Brevet FR2501526A1 — publié le 19820917

Nouveaux émulsionnants et leur application pour la production de vaccins. La présente invention concerne de nouveaux produits émulsionnants, l'application de certains de ces produits a la préparation de vaccins émulsionnés et les vaccins ainsi obtenus. Les émulsionnants sont des produits connus de type anionique, cationique ou non ionique pouvant appartenir à des familles chimiques très diverses. Une propriété particulièrement importante de ces produits est constituée par leur "balance hydrophile - lipophile" (ou H.L.B.). Parmi ces émulsionnants on a déjà décrit et utilisé les produits résultant de la condensation de l'acide oléique et des produits de déshydratation du mannitol. Dans la présente demande, l'expression "acide oléique" signifie non seulement l'acide oléique tui-meme, produit pur, mais également les mélanges d'acides gras contenant des quantités prédominantes d'acide oléique, ces melanges et les esters de mannitol en résultant étant des produits liquides. Les produits de déshydratation du mannitol sont, par définition, les produits obtenus par enlèvement d'une ou de deux molécules d'eau à la molécule de mannitol de départ ; ces produits sont purs ou en mélanges. Les émulsionnants résultant de la condensation de l'acide oléique et des produits de déshydratation du mannitol sesont révélés intéressants notamment, pour certains d'entre eux, comme émulsionnants pour la précaration de vaccins huileux ; ces produits intéressants, généralement désignés sous le nom de "monooléate de mannide" (et qui sont en réalité des mélanges de monooléate de mannide, de dioléate de mannide et de mannitane), possèdent en effet, outre leur pouvoir émulsionnant, des propriétés intéressantes pour cette application car ils ne sont pas toxiques, satisfont au test de BERLIN et donnent naissance a des vaccins émulsionnés relativement fluides et stables. Il a été trouvé, et c'est la l'objet de la présente invention, que les produits nouveaux qui sont les esters de l'acide oléique avec les produits de déshydratation du mannitol, oxyalkylés par réaction avec 1 à 20 moles d'oxyde d'alkylène par mole d'ester, possèdent, par rapport aux esters connus, des propriétés émulsionnantes intéressantes notamment quant a la balance HLB de ces nouveaux produits. I1 a également été trouvé que les nouveaux produits selon l'invention, obtenus par la condensation de 2 a 10 moles d'oxyde d'alkylène sur l'ester, possèdent des propriétés émulsionnantes intéressantes pour la préparation des vaccins émulsionnés huileux. Cette dernière application est spécialement intéressante car, si dans une certaine mesure on pouvait s'attendre à ce que la condensation de molécules d'oxyde d'alkylène sur des esters d'acide oléique et de mannitol déshydraté modifie les propriétés émulsionnantes (HLB) des dits esters, il était totalement inattendu que les nouveaux émulsionnants permettent de résoudre les problèmes rencontrés lors de l'utilisation du "monooléate de mannide" dans l'emploi des vaccins huileux émulsionnés. On sait que les vaccins huileux (se présentant sous forme d'émulsions) présentent, par rapport aux vaccins aqueux (se présentant sous forme de dispersions) l'avantage de donner naissance à une excellente immunité et d'assurer le maintien de cette immunité pendant une période plus longue. Ces vaccins huileux sont utilisés essentiellement aujourd'hui dans le domaine vétérinaire pour le traitement de la fièvre aphteuse, de la pesté aviaire, de la brucellose, de la maladie vésiculaire des porcs, etc. Or, aujourd'hui, le "monooléate de mannide" apparaît comme un des rares émulsionnants présentant sur le plan efficacité (fluidité et stabilité de l'émulsion) et inocuité (absence de toxicité) les propriétés lui permettant d'etre utilisé dans la préparation de ces vaccins huileux émulsionnés. Malheureusement, ces "monooléates de mannide", s'ils possèdent les propriétés émulsionnantes nécessaires, s'ils sont bien tolérés par l'organisme, s'ils sont non toxiques et répondent au test de MERLIN, donnent naissance a. des émulsions de stabilité insuffisante et par ailleurs provoquent au point d'injection du vaccin la formation de nodule et éventuellement d'abcès. Il a été trouvé comme indiqué ci-dessus que les produits selon l'invention comportant 2 à 10 moles d'oxyde d'alkylène par mole d'ester permettaient de surmonter, dans les vaccins huileux émulsionnés, les difficultés mentionnées ci-dessus. L'utilisation, dans les vaccins, des nouveaux produits mentionnés ci-dessus peut se faire - soit en employant comme seuls émulsionnants lesdits produits, - soit en employant lesdits produits en mélange avec le "monooléate de mannide". Dans le premier cas, on utilisera de préférence des émulsionnants selon l'invention comportant environ 2 à 5 moles d'oxyde d'alkylène par mole d'ester de départ et les quantités de ces émulsionnants seront de l'ordre d'environ 3 à environ 7 % en poids par rapport a l'ensemble de l'émulsion. Dans le deuxième cas, on utilisera de préférence des émulsionnants selon l'invention comportant d'environ 5 à environ 10 moles d'oxyde d'alkylène par mole d'ester de départ et les quantités de ces émulsionnants pourront varier de 0,5 à environ 7 % en poids par rapport a l'ensemble de l'émulsion. I1 a été trouvé que l'émulsionnant à utiliser devait en effet avoir pour HLB une valeur comprise entre environ 5 et environ 10. La préparation des produits selon l'invention peut s'effectuer en deux stades, l'un consistant dans la préparation de l'ester et l'autre consistant dans la condensation d'oxyde d'alkylène sur ledit ester. L'estérification s'effectuera en faisant réagir "l'acide oléique", ou l'un de ses dérivés avec le mannitol déshydraté, cette estérification étant réalisée avec évacuation de l'eau formée selon des techniques connues. Comme mannitol déshydraté, on peut utiliser le mannitol auquel on a enlevé une ou deux molécules d'eau. Lorsqu'on utilisera le mannitol dans lequel on a enlevé une molécule d'eau, on utilisera de préférence un excès d'acide oléique de façon à fixer plus d'une molécule d'acide oléique sur chaque molécule de mannitol déshydraté. Lorsqu'on utilisera du mannitol dans lequel on a enlevé deux molécules d'eau, on utilisera une quantité d'acide oléique sensiblement équimoléculaire de façon à ne fixer qu'une molécule d'acide par molécule de mannitol déshydraté. Il importe en effet que, quel que soit le mannitol de départ, il subsiste dans la molécule d'ester produite un radical hydroxylé sur lequel s'effectuera la réaction ultérieure avec l'oxyde d'alkylène. Compte tenu que l'estérification décrite ci-dessus s'effectue avec élimination de l'eau formée, il est possible et même avantageux de réaliser simultanément la déshydratation du mannitol et l'estérification du produit déshydraté obtenu. Cela peut se faire par exemple en opérant en milieu alcalin à une température élevée (150-200 C) dont le coix dépendra du degré de déshydratation souhaité pour le mannitol de départ. La réaction de l'ester obtenu avec l'oxyde d'alkylène peut s'effectuer par les procédés connus. L'oxyde d'alkylène pourra être choisi parmi l'oxyde d'éthylène et l'oxyde de propylène. Les émulsions injectables préparées selon l'invention comporteront - une phase virale ou bactérienne aqueuse (milieu de Hanks, de Eagle...) - une phase huileuse, constituée par une huile végétale ou minérale Codex (par exemple NARCOL 52, marque déposée par ESSO FRANCE). - un émulsionnant dérivé de l'ester oléique du mannitol. Le procédé de préparation de l'émulsion est le suivant : L'émulsionnant est dilué dans la phase huileuse, à température inférieure à 25"C jusqu'à ce que le mélange soit homogène ; la phase virale aqueuse est alors ajoutée peut à peu à température inférieure à 250C et sous agitation continue. L'agitation est obtenue à l'aide d'un émulseur habituellement utilisé en galénique Emulseur Ystral, Silverson... L'émulsion est examinée après 24 heures de repos et les essais effectués concernent - son sens : déterminé'par conductivité à l'aide d'un conductivimètre Seibold LTD. La valeur de la conductivité dans le cas d'une émulsion "eau dans huile" doit être inférieure à 1 microsiemens et ne pas varier fortement au cours de la mesure. - sa viscosité : mesurée à l'aide d'un viscosimètre à corps tournant Brookfield, équipé du mobile 1 avec les vitesses de rotation 6et 12. La viscosité de l'émulsion doit être inférieure à 300 centipoises. - sa stabilité : contrtlFe a des températures de stockage de 4 C, 200C et 370C ; par centrifugation pendant 30 minutes å 3000 tours/minute. Les examens de stabilité sont répétés une fois par semaine pendant le premier mois, ensuite une fois par mois. Une émulsion est considérée comme stable tant que la quantité d'huile séparée par relargage, décantation ou déphasage est inférieure a 10 h du volume total après 30 minutes de centrifugation. Une émulsion est considérée comme utilisable dans la préparation des vaccins lorsque - sa stabilité a 40C est supérieure a 6 mois, - sa stabilité a 200C est supérieure å 1 mois, - sa stabilité à 370C est supérieure a 1 semaine. Les exemples non limitatifs ci-après illustrent l'invention. L'acide oléique utilisé pour la synthèse est en réalité un mélange d'acides hydrocarbonés de C12 a C20 contenant une proportion notable "d'acide oléique" proprement dit (acide insa turé en c18 > ; une composition de cet acide oléique est la suivante - acide insaturé en C18 75-80 % (acide octadécénotque) - acide saturé en C18 5 7. maximum - acide insaturé en C16 8 a 10 7. environ - acide insaturé en C14 3 X maximum - acide sature en C12 3 % maximum Le mannitol utilisé pour la synthèse est le produit défini dans le Codex. On a réalisé simultanément l'anhydrisation du mannitol et l'estérification de l'acide oléique par le mannitol déshydrate en opérant en milieu alcalin, a une température comprise entre 150 et 2000C et avec élimination continue de l'eau provenant a la fois de l'anhydrisation du mannitol et de l'estérification. Lorsqu'on opère avec un excès d'acide oléique, on prépare "in fine" un diester oléique de 1,4-anhydromannitol polyoxy sîkyléné. Lorsqu'on réalise une déshydratation plus poussée du mannitol et une estérification avec des quantités quasi équimoléculaires de réactifs, on prépare le monoester de 1-4, 3-6 dianhydromannitol polyoxyalkyléné. L'oxyalkylation s'effectue par condensation d'un nombre (n) déterminé de molécules d'oxyde d'alkylène (oxyde d'éthylène ou oxyde de propylène) sur l'ester préparé ; cette oxyalkylation s'effectue en milieu alcalin. Exemple 1 On a réalisé une émulsion en diluant un émulsionnant dans une huile minérale Codex, en ajoutant ensuite sous agitation une phase aqueuse virale puis en agitant vigoureusement. L'émulsion ainsi réalisée contient - 45 parties (en poids) d'huile minérale Codex (Marcol 52) - 5 parties (en poids) d'émulsionnant - 50 parties (en poids) de phase aqueuse virale (milieu de Hanks) L'émulsionnant utilisé est un mélange de 85 7. en poids d'ester octadécénotque de 1-4, 3-6 anhydroman- nitol, 15 Z en poids d'ester octadécénotque de 1-4, 3-6 anhydroman nitol éthoxylé avec 18 molécules d'oxyde d'éthylène. L'émulsion aqueuse obtenue a les caractéristiques suivantes - conductivité stable de 1 microsiemens : émulsion eau dans huile - viscosité à 200C : environ 180 cP - stabilité à 40C : maximum 3 semaines à 250C : maximum 1 semaine. Si l'émulsionnant utilisé présente des propriétés intéressantes, on a constaté que l'émulsion obtenue avait une stabilité (dans le temps) insuffisante, qu'elle n'était pas injectable facilement. De plus, l'émulsionnant présente une certaine toxicité. Exemple 2 Une émulsion injectable a été préparée selon le procédé décrit ci-dessus, a partir de - 45 parties d'huile minérale Codex (MARCOL 52) - 5 parties drun émulsionnant : ester octade-cénotque de diéthoxy 1-4 anhydromannitol - 50 parties de phase virale aqueuse (milieu de Hanks) L'émulsion obtenue a les caractéristiques suivantes - conductivité stable d'environ 0,5 microsiemens : type eau dans l'huile - viscosité a 2O0C : environ 200 cP - stabilité : . 40C supérieure 6 mois à å 200C supérieure a 1 mois a å 370C supérieure a 8 jours. L'émulsion obtenue est bien tolérée apres injection, ne provoque pas de réactions et prolonge la durée de l'immunité conférée par la phase virale ou bactérienne comparativement celle que donnerait la même phase virale ou bactérienne formulée en vaccin aqueux. Exemple 3 Une émulsion injectable a été préparée selon le même procédé, elle contenait - 45 parties d'huile minérale Codex (MARCOL 52) - 5 parties d'émulsionnant - 50 parties de phase virale aqueuse (milieu de Tanks). L'émulsionnant était un mélange de deux émulsionnants ayant tous deux passé avec succès le test de Berlin,sa constitution étant - 80% d'ester octadécénotque du 1-4,3-6 anhydromannitol - 20X d'ester octadécénotque de l'octaéthoxy 1-4,3-6 anhydromannitol. L'émulsion obtenue a les caractéristiques suivantes - conductivité stable d'environ 0,5 microsiemens : émulsion eau dans huile, - viscosité à 200C : environ 200 cP - stabilité : . a 40C supérieure à 6 mois a 250C supérieure a 1 mois a a 370C supérieure a 1 semaine. L'émulsion obtenue est bien tolérée apres injection, ne provoque pas de réactions et prolonge la durée de l'immunité conférée par la phase virale ou bactérienne comparativement 9 celle que donnerait la nieme phase virale ou bactérienne formulée en vaccin aqueux. Exemple 4 Un émulsion injectable est préparée dans les mêmes conditions que dans les exemples 1 et 2. Elle contient - 45 parties d'huile minérale Codex (MARCOL 52) - 5 parties d'émulsionnant - 50 parties de phase virale aqueuse (milieu de Eagle). L'émulsionnant est un mélange de deux émulsionnants qui ont passé avec succès le test de Berlin ; il est composé de - 80% d'ester octadécénotque du tétrahydroxy 1-4,3-6 anhydromannitol - 20% d'ester octadécénoique du 1-4 > 3-6 anhydromannitol. L'émulsion obtenue a les caractéristiques suivantes - conductivité stable d'environ 0,5 microsiemens : type eau dans huile - viscosité a 200C : environ 110 cP - stabilité : . 40C supérieure a 6 mois . a 250C supérieure a 1 mois . a 37"C supérieure à 1 semaine. L'émulsion obtenue est bien tolérée après injection, ne provoque pas de réactions et prolonge la durée de l'immunité conférée par la phase virale ou bactérienne comparativement à celle que donnerait la même phase virale ou bactérienne formulée en vaccin aqueux. Exemple 5 Un vaccin injectable sous forme d'émulsion huile dans eau est préparé de la façon suivante 5 parties d'un émulsionnant comprenant 50 60% d'ester octadécénoique du 1-4,3-6 anhydromannitol, et 50 à 40% d'ester octadécénoîque de l'octaéthoxy 1-4,3-6 anhydromannitol, sont dissoutes dans 45 parties d'huile minérale Codex (lARCOL 52) Ce mélange est versé peu a peu sous agitation, comme défini plus haut, dans 50 parties d'une phase aqueuse virale (milieu de Eagle ou milieu MEM 1031 (EUROBTO)). L'émulsion obtenue, du type huile dans eau,a les caractéristiques suivantes - conductivité stable d'environ 3,5 millisiemens : type huile dans eau â 40C, - viscosité a 40C : environ 80 cP - stabilité : a 40C supérieure 9 6 mois. L'émulsion obtenue est bien tolérée après injection, ne provoque pas de réactions et prolonge la durée de l'immunité conférée par la phase virale ou bactérienne comparativement 9 celle que donnerait la même phase virale ou bactérienne formulée en vaccin aqueux. Exemple 6 Une émulsion injectable a été préparée selon le même procédé, elle contenait - 47 parties d'huile minérale Codex - 4,5 parties de diester octadécénotque 1-4 anhydromannitol - 0,5 partie de diester octadécénotque de octaéthoxy 1-4 anhydromannitol - 48 parties de phase virale aqueuse (milieu IBR) L'émulsion obtenue a les caractéristiques suivantes - conductivité stable inférieure 9 0,5 microsiemens : émulsion eau dans huile - viscosité a 200C : environ 150 cP - stabilité : . a 40C supérieure a 6 mois a 250C supérieure a 1 mois. L'émulsion obtenue est bien tolérée apres injection, ne provoque pas de réactions et prolonge la durée de l'immunité conférée par la phase virale ou bactérienne comparativement celle que donnerait la même phase virale ou bactérienne formulée en vaccin aqueux. R E Y E N D I C A T I O N S 1. Nouveaux émulsionnants que sont les esters de l'acide oléique avec les produits de déshydratation du mannitol, caractérisés en ce que lesdits esters ont été oxyalkylés par réaction avec 1 a 20 moles d'oxyde d'alkylène par mole d'ester. 2. Nouveaux émulsionnants selon la revendication 1, utilisables pour la préparation de vaccins huileux sous forme d'émulsuions, lesdits vaccins étant employés dans le domaine vétérinaire, caractérisés en ce que lesdits esters ont été oxyalkylés par réaction avec 2- à 10 moles d'oxyde d'alkylène par mole d'ester. 3. Nouveaux émulsionnants selon la revendication 2, caractérisés en ce que lesdits esters ont été oxyalkylés par réaction avec 2 5 moles d'oxyde d'alkylène par mole d'ester et que lesdits émulsionnants sont employés 9 raison d'environ 3 à environ 7% en poids par rapport l'émulsion. 4. Nouveaux émulsionnants selon la revendication 2, caractérisés en ce que lesdits esters ont été oxyalkylés par réaction avec 5 a 10 moles d'oxyde d'alkylene par mole d'ester et que lesdits émul sonnants, utilisés en mélange avec du t'monooléate de mannide'', sont employés a raison d'environ 0,5 a environ 7: en poids par rapport à l'émulsion. 5. Nouveaux vaccins se présentant sous forme d'émulsion et utilisables dans le domaine vétérinaire, caractérisés en ce qu'ils comportent un émulsionnant selon l'une des revendications 2, 3 et 4.