Brevet FR2509139A1 — publié le 19830114

La présente invention concerne un procédé pour l'isolement d'une protéine de qualité supérieure à partir de cellules microbiennes, La protéine peut être utilisée comme additif pour enrichir la qualité en protéines d'aliments pour consommation humaine. Les cellules microbiennes ont une haute teneur en acides nucléiques, principalement en acide ribonucléique (ARN) Cette teneur peut aller jusqu'à 18 %, ce qui rend ces cellules inutilisables pour consommation humaine Un des produits finaux du métabolisme des acides nucléiques est l'acide urique, et l'homme ne possède pas l'enzyme uricase qui catalyse l'oxydation de l'acide urique en l'allantoine plus soluble De hautes teneurs en acide urique du plasma peuvent conduire à une précipitation de cristaux d'acide uri- que dans les articulations (goutte), dans les parties molles (tophi) ou à la formation de calculs dans l'appareil urinaire. Pour éviter ces problèmes, l'apport d'acides nucléiques à partir de sources microbiennes ne doit pas dépasser deux grammes par jour, comme recommandé par le Protein Advisory Group des Nations Unies Si de la protéine microbienne doit être une source importante de protéine dans l'alimentation humaine par exemple à raison de 25 grammes par jour, ce qui serait environ la moitié de la ration journalière recommandée pour un adulte, alors le rapport protéine/ARN dans un tel produit doit être d'au moins 12:1. Divers procédés ont été développés pour réduire la teneur en acides nucléiques de protéines unicellulaires. Certains procédés comportent le maintien des cellules entières intactes, et alors ou bien on extrait 1 'ARN, ou bien on laisse les produits de dégradation de digestion de l'ARN passer à travers les parois des cellules Toutefois, en laissant la protéine à l'intérieur des parois des cellules, la valeur nutritive est grandement réduite La désintégration des cellules par l'une quelconque des méthodes usuelles donne une fraction de débris cellulaires et une fraction de constituants cytoplasmiques solubles qui comprend à la fois la protéine et l'acide nucléique Certaines de ces méthodes pour recueil- lir la protéine avec une quantité réduite d'ARN associé comprennent des traitements par de la ribonucléase endogène ou exogène afin de digérer l ARN, un traitement thermique à une température de plus de 1000 C pour insolubiliser la proté- ine ou une hydrolyse alcaline pour hydrolyser l'ARN Les conditions sévères de certains de ces traitements donnent des produits insolubles de manière irréversible dans lesquels la protéine est considérablement dénaturée. On a maintenant trouvé qu'il est possible de traiter la fraction contenant la protéine et l'acide nucléique d'une manière telle que la protéine résultante soit recueillie dans une forme plus utile. En conséquence, la présente invention fournit un procédé pour l'isolement de protéine à partir de cellules microbiennes selon lequel les cellules microbiennes sont soumises à un traitement pour rompre,les parois des cellules de manière à produire une fraction de débris cellulaires et une fraction contenant la protéine et l'acide nucléique, on sépare les deux fractions, la fraction contenant la protéine et l'acide nucléique est traitée par un agent ché- lateur à un p H compris entre 5,5 et 7,0, on fait passer la solution résultante sur une résine échangeuse d'anions qui absorbe sélectivement l'acide nucléique et on recueille l'éluat 24 résultant. Les cellules microbiennes utilisables dans le pro- cédé selon la présente invention sont soit des cellules nou- vellement obtenues par prolifération dans un procédé de fermentation, soit de la matière cellulaire isolée comme sous- produit d'un procédé industriel comme de la levure de bière provenant d'une brasserie Des cellules utilisables sont celles qui peuvent être obtenues à partir de Candida utilis, de Saccharomyces cerevisiae, de Saccharomyces carlsbergensis ou de Zymononas mobilis. Les agents chélateurs qui sont utiles pour la mise en oeuvre de là présente invention sont ceux qui sont actifs dans l'intervalle de p H de 5,5 à 7,0 Des agents chélateurs utilisables selon la présente invention sont l'acide citri- que ou ses sels ou l'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) ou ses sels. Le p H peut être compris entre 5,5 et 7,0 La limite inférieure du p H est déterminée par le fait que la précipi- tation isoélectrique de la protéine se produit au-dessous de 5,5 pour la plupart des protéines de levures Des proté- ines différentes peuvent avoir des points isoélectriques différents Si la colonne est lavée avec le même tampon que celui dans lequel elle a été mise en équilibre, on trouvera que l'échantillon passant directement à travers la colonne en combinaison avec un liquide de lavage quelconque contient environ 40 à 65 % de la protéine initialement appliquée et 0,5 à 5,0 % de l ARN initialement appliqué Dans la plupart des cas, on recueille moins de 2 % de l'ARN initialement appliqué, mais un recueil de jusqu'à 5 % ou même plus est acceptable pour que le rapport protéine:ARN soit supérieur au minimum de 12:1. Des résines échangeuses d'anions utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention sont celles qui adsorbent sélectivement l'acide nucléique Des exemples de telles résines sont la DEAE cellulose ou î'ECTEOLA cellu- lose. Les cellules microbiennes, dans une bouillie de concentration appropriée, peuvent être rompues par l'utili- sation de n'importe lesquelles des méthodes usuelles, comme par homogénéisation sous haute pression, broyage, désinté- gration par vibrations, au moyen d'enzymes lytiques, etc. La bouillie de cellules désintégrées peut être fractionnée par centrifugation ou filtration en une fraction contenant des cellules non rompues en même temps que des fragments de parois de cellules et un extrait soluble L'extrait est la fraction contenant la protéine et l'acide nucléique et a un rapport protéine/ARN compris entre environ 2:1 et 5:1, suivant l'historique des cellules L'extrait est ensuite traité par un tampon contenant un agent chélateur Il-sera évident pour l'homme de l'art que la concentration mini- male de l'agent chélateur dépendra de son activité Pour chaque mg/cm 3 de protéine dans l'extrait, -la concentration des ions citrate, par exemple, doit être au moins 2 m M Les composés-chélateurs peuvent être présents dans le tampon homogénéisant ou peuvent être introduits ultérieurement, avant ou après élimination des débris cellulaires. L'extrait est ensuite appliqué à une colonne d'un échangeur d'anions approprié. Pour améliorer le rendement en protéine, on peut éluer l'échangeur d'anions avec le même tampon contenant en outre un sel, comme du chlorure de sodium ou du chlorure de potassium à une concentration allant jusqu'à 0,3 M Des proportions supplémentaires de 4 à 16 % de la protéine et de moins de 1 % de l'ARN initialement appliqués peuvent être éluées A des concentrations du sel supérieures à 0,3 M, une quantité importante d'ARN est éluée de la colonne. La distribution du recueil de la protéine entre les deux fractions, c'està-dire celle non liée et celle obtenue par élution avec le sel, peut varier avec des concentrations différentes du tampon, mais le recueil combiné est habituel- lement de 55 à 70 % de la protéine initiale et de moins de 2 % de l'ARN initial Ainsi, le rapport protéine:ARN est généralement accru d'unfacteur d'au moins 25 On peut régé- nérer la colonne pour utilisation ultérieure en faisant passer de l'hydroxyde de sodium à travers la colonne usée, avec ensuite remise en équilibre avec le tampon requis. L'effluent de la colonne peut être dépouillé du sel, par exemple par dialyse, et séché pour donner le produit. On a trouvé que ce produit contient de 55 à 80 % de protéine, le reste étant principalement des hydrates de carbone On a trouvé que le produit est complètement soluble dans l'eau à un p H de 7 ou plus élevé, ce qui indique que la protéine n'est pas dénaturée Comme la solubilité des protéines est une propriété fonctionnelle qui permet fréquemment de prévoir d'autres propriétés fonctionnelles des matières protéiques dans les systèmes alimentaires, ce produit est de bonne qualité pour utilisation comme additif pour enrichir la qualité en protéines des aliments Les profils des amino- acides des protéines microbiennes sont généralement riches en lysine et pauvres en amino-acides contenant du soufre, cystéine et méthionine Une application potentielle consis- terait à ajouter de la protéine microbienne à des produits cellulaires qui ont des protéines riches en cystéine et en méthionine et pauvres en lysine, pour obtenir un produit alimentaire ayant un bon équilibre des amino-acides. Exemple 1 On a cultivé Candida utilis (NRRL Y-900) en culture continue dans un chimiostat de 9,5 litres de capacité utile à une vitesse de dilution de 0, 4 h, sur un milieu de mélasse plus sels minimaux Environ 5 litres d'effluent cnt été recueillis dans un récipient réfrigéré, centrifugés à 3000 g, lavés à l'eau froide et congelés Cette crème a été ensuite décongelée et mise en suspension dans une solution 0,01 M de phosphate de sodium, p H 6,5, à un volume de 200 cm 3 pour donner une bouillie à 10 % (en poids/volume) de levure (en poids à sec) La bouillie a été passée à travers un Gaulin Laboratory Homogenizer (modèle 15 M-8 TA), équipé d'une valve de désintégration de cellules) à une pression de 700 kg/cm L'homogénat a été divisé en trois portions, on n'a pas effectué d'addition à une portion, on a ajouté du citrate de sodium à une autre portion de façon à obtenir une concentration de 0,08 M en ion citrate et on a ajouté de l'EDTA à 0,025 n M à la troisième, chaque fois au p H 6,5 Les trois échantillons ont été centrifugés à 5800 g pendant 10 minutes et les extraits solubles ont été séparés par décantation des débris cellulaires. On avait préparé trois colonnes d'environ 10 cm 3 de volume en mettant en équilibre dans les tampons corres- pondants pour chacun des extraits ci-dessus la cellulose échangeuse d'anions Cellex E (ECTEOLA Cellulose, Bio-Rad 6 2509139 Laboratories) L'extrait a été appliqué à chaque colonne à environ 40 % de la capacité de fixation de i'ARN, avec ensuite lavage par un volume de colonne de tampon et ensuite deux volumes de colonne de 0,2 M Na Cl dans le tampon approprié. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. Tableau 1 Rapport % % Accroissement Rapport Extrait protéine: de protéine d'ARN re du rapport protéine: ARN dans recueilli cueilli protéine: ARN l'extrait ARN i pas d'additions2,0:1 67,0 % 23,8 % 2,8 X 5,6:1 0,25 m MEDTA 2,0:1 60,9 % 4,6 % 13 X 26:1 0,08 Mcitrate 1,8:1 63,8 % 1,0 % 64 X 115:1 l Example 2 Candida utilis a été cultivé et récolté comme dans l'exemple 1 Une suspension de levure fraichement récoltée a été homogénéisée dans du tampon 0,01 M phosphate de sodium au p H 6,2 comme dans l'exemple 1 On a ajouté du citrate de sodium et du pyrophosphate de sodium à des portions de l'homogénat en quantités croissantes, puis on a centrifugé chacune à 5 800 g pendant 10 minutes Trois colonnes de Cellex E ayant des volumes d'environ 5 cm 3 ont été mises en équilibre dans des tampons correspondant à ceux des extraits. Chaque colonne a été chargée d'extrait, à environ 80 % de la capacité de fixation de i'ARN, lavée avec un volume de colonne de tampon et ensuite trois volumes de colonne de solution 0,2 M de chlorure de sodium dans le tampon approprié. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2. Tableau 2 xtrait Rapport % % Accroissement Rapport protéine: de protéine d'ARN du rapport protéine: ARN dans recueilli recueilli protéine:ARN ARN l'extrait 0,02 W 1 citrat pyrophosphate 2,4:1 65,3 % 9,7 % 6,7 X 16:1 0 041 eittate +*,005 pyrophosphate 2,0:1 62,9 % 3,2 % 20 X 40:1 0 o 08 Mcitrate &rhosphate 1, 8:1 64,0 % 21 M% 23 41: pyrophsphate1,8:1 64,0 % 2,8 % 23 X 41:1 Exemple 3 Candida utilis l'exemple 1 Les cellules solution 0,08 M de citrate a été cultivé et ont été mises en de sodium, 0,01 M récolté comme dans suspension dans une de pyrophosphate de sodium et 0,01 M de phosphate de sodium, au p H 6,2, et homo- généisées comme dans l'exemple 1 Des portions de l'homogénat ont été ajustées à diverses valeurs de p H, puis centrifugées à 5800 g pendant 10 minutes Les extraits ont été ensuite appliqués à des colonnes de Cellex E mises en équilibre dans le même tampon aux divers p H et élués comme dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3. Tableau 3 % d'ARN Accroissement du recueilli rapport protéine:ARN 77,3 % 54,1 % 54,1 % 58,4 % 59,2 % 59,5 % 59,0 % ,7 % 4,8 % 2,2 % 1,6 % 1,0 % 1,1 % 0,9 % 1,9 % 24,4 % 16 X X 36 X 58 X 54 X 66 X 31 X 2,5 X * C'était un extrait dilué, car le réglage du p H a causé la précipitation de 56 % de la protéine et de 70 % de l'AR Nb Exemple 4 Candida utilis a été fraîchement cultivé et récolté comme dans l'exemple 1 La levure a été mise en sus- pension dans un tampon contenant 0,04 M citrate de sodium, 0,005 M pyrophosphate de sodium, 0,01 M phosphate de sodium au p H 6,2 et homogénéisée comme dans l'exemple 1 L'homo- génat a été centrifugé à 5800 g pendant 10 minutes et l'ex- trait a été chargé sur une colonne de Cellex E d'un volume de lit de 44 cm, environ 90 % de a capacité de fixation de i'ARN Après avoir fait couler l'échantillon dans la colonne, on a effectué des lavages avec un volume de colonne de tampon et ensuite deux volumes de colonne de solution 0,2 M de Na Cl dans le même tampon Des fractions de 10 cm ont été recueillies et soumises à des déterminations de protéine et d'ARN Les récupérations sont indiquées dans le Tableau 4. Tableau 4 Fraction Protéine Récupération de ARN Récupération N {mg) protéine (mg) d'ARN __________ (cumulée) (cu-ulée) 1 80,1 17,7 % 0,51 0,20 % 2 97,6 38,9 % 0,78 0,53 % Non 3 40,6 47,7 % 0,99 0,92 % liée 4 16,7 51 ',4 % 0,89 1,26 % \ 5 6,6 52,8 % 0,83 1,54 % 6 4,0 53,7 % 0,48 1,77 % Iution7 4,6 54,7 % 0,25 1,87 % Elution avec un 8 8,7 56,6 % 0,25 1,96 % Sel 9 7,1 58,1 % 0,12 2,01 % 4,6 59,1 % 0,03 2,02 % il 2,7 59,7 % 0,0 2,02 % 12 2,0 60,2 % 0,01 2,03 % Exemple 5 Un extrait a été préparé comme dans l'exemple 1 à partir de crème de levure congelée et homogénéisée dans une solution 0,01 M de phosphate de sodium au p H 6,5 On a ajouté du citrate de sodium ( 0,08 M) à l'homogénat et ensuoite on a centrifugé le mélange à 5800 g pendant 10 minutes pour obte- nir l'extrait On a préparé des colonnes ayant des volumes d'environ 8 cm 3 en utilisant deux résines échangeuses d'anions différentes, une avec Cellex E comme dans les exemples pré- cédents et une avec Cellex D (DEAE cellulose, Bio-Rad Labo- ratories) Un échantillon a été chargé sur chacune à une capacité de fixation de i'ARN d'environ 45 % Les colonnes ont été lavées avec un volume de tampon et ensuite avec deux volumes de solution 0,2 M de Na Cl dans le même tampon, le tout à un p H de 6,5 Sur la colonne de Cellex E, on a recueilli 63,8 % de la protéine appliquée initialement et 1 % de l'ARN appliqué initialement Sur la colonne de Cellex D, on a recueilli 62,1 % de la protéine appliquée initiale- ment et 1,3 % de l'ARN appliqué initialement. Exemple 6 Un échantillon de levure de boulanger du commerce (Saccharomyces cerevisiae) a été mis en suspension dans un tampon contenant 0,08 M citrate de sodium, 0,01 M pyrophosphate de sodium au p H 6,2 à une teneur en cellules d'environ 10 % (en poids/volume, d'après le poids à sec) Cette suspension a été homogénéisée et centrifugée comme dans l'exemple 1 pour donner un extrait ayant un rapport protéine;ARN de 4,1. Une portion de l'extrait a été chargée sur une colonne de Cellex E mise en équilibre dans le même tampon à environ 70 de la capacité de fixation de l'ARN et lavée avec environ 1 volume de colonne de tampon. La fraction ayant traversé directement la colonne combinée avec le liquide de lavage contenait 66,5 % la prctéine initiale et 3,3 % de l'ARN initial L'élution avec deux volumes de colonne de solution 0,2 M de Na Cl dans le même tampon a entraîné la récupération d'une proportion supplémentaire de 3,6 % de la protéine initiale et de 0,7 % de 1 'ARN initial La récupération combinée pour ces deux fractions a été de 70,1 % de la protéine initiale et de 4,0 % de l ARN initial, avec un accroissement du rapport protéine: ARN d'un facteur de 17,5, portant ce rapport à 72:1 L'élution avec deux volumes de colonne de solution 0,4 M de Na Cl dans le même tampon a entraîné la récupération de proportions supplémentaires de 1,5 % de la protéine initiale et de 14,0 % de l ARN initial. Exemple 7 Saccharomyces carlsbergensis a été cultivé d'une manière discontinue sur un milieu de mélasse plus sels complets. Environ cinq heures après cessation du développement, les cellules ont été récoltées, centrifugées, lavées et ensuite mises en suspension dans un tampon contenant du citrate de sodium ( 0,08 M), du pyrophosphate de sodium (O,O 1 M) et du phosphate de sodium ( 0,O 1 M) au p H 6,5 à une concentration d'environ 10 % (en poids/volume, d'après le poids à sec). Cette bouillie a été homogénéisée comme dans l'exemple 1. L'extrait obtenu par centrifugation avait un rapport protéine: ARN de 2, 9:1 et a été appliqué à une colonne de Cellex D, à environ 70 % de la capacité de fixation de l ARN La colonne a été lavée avec un volume de tampon, et ensuite avec deux volumes de solution 0,2 M de Na Cl dans le tampon, avec pour résultat la récupération de 74,1 % de la protéine initiale et de 6,2 % de l ARN initial, avec un accroissement du rapport protéine:ARN d'un facteur de 12, portant ce rapport à 35:1. Exemple 8 cultivée La bactérie Zymomonas mobilis (ATCC 29191) a été/ de manière continue sur un milieu de glucose, d'extrait de levures et de sels Environ 700 cm 3 de culture ont été recueillis sur de la glace, centrifugés et lavés Dix grammes de crème de cellules et 10 cm 3 de tampon contenant du citrate de sodium ( 0,04 M), du pyrophosphate de sodium ( O 005 M) et du phosphate de sodium ( 0,005 M) au p H 6,2 ont été placés dans un flacon d'homogénéiseur de Braun avec 50 g de perles de verre ( 0,25-0,3 mm) Ce mélange a été homogénéisé durant deux périodes de 30 secondes à 4000 cycles par minute, avec un courant de CO 2 liquide pour refroidissement Le contenu du flacon a été décanté et on a rincé le flacon et les perles avec deux portions de 10 cm 3 de tampon L'homogénat et les liquides de lavage combinés ont été centrifugés à 5800 g pendant 10 minutes pour donner un extrait soluble ayant un rapport protéine:ARN de 1,5:1 Cet extrait a été appliqué à une colonne de Cellex E, qui a été lavée avec un volume de colonne de tampon L'échantillon passant à travers la colonne contenait 59,3 % de la protéine initiale et 2,0 % de PARN initial, avec un accroissement un rapport protéine: ARN d'un facteur de 30, portant ce rapport à 45:1. REVENDICATIONS 1 Procédé pour l'isolement de protéine à partir de cellules microbiennes, selon lequel les cellules microbiennes sont soumises à un traitement pour rompre les parois des cellules de manière à produire une fraction de debris cellu- laires et une fraction contenant la protéine et l'acide nucléique, on sépare les deux fractions, la fraction contenant la protéine et l Vacide nucléique est traitée par un agent chélateur à un p H compris entre 5,5 et 7,0, la solution ré- sultante est passée sur une résine échangeuse d'anions qui adsorbe sélectivement l'acide nucléique et on recueille l'éluat résultant. 2 Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que l'agent chélateur est l'acide citrique ou un sel de cet acide. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent chélateur est l'acide éthylènediaminetétracé- tique ou un sel de cet acide. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les cellules sont dérivées de Candida- utilis. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les cellules sont dérivées de Saccharomyces cerevisioe. 6 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les cellules sont dérivées de Zymomonas mobilis. 7 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé-en ce que les cellules sont dérivées de Saccharomfyces carlsbergensis. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le p H est compris entre 6 et 6,5. 9)Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'éluat est séché. 10 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'éluat est dépouillé de sel et ensuite séché.