Brevet FR2501231A1 — publié le 19820910

Levure tueuse La présente invention concerne une levure tueuse. Les levures de saké présentant un caractère tueur sont connues comme utiles pour éviter la contamination par les levures sauvages rencontrées lors du brassage du saké. Ces levures tueuses du saké présentent une immunité (résistance) vis-à-vis des toxines tueuses, si bien que la préparation et l'emploi d'excellentes levures de saké présentant une activité tueuse consti- tuent un avantage car non seulement ces levures ne peuvent pas être tuées Dar les levures tueuses sauvages qui leur sont mélangées, mais elles peuvent également éviter la contamination par les souches de levures sau- vages sensibles à la toxine tueuse qui sont encore plus souvent rencontrées. En ce qui concerne la lutte contre la contamination oar les levures sauvages, on préfère les levures qui résistent au plus grand nombre possible de types de toxines tueuses (également appelées substan- ces tueuses) que peuvent produire les levures tueuses sauvages et qui ont une action tueuse vis-à-vis d'autant de types de levures sauvages qu'il est possible. Les souches tueuses de Saccharomyces cerevisiae actuellement connues ne sont cependant pas satisfaisantes à cet égard. A la suite de recherches noussées, la demande- resse a découvert que l'on peut obtenir une levure tueuse ayant une résistance aux toxines tueuses et une activité tueuse vis-à-vis d'une gamme étendue de types de levures Dar introduction d'un certain Plasmide dans Saccharomyces cerevisiae selon une technique de fusion cellulaire ou de transformation. Ceci constitue la base de l'invention. En résumé, l'essence de l'invention est un Saccharomyces cerevisiae résistant aux toxines tueu- ses produites par les souches tueuses de Kluyveromyces lactis et ayant le même caractère tueur que lesdites souches tueuses. L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée. La levure tueuse selon l'invention appartient à Saccharomyces cerevisiae et présente une résistance aux toxines tueuses produites par les souches tueuses de Kluvverom ces lactis régules par des plasmides d'ADN bicaténaire (pGKe-1 et pGEC-2) (par exemple la souche IFO 1267 ou la souche ATCC 8585; la référence IFO étant celle attribuée par le Foundation Institute of Fermentation, Osaka à ladite souche qui y est dénose et la référence ATCC étant celle attribuée tar l'Ameri- can Type Culture Collection) et le même caractère tueur que les souches tueuses de Kluvveromvces lactis. La levure tueuse selon l'invention a une activité tueuse vis-à-vis de plus de types de ievures que les souches tueuses actuellement connues de Saccharomyces cerevi- siae régulées par des plasmides d'fRN bicaténaire, par exemple la souche portant le numéro B060 (numéro ATCC 42750) et la souche portant le numéro B 511-4C (numéro ATCC 38659). Donc, cette levure tueuse selon l'inven- tion a de même que les souches tueuses de Kluyveromyces lactis, par exemple la souche IFO '1267, une activité tueuse vis-à-vis des souches suivantes: 1) Souches sensibles à l'activité tueuse (c'est-à-dire qui sont tuées par la levure tueuse selon l'invention): Sacchararomyces cerevisiae G102D AH 22 (ATCC 38626) M1-7C BO 60 (souche tueuse) F 38-4A tueur (souche tueuse) B511-4C (souche tueuse) Klu veromYces lactis IFO 1903 IFO 0433 L3d L4 L5 Kluyveromyces thermotolerans IFO 0662 Kluyveromyces vanudenii IFO 1673 Saccharomyces rouxii M1 M7 Torulopsis glabrata IFO 0005 IFO 0662 Candida utilis IFO 0396 Candida intermedia IFO 0761 2) Souches sensibles à l'activité tueuse mais de façon faible: Saccharomyces italicus IFO 0523 IFO 1049 Kluvveromvces lactis W600B (ATCC 32143) Les souches de la levure tueuse selon l'inven- tion comme indiqué ci-dessus, comprennent la souche de Saccharomyces cerevisiae F 102-2 (déposée à "l'Agency of Industrial Science and Technology, the Fermentation Research Institute au Japon"; le numéro d'enregistre- ment pour la demande de dépôt du micro-organisme est 5903); le nouveau numéro de dépôt international con- forme au traité de Budanest effectué le 24 Février 1982 étant FERM-PB-106. De plus, la levure tueuse selon l'invention peut être définie comme ayant une résistance vis-à-vis des toxines tueuses produites par les souches tueuses de Saccharomvces cerevisiae (par exemple la souche B060) ainsi que vis-à-vis de celles produites par les souches tueuses de Kluyveromyces lactis et comme ayant le même caractère tueur que les souches tueuses de Saccharomy- ces cerevisiae (par exemple la souche B060) et celles de Kluyveromyces lactis. Donc, en conclusion, la levure tueuse de l'invention a l'activité tueuse des souches tueuses de Kluyveromyces lactis et de celles de Saccha- romyces cerevisiae. Concrètement, l'activité tueuse (en d'autres termes la mort des souches provoquée par la levure selon l'invention) est également observée dans Saccharomyces italicus en plus des souches indi- quées ci-dessus. De plus, cette activité est générale- ment suffisante dans le cas des souches IFO 0253 et 1049 de Saccharomvces italicus qui figurent parmi les souches indiquées en 2) ci-dessus comme n'ayant qu'une sensibilité limitée à l'activité tueuse. La levure tueuse selon l'invention est préparée par introduction de plasmides présents dans une souche tueuse de KluYveromyces lactis (pGKt-1 et pGKZ-2) dé- crits dans Journal of Bacteriology, vol. 145, pp. 382- 390 (1981)) selon une technique de fusion cellulaire ou de transformation. On peut par exemple utiliser une souche apparte- nant à Saccharomyces cerevisiae Hansen, par exemple la souche AH22 (ATCC 38626), la souche B060 (ATCC 42750) ou similaires comme souches de Saccharomyces cerevisiae constituant l'accepteur des plasmides. En particulier, on préfère utiliser un mutant po c'est-à-dire une sou- che dépourvue d'ADN mitochondrial. On préfère utiliser la souche B060 ou similaires lorsqu'on désire obtenir la levure tueuse selon l'invention résistant aux sou- ches tueuses de Saccharomyces cerevisiae et ayant le caractère tueur desdites souches tueuses. Comme plas- mides, on peut utiliser pGKZ-l et pGKe-2 présents dans les souches tueuses de Kluyveromyces lactis, par exem- ple la souche IFO 1267, comme décrit dans Journal of Bacteriology, vol. 145, pp. 382-390 (1981). Les plasmides pGK -1 et DGKe-2 sont des plasmi- des d'ADN linéaire ayant respectivement des poids mo- léculaires de 5,4 + 0,1 x 106 daltons et 8,4 0,1 o6 da3n tl êe 16dlose, , io6 daltons et la même masse volumique de],687 g/cm3. Les propriétés de leur digestion Dar divers types d'en- zymes de restriction sont les suivantes: 1) pGK-1: Avec EcoRI: digéré en deux fragments (p.m.: 2,4 x 6 6 et 3,0 x 106, l'unité étant le dal- ton (il en est de même ci-après)). Avec Hind III: digéré en trois fragments (0,5 x 10, 1,5 x 106 et 3,4 x 106). Avec BglII: digéré en trois fragments (4,0 x 10, 0,96 x 106 et 0,54 x 106). Avec Hinc II: digéré en deux fragments (4,1 x 106 et 1,4 x 106). Avec PstI: digéré en trois fragments (0,5 x 106, 1,0 x 106 et 3,9 x 106). Avec BamHI: digéré en deux fragments (2,7 x 10 et 2,7 x 106). Avec XhoI, HaeII, SmaI, SalI et HapI: non digéré. 2) pGKQ-2: Avec EcoRI: digéré en sept fragments (2,5 x 106, 6 66 2,3 x 106, 0,95 x 106, 0,85 x 106, 0,7 x 106, 0,55 x 106 et 0,5 x 106). Avec BamHI: digéré en deux fragments (3,6 x 10 et 4,8 x 106). Avec HindIII, PstI, HpaI, XhoI, HaeII, SmaI et HincII: non digéré. Pour construire la levure tueuse selon l'inven- tion, on introduit les deux plasmides pGKQ-1 et pGKt-2 dans Saccharomyces cerevisiae. Dans le cas o l'on utilise une technique de fu- sion cellulaire pour oréparer la levure tueuse selon l'invention, on mélange de façon classique les proto- plastes de Kluyveromvces lactis hébergeant les plasmides ci-dessus avec ceux de Saccharomyces cerevisiae puis on traite le mélange par le polyéthylèneglycol. Après ce traitement, on étale le mélange sur un milieu sélectif isotonique approprié sur lequel seuls les protoplastes de Saccharomyces cerevisiae peuvent se régénérer pour fournir la levure tueuse désirée. Si l'on effectue la préparation selon une tech- nique de transformation, on ajoute de façon classique les Dlasmides mentionnés ci-dessus à des protoplastes des souches de Saccharomvces cerevisiae. puis on traite par le polyéthylèneglyco!, puis on disperse le mélange dans un milieu isotonique. On isole ensuite les souches ayant la fonction tueuse des colonies des protoplastes régénérés. - On obtient la levure tueuse selon l'invention comme Drécédemment indiqué. De plus, également selon l'invention, on peut produire des produits protéiques utiles par introduction d'ADN exogène (par exemple des gènes codant pour la production d'hormones polypepti- diques humaines, d'enzymes, de vaccins, etc).dans les plasmides ci-dessus ou une partie d'entre eux (par exemple une partie dans laquelle demeurent les portions correspondant au promoteur, à l'origine de réplication et au facteur tueur mais dont les autres portions inu- tiles à la réplication du plasmide ou à l'expression des gènes introduits sont éliminées), selon des tech- niques de recombinaison de l'ADN. Dans ce cas, l'acti- vité tueuse est utile comme marqueur de transformation. L'invention qui vient d'être décrite de façon générale sera mieux comprise à la lecture des exemples illustratifs et nullement limitatifs suivants. Exemele 1 (préparation de la levure tueuse selon une technique de fusion cellulaire). On prépare des protoplastes à partir de 2 g d'une souche tueuse de Kluyveromyces lactis aDpelée souche 2105-lD (a ade leu pGKQ-1 et pGKZ-2) (cette souche est une des spores en tétrade obtenues par croisement entre la souche IFO 1267 de Kluyveromyces lactis et la souche W600B de Kluyveromyces lactis) et à partir de 0,8 g d'une souche non tueuse de Saccharo- myces cerevisiae appelée souche AH22 (a leu 2-3, leu 2-112 his 4-519 canl P) et on les ajoute respec- tivement à 10 et 5 ml de solutions tampons (solutions de tampon citrate-phosphate 0,1 M à pH 6,1) pour prépa- rer des suspensions. On mélange 2 millilitres des sus- pensions respectives et on centrifuge à 2 000 tr/min pendant 10 minutes. On ajoute au colot obtenu 4 ml d'une solution aqueuse à 33 % de polyéthylèneglycol mM en CaCl2 et on incube le mélange à 30 C pendant minutes. On centrifuge le mélange à 2 000 tr/min pendant 10 minutes et on ajoute une solution aqueuse 0,6 M de KCl au culot obtenu pour préparer une solution que l'on coule sur un milieu NB (base azotée fabriquée par Difco Laboratories) + leucine (leu) + histidine (his) + glucose (stabilisé par du KCl 0,6 M), ce milieu convenant à la régénération des protoplastes de la souche AH22 de Saccharomyces cerevisiae. On obtient de nombreuses colonies par incubation à 30 C pendant envi- ron 5 jours. On isole 243 de ces colonies dont on exa- mine les marqueurs génétiques et le caractère tueur. Sur 236 colonies ayant les mêmes marqueurs génétiques nucléiques que la souche AH22 de Saccharomyces cerevi- siae (type d'appariement a; besoins de leucine et d'histidine et résistance à la canavanine (a leu 2-3, 2-112 his 4-519 canl)), 61 présentent le caractère tueur particulier à Kluyveromyces lactis (propriété de tuer la souche tueuse B511-4C de Saccharomyces cerevi- siae). Par appréciation combinée des résultats des es- sais effectués par analyse sur gel d'agarose pour dé- terminer si les plasmides sont hébergés ou non, et d'autres observations de caractère taxonomique, y com- pris les caractéristiques morphologiques des cellules et autres (par exemple l'incapacité d'assimiler le lactose et la sensibilité au cycloheximide), il semble que les plasmides pGKt aient été transférés de Kluyve- romyces lactis à Saccharomyces cerevisiae par suite de la fusion cellulaire et qu'ils se soient répliqués pour conférer la fonction tueuse. Cette souche est appelée souche F102-2 de Saccharomyces cerevisiae (dé- posée à l'Agency of Industrial Science and Technology, the Fermentation Research Institute sous le numéro d'enregistrement 5903 pour la demande de dépôt du micro- organisme) et sous le numéro d'enregistrement national FERM- P-p6. Exemple 2 (préparation de la levure tueuse selon une technique de transformation). On transforme 1 g de la souche AH22 de Saccharo- myces cerevisiae (a leu 2-3, 2-112 his 4-519 canl p) en protoplastes que l'on lave trois fois avec une solu- tion aqueuse 0,6 M en KCl et que l'on centrifuge à 3 000 tr/min pendant 10 minutes. On met le culot obtenu en suspension dans 15 ml d'une solution de tampon Tris- HCl 10 mM (50 mM en CaC12 et 0,6 M en KCl). A 10 Pl de la suspension obtenue, on ajoute 10 pl d'une solution aqueuse 3,6 M de KCl puis on ajoute 40 pl d'une solu- tion de tampon Tris-HCl 10 mM à pH 7,6 contenant 0,5 pg de pGKe-l et 0,5 pig de pGKQ-2 (les plasmides pGKt-1 et pGKt-2 ont été préparés selon le procédé décrit dans Journal of Bacteriology, vol. 145, pp. 382-390) (conte- nant en outre une concentration en EDTA de 3 mM). On maintient le mélange obtenu (60 pl) au bain glacé pen- dant 30 minutes, puis on ajoute 500 Il d'une solution de tampon Tris-HC1 10 n4 (pH 7,6) contenant 40 % de polyéthylèneglycol (p.m.: 6 O00), 50 mM en CaCl2 et 0,6 M en KCl puis on incube à 30 C pendnat 60 minutes en agitant doucement. Après addition d'une solution aqueuse 0,6 M de KCl, on étale le mélange sur un milieu YEPD isotonique et on incube à 30 C pendant 4 jours pour obtenir 6 000 colonies de protoplastes régénérés. On isole 2 000 de ces colonies dont on examine la fonc- tion tueuse en utilisant comme organisme test la souche B511-4C de Saccharomyces cerevisiae. Sur ces colonies, deux sont transformées (tueuses). Les sous-clones ob- tenus par purification de ces deux souches transformées ont les mêmes propriétés génétiques (a leu 2-3, 2-112 his 4-519 canl) et les mêmes propriétés taxonomiques (sensibilité au cycloheximide et incapacité d'assimiler le lactose) que la souche parente AH22, et de plus pré- sentent la fonction tueuse des souches tueuses de Kluyveromyces lactis. Egalement tous les sous-clones hébergent les plasmides pGKQ comme le montre l'analyse sur gel d'agarose. Exemple 3 (préparation de la levure tueuse selon une technique de fusion cellulaire). On prépare des protoplastes de Saccharomyces cerevisiae présentant le caractère tueur propre à Kluyveromyces lactis et de la souche tueuse 8060 de Saccharomyces cerevisiae et on les soumet à une fusion cellulaire selon la technique de fusion cellulaire dé- crite dans l'exemple 1. On effectue simultanément la fusion nucléaire et le mélange cytoplasmique et la souche de Saccharomyces cerevisiae obtenue a le carac- tère tueur de Kluyveromyces lactis et de la souche 8060 de Saccharomyces cerevisiae. Exemple 4 (détermination de l'activité tueuse). On effectue la détermination de l'activité tueu- se selon la technique sur gélose au bleu de méthylène décrite dans Journal of Bacteriology, vol. 145, pp. 382-390. On incube des cellules d'une souche d'étude (souche dont on désire déterminer si elle est tuée ou non) dans le milieu YEPD (1 % d'extrait de levure + 2 % de peptone + 2 % de glucose). On met ensuite la souche en suspension dans l'eau stérile et on étale 0,1 ml de la suspension obtenue (107 cellules/ml) sur un milieu de détermination du caractère tueur (1 % d'extrait de levure + 2 % de peptone + 2 % de glucose + 0,003 % de bleu de méthylène + 2,5 % de gélose + tampon citrate-phosphate 0,05 M à pH 5,0). Pour examiner l'activité tueuse, on ensemence en strie avec les cellules d'une souche de la levure tueuse (la souche dont on désire déterminer si elle a une activité tueuse) cultivée sur gélose YEPD, un mi- lieu d'essai préparé comme précédemment indiqué sur lequel on a étalé les cellules de la souche d'étude et on incube à 25 0C pendant 2 à 3 jours. On observe une zone claire autour de la levure tueuse si elle a une activité tueuse. Dans le tableau suivant, les ré- sultats sont exprimés selon les critères suivants: +: tueuse; -: non tueuse; et +: faiblement tueuse, c'est-à-dire présence d'une petite zone d'activité tueuse autour de la levure tueuse. Les résultats de la détermination de l'activité tueuse des levures tueuses selon l'invention préparées dans les exemples 1 à 3 avec les souches d'étude indi- quées dans le tableau ci-dessous figurent dans ce même tableau. De plus, le tableau mentre l'activité tueuse des souches tueuses de Saccharomi-ces cerevisiae (B060 et B511-4C) et de la souche tueuse de Kluyverom ces lactis (IFO 1267). TABLEAU Souches d'étude Exem- Exem- Eem- S. K. ple 1 ple 2 ple 3 cerevi- lactis siae B060 IFO et B511- 1267 4C 01 02 S. cerevisiae G102D. + + + + + M1-7C + + + + + B060 + + + - + F38-4A + + + - + B511-4C + + + - + AH22 + + + + + il Souches d'étude Exem- Exem- Exem- S. K. ple 1 ple 2 ple 3 cerevilactis siae B060 IFO et B511- 1267 4C o1 02 S. italicus IFO 0253 + + + ++ IFO 0725 - - + + - IFO 1049 + + + + + K. lactis IFO 1903 + + + - + K43. . - L3a + + + - + WM37.. . W600B + + + + K51.. . L4 + + - + L5 + + + - + IFO 0648.. . IFO 1090. -.. IFO 1267.. . K. thermotolerans IPO 0662 + + + - + IFO 1050.. . IFO 1674.. . IFO 1778.. . IFO 1779 _ _. IFO 1780. .. K. africanus IFO 1671.. . K. drosophilarum IFO 1012.. . K. marxianus IFO 0219.. . ./ *..DTD: Souches d'étude Exem- Exem- Exem- S. K. ple 1 ple 2 ple 3 cerevi- lactis siae B060 IFO et B511- 1267 4C O1 02 K. phaffi IFO 1672. .. K. polysporus IFO 0996. .. K. vanudenii IFO 1673 + + + - + K. wickerrhamii IFO 1675.. . Schizosaccharo- myces pombe M210' -.. SG55.. . M216.. . Levure tueuse de l'exemple 1 + Levure tueuse de l'exemple 2 + - Levure tueuse de l'exemple 3 S. rouxii Mi + + - + M7 + + + - + Torulopsis alabrata IFO 0005 + + + + + iF0 0662 + + + + + Candida utilis IFO 0396 + + + - + Candida internedia IFO 0761 + + + - + _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 1 j. _ _ _ _ 3 _ _ J 1:la souche B060 et la souche B511-4C ont exactement la même activité tueuse si bien qu'elles figurent dans la même colonne. S. signifie Saccharomyces. *02 K. signifie Kluyveromyces. Comme le montre le tableau 1, les levures tueu- ses préparées dans les exemples 1 et 2 ont le même ca- ractère tueur que la souche IFO 1267 de K. lactis et la même résistance à cette souche. De plus, la levure tueuse préparée dans l'exemple 3 a le caractère tueur de la souche IFO 1267 de K. lactis et de la souche B060 de S. cerevisiae (ou de la souche B511-4C) et résiste à ces deux souches. REVENDICATIONS 1. Levures tueuses appartenant aux souches de Saccharomyces cerevisiae, caractérisées par la résistan- ce aux toxines tueuses produites par les souches tueuses de KluyveromYces lactis et par le même caractère tueur que lesdites souches tueuses. 2. Levures tueuses appartenant aux souches de Saccharomvces cerevisiae selon la revendication 1, carac- térisées par la résistance aux toxines tueuses produites par les souches tueuses de Sacchar5o:yces cere sisae ainsi que celles produites par les souches tueuses de Kluyveromyces lactis et par le même caractère tueur que les souches tueuses de Saccharomvces cerevisise et de - Kluyveromyces lactis. 3. Levures tueuses appartenant aux souches de Saccharomyces cerevisiae,. caractérisées en ce qu'elles sont obtenues en introduisant dans une souche de Saccharomyces cerevisiae des plasmides présents dans une souche tueuse de Kluvveromvces lactis par une technique de transformation ou de fusion cellulaire. 4. Levures tueuses appartenant aux souches de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 3, ca- ractérisées en ce que les plasmides sont introduits dans une souche de Saccharomyces cerevisiae, appartenant aux sou- ches de Saccharomvces cerevisiae Hansen, telle que la souche désignée par AH 22, déposée sous le n ATCC 38 626 bu la souche désignée par B 060, déposée sous le n ATCC 42 750 ou des souches analogues. 5. Levures tueuses appartenant aux souches de Saccharomyces cerevisiae selon l'une quelconque des re- vendications 3 ou 4, caractérisées en ce que les plasmi- des utilisés présents dans une souche tueuse de Klurveromyces lactis telle que celle désignée par IFO 1267 et de n ATCC 8585, sont tels que les plasmides pGKl-1 et pGKl1-2. 6. Levures tueuses appartenant aux souches de Saccharomyces cerevisiae présentant les caractéristiques de celles déposées à l'Agency of Industrial Science and Technology, the Fermentation Research Institute au Japon, sous le no FERM-P 5903 et sous le numéro d'enre- gistrement international FERM-PB 106. 7. Procédé de préparation de levures tueuses appartenant aux souches de Saccharomyces cerevisiae selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, carac- térisé par le fait que des plasmides présents dans une souche tueuse de Kluyveromyces lactis tels que pGK1 1 et pGKl 2, sont introduits selon une technique de fusion cellulaire ou une technique de transformation dans une souche de Saccharnoyces cerevisiae, notammernt Sacc es cerevisiae Hansen, telle que celle désignée par AH 22 et déposée sous le n0 ATCC 38 626 ou celle désignée par B 060 et déposée sous le n ATCC 42 750 ou des souches analogues. 8. Procédé de préparation de levures tueuses appartenant aux souches de Saccharomyces cerevisiae se- lon la revendication 7, caractérisé en ce que des proto- plastes extraits de Kluyveromyces lactis abritant les plasmides sont mélangés avec ceux provenant de Saccharomyces cerevisiae, et en ce que le mélange est traité avec du polyéthylène glycol, puis est étalé sur un milieu sélec- tif isotonique approprié sur lequel seuls les protoplas- tes de Saccharomyces cerevisiae sont susceptibles d'être régénérés pour obtenir la levure tueuse selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6. 9. Procédé de préparation de levures tueuses appartenant aux souches de Saccharomyces cerevisiae se- lon la revendication 7, caractérisé en ce que les plas- mides présents dans une souche tueuse de Kluyveromyces lactis sont ajoutes aux protoplastes provenant de sou- ches Saccharomyces cerevisiae et traitées au polyéthy- lène glycol, puis en ce que le mélange est dispersé dans un milieu isotonique et en ce que les souches pré- sentant la fonction tueuse sont isolées à partir des colonies de protoplastes régénérés. 2501231i 10. Levures appartenant au genre Saccharomyces cerevisiae, caractérisées par le fait qu'elles abritent des plasmides tels que ceux que l'on peut obtenir à par- tir de Kluyveromyces lactis qui confèrent une résistance aux toxines tueuses produites par les souches tueuses de Saccharomyces cerevisiae aussi bien que celles pro- duites par les souches tueuses de Kluyveromyces lactis et ayant les mêmes caractéristiques tueuses que les souches tueuses de Saccharomyces cerevisiae ainsi que de Kluyveromyces lactis.