Brevet FR2509860A1 — publié le 19830121

L'invention a pour objet un procédé et un appareil servant à la détermination objective et automatique du taux d'agglutination des globules rouges pendant les réactions d'immuno-agglutination effectuées avec du sang. Les réactions auxquelles on se réfère plus particulièrement ici sont celles du test de Beth-Vincent et du test de Simonin utilisées pour la détermination des groupes sanguins et du facteur rhésus. Elles sont effectuées très fréquemment et l'invention apporte à leur exécution des avantages importants au point de vue de 11 économie réalisée sur le volume des réactifs employés, du temps passé à leur mise en oeuvre, de la précision et de l'objectivité des résultats obtenus. Toutefois, bien que ces réactions soient une application typique et avantageuse de l'invention, il est entendu que celle-ci n'est pas limitée à la recherche des groupes sanguins. On peut l'employer pour toute réaction faite avec du sang et comportant l'adjonction d'un réactif susceptible de provoquer un changement de l'opacité du sang. Quand il s'agit des tests mentionnés plus haut, on les exécute actuellement selon une méthode manuelle qui consiste à ajouter à la main à une quantité de sang de l'ordre de 50/1 un volume de réactif de l'ordre de 60 souvent compris en réalité entre 50 et 100 + . On laisse le tout s'étaler librement sur une plaque de verre et on observe à l'oeil l'importance des agglutinations qui peuvent se produire; on exprime le résultat par une notation qualitative, non numérique, qui consiste souvent à utiliser le signe - pour l'absence d'agglutination ou pour un début incertain d'agglutination, et les signes + puis ++ et enfin +++ pour une agglutination plus forte allant jusqu'à l'agglutination totale. Selon le procédé de l'invention, on dépose le sang à tester sur une surface ayant un contour et une dimension déterminés, en relation avec un volume déterminé de sang augmenté du réactif, de façon à obtenir à l'intérieur du contour déterminé une épaisseur de liquide pouvant contenir à l'état libre environ 2 à 3 globules superposés, On effectue ensuite la mesure de l'affaiblissement de l'intensité lumineuse d'un rayon traversant cette couche, en un nombre élevé de points voisins sur la totalité de la surface limitée par le contour1 On affecte à l'intensité lumineuse recueillie à chaque point un coefficient d'affai blissement choisi entre l'absence d'affaiblissement et l'occultation totale et on traite les valeurs des coef ficients obtenus pour l'ensemble des points afin de parvenir à un facteur d'agglutination Par exemple, si on appelle Pi le coefficient d'affaiblissement d'un point quelconque où l'affaiblissement de l'intensité lumineuse indique une agglutination et Nv le nombre des points où l'absence d'affaiblissement indique une absence d'agglutination, le facteur d'agglutination s'exprime en pourcentage par le rapport FA% =jPi x 100, On arrive ainsi Nv à une appréciation numérique de l'agglutination qui est significative de son importance entre O et 100, en pratique entre 15 et 100. Selon un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, la mesure de l'affaiblissement de l'intensité lumineuse du rayon traversant n'est pas absolue mais relative en chaque point, en comparaison des points voisins de ce dernier. De préférence, on choisit un contour carre, on mesure l'affaiblissement de la transmission lumineuse par un balayage effectué ligne par ligne le long de lignes espacées l'une de l'autre d'une distance égale environ à une fois la dimension d'un globule rouge (10 microns) et sur un nombre de points espacés les uns des autres sur chaque ligne d'une distance égale environ au double de la dimension d'un globule rouge. Ces valeurs sont données à titre indicatif; elles ne sont pas absolues. Ellessont à multiplier par le rapport de grossissement optique éventuel. La seule condition imposée par l'invention est que le nombre des points où la mesure est effectuée soit au moins de deux pour la plus petite surface agglutinée à détecter. On donne à chaque point un coefficient d'af faiblissement choisi entre 0 (aucun affaiblissement) et 1 (opacité maximale} et on additionne. à ce coefficient celui des deux points voisins de part et d'autre sur la meme ligne et celui de chacun des trois points voisins correspondant à ces trois points sur la ligne voisine de balayage. De cette façon chaque point reçoit une valeur relative de pondération qui s'exprime par un chiffre allant de O (quand les six points considérés ont le coefficient O) à 6 (quand les six points ont le coefficient 1) -A partir de là, on considère les points par groupes et on admet comme étant un agglutinat tout ensemble d'au moins 9 points non disjoints ayant chacun une valeur relative de pondération égale ou supérieure à 2 et dont le poids total des 9 points est supérieur ou égal à 34.De cette façon, de l'ensemble des points de mesure on déduit le nombre des points qui sont considérés comme en dehors d'une agglutination et le nombre de ceux qui sont considérés comme inclus dans une zone d'agglutination. On calcule alors le facteur d'agglutination selon la valeur donnée plus haut dans laquelle, selon ce mode préféré de mise en oeuvre du procédé Pi est la somme des coefficients des points inclus dans des groupes d'agglutination. Les résultats obtenus par le procédé de l'invention tel qu'on vient de l'expliquer ont été comparés à ceux que donnent la méthode manuelle subjective classique et ont permis de traceur la courbe visible sur la figure 1. En abscisses, on a porté la notation faite à l'aide des signes -, +; ++, +++, selon l'appréciation visuelle (AV) de la méthode classique. En ordonnées, on a porté le facteur d'agglutination (FA) calculé comme dit ci-dessus. I1 est facile de constater que le procédé de l'invention rend possible une appréciation plus exacte et plus nuancée de l'agglutination.Ce résultat~est plus sûr et il est reproduit plus exactement quand on répète les mesures sur un même échantillon de sang Un autre avantage du procédé de l'invention est qu'il ne necess,,i,te qu'une quantité faible de sang et de ractif, Par exemple, pour le test de Beth.-Vincentf selon l'invention on utilise un volume de 2 microlitres d'une dilution de 2% d'hématies dans du PBS (eau physiologique) auquel il suffit d'ajouter 4 microlitres d'antisérum. Pour le test de Simonin, on emploie un volume de 2 microlitres d'une dilution 2% d'hématies dans du PBS auquel on ajoute 4 microlitres de sérum.On constate que la quantite d'échantillon du sang et de réactifs employés est environ 20 fois plus faible que pour la méthode classique. L'invention couvre aussi un appareil servant à la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus. Pour faire une détermination d'un groupe sanguin, il suffirait d'utiliser une plaque de matière transparente dans laquelle serait ménagée une case ayant le contour et la dimension voulus. Mais il est usuel, ainsi qu'on le sait, de faire la détermination d'un g-roupe sanguin en effectuant simultané quatre réactions du test de Simonin, quatre réactions inverses du test de Beth-Vincent, et une réaction supplémentaire pour le facteur Rhésus. Pour cette raison, l'invention prévoit l'emploi d'une plaque--présentant neuf cases voisines identiques.De préférence, chaque case a le contour d'un carré avec des côtés de 4 mm de long chacun et une profondeur de 2 mm avec un fond plat, Un appareil conforme à l'invention comprend un support de la plaque mise horizontalement laissant libre le passage d'un rayon lumineux à travers chaque case perpendiculairement à son plan, une source de lumière disposée d'un coté de la plaque pour envoyer un rayon lumineux à travers le contour d'une case, un détecteur sensible à l'intensité lumineuse disposée à l'opposé de la source de lumière par rapport à la plaque, un organe moteur attelé pour provoquer un déplàcement relatif pas à pas au moins dans une direction entre la plaque et le détecteur pour l'exploration d'un grand nombre de points de chaque case, des circuits électriques et électroniques transformant l'intensité lumineuse recueillie en chaque point et affichant et/ou imprimant le facteur d'agglutination relatif à chaque case, Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le détecteur est une barrette de photodiodes alignées de longueur étale à la longueur d'un côté d'une case. Une barrette de ce genre est disponible dans le commerce Pour une longueur de 4 mmt elle comprend 128 diodes ce qui permet de mesurer simultanément l'affaiblissement de la lumière à travers 128 points d'une même ligne. Dans ce cas, l'organe moteur provoque un déplacement pas à pas relatif dans une seule direction, perpendiculairement à la ligne des photodiodes. De préférence, la source de lumière et la barrette de détection sont montées sur un chariot auquel est attelé l'organe moteur et le support de la plaque est fixe, Le chariot est déplaçable le long d'une course qui permet de dégager entièrement le support de la plaque. L'appareil a une face frontale pourvue d'un verre dépoli situé en regard de l'emplacement de la plaque sur le support de plaque; de plus, une source supplémentaire de lumière est placée en-dessous de l'emplacement de la plaque à un niveau inférieur au niveau de la barrette de détection montée sur le chariot tandis qu'un miroir incliné est monté au-dessus du passage du chariot pour renvoyer sur le verre dépoli le faisceau lumineux venant de la source supplémentaire de lumière. De cette façon,quand le chariot est à une extrémité de sa course, le contenu des cases de la plaque est éclairé par la source supplémentaire de lumière et il apparait sur le verre dépoli. On donnera maintenant, uniquement a titre d'exemple, une description d'un exemple de réalisation d'un appareil conforme à l'inventionq On se reportera aux dessins annexés dans lequels : - la figure 1 est un graphique de comparaison entre le facteur d'agglutination FA calculé selon le procédé de l'invention et l'appréciation visuelle (AV) faite selon la méthode manuelle classique, - la figure 2 est une vue de côté en coupe par un plan transversal d'un appareil conforme à l'invention, - la figure 3 est un graphique montrant partiellement la tension fournie par la barrette de détection aux différents points successifs d'une ligne de balayage, - la figure 4 est un dessin agrandi de plusieurs points explorés servant à expliquer la manière d'établir leur coefficient de pondération, Un appareil selon l'invention comprend une enveloppe générale 1 avec une paroi frontale 2 ayant une ouverture centrale 3 munie a sa partie supérieure d'une bande de verre dépoli 4t A l'intérieur de cette enveloppe 1, un chariot 5 est guidé par une glissière horizontale 6 fixée à la paroi arrière 7 opposée à la paroi frontale 2. Ce chariot 5 ne repose pas sur le fond 8 de l'enveloppe 1; il comprend une paroi verticale 9 ayant une face arrière 9A tournée vers le fond 7 et une face avant 9B tournée vers l'ouverture 3. La face arrière 9A est pourvue des éléments nécessaires à son montage et à son coulissement sur la glissière horizontale 6. En plus ces éléments comprennent un écrou 8 immobilisé en rotation à travers lequel se visse une vis 11 à billes allongée parallèlement à la glissière 6 et accouplée à une extrémité à un moteur (non représenté). Ce dernier est supporté par une paroi latérale de l'enveloppe 1 et il est du type pas à pas, Il est capable de déplacer le chariot 5 soit de façon continue et constante, soit par une succession de pas nombreux de faible valeur. La face avant 9B de la paroi 9 est pourvue de trois plateaux étagés 12A, 12B, 12C, en porte à faux. Le plateau supérieur 12A supporte une source de lumière ou, de préférence, l'embout terminal 13 d'un câble optique (non représenté) provenant d'une source de lumière disposée dans l'enveloppe 1 (non visible sur la figure 2). Le plateau supérieur 12A est assez éloigné de la paroi supérieure 14 de l'enveloppe 1 pour laisser la place nécessaire au montage au-dessus de lui d'un miroir 15 incliné à 45s en face du verre dépoli 4 et en direction de ce dernier. Le plateau intermédiaire 12B est destiné à supporter une lentille ou tout moyen optique équivalent apte à donner un faisceau de lumière convenable pour l'éclairage uniforme de chacune des cases d'une plaque conforme à l'invention. Le plateau inférieur 12C est destiné à suporter un détecteur constitué dans cet exemple par une barrette de détection 16 composée de 128 photodiodes alignées 17.-Cette barrette 16 est incorporée à un circuit imprimé 16A dessiné partiellement en trait mixte. Le plateau inférieur 12C est situé à un niveau assez élevé au-dessus du fond 8 pour laisser la place à une source supplémentaire de lumière 15A disposée en-dessous du miroir incliné 15 et tournée vers lui. A la partie inférieure de l'ouverture 3 s'é~ tend à l'intérieur de l'enveloppe 1 à un niveau inférieur à celui du plateau intermédiaire 12B un support de plaque 18. La source de lumière 13, les moyens optiques portés par le plateau intermédiaire 12B et la barrette de détection 16 sont en alignement vertical et sont déplacés ensemble avec le chariot 5. Une plaque 19, en matière transparente, conforme à l'invention, comprend de préférence, pour les rai- sons données plus haut, neuf cases successives 20, à cons tour carré, ayant des côtés de 4 mm et une profondeur de 2 mm, avec un fond plat. Des moyens de support et de repérage précis 20, 21 sont prévus sur le support de plaque 18.De préférence, la plaque 19 a un prolongement latéral 22 grâce auquel elle est mise en place et retenue à sa position grâce à des moyens de fixation non représentés de façon que les cases 20 alignées se trouvent en porte à faux sur l'alignement de la source de lumière 13 et de la barrette de détection 16. Plus exactement, la largeur du chariot 5 en sens perpendiculaire au plan de la figure 2 est limitée à la valeur strictement nécessaire mais son dé placement dans cette direction se fait sur une course assez grande pour que le chariot se dégage totalement de l'espace contenu entre la source supplémentaire de lumière 15A et le miroir incliné 15, Dans ce cas, la plaque 19 mise en place se trouve de la lumière entre la source 15A et le miroir 15 et son image est renvoyée par ce dernier sur le verre dépoli 4.Des moyens optiques escamotables d'agrandissement 23 sont interposés, si on le juge utile, entre la plaque 19 et le miroir 151 Ils sont montés de préférence sur un côté du chariot 5 et se trouvent à la place voulue après le déplacement de ce chariot, On peut donc observer vis:uellement le contenu des cases 20, sur le verre 4, avant ou après l'opération de mesure que l'on décrira maintenant, Chaque case 20 est balayée ligne par ligne, par le déplacement pas à pas du chariot 5, chaque ligne étant égale à la largeur d'un côté du contour carré.Sur chaque ligne il y a 128 points de mesure correspondant chacun respectivement à l'une des 128 photodiodes de la barrette de détection 16 et on effectue la mesure sur 256 lignes para llèles, a chacun des 256 pas du chariot 5, A chaque ligne chacune des 128 photodiodes reçoit un éclairement plus ou moins affaibli en fonction de l'existence ou non d'un agglomérat sur le trajet du rayon qui la frappe, La tension émise par chaque diode dépend de l'af faiblissement de la lumière, comme le montre la figure 3. En abois ses on a porté un certain nombre des différents points successifs (Pts) d'une ligne et en ordonnées-la tension fournie -(en mV) par la diode correspondante, Quand la tension est a valeur maximale, on considère qu'il n'y a aucune agglomération au point considéré et on attribue à ce dernier la valeur de pondération 0. Quand la tension est nulle, on admet qu'il y a une occultation totale, donc une agglutination importante, et on attribue au point la valeur de pondération 1. A tout point où la tension est moins de quarante pour cent de la valeur maximale, c'està-dire à tout point où la valeur de pondération serait comprise entre 0,60 et 1, on donne en réalité la valeur 1, On donne la valeur O à tous les autres points. On a donc uniquement des points de valeur 0, qui sont représentés par un point blanc sur la figure 4, et des points de valeur 1, qui sont représentés par un point noir sur cette même figure 4. On attribue ensuite à chaque point un coefficient en tenant compte de la valeur de pondération des points voisins. Par exemple, (figure 4) sur une ligne L1 trois points successifs ont chacun la valeur 1, sur la ligne suivante L2 les trois points vois.ins correspondants ont respectivement la valeur 1, lr O; sur la ligne suivante L3, les points suivants Pg, Ph, pi ont les valeurs 0 O, 1; sur la ligne suivante 14, les points suivants Pj, PK, P1 ont les valeurs 1, 1, 1; sur la ligne suivante L5, les ponts suivants ont les valeurs 0, O, 1, etc... On obtent le coefficient du point Pb de la ligne L1 en ajoutant à sa valeur celle des deux points voisins Pa, Pc de la meme ligne et celle des trois points Pd, Pe, Pf correspondants de la ligne suivante, soit 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 0 = 5. On a de même pour Pe = 1 + 1 + 0 + O + O + 1 (de Pd à Pi) = 3; Pour Ph : O + O + 1 + 1 + 1 + 1 = 4, Si la ligne L5 est la dernière avant le bord d'une case, le coefficient de Pn est O + O + 1 (Pm'+ Pn + Po) = 1. Les coefficients vont donc de O à 6. C'est à partir de ces coefficients que l'on calcule comme indiqué plus haut le facteur d'agglutination du sang soumis à réaction dans la case observée. Le circuit imprimé 16A met en forme les signaux en vue de l'exécution de ces calculs. En particulier, chaque fois qu'un groupe de 9 a fait l'objet du calcul du coefficient, ces coefficients sont additionnés et le groupe est considéré comme faisant partie ou non d'un agglutinat comme expliqué plus haut, après quoi, pour chaque case le facteur d'agglutination est calculé. L'appareil contient aussi une imprimante (non représentée) qui émet un ticket donnant le facteur d'agglutination exprimé par un chiffre, entre O et 100, en rapport avec chaque case 20. Les circuits d'exécution de ces calculs sont connus en soi; il n'est donc pas nécessaire de les décrire. L'imprimante peut écrire directement sur le ticket le groupe sanguin et le facteur Rhésus du sang analysé. Bien entendu, quand on emploie comme détecteur des photodiodes, il est préférable d'émettre par la source 13 un faisceau à la longueur d'onde à laquelle Ces photodiodes sont les plus sensibles REVEND ICATIONS 1 ) Procédé de détermination objective et numérique de l'agglutination des hématies du sang au cours d'une réaction, selon leauel on mélange à une auantité déterminée de sang une quantité déterminée de réactif, caractérisé en ce qu'on dépose le sang.et le réactif sur une surface ayant un contour et une dimension déterminés de façon à obtenir à l'intérieur de ce contour une épaisseur de liquide pouvant contenir à l'état libre environ 2 à 3 globules rouges superposés, on fait traverser cette couche en un nombre élevé de points par un rayon de lumière dont on mesure l'affaiblissement en chaque point sur la totalité de la surface limitée par le contour, on affecte à chaque point un coefficient d'affaiblissement choisi entre l'affaiblissement nul et l'affaiblissement total, on traite les valeurs ainsi obtenues pour parvenir à un facteur d'agglutination global du sang sous l'effet du réactif. 20) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on distingue les points dont la valeur de pondération Pi indique une agglutination et les points dont la valeur indique une absence d'agglutination, on compte le nombre Nv de ces derniers points et on adopte comme facteur d'agglutination global le rapport FA % = EIPi x 100 Nv 30) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on pondèrellaffaiblissement de l'intensité lumineuse du rayon en chaque point d'une manière relative en tenant compte de l'affaiblissement provoqué aux points voisins du point considéré, 40) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on choisit un contour carré et on mesure l'affaiblissement par un balayage effectué ligne par ligne, ces lignes étant espacées d'une distance égale à environ une fois la dimension d'un globule rouge et les points de mesure sur chaque ligne étant espacés d'une distance égale environ au double de la dimension d'un globule rouge. 50) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on donne à chaque point un coefficient d'affaiblissement choisi entre O (aucun affaiblissement) et 1 (affaiblissement total), les points où l'affaiblissement est su périeur à 0,60 étant affectés du coefficient 1 et les autres points du coefficient 0, 6 ) Procédé selon revendication 4 caractérisé en ce que le contour carré a des côtés de 4 mm de longueur et une profondeur de 2 mmJ avec un fond plat. 70) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on utilise pour chaque réaction d'agglutination une quantité de 2 microlitres d'une dilution à 2% d'henaties dans du PBS, et une dose de 4 microlitres de réactif (sérum ou antisérum). 80) Plaque en matière transparente pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle présente dans sa surface au moins une case et de préférence neuf cases successives alignées ayant chacune un contour carré de 4 mm de côté et 2 mm de profondeur, avec un fond plat. 90) Appareil pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à l'aide d'une plaque selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend par la mesure de l'affaiblissement de la lumière une barrette de détection (16) composée de 128 photodiodes alignées (17). 100) Appareil selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'une source de lumière (13) et la barrette de détection (16) sont portés par un chariot (5) déplaçable pas à pas pour l'exploration de 256 lignes parallèles d'une case de 4 mm de côté, un support de plaque (18) étant disposé pour tenir une plaque (19) avec au moins une case (20) située sur l'alignement source de lumière (13) barrette de détection (16) pendant le déplacement pas à pas du chariot (5). 110) Appareil selon la revendication 10 caractérisé en ce que la course du chariot (5) est supérieure à la course de balayage de la ou des cases (20) de la plaque (19), une source supplémentaire (15A) de lumière, et un miroir incliné (15) sont montés en regard l'un de l'autre respectivement en-dessous et au-dessus du chariot (5) en alignement avec l'emplacement de la plaque (19) un verre dépoli (4) étant placé en face du miroir (15) pour recevoir l'image de la ou des cases (20).