Brevet FR2519845A1 — publié le 19830722

La présente invention concerne la conservation par congélation d'embryons de mammifères. De tels embryons trouvent application dans la transplantation embryonnaire. On connait dans l'art antérieur des petits tubes en matière plastique, dénommés paillettes, contenant des spermatozoides dans un liquide approprié. Par ailleurs, on sait que, pour congeler un embryon, il faut utiliser un cryoprotecteur. Cependant le retrait de ce cryoprotecteur après décongélation est nécessaire pour assurer une viabilité ultérieure de l'embryon. On a proposé la congélation d'un embryon bovin dans une paillette d'une structure différente de celle de la présente invention, dans laquelle il n'est pas prévu la dilution du cryoprotecteur après décongélation. La présente invention fournit une paillette d'une structure nouvelle, qui permet de retirer le cryoprotecteur sans manipuler l'embryon. Dans la paillette selon la présente invention, embryon est conditionné avant la congélation et ladite paillette est utilisée en l'état au moment de la transplantation. La présente invention propose une paillette scellée avec laquelle il n'est plus nécessaire d'effectuer de nombreuses manipulations de l'embryon, comme cela était le cas avec la technique antérieure. Ainsi, plus pré- aisément, un seul conditionnement est maintenant nécessaire, savoir celui utilisé pour la mise en place dans l'utérus de la femelle réceptrice. Grâce à la paillette selon l'invention, on peut utiliser l'embryon congelé, à la ferme, sans aucune manipulation à l'échelle microscopique. On peut stocker dans un récipient cryogénique transportable les embryons immédiatement disponibles. Toutes les techniques selon l'art antérieur nécessitaient auparavant l'intervention obligatoire d'un biologiste pour, après décongélation, manipuler l'embryon sous loupe binoculaire. La présente invention a pour objet une paillette pour la conservation par congélation d'embryons de mammifères dans un milieu de conservation capable d'être congelé et décongelé et comprenant une substance cryoprotectrice (ou cryoprotecteur) qui pénêtre à l'intérieur des cellules de l'embryon, ladite paillette étant caractérisée en ce qu'elle est scellée à ses extrémités jusqu'au moment de l'utilisation dans le mammifère et en ce que l'embryon dans le milieu de conservation par congélation est entouré respectivement - (A) d'une part, successivement en direction d'une extrémité, (a) d'un mélange gazeux, (b) d'un milieu de culture,.et (c) d'un premier bouchon extrême de scellement, - (B) et d'autre part, successivement en direction de l'autre extrémité, (d) d'une bulle de gaz, (e) d'une solution d'au mo.ins une substance miscible à l'eau, peu ou pas toxique à la température ambiante vis-à-vis de l'embryon, qui ne pénètre pas à l'intérieur des cellules de l'embryon mais qui assure à l'extérieur de celui-ci une pression osmotique suffisante pour permettre une diffusion progressive du cryoprotecteur à l'extérieur des cellules, la disposition étant telle que, à la décongélation, l'embryon dans son milieu de conservation est mis directement en contact avec ladite solution, (f) d'une autre bulle de gaz et (g) 'd'un deuxième bouchon extrême de scellement. La présente invention concerne également les caractéristiques ci-après, considérées isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles.: - le mélange gazeux (a) est choisi parmi l'air, l'azote, des mélanges gazeux binaires ou ternaires; - le mélange gazeux (a) est constitué d'azote, d'oxygène et de gaz carbonique, notamment à raison de 90% d'azote, de 5% d'oxygène et de 5% de gaz carbonique; - le milieu de culture (b) est un milieu de culture in vitro à tampon carbonate ou phosphate, par exemple un tampon carbonate comprenant essentiellement du gluco se, des sels minéraux et des acides aminés, ou un milieu à tampon phosphate de type PBS; - le cryoprotecteur est le glycérol; le diméthylsulfoxyde ou le propanediol; - la bulle de gaz (d) placée entre l'embryon et la solution (e) est formée par l'air, l'azote ou des mélanges de gaz binaires ou ternaires; - la solution (e) contient du sucrose et un tampon salin (phosphate ou carbonate); - la solution (e) contient de la polyvinylpyrrolidone et un tampon salin (phosphate ou carbonate); - la normalité du tampon salin de la solution (e) est fonction de la molarité de la substance qu'elle contient, la règle étant que plus la molarité de la substance augmente, plus la normalité du tampon diminue; - la bulle de gaz (f) placée entre la solution (e) et le deuxième bouchon (g) est formée par l'air, l'azote ou des mélanges de gaz binaires ou ternaires*; - la paillette est congelée horizontalement;; - le rapport en volume des éléments constitutifs pour un volume global d'une paillette de 500 microlitres se situe dans la gamme suivante embryon 40 microlitres mélange gazeux (a) 50 microlitres milieu de culture (b) 150 microlitres bulle de gaz (d) pla cée entre l'embryon et la solution (e) 20 microlitres solution (e) 200 microlitres bulle de gaz (f) pla cée entre la solution et le deuxième bouchon(g) 40 microlitres. L'invention sera encore illustrée en référence aux dessins annexés sur lesquels Fig. 1 représente la structure d'une paillette selon la présente invention avant la congélation. Fig. 2 illustre la meme paillette que celle de la figure 1 lors de la décongélation et de la dilution du cryoprotecteur avant l'application de la paillette en transplantation embryonnaire. Sur la figure 1, la paillette selon la présente invention est désignée dans son ensemble par 1. Elle est obturée à ses deux extrémités 13, 14 par un bouchon, les deux bouchons étant symbolisés respectivement par 2 et 3. Le premier bouchon 2 es-t un bouchon classique constitué de coton imbibé d'alcool polyvinylique. Un tel bouchon a été décrit dans le brevet FR 1.472.139. Le deuxième bouchon 3 peut être un bouchon identique à celui du bouchon 2, toutefois cela n'est pas nécessaire et il peut s'agir d'un simple bouchon d'alcool polyvinylique. Une paillette 1 d'une contenance de 500 microlitres présente une dimension de 13 cm pour un diamètre de 2,7 centimètres. L'embryon 4' se trouve dans le milieu de conservation par congélation.Celui-ci peut être tout milieu connu à cet effet. I1 s'agit d'un milieu tamponné et additionné d'un cryoprotecteur 4 constitué, par exemple, de glycérol, de diméthylsulfoxyde ou de propanediol. Pour avoir plus de renseignements au sujet d'un tel milieu de conservation par congélation, l'homme de l'art pourra se référer à l'ouvrage : The Freezing of Mammalian Embryos Ciba Fundation. Symposium 52 Elsevier North Holland, 1977 et à la publication Renaud et al. 1981 t Teriogenology, 15,113. A titre d'exemple, la concentration du cryoprotecteur (glycérol) 4 est d'environ 1 à 1,5 M. Pour une paillette 1 de 500 mirolitres, le volume de l'embryon 4' dans le milieu de conservation par congélation représente 40 microlitres, celuici est entouré respectivement du côté tourné vers le bouchon 2 par 50 microlitres d'un mélange gazeux 5. Le mélange gazeux 5 peut être de l'air, de l'azote ou il peut comprendre des mélanges binaires ou ternaires. A titre d'exemple, le mélange gazeux 5 peut être constitué d'azote, d'oxygène et de gaz carbonique notamment à raison de 90% d'azote, de 5% d'oxygène et de 5% de gaz carbonique. Entre le mélange gazeux 5 dont le volume représente, comme indiqué ci-dessus, sensiblement 50 microlitres et le bouchon 2 sé trouve le milieu de culture 6. Le milieu de culture 6 est tout milieu approprié à la culture in vitro. Un exemple spécifique d'un tel milieu est un milieu tampon carbonate mis sur le marché par la société API FRANCE sous la dénomination "Milieu INFRA MENEZO" et qui comprend essentiellement du glucose, des sels minéraux, des acides aminés.Un autre milieu 6 utilisable est celui disponible sous la dénomination générique PBS qui est un milieu tampon-phosphate; un milieu PBS est notamment décrit par Whittingham dans journal of Reproduction and Fertility Supplement 14:7-21 - 1971. Le milieu de culture in vitro 6 permet à la fois la viabilité de l'embryon 4' et la reprise normale de l'activité métabolique de celuici après décongélation.Sur le côté tourné vers le bouchon 3, l'embryon 4' dans le milieu de conservation par congélation renfermant le cryoprotecteur 4, est entouré par une bulle de gaz 7 d'un volume de 20 microlitres puis d'une solution 8 d'au moins une substance miscible à l'eau, peu ou pas toxique à la température ambiante vis-à-vis de l'embryon, qui ne pénètre pas à l'intérieur des cellules de l'embryon 4' mais qui assure à l'extérieur de l'embryon une pression osmotique suffisante pour permettre une diffusion progressive du cryoprotecteur 4 à l'extérieur des cellules; cette solution étant désignée par 8 et, dans l'exemple choisi, occupe un volume de 200 microlitres. Enfin, une autre bulle de gaz 9, de volume de 40 microlitres, sépare la solution 8 du bouchon 3. Les deux bulles de gaz 7 et 9 peuvent être constituées d'air, d'azote ou comprendre des mélanges de gaz binaires ou ternaires. La substance préférée pour la solution 8 est le sucrose. La solution 8 contient par exemple du sucrose et un tampon (phosphate ou carbonate) dont la normalité est choisie en fonction de la molarité du sucrose. Plus la molarité du sucrose augmente, plus la normalité du tampon diminue. Une combinaison qui a donné de bons résultats est constituée de sucrose 0,25M pour un tampon de 1 N. On peut remplacer le sucrose par de la polyvinylpyrrolidone, les conditions ci-dessus indiquées étant les mêmes. La solution 8 est une fraction permettant le retrait partiel du cryoprotecteur 4 à l'extérieur des cellules de embryon 4' .I1 est bien certain qu'une fraction minime de cryoprotecteur 4 restera de toute façon. La disposition dans la paillette 1 selon la présente invention est telle que, à la décongélation,l'embryon 4' dans son milieu de conservation est mis directement en contact avec la solution 8. La bulle de gaz 7 est une fraction qui disparatt au cours du réchauffement et qui permet la jonction de la solution 8 et du cryoprotecteur 4, tandis que le mélange gazeux 5 a pour effet de maintenir séparé jusqu'au transfert in utero le mélange de cryoprotecteur et de solution désigné par 11 et le milieu de culture 6. La solution 8 ne pénètre pas dans les cellules embryonnaires mais permet en élevant la pression osmotique du milieu, de limiter notamment les chocs osmotiques sur les membranes cellulaires lors de la diffusion passive du cryoprotecteur 4 à l'extérieur des cellules de l'embryon 4'. Les différentes fractions selon la structure cidessus sont placées par simple aspiration à l'aide d'une seringue de 1 ml dans a paillette 1 selon la présente invention. La paillette 1 est scellée à ses deux extrémités 13, 14 à l'aide des -deux bouchons 2 et 3 et l'ensemble tel qu'illustré sur la figure 1 est ensuite congelé horizontalement. La figure 2 illustre la décongélation et la dilution du cryoprotecteur 4 qui dans l'exemple choisi est du glycérol 1,5 M . Lors de la décongélation, la paillette 1 est disposée verticalement dans un bain-marie à une température sensiblement de 370C désigné sur la figure 2 par 10. La solution 8, moins concentrée que la solution de cryoprotecteur 4, commence à fondre la première.à partir des parois 15 de la paillette 1. ainsi, à la température de décongélation, la solution 8 dont la concentration est inférieure à celle du milieu de conservation par congélation, commence à fondre la première, ce qui permet à la bulle de gaz 7, dès le début du changement de température accompagnant la décongélation, de s'élever à l'intérieur de la paillette l; les dimensions de ladite bulle de gaz 7 sont définies de sorte que cette ascension se fasse progressivement. Le volume du mélange gazeux 5 qui est de plus grosse dimension que la bulle de gaz 7, reste pratiquement inchangé et maintient la séparation entre le milieu de conservation et le milieu de culture 6. On obtient ainsi dès la décongélation un mélange sucrose-glycérol 11. Le rapport des volumes de 1 à 5 glycérol : sucrose permet la diffusion progressive du glycérol. En retournant la paillette 1, une fois dans chaque sens pendant 5 à 7 minutes, on permet à l'embryon 4' de circuler tout le long de la colonne de liquide ce qui contribue à une diffusion homogène du cryoprotecteur 4. La paillette 1 tenue verticalement, est coupée à son extrémité supérieure, puis montée dans un pistolet de transplantation 12. Une partie du milieu de dilution 11, constitué de glycérol et de sucrose dans le présent exemple, est expulsée avant mise en place de l'embryon 4'. Le mélange avec le milieu de culture 6 est ainsi assuré au cours du dépôt de embryon 4' dans l'utérus de la receveuse. Sur la figure 2 les mêmes symboles de référence désignent des parties identiques à celles de la figure 1. La présente invention est applicable aux mammifères. Les meilleurs résultats ont été obtenus sur les embryons de bovins, d'ovins et de caprins. Toutefois, ilimporte de remarquer que la présente invention n'est pas limitée à l'application aux ovins, bovins et caprins. La paillette 1 de la présente invention a été utilisée en transplantation embryonnaire. Les résultats obtenus sont les suivants : Sur 30 embryons congelés, puis cultives in vitro, 24 heures ou 48 heures après décongélation, 25 se sont normalement développés. Ce nombre représente un rendement de 83,3%. Sur 14 embryons congelés, puis transplantés directement après congélation, 7 gestations à 55 jours ont été obtenues avec des taux de survie de 50%. Les techniques utilisées selon l'art antérieur ne permettaient qu'un taux de survie de 35%. La présente invention réside dans la structure particulière ci-dessus décrite de la paillette 1. I1 est clair que la matière plastique constituant les parois 15 est une matière plastique habituellement utilisée dans les paillettes, selon la technique antérieure et ne rentre pas dans le cadre de la présente invention. Enfin,il importe d'observer que la capacité de la paillette 1 de 500 microlitres peut varier et il est possible de réaliser des paillettes dont le volume peut être différent comme par exemple des paillettes de 250 microlitres. L'invention n'est pas limitée au mode de réalisation représenté et décrit en détail et diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Paillette pour la conservation par congélation d'embryons de mammifères dans un milieu de conservation capable d'être congelé et décongelé et comprenant une substance cryoprotectrice (ou cryoprotecteur) (4) qui pénètre à l'intérieur des cellules de l'embryon (4'), ladite paillette (1) étant caractérisée en ce qu'elle est scellée à ses deux extrémités (13 , 14) jusqu'au moment del'utilisation dans le mammifère et en ce que l'embryon (4') dans le milieu de conservation par congélation, est entouré respectivement:: - (A) d'une part, successivement en direction d'une extrémité (13), (a) d'un mélange gazeux (5), (b) d'un milieu de culture (6) et (c) d'un premier bouchon extrême de scellement (2), - (B) et d'autre part, successivement en direction de l'autre extrémité (14) (d) d'une bulle de gaz ( 7), (e) d'une solution (8) d'au moins une substance miscible à l'eau, peu ou pas toxique à la température ambiante vis-àvis de l'embryon (4') quine pénètre pasà l'intérieur des cellules de l'embryon (4') mais qui assure à l'extérieur de celui-ci une pression osmotique suffisante pour permettre une diffusion progressive du cryoprotecteur (4) à l'extérieur des cellules, la disposition étant telle que, à la décongélation, l'embryon (4') dans son milieu de conservation est mis directement en contact avec ladite solution t8), (f) d'une autre bulle de gaz (9) et (g) d'un deuxième bouchon extreme de scellement (3). 2. Paillette selon la revendication 1, caracté (5 risée en ce que le mélange gazeux (a)!êst choisi parmi l'air, l'azote, des mélanges gazeux binaires ou ternaires 3.Paillette selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le mélange gazeux (a) (5) est constitué d'azote, d'oxygène et de gaz carbonique, notamment à raison de 90% d'azote, de 5% d'oxygène et 5% de gaz carbonique. 4. Paillette selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le milieu de culture (b) (6) est un milieu de culture in vitro à tampon carbonate ou phosphate, par exemple à tampon carbonate, comprenant essentiellement du glucose, des sels minéraux et des acides aminés ou un milieu à tampon phosphate de type PBS. 5. Paillette selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le cryoprotecteur (4) est le glycérol, le diméthylsulfoxyde ou le propanediol. 6. Paillette selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la bulle de gaz (d) (7) placée entre l'embryon (4') et la solution (e) (8) est formée par l'air, l'azote ou les mélanges de gaz binaires ou ternaires. 7. Paillette selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la solution (e) (8) contient du sucrose et un tampon salin (phosphate ou carbonate). a. Paillette selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la solution (e) (8) contient de la polyvinylpyrrolidone et un tampon salin (phosphate ou carbonate). 9. Paillette selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la normalité du tampon salin de la solution (e) (8) est fonction de la molarité de la substance qu'elle contient. 10.Paillette selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la régle est que plus la molarité e la substance augmente, plus la normalité du tampon diminue. 11. Paillette selon l'une quelconque dçs revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la bulle de gaz (b) (9) place entre la solution (e) (8) et le deuxième bouchon (g) (3) est formée par l'air, l'azote ou des mélanges de gaz binaires ou ternaires. 12. Paillette selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est congelée horizontalement. 13. Paillette selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le rapport en volume des éléments constitutifs pour un volume global d'une paillette (1) de 500 microlitres se situe dans la gamme suivante embryon (4') 40 microlitres mélange gazeux (5) 50 microlit-res milieu de culture (b) (6) 150 microlitres bulle de gaz (d) (7) placée entre l'em- bryon (4') et la solu tion (e) (8) 20 microlitres solution (e) (8) 200 microlitres bulle de gaz (f) (9) placée entre la solu tion (e) (8) et le deu xième bouchon (g) (3) 40 microlitres. 14. Application de la paillette selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 en transplantation embryonnaire.