Brevet FR2510138A1 — publié le 19830128

Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 029 549 décrit et revendique l'utilisation de Mycobacterium fortui- tum NRRL B-8119 pour la préparation de l'acide 9-hydroxy- 3-oxo-4-prégnène-20-carboxylique / 9-hydroxybisnoracide_ 7. Le même micro-organisme est utilisé pour préparer la 9- hydroxy-4-androstène-3,17-dione / 9-hydroxyandrostène- dione 7 dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 035 236; et l'ester méthylique d'acide 9-hydroxy-3- oxo-4-prégnène-20-carboxylique /-ester méthylique de 9- hydroxybisnoracide_ 7 dans le brevet des Etats-Unis d'Amé- rique N 4 214 051. La demande de brevet européen N 79104372 2 fait connaître une fermentation en deux étapes pour la préparation de l'acide 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégna- diène-20-carboxylique (I) qui est utile comme composé inter- médiaire dans la synthèse de corticoides intéressants Ce procédé implique d'abord la transformation de stérols en acide 3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxylique par fer- mentation avec une souche NRRL B-8054 de Mycobacterium, puis la transformation de ce composé en composé (I) par incubation avec l'un quelconque de divers micro-organismes capables d'introduire un groupe hydroxyle dans la position 9 a. La présente invention propose un procédé de préparation par fermentation du nouveau composé intermé- diaire utile appelé 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène- -carboxaldéhyde (I), d'après le schéma suivant: SCHEMA I C H COOCH 2 CH 2 C'H 2 CH A B c On met en oeuvre ce procédé en utilisant un mutant de M fortuitum NRRL B-8119 Le procédé de la pré- sente invention couvre également l'utilisation de doubles mutants obtenus à partir des genres de micro-organismes indiqués dans le brevet des EtatsUnis d'Amérique N 4 029 549, à savoir les genres Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobac- terium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces. Les micro-organismes de ces genres sont tous bien connus pour leur aptitude à dégrader des stérols Les souches de types sauvages de ces genres dégradent non sélectivement des stérols en composés de faible poids moléculaire, par exemple CO 2 + H 20 Des mutants peuvent être obtenus à par- tir de ces types sauvages par les modes opératoires décrits dans l'exemple 1 du brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 029 549 précité Cet exemple-illustre la préparation de M fortuitum NRRL B-8119. COOC Hn Des mutants des genres indiqués ci-dessus, qui peuvent être obtenus en utilisant les modes opératoires de l'exemple 1 du brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 029 549 précité, peuvent ensuite être soumis à des processus de mutation décrits dans le présent mémoire pour l'obtention d'autres mutants Ces derniers mutants, tels qu'illustrés ici par M fortuitum NRRL B-12433, peu- vent être utilisés dans le procédé de fermentation décrit dans le présent mémoire pour préparer le composé (I). Micro-organismes Des mutants qui sont caractérisés par leur aptitude à dégrader sélectivement des stéroïdes ayant des chaînes latérales 17-alkyliques et accumuler du 9-hydroxy- 3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxaldéhyde (I) comme produit principal dans le bouillon de fermentation peuvent être obtenus par mutation de micro-organismes des genres suivants: Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Coryne- bacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Pro- taminobacter, Serratia et Streptomyces. On donne ci-après un exemple illustrant la préparation du mutant utilisé dans le procédé de fermenta- tion Le mutant préparé dans cet exemple est M fortuitum NRRL B-12433 Des mutants similaires provenant d'autres espèces du genre Mycobacterium et d'autres genres de micro- organismes tels que mentionnés dans le présent mémoire peuvent être préparés en suivant les modes opératoires de l'exemple ci-après. Préparation d'un mutant qui accumule du 9-hydroxy-3-oxo- 4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxaldéhyde comme produit prin- cipal de la dégradation de stérols On fait croitre Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 à 31 dans un milieu renfermant (par litre) 8 g de bouillon nutritif; 1 g d'extrait de levure; 5 g de gly- cérol; 0,1 % (en poids/volume) de "Tween 80 "; et de l'eau distillée On stérilise ce milieu par autoclavage pendant minutes sous pression de 0,105 M Pa On laisse les cel- lules se développer jusqu'à une densité d'environ 5 x 108 cellules par ml, puis on les recueille sur un filtre stérile de 0,2 micromètre On lave les cellules avec un volume égal de citrate de sodium 0,1 M stérile à p H 5,6, contenant 0,1 % de "Tween 80 ", puis on les remet en suspension dans un demi-volume du même tampon On ajoute de la N-méthyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidine à une concentration de 100 gg/ml et on fait incuber la suspension cellulaire à 31 C pendant 1 heure On lave ensuite les cellules avec deux volumes de tampon au phosphate de potassium 0,1 M stérile à p H 7, contenant 0,1 % de "Tween 80 ", puis on les remet en sus- pension dans un volume du même tampon On prépare un milieu contenant (par litre) 8 g de bouillon nutritif; 5 g de Na Cl; 5 g de glycérol; et de l'eau distillée On ajoute de la gélose à une concentration de 15 g/l et on autoclave le mélange pendant 20 minutes sous pression de 0,105 M Pa, puis on le verse dans des boîtes de Pétri stériles Les cellules ayant subi la mutagénèse sont ensuite ensemencées sur ce milieu et des colonnies qui se développent sur ces bottes sont ensuite sélectionnées dans des fermentations à petite échelle en vue de déterminer leur aptitude à con- vertir des stérols en composé (I) La détection du composé désiré est effectuée par chromatographie sur couche mince d'extraits chlorométhyléniques des fermentations d'essai, en utilisant le gel de silice et un système de solvants formé de chlorure de méthylène, d'acétone et d'acide acé- tique ( 212-38-1) On isole ainsi le mutant NRRL B-12433 qui accumule du 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20- carboxaldéhyde comme principal produit de la biotransfor- mation de stérols. La clé de l'isolement d'un mutant tel que celui qui est décrit dans le présent mémoire consiste à partir d'un mutant tel que NRRL B-8119 qui est déjà inhibé en matière de dégradation du noyau de stéroïdes, en sorte qu'il produit la 9 a-hydroxyandrostène-dione, et à provo- quer dans ce micro-organisme une seconde mutation affectant la dégradation de la chaîne'latérale des stérols. Description du micro-organisme: Le mutant engendrant la biotransformation décrite dans le présent mémoire diffère de sa culture-mère, par exemple Mycobacteriumr fortuitum NRRL B8119, simplement par son action sur des molécules de stéroides Sous tous autres rapports, tels que la morphologie et la sensibilité aux médicaments, ils sont similaires sinon identiques. Les deux cultures de M fortuitum sont des bacilles acido- résistants non motiles, ne produisant pas de spores, appar- tenant à la famille des Mycobacteriaceae, de l'ordre des actinomycétales D'après la classification de Runyon (E H. Runyon, 1959, Med Clin North America 43:273), il s'agit d'une mycobactérie non chromogénique du Groupe IV, c'est- à-dire que ce micro-organisme se développe rapidement à basse température en produisant des colonnies non pigmentées sur des milieux relativement simples. M fortuitum NRRL B-8119 et NRRL B-12433 ont été déposés dans la collection permanente du Northern Regional Research Laboratory, Ministère de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique, Peoria, Illinois, E U A Le micro-organisme M fortuitum NRRL B-8119 a été rendu acces- sible au public au moins depuis la délivrance des brevets des Etats-Unis d'Amérique précités qui en donnent la descrip- tion M fortuitum NRRL B-12433 a été déposé le 4 Mai 1981. On peut obtenir des repiquages de ces micro-organismes sur demande adressée à l'organisme NRRL o ils sont déposés. Il y a lieu de remarquer que le fait que la culture est disponible n'autorise pas pour autant à mettre en pratique la présente invention en dérogation aux lois de la Pro- priété Industrielle. Le composé (I) est utile comme composé inter- médiaire dans la synthèse de corticoldes intéressants. Par exemple, on peut l'oxyder en l'acide correspondant, c'est-à-dire l'acide 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène- -carboxylique qui peut à son tour être converti en acétate d'hydrocortisone par le mode opératoire décrit en détail dans la demande de brevet européen publiée sous le numéro 79104372 2. On donne ci-après des exemples illustrant le procédé de fermentation de la présente invention Ces exempt ne so nt que des illustrations et n'ont donc aucun effet limitatif Tous les pourcentages sont exprimés en poids et toutes les proportions des mélanges de solvants sont exprimées en volume, sauf spécification contraire. Exemple 1 Fermentation du sitostérol brut Le milieu de biotransformation contient (par litre) 8,0-g de "Ucon"; 5,0 g de "Cerelose"; 3,0 g de NH 4 Cl; 3,0 g de Ca CO 3; 3,0 g de Na 3 /citrate_ 7 2 H 2 o; 2,0 g de "Tween 80 "; 1,0 g de farine de soja; 0,5 g de KH 2 PO 4; 0,5 g d'urée et 30,0 g de sitostérol brut, dans de l'eau de ville dont le p H est ajusté à 7,0 Des fioles contenant des portions de 100 ml de ce milieu sont ino- culées avec 10 ml de cultures d'ensemencement de M fortui- tum NRRL B-12433, développées à 28 dans un milieu con- tenant (par litre) 8,0 g de bouillon nutritif; 5,0 g de glycérol; 1,0 g d'extrait de levure et 1,0 g de "Tween " dans de l'eau distillée, le p H étant ajusté à 7,0. On fait ensuite incuber les cultures à 28 pendant 336 heu- res sur une secoueuse rotative Après l'incubation, on extrait le mélange et on isole le produit comme indiqué en détail dans l'exemple 3 ci-dessous. Exemple 2 On procède exactement comme dans l'exemple 1, mais en utilisant divers substrats stéroidiques individuel- lement ou en mélanges et sous la forme pure ou sous la forme brute Ces substrats comprennent le sitostérol, le cholestérol, le stigmastérol et le campestérol. Exemple 3 Isolement du composé (I) de la fermentation de M fortuitum NRRL B-12433 1200 ml de bouillon de fermentation provenant de la biotransformation de sitostérol au moyen de M for- tuitum NRRL B-12433 sont acidifiés et extraits deux fois avec un volume égal de chlorure de méthylène (Me C 12), ce qui donne 29,2 g et, respectivement, 8,9 g d'extrait brut. Le premier extrait est redissous dans Me C 12 et lavé avec une solution saturée de bicarbonate de sodium pour éliminer les composants acides Les composants neutres restants sont obtenus sous la forme d'une huile brune ( 18,6 g) par élimination du solvant Cette huile contient d'après la chromatographie sur couche mince et la chroma- tographie en phase liquide trois zones principales d'absorp- tion des rayons ultraviolets La moins polaire de ces zones est un mélange des esters méthyliques A et B à pré- dominance de B (voir le schéma ci-dessus) La moins polaire est le composé 9,22-dihydroxylique C, et le composé de polarité moyenne est le 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégna- diène-20-carboxaldéhyde (I),d'après la méthode d'identifi- cation indiquée ci-après Une fraction enrichie en l'aldéhyde (I) est obtenue à partir d'un chromatogramme préliminaire sur une courte colonne de silice éluée avec de l'acétate d'éthyle à 30 % dans le chlorure de méthylène Cette matière ( 3,3 g) est rechromatographiée soigneusement sur trois colonnes de gel de silice "Lobar" préalablement garnies / modèle B; E Merck Co _ 7, disposées en série, et elle est éluée avec de l'acétate d'éthyle à 20 % dans le chlo- rure de méthylène L'aldéhyde (I) est obtenu sous la forme d'une substance solide incolore qui cristallise en aiguilles ( 1,05 g) dans un mélange d'acétate d'éthyle et de chlorure de méthylène; P F 194-2120, /_ _ 7 D + 960 /-c, 1,024; CHC 13 _ 7. Analyse: trouvé C = 77,53 %; H = 8,71 % Calculé pour C 22 H 3003 C = 77,16 %; H-= 8,83 %. Le spectre de masse a donné un ion moléculaire à m/e 342 (pic de base) et des ions fragmentaires princi- paux à 324, 309, 295, 191, 136 et 124. Spectre de résonance magnétique des protons 1,02, ( 18-CH 3); 1,36, ( 19-CH 3); 1,82, ( 21-CH 3); 5,88, ( 4-H); 10,04 (CHO) ppm. Spectre infrarouge 3497, 3440 cm-1 (-OH) 1663 cm-1 (carbonyle d'insaturation a,I); 1622, 1617 cm-1 (C=C). Spectre ultraviolet: Àmax 250 nm; (s, 27 900; méthanol). Exemple 4 En utilisant un micro-organisme dégradant les stérols choisi dans les genres Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, - Serratia et Streptomyces, à la place de Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 dans le procédé décrit pour la pré- paration de M fortuitum NRRL B-12433, on obtient des micro-organismes mutants qui sont caractérisés par leur aptitude à dégrader sélectivement des stéroides présen- tant une chaîne latérale en C-17 et à accumuler le composé (I) comme produit principal. Exemple 5 En remplaçant dans l'exemple 1 M fortuitum NRRL B-12433 par les mutants obtenus dans l'exemple 4, on obtient le composé (I). REVENDICATIONS 1 Procédé de production par fermentation d'un composé de formule: Hs CHO caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver Mycobacterium fortuitum NRRL B-12433 dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en présence d'un stéroide portant une chaîne latérale en C-17 et à recueillir le produit désiré. 2 Procédé de fermentation pour la préparation d'un composé tel que défini dans la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il consiste à cultiver un micro-organisme mutant choisi dans le groupe formé des genres Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protami- nobacter, Serratia et Streptomyces, ledit mutant se carac- térisant par son aptitude à dégrader sélectivement des stéroides portant une chaîne latérale en C-17 et à accumu- ler du 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxaldéhyde comme produit principal dans le bouillon de fermentation, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en présence d'un stéroide portant une chaîne latérale en C-17, et à recueillir le produit désiré. 3 Procédé de fermentation pour la préparation d'un composé tel que défini dans la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il consiste à cultiver un mutant de Myco- bacterium qui est caractérisé par son aptitude à dégrader sélectivement des stéroides portant une chaîne latérale en C-17 et à accumuler du 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène- -carboxaldéhyde comme produit principal dans le bouillon 2510138 i de fermentation, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en présence d'un stéroide portant une chaîne latérale en C-17, et à recueillir le produit désiré. 4 Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit stéroide est choisi dans le groupe comprenant le sitostérol, le choles- térol, le stigmastérol et le campestérol,ou un mélange de ces stéroides. Un composé de formule: i t HI