Brevet FR2505048A1 — publié le 19821105

Méthode pour la détermination rapide de la bilirubine totale et directe dans les liquides biologiques auec réactif unique. L'invention concerne une méthode pour la détermination rapide ae la bilirubine totale et directe dans les liquides biologiques avec réactif unique. Depuis qu'Ehrlich a introduit en 1883 la réaction de diazotation et qu'ensuite Van den Berg a démontré les réactions directe et indirecte, on a fait de multiples tentatives pour définir une méthode rapide et simple de détermina- tion de la bilirubine dans les liquides biologiques. Les réactifs de décopulation proposés ont été nombreux, depuis -1 'éthanol, la caféine et le benzoate jusqu'aux surfactifs ; on a formulé diverses propositions pour définir le temps de lecture de la bilirubine directe et aussi pour établir de façon assez concordante un temps de cinq minutes on a aussi discuté du problème du choix du pH final pour conclure essentiellement à l1 adoption du milieu alcalin. En tout cas, les méthodes proposées jusqu'ici sont assez complexes, étant donné qu'elles exigent la préparation du blanc pour chaque echantillon, un traitement diversifié pour les deux types de réaction, une alcalinisation, un contrôle strict des temps aux divers passages analytiques et,enfin, l'instabilité au réactif de diazotation. Récemment, on a proposé une méthode (méthode DPD) utilisant un réactif unique pour le dosage de la bilirubine totale avec emploi d'un agent de diazotation stabilisé, nais, dans ce cas, il est nécessaire de préparer le blanc. Le but de l'invention est donc d'utiliser un agent de diazotation stable, qui est le sel de ssF4 du Rast red B" (CI 37125) (avec comme synonymes : tétrafluoroborate de I-ami no-2-méthoxy-4-nitrobenzene diazoté ; "azoic diazo z5BF4tw tétrafluoroborate de 5-nitro-2-amino-anisole diazoté ; tétrafluoroborate de 5.nitro.2-aminométhoxybenzene di azoté) de formule C7H6N303. BF4, poids moléculaire 266,9, pour la détermination de la bilirubine aussi bien totale que directe, sans la préparation du blanc, même sur des sérums avec hémolyse évidente, aussi bien par utilisation manuelle qu'au moyen de systèmes automatiques de type quelconque. La méthode selon l'invention est caractérisée par le fait que l'on utilise le sel de 4 du "ast red b" en solution acide contenant des diazocopulants convenant à cet effet, comme, par exemple, l'urée et le méthanol, pour la détermination des bilirubines, par le fait que l'on élimine le blanc, par le fait qu'il permet la détermination simultanée de la bilirubine (totale et directe) avec le même réactif unique en ajoutant simplement au préalable de l'azoture de sodium (ou d'autres substances réductrices) à une concentration appropriée, conne inhibiteurs de la réaction de diazotation de la bilirubine indirecte, et par le fait qu'il élimine l'interférence due à l'hémoglobine (présente dans des sérums avec hémolyse) cette élimination étant obtenue grâce & l'addition d'ioduré de potassium à une concentration appropriée. Une autre caractéristique de la méthode proposée par l'invention réside dans le fait qu'elle utilise un réactif unique stable pour les deux formes de bilirubine et qu' el- le ne nécessite pas de blanc, de sorte qu'il se forme un comme posé coloré stable à coefficient d'absorption élevé, en un temps court (environ 15 minutes). Selon l'invention, en présence d'urée et de metha nol, en milieu acide, les bilirubines totale et directe réagissent sur le sel de diazonium stabilisé (sel de BF4 du "Fast red B") en formant un composé azoïque coloré en vertbleu. La réaction de la bilirubine indirecte est inhibée par le pretraitement de l'échantillon au moyen d'un réducteur. La couleur engendrée, stable pendant au moins 2 heures, lue a 592 nm (580 à 610 nm), est proportionnelle â la concentration de bilirubine jusqu'à 25 mg/dl. Pour atteindre le but que se propose l'invention, il est nécessaire dtutiliser deux réactifs pour les deux types ae bilirubine ; ils comprennent la solution du colorant et du aécopulant en milieu acide (réactif A) et la solution du reducteur à une concentration bien définie (réactif B). En outre, il peut être parfois utile d'utiliser un troisième réactif (réactif C) constitué par une solution d'iodure de potassium, pour éliminer les interférences dues à 1'hémoglo- bine. Une préparation typique est la suivante Réactif A : sel de BF4 du "Fast red B", 0,4 mmol/l, carbami@ 4 mol/l, méthanol 1 mol/l ; pH 2 Réactif B : azoture de sodium 0,15 mol/l Réactif C : KI 0,6 mol/l EXEMPLE : Introduire à Blanc Echantillon Echantillon la pipette pour pour dans l'é- Bilirubine bilirubine prouvette totale directe H2O 0,2 ml - Sérum - 0,2 ml 0,2 ml Réactif B - . 20 Réactif A 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml Mélanger ; attendre au moins 15 minutes ; lire à 592 (580 à 610) nm le pouvoir d'absorption des divers échantillons en prenant le blanc comme zéro. CALCUL Bilirubine (totale ou directe) mg/dl = A x 10 Sr-bilirubines (totales) ou (esters) Conc. mol/l = A x 171 INTERVALLES DE REFERENCE Bilirubine totale : 1 ng/dl Sr-bilirubines (totales) Conc. = 4 à 17 mol/l Bilirubine directe : Sr bilirubines (esters) Conc. Le procédé permettant dsatteindre le but de l'in vention peut être récapitulé par les points suivants 1) utiliser du sérum frais et éviter la lumière directe sur l'échantillon ; 2) l'analyse peut s'effectuer par des microméthodes, en uti lisant le même facteur de calcul et en diminuant propor- tionnellement les volumes 3) pour traiter les échantillons avec hémolyse, on ajoute directement au sérum 10 l de réactif C/0,2 ml de sérum, en éliminant ainsi les interférences dues à l'hémoglobine jusqu'à 400 sg/dl 4) pour le contrôle de qualité, utiliser des sérums contenant de la bilirubine à l'état natif, sans addition de conser vateurs etc. (sérum normal marque Roche, Clinocontrol N Sclavo, Seronorm Bracco etc.) ou comparer parfois les don nées obtenues en utilisant la méthode classique. Les expériences concernant la méthode selon l'in ventis ont été conduites sur des sérums de patients hyperbili rubinéniques, en comparant les données obtenues par la méthode de Jendrassik. La réaction de dia:otation est inhibée par des substances réductrices, ce qui fait que les sérums de patients en traitement massif par l'acide ascorbique etc. peuvent donner des valeurs faussement buses. RESULTATS OBTENUS Linéarité s on a utilisé un sérum hyperbilirubinémique ayant une concentration de bilirubine totale de 30 mg/dl, ditersi- née par la méthode de Jendrassik, en suivant les indications de Schellong et Wende. Lorsquton utilise les volumes indiqués, la méthode apparut linéaire au moins jusqu'à 20 mg/dl. Des étalons de bilirubine commerciale (par exemple les bilirubines étalons Behring) ne sont pas apparus appropriés, si ce n'est à des dilutions très élevées. Reproductibilité: l'analyse (n = 40) d'un sérum normal (bi bilirubine : 0,7 mg/dl) présente un coefficient de variation en pourcentage de 2,5. Corrélation : des dosages en parallèle de la bilirubine totale et directe ont été exécutés sur 70 sérums normaux et pathologiques par la présente méthode et la méthode de Jendrassik. La corrélation est excellente pour les deux formes de bilirubine (bilirubine directe : n = 70 ; r = 0,9974 a = -7,067 ; b = 0,9480 ; bilirubine totale : n = 70; r = 0,9886 t a = 0,7358 s b = 0,8828). - Développement de la couleur et effet des substances réductrices : le développement de la couleur du mélange de réaction, méme si l'on utilise des échantillons à haute concentration de bilirubine, s'effectue en 2 à 3 minutes et atteint en tout cas l'intensité maximale dans les 15 minutes. Toutefois, lorsqu'on utilise des sérums de patients en traitement par des substances réductrices (acide ascorbique etc.), la couleur se développe plus lentement ou même partiellement, en fonction de la concentration de la substance réductrice. - Utilisation de l'azoture de sodium dans la détermination de la bilirubine directe : on tire parti du phénomène de l'in hibition de la réaction de diazotation par des réducteurs, dans la présente méthode, en utilisant l'azoture de sodium dans la détermination de la bilirubine directe. En effet, en utilisant 100 pg de NaN3/l,l ml de mélange de réaction, on obtient des valeurs de bilirubine directe qui sont en corrélation parfaite avec celles que l'on obtient par la méthode de Jendrassik ( = 0,9986). - Caractéristiques du réactif chromogène : le réactif chromogéne de couleur jaune plie est stable à 4 OC pendant au moins 6 mois. Le complexe coloré a un pouvoir absorbant molaire d'environ 80 x 103l.mol-1.cm-1 à 592 nm, stable pendant plusieurs heures. Il présente un spectre d'absorption ayant un maximum entre 590 et 600 nm. L'azoture de sodium et l'iodure de potassium aux concentrations utilisées dans la présente méthode altèrent graduellement le réactif, mais,aussitôt ajoutés, ils ne modifient pas le spectre d'absorption. ~ Interférences et effet de l'iodure de potassium: la méthode est sensible non seulement aux substances réductrices mais à l'hémoglobine, méme à de faibles concentrations. L'addition d'ioduré de potassium au sérum à la concentration finale de 0,5 à 5,0 g/l permet un aosage correct, méme en présence d'hémolyse, jusqu'à 400 mg/dl d'hémoglobine. Les sérums hyperli sémiques ne donnent pas d'interférences appréciables, - Précision : on a analysé divers serums témoins du commerce (Tableau 1); certains présentent des valeurs nettement inférieures à la valeur préétablie, probablement à cause du type de conservateur ajouté. - Intervalle de référence : la recherche concernant les deux formes de bilirubine a été conduite aussi bien sur des sujets normaux ambulants que sur des donneurs de sang. Il faut noter que les aonneurs de sang présentent, par tendance, des valeurs plus élevées. TABLEAU I Résultats de l'analyse des sérums témoins : Sérums témoins Firme Valeur Valeur % expérimentale théorique Serum control N Roche 1,30 1,25 104 " " A " 2,70 3,2 84 Kontrollogen L Ist,Behring 1,37 1,30 105 Seronorm Nyegaard 1,72 1,77 97 S V R S Wellcome 3,50 3.78 92 Clinicontrol N Sclavo 1,15 1,20 96 Precinorm U Biochemia 1,05 1,61 65 TABLEAU 2 Intervalles de références de la bilirubine totale et directe, dosées par les deux méthodes (mg/dl) Bilirubines totales Bilirubines directes méthode selon méthode méthode selon méthode l'invention Jendras. l'invention Jendras. Sujets normaux 0,69 # 0,25 0,68 # 0,26 0,21 # 0,12 0,18 # 0,11 Donneurs de sang 0,83 # 0,22 - 0,25 # 0,09 REVENDICATIONS 1 - Méthode pour la détermination rapide de la bilirubine totale et directe dans les liquides biologiques avec réactif unique caractérisée par le fait que l'on utilise le sel de ssF4 du "Fast red B" en solution acide contenant des dé- copulants appropriés à cet effet, comme, par exemple, l'urée et le méthanol. 2 - Méthode selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'on élimine le blanc. 3 - Méthode selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait qu'elle permet la détermination des bilirubines, totale et directe, avec le même réactif unique, avec simplement une addition préalable d'azoture de sodium ou d'autres substances réductrices, â une concentration appropriée, comme inhibiteur de la réaction de diazotation de la bilirubine indirecte. 4 - Méthode selon l'une des revendications 1à3, caractérisée en ce qu'on élimine, par addition d'iodure de potassium à une concentration appropriée, l'interférence due à l'hémoglo- bine présente dans les sérums avec hémolyse.