Brevet FR2508488A1 — publié le 19821231

La présente invention concerne un nouveau procédé auto- matique en écoulement continu pour le dosage de la créatinine dans les liquides biologiques par transformation enz-natique de la créatinine par la créatininedésimidase (EC 3 5 4 21) pour donner de l'ammoniac et de la N-méthylhydanto-ine et détermination de l'ammoniac formé, caractérisé en ce que la créatininedésimidase est immobilisée et que l'ammoniac endogène présent dans les liquides biologiques est préalablement éliminé. La présente invention propose un nouveau procédé en écoulement continu pour le dosage de la créatinine avec la créati- ninedésimidase immobilisée et une série de matériels et de réactifs pour la mise en oeuvre du procédé. La créatinine est un produit du métabolisme de l'acide créatinephosphorique, qui est l'une des source d'énergie de la contraction musculaire. Dans les conditions normales, elle est présente dans le sang à des concentrations de 0,5-1,5-mg/l O ml et elle est éli- minée comme métabolite final dans l'urine. On sait que la détermination quantitative de la créatinine dans le sang et l'urine fournit un paramètre de diagnostic extreme- ment utile en vue de l'évaluation de la fonction rénale. Dans le diagnostic des maladies rénales, la détermination de la créatinine est d'une importance clinico-diagnostique très supérieure à celle des autres métabolites, tels que l'urée,par exemple. Une hypercréatininémie indique toujours une lésion des reins et,comme elle est presque indépendante du régime, elle permet de suivre le cours des maladies telles quepar exemple,néphrite aigué et chronique, néphrose, uréthrophraxie, mercurialisme, etc, même chez des patients qui sont à des régimes particuliers. La faible concentration de la créatinine dans le sang et l'absence de procédés fortement spécifiques de dosage empochent encore une détermination correcte de ce métabolite. La plupart des procédés publiés pour la détermination de la créatinine sont basés sur la réaction de cette dernière avec l'acide picrique en milieu alcalin, c'est-à-dire sur la réaction connue de Jaffé (Z Physiol Chem 10, p 391 ( 1886)). -2508488 On sait que la méthode de Jaffé n'est pas spécifique puisque de nombreux métabolites normalement présents dans les liquides biologiques provoquent des interférences (Clin Chem 21, p 286 D- 288 D ( 1975); Clin Biochem 11, p 82 ( 1978); Ann Clin Biochem 12, p 219 ( 1975)). On connaît aujourd'hui de nombreuses modifications de la réaction de Jaffé mais,bien qu'elles aient fortement augmenté la précision, elles n'ont modifié qu'à un certain degré la spéci- ficité (J Clin Chem Clin Bitchem 18, p 385 ( 1980). Les tentatives pour éliminer les composés dits "chromo- gènes à Jaffé positif" n'ont pas trouvé l'application dans les analyses de routine à cause des difficultés opératoires. La réaction de Jaffé après déprotéinisation et absorption sur terre à foulon (Z Klin Chem und Klin Biochem 8; p 587 ( 1970); Clinm Chem 27, p 179 ( 198 D), habituellement considérée comme la technique de référence, est elle aussi peu pratique pour des analyses de routine. Afin d'obtenir une plus grande spécificité dans la déter- mination de la créatinine, on a étudié des procédés enzymatiques basés sur l'hydrolyse de la créatinine en créatinine utilisant la créatinineamido-hydrolase (E C 3 5 2 10) et sur la détermination subséquente de la créatine obtenue (Scan J Clin Lab Invest 29, Suppl 126, p 30 1 ( 1972); Methods of Enzymatic Analysis, Section 4 H.U Bergmeyer, Ed Academic Press, New York, N Y 2 è édition, 1974 p 1786-1790; Clin Chem 21, p 1422 ( 1975) ; brevet britannique n 1359402). Bien que ces procédés aient une bonne spécificité, ils sont difficiles à mettre en oeuvre dans la pratique de laboratoire de routine, spécialement pour l'utilisation dans des appareils auto- matiques (Clin Chem 25, 1665-1666 ( 1979); J Clin Chem Clin. Biochem 17, p 633-638 ( 1979)). La présente invention propose un procédé enzymatique pour la détermination de la créatinine basé sur l'utilisation d'une enzyme qui catalyse la transformation de la crétinine en N-méthyl- hydantotne et en ammoniac, et sur la détermination subséquente de l'ammoniac formé. L'enzyme utilisée dans le mode opératoire selon l'inven- tion est la créatininedésimidase (E G 3 5 4 21). La créatininedésimidase a été découverte par J Szulmajster (J Bacteriol 75, p 633 ( 1958) et Biochim and Biophys Acta 30, p 154 ( 1958)) dans les cellules microbiennes de Clostridium para- putrificum et isolée par des techniques chromatographiques. H Thompson (Anal Chem 46, 2, p 246 ( 1974)) et F Lim (Clin Chem 20, 7, p 871 ( 1974)) ont indiqué ultérieurement l'uti- lisation de la créatininedésimidase pour la détermination quantita- tive de la créatinine, par le dosage de l'ammoniac produit dans la réaction enzymatique. Des brevets ont ensuite été publiés, au nom de la société Kyowa Hakko Kogyo Co, par exemple le brevet britannique n 1515805, qui décrit non seulement un procédé pour la production de créatinine- désimidase à partir de certaines sources microbiennes particulières, mais également un procédé pour la détermination quantitative de la créatinine par hydrolyse par la créatininedésimidas% suivie de détermination de l'ammoniac ou de la N-méthylhydantoine formés. Dans le brevet anglais ci-dessus mentionné, de même que dans les travaux précédents, on n'indique pas la possibilité d'appli- quer la méthode à des déterminations quantitatives en écoulement continu En particulier, il n'y a pas de description d'une technique automatique e N écoulement qui permette l'élimination préliminaire de l'ammoniac endogène, toujours présent dans les liquides biologiques, et le dosage qui en découle du seul ammoniac libéré par la créatinine. On sait que l'on utilise couramment dans le domaine des diagnostics des techniques automatiques en écoulement continu. La présente invention propose un procédé automatique en écoulement continu pour la détermination quantitative de la créatinine par hydrolyse par la créatininedésimidase et dosage spécifique de l'ammoniac produit. La mise au point d'une technique automatique en écoule- ment continu pour le dosage de la créatinine dans les liquides biologiques utilisant la créatininedésimidase comporte la résolution de problèmes complexes tels que,par exemple, la nécessité de limiter la quantité d'enzyme utilisée; d'utiliser de la créatininedésimidase exempte d'autres enzymes dépendant de NH 3, par exemple l'urtase; d'éliminer les interférences dues à l'ammoniac endogène qui est toujours présent dans le sérum et dans l'urine et d'utiliser des systèmes sensibles et spécifiques pour ne déceler que l'ammoniac produit dans la transformation enzymatique de la créatinine. Le procédé d'analyse de la créatinine qui fait l'objet de la présente invention permet de surmonter tous ces problèmes. La nécessité de limiter la quantité d'enzyme utilisée est évidemment pour des raisons économiques,un problème beaucoup plus important dans un procédé en écoulement continu que dans un procédé manuel. L'utilisation de créatininedésimidase en solution dans un système en écoulement comporte, outre une consommation élevée de cette enzyme, des phénomènes secondaires négatifs comme, par exemple,l'augmentation de la valeur à blanc, une perturbation des lignes de base,de longuesduréesd'incubation et la pénétration dans le système de substances étrangères d'origine protéique (par exemple des protéines enzymatiques) qui ne sont pas toujours compatibles avec le réactif utilisé pour la détection de l'ammoniac. Dans le procédé en écoulement selon l'invention, la créatininedésimidase est utilisée sous une forme izmnobilisée; il en résulte une consomation notablement réduite,avec pour conséquence la possibilité d'obtenir suffisamment d'enzyme, même à partir de sources microbiennes de production médiocre. L'utilisation dans l'enzyme iummobilisée permet de ne pas mettre en circulation de la matière protéique (par exemple des protéines enzymatiques), mais en mème temps de garantir une forte activité enzymatique qui permet de courtes incubations avec trans- formation complète du substrat sans perturbation de la ligne de base ou du système de détection de l'ammoniac provenant de la créatinine L'immobilisation de la créatininedésimidase peut Stre effectuée selon des techniques d'imxobilisation connues. Ces techniques peuvent être, par exemple, celles décrites pour d'autres enzymes dans Biochem J 147, p 593-603 ( 1975); et brevetsbritanniquesn 1470955 et 1485122. Un procédé particulièrement approprié pour l'immobilisa- tion de la créatininedésimidase prévoitpar exemple,la fixation de l'enzyme sur des tubes de "Nylon" par a) alkylation du tube de "Nylon" par le tétrafluoroborate de triéthyloxonium; b) introduction d'une chaîne droite ('écarteur) obtenue en faisant agir sur le'"ylon'alkylé une solution d'hexaméthylènediamine ou d'éthylènediamine; c) activation du'ilylodiécarteur par un réactif bifonctionnel qui peut être, par exemple,le subérimidate de diméchyle ou le glu- taraldéhyde; et d) fixation de l'enzyme sur leNylon activé - Dans une autre technique possible, après traitement comme décrit cidessus sous b), on fait réagir le "N-ylon" écarteur avec l'anhydride maléique ou l'anhydride succinique. Le "Nylon"-écarteur à fonction carboxylique terminale est ensuite traité par le N-hydroxysuccinimide en présence de N,N-dicyclohexylcarbodiimide et, enfin, on fixe l'enzyme en milieu tamponné à p H neutre, par exemple le tampon au phosphate, sur le "Nylon" carboxylique ainsi activé. Les techniques d'immobilisation mentionnées ci-dessus permettent a la fois de fixer au'"Nylod'une quantité notable d'enzyme, d'obtenir une enzyme sous une forme particulièrement purifiée et surtout exemple d'uréase et/ou d'autres enzymes dépendant de NH 3. L'enzyme immobilisée par le procédé selon l'invention est stable, active sur les échantillons aqueux et physiologiques et agit en écoulement continu. Les tableaux I et II ci-après indiquent la stabilité de la créatininedésimidase immobilisée selon les techniques décrites ci-dessus Le tableau III fournit les données concernant la fonction- nalité de l'enzyme immobilisée. Dans la détermination de la stabilité à 40 C de la créati- ninedésimidase immobilisée sur tubes de "Nylon", on immobilise l'enzyme sur des tubes de "Nylon" de 1 mm de dimaètre intérieur eton la met en équilibre à la température de 4 C dans une solution de tampon au phosphate 100 m M à p H 7 Les valeurs d'activité immobilisée sont exprimées en U/m/min et indiquées dans les témoins en % par rapport à l'activité initiale (temps 0). TABLEAU I Immobilisation A ='1 yloi'activé par le subérimidate de diméthyle Immobilisation B ='Nylord'activé par le glutaraldéhyde Immobilisation C ='N 1 ylod' activé par le N-hydroxysuccinimide Pour la détermination de la stabilité à 35 C,on immobi- lise l'enzyme sur des tubes de'Nylor'de 1 mm de diamètre et on les met en équilibre à la température de 35 C dans une solution de tampon au phosphate 1 00 m M à p H 7 Les valeurs de l'activité immobilisée sont exprimées en U/m/min et indiquées en % par rapport à l'activité initiale (temps 0). TABTEAIU TT dans les témoins Stabilité Immobilisation A Immobilisation B immobilisation C mois 35 C 35 C 350 C U/m/min U/m/min U/m/min % 0 8,6 100 9,6 100 8,9 100 1 8,3 96 8,2 85 8,7 97 2 7,1 83 7,9 82 8,2 92 4 7,5 87 7,1 74 7,9 88 6 6,3 73 5,8 60 5,7 64 Immobilisation A = "nylon" activé par le subérimidace de diméthyle Immobilisation B = "Nylon" activé par le glutaraldêhyde Immobilisation C = "Nylon" activé par le N-hydroxysuccinimide Stabilité Immobilisation A Inmobiiisation 3 I Lrobilisation C mois 44 C 4 e C 4 C U/m/min U /m/min % U/m/min % O 9,9 100 9,7 100 9,2 100 1 9,9 100 9:3 96 8,9 97 2 9,7 98 9,7 100 9,3 101 4 9,9 100 9,7 100 9,7 105 6 9,9 100 9,3 96 9,4 102 12 9,9 100 9,4 97 9,5 103 18 9,6 97 8,9 92 8,6 93 Pour la détermination de la fonctionnalité de la créa- tininedésimidase immobilisée en écoulement continu, on utilise la créatininedésimidase immobilisée sur un tube de'Nylon"'de 1 mm de diamètre intérieur et 1 m de long pour le dosage de routine de la créatinine dans le sérum,le plasma et l'urine, dans un système à écoulement du type représenté à la figure 3 ci-après. Les activités résiduelles sont contrôlées à des inter- valles de 5 000, 10 000 et 20 000 analyses et exprimées en % de la valeur initiale en U/m/min. TABLEAU III Immobilisation A ="ylo'n"activé par le subérimidate de diméthyle Immobilisation B ='Sylod'activé par le glutaraldéhyde Immobilisation C ="Nylon"activé par le N-hydroxysuccinimide La créatininedésimidase utilisée pour la dissociation enzymatique de la créatinine par le procédé selon l'invention peut être obtenue par des procédés connus à partir de diverses sources microbiennes et peut *tre,par exemple, l'enzyme mentionnée dans les références citées ci-dessus: Biochimica et Biophysica Acta 30, p 154 ( 1958) et Analytical Chemistry, 46, 2, p 246 ( 1974). Le problème de l'élimination des interférences dues à l'ammoniacendogène, qui est toujours présent dans le sérum et l'urine, est d'importance fondamentale dans l'analyse de la créati- nine basée sur le dosage de l'ammoniac produit dans le procédé de catalyse par la créatininedésimidase. Activité après Immobilisation Activité 5000 ana 10000 ana 20000 ana- initiale lyses lyses lyses U/m/min % U/m/min % U/m/min % t/m/min % A 9 100 8,2 91 8,1 90 6,6 74 B 8,6 100 7,5 87 7,6 88 6,1 71 C 8,3 100 7,4 89 7 84 6,2 75 Le problème est relativement simple lorsqu'on utilise un procédé manuel et on peut le résoudre par un dosage différentiel effectué sur le mime échantillon avant et après incubation avec la créatininedésimidase. Dans un procédé en écoulement continu, le dosage dif- férentiel, m Lime s'il est possible, est un problème beaucoup plus compliqué, spécialement dans les cas comme celui du dosage de la créatinine,o la valeur à blanc est importante par rapport & celle de l'échantillon. En outre, dans un procédé en écoulement continu avec dialyse, tel que celui proposé par l'invention, la contribution de l'ammoniac endogène sur la réponse totale serait encore accrue par le pouvoir de dialyse élevé de l'ion ammonium par rapport à la créatinine. Le procédé selon l'invention permet d'éliminer l'am- moniac endogène et de prédisposer le procédé de catalyse entre la créatinedésimidase immobilisée et la créatinine, afin de quanti- fier de manière univoque l'ammoniac produit dans la réaction enzy- matique seulement. Selon l'invention, le dosage quantitatif de la créati- nine dans le sérum et dans les urines est effectué par une technique en écoulement continu comprenant: a) l'élimination de l'ammoniac endogène dans l'échantillon par incubation en prédialyse avec un réactif approprié; b) la dialyse en continu; c) la réaction,dans le canal accepteur,de la créatinine avec la créatininedésimidase immobilisée pour donner de l'ammoniac et de la N-méthylhydantolne; et d) la détermination de l'ammoniac produit au moyen d'un système de détection approprié. Le réactif utilisé pour l'élimlrÀtion de l'ammoniac endogène dans le canal donneur doit être spécifique et ne pas interférer avec l'évaluation de l'ammoniac produit à partir de la créatinine dans le canal accepteur Par exemple,ce réactif peut être un réactif NADH/GLDH agissant sur l'ammoniac endogène selon la réaction N 3 (endogn + a-c Gtoglutarate + NADH LDH Na D + O NII 3 (endogène)+ a-cétoglutarate + NADH Na D + glutamate + H 20 ou bien un réactif à base -d'aspartase (E C 4 3 11) qui agit sur l'ammoniac endogène selon l'équation aspartase NH 3 (endogène) + fumarate aspartate Le procédé de dialyse permet d'éliminer la partie pro- téique et corpusculaire des échantillons, permettant ainsi une analyse correcte de la créatinine, même dans les sérums fortement lipémiques ou ictériques. La créatinine dialyse sensiblement exempte d'ammoniac endogène et rencontre en aval de la dialyse la créatininedésimidase immobilisée qui catalyse son hydrolyse en ammoniac et N-médylrldaitolne. Le dosage de l'ammoniac libre est effectué de préférence au moyen de la réaction avec un réactif de Berthelot, réactif chimique à base de phénol et d'hypochlorite de sodium, ou encore d'un réactif NADH/GLDH/"cétoglutarate qualitativement égal à celui utilisé pour détruire l'ammoniac endogène. Le système fumarate/aspartase utilisé pour éliminer l'ammoniac endogène peut être couplé avec le système de détection soit du type Berthelot (Clin Chem vol 8, p 130-132 ( 1962 >) soit du type NADH-GLDH. Au contraire, l'utilisation du réactif NADH/GLDH/a-céto- glutaratespour éliminer l'ammoniac endogène est une source d'inter- férencesavec le système de détection de l'ammoniac qui agit en aval de l'analyse, lorsque ce système consiste en le même réactif dépen- dant du NADH. Pour rendre ce couplage possible, il est absolument nécessaire d'éviter que le NADH résiduel du réactif utilisé dans la conduite donneur, après avoir détruit l'ammoniac endogène, passe dans la conduite récepteur, faisant varier de manière anormale la teneur en NADH du réactif de détection de l'ammoniac. Selon la technique de l'invention, on peut y parvenir en amenant le milieu à p H 2 de manière que le NADH résiduel,après élimination de l'ammoniac endogène et avant passage dans la dialyse, soit totalement éliminé par suite de son instabilité en milieu acide. Dans un mode de mise en oeuvre préféré, le milieu est acidifié par l'acide phosphorique et le p H est amené à environ 7,5 avant l'entrée dans la dialyse, par exemple par addition d'une solution de tris-hydroxyméthylaminomréthane. Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement pré- féré, l'utilisation du réactif NADH/GLDH pour l'élimination de l'ammoniac endogène est couplée avec l'utilisation du réactif de Berthelot pour la détection de l'ammoniac dérivé de la créatinine. Dans un autre mode de mise en oeuvre préféré, le procédé de l'invention prévoit l'utilisation d'un réactif aspartase/fumarate pour éliminer l'ammoniac endogène avant la dialyse, couplée avec l'utilisation du réactif NADH/GLDH pour le dosage de l'ammoniac produit à partir de la créatinine. La transformation de la créatinine en ammoniac et N-méthyl- hydantoine est toujours obtenue avec la créatininedésimidase immobi- lisée. Comme on l'a déjà indiqué> l'immobilisation est effectuée sur des tubes et en particulier sur des tubes de "Nylon" selon l'un des systèmes décrits précédemment. Le tube de'Nylon'utilisé peut avoir un diamètre intérieur variant d'environ 0,8 à 1,6 min, de préférence de 1 à 1,2 mm. La longueur du tube varie d'environ de 0,5 à 1 m,de pré- férence elle est voisine de 1 m, et l'activité de l'enzyme fixée doit de préférence ne pas être inférieure à 4-6 U/m/min pour per- mettre une conversion voisine de 100 % avec une réponse linéaire jusqu'à 15 mg/100 ml de créatinine. On peut effectuer des mlliers de dosages de la créatinine dans le sérum et dans l'urine avec un seul tube de créatininedési- midase immobilisée. La bonne fonctionnalité de la créatininedésimidase immobilisée et sa bonne stabilité dans le temps sont granties égale- ment par l'utilisation de substances-tampons qui rendent possibles des valeurs de p H et de force ionique appropriées. A cet effet, le courant accepteur est de préférence tamponné à p H 7-8, de préférence p H 7,5 par un tampon au phosphate, par exemple le tampon au phosphate 50 m M, ou à p H 7,8 par le tampon au"ris',' par exemple le tampon tris/H Cl 50 m M Le courant donneur est de préférence tamponné par le phosphate 200 m M à p H 7,5 ou par le tampon tris 200 m M à p H 7,8 Le tampon au phosphate est utilisé en combinaison avec le système chromogène du type Berthelot; le tampon tris/HC 1 est utilisé avec les systèmes du type NADH/GLDH. Le procédé en écoulement automatique selon l'invention est le résultat d'une étude en profondeur basée sur divers systèmes d'écoulement conçus toujours dans le but d'éliminer ou de réduire autant que possible l'ammoniac endogène avant la dialyse, de trans- former la créatinine après dialyse avec la créatininedésimidase immobilisée et de déceler l'ammoniac produit par des agents spéci- fiques compatibles avec le reste du système. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit en référence aux dessins annexés dans lesquels la figure 1 représente un schéma d'écoulement d'un système à un canal qui peut être utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention; la figure 2 représente un schéma d'écoulement d'un système à deux canaux qui peut être utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention; et les figures 3 et 4 représentent des schéma d'écoulement de systèmes d'écoulement à deux canaux avec un seul dialyseur que l'on peut utiliser pour la mise en oeuvre du procédé selon l'inven- tion. La demanderesse a expérimenté par exemple un système à un canal du type représenté à la figure 1, dans lequel l'échantillon X est mélangé avec un réactif R consistant en NADH/GLDH/a-cétoglutarate et pompé dans le système fractionné par des bulles d'air A. Le courant pénètre dans le bain B o l'ammoniac endogène est éliminé simultanément avec toutes les autres substances ayant une influence sur le NADH. Après incubation, le courant est acidifié par l'addition de P, par exemple par addition d'acide phosphorique dilué, maintenu à p H Z 2 sur tout le trajet S, et ramené ensuite à environ p H 7 par introduction dans le système de T, par exemple du trishydroxyméthyl- aminométhane Après ce traitement,le courant pénètre daàs le dialy- seur D par le serpentin S i La portion non dialysée est envoyée à l'orifice de sortie 0,tandis que la portion dialysée contenant la créatinine exempte de toute interférence pénètre dans le canal accepteur Le courant du canal accepteur qui contient le réactif F pour la détermination de l'ammoniac (NADH/GLDH/cz-cétoglutarate), fractionné par des bulles d'air A, passe en aval de la dialyse et pénètre dans le réacteur (tube de Nylon) contenant la créatinine- désimidase imnobilisée E. La créatinine présente libère de l'ammoniac qui,par réaction avec le réactif F dans le serpentin de développement Z. oxyde NADH en NAD Une lecture du colorimètre C, par exemple à 340 nm, permet de déterminer la concentration de créatinine et de l'enregistrer sur l'appareil enregistreur V Dans des systèmes à un canal comue celui représenté à la figure 1, l'élimination totale de l'ammoniac endogène et de toutes les substances agissant sur le système NADH, au moyen de la dialyse, est une condition néces- saire pour lire la valeur de l'échantillon par rapport à la valeur à blanc avec une ligne de base constante. Ces conditions absolument indispensables nécessitent toujours une efficacité parfaite des réactifs et peuvent limiter l'application du procédé, en particulier dans les contrôles de routine en milieu hospitalier. Outre le système à un canal du type représenté à la figure 1, par exemple, on a utilisé des systèmes à deux canaux pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention; ceux-ci prévoient l'élimination de l'ammoniac endogène, couplée avec la lecture de l'ammoniac provenant de la créatinine dans une phase différentielle, dans laquelle la valeur à blanc est automatiquement soustraite de celle de l'échantillon. La réponse est rendue plus sûre de cette manière en supprimant l'obligation de l'élimination complète de l'ammoniac endogène pour avoir un témoin constant et égal à la ligne de base. Simultanément, le procédé d'élimination de l'ammoniac endogène permet dans chaque cas de voir des témoins faibles et d'opérer dans des conditions optimales pour une analyse effectuée par lecture différentielle. Un exemple de système bicanal utilisable pour la mise en oeuvre du procédé selon l'inverntion est représenté à la figure 2 dans laquelle l'échantillon X est mélangé avec le réactif R qui peut être NADH/GLDH/acétoglutarate ou aspartase/fumarate et pompé dans le système, fractionné par des bulles d'air A Le courant pénètre dans le bain B pour l'élimination de l'ammoniac endogène. L'échantillon,débarrassé de l'ammoniac endogène,est pompé au moyen des tubes de recyclage C et C 1 qui partent du dévési-, culeur T, dans le courant en amont de la dialyse par rapport au dialyseur D du canal échantillon et au dialyseur D 1 du canal témoin. Les courants en amont de la dialyse-sont ensuite rejetés au moyen des orifices de sortie S et 51. Les courants en aval de la dialyse, T et Tj, fractionnés par des bulles d'air A, pénètrent dans le réacteur N (tube de Nylon avec créatininedésimidase immobilisée) et le réacteur à blanc N 1 (tube de référence à blanc). L'ammoniac libéré par la créatinine N est décelé au moyen d'un réactif à base de phénol F et d'hypochlorite de sodium I. Simultanément, la valeur à blanc est mise en évidence sur le canal de référence avec les mêmes réactifs pompés à travers F 1 et Il. Après l'incubation en Z et Z 11 les courants pénètrent dans le colorimètre Es lecture différentielle L et on lit la valeur de la créatininepar exemple à 650 nm,et on l'enregistre sur l'ap- pareil enregistreur V. Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré, le système à écoulement continu utilisé pour le procédé automatique d'analyse selon l'invention prévoit l'utilisation d'un système à deux canaux qui permet d'éliminer l'ammoniac endogène et d'effectuer l'analyse de manière univoque avec séparation en canal échantillon et canal à blanc seulement juste avant le procédé catalytique avec la créatininedésimidase immobilisée. Les points les plus caractéristiques de ce système sont les suivants: a) la plus grande simplicité du système de tubes par rapport aux systèmes classiques à deux canaux et à deux dialyseurs; b) la possibilité d'obtenir une sensibilité satisfaisante,meme en utilisant un faible volume d'échantillon, avec de bonnes valeurs d'exactitude et de précision; c) l'utilisation d'un seul dialyseur pour les deux canaux; d) le système de recyclage avec dévésiculeur qui permet la distribution du dialysat luimême à la fois dans le canal échantillon et dans le canal à blanc,simultanément et en volumes égaux; e) l'utilisation de créatininedésimidase immobilisée qui, placée convenablement dans le canal échantillon seul,rend possible la lecture différentielle du témoin; et f) la facilité de mise en phase qui ne fait intervenir que la dernière partie du système. Les systèmes d'écoulement à deux canaux avec un seul dialyseur possédant les caractéristiques ci-dessus mentionnéessont illustréspar exemple dans les figures 3 et 4 ci-annexées. Dans le système représenté à la figure 3, l'échantillon X est mélangé avec le réactif R et pompé dans le système, fractionné par des bulles d'air A. Le courant pénètre dans le bain W pour l'élimination de l'ammoniac endogène. Après l'incubation, le courant passe dans la zone avant dialyse du dialyseur D et il est éliminé par l'orifice de sortie S. La solution dialysée passe dans le courant accepteur F et, fractionné par les bulles d'air A, elle est transportée par le tube d au dévésiculeur T. Une partie du courant est recyclée dans le système>à partir du dévésiculeur à deux voiesau moyen des tubes G et G 1 et, fractionnée par des bulles d'air A, passe respectivement dans les réacteurs C (tube avec créatininedésimidase immobilisée) et B (tube de référence à blanc) L'ammoniac libéré par la créatinine C est décelé par un réactif à base de phénol L et d'hypochlorite de sodium M. La valeur à blanc est révélée simultanément dans le canal de référence avec les mêmes agents pompés à partir de L 1 et M 1. Après incubation dans Z et ZI, les courants pénètrent dans le colorimètre à lecture différentielle U et la valeur de la créatinine est lue,par exemple à 650 nmet enregistrée sur un appareil enregistreur V. Lorsque l'utilisation du réactif aspartase/fumarate * pour la destruction de l'ammoniac endogène est couplée avec l'uti- lisation du réactif GLDH/NADH/c-cétoglutarate pour la détection de l'ammoniac produit à partir de la créatinine, on utilise le système d'écoulement représenté à la figure 4. Dans ce système, le courant de l'échantillon X est mélangé avec le réactif R (aspartase/fumarate) et pompé dans le système, fractionné par des bulles d'air A Le courant pénètre dans le bain W pour l'élimination de l'ammoniac endogène et, après incubation, dans le dialyseur D d'o il est évacué par l'orifice de sortie S. Le dialysat passe dans le courant accepteur qui pénètre dans la dialyse, fractionné par des bulles d'air A. Le courant accepteur F contenant le réactif NADR/GLDH/ a-cétoglutarate est envoyé par le tube d ou dévésiculeur T. Une partie du courant est recyclée dans le système à partir du dévésiculeur à deux voies au moyen de tubes G et G 1 et, fractionnée par des bulles d'air A, passe respectivement dans les réacteurs C (tube contenant la crétininedésimidase immobilisée) et B (tube de référence à blanc L'ammoniac est libéré en C à partir à partir de la créatinine et réagit en Z avec le NADH. Dans le canal de référence, et précisément en B et Z 1, on développe le témoin qui est lu par lecture différentielle à 340 nm par exemple, en comparaison avec l'échantillon respectif, en uti- lisant un colorimètre U et en enregistrant le résultat au moyen de l'appareil enregistreur V. Outre le procédé enzymatique à écoulement continu décrit ci-dessus pour la détermination de la créatinine, l'invention propose également une série de matériaux et de réactifs pour la mise en oeuvre du procédé. Cette série de matériaux et de réactifs comprend a) un réactif pour l'élimination de l'ammoniac endogène dans un tampon approprié b) un réactif pour la détection de l'ammoniac provenant de la créatinine, c) la créatininedésimidase immobilisée. Le réactif pour l'élimination de l'ammoniac peut être l'un des réactifs NADH/GLDH et aspartase/fumarate précédemment men- tionnés, dans un tampon neutre-basique approprié. Le réactif pour la détection de l'ammoniac provenant de la créatinine peut être un réactif selon Berthelot ou un réactif FADH/GLDH conmme ceux indiqués précédemment. La créatininedésimidase immobilisée est une créatinine- désimidase immobilisée sur un tube, de préférence un tube en '"Nylon", selon les techniques décrites ci-dessus. Dans la série de réactifs proposés selon l'invention, lorsque le réactif pour l'élimination de l'ammoniac endogène est un réactif NADH/GLDH, la solution d'emploi dudit réactif contient de préférence tampon phosphate 200 m M à p H 7,3-7,8, de préférence 7,5; a-cétogluearate 8-12 mi N, de préférence 10 m M; NADH 0,6-1 me, de préférence 0,8 m I; GIDH 40-50 U/ml, de préférence 45 U/ml. Lorsque le réactif pour l'élimination de l'ammoniac endogène est un réactif aspartase/fumarate, la solution d'emploi dudit réactif contient de préférence tampon phosphate 200 m M à& p H 7,8-8,2, de préférence 8; aspartase 18-22 U/ml, de préférence 20 U/ml; fumarate 40-60 m M, de préférence 50 m M. Quand le réactif pour la détection de l'ammoniac pro- venant de la créatinine est un réactif selon Berthelot, le solution d'emploi dudit réactif contient de préférence: phénol 80-120 Bi, de préférence 100 nm; nitroferricyanure de sodium 1,2-1,6 mi, de préférence 1,4 m M; hypochlorite de sodium 13-17 m M, de préférence 15 m K; hydroxyde de sodium 0,15-0,19 nm, de préférence 0,17 r M. Lorsque le réactif pour la détection de l'ammoniac contenant la créatinine est un réactif NADH/GLDH, la solution d'emploi dudit réactif contient de préférence tampon phosphate 50 m M à p H 7,3-7,8, de préférence 7,5 a- cétoglutarate 6-10 m M, de préférence 8 a M; NADH 0,05-0,1 m K, de préférence 0,075 m M; GLDH 10-20 U/ml, de préférence 15 U/ml. Dans la série de réactifs proposés selon l'invention, la créatininedésimidase immobilisée a de préférence une activité d'environ 6-10 U/m/min, de préférence 8 U/m/min et elle est im- mobilisée de préférence sur des tubes de Nylon de 0,5-1 m de long, de préférence 0,7-0,8 m, d'environ 0,8-1,2 mm de diamètre intérieur, de préférence 1 mm. Dans les formes de réalisation préférées, la série de matériaux proposés selon l'invention contient un réactif NADH/GLDH pour l'élimination de l'ammoniac endogène, couplé avec un réactif selon Berthelot pour la détection de l'ammoniac provenant de la créatinine, ou encore un réactif aspartase/fumarate pour l'élimina- tion de l'ammoniac endogène, couplé avec un réactif NADH/GLDH pour la détection de l'ammoniac contenant de la créatinine, o les divers réactifs (NADH/GLDH, Berthelot, aspartase/fumarate) et la créatinine- désimidase immobilisée ont de préférence les compositions et caracté- ristiques préférées indiquées ci-dessus. Selon l'invention les abréviations NADH, NAD+et GLDH sont utilisées pour désigner le nicotinamideadéninedinuclétotide sous forme réduite, le nicotinamideadéninedinuclétotide sous forme oxydée et la glutamatedéshydrogénase respectivement; Les termes a-cétoglutarate, glutamate, fumarate et aspar- tate sont utilisés pour désigner un sel, de préférence un sel alcalin, en particulier un sel de sodium ou de potassium, des acides a-céto- glutarique, glutamique, fumarique et aspartique, respectivement; Les abréviations EDTA et tris désignent respectivement le sel disodique de l'acide éthylènediaminetétraacétique et le trishydroxyméthylaminométhane. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute- fois en limiter la portée - Exemple 1 On dose la créatinine dans les sérums en utilisant le système d'écoulement représenté à la figure 1 avec la créatinine- désimidase immobilisée et en utilisant la méthode de Jaffé (selon le mode opératoire décrit par H Bartels et col dans Clin Chim. Acta 37 p 193 ( 1972)) simultanément avec la méthode Mercotest 3385 (nom de marque). On dose 60 sérums vis à vis de témoins aqueux de créatinine à 2 mg/dl en utilisant l'appareil Technicon Autoanalyser II de la société Technicon Instruments Co Tarrytown, N Y: Les échantillons X = 0,23 ml/min sont analysés à raison de 60 analyses/heure. Le réactif R = 0,60 ml/min est une solution de tampon tris/HC 1 200 m M à p H 7,8 contenant du NADH 0,6 m M, de la GLDH 40 U/ml, de l'a-céto- glutarate de potassium 10 m M et de l'air A = C,23 ml/min. B = 5 ml est le bain d'incubation à 37 GC, P = 0,23 ml/min et T = 0,23 ml/min, pompent respectivement l'acide phosphorique à 2,5 % en poids par volume et le tris-hydroxyméthyl- aminométhane à 10 % en poids par volume, avec S et Si = 1,5 ml. D = 61 cm est le dialyseur. Le courant accepteur F = 1,2 ml/min est une solution de tampon tris/H Cl 50 bm M à p H 7,8 contenant du NADH 0,05 m M,de la GLDH 20 U/ml, de l'ccétoglutarate de potassium 8 m M et de l'air A = 0,23 ml/min. E = 1 m est le tube de'Nylon" avec la créatininedésimidase à 8 U/m/min. Z = 5 ml est le serpentin d'incubation à la température ambiante. C est le colorimètre qui fonctionne à 340 nm avec une cellule de 1,5 cm dans le domaine de linéarité 1-12 mg/dl de créatinine. Les résultats obtenus par le procédé selon l'invention (Y) sont comparés avec ceux obtenus par la méthode de référence de Jaffé (X). Les données de corrélation sont les suivantes: régression y = 0,946 x + 0,065 coefficient de corrélation r = 0,994 Exemple 2 On dose 60 sérums, 60 plasmas contenant de 'EDTA comma anticoagulant, 60 plasmas contenant l'héparine coumne anticoagulant et 60 échantillons d'urine (diluée 1:100 par l'eau) vis à vis de échantillons aqueux de créatinine à la concentration de 2 mg/dl, en utilisant un appareil Technicon Autoanalyzer II et le système d'écoulement représenté à la figure 3: Les échantillons X: 0,23 ml/min sont analysés à raison de 60 analyses par heure; le réactif R = 0,42 ml/min est une solution de tampon au phosphate 200 m M à p H 7,5 contenant du NADH 0,8 m M, de la GLDH 40 U/ml, de l'a-cétoglutarate de potassium 10 mn avec des bulles d'air A = 0,23 ml/min. W = 5 ml est le bain d'incubation à 3 7 C. Le courant accepteur F = 1 ml/min est une solution de tampon au phosphate 50 mli à p H 7,5. Les tubes de recyclage G et G 1 sont à 0,42 ml/min et C = lm est le tube de Nylon contenant la créatininedésimidase à 6 U/m/min. Le réactif phénol L/L 1 pénètre dans le système au débit de 0,42 ml/min et le réactif hypochlorite de sodium M/M 1 au débit de 0,42 ml/min. Apres incubation dans Z et Z 1 = 6 ml, on lit sur un colorimètre à deux canaux à 650 nm. Les iatats (Y sont obtenuspar le procédé de l'invention sont comparés avec ceux (X) obtenus avec la méthode de référence (méthode cinétique de Jaffé utilisée à l'exemple 1). Les données de corrélation obtenues sont: pour les sérums: régression y = 1,045 x 0,132; coefficient de corrélation r = 0,998; pour le plasma: EDTA: régression y = 1,012 x 0,137; coefficient de corrélation r = 0,998; pour le plasma à l'héparine: régression y = 1,032 x 0,164; coefficient de corrélation r = 0,995 pour l'urine: régression y = 0,997 x 0,137 coefficient de corrélation r = 0,996. Exemple 3 On analyse 60 sérums en procédant comme à l'exemple 2, mais en utilisant comme réactif R une solution de fumarate de potas- sium 50 m M et d'aspartase 20 U/ml dans le tampon au phosphate 200 m M à p H 8. Les résultats obtenus par le procédé de l'invention (Y) sont comparés avec ceux (X) obtenus par le procédé de référence (méthode cinétique de Jaffé indiquée à l'exemple 1). Les données de corrélation sont les suivantes régression: y = 1,032 x 0, 159; coefficient de corrélation r = 0,979. Exemple 4 En utilisant l'appareil Technicon Autoanalyser II et le système d'écoulement de la figure 3,on analyse une série de sérums étalons à différentes concentrations en créatinine. Le tableau IV ci-après donne le nom de marque du sérum, son numéro de lot, les valeurs de créatinine déterminées selon l'in- vention et la valeur moyenne indiquée par les fabricants, avec la méthode de Jaffé. TABLEAU IV Exemple 5 A du ium humain ayant un titre en créatinine de 1 mg/dl, on ajoute des quantités en série de créatinine étalon Les diverses fractions sont analysées sur l'appareil Technicon Autoanalyzer II avec le système d'écoulement de la figure 3 Les valeurs de récupé- ration de la créatinine sont indiquées dans le tableau V ci-après et exprimées en X par rapport à la valeur théorique calculée. TABLEAU V n Créatinin% en mg/dl de Sérum lot Trouvé Théorique Pathonorm L"' 16 1, 26 1,40 Pathonorm 16 7,60 7,80 Seronoru I 142 1,41 1,52 Monitrol P' 147 1, 36 1,40 "Precilip" 09367 1,33 1,24 Precinorm U' 08543 1,65 1,81 Precipath U" 09510 3,28 3,56 "k Ortho Norm " 7 T 025 0,93 1,05 Ortho Abn " 7 T 113 8,70 9,05 Sérum: Créatinine Créatinine Créatinine Récupéra- créatinine ajoutée théorique trouvée tion, % (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) 1 O 1 1 100 1 1 2 2,03 101 1 2 3 3,07 102 1 4 5 5,10 101 1 6 7 7,10 102 1 8 9 9,14 102 Exemple 6 On traite 1 ml de sérum humain ayant une teneur en créatinine de 1,33 mg/dl avec des quantités en série de G 5 à 2 ml d'un second sérum humain d'une teneur en créatinine de 7,86 mg/dl. On analyse les diverses fractions sur l'appareil Technicon Autoanalyzer II avec le système d'écoulement de la figure 3. Les valeurs trouvées de créatinine sont indiquées dans le tableau VI ciaprès et exprimées en pourcentage de récupération par rapport à la valeur théorique calculée. TABLEAU VI Valeurs de créatinine Sérum Sérum Théorique Trouvé Récupération à 1,33 mg/dl 7,86 àmg/dl mg/dl mg/dl X 1 ml + 0,5 ml 3,50 3,61 103 1 mi + 1 ml 4, 59 4,77 104 1 ml + 2 ml 5,68 5,85 103 Exemple 7 On effectue 20 analyses de 3 sérums humains de concen- trations différentes en créatinine sur l'appareil Technicon Auto- analyzer II avec le système d'écoulement de la figure 3. Les résultats relatifs à la valeur moyenne et au coef- ficient de variation sont indiqués dans le tableau VII ci-après. TABLEAU VII Concentration Valeur moyenne Coefficient de en créatinine mg/dl variation (C V) Basse 1,3 1,98 Moyenne 2,4 1,10 Haute 7,1 0,79 Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustra- tion et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1 Procédé automatique en écoulement continu pour le dosage de la créatinine dans les liquides biologiques par transformation enzymatique de la créatinine par la créatininedésimidase pour donner de l'ammoniac et de la N-méthylhydantolne et détermination quantita- tive de l'ammoniac résultant de l'hydrolyse, caractérisé en ce que la créatininedésimidase est immobilisée. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la transformation enzymatique de la créatinine par la créatinine- désimidase immobilisée pour donner de l'ammoniac et de la N-méthyl- hydantoine est précédée par l'élimination de l'ammoniac endogène présent dans les liquides biologiques. 3 Procédé automatique en écoulement continu pour le dosage de la créatinine dans les liquides biologiques au moyen de la trans- formation enzymatique de la créatinine par la créatininedésimidase pour donner de l'ammoniac et de la N-méthylhydantoine et détermina- tion subséquente de l'ammoniac formé, caractérisé en ce qu'il com- prend: a) l'élémination de l'ammoniac endogène présent dans les liquides biologiques au moyen du traitement par un réactif approprié, en prédialyse; b) la dialyse en continu; c) la réaction de la créatinine après dialyse avec la créatinine- désimidase immobilisée; et d) la détermination quantitative de l'ammoniac produit au moyen d'un système de détection approprié. 4 Procédé selon les revendications 1 et 3, caractérisé en ce que l'on effectue l'immobilisation de la créatininedésimidase sur un tube de Nylon introduit dans la conduite d'écoulement. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que l'élimination de l'ammoniac endogène est effectuée automatiquement dans le système en écoulement. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'élimination de l'ammoniac endogène est obtenue par traitement avec un réactif NADE/GLDH. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le réactif NADH/GLDH contient dans la solution d'emploi: tampon phosphate 200 m M à p H 7,3-7,8; a-cétoglutarate 8-12 m I, NADH 0,6-1 m Ni, GLDH 40-50 U/ml, 8 Procédé selon les revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'élimination de l'ammoniac endogène est obtenue par traite- ment avec un réactif aspartase/fumarate. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le réactif aspartase/fumarate contient dans la solution d'emploi: tampon phosphate 200 m M à p H 7,8-8,2, aspartase 18-22 U/ml, fumarate 40-60 m M. 10 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 & 9, caractérisé en ce que la détermination quantitative de l'ammoniac provenant de la créatinine est effectuée en utilisant un réactif & base de phénol et d'hypochlorite de sodium comme système chromogène de détection. 11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le réactif à base de phénol et d'hypochlorite de sodium contient dans la solution d'emploi: phénol 80-120 m M, nitroferricyanure de sodium 1,2-1,6 m M, hypochlorite de sodium 13-17 m M, hydroxyde de sodium 0,15-0,19 M. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la détermination quantitative de l'ammoniac contenant de la créatinine est effectuée en utilisant un réactif NADH/GLDH comme système de détection. 13 Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le réactif NADH/GLDH contient dans la solution d'emploi: tampon phosphate 50 m M à p H 7,3-7,8, a-cétoglutarate 6-10 mli, NADH 0,05-0,1 me, GLDH 10-20 U/ml. 14 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le système d'écoulement est un système à deux canaux avec lecture différentielle. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le système d'écoulement à deux canaux avec lecture différentielle comprend un seul dialyseur. 16 Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à , caractérisé en ce que le système d'écoulement consiste en un système tubulaire dans lequel on introduit les éléments suivants, dans l'ordre de l'écoulement a) un bain pour l'élimination de l'ammoniac endogène; b) un dialyseur; c) un système de recyclage avec dégazage qui permet la distribution simultanée dans le canal témoin et le canal échantillon du dia- lyseur unique; d) un réacteur témoin introduit dans le canal témoin; e) un réacteur contenant-la créatininedésimidase immobolisée intro duit dans le canal échantillon pour la réaction enzymatique avec la créatinine; et f) deux serpentins introduits respectivement dans la conduite témoin et la conduite échantillon pour le déroulement de la réaction de détection de l'ammoniac. 17 Appareil pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il consiste en a) un dispositif automatique pour prélever les échantillons; b) un système d'introduction des échantillons dans l'écoulement; c) un système d'écoulement; et d) un système de détection dans lequel le système d'écoulement est celui décrit dans la revendication 16; 18 Ensemble de matériaux et de réactifs pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend: a) un réactif pour l'élimination de l'ammoniac endogène dans un tampon convenable; b) un réactif pour la détection de l'ammoniac contenant de la créati- nine; et c) de la créatininedésimidase immobilisée. 19 Ensemble de matériaux et de réactifs selon la reven- dication 18, caractérisé en ce que le réactif pour l'élimination de l'ammoniac endogène consiste en un réactif,AD l GLDH tel que défini à la revendication 6 ou 7. 20 Ensemble de matériaux et de réactifs selon la revendi- cation 18, caractérisé en ce que l'élimination de l'ammoniac endo- gène est obtenue par traitement avec un réactif aspartase/fumarate tel que défini à la revendication 8 ou 9. 21 Ensemble de matériaux et de réactifs selon la revendi- cation 17, caractérisé en ce que la détermination quantitative de l'ammoniac provenant de la créatinine est effectuée en utilisant comme système chromogène de détection un réactif à base de phénol et d'hypochlorite de sodium tel que défini à la revendication 10 ou 11. 22 Ensemble de matériaux et de réactifs selon la revendi- cation 18, caractérisé en ce que la détermination quantitative de l'ammoniac contenant de la créatinine est effectuée en utilisant comme système de détection un réactif NADH/GLDH tel que défini à la revendication 12 ou 13. 23 Ensemble de matériaux et de réactifs selon la revendi- cation 18, caractérisé en ce que la créatininedésimidase immobi- lisée est immobilisée sur un tube de Nylon d'une longueur de 0,2 à 2 m et d'un diamètre intérieur compris entre 0,8 et 1,6 mm. 24 Ensemble de matériaux et de réactifs selon la reven- dication 23, caractérisé en ce que le tube de Nylon contenant la créatininedésimidase immobilisée est obtenu par une technique d'im- mobilisation consistant en a) l'alkylation du Nylon par le tétrafluoroborate de triéthyloxonium; b) l'introduction d'un élément écarteur à chaine linéaire sur le Nylon alkylé par traitement par l'hexaméthylènediamine ou l'éthylènediamine; c) l'activation du Nylonécarteur avec un réactif bifonctionnel tel que le subérimidate de diméthyle, le glutaraldéhyde ou leur mélange; et d) la fixation de l'enzyme sur le Nylon activé. Ensemble de matériaux et de réactifs selon la revendi- cation 18, caractérise en ce que a) le réactif pour l'élimination de l'ammoniac endogène est le réactif mentionné à la revendication 19; b) le réactif de détection de l'ammoniac provenant de la créatinine est celui indiqué à la revendication 21; et c) la créatininedésimidase immobilisée est obtenue dans la technique décrite à la revendication 24 sur un tube de Nylon comme décrit à la revendication 23.