Brevet FR2498626A1 — publié le 19820730

L'invention concerne un procédé pour préparer ou obtenir des cellules hybrides productrices d'un anticorps, procédé selon lequel: (a) on immunise des souris à l'aide d'un antigène, (b) on isole un mélange de lymphocytes des souris, (c) on fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris, (d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de;myélome B non hybridées dans un milieu de cul- ture pour les hybrides formés, on cultive les hybrides formés et on les sélectionne par rapport aux cellules de myélome B non hybridées, (e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui pro- duisent les anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène, et (f) on isole éventuellement les hybrides, le procédé étant caractérisé en ce que, à l'étape (d), on ef- fectue la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellu- lose et l'on injecte éventuellement les hybrides [qui ont été sélectionnés à l'étape (d)Jdans la cavité abdominale ou péri- tonéale de souris (qui ont été, au préalable, traitées par un stimulateur de tumeurs), on retire de la cavité péritonéale les hybrides qui se sont multipliés et l'on effectue ensuite les étapes (e) et (f) de sous-clonage et d'isolement. Pour l'immunisation, pour l'isolement d'un mélange de lymphocytes de la rate, pour effectuer une fusion ou une hybridation, pour cultiver les hybrides et les sélectionner, pour sous-cloner les hybrides qui produisent l'anticorps voulu, et pour isoler ces hybrides ou l'anticorps, l'homme du métier dispose de procédés correspondants. Pour effectuer une fusion ou hybridation et pour cultiver les hybrides formés, on peut se référer par exemple à HIlhler et collaborateurs, Nature (Londres),256 (1975) 495-497; Kbhler et collaborateurs, Eur. J. Immunol., 6 (1976) 511- 519 et Hochkeppel et collaborateurs, Eur. J. Biochem., 118 (1981) 437-442. Pour sélectionner, sous-cloner ou mono-cloner et pour isoler les hybrides et l'anticorps, on peut se référer par exemple à Secher et collaborateurs, Nature (Londres),285 (1980) 446-450 et Hochkeppel et collaborateurs, loc. cit., pour la notion du sous-clonage ou du mono-clonage, on se re- portera enfin à Vernon et collaborateurs dans: Mishell & Shiigi,Selected Methods in Cellular Immunology [Méthodes choi- siesA'immunologie cellulaire] 373-397, Freeman & Co., San Francisco 1980. Lors de l'étape du sous-clonage ou du mono- clonage, on peut suivre à l'aide d'un test d'activité de l'an- ticorps (inhibition de l'activité de l'antigène), par exemple selon les méthodes de Havell et collaborateurs, J. Antimicrob. Ag. Chemotherap., 2 (1972) 476-484, l'apparition d'une lignée cellulaire stable capable d'une production d'anticorps stables. A propos de la notion des cellules de myélome, voir, par exemple, Milstein, Scientific American, 243 (Octobre 1980) 56-64. On peut obtenir des cellules de myélome par exemple selon Groth & Scheidegger, J. Immunological Methods, 35 (1980) 1-21. Des exemples de cellules de myélome B ressortent du tableau suivant. L'homme du métier peut rechercher une souche con- venable de souris en vérifiant si les cellules de myélome B qu'il a choisies peuvent former des hybrides avec des lympho- cytes B de la souris d'essai. Avantageusement, on utilise des souris Balb/e et des cellules de myélome B de souris Balb/c, car ces souris sont tout à fait classiques dans les essais sur les animaux. On peut obtenir de telles souris dans le commerce et elles peuvent provenir par exemple du "Zentralinsti- tut fur Versuchstierzucht (Institut central d'élevage d'ani- maux d'essai)/Hannovre. Il peut Ptre avantageux d'introduire l'antigène servant à l'immunisation sous forme adsorbée sur un tamis mo- léculaire. De préférence, on effectue plus d'une fois l'immu- nisation. Dans le cas de l'interféron humain, on effectue la dernière immunisation de préférence à l'aide d'interféron hu- main dont la partie sucre a été enlevée. On peut effectuer l'enlèvement de la partie sucre, par exemple selon les métho- des de Bose et collaborateurs, J. Biol. Chem., 251 (1976) 1659-1662. On effectue la dernière immunisation de préférence quatre jours environ avant l'isolement du mélange des lympho- cytes. Avantageusement, on isole le mélange de lymphocytes de souris femelles, en particulier des souris Balb/c femelles. Les souris femelles présentent une immuno-réaction plus rapide. Nom scienti- Identification fique Source d'obtention de la source d'obtention (a) FO F.-Miescher-Institut/Bâle (Institut F. Miescher) CNCM/Paris I-153 (b) P3-X 63 Institut fur Immunologie Ag 8 (Institut d'immunologie)/Bâle Institut fur Genetik (Institut de génétique)/Cologne (c) P3-NS 1-1 Institut fur Immunologie/Bâle Institut fur Genetik/Cologne Lorsque l'on effectue la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et/ou sans macrophages, les cellules hybrides formées sont particulièrement ménagées. Le terme "méthylcellulose" englobe également des méthylcelluloses substituées comme, par exemple, de la carboxyméthylcellulose. Un exemple de méthylcellulose est "Methocel MC" (4000 cP; Fluka). Un exemple d'un milieu convenable est le milieu HAT; voir Hochkeppel et collaborateurs, endroit cité. On peut obtenir une bonne stabilisation des hybrides sélectionnés lorsque i 'on injecte les hybrides sélectionnés dans la cavité péritonéale de souris qui ont été au préalable pré-traitées à 1 'aide d'un stimulant de tumeur. On peut par exemple sélectionner durant quatre jours environ avant d'in- I -1 jecter les hybrides sélectionns,ans la cav it: pf;ritonéale de souris. Les hybrides qui se sont multipliés et ont été re- tirés de la cavité péritonéale sont ensuite soumis aux étapes de sous-clonage et d'isolement du procédé selon l'invention. Un exemple d'un stimulant usuel de tuie.ir sera encore indiqué dans ce qui suit. L'homme de l'art est fam.iliarisé avec les méthodes à appliquer; voir, par exemple, Secher et collabora- teurs, Nature (Londres), 285 (1930) 4-146-450. Par exemple, les souris Balb/c admettent un hybride qui a été obtenu à partir de lymphocytes B de souris Balb/c et de cellules de myélome B de souris Balb/c. En outre, on peut obtenir de bons résultats lorsque l'on injecte un stimulant de tumeur ou un adjuvant puis des hybrides sous-clonés, producteurs de l'anticorps, dans la ca- vité péritonéale de souris, que l'on retire les hybrides qui se sont multipliés et que l'on isole éventuellement l'anticorps. Les développements précédemment exposés pour l'injection d'hy- brides sélectionnés valent de manière correspondante. Le té- traméthyl-2,6,10,14 pentadécane constitue un exemple d'un sti- mulant usuel de tumeur et l'adjuvant de Freund constitue un exemple d'un adjuvant usuel. Pour l'injection d'hybrides sélectionnés ou d'hybri- des producteurs de l'anticorps, on utilise de préférence des souris femelles, notamment des souris Balb/c. L'invention concerne en outre un hybride producteur d'anticorps (dirigé spécifiquement contre l'interféron de fi- broblastes humains = Hu-IFN-bêta), que l'on peut obtenir en: (a) immunisant des souris a l'aide d'interféron de fibroblastes humains et puis, de façon connue en soi (b) isolant un mélange de lymphocytes des souris, (c) fusionnant ou hybridant des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris, (d) transférant le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de cul- ture des hybrides formés, en cultivant les hybrides formés et en sélectionnant par rapport aux cellules de myélome B non hybridées, (e) en sous-clonant pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dirigé spécifiquement contre l'inter- féron de fibroblastes humains, et (f) en isolant éventuellement ces hybrides. L'invention concerne en outre des hybrides présen- tant les caractéristiques essentielles de ceux déposés sous la désignation "I-154" de production d'un anticorps mono-clonal, à activité dirigée spécifiquement contre l'interféron de fi- broblastes humains, et les hybrides provenant de ce dépôt. L'invention concerne en outre des hybrides produc- teurs d'un anticorps (dont l'activité est dirigée spécifique- ment contre de l'immun-interféron humain = Hu-IFN-gamma), ces hybrides pouvant être obtenus lorsque: (a) on immunise des souris avec de l'immun-interfé- ron humain puis, de façon connue en soi (b) on isole un mélange de lymphocytes des souris, (c) on fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris, (d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de cul- ture des hybrides formés, on cultive les hybrides formés et on les sélectionne par rapport à des cellules de myélome B non hybridées, (e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dont l'activité est spécifiquement di- rigée contre.l'inmmun-interféron humain, et (f) on isole éventuellement ces hybrides. L'invention concerne en outre des hybrides produc- teurs d'un anticorps (dont l'activité est spécifiquement di- rigée contre l'interféron de fibroblastes humains) ou un anti- corps (dont l'activité est spécifiquement dirigée contre de l'immuninterféron humain), que l'on peut obtenir en effectuant, dans l'étape (d) la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et en injectant éventuellement les hybrides (qui ont été sélectionnés lors de l'étape (d)) dans la cavité péritonéale de souris (qui ont été au préalable pré-traitées à l'aide d'un stimulant de Uumeur), en retirant de la cavité péritonéale les hybrides qui s'y sont multipliés et en effec- tuant ensuite les étapes (e) de sous-clonage et (f) d'isole- ment. L'invention concerne en outre un anticorps mono-clonal, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'interféron de fibroblastes humains (Hu-IFN-bâta) et que l'on peut obtenir en: (a) immusisant des souris à l'aide dl'im.iun-inter- féron humain puis, de façon connue en soi (b) isolant un mélange de lymphocytes des souris, (c) fusionnant ou hybridant des lymphocytes B avec ses cellules de myélome B de souris, (d) transférant le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de cul- ture des hybrides formés, en cultivant les hybrides formés et en les sélectionnant par rapport à des cellules de myélome B non hybridées, (e) en sous-clonant pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dont l'activité est spécifiquement di- rigée contre l'interféron de fibroblastes humains, et (f) éventuellement en isolant l'anticorps. L'invention concerne en outre un anticorps monoclo- nal, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'immun- interféron humain (Hu-IFN-gamma) et que l'on peut obtenir en: (a) immunisant des souris à l'aide d'immun-interfé- ron humain puis, de façon connue en soi (b) isolant un mélange de lympho ytes des souris, () fusionnant ou hybridant des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris, (d) transférant le mélange des hybrides formés et des cellules de riyélome B non hybridées dans un milieu de cul- ture des hybrides formés, en y cultivant les hybrides formés et en les sélectionnant par rapport à des cellules de myélome B non hybridées, (e) en sous-clonant pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dont l'activité est spécifiquement di- rigée contre l'iminun-interféron humain, et (f) éventuellement en isolant l'anticorps. L'invention concerne en outre des anticorps mono- clonaux, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'interféron de fibroblastes humains ou spécifiquement diri- gée contre de l'immun-interféron humain, et que l'on peut ob- tenir lorsque, dans l'étape (d), on effectue la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et que l'on injecte éventuellement les hybrides (qui ont été sélectionnés au cours de l'étape (d)) dans la cavité péritonéale de souris (qui ont été au préalable prétraitées par un stimulant de tumeur), que l'on retire de la cavité péritonéale les hybrides qui s'y sont multipliés et que l'on effectue ensuite les étapes (e) de sous- clonage et (f) d'isolerient. Pour d'autres détails concernant la possibilité d'ob- tenir des hybrides qui produisent des anticorps dont l'activi- té est spécifiquement dirigée contre de l'interféron de fibro- blastes humains ou spécifiquement contre de l'immun-interféron humain, ou concernant la possibilité de produire de tels anti- corps, on se reportera au procédé général selon l'invention pour obtenir des cellules hybrides qui produisent un anticorps. Les anticorps s'édifient à partir d'un domaine qui leur est commun à tous et d'un domaine variable par lequel ils se distinguent. Dans le cas des anticorps mono-clonaux, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre de l'interféron de fibroblastes humains ou spécifiquement contre de l'immun- interféron humain, le domaine variable est spécifique de l'in- terféron de fibroblastes humains ou de l'immun-interféron humain; voir, par exemple, Milstein, Scientific American, 243 (Octobre 1980) 56-64. Pour identifier de l'interféron de fi- broblastes humains, voir par exemple Goeddel et collabora- teurs, Nucleic Acids Research, 8 (18) (1980) 4057-4074 et, pour identifier de l'immun-interféron humain, voir par exem- ple Yib et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (1981) 1601 - 1605. Cellules de myélome B (F0) et cellules d'hybridone utilisées. Les cellules utilisées ont été déposées à la Collec- tion Nationale de Cultures de Microorgariismies/Paris, et elles ont reçu les désignations suivantes de dépôt: Cellules Désignation de dépôt (1) Cellules de myélome B (FO) 1-153 (2) Cellules d'hybridome pour Hu-(IPNbgta) 1-154 (3) Cellules d'hybridome pour Hu-(IFN-gamma) Obtention et description des cultures: (1) Obtenuesà l'origine par Groth & Scheidegger, Journal of Immunological Methods, tomre 35 (1980) 121. (2) Obtenues par fusion de (1) avec des lymphocy- tes B de souris Balb/c, qui ont été immunisées avec de l'in- terféron de fibroblastes humains. (3) Obtenues par fusion de (1) avec des lymphocy- tes B de souris Balb/c qui ont été immunisées avec de l'immun- interféron humain. Milieu utilisé pour la culture: Milieu de Dulbecco modifié par Iscoves (IMDM), Gibco Laboratories, catégorie ng 430-2200, avec 10 % de sérum de foetus de veau et 50 pg/ml de gentamycine; on peut aussi utiliser le milieu RPMI. Concentration en hydrogénocarbonate de sodium 3,024 g de NaHCO3/litre à pH 7,0. Sérum utilisé pour la croissance des cellules: sérum de foetus de veau à 10 % (Seromed Co.). Composition des solutions pour les dispersions de cellules: également du milieu IMDM avec 10 % de sérum de foe- tus de veau. Température optimale de croissance: 37 C. Croissance de la culture en suspension: La concentration des cellules de départ se situe au mieux dans la zone de 103-104 cellules/ml; la récolte s'ef- 6 5 fectue à 10, au plus tôt à partir de 10 cellules/ml. L'es- pace de temps entre le début de la culture et la récolte est d'environ une semaine. Transfert des cellules: Les cellules peuvent adhérer partiellement à la sur- face du récipient de culture de tissus. Pour le transfert, on ne doit pas utiliser de trypsine mais au contraire détacher avec précaution les cellules de la surface en appliquant à la surface plusieurs gouttes du milieu de culture de tissus. Congélation des cellules: On sépare les cellules par centrifugation, on verse le milieu IMDM et l'on ajoute 1 ml de sérum de foetus de veau/ DMSO (diméthylsulfoxyde) (95 %/5 %) au culot ou à la pastille de centrifugation. Puis l'on congèle lentement en vapeur d'a- zote ou à -702C et l'on maintient durant un jour en vapeur d'azote ou à 7OqC, et l'on conserve ensuite dans de l'azote liquide. La composition du milieu de suspension est de 95 % de sérum de foetus de veau et 5 % de DMSO; la concentration des cellules est de 10 cellules/ml. Décongélation des cellules On verse les cellules dans IMDM glacé, puis l'on centrifuge à 1000 tr/min durant 10 ninutes et l'on remet en suspension dans IMDM tiède comportant 10 % de sérum de veau au bout d'un jour, il faut remplacer à nouveau le milieu. Remarques: On doit fournir du milieu tous les trois jours envi- ron aux cellules en cours de croissance. Au bout d'une semaine environ, il est nécessaire de remplacer complètement le milieu. Puisque toutes les cellules n'adhèrent pas à la surface, il faut séparer les cellules par centrifugation lorsque l'on rem- place le milieu. L'invention sera maintenant décrite plus en détail en regard des sept figures annexées et de deux exemples. Voici quelques détails concernant plus spécialement les figures annexées. La figure 1 concerne l'im.,unordaction de IFN-bê:a "en forme de tache" avec de l'anti-(Hu-IFN-b&ta) mono-clonal dans ELISA. Sur la figure 2: (a) concerne de l'IFN-bêta non purifié (quatre jours d'autoradiographie), (b) concerne de l'IFN-bêta non purifié (un jour d'autoradiographie), (c) concerne IFN-bêta immunoadsorbé de manière spé- cifique (quatre jours d'autoradiographie), et (d) désigne des protéines normales, marquées par 4C, pour la détermination du poids moléculaire (PM). La figure 3 montre le profil d'élution, sur "Sephadex G200") de (A) une immunoglobuline M (IgM), anticorps anti- (IEN-bêta) purifié, en comparaison d'une IgM témoin (B), et l'activité de neutralisation (de l'activité antivirale de IFN- bêta) des fractions individuelles. Les ordonnées de droite indiquent le coefficient d'absorption, ou absorbance, à 280 nm (courbes en trait plein), cependant que les ordonnées de gan- che indiquent le pourcentage d'inhibition à la dilution de 1:30 de l'anticorps (courbe en trait mixte), les abscisses indiquant le numéro des fractions, et la flèche horizontale le sens de l'élution. La ligne en pointillé indique le volume vide ou d'exclusion. La figure 4 montre le profil d'élution, sur "Sephadex G200", de l'immunoglobuline IgM anti-(Hu-IFN-gamma) (on trait plein), et de l'immunoglobuline M (IgM témoin) (en pointillé). Les abscisses indiquent le numéro de la fraction (la flèche horizontale montrant le sens de l'élution), et les ordonnées l'absorbance de la protéine (à 280 nm), la flèche horizontale à deux têtes indiquant le volume vide ou d'exclusion. La figure 5 montre une réaction ELISA de l'anti- (Hu-IFN-gamma) humain avec Hu-IFN-gamma qui a été transféré d'un gel de polyacrylamide SDS (sans traitement préliminaire par du bêta-mercaptoétlhanol) sur des bandes de nitrocellulose. a) concerne Hu-IFN-gammrina plus de l'anti-(Hu-IFN- gamma) mono-clonal, b) concerne Hu-IFN-gamma plus du milieu (témoin négatif), et c) concerne des protéines témoins marquées par 14C. Les poids moléculaires sont indiqués en PM. La figure 6 montre une réaction ELISA comme sur la figure 2, mais après un traitement préliminaire par du bêta- mercaptoéthanol de llu-IFN-gamma pour l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS. a) concerne Hu-IFN-gamma plus de l'anti-(Hu-IFN- gamma)mono-clonal, et b) concerne des protéines normales colorées par du noir d'amide. PM désigne les poids moléculaires. La figure 7 est un autoradiogramme d'un gel de po- lyacrylamide SDS (sans traitement préliminaire par du bêta- mercaptoéthanol de Hu-IFN-gamma) de Hu-IFN-gamma marqué par de l'iode 125 et précipité à l'aide d'anti-(Hu-IFN-gamma). a) concerne Hu-IFN-gamma, marqué par de l'iode 125 et spécifiquement précipité; b) est une matière protéinique "de lavage", à ad- sorption non spécifique; c) est une préparation de Hu-IFN-gamma, marque par de l'iode 125 mais non traité; et d) désigne des protéines normales marquées par 14C. PM indique les poids moléculaires. Exemple 1. On immunise une souris femelle Balb/c quatre fois au total avec de l'interféron de fibroblastes humains (IFN- bêta) à la dose de 1 pg par immunisation.- Pour le début de l'immunisation, on utilise de l'IFN-bêta fortement purifié, qui est lié sur une matière pour colonnes "Blue Sepharose"'. On injecte chaque semaine à la souris ce complexe matière de colonne "Blue Sepharose"/IFN-bêta (mélangé à de l'adjuvant). De cette façon, on stabilise d'une part IFN-bêta contre une dégradation enzymatique et l'on élèv, d'autre part nette;ent le caractère antigénique de IFN-bta. La dernière imrunisa- tion est effectuée, quatre jours avant l'isolement d'un mélan- ge de lymphocytes, à l'aide de IFN-b'ta non fixé sur une co- lonne et dont la partie sucre a été enlevée. Quatre jours après la dernière immnunisation, on en- lève la rate, on isole un mélange de lymphocytes, puis l'on fusionne des lymphocytes B avec des cellules de m.yélome B (F0PO) et l'on cultive une à deux sem.aines dans du milieu HlAT avec de la méthylcellulose. On isole ensuite à l'aide de ca- pillaires stériles les cultures d'hybridome en cours de crois- sance et on les sous-clone dans un milieu HAT sans méthylcel- lulose. Les colonies qui se développent alors sont soumises à des essais de production d'anticorps spécifiques. Les essais sont effectués au cours d'un dosage d'interféron antiviral sur des cellules de fibroblastes humains FS4 selon Havell et collaborateurs; J. Antimicrob. Ag. Chemotherap., 2 (1972) 476-484. On mesure l'inhibition, par l'anticorps mono-clonal, du pouvoir protecteur de l'interféron de fibroblastes contre du virus VSV (virus de stomatite vésiculaire; voir tableau I). On établit l'existence de plusieurs lignées d'hybridomes sta- bles de souris. On ne constate pas de réactions croisées avec de l'interféron de leucocytes purifiés; voir tableau II. L'action antivirale de l'interféron peut également, après dé- gradation de la partie sucre de l'interféron de fibroblastes par un mélange d'enzymes capables de dégrader du sucre, être encore inhibée par les anticorps spécifiques; voir tableau II. Par la réinjection de cellules stables d'hybridomes (qui * séparent les anticorps mono-clonaux spécifiques) dans la cavi- té péritonéale de souris femelles Balb/c et l'obtention d'une tumeur ascitique, on peut extraire de la cavité abdominale ou péritonéale des souris Balb/c, après environ quatorze à vingt et un jours, un anticorps enrichi en activité spécifique contre l'interféron de fibroblastes humains, qui est capable d'inhiber l'interféron de fibroblastes, dans un dosage anti- viral, entièrement,même à une dilution de l'anticorps de 1:30 voir le tableau III. On démontre la spécificité de l'anticorps à l'aide de la méthode connue de preuve ELISA. Pour cela, on sépare par électrophorèse de l'interféron de fibroblastes humains partiellement purifié, tout d'abord sur un gel de SDS selon Lâmmli (Nature, 227 (1970) 680-685) (parallèlement avec des protéines normales) puis l'on transfère par électrophorèse selon Towbin et collaborateurs (Proc. Natl. Sci. USA 76 (1979) 4350-4.354) sur des bandes de nitrocellulose. Alors que la par- tie en forme de tache comportant des protéines normales est colorée par du noir d'amide, on soumet la partie formant des taches et comportant de l'interféron de fibroblastes à la technique ELISA et, selon Towbin et collaborateurs, on visua- lise à l'aide d'anticorps IgG-antisouris de lapin, conjugués à de la peroxydase, et avec de l'o-dianisidine comme substrat d'enzyme, en une bande fortement colorée en brun; voir fi- gure 1. TABLEAU I Provenant de l'hybridome Activité antivirale de (série de dilution) IFNbéta normal (%) 1:3 20 1:6 40 1:10 70 1:20 90 témoin, sans anticorps 100 TABLEAU il Echantillon Protection antivirale de cellules FS4 contre - VSV,(ô l_, 1 IFN-bêta 100 2 Fraction protéinique de IFN-bêta 100 3 IFN-b6ta + anticorps mono-clonal contre IFN-btta O 4 IFN-bêta + anticorps mono- clonal (traité à la trypsine) contre IFN-bêt a 100 Fraction protéinique de IFN-bêta + anticorps mono-clonal contre IFN-bgta O 6 IFN-alpha + anticorps mono-clonal contre IFN-b8ta 100 TABLEAU III IgM d'hybridome mono-clonal Activité antivirale de contre IFN-bêta IFNbêta normal (%) 1:3 30 1:6 50 1:15 70 1:30 90 témoin, sans anticorps 100 L'anticorps mono-clonal selon l'invention peut ser- vir à séparer spécifiquement de l'interféron de fibroblastes humains à partir d'un mélange de matières contenant cet inter- féron, et ainsi à purifier l'interféron. On a fixé de l'anticorps mono-clonal contre IFN-bêta sur de la "Sepharose-4B" activée par CNBr; on a vérifié l'immu- noadsorption spécifique de IFN-bêta par cette colonne d'anti- corps. Pour cela, on a marqué par 125I (selon Hunter et colla- borateurs, Nature, 194 (1962) 495-496) un échantillon de IFN- bêta. non purifié. On a ensuite chargé cet échantillon de IFN- bêta marqué par 125I sur la colonne d'anticorps et on a ensuite lavé de façon poussée avec TBS neutre (solution saline tampon- née, avec du tris) pour enlever de la. protéine non spécifique- ment liée. On a ensuite élué avec dlu tampon à 0,1 m de gly- cine/HCl (pH 2,3) IFN-bSta marqué par 12-I et spécifiquement lié, on l'a concentré par lyophilisation puis on l'a séparé par électrophorèse sur un gel de SDS-polyacrylamide, parallè- lement avec du IFN-bêta marqué par 125-I non purifié et avec des protéines normales marquées par 14-C pour détermination du poids moléculaire (Laemmli, Nature (Londres), 227 (1970) 680-685). Puis l'on a autoradiographié le gel. La figure 2 montre nettement que IFN-bêta est spécifiquement lié par la colonne de "Séphlarose" traitée par CNBr et comportant de l'an- ti-(Hu-IFN-bgta) mono-clonal. On a ensuite purifié l'anticorps du liquide de l'asci- te avec du sulfate d'ammonium à 35 % et par une étape subsé- quente sur une colonne de "Sephadex-G200". Le profil d'élution sur "Sephadex-G200" a montré qu'il s'agit, pour l'anti-(Hu- IFN-bêta) mono-clonal, d'une immunoglobuline IgM; voir figu- re 3. Exemple 2. On immunise selon l'exemple 1 une souris femelle Balb/c, sauf que l'on utilise de l'immun-interféron humain (Hu-IFN-gamma) jusqu'à établir dans le sérum de la souris la présence d'un titre positif en anticorps contre Hu-IFN-gamma. Quatre jours avant l'isolement d'un mélange de lymphocytes de la rate de la souris Balb/c immunisée, on effectue une der- nière immunisation "de rappel" (Booster). Quatre jours plus tard, on isole le mélange de lymphocytes de la rate, puis l'on fusionne des lymphocytes B avec des cellules de myélome B [FO (Groth et Scheidegger) 1980), J. Immunol. Methods 35, 1-25)] (voir Hochkeppel et collaborateurs, Europ. J. Biochem., 118 (1981) 437-442) et l'on cultive durant cinq jours dans un mi-. lieu HAT avec 1 % de méthylcellulose et 20 % de sérum de foetus de veau. Pour une meilleure multiplication des hybrides sur- vivants et pour stabiliser les hybrides contre une perte de gènes, on injecte ensuite les hybrides dans la cavité périto- néale d'une souris Balb/c qui a été prétraitée par du "Pristan"' ou tétraméthyl-2,6,0i,14 pentadécanlle. Au bout d'une semaine, on prélève de manière stérile le liquide ascitique de la ca- vité péritonéale et l'on place les cellules hybrides ainsi ob- tenues, sans méthylcellulose, dans du milieu normal de Dulbecco modifié par Iscove etqui contient 10 d 2e sérum de.oetus deveau. On sous-clone ensuite les cultures d'hybridome en cours de croissance dans des plaques de culture de tissus pour mono- clone de Greiner. On soumet les colonies qui se développent ainsi à des essais de détermination de la production d'anti- corps spécifiques. Les essais sont effectués après un essai de neutralisation antiviralesur des cellules CCL23 humaines. Pour cela, on provoque tout d'abord].'adsorption durant seize heures d'un anticorps dirigé contre des immunoglobulines de souris à la surface des trous d'une plaque de microtitrage im- munologique,-puis l'on ajoute également durant seize heures ce qui provient ou surnage des cultures d'hybridome pour fixer sur les anticorps adsorbés les anticorps anti-Hu-IFN-gamma éventuellement obtenus et l'on ajoute enfin dix unités anti- virales, par millilitre, de Hu-IFN-gamma (quatre heures). On soumet ce que l'on obtient ainsi à des essais d'activité anti- virale résiduelle ou rémanente contre VSV (virus de la stoma- tite vésiculaire) sur des cellules humaines CCL23 contre un échantillon de HIlu-IFN-gamma non traité. De cette façon, on éta- blit l'existence de plusieurs lignées stables d'hybridomes de souris qui séparent spécifiquement de l'anti-(Hu-IFN-gamma) mono-clonal.- Pour identifier la nature de l'immunoglobuline de l'anticorps mono-clonal, on purifie tout d'abord l'anticorps provenant de l'hybridome par précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium à-40 Yf et par une étape subséquente-de chromatogra- - phie sur une colonne de "Sephadex-G200". On identifie ainsi l'anti-(HuIFN-gamma) comme étant IgM qui, dans un volume d'exclusion ou d'élution de la colonne de Sephadex-G 200 s'élue de manière identique au profil d'élution d'une IgM (immunoglo- buline M) témoin (figure 4). La spécificité de l'immunoglobu- line anti-(Hu-IFN-gamma) mono-clonaleainsi purifiée est ensui- te établie indubitablement par les essais suivants de spécifi- cité. Tout d'abord, on sépare par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide-SDS selon Lâmmli (Nature (Londres) 227 (1970) 680-685), sans traitement préliminaire par du bêta- mercaptoéthanol, du Hu-IFN-gamma partiellement purifié paral- lèlement avec des protéines normales puis l'on transfère par électrophorèse selon Towbin et collaborateurs (Proc. Natl. Sci. Acad. USA, 76 (1979) 4350-4354) sur des bandes de nitro- cellulose. Alors que la partie en forme de tache comportant les protéines normales est colorée par du noir d'amide, la partie en forme de tache comportant Hu-IFN-gamma est soumise à la technique ELISA selon Hochkeppel et collaborateurs (Europ. J. Biochem. 118 (1981) 437-442), en faisant incuber tout d'a- bord la tache avec de l'anti-(Hu-IFN-gamma) mono-clonal de souris puis avec de l'anticorps IgM de lapin à activité anti- IgM de souris et finalement avec de l'anticorps IgM de chèvre, à activité anti-IgM de lapin (conjugué à de la peroxydase), puis l'on visualise le Hu-IFN-gamma à l'aide d'o-dianisidine comme substrat d'enzyme en une bande nette autour de 46 000 daltons (figure 5). On répète la même expérience avec Hu-IFN- gamma, qui a été prétraité par du bgta-mercaptoéthanol/SDS. Avec une tache ELISA, on visualise à l'aide d'o-dianisidine une bande spécifique autour de 22 000 daltons (figure 6). L'an- ti-(Hu-IFN-gamma) mono-clonal a donc une activité spécifique- ment dirigée contre deux sous-espèces différentes de Hu-IFN- gamma ou contre le dimère (figure 5) et contre le monomère (figure 6) de la molécule de Hu-IFN-gamma, le déplacement du poids moléculaire des bandes de réaction immunologiaue, après un traitement préliminaire par le bêta-mercaptoéthanol indi- quant plut8t qu'il s'agit du monomère et du dimère de Hu-IFN- gamma. Dans un autre essai de spécificité, on fait incuber tout d'abord du Hu-IFN-gamma partiellement purifié, qui a au préalable été marqué par de l'iode 125 selon Hunter et colla- borateurs (Nature, 124 (1962) 495-496) avec dfe l'anti-(Hu- IFN-gamma) mono-clonal de souris et ensuite avec IgG de lapin, à activité anti-IgM. On précipite ensuite le complexe avec de la protéine A de Staphylococcus-aureus spécifique de IgG (Pansorbine). Après plusieurs lavages poussés du complexe et détachement subséquent par traitement par SDS de Hu-IFN-gamma, marqué par 125I et précipité spécifiquement avec de l'anti- (Hu-IFN-gamma) mono-clonal, on sépare par électrophorèse, sans traitement préliminaire par du b$ta-mercaptoéthanol, la ma- tière immuno-précipitée sur un gel de polyacrylamide SDS selon Lâmmli (Nature (Londres), 227 (1970) 680-685) parallè- lement avec des protéines normales marquées par 14C. Puis, après séchage, on autoradiographie le gel. L'autoradiogramme (figure 7) montre nettement que IPN-gamma marqué par 125I est spécifiquement précipité à. l'aide d'anti-(Hu-IFN-gamma) mono- clonal et peut être visualisé sous forme d'une bande radio- active nette autour de 46 000 daltons sur l'autoradiogramme d'un gel de polyacrylamide-SDS. Voici, à titre de remarque, des adresses permettant d'obtenir les produits dont l'utilisation est ici décrite: Colonnes de ConA, de "Sephacryl-S-200" et de "Sepha- dex-G-200": Deutsche Pharmacia GmbH, 6000 Frankfurt/lain 50 Milieu de Dulbecco modifié par Iscoves: BCK-Biokult- Chemie, numéro postal 21 02 65, 7500 Karlsruhe Plaques de culture de tissus Greiner (384 fois pour des clones de cellules): Greiner & Sbhne, numéro postal 13 20, 7440 NUrtingen IgM, IgG, anticorps de chèvre et de lapin ou anti- corps anti-IgM: Byk-Mallinckrodt, Von-Hevesystr. 1-3, 6057 Dietzenbach 2 Gel de polyacrylamide SDS: voir Lâmmli, Royaume Uni, Nature (Londres) 227 (1970) 680-685 et Hochkeppel et collabo- rateurs, Eur. J. Biochem., 118 (1981) 437-442 "Pansorbine" (protéine A de Staphylococcus aureus) Calbiochem, numéro postal 11 03 60, 6300 Giessen Cellules CCL23: (a) Regainstitut, Minderbroederstraat , B-3000 Leuven (Belgique), et (b) Flow Laboratories, MUhlen- grabenstr. 10, 5309 Mectkenheim/Bonn. REVENDICATI O:S 1. Procédé pour obtenir d,- clulle:s hx,-rii::,rr- ductrices d'un anticorps. selon].eu i: (a) on immunise des souri.;Avec un antig ne. (b) on isole un mélange de lymphocytes des souris. (c) on fusionne ou hybride des lvymphocytes B vecic des cellules de myélome B de souris, (d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de vyélome B non hybridées dans un milieu de cul- ture pour les hybrides formés, on cultive les hybrides formés et on les sélectionne par rapport aux cellules de r.Myélome B non hybridées. (e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps à activité spécifique contre l'antigène, et (f) on isole éventuellement les hybrides, procédé caractérisé en ce que, lors de l'étape (d), on effectue la sélection dans un milieu contenant-de la niéthylcellulose et l'on injecte les hybrides sélectionnés à l'étape (d) éven- tuellement dans la cavité péritonéale de souris (qui ont été au préalable traitées à l'aide d'un stimulant de tumeur), on retire de la cavité péritonéale les hybrides qui s'y sont mul- tipliés et l'on effectue ensuite les étapes (e) de sous-clo- nage et (f) d'isolement. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise des lymphocytes B de souris Balb/c ou des cellules de myélome B de souris Balb/c ou les deux. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on effectue plus d'une immunisation ou en ce que l'on effectue la dernière immunisation quatre - jours environ avant l'isolement du mélange des lymphocytes ou en ce qu'on applique les deux mesures. - 4. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce qu'on immunise à l'aide d'un antigène qui est adsorbé sur un tamis moléculaire. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce qu'on immunise à l'aide d'un interféron humain, par exemple Hu-IFN-bêta ou Hu-IFN- gamma, et en ce qu'on effectue éventuellement la dernière immunisation à l'aide d'interféron humain, après enlèvement du fragment sucre de cet interféron. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce qu'on isole le mélange de lymphocytes sur des souris femelles, de préférence des souris Balb/c femelles. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce qu'à l'étape (d) on ef- fectue la sélection dans un milieu ne comportant pas de macro- phages. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce qu'à l'étape (d) on sé- lectionne durant quatre jours environ avant d'injecter les hybrides sélectionnés dans la cavité péritonéale de souris. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce qu'on injecte également, dans l'étape (f) un stimulant de tumeur ou un adjuvant puis les hybrides producteurs de l'anticorps dans la cavité péri- tonéale de souris, on en retire les hybrides qui s'y sont mul- tipliés et l'on isole éventuellement l'anticorps. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1, 8 ou 9, caractérisé en ce qu'on effectue l'injection dans la cavité péritonéale de souris femelles, de préférence des souris femelles Balb/c. 11. Procédé de production d'un anticorps mono-clonal, selon lequel: (a) on immunise des souris à l'aide d'un antigène, (b) on isole un mélange de lymphocytes des souris, (c) or fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris, (d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de cul- ture pour les hybrides formés, on cultive les hybrides formés et on les sélectionne par rapport à des cellules de myélome B non hybridées, (e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps à activité spécifique contre l'antigène, et (f) on isole éventuellement l'anticorps, procédé caractérisé en ce que, à l'étape (d) on effectue la sélection dans un milieu contenant de la mathylcellulose et l'on in- jecte éventuellement dans la cavité péritonéale de souris (qui ont été au préalable traitées par un stimulant de la formation d'une tumeur) des hybrides éventuellement sélectionnés à l'é- tape (d) et l'on retire de la cavité péritonéale les hybrides qui s'y sont multipliés. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on applique au moins l'une des mesures de l'une quel- conque des revendications 2 à 10. 13.- Application des hybrides producteurs d'un anti- corps pour une injection selon la revendication 9 ou 10 ou pour l'isolement d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 9, 10, 11 ou 12. 14. Hybrides producteurs d'un anticorps dont l'ac- tivité est spécifiquement dirigée contre l'interféron de fi- broblastes humains, ces hybrides étant caractérisé en ce qu'on peut les obtenir lorsque: (a) on immunise des souris avec de l'interféron de fibroblastes humains puis: (b) on isole un mélange de lymphocytes des souris, (c) on fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris, (d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de cul- ture des hybrides formés, on cultive les hybrides formés et l'on sélectionne par rapport aux cellules de myélome B non hy- bridées, (e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dont l'activité est spécifiquement di- rigée contre l'interféron de fibroblastes humains, et (f) on isole éventuellement ces hybrides. 15. Hybrides ayant les caractéristiques essentiel- les du dépôt I-154 pour la. production d'un anticorps mono- clonal dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'in- terféron de fibroblastes humains, et les hybrides qui dérivent de ce dépôt. 16. Hybrides produisant un anticorps dont l'acti- vité est spécifiquement dirigée contre l'immun-interféron hu- main, caractérisés en ce qu'on peut les obtenir lorsque: (a) on immunise des souris avec de l'immun-inter- féron humain puis, (b) on isole un mélange de lymphocytes des souris, (c) on fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris, (d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de cul- ture des hybrides formés, on cultive les hybrides formés et on les sélectionne par rapport aux cellules de myélome B non hybridées, (e) on sous-clone pour obtenir des hybrides pro- duisant l'anticorps dont l'activité est spécifiquement diri- gée contre l'immun-interféron humain, et (f) on isole éventuellement ces hybrides. 17. Hybrides selon la revendication 14 ou 16, ca- ractérisé en ce qu'on peut les obtenir en effectuant, dans l'étape (d) la sélection dans un milieu contenant de la mé- thylcellulose et en injectant éventuellement dans la cavité péritonéale de souris (qui ont été au préalable traitées par un stimulant de la formation de tumeur) des hybrides sélec- tionnés lors de l'étape (d), en retirant de cette cavité pé- ritonéale les hybrides qui s'y sont multipliés et en effec- tuant ensuite les étapes (e) de sous-clonage et (f) d'isole- ment. 18. Anti conrps mono-cl on. doint. I ct ivit-J. p.- cifiquement dirigée contre l'interf('ron de f'ibroblastes hu- mains, caractérisé en c..ti'on peutt i.roduiru lor.quc: (a) on iiimmunise des souris avec de 'interftron J- fibroblastes humains puis. de façon ColnUe: (b) on isole un ridla:nge (i iymphoc.tes de souris, (c) on fusionne ou hybridi des]vymphocytes B,v-c des cellules de myélome B de souris, (d) on transfère le mélang, des hybrides formés et de cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de cul-- ture des hybrides formés, on cultive les hybrides formés et on les sélectionne par rapport à des cellules de myélome B non hybridées, (e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dont l'activité est spécifiquement di- rigée contre l'interféron de fibroblastes humains, et (f) éventuellement on isole l'anticorps. 19. Anticorps mono-clonal, dont l'activité est sTp- cifiquement dirigée contre l'immun-interféron humain, carac- térisé en ce qu'il peut être obtenu lorsque: (a) on immunise des souris avec de l'immun-inter- féron humain puis, de façon connue: (b) on isole un mélange de lymphocytes des souris, (c) on fusionne ou hybride 'des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris, (d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture des hybrides formés, on cultive les hybrides formés et l'on sélectionne par rapport aux cellules de myélome B non hybridées, (e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dont l'activité est spécifiquement di- rigée contre l'immun-interféron humain, et (f) on isole éventuellement l'anticorps. 20. Anticorps selon la revendication 18 ou 19, ca- ractérisé en ce qu'il peut être produit lorsque, dans l'étape (d) on effectue la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et l'on injecte éventuellement dans la cavité péritonéale de souris (qui ont été au préalable traitées par un stimulant de formation de tumeur) des hybrides sélectionnés à l'étape (d), on retire de la cavité péritonéale des hybri- des qui s'y sont multipliés et l'on effectue ensuite les éta- pes (e) de sous-clonage et (f) d'isolement.