Brevet FR2503183A1 — publié le 19821008

La présente invention concerne un procédé et un ensemble de production de matières biologiques, du type formé par des cellules. Les progrès en biologie cellulaire ont montré que des cellules de divers organismes supérieurs produi- sent de petites quantités de substances ayant une utilité potentielle ou démontrable notable dans le traitement ou le diagnostic des maladies. Des exemples de telles substan- ces abondent dans la littérature et comprennent notamment divers agents modificateurs de réponse biologique, tels que des hormones, des interférons et des lymphokines, ainsi que d'autres substances telles que des anticorps utilisées dans les essais de diagnostic. Les cultures cellulaires d'origine microbienne ont été utilisées depuis longtemps pour la fabrication de grandes quantités d'antibiotiques. Il existe un risque toujours présent de contami- nation bactérienne ou autre, notamment dans les cultures cellulaires dérivées des animaux supérieurs. En outre, dans la plupart des cas, les quantités de substances in- téressantes produites par les cultures de cellules sont très faibles et se rassemblent dans le milieu de culture qui contient un mélange complexe de protéines du sérum et d'autres substances. L'isolement et la purification de la substance intéressante sont alors difficiles. L'invention concerne un ensemble et un procédé de production de substances créées par des cellules vivan- tes. La mise en oeuvre de l'invention présente le double avantage d'assurer une protection des cellules de la cul- ture et de permettre la collecte des substances intéres- santes dans un milieu ayant un nombre réduit d'ingrédients étrangers mélangés. L'invention peut être utilisée pour la séparation de la substance intéressante des protéines du sérum ayant un poids moléculaire plus élevé et des ma- tières analogues, normalement nécessaire à l'entretien de la viabilité permanente et du métabolisme des cellules productrices. L'invention peut aussi être utilisée pour la collecte de la substance intéressante dans un milieu contenant des quantités relativement faibles d'ingrédients nutritifs de faible poids moléculaire ou de produits mé- taboliques des cellules. Le procédé selon l'invention comprend l'encapsu- lation de cellules dans une membrane qui est perméable aux ingrédients nutritifs, aux ions et à d'autres matières de poids moléculaire relativement faible, nécessaires au métabolisme normal et à la viabilité permanente des cellules. La membrane peut être perméable ou non à la substance in- téressante sécrétée par les cellules mais, dans tous les cas, elle a une limite supérieure de perméabilité suffi- samment élevée pour que les molécules ayant un poids molé- culaire de valeur choisie, en général inférieur à 2,0.105 daltons environ, puissent la traverser. Les capsules ainsi formées sont mises en suspension dans un milieu aqueux classique de culture et les cellules encapsulées peuvent alors subir un métabolisme normal in vitro. Les substances de poids moléculaire inférieur à la limite supérieure de perméabilité de la membrane et qui sont sécrétées par les cellules, traversent la membrane et se rassemblent dans le milieu de culture. Les substances de poids moléculaire élevé telles que les protéines du sérum qui sont nécessai- res pour la santé et la viabilité de nombreux types de culture de cellules d'animaux supérieurs mais qui ne sont pas elles-mêmes consommées en général, peuvent être avan- tageusement incorporées aux microcapsules dans lesquelles elles sont confinées et elles ne peuvent pas diffuser dans le milieu de culture. Des substances que consomme la cul- ture cellulaire pendant le métabolisme et ayant un poids moléculaire suffisamment faible pour qu'elles puissent diffuser à travers les membranes des capsules, traversent ces membranes à partir du milieu de culture. Les produits métaboliques des cellules dont la dimension moléculaire est suffisamment faible pour qu'ils puissent traverser la membrane diffusent dans le milieu externe aux capsules. Les substances intéressantes, lorsque leur poids moléculaire est inférieur à la limite supérieure de perméabilité, diffu- sent dans le milieu externe aux capsules et dans lequel elles peuvent être récoltées d'une manière relativement facile étant donné l'absence de matières contaminantes de poids moléculaire élevé, présentes dans les cultures cel- lulaires classiques sans encapsulation. Si la substance intéressante a un poids moléculaire supérieur à la limite supérieure de perméabilité des membranes, elle est collec- tée dans les capsules qui peuvent ensuite être isolées du milieu de culture et fracturées afin qu'elles permettent une extraction. L'invention ne présente pas de limite pratique- ment en ce qui concerne les types de cellules qui peuvent être placées dans le volume interne délimité par les mem- branes des capsules. Par exemple, les cultures cellulaires peuvent être celles de tissus de tous les animaux supé- rieurs ainsi que de microorganismes. Des cellules conden- sées, par exemple des cellules d'hybridomes ou des cellu- les modifiées génétiquement produites par exemple par la technologie de l'acide désoxyribonucléique recombinant qui apparait, peuvent de manière analogue être encapsulées sans difficulté. En résumé, pourvu qu'il existe un milieu de culture capable d'entretenir le type considéré de cellu- les in vitro, ce type de cellule peut être utilisé pour la mise en oeuvre des techniques décrites dans le présent mémoire. Des exemples non limitatifs de ce type de sub- stances qui peuvent être produites par mise en oeuvre du procédé et de l'ensemble selon l'invention sont l'insuline, le glycogène, la prolactine, la somatostatine, la thyroxine, les hormones stéroldales, les hormones pituitaires, les interférons, les hormones de stimulation des follicules, les hormones parathyroidiennes et les anticorps. L'ensemble selon l'invention comporte des cellules viables encapsulées et en suspension dans un milieu aqueux de culture. Les cellules encapsulées ont des membranes caractérisées par une limite supérieure de perméabilité suffisante pour que les matières nutritives nécessaires au métabolisme des cellules et à leur viabilité permanente puissent les traverser. Les membranes entourent des cellu- les viables placées dans un milieu qui contient tous les constituants nécessaires à l'entretien du métabolisme des cellules et dont la dimension est supérieure à la limite supérieure de perméabilité de la membrane. Le milieu de culture comprend des constituants nécessaires au maintien de la viabilité des cellules et ayant un poids moléculaire inférieur à la limite supérieure de perméabilité des mem- branes. Ainsi, l'invention concerne un ensemble et un procédé de production de matériaux biologiques du type formé par des cellules. Elle concerne aussi un tel ensemble dans lequel les cellules productrices sont contenues dans un micro-milieu protecteur salubre confiné par une membrane semi-perméable destinée à séparer les produits du métabo- lisme des cellules des matières de poids moléculaire élevé nécessaires à la fiabilité et à l'entretien des cellules. Elle concerne aussi un procédé de production de matériaux biologiquement actifs à partir de culture de cellules. Elle concerne aussi la production d'anticorps et d'agents modificateurs du comportement biologique tels que les hor- mones, les interférons et les lymphokines dans un milieu dépourvu de sérum. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion ressortiront mieux de la description qui va suivre, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels: la figure 1 est un schéma utile pour la compré- hension de la mise en oeuvre de l'invention; la figure 2 est un graphique représentant les ré- sultats de l'expérience de l'exemple 5. L'invention concerne de façon générale la dispo- sition d'une membrane semi-perméable autour de celles indi- viduelles ou de groupes de cellules afin qu'un micro-milieu contenant le milieu de culture des cellules soit délimité et séparé par la membrane, par rapport à un milieu aqueux externe. Les cellules d'origine mammifère nécessitent ha- bituellement, pour être saines et viables, la présence de protéines du sérum dont une partie a un poids moléculaire supérieur à environ 65 000-150 000 daltons. Dans la techni- que connue de culture de cellules non encapsulées, des matières intéressantes secrétées par les cellules sont dispersées dans le milieu de culture et se mélangent avec les ingrédients de poids moléculaire élevé et faible à la fois. Comme les quantités de produits formés par les cellules sont habituellement très faibles, l'isolement de la substance intéressante constitue une tâche très ardue de purification. En outre, les cultures de cellules de mammifères sont bien connues comme étant sensibles à la contamination par les bactéries et d'autres sources. Il faut donc que la culture soit mise en oeuvre à l'aide de diverses techniques entretenant la stérilité, et des anti- biotiques doivent souvent être incorporés au milieu. Selon l'invention, les difficultés précédentes sont supprimées par encapsulation des cellules de la cul- ture dans des membranes semi-perméables ayant une limite choisie de perméabilité qui en général ne dépasse pas 200 000 daltons environ, c'està-dire que la membrane contient des pores qui permettent aux substances dont le poids molé- culaire maximal est égal ou inférieur à la limite supérieure de perméabilité, de traverser la membrane alors que les substances dont le poids moléculaire est supérieur à la limite supérieure de perméabilité ne peuvent pas traverser la membrane. De cette manière, les cellules peuvent être encapsulées avec un milieu de culture contenant tous les ingrédients nécessaires à la viabilité permanente, au mé- tabolisme et même à la caryocinèse, et les cellules ainsi encapsulées peuvent être mises en suspension dans un milieu de culture qui contient des substances de poids moléculai- re relativement faible, consommées par les cellules mais qui n'a pas à contenir les substances nécessaires de poids moléculaire élevé. Par exemple, les cellules d'organismes supérieurs n'ingèrent pas les protéines du sérum ayant un poids molécu- laire élevé et analogue mais nécessitent au contraire qu'elles soient très proches afin qu'elles présentent des réponses biologiques normales de façon permanente. Des sels, des aminoacides et d'autres facteurs de faible poids moléculaire qui sont ingérés ou métabolisés par les cellu- les traversent librement la membrane et peuvent être renou- velés le cas échéant par simple changement du milieu de culture qui se trouve à l'extérieur des cellules. Les pro- duits sécrétés par le métabolisme des cellules et ayant un poids moléculaire inférieur à la limite supérieure de la perméabilité des membranes, se rassemblent dans le milieu externe aux capsules si bien que, comme le milieu ne contient pas de matière de poids moléculaire élevé, la récolte et l'isolement des produits intéressants du métabolisme sont simplifiés. La récolte des produits intéressants dont le poids moléculaire dépasse la limite supérieure de perméa- bilité est aussi facilitée par ces produits se rassemblent dans les capsules et ne sont pas dispersés dans le volume extérieur aux capsules. La figure 1 illustre schématiquement le principe de l'invention, appliqué à des produits cellulaires de faible poids moléculaire. Sur la figure 1, les triangles noirs représentent la substance intéressante produite par la cellule. Les cercles et les carrés blancs représentent des substances de faible poids moléculaire, ingérées par la cellule. Les cercles et carrés blancs barrés représen- tent des produits externes du métabolisme. Comme repré- senté, une cellule 10 est placée dans une membrane 12 d'une capsule ayant des pores 16. Des facteurs 18 de poids molé- culaire élevé sont entourés par la membrane 12 et sont libres de circuler à l'intérieur de celle-ci dans le milieu 14. Les ingrédients 20 dont la cellule a besoin ainsi que les produits 22 du métabolisme, y compris la substance intéressante 22', circulent librement dans le milieu interne aux capsules et dans le milieu externe à celles-ci et tra- versent la membrane par les pores 16. Le milieu exterr.e aux capsules, avec tous ces ingrédients, peut être séparé périodiquement ou de façon continue, par aspiration ou j analogue des capsules elles-mêmes et remplacé par un mi- lieu neuf. Le milieu collecté est pratiquement dépourvu d'ingrédients 18 de poids moléculaire élevé si bien que la récolte et l'isolement sont simplifiées. En outre, la cellule 10 reste protégée dans le micro-milieu interne aux capsules, à tout moment. Dans certains cas, par exemple lorsque la produc- tion d'une substance intéressante particulière par les cellules encapsulées doit être stimulée, il faut que les cellules soient soumises à l'action d'ingrédients de poids moléculaire élevé, ayant des dimensions moléculaires trop grandes pour qu'ils puissent traverser la membrane. Un exemple en est la production d'interféron par les fibro- blastes humains, les leutocytes ou les cellules lympho- blastoldes qu'un traitement par certains virus ou par des bacilles nucléiques de poids moléculaire élevé induit à secréter un interféron. Dans ce cas, si la limite supé- rieure de perméabilité des membranes est inférieure au poids moléculaire du facteur inducteur, les cellules doivent être soumises à une induction de l'interféron avant l'en- capsulation, ou les membranes des capsules, après la cul- ture des cellules doivent être sélectivement fracturées afin que ces matières de poids moléculaire élevé puissent être ingérées par la cellule. Le procédé de l'invention repose sur la possibili- té de la formation de membranes semi-perméables autour de cellules sans que leur viabilité permanente en soit simultanément perturbée. Un procédé convenable d'encapsu- lation est décrit en détail dans la suite du présent mémoire. On considère plus précisément l'encapsulation des cellules. Le tissu ou les cellules à encapsuler sont mis en suspension dans un milieu aqueux convenant à l'en- tretien ou au maintien des processus métaboliques permanents du type de tissus ou de cellules particuliers considérés. Des milieux convenant à cet effet sont disponibles dans le commerce. Le diamètre moyen de la matière à encapsuler peut beaucoup varier, entre quelques microns et plusieurs millimètres. Cependant, on obtient les meilleurs résultats avec des capsules dont la dimension est comprise entre 300 et 1000 um. Les ilots de Langerhans des mammifères ont habituellement un diamètre de 50 à 200 gm. Les cellu- les individuelles telles que des fibroblastes, des leuco- cytes, des lymphoblastoides, des cellules béta du pancréas, des cellules alpha, des cellules delta, divers rapports de ces cellules ou d'autres unités tissulaires peuvent être encapsulés le cas échéant. En outre, des microorganis- mes peuvent être encapsulés, notamment ceux qui ont subi une modification génétique par l'acide désoxyribonucléique recombinant ou par d'autres techniques. La viabilité permanente d'une telle matière vi- vante dépend entre autres choses de la disponibilité des matières nutritives nécessaires, du transfert d'oxygène, de l'absence de substance toxique dans le milieu, et du pH de celui-ci. Jusqu'à présent, on n'a pas su maintenir cette matière vivante dans un milieu compatible physiolo- giquement avec encapsulage simultané. Le problème qui s'est posé est que les conditions nécessaires à la formation des membranes sont léthales ou nuisibles aux tissus et il n'existait pas jusqu'à présent de procédé de formation de membranes permettant aux tissus de survivre sous une forme saine. Cependant, on a constaté selon l'invention que certaines substances hydrosolubles, compatibles physiologi- quement avec les tissus vivants et qui peuvent être rendues insolubles dans l'eau avec formation d'une masse cohérente et gardent sa forme, pouvaient être utilisées pour la formation d'une "capsule temporaire" ou d'une couche pro- tectrice autour des cellules individuelles ou des groupes de cellules, et que cette capsule temporaire pouvait être traitée afin qu'une membrane semi-perméable plus permanente se dépose autour des cellules sans détérioration de celles- ci. Une telle substance est ajoutée par exemple à une con- centration de l'ordre de quelques pourcents en poids, au milieu de culture des tissus, contenant aussi des cellules de la culture, des ingrédients du sérum (le cas échéant) et éventuellement un substrat cellulaire tel que du col- lagène ou une autre matière dispersable dans l'eau et ayant un poids moléculaire élevé agissant comme substrat de fixation. Lors de l'utilisation de collagène, la con- centration doit être comprise entre environ 10 gg/cm3 et 1 mg/cm3 mais elle est de préférence de l'ordre de 100 à 500 gg/cm3 La solution est alors mise sous forme de gout- telettes contenant le tissu avec son milieu, et elle est rendue immédiatement insoluble dans l'eau et gélifiée, au moins dans une couche superficielle. Ensuite, les cap- sules temporaires qui conservent leur forme reçoivent une membrane plus permanente qui peut elle-même être ultérieu- rement fracturée sélectivement lorsque le tissu doit être- libéré sans détérioration. Lorsque la matière utilisée pour la formation des capsules temporaires le permet, l'in- térieur de la capsule peut être remis à l'état liquide après formation de la membrane permanente. L'opération est réalisée par rétablissement dans le milieu des condi- tions dans lesquelles la matière est soluble. La matière utilisée pour la formation des capsules temporaires peut être toute matière hydrosoluble et non toxique qui, lors d'un changement de concentration ou de milieu ionique, peut se transformer en une masse qui conserve sa forme. La matière doit aussi contenir plusieurs motifs anioniques qui s'ionisent facilement, par exemple des groupes carboxyle, capables de réagir par formation d'un sel avec des polymères contenant plusieurs groupes cationiques.Comme décrit dans la suite du présent mémoire, l'utilisation de ce type de matière permet le dépôt d'une membrane permanente ayant une limite supérieure choisie de perméabilité, sans difficulté, dans les couches super- ficielles de la capsule temporaire. Les matières sans doute les plus avantageuses pour la formation de la capsule temporaire sont des gommes naturelles ou synthétiques de polysaccharide, qui sont acides et hydrosolubles. De telles matières sont disponi- bles dans le commerce. On les extrait habituellement des matières végétales et on les utilise souvent commue addi- tifs de divers aliments. L'alginate de sodium est la GOn- me hydrosoluble sans doute la plus avantageuse. On peut utiliser un alginate dont la plage de poids moléculaires dépasse 150 000 daltons mais, étant donné ses dimensions moléculaires et sa viscosité, il ne peut pas habituellement traverser les membranes des capsules formées finalement. Un alginate de plus faible poids moléculaire, par exemple compris entre 5-0 000 et 80 000 daltons, est plus facile- ment extrait du volume interne des capsules par diffusion à travers une membrane de porosité convenable, et il est donc préférable. D'autres gommes qui peuvent être utilisées comprennent des fractions acides de la gomme guar, de la caraghenine, de la pectine, de la gomme adraganthe et de la gomme de xanthane. Ces matières comprennent des chaînes saccharide à liaison glycoside. Ces groupes acides libres sont souvent présents, sous forme d'un ion d'un métal alcalin, par exem- ple sodium. Si un ion multivalent tel que du calcium ou de l'aluminium remplace l'ion alcalin, les molécules de polysaccharide hydrosoluble sont "réticulées" et forment un gel insoluble dans l'eau et conservant sa forme, qui peut être remis en solution par retrait des ions par échange d'ions ou à l'aide d'un agent séquestrant. Bien que tout ion multivalent capable de former un sel avec la gomme acide convienne pratiquement, il est avantageux que les ions utilisés soient compatibles physiologiquement, par exemple des ions calcium. De cette manière, le tissu tend à être conservé à l'état vivant. D'autres cations multiva- lents peuvent aussi être utilisés. Les ions magnésium ne permettent pas une gélification efficace de l'alginate de sodium. Un exemple de composition en solution contient des volumes égaux d'une culture de cellules dans son milieu, et une solution à 1 ou 2 % de gomme dans du sérum phvsiolo- gique (soluté physiologique). Lors de l'utilisation d'al- ginate de sodium, une solution à 1,2-1,6 % a été utilisée avec succès. Si les cellules à encapsuler sont du type qui nécessite la fixation à un substrat pour présenter une caryocinèse, et si les cellules doivent croître à l'in- térieur des capsules, du collagène ou un polypeptide ou une protéine dispersable dans l'eau, de poids moléculaire élevé d'un autre type, naturel ou synthétique, peut être incorporé dans la culture des cellules et est délimité à l'intérieur du volume des capsules formées finalement. Si un polymère possédant plusieurs groupes cationiques, par exemple de la polylysine, est utilisé à cet effet, les groupes cationiques réagissent avec des types anioni- ques présents sur la gomme hydrosoluble et forment un liant pratiquement insoluble dans l'eau, imbriqué dans la gomme. Les concentrations avantageuses pour ces matières sont de l'ordre de 100 à 500 gg/cm3 de solution (y compris la solution de gomme). Dans la dernière étape de l'opération d'encapsu- lation, la solution de gomme contenant le tissu est mise sous forme de gouttelettes de dimension voulue. Ensuite, les gouttelettes sont gélifiées immédiatement en masse capable de retenir leur forme, ayant de préférence mais non obligatoirement, une configuration sphéroldale ou sphé- rique. La formation des gouttes peut être réalisée par: différents procédés. L'un d'entre eux, donné à titre pure- ment illustratif, est le suivant. Un tube qui contient une solution aqueuse de - cations multivalents ou plurivalents, par exemple une solu- tion à 1,5 % de CaCl2, est monté sur un bouchon qui porte un appareil de formation de gouttes. Cet appareil comprend un bottier ayant une buse supérieure d'entrée d'air et un corps creux et allongé emmanché par friction dans le bouchon. Une seringue de 10 cm, associée à une pompe pas à pas, est montée sur le boîtier avec par exemple une ai- guille de 0,25 mm de diamètre interne, revêtue de "Teflon", disposée dans toute la longueur du boîtier. L'intérieur de ce dernier est réalisé de manière que le bout de l'ai- guille soit soumis à un courant laminaire constant d'air jouant le rôle d'un rideau d'air. Lors de l'utilisation, lorsque la seringue est pleine de solution contenant la matière à encapsuler, la pompe pas à pas est commandée afin qu'elle chasse progressivement des gouttelettes de solution hors du bout de l'aiguille. Chaque goutte est "arrachée" par le courant d'air et tombe sur environ 2,5 cm dans la solution de CaCl2 dans laquelle elle se gélifie immédiatement par absorption d'ions calcium. La distance comprise entre le bout de l'aiguille et la sur- face de la solution de CaCl2 est suffisamment grande, dans ce cas, pour que la suspension d'alginate de sodium et des cellules prenne la configuration la plus favorable au point de vue physique, c'est-à-dire celle d'une sphère (volume maximal pour une surface minimale). L'air qui se trouve dans le tube s'échappe par un orifice du bouchon. En conséquence, le gel présente une "réticulation" et une capsule protectrice temporaire de viscosité élevée et capable de conserver sa configuration, contenant le tissu en suspension et son milieu, se forme en conséquence. Les capsules se rassemblent dans la solution sous forme d'une phase séparée et peuvent être extraites par aspi- ration. Dans l'étape suivante du procédé, une membrane semi-perméable est déposée autour de la surface des capsu- les temporaires par "réticulation" des couches superficiel- les. L'opération peut être réalisée par traitement des capsules temporaires gélifiées par une solution aqueuse d'un polymère contenant des groupes cationiques aptes à réagir avec des fonctions anioniques incorporées aux molé- cules de gel. Des polymères contenant des groupes réactifs acides, par exemple des groupes imine ou amine libres, sont avantageux. Dans ce cas, la gomme de polysaccharide est réticulée par interaction (par formation de liaisons salines) entre les groupes carboxyle et les groupes amine ou imine. La perméabilité peut être réglée entre des limites voulues par sélection du poids moléculaire du polymère utilisé pour la réticulation et par réglage de la con- centration de la solution de polymère et de la durée d'ex- position. Une solution de polymère de faible poids molé- culaire pénètre plus dans les capsules temporaires qu'un polymère de poids moléculaire élevé, en un temps déter- miné. Le degré de pénétration du polymère de réticulation est relié à la perméabilité résultante. En général, plus le poids moléculaire est élevé et plus la pénétration est faible, et plus la dimension des pores est grande. Les polymères ayant de façon générale un poids moléculaire compris entre 3000 et 100 000 daltons ou plus peuvent être utilisés suivant la durée de la réaction, la concentration de la solution de polymère et le degré voulu de perméabili- té. Un jeu satisfaisant de conditions réactionnelles lors de l'utilisation de polylysine dont le poids moléculaire moyen est de 35 000 daltons environ, comprend une durée réactionnelle de 2 min, sous agitation, dans une solution de sérum physiologique contenant 0,0167 % de polylysine. Il se forme alors des membranes dont la limite supérieure de perméabilité est de 100 000 daltons environ. On peut facilement déterminer empiriquement les conditions réac- tionnelles optimales convenant au réglage de la perméabi- lité dans un système donné, compte tenu des directives qui précèdent. La mise en oeuvre de cette méthode permet l'établissement de la limite supérieure de perméabilité des membranes à une valeur choisie, inférieure à 000 daltons environ. Des exemples de polymères convenables de réticula- tion sont des protéines et des polypeptides, naturels ou synthétiques, ayant des groupes amino ou imino libres, des polyéthylèneamines, des polyéthylèneimines et des poly- vinylamines. La polylysine, à la fois sous ses formes D et L, a été utilisée avec succès. Des protéines telles que la polyargénine, la polycitrulline et la polyornithine conviennent aussi. Des polymères ayant une densité de charg% positives plus importante, par exemple la polyvinylamine, adhèrent fortement aux groupes anioniques des molécules de gel et forment des membranes stables, mais celles-ci se fracturent alors difficilement. * Le traitement par une solution diluée de gomme provoque la fixation de groupes amino libres aux surfaces des capsules car ces groupes pourraient donner aux capsu- les une tendance à l'agglomération. A ce moment de l'encapsulation, les capsules peuvent être collectées sous forme qui comprend une membrane semi-perméable entourant une solution gélifiée de gomme, un milieu de culture compatible avec le type des cellules, des cellules et éventuellement un liant interne de colla- gène ou d'un autre substrat de fixation. Comme le trans- fert massique doit être favorisé à l'intérieur des capsules et à travers les membranes, il est avantageux que le gel soit remis à l'état liquide sous sa forme hydrosoluble. L'opération peut être réalisée par rétablissement des con- ditions dans lesquelles la gomme est liquide, par exemple par enlèvement des cations calcium ou multifonctionnels autres du gel intérieur. Le milieu qui se trouve dans la capsule peut être simplement redissous par immersion des capsules dans une solution saline tamponnée par un phos- phate, contenant des ions de métaux alcalins et des ions hydrogène. Les ions monovalents remplacent les ions cal- cium ou multifonctionnels autres à l'intérieur de la gomme lorsque les capsules sont immergées dans la solution, sous agitation. On peut utiliser des solutions de citrate de sodium dans le même but, afin qu'elles permettent la sé- questration des ions bivalents. Des cultures de cellules encapsulées comme décrit précédemment peuvent être mises en suspension dans un milieu de culture réalisé spécifiquement afin qu'il corresponde à tous les critères nécessaires au type particulier de cellule considéré, et ces cultures continuent à présenter un métabolisme normal in vitro. Si la culture necessite un milieu contenant des ingrédients de poids moléculaire élevé tels que des constituants du sérum, ceux-ci peuvent être supprimés du milieu externe aux capsules. Par exem- ple, les constituants normalement ingérés par les cellu- les ont un poids moléculaire relativement faible et dif- fusent facilement à travers les membranes, dans le micro- milieu des cellules dans lequel ils pénètrent dans la membrane des cellules. Les produits du métabolisme des cellules qui sont secrétées dans le milieu interne aux capsules, lorsqu'ils ont un poids moléculaire inférieur à la limite supérieure de perméabilité de la membrane des capsules, diffusent de manière analogue à travers ces mem- branes et se rassemblent dans le milieu extérieur aux cap- sules. Les cellules encapsulées peuvent être cultivées dans des conditions par exemple de température, de pH et de milieu ionique, qui sont identiques à celles des cul- tures classiques. En outre, les produits formés par les cellules peuvent être récoltés dans le milieu extérieur aux capsules ou dans les capsules, par mise en oeuvre des techniques classiques. Cependant, la technique de cul- ture selon l'invention présente les avantages suivants: 1. Les cellules de la culture sont protégées contre les forces de cisaillement et la détérioration mé- canique ainsi que contre la contamination par des facteurs ayant des dimensions supérieures à la limite supérieure de perméabilité des membranes. Cela signifie que les cri- tères de manipulation et de stérilité normalement imposés par les procédures de culture peuvent être moins astreignants dans une certaine mesure puisque les microorganismes ne peuvent pas atteindre les cellules encapsulées et les cel- lules infestées par les virus n'ont pas à contaminer d'au- tres cellules. 2. Les capsules immobilisent en fait les cellules dans un milieu dans lequel les matières de poids molécu- laire élevé sont confinées, alors que les matières nutri- tives des cellules et les produits des cellules, ayant un poids moléculaire plus faible, peuvent être facilement introduits ou retirés. De cette manière, le bouillon nutritif peut être récolté et renouvelé le cas échéant par inter- mittence ou de façon continue, sans perturbation des cel- lules. 3. Des substances intéressantes produites par les cellules peuvent être facilement extraites. Des pro- duits cellulaires secrétés avec des dimensions molécu- laires suffisamment faibles pour qu'ils traversent les membranes des capsules se rassemblent dans le milieu ex- térieur aux capsules, sous forme d'un mélange avec les matières nutritives. Cependant, des ingrédients du sérum qui ont un poids moléculaire élevé et les substances ana- logues ne sont pas libérés dans le milieu extérieur aux capsules si bien que la récupération du produit cellulaire intéressant est simplifiée. Les produits cellulaires sé- crétés dont les dimensions moléculaires sont supérieures à la limite supérieure de perméabilité des membranes se rassemblent dans les capsules. Evidemment, les produits cellulaires qui ne sont pas sécrétés à travers la membrane des cellules peuvent aussi être intéressants. Ils peuvent être récupérés sous une forme relativement concentrée par isolement des capsules puis fracture sélective des membranes des capsules, par exemple à l'aide de la technique décrite dans la suite du présent mémoire, et le cas échéant, par fracture des membranes des cellules. 4. Le volume interne aux capsules forme un milieu convenant bien à la division des cellules. On a constaté que les cultures en suspension présentaient une caryocinèse à l'intérieur de la capsule. Les cellules nécessitant une fixation et qui, dans les cultures normales, croissent sous forme d'une monocouche bidimensionnelle, se multiplient en formant un arrangement dans la capsule. De telles cel- lules utilisent les surfaces internes de la membrane comme substrats et/ou se fixent aux matières de poids moléculaire élevé, indiquées précédemment et qui sont disposées dans la capsule. La densité des cellules est donc fortement accrue par rapport aux cultures classiques. La viabilité permanente de ces groupes de cellules est facilitée par le fait que les rapports de la surface au volume des cap- sules peuvent être très élevés et ainsi toutes les cellu- les peuvent avoir accès aux matières nutritives, à l'oxy- gène, etc. qui sont nécessaires. Dans certains cas, il est avantageux que les membranes des capsules soient fracturées sélectivement afin que les cellules soient libérées sans dommage. Un exemple notable est la production de l'interféron. Des cellules capables de produire de l'interféron doivent être soumises à certains virus ou acides nucléiques, lors d'une préparation en vue de l'étape de production de l'interféron. En outre, selon plusieurs opérations d'induction d'interfé- ron, des réactifs sont ajoutés à la culture afin que la synthèse des protéines soit inhibée. Ainsi, l'étape dz croissance du processus de culture doit être mise en oeuvre dans des conditions très différentes de l'étape d'induction d'interféron. Si les substances utilisées pour l'induction d'interféron ont un poids moléculaire supérieur à la limite supérieure de perméabilité des membranes des capsules (comme dans le cas des inductions par des virus), le processus d'induction ne peut pas être réalisé dans la culture de cellules encapsulées. Ainsi, des cellules de production d'interféron, lorsqu'elles croissent dans la capsule, doi- vent être libérées par fracture de la membrane afin qu'elles soient soumises au processus d'induction. On considère maintenant la fracture des membranes. Les cellules confinées dans des membranes du type décrit précédemment peuvent être libérées par une opération met- tant en oeuvre des réactifs disponibles dans le commerce et ayant des propriétés qui ne nuisent pas notablement aux cellules encapsulées. D'abord, les capsules sont sé- parées du milieu de mise en suspension, soigneusement lavées afin que les impuretés présentes à l'extérieur des micro- capsules soient retirées, puis dispersées sous agitation dans une solution mixte de cations plurivalents monoatomi- ques tels que des ions calcium, et d'un polymère d'extrac- tion ayant plusieurs motifs anioniques, par exemple un sel d'un acide polysulfonique ou polyphosphorique. L'hé- parine qui est un polysaccharide sulfoné naturel, est avan- tageuse à cet effet. La densité de charges anioniques portée par le polymère d'extraction utilisé doit être égale à la densité de charges de la matière polyanionique utilisée à l'origine pour la formation des membranes ou supérieure à cette densité. Le poids moléculaire du polymère doit être au moins comparable au poids moléculaire du polymère ayant plusieurs groupes cationiques utilisé pour la for- mation de la membrane, et est de préférence supérieur. Les ions calcium, dans la suspension de capsules formée dans la solution mixte, entrent en compétition avec les chaînes polymères polycationiques utilisées pour la forma- tion de la membrane, pour la fixation sur les sites anioni- ques présents sur la gomme hydrosoluble. Simultanément, l'héparine ou un autre polymère ayant plusieurs motifs anioniques, dissous dans la solution, entre en compétition avec la gomme présente dans la membrane pour la fixation sur les sites cationiques présents sur les chaînes poly- mères. Il se forme ainsi un complexe dispersable dans l'eau ou de préférence hydrosoluble, par exemple de polylysine et d'héparine, avec association des cations monoatomiques avec des molécules du gel. Cette étape permet à la membrane de se dissoudre lorsqu'elle est ensuite exposée à un agent séquestrant qui termine l'opération de fracture par prélèvement d'ions monoatomiques du gel. Des débris des membranes des cap- sules qui restent dans le milieu le cas échéant, peuvent être facilement extraits des cellules. La solution sans doute la plus avantageuse pour la première étape de la fracture sélective, contient du chlorure de calcium à raison de 1,1 % en poids par volume, et 500 à 1500 unités d'héparine par cm3 de solution. Un certain volume de microcapsules est ajouté à cette solution, en quantité suffisante pour qu'il forme 20 à 30 % environ du volume total de la suspension. Le chlorure de calcium et l'héparine sont des substances avantageuses pour la fracture des membranes des capsules contenant des cellu- les car ces deux réactifs sont compatibles physiologique- ment avec la plupart des cellules et réduisent donc au minimum la possibilité de la détérioration des cellules. Des mélanges de sels d'aluminium ou d'autres cations plu- rivalents (mais non des ions-Mg++) peuvent aussi être utilisés avec des sels d'un acide polysulfonique ou polyphosphorique, du type décrit précédemment. Les concentrations des ions monoatomiques et du polymère anionique utilisés dans cette étape peuvent en général beaucoup varier. Les concentrations optimales peuvent être facilement déterminées d'une manière empiri- que et elles dépendent du temps d'exposition ainsi que du polymère particulier utilisé pour la formation des membranes L'agent séquestrant sans doute le plus avantageux pour la fracture sélective est le citrate de sodium bien que d'autres sels formant des citrates de métaux alcalins et des sels d'acides éthylènediaminetétracétiques d'un métal alcalin peuvent aussi être utilisés. Lorsque le sel est le citrate de sodium, la concentration optimale est de l'ordre de 55 mM. Il est avantageux que le citrate ou un autre agent séquestrant soit dissous dans une solution saline isotonique afin que la détérioration des cellules soit minimale. On considère maintenant des exemples de mise en oeuvre de l'invention donnés à titre purement illustra- tif et non limitatif. EXEMPLE 1: Production d'insuline On prélève des ilots de Langerhans sur un pancréas d'un cadavre humain ou d'animal et on les ajoute à une culture complète de tissu ("CMRL-1969" de Connaught Labora- tories, Toronto, Canada) à une concentration d'environ 3 3 ilots par cm. La culture de tissu contient toutes les matières nutritives nécessaires à une viabilité permanente des ilots ainsi que les aminoacides utilisés par les cellules béta pour la fabrication d'insuline. On ajoute alors 0,4 cm3 d'une suspension de 103 ilots par cm3 à un volume de 0,5 cm3 d'une solution d'alginate de sodium à 1,2 % (Sigma Chemical Company) dans du sérum physiologique. Ensuite, on utilise une solution de chlorure de calcium à 1,5 % pour la gélification de gouttelettes de la solution formée comme indiqué précédemment. Les gout- telettes ayant un diamètre de l'ordre de 300 à 400 nom, provenant du bout de l'aiguille, se gélifient dès qu'elles pénètrent dans la solution contenant du calcium. Les cap- sules gélifiées sont alors mises dans un bécher contenant cm3 d'une solution comprenant 1 partie d'une solution tampon d'acide 2(cyclohexylamino)éthanesulfonique à 2 % dans une solution de NaCl à 0,6 % (solution isotonique de pH = 8,2) diluée par 20 parties de solution de CaCl2 à 1 %. Après immersion pendant 3 min, on lave deux fois les capsules dans de la solution à 1 % de CaCl2. On transfère alors les capsules dans 32 cm3 d'une solution 1/80 de solution de polylysine à 1 % (poids molé- culaire moyen de 35 000 daltons) dans du sérum physiolo- gique. Après 3 min, on décante la solution de polylysine. On lave alors les capsules avec une solution à 1 % de CaCl2, et on remet éventuellement en suspension pendant 3 min dans une solution de polyéthylèneimine (poids molé- culaire 40 000-60 000) formée par dilution d'une solution mère de polyéthylèneimine à 3,3 % dans une solution tampon d'acide morpholinopropanesulfonique (0,2 M, pH = 6) avec suffisamment de solution à 1 % de CaCl2 pour que la con- centration finale du polymère soit égale à 0,12 %. Les capsules résultantes, ayant des membranes semi-perméables- "permanentes" sont alors lavées deux fois avec une solution à 1 % de CaCl2 deux fois avec du sérum physiologique puis sont mélangées à 10 cm3 d'une solution d'acide algi- nique à 0,12 %. Les capsules résistent à l'agglomération et on note que de nombreuses contiennent des ilots de Langerhans. Le gel formé à l'intérieur des capsules est remis à l'état liquide par immersion des capsules dans un mélange de sérum physiologique et d'une solution tampon de citrate (pH = 7,4) pendant 5 min. Enfin, on remet en suspension les capsules dans le milieu "CMLR-69". On note au microscope que ces capsules comprennent une très mince membrane qui entoure un ilot dans lequel on peut voir des cellules individuelles. Les molécules de poids moléculaire pouvant atteindre 100 000 environ peuvent traverser les membranes. De cette manière, l'oxy- gène, les aminoacides, les matières nutritives et les cons- tituants du plasma utilisés dans les milieux de culture (c'est-à-dire les constituants de faible poids moléculaire d'un plasma de veau foetal) peuvent atteindre l'ilot et permettent la secrétion d'insuline. Après des lavages répétés dans du sérum physio- logique, les microcapsules réalisées par le procédé décrit précédemment et contenant environ 15 ilots, sont mises en suspension dans 3 cm3 du milieu "CMRL-1969". Apres 8 jous de vieillissement, en présence de glucose à raison de 6 g/l, les capsules secrètent, dans le milieu externe aux capsules, 67 unités d'insuline par cm en 1,5 h, en une seule opération. Dans une seconde opération, 68 unités d'insuline sont produites par cm3, pendant le même temps. Des capsules formées depuis une semaine, dans le même milieu mais en présence de glucose à 1 g/l, secrètent 25 unités d'insuline par cm3 en 1,2 h, dans un premier essai et se- crètent 10 unités par cm3 dans un second essai. EXEMPLE 2: Production d'interféron béta On met en suspension des fibroblastes humains obtenus par traitement de tissus de prépuce humain avec de la trypsine et l'acide éthylènediaminetétracétique pen- dant 5 min à 37 C, de manière connue, dans un milieu complet de croissance ("CMLR-1969" de Connaught Laboratories), complété par du sérum de veau foetal purifié, à 40 % en volume par volume, de l'alginate de sodium en solution à 0,8 % (Sigma) et 200 gg/cm3 de collagène purifié de peau de veau. La densité de la suspension de cellules est d'en- viron 1,5.107 cellules/cm3. On forme des capsules temporaires viron 1,5. 10 cellules/cm. on forme des capsules temporaires d'alginate comme décrit dans l'exemple 1. Les membranes semi-perméables se déposent sur les couches superficiel- les des capsules lorsqu'elles sont mises en suspension dans une solution aqueuse à 0,005 % en poids par volume de polylysine (poids moléculaire 43 000 daltons) pendant 3 min. Les capsules résultantes sont alors mises en suspension dans le milieu (CMLR-1969") complété par du sérum de veau foetal à 10 %. Les étapes précédentes sont toutes mises en oeuvre à 37 C. Après incubation à la même température, on constate par examen au microscope que les capsules contiennent des fibroblastes qui ont subi une caryocinèse et qui ont une morphologie fibroblastique tri- dimensionnelle dans les microcapsules. Après 4 à 5 jours d'incubation, les fibroblastes encapsulés sont soumis à une technique de "superinduction" d'interféron béta selon la méthode de Vilcek. Dans une atmosphère à 5 % de CO2 (95 % d'air), la suspension de capsules incube à 37 C pendant 1 h en présence de 3' 100 gg/cm de poly IPoly C, qui est un acide ribonucléique à deux nappes (inducteur connu d'interféron béta) dispo- nible auprès de PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin et de 50 gg/cm3 de cycloheximine (inhibiteur de la syn- thèse protéinique, disponible auprès de Calbiochem, La Jolla, Californie).Après une heure, les capsules en sus- pension sont lavées dans le milieu ("CMLR-1969") contenant ig/cm3 de cycloheximide puis remises dans la suspension dans la même solution pendant 3 h à 37 C, en atmosphère contenant 5 % de CO2. A la fin de cette incubation, l'opé- ration de lavage est répétée et les capsules sont remises en suspension dans un milieu contenant 50 gg/cm3 de cyclo- heximide et 5 gg/cm3 d'actimomycine D (inhibiteur connu de synthèse d'acide ribonucléique de Calbiochem), et subis- sent une incubation de 2 h à 37 C en atmosphère à 5 % de Co2. Les capsules sont alors lavées deux fois dans le milieu et mises en suspension dans un milieu dépourvu de sérum, à 37 C pendant 18 à 24 h et pendant ce temps, les fibro- blastes secrètent de l'interféron béta qui a un poids molé- culaire de l'ordre de 21 000 daltons et qui peut être ré- colté dans le milieu externe aux capsules. EXEMPLE 3: production d'interféron bêta On répète les opérations de l'exemple 2, mais, avant induction, les membranes des capsules sont fractu- rées sélectivement afin que la substance Poly I-Poly C puisse avoir plus facilement accès aux fibroblastes. La fracture est mise en oeuvre de la manière suivante. On laisse se déposer des fractions de 10 cm3 de suspension de microcapsules contenant environ 500 à 1 000 capsules par cm, et on retire le milieu de suspen- sion par aspiration. On lave alors les capsules deux fois avec une solution saline tamponnée par un phosphate (pH = 7,4). On mélange alors les capsules lavées à une fraction de 3,0 cm3 de la solution saline tamponnée con- tenant 1000 unités d'héparine par cm3 et CaCl à raison de 1,1 % en poids par volume. On agite la suspension à 370C pendant 3 min et on laisse les capsules se déposer, puis on retire la matière qui surnage par aspiration et on lave deux fois les capsules avec 3,0 cm3 d'une solu- tion 0,15 M de NaCl. Après aspiration de la seconde solu- tion de lavage, on mélange les capsules à 2,0 cm3 d'une solution mixte contenant des volumes égaux d'une solution de citrate de sodium 110 mM et d'une solution de NaCl 0,15 M (pH = 7,4). On fait tourbillonner le mélange à la main pendant 1 min afin de provoquer la dissolution des membranes et on lave ensuite deux fois les cellules dans le milieu. On remet en suspension les cellules dans le milieu, on leur fait subir l'opération d'induction indiquée dans l'exemple 2 et on les réencapsule comme décrit dans l'exem- ple 2. La suspension de capsules subit alors une incubation dans un milieu dépourvu de sérum. pendant 18 à 24 h et, pendant ce temps, les cellules sécrètent de l'interféron bêta qui traverse les membranes des capsules et se rassem- ble dans le milieu extérieur aux capsules. Les exemples 2 et 3, lorsqu'on les réalise avec la substance Poly I-Poly C (5S) (valeur de sédimentation, les substances Poly I et Poly C étant traitées afin qu'el- les forment de l'acide ribonucléique à deux nappes) donnent les quantités suivantes d'interféron béta, exprimées en unités d'interféron bêta pour 105 cellules: Exemple 2 1. 2. 25 Exemple 3 2 500 2 500 Lorsqu'on exécute les exemples 2 et 3 avec la substance Poly I-Poly C (12S) (valeur de sédimension, matière à deux nappes telle qu'achetée), on obtient les productions suivantes d'interféron bêta, exprimées en unités d'interféron bêta pour 105 cellules: Exemple 2 1. 2. 25 Exemple 3 2 500 2 500 La multiplication par 100 de la production obtenue dans l'exemple 3 par rapport à celle que donne l'exemple 2 est sans doute due, au moins en partie, au fait que la substance Poly I-Poly C à un meilleur accès aux cellules dans le procédé de l'exemple 3. EXEMPLE 4 On répète les opérations de l'exemple 2 mais on utilise des capsules ne contenant pas de collagène. Les cellules encapsulées subissent une croissance en culture classique à monocouche, subissent un traitement par de la trypsine, et une induction par le Poly I-Poly C (5S) avec microencapsulation simultanée. On constate que le milieu extérieur aux capsules contient 2500 unités d'inter- féron béta par fraction de 105 cellules. EXEMPLE 5: anticorps monoclonal On cultive des cellules d'hybridomes obtenues auprès de Herman Eisen au Massachussets Institue of Techno- logy, à une densité de 3,0.106 cellules par cm3. Ces cellu- les ont été condensées à partir de cellules de rate de souris et de cellules de myélome de souris, d'une manière maintenant bien connue, et constituent une lignée de cellu- les immortelles qui, lorsqu'elles sont cultivàes,forment des anticorps actifs contre l'albumine de dinitrophényl- sérum bovin. On prépare des fractions de 3 cm3 de la suspen- sion de cellules par addition de 2,1 cm3 de suspension contenant 1,4 % d'alginate de sodium à 0,6 cm3 de sérum de veau foetal et 0,3 cm3 de sérum physiologique (150 mM). Des gouttelettes de suspension se gélifient immédiatement dans une solution de CaCl2, et on les traite ensuite avec une solution à 0,07 % en poids de poly-L-lysine. On met alors l'intérieur des-capsules résultantes à l'état liquide par immersion dans une solution d'une partie de citrate de sodium 110 mM et de 3 parties de sérum physiologique mM, pendant 6 min. On met alors en suspension les capsules contenant les cellules d'hybridomes dans un mélange de milieu "RPMI-1640" de Gibco contenant 20 % de sérum de veau foetal inactivé par chauffage. On détermine périodiquement les nombres de cellu- les des cultures d'hybridomes encapsulées et non encapsulées, ainsi que la quantité d'anticorps monoclonal produite à la fois par les cultures encapsulées et non encapsulées. Les résultats sont représentés graphiquement sur la figure 2 sur laquelle les courbes à points carrés et circulaires clairs représentent respectivement la densité de cellules dans le cas des cellules non encapsulées et encapsulées respectivement, et les courbes ayant les points carrés et circulaires sombres représentent la quantité d'anticorps obtenue dans le cas des cellules non encapsulées et encap- sulées respectivement, les abscisses représentant le nombre de jours après l'encapsulation. EXEMPLE 6: production d'interféron alpha à partir de leucocytes On traite 30 cm3 de couenne inflammatoire obtenue 3 - auprès de the American Red Cross avec 3,0 cm d'acide éthylènediaminetétracétique à 5 %, et on répète les expo- sitions de 10-min à une solution de NH4Cl à 0,83 %, à 40C afin que les globules rouges subissent une rupture. Les débris sont séparés des leucocytes intacts restants par centrifugation de 5 min (à 1200 tr/min et 4 C) entre les traitements par NII4Cl. On met ensuite en suspension les cellules dans un milieu essentiel minimal, dépourvu de sérum MEM de Gybco, dilué par un facteur 100 et coloré par du bleu de tryptane,pendant 15 min. Un comptage des cellules réalisé sur un échantillon indique qu'environ 1,3.10 leucocytes survivent par fraction de 30 cm3 de couenne inflammatoire.. On met alors les cellules en sus- pension avec une densité de 1.10 cellules/cm3 dans un milieu complété par 2 % de sérum de veau foetal inactivé par chauffage. L'induction est réalisée par exposition de la suspension de cellules au virus de Sendai (diverses concen- trations en unités d'hémagglutination par cm3, disponibles auprès de Flow Laboratories, Maryland, Etats-Unis d'Améri- que) pendant 1 h à 370C, sous agitation. On sépare alors le virus des cellules par centrifugation à température ambiante et on remet les cellules en suspension dans les volumes égaux de la solution du milieu MEM et de 4 % de sérum foetal inactivé par chauffage, et d'alginate de sodium à 1,4 %. Les capsules se forment comme indiqué précédemment et on les remet en suspension dans des milieux dépourvus de sérum et contenant du sérum. Il n'y a pas de différence notable entre les quantités d'interféron détectées dans le milieu extérieur aux capsules, pour ces échantillons d'essai. Les quantités d'interféron produit sont aussi identiques dans les cultures témoins non encapsulées. Les résultats de ces expériences figurent dans le tableau qui suit. Virus de Sendai, Interféron produit Unités HA/cm Unités/10 cellules 600 10 300 20 33 75 50 EXEMPLE 7: production d'interféron alpha à partir de lympho- blastoides On fait subir une croissance à des cellules de Namalwa obtenuesauprès de the American Type Culture Collection à la fois dans une culture classique et dans des microcapsules dans un milieu "RPMI- 1640" complété par 10 % de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur. Les volumes de suspen- sion de cellules sont alors soumis aux opérations d'induction et de production d'interféron, un volume étant encapsulé et l'autre non. Les cultures contiennent pratiquement les mêmes nombres de cellules. On ajoute alors à la fois aux cultures encapsulées et non encapsulées 25 mg/cm3 de bromo- désoxyuridine dans de l'eau deux fois distillée afin que la caryocinèse soit inhibée. Après incubation de 36 h à 370C, on lave les cellules des deux cultures et on les met en suspension dans le milieu "RPMI-1640" complété par 2 % de sérum de veau foetal, inactivé par chauffage. On traite alors la culture encapsulée afin que les membranes des capsules soient fracturées sélectivement. On lave alors trois fois les capsules dans du sérum physio- logique, puis elles subissent une incubation dans une solu- * 3' tion à 1000 unités/cm. d'héparine contenant 1,1 % de CaCl2, pendant 10 min à 370C, et on les lave à nouveau avec du sérum physiologique. Les capsules lavées subissent alors une nouvelle incubation de 5 min à 370C en présence d'une solution diluée de citrate de sodium dans du sérum physio- logique.L'agitation de la suspension de capsules provoque à ce moment la dissolution des membranes et la libération des cellules de.Namalwa. La suspension' des cellules est alors soumise à une centrifugation qui retient les débris et on la lave plusieurs fois dans une solution de sérum physiologique et de citrate. On met ensuite en suspension les deux cultures dans un milieu 9 de culture "RPMI-1630" complété par 2 % de sérum de veau foetal inactivé par chauffage et par une solution tampon (pH = 7,4) à une densité de 6 3 1,0.10 cellules/cm On ajoute alors à la fois à la culture classique et à la culture qui a été encapsulée, la souche Bankowski du virus de la maladie de Newcastle dans du fluide amnioti- que. Le virus a une concentration de 1,0.10 pfu/cm et il est disponible auprès de Poultry Health Laboratories, Davis, Californie, Etats-Unis d'Amérique. On ajoute 1 cm3 du virus pour chaque fraction de 10 cm de suspension de cellules. Les culture subissent alors une incubation de 24 h à 37WC. On dilue alors la culture classique en 5 parties (repérées par les références 1 à 5 dans la suite du pré- sent mémoire) et on divise la culture qui a été encapsulée en quatre parties (repérées par les références 6 à 9 dans la suite). On fait alors subir aux 9 fractions de culture des essais de production d'interféron, par mise en oeuvre des traitements suivants. 1. non traité 2. remis en suspension dans le milieu "RPMI- 1640" avec 2 % de sérum de veau foetal inactivé par chauf- fage 3. remis en suspension dans le milieu "RPMI- 1640" sans sérum 4. encapsulé avec le milieu "RMPI-1640" et % de sérum de veau foetal inactivé par chauffage, les capsules étant en suspension dans un milieu dépourvu de sérum 5. encapsulé avec le milieu "RPMI-1640" et % de sérum de voeau foetal inactivé par chauffage, les capsules étant en suspension dans un milieu contenant 2 % de sérum de veau foetal 6. remis en suspension dans un milieu dépourvu de sérum 7. remis en suspension dans un milieu contenant 2 % de sérum de veau foetal inactivé par chauffage 8. reencapsulé avec un milieu et 5 % de sérum de voeu foetal inactivé par chauffage, les capsules étant mises en suspension dans un milieu dépourvu de sérum 9. réencapsulé avec un milieu et 5 % de sérum de voeu foetal inactivé par chauffage, les capsules étant en suspension dans le milieu additionné de 2 % de sérum. Le tableau qui suit indique la quantité de cel- lules nécessaires dans chacune des cultures 1 à 9 pour la production d'une unité d'interféron alpha. 1 30 6 40 2 45 7 40 3 - 8 1000,360 4 680 9 200, 100 2000 Il est bien entendu que l'invention n'a été décrite et représentée qu'à titre d'exemple préférentiel et qu'on pourra apporter toute équivalence technique dans ses éléments constitutifs sans pour autant sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une substance produite par des cellules vivantes, caractérisé en ce qu'il com- prend A. l'encapsulation des cellules dans des membranes ayant une limite supérieure choisie de perméabilité, B. la mise en suspension des cellules encapsulées dans un milieu aqueux de culture, C. la réaction naturelle des cellules afin qu'el- les présentent un métabolisme in vitro et qu'elles secrètent ladite substance, et D. la récolte de ladite substance soit dans le milieu aqueux soit dans le volume délimité à l'intérieur des membranes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape A d'encapsulation est réalisée par forma- tion de la membrane par réaction entre les groupes cationi- ques portés par des chaînes polymères et des groupes anioni- ques portés par une gomme hydrosoluble, l'ensemble formant un liant insoluble dans l'eau et ayant des liaisons salines. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape A d'encapsulation est réalisée à l'aide d'étapes qui comprennent 1) la mise en suspension des cellules dans un milieu aqueux compatible physiologiquement avec les cellu- les et contenant une gomme hydrosoluble ayant plusieurs motifs anioniques, 2) la formation de gouttelettes contenant les cellules à partir de la suspension, 3) le traitement des gouttelettes par une solu- tion de cations plurivalents, compatibles physiologiquement, afin que les gouttelettes se gélifient en formant des cap- sules temporaires insolubles dans l'eau, séparées et conser- vant leur forme, et 4) la réticulation de couches superficielles des capsules temporaires afin qu'elles forment des mem- branes semi-perméables autour des gouttelettes par trai- tement à l'aide d'un polymère contenant plusieurs groupes cationiques capables de réagir avec les motifs anioniques. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la redissolution du gel dans la membrane, après sa production dans l'étape (4). 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance a un poids moléculaire inférieur à la limite supérieure choisie de perméabilité, et le procé- dé comprend la diffusion naturelle de la substance à tra- vers les membranes vers le milieu aqueux, et la récolte de la substance dans ce milieu. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 et 5, caractérisé en ce que les cellules sont encapsulées avec un milieu complet de culture des cellules suffisant pour l'entretien des cellules et pour que ladite substance puis- se être formée par biosynthèse in vitro. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 et 5, caractérisé en ce que le milieu aqueux utilisé dans l'étape B est un milieu complet de culture de cellules, suffisant à l'entretien des cellules et à la biosynthèse de la sub- stance in vitro. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les cellules doivent disposer d'un constituant ayant un poids moléculaire supérieur à la limite supérieure de perméabilité des membranes lors de la biosynthèse in vitro de la substance, et le procédé comprend l'étape sup- plémentaire d'encapsulation de ce constituant avec les cellules. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 et 5, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules de mammifères. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 et 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la caryocinèse naturelle des cellules qui se trouvent dans la capsule. il. Procédé selon l'une des revendications 1 et 5, caractérisé en ce que les cellules sont d'un type qui a subi une modification génétique. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 et 5, caractérisé en ce que l'étape d'encapsulation A assure l'encapsulation de microcapsules sphéroldales dont le diamètre est inférieur à 0,5 mm environ. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 et 5, caractérisé en ce que la substance récoltée dans l'étape E est choisie dans le groupe qui comprend l'insuline, le glycogène, la prolactine,la somatostatine, la thyroxine, les hormones stéroldales, les hormones pituitaires, les interférons, les hormones stimulant les follicules et les hormones parathyroldiennes. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 et 5, caractérisé en ce que la substance récoltée dans l'étape E est choisie dans le groupe qui comprend les hormones, les interférons, les lymphokines et les anticorps. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 et 5, caractérisé en ce que les cellules encapsulées de l'étape A doivent être au contact d'un constituant ayant un poids moléculaire supérieur à la limite supérieure de perméabili- té des membranes afin que la production de substances soit entretenue, le constituant étant encapsulé avec les cellu- lesdans l'étape A, et le milieu aqueux de culture utilisé dans l'étape B est pratiquement dépourvu de ce constituant. 16. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la limite supérieure choisie de perméabilité est inférieure à 1,5.10 daltons environ. 17. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules d'hybridome, la- dite substance est constituée d'anticorps monoclonaux ayant un poids moléculaire supérieur à la limite supérieure choi- sie de perméabilité, et les anticorps sont récoltés dans les volumes délimités à l'intérieur des membranes. 18. Ensemble de culture de cellules vivantes, carac- térisé en ce qu'il comprend des cellules viables encapsulées, en suspension dans un milieu aqueux de culture, les cellules viables encapsulées comprenant des membranes ayant une limite supérieure de perméabilité suf- fisante pour que les matières nutritives nécessaires aux cellules puissent les traverser, les membranes entourant les cellules viables en suspension, placées dans un milieu qui comprend tous les ingrédients (A) nécessaires à la conservation de la viabilité des cellules et dont la di- mension est supérieure à la limite supérieure de perméa- bilité des membranes, le milieu aqueux de culture contenant tous les constituants (B) nécessaires à la conservation de la via- bilité des cellules et ayant un poids moléculaire inférieur à la limite supérieure de perméabilité des membranes. 19. Ensemble selon la revendication 18, caractérisé en ce que les constituants A comprennent des constituants du sérum. 20. Ensemble selon la en ce que les cellules sont 21. Ensemble selon la en ce que les cellules sont 22. Ensemble selon la en ce que les cellules ont 23. Ensemble selon la en ce que les cellules sont 24. Ensemble selon la en ce que les cellules sont une substance choisie dans mones, les interférons, les 25. Ensemble selon la en ce que les cellules sont revendication 18, caractérisé des cellules de mammifères. revendication 18, caractérisé des microorganismes. revendication 18, caractérisé subi une modification génétique. revendication 18, caractérisé des cellules d'hybridome. revendication 18, caractérisé capables de secréter in vitro le groupe qui comprend les hor- lymphokines et les anticorps. revendication 18, caractérisé capables de secréter in vitro une substance choisie dans le groupe qui comprend l'insuline, le glycogène, les hormones de croissance, les hormones pituitaires, les hormones stéroldales, la prolactine, la somatostatine, les hormones parathyroidiennes et les hor- mones de stimulation des follicules. 26. Ensemble selon la revendication 18, caractérisé en ce que les membranes contiennent une gomme polymère ayant plusieurs motifs anioniques liés par des liaisons salines à un polymère ayant plusieurs motifs cationiques destinés à former un liant poreux.