Brevet FR2502958A1 — publié le 19821008

La présente invention se rapporte à une composition orale. Plus particulièrement, la présente invention concerne une composition orale qui contient un véhicule acceptable en pharmacie, de la dextranase et de l' o diverses maladies de la bouche. Ceux qui sont compétents en la matière savent bien que les caries dentaires et les gingivites sont induites par la formation de la plaque dentaire. La plaque dentaire se forme par l'adhérence de glucanes visqueux aux dents et aux gencives. Ces glucanes sont produits du saccharose par l'action de streptocoques provoquant des caries, que l'on trouve toujours dans la cavité orale. Par conséquent, la dégradation et l'enlèvement des glucanes adhérant aux dents et aux gencives doivent très efficaces pour empêcher les maladies de la bouche telles que les caries dentaires. Etant donné cela, on a proposé diverses techniques pour dissoudre et retirer les glucanes, par exemple, l'hydrolyse avec la dextranase ou 1' O(-1,3 glucanase (voir par exemple publication du brevet japonais avant examen NI 58 243/1975, publication du brevet japonais NO 35 136/1978, publication du brevet japonais N'15 443/1980, publication du brevet japonais N0 50 006/1980, brevets U.S. NO 3 622 661, N0 3 912 594 et NO 4 115 546). Cependant, on ne peut s'attendre à un effet satisfaisant de prévention des caries dentaires dans un tel art antérieur. La raison semble enêtre la suivante. Les glucanes responsables de la plaque dentaire peuvent,en général, être grossièrement subdivisés en deux groupes, c'est-à-dire un dextrane soluble dans l'eau (fréquemment appelé ci-après "dextrane") et un glucane insoluble dans l'eau (fréquemment appelé ci-après "glucane insoluble"). Le dextrane a une forte proportion de liaison o( -1,6 glucosidique et peut être totalement hydrolysé uniquement avec la dextranase qui peut spécifiquement scinder la liaison Au contraire, le glucane insoluble a une forte proportion de liaison " l'art antérieur ci-dessus. Pour cette raison, un usage combiné de dextranase et d' 0( -1,3 glucanase a été proposé pour dégrader et retirer simultanément le dextrane et 1' 0 sont toutes deux efficaces pour réduire la plaque et - l'administration simultanée des deux enzymes a pour résultat une effet supplémentaire. Cependant, il est difficile de dire qu'un effet suffisant de l'administration simultanée d' 3 2502958 de sens étant donné l'erreur standard. Par ailleurs, Guggenheim et autres n'ont révélé aucun effet de l'usage simultané de la dextranase et de l' o( -1,3 glucanase sur la prévention des caries dentaires des animaux des champs. Entre/emps, dans le brevet britannique NI 1 385 095 est révélée une préparation orale contenant la dextranase et la cariogénanase.Cependant, la cariogénanase utilisée dans la préparation orale est différente de 1' o cariogénanase est inactive sur le nigérane et le nigérose. Au contraire, ceux qui sont compétents en la matière savent bien que 1' C1,3 glucanase scinde spécifiquement 1' c -1,3 glucane qui est un glucane ramifié possédant une proportion importante de liaisons o 1' c Comme cela est apparent à la lecture de ce qui précède, une composition orale contenant, comme ingrédients actifs, de la dextranase et de l' O la dextranase seule ou l' o Etant donné ce qui précède, les présents inventeurs ont effectué des recherches extensives et intensives sur un usage efficace et combiné de dextranase et d' " -1,3 glucanase, afin de développer une composition orale très utile pour la prévention des maladies de la bouche. 4 2502958 Par suite, les présents inventeurs ont trouvé de façon inattendue que les maladies de la bouche pouvaient- non seulement être empêchées mais également supprimées par l'administration combinée de dextranase et d' 0" -1,3 glucanase à un rapport d'unitésd'enzyme de 1:2 à 2:1. Par ailleurs, les présents inventeurs ont trouvé de façon inattendue et surprenante que l'usage combiné de dextranase et d' 0 avait un effet synergique sur la prévention et la suppres- sion des maladies de la bouche. La présente invention a été accomplie en se basant sur ces nouvelles découvertes. Le terme "unité d'enzyme" pour la dextranaseutilisé iciest un critère de l'activité de la dextranase et "une unité d'enzyme" pour la dextranase est définie comme la quantité de l'enzyme capable de libérer 1, . M de sucre réducteur sous forme de glucose par minute, du dextrane. Le procédé pour mesurer l'activité de la dextranase sera décrit ci-après. Le terme "unité d'enzyme" pour 1' 0 minute à partir de glucane insoluble. Le procédé pour. mesurer l'activité de 1' OK -1,3 glucanase sera décrit ci-après. En conséquence, la présente invention a pour objet une composition orale contenant, comme ingrédients actifs, de la dextranase et de 1' " -1,3 glucanase empêchant très efficacement les maladies de la bouche. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence au dessin schématique annexé donné uniquement à titre d'exemple illustrant un mode de réalisation de l'invention,et dans lequel: 2502958 - la figure unique est un graphique montrant l'activité de dégradation du substrat de la dextranase et de 1' o -1,3 glucanase par rapport au cas o on les utilise seules et par rapport au cas o on les utilise en combinaison, la durée de la réaction en minutes étant indiquée sur l'axe des abscisses et le sucre solubilisé sur l'axe des ordonnées. Sur cette figure, on a = dextranase, X = o d'enzyme de 1:2 à 2:1 par rapport à 1' o Selon un autre aspect de l'invention, on prévoit unl procédé pour la prévention et la suppression des maladies de la bouche, qui consiste à administrer, à un patient, une quantité efficace d'une composition orale qui contient un véhicule acceptable en pharmacie, de la dextranase et de 1' rapport à 1' (-1,3 glucanase. Ceux qui sont compétents en la matière savent bien que la dextranase et 1' c -1,3 glucanase ont le type endo et le type exo. Selon l'invention, on peut utiliser le type endo et le type exo de la dextranase et de 1' C 6 2502958 employées comme ingrédients actifs dans une composition orale selon l'invention. Pour les micro-organismes capables de produire la dextranase, on connait des micro-organismes comme les moisissures, telles que les champignons appartenant au genre Penicillium, Aspergillus, Spicaria, Chaetomium, Verticillium, Fusarium et Helminthosporium, des bactéries telles que celles appartenant au genre Lactobacillus, Cellvibrio, Cytophaga, Brevibacterium, Pseudomonas, Flavobacterium et Corynebacterium. La dextranase que l'on peut employer comme l'un des ingrédients actifs de la composition orale selon l'invention peut être une dextranase produite de chacune des moisissures et bactéries ci-dessus. Cependant, parmi les dextranases produites par les micro-organismes ci-dessus, la dextranase produite par des micro-organismes appartenant au genre Corynebacterium est utilisée de préférence comme l'un des ingrédients actifs de la composition orale selon l'invention parce qu'une telle dextranase exerce des effets de prévention et de suppression particulièrement excellents sur les maladies de la bouche quand on l'utilise avec 1' o(-1,3 glucanase. Comme exemples de micro-organismes que l'on emploie de préférence pour la production de la dextranase à employer dans la composition orale selon l'invention, on peut mentionner une souche Corynebacterium AK-01 (déposée à l'Institut Technique de Recherche de l'Industrie Microbienne, Agence de la Science Industrielle et de la Technologie, au Japon, sous le N FERM N 2505) et tous les mutants qui peuvent être produits à partir des micro- organismes appartenant au genre Corynebacterium au moyen de divers procédés de variation comme une irradiation aux rayons ultraviolets, une radiation aux rayons X, un traitement à la nitrosoguanidine, un traitement à la moutarde azotée et un traitement à l'acide nitreux et qui sont capables de produire de la dextranase, par exemple de ces mutants se montrant négatifs à la protéase et négatifs à la cellulose, ou mutants artificiels. 7 2502958 Une dextranase à utiliser comme l'un des ingrédients actifs de la composition orale selon l'inven- tion peut être produite à partir des micro-organismes ci- dessus mentionnés au moyen de procédés conventionnels de production de dextranase comme cela est décrit, par exemple, dans Jan-Christer Janson et Jerker Porath, Methods in Enzymology, 8, 615-621 (1966); Chalet et autres, Applied Microbiology volume 20, No 3 421-426 (1970); Fukumoto et autres, J. Biochem., 69,1113-1121 (1971); Hanada et autres, Agricultural and Biological Chemistry, 48, N0 1, 15-26 (1974); la publication du brevet japonais NI 47-37029 (1972); le brevet U.S. N0 3 912 594; et la publication du brevet japonais N0 53-46918 (1978). Parmi les procédés de production de dextranase ci-dessus mentionnés, celui révélé dans la publication du brevet japonais N0 53-46918 (1978) est employé de préférence pour la production de dextranase à utiliser comme l'un des ingrédients actifs de la compo- sition orale selon l'invention, du point de vue facilité du processus et économieparce que ce procédé ne nécessite pas un moyen d'inductionet du point de vue activité de la dextranase préparée. On décrira ci-après un exemple représentatif des procédés de production de dextranase à utiliser comme l'un des ingrédients actifs de la composition orale selon l'invention. Afin de produire de la dextranase, un micro- organisme produisant la dextranase est mis en culture dans un milieu nutritif naturel ou synthétique. Le milieu nutritif à employer peut être soit du type liquide ou solide, mais il est préférable, pour la production à une échelle commerciale, d'employer une culture submergée en milieu nutritif liquide avec aération-agitation. Les sources nutritives du milieu peuvent être toutes celles habituellement utilisées dans la technique pour la mise en culture d'un micro-organisme. Par exemple, comme sources de carbone assimilable, des matériaux tels que le dextrane, le saccharose, des citrates, de l'amidon soluble et de la 8 2502958 mélasse peuvent être employés. Comme source d'azote dans le milieu nutritif, des matériaux tels qu'une peptone, de l'extrait de viande, de l'extrait de levure, de l'hydrolysat de caséine, de la poudre de soja dégraissée et des sels d'ammonium peuvent être employés. Comme sels inorganiques, on peut employer des sels tels que ceux avec l'acide phosphorique, du magnésium ou du potassium. Un dextrane, par exemple "Dextran T10" (fabriqué et vendu par Pharmacia Co., Ltd, Uppsala, Suède) ou un dextrane produit par l'action des streptocoques provoquant les caries dentaires peut avantageusement être Incorporé, en tant que moyen d'induction, dans le milieu nutritif pour obtenir un rendement élevé de dextranase. La température de culture est comprise entre 5 et 370C, de préférence entre 20 et 370C. La valeur du pH du milieu de culture peut être ajustée à 5,5 à 9,0, de préférence entre 6,5 et 8,5. La durée de culture varie selon d'autres conditions de la culture, mais elle est habituellementde l'ordre de 3 à 7 jours dans une culture stationnaire ou environ 1 à 2 jours dans une culture avec aérationagitation. Le bouillon de culture o le micro-organisme s'est développé de façon abondante dans les conditions ci-dessus mentionnées est soumis à une centrifugation stérile pour séparer la solution d'enzyme brute du bouillon de culture. La solution d'enzyme brute ainsi préparée peut être purifiée par des procédés conventionnels tels qu'une concentration sous pression réduite, un dessalage avec du sulfate d'ammonium, une précipitation avec un solvant et un fractionnement en colonne, que l'on peut employer seul ou en combinaison. L'activité de la dextranase ainsi produite est mesurée comme suit. On emploie, comme substrat,du "Dextran T70" (dénomination commerciale d'un dextrane fabriqué et vendu par Pharmacia Co., Ltd., Uppsala, Suède). A 4 ml d'une solution à 2,5% en poids/volume du dextrane, on ajoute 14 ml d'une solution de tamporEde phosphate à 0,02 M et 2 ml de la solution de l'enzyme. On laisse le mélange 9 2502958 résultant au repos à 40 C pendant 10 minutes sous un pH de 7,0, puis on détermine la quantité accrue du sucre réducteur au moyen du procédé de Somogyi-Nelson CM. Somogyi, J. Biol. Chem., 195,19 (1952)J. Une unité d'enzyme pour la dextranase est définie comme étant la quantité d'enzyme capable de libérer 1 /o4M de sucre réducteur sous forme de glucose par minute, de dextrane. Par ailleurs, pour les micro-organismes capables de produire 1' " -1,3 glucanase, on conna t des micro- organismes tels que des moisissures comme des champignons appartenant au genre Penicillium et Trichoderma harzianum, des bactéries comme celles appartenant au genre Pseudomonas et Flavobacterium. L' o -1,3 glucanase que l'on peut employer comme l'un des ingrédients actifs de la composition orale selon l'invention peut être celle produite à partir de toute moisissure et bactérie ci-dessus. Cependant, parmi les c -glucanases produites avec les micro-organismes ci- dessus, l' c -1,3 glucanase produite à partir de micro- organismes appartenant au genre Pseudomonas est de préfé- rence utilisée comme l'un des ingrédients actifs de la composition orale selon l'invention parce qu'une telle dextranase exerce des effets de prévention et de supres- sion particulièrement excellents sur les maladies de la bouche quand on l'utilise en combinaison avec la dextranase. Comme exemples des micro-organismes que l'on emploie de préférence pour la production d' 0 l'Institut Technique de Recherche de l'Industrie Micro- bienne, Agence de Science Industrielle et Technologie, Japon, sous le numéro FERM N 2505) et tous les mutants qui peuvent être produits à partir des micro-organismes appartenant au genre Pseudomonas au moyen de divers procédés conventionnels de variation, et capables de produire l' a cellulose, ou bien des mutants artificiels. L' "-1,3 glucanase à utiliser comme l'un des ingrédients actifs de la composition orale selon l'inven- tion peut être produite à partir des micro-organismes ci-dessus au moyen de procédés conventionnels de production W -1,3 glucanase comme cela est décrit par exemple dans ce qii suit: Shiro Hasegawa et John H. Nordin, J. Biol. Chem., 244(20), 5460-5470 (1969); Kohei Imai et autres, Agri. Biol. Chem., 41(8), 1339-1346 (1977); KoheiImai et autres, Agric. Biol. Chem., 41(10), 1889-1895 (1977); Tsunoda et autres, Agric. Biol. Chem., 42(5), 1045-1053 (1978); Guggenheim et autres, J. dent. Res., 51,394-402 (1972); publication du brevet japonais N 50-20155 (1975); et publication du brevet japonais N 56-1070 (1981). Parmi les procédés de production d' c à utiliser comme l'un des ingrédients actifs de la composi- tion orale selon l'invention, du point de vue facilité du processus et économie, parce que ce processus ne nécessite pas un moyen d'induction et du point de vue activité de 1' c-1,3 glucanase préparée. Un exemple représentatif des procédés de production d' "C-1,3 glucanase à utiliser comme l'un des ingrédients actifs de la composition orale selon l'inven- tion sera décrit ci-après. Afin de produire de l' Q dans un milieu nutritif liquide avec aération-agitation. Les sources nutritives du milieu peuvent être toutes celles habituellement utilisées dans la technique de la culture d'un micro- organisme. Par exemple, comme sources nutritives, on peut mentionner l'amidon, l'amidon soluble, le maltose, le galactose, le dextrose, la poudre de soja, la liqueur de trempage de mais, la peptone, de l'extrait de viande, de la caséine, de l'azote inorganique, divers sels inorganiques et divers ions métalliques. Un Oç -1,3 glu- cane peut avantageusement être incorporé, comme moyen d'induction, dans la milieu nutritif pour obtenir une production élevée en o(-1,3 glucanase. La température de la culture est comprise entre 10 et 371C et de préfé- rence entre 20 et 300C. La valeur du pH du milieu de culture peut être ajustée à 5,0 à 8,0 et de préférence entre 6,0 et 7,5. La durée de la culture varie selon d'autres conditions de la culture, mais elle est habituel- lement de l'ordre de 1 à 3 jours. Le bouillon de culture o le microorganisme s'est développé abondamment dans les conditions ci-dessus mentionnées est soumis à une centrifugation stérile pour séparer la solution de l'enzyme brute du bouillon de culture. La solution de l'enzyme bruteainsi préparée peut être incorporée dans un véhicule acceptable en pharmacie, avec la dextranase>comme ingrédients actifs. Mais il est préférable que la solution de l'enzyme brute soit purifiée par des procédés conventionnels comme une concentration avec une membrane; une concentration sous pression réduite; un dessalage avec du sulfate d'ammonium, du sulfate de sodium ou analogue; une précipitation diffé- rentielle avec un solvant tel qu' l'acétone ou l'éthanol; et une précipitation au point iso-électrique. Ces procédés peuvent être effectués seuls ou en combinaison. L'activité de 1' cd -1,3 glucanase ainsi produite est mesurée comme suit. Un glucane insoluble d'une souche Streptococus mutans OMZ-176 (streptocoque provoquant la carie dentaire) est utilisé comme substrat. A 8 ml d'une solution à 5% poids/volume du glucane insoluble, on ajoute 10 ml d'une solution de tamponsde phosphate à 0,02 M, 3 ml d'eau distillée et 2 ml de la solution d'enzyme. On laisse le il 12 2502958 mélange résultant au repos à 40 0C pendant 5 minutes sous un pH de 6,5 puis on détermine la quantité accrue de sucre réducteur au moyen du procédé de Somogyi-Nelson [M. Somogyi, J. Biol. Chem., 195,19 (1952)3. Une unité d'enzyme pour l' o 1' O(-1,3 glucanase et un véhicule acceptable en pharmacie. Comme véhicule acceptable en pharmacie, on peut mentionner un véhicule non consommable tel qu'une pâte dentifrice, une poudre dentifrice, un dentifrice solide, un bain de bouche, une pulvérisation buccale, un onguent à frotter, un chewing-gum, une éponge d'application et un agent de traitement des dentiers; et un véhicule consommable tel qu'un bonbon, un aliment, une boisson, un chocolat, une pastille, un caramel, une tablette et un morceau de caramel au beurre. Selon la présente invention, il est essentiel que le rapport d'unitésd'enzyme de dextranase à l'0 dextranase et de 1' x -1,3 glucanase ne s'exerce pas. Selon la présente invention, il est préférable que la dextranase et 1' 0 par gramme de la composition orale. Comme on l'a mentionné ci-dessus, selon un autre aspect de l'invention, on prévoit un procédé pour la prévention et la suppression des maladies de la bouche qui consiste à administrer, à un patient, une quantité effec- tive d'une composition orale selon l'invention. La dose quotidienne de la composition orale de l'invention variera naturellement selon l'âge et la condition du patient. Cependant, la composition orale peut normalement être administrée en doses divisées de l'ordre de 1,5 à 20 unités d'enzyme par jour et par personne en termes de la quantité de dextranase et d' oç-1,3 glucanase. Comme on l'a expliqué ci-dessus, la composition orale selon l'invention est très efficace, non seulement pour la prévention de diverses maladies de la bouche, mais également pour supprimer la progression des caries. Exemple de référence N0 1 Préparation de la dextranase Un milieu de culture liquide (ajusté à pH 8,0), contenant 1,5% poids/volume de polypeptone, 0,1% poids/ volume d'extrait de levure, 0,2% poids/volume de phosphate monopotassique, 0,2% poids/volume de phosphate de mono- ammonium et 0,1% poids/volume de sulfate de magnésium, a été inoculé d'une souche des micro-organismes appartenant 14 2502958 au genre Corynebacterium, Corynebacterium AK-01 (déposée à l'Institut Technique de la Recherche de l'Industrie Microbienne, Agence de Science et de Technologie Indus- trielles,Japon, sous le numéro FERM 2505). La culture a été effectuée sous aération-agitation à 25 C pendant heures. Le bouillon de culture ainsi obtenu a été soumis, aseptiquement, à une centrifugation pour retirer les cellules et les débris de cellule. La culture sur- nageant, à son tour, a été soumise à un dessalage avec du sulfate d'ammonium, une adsorption et une désorption sur une colonne de DEAE, et une filtration avec du Bio-gel pour purifier la dextranase. On a entrepris un essai sur la présence d'autres enzymes par rapport à la poudre d'enzyme préparée. Par suite, on a trouvé que l'enzyme préparé était négatif à la protéase, négatif à la cellulose et négatif à la laminaranase. L'enzyme ainsi obtenu a été lyophilisé pour préparer la poudre d'enzyme. La poudre d'enzyme a été maintenue à 4 C avant son utilisation. Par ailleurs, on a entrepris un essai sur la toxicité de la dextranasepréparée ci-dessus, vis-à-vis de rats. Par suite, on a trouvé que la valeur de LD50 (dose létale moyenne) était supérieure à 500.000 unités d'enzyme par kilogramme de rat. Exemple de référence N 2 Préparation de l' PC-1,3 glucanase Dans un réservoir de culture de 200 litres, on a introduit 120 litres d'un milieu de culture liquide (ajusté à pH 7,0) contenant 1,0% poids/volume de polypeptone 0,1% poids/volume d'extrait de levure, 1,0% poids/volume d'amidon soluble, 0,1% poids/volume de chlorure de magnésium, 0,05% poids/volume de chlorure de calcium et 0,05% poids/volume de phosphate monopotassique, et le milieu de culture liquide a été stérilisé à chaud. Le milieu de culture liquide stérilisé a été inoculé de 500 ml d'un bouillon de cultureensemencéd'une souche des micro-organismE appartenant au genre Pseudomonas, Pseudomonas SK-01 (déposé à l'Institut de Recherche Technique de l'Industrie Microbienne, Agence de Science et technologie industrielles, Japon, sous le numéro FERM 4273), lequel bouillon avait précédemment été mis en culture tout en agitant dans la même sorte de milieu liquide que celui ci-dessus mentionné. La culture sous aération-agitation a alors été effectuée à 250C pendant 40 heures. Le bouillon de culture obtenu a été soumis à une centrifugation pour retirer les cellules et les débris de cellule. Ainsi, on a obtenu 110 litres d'un fluide surnageant. Au fluide surnageant on a ajouté 70% en volume d'éthanol pour précipiter 1' C nase. L' I -1,3 glucanase précipitée a été soumise à une adsorption et une désorption sur une colonne de DEAE, et on a filtré avec Bio-gel pour purifier 1' " -1,3 glucanase. L'enzyme ainsi obtenu a été lyophylisé pour préparer la poudre d'enzyme. On a entrepris un essai sur la présence d'autres enzymes par rapport à la poudre d'enzyme préparée. Par suite, on a trouvé que l'enzyme préparé était négatif à la protéase, négatif à la cellulose et négatif à la laminaranase. La poudre d'enzyme a été maintenue à 40C avant son utilisation. Par ailleurs, on a entrepris un essai sur la toxicité de 1' Q{/-1,3 glucanase préparée ci-dessus, vis-à- vis de rats. Par suite, on a trouvé que la valeur de LD50 (dose létale moyenne) était supérieure à 75.000 unités d'enzyme par kilogramme de rat. Expérience de Référence N01 Essais des enzymes sur l'activité de dégradation du substrat Les essais ont été entrepris afin d'évaluer les activités de dégradation du substrat de la dextranase et de 1' C -1,3 glucanase par rapport au cas o on les utilise seules et par rapport au cas o on les utilise en combi- naison. Du glucane insoluble dans l'eau a été préparé comme suit. Un milieu liquide contenant 3% poids/volume d'un bouillon de soja de trypticase a été inoculé d'une souche de Streptococcus Mutans OMZ-176, puis on l'a soumis à une culture stationnaire à 37WC pendant 20 heures. Le bouillon de culture résultant a été soumis à une centrifu- gation pour retirer les cellules et les débris de cellule. La culture surnageant,à son toura été soumise à un dessa- lage. Le précipité résultant a été recueilli au moyen d'une centrifugation et dissous dans l'eau distillée. La solution obtenue a été dialysée dans un tampon de phosphate à 0,1 M (pH 6,8) pour préparer une solution insoluble d'enzyme producteur de glucane. A la solution insoluble d'enzyme producteur de glucane on a ajouté, comme substrat, du saccharose en une quantité de 10% poids/volume et on a laissé le mélange résultant réagir à 370C pendant 48 heures. Le mélange réactionnel a été soumis à une centrifugation pour obtenir du glucane insoluble comme précipité. Le glucane insoluble ainsi obtenu a été mis en suspension dans de l'eau distillée et la suspension a été soumise de nouveau à une centrifugation. Le traitement du glucane insoluble avec la trypsine a été effectué à 37WC pendant heures pour retirer les protéines contenues dans le glucane insoluble. Le mélange réactionnel résultant a été soumis à une centrifugation pour recueillir le glucane insoluble sous forme de précipité et le précipité a été lavé avec de l'eau distillée et lyophilisé pour préparer un glucane insoluble séché. Le glucane insoluble ainsi obtenu a été ajouté à un tampon de phosphatesà 0,1 M (pH 6,5) à un rapport de 1,4 mg/ml pour former une suspension du substrat et la suspension résultante a été maintenue à 37WC. Par ailleurs, chacun des enzymes préparés aux exemples de référence 1 et 2 a été dissous dans un tampon de phosphatesà 0,1 M (pH 6,5) puis dilué. On a ainsi formé, comme solutions d'enzymes, une solution de dextra- nase (0,03 unité d'enzyme/ml); et une solution d'enzyme d' 0 du substrat, lequel mélange avait été soumis à un traite- ment thermique de la même façon qu'on l'a mentionné ci- dessus pour arrêter la réaction enzymatique. Comme on peut le voir par les résultats illustrés sur la figure, l'usage combiné des deux enzymes a un effet synergique sur la solubilisation et la dégradation du glucane insoluble produit par la souche cariogène cidessus mentionnée OMZ-176 en comparaison à l'usage seul de chaque enzyme. Expérience de référence N02 On a répété sensiblement le même processus qu'à l'expérience de référence N01 mais en employant, comme substrat, des glucanes insolubles produits par d'autres souches cariogènes, c'est-àdire Streptococcus mutans souche AHT, souche BHT, souche MT-6 et souche HS-6 respec- tivement. On a déterminé l'activité de dégradation du substrat dans chaque cas de l'usage seul et de l'usage combiné des enzymes ci-dessus. Par suite, on a pu observer un effet synergique semblable dans la dégradation du substrat, à celui de l'expérience de référence NI 1, quand on utilisait les deux enzymes ensemble. Pour illustrer l'effet synergique de l'usage combiné des deux enzymes en plus de détail, les essais sur animaux qui suivent ont été entrepris en tant qu'expériences N0 1 et N02. 18 2502958 Expérience N01 Les essais sur animaux qui suivent ont été entrepris avec des hamsters dorés qui sont considérés comme tartun modèle pour les caries à surface lisse, afin d'évaluer l'effet de prévention et de suppression des caries de la dextranase et de 1' o cas o les utilise en combinaison. Les essais sur animaux ont été entrepris sur seize groupes d'hamsters dorés de 25 jours, chaque groupe consistant en dix animaux. Les hamsters dorés de chaque groupe ont reçu pendant 2 jours, en tant qu'eau potable, de l'eau distillée avec, en suspension, 107/ml cellules de culture fraîche d'une souche cariogène résistant à la streptomycine, Streptococcus mutans 0MZ-176. Pendant cette période,ils ont reçu, comme régime, le régime pulvérulent induisant les caries "Diet 2000" fabriqué et vendu par Nihon Kurea K.K., Japon. Après avoir confirmé le dépôt de la souche OMZ-176 dans les cavités orales des hamsters de chaque groupe, ils ont reçus de l'eau distillée (10 à 20 g/animal/jour) et le régime ci- dessus mentionné "Diet 2000" (10 à 15 g/animal/jour) contenant une seule sorte de dextranase préparée à l'exemple de référence N 1 ou d' " -1,3 glucanase préparée à l'exemple de référence N 2 ou bien un mélange d'entre elles à un rapport variable d'enzymescomme cela est indiqué au tableau 1. Les barèmes de temps pour l'administration des enzymes et les résultats sont résumés au tableau 1 qui suit. Tableau 1 GroupeQuantité d'en-Résul- Barême de temps zyme donné1) t tpour 1l'adminis- N des - tration des nzyme Enzyme caries 4 enzymes 2)II 3) ç 1I 1 1 5,2 Groupes d'essai , 2 de prévention des 0o 2 1,5 9,> 0caries: enzyme $ h' 3 0,5 1 10,5 donné jusqu'au P4.4' -P 6lème jour 4 2 O 19,3 (autopsie) immé- 9, diatement après 1r 5 0 2 22,4 infection avec o 6 0,1 19,6 souche OMZ176 m 6 I 0,1 19,6 o h 7 0,1 1 21,4 8 1 1 30,6 Groupes d'essai 9 I 0,5 38, 9 de suppression h S 1 0O, 5 1 33,4 des caries (D0 10 0,5 I 33,4 a_> O1-10 0,5 enzyme donné du _1_-If___ _ _ __ _ _ __ _ _ _ 3lème jourau I_11 2O78, 1 t6ième jour après 7, infection avec j 12 O 2 89,2 la souche Cuo OMZ-176 zU 13 1 0,1 76,4 OMZ-176 0 C 14 0,1 1 81,0 Autopsie au 3lème 5) 0 29,0 jour après infection par la souche OMZ-176 Autopsie au 61ème o jour après infec- ) e 16 0) 0 139,5 tion par la E-1> souche OMZ-176 Notes: 1) Unités d'enzyme/g du régime "Diet 2000" et de l'eau distillée. 2) Dextranase. 3) w -1,3 glucanase. 4) Mesurés par le procédé de Keyes [Keyes P.H.: J. Dent. Res., 23, 439444 (1944)3: la valeur du cas o 100% des dents de hamster ont souffert de caries est évaluée à 282. ) "Diet 2000" et de l'eau distillée sans aucun enzyme incorporé ont été donnés, aux deux témoins. Expérience N 2 On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'expérience N 1 par rapport à quatorze groupes d'hamsters dorés de 25 jours à l'exception que les quantités des enzymes ont été modifiées comme l'indique le tableau 2. Les barèmes de temps pour l'administration des enzymes ainsi que les résultats sont résumés au tableau 2 qui suit. Tableau 2 Quantité d'en- Groupe Quaeit d) Resul- Barème de temps Noupzyedé tats pour l'adminis- Enzyme Enzyme des 4) tration des _ _ I II) _ caries enzymes 2I 3) I 17 1 1 54 Groupes d'essai h O o 7, de prévention des P.. C d _- caries: enzyme 18 1 O 24,2 donné jusqu'au 6lème jour 19 O 1 27,8 (autopsie) immé- 2O 19 diatement après 2 9,3 infection avec la Pt a r 21 0 2 23,2 souche OMZ-176 0o ig I Groupes d'essai de suppression O > o 22 1 1 37,2 des caries h, _. enzyme donné du 23 1 O 84 7 3lème jour au 61ème jour après Ji 24 O 1 97,0 infection avec a la souche 25 2 0 79,8 OMZ-176 OMZ- 176 h4 26 O 2 91,2 C 27 5 0 63,6 o 28 O 5 76,2 Autopsie au )X 31ème jour après 29 5) 0 3, 295 O O 34,2 infection par la souche OMZ-176 À.^ Autopsie au o S 306)O 1 61ème jour après 143,9 oinfection par la souche OMZ-176 Note: 1) à 5) cidessus ont la même signification que pour le tableau 1. Comme cela est apparent par les résultats des caries des tableaux 1 et 2, les caries des hamsters ont été empêchées de façon synergique et supprimées en administrant la dextranase et 1'0 -1,3 glucanase en combinaison à un rapport d'unitésd'enzyme de 1:2 à 2:1. Au contraire, les caries n'ont pu être empêchées ni supprimées efficacement avec de la dextranase ou de 1' Oc-1,3 glucanase administrée seule ni avec la dextra- nase et 1' " gamme ci-dessus définie. Expérience N03 Les essais sur animaux qui suivent ont été entrepris sensiblement de la même façon qu'à l'exemple 1 mais en utilisant, à la place des hamsters, des rats qui sont considérés comme étant un modèle pour les caries par fissure, donc les effets de prévention et de suppres- sion des caries de dextranase et d' " consistant en dix animaux. Les barèmes des temps pour l'administration des enzymes et les résultats obtenus sont résumés au tableau 3 qui suit. *Tableau 3 Quantité d'en- Groupe Quantité d'en Résul- Barème., de temps zednéO tats pour l'adminis- NO des tration des Enzyme Enzyme caries 4) tration des I 2) 3) 2) 3) caries enzymes aI) o 31 1 1 6,4 Groupes d'essai m 32 1 0 5 7 4 de prévention des a)JC 32 I 0,5 7,4 a O s caries: enzyme h4 -i 33 0,5 1 9,5 donné jusqu'au m -. 61ème jour (autopsie) o 34 2 0 13,0 immédiatement 2 17 5 après infection XCli 7, avec la souche o 36 1 0,1 11,6 OMZ-176 a 37 0,1 I 14,0 o O O o.oo38 I 1 29,0 Groupes d'essai 39 1 0,5 34,1 de suppression (DS 39 I 0,5 34,1 X o des caries: 0,5 1 32,5 enzyme donné du 1 465 0 0 95,11 E-i> infection avec la souche OMZ-176 Notes: 1) à 3) et 5) ci-dessus ont les mêmes significations que pour le tableau 1. 4) mesurés par le procédé de Keyes: la valeur du cas o 100% des dents des rats ont souffert de caries est évalué à 282. Expérience N14 On a répété sensiblement le même processus qu'à l'expérience N03, par rapport à quatorze groupes de rats SD de 20 jours, mais avec les quantités des enzymes modifiées comme indiqué au tableau 4. Les barèmes des temps pour l'administration des enzymes ainsi que les résultats sont résumés au tableau 4 qui suit. Tableau 4 Quantité d'en- Groupe zyme donné 1) Résul- Barême de temps NO tats pour 1l'adminis- Enzyme Enzyme des 4) tration des I 2) 3) caries enzymes o 47 I 1 6,2 Groupes d'essai $ À1> H de prévention des caries: enzyme donné o 48 1 O 11,3 jusqu'au 61ème C 49 O117 jour (autopsie) 49 0 I 15,7 CoX 5, immédiatement o 50 2 O 10,8 après infection S 51 O 2 13,1 avec la souche r= 51 0 2 13,1 o OMZ-176 Or mi s a) Groupes d'essai h 52 I 1 24,4 de suppression Q-i U - des caries: enzyme donné du 53 1 O 75,3 31ème jour au o 54OGlè 85,361ème jour après 54 O0 I 85,3 infection avec o 2 0 68,5 la souche 56 O 2 80,2 OMZ-176 Cd 57 5 O 59,0 58 O 5 63,2 ) O O 19,5 Autopsie au 31ème 595) 0 0 19,5 jour après infection par la souche OMZ-176 o ) 606) Autopsie au 61ème E-4 60 O O 91,2 jour après infection par la souche OMZ-176 Note: 1) à 5) ci-dessus ont les mêmes significations que pour le tableau 3. Comme cela est apparent par les résultats des caries des tableaux 3 et 4, les caries des rats sont empêchées et supprimées de façon synergique quand la dextranase et l'".-1,3 glucanase sont administrées en combinaison à un rapport d'unitésd'enzyme de 1:2 à 2:1. Au contraire, les caries n'ont pu être empêchées ni supprimées efficacement en administrant uniquement de la dextranase ou de 1' c -1,3 glucanase ou bien en administrant de la dextranase et de 1' c ci-dessus définie. Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer la présente invention en plus de détail mais sans en aucun cas en limiter le cadre. Exemple 1 On a préparé une pâte dentifrice ayant la formule qui suit, o tous les chiffres sont en pourcentages poids/poids. Phosphate dicalcique dihydraté 45 Glycérine 25 Carboxyméthylcellulose de sodium 0,5 Carroghénines 0,5 Polysorbate 80 1,0 Saccharine (sel de sodium) 0,15 Dextranase (activité d'enzyme: 100.000 unités d'enzyme/g) 0,002 o Exemple 2 Un bain de bouche liquide a été préparé avec la formule qui suit o tous les chiffres sont en pour- centages poids/poids. Chlorure de calcium 0,2 Glycérine 5,0 Ethanol 4,0 1-Menthol 0,1 Huile de cannelle 0,1 Saccharine (sel de sodium) 0,1 Dextranase (activité d'enzyme: 100.000 unités d'enzyme/g) 0,002 CC-1,3 glucanase (activité d'enzyme: 15.000 unités d'enzyme/g) 0,02 Eau 90,478 Exemple 3 On a préparé une pastille ayant la formule qui suit o tous les chiffres sont en pourcentages poids/poids. Gomme arabique 6,0 Glucose 70 Galactose 1,0 Dextranase (activité 'd'enzyme: 100.000 unités d'enzyme/g) 0,003 o(-1,3 glucanase (activité d'enzyme: 15.000 unités d'enzyme/g) 0,03 Eau 22,967 Exemple 4 On a préparé un chewing-gum ayant la formule qui suit o tous les chiffres sont en pourcentages poids/ poids. Gomme base 20 Carbonate de calcium 1,0 Sirop d'amidon 20 Glucose 57 Galactose 1,0 Dextranase (activité d'enzyme: 100.000 unités d'enzyme/g) 0,003 3 -1,3 glucanase (activité d'enzyme: 15. 000 unités d'enzyme/g) 0,03 Arome 0,967 28 2502958 R E V E N D I C A T I 0 N S 1.- Composition orale, caractérisée en ce qu'elle contient un véhicule acceptable en pharmacie, de la dextranase et de 1' par rapport à l'O-1,3 glucanase. 2.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la dextranase est contenue en une quantité de 0,5 à 100 imités d'enzyme par gramme de la composition orale. 3.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l' c de la composition orale. 4.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la dextranase est préparée à partir d'un micro-organisme de biosynthèse de la dextranase appartenant au genre Corynebacterium. 5.- Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le microorganisme de biosynthèse de la dextranase précité est une souche Corynebacterium AK-01 déposée à l'Institut Technique de Recherche de l'Industrie Microbienne, Agence de Science et Technologie Industrielles, Japon, sous le numéro FERM N 2505. 6.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que 1'o glucanase appartenant au genre Pseudomonas. 7.- Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que le microorganisme de biosynthèse de l' 0 -1,3 glucanase est une souche Pseudomonas SK-01 déposée à l'Institut Technique de Recherche de l'Industrie Microbienne, Agence de Science et Technologie Industrielles, Japon sous le numéro FERM N 4273. 8.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le véhicule acceptable en pharmacie précité est un véhicule non consommable choisi dans le groupe consistant en pâte dentifrice, poudre dentifrice, dentifrice solide, bain de bouche, pulvérisa- tion de bouche, onguent à frotter, chewing-gum, éponge d'application et agent de traitement de dentier. 9.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le véhicule acceptable en pharmacie précité est un véhicule consommable choisi dans le groupe consistant en un bonbon, un aliment, une boisson, un chocolat, une pastille, un caramel, une tablette et un morceau de caramel au beurre. 10.- Procédé de prévention et de suppression des maladies de la bouche, caractérisé en ce qu'il consiste à administrer, à un patient, une quantité efficace d'une composition orale contenant un véhicule acceptable en pharmacie, de la dextranase et de 1' o d -1,3 glucanase. 11.- Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la quantité efficace précitée de la composition orale est de l'ordre de 1,5 à 20 unités d'enzyme par j=u par personne en termes de la quantité de dextranase et d' c