Brevet FR2509614A1 — publié le 19830121

La présente invention concerne la production en grandes quantités d'interférons humains INF, de type fibroblaste ( È) ou leucocyte ( domaines Sa production est plutôt difficile et des amé- liorations dans ce domaine présentent une grande importan- ce et valeur. L'expression des gènes de mammifères dans des bactéries comme E Coli est habituellement impossible du fait de la présence de séquences intermédiaires, interrompant la sé- quence de codage du gène Il existe toutefois un certain nombre de gènes qui n'ont pas d'introns Récemment, Nagata et coll (Nature 287, 401-408, 1980) ont montré que les gènes de l'interféron- du leucocyte humain manquent également d'introns Ils ont pu déceler de faibles taux d'expression de ces gènes dans E Coli. Les fibroblastes diploïdes humains, induits par ARN à dou- ble filament, renferment au moins deux m ARN codant pour l'inteféron (Weissenbach et coll PNAS 77, 7152-7156, 1980) L'un d'eux, long de 0,9 kb ( 11 S) correspond à l'es- pèce d'interféron principale IFN 1 produite par ces cel- lules, dont la séquence amino-acide est partiellement dé- terminée (Knight et coll Science 207, 325-326, 1980) Le clonage via AD Nc de cet IFN Pl AR Nm, au moyen de plasmide p BR 322 de E Coli en tant que vecteur, a été réalisé (Goeddel et coll Nucleic Acid Res 8, 4057-4075, 1980) La séquence nucléotide de ces clones d'ADN correspond à celle qui est déterminée pour la protéine et, après construction de plas- mides d'expression, le IFN-/31 AD Nc est reconnu diriger la synthèse de l'interféron humain dans E Coli La demanderesse a isolé des fragments génomiques porteurs de gène IFN- 1 (Mory et coll, Eur J Biochem 120, 197202, 1981) et de gènes IFN-c être en conséquence directement exprimés dans E Coli. Le nouveau procédé de production d'interféron humain du type fibroblaste (") et du type leucocyte (>), comprend l'introduction d'ADN génomique humain dans un phage approprié, suivie, soit de la contamination des bac- téries appropriées par ce phage recombinant, ou bien de la récupération, à partir de ce phage, d'un segment d'ADN con- venable,introduction de ce segment dans le plasmide d'ex- pression de la bactérie appropriée, culture de ces bacté- ries et récupération de l'interféron. L'invention concerne un procédé, dans lequel un fragment spécifique d'ADN génomique humain, extrait de cellules sanguines humaines, est cloné dans un vecteur bac- tériophage, et utilisé directement pour programmer la synthèse d'IFN dans des bactéries, qui sont cultivées en vue de la production d'interféron Au cours de ce procédé, il n'y a nul besoin de préparation pénible et de clonage d'ADN complémentaire (AD Nc) de longueur totale, à partir de Arim Conformément à l'invention, une portion convenable d' ADN est prélevée directement à partir d'une cellule humaine facilement disponible, comme globule blanc, et est clonée dans un vecteur >%-phage Le gène IFN nécessaire n'est pas interrompu par des introns, il est donc capable de syn- thètiser directement l'IFN dans les bactéries Une forte activité IFN est produite par l'infection de bactéries ap- propriées, comme E Coli, par un >-phage recombinant, ren- fermant un ADN humain inséré dans le gène IF Np 1 ou le gène IFN-c O( IFN est recueilli et purifié à partir du lysat bac- térien résultant de cette contamination On a constaté que les phages étaient des vecteurs appropriés pour l'introduc- tion de fragments d'ADN humain dans les bactéries; X Charon - 4 A s'avère particulièrement approprié et conduit à une forte production d'IFN L'invention concerne également l'introduc- tion de ces fragments clonés d'ADN génomique humain dans des vecteurs d'expression de plasmide, qui sont munis de forts initiateurs Ce procédé peut être réalisé avec dif- férents gènes IFN-" aussi bien qu'avec différents gènes IFN-1 ', pourvu que ceux-ci soient exempts d'introns. Dans une forme de réalisation, l'ADN prove- nant d'un adulte humain est fragmenté par digestion partiel- le Eco RI, et est cloné dans dul Charon 4 A Le clone ainsi obtenu, désigné comme Clone C 15, avec une insertion d'ADN humain de l'ordre de 17 kb, est identifié comme renfermant un gène pour l'interféron IFN 1 de fibroblaste Le repé- rage par restriction montre que ce gène, situé sur un frag- ment 1,8 kb Eco RI, n'est pas interrompu par des introns. Ce fragment d'ADN génomique humain est capable de diriger la synthèse de IFN Ai actif humain dans E Coli et dans d' autres bactéries appropriées Une forte activité IFN peut être recueillie à partir des lysats de phage, qui, sous certaines conditions, peut atteindre 107 U/litre Ces ly- sats sont avantageusement soumis à une chromatographie, de préférence sur du " Cibacron Blue Sepharose" ou sur des co- lonnes similaires, et l'interféron ainsi obtenu possède les mêmes propriétés immunologiques et la même spécificité d' espèce que IFN produit à partir de fibroblastes humains. On obtient des résultats semblables avec IFN-"c, dont le gène est identifié dans le clone 18-3 renfermant un frag- ment génomique humain de 13 kb. Dans une autre forme de réalisation, le frag- ment d'ADN génomique humain, renfermant le gène IFN-_ 1 ou IFN-qc, est introduit dans un plasmide tel que plasmide p BR 322 renfermant le promoteur rec A de E Coli Les cul- tures de E Coli, transformées par ces plasmides recombi- nants, produisent de grandes quantités,respectivement, de IFN-A 1 ou de IFN-"c, quand le promoteur rec A est induit par de l'acide nalidixique Le fragment génomique IFN-Ai est en- suite coupé près du codon pour le premier méthionine de 1 ' IFN-1 i mûr, et est lié au site de liaison ribosomale de promoteur d'E Coli lac Cet initiateur de lac est modi- fié de manière à renfermer le site de liaison de l'ARN po- lymérase du promoteur tryptophane Avec cet initiateur hy- bride tryp-lac, l'ADN génomique IFN-/1 est apte à produire 108 U/litre d'IFN-i 1 dans la souche de minicellule P 679-54 d'E Coli Des rendements semblablement satisfaisants d'IFN -"c sont obtenus lorsque le gène IFN c est lié de manière appropriée à l'initiateur de tryp-lac Dans tous les cas, l'activité d'IFN est récupérée à parti/de la cellule bac- térienne par lyse à l'aide de lysozyme et de propylène glycol à 30 %, et est ensuite purifié, en ce qui concerne les lysats de phage, sur un support hydrophobe de chroma- tographie: pour IFN-j 1 le support préféré est Cibacron Blue Sepharose L'élution peut être réalisée par des sub- stances comme éthylène glycol, ou mieux, propylène glycol. Une purification ultérieure de IFN-i 1 ou IFN-c peut être réalisée par chromatographie par immunoaffinité sur des colonnes d'anticorps monoclonal, ou par d'autres techniques classiques. Il en ressort donc clairement que des fragments d'ADN génomique humain peuvent être utilisés pour la produc- tion à rendement élevé de IFN humain, dans E Coli et dans d' autres bactéries appropriées Ainsi qu'il est dit plus haut le procédé selon la présente invention consiste à introdui- re un fragment d'ADN génomique humain dans un vecteur con- venable, tel qu'un phage, à contaminer une culture de bac- téries avec de tels phages, ce qui aboutit à la lyse de ces bactéries, et à recueillir l'interféron résultant, con- tenu dans le lysat L'invention se rapporte aux nouveaux phages, obtenus par l'introduction d'ADN génomique humain, et en particulier aux-phages recombinants de type -> comme clone C 15, donnant IFN 2 et 18,3 donnant IFN Oc L'inven- tion concerne en outre un procédé pour la production d'in- terféron, par introduction d'ADN génomique humain dans un phage approprié, récupération à partir de ce phage d'une section d'ADN convenable, introduction de celle-ci dans l'expression de plasmide de bactéries appropriées, culture de ces bactéries et récupération de l'interféron cherché. D'autres objets de l'invention apparaitront en partant de la description détaillée suivante, non limitative. Un grand avantage de cette invention réside dans le fait que l'on peut comparer les gènes d'individus bien portants ou malades, pour leur aptitude à produire de l'IFN, ce qui permet l'étude de déficiences génétiques dans la production d'IFN. Pour commencer, on étudie les substances et les procédés utilisés. Préparation d'une collection gènes humains On prépare de l'ADN de poids moléculaire élevé à partir de cellules sanguines périphériques d'un adulte, avec j-thalas- semie Des portions ( 40/g) d'ADN sont digérées séparément pendant 30 minutes avec 100, 200 ou 300 unités Eco RI, puis sont chauffées pendant 10 minutes à 65 C, et sont appliquées ensemble sur un gradient à 10 à 40 % de sucrose, comme dé- crit Les fragments d'ADN entre 10 et 20 kb sont liés avec T 4 ADN ligase, comme décrit par Mory et coll (Mol Biol. Reports 6, 203-208, 1980) aux branches de >Charon 4 A d'ADN préparé par digestion Eco RI selon Maniatis et coll (Cell. 687-701, 1978). Le conditionnement in vitro est fait comme décrit par Hohn et Murray (PNAS 74, 3259-3263, 1977) par mélange de plu- sieurs portions aliquotes de 8/ul de la réaction de liaison ( 0,5 bg de vecteur d'ADN et 0,125/Lg d'ADN humain) avec 50 /f d'extraits de E Coli BHB 2688 /N 205 rec A -(imm 434 c Its b 2 red 3 Eam 4 Sam 7)/> 1 l et BHB 2690 %N 205 rec A (Limm 434 c Its b 2 red 3 Dam 15 Sam 7)/ 7 Par gag d'ADN recombinant, on obtient 3 x 105 pfu, comparé 8 10 pfu/g de ADN-\ intact. Un total de 1,8 x 10 phages recombinant sont dilués dans 6 ml de Tris-H Cl 10 m M, p H 7,5, 10 m M de SO 4 Mg, 0,01 % de gélatine Apres addition de 0,1 ml de chloroforme et élimi- nation de débris par centrifugation par microfuge, les pha- ges sont développés 10 fois par dépôt sur E Coli DP 50 (Le- der et coll, Science 196, 175-177, 1977) à 4 x 103 pfu/15 cm de plaque Pour le triage(screening) 2 x 104 pfu sont ense- mencés sur des plaques de 15 cm, et des filtres doubles en nitrocellulose sont élevés en suivi comme indiqué par Benton et coll (Science 196, 180182, 1977), Ce travail est réalisé dans des conditions de retenue P 3. Préparation d'essai de IFN-A 1 AD Nc Des poly A provenant de cultures de fibroblastes F 511 de prépuce induites pendant 4 heures par 100/g/ml de poly(r I) :(r C), 501 g/ml de cycloheximide (avec 2 pg/ml d'Actinomycin D pendant la dernière heure), sont préparés, et les deux pics de AR Nm d'interféron sont fractionnés par centrifuga- tion de gradient de sucrose, comme détaillé par Weissenbach et coll (PNAS 77, 7152-7156, 1980; et Eur J Biochem 98, 1-8, 1979) Le 11 S m ARN ( 1,5 pg) est utilisé pour préparer des hybrides ARN-AD Nc avec transcriptase inverse provenant de virus myeloblactosis aviaire (J Beard) et oligo(d T), comme plus haut, Weissenbach et coll (PNAS, 77, 7152-7156, 1980) Ces hybrides ARN-AD Nc sont directement clonés selon Zain et coll (Cell 16, 851-861, 1979),mais en utilisant d CTP pour l'équeutage des hybrides, et des d G équeutés, des Pst I-fendus p BR 322 comme vecteur (Chang et coll Nature 275, 617-624, 1978) On obtient un total de 12 500 tetr S amp transformants d'E Coli MM 294, comme indiqué par Sten- lund et coll (Gene, 10, 47-52 1980) L'hybridation de co- lonie est faite avec des essais d'AD Nc à 32 P transcrits soit à partir de 11 S AR Nm ( 6/g) de cellules F 511 ou à par- tir de poly A±ARN ( 3,7/Ag) de cellules non induites La synthèse d'AD Nc est amorcée avec une amorce complémentaire, synthétique, (voir Narang et coll, Methods Enzymols, 68, -98, 1979), 5 'GAGATCTTCAGTTTC 3 ', qui comprend le site Bgl II de la séquence d'IFN-b 1 Avec une amorce marquée à ter- minaison 32-5 '(Houghton et coll, Nul Ac Res 8, 1913-1931, minaison P-5 ' 1980), 1980), on observe un AD Nc espéré, long de 640 nu- cléotides, seulement quand on utilise de l'ARN induit comme modèle Pour préparer les essais, 20 #oles d'amorce sont recuites à chaque ARN dans 4/1 de KC 1 0,4 M, à 30 C pendant 60 minutes, puis mises à incuber dans 25 d avec p Ci chaque de d CTP et d' " -d ATP à 32 p (à la fois 400 Ci/mmole), 0,5 m M chaque de d GTP et de TTP, 50 m M de Tris- H Cl p H 8,3, 5 m M de dithiothreitol, 50/g/ml d'actinomy- cine D, 4 m M de pyrophosphate et 30 unités de transcrip- tase inverse, pendant 2 heures à 37 C Après addition de ,4 g d'ADN de E Coli, le milieu est traité par Na OH 0,3 N pendant 60 minutes à 70 C, il est neutralisé et filtré sur Séphadex G-50 dans 50 m M de Tris-H Cl p H 8, 0,1 M Na Cl, 10 m M d'EDTA, 0,5 % de sulfate de dodécyle On obtient à partir de chaque ARN, 5 x 106 cpm de AD Nc Les colonies, cul- tivées sur des filtres de nitrocellulose, sont fixées, et l'ADN est dénaturé comme décrit par Thayer (Anal Biochem. 98, 60-63, 1979) Chaque filtre est préhybridé avec 10 ml de 6 XSET (SET = 150 m M de Na Cl, 2 m M d'EDTA, 30 m M de Tris- H Cl p H 8) 10 x solution de Denhardt (Denhardt 1966, Biochem. Biophys Res Comm 23, 641-646), 0,1 % de pyrophosphate de Na, 0,1 % de sulfate de dodécyle, 50/ g/ml d'ADN modifié d'E Co- li,pendant 4 heures à 67 C Ces filtres sont hybridés à 67 C pendant 1418 heures dans la même solution avec 0,5 x 106 cpm/filtre de l'un des deux essais de AD Nc à 32 p, 10, g/ml de poly A et 2,5 ug/ml de poly C Les filtres sont rincés pendant 1 heure à 67 C dans la solution de préhybridation, puis à 3 reprises supplémentaires pendant 30 minutes à 67 C avec 3 XSET, 0,1 % de pyrophosphate, 0,1 % de sulfate de dodé- cyle, puis pendant 60 minutes à 25 C avec 4 XSET (voir Mania- tis, 1978, Cell 15, 687-701) Les filtres sont séchés et exposés à des pellicules Agfa Curix rayon+, pendant 1 à 2 jours à -70 C avec des écrans de renforcement. Parmi 3 500 colonies examinées, 14 se sont hybridées de pré- férence à AD Nc amorcé provenant de 1 'AR Nm induit, tandis que 130 se sont hybridées à AD Nc amorcé de l'AR Nm non in- duit L'ADN ( 0,3/ug) des plasmides provenant du premier groupe est hybridé sur des filtres (Kafatos et coll 1979, Nucl Ac Res 7, 1541-1552) avec l'extrémité 5 ' de l'a- morce marquée 32 p ( 0,3 +oles, 4 x O 106 cpm) dans 6 XSSC, xsolution de Denhardt, à 35 C pendant 21 heures, puis est rincé avec 6 XSSC ( 900 m M de Na Cl, 90 m M de citrate de Na) à 35 C Un clone I-6-5 est fortement positif et la succession de l'ADN (voir Maxam et coll, 1980, Methods Enzymol 65, 499-560) montre qu'il renferme environ 370 nucléotides à partir du côté -3 ' de la séquence d'IFN-A 1. On examine 50 000 autres clones préparés comme précédemment, par introduction de d C-equeutés ds-AD Nc, provenant de l'AR Nm induit purifié par gradient de sucrose dans le site Pst I de p BR 322: la proportion de clone d'IFN-A 1 est de 0,16 % ( 80 clones) pour 0,65 % de clones d'IFN-1 2. Le clone IFN-/1 I-6-5, décrit plus haut et préparé à partir -de l'AR Nm FS-11, est utilisé pour le triage de la collection humaine. Isolation du clone génomique: IFN-/1 clone 15 Les clones d'ADN de plasmide provenant de IFN i, AD Nc sont marqués par "translation d'entaille",selon Rigby et coll ( 1977, J Mol Biol 113, 237-251) à 2 x 108 cpm g de ADN et hybridés à 106 cpm/filtre avec le gène de la collec- tion humaine La préparation des filtres, les modes opéra- toires de modification d'ADN et d'hybridation, sont comme décrit plus haut Des phages, provenant de plaques donnant des hybridations positives, sont redéposés à une densité de 1 à 2 x 102 pfu, sur des plaques de 9 cm et réexaminés Ce mode opératoire est répété à 3 reprises, jusqu'à ce que plus de %des plaques s'hybrident en IFN 1 AD Nc Le phage clone est isolé à partir de l'une de ces plaques. Les phages sont cultivés dans des cultures liquides, comme décrit par Blattner et coll -( 1977, Science, 196, 161-169). E Coli DP 50 sont cultivés une nuit durant dans 1 % de tryp- tone, 0,5 % d'extrait de levure, 0,2 % de maltose, 0,25 % de 504 Mg, 0,01 % d'acide diaminopimélique, 0,004 % de thymidine. Environ 0,3 ml de cette culture est mélangé en vue de pré- adsorption avec 0,3 ml de Mg 504 10 m M, 10 m M de Ca Cl et 7 2 107 phages, pendant 20 minutes à 37 C Ces cultures sont ensuite diluées dans un flacon de 2 litres avec 500 ml de milieu préchauffé, renfermant 1 % de NZ amine, 0,5 % d'ex- trait de levure, 0,5 % de Na Cl, 0,1 % d'acides casamino, 0,25 % de Mg SO 4, 0,01 % d'acide diaminopimélique, 0,004 % de thymidine, et le tout est mis à incuber sous bonne aération pendant 15 à 18 heures à 37 C Après lyse complète, les débris de cellules sont enlevés par centrifugation dans le froid pendant 15 minutes, à 7 000 tours/minute dans An rotor de Sorvall GSA Les phages sont précipités à partir de ce lysat clarifié à l'aide de polyéthylène glycol 6000 à 7 % et ils sont purifiés par 2 gradients successifs de Cs Cl L'ADN C 15 de phage est purifié au phénol et sa struc- ture est analysée par digestions aux enzymes de restriction, électrophorèse horizontale sur gel d'agarose dans 20 m M de tris base, 10 m M d'acétate de Na, 1 m M d'EDTA avec 0,5/g/ ml de bromure d'éthidium, puis il est transféré sur des fil- tres de nitrocellulose( Southern, 1975, J Mol Biol 98, 503-517) et hybridé avec de l'IFN 1 AD Nc de translation comme plus haut Des fragments Eco RI d'ADN C 15 sont sous- clonés dans le site Eco RI de p BR 322 en vue d'un repérage par restriction précis de l'ADN du plasmide, selonle mode opératoire établi (voir Bolivar, 1979, Methods Enzymol 68, 245-267). Essai d'activité d'interféron dans les lysats de phage Des lysats de phage IFN A 1 C 15 clarifiés, préparés comme ci-dessus, sont dialysés contre une solution saline tampo- née au phosphate (PBS) pendant 7 heures Une portion de 10 ml est chargée dans une colonne de 0,3 ml de Cibacron Blue Sepharose CL 6 B (Pharmacia Fine Chem) La colonne est rin- céekvec 10-15 ml de Na Cl 1 M, du tampon phosphate de so- dium 0,02 M p H 7,2 et ensuite avec 10 ml de propylène gly- col dans la solution de rinçage Des fractions ( 0,5 ml) sont recueillies et conservées à 4 C; dans certains cas on ajoute 0,1 % d'albumine de sérum humain, pour stabiliser, L'activité d'interféron est essayée, comme décrit par Weissenbach et coll ( 1979, Eur J Biochem 98, 1-8), par dilution de chaque fraction en série dans une microplaque à 95 logements Chaque logement reçoit 2-3 x 104 fibroblastes humains F 511 dans 0,1 ml de Milieu Essentiel Minimal (Gibco), %de sérum foetal de veau(FCS), 0,5 % de Gentamine Après 18 heures à 37 C, le milieu est enlevé et l'on ajoute du virus de stomatite vésiculaire (VSV) à raison de 1 pfu/cel- lule dans du milieu à 2 % de FCS L'inhibition de l'effet cytopathe est enregistré 30 à 40 heures après la contamina- tion, en comparaison de l'IFN de NIH étalon G 023-902-527. L'activité antivirale est également mesurée par la réduc- tion de l'incorporation de 3 H-uridine après contamination par VSV comme décrit antérieurement (Weissenbach et coll. 1979, Eur J Biochem 98, 1-8) De l'anti-sérum contre IFN-g est obtenu à partir de lapins et est essayé comme précé- demment (Weissenbach et coll 1979, Eur J Biochem 98, 1-8) Pour l'essai de neutralisation 0,1 ml d'anti-sérum (titrant 104 U/ml) ou du sérum non immune, est mélangé avec 0,2 ml d'une suspension à 50 %de protéine A perles de Sépha- rose (Pharmacia Fine Chem) dans PBS, pendant 1 heure à 37 C Les perles sont rincées à 2 reprises avec du PBS, et l'on ajoute 0,1 ml d'interféron bactérien ( 100 U/ml) Au bout de 2 heures à 37 C, les perles sont centrifugées et le pro- duit surnageant est essayé en tant qu'inhibiteur de l'incor- poration de H-uridine dans les cellules contaminées par VSV. Isolation du clone génomique IFN c clone 18-3 Deux courts oligo-nucléotides à filament unique, chimique- ment synthétisés comme plus haut, sont utilisés pour trier directement la collection humaine Ces oligo-nucléotides sont complémentaires de la séquence habituelle des gènes IFN-"c et ont la séquence 5 'CTCTGACAACCTCCC 3 ' et 'CCTTCTGGAACTG 3 ' Ces oligo-nucléotides sont utilisés après marquage en 5 ', conme plus haut, soit directement, ou comme amorce pour la syntyèse de l'AD Nc sur ARN de cellu- les leucémiques humaines induites à partir de virus de Sendal Les 32 Poligo-nucléotides ou AD Nc amorcé, sont hybridés pour un total de 500 000 Xphages recombinants, comme démontré plus haut On utilise approximativement x 105 cpm par filtre de nitrocellulose de 9 cm Les hybri- dations sont réalisées dans des sachets de cuisine scel- lés, en matière plastique, dans des volumes minimaux de li- quide L'hybridation avec les amorces de base 15 est réa- lisée comme suit: d'abord préhybridation dans 6 XSSC, x Denhardts à 37 C pendant 4 heures; puis, hybridation dans 6 XSSC, 10 x Denhardts à 37 C pendant 18 heures, et rinça- ges, 3-4 fois, 30 minutes chaque,dans 6 XSSC à 37 C ou jusqu' à ce qu'on ne trouve plus de comptes dans le rinçage Pour l'hybridation avec les amorces de base 13, les températures d'hybridation et de rinçage sont abaissées à 30 C Un total de 16 phages donnent une hybridation positive et sont ana- lysés par repérage par restriction et séquences de DNA On démontre que le clone 18-3 est porteur de 3 gènes IFN-(, dont l'un présente une séquence identique à celle du clone oc de l'AD Nc de Goeddel et coll ( 1981, Nature, 290, 20-25). Le clone 18-3 est purifié comme décrit pour le clone 15 ci- dessus L'expression du clone 18-3 dans un \bactériophage et après insertion dans un vecteur de plasmide d'expression, est décrit dans les résultats ci-dessous. 1 Structure du clone C 15 génomique d'IFN-i 1. Ce clone de phage est isolé à partir d'une collection d'ADN humain qui a été partiellement digéré avec Eco RI et cloné dans les branches de X Charon 4 A Le clone s'hybride forte- ment en 2 essais différents d'IFN-3 1 AD Nc, préparés indépen- damment à partir de fractions de AR Nm de 2 souches de fi- broblastes humains La digestion de l'ADN de phage par Eco RI montre, en plus des deux branches X, quatre fragments de 12, 2,6, 1,84 et 0,6 kilobases (Fig 1 A) Le trans- fert sur nitrocellulose par le procédé de Southern ( 1975 J.Mol Biol 98, 503-517), et l'hybridation avec ADN de translation d'entaille, provenant du clone IFN-141 I-6-5 AD Nc, indique que le fragment 1,84 kb renferme le gène IFN A Ce fragment d'Eco RI est recloné dans le site Eco RI de p BR 322; l'analyse par restriction de ce sous-clone 1,84 kb avec Bgl II, Pvu II, Pst I, Hinc II et Taq I, et 1 ' hybridation avec des essais de longueur totale ou partielle de IFN-i 1 AD Nc, permettent de conclure que la séquence de codage pour la préprotéine de IFN-/1 (site Hinc II) com- mence à environ 35 Sucléotides à partir du site d'Eco RI (Fig 1 A) Les distances entre les différents sites de res- triction, dans l'ADN génomique,sont les mêmes que dans la séquence de AD Nc dans la limite de l'erreur expérimentale (Tableau 1) On n'observe aucun site de restriction inatten- du dans les limites de la région de codage de IFN-A 1, ce qui indique l'absence de toute séquence nette intermédiaire. Les digestes partiels d'Eco RI de ADN C 15 montrent que le fragment Eco RI 0,6 kb est situé entre les fragments 1,84 et 2,6 kb On trouve un site Bam HI en 2,6 kb, mais pas dans les autres fragments Eco RI de l'insert d'ADN humain. Le fragment Eco RI 1,84 kb, qui s'hybride à AD Nc d'IFN-3 1, se trouve sur un fragment Bam HI 9,6 kb d'ADN C 15 Comme indiqué sur la figure 1, ce fragment ne peut provenir que du site Bam HI de la branche droite > ( 5,1 kb de Eco RI), laissant 4,5 kb pour le segment Eco RI-Bam HI de l'insert humain, et montrant que le fragment 1,84 kb Eco RI doit ê- tre situé prés de la branche droite X L'orientation du gène (Fig 1 A) est déterminée comme suit Quand l'ADN C 15 est coupé avec Pvu II et s'hybride avec la longueur totale ou la demi-longueur en 3 ' de l'AD Nc d'IFN e 1, seul un fragment 0,66 kb s'hybridant avec l'extrémité 5 ' de IFN-/i I est trouvée Mais, lorsque la partie 1,84 kb Eco RI est coupée avec Pvu II, l'extrémité 5 ' de IFN 1 est sur un plus petit fragment 0,54 kb Comme aucun site Pvu II n'est constaté dans la partie 0,6 kb d'Eco RI de l'intercalaire humain, le fragment 0,66 kb-Pvu II doit terminer la branche droite' et, par suite, l'extrémité 5 ' de IFN-il, est la plus proche de la branche droite X La structure indiquée dans la figure 1 A est soutenue par plusieurs autres expé- riences de repérage par restriction, utilisant les diges- tions de Hind III, Sma I et Bgl II La séquence de codage de IFN /1 dans le clone C 15 est, en conséquence, interca- lée vers les nucléotides 1 775 à partir du fort initiateur PL qui contrôle la transcription vers la gauche (Williams et coll, 1980, Genetic Engineering Vol I Ipp 201-281, Plenum Corp) et en orientation convenable à gauche Cela, conjointement avec l'absence d'introns décelables, a in- cliné la demanderesse à chercher si l'interféron pouvait être produit dans E Coli contaminé avec le phage recombi- nant de C 15. 2 Récupération de l'activité biologique d'interféron à par- tir de lysats d'E Coli contaminés par le phage C 15 d'IFN-41 Des phages provenant du clone C 15 sont cultivés dans des cultures de 500 ml d'E Coli DP 50, comme décrit plus haut au chapitre des procédés 10 ml de lysat clarifié sont dialysés et chargés sur une petite colonne de Cibacron Blue Sepharose ( 0,3 ml) et les fractions sont essayées quant à leur pouvoir inhibiteur de l'effet cytopathe de VSV, avec comme référence un INF-/ étalon Au cours d'une expérimen- tation, dans laquelle le titre de phage dans le lysat est de 1,3 x 1010 phages/ml, le type d'activité de l'interféron représenté dans la figure 2 est observé On récupère, dans les fractions éluées à partir de la colonne par propylène glycol à 50 %-Na Cl 1 M, un total de 7 500 unités d'activité d'IFN Cela correspond à 0,75 x 106 unités/litre de lysat. Toutefois, dans ce lysat brut, l'activité mesurable est bien inférieure, ce qui suggère que dans ce lysat, quelque substance empêche un essai correct d'activité d'IFN Au cours d'une expérimentation de reconstruction, de l'IFN-/ humain normalisé est ajouté à un lysat de X Charon 4 A de type sauvage, et en effet l'activité mesurée ne représente qu'un dixième de l'apport Lorsqu'on fait passer ce mélange sur la colonne de Blue Sepharose, on récupère 75 % de l'ac- * tivité introduite Dans une opération de contrôle, on ana- lyse du lysat de phages \Charon 4 A de type sauvage (sans addition d'IFN), et on ne constate aucune activité IFN (figure 2). Le comportement chromatographique d'IFN provenant de lysats de clone C 15 peut varier Dans une expérimentation, au cours de laquelle le titre de phage est de 3 xl O 11 pfu/ml, 1 ' activité d'IFN est forte mais n'est pas retenue sur la co- lonnee Blue Sepharose Dans cette expérimentation, l'ac- tivité totale,récupérée à partir de la colonne, s'élève à 70-80 000 unités d'IFN, pour une introduction de 10 ml de lysat ( 7-8 x 106 unités/litre) Les fractions effluentes sont réadsorbées sur une seconde colonne de Blue Sepharose: cet- te fois l'activité est retenue sur la colonne, mais à nou- veau est éluée par rinçage de la colonne avec PBS IFN-I 1 humain doit être normalement élué du Blue Sepharose, seule- ment par des solvants hydrophobes (Knight et co LL 1980, Science 207, 525526) En conséquence, de l'IFN-/ humain normalisé est mélangé avec ce même lysat de phage et le tout est appliqué sur la colonne: 30 % de l'activité n'est pas retenue, et la récupération d'activité n'est que de 25 %. Cela suggère que des constituants de ce lysat déstabilisent probablement l'interaction de IFN-/, en particulier celle qui est produite par les bactéries, avec le Blue Sepharose. Même si l'interféron n'est pas retenue sur la colonne, plus de 90 % de protéine du lysat est enlevé des fractions acti- ves qui ont une activité spécifique de 4-5 x 105 U/ml de pro- téine Cette purification partielle est essentielle pour éliminer les produits chimiques qui dissimulent l'activité dans les lysats bruts Au cours d'une expérimentation, 1 ' activité d'IFN du clone C 15 est également récupérée après chromatographie du lysat sur carboxyméthylSepharose (non indiqué). 3 Propriétés de l'interféron produit dans E Coli conta- miné par le clone C 15 L'activité d'interféron, récupérée après le stade chroma- tographique, réduit l'incorporation de 3 H-uridine dans des cellules humaines contaminées avec VSV, traitées par Acti- nomycine D (Weissenbach, 1979, Eur J Biochem 98, 1-8) La courbe de titrage, obtenue pour l'IFN bactérien, est si- milaire à celle de l'IFN-/ humain normalisé (figure 3) A- fin d'essayer les propriétés immunologiques de l'IFN bacté- rien, on mélange le produit partiellement purifié avec du sérum de lapin anti-IFN-A (inactif sur IFN-O) ou avec du sérum de lapin non immune qui a été préalablement lié à protéine A-Sepharose Après centrifugation, on essaye 1 ' activité IFN de la partie surnageante: le sérum anti-IFN-A enlève toute l'activité de l'interféron, tandis que l'ac- tivité demeure lorsqu'on utilise le sérum non immune (fi- gure 3) L'IFN bactérien ( 20 U/ml) est semblablement neu- tralisé lorsqu'il est mélangé avec anti-IFN-A ( 20 U/ml) sur la culture cellulaire et essayé par inhibition de l'ef- fet cytopathe de VSV La spécificité d'espèce de l'inter- féron bactérien est essayée par comparaison de différents types de cellule Comme IFN-A humain, le produit d'E Coli contaminé par le clone C 15, présente moins de 10 % d'activi- té sur la cellule BSC-1 du rein de singe et les cellules MDBK de bovidé par comparaison aux cellules humaines Il n'y a pas d'activité antivirale décelable sur les cellules L ou A 9 de souris (tableau 2) Des résultats identiques sont obtenus avec 6 000 U/ml d'IFN bactérien produit par le clone C 15. La présente invention démontre, par conséquent, que le gè- ne IFN" 1, isolé directement à partir de fragments par- tiels d'Eco RI d'ADN génomique humain par clonage dans X Charon 4 A, peut être exprimé et conduit à l'accumulation de quantités importantes d'activité d'IFN dans les lysats de culture L'activité produite est manifestement de 1 ' interféron (e) de fibroblaste, comme l'indiquent ses pro- priétés immunologiques et sa spécificité d'espèce L'acti- vité n'est produite par la culture bactérienne qu'en répon- se à la contamination par le clone de phage IFN e 1 C 15. L'activité IFN produite par le clone 15 dans E Coli, res- semble à l'IFN-A humain dans ses propriétés chromatogra- phiques sur Cibacron Blue Sepharose Le stade chromatogra- phique est essentiel pour recouvrer une forte activité (jusqu'à 7 x 106 U/litre) à-partir du lysat bactérien Les interferons fournissent en conséquence les premiers exem- ples de protéines biologiquement actives à avoir été pro- duites par des bactéries sous la direction d'une partie d'ADN humain pris directement à partir du génome d'un in- dividu. 4 Clone 18-3 génomique d'IFN 4 j Ce clone est identitié par hybridation directe de courts oligonucléotides, synthétisés chimiquement pour être com- plémentaires de séquences dans IFN-0 A partir d'un total de O,5 x 106 génomiques, 16 clones s'avèrent positif dans l'hybridation Les fragments Eco RI s'hybridant avec les o- ligonucléotides sont séquences et l'on montre que le clone 18-3 comme dans la figure l B, contient un fragment 2 kb Eco RI 18-33 (intercalaire de la figure l B) dans lequel est si- tué le gène d'IFN Oc Ce gène est, nettement, la source du AR Nm qui donne naissance au clone d'IFN-" c rapporté par Goeddel et coll ( 1981, Nature 290, 20-25) Le clone 5-1 re- présente un fragment d'ADN qui s'imbrique avec un autre En- semble, le clone 5-1 et le clone 1 &-3-portent en plus de IFN- c' deux autres gènes d'IFN-Kdésignés par i-c 2 et _ 4 (figure l B). c Expression de fragment génomique d'IFN humain sous contrôle d'initiateur rec A. L'initiateur rec A est considéré commne l'un des initiateurs d'E Coli les plus forts Normalement, il est fortement freiné par le produit du lex gène, même lorsqu'il est pré- sent sur un plasmide de multicopie tel que p BR 322 Il est induit, en présence d'ADN endommagé, pour scinder son pro- pre frein, et il subit l'induction àae très forts niveaux (Sancar et Rupp, 1979, PNAS 76, 3144-3148) Les inducteurs habituels pour rec A sont l'acide nalidixique (qui bloque la synthèse de l'ADN) ou la mitomycine C (qui réticule l'ADN) - Un plasmide, p DR 1453, contenant le gène rec A clone, est utilisé pour isoler l'initiateur sur un fragment Taq I-Bam HI d'environ 1 kilobase Celui-ci est lié dans p BR 322 qui a été ouvert avec Cla I et Bam I pour édifier le plasmide RAP-1. La liaison Taq I-Cla I rétablit dans ce cas le site Cla I, ce qui permet l'ouverture du plasmide uniquement dans le troisième codon du gène de rec A RAP-2 est éditié par cou- pure de RAP-1 avec Eco RI et Cla I, garnissage aux extrêmi- tés adhérentes et reliaison, ce qui rétablit le site RI. Lorsque RAP-2 est ouvert au site RI, de l'ADN étranger peut être intercalé au troisième codon de la protéine rec A. Le vecteur RAP-1 est utilisé pour l'expression indirecte de l'activité interféron par des fragments génomiques de la "library" génomique humaine Le gène IFN-i 1 et plusieurs gènes isolés IFN- antiviral normalisé), lors de leur insertion dans ce plas- mide Les fragments RI d'ADN sur lesquels résident ces gènes (figures 1 A et l B) sont sous-clonés dans le site RI du plas- mide RAP-1 Ce plasmide est placé dans un hôte rec A+, les bactéries sont cultivées et induites avec de l'acide nalidi- xique, les cellules sont récoltées et lysées par du lysozyme plus propylène glycol à 30 %, et l'extrait est essayé pour son activité antivirale Le taux d'activité dépend nette- ment de l'induction par l'acide nalidixique, la valeur optimale étant à 50/4 g/ml D'une manière intéressante, dans certains cas, le fragment génomique produit de l'acti- vité dans deux orientations possibles relatives à l'initia- teur rec A Les gènes d'IFN-/ 1 et d'IFN-i qui montrent de l'activité sont tous situés sur des fragments Eco RI d'ADN de 1,8-2 kilobases, de telle sorte que la distance de l'i- nitiateur au codon de départ ATG du gène d'interféron est de l'ordre de plusieurs centaines de nucléotides. Ces expérimentations montrent que l'initiateur fonctionne comme prévu et elles permettent de déterminer rapidement ceux des gènes, de type interféron, de la "gene library", qui peuvent être actifs. 6 Forte expression de gène d'IFN 1 sous le contrôle d'un initiateur hybride tryp-lac Le plasmide PLJ 3 (Johnsrud, PNAS, 1978, 75, 5314-5318) renfer- me deux initiateurs lac, chacun long de 95 paires de base, séparées par 95 nucléotides non apparentés Ce fragment de 285 nucléotides est intercalé dans le site Eco RI du plas- mide PMB 9 Les séquences lac, longues de 95 kaires de base, renferment la séquence opératrice et initiatrice et s'arrê- tent juste avant l'ATG de la / -galactosidase Une séquence codant ADN avec un initiateur ATG, intercalée à distance convenable du site de liaison ribosomal du gène de ( -galac- tosidase, doit être correctement exprimée dans les cellules d'E Coli Le fragment Eco RI de 285 paires de base est re- cloné dans p BR 322 au site Eco RI; les recombinants sont es- sayés par culture des cellules sur des plaques renfermant /qg/ml X-gal et 15/ig/ml de tétracycline Seules les colo- nies bleu positif sont rassemblées et l'ADN est purifié par centrifugation de gradient de Cs Cl. Deux orientations d'initiateurs de lac sont escomptées: vers le gène d'ampicilline ou vers le gène de tétracycline de p BR 322 Comme seul le site d'Eco RI situé entre le site de liaison ribosomale de lac et la séquence de p BR 322 est très intéressant, ce site est protégé par liaison d'ARN polymérase avec ADN du plasmide, tandis que le site le plus éloigné est ouvert par Eco RI restriction, est chargé avec le fragment Klenow d'ADN polymérase et est relié A- près transformation de cellules MM 294 d'E Coli, les plasmi- des sont isolés et la distance entre le site Eco RI et le site Bam HI de p BR 322 est mesurée Les plasmides renfermant un fragment à 375 paires de base sont ceux dans lesquels les initiateurs de lac sont vers le gène tétracycline, tan- dis que ceux qui renferment un fragment de 670 paires de base ( 375 295 p b) ont les initiateurs de lac dirigés vers le gène d'ampicilline. A partir du sous-clone à 1,84 kb d'Eco RI du fragment géno- mique d'IFN ( 1, on coupe un fragment Hinc II-Bgl II renfer- mant la séquencqdu préinterféron La protéine mère d'IFN-1 i- renferme à son extrêmité terminale-NH 2, un méthionine qui peut être utilisé comme un codon initiateur dans E Coli. Il existe deux sites Alu I près de ce codon ATG, séparés par 13 nucléotides, l'un de ces sites se trouve 8 nucléotides avant ATG, tandis que l'autre se trouve 2 nucléotides après ATG Une digestion partielle d'Alu I est réalisée sur le frag- ment Hinc II-Bgl II et des fragments aux alentours de 510 pai- res de base sont isolés à partir de gels d'agarose Le vec- teur renfermant les initiateurs de lac vers le gène de té- tracycline est réduit avec Eco RI, le site est chargé de ADN polymérase et recoupé avec Bam HI Lors de la liaison des fragments Alu I-Bgl II au vecteur chargé en Eco RI-Bam HI, le site Eco RI est rétabli Pour pouvoir différencier parmi les clones renfermant le codon ATG (plus long de 13 nucléo- tides), les clones obtenus sont réduits avec Eco RI et Pstl; les clones renfermant les fragments souhaités à 151 paires de base sont séquencées Le site Eco RI est alors réouvert et la distance entre le site de liaison ribosomal et A Tg est raccourci par digestion de Bal 31, et reliaison Les cel- lules d'E Coli transformées par ces plasmides sont triés pour la production d'IFN /1. On constate qu'un clone, L-11, produit environ 3 x 10 o 6 U/li- tre d'IFN-f La région initiatrice de lac dans ce clone est coupée avec Hpa HI, c'est-à-dire 17-nucléotides avant le début de m ARN Pour couper le gène d'IFN-/1, on utilise l'enzyme Sai 3 a qui coupe l'ADN juste 3 nucléotides au-delà du codon de terminaison d'IFN I 1 Ce fragment Hpa IISau 3 a lac-IFN-p,1 est introduit entre les sites Cla I et Hind III d'un plasmide initiateur de tryp, préparé comme suit Un fragment Taq I-Taq I long de 180 nucléotides, provenant de -21 à -201 avant le début du m ARN de tryp, est coupé du plasmide de tryp p EP 121-221, et est cloné dans le site Cla I de p BR 322 On s'arrange pour que le fragment initiateur de tryp'soit orienté dans le sens des aiguilles d'une mon- tre Cette opération rétablit un site Cla I en position -21 de l'initiateur de tryp Apres liaison avec le fragment d'IFN-A 1-lac, i I y a formation d'un initiateur hybride tryp-lac avant le gène d'IFN-/11 Ce plasmide TL-11, est utilisé pour transformer E Coli MM 294 ou la souche minicel- lulaire d'E Coli p 679-54 Ces bactéries produisent 108 U/ litre d'IFN-A 1, sous culture en fermenteur, à un O D 650 de , ce qui démontre que le fragment d'ADN génomique d'IFN- f 1 est très actif (figure 4). Voir le tableau 1 à la page suivante. TABLEAU 1 Sites de restriction d'IFN-(&I AD Nc et gène Sites de restriction Taq I - Hinc II Hinc II Pvu II Pst I Pvu II l Pvu II Bgl II Bgl II Bgl II Distances Calculées partir des séquences de ADN-A * nucléotides entre les sites mesurées à ar- tir de ADN génomique ** nucléotides * D'après Taniguchi et al 1980 Gène 10 ( 11-15) ** Mesuré à partir de fragment 1,84 kb Eco RI Les sites Hinc II et Taq I pris en considération sont ceux qui sont les plus proches de l'extrêmité -5 ' du gène. TABLEAU 2: Spécificité d'espèce|l'lnterféron bactérien produit par le génomique C 15 d'IFN-,i 1 Source d'interféron Titre en Interféron, U/ml Cellu Cellu Cellu cellules les hu les de les bo de souris maines singe vines L A 9 F 511 BSC-1 MDBK 1 Cellules humaines F 511 2 E Coli contaminé par clone C 15 1,000 32 32 32 32 L'IFN bactérien est utilisé après chromatographie du lysat de C 15 sur Cibacron Blue-Sepharose comme dans la Figure 2. TABLEAU 3 Activités d'IFN-Ket -produites par des fragments génomiques dans rec A plasmide RAP-1 Conditions Activité d'IFN U/ml RAP-1 ( 1833)-IFN-c + acide nalidi- xique RAP-1 ( 1833)-IFN-" Kc acide nalidi- xique RAP-1 ( 631)-IFN-A 1 Clone RAP-1 orientation oppo- sée ( 1833) renferme le fragment Eco RI avec le gène d'IFN-ic (Fig 1 B). c Clone RAP-1 ( 631) renferme le fragment Eco RI avec le gène d'IFN 1 (Fig 1 A) - Les fragments sont intercalés au commencement du gène de rec A L'orientation est donnée en conformité avec celle de l'initiateur de rec A. Clone Exp. 1. - LEGENDES DES DESSINS ANNEXES Figure 1 A:Structure schématique d'ADN clone C 15 d'IFN-e 1 (a) diagramme schématique de "Charon 4 A Les deux branches sont indiquées en ligne pleine. (b) structure de l'intercalaire d'ADN humain dans le clone C 15; la surface noircie montre le frag- ment Eco RI qui s'hybride avec AD Nc de IFN-1. (c) agrandissement du fragment noirci provenant de (b?, indiqué sous forme d'une ligne double La ligne simple est une partie de la branche \ droite PL est l'initiateur > vers la gauche. (d) position du m ARN d'IFN 1 ' L'échelle supérieure correspond à (a) et (b) et l'échelle inférieure à (c) et (d) Pour le détail voir le texte. Figure l B: Structure schématique du clone 18-3 d'IFN ac Elle représente le diagramme de réduction des in- serts des deux clones de >Charon 4 A Le gène d'IFN* autres gènes d'IFN- Les inserts montrent le fragment 18-33 d'Eco RI 2 kb, qui renferme les gènes d'IFN cloné dans le plasmide rec A, comme expliqué dans le texte Les symboles pour les sites d'enzyme de réduction sont indiqués. Figure 2: Essai d'interféron, produit par clone génomique C 15 d'IFN 1, sur Blue Sepharose Du lysat brut d'E Coli DP 50 contaminé par le pha- ge C 15, est fractionné comme décrit plus haut dans la partie concernant procédés et substances, et l'activité d'IFN est essayée sur chaque fraction (e) La concentration en protéine est mesurée dans les mêmes fractions () Une chromatogra- phie parallèle et un essai du lysat provenant du phage N Charon 4 A, sont également représentés ( Q). : Titrage d'interféron de clone génomique C 15 d'IFN 1 Une fraction d'IFN de phage C 15 provenant de la colonne de la figure 2 (environ 10 U/ml), est diluée au 1/40 ème puis est diluée en série dans la microplaque en vue de l'essai d'IFN par di- lution de synthèse de VSV RNA (o o) 25 U/ml d'interféron de fibroblaste humain normalisé sont essayées en parallèle ( À) Des témoins sans VSV (C) et avec VSV sans IFN (V) sont re- présentés Les 2 colonnes à droite montrent l'ac- tivité résiduaire de l'IFN du phage C 15 (à dilu- tion finale de 1/40 ème) après adsorption sur de l'anti-IFN-f ou de l'Ig G non immune, comme dé- crit plus haut dans le paragraphe concernant les procédés. : Culture et production d'IFN dans E Coli ren- fermant du plasmide TL 11 Le plasmide-TL 11 renferme un initiateur hybride tryp-lac et la séquence de codage pour IFN- 1 humain mûr, provenant du fragment génomique hu- main comme décrit dans le texte Des cultures bactériennes sont -réalisées dans un fermenteur de New Brunswich de 1 litre, et aux temps indi- qués, les bactéries sont lysées par du lysozyme additionné de propylène glycol, et l'activité d' IFN est essayée sur des cellules humaines atta- quées par VSV Cette activité est calculée par ml de culture bactérienne - Figure 3 Figure 4 Revendications 1 Procédé de production d'interféron humain de ty- pes fibroblaste ( étant de type \>. 3 Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce que le phage est du \ Charon 4 A donnant un clone désigné par C 15. 4 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'interféron produit étant de type ce que le phage est le X Charon 4 A donnant le clone 18-3. 6 Procédé suivant une des revendications 1 à 5, dans lequel la bactérie infectée est l'E Coli. 7 Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le phage étant >-Charon 4 A, la bactérie infectée est l E Coli DP-50. 8 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'un fragment d'ADN génomique, humain, est récupéré du phage, qu'il est introduit dans un vecteur d'expression d' un plasmide d'une bactérie appropriée, qui est ensuite cul- tivée pour la production de l'interféron. 9 Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'ADN est introduit dans leplasmide muni d'un fort promoteur. * 1 Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le plasmide utilisé est le p BR 322, tandis que le gène introduit est le IFN-i ou le IFN c. 11 Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que le plasmide p BR 322 contient le promoteur rec A de l'E Coli. 12 Procédé suivant la revendication 8, ou 10, carac- térisé en ce que le fragment d'ADN génomique, humain, con- tenant le gène IFN-1 ou -ô, est supprimé du phage ou du plasmide, coupé en codon pour le premier groupe méthionine de l'IFN mûr, lié au site d'attache ribosomal du promoteur lac d'E Coli, modifié de façon à contenir le site d'at- tache polymérase de l'ARN du promoteur à tryptophane, don- nant un promoteur tryp-lac hybride, et que le plasmide est réintroduit dans la bactérie qui est ensuite cultivée pour liproduction d'interféron. 2 Q w