Brevet FR2514783A1 — publié le 19830422

La présente invention se rapporte au domaine de la technologie de l'ADN recombinant, aux moyens et méthodes utili- sant cette technologie dans la découverte de la séquence d'ADN et de la séquence d'aminoacides déduite pour l'interféron immuni- taire humain, à sa production et aux divers produits de cette production de même qu'à leurs utilisations. Plus particulièrement la présente invention se rapporte à l'isolement et à l'identification de séquences d'ADN encodant l'interféron immunitaire humain et à la construction de véhicules d'expression d'ADN recombinant contenant lesdites séquences d'ADN reliées opératoirement aux séquences de promo- teurs effectuant l'expression et aux véhicules d'expression ainsi construits Suivant un autre aspect, la présente invention se rapporte à des systèmes de cultures-hôtes, comme diverses cultu- res de microorganismes et de cellules de vertébrés transformées avec ces véhicules d'expression et ainsi tournées vers l'expres- sion des séquences d'ADN signalées plus haut Suivant encore d'autres aspects, la présente invention se rapporte aux moyens et aux méthodes de conversion des produits finals de cette expres- sion en de nouvelles entités, comme des compositions pharmaceuti- ques, utilisables pour un traitement prophylatique ou thérapeuti- que des êtres humains Dans des formes de réalisation préférées, la présente invention apporte des véhicules d'expression particu- liers qui sont adéquatement séquences pour qu'il y ait production et sécrétion d'interféron immunitaire humain par la cellule-hôte en la forme mûre De plus, la présente invention se rapporte à divers procédés utilisables pour la production de ces séquences d'ADN, de ces véhicules d'expression, de ces systèmes de cultu- res-hôtes et de ces produits finals ainsi que de leurs entités, et à leurs formes de réalisation spécifiques et associées. La présente invention provient en partie de la décou- verte de la séquence d'ADN et de la séquence d'aminoacides déduite encodant l'interféron immunitaire humain De plus la présente invention apporte une information séquentielle sur les séquences de flanquement 3 ' et 5 ' du gène d'interféron 14783 immunitaire humain, facilitant sa liaison in vitro dans les véhicules d'expression En particulier on apporte le segment 5 '- ADN encodant le polypeptide signal endogène putatif qui précède immédiatement la séquence d'aminoacides de l'interféron immuni- taire humain mûr putatif Ces découvertes à leur tour ont permis le développement des moyens et méthodes pour la production, via la technologie de lt ADN recombinant, de quantités suffisantes d'interféron immunitaire humain pour permettre à son tour la détermination de ses propriétés biochimiques et de sa bioactivité. Les publications et autres matières de celles-ci que l'on utilise pour éclaircir, les fondements de l'invention, et dans des cas particuliers, pour apporter des détails additionnels concernant sa mise en pratique, sont incorporées ici par voie de référence et, pour la commodité, elles portent un numéro de réfé- rence dans le texte qui va suivre et sont respectivement groupées dans la bibliographie en annexe. Les interférons humains peuvent être classés en trois groupes en se basant sur l'antigénicité différente et sur les propriétés biologiques et biochimiques. Le premier groupe comprend un famille d'interférons de leucocytes (a interféron, Le IF ou IFN-a), qui normalement sont produits principalement par des cellules constituantes du sang humain par une induction virale Ils ont été produits par la voie microbienne et se sont avérés biologiquement actifs ( 1, 2, 3) Leurs propriétés biologiques ont suggéré leur utilisation en clinique comme agents thérapeutiques pour le traitement d'infec- tions virales et de conditions malignes ( 4). Dans le second groupe se trouve l'interféron de fibroblaste ( einterféron, FIF ou IFN-S), produit normalement par les fibroblastes par induction virale, qui a été de même produit par la voie microbienne et qui s'avère présenter un spectre étendu d'activités biologiques ( 5) Les essais cliniques indiquent aussi sa valeur thérapeutique potentielle Les interfé- rons de leucocyte et de fibroblaste présentent des similitudes très nettes dans leurs propriétés biologiques en dépit du fait que le degré d'homologie au niveau des aminoacides est relative- ment faible De plus, les deux groupes d'interférons contiennent à 166 aminoacides et sont des protéines stables aux acides. L'interféron immunitaire humain (Y -interféron, interféron gamma humain ou IFN-Y), auquel la présente invention s'adresse, est, contrairement aux interférons " et S, labile à p H 2, produit principalement par induction mitogène de lymphocy- tes et il est également nettement distinct antigéniquement. Jusque récemment l'interféron immunitaire humain ne pouvait être décelé qu'à des niveaux très faibles, ce qui évidemment gêne sa caractérisation Récemment, une purification assez étendue, bien qu'encore partielle, de l'interféron immunitaire humain a été rapportée ( 6) Le composé serait produit à partir de cultures de lymphocytes stimulées avec une combinaison de phytohaemagglutine et d'un ester de phorbol, et purifié par des séparations chroma- tographiques séquentielles Ce mode opératoire a conduit à un produit ayant un poids moléculaire de 58 000. L'interféron immunitaire humain a été produit en de très faibles quantités par traduction d'AR Nm dans des oocytes, montrant une activité d'interféron caractéristique de l'interfé- ron immunitaire humain et donnant l'espoir que l'AD Nc d'interfé- ron immunitaire pourrait être synthétisé et cloné ( 7). La quantité d'interféron immunitaire obtenue jusqu'à présent est certainement insuffisante pour exécuter des expérien- ces non ambiguës sur la caractérisation et les propriétés biolo- giques du composant purifié Toutefois, des études in vitro exé- cutées avec des préparations brutes, de même que des expériences in vivo avec des préparations de y -interféron murines, suggèrent que la fonction première de l'interféron immunitaire peut être en tant qu'agent immunorégulateur ( 8, 9) L'interféron immunitaire a non seulement une activité antivirale et anticellulaire en commun avec tous les interférons humains, mais il montre un effet de potentialisation sur ces activités avec l'a et le e -interféron ( 10) De même, l'effet d'antiprolirération in vitro du Y - interféron sur les cellules tumorales est signalé comme environ à 100 fois celui des autres classes d'interférons ( 8, 11, 12). Ce résultat, conjointement avec son r 6 le immunorégulateur prononcé ( 8, 9) suggère une activité antitumorale beaucoup plus prononcée pour l'IFN Y que pour l'IFN a et l'IFN En fait, des expériences in vivo avec des souris et des préparations muri- nes d'IFN y font apparaltre une nette supériorité sur les inter- férons induits antiviralement dans son effet antitumoral contre le sarcome ostéogénique ( 13). La totalité de ces études, Jusqu'à la présente inven- tion, devaient être réalisées avec des préparations assez gros- sières, dues à la disponibilité très faible Néanmoins, elles suggèrent certainement des fonctions biologiques très importantes pour l'interféron immunitaire Non seulement l'interféron immuni- taire a une activité antivirale associée puissante, mais proba- blement aussi une forte activité immunorégulatrice et antitumo- rale, indiquant clairement un candidat clinique potentiellement très prometteur. Il a été perçu que l'application de la technologie de l'ADN recombinant pourrait constituer une voie des plus efficaces pour la production des quantités plus grandes requises d'interfé- ron immunitaire humain Que les matières ainsi produites compor- tent ou non une glycosylation qui est considérée comme la carac- téristique du matériel natif dérivant de l'être humain, elles devraient probablement présenter une bioactivité qui admet leur utilisation clinique dans le traitement d'une gamme étendue de conditions ou maladies virales, néoplastiques et immuno- supprimées. La technologie de l'ADN recombinant a atteint l'âge d'une certaine sophistication Les biologistes moléculaires sont en mesure de recombiner diverses séquences d'ADN avec une certaine facilité, en créant de nouvelles entités d'ADN capables de produire des quantités copieuses de produit protéique exogène dans des microbes transformés Les moyens et méthodes généraux sont en main pour la ligation in vitro de divers fragments d'ADN à 14783 extrémité émoussée ou "collante", produisant des véhicules d'expression puissants utilisables dans la transformation d'orga- nismes particuliers, en orientant ainsi leur synthèse efficace du produit exogène désiré Toutefois, sur la base d'un produit indi- viduel, le cheminement demeure quelque peu tortueux et la science n'a pas progressé à un point auquel des prédictions régulières de succès peuvent être faites En réalité ceux qui présagent des résultats positifs sans avoir la base expérimentale, le font avec un risque considérable d'inopérabilité. Le plasmide, qui est une boucle non chromosomique d'ADN à deux brins rencontré dans les bactéries et autres micro- bes, parfois en copies multiples par cellule, reste un élément de base de la technologie de l'ADN recombinant Est incluse dans l'information encodée dans le plasmide de l'ADN, celle requise pour reproduire le plasmide chez les cellules filles (à savoir une origine de réplication ou "réplicon") et ordinairement une ou plusieurs caractéristiques phénotypiques de sélection comme, dans le cas des bactéries, la résistance aux antibiotiques, qui permet aux clones de la cellule-hôte contenant le plasmide en question d'être reconnus et cultivés préférentiellement dans des milieux sélectifs L'utilité des plasmides réside dans le fait qu'ils peuvent être sélectivement clivés par l'une ou l'autre endonu- cléase de restriction ou "enzymes de restriction", dont chacune reconnaît un site différent sur le plasmide d'ADN Par la suite, des gènes hétérologues ou fragments de gènes hétérologues peuvent être insérés dans le plasmide par jonction bout-à-bout au site de clivage ou aux extrémités reconstruites adjacentes au site du clivage Sont ainsi formés les véhicules d'expression dits réplicables La recombinaison de l'ADN se fait à l'extérieur de la cellule, mais le véhicule d'expression réplicable "recombinant" résultant, ou plasmide, peut être introduit dans les cellules par un processus connu sous le nom de transformation et l'on obtient de grandes quantités de véhicule recombinant obtenu par culture du transformant En outre, lorsque le gène est inséré de manière appropriée par rapport aux portions du plasmide 14783 qui gouvernent la transcription et la traduction du message d'ADN encodé, le véhicule d'expression résultant peut être utilisé pour produire effectivement la séquence polypeptidique pour laquelle le gène inséré code, processus appelé expression. L'expression est amorcée dans une région connue sous le nom de promoteur qui est reconnue par et liée par l'ARN polymérase Dans la phase de transcription de l'expression, l'ADN se déroule en l'exposant comme un gabarit pour la synthèse amor- cée de l'ARN messager à partir de la séquence d'ADN L'ARN messa- ger est à son tour traduit en un polypeptide ayant la séquence d'aminoacides encodée par l'AR Nm Chaque aminoacide est encodé par un triplet de nucléotides ou "codon" constituant collective- ment le "gène de structure", c'est-à-dire la partie qui encode la séquence d'acides aminés du produit polypeptidique exprimé La traduction est amorcée à un signal de "départ" (ordinairement ATG qui, dans l'ARN messager résultant devient AUG) Les codons dits d'arrêt définissent la terminaison de la traduction et par consé- quent de la production d'autres unités d'aminoacides Le-produit résultant peut être obtenu par une lyse, si c'est nécessaire, de la cellule-hôte dans les systèmes microbiens et en récupérant le produit par une purification appropriée à partir d'autres protéines. Dans la pratique, l'utilisation de la technologie de l'ADN recombinant peut exprimer entièrement les polypeptides hétérologues ce que l'on appelle l'expression directe ou bien peut exprimer un polypeptide hétérologue fusionné à une portion de la séquence d'aminoacides d'un polypeptide homologue Dans ces derniers cas, le produit bioactif recherché est parfois rendu bioinactif dans le polypeptide homologue/hétérologue fusionné, jusqu'à ce qu'il soit clivé dans un environnement extracellu- laire Se rapporter au brevet britannique n 2 007 676 A et à Wetzel, American Scientist 68, 664 ( 1980). L'art des cultures de cellules ou de tissus pour l'étude de la génétique et de la physiologie cellulaire est bien établi On a en main les moyens et ies méthodes pour maintenir des lignées cellulaires permanentes, préparées par des transferts successifs en série à partir des cellules normales isolées En vue de l'utilisation dans les recherches, ces lignées cellulaires sont maintenues sur un support solide en milieu liquide, ou par croissance en suspension qui contient des éléments nutritifs de support La mise à l'échelle pour de grandes préparations semble ne poser que des problèmes mécaniques Pour un supplément de connaissances de base on s'adressera à Microbiology, 2 ème édition, Harper et Row, Publishers, Inc Hagerstown, Maryland ( 1973), spécialement aux pages 1122 et suivantes, de même qu'au Scientific American 245, 66 et suivantes ( 1981), publications qui sont incorporées ici par cette référence. La présente invention est basée sur la découverte que la technologie de l'ADN recombinant peut être utilisée pour produire avec succès de l'interféron immunitaire humain, de préférence sous la forme directe, et en des quantités suffisantes pour entamer et conduire des essais sur animaux et cliniques en tant que condition préalable à l'approbation sur le marché Le produit convient pour l'utilisation, en la totalité de ses formes, dans le traitement prophylactique ou thérapeutique des êtres humains pour les infections virales et les conditions mali- gnes, immunosupprimées ou immunodéficientes Ses formes compor- tent diverses formes oligomères possibles pouvant inclure une glycosylation associée Le produit est formé par des systèmes de culture de cellules ou des microorganismes construits génétique- ment Dès lors existe donc maintenant la possibilité de préparer et d'isoler de l'interféron immunitaire humain suivant un mode plus efficace que ce qui était possible jusqu'ici Un facteur significatif de la présente invention, dans des formes de réali- sation qui sont surtout préférées, est l'accomplissement de la direction génétique d'un microorganisme ou d'une culture cellu- laire pour produire de l'interféron immunitaire humain en des quantités isolables, sécrété par la cellule-hôte sous la forme mûre. La présente invention comporte l'interféron 2514 * 783 immunitaire humain ainsi produit de même que les moyens et les méthodes pour sa production La présente invention est en outre tournée vers des véhicules d'expression d'ADN réplicables héber- geant des séquences de gènes encodant l'interféron immunitaire humain sous une forme exprimable De plus la -présente invention est tournée vers des souches de microorganismes ou des cultures cellulaires transformées avec les véhicules d'expression décrits plus haut et vers des cultures microbiennes ou cellulaires de ces souches ou cultures transformées, capables de produire de l'interféron immunitaire humain Suivant encore d'autres aspects, la présente invention est tournée vers divers procédés utilisa- bles pour la préparation desdites séquences de gènes d'interféron immunitaire, de véhicules d'expression d'ADN, de souches de microorganismes et de cultures cellulaires et vers leurs formes de réalisation spécifiques De plus, la présente invention est tournée vers la préparation de cultures de fermentation de ces microorganismes et cultures cellulaires En outre la présente invention est dirigée vers la préparation d'interféron immuni- taire humain, en tant que produit d'expression directe, sécrété par la cellule-hôte en la forme mûre Cette approche peut utili- ser le gène encodant la séquence de l'interféron immunitaire humain mûr plus l'ADN à flanquement 5 ' encodant le polypeptide de signal Le polypeptide de signal est censé aider le transport de la molécule vers la paroi cellulaire des organismes-hôtes, là o elle est clivée durant le processus de sécrétion du produit interféron humain mûr Cette forme de réalisation permet l'isole- ment et la purification de l'interféron immunitaire mûr recherché sans recourir aux modes opératoires impliqués qui sont conçus pour éliminer les contaminants de la protéine intracellulaire de l'hôte ou les débris cellulaires. Le recours ici à l'expression "interféron immunitaire humain mûr" signifie la production microbienne ou par culture cellulaire d'interféron immunitaire humain non accompagné par le peptide de signal ou le peptide de préséquence qui s'occupe immé- diatement de la traduction de l'AR Nm d'interféron immunitaire humain L'interféron immunitaire humain mûr, selon la présente invention est ainsi fourni, avec, en tant que son premier amino- acide, de la méthionine (présent en raison de l'insertion du codon de signal de départ ATG en face du gène de structure) ou, lorsque la méthionine est clivée intra ou extracellulairement, avec, en tant que son premier aminoacide, normalement de la cystéine L'interféron immunitaire humain mûr peut aussi être produit, conformément à ceci, conjointement avec une protéine conjuguée autre que le polypeptide de signal conventionnel, le conjugué étant spécifiquement clivable dans un environnement intra ou extracellulaire Voir à ce propos le brevet britannique n O 2 007 676 A Enfin, l'interféron immunitaire humain mûr peut être produit par expression directe, sans qu'il soit nécessaire de détacher par clivage tout polypeptide superflu étranger Ceci est particulièrement important au cas o un hôte donné ne peut pas, ou du moins pas efficacement, éliminer un peptide de signal au cas o le véhicule d'expression est destiné à exprimer l'interféron humain mûr conjointement avec son peptide de signal. L'interféron immunitaire humain mûr ainsi produit est récupéré et purifié à un niveau qui convient pour son utilisation dans le traitement de conditions virales, malignes, immunosupprimées ou immunodéficientes. L'interféron immunitaire humain est obtenu conformé- ment à ce qui suit 1 des tissus humains, par exemple du tissu de rate humaine ou des lymphocytes sanguins périphériques, sont cultivés avec des mitogènes pour stimuler la production de l'interféron immunitaire. 2 Des pastilles cellulaires de ces cultures cellu- laires sont extraites en présence d'un inhibiteur de ribonucléase pour isoler la totalité de 1 'ARN du cytoplasme. 3 Une colonne oligo-d T isole la totalité de 1 'ARN messager (AR Nm) sous la forme polyadénylée Cet AR Nm est frac- tionné à dimension en utilisant un gradient de densité de sucrose et l'électrophorèse sur gel d'urée acide. ? 25 14783 4 L'AR Nm approprié ( 12 à 18 S) est converti en l'ADN complémentaire à brin unique correspondant (AD Nc) à partir duquel est produit l'AD Nc à deux brins Après allongement de queue (tailing) poly-d C, il est inséré dans un vecteur tel qu'un plas- mide portant un ou plusieurs marqueurs phénotypiques. Les vecteurs ainsi préparés sont utilisés pour transformer les cellules bactériennes en fournissant une "bibliothèque" de colonies On utilise de l'AD Nc radiomarqué préparé à partir d'AR Nm à la fois induit et non induit, dont la provenance est décrite plus haut, pour explorer séparément les "bibliothèques" de colonies en double L'AD Nc en excès est alors enlevé et les colonies sont exposées à une pellicule pour rayons X, en sorte d'identifier les clones d'AD Nc induits. 6 Partant des clones d'AD Nc induits, on isole l'ADN plasmidique correspondant et celui-ci est séquence. 7 L'ADN séquencé est alors mis sur mesure in vitro pour l'insertion dans un véhicule d'expression approprié qui est utilisé pour transformer une cellule-h 8 te appropriée, laquelle à son tour permet la croissance dans une culture et l'expression du produit interféron immunitaire humain désiré. 8 L'interféron immunitaire humain ainsi produit possède sans nul doute 146 aminoacides dans sa forme mûre, en commençant avec la cystéine, et il est de caractère fortement basique Son poids moléculaire à l'état de monomère a été calculé comme étant de 17 140 Peut-être à cause de la présence de nombreux résidus basiques, de l'hydrophobicité, de la formation de ponts salins et ainsi de suite, la molécule peut s'associer avec elle-même en des formes oligomères, par exemple en la forme dimère, trimère, ou tétramère Les poids moléculaires élevés précédemment observés avec la matière naturelle ( 6) qui ne peut pas entrer en ligne de compte sur la base de la séquence d'amino- acides seule, peuvent être dus à ces formes oligomères de même qu'à la contribution de carbohydrate provenant d'une glycosyla- tion postérieure à la traduction. 9 Dans certains systèmes de cellules-hôtes, en Il particulier en cas de ligation dans un véhicule d'expression en sorte d'être exprimé conjointement avec son peptide "signal" de aminoacides, la forme mare de l'interféron immunitaire humain est exportée dans le milieu de culture des cellules, ce qui faci- lite incommensurablement les méthodes de récupération et de purification. Cultures de cellules/microorganismes 1 Souches bactériennes/promoteurs Les travaux décrits ici sont exécutés en employant, entre autres, le microorganisme E coli K-12 souche 294 extrémité A, thi-, hsr-, khsm+, comme décrit dans le brevet britannique n 2055382 A Cette souche a été déposée à l'American Type Culture Collection, ATCC n 31446 Cependant diverses autres souches microbiennes sont utilisables, dont les souches connues de E coli comme le E coli B, le E coli 1776 (ATCC n 31537) et le E coli W 3110 (F-, A-, protophique) (ATCC no 27325) ou d'autres souches microbiennes dont beaucoup d'entre elles sont déposées et (potentiellement) disponibles auprès d'institutions de dépôts de microorganismes reconnues, comme l'American Type Culture Collection (ATCC) cf le listing du catalogue ATCC. Voir aussi la demande de brevet allemand DE-OS 2644432 Ces autres microorganismes comprennent par exemple les Bacilli comme le Bacillus subtilis et autres entérobactériacées parmi lesquelles on peut mentionner en tant qu'exemples le Salmonella typhimurium et le Serratia marcesans, en utilisant des plasmides qui peuvent répliquer et exprimer les séquences de gènes hétérologues qui s'y trouvent. Comme exemples, les systèmes promoteurs à bêta lacta- mase et lactose ont été utilisés avantageusement pour amorcer et soutenir la production microbienne de polypeptides hétérologues. Des détails se rapportant à la confection et à la construction de ces systèmes promoteurs ont été publiés par Chang et coll, Nature 275, 617 ( 1978) et Itakura et coll Science 198, 1056 ( 1977), qui sont incorporés ici par référence Plus récemment a été développé un système basé sur le tryptophane, le système promoteur dit trp Des détails se rapportant à la confection et à la construction de ce système ont été publiés par Goeddel et coll, Nucleic Acids Research 8, 4057 ( 1980) et par Kleid et coll, demande de brevet U S nô 133, 296, déposée le 24 mars 1980, qui sont incorporés ici à titre de référence De nombreux autres promoteurs microbiens ont été découverts et utilisés et des détails concernant leurs séquences de nucléotides, permettant à un spécialiste de les lier fonctionnellement à l'intérieur des vecteurs plasmidiques, ont été publiés -, cf par exemple Siebenlist et coll, Cell 20, 269 ( 1980), qui est incorporé ici par cette référence. 2 Souches de levures/promoteurs de levures Leur système d'expression peut aussi employer le plasmide Y Rp 7 ( 14, 15, 16), qui est capable de sélection et de réplication à la fois chez le E coli et chez la levure Saccharo- myces cerevisiae Pour la sélection dans la levure le plasmide contient le gène de TR Pl ( 14, 15, 16) qui complémente (autorise la croissance en l'absence de tryptophane) la levure contenant des mutations dans ce gène trouvé sur le chromosome IV de la levure ( 17) La souche utilisée ici est la souche RH 218 ( 18) déposée à l'American Type Culture Collection sans restriction (ATCC n O 44076) Toutefois on comprendra que n'importe quelle souche de Saccharomyces cerevisiae contenant une mutation qui fait le trpl cellulaire sera un environnement efficace pour l'expression du plasmide contenant le système d'expression Un exemple d'une autre souche que l'on pourrait utiliser est le pep 4-1 ( 19) Cette souche auxotrophe de tryptophane a également un point de mutation dans le gène-de TRP 1. Etant placé sur le c 8 té 5 ' d'un gène de non-levure, la séquence d'ADN de flanquement 5 ' (promoteur) d'un gène de levure (pour l'alcool déshydrogénase 1) peut promouvoir l'expres- sion d'un gène étranger dans la levure en cas de placement dans un plasmide utilisé pour transformer la levure A c 8 té d'un promo- teur, l'expression appropriée d'un gène de non-levure dans la levure exige une seconde séquence de levure placée à l'extrémité 3 ' du gène de non-levure sur le plasmide pour permettre la termi- naison appropriée de la transcription et la polyadénylation dans la levure Ce promoteur peut être adéquatement utilisé dans la présente invention ainsi que d'autres voir infra Dans les formes de réalisation préférées, la séquence de flanquement 5 ' du gène de 3-phosphoglycérate kinase de levure ( 20) est placé en amont du gène de structure suivi de nouveau par l'ADN contenant des signaux de terminaison-polyadénylation, par exemple le gène de TR Pl ( 14, 15, 16) ou le gène de PGK ( 20). Parce que la séquence de flanquement 5 ' de levure (conjointement avec l'ADN de terminaison de levure 3 ') (infra) peut intervenir pour promouvoir l'expression de gènes étrangers dans la levure, il parait vraisemblable que les séquences de flanquement 5 ' de n'importe quel gène de levure fortement exprimé pourraient être utilisées pour l'expression de produits gènes importants Comme dans certaines circonstances la levure exprime Jusqu'à raison de 65 % de sa protéine soluble à l'état d'enzymes glycolytiques ( 21) et comme ce niveau élevé parait résulter de la production de niveaux élevés des AR Nm ( 22) individuels, il pourrait êtrepossible d'utiliser les séquences de flanquement 5 ' de n'importe lequel d'autres gènes glycolytiques pour de telles applications d'expression par exemple énolase, glycéraldéhyde- 3-phosphate déshydrogénase, hexokinase, pyruvate décarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomérase, 3-phospho- glycérate mutase, pyruvate kinase, triose phosphate isomérase, phosphoglucose isomérase et glucokinase N'importe lesquelles des séquences de flanquement 3 ' de ces gènes pourraient aussi être utilisées pour la terminaison adéquate et la polyadénylation d'AR Nm dans un tel système d'expression cf supra Certains autres gènes fortement exprimés sont ceux pour les phosphatases acides ( 23) et ceux qui expriment des niveaux-élevés de produc- tion suite à des mutations dans les régions de flanquement 5 ' (mutants qui augmentent l'expression) suite ordinairement à la présence d'un élément transposable TY 1 ( 24). Tous les gènes mentionnés plus haut sont censés être transcrits par l'ARN polymérase II de levure ( 24) Il est possi- ble que les promoteurs pour l'ARN polymérase I et III, qui trans- crivent les gènes pour les AR Nt, l'ARN 5 S et l'ARN de ribosomes ( 24, 25), puissent aussi être utilisables dans de telles constructions d'expression. Finalement, beaucoup de promoteurs de levure contien- nent aussi un contrôle de transcription, d'o ils peuvent être fermés ou ouverts en faisant varier les conditions de croissance. Certains exemples de ces promoteurs de levures sont les gènes qui produisent les protéines suivantes: alcool déshydrogénase Il, isocytochrome-c, acide phosphatase, les enzymes dégradantes asso- ciées au métabolisme azoté, glycéraldéhyde-3-phosphate déshydro- génase, et enzymes responsables pour l'utilisation du maltose et du galactose ( 22) Cette région de contrôle pourrait être très utile dans le contrôle de l'expression des produits protéiques spécialement lorsqueleur production est toxique pour la levure. Il pourrait aussi être possible d'installer la région de contrôle d'une séquence de flanquement 5 ' avec une séquence de flanquement ' contenant un promoteur d'un gène fortement exprimé Il en résulterait un promoteur hybride, ceci étant possible puisque la région de contrôle et le promoteur paraissent constituer des séquences d'ADN physiquement distinctes. 3 Systèmes de cultures cellulaires/vecteurs de cul- tures cellulaires. La propagation de cellules de vertébrés dans une culture (culture de tissus) est devenue un mode opératoire de routine ces dernières années (cf Tissus Culture, Academic Press, éditeurs Kruse et Patterson, 1973) On utilise ici la lignée COS- 7 des fibroblastes de rein de singe comme hôte pour la production d'interféron immunitaire ( 25 a) Toutefois, les expériences détaillées ici peuvent être exécutées dans une lignée de cellules quelconque capable de réplication et d'expression d'un vecteur compatible, par exemple WI 38, BHK, 3 T 3, CHO, VERO et les lignées cellulaires He La De plus, ce qui est requis du vecteur d'expres- sion est une origine de réplication et un promoteur localisé en face du gène devant être exprimé, conjointement avec des sites de liaison de ribosome nécessaires, des sites d'épissure ou jonction (splice) d'ARN, un site de polyadénylation et des séquences de terminaison de transcription Bien que ces éléments essentiels de SV 40 aient été exploités ici, on comprendra que l'invention, bien que décrite ici en termes d'une forme de réalisation préférée, ne doit pas être considérée comme limitée à ces séquences Ainsi, on peut utiliser l'origine de réplication d'autre vecteurs viraux (par exemple Polyoma, Adeno, VSV, BPV, etc) de même que des origines cellulaires de réplication d'ADN qui pourraient fonctionner dans un état non-intégré. Systèmes vecteurs 1 Expression directe de l'interféron immunitaire naturel chez le E coli Le mode opératoire utilisé pour obtenir l'expression directe de l'IFN Y chez le E coli à l'état de polypeptide d'interféron mûr (moins la séquence de signal) est une variante de celui employé antérieurement pour l'hormone de croissance humaine ( 26) et pour l'interféron de leucocyte humain ( 1), dans le mesure o il comporte la combinaison d'AD Nc et de constituants N-terminaux synthétiques. Comme on le déduit de la séquence de nucléotides du p 69 décrite infra, et de la comparaison avec le site de clivage connu entre peptide "signal" et polypeptide mûr pour plusieurs IFN c ( 2), l'IFN-y a un peptide signal hydrophobe de 20 amino- acides suivi par 146 aminoacides d'IFN y mûr (figure 5) Comme montré dans la figure 7, un site d'endonucléase de restriction Bst NI est localisé adéquatement à l'aminoacide 4 de l'IFN y mûr. Deux désoxyoligonucléotides synthétiques sont conçus, qui incor- porent un codon d'initiation de traduction ATG, des codons pour les aminoacides 1, 2 et 3 (cystéine-tyrosine-cystéine) et créent une extrémité de cohésion Eco RI Ces désoxyoiigonucléotides sont reliés par ligation à un fragment Bst NI-Pst I à 100 paires de bases de p 69 pour construire un gène hybride synthétique-naturel à 1115 paires de bases qui code pour l'IFN y et qui est lié par les 251 t 4783 sites de restriction Eco RI et Pst I Ce gène est inséré dans le plasmide p Le IF A trp 103 entre les sites Eco RI et Pst I pour donner le plasmide d'expression p IFN y trp 48 Dans ce plasmide le gène d'IFN y est exprimé sous le contrôle du promoteur trp de l'E coli (Le p Le IF A trp 103 est un dérivé de p Le IF A 25 dans lequel le site Eco RI distal au gène de Le IF A est éliminé Le mode opératoire utilisé pour éliminer ce site Eco RI a été décrit antérieurement ( 27)). 2 Expression dans la levure Pour exprimer un gène hétérologue tel que l'AD No pour l'interféron immunitaire dans la levure, il est nécessaire de construire un vecteur plasmidique contenant quatre composants Le premier composant est la partie qui autorise la transformation à la fois de l'E coli et de la levure et qui doit de ce fait contenir un gène pouvant être sélectionné à partir de chaque organisme (Dans ce cas, c'est le gène pour la résistance à l'ampicilline de l'E coli et le gène de TR Pl de la levure) Ce composant exige aussi une origine de réplication de la part des deux organismes pour être maintenu comme ADN plasmidique dans les deux organismes (Dans ce cas c'est l'origine d'E coli de p BR 322 et l'origine ars 1 du chromosome III de la levure). Le second composant du plasmide est une séquence de flanquement 5 ' d'un gène de levure fortement exprimé pour promou- voir la transcription d'un gène de structure placé en aval Dans ce cas, la séquence de flanquement 5 ' utilisée est celle du gène de 3phosphoglycérate kinase (PGK) de la levure Le fragment est construit en sorte d'éliminer l'ATG de la séquence de structure de PGK ainsi que 8 bp (paires de bases) en amont de cet ATG Cette séquence est remplacée par une séquence contenant un site de restriction à la fois Xba I et Eco RI pour l'attachement adéquat de cette séquence de flanquement 5 ' au gène de structure. Le troisième composant du système est un gène de structure construit en sorte de contenir à la fois un départ de traduction ATG et des signaux d'arrêt de traduction L'isolement et la construction d'un tel gène sont décrits infra. Le quatrième composant est une séquence d'ADN de levure contenant la séquence de flanquement 3 ' d'un gène de levure, qui contient les signaux appropriés pour la terminaison de la transcription et la polyadénylation. Tous ces composants étant présents, l'interféron immunitaire a été produit dans la levure. 3 Expression dans la culture de cellules de mammi- *fères La stratégie pour la synthèse de l'interféron immuni- taire dans la culture de cellules de mammifères repose sur le développement d'un vecteur capable à la fois de réplication et d'expression autonome d'un gène étranger sous le contrôle d'une unité de transcription hétérologue La réplication de ce vecteur dans la culture de tissus est accomplie en fournissant une origine de réplication d'ADN (dérivée du virus SV 40) et en four- nissant une fonction d'assistance (antigène T) par l'introduction du vecteur dans une lignée de cellules exprimant endogènement cet antigène ( 28, 29) Le dernier promoteur du virus SV 40 précède le gène de structure de l'interféron et assure la transcription du gène. Le vecteur utilisé pour obtenir l'expression de l'IFN Y consiste en des séquences p BR 322 qui fournissent un marqueur pouvant être choisi pour la sélection dans l'E coli (résistance à l'ampicilline) de même qu'une origine d'E coli de réplication Ces séquences sont dérivées du plasmide p ML-1 ( 28) et renferment la région couvrant les sites de restriction Eco RI et Bam HI L'origine du SV 40 provient d'un fragment Pvu II-Hind III à 342 paires de bases couvrant cette région ( 30, 31) (les deux extrémités étant converties en extrémités Eco RI) Ces séquences, en plus de comporter l'origine virale de la réplication d'ADN, encodent le promoteur à la fois pour l'unité de transcription précoce et la tardive L'orientation de la région d'origine du SV 40 est telle que le promoteur pour l'unité de transcription tardive est mis en position à proximité du gène encodant l'interféron. Brève description des dessins La figure 1 représente l'expression d'une centrifuga- tion sur un gradient de sucrose (sucrose ( 5 à 25 %) dans formamide ( 70 %)) d'un Poly (A) + ARN de lymphocyte sanguin périphérique (PBL) induit On observe deux pics d'activité d'interféron (comme indiqué par les rectangles hachurés) avec des dimensions de 125 et 16 S Les positions des marqueurs d'ADN de ribosomes (centrifugés indépendamment) sont répérées au-dessus du profil d'absorbance. La figure 2 représente l'expression d'une électropho- rèse de Poly (A) + ARN de PBL induit, sur un gel d'agarose ( 1,75 %) urée ( 6 M) acide On observe seulement un pic d'activité qui migre conjointement avec l'ARN 18 S Les positions des marqueurs d'ARN de ribosomes qui ont subi l'électrophorèse dans un passage adjacent et qui sont visualisées par teinture au bromure d'éthidium sont répérées au-dessus du profil d'activité. La figure 3 montre des modèles d'hybridation de 96 colonies avec des prélèvements (prises) d'AD Nc marqué au 32 p induits (photo supérieure) et-non induits (photo inférieure) 96 transformants individuels sont développés dans une plaque de microtitrage, les répliques sont étendues sur deux membranes de nitrocellulose et alors les filtres sont hybridés avec des échan- tillons de 32 P-AD Nc préparés soit à partir d'AR Nm induit (en haut) ou d'AR Nm isolé à partir de cultures de PBL non induites (non induites, en bas) Les filtres sont lavés pour éliminer l'ARN non-hybridé et ensuite exposés à une pellicule pour rayons X Ce Jeu de filtres est représentatif de 86 de ces Jeux ( 8300 colonies indépendantes) Un exemple de clone "induit" est étiqueté H 12. La figure 4 est une carte d'endonucléases de restric- tion de l'insert d'AD Nc du clone 69 L'insert d'AD Nc est borné par des sites Pst I (points aux deux extrémités) et des queues oligo d C-d G (lignes simples) Le nombre et la dimension des fragments produits par clivage à la nucléase de restriction est estimé par électrophorèse à travers des gels à 6 % de polyacrylamide Les positions des sites sont confirmées par le séquençage des acides nucléiques (qu'on représente sur la figure ) La région de codage du cadre de lecture le plus largement ouvert est représentée par des rectangles et la région hachurée représente la séquence peptidique putative "signal" à 20 résidus, tandis que la région pointillée représente la séquence IIF mûre ( 146 aminoacides) L'extrémité 5 ' de l'AR Nm est à gauche tandis que l'extrémité 3 ' est à droite. La figure 5 représente la séquence de nucléotides de l'insert d'AD Nc du plasmide p 69 illustrant cependant la forme allélique la plus commune de l'IFN-y La séquence d'aminoacides déduite du cadre de lecture ouvert le plus long est également présentée La séquence "signal" putative est représentée par les résidus marqués 51 à 520. La figure 6 est une comparaison de la structure d'AR Nm de l'IFN-y avec celle des interférons de leucocyte (IFN- a) et de fibroblaste (IFN) L'AR Nm du clone 69 (immunitaire marqué) contient des quantités nettement plus grandes de séquen- ces non traduites. La figure 7 est un diagramme schématique de la cons- truction du plasmide p IFN y trp 48 d'expression de l'IFN-y La matière de départ est l'insert à 1250 paires de bases Pst I AD Nc provenant du plasmide p 69. La figure 8 montre un diagramme de plasmide utilisé pour l'expression de l'IFN y dans les cellules de singe. La figure 9 montre l'hybridation Southern de huit différents ADN de génome humain digérés avec Eco RI, hybridés avec un fragment à 600 paires de bases Dde I marqué au 32 p provenant de l'insert d'AD Nc du p 69 (clone 69) Deux fragments Eco RI s'hybri- dent clairement avec le prélèvement dans chaque échantillon d'ADN. La figure 10 montre une hybridation de Southern de l'ADN du génome humain digéré avec six endonucléases de restric- tion différentes qui ont subi une hybridation avec un prélèvement marqué au 32 p en provenance de p 69 (clone 69). La figure 11 illustre schématiquement la carte de restriction de l'insert à 3,1 kbp Hind III du vecteur p B 1 duquel a été isolé le promoteur de PGK Est indiquée l'insertion d'un site Eco RI et d'un site Xba I dans l'ADN de flanquement 5 ' du gène de PGK (de levure). La figure 12 illustre la séquence de flanquement 5 ' plus la séquence de codage initial du gène de PGK avant insertion des sites Xba I et Eco RI (Séquence d'ADN de l'extrémité 5 ' du gène de structure de PGK de levure et ADN de flanquement). La figure 13 illustre schématiquement les techniques utilisées pour insérer un site Xba I en position 8 du promoteur de PGK et pour isoler un fragment à 39 bp (paires de bases) de la séquence de flanquement 5 ' de PGK contenant cette extrémité Xbai et une extrémité Sau 3 A. La figure 14 illustre schématiquement la construction d'un fragment à 300 bp contenant le fragment susdit à 39 bp, une séquence supplémentaire ( 265 bp) de flanquement 5 ' de PGK allant de Pvu I à Sau 3 A (voir figure 11), et un site Eco RI ad Jacent au Xba I. La figure 15 illustre schématiquement la construction du fragment de promoteur de PGK à 1500 bp (Hind III/Eco RI) qui contient en plus du fragment construit à la figure 14, un fragment de Hind III à Pvu I à 1300 bp provenant d'une séquence de flanque- ment 5 ' (voir figure 11). La figure 16 illustre la composition d'un vecteur d'expression pour l'interféron immunitaire humain dans la levure, contenant le promoteur de PGK modifié, l'AD Nc de l'IFN-Y et la région de terminaison du gène de PGK de la levure comme décrit plus en détail ci-après. Description détaillée A Source d'AR Nm d'IFN-y (IFN y AR Nm) Des lymphocytes sanguins périphériques (PBL) sont tirés de donneurs humains par leukophorèse Les lymphocytes PBL sont purifiés par centrifugation sur un gradient selon Ficoll- Hypaque et sont ensuite cultivés à une concentration de 5 x 13 cellules/ml dans une solution de RPMI 1640, 1 % de L-glutamine, m M de HEPES et 1 % de pénicilline-streptomycine (Gibco, Grand Island, NY) Ces cellules sont amenées à produire de l'IFN y sous l'action de l'entérotoxine B de staphylocoque mitogène ( 1 ig/ml) et sont cultivées 24 à 48 heures à 370 C dans 5 % de C 02 On a Joute de la désacétylthymosine-c L-1 ( 0,1 lig/ml) aux cultures de PBL pour augmenter le rendement relatif de l'activité de 1 'IFN y B Isolement de l'ARN messager La totalité de l'ARN des cultures de PBL est extraite essentiellement selon Berger, S L et al ( 33) Les cellules sont mises en pastilles par centrifugation et puis remises en suspen- sion dans 1 Om M de Na Cl, 10 m M de Tris-HCL (p H 7,5), 1,5 m M de Mg Cl 2 et 10 m M de complexe ribonueléoside vanadyle Les cellules sont lysées par l'addition de NP-40 ( 1 % concentration finale) et les noyaux sont mis en pastilles par centrifugation Le surna- geant contient tout l'ARN qui est purifié davantage par de multi- ples extractions au phénol et au chloroforme La phase aqueuse est rendue 0,2 M en Na Cl et tout l'ARN est précipité par addition de deux volumes d'éthanol L'ARN provenant de cultures non indui- tes (non stimulées) est isolé par les mêmes procédés On utilise la chromatographie sur cellulose oligo-d T pour purifier l'AR Nm de toutes les préparations d'ARN ( 34) Les rendements de 1 à 2 litres de PBL cultivés sont typiquement de 5 à 10 mg d'ARN au total et de 50 à 200 microgrammes de Poly (A) + ARN au total. C Fractionnement de taille de l'AR Nm Deux méthodes servent à fractionner les préparations d'AR Nm Ces méthodes sont utilisées indépendamment piut St qu'à l'unisson et chacune d'entre elles donne lieu à un enrichissement significatif de l'AR Nm d'IFN-y La centrifugation sur gradient de sucrose en présence de formamide dénaturant sert à fractionner l'AR Nm Des gradients de sucrose ( 5 à 25 %) dans le formamide ( 70 %) ( 32) sont centrifu- gés à 154 000 g pendant 19 heures à 20 C Des fractions successi- ves ( 0,5 ml) sont ensuite enlevées du sommet du gradient, -25 14783 précipitées à l'éthanol et une aliquote est injectée dans des oocytes de Xenopus laevis pour la traduction de l'AR Nm ( 35). Après 24 heures à température ambiante, on teste le milieu d'incubation en vue de l'activité antivirale en effectuant un test d'inhibition de l'effet cytopathique standard mettant en oeuvre un virus de stomatite vésiculaire (souche Indiana) ou un virus d'encéphalomyocardite et des cellules WISH (amnion humain) comme décrit par Stewart ( 36), sauf que les échantillons sont incubés avec les cellules pendant 24 heures au lieu de 4 avant d'être mis en présence du virus On observe de manière constante deux pies d'activité dans l'ARN fractionné sur un gradient de sucrose (figure 1) Un pic présente une sédimentation avec une dimension calculée de 12 S et contient 100 à 400 U/ml d'activité antivirale (comparée à un IFN-c standard) L'autre pic d'acti- vité présente une sédimentation de 16 S en dimension et contient environ la moitié de l'activité du pic de sédimentation plus lente Chacun de ces pics d'activité semble provenir de l'IFN y, car on n'observe aucune activité lorsque les mêmes fractions sont testées sur une lignée de cellules bovines (MDBK) non protégée par l'IFN y humain Les deux activités de l'IFN a et de l'IFN- B auraient été facilement détectées par l'essai MDBK ( 5). Le fractionnement de l'AR Nm ( 200 i g) se fait égale- ment par électrophorèse en utilisant des gels d'agarose-urée acides La lamelle degel d'agarose ( 37, 38) se compose de 1,75 % d'agarose, 0,025 M de citrate de sodium, p H 3,8 et 6 M d'urée. L'électrophorèse dure 7 heures à 25 milliampères et à 40 C Le gel est ensuite fractionné avec une lame de rasoir Les tranches individuelles sont fondues à 70 Cet extraites deux fois avec du phénol et une fois avec du chloroforme Les fractions sont ensuite précipitées à l'éthanol et testées subséquemment en vue de l'AR Nm d'IFN-y par injection dans des oocytes de Xenopus laevis suivie d'un test antiviral Un seul pic d'activité est observé dans les échantillons de gel fractionné (figure 2) Ce pic migre simultanément avec l'ARN 18 S et a une activité de 600 U/ml par microgramme d'ARN injecté I 1 apparait que cette activité est également spécifique de l'IFN-y car elle ne protège pas les cellules de MBDK. La discordance de taille entre les pics d'activité observée sur des gradients de sucrose ( 12 S et 16 S) et sur des gels d'urée acides ( 18 S) peut s'expliquer par l'observation que ces méthodes de fractionnement indépendantes ne sont pas appliquées dans des conditions de dénaturation totale. D Préparation d'une "bibliothèque" de colonies contenant des séquences d'IFN-y 3 yg d'AR Nm fractionné sur gel servent à la prépara- tion d'AD Nc à deux brins par des modes opératoires classiques ( 26, 39) La taille de l'AD Nc est fractionnée sur un gel à 6 % de polyacrylamide Deux fractions sont électroéluées, l'une de 800 à 1500 bp ( 138 ng), l'autre de > 1500 bp ( 204 ng) Des parts de 35 ng d'AD Nc de chaque taille sont étendues avec des restes désoxy C en utilisant de la désoxynucléotidyl transférase ( 40) et sont fixées (annealed) avec 300 ng du plasmide p BR 322 ( 41) qui a reçu une terminaison semblable avec des résidus de désoxy C au site Pst I ( 40) Chaque mélange fixé est ensuite transformé en E coli K 12 souche 294 Environ 8000 transformants sont obtenus avec l'AD Nc à 800 1500 bp et 400 transformants sont obtenus avec l'AD Nc à > 1500 bp. E Tri d'une "bibliothèque" de colonies pour les AD Nc induits Les colonies sont inoculées individuellement dans les creux de plaques de microtitrage contenant LB ( 58) + 5 pg/ml de tétracycline et sont mises au repos à -20 C après addition de DMSO à 7 % On fait crottre deux copies de la "bibliothèque" de colonies sur des filtres de nitrocellulose et on fixe l'ADN de chaque colonie au filtre selon la technique de Grunstein-Hogness ( 42). Des échantillons ou prélèvements d'AD Nc marqué au 32 p sont préparés en utilisant de l'AR Nm de taille 18 S fractionné sur du gel et provenant de cultures de PBL avec ou sans induction. L'oligo d T 12 _ 18 est utilisé comme amorce et les conditions de réaction ont été décrites-précédemment ( 1) Les filtres contenant 8000 transformants en provenance de la fraction d'AD Nc à 600- 1500 bp et 400 transformants de la fraction d'AD Nc à > 1500 bp sont hybridés avec 20 x 106 cpm d'AD Nc 32 p induit Un Jeu de filtres obtenu, par duplication est hybridé avec 20 x 106 cpm d'AD Nc 32 p non induit L'hybridation dure 16 heures dans les conditions décrites par Fritsch et al ( 43) Les filtres sont lavés abondamment ( 43) et puis exposés à une pellicule pour rayons x KODAK XR-5 avec des écrans d'intensification Dupont Lightning-Plus pendant 16 à 48 heures On compare le modèle d'hybridation de chaque colonie avec les deux échantillons Envi- ron 40 % des colonies présentent une hybridation claire avec les deux échantillons tandis qu'environ 50 % des colonies ne font aucune hybridation avec l'un et l'autre échantillon (voir figure 3) 124 colonies s'hybrident de façon significative avec l'échantillon induit mais de façon indétectable ou plus faible- ment avec l'échantillon non induit Ces colonies sont inoculées individuellement dans les creux ou puits de plaques de microti- trage, on les laisse croitre et on les transfère sur des filtres de nitrocellulose et on les hybrides ( 45) avec les échantillons induits et non induits L'ADN de 22 colonies s'hybride seulement avec l'échantillon induit et donne lieu à des colonies dites "induites". F Caractérisation des colonies induites L'ADN plasmidique est préparé à partir de 5 colonies induites ( 46) et sert à la caractérisation des inserts d'AD Nc. L'établissement de la carte d'endonucléase de restriction dans le cas de cinq plasmides induits (p 67, p 68, p 69, p 71 et p 72) suggère que quatre d'entre eux ont des cartes de nucléase de restriction similaires Ces quatre plasmides (p 67, p 69, p 71 et p 72) ont chacun quatre sites Dde II, deux sites Hinf I et un seul site Rsa I dans l'insert d'AD Nc Le cinquième plasmide (p 68) contient un fragment Dde I commun et apparaît comme un court clone d'AD Nc en relation avec les quatre autres L'homologie suggérée par l'éta- blissement de cartes de nucléase de restriction est confirmée par hybridation On prépare un échantillon d'ADN marqué au 32 p ( 47) à partir d'un fragment à 600 bp Dde I du plasmide p 67 et on l'utilise pour l'hybridation ( 42) vers les autres colonies induites Toutes les cinq colonies dont les cartes de nucléase de restriction ont été établies forment des hybrides croisés avec cet échantillon, de même que les 17 autres colonies parmi les 124 choisies dans le tri entre induit/non induit La longueur de l'insert d'AD Nc dans chacun de ces plasmides d'hybridation croisée est déterminée par digestion au Pst I et électrophorèse sur gel Le clone avec le plus long insert d'AD Nc se révèle être le clone 69 avec une longueur d'insert de 1200-1400 bp Cet ADN sert pour toutes les autres expériences et sa carte d'endonucléase de restriction est montrée sur la figure 4. On démontre que l'insert d'AD Nc dans le p 69 est l'AD Nc d'IFN y par son produit d'expression, produit dans trois systèmes d'expression indépendants, produisant une activité anti- virale, comme décrit plus en détail ci-après. G Analyse de séquence de l'insert d'AD Nc du p 69 La séquence complète des nucléotides de l'insert d'AD Nc du plasmide p 69 est déterminée par la méthode de termi- naison de cha;ne au didésoxynucléotide ( 48) après subelonage de fragments pour les introduire dans le M 13 vecteur mp 7 ( 49) et par le procédé chimique de Maxam-Gilbert ( 52) Le cadre de lecture ouvert le plus long encode une protéine de 166 aminoacides, pré- senté sur la figure 5 Le premier résidu encodé est le premier codon MET rencontré à l'extrémité 5 ' de l'AD Nc Les premiers 20 résidus à la terminaison amino servent probablement de séquence de "signal" pour la sécrétion des 146 acides aminés restants. Cette séquence de signal possible ou putative a des propriétés en commun avec d'autres séquences "signal" caractérisées comme la taille et le caractère hydrophobe En outre, les quatre amino- acides trouvés dans la séquence putative de clivage (ser-leu-gly- cys) sont identiques aux quatres résidus trouvés au point de clivage de plusieurs interférons de leukocyte (Le IF B, C, D, F et H, ( 2)) La séquence d'aminoacides encodée comportant 146 amino- acides a un poids moléculaire de 17 140. Il y a deux positions potentielles de glycosylation ( 50) dans la seconde séquence protéinique encodée aux aminoacides 28 à 30 (asn-gly-thr) et aux aminoacides 100 à 102 (asn-tyr-ser). L'existence de-ces positions est en accord avec la glycosylation de l'I Fn y humain observée ( 6, 51) En outre les deux seuls résidus de cystéine (positions 1 et 3) sont stériquement trop proches pour former un pont disulfure, ce qui est en accord avec la stabilité observée de l'IFN y en présence d'agents réducteurs tels que le B -mercaptoéthanol ( 51) La séquence d'aminoacides mûre déduite est généralement totalement basique avec 30 résidus de lysine, d'arginine et d'hystidine au total et seulement 19 résidus d'acide aspartique et d'acide glutamique au total. La structure d'AR Nm de l'IFN-y telle que déduite de la séquence d'ADN du plasmide p 69 est nettement différente de celle de l'AR Nm de l'IFN a ( 1, 2) ou de l'IFN B ( 5) Comme on le voit sur la figure 6, la région de codage de l'IFN-y est plus courte tandis que les régions non traduite 5 ' et non traduite 3 ' sont beaucoup plus longues que pour l'IFN-a ou pourl'IFN H Expression directe de l'interféron immunitaire mûr dans E Coli En se référant à la figure 7, 50 i g de plasmide p 69 sont digérés avec du Pst I et l'insert à 1250 paires de bases est isolé par électrophorèse sur un gel de 6 % de polyacrylamide. Environ 10 *yg de cet insert sont électroélués à partir du gel. eg de ce fragment Pst I sont digérés partiellement avec 3 unités de Bst NI (Bethesda Research Labs) pendant 15 minutes à 37 C et le mileu de réaction est purifié sur un gel à 6 % de polyacrylamide. Environ 0,5 pg du fragment désiré à 1100 paires de bases Bst NI - Pst I est recueilli On synthétise les deux désoxyoligonucléoti- des, 5 '-d AATTCATGTGTTATTGTC et 5 '-d TGACAATAACACATG (figure 7) en appliquant le procédé au phosphotriester ( 53) et on effectue leur phosphorylation comme suit 100 pmoles de chaque désoxyoligo- nucléotide sont combinés dans 30 pl de 60 m M Tris-HC 1 (p H 8), 10 m M de Mg C 12, 15 m M de B-mercaptoéthanol et 240 I Ci (y-32 P) ATP (Amersham, 5000 Ci/mmole) On ajoute 12 unités de T 4 polynucléo- tide kinase et on laisse la réaction progresser à 37 C pendant 30 minutes On ajoute 1 p 1 d'ATP 10 m M et on laisse la réaction progresser 20 minutes supplémentaires Après extraction au 0- OH/c Hc 13, les olygomères sont combinés à 0,25 gg du fragment Bst NI-Pst I à 1100 paires de bases et sont précipités à l'éthanol. Ces fragments subissent une ligation à 20 C pendant 2 heures dans il de 20 m M Tris-HC 1 (ph 7,5), 10 m M Mg Cl 2, 10 m M dithiothréi- tol, 0,5 m M ATP et 10 unités de T 4 ADN ligase Le mélange est digéré 1 heure avec 30 unités de Pst I et 30 unités d'Eco RI (pour éliminer la polymérisation par ligation des terminaisons cohésives) et subit une électrophorèse sur un gel à 6 % de poly- acrylamide Le produit à 1115 paires de bases ( 110 000 cpm) est recueili par électroélution. Le plasmide p Le IF A trp (figure 7) est un dérivé du plasmide p Le IF A 25 ( 1) dans lequel le site Eco RI distal par rapport au gène de Le IF A a été enlevé ( 27) 31 jg de p Le IF A trp 103 sont mis en digestion avec 20 unités d'Eco RI et 20 unités de Pst I pendant 90 minutes à 37 C et soumis à électrophorèse sur un gel à 6 % de polyacrylamide Le grand fragment (environ 3900 paires de bases) de vecteur est recueilli par électroélution Le fragment à 1115 paires de bases Eco RI-Pst I de l'ADN d'IFN-y subit une ligation dans 0,15 pg de ce vecteur préparé La trans- formation de l'E coli K-12 souche 294 (ATCC n 31446) donne 120 colonies résistantes à la tétracycline L'ADN de plasmide est préparé à partir de 60 de ces transformants et digéré avec Eco RI et Pst I Trois de ces plasmides contiennent le fragment désiré à 1115 paires de bases Eco RI- Pst I L'analyse des séquences d'ADN permet de vérifier que ces plasmides ont la séquence de nucléo- tide voulue aux Jonctions entre le promoteur trp, l'ADN synthéti- que et l'AD Nc Un de ces plasmides p IFN-y trp 48 a été choisi pour une étude supplémentaire Ce plasmide a servi à transformer l'E coli K-12 souche W 3110 (ATCC n 27325). I Structure de gène de la séquence de codage pour l'IFN y La structure du gène codant pour de lt'IFN y a été analysée par hybridation de Southern Selon cette méthode ( 54), on fait digérer 5 microgrammes d'ADN de lymphocytes humains de poids moléculaire élevé (préparé selon 55) Jusqu'au bout avec diverses endonucléases de restriction, on traite par électrophorèse sur gels d'agarose à 1 % ( 56) et on sèche sur un filtre de nitrocellulose ( 54) On prépare un échantillon d'ADN marqué au 32 p ( 47) à partir d'un fragment à 600 bp Dde I de l'insert d'AD Nc du p 69 et on hybride ( 43) avec la tache de nitrocellulose-ADN 107 éléments (counts) par minute de l'échantillon sont hybridés 16 heures et puis lavés comme décrit ( 43) Huit échantillons d'ADN génomique provenant de différents donneurs humains sont digérés avec l'endonucléase de restriction Eco RI et sont hybridés avec le prélèvement de p 69 marqué au 32 p Comme représenté sur la figure 9, on observe deux signaux clairs d'hybridation avec des tailles de 8,8 kilo paires de bases (kbp) et 2,0 kbp selon estima- tion par comparaison de mobilités avec l'ADNX digéré par Hind III. Ceci pourrait provenir de deux gènes de l'IFN-y ou d'un seul gène scindé par un site Eco RI Comme l'AD Nc du p 69 ne contient aucun site Eco RI, une séquence intercalaire (intron) avec un site Eoo RI interne serait nécessaire pour expliquer un seul gène Pour distinguer entre les deux possibilités, on effectue une autre hybridation de Southern avec le même échantillon à l'encontre de cinq autres digestions à l'endonucléqase d'un seul ADN humain (figure 10) On observe deux fragments d'ADN hybridant avec deux autres produits de digestion à l'endonucléase, Pvu II ( 6,7 kbp et 4,0 kbp) et Hinc II ( 2,5 kbp et 2,2 kbp) Cependant trois modèles de digestion à l'endonucléase fournissent seulement un simple fragment d'ADN hybridant: Hind III ( 9,0 kbp), Bgl II ( 11,5 kbp) et Bam HI ( 9,5 kbp) Deux gènes d'IFN-y devraient être liés à une distance anormalement proche (moins de 9,0 kbp) pour être conte- nus dans le même fragment d'hybridation Hind III Ce résultat sug- gère qu'un seul gène d'IFN-y homologue (contrairement aux nombreux gènes d'IFN-a reliés) est présent dans l'AD Ndu génome humain et que ce gène est scindé par un ou plusieurs introns contenant des sites Eco RI, Pvu II et Hinc II Cette prédiction est supportée par l'hybridation d'un fragment marqué au 32 p ( 47) préparé précisément à partir de la région 3 ' non traduite de l'AD Nc du p 69 (fragment à 130 bp de Dde I de 860 à 990 bp sur la figure 5) à l'encontre d'un produit de digestion Eco RI de l'ADN génomique humain Seul le fragment à 2,0 kbp Eco RI donne une hybridation sur cet échantillon, ce qui suggère que ce fragment contient les séquences 3 ' non traduites, alors que le fragment à 8,8 kbp Eco RI contient les séquences 5 ' La structure de gène de Op l'IFN-y (un gène avec au moins un intron) est nettement diffé- rente de celle de l'IFN a (gènes multiples ( 2) sans introns ( 56)) ou de celle de l'IFN e (un gène sans introns ( 57)). J Préparation d'extraits bactériens Une culture nocturne d'E coli W 3110/p IFN y trp 48 en bouillon de culture de Luria + 5 microgrammes par ml de tétra- cycline sert à innoculer un milieu M 9 ( 58) contenant 0,2 % de glucose, 0,5 % de casamino acides et 5 microgrammes par ml de tétracycline en dilution de 1:100 On ajoute de l'acide indole acrylique pour atteindre une concentration finale de 20 micro- grammes par ml quand A 550 est compris entre 0,1 et 0,2 Des échantillons de dix ml sont recueillis ou récoltés par centrifu- gation à A 550 = 1 et remis en suspension dans 1 ml de tampon salin de phosphate contenant 1 mg par ml d'albumine de serum bovin (PBS- BSA) Les cellules sont ouvertes aux ultrasons et débarrassées des débris par centrifugation Les surnageants sont stockés à 4 C Jusqu'aux essais L'activité d'interféron des surnageants est déterminée égaie à 250 U/ml par comparaison avec des standards d'IFN-c en appliquant le test d'inhibition de l'effet cytopathique (CPE). K Transformation de souches de levure et milieux appropriés On transforme des souches de levure comme décrit pré- cédemment ( 59) On utilise E coli souche JA 300 (thr leu B 6 thi thy A trp C 1117 hsdm hsd R str R) ( 20) pour sélectionner en vue des plasmides contenant le gène fonctionnel TRPI On utilise une -.2514783 souche de levure RH 218 comportant le génotype (a trpl ga 12 SUC 2 mal CUPI) ( 18) comme hôte de transformation de la levure RH 218 a été déposé sans restriction auprès de l'American Type Culture Collection, ATCC n 44076 Le M 9 (milieu minimal) comportant 0,25 % de casaminoacides (CAA) et le LB (milieu riche) sont tels que décrits par Miller ( 58) avec l'addition de 20 ig/ml d'ampi- cilline (Sigma) après avoir mis le milieu en autoclave et l'avoir refroidi On fait croître la levure sur les milieux suivants: YEPD contenant 1 % d'extrait de levure, 2 % de peptone et 2 % de glucose 3 % d'agar de Difco YNB+CAA contient 6,7 g de base azotée de levure (sans aminoacides) (YNB) (Difco) 10 mg d'adénine, 10 mg d'uracile, 5 g de CAA, 20 g de glucose et t 30 g d'agar par litre. L Construction du vecteur d'expression de levure 1 On fait digérer 10 pg de Y Rp 7 ( 14, 15, 16) avec Eco RI Les extrémités collantes ou agglutinantes d'ADN ainsi formées sont rendues émoussées à l'aide d'ADN Polymérase I (fragment de Klenow) On fait passer le vecteur et l'insert sur un gel d'agarose à 1 % (Seakem), on les coupe du gel, on soumet à électroélution et on extrait deux fois avec des volumes égaux de chloroforme et de phénol avant de précipiter à l'éthanol Les molécules d'ADN à terminaisons émoussées ainsi formées sont ensuite réunies par ligation dans un volume final de 50 111 pendant 12 heures à 12 C Ce mélange de ligation sert ensuite à transfor- mer E coli souche JA 300 en résistance à l'ampicilline et en prototrophie de tryptophane On isole des plasmides contenant le gène TR Pl dans les deux orientations p FRW 1 a le gène de TR Pl dans la même orientation que Y Rp 7 tandis que p FRW 2 a le gène de TR Pl en orientation opposée. 20 gg de p FRW 2 sont linéarisés avec Hind III et soumis àélectrophorèse sur un gel à 1 % d'agarose Les molécules linéai- res sont éluées à partir du gel et une quantité de 200 ng subit ensuite une ligation avec 500 ng de l'insert à 3,1 kb Hind III du plasmide p B 1 ( 13) qui est un fragment de restriction contenant le gène de 3phosphoglycérate kinase de levure Le mélange de liga tion sert ensuite à transformer E coli souche 294 en résistance à l'ampicilline et en sensibilité à la tétracycline Le plasmide préparé à partir d'un tel recombinant a un gène de TR Pl intact avec le fragment à 3,1 kbp de Hind III provenant de l'ADN d'insert p B 1 au site Hind III du gène de résistance à la tétracycline Il s'agit du plasmide p FRM 31 5 p g du p FRM 31 sont digérés complètement avec Eco RI, extraits deux fois avec du phénol et du chloroforme et puis précipités à l'éthanol Les extrémités cohésives de la molécule sont remplies au moyen d'ADN Polymérase I (fragment de Klenow) dans une réaction rendue 250 i M en chaque désoxynucléotide triphosphate La réaction est faite 20 minutes à 14 C, l'ADN étant alors extrait deux fois au phénol-chloroforme et puis précipité à l'éthanol L'ADN remis en suspension est ensuite digéré complètement avec Cla I et traité par électrophorèse sur un gel à 6 % de polyacrylamide Le fragment de vecteur est séparé du gel par élution, extrait au phénol- chloroforme et précipité à l'éthanol. Les six aminoacides N-terminaux de l'enzyme 3- phosphoglycérate purifié à partir de produits humains sont comme suit: 1 2 3 4 5 6 SER LEU SER HSM LYS LEU - Un des cadres de lecture de traduction engendré par la séquence du fragment de restriction à 141 bp Sau 3 A à Sau 3 A (contenant le site interne Hinc II; voir carte de restriction de PGK, figure 11) produit la séquence suivante d'aminoacides. 1 2 3 4 5 6 MET SER LEU SER SER LYS LEU - Après enlèvement de la méthionine d'amorce, on voit que la séquence d'aminoacides N-terminale de PGK a une homologie de 5 à 6 aminoacides avec la séquence d'aminoacides N-terminale de PGK humain. La forme de séquence ainsi obtenue suggère que le départ du gène de structure de PGK de levure est codé par l'ADN dans le fragment de restriction à 141 bp Sau 3 A du PB 1 Des travaux antérieurs ont suggéré ( 20) que les séquences d'ADN spécifiant 1 'AR Nm de PGK peuvent se trouver dans cette zone du fragment Hind III Une autre formation de séquence du fragment à 141 bp Sau 3 A donne plus de séquence d'ADN du promoteur de PGK (figure 12). Un oligonucléotide synthétique de séquence 'ATTTGTTGTAAA 3 ' est synthétisé par des procédés normalisés (Créa et al, Nucleic Acids Res 8, 2331 ( 1980)) 100 ng de cette amorce sont marqués à l'extrémité 5 ' au moyen de T 4 polynucléotide kinase dans 20 I 1 de milieu de réaction contenant 200 i Ci de (y 32 p) ATP Cette solution d'amorce marquée sert dans une réaction de réparation des amorces destinés à constituer la première étape d'un procédé à plusieurs étapes pour mettre un site de restriction Eco RI dans l'ADN de flanquement 5 ' de PGK juste avant la séquence de gène de structure de PGX. On digère 100 pg de p Bl ( 20) complètement avec Hae III puis on passe sur un gel à 6 % de polyacrylamide La bande supé- rieure du gel teinté à l'éthidum (contenant la région du promo- teur de PGK) est isolée par électroélution comme décrit plus haut Ce morceau d'ADN Hae III à 1200 bp est restreint avec Hinc II puis passé sur un gel de polyacrylamide à 6 % La bande à 650 bp est isolée par électroélution On isole 5 pg d'ADN Ce morceau d'ADN Hae III-à-Hinc II à 650 bp est remis en suspension dans 20 pg de H 20, puis mélangé aux 20 i 1 de solution d'amorce phosphorylée décrite plus haut Ce mélange est extrait une fois au phénol- chloroforme puis est précipité à l'éthanol De l'ADN sec est remis en suspension dans 50 p 1 de H 20 et puis est chauffé au bain d'eau bouillante pendant sept minutes Cette solution est ensuite refroidie rapidement dans un bain de neige carbonique éthanol ( 20 10 secondes) puis est transférée dans un bain d'eau glacée. A cette solution, on ajoute 50 pl d'une solution contenant 10 p 1 de 10 X ADN Polymérase I tampon (Boehringer Mannheim), 10 U 1 d'une solution faite d'avance 2,5 m M en chaque désoxynucléoside tri- phosphate (d ATP, d TTP, d GTP et d CTP), 25 W 1 de H 20 et 5 unités d'ADN Polymérase I, fragment de Klenow Ce milieu de réaction de ll est incubé à 37 C pendant 4 heures La solution est ensuite extraite une fois au phénol-chloroforme, précipitée à l'éthanol, séchée par lyophilisation puis restreinte de façon exhaustive avec 10 unités de Sau 3 A Cette solution est ensuite passée sur un gel à 6 % de polyacrylamide La bande correspondant à 39 bp de taille est coupée du gel puis isolée par électroélution comme décrit plus haut Cette bande à 39 bp a une extrémité émoussée et une extrémité cohésive ou agglutinante Sau 3 A Ce fragment est cloné dans un vecteur p FIF trp 69 modifié ( 5) 10 pg de p FIF trp 69 sont linéarisés avec Xba I, extraits 1 X au phénol- chloroforme, puis précipités à l'éthanol L'extrémité collante Xba I est remplie en utilisant de l'ADN Polymérase fragment de Klenow dans 50 pl d'un milieu de réaction contenant 250 p M dans chaque nucléoside triphosphate Cet ADN est coupé avec Bam HI puis passé sur un gel à 6 % de polyacrylamide Le fragment de vecteur est isolé du gel par électroélution puis remis en suspension dans i 1 H 20 On provoque une ligation de 20 ng de ce vecteur avec ng du fragment à 39 bp préparé ci-dessus 4 heures à température ambiante Un cinquième du mélange de ligation sert à transformer E coli souche 294 en résistance à l'ampicilline (sur plaque LB+ 20 Ug/ml amp) Les plasmides des transformants sont examinés selon une technique de tri rapide ( 44) Un plasmide, p PGK-39, est choisi pour l'analyse des séquences On digère 20 ng de ce plas- mide avec Xba I, on précipite à l'éthanol puis on traite avec 1000 unités de phosphase alcalin bactérien à 680 C pendant 45 minutes. L'ADN est extrait 3 X au phénol-chloroforme, puis précipité à l'éthanol Les extrémités déphosphorylées sont ensuite marquées dans un milieu de réaction de 20 pl contenant 200 W Ci de (y 32 P) ATP et 10 unités de T 4 polynucléotide kinase Le plasmide est coupé avec Sal I et passé sur un gel à 6 % de polyacrylamide. La bande d'insert marquée est isolée et séquencée par la méthode de dégradation chimique ( 52) La séquence d'ADN à l'extrémité 3 ' de ce morceau de promoteur est telle qu'attendue. 2 Construction du fragment de promoteur de PGK à 312 bp Pvu I-à-Eco RI On digère 25 pg de p PGK-39 (figure 13) simultanément avec Sal I et Xba I ( 5 unités chacun) puis on traite par électro- phorèse sur un gel à 6 % La bande à 390 bp contenant le morceau de promoteur à 39 bp est isolée par électroélution L'ADN remis en suspension est restreint avec Sau 3 A puis soumis à électrophorèse sur un gel à 8 % de polyacrylamide La bande de promoteur de PGK à 39 bp est isolée par électroélution Cet ADN contien 39 bp de l'extrémité 5 ' du promoteur de PGK sur un fragment Sau 3 A-à-Xba I. ig de p B 1 sont restreints avec Pvu I et Kpn I puis traités par électrophorèse sur un gel à 6 %de polyacrylamide La bande à 0,8 kbp de l'ADN est isolée par électroélution, puis restreinte avec Sau 3 A et soumise à électrophorèse sur un gel à 6 de polyacrylamide La bande à 265 bp du promoteur de PGK (figure 11) est isolée par électroélution. On provoque ensuite une ligation de cet ADN avec le fragment de promoteur à 39 bp décrit ci-dessus pendant 2 heures à température amnbiante Le mélange subit une restriction avec Xba I et Pvu I puis une électrophorèse sur un gel à 6 % de polyacrylamide Le fragment de restriction Xba-à-Pvu I à 312 bp est isolé par électroélution, puis ajouté à un mélange de liga- tion contenant 200 ng de p BR 322 ( 41) (isolé antérieurement sans le fragment de restriction pvu I-à-Pst I à 162 bp) et 200 ng du gène d'AD Nc Xba I-à-Pst I Le IF A précédemment isolé de 20 ig de p Le IF trp A 25 Ce mélange de ligation à trois facteurs sert à transformer E coli souche 294 en résistance à la tétracycline Des colonies transformantes subissent un minitri ( 44) et une des colonies, p PGK-300 est isolée sous une forme comportant 304 bp d'ADN de flanquement 5 ' fusionné au gène de Le IF dans un vecteur basé p BR 322 L'extrémité 5 ' du gène de Le IF A a la séquence suivante: 5 '-CTAGAATTC-3 ' Ainsi la fusion du site Xba I du fragment de promoteur de PGK dans cette séquence permet l'addition au site Xba I d'un site Eco RI Le p PGK-300 contient donc une partie du promoteur de PGK isolé dans un fragment Pvu I-à-Eco RI. 3 Construction d'un fragment de promoteur de PGK ' Eco RI-à-Eco RI à 1500 bp On digère 10 pg de p B 1 avec Pvu I et Eco RI et on fait passer sur un gel à 6 % de polyacrylamide La bande d'ADN Pvu I-à- Eco RI à 1,3 kb de l'ADN de flanquement 5 ' du PGK est isolée par électroélution On digère 10 pg de p PGK-300 avec Eco RI et Pvu I et on isole le fragment de promoteur à 312 bp par électroélution après avoir fait une électrophorèse du mélange de digestion sur un gel à 6 % de polyacrylamide On coupe 5 pg de p FRL 4 avec Eco RI; on précipite à l'éthanol et on traite avec de la phosphatase alcaline bactérienne à 68 C pendant 45 minutes Après trois extractions de l'ADN avec du phénolchloroforme, précipitation à l'éthanol, et remise en suspension dans 20 ml de H 20, on fait une ligation de 200 ng du vecteur avec 100 ng d'ADN à 312 bp Eco RI-à- Pvu RI du p PGK-300 et 100 ng de l'ADN Eco RI-à-Pvu I du p BL Le mélange de ligation sert à transformer E coli souche 294 en résistance à l'ampicilline Un des transformants obtenus est le p PGK-1500 Ce plasmide contient le fragment de promoteur de PGK à 1500 bp sous la forme d'un morceau d'ADN Eco RI-à-Eco RI ou Hind III-à-Eco RI. On digère complètement 10 pg de p PGK-1500 avec Cla I et Eco RI puis on effectue l'électrophorèse du mélange de diges- tion sur un gel à 6 % de polyacrylamide Le fragment à 900 bp contenant le promoteur de p PGK est isolé par électroélution On digère complètement 10 pg de p IFN-y trp 48 avec Eco RI et Hinc II et on le soumet à électrophorèse sur un gel à 6 % de polyacrylamide. La bande à 938 bp contenant l'AD Nc d'IFN-y directement exprimable est isolée du gel par électroélution. Le vecteur d'expression de levure est construit dans un milieu de réaction à trois facteurs en reliant entre eux par ligation le fragment de promoteur de PGK (sur un morceau Cla I-à- Eco RI), le p FRM-31 soumis à délétion et l'AD Nc d'IFN-y isolé ci- dessus Le mélange de ligation est incubé 12 heures à 14 C Le mélange de ligation sert ensuite à transformer E eoli souche 294 en résistance à l'ampicilline Les transformants sont analysés pour détecter la présence du plasmide d'expression proprement construit, p PGK-IFN y (figure 16) Les plasmides contenant le système d'expression servent à transformer des sphéroplastes de levure souche RH 218 en prototropie de tryptophane dans de l'agar manquant de tryptophane Ces levures recombinantes sont ensuite testées pour détecter la-présence d'interféron immunitaire. On prépare des extraits de levure comme suit: on fait croître dix ml de cultures dans YNB+CAA Jusqu'à A 660 1-2, on collecte par centrifugation puis on remet en suspension dans 500 111 de tampon,PBS ( 20 m M Na H 2 PO 4, p H = 7,4, 150 m M Na Cl) On a Joute un volume égal de perles de verre ( 0,45-0,5 mm) et on soumet le mélange à un vortex pendant 2 minutes On fait tourner les extraits 30 secondes à 14 000 tpm et on enlève le surnageant. On détermine l'activité d'interféron du surnageant et on trouve 16.000 U/ml par comparaison avec un standard d'IFN a, en * appliquant le test d'inhibition de CPE. M Construction du vecteur p SVY 69 de culture cellu- laire Le fragment Hind III-Pvu II à 342 paires de bases englobant l'origine de SV 40 est converti en un fragment lié au site de restriction Eco RI Le site Hind III est converti par l'ajoute d'un oligomère synthétique ( 5 'd AGCTGAATTC) et le site Pvu II est converti par ligation d'extrémité émoussée en un site Eco RI rempli en utilisant la Polymérase I (fragment de Klenow). Le fragment Eco RI résultant est inséré dans le site Eco RI du p ML-1 - ( 28) Un plasmide comportant le promoteur tardif (late) de SV 40 orienté à l'écart du gène d'amp R subit une modification ulté- rieure par enlèvement du site Eco RI le plus proche du gène d'amp R du p ML-1 ( 27). On isole le fragment Hpa I-Bg II à 1023 paires de bases de l'ADN du HBV cloné ( 60) et on convertit le site Hpa I du virus d'hépatite B (HBV) en un site Eco RI avec un oligomère synthétique ( 5 'd GCGAATTCGC) Ce fragment lié Eco Ri-Bgl II est cloné directe- ment dans les sites Eco RI-Bam HI du plasmide susdécrit portant l'origine du SV 4 O. Dans le site Eco RI restant, on insère le gène d'IFN- y sur un fragment Pst I à 1250 paires de bases du p 69 après conversion des extrémités Pst I en extrémités Eco RI On isole des clones dans lesquels le promoteur tardif de SV 40 précède le gène de structure de l'IFN-y Les plasmides résultants sont alors introduits dans des cellules de culture tissulaire ( 29) en utili- sant une technique au dextrane-DEAE ( 61) modifiée de façon que la "transfection" en présence de dextrane-DEAE dure 8 heures Les milieux cellulaires sont changés tous les 2-3 Jours On enlève chaque Jour 200 microlitres pour un biotest d'interféron Les rendements sont typiquement de 50-100 U/ml pour des échantillons testés trois à quatre Jours après transfection. N Purification partielle de l'interféron immuni- taire dérivé de cellules de singe Pour produire de plus grandes quantités d'IFN y dérivé de cellules de singe, on effectue la transfection de mono- couches fratches de cellules de COS-7 dans dix plaques de 10 cm avec un total de 30 ig de p DLIF 3 dans 110 ml de dextrane-DEAE ( 2001 g/ml de dextrane-DEAE poids moléculaire 500 000, 0,05 M Tris p H 7,5 dans DMEM) Après 16 heures à 37 C, on lave les plaques deux rois avec DMEM A chaque plaque on ajoute 15 ml de DMEM additionné de 10 % f b s, 2 m M glutamine, 50 p /ml de pénicciline G et 50 mg/ml de streptomycine On renouvelle les milieux le jour suivant avec du DMEM exempt de sérum Les milieux frais exempts de sérum sont alors ajoutés chaque jour Les milieux recueillis sont gardés à 4 C soit jusqu'à essai soit Jusqu'à liaison au CPG Les fractions regroupées d'échantillons de 3 et 4 Jours de transfection montrent qu'elles contiennent essentiellement toute l'activité. On a Joute 0,5 g de CPG (controlled pore glass, verre à pores contr 8 ôlés, Electronueleonics, CPG 350, calibre 120/200 mesh, 0,074 à 0,125 mm d'ouverture) à 100 ml de surnageant cellu- laire et on agite le mélange 3 heures à 4 C Après une brève centrifugation dans une centrifugeuse de table, on tasse dans une colonne les perles déposées et on lave abondamment avec un mélange de 20 m M Na P 04, 1 M Na Cl, 0,1 % B -mercaptoéthanol, p H 7,2 L'activité est ensuite éluée avec le même tampon contenant de l'éthylèneglycol ( 30 %), cette opération étant suivie d'une autre élution avec ledit tampon contenant de l'éthylèneglycol ( 50 %) Essentiellement toute l'activité se lie au CPG On trouve 75 % de l'activité éluée dans les fractions éluées avec 30 % d'éthylèneglycol Ces fractions sont regroupées (pooled) et diluées avec 20 m M Na PO 4, 1 M Na Cl, p H 7,2 pour arriver à une concentration finale de 10 % d'éthylèneglycol et sont appliquées à une colonne de 10 ml Con A Sepharose (Pharmacia) Après un lavage sérieux avec le mélange 20 m M Na PO 4, 1 M Na Cl, p H 7,2, on élue l'activité avec un mélange de 20 m M Na PO 4, 1 M Na CL, 0,2 M t-méthyl-D-mannoside Une part importante de cette activité ( 55 %) ne se lie pas à cette lectine 45 % de cette activité sont élués avec 1 ' a-méthyl-D-mannoside. Compositions pharmaceutiques Les composés selon la présente invention peuvent être formulés selon les méthodes connues pour la préparation de compo- sitions pharmaceutiquement utiles, l'interféron immunitaire humain de ces produits étant combiné en mélange à un véhicule support pharmaceutiquement acceptable Les véhicules appropriés et leur formulation sont décrits dans Remington's Pharmaceutical Sciences par E W Martin, qui est incorporé ici par référence. Ces compositions contiennent une quantité efficace de protéine d'interféron avec une quantité appropriée de véhicule pour prépa- rer des compositions pharmaceutiquement acceptables convenant pour être administrées efficacement à l'hôte. A Administration parentérale L'interféron immunitaire humain peut être administré par la voie parentérale à des sujets qui requièrent un traitement antitumoral ou antiviral et à ceux qui manifestent des conditions d'immunosuppression Les doses et la posologie peuvent être appliquées en se conformant à celles couramment utilisées dans les recherches cliniques d'autres interférons humains, par exem- ple ( 1-10) x 106 unités par Jour, et pour les produits de pureté plus grande que 1 %, on peut aller vraisemblablement Jusqu'à 50 x 35106 units par Jour Les doses d'FN-y pourraient tre 10 unités par jour Les doses d IIFN-y pourraient être 2514 ? 83 augmentées de façon significative pour obtenir de plus grands effets essentiellement en raison de l'absence de protéines humai- nes autres que l'IFN y, lesquelles protéines lorsqu'elles sont présentées dans les produits d'origine humaine, peuvent induire certains effets indésirables. A titre d'exemple de forme de dosage appropriée pour l'IFN-y essentiellement homogène applicable sous forme parenté- rale, on peut dissoudre 3 mg d'IFN y d'activité spécifique, par exemple de 2 x 108 U/mg dans 25 ml d'USP-albumine (humaine) sérum 5 N, faire passer la solution à travers un filtre bactériologique et répartir de façon aseptique la solution filtrée dans 100 flacons contenant chacun 6 x 106 unités d'interféron pur conve- nant à l'administration parentérale Les flacons sont stockés de préférence à froid (-200 C) avant l'emploi. Données biologiques ou biochimiques A Caractérisation de l'activité antivirale Pour les neutralisations d'anticorps, on dilue des échantillons en cas de nécessité pour atteindre une concentration de 500- 100 U/ml avec PBS-BSA Des volumes égaux d'échantillon sont incubés 2 à 12 heures à 40 C avec des dilutions sérielles de leukocyte antihumain de lapin, du fibroblaste ou des antisérums d'interféron immunitaire Les anti- IFN-a et $ proviennent du National Institute of Allergy and Infectious Diseases L'anti- IFN y est préparé à l'aide d'authentique IFN y (pureté 5-20 %) purifié à partir de lymphocytes sanguins périphériques stimulés. Les échantillons sont centrifugés 3 minutes à 12 000 g 3 minutes avant l'essai Pour tester la stabilité à p H 2, on met les échan- tillons à ce p H en ajoutant du H Cl 1 N, on incube 2 à 12 heures à C et on neutralise en ajoutant du Na OH 1 N avant l'essai Pour tester la sensibilité au dodécyl sulfate de sodium (SDS), on incube les échantillons avec un volume égal de SDS à 2 % pendant 2 à 12 heures à 40 C avant l'essai. B Caractérisation de l'IFN Y produit par E coli et des cellules de COS-7 Activité antivirale (U/ml) E coli W 3110/ Cellules de p IFNf trp 48 COS7/p S Vy 69 Traitement IFN-a IFN-e IFN-y extrait surnageant Non traité 375 125 250 250 62,5 p H 2 375 125 0,1 % SDS 375 Anti-IFN-a de lapin par l'antisérum d'interféron immunitaire Elle n'est pas neutra- lisée par les anticorps pour IFN-c ou 3 Ces données confirment que l'interféron produit dans ces systèmes est l'IFN-y et que l'insert d'AD Nc du plasmide p 69 code-pour l'IFN-Y. Ci-après on décrit au moyen du schéma général suivant un procédé de purification de 1 'IFN y par exemple au départ de bactéries. 1 Extraction des cellules dans un milieu tampon (p H environ 8) a lyse de hauteconductivité par passage à travers un homogénéiseur à haute pression, refroidissement de l'effluent au bain de glace. 2 Précipitation de l'ADN par addition de poly- éthylèneimine sous agitation par exemple à 4 C. 3 Précipitation, sous l'influence du p H, des protéi- nes bactériennes laissant à nouveau l'IFN-y en solution. 4 Séparation des solides par centrifugation à 4 C. Concentration du surnageant (après réajustement du p H) par exemple par ultrafiltration. 6 Dialyse du concentré à l'encontre d'un tampon de faible conductivité. 7 Enlèvement des solides par centrifugation laissant 1 'IFN-y en solution. 8 Chromatographie échangeuse d'ions sur carboxy- méthylcellulose, élution avec un gradient de force ionique croissante. 9 Chromatographie sur gel de phosphate caleique par élution avec un gradient de force ionique croissante. Chromatographie échangeuse d'ions sur carboxy- méthylcellulose dans des conditions faiblement dénaturantes par élution avec un gradient de force ionique croissante. 11 Séparation par chromatographie filtration sur gel. Ce procédé fournit le produit avec une pureté supé- rieure à 95 %. La protéine d'interféron immunitaire selon l'inven- tion a été définie à l'aide d'un séquençage déterminé de gène d'ADN et d'aminoacides déduits, voir figure 5 Il est entendu que pour cet interféron englobé ici, il existe des variations alléli- ques naturelles d'un individu à l'autre Ces variations peuvent se manifester par une ou plusieurs différences dans les acides aminés dans l'ensemble de la séquence ou par des délétions, inversions ou ajoutes d'un ou de plusieurs aminoacides dans cette séquence Toutes ces variations alléliques sont comprises dans le cadre de la présente invention. En effet, l'utilisation de la technologie de l'ADN recombinant offre la possibilité de préparer divers dérivés d'IFN-Y humain, en effectuant diverses modifications de rempla- cementsa Joutes, délétions ou substitutions d'aminoacides simples ou multiples Toutes ces modifications qui donnent lieu à de tels dérivés de l'IFN-y humains sont comprises dans le cadre de la présente invention tant que l'activité essentielle, caractéristi- que de l'IFN-y reste inchangée dans sa nature. Ayant en mains les séquences d'ADN et d'aminoacides de 1 'IFN y (figure 5) , la façon la plus préférable de reproduire la présente invention implique certainement la préparation soit du gène complet par voie de synthèse (voir 26, par exemple) soit celle des désoxyoligonucléotides synthétiques avec lesquels la "bibliothèque" de génome humain ou une autre source d'AD Nc peut être explorée en vue d'isoler le gène par des techniques d'hybri- dation normalisées Une fois obtenue la séquence de nucléotides qui encode la protéine requise pour l'IFN-y, on peut adopter les -moyens d'expression, d'isolement et de purification pour l'obten- tion de préparations d'IFN y très pures conformes à la descrip- tion qui précède. Malgré la référence à des formes de réalisation par- ticulières et préférées, il est entendu également que l'invention n'est pas limitée aux détails décrits plus haut. 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Valenzuela et ai, Animal Virus Genetios (ed Fields, Jaenisch and Fox) p 57 Academic Press, New York ( 1980). 61 McCuthan et ai, J Nati Cancer Inst 41, 351 ( 1968) - REVENDICATIONS 1 Composition de matière consistant essentielle- ment en un polypeptide qui comprend la séquence d'aminoacides de l'interféron immunitaire humain mûr. 2 Polypeptide selon la revendication 1, sans l'accompagnement d'une glycosylation native associée. 3 Polypeptide selon la revendication 1, conte- nant facultativement l'aminoacide méthionine attachéà la terminaison N de l'aminoacide venant ordinairement en premier de cet interféron. 4 Polypeptide selon la revendication 1, conte- nant une protéineconjuguée ou signal détachable ou clivable attachée à la terminaison N de l'aminoacide venant ordinai- rement en premier de cet interféron. 5 Séquence d'ADN, comprenant un codage de séquence du polypeptide selon les revendications 1, 3 ou 4. 6 Séquence d'ADN selon la revendication 5, liée de façon opérationnelle avec la séquence d'ADN capa- ble d'effectuer l'expression d'un polypeptide selon les revendications 1, 3 ou 4. 7 Véhicule d'expression réplicable capable,. dans une culture cellulaire ou un micro-organsime trans- formant, d'exprimer un polypeptide selon les revendications 1, 3 ou 4. 8 Culture de cellules ou micro-organismes transformés par la véhicule selon la revendication 7. 9 Culture cellulaire selon la revendication 8, obtenue par transformation d'une lignée COS-7 de fibro- blastes de rein de singe - 10 Micro-organisme selon la revendication 8, obtenu par transformation d'une souche d'E coli. 11 Micro-organisme selon la revendication 8, obtenu par transformation d'une souche de levure. 12 Plasmide, choisi dans le groupe des p IFN-y- trp 48, p SV-y-69 et p PFK-IFN-y. 13 Culture cellulaire ou micro-organisme transformés avec chacun des plasmides selon la revendica- tion 12. 14 Extrait de culture cellulaire, comprenant un polypeptide pur à raison de plus de 90 %, consistant essentiellement en la séquence d'aminoacides de l'inter- féron immunitaire mûr selon les revendications 1 à 4. 15 Composition comprenant une quantité thé- rapeutiquement efficace d'interféron immunitaire humain selon les revendications 1, 3 ou 4, convenant pour l'administration pharmaceutique. 16 Culture de cellules transformantes, capable de produire de l'interféron immunitaire humain mûr. 17 Procédé comprenant l'expression d'un gène encodant l'interféron immunitaire humain sous une forme mûre dans un micro-organisme ou dans une culture cellulaire. 18 Procédé comprenant la production d'un polypeptide selon les revendications 1, 3 ou 4 dans un micro-organisme ou une culture cellulaire. 19 Procédé de production d'un polypeptide défini aux revendications 1, 3 ou 4, caractérisé en ce qu'on fait croître une culture de micro-organisme ou une culture cellulaire, transforméo avec un véhicule d'ex- pression réplicable, et on effectue la production de ce polypeptide et puis on récupère celui-ci. Procédé de production d'un véhicule d'ex- pression défini à la revendication- 7, caractérisé en ce qu'on construit une première séquence d'ADN codant pour ce polypeptide (défini à la revendication 7) et on lie cette première séquence d'ADN de façon opérationnelle à' une deuxième séquence d'ADN capable d'effectuer l'expression de cette première séquence d'ADN. 21 Composition de matière comprenant de l'inter- féron humain immunitaire mûr essentiellement exempt d'autres protéines d'origine humaine. 22 Polypeptide en substance pur dont la sé- quence d'aminoacides est en substance telle que représentée sur la figure 5 ci-annexée.