Brevet FR2510408A1 — publié le 19830204

La présente invention concerne une colle pour tissus, à base de protéines humaines ou animales, ayant une certaine teneur en facteur XIII, en fibrinogène et en un antibiotique L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'une telle colle. Par les brevets autrichiens Nos 359 652 et 359 653, on connalt déjà des procédés de préparation d'une colle pour tissus, possédant une certaine teneur en fibrinogène et en facteur XIII, conformément aux- quels on réalise des rapports de concentration détermi- nés en facteur XIII vis-à-vis du fibrinogène et éven- tuellement de l'albumine et les préparations sont congelées ou lyophilisées Ces préparations possédaient, pour l'essentiel, des propriétés satisfaisantes, à sa- voir une solidité ou résistance des collages élevées ainsi qu'une bonne résorbabilité; cependant, il est souhaitable d'améliorer ces préparations dans le sens d'une activité antimicrobienne. Il est vrai que l'on a déjà proposé, dans le 2 D brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2 533 004, tout comme par Fellinger et autres dans le périodique '' Der Tuberkulosearzt'' ( 6/11, 1952),d'ajouter des antibio- tiques à des solutions de fibrinogène pour les utiliser ensuite comme colles de plaies; cependant, ces solu- tions à préparer seulement au lit du malade n'assurent ni stabilité, ni solidité suffisantes au coagulum fi- brineux qui en est formé. Au surplus, par un travail de Bbsch et coll, "Archiv fur orthopâdische und Unfall-Chirurgie", volume 90 ( 1977), pages 63 à 75, il est connu, en relation avec les greffes osseuses destinées à la recharge de défaillances osseuses, d'utiliser un système de colle à la fibrine, conformément auquel la fibrine est trans- formée à l'endroit voulu, immédiatement au trou osseux, en une solution de fibrinogène par addition de thrombine. Selon les besoins, on ajoute aussi des préparations de combinaison de la néomycine disponibles dans le commerce, sous forme de poudre Finalement, conformément à la demande PCT 80/00083, on a proposé la préparation d'un gel de fi- brinogène(antibiotique pour laquelle on utilise un mé- lange à préparer au lit du malade d'un cryoprécipité avec la tobramycine et la gentamycine comme anti- biotique. Selon les recherches propres-effectuées par la demanderesse, on a constaté que les colles pour tissus décrites et connues, qui contiennent du fibrinogène, du facteur XIII et un antibiotique, ne possèdent pas la combinaison souhaitée de propriétés, à savoir une so- lidité ou résistance élevée des collages et une acti- vité antimicrobienne, mais qu'au contraire, entre les antibiotiques et le facteur XIII se produit une interaction désavantageuse avec pour résultat que la capacité de réticulation du fibrinogène diminue forte- ment et que la capacité de coagulation s'en trouve dé- favorablement influencée Par conséquent, on assiste à une moindre solidité et à une plus faible adhésivité de la colle aux surfaces des plaies ou des tissus. Un autre inconvénient des préparations connues réside dans le fait que la fourniture de l'antibiotique au tissu s'effectue trop rapidement, si bien que le retardement de l'antibiotique ne suffit pas pour lui permettre d'agir pendant une longue période et d'obte- nir une fourniture importante de substance active. La présente invention a pour objet d'obvier à ces inconvénients et difficultés et se propose de mettre au point une colle pour tissus d'origine hu- maine ou animale, qui possède la combinaison de pro- priétés susmentionnée et qui garantisse simultanément une meilleure activité de l'antibiotique. On parvient à résoudre le problème qui était à la base de la présente invention par une colle pour tissus de la nature définie dans le préambule, o le rapport du facteur XIII au fibrinogène, exprimé en unités du facteur XIII par g de fibrinogène, atteint au moins 500 et o la colle contient un antibiotique choisi dans le groupe formé par les aminoglycosides, les b 9 talactames, les polypeptides et les tétracyclines. Une colle pour tissus congelée contient avanta- geusement le facteur XIII en une proportion d'au moins unités/ml. Selon une autre forme de réalisation de l'inven- tion, une colle pour tissus lyophilisée contient au moins 33 % en poids de fibrinogène, le facteur XIII y étant présent en une proportion d'au moins 170 unités/g de lyophilisat. La préparation suivant l'invention contient avan- tageusement encore un inhibiteur de plasmine ou un activateur-inhibiteur de plasminogène choisi dans le groupe formé par l'aprotinine, l'2-antiplasmine, l'72- macroglobuline, l'a 1-antitrypsine, l'acide c-amino- caprolque et l'acide tranexamique. La colle pour tissus se présente avantageusement sous forme de préparation à deux composants, o le pre- mier composant contient le facteur XIII, le fibrinogène et l'inhibiteur de plasmine ou l'activateur-inhibiteur de plasminogène, cependant que le second composant contient l'antibiotique,dela thrombine et du calcium bivalent. L'antibiotique se présente avantageusement sous la forme d'un dérivé difficilement soluble Selon une variante de cette forme de réalisation, on utilise, en plus du dérivé difficilement soluble, également un dé- rivé facilement soluble, éventuellement réparti dans les deux composants de la colle pour tissus Cette forme de réalisation présente l'avantage de délivrer rapide- ment le dérivé facilement soluble et de garantir ainsi une activité d'amorce élevée, tandis que le dérivé dif- ficilement soluble veille à l'activité de longue durée. L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'une colle pour tissus, conformément à une variante duquel on règle, dans une fraction de plasma sanguin contenant du fibrinogène, un rapport de con- centration du facteur XIII au fibrinogène, exprimé en unités du facteur XIII/g de fibrinogène, à une valeur d'au moins 500, par l'addition de facteur XIII, puis on ajoute l'antibiotique et on congèle ou lyophilise la préparation. Selon une autre variante, on règle dans une frac- tion de plasma sanguin contenant du fibrinogène, un rapport de concentration du facteur XIII au fibrino- gène, exprimé en unités du facteur XIII/g de fibrino- gène, à une valeur d'au moins 500 par l'addition de facteur XIII, puis on congèle ou on lyophilise la pré- paration que l'on réunit, après décongélation ou re- constitution, à une solution contenant un antibiotique. Conformément à cette dernière forme de réalisation, on peut ajouter l'antibiotique après la décongélation ou à la solution de reconstitution Cependant, il faut prêter attention, lors de la mise en oeuvre de cette dernière forme de réalisation, de ne pas rester en dessous d'une concentration en facteur XIII minimale; cette der- nière sera supérieure à 40 unités/ml. Selon une forme de réalisation préférée de l'in- vention, conformément à laquelle la fraction de plasma sanguin contenant le fibrinogène est lavée à l'aide d'une solution tampon, on poursuit le processus de la- vage jusqu'à l'obtention d'une concentration en facteur XIII de 200 unités de facteur XIII/g de fibrinogène, 345 puis on ajoute du facteur XIII en une proportion d'au moins 300 unités/g de fibrinogène sous la forme d'un concentré ou d'un lyophilisat. La colle pour tissus conforme à l'invention et le procédé de préparation de cette colle seront à uré- sent plus amplement détaillés dans les exemples non li- mitatifs qui suivent. Exemple 1 On a obtenu un cryoprécipité ( 100 g) à partir de plasma frais humain congelé,par chauffage à 20 C, on l'a séparé par centrifugation et on l'a lavé à deux reprises dans une solution tampon contenant du citrate trisodique, du Na Cl, de la glycine, du glucose, de l'a- protinine et de l'héparine, à un p H de 6,5 et on a dissous le précipité séparé dans une solution tampon contenant de la glycine ( 255 ml) à un p H de 7,9 On a constaté que cette solution présentait un rapport du facteur XIII au fibrinogène de 226 unités de facteur XIII/g de fibrinogène Pour l'installation du rapport souhaité conforme à l'invention supérieur à plus de 500 unités/g de fibrinogène, on a additionné la solution de 9000 unités d'une préparation de facteur XIII sous forme pulvérulente, de manière à renforcer le rapport de concentration de la solution à 826 unités de fac- teur XIII /g de fibrinogène On a stérilement filtré cette solution, on y a ensuite ajouté 1,7 g de genta- mycine dans des conditions stériles, on a introduit ce mélange dans son récipient final ( 2,5 ml),on l'a con- gelé et lyophilisé. Exemple 2 On a entrepris la préparation de la base de colle pour tissus constituée du cryoprécipité,d'une manière identique à celle décrite à l'exemple 1, à la seule différence qu'après un seul lavage, on a liquéfié le précipité de cryoprécipité par chauffage jusqu'à 37 C et que l'on a ajouté 13 600 unités de facteur XIII sous forme de poudre On a ainsi obtenu un rapport du fac- teur XIII au fibrinogène de 967 unités de facteur XIII/g de fibrinogène. On a incorporé 5,67 g d'acide 7-f (thiényl)-( 2)- acétamido_ 7-céphalosporanique à la solution, à titre d'antibiotique On a introduit la suspension obtenue dans son récipient final ( 1 ml) et on l'a congelée Le facteur XIII était présent en une proportion de 87 uni- tés /ml dans la préparation introduite dans le récipient final. L'application des colles pour tissus préparées conformément aux exemples 1 et 2 s'effectue avantageu- sement en mélangeant le mélange décongelé ou reconstitué à de la thrombine et du chlorure de calcium et en l'ap- pliquant sur les tissus à relier Il est également pos- sible d'appliquer les deux constituants séparés sur le tissu à relier ou à charger. Exemple 3 On a répété le mode opératoire décrit à l'exem- ple 1 jusqu'à l'addition de l'antibiotique On a sté- rilement filtré le précipité lavé après dissolution dans la solution tampon, on en a rempli le récipient final ( 2,5 ml), puis on a procédé à la congélation et à la lyophilisation, de manière à rendre le premier compo- sant de la colle pour tissus suivant l'invention conser- vable On a préparé le second composant,avant l'appli- cation,à partir d'une solution de thrombine et de chlo- rure de calcium par l'addition d'acide 7-(-(thiényl)-( 2)- acétamido_ 7-céphalosporanique ( 30 mg/ml) Exemple 4 On a répété le mode opératoire décrit à l'exem- ple 2, en ajoutant 1,89 g de gentamycine après disso- lution du précipité de cryoprécipité pour ensuite in- troduire la solution dans le récipient final ( 1 ml) et la congeler On obtient ainsi le premier composant de la colle suivant l'invention sous une forme conservable. Le second composant, contenant 30 mg d'acide 7-gthié- nyl)-( 2)-acétamido_ 7-céphalosporanique par ml d'une solution de chlorure de calcium -thrombine fut préparé avant l'application. Au lieu de l'aprotinine ajoutée dans les exemples 1 à 4, on peut aussi utiliser, à titre d'inhibiteur de plasmine ou d'activateur-inhibiteur de plasminogène, un ou plusieurs des composés qui suivent: a 2-antiplas- mine, a 2-macroglobuline, a 1-antitrypsine, acide ú- aminocapro Ique et acide tranexamique. Les colles pour tissus préparées conformément à la présente invention possèdent une utilité générale pour la réunion sans couture de tissus humains ou ani- maux ou de parties d'organes pour le pansement des plaies et l'hémostase, avec une activité antimicro- bienne essentiellement améliorée. Les propriétés d'adhésion améliorées pour une activité antimicrobienne également améliorée des colles pour tissus conformes à l'invention ressortent des exemples comparatifs suivants, résumés sous forme de tableau; pour la réalisation de ces essais, on a comparé le degré de réticulation des colles pour tissus conformes à l'invention, à rapport facteur XIII/fibri- nogène augmenté, au degré de réticulation de colles pour tissus connues, sans rapport facteur XIII/fibrinogène accru, en utilisant dans chaque cas des antibiotiques différents Le degré de réticulation a a été déterminé selon le procédé d'électrophorèse à travers gel de M O polyacrylamide (SDS)-laurylsulfate de sodium, réalisé de manière à incuber à 37 O C le mélange obtenu par mé- lange de la colle pour tissus au même volume d'une so- lution contenant 40 gmoles de Ca C 12 et 15 unités de NIH (US National Institute of Health) de thrombine par ml. On détermine le degré de réticulation a après l'arrêt Z 510408 de la réaction et la scission réductrice des ponts de disulfure contenus dans les protéines par addition d'un mélange d'urée, de dodécylsulfate de sodium et de $- mercaptoéthanol par électrophorèse à travers gel. Dans une autre partie du tableau, on compare la résistance ou solidité du caillot dans le thrombo- élastographe d'une colle pour tissus suivant l'invention à celle d'une colle pour tissus connue, l'antibiotique utilisé étant la gentamycine. Finalement, le tableau contient des valeurs com- paratives de la résistance à la déchirure ou à la rup- ture d'une colle pour tissus suivant l'invention; à celle d'une colle connue, en se servant de gentamycine comme antibiotique. Réticulation a de la fibrine (à 37 C après 60 mn) Antibiotique Colle pour tissus Colle pour tissus ajouté suivant l'inven sans teneur en tion avec teneur facteur XIII en facteur XIII accrue accrue> 500 U/g fbg Gentamycine 70 % 30 % Néomycine 41 % 21 % Phosphomycine 47 % 24 % Azlocilline 66 % 42 % Doxycycline 65 % 26 % Céfoxitine 54 % 44 % -0 Résistance du caillot dans thromboélastographe le ( 37 C 60 mn) e= module d'élasticité Gentamycine 1150 426 Résistance à la rupture en g/cm 2 ( 47 C-ZO mn) Gentamycine I Finalement, on a encore entrepris la réalisation d'un exemple comparatif concernant la libération d'an- tibiotique par une colle pour tissus préparée conformé- ment au procédé décrit dans l'exemple 4, conformément auquel, au cours d'un essai in vitro,, déjà 85 % de la gentamycine étaient libérés après 72 heures à par- tir du caillot préparé avec cette colle Après 96 heu- res, on n'a plus constaté de libération de gentamycine, tandis que l'on pouvait encore déceler de l'acide 7- (-(thiényl)-( 2)-acétamido_ 7-céphalosporanique après une durée de 8 jours. REVENDICATIONS 1. Colle pour tissus congelée ou lyophilisée, à base de protéines humaines ou animales, contenant du facteur XIII, du fibrinogène et un antibiotique, carac- térisée en ce que le rapport du facteur XIII au fibri- nogène,exprimé en unités du facteur XIII par g de fi- brinogène, atteint au moins 500, et en ce qu'elle contient un antibiotique choisi dans le groupe formé par les aminoglycosides, les bêtalactames, les poly- peptides et les tétracyclines. 2. Colle pour tissus congelée suivant la re- vendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient le facteur XIII en une proportion d'au moins 40 unités/ml. X. Colle pour tissus lyophilisée suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient au moins 33 % en poids de fibrinogène, le facteur XIII étant présent en une proportion d'au moins 170 unités/g de lyophilisat. 4. Colle pour tissus congelée ou lyophilisée suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient, en outre, un inhibiteur de plasmine ou un activateur-inhibiteur de plasminogène, choisi dans le groupe formé par l'aprotinine, l'a 2-antiplasmine, l'a 2- macroglobuline, l'a 1-antitrypsine, l'acide c-amino- caproîque et l'acide tranexamique. 5. Colle pour tissus suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de préparation à deux composants, o le premier composant contient le facteur XIII, le D O fibrinogène et l'inhibiteur de plasmine ou l'activateur- inhibiteur de plasminogène, tandis que le second compo- sant contient l'antibiotique, la thrombine et du calcium bivalent. 6. Colle pour tissus congelée ou lyophilisée $ 5 suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'antibiotique y est présent sous forme d'un dérivé difficilement soluble. 7. Procédé de préparation d'une colle pour tissus à base de protéines humaines ou animales, sui- vant l'une quelconque des revendications 1 à 6, con- tenant du facteur XIII, du fibrinogène, un inhibiteur de plasmine ou un activateur-inhibiteur de plasminogène et un antibiotique choisi dans le groupe formé par les aminoglycosides, les bftalactames, les polypeptides et les tétracyclines, caractérisé en ce que l'on établit, dans une fraction de plasma sanguin contenant du fibri- nogène, un rapport de concentration du facteur XIII au fibrinogène, exprimé en unités du facteur XIII/g de fi- brinogène, d'au moins 500, par l'addition de facteur XIII, en ce que l'on procède ensuite à l'addition de l'antibiotique et finalement à la congélation ou à la lyophilisation de la préparation. 8. Forme de réalisation modifiée-du procédé suivant la revendication 7, caractérisée en ce que l'on établit, dans une fraction de plasma sanguin contenant du fibrinogène, un rapport de concentration du facteur XIII au fibrinogène, exprimé en unités du facteur XIII/g de fibrinogène, d'au moins 500,par l'addition de fac- teur XIII, en ce que l'on procède ensuite à la congéla- tion ou à la lyophilisation de la préparation que l'on réunit ensuite après décongélation ou reconstitution, à une solution d'un antibiotique. 9.-Procédé suivant l'une quelconque des revendi- cations 7 et 8, selon lequel on lave la fraction de plas- 3 O ma sanguin contenant le fibrinogène à l'aide d'unè solu- tion tampon, caractérisé en ce que l'on poursuit le pro- cessus de lavage jusqu'à l'obtention d'une concentra- tion en facteur XIII de 200 unités de facteur XIII/g de fibrinogène, puis on ajoute du facteur XIII en une quan- tité d'au moins 300 unités/g de fibrinogène, sous la forme d'un concentré ou d'un lyophilisat.