Brevet FR2510604A1 — publié le 19830204

La présente invention concerne un procédé de pro- duction d'activeur de plasminogène, ci-après désigné par a.p, ainsi que l'enzyme ainsi obtenue. L'urokinase est une enzyme protéolytique,utilisée en médecine pour traiter des patients souffrant de caillots sanguins Son efficacité a été prouvée, et son utilisation est autorisée aussi bien aux U S A qu'en Europe et au Ja- pon Il semble que les enzymes, désignées sous les noms d'urokinase d'une part, et d'activeur de plasminogène d'au- tre part,soient pratiquement identiques A l'heure actuel- le, l'urokinase est produite principalement à partir de 1 ' urine, dans laquelle elle est présente en très petites quan- tités, de l'ordre de 8 Unités/ml Le coût de la préparation finale est très élevé, et les quantités disponibles sont très faibles En conséquence, on a cherché à produire a p. par d'autres procédés, en quantités pouvant être mises dans le commerce. *La présente invention est basée sur la constata- tion inattendue que l'on pouvait obtenir l'enzyme a p, en quantités industriellement intéressantes, à partir de cel- lules diploïdes normales Des cellules sont isolées, qui produisent a p, et leurs lignées sont conditionnées pour produire des quantités accrues de a p, sans recours à des transformations au moyen de virus ou de traitements chi- miques (inducteurs) qui sont carcinogènes ou co-carcinogè- nes A la fin du cycle de production, les cellules sont in- changées quant au nombre de leurs chromosomes et à leurs caractéristiques de croissance Elles prolifèrent dans les conditions normales, utilisées pour chaque lignée de cel- lules et peuvent ainsi être recyclées. Le nouveau procédé selon l'invention, de produc- tion de a p, consiste à cultiver une souche de fibroblastes diploïdes, fixée sur des surfaces enduites ou non enduites, pour un certain nombre de passages dans un milieu de culture contenant du sérum, puis à cultiver les cellules ainsi con- ditionnées, dans le milieu de culture o elles produisent de l'a p, qui est récupéré à partir de ce milieu. On a constaté que certaines lignées de cellules diploides établies, humaines, comme IMR-90, WI-38 ou HEL-299, acquièrent l'aptitude à produire l'a p, lorsqu' on les cultive initialement pendant une certaine période de l'ordre de 5 à 15 jours, sur un milieu renfermant un sérum autre que le sérum foetal de veau (FCS), de préféren- ce du sérum de cheval (HS), ou lorsqu'on les cultive sur des coupelles préalablement enduites d'une matrice, comme poly-D-lysine Les cellules, ainsi conditionnées, produi- sent par la suite et excrètent l'a p de manière continue sur une période d'au moins 15 jours, dans un milieu exempt de sérum renfermant de l'hydrolysat de lactalbumine (LH) ou un autre milieu nutritif convenable Après accumulation d'a p dans le milieu, et lorsqu'une certaine concentration est atteinte, la production de a p diminue, et même éven- tuellement s'arrête La valeur de cette concentration maxi- male est de l'ordre de 1 U/ml pour de nombreuses lignées de cellules normales; de 3 à 5 U/ml pour les cellules trans- formées, de 30 à 50 U/ml pour les cellules de vessie de porc et de 100 à 300 U/ml pour IMR-90 L'élimination conti- nue de l'a p du milieu nutritif, empêche d'atteindre cet- te concentration maximale; ainsi, les cellules produisent l'a p pendant un laps de temps très prolongé Avec IMR-90 le taux de production est d'environ 50 U/jour/105 cellules. L'a p peut également être absorbé à partir du milieu et ce dernier peut être recyclé L'a p produit est analysé et on constate qu'il a un poids moléculaire d'environ 55 KD, et qu'il a des réactions immunologiquement croisées avec l' urokinase urinaire (UK) Il semble donc que l'a p produit et l'espèce 54 KD d'urokinase urinaire (H-UK) soient homolo- gues, cette dernière étant considérée comme étant l'espèce à activité thérapeutique la plus forte. IMR-90 est une lignée cellulaire similaire à WI-38, cette dernière étant une source classique pour la production de vaccins vivants contre la polio et la rubé- ole La culture de ces lignées cellulaires est décrite en détail dans la littérature, et les conditions optimales sont bien connues Conformément à l'invention, le procédé est décrit avec référence à la lignée de cellules IMR-90. Il est bien entendu que cela n'est fait qu'à titre d'exem- ple non limitatif, et que l'on peut utiliser, dans le même but, des lignées cellulaires nouvelles ou établies, simi- laires, ayant des caractéristiques proches. Parmi les différents sérums utilisables selon l'invention, on peut citer ceux du porc, du cordon humain, du veau nouveau-né, du chien, de la chèvre, de la poule etc. Une lignée préférée de cellules utilisée, est IMR-90, une souche de fibroblastes diploïdes humains, ob- tenus par W W Nichols ( 1977) à partir de poumon d'un foetus femelle âgé de 16 semaines Les cellules proviennent de ATCC (CCL 186, passage 7) Pas plus IMR-90, que WI-38 ou HEL-299 n'ont eu la réputation de produire a p en quantité appréciable A l'origine, au cours de la présente recherche, ces souches étaient considérées comme non productrices On a découvert qu'il était possible de convertir ces cellules en producteurs de quantités appréciables d'a p, par cultu- re sur un milieu renfermant du sérum de cheval, suivie de culture ultérieure sur d'autres milieux nutritifs Les cel- lules IMR-90 provenant d'ATCC sont dégelées et déposées dans un milieu contenant 10 % de FCS, comme recommandé par ATCC Après un passage, les cellules sont transférées dans le milieu LH, et l'on dose la teneur en enzyme On observe une lente formation d'a p (moins de 5 U/ml après 4 jours). Après deux passages dans FCS, les cellules IMR-90 sont repiquées dans un milieu contenant 10 % de HS (sérum de cheval) Après quatre passages ( 12 duplications estimées) dans ce milieu, les cellules sont transférées dans LH Les résultats (figure 1) montrent que les cellules deviennent très fortement productrices de l'a p L'enzyme est pro- duite rapidement et sa concentration dans la solution-at- teint environ 100 U/ml. Dans la figure 1, en ordonnée,est portée l'activité de 1 ' a.p en U/ml et, en abcisse, la durée en jours du séjour dans le milieu LH. Les mêmes cellules sont repiquées de manière continue dans du HS et la production de l'a p est contrôlée de temps en temps Les résultats (Tableau 1) indiquent que la capa- cité de production de l'a p demeure, jusqu'à ce que les cellules commencent à montrer des signes de vieillissement, c'est-à-dire une division lente et l'aplatissement". On observe ce phénomène après le passage 22 à 24, ce qui est estimé correspondre à 65 à 70 duplications. Afin d'éliminer la possibilité que la production de l'a p soit le résultat d'un cas de mutation singulier et non reproductible, on répète l'expérimentation en par- tant de cellules congelées après le 9 ème passage Les résul- tats indiquent que la capacité de production de l'a p s'ex- prime de façon reproductible. Dans certaines conditions, les lignées ci-dessus de cellules fibroblastes peuvent être conditionnées pour produire de l'a p, par culture sur certains substrats en présence de sérums On fait croître les cellules sur diffé- rents sérums, dans des récipients pour culture qui ont été préalablement enduits de divers composés (voir ci-dessous), et l'on suit l'apparition de la capacité productrice de l' a.p On constate que la quantité d'a p dans le milieu varie à la fois selon le sérum et selon la matrice Les ré- sultats obtenus avec des récipients préalablement enduits de poly-Dlysine (tableau IV) montrent que, sur ces matrices, des cellules peuvent s'adapter pour produire de l'a p dans des milieux tels que FCS (sérum foetal de veau) qui autre- ment ne mènent pas à la production d'enzyme Une fois adap- tées, ces cellules continuent à produire l'enzyme dans un milieu sans sérum, comme décrit plus haut Ces cellules conditionnées sont utilisées dans le procédé de produc- tion. Suivant les observations décrites plus haut, la production est caractérisée par quelques détails Au cours de ces expérimentations, les cellules croissent dans un milieu contenant HS, puis sont transférées vers un milieu contenant LH, et le taux d'a p dans le milieu est contrôlé. Les résultats, rassemblés dans la figure 2, mon- trent qu'avec les cellules provenant de passages de début, la concentration en enzymes dans le milieu atteint une li- mite supérieure de l'ordre de 100 U/ml Cette limite supé- rieure augmente lorsqu'on utilise des cellules provenant de passages ultérieurs Avec de très vieilles cellules la production d'enzyme ne s'arrête pas, même quand sa concen- tration dans le milieu atteint 300 U/ml. Sur les figures 3 à 5, les signes suivants sont employés: O pour la totalité du milieu remplacé; A remplacement de la moitié du milieu; * pas de remplacement du tout. Figure 3: Les cellules IMR-90, après le passage 15 ( 6 passages dans HS) sont déposées (lxl O) dans des boîtes de Pétri de 60 mm avec 2,5 ml de milieu HS 24 heures plus tard ce milieu est remplacé par LH Aux moments indiqués par les flèches, la moitié ou la totalité du milieu dans chaque boîte, est recueilli et remplacé avec du LH frais. Dans les boîtes témoins, 100 il de milieu sont recueillis pour essayer a p et sont remplacés par LH frais. Figure 4: Les cellules IMR-90, après le passage 9 dans FCS, sont déposées ( 5 x 10) dans un logement ( 16,4 mm) avec 2 ml d' un milieu renfermant FCS 24 heures plus tard ce milieu est remplacé par un milieu renfermant LH, et on pour- suit l'expérience. Figure 5: Les cellules IMR-90, après le passage 23 ( 13 passages dans milieu ES), sont déposées ( 2 x 10) dans les bottes de Pétri de 60 mm avec 2,5 ml de milieu renfermant HS 24 heures plus tard, ce milieu est remplacé par LH Les milieux sont changés aux moments indiqués par les flèches. Dans le groupe 1, la moitié du milieu dans chaque boite est recueilli et remplacé par du milieu LH frais Dans le groupe 2, la totalité du milieu est recueillie 1,25 ml de LH frais est ajouté aux cellules Le milieu récolté est traité avec de la silice (pour absorber a p) et 1,5 ml de ce milieu est recyclé vers chaque boîte du groupe 2 L'ac- tivité de a p est déterminée sur des échantillons de mi- lieu en chaque point. Ces résultats suggèrent avec force que le taux d'a p, observé dans le milieu, est déterminé par sa forma- tion d'une part, et quelque processus "négatif" d'autre part Ce dernier peut être une rétroaction inhibitrice sur la synthèse (ou excrétion) de l'enzyme, ou la formation d' un autre produit cellulaire qui inhibe l'enzyme ou cata- lyse sa dégénérescence Le passage répété de ces cellules, dans un milieu contenant ES, semble amoindrir ce réglage négatif, permettant ainsi l'accumulation de l'activité en- zymatique décelable, supérieure, dans le milieu. Il faut remarquer qu'une activité de 100 U/ml correspond à une concentration en enzyme de l'ordre de 1 mg/litre, de sorte que les taux de produit dans les expérimentations ci- dessus sont compris dans l'intervalle de 1 à 3 mg/litre. La récolte et la purification du produit s'ef- fectuent comme suit: l'a p produit par les cellules peut être récolté par adsorption à partir du milieu de culture, au moyen d'agents connus pour adsorber l'urokinase, par con- centration au moyen de membranes, ou par combinaison de ces procédés Deux exemples sont donnés ci-après à titre d'il- lustration non limitative. 1 Adsorption. Le milieu LH contenant l'a p est traité avec de la silice finement divisée, par addition de 1 à 2 mg de -olides par ml de solution, et on mélange pendant 1 heure es solides sont alors récupérés par centrifugation On constate que la partie surnageante contient moins de 5 % de l'a p ini- tialement présent, et on la réutilise comme décrit plus loin - L'analyse du solide révèle que a p peut être quantitative- ment libéré de la silice par traitement avec une base, en particulier ammoniac, amine organique et amines polymères, ce qui donne une solution de l'a p qui peut être encore purifiée par divers procédés utilisés dans ce domaine. 2 Concentration par dialyse Le milieu LH contenant de l'a p est transféré dans une poche à dialyse et on place à l'extérieur une substance absorbant l'eau L'enzyme est ainsi concentrée de 10 à 20- fois, avec une récupération totale supérieure à 75 %. On étudie l'action des modifications de milieu sur la production d'a p de la manière suivante. La similitude entre les durées de production de l'a p par IMR-90 et ceux que l'on a observés Fntérieurement avec d'au- tres cellules, conduit à des essais sur l'action de change- ments répétés de milieu On constate (figure 2) que, comme dans les cas antérieurs, le retard de l'apparition de l'en- zyme dans les cultures de IMR-90, à concentration élevée en enzyme, est aboli dans une grande mesure par une perfusion. Apparemment, la perfusion interfère quelque peu avec le mécanisme de réglage de la rétroaction négative dont il a été question plus haut. Les résultats de la figure 3 (en ordonnée la pro- duction totale d'enzyme exprimée en Unité et en abcisse le nombre de jours dans le milieu LH) semblent indiquer que le changement de milieu agit sur la vitesse d'apparition de 1 ' a p lorsqu'une quantité appréciable d'enzyme s'accumule dans le milieu, mais n'agit pas sur la vitesse initiale de production d'a p Une preuve supplémentaire est appor- tée par une expérimentation, au cours de laquelle des cel- lules, ayant poussé dans FCS, sont transférées dans LH (fi- gure 4: en ordonnée la production totale d'enzyme expri- mée en Unité, et en abcisse le nombre de jours dans le milieu LH) Ces cellules produisent de l'a p très lente- ment, de sorte que la concentration dans le milieu est faible, et la vitesse de formation d'a p n'est pas affec- tée par les changements de milieu. Comme le coût du milieu est considéré comme un facteur économique important, on réalise une expérimentation conçue pour essayer la possibilité de recyclage de ce milieu. Le milieu usé est traité avec de la silice pour en éliminer l'a p, et il est recyclé après dilution dans la proportion de 1/1 avec du milieu frais On constate quele traitement par la silice élimine 90 % ou plus de l'a p contenu dans le milieu Les résultats (figure 5: en ordonnée la produc- -tion totale d'enzyme et en abcisse le nombre de jours dans le milieu LH) indiquent que le recyclage du milieu est pos- sible La production observée d'a p est réellement plus forte avec le milieu recyclé que lors de la perfusion de milieu frais. Le milieu utilisé pour la production de l'a p, au cours des expérimentations ci-dessus, contient de l'hydro- lysat de lactalbumine (LH), suivant le mode opératoire géné- ral employé dans les recherches sur a p On observe cepen- dant, que la production de l'a p peut être obtenue avec différentes peptones, comme substrat pour la croissance de micro-organismes qui sont des produits d'hydrolyse de pro- téines d'origine animale ou végétale Des résultats en sont donnés dans le tableau V. Culture de cellules IMR-90 1 Mode opératoire normal Les cellules sont cultivées de manière habituelle sur des plaques de Falcon en matière plastique, de 90 mm, dans un milieu composé d'un mélange ( 1/1 en volume/volume) de DMEM et de F-12, et on y ajoute à une concentration réelle de %, du sérum foetal de veau (FCS) ou du sérum de cheval (HS), fournis par Gibco USA Chaque plaque est ensemencée avec 5 x 105 cellules et 7 ml de milieu La confluence est atteinte en 3 à 5 jours, à environ 8 x 106 cellules par pla- que En vue de leur passage, les cellules sont trypsinisées avec une solution de trypsine à 0,25 % (Biolab, Jérusalem). On ajoute à la plaque 2 à 3 ml de solution de trypsine, et après 1 minute à température ambiante, on aspire cette so- lution de trypsine Les cellules sont laissées recouvertes d'une fine pellicule de liquide Après 15 à 20 minutes, on ajoute une petite quantité de milieu frais, que l'on mélange vec les cellules et on aspire dans une pipette à plusieurs reprises, pour obtenir une suspension de cellules disper- sées On ajoute alors à chaque plaque 5 ml de milieu frais, et l'on prélève des portions pour compter les cellules et pour les redéposer. On a également cultivé les cellules sur des plaques de di- mensions différentes, ou dans d'autres récipients utilisés pour les cultures cellulaires, en utilisant le même rapport cellules/surface spécifique que plus haut, et en suivant le même mode opératoire général. 2 Effets du substrat sur la fixation et la prolifération de IMR-90 On a effectué des études concernant la culture de IMR-90 sur différents substrats et enduits Les cellules sont dé- posées sur différents substrats et on les laisse proliférer pendant 4 jours de façon à obtenir un effet combiné sur 1 ' efficacité du dépôt et la prolifération. Les résultats (Tableaux Il et III) montrent que la culture peut être améliorée par un revêtement préalable des plaques. Le prérevêtement efficace le plus simple est constitué par de la gélatine En outre, une couche de gélatine permet aussi la croissance sur d'autres surfaces comme"Gelbond". Unités L'activité de l'enzyme est exprimée en unités CTA Les essais d'enzyme sont réalisés par le procédé de la plaque de fibrine, graduée avec de l'urokinase normale provenant de NIH (USA). Caractérisation des cellules après utilisation pour la production d'a p. Des cellules IMR-90, adaptées en vue de la production d'ap. comme décrit plus haut, sont caryotypées Un complément normal de chromosomes ( 2 N= 46) est constaté, avec une dis- tribution des résultats expérimentaux, similaire à celle de la lignée de cellule d'origine Des cellules, utilisées pour la production d'a p en milieu LH pendant 12 jours, sont transférées dans un milieu de croissance contenant % de FCS, et se propagent dans les conditions normales, décrites plus haut Ces cellules sont suivies pendant 1 mois, et on observe que, la vitesse de croissance, la den- sité cellulaire à la confluence et l'aspect morphologique des cellules, sont identiques à ceux des IMR-90 d'origine. La production d'a p tombe également au niveau de celui des cellules normales. On peut obtenir des résultats similaires avec des cellules de lignées telles que WI-38, HEL-299, ou si- milaires, et l'invention a également pour objet l'utilisa- tion de ces lignées de cellules pour la production d'a p. TABLEAU I Production d'a p par des cellules IMR-90, qui se propagent dans un milieu contenant du sérum de cheval (HS) Exp Nombre de Taux d'a p U/ml passages * 1 12 98 110 208 22 45 ** 24 15,6 Exp Nombre de Taux d'a p U/ml passages * 2 14 160 17 43 ** 24 272 Passages numérotés à partir de 8 * 0,5 x 105 cellules, seulement Les cellules sont repiquées en continu dans du milieu HS (sérum de cheval), par le mode opératoire normal Afin de déterminer la production d'a p, elles sont déposées, a- près trypsinisation, dans du milieu HS, ( 2 x 105 cellules, plaque de 30 mm, 1,5 ml de milieu) et 24 heures plus tard ce milieu est remplacé par du LH (hydrolysat de lactalbu- mine) L'activité est déterminée sur une portion de ce mi- lieu 96 heures après le transfert sur LH Des témoins, con- duits avec des plaques exemptes de plasminogène sont néga- tifs. IMR-90, reçues congelées après le passage 7, snt dégelées et passées à deux reprises (passages 8 et 9) dans DMEM/FCS. La première expérimentation est menée avec des cellules con- gelées après le passage 9, et conservées dans l'azote li- quide Ces cellules sont dégelées, passées à deux reprises dans DMEM/FCS, puis passées dans DMEM/HS. TABLEAU II Utilisation de pellicules de GELBOND* et de revêtement de GELATINE pour cultiver IMR-90 Substrat Compte des cellules (x 10-5 Plaque non traitée 1, 3 Plaque traitée à la gé- latine 3,2 Gelbond 1,0 Gelbond traité à la gélatine 1,7 *Gelbond est le nom de marque (Marine Biocaloids) de fines feuilles de polyester Une face de la feuille est rendue hydrophile par un procédé non décrit, probablement à l'aide d'alcali C'est cette face que l'on utilise. Les expérimentations sont réalisées sur des plaques de mm, avec au départ 1 x 105 cellules et 1,5 ml de milieu- HS Pour les expérimentations avec "Gelbond", on prépare un rond de pellicule et on en couvre le fond de la plaque. La gélatine est appliquée sous forme de solution aqueuse à 0,03 %, laissée 20 minutes sur la plaque, puis cette so- lution est enlevée par aspiration. A 4 out de 96 heures de croissance, les cellules sont déta- chées par trypsinisation, et comptées. *TABLEAU III Utilisation de divers revêtements de plaques Substrat Comptes des 4 N/No cellules (x 10) Plaque non traitée 4,5 1,3 Traitée au sulfate de protamine 3,0 0,8 Traitée à la poly-D- lysine 6,5 1,8 Matrice de cellule 7,5 2-,1 Les détails expérimentaux sont les mêmes que pour le ta- bleau II, sauf que l'on utilise une série différente de cellules et que 2, 6 x 104 cellules sont déposées sur des plaques de 30 mm Ces plaques sont traitées avec du sulfate de protamine ou dqla poly-D-lysine ( 0,1 mg/ml). Après 5 minutes d'incubation, les plaques sont rincées à deux reprises avec H 20 stérile et une fois avec du milieu et on y dépose les cellules. La matrice de cellule est préparée par la croissance de monocouches de cellules CCL 6 (épithéliales, intestin hu- main) et traitement avec "Triton X-100 " à 0,5 % dans l'eau. Au bout de 10 minutes d'incubation, les plaques sont rin- cées à deux reprises avec PBS et une fois avec du milieu. A ce stade, les plaques sont prêtes à recevoir des cellules. TABLEAU IV Production de a p par des cellules IMR-90 qui se ropa- gent dans divers sérums Sérum Revêtement de a p dans le Sérum foetal de veau (FCS) Sérum de cheval (HS) i Sérum de porc Il Sérum de cordon humain Il Sérum de veau nouveau-né Il Sérum de chien It Sérum de chèvre l Sérum de poulet il Poly D-lysine + + + + + + + + milieu en U/ml i Les cellules IMR-90 se propagent dans un milieu renfermant % de sérum, dans des boîtes de Pétri en matière plasti- que, préalablement recouvertes avec 0,1 % de poly-D-lysine. L'activité d'a p est essayée dans le milieu. TABLEAU V Effet de différentes peptones sur la production d'a p. Peptone a p dans le milieu U/ml Hydrolysat de lactalbumine 36 Hydrolysate de caséine 72 D. M peptone Bouillon au phosphate de tryptose Prematone K Hydrolysat de lactalbumine " de caséine D.M peptone 1 1 0,5 % de Bio-lab ISRAEL 2 % de Gibco U S A. 0,5 % de Scientific Protein Labor Inc. TABLEAU V (suite) Peptone a p dans le milieu __ U/ml Bouillon de phosphate de tryptose 0,5 % de Difco Prematone K 0,5 % de Humko Sheffield Chemicals. Les cellules ( 105 cellules/coupelle de 30 mm) sont déposées dans un milieu avec 10 % de HS, et 48 heures plus tard ce milieu est remplacé par du milieu frais renfermant la pep- tone indiquée La quantité d'a p dans le milieu est déter- minée au bout de 24 heures. Revendications 1 Procédé de production d'activeur de plasminogène (a.p) par culture, caractérisé en ce qu'on cultive une souche de fibroblastes diploïdes, fixés sur des surfaces enduites ou non enduites, par un certain nombre de passa- ges dans un milieu de culture renfermant du sérum, puis cultive les cellules ainsi conditionnées dans un milieu de culture approprié à la production de a p, d'o l'on recueille a p. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé entze que les cellules fibroblastes diploïdes sont des li- gnées de cellules IMR-90, HEL-299 ou WI-38. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules sont cultivées sur les surfaces non enduites de plaques, feuilles, grains, ou autres. 4 Procédé selon une des revendications 1 à 3, carac- térisé en ce que les cellules sont conditionnées par cul- ture sur des surfaces enduites avec de la poly-D-lysine, du sulfate de protamine ou de la gélatine, ou bien sur une matrice cellulaire, et sont ultérieurement cultivées sur une surface enduite ou non enduite. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que les cellules sont conditionnées dans un milieu contenant du sérum de cheval (HS) pendant 3 à 12 - jours, puis cultivées dans un milieu renfermant de l'hy- drolysat de lactalbumine (LH). 6 Procédé selon une des revendications 1 à 5, carac- térisé en ce que les cellules sont conditionnées pour pro- duire de l'a p par culture dans un milieu renfermant du sérum de veau foetal (FCS), sérum de porc, sérum de cordon humain, sérum deqveau nouveau-né, sérum de chien, sérum de chèvre, ou sérum de poulet, puis sont ultérieurement culti- vées dans un milieu renfermant un hydrolysat approprié pour produire l'a p voulu. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la production d'a p s'effectue par culture dans un milieu renfermant une peptone choisie à partir d'hydro- lysat de caséine, bouillon de phosphate de tryptose pep- tone D M,Prematone-K, ou autre produit équivalent du commerce. 8 Procédé selon une des revendications 1 à 6, carac- térisé en ce que l'a p produit est enlevé en continu de la culture par perfusion. 9 Procédé selon une des revendications 1 à 8, carac- térisé en ce que a p est adsorbé sur de la silice, libéré par contact avec une base et purifié par des moyens clas- siques. Procédé selon une des revendications 1 à 9, ca- ractérisé en ce que le milieu est recyclé après enlèvement d'a p. 11 Activeur de plasminogène obtenu par le procédé se- lon une des revendications 1 à 10.