Brevet FR2511156A1 — publié le 19830211

La présente invention concerne le dépistage de la toxoplasmose Elle concerne plus particulièrement des toxo- plasmes colorés en suspension stable dans un milieu liquide et un procédé amélioré pour le dépistage de la toxoplasmose utilisant de tels toxoplasmes et reposant sur une agglutina- tion directe de ceux-ci. Parmi les tests connus de dépistage de la toxoplasmo- se, l'agglutination directe est un des plus répandus Son principe est connu depuis 1965: il consiste à visualiser la présence éventuelle d'anticorps anti-toxoplasmes par l'agglutination d'une suspension de parasitesdans une cupule de microtitration En présence d'anticorps,les parasites, reliés par un réseau de gamma-globulines,forment un voile qui tapisse le fond de la cupule En l'absence d'an- ticorps,par contre,ils sédimentent en bouton. L'inconvénient majeur de cette réaction très spécifi- que est de fatiguer la vue des personnes qui effectuent ces tests Les toxoplasmes sont pratiquement transparents et les voiles d'agglutination sont pratiquement invisibles Les bou- tons de sédimentation exigent un éclairage rasant pour être bien visibles. De ce fait,nombre de biologistes préfèrent utiliser des hématies sensibilisées avec un extrait antigénique de toxoplasmes L'hémagglutination-ou la sédimentation- peut alors être constatée sans aucune fatigue visuelle. Cependant,pour être specifique,la réaction nécessite qu'on épuise au préalable les sérums en anticorps anti-hématies,de façon à ne laisser subsister que les anticorps anti-toxo- plasmose Cette technique présente également un autre incon- vénient:comme elle fait appel à un antigène figuré,réalisé en greffant chimiquement une fraction antigénique solubili- sée sur une hématie,la réponse de la réaction d'hémaggluti- nation est moins parallèle à la technique de référence (dit "dyetest")que l'agglutination directe. La présente invention a pour but de procurer un moyen de dépistage de la toxoplasmose qui allie la spécificité à la lisibilité et permette ainsi de procéder à des tests sûrs sans fatigue visuelle excessive. On y parvient selon l'invention en rendant l'agglutination directe très facilement lisible grâce à l'utilisation de toxoplasmes colorés en suspension stable, c'est-à-dire d'une suspension de toxoplasmes colorés qui garde ses qualités d'antigénicité et de coloration pendant une longue périodeen pratique pendant plusieurs mois. La réaction d'agglutination est alors aussi nette qu'elle le serait avec des hématies. Il est bien certain que le principe consistant à colorer des microorganismes est connu depuis longtemps Ce- pendant toutes ces colorations ont en commun deux points qui les distinguent de la présente invention,du point de vue tant du choix et de l'agencement que de la finalité des mo- yens concernés:- -la coloration est toujours extemporanée et est destinée à faciliter un examen microscopique immédiat La préoccupation de stabilité à long terme de la coloration et de la qualité antigénique de parasite est toujours absente de ce type d'examen. -la coloration n'a jamais été employée, à la connais- sance de la demanderesse,pour visualiser un phénomène d'agglutination d'une suspension de toxoplasmes,même extemporanément. C'est ainsi qu'on emploie classiquement notamment du Bleu Evans pour colorer les toxoplasmes et améliorer par ce biais le contraste de lecture en immunofluorescence;mais selon cette technique,qui repose sur une lecture en immuno-fluorescence,les parasites sont déposés sur une lame de microscope et mis à sécher,et on dépose sur la forme sèche du produit une goutte de colorant,on laisse incuber, puis on rince Cette technique de coloration extemporanée a fondamentalement pour objectif d'améliorer le contraste entre le bord du microorganisme et le centre,lors d'un examen par fluorescence. Selon l'invention,par contre,on prépare des toxoplas- mes colorés en suspension stable en milieu liquide et on sa- tisfait à la double exigence de stabilité à long terme de la coloration et de qualité antigénique du moyen de dépistage de la toxoplasmose ainsi réalisé Pour ce faire,on traite une suspension du parasite non sèche,en y fixant un colorant selon les techniques connues de l'homme de l'art et appropriées au type de colorant choisi,et on lave pour enlever l'excès de colorant. Les substances colorantes qui peuvent être mises en oeuvre selon l'invention sont: -d'une manière générale tous les colorants des protéi- nes,des lipides,des lipo-protéines,des mucopolysacchaidesa,des glycoprotéines et/ou des acides nucléiques. -plus particulièrement tous les colorants du cyto- plasme,des vacuoles,du noyau et autres organites intracellulai- res ou des membranes cellulaires;et -plus spécifiquement,mais à titre d'exemples uniquement: le Noir Soudan B(qui est actuellement le colorant qu'on préfère à tous les autres),le Bleu Evans,les sels de tétrazolium, l'acide osmique,l'iode,etc Avant de mettre en oeuvre un colorant déterminé conformément à l'invention,il convient de vérifier par un test préalable si ce colorant est approprié ou non Le test à effectuer est double et peut se définir comme suit: Après la réaction de coloration en milieu liquide, les toxoplasmes sont lavés et centrifugés jusqu'à ce que le surnageant des centrifugations soit limpide et incolore Si les toxoplasmes sont encore colorés,on teste leur qualité antigénique par la réaction bien connue d'agglutination directe: -les parasites ne doivent pas avoir perdu de sensibilité (même titre d'agglutination pour le même sérum positif,avant et après coloration), -ils ne doivent pas avoir perdu de spécificité:les sérums négatifs ne doivent pas donner d'agglutination. Si ces tests sont satisfaisants,on examine alors la stabilité de la coloration: -à court terme,en vieillissement accéléré de quelques jours à 37 C, -à long terme,en vieillissement naturel d'un an à + 4 C. Le milieu de suspension doit rester suffisamment peu coloré pour permettre une parfaite visualisation des pa- rasites,et les qualités de spécificité et de sensibilité doivent être conservées. Si tous ces critères sont satisfaits,le colorant testé peut être retenu. L'invention a donc pour premier objet des toxoplasmes colorés en suspension stable en milieu liquide, qui satis- font au double test d'antigênicité,et de stabilité défini ci-dessus. Selon une variante tout particulièrement préférée,mise en oeuvre selon des méthodes faisant appel à des techniques de fixation de substances entre elles par liaisons covalentes que l'homme de l'art est apte à adapter au cas d'espèce, les toxoplasmes colorés selon l'invention comportent un chro- mophore fixé par liaison chimique covalent entre des fonctions respectives appropriées dudit chromophore et du toxoplasme. L'invention a également pour objet l'application de ces toxoplasmes colorés en suspension stable en milieu liquide au dépistage de la toxoplasmose par agglutination directe avec formation d'un voile coloré La technique d'agglutination directe à laquelle peuvent être soumis les toxoplasmes colorés est décrite,notamment,dans "Agglutination Directe des Toxoplas- mes" P COUGINEAU et H BAUFINE-DUCROCQ-Ann Biol Clin 28, 411-415 ( 1970). L'invention est décrite plus en détail dans les exemples concrets ciaprès,qui visent à mieux l'illustrer et ne la limitent aucunement. EXEMPLE 1:Coloration du cytoplasme. Les toxoplasmes sont suspendus dans une solution de Bleu Evans à 25 mg/l, de préférence tamponnée à p H 7,0 par un tampon phosphate 0,02 M contenant 7,5 g/l de chlorure de sodium (P B S). Après incubation d'une demi-heure à 37 C,les toxo- plasmes sont rincés environ 5 fois par centrifugation dans du P.B S jusqu'à obtention d'un surnageant incolore. La richesse de la suspension est alors ajustée à 000 parasites/microlitre par dilution dans du P B S con- tenant un conservateur,par exemple de l'azide de sodium à 1 g/l Cette suspension est prête à l'emploi pour les tests dits d'agglutination directe. EXEMPLE 2 Coloration des substances lipidiques On prépare une solution de Noir Soudan B dans la proportion suivante: -Noir Soudan B 0,2 g -Ethanol 70 ml -Eau 30 ml A 5 ml de suspension de toxoplasmes dans du P B S, on ajoute 2 ml de cette solution de Noir Soudan B. Le mélange est mis à incuber 30 minutes à 37 C, puis les toxoplasmes sont rincés comme dans l'exemple 1. La richesse de la suspension est ajustée de la même façon que dans l'exemple 1 et cette suspension ajustée est également prête à l'emploi pour des tests d'agglutination directe sur toxoplasmes colorés. EXEMPLE 3 Couplage chimique d'un chromophore. Cet exemple a pour but de montrer qu'on peut également coupler une substance colorée par une liaison chimique covalente entre le chromophore et le support toxo- plasme. On suspend les parasites dans une solution fraîche à 1 % d'acide periodique dans l'eau,ce qui transforme les al- cools vicinaux des sucres en aldéhyde. Après incubation de 5 minutes,les toxoplasmes sont rincés une fois au P B S On ajoute alors une solution de fuchsine basique préparée de la façon suivante: -Fuchsine basique 2 g -Métabisulfite de potassium 4 g -Acide chlorhydrique 2 N 20 ml -Eau 400 ml. On incube 15 minutes à température ambiante. Les amines sont capables de se coupler aux fonctions aldéhydes créées par l'oxydation à l'acide périodique On conjugue ainsi la fuchsine au toxoplasme. On rince 2 fois pendant 5 minutes avec une solution légèrement acide (p H 2,5) de 4 g/l de métabisulfite de potassium dans de l'eau additionnée d'acide chlorhydrique. On termine par un rinçage-au P B S et l'ajustement de la suspension comme décrit dans l'exemple 1 On obtient ainsi une suspension prête à l'emploi pour des tests d'agglutination directe améliorés conformément à l'invention. REVENDICATIONS l.Toxoplasmes colorés,caractérisés en ce qu'ils sont en suspension stable en milieu liquide. 2.Toxoplasmes colorés selon la revendication 1, caractérisés en ce que le colorant est choisi parmi les colorants des protéines,des lipides,des lipo-protéines, des mucopolysaccharides, des glycoprotéines et/ou des acides nucléiques. 3 Toxoplasmes colorés selon la revendication 2, caractérisés en ce que le colorant est un colorant du cyto- plasme, des vacuoles, du noyau et autres organites intra- cellulaires ou des membranes cellulaires. 4 Toxoplasmes colorés selon la revendication 2, caractérisés en ce que le colorant est choisi parmi le Noir Soudan B, le Bleu Evans et la fuchsine en solution basique. Toxoplasmes colorés selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,caractérisés en ce qu'ils sont en suspension stable en milieu aqueux. 6 Toxoplasmes colorés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisés en ce qu'ils comportent un chromophore fixé par liaison chimique covalente entre des fonctions respectives appropriées dudit chromophore et du toxoplasme. 7 Application des toxoplasmes colorés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 au dépistage de la toxoplasmose par agglutination directe avec formation d'un voile coloré.