Brevet FR2510606A1 — publié le 19830204

1. La présente invention concerne un procédé d'ob- tention de polyosides capsulaires, les polyosides obtenus par ce procédé et l'application de ces polyosides à la préparation de vaccins. On sait que la lutte contre les maladies infec- tieuses peut être exercée à deux niveaux: soit par une action directe à l'égard du germe pathogène (antibio- tiques, antiseptiques), soit par une action indirecte par le renforcement de défenses de l'organisme (vacci- nation, sérothérapie, immunomodulation). L'utilisation des agents susceptibles d'agir directement se heurte souvent à certaines difficultés pouvant limiter son action (notamment toxicité de la molécule et résistance bactérienne). Par contre, le renforcement des défenses de l'organisme par l'acquisition des anticorps spécifiques présente des avantages certains, notamment du point de vue de la durée de la protection et de la spécificité. Mais, la vaccination à l'aide de corps microbiens entiers n'est pas toujours sans inconvénients: phénomènes d'hypersensibilisation, mauvaise tolérance ou pyrogéni- cité sont parmi les plus fréquents Ils sont liés-à la présence de multiples antigènes de la bactérie. C'est donc tout naturellement vers l'isolement de l'antigène responsable des anticorps protecteurs que les efforts des chercheurs se sont cristallisés. Dans le cas des bactéries capsulées, les poly- osides capsulaires se révèlent immunogènes chez l'homme, avec peu de réactions secondaires. Une première application chez l'homme de ces poly- osides capsulaires est l'apparition du vaccin antiménin- gococcique A et C et, tout récemment, du vaccin polyvalent 10606 2. contenant les polyosides purifiés de quatorze types séro- logiques de pneumocoque. Plusieurs autres bactéries capsulées sont impli- quées dans divers processus pathologiques, par exemple Hemophilus influenzae, type b, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, ou Streptocoques, groupe B, et des vaccins correspondants peuvent être préparés à partir de leurs polyosides capsulaires. Dans la demande de brevet européen O 002 404, on a décrit un procédé d'obtention de polyosides capsulaires à partir de Streptococcus pneumoniae. Selon ce procédé, on cultive le microorganisme à l'aide de milieux de culture complexes Puis, après inactivation au phénol, sans séparer les microorganismes du milieu de culture, on effectue une première addition d'alcool tel que l'éthanol, on sépare les impuretés pré- cipitées, on effectue une deuxième addition d'alcool afin de précipiter alors le polyoside Le polyoside remis en suspension est ensuite débarrassé des substances conta- minantes (protéines, acides nucléiques) par un traitement enzymatique ou par un traitement par un surfactif catio- nique (bromure de citrimonium), qui peuvent être complétés par une diafiltration. Ce procédé n'a pas, en fait, de caractère géné- ral, car les conditions spécifiques de chaque stade va- rient avec le polyoside à séparer Ainsi, il est néces- saire de faire des pré-tests afin de déterminer les condi- tions des diverses précipitations De plus, en raison de l'utilisation de certains milieux, ce procédé est suscep- tible dlentra Iner une dégradation des chaînes polyosi- diques. La présente invention vise à fournir un procédé plus général, plus simple et moins dégradant permettant d'obtenir des polyosides de masse moléculaire très éle- vée. 3. La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de polyosides capsulaires immunogènes à partir de bactéries capsulaires les contenant, caracté- risé en ce que l'on effectue une culture des bactéries en milieu synthétique ou semi-synthétique, à la fin de la phase de croissance de cette culture on sépare les corps microbiens d'une phase surnageante, on soumet cette phase surnageante à une filtration sur une membrane retenant les molécules d'une masse moléculaire égale ou supérieure à 100 000 daltons, obtenant ainsi un rétentat riche en polyosides capsulaires,et l'on élimine les protéines, les acides nucléiques et les lipides de ce rétentat obte- nant ainsi un polyoside capsulaire purifié. Ainsi, selon une caractéristique essentielle de la présente invention, on effectue la culture des bacté- ries en milieu synthétique ou semi-synthétique Par milieu synthétique, on désigne des solutions aqueuses de compo- sés chimiques connus, de faible masse moléculaire qui sont présents en proportions déterminées. Par milieu semi-synthétique, on désigne un milieu analogue au précédent, mais qui contient, en outre, une faible proportion (généralement moins de 0,5 % en poids) de produits d'origine naturelle, tels que des hydrolysats de protéine. En outre, selon la présente invention, l'extrac- tion des polyosides est effectuée sur le surnageant de la culture débarrassée des corps microbiens et non pas sur l'ensemble du milieu de culture. La filtration sur une membrane dont la porosité est capable de retenir les molécules d'une masse molécu- laire égale ou supérieure à 100 000 daltons permet d'obtenir rapi- dement un rétentat renfermant principalement les poly- osides, ainsi que, en faibles proportions, des protéines, des acides nucléiques et des lipides. L'élimination des contaminants est avantageuse- ment effectuée de la façon suivante: ou soumet le ràten- tat à une hydrolyse enzymatique, notamment à l'aide d'un 4. mélange de Pronase, R Nase et D Nase, on ajoute un mélange butanol-chloroforme (de préférence un mélange 1:1 en volume), on sépare la phase aqueuse, on soumet la phase aqueuse à une dialyse et on effectue une filtration sur une membrane retenant les molécules ayant une masse molé- culaire égale ou supérieure à 100 000 daltons. Le polyoside purifié peut être séparé, de manière connue, du rétentat par précipitation à l'aide d'un al- cool tel que l'éthanol. Les exemples suivants illustrent la présente demande: EXEMPLE 1 Polyoside pneumococcique du type 3. On part d'une souche lyophilisée de Streptococcus pneumoniae de type 3. a) Préparation de lots d'ensemencement. On introduit la souche lyophilisée dans du bouillon T. On effectue la culture pendant 16 heures à 370 C. On mélange 5 ml de la culture obtenue avec ml de lait écrémé stérilisé On distribue dans des ampoules à raison de 0,5 ml/ampoule et on lyophilise Les lyophilisats sont conservés à + 4 c. b) Préculture. On introduit un lot d'ensemencement (lyophi- lisat en ampoule) dans un ballon contenant 200 ml du mi- lieu semi-synthétiaue indiqué ci-après et on effectue la culture à 37 C pendant 6 heures. Milieu de culture: Peptone pancréatique de caséine (IBF) 1500 mg Qcystine 150 mg dl-tryptophane 20 mg 2-tyrosine 200 mg Phosphate bipotassique 4960 mg d-glucose anhydre 12500 mg Sulfate de magnésium, 7 H 20 500 mg 5. Sulfate ferreux, 7 H 20 5 mg Sulfate de zinc, 7 H 20 0,8 mg Sulfate de manganèse, 7 H 2 O 0,3 mg -2. Acide chlorhydrique RP fumant 17, 8 mg d-biotine 15 mg Acide nicotinique 1 mg Pyridoxine H Cl 1 mg Riboflavine 1 mg Thiamine 1 mg Pentothénate de calcium 5 mg Adénine H Cl 10 mg Uracile 10 mg Chlorure de choline 10 mg Asparagine 100 mg Eau distillée q s p 1000 ml c) Culture. La culture proprement dite est effectuée dans un fermenteur contenant 18 1 du milieu de culture défini sous b On ensemence à raison de 1 % avec la préculture. La culture est effectuée à 37 C, à p H 7,4, sous agitation pendant généralement environ 16 h, jusqu'à la fin de la phase exponentielle de croissance. d) Séparation du surnageant. A la fin de la phase exponentielle, on sépare immédiatement le surnageant par centrifugation en continu à 5000 t/mn Le surnageant est soumis à une filtration stérilisante sur membrane Millipore 0,22 g et utilisé immédiatement ou bien il est conservé à -25 C. e) Extraction. Un volume de surnageant égal à environ 20 li- tres est concentré à un volume de 2 litres par filtration sur membrane Miilipore 105, permettant de retenir les molécules d'une masse moléculaireégale ou supérieure à 000 daltons. Le rétentat ainsi obtenu est diafiltré sur membrane Diaflo 105 après addition de 5 litres d'eau 6. distillée stérile et apyrogène pour compléter la séparation selon la masse moléculaire. Plusieurs diafiltrations successives permettent de concentrer à environ 350 ml qui sont lyophilisés dans des ballons de 1 litre. Toutes ces opérations sont effectuées à une température au plus égale à 8 C. f) Purification. Le produit intermédiaire lyophilisé est dissous dans 900 ml de tampon phosphate 0,01 M p H 7. On ajoute ensuite 20 mg de R Nase type 1, 20 mg de D Nase pancréatique et 180 j 1 ( 20 unités/ml) de Rnase T 1 On effectue une incubation de 4 h à 37 C On ajoute alors 170 mg de Pronase type 8, 900 i 1 de phénol pur et 2 gouttes de toluène. On incube le mélange pendant une nuit à 37 C. On arrête la réaction et on ajoute un volume égal ( 900 ml) d'un mélange butanol-chloroforme 1:1 On agite pen- dant i h On décante les deux phases par centrifugation à 10 000 t/mn pendant 30 mn. La phase aqueuse qui contient le polyoside est dialysée contre 20 litres d'eau distillée stérile et apyrogène pendant environ 60 h. On diafiltre le dialysat sur membrane Amicon 10 Le volume du rétentat est de 1140 ml On ajoute 160 ml d'acétate de sodium 40 % (concentration finale 5 %) et 3, 9 litres d'éthanol absolu ( 3 volumes). On recueille le précipité par centrifugation à 12 000 t/mn pendant 30 mn On dissout ce précipité dans de l'eau distillée apyrogène On répartit la solution en flacons sous un volume de 4 ml On lyophilise sous vide On obtient 9 g de produit C'est le polysaccharide purifié qui contient: sucres 64 % protéines 0,8 % acide nucléique Toutes les opérations (en dehors des incuba- tions) sont effectuées entre 0 et + 4 C. EXEMPLE 2 Polyoside pneumococcique du type 23. On part d'une souche lyophilisée de Streptococcus pneumoniae du type 23. On effectue la culture et la séparation du surna- geant dans les conditions définies à l'exemple 1 (stades a à d) L'extraction et la purification du polyoside sont effectuées de la façon suivante: e) Extraction Un volume de surnageant égal à 15 litres est concentré à un volume de 1,5 litre dans les conditions définies à l'exemple 1-e. Trois diafiltrations successives permettent de concentrer, puis de lyophiliser On obtient 1,8 g de produit ayant la composition suivante: sucres 60 % protéines 19 % acide nucléique 3,6 % f) Purification On reprend le produit intermédiaire lyophilisé avec 200 ml de tampon phosphate 0,01 M p H 7 On ajoute 1 mg de R Nase, 1 mg de D Nase et 20 unités de R Nase Tl/ml On incube pendant 3 h à 37 C On ajoute de la Pro- nase type 8 ( 180 ug/ml), 1 gl/ml de phénol et une goutte de toluène On incube pendant une nuit à 37 C. On effectue trois extractions successives avec 8. un mélange à volume égal ( 200 ml) de butanol-chloroforme 1:1 Le mélange est agité mécaniquement. La phase aqueuse finale est dialysée pendant envi- ron 60 heures contre 4 1 d'eau distillée stérile et apy- rogène. Le dialysat est diafiltré sur membrane Amicon 105. On concentre à 50 ml On ajoute 3 volumes d'éthanol absolu et de l'acétate de sodium (concentration finale %) On laisse pendant une nuit à -20 C. On recueille le précipité par centrifugation Ce précipité est dissous dans de l'eau distillée stérile et apyrogène puis lyophilisé. On obtient 1050 g d'un produit qui contient: sucres 75 % protéines 1,7 % acide nucléique 0,7 % Toutes les opérations (sauf indication contraire) sont effectuées entre 0 et + 6 C. EXEMPLE 3 Polyoside pneumococcique du type 19. On part d'une souche lyophilisée de Streptococcus pneumoniae du type 19. On effectue la culture et la séparation du surna- geant dans les conditions définies à l'exemple 1 (stades a à d). L'extraction et la purification du polyoside sont effectuées de la façon suivante e) Extraction En opérant comme à l'exemple 1-e, on concentre un volume de surnageant de 75 litres par trois diafiltra- tion à 2 litres On obtient 2,3 g ayant la coposition suivante: sucres 30 % protéines 15 % acide nucléique 3,4 % f) Purification Le produit intermédiaire lyophilisé est dissous avec 150 ml de tampon phosphate 0,01 M p H 7 On ajoute 3 mg de Dnase, 3 mg de R Nase et 30 il de R Nase T 1 On incube pendant 4 h à 37 C On ajoute ensuite 62 mg de Pronase, 150 gl de phénol et une goutte de toluène. On laisse agir pendant une nuit à 37 C. On déprotéinise par le mélange chloroforme-butanol 1:1, à volume égal ( 3 extractions successives). La phase aqueuse est dialysée pendant 60 heures contre 4 litres d'eau distillée stérile et apyrogène On effectue une diafiltration du dialysat sur membrane Amicon XM 100. On précipite le rétentat par 3 volumes déthanol contenant de l'acétate de sodium à 5 %. Après une nuit au congélateur, le précipité est dissous dans l'eau stérile et apyrogène et lyophilis 6. On obtient 730 mg de produit qui contient: sucres 73 % protéines 0,2 % acide nucléique 0,5 % Là encore, toutes les opérations (en dehors des incubations) sont effectuées entre O et + 4 C. EXEMPLE 4 Polyoside pneumococcique du type 1. On part d'une souche lyophilisée de Streptococcus pneumoniae du type 1 On effectue la culture et la sépa- ration du surnageant dans les conditions définies à l'exemple 1. L'extraction et la purification du polyoside sont effectuées de la façon suivante: e) Extraction litres de surnageant de culture sontdia- filtrés sur cassettes Pellicon (Millipore, membrane 105). Le volume du rétentat final est de 3 litres On lyophi- lise en ballons On obtient 6,1 g de produit contenant: acide galacturonique 46,5 % protéines 7,7 % f) Purification On dissout le produit obtenu dans 800 mi d'EDS (eau distillée stérile) apyrogène On ajoute: 16 mg de R Nase 16 mg de D Nase 10. g 1 de R Nase T 1. On incube pendant 4 heures à 37 C On ajoute alors 300 Al de phénol, 2 gouttes de toluène et 150 mg de Pronase type 8 On incube pendant une nuit à 37 C On extrait encore les protéines à l'aide d'un mélange à volume égal de chloroforme-butanol ( 1:1) On dialyse la phase aqueuse pendant 60 heures On diafiltre sur membrane Amicon XM 100. Le volume de térentat final est de 150 ml On précipite la solution par 3 volumes d'éthanol froid contenant de l'acé- tate de sodium 5 %. Le culot est repris par 250 ml d'EDS apyrogène. On lyophilise en flacons sous vide On obtient 3,7 g de polyoside purifié contenant: acide galacturonique 55,5 % (ce qui correspond à 85 % de sucres) protéines 1 % Le coefficient de diffusion dans le gel KD du polyoside est de 0,05 La masse moléculaire est donc d'au moins 2 x 107. X 5 Polyoside de K pneumoniae du type 2 On part d'une souche de Klebsiella pneumoniae du type 2. On effectue la culture et la séparation du surna- geant dans les conditions définies à l'exemple 1 (stade a à d), mais en utilisant comme milieu de culture le milieu de culture synthétique suivant: Citrate trisodique 0,85 g Sulfate d'ammonium 0,17 g Sulfate de magnésium 0,17 g Acide glutamique 0,17 g d-glucose 16,70 g Phosphate bipotassique 10 g Phosphate monopotassique 6,66 g Eau distillée q s p 1000 ml p H final: 6,8. L'extraction et la purification du polyoside sont effectuées de la façon suivante: 11. e) Extraction On utilise 90 litres de surnageant de culture. On diafiltre sur cassette Pellicon ( 2 cassettes, membrane ) On effectue 3 lavages par 10 litres d'eau après avoir concentré à 1,5 litre Le rétentat final est de 2,6 litres On lyophilise en ballons, on obtient 6,1 g de produit qui contient: sucres 50 % protéines 15 % f) Purification Le produit obtenu est dissous dans 350 ml d'eau On ajoute: 7 ml de tampon phosphate 0,5 M, p H 7,0 7 mg de R Nase 7 mg de D Nase 1 de Rnase T 1 (filtration préalable des enzymes sur 0,22 g). On incube 4 heures à 37 C On ajoute ensuite mg de protéase type 8, 350 il de phénol et 1 goutte de toluène On incube pendant la nuit à 37 C On arrête la réaction et on achève la déprotéinisation par 3 ex- tractions au butanol-chloroforme ( 1:1) On dialyse la phase aqueuse pendant 60 heures contre de l'EDS apyrogène. On diafiltre sur membrane Amicon XM 100 Le volume de ré- tentat final est de 150 ml On précipite la solution par 3 volumes d'éthanol absolu froid contenant de l'acétate de sodium 5 % Le précipité, recueilli par centrifugation est dissous dans 250 ml d'eau, puis lyophilisé en flacons sous vide On obtient un polyoside pur, contenant: sucres 76 % (Hexoses/acide uronique = 3:1) protéines 3,8 % Le KD du polyoside obtenu est 0,1 La masse D moléculaire est donc supérieure à 10. EXEMPLE 6 Polyoside de H influenza du type b On part d'une souche lyophilisée d'Hemohilus influenzae du type b. 12. On effectue la culture et la séparation du surnageant dans les conditions définies à l'exemple-1 (stade a à d) mais en utilisant comme milieu de culture le milieu de culture semi-synthétique suivant: Proteose peptone 5 g chlorure de sodium 3,5 g d-glucose 4 -g Phosphate monopotassique 1,3 g Phosphate bipotassique 3,5 g NAD (nicotine adenosine dinucléotide) 0,001 g Extrait globulaire 50 ml Eau distillée q s p 1000 ml L'extraction et la purification du polyoside sont effectuées de la façon suivante: e) Extraction On utilise 30 litres de surnageant de culture. On effectue une diafiltration sur membrane Millipore 000 ( 2 cassettes) La première concentration conduit à un volume de 1 litre On lave par 3 fois 10 litres d'EDS On concentre à 1,3 litre On lyophilise en bal- lons On obtient 3,9 g d'un produit qui contient: sucres 53 % protéines 13 % Le produit obtenu est dissous dans 200 ml. On ajoute (après filtration sur 0,22 y): 4,5 ml de tampon phosphate 0,5 M, p H 7,0 4 mg R Nase 4 mg D Nase 40 g 1 R Nase T 1 On effectue une incubation pendant 4 heures à 37 C Ensuite on ajoute 65 mg de protéase type 8, 200 g 1 de phénol et 2 gouttes de toluène On incube pendant une nuit à 37 C On arrête la réaction par 3 extractions au butanolchloroforme ( 1:1) On recueille la phase aqueuse par centrifugation à 12 000 t/mn à + 4 C pendant 30 mi- nutes On dialyse pendant 60 heures contre de l'EDS apy- rogène (changements de milieu de dialyse fréquents). 13. On concentre sur membrane Amicon XM 100 ( 2 lavages x ml) Le volume du diafiltrat est de 100 ml On préci- pite le diafiltrat par 3 volumes d'éthanol absolu froid contenant de l'acétate de sodium à 5 % Le précipité, re- cueilli par centrifugation est repris dans 100 ml d'EDS apyrogène La solution est lyophilisée en flacons sous vide. On obtient 1,3 g de polyoside pur contenant sucres (PRP) 63 % protéines 2 % Le rapport des constituants du polyoside est le suivant: Ribose: Ribitol Phosphore = 0,9; 1; 0,98 (rapport théorique: 1: 1: 1). Le KD avoisine 0,1, ce qui correspond à une masse D moléculaire d'environ 10 Les polyosides capsulaires immunogènes purifiés obtenus selon la présente invention peuvent être utilisés pour la préparation de vaccins destinés à être adminis- trés à titre préventif (ou curatif) à l'homme et aux animaux Les vaccins peuvent être préparés par incorpo- ration des polyosides capsulaires purifiés obtenus selon la présente invention dans un véhicule liquide physiolo- giquement acceptable, tel qu'une solution physiologique ou de l'eau pour injection. On peut incorporer à cet effet un ou, de préfé- rence, plusieurs polyosides capsulaires purifiés obtenus selon la présente invention et à partir de différents types sérologiques En outrer des vaccins polyvalents peuvent êtrepréparés par incorporation de deux ou plu- sieurs polyosides capsulaires purifiés obtenus à partir de différents germes. On donnera ci-après des résultats des essais mettant en évidence l'activité immunogène des polyosides obtenus selon la présente invention. 14. a) Titrage des anticorps sériques chez la souris a Des souris mâles Swiss de 20 g ont été groupées par lots de 10 animaux 1 lot témoin n'a reçu auduii traitement. 1 lot a été traité par voie I P à raison de plusieurs doses de polyoside de l'exemple 1 par animal. Le titrage des anticorps hémagglutinants * a été effectué selon les techniques décrites dans la lit- térature, utilisant le globule rouge de mouton sensibi- lisé par le polyoside à l'aide du chlorure de chrome. Les résultats figurant dans le Tableau I mettent en évidence une augmentation du titre sérique des anticorps hémagglutinants chez les animaux traités aux faibles doses par rapport aux animaux témoins et une paralysie immunitaire classique pour les fortes doses. Des essais analogues ont été effectués chez la souris avec le polyoside de l'exemple 5 (poly- oside de Klebsiella pneumoniae, type 2). Les résultats sont donnés dans le Tableau Il. T A B L E A U I SOURIS TITRES SERIQUES ANTICORPS HEMAGGLUTINANTS Animaux témoins ( 1) o ( 2) 4,8 1,84 Animaux traités 77 gg/souris ( 1) O O ( 2) o o o O Animaux traités 0,77 gg/souris ( 1) ( 2) 1 1 7,5 1,85 Animaux traités 0,077 gg/souris ( 1) > 4096 > 4096 ( 2) 8,9 + 2,02 ul VI C DO p ( 1) ( 2) ( 1) ( 2) ( 1) ( 2) ( 1) ( 2) ()( 2) 1 O O O 8 3 O 2 O O 16 4 16 4 3 O O O 32 5 16 4 4 O O O 16 4 32 5 O O O 8 3 64 6 6 0 O 8 3 16 4 32 5 7 O O O 16 4 164 8 O 2 1 16 4 32 5 9 O O 32 5 64 6 O O 0 64 6 16 4 4,2 0,69 4,3 1,28 p ( 1) Anticorps hémagglutinants Inverse de la dilution ( 2) Anticorps hémagglutinants Log 2 de l'inverse de la dilution .à rfl Q- C> 17. b) Titrage des anticorps sériques chez le rat. La même étude a été réalisée chez le rat Sprague Dawley de 400-450 g mâle. Les lots de 10 animaux ont reçu unie injection S I P de 2 et 20 gg de polyoside de Streptococcus pneumo- niae, type 3, par animal. Le titrage des anticorps hémagglutinants a été effectué les 4, 6 et 14 ème jours après l'adminsitration. Les résultats sont donnés dans le Tableau III. En accord avec la littérature, le titre s'é- lève progressivement pour atteindre son taux maximal le 6 ème jour. SN Loo' O> Loolo> Loo " o> LOO'o> qq'IL 9 PIL Z 91 O:; 68 O zz ', L 99 ip ggàg L 9 0 9 O L O O O 6 0 E 9 9 O O O 8 E O L ú 9 9 t, O O O L 0 9 O z O O O 9 ú O L 6 t, 9 L O O O 9 0 6 8 9 L 9 O O O P z 9 9 ú 9 9 O O O E 0 9 O L 9 O O O z 0 9 O 9 L O O O L t, L 9 t I.C t, L 9 P L LI 9 sgl Tezrq xnleui Tuv S 94 T-ezr-4 xn-eui Tuv su Tompq xn'eui TUV Noljjarljcl vri 5 ICI SSUEIAN Il SCl ZE)OU Sclao DIJINV SSEIII slw li S ri Al V 1 %,O CD %a CD Ln 6 à o 19. c) Protection spécifique a Des lots de 10 souris mâles, d'origine Swiss, ont été immunisés avec le polyoside de Streptococcus pneumoniae de type 1, obtenu selon l'exemple 4, par voie sous-cutanée (deux injections à une semaine d'intervalle); doses injectées: 0,47 4,7 47 et 470 g/kg. Le 10 ème jour après la 2 ème immunisation, les animaux ont été infectés avec le pneumocoque virulent du type 1, par voie sous-cutanée ( 1250 germes/animal). La mortalité après dix jours d'observation a été la suivante: - animaux non traités 100 % animaux traités 0,47 gg/kg 30 % animaux traités 4,7 gg/kg 10 % animaux traités 47 gg/kg 30 % animaux traités 470 gg/kg 40 % Des lots de 10 souris mâles, d'origine Swiss, ont été immunisés avec le polyoside de KP 2 par voie sous-cutanée ( 2 injections à une semaine d'inter- valle doses injectées: 53 533 5332 gg/kg. Le 8 ème jour après le dernier traitement, les animaux ont été injectés avec la souche de Klebsiella pneumoniae type 2 à raison de 650 germes par animal La mortalité après 10 jours d'observation a été la suivante: animaux non traités 100 % animaux traités 53 gg/kg O % animaux traité 533 gg/kg O % animaux traités 5333 gg/kg O % Les polyosides obtenus selon la présente inven- tion peuvent être utilisés notamment pour la préparation des vaccins suivants: a) vaccins destinés au traitement préventif et curatif des affections respiratoires aiguës et chro- niques contenant un des polyosides purifiés correspondant à chacun des germes suivants: Streptococcus pneumoniea Hemophilus influenzae, type b - Klebsiella pneumoniae Escherichia coli A titre d'exemple 1) mélange de polyosides de S pneumoniae, types 1, 6, 14, 23 j ' ' Y '' ' 50 Lig polyoside de K pneumoniae, type 2 20 gg polyoside-d'H influenzae, type b 20 lig volume final 0,5 ml d'eau physiologique. 2) mélange de polyosides de S pneumoniae, types 1,6,14,23 25 g polyoside de K pneumoniae, type 2 10 $g polyoside d'H influenza, type b 10 $g b) Vaccin antipneumococcique contenant les poly- osides purifiés des types suivants de Streptococcus pneu- moniae: 1, 3, 4, 6 A, 7 F, 8, 9 N, 12 F, 14, 18 L, 19 F, 23, 2, 11 A, 15 F. A titre d'exemples: mélange à 50 gg, dans un volume de 0,5 ml d'eau physiologique, mélange à 25 gg dans un volume de 0,5 ml d'eau physiologique. 251 Q 606 REVENDICATIONS 1 Procédé d'obtention de polyosides capsulaires immunogènes à partir de bactéries capsulées les contenant, caractérisé en ce que l'on effectue une culture des bac- téries en milieu synthétique ou semi-synthétique, à la fin de la phase de croissance de cette culture on sépare les corps microbiens d'une phase surnageante, on soumet cette phase surnageante à une filtration sur une membrane retenant les molécules d'une masse moléculaire égale ou supérieure à 100 000 daltons, obtenant ainsi un rétentat riche en polyosides capsulaires et l'on élimine les protéines, les acides nucléiques et les lipides de ce rétentat, obtenant ainsi un polyoside capsulaire purifié. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour éliminer les protéines, les acides nuclé- iques et les lipides du rétentat, on soumet le rétentat à une hydrolyse enzymatique, on ajoute un mélange butanol- chloroforme, on sépare la phase aqueuse, on soumet la phase aqueuse à une dialyse et on effectue une filtration sur une membrane retenant les molécules ayant une masse moléculaire supérieure à 100 000 daltons. 3 Procédé selon la revendication 1 ou la revendi- cation 2, caractérisé en ce qu'on effectue la culture en milieu semisynthétique contenant moins de 0,5 % en poids de produits d'origine naturelle. 4 Polyosides capsulaires obtenus par un procédé selon l'une quelconque des revendicatio ns 1 à 3. Polyosides capsulaires selon la revendication 4, caractérisés en ce qu'il sont obtenus à partir de Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Kleb- siella pneumoniae ou Escherichia coli. 6 Polyosides capsulaires selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'ils sont obtenus à partir de Streptococcus pneumoniae. 7 Vaccin contenant au moins un polyoside capsu- laire selon l'une quelconques des revendications 4 à 6.