Brevet FR2509749A1 — publié le 19830121

La présente invention se rapporte à un procédé pour l'hydrolyse de substrats cellulosiques afin de produire des mono et/ou disaccharides en utilisantles enzymes cellulases. On sait que les substrats de cellulose peuvent être hydrolysés en mono et/ou disaccharides en utilisant les enzymes cellulases dérivés de champignons et actinomyces. On a cependant trouvé que le taux de production d'enzymes et le temps pour produire des rendements maximum des - enzymes à partir de champignons et actinomycès rendaient la préparation des enzymes, pour ces sources, relativement coûteuse. On sait également que certaines bactéries du genre Cellulomonas ou Pseudomonas peuvent utiliser des substrats cellulosiques et peuvent croître aux dépens des sucres qui sont produits par suite de l'hydrolyse enzymatique des substrats cellulosiques Récemment, on a montré que ces bactéries pouvaient être mutées pour produire des souches mutantes capables de produire des niveaux élevés d'enzymes cellulases Des cultures ou préparations sur culture de telles souches de Cellulomonas ou Pseudomonas peuvent être utilisées pour hydrolyser les substrats cellulosiques en sucres simples Malheureusement, ces préparations de bac- téries sont limitées dans leur étendue de saccharifica- tion, lors d'un usage in vitro. La présente invention concerne un procédé pour l'hydro- lyse d'un substrat cellulosique pour former des mono et/ou disaccharides, qui consiste à traiter le substrat cellulosi- que avec une préparation d'enzymes cellulolytiques d'une souche ou dérivé mutant d'une bactérie du genre Cellulomonas ou Pseudomonas que l'on complète avec une cellulase dérivée soit d'un champignon ou d'un actinomycète. Les présents inventeurs ont trouvé que l'on pouvait obtenir un résultat synergique si l'on ajoutait l'enzyme cellulase d'un champignon ou d'un actinomycète à une culture d'une bactérie du genre Cellulomonas ou Pseudomonas Cette combinaison s'est révélée hydrolyser le substrat bien plus extensivement qu'une culture bactérienne d'elle-même Il faut bien moins de protéines d'enzymes pour une saccharifi- cation donnée en comparaison à une préparation d'enzymes de champignons tels quels. La présente invention concerne de plus une préparation cellulolytique contenant une préparation d'enzyme cellulo- lytique que l'on obtient d'une bactérie du genre Cellulomonas ou Pseudomonas, et que l'on complète d'une cellulase dérivée soit d'un champignon ou d'un actinomycète. Cet effet synergique est assez inattendu et une expli- cation totale de ce phénomène est, en ce stade, impossible. On a trouvé que les souches Cellulomonas et Pseudomonas montraient de bons taux de croissance et de bons taux-de conversion de cellullose in vivo, cependant, lors d'une utilisation in vitro, les bons taux initiaux atteignent rapidement un palier Même une très faible quantité des enzymes cellulases d'un champignon ou d'un actinomycète que l'on ajoute à la culture de Cellulomonas ou Pseudomonas, donne des résultats fortement améliorés Il est possible que cela soit dû auxniveaux élevés d'activité que la cellulase du champignon montre contre la cellulose cristal- line in vitro. Les préparations bactériennes sont bien meilleur marché à produire que les préparations de champignons ou d'actinomycètes,car les allures-de production des enzymes sont considérablement plus rapides L'addition de faibles quantités de cellulase de champignons peut, dans des condi- tions préférées, donner lieu à des niveaux d'hydrolyse qui sont cinq fois supérieursau niveau auquel on peut s'attendre si la cellulase du champignon est utilisée à elle-seule. La préparation d'enzymes bactérienes peut être une préparation en culture complète, une préparation en culture complète o les cellules ont été désintégrées, ou une préparation extracellulaire Les champignons et les actino- mycètes excrêtent des enzymes cellulases que l'on peut séparer de l'organisme producteur et utiliser dans le présent procédé Si on le souhaite, des cultures entières de champignons ou des actinomycètes peuvent être utilisées. Toute source de matière cellulosique peut être utilisée comme matière première pour le procédé selon l'invention. Parmi les diverses matières cellulosiques dont on dispose, et que l'on emploie avantageusement, on peut citer la bagasse de canne à sucre, la bagasse de sorgum, la paille de blé, la paille de riz, les rafles et le fourrage de mais, le kenaff, la sciure, les copeaux de bois et autres matériaux dérivant des forêts,des déchets de papier et de la pâte à papier. Avec des matériaux qui n'ont pas été précédemment traités, une certaine forme de pré-traitement chimique ou physique est nécessaire Ce prétraitement rend la cellulose et l'hemicellulose plus accessibles à l'attaque des enzymes, en rompant les liaisons entre la cellulose et la lignine, en diminuant la cristallinité de la cellulose et en retirant les composants organiques Le pré-traitement peut prendre la forme d'un traitement physique comme un broyage; d'une forme chimique comme un traitement avec un alcali dilué; ou une combinaison de traitements physique/ chimique comme un chauffage à de hautes températures avec ensuite décompression rapide A la suite du pré-traitement, le matériau peut être amené à un réacteur pour la saccharifi- cation par le complexe de cellulase. On fait de préférence croître initialement, dans des conditions favorisant la croissance et la production des enzymes, les souches Cellulomonas ou Pseudomonas ou mutants, d'o on doit obtenir la cellulase bactérienne Quand une population suffisante de cellules et de complexes d'enzymes cellulases a été produite, les conditions peuvent être modifiées afin de favoriser la production de sucres Ces conditions changées qui inhibent la croissance des cellules peuvent être une température accrue, une limite de la disponibilité d'un nutritif principal de croissance, une opération en conditions anaérobies ou l'addition d'inhibiteurs métaboliques dans le milieu de culture. La cellulase des champignons ou des actinomycètes est de préférence obtenue à partir d'un champignon qui est un membre de l'espèce: Trichoderma Penicillium * Aspergillus Fusarium Schlerotium et les actinomycetes Streptomyces, et Thermoactinomyces De préférence, le champignon est Trichoderma reesei. On a également observé un synergisme si les enzymes cellulases de plus d'un organisme de la liste ci-dessus sont ajoutés aux préparations de Cellulomonas ou Pseudomonas. La cellulase de champignons ou d'actinomycès doit être présente en une quantité d'au moins 0,01 FPU/ml et mieux entre O,1 FPU/ml et 5 FPU/ml Audessus de 5 FPU/ml, il n'y a pas de justification économique pour une plus ample addition de la cellulase et cependant il semble que l'effet synergique de la présente invention soit encore observé au-dessus de ce niveau La culture de cellules de Cellulomonas ou Pseudomonas doit être aussi concentrée que possible afin d'obtenir la conversion la plus rapide possible de la cellulose en sucres Dans la pratique, des préparations ayant une teneur en protéines de 0,5 à 20 mg/ml sont appropriées. En plus de la production de sucres simples par l'hydro- lyse des matières cellulosiques, l'hydrolyse de la cellulose peut être effectuée en présence de bactéries ou de levures capables de fermenter directement les sucres produits, par l'hydrolyse, en éthanol De cette façon, on peut obtenir irne conversion en un seul stade de la cellulose en éthanol. L'éthanol devra être récupéré du milieu réactionnel par des techniques conventionnelles. On donnera ci-après un mode de réalisation préféré de la présente invention. Exemple 1. On a fait croître Cellulomonas C 51-17 pendant 24 heures sur un milieu de sels équilibrés, d'extrait de levure et de bagasse prétraitée à 2 % d'alcali à une température de 32 C et un p H compris entre 7,0 et 8,0. La bagasse de canne à sucre avait été prétraitée ern la chauf- fant avec 0,1 g de Na OH/g, poids secde bagasse à 1000 C pendant une heure La température de la culture a alors été élevée à 37 C, la culture a été rendue anaérobie et on y a ajouté 75 g/l de bagasse prétraitée aux alcalis. La libération de sucre réducteur a été suivie par la déter- mination DNS et s'est révélée être de 18,5 mg/ml à 18 heures, 22 mg/ml à 24 heures et 23 mg/ml à 48 heures. On a fait croître Cellulomonas C 51-17 sur de la bagasse pré-traitée aux alcalis comme on l'a précédemment indiqué Au bout de 24 heures de croissance, on a ajouté la bagasse prétraitée aux alcalis ( 75 g/l) ainsi que de faibles niveaux d'un complexe de cellulase de Trichoderma reesei QM 9414 et la saccharification a été effectuée à 45 C et à un p H compris entre 5 et 6 Des expériences témoins ont été effectuées en n'utilisant que les enzymes de Cellulomonas et uniquement l'enzyme de Trichoderma reesei Les données sont indiquées ci-après: - DIGESTION DE BAGASSE PRETRAITEE A 7,5 % D'ALCALIS PAR TRICHODERMA REESEI QM 9414 Concentra Sucre réducteur tion de Concentrations (mg/ml) l'enzyme Concentrations 1 ' enzyme CELLULASE en protéine 14 heures 24 heures 48 heures (mg/ml) 0,1 FPU/ml 0,25 7,0 8,4 11,2 0,25 FPU/ml 0,60 14,9 16,9 25, 5 0,5 FPU/ml 1,45 21,8 26,0 34,6 1,0 FPU/ml 3,00 42,0 DIGESTION DE BAASSE PRETEAI A 7,5 % D'AlCALIS PAR LA CETTLULASE DE CEL Lt ULMNAS C 51-17 ET L'ENZYME DE CEîL VUM 7 S, TRICHODERMA REESEI QM 9414 COMBINES Enzynme Concentration en Sucre réducteur coplexes protéine 14 heures 24 heures 48 heures (mg/mi L) O, 1 FPU/ml Trichoderma Reesei + Celluloeonas C 51-17 1,18 28,6 33,1 42,2 O,25 FPU/ml Trichoderma Reesei+ Cellulomonas C 51-17 1,53 35,1 41,2 49,2 0,5 FPU/ml Trichoderma Reesei + Cellulcmonas C 51-17 2,38 40,0 43,6 51,2 Celluloronas C 51-17 seule 0,93 16,9 20,1 23,2 Exemple 2. On a fait croître Cellulomonas C 51-17 sur de la bagasse prétraitée aux alcalis comme on l'a précédemment indiqué. Au bout de 24 heures de croissance, la bagasse prétraitée 3 O aux alcalis ( 75 g/l) a été ajoutée ainsi que de faibles niveaux d'un complexe de cellulase de Trichoderma reesei Rutgers C-30 et deÉ-glucosidase de Novo Industry Danemark, et la saccharification a été effectuée à 45 C et à un p H entre 5 et 6 Les données sont indiquées ci-après. DIGESTION DE BAGASSE PRETRAITEE A 7,5 % D'ALCALIS PAR CELLULOMONAS C 51-17, TRICHODERMA REESEI RUT C-30 ET NOVO X -GLUCOSIDASE Enzyme Concentration en sucre Complexes réducteur (mg/ml) C 51-17 + glucosidase ( 2 IU/ml) + T reesei C-30 au niveau 12 heures 24 heuree 48 heures de 0,5 FPU/ml 50,7 56,5 60,4 0,25 FPU/ml 44,1 52,5 56,5 0,1 FPU/ml 33,4 40,6 48,3 Exemple 3. On a fait croître une souche Pseudomonas P 52-1 sur de la bagasse prétraitée aux alcalis comme on l'a précédem- ment indiqué pour Cellulomonas Pendant les conditions de saccharification indiquées pour Cellulomonas, il y a eu libération de 12 mg/ml de sucre réducteur à partir de 7,5 % de bagasse prétraitée aux alcalis qui avaient été ajoutées. La saccharification en présence de 0,1 FPU/ml de cellulase à partir de Trichoderma reesei QM 9414 a donné la libéra- tion de 28 mg/ml de sucre réducteur Aucune tentative n'a été faite pour améliorer les souches Pseudomonas par muta- tion ou autre moyen, cependant, le synergisme observé pour Cellulomonas s'applique également à la souche Pseudomonas cellulolytique examinée. Dans les exemples ci-dessus, les enzymes de Trichoderma reesei ont été utilisés avec les enzymes de Cellulomonas ou Pseudomonas La présente invention couvre également l'utilisation de cellulases d'autres sources de champignons ou d'actinomycès en conjonction avec les préparations d'enzymes de Cellulomonas ou Pseudomonas. Dans l'exemple ci-dessus, FPU signifie "unité de papier filtre" (unité internationale), et c'est une mesure reconnue de l'activité cellulolytique dans des enzymes de cellulose dérivés de sources de champignons. REVENDICATI ONS 1 Procédé d'hydrolyse d'un substrat cellulosique pour former des mono et/ou disaccharides, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter le substrat cellulosique avec une préparation d'enzymes cellulolytiquesd'une souche ou d'un dérivé mutant d'une bactérie du genre Cellulomonas ou Pseudomonas, que l'on complète d'une cellulase dérivée soit d'un champignon ou d'un actinomycète. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellulase dérivée d'un champignon ou d'un actino- mycète est présente en une quantité de 0,01 FPU/ml à FPU/ml. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la cellulase dérivée d'un champignon ou d'un actinomycète est présente en une quantité de 0,1 à 5 FPU/ml. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la cellulase du champignon est obtenue d'un champignon choisi dans le genre Trichoderma Penicillium Aspergillus Fusarium ou Schlerotium Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le champignon est Trichoderma reesei. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la préparation d'enzymes cellulolytiques bactériennes est obtenue de bactéries que l'on a fait croître dans des conditions favorisant la production des enzymes. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hydrolyse de la cellulose est effectuée en présence d'une bactérie ou d'une levure capable de fermenter les sucres pour former de l'éthanol. 8 Préparation cellulolytique caractérisée en ce qu'elle contient une préparation d'enzymes cellulolytiques obtenue d'une bactérie du genre Cellulomonas ou Pseudomonas, que l'on complète d'une cellulase dérivée soit d'un champignon ou d'un actinomycète.