Brevet FR2499412A1 — publié le 19820813

La présente invention concerne un procédé pour la production de vaccin actif contre des virus. Il est classique de préparer des vaccins contre des virus, par inactivation et détoxification du virus au moyen de formaldéhyde ou de Ppropiolactone, sans diminu- tion de son immunogénicité, ou bien par isolation d'une certaine souche de virus à toxicité plus faible; ces vac- cins ont été utilisés pour des essais prophylactiques, thérapeutiques et/ou de diagnostic, des maladies virales. Cependant, ces vaccins de type classique, contre les virus, présentent l'inconvénient de pouvoir produire de l'immuno- globuline E, un anticorps qui provoque des allergies et/ou un choc anaphylactique, avec par rapport au virus intact une possibilité de production plus faible des autres anti- corps, par exemple immunoglobuline G et immunoglobuline M, qui sont actifs pour la prévention des infections virales. La présente invention permet d'éviter ces incon- vénients de l'art antérieur et de préparer des vaccins dont l'aptitude de produire de l'immunoglobuline E est remarqua- blement abaissée, sans diminution du pouvoir de production des immunoglobulines G et M. Le nouveau procédé,selon l'invention de production de vaccin antivirus, consiste à réaliser un produit conju- gué saccharide-virus qui peut tre obtenu par liaison de covalence entre ses deux constituants. Le procédé selon l'invention peut s'appliquer à tout virus responsable de maladies virales chez l'homme et/ou les ani- maux, et capable d'y stimuler la production d'anticorps t comme par exemple le virus de la vaccine, de la polio, de l'influenza, de l'encéphalite japonaise, de la fièvre jaune, de la rougeole, de la rubéole, des oreillons, de l'hépatite B, d'Epstain-Barr,de la rage, de Sendal, de la maladie de Newcastle, "adeno" virus et "distemper" virus. Le virus peut être soumis tel quel, ou éventuellement après traitement par acide, alcali, chauffage, irradiation aux U.V. et/ou solvant organique, à la réaction de conjugai- son avec un saccharide activé. Les saccharides utilisés conformément à l'inven- tion sont des polysaccharides, comme amidon, amylose, dex- trane, polysucrose ou Ficoll (Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède), pullulane, elsinane, curdlane, gomme arabique, gomme adragante, gomme guar, gomme xanthane, carraghéna- ne, pectine, cellulose, glucomannane et chitosane, ainsi que leurs dérivés et hydrolysats partiels, dont les poids moléculaires moyens sont généralement compris entre 1000 et 10 000 000, de préférence entre 10 000 et 1 000 000. Conviennent plus particulièrement pullulane, elsinane et leurs hydrolysats partiels, car la liaison de covalence entre le virus et ces produits, accro t de façon remar- quable leur pouvoir naturel à produire les immunoglobuli- nes G et M, et diminue fortement l'aptitude à produire de l'immunoglobuline E, tout en inactivant et détoxifiant suffisamment le virus. En ce qui concerne le procédé utilisé pour réali- ser la liaison de covalence entre le virus et le sacchari- de, on peut, conformément à l'invention, utiliser tout procédé dans la mesure o il entraIne la formation de cet- te liaison de covalence, par exemple copulation par diazo- tation, peptidisation, alkylation, réticulation et disul- furation. Dans le procédé de copulation par diazotation, un saccha- ride, doté par un procédé classique d'au moins un groupe- ment amino-aromatique, par exemple p-aminobenzyle, p-amino- benzoyle, m-aminobenzyle, m-aminobenzoyle, m-aminoamisoyle, m-aminobenzyloxyméthyle, (p-aminophênoxy)-3 hydroxy-2 pro- pionyle ou (p-amino m-méthylanilino)-3 chloro-5 triazinyle, est soumis à une réaction de conjugaison avec le virus. Pour le procédé par peptidisation, le virus est soumis à la réaction de conjugaison avec un dérivé carbonate, par exemple un azide d'acide, un chlorure d'acide, un carbodi- imide ou un isocyanate, obtenu à partir d'un carboxyl saccharide, ou bien un dérivé imino ester comme un sac- charide activé par BrCN. Dans le procédé par alkylation, le virus est soumis à la réaction de conjugaison avec un dérivé de saccharide por- teur de groupements halogéno-alkyle comme chloro-, bromo-, iodo-acétyle, ou chlorotriazinyle. Le procédé,par réticulation, implique une réaction de ré- ticulation entre la protéine du virus et le saccharide, en présence d'un réactif polyfonctionnel comme glutaraldé- hyde, glyoxal, succindialdéhyde, diisocyanate d'hexaméthy- lène, diisocyanate de toluène-2,4, bis-azobenzidine ou N,N'-éthylène bis maléimidee Les proportions pondérales préférées virus/sac- charide, au cours de la réaction de conjugaison, sont com- prises entre 1/1 000 et 1 000/1, de préférence entre 1/100 et 100/1. Au cours de la réaction de conjugaison, on peut utiliser plus d'une variété de virus et de saccharide X ainsi, est-il possible d'obtenir une préparation mixte de vaccins, par conjugaison d'un virus avec 2 ou plus de va- riété de saccharides, ou par conjugaison d'une variété de saccharide avec 2 ou plus de variétés de virus. En ce qui concerne les conditions de la réaction de conjugaison, on peut appliquer toutes les conditions dans la mesure o la réaction aboutit à l'inactivation et la détoxification de virus, et diminue fortement le pou- voir de production de l'immunoglobuline E, qui provoque des maladies allergiques et/ou un choc anaphylactique, sans entraPner de diminution du pouvoir de production des immunoglobulines G et M, qui se révèlent efficaces quant à la prévention des maladies virales; en général on opère à une température de 0 à 100 C, à une valeur de pH compri- se entre 3 et 12, pendant une durée de 5 minutes à 50 heu- res. Le vaccin antivirus ainsi obtenu peut être géné- ralement soumis aux stades de séparation et/ou de purifi- cation, grâce à des modes opératoires classiques comme filtration, lavage, centrifugation, relargage, dialyse, adsorption et désorption à l'aide d'un absorbant, filtra- tion sur gel, chromatographie par échange d'ions, chromato- graphie par affinité et/ou électrophorèse, puis être con- centré sous forme de liquide ou de pâte, qui peut être ré- duit par un séchage ultérieur à l'état de poudre. Ce vaccin antivirus peut être avantageusement u- tilisé isolément ou, si nécessaire, en combinaison avec d'autres agents comme antiseptique ou adjuvant, comme agent prophylactique, thérapeutique ou de diagnostic, désensibi- liseur ou inducteur d'interféron, au cours de la préven- tion et du traitement de maladies virales chez l'homme et lbnimal. En outre, conformément à l'invention, la détoxi- fication du virus peut être réalisée dans un court inter- valle de temps, c'est-à-dire généralement i à 2 jours, et le vaccin antivirus résultant est très stable sur une lon- gue période de temps, sans-présenter de danger de retour de la toxicité, alors que le procédé classique utilisant le formaldéhyde nécessite plus de temps, c'est-à-dire 20 à 90 j'ours, pour la détoxification du virus, et que le vac- cin ainsi obtenu, présente une tendance à retrouver sa to- xicité; aussi, peut-on facilement réaliser, conformément à l'invention, une production et un entreposage adéquat de vaccin antivirus, pour maîtriser l'existence ou l'explo- sion de maladies virales. En outre, ce procédé n'exige pas nécessairement une préparation de virus hautement purifiée, puisqu'il é- vite la contamination par d'autres protéines, par exemple celles du milieu de culture, qui provoquent des maladies allergiques fatales et/ou un choc anaphylactique. Conformé- ment à l'invention, une préparation brute de virus peut 4- tre directement inactivée et détoxifiée, sans stades de purification compliqués, et donne une grande quantité de vaccin antivirus à faible coCt. On a en outre confirmation du fait que, un vaccin antivirus obtenu à partir d'une préparation de virus bru- te, présente une activité immunologique comparable ou su- périeure à celle que l'on obtient avec une préparation hautement purifiée. Plusieurs formes de réalisation non limitatives de l'invention sont décrites dans les exemples suivants. EXEMPLE 1 Vaccin contre le virus de l'encéDhalite jaDonaise A. PrE2aration du virus de l'encihalite _laonaise Une souche de virus de l'encéphalite japonaise, Nak*yama, est ensemencée dans des souris âgées de 4 semaines, et les animaux sont ensuite nourris pendant environ 80 heures, Jusqu'à ce qu'ils soient complètement paralysés. Leurs cer- vaux sont enlevés par incision et mis en suspension dans 4 fois leur volume de sérum physiologique, contenant 1/15 M de tampon phosphate (pH 8), et l'on homogénéise, Le pro- duit résultant est alors centrifugé à 3 000 x g pendant 20 minutes, et la partie surnageante est additionnée d'une so- lution aqueuse de sulfate de protamine, Jusqu'à une concen- tration de 2 mg/ml. Ce mélange est ensuite agité pendant 2 heures, et centrifugé pour donner une partie surnageante contenant le virus de l'encéphalite japonaise, à raison de 0,8 % en poids/volume. B. Conjug2aison du virus de l'encéphalite aponaise ___ - ------___ _ __ __ __ _ ____ __ __ avec le pullulane A une solution de pullulane, préparée par dissolution de ,2 g de pullulane de poids moléculaire moyen de 100 000, dans 110 ml de diméthyl formamide, avecchauffage suivi de refroidissement à température ambiante, on ajoute 10 ml de pyridine, puis on additionne ce mélange, sous agitation, avec 1 g de chlorure de p-nitrobenzoyle. On laisse reposer à température ambiante pendant 17 heures. Ensuite, on a- joute au produit, deux fois son volume de n-propanol et l'on recueille le précipité qui est redissous dans de la diméthyl formamide fraIche. L'opération ci-dessus de pré- cipitation-dissolution, est répétée à 3 reprises, et le précipité obtenu finalement est dissous dans une solu- tion aqueuse à 5% en poids/volume de dithionite de sodium. Après mise à incuber de ce mélange à 80"C pendant 30 minu- tes, on décolore le produit résultant avec du charbon ac- tivé, puis on y ajoute 2 volumes de n-propanol pour réa- liser la précipitation. Le précipité obtenu est dissous dans l'eau et dialysé une nuit durant contre de l'eau cou- rante provenant du robinet. Après refroidissement de la solution dialysée à une tempé- rature inférieure à 2 C, on y ajoute de l'acide chlorhy- drique jusqu'à une concentration de l'ordre de 0,1 N, et on additionne ultérieurement ce mélange avec du nitrite de sodium, sous agitation, jusqutà une concentration de l'ordre de 1% en poids/volume. Cqeélange est alors soumis à une réaction de diazotation à cette température, pendant minutes. Lorsque la réaction est achevée, le mélange réactionnel est dialysé contre de l'eau distillée pendant 2 heures à une température inférieure à 2"C, ce qui donne une solution de pullulane activ6.On ajoute à cette solu- tion 100 ml de solution de virus de l'encéphalite japonai- se, obtenue en A du présent exemple, et préalablement inac- tivéebar 3 heures de chauffage à 600C, et l'on ajuste le pH de ce mélange à 8,5 avec une solution de carbonate de sodium. Ce mélange est ensuite soumis à la réaction de dia- zo-copulation, pendant 2 heures, sous agitation, à une tem- pérature inférieure à 40C. On ajoute au mélange réactionnel 3 volumes d'acétone, et on recueille le précipité résul- tant. Après dissolution du précipité dans du tampon phos- phate 0,01 M (pH 7), la solution obtenue est centrifugée pour éliminer la substance insoluble. La partie surnageant est fractionnée par un mode de filtration sur gel, ce qui donne une fraction contenant le produit conjugué pullula- ne-virus de l'encéphalite japonaise, qui est alors soignes- sement filtré, concentré et lyophilisé, donnant avec un rendement voisin de 60%, rapporté au virus introduit au départ, un vaccin en poudre contre le virus de l'encépha- lite japonaise. Le vaccin témoin est préparé comme suit: A 50 ml de so- lution de virus, obtenue en A du présent exemple, on a- joute 0,05% en poids/poids de solution de formaldéhyde de la pharmacopée japonaise, et on laisse reposer ce mé- lange à 4 C pendant 60 jours afin d'inactiver le virus. Le produit résultant est centrifugé à 3 000 x g pendant minutes, et la partie surnageante est successivement soigneusement filtrée, concentrée et lyophilisée, ce qui donne le vaccin témoin contre le virus de l'encéphalite japonaise, avec un rendement voisin de 50% rapporté au virus de départ. C. Administration chez la sour_ du vaccin contre le virus de l'encéphalite Japonaise L'injection intraveineuse de la solution de virus obtenue en A du présent exemple, dans des souris (DDD x BALB/C) F1, à raison d'une dose de 5 x 10o8 g/animal, aboutit à leur mort par encéphalite japonaise. Par contre, l'injection intraveineuse à des souris de mê- me souche, du vaccin selon cet exemple ou du vaccin té- moin, à raison de jusqu'à 1073g de virus intact, n'aboutit pas à leur mort, ce qui confirme que les deux vaccins sont suffisamment inactivés et détoxifiés. Après avoir reçu, séparément, par voie intraveineuse, du vaccin antivirus selon cet exemple ou du vaccin témoin, à raison de 5 x o5 g exprimés en quantité de virus, des souris de même souche reçoivent une nouvelle injection du même vaccin, 7 jours après la première. Ces animaux sont saignés 10 jours après la première injection, et l'on dose la produc- tion d'anticorps dans leurs sérums; la production des immunoglobulines M et G est essayée par la réaction d' hémoagglutination passive (AHP), et celle de l'immuno- globuline E par la réaction d'anaphylaxie cutanée pas- sive (ACP). Les expérimentations ci-dessus confirment que l'on ob- tient une production d'immunoglobulines G et M environ 16 fois supérieure avec le vaccin selon l'invention, et qu' il n'y a pas simultanément de formation décelable d'immu- noglobuline E. Par contre, on constate avec le vaccin té- moin la formation d'une grande quantité d'immunoglobuline E, qui correspond à environ la moitié de la production des immunoglobulines G et M obtenue dans ce cas. Un essai au cours duquel on met à incuber à 40"C dans du tampon phosphate 0,1 M (pH 7) contenant en tant qu'agent antiseptique 0,01% en volume/volume d'aldéhyde formique de la pharmacopée japonaise, du vaccin selon l'invention ou du vaccin témoin, et au cours duquel la quantité des immunoglobulines G et M formées sont dosées par réaction AHP, après administration du vaccin incubé chez la souris, confirme que la demi durée de vie immunologique du vaccin selon l'invention est 8 fois plus longue que celle du vac- cin témoin. En conséquence, le vaccin selon l'invention peut être a- vantageusement utilisé contre le virus de l'encéphalite japonaise, sans danger d'allergies et/ou de choc anaphylac- tique, en raison de sa stabilité satisfaisante. EXEMPLE 2 Vaccin contre le virus de l'encéphalite Japonaise A une solution aqueuse d'elsinane, préparée par dissolu- tion de 8 g d'elsinane de poids moléculaire moyen voisin de 700 000, dans 200 ml d'eau chaude, suivie de refroidis- sement à température ambiante, on ajoute 100 de chlorure cyanurique dans 40 ml de diméthyl formamide, puis on ajuste le pH à 7, et soumet ce mélange à la réaction d'activation pendant 2 heures dans les conditions ambiantes, avec main- tien du pH à la même valeur par addition de solution iN de carbonate de sodium, Le mélange réactionnel est ensuite dialysé contre de l'eau à 4 C et même pH, une nuit durant, pour obtenir une solution d'elsinane activé. A cette solution on ajoute 45 ml de solution de virus de l'encéphalite japonaise, obtenue comme en A de l'exemple 1, et préalablement inactivé par irradiation aux UV, puis le mélange est ajusté à pH 9 et abandonné pendant 2 heures sous agitation et dans les conditions ambiantes, afin que s'effectue la réaction de conjugaison. Le produit résul- tant est ensuite purifié comme au B de l'exemple 1, ce qui donne une poudre de vaccin contre le virus de l'encé- phalite japonaise, avec un rendement voisin de 60% rappor- té au virus de départ. L'injection intraveineuse du vaccin ainsi obtenu s'effec- tue comme au C de l'exemple 1, et confirme qu'il est suf- fisammentinactivé et détoxifié. La production en immunoglobulines G et M est environ 10 fois supérieure à celle du vaccin témoin préparé en B de l'exemple 1, et il n'y a pas de formation simultanée déce- lable d'immunoglobuline E. La demi durée de vie immunolo- gique du présent vaccin est environ 4 fois plus longue que celle du témoin; aussi peut-on l'utiliser avantageusement comme vaccin contre le virus de l'encéphalite japonaise. EXEMPLE 3 Vaccin contre le virus de l'encéphalite Japonaise On opère comme au B de l'exemple 1, mais avec remplacement du pullulane par du dextrane de poids moléculaire moyen de 70 000. Le rendement en vaccin est d'environ 40% rapporté au virus de départ. L'essai d'administration de cekaccin est réalisé comme au C de l'exemple 1, et confirme qu'il est suffisamment inactivé et détoxifié. La production d'im- munoglobulines G et M, avec le présent vaccin, est environ 16 fois supérieure à celle du vaccin témoin préparé au B de l'exemple 1, tandis que la production d'immunoglobuline E ne représente que 1/64 de celle du vaccin témoin. La demi durée de vie immunologique du présent vaccin est double de celle du vaccin témoin; aussi peut-il être a- vantageusement utilisé comme vaccin contre le virus de 1' encéphalite japonaise. EXEMPLE 4 Vaccin contre le virus de l'influenza A. Préparation du virus de l'influenza On ensemence des oeufs embryonnés de 10 jours avec une sou- che de virus de l'influenza A/Tokyo/6/73 (H3i2), et on les met à incuber à 36 C pendant 3 jours, puis on recueille leur fluide allantoTque. Ce fluide est centrifugé à 2 000 x g pendant 20 minutes, et la partie surnageante est fil- trée au travers d'une membrane filtrante, dont les pores ont une dimension de 0,87U., ce qui donne une solution con- tenant le virus de l'influenza. B. Conjugaison du virus de l'influenza et d'un hdo- I.ya lpartieldepMllulane- Une solution aqueuse de pullulane est préparée par disso- lution de 5 g d'hydrolysat partiel de pullulane, de poids moléculaire moyen voisin de 10 000, dans 400 ml d'eau, et ce mélange est ajusté à pH 10,7 avec une solution d'hydro- xyde de sodium 1 N. On ajoute progressivement à cette so- lution 3 g de BrCN, sous agitation, à pH constant, puis on abandonne dans ces conditions pendant 1 heure, afin que s'effectue la réaction d'activation. Le mélange réaction- nel est alors ajusté à pH 5 avec de l'acide chlorhydrique 1N, et il est dialysé contre de l'eau glacée à ce même pH pour obtenir une solution de pullulane activé. Après ajustement de cette solution à pH 8 au moyen de tam- pon carbonate 0,05 M, or. ajoute 200 ml de la solution de virus de l'influenza obtenue en A du présent exemple, et on soumet le mélange à la réaction de conjugaison pendant 24 heures dans les conditions ambiantes. Le mélange réac- il tionnel est purifié, concentré, et lyophilisé comme au B de l'exemple 1, ce qui donne une poudre de vaccin contre le virus de l'influenza, avec un rendement voisin de 70% rapporté au virus de départ. Le vaccin témoin est préparé comme suit: A la solution de virus de l'influenza obtenue au A du présent exemple, on ajoute 2 volumes d'éther, et l'on met à incuber ce mélange à 4PC pendant 2 jours. Le produit résultant est filtré, et le filtrat est lyophilisé, ce qui donne une poudre de vaccin témoin avec un rendement voisin de 60% rapporté au virus de départ. C. Administration à la souris du vaccin contre le virus de' 'influenza. L'injection intraveineuse des vaccins,ainsi obtenus, s'o- père comme au C de l'exemple 1, dans des souris de même souche, et confirme que les deux vaccins sont suffisamment inactivés et détoxifiés. La production des immunoglobulines G et M, dans le cas du présent vaccin, est environ 8 fois plus forte que dans le cas du vaccin témoin, et on n'observe pas de formation simultanée décelable d'immunoglobuline E. Par contre, dans le cas du vaccin témoin ilk a formation d'une grande quantité d'immunoglobuline E, qui correspond à environ la moitié de la production des immunoglobulines * G et M, En conséquence, le présent vaccin peut être avan- tageusement utilisé comme vaccin contre le virus de l'in- fluenza. EXEMPLE 5 Vaccin contre le virus de Sendat A. Préparation du virus de Senda! On ensemence du virus de Sendal dans des oeufs embryonnés de 10 Jours que l'on met à incuber ensuite comme au A de l'exemple 4. Le fluide allantolque de ces oeufs est récol- té et purifié comme dans ce même exemple, ce qui donne une partie surnageante contenant le virus de Sendalo B. Conju2aison du virus de Sendal et du pullulane. A une solution aqueuse de pullulane, préparée par disso- lution de 10 g de pullulane de poids moléculaire moyen de 70 000, dans 200 ml d'eau à chaud, suivie de refroi- dissement à température ambiante, on ajoute 5 g d'hexa- méthylène diamine, et le mélange est ajusté à pH Il avec une solution d'hydroxyde de sodium IN. Ce mélange est alors refroidi au-dessous de 20'C avec un bain de glace, et on l'additionne peu-à-peu avec 5 g de BrCN, sous agi- tation, avec maintien du même pH, puis on abandonne pen- dant 30 minutes dans ces conditions. Le mélange réaction- nel est dialysé contre de l'eau distillée à 4C pendant 1 heure, ce qui donne une solution de pullulane activé. A cette solution on ajoute 25% en poids/volume de gluta- raldéhyde dans 2 ml d'eau, 60 ml de solution de virus de Senda! obtenue au A du présent exemple, et 10 ml de tam- pon acétate 1M (ph 5), puis orMoumet ce mélange à la ré- action de conjugaison à 40C pendant 24 heures, sous agi- tation. La réaction de conjugaison est suspendue par addi- tion de glycine jusqu'à une concentration de 1M, et on abandonne le mélange à température ambiante pendant 24 heures. Le produit résultant est centrifugé, et la partie surnageante est fractionnée par une technique de filtra- tion sur gel, ce qui donne une fraction contenant le pro- duit conjugué pullulane-virus de Sendat. Cette fraction est ensuite concentrée, soigneusement filtrée, et finalement additionnée d'aldéhyde formique de la pharmacopée japonai- se, en tant qu'agent antiseptique, jusqu'à une concentra- tion de 0,01 % poids/poids, ce qui donne un vaccin liquide contre le virus de Senda! avec un rendement de l'ordre de % rapporté au virus de départ. Le vaccin témoin est préparé comme suit: A la solution de virus de Sendal obtenue au A du présent exemple, on ajoute de l'aldéhyde formique de la pharmacopée japonaise jusqu'à une concentration de 0,05% en poids/poids, et l'on met à incuber ce mélange pendant 60 heures à 40C, afin d'inac- tiver le virus. Le produit résultant est ensuite centri- fugé à 3 000 x g pendant 20 minutes, et la partie surna- geante est soigneusement filtrée, ce qui donne un vaccin témoin liquide avec un rendement voisin de 40% rapporté au virus de départ. C. Administration chez la souris du vaccin contre le virus de Sendai L'essai d'administration des vaccins obtenus plus haut, est réalisé comme au C de l'exemple 1, et confirme que ces deux vaccins sont suffisamment inactivés et détoxifiés. La production des immunoglobulines G et M, dans le cas du présent vaccin, est environ 10 fois plus élevée que dans le cas du vaccin témoin, et on ne constate pas de forma- tion simultanée, décelable, d'immunoglobuline E. Par contre, dans le cas du vaccin témoin, on observe la formation d'une forte quantité d'immunoglobuline E, qui correspond à environ la moitié de la production d'immûno- globulines Qét M obtenues dans ce cas. En conséquence, le présent vaccin peut être avantageusement utilisé comme vac- cin contre le virus de Sendal. EXEMPLE 6 Vaccin contre le virus de la rouaeole A. Préparation du virus de la rougeole "Vero cells", provenant de rein de singe vert, sont infec- tées avec du virus de la rougeole, souche Edmonston, dans du milieu de Eagle, additionné de 5% en volume/volume de sérum de veau, et on cultive à 370C pendant 7 jours. Lors- que la culture est achevée, on centrifuge à 3 000 x g pen- dant 20 minutes, et la partie surnageante est à nouveau centrifugée à 110 000 x g pendant 30 minutes. Le sédiment est mis en suspension dans du sérum physiologique au dou- ble de son volume total, ce qui donne une solution conte- nant le virus de la rougeole. B. Conlugaison du virus de la rougeole et de carboxl- LnÉthyl cellulose A 200 ml d'une solution aqueuse à 1% en poids/volume de carboxyméthyl cellulose, de poids moléculaire moyen 000, on ajoute 2 g dtéthyl-l (diméthylamino)-3' pro- pyl-3 carbodiimide, et on ajuste le pH du mélange à 4 avec de l'acide chlorhydrique, avant de l'abandonner sous agitation, à ce pH et à température ambiante, pendant 2 heures, afin que s'effectue la réaction d'activation. Ce mélange réactionnel est ensuite dialysé contre de l'eau distillée, ce qui donne une solution de carboxyméthyl cellulose activée. On ajoute à cette solution 90 ml de la solution de virus de la rougeole, obtenu en A du présent exemple, et l'on soumet ce mélange à la réaction de conjugaison à tempé- rature ambiante, une nuit durant, avec agitation et main- tien du pH à 4,5. Le mélange réactionnel est ensuite cen- trifugé, et la partie surnageante est fractionnée par une technique de filtration sur gel, pour obtenir une frac- tion contenant un produit conjugué carboxyméthyl cellulo- se- virus de la rougeole. Cette fraction est soigneuse- ment filtrée, et le filtrat est additionné de thimerosal, un agent antiseptique, jusqu'à une concentration de 0,01% en poids/volume, ce qui donne un vaccin liquide contre le virus de la rougeole avec un rendement voisin de 50% par rapport au virus de départ. Le vaccin témoin est préparé comme suit: La solution de virus de la rougeole, obtenue au A du présent exemple, est traitée comme en B de l'exemple 1, ce qui donne un vaccin témoin avec un rendement de l'ordre de 40% rapporté au vi- rus de départ. C. Administration chez la souris du vaccin contre le virus de la rougeole L'essai d'injection intraveineuse des vaccins, ainsi obte- nus, s'effectue comme au C de l'exemple 1, et confirme que les deux vaccins sont suffisamment inactivés et détoxi- fiés. La production des immunoglobulines G et M dans le cas du présent vaccin est environ 4 fois supérieure à celle du vaccin témoin, alors qu'il n'y a pas de formation simul- tanée décelable d'immunoglobuline E. Par contre, dans le cas du vaccin témoin, il y a formation d'une grande quan- tité d'immunoglobuline E, qui correspond à environ 1/4 de la production d'immunoglobulines G et M. En conséquence, le présent vaccin peut être avantageusement utilisé con- tre le virus de la rougeole. EXEMPLE 7 Vaccin contre le virus de la maladie de Newcastle Un virus de la maladie de Newcastle de toxicité moindre (souche Ishii) est ensemencé dans des oeufs embryonnés, âgés de 8 jours, qui sont ensuite mis à incuber comme au A de l'exemple 4. Après l'incubation, on récolte le fluide allantoIque et le traite comme au A de l'exemple 6, ce qui donne une solution contenant le virus de la maladie de Newcastle. A 100 ml de cette solution de virus, on ajoute une solu- tion de pullulane activé, préparé comme au B de l'exemple 1, et ce mélange est soumis à la réaction de conjugaison à pH 8, pendant 24 heures dans les conditions ambiantes. Le produit conjugué résultant est séparé, purifié et lyo- philisé comme au B de l'exemple 1, ce qui donne un vaccin en poudre contre le virus de la maladie de Newcastle, avec un rendement voisin de 50%rapporté au virus de départ. Comme le présent vaccin prévient de façon remarquable 1' infection virale, sans provoquer d'allergies ou dechoc anaphylactique, on peut l'utiliser avantageusement comme vaccin contre le virus de la maladie de Newcastle. Revendications 1, Procédé pour la production de vaccin contre des virus, caractérisé en ce que l'on prépare un produit con- jugué saccharide- virus, dans lequel les deux constituants sont liés par covalence, puis recueille le produit conju- gué ainsi obtenu. 2o Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le saccharide est constitué par un ou plusieurs des produits suivants: amidon, amylose, dextrane, poly- sucrose, pullulane, elsinane, curdlane, gomme arabique, gomme adragante, gomme guar, gomme xanthane, carraghénane, pectine, cellulose, glucomannane, chitosane et leurs déri- vés et produits d'hydrolysation partielle. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le poids moléculaire moyen du saccharide est com- pris entre 1 000 et 10 000 000, de préférence entre 000 et 1 000 000o 4. Procédé selon une des revendications 1 à 3, carac- térisé en ce que le virus est un ou plusieurs des virus suivants: virus de la vaccine, de la polio, de l'influen- za, de l'encéphalite japonaise, de la fièvre jaune, de la rougeole, de la rubéole, des oreillons, de l'hépatite B, d'Epstein-Barr, de la rage, de Sendat, de la maladie de Newcastle, "adéno" virus ou "distemper" virus. o Procédé selon une d-s revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que la liaison de covalence entre le saccha- ride et le virus est réalisée à pH compris entre 3 et 12, à température comprise entre 0 et 1000C et pendant une durée s'étalant entre 5 minutes et 50 heures. 6. Procédé selon une des revendications 1 à 5, ca- ractérisé en ce que le rapport pondéral virus/saccharide est compris dans l'intervalle entre 1/1 000 et 1 000, de préférence entre 1/100 et 100. 7. Procédé selon une des revendicationd 1 à 6, ca- ractérisé en ce que la liaison de covalence est réalisée par copulation diazoTque, alkylation, réticulation, pep- tidisation ou disulfuration.