Brevet FR2505186A1 — publié le 19821112

Préparations à base de membranes cellulaires ou de cellules entières de propionibactéries, utilisables notamment en can- cérologie, et utilisation de propionibactéries pour obtenir ces préparations. L'invention a pour objet des préparations pharmaceutiques à base de membranes cellulaires ou de cellules entières obtenues à partir de propionibactéries, en particulier de Propionibacterium granulosum, Propioni- bacterium avidum et/ou Propionibacterium acnes, lesquelles préparations sont utilisables dans le traitement des tu- meurs ou lors de la radio ou chimiothérapie des tumeurs. On connait des préparations à base de formes anaérobies de corynebactéries, par exemple C-Parvum, CN 6134, qui sont décrites en tant qu'agents antitumoraux Il est cependant apparu que ces préparations conduisent à des activités secondaires et complications indésirables lors de la thérapie systémique ou locale, de sorte qu'il est recommandé dans la littérature d'éviter des doses supéri- eures à 7,5 mg/m 2 de surface Cette quantité correspondrait à peu près à une quantité de 20 mg par patient. Selon l'invention on a établi que des pré- parations à base de cellules complètes tuées ou de membra- nes cellulaires de propionibactéries sont extraordinaire- ment actives lors de la chimiothérapie ou de la radiothé- rapie des tumeurs Ces préparations conviennent tout parti- culièrement à la thérapie de renforcement L'activité est particulièrement grande en cas d'application locale. Ainsi, grâce à des recherches on a montré que P acnes, P granulosum et P avidum, par injection intrapéritonéale à des souris à une dose de 1,5 mg par souris prolongent de façon significative la durée de sur- vie de souris irradiées à des doses léthales ( 850 R), P granulosum étant le plus actif On a établi que les pré- parations selon l'invention conviennent à la stimulation de la prolifération de cellules formant des colonies dans la rate, c'est-à-dire à la stimulation d'une migration des unités hématopolétiques formant des colonies à partir de la moelle osseuse pour pénétrer dans le cycle cellulaire et pour mi- grer vers le sang périphérique Dans la pratique clini- que cette découverte signifie que les préparations selon l'invention sont précieuses en tant que thérapie adjuvante lors de la radiothérapie des tumeurs, car elles augmentent considérablement la tolérance des patients vis-à-vis des rayons. En outre, des recherches ont permis d'éta- blir que les préparations selon l'invention sont actives contre les sarcomes 180 murins chez les souris et condui- sent à une régression supérieure à 70 % des tumeurs de sarcomes 180 lorsqu'on les applique dans la tumeur. On a également établi que les préparations selon l'invention, par administration systémique à des patients présentant des tumeurs primaires ou secondaires des poumons en tant que traitement adjuvant de la chimio- thérapie aident à éviter l'une des principales complica- tions de la chimiothérapie des tumeurs, c'est-à-dire le risque d'infection Il s'est donc révélé que les prépara- tions selon l'invention peuvent être utilisées en tant qu'agents de traitement adjuvants antibactériellement actifs remarquables lors de la chimiothérapie du cancer. Les résultats précédents qui sont appuyés dans ce qui suit par l'exposé de quelques études in vivo, doivent à tout égard être considérés comme inattendus. L'utilisation selon l'invention pour l'ob- tention de préparations de parois cellulaires s'est révélée comme particulièrement utile car avec ce type de prépara- tions le risque d'effets secondaires indésirables est par- ticulièrement faible Les préparations à base de parois cellulaires n'ont jamais, selon l'état de la technique, été étudiées en clinique jusqu'à présent. L'objet de l'invention est donc l'utilisa- tion de Propionibactéries, notamment Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum et/ou Propionibacte- rium acnes pour l'obtention de préparations de membranes cellulaires ou de préparations de cellules complètes utilisables dans la radio ou chimioth Wrapie des tumeurs. Selon une forme de réalisation proférée de l'invention, on utilise Propionibacterium granulosum et Propionibacterium avidum, en particulier Propionibacterium granulosum de sou- che KP 45 et Propionibacterium avidum de souche KP 40. Il est préférable de préparer des suspen- sions injectables en solution de chlorure de sodium tampon- née au phosphate Dans ce cas une concentration de 0,5 à mg de matière active par ml de solution est particuliè- rement avantageuse Une concentration de 2 à 12 mq/ml de solution, en particulier de 5 à 7,5 mq/ml de solution est préférée. Des solutions pour perfusions intraveineuses contenant 15 à 30 mg de la préparation dans 100 ml de solu- tion sont particulièrement adaptées Un tel dosage s'est révélé particulièrement avantageux pour l'administration lors du traitement des néoplasmes primaires et secondaires des poumons; il est souhaitable que dans ce cas une pre- mière injection ait lieu au moins 10 jours avant le traite- ment chimiothérapeutique. Comme tampon au phosphate on utilise avan- tageusement un tampon au phosphate Na 2 HPO 4/KH 2 PO 4 qui pré- sente avantageusement un p H d'environ 7,2. L'invention n'est pas limitée à une sou- che de Propionibacterium particulière On peut avoir re- cours à différentes souches de propionibactéries, par exemple les propionibactéries décrites dans "FEMS Micro- biology Letters", volume 2, n Ol, juillet 1977, pages 5 à 9. Les souches P granulosum KP 45 et P avi- dum KP 40 sont particulièrement préférées Elles ont été déposées dans la Collection Allemande de Microorganismes, DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gesellschaft f Ur Biotechnologische Forschung mb H, Grisebachstrasse 8, D-3400 Gbttingen, Allemagne) avec le numéro de dépôt DSM 1773 pour P granulosum KP 45 et 1772 pour P avidum KP 40 et la date d'entrée du 11 03 1980 Les deux souches peu- vent être obtenues auprès de-la DSM conformément à la dé- claration de mise à la disposition (actuellement formulaire P 2750) préalablement déposée par le déposant auprès de la DSM et auprès de l'Office Allemand des Brevets (Deutsches Patentamt). P granulosum, P acnes et P avidum peu- vent par ailleurs être isolés par frottis à partir d'efflo- rescences d'acné (Acne vulgaris, Acne papulopustulosa et Acnes conclobata) et cultivés En ce qui concerne la taxo- nomie voir "Der Hautarzt" 30, 242 à 267, ( 1979). D'autres souches de propionibactéries pou- vant être utilisées selon l'invention sont par exemple décrites dans "Applied Microbiology", février 1973, pages 222 à 229 de "l'American Society for Microbiology", volume 25, n 2. Caractérisati on des propionibactéries P avidum socixhe KP 4 C et P Qranulosu-n KP 45 Provenance Frottis à partir d ' une plaie inf ectée extrait de la zo- ne du prépuce d' une personne clinique- ment saine Espèce P gra- nulo- SUDI P avi- Réactians bicxhimiiques (re 5, 1) Saccha Mal-i Sor 1 ai i Sali- c'Oe I tose Ibitol Itoi Icine * Ino- si- toi Hydrolyse de l'escu- line Indo i Nitra- le 1 te i i y+ i i i f t + + + + + + + -1 * 4 L L j ___________ Souche nla K 2 P 45 KP 40 Géla- tine Dex- tri- ne Méli- tose + + + + + (il Ln I CD Lni Co Sériologie (réf 2) P ac-r nes KB P granu- losuii i D 34 P avidun 05751 I Lysotipie des phiages (réf 3) I 431 K 613 (souches de phiages selon la réf 3) KP 45 Frottis à partir P granu- d'une plaie losun + NN infectée ICP 40 Ebctrait de la P avi- zone du prépuce dtrn + NN d 'une persoene cliniquenent saine NN = non nonnalisable 1) G Pulverer et H L Kz O Fermentative and Serological Studies on Propionibacteriun acnes App Microb 25 222-229 1973 2) U I 56 ffler, H L No et G Pulverer Serotyping of Propionibacteriurm acnes and related ricrobial species. Fems Microbiology letters, vol 2, 5 -9, 1977 3) E C Jong, H L Ko et G Pulverer Stulies on Bacteriophages of P acnes Med Microbiol Imuarxl 161, 263-271, 1975 et Der Hautarzt 30, 242-2 47 ( 1979) Differenzierung unterschiedlicher Propionibakterienspezie aus Acne- vulgaris- Effluoreszenzen. LM Co (suite) Souche no Origine E Sp èce a' Les exemples suivants servent à illustrer la fabrication de préparatiorns selon l 'invention. Exemple 1 Méthode générale de travail Vour obtenir les mnembranes cellulaires. La culture en milieu liquide du Propionibacterium choisi a été effectuée dans un litre (fiole d'Erlenmeyer) à 370 C dans des conditions anaérobies (Procédé "Gas-Pak, BBL" ensemble cauwercial e A, Becton + Dickinson, Cackeysville, Maryland W pour la culture anaérobie). Pour cette Culture en grande quantité, le milieu (Bouillon A ou "Triptic soy broth"l de la société Difco) a été ensemencé avec une suspension épaisse de Propionibacterium La suspension d'ensemencement a été préparée par broyage d'une culture de trois jours sur gélose A de Propionibacterium dans 10 ml de bouillon Après une durée d'incubation de 72 heures à 37 C, les cellules ont été séparées du liquide par centrifugation à 10 000 g ( 20 minutes) dans un dispositif de centrifugation à froid de type R 2 de la marque SORVAL Le sédiment a été lavé trois fois à l'eau distillée et mélangé ensuite avec le volume double de perles de verre ( O 0,17-0,18 mm) et brisé pendant 1 h à 1 h 1/2 dans un broyeur de cellules +++. Après avoir vérifié, par contrôle microscopique (préparation Gram), qu'il n'y avait plus de cellules entières, les perles de verre ont été séparées de l'homogénéisat au moyen d'un verre fritté de type G-1, en utilisant du tampon au phosphate++ (p H 7,2). La suspension laiteuse (qui contenait des membranes cellulaires et des cytoplasmes) a été centrifugée minutes à 40 000 g et le sédiment a été repris dans du tampon au phosphate (p H 7,2) Les enzymes autolytiques ont été inactivées par ébullition pendant 10 minutes au bain d'eau. Ces membranes cellulaires renfermant encore des protéines ont été encore purifiées par incubation à 37 C pendant 24 heures avec de la trypsine (Merck, 0,5 mg/ ml de suspension) et 1 ml de toluène pour 100 ml de suspen- sion (pour empêcher la croissance des bactéries). Les membranes cellulaires purifiées par digestion tryptique ont été ensuite centrifugées à 40 000 g ( 30 minutes) et lavées trois fois à l'eau distillée, puis lyophilisées. +) Bouillon A Casiton Vacto (marque de la société DIFCO) 12 g (Pe Dtone spéciale pour cultures bacteriologiques) Extrait de levure Bacto 12 g KH 2 PO 4 4 g Mg SO 4 7 H 20 1 g Glucose 4 g Eau distillée qsp 1000 ml, p H 7,2 pour gélose A + 28 g de gélose Bacto. ++) Tampon au phosphate 1/15 M de Na 2 HPO 4 2 H 20 et 1/15 M de KH 2 P 04 ont été dissous chacun dans 1000 ml d'eau distillée; 612 g de la solution de phosphate de sodium secondaire ont été mélangés avec 388 g de la solution de phosphate de potassium primaire et le p H a été réglé à 7,2. +++) Broyeur de cellules: broyeur de cellules "Vibrogen" vi 3, Edmund B Uhler, 7400 T Ubingen (R F A). Exemple 2 Préparation de suspensions de P acnes (souche ATCC 6919), P avidum (souche 0575, KP 40) et P qranulosum (souche KP 45) Des propionibactéries du type mentionné, lyophilisées selon la méthode générale de travail de l'exemple 1,sont mises en suspension dans une solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate du type indiqué plus haut à une concentration de 5,0 ou respectivement de 7,5 mg/ml La suspension obtenue convient en particulier pour l'injec- tion intrapéritonéale. S Exemple 3 En procédant comme à l'exemple 2, on prépare des suspensions injectables par voie intrapéritonéale de P granulosum de souche KP 45, 95 K, de P acnes de souche ATCC 6919 et de P avidum de souche 0575, KP 40 à partir de matière lyo- philisée, à une concentration de 5 ou respectivement de 7,5 mg/ml de matière cellulaire. Exemple 4 Préparation de suspensions injectables pour le traitement adjuvant lors de la chimiothérapie. On prépare P granulosum de souche KP 45 selon la méthode générale de l'exemple 1 On prépare une suspension de 30 mg de matière cellulaire dans 100 ml de solution de perfusion pour l'administration intraveineuse. Les préparations selon l'invention peuvent contenir des additifs habituels Ces préparations peuvent se présenter sous forme d'ampoules ou être introduites dans des flacons stériles avec fermeture perforables On peut également réaliser des présentations avec conservation séparée des constituants pour la préparation au moment de l'application. Etudes in vivo 1 Hémopolèse chez des souris traitées avec des propionibac- téries après irradiation létale. On a injecté trois souches de propionibactéries (P acnes, P granulosum et P avidum) à chaque' fois à une dose de 1,5 mg par souris, par voie intrapéritonéale, à des souris irradiées de façon létale ( 850 R) Il s'est ré- vélé que P granulosum prolonge le plus la survie des souris irradiées. On a utilisé des souris mâles de souche Swiss adultes, âgées de 8 semaines Les animaux ont été alimentés avec une diète standard Ils avaient de l'eau à disposition ad libidum L'eau et la nourriture étaient stérilisées. L'eau contenait de l'oxytétracycline ( 1 g pour 1000 ml). Irradiation: les souris ont été irradiées avec 650 ou respectivement 850 R dans une petite cage en méthacrylate ( 10 souris par cage) en rotation, à une distance de cm de l'unité MEDICOR THX 250, qui était alimentée sous 200 k V et était munie d'un filtre de Cu de 0,5 mm. Le taux d'irradiation d'environ 75 R par minute a été déterminé au moyen d'un dosimètre R à thermoluminescence CT-1. Pour les expériences, on a utilisé P acnes de souche ATCC 6919, P avidum de souche 0575, KP 40 et P granu- losum de souche KP 45 sous forme de cellules complètes tuées et sous forme de membranes cellulaires On a mis les propionibactéries lyophilisées en suspension dans une solution de chlorure de sodium tamponnée au phospha- te à une concentration de 7,5 mg/ml et on a injecté 0,2 ml de la suspension par voie intrapéritonéale ( 1,5 mg par souris). Etude des colonies exogènes de la rate 3, 2 ou respectivement 1 jour avant la transplantation de moëlle osseuse on a injecté 1,5 mg de P granulosum aux souris donneuses On a préparé la suspension de cellules de moelle osseuse par rinçage des deux os de la cuisse avec du milieu de Parker stérile Les cellules ont été comptées dans un hémocytomètre 5 x 105 cellules aptes à la prolifération dans 0,2 ml de milieu de Parker ont été injectées à chaque souris dans la veine de la queue, lesquelles souris avaient été irradiées avec 850 R 4 heures avant la transplantation de moelle osseu- se Les souris témoins ont reçu une injection de 0,2 ml de milieu ou de 5 x 10 cellules de moelle osseuse pro- venant de souris normales (non traitées avec P, granu- losum) A un autre groupe de souris donneuses on a admi- nistré comme précédemment P granulosum, puis les ani- maux ont été anesthésiés à l'éther et on a prélevé du sang par le plexus retrobulbaire Les cellules du sang ont été comptées dans l'hémocytomètre et des portions aliquotes de sang renfermant 5 x 105 cellules nucléées ont été injec- tées dans la veine de la queue des souris irradiées par 850 R Les souris témoins ont reçu les mêmes volumes de sang qui avait été prélevé sur des souris normales (non trai- tées par P granulosum) Toutes les souris ont été tuées 9 jours après la transplantation de sang ou respectivement de moelle osseuse et pesées, la rate a été prélevée, on a de nouveau pesé et on a déterminé le nombre de colonies par rate après fixation dans le chloroforme: éthanol ( 1: 3). Etude des colonies endocènes de la rate 3, 2 ou respectivement 1 ou O jour avant l'irradiation avec 650 R les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de P granulosum Les souris témoins ont reçu des volumes égaux de PBS (solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate) 9 jours après l'irradiation les animaux ont été tués, les rates ont été extraites, pesées et les colonies ont été dénombrées comme dans l'essai précédent pour dé- terminer les colonies endogènesde la rate. Essai de survie Des souris ont été réparties en 7 groupes, chaque groupe comprenant 15 souris qui ont été irradiées avec 850 R de rayons X 4 heures après l'irradiation, on a injecté des membranes cellulaires ou des cellules entières de Dro Dioni- bactéries-aux animaux Les souris témoins ont reçu des vo- lumés égaux de PBS Le nombre des animaux survivants dans chaque groupe a été compté à partir du loème jour après l'irradiation. Pour l'analyse statistique on a eu recours à la méthode d'ex- mloitation statistique connue sous le nom de "Student t-Test"l La figure unique jointe représente graphiquement l'influen- ce des propionibactéries de souches mentionnées plus haut sur la survie de souris irradiées par une dose létale ( 850 R) Toutes les trois souches de propionibactéries ont conduit, par comparaison aux animaux témoins, à une augmen- tation significative de l'extension de survie P granulosum, sous forme de préparation de cellules entières et sous for- me de préparation de membranes cellulaires, s'est révélé plus actif que P acnes et P avidum. Influence de P aranulosum (souche KP 45) sur les colonies endoqènes de la rate. Tableau I Nombre de colonies endoaènes de la rate chez des souris traitées avec Propionibacterium granulosum (valeur moyenne + écart type) (souche KP 45). poids relatif de la rate Nombre de colo- nies endogènes de la rate témoins ( 650 R) 1,82 0,45 1,24 0,67 P granulosum 3 jours avant 1,66 + 0,24 10,6 4,45 x l'irradiation P granulosun 2 jours avant 1,73 + 0,21 8,17 + 3,49 x 1 'irradiation P granulosum 2 jour avant 2,18 0,42 11,2 + 5,30 x l' irradiation P granulosumn 1 jour avant 21 2,8 0,42 11,2 + 5,30 x i 1 'irradiationi P granulosum 4 heures après 2,32 0,38 14,1 + 4,70 X 2,32 + 0,38 14,1 4,70 1 'irradiaticn , À, -p 4 heures après l'irradiation avec 650 R Cependant le nom- bre des colonies endogènes de la rate croit de façon signi- ficative pour l'ensemble des traitements. 2505 1 86 Activité de P aranulosum (souche KP 45) sur la formation de colonies exogènes de la rate. Nombre de colonies exocènes après transfusion de moelle osseuse de souris traitées avec P granulosum (souche KP 45). (valeur moyenne écart type) Transfusion Poids relatif de la rate Nombre de colonies exogénes de la rate XX 6 CFU-S pour 10 cellules nucléées de moel le osseuse Témoins ( 0,5 ml de milieu de Parker) 0,99 0,19 1,12 0,32 11,2 + 3,2 Moelle osseuse de souris normales 1,52 + 31 20,4 + 2,14 204,0 21,4 , Dkelle osseuse de souris traitées avec P granulosumn 3 jours avant la transfusion 1,51 0,49 10,3 1, 87 x 103,0 18,7 x Moelle osseuse de souris traitées avec P granulosum 2 jours avant la transfusion 1,75 0,44 11,6 44 x 116,0 44,2 Moelle osseuse de souris traitées avec +, P granulosun i 1 jour avant la transfusion 1, 69 + 0,27 10,7 4,3 x 107,0 43, x ,,, , -p relatif de la rate entre les souris qui avaient été trans- plantées avec de la moelle osseuse normale et les souris transplantées avec la moelle osseuse d'animaux donneurs traités avec P granulosum 2, 3 ou 1 jour avant la trans- plantation Ce traitement a conduit à une diminution signi- ficative du nombre des colonies exogènes de la rate chez les animaux irradiés par-850 R, par comparaison aux animaux dont la moelle osseuse avait été donnée par des animaux donneurs non traités Cette constatation dénote une diminu- tion du nombre des cellules formant des colonies dans la rate dans la moelle osseuse des souris traitées par P granulosum. D'autre part, une injection de sang de souris qui avaient été traitées avec P granulosum à des animaux d'expérience irradiés à des doses létales conduit à un accroissement si- gnificatif de la valeur des poids relatifs de la rate et du nombre des colonies de la rate par comparaison à l'injection de sang provenant d'animaux donneurs non traités, comme cela résulte du tableau III suivant r l e e art arstanfsond a oeat esurstatésae P c ranulosum (souche KP 45). (valeurs moyennes + écarts types). Transfusion Leucocytose dans Poids relatif le sang trans de la rate fusé Sang de souris normales 6480 1,41 + 0,23 Sang de souris qui avaient été traitées avec P granulosum 9960 2,62 + 0,88 3 jours avant la transfusion Sang de souris qui avaient été traitées avec P granulosum 10120 3,45 + 1, 81 x 2 jours avant la transfusion Sang de souris qui avaient été traitées avec P granulosun 9650 3,23 + 1,48 x 1 jour avant la transfusion x Nombre de colonies exogènes de la rate CEU-S pour 106 cellules nucléées ce moelle osseuse. -p Ln co C% l anrès transfusion de sang Provenant de souris traitées avec wrinhrp r Ip c nlnrti,- q enncènes de la rate Tableau 111- Le sang prélevé sur des souris donneuses qui avaient reçu une injection deux ou trois jours avant la transplantation de sang était le plus actif dans la stimulation de la for- mation de colonies de la rate La leucocytose était cepen- dant augmentée dans le sang transplanté après le traitement avec P granulosum 3, 2 ou 1 jour avant le prélèvement de sang. Dans les expérimentations précédentes, P granulosum s'est révélé être l'agent le plus actif chez les rats irradiés à des doses létales L'effet mortel des doses létales de rayons X est le résultat de l'inhibition de l'aptitude à la prolifération des cellules souches hémopolétiques et de l'atteinte des cellules épithéliales des organes internes avec développement subséquent d'infections géné- ralisées par des bactéries saprophytes En fait, dans l'expérimentation précédente, il est apparu que les souris traitées par des propionibactéries ne présentaient aucun * symptôme de diarrhées et/ou de saignements du tube diges- tif En conséquence on peut ajouter à l'activité protec- trice des propionibactéries un rétablissement renforcé des cellules souches hémopolétiques de la moelle osseuse après l'irradiation. 2 Activité de P aranulosum, P acnes et P avidum en pré- sence de tumeurs de sarcomes 180 murins expérimentaux chez la souris. Chacune des trois propionibactéries mentionnées précédem- ment a été administrée par voie intrapéritonéale ou intra- tumorale en plusieurs doses, à chaque fois à raison de 1 mg par souris et s'est révélée active dans le ralentisse- ment de la croissance et la stimulation de la régression de sarcomes 180 chez les souris CFW De plus, l'adminis- tration de propionibactéries a produit une prolongation de la survie de souris avec des sarcomes 180. Propionibactéries utilisées Pour les expérimentations on a utilisé Propionibacterium granulosum de souche KP 45 (isolé à partir de blessures infectées à l'Institut d'Hygiène de l'Université de Colo- gne), Propionibacterium acnes de souche 6919 (ATCC), Pro- pionibacterium avidum de souche 0575 (C S Cummins, Anaero- be Labs, Institut Polytechnique de Virginie et Université d'Etat, Blackburg), de souche KP 40 Les propionibactéries mentionnées ont été lyophilisées et mises en suspension en solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate, à une concentration de 5 mg/ml 0,2 ml de la suspension a été administré par voie intrapéritonéale ou intratumorale aux souris portant des tumeurs. Souris portant des tumeurs: Dans ce système tumoral on a utilisé des souris CFW mâles, adultes Les tumeurs ont été induites comme décrit dans Radio Sci 12 ( 1978) pages 185 à 189 Pour ce faire on a enlevé au scalpel des tumeurs de sarcomes 180 de souris donneuses, on a hâché, trypsinisé ( 0,25 % de trypsine, 15 minutes à 37 C) et filtré les tissus tumoraux On a déter- miné le nombre des cellules et on a réglé à 108 le nombre des cellules aptes à la prolifération pour 1 ml de solution de chlorure de sodium 0,1 ml de la suspension a été injecté par voie sous-cutanée intrascapulaire Cette façon de procé- der a conduit au développement de tumeurs perceptibles après environ 4 à 5 jours Une croissance rapide des tumeurs a eu lieu entre le 4 ème et le 14 ème jour après la transplan- tation, l'effet létal intervenant entre le 20 ème et le 28 ème jour. On a utilisé en tout 225 souris mâles CFW dans les essais Dans les tests de survie, on a réparti souris en sept groupes ( 15 souris par groupe) et on a injecté les propionibactéries aux animaux des groupes expé- rimentaux (I à VI) aux jours O, 4, 8, 12 et 16 après l'im- plantation des cellules tumorales On a injecté P granulo- sum, P avidum ou P acnes par voie intrapéritonéale ( 3 groupes) ou intratumorale ( 3 groupes) à une dose de 1 mg/ souris Les souris témoins ont reçu par voie intrapéritonéa- le ou intratumorale des injections de PBS Le nombre des animaux survivants a été enregistré au 16 ème ou respective- ment 20 ème jour après l'implantation des cellules tumorales et ensuite tous les deux jours jusqu'au 44 ème jour après l'implantation Les 120 animaux restants ont été répartis en 8 groupes et les souris des groupes expérimentaux (I à VI) ont reçu comme précédemment une injection de propioni- bactéries et les souris témoins (groupes VII et VIII) une injection de PBS Le 20 ème jour après l'implantation des cellules tumorales, toutes les souris ont été tuées et les tumeurs prélevées et pesées La moyenne arithmétique et les écarts types ont été déterminés pour chaque groupe et l'ensemble des tumeurs des groupes expérimentaux qui se trouvaient à plus de deux écarts types au-dessous de la valeur moyenne des témoins ont été considérées comme régressives Les résultats ont été analysés statistique- ment au moyen de "Studen t-Test"l (masse des tumeurs) ou de la méthode d'exploitation statistique connue sous le nom de "Chi-Quadrat-Test correction de Yates" (régression des tumeurs et survie des souris). Dans le tableau IV suivant sont rassemblés les résultats obtenus. Tableau IV Survie de souris CFW portant des sarcomes 180 sous traitement par des propionibactéries (l mg/souris) aux jours 0,-4, 8, 12 et 16 ap Drès l'implantation des cellules tumorales. Jours après 1 'Iximplantaticn des cellules turorales Tém Dins 15 ' 1 r i S 7 3 P granulosun par voie intrapéritonéale 15 15 15 15 12 12 10 9 9 7 6 3 3 P acnes par voie 5 intrapéritonéale 15 15 15 15 15 14 12 8 818 5 5 2 P avidum par voie intrapéritonéale 15 15 15 14 14 13 il 10 8 5 14 î 4 O P granulosun par voie 9 intratumora 51511 15 15115 i 13 12 il 9 7 7 6 3 P acnes par voie I intraturr Drale 15 15 15 15 15 14 12 11 9 7 71 7 2 P avidu-n par voie 1 intratuxmrale 151 15 15 15 15 15 14 13 10 8 8 6 4 3 Ln Le tableau V suivant montre l'influence des propionibac- téries sur la croissance et la régression des sarcomes chez les souris CFW. Tableau V Masse des tuxreurs et nombre de tixreurs avant réciressé chez des souris rortant des sarcanes 180, traitées par des propionibactéries ( 1 mia/souris) le jour de l'1 implantation et les 4 e, 8 e, 12 e et 16 e Jours après i 'irrlantation de cellules tumorales. Injection intrapéritornéale f Injection intratumrorale Masse des tumeurs (g) Naombre de tu- meurs ayant régressé Pourcentage de régres- sion Masse des (g) tuneurs Nanbre de tu- meurs ayant régressé Pourcentage de régres- sion. i Téoins 2631 321 0/15 O 2631 321 0/15 0 Propionibacterium++ granulosum, 842 -312 8/15 53,3 538 212 11/15 73,3 Propionibacterium ++ avidum 1032 -381 6/15 40,0 842 -246 10/15 66,6 Propionibacteriun acnes 1126 -412 5/15 33,3 731 -218 9/15 60,0 KM Ln I Co 0 % Dans le cas de l'administration par voie intrapéritonéale en une seule dose de 1 mg/souris, il est résulté avec chacune des trois souches testées de propionibactéries un accroissement significatif de la rate le 4 ème jour après l'injection avec encore une augmentation de la masse de la rate aux jours 6 à 14 Cet accroissement de la rate reflète la stimulation du système réticuloendothélique et se développe de façon parallèle à l'activité antitumeur de ces immunostimulants. P granulosum conduit à une régression de plus de 70 % dans le cas des tumeurs de sarcomes 180, après administra- tion par voie intratumorale. 3 Activité cytostatique in vivo due à Propionibacterium cranulosum, en présence de cellules tumorales murines. Dans un autre essai, on a étudié l'activité cytostatique de Propionibacterium granulosum de souche KP 45 en présen- ce de sarcomes L-1 sur des souris de souche BALB/c (poumons) Dans ce cas également il a résulté une activité significative par comparaison aux animaux non traités. 4 Activité antibactérienne en tant que traitement adjuvant dans la chimiothérapie de tumeurs primaires ou secondaires des poumons. patients avec des tumeurs métastatiques primaires ou secondaires des poumons ont été choisis pour ce test. des patients ont reçu des perfusions intraveineuses de mg de P granulosum dans 100 ml de solution pour perfu- sion intraveineuse Les 20 autres patients ont servi de témoins. L'ensemble des patients ont été traités par voie chimiothé- rapeutique en vue de synchroniser la prolifération des cellules néoplasiques Chaque série a duré 3 jours. ler jour: vincristine 1,5 mg par voie intraveineuse à 8 heures et à 20 heures; 2 ème jour: méthotrexate 25 mg par voie intramusculaire à heures; 3 ème jour: méthotrexate 25 mg par voie intramusculaire à 8 heures, suivi de méthotrexate par voie intraveineuse, mg, à 14 heures et perfusion de 30 mg/kg de cyclophos- phamide en même temps. Ce traitement chimiothérapeutique a été répété trois fois tous les 21 jours. La Chimiothérapie globale était constituée des trois cycles susindiqués, commençant aux ler, 22 ème et 43 ème jour d'ob- servation. Pendant le 3 ème, loème, 31 ème et 52 ème jour d'observation, on a injecté P granulosum à une dose de 30 mg/100 ml de solution de perfusion intraveineuse, en l'espace de 15 minutes (le dernier jour du premier cycle chimiothérapeu- tique et ensuite 1 semaine après la fin de chaque cycle). Chez les patients traités uniquement par la chimiothérapie, il y a eu cinq cas d'infections bactériennes (trois pneumo- nies, une septicémie et un cas d'angine tonsillaire) en l'espace d'une période d'observation de 60 jours, tandis que chez les 10 patients traités par la chimiothérapie et des perfusions intraveineuses de P granulosum aucun symp- tôme d'infection bactérienne n'est apparu Cette différen- ce est à considérer comme statistiquement significative. La tolérance des patients vis-à-vis des perfusions intra- veineuses de P granulosum de souche KP 45 était bonne. Certes, pendant la perfusion en une quantité de 30 mg de P granulosum, il s'est produit des sensations de froid et ensuite de la fièvre jusqu'à 39 WC ( 2 à 12 heures après la perfusion), cependant le jour suivant ces effets se- condaires n'étaient plus constatables Des perfusions répétées de P granulosum n'ont pas conduit au dévelop- pement d'une hypersensibilité ralentie pendant les 60 jours d'observation On en a conclu que la perfusion intravei- neuse de 30 à 240 mg de P granulosum de souche KP 45 peut être entreprise sans risque de réactions secondaires ou complications sérieuses chez les patients. Instructions Générales pour l'application locale (cancer de l'estomac et de l'intestin) On met en suspension 10 mg de produit lyophilisé dans 1 ml de xylocaine à 1 % en solution de chlorure de sodium et on injecte par voie intratumorale à travers la peau (diamètre 1 mm), en utilisant un tuyau rigide en polyéthylène, de cm de long, muni d'une aiguille intramusculaire (taille 18) solidement fixée, sans épiphyse Le tuyau est intro- duit dans un endoscope (gastrofibroscope ou colonoscope) à travers un canal bioptique, la tumeur néoplastique se trouvant sous contrôle visuel étant ainsi pointée et l'ai- guille introduite de 0,5 à 1 cm dans le tissu tumoral Le produit est injecté par le tuvau et on rince avec 1 à 2 ml de xylocaine à 1 % dans une solution de chlorure de sodium. Les injections intratumorales ( 10 mg de produit dans cha- que cas) sont administrées par exemple pendant les trois premiers jours, puis le 10 ème et le 17 ème jour de l'ob- servation. REVENDICATIONS 1 Préparations à base de membranes cellulaires ou de cellules entières obtenues à partir de propionibac- téries, utilisables notamment dans le traitement des tumeurs ou lors de la chimio ou radiothérapie des tu- meurs. 2 Préparations selon la revendication 1, caracté- risées en ce que les propionibactéries sont choisies dans le groupe constitué par Propionibacterium granu- losum, Propionibacterium avidum et Propionibacterium acnes. 3 Préparations pharmaceutiques à base de membra- nes cellulaires ou de cellules entières obtenues à par- tir de Propionibacterium granulosum de souche KP 45, utilisables notamment dans le traitement des tumeurs ou lors de la chimio ou radiothérapie des tumeurs. 4 Préparations pharmaceutiques à base de membra- nes cellulaires ou de cellules entières obtenues à par- tir de Propionibacterium avidum de souche KP 40, utili- sables notamment dans le traitement des tumeurs ou lors de la chimio ou radiothérapie des tumeurs. Préparations pharmaceutiques selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de suspensions injectables en solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate. 6 Préparations selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de suspensions de membranes cellulaires ou de cellules entières en solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate, avec une concentration de 0,5 à 50 mg de matière active par ml de solution. 7 Préparations selon la revendication 5 ou 6, caractérisées en ce que le tampon au phosphate utilisé est un tampon Na 2 HPO 4/KH 2 PO 4 à un DH de 7,2. 8 Utilisation de propionibactéries, notamment Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum et/ou Propionibacterium acnes pour l'obtention de pré- parations à base de membranes cellulaires et/ou de cellules entières, utilisables notamment dans le trai- tement des tumeurs ou en tant que traitement adjuvant en radio ou chimiothérapie.