Brevet FR2500008A1 — publié le 19820820

250000S La présente invention concerne un procédé pour la production d'acide L-glutamique par fermentation. L'acide L-glutamiquedont le sel monosodique a été utilisé comme assaisonnement, était précédemment produit par un procédé de fermentation dans lequel on utilise des souches sauvages ou des mutants artificiels de bactéries productrices d'acide L-glutamique, en particulier du genre Brevibacterium ou Corynebacterium. On connaît actuellement divers mutants artificiels du genre Brevibacterium ou Corynebacterium capables de produire l'acide L-glutamique. Des exemples de ces mutants artificiels sont les mutants ayant besoin de L-arginine,de L-histidine, de pyrimidine, d'hypoxanthine, de glycérol, de composés chimiques ayant une liaison disulfure ou d'un acide gras insaturé, tel que l'acide oléique (comme décrit dans les demandes de brevets japonais examinées publiées n 507/1667, 508/1967, 509/1967, 27390/1970, 27391/1970, 19632/1975, 33997/1976, 2998/1977, 6233/1978, 6234/1978 et 8798/1978); les mutants résistants au chloramphénicol, à la strepto- mycine, à la chlorotétracycline, à la S-(2-aminoéthyl)-cystéine, à l'acide monofluoracétique, à l'acide fluorocitrique, à l'acide cétomalonique, à l'acide a-amino-p-hydroxyvalérique, au DL-thréonine hydroxamate, à l'acide 2-amino-3-phosphopropionique, à l'acide - aminolévulinique, aux analogues de l'acide glutamique, à la benzopyrone, à la naphtoquinone, à l'acide 2,6-pyridinedicarboxy- lique ou aux inhibiteurs du système respiratoire, tels que l'acide malonique, NaN3,KCN, l'arsénite de sodium, le 2,4-dinitrophénol, l'hydroxylamine et la guanidine (comme décrit dans les demandes de brevets japonais non examinée publiées n 4398/1966, 126877/1975, 38088/1977, 89085/1979, 21763/1980, 21764/1980, 124492/1980, 1889/1981, 35981/1981, 39778/1981 et 48890/1981); les mutants sensibles à l'acide N-palmitoylglutamique, au lysozyme ou à une température de plus de 34 C (comme décrit dans les demandes de brevets japonais non examinées publiées n 64486/1975, 32193/1978, 66687/1977, 122794/1979, 114293/i980); et les mutants ayant une activité réduite vis-à-vis de la pyruvicodéshydrogénase (comme décrit dans la demande de brevet japonais non examinée publiée n 21762/1980). La demanderesse a maintenant découvert selon l'invention que le mutant du genre Brevibacteriumartificiellement induit à partir d'une souche productrice d'acide L-glutamique et privé de la faculté de pousser dans un milieu de culture spécifique contenant de l'acide L-glutamique% peut produire plus d'acide L-glutamique que sa souche mère. On propose donc selon l'invention un procédé pour la production d'acide Lglutamique par fermentation, qui consiste a cultiver en conditions aérobies dans un milieu de culture classique un mutant du genre Brevibacterium qui est privé de la faculté de pousser dans un milieu de culture spécifique contenant de l'acide L-glutamique et qui est capable de produire l'acide L-glutamique dans un milieu de culture classique, le milieu spéci- fique consistant en 1,0 1 d'eau, 7,0 g de L-glutamate monosodique, 1,0O ml d'ammoniaque aqueuse, 1,O g de dihydrogénophosphate de potas- sium, 0,4 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 10 mg de sulfate ferreux heptahydraté, 81 mg de sulfate de manganèse têtrahydraté, 0l0ug de chlorhydrate de thiamine, 30/ug de biotine et 20 g de gélose, et étant ajusté à pH 7,0 par l'hydroxyde de potassium. Le procédé selon l'invention comprend également, de manière appropriée, la récupération de l'acide L-glutamique accumulé dans le milieu de culture. De préférence, le mutant utilisé dans le procédé selon l'invention appartient à l'espèce Brevibecterium flavum ou Brevibacterium lactofermentum, il est privé de la faculté de pous- ser dans un milieu de culture spécifique contenant de l'acide Lglutamique et capable de produire de l'acide L-glutamique dans un milieu de culture classique. Un exemple de ces mutants de l'invention est Brevibacterium flavum AJ 11664, FERM-P 5878 (FERM BP-84). Les numéros AJ sont des numéros de référence internes de la demanderesse. Le mutant identifié ci-dessus par son numéro FERM-BP a été initialement déposé sous le numéro FERN-P indiqué le 14 févfier 1981 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade 4nd Industry (FRI), 1-3 Higashi 1-chome, Yatabemachi, Tsukuba-gun, Ibaragi-ken 305, au Japon, et ce dép8t à été transformé en numéro de dépôt FERM-BP selon le traité de Budapest le 9 décembre 1981 auprès du FRI qui a acquis le statut d'autorité de dépôt inter- nationale le ler mai 1981. Le mutant indiqué ci-dessus a été induit à partir de la souche mère du genre Brevibacterium par un procédé classique. La première étape de l'induction consiste à faire muter la souche mère avec un mutagène chimique convenable, tel que la N-méthyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidine(ci-après dénommée NG) et l'acide nitreux ou par irradiation en lumière ultraviolette. La seconde étape consiste à choisir par un procédé de reproduction un mutant qui ne peut pas pousser dans un milieu de culture contenant de l'acide L-glutamique comme seule source de carbone, mais qui peut pousser dans un milieu de culture conte- nant de l'acide succinique comme seule source de carbone. Enfin, on évalue par une technique classique l'aptitude des mutants à produire de l'acide L-glutamique. Le mutant FERM BP-84 a les mêmes caYactéris- tiques générales que sa souche mère, c'est-à-dire ATCC 14067. On utilise comme souche mère n'importe quelle souche sauvage du genre Brevibacterium capable de produire l'acide L-glutamique. Les souches sauvages préférées sont des bactéries productrices d'acide glutamique de la forme coryne, par exemple: Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium saccharoliticum ATCC 14066 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Comme autres types de souches mères, on utilise de préférence des mutants du genre Brevibacterium qui sont induits à partir de souches sauvages comme indiqué ci-dessus et dont on sait qu'ils ont les caractéristiques biologiques efficaces pour la production d'acide glutamique, telles que la résistance à l'acide fluoromalonique, à l'acide fluorocitrique, à l'acide cétomalonique et à l'acide 2,6- pyridinedicarboxylique et la sensibilité au lysozyme et au N-palmitoylglutamate. On peut conférer ces caractéristiques, intéres- santes pour la production d'acide L-glutamique, avant ou après avoir donné aux souches sauvages les caractéristiques d'incapacité à pousser dans le milieu de culture spécifique contenant de l'acide Leglutamique comme seule source de carbone. Le procédé par lequel on induit le mutant de l'inven- tion et le degré de croissance sur la plaque de gélose du milieu de culture contenant de l'acide L-glutamique ou de l'acide succinique comme seule source de carbone sont-indiqués dans les expériences 1 et 2 suivantes. EXPERIENCE 1 On recueille par grattage des cellules de la souche connue Brevibacterium flavum ATCC 14067 ayant poussé sur tranche de gélose inclinée au bouillon et on les met en suspension dans de l'eau stérilisée contenant 850 /ug/ml &dNG et on laisse reposer la suspen- sion à 30 C pendant 15 min. On lave les cellules microbiennes ainsi traitées par une solution tampon au phosphate et ensuite on les ense- mence sur une plaque' de gélose du milieu de culture ayant la com- position indiquée dans le tableau 1 ci-après. On choisit ensuite Brevibacterium flavum AJ 11667 parmi les mutants qui ont poussé sur la plaque de gélose du milieu contenant de l'acide 'succinique comme seule source de carbone,.mais ne poussent pas sur la plaque du milieu contenant de l'acide L-glutamique comme seule source de carbone. TABLEAU 1 (Composition du milieu de culture) Milieu à l'acide Milieu a l'acide Ingrédients L-glu tamigue sucinique L-glutamate monosodique 7,0 g/dl - acide succinique -5,0 g/dl ammoniaque aqueuse 1,0 ml/1 1,0 ml/1 KH 4-1, g/P 1,0 g/ 1 /1 Mg S04 0,4 g/l 0,4 g/l Fe SO4 10 mg/1 O5 g/1 Mn S04 81 mg/l 8,1 g/1 Thiamine, HC1 100 /ug/1l 100 /ug/l Biotine 30 /ug/1 30 ul gélose 20 g/l 20 g/1 pH (KOH) 7,0 7 0 EXPERIENCE 2 On fait pousser chaque souche à essayer énumérée dans le tableau 2 ciaprès sur un milieu de gélose contenant 1,O g/dl de peptone, 1,O g/dl d'extrait de levure, O,1 g/dl d'acide acétique, 0,5 g/dl de chlorure de sodium et 2,0 g/dl de gélose et on l'ense- mense sur une plaque du milieu de culture de gélose ayant la compo- sition indiquée dans le tableau 1 et on effectue la culture à 30"C pendant 48 h. Après la culture, on détermine le degré de croissance de chaque souche et les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 2. TABLEAU 2 Degré de croissance. Milieu à Milieu à Souche l'acide l'acide L-glutamique succinique Brevibacterium flavum AJ 11664 - ++ Brevibacterium flavum ATCC 14067 ++ + 4-+ Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 ++ +i Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ++ I 4+ - = pas de croissance -+ = bonne croissance Ill = très bonne croissance. De manière semblable, on cultive également chaque souche énumérée dans le tableau sur une plaque de gélose du milieu à l'acide succinique du tableau 1 qui contient 5,0 g/dl d'acide fumarique, d'acide malique, d'acide acétique, d'acide L-aspartique ou de glucose au lieu de 5,0 g/dl d'acide succinique et on détermine le degré de croissance de chaque souche. Les résultats obtenus montrent que la croissance de chaque souche est aussi bonne que dans le cas du milieu à l'acide succinique. On cultive les mutants en conditions aérobies dans un milieu de culture classique contenant des sources de carbonne, des sources d'azote et des ions inorganiques et des oligoéléments si nécessaire. On peut utiliser de préférence comme sourcesde carbone des saccharides, tels que glucose, saccharose, mélasses et 0È008 amidon hydrolysé, des acides organiques, tels qu'acide acétique et acide propionique,et des alcools,tels que l'éthanol, Les sources d'azote sont, par exemple, le sulfate d'ammonium, l'ammoniac gazeux et l'urée. Comme ions inorganiques, on ajoute, si nécessaire, au de culture+ + 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ milieu de culture des ions K, Na, Ca, Fe, Mn, Mg, Zn SO 22-, Ci et PO43-. 2 4 Lorsque l'on utilise une source de carbone qui ne contient pas de biotine, comme l'amidon hydrolysé, on ajoute au milieu de culture de la biotine et sa concentration doit être réglée au-dessous de la quantité appropriée pour la croissance du mutant. D'autre part, lorsque l'on utilise une source de carbone brute, telle que des mélasses de canne à sucre,contenant plus de biotine que la--quantité appropriée pour la croissance des mutants, on doit ajouter au milieu un agent anti-biotine tel que pénicilline, acide gras supérieur ou agent tensioactif. On effectue normalement la culture dans des condi- tions aérobies pendant 1 à 7 jours à une température de 20 à 40 C et on règle le pH du milieu de culture entre 5 et 9 par addition d'un acide organique ou inorganique ou d'un alcali. A cet effet, on utilise de préférence l'urée, CaCO3 ou l'ammoniac gazeux. On peut recueillir l'acide L-glutamique accumulé dans le bouillon de culture par une technique de récolte tout à fait classique. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On verse des portions de 50 ml d'un milieu de culture aqueux,dont la composition est indiquée dans le tableau 3 suivant, dans des ballons de 500 ml et on chauffe à 115 C pendant 10 min pour les stériliser, TABLEAU 3 Ingrédients Concentration Glucose 3,6 s/dl Urée 1,0 g/dl KH2PO4 O,1 g/dl MgS0437H20 0,04 g/dl MgS04, 7H20 0, 04 g/dl 250000b - TABLEAU 3 (suite) TABLEAU 3 cultive à 30 C pendant 2 jours en agitant. Après la culture, on détermine la quantité d'acide L-glutamique accumulée dans le bouillon de culture: les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 4 ci-dessous. TABLEAU 4 Souche AJ 11664 ATCC 14067 Acide L-glutamique accumulé (g/dl) 19,7 17,6 EXEMPLE 2 On verse dans des ballons de 500 ml des portions de ml d'un milieu de culture aqueux ayant la composition indiquée dans le tableau 5 ci-après et on les chauffe pour les stériliser. La solution d'oligo-éléments indiquée dans le tableau 5 contient 8,8 g/l de Zn S04,7H20, 970 mg/1 de FeC13,6H20, 393 mg/1 de Cu S04,5H20, 88 mg/l de Na2B407, 72 mg/1 de MnC13,41H20 et 37m8/1 de (NH4)6Mo70O24, 4H20. TABLEAU 5 Ingrédients Acétate d'ammonium Acétate de sodium KH2PO4 MgSO4,7H20 FeSO4, 7R20 MnSO4, 4H20 Thiamine, HCl Concentration 2,31 g/dl 2,72 g/dl 0,3 g/dl 0,08 g/dl 2,0 mg/dl 3,24 mg/dl 2,5 /ug/dl 250000 b TABLEAU 5 (suite) Ingrédients Biotine Solution d'oligo-éléments inorganiques Rouge de crésol Caséine hydrolysée pH Concentration 0, 05/ug/dl 0,05 ml/dl 0,5 mg/dl Oil g/dl 8,0 On inocule le milieu avec Brevibacterium flavum AJ 11664 et ATCC 14067 ayant poussé à 30 C pendant 24 h sur un milieu de gélose au bouillon contenant en outre 0,5 g/dl de glucose et on les cultive à 30 C pendant 3 jours en culture agitée. Après la culture, on détermine la quantité d'acide L-glutamique accumulée dans le bouillon de culture; les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 6 ci-dessous. TABLEAU 6 Souche AJ 11664 ATCC 14067 Acide L-glutamique accumulé (g/dl) ,6 9,5 Il est entendu que l'invention'n'est Ras limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus h titre d'illus- tration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifi- cations et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. 250$000 R E VE N D I C A T I 0 N S 1 - Procédé pour la production d'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé en ce que l'on cultive en conditions aérobies dans un milieu de culture classique un mutant du genre Brevibacterium qui est privé de la faculté de pousser dans un milieu de culture spécifique contenant de l'acide L-glutamique et qui est capable de produire de l'acide Lglutamique dans un milieu de culture classique, ledit milieu spécifique consistant en 1,0 1 d'eau, 7,0 g de L-glutamate monosodique, 1,0 ml d'ammoniaque aqueuse, 1,0 g de dihydrogénophosphate de potassium, 0,4 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 10 mg de sulfate ferreux heptahydratd, 81 mg de sul- fate de manganèse tétrahydraté, lOOpg de chlorhydrate de thiamine, /ugde biotine et 20 g de gélose, et étant ajusté à pH 7,0 par l'hydroxyde de potassium. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en outre b recueillir l'acide L-glutamique accu- mulé dans le milieu de culture. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le mutant appartient b l'espèce Brevibacterium flavum ou Brevibacterium lactofermentum. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le mutant est Brevibacterium flavum FERM-P 5878 (FERM BP-84).