Brevet FR2499854A1 — publié le 19820820

Médicament utile notamment pour provoquer la prolifération des bifidobactéries intestinales. La présente invention se rapporte à un médicament utile notamment en ce qu'il provoque la prolifération des bifidobactéries, en particulier des bifidobactéries intestinales. L'expression "bifidobactérie" sert à désigner d'une manière générale les bactéries appartenant au genre bifidobacterium (cf. Bergey's Manual of Determi- native Bacteriology, huitième édition, page 659-676, Baltimore, The Williams & Wilkins Company) connues comme bactéries utiles existant dans les intestins des humains. Les bifidobactéries contribuent dans une mesure importante à l'entretien de la santé en empêchant les infections intestinales et en apportant à l'hôte des substances nutritives sans production de substances nocives telles que des amines et l'ammoniac. On a signalé en particulier que la morbidité et la mortalité étaient plus fortes chez les nourrissons alimentés au biberon que chez les nourrissons alimentés au sein parce que le nombre de bifidobactéries contenues dans les intestins des premiers étaient plus faibles que dans les intestins des derniers; on considère mainte- nant que la prolifération intestinale des bifidobacté- ries constitue une nécessité. Compte tenu de l'utilité des bifidobactéries dont il a été question ci-dessus, on a déjà proposé d'admi- nistrer des bifidobactéries elles-mêmes en tant que pro- duits pharmaceutiques et on trouve en fait dans le com- merce des types variés de préparations contenant des bifidobactéries. Or, les bifidobactéries sont en général instables et risquent d'être détruites au cours d'une conservation prolongée, de sorte qu'on considère qu'il est difficile de maintenir dans une préparation pharmaceutique la quantité voulue de bifidobactéries viables. En outre, même lorsqu'on administre artificiellement des bifido- bactéries viables, celles-ci se fixent difficilement dans les intestins et ne prolifèrent pas pendant des durées prolongées. La demanderesse a procédé à des études relative- ment à la prolifération intestinale des bifidobactéries et elle a trouvé qu'on provoquait une prolifération exclusive tout à fait étonnante des bifidobactéries, n'affectant pas les autres bactéries intestinales, lorsqu'on administrait de la cyclodextrine à un sujet humain. Cette découverte est à la base de l'invention. Ainsi donc, conformément à l'invention, les bi- fidobactéries ne sont pas introduites de l'extérieur dans l'organisme: on provoque leur prolifération dans l'organisme. Le médicament selon l'invention, utile notamment pour provoquer la prolifération des bifidobactéries, contient de la cyclodextrine en tant que composant ac- tif. On peut utiliser dans l'invention l'alpha-, la bê- ta- ou la gamma-cyclodextrine. Les propriétés physico- chimiques de ces cyclodextrines sont rapportées dans le tableau 1 ci-après. Nota: 1) après recristallisation dans l'eau 2) [cQ5 (dans l'eau). On a étudié la toxicité et les activités pharma- cologiques des cyclodextrines utilisées dans l'inven- tion. Les résultats de ces études sont rapportés ci- apres. (1) Toxicité aiguë. On a administré chacune des cyclodextrines (al- pha-, bêta- et gamma-) par les voies indiquées ci-après à des rats et à des souris et on a déterminé les va- leurs de DL50. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 2 ci-après. TABLEAU 1,u a-cyclo- 0-cyclo- y-cyclo- dextrine dextrine dextrine nombre de motifs de glucose 6 7 8 poids moléculaire 973 1135 1297 O diamètre de cavité, A 5-6 7-8 9-10 O profondeur de cavité, A 7-8 7-8 7-8 forme cristalline 1) acicu- prisma- prisma- laire tique tique pouvoir rotatoire spécifique 2) +150, 50 +162, 50 +177, 40 spécifique 2) solubilité dans l'eau, g/100 ml à 250C 14,5 1,85 23,2 TABLEAU 2 Voies d'ad- Animal LD50 (g/kg) ministration de la- - bora- a-cyclo- e-cyclo- y-cyclo- toire dextrine dextrine dextrine { > 12,5 > 12,5 > 12,5 souris > 12,5 > 12,5 > 12,5 orale _ > 12 > 12 > 12 rat. $ > 12 > 12 > 12 > 0,9 > O,9 > O,9 souris > 0,.9 > 0,9 > 0,9 sous-cutanée > 1,5 > 1,5 > 1,5 rat - > 1,5 > 1,5 > 1,5 > 0 > > 0,9,90,9 souris > 0,9 > 0,9 > 0,9 intraéri-..... tonéale > 1,2 > 1,2 > 1,2 rat __ ',>,>2 > 1,2 > 1,2 > 1,2 Les résultats rapportés dans le trent que les cyclodextrines utilisées tableau 2 mon- conformément à - l'invention ont une faible toxicité aiguë. (2) Activité antibactérienne. On a étudié l'activité antibactérienne de la cyclodextrine sur les bactéries identifiées ci-après par la méthode à la dilution de la plaque de gélose selon le mode opératoire normalisé publié par la So- ciété Japonaise de Chimiothérapie. Les modes opératoires d'essais sont les suivants (a) Activité antibactérienne sur des bactéries aérobies. Espèce de bactérie Numéro de dépôt de la souche Escherichia coli IFO 12734 Staphylococcus aureus IAM 1011 Bacillus subtilis IAM 1069 Après inoculation du milieu de culture trypto- bouillon de soya par chacune des bactéries et incubation de 18 heures à 370C, on a préparé une suspension aqueuse contenant 108 cellules des bactéries proliférées par ml. On a préparé une plaque de gélose en mélangeant une partie en volume de chacune des solutions aqueuses contenant. l'alpha-, la bêta- ou la gammacyclodextrine aux concentrations de 400, 800 ou 1.600 pg par ml avec neuf parties en volume de milieu de culture à la gélose à l'infusion de coeur, en vue d'examiner la sensibilité du médicament; on a coulé chacun des milieux de cul- ture mélangés dans des boites de Pétri. Après frottement de chacune des suspensions aqueuses de bactéries à la surface de la plaque de gé- lose par étirage d'un trait de 2 cm de longueur à l'aide d'une boucle de fil de platine, on a soumis les bactéries à incubation de 18 heures à 370C et on a adopté comme valeur de CMI (concentration minimale inhibitrice) la concentration de cyclodextrine dans le milieu de culture à laquelle il y a inhibition com- plète de la croissance des bactéries. (b) Activité antibactérienne sur des bactéries anaérobies. Espèce de bactérie Numéro de dépôt de la souche Bacteroides fragilis ATCC 25285 Lactobacillus casei IAM 1118 Bifidobacterium bifidum ATCC 15696 Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 Bifidobacterium infantis ATCC 15697 Bifidobacterium oseudolongu-m ATCC 25526 A part l'utilisation du milieu de culture au bouillon GAM en tant que milieu pour la prolifération des bactéries et du milieu de culture à la gélose GAM pour l'examen de la sensibilité des bactéries au médi- cament, à part également l'incubation du milieu de cul- ture inoculé par la méthode de Gaspak (concentration d'anhydride carbonique 5 % en volume) pendant 24 heures à 37 C, on a déterminé la CMI par un mode opératoire analogue à celui décrit ci-dessus sous (a). Dans les essais (a) et (b), on a constaté que la CMI pour chacun des types de cyclodextrine était supé- rieure à 1.600 pg/ml de suspension aqueuse, ce qui mon- tre que la cyclodextrine n'a pas d'activité antibacté- rienne appréciable. (3) Mutagénicité. On a étudié la mutagénicité de la cyclodextrine par le mode opératoire décrit dans "Guidebook for Test of Mutagenicity by Microorganisms" (publié par la Sec- tion of Research for Chemical Substances, department of Safety and Health, Ministry of Labour, Japan). Après incubation de 20 mn à 37 C d'un mélange de 0,5 ml de tampon phosphaté, 0,05 ml de la solution aqueu- se de cyclodextrine (alpha-, bêta- ou gamma-cyclodextrine à 5.000 pg par plaque, même à la concentration maximale) et 0,1 ml de suspension aqueuse de Salmonella typhimurium TA 98 ou TA 100, tous deux isolés à l'origine par Ames et collaborateurs et obtenus au National Institute of Genetics, Japon, ce micro-organisme servant de bactérie d'expérience, on a aDpliqué une couche de la culture bactérienne incubée sur le milieu de culture minimum et on a soumis la culture en couches à incubation de 48 heures à 37 C. On a ensuite comDté le nombre de colonies donnant lieu à réversion dans le milieu de culture. Comparativement à l'essai témoin (dans lequel on utilise de l'eau à la place de la solution aqueuse de cyclodextrine), il n'y a pas d'augmentation notable du nombre des colonies de chacune des souches bactériennes donnant lieu à réversion. Ces résultats montrent que la cyclodextrine ne présente pratiquement aucune mutagénicité. L'activité de la cyclodextrine dans la proliféra- tion des bifidobactéries a été mise en évidence dans l'essai décrit ci-après; on a administré la cyclodex- trine par voie orale à des animaux d'expérience tels que des souris, à la dose de 2 g/kg de poids corporel par jour pendant 2 semaines et on a compté par la mé- thode habituelle le nombre des bactéries intestinales viables telles que bifidobactéries, Escherichia coli, Lactobacilli et Bacteroides sp. dans les fèces de l'ani- mal d'expérience sept jours après l'administration. La cyclodextrine a manifesté un effet remarquable en ce qu'elle a provoqué la prolifération spécifique des bifidobactéries exclusivement, dans un rapport pouvant atteindre 90 fois. Ainsi donc, lorsqu'on administre à un patient le médicament provoquant la prolifération des bifidobactéries selon l'invention, on peut provo- quer la prolifération exclusive des bifidobactéries dans l'intestin sans perturbation de la flore bacté- rienne intra-intestinale. Le médicament provoquant la prolifération des bifidobactéries selon l'invention permet donc d'inter- venir avantageusement sur les symptômes de maladies intestinales telles que la diarrhée, l'entérite, l'in- digestion et la constipation, et peut également être utilisé en tant que médicament thérapeutique pour l'en- céphalopathie hépatogène. En outre, en ajoutant la cyclodextrine selon l'invention à des aliments, des boissons et des frian- dises, on peut également favoriser la prolifération des bifidobactéries intestinales. Pour. l'utilisation de la cyclodextrine en tant que médicament favorisant la prolifération des bifido- bactéries, on peut l'administrer seule ou sous forme de mélange avec un diluant acceptable pour l'usage pharmaceutique ou un autre médicament, sous la forme d'unités de dosage d'une composition pharmaceutique. Ainsi, par exemple, la composition pharmaceutique peut prendre des formes variées telles que les formes de poudre, de granulés, de comprimés, de comprimés revê- tus de sucre, de capsules, de suspension, de solution, d'émulsion et d'ampoules. On peut en outre utiliser comme diluants des substances solides, des substances liquides, des sub- stances semi-solides, ou inclure dans le diluant des capsules ingérables par voie orale. Comme exemple de diluants, on peut citer par exemple des véhicules, des étendeurs, des agents de conjugaison, des agents mouil- lants, des agents désagrégeants, des agents tensio-ac- tifs, des agents lubrifiants, des agents dispersants, des tampons, des parfums, des préservateurs, des agents solubilisants et des solvants. On peut utiliser un seul diluant ou une combinaison de plusieurs diluants. Le médicament selon l'invention contient de 0,01 à 100 X en poids de cyclodextrine, composant actif, dans les cas habituels et il est administré par voie orale ou parentérale mais on préfère l'administration orale. Le dosage du médicament selon l'invention dépend de l'espèce, de l'âge, du symptôme et des conditions individuelles de l'hôte, cependant, ordinairement, et en administration orale à un patient humain, on peut administrer de 0,01 à 1lg par kg de poids corporel et par jour, de préférence de 0,1 à 0,5 g par kg et par jour, réparti en 1 à 4 administrations par jour, avec la dose quotidienne divisée par un à quatre. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée: dans ces exemples, les indications de parties et de pourcentages s'enten- dent en poids sauf mention contraire. Exemple 1. On prépare deux solutions aqueuses contenant chacune 20 % en poids d'alpha-cyclodextrine ou de gamma- cyclodextrine et une suspension aqueuse contenant 20 X en poids de bêtacyclodextrine ainsi qu'une solution aqueuse contenant 20 % en poids de dextrine et qui sert de témoin. Chacune des solutions ou suspensions est adminis- trée à des souris femelles C3H/He à la huitième semaine après la naissance; les animaux sont répartis en quatre groupes de cinq sujets chacun; la dose administrée est de 2,0 g de cyclodextrine par kg de poids corporel et par jour, l'administration étant poursuivie pendant deux semaines. Avant l'administration et 7 jours après l'admi- nistration, on recueille les fèces de chaque souris après dilution par 100 fois leur poids d'un tampon phosphaté anaérobie et broyage, on inocule 0,1 ml de chacune des fèces broyées sur le milieu de culture (indiqué dans le tableau 3 ci-après) de l'espèce par- ticulière de bactérie, et on soumet les milieux de culture inoculés à incubation à 370C pendant un à cinq jours dans des conditions aérobies ou anaérobies (selon la méthode en boite de plantation anaérobie). TABLEAU 3 Espèce de bactérie Milieu de Conditions de culture culture bifidobactérie gélose BS anaérobie, 370C, jours Lactobacilli gélose LBS comme ci-dessus Bacteroides sp. gélose NBGT comme ci-dessus Escherichia coli gélose DHL aérobie, 37 C,un jour Après incubation, on compte le nombre de bifido- bactéries, Escherichia coli, Lactobacilli et Bacteroides sp. dans le milieu de culture. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 4 à 7; les chiffres rapportés pour les comptes sont les moyennes obtenues sur 5 soucis. TABLE AU 4 alpha-cyclodextrine Espèce de bactérie Compte des germes Taux de proli- viables 1) fération, B/A avant (A) 7 jours après(B) administration 7 bifidobactéries 5,4 x 10 6,5 x 10 120 Lactobacilli 8,8 x 108 8,8 x 108 1, 00 Bacteroides sp. 8,6 x 108 8,4 x 108 0,98 Escherichia coli 6,2 x 106 9, 0 x 10o6 1,45 Nota: 1) par g des fèces. TABLEAU 5 bêta-cyclodextrine Espèce de bactérie Compte des germes Taux de proli- viables 1) fération, B/A avant (A) 7 jours après(B) administration bifidobacteries 1,3 x 105 1,8 x 108 1385 Lactobacilli 1,5 x 10 2,2 x 109 1,47 Bacteroides sD. 3,5 x 10 3,7 x 108 1,06 Escherichia coli 4,0 x 106 5, 8 x 106 1,45 Nota: 1) par g des fèces. TABLE AU 6 aamma-cyclodextrine Espèce de bactérie Compte des germes Taux de proli- viables 1) fération, B/A avant (A) 7 jours après(B) administration bifidobactéries 2,0 x 104 1,8 x 106 90 Lactobacilli 9,0 x 108 7,0 x 108 0, 78 8 807 Bacteroides sp. 1,0 x 10 3,0 x 108 3,00 Escherichia coli 7,5 x 106 7,0 x 106 0,93 Nota: 1) par g des fèces. TABLEAU 7 dextrine (comp ratif) Espèce de bactérie Compte des germes Taux de proli- viables 1) fération, B/A avant (A) 7 jours après(B) administration bifidobactéries 2,3 x 105 1,6 x 105 0,70 Lactobacilli 5,0 x 108 6,0 x 108 1,20 Bacteroides sp. 3,2 x 108 8,0 x 108 -2,50 Escherichia coli 9,0 x 106 7,2 x 106 080 Nota: 1) par g des fèces. Les résultats rapportés dans les tableaux 4 à 6 montrent que la cyclodextrine provoque une proliféra- tion spécifique des bifidobactéries exclusivement dans les intestins de l'animal vivant, à un taux de prolifé- ration qui peut dépasser 90 fois; par contre, la dex- trine n'a pas cette activité sur la prolifération des bifidobactéries comme il résulte du tableau 7. Par ailleurs, on n'a observé aucun caractère anormal des fèces de tous les animaux traités par la cyclodextrine. Exemple 2. On prépare des compositions pharmaceutiques pul- vérulentes en mélangeant uniformément 10 parties d'al- pha-, bêta- ou gamma-cyclodextrine, 15 parties de ma- gnésie lourde et 75 parties de lactose. On peut prépa- rer des compositions pharmaceutiques en capsules en introduisant ces compositions pulvérulentes dans des capsules. Exemple 3. Dans cet exemple, on décrit les résultats obte- nus dans l'administratiqn à des sujets normaux d'une composition pharmaceutique en capsules contenant de la bêta-cyclodextrine en tant que composant actif. A trois volontaires masculins adultes en bonne santé, on a administré quotidiennement la composition en capsules de l'exemple 2 en continu pendant 2 semai- nes à raison de 10 g de cyclodextrine par jour. Avant l'administration et après la fin de l'administration, on a recueilli des échantillons des fèces des trois personnes et on a déterminé le nombre des bactéries (y compris les bifidobactéries) dans les échantillons par les modes opératoires décrits dans l'exemple 1. Ces déterminations ont fait apparaître que le nombre de bifidobactéries existant dans les fèces re- cueillies après administration avait augmenté et repré- sentait environ 10 à 100 fois celui trouvé dans les fèces avant administration. Par ailleurs, chez les sujets dont les fèces contenaient un nombre relative- ment important de bifidobactéries avant l'administra- tion, on n'a pas observé une augmentation aussi forte du nombre des bifidobactéries dans les fèces recueil- lies après l'administration. REVENDICATIONS 1. Médicament, utile notamment en ce qu'il per- met de favoriser la prolifération intestinale des bifi- dobactéries, caractérisé en ce qu'il consiste en la cy- clodextrine. 2. Médicament selon la revendication 1,, caracte- risé en ce qu'il consiste en bêta-cyclodextrine. 3. Composition théraDeutique utile notamment pour favoriser la prolifération des bifido3actéries dans les intestins, caractérisée en ce qu"elle oetiennt de la cyclodextrine en tant que composant actif, avec des véhicules et diluants acceptables pour."usage pharmaceutique. 4. Composition selon la revendicationm 3,, earact- risée en ce qu'elle contient de la bèta-cycLdextrDme en tant que composant actif.