplificateur substrat-CEZ+ + glucose-6-phosphate substratcEZE + H+ + oxaloacétate substrat-CEZ+ + malate, l'arrêt du cycle et la révélation du malate et/ou du 6-phosphogluconate formés par un système choisi parmi l'un quelconque des 5 systèmes suivants malate + ou pyruvate + CO2 + ANADPH + malate + NAD+ oxaloacéate + NADE + oxaloacétate + hydrazine - > oxaloacétate hydrazone ou malate + oxaloactate + NADH + oxaloacetate + glutamate ou aspartate + &alpha;;-cétoglutarate 6-phosphogluconate + NADP+ ou ribulose-5-phosphate + CO2 + NaDPH + H+ 6-phosphogluconate + NADP+ ribulose-5-phosphate + C02 + NADPH + B+ ribulose-5-phosphate xYlUlose-5-phosphate xylulose-5-phosphate + ribose-5-phosphate Sédoheptulose- 7-phosphate + glyceraldehyde-3-phosphate glyciraldshyde-3-phosphate + glycdrate-3-phosphate + NADH + et la mesure finale du NADPH (NADH) formé en spectrophotométrié ou en fluorimétrie. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la molécule à doser le substrat est contenue dans un fluide biologique et la substance ayant une affinité pour le substrat est un anticorps spécifique dirigé contre lui. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le coenzyme est un dérivé du NAD+ portant un groupement carboxylique accessible, et notamment du 16-(2-carboxyméthyl)NAD+ ou du N6 -(2-carboxyethyl)NAD+. 4. Système d'amplification, caractérisé en ce qu'il comprend1 associés en des proportions appropriées, les produits et les enzymes réalisant les deux réactions suivantes: substrat-CEZ+ + glucose-6-phosphate substratEZE + H+ + oxaloacétate + malate 5, Système de dosage, caractérisé en ce qu'il associe les moyens réalisant l'équilibre de compétition substrat-CEZ+ + substrat + N substrat-N + (substrat-CEZ+ )N, où N représente une substance ayant une affinité pour le substrat tandis que CEZ+ représente le NAD+ lui-même ou un dérive de celui-ci, avec le système d'amplification selon la revendication 4 et avec des moyens de révélation du malate ettou du 6-phosphogluconate formés et de mesure finale du NADP (MATH) formé en spectrophotométrie ou en fluorimétrie. 6. Système de dosage selon la revendication 5, caractériaé en ce que la substance ayant une affinité pour est un le substrat, la molécule à doser,lanticorps spécifique dirigécontre lui. 7. Système de dosage selon l'une des revendications 5- ou 6, caractérisé en ce que le dérivé de NAD+ est -choisi parsi'les dérivés du NAD+ portant un groupement carboxylique accessible, et notamment du N6 -(2-carboxyméthyl)NAD+ ou du N6 -(2-carboxyéthyl)NAD+. 8. Ensemble pour la réalisation de dosages dans des fluides biologiques par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend, dans des conteneurs appropriés - une substance ayant une affinité pour la molécule à doser - cette molécule marquée par le NAD ou par un dérivé du NAD+ ; - un tampon du cycle amplificateur et les substrats spécifiques de ce cycle, ainsi que les enzymes de ce cycle amplificateur - un tampon de révélation avec le(s) enzyme(s), le(s) coenzyme(s) de révélation et le(s) substra - et éventuellement un (ou plusieurs) standard(s). 9. Ensemble selon la revendication 8, caractérisé en ce que la substance ayant une affinité pour le substrat à doser est un antisérum.