Brevet FR2501715A1 — publié le 19820917

La présente invention concerne un procédé de culture de cellules nécessitant une fixation, c'est-à- dire de cellules du type qui doit normalement se reproduire sous forme d'une ou plusieurs couches formées sur un substrat et qui ne peuvent pas se reproduire en suspension. Les progrès de la biologie cellulaire ont montré que les cellules nécessitant une fixation, appartenant à divers organismes supérieurs, peuvent produire de petites quantités de substances ayant une utilité potentielle ou démontrable importante pour le traitement de certaines maladies, notamment d'interférons. De telles cellules sont aussi utiles dans la recherche. Dans de telles cultures de cellules, il existe un risque permanent de contamination bactérienne ou autre. En outre, dans la plupart des cas, les quantités de la substance intéressante produite par la culture de cellules sont très faibles. Comme les cellules nécessitant une fi- xation, contrairement aux cultures en suspension, ne peu- vent pas être cultivées afin qu'elles remplissent un volume, on considère qu'il n'existe pas actuellement de procédé utile en pratique pour la culture d'un grand nombre de cellules nécessaires à la production de quantités notable de substances intéressantes produites par de telles cellu- les. Des cellules nécessitant une fixation, telles que des fibroblastes normaux et certaines cellules épithé- liales et du rein doivent être couramment cultivées sur un substrat. Des feuilles de matière plastique destinées à constituer des substrats sont disponibles dans le commerce. Certains types de cellules nécessitant une fixation se reproduisent jusqu'à ce que la feuille soit couverte d'une monocouche de cellules, et elles cessent alors de se multi- plier. D'autres continuent à se multiplier en formant une ou plusieurs couches supplémentaires sur Ja première. La présente invention concerne un procédé de culture en suspension de cellules nécessitant une fixation, et elle pcrmet dcnc la croissance de plus grands nombres de cellules par unité de volume de milieu de culture, par rapport aux cultures en monocouches. Selon l'invention, une culture germe de cellules nécessitant une fixation est enrobée dans des microcapsu- les formées de membranes semi-perméables. La synthèse des membranes est réglée de manière qu'elles présentent une limite supérieure choisie de perméabilité, c'est-à-dire que les membranes forment des micropores de dimension suf- fisamment grande pour qu'ils permettent le passage de molé- cules ayant un poids moléculaire atteignant par exemple 2.105 daltons, mais empêchent pratiquement le passage de matière de poids moléculaire plus élevé. La membrane de la capsule forme donc un micro-milieu dans lequel les cellu- les et les composants d'un sérum ayant un poids moléculaire élevé sont maintenus, mais permettant aux cellules un accès libre aux matières nutritives des cellules, ayant un poids moléculaire plus faible, par exemple des aminoacides, et les métabolites de faible poids moléculaire formés par les cellules quittent le micro-milieu. Les microcapsules contenant des cellules sont alors dispersées dans un milieu classique de culture. Les surfaces internes de la membrane de la capsule et/ou cer- taines matières de poids moléculaire élevé, qui peuvent être dispersées dans l'eau, sont incorporées à la micro- capsule et jouent le rôle d'un substrat auquel les cellules se fixent. Comme le rapport de la surface des capsules au volume du milieu qui leur est extérieur peut très élevé, les cellules individuelles ont un accès convenable aux matières nutritives nécessaires, et la surface sur la- quelle les cellules peuvent croître est accrue par rapport aux cultures classiques en monocouches. Le diamètre moyen des microcapsules peut varier de façon générale entre quel- ques microns et 1 mm ou plus. Une dimension moyenne avan- tageuse est de l'ordre d'un diamètre de 100 à 500 microns. Lorsqu'un substrat de fixation, par exemple du collagène ou analogue, est incorporé dans les capsules, les fibroblastes croissent aussi vers l'intérieur des mem- branes et présentent une morphologie fibroblastique normale. L'invention concerne ainsi un procédé perfectionné de culture de cellules nécessitant une fixation. Elle con- cerne aussi l'augmentation du rendement de cellules nécessi- tant une fixation ou inhibées par contact, cultivées in vitro. Elle concerne aussi la réalisation, dans le volume du milieu de culture des cellules, d'une surface importante convenant comme substrat pour la croissance de cellules nécessitant une fixation. Elle concerne aussi un procédé de croissance de cellules permettant la production d'inter- férons. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion ressortiront mieux de la description détaillée qui va suivre, faite en référence au dessin sur lequel la fi- gure unique est une photomicrographie à un grandissement de.200, représentant des cellules nécessitant une fixation, qui se multiplient dans une microcapsule, par mise en oeuvre de l'invention, et elle montre la morphologie fibroblasti- que classique. L'invention concerne de façon générale la formation d'un grand nombre de membranes semi-perméables autour de cellules individuelles ou de groupes de cellules afin que ces membranes forment un substrat de grande surface auquel les cellules peuvent s'accrocher et/ou permettant le confi- nement d'une matière de poids moléculaire élevé dans les microcapsules afin qu'elles constituent un substrat de fixation. Les cellules qui croissent en suspension peuvent aussi être encapsulées selon l'invention. Les microcapsules forment un micro-milieu pour les cellules, avec au moins les constituants de poids moléculaire élevé du milieu de culture, et elles séparent les cellules du milieu aqueux qui baigne les capsules. Les bactéries et d'autres matières d'impureté relativement grosses ne peuvent pas traverser les membranes. Les cellules nécessitant une fixation et ayant une origine chez les mammifères, par exemple les fibroblastes, les cellules étpithéliales et les cellules du rein, nécessitent, pour avoir une viabilité permanente, la présence de cons- tituants du sérum dont une partie peut avoir un poids molé- culaire supérieur à la limite supérieure de perméabilité des membranes. Ces constituants peuvent être incorporés aux cellules encapsulées et n'ont pas à être présents dans le milieu externe. Il est avantageux mais non indispensable aussi que les microcapsules contiennent une matière de poids moléculaire élevé destinée à former un substrat de fixation. On a utilisé avec succès à cet effet du collagène qui est une protéine naturelle formant l'un des constituants principaux des tissus conjonctifs. D'autres protéines compa- tibles de poids moléculaire élevée et dispersables dans l'eau peuvent aussi être utilisées, notamment la poylysine. Si les protéines possèdent des groupes amino libres, elles peuvent être rendues insolubles dans l'eau par réaction avec une gomme hydrosoluble pendant la formation de la membrane, comme décrit dans la suite du présent mémoire. L'utilisation de telles matières provient sans doute de la création d'un liant dans le volume interne à la capsule. L'incorporation d'une telle matière peut accroître la densi- té de cellules dans les capsules car les cellules croissent dans le volume extérieur aux capsules au lieu de croître autour de l'intérieur de la membrane ou en plus de cette croissance interne. La culture germe encapsulée est alors mise en suspension dans un milieu convenable de croissance du type utilisé pour la croissance des cultures classiques. Les protéines du sérum qui ne sont pas ingérées par les cellu- les peuvent être omises dans le milieu externe aux capsules. - Cependant, le pH, la température, la concentration ionique et les paramètres analogues doivent être les mêmes que dans les milieux classiques. En outre, le transfert d'oxy- gène et de CO2 peut être favorisé de la même manière que dans les cultures classiques, car ces gaz dissous traver- sent librement la membrane. L'incubation de la culture de cellules encapsulées provoque la caryocinèse des cellules. Les croissances de fibroblastes présentent une morphologie fibroblastique classique et forment des arrangements de cellules sur la face interne de la membrane ou sur le substrat de fixa- tion contenu dans les capsules. Un milieu neuf de crois- sance peut être fourni le cas échéant soit de façon conti- nue, soit par intermittence, par modification du milieu externe aux capsules. Si la culture a pour but la produc- tion d'un métabolite intéressant des cellules, le métabolite peut être récolté soit dans le volume interne aux capsules soit à l'extérieur de celles-ci, suivant son poids molécu- laire et la limite supérieure de perméabilité des membranes. Dans un mode de réalisation avantageux du procédé, les membranes sont d'un type qui peut être fracturé sélec- tivement sans détérioration des cellules. De cette manière, les cellules peuvent être libérées des capsules le cas échéant. Une raison de la libération des cellules après leur période de croissance est la stimulation de la produc- tion d'une substance intéressante par les cellules. Un exemple est la production d'interférons par des fibroblastes humains, des leucocytes ou des cellules lymphoblastoides dont l'excrétion d'interférons est induite par traitement à l'aide de certains virus ou d'acides nucléiques de poids moléculaire élevé. Dans ce cas, si la limite supérieure de perméabilité des membranes est inférieure au poids mo- léculaire du facteur inducteur, les cellules doivent être soumises à une induction d'interférons avant l'encapsulation ou les membranes des capsules, après culture des cellules, doivent être fracturées sélectivement afin qu'elles permet- tent à de telles matières de poids moléculaire élevé de venir au contact de la cellule. Le procédé selon l'invention repose sur l'aptitude à la formation de membranes semi-perméables autour des cellules sans perturbation nuisible simultanée de leur viabilité permanente. La suite du présent mémoire décrit un tel prccédé convenable d'encapsulation. On considère maintenant l'encapsulation des cellu- les. Les tissus ou cellules à encapsuler sont mis en sus- pension dans un milieu aqueux convenant de préférence à la croissance du type de cellules considérées. Des milieux qui conviennent à cet effet sont disponibles dans le com- merce. Le diamètre moyen de la matière à encapsuler peut beaucoup varier entre quelques microns et 1 mm environ. Cependant, on obtient les meilleurs résultats avec des capsules dont la dimension est comprise entre 100 et 500 hm. Des cellules individuelles nécessitant une fixation, par exemple des fibroblastes de tissu humain ou d'autres ani- maux, des cellules du rein et des cellules épithéliales, peuvent être encapsulées le cas échéant. En outre, d'autres cellules telles que des leucocytes, des lymphoblastes, des cellules pancréatiques beta, des cellules alpha, des cellules delta, divers rapports de telles cellules ou d'au- tres éléments cellulaires peuvent être encapsulés. La viabilité permanente d'une telle matière vivante dépend entre autres choses de la disponibilité des matières nutritives nécessaires, du transfert d'oxygène, de l'ab- sence de substance toxique dans le milieu et du pH de celui- ci. Jusqu'à présent, on n'a pas su maintenir une telle matière vivante dans un milieu physiologiquement compatible avec un encapsulage simultané. Le problème qui s'est posé est que les conditions nécessaires à la formation de la membrane ont été léthales ou nuisibles aux tissus si bien qu'on ne disposait pas de procédé de formation de membranes permettant aux tissus de survivre en bonne santé. Cependant, on a constaté que certaines substances hydrosolubles qui sont physiologiquement compatibles avec les tissus vivants et qui peuvent être rendues insolubles dans l'eau en formant une masse cohérente qui conserve sa configuration, peuvent être utilisées pour la formation- d'une "capsule temporaire" ou d'une couche protectrice autour de cellules individuelles ou de groupes de cellules et que cette capsule temporaire pouvant être traitée afin qu'une membrane semi-perméable plus permanente puisse se déposer autour des cellules sans détérioration de celles- ci. Une telle substance est ajoutée, par exemple à une concentration inférieure à 1,0 % en poids environ, au milieu de culture des tissus qui contient aussi des cellules de la culture germe, des constituants du sérum (le cas échéant) et éventuellement du collagène ou une autre matière de poids moléculaire élevée dispersable dans l'eau, jouant le rôle d'un substrat de fixation. La concentration de la matière utilisée comme substrat doit être comprise entre 3 3 environ 10 g/cm et environ 1 mg/cm, mais elle est de préférence de l'ordre de 100 à 500 gg/cm La solution est alors mise sous forme de goutte- lettes contenant un tissu avec son milieu et elle est immé- diatement rendue insoluble dans l'eau et gélifiée, au moins dans une couche superficielle. Ensuite, les capsules tempo- raires conservant leur configuration reçoivent une membrane plus permanente qui peut elle-même être ensuite fracturée sélectivement si le tissu doit être libéré sans détérioration. Lorsque la matière utilisée pour la formation des capsules temporaires le permet, l'intérieur des capsules peut être reliquéfié après la formation de la membrane permanente. L'opération est réalisée par rétablissement dans le milieu des conditions dans lesquelles la matière est soluble. La matière utilisée pour la formation de capsules temporaires peut être toute matière hydrosoluble et non toxique qui, par changement de la concentration ou du milieu ionique peut être transformée en une masse conservant sa configuration. La matière doit aussi contenir plusieurs motifs anioniques facilement ionisés, par exemple des groupes carboxyle pouvant réagir à la formation d'un sel avec des polymères contenant plusieurs groupes cationiques. Comme décrit dans la suite du présent mémoire, l'utilisation de ce type de matière permet le dépôt d'une membrane perma- nente ayant une limite supérieure choisie de perméabilité (tre dépassant pas en général 100 000 à 150 000 daltons) sans présenter de difficultés, dans les couches superficielles de la capsule temporaire. Les matières les plus avantageuses pour la formation de la capsule temporaire sont des gommes de polysaccharides naturelles ou synthétiques acides et hydrosolubles. Ces matières sont disponibles dans le commerce, on les extrait par exemple des matières végétales et on les utilise souvent comme additifs dans divers aliments. L'alginate de sodium est une gomme hydrosoluble particulièrement avantageuse. L'alginate ayant un poids moléculaire supérieur à 150 000 daltons peut être utilisé mais, étant donné ses dimensions moléculaires et sa viscosité, il ne peut pas habituellement passer à travers les membranes des capsules finalement formées. Un alginate de plus faible poids moléculaire, par exemple compris entre 50 000 et 80 000 daltons, est plus facilement retiré du volume interne des capsules par diffusion à travers une membrane de porosité suffisante, et il est donc préférable. D'autres gommes utilisables sont des fractions acides de la gomme guar, la caraghénine, la pectine, la gomme adraganthe et la gomme de xanthane. Ces matières comportent des chaînes saccharides à liaison glycoside. Leurs groupes acides libres sont souvent présents sous forme d'un ion d'un métal alcalin, par exemple sodium. Lorsqu'un ion multivalent tel que le calcium ou le strontium remplace l'ion alcalin, les molécules hydro- lubles de polysaccharide sont "réticulées" et forment un gel insoluble dans l'eau et conservant sa forme, pouvant être remis. en solution, après enlèvement des ions par échange d'ions ou à l'aide d'un agent séquestrant. Bien que tout ion multivalent pratiquement capable de former un sel avec la gomme acide puisse être utilisé, il est préférable qu'il s'agisse d'ions physiologiquement compatibles, par exemple calcium. Cette caractéristique a tendance à conser- ver le tissu à l'état vivant. D'autres cations multivalents peuvent être utilisés. Les ions magnésium ne permettent pas une gélification efficace de l'alginate de sodium. Un exemple de composition de solution contient des volumes égaux d'une culture de cellules dans son milieu (avec ou sans substrat de fixation) et d'une solution à 1 ou 2 % d'une gomme dans du sérum physiologique. Lors de l'utilisation d'alginate de sodium, une solution à 1,0- 1,5 % donne satisfaction. Du collagène ou une autre protéine ou un polypeptide dispersable dans l'eau et ayant un poids moléculaire élevé, naturel ou synthétique, peut être incorporé dans la culture de cellules et est confiné dans le volume interne des capsules finalement formées. Lors de l'utilisa- tion d'un polymère ayant plusieurs groupes cationiques, par exemple la polylysine, les groupes cationiques réagissent avec des sites anioniques dans la gomme hydrosoluble et forment un liant pratiquement insoluble dans l'eau, imbriqué dans la gomme. Des concentrations avantageuses pour ces matières sont de l'ordre de 100 à 500 gg/cm3 de suspension (y compris la solution de gomme). Au cours de l'étape suivante de l'encapsulation, la solution de gomme contenant le tissu est mise sous forme de gouttelettes de dimension voulue, et ces gouttelettes se gélifient immédiatement afin qu'elles forment des masses sphériques ou sphéroldales qui conservent leur forme. La formation des gouttelettes peut être réalisée de la manière suivante. Un tube contenant une solution aqueuse de cations multivalents, par exemple d'une solution à 1,5 % de CaCl2, est muni d'un bouchon qui supporte un appareil de formation de gouttes. Cet appareil comprend un bottier ayant une buse supérieure d'admission d'air et un corps allongé et creux maintenu par frottement dans le bouchon. Une seringue de 10 cm3 munie d'une pompe pas à pas est montée sur le bottier avec par exemple une aiguille de 0,25 mm de diamètre interne, revêtue de "Teflon" passant dans la longueur du boîtier. L'intérieur de ce dernier est réalisé de manière que le bout de l'aiguille soit soumis à un courant laminaire constant d'air jouant le rôle d'un rideau d'air. Lors de l'utilisation, lorsque la seringue est pleine d'une solu- tion contenant la matière à encapsuler, la pompe pas à pas est commandée afin qu'elle chasse progressivement des gouttelettes de solution à l'extrémité de l'aiguille. 1 0 Chaque goutte est "arrachée" par le courant d'air et tombe sur une distance de 2,5 cm environ dans la solution de CaCl2 dans laquelle elle se gélifie immédiatement par ab- sorption d'ions calcium. La distance comprise entre le bout de l'aiguille et la surface de la solution de CaCl2 est suffisamment grande, dans ce cas, pour que la suspen- sion d'alginate de sodium et des cellules prenne la confi- guration la plus favorable au point de vue physique, c'est- à-dire d'une sphère (le volume maximale pour la surface minimale). L'air qui se trouve dans le tube s'échappe par un orifice formé dans le bouchon. L'opération provoque une "réticulation" du gel et la formation d'une capsule protectrice temporaire de viscosité élevée, conservant sa forme et contenant le tissu en suspension et son milieu. Les capsules se rassemblent dans la solution sous forme d'une phase séparée et peuvent être extraites par aspiration. Dans l'étape suivante du procédé, une membrane semi-perméable se dépose autour de la surface des capsules temporaires par "réticulation" des couches superficielles. L'opération peut être réalisée par traitement des capsules temporaires gélifiées à l'aide d'une solution aqueuse d'un polymère contenant des groupes cationiques qui peuvent réagir avec les fonctions anioniques des molécules de gel. Des polymères contenant des groupes acides réactifs, par exemple des groupes imine ou amine libres, sont avantageux. Dans ce cas, la gomme de polysaccharide est réticulée par interaction (formation de liaisons salines) entre les groupes carboxyle et les groupes amine ou imine. La perméabilité peut être réglée entre des limites par sélection du poids moléculaire du polymère utilisé pour la ràticulation et par réglage de la concentration de la solution polymère ainsi que de la durée et de la température d'exposition. Une solution de polymère de faible poids moléculaire, dans une période déterminée, traverse plus vers l'intérieur des capsules temporaires qu'un polymère de poids moléculaire élevé. Le degré de pénétration de l'agent de réticulation peut être rélié à la perméabilité résultante. En général, 1 1 plus le poids moléculaire est élevé et plus la pénétration est faible, plus la dimension des pores est importante. Les polymères ayant un poids moléculaire compris entre 3000 et 100 000 daltons ou plus peuvent être utilisés en général suivant la durée de la réaction, la concentration de la solution de polymère et le degré voulu de perméabili- té. Un jeu satisfaisant de conditions réactionnelles, lors de l'utilisation de polylysine de poids moléculaire moyen égal à 35 000 daltons environ, donne une réaction de 2 min sous agitation de sérum physiologique contenant 0,0167 % de polylysine. Des membranes formées ont une limite supérieure de perméabilité d'environ 100 000 daltons. Les conditions réactionnelles optimales convenant au réglage de la perméabilité dans un système donné peuvent être faci- lement déterminées d'une manière empirique, une fois connues les directives qui précèdent. La mise en oeuvre de ce procé- dé permet l'établissement de la limite supérieure de la perméabilité des membranes à un niveau choisi qui est en général inférieur à 150 000 daltons environ. Des exemples de polymères convenables de réticu- lation sont des protéines et des polypeptides, naturels ou synthétiques, ayant des groupes amino ou imino libres, des polyéthylèneamines, des polyéthylèneimines, et des polyvinylamines. La polylysine, à la fois sous ses formes D et L, donne satisfaction. Des protéines telles que la polyarginine, la polycitrulline ou la polyornithine peuvent aussi être utilisées. Des polymères ayant une densité élevée de charges positives, par exemple une polyvinylamine, adhèrent fortement aux groupes anioniques des molécules de gel lors de la formation de membranes stables,mais la fracture des membranes présente quelques difficultés. Le traitement par une solution diluée d'une gomme ou un tampon hermaphrodite provoque la liaison des groupes amino libres aux surfaces des capsules qui pourraient par ailleurs avoir tendance à s'agglomérer. A ce stade de l'encapsulation, les capsules peuvent être collectées sous une forme qui comprend une membrane semi-perméable entourant une solution gélifiée de gomme, un milieu de culture compatible avec le type de cellule, des cellules et éventuellement un liant interne de colla- gène ou d'un autre substrat de fixation. Comme le trans- fert massique doit être favorisé à l'intérieur des capsules et à travers les membranes, il est avantageux que le gel soit remis sous une forme liquide et hydrosoluble. L'opération peut être réalisée par rétablissement des condi- tions dans lesquelles la gomme est liquide, par exemple par enlèvement des cations calcium ou multifonctionnels d'un autre type du gel interne. Le milieu délimité dans la capsule peut être remis en solution par simple immersion des capsules dans une solution saline tamponnée par un phosphate, contenant des ions de métaux alcalins et des ions hydrogène. Les ions monovalents remplacent les ions calcium ou multifonctionnels autres dans la gomme lorsque les capsules sont immergées dans la solution sous agitation. On peututiliser des solutions de citrate de sodium à cet effet, afin qu'elles assurent la séquestration des ions bivalents. Les cultures de cellules encapsulées comme décrit précédemment peuvent être mises en suspension dans un milieu de croissance plus spécialement destiné à satisfaire tous les critères du type particulier de cellule considérée, et continuent à présenter un métabolisme et une caryocinèse in vitro normaux. Si la culture nécessite un milieu conte- nant des ingrédients de poids moléculaire élevé tels que des constituants du sérum, ceux-ci peuvent être omis dans le milieu externe aux capsules. Par exemple, les constituants normalement ingérés par les cellules sont de poids molécu- laire relativement faible et diffusent facilement à travers les membranes des capsules vers le micro-milieu des cellules et traversent ainsi la membrane des cellules. Les métabolites des cellules qui sont excrétés dans le milieu interne aux capsules, lorsqu'ils ont un poids moléculaire inférieur à la limite supérieure de perméabilité des membranes des capsules, diffusent de manière analogue à travers ces membranes et se rassemblent dans le milieu extérieur aux capsules. Les cellules encapsulées croissent dans des condi- tions de température, de pH et de milieu ionique par exem- ple, qui sont identiques à celles des cultures classiques. Les métabolites des cellules peuvent être collectés dans le milieu externe aux capsules ou dans le volume interne des capsules, par mise en oeuvre des techniques classiques. Cependant, la technique de culture décrite dans le présent mémoire présente les avantages suivants: 1. Les cellules de culture sont protégées contre la contamination par des facteurs ayant des dimensions qui dépassent la limite supérieure de perméabilité des membranes. Cela signifie que les critères de stérilité normalement nécessaires dans les procédures de culture peuvent être moins astreignants puisque les microorganismes ne peuvent pas atteindre les cellules encapsulées. 2. Les capsules assurent en fait l'immobilisation des cellules dans un milieu dans lequel des matières de poids moléculaire élevé sont confinées, et les produits et ingrédients nutritifs des cellules qui ont un poids moléculaire plus faible sont facilement extraits et intro- duits. De cette manière, le milieu nutritif peut être col- lecté ou renouvelé par intermittence ou de façon continue le cas échéant, sans perturbation des cellules. 3. Les substances intéressantes produites par les cellules peuvent être très facilement récupérées. Les produits des cellules ayant des dimensions moléculaires suffisamment faibles pour qu'ils traversent les membranes descapsules se rassemblent dans le milieu externe aux capsules, sous forme d'un mélange avec les ingrédients nutritifs. Cependant, des constituants du sérum de poids moléculaire élevé et analogues ne sont pas extraits vers le milieu externe aux capsules si bien que la récupération du produit intéressant des cellules est simplifiée. Les produits des cellules ayant des dimensions moléculaires supérieures à la limite supérieure de perméabilité de la membrane se rassemblent dans les capsules. Ces produits 250 1715 peuvent être récupérés sous une forme relativement concen- trée par isolement des capsules puis par fracturation sélec- tive ultérieure des membranes à l'aide par exemple de la technique décrite dans la suite du présent mémoire. 4. Le volume interne des capsules forme un milieu convenant bien à-la division des cellules. On observe que les cultures en suspension présentent une caryocinèse à l'intérieur de la capsule. Les cellules nécessitant une fixation et qui, dans les cultures normales, croissent sous forme d'une monocouche bidimensionnelle, se multiplient en formant un arrangement dans la capsule. Ces cellules utilisent les surfaces internes de la membrane comme substrats et/ou se fixent aux matières de poids moléculaire élevé indiquées précédemment, placées dans la capsule. La densité des cellules augmente donc notablement par rapport aux cultures classiques. La viabilité permanente de ces groupes de cellules est accentuée par le fait que les rapports surface/volume des capsules peuvent très importants si bien que toutes les cellules ont accès aux matières nutri- tives, à l'oxygène, etc. qui sont nécessaires. Dans certains cas, il est avantageux que les membranes des capsules soient fracturées sélectivement afin que les cellules soient libérées sans détérioration. Un exemple à noter est la production de l'interféron. Des cellules capables de produire de l'interféron doivent être soumises à certains virus ou acides nucléiques au cours de la préparation, dans une étape de production d'inter- féron. En outre, dans plusieurs procédures d'induction d'interférons, des réactifs sont ajoutés à la culture afin qu'ils empêchent la synthèse des protéines. Ainsi, l'étape de croissance du procédé de culture doit être ré- alisée dans des conditions très différentes de l'étape d'induction de l'interféron. Si les substances utilisées pour l'induction de l'interféron ont un poids moléculaire supérieur à la limite supérieure de perméabilité des meM- branes des capsules (comme dans le cas des inductions par virus), le processus d'induction ne peut pas être mis en 250 1715 oeuvre dans la culture encapsulée de cellules. Ainsi, les cellules produisant de l'interféron, lorsqu'elles sont formées dans la capsule, doivent être libérées par frac- * turation de la membrane afin qu'elles puissent subir le processus d'induction. On considère maintenant la fracture des membranes. Les cellules confinées à l'intérieur des membranes du type indiqué précédemment, peuvent être libérées par un proces- sus mettant en oeuvre des réactifs disponibles dans le commerce et ayant des propriétés qui ne nuisent pas de façon importante aux cellules encapsulées. D'abord, les capsules sont séparées du milieu de mise en suspension, lavées soigneusement afin que des impuretés qui peuvent être présentées à l'extérieur des microcapsules soient chassées, puis dispersées, sous agitation, dans une solu- tion contenant à la fois des cations monoatomiques multiva- lents tels que les ions calcium, et un polymère ayant plu- sieurs motifs anioniques, par exemple un sel d'un acide polysulfonique ou polyphosphorique. L'héparine qui est un polysaccharide sulfoné naturel, est avantageuse à ce moment. La densité des charges anioniques du polymère utilisé doit être égale à la densité de charges de la gomme acide utilisée à l'origine pour la formation d'une membrane ou de préférence supérieure. Le poids moléculaire du polymère doit être au moins comparable à celui du polymère ayant plusieurs groupes cationiques utilisés pour la formation de la membrane, et de préférence supérieur. Dans la sus- pension de capsules formée dans la solution mixte, les ions calcium entrent en concurrence avec les chaînes poly- mères cationiques utilisées pour la formation de la membra- ne pour l'occupation des sites anioniques formés sur la gomme hydrosoluble.Simultanément, l'héparine ou un autre polymère ayant plusieurs motifs anioniques, dissous dans la solution, entre en compétition avec la gomme anionique présente dans la membrane pour l'occupation des sites ca- tioniques présents sur les chaînes polymères. Il en résul- te la formation d'un complexe dispersable dans l'eau ou de préférence soluble dans l'eau, par exemple de polylysine et d'héparine, avec association des cations monoatomiques avec des molécules du gel. Cette opération rend la membrane susceptible de se dissoudre lorsqu'elle est ultérieurement exposée à un agent séquestrant qui complète le processus de frac- ture par prélèvement d'ions monoatomiques du gel. Les débris des membranes des capsules qui restent dans le milieu le cas échéant peuvent être facilement séparés des cellules. La solution sans doute la plus avantageuse pour la première étape du processus de fracture sélective con- tient 1,1 % (en poids par volume) de chlorure de calcium et 500 à 1500 unités d'héparine par cm3 de solution. Un certain volume de microcapsules est ajouté à cette solution, en quantité suffisante pour qu'il forme de 20 à 30 % environ du volume total de la suspension. Le chlorure de calcium et l'héparine sont préférables car ces deux réactifs sont compatibles physiologiquement avec la plupart des cellules et rendent donc minimales les possibilités de détérioration des cellules. Les mélanges de sels de strontium et d'autres cations multivalents (autres que les ions Mg) peuvent aussi être utilisés avec les sels d'acide polysulfonique ou-polyphosphorique du type indiqué précédemment Les concentrations d'ions monoatomiques et de polymère anionique utilisés dans cette étape peuvent en général beaucoup varier. Des concentrations optimales peu- vent être facilement déterminées d'une manière empirique et elles dépendent du temps d'exposition ainsi que du poly- mère particulier utilisé pour la formation des membranes. L'agent séquestrant sans doute le plus avanta- geux pour la fracture sélective est le citrate de sodium bien que d'autres sels sous forme de citrate alcalin et des sels de l'acide éthylènediaminetétracétique et d'un métal alcalin puissent aussi être utilisés. Lorsque le citrate de sodium est utilisé, la concentration est de l'ordre de 50 à 60 mM. Il est avantageux que le citrate ou un autre agent séquestrant soit dissous dans une solution saline isotonique afin que la détérioration des cellules soit minimale. Les exemples qui suivent, donnés à titre purement illustratif et non limitatif, illustrent la mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE: fibroblastes humains Des fibroblastes humains obtenus par traitement d'une culture monocouche classique avec de la trypsine et de l'acide éthylènediaminetétracétique pendant 5 min à 370C de manière connue, sont mis en suspension dans un milieu complet de croissance ("CMLR 1969", Connaught Laboratories) complété par une solution à 40 % en volume de sérum foetal de veau purifié, contenant 0,8 % d'alginate de sodium ("Sigma") et 200 sig/cm3 de collagène purifié de peau de veau. La densité de la suspension de cellule 7 3 est de l'ordre de 1,5.10 cellules/cm Ensuite, on utilise une solution à 1,5 % de chlo- rure de calcium pour la gélification de gouttelettes formées par utilisation d'un appareil convenable, du type décrit * 20 précédemment. Les gouttelettes ayant un diamètre de l'ordre de 50 à 500 dam, quittent le bout de l'aiguille et se géli- fient immédiatement, dès leur entrée dans la solution de calcium. min après, on retire par aspiration la solution qui surnage. Les capsules gélifiées sont alors transférées dans un bécher contenant 15 cm3 d'une solution qui contient une solution tampon d'acide 2-(cyclohexylamino)éthanesulfo- nique à 2 % dans une solution à 0,6 % de NaCl (solution isotonique, pH = 8,2) diluée par 20 parties d'une solution à 20 % de CaCl2. Après 3 min d'immersion, les capsules sont lavées deux fois dans une solution à 1 % de CaCl2. On transfère alors les capsules dans 32 cm3 d'une solution contenant 0,05 % (en poids par volume) de polyly- sine (poids moléculaire moyen de 43 000 daltons) dans du sérum physiologique. Après 3 min, la solution de polylysine est décantée. Les capsules résultantes, ayant des membranes semi-perméables "permanentes", sont alors lavées deux fois avec une solution à 1 % de CaCl2, deux fois avec du sérum physiologique et sont mélangées à 10 cm3 d'une solution à 0,03 - d'acide alginique. Les capsules résistent à l'agglomération et on peut noter qu'elles contiennent toutes des fibroblastes. Le gel qui se trouve à l'intérieur des capsules est remis à l'état liquide par immersion des capsules dans un mélan- ge de sérum physiologique et d'une solution tampon à base de citrate (pH = 7,4) pendant 5 min. Toutes les opérations précitées sont mises en oeuvre entre 22 et 37WC. On observe alors ces capsules au microscope et on note qu'elles comprennent une très mince membrane qui entoure des cellules. Les molécules dont le poids molé- culaire peut atteindre 100 000 environ peuvent traverser les membranes. Les capsules résultantes sont alors mises en suspension dans le milieu de culture "CMLR-1969" complété par 10 % de sérum foetal de veau. Après incubation à 37WC pendant 4 à 5 jours, on constate au microscope que les capsules contiennent des fibroblastes qui ont subi une caryocinèse et qui présentent une morphologie fibroblas- tique classique, à l'intérieur des microcapsules. Les membranes des capsules peuvent être frac- turées sans détérioration des cellules par sédimentation d'une fraction de 10 cm3 de la suspension de microcapsules contenant environ 500 à 1000 capsules par cm. Après aspi- ration du milieu, les capsules sont lavées deux fois avec du sérum physiologique. Les capsules lavées sont alors mélangées à une fraction de 3,0 cm3 contenant 1000 unités/cm3 d'héparine et CaCl à raison de 1,1 '. en poids par volume. La solution est agitée à 37WC pendant 3 min, et les capsules peuvent se séparer alors par sé- dimentation, le liquide qui surnage est retiré par aspira- tion, et les capsules sont lavées deux fois avec 3,0 cm 3 d'une solution 0,15 M de NaCl. Après aspiration de la solu- tion du second lavage, les capsules sont mélangées à 2,0 cm3 d'une solution mixte contenant des volumes égaux d'une solution 110 mM de citrate de sodium et d'une solu- tion 0,15 M de NaCl (pH = 7,4). On agite alors à la main le mélange en le faisant tourbillonner pendant 1 min afin que la dissolution des membranes soit provoquée, et les cellules sont alors lavées deux fois dans le milieu. Les fibroblastes sont soumis à une technique de "superinduction" d'interféron B, selon la méthode de Vilcek. Dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 (95 % d'air), la suspension de cellules subit une incubation à 37 C pendant 1 h en présence de 100 gg/cm3 de Poly I-Poly C, qui est un acide ribonucléique à deux nappes (inducteur connu d'interféron B) disponible auprès de PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin et 50 4g/cm3 de cyclo- heximide (inhibiteur de synthèse de protéine de Calbiochem, la Jolla, Californie). Après 1 h, les cellules en suspen- sion sont lavées dans un milieu de culture ("CMLR-1969") contenant 50 gg/cm3 de cycloheximide, puis remises en sus- pension dans la même solution pendant 3 h à 37 C, en at- mosphère contenant 5 % de CO2. A la fin de cette incubation, l'opération de lavage est répétée et les cellules sont remises en suspension dans un liquide contenant 50 gg/cm3 de cycloheximide et 5.g/cm3 d'actimomycine D (un inhibi- teur connu de synthèse d'acide ribonucléique de Calbiochem), puis subissent une incubation pendant 2 h à 37 C en at- mosphère contenant 5 % de CO2. Les cellules sont alors lavées deux fois dans le milieu et mises en suspension dans un milieu dépourvu de sérum, à 37 C pendant 18 à 24 h et pendant ce temps, les fibroblastes sécrètent de l'inter- féron B qui a un poids moléculaire de l'ordre de 21 000 daltons et qui peut être récolté dans le milieu externe aux capsules. Dans une expérience mise en oeuvre avec Poly I-Poly C (5S) (valeur de sédimentation, des substances Poly I et Poly C étant traitées afin qu'elles forment de l'acide ribonucléique à deux nappes), 2500 unités d'inter- féron B sont produites par 105 cellules dans la culture. On obtient un rendement identique dans un second essai avec 2 501715 Poly I-Poly C (à deux nappes, vendu sous cette forme). Il est bien entendu que l'invention n'a été décrite et représentée qu'à titre d'exemple préférentiel et qu'on pourra apporter toute équivalence technique dans ses élé- ments constitutifs sans pour autant sortir de son cadre qui est défini dans les revendications annexées. REVENDICATIONS 1. Procédé de culture de cellules nécessitant une fixation, caractérisé en ce qu'il comprend A. la mise en suspension des cellules dans un milieu de culture contenant tous les ingrédients (A) né- cessaires à la conservation de la viabilité et à l'entre- tien de la caryocinèse des cellules et ayant un poids molé- culaire supérieur à une valeur choisie, B. l'encapsulation des cellules avec le milieu dans plusieurs membranes semi-perméables ayant une limite supérieure de perméabilité suffisante pour que les ingré- dients (A) ne puissent pas traverser la membrane et pour que des molécules ayant un poids moléculaire inférieur à la valeur choisie puissent traverser les membranes, C. la mise en suspension du produit de l'étape B dans un milieu de culture contenant tous les ingrédients (B) nécessaires à la conservation de la viabilité et à l'entretien de la caryocinèse des cellules et ayant un poids moléculaire inférieure à une valeur choisie, et D. la caryocinèse naturelle des cellules dans le volume délimité à l'intérieur des membranes. 2. Procédé selon la. revendication 1, caractérisé en ce que le substrat de fixation, ayant un poids molécu- laire supérieur à la valeur choisie, est incorporé dans la suspension de l'étape A. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat de fixation est une protéine. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat de fixation est du collagène. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat de fixation est du collagène de peau de veau et est incorporé à la suspension à une concentra- tion comprise entre 10 gg/cm3 et 1,0 mg/cm3 environ. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la fracture sélective des membranes après l'étape B afin que les cellules soient libérées. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules sont des fibroblastes. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ingrédients (A) contiennent des constituants du sérum. a 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules sont des fibroblastes humains capa- bles de secréter de l'interféron. 10. Procédé selon la revendication 1, selon lequel les cellules sont des fibroblastes aptes à sécréter de l'interféron, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes supplémentaires suivantes: E. la fracture sélective des membranes après l'étape D afin que les cellules soient libérées, F. l'application aux cellules d'un traitement d'induction d'interféron, G. l'incubation des cellules obtenues dans l'étape F, dans un milieu de culture, et H. la récolte de l'interféron dans le milieu obtenu dans l'étape G. il. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pendant l'encapsulation, il se forme des membranes sphéroldales dont le diamètre moyen est compris entre 100 et 500 Nom. 12. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat de fixation est une protéine ayant plusieurs groupes cationiques libres. 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la valeur choisie est inférieure à 2,0.105 dal- tons environ. 14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la valeur choisie est inférieure à 1.105 daltons environ.