Brevet FR2510603A1 — publié le 19830204

SOUCHE DE MICROORGANISME DE L'ESPECE CLAVICEPS PURPUREA (FR) Tul CCM F-725 L'invention concerne un micro- organisme de l'espèce Claviceps Purpurea (Fr) Tul. CCM F-725, qui constitue une souche nouvelle Cette souche a été obtenue par l'amélioration, sur une -p 6 riode prolongée, d'une souche utilisée pour la culture en champs d'ergots contenant de l'ergocornine et de l'ergocryptine,( 1974/K Strnadova, J Kybal, Folia Microbiol 19, 272, 1974) Au cours de cette améliora- tion, il a été obtenu une souche CCM F-508 (Certificat d'Auteur Tchécoslovaque n 176 803), qui a été égale- ment utilisée pour la production sur champs Cette souche appartient également à la race chimique ergocornine-ergocryptine, et produit en culture sur champ des sclérotia contenant-0,5 % en poids'd'alca- loides en matière séche, en moyenne, le rapport en poids de ces deux alcaloïdes étant de 6:4 à 4:6. L'inconvénient de la souche CCM F-508 utilisée actuellement consiste en une teneur relativement faible en alcaloïdes et surtout, dans le rapport défavorable entre les deux composants ergocryptine, à savoir l -ergocryptine et la - ergocryptine, fortement déplacé en faveur de l' - ergocryptine L'ergocryptine est une substance médicale importante, et un composé de départ dans la l 10603 préparation de dérivés, et de produits pharmaceutiques obtenus à partir de ces dérivés Les formes o le rapport en poids entre i'o( et la "ergocryptine est exactement défini, à savoir de 1,5:1 à 2,5:1, ont été récemment appliquées en thérapie, ces formes assu- rant une action thérapeutique standard En raison du rapport en poids désavantageux de ces deux compo- sants dans les slcérotia d'ergot de la souche CCM F-508, l'ergot de ce type est devenu une matière première désavantageuse pour les préparations sou- haitées Au cours de l'amélioration de la souche d'ori- gine, un mutant asporogène auxotrophique a été sélec- tionné après un traitement mutagénique avec l'acide nitrique, en plus de la souche CCM P-508; ce mutant est capable de synthétiser les alcaloïdes non seule- ment en culture parasitaire, mais aussi en culture saprophyte Dans la suite des opérations de perfec- tionnement de ce mutant, il a été isolé un mutant suppresseur généré spontanément, qui conservait les caractéristiques de production mentionnées et pour lequel un renouvellement de l'aptitude à la formation de conidia avait lieu simultanément avec un retour à la prototrophie. La nouvelle souche qui fait l'objet de l'invention, a été obtenue en poursuivant l'améliora- tion du mutant mentionné, par utilisation de traitements mutagéniques classiques: les conidia ont été soumises à l'action d'acide nitrique dans une concentration de 0,0030 à 0,0045 M(selon la sensibilité des conidia) par mélange pendant 5 minutes Les conidia ont été alors centrifugés, lavées avec de l'eau et semées sur un milieu classique, puis testées pour la production d'alcaloïdes L'action de l'acide nitrique a été répétée six fois en tout On a utilisé en outre l'action de sulfonate d'éthylméthane, à la concentration de 0,01 M dans une suspension de conidia, sous agitation pendant cinq heures Ce temps écoulé, les conidia ont été lavées, semées sur un milieu classique et testées pour la production d'alcaloïdes Ce traitement a été répété trois fois Comme troisième traitement mutagène, du 5-bromo-uracil a été ajouté, à la concentration de 0,'0 % en poids, avec 0,1 % en poids de sulfathiazole dans le milieu inoculé complet La culture a duré quatorze jours à une température de 240 C Les conidia ont été récoltées sur les cultures développées, puis isolées, et testées pour la production d'alcaloïdes. Dans toute la mesure du possible, on a inséré dans les études des sélections de culture mono-conidiales sans mutation. La nouvelle souche a été déposée dans la Collection Tchécoslovaque de Microorganismes de l'Université J E Purkyné, Brno, Obrancumiru 10, sous le numéro CCM F-725. La souche Claviceps Purpurea (Fr) Tul CCM F 725 est prototrope Elle est capable de se développer dans des conditions parasitaires sur l'épi de seigle, mais aussi dans des conditions saprophytes, en culture stationnaire, en milieu liquide Dans les deux cas, elle produit des alca- loides. Sur un miliéu complet durci (moût de bière en fermentation, à 5 Bé, hydrolysat acide de caséine 1 % en poids, sulfate de magnésium cristallisé 0,1 % en poids, agar 3 % en poids, p H 6,3) inoculé par pulvérisation d'une suspension de conidia, la surface du milieu est garnie complètement en quatre à cinq jours à 25 C, et il se forme alors un mycélium aérien, étouffant de nombreuses conidia Les hyphées sont typiquement sphacéliques, longs, peu ramifiés et rarement divisés Les cellules ont des parois minces et une faible teneur en inclusions graisseuses Le mycélium est à sa base, dans les phases ultimes de son évolution, coloré en violet par un pigment, le mycélium aérien par contre est exempt de pigment La formation des conidia est complète après vingt et un jours d'incubation Les conidia sont ovales, ont généralement quatre à sept y de long et 3 à 5 /Pde large, à parois minces, et mononucléaires En semant la même composition sur un milieu frais, on obtient une germination en 24 à 48 heures, le plus fréquemment sur un p 8 le, rarement sur les deux Une culture dans un tube à essai de 2 Ox 200 mm contient environ 3 x 109 conidia. Dans un milieu de production liquide ( 25 %en poids de saccharose, 0,44 % en poids de liqueur saturée de mais, 0,06 % en poids de phosphate dihydrogèné de potassium, 0,946 % en poids d'acide citrique, 0,16 % en poids de nitrate de calcium cristallisé, 0,11 % en poids de sulfate de magnésium cristallisé, p H ajusté à 6,8 avec de l'ammoniaque) la souche se développe en vingt et un jours d'incubation à une température de 240 C, en my- célium sclérotial compact, mélangé, pigmenté de brun- jaune à brun pourpre, ce mycélium se développant vers le bas et étouffant les conidia en haut Les hyphées sont courtes et larges, les cellules sont pratique- ment isodiamétriques, à parois épaisses et à teneur élevée en graisses Les conidia ont des propriétés similaires à celles des conidia obtenues en milieu complet durci, leurs dimensions varient seulement légèrement. Il se forme en culture parasitaire sur l'épi de seigle des sclerotia allongées, généralement de 2 à 6 mm d'épaisseur et 10 à 30 Omm de long, droites ou en forme de faucille, se rétrécissant vers l'apex. La coloration des sclérotia adultes est brun-rouge à la surface et blanche avec une nuance jaunâtre à la fracture. Selon le spectre des alcaloïdes produits, la nouvelle souche appartient à la race chimique ergocornine-ergocryptone L'ergocornine et l'ergocryptine sont représentés dans un rapport en poids de 1:1 et constituent les principaux alcaloïdes contenus aussi bien dans les sclérotia d'ergot parasitaires que dans le mycélium de culture saprophyte. Le composant ergocryptine est formé de -ergocryptine et de -ergocryptine dans les sclérotia parasitaires dans un rapport en poids d'environ 2:1 à 1; 1, et dans le mycélium saprophyte, sans utilisation d'un précurseur, dans un rapport en poids d'environ 5:1 Outre les principaux alcaloïdes ci-dessus, le spectre d'alcaloïdes se compose d'ergométrine courante et de petites quantités d'ergosine ainsi que de traces d'ergocristine, ergo- tamine, amide de lysergylvaline, ergoxine (ergostine, ergonine, ergoptine) et de trois autres alcaloaes non identifiées. Une production élevée d'alcaf loides caractérise la nouvelle souche selon l'invention, et ceci aussi bien en culture parasitaire que sapro- 3 phyte Les sclérotia de la culture parasite aussi bien que le mycélium de la culture saprophyte, contiennent jusqu'à 1,5 % en poids d'alcaloïdes totaux Une autre fraction d'alcaloïdes est en outre libérée dans le milieu de production au cours de la culture 10603 saprophyte en surface, ce milieu contenant jusqu'à 250 g/ml d'alcaloïdes (exprimé en ergo- métrine) quand la fermentation a été complète. REVENDICATIONS Souche de microorganisme nouvelle caractérisée en ce qu'elle est constituée par une souche de l'espèce Claviceps purpurea portant la désignation (Fr) Tul CCM F-725, produisant de l'ergocornine et de l'ergocryptine.