Brevet FR2509750A1 — publié le 19830121

La présente invention concerne un procédé et un dispositif pour déceler des polluants ainsi que pour réa- liser le prélèvement d'échantillons de liquide et pour réaliser la culture des micro-organismes, contenus dans les échantillons, en vue d'effectuer un contrôle biologi- co-hygiénique dans des installations de l'industrie ali- mentaire et de branches industrielles similaires. Les solutions techniques connues présentent les caractéristiques indiquées ci-après. Pour déceler des polluants,'on connaît diverses méthodes qui fournissent une indication concernant la ca- ractéristique de la charge de germes contenus dans un pro- duit ou dans un appareil ou une partie d'installation Ce- pendant, la mise en évidence s'effectue en principe en plusieurs phases opératoires. Le prélèvement d'un volume déterminé d'échantillon d'un liquide ou d'une suspension au laboratoire s'effectue à partir d'un récipient au moyen d'un appareil stérile (par exemple une pipette), afin de déposer, avec des frac- tions correspondantes de l'échantillon, des cultures sur des milieux nutritifs appropriés solides et/ou liquides. Ce récipient peut être par exemple une bouteille desti- née à contenir une boisson ou bien un récipient de trans- port, que l'on remplit d'un échantillon, dans des condi- tions stériles, en dehors du laboratoire Une appréciation de l'échantillon au moyen de l'image fournie par un micro- scope n'est possible que dans le cas d'une pollution assez intense Le risque d'une pollution secondaire existe en rai- son du nombre des appareils nécessaires et du contact avec l'air ambiant. La détermination des polluants même en un nombre très faible est importante pour le contrôle de la capaci- té de conservation par exemple de boissons A cet effet on filtre un volume d'échantillon assez important à tra- vers une membrane et on place cette dernière sur un milieu nutritif. Cependant, dans le cas de méthodes de culture, on détermine un résultat satisfaisant au plus tôt après une incubation de 3 à 4 jours, étant donné que des germes sensibles croissent sur un milieu nutritif solide plus lentement que dans des cultures liquides Ceci est également valable pour le procédé connu de culture sur plaques de Koch. Une coloration des microorganismes retenus par des filtres à membrane et leur comptage ultérieur ainsi que leur caractérisation à l'aide du microscope ne sont possibles qu'au niveau de postes de travail bien équipés et requièrent une qualification appropriée En outre, dans le cas du comptage direct, on ne peut établir une distinction entre les germes vivants et les germes morts, que dans certaines conditions. Un inconvénient important de méthodes usuelles réside en outre dans le fait, qu'en dehors du degré de pol- lution, on ne peut pas déterminer également simultanément des propriétés caractéristiques des organismes polluants (dégagement de gaz, activité de fermentation, formation d'acides, croissance dans des conditions anaérobie). Pour des germes, qui ont une importance dans l'in- dustrie alimentaire et dans des branches industrielles sem- blables, la détermination simultanée d'une possibilité de formation de gaz et d'acides dans des conditions aérobie ainsi que de croissance dans des conditions anaérobie, est particulièrement importante. Conformément au mode opératoire usuel, on décèle le dégagement de gaz d'une manière qualitative ou bien il est nécessaire d'utiliser un appareil particulier de culture (par exemple des tubes à fermentation) Les pro- cédés usuels obligent le personnel de laboratoire à pré- parer des appareils stérilisés et des milieux nutritifs. De ce fait un nombre plus réduit de lieux de travail sont chargés d'une manière plus importante. D'autre part on connaît des procédés et des sys- tèmes déterminés dans le système médical des prélèvements. sanguinset du traitement ultérieur des échantillons de sang D'après les demandes de brevets allemandspubliées sous les No 35 36 061 et 28 35 101, il est possible de raccorder, à des systèmes de canules, qui ont été en- fichées dans une veine du patient, des tubes à échan- tillon, dans lequel le vide a été préalablement réalisé et qui servent de récipients pour le transport des échan- tillons ou bien peuvent être utilisés comme récipients pour des réactions biochimiques ou bien comme récipients de culture D'après la demande de brevet allemand publiée sous le No 24 11 651, à l'intérieur d'un système de pré- lèvement sanguin, un dégagement de gaz est indiqué au moyen d'un organe de blocage sensible à la pression et imperméable au gaz et il existe une possibilité de rac- cordement permettant une analyse des gaz. Un système combiné de prélèvement de sang et de culture servant à l'étude des bactéries, conforme à la demande de brevet allemand publiée sous le No 30 12 056, permet d'effectuer une culture simultanée sur des milieux nutritifs solides et liquides, le sang étant aspiré, en étant dosé du point de vue quantitatif, par l'intermédiaire d'un sys- tème de prélèvement, dans un récipient, dans lequel le vi- de a été fait ou bien qui comporte un gaz de remplissage, d'un svstème de culture du sang, et ce avec une inoculation tant dans le milieu nutritif liquide que dans le milieu nutritif solide Un indicateur, sensible au p H, permet de rendre visible la formation d'acides,qui est liée à la croissance. L'incubation s'effectue avec le système placé dans une position oblique, la canule de prélèvement res- tant fermée au moyen d'un bouchon stérile de plastomère. Mais on ne peut pas utiliser ce système dans le domaine de l'industrie alimentaire. La présente invention a pour but d'élaborer un procédé et un dispositif servant à l'étude microbiologi- que de produits et d'appareillages de l'industrie alimen- 25097-5 È taire et des branches apparentées, et auxquels ne soient pas liés les inconvénients des solutions connues jusqu' alors et à l'aide desquels il soit possible de réaliser une détermination quantitative rapide et combinée du de- gré de pollution et des propriétés essentielles des pol- luants, Sême dans le cas de l'utilisation du dispositif sous la forme de récipients jetables. Ci-après on va exposer l'objet de l'invention. L'invention a pour but de développer un procédé qui permette de réaliser, d'une manière plus sûre, le contrôle microbiologique, moyennant une réduction simul- tanée des dépenses du point de vue travail et du point de vue temps, ainsi qu'un dispositif réunissant toutes les fonctions nécessaires du prélèvement d'échantillons et de la culture d'échantillons de sorte, que, dans le cas de l'utilisation de milieux nutritifs correspondants liquides et/ou solidesil soit possible de déceler les polluants dans des liquides ou bien des micro-organismes placés en suspension dans des liquides au moyen de mé- thodes connues. Le procédé conforme à l'invention est de préféren- ce approprié pour déceler des bactéries, des levures et du mildiou, et selon ce procédé, on aspire l'échantillon liquide; en le dosant du point de vue quantitatif, dans un récipient combiné de prélèvement et de culture d'échan- tillons qui a été mis en dépression et/ou qui est rempli d'un gaz particulier (par exemple CO 2,N 2), et on mélange cet échantillon au milieu nutritif liquide. Dans une section particulière du dispositif, on peut loger un ou plusieurs milieux nutritifs solides, ce qui permet que l'échantillon mélangé avec le milieu nutri- tif liquide imprègne simultanément le milieu nutritif li- quide et le ou les milieux nutritifs solides. C'est pour une température déterminée et alors que le récipient est disposé verticalement, que se produit la culture des micro-organismes, dont la croissance est identifiable au trouble du milieu nutritif liquide ou à la croissance sous la forme de colonies ou en forme de gazon, sur les milieux nutritifs solides. La capacité des micro-organismes polluants à for- mer des acides est visible par suite de la modification de la couleur d'un système indicateur sensible au p H, de préférence du vert de bromocrésol ( 3 ',5 ' 3 " 5 "-tétrabrom- m-crésolsulfonephtaléine) ou dubleu du bromphénol (tétra- bromphénolsulfonephtaléine) Conformément à l'invention, le procédé est caractérisé par le fait qu'on décèle un dégagement de gaz des micro-organismes en fixant le ré- cipient en position verticale dans un support approprié, avec la canule ouverte dirigée vers le bas, de sorte qu' à partir du récipient il se produit le refoulement d'un volume, approprié pour le dégagement de gaz, de la sus- pension des micro-organismes dans le milieu nutritif, ledit volume étant déterminé dans un petit tube calibré, de préférence stérile, fermé par un tampon d'ouate stéri- le. Conformément à l'invention le procédé est en ou- tre caractérisé par le fait que l'on détermine simultané- ment, côte-à-côte, des propriétés caractéristiques des or- ganismes polluants, telles que par exemple la teneur en germes, le dégagement de gaz, l'activité de fermentation ou la formation d'acide Ainsi à l'aide de ce procédé, il est également possible de contrôler l'activité de fer- mentation des levures de production utilisées. Pour des études particulières, on prélève un échantillon aussi bien du tube récepteur que d'un milieu nutritif liquide et/ou solide, après l'opération de cul- ture. Le dispositif conforme à l'invention est caracté- risé par le fait que la canule de l'appareil de prélève- ment et de cultures d'échantillons est réalisée simultané- ment sous la forme d'une tubulure d'aspiration pour le liquide devant être examiné et sous la forme d'une tubulu- re de sortie pour la suspension de germes dans le milieu nutritif, refoulée lors du dégagement de gaz, qu'elle pos- sède de préférence un diamètre inférieur à 3 mm et qu' elle est maintenue verticale, au moyen d'un bouchon sté- rile, dans un récipient de mesure gradué En outre le dispositif est caractérisé par le fait que le récipient prévu pour un ou plusieurs milieux nutritifs solides est disposé à l'extérieur du récipient destiné à rece- voir le milieu nutritif liquide, de préférence sous la forme d'un récipient séparé à côté de l'enceinte dans laquelle le vide a été fait ou qui est remplie de gaz et est équipé d'un support pour le milieu nutritif solide. Les avantages du procédés conforme à l'invention et du dispositif résident dans le fait que l'invention permet de déceler de façon simultanée la présence de mi- cro-organismes dégageant des gaz et formant les acides. Parrapport au procédé proposé connu, le procédé et le dis- positif selon l'invention sont utilisés avantageusement dans l'industrie zymologique et dans l'industrie des bois- sons ainsi que dans des branches industrielles semblables. Contrairement à des dispositifs connus, la mise en place d'un dispositif particulier de prélèvement des gaz n'est pas nécessaire, étant donné que le dégagement de gaz est indiqué par suite de la sortie du milieu nutri- tif par la tubulure de prélèvement de l'échantillon. Par rapport à des procédés connus, dans le cas de la présence de levures ayant une activité de fermen- tation, il est possible de prélever des échantillons en vue d'un examen ultérieur, déjà pendant l'incubation. Le système est approprié nonseulement pour déceler des germes polluants, mais également pour déterminer l'ac- tivité de fermentation de levures de production. Le corps recevant le milieu nutritif solide est placé à l'extérieur de l'appareil L'incubation du milieu nutritif se produit debout, après une inoculation corres- pondante du milieu nutritif solide On peut par consé- quent identifier immédiatement la formation de colonies. Un autre avantage de cet appareil réside dans le fait, 250975 O que, par rapport auiprocédés et aux méthodes usuelles, c'est-à-peine s'il peut se produire une pollution de la substance de l'échantillon, étant donné que pour effec- tuer le prélèvement d'échantillons de milieux devant être étudiés, on réalise un prélèvement direct, par exemple par perforation de membranes. D'autres caractéristiques et avantages de la pré- sente invention ressortiront de la description donnée ci- après, prise en référence aux dessins annexés, sur les- quels: La figure 1 est un diagramme illustrant le dégage- ment de gaz produit par des germes dans une boisson ra- fraîchissante; la figure 2 représente un diagramme illustrant le dégagement de gaz produit par des germes dans une substan- ce de base formée de limonade; la figure 3 représente le dispositif conforme à l'invention permettant différentes utilisations possibles; a: système à récipient ouvert avec piston pour milieu nutritif liquide b: système à récipient ouvert avec piston pour milieu nutritif liquide et milieu nutritif solide; la figure 4 représente le dispositif conforme à l'invention permettant différentes utilisations possibles: a: système à récipient fermé pour milieu nutri- tif liquide b: système à récipient fermé pour milieu nutri- tif liquide et milieu nutritif solide. Lors de la détermination simultanée d'organismes fermentantet d'organismes produisant les acides dans une boisson rafraîchissante, il faut qu'avant l'examen de la présence de polluants, la boisson soit décarbo- nylée, comme cela est en général usuel dans le cas d' étude microbiologique. On ajoute une solution d'indicateur stérile à l'échantillon soumis à l'examen et l'on utilise alors l'indicateur utilisé également dans le milieu nutritif du système de prélèvement et de culture On ajoute de la les- sive de soude normale stérile jusqu'à ce que la couleur de l'indicateur vire, étant donné que l'acide présent a été dans une large mesure neutralisé. On plonge la tubulure d'aspiration de l'appareil de prélèvement et de culture dans l'échantillon devant être examiné et on la raccorde au récipient du milieu nutritif, qui, par suite de la dépression qui existe en son intérieur, crée un appel du liquide à examiner dans le milieu nutritif. On fait pivoter soigneusement l'appareil ensemen- cé afin que soit garanti un mélange intime de l'échantillon et du milieu nutritif, ensuite on dispose verticalement 1 ' appareil ensemencé, et, après avoir laissé s'égoutter d' éventuelles gouttes résiduelles par la tubulure d'aspira- tion ouverture tournée vers le bas, on place l'appareil ensemencé sur un appareil de mesure étalonné vide et sté- rile, fermé avec un bouchon d'ouate stérile que traverse la tubulure. On soumet l'ensemble du dispositif, placé verti- calement sur un support, à une incubation à 300 C. Comme système de prélèvement d'échantillonson utili- se la forme,représentée sur la figure 3, du dispositif conforme à l'invention, dans laquelle la tubulure de sor- tie est modifiée et qui permet le montage d'un récipient de mesure gradué et étalonné pour la suspension sortante de germes dans le milieu nutritif Chaque jour, on contrô- le le trouble du milieu nutritif liquide, le volume de la suspension de germes dans le milieu nutritif, refoulée hors de l'appareil de prélèvement et de culture d'échantillons, ainsi que la modification de la couleur de l'indicateur. La figure 1 représente le résultat de ces examens. Lors de la détection simultanée d'organismes fermentantet produisant des acides dans une substance de ba- se formée de limonade, on effectue, avant l'examen de la substance de base, une dilution avec de l'eau stérile, on ajoute une solution d'indicateur stérile, tout comme dans le cas du mode opératoire indiqué ci-dessus, et on règle la valeur p H au moyen d'une lessive de soude normale sté- rile Les phases opératoires suivantes se déroulent comme indiqué cidessus Lors de la détermination de la charge en germes, il faut tenir compte du taux de dilution. La figure 2 représente un résultat de cet examen. Lors de la détermination de germes coliformes, on remplit le système de prélèvement et de culture avec un milieu nutritif particulier, par exemple une solution de gentiane -bile lactose La préparation des échantillons ainsi que l'introduction du liquide à examiner et l'incubation ultérieure des germes s'effec- tuent également de la manière décrite. Grâce à un piston ou bien grâce à la dépression créée dans le système, une quantité fixée d'échantillon est aspirée dans l'appareil de prélèvement et de culture d'échantillons,par exemple 1 mi ou 5 ml Après incuba- tion et évaluation de l'échantillon, le résultat fournit, dans le cas de l'absence de dégagement de gaz, un titre conforme négatif dans un volume d'échantillon de 1 ml ou 5 rml. Le dispositif permettant de déceler des polluants est constitué, de façon connue, d'un récipient de culture 1 comportant une pointe en verre 2, pouvant être cassée au niveau d'un anneau de rupture 7, et une canule 3 Cette canule 3 est réalisée de manière à constituer simultané- ment une tubulure d'aspiration pour l'échantillon de li- quide devant être examiné et une tubulure de sortie pour la suspension de germes dans le milieu nutritif, refoulée lors du dégagement de gaz Elle possède de préférence un diamètre inférieur à 3 mm et est maintenue verticalement, après l'opération de culture, par l'intermédiaire d'un bouchon stérile 13 dans un récipient de mesure gradué 4. Dans le récipient de culture 1 est disposé un milieu nutritif liquide 5, tandis qu'à l'extérieur de ce récipient 1 se trouve disposé un récipient en verre 10 utilisé pour un ou plusieurs milieux nutritifs solides 6. Ce récipient 10 est situé, de préférence sous la forme d' un récipient séparé à côté de l'espace 9, dans lequelle vide est réalisé ou qui est rempli de gaz, et est mu- ni d'un support 11 pour le milieu nutritif solide 6 Pour réaliser l'étude des germes du milieu nutritif solide 6 soumis à incubation, on prélève un échantillon du réci- pient en verre 10 en ouvrant ce dernier au niveau de 1 ' anneau de rupture 8. REVENDICATIONS 1 Procédé pour déceler des polluants dans l'indus- trie alimentaire, selon lequel on mélange dans un appareil combiné de prélèvement et de culture d'échantillons, des liquides contenant des germes ou des liquides, dans lesquels on introduit des germes en vue de réaliser l'examen à 1 ' aide de méthodes connues, à une quantité choisie d'un mi- lieu nutritif, caractérisé en ce que la culture ultérieure de la suspension de germesdans le milieu nutritif est réa- lisée par l'intermédiaire d'une tubulure de sortie, ouver- te vers le bas, de l'appareil de prélèvement et de culture d'échantillons, que pendant la culture, lors du dégage- ment de gaz produit par les organismes faisant l'objet de 1 ' examen, des quantités mesurables équivalentes de la sus- pension de germes dans le milieu nutritif s'évacuent et, en liaison avec des modifications du trouble et de la cou- leur du milieu nutritif contenant l'indicateur, on obtient simultanément des indications quantitatives, sous la forme de valeurs analogiques, indiquant la teneur en germes, le dégagement de gaz, l'activité de fermentation et la formation d'acide produits par les organismes polluants. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que on insère en supplément un ou plusieurs milieux nutritifs solides dans une partie spéciale de l'appareil de culture, qu'une croissance en forme de colonie/sous forme de gazon des germes faisant l'objet de l'examen in- tervient sur ces milieux nutritifs solides après introduc- tion du liquide devant être examiné et qu'après l'opéra- tion de culture, on prélève des échantillons en vue d'ef- fectuer un contrôle au microscope et/ou une étude ulté- rieure ainsi que pour poursuivre la culture d'organismes. 3 Dispositif pour déceler des polluants, cons- titué rr un appareil combiné de prélèvement et de culture d'échantillonscomportant un récipient de culture, une pointe en verre pouvant être rompue, une canule et un anneau de rupture ainsi qu 'un milieu nutritif liquide et un milieu nutritif solide, caractérisé en ce que la canu- 260975 Q le ( 3) est réalisée simultanément sous la forme d'une tu- bulure d'aspiration pour le liquide devant être examiné et sous la forme d'une tubulure de sortie pour la suspen- sion de germes dans le milieu nutritif, refoulée lors du dégagement de gaz, et qu'elle possède un diamètre infé- rieur à 3 mm et est maintenue-verticale, par l'intermédiai- re d'un bouchon stérile gradué ( 4). 4 Dispositif selon la revendication 3, caractéri- l O sé en ce qu'un récipient en verre ( 10) prévu pour un ou plusieurs milieux nutritifs solides ( 6) est disposé à l'extérieur du récipient de culture ( 1) pour le milieu nutritif liquide ( 5), sous la forme d'un récipient séparé à côté de l'espace réalisé ou qui est rempli de gaz, et est équipé d'un sup- port ( 11) pour le milieu nutritif solide ( 6).