Brevet FR2508060A1 — publié le 19821224

Procédé de production de guanosine. L'invention a pour objet un procédé de production de guanosine utilisant un microorganisme. La guanosine est utile comme matière de départ pour la produc- tion de l'acide 5 '-guanylique qui est un condiment important dans l'indus- trie alimentaire On connaît des procédés pour la production de guanosine par fermentation, par exemple un procédé utilisant Bacillus pumilus ou Bacillus licheniformis (demande de brevet japonais (examinée) n 33 392/1973) et un procédé utilisant Bacillus subtilis (demande de brevet japonais (exami- née) n 2955/1980) Cependant ces procédés connus ne sont pas très avantageux pour une production industrielle, car la: quantité de guanosine accumulée dans le bouillon de fermentation atteint tout au plus 8 à 10 g par litre. Les inventeurs ont découvert à la suite de travaux de recherche suivis destinés à augmenter l'accumulation de la guanosine dans le bouillon de fermentation, qu'une augmentation notable du rendement en guanosine peut être obtenue en cultivant un microorganisme produisant de la guanosine et exigeant de l'adé- nine, si la matière contenant l'adénine qui est essentielle pour la croissan- ce du microorganisme, estajoutée par petites portions de façon intermitten- te ou en continu au cours de l'incubation, en prenant en considération la croissance du microorganisme ainsi que d'autres facteurs Les recherches basées sur cette découverte ont conduit à la présente invention. Ainsi, l'invention a pour objet un procédé de production de guanosine comprenant la croissance dans un milieu de microorganismes exigeant de l'adénine et produisant de la guanosine et la récupération à partir du bouillon de la guanosine produit et accumulé dans ledit bouillon de fermen- tation, ce procédé étant caractérisé par le fait que l'incubation est commencée dans unimilieu ne contenant pas plus d'environ 50 % de la quantité nécessaire de matière contenant l'adénine et après que la matière contenant l'adénine dans le milieu a été consommée presque complètement, on continue l'incubation avec addition intermittente ou continue de la quantité restante de ladite matière contenant de l'dénine. La matière contenant de l'adénine a utiliser dans la mise en oeuvre de l'invention comprend, entre autres, l'adénine, l'addnosine, le monophosphate de 5 '-adénosine, le monophosphate de 31-adénosine, le diphos- phate de 5 '-adénosine, le triphosphate de 5 '-adénosine, l'acide ribonucléi- que et l'acide désoxyribonucléique et des matières organiques naturelles contenant ces produits, telles que cellules microbiennes, extraits de cellules, extraits de viande et extraits de poisson, ainsi que des dérivés de l'adénine tel que l'acide adényle succinique. Lors de l'incubation selon l'art antérieur de microorganismes exigeant de l'adénine, la quantité totale de la matière contenant l'adénine est ajoutée au milieu initial Selon la présente invention la quantité de la matière contenant de l'adénine à ajouter au milieu initial ne dépasse pas 50 % de la quantité nécessaire et après-que la matière contenant l'adénine ajoutée au milieu initialaitd Ré consommée presque complètement, le restant de la quantité nécessaire est ajouté de façon intermittente ou en continu. La phrase "la quantité nécessaire de la matière contenant de l'adénine" utilisée dans cette description signifie une quantité de matière contenant de l'adénine à ajouter au milieu tel que la production et l'accu- mulation de la guanosine devienne maximale Généralement cette quantité, exprimée en adénine est d'environ 0,001 à 0,002 mole par litre quoique cette quantité dépende de la souche microbienne utilisée et des conditions d'incubation. La phrase "après que la matière contenant l'adénine ait été consommée presque complètement" signifie que la quantité de la matière contenant de l'adénine dans le milieu atteigne à ce moment environ 0,01 millimole ou moins par litre, exprimé en adénine. Le mode d'addition de la matière contenant de l'adénine, selon l'invention, comprend, entre autres, ( 1) addition intermittente ou continue, en portions égales ou en portions variables en fonction du temps, de la quantité nécessaire de matière contenant de l'adénine selon un horaire précisé à l'avance, ( 2) addition intermittente ou continue de la matière contenant de l'adénine tout en variant la vitesse d'addition selon le changement dans la croissance du microorganisme dans le bouillon de fermen- tation et ( 3) addition intermittente ou continue de la matière contenant de l'adénine à des doses précisées à l'avance,selon l'état de croissance du microorganisme représenté, par exemple, ear le changement de la concentra- tion en oxygène dissout dans le bouillon de culture, la consommation d'oxy- gène par le bouillon de fermentation ou la chaleur produite dans le bouillon de fermentation, chacun de ces changements étant détectable par divers capteurs ou moyens de détection O peut utiliser n'importe lequel de ces modes d'addition Parmi ces modes d'addition celui comprenant l'augmenta- tion de la dose de matière contenant l'adénine sous forme d'une fonction exponentielle du temps d'incubation est le plus avantageux en particulier parce qu'il rend possible la production et l'accumulation de grandes quantités significatives de guanosine-en une courte période de temps Dans ce cas, la dose de la matière contenant l'adénine par inter- valle d'unité de temps, F(t) (appelé ci-après"vitesse d'alimentation"), au temps t après le commencement de l'addition de la matière contenant l'adénine, peut être exprime par la formule suivante: F (t) = F ( 0) exp (Kt); (K t O) o F ( 0) est la vitesse d'alimentation au début de l'addition et K est un constant (appelé ci-après "vitesse d'alimentation spécifique") Selon ce mode d'alimentation la quantité de matière contenant de l'adénine Ad To TAL, TTTL ajputée jusqu'au temps t FIN peut être exprimé par la formule ci-après: F(O) Z _TOTAL)K -exp(Kt FIN)-l 7 + Ad IN Ad o -AFIN I o Ad IN est la quantité de matière contenant l'adénine ajoutée au milieu IN initial. Le moment pour commencer l'addition de la matière contenant l'adénine, la quantité de matière contenant de l'adénine (Ad -To TAL Adi N=Ad ADD) TOTAL IN D la vitesse initiale d'alimentation F(O) et la vitesse d'alimentation spécifi- que K dépendent de la souche microbienne et du milieu utilisé, des conditions d'incubation et d'autres facteurs Généralement cependant l'addition de la matière contenant de l'adénine doit de préférence être commencée-lorsque la croissance du microorganisme a atteint 0 % à environ 75 %, plus avantageuse- ment environ 5 % à environ 50 % du taux de croissance pouvant finalement être atteint La valeur Ad ADD est de préférence d'environ 25 % à 100 %, plus avantageusement d'environ 50 % à 95 % de la quantité de croissance requise pour ledit microorganisme (généralement d'environ 0,001 à 0,002 mole par litre exprimé:en adénine) F(O) est de préférence d'environ 0,1 % à 50 %, plus avantageusement d'environ 1 % 20 % de Ad ADD par unité d'intervalle -1 D-1 de temps et K est de préférence d'environ 0,01 heure à 5 heures, plus avantageusement d'environ 0,05 heure 1 à 0,2 heure leteplus avanta- -1 geusement d'environ 0,075 à 0,15 heure Le microorganisme à utiliser selon l'invention peut être n'impor- te quel microorganisme produisant de la guanosineetexigeant de l'adénine. Comme exemples de tels microorganismes on peut citer, parmi d'autres, les espèces Bacillus, les espèces Brevibacterium et les espèces Corynebacterium. Les espèces Bacillus englobent, entre autres, Bacillus pumilus et Bacillus subtilis, plus spécifiquement Bacillus pumilus né 148-S-16 et Bacillus subtilis ATCC 19221 Bacillus pumilus n 148-S-16 a été déposé dès le 4 Juin 1981 à l'Institut de Recherche de la Fermentation, Agence de Science et Technologie Industrielle, Ministère du Commerce International et de l'Industrie du Japon, (FRI) sous le N d'admission FERM BP-6, en accord avec les prescriptions du traité de Budapest et déposé dès le 11 Janvier 1967 à l'Institut de Fermentation d'Osaka (IFO), Japon sous le numéro d'admission IFO 12483 Bacillus subtilis ATCC 19221 a également été déposé dès le 27 Mai 1981 à IFO sous le numéro d'admission IFO 14123 Le numéro ATCC est le numéro de dépot pour la souche considérée déposée à l'American Type Culture Collection (USA). La souche IFO 12483 susmentionnée est décrite dans la demande de brevet japonais (examinée) 33392/1973 La souche ATCC 19221 susmentionnée figure au "Catalogue of Strains I (Catalogue des souches I) de "American Type Culture Collection " 14 ème édition 1980. Pour la croissance d'un microorganisme approprié selon l'inven- tion, on utilise un milieu dans lequel le microorganisme peut croltre Ainsi, par exemple la source de carbone à ajouter au milieu comprend, entre autres, des saccharides (par exemple, amidon, glucose, sucrose), des monoalcools et des polyalcools (par exemple glycérol, méthanol, éthanol, sorbitol), des acides gras (par exemple acide acétique, acide propionique, acide stéari- que, acide oléique), des graisses et huiles (par exemple huile de soja, huile d'olive, huile de poisson, huile de baleine, huile de grains de coton, huile de palme, lard), des paraffines normales (par exemple, nonane, décane, undecane, hexadécane, eicosane, pentacosane), et des hydrocarbures tels que le kérosène, gasoil et gasoil lourd et mélanges de ces composés La source d'azote comprend des sources d'azote organique telles que peptones, farine de soja, liqueur de mat 4 ration de mals, extrait de levure et extrait de viande et des sources d'azote inorganique telles que sels d'ammonium des acide sulfurique, nitrique, chlorhydrique ou carbonique, du gaz ammoniac, de l'ammoniaque en solution aqueuse et l'urée On utilise ces produits seuls ou en combinaison Divers sels minéraux nécessaires pour la croissance dudit microorganisme tels que dessels de calcium, potassium, sodium, magnésium, manganèse, fer, cuivre et zinc des acides sulfurique, chlorhydrique, carbonique, nitrique, phosphorique, acétique et autres acides ainsi que des acides aminés, des vitamines et d'autres produits nécessaires pour la crois- sance dudit microorganisme peuvent être choisis pour une addition unique ou combinée au milieu, selon les nécessités En outre, on peut ajouter, si nécessaire, des produits tels que anti-mousse, agents de surface et autres agents tels que huiles de silicones et éthers de polyalkylèneglycols. L'incubation est mise en oeuvre dans des conditions aérobies de culture secouée ou de culture immergée avec aération et agitation Le p H du milieu est généralement choisi dans l'intervalle d'environ 5 à 8 et de préférence dans l'intervalle d'environ 5,5 à 7,5 Si l'on observe des chan- gements dans le p H du milieu au cours de l'inuubation on peut ajouter une solution ou suspension aqueuse d'un hydroxyde alcalin (par exemple hydroxyde de sodium) du carbonate de calcium ou d'ammonium ou de l'ammoniac gazeux, par exemple, de façon à ajuster le p H à une valeur dans l'intervalle désiré. La température d'incubation peut être choisie de façon qu'elle convienne pour la croissance du microorganisme utilisé Généralement l'incubation est mise en oeuvre à une température d'environ 20 à 60 'C et de préférence de à 450 C La durée d'incubation peut être telle qu'une accumulation maximale de guanosine soit obtenue pendant cette durée Généralement le résultat désiré peut être obtenu par une incubation d'environ 24 à 144 heures. La guanosine produite dans le bouillon de fermentation par le procédé selon l'invention peut être récupérée par n'importe quel moyen habituel connu, par exemple chromatographie, utilisation d'une résine échan- geuse d'ions ou de charbon activé, précipitation, extraction aux solvants ou autres moyens de séparation-purification, utilisé seul ou en combinaison. Le procédé selon l'invention rend possible de provoquer l'accu- mulation de la guanosine dans le bouillon de fermentation en une quantité approximativement double de celle obtenue par les procédés de l'art antérieur selon lesquels la matière contenant de l'adénine et ajoutée au milieu tout de suite Par conséquent, l'utilisation du procédé selon l'invention peut conduite à une augmentation de la production donc du produit désiré, notam- ment de la guanosine et en outre faciliter la récupération de la guanosine produits grace à une teneur plus élevée du bouillon de fermentation en guanosine Pour cette raison ainsi que pour d'autres raisons, le procédé selon l'invention est avantageux du point de vue d'une production industriel- le. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples illustra- tifs ci-après Dans ces exemples le pourcentage d'addition pour chaque additif au milieu s'entend, sauf mention contraire, en pourcent poids/volume. EXEMPLE 1 On utilise du Bacillus pumilus nq 148-S-16 (FERM BP 6, IFO 12483) cultivé sur un milieu d'agar agar contenant 100 ml/l d'adénine pour l'inocu- lation de 20 ml de milieu de souche stérilisée dans chacun des cinq flacons Erlenmeyer de 200 ml Le milieu de souche contenait 4 % de glucose, 0,2 % d'urée, 0,5 % de L-glutamate de sodium, 0,2 % de sulfate de magnésium (hepta- hydrate), 0,1 % de chlorure de potassium, 0,003 %-de sulfate de manganèse (approximativement tétrahydrate), 0,2 % de chlorure de calcium (dihydrate) , 2 % de liqueur de macération de mais, 0,25 % d'acide ribonucléique, 0, 03 % d'histidine et 200 pg/l de biotine L'incubation a été réalisée avec secouage à 370 C pendant 18 heures. Le liquide de culture de souche (l O Oml)a- été transplanté dans un récipient de fermentation de 5 litres contenant 1 litre de solution de glucose à 22 % stérilisée et 1 litre de milieu principal de fermentation stérilisé contenant 0,8 % de sulfate d'ammonium,l,0 % de L-glutamate de sodium, 0,4 % de sulfate de magnésium (heptahydrate), 0,2 % de chlorure de potassium, 0,4 % de chlorure de calcium (dihydrate), 0,006 % de sulfate de manganèse (approximativement tétrahydrate), 0,03 % d'histidine, 400 pg/litre de biotine, 0,1 % d'inosine, 5,0 % de liqueur de macération de mats et 0,03 % d'acide ribonucléique (environ 10 % de la quantité requise de matière contenant de l'adénine) et la fermentation principale a été commencée à une température de 30 C, avec une agitation de 1000 tours/minute et un taux d'aération de 0,6 VVM (volume/volume/minute) Pour ce milieu,les essais préliminaires ont montré que la valeur du produit de l'absorbanceà la longueur d'onde de 590 mm (mesurée comme valeur représentative pour indiquer le taux de crois- sance) et le nombre de dilutions (ledit produit sera appelé ci-après "U O D " était initialement de 4 et à la fin de 32 Pour cela après 8 heures d'incuba- tion lorsque la valeur U O D résultant de la croissance du microorganisme était de 7,2, l'addition d'une solution à 107 o d'acide ribonurléique comme matière contenant de l'adénine était commencé à la vitesse initiale d'alimentation F( 0)= 0,003 %/heure et ensuite l'addition a été répétée chaque heure à la vitesse d'addition spécifique K mentionnée dans le tableau I jusqu'à ce que la quantité totale d'acide ribonucléique ajoutée était de 0,32 % du volupe du milieu L'incubation a été ainsi conduite pendant 72 heures Le p H du milieu était maintenu à 6,7 pendant l'incubation par addition automatique d'ammoniaqfe aqueuse à 25 % La teneur en guanosine du bouillon de fermentation ainsi obtene était détermindepar chromatogra- phie liquide de haute performance Les résultats figurent sur le tableau 1. TABLEAU 1 Acide ribonu Fin de l'addition U O D Quantité de cléique (heures) aprèes guanosine vitesse 24 heures produite (g/l) vitesse d'alimentation Exemple con Ajouté immédia- paratif 1 tement (procédé 8,0 connu) -1 Exemple 1-1 K= 0,035 hr 48 18 8,5 - Exemple 1-2 K= 0,0050 hr-1 42 20 10,4 -1 Exemple 1-3 K= 0,075 hr 35 22 13,6 Exemple 1-4 K= 0,10 hr'1 31 25 15,4 -1 Exemple 1-5 K= 0,15 hr 26 31 16,2 E.n Exemple 1-6 K= O 20 h,-l 9 o 33 12 O WFV, Z.J EXEMPLE 2 La fermentation principale a utilisé du Bacillus subtilus ATCC 19221 (IFO 14123) a la place de Bacillus pumilus No 148-S-16, dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 La valeur Ub O D atteinte est de 7,5 en 8 heures d'incubation Ensuite l'acide ribonucléique a été ajouté à des intervalles de l heure à la vitesse d'addition figurant au tableau 2 jusqu'à ce que la quantité totale ajoutée atteint 0,27 ou 0,28 % La déter- mination de la guanosine a été faite 72 heures après l'incubation Les résultats obtenus figureit au tableau 2. TABLEAU 2 Vitesse d'ali Fin de l'addi Guanosine mentation en acide tion (heures) produite ribonucléique (g/l) Exemple 2-1 0,01 %/heure 34 13,8 Exemple 2-2 0,02 % 7/heure 21 13,3 Exemple 2-3 0,03 %/heure 16 9,5 Exemple 2 de Ajouté Immé- comparaison diatement 7,2 EXEMPLE 3 La fermentation principale a été commencée en utilisant Bacillus pumilus N 148-S-16 ((FERM BP-6, IFO,12483) de la même façon que dans l'exem- ple 1, sauf que la quantité d'acide ribonucléique ajoutée au milieu initial varie comme indiqué au tableau 3 Après avoir atteint les valeurs U O D. figurant au tableau 3, l'addition supplémentaire d'acide ribonucléique a été réalisée à des intervalles delhiure -à F( 0)=O,003 %/heure et K= 0,1 hr/ 1 jusqu'à ce que la quantité totale d'acide ribonucléique ajoutée atteint 0,3 % La détermination de la guanosine a été réalisée 72 heures après l'in- cubation Les résultats figurent au tableau 3. TABLEAU 3 Concentration Quantité Début de Guanosine de l'acide ribo d'acide ri l'addition produite nucléique au mi bonucléique g/l lieu initial (%) ajoutée (%) _ U O D Heures Exemple 3-1 O 0,30 4 O 12,3 Exemple 3-2 0,015 0,285 5,5 6 14,2 Exemple 3-3 0,03 0,27 7,5 8 16,6 Exemple 3-4 0,06 0,24 10 10 16,5 Exemple 3-5 0,15 0,15 20 14 10,8 Exemple 3 de comparaison 0,27 0,03 30 18 9,0 compara, O 30 on 9, EXEMPLE 4 Utilisant une solution d'amidon saccharifié contenant 196 g de glucose et 29 g d'oligo saccharidespar litre comme source de carbone, la fermentation principale a été commencée en utilisant Bacillus pumilus N 148- S-16 (FERM BP-6, IFO 12483) dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. Après que la valeur U O D atteint 7,4 après 8 heures d'incubation, on réalise l'addition supplémentaire d'acide ribonucléique à des intervalles de 1 heure à la vitesse d'alimentation initiale F(O) figurant au tableau 4 et à la vitesse d'addition spécifique K = 0,1 heure 1 On détermine la teneur en guanosine après 60 heures d'incubation Les résultats figurent au tableau 4. TABLEAU 4 F(O) Fin d'addition Quantité de guanosine (% heure) (heures) produite (g/l) Exemple 4-1 0,003 31 15,9 Exemple 4-2 0,01 21 16,7 Exemple 4-3 0,03 14 14,3 Exemple 4-4 0,1 10 9,6 Exemple 4 de ajouté tout 8,1 comparaison de suite EXEMPLEI 5 Avant de commencer la fermentation principale en utilisant Bacilus pumilus N 148-S-16 (FERM BP-6, IFO 12483), de la même façon que dans l'exemple 1, 0,0001 mole par litre de matière figurant au tableau 5 est ajouté au milieu initial comme matière contenant de l'adénine à la place de l'acide ribonucléique La fermentation est commencée et lorsque la valeur U O D atteint 7 ou 8, on commence l'addition supplémentaire de la- dite matière contenant de l'adénine à des intervalles de heure, à la vitesse -1 initiale d'alimentation F(O)= 0,0002 mole/l/h et K=O,1 h jusqu'à ce que la quantité totale de matière contenant de l'adénine ajoutée atteint 0,001 ou 0,002 mole par litre On détermine la teneur en guanosine du bouillon de fermentation 72 heures après l'incubation Les résultats obtenus figurent au tableau 5. Exemple Matière conte- N nant de l'adé- nine 5-1 Adénine -2 -3 -4 Adénine Adénosine Adénosine TABLEAU 5 Début de l'addition heures U O D. 7,2 7.0 7.0 7.0 Quantité to Quantité de tale ajoutée guanosine pro- duite (g/l) 0,001 14,7 0,002 0,001 0,002 12,8 16,4 13,5 5-5 -6 '-Adénosine monophosphate '-Adénosine monophosphate 7.8 7.5 0,001 0, 002 ,4 ,8 EXEMPLE 6 Un litre du bouillon de fermentation obtenu dans l'exemple 1 -1 (K=O,1 h avec une teneur en guanosine de 15,4 grammes par litre est chauffé et centrifugé La liqueur surnageante est refroidie à 2 C pour précipiter la guanosine et on obtient ainsi 16,3 g de cristaux bruts de guanosine La guanosine brute est suspendue dans un litre d'eau puis on chauffe la suspen- sion à 80 C pour dissoudre puis on refroidit à 2 C pour faire reeristalli- seér On obtient ainsi 13,3 g de guanosine cristallisée. REVENDICATIONS 1 Procédé de production de guanosine comprenant la croissance d'un microorganisme produisant de la guanosine, exigeant de l'adénine, dans un milieu et récupérant la guanosine ainsi produite et accumulée dans le bouillon de fermentation, caractérisé par le fait que l'incubation est commencée dans un milieu ne contenant p S plus d'environ 50 % de la quantité requise de matière contenant de l'adénine et après avoir consommé presque complètement la quantité contenant de l'adénine du milieu, on continue l'incubation avec addition continue ou intermittente de la quantité restante de matière contenant de l'adénine. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'addition intermittente ou continue de matière contenant de l'adénine est mise en oeuvre selon la formule: F(t) = F(O) exp (Kt) (K e 0) o F(t) est la dose de matière contenant de l'adénine par unité de temps (vitesse d'alimentation), F(O) est la vitesse d'alimentation au début de l'addition, K est un constant (addition spécifique) et t est le temps compté à partir du commencement de l'addition de la matière contenant de l'adénine.