Brevet FR2504525A1 — publié le 19821029

Procédé de préparation d'oligopeptides lysine-tryptophane, de leurs dérivés et de leurs sels physiologiquement utilisables. La présente invention concerne un procédé de préparation d'oligopeptides constitués par des résidus de lysine et de tryptophane caractérisés par la formule générale ( 1) suivante: (L Ys)a (Try)b ( 1) a > 0; b > O Lys = lysine Try = tryptophane cette formule générale comprenant toutes les combinaisons possibles de séquences pouvant se former avec ces aminoacides appartenant aussi bien à la série d qu'à la série ú ou avec toutes les combinaisons séquentielles possibles de la série d et de la série Q, à la seule condition que la liaison pepti- dique -CONH ait été engendrée par apport du groupe amino de la lysine ou du groupe amino en position a du carboxyle qui donne lieu à la formation de ladite liaison. L'invention se réfère également aux dérivés et aux sels physiologiquement utilisables des composés de formule générale ( 1) et plus spécialement à ceux facilitant une action théra- peutique possible. Le procédé auquel se réfère la présente invention se caracté- rise par les trois étapes indiquées ci-dessous: Etape 1: Réaction d'un composé de formule générale ( 2) avec un sel d'un composé de formule ( 3), de préférence un chlorhydrate ou p-toluènesulfonate, au sein d'un solvant inerte aprotique tel que le tétrahydrofuranne, l'acétonitrile, le N,N-diméthylformamide ou des mélanges de ces solvants, en présence d'une base aprotique telle que la triéthylamine, la N-méthylmorpholine, la 2,6lutidine, etc, pendant 1 à 2 heures R H i = NH -CH-C i Q /S-N O R 2 OR 3 02 ( 2) ( 3) o R 1 et R 2 peuvent être indistinctement un groupe e-méthy- H 2- lènindole () ou ó-aminobutyle dans lequel le groupe ú-amino est protégé par un groupe P (PHN-(CH 2)3-CH 2-) dont la signification est celle d'un protecteur d'amines usuel dans la chimie des aminoacides et des protéines, tel que le carbobenzyloxy substitué, le carbo-ter-butyloxy, le trityle, le tosyle, etc, ou un résidu quelconque d'une séquence pepti- dique quelconque (Lys)c-(Try)d (c> O et/ou d> 0) à la seule condition que R 1 ou R 2 possède au moins un résidu de 8-méthy- lènindole ou de c-aminobutyle protégé R 3 désigne un radical alkyle, aryle ou aralkyle. On obtient ainsi, sans qu'aucune racémisation n'ait lieu, un composé de formule générale ( 4) O S-NIH-l H-CO-NH-óH-Cie O ( 4) 2 XOR 3 o R 1, R 2 et R 3 ont la signification déjà indiquée. Les composés de formule générale ( 2) peuvent être obtenus par réaction de chlorure de o-nitrophénylsulfényle avec de l'anhydride de Leuch (Ncarhoxy anhydride de a-aminoacide ou peptide) selon le procédé décrit par H R Kricheldorf, Angew Chem 85,86 ( 1973), Chem Ber 107, 3553 ( 1974) et R Katakai, J Org Chem 40 ( 19), 2697 ( 1975). Etape 2: réaction sous des conditions douces du composé de formule générale ( 4) avec l'un quelconque des réactifs connus dans la littérature pour éliminer le groupe o-nitrosulfényle tel que les thiols dans des solvants inertes non aqueux, des halogénures d'hydrogène en solution diluée de dioxane à basses températures, t le peptide. De la manière indiquée, on obtient le composé de formule générale ( 5) suivant, sous forme d'hydrohalogénure si on utilise HC 1 ou H Br/dioxane comme réactif. R 1 NH 2 H-CO-NH-CH-C/ ( 5) 2 OR 3 o R 1, R 2 et R 3 ont la signification déjà indiquée. Etape 3: Traitement du composé de formule générale ( 5) obtenu au cours de l'étape 2, sous atmosphère d'azote ou en présence d'un antioxydant, avec l'un quelconque des réactifs habituel- lement utilisés dans la chimie des peptides et des aminoacides, pour éliminer des groupes protecteurs des amines, tels que l'hydrogène sur des catalyseurs distincts dans des solvants adéquats, des halogénures d'hydrogène dans de l'acide acétique, etc On obtient ainsi un ester dérivé du produit de formule générale ( 1) qui, par traitement avec une base dans un solvant inerte selon les méthodes habituelles de la chimie organique pour la saponification des esters, par exemple avec un hydro- xyde alcalin ou alcalino-terreux en milieu aqueux ou hydro- alcoolique, suivi par la neutralisation de la solution alca- line antérieure, en faisant passer de préférence cette solution au travers d'une colonne acide à échange d'ions, conduit au peptide libre comprenant les aminoacides lysine et tryptophane de formule générale ( 1) suivante: (Lys)a -(Try)b a > O; b > O L'ester méthylique suivant, z-Lys-Z- Try O Me dérivé du composé de formule générale ( 1) o a = b = 1, a déjà été décrit sous forme de mono et de dihydrochlorure par M Szekerke, J Erchegyi et J Sàgi, Acta chim Acad Sci Hung 80, 193 ( 1974), bien que le procédé décrit pour sa synthèse soit différent. Les rendements obtenus pour toutes les réactions sont bons (y 90 %), sans qu'aucune racémisation ait lieu. Les exemples suivants qui illustrent le procédé de l'inven- tion ne doivent pas être considérés comme limitatifs Dans tous ces exemples, on utilise les abréviations suivantes: NPS, NCA et Z ayant les significations indiquées ci-dessous, ces abréviations étant celles qui sont utilisées universelle- ment et habituellement en chimie des aminoacides et des pep- tides pour indiquer les groupes qu'elles représentent et qui sont largement connues des spécialistes en la matière. NPS = o-nitrophénylsulfényle NCA = a-N-carboxy-anhydride Z = carbobenzyloxy EXEMPLE 1 H Cl Z-Lys-t-Try O Me 1 NPS-e-Z-t-Lys-t-Try O Me. On met en suspension 38,2 g de chlorhydrate de l-tryptop Manate de méthyle dans 300 ml de tétrahydrofuranne sec et on ajoute ensuite 21 ml de triéthylamine en filtrant ensuite le chlor- hydrate de triéthylamine formé On ajoute au filtrat 72,6 g de NPS-c-Z-ZLys-NCA en soumettant le mélange à agitation pendant deux heures La solution est évaporée sous pression réduite, la température du bain ne dépassant pas 35 C, et il reste un résidu qu'on dissout dans 600 ml d'acétate d'éthyle, qu'on lave ensuite avec une solution aqueuse d'acide tar- trique à 5 %, de bicarbonate de sodium à 5 % et de l'eau On sèche la phase organique sur du sulfate de sodium et on l'évapore sous vide; on obtient ainsi un sirop épais qu'on utilise au cours de l'étape suivante et dont l'identité et la structure sont déterminées sur la base de ses données spec- troscopiques et analytiques. RMN (diméthylsulfoxyde-d 6)S: 7-8,5 (m,14; 5 indol, 5 groupes Z, 4 NPS); 5,1 (s, 2, CH 2 groupe Z); 3,4 (s, 3, CO 2 CH 3). Analyse: calculé pour C 32 H 35 N 507 S: C: 60,65 %; H: 5,56 % N: 11,05 %; S: 5,04 % trouvé: C : 61,03 % ; H : 5,89 % N: 10,88 %; S: 5,29 % 2 H Cl -Z-9-Lys-Z-Try O Me. On dissout 88,3 g de NPS-c-Z-L-Lys-Z-Try O Me obtenu anté- rieurement dans 350 ml d'une solution 1 N d'acide chlorhydrique dans du dioxane refroidi à -5 C On évapore ensuite la solu- tion sous pression réduite jusqu'à ce qu'elle soit sèche, pour donner lieu à un résidu gommeux qui se solidifie par traitement avec du benzène et sous agitation, et dont la structure est déterminée sur la base de ses données spectro- scopiques et analytiques. RMN (diméthylsulfoxyde-d 6)&: 5,1 (s, 2 CH 2 groupe Z); 3,5 (s, 3,CO 2 CH 3). Analyse: calculé pour C 26 H 33 N 405 C 1 2 H 20: C 56,47 %; H 6,69 % N 10,13 %; Cl 6,42 % trouvé: C 56,28 %; H 6,90 % N 9,97 %; Cl 6,68 % 3 H Ci t-Lys-t-Try O Me. On fait chauffer à 100 C pendant une heure dans une atmosphère d'azote une solution de 8 g de H Cl c-Z-t-Lys-Try O Me obtenu au cours de l'étape précédente, dans 40 ml d'acide acétiaue saturé en acide chlorhydrique La solution est évaporée sous vide jusqu'à ce qu'elle soit sèche,pour donner lieu à un sirop qu'on lave à l'acétone de manière qu'il acquière ainsi une consistance gommeuse Bien qu'on ne puisse le cristalliser, son identité est confirmée sur la base des données spectro- scopiques et il présente un pouvoir rotatoire analogue à celui décrit dans la bibliographie; (a)D = + 8 (c = 1,5 H 20); (a)D bibliographie = + 6,2 (c = 1,1 H 20). EXEMPLE 2 H Cl À-Lys Z-Lys t-Try O Me. 1 NPS c-Z Z-Lys c-Z Z-Lys t-Try O Me. On met en suspension 62 g de H Cl c-Z-Z-Lys-Z-Try O Me, obtenu selon l'exemple précédent, dans 600 ml de tétrahydrofuranne sec et on ajoute 16, 8 ml de triéthylamine On filtre le précipité formé et on ajoute au filtrat 50,4 g de NPS-5-Z-Z- Lys-NAC Le mélange est soumis à agitation pendant deux heures à la température ambiante La solution est évaporée sous pression réduite jusqu'à ce qu'elle soit sèche et le résidu est dissous dans 2 litres d'acétate d'éthyle, puis on le lave avec des solutions aqueuses d'acide tartrique à 5 %, de bicar- bonate de sodium à 5 % et de l'eau. On sèche la phase organique sur du sulfate de sodium et la solution d'acétate d'éthyle, une fois sèche, est évaporée sous vide jusqu'à ce qu'on obtienne un résidu gommeux qui se solidifie par traitement à l'hexane pour devenir un solide amorphe; le produit obtenu est identifié sur la base de ses données spectroscopiques RMN et d'analyse: RMN (diméthylsulfoxyde-d 6)6: 7-8,5 (m, 19; 5 indol,10 groupes Z, 4 NPS); 5,1 (s, 4,CH 2 groupes Z); 3,5 (s, 3,CO 2 CH 3). Analyse; calculé pour C 46 H 53 H 701 QS; C; 61,67 %; H: 5,92 % N: 10,94 %; S: 3,57 % trouvé C 61,48 %; H: 6,16 % N: 10,69 %; S: 3,72 % 2 H Cl ó-Z-Z-Lys Z-Z Lys-Z-Try O Me. On dissout 102 g de NPS-e-Z-Z-Lys-c-Z-Z-Lys-Q-Try O Me obtenu au cours de l'étape précédente dans une solution 1 N d'acide chlorhydrique dans du dioxane refroidi à -50 C Ensuite, la solution est évaporée sous pression réduite jusqu'à ce qu'elle soit sèche, pour donner lieu à un sirop épais qui se solidifie en lui ajoutant de l'éther éthylique Le solide est lavé à l'éther et il cristallise dans du tétrahydrofuranne- éther éthylique, pf = 120-1210 C. Analyse: calculé pour C 40 H 51 N 608 C 1 2120: C: 58,93 %; H: 6,70 % N: 10,31 %; Cl: 4,35 % trouvé: C: 58,59 %; H: 6,31 % N: 10,27 %; CI: 4,72 % 3 H Cl Z-Lys-Z-Lys-t-Try O Me. On chauffe à 100 C en atmosphère d'azote et pendant une heure une solution de H Cl c-Z-1-Lys-E-Z-Q-Lys-Q-Try O Me obtenu au cours de l'étape précédente dans 300 ml d'acide acétique saturé d'acide chlorhydrique On évapore ensuite sous vide jusqu'à siccité; on obtient un résidu qu'on lave avec de l'acétone sous agitation jusqu'à ce qu'il acquière la texture d'un solide amorphe qui, bien qu'il ne puisse être cristalli- sé, est identifié sur la base de ses données spectroscopiques et analytiques: RMN (diméthylsulfoxyde-d 6) 8: 1,1-1,9 (m, 12,CH 2 lysines non contiguës au groupe amine), 3,50 (s, 3,CO 2 CH 3) 6,85-7,90 (m, s, tryptophane). Analyse: calculé pour C 24 H 39 N 604 C 1; C; 56,41 %; H: 7,64 % N: 16,45 %; Cl: 6,95 % trouvé: C : 56,73 %; H: 7,28 % N: 16,09 %; Cl: 70,2 % EXEMPLE 3 Z-Lys-L-Lys-t-Lys-Z-Try O Me et Z-Lys-Z-Lys-t-Lys-Try OH 1 NPS-5-Z-Z-Lys-ó-Z-Q-Lys-e-Z-Z-Lys-Q-Try O Me. On met en suspension 79 g de HC 1 s-Z-Z-Lys-ó-Z-L-Lys-Z-Try O Me obtenu selon l'exemple 2, dans 600 ml de tétrahydrofuranne sec et on ajoute 14,6 ml de triéthylamine On filtre le précipité formé et on ajoute au filtrat 46 g de NPS-e-Z-t-Lys-NCA Le mélange est soumis à agitation pendant 1 heure et demie à la température ambiante A la fin de cette période, il est évaporé sous vide et on obtient un sirop épais qui se soli- difie à l'acétate d'éthyle pour fournir un solide jaune qui cristallise dans l'acétate d'étkyle pf = 172-174 C. RMN (diméthylsulfoxyde-d 6)e: 7-8,5 (m, 24: 5 indol, 15 - groupe Z, 4 NPS); 5,1 (s, 6, CH 2 groupes Z); 3,4 (s,3,CO 2 CH 3). Analyse: calculé pour C 60 H 72 N 9013 S: C: 62,18 %; H: 6,22 % N: 10,88 % trouvé: C : 62,42 %; H : 5,93 % N: 10,58 % 2 H Cl ó-Z-2-Lys-5-Z-Z-Lys-c-Z-Q-Lys-L-Try O Me. On dissout 107 g de NPS-ó-Z-2-Lys-e-Z-Z-Lys-c-Z-Z-Lys-Z-Try O Me obtenu au cours de l'étape précédente dans une solution 1 N d'acide chlorhydrique dans du dioxane refroidi à -5 C Ensuite, on évapore sous pression réduite jusqu'à siccité, la tempé- rature du bain étant inférieure à 35 C, pour donner un résidu solide qu'on lave plusieurs fois à l'éther éthylique On obtient ainsi un produit qui recristallise dans du tétra- hydrofuranne-éther éthylique, pf = 170-171 C. 04525 Analyse: calculé pour C 54 H 69 N 8011 C 1 2 H 20 C: 60,20 %; H: 6,78 % N: 10,40 %; Cl: 3,30 % trouvé: C: 60,54 %; H: 6,48 % N: 10,76 %; Cl: 3,45 % 3 HC 1 Z-Lys-t-L Ys-Z-Lys-Trv O Me et Z-Lys-Z-Lyst-Lys-Try OH On chauffe à 100 C et dans une atmosphère d'azote pendant une heure une solution de 80 g de U Cl ó-Z-t-Lys-e-Z-t-Lys-c- Z-Q-Lys-Q-Try O Me, obtenu au cours de l'étape précédente, dans 400 ml d'acide acétique saturé d'acide chlorhydrique A la fin de cette période, on évapore sous vide jusqu'à siccité pour donner un résidu gommeux qui, lavé et agité avec de l'acétone, acquiert la consistance d'un solide amorphe. Bien qu'il ne puisse être cristallisé, il est identifié comme étant H Cl ú-Lys-t-Lys-t-Lys-Try O Me sur la base des données analytiques et spectroscopiques. RMN (diméthylsulfoxyde-d 6)a: 1,1-1,9 (m, 18,CH 2 lysines non contiguës au groupe amine), 3,52 (s, 3,CO 2 CH 3), 6,85-7,90 (m, 5,tryptophane). Analyse: calculé pour C 30 IH 41 N 805 Cl: C: 57,28 %; H: 6,52 % N: 17,82 %; Ci: 5,64 % trouvé: C: 57,49 %; H: 6,78 % N: 17,51 %; Cl: 5,82 % On dissout ensuite ce produit dans 575 ml d'éthanol et on ajoute lentement à la solution 80 ml d'hydroxyde de sodium 4 N, sous agitation Le mélange est soumis à agitation pendant une heure et demie à température ambiante et on l'évapore sous vide jusqu'à siccité; on obtient un résidu qu'on dissout ensuite dans de l'eau et qu'on neutralise en le faisant passer au trayers d'une colonne acide à échange d'ions IR-120. La solution aqueuse qui est diluée dans la colonne est évaporée sous vide jusqu'à siccité, et on obtient ainsi un solide qui recristallise dans la méthanol-acétone, pf = 187- 188 e C et qui correspond au tétrapeptide libre Z-Lys-Z-Lys-t- Lys-Try OH. RMN (diméthylsulfoxyde-d 6)6: 1,1-1,9 (m, 18,CH 2 lysines non contiguës au groupe NH 2), 6,85-7,90 (m, 5,tryptophane). Analyse: calculé pour C 29 H 38 N 805: C: 60,20 %; H: 6,57 % N: 19,37 % trouvé: C : 59,97 % ; H : 6,53 % N: 19,08 %. Revendicat Qions 1. Procédé de préparation d'oligopeptides lysine-tryptophane, de leurs dérivés et de leurs sels physiologiquement utili- sables, qui répondent à la formule générale ( 1) suivante: (Lys)a (Try)b a > O; b > O ( 1) comprenant les combinaisons possibles de séquences pouvant se former avec la lysine et le tryptophane de la série d et/ou Q, à la seule condition que la liaison peptidique -CONH ait été engendrée par apport du groupe amino de la lysine ou du groupe amino en position a du carboxyle qui donne lieu à la formation de ladite liaison, le procédé étant caractérisé par les trois étapes de réaction suivantes: Etape 1: Réaction du composé de formule générale ( 2) avec un sel d'un composé de formule générale ( 3) en présence d'une base aprotique et au sein d'un solvant inerte adéquat; R 1 Il O /HC C=O NH 2 CH Cet k> ' 2 OR 3 NO 8 2 ( 2) ( 3) o R 1 et R 2 peuvent être indistinctement le e-méthylènindole ou l'eaminobutyle dans lequel le groupe s-NH 2 est protégé, ou un résidu quelconque d'une séquence peptidique quelconque (Lys)c-(Try)d (c et/ou d > 0) à la condition que R 1 ou R 2 possède au moins un résidu de C-méthylènindole ou de E-amino- butyle protégé; et R 3 désigne un radical alkyle, aryle ou aralkyle, ce par quoi on obtient un composé de formule générale ( 4) suivante: 3 R O N O XOR 3 Etape 2; Réaction du composé de formule générale ( 4) obtenu au cours de l'étape précédente avec un acide dilué au sein d'un solvant inerte adéquat, de par quoi on obtient un composé de formule générale ( 5) suivante: R 1 O NH 2-i H-CONH-CHI-C/ 2 OR 3 o R 1, R 2 et R 3 ont la signification déjà indiquée; Etape 3: Réaction du composé de formule générale ( 5) obtenu au cours de l'étape précédente avec une solution d'hydracide et d'acide acétique ou d'hydrogène dans de l'acide acétique en présence d'un catalyseur, ce par quoi on obtient un ester dérivé du produit de formule générale ( 1) qui, par saponifi- cation avec une solution aqueuse ou alcoolique-aqueuse d'une base, suivie de la neutralisation du mélange résultant, conduit au peptide libre de formule générale ( 1) suivant qui comprend toutes les combinaisons peptidiques possibles mentionnées précédemment: (Lys)a (Try)b a > O; b > O 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction correspondant à la première étape est réalisée dans du tétrahydrofuranne et à température ambiante. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la base aprotique utilisée au cours de la première étape est la triéthylamine. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction correspondant à la seconde étape est réalisée avec de l'acide chlorhydrique 1 N dans du dioxane à une tempé- rature de 0 O 50 C. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupe protecteur du groupe amino terminal de la lysine est le groupe carbobenzyloxy. 04525 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction d'élimination du groupe carbobenzyloxy corres- pondant à la troisième étape est réalisée au moyen d'une solution saturée d'acide chlorhydrique dans de l'acide acétique à 80-100 C, pendant une période de 30 à 60 minutes. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction de saponification correspondant à la troisième étape est réalisée avec un hydroxyde alcalin ou alcalino- terreux en milieu aqueux ou hydro-alcoolique. 8. Chlorhydrate de Z-Lys-t-Lys-t-Try-O-méthyle. 9. Chlorhydrate de Z-Lys-L-Lys-Q-Lys-R -Try-O-méthyle. 10. Z-Lys-t-Lys-Q-Lys Try-OIH.