Brevet FR2509324A1 — publié le 19830114

-1 2509324 L'invention concerne un substrat pour doser lay glutamyl transpeptidase lE C 2 3 2 1, glutamine: D-glutamyl glutamyltransferase, ci-après désignée par Y-GTPl et une méthode de dosage utilisant ce substrat. La '-GTP est une enzyme qui catalyse une réaction d'hydrolyse du groupe 6glutamyl en peptide de 6-glutamyl et de transfert dudit groupe à un autre amino acide ou peptide tel que la glycylglycine. L'enzyme 6-GTP présente un intérêt spécial depuis qu'une méthode de dosage utilisant un substrat synthétique a été développée par Orlowski et autres et Goldberg et autres, au début de l'année 1960, et que l'importance clinique du sérum 6-GTP dans le traitement de l'hépatite et de la cystite a été reconnue. La valeur du sérum e-GTP est dite inférieure dans l'hépatite chronique non-active et élevée dans l'hépatite chronique active, ainsi que dans la stase biliaire, l'ictère obstructif, l'hépatome primaire ou métastatique La détermination de l'activité du sérum -GTP est spécifique pour l'hépatite chronique et est utile pour le diagnostic clinique et la détermination exacte pathologique de ces maladies. On connaissait jusqu'à présent, pour le dosage de la -GTP, des substrats et des méthodes utilisant ces substrats, ces derniers étant des dérivés de i-glutamyl-aniline (cf. demandesde brevets japonais publiéesavant examen N 47-5898, 49-86338, 49-87392, 52-152291, 53-111793 et 53-147034) des dérivés de Y-glutamyl-naphtylamine (N 50-6393), la 6-glutamyl-p- nitroanilide, la i-glutamyl-O -naphtylamide. Dans une méthode de dosage utilisant le -glutamyl- p-nitroanilide, on traite le Y-glutamyl-p-nitroanilide avec de la Y-GTP pour libérer la p-nitro-aniline colorée en jaune et dont la mesure colorimétrique est 410 nm Le fluide corporel, notamment la bilirubine inhibe l'absorption à 410 nm La p-nitroaniline également libérée est condensée avec le composé aldéhyde tel que le p-diméthylbenzaldéhyde pour produire une couleur qui est soumise à un dosage colorimétrique à son absorption maximale Cette méthode de dosage colorimétrique est très complexe et exige des opérations strictes, en sorte qu'elle n'est pas appropriée pour des diagnostics cliniques. On traite aussi le '-glutamyl-0 (-naphtylamide ou le -glutamyl P -naphtylamide avec la -GTP pour libérer l'c naphtylamine ou le P-naphtylamine qui est changé en sel de diazonium et est mesuré par colorimétrie ou est mis à réagir avec le 3-méthyl-2benzothiazo-linonehydrazone et un agent d'oxydation pour révéler la couleur Cette méthode de dosage exige des opérations strictes avec un procédé de réaction complexe qui présente des inconvénients De plus, la o(-naphtylamine et le P-naphtylamine ont une toxicité élevée et sont des facteurs de la tumeur de la vessie. On a maintenant trouvé que le substrat synthétique préparé en faisant réagir la méthylamine substituée qui n'existe pas dans un sérum tel que la benzylamine, la tyramine, la butylamine ou l'éthanolamine avec le groupe -carboxyle de l'acide L-glutamique, libère de la méthylamine substituée par l'action de la Y-GTP. La méthylamine substituée est oxydée par l'action de l'oxydase correspondante et de l'oxygène est consommé ou du peroxyde d'hydrogène et de l'ammoniac sont engendrés selon la quantité de méthylamine substituée libérée _On peut mesurer l'activité de la -GTP en mesurant la quantité d'oxygène consommé, ou de peroxyde d'hydrogène ou d'ammoniac engendré En outre, des moyens de mesure électriques tels que l'électrode à oxygène, l'électrode à peroxyde d'hydrogène ou l'électrode à ammoniac, ou l'électrode à enzyme, qui est couverte par l'oxydase immobilisée à la surface de l'électrode, peuvent être appliques sans affecter la substance colorée dans le sérum pour le dosage de l'activité de la '-GTP durant une courte durée. Un but de la présente invention est de fournir un substrat pour le dosage de l'activité du X -GTP de formule: R-CH 2-NH-CO-CH 2-CH 2-CH-COOH (I) o R est un groupe organique, ou un de ses sels. Un autre but de l'invention est de fournir une méthode de dosage de la YGTP dans laquelle on fait réagir le substrat de formule (I) avec un échantiilon pour le dosage de l'activité de la e-GTP, pour libérer la méthylamine substituée, on oxyde ladite méthylamine substituée par l'oxydase correspondante et on mesure l'toxygène consommé ou le peroxyde d'hydrogène ou l'ammoniac engendré'. On produit un substrat pour le dosage de la K-GTP selon la présente invention en faisant réagir le groupe Y-carboxyl de l'acide L-glutamique avec la méthylamine substituée et ce substrat a la formule (I) R-CH 2-NH-CO-CH 2-CH 2-CH-COOH (I) NH 2 o R est un groupe organique (ci-après désigné comme substrat (I) de la i-GTP). Des exemples de méthylamine substituée de formule (II) R-CH 2-NH 2 (II) o R a les mêmes significations que ci-dessus, sont les suivants: benzylamine, p-hydroxyphényléthylamine (tyramine), 3,4-dihydroxy- phényléthylamine, histamine, triptamine, alkylamine telle que éthylamine, n-propylamine, n-butylamine, iso-butylamine, n-amylamine, iso-amylamine ou n-hexylamine et hydroxyalkylamine telle qu'éthanolamine ou amino- propyl alcool On fait réagir ladite méthylamine substituée avec l'acide Lglutamique ou l'acide pyroglutamique ou son dérivé protégé Le dérivé protégé peut être obtenu par des procédés de protection connus tels que le groupe protecteur connu du groupe carboxyl, ou de l'amine primaire ou secondaire Le groupe O par un groupe protecteur classique tel que le groupe t-butoxycar- bonyl, t-amyloxycarbonyl ou benzyloxycarbonyl, et le groupe 0 carbodiimide, le carbonyl-diimidazole ou l'isoxazole. 21 5609324 -. 25095 Z 4, - On fait réagir l'acide glutamique activé avec la méthylamine substituée dans un solvant inerte tel que diméthylformamide, diméthylacétamide, diméthylsulfoxyde, tétrahydrofuran, benzène, xylène, toluène ou diéthyléther, à une température d'environ -30 C à environ la température amhiante pendant 1 à 30 heures On élimine le groupe protecteur après achèvement de la réaction. Dans le groupe amino protecteur, par exemple le groupe t- butoxycarbonyl est éliminé par l'acide trifluoroacétique et on élimine le groupe benzyloxy-carbonyl par réduction catalytique au moyen de carbonepalladium L'acide pyroglutamique est protégé en acide benzyloxycarbonyl pyroglutamique et est mis à réagir avec le méthylamide substitué Dans le cas d'un liquide de réaction, la méthylamine substituée elle-même peutêtre utilisée comme solvant de la réaction Des exemples de substrats pour la X-GTP ( 1) sont indiqués dans le tableau 1. TABLEAU 1 G T P substiat lIl _ _ _ _ __=_ _ _ _ _ _ R f R 6 3 s Q 4 L O HO/,-CH 2 O j 3 a ' HOH_ O;c H3 Y C H 3) O CH 3 CH 2 O 52 CH 3-CH 2-CH 2 O) 3 C H 3 CH O) S 5 CH 3 -CH 2-CH 2 -CH 2 0) 5 S HO-CH 2 O S i HO-CH 2 -CH 2 052 Valeur Rf: TLC, n-butanol: acide acétique eau = 3:1:1 l Le substrat pour la Y-GTP(I) peut être utilisé sous la forme d'un sel tel que le chlorhydrate, le phosphate ou l'acétate. Dans un dosage de la -GTP, la méthylamine substituée est libérée. L'oxydase correspondante est une enzyme qui catalyse la réaction sur un substrat de la méthylamine substituée telle que la benzylamine, la tyramine, la butylamine ou l'hydroxyamine, et au moins l'oxygène consommé, et engendre le peroxyde d'hydro- gène et l'ammoniac dans la réaction On peut mentionner,par exemple, l'amine oxydase telle que la monoamine oxydase, la diamine oxydase, la polyamine oxydase ou l'éthanolamine oxydase L'amine oxydase pour la benzylamine ou l'alkylamine comme substrat peut être obtenue à partir du sérum de porc ou de bovin ou l'Aspergillus niger On peut obtenir la tyramine oxydase à partir de Sarcina lutea IAM 1089 lBiochem Biophys Res Comm, 27, 350 ( 1967), Method in Enzymology, Vol 17, p 722 ( 1971)l L'éthanolamine oxydase peut être obtenue à partir de Arthrobacter lJ Biol Chem. 239 ( 7), 2180 2193 ( 1964)l En outre, on peut aussi utiliser de préférence l'amine oxydase ayant une large gamme de spécificité de substrat obtenu à partir de Talaromyces flavus var flavus M 4175 NRRL 15054, Petromyces alliaceus M 4648 NRRL 15-57, Neosartorya fischeri M 4690 NRRL 15055, Eurotium chevelieri M 4805 NRRL 15056 et Eupenicillium parvum M 5051 NRRL 15058 Les propriétés taxonomiques sont décrites dans la demande de brevet E.U A n 351 486 (demande de brevet de la République Fédérale d'Allemagne P 32 06 826 3). Les enzymes peuvent être produites par les procédés classiques, en particulier par culture aérée submergée pour la production industrielle. 6 2509324 Les milieux nutritifs utilisables sont les milieux qui sont utilisés habituellement dans la culture des micro- organismes Les sources de carbone utilisables telles que le glucose, le sucrose, le lactose, le maltose, le fructose ou la mélasse peuvent être utilisées et des sources d'azote assimilables telles que la peptone, les extraits de-viande, les extraits de levure, les hydrolysats de caséine et les extraits de pomme de terre peuvent également être utilisées. Il est possible également d'utiliser les phosphates et d'au- tres sels de magnésium, de calcium, de potassium, de fer, de manganèse et de zinc si cela est nécessaire. Les températures de culture peuvent varier en fonc- tion des aptitudes de croissance des microorganismes et de la production d'amine oxydase, cette température est de préfé- rence comprise entre 25 et 37 ?C La durée de culture peut va- rier en fonction des conditions de culture et se termine de préférence au maximum de production de l'amine oxydase, c'est- à-dire-environ au bout de 10 à 25 heures. L'amine oxydase est isolée des microorganismes ainsi cultivés car l'enzyme de la présente invention est une endo-enzyme. L'amine oxydase peut être isolée par le procédé suivant. Les-microorganismes cultivés sont séparés par fil- tration ou centrifugation et les cellules ainsi isolées sont broyées mécaniquement ou par des moyens enzymatiques tels que la lysozime pour solubiliser l'amine oxydase Un sel soluble tel que le sulfate d'ammonium ou le chlorure de sodium est ajouté à la solution d'amine oxydase après con- centration ou sans concentration pour obtenir l'enzyme. La solution enzymatique est traitée en ajoutant u SA'olvant organique miscible à l'eau tel que le méthanol, l'éthanol ou l'acétone de façon à précipiter l'enzyme Le précipité dissous dans l'eau est dialysé avec une membrane semi- perméable pour isoler les impuretés de bas poids moléculaire. Les impuretés peuvent également être éliminées par une ab- sorption chromatographique ou une chromatographie d'échange 7 2509324 d'ion en utilisant des agents d'absorption ou des agents de filtration sur gel La solution d'enzyme est concentrée sous vide ou lyophilisée pour obtenir une poudre d'enzyme par- tiellement purifiée Une purification complémentaire peut être effectuée par des moyens conventionnels de purification des enzymes tels que l'absorption chromatographique, la chro- matographie d'échange d'ion ou la filtration sur gel. L'amine oxydase de la présente invention est dé- crite comme suit - Chaque enzyme est abrévié par M 4805 pour une en- zyme produite par culture de Eurotium chevalieri M 4805, M 4890 pour une enzyme produite par culture de Neosatorva fischeri M 4690, M 4648 pourune enzyme produite par culture de Petromyces alliacius M 4648, M 5051 pour une enzyme pro- duite par culture de Eupenicillium parvum M-5051 et M 4175 pour une enzyme produite par culture de Talaromyces' flavus var flavus M 4175. ( 1) Action: L'enzyme catalyse la réaction qui forme des aldé- hydes, de l'ammoniac et du peroxyde d'hydrogène à partir des monoamines, de l'oxygène et de l'eau. RCH 2 NH 2 + 02 + H 20-> RCHO + NH 3 + H 202 monoamine aldéhyde ( 2) p H optimum: On utilise une n-butylamine comme substrat L'élec- trode à oxygène est utilisée pour la mesure Les tampons suivants sont utilisés tampon phosphate p H 6 8 tampon tris-HC 1: p H 9 10 L'activité amine oxydase à différents p H est indi- quée dans les figures 1 à 5 (Fig 1: M 4805, Fig 2: M 4690, Fig 3: M 4648, Fig 4: M 5051, Fig 5: M 4175) Le p H optimum de l'amine oxydase est comme suit M 4805: p H 7,5 8,5 (Fig 1) M 4690: p H 7,5 8,5 (Fig 2) M 4648: p H 7,5 8,5 (Fig 3) N 5051: p H 7,5 8,5 (Fig 4) N 4175: p H 7,5 8,5 (Fig 5) 8 2509324 ( 3) Stabilité à la chaleur: Une solution d'enzyme ( 0,1 ml) est mélange avec un tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0, 0,9 ml)'mis en incubation à différentes températures de 0, 30, 37, 40, 50, 60 et 70 C pendant 10 minutes et l'activité enzymatique restante est mesurée selon la méthode de dosage Les résultats sont indi- qués dans les Fig 6 à 10 (Fig 6: M 4805, Fig 7 M 4690, Fig 8: H 4648, Fig 9: M 5051, Fig 10: N 4175) Chaque -enzyme est stable jusqu'à 40 OC et complètement dénaturé au- delà de 60 C 0. ( 4) Stabilité au p H: Chaque solution d'enzyme ( 0,1 ml) est mélangée avec un tampon acétate 0,1 N-(p H 3 -6, 0,9 ml), un tampon phosphate 0,1 M (p H 6 8, 0,9 ml) ou un tampon Tris-Ji Ol 0,1 M (p H 8 10, 0,9 ml), par incubation à 3 '7 O pendant 3 heures 100/ul des solutions enzymatiques incubées sont dosés selon le procédé de dosage de l'enzyme Le résultat est indiqué Fig 11 15 (Fig 11:M 4805, Fig 12: M 4690, Fig 13: M 4648, Fig 14: M 5051, Fig 15: M 4175). Chaque enzyme est stable à un p H 5 7. ( 5) Spécificités du substrat: Chaque solution enzymatique ( 100 l) est dosée avec les composés suivants monoamines, amino acides et pep- tides selon le procédé de dosage. Les activités relatives sont indiquées dans le tableau ci-dessous (la n-butylamine est utilisée comme éta- lon). enzyme f 4 > 49 it i q 'IL o, zte Si 546D /; /-/ e 4 i Hi ? 17. substrat ethylamine 47 6 4 t ? 3 eO C n-propylamine ' /i 6-À 7 e 73 Ec- n-butylamine IOO C UO O 100 O-O Do O I CO O n-amylamine 122O I I c 7 i,3 2 o t - _o __ n-hexylamine i 12 i3 i ? 3 2 t Z 2 _ benzylamine 20 O 22 4 3 31 26 tyramine ZZ e t e 4t 4 ir-8 7- L'enzyme suivant la présente invention présente également une faible activité sur les diamines. ( 6) Poids moléculaire: Le poids moléculaire de l'enzyme est mesuré par une méthode de filtration sur gel en utilisant Sephadex G-100 (produit de Pharmacia Co, marque déposée) Les résul- tats sont les suivants: t M 4805: environ 76 000 80 000 M 4690: M 4648: " M 5051: " M 4175: " (Une méthode de dosage d'activité enzymatique: Une méthode de dosage de l'amine oxydase de la présente invention est la suivante. 0,2 M tampon tris-HC Ol (p H 8,0) 0,1 ml 0,2 % phénol 0,05 ml 0,5 % 4aminoantipyrine 0,05 ml 0,05 % peroxidase (Signa Type I) 0,05 ml 0,1 M nbutylamine (p H 7,0) 0,1 ml eau distillée 0,05 ml Le mélange réactionnel précédent ( 0,4 ml) dans un tube à essai est pré-incubé à 37 C pendant 3 ' minutes La solution d'enzyme ( 100/ul) est ajoutée et incubée à 57 C pendant 5 minutes La réaction est arrêtée en ajoutant de l'éthanol ( 2,5 ml) et on effectue une mesure colorimétrique A 480 nm Une unité (U) est définie comme I/umole de peroxyde d'hydrogène libéré en une minute. U/ml = 0,35 X D 480 X taux de dilution temps de quantité réaction X d'enzyme (min) (ml) L'enzyme oxydase est utilisée de préférencesous formes d'enzyme immobilisé qui peut être placé dans un ana- lyseur automatique le dosage pouvant être effectué au moyen de mesures électriques, par exemple une électrode à oxygène, lectrode à peroryade d'hydrogène, une électrode à mem- brane au gaz ammonium ou une électrode sélective à ion ammo- nium Grâce à ces électrodes on peut restreindre l'utili- sation d'enzymes coûteuses Les enzymes immobilisées sont assemblées sur la surface d'un détecteur à électrode pour former une électrode enzymatique, ainsi la K-GTP peut être dosée de façon répétée et rapidement sans consommer de réactif Des échantillons colorés peuvent également être dosés L'immobilisation de l'enzyme peut être effectuée par des techniques d'immobilisation classiques, par exemple de préférence en les piégeant par du polyacrylamide, en le mé- langeant avec de l'albumine et en réticulant, en les immobi- lisant par du collagène ou de la fibroine, par immobilisation avec du polysaccharide tel que la cellulose, l'agarose ou la dextrane, l'immobilisation par les polyacrylamides, le poly- styrène ou le nylon, ou en les piégeant par photopolymérisa- tion, absorption ou liaison covalente avec des verres aminés poreux. Les enzymes immobilisés peuvent se présenter sous forme de-membrane, de fibre, de pastille ou de tube. Un mode de réalisation du dosage de f-GTP est le suivant. Des concentratiorsaliquotesde 1-GTP lIl sont mises en incubation avec un échantillon tel que le sérum-, glycyl- glycine, tampon et éventuellement du chlorure de magnésium à 37 C pendant un temps suffisant pour libérer la méthylamine substituée du substrat lIl La méthylamine substituée ainsi libérée est oxydée par l'oxydase correspondante pour consom- mer l'oxygène ou le peroxyde d'hydrogène généré ou bien l'ammoniac à 370 C, ceci est mesuré de préférence par l'élec- trode d'oxygène, l'électrode à peroxyde d'hydrogène ou 1 'é- lectrode à ammonium L'ammonium peut être mesuré par une électrode sélective à ion ammonium Ces électrodes peuvent être réalisées avec les enzymes immobilisées mentionnées précédemment pour former l'électrode enzymatique et la me- sure peut être effectuée par des opérations extrêmement simples La valeur mesurée grâce à des moyens de mesure électriques peut être enregistrée par des moyens électriques ou bien fournit sous forme digitale pour calculer l'activité 11 2509324 Y -GTP lie peroxyde hydrogène peut être mesuré par colorimé- trie en utilisant un réactif coloré tel que le phénol, la 4-amino-antipyrine et la p'roxydase; le phénol, la e-amino- phénazone et la peroxydase; ou la N,N'-diéthyl-m-toluidine, la 4aminoantipyrine et la péroxydase Les autres dispositifs de mesure du peroxyde hydrogène tels que par exemple la com- binaison de 2,6-dichlorophénolindophénol et péroxydase, ou la combinaison de résine de guaiacum et de péroxydase, ou la combinaison d'acide homovanilique et de péroxydase peuvent également être utilisés. Un mode de réalisation d'un dispositif pour le do- sage '-GTP est le suivant. La T-GTP comme réactif de dosage, le substrat de Y'-GTP lIl, le récepteur tel que la glycylglycine et la solution tampon sont injectés par l'orifice d'injection, introduits dans le récipient de réaction à Y-GTP, incubés avec l'oxydase correspondante pour former la méthylamine substituée à partir du substrat de Y-GTP lIl et la quanti- té d'oxygène consommée de peroxyde hydrogène généré ou d'am- moniac généré sont déterminés dans le récipienedétection. Dans le récipient de détection la partie de colonne réaction- nelle correspondant à l'oxydase immobilisée et la partie de mesure électrique comprenant le détecteur à électrode sont - de préférence séparées, ou la partie de détection de l'é- lectrode est éventuellement recouverte avec l'enzyme immo- bilisé pour constituer l'électrode enzymatique En outre, le récipient de réaction de r-GTP et le récipient de dé- tection ne sont pas nécessairement limités dans leur présen- tation, et peuvent être construits par exemple sous forme d'un récipient détecteur unique et d'une pluralité de réci- pient réactionnel de T-GTP dans lesquels les échantillons sont introduits par étapes dans le récipient de détection au moyen d'un appareil d'échantillonnage à partir d'une plu- ralité de récipient de réaction Y-GTP suivie d'une détec- tion répétée et de lavage. La mesure électrique de la Y-GTP peut être ef- fectuée dans des dosages multiples et simultanés pour les 12 f 25093 Z 4 différents éléments 'de diagnostic En outre, la partie de mesure électrique est remplacée par le récipient de réaction, dans lequel juste à côté de la partie colonne de réaction on trouve l'orifice d'injection du réactif pour injecter le réactif destiné à la'détermination quantitative du peroxyde d'hydrogène, et le réactif injecté est mis en réaction avec le peroxyde d'hydrogène ainsi généré qui est mesuré une longueur d'onde déterminée Ce réactif est éventuellement laminé dans un film synthétique ou un papier filtre pour constituer un film laminé. L'électrode à oxygène peut également être rempla- cée par une électrode à peroxyde d'hydrogène pour déterminer le peroxyde d'hydrogène Les ions ammonium ou l'ammoniac peuvent être mesurés par l'électrode à ammoniac. Comme cela est expliqué le substrat Y -GTP lIl de la présente invention est utile pour doser la f -GTP et est également utile dans la méthode de dosage de la r-GTP telle que décrite précédemment qui est un procédé de dosage avanta- geux simple et rapide avec une bonne reproductibilité et qui est également utile pour les diagnostics cliniques - Les exemples ci-après sont destinés à illustrer la présente invention mais ne doivent pas être considérés comme pouvant la limiter. Exemple 1 r-benzylamide de l'acide L-glutamique De la benzylamine ( 10 ml) sont ajoutés à de l'a- cide benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamique lproduit commercial: ll 25 = 29,1 o, (c = 1,01) méthanol), p f: 134 135 Cl ( 2,6 g, 10 ma), agités à 80 C pendant 1 heure Lorsque la réaction est complète, on ajoute de l'éther diéthylique, on rassemble les précipités et on lave avec de l'éther diéthy- lique Le précipité est dissousdans l'acétate d'éthyle et % d'acide citrique, agité, et les fractions acétate d'é- thyle sont rassemblées, lavées avec de l'eau et séchées- sur sulfate de sodium anhydre On élimine l'agent de déshy- dratation et on distille l'acétate d'éthyle sous vide On ajoute de l'éther diéthylique au résidu pour obtenir le pré- cipité qui est recristallisé dans l'acétate d'éthyle Les 13 2509324 cristaux ainsi obtenus sont mis en suspension dans 50 % d'éthanol ( 200 ml), on ajoute 5 % de-palladium-carbone ( 500 mg) et l'on fait buller de l'hydrogène pendant 3 heures. On élimine le palladium-carbonepar filtration et le filtrat est séché sous vide puis recristallisé dans un mélange eau- éthanol pour obtenir la mique ( 1,26 g, 5,33 m M). Rendement: 53,3 % P.F: 212 2140 C- CCM: Rf = 0,35 Analyse élémentaire lC 12 H 1603 N 2 l: 0 % H % N% trouvé 60,84 6,91 12,16 calculé 61,00 6,83 11,86 kmax = 258 nm (c = 1,eau) IR: voir Fig 16 Exemple 2 Y-benzylamide de l'acide L-glutamique: On dissout a-benzyl ester de l'acide benzyloxycar- bonyl-L-glutamique lproduit commercial: lal 25 = -23,8 (c = 1,23, méthanol), p f: 97-98 Cl ( 7,37 g, 20 m M) et la N-hydroxysuccinimide ( 2,3 g, 20 m M) dans le diméthylformamide ( 100 ml) On ajoute goutte à goutte du dicyclohexylcarbo- diimide ( 4,13 g, 20 m N) dans le diméthylformamide ( 20 mil) sous agitation à -10 O C pendant 5 minutes Le mélange réac- tionnel est agité pendant 2 heures sous refroidissement, puis agité de nouveau à température de la pièce pendant * heures Le précipité est éliminé et le filtrat est con- centré sous vide On ajoute de l'hexane au résidu pour obte- nir un précipité visqueux par décantation Le précipité est dissous dans le diméthylformamide ( 30 ml), on ajoute de la benzylamine ( 2,14 g, 20 m M) et on agite à la température am- biante pendant 20 heures Le mélange réactionnel est concen- tré sous vide Le résidu est mélangé avec du chloroforme et une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5 % puis agité La couche chloroformique est rassemblée, lavée avec une solution à 5 % de bicarbonate de sodium deux fois avec 14 2509324 HC 01 I N, deux fois avec une solution aqueuse de chlorure de sodium et de nouveau avec de l'eau puis séchée sur sul- fate de sodium anhydre L'agent de séchage est éliminé par filtration, la couche chloroformique est distillée, le rési- du est cristallisé deux fois dans un mélange d'acétate d'é- thyle-benzène pour obtenir a-benzyl ester du rendement: 44,08 %). P.F: 145 1470 C CCM: Rf = 0,75 (chloroforme: méthanol: acide acétique = 95: 5: 3, plaque silica-gel) Analyse élémentaire lC 27 H 2805 N 2 l l C % H % N% trouvé 70,71 6,18 6,16 calculé 70,42 6,13 6,08 % de palladium-carbone ( 500 mg) sont immergés dans une petite quantité d'eau L'amide ester précédent ( 3,86 g, 8,4 m N) est dissous dans le méthanol ( 20 ml), de l'acide acétique ( 10 ml) et-de l'eau ( 5 ml) puis ajouté au catalyseur précédent Le mélange réactionnel est versé dans du gaz hydrogène pendant 3 heures sous agitation Le catalyseur est éliminé et le filtrat est concentré sous vide pour obtenir le précipité Le précipité est dissous de l'acide acétique aqueux I M puis chargé sur une colonne ( 3,0 x 110 cm) de Sephadex LH-20 De l'acide acétique aqueux I M est passé dans la colonne qui est fractionnée pour chaque fraction de 9,6 ml Les fractions N 70 95, testées par chromatographie en couche mince,sont rassemblées et lyophili- sées pour obtenir la t(-benzylamide de l'acide L-glutamique ( 1013 mg, 4,29 m N). Exemple 3 Le r--hydroxyphényl-2-éthyl) amide de l'acide L-glutamique: 1,7 g ( 5 mm) d'a-benzyl ester de l'acide t-butoxy- carbonyl-L-glutamique et 0,5 g ( 5 m M) de N-méthylmorpholine sont dissous dans 30 ml de tétrahydrofuranne et refroidi à -200 C 0,47 ml ( 5 m M) de chlorocarbonate d'éthyle sont égale- ment ajoutés au mélange, agités à -15 C pendant 2 heures, O puis on ajoute 0,7 g ( 5 m M) de tyramine dans 10 ml de di- méthylformamide, on agite à O O pendant 2 heures, puis on agite à la température ambiante pendant 15 heures Le mé- lange réactionnel est alors concentré sous vide et le résidu est extrait à l'aide d'acétate d'éthyle et une solution d'a- cide citrique à 10 % La couche d'acétate d'éthyle est lavée deux fois avec une solution de bicarbonate de sodium à 5 % et trois fois avec de l'eau puis est séchée par addition de sulfate de sodium L'acétate d'éthyle est distillé et le résidu est recristallisé à l'aide d'un mélange diéthyl éther- hexane 5 ml d'acide trifluoroacétique sont ajoutés à O C au mélange réactionnel qui est maintenu sous agitation à la température ambiante pendant,30 minutes Immédiatement après on sèche sous vide Le résidu est dissous dans 50 ml d'eau additionné de 300 mg de charbon palladié à 5 %, et l'on fait barboter dans ce mélange de l'hydrogène gazeux sous agitation, à la température de la pièce pendant 2 heures. Le charbon palladié est filtré puis le filtrat est concentré sous vide pour obtenir un précipité qui recristallise dans- le mélange eau-éthanol On obtient ainsi le (-(p-hydroxy- phényl-2-éthyl) amide de l'acide L-glutamique ( 0,7 g, soit 2,63 m M). Rendement: 52,6 % p.f: 229 2310 C CCM:Rf = 0,40 Analyse élémentaire lC 13 H 1804 N 2 l: 0 % H% trouvé: 58,76 7,04 10,29 calculé: 58,63 6,81 10,52 Amax = 274 nm (c = 1, eau> IR: voir Fig 17. Exempie 4 En remplaçant dans l'exemple 3 la tyramine par À la la 3,4-dihydroxyphényl-2-éthylamine, tryptamine, 1 'éthyl- amine, la n-propylamine, la n-butylamine, 1 'iso-butylamine, la n-amylamine, l'éthanolamine et l'alcool Y-aminopropy- lique, on obtient l'amide correspondant indiqué dans le tableau ci-dessous. 16 ' 2509324 R-(CH 12) N -CH 2 -NH-,-CO CH 2-C H 2 -CH-COOH NII 2 max: c = 1, eau, Rf: révélateur n-butanol: acide acétique: eau = 3:: 1). Exemple 5 Essai d'activité -GTP utilisant lé f-benzylamide de l'a- cide L-glutamique: Un Iélange comprenant du -benzylamide de l'acide Un melag cpenndu-bzyamiedl'ie L-glutamique dans un tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0, 1 ml) et 0,5 ml de glycylglycine 0,5 M est introduit dans un ré- cipient réactionnel couplé à une électrode d'oxygène L'é- chantillon ( 50 ul) de concentration aliquote de Y-GTP (Sigma Co) sont ajoutés et mis à incuber à 37 C pendant minutes sous agitation L'amine oxydase ( 21 U/ml, 50/ul) obtenue à partir d'Eurotium chevalieri M 4805 est alors ajoutée et mise à incuber à 37 C pendant I minute pour oxy- der la benzylamine libéré à partir de f-GTP Les quantités décroissantes d'oxygène consommé ont été mesurées sous la forme de variation de courant électrique par l'électrode d'oxygène Les résultats sont reportés sur le diagramme de R N Rf oH l O 3 8 (imax= 278 'nm) 0, 3 8 ' (lmax= 2 Q Om) CH 3 0,552 CH 3-CH 2 0, 53 CH 3 CH_ O 055 S CH 3- CH 3 - C Hz 2-CH 2 O, S HO-CH 2 O O,5 i H O -CH 2 Oi s 17 2509324 la Fig 18 illustrant les variations de courant électrique en fonction de l'activité -GTP. Exemple 6 Essai -GTP utilisant le r-(p-hydroxyphényl-2-éthyl) amide de l'acide Lglutamique: Le -benzylamide de l'acide L-glutamique de l'e- xemple 5 a été remplacé par le r-(p-hydroxyphényl-2-éthyl) amide de l'acide L-glutamique ( 50 m M) Les résultats obtenus sont représentés sur le diagramme de la Fig 19). Exemple 7 Le diagramme de circulation pour la mise en oeuvre de l'essai Y-GTP est représenté à la Fig 20 sur laquelle les références correspondent aux différents éléments suivants 1: zone d'injection de l'échantillon pour l'essai V-GTP 2: récipient contenant le substrat pour (-GTP 3: récipient réactionnel pour y-GTP 4: pompe à volume constant : colonne d'amine oxydase immobilisée 6: récipient de la solution tampon 7: pompe à volume constant 8: électrode 9: cellule de circulation : bain à la température constant 11: amplificateur 12: enregistreur 13: appareil de mesure digital et 14: enregistreur digital. Dans cet exemple 7 l'échantillon pour l'essai Y-GTP est introduit par injection dans la zone 1 et une solution de substrat pour Y-GTP est introduite dans le ré- cipient réactionnel Y-GTP 3 à l'aide d'une pompe à volume constant 4 à partir du récipient 2 L'échantillon pour l'es- sai Y-GTP est injecté à l'aide d'une micropipette ou de tout autre dispositif d'échantillonnage automatique Le mé- lange réactionnel est incubé dans le récipient réactionnel de Y-GTP pendant l'intervalle de temps constant et la solu- tion est introduite dans la colonne d'enzyme immobilisée 5, dans laquelle est introduite la solution tampon à partir du récipient de solution tampon 6 à l'aide de la pompe à volume constant 7 La solution passant au travers de la co- lonne d'enzyme immobilisée 5 est introduite dans la cellule de circulation contenant une électrode 8, telle qu'une élec- trode à oxygène, une électrode à peroxyde d'hydrogène ou encore une électrode d'ammonium L'ensemble du système dé- crit précédemment est placé dans un bain à température cons- tante 10 Les variations de courant électrique détectées sont enregistrées à l'aide de l'enregistreur 12 par l'in- termédiaire d'un amplificateur ou d'un enregistreur compre- nant un dispositif de mesure digital 13 et un enregistreur digital 14. Dans le diagramme de circulation le récipient 2 de solution de substrat de Y-GTP contient une solution de C-benzylamide d'acide L-glutamique ( 50 m M) et de glycyl- glycine ( 250 m M) dans un tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0). La colonne d'enzyme immobilisée 5 est constituée par une colonne ( 3 mm x 30 mm) d'une amine oxydase immobilisée ( 1,4 U/g support, 130 mg), dans laquelle l'amine oxydase obtenue à partir d' Eurotium chevalieri M 4805 est liée de manière covalente à des billes de verre aminées poreuses (billes de verre poreuses traitées à l'aide de r-amino- propyl triéthoxysilane) à l'aide de glutaraldéhyde le récipient de solution tampon contient un tampon phosphate 0,1 M à p H 7,0 La cellule de circulation 9 présente un volume interne de 0,1 ml et se trouve couplée à une élec- trode d'oxygène 8. La solution de substrat ( 6 fil) est introduite par la pompe à volume constant et l'échantillon de Y-GTP ( 4,1 l) est-injecté puis mis à réagir à 370 C pendant 30 minutes Le tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) est introduit dans la co- lonne d'enzyme immobilisée par la pompe à volume constant à partir du récipient de solution de tampon à une vitesse de l'ordre de I ml/min Ce mélange réactionnel est alors introduit dans la colonne d'enzyme immobilisée après stabi- lisation et l'oxygène dissous est mesuré par l'électrode 19 2509324 d'oxygène dans la cellule de circulation La benzylamine libérée par -GTP est oxydée par l'oxydase immobilisée et consumée par l'oxygène dissous La quantité d'oxygène est mesurée par une électrode d'oxygène sous la forme d'un courant électrique et les variations de courant électrique sont enregistrées au travers d'un amplificateur Les ré- sultats obtenus sont représentés à la Fig 21. Exemple 8 Le -benzylamide de l'acide L-glutamique est rem- placé par le -(p-hydroxyphényl-2-éthyl) amide de l'acide L-glutamique et les différents amides obtenus à l'exemple 4. Ces différents amides ont été testés selon le même protocole opératoire de l'exemple 7 dans lequel l'activité -GTP a été testée de façon avantageuse. Exemple de référence 1 Un mélange ( 500 ml, p H 6,0) comprenant 2 % de glu- cose, 50 ml d'extrait de pomme de terre (extrait obtenu à partir de 300 g de pommes de terre à l'aide d'un litre d'eau), 0,5 % de monophosphate de potassium, 0,25 % de sulfate de magnésium et 0,1 % de N-butylamine réparti dans 5 Erlenmeyer de 500 ml contenant chacun 100 ml d'eau Ces Erlenmeyers sont stérilisés à 120 G pendant 20 minutes Les souches Eurotium chevalieri M 4805 FERM-P N 5869, Neosartorya fischeri M 4690 FERM-P N' 5868, Petromyces alliaceus M 4648 FERM-P N 5867, Eupenicillium parvum M 5051 FERM-P N 5879 et Talaromyces flavus var flavus M 4175 FERM- P N 5866 sont inoculées respectivement et cultivées sous agita- tion à 30 C pendant 24 heures à 300 tpm Le liquide de cul- ture est filtré et les cellules obtenues sont lavées -à l'aide d'eau distillée puis filtrées Les cellules ainsi obtenues sont éclatées par addition de 2 volumes de sable (par exemple commercialisé par la Société Nakarai Chem Co) puis on ajoute le tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0, environ deux fois le volume des cellules) pour l'extraction de l'enzyme, on centrifuge et on obtient une solution surnageante contenant l'amine oxydase Les activités enzymatiques dans la solution surnageante apparaissent comme suit: -2509324 Souche Activité enzymatique (U/ml liquide cultivé)- M 4805 0,051 M 4690 0,038 M 4648 0,060 H 5051 0,052 H 4175 0,046 Exemple de référence 2 Un milieu ( 20 litres) contenant la même composition qu'avec l'exemple de référence 1 est introduite dans un fer- mentateur de 30 litres et stérilisée Une culture d'ensemen- cement ( 200 ml) de Eurotium chevalieri M 4805 FERM-P N 5869 est précultivée de la même manière qu'indiqué à l'exemple 1 - puis est inoculée et cultivée à 30 C pendant 20 heures. Les cellules cultivées (environ 150 g, poids sec) sont col- lectées par filtration. Les cellules ainsi obtenues sont inoculées dans un milieu stérilisé ( 20 litres, p H 6,0) comprenant 3 % de glucose, 0,1 % de monophosphate de potassium, 0,05 % de sulfate de magnésium, 0,05 % de chlorure de potassium et 0,1 % de n-butylamine, puis cultivées à 309 C pendant 20 heu- res à 260 tpm Les cellules cultivees sont collectées par filtration, lavées à l'aide de l'eau et filtrées pour obte- nir environ 150 g de cellules sèches Les cellules ainsi obtenues sont éclatées par addition de deux volumes de sable (environ 300 g), extraites avec un tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) et centrifugées pour obtenir une solution sur- nageante contenant l'amine oxydase (environ 310 ml, 0,5 U/ml). Le surnageant est concentré à cinq reprises avec une solution à 30 % de carbowax 20000 (produit commercialisé par la Société Wako Pure Chem Co) dissous dans un tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) et dialysé contre une solution de tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) Le dialysat (environ 65 ml) est chargé dans une colonne ( 3 x 80 cm) de Sephadex G-100 et l'on collecte les fractions contenant l'amine oxydase pour obtenir la solution d'amine oxydase (environ 210 ml, 32 U) La solution est concentrée environ dix reprises en utilisant une solution à 30 % de carbowax 20000 dissous dans un tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0), puis dialysé contre une solution de tampon phosphate 0,005 M (p H 7,0) pendant 48 heures Le dialysat (environ 25 ml) est chargé sur une colonne ( 1,5 x 20 cm) de DEAE-cellulose (produit commerciali- sé par la Société Seikagaku Kogyo Co) préalablement tamponné à l'aide d'une solution tampon de phosphate 0,005 M (p H 7,0) pour absorber l'amine oxydase L'amine oxydase est éluée à l'aide d'un volume double du volume de la colonne de tam- pon phosphate respectivement 0,005 M, 0,01 M et 0,025 M (p H 7,0) Les différents éluats sont combinés pour obtenir une solution d'amine oxydase (environ 135 ml, 85 U) La solution d'amine oxydase est concentrée jusqu'à environ 12 fois son volume par utilisation d'une solution à 30 % de carbowax 20000 dissous dans un tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) et dialyséepour obtenir une solution d'enzyme ( 9,5 ml, 8,2 U/ml, activité récupérée 50,3 %) qui est lyo- philisée pour obtenir une poudre d'amine oxydase ( 18,5 mg). 22 T REVEND ICAT IONS 1 Une méthode de dosage de la '-glutamyl transpeptidase, dans laquelle on fait réagir un substrat de formule R-CH 2-NH-CO-CH 2-CH 2-CH-COOH () NH 2 dans laquelle R est un groupe organique ou un de ses sels, avec un échantillon pour le dosage de la '-glutamyl transpeptidase, on fait incuber la méthylamine substituée qui est un produit de la réaction avec l'oxydase correspondante et on mesure l'oxygène consommée ou le peroxyde d'hydrogène engendré, ou l'ammoniac. 2 Une méthode caractérisée en ce que hydroxybenzyl. 3 Une méthode caractérisée en ce que hydroxyalkyl. 4 Une méthode caractérisée en ce que benzylamine. Une méthode caractérisée en ce que 6 Une méthode caractérisée en ce que ou l'hydroxyalkylamine. 7 Une méthode caractérisée en ce que butylamine. 8 Une méthode caractérisée en ce que 9 Une méthode caractérisée en ce que Une méthode caractérisée en ce que de dosage selon la revendication 1, le groupe R est un groupe phényl ou de dosage selon la revendication 1, le groupe R est un groupe alkyl ou dosage selon la revendication 1, la méthylamine substituée est la de dosage selon la revendication 1,- la méthylamine substituée est la tyramine. de dosage selon la revendication 1, la méthylamine substituée est l'alkylamine de dosage selon la revendication 6, l'alkylamine est la propylamine ou la de dosage selon la revendication 6, l'hydroxyalkylamine est l'éthanolamine. de dosage selon la revendication 1, l'oxydase est l'amine oxydase. de dosage selon la revendication 1 ou 9, l'oxydase est l'oxydase immobilisée. 11 Une méthode de dosage selon l'une-des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'on mesure la quantité d'oxygène consommée au moyen d'une électrode à oxygène ou de son électrode à enzyme. 12 Une méthode de dosage selon l'une des revendications , caractérisée en ce qu'on mesure le peroxyde d'hydrogène engendré au moyen d'une électrode à peroxyde d'hydrogène ou de son électrode à enzyme. 13 Une méthode de dosage selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'on mesure le peroxyde d'hydrogène engendré au moyen d'un réactif de coloration, d'un réactif d'émission ou d'un réactif de fluorescence. 14 Une méthode de dosage selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'on mesure l'ammoniac au moyen d'une électrode à ammoniac ou de son électrode d'enzyme. Substrat pour le dosage de la f-glutamyl - transpeptidase de formule: R-CH 2-NH-C 0-CH 2-CH 2-CH-COOH (I) NH 2 dans laquelle R est un groupe organique ou un de ses sels. 16 Substrat selon la revendication 15, caractérisé en ce que R est un groupe phényl. 17 Substrat selon la revendication 15, caractérisé en ce que R est un groupe hydroxybenzyl. 18 Substrat selon la revendication 15, caractérisé en ce que R est un groupe alkyl ou hydroxyalkyl.