Brevet FR2499409A1 — publié le 19820813

Les troubles allergiques sont induits par une ré- action antigène-anticorps. Lorsqu'un individu a été immunolo- giquement marqué ou sensibilisé, un autre contact avec un an- tigène peut conduire non seulement à un renforcement secon- daire de la réponse immune, mais peut également provoquer des réactions endommageant les tissus, c'est-à-dire des trou- bles allergiques. On croit actuellement que le mécanisme de la pathogénèse des troubles allergiques est le suivant: Après avoir été exposé à un antigène pathogène, un individu produit un anticorps. Une seconde exposition à l'an- tigène entraine une réaction antigène-anticorps et les com- plexes antigène-anticorps formés se déposent sur les tissus et des médiateurs chimiques sont libérés à partir des cellu- les sensibilisées. Puis ces médiateurs et/ou les complexes antigène-anticorps déposés endommagent les tissus. Les antigènes pathogènes sont des antigènes xéno- gênes (allergène inhalé, allergène alimentaire, médicaments et autres), des antigènes allogènes et des antigènes autolo- gues qui sont des constituants autologues dénaturés des tis- sus, ou organes, et agissent comme s'ils étaient une substan- ce étrangère. Les troubles dits allergiques peuvent être clas- sés en 4 types. (1) Allergie de type I (type anaphylactique) dans laquelle l'antigène réagit avec une classe spécifique d'anticorps fi- xés sur des mastocytes ou des basophiles mobiles par une ré- gion spécialisée de l'anticorps. Ceci conduit à une dégranu- lation des cellules et à une libération de médiateurs vaso- actifs. (2) Allergie de type II (type cytotoxique) dans laquelle les anticorps sur la surface de la cellule se fixent à un antigène et entraînent plusieurs réactions telles que la pha- gocytose opsonique ou immune de la cellule, et la lyse de la cellule par l'action du système du complément. - (3) Allergie de type III (type d'Arthus, impliquant un im- muncomplexe) dans laquelle un complexe est formé entre un antigène et un anticorps humoral et provoque une activation du système du complément, une agrégation des plaquettes, une formation de microthrombus et autres. (4) Allergie de type IV (type à médiation cellulaire ou re- tardée) dans laquelle les lymphocytes provenant du thymus (cellules T) avec des récepteurs spécifiques sont stimulés par des antigènes et libèrent des médiateurs. Dans le cas de rejet-de tissu, ces lymphocytes se transforment pour tuer certaines cellules avec l'antigène dthistocompatibilité de la greffe. Parmi les réactions allergiques, les types d'al- lergies I, III et IV participent, par exemple, à l'asthme bronchique et chacune de ces réactions est considérée indé- pendamment, ou en association, pour provoquer ces troubles. Le mécanisme d'induction des troubles allergiques est consi- déré comme suit: un antigène qui pénètre dans un organisme est traité par des macrophages et l'information immunologi- que est transmise au système cellule T - cellule B. Les cel- lules B qui ont reçu l'information, produisent un anticorps (un anticorps de type IgE est principalement produit dans l'allergie de type I et un anticorps de type IgG dans l'al- lergie de type II ou de type III). L'anticorps de type IgE se fixe sur des basophiles en mouvement ou sur des mastocy- tes dans les tissus, établissant ainsi ltétat sensibilisé. Après quoi, le même antigène qui pénètre dans l'organisme sensibilisé se fixe avec l'anticorps sur ces cellules et li- bére des médiateurs chimiques, tels que l'histamine, ou des substances de l'anaphylaxie à réaction lente (SRS-A). Les médiateurs chimiques ainsi libérés induisent des symptômes allergiques tels que l'érythène, l'oedéme, ou une augmenta- tion des sécrétions glandulaires provoquée par la contraction des muscles lisses et une augmentation de la perméabilité ca- pillaire. D'autre part, l'anticorps de type IgG fixe des leu- cocytes polymorphonucleaires pour aboutir à une sensibili- sation et de la SRS-A, en tant que médiateur chimique, se- rait sécrétée. Les agents pour le traitement des troubles aller- giques peuvent remplir leur but thérapeutique en inhibant un stade quelconque des processus mentionnés ci-dessus. Par exemple, des dérives de xanthine, des stimulants P-adréner- giques (P-stimulants) ou des corticostéroides sont utilisés pour le traitement de l'asthme bronchique. Cependant, des réactions nocives défavorables ont souvent été observées a- vec ces médicaments. Notamment, des palpitations et une ta- chycardie sont rapportées chez des malades recevant des dé- rivés de xanthine et des,B-stimulants. En outre, les corti- costéroides provoquent des réactions nocives telles qu'un ulcère peptique et une complication des infections bactérien- nes. Les agents anti-histaminiques n'agissent pas contre l'asthme bronchique: ces agents aggravent même parfois l'as- thme en rendant difficile l'expectoration des sécrétions tra- chéales. Les maladies dues à une immuncomplexe, représen- tées par l'arthrite rhumatorde, le lupus érythémateux systé- mique (SLE) et le lupus néphrétique, tels qu'impliqués par le nom, sont des maladies qui sont induites par des comple- xes d'antigènes avec des anticorps, c'est-à-dire des immun- complexes et appartiennent aux allergies de type III. Bien que le mécanisme de l'origine de ces maladies soit compliqué et comporte de nombreux points non encore expliqués, on pen- se généralement qu'il suivrait le cours décrit ci-dessous. Lorsque des infections bactériennes ou virales endommagent des tissus, des anticorps sont produits contre les auto-antigènes récemment formés ou les cellules infec- tées par un virus en formant des immuncomplexes. Etant donné que ces immuncomplexes activent le système du complément et les plaquettes, des substances vaso-actives telles que l'his- tamine et la sérotonine sont libérées et la perméabilité des vaisseaux sanguins est augmentée. Puis les immuncomplexes cir- culants p6nètrent dans, et se déposent le long de, la cou- che sous-endothéliale de la paroi des vaisseaux dont la per- méabilité a été accrue. Aux endroits o les immuncomplexes se sont déposés, des leucocytes polymorphonucléaires se ras- semblent sous l'action des facteurs chimiotactiques des leu- cocytes qui ont été formés par l'action du complément sur les immuncomplexes déposés. Les leucocytes polymorphonuclé- aires, réagissant avec les immuncomplexes, libèrent diverses substances endommageant les tissus: telles que les cathepsi- nes D et E, la collagénase, l'élastase et des facteurs de perméabilité, et ces substances endommagent éventuellement le tissu. Chez des malades atteints de maladies avec immuncom- plexe telles que le SLE, le taux du complément dans le sérum est généralement faible et l'aggravation des conditions de la maladie est en rapport étroit avec la diminution du taux du complément. On pense que ce déclin serait dû à une consom- mation importante du complément au site de la réaction entre les antigènes et les anticorps, c'est-à-dire les reins et les vaisseaux sanguins. De plus, les immuncomplexes sont également en relation avec les systèmes de coagulation sanguine et on suppose que les immuncomplexes sont la cause de sérieux symp- tGmes par divers mécanismes, par exemple par une accélération du dcépôt de fibrinoides sur les tissus lésés. Actuellement, il existe plusieurs sortes d'agents pour le traitement des maladies avec immuncomplexe: des a- gents immunosuppresseurs tels que des stéroides qui suppri- ment le système immun activé, des agents anti-inflammatoires qui réduisent les inflammations locales et les douleurs ou des agents anticoagulants et des agents anti-plaquettes qui servent à améliorer les anomalies du système de coagulation- fibrinolyse dans les vaisseaux sanguins. Cependant, ces a- gents ne sont pas totalement efficaces et sont associés à di- verses réactions nocives. C'est ainsi que le développement d'un médicament sûr et parfaitement efficace dans le traite- ment des maladies est fortement désiré. D'autre part, on a mis au point de nombreux agents pour le traitement des tumeurs malignes. Les agents anti-tumeurs sont classés grossière- ment en deux types. C'est-à-dire, un premier type comprenant les médicaments dits cytotoxi ues qui suppriment directement le développement des tumeurs et un second type de médicaments qui mattrisent indirectement le développement des tumeurs en activant les fonctions immunologiques protectrices de l'hôte. Toutefois, le premier type ne montre pas une cyto- toxicité sélective suffisante vis-à-vis des cellules tumora- les et est également toxique vis-à-vis des cellules normales, auquel cas la quantité totale de l'agent qui peut être uti- lisée, est considérablement limitée. D'autre part, le second type, c'est-à-dire les immunopotentialisateurs, est généra- lement utilisé en toute sécurité, montrant moins fréquemment des réactions nocives défavorables par rapport au premier. Cependant, les tumeurs proviennent des cellules normales du malade, de sorte que la tumeur ne peut pas être suffisamment reconnue comme une substance étrangère. En conséquence, cer- taints immunopotentialisateurs posent un problème essentiel en ce qu'ils ne provoquent pas un effet anti-tumeur suffisant. L'invention a pour but de fournir un agent pour le traitement des troubles allergiques, des mala- dies avec immuncomplexe et des tumeurs, qui contient une protéase acide urinaire humaine, en tant qu'ingré- dient actif. Plus spécifiquement, l'invention a pour but de. fournir un agent thérapeutique pour les troubles allergiques, les maladies avec immuncompiexe et les tumeurs, ne produi- sant pas de réaction nocive. L'invention a encore pour but de fournir un moyen pour traiter des troubles allergiques, des maladies avec im- muncomplexe et des tumeurs, en utilisant une protéase acide qui est isolée et purifiée a partir de l'urine humaine. Les figures du dessin annexé représentent respec- tivement la figure 1, les résultats de l'expérience 1; les figures 2 et 3, le résultat de l'expérience 7; et la figure 4, les résultats de la mesure du taux de protéine urinaire dans l'expérience 8. Le taux de protéine urinaire est évalué de O à 4 par le degré de coloration d'un papier du commerce pour la détection des protéines, et le taux moyen de protéine pour chaque groupe est calculé à partir de ces résultats. En partant des données ci-dessus, la Demanderesse a étudié intensivement le développement d'un agent thérapeu- tique efficace pour le traitement des troubles allergiques, des maladies avec immuncomplexe et des tumeurs. Il s'ensuit que la Demanderesse a trouvé qu'une protéase acide isolée et purifiée à partir de l'urine humaine montre un effet anti- allergique puissant, supprime de façon remarquable différen- tes maladies avec immuncomplexe et exerce un effet excellent sur les tumeurs. La présente invention a été établie dans le cadre de ces recherches. La protéase acide qui constitue l'ingrédient ac- tif des agents de l'invention, est une enzyme connue Mirsky et al: J.Clin. Invest. 27,818,1948) qui n'a jamais été utilisée comme agent thérapeutique pour le traitement de troubles allergiques,de maladies avec immuncomplexeet de tumeurs. La protéase acide peut être obtenue à partir de l'urine hu- maine en associant de façon appropriée des procédés usuels pour isoler les protéines, tels que le relargage, la chroma- tographie d'adsorption sur des adsorbants inorganiques, la chromatographie d'échange d'ions sur une résine échangeuse d'ions ou la chromatographie sur gel utilisant un tamis molé- culaire. On fait passer par exemple l'urine humaine sur une colonne de DEAE-cellulose équilibrée avec une solution tampon d'acétate 0,1 M (pH 5, 3) selon le procédé de Seijffers et al. (American JOurnal of Physiology 206, 1106, 1964),de façon que la protéase acide soit adsorbée sur la colonne. On élue ensuite la protéase avec la même solution tampon con- tenant du chlorure de sodium 0,3 M. On concentre l'éluat, puis on purifie par chromatographie sur gel en utilisant du Sepha- dex G-100 et on soumet à un traitement acide. Le traitement acide peut être effectué, par exemple, en ajustant le pH de la fraction à une valeur au-dessous de 5 avec de l'acide chlorhydrique, puis en incubant pendant un temps approprié. On obtient ainsi la protéase acide de l'invention. La protéase acide obtenue selon le procédé ci- dessus a une masse moléculaire de 32 000 à 38 000, déterminée par chromatographie sur gel sur du Sephadex G-100, et un point isoélectrique dans la ganme de pH de 1 à 3 par la mesure du point isoélectrique sur Amnholine. Elle présente un maximum d'absorption à 278nm, montre une réaction positive à la ninhydrine et est facilement soluble dans l'eau et insoluble dans l'éther et le chioroforme. La protéase acide montre une excellente activité hydrolytique dans une gamme de pH acide, d'une valeur infé- rieure à 7, lorsque l'hémoglobine est utilisée comme substrat. La protéase acide est inhibée par la pepstatine. L'activité de la protéase acide reste stable dans une gamme acide de pH, de valeur inférieure à 7, tandis que la protéase acide perd son activité dans la gamme alcaline de pH, d'une valeur supérieure à 8. Ce qui suit est un exemple d'un procé- dé pour isoler et purifier la protéase acide suivant la pré- sente invention. Toutefois, cet exemple est simplement il- lustratif et non limitatif du procédé en question. Exemple du procédé d'isolation et de purification: 100 litres d'urine humaine sont concentrés à environ 1/100ème de leur valeur initiale en utilisant un appareil d'ultrafiltration sous pression (PELLICON - marque Déposée de Millipore CO., et DIAFLO - Marque Déposée de Amicon Co.) avec une valeur limite de 10 000 daltons. 100 ml de l'urine concentrée sont introduits dans une colonne (2,5x cm) de DEAE-cellulose (Whattman CO.) équilibrée avec un tampon d'acétate 0,1 M (pH 6,0) et éluée avec le même tampon contenant 0,3 M de chlorure de sodium. On concentre l'éluat à environ 100 ml par ultrafiltration et on le soumet à une dialyse. La solution dialysée est ensuite introduite dans une colonne (2,5 x 20 cm) de DEAE-Sépharose (Pharmacia CO.) dans les mêmes conditions que décrites ci-dessus. La fraction e0 éluée est concentrée à environ 10 ml et introduite dans une colonne de filtration sur gel SEPHADEX G-100 pour une nouvelle purification et l'élimination simultanée des substrats pyrogènes. 8o ml environ de la solution ainsi obtenue sont ajustés à pH 2 avec de l'acide chlorhydrique, puis on fait suivre d'une incubation de 10 mn à37 C. La solution est alors lyophilisée pour fournir 20 mg environ de la protéase acide. On décrira ci-après l'action pharmacologique et la toxicité de cette protéase acide, à l'aide des expériences typiques suivantes. Expérience 1 - Effet suppresseur sur la production d'anticorps de type IgE anti-ovalbumine On a utilisé un groupe de 10 rats miles Wistar pe- sant entre 180 et 200 g. On leur a injecté par voie intra- péritonéale 0,1 ïng d'ovalbumine et 20 mg de gel d'hydroxyde d'aluminium. A partir du jour suivant, on a injecté par voie intraveineuse de la protéase acide une fois chaque jour pen- dant 14 jours. On a recueilli les sérums les 7ème, 10ème et 14ème jours après l'injection de l'ovalbumine et on a deter- miné l'anticorps de Type IgE anti-ovalbumine dans le sérum par réaction d'anaphylaxie active cutanée (PCA) homologue du rat (H. Maruya!na et al., Folia Pharmacologica Japonica 74, 179, 1978). Les résultats sont rapportés sur la figure 1. On voit que la production d'anticorps de type IgE anti-ovalbumine était considérablement diminuéeo Expérience 2 - Effet suppresseur sur l'asthme bronchique On a utilisé un groupe de 10 rats mâles Wistar pe- sant entre 180 et 200 go On a injecté par voie intrapérito- néale 0,1 mg d'ovalbumine et 20 mg de gel d'hydroxyde d'alu- minium. A partir du jour suivant, on a injecté de la protéase acide par voie intraveineuse une fois chaque jour pendant 14 jours. Pour induire l'asthme bronchique, le 14ème jour, on a injecté 25 mg/kg d'ovalbumine par voie intraveineuse. On a me- suré la contraction trachéale ainsi induite, par la méthode de Konzett et Rossler (Arch.Exptl. Path. Pharmacol. 195, 71, 1940). On a calculé le taux de contraction de la trachée en prenant comme base la valeur 100 pour le taux de contraction du groupe témoin. Les résultats sont rapportés dans le Ta- bleau 1. TABLEAU 1 Taux de contraction de la trachée (%) Témoin 100 Protéase acide 0,05 mg/kg 72 0,5 mg/kg 47 mg/kg 24 La contraction trachéale était donc diminuée de façon importante par l'administration de la protéase acide. ExrDérience 3 - Hydrolyse d'un immuncomplexe On a dissous 15 mg d'un immuncomplexe soluble (IgG humaine - anticorps anti-IgG humaine de lapin) et 3 mg de chacune des protéines suivantes: protéase acide, tryp- sine, 0 -chymotrypsine ou plasmine, dans 1 ml de solution tampon au phosphate (0,06 M, pH 6,0) et incubé a 37 C pen- dant 60 minutes. On a arrêté la réaction par addition de 1 ml d'une solution aqueuse d'acide perchlorique a 20 %. On a me- suré l'absorbance du produit surnageant à 280 nm pour calcu- ler le taux d'hydrolyse. On a répété le même procédé en uti- lisant de l'IgG humaine au lieu de l'immuncomplexe. On a cal- culé le rapport du taux d'hydrolyse de l'immuncomplexe, ob- tenu, à celui de l'IgG humaine. Les résultats sont rapportés dans le Tableau 2. Par rapport aux autres protéases, la protéase aci- de a hydrolysé l'immuncomplexe soluble plus sélectivement que l'IgG humaine normale. TABLEAU 2 Taux relatif Rapport d'hydro- d'hydrolyse lyse (immuncom- IgG humaine Immuncomplexe plexe/IgG humaine) Protëase acide 100 380 3,8 Trypsine 130 169 1,3 X -Chymotrypsine 22 26 1,2 Plasmine 26 29 1,1 Expérience 4 - Hydrolyse d'un immuncomplexe On a dissous 15 mg d'un immuncomplexe soluble (IgG humaine - anticorps anti-IgG humaine de lapin) et 0,3 mg de protéase acide ou de trypsine dans 1 ml d'une solution tampon au phosphate (0,06 %, pH 6,0) et on a ajouté au mé- lange 250 Ml de sérum de rat ou de la même solution tampon au phosphate. On a incubé le mélange à 37 C pendant 60 mi- nutes. Lorsque la réaction a été terminée, on a mesuré l'IgG humaine restante par la méthode d'immunodiffusion radiale simple en utilisant du sérum de lapin anti-IgG humaine de façon à déterminer le rapport de l'immuncomplexe hydrolysé à l'immuncomplexe incubé initialement. Les résultats sont rapportés dans le Tableau 3. TABLEAU 3 Rapport d'hydrolyse (%) Absence de sérum Présence de sérum Protéase acide 35 35 Trypsine 19 2 Expérience 5 - Effet suppresseur sur la thyroldite On a étudié l'effet suppresseur de la protéase acide sur la thyro dite selon la méthode de Kotani et al. (Clinical Immunology 9, 635, 1977).o On a fait subir une thy- mectomie à un groupe de 10 rats mâles BFU/HDK (âgés de 6 se- maines) et on les a exposés à 4 irradiations répétées aux rayons X, de 200 rads chacune toutes les deux semaines. 14 semaines après la thymectomie, on a sacrifié les rats. La grande thyroide de chaque rat a été prélevée et enrobée dans un bloc de paraffine, puis colorée avec de l'hématoxyline- À ' éosine ou avec de l'azane, puis on a examiné le degré d'in- filtration des cellules mononucléaires, de destruction du réticulum endoplasmique et de la fibrose glandulaire, pour estimer la sévérité de la thyroidite, exprimée par une valeur de O à 4. On a administré la protéase acide une fois par jour par voie intraveineuse. Comme témoin, on a administré une pro- téase acide inactivée. Les résultats sont rapportés dans le Tableau 4. Par comparaison avec le témoin, on a trouvé que la protéase acide diminue à la fois l'apparition et la sévé- rité de la thyroidite en fonction de la dose administrée. TABLEAU 4 * Apparition (%r) Sévérité Témoin 90 3,4 + 0,3 Procétase acide 1 mg/kg 80 2, 8 - 0,4 3 mg/kg 60 2,0 0,1* mg/kg 40* 1,3 O,1** * p Expérience 6 - Effet suppresseur sur la néphrite avec immun- complexe A un groupe de 10 souris mâle C57BL, on a injecté par voie intraveineuse 200 mg/kg de complexe d'IgG humaine - anticorps anti-IgG humaine de lapin trois fois par jour tou- tes les 8 heures pendant 3 jours. Le quatrième jour, on a sa- crifié les animaux et on a prélevé les reins. On a observé le dépôt de l'immuncomplexe dans les glomérules par la tech- nique avec un anticorps fluorescent en utilisant un anticorps de chèvre anti-IgG de lapin, marqué avec de l'isothionate de fluorescéine. De plus, on a mesuré le taux d'immuncomplexe dans le sérum par le test de fixation de Clq (fraction du com- plément). On a mesuré la protéine urinaire avec un papier d'essai du commerce pour les 34 souris dont l'urine avait été recueillie avant de les sacrifier. On a administré la protéase acide par voie intraveineuse trois fois par jour, immédiatement après l'injection de l'immuncomplexe. Comme témoin on a administré une protéase acide inactivée. Ls ré- sultats sont rapportés dans le Tableau 5. On constate que le taux d'immuncomplexe dans le sérum a diminué ainsi que l'incidence de la protéinurie et de l'immuncomplexe déposé dans les glomérules par l'adminis- tration de la protéase acide. TABLEAU 5 Taux d'im- Protéinurie DépSt d'immun- muncomplexe (nombre de sou- complexe sur dans le sé- ris positivesf/ le glomérule rum nombre total de (nombre de sou- (lag/ml) souris examinées) ris positives par rapport au nombre de sou- ris examinées) Témoin 156 + 18 7 / 8 10 / 10 Protéase acide 0,3 mg/kg 128 9 5 / 7 8 / 10 1,0 mg/kg 88 + 12* 4 / 10 5 / 10* 3,0 mg/kg 53 + 7** 3 / 9* 2 / 10** # Souris montrant un degré de protéinurie de 3 ou 4 * p 40,05, ** p t 0,01 Expérience 7 - Effet suppresseur sur la néphrite de MIasugi Selon la méthode de Suzuki et al. (Folia Pharma- cologica Japonica 68, 572, 1972), on a administré par voie intraveineuse du sérum de lapin anti-rein de rat à un grou- pe de 10 rats mâles Wistar a une dose de 5 ml/kgo On a ad- ministré la protéase acide par voie intraveineuse une fois par jour après l'administration du sérum anti-rein. On a me- 3S5 sure chaque semaine le taux d1immuncomplexe dans le sérum et le taux de protéine dans l'urine. Comme témoin, on admi- nistré une protéase acide inactivée. Les résultats sont rap- portés sur les figures 2 et4. Dans le groupe traité avec la protéase acide, on a observé une diminution du taux de protéine dans l'urine et une diminution du taux d'immuncomplexe dans le sérum. Expérience 8 - Effet suppresseur sur le lupus néphrétique spontané chez les souris On a utilisé la méthode de Abe et Al. (The Ryu- machi 14, 43, 1974). A un groupe de 16 souris mâles âgées de 16 semai- nes (NZB x NZW)F1, on a injecté la protéase acide par voie intraveineuse à une dose de 10 mg/kg une fois par jour. Com- me témoin, on a administré une protéase acide inactivée. Tou- tes les 4 semaines, on a déterminé le taux de protéine dans l'urine avec un papier d'essai du commerce selon des valeurs ae O à 4. Les résultats sont rapportes sur la figure 4. On a sacrifié 6 souris de chaque groupe à l'âge de 32 semaines pour observer l'infiltration cellulaire dans les glomérules rénaux. On a poursuivi l'administration de la protéase acide aux souris restantes de chaque groupe pour déterminer le taux de survie à l'âge de 50 semaines. Les résultats sont rapportés dans le Tableau 6. L'administration de la protéase acide se traduit par une nette réduction de l'augmentation de la protéine uri- naire, une diminution de l'infiltration cellulaire et une aug- mentation du taux de survie. Ces résultats indiquent que la protéase acide supprime le lupus néphrétique chez les souris. TABLEAU 6 Groupe témoin Groupe traité avec la protéase acide Infiltration Importante infiltra- Légère infiltration cellulaire tion de petits lym- autour de la paroi phocytes et de cel- des vaisseaux lulesDlasmatiaues Taux de survie 20 % 80 S* p Journal of Experimental Pathology 55, 498, 1974), on a injec- té plusieurs fois de la LSP (lipoprotéine de membrane spéci- fique du foie) de foie humain avec un adjuvant complet de Freund à un groupe de 10 lapins pour induire une hépatite active chronique. On a administré la protéase acide' par voie intraveineuse aux lapins, une fois par jour pendant deux se- mnaines. Deux semaines après l'induction de l'hépatite, on a mesuré les activités de la GOT et de la GPT sériques. Comme témoin, on a administré de la protéase acide inactivée. Les résultats sont rapportés dans le Tableau 7. Ia protéase acide supprime l' accroisseirent des activités de la (DT et de GPT sériques d'une manière qui dépend de la dose. TABLEAU 7 Activité de la Activité de la GPT GOT (unité/ml) (unité/ml) Témoin 337,5 + 34,5 395,1 * 40,5 Protéase acide 1 mg/kg 311,5 + 27,4 351,2 + 37,8 3 mg/kg 256,2 + 41,1 301,5 + 29,7 mg/kg 193,3 + 36,3** 245,7 + 31,4 **p '0, 01 Exoérience 10 - Effet suppresseur sur l'arthrite - Selon la méthode de Tsukada et al. (The Ryumachi 16, 255, 1976), on a injecté 4 ml d'un complexe d'albumine sérique de bovin (BSA) - anticorps de lapin anti-BSA, conte- nant 2 mg d'azote - anticorps, dans les rotules bilatérales des lapins (10 animaux par groupe) une fois par jour pendant 6 jours pour induire une arthrite allergique. On a adminis- tré la protéase acide par voie intraaiticulaire une fois par jour à partir du premier jour de l'administration du comple- xe BSA - anticorps anti-BSA. 10 jours aDrès la première ad- ministration du complexe, on a sacrifié les lapins. Les ro- tules ont été fixées avec du formol, colorées avec de l'héna- toxyline-éosine et examinées au microscope. Comme témoin, on a administré une protéase acide inactivée. Les résultats sont rapportés dans le Tableau 8. Dans le groupe témoin, on a observé une hyperpla- sie des cellules synoviales, la formation d'un pannus et une infiltration cellulaire de follicules lymphoides dépourvus du centre germinal. Au contraire, dans le groupe traité, la formation de pannus et l'infiltration cellulaire de follicu- les lympho5des avaient considérablement diminué. TABLEAU 8 Observation pathohistologique Hyperplasie des Formation Infiltration cellules de pannus cellulaire de synoviales follicules ____________________ lymphoides Témoin 10/10 9/10 8/10 Protéase acide 1 mg/kg 10/10 5/10 4/10 3 mg/kg 10/10 4/10* 2/10* mg/kg 10/10 3/l10** 2/10* Exprimées en nombre d'animaux positifs/nombre d'animaux utilisés *p 40,05 **p 0O,01 Expérience 11 - Hydrolyse d'un immuncomplexe humain On a recueilli les sérums de malades atteints d'arthrite rhumatoide, de lupus érythémateux systémique (SLE) et d'hépatite avec des immuncomplexes. On a incubé 1 ml de chacun des sérums avec 10, 30 et 100 pg de la protéase acide à 37 C pendant 60 minutes. Puis on a déterminé le taux d'im- muncomplexe par la réaction hémolytique des hématies de mou- ton en utilisant le complément d'un cobaye et en prenant com- me référence de l'IgG humaine agrégée, selon la méthode de FUst et al. (Atherosclèrosis 29, 181, 1978). De plus, dans les sérums des malades atteints d'arthrite rhumatoide, on a déterminé le facteur rhumatoide (facteur RA) par la réaction d'h6érag9alutination (Test RAHA) selon la méthode d zua e. ai. (The r'vu-machi 12, 330. 1972). Los r-'sultats ont ra.)z.- t6s dans les Tableaux 9 et 10. La protéase acide a diminue le taux dtinrmunccm- plexe dans le sérum de ces malades, en fonction de la dose. La protéase acide a diminué également le taux de facteur R: des malades atteints d'arthrite rhumato5'de. TABLEAU 9 Hydrolyse d'un immuncomplexe humain Maladie Sérum Quantité de protéase Taux d'immun- nu acide ajoutée complexe (jig/ml) (pg/ml> Arthrite rhumatoúde 1 O 75 63 52 4 50 2 0 234 180 151 120 3 O 103 84 63 Lupus érythé- mateux systé- mique 1 O 426 384 203 150 2 0 120 74 56 450 3 0 153 108 63 i00 50 Hépatite 1 O 63 59 À 50 2 0O 72 68 59 52 TABLEAU 10 Effet sur le facteur RA Sérum Quantité de protéase n acide ajoutée (jg/ml) o0 o0 Dilution maximale pour obtenir une réaction positive par RAHA Expérience 12 - Effet sur le développement de cellules cul- tivées du cancer, du sein humain MX-1 et de cellules cultivées de leucémie L1210 de la souris. On a mis respectivement des cellules du cancer du sein humain MX-1 et des cellules leucémiques L1210 de la sou- ris en suspension à une concentration en cellules de 10 /ml dans un milieu de Eagle contenant 10 % de sérum bovin et les substances d'essai. On a cultivé les cellules à 37 C sous C02 à 5 % pendant 48 heures. Puis, on a compté le nombre de cellules viables après coloration avec du Bleu Tripan. On a calculé le taux d'inhibition du développement selon l'téqua- tion suivante; les résultats sont rapportés dans le Tableau 11. Taux d'inhibition du = ( 1 - développement Nombre de cellules viables dans le groupe traité Nombre de cellules viables dans le témoin x 100 TABLEAU 1 1 Concentration ajoutée Taux d'inhibition du (pg/ml) développement (%) NS-1 L1210 Protéase acide 30 15 8 33 21 300 55 30 Mitomycine C 100 47 62 La protéase acide a inhibé le développement des cellules tumorales, même à une faible concentration. Expérience 13 - Effet sur une souris nue porteuse de cellu- les de cancer du sein humain MX-1 On a transplanté un fragment de 2 mm2 de cancer du sein humain EX-1 par voie sous-cutanée chez un groupe de 5 souris nues (BALB/C, nu/nu). Deux semaines après la trans- plantation, on a injecté la protéase acide par voie intravei- neuse deux fois par jour pendant 18 jours. On a pesé la tu- meur 32 jours après la transplantation de la tumeur. Les ré- sultats sont rapportés dans le Tableau 12. TABLEAU 12 Dose Poids de la tumeur (mg/kg) (g) Témoin 1,32 0,09 Protéase acide 0,3 0,79 * 0,2* 3,0 0,65 0,15* * P La protéase acide a montré un effet anti-tumeur significatif. ExDérience 14 - Effet sur des souris porteuses de cellules leucémiques P388 On a transplanté 10 cellules leucémiques P388, par voie intrapéritonéale, à un groupe de 5 souris mâles BDF1o On a injecté la protéase acide aux souris par voie 2499A09 intraveineuse, deux fois par jour le lendemain de la trans- plantation ci-dessus jusqu'à la mort des animaux. On a cal- culé la durée de vie moyenne et on l'a exprimée sous forme du pourcentage de changement par rapport au témoin. Les réa sultats sont rapportés dans le Tableau 13. Nombre moyen de jours de survie -du groupe traité Dur6e de vie moyenne ( 1TABLEAU 13 TABLEAU 13 - Dose Dur6e de vie (mg/kg) moyenne (5) T6moin 100 5 Protéase acide 0,3 110 + 5 1,0 121 + 9 3,0 123 + 9* Mitomycine C 0,5 136 + 17 * P 40,05 La protéase acide a nettement augmenté la durée de vie moyenne. ExDérience 15 - Toxicité aiguë Par voie intraveineuse ou intrapéritonéaie, on a administré la protéase acide dissoute dans une solution sa- line physiologique à un groupe de 10 souris mâles ddY pesant 1 g à une dose de 2g/kg. Pendant une semaine, on a main- tenu les souris en observation quotidienne quant à tout symp- tome toxicologique0 Pendant cette période on n'a observé au- cun signe de toxicité. Comme décrit dans les expériences pr6cédentes, la protéase acide qui constitue l'ingr6dient actif de l'agent pharmaceutique de l'invention, supprime la production d'an- ticorps de type IgE et montre un net effet thérapeutique sur l'asthme bronchique. De plus, elle supprime nettement l'appa- rition et le développement de plusieurs maladies qu'on pense être induites par des inmuncomplexes, par exemple la thyroi- dite et la néphrite. La protéase acide montre également un effet anti-tumeur important. La quantité de protéase acide requise pour obte- nir ces effets correspond à une gamme suffisamment sure, se- lon les résultats de l'étude de toxicité aiguë. Etant donné que la protéase acide est une protéine d'origine humaine, on peut supposer que la probabilité qu'elle puisse induire des réactions nocives graves, telles qu'un choc anaphylactique dé à son caractère antigénique, reste extrêmement faible. Elle peut donc constituer un agent thérapeutique très utile contre les troubles allergiques tels que l'asthme bronchique$ l'urticaire, le rhume des foins, la dermatite de contact, l'allergie alimentaire, l'allergie médicamenteuses la rhinite allergique, la pneumonie par hypersensibilité, différentes maladies avec immuncomplexes telles que le lupus érythémateux systémique, la glomérulose avec immuncomplexe, la périarté- rite noueuse, l'arthrite rhumatoide, l'hépatite avec immun- complexe, la thyroidite, la maladie du sérum, la myasthénie grave, diverses tumeurs telles que le cancer de l'estomac, le cancer du poumon, le cancer du foie, le cancer du colon, le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer utérin, le cancer de la vessie, la leucémie, le cancer de l'oesopha- ge, les lymphomes. Bien que l'agent de l'invention soit généralement préparé sous la forme d'une solution pour injection intra- veineuse, sous-cutanée, intramusculaire ou intra-articulai- re, il peut être utilisé sous la forme d'un agent pour voie orale, d'un agent à inhaler ou d'un suppositoire rectal. Bien que la dose journalière de la protéase acide pour un adulte soit de l'ordre de 1 à 1 000 mg, de préférence de 50 à 500 mg, cette dose peut être augmentée ou diminuée de façon appro- priée selon le symptSme et le mode d'administration. Des préparations pour injection peuvent compren- dre des préparations lyophilisées qui sont dissoutes immé- diatement avant l'administration, ainsi que des préparations liquides. Des préparations orales peuvent comprendre des gé- lules, des comprimés, des granules et des poudres ainsi que des préparations orales liquides. Des agents à inhaler peu- vent comprendre une préparation lyophilisée. Pour une admi- nistration rectale, la forme de suppositoire convient par- faitement. La protéase acide de l'invention peut être formu- lée sous forme d'agents par l'un quelconque des procédés classiques, avec des véhicules ou des excipients pharmaceu- tiquement acceptables. Comme exemple de véhicules et d'exci- pients solides avantageusement utilisables ici, on citera des excipients communs tels que le lactose, le mannitol, l'amidon de mals et l'amidon de pomme de terre, des liants tels que la cellulose cristalline, des dérivés cellulosiques, la gom- me arabique, l'amidon de mals et la gélatine; des agents de désintégration tels que l'amidon de mais, l'amidon de pomme de terre et le carbohydroxyméthylcellulose calcique; et des lubrifiants tels que le talc et le stéarate de magnésium. Com- me exemples de véhicules liquides avantageusement utilisables ici, on citera l'eau distillée pour injection, une solution saline physiologique, des huiles végétales pour injection et des glycols tels que le propylène glycol et le polyéthylène glycol. On donnera ci-après des formulations typiques de l'agent de l'invention. Formulation 1 On dissout 100 mg de la protéase acide dans 10 ml d'une solution saline physiologique. On stérilise cette solu- tion par-filtration sur un filtre à membrane. On introduit 1 ml du filtrat dans un récipient en verre stérilisé au préa- lable et on lyophilise. On scelle le récipient pour obtenir des préparations pulvérulentes lyophilisées. Formulation 2 On pèse 100 g de protéase acide lyophilisée, 97 g de lactose et 3 g destearate de magnésium et on mélange pour obtenir un produit homogène. On introduit 200 mg du mélange résultant dans une gélule de gélatine n02 et on enduit la gé- lule avec un revêtement entérique pour obtenir une gélule en- térique. - REVENDICATIONS - 1.- Agent thérapeutique contre les troubles all2z4-99409 gigues, les maladies avec immuncomplexe et les tumeurs, caractérisé en ce qu'il contient une protéase acide urinaire humaine en tant qu'ingrédient actif. 2.- Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase acide possède les propriétés sui- vantes: a) un poids moléculaire dans la gamme de 32000 à 3800 tel que déterminé par chromatographie sur gel sur IO Sephadex G-100 (marque déposée), b) un point isoélectrique dans la gamme de pHl à pH3 déterminé par mesure du point isoélectrique sur Ampholine (marque déposée, c) un maximum d'absorption à 178 nm, I5 d) une excellente activité hydrolytique dans une gamme acide à valeur de pH inférieure à 7, lorsque de l'hémoglobine est utilisée comme substrat, e) une réactivité positive à la ninhydrine, f) elle est soluble dans l'eau et insoluble dans l'éther et le chloroforme, g) elle est inhibée par la pepstatine, et h) elle est stable en milieu acide à une valeur de pH inférieure à 7, et instable en milieu alcalin à une valeur de pH supérieure à 8. 3.- Agent selon la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce qu'il contient l'ingrédient actifavecdes véhi- cules et/ou des excipients. 4.- Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est utilisé sous la forme- d'une solution pour injection. 5.- Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est utilisé sous la forme d'une préparation orale. 6.- Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est utilisé sous la forme d'un suppositoire pour administration rectale. 7.- Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé-en ce qu'il est utilisé sous la forme d'une préparation à inhaler.