Brevet FR2509323A1 — publié le 19830114

La présente invention concerne un procédé pour la produc- tion de 17 g-hydroxyandrost-4-ène-3-one (testostérone) et de 179- hydroxyandrost-1,4-diène-3-one ( 1,2-déshydrotestostérone) Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour la fabrication de testostérone à partir de stéroides ou de 4-androstène-3,17-dione (ciaprès dénommée AD) par fermentation au moyen d'un nouveau micro-organisme du genre Mycobacterium sp La souche utilisée selon l'invention a été déposée par la demanderesse le à l'Agricultural Research Culture Collection, Northerm Regional Research Center (NRRL), Peoria, Illinois 61 604, EUA, sous le n B-12 472 L'invention concerne également un procéde pour la production de 1,2-déshydrotestostérone à partir de 1,4-androsta- diène-3,17-dione (ci-après dénommée ADD) par fermentation avec le nouveau micro-organisme Mycobacterium sp NRRL B-12 472. La transformation des stéro Ides par les micro-organismes a été largement étudiee et a fait l'objet de nombreuses publications. Apparemment, les premiers de ces travaux ont été faits par Mamoli et Vercellone en 1937, dans Ber 70, page 470 et Ber 70, page 2079. Ces auteurs décrivent la réduction des 17-cetostérotdes ou des 17hydroxystéroldes par une levure de fermentation Plus récemment, Peterson et Murray décrivent la 11-hydroxylation de la progestérone par le champignon Rhizopus nigricans; voir brevet des Etats-Unis d'Amérique n 2 602 769 ( 1952) Récemment, également, Kraychy et col décrivent dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 684 657 ( 1972) la dégradation microbiologique sélective des 17-alkyl- stéro Ides par fermentation d'un stérolde contenant au moins B atomes de carbone dans la chatne latérale 17-alkyle par Mycobacterium sp. NRRL B-3683 pour préparer l'androst-4-ène-3,17-dione, l'androst-1,4- diène-3,17-dione et la 20 oc-hydroxyméthyl-prégna-1,4-diène-3-one. Plus récemment encore, Marsheck et col décrivent dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 3 759 791 ( 1973) la préparation micro- biologique sélective de l'androst-4-ène-3,17-dione avec un bon rendement et de la 20 c-hydroxyméthyl-pregna-4-ène-3-one avec un rendement plus faible par fermentation d'un stéro Tde contenant au moins 8 atomes de carbone dans la chatne latérale 17-alkyle par Mycobacterium sp NRRL B-3805. Les micro-organismes et leurs mutants entrant en ligne de compte dans la dégradation sélective des stéro Ydes sont largement connus de l'homme de l'art comme indiqué ci-dessus. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 3 759 791 décrit un procédé pour produire l'androst-4-ène-3,17-dione, précurseur de la testostérone, en utilisant Mycobacteri'um sp NRRL B-3805. Le brevet japonais J 5 5037-121 décrit uni procéde pour la production de 1,2-déshydrotestostérone en utilisant un inhibiteur oxydant et un micro-organisme de l'espèce Mycobacterium ou Brevibacterium. La présente invention concerne en particulier un procédé pour la production de testostérone qui comprend les étapes suivantes: a) on cultive un micro-organisme producteur de testos- térone dans un milieu nutritif aqueux en conditionsaérobiesen pré- sence d'AD ou d'un stéroide ayant de 2 à 10 atomes de carbone inclus dans la chaîne latérale 17-alkyle pour produire de la testostérone dans le bouillon de fermentation; et b) on isole ladite testostérone du bouillon de fermentation. L'invention concerne également un procédé pour la produc- tion de 1,2-déshydrotestostérone qui comprend les étapes suivantes: a) on cultive un micro-organisme producteur de 1,2-déshydro- testostérone dans un milieu nutritif aqueux en conditions aérobies en présence d'ADD pour produire la 1,2-déshydrotestostérone dans le bouillon de fermentation; et b) on isole ladite 1,2-déshydrotestostérone du bouillon de fermentation. Enfin, l'invention concerne une culture biologiquement pure du micro-organisme Mycobacterium sp ayant les caractéris- tiques d'identification de NRRL B-12 472, ladite culture étant capable de produire de la testostérone à partir d'androstènedione ou d'un stérotde ayant de 2 à 10 atomes de carbone inclus dans la chaîne latérale 17alkyle et de produire la 1,2-déshydrotestostérone à partir d'androstadiènedione, en quantités récupérables par fermen- tation dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assi- milables de carbone,d'azote et-des substances inorganiques. L'intérêt de ce procédé provient notamment de ce que les stero Ides produits sont des produits intéressants du point de vue pharmacologique Voir Goodman et Gilman 4 e édition, pages 1566-1580 et brevet japonais J 55037-121, abrégé dans le Derwent sous le n 66 629 C/38 En outre, le procédé de l'invention donne des rendements plus élevés que les procédés microbiologiques precédem- ment connus Enfin, ce procéde peut être utilisé sans que l'on ait besoin d'un inhibiteur tel qu'un agent chélatant. Le nouveau micro-organisme Mycobacterium sp NRRL B-12472 a été obtenu par mutagénèse du micro-organisme connu Mycobacterium sp NRRL B-3805 Le microorganisme s'adaptant donc de manière unique a la dégradation microbienne seélective selon l'invention peut être obtenu à partir du A R S Culture Collection Research, Fermentations Laboratory, Northern Regional Research Laboratory, 18 N University Ave, Peoria, IL 61604. On peut utiliser selon l'invention d'autres mutants de Mycobacterium, ainsi que les genres suivants de micro-organismes, pour autant qu'ils soient capables de dégrader sélectivement les stéro Ydes ayant une chatne latérale 17-alkyle en C 2-C 10 inclus, et d'accumuler des quantités appréciables de testostérone ou de 1,2-déshydrotestostérone dans le bouillon de fermentation Les genres de micro-organismes qui entrent dans le cadre de l'invention sont Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium,' Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces Le genre préféré est Mycobacterium Des espèces caractéristiques de ce genre sont M phlei, M smegmatis, M rhodochrous, M mucosum, M fortuitum, M butyricum et M vaccae Des modes opératoires sont décrits ci-après pour la mutation des micro- organismes des genres ci-dessus pour donner les mutants désires Des exemples de substrats stéroides appropriés sont le sitostérol, le cholestérol, le stigmastérol, le campestérol, et d'autres stéro Ides ayant des chaînes latérales 17-alkyle en C 2-Cl Oinclus Ces substrats peuvent être soit sous forme pure, soit sous forme brute. En général, les conditions pour la production de testos- térone ou de 1,2-déshydrotestostérone par dégradation microbienne sélective dans le procéde selon l'invention sont les mêmes que pour la culture de l'organisme de la croissance normale, à part l'incor- poration du stéroide à convertir, AD ou ADD. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre dans une culture de Mycobacterium sp NRRL B-12472 au d'un autre micro- organisme comme décrit ci-dessus, soit par addition du substrat choisi à la culture pendant la période d'incubation> soit par incorporation dudit substrat dans le milieu nutritif avant l'ino- culation Le stéroide, AD ou ADD, peut être ajouté soit seul, soit en combinaison avec un AD, ADD et un stéro Tde différent La gamme de concentration préférée mais non limitative du stérotde dans la culture est d'environ 0,1 à 100 g/1 On fait pousser la culture dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, par exemple un hydrate de carbone assimilable, et une source d'azote, par exemple un-composé azoté assimilable, ou une matière protéinée Les sources de carbone préférées comprennent le glucose, le sucte brun, le saccharose, le glycérol, l'amidon, le sirop de fructose, l'amidon de mais, le lactose, la dextrine, les mélasses, etc Les sources d'azote préférées comprennent la liqueur de trempage de mats, la levure, la levure de bière autolyse avec des solides du lait, la farine de soja, l'urée, la farine de graine de coton, la farine de mais, les solides du lait, le produit de digestion pancréatique de la caséine, la farine de poisson, lessolides de distillerie, les liqueurs peptoniques animales, les déchets de viande et d'os, les sels d'ammonium, les nitrates On peut avantageusement utiliser des combinaisons de ces sources de carbone et d'azote Il n'est pas nécessaire d'ajouter au milieu de fermentation des oligo-éléments, par exemple zinc, manganèse, cobalt, fer, etc, car l'eau du robinet et d'autres ingrédients contenant ces métaux sont utilisés comme composants du milieu. Le procédé de fermentation peut durer d'environ 3 h à 4 jours La températured'incubation pendant le procédé de fermen- tation peut varier entre environ 25 C et environ 37 C, on opère de préférence a 30 C On aère et on agite le contenu du-récipient de fermentation pour faciliter la croissance du-micro-organisme et augmenter ainsi l'efficacité du procédé de fermentation. Lorsque la fermentation est terminée, comme on le voit par chromatographie sur couche-mince en utilisant des plaques de gel de silice et un système solvant convenable, on récupère le stéro Tde transformé désiré par des techniques bien connues de l'homme de l'art Par exemple, on peut extraire le mélange de fermen- tation contenant la liqueur de fermentation et les cellules par un solvant organique des stéro Tdes non miscible avec l'eau Les solvants appropriés sont le chlorure de méthylène, le chloroforme, le tétra- chlorure de carbone, le chlorure d'éthylène, le trichloroéthylène, l'éther, l'acétate d'amyle, le toluène et les analogues, de préfé- rence le chlorure de méthylène. On peut aussi séparer d'abord la liqueur de fermentation et les cellules par des techniques classiques, par exemple filtra- tion ou centrifugation, et extraire ensuite séparément par des solvants convenables Les cellules peuvent être extraites par des solvants soit miscibles, soit non miscibles avec l'eau La liqueur de fermentation débarrassée des cellules peut être extraite par des' solvants non miscibles avec l'eau. On peut filter les extraits sur de la terre d'infusoires et reprendre le filtrat à siccité sous vide ou par d'autres moyens. On peut ensuite dissoudre le résidu résultant contenant le stéroide transformé désiré dans le chloroforme à 10 % dans le méthanol et concentrer ensuite cette solution avec un courant d'azote au bain de vapeur jusqu'à l'apparition de cristaux On peut ensuite refroidir la solution à la température ambiante et filtrer pour séparer le stéro Tde précipité On peut également obtenir le stéro Yde transformé recherché à partir du liquide surnageant restant après évaporation du solvant du liquide surnageant. Les rendements sont calculés par la formule F Y O(S-R) dans laquelle Y représente le rendement en %, P le poids de produit recristallisé, Q le poids moléculaire du produit divisé par le poids moléculaire du substrat, S le poids initial du substrat et R le poids de substrat récupéré Les conversions sont calculées par la formule c _ lop QS dans laquelle C représente la conversion en % et P, Q et S ont les. mêmes significations que ci-dessus. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toi toutefois en limiter la portée Dans ces exemples, les quantités relatives de substances sont en poids par unité de volume, sauf indication contraire. EXETMPLE 1 Préparation du mutant Microbacterium sp NRRL B-12472 à partir de M sp NRRL B-3805 (a) muta&ténsear 1 _anitroso&uanidine - On ajuste à p H 7,7 par l'hydroxyde de potassium un milieu consistant en: 1 g de chlorure d'ammonium, 0,5 g de phos- phate dipotassique, 0,5 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,001 g de sulfate ferreux heptahydraté, 20 g de glycérol, 0,01 % de "Tween 80 " (monooléate de polyoxyéthylène-20-sorbitanne) et 1 litre d'eau du robinet On ajoute le milieu résultant (MGYB + "Tween 80 ") par portions de 50 ml à des flacons à secousses de 250 ml et on stérilise par chauffage pendant 20 min à 121 C, On inocule ce milieu avec 2,5 ml d'une culture liquide de Mvcobacterium sp NRRL B-3805 ayant poussé sur le même milieu On incube la culture à + 1 C sur une secoueuse rotative ayant une course circulaire de '5,04 cm à 200 tr/min pendant 2 jours. La culture est pelletisle par centrifugation et on-met en suspension les cellules dans un égal volume de tampon tris- acide maléique 0,05 M (p H 8,0) contenant 0,01 % de "Tween 80 ". On ajoute 15 ml de tampon tris-acide maléique contenant 1 mg/ml de' nitrosoguanidine (NTG) à 15 ml de la suspension de cellules pour donner une concentration finale en NTG de 500 mg/ml On fait incuber la suspension de cellules dans une secoueuse au bain-marie pendant 15 min à 300 C, après quoi on centrifuge encore une fois la suspension On lave les cellules trois fois avec une solution à 0,85 % de Na Cl et 0,01 % de Tween 80 et on remet en suspension dans le milieu MGYB + Tween 80. (b) Isolement du mutant M S NRRL Bi-12472 Apres incubation sur la secoueuse pendant 1 jour à 30 1 C pour permettre la ségrégation des mutants putatifs des touffes de cellules, on dilue la culture en série par le tampon tris-acide maléique avec du Tween 80 On place des portions aliquotes aux dilutions appropriées sur la surface de plaques préalablement préparée contenant 20 à 25 ml de milieu CGYA de composition suivante: 20 g de bouillon Trypticase soja (société Baltimore Biological Laboratories), 5 g d'extrait de levure, 20 g de glycérol, 15 g de gélose et 1 litre d'eau du robinet et que l'on stérilise pendant 20 min à 121 C On fait ensuite incuber les plaques a 30 + 1 C pendant 7 jours. (c) Evaluation en tube de secoueuse _______________________________ On prélève au hasard les colonies résultantes qui apparaissent sur les plaques de gélose et on les transfère dans des tubes à essais contenant 4 ml de milieu CGYB (milieu CGYA dans lequel on a supprimé la gélose) On fait incuber les cultures de manière statistique pendant 7 jours à 30/+ 1 C On transfère ensuite des portions de 1/2 ml des cultures d'inoculum dans des tubes à essais ( 25 x 125 mm) contenant 10 ml de milieu MGYB auquel on a ajouté environ 150 mg de sitostérols, N F avant stérilisation. Après 7 jours d'incubation sur la secoueuse à 30 + l C, on extrait les cultures en tubes de secoueuse avec 10 ml de chlorure de méthylène On analyse les extraits chlorométhyléniquespar chromatographie sur couche mince en utilisant un gel de silice et un système solvant toluène-éthanol 90:10 (en volume). La présence de quantités appréciables de testostérone confirme la dégradation sélective du sitostéro Yde par le nouveau mutant produit à partir de la souche mère de M sp NRRL B-3805. EXEMPLE 2 Transformation de l'AD en testostérone On ajoute des portions de 50 ml de milieu MGB à des flacons de secoueuse de 250 ml contenant 500 mg d'AD Le milieu MGB est pré- pare comme le milieu MGYB sauf que le glycérol est supprimé et on ajoute 2 ml de solution stérile de dextrose à 50 % à chaque flacon après passage à l'autoclave On inocule cinq flacons de milieu M 14 GB avec 2,5 ml d'une culture liquide de M sp NRRL B-12472 et on fait incuber à 30 + 1 C pendant 7 jours sur la secoueuse. On extrait la totalité du bouillon de culture combiné ( 250 ml) trois fois par le-chlorure de méthylène On sèche les extraits réunis sur sulfate de sodium anhydre, on filtre et on évapore à siccité sous vide On redissout le résidu dans le mélange acétate d'éthyle-toluène ( 1:5 en volume) et on chromatographie sur une colonne contenant 80 g de gel de silice Woelm On élue la colonne par le mélange acétate d'éthyle-toluène ( 1:5 en volume) et on suit les fractions par chromatographie sur couche mince On évapore sous vide les fractions contenant la testostérone pour obtenir le produit cristallisé que l'on analyse par chromatographie gazeuse (détermina- tion quantitative par chromatographie gazeuse: 3 % de OV-17/OV-210 sur "Chromosorb W/HP", O, 149-0,177 mm; à 240 C; en utilisant un détecteur à ionisation de flamme pour une pureté de plus de 80 %. Le rendement de conversion est de 28 % pour 1 'AD Les spectres physicochimiques, IR et-de RMN,sont conformes pour la testostérone - EXEMPLE 3 Transformation du sistostérol en testostérone On utilise le procédé selon l'exemple 2, sauf que l'on remplace V'AD par 750 mg de sitostérol N F On traite également la totalité du bouillon de culture combiné comme à l'exemple 2, rendement de conversion 19 %. EXEMPLE 4 Transformation de ' &DD en testostérone. On utilise un procédé selon l'exemple 2 sauf que l'on remplace 1 'AD par V'ADD On extrait la totalité du bouillon de culture combiné de 5 flacons de-secoueuse trois fois par un égal volume de chlorure de méthylène On sèche les extraits organiques réunis sur sulfate de sodium anhydre, on filtre, puis on évapore à siccité sous vide On détermine la testostérone dans le résidu par chromatographie gazeuse, rendement de conversion 69 %. EXEMPLE 5 On utilise un procédé selon l'exemple 2 sauf que l'on chromatographie 1, 050 g de l'extrait chlorométhylénique séché (dosé à 39 % par chromatographie gazeuse) et on élue successivement la colonne de silice Woelm en utilisant les proportions et les volumes suivants d'acétate d'éthyle:toluène: 1) 15:85, 96 ml; 2) 25:75, 96 ml; 3) 35:65, 104 ml; 4) 50:50, 160 ml et 5) 80:30, 152 ml. On réunit les fractions contenant la testostérone, déterminées par chromatographie sur couche mince et on évapore pour obtenir 0,3487 g de solides La recristallisation dans l'acétone aqueuse donne 0,307 g de testostérone; F 153,5-154,5 C, Amax 241 mm (E= 16 000) lalO = + 120,7 (c = 1,007 dans CHC 13) Le spectre IR (pastille de K Br) et le spectre de RMN (CDC 13) sont identiques à ceux d'un échantillon de testostérone connu. EXEMPLE 6 On utilise un procédé conmme à l'exemple 2 sauf que l'on remplace l'AD par 500 mg de sitostérols N F On traite la moitié du résidu de l'extrait séché, 0,445 g ( 25 % de testostérone et % d'AD, déterminées par chromatographie gazeuse) comme à l'exemple 4. On combine et on évapore les fractions contenant la testostérone, déterminées par chromatographie sur couche mince, pour obtenir O, 1035 g de résidu sec On recristallise dans l'acétate aqueux pour obtenir 0,074 g de testostérone, F 153-153,5 C, Xmax 241 mm (t= 16 600). Le spectre IR (pastille de K Br) et le spectre de RMN sont identiques à ceux d'un échantillon connu de testostérone. EXEMPLE 7 On utilise un procédé selon l'exemple 2 sauf que l'on remplace l'AD par 500 mg d'ADD La chromatographie sur couche mince de l'extrait au chlorure de méthylène séché, 0,957 g -indique que le constituant principal est la 1,2-déshydrotestostérone, avec de plus faibles quantités d'ADD et de testostérone On chromatographie l'extrait de la même manière qu'à l'exemple 4 On réunit et on évapore les fractions contenant la 1,2-déshydrotestostérone, déter- minées par chromatographie sur couche mince On recristallise le résidu, 0, 719 g dans l'acétate d'éthyle pour obtenir 0,510 g de 1,2déshydrotestostérone, F 170-172 C, lctlD 21,7 C(c" 1,012 dans CHRC 13) kmax 244,5 mm (t= 14 640) Le spectre IR (pastille de K Br) et le spectre de RMN (CD C 13) sont identiques a ceux d'un échantillon connu de 1,2déshydrotestostérone On ne décèle pas d'impuretés dans les produits isolés à l'analyse par chromatographie gazeuse. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus a titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention REVENDICATIONS _____________ _____________ 1 Procédé pour la production de testostérone, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on cultive un micro-organisme producteur de testostérone dans un milieu nutritif aqueux en conditions aérobies en présence de 4-androstène-3 17-dione ou d'un stéro Yde ayant une chaîne latérale 17-alkyle en C 2-Co inclus pour produire la testostérone dans le bouillon de fermentation; et b) on isole ladite testostérone du bouillon de fermentation. 2 Procédé selon larevendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive le micro-organisme en présence de 4-androstène 3,17-dione 3 Procedé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive le micro-organisme en présence d'un stéro Yde ayant une chatne latérale 17-alkyle en C 2-Ci inclus. 4 Procédé sel-on la revendication 3, caractérisé en ce que ledit stéro Mde est choisi parmi le sitostérol, le cholestérol, le stigmastérol et le campestérol. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit microorganisme producteur de testostérone est un mutant choisi parmi les espèces Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces, capable de dégrader sêlectivement la 4-androstène-3,17-dione ou un stéro Tde ayant une chaîne latérale 17-alkyle en C 2-C 10 inclus et d'accumuler la testostérone dans le bouillon de fermentation. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit mutant est un mutant de Mycobacterium. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit mutant est Mycobacterium sp NRRL B-12472. 8 Procédé pour la production de 1,2-déshydrotestostérone, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on cultive un micro-organisme producteur de 1,2-déshydrotestos- térone dans un milieu nutritif aqueux en conditions aérobies en présence de 1,4-androstadiène-3,17-dione pour produire la 1,2-déshydrotestostérone dans le bouillon de fermentation et b) on isole ladite 1,2-déshydrotestostérone du bouillon de fermenta- tion. 11. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit micro-organisme producteur de 1,2-déshydrotestostérone est choisi parmi les genres Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacterium Serratia et Streptomyces et capable de dégrader sélectivement la 1,4-androstadiène-3,17-dione et d'accumuler la 1,2-déshydrotestos- térone dans le bouillon de fermentation. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit microorganisme producteur de 1,2-déshydrotestostérone est un mutant de Mycobacterium capable de dégrader sélectivement la 1,4-androstadiène-3,17-dione et d'accumuler la 1,2-déshydrotestos- térone dans le bouillon de fermentation. 11 Procédé selon la revendication 10,caractérisé en ce que ledit mutant est Mycobacterium sp NRRL B-12 472. 12 Culture biologiquement pure de micro-organisme Mycobacterium sp ayant les caractéristiques d'identification de N RL B-12472, caractérisée en ce qu'elle est capable de, produire la testostérone à partir de 4-androstène3,17-dione ou d'un stêro Tde ayant une chalne latérale 17-alkyle en C 2-C 10 inclus et de produire la 1,2-déshydro- testostérone à partir de la 1,4-androstadiène-3,17-dione, en quantités récupérables par fermentation dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote et des substances inorganiques.