Brevet FR2502787A1 — publié le 19821001

Nouveau procédé de détection de l1HCG et son application notamment dans un nouveau test de grossesse. La pressente invention concerne un nouveau procédé de detection de l'HCG (hormone gonadotrophine chorionique) par voie immunologique selon une réaction du type antigèneanticorps. Elle concerne également l'application de ce procédé notamment dans un nouveau test de grossesse. On sait que pour détecter la présence d'HCG dans l'urine de la femme, des tests de grossesse mettant en oeuvre des mécanismes réactionnels du type antigene-anticorps ont éte proposés et commercialisés. Selon ces tests de grossesse connus, le principe du dosage repose sur l'utilisation d'un anticorps anti-HCG. Or il se trouve que les meilleurs de ces tests connus ne sont fiables qu'a partir des 9è a 15è jours de retard de règles, c'est-à-dire I partir du moment où la teneur en HCG dans l'urine de la femme enceinte est de l'ordre de 1 I 1,5 UI/ml. Selon l'invention on préconise un nouveau procédé de détection de l'HCG qui a l'avantage de permettre notamment la réalisation d'un test de grossesse fiable à 97 % dès le 2è jour de retard de regles quand la teneur en HCG dans l'urine de la femme enceinte est de l'ordre de 0.250 UI/ml; et qui, d'une manière générale, permet la détection d'une quantité de HCG supérieure ou égale I 0,05 UI/ml. Les difficdîtés de détection rencontrées dans les techniques antérieures mettant en oeuvre un mécanisme du type antigène-anticorps sont dues au fait que ledit mécanisme fait appel I l'utilisation d'un moyen anticorps anti-HCG obtenu I partir de la structure complète de l'HCG. L'HCG est une glycoprotéine qui est constituée, comme les hormones glycoprotéiques telles que les FSH (hormone folliculostimulante qui assure la croissance et la maturation des follicules de De Graaf), et LH (hormone lutéinisante qui provoque la ponte ovulaire, la formation du corps jaune et stimule la sécrétion de progestérone) qui sont présentes dans un cycle hormonal normal,et comme la TSH (hormone thyroido-stimulante),de deux chaînes (désignées ci-après par le terme "sous-unités") &alpha; et ss qui sont liées entre elles par des ponts disulfure et qui sont structurellement différentes l'une de l'autre.Les sous-unitésC FSH : TSH : LH : HCG Le procédé de détection selon l'invention s' appuie sur la constatation surprenante que l'anticorps anti-/ss-HCG obtenu à partir de la sous-unité/3 de l'HCG et qui est spécifique de celle-ci, permet de reconnaître la présence de l'HCG avec une plus grande fiabilité. Le procédé de détection de l'HCG que l'on préconise selon l'invention, et qui repose sur un mécanisme immunologique du type antigène-anticorps mettant en oeuvre un anticorps spécifique de la sous-unité4 de l'HCG, est caractérisé en ce que l'on met en contact dans un solvant convenable a) un moyen anticorps anti-ss -HCG obtenu par inoculation à un mammifère A d'un moyen antigène ss -HCG puis récupération à partir du sérum dudit mammifère, b) un moyen antigène HCG fixé sur des hématies d'un mammifère B appartenant une espèce différente de celle du mammifère A, et c) une solution aqueuse échantillon à étudier susceptible de contenir de l'HCG, la sédimentation (inhibition de l'agglutination) des hématies sur lesquelles est fixé le moyen antigène HCG indiquant la présence d'HCG dans ledit échantillon, et l'agglutination des dites hématies par formation de ponts par le moyen anticorps anti-,j-HÇG entre les sites antigèniques desdites hématies indiquant l'absence d'HCG dans ledit échantillon. Selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé de dosage, objet de l'invention, le moyen anticorps est un anti-A-HCG de lapin obtenu par inoculation de /3-HCG au lapin, et le moyen antigène est fixé sur des hématies de mouton. Le moyen antigène fixé sur des hematies pourra être constitué par la structure entière de l'HCG soit encore par la sous-unite de l'HCG Pour la préparation des cellules antigènes, on traite des hématies de mammifère B (en particulier des hématies de mouton) avec du formaldéhyde selon la technique de CSIMAS, Soc. Exp. Biol 103, 157 (1960) puis on les sensibilise par HCG ou /3-HCG selon une méthode connue en soi. La sous-unité 3-HCG est obtenue à partir d'HCG purifiée selon la technique de MORGAN et al., Endo. 94, 1601-1606 (1974). Le moyen anticorps est obtenu par incorporation de A-HCG dans une émulsion d'eau dans de l'huile minérale en présence d'Arlacel et de protamine, et le mélange résultant est inoculé à des mammifères A (en particulier des lapins) puis les animaux sont saignés à intervalles réguliers. Le moyen antigène fixé sur les hématies et le moyen anticorps sont avantageusement lyophilisés soit séparément, soit, de préférence, ensemble selon la technique dite à deux couches, avant d'être utilises dans le procédé de dosage de l'HCG. Parmi les solvants qui conviennent pour la mise en contact du moyen anticorps, du moyen antigène et de l'échantillon à étudier, le préféré est l'eau déminéralisée. Le procédé de détection de l'HCG selon l'invention est directement applicable I la détermination de cette hormone dans des liquides corporels, chaque fois que l'on peut supposer qu'elle a éte secrétée, comme cela est le cas surtout chez la femme enceinte, mais également dans les cas de môles hydati formes avant curetage (pour lesquels les taux sériques de HCG et de ss-HCG présentent une augmentation de 7 à 13 fois supérieurs au taux sérique des grossesses témoins), dans les cas de menaces d'avortement spontané (où les taux d'HCG native diminuent considérablement), et dans les cas de certains syndromes néoplasiques ou para-néoplasiques (où on peut mettre en évidence une secrétion d'HCG aussi bien chez la femme que chez l'homme). D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris 1 la lecture de la description qui va suivre, en regard des dessins annexés, donnée titre d'exemple non limitatif - les figures 1 et respectivement 2 représentent les courbes relatives au taux hormonal normal sans fécondation et respec tivement au taux hormonal normal après fecondation, chez la femme ; - la figure 3 représente schématiquement le procédé de dosage selon l'invention appliqué au test de grossesse - la figure 4 représente une vue en perspective du conditionnement du test de grossesse selon l'invention ; - la figure 5 représente une vue en perspective du portoirlogeable dans le conditionnement sus-nommé ; - la figure 6 est une coupe du portoir selon VI-VI ; et - la figure 7 est une vue en perspective de la pochette renfermant le solvant. Les courbes des figures 1 et 2 donnent la variation en mUI/ml dans l'urine de la femme des FSH et LH quand il n'y a pas eu fécondation (figure 1), et des FSH, LH et HCG quand il y a eu fécondation et nidation (figure 2). Plus précisément, la figure 2 montre comment, s > il y a eu fécondation et nidation, la quantité de HCG secrétée croît rapidement à partir du 9è - 10è joursenviron apres la décharge en LH. Le diagramme de la figure 3 illustre l'obtention d'un anticorps 1 anti-/3 -HCG par inoculation d'antigène p -HCG humain 3 à un lapin, et l'obtention d'hématies 2 sensibilisées par des antigènes fixes sur des globules rouges 4 de mouton. Les moyens anticorps 1 et antigène 2 sont mis en présence dans un ttibe I essai en même temps que l'urine contenant de l'HCG complet 5. Les anticorps reconnaissent spécifiquement la sous-unitéi de l'HCG présente dans l'urine, ils sont donc bloqués comme représenté en 6, et les hématies libres ne peuvent s'agglutiner mais sédimentent en formant un anneau au fond du tube à essai. En revanche, si I et 2 sont mis en présence en même temps que l'urine sans HCG, les anticorps forment des ponts entre les sites antigéniques des hématies, ce qui provoque une agglutination représentée en 7 qui se traduit par une coloration uniforme au fond du tube. Les moyens et dispositifs pour mettre en oeuvre l'application du procédé de détection selon l'invention dans le cadre d'un test de grossesse ont été décrits ci-après par référence aux figures 4 I 7. Ladite application est caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une composition de matiere comprenant - une bote de conditionnement, - un porte-objet ou portoir 10 qui est (i) muni sa partie supérieure d'un conduit creux 22 opaque pourvu d'un rebord circulaire 23 destiné I soutenir un tube transparent 21 logé dans ledit conduit, ce tube renfermant le mélange lyophilisé des moyens anticorps et antigène devant réagir avec l'urine de la femme en présence d'un solvant, et (ii) pourvu à sa partie inférieure d'un miroir 11 permettant de visualiser l'image 25 du fond du tube situé dans la lumière du rebord 23, ledit miroir étant maintenu incliné par un dispositif convenable disposé sur la paroi intérieure du portoir, et - un solvant. Selon un mode de réalisation, cette composition de matière est présentée sous la forme d'un ensemble ou kit, prêt à l'emploi constitué par - une boîte de conditionnement qui est utilisable pour recueillir l'urine de la femme, comprenant un réservoir 8 et un couvercle 9 - un porte-objets ou portoir 10 du type corps creux parallé lipipedique comprenant deux faces latérales verticales et deux faces horizontales l'une inférieure et l'autre supe rieure munie d'orifices 18 pour soutenir une pochette 20 contenant de l'eau déminéralisée et un compte-gouttes 17 destiné au prélèvement du volume desiré d'urine et un conduit creux 22 opaque pourvu I sa partie inférieure d'un rebord 23 soutenant un tube transparent 21 logé dans ledit conduit creux 22, le tube transparent 21 contenant un mélange lyophilisé 24 de moyen anticorps anti-/3-HCG de la pilet de moyen antigène constitué parHCGou/J'-HCG sur hématies de mouton, les moyens anticorps et antigène ne réagissant pas à l'état sec mais étant susceptibles de réagir en présence d'eau, ledit tube 21 étant destiné à recevoir des gouttes d'urine et l'eau contenue dans la pochette 20 et libérée au moyen d'un dispositif d'ouverture 26 prévu sur la pochette 20 (et qui est dans le cas d'espèce un papillon secable) ;; - un miroir 11 disposé,de façon inclinée, sous le rebord 23 du tube 21, à la partie inférieure du portoir 10, et lié audit portoir au moyen d'un dispositif de positionnement (qui est dans le cas d'espèce constitué par des ergots 12, 13 et 14 et des barrettes horizontales inférieure 15 et supérieure 16, et qui pourrait être constitué par des rainures équivalentes) prévu sur le côté intérieur de chaque face latérale du portoir 10, le fond du tube 21 situé dans la lumière du rebord 23 étant visualisé sur le miroir par une image 25. Le conduit opaque 22 et le rebord 23 ont pour objet (i) d'éviter toute manipulation quand la réaction anticorpsantigène se développe, et (ii) de faciliter la lecture du résultat en évitant les risques d'erreur qui pourraient resulter de reflets. La lyophilisation des moyens anticorps et antigène est avantageusement effectuée en deux couches. A cet effet, on procède comme suit : les hematies de mouton sensibilisées sont mises en suspension dans un milieu aqueux de lyophilisation comprenant un tampon de sels minéraux, de l'albumine et du sucre à pH 6, 4 ; après congélation, une quantité d'antisérum nécessaire et suffisante pour produire un test sensible à la présence de d'une quantité supérieure ou égale A 50 UI de HCCw par litre d'urine est ajoutée (par exemple pour avoir une sensibilité de 50 Ulil ou de 250 Ulil de HCG) et le tout est lyophilisé. Les lyophilisats restent stables pour une durée de 2 ans au moins, lorsqu'ils sont conservés à une température inférieure ou égale à 20"C. Le mode d'emploi préconisé est décrit ci-après. On recueille la première urine du matin dans le récipient 8. On prélève de l'urine au moyen du compte-gouttes 17 et verse 3 gouttes (0,15 ml) dans le tube 21 contenant un mélange lyophilisé 24 d'anticorps et d'antigène préparé comme indiqué ci dessus-.0n ajoute dans le tube 21 le contenudela pochette 20(0,25 ml d'eau déminéralisée) par l'intermédiaire du papillon 26.0n rebouche le tube 21 puis le secoue pour bien mélanger les 4 ingrédients le moyen anticorps, le moyen antigène, l'eau déminéralisée et l'urine. On replace le tube dans son logement 22 et on le laisse au repos pendant exactement 2 heures dans un endroit dépourvu de vibrations et loin d'une source de chaleur. La lecture est alors effectuée sur le miroir.Un anneau de sédimentation nettement délimité de couleur brune au fond du tube indique que la femme est enceinte. En revanche, une coloration uniforme (agglutination) de couleur brun-rougeâtre au fond du tube indique que la femme n'est pas enceinte. Si le tube a été secoué par inadvertance avant que les 2 heures ne soient écoulées, le mélange des quatre ingrédients peut etre remis en suspension en le resecouant et la lecture est réalisée 2 heures après. Dans ce test, on peut bien entendu introduire dans le tube 21 l'eau déminéralisée avant l'urine sans modifier le résultat. Ce test de grossesse pérmet de déceler une teneur en HCG dans l'urine supérieure ou égale à 0,05 UI/ml. Par exemple la sensibilité en HCG pourra être choisie entre 0,05 et 0,25 UI/ml. Si le test est sensible I une teneur en HCG de 0,25 UI/ml, la fiabilité sera au moins de 97 Z à partir du 2è jour de retard de règles. Si le test est sensible une teneur en HCG de 0,05 UI/ml, on obtiendra un résultat avec la même fiabilité plus tôt. En revanche, les tests de grossesse antérieurement connus ne présentent la meme fiabilité qu'à compter du 9è au 15è jours environ de retard de règles. Le test selon l'invention permet donc de donner une réponse fiable précoce. Par ailleurs, ce test est spécifique de l'HCG car il n'est pas influencé par les autres hormones glycoprotéiques. En particulier, les essais relatifs I une éventuelle interférence avec la LH ont montré qu'il n'y avait pas d'inhibition de l'agglutination (c'est-à-dire pas de sédimentation) à la concentration de 2,56 UI/ml en LH, alors que l'HCG est détectable à partir de 0,05 UI/ml. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection de l'HCG selon un mécanisme immunologique du type antigène-anticorps mettant en oeuvre un anticorps spécifique de la sous-unitép de l'HCG, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met en contact dans un solvant convenable a) un moyen anticorps anti-P-HCG obtenu par inoculation à un mammifère A d'un moyen antigène/?-HCG puis récu pération à partir du sérum dudit mammifère, b) un moyen antigène choisi parmi HCG et/3-HCG et fixé sur des hématies d'un mammifère B appartenant à une espèce différente de celle du mammifère A, et c) une solution aqueuse échantillon à étudier susceptible de contenir de l'HCG, la sédimentation des hematies sur lesquelles est fixé le moyen antigène indiquant la présence d'HCG dans ledit échantillon, et l'agglutination desdites hématies par formation de ponts par le moyen anticorps anti-/3-HCG entre les sites antigéniques desdites hématies indiquant l'absence d'HCG dans ledit échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène fixé sur des hématies est constitué par la sous-unité/9 de l'HCC. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène fixé sur les hématies est constitué par l'HCG. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le moyen anticorps est un anti-/ -HCG obtenu par inoculation de p -HCG à un lapin. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène choisi parmi l'ensemble HCG et/I- HCG est fixé sur des hématies de mouton. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant pour la mise en contact de l'anticorps anti--HCG de lapin, de l'antigène fixé sur des hématies de mouton est l'eau déminéralisée. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les quantités respectives de moyens antigène et anticorps sont choisies de telle façon que le dosage soit sensible à une quantité supérieure ou égale à 0,05 UI/ml en HCG dans l'échantillon. 8. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que les quantités respectives de moyens antigène et anticorps sont choisies de telle façon que le dosage soit sensible à une quantité supérieure ou égale à 0,25 UI/ml en HCG dans l'échantillon. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens antigène et anticorps sont lyophilisés selon la technique dite I deux couches, par congelation du moyen antigène préalablement fixé sur hématies de mouton dans un milieu approprie, addition du moyen anticorps, et lyophilisation de l'ensemble résultant. 10. Application du procédé de dosage de l'HÇG selon la revendication 1, dans le cadre d'un test de grossesse précoce et fiable, ladite application étant caractérisée en ce que l'ensemble des moyens nécessaires comprend - une boîte de conditionnement, - un portoir 10 qui est (i) muni à sa partie supérieure d'un conduit creux 22 opaque pourvu d'un rebord circulaire 23 destiné å soutenir un tube transparent 21 logé dans ledit conduit, ce tube renfermant le mélange lyophilisé des moyens anticorps et antigène devant réagir avec l'urine de la femme en présence d'un solvant, et (ii) pourvu à sa partie inférieure d'un miroir Il permettant de visualiser l'image 25 du fond du tube situé dans la lumière du rebord 23, ledit miroir etant maintenu incliné par un dispositif convenable disposé sur la paroi inté- rieure du portoir, et - un solvant, et en ce que le mélange lyophilisé des moyens antigène et anticorps a été obtenu par lyophilisation en deux couches, les quantités respectives des moyens antigène et anticorps ayant éte choisies de telle façon que le dosage soit sensible à une concentration en HCG dans l'urine à tester, supérieure ou égale à 0,05 UI/ml, et notamment de 0,25 UI/ml.