Brevet FR2502785A1 — publié le 19821001

La présente invention concerne un procédé pour la détection d'un acide désoxyribonucléique viral dont on soupçonne la présence dans un liquide biologique acellulaire. Plus particulièrement l'invention concerne la détection d'un acide désoxyribonucléique viral (appelé parfois ci-après "ADN") dont on soupçonne la présence dans un liquide biologique acellulaire tel que le sérum humain, le liquide céphalo- rachidien et similaires. Les procédés ou protocoles pour la détection et la détermination quantitative de séquences spécifiques d'acides nucléiques comprenant une purification, une dénaturation et simi- laires d'un acide nucléique sont bien connus dans le domaine de la recherche en biologie moléculaire. De nombreux travaux dans le domaine de la renaturation thermique de l'ADN ont été effectués par Marmur et Doty, (1961) J. Mol. Biol. 3, 585 avec des comparai- sons entre l'ADN et l'ADN renaturé qui montrent la reproductibilité de la transition hélice-spirale et la reformation de la même structure secondaire. Une technique d'immobilisation d'ADN dénaturé à un substrat solide tel qu'un filtre de nitrocellulose puis la renatura- tion ou l'hybridation avec un ARN complémentaire a été publiée par Gillespie et Siegelman (1965), J. Mol. Biol. 12, 829. Cette technique a été de plus modifiée et élargie par Denhardt, (1966) Biochemical and Biophysical Research Communications 23, n0 5, 641, pour détecter des séquences d'ADN dénaturé complémentaires par l'emploi d'une sonde constituée d'ADN marqué. Un procédé de détection de l'ADN du virus Epstein-Barr dans des lignées cellulaires lymphotdes est décrit par Braudsma et Miller, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Un procédé clinique, dont on dispose pour déterminer l'infectivité d'un sérum humain dans lequel on soupçonne la présence du virus de l'hépatite B, nécessite actuellement l'inoculation in vivo du sérum humain suspect à un chimpanzé, bien que l'on dispose de nombreuses techniques pour détecter les produits d'un tel acide désoxyribonucléique viral suspecté. L'emploi des chimpanzés est coûteux et long tandis que la détection des produits est indirecte. La détection d'autres agents pathogènes pose des problèmes sem- blables de coût, de manque de fiabilité, de nécessité d'effectuer un prélèvement d'échantillon par voie sanglante et similaires. L'invention a pour objets: un nouveau procédé pour la détection d'un ADN viral dans un liquide biologique acellulaire, tel que le sérum humain, le liquide céphalo-rachidien ou similaires; un procédé efficace pour la détection d'un ADN viral dans un liquide biologique acellulaire, tel que le sérum humain, le liquide céphalo-rachidien ou similaires évitant l'emploi clinique d'un mammifère de laboratoire; un nouveau procédé pour la détection d'un ADN viral dans un liquide biologique acellulaire, tel que le sérum humain, le liquide céphalo-rachidien ou similaires, de façon plus économique et fiable que les procédés connus; un nouveau procédé pour la détection d'un ADN viral dans un liquide biologique acellulaire, tel que le sérum humain, le liquide céphalo-rachidien humain ou similaires, permettant une détermination très rapide; et un nouveau procédé pour la détection d'un ADN viral dans un liquide biologique acellulaire tel que le sérum humain, le liquide céphalo-rachidien ou similaires rendant inutile la culture in vivo ou in vitro de l'agent pathogène. Selon l'invention on traite un liquide biologique acellulaire, tel que du sérum humain, pour immobiliser sous une forme dénaturée les acides désoxyribonucléiques, y compris l'acide désoxyribonucléique viral soupçonné, sur un support ou substrat solideset on met le support ou substrat solides en contact avec un ADN viral dénaturé à marquage radioisotopique pour permettre à l'ADN à marquage radio-isotopique de renaturer tout ADN viral soupçonné immobilisé. Ces stades sont suivis d'une analyse pour détecter l'ADN viral renaturé soupçonné à marquage radio-isotopique. L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée. On mélange un échantillon d'un liquide biologique acellulaire, tel que du sérum humain, du liquide céphalo-rachidien, de l'urine ou similaires que l'on pense contenir un virus ADN, tel que le virus de l'hépatite B. le virus de l'herpès Type 1, le virus de l'herpès Type 2, un virus cytomégalique, le virus Epstein- Barr, une bactérie ou similaires, avec un détergent, tel que le dodécylsulfate de sodium et une enzyme protéolytique, telle que la Proteinase K (Boeringer, Mannheim) dans un milieu aqueux. On maintient le mélange à une température comprise dans la gamme de à 80C, de préférence à environ 700C, pendant une durée de 1 à 10 heures, de préférence pendant environ 2 heures, pour faci- liter la désintégration des particules virales et assurer ainsi des rendements élevés en ADN. On extrait la solution obtenue avec des solvants organiques, tels que le phénol et le chloroforme, pour extraire dans une phase organique la majeure partie des pro- téines et obtenir une phase aqueuse contenant pratiquement la totalité de l'ADN. On ajoute à la phase aqueuse une base, telle que l'hydroxyde de sodium, par exemple une solution d'hydroxyde de sodium 1,0 M, pour obtenir un pH compris dans la gamme de 10 à 12, de pré- férence d'environ 11,5 pour effectuer la dénaturation des ADN. On porte ensuite la solution à un pH neutre par addition d'un acide, tel que l'acide chlorhydrique, et d'un tampon, tel que le tris- hydroxyaminométhane, afin de rétablir un pH d'environ 7,0. Après obtention d'un pH neutre, on élève la concentration saline de la phase aqueuse par incorporation d'une concentration élevée d'un sel, tel que le chlorure de sodium, afin d'accroltre la fixation des ADN dénaturés comme expliqué plus en détail ci-après. On fait passer la solution aqueuse des ADN dénaturés, y compris l'ADN viral dénaturé soupçonné, à travers un substrat solide ou on l'applique à un substrat solide, tel qu'un filtre en nitrocellulose pur du commerce, pour immobiliser les ADN dénaturés sur le substrat solide. De façon avantageuse, on applique le mélange au substrat solide en s'aidant d'un léger vide. Après filtration, on cuit le substrat solide sous vide à une température d'environ à 1000C, de préférence de 750C, pendant une durée de 1 à 6 heures, de préférence 2 heures. On traite ensuite le substrat solide cuit pour éviter la fixation ultérieure d'un acide nucléique au substrat solide. On effectue le marquage radio-isotopique avec une activité spécifique élevée d'une certaine quantité d'ADN recombi- nant purifié contenant la séquence codant pour le génome viral soupçonné. Les radio-isotopes que l'on peut utiliser dans cette opération comprennent P 1I, I et H. On dénature l'ADN recombinant viral soupçonné à marquage radio-isotopique, et on l'applique au substrat solide contenant les ADN dénaturés immobi- lisés pendant une période prédéterminée et dans des conditions chimiques et thermiques suffisantes pour effectuer la renaturation ou l'hybridation de tout ADN viral dénaturé soupçonné, immobilisé sur le substrat solide. L'ADN recombinant dénaturé viral soupçonné, à marquage radio-isotopique (ou sonde) est amené à se fixer par des liaisons hydrogène à la séquence complémentaire de l'ADN déna- turé viral soupçonné, fixé au substrat solide. Après une-période prédéterminée, on soumet le substrat solide à une opération de lavage pour éliminer l'ADN dénaturé viral soupçonné, à marquage radio-isotopique non fixé de façon spécifique. On soumet ensuite le substrat solide à une analyse pour détecter l'ADN renaturé viral soupçonné, à marquage radio-isotopique, par exemple par spectrométrie de scintillation ou autoradiographie. Un appareil convenant à de telles techniques peut non seulement détecter l'ADN renaturé vital soupçonné, à marquage radio-isotopique, mais également évaluer quantitativement la population virale cor- respondante. L'invention est illustrée par l'exemple non limitatif suivant. Exemple Dans un tube à essai de 1,5 ml, on ajoute 1 mg de Proteinase K à 100 jil d'un mélange [100 millimoles d'acétate de sodium à pH 6,5; 27. en poids/volume de dodécylsulfate de sodium; millimoles d'acide éthylènediaminotétraacétique; 50 pg/ml d'ADN de sperme de hareng; 100 pg/ml d'ARN de transfert (provenant de levure)]. On prélève à un porteur chronique d'hépatite B. 300ul d'un échantillon de sérum que l'on introduit dans le tube à essai et on incube à 70C pendant 1 heure. On ajoute et mélange 300,pl de phénol pour former une émulsion. Ensuite on mélange 300 >1 de chloroforme et on sépare une phase organique par centrifugation. On mélange une autre portion de 300 ul de chloroforme à la phase minérale et, après centrifugation, on introduit 50 pl de la phase aqueuse obtenue dans un godet d'une plaque & microfiltres comportant 96 godets. On ajoute 50 ul de NaOH 1,0 M à la phase aqueuse et on incube pendant 5 minutes à environ 20 C. On ajoute à l'échantil- lon lOul d'une solution 1,5 M en NaCl et 0,5 M en HC1 et 0l0,ul d'une solution 2,5 M en NaCl et 1,0 M en tris-hydroxyaminométhane (pH 7,0). On filtre la solution obtenue sur un filtre de nitro- cellulose pure (Millipore Corp.) en s'aidant d'un léger vide pour obtenir une tache de 3,0 mm de diamètre. On lave l'échantillon avec une solution de 6 x SSC, on sèche et on cuit à 80aC pendant 2 heures sous un vide d'environ 66 ubar. Après cuisson, on plonge le filtre dans une solution de 6xSSC à 0,2 % de polyvinylpyrrolidone 360 (Sigma), 0,2 % de sérumalbumine bovine (fraction V d'Armour), 0,2% de Ficoll (Pharmacia) (Sigma) et 0,5 mg/ml d'ADN de sperme de hareng puis on incube à 65 C pendant 10 heures. On prépare un ADN viral dénaturé à marquage radio- isotopique à partir de 2 ug d'ADN représentant un plasmide d'ADN recombinant constitué d'ADN viral d'hépatite B inséré dans un véhicule de clonage du plasmide pBR322 comme modèle pour la réaction de "translation à l'état relâché" (Rigby et coll.) pour obtenir un ADN à marquage radioactif ayant une activité spécifique d'environ 1 x 108 désintégrations par minute par pg d'ADN. On ajoute le filtre de nitrocellulose au mélange de renaturation comprenant l'ADN viral à marquage radioactif et on chauffe le filtre à 85 C pendant 10 mi- nutes puis on refroidit rapidement. On effectue larenaturation pendant 18 heures à 37 C. Après renaturation, on lave plusieurs fois le filtre de nitrocellulose avec une solution 1,5 M de NaCl, 50 mM de tampon phosphate de sodium (pH 6,8), 10 pm d'acide éthylènediamino- tétraacétique et 0,5% en poids/volume de dodécylsulfate de sodium. On place le filtre de nitrocellulose entre deux pel- licules transparentes d'acétate de cellulose et on le place à proxi- mité d'une pellicule radiographique. On place un écran renforçateur sur le côté composé de l'ensemble stratifié placé dans un emballage opaque à la lumière. Après un temps prédéterminé, on développe la pellicule et on détermine la présence de l'ADN du virus de l'hépa- tite B par la présence d'une tache sur la pellicule. Le procédé de l'invention pour la détection d'un ADN viral dont on soupçonne la présence dans des liquides biologiques acellulaires comprend plusieurs stades opératoires très souhaitables autres que les stades fondamentaux de dénaturation, immobilisation et renaturation pour obtenir le degré élevé de fiabilité ou de reproductibilité. Ainsi l'extraction organique permet-elle d'éli- miner les protéines et le détergent susceptibles de gêner la fixa- tion des ADN dénaturés au substrat solide. La neutralisation de la phase minérale après la dénaturation de l'ADN améliore l'effi- cacité de la fixation des ADN dénaturés sur le substrat solide. La cuisson améliore la fiabilité et constitue un traitement de la nitrocellulose empêchant la fixation non spécifique d'ADN après la cuisson. Le lavage du substrat solide après la renaturation améliore également la fiabilité des résultats. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limita- tifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'évaluation de la présence soupçonnée d'un ADN viral dans un liquide biologique acellulaire évitant les techniques de culture in vivo ou de culture tissulaire, caractérisé en ce qu'il comprend: a) le traitement dudit liquide biologique acellulaire pour immobiliser les ADN sous une forme dénaturée sur un substrat solide; b) le contact dudit substrat solide avec un ADN dénaturé viral soupçonné, à marquage radioisotopique pour renaturer l'ADN viral natif soupçonné, immobilisé et c) l'évaluation du produit du stade b) pour déter- miner la présence d'ADN renaturé à marquage radio-isotopique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit liquide biologique acellulaire est un sérum humain. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit liquide biologique acellulaire est un liquide céphalo- rachidien. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, carac- térisé en ce que ledit ADN viral soupçonné est l'ADN de l'agent infectieux de l'hépatite B. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 3, carac- térisé en ce que ledit ADN viral soupçonné est un virus herpétique de Type 1. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que ledit liquide biologique acellulaire est traité avec un solvant organique avant le stade a) pour éliminer les matières protéiques dans une phase organique. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'évaluation du stade c) est effectuée selon une technique de spectrométrie par scintillation. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite évaluation du stade c) est effectuée selon une technique autoradiographique. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit substrat solide est en nitrocellulose pure. 10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que,dans le stade a), on utilise un léger vide pour effectuer l'immobilisation. il Procédé pour évaluer dans un liquide biologique acellulaire des ADN comprenant un ADN viral soupçonné, caractérisé en ce qu'il comprend a) le contact dudit liquide biologique acellulaire avec un détergent et une enzyme protéolytique; b) l'extraction du produit du stade a) avec un sol- vant organique pour former une phase aqueuse essentiellement dépour- vue de protéines contenant lesdits ADN; c) le contact de ladite phase aqueuse du stade b) avec un alcali pour dénaturer lesdits ADN; d) la neutralisation de la solution obtenue dans le stade c); e) l'application de la solution du stade d) à un substrat solide pour y immobiliser lesdits ADN dénaturés; f) le contact dudit substrat solide du stade e) avec une solution d'un ADN dénaturé viral soupçonné, à marquage radio- actif pour renaturer l'ADN viral dénaturé soupçonné, immobilisé sur ledit substrat solide; et g) l'évaluation de l'ADN viral renaturé soupçonné, à marquage radioactif dudit substrat solide. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on effectue le stade a) à une température de 60 à 80'C pendant une durée de 1 à 10 heures. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la température est de 700C pendant une durée de 2 heures. 14. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on effectue le stade c) à un pH de 10 à 12,5. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit pH est de 11,5. 16. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on cuit ledit substrat solide du stade e) à une température de 60 à 100'C pendant 1 à 6 heures avant le stade f). 17. Procédé selon l'une des revendications Il ou 16, caractérisé en'ce que l'on traite ledit substrat solide pour y empêcher la fixation ultérieure d'un acide nucléique. 18. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit substrat solide du stade f) est lavé avant le stade g) pour éliminer l'ADN viral dénaturé soupçonné, à marquage radio- actif, non fixé de façon spécifique. 19. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on effectue le stade g) par spectrométrie par scintillation. 20. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on effectue le stade g) par autoradiographie.