Brevet FR2501716A1 — publié le 19820917

NOUVEAU PRODUIT N()TAMMENT POUR LA FIXATION DE HICROORGANISHES, A DES FINS AGRONOMIQUES La présente invention a pour objet un nouveau produit pour la fixation notamment de micro-organismes, et son application en parti culer dans te domaine de l'agronomie. On sait que l'on a proposé depuis longtemps d'enrichir les sols ou les semences en bactéries, grâce à des bactéries capables de fixer l'azote atmosphérique soit directement soit par voie symbioti- que. C'est ainsi que dans 1'US 1 909 622 déposé en 1923 l'on a décrit un procédé pour apporter des bactéries fixant l'azote du genre Rhizobium. Notamment dans le brevet belge 521 850 de 1953 on a proposé d'apporter une culture par exemple de Rhizobium sur une substance adsorbante constituée par de la terre de diatomées ; la silice colloldale est également mentionnée dans ce document. Dans le brevet français 1 180 000 dans le cas de la fabrication de préparations riches en bactéries du groupe des Azotobacter on a fait appel à un moût auquel l'on ajoute des substances à action adsorbante comme la cellulose, la farine d'os, le kaolin, du gel de silice. On a aussi fait appel à de la bentonite comme par exemple dans le GB I 177 077, à des granulés de plâtre (FR I 490 046) et de la lignite. Bien entendu l'énumération qui vient d'être donnée n'est pas exhaustive, mais elle est illustrative des efforts qui ont été faits pour obtenir une solution acceptable. D'un simple point de vue technique l'on se heurte à la nécessité de répondre à plusieurs exigences qui doivent être toutes satisfaites. Tout d'abord il va de soi qu'il faut fixer le micro-organisme sur le support, sans détériorer ledit micro-organisme. I1 est aussi nécessaire d'assurer la survie du micro-organisme et sa protection lors du transport et du stockage. En particulier la viabilité du micro-organisme doit être maintenue, même après des périodes de temps au moins de plusieurs semaines. Une autre exigence à satisfaire réside dans l'aptitude à la libération du micro-organisme inclus pour permettre son essaimage dans le milieu, et une aptitude éventuelle au greffage d'additifs. A ceci, l'on doit ajouter le problème de la forme sous laquelle on apporte le micro-organisme. Traditionnellement cet apport se fait soit sous forme d'une suspension bactérienne liquide, soit sous forme d'une suspension bactérienne adsorbée sur des supports solides. Cet apport se fait soit au sol, soit aux graines sous divers enrobages. Des recherches ont donc été conduites soit dans le but d'amé- liorer l'inclusion des micro-organismes dans un milieu propice ou un support adequat, soit afin d'améliorer la manière d'apporter le milieu ou le support aux plantes. C'est ainsi que dans le FR 77 10254 du 5 avril 1977 (correspondant à 1'US 4 155 737) on a proposé un procédé microbiologiquc destiné à maîtriser la productivité des plantes cultivées, caracté- risé en ce que l'on inocule dåns la rhizosphère desdites plantes des fragments d'une gel polymère dans lequel se trouve inclus au moins un micro-organisme tellurique à effet rhizosphérique favorable supportant l'inclusion dans ledit gel. Selon ce brevet le gel polymère peut être constitué par un gel de polyacrylamide ou un gel de silice. Or l'on sait que pratiquement le polymère doit être biodégradable ou tout au moins non polluant. De plus pour des raisons économiques évidentes le prix de l'inoculum doit rester le plus bas possible. C'est pourquoi dans la demande française 79 08587 du 5 avril 1979 au nom de la demanderesse on a revendiqué de choisir comme support une matrice à base d'au moins un polymère du groupe des polysaccharides ce procédé se caractérisant par le fait que l'on fait subir audit polymère un traitement de réticulation au moins partielle. De plus on a revendiqué dans cette demande d'additionner le gel d'une substance à grande absorption d'eau, telle qu'une silice synthétique ou naturelle. Les résultats obtenus ont été spectacula ires. Or on sait que le problème de la viabilité de l'inoculun est très delicat, car il faut que le support, ou la matrice se comporte comme un réservoir d'eau qui libère l'eau en fonction des besoins du micro-organisme et en tenant compte du milieu. Dans cette optique on a en particulier étudié la courbe de sorption de l'eau d'un produit biologique et l'importance des diverses réactions de dégradation et notamment le degré hygrométrique d'équilibre (ERH : Equilibrum Relative Humidity - GROVER 1947 Mossel 1949-1955 - Clayson 1955). Malheureusement, selon LONCIN, (les opérations unitaires du Génie Chimique - DUNOD 1961) il est impossible de prévoir théoriquement les variations de ce ERH en fonction de la quantité de liquide contenu par unité de matière séche. On ne peut donc avancer que de manière empirique, il faut encore ajouter que le produit final doit se présenter sous une forme facile à mettre en oeuvre, stockable et présentant une bonne coula bilité. Poursuivant ces recherches la demanderesse a observé que l'on pouvait obtenir des resultats spectaculaires avec certains produits à base de silice précipitée, caractérisés par le fait qu'ils présentaient - une suface CTAB inférieure à 150 m2/g t de préférence comprise entre 90 et 120,2/g, entre 80 et 120 m/g, - une prise d'huile supérieure à 200 cm3/100 g et de préférence entre 250 et 450 cm3/100 g, - un volume des pores mesuré au porosimètre à mercure pour des pores de taille inférieure à 1 000 A et avantageusement 500 A, d'au moins 70 cm3 pour 100 g de silice. - une courbe d'adsorption dleau asymptotique à la parallèle à l'axe des coordonnées pour une valeur de P/Po inférieure à 0,85 Une telle courbe d'adsorption peut être déterminée de manière connue comme décrit par exemple par Sing et Madeley. J. Appui. Chem. 4, July 1954. D'une manière générale on observe que si l'eau nécessaire renfermée dans des pores de diamètre est trop faible la survie du micr > organisme est mauvaise, alors que si le diamètre est trop grand on peut avoir une bonne survie, mais l'on note une mauvaise coulabilité. Pour la simplicité du langage on désignera par la suite le produit selon l'invention sous le terme de silice même s'il peut renfermer d'autres composés. Les inoculums peuvent présenter des micro-organismes adsorbés ou inclus. Dans le premier cas, la culture renfermant le micro-organisme est apportee directement sur le produit selon l'invention qui sert de support. Dans le second cas le micro-organisme est inclus dans une matrice constituée par un gel de polymère et le produit selon l'invention est apporté comme additif selon le FR 79 08587. Celui-ci peut être constitué par un polyacrylamide ou un gel de silice comme dans le FR 77 10254 (US 4 155 737) ou un polymère du groupe des polysaccharides comme dans le FR 79 O8587 au nom de la demanderesse. On observe dans ce cas une survie qui dans le cas du Rhizobium japonicum peut atteindre quelques mois. Dans le second cas d'un micro-organisme inclus dans une matrice de polysaccharide on observe que dans le cas où l'on fait appel, comme additif à une silice selon l'invention, l'on obtient un résultat spectaculaire en ce qui concerne aussi bien la viabilité qui est de plusieurs mois, que la coulabilité. Cette voie offre un maximum d'applications possible. I1 y a effet de synergie entre la silice et le polysaccharide dans lequel le micro-organisme est inclus. Comme dit précedemment les silices selon l'invention présentent une allure d'isotherme d'adsorption d'eau particulière. De telles silices peuvent etre obtenues en particulier de la manière suivante On prépare une solution de silicate de sodium que l'on amène à un pH correspondant sensiblement au pH de précipitation, et à la température de précipitation. On ajoute ensuite, au pied de cuve ainsi formé, simultanément une solution de silicate et une solution d'acide de manière à maintenir le pH et la température aux mêmes valeurs jusqu'à la fin de la précipitation, puis on acidifie jusqu'à pH de l'ordre de 3,5. On sépare et on sèche la silice ainsi obtenue. Mais la pressente invention sera plus aisément comprise à l'aide des exemples SlìiVantS donnés à titre illustratifs, mais nullement limitatifs. On a choisi deux silices non conformes à 1'tnvention et une selon l'invention. Les deux silices non conformes sont - une silice naturelle (1) (Clarcel Flo à base de perlite), - une silice précipité (3) : . surface BET = 250,2/g prise d'huile = 320 cm3/100 g CTAB = 170 m2/g La silice selon l'invention (2) présente - une surface BET : 200 m/g - une prise d'huile : 350 cm3/100 g - CTAB 90 m/g Pour les silices 2 et 3, les pores remplis par 70 cm3 de mercure pour 100 g de silice correspondent à un rayon inférieur à 500 A. La surface BET : méthode de BRUNAUER - EMMETT - TELLER décrite dans "The Journal of the American Chemical Society", vol. 60, p. 309, Février 1938). La surface CTAB : surface externe par adsorption de bromure de céthyl triméthyl ammonium à pH 9 selon la méthode exposée par JAY, JANZEN et G.KRAUS dans Rubber Chemistry and Technology 44 (1971) p. 1287-1296. Prise d'huile : prise DOP (dioctylphtalate). Par ailleurs on a représenté à la figure 1, la courbe de répartition poreuse des silices, mesurée au porosimètre à mercure en portant le volume exprimé en cm 3/g en fonction du rayon en Angstroms. Sur la figure 2, on a voulu montrer l'allure des courbes d'isothermes de manière comparative. Pour cela on a été amené à changer l'échelle des ordonnées de la courbe 1 en la réduisant d'un facteur 100 (par exemple 1, pour la courbe 1 ; 100 pour les courbes 2 et 3). Les valeurs en abscisses représentent P/Po et les valeurs en ordonnées le poids d'eau absorbée en mg eau/g silice. Ces courbes montrent très clairement les différences de comportement des différentes silices, et sont à voir en fonction du tableau page 7. L'on voit que les trois courbes sont très différentes. Le mil pieu de culture a été préparé de la manière suivante Le milieu de culture est constitué par le milieu YEM = Yeast Extract, Mannitol (g/l).(WACEK T.J.,BRILL W.J. 1976 Crop Science 16 519-523). - Mannitol 5,0-10,0 ; Yeast Extract Difco 0,5-1,0 K2HPO4 0,5 ; MgSO4 7H2O 0,2 Fe (:13 0,004 ; NaCl 0,2 - pH ajusté à 7,0 avec un HCl N - H2O distillée qsp = 1000 ml - Stérilisation : 20 min. à 120 C - Conditions : 1000 ml de milieu dans un erlenmeyer de 2000 ml bouché avec un tampon polyuréthane, stérilisation 25 minutes à 12O0C. - Ensemencement par une culture utilisée directement après incubd- tion (ou éventuellement conservée à + 4 C) de Rh. japonicum souche G3 USDA 311 b 138 collection INRA 7, Rue Sully 21000 DIJON) sur gélose YEM ou préférentiellement par une culture inoculum liquide intermédiaire. - Incubation 4 à 5 jours à 28 C sur table d'agitation tournant .1 100 t/min., excentration du plateau 25 mm - La population de la culture est comprise entre I - 3,0 germes/ml, le pH est de 7-7,2. La viabilité du micro-organisme est déterminée par la technique des suspensions dilution sur milieu gélose YEM, on l'exprime en log du nombre de germes, rapporté à 1 ml de la culture. Préparation de l'inoculum a) 100 ml de culture sont additionnés de 40 g de silice, malaxés puis le mélange est séché à température ambiante jusqu'à ce que la teneur en eau résiduelle soit voisine de 70 g par 100 g d'additif ; l'inoculum ainsi préparé est conservé en flacon bouché à température comprise entre 25 et 28CC. b) mélange de 100 ml de gel à base de gomme xanthane + farine de graine de caroube avec micro-organisme inclus avec 40 g de silice et séchage, comme décrit en a). La gomme xanthane est constituée par un hétéropolysaccharide à haut P.M obtenu par fermentation d'un hydrate de carbone par Xanthomonas Campestris. Rôle respectif des polysaccharides et de la silice sur la survie du Rhizobium Afin de mettre en évidence le rôle respectif des polysaccharides et de la silice sur la survie du Rhizobium au cours du stockage à 280C, on a comparé la viabilité du micro-organisme - dans le mélange culture + silice - dans le melange gel (gomme Xanthane + graine de caroube + silice), mélanges conservés tous deux en flacons bouchés avec une teneur en eau résiduelle de 75 Z . Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau suivant. Viabilite : (log nbg/ml) : Nombre de mois de stockage à 280C : Inoculum : O : 1 : 2 : 4 6 8 : 10 : 12 : 16 : gel seul sec: 8,8 : 7,0 : 6,4 : : : : culture + : : : : : : : : : silice 1 : 9,1 : 9,2 : 9,0 : 9,4 : : : : : Culture + : : : : : : : : : : silice 2 : 8,8 : 7,9 : 8,0 : 6,4 : 6,8 : : : Culture + : : : : : : : : : silice 3 : 7,9 : 5,5 : 3,6 : : : : : : : : : : :Gel+silice I : 9,1 : 9,1 : 9,1 : 9,3 : 9,1 : : 9,1 : : :Cel+silice 2*: 8,8 : 8,5 : 8,5 : 8,6 : 8,3 : 8,1 : 7,9 : 8,3 : 8,7 :Gel+silice 3 : 8,6 : 6,7 : 6,5 : : . * moyenne de 18 essais Sauf dans le cas de la silice I l'effet protecteur de la silice est renforcé par l'addition des polysaccharides, addition facilitant en outre la mise en forme ultérieure. Densité apparente et coulabilité en fonction du diamètre de tamisage Les caractéristiques (densité apparente et vitesse d'écoulement) de l'inoculum, à base de gel + silice 2, renfermant 70 % d'eau résiduelle, malaxé durant 3 minutes 30 secondes, puis tamisé après broyage sur tamis à différents diamètres de mailles figurent dans le tableau ci-après. Caractéristiques des inoculums après tamisage à différents diamètres :Diamètre particules (mm): Gel + silice 2 : Da (1) : Vo (2) : 2 : 0,334 : 3,80 : 1,6 0,332 : 3,73 : ( 1,0 : 0,330 : 3,71 : ( 0,63 : 0,308 : 1,89* : ( 0,20 : 0,214 : * * ne coule pas ou coule mal. (1) Da = densité apparente (2) Ve = vitesse d'écoulement (g/sec.) déterminée dans un entonnoir conique à 600 (diamètre d'ouverture 10 cm, diamètre de sortie l cm, hauteur 12 cm). Répartition granulométrique La répartition granulométrique de l'inoculum précédent, figure dans le tableau ci-dessous Répartition granulométrique des inoculums (p. cent. du poids total) Diamètre particules (mm) : gel + silice 2 2,0 - 1,6 20,7 1,6 - 1,0 27,4 1,0 - 0,63 : 22,5 0,63 - 0,4 : 10,9 0,4 - 0,2 9,6 : 0,2 * 8,8 * ne coule pas. Essais en vases de végétation Afin d'essayer de déterminer les rôles respectifs des silices et des polysaccharides dans le sol, après semis et inoculation, celui-ci a été soumis à une période de sécheresse de 10 jours en vase de végétation les résultats obtenus sur soja var. AMSOY après 42 jours de culture en conditions contrôlées figurent dans le tableau suivant. Influence d'une période de sécheresse sur la nodulation du soja en fonction du type d'lnoculu v Nombre nodules/plante : Inoculum : : sans : avec dessiccation : dessiccation non inoculé i 0 . 0 : : culture + silice 2 : 33,0 : 2,4 : liquide, : gel + silice 2 : 21,0 : 9,0 : solide : gel + silice 2 : 33,4 : * 2kg/200 1 H20/ha mise en suspension au noient de l'emploi. On voit donc que seule une silice selon l'invention permet de satisfaire à la fois aux conditions de coulabilité et de viabilité. Par ailleurs, la présence d'un gel à base de polysaccharides permet d'atténuer l'effet léthal de la dessiccation sur le microorganisme. H E V EN D I C: A T I (w N S 1) Produit pour la fixation de micro-organismes, à base d silice précipitée, caractérisé par le fait qu'il présente - une surface CTAB inférieure à 150 m/g, - une prise d'huile supérieure à 200 cm /100 g, - un volume de pores mesuré au porosimètre à mercure, pour des pores de taille inferieure à 1 000 A, d'au moins 70 cm3 pullr 100 g de silice, - une courbe d'adsorption d'eau asymptotique à la parallèle à l'axe des ordonnées pour une valeur de P/Po supérieure à 0,85. 2) Produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il présente : - une surface CTAB comprise entre 80 et 120 m2/g, - une prise d'huile comprise entre 250 et 450 cm3/100 g, - un volume de pores mesuré au porosimètre à mercure, pour des pores de taille inférieure à 500 A, d'au moins 70 cm3 pour 100 g de silice. 3) Application du produit selon l'une des revendications I et 2, caractérisée par le fait que le dit produit est utilisé comme support du micro-organisme. 4) Application du produit selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait qu'il est apporté comme additif à un gel de polymère. 5) Application du produit selon la revendication 4, caractérise par le fait que le polymère est du groupe des polysaccharides. 6) Application du produit selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée par le fait que le micro-organisme est du genre Rhizobium (Rh.japonicum).