Brevet FR2518754A1 — publié le 19830624

La présente invention est relative à un procédé et à une préparation pour le dosage de la quantité de substances qui se fixent sur des récepteurs cérébraux (principalement des benzodiazépines, des substances ss-bloquantes adré- nergiques et de l'acide y-aminobutyrique). La présente invention est également relative à la production de la préparation destinée à être utilisée dans ce dosage. En thérapeutique, il est fréquemment nécessaire dans des buts diagnostiques et/ou thérapeutiques de doser la quantité des substances qui se fixent sur des récepteurs cérébraux, qui sont présentes dans les fluides corporels. C'est ainsi par exemple que l'on peut tirer des conclusions concernant certaines ancéphaloses, de la teneur du liquide spinal en acide y-aminobutyrique. L'on sait également que les fluides corporels contiennent habituellement la substance à doser à une concen tration très faible (de l'ordre de 10 à 10112 mole), en sorte que la mesure de leur quantité requiert des méthodes spéciales, très sensibles. Des méthodes appropriées par spectrométrie de masse, par chromatographie en phase liquide de forte puissance et par fluorométrie par échange d'ions,pour le dosage de la teneur en acide y-aminobutyrique, sont décrites dans les publications suivantes : J. Chromat. 118, 395 (1976), Brain Res. 167, 297 (1979) et Anal. Biochemistry 101, 349 (1980). Bien que les méthodes qui viennent d'être énumérées soient suffisamment sensibles, elles présentent l'inconvénient commun de ne pas permettre l'utilisation directe de l'échantillon biologique à examiner, lors de la mesure, mais ne permettent son utilisation qu'après une préparation compliquée de l'échantillon (purification comprenant plusieurs étapes, préparation d'un dérivé, etc.). Pour la mise en oeuvre du test des radio-récepteurs qui a été développé récemment pour le dosage de la teneur en acide y-aminobutyrique /J. Neurochem. 28, 1121 (1977), Brain Res. 182, 99 (1980), Clinica Chimica Acta 109, 77 (1981)7 il n'est pas nécessaire de soumettre le fluide corporel à examiner à un traitement préalable. L'inconvénient de ce test réside cependant en ce que la suspension de récepteurs nécessaire pour réaliser l'examen doit être fraicnement préparée chaque fois, par les méthodes connues, à partir de cervelles d'animaux expérimentaux. Dans ce but, il est nécessaire d'entretenir une animalerie et un laboratoire biochi mique spécial, ce dont ne disposent généralement pas les hôpitaux et les cliniques.Il est donc nécessaire de pouvoir disposer d'une préparation de récepteurs qui puisse se cùnser- ver à l'état sec pendant un temps illimité et puisse être utilisée de façon fiable pour le dosage de la quantité de substances qui se fixent sur des récepteurs cérébraux. La production d'une préparation de récepteurs sèche, qui puisse se conserver indéfiniment et qui soit d'ur. maniement simple, est décrite dans la Demande de Brevet allemand publiée avant examen nO 29 02 071. Selon le procédé connu décrit dans cette Demande de Brevet, la préparation de récepteurs est produite en homogénéisant du- tissu encéphalique animal avec une solution aqueuse d'une substance neutre, hydrosoluble, avantageusement du saccharose, et en lyophilisant 1 'homogénéisat. L'inconvénient de la préparation de récepteurs connue réside cependant en ce qu'elle ne peut être utilisée que pour le dosage de la quantité de benzodiazépines et que, de plus, elle ne convient pas -pour la mesure séparée des différents types de benzodiazépines. Le dosage de la quantité d'autres substances qui se fixent sur des récepteurs cérébraux, par exemple d'acide y-aminobutyrique et de ss-bloquants adré nergiquesntest pas possible avec la préparation de récepteurs connue. Au cours de ses recherches, la Demanderesse a observé que ce défaut peut être attribué au fait que la préparation de récepteurs connue contient la majeure partie des récepteurs cérébraux sous une forme inactivée par des substances endogènes. En éliminant complètement les substances endogènes inactivantes, les sites des récepteurs cérébraux peuvent être libérés et la préparation peut ainsi doser chaque substance qui peut se combiner à des récepteurs cérébraux. La présente invention a en conséquence pour objet un procédé de production d'une préparation de récepteurs stables,qui convient au dosage de la quantité de substances qui se fixent sur des récepteurs cérébraux. Conformément d l'invention, on centrifuge un homogénéisat de cerveau ou d'une partie de cerveau préparée avec une solution aqueuse d'une substance hydrosoluble inerte, à une vitesse de 800-1100 g, pendant 8 à 20 minutes, on sépare le surnageant et on centrifuge pendant 10 à 20 minutes à une vitesse de 18 000 - 22 000 g, on homogénéise à nouveau la substance solide ainsi obtenue, dans de l'eau distillée, on congèle l'homogénéisat, si on le désire, et on le décongèle, puis on centrifuge pendant 5 à 15 minutes à une vitesse de 7000-9000. g, on sépare le surnageant et on centrifuge pendant 20 à 30 minutes à une vitesse de 35 000 à 45 000 g, puis on lave au moins une fois la substance solide obtenue avec une solution tampon aqueuse à pH compris entre 6 et 8, on congèle et on décongèle au moins une fois, si on le désire, pendant le lavage, une suspension obtenue à partir de la substance solide et du liquide de lavage, et on lyophilise enfin la suspension. L'on obtient par ce procédé, une préparation de récepteurs solide, stable, de conservation illimitée, qui contient tous les sites des récepteurs cérébraux à Pétant actif et qui convient d'une façon générale pour le dosage de la quantité de toutes les substances qui peuvent se combiner avec les récepteurs-cérébraux, dans le test des radio-récepteurs. L'on a avantage à utiliser comme substance de départ une cervelle d'animal (de rat, de boeuf, de volaille, etc.) à partir de laquelle un homogénéisat de cervelle est préparé de la manière décrite dans la Demande de Brevet allemand publiée avant examen nO 29 02 071. L'on ajoute avantageusement du saccharose en tant que substance inerte, hydroso luble, au milieu aqueux. La première centrifugation réalisée à une vitesse de 800-1100 g permet la séparation du précipité grossier d'homogénéisat de cervelle ou d'une partie de cervelle ; le surnageant contient l'élément de ase de la préparation de récepteurs.Cet élément de base de la préparation de récepteurs est séparé du surnageant avec des noyaux de cellules et des mytoc-hondries, à l'état impur, par la deuxième étape de centrifugation réalisée à une vitesse de 18000-22000 g. L'élément de base de lapréparationderécep teurs contient, dans cette- étape, la majorité prédominante des sites de récepteurs actifs encore à l'état inactivé par les substances endogènes Cette substance solide est alors à nouveau homogénéisée dans de l'eau distillée. Puis les membranes cellulaires se rompent et les substances endogènes qui bloquent les sites des récepteurs actifs passent dans le milieu aqueux. La nouvelle homogénéisation a avantageusement lieu dans de l'eau distillée froide (à 4-100C).Pour réaliser la nouvelle homogénéisation d'une partie en poids de substance solide on utilise avantageusement au moins 15 parties en poids d'eau distillée. En général on élimine d'autant plus efficacement les substances endogènes bloquantes des sites récepteurs actifs que l'on utilise plus d'eau distillée pour la nouvelle homogénéisation. La limite supérieure de la quantité d'eau distillée est essentiellement déterminée par un point de vue économique. Pour homogénéiser une partie en poids de substance solide,. on utilise généralement de 10 à 20 parties en poids d'eau distillée. Pour accélérer la rupture des membranes cellulaires, on peut, si on le désire, congeler et décongeler l'homogénéisat qui contient l'eau distillée. Les noyaux cellulaires et les mytochondries qui ne contiennent pas de sites récepteurs actifs et dont la présence influencerait de façon désavantageuse les propriétés (par exemple la filtrabilité) de la préparation de récepteurs sont éliminés de l'homogénéisat qui contient l'eau distillée, par la première centrifugation réalisée à une vitesse de 7000 à 9000 g. L'élément debase de la préparation est séparé du surnageant par la centrifugation suivante réalisée à une vitesse de 35 000 à 45 000 g, et cet élément de base de la préparation est alors lavé au moins une fois avec une solution tampon aqueuse dont le pH est compris entre 6 et 8 -avantageusement avec une solution tampon tris-citrate (pH = 7,1)-.Le rendement de la purification peut être augmenté en congelant et décongelant au moins une fois, pendant le lavage, la suspension obtenue à partir du liquide de lavage et de la substance solide. Lorsqu'on lave une seule fois, le liquide de lavage est éliminé et la substance solide obtenue est mise en suspension dans une solution tampon aqueuse en quantité connue et à teneur en sel connue. Cette suspension est lyophilisée. Lorsque la substance solide est lavée à plusieurs reprises, la suspension formée directement avec le dernier liquide de lavage est lyophilisée ; la quantité et la teneur en sel du liquide de lavage (solution tampon) doivent naturellement également être connues en pareil cas. La préparation de récepteurs solide, stable, obtenue de cette manière, peut être utilisée comme suit pour le dosage de la quantité de substances qui se fixent sur des récepteurs cérébraux On ajoute à la solution aqueuse qui contient la substance à examiner marquée par un isotope radioactif (habituellement par du tritium), la suspension de la préparation de recepteurs obtenue au moyen d'une solution tampon aqueuse à pH compris entre 6 et 8 ou d'eau distillée. Le mélange est incubé, puis la substance solide est séparée par filtration, lavée avec de la solution tampon et la radioactivité de la substance solide est déterminée.On ajoute alors à la préparation de récepteurs qui porte la substance à examiner marquée par un isotope radioactif, une quantité connue de substance à examiner non radioactive, on incube le mélange, on sépare la substance solide par filtration, on lave à l'aide d'une solution tampon et on mesure à nouveau la radioactivité. Cette dernière opératipn est répétée à plusieurs reprises avec différentes quantités connues d'une substance à examiner non radioactive. Sur la base des résultats de mesures, on établit une droite de calibrage concentration/radioactivitd (on désigne par "concentration" la concentration de la substance à examiner non radioactive). La quantité de substance à examiner présente dans le fluide corporel (par exemple dans le liquide spinal) est dosée à l'aide des droites de calibrage précitées en ajoutant à la préparation de récepteurs qui porte la substance à examiner, marquée par un isotope radioactif, une quantité connue de fluide corporel, en incubant le mélange, en séparant la substance solide par filtration, en lavant celle-ci et en mesurant sa radioactivité et en lisant sur les droites de calibrage la concentration correspondant à la valeur mesurée. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, que se réfère à des exemples de production de préparations de récepteurs et de dosage à l'aide de ces préparations. il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de production de préparations de récepteurs et de dosage à l'aide de ces préparations, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 Production d'une préparation de récepteurs On décapite des rats mâles ae souche CFY. On prélève immédiatement leur cervelle et on la lave avec une solution physiologique glacée de chlorure de sodium. La partie de la cervelle dénommée "calotte" et la partie occipitale de la cervelle ont été enlevées et on a formé un homogénéisat à partir du résidu avec une solution aqueuse 0,32 molaire de saccharose dont le volume est 15 fois celui du résidu. L'homogénéisat est centrifugé pendant 10 minutes à une vitesse de 1000 g, puis le surnageant est séparé et centrifugé pen- dant 10 minutes à une vitesse de 20 000 g.La substance solide qui se sépare est à nouveau homogénéisée dans de l'eau distillée froidé (d + 40C) qui représente 15 fois le volume de la substance solide, puis l'homogénéisat est centrifugé pendant 10 minutes à une vitesse de 8000 g. Le surnageant est séparé et centrifugé pendant 20 minutes à une vitesse de 40 000 g. La substance solide obtenue est homogénéisée dans 50 fois son volume d'une solution tampon 50 millimolaire de tris-citrate (à pH = 7,1) et la suspension est à nouveau centrifugée à une vitesse de 40 000 g. La dernière étape de lavage est répétée. La substance solide est alors mise en suspension dans de la solution tampon qui représente 10 fois son volume et elle est congelée et maintenue pendant 10 heures à - 200C. La suspension est décongelée, diluée jusqu'S 5 fois son volume à l'aide d'eau distillée et à nouveau centrifugée d une vitesse de 40 000 g. Ce cycle congélation-décongélation-centrifugation est répété 3 fois. Après la dernière decongélation, la suspension est divisée en plusieurs parties, congelée et lyophilisée. On obtient une préparation de récepteurs pulvérulente qui est délayée avec de la solution tampon ou de l'eau distillée avant d'être utilisée (pour la mesure). La préparation de récepteurs pulvérulente peut être stockée-pendant des années sans modification. EXEMPLE 2 Etablissement de la courbe de calibrage pour le test des radio-récepteurs. Pour établir la courbe de calibrage on utilise des solutions ou des suspensions présentant la composition suivante Solution I.a : 0,7435 g NaCl, 0,0186 g KCl, 0,0144 g CaCl2, 0,012 g MgSO4 dissous dans 10 ml d'eau bidis tillée. Solution I.b : 1 g de serumalbumine de boeuf dissous dans 10 ml de solution I.a. Solution II.a: 1 mg d'acide y-aminobutyrique dissous dans 1000 iil de solution V. Solution II.b : mélange de 10 l de solution II.a et de 10 ml de solution V. Solution II.c : mélange de 100 iil de solution II.b et de 900 l de solution V. Solution II.d : mélange de 750 l de solution II.c et de 250 l de solution V. Solution II.e : mélange de 500 l de solution II.c et de 500 iil de solution V. Solution II.f : mélange de 250 iil de solution II.c et de 750 l de solution V. Solution II.g : mélange de 100 l de solution II.c et de 900 l de solution V. Suspension III : 0,2 g de préparation de récepteurs produite suivant l'exemple 1 sont mis en suspension dans 3 ml d'eau bidistillée, puis ia suspen sion est diluée par 17 ml de solution V. Solution IV : solution d'acide 3H-y-aminobutyrique présentant une activité de 40 nCi/500 iil (solvant : solu tion aqueuse d'acide chlorhydrique à pH 4). Solution V : solution tampon tris-citrate 50 millimolaire (pH = 7,1) (a) Détermination de la capacité defixationtotale (valeur de Cc) On mélange successivement les solutions ou les suspen sions suivantes 500 l de solution IV, 10 l de solution I.b, 10 ijl de solution Vet 500 l de suspension III. Le mélange est incubé durant 20 minutes à 40C, puis la substance solide est filtrée sur un filtre Micropore en fibres de verre du type Whatman GF/C. La substance solide est délayée avec 10 ml de solution de mesure par scintillation en phase liquide, de composition connue, la suspens ion est abandonnée pendant 1 heure au réfrigéra teur, puis secouée et la radioactivité de la suspension est déterminée. La valeur de radioactivité ainsi obtenue est désignée par C c ceci représente la quantité totale d'acide y-aminobutyrique pouvant entre fixée par la pré paration. (b) Abaissement de la teneur en acide y-aminobutyrique mar qué par un isotope radioactif par de l'acide y-amino butyrique non radioactif L'on procède comme décrit dans le paragraphe (a) mais au lieu de 10 ml de solution V on utilise successive ment chaque fois 10 ml de solution II.c, II.d, II.e, II.f et II.g, respectivement. Les valeurs de radioacti vité mesurées sont désignées par Cx (c) Détermination de la quantité d'acide y-aminobutyrique non spécifiquement fixée (valeur i) On procède comme décrit dans le paragraphe (a) ci-dessus, mais on utilise à la place de 10 l de solution V, 10 iil de solution II.a.Dans ce cas la quantité totale de l'acide 3H-y-aminobutyrique spécifiquement fixée est abaissée par l'acide y-aminobutyrique non radioactif de la préparation. On obtient le facteur de correction qui caractérise la quantité de l'acide 3H-y-amine- butyrique qui ne se fixe pas spécifiquement à la prépa ration, par la mesure de la radioactivité de l'dchan- tillon. Ce facteur de correction (valeur Cb) est déduit des valeurs C c et Cx lors de l'établissement des droites de calibrage. Les résultats des mesures sont réunis dans le tableau I qui va suivre. TABLEAU I Désignation Concentration de Impulsions de C - Cb de la l'acide y-amino- comptage/ c b solution butyrique inactif minute Cx - Cb nM II.a 105 160 II.c 10 2049 2,15 II.d 7,5- 2367 1,84 II.e 5,0 278D 1,55 II.f 2,5 3284 1,30 II.g 1,0 3754 1,13 V. - 4221 1,00 Si on représente les valeurs C -C /C -C en fonction de la concentration de l'acide y-aminobutyrique inactif, on obtient la droite de calibrage. Pour déterminer la concentration en acide y-aminobutyrique du fluide corporel, on ajoute au mélange 10 iil de fluide corporel à la place de 10 iil de solution tampon (solution V) ou de solution d'acide y-aminobutyrique inactif de concentration connue, puis on mesure la radioactivité de la préparation et on lit sur la droite de calibrage la concentration en acide y-aminobutyrique qui correspond à la radioactivité mesurée. EXEMPLE 3 Dosage de la quantité d'autres substances qui se fixent spécifiquement sur des récepteurs cérébraux 3.1 Dosage du 3H-diazépam On met en suspension 5 mg de la préparation de récepteurs lyophilisée produite conformément à l'exemple 1, dans un mélange de 0,9 ml de solution tampon aqueuse tris-citrate (pH = 7,1) et de 0,1 ml d'eau bidistillée. On ajoute à la suspension 2 nM de 3H-diazépam, on incube pendant 30 minu tes à 40C, puis on filtre la substance solide sur un filtre Micropore en fibres de verre de type Whatman GF/C et on lave à 8 reprises à l'aide de 2,5 ml de solution tampon tri-citrate glacée. La radioactivité est mesurée comme indiqué dans l'exemple 2.On détermine ainsi la capacité totale de fixation (Cc) de la préparation. La droite de calibrage est établie à l'aide de la méthode de diminution décrite à l'exemple 2 et la quantité de 3H-diazépam fixée de façon non spécifique (facteur de correction Cb) est déterminée comme dans l'exemple 2. 3.2 Détermination du 3H-diazépam dépendant de l'acide y-aminobutyrique On procède comme décrit à l'exemple 3.1 en ajoutant cepen dant encore au mélange d'incubation 2 X 10 5 moles d'acide y-aminobutyrique. 3.3 Détermination de l'acide 3H-y-aminobutyrique dépendant du Ca2+ On met en suspension 5 mg de la préparation de récepteurs lyophilisée obtenue conformément à l'exemple 1, dans un mélange de 0,9 ml de solution tampon tris-HCl (pH = 7,4) et de 0,1 ml d'eau bidistillée. On ajoute à la suspension 250 nM de chlorure de calcium, 40 ssM d'isoguvacine et 5,4 FM d'acide 3H-y-aminobutyrique. Le mélange est incubé pendant 30 minutes à la température ambiante, puis la substance solide est filtrée et lavée à la température ambiante à l'aide d'une solution tampon tris-HCl (pH = 7,4).La radioactivité est mesurée comme dans l'exemple 2 le facteur de correction (Cb) est déterminé comme décrit à l'exemple 2 3.4 Dosage du 3H-dihydroalprénolol On met en suspension 5 mg de la préparation de récepteurs lyophilisée obtenue conformément à l'exemple 1, dans un 1 ml de solution tampon tris-HCl (pH = 8,0). On ajoute à la suspension 2 nM de 3H-dihydroalprénolol, on incube pendant 30 minutes à la température ambiante, puis on filtre la substance solide et on la lave à la température ambiante à l'aide d'une solution tampon tris-HCl (pH = 8,0) La radioactivité est mesurée comme décrit à l'exemple 2 le facteur de correction (Cb) est déterminé selon la méthode décrite à l'exemple 2. La quantité (Cc - Cb) de 3H-ligands fixée de façon spécifique est indiquée dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU II Numéro d'exemple 3H-ligand fixé de façon spécifique fMole/ml fMole/ml 3.1 - 111 3.2 231 3.3 22 3.4 19 3.4 19 Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven- tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matiere, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1) Procédé de production d'une préparation de récepteurs stable, qui convient au dosage de la quantité de substances qui se fixent sur des récepteurs cérébraux, dans lequel un homogénéisat de cervelle ou d'une partie de cervelle préparé avec une solution aqueuse d'une substance hydrosoluble inerte, est centrifugé pendant 8 à 20 minutes à une vitesse de 800-1100 g et l'élément de base de la préparation est séparé du surnageant, lequel procédé est caractérisé en ce que le surnageant est centrifugé à une vitesse de 18 000 à 22 000 g pendant 10 à 20 minutes, la substance solide ainsi obtenue est homogénéisée nouveau dans de l'eau distillée, l'homogénéisat est congelé et décongelé, si on le désire, puis centrifugé pendant 5 à 15 minutes à une vitesse de 7 000 à 9 000 g, le surnageant est séparé, centrifugé pendant 20 à 30 minutes à une vitesse de 35 00( > à 45 000 g, la substance solide obtenue est lavée au moins une fois à l'aide a d'une solution tampon aqueuse dont le pH est compris entre 6 et 8, la suspension constituée par la substance solide et liteau de lavage est, si on le désire, congelée et décongelée au moins une fois pendant le lavage et enfin la suspension est lyophilisée d'une manière connue. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la nouvelle homogénéisation est réalisée dans de l'eau distillée à une température comprise entre 4 et 100C. 3) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'on utilise 10 à 20 parties en volume d'eau distillée pour une partie en volume de substance solide, pour la nouvelle homogénéisation. 4) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise pour le lavage une solution tampon de tris-citrate- à pH = 7,1. 5) Préparation de récepteurs caractérisée en ce qu'elle est préparée en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6) Procédé de dosage de la quantité de substances qui se fixent sur des récepteurs cérébraux, au moyen d'un test de radio-récepteurs connu en lui-même, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre pour le test une préparation de récepteurs constituée par une substance préparée conformément à l'une quelconque des revendications 1 à 4. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on dose la quantité d'acide y-aminobutyrique présente dans le liquide spinal.