Brevet FR2501692A1 — publié le 19820917

La présente invention se rapporte à un nouveau produit d'érythropolétine provenant de l'urine d'un être humain sain, ainsi qu'à un procédé pour sa préparation. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un nouveau procédé de purification de l'érythropolétine brute obtenue de l'urine d'un être humain sain, par un processus spécifique pour donner un nouveau produit d'érythropoiétine ne présentant pas d'activité inhibitoire contre l'érythropolèse ainsi qu'au produit d'érythro- polétine ainsi préparé. L'érythropolétine est, comme on le sait bien, une hormone ayant une activité pour stimuler l'érythropolèse d'une façon spécifique et qui est un facteur indispensable pour la différenciation des cellules formant le sang en corpuscules rouges du sang et donc sa déficience ou une diminution de sa concentration, dans le sang, provoque l'anémie. Par conséquent, l'érythropolétine est un médicament thérapeutique prometteur dans le traitement clinique de l'anémie ou, en particulier, de l'anémie rénale. Mal- heureusement, l'utilisation d'érythropolétine n'est pas prédominante dans la thérapie pratique du fait de sa faible disponibilité. Le procédé entrepris jusqu'à maintenant pour la préparation de produits d'érythropolétine est presque exclusivement la concentration et la purification de l'urine de patients ayant une forte sécrétion en érythropolétine, et qui souffrent d'anémie aplastique et maladies analogues. Du fait de la source limitée de cette urine de patients qui est un obstacle à l'utilisation pratique de I'érythropoiétine, il est tout-à-fait souhai- table de préparer des produits d'érythropoiétine à partir de l'urine d'être humain sain, dont on dispose en volumes importants. L'utilisation de l'urine d'un être humain sain pose un problème qui est sa faible teneur en érythropolétine en comparaison à l'urine du patient. De plus, l'urine d'un être humain sain contient un certain facteur d'inhibition de l'érythropolèse à une concentration considérablement élevée, on ne peut donc obtenir d'effet thérapeutique satisfaisant même si le produit d'érythropoiétine préparé à partir de l'urine d'un être humain sain est administré à un patient souffrant d'anémie. Les présents inventeurs ont déjà proposé un procédé réussi de préparation d'un produit d'érythropolétine à partir de l'urine d'un être humain sain (voir brevet U.S. N 4 303 650), mais le produit d'érythropolétine préparé par le procédé proposé pose toujours le problème ci-dessus mentionné de l'inhibition de l'érythropolèse, et n'est pas suffisant pour répondre aux conditions thérapeutiques de l'anémie. La présente invention a par conséquent pour objet lmun nouveau produit d'érythropoiétine ayant une forte activité érythropolétique, mais ne présentant pas d'effet inhibitoire contre l'érythropoîèse, et qui provient de l'urine d'un être humain sain et est assez différent des produits conventionnels d'érythropolétine préparés à partir de l'urine d'un patient. La présente invention a pour autre objet un nouveau procédé de préparation du produit d'érythropoiétine ci-dessus mentionné utile comme médicament thérapeutique pour l'anémie. Le produit d'érythropolétine selon l'invention peut définitivement être différencié de produits conven- tionnels d'érythropoiétine par rapport à plusieurs proprié- tés parmi lesquelles l'activité physiologique. Par exemple, le produit d'érythropolétine selon l'invention a un poids moléculaire de l'ordre de 4.000 à environ 13.000, déterminé par le procédé de filtration sur gel en utilisant un gel de dextrane (Sephadex) tandis que le poids moléculaire des produits conventionnels d'érythropolétïne est compris entre 20.000 et 40.000 et le point iso-électrique du produit d'érythropoiétine selon l'invention est compris entre environ 3,1 et environ 3,6, en déterminant par le procédé de la focalisation iso-électrique tandis que le point isoélectrique des érythropoIétines conventionnelles est de 4 + 0,1. Par ailleurs, l'activité du produit selon l'inven- tion est au moins 20 fois plus forte que celle des produits conventionnels, non seulement par la détermination de l'activité de l'érythropoIétine par le procédé de la culture de la cellule de moelle osseuse mais également dans l'essai in vivo pour l'augmentation de l'hémoglobine corpusculaire rouge quand la base de la comparaison est l'activité de l'érythropolétine par le procédé de la détermination sur la souris polycythémique. Le nouveau produit d'érythropolétine ci-dessus défini peut être préparé à partir de l'érythropolétine brute obtenue de l'urine d'un être humain sain, que l'on adsorbe d'abord sur un échangeur d'anions faiblement basique en condition neutre ou faiblement acide en présence d'un sel neutre inorganique à une concentration de 0,1 à 0,2 mole par litre, avec ensuite élution de l'ingrédient effectif ainsi adsorbé avec une solution aqueuse d'un sel neutre inorganique à une concentration de 0,5 à 0,7 mole par litre. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence au dessin schématique annexé donné uniquement à titre d'exemple illustrant un mode de réalisation de l'invention et dans lequel: - la figure unique est un graphique montrant les résultats d'essaissur des animaux pour l'efficacité du produit d'érythropoîétine selon l'invention, en prenant la dose totale de deux fois l'administration sur l'axe des abscisses et la concentration en hémoglobine dans le sang sur l'axe des ordonnées. La matière première utilisée dans le procédé selon l'invention est un produit d'érythropolétine brute que l'on obtient de l'urine d'un être humain sain. Le procédé de préparation d'un tel produit d'érythropolétine brute est décrit en détail dans le brevet U.S. ci-dessus indiqué. En effet, la valeur du pH de l'urine d'un être humain sain est d'abord ajustée à 6 à 8 en ajoutant un acide minéral ou organique ou un alcali tel que de l'ammoniaqueet l'ingrédient érythropolétiquement actif dans l'urine est alors adsorbé sur un adsorbant spécifique qui est une résine adsorbante poreuse à base de polystyrène, du chitosan ou de la diatomite avec ensuite élution avec un solvant organique comme un alcool ou une solution alcaline aqueuse dans le cas du polystyrène adsorbant ou avec une solution alcaline aqueuse dans le cas du chitosan ou de la diatomite comme adsorbant. L'érythropolétine ainsi préparée est un produit brut et, comme on l'a mentionné ci-dessus, présente encore une activité inhibitoire contre l'érythropolèse. Aucun effet de purification ne peut être obtenu si ce produit dérythropolétine brute est soumis au processus pour la purification dans la condition connue comme étant efficace pour la purification des produits d'érythropotétine brute que l'on obtient de l'urine d'un patient et l'activité inhibitoire contre l'érythropolèse ne peut être réduite. Il est essentiel, dans la mise en pratique du procédé selon l'invention, que l'adsorption de l'ingrédient efficace dans l'érythropoiétine-brute soit accomplie en présence d'un sel neutre inorganique dans la solution de l'adsorbat. Les sels neutres inorganiques appropriés sont représentés par des halogénures de métaux alcalins et alcalino-terreux comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de magnésium, le chlorure de calcium, le bromure de sodium et analogues. On préfère le chlorure de sodium pour sa sécurité physiologique. La concentration de ces sels dans la solution de l'adsorbat est de préférence comprise entre environ 0,1 et environ 0,2 mole par litre. Une concentration plus faible du sel n'est pas souhaitable du fait de l'adsorption insuffisante de l'adsorbat. L'effet de l'adsorption sur l'échangeur d'anions est peu affecté par la sorte des sels neutres inorganiques mais le paramètre d'influence et la résistance ionique du sel dans la solution. Le contrôle de la valeur du pH de la solution de l'adsorbat dans la gamme souhaitée peut être encore facilité en mélangeant un sel présentant une action de tampon comme le chlorhydrate de pyridine, le chlorhydrate d'imidazole et certains phosphates, afin d'améliorer l'adsorption. Le matériau adsorbant pour l'ingrédient efficace dans le produit d'érythropolétine brute est un échangeur d'anions faiblement basique représenté par des carbohydrates diéthylaminoéthylés comme la diéthylaminoéthylcellulose, le diéthylaminoéthyldextrane, le diéthylaminoéthylagarose et analogues. L'ingrédient effectif dans le produit d'érythropolétine brute est très efficacement adsorbé sur ces échangeurs d'anions en condition neutre à faiblement acide. La gamme appropriée de la valeur du pH de la solution de l'adsorbat est de préférence comprise entre environ 6,0 et environ 7,5. L'ingrédient effectif adsorbé à la façon ci-dessus décrite, de la solution aqueuse de l'érythropolétine brute contenant le sel neutre inorganique spécifié sur l'échan- geur d'anions faiblement basique est, à la suite d'un lavage avec une solution tampon, élué de l'échangeur d'anions en utilisant une solution d'éluant qui peut être une solution aqueuse d'un sel neutre inorganique à une concentration comprise entre environ 0,5 et environ 0,7 mole par litre. Une concentration supérieure du sel donne une élution des impuretés. Les conditions pour l'élution ou l'adsorption sont à peu près les mêmes que dans l'adsorption à l'exception de la concentration du sel. La solution de l'éluat que l'on obtient ainsi peut être utilisée telle quelle dans des buts thérapeutiqoes mais, si on le souhaite, des produits purifiés d'érythro- polétine peuvent être séparés et récupérés de cette solution, par un processus conventionnel comprenant une 250 1692 lyophilisation, une dialyse et analogues. Selon le procédé de l'invention, un produit d'érythropoiétine ayant une forte activité érythropoiétique mais présentant peu d'activité inhibitoire contre l'érythropoièse peut être préparé,à un rendement élevé, de l'urine d'un être humain sain, cela ouvre donc une voie pleine d'espoir pour le traitement thérapeutique des patients souffrant d'anémie. On donnera ci-après des exemples illustrant le procédé selon l'invention pour la préparation du nouveau produit d'érythropoiétine ainsi que pour illustrer l'efficacité du produit d'érythropoîétine selon l'invention. Dans les exemples qui suivent, la détermination de l'érythropoîétine a été effectuée par le procédé de Goldwasser (voir E. Goldwasser et autres, Endocrinology, volume 97, 2, page 315, 1975), o l'échantillon examiné a été, après dialyse ou dilution appropriée, soumis à la détermination de l'érythropolétine par la quantité de l'isotope Fe59 absorbé dans les cellules mises en culture de moelle d'os du rat. L'unité (U) a été standardisée par la courbe de calibrage préparée en utilisant le standard de travail de l'érythropolétine EPWS 11, qui est un produit d'érythropotétine obtenu de l'urine de patientssouffrant d'anémie aplastique avec ensuite purification selon le procédé d'Espada (voir J. Espada, Biochem. Med., volume 3, page 465, 1970) et on a examiné l'activité par la méthode de Cotesde la détermination sur la souris polycythémique exhypoxique en se référant à la préparation de référence internationale de l'érythropoiétine (WHO Second Interna- tional Reference Preparation of Erythropoietin 67/343). La détermination de la protéine dans le produit d'érythro- poiétine a été entreprise par le procédé de Lowry (voir 0.B. Lowry et autres, J. Biol. Chem., volume 193, page 265, 1951), en se référant à l'albumine de sérum bovin comme standard. Exemple 1 La valeur du pH de 10 litres d'urine recueillie d'un être humain sain a été ajustée à 7,0 en ajoutant un petit volume d'acide chlorhydrique aqueux à 2N et 87 g de chitosan (FLONAC-N, produit de Kyowa Yushi Kogyo Co) ont été ajoutés dans l'urine ayantson pH ainsi ajusté, avec ensuite agitation à la température ambiante pendant une heure et demie. La portion du liquide surnageant a été retirée par décantation et le chitosan a été recueilli. Le chitosan ayant ainsi adsorbé l'érythropolétine dans l'urine a alors été dispersé dans 800 ml d'une solution tampon à 0,1M de carbonate de sodium à un pH de 11, contenant 0,5 mole par litre de chlorure de sodium et on a agité pendant 3 heures à 71C avec ensuite filtration pour donner une solution d'un éluat. Un dessalement de cette solution d'éluat avec du sulfate d'ammonium a donné des précipités sous forme d'un produit d'érythropolétine brute. Ce produit ayant une activité d'érythropolétine de 54 U/mg protéine est appelé ci-après produit A. Des souris femelles de 7 semaines ont reçu 5,3. yg du produit A ci-dessus obtenu, sur deux jours,à raison d'une fois par jour, avec une demi-dose de la quantité totale dissoute dans une solution saline, par exemple dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 poids/volume, %, par injection intrapéritonéale. Les indices d'hématocrite des quatre souris ainsi traitées ainsi que de quatre autres souris ayant reçu le même volume de la solution saline comme groupe témoin, ont été déterminés au bout de 4 jours à partir de la première administration, pour obtenir les résultats indiqués au tableau 1 ci- dessous, avec une analyse statistique. Tableau 1 Groupe de souris Indices d'hématocrite Administration d'une solution saline 50,2 + 1,9% Administration du produit A 42,5 + 3,6% (P Les résultats ci-dessus indiquent que la diminu- tion de l'indice d'hématocrite dans les souris appartenant aux groupes ayant reçu le produit A est importante en comparaison au groupe témoin ayant reçu une simple solution physiologique de chlorure de sodium. La dose de l'activité administrée dans ce cas était de 0,57 U par souris ou 27 U par kg de poids corporel, car l'activité spécifique du produit A était de 54 U/mg de protéine. Ensuite, on a adsorbé 48 U du produit A sur 2,0 ml de diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-Sephacel, produit de Pharmacia Co.) dans une colonne, d'une solution tampon de pyridine-acide chlorhydrique à M/80, à un pH de 6,5 et contenant 0,15 mole par litre de chlorure de sodium, et, après lavage de l'adsorbant avec la même solution tampon, l'ingrédient adsorbé a été soumis à une élution en deux étapes successives avec une solution tampon de pyridine- acide chlorhydrique à M/80, à un pH de 6,5, contenant 0,3 mole par litre de chlorure de sodium et une solution tampon de pyridine-acide chlorhydrique à M/80 à un pH de 6,5 contenant 0,7 mole par litre de chlorure de sodium comme solutions d'éluant pour les première et seconde étapes de l'élution respectivement. Tandis que l'onn'a pu déterminer aucune activité de l'érythropolétine dans la solution de l'éluat obtenue à la première étape de l'élution, la solution de l'éluat de la seconde étape a présenté l'activité correspondant à 38 U d'érythropolétine. Ce produit, appelé ci-après produit B, a une activité spécifique de 372 U/mg de protéine, indiquant un enrichissement de 6,9 fois par rapport au produit A. Le produit B cidessus obtenu a été soumis au traitement de dialyse avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 w/v %,tamponnée à un pH de 7,4, contenant 0,01 mole par litre de Na2HP04 et NaH2PO4. Le produit d'érythropolétine ainsi dialysé, appelé produit B' ci- après, a été administré à des souris femelles de 6 semaines, sur 2 jours, à raison d'une fois par jour avec la même dose par injection intrapéritonéale pour donner une dose totale de 1,4 à 47 U/kg de poids corporel. Les résultats de la détermination de la concentration en hémoglobine dans le sang de chacun des animaux d'essai sont indiqués sur la figure jointe par la courbe B'. La figure contient également les courbes P et Q indiquant les résultats obtenus dans les essais témoins entrepris en administrant, aux animaux, le produit d'érythropolétine préparé avec l'urine du patient ou avec une simple solution saline, respectivement. Le produit d'érythropolétine préparé à partir de l'urine du patient et utilisé dans l'essai témoin ci-dessus (appelé ci-après produit P) a été préparé par séparation de l'urine de patients souffrant d'anémie aplastique selon le procédé d'Espada, et avec une activité spécifique de 19,4 U/mg protéine. L'administration du produit B' était très efficace pour augmenter la concentration en hémoglobine dans le sang des animaux sujets en comparaison aux résul- tats de l'essai témoin avec administration d'une simple solution saline, suggérant que le produit B' avait une activité médicale avec une bonne dépendance de la dose sur l'augmentation de la concentration en hémoglobine ou la dose de l'administration. Par ailleurs, quatre souris ont reçu de la même façon que ci-dessus, chacune, 1 ml, correspondant à 200 ml de l'urine brute, de la solution à l'effluent de la colonne dans l'adsorption du produit d'érythropoiétine brute A sur la colonne DEAE-Sephacel, et contenant les ingrédients non adsorbés et ayant été dialysés avec une solution physio- logique de chlorure de sodium contenant une solution tampon de Na2HPONaH2PO4 à M/100, à un pH de 7,4, et on a examiné la concentration de l'hémoglobine dans le sang des animaux. Les résultats sont indiqués au tableau 2 ci- dessous en même temps que les résultats de l'essai témoin en administrant, à six souris, une solution saline, indiquant que la concentration en hémoglobine était considérablement diminuée par l'administration des ingrédients non adsorbés en comparaison à la solution saline. 0 1 6 92 Tableau 2 Dans l'essai ci-dessus, la solution contenant les ingrédients non adsorbés n'avait pas d'activité érythropolétique. Exemple 2 L'adsorption de 97 U du produit d'érythropoiétine brute A a été effectuée sur 5 ml de DEAE-Sephacel dans une colonne à partir d'une solution tampon tris-acide chlorhydrique à M/100 à un pH de 6,5, contenant 0,15 mole par litre de chlorure de sodium avec ensuite lavage avec la même solution tampon et élution d'abord avec une solution tampon tris-acide chlorhydrique à M/100à un pH de 6,5 contenant 0,25 mole par litre de chlorure de sodium puis avec une solution tampon tris-acide chlorhydrique à M/100 à un pH de 6,5 contenant 0,55 mole par litre de chlorure de sodium. Par suite, l'activité d'érythropolétine a été récupérée uniquement dans la solution de l'éluat avec ce dernier éluant contenant 0,55 mole par litre de chlorure de sodium. Ce produit d'érythropoiétine est appelé ci- après le produit C. L'activité érythropolétique récupérée dans le produit C était de 278 U, correspondant à 278% de l'activité dans la matière première, et l'activité spécifique était de 2670 U/mg protéine, indiquant une augmentation de 40 fois par rapport au produit A. Exemple.3 La purification du produit d'érythropoiétine brute Groupe de souris Concentration en- hémoglobine dans le sang, g/dl Administration d'une solution saline 13,8 + 1,0 Administration d'ingrédients non adsorbés 10,9 + 1,6 (P préparé à partir de l'urine d'un être humain sain de la même façon qu'à l'exemple 1, a été entreprise avec 2310 U du produit brut. Ainsi, le produit brut a été adsorbé sur 94 ml de diéthylaminoéthylagarose (DEAESepharose CL-6B, produit de Pharmacia Co.) dans une colonne, d'une solution tampon d'imidazole-acide chlorhydrique à M/100, à un pH de 6,5, et contenant 0,15 mole par litre de chlorure de sodium avec ensuite élution d'abord avec une solution tampon imidazole-acide chlorhydrique à M/100 à un pH de 6,5 contenant 0,4 mole par litre de chlorure de sodium puis avec une solution tampon imidazole-acide chlorhydrique à M/100 à un pH de 6,5, contenant 0,6 mole par litre de chlorure de sodium. L'activité d'érythropolétine était récupérée dans la solution de l'éluat obtenue avec le dernier éluant contenant 0,6 mole par litre de chlorure de sodium. L'activité du produit d'érythropoiétine ainsi récupéré, appelé ci-après le produit D, était de 3030 U etson activité spécifique était de 566 U/mg protéine. L'activité de ce produit après dialyse avec une solution physiologique de chlorure de sodium à un pH de 7,4 contenant Na2HPO4-NaH2PO4 à M/100 était de 169 I.U. (unité internationale), en déterminant selon la détermina- tion de la souris polycythémique exhypoxique de Cotes, par rapport à la courbe de calibrage préparée avec le standard de travail sur l'érythropoiétine. Les résultats de comparaison de la détermination d'activité spécifique sont donnés au tableau 3 ci-dessous pour les produits D et P, en déterminant par les procédés de la culture des cellules de moelle osseuse et la détermination de la souris exhypoxique et polycythémique. Tableau 3 (U/mg protéine) ) Culture de cellules de moelle osseuse **) Détermination de la souris polycythémique exhypoxique. Exemple 4 Quatre portions, chacune de 58,0 U du produit d'érythropoiétine brute A, ont été adsorbées sur 2,0 ml de DEAE-Sephacel dans une colonne dans les conditions respectives différentes indiquées au tableau 4 ci-dessous, avec ensuite lavage d'abord avec la solution tampon équilibrée respective puis avec une solution tampon tris-acide chlorhydrique à M/100 à un pH de 6,5, contenant 0,5 M de chlorure de sodium et élution avec la même solution tampon mais contenant 0,55 M de chlorure de sodium. L'activité et l'activité spécifique de chacun des produits d'érythropolétine ainsi obtenus sont indiquées au tableau 4.. Détermination de l'activité.par la ' Erythropoiétine méthode (a)/(b) (a)) (b) **) Produit D 566 31,5 18,0 Produit P 19,4 11,3 1,7 Tableau 4 Comme cela est clair sur le tableau 4, l'activité spécifique des produits d'érythropolétine ainsi récupérés était remarquablement accrue de 9,3 à 23 fois par rapport à la valeur de 54 U/mg protéine du produit A, bien que la récupération de l'activité soit quelque peu diminuée selon les conditions de l'adsorption. Exemple de Comparaison N01 L'adsorption d'un produit d'érythropolétine brute ayant une activité de 113 U, obtenu de l'urine d'un être humain sain par le procédé d'Espada a été effectuée sur 14,3 ml de DEAE-Sephacel à partir d'une solution tampon tris-acide chlorhydrique à M/100, à un pH de 7,0, avec ensuite élution en succession avec des solutions aqueuses de chlorure de calcium à des concentrations de 5,30 et 100 m moles par litre. La solution d'effluent obtenue à l'étape de l'adsorption contenant les ingrédients non adsorbés et la Activité N Conditions d'adsorption Activité, spécifi- U que u/mg protéine 1 M/100 Na2HP04-NaH2P04, 0,1 M NaCl, 47,7 832 pH 6,5 2 M/100 Na2HP04-NaH2P04, 0,15 M NaCl, 29,9 1263 pH 6,0 3 M/100 Na2HPO4NaH2P04, 0,15 M NaCl 62,6 501 pH 7,0 4 M/100 Na2HP04-NaH2P04, 0,15 M NaCl 20,9 759 pH 7,5 solution de l'éluat ayant l'éluant de chlorure de calcium de 100 m moles par litre de concentration présentaient toutes deux l'activité érythropolétique. Les activités des solutions étaient de 48 U dans le premier cas et 52 U dans le dernier, avec des activités spécifiques de 4,5 et 1,8 U/mg de protéine respectivement. Exemple de Comparaison N 2 L'adsorption de 5,5 U du produit d'érythropolétine brute A a été effectuée sur 1,5 ml de diéthylaminoéthyl- dextrane (Diéthylaminoéthyl Sephadex A-50, produit de Pharmacia Co.) d'une solution tampon tris-acide chlorhydrique à M/100, à un pH de 7,0 avec ensuite élution d'abord avec une solution aqueuse de chlorure de calcium à une concentration de 15 m moles par litre puis avec de l'eau ammoniaquée à 4%. La solution d'effluent obtenue à l'étape de l'adsorption contenant les ingrédients non adsorbés et la solution d'éluat avec l'eau ammoniaquée à 4%, présentaient toutes deux l'activité érythropolétique. Les activités de ces solutions étaient de 3,3 U dans le premier cas et 3,0 U dans le dernier, avec des activités spécifiques respective- ment de 49,7 et 50,6 U/mg. Exemple de Comparaison N 3 L'adsorption de 185 U du produit d'érythropolétine brute A a été effectuée sur 11 ml de DEAE-Sephacel d'une solution tampon Na2HP04-NaH2P04 à M/100, à un pH de 6,0 avec ensuite élution avec une solution aqueuse de chlorure de sodium à une concentration de 0,25 mole par litre. La solution de l'effluent obtenue à l'étape de l'adsorption contenant les ingrédients non adsorbés et la solution de l'éluat avec l'éluant de chlorure de sodium présentaient toutes deux l'activité érythropolétique. Les activités de ces solutions étaient respectivement de 30 U dans la première et de 69 U dans la dernière, tandis que l'activité spécifique dans la dernière solution était de 48,5 U/mg protéine, indiquant quelton n' avait obtenu presqu'aucun effet de purification. R E V E N D I C A T I 0 N S REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation d'un produit d'érythropolétine n'ayant pas d'effet d'inhibition contre l'érythropolèse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: (a) adsorber un produit d'érythropolétine brute obtenu de l'urine d'un être humain sain sur un échangeur d'anions faiblement basique à partir d'une solution aqueuse neutre ou faiblement acide en présence d'un sel neutre inorganique à une concentration comprise entre 0,1 et 0,2 mole par litre, et (b) éluer le produit d'érythropolétine ainsi adsorbé avec une solution aqueuse d'un éluant contenant un sel neutre inorganique à une concentration comprise entre 0,5 et 0,7 mole par litre. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel neutre inorganique précité utilisé à l'étape (a) est choisi dans le groupe consistant en chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure de magnésium, chlorure de calcium et bromure de sodium. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échangeur d'anions faiblement basique précité est un carbohydrate diéthylaminoéthylé. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le carbohydrate diéthylaminoéthylé précité est choisi dans le groupe consistant en diéthylaminoéthyl- cellulose, diéthylaminoéthyldextrane et diéthylaminoéthyl- agarose. 5.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse neutre ou faiblement acide précitée a un pH compris entre 6,0 et 7,5. 6.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse de l'éluant a un pH compris entre 6,0 et 7,5. 7. Produit d'érythropolétine n'ayant pas d'effet inhibitoire vis-à-vis de l'érythropoîèse, caract6risé en ce qu'il a un poids moléculaire de l'ordre de 4000 à environ 13 000 et un point iso-électrique compris entre 3,1 et 3,6.