Brevet FR2498627A1 — publié le 19820730

La présente invention concerne un procédé permettant de suivre et mesurer en continu l'activité des microorganismes d'un milieu bactérien, et une installation pour mettre en oeuvre ce procédé, applicable d'une façon générale en génie biochimique et en particulier au contrôle et à la régulation des procédés mettant en jeu une activité bactérienne tels que : épuration biologique des eaux usées, fermentation, etc. En effet, il est important, dans ces différents procédés, de connaftre et de contrôler l'activité des microorganismes : par exemple, dans le procédé des boues activées, dont l'efficacité dépend étroitement de l'activité des microorganismes épurateurs, il est particulièrement utile de détecter toute baisse de cette activité dûe à la présence d'éléments toxiques dans l'eau à traiter ; de même, dans un procédé de fermentation il est intéressant de suivre l'évolution des produits formés au cours du processus de fermentation, fonction de l'activité des micro organismes. I1 existe à ce jour deux types de méthodes pour mesurer l'activité bactérienne : les premières, basées sur le dosage d'un constituant cellulaire -méthode à 1'A. T. P. ou adénosine triphosphate, à 1'A. D. N. ou acide désoxyribonucléique ou sur la mesure des activités enzymatiques -méthode au T. T. C. ou dosage par le chlorure 2-3-5 triphényltetrapolium des enzymes déshydrogénasiques, ou encore sur la microcalorimétrie, font appel à des analyses complexes peu adaptées au contrôle en continu par exemple pour la régulation d'une station d'épuration par boues activées ; en outre les paramètres mesurés ne sont pas reliés avec certitude à l'activité réelle de la masse bactérienne, et les résultats de ces procédés sont donc inexploitables. Une méthode plus fiable est basée sur la mesure de la consommation directe d'oxygène par les microorganismes et mise en oeuvre au moyen d'appareils dénommés respiromètres, de types divers, permettant de contrôler la variation de pression dans une enceinte fermée contenant un échantillon de la culture bactérienne, variation de à la consommation d'oxygène et à la production de gaz carbonique. Pour des raisons de simplicité de mise en oeuvre et d'interprétation des résultats, les seuls respiromètres permettant actuellement de suivre en continu et de façon fiable l'activité d'une biomasse en présence d'un substrat, comportent un support inerte sur lequel sont fixés les microorganismes.Ces appareils présentent plusieurs inconvénients ; en cas d'empoisonnement de la biomasse, il est nécessaire de procéder à un nouvel ensemencement ce qui exige des délais relativement longs ; ces appareils nécessitent en outre un dispositif complexe de nettoyage en continu du support inerte de façon à éviter une prolifération bactérienne excessive sur ce support s enfin on ne connalt pas avec précision la masse de microorganismes présents. Pour pallier ces inconvénients on a pensé à mesurer activité des microorganismes en se basant sur le principe bien connu des piles à combustible biologique décrit par Potter dès 1911 dans un article intitulé "Electrical effects accompanying the decomposition of organic compounds" paru dans la revue Pro. Roy. Soc. London (1911) n 84, p. 260 - 276, principe suivant lequel la dégradation d'un substrat organique par des microorganismes libère de l'énergie électrique en quantité directement mesurable. Des piles à combustible biologique ont déjà été décrites dans les publications de Cohen "The bacterial structure as an electrical hall cell Soc. am Bact. 32 annual meeting. J. Bacteriol. (1931) 21, p. 18-19, ainsi que de F.D. Sisler "Electrical energy from microbiological processus' J. Washington Academy of Sciences (196z) Nov. p. 181-187 et "Biochemical fuel cells" Progress in industrial microbiology (1962) p. 1-11 et dans les brevets américains n" 3 228 799, n 3 477 879, n" 3 284 239 et n 3 331 848 et le brevet anglais n" 981 803. Ces publications décrivent divers types de piles à combustible biologique, tous basés sur la faculté des microorganismes, par suite de leur activité enzymatique et donc métabolique, de modifier le potentiel d'oxydoréduction du milieu dans lequel ils se trouvent, le processus biologique s'effectue au niveau de l'anode et/ou de la cathode dans des compartiments dénommés demi-piles ; directement au niveau des électrodes dans une pile dite directe ou dans deux compartiments de la pile, séparés par une paroi qui laisse migrer les produits du métabolisme, dans une pile dite indirecte. Une modification de l'activité électrochimique du milieu constituant le combustible biologique par diminution ou augmentation relatives de la concentration en espèces électro chimiquement actives dans ce milieu, provoque des variations du potentiel d'électrode par rapport à celui qui existe dans le milieu de référence. L'intensité du courant produit dans de telles piles s'exprime par la relation dans laquelle Vc et Va représentent les potentiels à la cathode et à l'anode, r la résistance interne de la cellule, Re la résistance externe du circuit. Le procédé suivant l'invention, qui permet de suivre et de mesurer en continu l'évolution de l'activité des microorganismes d'un milieu bactérien en présence d'un substrat, est caractérisé essentiellement en ce qu'il consiste à utiliser une pile à combustible biologique. Avantageusement, et suivant une des caractéristiques de l'invention, le milieu bactérien est amené à traverser en continu la pile à combustible biologique, le courant électrique produit par la pile étant utilisé pour alimenter des moyens de mesure et/ou de régulation. Le procédé suivant l'invention peut être avantageusement mis en oeuvre au moyen d'une installation caractérisée en ce qu'elle comporte une pile à combustible biologique, des moyens pour alimenter en continu ladite pile en le milieu bactérien dont on veut suivre et mesurer l'activité, des moyens pour mesurer l'intensité du courant électrique produit et des moyens pour alimenter avec ce courant des moyens de mesure et/ou de régulation. La pile à combustible utilisée est de préférence du type à deux demi-piles, comportant un compartiment anodique et un compartiment cathodique séparés par une membrane sélective le compartiment anodique contenant une solution oxydante de référence constituée de préférence par une solution de ferri-cyanure de potassium, le compar timent cathodique alimenté en le milieu bactérien dont on veut mesurer l'activité, étant muni d'un agitateur ; les électrodes disposées dans chaque compartiment sont de préférence en platine irridié. Le procédé permet en particulier de suivre et de contrôler les mesures et procédés utilisant l'activité bactérienne : contrôle et régulation de l'épuration biologique des eaux usées ; contrôle et régtiiation des procédés de fermentation utilisés par exemple dans les industries alimentaires et pharmaceutiques ; mesure de la pollution biodégradable contenue dans une eau. On a décrit ci-après un exemple de réalisation d'une installation permettant de mettre en oeuvre le procédé suivant l invention, étant précisé que cet exemple n'a rien de limitatif, toutes autres formes, proportions et dispositions pouvant être adoptées sans sortir du cadre de l'invention. Au cours de cette description, on se réfère aux dessins cijoint, sur lesquels: La figure 1 représente une vue schématique d'une installation de mesure de l'activité des microorganismes suivant l'invention, la figure 2 represente, en vue de profil, le compartiment cathodique de la pile à combustible biologique utilisée dans l'installation. Comme on le voit sur les dessins, l'installation comporte une pile à combustible biologique 1, constituée par deux demi-piles 2, permettant une capacité et une surface de contact maximales pour un moindre encombrement entre les deux compartiments anodique 3 et cathodique 4. Chaque demi-pile est maintenue à température constante par circulation d'eau dans une enveloppe double, (non représentée); pour éviter que les électrodes 5 ne soient en contact avec l'air, ce qui perturberait les mesures, l'air est évacué par un évent 6 (Figure 2). Deux colliers métalliques 7 assemblent les demi-piles séparées par une membrane échangeuse d'ions 8 ; l'étanchéité étant assurée par des joints en matière plastique 9 maintenant à bonne distance la membrane 8 et les deux électrodes en platine. De la sorte les deux compartiments anodique et cathodique ne sont en communication que par l'intermédiaire de la membrane sélective. Le compartiment anodique est empli d'une solution oxydante de référence. Le compartiment catho dique est alimenté en milieu bactérien par une tuyauterie 10, à partir d'un bac ll au moyen d'une pompe 12 le milieu bactérien étant recyclé dans le bac 11 par la tuyauterie de sortie 13. La demi-pile comporte en outre une ouverture rodée 14 pour l'introduction de l'arbre de l'hélice d'un agitateur 15. Le compartiment anodique est empli d'une solution de référence oxydante ; dans le compartiment cathodique circule en continu la culture bactérienne dont on mesure l'activité. Les électrodes 5 sont reliées par les conducteurs 5a à un microampèremètre 16, lui-même reiié à un système enregistreur classique 17. On va maintenant donner quelques exemples, non limitatifs eux aussi d'applications du procédé et de l'installation suivant l'invention: Application au contrôle et à la régulation de l'épuration des eaux par voie biologique. Exemple 1 Cet exemple se rapporte au contrôle du fonctionnement d'une station d'épuration d'eaux usées par le procédé des boues activées. Les essais auxquels on a procédé ont été effectués dans une installation comportant une pile à combustible biologique constituée par deux demi 3 cellules de 150 cm , munie chacune d'une électrode de platine irridié 2 de 11 cm de diamètre et de 75 cm de surface utile, les deux électro- des étant distantes de 1, 5 cm.Les électrodes étaient constituées de mailles de fil de platine de diamètre 0, 16 mm à raison de 196 mailles 2 2 par cm , le poids de l'électrode par unité de surface étant de 0, 14 g/cm La membrane sélective séparant les compartiments anodique et z cathodique était une membrane cationique "SELEMION CMV" de 78 cm On a utilisé comme solution de référence une solution de ferricyanure de potassium de concentration 0, 01 M dans un tampon phosphate de pH 6, 8 préparée par mélange volume à volume de deux solutions de base KH2PO4 à 9,078 g/l et Na2HPO4, 2H20 à 11, 876 g/l. On a alimenté en continu la pile à combustible biologique avec un débit de 65 ml/mn, à partir d'un bac mélangeur contenant 1 500 mg de boues activées auxquelles on a ajouté successivement par fractions de 500 ml une eau résiduaire constituant le substrat des microorgat nismes contenus dans les boues activées, cette eau résiduaire contenant de 250 à 10 000 mg de DCO. On a obtenu dans la pile une variation d'intensité de courant de 13 à 30/go. On a alors ajouté au substrat 300 mg/l de formol de façon à ce que la concentration en formol dans la pile soit de 60 mg/l au moment de la réaction. L'intensité du courant dans la pile a commencé à baisser 40 à 50 mn après l'addition de formol au substrat, et est tombée brusquement de 30rut A à l0/À dès l'arrivée du formol dans la pile pour continuer de décroître lentement jusqu'à 5rA. De la même façon on a injecté dans le substrat 3 mg/l de cyanure, la concentration en cyanure dans la pile étant de 0, 6 mg/l. L'intensité du courant est tombée brusquement de 45#A à moins de 1O/GcA dès l'arrivée du cyanure dans la pile. Les seuils de toxicité en formol et en cyanure étaient dans ces deux cas dépassés dans l'eau résiduaire utilisée. On a procédé dans les mêmes conditions à une injection de chromate de potassium à 1 mg/l, soit de 0, 27 mg/l de chrome et observé une légère chute de l'intensité du courant dans la pile de 18 à lytA ; cette intensité croît ensuite de nouveau légèrement. Une deuxième injection de chromate de potassium à 2, 7 mg/l de chrome se traduit ensuite par une baisse régulière de l'intensité de courant jusqu'à l0A et au-delà, cette baisse n'étant pas affectée par des injections ultérieures de chrome. On peut en conclure que le seuil de toxicité en chrome se situe entre 0, 27 et 2, 7 mg/l. De même, une injection de 5 ml d'eau de Javel au 1/10 soit 14 mg/l de chlore actif s'est traduitepar une baisse de l'intensité du courant dans la pile, puis une légère remontée. Deux injections successives de la même quantité de chlore ont entraîné une baisse régulière de l'intensité. Une injection plus importante de 140 mg/l de chlore actif a entraidé une chute de l'intensité du courant dans la pile de 14/A à une valeur pratiquement nulle. Ainsi, l'addition d'un élément toxique dans le substrat s'est traduite immédiatement par une chute de l'intensité du courant produit dans la pile, correspondant à une baisse du métabolisme bactérien. Le seuil de sensibilité et la rapidité de la réponse de la pile sont très nets. Cette installation, suivant l'invention, disposée en amont du bassin de traitement par boues activées d'une station d'épuration d'eaux usées permet donc de détecter rapidement l'arrivée massive de toxiques tels que formol, chrome, cyanures, chlore, etc. . . sur une station. Le dispositif est alors alimenté à partir d'un bac mélangeur recevant l'eau à épurer et les boues activées provenant du bassin de traitement. En cas de baisse de l'intensité de courant enregistrée dans la pile qui signifie baisse de l'activité des microorganismes donc arrivée de toxiques dans l'eau à épurer, une alarme et un système automatique permettent la dérivation de l'eau à épurer toxique vers un stockage, pour éviter toute perturbation du fonctionnement de la station. Cette eau est ensuite épurée ultérieurement à faible débit L'invention est donc particulièrement intéressante dans son application au contrôle et à la régulation des stations de traitement d'eaux usées par les boues activées. Application de l'invention au contrôle et à la régulation de procédés de fermentation. Exemple 2 On a utilisé une installation comportant la même pile à combustible que dans l'exemple 1 pour contrôler une fermentation lactique, en particulier pour contrôler les facteurs qui règlent l'acidification bactérienne. Pour cela, on a alimenté en continu la pile à combustible biologique à partir d'un flacon contenant 500 ml de lait, maintenu à température constante de 25 C, température optima de développement des germes mésophiles. On a mesuré en fonction du temps l'intensité du courant obtenu dans la pile, et par ailleurs le pH et le degré Dornic (degré d'acidité organique) du milieu. On a ainsi observe, en I' espace de 12 heures, une intensité de courant allant de 5A A à 110/gA pour un pH variant dans le meme temps de 6, 4 à 5, 1 et un degré Dornic variant de 10 à 50. Exemple 3 On a également utilisé une installation suivant l'invention pour contrôler l'injection d'antibiotiques dans le lait. Dans 500 ml de lait on a injecté des doses successives d'antibiotiques "Dicoplan T" contenant 500 mg de cloxacilline benzathine (C), 100 mg d'ampicilline base (A) et 200 mg de néomycine base (N) à raison de 1 ppm de C, 0, 2 ppm de A et 0, 8 ppm de N par injection. On a mesuré l'intensité de courant obtenu dans la pile à combustible en fonction du temps ainsi que le pH et le degré Dornic du milieu. Chaque injection d'antibiotique se traduit par une baisse sensible de l'intensité du courant pendant un certain temps, puis une remontée légère, puis à nouveau une baisse, etc..., donnant une série de paliers, chaque palier précédent une baisse du pH et une augmentation du degré Dornic. Ainsi une première injection, après 2H45 mn a donne bac de O, 5A A pendant 8 mn puis une remontée de 2A pendant 42 mn une deuxième injection a provoqué une baisse de 2, 5AA pendant 21 mn et une remontée de 2A pendant 35 mn, etc... Cette baisse et cette augmentation de courant après l'injection d'antibiotique traduisent la sélection de germes antibiorésistants qui s'opère dans le milieu. On peut ainsi matérialiser l'évolution de la composition de la flore bactérienne au cours du temps. L'invention est ainsi particulièrement intéressante dans son application au contrôle des inhibiteurs de la fermentation, et à l'évolution de tout processus de fermentation et présente l'avantage d'une très grande rapidité et d'une extrême sensibilité de réponse qui permettent de percevoir la moindre contamination du milieu. Le procédé et l'installation suivant l'invention trouvent également une application dans la mesure de la pollution biodégradable contenue dans une eau, généralement effectuée par la mesure de la demande bio logique en oxygène (DBO ) dont le délai de réponse est de 5 jours. 5 La rapidité de la réponse de la pile, de quelques minutes à quelques heures, en fait une technique particulièrement intéressante pour la mesure de la DBO, la corrélation intensité de courant - DBO étant immédiate. REVENDICATIONS I - Procédé pour suivre et mesurer en continu l'évolution de l'activité des microorganismes d'un milieu bactérien en présence d'un substrat, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser une pile à combustible biologique. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les microorganismes et le substrat sont amenés à traverser en continu la pile à combustibl biologique, le courant électrique produit par la pile étant utilisé pour alimenter des moyens de mesure et/ou de régulation. 3 - Installation pour mettre en oeuvre le procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce quelle comporte une pile à combustible biologique, des moyens pour alimenter en continu ladite pile en un milieu bactérien à contrôler, et des moyens pour alimenter avec le courant produit par la pile des moyens de mesure et/ou de régulation. 4 - Installation suivant la revendication 3, caractérisée en ce que la pile à combustible biologique est munie d'un agitateur disposé dans le compartiment contenant les microorganismes et leur substrat. 5 - Installation suivant l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisée en ce que la pile à combustible biologique est munie d'électrodes en platine irridié. 6 - Installation suivant l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que l'un des compartiments de la pile à combustible biologique contient une solution oxydante de référence constituée avantageusement par du ferricyanure de potassium. 7 - Application du procédé et de l'installation suivant l'une quelconque des revendications précédentes, au contrôle et à la régulation de l'épuration biologique des eaux usées. 8 - Application du procédé et de l'installation suivant l'une quelconque des revendications précédentes au contrôle et à la régulation des procédés de fermentation. 9 - Application du procédé et de l'installation suivant l'une quelconque des revendications précédentes à la mesure de la pollution biodégradable contenue dans une eau usée.