Brevet FR2510580A1 — publié le 19830204

I - DESCRIPTION Cristaux en forme de fines aiguilles, blanches à la lumière naturelle et présentant une fluorescence jaune vert en lumière U.V. Les solutions alcooliques présentent une fluorescence bleue intense en lumière U.V. L'étude optique au microscope polarisant montre des fibres généralement -aplaties, transparentes et incolores, présentant au moins deux clivages - un clivage longitudinal, facile, suivant le plan d' zplatissement; - un clivage transversal, moins facile, perpendiculaire au précédent. Ces cristaux sont biaxes positifs. Les valeurs des indices de réfraction principaux sont les suivants - Np = I,590 - Nm = I,595 t 0,005 - Ng = I,670 d'où une biréfringence forte Ng - Np = 0,0080 Ces cristaux sont - Insolubles dans le chloroforme, l'éther, l'acétone, l'éther de pétrole, le benzène. - Presque insolubles dans l'eau froide. - Solubles dans les alcools aliphatiques en proportion inverse de leur PM (3%,dans le méthanol à chaud) ; dans l'éther monométhylique de l'éthylèneglycol (12là froid ; 20%*à chaud) dans les polyéthylène-glycols de 200 à 400 de PM (20%*dans le PEG 400 à chaud). En chromatographie ascendante sur plaque de silice en couche mince, dans le système butanol-méthylcellosolve-chlorofDrme dans la proportion 5:3:in on obtient une tache, identifiable par sa forte fluorescence bleue sous les U.V., de Rf 0,45. Structure moléculaire : la spectrographie de masse à haute résolution (Professeur HUSSON,CNRS,Gif/Yvette) montre la présence d'une génine de formule brute CI6HI205, PM = 284. Le pic le plus lointain du spectre indique un PM = 8I2, qui pourrait être celui de la molécule mère. La faible intensité de ce pic et la présence de nombreux autres pics correspondant à des PM plus faibles, indiquent la fragmentation importante de la molécule initiale dans le spectrographe. L'hydrolyse acide (HC1 2N) de ces cristaux libère - la génine, peu soluble dans l'éther, soluble dans le méthanol, de fluorescence rouge brique à l'état sec en lumière U.V. - 2 oses : glucose et xylose en proportion 2:I. 2 - PREPARATION En premier lieu, les tubercules de Gnidia kraussiana sont broyés, traités au chloroforme dans un extracteur atomiseur (température du solvant 40-500C) afin d'éliminer les diterpénoides, à fonctions époxydes et étheroxydes entre phénols, de toxicité élevée. En présence d'autres constituants de la racine de Gnidia kraussiana, les cristaux se montrent solubles dans l'eau, ce qui implique la possibilité de préparer un extrait aqueux : produit I, riche en hétéroside triterpénique décrit ci-dessus à partir de la poudre de racine détoxiquée. Un extrait plus concentré en hétéroside peut être obtenu par extraction à méthanol 700 à froid (possibilité de préparer une teinture mère au I/IOème). Une extraction plus complète des constituants des racines est réalisée par le méthanol dans l'appareil de Soxhlet. On évapore sous vide cet extrait méthanolique; le résidu, repris dans l'eau, est dialysé. L'hétéroside passe dans la phase externe. L'eau de dialyse est concentrée puis saturée avec un léger excès de butanol ; on laisse déposer à l'obscurité : lthétéroside se dépose. On le recueille sur un filtre ; le précipité est lavé à l'eau, cristallisé dans le méthanol (plusieurs fois si l'on désire obtenir un produit pur) : produit 2. Le rendement de cette opération est très faible. I1 est beaucoup plus facile d'obtenir une préparation riche en cristaux d'hétérosides, contenant aussi d'autres corps non toxiques de la plante. Au lieu de l'alternance des lavages à l'eau et des cristallisations dans le méthanol, le précipité obtenu dans le mélange eaubutanol est lavé à l'eau, dissous dans le méthanol ; après évaporation du méthanol, le résidu est délipidé à l'éther puis lavé deux fois dans de l'eau distillée à 30C. La solution de ce composé à 3sedans le PEG 400 constitue une préparation galénique injectable par perfusion intraveineuse : produit 3. 3 - TOXICOPHARMACOLOGIE La racine de Gnidia kraussiana est utilisée dans la pharmacapée africaine traditionnelle (à l'état brut malgré sa toxicité) dans la lèpre lèpromateuse, les eczémas et le psoriasis. les effets cliniques sont incontestables dans ces affections et suggèrent un mécanisme immunitaire. Des extraits alcooliques de Gnidia kraussiana délipidé par le chloroforme ne montrent pas de toxicité léthale etsubléthale par voie orale et intrapéritonéale chez la souris. Les premiers essais effectués au laboratoire de pharmacologie et de toxicologie fondamentales montrent l'absence apparente de mutagénecité de l'hétéroside triterpénique. Un produit de chromatographie sur colonne de cellulose contenant entr'autres le produit (qui n'avait pas été encore identifié) a été étudié en I967-I968 à l'institut de Cancérologie et d'Immunogénétique de Villejuif. I1 a été constaté à la fois un effet immunostimulant : augmentation de la rate des souris ; et un effet cytolytique : action significative sur la leucémie L I2IO des souris (IOO de prolongation de survie et 20- de guérison). L'action immunostimulante a été confirmée par l'augmentation des gammaglobulines chez les lapins. Afin de comprendre ces résultats paradoxaux (cytolyse et immunostimulation), un test sur moëlle des souris a été effectué en I97I au Centre de transfusion sanguine de Toulouse: cinq lots de cinq souris sacrifiés respectivement, au jour 0 (témoins), puis aux jours 3-I0-20-40 après injection. I1 en ressort que seules les miélocytes et métanomyélocytes disparaissent au jour 3 et régénèrent lentement ensuite, alors que tous les autres stades de la granulopolèse sont respectés. La lignée lymphocytaire n'est pas touchée, les plasmocytes sont augmentés. Un autre test sur les lapins pratiqué avec le produit 2, lorsqu'il a été obtenu à l'état pur (I975) a montré qu'une injection intraveineuse à dose forte (I,5 mg/kg) déclanchait une hémolyse, vite récupérée. Ce même produit 2 a donné aussi un résultat positif dans la leucémie P 388 des souris (I.C.I. I978). Mais ce résultat n'a pu être reproduit dans des tests ultérieurs, probablement en raison d'une altération de l'hétéroside durant la purification et de la faible solubilité de ce dernier. Un test in vitro sur l'incorporation de la thymidine tritiée par les cellules leucémiques humaines en culture a montré par deux fois une action antiblastique au moins égale aux antimitotiques les plus efficaces testés dans la même expérience (AdziXfnycine et Binca- rocristine) ; ceci, à des concentrations réalisables in vivo. Tous ces faits suggèrent une action de lyse cellulaire par destruction de membrane : hémolyse à dose forte et toxique, destruction spécifique de cellules à membranes fragiles à doses thérapeutiques : cellules leucémiques, myélocytes et métamyélocytes (on peut noter en effet que ces deux variétés de cellules sont les cibles privilégiés d'un autre processus de destruction membranaire : les granulopénies immunoallergiques). Cette hypothèse a été avancée par KUPCHAN (chimiste au National Cancer Institut de Bethesda) au sujet de 11action antileucémique de la gnididine, corps extrait d'une autre Thymélacée (Daphné). Les conséquences immunitaires de cette action pharmacologique sont multiples a) pas d'action neutropéniante aux doses thérapeutiques : la destruction spécifique au stade myélocyte est vite compense par les autres casiers de multiplication. b) sur les lymphocytes : après injection à des lapins, on assiste à la disparition des grands lymphocytes sanguins entre la 4ème et la 24ème heure. Puis ils réapparaissent en nombre plus élevé qurau départ et restent élevés plusieurs semaines. Les plasmocytes augmentent après quelques jours dans la moëlle et apparaissent souvent dans le sang. Après une semaine, les gammaglobulines augmentent et restent élevées plusieurs semaines. Ces faits peuvent expliquer l'action dans les affections autoimmunes à médiation cellulaire et dans 11hypersensibilité retardée : les clones lymphocytaires hyperplasiques responsables de l'autoimmunité diminuent leur virulence par suite de la destruction de leurs éléments lymphoblastiques les plus jeunes. Les autres clones lymphocytaires sont stimulés par la suite, rétablissant l'équilibre interclonal. Enfin, l'augmentation des gammaglobulines contribuera à la stabilisation à long terme de ces affections, par la permanence d'une bonne immunité sérique dont les diverses variétés d'immunoglobulines seront bien représentées. 4 - PREPARATIONS GALENIQUES En raison de l'impossibilité actuelle de disposer de quantités suffisantes de produit pur pour usage humain, on utilise les préparations suivantes - Produit I : extrait aqeux buvable, dosable en principe actif, mis en ampoules dans de l'eau glucosée. Ce produit peut être remplacé par la teinture mère, au I/IOème, de racines débarassées des diterpénoides à fonction époxydes et éthéroxydes entre phénols. - Produit 2 : en solution à 3%. dans du polyéthylèneglycol 400 (ampoules de 5 ml par exemple), on obtient un médicament utilisable en perfusion intraveineuse (une ou plusieurs ampoules dans un flacon de soluté isotonique de C1 Na ou de glucose). 5 - INDICATIONS. RESULTATS CLINIQUES le composé nOI et la teinture mère ont prouvé leur efficacité dans la maladie de Kahler et les métastases osseuses du cancer du sein : effet antalgique durable obtenu après 5 à IO jours. On assiste parfois à une restauration osseuse ; et les paramètres hématologiques du myélone sont souvent restaurés s'ils étaient altérés. Une statistique significative prouve leur efficacité dans la prévention des métastases osseuses du cancer du sein. Le composé n02 a fait la preuve de son efficacité dans la sclérose en élagues : les lésions datant de moins de six mois ont été récupérées pratiquement en totalité dans tous les cas traités (stastitique de 35 cas). I1 est évident que les lésions plus anciennes, passées au stade de sclérose, sont irrécupérables. Ces résultats impliquent a) que tous les cas traités dès la première poussée (I2 cas : recul maximum 7 ans), sont restés normaux, moyennant des séries de 5 perfusions de I ou 2 ampoules du composé n02 ; ces séries de perfusions sont à recommencer chaque fois que se manifestent des poussées ou une aggravation. La variabilité du "mode évolutif" de chaque cas implique la variabilité du nombre de séries de perfusions : de I seule en 7 ans à I2 en 7 ans. b) que les cas présentant des lésions fixées ne s'aggravent pas si on les traite dès la moindre aggravation. Ce composé n02 a été aussi capable, à plus fortes doses, d'induire des rémissions dans quelques cas de leucémies aigues, spécialement des formes redoutables par leur chimiorésistance leucémies myéloblastiques, leucémies lymphoblastiques en rechute, et un cas de leucémie lymphoblastique B. Cette action antiblastique, prouvée par les tests sur souris et confirmée par la clinique humaine, a fait utiliser ce produit dans la prévention de la crise blastique des leucémies myêloides chroniques. Une stastitique significative prouve l'efficacité du protocole suivant : 5 perfusions par mois d'une ampoule de 5cc à 3%,. En raison de l'impureté du produit, il est prudent d'administrer un corticoïde injectable dans la tubulure en début de perfusion, en vue de prévenir les éventuels pyrogènes. REVENDICATIONS 1 - L'isolement à l'état pur, cristallisé d'un hétéroside flavonique comme principe pharmacologiquement actif des racines de Gnidia kraussiana : la génine de cet hétéroside a pour formule brute C16H1205 son poids moléculaire est de 284 ; les glucides de cet hét4- roside sont le glucose et le xylose dans la proportion 2 : 1 2 - Le traitement prolongé au chloroforme des racines de Gnidia kraussiana broyées qui solubilise les diterpénoides à fonctions époxydes et étheroxydes entre phénols de toxicité élevSe. Les racines ainsi traitées peuvent être utilisées directement pour préparer décoctions et teintures dépourvues de toxicité, riches en ce principe actif. 3 - Une méthode permettant d'obtenir, de façon reproductible, des préparations injectables très riches en cet hétéroside extraction méthanolique des tubercules broyés, traités au chloroforme et purifications successives de cet extrait : dialyse, préci- pitation de l'hétéroside à l'aide de butanol, lavages à l'éther et à l'eau glacée - le produit ainsi purifié est dissous dans le PEG 400 4 - L'activité pharmacologique de cet hétéroside dûe à son effet destructeur des cellules jeunes à membranes plus fragiles cellules cancéreuses et leucémiques, c\ontS lymphocytaires en hyperplasie des maladies autoimmunes (sclérose en plaques), lymphocytes T suppresseurs, *esponsables du blocage de l'immunité sérique.