Brevet FR2505502A1 — publié le 19821112

Procédé intégral pour la détermination d'anticorps antistreptolysiniques, et moyenspour la mise en oeuvre de ce procédé. L'invention a pour objet un procédé amélioré et complet pour déterminer la présence et/ou la quantité d'anticorps antistreptolysiniques dans le sang ainsi que les moyens pour la mise en oeuvre de telles déterminations. On sait que la O-streptolysine est une toxine de nature protéinique, secrétée par certains streptocoques du groupe A. Cette toxine est mortelle pour les animaux d'essais, elle détruit les cultures de cellules, produit la lyse (dissolution) descellules rouges et des cellules blanches du sang de nombreuses espèces d'animaux. Il est également connu que quelques agentsoxydants réussissent à inhiber le pouvoir lytique d'une telle toxine et dans le cas d'une oxydation douce, la réaction est rever- sible Ceci signifie que sous l'action d'un agent réducteur approprié, la toxine recouvre son pouvoir hémolytique. On a déjà suggéré, il y a longtemps, la détermination des anticorps antistreptolysiniques, comme une approche ap- propriée pour connaître l'état et la gravité de la situation pathologique reliée à la présence de micro-organismes qui produisent la O-streptolysine. Le premier procédé utilisé dans ce but a été celui proposé par TODD (J Exp Med, 55, 267-280 ( 1932), cet auteur amontré la présence d'anticorps antistreptolysiniques dans le sérum de patients ayant subi une infection due à des strepto- coques Les essais de diagnostic ont été réalisés en neutralisant la Ostreptolysine au moyen de différentes quantités de sérum à essayer, préalablement désactivés L'excès de O-streptolysine non neutralisé était mis en évidence par 1 ' hémolyse de cellules rouges du sang ajoutées au système. RANTZ et RANDALL (Proc Soc Exp Biol Med, 59, 22-25 ( 1945)), ont suggéré, à leur tour, d'utiliser pour déterminer le taux d'antistreptolysine du sérum, des solutions concentrées de 0-streptolysine qui a été totalement réduite avant de réaliser l'essai de diagnostic. Les demanderesses ont déposé la demande de brevet française no 76 38 584, le 21 décembre 1976 et cette demande concerne un procédé particulier pour la détermination du taux d'antistreptolysine, ce procédé prévoyant, entre autre, la mise en oeuvre d'une série de stades, le premier stade comprenant quelquefois la préparation d'un grand nombre de solutions, ayant des concentrations prédéterminées de 0-streptolysine oxydée, auxquelles on ajoute du sang complet dilué dans un milieu approprié et ensuite le procédé prévoit l'ad- dition d'agents réducteurs qu'on ajoute aux mélanges obtenus comme indiqué ci-dessus, en vue de rétablir les propriétés hémolytiques de la 0-streptolysine. Aucun de ces procédés ci-dessus indiqués ni aucun autre-procédé n'a cependant pas suggéré la mise en oeuvre simultanée ou séquentielle, selon le désir des opérateurs ou selon la nécessité, d'une évaluation quantitative de la présence ou de l'absence d'anticorps antistreptolysiniques et/ou d'une détermination précise du taux antistreptolysinique. Le procédé décrit dans la demande de brevet sus-indiquée, même s'il comporte l'avantage provenant de l'utilisation de 0-streptolysine qui a été directement oxydée au cours de la progression de l'analyse,et de l'utilisation de sang complet, est inévitablement sujet à des critiques, chaque fois qu'on désire passer de la détermination précise du taux antistrepto- lysinique directement à une estimation purement et uniquement qualitative de la présence d'anticorps ou à la détermination du seuil d'anticorps de certains échantillons Enfin, le fait de recourir à un grand nombre de solutions ayant différentes concentrations connues en 0-streptolysine oxydée,présente sans aucun doute, de nombreux avantages lorqu'il faut déterminer le taux de 0-antistreptolysine, mais perd une partie de son utilité lorsqu'on désire la seule détermination du seuil d'anticorps. Les inventeurs ont fait la découverte qui est l'objet de l'invention, qu'une solution permet d'exploiter les avantages de l'utilisation de 0streptolysine oxydée,à la fois dans le cas de la détermination du taux exact d'anticorps et dans le cas o l'on désire seulementdéterminer le seuil d'anticorps. L'invention a par conséquent pour objet de fournir une composition de base qui est adaptée pour réaliser les deux buts ci-dessus indiqués et qui est composée d'une quantité connue de 0-streptolysine oxydée, d'un agent réduc- teur pour rétablir les propriétés hémolytiques de 0-strepto- lysine, d'un diluant de l'échantillon à contrôler et d'un essai témoin à blanc Les différents composants peuvent être logés dans différents récipients ou bien tout en restant séparés, ils peuvent former une seule pochette de diagnostic Les composants peuvent, dans les deux cas, se trouver sous forme prête à être utilisée ou sous forme d'une solution concentrée ou sous forme solide ou également la 0-streptolysine oxydée peut être présente sous forme d'une série de solutions ayant des concentrations préétablies. Ainsi, par exemple, la composition appropriée à déterminer I&e anticorps peut être composée de trois parties différentes, l'une contenant la 0streptolysine oxydée, l'autre l'agent réducteur et la troisième le diluant. Selon un autre mode-de réalisation, les trois parties peuvent être réunies, tout en restant séparées, dans une seule pochette La 0streptolysine oxydée peut à son tour être présente en plusieurs portions, séparées -les unes des autres en des quantités identiques ou différentes. La 0-streptolysine oxydée peut être présente sous forme solide ou bien diluée dans un milieu approprié, sous forme d'une poudre ou sous n'importe quelle autre forme,telle que comprimée, lyophylisée ou sous une autre forme. L'invention a également pour objet un procédé d'analyse d'anticorps antistreptolysiniques,un tel procédé prévoyant essentiellement de mettre en contact la 0-streptolysine oxydée avec l'échantillon à contrôler, le traitement ultérieur avec un agent réducteur pour rétablir le pouvoir hémolytique de la 0-streptolysine et la comparaison avec un essai témoin à blanc. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé complet pour l'analyse d'anticorps antistreptolysini- ques, ledit procédé comprenantcomme stades la détermination préliminaire du seuil d'anticorps et ensuite la mesure précise de la teneur en anticorps antistreptolysiniques, ce deuxième stade pouvant être supprimé au cas o la valeur obtenue ail premier stade se trouve être inférieure au seuil limite. Un des avantages du procédé est de pouvoir utiliser indifféremment du sang complet ou de sérum tel quel, non désactivé. La description plus en détail des stades individuels du procédé complet pour l'analyse d'anticorps antistrepto- lysinique, selon l'invention, comprend les stades de prépa- ration d'une solution de 0-streptdlysine oxydée de concen- tration connue, la préparation d'une ou de plusieurs solutions d'un agent réducteur approprié, la dilution de l'échantillon avec un milieu nonhémolytique, la mise en contact de la 0-streptolysine oxydée avec une quantité pré- établie d'un échantillon, le repos du mélange ainsi obtenu à une température comprise entre 150 C et 750 C, l'addition de l'agent réducteur, l'attente pour la sédimentation des cel- lules rouges du sang, le contrôle des conditions d'hémolyse ou de non-hémolyse et le contrôle de l'essai témoin blanc. La séquence des différents stades sus-indiqués a bien entendu pour but la détermination du taux d'antistreptolysine que l'on détermine à partir du dernier stade dans lequel on n'a pas détecté de l'hémolyse des cellules rouges du sang. Un tel résultat peut être obtenu en partant de solutions de 0streptolysine oxydée ayant une concentration constante et en y ajoutant différentes quantités de l'échantillon à contrôler ou,selon un autre mode de réalisation, enutilisant une série de solutions de 0-streptolysine oxydée dont les concentrations connues augmentent graduellement et en ajoutant à toutes ces solutions la même quantité d'échantillons à contrôler. A son tour, un seul essai au cours duquel on ajoute une solution de l'échantillon à contrôler a une solution contenant une concentration connue de 0-streptolysine (oxydée) et on v introduit ensuite l'agent réducteur, permet par comparaison avec l'essai témoin blanc de s'assurer de la présence> s'il y en a, d'anticorps antistreptolysiniques dans l'échantil- lon et permet de calculer, en connaissant la concentration de la 0streptolysine, la quantité correspondant à une telle concentration Si la concentration est bien choisie, ce seul essai indique clairement la valeur du seuil d'anticorps. Comme suggéré ci-dessus, ces différents stades ont été possibles grâce à la nature même de la composition de base, laquelle prévoyant la présence de plusieurs constituants, comprend ces derniers sous forme séparée l'un de l'autre; tous les consti- tuants étant réunis dans une miême pochette ou si on le désire, chaque constituant se trouvant dans un récipient séparé. Parmi les agents réducteurs qu'on peut utiliser pour le procédé, onpeut citer à titre d'exemple, le mercaptoéthanol, le dithiothréitol, la cystéine, la N-acétylcystéine, le métabisulfite de sodium, le sulfite de sodium, etc. Comme indiqué ci-dessus, il est possible d'utiliser, endehors du sang-complet, du sérum Dans ce dernier cas, il faut prévoir un stade d'addition de cellules rouges du sang, après l'addition de l'agent réducteur, pour contrôler S 'il y a ou non de l'hémolyse. L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exemple non limitatif ci-après. E X E M P L E En supposant qu'on doive effectuer l'analyse d'anticorps antistreptolysiniques dans un lot de 80 échantillons de sang (ou d'échantillons de sérum:auquel cas il serait nécessaire d'ajouter aux échantillons individuels, au moment approprié, les cellules rouges du sang), et en supposant également que la valeur seuil d'anticorps est de 200 U I /ml (unitésinternationa- les par millilitres), une valeur en-dessous de laquelle l'essai est considéré comme négatif, tandis que la présence d'anticorps antistreptolysiniques au-dessus de cette valeur fait considérer l'essai comme positif, on prépare 80 récipients et dans chacun de ces récipients, on introduit de la 0-strepto- lysine oxydée, en une quantité telle qu'elle correspondeà la valeur du seuil d'anticorps Ces récipients forment les réci- pients pour la détermination du seuil. On dilue les 80 échantillons avec un diluant approprié et on analyse (selon le procédé ci-dessus indiqué) en utilisant les récipients pour la détermination du seuil Pour compléter l'analyse, après avoir réalisé la comparaison avec l'essai témoin respectif, on divise les échantillons en deux lots 1) Les échantillons qui ont provoqué l'hémolyse dans le récipient, ce qui signifie que la quantité d'anticorps 0antistreptolysinique présenteest inférieure à la quantité considérée comme seuil d'anticorps On peut considérer en ce qui concerne ces échantillons que l'analyse est complète et le résultat final est exprimé sous forme de taux d'antistrepto- lysine inférieur à 200 U I /ml; 2) Les échantillons qui n'ont pas provoqué d'hémolyse dans le récipient; ceci signifie que la quantité d'anticorps O-antistreptolysinique présente est Égale ou supérieure à la quantité considérée comme seuil d'anticorps Pour ces échantil- lons, on ne peut pas considérer que l'analyse est terminée, car il est nécessaire de connaître le taux exact d'antistrep- tolysine. Tout en considérant l'exemple de l'analyse de 80 échantillons, supposons que les échantillons du second groupe sont au nombre de 10 On prépare dans ce cas 10 lots de récipients contenant de la O-streptolysine oxydée en quantités préétablies, et en augmentation progressive (le nombre de récipients pour chaque lot et les quantités de O-streptolysines oxydées sont choisis en rapport avec le taux d'antistreptolysine que l'on désire déterminer). Les échantillons en question sont ensuite analysés (selon le procédé cidessus indiqué), chacun avec un lot de récipients. Le résultat final est défini par la quantité de 0- streptolysine présente dans le récipient dans lequel on n'a pas observé d'hémolyse de cellules rouges du sang et lequel précède immédiatement le premier des récipients dans lequel l'hémolyse des cellules rouges de sang a été observée. REVENDICATIONS 1 Composition appropriée pour l'analyse d'anticorps antistreptolysiniques composés de O-streptolysine oxydéeen une quantité connue, d'un agent réducteur pour rétablir le pouvoir hémolytique de la O-streptolysine, d'un diluant de l'échantillon à contrôler et d'un essai témoin à blanc. 2 Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait que la Ostreptolysine oxydée est présente en quantité connue dans un lot d'échantillons divisés, en des concentrations prédéterminées. 3 Pochette d'échantillons pour l'analyse d'anticorps antistreptolysiniques, comprenant, dans des récipients séparés, de la Ostreptolysine oxydée en quantités connues, un agent réducteur pour rétablir les propriétés hémolytiques de la O-streptolysine et un diluant pour l'échantillon à contrôler. 4 Pochette de diagnostics selon la revendication 3, caractérisée par le fait que la O-streptolysine oxydée est présente en quantités connues dans un lot de récipients séparés, chaque récipient contenant une fraction ayant une concentration prédéterminée. Procédé intégral pour l'analyse d'anticorps anti- streptolysiniques comprenant les stades de détermination préliminaire de la valeur du seuil de la teneur d'anticorps et ensuite, éventuellement, la mesure précise du taux d'anti- corps antistreptolysinique. 6 Procédé intégral pour déterminer le taux d'anticorps antistreptolysinique selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on met en oeuvre le premier stade en mettant en contact une quantité connue de O-streptolysine oxydée avec l'échantillon concerné, entraitant ensuite ce qui a été obtenu avec un agent réducteur, attendant la sédimentation des cellules rouges du sang, contrôlant l'hémolyse possible des cellules rouges et contrôlant l'état de l'essai témoin blanc. 7 Procédé intégral pour l'analyse d'anticorps anti- streptolysiniques selon la revendication 5, comprenant de préférance les stades de préparation d'une ou plusieurs solutions ayant desconcentrations connues en O-streptolysine oxydée, la préparation d'une solution d'un agent réducteur approprié, la dilution de l'échantillon à contrôler avec un milieu non hémolytique, la mise en contact de la 0streptolysine oxydée avec une quantité prédéterminée de l'échantillon à contrôler, le repos du mélange ainsi obtenu a une température comprise entre 15 C et 75 C, l'addition d'un agent réducteur, l'attente pourla sédimentation des cellules rouges du sang, le contrôle de l'hémolyseetlecontr 8 le de l'état de l'essai témoin blanc. 8 Procédé intégral pour l'analyse d'anticorps antistreptolysiniques selon l'une quelconque des revendications à 7, caractérisé par le fait que l'échantillon à contr 8 ôler est du sang complet ou du sérum tel quel. 9 Procédé intégral pour l'analyse d'anticorps anti- streptolysiniques, selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'échantillon à contr 5 ler est un sérum tel quel et le rétablissement des propriétés hémolytiques de la 0-strepto- lysine est précédé par une addition appropriée de cellules rouges du sang. Composition selon les revendications 1 ou 2, caractérisée par le fait que la 0-streptolysine oxydée est présente à l'état solide ou en solution à une concentration connue ou à l'état lyophylisé. 11 Composition selon les revendications 1 ou 2, caractérisée par le fait que l'agent réducteur est choisi dans un groupe formé par le mercaptoéthanol, le dithiothréitol, la cystéine, la Nacétylcystéine, le métabisulfite de sodium et le sulfite de sodium. 12 Pochette de diagnostic selon les revendications 3 et 4, caractérisée par le fait que la 0-streptolysine oxydée est présente à l'état solide, en solution à une concentration connue ou à l'état lyophylisé. 13 Pochette de diagnostic selon les revendications 3 ou 4, caractérisée par le fait que l'agent réducteur est choisi dans le groupe formé par le mercaptoéthanol, le dithio- thréitol, la cystéine, la N-acéty-lcystéine, le métabisulfite de sodium et le sulfite de sodium.