Brevet FR2514782A1 — publié le 19830422

PROCEDE DE PREPARATION D'UNE SOLUTION AQUEUSE, PRATIQUEMENT DEPOURVUE DE CELLULES, D'ASPARTASE ET SON APPLICATION A LA FABRICATION DE L'ACIDE ASPARTIQUE La présente invention concerne la production de l'as- partase Plus particulièrement, l'invention concerne un pro- cédé permettant de préparer une solution-aqueuse, dépourvue de cellules, d'aspartase, que l'on peut utiliser pour la transformation du fumarate d'ammonium en acide aspartique. L'acide L-aspartique est un acide aminé important que l'on utilise dans des applications pharmaceutiques et comme matière première pour des spécialités chimiques telles que la L-alanine et l'aspartame Cet acide aminé est également utili sé comme additif pour des aliments pour animaux et pour hu- mains L'acide aspartique est actuellement produit par des moyens chimiques, mais les procédés chimiques donnent généra- lement un mélange racémique des formes D et L Seule la forme L de l'acide aspartique est biologiquement assimilable En conséquence, les procédés préférés de production de l'acide aspartique impliquent la culture de micro-organismes produc- teurs d'aspartate sur des milieux nutritifs appropriés Par exemple, le brevet US 3 214 345 décrit des procédés de fermen tation permettant la production d'acide aspartique, dans lesquels l'acide fumarique (sous la forme de son sel d'ammo- nium) est utilisé comme source majeure de carbone Le procédé en question est mis en oeuvre en discontinu, un micro-organis me étant inoculé à un milieu de fermentation nutritif, et après une certaine période d'incubation, l'acide aspartique étant recueilli du milieu de fermentation. La production d'acide aspartique à l'aide de réacteurs a cellules immobilisées a également été rapportée Par exempl le brevet US 3 791 926 décrit la préparation d'acide aspartique à I'aide d'un réacteur à cellules immobilisées, consistant à emprisonner dans un polymère d'acrylamide des cellules de micro-organismes producteurs d'aspartate On prépare ensuite l'acide aspartique en mettant les cellules immobilisées en contact avec du fumarate d'ammonium La réaction peut être discontinue ou continue Dans les réacteurs continus, les 2 2514782 . cellules immobilisées garnissent une colonne dans laquelle on fait passer en continu une solution de fumarate d'ammonium. Les réacteurs à cellules immobilisées présentent plu- sieurs avantages sur les procédés de fermentation discontinus. Dans les procédés discontinus, la récupération du produit met fréquemment en jeu des modes opératoires complexes qui ont pour effet de réduire le rendement global, et dans bien des cas aboutissent à un produit qui est contaminé par des cellu- les, des métabolites et d'autres substances présentes dans o le milieu nutritif L'emploi de cellules immobilisées permet d'éliminer un grand nombre de ces problèmes, mais des quanti- tés importantes d'impuretés cellulaires peuvent néanmoins être présentes dans le produit final. Les techniques qui permettent de surmonter les problè- mes de récupération et de contamination associés aux procédés discontinus et à cellules immobilisées comprennent l'isolement, la purification et l'utilisation de la'ou des enzymes indispen- sables à la mise en oeuvre de la réaction voulue L'enzyme mise en jeu dans la transformation du fumarate'd'ammonium en acide aspartique est l'aspartase Des tentatives ont été fai- tes pour immobiliser l'aspartase sur des colonnes ou des sup T ports solides en vue de la transformation directe du fumarate d'ammonium en acide aspartique Par exemple, l'introduction du brevet US 3 791 926 décrit des techniques impliquant la fixa- tien de l'aspartase sur un polysaccharide d'échange d'anions, ou bien l'emprisonnement de l'aspartase dans un polymèrte d'acrylamide Mais ces procédés n'ont rencontré qu'un succès limité, en ce sens que l'extraction et la purification de l'enzyme aspartase sont difficiles, et qu'une perte importante de l'activité enzymatique se produit pendant la purification, la concentration et l'immobilisation de l'enzyme. Des réacteurs à dialyse ont également été proposés pour l'immobilisation des enzymes Tel qu'il est utilisé ici, le terme "dialyse" est pris dans son sens large incluant ia véritable dialyse (échange de molécules de soluté entre deux liquides séparés par une membrane), l'osmose (transfert de solvant à travers une membrane), et l'ultrafiltration (mouvement du sol- vant ou du soluté provoqué par une différence de pression à 3 2 52514782 travers une membrane) Dans les réacteurs à dialyse, une so- lution d'enzyme est en fait retenue sur l'un des-côtés d'une membrane semi-perméable Le substrat qui est destiné à la réaction enzymatique est ensuite mis en contact avec l'autre côté de la membrane semi-perméable la membrane semi-perméable est conçue de façon à être perméable au substrat et au produi mais imperméable à l'enzyme Ainsi, le substrat peut migrer vers le côté enzyme de la membrane, o il est transformé en produit, et le produit peut migrer en retour dans la solution de substrat, de laquelle on peut le recueillir. Les réacteurs à dialyse peuvent prendre des formes très diverses. Par exemple, les unités industrielles sont généralement du type filtrepresse, comprenant de nombreuses plaques à membranes parallèles, séparées par des coepartiments que les liquides peu- vent traverser. Kan, J K et Shuler, M L, Biotechnology and Bioengi- neering, 20, 217-230 ( 1978) décrivent l'emploi d'une unité de dialyse à fibres creuses, servant de rein artificiel, comme réacteur à dialyse Lorsqu'on utilise une telle unité, les cellules microbiennes entières sont immobilisées sur le côté calandre de l'unité de dialyse On fait circuler une solution d'un substrat à travers le côté tube des fibres creuses dans le dialyseur Le substrat diffuse à travers les fibres vers les cellules, o des réactions ont lieu, et les produits ré- sultants rediffusent dans le courant de recirculation L'ins- tallation particulière décrite met en jeu l'immobilisation d'une souche de Pseudomonas fluorescens, en vue de la trans- formation enzymatique de la L-histidine en acide urocanique. Jusqu'à présent, les tentatives qui ont été faites pour utiliser une enzyme aspartase immobilisée dans les réac- teurs à dialyse en vue de la production d'acide aspartique ont généralement été infructueuses (voir par exemple le brevet US 3 791 926, supra) On pense que la raison de cet échec tient au fait que les procédés connus d'isolement et de puri- fication de l'aspartase aboutissent à des pertes importantes de l'activité enzymatique. Conformément à la présente invention, il est procuré un procédé permettant de préparer une solution aqueuse, 4 2514782 pratiquement dépourvue de cellules, d'aspartase, qui consiste à former une suspension aqueuse de cellules microbiennes con- tenant de l'aspartase; à faire incuber cette suspension aqueuse de cellules dans des conditions permettant la libéra- tion de l'aspartase, pendant un temps suffisant pour qu'une partie importante de l'aspartase intracellulaire passe dans le fluide extracellulaire; à enlever les solides de la sus- pension de cellules pour former une solution clarifiée conte- nant l'aspartase, et à ajouter à la suspension aqueuse de cellules ou bien à la solution clarifiée contenant l'asparta- se une quantité suffisante d'un sel stabilisateur de l'aspar- tase pour rendre ladite solution hypertonique par rapport aux cellules microbiennes Dans une forme de réalisation préférée, *on forme la suspension aqueuse de cellules avec une solution hypertonique du sel stabilisateur de l'aspartase. Le mode opératoire est simple et efficace, et plus de % de l'activitéaspartase des cellules sont généralement recueillis dans la solution d'aspartase dépourvue de cellules. En outre, on a constaté que l'enzyme conservait son activité pendant des laps de temps prolongés dans une telle solution. Les solutions peuvent être utilisées très efficacement dans les réacteurs à dialyse, comme exposé ci-dessus. L'enzyme aspartase est produite par des micro-organismes très divers, et la présente invention ne se limite pas à l'em- plot d'un genre, d'une espèce ou d'une souche particuliers. Par exemple, des bactéries telles que Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeroginosa, Bacillus subtilis, Bacillus megatherium, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Escherichia coli et Aerobacter aerogenes ont été décrites comme appropriées à la production de l'acide aspartique Un organisme particulier à partir duquel l'aspartase a été recueillie est un mutant, uti- lisant le glutamate, de E coli (ATCC n 31976). Comme source d'aspartase, on peut utiliser des cellules productrices d'aspartase obtenues par culture sur un milieu nutritif conçu en vue de la production de l'enzyme et d'une croissance rapide dés cellules Les procédés de préparation et de conservation des cultures de cellules sont bien connus et ne font pas partie de la présente invention. -. 2514782 On utilise généralement un milieu nutritif contenant des produits minéraux et des facteurs de croissance essentiels ainsi que des sources assimilables de carbone et d'azote Il est bon que ce milieu contienne de l'acide fumarique, et qu'il contienne également de préférence un extrait de levure comme source d'azote, de vitamines et de facteurs de croissance, des ions ammonium en tant que source supplémentaire d'azote, et des sels de calcium et de magnésium en tant que produits minéraux essentiels Des phosphates et des carbonates de po- tassium ou de sodium peuvent être utilisés comme tampons. On fait généralement fermenter le milieu inoculé dans des conditions de croissance pendant un laps de temps suffi- sant pour produire d'environ 2 à environ 6 g/1 de matières so ides Normalenent, une fermentation à 37 C environ pendant 12 -à 14 heures environ suffit à donner la concentration de cellules voulue. Apres une période de croissance appropriée, on a inté- rêt à séparer les cellules de la partie extracellulaire du mi- lieu de fermentation (par centrifugation ou filtration par exemple), et à les laver On peut libérer l'aspartase des cel- lules en les mettant en suspension dans un milieu aqueux et en les faisant incuber dans des conditions permettant-la li- bération de l'aspartase Le milieu aqueux de suspension peut être l'eau ou n'importe quelle solution aqueuse qui n'a pas d'effets néfastes sur l'enzyme (par exemple, des tampons com- muns) Les milieux aqueux préférés de mise en suspension sont des solutions hypertoniques de sels stabilisateurs de l'aspar- tase (comme exposé ci-après), et des milieux tout particuliè- rement préférés sont des solutions hypertoniques de sels so- lubles de l'acide fumarique ou de l'acide aspartique On pré- fère tout particulièrement des solutions de fumarate d'ammo- nium dont la concentration se situe entre 1,0 M environ et la-saturation, et est de préférence égale à 1,4 M environ. On a intérêt à mettre les cellules en suspension dans le milieu aqueux à une concentration d'au moins environ 5 g/l, et de préférence d'environ 10 à environ 15 g/l, en poids sec de cellules. On fait généralement incuber la suspension de cellules 6 -; 25 '4782 dans des conditions permettant la libération de l'aspartase, pendant un temps suffisant pour qu'une partie importante de l'aspartase intracellulaire passe dans la solution de fumara-. te On utilise généralement une température d'incubation d'en- viron 2 C à environ 70 C, de préférence d'environ 25 C à en- viron 50 C Une température d'incubation tout particulièrement préférée est de 37 C environ A des températures d'incubation plus basses correspondent de plus faibles vitesses de libéra- tion de l'enzyme et de moindres activités enzymatiques, tandis que des températures d'incubation plus élevées risquent d'avoir un effet néfaste sur l'enzyme Le temps d'incubation dépend, dans une certaine mesure, de la température d' incubation, mais il est généralement égal à au moins 10 mn environ De préfé rence, on utilise une période d'incubation d'au moinsuné heure environ, et dans le meilleur des cas d'environ 12 heures à-en- viron 60 heures. Après l'incubation, on retire les solides de la suspen- sion de cellules, par centrifugation ou filtration par exemple, pour former une solution clarifiée contenant l'aspartase On peut utiliser n'importe quelle technique de clarification qui n'a pas pour résultat des pertes importantes de ' l-'actfivt té aspartase La solution résultante contient généralement envi- ron 80 % de l'activité aspartase contenue à l'origine dans les cellules Ces solutions sont relativement exemptes, d'impuretés indésirables,'et on a constaté qu'elles conservaient la quasi- totalité de leur activité aspartase pendant plus de 40 jours à 37 C. On ajoute à la solution clarifiée une quantité suffisan- te d'un sel stabilisateur de l'aspartase pour rendre cette so- lution hypertonique Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, on utilise la solution de sel stabilisateur de l'aspartase comme milieu aqueux de mise en suspension des cellules, et quand on utilise cette technique, l'addition d'un sel stabilisateur de l'aspartase à la solution clarifiée n'est généralement pas nécessaire. On a constaté que le sel stabilisateur de l'aspartase stabilisait l'enzyme vis-à-vis de la perte d'activité pendant un laps de temps prolongé, et qu'il la stabilisait également vis-à-vis de la dégradation thermique Par exemple, des compa raisons de l'activité aspartase dans des solutions entreposée à 65 C indiquent que l'enzyme extraite par tampon perd la quasi-totalité de son activité au bout de 30 mn, alors que l'enzyme extraite dans du fumarate d'ammonium 1,4 M conserve au moins 80 % de sa stabilité au bout de deux heures d'entre- posage. Les sels préférés de stabilisation de i'aspartase sont des sels solubles de l'acide fumarique ou de l'acide asparti- que Dans la mesure o l'acide fumarique est le substrat de l'enzyme pour la production de l'acide aspartique, l'emploi de sels de ces acides rend généralement inutile-une séparation ultérieure du sel d'avec l'aspartase En outre, ces sels, notamment le fumarate d'ammonium, se sont révélés particuliè- rement efficaces pour l'extraction et la stabilisation de l'enzyme Bien que l'on préfère les fumarates et les asparta- tes, on se rendra compte que l'on peut utiliser n'importe quel sel soluble dans l'eau ayant un effet stabilisateur sur l'enzyme De tels sels peuvent être représentés d'une manière générale par la formule MX dans laquelle M représente un ca- tion, par exemple un métal alcalin ou alcalino-terreux, l'ion ammonium, l'ion (alkyl inférieur) ammonium, l'ion (alkyl inférieur) ammonium quaternaire, etc, et X représente un anion, par exemple un ion halogénure,nitrate,carbonate,phos- phate,sulfate,maléate, fumarate, aspartate, etc La concentra tion du sel stabilisateur de l'aspartase dans la solution clarifiée se situe avantageusement entre 0,5 M environ et la saturation, de préférence entre 1,0 M environ et 1,4 M envi- ron. Les solutions d'aspartase préparées par ce procédé sont particulièrement utiles dans les réacteurs à dialyse, notamment dans les réacteurs à fibres creuses On peut faci- lement introduire la solution dépourvue de cellules dans le côté calandre d'un tel réacteur, en appliquant simplement une succion sur le côté tube du réacteur Apres avoir introduit l'enzyme dans le réacteur, on peut faire circuler une solutioi de fumarate d'ammonium dans le côté tube du réacteur Le sub- strat de fumarate d'ammonium et le produit acide aspartique 8 251-4782 traversent librement les parois des tubes de dialyse, et on peut recueillir l'acide aspartique de la solution qui circule. En revanche, l'enzyme aspartase ne peut traverser -les parois des tubes, et par conséquent elle est en fait retenue dans le réacteur L'élimination des impuretés et des corps colorés dialysables se produit peu après le début de la réaction, et par conséquent le gros du courant de produit ne se trouve pas contaminé. On-peut'faire varier les conditions de réaction en fonc- tion du type de réacteur utilisé Généralement, le substrat est une solution concentrée de fumarate d'ammonium, dont la concentration est par exemple de 1 M environ à la saturation, de préférence égale à 1,8 M environ On;fait incuber les mi- lieux de réaction dans des conditions propres à produire de l'acide aspartique On a intérêt à maintenir le réacteur à une température élevée pour assurer une transformation effica- ce du substrat en produit On utilise généralement des tempé- ratures de 20 C environ à 70 'C environ, de préférence de 250 ú à 50 'C environ, et dans le meilleur des cas de 370 C environ. La réaction enzymatique est exothermique, et par conséquent dans les grands réacteurs ou dans les réacteurs dans lesquels on fait circuler le substrat à faible débit, on peut utiliser des moyens permettant d'éliminer l'excès de calories Le débit voulu de la solution de substrat à travers le réacteur dépend du réacteur particulier utilisé, de la concentration du sub- strat, de la configuration du système (à circulation ou à une seule passe par exemple), du niveau de charge en enzyme, et de la vitesse voulue de dissipation thermique. On peut faire travailler le réacteur à fibres creuses en discontinu avec recirculation, le courant de sortie du réacteur retournant à un réservoir On continue la circulation de la solution de substrat jusqu'à ce que la majeure partie du fumarate d'ammonium ait été transformée en acide asparti- que D'autres modes de réaction mettent en jeu des installa- tions à une seule passe dans lesquelles on peut faire travail- ler plusieurs réacteurs en série. On a constaté que la présente invention procurait un procédé simple et efficace pour récupérer l'aspartase de 9 2514782 cellules productrices d'aspartase On peut utiliser la solu- tion d'aspartase résultante, dépourvue de cellules, en mode discontinu ou en mode "immbilisé", et elle convient particu- lièrement bien pour les réacteurs de dialyse à fibres-creuses Les solutions d'aspartase dépourvues de cellules selon la présente invention présentent plusieurs avantages sur les cellules entières dans les réacteurs à dialyse Pour obtenir un haut niveau d'activité enzymatique avec des cellules en- tières, il faut généralement que les cellules soient sous une forme concentrée Les milieux cellulaires concentrés sont trè denses et visqueux, ce qui entraîne au moins deux difficultés que le système sans cellules de la présente invention permet d'éviter Premièrement, les impuretés et les corps colorés provenant de la bouillie de cellules migrent à travers la mem brane de dialyse et passent dans le courant de produit Au lieu d'apparaître au cours d'un bref laps de temps au début de la réaction, comme c'est le cas avec les solutions dépour- vues de cellules, les impuretés et les corps colorés tendent à diffuser des cellules entières pendant des laps de temps prolongés Un second avantaae du système sans cellules a trait aux problèmes de diffusion posés par les systèmes à cellules entières On pense que l'aspartase est une enzyme intracellu- laire, et que par conséquent les produits qui réagissent et les produits résultants doivent obligatoirement diffuser non seulement à travers la membrane du réacteur, mais aussi à tra- vers le fluide extracellulaire et les constituants cellulaire E En conséquence, avec de tels systèmes à cellules entières, on observe de moins bons taux de transformation Par exemple, avec à peu près la même quantité d'activité enzymatique, on a montré qu'un réacteur à fibres creuses sans cellules permet- tait d'obtenir un taux de transformation supérieur d'environ % à celui observé avec le système à cellules entières. L'invention est illustrée plus en détail par les exem- ples suivants qui ne sont pas destinés à la limiter ' Exemple I- On a procédé à plusieurs expériences dans lesquelles on faisait fermenter des milieux nutritifs contenant des lo -251478-2 quantités variables d'extrait de levure pour produire de l'as- partase Chaque milieu de fermentation contenait, par litre: 24 à 60 g d'extrait de levure, 30 g d'acide fumarique, 2 g de phosphate de potassium dibasique, 0,5 g de carbonate de sodium, 2 m M de sulfate de magnésium, et 0,1 m M de chlorure de calcium, le p H étant ajusté à 7,2 environ avec de l'ammoniaque A cha- que milieu on inoculait 1 ml d'une culture de E coli (ATCC n 31976) que l'on avait fait incuber pendant 12 à 16 heures à 37 C dans un milieu de peptone contenant 0,5 % de glutamate monosodique On faisait incuber chaque milieu inoculé à 37 C pendant 12 à 14 heures, après quoi on récoltait les cellules. Au moment de la récolte, le poids sec des cellules était de 2 à 7 g environ par litre, suivant la quantité d'extrait de levure utilisée La vitesse de production de l'aspartase pour chaque milieu de fermentation est indiquée dans le tableau I ci-après. On a procédé à une seconde série d'expériences dans lesquelles on préparait et on faisait fermenter comme décrit ci-dessus des milieux de fermentation contenant diverses con- centrations de fumarate d'ammonium Chacun de ces milieux con- tenait 8 % d'extrait de levure et les mêmes concentrations d'autres ingrédients que celles qui oit été décrites ci-dessus. Les résultats de ces expériences sont donnés dans le tableau II ci-après On centrifugeait la culture de cellules préparée à partir du milieu de fermentation contenant 2,4 %, en poids/ volume, d'extrait de levure, et 3, 0 % de fumarate d'anmonium, et on faisait décanter le liquide et on le jetait On lavait ensuite les cellules avec de l'eau, on les recentrifugeait,. on les faisait décanter et on les remettait en suspension à 1/20 du volume d'origine dans du tampon tris-H Cl 0,05 M, p H 8,5 On diluait ensuite cette bouillie avec une solution 1,8 M de fumarate d'ammonium, p H 8,5, pour faire une suspension de cellules ayant le 1/5 du volume de fermentation d'origine On séparait la suspension résultante en six fractions que l'on faisait incuber à 37 C pendant les laps de temps indiqués dans le Tableau III ci-après, puis que l'on centrifugeait On fai- sait-décaniter les surnageants,et on jetait les solides On analysait les surnageants pour déterminer leur activité il aspartase, les résultats étant indiqués dans le tableau III ci-après Exemple II On a introduit dans le côté calandre d'un rein artifi- ciel Cordis-Dow (CDAK 2,5 D) une solution d'aspartase, dépour- vue de cellules, obtenue à partir de 12,5 g (poids sec) de cellules préparées conformément au procédé de l'exemple I ( 2,4 % d'extrait de levure, 3 % de fumarate d'ammonium), en appliquant une succion au côté tube du rein artificiel Après avoir introduit l'enzyme dans le réacteur, on fermait hermé- tiquement le côté calandre et on faisait passer à travers le côté tube du réacteur une solution 1,8 M de fumarate d'ammo- nium, p H 8,5, à un débit d'environ 11 à 15 1/h On utilisait un procédé à recirculation, dans lequel on faisait recirculer la solution de substrat à travers le réacteur à partir d'un réservoir On maintenait le réacteur à une température de 37 ( On analysait périodiquement le contenu du réservoir pour dé- terminer le fumarate résiduel, et les résultats des analyses sont donnés dans le tableau IV ci-après On faisait précipi- ter l'acide aspartique à p H 2,8 en ajoutant de l'acide sulfu- rique, on filtrait, on lavait et on séchait A partir d'une moyenne de 2,1 kg d'acide fumarique, on recueillait 2,0 à 2,1 kg d'acide aspartique ( 83 % à 86 % du rendement théoriquel L'acide aspartique ainsi produit se caractérisait par des ana- lyses élémentaires pour le carbone, l'hydrogène, l'azote et l'oxygène qui étaient en accord à 97-99 % avec la théorie On a mesuré le pouvoir rotatoire du produit qui était: lal 250 = + 26 (C = 10 dans HC 1 2 N) On a analysé le produit D par un essai enzymatique couplé au diagnostic, et le résultat était en accord à 96 % avec un étalon authentique d'acide aspartique. Tableau I Effet de la concentration de l'extrait de levure dans le mi- lieu de fermentation (contenant 3 % de fumarate d'ammonium) sur l'activité aspartase volumétrique du bouillon de fermen- tation. % d'extrait de levure en poids/volume 1,0 1,8 2,7 3,0 4,0 ,0 6,0 7,0 8,0 Production d'aspartase en mmoles/h/ml de bouillon 0,22 0,64 0,90 1,20 1, 50 1,76 2,14 2,26 2,24 Tableau II Effet de la concentration du fumarate d'ammonium dans le mi- lieu de fermentation (contenant 8 % d'extrait de levure) sur l'activité aspartase volumétrique du bouillon de culture. % d'acide fumarique en poids/volume 2,0 4,0 6,0 Production d'aspartase en mmoles/h/ml 1,00 2,50 2,52 0,48 Tableau III Extraction de l'aspartase de cellules avec du fumarate d'am- monium 1,4 M Temps (en h) % d'activité extraite % 73 % 79 % % 84 % Tableau IV Réacteur à fibres creuses (CDAK 2,5 D) chargé avec une enzyme dépourvue de cellules (extraite d'environ 12,5 g de cellules- poids sec); utilisé en discontinu avec recirculation avec un réservoir agité de 10 1 contenant du fumarate d'ammonium 1,8 1 Les échantillons étaient prélevés du réservoir et analysés pour déterminer le fumurate résiduel. Temps (en h) 0,0 0,25 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 ,0 6,0 7,0 Fumarate résiduel (M) 1,81 1,63 1,52 1,30 1,12 0,98 0,82 0,70 0,58 0,48 0,32 0,21 0,14 14 2 514782 14 - Revendications 1 Procédé permettant de préparer une solution aqueuse, pratiquement dépourvue de cellules, d'aspartase, caractérisé en ce qu'il consiste à former une suspension aqueuse de cel- lules microbiennes contenant de l'aspartase; à faire incuber cette suspension aqueuse de cellules dans des conditions per- mettant la libération de l'aspartase, pendant un temps suffi- sant pour qu'unepartie importante de l'aspartase intracellu- laire passe dans le fluide extracellulaire; à enlever les 1 Q solides de la suspension de cellules pour former une solution clarifiée contenant l'aspartase; et à ajouter à ladite sus- pension de cellules, ou bien à ladite solution clarifiée con- tenant l'aspartase, une quantité suffisante d'un sel stabili- sateur de l'aspartase pour rendre ladite solution clarifiée qui contient l'aspartase hypertonique par rapport aux cellules microbiennes. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on prépare ladite suspension aqueuse de cellules en met- tant les cellules microbiennes en suspension dans une solution hypertonique dudit sel stabilisateur de l'aspartase. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit sel stabilisateur de l'aspartase est un sel, soluble dans l'eau, de l'acide fumarique ou de l'acide aspar- tique. 4 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit sel stabilisateur de l'aspartase est le fuma- rate d'ammonium ou l'aspartate d'ammonium. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit sel stabilisateur de l'aspartase est le fumarate d'ammonium. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration du fumarate d'ammonium dans la solu- tion hypertonique de fumarate d'ammonium est de 0,5 M environ à la saturation. 7 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration du fumarate d'ammonium dans la solu- tion hypertonique de fumarate d'ammonium est de 1,0 M environ à 1,4 M environ. 2514782 8 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les conditions de récupération de l'aspartase compren- nent une température d'incubation de 2 C environ à 70 C envi- ron, et en ce qu'on fait incuber la suspension de cellules pendant au moins 10 mn environ. 9 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les conditions de récupération de l'aspartase compren- nent une température d'incubation de 25 C environ à 50 C envi- ron, et en ce qu'on fait incuber la suspension de cellules pendant 12 heures environ à 60 heures environ. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la température d'incubation est de 37 C environ. 11 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on met les cellules bactériennes en suspension dans une quantité suffisante de solution hypertonique de fumarate d'ammonium pour obtenir une concentration de cellules au moin E égale à 5 g/l environ, en poids sec de cellules, et en ce que les conditions de récupération de l'aspartase comprennent en outre un p H de 7 environ à 9 environ. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé el ce qu'on met les cellules bactériennes en suspension dans une quantité suffisante de solution hypertonique de fumarate d'am- monium pour obtenir une concentration de cellules de 10 g/l environ à 15 g/l environ, en poids sec de cellules, et en ce que le p H est de 8 environ d 9 environ. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 5, 6, 7, 9 ou 12, caractérisé en ce que les cellules bac- tériennes sont choisies dans le groupe comprenant les souches productrices d'aspartase de Pseudomonas fluorescens, Pseudomo- nas aeroginosa, Bacillus subtilis, Bacillus megatherium, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Escherichia coli et Aerobacter aerogenes. 14 Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les cellules bactériennes sont des cellules de E coli. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les cellules bactériennes sont des cellules de E coli, souche ATCC 31976. 16 Solution aqueuse, pratiquement dépourvue de cellu- les, d'aspartase, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé de la revendication 1. 17 Solution aqueuse, pratiquement dépourvue de cellu- les, d'aspartase, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé de la revendication 11. 18 Solution aqueuse, pratiquement dépourvue de cellu- les, d'aspartase, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé de la revendication 13. 19 Procédé de fabrication d'acide aspartique dans un réacteur comprenant un premier compartiment et un second com- partiment, ainsi qu'une membrane semi-perméable qui sépare le premier compartiment du second, ladite membrane semi-perméable étant perméable aux aspartates et aux fumerates, mais imper- méable à l'aspartase, caractérisé en ce qu'il consiste àapla- cer la solution aqueuse d'aspartase, pratiquement dépourvue de cellules, selon la revendication 16 ou 17, dans ledit pre- mier compartiment, en communication de fluide avec ladite membrane semi-perméable, et à placer dans ledit second compar- timent une solution contenant du fumarate d'ammonium, en com- munication de fluide avec ladite membrane semi-perméable; à faire incuber lesdites solutions dans-des conditions propres à produire de l'acide aspartique; et à recueillir l'acide aspartique de la solution contenue dans ledit second comparti- ment. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit réacteur comprend une calandre pouvant être fer- mée hermétiquement et comportant des moyens permettant de remplir ladite calandre avec un liquide, et un grand nombre de fibres creuses à membrane semi-perméable qui traversent ladite calandre, de telle sorte que les parties creuses des- dites fibres sont isolées de l'intérieur de ladite calandre, et chaque fibre comporte une extrémité d'entrée qui débouche dans un collecteur d'entrée comportant une lumière d'entrée de tube, et une extrémité de sortie qui débouche dans un col- lecteur de sortie ayant une lumière de sortie de tube, ladite solution aqueuse d'àspartase pratiquement dépourvue de cellu- les étant placée dans ladite calandre, et on fait passer ledit 17 2514782 fumarate d'ammonium à travers lesdites fibres creuses à mem- brane semi-perméable, et on recueille l'acide aspartique de ladite solution de fumarate d'ammonium. 21 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la concentration du fumarate d'ammonium dans la solu- tion de fumarate d'ammonium est de l M environ à la concen- tration de saturation. 22 Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'on utilise une solution de fumarate d'ammonium pratique- ment saturée. 23 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que les conditions de production de l'acide aspartique com- prennent une température d'incubation de 20 C environ à 70 C environ. 24 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que les conditions de production de l'acide aspartique com- prennent une température d'incubation de 250 C environ à 500 C environ. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'on fait fonctionner le réacteur en discontinu avec re- circulation, la solution de fumarate d'ammonium étant recyc- lée d'un réservoir à travers le réacteur jusqu'à ce qu'une quantité importante du fumarate d'ammonium ait été transformée en acide aspartique.