Brevet FR2505856A1 — publié le 19821119

La présente invention concerne un procédé amélio- ré pour la production de pigment de Monascus. Le pigment de Monascus est un pigment naturel, rouge, comestible, produit par un microorganisme du genre Monascus, largement utilisé depuis les temps anciens en Chine et dans les pays du sud-est asiatique dans différents aliments comme An-chiu et Tou-Fu-Ju. Récemment, on a interdit l'utilisation, comme agents colo- rants comestibles, de différents agents colorants synthé- tiques, présentant un danger d'activité carcinogène et/ou tératogène De ce fait, la demande en agents colorants co- mestibles, naturels, sans danger, a inévitablement crû, et le pigment de Monascus est l'un d'eux Des études anté- rieures sur la production de ce pigment sont reportées par exemple dans J Ferment Technol, Vol 51, N 06, pp 407- 414 ( 1973), et dans Agr Biol Chem, Vol 39, N 09, pp. 1789-1795 ( 1975). Quelques procédés pour la production de pigment de Monascus sont également décrits dans des demandes de brevet: par exemple, le Kokai japonais N O 4/80, décrit qu'il est préférable d'utiliser un microorganisme du genre Monascus ayant une aptitude à produire de l'amylase aussi faible que possible; et le brevet japonais, publié sous le no 44 880 /73, indique que les constituants préférés pour le milieu de culture sont des saccharides, par exemple glucose et dextrine et des protéines hydro-solubles. Cependant, tous les essais, décrits dans ces demandes de brevet, aboutissent à des rendements en pigment non satis- faisants. La demanderesse, afin d'établir un procédé de pro- duction de pigment de Monascus à l'échelle industrielle, a effectué des recherches sur différents constituants à ac- tion optimale du milieu de culture, principalement sur les sucres alcools. La présente invention est basée sur la constata- tion que l'on peut obtenir, de façon inattendue, de grandes quantités de pigment de Monascus, par culture d'un vicro- organisme du genre Monascus, capable de produire ce pig- ment, dans un milieu nutritif contenant du maltitol. Le nouveau procédé selon l'invention de produc- tion de pigment de Monascus, est caractérisé par la culture dans un milieu nutritif contenant du maltitol, d'un micro- organisme du genre Monascus capable de produire ce pigment, suivie de la récolte du pigment résultant, à partir de cet- te culture. On peut utiliser conformément à l'invention, comme micro-organisme du genre Monascus, tout micro-organisme de ce genre dans la mesure o il produit ce pigment au cours de sa culture; conviennent notamment Monascus anka ATCC 16360, Monascus anka IFO 6540, et Monascus purpreus IFO 4513. Les milieux de culture utilisables sont ceux oui contiennent du maltitol et sur lesquels le micro-organisme peut pousser et libérer le pigment La teneur en maltitol du milieu de culture, qui dépend du procédé de culture uti- lisé, est comprise dans l'intervalle d'environ 0,1 à 95 %, rapporté au produit sec, de préférence entre 1 et 90 %. Habituellement on peut ajouter au milieu de culture d'au- tres substances, par exemple des minéraux comme phosphates, sulfates, sels de sodium, potassium, magnésium, calcium ou fer, ainsi qu'éventuellement de l'amidon ou des substances amylacées comme graines ou tubercules, dont l'amidon est le constituant principal, comme source de carbone; des compo- sés azotés organiques ou minéraux comme nitrates, sels d'am- monium, protéines, peptides ou amino-acides, comme source d'azote, et, pour amorcer, une petite quantité de solution éthanolique de pigment de Monascus. On a également constaté que la combinaison du maltitol avec du Laspartate de magnésium et/ou une substance amylacée, donne un effet synergique remarquable sur la production de pigment de Monascus. Les procédés de culture, utilisables conformément à l'invention, comprennent la culture submergée et la cul- ture solide, au cours desquelles un micro-organisme du gen- re Monascus, capable de produire le pigment, est habituel- lement cultivé à une température comprise dans l'intervalle de 250 à 40 'C pendant environ 2 à 15 jours. En ce qui concerne le procédé de récolte du pig- ment à partir de la culture, on peut employer, conformément à l'invention, tout procédé, sans considération particulière, pourvu qu'il permette de récolter, à partir de la culture, un pigment utilisable dans les aliments: par exemple, dans le cas de culture solide, celle-ci peut être séchée et pul- vérisée sans traitement ultérieur, afin de donner un produit pulvérulent, ou bien ce produit pulvérulent peut être sou- mis en plus à un stade d'extraction par solvant organique, comme éthanol, pour donner un produit liquide L'évapora- tion et l'élimination du solvant à partir de ce liquide, don- nent un pigment de Monascus de grande pureté, sous forme de pâte ou de poudre. Dans le cas de culture submergée, on peut utiliser celle-ci telle quelle comme agent de coloration comestible, liquide, pour le traitement des aliments, ou bien, habituellement, sous forme floculée par addition d'un agent de floculation comme l'alun, le produit résultant étant séparé en une portion liquide et une portion insoluble contenant les myce- lia, au moyen de centrifugation et/ou filtration Comme une grande partie du pigment se trouve dans les mycelia, la por- tion insoluble peut être soumise, comme dans le cas de la culture solide, à une extraction ultérieure à l'aide de sol- vant organique. Le pigment de Monascus ainsi obtenu est avantageu- sement utilisable comme agent colorant rouge, naturel, comes- tible, pour différents aliments, par exemple confiseries, bonbons, desserts, glaces, produits lactés, produits dérivés de la viande et de la chair de poisson, boissons sucrées, yoghourts, pâtes, produits laitiers, aliments en boite, en bouteille et conserves au vinaigre. Les expérimentations suivantes expliquent concrè- tement la présente invention. EXPERIMENTATION 1 Choix de la source de carbone On effectue ce choix principalement sur des sucres alcools. La culture à ensemencer est réalisée comme suit: des fla- cons secoueurs de 500 ml, contenant des prélèvements de 50 ml d'un milieu (p H 6,2) constitué par 5 % en poids/volume de poudre de riz, 0,25 % en poids/volume de KH 2 PO 4, 0,15 % en poids/volume de Na NO 3, 0,1 % en poids/volume de Mg SO 4. 7 H 20, 0,1 % en poids/volume d'acide casamino, 0,001 % en poids/volume de Ca C 12 2 H 20 et de l'eau du robinet, sont mis à l'autoclave à 120 C pendant 20 minutes en vue de leur stérilisation, puis sont refroidis et ensemencés avec Mo- nascus anka ATCC 16360 de manière habituelle Les mélanges obtenus sont alors cultivés à 30 C pendant 4 jours, sous agitation. Ensuite, on réalise comme suit la culture principale (sauf indication contraire, les pourcentages sont donnés en poids/ volume): des flacons secoueurs de 500 ml, contenant des prélèvements de 50 ml d'un milieu constitué par 3 % de l'une des substances énumérées dans le tableau 1 (tous les pour- centages sont exprimés sur la base de produit solide sec) en tant que source de carbone, 0,25 % de KH 2 PO 4, 0,2 % de Na N 03 > 0,1 % de Mg SO 4 7 H 20, 0,1 % d'acide casamino, 0,001 % de Ca Cl 2 2 H 20 et de l'eau du robinet,sont mis à l'auto- clave à 120 C en vue de leur stérilisation, puis sont re- froidis et ensemencés avec la culture à raison de 2 % en volume/volume, comme plus haut On laisse ensuite se dé- velopper la culture à 30 C pendant 7 jours sous agitation. Les résultats de l'expérimentation sont indiqués dans le tableau 1, la production de pigment de Monascus A 500 y 6- tant déterminée comme suit: après avoir ajusté le milieu de culture à p H 6,5 par addition d'acide chlorhydrique 3 N et/ou d'hydroxyde de sodium, on le place dans un fla- con d'Erlenmeyer de 500 ml, et on y ajoute 200 ml d'éthanol anhydre, de façon à obtenir une solution éthanolique à 80 % en volume/volume Puis, le flacon contenant cette solution est placé sur un secoueur rotatif, à 30 C pendant 1 heure, afin d'extraire le pigment, et l'extrait obtenu est filtré sur papier filtre du commerce, "Toyo Roshi N 2 " de Toyo Roshi Company Ltd, Tokyo Le filtrat obtenu est ensuite é- ventuellement dilué avec une solution aqueuse d'éthanol à 80 % en volume/volume Après dilution, on détermine la capacité d'absorption du filtrat pour une longueur d'onde de 500 nm, en utilisant une cellulede 1 cm, et la produc- tion de pigment est calculée à l'aide de l'équation sui- vante: Production de pigment (A 500) = Absorption x 50 x dilution Il ressort des résultats expérimentaux du tableau 1, que le maltitol, parmi les produits essayés, est la source de car- bone la plus souhaitable pour la production de ce pigment. TABLEAU 1 N Source de carbone ( 3 % en Production de Pigment poids/volume) (Arnr) 4 9 14 Ethanol Glucose Maltose Amidon soluble Poudre de riz Xylitol Mannitol Sorbitol Dulcitol Maltitol Sirop de maltose hydrogéné Isomaltitol Lactitol Cellobiitol 7,1 0,8 3,2 1,7 3,7 4,1 0,4 2,8 4,2 31,4 29,5 3,9 3,1 2,9 TABLEAU 1 (suite) N Source de carbone ( 3 % en Production de Pigment poids/volume) (A 500) Maltotriitol 4,4 16 Maltotétraitol 3,8 17 Amylitol 2,9 _________________________________________________________ Note*: Le sirop de maltose hydrogéné est un produit du commerce, à teneur en maltitol de l'ordre de 78 % sur la base du produit solide sec, fabriqué par Hayashibara Com - pany Ltd sous le nom de "Mabit". EXPERIMENTATION 2 Choix de la source d'azote On essaye des substances, principalement des amino-acides, dans le but de déterminer la source d'azote à action opti- male dans un milieu nutritif contenant du maltitol comme source de carbone. On réalise la culture comme dans l'expérimentation 1, pour produire le pigment de Monascus, à ceci près que la teneur en maltitol dans le milieu de culture est de 3 %, et la te- neur en acide casamino est de 0,5 % comme dans le tableau 2. Les résultats expérimentaux sont donnés dans le tableau 2. TABLEAU 2 N Source d'azote ( 0,5 % en Production de pigment poids/volume) (A 50) 1 néant 28,8 2 Acide Casamino 36,6 3 Extrait de levure 30,3 4 Polypeptone 38,3 Glycine 32,5 6 L-Alanine 43,1 7 Acide L-Glutamique 44,7 8 LGlutamate de sodium 47,2 9 L-Glutamate de magnésium 45,0 L-Asparagine 58, 6 11 Acide L-Aspartique 62,5 TABLEAU 2 (suite) N Source d'azote ( 0,5 % en Production de pigment poids/volume) (A 500) 12 L-asparatate de sodium 62,1 13 L-asparatate de potassium 66,2 14 L-asparatate de magnésium 116,4 Il ressort des données du tableau 2 que l'on obtient la production la plus forte de pigment de Monascus, avec comme source d'azote combinée au maltitol, L-asparagine, acide L-aspartique ou un L-aspartate, en particulier L-aspartate de magnésium. EXPERIMENTATION 3 Combinaison du maltitol avec L-aspartate de magnésium et poudre de riz On étudie l'effet synergique sur la production de pigment, par utilisation de maltitol et de L-aspartate de magnésium, tous deux confirmés comme d'excellents constituants de mi- lieu de culture par les expérimentations précédentes,en combinaison avec de la poudre de vieux riz: à un milieu de base, constitué par 0,25 % de KH 2 PO 4, 0,2 % de Na NO 3, 0,1 % de Mg 504, 7 H 20, 0,001 % de Ca Cl 2 2 H 20 et de l'eau du ro- binet, on ajoute 3 % de maltitol, 0,5 % de L-aspartate de ma- gnésium et/ou 3 % de poudre de riz, pour préparer le milieu de culture nutritif du tableau 3 Ensuite, on effectue la culture principale comme dans l'expérimentation 1, pour pro- duire le pigment Cette production est estimée identique à celle de ladite expérimentation, et les résultats sont ras- semblés dans le tableau 3. (voir tableau 3 à la page suivante). TABLEAU 3 N Composition du milieu Production de pig- ment (A 500) 1 Milieu de base 0,1 2 Milieu de base plus maltitol 28,8 3 Milieu de base plus aspartate de magnésium 15,1 4 Milieu de base plus poudre de riz 2,6 Milieu de base + maltitol + aspartate de magnésium 116, 4 6 Milieu de base + maltitol + poudre de riz 107,3 7 Milieu de base + aspartate de Mg + poudre de riz 41,4 8 Milieu de base + maltitol + aspartate de Mg + poudre de riz 243,0 Il ressort des données du tableau 3 que la combinaison du maltitol avec le L-aspartate de magnésium et la poudre de riz exerce un effet synergique remarquable sur la produc- tion de pigment de Monascus. Plusieurs formes de réalisation non limitatives de l'invention sont décrites ci-après à titre d'illustra- tion (Sauf indication contraire, les pourcentages sont don- nés en poids/volume). EXEMPLE 1 On place 16 litres d'un milieu constitué par 5 % de maltitol, 0,7 % de Laspartate de magnésium, 0,25 % de KH 2 P 04, 0,2 % de Na N 03, 0,1 % de Mg SO 4 7 H 20, 0,001 % de Ca C 12 2 H 20 et de l'eau du robinet, dans une fiole à fermentation de 30 litres, et l'on met à l'autoclave à 120 C pendant 30 minutes, afin de stériliser Après refroidissement on ensemence ce milieu avec une culture de Monascus anka ATCC 16360, à rai- son de 2 % en volume/volume, et on laisse se développer la culture à 33 C pendant 4 jours de manière habituelle, sous aération et agitation; on obtient une culture colorée en orange foncé. La production en pigment de Monascus dans la culture est dé- terminée comme dans l'expérimentation 1, sur 50 ml de cette culture Cette production est de l'ordre de 172,3. Le pigment de Monascus ainsi obtenu est avantageusement utilisable comme agent colorant rouge pour différents ali- ments à teneur élevée en protéines, par exemple des pro- duits de chair de poisson, de viande et de viande artifi- cielle. EXEMPLE 2 16 litres d'un milieu constitué par 4 % de sirop de maltose hydrogéné une fiole à fermentation de 30 litres, que l'on met à l'au- toclave à 1200 C pendant 30 minutes pour stériliser Après refroidissement, on ajoute à cekilieu, dans des conditions stériles, 300 ml de solution éthanolique de pigment de Mo- nascus, contenant une quantité de pigment telle, que la ca- pacité d'absorption dans les conditions définies précédem- ment est voisine de 2, puis on ensemence comme dans l'exem- ple 1 le mélange ainsi obtenu avec une culture d'ensemence- ment de Monascus anka ATCC 16360, et on laisse s'effectuer la culture pendant 6 jours à 30 C, sous aération et agita- tion, ce qui a pour résultat une culture colorée en orange foncé _ La production de pigment dans cette culture est déterminée comme dans l'expérimentation 1 Elle est de l'ordre de 246,2. On ajoute ensuite à cette culture de la solution d'alun à 4 %, et l'on ajuste le p H de ce mélange à 6,5 avec de l'hy- droxyde de sodium 4 N, puis l'on centrifuge le produit résul- tant, ce qui donne un sédiment à teneur élevée en pigment de Monascus. On extrait alors ce sédiment dans 2 volumes d'éthanol anhy- dre à 600 C pendant 2 heures, et le résidu est extrait de ma- nière identique à 2 reprises, ce qui donne une solution é- thanolique de coloration rouge pourpre foncé, à forte te- neur en pigment de Monascus Le rendement est de l'ordre de 90 % rapporté à la culture de départ. La solution éthanolique à forte teneur en pigment de Monas- cus est avantageusement utilisable comme colorant rouge pour différents aliments, par exemple boissons alcooliques, comme vins et liqueurs; confiseries comme gelées, bavaroi- ses et bonbons; boissons sucrées comme jus et boissons gazeuses; desserts glacés comme sorbets et crèmes glacées; ainsi que pour la coloration de conserves au vinaigre, par exemple "Fukuzin-zuke" une espèce de conserve au vinaigre de style japonais. EXEMPLE 3 On lave avec de l'eau 1 kg de riz poli, et on le fait trem- per pendant 2 heures dans 3 litres de sirop de maltose hy- drogéné, ("Mabit') à une concentration de 1 %, rapporté au produit solide sec Après élimination de l'eau par essorage pendant 1 heure, ce riz est placé dans un récipient, nommé "Koji-Buta", muni à son extrémité inférieure d'un tamis mé- tallique, et le tout est mis à l'autoclave à 120 C pendant minutes, afin d'être stérilisé Après refroidissement dans les conditions ambiantes, on ensemence le contenu avec Monascus anka IFO 6540 par pulvérisation d'une culture d'en- semencement, et on laisse la culture se développer à 330 C pendant 10 jours, pour obtenir du koji rouge Ce koji rouge est chauffé à l'air chaud et pulvérisé, ce qui donne envi- ron 910 g de poudre. Au cours de cet exemple, la production de pigment de Monas- cus est déterminée comme/suit: 2 g de la poudre sont placés dans un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml, et on y ajoute 250 ml d'une solution aqueuse d'éthanol à 80 % en volume/volume. La capacité d'absorption de la solution est ensuite déter- minée comme dans l'expérimentation 1, afin de connaître la production de pigment Celle-ci est de l'ordre de 145,2. La poudre ainsi obtenue peut être également avantageuse- ment utilisée comme colorant rouge comestible pour dif- férents aliments, par exemple assaisonnements comme purée de tomate et par exemple marque "Ketchup"; confitures comme confiture de framboise ou de fraise; "Kasu-Zuke" comme ceux de fruits de mer (conserve au vinaigre de style japonais); "Koji-Zuke" comme ceux de langouste et de brème de mer (conserve au vinaigre de style japonais) En outre, cette poudre peut être utilisée pour produire An-chiu. Revendications 1 Procédé pour la production de pigment de Monascus qui consiste à cultiver dans un milieu nutritif un micro- organisme de genre Monascus capable de produire ce pigment, puis à récolter le pigment résultant à partir de la culture, caractérisé en ce que le milieu de culture renferme du mal- titol comme source de carbone. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur du milieu en maltitol est compris entre 0,1 et 95 %, de préférence entre 1 et 90 %, du produit solide sec. 3 Procédé selon une des revendications 1 ou 2, carac- térisé e#ce que le micro-organisme est Monascus anka ATCC 16360, Monascus anka IFO 6540 ou Monascus purpreus IFO 4513. 4 Procédé selon une des revendications 1 à 3, carac- térisé ence que le milieu nutritif contient outre le malti- tol, une substance amylacée et une ou plusieurs des sub- stances suivantes: L-asparagine, acide L-aspartique, L- aspartate de magnésium, L-aspartate de sodium, L-aspartate de potassium. 5 Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que la substance amylacée est de la poudre de riz. 6 Procédé selon une des revendications 1 à 5, caracté- risé en ce que le micro-organisme est cultivé en présence d'une solution éthanolique de pigment de Monascus, utilisée pour induire la production du pigment dans le micro-organis- me.