Brevet FR2515356A1 — publié le 19830429

Chr Tmogène pour la déterminatnion colorimétrique de peroxydes et procédé pour la mise en oeuvre de cette déterminatnion. L'invention a pour objet un système de réactifs qui permet la mise en application d'un procédé pour la détermina- tion de peroxydes, également de ceux formés par des réactions enzymatiques et/ou chimiques. Il est connu que de nombreuses réactions utilisent la contribution d'enzymes afin d'obtenir une vitesse de réac- tion plus élevée et, dans un petit nombre de cas, pour obtenir la possibilité d'un contrôle plus étroit Beaucoup de réactions enzymatiques comportent une interaction entre le support et l'oxygène et l'un des produits formés est l'eau oxygénée (pe- roxyde d'hydrogène) dont la quantité est proportionnelle à la quantité des matières de départ. Il y a en outre également une gamme étendue de réac- tions qui sont des réactions purement chimiques et qui se déroulent dans le temps pour donner, comme produitsfinals,des peroxydes, la production de ces derniers étant de nouveau proportionnelle à la quantité de produits introduits dans la réaction,dans les conditions initiales. De plus il est également connu que l'eau oxygénée esten général tous les peroxydes peuvent être utilisés comme support pour réaliser une réaction qui se sert d'enzymes particulières telles que le peroxydase (POD) et le catalase. De telles enzymes catalysent l'oxydation de substan- ces appropriées au dépens du peroxyde qui est réduit (dans le cas particulier de peroxyde d'hydrogène laréduction donne de l'eau); la substance oxydée, produite à son tour sera proportionnelle à la quantitéde peroxyde présente et par conséquent à la quantité de support de départ qui a pris part à la réaction préliminaire pour produire le peroxyde. On a suggéré un certain nombre de réactifs pour la détermination colorimétrique de l'eau oxygénée,selon le imdèle ci-après: Accepteur réduit + H 2 2 (POD) Accepteur oxydé + H 20 incolore coloré Comme accepteur réduit on a utilisé des substances variées telles que par exemple les suivantes: o-dianisidine, t 5356 o-toluidine, o-phénylènediamiine gaac, adrénaline, phénol- phtaléine, ARTS (sel d'ammonium de l'acide 2,2 '-azino-di- ( 3-éthyl-benzothiazoline-6-sulfonique), ferrocyanures et autres. De 1937 à 1943 Eisenstaedt (et autres) ont montré qu'il était possible que la 4-amino-antipirine, donne naissan- ce, en présence de composés aromatiques ou de composés, hété- rocyliques nombreux, à des produits de réaction colorés, par l'action de substances oxydantes telles que par exemple le ferrocyanure. On a également proposé une technique colorimétri- que pour la mesure du glucose dans des fluides biologiques selon le modèle suivant Glucose + H 20 + 02 _____ Acide gluconique + H 202 Glucose oxidase H 202 + 4 -aminoantipirine + phénol quinone (coloré) + (POD) + H 20 De nombreux auteurs ont préparé une série de chro- mogenes qui suggèrent l'utilisation, ensemble avec la 4-amino- antipirine, d'amines aromatiques qui peuvent être substituées sur le(s) atome(s) d'hydrogène (N,N-diméthyl aniline, N,N- diéthylaniline) et également d'amines dont le noyau aromati- que est substitué tel que la N,N-diéthyltoluidine, la N-éthyl- N-éthylacétamide-m toluidine. On a découvert et ceci forme l'objet de l'invention, qu'un certain nombre d'amino acides aromatiques sont capables de se condenser avec la 4aminoantipirine ou avec des composés similaires, en présence de substances oxydantes pour fournir des composés colorés. De tels composés, en remplacement d'amines aromati- ques mentionnées,ci-dessus, fournissent un certain nombre d'avantages, notamment: 1 le produit de condensation coloré qui est obtenu a un coefficient d'extinction molaire supérieur à celui des produits colorés obtenus avec les amines aromatiques corres- pondantes. 2 Les aminoacides aromatiques qui ont été mentionnés sont solides, de façon qu'ils peuvent être inclus dans des mélanges solides, différant ainsi des amines aromatiques correspondantesqui sont liquides. 3 Les aminoacides aromatiques ne sont pas toxiques contrairement aux amines aromatiques correspondantes. La demande de brevet français no 7729833 déposée la 4 Octobre 1977 de la demanderesse, concerne une composition chromogène particulière qui est adaptée de plus à la détermina- tion de peroxydes et qui est composée de la 4-amino-antipirine (ou d'un composé analogue) et d'un constituant qui contient par molécule au moins un noyau du type aromatique avec au moins un groupe -OH de type phénolique. Dans la détermination de l'eau oxygénée qui est libérée par des enzymes dans des fluides biologiques, ladite composition permet l'obtention de résultats satisfaisants. Cependant, dans de nombreux casil est essentiel d'obtenir une sensibilité plus marquée du chromogène pour déterminer l'eau oxygénée qui est libérée de façon enzymatique par des substances et des métabolytes qui sont présents dans les flui- des biologiques en une très petite concentration La possibilité de disposer d'un système chromogène, lequel pour quelques forma- tions citées ici, est d'environ quatre fois plus sensible que ceux utilisant la 4-amino-antipirine et le phénol ou le p hydroxybenzoate rend possible l'utilisation de petits échantillons de fluides biologiques (le dosage de la substance concernée restant suffisamment précis et fiable) avec l'avantage supplémentaire de réduire dans le mélange réactionnel la concentration de substances susceptibles de gêner et quipeuvent être simultanément présentes dans l'échantillon à doser. Ainsi, le premier objet de l'invention est de four- nir une nouvelle composition chromogène qui est adaptée à la détermination de peroxydes et plus particulièrement adaptée à la détermination du peroxyde d'hydrogène (eau oxygénée) qui est libéré par voie enzymatique de supports contenus dans les fluides bilogiques, ladite composition étant constituée d'un composé contenant au moins un groupe réactif lié à une structure dérivée de la 1-phényl-5-pyrazolinone et d'un aminoacide aromatique de formule R R \ / N. X {J COOX o R et R 1, identiques ou différents, désignent l'hydrogène ou un radical hydrocarboné et X désigne hydrogène ou un cation monovalent. Parmi ces derniers, particulièrement intéressants se sont montrés les acides ortho ou méta-aminobenzoîqueset les dérivés N-alkyl méta aminobenzoîques, les dérivés N,N- dialkyl méta aminobenzoîqueset plus particulièrement les dérivés méta substitués Parmi ces derniers on a trouvé le plus efficace les acides quisont complètement substitués sur l'atome d'azote. Parmi les composés principaux utilisés dans le système en remplacement de la 4-amino-antipirine, on peut citer ci-après les suivants: -aminophénazone (= 4-diéthylamino-2,3,-diméthyl-1-phényl-3- pyrazoline-5-one); sulphamipirine (sel de sodium de l'acide 2,3-diméthyl-1- phényl-5-pyrazolone-4-aminométhanesulfonique); dibupyrène ((sel de sodium de l'acide 1-phényl-2,3-diméthyl- -pyrazolone-4-yl) isobutylamino méthanesulfonique); propyl- phénazone ( 4-isopropyl-2,3-diméthyl-1-phényl-3-pyrazoline-3- one); thozalinone ( 2-diméthylamino-5-phényl-2-oxazoline-4-one); méthampyrone ( 1-phényl-2,3-diméthyl-5-pyrazoldne-4-méthylamino- méthane sulfonate de sodium). On indique ci-après le modèle général de la réaction d'oxydation des séries de chromogène décrit dans l'invention, utilisant de l'eau oxygénée en présence de peroxydase comme agent oxydant pour le chromogène, quoique d'autres peroxydes et agents oxydants appropriés conviennent. C 6 H 6 COOX 1 N 'c=o R POD I I 20 /' + NR + H 202 OD C \z R 1 H 3 C NH 2 C 6 H 6 CH 3 R 1 N\c=O COUX RN 2 H 20 CH 3 C\Rl 5 N EXEMPLES Exemple 1 Détermination de l'eau oxygéréeet de peroydes. Le principe de la réaction est la suivantes: une solution contenant des peroxydes, en concentrations appro- priées, est mélangée avec une solution tamponnée qui contient l'un des chromogènes décrits et des peroxydes. Lorsque la couleur est complètement développée on effectue la lecture photométrique,à la longueur d'onde appro- priée La couleur développée est proportionnelle à la concen- tration des peroxydes Le réactif peut être formulé de la fa- çon suivante: un réactif en poudre contenant: a) un système tampon qui peut être fait de phosphates, TRIS, acétate d'aminopropanediol et d'autres dé- rivés ou un autre équivalent, b) un antiseptique et des substances antimoisissures, c) un système chromogène constitué de 4-amino-antipiri- ne et composés similaires et un aminoacide aromatique, d) du peroxydase. Exemple 2 Détermination du l'acide urique par procédé manuel ou automatique (avec appareil à flux continu ou échantillon séparé) avec lecture terminale. Le principe du dosage est le suivant: La matière à doser est mélangée, manuellement ou automatiquement, avec le réactif qui contient les enzymes (uricase et perodixase) et le chromogène, le tout dans une solution tamponnée Après que l'acide urique ait été oxydé par l'enzyme et que la couleur de la réaction ait été développée, on effectue la lecture photométrique soit manuellement soit par voie automatique, à une longueur d'onde appropriée. La couleur développée est proportionnelle à la quantité d'acide urique présent dans l'échantillon. Selon un tel modèle de réaction, la formulation pour le réactif peut être le suivant: dans un seul mélange on peut trouver toutes les substances qui sont nécessaires pour les réactions enzymatiques et chromogéniques ou les enzymes uricases et POD, le tampon (phosphate, TRIS, acétate, aminopropanediol et dérivés et autres), l'aminoacide aromati- que et la 4-aminoantipirine (ou un composé similaire), des agents antibactériens, des agents capillaire actifs et des composés adaptés pour éviter des interférences potentielles. Exemple 3 Résultats obtenus dans la détermination de l'acide urique, par procédé manuel, sur le sérum du sang humain et composition de réactif fourni spécialement. Les concentrations des réactifs dans le système de réactif prêt à utiliser: tampon phosphate 100 m M p H 7,4; 4-aminoantipirine 0,05 m M, acide N,N-diméthyl-m-aminobenzoique 1 m M, peroxydase 2000 U/l, Uricase 50 U/l. La corrélation entre A (Absorbance) à 550 nm et la concentration de l'acide urique sont linéaires jusqu'à 20 mg/dl d'acide urique dans l'échantillon. L'essai de comparaison avec le procédé de Fossati, P., Prencipe, L (Quad Sclavo Diagn 14, 2, 1978) a fourni les résultats suivants: (Y = méthode de Fossati) Y = 1 001 x 0,036 mg/dl r = 0,985. (r = coefficient statistique de corrélation). Précision dans les"séries": N 20, moyenne 4,6 mg/dl S D: 0,08 mg/dl C V % = 1,84. Précision "parmi les séries": N 20, moyenne 4,7 mg/dl S D: 0,12 mg/dl C V % = 2,84 (S D = déviation ordinaire ou écart type; C V % = coefficient de variation). REVENDICATIONS 1 Composition chromog ne adaptée à la détermina- tion colorimétrique de peroxydes comprenant un composé conte- nant au moins un groupe réactif lié à une sturcture dérivée de la 1phényl-5-pyrazolinone et un aminoacide aromatique de formule: R N R 1 ,,COOX o R et R 1, identiques ou différents, désignent l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, X désigne l'hydrogène ou un cation monovalent. 2 Composition chromogène selon la revendication 1, caractérisée par le fait que la structure dérivée de la 1-phényl-5-pyrazolinone est la 4-aminoantipirine.