Brevet FR2520121A1 — publié le 19830722

La présente invention concerne un procédé et des réactifs pour l'emploi de la ss-D-galactosidase comme marqueur en immunocytochimie. Les anticorps à marquage enzymatique et fluorescent sont couramment utilisés en immunohistochimie pour mettre en évidence la localisation des antigânes dans les tissus. [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 47 : 200-202, 1941; J. Immunol. 45: 159-170, 1942; J. Exp. Med. 91: 1-13, 1950; Arch. Pathol. Lab. Med. 102: 113-121, 1978; J. Clin. Pathol. 27: 14-20, 1974]. Cependant la vogue de l'immunolocalisation enzy matique s'est récemment accrue car celle-ci apporte à l'anatomo- pathologiste certains avantages nets par rapport à l'immunofluores- cence. Ces avantages comprennent les préparations colorées plus stables contrastées et à détails fins, la permanence de lames, la possibilité d'observer le tissu environnant et, pour la plupart des antigènes, l'emploi d'une matière que l'on a préparée selon des techniques classiques de fixation et d'inclusion pour la micros- copie optique, Par suite de ces avantages les méthodes immuno- enzymatiques sont si sensibles et si précises que parmi toutes les techniques immunohistochimiques, les techniques histochimiques immuno enzymatiques sont actuellement les plue utilisées pour le diagnostic anatomopathologique, Les méthodes cytochimiques immuno-enzymatiques, en particulier les méthodes histochimiques, fournissent des informations importantes, par exemple en pathologie rénale, dans l'étude des maladies bactériennes et virales, dans l'étude physiopathologique du système immunitaire ainsi que sur la sécrétion des @ormones , De plus > on a découvert des marqueurs spécifiques de maladies et de types cellulaires déterminés permettant d'obtenir une information importante sur l'histogénèse et la différenciation des tumours. Une grande diversité de produits cellulaires, y compris des enzymes, des hormones polypeptidiques et stéroldes des immunoglobulines, des antigènes à caractère tumoral, des antigènes viraux et d'autres protéines à spécificité cellulaire ont été mis en évidence dans des coupes de tissus congelés ou fixés et incluses de façon typique grace à l'emploi de ces techniques. Les applications principales de ces procédés comprennent par exemple la mise en évidence de diverses catégories d'immunoglobulines dans les tumeurs d'origine lymphoréticulaire et les processus atypiques de prolifération du système lymphatique, l'identification des hormones polypeptidiques dans les tumeurs endocrines et la mise en évidence de divers marqueurs tumoraux tels que l'antigène carcino-embryonnaire et l'&alpha;-foetoprotéine dans les états néoplasiques et prénéoplasiques. Un résumé concis de certaines applications des techniques immuno-enzymatiques en histopathologie figure dans Human Pathology, 12 590-596 (1981). Pas moins de 70 domaines d'emploi possibles sont énumérés. La possibilité d'identifier dans des cellules et des tissus fixés et inclus dans la paraffine de façon classique, une grande diversité de marqueurs dont beaucoup snt spécifiques d'une maladie donnée et certains sont même étiologiques, fournit à l'anatomopa thologiste de nouveaux critères objectifs de diagnostic contrairement aux paramètres traditionnels purement morphologiques souvent subjectifs. Actuellement, la peroxydase est l'enzyme la plus couramment employée en immunocytochimie [Am. J. Clin. Pathol. 71 483-488, 19791. Bien que d'une part cette enyme présente des avantages, tels qu'une stabilité notable, la possibilité d'utiliser un substrat insoluble très bien défini et de former des chaumes consti- tuées de couches multiples d'anticorps comportant uniquement des liaisons de type immunologique (c'est-à-dire le système PAP, peroxy- dase-antiperoxydase) on a rencontré certaines difficultés lors de l'emploi de ces procédés regroupés sous le nom de "procédés immunoperoxydasiques". Des peroxydases et des pseudo-peroxydases endogènes sont présentes dans certains tissus et elles peuvent produire un résultat faussement positif ; le substrat chromogène le plus couram- ment utilisé qui est le tétrachlorure de diamino-3,3',4,4' benzidine (DAB) a une activité carcinogène notable [registry of toxic effeeja of Chemical Substances - Ed. NIOSH - U.S Dept, of Health and Human Services - Cincinnati - 1980] et il est de plus en plus difficile de trouver un composé ayant un degré élevé de pureté sur le marché tJ, Histochem. n 28, pages 191-192 La solution utilisée pour la mise en évidence de la peroxydase est instable et ne doit Strie préparée que quelques minutes avant l'emploi tSternberger L.A. : Immunocytochemistry 2e édition - John Wiley and Sons - New York, 1979). De plus le substrat chromogène de la peroxydase présente une couleur brun foncé sur un fond brun clair ce qui pose parfois des problèmes importants d'évaluation de la préparation et peut conduire à une fausse positivité. D'autres substrats des peroxydases ou d'autres enzymes, tels que par exemple la glBcose-oxydase et la phosphatase alcaline, ont été proposés mais des résultats comparables à ceux donnés par le système peroxydase + DAB n'ont pas encore été obtenus à ce jour, en particulier du fait que beaucoup des procédés conduisènt à la formation-de composés chromogènes solubles dans les solvants organiques utilisés pour la déshydratation et l'éclaircissement des préparations ou sont moins sensibles pour révéler les antigènes tissulaires. La demanderesse a découvert que l'emploi de ss-D-galac- tosidase comme marqueur permet de supprimer les inconvénients associés aux techniques cytochimiques immuno-enzymatiques connues, en particulier le procédé cytochimique à l'immunoperoxydase. L'invention concerne un procédé cytochimique immunoenzymatique pour l'identification d'antigènes dans les tissus en particulier dans les tissus humains, caractérisé en ce qu'on utilise comne marqueur l'enzyme (3-D-galactosidase. Selon l'invention, on identifie les antigenes dans les tissus par formation d'un produit insoluble et coloré obtenu par l'action de la ss-D-galactosidase sur un substrat chromogène spécifique. Plus précisément l'invention fournit un procédé pour l'identification d'antigènes dans les tissus qui comprend la liaison de l'enzyme ss-D-galactosidase à l'antigène à identifier par l'intermédiaire d'un agent de liaison spécifique quelconque et la mise en évidence de l'activité ss-D-galactosidasique par réaction avec un substrat spécifique capable de former un produit insoluble et coloré sous l'effet de la ss-D-galactosidase. L'enzyme ss-D-galactosidase utilisé dans le procédé de l'invention peut être une ss-D-galactosidase quelconque d'origine microbienne bien qu'elle soit de préférence la ss-D-galactosidase d'Escherichia coli. Selon l'invention la ss-D-galactosidase peut etre liée à l'antigène à identifier par l'intermédiaire d'un type quelconque d'agent de liaison spécifique. En particulier, par exemple, on peut utiliser l'une quelconque des techniques de marquage ou de pontage précédemment décrites pour la peroxydase dans les procédés immunoperoxydasiques pour lier la p-D-galactosidase à l'antigène à révéler. Selon les techniques préférées, on fait réagir ledit antigène avec un premier anticorps qui est spécifique de l'antigène lui-meme et qui à son tour est lié à la ss-D-galactosi- dase soit directement soit par l'intermédiaire d'un système de conjugaison quelconque capable de fournir un conjugué de la ss-D- galactosidase. Un conjugué de p-D-galactosidase approprié peut en particulier être par exemple un conjugué enzyme anti-anticorps du type décrit par exemple dans FEBS lett. 95, 311 (1978) ou dans Am. J. Clin. Pathol. 71, 483 (1979), ou un conjugué enzyme-système biotine-avidine selon l'une quelconque de ces configurations possibles; par exemple du type indiqué dans J. Histochem. Cytochem. vol. 27, n 0 8, 1131 (1979). De préférence on effectue successivement le stade de réaction de l'antigène à identifier avec le premier anticorps spécifique de l'antigène lui-meme et le ou les stades suivants conduisant à établir un pont entre ledit anticorps spécifique et la ss-D-galactosidase. Pour mettre en évidence l'activité P-D-galactosi dasique, selon le procédé de l'invention, on peut utiliser un substrat chromogène quelconque qui est spécifique de l'enzyme P-D-galactosi- dase et qui en plus est capable de fournir sous l'action de la ss-D- galactosidase un produit réactionnel coloré, insoluble et stable. Le produit qui dérive dudit substrat chromogène sous l'effet de la ss-D-galactosidase , en plus de son caractere coloré et stable, doit Titre insoluble soit dans les solvants aqueux soit dans les solvants organiques couramment utilisés pour le traitement des tissus en histologie et de préférence il est à la fois insoluble dans les solvants aqueux et les solvants organiques. De préférence le substrat chromogène spécifique de la ss-D-galactosidase est soluble dans les mêmes solvants. Ce substrat chromogène spécifique de la p-D-galac- toidase peut etre un dérivé quelconque de type ss-D-galactosidase qui, dès qu'il est décomposé par l'enzyme, est capable de former un produit réactionnel coloré insoluble et stable comme précédemment indiqué. Des exemples de substrats chromogènes particulièrement utiles dans le procédé de l'invention sont par exemple certains dérivés de type indolyl- et naphtyl-ss-D-galactoside. Les substrats que l'on préfère particulièrement- sont les dérivés de type indolyl-P-D-galactoside et parmi eux on préfère particulièrement le bromo-5 chloro-4 indolyl-3 ss-D-galac- toside. Parmi les dérivés de type naphtyl-ss-D-galactoside, on pré- frère le bromo-6 naphtyl-2 P-D-galactoside. Pour mettre en évidence l'activité ss-D-galactosi- dasique, il peut parfois etre nécessaire de faire réagir le substrat chromogène en présence d'un ou plusieurs réactifs additionnais qui peuvent par exemple itre des agents de couplage, des agents d'oxy- dation ou des agents de transfert d'é-lectrons. Ainsi par exemple, lorsqu'on utilise comme substrat chromogène un dérivé de type naphtyl-ss-D-galactoside, La présence d'un agent approprié de couplage azoïque est nécessaire pour mettre en évidence l'activité enzymatique et un agent de couplage azoïque peut également etre éventuellement présent dans le réactif révélateur lorsqu'on emploie un chromogène de type indolyl-ss-D-galactoside. Des agents de couplage azoïque appropriés peuvent par exemple titre la p-rosaniline hexazotée, le Fast Blue VB, BB et RK, le Fast Carnet GBC et similaires, la p-rosaniline hexazotée étant particulièrement préférée. De plus, pour accélérer la réaction de révélation à catalyse enzymatique, en particulier lorsqu'on utilise un substrat de type indolyl-B-D-galactoside, un agent oxydant ou un agent de transfert d'électrons peut également être présent dans le milieu réactionnel. Les agents oxydants ou de transfert d'électrons peuvent titre, sous réserve qu'ils soient appropriés, l'un quelconque des agents oxydants et agents de transfert d'électrons connus en chimie minérale et organique, les agents minéraux étant particulièrement préférés. Des exemples d'agents oxydants ou d'agents de transfert d'électrons préférés sont en particulier le méthosulfate de phénazine, les sels de tétrazolium ou l'un quelconque des couples ioniques redox appropriés. Un sel de tétrazolium approprié peut par exemple être le chlorure de p-nitro Bleu de tétrazolium ou le chlorure de tétranitro Bleu de tétrazolium. Un couple ionique redox approprié peut par exemple être choisi parmi les couples ioniques Fe2+/Fe3+, Ce2+/C34+, I-VO43-, I-/VO3-, I-/WO2-4, I-/B4O72-, I-/Mo42-, I-/Mo7O24, 6- et similaires. Les couples de type Fe2+/Fe3+ en particulier, peuvent etre apportés par les cyanures complexes ou les sulfates correspondants; les cyanures complexes sont de préférence les ferrocyaZ nures/ferricyanures alcalins, en particulier le ferrocyanure/ferri cyanure de potassium. Les couples Ce2+/ce4+ sont de préférence apportés par les sulfates respectifs. Les couples ioniques sont apportés par les sels respectifs, de préférence les sels de métaux alcalins ou alcalino- terreux. Selon le procédé de l'invention, on peut préparer les échantillons de tissus selon I'une quelconque des techniques connues par exemple les techniques de congélation, fixation et inclusion couramment employées en histochimie. Par exemple, on examine très facilement selon le procédé de l'invention des tissus fixés par la formaline et inclus dans la paraffine. L'évaluation des échantillons peut être effectuée evec un microscope optique ordinaire quelconque grossissant 20 à 800 fois. L'emploi de l'enzyme S-D-galactosidase et d'un substrat chromogène spécifique approprié permet comme précédemment indiqué de supprimer les inconvénients rencontrés lorsqu'on emploie par exemple la peroxydase. Par exemple, en particulier, les problèmes provoqués par la présence dans les échantillons de tissu de peroxydases et de pseudo-peroxydases endogènes qui, comme précédemment indiqué, limitent fortement les méthodes immunohistochimiques peroxydasiques, sont évités dans le procédé de l'invention car l'enzyme ss-D-galactosidase est généralement absente dans les tissus humains et qu'en tout cas la gamme des pH d'activité de la ss-D-galactosidase humaine est totalement différente de la gamme des pH d'activité de la p-D-galactosi- dase microbienne utilisée dans le procédé de l'invention : la gamme d'activité de la ss-D-galactosidase humaine est d'environ 5,5-6 tandis que par exemple la gamme des pH d'activité de la ss-D-galactosidase d'Escherichia coli est d'environ 7,0-7,5. De plus, la ss-D-galactosidase est inactivée en moins d'une minute à environ 550C (The Enzymes, 1960, 2e édition,- pages 409430 vol. 4 Ed : P.D. BOYER, H. LAm)Y > K. MYRBACH, Academic Press New York) qui est une température normalement atteinte lors des opérations classiques d'inclusion. Par suite de l'absence d'interférence par les p-D-galactosidases endogènes, les problèmes de coloration du fond qui se posent avec les peroxydases habituellement utilisées du fait de l'activité caractère peroxydasique des tissus ne se posent pas avec la p-D-galactosidase. La ss-d-galactosidase microbienne ne provoque pas de coloration du fond dans les tissus des mammifères et réagit avec le substrat chromogène disponible pour former des images morphologiques très contrastées et faciles à identifier. Les colorations obtenues sont bien mieux définies et discer.nables que celles géné raiement obtenues avec les techniques peroxydasiques également du fait que la plupart des substrats chromogènes de la j3-D-galactosi dase utilisés permettent d'avoir un fond presque totalement blanc. Par conséquent, l'observation et l'interprétation des sites d'immunoréactivité spécifique sont fortement facilitées. Le procédé utilisant la ss-D-galactosidase de l'invention apporte une sensibilité accrue et est particulièrement utile pour l'examen des tissus atteints de lésions hémorragiques ou inflammatoires. De plus les réactifs utilisés pour les réactions histologiques p-D-galactosidasiques, en particulier par exemple les chromogènes de type indolyl-ss-D-galactoside que l'on préfère tout particulièrement employer, ne sont pas connus comme cancérigènes contrairement au substrat à fort contraste qu'est la diaminobenzidine que l'on emploie principalement dans les. colorations peroxydasiques. De plus., les réactifs utilisés pour la mise en pratique du procédé de l'invention sont stables et produisent des lames qui sont également stables de façon permanente et qu'on peut examiner avec un microscope optique ordinaire simple. Graciez aux avantages précédemment exposés, le procédé immunocytochimique à la -D-galactosidase de l'invention apporte un degré très élevé de précision et de sensibilité au moins comparable à celui des techniques peroxydasiques tout en étant simulta- nément dépourvu des inconvénients caractéristiques de ces dernières techniques. Par suite de la grande sensibilité, le procédé de l'invention permet d'obtenir également des résultats optimaux dans la localisation des antigènes dans des matibres fixées et incluses de façon courante dont l'antigénicité résiduelle n'est quine fraction de celle observée dans un tissu congelé. Bien qu'avec le procédé de l'invention un prétraitement des échantillons de tissu soit généralement inutile, néanmoins pour accroître encore la sensibilité de la technique, un pré traite- ment, par exemple selon Heydermann (J. Clin. Pathol. 32, 971-978 (1979)) peut parfois etre utile pour éliminer de légères interférences possibles dues aux peroxydases endogènes et/ou au fer tissaulaire. Le procédé de l'invention permet également d'identifier une grande diversité de produits cellulaires et en particulier une gamme étendue de marqueurs dont beaucoup sont spécifique de maladies données et certains sont meme éthiologiques, ces produits cellulaires et marqueurs pouvant par exemple etre ceux précédemment indiqués dans la présente description. L'invention fournit également des réactifs pour la réalisation du procédé immunohistochimique utilisant la ss-D-ga- lactosidase décrit ci-dessus. Un réactif peut etre soit 1) un réactif spécifique comprenant comme composants essentiels, a) un anticorps spécifique de l'antigène à identifier, b) de la I3-D-galactosidase ou un conjugué de ss-D-galactosidase et c) un substrat chromogène spécifique de la p-D-galactosi- dase et capable de former un produit insoluble et coloré sous l'effet de la ss-D-galactosidase; soit 2) un réactif comprenant comme composants essentiels, a') un conjugué ss-D-galactosidase anti-anticorps et et b') un substrat chromogène spécifique de la p-D-galactosidase et capable de former un produit insoluble et coloré sous l'effet de la P-D-galactosidase. Bien entendu un réactif du type indiqué en 1) cidessus est utile uniquement pour la détermination de l'antigène particulier qui peut etre reconnu par l'anticorps constitutif a) spécifique de l'angigène lui-même. Au contraire un réactif du type indiqué an 2) cidessus convient à la détermination d'un antigène quelconque En fait l'anti-anticorps conjugné avec la $ss-Dgalactosidase dans le composant a') est tel qu'il est capable de reconnattre sans distinction tout anticorps dirigé contre tout antigene à identifier sous réserve que ce dernier anticorps soit produit dans une espèce contre laquelle l'anti-anticorps do composant a') est "anti". rar conséquent l'anti-anticorps du compo- sant a') est "spécifique d'espèce", c'est-à-dire spécifique de l'espèce dans laquelle l'anticorps contre les antigènes à identi- fier est produit. Ainsi par exemple un anti-anticorps qui est antilapin (ctest-a-dire qui est "anti" espèce lapin) est capable de reconnattre tout anticorps produit chez le lapin; un anti-anticorps qui est anti-chèvre ou anti-mouton est capable de reconnaître tout anticorps produit respectivement chez la chèvre ou chez le mouton; et de façon analogue, un anti-anticorps qui est anti-sollris est capable de reconnaître tout anticorps produit chez la souris. Par conséquent, l'invention fournit divers réactifs du type 2) ci-dessus qui different les uns des autres en ce qui concerne la "spécificité d'espèce" tels que par exemple un réactif spécifique du lapin contenant contenant un conjugué de B-D-galacto- sidase-antisérum anti-lapin comme composant a'); un réactif spécifique de la chèvre (ou spécifique du mouton) contenant un conjugué ss-D-galactosidase-antisérum anti-chèvre (ou anti-mouton) comme composant a'); et un réactif spécifique de la souris contenant un conjugué ss-D-ga- Iacto6idase-antisérum anti-souris comme composant a'). Chacun desdits types de réactifs 2) peut entre utilisé pour l'identification d'un antigène quelconque sous réserve qu'on emploie un anticorps dirigé contre l'antigène qui est produit dans l'espèce appropriée : cette espèce étant par exemple le lapin pour un réactif spécifique du lapin, la chèvre pour un réactif spécifique de la chèvre, le mouton pour un réactif spécifique du mouton et la souris pour un réactif spécifique de la souris. Il est cependant évident que dans tous les cas un anticorps spécifique de l'antigène à mettre en évidence, meme s'il n'est pas incorporé dans un réactif du type 2) ci-dessus) doit toujours etre utilisé pour permettre la détection de l'antigène. Si on le désire, un anticorps spécifique de l'antigène à identifier ou une série d'anticorps spécifiques d'une série d'antigènes à identifier peuvent etre fournis séparément avec le réactif 2). Chacun desdits réactifs 1) et 2) peut de plus comprendre de nombreux composants complémentaires tels que par exemple un agent de couplage azotique, un agent oxydant ou un agent de transfert d'électrons et un tampon. Les divers composants de chaque réactif peuvent etre conditionnés, ensemble ou séparément, de façon appropriée quelconque permettant l'emploi facile et rapide du réactif. Dans chaque réactif, les caractéristiques des divers composants sont celles précédemment indiquées dans la description du procédé de l'invention, les composants préférés étant également ceux indiqués comme préférés dans la description cidessus. Ainsi par exemple, selon une forme préférée, le réactif indiqué en 1) ci-dessus comprend comme composants essentiels a) un anticorps spécifique de l'antigène à identifier, b) un conjugué de ss-D-galactosidase et c) un indolyl-P-D-galac- toside comme substrat chromogène. Selon une forme préférée, le réactif indiqué en 2) ci-dessus comprend comme composantsessentiels a') un conjugué p-D- galactosidase-anti-anticorps spécifique d'espèce et b') un indolyl-ss-D-galactosidase comme substrat chromogène. Dans la forme préférée du réactif 1) ci-dessus le conjugué spécifique de ss-D-galactosidase est de préférence un conjugué ss-D-galactosidase-anti-anticorps ou un conjugué p-D-ga- lactosidase-systeme biotine-avidine. Dans la forme préférée ci-dessus du réactif 2), le conjugue ss-D-galactosidase-anti-anticorps spécifique d'espèce est de préférence un conjugué ss-D-galactosidase-anti-anticorps de lapin ou un conjugué B-D-galactosidase-anti-anticorps de chèvre ou de mouton ou un conjugué B-D-galactosidase-anti-anticorps de souris. Dans les deux formes préférées indiquées ci-dessus des réactifs 1) et 2), le substrat chromogène de type indolyl--D- galactoside est de préférence le bromo-5 chloro-4 indolyl-3 p-D-ga- lactoside. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 On identifie l'insuline humaine dans le pancréas humain selon les techniques suivantes. On utilise du tissu pancréatique humain fixé dans de la formaline tamponnée avec 10 % de phosphate et inclus de façon courante dans la paraffine. On place les coupes de tissu inclus dans la paraffine dans du tampon salé phosphaté à pH 7,2 (PBS) et on traite avec du peroxyde d'hydrogène à 7,5% pendant 5 minutes et finalement avec du borohydrure de sodium à 0,02 % pendant 2 minutes. (J. Clin. Pathol. 32, 971-978 (1979)]. Après plusieurs lavages dans le PBS, on incube les coupes pendant une nuit à 4 C avec un antisérum de lapin anti-h-insuline dilué au 1/1 000 avec du PBS. Après lavage dans le PBS, on ajoute aux coupes des anticorps constitués d'immunoglobulines anti-lapin provenant d'anes et conjugués à la p-D-galactosidase d'Escherichia coli selon la technique décrite dans FEBS Letters 95, 311 (1978), dilués au 1/30 dans du PBS contenant 1 % de sérum de porc normal. Apres 30 minu tes à la température ordinaire, on lave les tissus dans du PBS et on révèle l'activité enzymatique en utilisant une solution obtenue par dissolution dans du PBS à pH 7,2 de Br-5 C1-4 indolyl-3 ss-D-galactoside 0,44 g/l chlorure de magnésium 1,1 mmol/l ferricyanure de potassium 3,0 mmol/l ferrocyanure de potassium 3,0 mmol/l On effectue le traitement avec cette solution révélatrice par incubation pendant une heure à 370C.Après lavage et contre-coloration avec du rouge neutre, on déshydrate les coupes et on les monte dans de l'Eukitt, On examine les tissus avec un microscope optique tLeitz Orthoplan) avec un grossissement de 200. La réaction positive apparat en bleu intense. La coloration positive apparatt très bien car le fond est incolore et les noyaux sont rouges. On compare les résultats avec ceux obtenus dans le meme tissu traité avec le même antisérum anti-insuline puis traité selon la technique peroxydasique PAP (Sternberger - J. Histochem. Cytochem. 18 315 (1970)).~Le résultat obtenu selon la technique peroxydasique est une réaction positive de couleur brun intense. La coloration positive est cependant moins évidente et moins nette que celle obtenue avec la méthode à la p-galactosidase par suite de la coloration légèrement brune du fond. Donc la méthode à la ss-D-galactosidase permet d'obtenir une bien meilleure coloration que celle obtenue selon la technique peroxydasique PAP. Exemple 2 En utilisant le mode opératoire de l'exemple 1 mais en remplaçant l'antisérum anti-insuline par des antisérums appropriés, tous produits chez le lapin, on identifie également les antigènes suivants caséine humaine dans le tissu mammaire humain; antigène HB de surface (HBsAG) dans le foie humain; lysozyme humaine dans l'intestin grêle humain; myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain; et glucagon humain dans le pancréas humain. On obtient des résultats analogues à ceux obtenus dans l'exemple 1. Exemple 3 On identifie la myoglobine humaine dans le muscle squelettique selon la technique suivante. On utilise du tissu musculaire squelettique humain fixé dans de la formaline tamponnée avec 10% de phosphate et inclus de façon courante dans la paraffine. On place les coupes de tissu inclus dans la paraffine dans du PBS t on incube pendant une nuit à 40C avec de l'antisérum de lapin anti-myoglobine (Bebringwerke) dilué au 1/500 avec du PBS. Après lavage dans le PBS, on suit le mode opératoire de l'exemple 1 et on obtient le même type de résultat. Selon une technique analogue et en utilisant les antisérums appropriés, on identifie les antigènes suivants insuline humaine dans le pancréas humain; caséine humaine dans le tissu mammaire humain antigène HB de surface (HBsAg) dans le foie llumain; lysozyme humaine dans l'intestin grele humain; glucagon humain dans le pancréas humain. Exemple 4 On identifie comme salit l'antigène HB de surface (HBsAg) dans le foie humain. On utilise du tissu hépatique humain fixé et inclus comme décrit dans l'exemple 1. On reprend le mode opératoire de l'exemple 1 en remplaçant l'antisérum anti-insuline par de l'antisérum de lapin anti-HBsAg (Behringwerke) dilue au 1/500 avec du PBS, De plus, on utilise une solution révélatrice dans le PBS semblable à celle employée dans l'exemple 1 mais ne contenant pas les réactifs ferrocyanure de potassium et ferricyanure de potassium. On obtient le méme type de résultat que dans l'exemple 1 selon ce mode opératoire.En opérant de façon analogue mais en utilisant les antisérums appropriés, on identifie les antigènes suivants insuline humaine dans le pancréas humain; caséine humaine dans le tissu mammaire humain; lysozyme humaine dans l'intestin grêle humain; myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain; et glucagon humain dans le pancréas humain. Exemple 5 On identi-fie la lysozyme humaine dans l'intestin grele humain selon le mode opératoire suivant. On utilise du tissu d'intestin grele humain fixé et inclus comme décrit dans l'exemple 1. On reprend le mode opératoire de l'exemple l en remplaçant l'antisérum anti-insuline par de l'antisérum de lapin anti-lysozyme (DAKO) dilué au 1/500 avec du PBS et en utilisant comme solution révélatrice une solution dans le PBS à pH 7,2 contenant Br-5 C1-4 indolyl-3 p-D-galactoside 0,44 g/l chlorure de magnésium 1.1 mmol/l iodure de potassium 17 tungstate de sodium 0 > 0015 % On obtient des résultats analogues à ceux obtenus dans l'exemple 1. En opérant de façon analogue mais en utilisant les antisérums appropriés, on identifie les antigènes suivants insuline humaine dans le pancréas humain; caséine humaine dans le tissu mammaire humain; antigène HB de surface (HBsAg) dans le foie humain; myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain; glucagon humain dans le pancréas humain. Exemple 6 On identifie la caséine humaine dans le tissu mammaire humain de la façon suivante. On utilise du tissu mammaire humain congelé. On prépare des coupes avec un cryostat et on les traite comme dans l'exemple 1 en remplaçant l'antisérum antiinsuline par de l'antisérum de lapin anti-caséine dilué au 1/1 000 dans du PBS. On obtient des résultats analogues à ceux de l'exemple 1. En opérant de façon analogue sur des tissus congelés en utilisant les antisérums appropriés, on identifie les antigènes suivants insuline humaine dans le pancréas humain; antigène HB de surface (HBsAg) dans le foie humain; lysozyme humaine dans l'intestin grêle humain; myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain; et glucagon humain dans le pancréas humain. Exemple 7 On identifie comme suit l'antigène HB de surface (HBsAg) dans le tissu hépatique humain. On utilise du tissu hépatique humain fixé et inclus comme décrit dans l'exemple 1. On place des coupes de tissu inclus dans la paraffine dans du PBS à pH 7,2. On lave les coupes avec du PBS pendant 15 minutes puis on incube à 370C pendant 2 heures avec de l'antisérum de lapin anti-HBsAg (solution à 1/500 dans le PBS). Après 15 minutes de lavage dans le PBS, on ajoute aux coupes une solution dans le PBS (50 pl) contenant des fragments Fc d'immunoglobulines anti-lapin provenant d'ânes (4,5 x 106 M) et conjugués à de la p-D-galactosidase d'Escherichia coli (1,5 x 10 selon le mode opératoire indiqué dans FEBS Letters 95, 311 (1978) et contenant 1 % de sérum normal d'âne Après 30 minutes à la température ordinaire, on lave les coupes avec du PBS pendant 15 minutes puis on applique une solution révélatrice obtenue par dissolution dans le PBS à pH 7,2 de Br-5 Cl-4 indolyl-3 ss-D-galactoside 0,44 g/l chlorure de magnésium 0,9 mmol/l iodure de sodium 1% tungstate de sodium 0,0015 % Après 30 minutes d'incubation à la température ordinaire et lavage avec du PBS, on contre-colore les noyaux avec du rouge neutre et on déshydrate les coupes que l'on monte dans 1 'Eukitt. On examine les tissus avec un microscope optique (Leitz Orthoplanl avec un grossissement de 200. La réaction positive apparatt en bleu intense. La coloration positive est très nette car le fond n'est pas coloré et les noyaux sont rouges. On compare les résultats avec ceux obtenus dans le meme tissu traité avec le meme antisérum anti-HBsAg puis traité selon la technique peroxydasique PAP de Sternberger (voir la référence dans l'exemple 1). On observe des résultats analogues à ceux décrits dans l'exemple 1. On répète le mode opératoire de l'exemple 7 en utilisant une solution révélatrice contenant 0,0015 % de tetra- borate de sodium ou 0,0075 % de molybdate de sodium au lieu de 0,0015 % de tungstate de sodium. On observe également des résultats analogues à ceux décrits dans l'exemple 1. Exemple 8 On prépare un réactif pour l'identification histochimique de l'antigène HB de surface (HBsAg) sur 50 coupes de tissu hépatique humain comprenant a) une solution d'antisérum de lapin anti-HBsAg au 1/500 dans du PBS : 2,5 ml; b) une solution de conjugué de ss-D-galactosidase d'Escherichia coli et de fragments Fc d'immunoglobulines anti-lapin au 1/100 dans du PBS : 2,5 ml; et c) un composant lyophilise à dissoudre avant l'emploi dans l'eau distillée pour obtenir 2,5 ml d'une solution aqueuse ayant la composition suivante Br-5 Cl-4 indolyl-3 ss-D-galactoside 0,44 g/l chlorure de magnésium 0,9 mmol/l iodure de sodium 1 X tungstate de sodium - 0,0015 % On utilise les composants a), b) et c) du réactif selon le mode opératoire décrit dans exemple 7. On prépare des réactifs analogues ayant la meme composition que ci-dessus mais avec un composant lyophilisé c) contenant 0,0015 X de tétraborate de sodium ou 0,0075 59 de molybdate de sodium au lieu de 0,0015 % de tungstate de sodium, les.concen- trations (%) du tétraborate de sodium et du molybdate de sodium correspondant également à 2,5 ml de la solution aqueuse. On utilise ces réactifs pour l'identification de l'antigène HBsAg dans le tissu hépatique humain selon le mode opératoire de l'exemple 7. Exemple 9 On prépare un réactif spécifique du lapin pour la mise en évidence histochimique d'un type quelconque d'antigènes sur 50 coupes de tissu humain, comprenant a') une solution de conjugé de p-D-galactosidase d'Escherichia coli et de fragments Fc d'immunoglobulines anti-lapin à 1/100 dans du PBS : 2,5 ml et b') un composant lyophilisé à dissoudre avant l'emploi dans de tteau distillée pour fournir 2,5 ml d'une solution aqueuse ayant la composition suivante Br-5 Cl-4 indolyl-3 ss-D-galactoside 0,44 g/l chlorure de magnésium 0,9 mmol/1 iodure de sodium 1% tungstate de sodium 0,0015 % On utilise les composants a') et b') du réactif dans des modes opératoires analogues à celui décrit dans les exemples 1 à 7 pour l'identification de l'insuline humaine dans le pancréas humain, la caséine humaine dans le tissu mammaire humain, l'antigène HB de surface (I;;BsAg) dans le foie humain, la lysozyme humaine dans l'intestin grole humain, la myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain et le glucagon humain dans le pancréas humain, en employant dans tous les cas un anti-sérum produit chez le lapin, c'est-à-dire respectivement un antisérum anti-insuline produit chez le lapin,un un antisérum anti-casdine produit chez le lapin, un antisérum anti-HBsAg produit chez le lapin, un antisérum anti-lysozyme produit chez le lapin, un antisérum anti-myoglobine produit chez le lapin et un antisérum antiglucagon produit chez le lapin On prépare des réactifs analogues spécifiques du lapin ayant la meme composition que ci-dessus mais avec un composé lyophilisé b') contenant 0,0015 Z de tétraborate de sodium ou 0,0075 % de molybdate de sodium au lieu de 0,0015 % de tungstate de sodium, les pourcentages des concentrations du tétraborate de sodium et du molybdate de sodium correspondant 9 2,5 ml de solution aqueuse. On utilise lesdits réactifs pour l'identification de tous les antigènes mentionnés ci-dessus dans cet exemple selon des modes opératoires analogues à ceux décrits dans les exemples 1 et 7. Exemple 10 On prépare un réactif spécifique de la chèvre pour l'identification histochimique d'un antigène sur 50 coupes de tissu humain, ayant la meme composition que le réactif décrit dans l'exem- ple 9 mais contenant un conjugué de ss-D-galactosidase et de fragments Fc d'immunoglobulines anti-chèvre au lieu du conjugué de p-D-galacto- sidase et de fragments Fc d'immunoglobulines anti-lapin. On prépare des réactifs semblables mais contenant un conjugué de -D-galactosi- dase et de fragments Fc dtimmunoglobulines anti-lapin ou respectivement un conjugué de -D-galactosidase et de fragments Fc d'immunoglobulines anti-souris au lieu du conjugué de ss-D-galactosidase et de fragments Fc d'imunoglobulines anti-lapin. On emploie chaque réactif pour l'identification de la myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain et de l'antigène HB de surface (HBsAg dans le tissu hépatique humain) selon des modes opératoires analogues à ceux décrits dans les exemples 1 et 7 mais en utilisant respectivement de l'antisérum anti-myoglobine et de l'antisérum anti-HBsAg produits respectivement chez la chevre ou le mouton ou chez la souris. Bien entendu diverses modifications peuvent cotre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procedé cytochimique immuno-enzymatique pour l'identification des antigènes dans les tissus, caractérisé en ce que la p-D-galactosidase est utilisée- comme marqueur. 2. Procédé cytochinique immuno-enzymatique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'identification des antigènes dans les tissus est obtenue par formation d'un produit insoluble et coloré obtenu par action de la ss-D-galactosidase comme marqueur sur un substrat chromogène spécifique et en ce que le marqueur constitué de ss-D-galactosidase est lié à l'antigène à identifier par un agent de liaison spécifique. 3. Procédé cytochimique immuno-enzymatique selon la revendication 2, caractérisé en ce que la ss-D-galactosidase est une ss-D-galactosidase microbienne notamment la ss-D-galactosidase d'Escherichia coli. 4. Procédé cytochimique immuno-enzymatique selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de liaison spécifique liant la ss-D-galactosidase à l'antigène à identifier est constitué d'un anticorps spécifique de l'antigène lui-meme. 5. Procédé cytochimique immuno-enzymatique selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de liaison spécifique liant la ss-D-galactosidase à l'antigène à identifier est constitué d'un anticorps spécifique de l'antigène lui-meme et d'un système de conjugaison capable de former un conjugué avec la p-D-galactosidase. 6. Procédé cytochimique immuno-enzymatique selon la revendication 5, caractérisé en ce que le conjugué de ss-D-galactosi- dase est un conjugué de ss-D-galactosidase-anti-anticorps. 7. Procédé cytochimique immuno-enzymatique selon la revendication 5, caractérisé en ce que le conjugué de p-D-galacto- sidase est un conjugué de p-D-galactosidase-système biotine-avidine. 8. Procédé cytochimique immuno-enzymatique selon la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat chromogène spé- cifique est un dérivé de p-D-galactoside notamment un dérivé d'indolyl-ss-D-galactoside tel que le bromo-5 chloro-4 indolyl-3 ss-D-ga- lactoside ou un dérivé de naphtyl-ss-D-galactoside notamment le bromo-6 naphtyl-2 ss-D-galactoside. 9. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise un dérivé d'indolyl-ss-D-galactoside ou de naphtyl- ss-D-galactosidase comme substrat chromogène et en ce qu'un agent de couplage azotique, notamment un agent de couplage azoique choisi dans le groupe constitué par la p-rosaniline hexazotée, le Fast-Blue VB, le Fast-Blue BB, le Fast-Blue RR et le Fast-Garnet GBC, est également présent comme composé réagissant additionnel. 10. Procédé selon la revendication 2, caractérise en ce qu'on utilise un dérivé d'indolyl-f3-D-gaîactoside comme substrat chromogène et en ce qu'un agent oxydant ou un agent de transfert d'électrons, tel que le méthosulfate de phdnazine, un sel de tétra 2+ 3+ zolium ou un couple ionique redox constitué d'ions Fe-/Fe, Ce2+/Ce4+, I-VO3-4, I-/VO3-, I-/WO42-, I-/Mo42-, I-Mo7O24 6- et I-/B4O72- est également present. 11. Réactif pour la réalisation d'un procédé cytochimique immuno-enzymatique pour l'identification des antigènes dans les tissus, utilisant la p-D-galactosidase comme marqueur, caracté- risé en ce qu'il comprend comme composants essentiels a) un anticorps spécifique de l'antigène à identifier, b) de la ss-D-galacto- sidase ou un conjugué de P-D-galactosidase et c) un substrat chromogène spécifique de la ss-D-galactosidase et capable de former un produit insoluble et coloré par action de la ss-D-galactosidase. 12. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce que la P-D-galactosidase est une ss-D-galactosidase d'Escherichia coli. 13. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce que le conjugué de ss-D-galactosidase est un conjugué ss-D-galacto- sidase-anti-anticorps ou un conjugué ss-D-galactosidase-système biotine-avidine. 14. Réactif pour la réalisation d'un procédé cytochinique immuno-enzymatique pour l'identification des antigènes dans les tissus, utilisant la -D-galactosidase comme marqueur, caractérisé en ce qu'il comprend comme composants essentiels a') un conjugué p-D- galactosidase-anti-anticorps et b') un substrat chromogène spécifique de la p-D-galactosidase et capable de former un produit insoluble et coloré par l'action de la P-D-galactosidase. 15. Réactif selon la revendication 14, caractérisé en ce que la ss-D-galactosidase du composant a') est la ss-D -galactosi- dase d'Escherichia coli. 16. . Réactif selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'anti-anticorps conjugué à la ss-D-galactosidase dans le composant a') est un anti-anticorps de lapin, un anti-anticorps de chèvre, un anti-anticorps de mouton ou un anti-anticorps de souris.