Brevet FR2501528A1 — publié le 19820917

La présente invention concerne un procédé d'encapsulation qui est réversible, c'est-à-dire un procédé pouvant servir à encapsuler un liquide ou une matière soli- de et à libérer ensuite la matière par rupture sélective des membranes des capsules. Un aspect important de l'invention implique la micraencapsulation de cellules vivantes pouvant ensuite être libérées, sans dégâtsde l'intérieur des mem- branes des capsules produites. La première demande divisionnaire de la deman- de de brevet français NI 80 06 875 du 27 mars 1980 a décrit une technique de microencapsulation pouvant servir à encapsu- ler essentiellement n'importe quelle matière solide ou li- quide au sein de membranes semi-perméables ou sensiblement imperméables de capsules. Un avantage important du procédé réside dans le fait que les conditions dans lesquelles les membranes des capsules se forment n'impliquent pas de réac- tifs toxiques ou dénaturants, pas de valeurs extrêmes de la température ni d'autres conditions qui endommagent des cel- lules vivantes. Le procédé de la demande précitée convient donc très bien pour produire des matières vivantes micro- encapsulées qui restent viables et à un état sain. Puisque le procédé permet un certain degré de maîtrise de la perméa- bilité de la membrane, il est maintenant possible de micro- encapsuler des cultures de cellules de procaryotes, d'eu- caryotes, ou d'une autre origine, de manière à protéger les cellules de la culture contre des bactéries contaminantes, des immunoglobulines à poids moléculaire élevé et d'autres facteurs potentiellement nuisibles, et à garder les cellules des cultures confinées au sein d'un microenvironnement convenant bien pour la poursuite de leur viabilité et de leurs fonctions métaboliques. Si les microcapsules sont suspendues dans un milieu classique de culture suffisant pour entretenir la croissance des cellules vivantes en cause, les cellules microencapsulées peuvent librement ingérer des substances nécessaires pour leur métabolisme, qui diffusent à travers la membrane,et peuvent librement excréter à travers la membrane de capsule leurs produits de métabolisme vers le milieu environnant. 250 1528 La présente invention vise un procédé pour rompre sélectivement certaines membranes synthétisées au cours des opérations de microencapsulation décrites dans la demande précitée, sans provoquer de dégâts décelables de la matière centrale encapsulée. Plus particulièrement, le procédé de la présente invention est mis en pratique sur des membranes comprenant une matrice d'enrobage insoluble dans l'eau, formée d'au moins deux constituants hydrosolu- bles: un polymère qui comprend de multiples fragments ca- tioniques (polymère polycationique, par exemple de la poly- éthylène-amine), et un polymère ayant de multiples fragments anioniques (polymère polyanionique, par exemple de la gomme d'alginate de sodium). Les deux constituants sont reliés par des ponts salins entre les fragments anioniques et catio- niques pour former la matrice d'enrobage. Le procédé de l'invention comprend les étapes consistant à exposer des membranes du type précité à une solution de cations, de préférence des cations multivalents monoatomiques ou à bas poids moléculaire, et à une solution d'un polymère à rôle de séparation ou de rupture, comportant plusieurs fragments anioniques. De préférence, on mélange ces solutions ensemble. La charge anionique du polymère doit être suffisante pour rompre les ponts salins (ou ponts de fonction sel) et elle doit de préférence être égale ou supérieure à la densité de charge du polymère polyanionique de la membrane. On met la solution au contact des capsules pour permettre aux cations, par exemple le calcium ou l'alu- minium, d'entrer en compétition avec le polymère polycationi- que présent dans la membrane de capsule pour la liaison avec des sites anioniques du polymère polyanionique. Simulta- nément, le polymère à rôle séparateur, qui comporte plusieurs fragments anioniques, entre en compétition avec le polymère polyanionique pour la liaison avec des sites cationiques des chaînes de polymères. Cela aboutit à "ramollir" ou "défaire" les membranes des capsules. Pour achever la rupture, on lave les capsules puis on les expose à l'action d'un agent de séquestration pour enlever des cations associés au polymère polyanionique. Les agents préférés de séquestration sont des agents de chélation comme les ions citrate ou les ions EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique). Si, comme dans une forme importante de réalisation, les capsules con- tiennent des cellules viables, on préfère mélanger l'agent de séquestration à une solution saline isotonique. Le cation actuellement préféré est le calcium. Des exemples de polymères à rôle séparateur, comportant plu- sieurs groupes anioniques, que l'on utilise dans la solution mixte comprennent des acides polysulfoniques ou, de préfé- rence, leurs sels, naturels ou synthétiques. On a obtenu des résultats remarquables en utilisant de l'héparine, qui est un polymère naturel contenant plusieurs groupes sulfonates. On peut aussi utiliser des polymères contenant des fragments sel d'acide polyphosphorique ou d'acide polyacrylique. L'agent de séquestration actuellement préféré est le citrate de sodium. L'invention envisage également un procédé pour encapsuler des cellules viables au sein d'un environne- ment protecteur et pour libérer ensuite les cellules. Ainsi, l'invention propose ce que l'on peut décrire comme étan.t un emballage, qui maintient des cultures de cellules vivantes de n'importe quelle origine dans un environnement stérile et stabilisant, dans lequel elles peuvent subir des proces- sus de métabolisme normal et même de la mitose, et d'o elles peuvent ensuite être libérées ou dégagées. Donc, l'invention vise notamment à proposer un procédé: - pour encapsuler des cellules vivantes au sein de membranes perméables et pour rompre ensuite sélecti- vement les membranes afin de libérer les cellules; - pour rompre sélectivement des membranes, cela sans endommager des tissus vivants voisins; et - pour encapsuler puis libérer des matières, liquides et solutions à l'état finement divisé. Ces buts, caractéristiques et avantages de l'invention ressurtiront à l'examen de la description sui- vante, faite à titre illustratif et nullement limitatif, de quelques formes importantes de réalisation de l'invention. Le procédé de rupture sélective de membrane selon l'invention, se pratique sur des membranes consistant en une matrice d'enrobage, comportant des ponts salins de liaison entre un polymère polycationique et un polymère polyanionique. Habituellement, les membranes auront une for- me sphéroldale délimitant un espace intérieur clos contenant une substance encapsulée. Cependant, le procédé peut égale- ment être mis en pratique sur des membranes de ce type qui assument une forme autre que sphéroldale. En principe, essentiellement n'importe quelle matière (compatible avec des environnements aqueux), sous forme liquide ou solide, peut être encapsulée puis libérée sans dommage, par le procédé de la présente invention, mais l'utilité la plus notable de ce procédé, comme on l'envisage actuellement, réside dans son aptitude à encapsuler, puis à libérer, des systèmes vivants comme des cultures de cellules. Donc, la description qui suit se limitera principalement à un exposé de l'encapsulation et de la libération de cellules. L'homme du métier pourra adapter sans difficulté le procédé en vue de l'encapsulation de matières moins fragiles. On va maintenant décrire plus particulièrement l'encapsulation. On met le tissu, ou les cellules, à encapsuler en suspension dans un milieu aqueux convenant pour le main- tien et l'entretien de la poursuite des processus métaboli- ques du type particulier de cellules en cause. Des milieux convenant à cette fin sont bien cornnus de l'homme du métier et ils sont souvent disponibles dans le commerce. Le diamè- tre moyen de la masse de cellules ou d'une autre matière à encapsuler peut largement varier entre quelques microns et 1 mm ou davantage. Les îlots de Langerhans des mammifères, par exemple, ont typiquement un diamètre compris entre 50 et 200 microns. On peut encapsuler, selon les désirs, des fragments de tissu et des cellules individuelles comme des fibroblastes, des leucocytes, des lymphoblastoides, des cellules bêta, alpha ou delta du pancréas, des îlots de Langerhans, des -hépatocytes ou les cellules d'un autre tissu. De même, on peut encapsuler des micro-organismes et notam- ment ceux qui ont été génétiquement modifiés par recombinai- son de ADN (acide désoxyribonucléique) ou par d'autres tech- niques. La poursuite de la viabilité d'une telle ma- tière vivante dépend notamment de la disponibilité de matiè- res nutritives requises, d'un transfert d'oxygène, de l'ab- sence de substances toxiques dans le milieu, et du pH de ce milieu. Jusqu'à présent, il n'a pas été possible de main- tenir une telle matière vivante dans un environnement physiologiquement compatible tout en encapsulant simultané- ment cette matière vivante. Le fait que les conditions re- quises pour la formation d'une membrane sont jusqu'à pré- sents léthales ou nuisibles au tissu a soulevé un problème et, avant l'invention de la demande de brevet précité, il n'existait aucun procédé pour former une membrane et permet- tre à du tissu encapsulé de survivre dans un état de bonne santé. Or, il a été découvert que certaines substan- ces hydrosolubles, qui sont physiologiquement compatibles avec du tissu vivant et peuvent être rendues insolubles dans l'eau pour former une masse cohérente conservant sa forme, peuvent servir à former une "capsule temporaire" ou une couche formant barrière protectrice autour de cellules individuelles, de groupes de cellules ou de tissus. On ajoute une telle substance, typiquement à une concentration de l'ordre de 1 à 2 en poids, au milieu de culture de tissu. On donne ensuite à la solution la forme de gouttelettes con- tenant du tissu ainsi que le milieu nécessaire à son entre- tien ou à sa croissance et, immédiatement, on rend la ma- tière insoluble dans l'eau et on la gélifie, au moins dans une couche superficielle. On munit ensuite les capsules tem- poraires, qui conservent leur forme, d'une membrane plus permanente qui, selon la présente invention, peut ensuite être sélectivement rompue pour libérer sans dommages le tis- su encapsulé. Lorsque la matière ayant servi à former les capsules temporaires le permet, l'intérieur des capsules peut être reliquéfié après formation de la membrane perma- nente. On effectue cette reliquéfaction en rétablissant dans le milieu les conditions dans lesquelles la matière est solu- ble. La matière servant à former les capsules tem- poraires peut être n'importe quelle matière hydrosoluble non toxique qui, par une modification de l'environnement ionique qui l'entoure ou de la concentration, peut être transformée en une masse capable de retenir sa forme. La matière comprend également plusieurs fragments anioniques facilement ionisés, par exemple des groupes carboxyles, que l'on peut faire réagir, par formation de liaisons du type sel, avec des polymères contenant plusieurs groupes cationi- ques. Comme on l'expliquera ci-après, ce type de matière permet le dépôt d'une membrane permanente ayant une perméa- bilité choisie (ce qui comprend une membrane essentiellement non poreuse jusqu'à un niveau de plusieurs centaines de milliers de daltons). La matière polyanionique actuellement préférée pour former la capsule temporaire est constituée par une ou plusieurs gommes acides, hydrosolubles, de type polysaccha- ride naturel ou synthétique. De nombreuses matières de ce genre sont disponibles dans le commerce. On les extrait typi- quement de la matière végétale et on les utilise souvent à titre d'additifs ajoutés à divers aliments. L'alginate de sodium constitue le polymère anionique actuellement préféré. On-peut utiliser de l'alginate dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 150 000 daltons, mais en raison de ses dimensions moléculaires, un tel alginate ne pourra habi- tuellement pas laisser passer par perméation les membranes des capsules finalement formées. Pour produire des capsules n'emprisonnant pas de l'alginate liquide, on peut utiliser de l'alginate à plus bas poids moléculaire, compris par exemple entre 40 000 et 80 000 daltons. Dans la capsule fi- nale, l'alginate peut être plus facilement retiré du volume intracapsulaire par diffusion à travers une membrane de porosité suffisante. D'autres gommes polyanioniques utilisa- bles comprennent des fractions acides de gomme guar, de carraghénine, de pectine, de gomme adragante ou de gomme de xanthane. Ces matières comprennent des chaînes de saccha- rides à liaison glycoside. Leur groupes acides libres sont en fait souvent présents sous forme du sel de l'ion de métal alcalin, par exemple sous forme sodique. Si un ion multiva- lent, comme du calcium, du strontium ou de l'aluminium, est introduit à la place de l'ion de métal alcalin, les molécu- les de polysaccharides hydrosolubles liquides sont "réticulées" pour former un gel insoluble dans l'eau, qui garde sa forme et peut être resolubilisé lorsqu'on enlève les ions par un échange d'ions ou à l'aide d'un agent de séquestration. On -peut faire appel à essentiellement n'importe quel ion multi- valent capable de former un sel avec la gomme acide mais l'on préfère utiliser des ions physiologiquement compatibles, par exemple du calcium. Cela tend à préserver le tissu et à le maintenir à l'état vivant. On peut utiliser d'autres cations multivalents dans le cas d'une matière moins fragile. Des ions magnésium sont incapables de gélifier de l'alginate de sodium. Une composition de solutions typiques comprend des volumes égaux d'une suspension de cellules dans leur milieu et une solution à 1 à 2 'O de gomme dans une solution saline physiologique. Lorsqu'on fait appel à de l'alginate de sodium, on utilise avec succès une solution contenant 1,2 à 1,6 'O de cet alginate. Dans l'étape suivante du procédé d'encapsula- tion, on donne à la solution de gomme, contenant le tissu, la forme de gouttelettes d'une dimension voulue qui suffit à envelopper les cellules à encapsuler. Puis on gélifie im- médiatement les gouttelettes pour former des masses sphériques ou sphéroidales conservant leur forme. La formation des gouttes peut être effectuée par des techniques connues. On équipe un tube, contenant une solution aqueuse de cations multivalents, par exemple une solution à 1,5 "O de CaCl2, d'un bouchon portant un appareil de forma- tion de gouttes. L'appareil comprend une enveloppe présen- tant un ajutage supérieur d'admission d'air et un corps creux allongé ajusté avec frottement dans le bouchon. On monte au- dessus de l'enveloppe une seringue munie d'une pompe à - 2501528 échelonnement et comportant, par exemple, une aiguille de 0,25 mm de diamètre interne, revêtue de "Teflon" et traver- sant l'enveloppe sur toute sa longueur. L'intérieur de l'en- veloppe est conçu de manière que l'extrémité de l'aiguille soit soumise à un écoulement laminaire constant d'air jouant le rôle d'une lame d'air. En service, la seringue étant em- plie de la solution contenant la matière à encapsuler, on fait fonctionner la pompe de manière à refouler progressive- ment des gouttelettes de solution de l'extrémité de l'ai- guille. Chaque goutte est "coupée" par le courant d'air et tombe d'environ 2,5 cm dans la solution de CaCl2, o elle est immédiatement gélifiée par absorption d'ions calcium. La distance entre l'extrémité de l'aiguille et la surface de la solution de CaCl2 est, dans ce cas, assez grande pour permettre à la suspension de cellules/alginate de sodium de prendre la forme physiquement la plus favorable, à savoir une sphère (maximum de volume pour le minimum de surface externe). L'air présent à l'intérieur du tube s'en échappe par un orifice percé dans le bouchon. Il en résulte une "réticulation" du gel et la formation d'une capsule tempo- raire protectrice à grande viscosité, qui garde sa forme et contient le tissu en suspension et son milieu. Les capsules se regroupent sous forme de phases séparées dans la solution et elles sont séparées par aspiration. Dans l'étape suivante du prccédé, on dépose une membrane autour de la surface des capsules temporaires, -par réticulation de couches superficielles. On y parvient en soumettant les capsules temporaires comprenant du poly- anion à l'action d'une solution aqueuse d'un polymère con- tenant des groupes cationiques capables de réagir avec les groupes fonctionnels anioniques présents dans le polymère polyanionique. On préfère des polymères contenant des groupes cationiques réactifs, comme des groupes amines libres ou des combinaisons de groupes amine et imine. Dans cette situation, la gomme de polysaccharide est réticulée par inter- action (formation de liaisons salines ou du type sel) entre les groupes carboxyles et les groupes amines ou imines du polymère polycationique. Avantageusement, on peut régler entre certaines limites la perméabilité en choisissant le poids moléculaire du polymère de réticulation que l'on utilise et en faisant varier le temps d'exposition et la concentra- tion du polymère en solution. En un temps donné, une solu- tion de polymère à bas poids moléculaire pénétrera davanta- ge qu'un polymère à poids moléculaire élevé dans les capsu- les temporaires. On a établi des corrélations entre le de- gré de pénétration de l'agent de réticulation et la perméa- bilité résultante. En général, la dimension des pores est d'autant plus grande que le poids moléculaire est plus élevé et qu'il y a moins de pénétration. De plus longues durées d'exposition et l'emploi de solutions plus concentrées en polymère tendent à diminuer la limite supérieure de per- méabilité des membranes résultantes. Cependant, le poids mo- léculaire moyen du polymère constitue le facteur à effet prédominant. On peut utiliser en gros des polymères dont le poids moléculaire se situe entre 10 000 et 100 000 daltons ou davantage, selon la durée de la réaction, la concentration de la solution de polymère et le degré de perméabilité vou- lu. Un groupe de conditions de réaction couronné de succès, lorsqu'on utilise de la polylysine dont le poids moléculaire moyen est d'environ 35 000 daltons, implique une réaction durant 3 minutes, avec agitation, d'une solution physiologi- que saline contenant 0,0167 % de polylysine. Cela donne des membranes ayant une limite supérieure de perméabilité d'environ 100 000 daltons. Généralement, des matières à plus grand poids moléculaire forment des membranes qu'il est ensuite plus difficile de rompre, en comparaison du cas de matières à plus bas poids moléculaire. La densité des char- ges du polymère polycationique de réticulation influe égale- ment sur la dimension des pores et sur la facilité de rup- ture des membranes. Généralement, des matières à plus grande densité de charge forment des membranes moins poreuses et qui sont plus difficiles à rompre. On petit facilement dé- terminer de manière empirique, en tenant compte des règles directrices cidessus, les conditions optimales de réaction convenant pour régler la perméabilité dans le cas d'un système donné. Des exemples de polymères convenant bien pour la réticulation comprennent notamment des protéines et/ou des polypeptides comportant plusieurs motifs amino-acides, comprenant des groupes amino libres ou des combinaisons de groupes amino et imino, des polyéthylène-amines, des poly- éthylène-imines, des polyvinylamines ou leurs mélanges. On a utilisé avec succès de la polylysine, sous forme D comme sous forme L. On peut aussi utiliser des protéines comme de la polyarginine de la polycitrulline ou de la polyornithine. Des polymères se situant dans la gamme supérieure de la densité des char- ges positives (par exemple de la polyvinylamine) adhèrent vigoureusement aux groupes anioniques des molécules poly- anioniques et sont plus difficiles à rompre. A ce point de l'encapsulation, on peut col- lecter les capsules comprenant une membrane "permanente" semi-perméable entourant une solution gélifiée de gomme, un milieu de culture compatible avec les types de cellules, et les cellules. Si le but visé consiste tout simplement à préserver les cellules en les maintenant dans un milieu environnant protecteur, il n'est pas nécessaire d'appliquer d'autres étapes. Cependant, si un transfert de masse ou de matière doit être favorisé au sein des cellules et par pas- sage à travers les membranes, on préfère reliquéfier le gel et le faire passer à nouveau sous sa forme hydrosoluble. On peut y parvenir en rétablissant les conditions dans les- quelles la gomme est un liquide, par exemple en enlevant du gel le calcium ou les autres cations multifonctionnels ou multivalents. Le milieu présent dans la capsule peut être resolubilisé tout simplement par immersion des capsules dans une solution saline tamponnée par du phosphate, qui contient des ions de métal alcalin et des ions hydrogène. Les ions monovalents remplacent par échange les ions cal- cium ou d'autres ions multivalents ou multifonctionnels au sein de la gomme lorsqu'on immerge les capsules dans la solution tout en agitant. On peut utiliser pour le même but des solutions de citrate de sodium et elles servent à séques- trer les ions divalents. Des molécules de gomme, dont le poids moléculaire est inférieur à la limite supérieure de perméabilité des membranes, peuvent ensuite être enlevées par diffusion du volume intracapsulaire. Enfin, il peut s'avérer souhaitable de traiter les capsules afin de fixer ou bloquer des groupes amino libres ou des groupes analogues qui, sinon, risquent de confé- rer aux capsules une tendance à s'agglomérer. On peut effec- tuer par exemple ce traitement en immergeant les capsules dans une solution diluée d'alginate de sodium. Il ressort de ce qui précède qu'il n'est pas nécessaire d'utiliser, dans le processus de formation des membranes, de réactifs rudes, de valeurs extrêmes de la tem- pérature ou d'autres conditions nuisibles à la santé et à la viabilité des cellules. Ainsi, même des cellules très sensibles comme des hépatocytes de mammifères, des leucocytes, des fibroblastes, des lymphoblastes, et des cellules de divers tissus de glandes endocrines peuvent être encapsulés sans difficulté. Bien entendu, on peut également encapsuler sans les endommager des cellules d'origine microbienne comme des levures, des moisissures et des bactéries, qui sont mieux adaptées à survivre dans des environnements hostiles, ainsi que des composés chimiques relativement inertes, voire des réactifs, des matières solides ou des matières douées d'une activité biologique. Les cellules encapsulées du type décrit ci- dessus peuvent être mises en suspension dans un milieu desti- né à leur entretien ou dans un milieu de croissance en vue de leur stockage ou de leur culture, et elles restent libres de toute infection bactérienne. Si elles sont en suspension dans un milieu de croissance, les cellules qui subissent une mitose in vitro le feront également au sein des capsules. Le métabolisme normal in vitro continue, pourvu que les ma- tières ou facteurs nécessaires pour les processus métaboli- ques soient d'un poids moléculaire suffisamment bas pour que ces matières ou facteurs puissent traverser la membrane des capsules, ou pourvu que ces matières ou facteurs soient encapsulés avec les cellules. Les produits résultant du métabolisme des cellules pénètrent dans la membrane et la traversent (si ces produits ont un poids moléculaire inférieur à la limite supérieure de perméabilité) et ils se rassemblent dans le milieu. Les cellules sous forme encapsulées peuvent être conservées, expédiées ou cultivées selon les désirs, et elles peuvent être libérées de leur environnement protec- teur, sans être endommagées, par la mise en oeuvre du procédé suivant de rupture sélective des membranes. Selon l'invention, la matière encapsulée peut être libérée par un procédé en deux étapes impliquant des réactifs disponibles dans le commerce et doués de propriétés qui ne nuisent pas aux cellules encapsulées. En premier lieu, on sépare les capsules de leur milieu de mise en suspension, on les lave de façon pous- sée pour enlever toutes les matières contaminantes ou pol- luantes puis on les disperse, avec agitation, dans une solu- tion séparée, ou de préférence mélangée, de cations comme des ions calcium ou d'un autre cation multivalent monoatomique à bas poids moléculaire, et d'un polymère de séparation, comportant plusieurs fragments anioniques comme des groupes acides polysulfoniques. On peut également utiliser des poly- mères comportant des fragments acides polyphosphoriques ou acides polyacryliques. On préfère, pour rompre des membranes contenant des cellules, utiliser de l'héparine qui est un polysaccharide sulfoné naturel. La charge anionique du poly- mère séparateur ou de rupture que l'on utilise doit être suffisante pour rompre les ponts salins. Ainsi, la densité des charges anioniques peut être égale, ou de préférence supérieure, à la densité des charges du polymère polyanioni- que intérieur (par exemple la gomme) que l'on a utilisé à l'origine pour former les membranes. Le poids moléculaire du polymère séparateur ou de rupture doit être au moins comparable, et de préférence supérieur, au poids moléculaire du polymère polycationique intérieur ayant servi à former la membrane. Au sein de la suspension, les ions calcium entrent en compétition avec le polymère polycationique in- térieur formant la membrane, pour la liaison de fixation avec les sites anioniques du polymère polyanionique. Simul- tanément, le polymère à action de rupture ou de séparation, dissous dans la solution, entre en compétition avec la gomme *250 1528 polyanionique de la membrane pour une liaison de fixation sur les sites cationiques du polymère polycationique. Cela aboutit à former un complexe pouvant se disperser dans l'eau, ou de préférence hydrosoluble, de, par exemple, poly- lysine et du polymère polyanionique, et à une association des cations avec les molécules du gel. Cette étape rend la membrane sensible à une exposition subséquente à un agent de séquestration, qui achè- ve le processus de rupture en prélevant sur le gel des ions di- ou trivalent. Typiquement, les débris éventuels des mem- branes de capsules restant dans le milieu peuvent être fa- cilement séparés des cellules. La solution actuellement préférée pour la première étape du procédé de rupture sélective comprend 1,1 % de chlorure de calcium (en poids/volume) et de 500 à 1500 unités d'héparine par ml de solution. On ajoute à cette solu- tion un volume de microcapsules suffisant pour constituer environ 20 à 30 ' du volume total de la suspension. On préfère utiliser du chlorure de calcium et de l'héparine lorsqu'on rompt des membranes de capsules contenant des cel- lules, puisque les deux réactifs sont physiologiquement com- patibles avec la plupart des cellules et minimisent la possi- bilité d'endommagement des cellules. On peut également uti- liser des mélanges de sels d'aluminium ou d'autres cations multivalents (mais non pas des ions Mg++) avec le sel d'aci- de polysulfonique ou d'un autre acide du type indiqué ci- dessus. En général, la concentration des ions et du polymère anionique dans la solution, que l'on utilise dans cette étape, peut largement varier. Des valeurs optimales des concentrations peuvent être facilement déterminées par voie expérimentale. On préfère faire appel, pour un lot par- ticulier de cellules encapsulées, à la plus faible concentra- tion utilisable. L'agent de séquestration que l'on préfère ac- tuellement pour effectuer la rupture sélective est du citra- te de sodium, bien qu'on puisse également utiliser d'autres citrates de métaux alcalins et un sel de métal alcalin de EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique). Lorsqu'on utili- se le citrate de sodium, la concentration optimale est de l'ordre de 55 millimoles. Lorsque les membranes des capsu- les soumises à la rupture contiennent du tissu viable, il vaut mieux que le citrate soit dissous dans une solution saline isotonique afin de minimiser les risques d'endomma- gement des cellules. L'invention sera maintenant décrite plus en détail à l'aide des exemples non limitatifs suivants. Les exemples 1 à 4 décrivent la formation des capsules. Exemple 1: encapsulation du tissu pancréatique On obtient sur du pancréas de rat des îlots de Langerhans que l'on ajoute à une culture de tissu complet ("CMRL-1969" Connaught Laboratories, Toronto, Canada) à la concentration d'environ 103 îlots par millilitre. La culture de tissu contient toutes les matières nutritives nécessaires pour la poursuite de la viabilité des îlots ainsi que les aminoacides utilisés par les cellules pour produire des hormones. On ajoute ensuite 0,4 ml d'une sus- pension d'îlots, contenant environ 103 îlots par millilitre, à un volume d'un demi-millilitre de solution saline physio- logique contenant 1,2 % d'alginate de sodium (Sigma Chemical Company). On utilise ensuite une solution à 1,5 % de chlorure de calcium pour gélifier des gouttelettes ayant un diamètre de l'ordre de 300 à 400 microns. Après enlève- ment, par aspiration, de la solution surnageante, on trans- fère les gouttelettes gélifiées dans un bécher contenant 15 ml d'une solution comprenant une partie d'une solution tampon à 2 %O d'acide 2(cyclohexylamino)-éthane sulfonique dans du NaCl à 0,6 % (solution isotonique; pH = 8,2) diluée avec 20 parties de CaC12 à 1 %. Après 3 minutes d'immersion, on lave les capsules deux fois dans une solution à 1 % de CaC12. On transfère ensuite les capsules dans 32 ml d'une solution comprenant 1/80 de pourcent de polylysine (poids moléculaire moyen: 35 000) dans une solution saline physiologique. Au bout de 3 minutes, on décante la solution de polylysine. On lave les capsules avec une solution à 1 'O de CaCl2 et on les remet éventuellement en suspension durant 3 minutes dans une solution de polyéthylène-imine (poids moléculaire 40 000-60 000) produite par dilution d'une solution de réserve à 3,3 % de polyéthylèneimine dans du tampon d'acide morpholinopropanesulfonique (0,2 M pH = 6) avec suffisamment de solution à 1 'O de CaCl2 pour obtenir une concentration finale en polymère de 0,12 'O. On lave ensuite les capsules résultantes, qui ont des mem- branes semi-perméables "permanentes", deux fois avec de la solution à 1 'a de CaCl2, deux fois avec une solution sa- line physiologique et on les mélange avec 10 ml d'une solu- tion à 0,12 d'acide alginique. Les capsules n'ont pas tendance à s'agglomérer, et l'on peut voir que de nombreuses capsules contiennent des lots de Langerhans. On reliquéfie le gel à l'intérieur des capsules en les immergeant durant 5 minutes dans un mélange de solution saline et de tampon de citrate (pH = 7,4). Enfin, on met les capsules en suspension dans du milieu "CMLR-69". On observe au microscope que ces capsules comprennent une mince membrane qui encercle un Ilot au sein duquel on peut voir des cellules individuelles. Des molécu- les ayant un poids moléculaire jusqu'à environ 100 000 peu- vent traverser les membranes. Cela permet à l'oxygène, à des aminoacides, des matières nutritives et des constituants du plasma que l'on utilise dans les milieux de culture (par exemple des constituants à bas poids moléculaire de sérum de foetus de veau) d'atteindre l' lotet cela permet l'excrétion de l'insuline formée. Exemple 2: encapsulation d'hépatocytes On répète le mode opératoire de l'exemple 1, sauf que l'on utilise 0,5 ml d'une suspension de cellules de foie, contenant environ 1O5 cellules par ml, à la place des 0,4 ml de suspension des îlots. La poursuite de la viabilité des cellules hépatiques a été mise en évidence par la technique de l'exclusion d'un colorant (exclusion du bleu trypan) et 2 5 0 1528 par leur aptitude observée à continuer à produire de l'urée. On sait que du tissu hépatique peut, in vitro, ingérer des toxines provenant de son environnement. Donc, des toxines d'un poids moléculaire assez faible pour pouvoir traverser les membranes semi-perméables sont détoxifiées par les cellules. Exemple 3: encapsulation de charbon actif On répète le mode opératoire de l'exemple 1, sauf que l'on met du charbon actif particulaire directement en suspension dans la solution d'alginate de sodium, on omet le demi-millilitre de suspension de tissu, et l'on utilise comme agent de réticulation de la polylysine ayant un poids moléculaire moyen de 35 000. Tant que les particules de charbon sont plus petites que le plus petit diamètre inté- rieur du capillaire servant à produire les gouttelettes, on obtient du charbon à grande surface spécifique de contact entouré par une membrane semi-perméable. Cette membrane em- pêche efficacement les petits morceaux ou la poussière de charbon de s'échapper, alors que ce charbon peut servir à absorber des matières se situant dans n'importe quelle gamme, choisie au préalable, du poids moléculaire et provenant du fluide ayant traversé les capsules. Exemple 4: encapsulation de fibroblastes humains On met des fibroblastes humains, obtenus en traitant du tissu de prépuce humain par de la trypsine et EDTA durant 5 minutes à 371C de façon connue, en suspension dans un milieu complet de croissance ("CfMILR 1969", Connaught Laboratories) additionné de 40 % (volume/volume) de sérum de foetus de veau purifié, 0,8 % d'alginate de sodium (Sigma) et de 200 mg/ml de collagène de peau de veau purifié. La densité de la suspension des cellules est d'environ 1,5 x 1,5 x 10 cellules/ml. On forme comme indiqué ci-dessus des capsules temporaires d'alginate. On dépose des membranes semi-perméables, en couches superficielles sur les capsules, en mettant ces capsules en suspension dans une solution aqueuse à 0,005 (poids/volume) de polylysine L (poids moléculaire: 43 000 daltons) durant 3 minutes. On met les capsules résultantes en suspension. dans "CtlLR-1969", additionné de 10 % de sérum de foetus de veau. On conduit toutes les opérations précisées à 370C. Après incubation à la même température, on trouve, en exami- nant les capsules au microscope, qu'elles contiennent des fibroblastes ayant subi une mitose et l'on constate au sein des microcapsules la présence d'une morphologie tridimension- nelle de fibroblastes. Les exemples suivants vont décrire plus par- ticulièrement la rupture sélective des membranes. Exemple 5 On peut traiter comme suit des microcapsules provenant de l'un quelconque des exemples 1 à 4 afin de rom- pre sélectivement les membranes de ces capsules sans endom- mager la matière centrale encapsulée. On laisse des portions de 10 ml chacune des suspensions de microcapsules, contenant environ 500 à 5000 capsules par ml, se déposer et l'on enlève par aspiration le milieu de suspension. On lave les capsules deux fois avec une solution saline. On mélange ensuite les capsules, ainsi lavées, avec 3,0 ml d'une solution saline contenant de l'héparine selon les diverses concentrations indiquées ci-après, et contenant aussi 1,1 y (en poids/volume) de CaC12. A l'achèvement de cette étape, les capsules dans les- quelles de l'alginate est enclos présentent une partie cen- trale gélifiée et conservant sa forme. On agite la suspension à 370C durant 10 minutes, après quoi on laisse les capsules se déposer, on enlève par aspiration le liquide surnageant et on lave les capsules deux fois avec à chaque fois 3,0 ml de NaCl 0,15 M. Après aspiration de la seconde solution de lavage, on mélange les capsules avec 2,0 ml d'une solution mélangée comprenant des volumes égaux de citrate de sodium mM et de NaCl 0,15 M (pH = 7,4). Les membranes des capsules qui ont été trai- tées par 1000 unités d'héparine par ml et ont été soumises durant 1 minute à du tourbillonnement dans la solution de NaCl-citrate de sodium sont complètement désagrégées. On obtient le même résultat avec des capsules traitées durant 2 minutes avec 2000 unités d'héparine par ml puis 15 à 30 e secondes de tourbillonnement manuel. On préfère utiliser de très faibles concentrations d'héparine, car le risque d'en- dommagement des cellules diminue alors. Après dissolution des membranes, les débris éventuels de ces membranes peuvent être enlevés par aspira- tion ou lavage. Après remise en suspension dans du milieu de culture des cellules ainsi libérées, on peut soumettre des cellules à des essais par la technique d'exclusion du colo- *rant bleu tryptan, et l'on trouve que les cellules sont dans un état sain et viable, relativement très peu de cel- lules présentant une absorption de colorant. Exemple 6 Après lavage, on traite des capsules produites selon l'exemple 3 avec 3,0 ml d'une solution contenant par ml 1000 unités d'héparine, et contenant aussi 1,0 A de AlCl3, durant 6 minutes tout en agitant. Après aspiration du liquide surnageant, on libère la matière centrale en faisant tourbillonner les capsules durant 30 à 90 secondes avec une solution 0,lM de citrate de sodium. Exemple 7 On répète le mode opératoire de l'exemple 6, sauf que l'on utilise de 1'EDTA 0,10 M (forme sodique) à un pH de 7,0 à la place du citrate de sodium, ce qui provo- que une rupture rapide des membranes des capsules. Exemple 8 Après lavage, on traite des capsules, produites selon l'exemple 3, par 3,0 ml d'une solution aqueuse conte- nant par ml 10 mg de sulfate de polyvinyle (poids approxima- tif: 50 000 daltons) et contenant aussi 1 lé de CaC 12* Un traitement postérieur par du citrate de sodium 0,10 M provo- que une dissolution quasi totale des capsules. Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvéiet être appor- tées au procédé décrit. 2 50 1528 REVENDICATIONS 1. Procédé pour rompre sélectivement une membrane perméable comprenant une matrice d'enrobage formée d'un premier polymère comportant de multiples fragments ca- tioniques et d'un second polymère comportant de multiples fragments anioniques et présentant une première densité de charge, ces premier et second polymères étant reliés par des ponts salins formés entre les fragments anioniques et cationiques, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il com- porte les étapes consistant à: A) exposer la membrane à une solution de cations et d'un polymère à action de rupture, comportant plusieurs fragments anioniques et présentant suffisamment de charge pour rompre les ponts salins; B) laisser les cations entrer en compétition avec le premier polymère pour des liaisons de fixation sur les sites anioniques du second polymère et laisser le poly- mère à action de rupture entrer en compétition avec le se- cond polymère pour former des liaisons de fixation sur les sites cationiques du premier polymère; et C) séquestrer les cations associés au second polymère après l'étape B. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la séquestration, dans l'étape (C) en exposant les membranes à une solution conte- nant un agent de chélation. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de chélation est choisi parmi les ions citrate et des ions de EDTA (acide éthylène-diamine- tétraacétique). 4. Procédé-selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier polymère comprend de multi- ples groupes amino. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le second polymère comprend une gomme acide hydrosoluble. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le second polymère est ou comprend de l'alginate. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le polymère à action de rupture comprend de l'héparine, et les cations sont ou comprennent Ca±+. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier polymère est choisi parmi: a) des protéines comportant plusieurs motifs aminoacide et ayant des groupes amino libres; b) des protéines comprenant plusieurs motifs aminoacide et ayant des groupes imino libres; c) des polypeptides comprenant plusieurs mo- tifs aminoacide et ayant des groupes amino libres; d) des polypeptides comprenant plusieurs mo- tifs aminoacide et ayant des groupes imino libres; e) des polyvinylamines; f) des polyéthylène-imines; g) des polyéthylène-amines; et h) leurs mélanges. 9. Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que le polymère à action de rupture est choisi parmi: a) des acides polysulfoniques; b) des acides polyphosphoriques; c) leurs sels; et d) leurs mélanges. lO. Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que le polymère à action de rupture est un polymère de sel d'acide polysulfonique. Il. Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que le polymère à action de rupture compor- tant plusieurs fragments anioniques présente une densité de charges supérieure à la première densité de charge. 12. Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que la membrane délimite une microcapsule contenant au moins une cellule vivante. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le premier polymère comprend une proté- ine; la gomme hydrosoluble comprend de l'alginate de sodium; les cations comprennent du calcium; et le polymère à action de rupture, comportant plusieurs fragments anioniques, est ou comprend de l'héparine. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on effectue la séquestration en utili- sant du citrate dissous dans une solution physiologiquement compatible avec la cellule vivante.