Brevet FR2498760A1 — publié le 19820730

La présente invention concerne les déterminations immunologiques en général et en particulier la détermination inimuno- logique de l'IgM dirigée contre le virus de l'hépatite A. L'invention comporte un procédé pour améliorer la spécificité de détection de l'lgM dirigée contre le virus de l'hépatite A dans le sérum ou le plasma humain. Pendant la phase aiguë de l'infection par l'hépatite A, un anticorps du type IgM dirigé contre le virus de l'hépatite A (lgM anti-VHA) apparaît dans le sérum du patient et persiste pendant le début de la convalescence et n'est pas décelé chez les sujets normaux. Donc, la détection de l'IgM anti-\'HA constitue un diagnostic pour l'infection aiguë par l'hépatite A. La technique antérieure décrit diverses tentatives pour classer la détection d'anticorps spécifiques, par exemple les brevets des Etats-Unis d'Amérique n" 4 020 151, 4 048 298 et 3 904 367; Bradley et coll, Journal of Clinical Microbiology, mai 1977, pages 521-530; Lancent, 23 septembre 1978, page 684; Hepatitis Scientific Hemorandum, novembre 1978, page 3; et Hepatitis Scientific Memo randum, février 1979, page 2; tous ces documents indiquent des tentatives pour classer la détection d'anticorps spécifiques. La demande de brevet des Etats-Unis d'Amériqúe Serial nO 928 651 déposée le 28 juillet 1978 au nom de la demanderesse décrit en particulier une détermination immunologique de l'IgM sur phase solide en trois étapes.Dans cette dernière, on fait incuber une perle de matière plastique revetue d'anti-IgM humaine (spécifique des chaines principales ou anti- > i) successivement avec l'échantillon de sérum, le virus d'hépatite A et l'anticorps marqué dirigé contre le virus d'hépatite A. La présente invention représente un perfectionnement a cette détermination, dans lequel le support solide revetu avec l'anti-IgM humaine anti-? où l'échantillon d'essai est traite avec une solution aqueuse diluée de sérum ou plasma humain hépatite négatif ou d'une de leurs fractions contenant ï'lgG. L'invention concerne un perfectionnement dans la détection de la phase aiguë de l'infection par l'hépatite A par mesure des anti-IgM anti-virus de l'hépatite A. Ce perfectionnement consiste à diluer l'échantillon d'essai avec une solution aqueuse contenant du sérum ou du plasma hépatite-négatif ou une de leurs fractions contenant l'IgG. La demanderesse a donc découvert qu'une dilution de 100 à 200 fois de l'échantillon d'essai avec un diluant contenant environ 0,1% de sérum ou de plasma humain hépatite-nAga- tif améliore fortement la spécificité d'une détermination en phase solide comportant une détermination au moyen d'un réactif constitué d'un support solide revêtu d'anti-IgM humaine, dans laquelle on fait réagir le réactif sur support solide avec l'échantillon d'essai dilue, on le lave, on le fait réagir avec l'antigène de l'hépatite A, on lave et on fait réagir avec l'anticorps marqué anti-hépatite A, on lave et on mesure le marquage sur le support solide. Le support solide peut également être prétraité avec une solution aqueuse diluée de sérum ou de plasma humain hépatite-négatifs ou d'une de leurs fractions contenant de l'igC. Dans ce dernier mode de mise en oeuvre, on préfère le traitement par la fraction contenant l'IgG. Pour la mise en oeuvre d'un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, on prépare les réactifs suivants Perles revêtues d'anti-y On se procure de l'antisérum de chèvre anti-IgM humaine anti-u chez la société Litton Bionetics. On revet des perles de polystyrène (6 mm) pendant 2 heures avec l'antisérum dilué 1 000 fois par le tampon tris O,OlM à pH 9,0, et on les lave et on sèche à l'air. On conserve les perles à 4"C jusqu'à l'utilisation. Solution d'antigène du virus de l'hépatite A (VHA) On obtient le VHA à partir des foies de tamarins aux stades aigus de l'hépatite A. On prépare les extraits de foies et on inactive l'infectiosité virale par le formaldéhyde en solution aqueuse à environ 372 (formaline). On dilue des extraits dans le tampon au phosphate 0,014 a pH 7,0 dans le sérum normal (sTPI contenant de 1'EDTA 5mM et 0,1% d'azide de sodium pour donner le comptage convenable (coups/min) dans l'essai. 12.5I-anti-VHA On isole l'IgG par chromatographie sur DEAE-cellulose (diéthylaminoéthylcellulose) à partir de sérums convalescents ayant des titres élevés en anti-VHA. On la marque par l'iode radioactif 1251 par la méthode de Greenwood. On dilue l'anticorps iodé jusqu'à environ 5 . 106 coups/min par ml dans le STP contenant du sérum de veau, du sérum humain normal, de l'EDTA et de l'azide de sodium. Première solution diluée On dilue d'abord 200 fois chaque échantillon à essayer dans le sérum normal (chlorure de sodium à 0,9%) ou dans le sérum tamponné au phosphate (STP au phosphate de sodium 0,01M, pH 7,2 dans le sérum à 0,920). Seconde solution diluée On utilise une seconde solution pour une nouvelle dilution de l'échantillon. On place une partie aliquotede la première dilution de l'échantillon dans le sérum ou le STP dans le godet de réaction et on dilue 21 fois avec une solution consistant en : 0,1% de sérum ou plasma humain normal; 8% de sérum fétal de veau EDTA 0,005M (Bthylènediaminetétraacétate); 0,2% de "Tween-20" et 0,1% d'azide de sodium dans le sérum tanponné au pnospllate, 0,019 a pil 7,4. Préparation de témoins On prépare un témoin positif à partir de sérum en phase aiguë ou en début de convalescence prélevé sur des sujets atteints d'hépatite A. On prépare un témoin négatif de la meme manière à partir de sérums négatifs à l'anti-Vi. Mode opératoire Le mode opératoire peut être résumé de la façon suivante 1. Perle.anti- + IgM t Perle.anti-y-IgM 2. Perle.anti-y-IgM + VHA 4 PerLe.anti-p-IgM-VHA 3. Perle.anti-P-IgM-VHA + 125I-anti-VHA - > Perle.anti- -IgM-VHA-125I-anti-VHA Les essais,y compris avec les témoins positif et négatif,sont effectués selon le mode opératoire suivant 1. On ajoute 10 yl de chaque échantillon à 2 ml de sérum normal. 2. On pipette 10 ,al de chaque temoin ou échantillon dilué dans l'un des godets d'une plaque de rédaction. 3. On ajoute 200 200 l d'échantillon diluant dans chaque godet, on tapote la plaque pour mélanger. 4. On ajoute dans chaque godet une perle revêtue avec l'anticorps anti-IgM humaine. 5. On couvre la plaque et on tapote pour mélanger. On fait incuber la température ambiante pendant 2 heures. 6. On aspire le liquide,puis on lave chaque perle deux fois avec 5 ml d'eau. 7. On ajoute dans chaque godet 200 pl de solution de VHA. On couvre et on fait incuber la température ambiante pendant 18 à 22 heures. 8. On répète l'étape 6. 9. On ajoute dans chaque godet 125I anti-VHA. On couvre et on fait incuber å 450C pendant 4 heures. 10. On répète l'étape 6. 11. On transfère les perles dans des tubes de comptage et on les passe dans un compteur approprié pendant une minute. 12. On détermine le comptage moyen en coups par minute du témoin positif et du témoin négatif. On calcule le passage positif négatif ou "cut off" en ajoutant un d i x i è m e de la moyenne du témoin positif a la moyenne du témoin négatif, par exemple x PC + x NC = cut-off. 10 Un échantillon est jugé positif si ses valeurs de comptage (coups par minute) sont égales ou supérieures à la valeur de cut-off. 13. A titre de vérification des résultats de l'essai, on determine le rapport positif/négatif (P:N) en utilisant les valeurs nettes de comptage pour chaque témoin. La valeur P:N doit etre inférieure d 5,0 pour assurer un essai valable. L'effet de la dilution de l'échantillon et de la présence de plasma humain normal (PHN) sur la spécificité de 1'IgH pour l'hépatite A est indiqué dans le tableau ci-après. TABLEAU Paa de PHN dans le o,lwZ de PHN dans le diluant diluant Dilution de l'échantillon 1:50 1:200 l:SO 1:200 *S:CO +/o S:CO +/o S:CO +/o S:CO +/o IgM anti-VHA forte 6,32 + 5,88 + 6,61 + 6,44 + IgM anti-VHA faible 5,17 + 2,69 + 4,80 + 2,33 + IgG anti-VHA du patient I 1,10 + 1,03 + 0,85 o 0,54 o IgG anti-VHA du patient II 1,10 t 0,84 o 0,96 o 0,63 o S:CO est le rapport échantillon/cut-off. On peut voir d'après les patients I et II que des teneurs fortes ou élevées en IgG anti-VN peuvent donner un résultat positif faux,mais celui-ci est éliminé par dilution avec un diluant contenant 0,1 de plasma humain normal. Donc, en diluant un échantillon 50 à 500 fois par le sérum physiologique normal en présence d'une dilution d'environ 10-25 fois avec une solution à 0,1 de de sérum ou de plasma humain hépatite-négatif, on augmente le rapport de sensibilité IgM/IgG du support solide revêtu avec le réactif anti-IgM humaine.L'homme de l'art rompu à la technique des déterminations immunologiques reconnattra que l'on peut faire réagir le support solide revêtu avec l'IgM anti-humaine avec une solution aqueuse de sérum ou de plasma hépatite-négatif ou d'une de leurs fractions d'IgG avant de commencer le mode opératoire oubien oamne ci-dessus pendant le déroulement de la détermination. Généralement, de très faibles quantités seulement du sérum ou plasma hépatitenégatif s o n t nécessaires pour augmenter le rapport de sensibilité IgM/IgG du réactif. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Perfectionnement au procédé pour la détermination de l'anticorps IgM dirigé contre l'antigène du virus d'hépatite A, du type dans lequel on fait réagir un support solide revetu avec l'IgM anti-humaine avec un échantillon d'essai, on lave, on fait réagir avec l'antigène d'hépatite A, on lave, on fait réagir avec un anticorps marqué dirigé contre l'antigène d'hépatite A, on lave et on mesure la quantité d'anticorps marqué fixé sur le support solide, ledit perfectionnement étant caractérisé en ce que l'on dilue l'échantillon d'essai avec une solution aqueuse de serum ou de plasma .humain hépatite-négatif ou d'une de leurs fractions contenant 1'IgC. 2, ProcEdé pour améliorer le rapport de sensibilité IgM/IgG d'un réactif pour déceler l'IgM pour le virus d'hépatite A dans un échantillon d'essai dans lequel le réactif est un support solide revetu d'anti-IgM humaine, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met en contact le support solide revêtu d'anti-IgM humaine avec une solution aqueuse de sérum ou de plasma hépatite négatif ou d'une de leurs fractions contenant 1'IgG. 3. Réactif de détermination immunologique caractérisé en ce qu'il comprend un support solide revêtu d'anti-IgM humaine, ledit réactif étant ensuite traité avec une solution aqueuse diluée de sérum ou de plasma humain hépatite-négatif ou d'une de leurs fractions contenant 1'IgG.