Brevet FR2515824A1 — publié le 19830506

L'invention concerne un procédé pour enregistrer des spectres bidimensionnels de résonance magnétique nucléaire (RMN), selon lequel on excite le système de spins nucléairesà étudier par trois impulsions successives de 90 espacées dans le temps et on soumet l'interférogramme obtenu après la troisième impulsion de 90 à une analyse de Fourier, selon lequel on effec- tue un grand nombre de telles-mesures avec des intervalles (temps de développement t) différents entre la première et la seconde impulsion de 90 , on mémorise les différentes valeurs d'amplitude ainsi obtenues des raies de résonance fournies par l'analyse de Fourier comme valeurs instantanées d'un nouvel interférogramme, que l'on soumet à une nouvelle analyse de Fourier et selon lequel, enfin, à chaque répétition de la mesure avec un autre temps de développement tl, on varie simultanément l'intervalle dans le temps (temps de mélange t m) entre la seconde et la troisième impul- sion de petites quantités qui recouvrent des régions définies par la période des glissements de fréquence résultant de couplages scalaires ou cohérents. La spectrométrie RMN bidimensionnelle est décrite dans un article de J Jeener, B R Meier, P Bachmann et R R Ernst dans J Chem Phys J 1, 4 546 ( 1979) Elle permet d'observer des processus d'échange dans une molécule, qui ont pour conséquence que la fréquence de résonance d'un spin nucléaire change L'analyse de Fourier du premier interférogramme renseigne sur la fréquence de résonance après l'échange, tandis que l'analyse de Fourier de l'interférogramme obtenu par variation du temps de développement renseigne sur la fréquence de résonance originale du même moment de spin excité Ainsi peuvent être obtenues des valeurs de réseau complètes concernant la transmission non cohérente de magnétisations par voie d'échange chimique et d'une relaxation croisée dip 8 le- dipôle Une application particulièrement importante est la déter- mination de la conformation de macromolécules biologiques Pour déterminer les constantes de vitesse qui gouvernent l'échange de magnétisation, il faut effectuer des examens avec différents inter- valles temporels (temps de mélange tm) entre la seconde et la troisième impulsion de 90 ', y compris avec des temps de mélange t très courts Dans ces conditions, des raies dites "raies croisées J" peuvent apparaître dans le spectre 2 D, qui résultent d'une transmis- sion cohérente de la magnétisation (S Macura, Y Huang, D Suter et RR Ernst, J Magn Resonance 43, 259 ( 1981)) L'analyse précise du spectre demande l'élimination des raies croisées J provenant d'un échange cohérent La méthode connue pour cette élimination consiste en l'établissement statistique d'une moyenne par change- ment aléatoire du temps de mélange t Cela entratne toutefois m une perte d'information par étalement de l'intensité de raies croisées J en direction de l'axe des fréquences et par production d'ondes basses ou de rides qui peuvent cacher des raies d'échange de plus faible intensité. L'invention vise à indiquer une méthode qui permette d'éliminer les raies croisées J sans perte d'information. Selon l'invention, on peut obtenir ce résultat lorsque, partant d'une valeur initiale t 0, on change le temps de mélange t proportionnellement au temps de développement t 1 (tm = t O + A Xt 1), de manière que, pour N mesures prévues, la variation du temps de mélange t tmf, qui est petite par rapport à tm O o soit à peu près égale à la période de glissements de fréquence résultant de couplages scalaires ou cohérents, et on soumet le spectre 2 D ainsi obtenu à une triangulation ou équilibrage symétrique éliminant toutes les raies non symétriques par rapport à la diago- nale principale. Le changement du temps de mélange t est si faible, dans le procédé de l'invention, qu'il ne modifie pratiquement pas l'amplitude fonction du temps de mélange des différentes raies, dont la variation renseigne sur le déroulement dans le temps des processus d'échange non cohérents En revanche, les processus d'échange périodiques relativement rapides résultant d'un couplage cohérent ou scalaire sont décalés unilatéralement par rapport à la diagonale, de sorte qu'ils ne paraissent plus dans le spectre après l'équilibrage symétrique. Un effet analogue se produit lorsqu'on applique une impulsion de 1800 entre la seconde et la troisième impulsion de 900 et, à chaque répétition de la mesure avec un autre temps de dévelop- pement tl, également selon l'invention, on change simultanément l'intervalle temporel t entre l'impulsion de 1800 et la seconde impulsion de 90 , partant d'une valeur initiale t 0, proportionnel- lement au temps de développement t 1 (tp = t PO + Xt 1), de manière que, pour N mesures prévues, la variation du temps de position t tpo, qui est petite par rapport à t, soit de l'ordre de pn p O grandeur de la période de glissements de fréquence résultant de couplages scalaires ou cohérents, et on soumet le spectre 2 D ainsi obtenu à une triangulation ou équilibrage symétrique éliminant toutes les raies non symétriques par rapport à la diagonale principale. Les deux formes de mise en oeuvre du procédé de l'invention éliminent donc du spectre RMN bidimensionnel les doublets attribuables à un couplage scalaire ou cohérent, si bien que des processus d'échange non cohérents et en particulier l'effet de Overhauser, désigné par NOE (pour "Nuclear Overhauser Effect"), peuvent être observés sans perturbations La triangu- lation ou l'équilibrage symétrique nécessaire pour y parvenir est décrit par R Baumann, Anil Kumar, R R Ernst et K W Uthrich daqs J Magn Resonance 4 _ 4, 76 ( 1981) respectivement par R Baumann, G Wider, R R Ernst et K Wilthrich dans J Magn Resonance g 44 402 ( 1981). Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre au moyen de tous les spectromètres RMN possédant un générateur capable de produire trois ou quatre impulsions radiofréquence successives dont l'intervalle dans le temps est réglable L'inven- tion a cependant aussi pour objet une réalisation particulièrement avantageuse pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention d'un tel spectromètre RMN> qui consiste en ce que le spectromètre est conçu pour l'ajustement d'un intervalle t respectivement tp entre la seconde et la troisième impulsion, qui change proportion- nellement à l'intervalle t 1 entre la première et la seconde impulsion, par sélection d'un premier intervalle temporel tl, d'une valeur initiale t M respectivement t PO de l'intervalle entre la seconde et la troisième impulsion et d'un facteur-de proportionnalité X, de telle manière que t = t M + Xt respectivement t = t O + Xtl. L'invention sera décrite et explicitée plus en détail en référence aux diagrammes des dessins annexés; dont les différentes figures montrent: figure 1 le diagranme en fonction du temps de la suite d'impulsions dans la première variante de mise en oeuvre du procédé selon l'invention; figure 2 le diagramme en fonction du temps des signaux obtenus par excitation d'un système de spins avec une cohérence quantique zéro et une cohérence quantique double; figure 3 un spectre d'échange bidimensionnel d'un mélange 1:1 de 1,1,2-trichloréthane et NN-diméthylacétamide à 297 K et une variation du temps d'échange t de 100 à 132 ms m selon l'invention; figure 4 le même spectre que sur figure 3 mais après équilibrage symétrique; figure 5 une coupe du spectre de figure 3; figure 6 une coupe du spectre de figure 4; figure 7 un spectre NCESY de l'inhibiteur basique pancréatique de trypsine (BPTI) avec utilisation d'un temps de mélange fixe t = 30 ms selon l'état de la technique; figure 8 un spectre du même BPTI en cas de varia- tion du temps de mélange de 30 ms à 37,8 ms selon l'invention; figure 9 des représentations bi et tridimension- nelles du médaillon A du spectre de figure 7; figure 10 des représentations bi et tridimension- nelles du médaillon A' correspondant du spectre de figure 8; et figure Il le diagramme en fonction du temps de la suite d'impulsions dans la deuxième variante de mise en oeuvre du procédé de l'invention. Les figures 1 et 2 illustrent les processus fondamen- taux de la spectroscopie d'échange 2 D Comme le montre figure 1 -on applique d'abord une impulsion de 900 pour produire une magnéti- sation transversale Le temps de développement t 1 sert à imprimer aux différentes composantes de magnétisation une "étiquette de fréquence" sous forme de leurs fréquences de précession de Larmor. On sait que, dans la spectroscopie 2 D, on augmente le temps de développement t 1 d'une mesure à l'autre jusqu'à la fin de l'expé- rience spectroscopique complète A la fin du temps de développement t, une seconde impulsion de 90 fait pivoter la composante x de la magnétisation dans le sens de l'axe z et le processus d'échange lent à étudier peut avoir lieu pendant le temps de mélange t qui suit Une troisième impulsion de 90 ' produit de nouveau une magnétisation transversale Le résultat du processus d'échange est constaté ensuitepar les fréquences de précession des compo- santes de la magnétisation, pendant le temps de détection t 2. Une transformation bidimensionnelle de Fourier du signal s(tl, t 2) obtenu conduit enfin au spectre d'échange 2 D ou spectre Nî désiré Les intensités a AB et a BA des raies croisées d'échange pour un système à deux noyaux échangeurs croissent avec le taux d'échange de magnétisation RC jusqu'à un équilibre, si le temps de mélange augmente, pendant que le taux de fuite RL réduit en même temps l'intensité des raies croisées Selon S 4 acura et R.R Ernst dans Mol Phys 41, 95 ( 1980), ces processus peuvent. être décrits par M a AB (tm) = a BA (tm) = ll-exp(-R Ctm)l exp(-RL t) ( 1) Dans cette expression, les composantes de magnétisation transversale qui subsistent après la seconde impulsion de 90 ont été négligées Il est connu aussi que deux impulsions de 9 Q O qui se suivent avec un intervalle temporel t 1 produisent une cohérence quantique zéro, double et multiple (Aue et al dans J Chem Phys. 64, 2 229 ( 1976) Ces composantes de cohérence se développent pendant le temps de mélange tl, comme indiqué schématiquement figure 2. Les troisièmes impulsions de 90 transforment ces composantes partiel- lement en une magnétisation transversale observable Ces voies supplémentaires de transmission sont responsables de l'apparition de raies dites "raies croisées J" dans le spectre d'échange 2 D. Des raies croisées peuvent donc contenir à la fois des fractions d'un transfert de magnétisation incohérent par un processus d'échange quelconque et des fractions d'un transfert cohérent par un réseau de couplage J. Pour simplifier l'interprétation, il est souhaitable de supprimer les raies croisées J dans le spectre d'échange 2 D. Le procédé selon l'invention pour supprimer ces raies est basé sur la dépendance caractéristique des processus de transfert cohérents et incohérents de la durée du temps de mélange Alors que l'échange incohérent selon l'équation ( 1) est un processus lent, le transfert cohérent présente une dépendance oscillante du temps de mélange. Conformément à l'invention, on change le temps de mélange t parallèlement au-temps de développement t 1 selon la m relation suivante t =t + Et 1 ( 2) m Mo 1 ' L'augmentation maximale du temps de mélange est choisie suffisamment petite pour éviter une perturbation notable. de l'échange incohérent Le procédé selon l'invention conduit à un décalage de toutes les raies croisées J de leurs positions originales dans la direction W 1 Ce décalage détruit la symétrie propre des motifs de raies croisées J Les raies croisées décalées dans la direction GO 1 ne présentent pas de contreparties dans la position symétrique par rapport à la diagonale principale du spectre 2 D De ce fait, elles peuvent être éliminées par une triangulation ou équilibrage symétrique qui laisse seulement subsister les raies présentes sous forme de couples symétriques. Pour expliciter davantage le procédé selon l'invention, on examine maintenant de plus près une composante de magnétisation appartenant originalement à la transition a et possédant, avant l'échange, la fréquence de précession W a Il est supposé que le processus de mélange amène cette composante de magnétisation en cohérence avec une autre transition b ayant la fréquence W b Le chemin suivi pendant le mélange peut passer par toutes les transitions k possibles ayant les fréquences de précession W k' y compris une cohérence quantique zéro, simple et multiple (figure 2). Ces processus conduisent alors à la composante de magnétisation observable: Mab(tltmt 2) Moa exp {fiwa tl tl/Tqa* Rbk Rka exp -i Cok, t t/T 2 k exp {-io 3 b t 2 t 2/T 2 b}. Dans cette équation, Rka et %bk sont des éléments de matrice de l'opérateur de rotation qui représente l'échange cohérent de la transition a à la transition k et de la transition k à la transition b, échange qui est déclenché par les impulsions radiofréquence La totalisation par k passe par toutes les transitions permises et interdites, y compris les transitions qui se distinguent uniquement par leurs signes. Si l'on augmente le temps de mélange t proportion- m nellement à tl, conmme indiqué dans l'équation ( 2), on obtient: Mb(tl'tmo + t't 2 > = î 2 Nk Rka exp -i(wa + X wk) t 1 t 1 (l/T 2 a + X /T 2 k)} ( 4) exp { > k-to t MO/T 2 k} exp4-iw b t 2 t 2 T La transformation bidimensionnelle de Fourier pour un temps de mélange t fixe conduirait à des raies croisées m distinctes à u u = 3 et wu = w Ub Par contre, en cas d'augmen- a 2 tation de t, on produit un groupe unidimentionnel de raies à i 1 a k et 2 = b présentant une largeur de raie a k 2 b 1/T 2 + 1/T 2 k dans la direction e 1 Il est essentiel d'observer que toutes les voies de transition indésirées à comportement oscillatoire (wk 0) conduisent à des raies croisées décalées et qu'il subsiste exclusivement des raies croisées avec des intensités d'échange aléatoires aux positions o 1 = ui et a 2 = C Ob La grandeur du décalage des raies croisées J peut être fixées par le choix du paramètre Le transfert de magnétisation incohérent n'est pas influencé de façon notable par l'augmentation pas à pas du temps de mélange tant que le paramètre X déterminant l'augmentation pas à pas et la variation totale du temps de mélange t sont m maintenus suffisamment petits. Pour expliciter plus encore l'invention, on donne ci-après les résultats d'expériences obtenus à l'aide du procédé selon l'invention sur deux systèmes, dont l'un est formé de petites et le second de très grandes molécules. Spectres d'échange d'un mélange de 1,1,2-trichloréthane et NN-diméthylacétamide. Le mélange de 1,1,2-trichloréthane (TCE) et N,N-diméthyl- acétamide (DMA) a été choisi pour illustrer la signification des transferts de magnétisation cohérents et incohérents Le spectre. de résonance des protons de TCE consiste en un système de spins AX 2 à couplage J, qui conduit à un transfert cohérent D'un autre c 8 té, l'échange chimique, qui est d O à une rotation entravée dans le DMA, produit un transfert de magnétisation incohérent La figure 3 représente un spectre 2 D enregistré selon l'invention sous forme d'un diagramme de contours des valeurs absolues d'un mélange de fractions égales de TCE et DMA Les six raies du spectre unidimen- sionnel, qui sont caractéristiques pour les déplacements chimiques de TCE, pour le solvant et pour DNA, sont représentées le long de la diagonale principale o 1 = 'J 2 La structure à multiplets des raies de TCE n'est pas reconnaissable en raison de la résolu- tion numérique limitée Les deux raies croisées 1 et 2 entre les deux raies N-méthyle 3 et 4 du DMA illustrent l'échange entre les groupes méthyle dû à une rotation interne Les raies croisées d'échange sont mieux reconnaissables dans la représentation à plus grande échelle du médaillon Les deux raies croisées J à ( = 1 A% " 2 == X) et ( f% X 2 = f A), auxquelles on pourrait s'attendre pour le système de spins AX, du TCE, apparaissent décomposées en leurs composantes quantiques multiples, qui sont réparties lelong des raies J 2 = l A et A 1 J 02 = fl On reconnatt, le long des deux raies, quatre couples X' de raies croisées J, qui sont décalées dans la direction UW de façon symétrique dans le sens positif et dans le sens négatif, des fréquences de précession à quanta multiple, avec le facteur de cadrage y Les quatre couples de raies croisées J appartiennent à deux transitions à un quantum 1 QTA et IQTX, une transition à zéro quantum ZQT et une transition à deux quanta 2 QT Le motif à quanta multiple de la raie croisée J situéeen bas à gauche sur la figure 3 est perturbé par convolution de signal à la fréquence o 1 = O Les deux raies diagonales de TCA, liées entre elles par des couplages J, sont également décomposées en leurs composantes à quanta multiple, comme les raies croisées J Des raies axiales apparaissent le long de l'axe L'2 (w = 0), et ce par suite d'une 2 1 restauration partielle de la magnétisation longitudinale pendant le temps de mélange Des raies situées sur la droite co = o 1 2 ' proviennent d'une magnétisation longitudinale établie pendant le temps de développement Cette magnétisation est tournée dans le plan transversal par la seconde impulsion de 90 et se développe seulement pendant le temps de mélange De ce fait, sa fréquence O> 1 est affectée du facteur Deux groupes de raies situés sur les droites o 1 = ( 1 X)2 et 1 = ( 1 C) 002 appartiennent à une magnétisation transversale tant pendant le temps de dévelop- pement que pendant le temps de mélange Les deux angles de préces- sion obtenus - ltl et 1 J t 1 peuvent être additifs ou soustractifs en raison de l'action de la seconde impulsion de 90 . La figure 4 montre le spectre de la figure 3 après un équilibrage symétrique Toutes les raies non symétriques par rapport à la diagonale principale ont été éliminées Il ne reste par conséquent I O que des raies diagonales et des raies croisées d'échange Ceci ressort également clairement des figures 5 et 6, montrant des coupes parallèlement à o 1 pour 4 -)2 = des diagrammes selon 1 2 A les figures 3 et 4 Il est important de constater qu'à la fréquence nf X il n'y a pas de raies dans la section f QA en cas d'application du procédé selon l'invention (et pas davantage, de façon analogue, à la fréquence /l A dans la section Y-X) Ceci est la base pour la suppression complète de raies croisées J par l'équilibrage symétrique Les figures 5 et 6 représentent deux coupes corres- pondantes parallèlement à wo 1 des spectres des figures 3 et 4, à 02 = A, et montrent de façon impressionnante l'efficacité 2 A' de la méthode selon l'invention pour la suppression des raies croisées J. Spectre NOE d'un inhibiteur basique pancréatique de trypsine (BPTI). L'application du procédé de l'invention à l'examen de macromolécules biologiques est illustrée à l'aide des spectres de BPTI, dont les valeurs de couplage J et les valeurs de réseau de relaxation croisée sont bien comprises (voir, par exemple, K Wuthrich et G Wagner dans J Mol Bol 130, 1 ( 1979)) Les figures 7 et 8 représentent un spectre NOE, enregistré avec un temps de mélange fixe dans un cas et avec un temps de mélange augmenté pas à pas selon l'invention dans l'autre cas Les deux spectres ont été "symétrisés" La partie de description qui va suivre est concentrée sur les différences entre les spectres des figures 7 et 8 dans les régions ou médaillons A respective- ment A', qui sont représentés de façon plus détaillée sur les figures 9 et 10. Cinq des raies croisées J appparaissant dans la région A du spectre de la figure 7 sort éliminées par application du procédé selon l'invention, comme le montre clairement le médaillon A' de figure 8 Un examen plus précis des mêmes régions montre cependant que, après l'élimination des raies croisées J, des raies croisées NOE qui coïncident avec elles deviennent visibles La possibilité de séparer des raies croisées J et NCE 2 5 1 5 8 2 4 coïncidentes est très importante pour l'interprétation quantita- tive des données de NCE de protéines parce que, dans les spectres enregistrés avec des temps de mélange très courts, des raies croisées NE appartenant à des protons du même reste d'amino- acide peuvent être recouvertes par des raies croisées J qui coïncident avec elles Par exemple, la raie croisée entre C H et NH du reste F 33 (figure 9) est une raie croisée J typique qui recouvre la raie croisée NOE coïncidant avec elle Or, comme la raie croisée J a été éliminée par application du procédé selon l'invention, la raie croisée NOE devientvisible et mesu- rable quantitativement (figure 10) D'un autre côté, des raies croisées NOE pures, comme celle entre C a I de T 32 et LE de F 33, ne sont pas touchées par l'augmentation pas à pas de t Un comportement identique a été observé pour les liaisons de toutes les cinq résonances de proton amide désignées sur les figures 9 et 10, à savoir pour les groupes NH de F 45, F 22, F 33, Y 21 et Q 31 Chacun de ces protons amides donne lieu à deux raies croisées dans la région spectrale représentée sur les figures 9 et 10 Dans chaque cas, la raie croisée NOE pure avec le proton a du reste précédent dans la séquence d'aminoacidesprésente essen- tiellement la même intensité dans les spectres des figures 9 et 10. Par contre, par suite de l'augmentation du temps de mélange, l'intensité de la raie croisée avec le proton a voisin du même reste a été réduite sur la figure 10, de sorte que l'intensité résiduelle peut être attribuée totalement à l'échange NOE incohérent. Les spectres représentés dans les dessins annexés ont été enregistrés au moyen d'un spectromètre RMN du type CXP 300 de la firme Bruker-Analytik Gmil Ce spectromètre permet de produire des suites d'impulsions de 90 dont les intervalles entre les impulsions peuvent être réglés respectivement programmés indépendamment les uns des autres Un tel spectromètre peut être agencé spécialement pour la mise en oeuvre du procédé selon l'inven- tion, de manière que, à la place de l'introduction des couples de temps t 1, t comme variables, il suffit d'introduire les temps t 1, tandis que le temps de mélange initial t o et le facteur de propor- tionnalité X peuvent être ajustés respectivement introduits de façon fixe dans le cas d'un déroulement programmé du processus de mesure, de sorte que le spectromètre fixe lui-même le second intervalle entre impulsions t = t + Xt Il ressort de ce qui précède que le mot "ajusté" couvre également l'introduction d'un ordre correspondant dans le dispositif de commande d'un tel spectromètre. Au lieu de changer l'intervalle temporel entre la seconde et la troisième impulsion de 90 (le temps de mélange t) proportionnellement au temps de développement t 1 à chaque répé- tition de l'expérience, comme décrite dans ce qui précède, il est possible aussi, avec le même résultat, de produire une impul- sion supplémentaire de 1800 à l'intérieur de la période de mélange, dont la position t est incrémentée proportionnellement au temps de développement t 1 (t = t O + Xt 3) comme représenté sur la figure 11 Le temps de mélange t total doit dans ce cas être maintenu constant La position de l'impulsion de 1800 influence exclusivement la précession de la magnétisation conduisant aux raies croisées J, tandis que l'échange de magnétisation incohérent, dont la mesure est le but de l'expérience, n'est pas influencé. L'impulsion décalée dans le temps de 1800 produit le même effet de décalage sur les raies croisées J que l'incrémentqtion du temps de mélange t, de sorte que les raies croisées J sont de nouveau éliminées par la triangulation ou l'équilibrage symétrique. Par contre, l'impulsion de 180 n'influence aucunement l'échange incohérent, si bien que cette variante du procédé selon l'invention est préférable pour obtenir la précision maximale dans des situations critiques. 15824 R E V E N D I C A T I O N S ____________________, ______ 1 Procédé pour enregistrer des spectres bidimensionnels de résonance magnétique nucléaire (RMN), selon lequel on excite le système de spins nucléairesà étudier par trois impulsions successives de 90 espacées dans le temps et on soumet l'inter- férogramme obtenu après la troisième impulsion de 90 à une analyse de Fourier, selon lequel on effectue un grand nombre de telles mesures avec des intervalles (temps de développement t 1) différents entre la première et la seconde impulsion de 90 , on mémorise les différentes valeurs d'amplitude ainsi obtenues des raies de résonance fournies par l'analyse de Fourier comme valeurs instantanées d'un nouvel interférogramme, que l'on soumet à une nouvelle analyse de Fourier et selon lequel, enfin, à chaque répé- tition de la mesure avec un autre temps de développement (t 1), on varie simultanément l'intervalle dans le temps (temps de mélange t) entre la seconde et la troisième impulsion de petites quantités qui recouvrent des régions définies par la période des glissements de fréquence résultant de couplages scalaires ou cohérents, carac- térisé en ce que, partant d'une valeur initiale (t 0), on change le temps de mélange (t) proportionnellement au temps de dévelop- pement (t 1) (t = t O = It), de manière que, pour N mesures prévues, la variation du temps de mélange (tmn t 0), qui est petite par rapport à t O O soit à peu près égale à la période de glissements de fréquence résultant de couplages scalaires ou cohérents, et on soumet le spectre 2 D ainsi obtenu à une triangu- lation ou équilibrage symétrique éliminant toutes les raies non symétriques par rapport à la diagonale principale. 2 Procédé pour enregistrer des spectres bidimensionnels de résonance magnétique nucléaire (RMN), selon lequel on excite le système de spins nucléaire à étudier par trois impulsions successives de 90 espacées dans le temps et on soumet l'interfé- rogramme obtenu après la troisième impulsion de 90 à une analyse de Fourier, selon lequel on effectue un grand nombre de telles mesures avec des intervalles (temps de développement t 1) différents entre la première et la seconde impulsion de 900 e on mémorise les différentes valeurs d'amplitude ainsi obtenues des raies de résonance fournies par l'analyse de Fourier comme valeurs instantanées d'un nouvel interférogramme, que l'on soumet à une nouvelle analyse de Fourier et selon lequel, enfin, on produit une impulsion de 1800 entre la seconde et la troisième impulsion de 90 et, à chaque répétition de la mesure avec un autre temps de développement (t), on varie simultanément l'intervalle (t) entre la seconde impulsion de 90 ' et l'impulsion de 1800 de petites quantités qui recouvrent des régions définies par la période des glissements de fréquence résultant de couplages scalaires ou cohérents, caractérisé en ce que l'on change simultanément l'intervalle (t) entre la seconde impulsion de 90 et l'impulsion de 1800, partant d'une valeur initiale (t), proportionnellement au temps de développement (t) (t = t O = X t 1), de manière que, pour N mesures prévues, la variation du temps de position (t N t), qui est petite par rapport à t, soit de l'ordre de grandeur de la période de glissements de fréquence résultant des couplages scalaires ou cohérents, et on soumet le spectre 2 D ainsi obtenu à une triangu- lation ou équilibrage symétrique éliminant toutes les raies non symétriques par rapport à la diagonale principale. 3 Spectromètre de résonance magnétique nucléaire pour. la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1 ou 2, possé- dant un générateur capable de produire trois ou quatre impulsions radiofréquence successives dont l'intervalle dans le temps est réglable, caractérisé en ce qu'il est conçu pour l'ajustement d'un intervalle t respectivement t, entre la seconde et la troisième m p impulsion, qui change proportionnellement à l'intervalle t entre la première et la seconde impulsion, par sélection d'un premier intervalle temporel tl, d'une valeur intiale t O respectivement t de l'intervalle entre la seconde et la troisième impulsion et d'un facteur de proportionnalité X, de telle manière que tm = t M O + > t respectivement t = t PO + tl.