Brevet FR2510120A1 — publié le 19830128

Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 029 549 décrit et revendique l'utilisation de Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 pour la préparation de l'acide 9-hydroxy-3-oxo- 4-prégnène-20-carboxylique /-9-hydroxybisnoracide_ 7 Le même microorganisme est utilisé pour la préparation de la 9-hydroxy-4-androstène-3,17-dione /-9-hydroxyandrostène- dione_ 7 (HAD) dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 035 236; et pour la préparation de l'ester méthyli- que d'acide 9-hydroxy-3-oxo-4-prégnène-20-carboxylique /-ester méthylique de 9-hydroxybisnoracide_ 7 dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 214 051. La présente invention propose un procédé de préparation par fermentation du composé intermédiaire uti- le appelé 6-fluoro-9 a-hydroxy-androst-4-ène-3,17-dione ( 6- fluoro-HAD) par conversion de dérivés 6-fluoro-A 4-3-céto- niques de stérols, par exemple le cholestérol, le sitostérol, le stigmastérol, etc, d'après le schéma I suivant: SCHEMA I O I Ferrrentation> F F On met ce procédé en oeuvre en utilisant M. fortuitum NRRL B-8119 Le procédé de la présente invention englobe également l'utilisation de mutants obtenus à par- tir des genres de micro-organismes décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 029 549, c'est-à-dire Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces Les micro-organismes de ces genres sont tous bien connus pour leur aptitude à dégrader des stérols Les souches de type sauvage de ces genres dégra- dent des stérols non sélectivement en composés de faible poids moléculaire, par exemple CO 2 + H 20 Des mutants peuvent être créés à partir de ces types sauvages d'après les modes opératoires décrits dans l'exemple 1 du brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 029 549 précité Cet exemple décrit la préparation de M fortuitum NRRL B-8119. Le procédé de l'invention est le seul procédé connu pour la préparation du 6 a-fluoro-HAD. Micro-organismes Des mutants qui sont caractérisés par leur aptitude à convertir sélectivement des dérivés 6-fluoro-A 4- 3-cétoniques de stérols ayant des chaînes latérales 17-alky- liques et à accumuler du 6-fluoro-HAD dans un bouillon de fermentation peuvent être obtenus par mutation de micro- organismes des genres suivants: Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobac- terium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces. Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 est décrit dans le brevet des EtatsUnis d'Amérique N 4 029 549 M. fortuitum NRRL B-8119 a été déposé dans la collection per- manente du Northern Regional Research Laboratory, Ministère de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique, Peoria, Illinois, E.U A Il a été mis à la disposition du public au moins depuis la délivrance des brevets des Etats-Unis d'Amérique précités décrivant ce micro-organisme Il y a lieu de remar- quer que le fait de pouvoir disposer de la culture n'autorise pas pour autant à mettre en oeuvre la présente invention en dérogation aux lois de la Propriété Industrielle. Le 6-fluoro-HAD est utile comme composé inter- médiaire dans la synthèse de corticoides intéressants Par exemple, par application de la technologie courante telle que décrite dans la littérature concernant les stéroïdes, les dérivés de fluoro-HAD peuvent être convertis en les stéroldes importants du point de vue pharmacologique tels que fluocinolone-acétonide, fluocinonide, flurandrénolide, paraméthasone, fluprednisolone. On donne ci-après des exemples illustrant le procédé de fermentation de la présente invention Ces exemples ne sont que des illustrations et ne doivent donc pas être interprétés comme limitatifs Tous les pourcen- tages sont exprimés en poids et toutes les proportions des mélanges de solvants sont exprimées en volume, sauf spécification contraire. Exemple 1 Fermentation de la 6 a-F-cholesténone Le milieu de biotransformation contient (par litre) 8,0 g de "Ucon"; 5,0 g de "Cerelose"; 3,0 g de NH 4 Cl; 3,0 g de Ca CO 3; 3,0 g de Na 3 -citrate_ 7 2 H 20; 2,0 g de "Tween 80 "; 1,0 g de farine de soja; 0,5 g de KH 2 PO 4; 0,5 g d'urée et 2,0 g de 68-F-cholesténone dans. de l'eau de ville dont le p H est ajusté à 7,0 Des fioles contenant des portions de 100 ml de ce milieu sont inocu- lées avec 10 ml de cultures d'ensemencement de M fortuitum NRRL B-8119, développées à 28 dans un milieu contenant (par litre), 8,0 g de bouillon nutritif; 5,0 g de glycérol; 1,0 g d'extrait de levure et 1,0 g de "Tween 80 " dans de l'eau distillée, le p H étant ajusté à 7,0 On fait ensuite incuber les cultures à 28 pendant 336 heures sur une secoueuse rotative Après l'incubation, on extrait le mélange avec un volume égal de CH 2 Cl 2 et on isole le pro- duit, à savoir le 6 a-fluoro-HAD, de cet extrait en utilisant des méthodes chromatographiques classiques. Exemple 2 En remplaçant la 63-fluorocholesténone par la 6 a-fluorocholesténone dans l'exemple 1, on obtient le 6 a-fluoro-9 a-hydroxy-AD. Exemple 3 En remplaçant la 66-fluorocholesténone dans l'exemple 1 par un dérivé fluorocétonique d'un autre stérol, par exemple le sitostérol, le stigmastérol, etc, on obtient le 6 B-fluoro-HAD: Les stérols peuvent être uti- lisés individuellement ou en mélanges et sous la forme pure ou sous la forme brute. Exemple 4 En utilisant un micro-organisme dégradant les stérols choisi dans les genres Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces, à la place de Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 dans le procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 029 549 pour la préparation de M fortuitum NRRL B-8119, on obtient des micro-organismes mutants qui sont caractérisés par leur aptitude à convertir sélectivement des dérivés 6-fluoro-A 4- 3-cétoniques de stérols portant une chalne latérale en C-17 et à accumuler comme produit le 6-fluoro-HAD. Exemple 5 En-remplaçant la 6 B-fluorocholesténone dans l'exemple 1 par un dérivé 6 a-fluoro-A 4-3-cétonique d'un autre stérol tel que le sitostérol, le stigmastérol, etc, on obtient le 6 a-fluoro-HAD Les stérols peuvent être uti- lisés individuellement ou en mélanges et sous la forme pure ou sous la forme brute. Exemple 6 En remplaçant M fortuitum NRRL B-8119 dans les exemples 1 et 3 par les mutants obtenus dans l'exemple 4, on obtient le 6 g-fluoro-HAD. Exemple 7 En utilisant les mutants obtenus'dans l'exemple 4, à la place de M fortuitum NRRL B-8119 dans les exemples 2 et 5, on obtient le 6 a-fluoro-HAD. Exemple 8 Les dérivés 6-fluoro-A 4-3-cétoniques de stérols peuvent être préparés en suivant les modes opératoires décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 100 027. REVENDICATIONS 1 Procédé de fermentation pour la préparation d'un composé de formule: O O F caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en présence d'un dérivé 6-fluoro-A 4- 3-cétonique d'un stérol présentant une chalne latérale en C-17 et à recueillir le produit désiré. 2 Procédé de fermentation pour la préparation d'un composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un microorganisme mutant choisi dans les genres Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces, ledit mutant étant caractérisé par son aptitude à convertir sélectivement le dérivé 6- fluoro-A 4-3-cétonique de stérols présentant une chaîne latérale en C-17 et à accumuler du 6-fluoro-HAD dans le bouillon de fermentation, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en présence d'un dérivé 6- fluoro-A 4-3-cétonique d'un stérol portant ou non une chaîne latérale en C-17. 3 Procédé de fermentation pour la préparation d'un composé tel que défini dans la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il consiste à cultiver un mutant de Myco- bacterium qui se caractérise par son aptitude à convertir 4 __ sélectivement le dérivé 6-fluoro-A 4-3-cétonique de stérols portant une chaîne latérale en C-17 et à accumuler du 6- fluoro-HAD dans le bouillon de fermentation, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en présence d'un stéroide portant une cha Xne en C-17. 4 Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit stérol est choisi dans le groupe comprenant le sitostérol, le choles- térol, le stigmastérol et le campestérol ou un mélange des- dits stérols. A titre de composé nouveau, la 6 a-fluoro-9 a- hydroxy-androst-4-ène-3,17dione. 6 Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que ledit dérivé 6-fluoro-A 4-3-cétonique d'un stérol est la 6 -fluorocholesténone. 7 Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que ledit dérivé 6-fluoro-A 4-3-cétonique d'un stérol est la 6 a-fluorocholesténone.