Brevet FR2509313A1 — publié le 19830114

Dérivés de 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine, leur pré- paration et leurs applications biologiques. L'invention est relative à des dérivés de 3-fucosyl- N-acétyl lactosamine, leur préparation et leurs applica- tions biologiques. Elle concerne plus particulièrement des dérivés de 3fucosyl-N-acétyl lactosamine répondant à la séquence trisaccharidique suivante 0 Gal1 1 4 Glc N Ac 1,i 3 Fuc sera appelé ci-après glucosamine) et Fuc un motif fucopyra- nosyle. Cette séquence trisaccharidique a déjà été détectée chimiquement sur certaines glycoprotéines et sur certains glycolipides de tissus normaux ou tumoraux Aucune infor- mation n'a cependant été donnée sur sa distribution dans les tissus. I 1 avait été suggéré que cette structure; présente sur des érythrocytes, avait pu conduire, dans un cas par- ticulier, à une réponse immunologique Mais, il n'en résultait aucune information sur une détection possible de cette séquence oligosaccharidique en tant qu'anti- gène dans divers tissus. Aucune corrélation n'avait donc été établie entre la présence de cette structure dans les tissus et la possi- bilite de la détecter en tant qu'antigène. De plus, ces connaissances ne pouvaient amener établir de corrélations entre la présence de cette structure dans les tissus et la présence d'anticorps vis-à-vis de cette structure durant le développement normal des tissus ou dans les états pathologiques. En outre, dans les travaux antérieurs effectués dans ce domaine, la matière étudiée était constituée par des produits naturels d'extraction Or, de tels produits contiennent souvent des contaminants, avec des substances non déterminées, ce qui introduit des facteurs d'inexac- titudes quant à la spécificité des observations immunolo- giques. Il a été à présent découvert que la séquence 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine en question ne peut être détectée comme antigène que dans certaines conditions Ces travaux établissent donc que si cette structure peut être chimiquement détectable, elle ne s'exprime pas dans tous les cas en tant qu'antigène. Les travaux qui ont conduit à la mise au point de- l'invention se rapportent à l'étude d'un anticorps, appelé anti-SSEA 1, formé contre un carcinome de souris L'inté- rêt pour cet anticorps résultait de sa reconnaissance d'un antigène embryonnaire (de structure inconnue) apparaissant à un stade du développement embryonnaire de la souris correspondant à huit cellules, ou antigène SSEA-1. Il a été alors trouvé que, d'une manière inattendue, l'anticorps anti-SSEA 1 reconnaissait des structures com- portant la séquence 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine en ques- tion La démonstratibn de la reconnaissance spécifique de cette structure par l'anticorps anti-SSEA 1 a été appor- tée en utilisant le trisaccharide obtenu par voie de synthè- se, et par là de pureté et de spécificité élevées. Il a pu être ainsi établi que l'antigénicité du SSEA-1 résultait de la séquence 3-fucosyl-N-acétyl lacto- samine. L'étude des conditions et des tissus dans lesquels la séquence en question se trouve non seulement présente, mais o son antigénicité peut s'exprimer a permis de réaliser une autre étape de l'invention en conduisant à étudier l'uti- lité de la 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine et de dérivés de substitution de ce trisaccharide ainsi que des anticorps formés par le trisaccharide et ses produits de substitution, en particulier pour des diagnostics et en thérapeutique. L'invention a donc pour objet de fournir de nouveaux dérivés du trisaccharide 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine, utilisables comme réactifs biologiques ou facilitant grâce à leurs caractéristiques propres la mise à profit des propriétés du trisaccharide en question Elle vise égale- ment à fournir des voies d'accès à ces trisaccharides. Elle a également pour but les applications, comme déterminant antigénique, dutrisaccharide 3-fucosyl-N- acétyl lactosamine et ses dérivés, en particulier, les réactifs antigéniques et les anticorps élaborés à partir de ces produits ainsi que les immunoabsorbants résultant du couplage de ces produits sur des supports solides. Les nouveaux trisaccharides de l'invention sont des dérivés de substitution du trisaccharide O--L-fucopyrano- syl ( 11)3) -/O-ê-D-galaotopyranosyl ( 1 4)-2- acétamido-2-déoxy-D-glucopyranose_ (ce trisaccharide est désigné dans la description et les revendications par le ter- me 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine) et répondent à la formule: BO OB C Ti 2 OB 0 o O OA o Y B CHOB 2 NH Ac OB OB B dans laquelle: A représente un groupe alcoyle comportant 2 à 10 atomes de carbone, ou un groupe hydroxy-alcoyle avec 2 à 10 atomes de caibone comportant un ou plusieurs groupes hydroxyle, avanta- geusement un groupe hydroxyle en bout de chaine, ou un groupe comportant une ou plusieurs liaisons insaturées, en particulier un radical éthyléniquement insaturé, choisi parmi les radicaux alcényle, et plus spécialement les radi- caux alcényle à 2 à 10 atomes de carbone, ou encore l'un des groupes précédents, mais comportant un ou plusieurs groupes éther et/ou amine intercalaires, les différents groupes représentés par A pouvant être terminés par un groupement azoté notamment amino, amido, hydrazine, azido, ou un groupement acide carboxylique éventuellement éthérifié ou estérifié, les substituants B, identiques ou différents les uns des autres,(l)représentent,le cas échéant avec un substi- tuant voisin, des groupes de protection de radicaux hy- droxyle et sont choisis parmi des groupes stables, non réactifs dans les conditions habituelles de synthèse osi- dique et facilement éliminables dans des conditions douces, compatibles avec le maintien de la structure osi- dique, en particulier,par des groupes benzyle, benzylidény- le ou acétyle, ou ( 2) représentent un atome d'hydrogène. Dans un groupe préféré de dérivés d'osides selon l'invention, A représente un radical alcoyle comportant 2 à 10 atomes de cai Zbone, substitué par au moins un groupe hydroxyle, avantageusement en bout de chaine, notamment un radical alcoylèneglycol ou hydroxyalcoyle. Des produits dans lesquels A représente un groupe 0;, dihydroxypropyle, hydroxyéthyle ou hydroxypropyle constituent des réactifs biologiques spé- cialement intéressants dans les applications biologiques faisant intervenir leur fixation sur une protéine ou un sup- port insoluble comportant des fonctions amino libres, par exemple, pour la constitution respectivement d'antigènes artificiels et d'immunoabsorbants. Dans un groupe préféré de trisaccharides selon l'in- vention, A comprend une, avantageusement deux, fonctions éther intercalaires et comporte en bout de chaine un groupe azoté Ces significations correspondent à des chaines du type ( 1): -(CH 2)n -0-(CH 2)n,-0-R, ou ( 2): -(CH 2)n I-0-R, ou ( 3): -(CH 2)n"'-R dans lesquelles R représente un groupe azoté tel que -NH 2, N NH NH 2, et N et n, identiques ou différents l'un de l'autre, sont égaux à 1,2; 3, ou 4, N + n' étant avantageusement un 25093 i 3 nombre de 4 à 10, de préférence égal a 8, ni" et n"' sont des nombres de 1 à 10, avantageusement de 4 à 10, de préférence égaux à 8. D'autres trisaccharides préférés comportent une chaîne A de structure ( 1) ou ( 2), dans laquelle R représente un atome d'hydrogène. Dans un autre groupe préféeere de trisaccharides, A représente des chaînes possédant la structure ( 1), ( 2) ou ( 3) ci-dessus dans laquelle R représente un groupe -COOR' ou -COR', R' représentant un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle avec 1,2 ou 3 atomes de carbone ou encore R représente un groupe -CONH 2- D'autres trisaccharides préférés comportent dans la chaîne A un ou plusieurs groupements amine intercalaires. Des trisaccharides également avantageux correspon- dent à des produits dans lesquels A présente la structure ( 1) ou ( 2) cidessus, dans laquelle R représente un groupe alcényle avec 2 à 10 atomes de carbone, de préférence un groupe allyle. La préparation de ces nouveaux trisaccharides sein- tègre avantageusement dans le processus de synthèse du tri- saccharide 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine décrit par JACQUI- NET et SINAY dans J Chemo Soc p 314-318,1979 o On rappelle que dans son senéma le plus général, ce procédé comporte dans une première etape, la réaction du bromure de 2,3,4,6-tétra-0-acétyl D-galactopyranosyle avec du benzyl-2-acétamido-3-O-allyl-6-O-benzyl-2-déoxy D-glucopy- ranoside dans du dichloroéthane-1,2, en présence de bromure de'mercure et de tamis moléculaire 4 A o Le produit résultant est alors constitué'par le benzyl 2-acétamido-4-0 ( 2,3,4,6-tétra-0-acétyl D-galactopyranosyle)-3-0-allyl- 6-0-benzyl-2-déoxy D-glucopyranoside Dans une deuxième étape, le groupe allyle est éliminé avec du chloro (tristri- phénylphosphine)-rhodium et le produit obtenu est condensé avec du bromure de 2,3,4-tri-O-benzyl L-fucopyranosyle. Les groupes acétyle sont ensuite éliminés et le trisaccha- riae 3-rucosyil lactosamine est obtenu après hydrogénolyse catalytique. Dans le cadre de l'invention, ce schéma est donc avantageusement utilisé, mais on le réalise en mettant en oeuvre un motif glucopyranose, élaboré de manière à comporter le bras de substitution désiré. Selon un mode de réalisation de ces produits permettant plus spécialement l'élaboration de chaînes ( 1) c'est-à-dire comportant au moins deux groupements éther intercalaires, on met en oeuvre, aux fins de constitution de ces chalnes,-du triéthylène glycol. Cette variante présente l'avantage de permettre l'utilisation d'un produit de faible coût et dont la réac- tivité offre l'accès à de nombreuseswsubstitutions - Les chaînes élaborées sont alors condensées avec un dérivé réactif de la glucosamine évoquée en rapport avec le procédé de synthèse de JACQUINET et SINAY ci-dessus, par exemple, le chlorure de cette glucosamine, et le produit résultant est mis en oeuvre dans le procédé en-question. Dans une autre variante, qui permet plus spécialement l'obtention de trisaccharides substitués sur le motif glucosamine par une chaîne de structure ( 3) on a avanta- geusement recours aux méthodes classiques de type KOENIGS- KNORR comportant la réaction d'un dérivé réactif d'une glucosamine/tel qu'une 1,2-oxaline, avec un acide monocarboxy- lique de structure: HO (CH 2)n,-COOR dans laquelle n"' -et R présentent les significations données ci-dessus. La @-glucosamine de formule: O O (CH 2)n"' -COOR CH 2 n'y C 6 H 5 OH O L NH Ac est ensuite intégrée dans le procédé de JACQUINET et SINAY. Selon un autre mode de réalisation permettant d'obtenir les trisaccharides de l'invention dans lesquels A représente un groupe allyle ou une chaine pouvant être obtenue en utilisant la réactivité du groupe allyle, on procède tout d'abord à la synthèse d'un trisaccharide répondant à la structure des trisaccharides de l'invention, dans lequel tous les groupes -OH sont engagés dans des groupements pro- tecteurs, et sont avantageusement benzylés Selon les réac- tions classiques de la synthèse organique, on introduit un groupement allyle en position 1, en, de la g Iucosamine. A partir de l'allyl-l-e-glucosamine, grâce à la réactivité du groupe allyle, i- 11 est possible de procéder à l'allongement de la chaîne de manière à introduire les différents groupes souhaités,L'articulation des différentes réactions impliquées s'effectue selon les techniques classiques de synthèse. Il est notamment avantageux, pour allonger la chaine allylique, de soumettre le dérivé allyle à une réaction d'hydroboration, en utilisant un réactif tel que le 9-borabicyclo l 3 3 17 nonane, puis à l'action d'une base. On obtient alors une chaine correspondante terminée par un groupement fonctionnel alcool On notera que ce groupe peut être aisément éthérifié et permet l'introduction d'un groupe éther intercalaire dans la chaine de substitution A, les autres hydroxyle du trisaccharide étant protégés par des éthers benzyliques. En vue des applications o il apparait souhaitable de 'disposer d'une chaine servant de bras de couplage pour la fixation sur un support, on traite la chaîne à groupement alcool précédente par un halogénure d'allyle pour introduire un nouveau groupement allyle qui sera à son tour avantageuse- ment soumis à 'une réaction d'hydroboration. Ce jeu de réactions permet d'augmenter, comme souhaité, la longueur de la chaîne de substitution et de disposer en bout de chaîne de groupements fonctionnels permet- tant par leur réactivité une meilleure mise à profit des propriétés des osides de l'invention. 2509313- Parmi les diverses possibilités de traitement offertes, il est avantageux de recourir à une tosylation puis de faire réagir le dérivé tosylé avec un azide. Comme indiqué ci-dessus, -les travaux qui sont à la base de la mise au point de-l'invention ont montré que la séquence 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine pouvant être détectée en tant qu'antigène et qu'elle ne s'exprimait que dans certaines conditions et dans certains tissus o la densité de cette séquence était relativement élevée Une O 10 série de résultats d'essais radioimmunologiques effectués à cet égard sont donnés ci-après à titre illustratif. L'invention fournit alors des moyens permettant d'assurer la détection de cette séquence, et de metrre à profit cette détection dans diverses applications immuno- logiques de grand intérêt. L'invention vise; en particulier, des réactifs de diagnostic, mettant à profit le caractère antigénique du trisaccharide 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine, ou de ses dérivés de substitution définis ci-dessus Ces réactifs sont utilisables tels quels ou sous forme immobilisée Elle vise également les anticorps formés vis-à-vis de ce tri- saccharide et de ses dérivés. Ces réactifs antigéniques s'avèrent spécialement précieux pour la caractérisation de structures et d'anticorps,en particulier, pour détecter la présence ou étudier les variations de taux d'anticorps -dans diverses conditions liées au développement cellulaire (embryogénèse)u à des états pathologiques qui correspondent alors à unstade o le caractère antigéniqie de la séquence 3-fucosyl-N-acé- tyl lactosamine a-pu s'exprimer - Ils présentent, en particulier, un grand intérêt pour la détection d'anticorps libérés au cours de maladies auto-irmunes, de troubles de la grossesse, (notamment dans le cas de toxémies) et chez les patients atteints de certains cancers ou encore dans lecas -de tératocarcinomes. L'invention vise également les anticorps spécifi- ques formés vis-à-vis du trisaccharide 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine et de ses dérivés de substitution selon l'invention. D'une manière avantageuse, ces anticorps spécifi- ques permettent de déterminer comment l'antigénicité de la structure trisaccharidique en question peut être affectée durant le développement cellulaire et, d'une manière générale, si cette structure s'exprime ou non comme anti- gène dans les tissus. De tels produits, quiseront avantageusement radio- marqués,* soit par des radioisotopes soit par des subs- tances fluorescentes ou autres substances biochimiquement décelables pour faciliter les localisations constituent de précieux composés de référence en permettant de reconnaître la structure 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine en tant qu'an- tigène dans des séquences complexes de matériaux biologi- ques. On mesurera l'intérêt pour ces diverses applica- tions de pouvoir disposer aisément de produits de pureté élevée, grâce à leur obtention possible par voie de synthèse. La 3-fucosyl-N-acétyl lactosamins et les dérivés selon l'invention sont également avantageusement mis en oeuvre, comme composes de réféerence pour élaborer des substrats d'enzyme, en particulier, des substrats de gly- cosédases et de glycosyl-transférases. Les chaînes de substitution définies ci-dessus permettent la mise à profit des propriétés antigéniques du trisaccharide 3-fucosyl-W-acétyl lactosamine dans des an- tigènes artificiels ou dans des immunoabsorba-nts Ces chai- nes constituent en effet de précieux bras espaceurs permet- tant, selon leur nature, une fixation sur des protéines ou divers types de supports insolubles aux fins d'élaboration respectivement d'antigènes artificiels et d'immunoabsor- bants. L'invention vise donc également, en tant que produits nouveaux, ces antigènes artificiels et ces immuno- absorbants. Pour l'élaboration d'antigènes artificiels, on utilise des trisaccharides dont les chaînes se terminent plus spécialement par un groupe -COOH ou -NH 2 le couplage étant effectué sur une macromolécule porteuse, pouvant être administrée à l'animal, telle que la poly-Lalanine- lysine, l'albumine ou la thyroglobuline. Les chaînes possédant au moins une fonction éther intercalaire, c'est-àdire au sein de la chalne, présentent un caractère hydrophile précieux. Les chaînes de ce type terminées par un groupe amino sont particulièrement avantageuses pour le couplage du trisaccharide sur des supports solides de grande stabi- lité, comportant des sites de fixation -OH ou -COOH, ou encore -CONH 2. Les chalnes de substitution des trisaccharides de l'invention permettent ainsi d'accéder à-des supports conduisant à des immunoabsorbants dotés d'une capacité d'absorption d'anticorps anti-3 fucosyl lactosamine élevée et ne donnant pas lieu à des absorptions non spécifiques. Des supports avantageusement utilisables sont cons- titués par des supports à base depolymères renfermant des polysaccharides notamment à base de cellulose, éventuellement en combinaison avec d'autres dérivés tels que la lignine. Des supports de ce type sont constitués par de la rafle de mais. D'autres supports donnant lieu à une absorption spé- cifique élevée sont constitués par des polymères r'enfermant ou formés de polysaccharides, tels que de l'agarose ou de l'agarose modifié par réticulation de ses chaînes polysac- charidiques, (notamment celui commercialisé sous la marque Sépharose par Pharmacia). D 4 autres supports appropriés comprennent la silice, des billes de verre ou de latex ou des polymères mixtes renfermant, outre les polysaccharides ci-dessus, d'autres dérivés polymères tels que des polyacrylamides. Co.m-Tc support de ce Lype cowvenant dans le cadre de l'in- vention, on peut citer ceux commercialisés-sous les marques ULTROGEL ou encore MAGNOGEL par IBF(Industrie Biolo- gique Française). D'une manière générale, afin d'empecher toute fixation non spécifique, le produit de couplage est avantageusement mis en suspension dans une solution permettant de saturer les sites de fixations encore libres. Cette mise en suspension est, par exemple, effectuée dans une solution protéique. Pour le couplage desproduits de l'invention sur les supports du type évoqué ci-dessus, on a avantageusement recours aux méthodes générales utilisées en chromatographie d'affinité - Selon les techniques courantes, le support solide sur lequel on souhaite immobiliser le dérivé d'oside est au préalable activé Cette activation peut être réalisée selon différents moyens, par exemple, à l'aide de bromure de cyanogène, de carbonyldiimidazole, d'hydrazine ou de glutaraldéhyde ou tout autre produit connu à cet effet et équivalent. L'invention fournit donc des immunoabsorbants de synthèse particulièrement précieux, permettant l'élaboration de sérums-tests à spécificité 3-fucosyl-lactosamine ou dépourvus d'anticorps anti-3-fucosyl- lactosamine qu'on désire-éliminer. L'intéret de ces immunoabsorbants de l'invention est d'autant plus grand qu'ils sont régénérables Ainsi, après élution en milieu acide des anti-SSEA-ofixés sur des immuno- absorbants et concentration, on élimine les anticorps anti- SSEA-Iet l'on dispose des immunoabsorbants qui peuvent être à nouveau utilisés Les anti-SSEA-lsont alors récupérés avec des titres élevés. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et en se reportant aux figures. EXEMPLE 1: Préparation -du trisaccharide d e formule o O u Gaic O o NH 2 Ga 15 / 1 L-Fuc - dans laquelle Gal et Fuc présentent les significations données ci-dessus et Ac un groupe acétyle. On opère selon le procédé de JACQUINET et SINAY décrit dans J Chem Soc p 314-318,-1979, mais à la place de benzyl glycoside (a), on utilise un glycoside avec HO-(CH 2)2-O-(CH 2)2 (CH 2)2 N 3 Cet azide est obtenu à l'aide des trois étapes a) monotosylation du triéthylèneglycol b) formation du dérivé azido correspondant c) condensation avec le chlorure de 2-acétamido-3,4,6- tri-O-acétyl-2-désoxy- -D-glucopyranosyle. On réalise chacune de ces étapes en procédant comme suit: a) monotosylation du triéthvlènel col: OH o Ts représente le groupe tosyle. On dissout 1 g de triétgylèneglycol dans 10 ml de pyridine anhydre, on refroidit à O C puis on verse goutte à goutte une solution de 1,26 g dechlorure de tosyle (c'est-à-dire un équivalent) dans 5 ml de pyridine et on soumet le mé- lange à agitation pendant 4 heures De l'eau glacée est alors ajoutée, puis on soumet le mélange résultant à agita- tion pendant une heure Le traitement classique (extraction à l'aide de chloroforme, lavage de la phase chloroformique à l'eau et séchage avec du sulfate de sodium) conduit à un résidu qui est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice. Rendement 60 à 75 % en monotosyle de triéthylèneglycol. b) passage au dérivé azido correspondant: O OH o OH On dissout 20 g de dérivé monotosyle dans 20 ml de DMF anhydre, 8,5 Na N 3 ( 2 équivalents par rapport au déri- vé monotosyle), on soumet le mélange à agitation pendant 1 heure à 80 C, puis on refroidit On élimine ensuite les sels insolubles par filtration sur verre frittée Après plusieurs lavages au chloroforme, on récupère le filtrat global (y compris les eaux de lavage avec le chloroforme) et on le lave avec de l'eau jusqu'à p H neutre. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium et éva- porée sous vide Le DMF est éliminé sous IO mm de mercure entre 80 et 1200 C, puis le produit, séché, est distillé sous mm de mercure à environ 150 C On obtient ainsi, dans cette manipulation environ 7,5 g de produit, ce qui repré- sente un rendement de 65 % en azide Une distillation supplé- mentaire sous 10-3 mm de mercure conduit à un produit ayant un point d'ébullition de 60 O C. Analyse élémentaire calculé trouvé Carbone 41, 13 41,34 Hydrogène 4,48 7,54 Azote 23,99 23,61 c) condensation avec le chlorure de 2-acétamido= 34 6-tri-O- acétol-2-dés -"-D-clL Sucogprano ' On fait réagir 12,5 g d'acêtochloro Nacétylglucosamine, 3 g du dérivé d'azido précédent, 3 g de tamis moléculaire 4 A, 2 ml de tétraméthylène, 20 ml de dichlorométhane anhydre, et l'on soumet le mélange à agitation à ODC pendant 30 mno On ajoute alors 7 g de triflate d'argent, puis on soumet ce mélange à agitation à l'abri de la lumière et de l'humidité pendant 17 heures à température ambiante. Après avoir effectué le traitement habituel, (dilution avec ec lu, c cxtraztion àll'aic de chloroforme, lavage de la phase chloroformique avec de l'eau et séchage de la phase chloroformique avec du sulfatede sodium), on soumet le résidu obtenu à une chromatographie sur colonne de gel * de silice de 250 g en utilisant com me éluant l'éther- méthanol ( 20: 1 volume de méthanol) On récupère 6,5 g de produit cristallin. _ O Ac 7 O Ac O N N o " Xy O Ac O Ac NH Ac Rendement de 75 % On récupère 1,3 g supplémentaire de produit en traitant les produits restant à la surface de la colonne, ce qui cor- respond à un rendement total de 90 %. Les caractéristiques physiques et analytiques de ce pro- duit sont les suivantes: PF = 69-700 C 1 C K 29,6 (c = 1,08 de chloroforme) D Analyse élémentaire-: calculé trouvé Carbone 47,61 47,48 Hydrogène 6,39 6,17 Azote 11,10 10,89 Au cours d'une étape supplémentaire, on procéde à l'élimination des groupes acétyle en opérant comme suit: 500 mg du produit tétraacétylé sont à dissoudre dans 10 ml de méthanol anhydre, on ajotue quelques gouttes d'une solu- tion de méthoxyde de sodium dans le méthanol et on soumet le mélange à agitation pendant 2 heures à température am- biante,Le traitement habituel évoqué ci-dessus est suivi d'une purification sur gel de silice On récupère 285 mg de pro- duit. Rendement 75 %. L'analyse élémentaire du produit purifié est la suivante: calculé trouvé Carbone 44,44 44,65 Hydrogène 6,93 7,00 Azote 14,81 14,65 O Ac L O 3 /:o 0 \ O O l IA o O Ac K Nlsc Nt N Ac Le produit "désacétylé" peut être utilisé tel quel, c'est-à-dire sans purification préalable pour former le dérivé: o-1 NHAé On dissout 300 mg du produit désacétylé dans 6 ml' de DMF anhydre, on ajoute 133 mg de diméthoxy toluène, une quantité catalytique d'acide paratoluène sulfonique, et on laisse le réacteur sur un évaporateur de type B Uchi dont le bain-marie est maintenu à 55-60 C pendant une heure. On refroidit ensuite le mélange réactionnel, on le dilue avec du chloroforme et on le lave avec une solution de bicarbonate de sodium puis avec une solution de chlorure de sodium Après séchage de la phase organique sur du sulfate de sodium et évaporation, on obtient un résidu que l'on recristallise dans l'éthanol, ce qui conduit à 304 mg (rendement de 82 %) d'un produit cristal- lin présentant les caractéristiques suivantes: PF 1931940 C C C'CI 76,5 ( c = 1,62 chloroforme) _W^D 250931,3 Analyse élémentaire Carbone Hydrogène Azote calculé 54,07 6,48 12,01 trouvé 54,24 6,34 12,14 EXEMPLE 2: Préparation du trisaccharide de formule: Vo l -OH O ou On soumet le dérivé azido obtenu selon l'exempie 1 àl'action de m 6thylate de sodiumn, en presence de méthanol, puis on hydrogène en présence de'Pd/C et de CH 3 COOH ce qui conduit au produit r O cherch. Hhi Ac 01- Onla formumet le dérivé azido obtenu selon l'exemple 2 mais dans laquelle à l'action de méthylate de sodiuni, en présence de méthanol, puis on hydrogène en présence de Pd/C et de 3 CH OH ce qui conduit au produit rècherché. EXEMPLE 3 Préparation du trisaccharide répondant à la formule donnée-dansl'exemple 2, mais dans laquelle la chaîne de substitution est constituée par le groupe. -O-(CH 2)8-COOCH 3 Ce produit est obtenu en soumettant le trisaccharide de formule OAc r I OB Ac O c OXL (Ci 2)l COO Me ? Ac/ x}o o / OB O OB au traitement donné dans l'exemple 2. EXEMPLE 4 Essais relatifs à la reconnaissance spécifique de la séquence 3-fucosyllactosamine. Les résultats des essais a) et b) sont rapportés ci-après. Dans les essais a), on a étudié l'inhibition de la fixation d'anti-SSEA-1 à du méconium d'origine humaine marqué par I 125, par d'une part, divers oligosaccharides naturels (C'est-à-dire constituant les chaînes de produits natu- rels), d'autre part, la 3-fucosyl-lactosamine elle-même, obtenue par voie de synthèse et un tetrasaccharide de synthèse. Les essais b) se rapportent à l'étude de J'in- hibition de la fixation d'anti-SSEA-1 à du méconium mar- qué par I 1 par du méconium, du placenta, ec uu úiuide amniotique, tous trois d'origine humaine. 18- Ces essais sont réalisés selon les techniques radio-immunologiques, avec utilisation de deux anticorps Le procédé de détermination utilisé cor- respond à une méthode modifiée par rapport à celle décrite par Wood, E, Lecompte, J, Childs, R A & FEIZI, T Mol Immunol 16, 813-819 ( 1979) L'anticorps anti-SSEA-l (dilution 1: 3000 dans de la sérum albumine bovine, tampon phosphate)' est obtenu à partir d'un liquide d'ascite de souris BALB/'c traitée avec du prispane, et à laquelle on a injecté des cellules hybrides produisant des anti- corps. A titre de véhicule, on utilise du sérum normal de souris (dilution i 100) - Le deuxième anti-corps est constitué par un sérum anti-souris d'immunoglobuline de lapin, non dilué (de Dako-immunoglobulins, Copenhague, Danemark). Essais a Les oligosaccharides utilisés sont les suivants (on indique pour chacun d'eux le symbole utilisé sur les cour- bes données sur la figure 1, leur structure et leur dési- gnation). :l 7 Gall 1 4 Glc N Acl 6 ? 3 hexenetetrol(s) N-1 RLO 7: I Fuccla 1,3 (t I Gald 1 c 'lu, 3 Glc N Ac-I 3 ou 4 galactitol N-1 RL O 28 1,4 Fuc V( 3 Glc N Ac Il I 1,4 Fuc O F 1,4 Fuc C& 3 Gal 1 $ 4 Gc Lacto-N-difucohexa- ose II î 1,3 Fuc A 3 Galf 1 4 Glc Lacto-N-fucopenta- I ose II (LNFP II) I " 7 Gall > kr Ga F 13 l NA l G 11 4 l Lacto-Ndifucohexaose I 1,2 1,4 Fuc o Fuc al? 1 4 Glc 3- fucosyl lactose 1-:> 3 Ga 1 l 1 4 G 1 c Lacto-N-fucopentaôse I I 1,2 Fuc oc all 4 Gl 2 l fucosyl'lactose 1 a 1,2 Fuc c/\ ZGal 1-44 G 1 ic N Ac 1 > 3 Gal pl-$Glc Lacto-N-néotétraose Il s'agit d'oligosaccharides avec des séquence s (Galel- 3 Glc N Ac),dites de type i ou (Gal I 3 l-4 G 1 c N Ac/Glc) dites de type 2. Les résultats de ces essais d'inhibition sont rap- portés sur la fig 1. Il apparait que les oligosacchiarides avec des séquences de type I sont inactifs en tant qu'inhibiteurs de l'anti-SSEA-1. En revancheune inhibition très importante apparaît avec l'oligosaccharide appelé N-i RL 0,71 a qui contient une séquence fucosylée de type 2. En effet, 0,55 nmole donne une inhibition de 50 %. Cet olicjosaccharide a été isolé à partir d'une glycoprotéine N-1, après dégradation alcaline partielle (Lloyd, K O,, Kabat, E A & Licerio, E B 3 iochemistry, 7, 2976-2990 ( 1968)). Il est intéressant de remarquer la faible inhibition obtenue avec l'oligosaccharide renfermant la séquence 3 fucosyl-lactose, ce qui indique l'importance du groupe N-acétyl-glucosamine dans la fonction du SSEA-1 en tant que déterminant antigénique. Les oligosaccharides actifs Le (Lewisa) possédant une structure de type 1 avec séquence terminale Gal 1 3 Glc N Ac o 10 1,4 Fqc a se sont révélés au moins 10 fois moins actifs que leurs isomères de-type 2 Il a été montré du reste que cette activité étant d'ailleurs due à la présence des isomères de type 2 ion notera qu'il s'agit, en effet, de produits d'origine naturelle qui ne sont don= pas purs) Le lacto-N- difucohexose I (Le b actif), le lacto-N-fucopentose I (H actif) et le 3fucosyl-lactose sont apparus 200 à 1000 fois moins actifs en tant qu'inhibiteurs. Le 2-fucosyl-lactose, le lacto-N-tétraose et le lacto-N-neotétraose se sont révélés inactifs. L'ensemble de ces résultats montre bien la recon- naissance spécifique par l'anti-SSEA-1 de la structure 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine comme déterminant anti- génique. Une confirmation de ces résultats est donnée en étudiant l'inhibition obtenue avec la 3-fucosyl-lactosamine préparée selon le procédé de JACQUINET et SINAY évoqué- ci-dessus et le tétrasaccharide O-d L-Fucopyranosyl-( 1 2)- O D-galactopyranosyl-( 1 4)-O /$-L-fucopyranosyl- ( 1 i 3)-2-acétamido-2-déoxy--D-glucopyranose Gal a 1 4 Glc 4 Ac T u 1,2 a 1,3 Fuc Fuc préparé selon JACQUINET et SINAY, J O C 42,72 ,1477. Les résultats de l'inhibition observée sont rap- portés sur la fig 2 (courbe avec X) dont l'examen montre une inhibition complete de la fixation, alors qu'aucun effet n'est observé avec le tétrasaccharide de synthèse Ces résultats établissent clairement la reconnaissance en tant qu'antigène de la séquence trisaccha- ridique en question. Essais b En opérant comme précédemment, on a utilisé comme substances inhibitrices du placenta, du méconium et du fluide amniotique d'origine humaine. Les résultats d'inhibition obtenus sont rapportés sur la fig 3 o le symbole @ se rapporte au méconium X et( a deux essais sur du placenta, et a a deux essais sur du fluide amniotique. Il res 'ort de ces résultats que la séquence 3-fucosyl lactosamine s'exprime dans les substances étudiées o elle peut donc être avantageusement mise en évidence avec les réactifs de l'invention aux fins des diagnostics des développements de grossesses. EXEMPLE 5: Préparation d'un antigène artificiel A l'aide du trisaccharide de l'exemple 2 et utilisation comme réactif de diagnostic. Selon des méthodes en soi connues (activation, puis fixation), on a fixé, dans différents essais, le- trisaccharide de l'exemple 2, comportant une chaîne de Substi Lution à terminaison amino, respectivement sur des billes de latex de verre et d'agarose. 22- L'antigène fixé, ainsi préparé a été mis en contact avec le sérum à tester On a, de cette façon, obtenu une réaction d'agglutination, ce qui a permis la détection de la présence d'anticorps dans le sérum. Ce test est particulièrement intéressant pour reconnaltre la présence d'anticorps anti-3-fucosyl N- acetyl lactosamine dans le sérum de la femme enceinte. EXEMPLE 6: Elaboration d'anticorps spécifiques à l'aide du trisaccharide de l'exemple 3 et application pour la détection de tératomes. On a procédé selon des techniques connues à la fixation du trisaccharide de l'exemple 3 sur différents véhicules porteurs, à savoir, l'albumine, la thyroglobu- line et la poly-L-alanine-lysine qui sont des supports compatibles avec l'administraiton à l'animal. L'antigène ainsi fixé a été administré au lapin et on a recueilli un immunsérum que l'on a purifié pour obtenir les immunoglobulines spécifiques. Cet anticorps spécifique a été fixé sur billes de latex (dans d'autres essais, on a utilisé des billes de verre ou d'agarose)-et a permis l'identification par réac- tion d'agglutination de l'antigène 3-fucosyl-N-acétyl, lactosamine dans un tératome. 23 2509313 REVENDICATIONS 1 Trisaccharides dérivés du O L-fucopyrano y 1- ( 1 3)-ZÈ p-D-galactopyranosyl-( 1 4)-2-acétamido-2- déoxy-D-glucopyranose 7 ou 3 fucosyl-N-acétyl-lactosamine, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule: 03 HO ' o 1 O I on 2 0 i OB dans laquelle: A représente un groupe alcoyle comportant 2 à 10 atomes de carbone, ou un groupe hydroxy-alcoyle avec 2 à 10 atomes de carbone comportant un ou plusieurs groupes hydroxyle, avanta- geusement un groupe hydroxyle en bout de chaîne, ou un groupe comportant une ouplusieurs liaisons insaturées, en particulier un radical éthyléniquement insaturé, choisi parmi les radicaux alcényle, et plus spécialement les ra- dicaux alcényle à 2 à 10 atomes de carbone, ou encore l'un des groupes précédents, mais comportant un ou plu- sieurs groupes éther ct/ou amine intercalaires, les différents groupes représentés par A pouvant etre terminés par un groupcment azoté notamment amnino, amido, hydrazine, azido, ou un groupement acide carboxyiique éven- tuelleminent éthérifié ou estérifié les substituants B, identiques ou différents les uns des autres(Q)représentent, le cas échéant avec un substituant voisin des groupes de protection de radicaux hydroxyle et sont choisis parmi des groupes stables, non réactifs dans les conditions babituelles de synth; 2 se osidic Jque et facile- ment éliminables dans des conditions douces, compatibles avec le maintien de la structure osidique, en particulier, par des groupes benzyle, lenzylidényle ou acétyle o ( 2) représente un atome d'hydrogène. 2 Trisaccharides selon la revendication 1, caracté- risés en ce que A représente un radical alcoyie comportant 2 à 10-atomes de carbone, substitué par au moins un groupe hydroxyle, avantageusement en bout de chaîne, notamment un radical alcoylèneglycol ou hydroxyalcoyle. 3 Trisaccharides selon la revendication 1, caractérisés en ce que A comprend une, avantageusement deux, fonctions éther intercalaires et comporte en bout de chaîne un groupe azoté, et répond à des structures du type ( 1) -(CH O-(CH 2),-0-R, ou : (C 2 n 2 N 2 ( 2): _(CH 2)n",-0-R; ou ( 3) -(Cl) 1 dans lesquelles R représente un groupe azoté tel que -NH 2, - N 3, -NH-l H 2, et N et n;,identiques ou différents l'un de l'autre, sont égaux à 1,2,3, ou 4, N + n' étant avantageusement un nombre do 4 à 10, de préférenceégal à 8; n" et n"' sont des nombres de 1-à 10, avantageusement de 4 à 10, de préférence égaux à 8. 4 Trisaccharides selon la revendication 3, caracté- risés en ce qu'ils comportent une chaîne A de structure -( 1) ou ( 2), dans laquelle R représente-un atome d'hydro- gène. Trisaccharides selon la revendication 3, caractérisés en ce que A représente des chalnes possédant la structure (l, ( 2) ou ( 3), dans laquelle R représente un groupe -COOR' ou -COR', R' représentant un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle avec 1,2 ou 3 atomes de carbone ou encore R représente un groupe -CONH 2. 6. 6 Trisaccharides selon la revendication 3, dans lesquels A présente la structure ( 1) ou ( 2), dans laquelle représente un groupe alcényle avec 2 à 10 atomes de carbone, de préférence un groupe allyle. 7 Procédé de préparation de trisaccharides répondant à la structure donnée dans la revendication 1, selon une technique générale comportant la réaction d'un dérivé réactif de galactopyranosyle avec un dérivé réactif de glu- cosamine et la condensation du disaccharide correspondant avec un dérivé réactif de fucopyranosyle, caractérisé en ce que pour l'élaboration de trisaceharides dans lesquels A représente plus spécialement une cha Tne de type( 11, on met en oeuvre un dérivé réactif de glucosamine soumis auparavant à une réaction de condensation avec du triéthylène glycol, ou pour l'élaboration de trisaccharides dans lesquels A repré- sente plus spécialement une chaîne de type ( 3) on met en oeuvre un dérivé réactif de glucosamine obtenu par réaction d'un dérivé de glucosamine tel qu'une 1,2-oxaline, avec un acide monocarboxylique de structure HO (CH 2)n -COOR 2 n" dans laquelle n"' et R présentent les significations données dans la revendication 3, ou pour l'élaboration de trisaccha- rides dans lesquelles A représente un groupe allyle ou une chalne pouvant être obtenue en utilisant la réactivité du groupe allyle, on procède tout d'abord à la synthèse d'un trisaccharide répondant à la structure des trisaccharides de l'invention, dans lequel tous les groupes -OH sont engagés dans des groupements protecteurs, et sont avantageusement benzylés, selon les réactions classiques de la synthèse organique, on introduit un groupement allyle en position 1, en p, de la glucosamine, et l'on procède, si on le désire, à l'allongement de la chazne, selon lesréactions classiques de synthèse, de manière à introduire les groupements chimi- ques souhaités, notamment on soumet le dérivé allyle à une réaction d'hydroboration, en utilisant un réactif tel que le 9-borabicyclo l 3 3 1 7 nonane, puis à l'action d'une base, ce qui conduit à une chaîne terminée par un groupement fonc- tionnel alcool, on éthérifie si on le désire ce groupe ou on le traite par un halogénure d'allyle pour introduire un nouveau groupement allyle qui sera à son tour avantageuse- ment soumis à une réaction d'hydroboration, ce dérivé étant à son tour, si on le désire, soumis à une réaction de tosyla- tion et le dérivé tosylé obtenu à une réaction avec un azide, conduisant à une chaîne A à terminaison azido. 8 Réactifs immunologiques possédant la structure 3-fucosyl N-acétyl lactosamine et constitués par les tri- saccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou le trisaccharide 3-fucosyl-N-acétyl lactosamine, se pré- sentant tels quels, ou sous forme immobilisée, notamment pour l'élaboration de réactifs de diagnostics, antigènes artificiels ou immunoabsorbants. 9 Anticorps spécifiques-vis-à-vis du trisaccharide 3-fucosyl-N-acétyl Llactosamine et de ses dérivés de substitu- tion selon l'une quelconque-des revendications 1 à 6.