Brevet FR2522001A1 — publié le 19830826

Polysaccharides, leur préparation et compositions thérapeutiques contenant ces produits. La présente invention concerne de nouveaux poly- saccharides, leur préparation et les compositions théra- peutiques contenant ces produits. Plus particulièrement, elle concerne des polysaccha- rides qui sont obtenus par purification des extraits à l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L, leur préparation et les compositions thérapeutiques contenant ces produits Les polysaccharides de l'invention sont utilisés pour la thérapie de divers cancers. On sait jusqu'ici que les extraits de Melia azadirachta L montrent diverses activités pharmacolo- giques En fait, il a été révélé: un procédé de fabri- cation de produits cosmétiques pour la peau à partir de l'écorce, des feuilles, des fleurs, des fruits, de l'épiderme des racines ou de la résine de Melia azadirachta L en épuisant ces parties avec de l'eau ou un solvant hydrophile ou en les broyant finement (publication des brevets japonais n' 28853/77, 28854/77 et 10125/78); un procédé de préparation, à partir de ces matières premières provenant de Melia azadirachta L, des consti- tuants possédant des activités antimicrobiennes ou des activités améliorant les fonctions gastro-intestinales ou hépatiques en épuisant les parties en question avec de l'eau chaude (publication du brevet japonais n' 10124/78); et un procédé de préparation, à partir de ces matières premières de Melia azadirachta L, de constitu- ants efficaces pour la thérapie de maladies dermatologiques et rhumatismales par épuisement de ces matières avec un solvant hydrophobe (publication du brevet japonais no 13689/78). Après des études poussées sur les constituants phar- macologiquement actifs de l'écorce de Me-lia azadirachta L, les auteurs de la présente invention ont isolé des poly- saccharides à partir des extraits par l'eau chaude de l'écorce, ayant une activité anti-tumorale Il a main- tenant été découvert dans l'art antérieur que l'écorce de Melia azadirachta L contient des polysaccharides. Par conséquent, la présente invention a pour objet de fournir des polysaccharides utilisés comme agents anti- cancéreux Un autre objet est la fourniture de compositions thérapeutiques contenant les polysaccharides Encore un autre objet est la fourniture d'un procédé de préparation des polysaccharides. Comme on le décrit ci-dessous, les polysaccharides de la présente invention qui sont des substances nouvelles possèdent une activité inhibitoire élevée contre l'ascite du Sarcome 180 et contre les tumeurs consistantes trans- plantées chez les souris et la tumeur consistante Meth A transplantée chez les souris Ils sont particulièrement efficaces sur les tumeurs consistantes fixées. Premièrement, selon la présente invention, celle-ci fournit le polysaccharide N 9 GI obtenu à partir de l'écorce de Melia azadirachta L qui a les propriétés physiques et chimiques suivantes: ( 1) Couleur et aspect Le produit lyophilise est une poudre blanche ou brun jaunâtre pâle. ( 2) Spectre d'absorption infrarouge Comme le montre la figure 1. IR 1 KB-r C l: 3400, 1630, 1030. max. ( 3) Spectre d'absorption ultraviolet Quand les mesures sont faites en solution aqueuse, on ne remarque aucune absorption maximum et seule l'absorption finale est observée. ( 4) Solubilité Soluble dansl'eau mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acétone, éther, chloroforme, acétate d'éthyle, benzène, hexane, et produits analogues. ( 5) Réaction colorée Les réactions avec le sulfate de phénol et le sulfate d'anthrone sont positives Le produit vire au bleu verdatre en ajoutant de l'iode. Deuxièmement, selon la présente invention, celle-ci fournit un procédé de préparation du polysaccharide N 9 GI ayant les propriétés physiques et chimiques décrites ci- dessus qui consiste à épuiser l'écorce de Melia azadirachta L avec de l'eau chaude, à purifier le produit extrait par précipitation avec un alcool ou à l'aide d'une membrane perméable, à dissoudre le produit purifié ainsi obtenu dans l'eau, à traiter ladite solution aqueuse avec un tamis moléculaireayant une plage de fractionnement des poids moléculaires comprise entre environ 1 x 10 - 1 x 105 et 1 x 103 1,5 x 105 et à isoler la première fraction des trois fractions de polysaccharide séparées. Troisièmement, selon la présente invention,celle-ci fournit un polysaccharide N 9 G Ia obtenu à partir de l'écorce de Melia azadirachta L qui a la structure et les proprié- tés suivantes: ( 1) Structure Polysaccharide neutre qui contient la chaîne prin- cipale "-( 1 4)-glucane reliée à de l'arabinose au moyen d'une liaison C(( 1-)6),et qui est composé de glucose et d'arabinose dans un rapport d'environ 5:1. ( 2) Couleur et aspect Le produit lyophilisé est une poudre blanche ( 3) Solubilité Soluble dans l'eau mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acétone, éther, chloroforme, acétate d'éthyle, benzène, hexane et produits similaires. ( 4) Réaction colorée Les réactions avec le sulfate de phénol et le sulfate d'anthrone sont positives Le produit vire au bleu verdatre en ajoutant de l'iode. ( 5) Poids moléculaire La chromatographie sur colonne de gel utilisant du gel de dextrane ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires de 1 x 10 2 x 105 donne un seul pic indiquant un poids moléculaire d'environ 94 000. ( 6) Pouvoir rotatoire spécifique 22: -35 (c= 0,4, H 20). ( 7) Spectre d'absorption infrarouge Comme le montre la figure 2. I Ra K Br cm -1: 3400, 2930, 1620. max ( 8) Spectre d'absorption ultraviolet Quand la mesure est effectuée en solution aqueuse, on ne voit aucun maximum d'absorption, seule l'absorption finale est observée. ( 9) Spectre de résonance magnétique nucléaire 13 C. Le spectre de résonance magnétique nucléaire 13 C à M Hz mesuré dans l'eau lourde utilisant comme * étalon externe le TMS (têtraméthylsilane) est indiqué sur la figure 4. Quatrièmement, selon la présente invention, celle-ci fournit un procédé de préparation du polysaccharide N 9 G Ia ayant la structure et les propriétés décrites ci-dessus qui consiste à traiter l'extrait à l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L avec un tamis molécu- laire pour isoler un composé ayant un poids moléculaire d'environ 94 000. Cinquièmement, selon la présente invention, celle-ci fournit le polysaccharide N 9 G Ib obtenu à partir de l'écorce de Nelia azadirachta L, qui a la structure et les propri- étés suivantes: ( 1) Structure Polysaccharide neutre qui contient la chatne prin- cipale d -( 1-44)-glucane parsemée de A-( 1)3)- fucose et ramifiée avec du" -( 1-6)-arabinose,et qui est composé de glucose, d'arabinose et de fucose dans un rapport d'environ 5:2:1. ( 2) Couleur et aspect Le produit lyophilisé est une poudre blanche. ( 3) Solubilité Soluble dans l'eau mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acetone, éther, chloroforme, acétate d'éthyle, benzène, hexane et produits similaires. ( 4) Réaction colorée Les réactions avec le sulfate de phénol et le sulfate d'anthrone sont positives Le produit vire au bleu verdâtre en ajoutant de l'iode. ( 5) Poids moléculaire La chromatographie sur colonne de gel utilisant du gel de dextrane ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires de 1 x 103 2 x 105 donne un seul pic correspondant à un poids moléculaire d'environ 21 000. ( 6) Pouvoir rotatoire spécifique E ( 7) Spectre d'absorption infrarouge Comme le montre la figure 4- IR max Br cm -1: 3400, 2930, 1630. max. ( 8) Spectre d'absorption ultraviolet Quand la mesure est faite en solution aqueuse, on ne voit pas de maximum d'absorption, seule l'absorp- tion finale est observée. ( 9) Spectre de résonance magnétique nucléaire 3 C Le spectre de résonance magnétique nucléaire 13 C M Hz mesur dans l'eau lourde en utilisant comme à 100 M Hz mesuré dans l'eau lourde en utilisant comme étalon externe du TMS (tétraméthylsilane) est montré sur la figure 5. Sixièmement, selon la présente invention, celle-ci fournit un procédé de préparation du polysaccharide N 9 G Ib ayant la structure et les propriétés décrites ci-dessus qui consiste à soumettre un extrait à l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L A un traitement avec un tamis moléculaire isolant ainsi un composé ayant un poids moléculaire d'environ 21 000. On va maintenant décrire rapidement les dessins ci-annexés. La figure 1 montre le spectre d'absorption infra- rouge du polysaccharide N 9 GI. Les figures 2 et 3 montrent respectivement le spec- tre d'absorption infrarouge et le spectre de résonance magnétique nucléaire C du polysaccharide N 9 G Ia. Les figures 4 et 5 montrent respectivement le spectre d'absorption infrarouge et le spectre de résonance magnétique nucléaire C du polysaccharide N 9 G Ib. La plante utilisée dans la présente invention comme matière de départ est appelée scientifiquement Melia azadirachta L o Azadirachta indica Juss, qui est un grand arbre ayant au moins 10 mètres de hauteur et pous- sant sous les tropiques Dans le procédé selon la présente invention, le produit extrait par l'eau chaude de l'écorce de cette plante est utilisé comme source de polysaccharides. L'écorce récoltée en toute saison peut être utilisée comme matière de départ L'épuisement à l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L est effectué par des procédés classiques En fait, il est effectué en ajoutant à l'écorce finement divisée de l'eau chaude à environ 800 C ou au- dessus, ou bien en'ajoutant de l'eau à l'écorce et en portant le mélange à l'ébullition Le chauffage peut être effectué dans un bain-marie bouillant ou sur un dispositif 252200 i de chauffage direct Bien que la durée du chauffage dépende de la qualité de la matière de départ et d'autres facteurs, elle est comprise généralement entre 1 et 48 heures Une fois l'extraction terminée, le mélange d'ex- traction est soumis à la filtration pour obtenir un extrait Etant donné que le produit extrait par l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L ainsi obtenu contient une grande quantité d'impuretés, il est souhai- table de purifier ledit extrait par précipitation avec un alcool ou au moyen d'une membrane perméable, avant de le placer dans le stade du tamisage moléculaire Par exemple, quand la purification est effectuée par préci- pitation avec un alcool, un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol est ajouté à l'extrait susmentionné, et le précipité ainsi formé est isolé, par exemple, par centri- fugation pour obtenir l'extrait désiré Quand une membrane perméable est utilisée pour la purification, ledit extrait est placé dans une membrane perméable qui est ensuite plongée dans l'eau pour effectuer la dialyse Si on le désire, le dialysat est concentré à siccité ou lyophilisé pour obtenir l'extrait désiré Comme membrane perméable, on peut utiliser la cellulose régénérée ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires s'étalantau maximum jusqu'à 50 000, par exemple, avec un appareil "Spectra Por"l 6 (fabriqué par Spectrum Medical Industries Co) ou un "Visking Tube' (fabriqué par Union Carbide Co) La matière de départ dans le procédé de la présente invention, c'est-à-dire le produit extrait par l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L, est préparéeen dissolvant l'extrait dans l'eau, après purification à l'aide d'une membrane perméable ou par précipitation avec un alcool. En outre, il est également souhaitable d'éliminer les constituants inutiles avant l'épuisement à l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L en soumettant l'écorce à un pré-traitement avec un solvant organique et/ou avec de l'eau à la température ordinaire Comme solvant uti- lisé pour le pré-traitement, on peut citer les solvants organiques polaires tels que méthanol, éthanol, propanol, pyridine et acétone, et les solvants organiques non- polaires tels que benzène, toluène, xylène, N -hexane, chloroforme, tetrachlorure de carbone et acétate d'éthyle. Le tra=ttoet avec un tamis moléculaire pour la sépa- ration des polysaccharides selon la présente invention est effectué de préférence par filtration sur gel à l'aide d'un agent filtrant en gel Comme agent filtrant en gel, on préfère utiliser le gel de dextrane, le gel de poly- acrylamide, le gel de polymère polyvinylique, des perles de verre poreuses et produits similaires. Le polysa=charide N 9 GI de la présente invention est préparé en faisant passer le produit extrait par l'eau chaude susmentionné de l'écorce de Melia azadirachta L à travers une colonne garnie d'un agent filtrant en gel ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires comprise entre environ 1 x 103 1 x 105 et 1 x 103 - 1,5 x 10, en éluant la colonne avec de l'eau distillée, en recueillant la première fraction des trois fractions séparées de polysaccharides et en évaporant à siccité ou en lyophilisant la fraction recueillie L'élution est effectuée, tout en discernant l'élution du polysaccharide, par un procédé tel que celui au sulfate de phénol suivant les procédés classiques Comme agent filtrant en gel ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires comprise entre environ 1 x 103 1 x 105 et 1 x 103 - 1,5 x 10, on utilise de préférence le "Sephadex G-100 " (fabriqué par Pharmacia Co, Suède) qui est un gel de dextrane, le "Biogel P-100 " (fabriqué par Biorad Co, U.S A) qui est un gel de polyacrylamide, le "Toyopal HW-55 " (fabriqué par Toyo Soda Industries) qui est un gel de polymère polyvinylique, le "CPG-10 " (fabriqué par Electro-Nucleonics, U S A), qui sont des perles poreuses. Les polysaccharides N 9 G Ia et N 9 G Ib sont obtenus respectivement en soumettant le produit extrait par l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L à un traitement au tamis moléculaire pour isoler un polysac- charide ayant un poids moléculaire d'environ 94 000 et un polysaccharide ayant un poids moléculaire d'environ 21 000. De préférence, la fraction contenant le polysac- charide N 9 GI susmentionné, ou une solution aqueuse du polysaccharide N 9 GI, sont encore passées à travers une colonne garnie d'un agent filtrant en gel ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires comprise entre environ 1 x 103 2 x 105 et 1 x 103 -8 x 105, la colonne étant éluée avec de l'eau distillée et le polysaccharide N 9 G Ia est obtenu à partir de la première fraction des deux fractions séparées de polysaccharides, et le polysac- charide N 9 G Ib est obtenu à partir de la seconde fraction de polysaccharides. Comme agents filtrants en gel ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires comprise entre environ 1 x 103 2 x 105 et 1 x 103 8 x 105, on préfère utiliser le "Sephadex G-200 ", le "Sephacril S-300 " (fabriqués par Pharmacia Co, Suède), qui sont des gels de dextrane, le "Biogel P-300 " (fabriqué par Biorad Co, U S A) qui est un polyacrylamide, le "Toyopal HW-60 " (fabriqué par Toyo Soda Industries)qui est un polymère polyvinylique, les perles poreuses "CPG-10 " et des produits similaires. Le polysaccharide N 9 GI de la présente invention est considéré comme étant un mélange de polysaccharide N 9 C Gia et de polysaccharide N 9 G Ib Les études pharmacologiques ont révélé que ce polysaccharide possède une activité inhibitoire marquée contre l'ascite du Sarcome 180 et les tumeurs consistantes transplantées chez les souris et la tumeur consistante Meth A transplantée chez les souris Il a également été démontré que les polysaccharides N 9 G Ia et N 9 G Ib exercent une activité pharmacologique similaire, Par conséquent, la séparation du polysac- charide N 9 GI en polysaccharide N 9 G Ia et polysaccharide N 9 G Ib n'est pas nécessaire pour l'utiliser comme agent anti-cancéreux Il est plus pratique d'utiliser les deux en mélange, c'est-à-dire sous forme de polysaccharide N 9 GI. La présente invention est illustrée par les exemples de références, les exemples et les essais pharmacologiques, non limitatifs, ci-après: Exemple de référence Préparation d'un extrait par l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L. ( 1) Le prétraitement est effectué avec 50 g d'écorce séchée de Melia azadirachta L en épuisant l'écorce avec du benzène ( 3 x 500 ml) et du méthanol ( 3 x 500 ml) a la température ordinaire pendant 24 heures Le résidu ainsi obtenu par l'épuisement est épuisé avec trois portions de 200 ml d'eau chaude Les extraits combinés sont concentrés à sec sur un évaporateur rotatif pour obtenir 1960,5 mg de poudre. ( 2) A une solution de 1000 mg de poudre obtenue en ( 1) ci-dessus, dans 200 ml d'eau, est ajouté lentement de l'éthanol pur tout en agitant à la température ordinaire jusqu'à ce que l'on ait une concentration en éthanol de % dans la solution aqueuse Il se forme alors un préci- pité qui est isolé par centrifugation pour obtenir 594,5 mg de poudre brune. ( 3) Une solution de 500 mg de la poudre obtenue en ( 1) ci-dessus dans 50 ml d'eau est placée dans l'appareil "Spectra Por 6 " (plage de fractionnement des poids molé- culaires allant jusqu'à 50 000) pour être dialysée contre l'eau Le dialysat est concentré à siccité sur un évaporateur rotatif pour obtenir 310 mg de poudre brune. il Exemple 1 Préparation du polysaccharide N 9 GI Une solution de 1020 mg du produit extrait par l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L obtenu dans l'exemple de référence ci-dessus en ( 2) ou ( 3), dans ml d'eau distillée, est versée sur une colonne ( 7 cm de diamètre et 35 cm de longueur) garnie de 'Sephadex G-100 " et la filtration surgel est effectuée en utilisant de l'eau distillée Le taux de sucre dans l'éluat est déterminé par a procédé au sulfate de phénol pendant la filtration sur gel On obtient un polysaccharide en trois fractions Quand le solvant est chassé par distillation de la première fraction éluée, on obtient 273 mg du polysaccharide N 9 GI désiré. On obtient un résultat similaire en utilisant le "Biogel P-100 " à la place de l'agent filtrant en gel u Sephadex G-100 " dans le procédé ci-dessus. Exemple 2 Préparation des polysaccharides N 9 G Ia et N 9 G Ib Une solution de 50 mg du polysaccharide N 9 GI obtenu dans l'exemple 1, dans 5 ml d'eau distillée, est versée sur une colonne ( 4 cm de diamètre et 50 cm de longueur) garnie de "Sephadex G-200 ", et la filtration sur gel est effectuée en utilisant de l'eau distillée Le taux de sucre dans léluat est déterminé par le procédé au sulfate de phénol pendant la filtration sur gel On obtient les polysaccharides en deux fractions La première fraction de polysaccharide donne 18 mg de polysaccharide N 9 G Ia et la seconde fraction donne 16 mg de polysaccharide N 9 G Ib. On voit que ces polysaccharides sont respectivement un composé simple par chromatographie en phase liquide à haute performance et par électrophorèse. On obtient des résultats similaires en utilisant le Sephacril S-300 " à la place du "Sephadex G-200 "dans la filtration sur gel ci-dessus. La structure et les propriétés des polysaccharides N 9 GI, N 9 G Ia et N 9 G Ib sont celles indiquées ci-dessus, étant donné que le spectre d'absorption IR est mesuré par le procédé avec K Br en utilisant un spectrophotomètre à infrarouge "Hitachi, modèle 295 " (fabriqué par Hitachi Ltd), que le spectre d'absorption UV est mesuré en utilisant le méthanol comme solvant, avec un "spectrophotomètre à double faisceaux "Hitachi, modèle 200-20 "(fabriqué par Hitachi Ltd) et que le spectre de résonance magnétique nucléaire 13 C est mesuré en utilisant du "JEOL FX100 " (fabriqué par Japan Electron Optics Laboratory Co, Ltd). Les résultats des essais pharmacologiques des poly- saccharides N 9 GI, N 9 G Ia et N 9 G Ib de la présente invention sont décrits ci-dessous. Exemple d'essai 1 Effet sur la tumeur ascitique du Sarcome 180 (Préparation de la matière d'essai) Dans une suspension de 0,5 % de carboxyméthylcellulose (CMC) dans une solution de saline tamponnée au phosphate (fabriquée par Gibco, contenant 9,5 m M de phosphate; PBS) est dissoute la matière d'essai à une concentration prédéterminée. (Transplantation de cellules tumorales de Sarcome 180) Des cellules tumorales de Sarcome 180 repiquées dans la cavité abdominale d'une souris sont enlevées et diluées avec une solution de saline physiologique jusqu'à ce qu'on ait un nombre de cellules de 1 x 108 /ml La suspension de cellules est transplantée par voie intra- péritonéale chez des souris m Ales ICR âgéS de 4 semaines à l'aide d'une seringue à raison de 0,5 ml par souris Le nombre de cellules transplantées par souris s'élève A 1 x 107. (Administration de la matière d'essai) Le jour qui suit la transplantation des cellules tumorales de Sarcome 180, la matière d'essai préparée comme on l'indique ci-dessus est administrée par voie intrapéritonéale, à l'aide d'une seringue, à une dose de 0,1 ml/souris, et l'administration est faite une fois par jour pendant 4 jours en tout Six souris sont utili- sées pour chaque concentration de chaque matière d'essai. Comme témoin, on utilise le PBS contenant de la CMC, le solvant pour la matière d'essai, et on administre le tout de la même façon La dose est exprimée en mg/kg de poids du corps de la souris. (Procédé d'évaluation) Le 7 ème jour qui suit la transplantation des cellules tumorales, le poids de chaque souris est déterminé Ensuite, l'ascite accumulé dans la cavité abdominale est enlevé complètement et le poids de la souris est déterminé La différence de poids avant et après avoir retiré l'ascite, est considérée comme la quantité d'ascite. L'ascite retiré est ensuite introduit dans un tube hématocrite puis centrifugé sur une centrifugeuse héma- tocrite à basse température pour obtenir la valeur d'ascite (proportion des cellules tumorales dans l'ascite) qui correspond à lavaleur hématocrite du sang Cette valeur multipliée par le volume d'ascite donne le volume de cellules présentes dans la totalité de l'ascite Ceci est désigné comme le volume total de cellules agglomérées (VTCA) Dans le cas du témoin, le volume total de l'ascite est de 6-10 ml, et le VTCA est de 1,6 2,5 ml. L'effet sur la tumeur est estimé mauvais (-) quand le rapport du VTCA des souris administrées par la matière d'essai aux souris témoins (T/C) est de 100 66 %, assez bon (+) quand le rapport est de 65 41 %, bon (++) quand il est de 40 11 % et excellent (+++) quand il est de 10 O %. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1. Exemple d'essai 2 Effet sur la tumeur consistante du Sarcome 180 (Transplantation des cellules tumorales de Sarcome 180) Une suspension de cellules ayant une concentration de X x L 0 cellules/ml est préparée de la même façon que dans l'exemple 4 'essai 1 Les cellules sont transplantées par voie sous-cutanée sur le dos de souris mâles ICR âgés *de 4 semaines à raison de 0,1 ml par souris, à l'aide d'une seringue. (Administration de la matière d'essai) 21 jours après la transplantation des cellules tumorales, le tissu tumoral développé est prélevé et pesé (moyenne pour un groupe de 6 animaux) L'effet est évalué sur la base d'un rapport du poids moyen pour les animaux traités à celui des animaux témoins (T/C) Le poids du tissu tumoral pour les animaux témoins est de 3 à 4,5 g. L'effet est estimé mauvais (-) quand le rapport est de 100 à 71 %, assez bon (+) quand ce rapport est de 70 à 51 %, bon (++) quand il est de 50 à 21 % et excellent (+++) quand il est de 20 à 0 % Les résultats sont indiqués sur le tableau 1. Tableau 1 Effets sur les tumeurs transplantées du Sarcome 180 (souris) Matière d'essai Dose w/Ag Tumeur ascitique T/C(%) Evaluation Tumeur T/C (%) consistante Evaluation Polysaccharide 75 N 9 GI 46 - +F + 100 %k *k +* Polysaccharide 75 21 + 43 * N 9 G Ia 50 23 *+ 61 + 25 4 + 70 + 17 4 + 98 - Polysaccharide 75 22 + 64 + N 9 G Ib 50 24 4 + 77 - 30 ++ 103 - 43 + 105 - 30. Exemple d'essai 3 Effet sur la tumeur consistante du Sarcome 180 La préparation de la matière d'essai, la transplan- tation des cellules tumorales de Sarcome 180, l'adminis- tration de la matière d'essai et l'évaluation de l'effet sont réalisées de la Mmxe façon que dans l'exemple d'essai 2, sauf que l'administration de la matière d'essai est faite de trois façons: Administration les premier, troisième, cinquième, septième et neuvième jours après la transplantation des cellules tumorales une fois par jour, administration consécutive à partir du premier jour de la transplantation, une fois par jour, pendant 10 jours et administration consécutive à partir du premier jour de la transplantation,une fois par jour, pendant 20 jours L'effet est évalué le 35 ème jour qui suit la transplantation des cellules, en prélevant le tissu tumoral Les résultats sont indiqués dans e tableau 2. Tableau 2 Effet sur tumeur consistante du Sarcome 180 (souris) Jour de Dos l'administration (mg/k 1, 3, 5,7 et 9 èroe T/C (%) Evaluation 1 er T/C o Me 1 er 20 ỏe Evaluation T/C (%) Evaluation Polys accharide 4 ( M+) 7/9 * 7 C-H+I 5 /7 il (-H+l 5/9 68 (-) 1/9 24 (+ 1-) 5/10 6 53 (+) 2/11 * indique le natbre de souris dans lesquelles le ti Ssu tumnoral a subi une involution complète. ar Ln CMJ matière d'essai N 9 GI r- 22200 1 Exemple d'essai 4 Effet sur la tumeur consistante fixée Des cellules de Sarcome 180 sont transplantées par voie sous-cutanée sur le dos de souris mâles ICR ( 10 animaux) à la dose de 1 x 107 cellules par animal et les souris sont élevées A partir du 10 ème jour o la tumeur consistante s'est complètement fixée et développée jusqu'à peser environ 1 à 2 g, l'administration d'une dose prédéterminée de la matière d'essai est faite par voie intrapéritonéale, une fois par jour, pendant 5 jours. 21 jours après la transplantation, la tumeur est prélevée et son poids est comparé avec celui du groupe témoin. L'effet est évalué selon la méthode de l'exemple d'essai * 2 Les résultats sont indiqués sur le tabbau 3. Tableau 3 Effet sur tumeur consistante fixée Matière Dose d'essai (mg/kg) T/C (%) Evaluation Polysaccharide 100 6 4 + N 9 GI 50 15 *+ 33 4 + 39 4 + Polysaccharide 100 5 44 + N 9 G Ia 50 7 *+ 22 4 + 47 4 + Polysaccharide 100 18 *+ N 9 G Ib 50 25 y+ 39 4 54 + Exemple d'essai 5 Effet sur la tumeur consistante fixée Les effets sur la tumeur consistante fixée sont dé- terminés de la môme façon que dans l'exemple d'essai 4,sauf que l'administration de la matière d'essai est faite de trois façons:Administration consécutive du 6 ème jour au loème jour de la transplantation des cellules tumorales, une fois par jour, du 6 ème jour au 15 ème jour, une fois par jour, et du llème jour au 20 ème jour une fois par jour. 1 o L'effet est évalué au 35 ème jour qui suit la transplantation des cellules tumorales Les résultats sont indiqués dans le tableau 4. Tableau 4 effets sur tumeur consistante fixée (souris> Jour de Dose ladministration 6 èoe 6 ( 14 +>7/9 * 3 t 44 + 14/6 t*I > 5/7 3 (-*I-)7/10 57 C+) 1/10. i (L*I-1 8/9 7 N 9 GI o N. I Comme on peut le voir d'après les tableaux 1 à 4 ci- dessus, les polysaccharides N 9 GI, N 9 G Ia et N 9 G Ib de la présente invention possèdent une activité inhibitoire élevée contre l'ascite et les tumeurs consistantes et la tumeur consistante fixée du Sarcome 180 par administration intrapéritonéale. Exemple d'essai 6 Effet sur la tumeur consistante du Sarcome 180 par adminis- tration orale Les effets des polysaccharides de la présente invention par administration orale sur la tumeur consistante du Sarcome 180 sont déterminés dans les mêmes conditions que dans es exemples d'essais 2 et 3, sauf que la dose des cellules transplantées est de 2 x 106 cellules par souris et que l'évaluation est faite en se basant sur le poids au 32 ème jour La matière d'essai a une concentration prédéterminée, est administrée par force dans l'estomac au moyen d'une sonde stomacale à raison de 0,1 ml/adminis- tration/souris Les résultats sont indiqués dans le tableau 5. Tableau 5 Effet sur tumeur consistante du Sarc ome 180 par administration orale (souris) Matière d'1 essai Pol ysaccharide: N N 9 GI c'. D o S e a i i S r t o ( 3.), L 1 %Il ('J Ln. 1,3,5,7,9 ème (-+ 1 D'après le tableau 5, on voit que le polysaccharide de la présente invention possède aussi une activité antitumorale, parx administration orale, à une dose de 250 mg/kg de poids du corps. Exemple d'essai 7 Effet sur le fibroblastosarcome Meth A Les cellules de fibroblastosarcome Meth A repiquées dans la cavité abdominale d'une souris Balb/C sont enlevées en même temps que l'ascite et diluées avec une solution de saline physiologique pour régler la quantité de cellules à 1 x 10 cellules par ml La suspension de cellules est transplantée par voie sous-cutanée sur le dos de souris males Balb/C àgés de 5 semaines à raison de 0,1 ml par animal, à l'aide d'une seringue Le nombre de cellules transplantées par animal est de 1 x 106 La matière d'essai est préparée de la même façon que dans les exemples d'essai 2 et 3, et est administrée par voie intrapéritonéale un jour prédéterminé L'évaluation est faite en prélevant le tissu du sarcome le 2 lème jour qui suit la transplan- tation des cellules du sarcome et en déterminant son poids. Les résultats sont indiqués dans le tableau 6. TE 19 LZ t 9 ' P 9 i 9 ujouiqq adnoaf) -1 Tvsse T aud nve A Tu np soue 4 m Dckq x ( 1.) 8019 zz Wç (zo L O >d) 6 Z TEL E (lot O >d) 6 IE 91 i 9 P L i P t O i P L Oi 9 801 ç 99 Lt (sol O >ci) oz (ZO 10 >d) 6 T (SO LO>d) SZ E if)6 N 001 ep Taeq O oes Alod (evfw) UOTIP-T Isl FOE P-i soa à T ap -mor M (b) M UOT 4 Tqp-l Lq amz=es UDP Tqpm p imig Z np 8 p Tocl p xnil OUlzoe il au Q 51 (.6) auxx)-oes np sp Toc I M (B) UOT 4 Tq TT 4 q amoaes p xnej np sp Toa a UQ 61 '*úT'TI'6 j Ll S Tessaàp 02 QT 4 % (s Tanos) v 1 qiew ans qagga 9 nnelqui Comme le montre le tableau 6, le polysaccharide de la iêsente invention possède une activité inhibitoire importante sur le développement également contre le fibroblastosarcome Meth A, une tumeur isogène, quand il est administré 8 à 10 fois à une dose de 100 mg/kg. Exemple d'essai 8 Toxicité aiguë Les essais de toxicité aiguë sont effectués pour chacun des polysaccharides N 9 GI, N 9 G Ia et N 9 G Ib en utilisant des souris m Ales ICR pesant 20 + 1 g Les valeurs LD 50 sont supérieures à 600 mg/kg par adminis- tration intrapéritonéale et supérieures à 1000 mg/kg par administration orale avec l'un quelconque des poly- saccharides. Comme on peut le voir effectivement par les es- sais pharmacologiques ci-dessus, les polysaccharides de la présente invention qui possèdent une activité anti-tumorale marquée et ont une toxicité très faible sont attendus pour être d'excellents agents anti-cancé- reux On s'attend également, d'après leur activité inhibitoire particulièrement élevée contre les tumeurs consistantes fixées, à ce que les polysaccharides de la présente invention possèdent une activité antitumorale du type immuno-activation. Les polysaccharides de la présente invention sont efficaces sur une variété de maladies cancéreuses, particulièrement de cancers consistants fixés tels que le cancer gastrique, le cancer du gros intestin et le cancer rectal Bien que la posologie dépende des symp- tômes, de l'Age, du poids et d'autres conditions, la dose quotidienne pour les adultes est de 100 à 2500 mg et peut être administrée en une à quatre doses séparées. Les polysaccharides de la présente invention sont formulés éventuellement avec des véhicules ou des excipients pharmaceutiques pour l'administration orale ou parentérale. Des formulations Pour l'administration orale tels que comprimés, poudres, cachets et granulés peuvent contenir les excipients classiques, par exemple e le carbonate de calcium, phosphate de calcium, amidon de mals, fécule de pommes de terre, saccharose, lactose, talc, stéarate de magnésium, gomme arabique et produits similaires La préparation liquide pour administration orale peut être une suspension, une solution, aqueuses ou huileuses, un sirop, un élixir, et produits similaires. La préparation injectable est sous la forme d'une solution ou d'une suspension et peut contenir des excipi- ents tels que des agents de mise en suspension, des sta- bilisants ou des dispersants Elle peut également contenir de l'eau distillée stérilisée, de l'huile purifiée telle que l'huile d'arachide ou l'huile de mais, ou bien des solvants non aqueux tels que le polyéthylèneglycol ou le polypropylêneglycol. Pour l'administration rectale, il est fournit des formes de compositions en suppositoires-qui peuvent contenir des véhicules pharmaceutiques connus, tels que par exemple l'éthylèneglycol, la lanoline et l'huile de coprah. Une formulation préférée est une préparation pharmaceutique sous une forme posologique comprenant par dose unitaire de 10 a 500 mg de polysaccharides de la présente invention et un diluant pharmaceutique. REVENDICATIONS 1 Polysaccharide N 9 GI obtenu à partir de l'écorce de Melia azadirachta L qui a les propriétés physiques et chimiques suivantes ( 1) Couleur et aspect Le produit lyophilisé est une poudre blanche ou d'un brun jaunltre pale. ( 2) Spectre d'absorption infrarouge Comme le montre la figure 1. IR; I Br cm 1: 3400, 1630, 1030. max ( 3) Spectre d'absorption ultraviolet Quand la mesure est faite en solution aqueuse, on ne voit aucun maximum d'absorption, mais seulement l'absorption finale. ( 4) Solubilité Soluble dans l'eau mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acétone, éther, chloroforme, acétate d'éthyle, benzène, hexane et produits similaires. ( 5) Réaction colorée Les réactions avec le sulfate de phénol et avec le sulfate d'anthrone sont positives Le produit vire au bleu verdatre en ajoutant de l'iode. 2 Composition thérapeutique sous forme poso- logique comprenant par dose unitaire de 10 à 500 mg du polysaccharide selon la revendication 1, et d'un diluant pharmaceutique. 3 Procédé pour la préparation du polysaccharide N 9 GI ayant les propriétés physiques et chimiques décrites ci lssoes, caractérisé par le fait qu'il consiste à épuiser l'écorce de Melia azadirachta L avec de l'eau chaude, à purifier ledit extrait par précipitation avec un alcool ou à l'aide d'une membrane perméable, à dis- soudre dans l'eau le produit purifié ainsi obtenu, à traiter ladite solution aqueuse avec un agent de tamisage moléculaire ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires comprise entre 1 x 10 1 x 105 et 1 x 10 1,5 x 105, et à isoler la première fraction des trois fractions de polysaccharides séparées. ( 1) Couleur et aspect Le produit lyophilisé est une poudre blanche ou de couleur brun jaunàtre pale. ( 2) Spectre d'absorption infrarouge Comme le montre la figure 1. IRA K Br cm: 3400, 1630, 1030. Max ( 3) Spectre d'absorption ultraviolet Quand la mesure est faite en solution aqueuse, on ne voit aucun maximum d'absorption mais seulement 1 'absorption finale. ( 4) Solubilité Soluble dans l'eau, mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acétone, éther, chloroforme, acétate d'éthyle, benzène, hexane et produits similaires. ( 5) Réaction colorée Les réactions avec le sulfate de phénol et avec le sulfate d'anthrone sont positives Le produit vire au bleu vert en ajoutant de l'iode. 4 Procédé de préparation du polysaccharide N 9 GI selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le traitement au tamis moléculaire est une filtration sur gel et que l'agent de tamisage moléculaire est un agent filtrant en gel. Procédé de préparation du polysaccharide N 9 GI selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'agent filtrant en gel est du gel de dextrane, du gel de polyacrylamide, du gel polyvinilique hydrophile ou des perles de verre poreuses. 6 Polysaccharide N 9 G Ia obtenu à partir de l'écorce de lielia azedirachta L ayant la structure et les propriétés suivantes: ( 1) Structure Polysaccharide neutre qui contient la chaîne principale d'o C-( 1 44)-glucane reliée à l'ara- binose par une liaison X-( 14 16), et qui est constitué par du glucose et de l'arabinose dans un rapport d'environ 5:1. ( 2) C Ouleur et aspect Le produit lyophilisé est une poudre blanche. ( 3) Solubilité Soluble dans l'eau, mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acétone, éther, chloroforme, acétate d'éthyle, benzène, hexane et produits similaires. ( 4) Réaction colorée Les réactions avec le sulfate de phénol et avec le sulfate d'anthrone sont positives Le produit vire au bleu verdatre en ajoutant de l'iode. ( 5) Poids moléculaire La chromatographie sur colonne de gel en utilisant le gel de dextrane, ayant une plage de fraction- nement des poids moléculaires de 1 x 10 2 x 10, donne un pic unique correspondant à un poids moléculaire d'environ 94 OOO. ( 6) Pouvoir rotatoire spécifique l 2 _ 35 o (c= 0,4, H 20). ( 7) Spectre d'absorption infrarouge Comme le montre la figure 2. IR ' K Br cm -1 3400, 2930, 1620. max ( 8) Spectre d'absorption ultraviolet La mesure faite en solution aqueuse ne montre aucun maximum d'absorption mais on observe seulement l'absorption finale. ( 9) Spectre de résonance magnétique nucléaire 13 C. est indiqué sur la figure 4. 7 Composition thérapeutique sous forme de doses unitaires comprenant par dose unitaire de 10 à 500 mg du polysaccharide selon la revendication 6 et un diluant pharmaceutique. 8 Procédé pour la préparation du polysaccharide N 9 G Ia ayant la structure et les propriétés décrites ci- dessous qui consistent à traiter le produit extrait par l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachata L avec un tamis moléculaire pour isoler un composé ayant un poids moléculaire d'environ 94 000. ( 1) Structure Polysaccharide neutre qui contient la chatne principale d'c(r( 1-44)-glucane reliée à l'ara- binose par une liaison d-( 1-% 6), et qui est constitué par du glucose et de l'arabinose dans un rapport d'environ 5:1. ( 2) Couleur et aspect Le produit lyophilisé est une poudre blanche. ( 3) Solubilité Soluble dans l'eau, mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acétone, éther, chloroforme, acétate d'éthyle, benzène, hexane et produits similaires. ( 4) Réaction colorée Les réactions avec le sulfate de phénol et avec le sulfate d'anthrone sont positives Le produit vire au bleu verdâtre en ajoutant de l'iode. ( 5) Poids moléculaire La chromatographie sur colonne de gel en utilisant le gel de dextrane, ayant une plage de fraction- nement des poids moléculaires de 1 x 10 2 x 105 donne un pic unique correspondant à un poids moléculaire d'environ 94 000. ( 6) Pouvoir rotatoire spécifique ED 22: 35 O (c= 0,4, H 20). ( 7) spectre d'absorption infrarouge Comme le montre la figure 2. IR K Br cm -: 3400, 2930, 1620. max ( 8) Spectre d'absorption ultraviolet La mesure faite en solution aqueuse ne montre aucun maximum d'absorption mais on observe seulement l'absorption finale. ( 9) Spectre de résonance magnétique nucléaire 13 C. Le spectre de résonance magnétique nucléaire C à 100 M Hz mesuré dans l'eau lourde, en utilisant comme étalon externe du TMS (tétraméthylsilane) est indiqué sur la figure 4. 9 Procédé pour la préparation du polysaccharide N 9 G Ia selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le traitement au tamis moléculaire est effectué d'abord en utilisant un agent de tamisage moléculaire ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires compris entre environ 1 x 103 1 x 10 et 1 x 103 - 1,5 x 105 pour la première fraction des trois fractions de polysaccharides séparées, en utilisant ensuite un agent de tamisage moléculaire ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires comprise entre environ 1 x 103 2 x 105 et 1 x 10 8 x 105, et que la première fraction de polysaccharide des deux fractions de polysaccharides séparées est isolée. Procédé pour la préparation du polysaccharide N 9 G Ia Selon la revendication 9, caractérisé par le fait que le traitement au tamis moléculaire est une filtration sur gel et que l'agent de tamisage moléculaire est un agent filtrant en gel. 11 Procédé pour la préparation du polysaccharide N 9 G Ia selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'agent filtrant en gel est le gel de dextrane, le gel de polyacrylamide, un gel polyvinylique hydrophile ou des perles de verre poreuse. 12 Polysaccharide N 9 G Ib obtenu d partir de l'écorce de Melia azadirachta L ayant la structure et les propriétés suivantes: ( 1) Structure Polysaccharide neutre qui contient la chaîne principale d'o(-( 1-4)-glucane parsemée de P-( 1-3)-fucose et ramifiée avec de l'a-( 1-+ 6)- arabinose, et qui est constitué par du glucose, de l'arabinose et du fucose dansun rapport d'en- viron 5:2:1. ( 2) Couleur et aspect Le produit lyophilisé est une poudre blanche. ( 3) Solubilité Soluble dans l'eau, mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acétone, éther, chloroforme, acétate d'éthyle, benzène, hexane et produits similaires. ( 4) Réaction colorée Les réactions avec le sulfate de phénol et le sulfate d'anthrone sont positives Le produit vire au bleu verdàtre en ajoutant de l'iode. ( 5) Poids moléculaire La chromatographie sur colonne de gel en utilisant du gel de dextrane ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires de 1 x 10 o 2 x 105 donne un pic unique correspondant à un poids moléculaire d'environ 21 000. ( 6) Pouvoir rotatoire spécifique l.22 À -46 (c= 0,28, H 2 O). "lD 2 ( 7) Spectre d'absorption infrarouge Comme le montre la figure 4. IRK Br cm -': 3400, 2930, 1630. max ( 8) Spectre d'absorption ultraviolet Quand la mesure est faite en solution aqueuse, on ne voit aucun maximum d'absorption mais seu- lement l'absorption finale, ( 9) Spectre de résonance magnétique nucléaire 13 C. Le spectre de résonance magnétique nucléaire 13 C à 100 M Hz mesuré dans l'eau lourde en utilisant comme étalon externe du TMS (tétraméthylsilane) est indiqué sur la figure 5. 13 Composition thérapeutique sous forme de doses unitaires comprenant par dose unitaire de 10 à 500 mg du polysaccharide selon la revendication 11 et undiluant pharmaceutique. 14 Procédé pour la préparation du polysaccharide N 9 G Ib ayant la structure et les propriétés décrites ci-des- sous qui consiste à soumettre le produit extrait par l'eau chaude de l'écorce de Melia azadirachta L à un traitement avec un tamis moléculairejisolant ainsi un composé ayant un poids moléculaire d'environ 21 000. ( 1) Structure Polysaccharide neutre qui contient la chaîne principale d' d-( 1-94)-glucane parsemée de P-( 1 l-3)-fucose et ramifiée avec de 1 'o%-( 1-46)- arabinose, et qui est constitué par du glucose, de l'arabinose et du fucose dans un rapport d'en- viron 5:2:1. ( 2) Couleur et aspect Le produit lyophilisé est une poudre blanche. ( 3) Solubilité Soluble dans l'eau, mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acétone, éther, chloroforme, acétate d'éthyle, benzène, hexane et produits similaires. ( 4) Réaction colorée Les réactions avec le sulfate de phénol et le sulfate d'anthrone sont positives Le produit vire au bleu verdâtre en ajoutant de l'iode. ( 5) Poids moléculaire La chromatographie sur colonne de gel en uti- lisant du gel de dextrane ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires de 1 x 103- 2 x 105 donne un pic unique correspondant à un poids moléculaire d'environ 21 000. ( 6) Pouvoir rotatoire spécifique t 2: -46 (c= 0,28, H 20) ( 7) Spectre d'absorption infrarouge Comme le montre la figure 4. IROK Br cm: 3400, 2930, 1630. max ( 8) Spectre d'absorption ultraviolet Quand la mesure est faite en solution aqueuse, on ne voit aucun maximum d'absorption mais seu- lement l'absorption finale. ( 9) Spectre de résonance magnétique nucléaire 13 C. Le spectre de résonance magnétique nucléaire 13 C à 100 M Hz mesuré dans l'eau lourde en utilisant comme étalon externe du TMS (tétraméthylsilane) est indiqué sur la figure 5. Procédé pour la préparation du polysaccharide N 9 G Ib selon la revendication 14, caractérisé par le fait que le traitement au tamis moléculaire est effectué d'abord en utilisant un agent de tamisage moléculaire ayant une plage de fractionnement des poids moléculaires comprise entre environ 1 x 103 1 x 105 et 1 x 103 1,5 x 105 pour la première fraction des trois fractions de polysaccha- rides séparées, en utilisant ensuite un agent de tamisage moléculaire avant une plage de fractionnement de 3 po& molécu- laires dodrse eke e * qxl O 310 2 x 105 et 1 x 10 - 8 x 10, et que la seconde fraction de polysaccharide des deux fractions de polysaccharides séparées est isolée. 16 Procédé pour la préparation du polysaccharide N 9 G Ib selon la revendication 15, caractérisé par le fait que le traitement au tamis moléculaire est une filtration sur gel et que l'agent de tamisage moléculaire est un agent filtrant en gel. 17 Procédé pour la préparation du polysaccharide N 9 G Ib axlti-tumoral selon la revendication 16, caractérisé par le fait que lagent filtrant en gel est le gel de dextrane, le gel de polyacrylamide, un gel polyvinylique hydrophile ou des perles de verre poreuses.