Brevet FR2503182A1 — publié le 19821008

- l - 2503182 La présente invention concerne les micro-organismes qui sont cultivés industriellement pour la production d'antibiotiques, et plus spécialement de la fusafongine, antibiotique d'usage externe pour le traitement des affections de la gorge. Les souches précédemment utilisées ont été décrites dans la section des Fusarium Lateritium décrite en particulier dans le Brevet d'Invention N' 1.164.181 et dont un exemplaire a été déposé au Centraalbureau Voor Schimmelcultures à Baarn sous le N' CBS 119.63. Le rendement de cette souche était de 5,71% de fusafongine pour 88kg. de micellium seché et broyé selon le Brevet d'Invention N0 1.392.717 qui décrit les perfectionnements apportés au procédé de préparation de la fusafongine, soit 0,1 à 0,2 Kg/m de culture selon le procédé utilisé actuellement. Cette souche apporte un rendement faible en fusafongine. Divers procédés ont été testés qui n'ont pas permis d'améliorer le rendement, car la fusafongine, constituant du corps du fusarium est présente dans chaque souche à une concentration caractéristique que le procédé de préparation ne permet pas d'améliorer, à partir du moment o il restitue toute la fusafongine présente dans la préparation. D'autres souches ont été testées avec un rendement qui n'était pas plus avantageux et des conditions de culture plus difficiles. L'invention vise à disposer d'une souche qui produise une quantité plus importante de fusafongine de qualité égale - et par le même procédé de préparation. La demanderesse a réussi à obtenir une nouvelle souche sur ce critère. Le but est atteint dans la mesure o les anciennes souches donnent des rendements de l'ordre de 0,1 à 0,15 kg/m et la nouvelle souche donne de 0, 6 à 0,9 kg/m3 - soit un rendement 6 fois supérieur en moyenne. La souche originelle n'a pas été modifiée mais une variété nouvelle qui en est issue a été obtenue par dissociation, isolement de - 2 - 2503182 colonies, et ensemencement de différents supports. A partir des spores prélevées eur différents supports susceptibles de contenir des agents mutagène, des ensemencements sur milieu gélosé ont été réalisés. De ces cultures des dissociations par dilutions successives sur milieux gélosés ont été effectuées pour obtenir des colonies isolées. Celles-ci ont été testées sur milieu de production. Rendement et composition de la Fusafongine élaborée ont été déterminés. La souche, objet de l'invention, a été retenue. Celle-ci est maintenant stabilisée par lyophilisation sur lait écrémé. D'après ses caractéristiques cette souche nouvelle appartient au genre fusarium. Elle a été déposée et identifiée au Centraalbureau Voor Schimmelcultures à Baarn sous le N CBS 675.80. La présente souche ne peut être identifiée à aucune des espèces connues et il s'agit d'une nouvelle espèce que la demanderesse a appelée Fusarium Lateritium Servier. Etude morphologique: La souche nouvelle: Fusarium Lateritium Servier CBS 675 80 est de couleur sombre, la sporulation est d'aspect sporodochium avec des touffes de micelium aérien - alors que la souche d'origine déposée au Centraalbureau Voor Schimmelcultures à Baarn sous le N CBS 119.63 est claire, sa culture est lisse et la sporulation de type pionnote. Etude Génétique: La caractéristique biochimique de production importante de fusafongine est transmise génétiquement. Elle caractérise donc un gênome différent. La transmission de ces caractères à travers trois générations successives en les comparant à deux autres souches connues, cultivées simultanément et repiquées sur 3 générations dans des conditions identiques a été vérifiée par le protocole suivant: - - 2503182 L'espèce sauvage Cognassier Terreau et l'espèce CBS 119.63 ont été isolées de leur milieu de conservation par passage sur milieu liquide de Scheffer, avant d'ensemencer un tube de gélose enrichi à la farine d'Avoine, pour servir de référence. L'espèce Fusarium Latéritium Servier ayant ensemencé directement la gélose Avoine les protocoles suivis pour les trois espèces ont été identiques isolement d'un élément - ensemencement - à la fin du cycle prélèvement de la majeure partie pour fermentation et analyse, - isolement d'un élément et réensemencement d'une nouvelle Gélose. Le procédé est identique à la fin de la deuxième génération pour l'obtention d'une troisième génération. Les procédures de fermentation ont été identiques pour les 3 générations des 3 souches et ont utilisé le même milieu. Le tableau ci-après regroupe les résultats: Etude Biochimique. La quantité trIs forte de fusafongine présente supérieure à toutes les concentrations connues dans d'autres souches constitue une caractéristique biochimique de son originalité. Il a été établi que la fusafongine produite par cette souche est identique à celle produite par les différentes autres espèces utilisées pour la production de fusafongine - tant par sa coloration son point de fusion que son pouvoir antibiotique et ses PRODUCTION DE FUSAFONGINE PAR SOUCHE LITRE DE MILIEU (en g) 1 ère f 2ème 3ème. génération génération génér. F.latéritium "d'origine"l cognassier-terreau 0,1 0,12 0,09 CBS 119.63. 0,14 0,17 0,13 etti Servier (CBS 675.80). 0,710 0,605 0,826 -4- 2503182 spectres d'absorption des ondes éléctromagnetiques: Infrarouges et Ultraviolettes. Préparation de la Fusafongine: La souche de Fusarium Latéritium Servier peut être conservée sous forme lyophilisée dans des ampoules scéllées. Le contenu de l'Ampoule lyophilisée peut servir à ensemencer directement un tube de gélose enrichie tel qu'on en trouve dans le commerce ou selon les techniques classiques. Le micelium se développe progressivement, et il peut après un cycle total de 15 à 20 jours servir à réensemencer un autre tube pour obtenir la fermentation. On utilise un milieu composé de la façon suivante: Saccharose 25g/1. Glucose Massé 25g/1. Nitrate d'Ammonium lOg/l. Phosphate Monopotassique 5g/1. Sulfate de Magnésium 2,5g/1. Le pH spontané est alors de 5,4 à 5,5. Le milieu est alors stérilisé 30 minutes à 120 C et son pH passe alors à 4,8-5.- Le milieu est ensemencé puis on fixe sa température à 28 C. On assure une aération de 1 litre d'air/min/l de milieu et on laisse fermenter pendant 95 5 heures - jusqu'à épuisement des Hydrates de carbone. Apres fermentation le mycélium est extrait par un solvant chloré. Le solvant d'extraction est éliminé par évaporation sous pression réduite et le résidu est dissous dans un hydrocarbure duquel il est contrextrait par un alcool aqueux. La concentration de l'extrait hydroalcoolique provoque la précipitation du produit brut. - 5 - 2503182 La purification est réalisée par traitement d'une solution alcoolique au noir activé spécialement traité pour cet usage. Le produit purifié est recristallisé dans un mélange composé d'alcool éthylique et d'eau. L'invention comprend aussi une culture biologiquement pure de Fusarium Lateritium Servier dont les caractéristiques correspondent à celles de la souche identifiée sous le N0 CBS 675.80 et qui peut aussi produire la substance antibiotique par fermentation dans un milieu nutritif. La souche objet de l'invention peut être utilisée pour la préparation de tout composé d'origine biologique brut ou purifié. Il peut être utilisé dans l'industrie pharmaceutique ou cosmétologique ou alimentaire ou pour des utilisations domestiques, et constituer un médicament, un aliment, un adjuvant en agissant de par des propriétés physiques, chimiques ou biologiques. On peut faire muter la souche employée selon cette invention par des agents de mutation artificielle connue: l'ultraviolet et les Rayons X et diverses substances chimiques, telles que les nitrosoguanidines la mitomycine etc. et tous les mutans obtenus qui sont capable de produire la substance antibiotique Fusafongine peuvent être utilisés dans l'exécution de la présente invention. - 6- REVENDICATIONS. Nous revendiquons donc: 1) Une nouvelle souche de Fusarium Lateritium dont les caractéristiques sont celles de la souche identifiée sous le N CBS 675,80. 2) Une culture biologiquement pure de la souche selon 1. 3) L'utilisation de la souche selon 1 et 2 pour-la production de composés d'origine biologique. 4) L'application de lasoure selon revendicatio rsl et 2 pour la production de fusafongine. ) L'utilisation de la souche selon 1 pour la production d'aut souches par selection ou induction génétique. 6) L'utilisation thérapeutique de composés biologiques extra de la souche selon 1, 2, 3 et 4. 7) Les compositions pharmaceutiques comprenant des produits biologiques isolés de la souche selon 1, 2, 3 et 4 tres its