Brevet FR2502338A1 — publié le 19820924

La détection des potentiels cancérogènes, neutres, toxiques ou spécifiquement anticancéreux par un test biochimique rapide, a récemment fait l'objet d'une demande de brevet ne 77 28208. Ce test est basé sur l'action qu'exercent les différentes substances à tester dans la réplication in vitro des acides desoxyribonucléiques (ADN) isolés des cellules humaines ou animales saines et de cellules cancéreuses correspondantes. On mesure la quantité d'ADN radioactif synthétisé (acido précipitable) en utilisant comme matrice d'une part les ADN des tissus cancéreux et d'autre part des ADN de tissus sains.La synthèse a lieu dans un milieu d'wcubation contenant du tampon; du Mec12 et les quatre desoxyribonuclEoside-5'-triphosphates ADN dépendante. Les cancérogènes stimulent fortement la synthèse des ADN cancéreux; et faiblement celle des ADN de tissus sains. Les anticancéreux inhibent fortement la synthèse des ADN cancéreux, peu ou pas celle des ADN isolés des tissus sains. Différents tests biologiques ont été proposés pour la détection et la sélection des substances cancérogènes. Le test de Salmonella/microsome semble le plus utilisé dans ce but. La plupart des cancérogènes provoquent la mutation des bactéries His de Salmonella en bactéries His + (la bactérie His n'est pas capable de synthétiser l'histidine et ne peut pas croître tandis que la bactérie His le peut). Ce test a permis d'établir une corrélation entre les cancérogènes et les mutagènes.Cependant 10 à 20% des cancérogènes ne sont pas mutagènes, comme par exemple l'éthionine (puissant cancérogène du foie des animaux) ou l'actinomycine D, la bléomycine... (Benedict W.E Backer M.S.; Haroun L.; Choi E.; et Ames B.N Cancer Research 37 : 2209-2213 (1977)(test de Ames) et Mc Cann J.; Choi E.; Yamasaki E.; et Ames B.N. Proc. Nanti. Acad. Sci. USA 72 5135-5139 (1975). Conformément à la présente invention, au lieu d'étudier les mutations bactériennes induites par les can cérogènes, on va étudier l'action directe de ces derniers sur 1'ADN isolé de la bactérie mutante His de Salmonella. I1 a semblé en effet concevable que 1'ADN du mutant His réagirait aux cancérogènes alors que 1'ADN des bactéries témoins ne serait pas réactif. En effet, 1'ADN isolé de mutant Bis utilisé comme matrice pour la synthèse de 1 'ADN polymérase ADN dépendante, permet de montrer que les cancérogènes stimulent fortement in vitro de 1'ADEJ His (taux de synthèse mesuré par la radioactivité) ; dans les mêmes conditions, les cancérogènes n'ont pas d'action sur l'ADN des bactéries sauvages de Salmonella. Cette différence exprime une réac tivité différentielle de 1'ADN provenant du mutant His par rapport à 1'ADN provenant des bactéries sauvages. Cette différence est utilisée comme critère dans cette extension du test précédemment décrit et permettant de sélectionner selon leur potentiel, les substances à tester. Conformément à la présente invention un procédé de détection des substances à potentiels cancérogènes, neu tresr toxiques ou sp6cifigvemellt anticancéreux, est carac térisé en ce qu'on compare action de ces substances dans la synthèse in vitro des ADN isolés des mutants bactériens (dont le mutant His de Salmonella typhimurium) et des ADN des bactéries sauvages correspondant est on reconnait 1) les substances cancérogénes à ce qu'elles stimulent fortement la synthèse des ADN des mutants mais pratiquement pas celle des ADN des bactéries témoins 2) les substances spécifiquement anticancéreuses, à ce qu'elles inhibent l'initiation de la synthèse ou de l'élon- gation de la chaine d'ADN en voie de synthèse, sur ADN des mutants utilisé comme matrice, mais sont sans action appréciable sur les ADN témoins 3) les substances neutres, qui n'agissent ni sur 1'ADN des mutants ni sur 1'ADN des bactéries témoins ; et 4) les substances toxiques, qui inbibent la synthèse de l'ADN des mutants et celle des ADN témoins. Sur les dessins ci-joints, Les figures 1 à 11, sont des graphiques représentant l'action de produits cancérogènes indiqués sur chaque figure, respectivement sur 1'ADN His (courbe A) et 1'ADN His+ (courbe B). On a indiqué en abscisse la concentration en g du produit pour 0,5 pg d'ADN et en ordonnée la quantité d'ADN synthétisée exprimée en radioactivité : coup par minute x Les figures 12 à 17 sont des graphiques représentant l'action de diverses substances, indiquée sur chaque figure, respectivement sur 1'ADN His (courbe A) et 1'ADN His + (courbe B). Les coordonnées sont les mêmes que pour les figures 1 à 11. La figure 18 est un graphique représentant l'action de deux anticancéreux spécifiques, la serpentine et l'alstonine respectivement sur 1'ADN His (courbe A) et + 1'ADN Bis (courbe B), les coordonnées étant les mêmes que précédemment. Les figures 19 à 22 sont des graphiques représentant l'accroissement de l'absorption (pourcentage d'augmentation de l'absorption) à 260 manomètres pour certains des produits indiqués sur les figures précédentes, en fonction des concentrations telles que définies ci-dessus. Les cancérogènes bien connus, 9,10 -dimethylbenz(a) anthracene (DMBA),3-methylcholanthrene, 2-acetylaminofluo- rence, ethionine, stimulent fortement la synthèse de 1'ADN du mutant His , et n'ont pas d'action sur celle de 1'ADN des bactéries sauvages (témoins). De même, les cancérogènes stimulent également la synthèse de 1'ADN d'autres mutants, tels celui des bactéries showdomycino-resistantes d'E.coli, sans pour autant agir sur 1'ADN des bactéries sauvages d'E.coli (T 3000). La technique d'isolement de 1'ADN a partir des bactéries mutantes ou sauvages (Salmonella typhimurium et Escherichia coli) a été réalisdeselon les techniques classiques d'isolement des ADN intacts (polymérisés). Les ADN purifiés sont dialysés -20 . La quantité d'ADN purifié (0,38 de protéines et 0,5% d'ADN) est déterminée par l'absorption à 260, 280 et 230 nm. L'intégrité est contrôlée par ultracentrifugation et l'effet hyperchromique (augmentation de l'absorption à à 260 nm) est contrôlé par incubation en présence de KOH 0,1 N sUr une fraction aliquote. La préparation d'ADN polymérase ADN dépendante d'Escherichia coli est identique à celle utilisée dans le brevet français 77 28208. Le milieu réactionnel dans lequel s'effectue la synthèse de 1'ADN radioactif en l'absence et en présence de substance à tester, est identique à celui utilisé dans le brevet n 77 28208 ; le tampon Tris a été remplacé par le tampon phosphate pH 7,65. Les conditions opérationnelles sont identiques. Les résultats obtenus en utilisant comme matrice d'une part 1'ADN du mutant His et d'autre part 1'ADN des + bactéries sauvages His sont les suivants Les cancérogènes connus stimulent fortement la synthèse de 1'ADN His et non celle de 1'ADN His+ (figures 1 à 11 > . L'actinomycine D, la bléomycine et l'éthionine qui, bien que cancérogènes chez les animaux, n'agissent pas comme mutagènes dans le test dé Ames (voir ci-dessus). Cependant ces trois substances stimulent fortement la synthèse in vitro de 1'ADN His et n'ont pas d'action sur celle de 1'ADN His+ , ce qui confirme par le test leur comportement de cancérogènes chimiques. Les substances neutres n'ont aucune action sur la synthèse de 1'ADN His ou His+.(figures 12 à 17). Les substances toxiques inhibent sans distinction la synthèse de 1'ADN His et His+ en mhibantl'activite de llADN polymérase ADN dépendante. Les substances anticancéreuses spécifiques inhibent in vitro la synthèse de 1'ADN His mais non celle de 1'ADN His (Figure 18). Des résultats identiques ont été obtenus en utilisant 1'ADN provenant de bactéries showdomycinorésistantes d'E.coli et 1'ADN des bactéries sauvages 1'ADN des bactéries M 500 Sho-R se comporte en présence de cancérogènes, de substances neutres, toxiques ou anticancéreuses, comme 1'ADN His de Salmonella typhimurium ou encore comme les ADN isolés de tissus humains ou animaux, tissus cancéreux. I1 existe donc un mécanisme commun aux ADN cancéreux, aux ADN His ou Sho-R. Ce dénominateur commun a été déterminé et explique la forte stimulation de la synthèse de ces ADN par les cancérogènes alors que très peu ou pas d'effet sont observablespour les ADN témoins correspondants. Séparation des chaines d'ADN His ou ADN Sho-R ou cancéreux: Les cancérogènes chimiques et certains autres composés, ont une action particulière sur les ADN His-, Sho-R ou encore ADN isolés de tissus cancéreux, action qu'ils n'ont pas sur des ADN isolés des bactéries sauvages correspondantes ou sur les ADN provenant de tissus sains. En effet, un ADN purifié bien polymérisé (double brins), mis en suspension dans du tampon tris pH 7,65, ne manifeste pas de séparation spontanée de ses doubles brins, séparation que l'on évalue par l'absorption de 1'ADN en lumière ultra-violette (accroissement de l'absorption a 260 nm lorsqu'il y a hyperchromicité, c'est-a-dire séparation des doubles chaines de 1'ADN) (Figures 19 a 22). Or à des concentations choisies et en présence de 20 pg d'ADN/ml, chacun des agents capables de stimuler in vitro la synthèse de 1'ADN His augmente également l'hyperchromicité de 1'ADN mais ne le fait pas sur 1'ADN His (Figures 19 a 22). La même augmentation d'hyperchromicité s'observe en présente de cancérogènes et d'ADN M500 Sho-R mais ne s'observe pas pour 1'ADN de la souche témoin T 3000 (Estérichia coli). Ainsi l'ouverture des doubles chaînes des ADN His, Sho-R sous l'effet de substances à potentiel cancérogène, permet-il d'activer la matrice, d'où synthèse accélérée de ces ADN en présence des cancérogènes. Ceci s'explique par une fragilité des liaisons hydrogènes chez ces ADN, fragilité qui permet une ouverture des channes difficilement réalisable chez les ADN sains ou témoins. L'enzyme utilisé lors de la synthèse in vitro des ADN travaillant sur matrice simple brin, l'ouverture sous l'effet des cancérogènes permet de fournir à enzyme plus de matrice, d'où plus de synthèse. L'additivité de l'effet des cancérogènes, utilisés chacun séparément à une concentration saturante (figure 22) permet aux ADN His, Sho-R une ouverture pouvant aller jusqu'à 40%, ce qui est considérable (le maximum observable pour une de naturation complète de 1'ADN en présence de KOH à 452 étant de 35%). En présence des ADN His+, T 3000, les cancéro- gène s ne peuvent provoquer au maximum qu'une ouverture de l'ordre d 3% (parties droites des figures 19 à 22). A l'inverse des cancérogènes, les potentiels anticancéreux inhibent la synthèse in vitro des ADN His , Sho-R, mais n'inhibent pas la synthèse des ADN His+, T 3000. Ainsi peut-on détecter des potentiels cancéro- gènes ou anticancéreux par synthèse in vitro des ADN His ou ADN Sho-R (ou de tout autre mutant dont les ADN pré- sentent des propriétés comparables) et/ou par étude de l'hyperchromicité de ces mêmes ADN en présence de la substance à tester, les ADN homologues témoins (His ,T 3000) faisant référence. REVENDICATIONS : 1.- Procédé de détection des substances à potentiels cancérogènes, neutres, toxiques ou spécifiquement antieancéreux, caractérisé en ce qu'on compare l'action de ces substances dans la synthèse in vitro des ADN isolés des mutants bacteriens (dont le mutant His de Salmonella typhimurium) et des ADN des bactéries sauvages correspondantes ; on reconnaît 1) les substances cancérogènes à ce qu'elles stimulent fortement la synthèse des ADN des mutants (courbe A,figures 1 à 11 > mais pratiquement pas celle des ADN des bactéries témoins (courbe B, figures 1 à 11) 2) les substances spécifiquement anticancéreuses, à ce qu'elles inhibent l'initiation de la synthèse ou de l'élon- gation de la chaîne d'ADN en voie de synthèse, (courbe A figure 18), sur ADN des mutants utilisé comme matrice, mais sans action appréciable sur les ADN témoins , courbe B figure 18) 3 les substances neutres, qui n'agissent ni sur 1'ADN des mutants ni sur 1'ADN des bactéries témoins (figures 12 a 17) 4) les substances toxiques, qui inhibent la synthèse de 1'ADN des mutants et celle des ADN témoins. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce qu'on compare l'action de la substance a tester de préférence sur deux ou plusieurs couples différents d'ADN, un couple d'ADN étant constitué par un ADN du mutant bactérien et un ADN témoin de souche correspondante de méme espèce 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les deux couples d'ADN sont de préférence choisis parmi les suivants -ADN du mutant His et ADN des bactéries sauvages de Salmonella typhimurium -ADN des bactéries showdomycino-restantes et ADN des bactéries sauvages d'Escherichia coli -ADN isolé soit de mutant soit de bactérie resistante aux antibiotiques et présentant une réactivité particulière en présence de cancérogènes ou de substances anticancéreuses, réactivité évaluée soit par la synthèse in vitro de 1'ADN, soit par une modification physicochimique induite par ces substances. 4.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on fait agir une substance à tester d'une part sur ADN de bactérie mutante (ou résistante) et d'autre part sur 1'ADN témoin dans un milieu d'incubation tamponné à pH avoisinant 7,65 contenant quatre desoxyribonucléoside-5'-triphosphates en quantités équimolaires (dont un marqué par la radioactivité) et en présence d'une enzyme ll'ADN polymérase ADN dépendante3 pendant 10 sinues à 360C, qu'on arrête la réaction par addition d'acide tri chloroacétique et qu'on mesure la radioactivité du préci pité formé, constitué par 1'ADN synthétisé. 5.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les quatre desoxyribonucléoside-5'triphosphates présents dans le milieu d'incubation sont le desoxy-guanosine-5'-triphosphate, le desoxyadénosine- 5'-triphosphate, le desoxycytidine-5'-triphosphate et le thymidine-3' -triphosphate. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le desoxyribonucléosîde -5'-triphosphate est marqué par la radioactivité au niveau de la base. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on utilise une série de doses de substance à tester échelonnées de 0 à 100 g pour 0,5 à 1 g d'ADN matriciel. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'enzyme ADN-polymérase utilisée est un ADN polymérase ADN dépendant I et le pH étant ajusté autour de 7,65. 9.- Procédé selon une des revendications 1 à 8, caractérisé par la détection des cancérogènes par leur effet spécifique se manifestant par l'ouverture des deux brins d'ADN (et faisant de la sorte apparaître en quantité notable des simples brins) chez les ADN mutants (ou des micro-organismes résistants à des agents différents) et faiblement ou pas chez les bactéries ou micro-organismes témoins sauvages d'espèces correspondantes (figures 19 à 22). 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'ouverture des brins de 1'ADN de mutants ou résistants à divers agents, est mesurée par l'augmenta- tion de l'absorption en UV, libération de chaleur ou tout autre moyen de mesure correspondant a l'apparition des simples chaines d'ADN. 11.- Réactif pour mettre en oeuvre le procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est constitué par un couple ADN-mutant (ou ADN-résistant) et ADN témoin, tel que défini dans les revendications 2 et 3, les ADN étant purifies par un procédé connu et presentant un rapport des absorbances dans l'UV a 260 nm et à 280 nm variant de 2,0 à 2,1 et une teneur en protéine de 0,3 à 0,6%.