Brevet FR2511032A1 — publié le 19830211

La présente invention concerne la production de lysine par fermentation bactérienne. La production de L-lysine est un problème économique mondial, car il s'agit là d'un additif essentiel à la nourriture du bétail. La L-lysine est préparée par fermentation de mélasse ou d'hydrolysat d'amidon avec des souches de Corynebacterium ou de Brevibacterium qui excrètent de la lysine dans le milieu de culture. Les souches bactériennes utilises sont en général obtenues par isolement de bactéries mutantes affectées dans les systèmes de régulation qui gouvernent la biosynthèse de ce métabolite. Le nombre de ces mutations possibles est en genéral faible, leur isolement souvent difficile. On utilise essentiellement des bacteries "rustiques" dont les points de régulation sont peu nombreux. La présente invention propose une méthodologie différente utilisant les méthodes de génie génétique. Partant d'une souche "mère", on y introduit un plasmide portant l'un des gènes qui code pour l'une des enzymes de la chaîne de biosynthèse de la lysine. Ce plasmide étant présent en de nombreuses copies, on observe une "amplification" du gène consideré, ce qui, si des phénomènes de regulation n'interviennent pas, conduit à une synthèse accrue de l'enzyme correspondante et à une augmentation correspondante de l'excrétion de lysine. C'est pourquoi la presente invention concerne de nouveauxplasmides caractérisés en ce qu'ils comportent au moins un fragment d'ADN d'un plasmide vecteur et un fragment d'ADN portant le gène dapA. Le gène dapA est l'un des gènes codant pour l'une des étapes intervenant dans la biosynthèse de la lysine, les autres gènes impliqués étant asd, dap B, C, D, E et lys A qui sont olne dapA repartis sur le chromosome bactérien. Le schéma l représente la chaîne de biosynthèse de la L-lysine et le tableau I indique les différentes enzymes en cause et les gènes correspondants. En pointillé, on a représenté la répression de certaines enzymes notamment AKIII par la lysine. Selon la présente invention le fragment d'ADN portant le gêne dapA est de préférence un fragment de restriction PstI. Parmi les plasmides vecteurs on utilisera par exemple pBR 322, mais il est possible d'utiliser d'autres plasmides vecteurs tels que pACYC 177, pCRl, psC 101, Col El et 26K. La présente invention concerne également les souches bactériennes transformées par un plasmide selon I'invention et en particulier des souches bactériennes, telles que Escherichia Coli, qui ont perdu l'activité AKI et AKII et dont l'activité AKIII est désensibilisée à l'encontre de l'inhibition par la lysine. La présente invention concerne également un procédé de préparation de la lysine dans lequel on fait fermenter un milieu de culture par une souche bactérienne contenant un plasmide selon l'invention et on prélève la lysine qui s'est accumulée dans le milieu de culture. Bien entendu la nature des milieux de cultures et les conditions de fermentations ne constituent pas un élément caractéristique de l'invention et il est possible de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention en utilisant les éléments de la technique antérieure. Les exemples suivants sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. i 2 - semi-aldehyde - b L-aspartate semi-aldéhyde ~ 2 -HomDserine-Hoiroserine ss-aspartylphosphate asparti que A ~ / / \ I 3 / méthionine Thréonine Il 3 I Acide dihydropicolinique Isoleucine I I Acide tétrahydropicolinique de I I N-succinyl-L-amino-o céto L-pimélate 6 1 l l N succinyl-LL-2,6 diaminopimélate 7 1 LL 2,6-diaminopimélate 8 1 méso 2,6-diaminopimélate 9 i L,1 - -- lysine Schéma 1 Réaction Nom de l'enzyme Abréviation gène 1 aspartokinase I AKI thr A aspartokinase II AKII Met L aspartokinase III AKIII lys C 2 aspartate semi-aldéhyde ASADH asd deshydrogénase 3 dihydropicolinate DHDP synthétase dap A 4 dihydropicolinate DHDP réductase dap B réductase Suite Réaction Nom de l'enzyme Abréviation Gène 5 Tétrahydrodipi- THDP succinyl- dap C ou D colinate ase succinylase 6 N succinyl diamino- dap D ou C pimélate amino transférase 7 N succinyl diamino- dap E pimélate désucciny lase 8 diaminopimélate DAP épimérase épimérase 9 diaminopimélate DAP décarboxylase lys A dé carboxylase Exemple 1 - Préparation du plasmide pRpA On isole à partir d'une banque d'ADN d'Escherichia Coli clonée par Davis sur un phage Atransducteur, un phageA portant un fragment bactérien capable de complémenter toutes souches bactériennes possédant une mutation dans le gène dapA. On mélange alors l1ADN dudit phage'het l'ADN du plasmide pBR322, et on traite le mélange par l'enzyme de rectriction Pst I( commercialisée par la Société BOEHRINGER). Le mélange d'ADN obtenu est alors traité par la ligase de T4 (commercialisée par la Société BOEHRINGER). Le mélange de Zigation est alors utilisé pour transformer selon la méthode connue au CaCl2 des bactéries dap A , en particulier les souches Escherichia Coli RDA8. Parmi les souches obtenues, on sélectionne celle possédant le phénotype DAP , Tcr. Parmi les clones transformés présentant ce phénotype, plusieurs ont été analysés par la technique Birnboin H.C. Birnboin et J.Doly Nuc. Ac. Res. 7 (1979) 1513-23, ce qui a permis de mettre en colncidence que le rite unique PstI de pBR 322 comportait une insertion bactérienne de 2,8 kilobases. Une analyse par restriction à l'aide des enzymes EcoRI, BamHI, Taq, Pvu I permettant de mettreen évidence la carte physique suivante Plasmide pDAl (total 7,3 kb) ~~ Fragent bactérien 2,8 kb EcoBamHI PstI Taq Taq Taq PstI I T,aq, Taq EcoRi > Partie pBR 322 c PvuI pBR322 2 cm = 1 kb. Le plasmide ainsi obtenu pDAl a été déposé dans la souche TOC 21R à la Collection Nationale de Culture de mîcroorganisme le 6 Août 1981 sous le nO I 167. Ce plasmide est présent dans la souche RDA8 à environ 50 copies. Un dosage de la DHDP synthétase selon la méthode decrite dans J.L. Butour, B. Felenbok et J.C. Patte. Ann. Microbiol (Inst. Pasteur) 125 B (1974) 459-462. permet de montrer que l'activité spécifique de l'enzyme dans la souche RDA8 transformée (cultivée en présence d'Ampicilline) est d'environ 40 fois supérieure à celle de la souche "sauvage "dapA . Ceci confirme que le dosage génique est conservé. Les plasmides pRDA sont extraits et purifiés selon les procédés de Birnboin. Exemple 2 - Préparation d'une souche transformée La souche utilisée est une souche d'Escherichia Coli TOC 21R décrite dans Boy et al. Biochimie 61 (1979) 1151-1160. Cette souche présente le génotype suivant ThrA 1101, met LM 1000, ilvA, lys C 1008 et lys 1121. La mutation lysC 1008 conduit à la désinhibition de l'aspartokinase III vis-a-vis de la lysine, son effecteur allostérique ; la mutation lys 1121 conduit à une synthèse constitutive de l'aspartokinase III vis-à-vis de la lysine, son co-represseur. Dans un fermenteur de 15 litres, cette souche TOC 21R peut accumuler en phase stationnaire de croissance jusqu'à 2 grammes de lysine par litre de milieu glucosé. Le plasmide p2Al purifie obtenu selon le procédé mentionné précédemment à l'exemple 1 est utilisé pour transformer cette souche TOC21R. Les transformants sont sélectionnés pour leur caractère Tcr et à titre de témoin une souche TOC21R est transformée par pBR 322 seul. On obtient ainsi deux souches pBR 322 / TOC 21 R pDAl / TOC 21 R Exemple 3 - Synthèse de la lysine La synthèse de lysine a été étudiée par la technique de la croissance satellite d'un mutant auxotrophe pour la lysine : une quantité importante de bactéries à tester est déposée sur milieu gélosé (milieu synthétique additionné de tétracycline) dans lequel a été incorporée une suspension légère de souche indicatrice lysA .Après 48 à 72 h. de croissance, les bactéries qui excrètent de la lysine dans le milieu extérieur sont entourées d'un halo de croissance de la souche auxotrophe, qui utilise cette lysine excrétée pour sa propre croissance. La distance séparant le clone excréteur de la limite du halo de croissance est proportionnelle (de façon logarithmique) à la quantité de lysine produite. Dans le cas présent, l'estimation des résultats de l'expérience est la suivante (dans des conditions expérimentales bien définies) pBR 322 / TOC 21 R = environ 0,3 cm (témoin) pDAl / TOC 21 R = environ 2,6 cm. On peut estimer la quantité de lysine synthétisée à 8 à 10 fois celle du témoin. A titre de comparaison on a préparé dans les mêmes conditions des plasmides comportant un fragment d'ADN portant le gène asd dap B et lys A. Les souches transformées avec les plasmides obtenus ne donnent aucun accroissement de la quantité de lysine produite. REVENDICATIONS 1. Plasmide synthétique caractérisé en ce qu'il comporte au moins un fragment d'ADN d'un plasmide vecteur et un fragment d'ADN portant le gène dapA. 2. Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment d'ADN portant le gêne dapA est un fragment de restriction PstI. 3. Plasmide selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le plasmide vecteur est pBR 322. 4. Plasmide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide déposé dans la Collection Nationale de Culture de microorganisme sous le nO I 167. 5. Souche bactérienne transformée par un plasmide selon l'une des revendications 1 à 4. 6. Souche bactérienne selon la revendication 5, caractérsée en ce qu'elle a perdu les activités AKI et AKII et que l'activité AKIII est désensibilisée à l'encontre de l'inhibition par la lysine. 7. Souche selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un Escherichia Coli. 8. Procédé de préparation de lysine, caractérisé en ce qu'on fait fermenter un milieu de culture par une souche selon l'une des revendications 5 à 7 et en ce que l'on prélève la lysine accumulée dans le milieu.