Brevet FR2520614A1 — publié le 19830805

La présente invention concerne un procédé et une composition utilisant de la e-l,3-glucanase pour le nettoyage des dentiers. Depuis que L R Cahn a suggéré en 1936 une corrélation entre une stomatite due à l'application d'un dentier et Candida albicans qui est un des micro-organismes pathogènes présents dans la bouche (Ann Dent, 3, p 33, 1936), on a étudié la formation de tache ou de coloration qu'on appelle "plaque de dentier" non seulement comme un problème relatif à l'aspect d'un dentier, mais également comme un problème d'hygiène buccale Après des études poussées, on a récemment découvert que les micro-organismes et les substances qu'ils produisent sont une des causes principales de la coloration des dentiers En utilisant un microscope électronique à balayage, Akira Irahara a étudié la formation au cours du temps de la plaque sur la surface d'une base de dentier en contact avec une muqueuse de la bouche et a constaté que les micro-organismes principaux adhérant à la surface de contact de la base de dentier étaient Candida Berkhout, entre autres, Candida albicans (Hokkaido Shika Ishi Gakkai Shi, 3, p 56, 1975). Récemment, la stomatite provoquée par l'adhérence de Canida albicans à un dentier est devenue un problème important dans l'ensemble du monde, en particulier au Royaume-Uni de Grande-Bretagne et dans les pays d'Europe septentrionale (voir E Budtz-Jergensen et H Lde, Scand J Dent Res, 80, p 457, 1972; et I Olsen, Acta Odont. Scand, 33, p 41, 1975) Par conséquent, beaucoup de chercheurs se sont efforcés de mettre au point un agent de nettoyage efficace des dentiers, permettant en particulier d'éliminer Candida albicans de la surface des dentiers. Les agents de nettoyage des dentiers que l'on a employés à ce jour tels que les peroxydes alcalins, les hypochlorites alcalins, les acides et les germicides ont divers inconvénients et ne sont pas satisfaisants Les peroxydes alcalins qui sont parmi les plus répandustels que le Polident (Block Drug Co Inc, Jersey City, N.J, Etats-Unis d'Amérique), l'Efferdent (Warner-Lambert Co, Morris Plains, N J, Etats-Unis d'Amérique), le Steradent (Reckitt et Colman Ltd, Etats-Unis d'Amérique) et le Kleenite (Vick Chemical Co., Wilton, Connecticut, Etats-Unis d'Amérique) n'ont qu'un effet détersif faible. Bien que les hypochlorites alcalins tels que le Mersene (Colgat ePalmolive Ltd, Dist New York, N Y, Etats-Unis d'Amérique) soient généralement supérieurs aux peroxydes alcalins par leur effet détersif, ils ont des inconvénients graves en ce que non seulement ils érodent les métaux contenus dans un dentier, mais également blan- chissent et détériorent la résine constituant le dentier Les acides que l'on peut utiliser comme agents détersifs pour un dentier tels que l'acide chlorhydrique et l'acide phosphorique érodent également les métaux et détériorent les résines comme le font les hypochlorites alcalins Les germicides peuvent tuer les micro-organismes adhérant à un dentier mais ne sont pas capables de les éliminer du dentier. La demanderesse a découvert que l'on peut utiliser de façon efficace la el,3-glucanase comme agent de nettoyage pour un dentier car il a une forte action d'élimination de Candida albicans de la surface du dentier auquel ce micro-organisme adhère. L'invention concerne donc l'emploi de P-1,3-glucanase comme agent de nettoyage d'un dentier. La 9-1,3-glucanase,qu'on appelle également -1 l,3-glucane- hydrolase, g-l,3 ( 4)-glucane-glucanohydrolase ou laminaranase, est une hydrolase dérivant de divers micro-organismes 'et commercialisée par exemple sous les noms de marque suivants: Zymolyase 5 000 et Zymomse 60 =X dérivart toutes de O Ed'Arthrobacter luteus (Kirin Brewery Co, Ltd, Japon); YL-5 dérivant d'Achromobacter iunatus (Amano Seiyaku Co., Ltd, Japon); Celefro dérivant de Bacillus subtilis (Novo Industri A/S, Danemark); Finizym dérivant d'Aspergillus niger (Novo Industri A/S, Danemark); Novozym 234 dérivant de Trichoderma harzianum (Novo Industri A/S, Danemark) et Kitalase dérivant de Rhizoctonia solani (Kumiai Chemical Industry Co, Ltd, Japon). En plus de celles ci-dessus, la P-l,3-glucanase appelée EC 32 1 6 ou ÉC 3 2 1 39 (voir Enzyme Nomenclature; Elsevier Publishing Co 1965; Science 150:719, 1965) peut également etre employée dans l'invention, ainsi que l'enzyme dérivant de Physarum polycephalum (voir le brevet japonais publié n 2310/1979). La liste des enzymes ci-dessus n'est qu'illustrative et non limitative. -250614 Comme précédemment indiqué et comme décrit en détail ci-dessous, la P-l,3glucanase peut éliminer Candida albicans d'un dentier L'élimination des micro-organismes d'un dentier était précé- demment impossible à obtenir avec l'un quelconque des agents de nettoyage de l'art antérieur précités. En plus de l'effet remarquable qui vient d'être indiqué, la 9-l,3-glucanase a une action fongicide et empêche la formation d'une stomatite due à l'application du dentier. De plus, la P-l,3-glucanase n'a pas d'effet nuisible sur un dentier Donc, l'homme de l'art reconnaîtra facilement que la P-l,3-glucanase est un agent de nettoyage particulièrement approprié des dentiers. L'enzyme P-1,3-glucanase est de préférence combinée avec un ou plusieurs supports appropriés pour former une préparation solide telle que des comprimés, des pilules, des granules, des particules fines, une poudre, des capsules dures, etc L'enzyme peut également etre présentée sous d'autres formes telles que des capsules molles, des microcapsules, des granules enrobés, des comprimés enrobés et même des préparations liquides prêtes à l'emploi tant que l'enzyme peut y être stabilisée. L'invention fournit également une composition de nettoyage pour dentier qui comprend de la P-l,3 glucanase comme composant essentiel avec un ou plusieurs supports appropriés. Les supports appropriés à la formation des préparations ci-dessus tels que des excipients et des adjuvants peuvent etre choisis selon le type de la préparation particulière parmi ceux qui sont classiques dans l'art Sans s'y limiter, les supports préférés sont le lactose, l'amidon, l'amidon de mais, le stéarate de magnésium, le phosphate dicalcique, le sorbitol, le mannitol, la carboxyméthyl- cellulose, l'acide tartrique, l'acide citrique, le carbonate de sodium, le perborate de sodium, le bisulfate de sodium, l'hexaméta- phosphate de sodium, l'hydroxypropylcellulose, la gomme-laque, le saccharose, la méthylcellulose, l'éthylcellulose, l'hydroxypropyl- méthylcellulose, une hydroxypropylcellulose faiblement substituée (LHPC), le phtalate de diéthyle, le phtalate de dibutyle, le talc, le sulfate de calcium, le carbonate de calcium précipité, la gélatine, la gomme arabique, la carboxyméthylcellulose, la polyvinyl- pyrrolidone, l'alginate de sodium, le chlorure de sodium, le bicar- bonate de sodium, le stéarate de calcium, etc. Ces préparations, à l'exception des préparations liquides, sont dissoutes dans un milieu liquide approprié tel que de l'eau juste avant l'emploi. En plus des supports indiqués ci-dessus, on peut ajouter un agent tampon à la composition de nettoyage de l'invention de façon que la composition, lorsqu'elle est dissoute dans un milieu appro- prié tel que l'eau, puisse présenter un p H compris entre 5 et 8 qui est optimal pour la P-1,3-glucanase. Si on le désire, on peut ajouter à la composition un ou plusieurs autres agents tels que des conservateurs, des colorants et des parfums. On sait que des enzymes telles qu'une protéase (par exemple la papa Ine et la trypsine), une cellulase, une lipase et une mutanase possèdent une capacité> très faible, d'éliminer Candida albicans des résines auxquelles il adhère D'autre part, la deman- deresse a découvert que la chymotrypsine, l'Alcalase (Novo Industri A/S, Danemark) et la Pronase (Kaken Seiyaku Co, Ltd, Japon) ont également une faible action d'élimination de Candida albicans, de même que les enzymes qui viennent d' être citées. On ne peut pas utiliser l'une quelconque de ces enzymes isolément comme agent de nettoyage d'un dentier par suite de leur faible activité Cependant, on peut incorporer une ou plusieurs de ces enzymes à la composition de nettoyage de l'invention pour accroltre l'effet détersif de la 9-1,3-glucanase. On préfère que la quantité de P-1,3-glucanase contenue dans la composition de l'invention soit ajustée afin que la concen- tration de l'enzyme puisse être de 0,3 unité/ml ou plus lorsque la composition est dissoute dans une quantité prédéterminée d'eau. Dans la description ci-dessus, une unité de l'enzyme est par définition la quantité d'enzyme dans 1 ml d'eau nécessaire pour réduire la densité optique (à 880 nm) d'un mélange que l'on a obtenu par réaction de la 5-1,3-glucanase avec une suspension de levure de bière à 250 C pendant 2 heures, à une valeur inférieure de 307 à la densité optique initiale du mélange Par exemple, 0,3 unité de Zymolyase 5 000 correspond à 0,06 mg/ml de l'enzyme. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation et en se référant aux dessins annexés sur lesquels: 6 la figure 1 est une microphotographie prise au microscope électronique de la surface d'un dentier que l'on a porté pendant longtemps; et la figure 2 est une microphotographie semblable du dentier traité avec la 9-1,3-glucanase. Expérience 1 On évalue l'effet d'élimination de Candida albicans d'enzymes constituées de P-1,3-glucanase d'origines diverses et d'agents connus de nettoyage des dentiers A cet effet, on prépare des plaques de résine synthétique ( 1 cm x 1 cm) par polymérisation à chaud de polyméthacrylate de méthyle (nom commercial: Acron, G-C Dental Industrial Corp, Japon) Après rinçage avec de l'eau distillée, on place les plaques dans une botte de Petri On verse sur les plaques 6 ml d'une suspension de Candida albicans fourni par le Service de Bactériologie Buccale, Ecole Dentaire, Université d'Hiroshima, Japon, et on incube à 370 C pendant 1 heure On rince avec une solution phy- siologique les plaques obtenues auxquelles les micro-organismes adhèrent et on les place dans une nouvelle botte de Petri. On verse sur les plaques 6 ml d'un échantillon d'essai contenant une quantité déterminée de chacun des agents de nettoyage indiqués dans le tableau I et on laisse séjourner à 370 C pendant minutes Après rinçage avec de l'eau distillée, on traite les plaques avec de l'alcool méthylique à 99 % pendant 10 minutes de façon à fixer les organismes qui y sont éventuellement présents, on colore selon la méthode de Gram et on observe au microscope pour compter les organismes demeurant sur les plaques. On effectue un essai témoin de la meme façon que ci-dessus en utilisant de l'eau distillée au lieu de l'échantillon. Pour chaque échantillon, on calcule le pourcentage du nombre des microorganismes observés par rapport à celui du témoin, les valeurs figurant dans le tableau I Plus le pourcentage est faible, plus l'activité d'élimination des micro-organismes de la résine est élevée. Conc Agent de nettoyage Témoin Polidernt Duo Papaïne Chymotrypsin e Trypsine Pronase Alcalase'1 5 E a-Amy las e Dextrase Enido-N-acétylimulamydase Pancréatine a-1,3-glucanase fournie sous le nom de Zymolyase 60000 Zymolyase 60000 Zymolyase 5000 YL-5 Celefro Fînizvmu Novozvm 234 Ritalas'e EC 3 2 1 6 EC 3 2 1 39 3.-1,3-glucanase dérivée de Phvsarumn polycephalumf Granules de l'exemple 16 Particules fines de l'exemple 9 TABLEAU 1 entration (p/y) 2. 0, 005 0 005 0 005 0,005 0, 005 0, 005 0, 005 0,y 005 0,005 Nombre de micro- organismes ( 7. -90 -50 0,)005 0; 006 O; 005 0, 005 0, 005 ci 005 0 J O O;,005 1,5 1,5 O O o o O o o -20614 Le tableau I montre nettement que la P- 113-glucanase permet d'éliminer complètement Candida albicans de la résine,m Pme à une faible concentration de 0,3 unité/ml. Expérience 2 On évalue l'activité de bactériolyse de la 3-l,3-glucanase comme décrit ci-dessous. On ajoute de la Zymolyase 60 000 à 2 ml d'une suspension de Candida albicans IFO 1385 de façon à obtenir une concentration finale de l'enzyme de 0,2 mg/ml et on incube le mélange à 37 C On mesure la densité optique à 660 nm (D 0660 nm) du mélange à des intervalles de 10 minutes après l'addition de l'enzyme et on compare les valeurs observées de la D 0660 N la valeur initiale. Le tableau II montre les résultats des mesures exprimés par les pourcentages des valeurs respectives des D 0660 n O par rapport 660 nm à la valeur initiale De façon évidente, la diminution du pourcentage indique un accroissement de la bactériolyse due à la P-1,3-glucanase. TABLEAU II Temps (minutes) DO 660 nm) ______________ D 660 nm (% 0 100 10 19 5 5 5 5 60 5 5 5 5 Le tableau II montre que Candida albicans est lysé rapidement par la P-1,3-glucanase. Expérience 3 On observe au miscroscope électronique l'élimination des micro-organismes d'un dentier sous l'action de la 5-1,3-glucanase. On découpe deux morceaux de plaques (environ 5-8 mm) dans une portion colorée d'un dentier que l'on a utilisé pendant une période prolongée On rince les plaques à fond avec une solution physiologique On plonge une des plaques et on la maintient à 370 C pendant 1 heure dans 20 ml de tampon phosphate (p H 7,0) contenant 0,6-mg/ml de Zymolyase 5 000 On traite l'autre plaque comme ci-dessus, si ce n'est qu'on emploie le meme tampon ne contenant pas d'enzyme. On rince ensuite les deux plaques avec une solution physiologique, on fixe avec du glutaraldéhyde, on déshydrate et on sèche On vaporise ensuite sous vide sur les plaques un mélange d'or et de palladium puis on observe avec un microscope électronique à balayage. On observe un grand nombre de colonies de Candida albicans sur la plaque témoin, tandis qu'on n'observe pas de colonie sur la plaque traitée avec la Zymolyase 5 000 Les figures 1 et 2 représentent respectivement des microphotographies électroniques ( 1 x 1 200) de la plaque témoin et de la plaque traitée avec l'enzyme. Les exemples suivants illustrent des modes de réalisation spécifiquesdes compositions de nettoyage pour dentier de l'invention. Exemple 1 Poudre On mélange uniformément les composants suivants et on place 0,1 à 1 g du mélange obtenu dans un sachet de papier approprié pour former une dose unitaire. Composants Quantités (parties en poids) Zymolyase 60 000 1 KH 2 P 4 41 Na 2 HPO 412 H 20 161 Lactose G 97 Total 300 On dissout une dose unitaire de la poudre dans 60-100 ml d'eau et on utilise la solution comme solution de nettoyage d'un dentier. Exemple 2 Poudre On mélange uniformément les composants suivants et on place le mélange dans un sachet de papier approprié et on l'utilise comme décrit dans l'exemple 1. Composants Zymolyase 5 000 Alcalase 1 5 E KH 2 P 04 2 42 Na 2 HPO 4, 12 H 20 Lactose G Quantités (parties en poids) Total 300 Exemple 3 Poudre On mélange uniformément les composants suivants et on place le mélange dans un sachet de papier approprié et on l'utilise comme décrit dans l'exemple 1. Composants Kitalase KH 2 PO 4 Na 2 HPO 412 H 20 2 P 4 > 2 Lactose G Total Quantités (parties en poids) Exemple 4 Poudre On mélange uniformément les composants suivants, on place le mélange dans un sachet de papier approprié et on l'utilise comme décrit dans l'exemple 1. Composants Celefro KH 2 P 04 Na 2 HPO 4 12 H 20 Lactose G Total Quantités (parties en poids) - Exemple 5 Poudre On mélange uniformément les composants suivants, on place Je mélange dans un sachet de papier approprié et on l'utilise comme décrit dans l'exemple 1. Composants p-l,3-Glucanase dérivée de Physarum polycephalum * K 12 PO 4 Na 2 l PO 412 H 20 Lactose G Lactose G Total Quantités (parties en poids) * L'enzyme est obtenue selon le procédé décrit dans le brevet japonais publié n 2310/1979. Exemple 6 Poudre On mélange uniformément les composants suivants, on place le mélange dans un sachet de papier approprié et on l'utilise comme décrit dans l'exemple 1. Composants (par Finizym I Mutanase 2 Po 4 Na 2 HP 04 à 12 H 20 Lactose G Total Exemple 7 Poudre On mélange uniformément les composants le mélange dans un sachet de papier approprié et on comme décrit dans l'exemple 1. Composants Zymolyase 5 000 Kitalase KH 2 P 04 Quantités rties en poids) suivants, on place l'utilise Quantités (parties en poids) 1 l Na 2 HP 04 12 H 20 64 Lauroylsarcosinate de sodium 10 Sulfite de sodium 10 Lactose G 200 Total 300 Exemple 8 Granules et particules fines Composants Quantités Composants t(partiesenpoids) Zymolyase 5 000 10 Trypsine 30 Lactose G 150 KH 2 P 04 16 Na 2 HPO 4,12 H 20 64 Cellulose cristalline 30 Total 300 On mélange uniformément les composants ci-dessus et on façonne le mélange par compression avec une machine appropriée telle qu'un compresseur à cylindres pour former une masse en forme de plaque On fragmente la masse avec un broyeur, on granule avec un granulateur oscillant et on trie avec un appareil approprié tel qu'une machine à tamiser giratoire. On peut obtenir des particules fines en modifiant les conditions de l'opération de granulation indiquée ci-dessus. On dissout les granules ou les particules fines ( 0,1-1,5 g) obtenus dans 60 à 100 ml d'eau et on utilise la solution comme solution de nettoyage pour dentier. Exemple 9 Granules et particules fines En utilisant les composants suivants, on obtient des granules ou des particules fines de la même façon que décrit dans l'exemple 8 On dissout 2 ou 3 g des granules ou des particules dans à 150 ml d'eau avant l'emploi. Composants Quantités (parties en poids) Zymolyase 5 000 1 Finizym 9 Chymotrypsine 30 2 PO 4 N 2 HO 4 > 12 H 20 Lauroylsarcosinate de sodium Sulfite de sodium Cellulose cristalline Lactose G Total Exemple 10 Granules Composants Zymolyase 5 000 Chymotryps ine Lactose G KH 2 PO 4 Na 2 HO 4,12 H 20 Cellulose cristalline Quantités (parties en poids) Carboxyméthylcellulose sodique 15 Total 300 On soumet les composants cidessus & un mélange et à un broyage avec addition d'eau, on granule avec un granulateur appro- pri 4, on sache et On trie pour obtenir des granules ayant une taille prédéterminée (granulation humide) On peut utiliser les granules obtenus de la façon décrite dans l'exemple 8. Exemple 11 Comprimés Composants Zymolyase 5 000 Alcalase Lactose G Cellulose microcristalline Stéarate de magnésium KH 2 PO 4 Na 2 HPO 4, 12 H 20 Total Quantités (parties en poids) 39,5 0,5 On mélange uniformément les composants ci-desssus et on comprime directement le mélange pour former des comprimés pesant environ 100 à 300 mg On dissout 1 ou 2 comprimés dans 60 à 100 ml d'eau et on utilise la solution obtenue comme agent de nettoyage pour dentier. Exemple 12 Comprimés On utilise les composants suivants pour préparer des comprimés de la même façon que décrit dans l'exemple 11. Composants Quantités (parties en poids) Kitalase 10 Chymotrypsine 20 Pronase 10 Lactose G 39 Talc 0,5 LHPC 10 Stéarate de magnésium 0,5 KH 2 PO 4 52,5 Na 2 HP 04,1220 7,5 Total 150 Exemple 13 Comprimès En utilisant les composants suivants, on prépare des comprimés comme décrit dans l'exemple 11. Composants Zymolyase 5 000 Endo-N-acétylmulamydase Alcalase Lactose G Cellulose microcristalline Stéarate de magnésium K 2 PO 4 Na 2 HPO 4, 12 H 20 Total Quantités (parties en poids) 69,5 0,5 Exemple 14 Comprimés effervescents Composants Quantités (parties en poids) Zymolyase 5 000 5 Pronase 20 Acide citrique anhydre 40 Na HC 03 100 Polyoxyéthylène-éther 10 nonylphénylique Lactose G 125 Total 300 On mélange uniformément les composants ci-dessus et on comprime le mélange pour obtenir des comprimés effervescents pesant chacun 2 & 3 g On doit conserver les comprimés à l'abri de l'humi- dité On dissout un comprimé dans 100 à 150 ml d'eau pour obtenir une solution de nettoyage pour dentier. Exemple 15 Comprimés effervescents En utilisant les composants suivants, on peut obtenir des comprimés effervescents pesant chacun 2 & 3 g selon le procédé décrit dans l'exemple 14. Composants Quantités (parties en poids) Novozym 234 5 Kitalase 5 Alcalase 1 5 E 50 Polyoxyéthylène-é ther 10 nonylphénylique Lauroylsarcosinate de sodium 20 Acide citrique anhydre 40 Na HCO 3 100 Lactose G 70 Total 300 Exemple 16 Granules effervescents Granules A Composants Quantités (parties en poids) Zymolyase 5 000 1 Kitalase 9 Alcalase 1 5 E 50 Na HC 03 100 Polyoxyéthylène-éther laurylique 5 Lauroylsarcosinate de sodium 5 p-Hydroxybenzoate de méthyle 3 p-Hydroxybenzoate de propyle 2 Sulfite de sodium 10 Mannitol 25 Total 210 On mélange uniformément les composants cidessus avec addition d'eau et on soumet le mélange à l'opération de granulation humide décrite dans l'exemple 10 On sèche les granules humides ainsi obtenus et on les trie avec une machine à tamiser giratoire pour obtenir des granules A. Granules B Composants Quantités (parties en poids) Acide citrique anhydre 40 Ethylènediamine-tétraacétate 10 de sodium Mannitol 37 LHPC 3 Total 90 On traite les composants ci-dessus de la façon décrite pour les granules A pour obtenir des granules B. On mélange complètement 21 parties en poids des granules A et 9 parties en poids des granules B dans un mélangeur en V On introduit 2 à 3 g du mélange obtenu dans un sachet en papier appro- prié pour former une dose unitaire On dissout une dose unitaire du mélange dans 60 A 100 mi d'eau. Exemple 17 Comprimés effervescents On mélange complètement dans un mélangeur en V 21 parties en poids des granules A et 9 parties en poids des granules B décrits tous deux dans l'exemple 16 et on comprime le mélange pour former des comprimés effervescents On emploie un comprimé contenant 2 à 3 g du mélange de la meme façon que dans l'exemple 14. Bien entendu, diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. R E V E N D I C A T i O N S 1 Composition pour le nettoyage des dentiers, caractérisée en ce qu'elle comprend de la 3-1,3-glucanase comme composant essentiel avec un ou plusieurs supports appropriés. 2 Composition de nettoyage selon la revendication 1, caractérisée en ce que la -1,3-glucanase est celle fournie sous le nom de EC 3 2 1 6 ou EC 3 2 1 39, ou dérive de l'un quelconque des micro-organismes suivants: Arthrobacter luteus, Achromnobacter iunatus, Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Rhizoctonia solani et Physarum polycephalum. 3 Emploi de la P-1,3-glucanase comme agent de nettoyage d'un dentier. 4 Procédé pour nettoyer un dentier, caractérisé en ce qu'il comprend l'immersion de ce dentier dans une solution aqueuse contenant de la P-1,3-glucanase.