Brevet FR2512031A1 — publié le 19830304

Des particules colloïdales marquées par un radio- isotope sont déjà employées en médecine nucléaire pour des examens scintigraphiques, notamment pour la scintigraphie du poumon par perfusion ainsi que pour les examens du système réticulo-endothélial Le radioisotope utilisé d'habitude est le technétium-99 m en raison de ses proprié- tés radiologiques et physiques particulièrement favorables (demi-vie = 6,05 heures, énergie des rayons gamma = 140 ke V). Divers matériaux sous forme de particules ont déjà été proposés ou employés comme ligands ou substrats du radio-isotope, y-compris des protéines telles que l'al- bumine sérique humaine et l'hémoglobine lG V Taplin et coll, J Nucl Med 5 ( 1964), 259 l L'emploi d'albumine sérique humaine (ASH) comme matériau collo Mdal présente de nombreux avantages parce que les collo Pdes ou particu- les de ASH sont bien tolérées par l'homme et parce que leur aptitude à être métabolisées a été établie avec cer- titude, tant par des études histologiques du tissu pulmo- naire que par des mesures de la radioactivité. Divers procédés de préparation ont été proposés pour obtenir des produits d'une dimension particulaire susceptible d'être reproduite, par exemple, la coagulation de ASH en présence d'un sel stanneux dans une solution physiologique de sel (brevet britannique 1 389 809), la dé- naturation de protéine humaine par la chaleur au point iso- électrique de ASH (p H = 4,9) et la précipitation subséquen- te par l'acide chlorhydrique dilué (brevet britannique 1 409 176), l'utilisation de ASH après purification préa- lable par dialyse (demande de brevet allemand publiée pour opposition 2 536 008), l'utilisation du tartrate stanneux comme agent réducteur spécifique (demande de brevet alle- l 2 - mand publiée 2 654 298), l'adjonction d'ions métalliques à une solution de ASH dans la gélatine (brevet américain Re 29 066), ou l'emploi de solutions tampons (brevet amé- ricain 4 024 233) Tous ces procédés, cependant, donnent une proportion majeure de grosses particules de ASH, avec une distribution de la dimension particulaire allant de à 100 yim; elles sont employées pour la scintigraphie du poumon par perfusion. D'autre part, lorsqu'il s'agit de préparer de petites particules colloïdales de ASH, des complications surviennent parce qu'il est difficile de diriger le pro- cessus de coagulation Par suite de l'importance qu'elles ont comme agent de diagnostic radiologique pour l'examen du système réticulo-endothélial et du système lymphatique, les efforts se poursuivent afin d'obtenir de petites par- ticules de ASH avec des dimensions particulaires bien dé- finies. On a décrit entre autres l'utilisation d'albu- mine sérique humaine dégraissée comme produit de départ (demande de brevet allemand publiée 2 814 038) Deux sor- tes de collo Pdes de ASH en ont été obtenues: ceux dont la dimension particulaire est de 15 à 50 pm, c'est-à-dire des macroagrégats, sont utilisables pour la scintigraphie du poumon, tandis que les microagrégats, probablement, ont une dimension particulaire de 0,1 à 5 pm et s'avèrent ainsi d'une valeur limitée pour l'examen du système réti- culo-endothélial On savait aussi préparer des collo Pdes de ASH avec une dimension particulaire de 0,1 à 3,0 pm pour l'examen scintigraphique du système réticulo-endo- thélial, en désagrégeant au moyen d'ultrasons des macro- agrégats ( 10 à 100 pm) de ASH dénaturée et d'étain (bre- vet américain 4 187 285) Il est évident que tous ces pro- cédés exigent des opérations supplémentaires et coûteuses de séparation. Le brevet américain 4 226 846 a proposé des mi- croagrégats de ASH dont la dimension particulaire se si- tue, en majeure partie, dans la plage de 0,2 à 5 m" pour l'examen radioactif du système réticulo-endothélial Dans ce brevet, la microagrégation d'un mélange d'albumine sé- rique humaine et d'un sel stanneux est effectuée par déna- turation à la chaleur, en présence d'un ligand qui stabili- se les ions stanneux Le ligand est ajouté avant le trai- tement à la chaleur afin de prévenir, jusqu'à l'achèvement de la microagrégation, l'hydrolyse du sel stanneux et la formation d'hydroxyde insoluble; il contribue ainsi essen- tiellement à une bonne visualisation scintigraphique du système réticuloendothélial Des ligands préférés sont les diphosphonates, en particulier le méthylène diphospho- nate; des phosphates, tels que le pyrophosphate, des ami- nocarboxylates, des polyhydroxycarboxylates et des poly- carboxylates peuvent aussi être utilisés. On obtient par ce procédé des microagrégats de ASH avec une distribution de la dimension particulaire re- lativement large, c'est-à-dire environ 40 à 70 % de parti- cule dans la plage de 0,2 à 3 ym et environ l O 10 à 30 % dans le domaine inférieur à 0,2 Fm La large distribution des dimensions particulaires, bien entendu, compromet la sélectivité désirée du colloide pour l'organe On peut remédier partiellement au désavantage que constitue la courbe de distribution aplatie en éliminant par filtra- tion les particules de dimension supérieure (au dessus de 3}m de diamètre) ; toutefois, les particules du domaine de dimensions inférieur à celui qui est désiré ne peuvent pas être éliminées. 4 - Par suite de la distribution large des dimensions particulaires et de la valeur différente qu'elle prend pour chaque ligand particulier, les préparations colloïdales ob- tenues par ce procédé sont impropres à l'examen des états dynamiques ou des processus dynamiques du système réticulo- endothélial Elles sont utilisables seulement pour la vi- sualisation scintigraphique de dommages morphologiques du système réticulo-endothélial, en particulier du foie et de la rate (examen simultané du foie et de la rate), mais elles ne sont que d'une valeur limitée pour l'examen scin- tigraphique de la moelle osseuse Comme on le sait, une visualisation meilleure de la moelle osseuse est obtenue à l'aide de préparations colloïdales de dimension parti- culaire inférieure (en majeure partie, inférieure à 0,2 pm). Enfin, ces préparations ne peuvent pas être uti- lisées pour l'examen scintigraphique du système lymphatique pour lequel, comme il est bien connu, des préparations colloïdales d'une dimension particulaire inférieure sont nécessaires A l'heure actuelle, on emploie d'habitude à cette fin un collolde de 99 m-Tc-antimoine-soufre qui a une dimension particulaire de 0,002 à 0,015 "m, mais qui est métabolisé difficilement par les processus biologiques lG.N Ege et coll, Brit J Radiol 52 ( 1979), 124 l. Par suite des raisons mentionnées ci-dessus, on ne dispose pas encore, en ce moment, d'une préparation colloïdale radioactive 1 qui soit utilisable non seulement pour l'examen morpho- logique, mais aussi, en particulierpour les examens scin- tigraphiques du fonctionnement du système réticulo-endo- thélial, 2 qui permette, de façon satisfaisante, l'examen de la moelle osseuse, et -5- 3 qui ait, pour l'examen scintigraphique du système lym- phatique, des propriétés meilleures que celles des collo P- des de 99 m Tc-antimoine-soufre ou des collo Pdes de 99 m Tc- soufre disponibles à l'heure actuelle. Pour une étude quantitative des fonctions du sys- tème réticulo-endothélial, on demande un produit colloïdal qui ait les propriétés suivantes (I Zolle et coll, Ra- dioaktive Isotopen in Klinik und Forschung, Gasteiner Sym- posium 1972, vol 10, page 446): 1 de petites particules homogènes avec une distribution des dimensions particulaires bien définie, très étroite, 2 une bonne reproductibilité d'une préparation à l'autre, 3 une bonne stabilité du marquage, 4 une bonne tolérance et l'aptitude à être métabolisé chez l'homme. Pour l'examen scintigraphique des cellules réti- lo-endothéliales de la moelle osseuse, on souhaite dis- poser d'un produit colloïdal qui présente, en plus des propriétés mentionnées ci-dessus, une dimension particu- laire dans le domaine inférieur à 0,2 pm Comme on le sait, il existe une relation entre la dimension particulaire et le degré de concentration des collo Pdes dans la moelle osseuse La concentration la meilleure dans la moelle osseuse est obtenue avec les particules les plus petites lH.L Atkins et coll, J of Reticuloendothelial Soc 8 ( 1970), 176 l et l'on admet en général que la dimension particulaire idéale se situe dans une plage de 0,03 à 0,2 pm. Pour la visualisation scintigraphique du systè- me lymphatique, une préparation colloidale idéale de- vrait présenter, en sus des propriétés mentionnées ci- dessus aux chiffres 1 à 4, les caractéristiques suivantes: -6- une plage des dimensions particulaires de 0,002 à 0,03 ym, considérée comme optimum; 6 la stabilité du produit une agglomération ne doit pas se produire; 7 après administration par voie sous-cutanée, le produit doit avoir l'activité résiduelle la plus faible possible au lieu de l'injection. Or, on a trouvé maintenant un procédé par lequel on obtient des produits qui peuvent être marqués au techné- tium-99 m et contiennent de l'albumine sérique humaine col- loidale, et qui présentent les propriétés mentionnées ci- dessus; après marquage au technétium-99 m, ces produits s'a- vèrent éminemment propres non seulement à l'examen scinti- graphique de la morphologie ainsi que du fonctionnement du système réticulo-endothélial (du foie, de la rate et même de la moelle osseuse), mais aussi à l'examen du système lymphatique. Le procédé selon l'invention se base sur la dé- couverte inattendue que, si les concentrations des compo- sants sont maintenues constantes, la dimension particulai- re et la distribution des dimensions particulaires du pro- duit colloïdal formé dépendent seulement de la valeur du p H du mélange avant la microagrégation Les composants sont l'albumine sérique humaine, l'ion stanneux et un ou des agents tensioactifs non-ioniques dans une solution tampon. Le domaine des dimensions particulaires du produit col- loidal formé peut être commandé exactement et directement par un ajustement précis du p H avant la microagrégation. De manière surprenante, la distribution des dimensions particulaires du produit colloïdal qui se forme s'avère définie en des limites étroites, et reproductible Ceci requiert, toutefois, l'omission du ligand qui devrait être utilisé avant la microagrégation selon le brevet américain - 7- 4.226 846 déjà mentionné Tandis que selon cette méthode antérieure, la valeur du p H doit être ajustée en tout cas en conséquence du liant particulier mis en jeu, on a trou- vé qu'il suffit d'ajuster la valeur du p H pour obtenir d'un seul coup les résultats mentionnés ci-dessus. Le procédé selon l'invention consiste à mélan- ger les composants mentionnés ci-dessus, à ajuster le mé- lange réactionnel à une valeur de p H constante, choisie au préalable dans la plage de 3,5 à 8,0, par adjonction d'une solution tampon et à chauffer le mélange à une tem- pérature constante dans le domaine allant de 45 à 100 C au moyen d'un four à microondes ou sous agitation, jus- qu'à ce que l'hydrolyse du sel stanneux et la dénaturation de l'albumine sérique humaine soient achevées. Le chauffage au moyen d'un four à microondes présente l'avantage que l'hydrolyse complète, ensemble avec la dénaturation simultanée de l'albumine, s'effectue de façon homogène par suite de l'apport uniforme de chaleur. Le procédé selon l'invention fournit des pré- parations colloïdales de ASH de petite dimension par- ticulaire, tout en permettant simultanément de régler le domaine des dimensions particulaires con- formément à l'utilisation projetée, de produire des particules de dimensions particulière- ment homogènes ou, respectivement, d'un domaine de dimensions étroit et défini, et d'obtenir des colloldes qui présentent, d'une prépa- ration à l'autre, la même forme et la même composition. De manière spécifique, il est possible d'ob- tenir des préparations colloïdales de ASH avec une di- 8 - mension particulaire inférieure à 3,0 yum telles que, par exemple, dans la plage de 0,2 à 3,0 Fm, de 0,03 à 0,2 pm et au-dessous de 0,03 >m Ces préparation sont appropriées, respectivement, à la visualisation scintigraphique du foie et de la rate et à l'examen scintigraphique des fonctions du système réticulo-endothélial, aux examens scintigraphi- ques de la moelle osseuse, et à l'étude par radioactivité du système lymphatique. L'invention est décrite en détail ci-dessous. Comme albumine sérique humaine, on peut utili- ser tout produit du commerce, sans purification spéciale ou traitement préalable et, notamment, sans dégraissage ou purification préalable par dialyse, ultrafiltration ou chromatographie sur colonne On en prépare donc une solu- tion aqueuse dont la concentration se situe, avantageu- sement, de 0,05 à 20 mg/ml et, de préférence, de 0,2 à 2,5 mg/ml. Pour la lyophilisation du produit colloïdal qui, si désiré, fait suite à la préparation, il s'est avéré avantageux d'ajouter à la solution obtenue une matière de charge pharmacologiquement inerte et une substance agis- sant comme stabilisateur Par l'effet de ces adjonctions, la lyophilisation donne un lyophilisat de meilleure qua- lité. C'est pourquoi, au cours du marquage avec le 99 m Tc-pertechnétate de sodium dans une solution physio- logique de sel, le produit peut être dissous plus faci- lement et il demeure un collolde stable à la valeur phy- siologique du p H En particulier, une solution aqueuse de 0,05 à 40 mg de dextrose et 0,01 à 5 mg d'inosite hexa- phosphate de sodium (phytate de sodium) par ml, de pré- -9- férence de 10 à 20 mg de dextrose et de 0,1 à 0,5 mg de phytate de sodium par ml, est appropriée pour ces adjonc- tions. A part les substances mentionnées ci-dessus, il est possible, bien entendu, d'utiliser d'autres subs- tances agissant comme matières de charge ou stabilisateurs, par exemple des dérivés d'hydrate de carbone (mannite, fructose, lactose, inosite et sorbite), la glycine, le chlorure de sodium, l'albumine sérique humaine, des phosphates, sulfates et carbonates minéraux, des acides monocarboxyliques, des phosphonates etc Des publications détaillées à ce sujet se trouvent dans les monographies suivantes: H Sucker, P Fuchs et P Speiser, éditeurs: Pharmazeutische Technologie, pages 321-332 et 620-628, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1978; P H List et L. H 5 rhammer, éditeurs: Hlagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, vol 7, pages 297-302, 4 ème édition, Springer- Verlag, Berlin 1971. Si désiré, la solubilité du produit lyophilisé peut être améliorée aussi en maintenant le produit, avant la lyophilisation, à une température constante entre 35 et 75 C pendant un laps de temps de 1 à 3 heures Par là, les particules colloldales à effet réducteur, déjà for- mées, sont stabilisées également et leur bonne solubilité ou leur bonne aptitude à être remises en suspension est maintenue. Les agents tensioactifs mis en jeu sont des substances solubles dans l'eau, non ioniques, non toxi- ques, qui sont bien tolérées dans l'administration par voie parentérale Comme on le sait, ces substances sont nommées, selon l'utilisation projetée, solubilisants, - agents mouillants, émulsifiants, agents tensioactifs, dé- tergents ou agents de solubilisation Par conséquent, on peut utiliser entre autres les substances suivantes: le Tween 80, le Carbowax ou des polyéthylène glycols de type 600, 1500 ou 4000, la poly-Nvinylpyrrolidone de type ou 40, le Plasdone de type C-15, des dérivés de poly- saccharide tels que le dextrane, des dérivés de protéine tels que la gélatine, et des polymères bloqués d'oxyde de propylène et d'oxyde d'éthylène (Pluriol-PE ou Pluro- nics de type F-38, F-88, F-98 ou F-108, Cremophor de type EL, RH-40 et RH60, et des Tergitols) On peut trouver des exemples détaillés de ces classes de substan- ces dans la monographie suivante: H P Fiedler et H v. Czetsch-Lindenwald; Lexikon der Hilfsstoffe f Sr Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Editio Cantor KG, Aulen- dorf i W Urttemberg 1971. La concentration de l'agent tensioactif dans la solution aqueuse doit être, en général, de 1 à 20 fois la concentration en ASH; de préférence, on utilise de 0,2 à 40 mg/ml de Pluronic F-88. Il s'est avéré avantageux d'utiliser des solu- tions tampon pour-maintenir strictement la vaieur pré- déterminée du p H du mélange avant la microagrégation On peut utiliser entre autres comme tampons les mélanges: bicarbonate de sodium/carbonate de sodium, borax/solution d'hydroxyde de sodium, dihydrogénophosphate (par exemple, Na H 2 PO 4)/monohydrogénophosphate (par exemple Na 2 HPO 4)/phos- phate (par exemple, Na 3 P 04), diphtalate de potassium/solu- tion d'hydroxyde de sodium, l'acétate de sodium, le tris- (hydroxyméthyl)-aminométhane (tampon Tris), l'acide 2-l 4-( 2hydroxyéthyl)-pipérazine 1-yll éthane sulfonique/ solution d'hydroxyde de sodium (tampon HEPES), etc Des il - systèmes tampon utilisables sont indiqués dans les mono- graphies suivantes: H M Rauen, éditeur: Biochemisches Taschenbuch, 2 ème édition, vol 2, pages 90-104, Springer Verlag, Berlin 1964; N E Good, G D Winget, W Winter, T N Conolly, S Izawa et R M M Singh, Biochemistry 5, 467 ( 1966); H Eagle, Science 174, 500 ( 1971). Afin de simplifier les opérations, on peut mélanger tout d'abord la solution aqueuse consistant en albumine sérique humaine, agent tensioactif non ionique et sel stanneux dans l'acide chlorhydrique, avec la so- lution tampon et ajuster ensuite exactement la valeur de p H prédéterminée à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique. Le sel stanneux peut être, par exemple,Sn C 122 H 20, un autre halogénure stanneux ou le tartrate stanneux. La valeur du p H du mélange avant la microagré- gation est ajustée entre 3,0 et 8,0, selon la dimension particulaire désirée Si l'on ne mélange pas immédiate- ment la solution tampon avec la solution aqueuse d'albu- mine sérique humaine, d'agent tensioactif non-ionique et d'ions stanneux dans l'acide chlorhydrique, l'ajustement du p H prédéterminé peut être effectué au moyen d'une solution aqueuse d'un agent tampon ou d'un agent alcalin, par exemple une solution d'hydroxyde de sodium, une so- lution d'hydroxyde de potassium, l'ammoniaque aqueuse ou une base organique Il se forme ainsi, dans chaque cas, un mélange tampon qui maintient constante la valeur désirée du p H avant la microagrégation La quantité de solution tampon ainsi formée, ou ajoutée, sera avantageusement telle que sa concentration dans la solution soit de 0,05 à 50 mg/ml. 12 - Pour obtenir des préparations colloïdales d'une dimension particulaire de 0,2 à 3,0 ym, le p H est ajusté, de préférence, dans la plage de 5,8 à 6,8 mais, par contre, il est préférable d'ajuster le p H dans les domaines de 3,0 à 5,0 ou 6,8 à 8,0 pour une dimension particulaire de 0,03 à 0,2 Pm Ces valeurs du p H sont valables, notamment, lors- que la concentration en albumine sérique humaine est de 1,0 à 3,0 mg/ml, la concentration en agent tensioactif est de 1,0 à 40 mg/ml et la concentration en sel stanneux est de 0,1 à 0,8 mg de Sn C 12 2 H 20/ml Dans le domaine de p H com- pris entre 6,0 et 6,8, on peut préparer un colloide ayant une dimension particulaire de 0,03 à 0,2 ym et, dans le domaine de p H de 6,8 à 7,5, on peut préparer un collolde ayant une dimension particulaire inférieure à 0, 03 ym, lorsque la concentration en albumine sérique humaine est de 0,2 à 1,2 mg/ml, la concentration en sel stanneux est de 0,05 à 0,4 mg de Sn Ci 2 2 H 20/ml et la concentration en agent tensioactif est de 1,0 à 40 mg/ml. L'hydrolyse des ions stanneux présents dans le mélange réactionnel commence déjà pendant que se fait l'a- justement du p H à la valeur prédéterminée au moyen de la solution tampon; l'hydrolyse complète s'effectue, en même temps que le processus complet de microagrégation, lors- qu'on chauffe la solution Comme on le sait, l'hydrolyse des ions stanneux s'effectue de façon graduelle Il est hautement probable que le traitement de la solution par la chaleur provoque, non seulement la microagrégation com- plète de l'albumine sérique, mais encore la déshydratation des hydroxydes-d'étain avec formation de produits peu so- lubles qui se trouvent présents sous forme de particules colloïdales, ensemble avec l'albumine sérique coagulée. Il est avantageux d'effectuer le traitement par la chaleur au moyen d'un four à microondes ou en chauffant 13 - sous agitation à température constante Il est important, dans le procédé, que la valeur de p H choisie soit mainte- nue strictement, pour des rapports de la concentration des composants de la réaction maintenus constants En géné- ral, la solution est maintenue à une température spécifi- que, entre 45 et 100 O C Comme on le sait, la durée du pro- cessus de microagrégation dépend de la température choisie et du volume; elle peut varier entre 2 minutes et 2 heures et elle se situe généralement dans un domaine de 5 à 45 mi- nutes On réalise une durée plus courte de la microagré- gation en effectuant le traitement à la chaleur au moyen d'un four à microondes, entre 100 et 250 O C (de 50 secondes à 30 minutes) Il s'est avéré enfin que la microagrégation des produits qu'il s'agit de préparer peut être effectuée aussi en faisant circuler la solution dans un serpentin continu utilisé comme récipient à réaction et plongé dans un bain chauffant La circulation est maintenue au moyen d'une pompe refoulante incorporée au circuit réactionnel; la température du bain chauffant est maintenue, de préfé- rence, entre 70 et 90 'C. Le produit colloïdal obtenu peut ensuite être utilisé directement pour le marquage au 99 To, ou il peut être lyophilisé et emmagasiné sous cette forme jusqu'au moment du marquage par le 99 M Tc-pertechnétate de sodium. Pour faciliter la remise en solution du produit lyophilisé avant le marquage, il s'est avéré avantageux d'ajouter au produit, avant la lyophilisation, des subs- tances agissant comme matières de charge et stabilisateurs. A cette fin, on préfère utiliser un mélange de dextrose et de phytate de sodium (inosite hexaphosphate de sodium), car on connait bien les propriétés exceptionnelles du dextrose, acceptable au point de vue pharmacologique, ainsi que les avantages qu'offre la charge sphécifique 14 - * élevée du phytate de sodium ( 6 charges négatives par molé- cule) Il en résulte que les particules colloïdales à effet réducteur, déjà formées, sont mieux stabilisées et que leur bonne solubilité ou leur bonne aptitude à être remises en suspension est maintenue. Selon un mode d'exécution particulièrement pré- féré du procédé, on utilise comme agent tensioactif non- ionique le Pluronic F-88 ou le Cremophor-EL, comme tampon le monohydrogénophosphate disodique ou le tris-(hydroxy- méthyl)-aminométhane (tampon Tris) ou l'acide 2-l 4-( 2- hydroxyéthyl)-pipérazine l-ylléthane sulfonique/solution d'hydroxyde de sodium (tampon HEPES), et comme matière de charge et stabilisateur, le dextrose et le phytate de so- dium, respectivement; on effectue la microagrégation à l'aide d'un four à microondes. A partir du produit préparé selon l'invention (sous forme d'une solution colloïdale ou sous forme lyo- philisée), on peut préparer facilement une solution col- loldale radioactive correspondante pour les examens scin- tigraphiques en traitant le produit par une solution de 99 m Tcpertechnétate, de préférence une solution de Na 99 m Tc O 4. Il ressort clairement des données analytiques figurant aux tables i et 2 que le produit colloïdal obte- nu n'est pas simplement un mélange d'albumine sérique hu- maine, d'un sel stanneux et d'autres composants, présents sous forme séparée et qui, comme tels peuvent être marqués séparément par le technétium-99 m. Un mélange préparé sans la microagrégation (produit No 4) se comporte différemment des produits pré- parés selon l'invention (produits No 1, No 2 et No 3), - en ce qui concerne tant la distribution des dimensions particulaires que la distribution biologique après le marquage au 99 m Tc Le mélange (produit No 4) se comporte comme un nécessaire (kit) à base de réactif ASH hydrosolu- ble pour l'examen du volume sanguin (produit No 5-pré- paration du commerce) D'autre part, un véritable produit colloïdal (produits No 1 à 3) est obtenu en appliquant le procédé selon l'invention La différence entre les pro- duits No 1, No 2 et No 3 selon l'invention est que le produit No 1 a été préparé de manière spécifique avec une dimension particulaire de 0,2 à 3, 0 ym, le produit No 2 a été préparé avec une dimension particulaire de 0, 03 à 0,02 pm et le produit No 3 a été préparé avec une dimen- sion particulaire inférieure à 0,03 Vm La distribution des dimensions particulaires est déterminée à l'aide d'une microfiltration à travers des filtres Nucleopore; la di- mension des pores la plus petite qui soit disponible est de 0,03 ym Le fait que le produit No 3, conforme à l'in- vention (dimension particulaire inférieure à 0,03,m), est présent sous forme d'un véritable colloîde découle de sa distribution biologique (table 2) Après injection intra- veineuse, un colloide s'accumule dans le système réticulo- endothélial par phagocytose Les données valant pour les réactifs des nécessaires disponibles dans le commerce (collo Pdes de ASH et colloldes de Sb-S) sont présentées sous forme d'un résumé ainsi que, à titre de comparaison, les données valant pour une solution de 99 m Tc-pertechnéta- te. Pour déterminer la dimension particulaire, on fait passer le produit marqué au 99 m Tc à travers des mi- crofiltres ayant une dimension définie des pores (filtres Nucleopore) L'activité de la solution est mesurée, avant et après la filtration, dans un compteur à rayons gamma et la distribution des dimensions particulaires est dé- 16 - terminée à partir de la distribution de l'activité mesurée. Pour la distribution biologique, le produit mar- 99 m qué au Te est administré par voie intraveineuse, dans la veine caudale 30 minutes après l'administration, les animaux sont sacrifiés sousnarcose à l'éther et disséqués, et l'activité présente dans les différents organes est me- surée dans un compteur à rayons gamma. Les données biologiques pour le rat, telles que mesurées 2 heures après injection sous-cutanée dans le talon de la patte arrière droite, figurent à la table 3. Il est clair que les produits No 8 à 11, conformes à l'in- vention, sont propres, entre autres,à l'examen du système lymphatique. D'après l'étude par radio-chromatographie, le rendement du marquage des produits se situe toujours au- dessus de 95 % Pour déterminer le rendement du marquage, les produits marqués au 99 m Tc sont soumis à une radio- chromatographie et le radio-chromatogramme est mesuré à l'aide d'un appareil explorateur à couche mince L'absen- ce de 99 m Tc-pertechnétate non lié peut être montrée, no- tamment, à d'aide des systèmes tampons figurant à la ta- ble 4. Pour obtenir des produits colloïdaux propres à l'administration par voie parentérale, il est nécessaire que les réactifs, les solutions et les appareils employés soient stériles et exempts de pyrogènes, et que toutes les opérations de fabrication soient effectuées en atmos- phère d'azote et dans des conditions stériles L'épreuve de stérilité est effectuée selon la Pharmacopée U S XIX 17 - et l'épreuve sur les substances pyrogènes ou leur absence est effectuée selon la Pharmacopée Européenne - Exemple 1 Solution tampon: 1,O mg de Na HCO 3 + 0,5 mg de Na OH par ml d'eau Dans un récipient à réaction fermé, de 100 ml, on introduit tout d'abord 250 mg d'albumine sérique humai- ne (correspondant à 1,25 ml d'une solution à 20 % de ASH) et 250 mg de dextrose dans 70 à 75 ml d'eau Après addition de 2,5 ml d'une solution à 0,8 % de Sn C 12 dans H Cl O,1 N, on ajuste le mélange à un p H de 6,37 à l'aide de la solu- tion tampon (quantité utilisée: 14,0 ml) On dilue à l'eau le mélange faiblement opalescent, jusqu'à un volume de ml et l'on chauffe à 80 C pendant 3 minutes On refroi- dit la suspension laiteuse à la température ordinaire et l'on chauffe à nouveau à 60 C pendant 60 minutes Avant la lyophilisation, on ajoute 10 ml d'une solution de ASH so- luble et de Na HPO (correspondant respectivement à 100 mg 2 > 4 de ASH et de Na 2 HPO 4 par ml) et on lyophilise la solution formée dans des ampoules d'une contenance de 1 ml. 1 ampoule contient: 2,5 mg de ASH sous forme colloïdale 0,2 mg de Sn C 12 2 H 20 2,5 mg de dextrose 10,O mg de ASH soluble en tant que substance de charge ,0 mg de Na 2 HPO 4 en tant que stabili- sateur Na HCO 3/Na OH en tant que tampon avant la microagrégation. Les données biologiques pour le produit marqué au 99 m Tc figurent à la table 5. 18 - Exemple 2 Solution tampon: 1,0 mg de Na HCO + 0,5 mg de Na OH par ml d'eau On opère comme décrit à l'exemple 1 et l'on ajus- te le p H à 6,98. Une ampoule contient: 0,5 mg de ASH sous forme colloïdale 0,2 mg de Sn C 12 2 H 20 2,0 mg de Cremophor RH-40 ,0 mg de ASH soluble en tant que substance de charge 10,0 mg de Na 2 HP 04 en tant que sta- bilisateur Na HCO /Na OH en tant que tampon avant la microagrégation. Pour les données biologiques, voir la table 5. Exemple 3 Solution tampon: 1,0 mg de tétraborate disodique + 0,5 mg de Na OH par ml d'eau On introduit tout d'abord 250 mg d'albumine sérique humaine et 250 mg de polyvinyl-pyrrolidone (KW 29- 32) dans 50 ml d'eau On ajoute 2,5 ml d'une solution à 0,8 % de Sn C 12 2 H 20 dans l'acide chlorhydrique 0,1 N On ajuste le p H de la solution faiblement opalescente à 6,5 à l'aide de la solution tampon (quantité utilisée: 15 ml). Après addition d'eau jusqu'à un volume de 95 ml, on chauf- fe la solution à 80 C pendant 3 minutes le traitement ul- térieur est effectué comme décrit à l'exemple 1. 1 ampoule contient: 2,5 mg de ASH sous forme colloïdale 0,2 mg de Sn C 122 H 20 2,0 mg de polyvinyl-pyrrolidone ,0 mg de ASH soluble en tant que substance de charge 19 - ,0 mg de Na 2 HPO en tant que stabi- 2 4 lisateur borax/Na OH en tant que tampon avant la microagrégation. Pour les données biologiques, voir la table 5. Exemple 4 Solution tampon: 11,92 mg d'acide 2-l 4-( 2-hydroxyéthyl)- pipérazine l-yll éthane sulfonique (HEPES) + 2,0 mg d'hydroxyde de sodium par ml d'eau Dans un récipient fermé de 100 ml, on dissout 250 mg de ASH et 250 mg de Cremophor-EL dans 50 à 60 ml d'eau On ajoute 2,5 ml d'une solution à 0,8 % de Sn C 12 2 H 20 dans H Cl 0,1 N On ajuste la valeur du p H à 6,4 par addition de la solution tampon On chauffe la solution faiblement opalescente pendant 60 secondes dans un four à microondes (puissance de sortie: 1500 watts) On ajoute à la solution laiteuse 1,5 g de dextrose et 250 mg de phyta- te de sodium anhydre On lyophilise la solution colloïdale dans des ampoules d'une contenance de 1 ml. Pour les données biologiques, voir la table 5. Exemple 5 Solution tampon: Na 2 HPO 4 +Na OH Dans un récipient à réaction fermé, de 100 ml, on dissout successivement dans 50 à 60 ml d'eau les substances suivantes: 250 mg de ASH et 250 mg de Pluronic F-88, 2,5 ml de Sn C 12 2 H 20 à 1,6 % dans HC 1 0,1 N et mg de Na 2 HP O 04 On ajuste le p H à 6,4 par addition de Na OH 0,025 N On soumet le mélange faiblement opalescent aux mêmes opérations ultérieures que décrit à l'exemple 4 et on lyophilise. - Pour les données biologiques, voir la table 5. Exemple 6 Solution tampon: 1,0 mg de tétraborate disodique + 0,5 mg de Na OH par ml d'eau Dans un récipient à réaction fermé, de 100 ml, on mélange dans 50 à 60 ml g'eau 50 mg de ASH, 200 mg de Pluronic F-68 et 20,0 mg de Sn C 12 2 H 20 dans H Cl 0,1 N On ajuste le p H du mélange à 6,9 à l'aide de la solution tam- pon et l'on dilue ensuite le mélange à 100 ml avec de l'eau. On chauffe le mélange faiblement opalescent à l'aide d'un four à microondes comme à l'exemple 4 On marque la solu- tion collodale par du 99 m Tc-pertechntate. tion collo 51 dale par du Te-pertechnétate. Pour les données biologiques, voir la table v. Solution ajuste le 1 ampoule Exemple 7 tampom: 5,0 mg de Na 2 HPO 4 et 1,0 mg de Na OH par ml d'eau On procède comme décrit à l'exemple 6 et l'on p H à 6,8. contient: 0,5 mg de ASH sous forme colloïdale 0,2 mg de Sn C 12 2 H 20 2, 0 mg de Cremophor-EL ,0 mg de dextrose 0,25 mg de phytate de sodium anhydre Na 2 HP 04/Na OH en tant que tampon avant la microagrégation. Pour les données biologiques, voir la table 5. Table 1 Mierol'iltration des produits margués au 99 m Tc par filtres Nucleopore Distribution des dimensions particulaires, en 4 6 7 Pour com- Produit No 1 2 3 4 67 arainon Colloide Collolde Collolde Mélange con Réactif ASIH ASHT colloiSb-S colloi99,qrc O l- forioe au pro soluble d'un dal du com dal du com a partir du préparé sepréparé se préSparé se c 3 vn iesie mremregnrtu lon le pro bon le pro bon le pro cdavn l u ncossair erce mregnrtu cédé Cédé c Cédd mcroagréga d orec tion 7,07 > p: 5 to 3 Pmn: à 0,2 pmn: 0, 2 pmn: 1 à 0, 1 f: 3 à 0, 2 1: > 0,2 pin: 3 à 0,jir 02 plu: > 0,2 ym:> 96.7 % O z 4 " 5 % O z oz 680 0,77 2 % ,2 pin U:O 2à 0,03 pm 0,1 à0,03 pm: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ F _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 9 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ r\) Lri b ru LY Table 2 Distribution biologique des produits marqués au 99 m Tc ( 30 minutes après adminis- tration intraveineuse), % de la dose administrée, valeur moyenne de 3 animaux _ 4 7 6-Pour com- -Produit No1 1 2 3 7 paraison Préparatison Préparation Collolde pré Collo 2 de préColloïde Mélange cornRéactif ASH coll Sb-S 99 rc O O- paré selon paré selon pre par( se forme au ASH dal du comncollo P a partir d le procédé le procédé lon le pro procédé, soluble merce dal du générateur cédé avant la d'un né commer- microagré cessaire ce gation du com- merce Dimension par 032-3,0 pm 0,03-0,2 pm inférieur à inférieur à inférieur large répar infé inférieur à ticulaire (en m 2 ym à 0,2 pn tition rieur à 0,2 Imn majeure partie (voir Tablel 2 Pm dans le domaine) 0,2-3,0 pm Données Rat Rat Souris Rat Souris Souris Souris Souris biologiques _ _. Sang 0,37 0)59 2 > 63 14,86 28; 5 1 > 06 13; 3 8,0 Poumons 0,19 0; 18 0, 27 0778 2 > 1 6; 15 1,9 172 Foie 81,48 78,78 80,04 29; 87 15,7 78,78 66,5 6 X 8 Rate 2,20 145 1,76 0,55 0,5 1158 1,2 03 Reins 0)69 5 X 33 1 X 63 10, 52 4; 9 0; 98 1,3 1,2 Estomac et 0,20 1 X 74 1; 30 3 X 39 7 > 7 2; 12 2 Y 7 39 > 5 intestin Os et moelle 6 > 07 8,89 10 X 10 14,64 27 X 9 2,66 9 > 1 5,0 osseuse 3 Musclues 0)62 2 X 59 1 X 54 8,24 01 132 O y 1 00 Urine 0, 49 3)00 2,26 13)09 i 214 2,23 4 9 11 > 4 I 22 _; l _ b., rla Ln r 1 % s J Ou Table 3 -Distribution biologique chez le rat 2 heures aprèÄs administration souu-cutanéc > de la dose administrée, valeur moyernne de 2 animaux Pour compa- Produit No 8 9 10 i 12 raison Origine Conforme au Conforme Conforme Conforme Produit du Produit du Produit du99 mrc O 4 à Origine procéde au proctdc Sau procédé au procédé coninerce conmnercecormerce irtdur gné Note ASH colloldal Sli collo Tdal ASII collolda J ASII co Wdal(bRéactif Sb-S col Soufre col 99 aetréducteur getrédua agent nducagent r\iỉacS-ns o'a odlpu néTae-prtech- agent -AI-n o odl oa CLZ éaelibre stanneux eur stannetm tour stanmeux teur sta-nneux lubie d'tu pour le le système Cremophor Pluronic Cremophor Pluronic N 4 cessarnsystme lymphat iqte tamuntipon tampon twfipon pour vlu lymiphati- al'CO 3/Na Ol I borax/Na Ol I Nalll'O,1/Na Oi Na 2 Ii P(; 4/Na Ol H me sangl que _____ Lieu de l'in- econ(talon 4 Y, 5,656,58 51120 63 > 91 52,66 71,95 3140 de la patte drite) Garglion lymphar droit 12,0 13,39 14,46 17,15 1,57 7,88 6,12 0,03 gauche 0,006 0,007 0,005 0,002 0,00102 0,0 0,01 ganglion lymphi- Mqe O > 02 0,02 0,006 0,003 o; 026 0,005 0,0 0,01 dauche 0,10030006 0,003 0,026 0,005 0 0 0,01 l'ioni il ue i iaque di'ot 2,12 1 > 00 6 51 6,22 1, 11 5,86 2,31 0,01 gauche 0 > 10 0)002 O 003 O 02 O 04 002 O P 000 ique rénal O 002 0,14 0,002 0,0 0,00 irit et gauche 0,06 0,001 0,004 0,0,4,0 0, O y O Sa 7, 411,92,82 1,20 5,98 3 45 1,35 8,65 Foie 2,74 0,35 2,28 1,22 1,78 2,93 2,26 3,48 Rate 0:08 0,01 0,9 0,04 0,3 0,38 0,03 O > 10 _ens 4, 20 _____ _____ 2 _ 1,71 3,79 0 99 0,92 1,5 w 1.J 4 24 - Table 4 Système d'épreuve par radio-chromatographie des colloi- des marqués au 99 m Te Valeur Plaque de gel de silice Whatman-ET 31 Rf revêtue, Merck acétone solution de Na Cl à 0,9 % Pertech- nétate 1,O 1,O libre Radio- isotope O,O O 0,0 lié Table 5 Résumé des exemples du brevet Données biologiques 30 minutes après administration intraveineuse, moyenne de 3 animaux Exemple No 1 1 2 4 6 7 Colloide ASH ASH ASH ASH I ASH ASH ASH ASH agent éducteur sncî 2 H O Sn CI 211 O Sn Cl 21 i OSn C 1211 O n C 1 211 O Sn Cl H Isc 2 H 0 Sn C I 2 H O S re 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 T 02 212 agent Dextrose Cremoplior Polyvinyl Cremophor Pluronic Pluronie Cremophor Pluronic mouillant RHI-40 pyrrolidone EL P-88 'F-65 EL F-68 Nal HCO 3 Na IPO + i 3 rax + IIEPES + Na IIQ 4 loax i HO 4 + Acide citri- Tampon NGOX Nal Na O Il Na Gl N a 01 Na Il Naoi que + Na Ot H c H auvane 6; 4 6,1 6 5 6,4 6,4 6,9 6,8 5,9 Substance de ASH soluble ASH soluble ASH soluble Dextrose Dextrose Dextrose ASII soluble charge Phytate de phytate de phytate de Stabilisateur Na 2 PO 4 Na 2 IP 4 Na 2 II 4 Nata Na Na 2 HF 4 cidela dstre (Souris) (Souris) (Souris) (Souris) (Souris) (Souris) (Souris) (Souris) Sang 2,78 3,10 3,41 1,61 1,18 1,10 1,82 4,36 Poumoxns 0, 36 0,54 0,32 0,37 0,94 0,17 0,73 0,52 Foie 67,35 76,45 74784 80 >; 81 80;, 81 77,772 82,21 72,17 Rate 0, 78 0 > 67 0,63 1,32 1,36 1,27 1,19 1,19 Reins 6,04 1 > 83 3,00 0,96 0 > 62 O > 61 1,56 1,91 Estomac et intestin 3 > 2 2,27 3,65 1107 1,12 1,729 0,85 2,34 Os et moelle osseuse 5 > 65 4,80 6,02 4,81 3,18 7,90 7 5,00 Muscles 1,-63 1,15 1,72 1,24 0,96 0,78 1,98 0, 90 Urine 4,44 2,38 2,16 0,33 1,50 't ' 2,00 N) r 1 j Ln % K) C) L%à 26 - Exemple 8 Solution tampon: 5,0 mg d'acide citrique monohydraté + 1,O mg d'hydroxyde de sodium par ml d'eau On procède comme décrit à l'exemple 6 et-l'on ajuste le p H à 5,9. 1 ampoule contient: 0,5 mg de ASH sous forme colloïdale 0,2 mg de Sn C 12 2 H 2 O 2,0 mg de Pluronic F-68 ,O mg de ASH en tant que substance de charge l O,O mg de Na 2 HPO 4 en tant que stabi- sateur acide citrique + Na OH en tant que tampon avant la microagrégation. Pour les données biologiques, voir la table 5. 27 - Re v e N di c a t i o N s 1 Procédé de préparation d'un produit colloi- dal susceptible de dégradation physiologique, propre à être marqué par le technétium-99 m, qui contient de l'albu- mine sérique humaine et dont la dimension particulaire est faible et la distribution des dimensions particulaires est étroite et définie, caractérisé en ce que l'on mélange une solution aqueuse d'albumine sérique humaine avec un agent l O tensioactif non-ionique et une solution aqueuse acide d'un sel stanneux, qu'on ajuste la valeur du p H du mélange ré- actionnel à une valeur de p H constante, présélectionnée, de 3,0 à 8,0, par addition d'une solution tampon, et qu'on chauffe le mélange à une température constante dans le domaine de 45 à 10 O C, par action de microondes ou sous agitation, jusqu'à ce qu'une hydrolyse complète du sel stanneux et la dénaturation simultanée de l'albumine sé- rique humaine aient eu lieu. 2 Procédé suivant la revendication l, carac- térisé en ce qu'on utilise une solution aqueuse de chlo- rure stanneux dans l'acide chlorhydrique comme solution aqueuse acide d'un sel stanneux. 3 Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on lyophilise la solution colloïdale obtenue. 4 Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce qu'on ajoute à la solution colloïdale, avant la lyophilisation, du dextrose et de l'inosite hexaphos- phate de sodium (phytate de sodium). Produit colloïdal préparé par le procédé suivant la revendication 1 ou 2 et prêt à être marqué 28 - au technétium-99 m. 6 Produit lyophilisé préparé par le procédé suivant la revendication 3 et prêt à être marqué au technétium-99 m. 7 Utilisation du produit colloïdal obtenu par le procédé suivant la revendication i ou 2 pour préparer un produit radioactif colloïdal destiné aux examens scin- tigraphiques du système réticulo-endothélial ou du système lymphatique, caractérisé en ce que l'on traite ledit pro- duit par une solution de 99 m Tc-pertechnétate. 8 Utilisation suivant la revendication 7 du produit lyophilisé obtenu par le procédé suivant la re- vendication 3, caractérisée en ce que l'on traite ledit produit par une solution de 99 m Tc-pertechnétate.