Brevet FR2509748A1 — publié le 19830121

La présente invention concerne essentiellement un procédé de production d'aminoacides, en continu par emploi d'une souche bactérienne sélectionnée adsorbée sur un support poreux et les aminoacides obtenus par ledit procédé. On connait ddJà divers procédés de fermentation utilisés pour la production d'aminoacides. Ces procédés sont en général des procédés discontinus réclamant un volume important de réacteur en raison de leur faible productivité. De plus, dans ces procédés, une partie importante de la source de carbone utilisée sert à la production de biomasse, ce qui donne pour l'ensemble du procédé un rendement nettement inférieur au rendement thdorique de la production de l'acide aminé lui-même. I1 a dé3à été obtenu une amélioration importante au procédé de production d'aminoacides par fermentation en utilisant un procédé de production sur un réacteur à cellules vivantes immobilisées. Des procédés faisant appel à des cellules immobilisées ont déjà été décrits pour la production d'aminoacides dans le cas où la réaction est une bioconversion. On pourra citer à titre d'exemple les procédés décrits par la firme Tanabe : - dans le brevet américain No. 3 886 040 pour la production de citrulline - dans la revue Enzymes and Microbial Techn. (1979), vol. 1 page 95, ou dana la revue Methods in Enzymology Ed. : Academic Pressa, (1976) page 739 pour la production d'acide aspartique. Dans ce cas, les cellules immobilisées ne représentent qu'une forme brute de préparation enzymatique capable de catalyser une ou deux réactions successives seulement tandis que dans ces procédés, la biomasse n'est pas capable de se reproduire. D'ailleurs, ce que l'on attend des cellules dans ce type de procédés est qu'elles fassent de l'enzyme et non pas qu'elles se reproduisent. En particulier, si on désire opérer une fermentation continue, ce qui présente des avantages considérables dans la sise en oeuvre de matériel et dans l'exploitation de la fabrication, on est amené à soutirer du fermenteur une suspension dans laquelle le taux de biomasse est trXs important par rapport au taux d'acide aminé présent. Pour que la fermentation se poursuive, la biomasse soutirée doit continuellement être renouvelée par croissance de la souche au détriment de la source de matières nutritives, ce qui induit un rendement global de production d'acide aminé extrêmement faible. La présente invention a donc pour but d'apporter une amélioration décisive aux procédés de production d'amino- acides en prévoyant une solution qui permette de fixer ou d'immobiliser la biomasse de telle sorte qu'elle reste une biomasse vivante et qu'elle soit ainsi capable de se développer et de catalyser un ensemble important de réactions successives allant de l'assimilation des diverses sources nutritives, notamment de la source de carbone qui est en général de l'hydrate de carbone ; à l'excrétion de l'aminoacide désiré, avec production et régénération des cofacteurs nécessaires à la réaction. Cette solution consiste selon la présente invention en un procédé de production d'aminoacides en continu, comprenant 1' uctilisation d'au moins une souche bactérienne sélectionnée à cet effet en combinaison avec un milieu nutritif ou de fermentation approprié contenant les sources néoessaires telles que source de carbone assinilable, source d'azote organique, et des sels minéraux, par fermentation aérobie, caractérisé selon l'invention en çe que, en vue d'accrotre les performances de productivité et de rendement de la souche bactérienne pour la production d'aminoacides relativement au milieu de fermentation avec production et régénération des cofacteurs nécessaires à la réaction, ledit procédé comprend les étapes suivantes:: - on adsorbe des cellules vivantes de souche bactérienne sur un support poreux approprié disposé dans au moins une zone réactionnelle pour les fixer sur ledit support poreux tout en conservant la biomasse vivante - on alimente ladite zone réactionnelle, en continu, avec ledit milieu de fermentation tout en maintenant dans ladite zone réactionnelle une température de réaction convenable de préférence comprise entre 13 et 600C, et sous aération convenable pour assurer la fourniture de l'oxygène nécessaire à la réaction - on soutire, en continu, du milieu fermenté ayant traversé la zone réactionnelle, et - on traite ledit milieu fermenté pour en extraire l'aminoacide produit dans ladite zone réactionnelle que l'on récupère. Selon un mode de réalisation actuellement préféré de ce procédé, la zone réactionnelle est sensiblement verticalement disposée, l'alimentation en milieu de fermentation + ant réalisée à la partie supérieure de ladite zone réactionnelle, le soutirage du milieu fermenté précité étant réalisé à la partie inférieure de ladite zone réactionnelle tandis que l'alimentation en air est réalisée à la partie inférieure de ladite zone réactionnelle. De préférence, selon le procédé de l'invention on réalise l'opération d'adsorption précitée des cellules vivantes de souche bactérienne en disposant dans la zone réactionnelle au préalable le support poreux de manière à ce qu'il occupe au moins partiellement le volume de la zone réactionnelle puis en introduisant en continu ledit milieu de fermentation inoculé avec une culture de la souche bactérienne Jusqutà obtention d'un équilibre à partir duquel l'alimentation est réalisée avec un milieu de fermentation identique non inoculé0 On notera que la zone réactionnelle peut être complètement occupée par le support poreux car la matière poreuse laisse passer le milieu nutritif (éventuellement ensemencé) ce qui permet d'accroître le volume utile de la zone réactionnelle et de là le rendement du procédé. Avantageusement, on réalise l'inoculation à un taux de 0,1 à 10% en poids de culture de souche bactérienne par rapport au milieu de fermentation. Selon une autre caractéristique de ce procédé, l'introduction du milieu de fermentation est réalisée avec un débit tel que le temps de séjour moyen dans la zone réactionnelle est compris entre 1 et 40 heures, de préférence entre 5 et 20 heures. Par ailleurs, selon une autre caractéristique de ce procédé, avantageusement on réalise un recyclage de tout ou partie de l'effluent formé par le milieu fermenté extrait de I 'aminoacide produit dans la zone réactionnelle afin d'utiliser au maximum les sources nutritives non métabo- lisées, et en particulier les hydrates de carbone non métabolisés, et ce principalement dans la phase de mise en équilibre qui peut être longue et s'étendre sur une période allant de 1 à 40 ours. Selon une caractéristique préférentielle, la température optillnrr de production de la souche bactérienne est avantageusement comprise entre 30 et 40 Oc. Selon une autre caractéristique préférentielle, le domaine de pH est maintenu dans la zone réactionnelle entre 5 et 9 et de préférence entre 6 et 8. Par ailleurs, pour assurer l'aération suffisante de la zone réactionnelle on peut réaliser un passage continu ou une pulsion périodique, d'air ou d'un gaz contenant de l'oxygène ou de l'oxygène pur au travers de la zone réactionnelle à des taux compris entre 0,2 et 2 wi (volume d'air/volume de la zone réactionnelle/minute). Comte support poreux utilisable dans la présente invention on peut utiliser toute substance poreuse capable d'adsorber les micro-organismes de manière à ce que les cellules fixées puissent former une biomasse vivante capable de oe développer et de catalyser un ensemble importent de réactions successives allant notamment de l'assimilation de l'hydrate de carbone, à l'excrétion de l'aminoacide désiré, avec production et rbgénération des cofacteurs nécessaires à la réaction. On préfère utiliser actuellement comme support poreux les supports poreux choisis parmi la brique poreuse, les raffles de mats, les céramiques poreuses et les silicates de fer et d'aluminium et par extension tout support capable d'adsorber les bactéries. Le procédé selon la présente invention offre ainsi, comme avantages décisifs relativement aux procédés antérieurs, une faible production de biomasse et un accroissement inattendu du rendement en aminoacides par gramme de milieu de fermentation. Ce phénomène n'est pas encore complètement compris mais il est clair que le procédé selon la présente invention permet d'accroitre de manière tout à fait inattendue et remarquable les performances de productivité et de rendement de la souche bactérienne. Parmi les conditions de fermentation permettant de jouer sur la sélectivité du procédé, on peut citer entre autres les conditions d'aération, le contrtie de la température et du pH dans la zone réactionnelle, la nature du support poreux, ainsi que bien entendu, la nature du milieu nutritif ou de fermentation utilisé. On a pu ainsi observer que par rapport au procédé de fermentation en discontinu permettant de produire 40 g/l d'acide aminé en 80 heures de fergentation à partir d'un milieu de fermentation comprenant 120 g/l d'hydrate de carbone, le passage à un procédé de fermentation continu classique permet d'obtenir 5g/l d'acide aminé avec une production de biomasse de 25 g/l pour un temps de séjour de 30 heures, à partir de 90 g/l d'hydrate de carbone. Par contre, à l'aide du procédé faisant l'objet de la présente invention, on aboutit à la production remarquable de 10 g/l d'aeide aminé avec une fuite de biomasse seulement de l'ordre de 5 g/l et un temps de séjour de 8 heures dans la zone réactionnelle tout en partant d'un milieu de fermentation comprenant également 90 g/l d'hydrate de carbone. On peut noter que ce résultat est remarquable et tout à fait inattendu et qu'il permet par ailleurs de réduire d'une manière remarquable le temps de séjour nécessaire dans la zone réactionnelle. Divers exesples seront maintenant donnés à titre illustratif, lesdits exemples ne pouvant en aucune façon limiter la portée de la présente invention. Exemple 1. Cet exemple est relatif à un procédé de production de valine par fermentation discontinue classique en utilisant une souche de Corynebacterium glutamicum déposée à l'institut Pasteur le 14 Avril 1976 sous le No. 10 26, dans un réacteur contenant un milieu nutritif constitué de - mélasse qsp .......................90 g/l sucre - acétate d'ammonium ................30 g/l - KH2PO4............................. 0,5 g/l - K2HPO4............................. 0,5 g/l - MgSO4, 7 H2O....................... 0,25 g/l - MnSO4, H2O......................... 10 mg/l - FeSO4, 7 H2O....................... 10 mg/l - biotine ........................... 30 }/l - thiamine .......................... 100 - CaCO3............................. 30 g/l. Le pH du milieu est ajusté à 7,2 à l'aide de soude. On réalise une incubation pendant 72 heures à 300C et on extrait la valine du milieu de fermentation par des doyens classiques tels que par extraction par résine échangeuse d'ion. On obtient un rendement de valine égal à 25 g/l. Exemple 2. Cet exemple est relatif à la production de valine par fermentation continue classique en utilisant la souche de Corynebacterium glutamicum de l'exemple 1 dans un réacteur conforme à celui représenté à la figure 1 constitué d'une colonne de I litre de volume utile et de 2,5 1 de volume total ayant un diamètre extérieur de 7,5 cm et un diamètre de la colonne intérieure égal à 5,3 cm. On utilise un milieu identique à celui de l'exemple 1 que l'on introduit par les moyens d'alimentation 1 et que l'on soutire par les moyens de soutirage 2 à un débit de 40 ml/h. On alimente de l'air par les moyens d'alimentation 3 qui est soutiré par les moyens de soutirage de l'air 4 un débit de 1,5 l/mn. On contrôle la température pour la maintenir précisément à 33eC dans le réacteur à l'aide des moyens de contrôle de température 6. On obtient une production de biomasse de 15 g/l dans le milieu fermenté soutiré par les moyens 2, une teneur en sucre résiduelle de 30 g/l et une production de valine de 5 g/l. Exemple 3. Cet exemple est relatif à la production de valine conformément au procédé selon la présente invention en utilisant l'installation selon la présente invention représentée à la figure 2. On utilise la souche de Corynebacterium glutamicum de l'exemple 1. déposée à l'institut Pasteur sous le No. IO 26. Le réacteur selon l'invention 10 comprend par exemple une colonne 12 de 2 1 de volume total et de 1 1 de volume utile, c'est-à-dire que la colonne est remplie à moitié de support poreux 14 qui est dans le présent exemple constitué par du silicate d'aluminium et de fer. Le milieu de fermentation utilisé est identique à celui de l'exemple 1 et est introduit par les moyens d'alimentation 16 et soutiré après fermentation par les moyens de soutirage 18 tandis que de l'air est introduit par les moyens d'alimentation 20 et soutiré par les moyens de soutirage d'air 22 à un débit de 0,8 l/mn à l'aide de moyens permettant d'introduire cet air par pulsation. L'adsorption des cellules de Corynebacterium glutamicum est réalisée comme mentionné précédemment dans la partie introductive de la description par inoculation dans le milieu de fermentation puis après obtention de 1' équilibre le milieu de fermentation est introduit non inoculé, La température est contrôlée par tout système 24 d'échange de chaleur adapté tel que par exemple par la prévision d'une double enveloppe. Le débit du milieu de fermentation à régime continu est de 120 ml/h. La colonne ayant un diamètre de 7,5 ci comme celle de l'exemple 2. La production de biomasse est remarquablement faible et est de l'ordre de 5 g/l, la teneur en sucre résiduel du milieu fermenté soutiré par les moyens de soutirage 18 est de 30 gil tandis que la production de valine est de 10 g/i. Exemple 4. Cet exemple concerne la production de lysine par fermentation continue classique en utilisant une souche de Corynebacterium glutamicum déposée à 1' Institut Pasteur le 6 Juillet 1981 sous le No. I 165. Le réacteur utilisé est identique à celui de l'exemple 1 qui est représenté en figure 1. Le milieu utilisé est le suivant: - mélasse qsp ........................70 g/l sucre - liqueur de macération de ma#s ......20 g/l - (NH4)2 SO4..........................80 g/l - KH2PO4.............................. 1 g/l - MgSO4 .............................. 0,2 g/l - MnSO4 .............................. 0,01 g/l - FeSO4 .............................. 0,01 g/l - thiamine ........................... 100 #/l. Le pH du milieu est ajusté à 7,2 à l'aide de NaOH. Le débit du milieu de fermentation en régime continu est de 40 rl/h. On obtient une production de biomasse de 16 g/l dans le milieu fermenté, une teneur en sucre résiduel de 20 g/l et une production de lysine de 4 g/l. Exemple 5. Cet exemple est relatif à la production de lysine par fermentation continue à l'aide du procédé selon la présente invention. On réalise l'adsorption des cellules de ladite souche bactérienne Corynebacterium glutamicun de l'exemple 4, sur un support poreux identique à celui de l'exemple 3 dans le réacteur de l'exemple 3 représenté à la figure 2. Le milieu de fermentation utilisé dans le procédé de l'invention est celui de l'exemple 4. Le débit du milieu en régime continu est de 100 ml/h, ce qui est deux fois 1/2 le débit utilisé dans l'exemple 4. La production de biomasse dans le milieu fermenté soutird est de 10 g/l, la teneur en sucre résiduel de 20 g/l et la production de lysine est de 8 g/l ce qui est le double de la production obtenue par le procédé classique de l'exemple 4 avec un débit deux fois 1/2 plus élevé, ce qui est remarquable. Exemple 6. Cet exemple est relatif à la production de thréonine par fermentation continue classique. La souche utilisée est une souche de Corynebacterium glutamicum déposée à l'Institut Pasteur Le 6Juillet 1981 sous le No. I 166 Le réacteur utilisé est celui de l'exemple 2. On utilise le milieu de fermentation suivant : - mélasse qsp .....................70 g/l sucre - (NH4)2SO4 ................ 0e O O 0 O O 15 gil - KH2P04 ......................... e 1 g/l - K2HPO4 ...........................2 g/l - MgSO4 ............................0,4 g/l - MIlSO4 000 O OC O O C O C C O O 0 C C 0 00 C O C CC C C O 10 mg /l - FeSO4 ............................ 10 mg/l - thiamine .......................... 100 #/g - biotine ..................... 10 - CaC03 Ce CC C CC C O O 000 O O CC O C C O e O 25 g/l Le pH du milieu est ajusté à 8,1 à l'aide de soude. Le débit du milieu de fermentation en régime continu est de 25 ml/h, la production de biomasse est de 15 g/l dans le milieu fermenté soutiré et la teneur en sucre résiduel est de 10 g/l. On obtient une production de thréonine de 2 g/l. Exemple 7. Cet exemple est relatif à la production de thréonine par fermentation continue selon le procédé de la présente invention colportant l'adsorption des cellules de la souche bactérienne qui est en l'occurrence la souche Corynebacterium glutamicum de l'exemple 6. Le réacteur utilisé est celui de exemple 3 tandis que le milieu de fermentation à utiliser est celui de l'exemple 6, le support poreux étant quant à lui celui de l'exemple 3. Le débit du milieu de fermentation en régime continu est de 100 ml/h. La production de biomasse dans le milieu fermenté soutiré est de 5g/l, la teneur en sucre résiduelle de 5 g/l et la production de thréonine est de 7 g/l, ce qui est remarquable. Exemple 8. Cet exemple est relatif à la production de valine par fermentation continue selon le procédé de la présente invention comportant l'adsorption des cellules sur un support poreux. Dans ce cas la souche utilisée est le Corynebacterium glutamicum utilisé aux exemples 1 à 3 que l'on adsorbe sur un support poreux constitué par des raffles de malus disposés dans le réacteur de l'exemple 3. Le milieu de fermentation utilisé est celui de l'exemple le Les conditions de fermentation sont identiques à celles de l'exemple 3 sauf que le débit du milieu de fermentation en régime continu est de 90 ml/h. La production de biomasse dans le milieu fermenté soutiré est de 10 g/l, la teneur en sucre résiduelle est de 25 g/l et la production de valine est de 8 g/l. REVENDICATIONS le Procédé de production d'aminoacides, de préférence en continu, comprenant l'utilisation d'au moins une souche bactérienne sélectionnée à cet effet en combinaison avec un milieu nutritif ou de fermentation approprié contenant les sources nécessaires telles que source de carbone assimilable, source d'azote organique, et des sels minéraux, par fermentation aérobie, caractérisé en ce que, en vue d'accroître les performances de productivité et de rendement de la souche bactérienne pour la production d'aminoacides relativement au milieu de fermentation avec production et régénération des cofacteurs nécessaires à la réaction, ledit procédé comprend les étapes suivantes - on adsorbe des cellules vivantes de souche bactérienne sur un support poreux approprié disposé dans au rotins une zone réactionnelle pour les fixer sur ledit support tout en conservant la biomasse vivante - on alimente ladite zone réactionnelle, en continu J avec ledit milieu de fermentation tout en maintenant dans ladite zone réactionnelle une température de réaction convenable,- de préférence comprise entre 15 et 600C, sous aération convenable pour assurer la fourniture de l'oxygbne.nécessaire à la réaction; - on soutire, en continu , du milieu fermenté ayant traversé la zone réactionnelle ; et - on traite ledit milieu fermenté pour en extraire l'aminoacide produit dans ladite zone réactionnelle que l'on récupère. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la zone réactionnelle est sensiblement verticalement disposée, l'alimentation en milieu de fermentation étant réalisée à la partie supérieure de la zone réactionnelle, le soutirage du milieu fermenté étant réalisé à la partie inférieure de ladite zone réactionnelle, l'alimentation en air ou en gaz contenant de I oxygène, ou de l'oxygène pur étant réalisée à la partie inférieure de ladite zone réactionnelle et son soutirage à la partie supérieure de celle-ci. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on réalise l'opération d'adsorption précitée des cellules vivantes de la souche bactérienne en disposant dans la zone réactionnelle au préalable le support poreux de manière à ce qu'il occupe au mo@@@s en partie le volume de la zone réactionnelle puis en introduisant, de préf6- rence en continu, ledit milieu de fermentation inoculé avec une culture de la souche bactérienne jusqu'à obtention d'un équilibre à partir duquel l'alimentation est réalisée avec le milieu de fermentation identique non inoculd. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on réalise une inoculation à un taux de 0,1 à 10% en poids de culture de la souche bactérienne par rapport au milieu de fermentation0 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on réalise l'introduction de milieu de fermentation à.un débit tel que le temps de séjour moyen est compris entre 1 heure et 40 heures, et de préférence entre 5 et 20 heures. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le support poreux précité est choisi parmi la brique poreuse, les raffles de maTs, les céramiques poreuses, les silicates de fer et d'aluminium. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on réalise un recyclage de tout ou partie de 1' effluent constitué par le milieu fermenté extrait de l'aminoacide produit dans la zone réactionnelle afin de ne pas gaspilLer les sources nutritives non mdtabolisées. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on maintient la température dans la zone réactionnelle comprise entre 30 et 40 C. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, utilisé pour la production de valine, caractérisé en ce qu'on utilise une souche de Corynebacterium glutamicum déposée à 1' Institut Pasteur le 14 Avril 1976 sous le no. I026. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la production de lysine, caractérisé en ce qu'on utilise une souche de Corybacterium glutamicum déposée à l'Institut Pasteur le 6 Juillet 1981 sous le No. I 165. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la production de thréonine, caractérisé en ce qu'on utilise une souche de Corynebacterium glutamicum déposée à 1'Institut Pasteur le 6Juillet 1981 sous le No. I 166. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'on maintient le pH dans la zone réactionnelle compris entre 5 et 9 et de préférence entre 6 et 8. 13. Aminoacides, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.