Brevet FR2518117A1 — publié le 19830617

Procédé de mesure quantitative du phosphatidyl- glycérol. La présente invention est relative à un pro- cédé nouveau de mesure quantitative du phosphatidyl- glycérol. Récemment, on a diminué le nombre de décès chez les nouveauxnés de faible poids en raison du traitement amélioré des nouveaux-nés Mais le syndro- me de gêne respiratoire (SGR) d'un nouveau-né dans la période périnatale constitue toujours un problème grave et les décès qui lui sont dus représentent un pourcentage élevé de l'ensemble des décès On consi- dère que le SGR se produit en raison du défaut d'agent tensio-actif pulmonaire Cet agent est impor- tant pour empêcher une contraction des alvéoles pul- monaires qui se dilatent immédiatement après la naissance Le défaut de cet agent tensio-actif pulmo- naire emporte une atélectasie de respiration et l'apparition d'un SGR En conséquence, si l'on peut prévoir l'apparition du SGR assez tôt et si l'on peut commencer à soigner le nouveau-né assez tôt, on peut empêcher l'apparition du SGR, ou on peut le limiter à un cas bénin Il est donc nécessaire de mesurer cet agent tensio-actif pulmonaire. Les moyens dont on dispose à cet effet peu- vent être classés en gros en le procédé de mesure dans lequel on utilise la propriété physique de l'agent tensio-actif pulmonaire, et le procédé dans lequel on détermine biochimiquement les constituants de l'agent tensio-actif pulmonaire On a pratiqué ce dernier procédé en mesurant le rapport des lipides tel que le rapport de la phosphatidylcholine à la sphingomyéline, celui du phosphotidylglycérol au phosphatidylinositol ou par la mesure quantitative de la dipalmitoylphosphatidylcholine au moyen de la chromatographie en couche mince lAm J Obstet. Gynecol, 440: 109 ( 1971); Am J Obstet Gynecol, 613: 125 ( 1976); Am Obstet J Gynecol, 894: 133 ( 1979); Obstet & Gynecol, 295: 57 ( 1981); Am J Obstet Gynecol, 697: 138 ( 1980); etc l. Les résultats de ces divers examens ont permis récem- ment de montrer que l'existence du phosphatidylglycé- rol est un facteur important pour l'apparition du SGR Mais la mesure quantitative du phosphatidylglycé- rol était très difficile, parce qu'il n'existe qu'en une quantité ne représentant que le dixième environ de celle de la phosphatidylcholine. Jusqu'ici, comme procédé de mesure quantita- tive du phosphatidylglycérol, on connait le procédé par chromatographie en couche mince dans lequel, après avoir éliminé le constituant cellulaire du li- quide amniotique par séparation centrifuge, on ex- trait des constituants lipidiques de la phase qui surnage, on sépare les constituants de cet extrait par chromatographie en couche mince, on mesure quan- titativement chaque phospholipide, on obtient les rapports des divers phospholipides et on obtient la quantité de phosphatidylglycérol indirectement à partir de la teneur totale en phospholipides obtenue préalablement par la mesure quantitative du phosphate suivant le procédé de combustion par voie humide, lAm J Obstet Gynecol, 613 125 ( 1976); Am J Obstet Gynecol, 1079: 135 ( 1979); Am J Obstet Gynecol, 899: 133 ( 1979) ; Am J. Obstet Gynecol, 440: 109 ( 1971)l, ou le procédé de mesure quantitatif dans lequel on utilise la chromato- graphie liquide à vitesse élevée lJournal of Chromato- graphy, 277: 223 ( 1981)l Mais ce procédé de chroma- tographie en couche mince a des inconvénients en ce qu'il faut de deux à trois jours pour extraire les constituants lipidiques du liquide amniotique, en ce que les opérations sont compliquées et, en outre, en ce qu'il est nécessaire de chauffer à une température élevée, en raison de la détection des taches Ce pro- cédé a aussi l'inconvénient d'être un procédé de mesu- re indirecte fondé sur les rapports de quantités rela- tives à partir des taches et du phospholipide total, et de ne pas permettre d'effectuer le traitement si- multané de nombreux échantillons parce que l'on met en oeuvre la chromatographie en couche mince. Or on a maintenant trouvé que, dans le liqui- de contenant divers constituants lipidiques à exami- ner, tel qu'un liquide amniotique, on peut déterminer quantitativement le phosphatidylglycérol seul, d'une manière simple, commode et précise, en peu de temps. On a trouvé, d'une manière tout à fait inattendue, que la phospholipase D agit sur le phosphatidylglycé- rol en donnant du glycérol et de l'acide phosphatidi- que et on a mis au point un procédé satisfaisant de mesure quantitative du phosphatidylglycérol seul en mesurant quantitativement ce glycérol produit par la réaction et libéré. De préférence, on fait appel à un procédé dans lequel seul du phosphatidylglycérol peut être mesuré d'une manière satisfaisante et quantitative- ment en faisant agir de la phospholipase D sur le liquide à étudier pour obtenir du glycérol, puis en faisant agir de la glycérolkinase sur ce glycérol en la présence d'un donneur de phosphate tel que de l'adénosine triphosphate (ATP), puis en laissant la glycérophosphate oxydase agir sur ce produit et en mesurant ensuite la quantité d'oxygène consommée ou d'eau oxygénée produite par la réaction. L'invention est donc relative à un procédé de mesure quantitative de phosphatidylglycérol dans le liquide à étudier qui consiste à libérer le gly- cérol par l'action d'une enzyme qui joue le rôle du catalyseur dans la réaction de préparation de glycé- rol et d'acide phosphatidique à partir de phospha- tidylglycérol et d'eau et à mesurer ensuite quanti- tativement le glycérol produit L'invention vise de préférence un procédé de mesure quantitative du phos- phatidylglycérol dans le liquide à examiner qui con- siste à effectuer en combinaison les processus (a), (b), (c) et (d) suivants: (a) libération du glycérol par action de la phospholipase D sur du phosphatidylglycérol, (b) production de glycéro-3-phosphate par action de la glycérolkinam sur du glycérol en la présence d'un donneur de phosphate, (c) action de la glycérophosphate oxydase sur du glycéro-3phosphate, puis (d) mesure de la quantité d'oxygène consommée ou d'eau oxygénée produite par la réaction. Suivant l'invention, il est avantageux de pré- parer chaque réactif dans une trousse destinée à la mesure quantitative et, en outre, on peut effectuer cette mesure quantitative à la température ambiante de 37 C environ, l'opération étant très simple et le temps nécessaire à la réaction étant très bref De plus, on peut mesurer d'une manière précise le phos- phatidylglycérol jusqu'à une concentration très basse, et on peut mesurer directement la teneur en phosphatidyl- glycérol, ce qui se révèle d'une grande utilité Com- me la mesure peut être effectuée d'une manière simple et commode en peu de temps, on peut mesurer simultané- ment plusieurs échantillons L'invention procure donc un procédé utile de mesure quantitative du phosphati- dylglycérol. La figure 1 représente la courbe d'étalonnage de l'exemple 1 suivant l'invention, la figure 2 illus- tre les résultats de mesure quantitative du phospha- tidylglycérol quand on utilise divers échantillons de fluide amniotique et la figure 3 représente la courbe d'étalonnage de l'exemple 3 de l'invention. La phospholipase D est l'enzyme qui joue un rôle de catalyseur dans la réaction du phosphatidyl- glycérol et de l'eau pour donner du glycérol et de l'acide phosphatidique suivant l'invention. Cette phospholipase D est connue comme une enzyme qui est un catalyseur de la réaction qui pro- duit 1 mole d'acide phosphatidique et 1 mole de cho- line à partir d'l mole de lécithine et d'l mole d'eau Pour autant qu'une substance peut être un cata- lyseur dans la réaction enzymatique mentionnée ci- dessus, on peut l'utiliser, et notamment par exemple celle obtenue par l'extraction de cellules contenant de la phospholipase D ou d'un réactif enzymatique que l'on trouve sur le marché, par exemple une enzyme provenant d'un microorganisme obtenue par la culture d'une bactérie produisant de la phospholipase D qui appartient au genre Streptomyces lStreptomyces hachijoensis, souche A-1143 (FERM-P No 1329); brevet japonais examiné No 39918/1977, Streptomyces chromofussus souche A-0848 (FERM-P No 3519); deman- de de brevet japonais publié sous le No 130984/1977 l, etc et des réactifs enzymatiques de phospholipase D vendus sur le marché. La quantité de phospholipase D à utiliser doit être modifiée d'une manière convenable en fonc- tion du temps nécessaire à la mesure et de la concen- tration de phosphatidylglycérol et aucune limitation particulière n'est imposée-à cette quantité C'est ainsi, par exemple, que pour un essai on peut utili- ser de la phospholipase D habituellement en une quantité qui n'est pas inférieure à 0,1 unité et, de préférence, à raison de 1 à O 10 unités environ En outre, on utilise de préference cette phospholipase D après l'avoir dissoute dans un tampon tel qu'un tampon d'H Cl-Tris faiblement acide à faiblement al- calin, un tampon d'acide citrique et un tampon d'acide borique, un tampon PIPES-Na OH ou un tampon d'imidazole et, si nécessaire, on peut lui ajouter un agent tensio-actif non ionique tel que du Triton X-100 ou de l'albumine sérique On réunit ensuite la solution enzymatique contenant de la phospholipase D ainsi ajustée et le liquide à examiner et on produit du glycéro L et de l'acide phosphatidique à partir du phosphatidylglycérol du liquide à examiner avec consommation d'eau Le rapport de mélange des deux n'est pas limité d'une manière particulière et ils peuvent être mélangés en un rapport tel que de pré- férence de 1 à 10 unités environ de phospholipase D soient contenues pour un seul essai de liquide à examiner La température de réaction peut être de 37 C environ et la durée de réaction peut être celle qui est suffisante pour la libération du glycérol, habituellement pas inférieure à 5 minutes et, de pré- férence, pas inférieure à 10 minutes On mesure en- suite quantitativement le glycérol libéré par la réaction De cette valeur de mesure quantitative, on peut obtenir la teneur en phosphatidylglycérol dans le liquide à examiner. Pour la mesure quantitative du glycérol, on peut utiliser divers procédés connus pour la mesure chimique quantitative et ceux utilisant des enzymes. De préférence, il est simple et commode de faire ap- pel à un procédé enzymatique de mesure quantitative dans lequel on utilise, pour la réaction, une espèce ou plusieurs espèces d'enzymes dont le substrat est le glycérol et on mesure quantitativement le change- ment décelable de l'action enzymatique dans la réac- tion. C'est ainsi, par exemple que le procédé de type GK-GPO de mesure quantitative suivant lequel on fait réagir du glycéro-3-phoephate sur de l'adénosine diphosphate (ADP) par l'action sur le glycérol en la présence d'un donneur de phosphate tel que l'adénosine triphosphate (ATP) et la glycé- rolkinase (GK), puis dans lequel on laisse la glycé- rophosphate oxydase (GPO) agir sur le glycéro-3- phosphate de manière à consommer l'oxygène du liqui- de de réaction pour obtenir de l'eau oxygénée est particulièrement simple et commode. Dans ce procédé de type GK-GPO, on mesure la quantité d'oxygène consommée dans le liquide de réac- tion par une électrode à oxygène ou la quantité d'eau oxygénée produite par une électrode à eau oxygé- née en fonction du changement électrique La quantité d'oxygène ou d'eau oxygénée peut également être mesu- rée par une électrode enzymatique dans laquelle une électrode à oxygène ou une électrode à eau oxygénée et une GPO immobilisée sont réunies La GPO immobili- sée peut être sous forme de membranes, de fibres, de pastilles ou de tubes afin de faciliter l'installa- tion de l'enzyme à la partie de détection de l'élec- trode à oxygène ou à eau oxygénée Dans ce mode de réalisation, l'électrode peut fonctionner avec une petite quantité d'enzyme La phospholipase D ou GK utilisée peut également être imnobilisée d'une manière semblable ou d'une autre manière appropriée Pour l'immobilisation, on peut mettre en oeuvre n'importe quel procédé tel que par exemple le procédé d'inclu- sion par polymérisation utilisant par exemple de l'acrylamide; un procédé d'immobilisation utili- sant un agent de réticulation pour un mélange avec une protéine telle qu'une albumine; un procédé d'inclusion utilisant du collagène ou de la fibroi- ne; une adsorption sur une résine polymère organi- que poreuse ou une liaison par covalence sur une telle résine; un procédé d'inclusion utilisant une résine photodurcissable ou un procédé de liaison par covalence utilisant un verre aminé. En outre, comme autres moyens de mesure quan- titative de l'eau oxygénée, on peut effectuer la mesure quantitative par des procédés spectrophotomé- triques, en utilisant un indicateur qui est produit par la réaction sur l'eau oxygénée Comme indicateurs on utilise habituellement ceux dans lesquels on peut mesurer quantitativement un changement par des moyens spectrophotométriques, par exemple un réactif coloré dans lequel le virage se produit dans le domaine visible, une composition à réactif fluorescent qui est fluorescente, ou une composition à réactif lumi- nescent qui est luminescente lorsqu'elle est soumise à des rayons ultraviolets C'est ainsi, par exemple, que comme composition à réactif coloré on utilise un matériau contenant une substance ayant une action peroxydase et un chromogène Comme substance ayant l'action peroxydase, on utilise souvent habituelle- ment la peroxydase provenant du raifort et, comme chromogène, on utilise souvent habituellement l'asso- ciation d'un accepteur d'électrons et d'un donneur d'hydrogène Comme accepteur d'électrons, on peut faire appel par exemple à la 4-aminoantipyrine, au 2- hydrazinobenizothiazole, à la 3-méthyl-2-benzothiazo- lone hydrazine, au 2-aminobenzothiazole, etco Comme donneur d'hydrogène, on peut utiliser par exemple le phénol, la 3-méthyl-N-éthyl-N( -hydroxyéthyl)aniline, le 3,5-xylénol, la N,N-diméthylaniline, la N;N-di- éthylaniline, etc. Comme substrats lumineux d'une composition à réactif fluorescent ou d'une composition à réactif photogène, on peut citer par exemple un bis( 2,4,6- trichlorophénol)oxalate, la phénylthiohydantoine, l'acide homovanillique, l'acide 4-hydroxyphénylacéti- que, la vanillylamine, la 3-méthoxyéthylamine, l'aci- de phlorétique, l'hordénine, le monoanion luminolique, la lucigénine, etc Chacun d'entre eux peut être uti- lisé, si nécessaire, en association avec un accepteur d'électrons et/ou une substance ayant une action per- oxydase pour la mesure quantitative de l'eau oxygénée. Il n'y a pas de limitation particulière pour la quantité du réactif enzymatique ou du chromogène utilisé C'est ainsi, par exemple, qu'on peut utili- ser pour un essai, habituellement pas moins de 0,01 unité, de préférence de 0,05 à 100 unités de GK et habituellement pas moins de 0,05 et, de préférence de 0,1 à 200 unités de peroxydase On peut utiliser éga- lement une solution ajustée telle que la concentra- tion d'un accepteur d'électrons ou d'un donneur d'hydrogène ne soit pas inférieure habituellement à O,1 m M et une solution ajustée telle que la concen- tration d'un donneur de phosphate comme l'ATP ou la cytosine triphosphate ne soit pas inférieure à 0,1 m M De préférence, pour augmenter l'activité enzyma- tique du GK, on utilise un sel hydrosoluble relarguant des ions magnésium, par exemple du chlorure de magné- sium, et on peut le dissoudre dans de l'eau distillée ou dans un tampon faiblement acide à faiblement alca- lin Ces réactifs peuvent être utilisés séparément de la solution enzymatique de phospholipase D mention- née ci-dessus, ou ils peuvent être mélangés à celle- ci ou, en outre, on peut former ces réactifs en un stratifié intégré en les appliquant sur des papiers filtres,des pellicules ou autres. Le procédé de type GK-GPO de mesure quantita- tive présente une sensibilité élevée au glycérol pro- duit dans le liquide à examiner et, comme il n'est pas affecté par les impuretés du liquide à examiner, c'est un procédé excellent permettant d'effectuer une mesure précise. Comme GK utilisé pour ce procédé de type GK- GPO de mesure quantitative, on peut utiliser n'impor- te quelle enzyme pour autant qu'elle produit du glycé- rol-3-phosphate et de 1 'ADP, à partir de glycérol et d'ATP, par exemple des enzymes provenant du foie du rat ou du pigeon lJ Biol Chem, 211, 951 ( 1954) et Biochem Z, 329, 320 ( 1957)l, celles provenant de microorganismes qui sont des enzymes obtenues à partir du milieu de culture de microorganismes pro- duisant du GK tels que Candida mycoderma ou strepto- myces canus A-2408 (FERM-P No 4977) lBiochem Z, 333, 471 ( 1961), demande de brevet non examinée au Japon publiée sous le No 162987/1980 l, etc et d'autres enzymes vendues sur le marché. En outre, comme GPO on peut utiliser toute enzyme pour autant qu'elle joue un rôle de catalyseur dans la réaction de production de dihydroxyacétone- phosphate et d'eau oxygénée, à partir de glycéro-3- phosphate et d'oxygène, par exemple du genre Streptococcus, du genre Lactobacillus, du genre Leuco- nostoc, des bactéries produisant de la glycérophospha- te oxydase qui appartiennent au genre Pediodoccus (demande de brevet japonais non examinée publiée sous le No 72892/1978), une enzyme obtenue par la culture de bactéries produisant de la glycérophosphate oxyda- se qui appartiennent au genre Aerococcus (Aerococcus viridans souche IFO 12219 et souche IFO 12317, deman- de de brevet non examinée et publiée au Japon sous le No 15746/1980) et des enzymes vendues sur le marché. Un autre procédé enzymatique de mesure quanti- tative du glycérol consiste à faire réagir de la glycérolkinase sur du glycérol en la présence d'un donneur de phosphate tel que de i'ATP pour obtenir du glycéro-3-phosphate et de 1 'ADP, puis a faire réagir la glycérophosphate déshydrogénase sur ce glycéro-3- phosphate en la présence de nicotine adénine dinu- cleotide (NAD) pour produire de la dihydroxyacétone et du NAD réduit, puis à mesurer quantitativement ce NAD réduit de manière à déterminer la quantité de glycérol Quand on effectue la mesure quantitative de ce NAD réduit, on peut utiliser habituellement la mesure de l'absorbance à 340 nm environ, ou après lui avoir permis de donner naissance à une coloration en utilisant un sel hydrosoluble de tétrazolium tel que le bromure de 3-( 4,5-diméthyl)-2-thiazolyl-2 H-tétra- zolium, le chlorure de 2-(p-iodophényl)-3-(p-nitro- phényl)-5-phényl-2 H-tétrazolium, le chlorure de 3,3 '- ( 3,3 '-diméthoxy-4,4 '-biphénylène)-bis-l 2-(p-nitro- phényl-5-phényl-2 H-tétrazoliuml (bleu de nitrotétra- zolium) ou le 2,6-dichlorophénol-indophénol en la présence de diaphorase ou de phénazine méthosulfate, on peut mesurer la coloration en fonction des absor- bances en utilisant les longueurs d'ondes spéciales d'absorption. Comme procédé différent de celui mentionné ci- dessus on peut mentionner un moyen de mesure quantita- tive suivant lequel on fait réagir de la glycérol déshydrogénase sur du glycérol en la présence de NAD pour produire de la dihydroxyacétone et du NAD réduit et on mesure quantitativement ce NAD réduit. On peut en outre mentionner un moyen qui repose sur un processus suivant lequel on fait agir de la glycérolkinase sur du glycérol en la présence d'un donneur de phosphate tel que l'ATP pour obtenir du glycérophosphate et de l'ADP, on fait réagir de la pyruvate kinase sur cet ADP en la présence de phos- phoénolpyruvate pour obtenir de l'acide pyruvique et de l'ATP et on mesure quantitativement cet acide pyruvique Comme procédés de mesure quantitative de cet acide pyruvique, on utilise des moyens tels que celui qui consiste à faire agir une hydrazine telle que la 2,4-dinitrophénylhydrazine sur l'acide pyruvi- que pour donner naissance à une coloration et à mesu- rer la coloration en fonction de l'absorbance en uti- lisant une longueur d'onde de 440 nm environ, celui suivant lequel on fait réagir de la lactate déshydro- génase sur de l'acide pyruvique enla présence de NAD réduit pour obtenir du NAD oxydé et de l'acide lactique et on mesure la diminution de quantité de NAD réduit dans le système réactionnel par des moyens tels qu'une mesure d'absorbance à une longueur d'onde de 340 nm environ, celui suivant lequel on fait agir de la pyruvate oxydase sur de l'acide pyruvique et on mesure las quantité d'oxygène consommée ou celle d'eau oxygénée du système réactionnel en fonction d'une variable électrique et celui suivant lequel on mesure l'acide pyruvique par des moyens spectrophotométriques en utilisant une composition à indicateur pour l'eau oxygénée. Comme autres procédés que ceux mentionnés ci- dessus, on peut utiliser un procédé de mesure quanti- tative du glycérol suivant lequel on fait agir de la glycérol oxydase sur du glycérol et on mesure la quan- tité d'oxygène consomnée ou celle d'eau oxygénée ou de glycéraldéhyde produite dans le système réaction- nel. Comme enzymes, réactifs et autres, il est simple et commode d'utiliser ceux vendus sur le mar- ché et on peut déterminer d'une manière appropriée la quantité qui doit en être utilisée Si nécessaire, on peut également utiliser un agent tensio-actif ou un agent stabilisant. Comme liquide à examiner on peut mentionner n'importe quel échantillon, pour autant qu'il con- tienne du phosphatidylglycérol, par exemple des flui- des de l'organisme tels que du liquide amniotique. * Quand le liquide amniotique est le liquide à examiner, il est préférable d'utiliser l'échantil- lon prélevé dans la région contenant du phosphatidyl- glycérol; c'est ainsi, par exemple, que l'on extrait un échantillon de 5 à 6 ml de liquide amniotique par à 18 ml du mélange chloroforme-méthanol ( 2:1), qu'on recueille la couche chloroformique en centrifu- geant à 2000 tours/minute et qu'on l'évapore à sicci- té dans l'azote gazeux pour obtenir le lipide total. Ensuite, après avoir dissous ce lipide total dans une quantité définie d'une solution de Triton X-100 à 1 %, on fait agir une solution enzymatique de la phospholipase D et, par exemple, chaque enzyme sur la base du procédé de mesure quantitative de G-K-GPO men- tionné ci-dessus et d'autres réactifs sur le lipide total successivement ou simultanément Dans ce cas, il n'y a pas de limitation particulière au rapport d'utilisation du liquide à examiner au réactif enzymatique et autres et, habituellement, on utilise de 0,1 à 3 ml environ du réactif enzymatique ou au- tres pour 0,01 ml à 1 ml du liquide à examiner Pour ce qui concerne les conditions de la réaction, il est préférable d'effectuer la réaction à 370 C environ et pour ce qui concerne la durée de réaction, on peut choisir n'importe quelle durée pour autant que la réaction est achevée complètement; habituellement, on effectue la réaction pendant pas moins de 5 minu- tes et, de préférence, pendant pas moins de 10 minu- tes De même, pour ce qui concerne le milieu de réac- tion, on utilise de l'eau ou un tampon faiblement acide à faiblement alcalin, comme solvant de chaque réactif et autres. Ainsi, par la mesure quantitative du liquide à examiner on peut mesurer directement et quantitati- vement en très peu de temps le phosphatidylglycérol et on peut mesurer une teneur en phosphatidylglycérol aussi petite que 2,0 N moles, c'est-à- dire la teneur en phosphatidylglycérol de 0,03 mg/dl quand on utili- se de 5 à 6 ml de liquide amniotique Ceci signifie que l'on peut mesurer la quantité de phosphatidyl- glycérol en une concentration extrêmement basse en comparaison de la valeur de 0,2 mg/l de celui-ci qui est le niveau critique pour l'apparition du SGR En outre, aucune opération compliquée n'est nécessaire et l'on peut travailler à la température normale En conséquence, il s'agit là d'un bon procédé de mesure quantitative. De même, il n'y a pas de limitation particu- lière sur le procédé de mesure de chaque activité de phospholipase D, GK et GPO utilisée dans des exemples pratiques mentionnés ci-après suivant l'invention et ces procédés peuvent être illustrés de la manière suivante: (a) Procédé de mesure de l'activité de la phospho- lipase D. A O,1 ml d'une solution de jaune d'oeuf de phosphatidyléthanolamine à 4 %, on ajoute et mélange 0,8 ml de tampon à l'acide Tris-chlorhydrique 0,05 M (p H 7,5), 0,3 ml de Triton X-100 à l %, 0,3 ml d'eau et 0,2 ml d'une solution aqueuse 10 m M de Ca C 12 et on soumet le mélange à un traitement par ultrasons pen- dant 10 minutes On ajoute ensuite 0,2 ml d'éther éthylique et O,1 ml d'une solution enzymatique On laisse réagir le mélange à 37 C pendant 20 minutes et on interrompt la réaction par addition de 0,3 ml d'acide trichloroacétique à 20 % On lave le liquide réactionnel deux fois par 4 ml d'éther éhtylique, on ajoute 0,5 ml d'un tampon au citrate 0,2 N (p H 5,0) à 1 ml de la couche aqueuse, on y ajoute 0,1 ml d'une solution aqueuse à 2 % de Sn C 12 et 2 ml de solution de ninhydrine à 2 %, on chauffe le mélange à 100 C pendant 15 minutes pour libérer l'éthanolamine, qui donne naissance à une coloration par la réaction de la ninhydrine et on mesure l'absorbance à une DO de 570 mp L'activité de l'enzyme qui libère 1 pg d'éthanolamine par minute est définie comme 1 unité (U). (b) Procédé de mesure de l'activité de GK. Tampon acide Tris chlorhydrique 0,2 M (p H 9,0) 0,4 ml Glycérol O,1 M 0, 05 ml ATP 10 m M 0,1 ml Mg Cl 2 10 m M 0,1 ml Bleu de nitrotétrazolium à 0,25 % O,1 ml Albumine sérique du boeuf 1 % 0,14 ml NAD 10 m M 0,1 ml Phénazine méthosulfate à 0,05 % 0,01 ml Glycérophosphate déshydrogénase (fabriqué par Boehringer Sohn AG, 2 mg/ml, 65 U/mg) 5 pl. On pré-incube un millilitre du mélange réac- tionnel ayant chacun la composition mentionnée ci- dessus à 37 C pendant 5 minutes On y ajoute 50 1 pl d'une solution contenant du GK (tampon phosphate m M contenant 10 m M de glycérol, dilué de manière appropriée à un p H de 7,5) On fait réagir le mélange à 37 C pendant 10 minutes Puis, après avoir interrom- pu la réaction par l'addition d'H Cl 0,1 N, on mesure la coloration qui prend naissance à une longueur d'onde de 550 nm pour obtenir l'absorbance (A 550 nma). Une unité de GK est définie comme l'activité qui pro- duit 1 pmole de glycéro-3-phosphate par minute. L'équation de calcul est la suivante:. U/ml = AA x rapport de dilution x 1 A x rapport de 0,05 x 10 4 2 dilution (c) Procédé de mesure de-l'activité de GPO Tampon à l'acide Trischlorhydrique 0,2 M (p H 8,0) 0,2 ml Peroxydase ( 0,5 mg/ml, 45 U/ml) 0,1 ml 4-aminoantipyridine à 0,3 (P/V) 0,1 ml DL-glycéro-3-phosphate 0,1 M 0, 1 ml N,N-diméthylaniline à 0,2 % (V/V) 0,2 ml Eau distillée 0,3 ml. On charge un millilitre du mélange réaction- nel ayant la composition mentionnée ci-dessus dans un petit tube à essai et on effectue une pré-incuba- tion à 37 C pendant 3 minutes On ajoute 20 p 1 d'une solution enzymatique et on laisse réagir le mélange pendant 10 minutes On interrompt la réaction par l'addition de 2,0 ml de laurylbenzène sulfonate de sodium à 0,25 % (P/V) et on mesure l'absorbance du w rlo U-a qa 001-X uo: 7-Ti ao'uu q, j"agitéap arb T Ias ?U Tuirtq-l-,, p 3-LU oj- S: 9, O) julil gc, ap uos-t,? x ni iuleu 9 zuoo 3 srud-13so-7 ap 3 ug (g Hd) UOT-4 nlos ZUDD ap r u:, z Tu 9 O n nc C, o z z -, a,dsoucl no 9:D qj-?Z 3 001 O'1 2 T O-Z -p L'Ds-Du N a a -l 'U t? U O T q S O'J'U O D e O T -l 1 O S UOT',Ua AUT, T:U 9 Sn aun 01 SUPO X (O'9) (It U/fl) 91 JLZ Ua j ap 9-4 TA Tq D'y oq a:Ul PA Tn S UO Tq Pnba-j uolas aul,zua T ap eq TA Tqou l alnolo U O -ulu 999 ap apuop 2 nan Buoi aun P q Tnpoad Li ZL L 8 L Sz -À 2518117 ( 4) 60 m M d'EDTA. ( 5) Solution de 40 m M de Mg C 12 contenant 160 m M d'ATP: On mélange 1, 0 ml d'ATP 0,2 M, 0,10 ml de Mg C 12 0,5 M et O,15 ml d'eau distillée, de manière à obtenir 1,25 ml de la solution. ( 6) Solution enzymatique de GK. Tampon de Tris-H Cl 10 m M contenant 2 mg/ml de GK (p H 8). ( 7) Solution enzymatique de GPO. On prépare 10 ml d'une solution enzymatique de GPO consistant en 10 mg d'albumine sérique de vache contenant 3 mg/ml de GPO, 560,75 mg de (NH 4) 2504, 1,0 ml de tampon H Cl-Tris 0,1 M (p H 8) et 9 ml d'eau distillée. ( 8) Composition liquide à indicateur contenant de la GPO. ml 4aminoantipyridine 0,24 Solution aqueuse de phénol 0,16 ( 10 mg/ml) Triton X-100 ( 1,25 %) 0,8 Tampon Tris-H Cl ( 0,5 M, p H 8) 1,6 Peroxydase ( 90 U/ml d'eau distillée) 0,8 Solution enzymatique de GPO 0,8 ( 3 mg/ml de GPO) Eau distillée 15,6 A chaque échantillon de O ml à 0,10 ml de la solution contenant du phosphatidylglycérol (PG) Total 20 ml mentionnée cidessus, on ajoute du Triton X-l O O à i % de manière à ce que la quantité totale représente O,10 ml A ce mélange, on ajoute en outre 0,1 ml du tampon au Ca++ Après avoir réchauffé le mélange à 37 C pendant 5 minutes, on y ajoute 0,05 ml d'une solution enzymatique de phospholipase D et on laisse réagir le mélange à 37 C pendant 10 minutes Après la réaction, on ajoute 0,04 ml d'EDTA 60 m M et en outre 0,075 ml d'une solution de Mg C 12 40 m M conte- nant 160 m M d'ATP et 0,03 ml d'une solution enzyma- tique de GK On laisse réagir le mélange à 37 C pen- dant O 10 minutes Après la réaction,on ajoute 1,0 ml de la composition de liquide à indicateur contenant du GPO et on laisse réagir le mélange à 37 C pendant 20 minutes Puis on mesure l'absorbance due à la co- loration qui a pris naissance sous l'effet de la réaction à une longueur d'onde de 500 nm (DO 500). Les résultats sont représentés à la figure 1 On obtient une tendance à une relation linéaire satisfaisante dans la gamme allant du point de 0, 005 ml de solution contenant du PG (teneur en PG de 5 N moles) à celui de O,1 ml (teneur en PG de N moles). Il résulte en outre de cette figure 1 que l'on peut obtenir la tendance à une relation linéai- re quand la teneur en PG dépasse 2 N moles et que la sensibilité est très grande. EXEMPLE 2 Dans 18 ml d'un mélange de chloroforme et de méthanol ( 2:1), on dissout de 5 à 6 ml d'un échantil- lon de liquide amniotique On traite la solution par centrifugation à 2000 tours/minute Des trois couches qui se séparent on extrait la couche chloroformique que l'on évapore à siccité dans de l'azote gazeux pour obtenir le lipide total On dissout ensuite ce lipide total dans 0,1 ml de chloroforme et on charge la solution dans une colonne de gel de silice ( 0,3 g), la graisse neutre étant éliminée en faisant s'écouler ml d'un mélange de chloroforme et de méthanol ( 19:1) et on recueille la fraction contenant le phos- phatidylglycérol en faisant s'écouler 10 ml de mélan- ge de chloroforme et de méthanol ( 2:1) On enlève ensuite le solvant et on dissout le résidu dans 0,1 ml de Triton X-100 à l % pour préparer le liquide à examiner On ajoute ensuite 0,1 ml d'un tampon au Ca ++ au liquide à examiner et on porte le mélange à 370 C pendant 5 minutes Puis on ajoute 0,05 ml d'une solution enzymatique de phospholipase D et on laisse réagir le mélange à 370 C pendant 10 minutes Après la réaction, on ajoute 0,04 ml d'EDTA 60 m M>puis on fait suivre de l'addition de 0,075 ml d'une solution de Mg Cl 2 40 m M contenant 160 m M d'ATP et de 0,03 ml d'une solution enzymatique de GK, et on laisse réagir le mélange à 370 C pendant 10 minutes Ensuite, après la réaction, on ajoute 1,0 ml de la composition liqui- de à indicateur contenant du GPO et on laisse réagir le mélange à 370 C pendant 20 minutes On mesure l'absorbance due à la coloration qui prend naissance sous l'effet de la matière colorée produite par la réaction à une longueur d'onde de 500 nm et on obtient la teneur en PG (mg/dl) de l'échantillon de liquide amniotique à partir de la courbe d'étalonnage Les résultats sont tels que représentés à la figure 2. A la figure 2, X représente des cas mortels, O re- présente des cas d'apparition d'un syndrome de gêne respiratoire, A représente des cas d'apparition d'un syndrome de gêne respiratoire léger et * représente des cas o il n'apparaît pas de syndrome de gêne res- piratoire. EXEMPLE 3 ml Tampon d'H Cl-Tris 0,2 M (p H 7,5) 0,2 Ca C 12 10 m M 0,2 Mg C 12 10 m M 0,2 Triton X-100 à 10 % 0,05 ATP 10 m M 0,2 Phospholipase D à 20 U/ml, GK à 5 U/ml et liquide contenant 0,1 du GPO à 50 U/ml Peroxydase à 45 U/ml 0,1 4-aminoantipyrine à 0,3 % 0,2 3-méthyl-N-éthyl-N (-hydroxyéthyl) 0,2 aniline à 0,3 % Eau distillée 0,55 On prépare 2,0 ml du mélange réactionnel pour la mesure quantitative du phosphatidylglycérol ayant la composition mentionnée ci-dessus A ce mélange, on ajoute 50 p 1 du liquide à examiner qui est un liquide contenant des quantités différentes de PG (teneur en PG: 20 N moles à 100 N moles) On laisse réagir le mélange à 37 C pendant 15 minutes, puis on mesure à une longueur d'onde de 550 nm (D 0550) la coloration développée par la matière colorée produite après la réaction Les résultats obtenus sont consignés à la figure 3 et l'on obtient une courbe d'étalonnage qui présente une linéarité satisfaisante en fonction de la teneur en PG du liquide a examiner. Total 2,0 ml REVENDICATIONS 1 Procédé de mesure quantitative du phospha- tidylglycérol d'un liquide à examiner, caractérisé en ce qu'il consiste à faire agir une enzyme sur le phosphatidylglycérol pour libérer du glycérol, et à mesurer quantitativement le glycérol produit. 2 Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que l'enzyme est une enzyme qui joue un rôle de catalyseur dans la réaction de préparation de glycérol et d'acide phosphatidique à partir de phos- phatidylglycérol et d'eau. 3 Procédé suivant la revendication 2, carac- térisé en ce que l'enzyme qui joue un rôle de cataly- seur dans la réaction de préparation de glycérol et d'acide phosphatidique à partir de phosphatidylglycé- rol et d'eau est la phospholipase D. 4 Procédé suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le liquide à examiner est un fluide de l'organisme. 5 Procédé de mesure quantitative du phospha- tidylglycérol d'un liquide à examiner, caractérisé en ce qu'il comprend la combinaison des processus (a), (b), (c) et (d) suivants: (a) libération du glycérol en faisant réagir de la phospholipase D sur du phosphatidyl- glycérol, (b) production de glycéro-3-phosphate en faisant agir de la glycérolkinase sur du glycérol en la présence d'un donneur de phosphate, (c) action de la glycérophosphate oxydase sur le glycéro-3-phosphate, puis (d) mesure de la quantité d'oxygène con- sommée ou d'eau oxygénée produite dans la réaction. 6 Procédé suivant la revendication 5, carac- térisé en ce que le donneur de phosphate est l'adé- nosine triphosphate. 7 Procédé suivant la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que pour la mesure quantitative de l'eau oxygénée on fait appel à une composition à indi- cateur qui réagit sur l'eau oxygénée pour donner un produit qui peut être détecté. 8 Procédé suivant la revendication 7, carac- térisé en ce que la composition à indicateur est une matière contenant une substance ayant une action peroxydase et un chromogène. 9 Procédé suivant la revendication 8, carac- térisé en ce que le chromogène est la 4-aminoantipyri- ne et le phénol. Procédé suivant la revendication 8, carac- térisé en ce que le chromogène est la 4-aminoantipy- rine et la 3-méthyl-N-éthyl-N-(e-hydroxyéthyl)aniline. 11 Procédé suivant la revendication 9, carac- térisé en ce que la mesure consiste à effectuer une mesure d'absorbance à une longueur d'onde de 500 nm environ. 12 Procédé suivant la revendication 10, ca- ractérisé en ce que la mesure consiste à effectuer une mesure d'absorbance à une longueur d'onde de 550 nm environ.