Brevet FR2505615A1 — publié le 19821119

La présente invention a pour objet un procédé perfectionné pour l'extraction de certaines protéines de produits laitiers; elle vise plus spécialement l'ob- tention des protéines fixant le fer, transferrine et lactoferrine, ainsi que des immunoglobulines. L'intérêt des différentes protéines, autres que la caséine, que l'on trouve dans le lait des mammifères, a attiré l'attention de nombreux industriels et chercheurs. Aussi des travaux ont été effectués en vue de la sépara- tion de ces différentes protéines, plus particulièrement de celles qui se retrouvent dans le petit lait, c'est-à- dire dans le lacto-serum, après la séparation des caséi- nes Parmi les substances fort intéressantes, appartenant à cette catégorie, se trouvent les a-lactalbumine, trans- ferrine, lactoferrine, lysozyme, serum-albumine, immuno- globulines, etc La lactoferrine présente non seulement un intérêt nutritionnel, mais également pharmacologique e on sait en effet, à présent, que cette protéine qui fixe le fer est non seulement d'une grande utilité alimentaire pour le nourrisson, mais constitue également un véritable protecteur contre différentes infections bactériennes Ce dernier rôle est expliqué justement par l'action chélatan- te de cette protéine vis-à-vis du fer, qui soustrait cet élément au milieu, empochant ainsi le développement des bactéries auxquelles cet élément est absolument nécessaire. Cette propriété bactériostatique présente évidemment un avantage important En ce qui concerne les immunoglobuli- nes Ig A, Ig M, Ig G, leur importance augmente chaque jour avec le développement prodigieux de l'immunologie On con- nait d'autre part l'utilité et les applications des lac- talbumines, de la sérum-albumine, du lysozyme et de certai- nes autres protéines et également des protéines fixant la vitamine B 12 ou la céruloplasmine qui a la propriété de se combiner au cuivre On comprend donc que des travaux aient été menés en vue de la séparation de ces différentes pro- téines à partir des produits laitiers et surtout à partir du petit lait qui les contient à l'état dissous et qui gé- néralement constitue un résidu dans l'industrie laitière. La plupart des procédés utilisés sont basés sur l'applica- tion des échangeurs d'ions ou sur la chromatographie sur Sephadex, à des p H ne dépassant pas 7 et, le plus souvent, inférieurs à 6,3 Telle est par exemple la méthode préco- nisée dans les brevets U S nc 3 234 199 ou 3 969 337 On a également eu recours à l'électrophorêse ou à la précipi- tation par des sels et centrifugation, cette dernière mé- thode étant décrite par Montreuil et Mullet C R 250, 1736-7 ( 1960) Plus récemment des travaux sur la sépara- tion des protéines du lait ont été décrits dans les publi- cations de brevets français N O 2 390 906 et 2 399 214 o les protéines, autres que la caséine, sont d'abord extrai- tes avec une résine échangeuse d'anions et ensuite avec de la silice, ou inversement; l'extraction a lieu à des p H compris entre 4 et 7,5. Si les différents procédés de la technique con- nue conviennent bien à la séparation de protéines telles que les lactalbumines ou la sérum-albumine, aucune d'elles ne permet l'obtention efficace et pratique des protéines fixant le fer, c'est-à-dire des transferrines et lacto- ferrines Bien que le lacto sérum soit une matière peu coû- teuse, il ne contient qu'environ 6,5 q de protéines par litre, dont une faible proportion est constituée par les lactoferrines: on est donc amené à traiter d'assez grands volumes de cette matière première pour extraire un faible poids de protéines intéressantes Il est par conséquent important de disposer d'un procédé permettant de réaliser cette extraction avec d'aussi bons rendements que possible. C'est ce but qui est atteint par la présente invention En effet, le nouveau procédé suivant l'invention convient tout particulièrement à l'obtention des protéines ferro chéla- tantes, notamment lactoferrine et transferrine et, d'autre part, des immunoglobulines, à partir du serum de lait res- tant après la séparation des caséines. Dans la suite de la présente description, par mesure de simplification, on ne parle que de la lactofer- rine, mais il est bien entendu que ce terme comprend aussi la transferrine et éventuellement d'autres protéines ferro chélatantes du même type qui peuvent exister dans les laits des différents mammifères. Le procédé suivant l'invention résulte de la constatation que contrairement à la technique antérieu- re la séparation par l'adsorption des protéines sus-in- fiquées se fait le mieux en milieu légèrement basique. Le procédé suivant l'invention consiste à sou- mettre le milieu renfermant la lactoferrine à la fixation sur un adsorbant approprié, en milieu faiblement basique, à savoir dans un liquide de p H supérieur à 7,5 De préfé- rence, le p H du milieu est compris entre 7,7 et 8,8 et mieux encore entre 7,9 et 8,5. Le milieu à traiter suivant l'invention peut être constitué par tout liquide aqueux renfermant les dif- férentes protéines du lait, débarrassé au moins de la ma- jeure partie des caséines; la source la plus pratique est le petit lait, éventuellement concentré ou déjà traité pour l'extraction de protéines autres que la lactoferrine. Après l'adsorption en milieu faiblement basique, et élimination du liquide surnageant, les protéines fixées sur l'adsorbant sont éluées par abaissement du p H au-des- sous de 7 et, de préférence, environ 4; un mode opératoi- re préféré consiste à utiliser un éluant acide dont la force ionique a été augmentée par adjonction d'un sel so- luble. En tant qu'adsorbant, on peut employer avantageu- sement une silice de surface spécifique d'environ 5 à 150 m 2/g, présentant un diamètre poreux de 25 à 250 nm ( 250 à 2 500 A) La silice peut être employée sous une forme pul- vérulente, de granulométrie assez large, par exemple de e à 5 mm Pour l'utilisation en colonne, il est pré- férable de se servir de billes sphériques de diamètres de l'ordre de 10 à 500 Mm. Bien que la silice constitue un excellent sup- port pour la fixation préférentielle de la lactoferrine, d'autres supports peuvent être employés, notamment dif- férents silicates naturels ou artificiels, tels que pierre ponce, terres diatomées, bentonite, etc, ainsi que des alumines activées. La fixation en milieu faiblement basique présen- te l'avantage d'une grande sélectivité vis-à-vis de la lac- toferrine qui n'est accompagnée que d'une partie d'immuno- globulines Les autres protéines, notamment lactalbumines, lactoglobulines, serum albumine et le reste des immuno- globulines demeurent en solution dans le liquide surnageant Après la récupération de la lactoferrine et des immunoglobulines, le support en particulier la silice - est remis en contact avec une solution légèrement basique, par exemple de p H 8 h 9, ce qui le rend apte à servir à une nouvelle extraction à partir d'un produit laitier On voit que le procédé suivant l'invention est beaucoup plus simple que ceux de l'art antérieur; ainsi, par rapport aux brevets français cités plus haut, il suffit d'un seul support minéral au lieu de deux supports dont un est un échangeur d'ions En outre, la fixation a lieu en milieu ba- sique au lieu d'être effectuée à des p H inférieurs à 7,5 et surtout inférieurs à 7, comme c'est le cas de toute la technique antérieure. Dans une variante de l'invention, après l'élu- tion du support par une solution acide, on lave ce support avec une solution basique, ce qui permet d'extraire la frac- tion des immunoglobulines qui n'a pas été éluée en milieu acide; dans cegas, la solution basique peut permettre aus- si la récupération d'un reste de lactoferrine Le lavage, suivant cette variante, peut être effectué avec un p H de 8 à 10 par exemple Cependant, la capacité d'un support de silice, vis-à-vis de la lactoferrine, n'est pas influ- encée par un tel lavage; ce dernier peuit donc être omis lorsqu'on cherche à extraire seulement la lactoferrine. Le procédé, suivant l'invention, s'applique au lactoserum quel que soit le mode d'élimination de la ca- séine qui a conduit à ce lacto-serum: autrement dit, que la caséine ait été précipitée par acidification du lait initial ou bien par l'action d'une enzyme Le procédé con- vient au petit lait tel que, ainsi qu'à des liquides ob- tenus par la remise en solution des solides du lacto-sé- rum, obtenus par tout moyen connu, par exemple ultra fil- tration ou dessiccation. L'invention peut être utilisée pour l'extrac- tion de la lactoferrine de différentes sortes de laits, en particulier de ceux des ovins ou bovins, comme du lait humain Comme les premiers contiennent beaucoup moins de lactoferrine que le second, leur traitement est moins ef- ficace par les techniques connues et c'est là que l'utili- té de l'invention se fait particulièrement sentir. L'invention peut être réalisée dans les condi- tions prévues par Gordon, Ziegler & Basch, Biochim Biophys. Acta 60, 410-411 ( 1962): dans cette variante, la fixation sur un support adsorbant en milieu faiblement basique por- te sur un liquide renfermant la lactoferrine, auquel on a préalablement ajouté un composé du fer, de façon à saturer de fer la totalité de la lactoferrine présente. Le taux d'extraction de la lactoferrine,par le procédé suivant l'invention, est élevé En ce qui concerne la composition des protéines obtenues par ce procédé, à la suite de l'élution du support adsorbant par une solution acide, elle comprend plus de 50 % de lactoferrine, le reste étant constitué principalement d'immunoglobulines La pure- té de la lactoferrine, utilisée essentiellement comme agent Z 505615 bactériostatique, est tout à fait suffisante, et il n'est pas nécessaire de la séparer d'avec les immunoglobulines; en effet il a été démontré, in vitro, que le pouvoir d'in- hibition de la croissance des bactéries pathogunes de à la lactoferrine, était exalté par la présence d'immunoglo- bulines. Dans le cas, industriellement très avantageux, o le support est constitué par de la silice, on trouve une capacité de celle-ci, vis-à-vis de la lactoferrine, de plus de 20 mg par gramme de silice, ce qui justifie plei- nement l'application industrielle du procédé suivant l'in- vention. Dans les conditions opératoires de l'invention, les immunoglobulines, qui accompagnent la lactoferrine, ne subissent aucune dénaturation, etpeuvent, par conséquent, être utilisées dans les industries alimentaires, pharmaceu- tiques et vétérinaires, puisqu'elles conservent toutes leurs propriétés. Les différentes protéines, pouvant être sépar 4 es par le procédé de l'invention, sont identifiables par les méthodes classiques et, en particulier, par celles qui ont été décrites par J Garnier dans Ann Biol anim Bioch. Biophys 1964, 4 ( 2) 163-187 Les exemples qui suivent il- lustrent, non limitativement, la présente invention. EXEMPLE 1 Dans une colonne de 1 cm de diamètre intérieur sont placés 5 g de grains de silice, d'une granulométrie de -200 qm; cette silice présente une surface spécifique de 20 m 2/g et un diamètre poreux de 80 nm. La silice est lavée avec une solution de phosphate disodi- que Na 2 HPO 4 0,005 Y. Dans 1 litre de cette même solution de phosphate, on dis- sout 10 g d'une poudre obtenue par séchage des solides re- cueillis (rétentat) dans l'ultrafiltration d'un lactosérum; cette poudre contient 6,5 g de protéines Le p H de la solu- tion obtenue est ajusté à 8,2 ? On fait ensuite passer la solution à travers la charge de silice dans la colonne susindiquée, à un débit de 60 ml/h; cette charge est ensuite lavée avec une solution 0,005 M de phosphate disodique, de p H 8,2, de façon à chasser tou- tes les protéines non fixées sur la silice. La lactoferrine fixée est alors éluée à l'aide d'une solu- tion d'acide acétique 0,1 N additionnée de Na Cl à la con- centration de 0,5 M On obtient ainsi une fraction de 25 ml de liquide coloré en rose, contenant 40 mg de protéi- nes constituées de 66 % de lactoferrine, le reste étant des immunoglobulines Après un lavage de la charge de si- lice, par passage d'une solution de phosphate disodique 0,005 M, la colonne est prote pour un nouveau cycle d' adsorption. EXEMPLE 2 Dans une opération similaire à celle de l'exem- ple 1, la charge de la colonne est lavée avec un tampon tris-HC 1, p H 9, additionnée de 0,5 M Na Cl, après l'élu- tion à l'acide acétique et récupération de la fraction de lactoferrine Cela fournit une nouvelle fraction de 20 ml contenant 30 mg de protéines constituées essentiellement d'immunoglobulines, de lactoperoxydase et d'une très fai- ble quantité de lactoferrine. Après un lavage de la silice, dans la colonne, par une so- lution de phosphate disodique 0,005 M, la colonne est à nouveau prête à l'emploi. EXEMPLE 3 Le mode opératoire de l'exemple 1 est répété, mais la source de lactoferrine est constituée par 1 litre de petit lait, directement issu de la fabrication de fro- mage, sans concentration, ce liquide étant additionné de 0,005 M de phosphate disodique par litre. Les résultats sont les mêmes que dans l'exemple 1. EXEMPLE 4 Le lavage alcalin de l'exemple 2 est appliqué à un mode opératoire utilisant le petit lait, selon l'e- xemple 3 Cela conduit à des résultats identiques à ceux de l'exemple 2. Revendications 1 Procédé d'extraction de protéines du lait, en particulier de celles qui sont capables de fixer le fer, à partir d'un milieu aqueux substantiellement exempt de caséines, par adsorption sur un support solide et ensuite élution des protéines adsorbées, caracté_risé en ce que l'adsorption a lieu en milieu faiblement basique, de p H supérieur à 7,5, tandis que l'élution est effectuée au moyen d'une solution acide. 2 Perfectionnement suivant la revendication 1, ca- ractérisé en ce que le p H du milieu soumis à l'adsorp- tion est compris entre 7,7 et 8,8, et, de préférence, en- tre 7,9 et 8,5. 3 Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce que l'élution a lieu à un p H inférieur à envi- ron 4, l'éluant contenant-de préférence un sel soluble augmentant sa force ionique. 4 Procédé suivant une des revendications 1 à 3, dans lequel l'adsorbant est constitué par de la silice, dont la surface spécifique est d'environ 5 à 150 m 2/g et le dia- mètre poreux de 25 à 250 nm. Procédé suivant la revendication 4, dans lequel la silice étant sous une forme pulvérulente, sa granulo- métrie est de 5 qm à 5 mm et, de préférence, de 10 à 5001 m. 6 Procédé suivant une des revendications 1 à 3, dans lequel l'adsorbant est constitué par un silicate na- turel ou artificiel ou/et par une alumine activée. 7 Procédé suivant une des revendications précéden- tes, caractérisé en ce que l'élution en milieu acide du support adsorbant est suivie d'un traitement par une so- lution basique et de la récupération des immunoglobulines et de la lactoferrine ainsi libérées. 8 Application du procédé suivant une des revendica- tions l à 7 à l'extraction de la lactoferrine et d'immuno- globulines d'un liquide dérivé du lait, en particulier du lactoserum, éventuellement concentré avant l'extraction. 9 Application suivant la revendication 8, caracté- risée en ce que des immunoglobulines et/ou d'autres pro- téines sont récupérées du liquide restant après adsorption de la lactoferrine.