Brevet FR2504149A1 — publié le 19821022

La présente invention concerne un procédé pour pro- duire du L-tryptophane par fermentation. On sait que le L-tryptophanequi est un des amino- acides essentiels et un composant essentiel de la nutrition de l'homme et des animaux, peut être synthétisé selon divers voies, par exemple à partir du P-indolylaldéhyde et de l'acide hippurique (Ber 39, 2515, 1906) ou a partir de l'acide "-cétoglutarique et de la phénylhydrazone (brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 019 232). En dehors de ces procédés de synthèse chimique, on sait que le Ltryptophane est produit à partir de ses précurseurs tels qu'un acide anthranilique, l'indole, ou un indole-3-pyruvate sous l'effet de micro-organismes. On sait également que le L-tryptophane est produit selon un procédé de fermentation dans lequel on utilise des mutants producteurs de Ltryptophane du genre Brevibacterium On connait également divers mutants producteurs de L-tryptophane produits par mutation artificielle de souches sauvages de micro-organismes des genres Brevibacterium ou Corynebacterium Des exemples de tels mutants artificiels sont les mutants résistant à un analogue du tryptophane tel que le méthyl-5-tryptophane (demande de brevet japonais publiée non examinée n 18828/1973), des mutants reésistant à un analogue de tryptophane et à un analogue de la phénylalanine et les mutants résistant à ces analogues et nécessitant de plus pour leur croissance un L-amino-acide tel que la L-tyrosine, la L- phénylalanine, la L-méthionine et la L-histidine (demandes de brevets japonais publiées non examinées n 42091/1975 et n 129791/1975, demande de brevet japonais publiée examinée n 19037/1976 et Agr, Biol, Chem, 39, 343 ( 1975)). Depuis peu, le L-tryptophane est très recherché comme aliment pour animaux mais les besoins ne peuvent pas être couverts car il n'est pas possible de produire du L-tryptophane à un prix raisonnable selon un procédé de fermentation ou un procédé de synthèse chimique bien que l'on connaisse divers pro- cédés de production du L-tryptophane comme précédemment indiqué. Un des objets de l'invention est un procédé pour préparer du L-tryptophane avec un rendement amélioré selon un pro- cessus de fermentation. De façon générale, l'invention concerne un procédé pour produire du Ltryptophane par fermentation par culture aérobie d'un mutant du genre Brevibacterium qui résiste à l'azasérine et à un analogue du tryptophane et a récupérer le L-tryptophane accumulé dans un milieu de culture. Les modes de réalisation préférés de l'invention vont maintenant être décrits de façon détaillée. La demanderesse a découvert que l'on peut accroltre la production du Ltryptophane lorsqu'on confère une résistance à l'azasérine à un mutant connu résistant à un analogue du tryptophane et produisant du L-tryptophane appartenant au genre Brevibacterium. Les micro-organismes employés dans l'invention sont des mutants qui appartiennent au genre Brevibacterium et résistent à l'azasérine et à un analogue du tryptophane et sont capables de produire du L-tryptophane avec un rendement accru. L'azasérine (diazoacétate de serine; 0-diazoacdtyl L-sérine) est un des antibiotiques produits par les micro-organismes du genre Streptomyces qui a une activité antindoplasique et est connu comme un des antagonistes de la glutamine. Dans la présente invention, un analogue du trypto- phane est un composé chimique tel que ceux qui inhibent la crois- sance des micro-organismes du grenre Brevibacterium, cette inhibi- tion étant empêchée par la coexistence de L-tryptophane dans le milieu; parmi les analogues du tryptophane figurent les alkyl(infd- rieur)tryptophanes tels que le méthyl-5 tryptophane et le méthyl-6 tryptophane, les halogénotryptophanes tels que le fluoro-5 trypto- phane et le fluoro-6-tryptophane, l'hydroxamate de tryptophane et l'aza-7tryptophane. Selon un mode de réalisation préférd de l'invention, une caractéristique connue utile pour la production du L-tryptophane telle qu'un besoin en L-phénylalanine, en L-tyrosine ou en L-méthio- nine, et une résistance à un analogue de la phénylalanine est conférée aux mutants de l'invention, bien qu'un mutant présentant uniquement une telle caractéristique ne produise pas de L-trypto- phane. Un échantillon caractéristique de l'invention est: Brevibacterium flavum AJ 11667 FEPRI-P 5907 FERM BP-114 ( 5-F Tr, p-F-Pher, A Sr, Tyr-, Met-) ou l'abréviation entre parenthèses a la signification suivante: 5-F Tr: résistance au fluoro-5-tryptophane A Sr p-F-Pher: résistance à l'azasérine et à la p-fluorophényl- alanine Tyr-, Met:besoin de L-tyrosine et de L-méthionine pour la croissance. Le mutant identifié ci-dessus par la référence FER 4-BP a été à l'origine déposé avec la référence FERM-P le 10 mars 1981 à l'Institut de Recherche sur les Fermentations, Agence des Sciences et Technologies Industrielles, Ministère du Commerce International et de l'Industrie (FRI) , 1-3, Higashi 1-Chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaragi-ken 305, Japon et ce dépôt a été transformé en un dépôt selon le traité de Budapest le 29 mars 1982, le FRI ayant acquis le statut d'Autorité Dépositaire Internationalele lernmai 1981. Comme précédemment indiqué, les mutants de l'invention peuvent être induits à partir des souches parentes de micro-organismes selon un procédé de mutation classique quelconque Le premier stade de l'in- duction consiste à faire muter les souches parentes avec un agent mutagène chimique approprié tel que la N-métlyl-N'-nitro-N-nitro- soguanidine et l'acide nitreux ou par irradiation par la lumière ultraviolette Le second stade du procédé consiste à choisir les mutants résistants par prélèvement des colonies des micro-organismes cultivés sur des bottes d'un milieu gélosé nutritif contenant une quantité d'azasérine inhibant le développement des souches parentes. Ensuite on évalue la productivité du L-tryptophane des mutants selon une méthode standard. Les souches parentes appropriées à partir desquelles les présents mutants peuvent ttre induits comprennent les mutants qui résistent à un analogue du tryptophane et sont capables de produire du L-tryptophane ou les souches sauvages, du genre Brev 1- bacterium. Les mutants préférés résistant à un analogue du tryptophane sont par exemple: 2504 1 49 Brevibacterium flavum AJ 3246 ATCC 21427 ( 5-M Tr, Phe -, Tyr-) Brevibacterium flavum AJ 11353 FERM-P 5006 ( 5-F Tr, p-F-Pher, Met, Tyr-) -M Tr: résistant au méthyl-5-tryptophane. Lorsque l'on utilise des souches sauvages comme souches parentes, une résistance au tryptophane est conférée aux souches sauvages avant ou après qu'on leur air conféré une résistance à l'azasérine. Les souches sauvages préférés du genre Brevibacterium sont les bactéries corynéformes productrices d'acide Lglutamique dont on peut citer comme exemples: Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Le degré de résistance à l'azasérine du mutant AJ 11667 dérivant de Brevibacterium flavum AJ 11668 est illustré par l'expé- rience suivante. Expérience On de milieu minimal contenant de plus DL-tryptophane. prépare des bottes de gélose ( 8,5 cm de diamètre) dont la composition figure dans le tableau I et Pg/ml d'azasérine ou 500 pg/ml de fluoro-5 TABLEAU I Comonnsition du milieu Composants Glucose Sulfate d'ammonium Urée KH 2 PO 4 Mg SO 4 7 H 20 Fe SO 4 7 H 20 Mn SO 4 4 H 20 Chlorure de sodium d-biotine Thiamine H Cl L-mé thionine L-tyrosine Agar minimal Quantité pour 1,0 litre g g 3 g 1 g 0,4 g mg 8 mg 0,5 g Mg 'g mg mg g r On ensemence la botte d'une souche cultivée sur une gélose inclinée du milieu minimal; la taille de V'inoculum est ajustée à 106 cellules par boite On incube ensuite la boite à 300 C pendant 4 jours et on compte les colonies des micro-organismes qui se sont développées sur la botte Les résultats obtenus figurent dans le tableau II. TABLEAU II De Rré de résistance Nombres de colonies par botte Agent chimique AJ 11667 AJ 11353 AJ 11668 Néant ++ -H' Fluoro-5-tryptophane ++ 4 + - azasérine 4 + ++: le nombre des colonies est supérieur à 1 000 : pas de formation de colonies. La souche AJ 11668 du tableau Il est la souche parente de Ai 11667 et elle résiste à la p-fluorophénylalanine. On cultive les mutants de l'invention en aérobiose dans des milieux de cultures contenant des sources de carbone, des sources d'azote et des ions minéraux ainsi que s'il est nécessaire des substances nutritives secondaires. Des sources de carbone appropriées comprennent des saccharides tels que le glucose, le fructose et le saccharose et les mélasses et l'amidon hydrolysé contenant-ces saccharides, des acides organiques tels que l'acide acétique et l'acide citrique et des alcools. Des sources d'azote appropriées comprennent par exemple le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'ammoniac gazeux et l'urée On ajoute de façon appropriée au milieu de culture, lorsqu'il est nécessaire, des ions minéraux tels que K, Na, Ca Fe, Mn, Mg,Zn, SQ _, Cl et PO 4 Des substances nutritives secondaires appropriées comprennent des aminoacides, des vitamines, des extraits de levure, la peptone et l'hydrolysat protéique de soja. Lorsque des mutants nécessitent des substances nutri- tives telles que des L-amino-acides, on ajoute les substances nutri- tives-au milieu de culture. 25041 49 On effectue la culture de préférence en conditions aérobies pendant 1 à 4 jours à une température comprise entre 20 et 40 C en ajustant de préférence le p H du milieu de culture entre ,0 et 9,0 avec un acide ou une base organiques ou minéraux A cet effet on utilise de préfdrence l'urée, Ca CO 3 et l'ammoniac gazeux. On peut récupdrer le L-tryptophane accumulé dans le milieu de culture selon une technique de récupération totalement classique telle que celle utilisant une résine échangeuse d'anions. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'un exemple de réalisation. Exemple On introduit des portions de 20 ml du milieu de culture dont la composition figure dans le tableau III dans des flacons de 500 ml que l'on chauffe a 110 C pendant 10 minutes. Ensuite on ajoute au contenu de chaque flacon 1,0 g de Ca CO 3 std- rilisé séparément. TABLEAU III Composition du milieu de culture Composants Glucose Sulfate d'ammonium 2 Po 4 Acide fumarique Acide acétique Mn SO 4 4 H 120 d-biotine Thiamine HC 1 L-tyrosine DL-méthionine Mg SO 4 7 H 20 Hydrolysat protéique de soja (azote total 2,4 %) 6.5) Quantité 2 Our 1 O litre g g 1,0 g 12 g 3 1 8 mg pg 2,0 mg 650 mg 400 mg 1,0 g ml On ensemence les milieux de culture avec chacune des souches à étudier qui figurent dans le tableau IV, prdcgdetment cultivées sur une gélose inclinée constituée du même milieu de culture et on cultive en agitant à 30 'C pendant 72 heures. (EN 2504 49 Apres la culture, on détermine le L-tryptophane accumulé dans le bouillon de culture selon une méthode biologique standard utilisant Leuconostoc mesenteroides ATCC 8042; les résultats obtenus figurent dans le tableau IV. TABLEAU IV Quantité de L-tryptophane accumulée Souche n L-tryptophane (mg/ml) AJ 11668 (p-F-Phe) 0,0 AJ 11353 ( 5 F Tr, p-F-Pher, Met-, Tyr-) 7,1 r 'r AJ 11667 ( 5 F Tr, Asr, p-F-Pher, Met, Tyr 1) 9,1 On recueille et on centrifugre pour éliminer les cellules microbiennes un bouillon de culture de la couche AJ 11667 préparé comme précédemment décrit On fait passer 1,0 litre de la solution surnageante ainsi obtenue à travers une colonne de "Daiaion SK 104 " sous la forme acide On adsorbe ainsi sur la résine le L-tryptophane et on l'élue avec de l'hydroxyde d'am- monium 0,5 N On évapore l'éluat et on refroidit à une température suffisamment basse pour que le L-tryptophane cristallise. On dissout ensuite le L-tryptophane brut cristallin dans une solution d'éthanol à 507 et on ajoute du charbon actif à la solution Après décoloration, on obtient à partir de la solution décolorée 5,4 g de L-tryptophane cristallin. Bien entendu diverses modifications peuvent Etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limita- tifs sans sortir du cadre de l'invention. 2504 1 49 REVENDICATIONS 1 Procédé pour produire du L-tryptophane par fermenta- tion, caractérisé en ce qu'il consiste a: cultiver en aérobiose dans un milieu de culture un mutant du genre Brevibacterium résis- tant à l'azasérine et à un analogue du tryptophane et capable de produire le L-tryptophane et à récupérer le L-tryptophane accumulé dans le milieu de culture. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant appartient aux espèces Brevibacterium flavum ou Brevibacterium lactofermentum. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit analogue de tryptophane est le méthyl-5-tryptophane ou la fluoro-5-tryptophane. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant résistant à l'azasérine et à un analogue du trypto- phane est Brevibacterium flavum FERM BP-114.