Brevet FR2500305A1 — publié le 19820827

Procédé de préparation d'un extrait de sperme, extrait obtenu selon ce procédé et son utilisation notamment en thérapeutique et en cosmétique. La présente invention a trait à un nouveau procédé de préparation d'un extrait de sperme. Elle concerne également l'extrait obtenu selon ce procédé en tant que produit industriel nouveau, ainsi que son utilisation notamment en thérapeutique et en cosmétique. On sait que le sperme est constitué de cellules de reproduction, les spermatozoides, et d'un véhicule de conservation et de transport des dites cellules, le liquide spermatique. Le liquide spermatique qui est essentiellement constitué d'eau comprend notamment des sucres et des mucopolysaccharides. Le spermatozoide comprend à l'intérieur de sa cellule de l'eau essentiellement et des substances biochimiques telles que notamment des enzymes, des protéines, des aminoacides, des sucres (en particulier le fructose qui est fabriqué par voie enzymatique) et bien entendu des moyens permettant la fabrication de protéines et d'enzymes (ADN, t-ARN, m-ARN et r-ARN). Parmi les constituants biochimiques qu'il renferme, le spermatozoide comprend des substances que l'on ne retrouve nulle part ailleurs.En particulier, c'est le cas de la lactodéshydrogénase (en abrégé LDH) dans le domaine enzymatique : quand on soumet à une électrophorèse la LDH du sang, on observe cinq bandes, alors que à partir de la LDH du spermatozoide on obtient une bande supplémentaire (dénommez ci-après "LDH-X") située entre les bandes 3 et 4 de la LDH du sang. On sait également que le spermatozolde a la faculté de pénétrer in vitro dans les cellules somatiques et d'imposer son ADN dans les noyaux des cellules envahies. On sait enfin que la cellulothérapie, qui a été préconisée dans le passé pour revitaliser les cellules vieillies de l'organisme par administration, notamment par voie injectable, d'extraits cellulaires d'organes tels que moelle osseuse, rate, placenta et embryon, donne des effets bénéfiques temporaires (essentiellement au début du traitement) et conduit à des effets néfastes liés à des mécanismes de rejet. Selon l'invention, on propose une nouvelle solution technique pour résoudre le problème médical de la revitalisation des cellules, qui consiste à extraire puis administrer la plus grande partie des constituants biochimiques essentiels situés à l'intérieur de la cellule des spermatozoïdes. Un des buts de l'invention est de préconiser un procédé d'extraction du sperme conduisant à un produit final renfermant la plupart des constituants biochimiques essentiels non dégrades ou non dénaturés. Un autre but de l'invention est de proposer un extrait de sperme administrable par voie locale, orale et injectable sans mécanisme de rejet, et utile dans le domaine de la revitalisation des cellules vieillies notamment en therapeutique et en cosmétique Le procédé selon l'invention pour la préparation d'un extrait de sperme utile en thérapeutique et en cosmétique, qui comprend l'ouverture des cellules des spermatozoides par voie mécanique et l'extraction des constituants biochimiques contenus à l'intérieur des dites cellules, est caractérisé en ce que l'ouverture des cellules des spermatozoides est réalise en centrifugeant à une vitesse supérieure ou égale à 10000 tours/minute, pendant 2 à 10 minutes, de préférence pendant 4 à 6 minutes, du sperme renfermant des spermatossoides vivants et à maturation, et en ce que l'on écarte le culot de centrifugation et recueille le liquide ainsi obtenu. Le sperme qui intervient comme matière première peut être d'origine animale (cheval, taureau et porc notamment) ou humaine. I1 est utilisé selon l'invention après contrôles et analyses préalables. Les contrôles et analyses ont pour objet d'écarter tout sperme (i) jugé insuffisant en ce qui concerne la qualité et la quantité des spermato:oides qu'il contient, ou (ii) provenant d'un donneur souffrant d'une maladie grave telle que notamment les maladies virales et les maladies dites héréditaires. Par exemple chez l'homme, l'éjaculation donnant en général un volume de sperme de 3 à 4 cm3, on a intérêt à écarter les éjaculats ayant un volume nettement inférieur à 2 cm3 qui, sur le plan de la qualité des spermatozoides, sont considérés comme déficients, de même on a intérêt à écarter les éjaculats ayant un volume nettement supérieur à 4 cm3 qui, sur le plan de la quantité des spermatozoides, ne conviennent pas, les spermatozoides étant dans ce cas trop dilués dans le sperme. Il est essentiel, selon le procédé de l'invention, que les spermatozoldes que l'on traite soient vivants et à maturation (c'est-à-dire à l'état adulte). En effet, à partir de spermatozoides non vivants ou non adultes, on ne pourrait pas recueillir tous les constituants biochimiques souhaités, l'intérieur des cellules des spermatozoides morts se dégradant par autolyse, et les spermatozoides non adultes ne pouvant pas synthétiser un certain nombre de protéines et d'enzymes. En conséquence, pour avoir des spermatozoides vivants et adultes au moment de la centrifugation, on a intérêt sur le plan industriel à congeler à une température inférieure ou égale à - 20 C le sperme qui a été éjaculé avant de procéder à ladite centrifugation. On pourra par exemple congeler dans de l'azote liquide à - 1960C, à condition de diluer le sperme avec de l'eau pour éviter l'éclatement de la plupart des spermatozoides. De façon avantageuse, la congélation sera effectuée à une température inférieure ou égale à - 400C. En pratique, la congélation du sperme interviendra au plus tard 24 heures après 1 'éjaculation. Pour procéder à la centrifugation, on décongèle le sperme en l'amenant à une température comprise entre O et 250C. La centrifugation mise en oeuvre à une température inférieure ou égale à 25 C, de préférence comprise entre 2 et 20 C et de façon plus avantageuse comprise entre 15 et 2OC, sera réalisée dans les 48 heures qui suivent la décongélation et de préférence dans les 12. heures qui suivent ladite décongélation. La centrifugation qui est mise en oeuvre à une vitesse supérieure ou égale à 10.000 tours/minute pendant 2 à 10 minutes, sera avantageusement effectuée à une vitesse comprise entre 15.000 et 30.000 tours/minute pendant 4 à 6 minutes. Après centrifugation, on écarte l'insoluble qui est constitué essentiellement par des fragments de membrane de cellule, et recueille la fraction liquide qui contient la plupart des constituants biochimiques souhaités. Selon une des caractéristiques de l'invention, on procède à une stérilisation. Cette stérilisation, qui intervient avant, pendant ou après la centrifugation, est mise en oeuvre en évitant ou limitant au maximum la destruction ou dénaturation des constituants biochimiques. Le moyen que l'on préconise à cet effet est constitué par les rayonnements W. Selon une autre caractéristique de l'invention, on procède à la concentration de la fraction liquide contenant les constituants biochimiques ; cette concentration intervient pendant ou après la centrifugation. Pour éviter ou limiter au maximum la destruction ou dénaturation des constituants biochimiques, le moyen préconisé est l'évaporation de l'eau sous pression réduite ou par microondes. De façon avantageuse, la concentration sera effectuée de telle façon que l'on obtienne I volume de fraction liquide concentrée à partir de 1,5 à 2 volumes de sperme traité. Ainsi,à partir de 3 à 4 cm3 de sperme soumis à la centrifugation, on recueille 2 cm3 de fraction liquide après concentration. En pratique, la stérilisation et la concentration sont effectuées à une température avantageusement inférieure ou égale à 250C. De façon encore plus avantageuse, la température de stérilisation et de concentration sera celle de la centrifugation. La fraction liquide stérilisée et concentrée ainsi obtenue est conservée à une température inférieure ou égale à 40C, et de préférence à une température comprise entre O et 20C. Cette fraction liquide stérilisée et concentrée -peut être utilisée (i) telle quelle, (ii) après avoir été soumise à une ultrafiltration (dialyse sur membrane) de façon à écarter les substances ayant un diamètre supérieur à 3 u; et de façon avantageuse un diamètre supérieur à 1 e , ou (iii) diluée avec de l'eau distillée, de l'eau déminéralisée ou du sérum physiologique (solution aqueuse de NaCl de 0,5 à 9 gel). L'ultrafiltration par dialyse a pour objet l'élimination des substances en suspension dans la fraction liquide qui pourraient provoquer des phénomènes de rejet après injection. L'ultrafiltration constitue ici une despécification. La fraction liquide, le cas échéant diluee comme indiqué ci-dessus, est utilisable non dialysée a) par voie locale, notamment en cosmétique (sous forme de lotion, crème, pommade ou gel) quels que soient la nature (animale ou humaine) du sperme, d'une part, et le patient recevant le traitement, d'autre part ; et b) par voie orale ou injectable en thérapeutique par "autogamétothérapie" ou "homogaméto therapie", le mode d'administration préfére étant la voie intramusculaire. Par "autogamétothérapie" on entend ici le fait que le sujet apte à avoir une éjaculation est traité au moyen d'un extrait de son propre sperme. Par "homogamétothérapie" on entend ici le fait que le sujet à traiter reçoit un extrait de sperme d'un membre de sa famille. Ainsi quand le sujet de sexe masculin est dans l'impossibilité de recueillir son propre sperme pour différentes raisons (opération sur la sphère génitale, âge avancé), il sera traité avec un extrait de sperme du frère, du fils ou du père (même chromosome Y), de même quand il s'agit d'un sujet de sexe féminin il sera traité avec un extrait de sperme du frère, du fils ou du père (mimez chromosome X). Par voie orale et injectable, la fraction liquide non dialysée ne provoque aucun phénomène de rejet en autogamétothérapie et en homogametothérapie. La fraction liquide dialysée est administrable par voie locale comme fraction liquide non dialysée, d'une part, elle est également administrable par voie orale ou injectable sans rejet à un sujet de la même espèce que le donneur de sperme, d'autre part. La dilution de la fraction liquide dialysée ou non présente un intérêt sur le plan de la standardisation du procédé et de l'extrait selon l'invention, surtout quand ledit extrait va être administré par voie injectable. Si on attribue à un sperme soumis à la centrifugation et comprenant 106 sperma tozoldes vivants par cm3 une activite enzymatique de 1 en LDH-X contenue dans lesdits spermatozoides, on obtient après centrifugation, stérilisation et concentration une fraction liquide ayant une activite enzymatique de 0,60 à 0,85 en LDH-X contenue dans ladite fraction liquide, puis pour administration par voie injectable 1 volume de ladite fraction liquide étant dilué avec 5 volumes d'eau distillée ou déminéralisée ou de sérum physiologique. A partir d'un éjaculat de sperme humain de 3 à 4 cm3, on obtient 2 cm3 de fraction liquide stérilisée et concentrée que l'on dilue avec 10 cm3 d'eau distillé pour avoir 6 doses de 2 cm3 chacune. Selon l'invention, on préconise une composition utile notamment en thérapeutique et en cosmétique caractérisée en ce qu'elle renferme, en association avec un excipient physiologiquement acceptable, un extrait de sperme obtenu selon le procédé de l'invention comme principe actif revitalisant. La posologie préconisée pour application locale chez l'homme consiste à administrer pendant au moins 1 is, à raison de 1 application par j'our (sauf pendant la menstruation), une composition renfermant 0,05 à 10 Z en poids de fraction liquide stérilisée et concentrée. La posologie préconisée pour application par voie injectable (IM) est de 6 doses de fraction liquide (diluée comme indiqué ci-dessus) en autogamétothérapie et en homogamétothérapie pendant au moins 1 à 1,5 mois, à raison de 1 dose-tous les 5 ou 7 jours(le traitement étant suspendu pour les femmes et les animaux femelles pendant la menstruation). La fraction liquide dialysée et diluée est administrée selon la même posologie que la fraction liquide diluée et non dialysée, elle permet l'injection de l'extrait de sperme non seulement en autogamétothérapie et en homogamétothérapie mais encore à des patients de la même espèce que le donneur de sperme mais ayant des chromosomes X et/ou Y différents. Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention consiste a) à congeler le sperme d'un sujet à une température inférieure ou égale à -40 C dans les 24 heures qui suivent l'éjaculation, et de préférence moins de 12 heures après l'éjaculation ; b) à décongeler ledit sperme pour l'amener à une température comprise entre 15 et 200C ;; c) à soumettre dans les 48 heures, et de préférence les 12 heures, qui suivent la décongélation, le sperme à une (i) centrifugation à une vitesse comprise entre 15000 et 30000 tours/minute, pendant 4 à 6 minutes, à une tempéra- ture comprise entre 15 et 200C, et (ii) à une stérilisation au moyen de UV à une température également comprise entre 15 et 200C d) à recueillir le liquide surnageant ainsi obtenu, à le concentrer jusqu'à ce que l'on obtienne 1 volume de liquide surndgeant concentré à partir de 1,5 à 2 volumes de sperme soumis à la centrifugation, et à conserver la fraction liquide résultante à une température comprise entre O et 20 C ; et, e) le cas échéant, à soumettre ladite fraction liquide à une dialyse pour écarter les substances ayant un diamètre supérieur à 3, > vet de préférence les substances ayant un diamètre supérieur à 1 , puis à conserver la fraction liquide dialysée ainsi obtenue à une température comprise entre O et 20C. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. Dans ces exemples, le prélèvement du sperme a été effectué après contrôles et analyses préalables. EXEMPLE I Extrait de sperme de taureau 8 heures après éjaculation, on congèle à une température de -4O0C un sperme de taureau âge de 5 ans. Deux mois après, on décongèle lentement ce sperme jusqu ce que l'on atteigne une température de 15 à 200C. A cette température 7 cm3 de sperme contenant lo6 spermatozoides vivants par cm3 sont aussitôt à une centrifugation à 15000 tours/minute pendant 6 minutes. La stérilisation au moyen de UV est réalisée pendant la centrifugation. On recueille le liquide surnageant que l'on concentre sous vide jusqu'à un volume de 2 cm3. Le liquide ainsi concentre a une activité enzymatique en LDH-X de 0,75 alors que le sperme soumis à la centrifugation avait une activite enzymatique en LDH-X de 1.Ce liquide concentré est conserve à 20C jusqu'à ce qu'il soit utilise. Il peut notamment etre conditionné sous forme de gel, crème ou pommade pour application locale en cosmétique. EXEMPLE 2 Extrait de sperme humain On congèle à -80 C un sperme d'homme agé de 35 ans, 10 heures après éjaculation. On décongèle lentement jusqu'à ce que l'on atteigne une température de 15 à 200C. Une heure après décongélation 3 cm3 de sperme renfermant 106 spermatozoldes vivants par cm3 (activité enzymatique en LDH-X de 1) sont soumis à une centrifugation à 20000 tours/minute pendant 5 minutes, à une température de 15 à 20DC. La stérilisation est effectuée au moyen de UV pendant la centrifugation. On recueille le liquide surnageant que l'on concentre sous pression réduite jusqu'à 2 cm3. Le liquide ainsi concentre a une activite enzymatique en LDH-X de 0,75 et est conserve sans diminution d'activité pendant plusieurs mois à 20C. EXEMPLE 2bis Le liquide concentré (2 cm3) obtenu comme indiqué à l'exemple 2 est dilué avec 10 cm3 d'eau bidistillée, puis reparti en 6 doses de 2cm3 chacune, lesdites doses étant conservées à 20C jusqutau moment de l'administration par voie IM. EXEMPLE 3 Extrait de sperme humain dialysé L'extrait de sperme d'un sujet âgé de 45 ans préparé comme indiqué à l'exemple 2, est soumis à une température de 15 à 200C à une dialyse sur membrane de façon à écarter les substances ayant un diamètre supérieur à 1 . La fraction liquide ainsi obtenue est conservée à 20C jusqu'au moment de l'emploi. Le cas échéant, 1 volume de cette fraction liquide est dilué avec 5 volumes d'eau déminéralisée puis réparti en 6 doses de 1 volume chacune qui sont conservées à 20C jusqu'au moment de l'emploi par voie injectable. EXEMPLES 4 à 7 Extraits de sperme humain A partir d'échantillons de 3 cm3 de sperme décongelé renfermant 106 spermatozoides vivants par cm3 et ayant une activité enzymatique en LDH-X de 1, et en procédant comme indiqué à l'exemple 2 (le donneur étant le sujet de l'exemple 2) en faisant varier la vitesse et la durée de centrifugation, on obtient des fractions liquides concentrées de 2 cm3 du tableau I ci-après. TABLEAU I Ex.4 Ex. 5 0 4x. 6 Ex. 7 Vitesse de 10000 15000 30000 35000 centrifugation (tours/minute) Durée de 10 4 6 5 centrifugation (minutes) Activité en 0,60 0,70 f 0,70 0,65 LDH-X de l'extrait concentre ; Par ailleurs, un essai complémentaire effectué selon la même technique avec une centrifugation à 20000 tours/minute pendant 15 minutes donne une activité de 0,40 en LDH-X de l'extrait concentré, alors que la centrifugation selon l'exemple 2 (20000 tours/minute ; 5 minutes) donne une activité en LDH-X de 0,75.Ceci montre que lorsque la durée de centrifugation est supérieure à 10 minutes, l'activité enzymatique de extrait résultant diminue. EXEMPLE 8 Extrait de sperme de cheval On congèle le sperme d'un jeune étalon (ayant déjà sailli avec succès) à une température de -500C, 12 heures après éjaculation.On décongèle jusqu'à obtenir une température de 15'C puis à cette température on centrifuge 4 cm3 de sperme ayant 106/cm3 spermatozoldes vivants, pendant 4 à 5 minutes. La stérilisation au moyen d'UV est réalisée -apres la centrifugation. On concentre ensuite le liquide surnageant jusqu'à un volume de 2 cm3, le liquide concentré ainsi obtenu est conservé à 20C. EXEMPLE 9 1 volume du liquide concentré obtenu å l'exemple 8 est dialysé, dilué avec 5 volumes d'eau et réparti en 6 doses de 1 volume chacune selon le procedé de l'exemple 3. Les doses ainsi obtenues sont conservées à 20C. On a résumé ci-après une partie des essais entrepris chez l'homme et l'animal avec les extraits-de sperme selon l'invention, en ce qui concerne la revitalisation des cellules vieillies. Essais chez l'homme Les essais concernant le traitement de la sénescence de la peau (pigmentation de vieillesse notamment sur la peau du visage ou des mains, rides liées à l'absence de souplesse du derme) ont concerne 97 patients (57 femmes et 40 hommes) âgés de 45 à 72 ans, les patients recevant les extraits de sperme par voie locale ou injectable selon la posologie donnée ci-dessus (cure de 4 à 6 semaines, repos de 1 à 2 mois, nouvelle cure de 4 à 6 semaines puis examen 2 mois après).Les résultats du traitement ont été donnés dans le tableau II. Dans ces essais, on a observé 3 cas d'échec (pas d'amélioration de l'élasticité du derme). TABLEAU II Nombre de sujets sexe l'extrait d'adminitra- succès échec traités de sperme tion de sperme tion succès echec 15 F taureau local 14 5 M taureau local 5 10 F porc local 10 - 8 M porc local 8 - 20 F homme local 19 10 M ho,se local 9 1 12 P homme injection IM 12 - 17 H homme injection IM 17 Essais chez l'animal L'administration chez le cheval par voie injectable des extraits de sperme de cheval selon l'exemple 8 (homogaFto- thérapie) et de l'exemple 9 (animaux traités n'appartenant pas a la famille du donneur) a permis d'observer une amélioration du tonus chez les mâles et les femelles traités, ainsi que de meilleures performances à la course. REVENDICATIONS I. Procédé de préparation d'un extrait de sperme utile notamment en thérapeutique et en cosmétique en tant qu'agent de revitalisation, ledit procédé, qui comprend l'ouverture des cellules des spermatozoides par voie mécanique et l'extraction des constituants biochimiques contenus à l'intérieur des dites cellules, étant caractérisé en ce que l'ouverture des cellules des spermatozoides est réalisée en centrifugeant a une vitesse supérieure ou égale à 10000 tours/minute, pendant 2 à 10 minutes du sperme contenant des spermatozoides vivants et adultes, et en ce que lton recueille le liquide surnageant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la centrifugation est effectuée à une vitesse comprise entre 15000 et 30000 tours/minute. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la centrifugation est mise en oeuvre pendant 4 à 6 minutes. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la centrifugation est réalisée à unetemperature inférieure ou égale à 250C, de préférence comprise entre 2 et 200C, et de façon plus avantageuse comprise entre 15 et 250C. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide surnageant est conserve à une température inférieure ou égale à 40C et de préférence comprise entre 0 et 20C. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide surnageant est soumis à une ultra-filtration notamment par dialyse pour écarter les substances ayant un diamètre supérieur à 3 t et et de préférence les substances ayant un diamètre supérieur à 7. Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce qu'il comprend une stérilisation au moyen de UV. 8. Procéde selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une concentration du liquide surnageant pour obtenir 1 volume dudit liquide surnageant à partir de 1,5 à 2 volumes de sperme soumis à la centrifugation. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que successivement a) on congèle le sperme d'un sujet à une température infé rieure ou égale à -400C dans les 24 heures qui suivent l'éjaculation, et de préférence moins de 12 heures après l'éjaculation b) on décongèle ledit sperme pour l'amener à une température comprise entre 15 et 20"C ; c) on soumet dans les 48 heures, et de préférence les 12 heures qui suivent la décongélation, le sperme à une (i) centri fugation à une vitesse comprise entre 15000 et 30000 tours/ minute, pendant 4 à 6 minutes, à une température comprise entre 15 et 200C, et (ii) à une stérilisation au moyen de UV à une température également comprise entre 15 et 200C ;; d) on recueille le liquide surnageant ainsi obtenu, le concentre jusqu'à ce que l'on obtienne 1 volume de liquide surnageant concentré à partir de 1,5 à 2 volumes de sperme soumis à la centrifugation, et on conserve la fraction liquide résultante à une température comprise entre 0 et 20C; et e) le cas échéant, on soumet ladite fraction liquide à une dialyse pour ecarter les substances ayant un diamètre supérieur à 3,ur et de préférence les substances ayant un diamètre supérieur à l/u, puis on conserve la fraction liquide dialysée ainsi obtenue à une température comprise entre O et 20C. 10. Extrait de sperme caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11. Composition revitalisante, utile notamment en thérapeutique et en cosmétique, caractérisée en ce qu'elle renferme, en association avec un excipient physiologiquement acceptable, un extrait de sperme selon la revendication 10.