Brevet FR2512833A1 — publié le 19830318

L'invention concerne un procédé pour la détermination des transaminases, destiné à servir dans le domaine des dia- gnostics cliniques. Les transaminases glutamiques-oxalacétiques (L-asparta- tecétoglutarate-aminotransférase, EC 2 6 1 1) appelées GOT, AST ou AAT, existent sous deux formes qui se distinguent électrophorétiquement avec un emplacement subcellulaire dif- férent: 1) un isoenzyme cationique associé à la mitochondrie (m-GOT); 2) un isoenzyme anionique présent dans le cytoplasme (s-GOT). On utilise largement la mesure de l'activité totale de GOT dans le plasma pour le diagnostic de l'infarctus du myo- carde et on utilise aussi son niveau d'activité dans des li- quides physiologiques pour le diagnostic d'autres formes pa- thologiques, spécialement au niveau du foie ou de la muscula- ture squelettique. Les méthodes de détermination actuellement utilisées dans la pratique clinique permettent de mesurer sur des échan- tillons biologiques l'activité totale de l'enzyme, somme des deux isoenzymes. Il est important de distinguer l'activité relative des deux formes isoenzymatiques de transaminase glutamique-oxala- cétique afin d'obtenir un moyen d'investigation plus perfec- tionné en ce qui concerne l'état de nécrose des tissus. On a noté pour d'autres enzymest par exemple la déshy- drogénase lactique (LDH) et la créatine-kînase, que la déter- mination de l'activité relative aux différentes formes isoen- zymatiques permet un plus grand pouvoir de discrimination dans l'application diagnostique. Les méthodes de dosage qui existent actuellement pour les deux formes enzymatiques cytoplasmique et mitochondrienne, des transaminases glutamiques-oxalacétiques sont basées sur des techniques électrophorétiques, chromatographiques ou immu- nologiques dans lesquelles il est nécessaire de séparer d'abord l'un des isoenzymes de l'autre. La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage qui permet de déterminer individuellement l'activité des deux isoenzymes dans des échantillons de sérum oi de plasma sans qu'il soit nécessaire de séparer les deux isoen- zymes. Le procédé est basé essentiellement sur la réaction bien connue du O-sulfate de L-sérine sur la transaminase glutamique-oxalacétique cytoplasmique du porc qui, après dif- férents temps d'incubation, est désactivée par formation d'une liaison covalente entre un dérivé du substrat et un groupe réactif vis-à-vis du site actif de l'enzyme (R A. John, P Fasella: "The reaction of L-serine-0sulphate with Aspartate Aminotransferase", Biochemistry, volume 8, n 11, Novembre I 969). Au cours d'expériences, on a trouvé, contrairement à l'attentes que les conditions d'incubation pour la désactiva- tion de l'isoenzyme cytoplasmique humain en présence de l'iso- enzyme mitochondrien ne déterminent aucune perte d'activité de cette dernière. Il est donc possible, en déterminant l'activité GOT existant dans le plasma ou le sérum, avant et après incubation avec le 0-sulfate de Lsérine, de déterminer dans le premier cas l'activité totale des deux isoenzymes et dans le deuxième cas (après incubation avec le 0-sulfate de sérine), l'activité de l'isoenzyme mitochondrien seul Par simple différence, on obtient la valeur de l'activité de l'isoenzyme cytoplasmique. Les conditions expérimentales d'analyse pour la déter- mination de l'activité des deux isoenzymes de GOT, mitochon- drien et cytoplasmique, sont décrites 'ci-après. Pour la détermination dans le sérum ou le plasmas il est préférable de procéder en utilisant deux portions identi- ques du même échantillon dont l'une sert à déterminer l'acti- vité totale (somme des deux isqenzymes) tandis que d'après l'autres après incubation préalable avec le 0-sulfate de séri- ne, on obtient la valeur de l'isoenzyme mitochondrien seul. Du même échantillon de sérum ou de plasma, on retire 0,5 ml que l'on place dans deux tubes à essais différents. Dans le premier tube à essai (A), on ajoute 25 b 1 d'une solu- tion 2 M de 0-sulfate de sérine dans H 20 de manière à obtenir une concentration finale de O-sulfate de sérine d'environ m M, sans dilution excessive de l'échantillon Dans le deuxième tube à essai (B), on ajoute 25 h 1 de H 20 pour obtenir la même dilution que l'on a obtenue en ajoutant le O-sulfate de sérine dans le tube (A) On laisse incuber pendant 30 minutes à la température ambiante ou pendant minutes à 30 C Au bout de ce temps, la réaction est complète, c'est-à-dire que dans le tube (A), un composé dérivé du O-sulfate de sérine (acide aminoacrylique) a formé une liaison covalente avec un groupe présent au site actif de l'isoenzyme cytoplasmique, inactivant celui-ci complete- ment et irréversiblement, tandis que ce temps d'incubation ne permet pas une inhibition analogue de ltisoenzyme mito- chondrien. On détermine donc l'activité dans les deux tubes à essai en utilisant la méthode de Karmen, c'est-à-dire en suivant la consommation de la forme réduite du nicotinamide -adénine-dinucléotide (NADH) dans la réaction couplée de la transaminase glutamique-oxalacétique avec la déshydrogénase malique. D'après la différence des densités optiques à 340 nm par minute, on obtient les valeurs des unités enzymatiques par litre de sérum ou de plasma, comme suit: Tube à essai (B) = unités totale/1 (isoenzyme cytoplasmique + isoenzyme mitochondrien), Tube à essai (A) = unités/il de l'enzyme mitochondrien seul. D'après la différence: unités/1 (B) unités/ (A), on obtient le nombre d'unités/ 11 de l'isoenzyme cytoplasmique qui a été complètement inactivé dans le tube à essai (A). Exemple Afin de démontrer la validité de la méthode et d'illustrer son application, on prépare 5 lots de sérum hu- main contenant différentes quantités des deux isoenzymes. La matrice des 5 lots est formée de sérum humain ayant la plus faible activité endogène ( 5 U/l) A ce sérum, on ajou- te différentes quantités des deux isoenzymes, purifiées par la méthode de E J Sampson et al (Clin Chem 24, I 805, 1978). A la fin, les 5 lots sont constitués comme suit: lot n 1: 120 U/ ld'isoenzyme cytoplasmique seulement lot no 2:112,5 U/1, dont 90 U/1 d'isoenzyme cytoplasmique et 22,5 U/ ld'isoenzyme mitochondrien lot n 3: 105 U/ Idont 60 U/1 d'isoenzyme cytoplasmique et U/1 d'isoenzyme mitochondrien lot n 4: 97,5 U 1 i dont 30 U/1 d'isoenzyme cytoplasmique et 67,5 U/ ld'isoenzyme mitochondrien lot no 5: 90 U/1 d'isoenzyme mitochondrien seulement. En passant à la détermination des activités isoenzy- matiques selon la méthode décrite, on obtient les résultats indiqués par le tableau sous forme de moyenne de six déter- minations différentes (dans le tableau, l'isoenzyme cyto- plasmique est indiquée par s-GOT et l'isoenzyme mitochondrien par m-GOT). TABLEAU Valeur Théo- rique U/ (page 6) lot n 1: lot n 2: lot n 3: lot n 4: lot n 5: activité totale s-GOT m-GOT activité totale s-GOT m-GOT activité totale sGOT m-GOT activité totale s-GOT m-GOT activité totale s-GOT m-GOT 112,5 22,5 97,5 67,5 9 o Données expéri- mentales, U/1 118,5 118,5 114,7 91,2 I 03,1 57,3 47,1 101,3 31,3 67,9 88,14 88,4 D'après la comparaison entre les données expérimentales ainsi obtenues et les données théoriques concernant la compo- sition isoenzymatique, la validité du procédé ainsi que sa précision sont évidentes. REVENDICATIONS 1) Procédé pour la détermination des activités enzyma- tiques individuelles des izoenzymes cytoplasmique et mitochon- drien de la transaminase glutamique-oxalacétique (GOT) dans des échantillons de sérum ou de plasma, caractérisé en ce que l'on détermine l'activité GOT existant dans le sérum ou le plasma avant et après incubation avec du 0-sulfate de L-sérine pour obtenir dans le premier cas une valeur d'activité enzymatique correspondant à l'activité totale des deux isoenzymes et dans le deuxième cas une valeur d'activité enzymatique correspon- dant à l'activité de l'enzyme mitochondrien seulement, l'acti- vité de l'isoenzyme cytoplasmique étant donnée par la diffé- rence des deux valeurs susdites. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la détermination sur deux portions identi- ques d'un meme échantillon de sérum ou de plasma. 3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on effectue la détermination des activités enzy- matiques après consommation de la forme réduite de nicotina- mide-adénine-dinucléotide (NADH) dans la réaction couplée de GOT avec la déshydrogénase malique. 4) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on obtient l'inactivation de ltisoenzyme cytoplasmique par le 0-sulfate de L-sérine par incubation pendant 30 minu- tes à la température ambiante. ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on obtient l'inactivation de l'isoenzyme cytoplasmatique par le 0-sulfate de Lsérine par incubation pendant 20 minutes à 30 C. 6) Nécessaire diagnostique pour la détermination des activités enzymatiques individuelles des isoenzymes cytoplas- mique et mitochondrien de GOT par un procédé selon l'une quel- conque des revendications 1 A 5, caractérisé en ce qu'il com- prend, en tant que l'un de ses constituants, du 0-sulfate de L-sérine.