Brevet FR2507479A1 — publié le 19821217

VACCIN CONTRE LES INFECTIONS CHLAMYDIENNES DES ANIMAUX D'ELEVAGE La présente invention concerne des préparations biologiques vétérinaires, et plus précisément, un vaccin contre les infections chlamydiennes des animaux d'élevage, et elle peut être utilise pour la prophylaxie spécifique des infections chlamydiennes des animaux et pour l'obtention du sérum immunisant contre ces infections. On connaît des vaccins contre les avortements chlamydiosiques des moutons, se composant de suspensions inactivées de sacs vitellins d'embryons de poulet infectés par l'agent pathogène responsable de la chlamydiose, avec addition d'un adjuvant huileux. (J. Storz, chlamydia and chlamydia induced diseases, 1971, pages 270-279). L'inconvénient des vaccins connus est un faible pouvoir immunogéne, l'immunité insuffisante qu'ils confèrent, la nécessite de vaccinations répétées des animaux, la séparation de l'adjuvant huileux de la masse immunogène, l'è- paississement de l'adjuvant huileux aux températures basses (+4 C) qui rend indispensable le réchauffement du vaccin afin qu'il puisse passer par l'aiguille a injection, ainsi que leur utilisation limitée a une seule espèce animale. On s'est donc proposé,en utilisant un adjuvant nouveau, de créer un vaccin contre les infections chlamydiennes de toutes les especes d'animaux d'élevage, témoignant d'une action prolongée et d'une haute activité immunogène. La présente invention a pour objet un vaccin contre les infections chlamydiennes des animaux d'élevage contenant une liqueur antigénique constituée d'une suspension de cellules des sacs vitellins d'embryons de poulet, infectés par des chlamydiaceae pathogènes, dans une solution physiologique ou dans une solution de tampon phosphate et un adjuvant, ledit vaccin contenant comme adjuvant une solution aqueuse d'un melange de tris( hydroxymethyl)-aminomethane et de tetraméthyléthylenediamine, une solution aqueuse d'un mélange d'amide acrylique et d'amide méthyl-bis-acrylique, une solution aqueuse de persulfate d'ammonium et une solution aqueuse glutaraldéhyde présentant le rapport des composants initiaux suivant, en ml:: liqueur antigénique constituee de la suspension inactivée des cellules des sacs vitellins des embryons de poulet, infectés par des chlamydiaceae pathogenes: 8-10 solution aqueuse du mélange de tris(hydroxyméthyl) aminométhane et de tétraméthyléthylènediamine, dans un rapport pondérai de 15 à 16/1: 1-2 solution aqueuse du mélange d'amide acrylique et d'amide méthyl-bis-acrylique, dans un rapport pondéral de 37 a 38/1; 3-4 solution aqueuse à 1,4% de persulfate d'ammonium: 1-2 solution aqueuse à 25% de glutaraldéhyde: 0,026-0,038 . soluté physiologique ou solution de tampon phosphate en quantité égale à la quantité totale des ingré dients susmentionnés. L'inactivation de la suspension des cellules des sacs vitellins des embryons de poulet, infectés par des chlamydiaceae pathogènes peut être effectuée par des agents d'inactivation connus, notamment le merthiolate&commat;. Comme liqueur antigénique, le vaccin selon l'invention contient de préférence une suspension de cellules des sacs vitellins d'embryons de poulet, infectés par des chlamydiaceae pathogenes, inactivée par du merthiolate jusqu'à une teneur en merthiolate de la suspension de 0,05% en poids et par le formaldéhyde jusqu'à une teneur de 0,15% en poids dans la suspension. L'introduction du nouvel adjuvant dans la composition du vaccin permet de réaliser la po lymerisation des composants protéiques de la membrane des chlamydies avec conservation de leur activité antigénique.La polymérisation de la protéine diminue sa solubilité, en augmentant simultanément les propriétés antigéniques des structures proteiques des chlamydies. Parmi les conditions les plus importantes permettant d'accroître les propriétés immunogènes des antigenes est leur corpusculation assurant une structure macromoléculaire de l'antigène qui serait favorable pour l'interaction avec les éléments figurés macrophages du sang. Les antigènes agrégés insolubles ont une activité supérieure à celle des solutions d'antigènes de bas poids moleculaire. Dans le cas de la corpusculation de l'antigène, sa conversion à l'état agrégé capable de résister à la décomposition par les enzymes des tissus, est realisee par inclusion des chlamydes dans un gel synthétique de polyacrylamide. En même temps, se créent les conditions pour la formation du dépôt antigénique dans l'organisme. Tout cela garantit au vaccin selon l'invention une activité immunogene élevée avec une action prolongée. Le vaccin selon l'invention est obtenu de la manière suivante. On prépare une suspension de sacs vitellins d'embryons de poulet, infectés par des chlamydiaceae pathogènes. On peut utiliser toutes les especes de chlamydiaceae pathogènes. Les sacs vitellins d'embryons de poulet, de 6-7 jours, infectés par des chlamydiaceae pathogènes, sont soumis à une détermination du titre de l'agent pathogène. Par voie expérimentale on a determiné que le vaccin, préparé à partir de sacs vitellins d'embryons de poulet, infectes par 106,5'7,0 DLE50 (doses embryonnaires létales médianes) de chlamydies avait un pouvoir immunogène élevé. On infecte chaque sac vitellin d'embryon de poulet avec une dose de 0,25 à 0,3 ml contenant 1065'7,0 DLE50 d'agent pathogène. On prépare la suspension dans une solution de tampon phosphate stérile 0,2M à pH 7,6-7,8, le soluté physiologique ou la solution tampon de Hanks. On laisse décanter la suspension obtenue à la température de +4"C, on aspire le liquide surnageant dans un récipient stérile et on ajoute un inactivant. On peut utiliser comme inactivant une solutionne merthiolate (1:5000) jusqu'à une concentration finale de merthiolate dans la suspension de O,1X en poids ou le merthiolate en association avec le formaldéhyde jusqu'à une concentration finale dans la suspension de 0,05% en poids de merthiolate et de 0,15% en poids de formaldéhyde. On maintient le mélange obtenu pour inactiver lfagent pathogène dans une étuve réglée à la température de 37"C -pendant 10-12 heures ou dans un réfrigérateur à une température de +40C à +60C pendant 16-18 heures, en secouant periodiquement. On ajoute ensuite l'adjuvant à la suspension inactivée. On prépare pour cela des solutions: la première solution "A" est un mélange de tris (hydroxyméthyl)aminomêthane et de tétramêthyléthylènediamine, dans un rapport pondéral de 15 à 16/1, dissous dans l'eau distillée stérile. La deuxième solution "C" est un mélange d'amide acrylique et d'amide méthyl-bis-acrylique, dans un rapport ponderal de 37 à 38/. Les solutions "A" et "C" sont stables pendant un mois de stockage à la température de +5"C. On introduit successivement les solutions indiquées dans la suspension inactivée, puis on ajoute une solution aqueuse à 1,4% de persulfate d'ammonium et une solution à 25% de glutaraldéhyde. On agite soigneusement le mélange et on lue maintient dans un réfrigerateur à une température de +4"C à +6"C pendant 16-18 heures, ou dans une étuve réglée à la température de +370C pendant 2-3 heures. Il se produit alors la polymérisation de la masse vaccinale dans le gel de polyacrylamide. On homogénéise la masse vaccinale ainsi obtenue, polymerisee dans Te gel de polya crylamide,dans des homogénéisateurs ou dans les broyeurs colloïdaux avec un volume égal de solution physiologique stérile (pH 7,2-7,4) ou de solution de Hanks jusqu'à une consistance pâteuse, permettant le passage par l'aiguille d'injection. Le vaccin obtenu est mis en flacons dans des conditions stériles. On a testé le vaccin selon l'invention sur diverses espèces d'animaux d'elevage. Pour la prophylaxie des infections chlamydiennes il est recommandé d'injecter le vaccin en question aux animaux d'elevage par voie intramusculaire ou sous-cutanée en une dose unique: gros bétail à la dose de 5 ml, petit bétail à la dose de 1-2 ml. Pour mieux comprendre la présente invention, on donne ci-après des exemples d'essai du vaccin selon l'invention et du procedé de son obtention. EXEMPLE 1 On prépare 100 ml d'une suspension a 20X de sacs vitellins d'embryons de poulet infectés par la souche pathogène "250" de Chlamydia, dans la solution stérile de Hanks. On laisse décanter la suspension obtenue à la temperature de +4"C pendant 2 heures. On aspire le liquide surnageant avec une pipette stérile et on le place dans un ballon stérile. Pour contrôler l'absence de microflore étrangère dans la liqueur antigénique,on ensemence du bouillon de Marten que l'on maintient ultérieurement dans une étuve à 37"C pendant 6 jours. Le bouillon doit rester pur et ne doit pas observer la croissance d'une microflore étrangère.Pour l'inactivation, on introduit ensuite dans la liqueur antigéni- que surnageante,80 ml d'une solution aqueuse de merthiolate jusqu'à la concentration finale de 0,05% en poids et du formaldéhyde jusqu'à la concentration finale dans la liqueur antigénique de 0,15% en poids. On maintient le mélange à l'étuve réglée à la température de 37"C pendant 10-14 heures. On introduit ensuite de l'adjuvant. On prepare pour cela des solutions: Solution "A" A 48 ml d'une solution 1N d'acide chlorhydrique, on ajoute 36,3g de tri s(hydroxyméthyl )ami nomethane; 0,23 ml de têtraméthyléthylènedia;nine et on porte le volume a 100 ml en ajoutant de l'eau distillée sterile (pH=8,9). Solution "C" On dissout 30g d'amide acrylique et 0,8g d'amide méthylène-bis acrylique dans de l'eau distillez sterile jusqu'à 100 ml. Les solutions "A" et "C" sont stables pendant un mois, si on les conserve à la température de +50C. On ajoute ensuite à 80 inl de liqueur antigénique, successivement, 10 ml de solution "A" et 30 ml de solution "C", 10 ml de solution à 1,4% de persulfate d'ammonium et une solution à 25% de glutaraldéhyde jusqu'à sa concentration finale de 0,05% en poids dans la liqueur anti géni que. Après un brassage soigneux, on place le mélange dans une étuve thermostatée à la température de 37"C pendant 2-3 heures. On homogénéise 130 ml de la masse vaccinale polymerisee dans le gel de polyacrylamide ainsi obtenue avec un volume égal de solution de Hanks jusqu'à une consistance pâteuse, permettant le passage dans une aiguille à injection. On contrôle la toxicité et le pouvoir immunogene du vaccin obtenu.On effectue l'essai de la toxicité et du pouvoir immunogène du vaccin de l'invention sur des souris blanches ou des cobayes gravides par injection du vaccin par voie intrapéritonéale à des souris blanches (pesant 10-159) à raison de 0,25 ml, (cobayes granides: -0,5ml), avec infection intrapéritonéale ultérieure de ces animaux par la souche pathogène vivante "250" de Chlamydia. Un tiers des animaux indiqués n'était pas vacciné. Les animaux témoins non vaccinés (souris blanches) périssent, et les cobayes gravides avortent. Les souris blanches vaccinées survivent, et les cobayes gravides ont des portées saines normales. EXEMPLE 2 On prépare 120 ml d'une suspension à 40% de sacs vitellins d'embryons de poulet infectés par la souche pathogène "250" de Chlamidia dans une solution physiologique sterile à pH de 7,6-7,8. On laisse décanter la suspension obtenue à la température de +4"C pendant 2 heures. On aspire la liqueur surnageante avec une pipette stérile et on la place dans un ballon stérile. On contrôle l'absence de microflore étrangère de la maniere indiquée dans l'exemple 1. Dans 100 ml de la liqueur antigénique surnageante, on introduit ensuite, pour l'inactivation, une solution aqueuse de merthiolate jusqu'à la concentration finale de 0,1% en poids. On maintient le mélange au réfrigérateur à la température de +4 à +6"C pendant 16-18 heures. Puis on introduit de l'adjuvant dans le mélange. On prépare préalablement les solutions "A" et "C" comme dans l'exemple 1. On ajoute ensuite à 100 ml de liqueur antigènique, successivement, 20 ml de solution "A"; 40 ml de solution "C"; 20 ml d'une solution à 1,4% de persulfate d'ammonium et une solution à 25% de glutaraldéhyde jusqu'à la concentration finale dans la liqueur antigénique de 0,05% en poids.Après brassage soigneux on maintient le mélange au réfrigérateur à la température de +4"C à +60C pendant 16-18 heures. On homogénéise 180 ml de la masse vaccinale 'polymérisée dans le gel de polyacrylamide ainsi obtenue avec un volume egal de solution physiologique jusqu'à une consistance pâteuse permettant le passage par l'aiguille a injection. On obtient un vaccin dont on contrôle la toxicité et le pouvoir immunogène selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE 3 L'essai du vaccin selon l'invention a été réalisé sur des taureaux, des moutons et de jeunes vaches gravides. Une partie des animaux non vaccinés servait de témoin. D'après les données de littérature et les etudes du demandeur, l'agent pathogène du groupe des chlamydiacea responsable de l'avortement des vaches est aussi pathogène pour les moutons. Les deux vaccins ont eté injectés par voie sous-cutanée aux taureaux et aux jeunes vaches gravides à la dose de 5 ml, et aux moutons à la dose de 2 ml. On estime l'efficacité du vaccin suivant des indices cliniques et immunologiques et d'après les resultats de l'infection des témoins. Pour évaluer le vaccin, le sang a été prélevé deux fois avant la vaccination et aux 5e, 11e jours après la vaccination, puis aux 3e, 8e, 12e et 19e jours après l'infection.Les taureaux, les moutons et les jeunes vaches gravides vaccinés étaient infectés pour l'essai de la résistance immunologique, avec la souche pathogène vivante "250" de Chlamydia. On n'a pas observé de symptômes cliniques chez les animaux vaccinés. Des études sérologiques de la réaction de fixation du complément ont révélé la presence d'anticorps fixant le complément chez les moutons, les taureaux et les jeunes vaches gravides vaccinés dès le 5e et le 11e jour avec un titre de 1/16 à 1/128. L'infection témoin des animaux non vaccinés (moutons, taureaux, jeunes vaches gravides) s'accompagnait d'un abattement total des animaux, d'indolence, d'immobilité , de perte d'appétit et d'une élévation de la température générale du corps jusqu'a 41-41,5"C. Une semaine après, toutes les modifications pathologiques mentionnées ont disparu. Les jeunes vaches gravides non vaccinées après l'infection ont avorté ou mis bas prématurément des veaux faibles non viables morts 3 jours après le vêlage. On a observe la rétention du délivré chez tous les animaux. On n'a pas noté de modifications de l'état général chez les taureaux, les moutons et les jeunes vaches gravides vaccines après l'infection temoin. Les vêlages des jeunes vaches gravides se sontproduits au terme fixé; les veaux étaient normalement développés. Le vaccin assure l'activité antigénique et crée chez les animaux inoculés une immunité contre l'infection expérimentale. De façon analogue, on a réalisé quatre séries des essais. REVENDICATIONS 1. Vaccin contre les infections chlamydiennes des animaux d'élevage, contenant une liqueur antigenique constituée d'une suspension inactivée des cellules de sacs vitellins d'embryons de poulet, infectés par des chlamydiaceae pathogènes dans une solution physiologique ou une solution de tampon phosphate et un adjuvant, caractérisé en ce qu'il contient comme adjuvant une solution aqueuse d'un mélange de tris(hydroxyméthyl)aminométhane et de tétramethyléthylènediamine, une solution aqueuse d'un mélange d'amide acrylique et d'amide methyl-bis-acrylique, une solution aqueuse de persulfate d'ammonium et une solution aqueuse de glutaraldéhyde présentant le rapport des composants de départ suivant en ml:: liqueur antigénique constituée de la suspension des cellules des sacs vitellins d'embryons de poulet, infectes par des chlamydiaceae pathogènes: 8-10 solution aqueuse du mélange de tris(hydroxyméthyl) aminométhane et de tétraméthylèthylènediamine, dans un rapport pondéral de 15 à 16/1: 1-2 solution aqueuse du mélange d'amide acrylique et d'amide méthyl-bis-acrylique, dans un rapport pondéral de 37 à 38/1: 3-4 solution aqueuse à 1,4% de persulfate d'ammonium: 1-2 . solution aqueuse à 25% de glutaraldéhyde: 0,026-0,038 . solution physiologique ou solution de tampon phosphate en quantité égale à la quantité totale des composants cités. 2. Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient comme liqueur antigénique une suspension des cellules des sacs vitellins d'em bryons de poulet, inactivés par le merthiolatee (denomination commerciale d'un desinfectant consistant en ethylmercurithiosalicylate de sodium) jusqu'à une teneur de la suspension de 0,05 % en poids et par le formaldehyde jusqu'à 0,15 -% en poids.