Brevet FR2504552A1 — publié le 19821029

Les conoentrations élevées d'ATP d'origines autres que microbiennes dans l'urine, le lait et des produits à base de viande, rendent l'emploi du procédé rapide de la détermination rapide de bactéries par l'ATP difficile ou impossible, malgré le fait que les d'origine non microbienne a été éliminé soit par hydrolyse avec l'enzyme apyrase de la parme de terre (une enzyme ATP-ase fonction des ions Ca++), par voie de filtration ou de centrifugation.Même une fraction peu importante résiduel le du pourcentage de 1'ATP non bactérienne dans l'échantillon après l'extraction de 1'AIP d'origine bactérienne, peut être à l'origine d'impor- tantes erreurs dans le captage des bactéries dans les cas cd celui-ci est basé sur la mesure de 1'ATP bactérien.En outre, il n'a pas été possible de différencier et de mettre en évidence des microbes spécifiques car le procédé par 1'ATE décele tout 1'ATP, quelle que soit l'espce présente dans les échantillons. Les cellules microbiennes inactives au point de vue du métabolisme présentent une faible teneur en ATP et, sauf dans le cas où les cellules sont activées, la sensibilité et la précision de ce procédé sont insuffisantes. La présente invention remédie à cette limitation de la sensibilité, de la précision et au rapport défavorable entre les ATP d'origine microbienne et non microbienne. Le but visé par l'invention est atteint par une incubation de courte durée de l'échantillon avec un milieu nutritif spécifique, qui peut être solide ou liquide. Un autre avantage de la présente invention est de permettre que l'incubation et la mesure s'effectuent dans la merle cuvette, ce qui élimine les erreurs éventuelles faites par l'emploi d'une pipette et par le transfert de l'échantillon. Si des milieux spécifiques sont employés qui favorisent la croissance d'un certain type ou espèce de microbe, le procédé peut être utilisé pour l'identification de tels microbes.Le ricitre réduit de manipulations permet également l'automatisation de cette technique. Le principe du procédé est illustré par l'exemple suivant On introduit un petit échantillon microbien de 10 à 1 000 1, de préférence de 10 à 100 1 dans un milieu nutritif exempt d'ATP qui peut être un milieu nutritif universel, un milieu nutritif sélectif ou un milieu nutritif spécifique contenant des substances nutritives spécifiques, des substrats, des enzymes ou des inhibiteurs de croissance à l'égard de microbes spécifiques, des substances surfactives ou d'autres substances pour lyser ou pour tuer des cellules microbiennes et non microbiennes sélectionnées, ou pour rendre la paroi et la membrane de la cellule perméables à 1'ATP, et à d'autres produits de métabolisation de microbes ou de cellules non microbiennes sélectionnées.Le milieu peut également contenir une quantité contrôlée d'enzyme ATP-ase, telle que l'apyrase de la mne de terre, prise entre 0,001 et 0,5 unité, mais de préférence entre 0,01 et 0,1 unité par milimmètre pour hydrolyser 1'ATP non microbien pendant l'incubation. Le dosage de 1'ATP microbien extrait peut être effectué sans l'inactivation de l'enzyme ATP-ase, car l'activité de celle-ci est tellement faible qu'elle permet l'extraction et le dosage d'ATP microbien à condition que celui-ci soit dosé moins d'une minute après l'extraction, et de préférence après un intervalle constant apres l'extraction.Le volume de milieu nutritif peut varier entre 10 et 1 000 1, mais est compris de préférence entre 25 et 200 1, dans une cuvette transparente stérile en matière plastique ou en verre, d'un diamètre canaris entre 5 et 30 mm, mais de préférence entre 6 et 15 mm. Le milieu nutritif peut aussi être appliqué sur une membrane filtrante contenant l'échantillon microbien. Selon ce procédé la membrane filtrante est placée le bon côté tourné vers le haut, dans un récipient à fond plat stérile, par exemple une boite de Petri. On incube les échantillons pendant une période de 0,2 à 16 h pour les bactéries et des levures et de 0,5 à 5 jours pour des champignons et des mycobactéries. Après la période d'incubation, on extrait 1'AIP en traitant l'échantillon incubé avec 10 à 1 000 1 de NRB (réactif pour la libération de nucléotides), une solution aqueuse à une concentration comprise entre 0,05 et 2 % d'un mélange d'agents surfactifs ioniques d'amines éthoxylées et de sels quater naires d'amines éthoxylés, (NRB est une marque déposée par la société LUE SYSTEMS AG à Balle, Suisse) ou par des acides ou bases minéraux ou par toute autre substance susceptible d'extraire 1'ATP de cellules microbiennes sans dilution excessive de l'échantillon ou introduction de substances inhibitrices de la réaction luciférine du ver luisant-luciférase. Dans le cas où l'on emploie des acides ou des bases pour l'extraction d'ATP la concentration des ions d'hydrogène doit être portée à un peu compris entre 6,5 et 8,5, mais de préférence au pH 7,75 avant le dosage de 1'ATP avec le réactif luciférine-luciférase. Après l'extraction de 1'MCP des cellules microbiennes on place l'échantillon dans un photomètre à luminescence. Avant le dosage de l'échantillon on mélange celui-ci avec 10 à 1 000 1, de préférence avec 50 à 200 1 de réactif luciférineluciférase dans un tampon biochimique (par exemple du tris ou les tampons dits "de Good", HEPES, vMOPS, TES etc...) dont la teneur molaire est comprise entre 0,01 et 0,1, contenant 0,005 à 0,05 mole d'ion Mg++ et 0,001 à 0,010 mole d'agent chélateur tel que l'EDIA, 0,01 à 1 g/ml de luciférase et de 1 à 100 g/ml de luciférine. L'addition à l'échantillon et le mélange avec celui-ci peuvent être effectués avant de placer la fiole dans le photomètre, mais on les effectue de préférence dans l'instrument même. L'intensité de la lumière produite est directement proportionnelle à la concentration de 1'ATP dans l'échantillon. L'émission de lumière peut être mesurée sous la forme d'un signal continu (ou valeur proportionnelle) intégré sur une période prédéterminée, ou bien sous la forme d'une valeur de pointe (maximum). Les principes de la présente te invention seront décrits plus en détail sous la forme de différentes applications dans les exemples non limitatifs ci-après. de de réalisation 1 . Détermination d'un faible nombre de microbes La sensibilité de la mesure de 1'ATP par voie de biolumines- cence dépend de la sensibilité du photomètre et de la réactivité des agents employés. Jusqu'à une époque récente, les produits commerciaux permettaient la détermination de 100 000 cellules/cm ou de 0,1 ng/cm3 d'ATP. Le procédé lui-même est beaucoup plus sensible et au moyen d'un instrument récemment introduit sur le inarché (commercialisé sous la marque "Lumacounter" par la société LUMAC SYSTEMS AG à Bâle) et de réactifs à base de luciférine du ver luisant-luciférase (commercialisés sous la marque "Lumit" par la société LUMAC SYSTEMS AG à Bâle), il est possible d'abaisser le seuil de dosage à 0,1 pg d'AIP, ou à environ 100 bactéries dans un échantillon de 10 à 500 1. Toutefois, à cause de l'auto-absorption de lumière émise et de la présence de substances inhibitrices (extincteurs chimiques) la sensibilité pratique se situe dans la pratique à environ 1 000 à 5 000 cellules bactériennes par ml. Afin de pouvoir déterminer la qualité hygiénique de l'eau, de produits pharmaceutiques et de produits stérilisés, il devrait être possible d'abaisser le seuil de mesure jusqu a une seule cellule bactérienne. La culture des cellules microbiennes (bactéries, levures, cham- pignons, humeurs et moisissures) dans un milieu nutritif a été pratiquée depuis le debut de la bactériologie, et est la méthode la plus universelle rirent employée pour la multiplication de cellules microbiennes. La technique la plus répandue est de préparer une série de dilutions d'un echantillon liquide et d'inoculer avec celles-ci des boItes de Petri contenant de l'agar-agar nutritif solide. Après une période d'incubation de 16 à 72 h pour des bactéries et de 1 à 40 jours pour la levure et les champignons à une température entre 37 et 56 C, le nombre de colonies qui s'est développé sur l'agar-agar est compté visuellement. Les résultats sont exprimes en "unités formatrices de colonies" (CFU) pour les bactéries et la levure et en "hyphi" pour les chanpiqnons. Les CFTJ n'indiquent pas le nombre de cellules microbiennes, contrairement à ce qui est genéralement supposé, mais plat le nombre de groupes de bacteries agglanerees capables de se multiplier. Habituellement chaque colonie se forme à partir d'un groupe de 1 à 50 cel- lules ; ainsi le nombre total des cellules dans un échantillon original est beaucoup plus élevé que le nombre des CFU. La détermination de cellules microbiennes au moyen de l'essai de luminescence de 1'ATP est employée canne procédé rapide pour la détermination quantitative des microbes. Cette méthode est bien connue en soi (cf brevet américain n 3 475 090). Avec des réactifs luciférine-luciférase purifiés et les photanètres à luminescence sensibles actuellement disponibles sur le marché, il est possible de ccnpter jusqu'à 1 000 bactéries par ml. Pour la détermination d'un faible nature de cellules microbiennes dans des échantillons d'eau (eau de surface, eau de procédé ou eau potable) l'essai de bioluminescence de 1'ATP peut conduire à une sousestimation importante des cellules microbiennes viables, en raison du fait que les microbes dans l'eau sont dans un état de sous-alimentation et leur teneur en ATP par cellule est inférieure à celle des cellules en croissance active. Des cellules microbiennes à l'état sous-alimenté présentent une teneur en ATP inferieure à 10 % de la teneur des cellules à métabolisme actif. Dans un milieu nutritif approprié, le métabolisme des cellules microbiennes est activé en un intervalle de 5 à 10 nn.Selon la présente invention on applique une période d'incubation emprise entre 10 et 20 mn pour améliorer la précision et la sensibilité de la détermination des échantillons de microbes dont les cellules sont sous-alimentées ou autre- ment inactivées, bien que viables. La procédure suivante est mise en oeuvre On filtre un échantillon d'eau de 500 ml à travers une membrane filtrante de 2 m en appliquant un vide poussé (660 à 800 mbar). Pendant la filtration le filtre ne doit pas être asséché pour éviter d'exercer une contrainte sur les microbes. Le filtre est placé dans un récipient à fond plat, tel qu'une boite de Petri.On porte avec une pipette un faible volume (0,1 à 1 ml) d'une bouillie nutritive exempte d'ASP sur le filtre et on laisse le filtre pendant 10 à 20 mn à la température ambiante. Pendant cette période d'incubation les cellules se remettent des contraintes subies pendant la filtration et leur métabolisme s 'active, mais les cellules ne se multiplient pas. Après la période d'incubation l'ATP est extrait des cellules microbiennes en ajoutant de 0,1 à 1 ml d'un acide minéral (sulfurique, trichloracétique, perchlorique) ou d'une base (hydroxyde de sodium ou de potassium) dont la teneur molaire est comprise entre 1 et 5 ou de préférence, un mélange d'agents surfactifs ioniques sous la forme d'une solution aqueuse ayant une concentration comprise entre 0,1 et 0,5 % d'une amine éthoxylée et d'une amine éthoxylée quaternaire (réactif pour la libération de nucléotides, "NRB", de la société LUMAC SYSTEMS AG à Bâle, Suisse). Après avoir mélangé l'agent d'extraction et l'échantillon, une portion de 0,1 mi est introduite avec une pipette dans une cuvette transparente. Un réactif luciférine de ver luisant - luciférase (0,1 à 1 ml) carprenant entre 0,01 et 1 g de luciférase, entre 1 et 10ytg g de luci- férine, entre 10 et 200 g/ml de dithiothréitol, entre 0,1 et 10 mg/ml d'albumine de sérum bovin, entre 5 et 50 mmole d'ions de magnésium dans un tampon biochimique tel que le tris, l'HEPES, le .KPS ou le TES, à un pH compris entre 6,5 et 8,5, est ajouté à l'échantillon et on mesure l'émis- sion de lumière de l'échantillon dans un photomètre susceptible de détecter des photos à des longueurs d'onde comprises entre 400 et 650 nm. La quantité d'ATP dans l'échantillon est déterminée par cagaraison du résultat relevé à ceux obtenus par le dosage d'étalons d'ATP. Le narre de bacteries est calculé par division de la teneur en ATP de l'éthantillon par un femtogramme (10 15g), c'est-à-dine le poids de 1'ATP dans une cellule bactérienne. Dans les cas ou le nombre des cellules microbiennes est si faible qu'il ne peut pas être mesuré directement par le procédé de l'ATP, il est possible d'inoculer un faible volume d'un milieu de culture liquide ou solide (10 à 1 000jZ 1) dans une cuvette transparente en verre ou en matière plastique. L'échantillon est alors incubé avec ou sans agitation à une température comprise entre 20 et 560 C, en fonction du type de microbes à mettre en évidence. Le temps de formation des bactéries varie habituellement entre 15 et 60 mn en fonction de la tewerature d'incubation et de l'espèce. Le temps typique pour la formation de bactéries est de 20 mn a 370 C. Pour la levure et en particulier pour les champignons, le temps de duplica- tion des cellules ou de la bianasse est plus long, et peut atteindre plusieurs heures. Avant que les microbes commencent leur développement dans un milieu nouveau (après inoculation) il y a un intervalle de tenps sans aucune croissance. Cet intervalle est appelé la phase de latence. La durée de cette phase dépend de l'organisme, du milieu et de la température. Pour beaucoup de bactéries la durée de la phase de latence est comprise entre 20 et 30 mn à 370C. Pour une phase de latence de 20 mu et un temps de formation de 20 mn, une pwulation de bactéries se multiplie selon le schema suivant Temps d'incubation Facteur de multiplication en minutes pour la population originale 20 1 40 2 60 4 80 8 100 16 120 32 140 64 160 128 180 256 200 512 220 1 024 240 2 048 Après l'établissement de la courbe de croissance pour un échan- tillon d'un type particulier, il est possible de trouver par extrapolation à partir d'un ou de deux dosages d'MP dans l'échantillon après un certain tenps d'incubation la quantité originale des microbes dans l'échantillon. Exemple : Détemination d'escherichia coli 1 . On prépare un milieu solide (agar-agar nutritif) ou liquide (bouillie nutritive) strictement exempt d'ATP. 2 . Avec une pipette on introduit chaque fois 100y1 du milieu dans le nombre requis de cuvettes en verre ou en matière plastique utilisées dans le photomètre a luminescence, puis on les stérilise. 3 . Avec une pipette on introduit 10 à 50 1 de l'échantillon dans deux ou trois cuvettes répliques, celles-ci sont secouées pour repartir l'échantillon sur le milieu solide ou pour mélanger l'échantillon avec le milieu liquide. 4 . On place les cuvettes dans un incubateur dans lequel l'in- cubation se déroule à une température de 370 C, de préférence avec agitation continue. 5 . Après deux heures on enlève les cuvettes de l'incubateur et on les refroidit jusqu'à la température arrbiante. 6 . La quantité d'XrP est dosée de la façon suivante - on introduit avec une pipette dans la cuvette 100 1 d'agent de libération de nucléotides pour cellules microbiennes (NRB) et on mélange en agitant manuellement. En 15 sec l'ATP est libéré des cellules. - on place la cuvette dans la chambre de comtage du photanètre à luminescence et on ferme celle-ci de manière étanche à la lumière. - on ajoute 50 à 200 1 de réactif luciférine de ver luisant-luciférase à l'échantillon. On mesure l'intensité lumineuse de la bioluminescence soit comme valeur de pointe soit carne une valeur intégrée sur une période prédéterminée de 5 à 60 s. - les nabres d'unités de luminosité relative (RLU) relevés sont convertis en concentrations d'ATP ou en norrbre de cellules d'E. coli à l'aide du standard international, c'est-à-dire on capte un femtogramme (10-15g) $d'ATP par cellule. - le nanbre de cellules d'E. coli dans l'échantillon primitif est calculé de la façon suivante nombre mesuré narbre de cellules = 2X temps d'incubation - durée de la phase de latence où x = temps de formation Les paramètres suivants sont obtenus par voie expérimentale (cf la fig. 1A représentant la croissance d'E. coli dans 100 1 de bouillie nutritive, la durée de la phase de latence étant 30 mn, et aussi la fig. 1B représentant la croissance des bactéries E. coli sur 100 1 d'agar- agar nutritif solide dans une cuvette de verre mesurant 12 x 47 inm, à une température de 370 C. La durée de la phase de latence est également 30 nin. L'ordonnée dans les deux figures représente la quantité d'ATP en nanogram- mes (unités lumineuses) et l'abscisse le temps d'incubation (mn) Phase de latence = 30 rtn Temps de formation = 20 mn Nombre de ellules après 130 mn d'incubation : 352 000 352 000 352 000 Nombre de cellules = = 130 - 30 25 (=32) 20 2 (Dans l'expression ci-dessus x = 5 et 2X = 32). r/bde de réalisation 2 . Détermination du nombre de microbes dans des liquides physiologiques et dans des échantillons de produits alimentaires. Le noetre de bactéries dans des liquides physiologiques et des produits alimentaires est déterminé pour contrôler la propreté des aliments et pour déceler des infections microbiennes des liquides physiologiques. Normalement ces contrôles sont réalisés en faisant des cultures sur un milieu solide d'agar-agar. La méthode est manuelle ou semi-mécanisée et requiert un temps c.'incubation de 24 h. Le nombre de CPU est pris canne critère. Ce nombre n'est pas une incication précise de la contamination bactérienne des échantillons car ces types d'échantillons ne sont pas homo- gènes.Des bactéries adhérent aux particules et forment des conglomérats et des agglcmérations. Chacune de ces agglomérations ne formera qu'une seule colonie ; ainsi le nombre des CFU conduit à capter un nombre de bactéries moins élevé dans l'échantillon qu'il s'y trouve réellement. Pour cette raison, la méthode conventionnelle est à la fois lente, peu cannode et imprécise. Lorsqu'il s'agit d'un échantillon d'un aliment (lait, viande etc...) le produit sera peut-être déjà vendu pour la con somation avant que le résultat des essais soit connu, et dans le cas de la microbiologie idddioele un délai de 24 h peut être fatal pour le malade. La mise en évidence de l'ATP par bioluminescence du ver luisant a été appliquée à la détermination de bactéries dans l'urine (brevet américain n 3 745 090) et dans des produits alimentaires (cf Sharpe, A.N., M. N. woodrow and A.K. Jackson, Adenosine triphosphate levels in foods contamined by bacteria. J.Appl.Bacteriol 33 : : 758-67, 1970) mais dans ces deux applications la teneur élevée en ATP non microbien provenant de cellules sanguines, de l'épithélium et de muscles forme un obstacle. I1 est possible de traiter des cellules non microbiennes avec un agent surfactif tel que le Triton X-100 (brevets américains n 3 745 090 et4 014 745) effectuant la lyse de cellules non bactériennes, et d'ajouter ensuite de 1 'apyrase de la pare de terre à l'échantillon pour hydrolyser l'ATP non bactérien extrait pendant une courte incubation (5 à 20 mn) à une teppé- rature entre 20 et 500 C (cf brevet americain n 3 745 090).Ce traitement paraît laisser une faible proportion d'ATP non microbien qui n'est pas atteinte, probablement grâce à son association aux membranes cellulaires. Lorsque 1'ATP microbien est extrait ultérieurement par des acides minéraux (sulfurique, trichloracétique, perchlorique) ou par le tampon tris-EDTA bouillant, une partie de cet ATP non microbien est également extrait, en seule avec 1'ATP microbien. Cet ATP non microbien non détruit est un facteur d'erreur potentiel pendant la détermination de bactéries dans les liquides physiologiques et rend l'application de cette méthode rapide pour la mise en évidence de bactéries difficile dans des aliments. Afin de surinonter ces problèmes posés par 1'ATP non microbien résiduel et par la limitation de la sensibilité, on a développe un procédé dans lequel on hydrolyse 1'ATP non microbien par les enzymes mêmes des cellules non microbiennes, ou bien en présence d'une enzyme ARP-ase à faible activité (0,01 à 0,1 unité par ml), et le nombre de microbes dans l'échan- tillon est multiplié simultanément pendant une courte incubation d'une durée comprise entre 0,5 et 5 h pour des bactéries et des levures et entre 1 et 5 jours pour des champignons. Normalement une incubation d'une ou deux heures suffit pour des bactéries.Cette incubation est conduite directement dans la cuvette dans laquelle on dose 1'ATP microbien. Les cuvettes peuvent être préparées et assemblées en paquets. Elles prennent moins de place que les tubes de culture conventionnels ou les boltes de Petri. Avec un milieu solide il est mire possible de les employer sur le terrain. L'errploi d'une même cuvette pour l'incubation et pour le dosage permet une autanatisation facile de ce procédé. L'exerrple ci-aorès se réfère à l'enploi de ce procédé pour la détermination de bactéries dans le lait. Elimination d 'AfP non bactérien et détermination de bactéries dans le lait à l'aide de la mise en évidence de l'ATP car bioluminescence. - on introduit avec une pipette une quantité entre 50 et 200 1, de préférence 100 1, d'une bouillie nutritive stérilisée exenpte d'AfP comprenant entre 50 et 2û0t1 d'une solution aqueuse ayant une concentration comprise entre 0,02 et 0,5 % d'un agent surfactif non ionique, tel qu'un alkylphénol éthoxylé, par exemple le réactif pour la libération de nucléotides de cellules somatiques ("NRS" de la société LUMAC SYSTEMS à Bâle, Suisse) contenant entre 0,001 et 0,2 unités d'enzyme ATT-ase par mi, dans le ncrrbre requis de cuvettes transparentes en verre ou en matière plastique stérilisée. - on introduit avec une pipette des échantillons de lait d'un volurr. entre 10 et mais de préférence entre 10 et 100 1, bien agités, dans les cuvettes et on mélange. Le N dans le milieu rend les membranes cellulaires des leucocytes et des cellules d'épithélium perméables à 1'ATP et cet ATP non microbien sera hydrolysé par les enzymes des cellules non microbiennes et par l'enzyme ATP-ase ajoutée - l'échantillon est incubé pendant 60 à 120 mn à 280 C avec ou sans agitation - on retire les cuvettes de l'incubateur, on ajoute encore 50 à 300 1 de NRB et on mélange. Le NRB libère 1'ATP des bactéries en 10 à 20 s. - la cuvette est placée dans le photomètre à luminescence et l'ATP est dosé à l'aide de la réaction lucicérine de ver luisant-luciférase - le nombre de bactéries est calculé par division de la con- centration d'ATP mesurée par un futogramne (10-15g) représentant la teneur en ATP d'une seule bactérie.Le nombre de bactéries dans l'échantillon original est calculé comme indiqué ci-dessus à l'aide de l'expression naibre de cellules mesuré nombre de cellules = 2X temps d'incubation - phase de latence où X = temps de formation Les courbes de la fig. 2 montrent l'abaissement de 1'ATP non bactérien et l'augmentation de 1'ATP bactérien au cours de l'incubation selon la procédure ci-dessus décrite. De la façon décrite ci-dessus 1'ATP non bactérien est éliminé de l'échantillon jusqu'à environ 0,5 % de sa teneur originale et la teneur en ATP bactérien est miltiplié par huit en 120 mn. Cela signifierait que dans le lait normal la contribution de l'ATP non microbien résiduel est inférieure à 5 % de celle de 1'ATP bactérien. Cette quantité peut être soustraite et la teneur réelle en ATP non microbien, peut être mesurée canne suit - après l'incubation (voir ci-dessus) on ajoute entre 50 et 200 y 1, mais de préférence 100 1 de réactif luciférine de ver luisantluciférase à l'échantillon et on mesure la concentration de 1 'AT? non microbien. On ajoute à l'échantillon 200 1 de NRB et on mesure la teneur totale en ATP. - la soustraction de 1'ATP non microbien au total donne 1'ATP bactérien. Mode de réalisation 3 . identification de microbes à l'aide d'un milieu de culture spécifique et dosage de 1'ATP par bio-luminesoence. I1 est connu d'employer des milieux spécifiques pour la culture de certaines espèces de bactéries. On procède ainsi pour 1 'identifica- tion de bactéries en inoculant une espèce inconnue sur des milieux différents qui contiennent une substance spécifique, telles que sucres, amino- acides, vitamines, sels, inhibiteurs de croissance, antibiotiques, etc..., nécessaires à la croissance sélective d'une espèce spécifique de bactérie. Après une période d'incubation de 16 à 72 h, il est possible de vérifier visuellement une éventuelle croissance de l'espèce sur le milieu. En com- parant les résultats de croissance positifs et négatifs il est possible d'identifier l'espèce. Pour certains types ou espèces de bactéries il y a également des milieux sélectifs sur lesquels aucune autre espèce ne se développe, ou seulement lentement, tel que le milieu de Mc Conkey pour les bactéries coliformes. Ces procédés ne donnent actuellement des résultats qu'au bout de 1 à 3 jours.Ce délai peut être substantiellement réduit au moyen de la procédure suivante - des volumes de 10 à 200A1, de préférence 100A 1, de milieux aseptiques contenant des substances spécifiques pour l'identification biochimique de microbes spécifiques sont placés dans des cuvettes stérilisées transparentes en matière plastique ou en verre. - avec une pipette on introduit un volume compris entre 5 et 200/6 1, de préférence entre 10 et 50 1 d'une suspension d'un microbe inconnu isolé dans un narbre carpris entre 2 et 20 de cuvettes contenant des milieux de culture différents, solides ou liquides, et on mélange, chaque milieu de culture étant spécifique pour une certaine espèce de microbes. - la concentration initiale d'ATP dans la suspension microbienne est dosée à l'aide du système luciférine-luciférase dans un pnoto- mètre avec 50 à 209 1 de NRB ooerre agent d'extraction. - les cuvettes contenant ces échantillons sont incubées pendant 2 à 16 h à une température appropriée entre 20 et 560 C - après l'incubation, llATP est dosé en ajoutant avec une pipette 50 à 200 1 de NRB pour l'extraction d'ATP provenant de cellules microbiennes, on place une portion i 50 à 200 1 de l'échantillon dans une cuvette dans le photomètre, à laquelle on ajoute 100 à 200/fl de réac- tif luciférine-luciférase. - l'augmentation d'ZP par comparaison à la valeur initiale, rentre la croissance du microbe dans le milieu tandis qu'une teneur stable ou diminuant d'ATP indique une croissance negative. - en tenant carpte de la croissance, du taux de croissance ou de croissance négative, il est possible d'identifier le type ou l'espèce du microbe. La technique qui consiste à employer un milieu de culture, à effectuer l'incubation dans la cuvette de mesure et à traiter l'échantillon avec d'autres réactifs tels que le NRS et le NRB, simplifient la mise en évidence de 1'ATP microbien et permet 1 . d'augmenter la sensibilité du procédé 2 . d'éliminer ou de réduire l'erreur occasionnée par la présence d'ATP non microbien 3 . d'identifier rapidement des bactéries nécessitant des milieux spécifiques et sélectifs. Mode de réalisation 4 . Contrôle de l'absence de germes Les aliments, certains produits médicaux et autres devant etre exempts de germes, peuvent etre contrôlés à l'aide du dosage de l'ATP par bioluminescence. Les échantillons solides peuvent être hanogé- néisés et dosés après une incubation pendant 4 à 16 h en présence de NRS (et d'enzyme ATP-ase dans le cas où de l'ATP non microbien est présent). Les échantillons liquides peuvent être filtrés à travers une membrane filtrante dont les pores ont une dimension comprise entre 0,2 et 0,45 m. Le filtre est incubé dans une bouillie nutritive exempte d'ATP pendant 4 à 8 h, ce après quoi 1'ATP est extrait et dosé cas dans le mode de réalisation 1. Si l'échantillon est aseptique il n'y a pas d'ATP microbien et si l'échantillon contient des microbes, de l'AT? microbien est mis en évidence après l'incubation. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour augmenter la sensibilité de la détermination quantitative du nombre de cellules microbiennes par mise en évidence au moyen d'ATP, caractérisé en ce que l'on traite un échantillon contenant de telles cellules avec un milieu nutritif sélectionné pour favoriser la croissance de l'espèce particulière du microbe à déterminer, on incube l'échantillon ainsi un temps traité dans des conditions favorisant la croissance et pendangsuffisamment long pourqu'après la phase de latence, nécessaire à l'adaptation des microbes au milieu nutritif, ceux-ci forment de nouvelles générations de cellules, on continue le traitement de l'échantillon incubé avec un agent pour l'extraction d'ATP microbien des cellules microbiennes, on dose, par voie de bioluminescence, la concentration d'ATP ainsi libéré, et on calcule à partir de cette concentration le nombre de cellules microbiennes dans l'échantillon. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le temps d'incubation de l'échantillon traité est compris entre 10 et 20 mn, afin d'activer le métabolisme des cellules microbiennes. 3 - Procédé selon la revendication I pour déterminer quantitativement un nombre de cellules microbiennes particulièrement faible dans un échantillon, caractérisé en ce que le temps d'incubation est compris entre 2 et 16 heures lorsqu'il s'agit de bactéries et de levures, et entre 0, 5 et 5 jours pour des champignons et bactéries a' croissance lente, afin d'augmenter le nombre de cellules microbiennes dans l'échantillon jusqu "a un nombre suffisant pour le déceler par la mise en évidence de 1'ATP microbien par voie de biolumine science. 4 - Procédé selon la revendication i, caractérisé en ce que le traitement avec l'agent pour ltextraction de liATP microbien est effectué pendant 1 incubation. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'incubation est effectuée en présence d'une solution ayant une teneur comprise entre 0, 02 et 0, 5 % environ d'un agent surfactif non ionique et une quantité comprise entre 0, 001 et 0, 5 unité/ml-environ d'une enzyme ATP-ase pour détruire 1'ATP non microbien pendant la durée d'incubation requise pour augmenter le nombre de cellules microbiennes viables dans l'échantillon. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'incuba tion de l'échantillon dans le milieu nutritif et le dosage de 1'A TP sont effectués dans la même cuvette de dosage. 7 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le nombre de cellules microbiennes dans l'échantillon original est calculé à l'aide de la relation suivante: Nombre de cellules - Nombre de cellules mesuré 2 x où x = Temps d'incubation - phase de latence Temps de formation tence 8 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nombre de cellules bactériennes dans l'échantillon original est calculé par division de la teneur en ATP dosé dans l'échantillon traité par la teneur moyenne en ATP des cellules bactériennes. 9 - Procédé selon la revendication 1 pour l'identification d'une espèce ou d'un groupe particulier de micro-organismes, caractérisé en ce que l'on dose de façon indépendante la teneur en ATP dans une première portion de l'échantillon, on traite une seconde portion de l'échantillon avec un milieu nutritif sélectionné spécialement pour favoriser la croissance des microorganismes à mettre en évidence, et on incube cette seconde portion pendant une période comprise entre 2 et 16 heures, et l'on dose la teneur en ATP de cette seconde portion pour déterminer le taux de croissance relative ou l'absence de croissance dans le milieu nutritif, pour déceler ainsi la présence ou l'absence du micro-organisme dans l'échantillon. 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la seconde portion et les portions supplémentaires de l'échantillon sont traitées chacune avec un milieu nutritif différent, sélectionné de façon spécifique pour favoriser ou pour arrêter la croissance dans le milieu nutritif d'un microorganisme particulier que l'on cherche à mettre en évidence, on incube toutes ces portions pendant la période indiquée, et l'on dose la teneur en ATP de chaque portion pour déterminer le taux de croissance ou l'arrêt de croissance dans chacun des milieux nutritifs, et, de la sorte, le spectre microbien de l'échantillon.