Brevet FR2517204A1 — publié le 19830603

La présente invention concerne une nouvelle substan- ce physiologiquement active CH-1 et un procédé pour sa production. On connaissait jusqu'ici de nombreux polysaccharides ayant une activité d'induction de l'interféron ou une acti- vité anti-tumorale, et on utilisait en pratique un agent anti-tumoral comme PSK Cependant, on ne connaît pas de substance ayant à la fois une activité anti-tumorale et une nette activité d'induction d'interféron. On a trouvé qu'une substance extraite et isolée à partir de Chlorella pyrenoidosa appartenant au genre Chlorella présente les deux propriétés mentionnées ci-dessus. La nouvelle substance physiologiquement active CH-1 de l'invention (appelée ci-dessous CH-1) est un poly- saccharide acide et présente une activité d'induction de l'in- terféron et une activité anti-tumorale. Le CH-1 possède les propriétés physico-chimiques suivantes: 1) I 1 se compose au moins de carbone, d'hydrogène, d'oxygène et d'azote, et présente l'analyse élémentaire suivante: C: 38,49 %; fi: 6,07 %; N: 1,39 %. 2) Poids moléculaire: ne passe pas à travers une membrane de cellophane, et S = 6,15, mesuré par ultracentrifu- gation a une concentration de 0,2 %, dans un tampon phosphaté 0,2 M à p H 7,2 Type de rotor: RA 60 HC, 51 200 tpm. 3) Point de fusion: se colore à environ 240 C, puis on observe une carbonisation aux températures plus élevées 4) Rotation spécifique: ll 9 = -9,52 (c = 1, H 2 O). 5) Spectre UV: absorption finale dans une solution aqueuse à 0,125 %. 25172 C 04 6) Spectre IR: Miontré dans la figure 1, comprimé de K Br, bandes d'absorption à 3420, 2930, 1640, 1380, 1125, 1065, 1040, 990, 915, 835 et 800 cm 7) Solubilité: soluble: eau insoluble: les solvants organiques communs com- me le méthanol 8) Réaction colorée: positive: anthrone, Molisch et carbazole- H 25 04 négative: Folin-Lowry et ninhydrine. 9) Nature: acide, électrophorèse sur membrane d'acétate lélectrophorèse à 0,8 cm pour (+) dans les conditions suivantes: pyridine-acide acétique 0, 1 M, p H 5,0; V ( 4 m A), 20 minutesl. ) Couleur: poudre blanche 11) Protéine: non détectée (mesurée par la réaction colorée de Folin-Lowry) 12) Analyse des monosaccharides: rhamnose, arabinose, glucose, galactose et acide glucuro- nique (détecté par chromato- graphie sur papier et chroma- tographie en phase gazeuse après hydrolyse dans H 25 O 4 à 7 %, avec reflux pendant 2 h). 13) Teneur en sucre: 53 % (calculée sous forme de glucose) 14) Schéma d'ultra-centrifugation: figure 3 Les propriétés biologiques de CH-l sont les suivantes: I Activité d'induction de l'interféron: 1) Procédé de dosage A (in vitro): On saigne un lapin (japonais blanc) par artériotomie. On prélève la rate et on la trypsinise pour préparer des cellules en suspension ( 2 à 5 x 107 cellules) On fait incuber les cellules de rate avec CH-i à 25 WC pendant 24 h, on cen- trifuge et on recueille le surnageant, puis on détermine le titre d'interféron dans le milieu. 2) Procédé de dosage B (in vivo): A intervalles réguliers après injection intra- veineuse à des souris ddy, âgées de 4 semaines, avec 100 mg/ kg de CH-l, on sacrifie des souris et on détermine le titre d'interféron dans le sérum. 3) Procédé de dosage du titre d'interféron (IF): On dose le titre IF par un procédé de diminution de 50 % sur plaque en utilisant une culture d'une lignée cel- lulaire de rein de lapin R K 13 et le virus de î, stomatite vésiculaire comme virus d'aggression. 4) Résultats: ( 1) Procédé in vitro: Concentration de l'échantillon (pg/ml): 1 0,1 0,01 Titre d'IF (u): 49 34 20 - ( 2) Procédé in vivo Moment du saignement: 2 h plus tard 5 h plus tard Titre d'IF Cu): 240 15 Comme on le voit ci-dessus, le composé de l'invention possède une activité d'induction de l'interféron. II Activité d'inhibition de l'infection virale: 1) Procédé de dosage: On administre le CH-l par voie intraveineuse dans la veine caudale de souris dd Y et au bout de 2 à 12 h on procède sur les souris à une épreuve avec le virus de la vaccine administré par voie intra-veineuse dans la veine caudale. On compte le nombre de pustules apparues sur la peau de la queue le huitième jour après l'épreuve. 2) Résultat: Le résultat est donné ci-dessous. Activité d'inhibition de l'infection virale Dose (mg/kg) Schéma Nombre moyen de pustules posologique ( 5 souris) Témoin 58,7 -2 h 1 -2 h 1,6 -6 h 4 -6 h 26 III Activité anti-tumorale: ( 1) Activité contre la leucémie P-388 de la souris: On inocule par voie intra-péritonéale à des souris CDF 1 1 x 10 celluies P-388, et on traite les animaux quo- tidiennement du premier au quinzième jour avec CH-l. Résultat: Dose (mg/kg/ jour) Nb moyen de jours de survie ( 4 souris) Accroissement de la durée de vie (%) Témoin 15 O 16,8 8 250 19,5 26 Accroissement de la durée de vie (%) = nb moyen de jours de survie (animaux traités) x 100 100 nb moyen de jours de survie (témoins) ( 2) Activité contre la tumeur solide S-180: On inocule à des souris ICR par voie sous-cutanée des cellules de sarcome 180 ( 1 x 107) le jour 0, et on administre le CH-1 successivement par voie intra-péritonéale les jours 1 à 9, une fois par jour. Dose Durée de vie moyenne Accroissement de la (mg/kg/jour) (jours, 5 souris) durée de vie (%) 42 O 50 19 250 61 45 La substance active antitumorale antérieurement con- nue obtenue à partir du genre Chlorella est l'agent anti- tumoral isolé à partir de Chlorella regularis (brevet japonais non soumis à l'inspection publique n 52-79016) Ladite subs- tance contient 3,6 % de protéines tandis que l'on ne trouve pas de protéines dans CH-1 En outre, la substance antérieurement connue mentionnée ci-dessus est un polysaccharide composé de glucose à 95 + 2 % et de traces de rhamnose et de galac- tose, à savoir un polysaccharide constitué de glucose comme composant principal Cependant, le CH-1 de l'invention est un polysaccharide composé de petites quantités de galactose, d'arabinose, de glucose et d'acide glucuronique, et d'un composant principal qui est le rhamnose Les deux substances different l'une de l'autre de par les sucres qui les composent CH-1 est donc considérée comme une substance nouvelle. L'invention fournit également un procédé de productio de la substance CH1 dans lequel on cultive une chlorella appartenant au genre Chlorella et on isole le CH-1 des cellule ainsi cultivées. La chlorella utilisée dans l'invention est largement répartie dans la nature et est une algue unicellulaire. Le mode de réalisation préféré pour les cellules utilisées dans l'invention fait appel à Chlorella pyrenoidosa, et l'on peut utiliser dans l'invention une souche mutante artificielle préparée au moyen de rayons ultraviolets, de rayons X, de rayonnements-mutagènes ou d'agents mutagènes chimiques, ainsi qu'un mutant naturel des cellules chlorella qui produisent le CH-1. Dans l'invention, on cultive la chlorella appartenant au genre Chlorella dans un milieu approprié On peut utiliser un milieu nutritif comprenant de l'acide acétique, du dioxyde de carbone, un sel de calcium, un sel de magnésium et un sel de potassium, et, si nécessaire,d'autres sources de carbone comme le glucose, des sources d'azote comme l'urée et des vitamines La culture est généralement conduite de façon aseptique dans une cuve scellée dans des conditions aérobies. On applique la lumière visible, par exemple la lumière solaire, ou la lumière fluorescente. On peut extraire le CH-1 à l'eau chaude à partir de cellules cultivées ou de cellules séchées par pulvérisation. L'extraction est conduite à 80-90 'C pendant 1 h On traite l'extrait ou son concentré avec un solvant organique miscible à l'eau pour précipiter la matière Les exemples préférables de solvant organique miscible à l'eau sont les alcools infé- rieurs comme le méthanol et l'éthanol On peut choisir la concentration préférable dans un intervalle compris entre et 80 % On recueille par centrifugation le précipité ainsi obtenu, on le dissout dans l'eau et on dialyse avec une membrane semi-perméable comme un tube de cellophane pour retirer les impuretés à faible poids moléculaire. On traite le produit de la dialyse par chromatogra- phie d'adsorption et filtration sur gel pour purifier le CH-1. Par exemple, on adsorbe le produit de dialyse dans une colonne de DEAEcellulose et on élue avec une solution alcaline diluée On neutralise l'éluat,on le fait passer à travers une colonne de CM-cellulose et on lyophilise la fraction active. On dissout le lyophilisat dans l'eau et on l'adsorbe dans une colonne de DEAE-sepharcel, et on chromatographie selon un gradient avec de l'eau et Na Ci l M/H Cl 0,01 N On recueille les fractions actives, on les soumet à une filtration sur gel en utilisant du Sephadex G-75 et on lyophilise pour obtenir le CH-1. L'exemple suivant précise l'invention mais ne doit pas être compris comme limitatif. Exemple 1 On extrait une poudre séchée par pulvérisation ( 1 kg) de Chlorella pyrenoidosa avec de l'eau chaude 5 litres) à 80-90 C pendant 1 h On centrifuge l'extrait à 7000 tpm pendant 20 minutes On ajoute du méthanol à la solution sur- nageante jusqu'à une concentration de 40 % et on laisse reposer pendant la nuit à 5 C, puis on centrifuge à 9000 tpm pendant minutes On dissout le précipité dans l'eau et on dialyse la solution aqueuse dans un tube de cellophane contre un flux d'eau désioniséependant la nuit On adsorbe ie produit de dia- lyse dans une colonne ( 6,4 x 39 cm) de DEAE-cellulose, équili- brée avec un tampon phosphaté 0,005 M (p H 6,0), et on élue avec Na OH 0, 05 N On vérifie l'activité d'induction d'IF de chacune des fractions de 10 ml et on neutralise avec HC 1 1 N les fractions actives recueillies On fait passer la solution à travers une colonne ( 4 x 15 cm) de CMcellulose, on concentre l'éluat et on lyophilise On adsorbe la poudre brute dissoute dans une faible quantité d'eau dans une colonne ( 2,5 x 50 cm) de DEAE-sepharcel et on élue par élu- tion à gradient avec de l'eau ( 500 ml) et Na Cl 1 M/H Cl 0,01 N ( 500 ml) On vérifie toutes les fractions de 10 ml par anthrone-H 2 SO 4 et on recueille les fractions contenant une concentration élevée de saccharide, on neutralise avec Na OH 0,02 N, puis on dialyse avec un tube de cellophane contre l'eau du robinet pendant la nuit On fait passer le produit de dialyse à travers une colonne ( 5 x 70 cm) de Sephadex G-75. On lyophilise l'éluat pour obtenir une poudre blanche de CH-1 ( 200 mg). 4 Brève légende des dessins: Fig 1: spectre IR de CH-1. Fig 2: schéma électrophorétique de CH-1 sur membrane d'acétate Fig 3: schéma d'ultra-centrifugation de CH-1. REVENDICATIONS 1 Substance physiologiquement active CH-1 ayant les propriétés physicochimiques suivantes: 1) Elle se compose au moins de carbone, d'hydrogène, d'oxy- gène et d'azote, et présente l'analyse élémentaire suivante: C: 38,49 %; H: 6,07 %; N: 1,39 %. 2) Poids moléculaire: ne passe pas à travers une membrane de cellophane, et S = 6,15 S (mesuré par ultra-centrifugation). 3) Point de fusion: se colore à environ 240 C, puis on observ une carbonisation aux températures plus élevées. 4) Rotation spécifique: llD 29 = -9,52 (c = 1, H 20). ) Spectre d'absorption ultraviolet: absorption finale dans une solution aqueuse a 0,125 %. 6) Spectre d'absorption infra-rouge: fig 1 7) Solubilité: soluble:eau insoluble: solvant organique comme le méthanol. 8) Réaction colorée: positive: anthrone, Molisch et carbazol-H 25 04 négative: Folin-Lowry et ninhydrine. 9) Nature: acide, électrophorèse sur membrane d'acétate montrée dans la fig 2. ) Couleur: poudre blanche. 11) Protéine: non détectée (mesurée par la réaction colorée de Folin-Lowry). 12) Analyse des monosaccharides: rhamnose, galactose, arabi- nose, glucose et acide glucuronique (détectée par chromatographie sur papier et chromatographie en phase gazeuse après hydrolyse dans H 2 SO 4 à 7 % avec reflux pendant 2 h). 13) Teneur en sucre: 53 % (calculée sous forme de glucose). 2 Procédé de production de la substance physiologiquement active CH-1 dans lequel on extrait des cellules de chlorella appartenant au genre Chlorella avec de l'eau chaude, on pré- cipite de manière fractionnée en ajoutant un solvant organi- que miscible à l'eau à l'extrait, ondialyse une solution aqueuse du précipité, et on soumet le produit de dialyse ainsi obtenu à une chromatographie d'adsorption et à une filtration sur gel pour isoler la substance physiologiquement active CH-1. 3 Procédé selon la revendication 1 o la précipitation frac- tionnée par solvant est provoquée par un alcool inférieur. 4 Procédé selon la revendication 3 o ladite précipitation fractionnée par un alcool inférieur est provoquée par le méthanol. Procédé selon la revendication 4 o ladite précipitation fractionnée avec le méthanol est provoquée par une concentra- tion de méthanol de 40-80 %. 6 Procédé selon la revendication 2 o l'adsorbant pour la chromatographie d'adsorption est la DEAE-cellulose et la CM- cellulose. 7 Procédé selon la revendication 2 o le milieu de filtration sur gel pour la filtration sur gel est le Sephadex G-75 ou le Sephadex G100 8 Procédé selon la revendication 2 o ladite chlorella est Chlorella pyrenoidosa.