Brevet FR2500009A1 — publié le 19820820

La créatine kinase (CK) se rencontre dans les liquides organiques et les tissus animaux sous la forme de trois isoenzymes connus, appelés CK-BB, CK-MM et CK-MB. Chacun de ces trois isoenzymes, à savoir CK-BB, CK-MM et CK-MB, diffère des autres en ce qu'il contient une combinai- son différente de sousunités désignées par M ou B. CK-BB a deux sous-unités B, CK-MM a deux sous-unités M, et CK-MB a une unité M et une unité B. La détermination de la pré- sence de CK-MB dans les liquides biologiques, en particulier dans le sérum d'un malade, est devenue très utile dans le diagnostic de l'infarctus du myocarde (Galen. RS., Human Path. 6, No 2, 145-147, avril 1975). Les procédés immunolbgiques actuels pour déter- miner la présence de CK-MB et les inconvénients de ces pro- cédés ont- été récemment signalés et examinés (Current Problems in Cardiology, Vol. III, N0 12, mars 1979, pp7-28). Ces pro- cédés ne sont pas très satisfaisants pour résoudre la diffi- culté d'interférence de CK-MM et CK-BB pour distinguer ou déterminer CK-MB de CK-MM et CK-BB. Un procédé immunologique pour déterminer l'ac- tivité de CK-MB dans un échantillon de liquide biologique a été décrit dans les brevets américains N0 4 067 775 et 4 237 044. Le procédé décrit par ces brevets emploie un anticorps produit à partir d'un antigène CK-MM activé. Dans ce procédé il est nécessaire que l'échantillon de liquide testé ne contienne pas d'isoenzyme CK-BB. En particulier le brevet américain N' 4 067 775 énonce en colonne 3, lignes 38-40 que "CK-BB entrave le procédé de l'invention et ne doit donc pas être présent dans les liquides biologiques testés". Comme les liquides biologiques contiennent CK-BB, le dosage de ces brevets peut nécessiter des modes opé- ratoires fastidieux et difficiles pour commencer par enle- ver du liquide le CK-BB éventuellement présent. S'il y a du CK-BB dans l'échantillon de liquide, l'emploi de ce dosage produirait des résultats positifs erronés. On ne peut donc employer ce procéder pour déterminer CK-MB dans les liquides contenant CK-BB. Wreton et Pfleiderer, Clinica Chimica Acta 58, 223-232 (1975) décrivent un système d'immuno-dosage ou l'on détermine CK-MM et CK-BB par des dosages d'immuno- inhibition et d'immuno-titrage. Ces dosages nécessitent le dosage des valeurs obtenues en comparant l'activité d'iso- enzyme résiduelle avec l'activité d'iso-enzyme totale de l'échantillon. Un dosage d'immuno-inhibition des isoenzymes CK est un dosage dans lequel les activités enzymatiques des isoenzymes CK sont différenkiellement inhibées ou inacti- vées dans un échantillon expérimental de façon immunologique en inhibant ou en inactivant des anticorps qui maintiennent l'homogénéité de l'échantillon. Le procédé de Wreton et Pfleiderer nécessite une multiplicité de dosages (au moins 4) pour arriver aux valeurs nécessaires pour déterminer les activités d'isoenzyme CK. De façon correspondante, il y aurait donc quatre sources d'erreur, ainsi qu'un nombre égal de modes opératoires fastidieux. Un procédé décrit par Wursburg et coll. dans J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15, 131-137 (1977) emploie la précipitation d'anticorps pour différencier les isoenzy- mes CK dans un plan d'opération nécessitant des mesures à partir de quatre dosages différents. Les dosages prévoient la mesure de l'activité CK totale dans l'échantillon expé- rimental et des activités résiduelles après addition d'anti- CK-BB précipitant, d'anti-CK-MM précipitant et de ces deux anticorps précipitants pour séparer les récipients réac- tionnels. Dans ce procédé, l'homogénéité de l'échantillon n'est pas maintenue par les anticorps précipitant. Comme le procédé de WretonPfleiderer, ce procédé nécessite des dosages multiples laborieux et fastidieux avec des sources d'erreur d'importance correspondante. La présente invention concerne un procédé et un système de nécessaire expérimental diagnostique pour déterminer quantitativement l'isoenzyme CKMB, forme de créatine kinase qui est présente dans un échantillon de liquide biologique sous plusieurs formes isoenzymatiques contenant la sous-unité M ou B ou les deux. Selon l'invention on a découvert que lorsqu'on dose un échantillon de liquide biologique par le procédé suivant: (a) en incubant dans un premier récipient réactionnel la première des deux fractions d'un échantillon de liquide biologique avec un premier anticorps qui lie sélectivement immunologiquement les isoenzymes de créatine kinase conte- nant la sous-unité M par immuno-inhibition de la sous- unité M dans la première fraction pour inhiber l'activité enzymatique de la sous-unité M seulement des isoenzymes de créatine kinase puis en mesurant quantitativement l'activité de sous-unité B de la première fraction; (b) en incubant dans un récipient réactionnel séparé la seconde de deux fractions de l'échantillon de liquide biologique avec (i) un anticorps qui lie sélectivement immunologiquement les isoenzymes de créatine kinase conte- nant la sous-unité M et (ii) un second anticorps précipitant qui se lie sélectivement immunologiquement avec l'anticorps liant les isoenzymes de créatine kinase contenant la sous- unité M pour former un produit réactionnel du second anti- corps avec l'autre anticorps et les isoenzymes de créatine kinase contenant la sous-unité M comme précipité dans la seconde fraction puis en mesurant quantitativement l'acti- vité des enzymes B du surnageant dans la seconde fraction; et (c) en déterminant l'activité de CK-MB dans l'échantillon de liquide biologique d'après les mesures obtenues à partir de la première et de la seconde fraction; on peut déterminer rapidement et économiquement avec précision la quantité de CK-MB même dans les liquides contenant CK-BB. Ce procédé de l'invention ne nécessite pas une multiplicité de dosages ou de calculs qui pourraient mener à des résul- tats incommodes et moins exacts. Ce procédé est utile dans le diagnostic de l'infarctus du myocarde. La présente invention concerne un procédé pour déterminer quantitativement CK-MB dans n'importe quel liquide biologique. Selon le procédé de l'invention, on peut déterminer CK-MB en utilisant deux fractions obtenues à partir d'un seul échantillon d'un liquide biologique pour fournir deux valeurs pour l'activité de la sous-unité B dans chacune des fractions. A partir de ces activités on peut déterminer l'activité de CK-MB. Pour les procédés de l'invention il est possible d'utili- ser des liquides biologiques, p. ex. du sang entier, du plasma, des sérums, de la lymphe, de la bile, de l'urine, du liquide médulaire, du crachat, de la sueur, etc, ainsi que les selles de l'homme ou d'autres animaux. Il est également possible d'utiliser des préparations liquides de tissu humain ou d'autres tissus animaux comme les muscles squelettiques, le coeur, le rein, les poumons, le cerveau, la moelle osseuse, la peau, etc. Cependant, le liquide biologique préféré pour les procédés de l'invention est le sérum humain. Dans la plupart des cas il n'est pas nécessaire que le sérum soit dilué pour les procédés de l'invention, mais il peut être dilué pour obtenir de meilleurs résultats si la quantité de CK est anormalement élevée comme dans le sérum d'un malade souffrant d'infarctus du myocarde aigu. En particulier l'invention concerne un procédé pour déterminer quantitativement l'activité enzymatique de l'isoenzyme CK-MB dans un échantillon de liquide biolo- gique qui peut contenir CK-MB, CK-MM et CK-BB. Le procédé est réalisé (a) en incubant dans un premier récipient réactionnel la premier de deux fractions d'un échantillon de liquide biologique avec un premier anticorps qui se lie sélectivement immunologiquement avec les isoenzymes de créatine kinase contenant la sous-unité M par immuno-inhibi- tion sélective de la sous-unité M dans la première fraction pour inhiber l'activité enzymatique de la sous-unité M seule des isoenzymes de créatine kinase puis en mesurant quantitativement l'activité de sous- unité B de la première fraction de l'échantillon de liquide biologique, (b) en faisant incuber dans un secondrécipient réactionnel séparé la seconde des deux fractions de l'échantillon de liquide biologique avec: (i) un anticorps qui se lie sélectivement immunologiquement avec les isoenzymes de créatine kinase contenant la sous-unité M et (ii) un second anticorps préci- pitant qui se lie immunologiquement avec l'anticorps liant les isoenzymes de créatine kinase contenant la sous-unité M pour former un produit de réaction du second anticorps avec l'autre anticorps et les isoenzymes de créatine kinase conte- nant la sous-unité M comme précipité dans la seconde frac- tion puis en mesurant quantitativement l'activité d'isoenzyme B dans le surnageant de la seconde fraction; et (c) en déterminant l'activité de CKMB dans l'échantillon de liquide biologique d'après les mesures obtenues à partir des premières et secondes fractions. Le procédé de l'invention emploie deux réac- tions immunologiques, chaque réaction étant effectuée dans des récipients réactionnels séparés. On obtient à partir de chacune de ces deux réactions une mesure de l'activité enzymatique du liquide dans les récipients réactionnels. Chaque réaction peut être conduite simultanément ou à diffé- rents moments. On préfère que les réactions soient conduites simultanément. Il n'est pas essentiel que les récipients réactionnels contiennet des parties égales d'échantillon mais on préfère des parties égales pour la facilité du dosage. Afin de déterminer et de distinguer l'activité enzy- matique de CK-MB dans le liquide échantillon, il suffit de doser par n'importe quel procédé acceptable reconnu des spécialistes les valeurs de l'activité enzymatique obtenues à partir des deux réactions séparées. Ainsi, lorsque les récipients réactionnels contiennent des fractions égales d'é- chantillon, il suffit de soustraire l'activité enzymatique déterminée dans le second récipient réactionnel de l'activité enzymatique déterminée dans le premier récipient réactionnel. Lorsque les fractions sont inégales il suffit simplement de commencer par corriger en tenant compte des différences de concentration enzymatique, par n'importe quel procédé reconnu, avant de soustraire les valeurs obtenues pour les deux réci- pients réactionnels. Les récipients réactionnels utilisés dans le procédé de l'invention peuvent-être n'importe quel récipient reconnu par les spécialistes comme approprié pour effectuer un dosage immunologique. Parmi les récipients appropriés dont on dispose pour réaliser le procédé de l'invention - on peut citer les tubes à essais en verre, en plastique ou en métal. Le récipient réactionnel préféré est un tube à essais en verre. - L'invention concerne également un système de nécessaire expérimental diagnostique pour déterminer quan- titativement la présence d'une forme isoenzymatique CK-MB de créatine kinase qui apparaît dans un liquide biologique sous plusieurs formes isoenzymatiques contenant la sous- unité M ou B, ou les deux. Les constituants du système de nécessaire expérimental sont: (a) un premier récipient contenant un anticorps capable de se lier immunologiquement de façon sélective avec les isoenzymes de créatine kinase contenant la sous-unité M par immuno- inhibition sélective de la sous-unité M, (b) un second récipient contenant un second anticorps précipitant capable de réagir immunologi- quement de façon sélective avec l'anticorps contenu dans le premier récipient, et (c) un réactif d'enzyme-coenzyme et de substrat capable de déterminer l'activité enzymatique de la sous-unité B. Lorsque tous les composants du système de nécessaire expérimental diagnostique sont utilisés selon le procédé de l'invention tel qu'ici fourni, un spécialiste pourrait déterminer l'activité enzymatique de CK-MB dans un échantillon de liquide biologique contenant CK-MB, CK-MM et CK-BB. Le nécessaire expérimental conviendrait pour les cliniques, les hôpitaux, les laboratoires et les médecins de ville ayant besoin de déterminer et de distinguer CK-MB dans les liquides. Selon l'invention, le premier anticorps peut être n'importe quel anticorps qui immuno-inhibe sélective- ment la sous-unité M de CK sans immuno-inhiber de façon significative la sous-unité B. Ces anticorps peuvent être préparés de façon classique par injection d'un antigène CK-MM purifié à un animal et en saignant l'animal pour obtenir le sérum contenant l'anticorps. On peut utiliser n'importe quel moyen classique connu des spécialistes pour purifier l'antigène CKMM et pour injecter cet antigène à des animaux pour obtenir l'anticorps utilisé dans l'inven- tion. Parmi les anticorps que l'on peut utiliser, il faut mentionner ceux du brevet américain No 4 237 044 produits chez une espèce animale à partir d'antigène CK-MM qui a été activé avec un activateur comme le mercaptoéthanol avant l'inoculation ainsi que ceux produits à partir d'antigène CK-MM qui n'a pas été activé avant l'inoculation comme ceux que l'on emploie dans le dosage d'immuno-inhibition de la référence de Wreton-Pfleiderer mentionnée ci-dessus. Bien que l'addition du premier anticorps dans le procédé de l'invention puisse provoquer une précipitation, la précipi- tation ne se sédimentera pas mais restera homogène au cours de ce procédé. Le premier anticorps peut être produit chez n'importe quelle espèce animale reconnue des spécialistes. Les espèces animales comprennent en particulier les verté- brés, p. ex. les porcs, les bovins, les chiens, les ânes, les chevaux, les chèvres, les lapins, les rats, etc. Parmi ces animaux, on préfère les mammifères comme les ânes, les moutons et les chèvres. Les plus appréciés sont les chèvres. Dans un aspect préféré de l'invention, le premier anticorps est-produit en immunisant des chèvres, première espèce animale, avec un CK-MM purifié et en obte- nant de l'anti-(CK-MM) de chèvre, premier anticorps, par des techniques immunologiques classiques. Ce premier anticorps à appliquer dans l'invention doit être capable d'inhiber sélectivement la sous-unité M de CK par immuno-inhibition. "Immuno-inhibition" signifie que le premier anticorps inhibe immunologiquement la sous-unité M sans inhiber de façon si- gnificative la moindre sous-unité B, et que cette inhibition de la sous-unité M se produit dans les fractions d'échantil- lon avec maintien de l'homogénéité de l'échantillon. Le premier anticorps est mis à incuber et de préférence mélangé avec la première et la seconde de deux fractions, de préférence des fractions égales, de l'échan- tillon expérimental dans les récipients réactionnels. Il -s'ensuit que le premier anticorps se lie immunologiquement à tout CK-MB et CK-MM de chacune des fractions de l'échantil- lon pour assurer l'immuno-inhibition du CK-MB et du CK-MM sans lier de façon significative CK-BB. Il n'est ni essen- tiel, ni nécessaire que le premier anticorps provoque une immunoinhibition dans la seconde fraction. Il s'ensuit que le premier anticorps peut être remplacé dans la seconde fraction par un anticorps différent, produit à partir d'anti- gène CK-MM purifié chez un animal autre que l'animal utilisé pour produire le premier anticorps. En fait, l'anticorps utilisé comme premier anticorps dans la seconde fraction peut être n'importe quel anticorps qui se lie de façon sé- lective à la créatine kinase contenant une sous-unité M sans inhiber substantiellement la sous-unité B. La température et la durée d'incubation de chaque fraction de l'échantillon expérimental après addi- tion d'anticorps ne sont pas critiques, et on peut employer n'importe quelle température et n'importe quelle durée reconnues des spécialistes comme habituelles et appropriées à la réalisation d'immuno-dosages enzymatiques. Il est pré- férable de procéder aux incubations à la température ambiante et pendant 5 à 60 minutes. Selon l'invention, on procède à la mesure de l'activité enzymatique de la première fraction après avoir fait incuber ladite fraction avec un premier anticorps, tout en maintenant l'homogénéité de ladite fraction. Dans ce mode de mesure, on peut déterminer la sous-unité B de CK-MB et de CK-BB. La quantité de premier anticorps utilisée dans la seconde fraction de l'échantillon de l'échantillon est une quantité suffisante pour lier pratiquement la totalité des isoenzymes CK-MB et CK-MM de la fraction donnée. Pour obtenir les meilleurs résultats on ajoute le premier anti- corps à chacune des fractions d'échantillon en une quantité excédant la quantité normalement nécessaire pour lier la totalité du CK-MB et du CK-MM. La détermination de la quan- tité de premier anticorps nécessaire pour chaque fraction peut se faire par des procédés reconnus des spécialistes. On traite la seconde fraction de l'échantillon expérimental dans le second récipient réactionnel avec un second anticorps précipitant, après avoir ajouté un autre anticorps, soit le premier, soit un anticorps de remplace- ment. La durée de l'addition du second anticorps après l'addition du premier anticorps n'est pas critique, la durée préférée étant d'environ 5 minutes. Si on le désire, on peut utiliser des durées plus longues. Selon l'invention, le second anticorps précipitant peut être n'importe quel anti- corps qui lie sélectivement et précipite le premier anti- corps utilisé dans la seconde fraction, anticorps précipi- tant qui est pratiquement dépourvu d'activité immunologique contre la forme sous-unité B de la créatine kinase. Le second anticorps peut être produit chez n'importe quelle espèce animale autre que l'espèce animale utilisée pour produire l'autre anticorps de cette réaction par n'importe quel procédé reconnu des spécialistes. Typi- quement le second anticorps est produit en immunisant des ânes avec de la gamma-globuline (IgG) de chèvre et en obtenant de l'IgG anti-chèvre d'âne par des techniques immunologiques classiques. Le second anticorps, obtenu de cette manière, est capable de se lier avec n'importe quelle IgG de chèvre, y compris donc l'anti--CK-MM) de chèvre, premier anticorps préféré. Le second anticorps est de préférence lié à un support solide et le second support anticorps-solide résul- tant est mis à incuber avec la seconde fraction de l'échan- tillon expérimental dans le second récipient réactionnel, de préférence après qu'on ait mélangé, pendant environ 5 minutes à la température ambiante. Il s'ensuit que le second anticorps se lie immunologiquement à l'autre anticorps dans la seconde fraction de l'échantillon. Ceci fournit une immunoprécipitine contenant du CK-MB-premier anticorps- second anticorps, du CK-MM-premier anticorps-second anti- corps et du premier-anticorps-second anticorps. La quantité de second anticorps utilisée est une quantité suffisante pour lier la totalité du premier anticorps. Le second anti- corps est généralement ajouté en une quantité excédant celle qui est nécessaire pour lier la totalité du premier anti- corps selon le mode de réalisation préféré de l'invention. Selon l'invention, une fois que le précipité est formé dans la seconde fraction après qu'on ait ajouté le second anticorps, le précipité peut être séparé de la seconde fraction par n'importe quel moyen classique connu des spécialistes, laissant un surnageant résultant dont on mesure l'activité enzymatique. Selon l'invention, c'est bien le surnageant dont on mesure l'activité enzymatique. Parmi les moyens classiques dont on dispose pour séparer le précipité de la seconde fraction, on peut il citer les procédés classiques de filtration et de chroma- tographie. Le procédé le plus apprécié pour séparer le pré- cipité de la seconde fraction est la centrifugation suivie par une décantation du surnageant et une mesure du surnageant décanté. On mesure alors classiquement le surnageant de la seconde fraction pour déterminer l'activité d'isoenzyme CK-BB du surnageant par n'importe quel procédé reconnu des spécialistes. La mesure ou détermination de l'activité du CKMB et/ou du CK-BB dans chaque fraction de réaction de l'échantillon expérimental peut se faire par n'importe quel procédé classique reconnu des spécialistes. Parmi ces procédés on compte les procédés calorimétriques, tels que décrits par exemple dans "Methoden der enzymatischen Analyse" publié sous la direction de H.U. Bergmeyer, 3ème édition (1974), Vol. 1, pages 145 sq. On comprend également la détermination de CK-BB par fluorométrie. La créatine est libérée à partir de créatine phosphate par CK et cette créatine peut être mesurée par fluorométrie dans un procédé mis au point par R.B. Conn., Clin. Chem., Vol. 6, pages 537 sq (1960), par réaction avec la ninhydrine dans une réaction fortement alcaline. On préfère à cet effet les procédés cinétiques dans lesquels l'activité enzymatique est déterminée par mesure en UV à, par exemple, 334, 340 ou 366 nm. On préfère en particulier un procédé standard dans lequel on détermine CK en utilisant de la créatine phosphate et de l'adénosine diphosphate, Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., Volume 8, pages 658 sq (1970) et Volume 10, page 182 (1972). Des condition- nements expérimentaux pour déterminer l'activité CK par ce procédé sont disponibles dans le commerce. Typiquement, dans le procédé préféré, l'activi- té enzymatique du CK-MB et/ou CK-BB est suivie par l'addition d'enzymes, coenzymes et substrats appropriés grâce auxquels CK-BB catalyse le transfert réversible d'un groupe phosphate de la créatine phosphate à l'adénosine diphosphate, le taux d'adénosine triphosphate résultant étant mesuré en utilisant des réactions couplées catalysées par l'hexokinase et la glucose-6-phosphate déshydrogénase. L'activité de cette dernière enzyme pour réduire le nicotinamide adénine dinucléotide est suivie par spectro- photométrie en mesurant l'accroissement d'absorption à 340 nm, la vitesse de changement de l'absorption étant directement reliée à l'activité du CKMB et/ou CK-BB dans n'importe quelle fraction donnée de l'échantillon expérimental. L'isoenzyme, à savoir CK-MM, employé comme antigène pour produire le premier anticorps, peut être obtenu à partir de n'importe quel liquide biologique appro- prié comme le sérum sanguin ou organe ou tissu biologique comme le muscle cardiaque, le muscle squelettique, la moelle osseuse, ou n'importe quel autre tissu organique connu pour posséder cette isoenzyme. La source préférée de cette iso- enzyme est le muscle squelettique animal. La purification des isoenzymes ci-dessus men- tionnées à un état de pureté élevée avant utilisation pour la production d'anticorps est très souhaitable afin de diminuer la présence d'anticorps non spécifiques. Les isoenzymes peuvent être purifiées par n'importe quel procédé classique de purification reconnu par les spécialistes dans de tels buts. Le procédé de purification préféré comprend les modes opératoires classiquement reconnus comme le frac- tionnement alcoolique et la chromatographie d'échange d'anions. Le degré de pureté élevée des isoenzymes utili- sées pour porduire les anticorps ainsi que la spécificité des anticorps résultants peuvent être déterminés par les pratiques couramment acceptées par les spécialistes comme par immunodiffusion ou par des techniques électrophorétiques. Le procédé préféré pour la pureté des isoenzymes est l'élec- trophorèse sur gel d'acrylamide. Le second anticorps peut être insolubilisé en attachant le second anticorps à un matériau support solide insoluble. Les matériaux support solides appropriés compren- nent des substances polymériques organiques insolubles dans l'eau comme la cellulose ou d'autres polysaccharides, un polymère d'addition ou polymère de condensation de vinyle ou une substance inorganique de nature polymérique soluble dans l'eau, comme le verre ou les résines siliconées. D'un autre côté le second anticorps peut être adsorbé à la surfa- ce d'un support solide comme le polystyrène, le polypropy- lène, le polyfluoréthylène ou le fluorure de polyvinylidène. Le procédé de fixation du second anticorps au support solide n'est pas critique et peut impliquer (1) de coupler de façon covalente le second anticorps soluble à une forme polymérisée insoluble, comme par réaction avec un agent insolubilisant; (2) un piégeage physique de particules du second anticorps dans les pores d'un gel de polymère comme un polyacrylamide réticulé; ou (3) une adsorption physique sur une substance polymérique insoluble. Lorsqu'on utilise un support solide, le mode de réalisation préféré consiste à fixer le second anticorps par adsorption sur du fluorure de polyvinylidène activé (Kynar) en utilisant les procédés généraux bien connus des spécialistes comme le procédé décrit dans le brevet américain N0 3 843 443. Les exemples suivants précisent l'invention mais ne sont pas conçus pour en restreindre la portée ou l'esprit. Exemple 1 Purification de CK-MM I. Homogénat On dégèle à 4 C environ 1000 g de muscle squelettique ou de tissu cardiaque humain. On enlève au couteau l'excès de graisse du tissu que l'on découpe ensuite en petits (1 cm) morceaux. On homogénéise alors les morceaux de tissu dans un mélangeur avec 1000-1500 ml d'(hydroxyméthyl)-amino- méthane 0,05 M froid (4 C) [tampon Tris] contenant 1 mM de mercaptoéthanol à pH 7,4. On centrifuge l'homogénat résultant à 50 000 g pendant 20 minutes à 4 C, produisant une pastille comme précipité. On filtre le liquide surnageant résultant à travers un entonnoir en verre fritté et on le conserve. On remet la pastille dans un mélangeur avec 500-700 ml de tampon Tris et on homogénéise à nouveau, on centrifuge encore à 50 000 g et on rassemble le liquide surnageant avec le premier surnageant après avoir filtré, ce qui fournit les surnageants réunis pour la partie II. II. Précipitation à l'éthanol On ajoute de l'éthanol absolu froid (4 C) aux surnageants réunis de la partie I ci-dessus, lentement à 4 C jusqu'à une concentration finale de 50% (v/v) puis on agite à 4 C pendant 30 minutes. Au bout de ce temps on centrifuge le mélange obtenu à 7 000 g pendant 15 minutes à 4 C. On garde le surnageant résultant et on jette la pastille précipitée. On ajoute lentement au surnageant de l'éthanol absolu froid (4 C) jusqu'à ce que la concentration d'éthanol soit de 70%. On agite le mélange résultant pendant 30 minutes à 4 C et on centrifuge à nouveau à 7 000 g pendant 15 minutes à 4 C. On remet en suspension la pastille obtenue dans 500-700 ml de tampon Tris 0,05 M à pH 7,4 contenant 1 mM de mercapto- éthanol et 0,05 M de NaCl. III. Chromatographie d'échange d'ions (procédé discontinu) On ajoute une résine d'échange d'anions au diéthylaminoéthyl-dextran (DEAE Sephadex A50) équilibrée avec du Tris 0,05 M à pH 7,4 contenant 0,05 M de NaCl et 1 mM de mercaptoéthanol à la pastille remise en suspension de la partie II ci-dessus et on agite à 4 C pendant 30 minutes. On filtre la suspension à travers du papier filtre Whatman = 1 et on lave avec plusieurs fractions de tampon Tris 0,05 M à pH 7,4 contenant 1 mM de mercaptoéthanol jusqu'à ce que le filtrat contienne une activité CK négli- geable. On concentre alors le filtrat à 300-500 ml en utilisant une membrane filtrante PM-10 à 4 C sous pression. IV. Seconde précipitation à l'éthanol On ajoute lentement de l'éthanol absolu froid au filtrat concentré de la partie III jusqu'à ce qu'on obtienne une concentration de 50%. On agite le mélange ob- tenu pendant 30 minutes à 4 C et on centrifuge à 7 000 g pour fournir une pastille. On garde ce surnageant et on jette la pastille. On ajoute lentement de l'éthanol absolu froid au surnageant jusqu'à ce qu'on atteigne une concen- tration de 70%. On centrifuge à nouveau le mélange obtenu à 7 000 g pendant 15 minutes et la pastille résultante est obtenue et dissoute dans un volume minimum de Tris 0,05 M à pH 7,4 (p. ex. 50-75 ml). On dialyse ce mélange obtenu contre 2 000 ml de Tris 0,05 M à pH 7,4 à 4 C en changeant 2 fois de tampon. Le léger précipité qui se forme dans le mélange à la dialyse est retiré après centrifugation et jeté, laissant un surnageant destiné à être utilisé dans la partie V ci-dessous. V. Chromatographie d'échange d'ions (Colonne) On équilibre de la DEAE Sephadex A-50 avec du Tris 0,05 M à pH 7,4 et on prépare une colonne de 2,6 cm x 60 cm et on la lave abondamment avec ce tampon. On introduit le surnageant final de la partir IV dans cette colonne et on élue à partir de la colonne à 4 C à un débit de 30 ml/heure. On recueille des fractions de 10 ml. On analyse l'activité CK et la teneur en protéines des fractions. On dialyse les fractions réunies contenant la plus grande partie de l'isoenzyme CK-MM contre du Tris 0,05 M à pH 7,4 contenant 10 mM d'acide éthylènediamine-tétra-acétique (EDTA). On concentre les fractinos dialysées en utilisant une merm- brane filtrante PM-10 à 4 C sous pression à une concentra- tion appropriée (p. ex. 8-40 mg de protéine/ml), et on conserve à 4 C dans du tampon Tris 0,05 M à pH 7,5 contenant mM d'EDTA. On retire par centrifugation le léger précipité qui se forme au repos. La pureté du CKMM dans la matière conservée, telle que déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, est typiquement de 90-100%. On utilise l'électrophorèse sur gels d'agarose pour démontrer l'absence des isoenzymes MB et BB dans la matière conservée qui consti- tue l'échantillon définitivement purifié de CK-MM. Exemple 2 Sérum anti CK-MM de chèvre: Afin de préparer l'immunogène pour immuniser des chèvres, on dilue le CK-MM purifié obtenu par le procédé de l'exemple I à 4 mg/ml dans du tampon Tris 0,02 M à pH 7,5 et on mélange avec un volume égal-d'adjuvant complet de Freund (suspension d'huile minérale contenant des bacilles de tuberculose M tués). On homogénéise le mélange résultant pour produire une émulsion eau/huile qui constitue l'immu- nogène. On immunise les chèvres chaque semaine avec une injection de 1 ml d'immunogène par voie sous-cutanée dans les régions axillaires en deux endroits, chaque endroit recevant 0,5 ml de l'immunogène. On saigne les chèvres toutes les deux semaines pour fournir du sérum anti CK-MM de chèvre. Exemple 3 Activation du fluorure de polyvinylidène Afin de coupler la fraction globulinique du sérum d'IgG anti-chèvre d'âne à du fluorure de polyvinylidène (PVF), on commence par activer le PVF par le procédé suivant: 1. On prépàre 15 litres de tampon Tris-azide en dissolvant 36,3 g de Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Trizma base) et 15,0 g d'azide de sodium dans environ 14 000 ml d'eau désionisée à la température ambiante et en ajustant le pH à 7,5 + 0,1 avec de l'HCl 5 N que l'on a préparé en diluant ml d'HCl à 38% avec 70 ml d'eau désionisée. On ajuste le volume de la solution résultante à 15 OOO ml avec de l'eau désionisée et on conserve à la température ambiante. 2. On mélange 100 g de poudre de fluorure de polyvinylidène avec 600 ml de 2-propanol dans un récipient approprié. On homogénéise la suspension résultante dans un homogénéi- * seur pendant 30 secondes en réglant la vitesse pour obtenir une dispersion fine, fournissant un mélange qui est transfé- ré dans un cylindre gradué de 4 litres et qu'on laisse repo- ser pendant 10 minutes à la température ambiante. On ajoute au mélange 3400 ml de sel physiologique préparé en dissol- vant 28,9 g de NaCl dans 3400 ml d'eau désionisée. Après l'addition du sel physiologique on mélange bien le mélange obtenu et on le laisse reposer pendant 1 h ou jusqu'à ce que le fluorure de polyvinylidène se soit stabilisé à environ 1/5e du volume total. On retire le surnageant par aspi- ration et on augmente le volume pour le remettre à 4000 ml avec de l'eau désionisée. On laisse encore se stabiliser le fluorure de polyvinylidène et on aspire le surnageant. On remet ensuite le volume à 4000 ml et on lave le fluorure de polyvinylidène encore 3 fois de cette manière avec de l'eau désionisée. On lave ensuite le fluorure de polyvinyl- idène deux fois encore de la manière précédente avec du tampon tris-azide de l'étape 1. Après le lavage final, on amène le volume de fluorure de polyvinylidène à 2000 ml et on le conserve sous forme de suspension à la température ambiante jusqu'à ce qu'on l'utilise pour le coupler à du sérum d'IgG anti-chèvre d'âne. Exemple 4 Préparation de la fraction globulinique de sérum d'IgG anti- chèvre d'âne On prépare la fraction globulinique du sérum d'IgG antichèvre d'âne aux fins d'utilisation dans un couplage à du PVF activé obtenu selon l'exemple 3 en utilisant les ingrédients et le procédé suivants: Elément a) b) Ingrédient Sérum d'IgG anti-chèvre d'âne obtenu dans le commerce Solution saturée de sulfate d'ammonium préparée en ajoutant 500 g de sulfate d'ammonium solide (granulaire) à 500 ml d'eau dé- sionisée et en agitant vigoureu- sement.à la température ambiante pendant 1 h. Garder à 40C et laisser les cristaux se déposer Quantité ml ml c) Tampon tris-azide 0,02 M à pH 7,5 env. 6 1 d) Solution saturée de chlorure de barium préparée en ajoutant 50 g de BaCl2-2H20 (granulaire) à 100 ml d'eau désionisée, en agi- tant vigoureusement pendant 1 h à la température ambiante et en lais- sant les cristaux se déposer. Garder à la température ambiante. env. 1 ml Mode opératoire 1. On dispose 100 ml de sérum d'IgG anti-chèvre d'âne (élé- ment a) dans un récipient approprié à 40C sur une plaque d'agitation magnétique. On ajoute alors lentement au récipient en agitant modérément 60 ml de sulfate d'ammo- nium saturé (élément b) pour amener le contenu du récipient à une saturation de 37,5%. On agite le récipient pendant 1 h à 4*C, puis on recueille l'anticorps précipité sous la forme d'une pastille par centrifugation à 1200 g pendant minutes à 4WC. On dissout la pastille dans environ 70 ml de tampon Tris-azide (élément c) et on ramène le volume à sa valeur d'origine, soit 100 ml, avec le même tampon. On ajoute alors lentement 50 ml de sulfate d'ammo- nium saturé (élément b) en agitant modérément à 4 C pour amener le mélange obtenu à une saturation de 33%. On agite le mélange pendant 1 h à 40C. On obtient l'anticorps précipité sous forme de pastille à partir du mélange après centrifuga- tion à 1200 g pendant 30 minutes à 4WC. On dissout la pas- tille dans environ 40 ml de tampon Tris-azide (élément c),- et on. le transfère dans un sac de dialyse et on dialyse con- tre le tampon Tris-azide à 4WC. On change 3 fois le tampon (2 litres à chaque fois) après un minimum de 4 h de dialyse à chaque fois. On détermine la présence éventuelle d'ions sulfate en ajoutant 1 ml de dialysat à 1 ml de BaCl2 saturé, en mélangeant bien et en observant l'apparition éventuelle d'un précipité blanc qui indique la présence de soupape. Si l'on observe un précipité, on change le dialysat avec du tampon frais et on continue jusqu'à ce que le test du sulfate soit négatif. On ramène le volume du dialysat à 100 ml avec le tampon Trisazide et on centrifuge pendant minutes à 2000 g à 4 C, en recueillant le surnageant. On conserve à 4 C le(s) surnageant(s) contenant l'IgG anti- chèvre d'âne préparée jusqu'à ce que l'on soit prêt pour le couplage au fluorure de polyvinylidène activé obtenu dans l'exemple 3. Exemple 5 Couplage de la fraction globulinique du sérum d'IgG anti- chèvre d'âne à du fluorure de polyvinylidène activé Le couplage de la fraction globulinique du sérum d'IgG anti-chèvre d'âne préparée par le procédé de l'exemple 4 à une suspension de PVF activé préparée par le procédé de l'exemple 3 s'effectue en utilisant les ingré- dients et le mode opératoire suivants: Elément Ingrédient Quantité a) Fluorure de polyvinylidène activé (exemple 3) 2000 ml b) Fraction globulinique de sérum d'IgG anti-chèvre d'âne (exemple 4) 100 ml c) Tris (hydroxyméthyl) amino- méthane (Trizma base) 24"2 g d) Tétra-acétate d'éthylènediamine disodique (EDTA) 147,4 g e) Hydroxyde de sodium 10 N dans l'eau env. 20 ml Mode opératoire 1. On prépare 10 litres de tampon Tris-EDTA comme suit: On dissout 24,2 g de Trizma base (élément c), 10,0 g d'azide de sodium et 147,4 g d'EDTA (élément d) dans environ 9000 ml d'eau désionisée à la température ambiante. L'EDTA peut nécessiter d'agiter de façon continue pendant 30 à minutes jusqu'à obtention d'une solution complète. On ajuste le pH de la solution à 7,5 + O,1 avec NaDH 10 N et on ajuste la solution à un volume de 10 000 ml avec de l'eau désionisée et on conserve à la température ambiante. 2. On dispose 2000 ml de suspension de fluorure de polyvinyl- idène activée (élément a) dans un récipient approprié et on agite à une vitesse modérée. On ajoute à la suspension ml de sérum anti-chèvre-d'âne (élément b) et on agite pendant 6 h à la température ambiante et pendant la nuit (12-18 h) à 4 C, ce qui donne du fluorure de polyvinylidène couplé à de l'anticorps IgG anti-chèvre d'âne. 3. On recueille le fluorure de polyvinylidène couplé à l'anticorps de l'étape 2. ci-dessus sous forme de pastille par centrifugation à 1500 g pendant 10 minutes à 4 C. On décante le(s) surnageant(s), laissant la pastille que l'on remet en suspension avec soin dans un volume total de 2000 ml du tampon Tris-EDTA tel que préparé dans l'étape 1. ci-dessus. 4. On répète l'étape 3 pendant encore 3 fois au total. e 5. On remet en suspension la (les) pastille(s) finale(s) obtenue(s) après l'étape 4 dans du tampon Tris-EDTA (étape 1) jusqu'à un volume de 500 ml, et on dissout dans cette suspension 2,5 g de sérum-albumine de boeuf en agitant modé- rément pendant 30 minutes. On homogénéise alors cette suspension dans un homogénéiseur pendant 30 secondes en réglant la vitesse pour preparer une dispersion fine à fournir comme produit insoluble IgG anti-chèvre. 6. On conserve le produit IgG anti-chèvre insoluble à 4 C aux concentrations finales suivantes: % (p/v) de fluorure de polyvinylidène 0, 02 g de Tris 1 M à pH 7,5 0,1% (p/v) d'azide de sodium 0,5% (p/v) de SAB 39,6 mM d'EDTA. Exemple 6 On procède à une détermination de l'activité de CK-MB dans un liquide biologique par le procédé suivant qui emploie deux tubes à essais: 1. Au tube à essai n l on ajoute: 200P 1 de sérum de malade et 250 p 1 de sérum anti CK-MM de chèvre (tel que préparé dans l'exemple 2), en mélangeant doucement puis en laissant reposer pendant 20 minutes à la température ambiante pour fournir le mélange résultant pour l'étape 3. 2. Au tube à essais n 2 on ajoute: 200l 1 de sérum de malade et 50 1 de sérum anti CK-MM de chèvre (tel que préparé dans l'exemple 2) en mélangeant doucement puis en laissant reposer pendant 5 minutes à la température ambiante. On ajoute ensuite 200 il, l'IgG anti-chèvre insoluble conservée préparée selon l'exemple 5, on mélange doucement et on laisse reposer 5 minutes à la température ambiante. On centrifuge alors le tube pendant 5 minutes à 1000 g, et on obtient le surnageant pour l'étape 3. 3. On ajoute 100 ill du mélange résultant de l'étape 1 et 200 pl du surnageant de l'étape 2 respectivement pour séparer la première et la seconde fractions de 1,0 ml de réactif CK enzymatique (exemple 7) pour la mesure de l'activité d'enzyme CK. Ensuite on mélange avec soin chacune des fractions et on laisse incuber à 37 C pendant 5 minutes. On enregistre l'absorption pour chaque fraction à 340 nm à des intervalles périodiques pendant un total de 5 minutes dans un spectrophotomètre à 37 C en utilisant des cuvettes d'une longueur de trajectoire de 1,0 cm. On convertit les mesures d'absorption en variation d'absorption par minute, on obtient un nombre d'IU/litre d'activité CK pour chaque fraction. On soustrait alors la valeur de l'activité CK de la seconde fraction de la valeur de l'activité CK de la première fraction. Exemple 7 Les réactifs CK enzymatiques de l'exemple 7 contiennent les ingrédients suivants: Ingrédients actifs Créatine phosphate D-glucose ADP AMP NAD (levure) MgCl2 Hexokinase (levure) Glucose-6-phosphate déshydro- génase (Leuconostoc) Dithioérythritol Concentration telle que formulée 17 mM ,0 mM 1,2 mM 8 mM 2,3 mM mM 2500 IU/litre à 30 C 2500 IU/litre à 30 C mM Les ingrédients réactifs sont formulés dans un tampon pipérazine-N,Nbis(acide 2-éthanesulfonique), pH 5,8 + 0,15 (30 C). REVENDICATIONS 1. Procédé pour déterminer quantitativement la présence de la forme isoenzymatique MB de la créatine kinase qui se trouve dans les liquides biologiques sous plusieurs formes isoenzymatiques contenant la sous-unité M ou B ou les deux, procédé qui implique: a. de faire incuber dans un premier récipient réactionnel la première de deux fractions d'un échantillon de liquide biologique avec un premier anticorps qui se lie immunologi- quement de façon sélective avec les isoenzymes de créatine kinase contenant la sous unité M par immuno-inhibition sé- lective de la sous-unité M dans la première fraction de l'échantillon de liquide biologique, puis en mesurant quanti- tativement l'activité d'isoenzyme B de la première fraction de l'échantillon de liquide biologique, b. en faisant incuber dans un récipient réactionnel séparé la seconde de deux fractions de l'échantillon de liquide biologique avec: (i) un anticorps qui se lie immunologiquement de façon sélective avec les isoenzymes de créatine- kinase contenant la sous-unité M dans la seconde fraction du liquide biologique; et (ii) un second anticorps précipitant qui se lie immunolo- giquement de façon sélective avec l'anticorps liant les iso- enzymes de créatine kinase contenant la sous-unité M, pour former un produit de réaction dudit second anticorps avec ledit autre anticorps et lesdites isoenzymes de créatine kinase contenant la sous-unité M comme précipité dans ladite seconde fraction puis en mesurant quantitativement l'activité d'isoenzyme B du surnageant dans ladite seconde fraction, et c. en déterminant l'activité de CK-MB dans ledit échan- tillon à partir desdites mesures obtenues à partir des première et seconde fractions. 2. Procédé selon la revendication 1 o l'échantillon de liquide biologique est du sérum sanguin. 3. Procédé selon la revendication 1 o le premier anticorps de l'étape (a) et l'anticorps liant l'isoenzyme de créatine kinase contenant la sous-unité M de l'étape (b) sont l'anti- créatine kinase MM de chèvre, et le second anticorps de l'étape (b) est l'IgG anti-chèvre d'âne. 4. Procédé selon la revendication 1 o le second anticorps précipitant est lié à un support solide. 5. Procédé selon la revendication 4 o le support solide est le fluorure de polyvinylidène. 6. Procédé selon la revendication 1 o l'activité enzymati- que de l'isoenzyme B est déterminée par un dosage spectro- photométrique. 7. Procédé selon la revendication 6 o le dosage spectro- photométrique comprend: un mélange d'enzyme-co enzyme et de substrat. 8. Système de nécessaire expérimental diagnostique pour dé- terminer quantitativement la présence de la forme iso- enzymatique MB de la créatine kinase qui apparaît dans un liquide biologique sous plusieurs formes isoenzymatiques contenant la sous-unité M ou B ou les deux, le système de nécessaire expérimental comprenant: t500009 (a) un premier récipient contenant un anticorps capable de se lier immunologiquement de façon sélective avec les isoenzymes de créatine kinase contenant la sous-unité M avec immuno-inhibition sélective de la sous-unité M, (b) un second récipient contenant un second anticorps précipitant capable de réagir immunologiquement de façon sélective avec l'anticorps contenu dans le premier réci- pient, et (c) un réactif d'enzyme-co enzyme et de substrat capable de déterminer l'activité enzymatique de la sous-unité B. 9. Système de nécessaire expérimental selon la revendica- tion 8 o le second anticorps précipitant est lié à un support solide. 10. Système de nécessaire-expérimental selon la revendica- tion 9 o le support solide est le fluorure de polyvinyl- idène.