Brevet FR2505360A1 — publié le 19821112

Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 029 549 fait connattre et revendique l'utilisation de Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 pour la préparation de l'acide 9- hydroxy-3-oxo-4-prégnène-20-carboxylique /-9-hydroxybis- noracide 7 Le même micro-organisme est utilisé pour pro- duire la 9-hydroxy-4-androstène-3,17-dione /-9-hydroxy- androstènedione_ 7 dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 035 236; et pour produire l'ester méthylique de l'acide 9-hydroxy-3-oxo-4-prégnène20-carboxylique /-ester méthylique de 9-hydroxybisnoracide_ 7 dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 214 051. La demande de brevet européen N 79 104372 2 décrit une fermentation en deux étapes pour la préparation de l'acide 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxy- lique (I) qui est utile comme composé intermédiaire dans la synthèse de corticoïdes intéressants Ce procédé impli- que d'abord la transformation de stérols en acide 3-oxo- 4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxylique par fermentation avec la souche NRRL B-8054 de Mycobacterium, puis la transfor- mation de ce composé en composé (I) par incubation avec l'un quelconque de plusieurs micro-organismes capables d'introduire un groupe hydroxyle dans la position 9 a. La présente invention propose un procédé effi- cace de fermentation en une seule étape pour la préparation de l'acide 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxy- lique (I) qui constitue un composé intermédiaire utile Ce procédé est mis en oeuvre en utilisant un mutant nouveau de M fortuitum NRRL B-8119 Le procédé de la présente in- vention couvre également l'utilisation de nouveaux mutants doubles obtenus à partir des genres de micro-organismes dont il est question dans le brevet des Etats-Unis d'Améri- que N 4 029 549, c'est-à-dire Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobac- terium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces. Les micro-organismes de ces genres sont tous des agents bien connus de dégradation des stérols Les souches de type sauvage de ces genres dégradent non sélectivement des stérols en composés de faible poids moléculaire, par exemple Co 2 + H 20 Des mutants peuvent être engendrés à partir de ces types sauvages en suivant les modes opératoires révélés dans l'exemple 1 du brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 4 029 549 précité Cet exemple décrit la préparation de M fortuitum NRRL B-8119. Des mutants des genres décrits ci-dessus, qui peuvent être engendrés par les méthodes de l'exemple 1 du brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 4 029 549 précité, peuvent ensuite être soumis aux procédés de mutation décrits dans le présent mémoire pour préparer d'autres mutants Ces derniers mutants, illustrés ici par M fortuitum NRRL B-12433, peuvent être utilisés dans le procédé de fermentation en une seule étape décrit dans le présent mémoire pour préparer le composé ( 1). Le procédé de fermentation à une seule étape de l'invention constitue un très grand perfectionnement par rapport au procédé à deux étapes pour la préparation du composé (I) commenté ci-dessus. Micro-organismes Des mutants qui sont caractérisés par leur aptitude à dégrader sélectivement des stéroïdes portant des chaînes latérales 17alkyliques et à accumuler de l'acide 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)prégnadiène-20-carboxylique (I) comme principal produit dans le bouillon de fermentation peuvent être obtenus par mutation de micro-organismes appartenant aux genres suivants: Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobac- terium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces. On donne ci-après un exemple de préparation du nouveau mutant utilisé dans le procédé de fermentation à une seule étape de l'invention Le mutant préparé dans cet exemple est M fortuitum NRRL B-12433 Des mutants similaires venant d'autres espèces de Mycobacterium et d'autres genres de micro-organismes, comme indiqué dans le présent mémoire, peuvent être préparés en suivant les modes opératoires indiqués dans l'exemple ci-après. Préparation d'un mutant qui accumule de l'acide 9-hydroxy- 3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxylique comme principal produit de la dégradation de stérols On cultive Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 à 31 dans un milieu contenant (par litre) 8 g de bouillon nutritif; 1 g d'extrait de levure; 5 g de glycérol; 0,1 % (poids/volume) de "Tween 80 "; et de l'eau distillée. Ce-milieu est stérilisé par autoclavage pendant 20 minutes sous pression de 105 k Pa On fait croître les cellules jusqu'à une densité d'environ 5 x 108 par ml, puis on les recueille sur un filtre stérile de 0,2 Dm On lave les cellules avec un volume égal de citrate de sodium 0,1 M stérile à p H 5,6, contenant 0,1 % de "Tween 80 ", puis on les remet en suspension dans un demi-volume du même tampon. On ajoute de la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine à une concentration de 100 gg/ml et on fait incuber la sus- pension cellulaire à 31 C pendant 1 heure Ensuite, on lave les cellules avec deux volumes de tampon au phosphate de potassium 0,1 M stérile à p H 7 contenant 0,1 % de "Tween 80 ": puis on les remet en suspension dans 1 volume du même tampon On prépare un milieu contenant (par litre) 8 g de bouillon nutritif, 5 g de Na Cl, 5 g de glycérol et de l'eau distillée On ajoute de la gélose en proportion de 15 g/l et on autoclave le milieu pendant 20 minutes sous pression de 105 k Pa, puis on le verse dans des bottes de Pétri sté- riles Les cellules ayant subi la mutagenèse sont ensuite ensemencées sur ce milieu et les colonies qui se développent sur ces bottes sont ensuite testées sélectivement dans des fermentations à petite échelle pour déterminer leur aptitude à convertir des stérols en le composé (I) La détection du composé désiré est effectuée par chromatographie sur couche mince d'extraits chlorométhyléniques des fermenta- tions d'essai, en utilisant du gel de silice et le système de solvants formé de chlorure de méthylène, d'acétone et d'acide acétique dans la proportion de 212:38:1 On isole de la sorte le mutant NRRL B-12433 qui accumule de l'acide 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20carboxylique comme produit principal de la biotransformation de stérols. La clé de l'isolement d'un mutant tel que celui qui est décrit dans le présent mémoire consiste à partir d'un mutant,tel que NRRL B-8119, qui est déjà inhibé dans la dégradation du noyau de stéroïdes de manière qu'il produise la 9 a-hydroxyandrostènedione, et à induire dans ce micro-organisme une seconde mutation affectant la dégra- dation de la chaîne latérale du stérol. Description du micro-organisme: Le mutant occasionnant la biotransformation décrite dans le présent mémoire ne diffère-de sa culture d'origine, par exemple Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119, que par son action sur des molécules stéroldales Sous tous les autres rapports, tels que la morphologie et la sensibilité aux médicaments, ils sont similaires sinon identiques Les deux cultures de M fortuitum sont des bacilles non motiles, non sporulents, résistant aux acides, appartenant à la famille des Mycobacteriaceae, de l'ordre des Actinomycetales Conformément à la classification de Runyon (E H Runyon, 1959, Med Clin North America 43: 273), il s'agit d'une mycobactérie non chromogénique du groupe IV, c'est-à-dire d'un micro-organisme qui se dé- veloppe rapidement à basse température en produisant des colonies non pigmentées sur des milieux relativement simples. M fortuitum NRRL B-8119 et M fortuitum NRRL B-12433 ont été déposés dans la collection permanente du Northern Regional Research Laboratory, U S Department of Agriculture, Peoria, Illinois, Etats-Unis d'Amérique. M fortuitum NRRL B-8119 a été rendu accessible au public au moins depuis que les brevets des Etats-Unis d'Amérique précités décrivant le micro-organisme ont été accordés. M fortuitum NRRL B-12433 a été déposé le 4 Mai 1981. Des sous-cultures de ces micro-organismes sont disponibles sur demande auprès du NRRL o ils sont déposés Il y a lieu de remarquer que la mise à disposition de la culture n'autorise pas à mettre en oeuvre la présente invention en dérogation aux lois de la propriété industrielle. Le composé (I) est utile comme composé inter- médiaire dans la synthèse de corticoïdes intéressants Par exemple, on peut le convertir en acétate d'hydrocortisone en suivant le mode opératoire décrit en détail dans la demande de brevet européen publiée sous le numéro 79 104372 2. On donne ci-après des exemples qui illustrent le procédé de fermentation à une seule étape de la présente invention Ces exemples ne sont qu'une illustration et ne doivent donc pas être interprétés à un sens limitatif. Tous les pourcentages sont exprimés en poids et toutes les proportions des mélanges de solvants sont exprimées en volume, sauf spécification contraire. Exemple 1 Fermentation de sitostérol brut Le milieu de biotransformation contient (par litre) 8,0 g de "Ucon", 5,0 g de "Cerelose", 3,0 g de NH 4 Cl, 3,0 g de Ca CO 3, 3,0 g de Na 3 /-citrate_ 7 2 H 20, 2,0 g de "Tween 80 ", 1,0 g de farine de soja, 0,5 g de KH 2 P 04, 0,5 g d'urée et 30,0 g de sitostérol brut, dans de l'eau de ville, le p H étant ajusté à 7,0 On inocule des fioles;contenant des portions de 100 ml de ce milieu avec 10 ml de cultures d'ensemencement de M fortuitum NRRL B-12433 développées à 28 dans un milieu contenant (par litre) 8,0 g de bouillon nutritif, 5,0 g de glycérol, 1,0 g d'extrait de levure et 1,0 g de "Tween 80 " dans de l'eau distillée, le p H étant ajusté à 710 On fait ensuite incuber les cultures à 28 pendant 336 heures sur une secoueuse rotative Après l'incubation, on extrait le mélange et on isole le produit comme indiqué en détail ci-dessous dans l'exemple 3. Exemple 2 On procède tout comme dans l'exemple 1, mais en utilisant divers substrats stéroidique$ individuellement ou conjointement et sous la forme pure ou sous la forme brute Ces substrats renferment du sitostérol, du cholestérol, du stigmastérol et du campestérol. Exemple 3 Isolement du composé (I) du bouillon de fermentation de M fortuitum NRRL B-12433 Du bouillon de fermentation ( 1200 ml) provenant d'une biotransformation du sitostérol au moyen de M for- tuitum NRRL B-12433 est acidifié et extrait deux fois avec un volume égal de chlorure de méthylène (Me Cl 2), en don- nant, respectivement, 29,2 g et 8,9 g d'extrait brut. Le premier extrait est redissous dans Me C 12 et la solution est lavée avec une solution saturée de bicarbonate de sodium Les liqueurs aqueuses de lavage sont rassemblées, acidifiées avec H Cl dilué ( 4 N) et réextraites au chlorure de méthylène L'extrait est déshydraté sur du sulfate de magnésium et filtré L'éva- poration du solvant laisse une substance solide jaune qui est triturée avec du chlorure de méthylène en donnant une poudre de couleur jaune pâle On fait cristalliser cette poudre dans un mélange de Me C 12 et de méthanol dont on tire trois récoltes successives: a) 3,8 g; b) 2,1 g et c) 2,8 g Il s'agit, d'après la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire, de mélanges d'acides avec le composé A 17 ( 20)-déhydro (I) à des concentrations res- pectives de 90 %, 35 % et 10 %. Trois recristallisations de la première récolte dans un mélange Me C 12/Me OH donnent 1,8 g d'acide 9-hydroxy- 3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxylique (I) 7 P F 240- 242 0, /-a-7 D 40,7 (méthanol) Le spectre de masse donne un ion moléculaire à m/e 358 (C 22 H 3004). Exemple 4 En remplaçant Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 par un micro-organisme dégradant les stérols choisi dans les genres Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces dans le procédé décrit pour la préparation de M fortuitum NRRL B-12433, on obtient des micro-organismes mutants qui sont caractérisés par leur aptitude à dégrader sélectivement des stéroldes portant une chaîne latérale en C-17 et à accumuler le composé (I) comme produit principal. Exemple 5 En remplaçant M fortuitum NRRL B-12433 dans l'exemple 1 par les mutants obtenus dans l'exemple 4, on obtient le composé (I). REVENDICATIONS 1 Procédé de fermentation à une seule étape pour la préparation d'un composé de formule: CH 3 COOH 0 I caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un micro- organisme mutant choisi dans le groupe comprenant les genres Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Coryne- bacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces, ledit mutant étant caractérisé par son aptitude à dégrader sélectivement des stéroides portant une chaîne latérale en C-17 et à accumuler de l'acide 9-hydroxy-3-oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxy- lique comme produit principal dans le bouillon de fermen- tation, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies, en présence d'un stéroïde portant une chaîne latérale en C-17. 2 Procédé de fermentation en une seule étape pour la préparation d'un composé comme défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cul- tiver un mutant de Mycobacterium qui est caractérisé par son aptitude à dégrader sélectivement des stéroïdes por- tant une chaîne latérale en C-17 et à accumuler de l'acide 9-hydroxy-3oxo-4,17 ( 20)-prégnadiène-20-carboxylique comme produit principal dans le bouillon de fermentation, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en présence d'un stéroïde portant une chaîne latérale en C-17. 3 Procédé de fermentation en une seule étape pour la préparation d'un composé comme défini dans la revendication 1, caractérisé-en ce qu'il consiste à cultiver Mycobacterium fortuitum NRRL B-12433 dans un milieu nutri- tif aqueux dans des conditions aérobies en présence d'un stéroide portant une chaîne latérale en C-17 et à recueillir le produit désiré. 4 Procédé de préparation d'un composé comme défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver Mycobacterium fortuitum NRRL B-12433 dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en présence d'un mélange de deux ou plus de deux stéroides. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit micro-organisme mutant est cultivé dans un milieu nutritif aqueux dans des condi- tions aérobies en présence d'un mélange de deux ou plus de deux stéroides. 6 Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1, 2 et 3, caractérisé en ce que le stéroide est choisi entre le sitostérol, le cholestérol, le stigmastérol et le campestérol. 7 Procédé suivant la revendication 5, carac- térisé en ce que ledit mélange de stéroïdes est choisi dans le groupe comprenant le sitostérol, le cholestérol, le stigmastérol et le campestérol. 8 Mycobacterium fortuitum NRRL B-12433 à titre de mutant nouveau créé en laboratoire.