Brevet FR2502786A1 — publié le 19821001

Procédé de fixation d'antigènes et d'anticorps sur support de polysaccharides, et utilisation du produit ainsi obtenu pour les dosages immunologiques. L'invention a pour objet l'obtention d'un réactif utile pour le dosage de certains anticorps, de type réagines ou d'autres classes (IgG) ou pour le dosage d'antigènes (en particulier des immunoglobulines) par la méthode "sandwich". Les déterminations immunologiques des anticorps et des antigènes (immunoglobulines par exemple) présents dans le sérum sanguin peuvent être effectuées principalement selon deux méthodes Selon une première méthode, pour doser les anticorps spécifiques d'un antigène donné, et en particulier les réagines spécifiques d'un allergène, on utilise un support insoluble dans l'eau, ou immunoadsorbant, sur lequel a été fixé l'antigène contre lequel est dirigé spécifiquement l'anticorps à doser. Dans une première étape, ce support est mis en contact avec le sérum à doser: les anticorps spécifiques de l'antigène fixé sur le support se combinent avec celui- ci. Après lavage, le support est, dans une deuxième étape, mis en contact avec un anticorps dirigé spécifiquement contre les anticorps ou immunoglobulines à doser, et qui a été marqué, soit par un élément radioactif, soit par un enzyme. Après lavage, on mesure dans le premier cas la radioactivité (test radio-immunologique), dans le second cas, l'activité enzymatique, fixée sur le support par colorimétrie (test enzymo-immunologique). Selon une deuxième méthode, dite "sandwich", pour doser en particulier certaines immunoglobulines du sérum, qui jouent alors le rôle d'antigènes, on utilise également un support insoluble, mais sur lequel a été fixé l'anticorps dirigé contre les immunoglobulines à doser (par exemple, anti-IgE totales ou anti-réagines, ou anti-IgG). Ce. support est ensuite mis en contact avec le sérum contenant l'antigène à doser (IgE totales, ou réagines, ou IgG) qui se combine à l'anticorps. Après lavage, le support est mis au contact du même anticorps que le précédent, mais qui a été marqué par un élément radioactif ou un enzyme qui sert de révélateur, comme dans la première méthode. Dans l'une comme dans l'autre des deux méthodes ci-dessus, on utilise donc un support insoluble qui a fixé soit l'antigène, soit l'anticorps, et cette liaison doit être telle qu'elle ne soit pas rompue par lavage, et que l'antigène ou l'anticorps conserve sa capacité de se combiner réciproquement avec l'anticorps ou l'antigène correspondant. L'invention objet de la demande de brevet concerne un nouveau procédé de fixation d'un antigène ou d'un anticorps sur un support de polysaccharides et le réactif ainsi obtenu pour les dosages radio- et enzymo-immunologiques des immunoglobulines. Elle concerne en particulier un procédé de fixation de substances antigéniques dénommées allergènes sur un support de cellulo- se ou dérivé de la cellulose, et l'utilisation du réactif ainsi obtenu pour le dosage, dans le sérum des malades allergiques des immunoglo- bulines dites "réagines" spécifiques de l'allergène. Selon les techniques connues, on utilise fréquemment comme supports solides, insolubles, des disques, bandes ou plaques constitués par un polysaccharide, ou un dérivé de polysaccharide, tel que cellulose, dextrane, etc. L'antigène ou l'anticorps, qui est en général une pro- téine et présente par conséquent des groupes amino est, selon un procédé connu (Brevet français de Pharmacia n'i.584.535) lié au support par formation de liaison de covalence entre les groupes amino de la protéine et les groupes hydroxyle du support au préalable "activés" par réaction avec un halogénure de cyanogène. L'invention a pour objet un nouveau procédé d'activation des supports constitués par des polysaccharides avant de fixer sur ces supports un antigène (allergène) ou un anticorps (immunoglobulines). Le procédé selon l'invention est basé sur la réaction connue en elle-même, d'oxydation des chaînes de polysaccharides par le métaperiodate de sodium de formule NaIo4 qui provoque une ouverture des cycles béta-D-glucopyranosyle avec formation de groupes aldéhyde. Ainsi, lorsqu'on fait incuber la cellulose, formée de chaînes de ribose branchées, avec le catalyseur métaperiodate de sodium, la réaction partielle qui se produit peut être représente de la façon suivante: CH-OH / CH-OH \ CH-OH OH Le polysaccharide ainsi "activé" au métaperiodate peut ensuite être couplé avec une amine de formule RNH12, avec formation d'une liaison imine instable, de formule: n Une réduction par le borohydrure le polymère en transformant la liaison imine formule: CH2OR R de sodium stabilise en liaison amine de L'amine de formule RNH2 peut être en particulier une protéine ou un peptide, et la série des réactions cidessus a été déjà utilisée pour coupler: - des polysaccharides de pneumocoques aux globules rouges (Rebers et col.; J. Bactériol. 83, 335, 1952); - des protéines aux globules rouges; - le dextrane à un anticorps anti-globules rouges (Sanderson et col., Immuno chemistry 8, 163-8, 1971); - un polysaccharide tel que la cellulose à une molécule porteuse de groupes NH2: le lysoganglioside GM1 (Brevet francais 77/28163 de l'Institut Mérieux). La réaction d'activation d'un polysaccharide par le métaperiodate, suivie du couplage avec une protéine et de la stabilisation par réduction de la liaison imine formée, a été appliquée, selon l'invention, à la fixation d'un antigène ou d'un anticorps sur un support polysaccharidique, celuici pouvant ensuite être utilisé pour la détermination immunologique des immunoglobulines (réagines spécifiques d'un allergène, ou d'une IgG). On a ainsi préparé, selon l'invention des disques de- cellulose sur lesquels étaient fixés divers allergènes tels que poussières et moisissures domestiques ou pollen de dactyle, et on a utilisé ces disques avec succès pour ia détermination dans le sérum des réagines dirigées spécifiquement contre ces allergènes, soit par une méthode radio-immunologique (RAST) soit par une méthode enzymo- immunologique (ELISA). Le mode opératoire pour préparer les immunoadsorbants selon l'invention est le suivant a) Activation Le support cellulosique (disques de papier par exemple) est mis en contact à température ambiante, sous agitation, pendant 2 heures environ avec une solution 0,2 M de NaI04 à raison de ml de solution pour 5 à 10 g de cellulose. On rince ensuite le support avec un tampon carbonate 0,1 M - pH 9. L'apparition des fonctions aldéhyde sur le support cellulosique peut alors être contrôlée par le réactif de Schiff sur un prélèvement (apparition d'une coloration violette). b) Couplage de l'allergène L'allergène lyophilisé est repris par le tampon carbonate 0,1 M - pH 9 à la concentration voulue. La cellulose activée est placée dans un tube fermant hermétiquement et on ajoute l'allergène. On fait incuber le tout, sous rotation continue de 8 à 15 heures, de +40C à la température ambiante. c) Stabilisation par réduction Du borohydrure de sodium (NaBH4) en poudre est introduit directement dans les tubes de l'opération précédente, de façon à avoir une concentration finale 0,2 M en NaBH4 dans la solution cette opération est effectuée sous une hotte aspirante à cause du dégagement d'hydrogène. On laisse en contact 2 heures à la température ambiante, puis on rince le support une première fois au tampon carbonate 0,1 M; une deuxième fois au NaCl IM, et une troisième fois avec le tampon phosphate (PBS) qui servira ensuite pour les dosages. Puis on sèche le support sur papier absorbant et le stocke au congélateur à -25%C. On a montré que les supports sur lesquels un allergène a été fixé par le procédé selon l'invention, peuvent être utilisés avantageusement pour le dosage des réagines sériques, spécifiques de l'allergène, en les comparant à des supports sur lesquels le même allergène avait été fixé par le procédé connu d'activation préalable au bromure de cyanogène (BrCN). Dans ce but, on a utilisé à titre d'exemple, deux allergènes lyophilisés Pollen de dactyle (ci-dessous appelé "dactyle") titrant !67.000 unités d'azote protéique (PNU)f/ml; - Poussières et moisissures domestiques (cidessous désigné PMD) titrant 179.000 PNU/ml. Les disques de cellulose sur lesquels on avait fixé l'un de ces allergènes ont été ensuite essayés pour le dosage des réagines spécifiques, par le procédé radio-immunologique classique -5 (PAST) en utilisant un pool de sérums positifs (dilué au 1/5) et 3 témoins négatifs: - témoin HSA (albumine sérique humaine) 0,1 % - témoin sérum négatif (dilué au 1/5); témoin réactif (sans sérum et avec le réactif anti-IgE pour tenir compte des réactions non-spécifiques). Les tests RAST étaient réalisés de façon classique. Les disques à étudier sont placés dans les puits de plaques de microtitration et recouverts avec 50,pl de sérum dilué (ou de témoin). On laisse incuber 3 heures à température ambiante sous agitation horizontale continue, puis lave les disques trois fois avec du PBS-tween 20 (4 %). On élimine les solutions de lavage et ajoute sur chaque disque 25/pl de réactif anti-IgE marqué à l'iode 125. On couvre la plaque et laisse incuber toute une nuit à température ambiante. Les disques sont ensuite lavés 4 fois avec le tampon PBS-tween et les solutions de lavage sont éliminées. On met les disques secs dans des tubes préalablement repérés et lit au compteur gamma la radio-activité en coups par minute (c.p.m.). Recherche de la concentration optimale d'allergènes à fixer sur les disques de cellulose pour obtenir la plus grande sensibilité dans le dosage des réagines Deux lots de disques, l'un activé au BrCN selon la méthode connue, et l'autre au métaperiodate selon le procédé de l'invention, ont été couplés dans les mêmes conditions avec des concentrations croissantes d'allergène: soit 0,5 - 5 - 10 - 15 - 20 - 25 et 30 mg de lyophilisat par ml de diluant; ce qui correspond respectivement pour l'allergène PMD (179.000 PNU/ml) à 60 - 640 - 1290 - 2000 - 2600 - 3230 et 3800 pg de protéine théorique par ml de diluant, et pour l'allergène dactyle (167.000 PNU/ml) à 78 pg - 783 pg - 1,56 - 2,35 - 3,13 - 3,9 et 4,70 mg par ml de diluant. Après couplage, les sites réactifs libres sur les disques activés au BrCN sont saturés avec un mélange d'acides aminés (EPA33) et les disques activés au métaperiodate sont réduits par le NaBH4 selon le procédé de l'invention. On effectue le même jour, à l'aide de ces deux lots de disques, des dosages RAST avec le même sérum et le même réactif anti-IgE. Le tableau I ci-après présente les résultats enregistrés avec les disques activés au bromure de cyanogène, couplés à l'allergène PMD: Ia) contrôlés avec le sérum positif Ib) contrôlés avec le sérum négatif ou HSA. Le témoin réactif est un témoin "bruit de fond". Le tableau II ci-après présente les résultats enregistrés sur les disques activés avec le métaperiodate, dans les mêmes conditions. Les tableaux III et IV ci-après présentent les résultats obtenus avec l'allergène dactyle III: disques activés au BrCN; IV: disques activés au métaperiodate. L'examen de ces tableaux montre Pour les disques activés au métaperiodate (tableaux II et IV) selon l'invention, la sensibilité du dosage cro!t en fonction de la concentration de l'allergène et se stabilise plus ou moins pour une concentration de 15 mg d'allergène/ml (pour atteindre environ 5500 cpm pour le PMD et 7000 cpm pour le dactyle). Les témoins réactifs ou négatifs évoluent lentement en fonction de la concentration de l'allergène. Les valeurs du témoin réactif ne dépassent pas celles du témoin négatif et varient entre 270 et 340 cpm. Pour les disques activés au BrCN (tableaux I et III), la sensibilité du dosage croît en fonction de la concentration d'allergène et atteint un plateau à 10 mg d'allergène/ml. La sensibilité des témoins réactifs est indépendante de la concentra- tion de l'allergène, mais est plus élevée que pour les mêmes témoins avec les disques au métaperiodate. Vérification de la reproductibilité du couplage de l'alLergène sur les disques activés. Après avoir déterminé comme indiqué ci-dessus la concentration optimale de l'allergène à coupler sur les disques préalablement activés, on a incubé des disques préalablement activés, avec la même concentration du même allergène; c'est-à-dire disques activés au métaperiodate et t couplés avec 10 mg/ml disques activés au BrCN de dactyle; disques activés au métaperiodate et t couplés avec 15 mg/ml 10 disques activés au BrCN t de PMD Les dosages RAST ont été effectués avec les mêmes pools de sérums positifs que ceux utilisés précédemment, et avec 6 essais positifs et 4 négatifs par série, et ont été répétés 4 fois. Les résultats sont consignés dans le tableau V ci-après. Ils montrent que la sensibilité des disques activés au métaperiodate est légèrement supérieure à celle des disques activés au BrCN, mais les variabilités au sein de chaque essai sont identiques pour les deux méthodes de fixation et la reproductibilité est bonne d'un essai à l'autre. Les témoins négatifs et réactifs sont bas et très réguliers et le "bruit de fond" (témoin réactif) est légèrement plus faible pour les disques activés selon l'invention. Vérification de la reproductibilité de l'activation des disques par le métaperiodate. 4 lots de disques ont été activés indépendemment les uns des autres avec le métaperiodate. Les disques activés au BRCN faisaient tous partie du même lot d'activation. Le couplage s'est fait à partir d'une proportion unique d'allergène dactyle (10 mg/ml) et d'allergène PMD (15 mg/ml), répartie sur chaque série de disques. Les résultats sont consignés dans le tableau VI ci-après. Ils montrent que la sensibilité des disques au métaperiodate n'est pas modifiée d'un lot d'activation à l'autre. La variabilité de la sensibilité au sein d'un lot recoupe assez bien celle enregistrée avec les disques BRCN. Mais pour les disques activés au métaperiodate les témoins négatifs sont bas et peu variables et les témoins réactifs témoignent d'un bruit de fond faible. En conclusion, la sensibilité des dosages RAST avec les disques activés au métaperiodate selon l'invention est aussi bonne et même légèrement supérieure à celle des mêmes dosages effectués avec les disques activés auBrCN. La reproductibilité de l'activation par le métaperiodate et le couplage, selon l'invention, avec les allergènes étudiés est tout à fait satisfaisante. Les bruits de fond donnés par le témoin réactif et les témoins négatifs sont plus faibles avec les disques activés selon l'invention qu'avec ceux activés par le BrCN, d'o une sensibilité plus grande pour les sérums faiblement positifs. D'autre part, une série d'essais ont été faits pour utiliser les disques activés et couplés selon l'invention avec divers allergènes, dans les procédés de dosage enzymo-immunologiques (ELISA) des réagines spécifiques des allergènes Les disques sur lesquels un allergène a été fixé selon l'invention sont mis en contact avec un pool de sérum contenant les IgE à doser, spécifiques de l'allergène. Ces IgE se combinent sélectivement à un anti-IgE spécifique du fragment Fc de l'allergène, couplé à un enzyme que l'on peut déceler lors de la dégradation de son substrat. Le disque est alors éliminé, et le substrat coloré, en phase liquide, est lu au colorimêtre. On a ainsi pu observer la même sensibilité et reproduc- tibilité des dosages ELISA réalisés avec les disques selon l'invention, que lors des dosages RAST effectués avec les mêmes disques. Par le procédé selon l'invention, on a p également fixer sur un support cellulosique, constitué notamment par des disques de papier, l'anticorps dirigé contre les immunoglobulines à doser dans le sérum et utiliser les disques obtenus pour déterminer ces immunoglobulines par la méthode "sandwich", en particulier, par enzymo-immunologie, avec une sensibilité et une reproductibilité de dosage au moins égale à celle qu'on obtient en utilisant des disques activés au bromure de cyanogène. Les supports cellulosiques activés et couplés selon l'invention avec un antigène ou un anticorps peuvent donc être utilisés avec succès aussi bien pour les dosages radio-immunologiques que pour les dosages enzymoimmunologiques d'immunoglobulines, tout en présentant par rapport aux supports activés par la méthode connue au bromure de cyanogène, l'avantage de n'être pas toxique. SENSIBILITE DES TABLEAU I.a DISQUES BrCN-PMD MESUREE PAR LE RAST Sérum positif Concentration. d'allergène en mg 0,5 5 10 15 20 25 30 -, 1 20 25 3 A ctivité\ de lyophilisat/ml (c.p...) (. p.. _ _ _ _ ___ __ _ _ _._ _ __ _ _ _ _ __ __ _ _ _,_ __ _._ _ _ _ Moyenne sur 6 disques 3853 5116 5381 5139 5531 5564 5180 _. ___ Variation standard + 159 + 196 + 304301 - 316- 506 - 161 Pourcentage de variation 4% 4% 6% 6% 6t 97, 3% _ 6 _ 6 %g 9 % i __ oF C) tu LC C> ro -'i Co TABLEAU I.b SENSIBILITE DES DISQUES BrCN-PMD MESUREE PAR LE RAST Témoins négatifs \ Concentration d'allergène en mg ctivité de lyophilisat/ml (c.p.m.) 0,5 r r Témoin Moyenne sur 2 disques 303 300 365 346 348! 325 309 HSA + Variation standard 18 25 I 55 51 _ 37 29 29 0 t Pourcentage de variation 6% 8% 15% 157. 11%' 9% 9% i Moyenne sur 2 disques 277 303 287 296 309 264 262 Témoin I + I 2 + Sérum Variation standard! -7278 - 44 8 13 20 3 négatif Pourcentage de variation j 26 26% 15 3% 4 8% 1% Témoin Moyenne sur 2 disques 383 400 331 364 402 418 371 Variation standard -75 | 59 | 7 - 37 | 54 +0 t 13 Poretg devrainj 0733réactif 2 131 4 Pourcentage de variation j 20 15 i 2% 10% |13%/. % 4% 1- ru N o 0a TABLEAU II. a SENSIBILITE DES DISQUES METAPERIODATE-PMD MESUREE PAR LE RAST Sérum positif Concentration j Activit d'allergène en mg Q,5 5 10 15 20 25 30 de lyophilisat/ml1 (c.p.m.)I __________ _____ Moyenne sur 6 disques 4785 5990 5890 5714 6013 5720 6041 + +++ t _________. Variation standard - 862 i - 467 - 346 - 228 - 335 - 373 -144 Pourcentage de variation 18% 8% 6% 4% 6% 7% 2% b-. rN r1% Ln -'j Co CK Os TABLEAU II.b SENSIBILITE DES DISQUES METAPERIODATE-PMD MESUREE PAR LE RAST Témoins négatifs Concentration A v d'allergène en mg Activpté.) de lyophilisat/ml C_ P.ni. 0,5 Moyenne sur 2 disques NF 161 203 156 189 183 224 Témoin HSA Variation standard NF T 41 - 13 - 25 - 24 - 30 - 37 t + 0,1% Pourcentage de variation NF 25% 6% 16% 13% 16% 17% _ _ I.5 _. 6 Témoin Moyenne sur 2 disques 196 231 223 225 237 226 201 Sérum Variation standard NF 15 27 24 + 106 - 14 - 13 négatif négatif Pourcentage de variation NF 6% 12% 11% 45% 6% 67% i __ Moyenne sur 2 disques 158 165 248 191 206 203 182 Témoin, Variation standard NF t - 10 - 34 - 35 3 - 1 - 31 réactif l. Pourcentage de variation | NF 6% 14% 1 18% 1 OX 17% Ln Co rx TABLEAU III.a SENSIBILITE DES DISQUES BrCN-DACTYLE MESUREE PAR LE RAST Sérum positif Concentration d'allergène en mg 0,5 5 10 15 20 25 30 Activjté de lyophilisat/ml (c.p.m.) , (C.. Moyenne sur 6 disques 6312 7175 7346 7466 7552 7423 7561 Variation standard 306 - 464 - 212 211 269 269 306 Pourcentage de variation 5% 6% 3% 3% 4% 4% 4% _3, 4S rI' Ln rlu co 0o SENSIBILITE DES TABLEAU III.b DISQUES BrCN-DACTYLE MESUREE PAR LE RAST Témoins négzatifs | Concentration ô-. d'allergène en mg Activité. - de lyophilisat/ml !(c.p.m.) - 0,5 I 4 i ' l 4 5 Témoin Moyenne sur 2 disques 224 276 469 4 420435 502 383 HSA Variation standard I - 195 | F263 - 10 + 45 0,17 Pourcentage de variation 87% 95% 27. 11% 18% 277 |14% Témoin Moyenne sur 2 disques 361 319 422 366 384 378 515 Sérum Variation standard f - 61 ± 27 - 14 +0 + 3 + 31 - 69 négatif Pourcentage de variation 177 % 3% O% 01% 8% 13% l l Témoin oyenne sur 2 disques 451 496 443 540 496 497 445 réactif Variation standard + 1 - 110 - 66 - 25 + 39 - 33 -38 Pourcentage de variation 0% 22%. 15% 5% 8% 7% 9% . | fn M Ln Ni -'J CD 0% A= TABLEAU IV.a SENSIBILITE DES DISQUES METAPERIODATE-DACTYLE MESUREE PAR LE RAST Sérum positif Concentration d'allergène en mg 0,5 5 10 15 20 25 30 Activité de lyophilisat/ml (c.p.m.) _!.'__. '. Moyenne sur 6 disques 5433 6642 6847 6937 7608 6895 7170 Variation standard+ J+++++ Variation standard -482 439 291 178 246 402 325 Porcntg _dvraton9 7%4 3_ 3_ 6__ - i Pourcentage de variation 9% _ 4% 3% 3% 6% 5h, Pourcentage de variation 9%7% 4%. 3% 37% 67% 57 _ _ _ _ _ _ _ _ _.. __. _ . I __ o0 ru L; O0 TABLEAU IV.b SENSIBILITE DES DISQUES METAPERIODATE-DACTYLE MESUREE PAR LE RAST Témoins négatifs \ Concentration d'allergène en mg Activité de lyophilisat/ml (c.p.m.) 0,5 Témoin Moyenne sur 2 disques 242 297 325 376 419 391 398 HSA 4/_ 20_4/ 27 4/. .2, HSA Variation standard - 20 - 27 - 32,5 - 8 - 29 - 24 - 34 0,1% Pourcentage de variation 8% 9% 10% 2% 7% 6% 9% Témoin Moyenne sur 2 disques 205 291 344 404 379 407 481 Sérum Variation standard - 10 - 15 + 20 -+ 17 -81 + 24 27 ± ± +4 -+ +7 négatif Pourcentage de variation 5% 5% 6% 4% 21% 6% 6% Témoin Moyenne sur 2 disques 242 314 357 361 372 401 406 -f 2-20 -5 78 Variation standard + 2 0 - 20+38 + 35 - 79 + 4 réactif _ Pourcentage de variation 8% 6% 11% 10% 21% 1% 2% è-. -J tn co 0a CD TABLEAU V - REPRODUCTIBILITE DU COUPLAGE Activité en c.p.m. (RAST) o r4) Ln CO CO 0% \ dAllergèn C avec disques BrCN avec disques métaperiodate N' d \ Contrôle couplag PMD DCTYLE PMD DACTYLE Sérum + 4650 + 268 6571 - 234 5539 + 219 6307 + 298 1 Sérum - 194 -+ 39 281 ± 35 225 -+ 114 188 - 03 Réactif 288 - 03 330 - 03 154 - 06 193 - 24 Sérum + 4407 - 657 5511 - 637 5589 -+ 381 6220 - 348 2 Sérum - 200 59 272 + 79 143 ± 21 182 -f 09 Réactif 247 - 61 297 - 44 177 - 4 196 + 06 Sérum + 4428 - 677 5412 -+ 242 5478 -+ 273 6298 - 319 3 Sérum - 241- 27 254 + 08 181 ± 15 219 ± 04 Réactif 314 343 - 47 168 + 28 196 - 62 Sérum + 5024 -+ 861 5286 -+ 314 5304 +463 5954 ± 390 4 Sérum - 232'-+ 14 228 -+ 08 195 -+ 13 201 ± 55 Réactif 310 -+ 23 337 -15 141 - 01 207 - 44 TABLEAU VI - REPRODUCTIBILITE D'ACTIVATION Activité en c.p.m. (RAST) Al rgne Allergne Savec disques BrCN avec disques métaperiodate N0 de Contrl81e. couplage PMD DACTYLE PMDDACTYLE Sérum + 4382 +357 5679 ± 208 4351 269 5125 + 365 1 Sérum- 318 + 5 366 + 136 188 + 17 266 28 Réactif 402 - 31 425 - 27 171 ± 07 269 + 15 Sérum + 4467 + 188 5628 + 385 5066 +236 5210 + 215 2 Sérum - 286 + 8 384 +28 168 233 + 4 Réactif 351 + 30 488 - 03 180 265 + 24 Sérum + 4138 - 364 5292 + 638 4630 + 413 5326 + 73 3 Sérum- 311 + - 58 373 - 117 171 + 21 244 + 22 Réactif 497- 64 442 + 10 196 - 48 180 +31 Sérum + 4168 -+ 233 5376 + 359 4490 ± 274 5346 + 115 4 Sérum- 259 - 7 396- 11 180 + 45 214 + 23 ±4 186 4 23 41 23 Réactif 369-44 529 -38 196+ ± 41 + + 196- 23 181- 41,, %O %a REVENDICATIONS ______________ 1. Procédé de fixation d'antigènes et d'anticorps sur support insoluble de polysaccharides devant servir pour les dosages immunologiques respectivement des anticorps et des antigènes correspondants, caractérisé en ce que: - dans une première étape, le support est mis en contact avec une solution de métaperiodate de sodium 0,2 M, avec agitation à la température ambiante jusqu'à apparition de fonctions aldéhyde contrôlées sur un prélèvement par le réactif de Schiff; - dans une seconde étape, le support est, après rinçage avec un tampon carbonate 0,1 M à pH 9, couplé avec l'antigène ou l'anticorps dilué dans le même tampon, par incubation à la tempéra- ture ambiante pendant 8 à 15 heures; - dans une troisième étape, on ajoute à la solution contenant le support, du borohydrure de sodium en poudre jusqu'à une concentra- tion finale de 0,2 M; on laisse incuber 2 heures à la température ambiante, puis on rince le support d'abord avec le tampon carbonate, puis avec le tampon qui servira au dosage immunologique et on le sèche. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est constitué par de la cellulose ou des dérivés de la cellulose et en particulier des disques de papier. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'antigène fixé sur le support est un allergène tel qu'un mélange de poussières et moisissures domestiques ou un pollen. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la concentration optimale de l'allergène à coupler sur le support est de 10 à 15 mg d'allergène lyophilisé par ml de diluants. 5. Réactif pour le dosage radio ou enzymo-immunologique des immunoglobulines, caractérisé en ce qu'il comprend un support poly- saccharidique sur lequel on a fixé, par le procédé selon l'une des revendications 1 à 4, l'antigène ou l'anticorps contre lequel sont dirigés les globulines à doser.