Brevet FR2503184A1 — publié le 19821008

Composition pour la détermination de la phosphatase acide prostatique et procédé d'utilisation de cette dernière. La présente invention est relative à une nouvelle composition conçue pour la détermination immunochimique de la phosphatase acide prostatique; elle est relative en outre au procédé de diagnostic qui utilise une telle composition. Il est connu que les phosphatases acides sont des enzymes cellulaires qu'on rencontre dans l'organisme tout en- tier et qui sont capables de favoriser l'hydrolyse des esters d'acide phosphorique dans un environnement acide. Plus particulièrement, la phosphatase acide prosta- tique (APP) est une espèce spécifique d'isoenzyme qui se distin- gue par les antigènes des phosphatases présentes dans les autres tissus.Scnapparntimdans le flux sanguin a été associéeà la pré- sence du cancer de la prostate. Ce type de tumeur ne provoque pas de symptômes pendant une longue périodedetemps et est souvent localisé dans le lobe arrière, loin de l'uretère. Les stades cliniques du cancer sont principalement au nombre de quatre, à savoir: 1. Une tumeur confinée dans la glande prostatique et qui ne peut pas être détectée par palpation; 2. Une tumeur encore confinée à l'intérieur de la capsu- le prostatique, mais qui peut être détectée par proctoscopie; 3. Une tumeur qui est localement étendue avec uneinvolu- tlon des nodules lymphatiques environnants; 4. Une tumeur accompagnée de métastases. Cependant, l'activité des phosphatase acides peut aussi être exaltée par d'autres syndromes, ce qui impose de ma- nière à pouvoir effectuer un diagncsUc rapide, d'avoir recours à un procédé analytique qui est à la fois sensible et spécifique. Il est connu en fait que dans le cas d'un cancer, quel que soit son mode et son lieu de localisation, seul un traitement rapide est susceptible de procurer de bonnes chances de succès thérapeutique: un tel traitement, dans le cas du cancer de la prostate, peut être exécuté uniquement dans les premiers stades de la croissance de la tumeur, lorsque les taux de phosphatase acide qui circulent dans le sérum sanguin sont très faibles. La détermination del'actlvité de l'APP peut etre effectuée directement, en employant des substrats plus ou moins spécifiques, ou également indirectement, en utilisant un inhi- biteur d'APP tel que l'acide tartrique. Dans ce dernier eas, la fraction de l'activité enzymatique attribuable à APP est calculée par différence entre l'activité totale et l'activité résiduelle, précisément en présence d'acide tartrique. Cepen- dant, l'utilisation de ce dernier composé en tant qu'inhibiteur de l'isoenzyme prostatique,ne confère pasundegré suffisant de spécificité au dosage parce que d'autres pourcentages de phos- phatase acide d'origine différente sont également inhibés, tels que plus particulièrement celle provenant des plaquettes san- guines, du foie et du rein. L'utillsation d' antisérum spécifique a récemment été suggéréepour la détermination immunochimique de 'APP, ren- dant ainsi possible d'isoler l'isoenzyme prostatique du sérum sanguin dans lequel d'autres types de phosphatases sont égale- ment contenus. Des procédés telsque la contre-immnuncé1ectrophorfsle,et les dosages radioimmunologiques sont basés précisément sur un tel principe de base immunochimique. La contre.immunoélectrophorèse est un procédé qui est à la fois relativement simple et spécifique mais, quoi qu'il en soit, il ne permet pas les dosages quantitatifs. Les dosages radiommunologiques permettent une mesure quantitative, mais il y a des facteurs susceptibles de limiter leur possibilité d'utilisation pratique tels que le coût des réactifs, les dangers pour la santé provenant de l'utilisation de radioisotopes, l'lnstabilité des enzymes marquées et la nécessité d'employer des quantités importantes de phosphatase acide prostatique humaine dans des conditions de pureté pour la préparation des dispositifs de diagnostic. La demanderesse a découvert un procédé qui fait l'objet de la présente invention par lequel il est possible d'exécuter une analyse quantitative de la phosphatase acide protastique par un procédé simplifié, avec une sensibilité élevée, une haute précision et un degré très satisfaisant de spécificité.Le procédé selon l'invention ne requiert l'utilisa- tion d'inhibiteurs et en outre, procure l'avantage de déter- miner la phosphatase acide prostatique après qu'elle ait été séparée de facteurs d'inactivation qui peuvent être conte- nus dans le sérum sanguin à tester (P. Vihko, Clln. Chem.24, 1783 (1979)). En outre, le procédé selon l'invention ne requiert pas l'adoption de traceurs radioactifs onéreux et périssables et ne requiert pas davantage une préparation pré- liminaire de quantités importantes d'enzyme pure pour obtenir l'enzyme marquéequl est nécessaire pour qu'un dosage quantita- tif radioimmunologique puisse être exécuté. Conformément à la présente invention, le procédé de détermination de APP consiste donc à aJouter à l'échantll- lon à tester un antisérum spécifique, un sérum anti-gamma- globullne de la même espèce animale que celle utilisée pour la préparation de l'antisérum spécifique (ces sérums peuvent être dilués dans une solution-tampon appropriée), à centrifu- ger la suspension ainsi obtenue et finalement à mesurer l'actl- vité enzymatique du résidu par addition d'une solution d'un substrat approprié. La-.dtermination de l'activité enzymatique dans le résidu de la centrifugation peut être effectuée parce que l'enzyme APP conserve son activité même lorsqu'elle est liée à des anticorps spéciflques. La demanderesse utilise avantageusement en tant que substrat, le sel de sodium de l'acide p-nitrophénylphosphorl- que, mais des résultats satisfaisants peuvent également être obtenus lorsqu'on utilise d'autres sels de cet acide, et cela est également vrai lorsqu'on utilise des sels de sodium, potas- sium, ammonium et des dérivés d'ammonium (par exemple cyclo- hexylammonium, 2-amlno-2-éthyl-l,3-propanediol, 2-amino-2- méthyl-l,3-propanediol), ou d'autres cations, des acides phénylphosphorique, béta-glycérolphosphorique, alpha-naphtyl- phosphorique, phénolphtaléinephosphorique, thymolphtaléine- phosphorique, alphanaphtyl-AS-BI phosphorique et béta-naphtyl- phosphorique. Le procédé qui permet la détermination de l'activl- té de APP peut être mis en oeuvre avantageusement en utilisant une composition qui fait également l'objet de la présente in- vention, constituéed'un réactif pour exécuter l'essai témoin, d'un sérum spécifique (ou d'une fraction d'anticorps correspon- dante), d'un sérum anti-gamma-globuline de la même espèce ani- male que celle utilisée pour la préparation du sérum anti-APP (ces réactifs peuvent être dilués dans une solution-tampon appropriée), et d'un système substrat-tampon qui est conçu pourla détermination de l'activité enzymatique, Le milieu réactionnel peut contenir un additif approprié pour obtenir une action de précipitation maximum sur l'immunocomplexe avec un effet simultané minimum sur les autres phosphatases libres: par exemple, le milieu peut contenir un polyéthylèneglycol. Le même effet peut également être obtenu en maintenant le pH dans l'intervalle allant de 4,8 à 5,6. Comme on l'a souligné ci-dessus, une telle compo- sition permet de mettre en oeuvre un procédé spécifique doté d'une sensibilité considérable accompagnée d'une rapidité et d'une simplicité d'exécution qui sont considérablement amélio- rées par rapport à celles des procédés Immunochimiques habituels. Toutes ces caractéristiques et d'autres variantes qui sont utiles pour la compréhension et la mise en oeuvre du procédé selon-la présente invention apparaltront clairement à la lecture de l'exemple qui suit dans lequel est donnée égale- ment la formulation de la composition, cet exemple étant unique- ment illustratif et non limitatif de la portée de l'invention. EXEMPLE On aJoute 0,2 ml de l'échantillon à tester, qui est du sérum sanguin humain frais acidifié avec de l'acide acétique à un pH d'environ 6, à 0,1 ml de sérum spécifique anti-APP, provenant par exemple de lapins, qui a été dilué de manière appropriée et, séparément, à 0,1 ml de sérum normal de lapin, dilué de manière appropriée, dans des tubes à essais ( de préférence des tubes à essais de 5 ml): on peut utiliser des tubes à essais en matière plastique, pourvu qu'ils ne pré- sentent pas de phénomènes d'adsorption. Les dilutions des sérurs qui sont utilisés en tant que réactifs sont optimisées par approximations successives sur les lots individuels disponibles. Dans l'exemple suivant, les réactifs sont: - sérum spécifique anti-APP, lot CP 0ll, dilution l:100 avec de la glycine O,1 M et 0,5% de solution de séro-albumine bovine: pH 7,2; - sérum de lapin normal, lot FB 201, dilution 1:75 avec la même solution que ci-dessus; - sérum anti-gammaglobuline de lapin et de chèvres, lot MB 25, dilution 1:15 avec un tampon au phosphate 10 mM, pH 7,0, NaCl 0,15 M avec du polyéthylèneglycol dans des conditions de corentration optimisées. Le tube à essais contenant le sérum anti-APP spécifique est l'échantillon d'essai, tandis que le tube à essais qui contient le sérum de lapin normal est le témoin. Après qu'un temps d'incubation approprié se soit écoulé (tem- pérature 4 C), qui peut varier de 5 minutes à 24 heures, 30 minutes étant le temps préféré, on ajoute à chaque tube à essais 1 ml de sérum d'antigamma-globuline de lapin et de chèvres, ou d'un autre animal immunisé de manière appropriée, dilué avec un tampon au phosphate 10 mM, pH 7, NaCl 0, 15 M. Le polyéthylèneglycol (6000) en une concentration optimisée est également dissous dans la solution-tampon pour obtenir l'effet de précipitation maximum sur l'immunocomplexe, mais avec une influence minimum sur les autres phosphatases libres. Dans les conditions qui ont ainsi été adoptées, la concentration de polyéthylèneglycol dans le diluant-tampon peut varier de 0,5% à 4%, 1,5% étant le pourcentage préfé- ré. Le même effet peut être obtenu en diluant le sérum anti-gamma globuline de lapin avec un tampon de pH acide, par exemple avec un tampon citrate 50 mM, ayant un pH allant de 4,8 à 5,6, la valeur préférée étant 5,3. Après une incubation appropriée à 4 C (de 5 minu- tes à 24 heures, de préférence 30 minutes), on effectue une centrifugation, par exemple 1500 g pendant 15 minutes, pour séparer l'immunocomplexe du liquide surnageant, ce dernier étant reJeté. On place le précipité dans un bain d'eau thermo- staté (37 C) et on le délaye dans une solution de substrat dans un tampon approprié. On peut employer n'importe quel substrat à condi- tion qu'il puisse être hydrolysé par les phosphatases acides, parce que l'isoenzyme prostatique a été séparéeimmrnologique- ment. Après un temps Jugé nécessaire pour qu'une évolution suffisante à partir du substrat des substances qui peuvent être déterminées à l'aide d'une réaction chimique subséquen- te ou qui sont aussi des substances chromogènes, puisse se produire, la réaction est stoppée par une solution alcaline. A titre d'exemple, la détermination de l'activi- té à l'aide du sei de sodium du p-nitrophénylphosphate est décrite ci-dessous. Les tubes à essais qui contiennent le précipité obtenu par centrifugation de l'échantillon d'essai et du témoin reçoivent une addition de 0,5 ml chacun de sel de sodium de p-nitrophénylphosphate dissous dans un tampon citrate 50 mM, pH 5,0 + 0,1 à une concentration de 6 mM. Après une incubation de 30 minutes (temps exact) à 37 C, on aJoute 1 mi de solution pout stopper la réaction, qui est une solution O,]N NaOH contenant 26,3 mM de Na3PO4. La différence des densité optiques à 405 nm entre l'échantillon d'essai et le témoin est lue. Cette différence, multipliée par 13,44, donne l'activité enzymatique attribuable à APP en mU/ml du sérum testé. REVENDICATIONS 1. Composition conçue pour la détermination de l'actIvi- té de la phosphatase acide prostatique (APP), caractérisée par le fait qu'elle comprend un sérum spécifique anti-APP, un sérum spécifique antigamma-globuline de l'espèce animale utilisée pour la préparation du sérum anti-APP, un substrat approprié, un réactif pour stopper l'activité enzymatique, un système-tampon et éventuellement, un polyéthylèneglycol. 2. Composition conçue pour la détermination de la phos- phatase acide prostatique selon la revendication 1, caractéri- sée par le fait que le substrat est un sel de sodium, potassium, ammonium, cyclohexylammonium, 2-amino-2 - éthyl-l,3-propanedlol, 2-amino-2-méthyl-l,3-propenediol, des acides p-nitrophényl- phosphorique, phénylphosphorique, P-glycérolphosphorique, alpha-naphtylphosphorique, béta-naphtylphosphorique, phénol- phtaléine phosphorique, thymclphtaléinephosphorique, naphtyl-AS- BI phosphorique. 3. Composition conçue pour la détermination de l'activi- té de la phosphatase acide prostatique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par le fait que le substrat est constitué par le sel de sodium de l'acide p-nitrophénylphosphorique. 4. Procédé de détermination de l'activité de la phospha- tase acide prostatique caractérisé par le fait qu'il consiste à: a) ajouter à l'échantillon à tester un anti-sérum spécifi- que et un sérum anti-gamma-globuline de l'espèce animale utilisée pour la préparation de l'anti-sérum spécifique, b) centrifuger la suspension ainsi obtenue, c) ajouter au résidu une solution d'un substrat approprié, d) mesurer l'activité enzymatique. 5. Procédé de détermination de l'activité de la phospha- tase acide prostatique selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le substrat est un sel de sodium, potassium, ammonium, cyclohexylammonium, 2-amino-2-éthyl-l,3-propanediol, 2-amino-2-méthyl-l,3-propanedio, des acides p-nitrophényl- phosphorique, phénylphosphorique, béta-glycérolphosphorique, alpha-naphtylphosphorique, béta-naphtylphosphorique, phénol- phtaléinephosphorique, thymolphtaléinephosphorique, alpha- naphtyl-AS-BI phosphorique. 6. Procédé de détermination de l'activité de la phospha- tase acide prostatique selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le substrat est constitué du sel de sodium de l'acide p-nltrophénylphosphorique. 7. Procédé de détermination de l'actlvité de la phospha- tase acide prostatique selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'opération a) est exécutée en présence de polyéthylèneglycol. 8. Procédé de détermination de l'tactivité de la phospha- tase acide prostatique selon la revendication 4, caractérisé lO par le fait que l'opération a) est exécutée à un pH compris entre 4,8 et 5,6.