Brevet FR2507476A1 — publié le 19821217

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de substances actives extraites du placenta et les produits ainsi obtenus qui sont utilisables en thérapeutique. Le placenta est un important organe de sécrétion interne qui sécrète de nombreuses substances physiologiquement actives, y compris certaines hormones comme la gonadotropine, la thyréotropine, les oestrogènes etc... Plus récemment, on a démontré que le placenta humain secrète aussi certains facteurs dits hypothalamiques (G.S. KHûDR et T.M. SILER-KHODR, Science,vol.207, 1980, p.315 ainsi que M. MITNICK et coll., 56th Ann. Meet. Endocrine Soc., 1974, p.A-126). Les extraits placentaires sont utilisés en thérapeutique (cf. Dictionnaire Vidal), surtout en dermatologie, en gérontologie et dans les maladies cardiovasculaires, par exemple pour le traitement des artérites et de l'athérosclérose, et en cosmétique. Cependant, les extraits obtenus jusqu' présent avaient une activité très faible et peu constante du fait que l'on ne connaissait aucun moyen précis de titrage d'activité pour sélectionner les extraits adéquats. Dr, la présente invention fournit un moyen pour obtenir de tels extraits ayant une activité remarquable. Elle a été rendue possible par la découverte du rôle de l'adénosine monophosphate 3'5' cyclique (AMPc) dans la régulation des fonctions cellulaires. D'après le concept du deuxième messager de Sutherland (G.A. ROBISON, R.W. BUTCHER et E.W. SUTHERLAND, Cyclic AMP, Acad. Press, N.Y., 1971), les hormones ou les substances stimulant les fonctions cellulaires agissent en augmentant le niveau de 1'AMP cyclique intracellulaire. D'après Greengard, les effets de i'AMPc sur les cellules seraient produits par la stimulation de la phosphorylation de certaines protéines cellulaires (S.A. RUDOLPH et P. GREENGARD, J. Biol. Chem., 249, 1974, p.5684). L'AMPc active certains enzymes (protéine-kinases) qui catalysent l'incorporation des phosphates dans certaines protéines (D.A. WALSH et coll., J. Biol. Chem., 243, 1968, p.3763). Les fonctions cellulaires de base sont conditionnées par la phosphorylation de ces protéines. On a maintenant trouvé, de façon surprenante, que les extraits placentaires peuvent, de même que l'AMPc, activer l'incorporation des phosphates dans les protéines et cela de façon proportion neIle à leur pureté et leur activité thérapeutique. Le but de l'invention est donc l'obtention, par extraction et purification, à partir du placenta humain ou animal, d'une substance active a usage thérapeutique. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on détermine, à différentes étapes de la puri fication,la fraction active des extraits placentaires et leur degré d'activité par titrage de ces extraits qui consiste à mesurer l'augmentation qu'ils provoquent de la phosphorylation des protéines du cerveau incubées in vitro en présence de l'adénosine-5' triphosphate radioactive (32p ATP). L'extraction proprement dite peut être effectuée de manière connue. Le placenta humain, obtenu de suite après la délivrance, est placé dans une solution physiologique (0,9m NaCl) et est utilisé, soit frais, soit après conservation à la température de 40C pendant 7 à 14 jours. Après nettoyage des membranes et lavage dans la solution physiologique, le tissu est broyé (100 9/100 ml H20). Après filtration et centrifugation, le surnageant est chauffé deux fois 5 minutes à 950C dans un bain-marie et centrifugé chaque fois. Ce surnageant est soit congelé a -200C soit lyophilisé. La purification des extraits obtenus ci-dessus peut être effectuée de manière connue en soi, mais on verra plus loin que l'invention permet de choisir la qualité et le nombre d'étapes nécessaires en fonction de la pureté du produit que l'on désire obtenir. D'après nos études, différentes méthodes de purification et d'isolation des facteurs actifs peuvent être utilisées (cette liste n'est pas exclusive): - électrophorèse préparative sur gel acrylamide; - chromatographie liquide sur colonne de dextranne ("Séphadex", "Séphacryl", ou autres); - chromatographie liquide sur celluloses échangeuses d'ions (Diéthylaminoéthyl- ou carboxyméthylcellulose etc...); - filtration sur membranes. A titre d'exemple, la substance active selon l'invention a été obtenue par séparation sur colonne de dextranne "Séphacryl 5-200" d'un extrait placentaire (400 mg de lyophilisat dans 8 ml de tampon). Nous avons aussi obtenu de très bons résultats avec filtration sur membrane "Sélectron" laissant passer des molécules de poids moléculaires différents. Le titrage selon l'invention est effectué par incubation des extraits éventuellement purifiés avec des protéines du cerveau en présence d'ATP radioactive. Ces protéines peuvent provenir de cerveaux de mammifères, par exemple de rats ou souris, et sont précipitables par l'acide trichloracétique (TCA) . Ainsi la quantité de phosphate radioactif assimilé par les protéines peut être dosée de manière connue et ainsi une correspondance avec le degré d'activité des extraits placentaires a pu être établie. EXEMPLE a) Incubation. Les aliquots des différents extraits placentaires sont incubés en quadruplicata avec des broyats de cerveau de rat frais (2 mn à 30 C) en présence de 1 C -32P ATP (10-20 Ci/mmole), dans un tampon Hépès volume total: 200 ul). Après incubation, les protéines des trois échantillons correspondants sont précipitées avec l'acide trichloracétique (TCA) à 10%, la centrifugation (30 mn à 4.000 tours minutes) est répétée trois fois et le surnageant est chaque fois rejeté après centrifugation. La radioactivité du culot, redissous dans 0,5 NaOH, est comptée dans liteau (méthode de Tcherenkov) avec le compteur à scintillation (appareil "Tracerlab"). Les résultats sont exprimés en cpm (coup par minute) par échantillon et en pourcentage par rapport aux témoins. b) Contrôle de l'action par SDS (Sodium dodecyl sulfate) gel électrophorèse. Pour l'étude de la phosphorylation des protéines spécifiques, on utilise le quatrième échantillon. La réaction est arrêtée (au lieu de TCA) par la solution STOP (100 ,ul) (9% SDS, 15% glycérol, 30 mM Tris, pH 7,8, bleu de Coomassie 0,05t) et chauffée ensuite 10 minutes dans l'eau à lOOoC. On ajoute ensuite 100 jil de la solution de dithiothreitol (60 mg/ml) qu'on laisse à température ambiante pendant 12 heures. L'électrophorèse sur gel acrylamide SDS (10w) est faite sur plaques (12 x 16cm, 40mA 3-4h) dans un appareil "Biorad Gel Slab Cell N 220". Les plaques, après coloration (Bleu de Coomassie) et décoloration, sont séchées et mises sous films ("Kodak No-Screen Film NS-2T"). Après 3 à 5 jours d'exposition, les films sont développés et enregistrés par spectrophotométrie (Densité optique 624). En utilisant cette nouvelle méthode, on a pu démontrer que les extraits de placenta humain frais (après chauffage et élimination des protéines dénaturées par le chauffage) augmentent pendant l'incubation la phosphorylation des protéines du cerveau (précipitées par le TCA). Après conservation du placenta à la température de 40C pendant 7 jours, cette préparation devient nettement plus active (voir tableau 1 ci-après). Cette augmentation d'activité est encore plus nette après 14 jours de conservation à 40C, atteignant 50 > d'augmentation par rapport à la préparation du même placenta frais (voir tableau 2 ci-après). L'étude de l'augmentation de la phosphorylation avec des doses croissantes d'extraits placentaires nous a permis d'établir une courbe logarithmique doseréponse. Basés sur 1500 phosphorylations, on a pu définir une unité APP (Activateur de la Phosphorylation Protidique) comme quantité du produit actif nécessaire pour obtenir une augmentation de 50 de la phosphorylation par rapport aux témoins après 2 mn d'incubation dans les conditions décrites ci-dessus. Le tableau 3 ci-après exprime en unités APP par milligramme (mg) de lyophilisat ou par millilitre (ml) de solution les titrages dé différents extraits placentaires.L'étude des autoradiogrammes des gels SDS de ces incubats a montré une nette augmentation de la radioactivité de plusieurs pics de protéines (augmentation de la phosphorylation), ce qui confirme les résultats obtenus par la mesure de la radioactivité des protéines précipitées avec le TCA. Etude sur la souris in vivo de l'action des extraits obtenus selon l'invention. L'injection sous-cutanée de 0,1 ml de l'extrait placentaire filtré (par "Sélectron") à 50 souris miles et 50 souris femelles âgées de 4 à 8 mois, pendant 3 semaines quotidiennement (extrait placentaire XII Df) n'a provoqué d'abord ni réaction toxique ni mortalité. Ensuite l'étude de la phosphorylation des broyats de leurs cerveaux a montré une diminution de celle-ci chez les souris traitées avec des extraits placentaires actifs. L'autoradiogramme des gels après incubation a montré des modifications de phosphorylation de certaines protéines cérébrales chez ces souris traitées. Cette observation peut être mise en relation avec des effets thérapeutiques positifs rapportés par de nombreux auteurs (N.A. PUCHKOVSKAIA, Thérapie Tissulaire, Kiev, 1975) dans le traitement du vieillissement prématuré (en particulier troubles du système nerveux central). Etude du rendement des produits actifs. On a constaté que le rendement de substances actives dans le placenta peut être très augmenté (20 à 40m) après une perfusion du placenta frais par l'AMPc ou un de ses dérivés. Dans nos études, nous avons constaté que le placenta frais possède ces substances actives mais que la conservation au froid à 40C pendant 7 à 14 jours peut augmenter cette activité (voir tableau 2). Ceci est probablement dû à la modification de l'action de certains enzymes dans les conditions de conservation au froid. Cependant, nous avons observé que le chauffage des extraits au four à microondes (2 mn/100 g de tissu) au lieu du chauffage ordinaire lors de la précipitation accroit également l'activité des extraits (tableau 4). En combinant ces méthodes, on a obtenu selon l'invention des préparations 10 à 100 fois plus actives que celles du commerce (voir tableau 3). Tableau 1 - Action des extraits du placents frais et conservé 7 jours a 4 C sur la phosphorylation des protéines du cerveau de Rat. Contrôles Extr. placent. Extr. placent. (cpm # se) frais conservé (cpm # se) (cpm # se) 6300 # 63 6781 # 134 7426 # 45 (1) (100 %) (107 %) (118 %) t=6,42(**) A 5405 # 70 5591 # 44 7141 # 84 (100 %) (103 %) (132 %) t=23 (***) 11808 # 146 13438 # 143 14895 # 372 (100 %) (114 %) (126 %) t=5,17 (**) B 3697 # 120 4244 # 53 5092 # 140 (100 %) (115 %) (137 %) t=8,05 (**) * Radioactivité (P32) exprimée en coups par minute (cpm) avec l'écart type(se=stand.dev.)des protéines du cerveau précipitées par la TCA (triplicata) ou en pourcentage (%) par rapport aux contrôles corres pondants sprès incubation de 2 minutes à 30 C. A. Avec préincubation de 15 minutes à la température de 30 C. B. Sans préincubation. Incubation de 2 minutes seulement. Dose utilisée: 20 l des extraits placentaires non purifiés dans volume total de 200 l. (1) Signification statistique(conservé :frais) **=p conservation à 40 C,du même placenta (X). extraits Radioactivité % rapport Unités APP % d'augmentation des précipités contrôle par mgr. rapport extrait (cpm # se)* (lyoph.) placent. frais Contrôle 4745 # 134 100 - XA 6411 # 135 135 0,95 XB 6614 # 424 139 1,05 + 10 % XC 6871 # 57 145 1,11 + 16 % XD 7420 # 94 156 1,42 + 49 % * Moyennes de radioactivité (P32) des triplicats des précipités TCA des protéines du cerveau après incubation de 2 minutes à 30 C exprimées en coups par minute (cpm) avec l'ecart type (se) Incubation avec 0,8 mgr. d'extraits du même placenta X A = frais B = conservé 4 jours C = conservé 7 jours D = conservé 14 jours à 4 C. Tableau N 3 Activités en unités APP de différentes préparations placentaires. Préparat.* IXA IXD XA XD XIA XID Prép.** XIVA XIVD XIIDf XIVBf XVDf placent. pharma. *** Unités APP 1,4 1,9 1,25 1,89 1,00 2,50 1,05 3,3 8,00 5,00 10,00 12,00 par mg Unités APP 10,78 12,00 8,25 12,66 10,26 20,00 11,00 66,00 160,00 100,00 600,00 1200,00 par ml * Préparations d'extraits de différents placentas (N IX - XV) frais (A), conservés à 4 C (D); chauffés au four à microondes et filtrés sur membrane Sélectron (Df). ** Préparation pharmaceutique d'extrait placentaire (unités APP/mg exprimées à la base du poids du lyophilisat brut 10,4 mg/ml). *** Unités d'activation de la phosphorylation protidique (APP) correspondant à l'augmentation de 50% de la phosphorylation des protéines du cerveau dans une incubation de 2 minutes à 30 C. Tableau 4 - Augmentation de l'activité de l'extrait placentaire après chauffage au four à microondes. (1) (2) Extr. placent. XIIIA Contrôle Extr. placent. XIIIB (3) 0,4 mg 1,2 mg 0,4 mg 1,2 mg cpm * 15172 17207 9690 17171 20081 15171 17328 8793 16941 20773 14616 17162 8896 17222 19892 Moyenne 14986 17232 9126 17111 20248 % rapport 164 190 100 189 224 contrôle (1) Extrait du placenta frais (XIIIA) bouilli dans l'eau (95 C) deux fois 5 minutes. (2) Extrait correspondant du même placenta chauffé au four à microondes (XIIIB) (3) Dose d'extraits placentacentaires en mg de poudre après lyophilisation. (*) Radioactivité (P32) des protéines du cerveau de rat précipitées avec le TCA exprimée en coups par minute (cpm) et en pourcentage (%) par rapport aux contrôles. REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de nouvelles substances actives du placenta à usage thérapeutique, par extraction et purification, procédé caractérisé en ce que l'on détermine, à différentes étapes de la purification, la fraction active des extraits placentaires et leur degré d'activité par titrage de ces extraits, qui consiste à mesurer l'augmentation qu'ils provoquent de la phosphorylation de protéines du cerveau incubées in vitro en présence d'ATP radioactive. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les extraits placentaires sont chauffés et les substances précipitées éliminées. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la purification des extraits placentaires est effectuée par chromatographie liquide sur colonne de dextranne. 4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la purification des extraits placentaires est effectuée par filtration sur membrane laissant passer des molécules de poids moléculaires différents. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le. placenta de départ est conservé à une température d'environ 40C pendant 7 à 14 jours. 6.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le placenta de départ est perfusé avec l'AMPc ou un de ses dérivés. 7.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les extraits de placenta sont soumis au chauffage dans un four à microondes. 8.- Nouvelles substances actives -du placenta à usage thérapeutique obtenues par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.