Brevet FR2505359A1 — publié le 19821112

Ln fabrication de microorganismes s'effectue dans un milieu de culture incorporant des substrats nutri- tifs, dilué dans de l'eau Ce milieu de culture est ense- mencé initialement en microorganismes qui se développent ainsi en milieu quasi fermé, sauf l'apport d'agent neutra- lisant (culture dite en "batch") Ce type de fermentation, utilisé à échelle industrielle présente l'avantage de la simplicité, mais une faible efficacité, car il existe des facteurs limitants, soit dans le substrat nutritif lui- même, soit dans les agents inhibiteurs produits par les microorganismes, et dont la concentration de plus en plus élevée au cours de la fermentation a pour effet de réduire le taux de croissance des microorganismes. Pour pallier cet inconvénient, on a proposé d'assurer une fermentation en continu, c'est-à-dire d'as- surer à la fois une extraction dosée du milieu de culture simultanément à une alimentation également dosée en subs- trat nutritif, neutralisant et eau Cette façon de faire permet d'améliorer, pour un fermenteur de capacité volumi- 0 qnue donnée, la production des microorganismes, mais cela au prix d'une concentration réduite des microorganismes dans l'extrait que l'on opère sur le milieu de culture, donc avec en fait un rendement de micro-organismes subs- trat nutritif assez faible. Une autre façon de faire est de ménager ce même milieu de culture dans un fermenteur de taille nettement supérieure au volume initial dudit milieu de culture et d'ajouter de façon continue le substrat nutritif dilué dans de l'eau et l'agent neutralisant Ce type de fermen- tation (dit "feed batch"),oui permet de réduire l'effet néfaste des inhibiteurs en maintenant leur concentration à un niveau limité, présente cependant l'inconvénient mc:- jeur de nécessiter impérativement un fermenteur de capa- cité très surdimensionné, en sorte oue cette solution n' oue très rarement été retenue par l'industrie. Cn ^ glement propos d'éliminer les rgents inhibiteurs formés et ainsi d'accroi- tre les concentrations finales en microorganismes du milieu de culture, mais cette solution n'a pas été retenue par l'industrie parce que de telles membranes sont nettement trop fragiles, à la fois mécaniquement, thermiquement et chimicuement, parce que, également, leur msaîtrise opératoi- re est délicate et complexe, leur mode opératoire à volume variable peu souhaitable et le rendement en poids de micro- organismes produits relativement au substrat introduit da Lns le milieu reste faible. La technique des membranes d'ultrafiltration a permis de franchir un pas en avant dans la fermentation de produits biologiques et cela par passage forcé d'un débit recyclé dudit milieu de culture dans une cellule d'ultra- filtration, dont on peut choisir les caractéristiques de façon à assurer l'extraction du et des agents inhibiteurs, soutirés ainsi du milieu de culture avec, cependant et iné- vitablemient, une partie de substrats nutritifs, alors que les microorganismes sont maintenus dans le débit recyclé dans le milieu de culture On parvient ainsi à accroltre la concentration finale en microorganismes dans le milieu de culture, et cela dans des proportions de l'ordre de deux à trois par rapport au procédé dit en "batch" Cependant, on constate dans ce dernier procédé, même avec ses remarqua- bles qualités, une réduction très nette du taux de croissan- ce des microorganismes après un développement initial élevé. Le but, à l'origine de la présente invention, a été de re- chercher les conditions opératoires qui permettraient si possible d'accro tre encore, dans un procédé de ce type, la concentration finale en microorganismes tout en conser- vant un rendement acceptable en poids relatif de la consom- mation des substrats nutritifs. Ce résultat est atteint, selon l'invention, dans un procedé du type oh l'on effectue sur le milieu do cul- ture une opération d'ultrafiltration d'êlimin tion pr artiel- le d'un agent inhibiteur formé et cela pendant au moins une partie de la phase de développement des dits microorg - nismes, du genre o l'on assure un taux de croissance des microorganismes dudit milieu de culture qui pr 4 sente, d' ns une première phase initiale de développement, une valeur élevée et dans une phase successive une valeur constante plus modérée, par la combinaison des mesures suivantes: O 10 a) pendant toute la durée de la phase de fabrication, on régule l'apport en agent neutralisant pour maintenir le PH du milieu de culture à une valeur strictement constante, comprise entre 5,5 et 7,5; b) on règle les apports en substrat et en eau par rapport à l'apport préréglé selon a) en agent neutralisant et cela, par détermination de la concentration en agent inhibiteur résultant de l'action dudit agent neutrali- sant; c) on assure un taux de croissance modéré compris entre O,1 C et 0, 50; d) le début de la phase à taux de croissance plus modéré est déterminé par l'obtention d'une concentration cri- tique dans le milieu de culture de l'agent inhibiteur, cui correspond à une concentration maximale admissible pour ledit taux de croissance modéré choisi; e) on asservit au moins la phase essentielle de l'opération d'ultrafiltration au maintien d'un volume constant du- dit milieu deculture. Chacune de ces conditions concourt au résultat escompté: le réglage à valeur strictement constante du PH{ par un agent neutralisant a pour effet de permettre de doser très exactement les apports en substrat et en eau. Puisqu'on fait appel à un maintien précis du PH, on peut très simplement piloter le déroulement de la fermentation j 5 par la connaissance de la concentration en agent inhibi- teur et, puisqu'il existe une corrélation entre cette con- centration en agent inhibiteur et le taux de croissance, on peut ainsi très aisément, par ce moyen, modifier, après une phase initiale, les conditions d'alimentation en eau, et-éventuellemnent en substrat, pour assurer un taux de croissance quelque peu plus modéré, qui pourra 8 tre mainte- nu, tout au long du processus de fermentation, tandis cue la capacité d'ultrafiltration à mettre en oeuvre pour maintenir un volume constant est elle-même étroitement dé- pendante du taux de croissance retenu En effet, on com- prend qu'à taux de croissance plus élevé correspond une concentration en agent inhibiteur plus faible, donc à une plus grande capacité d'ultrafiltration C'est un des méri- tes de l'invention de proposer, pour la seconde phase de développement, des taux de croissance qui peuvent s'éten- dre de 0,10 à 0,50 mais qui, de façon avantageuse, sont compris entre 0,15 et 0,45, et encore plus avantageuse en- tre 0,20 et 0,40 On a pu même établir, pour certaines ap- plications, que la valeur optimale du':taux de croissance plus modéré se situe entre 0,30 et 0,35 Ainsi qu'il a été précisé, à chaque taux de croissance retenu et pour chaque microorganisme cultivé correspond une valeur maximale cri- tique de la concentration en agent inhibiteur et c'est pré- cis 6 ment lorsque cette valeur maximale critique est attein- te que l'on procède aux adaptations à la phase successive de développement à taux de croissance plus modéré. Selon une particularité essentielle de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, les débits de subs- trats et d'eau sont maintenus à des rapports constants relativement au débit d'agent neutralisant pendant toute la phase de développement initial à taux de croissance éle- vé et, dans d'autres rapports, pendant toute la phase suc- cessive de développement à taux de croissance plus modéré, pendant laquelle le débit relatif d'eau est rendu plus élevé, d'autant plus élevé que la concentration maximale admissible en agent inhibiteur est choisie plus faible. 2505359 Cette façon de faire qui consiste à faire dépendre par une liaison opérationnelle constante et optimalisée les débits d'alimentation a pour résultat une dépense minimale en sub- strat et une adéquation aussi parfaite cue possible des be- soins nutritifs des microorganismes à la croissance que l'on décide de leur imprimer Bien cue les adaptations de la phase initiale à la phase successive puisse paraître de faible envergure, sans de telles adaptations, le succès re- latif au rendement en poids substrat-microorganismes ne pourrait être atteint. L'invention vise, entre autres, l'application à la fabrication de bactéries lactiques, du genre o l'on alimente un milieu de culture, préalablement ensemencé, en substrat nutritif comportant avantageusement du lactose et de l'extrait de levure, et en ammoniaoue (ou soude) formant agent neutralisant, le tout dilué dans de l'eau et o l'on effectue sur ledit milieu de culture une opération d'élimi- nation partielle de lactate d'ammonium (ou de sodium) et cela pendant au moins une partie de la phase de développe- ment des dites bactéries lactiques, du genre o l'on assure un taux de croissance des bectéries dudit milieu de culture qui présente, dans une première phase initiale de développe- ment, une valeur élevée et dans une phase successive une valeur constante plus modérée, et dans cette application, l'invention prévoit la combinaison des mesures opératoires suivantes: a) pendant toute la durée de fabrication, on régule l'apport en ammoniaque (ou soude) pour maintenir le PH du milieu de culture à une valeur strictement constante, comprise entre 6 et 7; b) on règle les apports en substrat et en eau par rapport à l'apport préréglé selon a) en ammonia-ue (ou soude), et cela par détermination de la concentration en lactate d'ammonium (ou sodium) résultant de l'action de I'ammo- niaoue (ou soude) sur l'acide lactique formé lors de la dégradation du lactose; c) le début de la phase à taux de croissance plus modéré est déterminé par l'obtention d'une concentration cri- tique, dans le milieu de culture, du lactate d'ammonium (ou sodium), la concentration critique en lactate d'am- monium étant comprise entre 19 g/1 pour un taux de crois- sance de 0,50 et 54 g/1 pour un taux de croissance de 0,10; d) on asservit au moins la phase essentielle de l'opéra- tion d'ultrafiltration au maintien d'un volume constant dudit milieu de culture. Comme on le constate, il s'agit ici d'une adapta- tion du procédé précédemment décrit à une fabrication se- lon des modalités particulières exclusivement destinée aux bactéries lactiques Comme précédemment, ce qui est déci- sif, c'est la détermination préalable du taux de croissance de la seconde phase de développement (permettant d'obtenir une fermentation complète dans un laps de temps déterminé) et à ce taux de croissance correspond une concentration ma- ximale critique en lactate d'ammonium (ou sodium) qui, d'ailleurs est différente d'une bactérie à l'autre Ainsi on a pu établir en faisant des tests sur un très grand nom- bre de souches que les concentrations critiques en lactate d'ammonium s'établissent entre environ 19 g/1 (taux de crois- sance 0,50) et environ 54 g/1 (taux de croissance 0,10) et plus généralement entre 25 g/1 et 35 g/1 Une approche essen- tielle du procédé selon l'invention est donc la détermina- tion préalable de la concentration critique en agent inhi- biteur associé au taux de croissance retenu. L'invention a également pour objet une installa- tion de fabrication de microorganismes qui sera détaillée ultérieurement. Les caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront d'ailleurs de la description qui suit, en ré- férence auxdessins annexés parmi lesquels: la figure 1 est une vue schématique d'une installation de fabrication de bactéries lactiques selon l'invention; les figures 2 à 5 sont des diagrammes de détermination du taux de croissance. En se référant aux dessins, un fermenteur 1 eeou- pé d'un moyen de brassage 2 est alimenté à son extrémité supérieure 3 d'une part en substrat nutritif (lactose et levure) provenant d'un réservoir 4 au moyen d'une conduite équipée d'une pompe 6 et d'un débitmbtre-totalisateur 7, d'autre part en ammoniaque de neutralisation par une con- duite 8 équipée d'une pompe 9 et d'un débitmètre-totalisa- teur 10, enfin en eau stérile par une conduite ll équipée d'une pompe 12 et d'un débitmètre-totalisateur 13 Le fer- menteur estégalement équipé d'une conduite de soutirage 20, incorporant une pompe 21, aboutissant à une cellule d'ultrafiltration 22 à membrane 23 La sortie, c 8 té amont de la membrane 23, de la cellule d'ultrafiltration 22 est raccordée par une conduite 24 incorporant un échangeur de chaleur 25 au fermenteur 1 Un appareil 30 de mesure de Pf a une sonde 31 engagée dans une partie basse du fermenteur 1 et transmet un signal de mesure de PH à un régulateur 32. A partir de cette information, le régulateur 32 assure es- sentiellement via une ligne de commande 34 le réglage ap- proprié-du débit de la pompe d'ammoniaque 9, ou de son temps de fonctionnement, de façon à maintenir le PH à une valeur constante fixée de façon prédéterminée et oui peut être réglé en fonction du type de bactérie en cours de f C- brication Le régulateur 32 agit-également pur une ligne de commande 35 sur le débit ou la durée de fonctionnement de la pompe de substrat 6 et, via une:ligne de commande 36, sur le débit ou la durée de fonctionnement de la pompe d'eau de dilution 12. La cellule d'ultrafiltration 22 présente de frçon habituelle une sortie côté filtrat raccordée à l'évacuation par une conduite 40 incorporant une vanne de régl 2 ge 41 8 2505359 oui, elle-même, est asservie via une ligne de commande 42 Vu régulateur 32, oui reçoit à cet effet des informations, vin une ligne de mesure 43, d'indicateurs de niveaux mini- mal 44, moyen 45 et maximal 46 En fait, l'indicateur de niveau moyen 45 présente deux sondes distinctes 45 a, 45 b, de façon à pouvoir assurer le maintien d'un niveau cons- tant ainsi qu'il sera dataillé dans ce qui suit: Le fonctionnement de l'installation qui vient d'être décrite est le suivant: Au début d'une opération de fabrication de micro- organismes, on introduit dans le fermenteur 1 un volume de substrat de façon à ce que celui-ci atteigne à peu près le niveau de l'indicateur de niveau 45 On ensemence ce milieu de culture avec une bactérie lactique, on assure par des moyens appropriés une température de l'ordre de 300 C du mi- lieu de culture et l'on maintient une atmosphère surplom- bant le milieu de culture avec de l'azote à 0,5 bar, et on met en oeuvre le moyen de brassage 2 Du substrat nutritif incorporant essentiellement, dans le réservoir 4, du lac- tose à une concentration (Lo) et de la levure à une concen- tration (Bo) est délivrée par la pompe 6 dans la canalisa- tion 5 à un débit (D 1) (totalisaltion T 1), tandis que de l'ammoniaque à une concentration (No) est délivrée dans la canalisation 8 à un débit (D 2) (totalisation T 2) tandis que de l'eau stérile est délivrée dans la canalisation 11 à un-débit (D 3) (totalisation T 3). Pendant cette première phase, d'une part la con- centration de substrat dans le fermenteur a été choisie à une valeur relativement élevée (lactose 45 g/1, extrait de levure 15 g/l) et pendant une première phase initiale de développement les concentrations en lactose (Ll), levure (El) et ammoniaque (Nl) pénétrant à l'extrémité ( 3) dans le fermenteur 1 sont maintenus par exemple à 40 g/1 pour (L 1), 13,3 g/l pour (El) et 12 N pour (Nl) On notera que ces concentrations peuvent être aisément déterminées à partir du pupitre de contrôle ( 50), qui recueille les in- dications des débitmètres-totalisateurs 7,10 et 13. Pendant toute cette phase opératoire, il impor- te, pour un bon déroulement du procédé, de contrôler régu- lièrement le taux de croissance qui doit être aussi élevé que possible. Ce taux de croissance dans la phase exponentielle o l'on se situe pendant toute la durée du procédé de fa- brication est représenté par la constante d'accroissement logarithmicuede la masse biologique en cours de développe- ment en fonction du temps, selon la formule connue X = XO ef t (oi/4, est le taux de croissance) et l'on dé- montre d'ailleurs, dans le cas de l'exemple choisi, que le lactate d'ammonium oui se forme par la combinaison de l'acide lactique(résultant de la consommation du lactose) et de l'ammoniaque introduit est relié auitaux de crois- sance par la relation: Lgn /t + const, et l'on note que, la détermination de la concentration en lactate d'ammonium étant directement proportionnelle à l'admission d'ammoniaque (avec un milieu de culture à PH constant), il suffit de noter la variation du débit d'ammoniaque pour déterminer le taux de croissance en fonction du temps: t/= Lg d/ t. On conçoit donc qu'on peut suivre à chaque ins- tant et, le cas échéant, par la voie de tracé graphique igné =r t + const, la variation éventuelle du taux de croissance, représenté par la penite de la courbe ainsi tracée, et que par des corrections appropriées, on peut au contraire maintenir constant ce taux de croissance à une valeur prédéterminée par un réglage correctif des ap- ports en substrat et en eau par rapport à l'apport de neu- tralisant. Pendant toute une première phase opérationnelle, la pompe 21 du circuit d'ultrafiltration est hors de fonc- tionnement etle niveau du milieu de culture s'élève pro- 2505359 gressivement depuis le niveau indiqué par l'indicateur 45 jusqu'au niveau indiqué par l'indicateur 46 (volume maximal). Ce n'est que lorsque ce niveau 46 est atteint que le régula- teur 32 met en oeuvre, via la ligne de commande 42, l'ouver- ture régulée de la vanne 41, ce qui permet à l'ultrafiltrat d'être évacué et de commencer réellement l'opération d'ul- trafiltration. Ainsi, de façon connue en soi, les-agents inhibi- teurs tels que le lactate d'ammonium sont éliminés à tra- l O vers la membrane d'ultrafiltration 23, alors qu'au contrai- re les bactéries lactiques sont recyclées via la canalisa- tion 24 vers le fermenteur 1 Le niveau du milieu de cul- ture est réduit rapidement jusqu'à atteindre le niveau in- termédiaire contr 8 lé par l'indicateur 45 et une fois ce ni- veau atteint, le régulateur 32 est programmé pour que la vanne 41 se ferme quelque peu de façon à assurer un niveau quasi constant grâce aux deux sondes de niveau intermédiaire établi à faible distance 45 a et 45 b. Un contr 81 e des opérations, pendant toute cette période, est assuré, notamment du taux de croissance qui, comme on l'a vu, est déterminé par les variations logarith- miques dans le temps de la concentration du lactate d'ammo- nium dans le fermenteur Une fois qu'une concentration maxi- malee-,en lactate, qui a été initialement prédéterminée, est atteinte, qui correspond pour la bactérie cultivée à un taux de croissancedonné, on-fait en sorte que cette concentra- tion en lactate d'ammonium soit maintenue constante, ce qui a donc pour effet de maintenir constant le taux de croissan- ce des bactéries A cet effet, dès que cette valeur maximale de la concentration en lactate d'ammonium est atteinte, on augmente quelque peu le débit d'eau fournie par la pompe 12, de façon à introduire dans le fermenteur des quantités d'ammoniaaue qui correspondent très exactement au maintien constant de la concentration en lactate d'ammonium On peut aisément déterminer le débit (D 3) de la pompe 12 pour que la concentration en ammoniaque introduit soit celle oui correspond à la concentration, dans le fermenteur, en lic- tate d'ammonium, ce oui assure ainsi son maintien. On peut ainsi être assuré de maintenir à un ni- veau strictement constant le taux de croissance, le cas échéant par un réglage complémentaire d'ajustement de l'ap- port en substrat, le tout en maintenant le PH constant. Il y a lieu de noter que la mise en oeuvre de la phase d'ul. trafiltration est asservie à l'obtention par le milieu de culture du niveau repéré par l'indicateur de niveau 46, de sorte cue l'intervention de l'ultrafiltration, selon le cas peut précéder ou suivre la modification des conditions d'a- limentation qui découlent de la fixation à un niveau plus modéré du taux de croissance des bactéries lactiques. A titre d'exemple de mise en oeuvre, on donne ci-dessous, pour certaines bactéries lactiques, les concen- tration critiques en lactate d'ammonium pour un taux de croissance de 0, 35 avec l'indication ( 1) ou ( 2) signifiant Pour ( 1): bactéries disponibles au "Centre National de Re- cherches de Zootechniques" de Jouy-en-Josas (F Pance); Pour ( 2): bactéries disponibles à la "National Collection of Dairy Organisms" de Reading (Angleterre) et: S.L signifiant "streptococcus lactis" S C signifiant "streptococcus cremoris" S.D signifiant "streptococcus diacetyl lactis" ll 12 2505359 TYPE DE BACTERIE CONENTRATION CRITIQUE (P"= 0),35) S Ij 38 SL 57 3 L 6 SL ili SL 121 r 55 S Cr, 82 r 4 e 89 Sae 35 se T 42 SD 2 31 D 10 ( 1) ( 2) ( 1) ( 2) ( 2) ( 1) ( 2) ( 2) ( 1) ( 2) ( 2) ( 2) ( 1) ( 1) (lact-,te d'ammoniumi) *.* * * * 26 g/i * * 4* ** 00 * * * * 38 g/i * * ** * *** 26 g/i * 66 a* * a *009000* ** *** * O a o* *e & e0090ee* e e eO e O Oe e Oa eee O * *ee Oa000 a O a e *eee e e a a*e e e a e e *. * e * e e * * * aee e a a * e * e e e e O a 0000e 00 ee*e* e00 23 g/i 1 21 g/i 26 g/i g/i 21 g/i 28 g/i 38 g/i 28 g/i 32 g/1 Généralement, on est parti de substrats dans le réservoir 4 aux plus fortes concentrations possibles, de l'ordre de: (Lo) = 240 g/i (lactose) (Bo) = 80 g/i et surtout le taux de lactate à chaque instant, avec la re- lation: T 2 'No 107,11 (lactate) = VO + T 1 + T 2 + T 3 o Ti 1 voliume substrat totalisé T 2 = volume Ammoniaque totalisé T=volume eau totalisé, Vo ='Volume initiai dans le f'ermenteur 107,11 = Poids mol 6 culaire de l'ammoniaque. et le passage de la première phase initiale à taux de crois- sance élevé à la seconde phase à taux de croissance plus modéré, s'effectue simplement en accroissant le débit d'eau D 3 de façon à adapter la concentration en ammonicaque entrant à la concentration en lactate d'ammonium dans le fermenteur, impliquant la déitermination mathématique sui- * vante: vante: (No) x 107,11 x D 2 D 3 = _ (D 1 + u 2) (lactate) et le cas échéant, à ce moment, on modifie quelque peu l'apport en substrat suivant la modération du taux de crois- sance. On procède maintenant à un rapide examen des fi- gures 2 à 5 oui sont des diagrammes montrant le taux de croissance en fonction du temps: A la figure 2, concernant la souche SL 38, on note un taux de croissance élevé de l'ordre de 0,77 pendant les trois premières heures Après 5 H 30 mn le taux de lac- tate a atteint 30 g/l, et à partir de ce moment, on a modi- fié l'alimentation en eau, en l'accroissant d'environ 50 %, ce qui a eu pour effet de réduire la concentration en ammo- niaque assurant ainsi une introduction d'ammoniaque dans le fermnenteur apte à maintenir cette concentration de 30 g/l qui correspond à un taux de croissance de 0,3 V de cinq heu- res trente à huit heures On note que l'ultrafiltration est mise en oeuvre à peu près après quatre heures En fin de fer- mentation la concentration bactérienne obtenue est de 32 g de bactéries sèches par kg de culture Le rendement en sub- strats est de 7,5 kg de lactose par kg de bactéries sèches. A la figure 3, concernant la souche S Cr 1, on note un taux de croissance élevé de l'ordre de 0,71 par heure pendant les quatre premières heures Après cinq heu- res, le taux de lactate a atteint 24 g/l, et à partir de ce-moment, on a modifié l'alimentation en eau, en l'ac- croissant de 98 %, ce qui a eu pour effet de réduire 11 concentration en ammoniaque assurant ainsi une introduction d'ammoniaque dans le fermenteur apte à maintenir cette con- centration de 24 g/il qui correspond à un taux de croissance de 0,30 par heure de 5 heures à 9 heures On note que l'ultrafiltrution est mise en oeuvre un peu avant Y 5 heures. le débit substrat a été augmenté de 7 Sa avant la 7 ème heu- re En fin de fermentation la concentration bactérienne est de 2 U g de bactéries sèches par kilo de culture Le rendement en substrat est de 8,4 kg de lactose par kg de bactéries sèches. A la figure 4, concernant la souche S Cr 35, on note un taux de croissance élevé de l'ordre de 0,70 pendant les 4 premières heures A la sixième heure, le taux de lac- tate a atteint 28 gil, à partir de ce moment, on a modifié l'alimentation en eau, en l'accroissant de 66 %, ce qui a eu pour effet de réduire la concentration en ammoniaque as- surant ainsi une introduction d'ammoniaque dans le fermen- teur apte à maintenir cette concentration de 28 g/l qui correspond à un taux de croissance de 0,32 de la 6 ème heure à la Ilème heure On note que l'ultrafiltration est mise en oeuvre vers 7 heures En fin de fermentation, la concentration bactérienne est de 26 g de bactéries sèches par kg de culture Le rendement en substrats est de 9,2 kg de lactose par kg de bactéries sèches. A la figure 5, concernant la souche SD 10, on note un taux de croissance élevé de l'ordre de 0,80 pendant les 5 premières heures un peu avant la Sème heure, le taux de lactate a atteint 32 g 1 l, et à partir de ce moment, on a modifié l'alimentation en eau, en l'accroissant d'environ 42 % ce qui a eu-pour effet de réduire la concentration en ammoniaque, assurant ainsi une introduction d'ammoniaque delns le fermenteur apte à maintenir cette concentration de 32 g/l qui correspond à un taux de croissance de 0,26 de la 8 ème heure à la 12 ème heure Un note que l'ultrafiltration est mise en oeuvre avant la 7 ème heure En fin de fermenta- tion la concentration bactérienne est de 18 g de bactéries i) sèches par kg de culture Le rendement en substrats est de -15 2505359 7,9 kg de lactose par kg de bactéries sèches. L'invention s'applique à la fabrication de micro- organismes et plus particulièrement de bactéries lactiques quelles que soient leur utilisation: industrie fromagère, industrie vinicole, etc 1.6 2505359 REVENDICATIONS 1 Procédé de fabrication de microorganismes, du genre o' on alimente un milieu de culture, préalable- ment ensemencé, en substrat nutritif, en agent neutralisant, le tout dilué dans de l'eau et o l'on effectue sur ledit milieu de culture une opération d'ultrafiltration d'élimi- nation partielle d'un agent inhibiteur formé et cela pendant au moins une partie de la phase de développement des dits microorganismes, du genre o l'on assure un taux de crois- sance des microorganismes dudit milieu de culture qui pré- sente, dans une première phase initiale de développement, une valeur élevée et dans une phase successive une valeur constante plus modérée, caractérisé par la combinaison des mesures suivantes: a) pendant toute la durée de la phase de fabrication, on ré- gule l'apport en agentneutralisant pour maintenir le PH du milieu de culture à une valeur strictement constante, comprise entre 5,5 et 7,5; b) on règle les apports en substrat et en eau par rapport à l'apport préréglé selon a) en agent neutralisant et cela, par détermination de la concentration en agent inhibiteur résultant de l'action dudit agent neutralisant; c) dans le milieu de culture de l'agent inhibiteur qui cor- respond à une concentration maximale admissible pour le- dit taux de croissance modéré choisi; e) on asservit au moins la phase essentielle de l'opération d'ultrafiltration au maintien d'un volume constant dudit milieu de culture. 2 Procédé de fabrication selon la revendication 1, caractérisé en ce que le taux de croissance plus modéré est compris entre 0,15 et 0,45. 3 Procédé de fabrication selon la revendica- tion 2, caractérisé en ce que le taux de croissance plus modéré est compris entre 0,20 et 0,40. 4 Procédé de fabrication selon la revendica- tion 3, caractérisé en ce que le taux de croissance plus modéré est compris entre 0,30 et 0,35. Procédé de fabrication de microorganismes selon l'une quelconaue des revendications 1 à 5, caracté- risé en ce que les débits de substrat et d'eau sont mainte- nus à des valeurs constantes relativement au débit d'agent neutralisant pendant toute la phase de développement initial à taux de croissance élevé et, dans d'autres rapports, pen- dant toute la phase successive de développement à taux de croissance plus modéré, pendant laquelle le débit relatif d'eau est rendu plus élevé, d'autant plus élevé que la con- centration maximale admissible en agent inhibiteur est choi- si plus faible. 6 Procédé de fabrication-selon la revendicatinn l, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre, avant l'opération d'ultrafiltration, une phase préliminaire de développement du milieu de culture à volume croissant à partir d'un volume initial et cela, jusqu'à atteindre le volume maximal, après quoi on met en oeuvre l'opération d'ultrafiltration. { Procédé de fabrication selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase d'ultrafiltration provoque d'abord une réduction du volume du milieu de culture, puis un maintien à une valeur moyenne constante dudit volume du milieu de culture ainsi réduit. 8 Procédé de fabrication selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'opération d'ultrafiltration une fois terminée, on poursuit l'alimentation du milieu de cul- ture jusqu'à un niveau pouvant correspondre au volume maximal. 9 Procédé de fabrication de bactéries lacticue E -du genre o> l'on Alimente un milieu de culture, préalablemer 1 & 2505359 ensemence, en substrat nutritif comportunt avantageusement du lactose et de la levure, et en ammoniaaue ou soude for- mant agent neutralisant, le tout dilué dans de l'eau et o l'on effectue sur ledit milieu de culture une opération d'ultrafiltration d'élimination partielle de lactate d'am- monium (ou sodium) et cela pendant au-moins une partie de la phase de développement des dites bactéries lactiques, du genre o l'on assure un taux de croissance des b dudit milieu de culture qui présente, dans une/phase ini- tiale de développement, une valeur élevée et dans une phase successive une valeur constante plus modérée, caractérisé par la combinaison des mesures suivantes: a) pendant toute la durée de fabrication, on régule l'apport en ammoniaque (ou soude) pour maintenir le Pi S du milieu de culture à une valeur strictement constantecomprise entre 6 et 7. b) on règle les apports en substrat et en eau par rapport à l'apport préréglé selon a) en ammoniaque (ou soude) et cela par détermination de la concentration en lactate d'ammonium (ou sodium) résultant de l'action de l'ammo- niaque (ou soude) sur l'acide lactique formé lors de la dégradation du lactose. c) le début de la phase à taux de croissance plus modéré est déterminé par l'obtention d'une concentration criti- que, dans le milieu de culture, du lactate d'ammonium(ou sodium), la concentration critique en lactate d'ammonium étant comprise entre 19 g/l pour un taux de croissance de 0,50 et 54 g/l pour un taux de croissance de 0,10. d) on asservit au moins la phase essentielle de l'opération d'ultrafiltration au maintien d'un volume constant dudit milieu de culture. Procédé de fabrication selon la revendica- tion 9, caractérisé en ce que, pendant la phase de dévelop- pement à tauxde croissance plus modéré, la concentration dans le milieu de culture en lactose est comprise entre 19 2505359 g/1 (pour un taux de croissanoe de 0,10) et 18 g/l (pour un taux de croissance de 0,50), la concentration en extrait de levure est comprise entre 8 g/l (pour un taux de croissance de 0,10) et 18 g/1 (pour un taux de croissance de 0,50), la concentration en ammoniaque étant comprise alors entre 0,50 N (pour un taux de croissance de 0,10) et 0,18 N (pour un taux de croissance de 0,50).