Brevet FR2500476A1 — publié le 19820827

i Les travaux sur lesquels la présente demande est basée ont été appuyés par la subvention de recherche RO1 A1 115 113 du Service de Santé publique du National Institue of Allergy and Infectious Diseases. Le développement d'un vaccin contre la syphilis a été entravé par l'impossibilité de cultiver in vitro l'organisme responsable, à savoir Treponema pallidum. Des succès obtenus ont été mentionnés dans des publications, mais lorsque des chercheurs différents ont expérimenté des modes opératoires identiques, ils n'ont pas observé de multiplication. Pour réaliser la culture nécessaire, il est essentiel qu'un procédé soit reproductible dans d'autres laboratoires avant qu'on puisse parler de sa réussite. C'est ainsi que l'on peut consulter les brevets des Etats- Unis d'Amérique N 2 255 079, N 2 513 327, N 2 709 670, N 3 502 546 et N 4 098 646. Voir également Graves et collaborateurs, Retention of Motility and Virulence of T. pallidum in vitro; Infection and Immunity. 1975, 12(5) 1116-20 (Etats-Unis d'Amérique), - Serzhantova, Growth of T. pallidum in a Thioglycollate Medium Vestn. Dermatol. 1969, 43(8) 48-51 (en russe), - Boak et collaborateurs, Studies on the Cultivation of T. pallidum, American Journal of Syphilis, Gonorrhea, Venereal Diseases 33, 409-15 (1942). Voir également Fitzgerald,The Future of Tissue Culture Methods for Growth of Treponema pallidum in vitro, Sexually Transmitted Diseases, Avril-Juin, 1980, pages 97-99, - et Musher et collaborateurs -The Role of a Vaccine for Syphilis - ibid., Octobre-Décembre 1977, pages 163-166, C. D. Cox et M. K. Barber 1974. Oxygen uptake by Treponema pallidum, Infect. Immun. 10:123-127. A. H. Fieldsteel, F. A. Becker et J. G. Stout, 1977, Prolonged survival of virulent Treponema pallidum (Nichols strain) in cell-free and tissue culture systems, Infect. Immun. 18:173-182. A. H. Fiedsteel, D. L. Cox et R. A. Moeckli, 1981, Cultivation of virulent Treponema pallidum in tissue culture, Infect. Immun. 32:905-915. A. H. Fieldsteel, J. G. Stout et F. A. Becker, 1981, Role of serum in survival of Treponema pallidum in tissue culture in vitro, 17:28-32. T. J. Fitzgerald,R. C. Johnson, J. A. Sykes et J. N. Miller, 1977, Interaction of Treponema pallidum (Nichols strain) with cultured mammalian cells: Effects of oxygen, reducing agents, serum supplements, and different cell types, Infect. Immun. 15:444-452. G. E. Kimm, R. H. Allen, M. J. Morton et J. F. Morgan, 1962, Studies on the in vitro survival of virulent Treponema pallidum, Am. J. Hyg. 75:339-356. 5. A.R.iCelson Jr. 1948, Factors affecting the survival of Treponema pallidum in vitro, Am. J. Hyg. 48:120- 132. P. L. Sandok, H. M. Jenkin, H. M. Matthews et M. S. Roberts, 1978, Unsustained multiplication of Treponema pallidum (Nichols virulent strain) in vitro in the presence of oxygen, Infect. Immun. 19:421-429. T. B. Turner et D. H. Hollander, 1957, Biology of the treponematoses, W.H.O. Monogr. Ser. N 35. M. M. Weber 1960, Factors influencing the in vitro survival of Treponema pallidum, Am. J. Hyg. 71:401- 417. Les tentatives de culture de Treponema pallidum, agent responsable de la syphilis, sont la conséquence pres- que naturelle de sa découverte. Bien que de nombreux cher- cheurs aient prétendu en avoir fait la culture in vitro, aucune des souches isolées ne s'est montrée pathogène ou rien n'a prouvé qu'elles avaient une relation causale avec la maladie à tréponème chez les êtres humains. En outre, des chercheurs qui ont effectué des études sérologiques sur des souches Nichols, Noguchi, Reiter, Kazan et Kroo culti- vables de T. pallidum présumé ont trouvé que ces souches appartenaient à trois groupes sérologiques distincts et qu'elles étaient différentes, des points de vue morphologi- que et antigénique, de T. pallidum. Ils ont donc mis en doute l'identification de ces tréponèmes en tant que souches de T. pallidum. Plus récemment, les auteurs de la présente demande ont recouru à l'analyse biochimique pour déterminer s'il existait des relations génétiques entre T. pallidum virulent et cinq tréponèmes cultivables non virulents isolés d'êtres humains. Non seulement la composition de base (teneur en G+C) de l'acide désoxyribonucléique (ADN) des tréponèmes cultivables diffère beaucoup de celle de T. pallidum, mais des épreuves de réassociation par satu- ration ont révélé l'absence d'homologie décelable de la séquence de l'ADN. Par conséquent, les tréponèmes culti- vables non pathogènes étudiés n'étaient ni des variants ni des mutants de T. pallidum et constituaient des organis- mes réellement distincts du point de vue génétique. Initialement, on a en général supposé que T. pallidum était un organisme anaérobie parce qu'il survi- vait mal dans des conditions aérobies. Par conséquent, lorsqu'on a tenté de réaliser la survie et/ou la reproduc- tion de T. pallidum in vitro, on a entretenu des conditions anaérobies et on a ajouté des agents réducteurs aux milieux pour abaisser le potentiel d'oxydo-réduction. Bien que le temps de survie à 50 % (TS50) de T. pallidum ait atteint 16 jours dans ces conditions, il n'y avait manifestement aucune corrélation entre le TS50 et la virulence envers des lapins, qui avait disparu au bout de 6 jours in vitro. Malgré la nature anaérobie manifeste de trépo- nèmes, la présence de cytochromes a été démontrée chez le tréponème cultivable non pathogène de Reiter (T. phagedenis biotypique de Reiter), ce qui a suggéré l'utilisation pos- sible de l'oxygène moléculaire dans certaines conditions. Plus récemment, il a été démontré que T. pallidum consom- mait de l'oxygène à la même vitesse que le faisait un spirochète aérobie connu du genre Leptospira. L'absorption d'oxygène du premier a été sensible au cyanure, ce qui a indiqué que T. pallidum contenait un système fonctionnel de cytochrome-oxydase et était donc capable d'une respira- tion aérobie. Dans une étude portant sur les mécanismes impliqués dans le transport d'électrons terminaux par T. pallidum, ces observations ont été confirmées, laissant peu de doute en ce qui concerne l'aptitude à la respiration aérobie de T. pallidum virulent. Par conséquent, en raison de l'échec de toutes les tentatives de culture de T. nallidum dans des conditions anaérobies, il apparaît plus que pro- bable que l'oxygène est indispensable à la reproduction in vitro. Entre 1913 et 1948, quelques tentatives isolées ont été faites en vue de cultiver T. pal!idum dans des tissus de mammifères, et elles ont donné des résultats uniformément négatifs. Récemment, la culture de T. pallidum dans des cellules de mammifères a suscité un regain d'intérêt. Plusieurs chercheurs, utilisant des modes de culture aérobies et anaérobies, ont noté la fixation de T. pallidum à des cellules de culture sur tissu, avec des périodes de survie allant de 24 heures à 23 jours. La meilleure survie s'est manifestée dans des conditions de faible tension d'oxygène (3 %) et lorsque des agents réducteurs ont été ajoutés au milieu. Toutefois, les signes de reproduction des tréponèmes ont été faibles ou nuls. Par exemple, en 1976, Jones et collaborateurs (British Journal of Venereal Diseases 52:18-23) ont prdten- du avoir démontré la reproduction et le repiquage de T. pallidum pathogène dans des cultures de rein de jeunes hamsters, mais Foster et collaborateurs (ibid.) 53:338-339 ne sont pas parvenus à confirmer ces résultats. D'autres ont démontré ce qu'ils appelaient une "multiplication non entretenue" de T. pallidum dans des cultures sous tension d'oxygène réduite, tant en présence ql1'en l'absence de cellules de mammifères. La virulence des tréponèmes s'est atténuée en fonction du temps in vitro. La source initiale de T. pallidum virulent con- siste en testicules de lapins préalablement inoculés par voie intratesticulaire. Les organismes sont extraits d'un hachis de testicules dans un milieu de culture sur tissu. Le milieu d'extraction testiculaire et le milieu de culture sur tissu utilisé pour la croissance de T. pallidum consiste en un milieu essentiel minimal (MEM) de Eagle modifié, qui est préparé en réunissant les composants suivants dans de l'eau distillée jusqu'à un volume final de 100 ml: 10 ml de solution équilibrée de sels de Earle 10x, sans rouge de phénol et sans NaHCO3, 2 ml d'amino-acides de MEM 50x, 1 ml de vitamines de MEM 100x, 1 ml de L-glutamine 200 mM, 1 ml d'amino-acides non essentiels de MEM 100x, 1 ml de solution d'héparine sodique à 100 U/ml et 150 mg de glucose. On fait passer brièvement un courant de CO2 dans la solution, puis on ajoute 3,38 ml de NaHCO3 (7,5 %), 3,13 ml de HEPES 1 M (tampon organique), 0,63 ml de résazurine (20 mg %), 10 mg de pyruvate de sodium et 10 mg de DTT. On stérilise la solution par filtration, puis on ajoute 25 ml de sérum de foetus de bovidé (SFB) ou de sérum de veau inactivé à la chaleur. Ce milieu de culture est appelé milieu MBRM (Milieu de Base Réduit, modifié). La fiole de milieu est ensuite traitée trois fois alternativement par mise sous vide et passage d'un courant gazeux formé d'un mélange de % de CO2 et de 95 % de N2, et elle est conservée pendant la nuit avant l'usage. Deux à quatre jours après l'infection avec T. pallidum, des fioles de culture de tissus ou des flacons de prescription sont ensemencés avec des cellules épithélia- les (SflEp) de lapin du genre Sylvilagus en milieu MEM plus % de SFB, et incubés à 330C. Avant l'inoculation des tréponèmes, le milieu est retiré des fioles et remplacé par 10 ml de MBRM. On soumet les cultures au passage d'un courant de gaz à 5 % de C02 et 95 % de N2 pendant 1 minute à un débit de 3 litres/minute et on laisse s'équilibrer pendant 4-5 herres avant l'inoculation. L'extrait testicu- laire fraîchement recueilli contenant T. pallidum est ensuite dilué dans de l'extrait testiculaire ne contenant pas de tréponème (liqueur surnageante d'extrait infecté centrifugé à 12 000 x g pendant 10 minutes) de manière qu'un volume de 0,34 ml contienne le nombre désiré de tré- ponèmes à inoculer dans chaque fiole. Il en est ainsi égale- ment dans le milieu MBRM contenant l'extrait testiculaire à une concentration de 1:30, que l'on a préalablement recon- nu comme étant essentiel à la survie de T. pallidum en culture de tissu. Il est également possible d'utiliser un extrait testiculaire provenant de lapins non inoculés. En outre, il est possible d'utiliser l'extrait à l'état frais ou de le congeler à -80 C et de le décongeler juste avant son utilisation comme indiqué dans le présent mémoire. Les cultures sont ensuite exposées pendant 1 minute au passage d'un gaz contenant 1,5 % de 02, 5 % de C02 et 93,5 % de N2 à un débit de 3 litres/minute et l'incubation est effec- tuée à 33 C. Les cultures sont ensuite sacrifiées à divers intervalles allant jusqu'à 12 jours. Lorsque l'inoculum renferme 1 x 106 tréponèmes, il y a un accroissement du nombre de T. pallidum atteignant un facteur 100 le neuvième jour de l'incubation. On a trouvé que ces tréponèmes étaient virulents. Après inoculation intradermique à des lapins, des lésions indurées érythémateuses contenant T. pallidum sont apparues. Dans une série d'exemples annexes, il a été démontré que la souche Nichols virulente de Treponema pallidum se fixait et se reproduisait à la surface de cellules de culture de tissus de l'épithélium de Sylvilagus (SflEp) se développant en cultures monocouche classiques sous tension d'oxygène dissous de 1,5 %. Cinq jours apres l'inoculation de 106 T. pallidum, le nombre de tréponèmes - 6 7 s'était élevé entre 8 x 10 et 2,59 x 107. La viabilité d'organismes récoltés allait de 86 à 97 %. Le nombre de T. pallidum a continué de croître, atteignant généralement un palier entre le neuvième et le douzième jour d'incuba- tion, avec des accroissement pouvant atteindre un facteur et représentant en moyenne un facteur 49. On a constaté qu'il existait un plafond de multiplication d'environ 2 x 108 quel que soit l'inoculum, qui allait de 1 x 106 à 1 x 108 T. pallidum. Dans chaque expérience, des organismes ont été recueillis dans le groupe inoculé avec 1 x 10 T. pallidum après 7 jours d'incubation pour tester la virulence. Dans tous les cas, les organismes étaient virulents; des lésions érythémateuses indurées renfermant le tréponème ont été produites à partir d'une moyenne de 6 à 7 organismes. L'examen au microscope électronique à balayage a révélé qu'au cours de la reproduction, de nombreuses microcolonies de tréponèmes s'étaient formées à la surface des cellules. Plusieurs paramètres visant à optimiser les con- ditions de culture tant pour les cellules SflEp que pour Treponema pallidum ont également été examinés. La tempéra- ture optimale pour la reproduction de T. pallidum se situait dans une plage de 33 à 350C. A 330C, la reproduction a lieu en présence de concentrations en oxygène atmosphérique de moins de 0,3 % à 10 %, la plage optimale allant de 1,5 à %. Aucune reproduction n'a eu lieu en présence de 12,5 % d'oxygène. Lorsqu'on a fait varier la température et les concentrations en oxygène, respectivement, entre 33 et 350C et entre 1,5 et 5 %, on a observé peu de différences dans la reproduction. Bien qu'une variation de la concentration en oxygène dans chaque groupe de températures ait exercé peu ou pas d'effet sur la reproduction, elle a en fait in- fluencer la motilité, qui est restée plus grande à la con- centration en oxygène de 5 % après 9 à 12 jours de culture. La concentration optimale de sérum de foetus de bovidé (SFB) dans le milieu de culture a été égale à 20 %, bien que la reproduction ait eu lieu à des concentrations allant de 5 à 30 %. Le sérum de veau, soigneusement sélectionné, pourrait être substitué au sérum de foetus de bovidé. L'ex- trait testiculaire a été un composant essentiel du milieu de culture. Bien que l'extrait obtenu à partir d'un lapin adulte - normal ou infecté par T. pallidum - ait été légère- ment supérieur, la reproduction de T. pallidum a eu lieu lorsqu'on a utilisé, à la place, un extrait de testicule de rat ou de hamster. MATERIEL ET METHODES Lapins. Des mâles blancs de Nouvelle-Zélande pesant 3 à 4 kg, âgés de 6 à 8 mois et ne présentant pas d'infection à tréponèmes, comme déterminé par la non-réac- tivité au test VDRL, ont été utilisés pour le passage testiculaire et comme source de tréponèmes pour l'inocula- tion en culture de tissu. Des femelles âgées de 10 à 12 semaines ont été utilisées pour déterminer la virulence de T. pallidum après passage en culture de tissu. La région dorsale rasée de ces animaux a été inoculée par voie intracutanée avec 0, 1 ml de diverses concentrations de T. pallidum. Tous les animaux ont été maintenus dans des cages individuelles à une température de 16 à 18'C. T. pallidum. La souche Nichols virulente a été utilisée d'un bout à l'autre de cette étude et elle a été entretenue et soumise à des inoculations successives de la manière décrite par Fieldsteel et collaborateurs dans Infect. Immun. 18:173-182 (voir plus haut). Sérum de foetus de bovidé (SFB). On s'est aperçu que des lots de SFB du commerce, malgré leur aptitude à entretenir la croissance de cellules de mammifères, variaient grandement dans leur aptitude à entretenir la survie de Ts. pallidum. Par conséquent, tous les lots ont dû être comparés avec un lot connu pour son aptitude à entretenir la survie pendant au moins 2 semaines. Les lots admissibles ont été divisés en portions aliquotes suffisantes pour être utilisées dans une seule et même expérience. Les portions aliquotes ont ensuite été rapidement congelées dans un bain de neige carbonique et d'alcool et conservées à -20'C jusqu'au moment de leur utilisation, o on les a alors décongelées à 37WC. Bien que le sérum SFB ait été utilisé en l'occurrence, le sérum de veau est également efficace. Extrait de testicule et inoculums de cultures de tissus. Des lapins ont été inoculés par voie intratesticu- laire avec 5 x 10' T. pallidum. Les quatrième et neuvième jours après l'inoculation, les lapins ont été inoculés par voie intramusculaire avec 4 mg/kg de triamcinolone acétonide (Kenalog). Les testicules ont été prélevés dans des condi- tions aseptiques 12 jours (+ 1 jour) après l'infection, au moment o l'orchite est à son maximum. On les a débarrassés du tissu adhérent et on les a découpés en menus morceaux avec des ciseaux iris. Un testicule individuel a été extrait avec 5 ml de milieu MBRM (Milieu de Base Réduit, Modifié; voir ci-dessous en ce qui concerne la préparation) dans une fiole de Fernbach de 50 ml. L'air a été chassé de la fiole avec de l'anhydride carbonique à 5 % dans l'azote. La fiole a été bouchée à l'aide d'un bouchon en caoutchouc silicone et placée dans une senoueuse mécanique (118 oscillations/ minute) pour une durée de 30 minutes, à 33WC. L'extrait a ensuite été centrifugé à 500 x g pendant 5 minutes pour éliminer les particules grossières, et les tréponèmes ont été dénombrés dans la liqueur surnageante. Cette liqueur surnageante a ensuite été diluée dans de l'extrait testi- culaire infecté (ETI) frais. Ce dernier constitue la liqueur surnageante de l'extrait infecté centrifugé à 12 000 x g pendant 10 minutes. Ce traitement n'élimine pas nécessaire- ment la totalité des tréponèmes de la liqueur surnageante, mais on a observé que le résidu n'accroissait pas notable- ment le nombre total. La dilution avec l'extrait ETI est effectuée de manière que 0,34 ml de l'extrait renfermant des tréponèmes contienne le nombre désiré de tréponèmes devant être inoculé dans chaque fiole. L'addition de cet extrait à 10 ml de milieu MBRM, c'est-à-dire la quantité utilisée dans les bouteilles de culture de tissu, donne un rapport ETI:MBRM de 1:30, dont on a antérieurement déterminé le caractère essentiel à la survie de T. pallidum dans une culture de tissu comme indiqué dans Fieldsteel et collaborateurs, supra. MEM trypsine-"Versène" (MEM T-V). Cette solution consiste en milieu essentiel minimal (MEM) dépourvu d'ions Ca++ et Mg, contenant 10 mg % de dithiothréitol (DTT), mg % de trypsine cristalline et 20 mg % de "Versène" (EDTA-acide éthylènediamine-tétra-acétique, agent chélateur). Avec cette solution, il a été possible non seulement de rompre la monocouche cellulaire, mais aussi de séparer les tréponèmes des cellules SflEp. Ces dernières n'ont pas été enlevées de la suspension, attendu qu'elles n'interféraient pas avec le comptage des tréponèmes. Méthodes de culture de tissu. A cause des nombreux échecs par lesquels s'est soldée dans le passé la culture de T. pallidum, on donne des détails précis sur la méthode. Le milieu de culture de tissu utilisé pour la croissance de T. pallidum consistait en un MEM de Eagle modifié, addition- né de SFB jusqu'à une concentration finale de 20 %, et une dilution à 1:30 de ETI frais de lapins. Le milieu MEM modifié est obtenu par mise en présence des composants suivants dans de l'eau distillée jusqu'à un volume final de 100 ml: 10 ml de solution équi- librée de sels de Earle 10x sans rouge de phénol ni NaHCO3, 2 ml d'aminoacides de milieu MEM 50x, 1 ml de vitamines de MEM 100x, 1 ml de L-glutamine 200 mM, 1 ml d'amino- acides non essentiels de MEM 100x et 1 ml de solution d'héparine sodique à 100 U/ml. On fait passer brièvement un courant de CO2 dans la solution-; ensuite, on ajoute 3,38 ml de NaHCO3 (7,5 %), 3,13 ml de HEPES 1 M (tampon organique), 0,63 ml de resazurine (20 mg %), 10 mg de pyruvate de sodium, 10 mg de DTT et 150 mg de glucose. La solution est stérilisée par filtration et additionnée de 25 ml de SFB inactivé par la chaleur. Cela représente le milieu de culture MBRM auquel il a été fait allusion ci-dessus. La fiole de milieu est ensuite alternativement mise sous vide et exposée au passage d'un mélange gazeux de 5 % de CO2 et de 95 % de N2, à trois reprises, et con- servée pendant la nuit avant son utilisation. Deux jours avant l'infection avec T. pallidum, on ensemence des bouteilles de prescription de 113 ml avec 5 x 105 cellules de SflEp en milieu MEM additionné de 10 % de SFB, et on les fait incuber à 330C. Les cellules d'ense- mencement de SflEp ont été entretenues de la manière décrite dans Fieldsteel et collaborateurs, supra. Avant l'inocula- tion des tréponèmes, le milieu de croissance a été retiré des fioles et remplacé par 10 ml de MBRM. On fait passer dans les cultures un mélange gazeux à 5 % de CO2 et 95 % de N2 pendant 1 minute à un débit de 3 litres/minute et on les laisse s'équilibrer pendant 4 à 5 heures avant l'inoculation. On inocule ensuite chaque fiole avec 0,34 ml d'extrait testiculaire contenant le nombre désiré de tréponèmes. On fait passer dans les cultures pendant 1 minute un courant gazeux contenant 1,5 % de O., 5 %d de C02 et 93,5 % de N2 à un débit de 3 litres/minute. On a déterminé au préalable, dans des cultures en gradient ayant incubé en présence d'air, que la concentration de l'oxygène dissous était d'environ 1,5 % dans l'aire du gradient qui contenait les tréponèmes les plus nombreux et les plus actifs. L'élévation de la concentration en oxygène à 3,5 % a entraîné à la fois I une baisse de viabilité et d'assez faibles accroissements des nombres de T. pallidum. L'incubation a été conduite à 33 C. Des cultures ont été sacrifiées à divers inter- valles de temps jusqu'à un maximum de 12 jours et des numé- rations des tréponèmes ont été effectuées comme suit: le milieu a été prélevé et mis de côté. La monocouche a été rincée avec 2 ml de milieu MEM T-V qui a été séparé et mélangé avec 1,25 ml de SFB. On a encore ajouté 3 ml de milieu MEM T-V à la fiole dans laquelle on a fait passer pendant 30 secondes un courant gazeux contenant 5 % de C02 et 95 % de N2, on a bouché la fiole et on l'a maintenue sur une secoueuse pendant 20 minutes pour retirer la mono- couche du verre. Le liquide contenant des cellules en suspension et des tréponèmes a été pipetté énergiquement sur toute la surface de la bouteille pour détacher toutes cellules adhérentes. Cette suspension a été ajoutée au mélange précédent de liqueur de rinçage et de sérum. Le milieu MBRM qui avait été initialement séparé de la mono- couche a été ajouté ensuite. Des comptages de tréponèmes ont été effectués sur des échantillons en triple exemplaire prélevés dans chaque fiole, de la façon suivante: une por- tion aliquote de 10 il a été placée sous une lame couvre- objet de 22 mm2 et des plages prises au hasard ont été comptées à un grossissement de x8OO jusqu'à ce qu'au moins 100 tré- ponèmes aient été dénombrés ou que 50 champs aient été cou- verts. On a calculé le pourcentage de tréponèmes présentant une motilité active. Les comptages ont été effectués sur deux fioles par groupe chaque jour o une numération a été effectuée. Méthodes biochimiques. Dans chaque expérience, des épreuves ont été effectuées pour déterminer si l'ADN augmentait également, en vue de prouver les croissances numériques observées de T. pallidum. L'ADN de tréponème a été recueilli par les méthodes suivantes. Des cultures en double exemplaire, tant infectées que non infectées, ont été recueillies par les méthodes décrites ci-dessus et 1 ml de la suspension de tréponèmes a été prélevé en vue de la numération. Les cellules SflEp ont été séparées de l'échantillon restant par centrifugation à 500 x g pendant minutes, et la couche supérieure de 13 ml des échantil- lons a été isolée. Attendu qu'il restait 2,25 ml d'échan- tillon dans le tube de centrifugeuse, le culot de cellules Sf1Ep n'a pas été perturbé. Des échantillons de liqueur surnageante ont été contrôlés par un examen microscopique et aucune cellule SflEp n'a été décelée. On a trouvé moins de 5 % de différence entre des comptages effectués initia- lement et ceux qui ont été effectués après la séparation des cellules SflEp. Les fractions contenant les tréponèmes dans les bouteilles utilisées en double ont été rassemblées et centrifugées à 18 000 x g pendant 20 minutes. La liqueur surnageante a été isolée et le culot renfermant les trépo- nèmes a immédiatement été soumis à une congélation rapide dans un bain de neige carbonique et d'alcool et conservé à -200C. Des cultures non infectées ont été traitées d'une façon identique. Des épreuves portant sur l'ADN ont été exécutées simultanément après que tous les échantillons de la même expérience ont été recueillis. L'ADN provenant du culot décongelé a été extrait par exposition des tréponèmes à une digestion enzymatique par du lysozyme (0,5 mg/ml). Les tréponèmes ont ensuite été totalement disloqués et homogénéisés par un bref traitement aux ultrasons à 40C. L'ADN a été dosé quantitativement par la technique spectrofluorométrique de Labarca et Paigen (Anal. Biochem. 102:344-352, 1980). Cette méthode implique la réaction de l'ADN avec le colorant fluorescent appelé bisbenzimide. L'accroissement de fluorescence produit par une portion aliquote des échantillons d'essai a été comparé à celui qui est produit par une solution d'ADN de référence. La quantité nette d'ADN de tréponème par fiole a été déter- minée en retranchant la quantité d'ADN contenue dans les fioles témoins de la quantité d'ADN contenue dans les cul- tures infectées. Attendu que le culot ne représentait que 80 % du nombre total de tréponèmes provenant des deux bou- teilles, les résultats ont été multipliés par 1,25 pour déterminer la quantité réelle d'ADN de tréponème présente dans les bouteilles. Microscopie électronique à balayage (MEB). On a cultivé des cellules SflEp et on les a inoculées avec 1 x 107 T. pallidum comme décrit ci- dessus, à la différence que des lamelles couvre-objet ont été placées dans les récipients de culture. Les lamelles couvre-objet des cul- tures infectées et non infectées ont été retirées après , 7, 9 et 12 jours d'incubation. Elles ont été fixées dans un mélange à 2 % de para- formaldéhyde et 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon au phosphate 0,1 M (pH 7,2) à 40C pendant 45 minutes. Elles ont ensuite été lavées abondamment avec le tampon au phosphate et déshydratées dans une série graduelle de solutions d'éthanol (50 %, %, 95 %, 100 %, 100 %, 100 %, 5 minutes à chaque fois). L'éthanol a été remplacé par le fluide intermédiaire, à savoir de l'acétate d'amyle, selon une série graduelle de solutions éthanol/acétate d'amyle (2:1, 1:1, 1:2, 100 %, %, 100 %, 5 minutes à chaque fois). L'acétate d'amyle a ensuite été remplacé par le fluide de transition C02 dans la bombe d'un dispositif de séchage au point critique (Technics).Après le séchage au point critique à 430C et sous pression de 9,1 MPa, les lamelles couvre-objet ont été montées sur des lames microscopiques en aluminium avec de l'argent colloïdal conducteur, et elles ont été revêtues d'une couche de 20,0 nm d'alliage or-palladium (60:40 en poids) par pulvérisation par triode (Polaron). La matière ainsi préparée a été examinée à l'aide d'un microscope électronique à balayage Cambridge modèle II.> sous une énergie d'accélération de 1,602.10 15 J et avec une inclinaison de . Des microphotographies ont été effectuées avec un film noir et blanc positif/négatif Polaroid Type 55. Avec les méthodes de l'invention dans lesquelles des cultures en gradient d'épithélium (SflEp) de Sylvilagus ont été infectées avec T. pallidum, on a pu observer dans chacune des 25 expériences un accroissement manifeste des nombres de tréponèmes fixés. Ces accroissements allaient d'un facteur 3 à 5; toutefois, attendu qu'environ 5 % seulement des tréponèmes inoculés se sont f:xés aux cellu- les, on n'a pas observé d'accroissement global au-dessus de celui de l'inoculum initial. En contraste avec les faits établis dans l'art antérieur, on n'a jamais observé, con- formément à l'invention, de perte de virulence in vitro de T. pallidum. On rend compte à présent d'une multiplica- tion sans équivoque de T. pallidum virulent dans le système de culture de tissu décrit, en utilisant des cellules de SflEp comme substrat, dans des conditions de tension d'oxy- gène réduite (1,5 %), cette dernière condition étant extrê- mement importante et vitale pour la présente invention. RESULTATS Reproduction de T. pallidum virulent. Une série de 7 expériences a été effectuée d'une façon identique con- formément au mode opératoire décrit ci-dessus. Les résultats sont reproduits sur le tableau I. Des augmentations numéri- ques importantes ont eu lieu dans chaque expérience lorsque l'inoculum était à 1 x 106; ces augmentations ont atteint un maximum d'un facteur 100, avec une augmentation moyenne d'un facteur 49,3 après 9 jours d'incubation. Avec des ind- culums croissants, on a observé des baisses du facteur d'augmentation jusqu'au moment o, avec l'inoculum à 1 x 108, on a observé une croissance en nombre faible ou nulle des tréponèmes. Il est très frappant de constater que dans tous les groupes, quel que soit l'inoculum, un plafond de multiplication semblait être imposé. Malgré la différence d'un facteur 100 entre les inoculums à 1 x 106 et à 1 x 108, les différences entre groupes au niveau du plafond ont été remarquablement faibles. Le plafond maximal a été de 1,0 x 108 pour l'inoculum à 1 x 106, de 1,25 x 108 pour l'inoculum à 2,5 x 106, de 1,35 x 108 pour l'inoculum à 1 x 107 et de 2,37 x 108 pour l'inoculum à 1 x 108. Dosages de l'ADN sur T. pallidum cultivé. Les quantités moyennes d'ADN de tréponème recueillies dans les cultures des 7 expériences sont également présentées sur le tableau I. Dans les trois premières expériences, la teneur en ADN de tréponèmes de cultures inoculées avec 1,0 et 2,5 x 106 tréponèmes et soumises à l'incubation pendant 24 heures a été légèrement inférieure ou égale à celle des témoins négatifs. Du fait que l'ADN des tréponèmes était insuffisant pour qu'on puisse le doser quantitativement, ces déterminations ont été omises dans les expériences subséquentes. La quantité nette d'ADN recueillie dans les cultures infectées a augmenté en même temps que les nombres de tréponèmes dans tous les groupes d'inoculum. Lorsque l'inoculum était de 1 x 106, l'ADN de tréponème s'est élevé depuis la limite inférieure décelable de 0,05 gg par fiole à une quantité de 1,62 gg par fiole le neuvième jour, ce qui représente une augmentation d'un facteur minimal de 33 + 10. Les tréponèmes contenus dans les cultures inocu- lées avec 106 à 107 organismes entraient visiblement en phase logarithimique de croissance après 1 à 2 jours d'incu- bation. La teneur moyenne en ADN de T. pallidum pendant cette période était de 3,14 x 10 14 g par tréponème. Les tréponèmes dans les cultures inoculées avec 108 organismes se reproduisaient très peu, voire même pas du tout, et les organismes étaient manifestement dans une phase quasi stationnaire de croissance. La teneur moyenne en ADN par tréponème était de 1,88 x 10 14 g, ce qui est considérable- ment inférieur à la quantité trouvée dans les tréponèmes se reproduisant activement. Virulence de T. pallidum soumis à des passages sur culture de tissu. Dans 6 des 7 expériences récapitulées sur le tableau I, des tréponèmes recueillis le septième jour de l'incubation ont été inoculés par voie intracutanée dans la région dorsale rasée de lapins, dans des dilutions en série d'un facteur 10. On a procédé de la sorte non seule- ment pour confirmer la virulence, mais aussi pour déterminer le nombre minimal de T. pallidum reproduit par culture de tissu nécessaire pour produire des lésions érythémateuses et indurées caractéristiques renfermant des tréponèmes. Les résultats sont reproduits sur le tableau II. Dans chaque cas, les tréponèmes ont été virulents, et il a fallu en moyenne 6,59 (plage de 1,52 à 18,5) organismes pour produire une lésion. Observation au microscope électronique à balayage de T. pallidum en culture de tissu. En vue de mieux comprendre la fixation et la reproduction de T. pallidum dans des cul- tures de cellules SflEp, on a pris une série de microphoto- graphies au microscope électronique à balayage à des moments différents. Les figures 1A à 1D et 2A à 2D représentent ce que l'on observe au cours de l'incubation. Après la fixation, des colonies de tréponèmes se sont manifestement formées à la surface des cellules. Plusieurs de ces colonies ainsi que des tréponèmes individuels, après 5 jours d'incubation, sont visibles à un faible grossissement sur la figure 1A. La figure 1B est une vue à fort grossissement de l'une des colonies apparaissant sur la figure 1A. Les figures 1C et 1D sont des représentations à fort grossissement de colonies individuelles, montrant des groupes de tréponèmes enchevêtrés, après 7 jours d'incubation. Le nombre de colonies a augmenté avec la durée d'incubation. La figure 2A (faible grossisse- ment) montre de nombreuses colonies après 9 jours d'incuba- tion. L'une d'elles apparaît sous un fort grossissement sur la figure 2B. Ces colonies, ainsi que de nombreux tréponèmes individuels qui ont été manifestement enlevés par lavage au cours du processus de fixage, ont également été observés avec éclairage sur fond noir. Au douzième jour d'incubation (figure 2C), l'en- veloppe cellulaire commençait à se détériorer, les colonies commençaient manifestement à se démembrer et on voyait apparaître beaucoup plus de tréponèmes individuels. La figure 2D est une vue à fort grossissement de l'une des grandes colonies apparaissant sur la figure 2C. * On voit donc apparaître ici, avec preuve à l'appui, une révélation totale de ce que l'on considère comme étant la première culture réussie in vitro de T. pallidum. il a donc été démontré que dans les conditions définies dans le présent mémoire, T. pallidum virulent se fixe à la surface de cellules Sf 1Ep et s'y multiplie. Dans une série de 7 expé- riences, il a été démontré qu'une reproduction sans équivoque avait lieu à chaque fois. Le degré de multiplication des tréponèmes a été sous la dépendance de l'inoculum initial de T. pallidum la multiplication était maximale lorsque l'inoculum était de 106 et elle a été minimale avec un inoculum initial de 108. Il est intéressant de constater que la différence entre ces deux inoculums, d'un facteur 100, a été la multiplication maximale observée avec l'ino- culum à 106, bien que la moyenne ait été d'un facteur 49. Avec tous les inoculums, le plafond maximal de multiplica- tion était d'environ 1-2 x 108; par conséquent, les fac- teurs d'accroissement de la reproduction de T. pallidum ont diminué avec l'accroissement de la grandeur de l'ino- culum. Par conséquent, lorsque l'inoculum initial était de 2,5 x 106 T. pallidum, il y a eu une augmentation moyen- ne d'un facteur 27,5 (plage d'un facteur 16 à un facteur ) le neuvième jour après l'inoculation. Lorsque l'inoculum était de 1 x 107, l'augmentation moyenne était d'un facteur 11,8 (plage de 7,8 à 15,3) le neuvième jour après l'inocu- lation. Avec l'inoculum à 10 8, l'augmentation maximale a été d'un facteur 2,4, indiquant qu'il y avait peu ou pas de multiplication. Il importe de connattre la raison pour laquelle il existe un plafond manifeste de multiplication, attendu qu'il est en rapport avec une plus grande optimisation du système de culture. Selon une hypothèse qui a été émise, il n'existerait que des sites limités de fixation sur chaque cellule, qui limiteraient à coup sûr la reproduction. S'il en avait été ainsi, on aurait pu accroître le rendement en tréponèmes en élevant le nombre de cellules dans la culture. Toutefois, lorsque les 2,5 x 106 tréponèmes ont été inoculés dans les cultures de cellules SflEp dont la confluence était de 20 à 80 %, les vitesses de croissance ont été presque identiques, et le maximum d'augmentation du nombre de T. pallidum a été respectivement de 24,0 et de 20,2, ce qui indique que la reproduction n'était manifestement pas sous la dépendance de sites spécifiques de fixation sur chaque cellule. En fait, il est apparu qu'elle était sans relation avec la fixation cellulaire proprement dite. Le temps de génération de T. pallidum chez des lapins a été évalué à 30-33 heures. Par conséquent, l'augmen- 2.500476 tation maximale théorique du nombre de T. pallidum au cours de la période d'observation dans une culture de tissu atteindrait un facteur d'environ 100 dans les cultures con- tenant l'inoculum à 1 x 106. Ce maximum a été atteint dans une seule expérience, et bien qu'il y ait eu une grande variation dans les augmentations maximales des nombres de T. pallidum à partir de cet inoculum, le facteur moyen d'augmentation a été d'environ 49. Par conséquent, des augmentations à partir de l'inoculum à 1 x 106 n'ont pas été limitées par des sites de fixation, mais par le temps de génération. Pendant la période au cours de laquelle T. pallidum se multiplie, la monocouche de cellules SflEp progresse, en confluence, d'environ 25 à 100 %; il y a donc peu de différence dans le nombre d'organismes fixés avec un inoculum de 1 x 10 8. Cinq jours après l'inoculation, le nombre de tréponèmes fixés aux cellules était en moyenne de 1,6 x 108. Le neuvième jour, le nombre était presque identique, à savoir 1,7 x 108. Au douzième jour de l'incu- bation, il s'était abaissé à 1,3 x 108. Il peut être de la plus grande importance de constater que dans tous les groupes d'inoculums, la viabilité des tréponèmes avait effectué une chute spectaculaire au douzième jour d'incuba- tion. Il semble probable que le plafond de multiplication soit dû au concours de plusieurs facteurs, en premier lieu vraisemblablement à l'épuisement du milieu en un ou plusieurs composants essentiels ou à l'accumulation de produits toxi- ques. Etant donné que la monocouche de cellules SflEp s'est simultanément détériorée au douzième jour d'incubation, il n'a pas été possible de déterminer si les tréponèmes, les cellules ou les deux étaient affectés par ces facteurs. Il est vraisemblable que l'extrait testiculaire soit impliqué dans la disparition de tréponèmes, attendu que cela constituait un facteur du milieu qui ne pouvait pas être maîtrisé de façon satisfaisante et qui variait d'une expérience à une autre. On considère l'extrait testi- culaire comme représentant l'un des trois facteurs les plus importants dans le succès de la culture de T. pallidum. On a en outre déterminé qu'un extrait testiculaire préparé à partir de lapins normaux pouvait être tout aussi efficace qu'un extrait provenant de lapins infectés. Un second facteur tout aussi important dans la culture de T. pallidum est le soin avec lequel on choisit le sérum de foetus de bovidé utilisé tant dans le milieu d'extraction que dans le milieu de culture. Des lots de SFB du commerce varient grardemeent quant à leur aptitude à entretenir la survie de T. pallidum, et ils peuvent être suffisamment toxiques pour détruire la plupart des trépo- nèmes après quelques jours de culture. Le troisième facteur important pour le succès de la culture de T. pallidum est la quantité d'oxygène présente dans le système. On a déter- miné, par une mesure réelle, qu'une atmosphère à 1,5 % d'oxygène était optimale pour la reproduction de T. pallidum. En plus ou à la place du sérum SFB, on peut tout aussi bien utiliser du sérum de veau. Comme autre preuve du fait que T. pallidum se reproduit dans des cultures de SflEp, on a effectué des dosages simultanés d'ADN sur les tréponèmes obtenus par culture. On a observé des augmentations très importantes de la quantité d'ADN de tréponème lorsque les inoculums allaient de 1 x 106 à 1 x 107, les plus grandes augmenta- tions, comme on pouvait s'y attendre, se situant dans le premier groupe. Il y a eu aussi une excellente corrélation dans les quantités d'ADN par tréponème; les moyennes pour les groupes à 1 x 10, à 2,5 x 106 et à 1 x 10 étaient, respectivement, de 3,46 x 1014, 3,28 x 1014 et 2,79 x 1014 g par tréponème (3,14 + 0,72 x 10 14 g par tréponème). Toute- fois, la quantité moyenne d'ADN par tréponème pour le groupe d'inoculums à 1 x 108 (1,88 + 0,41 x 10 14 g) a été consi- dérablement plus faible que celle des autres groupes. Un phénomène semblable à celui-ci a été observé pour d'autres bactéries. N. E. Gillies et T. Alper, The Nucleic Acid Content of Escherichia Coli Strains B and B/R, Biochem. Biophys. Acta 43: 182-187, 1960, ont rapporté une augmenta- tion de la teneur en ADN par organisme pendant la phase logarithmique de croissance pour deux souches de E. coli, qui contenaient 1,4 à 1,8 fois autant d'ADN par organisme pendant la phase logarithmique de croissance que pendant la phase stationnaire. Il a également été rapporté que des cellules végétatives de Bacillus megaterium et de B. cereus contenaient, respectivement, 2,3 et 3,3 fois autant d'ADN qu'en contenaient leurs spores. Dans les expériences effectuées conformément à l'invention, la teneur moyenne en ADN par tréponème pour les cultures inoculées avec 106 à 107 organismes représentait 1,67 fois celle de tré- ponèmes issus de cultures inoculées avec 108 organismes. Cette différence est attribuée aux différents stades de croissance dans lesquels les tréponèmes se trouvaient et elle tombe dans la plage de teneur élevée en ADN rapportée pour d'autres bactéries en phase logarithmique de croissance. Dans toutes les expériences rapportées dans le présent mémoire, impliquant un seul passage de T. pallidum dans des cellules de SflEp, les organismes sont restés très virulents envers les lapins. Les nombres nécessaires pour produire des lésions contenant des tréponèmes ont concordé avec ceux qui sont rapportés pour T. pallidum virulent subissant des passages in vivo. Comme le démontre l'examen au microscope électro- nique à balayage sur T. pallidum pendant la reproduction dans des cellules de SflEp, des microcolonies de tréponèmes sont formées à la surface des cellules. Ces colonies, de même que beaucoup de tréponèmes individuels dispersés à travers la surface de la cellule, ont également été observés par éclairage sur fond noir. Très peu de tréponèmes individuels ont été observés à l'examen au microscope électronique à balayage avant le douzième jour d'incubation. Cela peut être dû au fait qu'ils ont été enlevés par lavage au cours du traitement des lamelles couvre-objet. Toutefois, au douzième jour d'incubation, de nombreux tréponèmes indi- viduels sont apparus en plus des colonies. Cela a également coïncidé avec le démembrement de l'enveloppe cellulaire et avec la perte de viabilité des tréponèmes. D'autres chercheurs ont déjà effectué des études au microscope électronique à balayage sur la fi:cation de T. pallidum à des cellules de mammifères. Des tréponèmes n'ont été observés qu'après une période d'incubation de 3 heures avec des cellules en culture. Des observations ont également été faites jusqu'à 22 heures après la co- incubation de cellules et de tréponèmes. Dans les deux cas, on a observé des tréponèmes fixés au hasard, mais la forma- tion de colonies n'a été observée en aucun cas. On présume que les colonies se forment vraisemblablement comme consé- quence de la multiplication et qu'on ne les observerait donc pas dans d'autres conditions. Le degré de multiplication des tréponèmes a manifestement dépendu de l'inoculum initial de T. pallidum. Il a été maximal lorsque cet inoculum était de 106 et minimal lorsque l'inoculum était de 10 8. Toutefois, pour tous les inoculums, le plafond maximal de multiplication a été de 1o8 à 2 x 1o8. Par conséquent, les facteurs d'accroissement du nombre de T. pallidum en cours de multiplication ont diminué avec l'augmentation de grandeur des inoculums. Lors- que l'inoculum initial était de 106 T. pallidum, il y a eu un facteur moyen d'accroissement de 49. Lorsque l'inoculum était de 10 le facteur moyen d'accroissement était de 11,8. Avec un inoculum de 108, le facteur maximal d'accrois- sement n'a été que de 2,4, indiquant une multiplication faible ou nulle. Le plafond de multiplication semblait être dû vraisemblablement à un concours de facteurs, comprenant l'épuisement du milieu en certains composants essentiels, l'accumulation de produits toxiques ou l'épuisement en oxygène, dont les cellules et les tréponèmes ont besoin pour survivre et pour se multiplier. Bien que la multiplication ait été limitée à un certain degré par le fait que l'enveloppe des cellules SflEp avait commencé à se détériorer au douzième jour de l'incu- bation, il a semblé possible que par une optimisation des conditions de culture tant pour les cellules que pour les tréponèmes, le rendement en tréponèmes puisse être élevé. A cette fin, on a alors examiné plusieurs paramètres com- prenant les exigences en matière de température, d'oxygène, de sérum et d'extrait testiculaire de lapin pour le système de culture. Dans les tests d'optimisation, les matériels et les méthodes utilisés ont été généralement les mêmes que ceux qui ont été décrits en détail cidessus, excepté les indications données ci-dessous. De jeunes mâles de lapins (âgés de 6 semaines), des rats Lewis adultes et des hamsters Golden Syrian adultes ont également été utilisés comme source d'extrait testicu- laire. Cellules de cultures de tissu. On a utilisé une lignée cellulaire établie d'épithélium de lapin du genre Sylvilagus (cellules SflEp). Cette lignée cellulaire a été reçue du docteur W. A. Nelson-Rees, et elle a été produite avec le soutien du National Cancer Institute, Biological Carcinogenesis Branch, Division of Cancer Cause and Preven- tion, sous les auspices de l'Office of Naval Research and Regents of the University of California. Les niveaux de passages utilisés dans ces essais allaient de 73 à 85. Sérum. Du sérum de foetus de bovidé (SFB) pro- venant des Flow Laboratories, Inc., Rockville, MD, a été sélectionné en ce qui concerne son aptitude à être utilisé dans un milieu de culture de tissu comme décrit ci-dessus. Du sérum de veau provenant de Sterile Systems, Inc., Logan, Utah, a été testé de la même façon en ce qui concerne son aptitude à être utilisé dans ce système et comparé avec un lot de SPB connu pour son aptitude à entretenir la mul- tiplication de T. pallidum. Extrait testiculaire et inoculums de cultures de tissu. La préparation de l'extrait testiculaire a été dé- crite de façon très détaillée. En bref, des testicules infec- tés sont fragmentés en fines particules et chaque testicule est extrait avec 5 ml du milieu de base réduit modifié (MBRM) pendant 30 minutes à 330C, l'opération étant suivie d'une centrifugation à 500 x g pendant 5 minutes pour éli- miner les particules grossières. La liqueur surnageante est ensuite diluée approximativement à la concentration désirée en utilisant de l'extrait frais de testicules infectés, qui constitue la liqueur surnageante de l'extrait infecté centrifugé à 12 000 x g pendant 10 minutes (extrait 12K). Un comptage final précis est ensuite effectué sur cette suspension, attendu que l'extrait 12K renferme un nombre faible - mais variable - de tréponèmes. La dilution avec l'extrait 12K est effectuée de manière qu'un volume de 0,34 ml contienne la concentration désirée de tréponèmes. L'addition du volume de 0,34 ml à 10 ml de MBRM, c'est-à- dire la quantité utilisée dans des bouteilles de culture de tissu, donne un rapport extrait testiculaire:MBRM de 1:30. L'extrait de testicules de lapins infectés par T. pallidum a été préparé sur une base empirique - un testi- cule, quelle que soit sa taille, étant extrait dans 5 ml de MBRM. Ce mode opératoire reste inchangé. Toutefois, en comparant l'aptitude d'un testicule de lapin non infecté, de même que des préparations de testicules de rats et de hamsters, à remplacer l'extrait de lapins infectés, on a établi une base poids/volume de la manière indiquée ci- après. Le poids total des deux testicules d'un lapin normal âgé de 6 mois était de 4,67 g. Ces testicules ont été extraits dans 10 ml de MBRM de la même manière que des tes- ticules infectés. Sur cette base, le pourcentage en poids/ volume du testicule de lapin adulte non infecté était de 46,7 g %. Cela constituait donc la base de poids/volume % pour l'extrait de testicules de lapins immatures non infec- tés, de rats et de hamsters à maturité. Les extraits 12K, la dilution de l'inoculum et l'inoculation des bouteilles ont été les mêmes que pour l'extrait 12K infecté. Ces essais ont été conduits à 330C sous une atmosphère renfermant 1,5 2 de 02 Les méthodes de culture de tissu ont été les mêmes que dans les essais et les exemples décrits ci-dessus. RESULTATS Effet de la température d'incubation sur la multiplication de T. pallidum. On a choisi arbitrairement la température de 33WC pour tous les essais précédents parce qu'on a pensé que la température optimale de survie de T. pallidum était égale ou inférieure à 35WC. En vue de déter- miner expérimentalement la température optimale de multipli cation de T. pallidum, on a cultivé les organismes à des températures allant de 31 à 37 C, ce qui a donné les résul- tats indiqués sur le tableau III. Bien qu'une croissance minimale ait eu lieu aux deux extrêmes, il est évident que la température optimale de multiplication se situait entre 33 et 350C. Effet de la concentration en oxygène atmosphéri- que sur la multiplication de T. pallidum. On avait déterminé au préalable, dans des cultures graduelles de cellules SflEp, que dans l'aire du gradient contenant le nombre maximal de tréponèmes, la concentration en oxygène dissous était de 1,5 %. Par conséquent, on a utilisé cette. concentration dans tous les essais de l'invention sans chercher à déter- miner si cette concentration en oxygène était optimale dans le système choisi en l'occurrence pour la multiplication de T. pallidum. On a conduit des essais pour déterminer que la concentration optimale en oxygène pour la multipli- cation de T. pallidum était de 330C. La multiplication a été observée à des concentrations en oxygène allant de moins de 0,3 % à 12,5 % (tableau IV). Une certaine multi- plication a été observée à toutes les concentrations sauf à 12,5 %. Toutefois, les concentrations en oxygène entre 1,5 et 5 % ont semblé se situer dans la plage optimale pour la reproduction de T. pallidum; les accroissements en nombre à ces concentrations se sont situés dans la plage de fac- teurs 22,4 à 27,7. Effet de la variation de la température et de la concentration en oxygène sur la reproduction de T. pallidum. Les résultats des essais précédents ont indiqué que la croissance optimale de T. pallidum avait lieu à des températures comprises entre 33 et 350C et à des concen- trations en oxygène allant de 1,5 à 5 %. On a donc conduit des essais à 33, 34 et 350C en utilisant une concentration en oxygène de 1,5, 3 et 5 %, ce qui a donné les résultats reproduits sur le tableau V. Il est évident qu'il n'y a pas une grande différence entre les groupes de multiplication de T. pallidum. Les facteurs maximaux d'accroissement allaient de 18,9 dans le groupe à 330C incubé sous concentration d'oxygène de 5 %, à 26,6 dans le groupe à 341C incubé sous concentration d'oxygène de 3 %. Une variation de la concen- tration en oxygène dans chaque groupe de température a exercé peu ou pas d'effet sur la multiplication. Toutefois, elle a effectivement influencé la motilité, qui est restée invariablement plus grande à la concentration en oxygène de 5 % qu'à des concentrations plus basses après 9 à 12 jours de culture. Effet de la concentration en SFB sur les multi- plications de T. pallidum. On a préalablement établi,au cours d'essais conduits dans des cultures graduelles, qu'une concentration en SFB de 20 % dans le milieu MBRM était opti- male pour la survie de T. pallidum. Dans le système de l'invention, dans lequel des cellules de culture de tissu et des tréponèmes se multipliaient et entraient en compéti- tion pour cette source de protéine, il a été important d'examiner de nouveau les exigences du système vis-à-vis du SFB. Les résultats sont reproduits sur le tableau VI. Bien que la multiplication de T. pallidum ait eu lieu à toutes les concentrations de sérum testées, la concentration opti- male dans ce système a aussi été de 20 %. En plus du SFB, on a également étudié l'aptitude du sérum de veau à entre- tenir la multiplication de T. pallidum. Les résultats n'ont pas été différents de ceux que l'on a obtenus dans des études antérieures portant sur l'examen de l'aptitude du sérum SFB à entretenir la survie de T. pallidum. On a testé huit lots de sérum de veau dont deux n'ont pas entretenu la multipli- cation de T. pallidum. Dans trois lots, les facteurs d'ac- croissement se sont situés dans une plage de 4,7 à 8. Dans deux autres lots, les facteurs d'accroissement ont été égaux à 9,1 et 9,8. Le huitième lot a donné des résultats comparables à ceux du sérum SFB témoin, le facteur moyen d'accroissement des nombres de tréponèmes étant égal à 13,7 dans trois essais, comparativement au facteur d'accroisse- ment de 16,5 dans le cas du sérum SFB témoin. Effet de diverses sortes d'extrait testiculaire sur la multiplication deT. pallidum. Nelson a montré que des extraits de testicules de lapin lapins normaux ou infectés par T. pallidum - ou de testicules de taureaux constituaient un facteur important pour la survie in vitro de T. pallidum dans un système ne comportant pas de cellules. On a trouvé qu'un extrait de testicules infectées de lapin était essentiel pour une survie prolongée de T. pallidum dans des cultures graduelles de cellules de SflEp. On a par conséquent utilisé cet extrait dans le milieu choisi pour les études initiales de multiplication selon l'inven- tion. Toutefois, on n'a pas déterminé au préalable si cet extrait était essentiel ou si d'autres extraits pouvaient être utilisés à sa place. Le tableau VII reproduit les résultats de ces expériences récentes. Il est clair que tous les extraits testiculaires soumis aux essais - lapin adulte infecté par T. pallidum, lapin adulte normal, lapin immature normal, rat adulte, hamster adulte - ont été capa- bles d'entretenir la multiplication de T. pallîdum. Lors- qu'aucun extrait n'a été ajouté, le nombre de tréponèmes s'est élevé d'un facteur 10,7, comparativement à l'accrois- sement d'un facteur 25,6 observé lorsqu'un extrait de tes- ticule infecté de lapin adulte a été ajouté. Cela est pro- bablement le reflet du fait que, attendu que l'inoculum provient de testicules de lapin, il ne peut pas être éliminé entièrement du milieu MBRM. Dans ces essais, la dilution finale de l'extrait dans le groupe dit "sans extrait" a été de 1:537, comparé à la valeur de 1:30 existant pour tous les autres groupes. Ainsi, il est maintenant confirmé que T. palli- dum se multiplie dans des cultures de cellules SflEp, et des plages de conditions optimales pour la multiplication in vitro de T. pallidum ont été déterminées. La température optimale de multiplication de T. pallidum a fait l'objet de nombreuses recherches. Turner et Hollander sont arrivés à la conclusion que T. pallidum pouvait se multiplier in vivo dans la plage de 30 à 38-C, mais que le niveau optimal de température était probablement de 35-380C. Pour la survie in vitro dans des cultures sans cellules, la température optimale a été diversement rappor- tée à des valeurs comprises entre 25 et 350C. Dans des études de survie de T. pallidum en culture de tissu, on doit prendre en considération des températures qui favori- seraient la croissance des cultures de tissus ainsi que des tréponèmes. A ce point de vue, on a utilisé des tempé- ratures comprises entre 33 et 360C. Dans la présente étude, on a trouvé que la température optimale de multiplication de T. pallidum se situait entre 33 et 350C. Bien qu'il y ait eu peu ou pas de multiplication à 31'C, 58 % des tré- ponèmes survivaient le douzième jour d'incubation. A 370C, l'accroissement maximal est apparu le septième jour de l'incubation, mais le douzième jour, aucun des tréponèmes n'avait survécu. Antérieurement à 1974, T. pallidum a été consi- déré comme étant un organisme anaérobie. Par conséquent, dans la plupart des tentatives de culture de l'organisme, des efforts rigoureux ont été accomplis pour exclure l'oxy- gène parce que sa présence était considérée comme hostile à la survie et à la croissance. Toutefois, en 1974, Cox et Barber ont démontré que T. pallidum non seulement uti- lisait de l'oxygène moléculaire, mais contenait aussi un système fonctionnel de cytochrome-oxydase. Par la suite, des concentrations variables en oxygène ont été incluses dans des systèmes de culture de tissu utilisés en vue de cultiver T. pallidum ou d'en obtenir la survie prolongée. On a maintenant démontré que T. pallidum était manifeste- ment un organisme micro-aérophile, se reproduisant dans des atmosphères d'oxygène allant de moins de 0,3 % à 10 %, mais ne parvenant pas à survivre dans une atmosphère à 12,5 % d'oxygène. La concentration optimale en oxygène pour la reproduction à 330C s'est située dans la plage de 1,5 à %. Toutefois, dans une série d'expériences dans lesquelles on a fait varier à la fois la température et les concentra- tions en oxygène, il est apparu que la condition optimale pour la reproduction de T. pallidum étai. une incubation à 340C dans une atmosphère contenant entre 3 et 5 % d'oxy- gène. Dans des études antérieures de la Demanderesse sur la survie de T. pallidum dans des cultures graduelles de cellules SflEp, il a été établi qu'une proportion de 20 % de SFB était optimale pour la survie des tréponèmes. Dans les expériences courantes, T. pallidum s'est multiplié à toutes les concentrations en SFB de 5 à 30 %, mais la Demanderesse a confirmé que la concentration optimale pour la multiplication était de 20 %. Du fait de la limitation croissante des sources de SFB, il était important de tester d'autres sources de sérum. La Demanderesse a découvert que lorsque le sérum de veau était soumis à des essais systé- matiques convenables, il pouvait être utilisé tout aussi bien que le SFB pour la culture de T. pallidum. L'un des ingrédients les plus importants du milieu MBRM a été l'extrait de testicules de lapins. Dans tous les essais antérieurs de la Demanderesse, cet extrait a été préparé à partir de testicules infectés utilisés comme source d'inoculum. La question s'est alors posée de savoir si l'extrait devait être préparé à partir du tes- ticule infecté, du testicule adulte, ou du testicule né- cessairement de lapin. Les résultats d'essais courants ont démontré tout à fait clairement que tout ce qui est néces- saire à l'entretien de la multiplication était présent dans toutes préparations de testicules de lapins, de rats et de hamsters et était sans relation avec l'état infectieux ou l'espèce animale utilisée. L'extrait préparé à partir du testicule de lapin infecté s'est montré un peu plus effi- cace que les autres préparations. Tous les extraits, excepté celui du testicule infecté, ont été préparés sur la même base poids/volume, et par conséquent, ils ont pu être com- parés correctement. Les testicules infectés, quel que fût leur poids, ont été extraits dans 5 ml de milieu MBRM. Etant donné que ces testicules étaient au moins deux fois plus gros que les testicules non infectés, l'extrait a généra- lement été plus concentré. Même en l'absence d'une addi- tion d'extrait testiculaire, on a observé un facteur d'ac- croissement du nomhre de tréponèmes de 10,7, vraisemblable- ment du fait que les cultures contenaient de l'extrait pro- venant de l'inoculum. Par conséquent, on a défini mieux encore les conditions de culture in vitro de T. pallidum. Ces résultats indiquent que T. pallidum n'est pas aussi exigeant qu'on le pensait de prime abord attendu qu'une multiplication a lieu dans des plages assez larges de température et de concentrations en oxygène. Ce succès de la culture in vitro de T. pallidum ouvre à présent la voie à des études biochimiques, physio- logiques et immunologiques de cet organisme, qui n'étaient pas possibles jusqu'à présent. TABLEAU I Croissance de T. ?allidum dans des cultures de tissu de lapin du genre Svlvilacus (Sf-1Ep)a Inoculum Jour de Nombre moyen l'obser- de tréponèmes/ vation fiole x 107 (plage) 1,59 3.x 10G 5 15 1 X 1o5 (0780-,O- z59) b (144-6%92) 4,93 9 (2,29-9,69) 4,91 12 (1)52-010o0) de 1 'épithélium Facteur %btilité pg d'ADN/ ADN/ moyen % (plage) fiole trépo- d'accrois- (valeur nème_4 sement moyenne x 10-1 (plage) + écart g ty'e) (valeur moyenne + écart _ _ _ _%_ _tvre) (e8 0-25,9) (z4,4-69 72) 49J3 (22,9-96,9) 49/1 (1512-2o0DO) ( 87,8 (78,2-93,2) 72;2 (38, 1-89, 1) >6 (7,8-59,9) 0164: 0,25 0199 0]38 1262 f 0,54 N.D.c 215 > Ios S x 10o 2 X Io,, 3 2 57 (1I81-3,99) 4,97 (3109-8130) 6$88 (4,00-10oO) 6,06 (2,82-12)50) 4,95 (3P87-6,00) 9,03 (810-.11,30) 11,76 (?175-15)30) ,01 *(6,57-13,50) olot 310, 16t 04 (13380-21 o00) 17,48 (12/l0-23p7) (14, 5o-0.18o) 13,41 (8,0;-20 0) (7,2-16,O)0 (12j4-33,2) 27)5 (16,0-40o0) 24,3 (11 3-50o0) ;0 (3,9-6,0) 9)0 (%11-1173) (7,8.15,3) (6,6-13,5) 1)6 (l,4-212) 1>7 1,9 (0,8-2, o) ,5 (86)3-94M3) 89)2 (Br8-eB-951) (59:9-9118) 28,4 (4,8-55M2 b.D. 71,8 -85131 89,G (85,1 -93.8)J 7lfR (54,2-90,8) 16,0 (5,3-35,6) N.D. 82,4 (75,2-E7,S) 76,6 (6812-89,4) (60o4-72,3) 13,7 (:;,;-3%:) 106 f 0131 3>91: 0,66 1360 f 0733 1399 t 0153 N.D. 0,33 0,04 3151 f 0133 2>16 * 0124 2,56 S 0785 ).D. 2102 f 0;23 2;89 = 0,75 2193 2 0126 3>31 s 0/50 2,96 t 0>49 X.D. 3,30 0,34 3110 f 0o0o 2,41: 0,32 2>32 t 0,18 R.D. 2102 I 0,23 1i66 f 0130 1376 s 0246 3707 S 0155 12S3: 0)20 iD.. S.V. aensemble des résultats obtenus dans sept expériences séparées. bdans chaque expérience, des organismes prélevés à ce stade ont provoqué chez des lapins des lésions contenant des tré- ponèmes. Il a fallu une moyenne de 6,59 tréponèmes (plage = 1,52 à 18,5) pour produire une lésion. Cnon déterminé. -,7; 0O70 3J,25: 0,97 3,43 2 0,74 t.D. TABLEAU II Virulence de T. pallidum après un passage dans des cellules SflEpb N de Nombre minimal de Jour d'apparition l'essai T. pallidum de la lésion produisant desb lésions E.I. 1 1,85 x 101 26 2 3,02 x 100 30 3 1,52 x 100 22 4 6,69 x 100 15 1,75 x 100 35 6 8,06 x 100 26 a Des tréponèmes ont été recueillis après 7 jours de culture, et des dilutions successives d'un facteur 10 ont été inoculées par voie intracutanée à des lapins. b Lésions érythémateuses indurées contenant T. pallidum. 1 0 TABLEAU III Effet de la température d'incubation sur la multiplica- tion de T. pallidum dans des cultures de cellules Sf1Epa Jour de Noimbre moyen MDtilité Facteur mDyen 9Tnpé- l'observa- de tréponèmes moyenne, d'accrois sent rature ( C) tion (x 107) % 31 5 0,65 60,2 1X3 0s78 0X95 01,69 1,54 4,35 4r74 7;89 3X89 6,43 54 4,80 9,47 ,82 6,33 2,16 2,77 1,45 0X89 68 1 69;5 58,1 ,4 84X3 71X3 91X5 2 X4 92X5 87;9 72;8 22,6 93,7 86/2 59>4 77)4 32>6 0%6 ,4 ;9 0,0 1,6 1,9 3,1 ,6 8;8 9>7 9)4 16,1 13, 1 11)3 9,8 17,12 19,3 11,9 12)8 11, 0 6,1 4,3 ,5 2,9 1j8 a Ensemble des résultats obtenus dans trois expériences. Les inoculums allaient de 4,78 x 106 à 5,18 x 106 (moyenne = 4,92 x 106) tréponèmes par bouteille. Les bouteilles renfermaient une atmosphère composée de 1,5 % de 02' 5 % de CO2 et 93,5 % de N2. lm OJ - CR O C _(l.b Cd! Cd tuM -p -il LnM Lnc' (M O (A O (M O0 ^ LA Oo t> .O oem ci o - O w e.,- ID -.1 M tJCA u M.dw m 0 Co4 MI W oe.c-M M.4M#d oe,>, (tJ..DTD: -3 t CD pu --- m O " L- ( f CA mC CALCDh OCo A N --O W.. -. We- Co CooMC-g ( oeM twIa o CAto O-4-O wed-aioe 0 gM OMD M D C Jg2C oe MM joee- C.->.> c..> '-,ea,.o OO to o t o, od M MW -. * s-- -:. - - - _ *%..w - - to /(A O V i aw -IWCo M w. O GM Cd(Am Nt t Cdoe - MOLi Ceoe 00-.O W ? OMM MMM -O Co. l';. Ft-C4 t 8- UDd -i rtq -'trt 4I- Pli t-.. j. g D I--, L0 "J, !" ' (w LI ul 0% a Les inoculums allaient de 4,24 x 106 à ,48 x 106 dans trois expériences séparées. La température d'incubation a été de 33 C. b Le mélange de gaz contenait le pourcentage indiqué d'oxygène et 5 % de CO2, le reste consistant en N2. T A B L E A U V Effet de la variation de la température et de la concentration en oxygène atmos- phérique sur la multiplication de T. pallidum dans des cultures de SfTEp cellules Termpérature d'incubation 33 C Concentration atmos- phérique en oxygènea (%) 1,5 3,0 ,0 34 C 1,5 3;0 Jour de 1 'observa- tion Nombre moyen de tréponèmesb (x 107) 1,60 4,29 8,15 ,75 9M03 ;50 1>40 3,66 8,74 8;68 3,35 6;85 ,45 7 95 3,22 7;,73 12 30 8,81 Motilité moyenne, % 88,1 92 7 42,8 ,8 88!9 91,18 42)2 92,0 88,8 91 1 88;2 88t0 39,8 4,4 87, 8 92,7 63,2 Facteur moyen d 'accrois- sement 3;7 9,3 17,6 23;3 3;5 9,0 19;5 22l7 3,3 7?9 18,9 18,8 7,3 14,8 22, 6 17,2 7/0 16; 7 19; 1 O w Ln M) u. l o ox VI T A B L E A U V (Suite) Effet de la variation de la température et de la concentration en oxygène atmos- phérique sur la multiplication de T. pallidum dans des cultures de cellules SflEp Ilpérature d'incubation C Concentration atmos- phérique en oxygènea (%) >0 Jour de l'observa- tion Nombre moyen de tréponèmes (x 107) b 2,98 12;20 72 3,69 89 11; 10 6 92 4,26 t26 8> 20 3 18 8 17 11> 02 9/94 Motilité moyenne, % 87,3 83,0 89)7 89>1 57 2 92,6 93>1 68;4 12,6 93, 7 93,3 81,5 /8 Facteur moyen d'accrois- Sellent 6,5 17,2 26,4 23Y2 8,0 23,6 24,0 ,0 9;2 >4 17;7 6,9 17,7 23>9 21 5 a Les fioles de culture contenaient la concentration et 5 % de C02, le reste consistant en N2. indiquée en oxygène b10 b Moyenne de deux expériences. L'inocuium était de 4,62 x 106 T. pallidum par fiole. 0'% ot' TABLEAU VI Effet de la concentration en sérum de foetus de bovidé (SFB) dans le milieu de culture sur la multipli- cation de T. palliduma Lcentra- Jour de Nombre moyen Motilité Facteur >n en SFB l'obser- de tréponèmes moyenne, moyen d'a( (%) vation (x 107% croissemei 5 1,23 71,0 2,6 8 1,89 48,9 4,0 12 4,29 68,4 9,1 Con tic 1,14 3,69 4,80 1,74 3,92 7,51 1,89 ,15 9,65 1,93 3,68 6,44 1,58 3, 89 6,36 78,5 66,1 69,6 89,4 73,1 69,6 88,5 86,9 53,3 ,3 79,3 ,4 ,0 ,0 ,1 CIt 2,4 7,9 ,2 3,7 ,3 16,0 4,0 11,0 ,5 4,1 8,1 13,7 3,4 8,3 13,5 a Le milieu de culture consistait en IBRM contenant les concentrations indiquées en SFB. L'incubation a été conduite à 33 C dans une atmosphère comprenant 1,5 % de 02, 5 % de CO2 et 93,5 % de N2. L'inoculum consistait en 4,70 x 106 T. pallidum. Anime duque a étÉ TABLEAU VII Effet des diverses sortes d'extrait testiculaire sur la multiplication de T. pallidum al à partir Jour de Nombre moyen Motilité Fax el l'extrait l'obser- de tréponèmes moyenne, m( préparé a vation (x 107) % d' Lapin adulte, infecté Lapin adulte, normal Lapin immature, normal Rat adulte Hamster adulte Pas d'additionb d'extrait 0,51 2,51 7,82 13,05 0,47 2,07 8, 60 ,85 0,45 1,82 6,51 9,22 0,48 1,83 6,12 7,89 0,46 1,83 4,40 9,21 0,43 0, 94 2,10 4,48 88,5 93,1 71,4 ,6 93,8 ,2 ,4 ,9 67,5 88,0 92,7 69,2 89,3 ,2 79,2 83,1 91,2 67,7 a Chaque extrait 12K a été préparé à partir du testicule de l'animal indiqué. L'inoculum pour chaque groupe a été dilué à partir de l'extrait de testicule de lapin infecté de manière que la concentration finale de chaque extrait 12K dans le milieu de culture soit égale à 1:30. cteur oyen accrois- sement 4,9 ,3 ,6 4,4 18,3 23,1 4,0 14,5 ,5 3,8 12A8 16,4 4,0 9,6 ,0 2,2 4, 9 ,7 b Contenait seulement l'extrait qui était présent dans l'inoculum. La dilution de l'inoculum a été effectuée en milieu MBRM plutôt qu'avec l'extrait testiculaire. La dilution finale de l'extrait était égale à 1:537, comparativement à la dilution de 1:30 pour les autres groupes. Figures 1A à 1D Figures 2A-2D LEGENDES DES FIGURES Microphotographies de T. pallidum prises au microscope électronique à balayage. (1A) cellule SflEp à laquelle sont fixés des tréponèmes après incubation pendant 5 jours. Pression égale 5 Am. (1B) Même repré- sentation que (1A), montrant de grands nombres de tréponèmes formant une micro- colonie (indiqué par une flèche sur la figure 1A). Pression = 1 jm. (lC) et (1D) colonies de T. pallidum après incubation pendant 7 jours. Pression = 1 gm. Microphotographies de T. pallidum prises au microscope électronique à balayage.(2A) Vue à faible grossissement montrant de nombreuses colonies de T. pallidum après incubation pendant 9 jours. Pression = 20 dm. (2B) Vue à fort grossissement d'une colonie (flèche) apparaissant en (A). Pression = 1 dm. (2C) Vue à faible grossissement après incubation pendant 12 jours, montrant une grande colonie (flèche), plusieurs colonies plus petites et de nombreux tréponèmes individuels. Pression = 5 dm. L'enveloppe cellulaire commence à se rompre.(2D) Vue à fort grossissement de la grande colonie apparaissant en (2C), renfermant de très nombreux tréponèmes. Pression = 1 dm. REVENDICAiONS 1. Procédé de culture et de mul ilication de TreDonema pallidum virulent, caracr en ce u'il con-. siste à inoculer une souche virulente de T. Dailidum à un milieu de culture de tissu comprenant un milieu essentiel minimal (MEM) de Eagle modifié additionné de sérum de foetus de bovidé (SF3) à une concentration finale d' environ e-;rcn % et une dilution d'environ 1:30 d'u.tra. t tesciculaire sous une tension d'oxygène dissous d'environ moins de 0,3 %O à environ 10 %. 2. Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que les cellules de la culture de tissu sur lesquelles l'organisme T. pallidum se fixe et se multiplie sont des cellules épithéliales (SflEp) de lapin du genre Sylvilagus croissant en cultures monocouche. 3. Procédé suivant la revendication 2, carac- térisé en ce que le milieu MEM de Eagle modifié comprend les composants suivants, à un volume final de 100 ml: 10 ml de solution de sels équilibrée de Earle 10x sans rouge de phénol ni NaHCO3, 2 ml d'aminoacides de MEM 50x, 1 ml de vitamines de MEI1i!00x, 1 ml de L-clutamine 200 mI, 1 ml d'amino-acides non essentiels de E1 100x et 1 ml d'héparine sadique à 100 U/ml, o on fait ensuite passer un courant gazeux de C02, après quoi on ajoute 3,33 ril de NaHCO3 (7,5 %), 3,13 ml de HEPES 12I (tampon organique), 0,63 ml de résazurine (20 rg %), 10 mq de pyruvate de sodium, 10 mg de dithiothréitol et 150 mg de glucose. 4. Procédé suivant la revendication 3, carac- térisé en ce que la solution obtenue est stérilisée par filtration avant l'addition de 25 ml de sérum de foetus de bovidé inactivé à la chaleur pour former le milieu de culture MBRM (Milieu de Base Réduit, Modifié) qui est alternativement mis sous vide et expose au passaae d'un courant gazeux formé d'un mêlange de 5 - de CO2 et de 95, de N2 avant l'utilisation, le sérum SFE pouvant être rem- placé avantageusement par du sérum de veau. 5. Procédé suivant la revendication 4, carac- térisé en ce que des récipients sont ensemencés avec x 105 cellules de l'épithélium SflEp dans du milieu MEM additionné de 10 % du SFB comme milieu de croissance et on les fait incuber à 330C, après quoi on retire le milieu de croissance et on le remplace par 10 ml de milieu MBRM que l'on expose ensuite au passage d'un courant gazeux formé de 5 % de Co2 et de 95 % de N2 pendant 1 minute à un débit de 3 litres/minute, on laisse le milieu s'équi- librer pendant 4 à 5 heures et on l'inocule avec 0,34 ml d'extrait testiculaire et on l'expose pendant 1 minute au passage d'un courant gazeux formé de 1,5 % de 02' 5 % de. C02 et 93,5 % de N2 à un débit de 3 litres/minute et on le fait incuber à 330C. 6. Procédé suivant la revendication 5, carac- térisé en ce que les inoculums de culture de tissu sont préparés par inoculation de lapins par voie intratesticulaire avec x 107 T. pallidum et les quatrième et neuvième jours suivants, on leur administre par voie intramusculaire 4 mg/kg de triamcinolone-acétonide, on prélève les testicules dans des conditions aseptiques le douzième jour approximativement, au moment o l'orchite est à son maximum, on subdivise les testicules en fines particules, on les extrait avec le mi- lieu MBRM, on les place sous vide, on les soumet à l'action d'un dispositif oscillant, on les centrifuge, on en dilue la liqueur surnageante dans de l'extrait testiculaire infec- té (ETI) frais, ce dernier constituant la liqueur surnageante de l'extrait infecté centrifugé à 12 000 x g pendant 10 mi- nutes, un volume de 0,34 ml de l'extrait renfermant les tréponèmes contenant le nombre désiré de tréponèmes devant être introduit dans chaque récipient de culture et l'addi- tion dudit extrait à 10 ml de milieu MBRM donnant le rapport ETI:MBRM optimal de 1:30 essentiel à la survie de T. palli- dum dans une culture de tissu, l'inoculum initial de T. pallidum étant de préférence de l'ordre de 106, ou bien de préférence, l'extrait testiculaire de lapins normaux étant utilisé comme diluant à la pluce de l'ETI. 7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la souche est la souche Nichols virulente. 8. Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que l'extrait testiculaire est choisi entre un extrait de testicules infectés (ETI) ou normaux de lapin adulte, de lapin immature, de rat adulte ou de hams- ter adulte, ou en ce que la plage de températures va d'environ 33 à environ 350C. 9. Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que la concentration en SFE est d'environ %, la tension en oxygène dissous va d'environ 1,5 à environ 5 % ou bien la période d'incubation est d'environ 9 jours à environ 12 jours. 10. Une culture de Treponema pallidum relative- ment pure et ne renfermant pas de tissu-hôte, obtenue par le procédé suivant la revendication 1.