Brevet FR2499414A1 — publié le 19820813

La présente invention concerne un procédé pour la production d'anticorps protéiniques humains, ci-après désignés en raccourci par "anticorps". Des anticorps ont été préparés,de manière clas- sique, par injection d'une protéine humaine dans un ani- mal à sang chaud, suivie de la récolte des anticorps pro- duits, à partir du sérum de cet animal. Toutefois, ces procédés classiques sont difficiles à ap- pliquer pour la production d'anticorps de grande pureté, à l'échelle industrielle, en raison des faits suivants s 1) le procédé nécessite habituellement une grande quantité de protéine humaine, qui agit comme un antigène pour la production d'anticorps g 2) l'injection de la protéine dans l'animal à sang chaud, provoque souvent un choc anaphylactique, avec mort ulté- rieure g 3) on ne peut produire qu'une petite quantité d'anticorps, et cet anticorps est souvent souillé. La présente invention permet d'éviter ces incon- vénients de l'art antérieur, et d'obtenir une grande quan- tité d'anticorps, 4 à 100 fois plus ou même davantage que par les procédés classiques, de pureté et de spécificité élevée, grâce à une plus forte induction de leur produc- tion dans les cellules d'animaux à sang chaud capables de les produire, par injection à ces animaux d'un produit con- jugué saccharide-protéine humaine, obtenu par liaison de covalence entre cette protéine et un saccharide. L'anti- corps résultant réagit de manière spécifique sur la protéi- ne humaine. L'augmentation de la production d'anticorps se- rait due à la formation d'une grande quantité d'immunoglo- buline G, tandis que la formation d'immunoglobuline E, res- ponsable du choc anaphylactique, est très diminuée ou même supprimée; avantageusement disparaît le danger de choc ana- phylactique ou de maladies allergiques chez l'animal. Le nouveau procédé selon l'invention de produc- tion d'anticorps humains protéiniques qui consiste à in- duire cette production dans des cellules d'animaux à sang chaud, capables de produire ces anticorps, par injection de la protéine humaine, puis à récolter les anticorps protéiniques humains résultants, est caractérisé en ce que la protéine humaine injectée est un produit conjugué saccharide-protéine humaine obtenu par liaison de cova- lence entre les deux constituants. Au cours de la présente description, on entend par "protéine humaine", une protéine ou substance pro- téinique humaine qui provient de certains fluides corpo- rels ou tissus humains, et qui agit comme un antigène lors de son injection chez un animal à sang chaud, en vue de la production d'anticorps. Entrent dans cette appellation des enzymes, hormones, lymphokines, immunoglobulines, sé- rum et composants du sang, tumeur maligne, urine, sueur, endomètre, placenta, fluide séminal, toutes substances qui sont habituellement purifiées avant leur fixation par covalence au saccharide, au moyen d'un ou plusieurs modes opératoires dont filtration, lavage, centrifugation, re- largage, adsorption et désorption avec un adsorbant, fil- tration sur gel, chromatographie par échange d'ion, chroma- tographie par affinité et électrophorèse. Le mot "saccharide", tel quiutilisé dans la pré- sente description, comprend différents polysaccharides comme amidon, amylose, dextrane, polysucrose ou Ficoll (fabriqué par Pharmacia Fine Chemicais AB, Suède), pullu- lane, elsinane, curdlane, gomme arabique, gomme adragante, gomme guar, gomme xanthane, cellulose, glucomannane, chi- tosane, et hydrolysats partiels de ces différents polysac- charides, ayant un poids moléculaire moyen compris entre 1000 et 10 000 000, de préférence de l'ordre de 10 000 à 1 000 000. En particulier, l'utilisation d'elsinane, de pullulane non-ioniques ou de leurs hydrolysats partiels constitués principalement de motifs maltotriose répétés, aboutit avantageusement à une très forte augmentation de la formation d'immunoglobuline G, laquelle réagit de ma- nière spécifique avec la protéine humaine, et soit à une remarquable réduction de l'immunoglobuline E responsable du choc anaphylactique, ou à sa suppression pratiquement totale, après la fixation par covalence sur la protéine humaine. En ce qui concerne le procédé utilisé pour réaliser la liaison de covalence, on peut, conformément à l'invention, utiliser tout procédé dans la mesure o il entraIne la formation de liaison de covalence entre la protéine humaine et le saccharide. Les procédés préférés sont les procédés par diazotation, peptidisation, alky- lation, réticulation et disulfuration. Les groupements fonctionnels utilisables au cours du procédé par diazotation sont les groupements p-aminobenzyle, p-aminobenzoyle, m-aminobenzyle, m-amino- benzoyle, m-aminoanisoyle, m-aminobenzyloxyméthyle, (p-aminophénoxy)-3 hydroxy-2 propionyle, (p-amino m-mé- thylanilino)-3 chloro-5 triazinyle, ainsi que d'autres groupements amino aromatiques, et les dérivés de saccha- ride dotés de ces groupements selon un procédé classique, réagissent facilement par copulation avec une protéine humaine, pour former un produit conjugué saccharide-pro- téine humaine. Les saccharidesutilisables pour le procédé par peptidisation, sont des dérivés de carbonate, tels que azide d'acide, chlorure d'acide, carbodiimide, isocyanate et imidoester, y compris les saccharides activés par BrCN, qui agissent comme un saccharide activé lorie la réaction de conjugaison avec une protéine humaine. Pour le procédé par alkylation, on peut utiliser comme saccharide des dérivés d'halogénure d'alkyle comme les dérivés de chlorobromo-, ou iodo-acétyle, ou des dé- rivés d'halogénure de triazinyle, qui réalisent au mieux la réaction d'alkylation avec une protéine humaine. Les procédés par réticulation que l'on peut utiliser conformément à l'invention, comprennent la for- mation de liaisons réticulées entre une protéine humaine et un saccharide, en présence d'un agent de réticulation tel que glutaraldéhyde, glyoxal, succindialdéhyde, diiso- cyanate d'héxaméthylène, diisocyanate de toluène-2,4, bis-azobenzidine ou N,N'-éthylène bis-maléimide. Les proportions préférées protéine humaine/sac- charide, sont comprises entre 1/1 000 et 1 000/1, de pré- férence entre 1/100 et 100/1o Les conditions dekéaction pour la fixation par covalence sont les suivantes: température comprise entre 0 et 100 C; valeurs de pH de l'ordre de 3 à 12; durée de réaction de 5 minutes à 50 heures. Le produit conjugué saccharide-protéine humaine ainsi obtenu peut être utilisé tel quel pour les stades ultérieurs, ou partiellement purifié, si nécessaire, par fractionnement par poids moléculaire, par filtration sur gel par exemple, préalablement à l'induction de la produc- tion d'anticorps. En ce qui concerne les procédés pour l'induction de la production d'anticorps dans les animaux à sang chaud, on peut utiliser tout procédé dans la mesure o cette in- duction s'y produit. Par exemple, une solution, émulsion ouksuspension aqueuse du produit conjugué saccharide-pro- téine humaine, est injectée par voie intraveineuse, intra- péritonéale ou sous-cutanée, dans un animal à sang chaud comme poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, rat nu, hamster, souris ou souris nue, qui est ensuite nourri pendant 3 jours ou plus, afin que s'y effectue l'induction de la production d'anticorps. L'injection peut être éventuellement répétée à intervalles de 3 à 30 jours environ, afin d'augmenter encore l'induction. Après cette plus forte induction de la produc- tion d'anticorps selon l'invention, les anticorps libérés dans le sérum de l'animal sont récoltés et purifiés selon un procédé classique. On peut obtenir une préparation d'anticorps dotée d'une spécificité supérieure, par culture in vitro ou in vivo de certaines cellules d'hybridome obtenues par un pro- cédé de fusion cellulaire, par exemple celui qui est re- porté par Kohler et coll. dans Nature, Vol. 256, pp. 495- 497 (1975) et Eur. J. Immunol., Vol. 6, pp. 511-519 (1976), qui utilise des cellules spléniques provenant d'un animal qui a été soumis à l'induction de la production d'anti- corps, et des cellules de myélome d'espèce identique ou différente, clonant la lignée de cellules d'hybridome ré- sultante, capable de produire l'anticorps, et récoltant ensuite l'anticorps à partir du produit de culture. Le procédé in vivo, en particulier, nécessite beaucoup moins ou pas de milieu nutritif contenant du sérum pour la mul- tiplication cellulaire, et réalise un pouvoir de multipli- cation supérieur des cellules d'hybridome et une produc- tion supérieure d'anticorps que dans le cas du procédé in vitro. Dans le cas du procédé in vivo, les cellules d'hybridome sont multipliées par implantation dans un animal à sang chaud de la même espèce que celle qui a été utilisée pour l'induction de la production d'anticorps, ou bien on les laisse se multiplier dans une chambre de diffusion dans laquelle leur esVfourni le fluide corporel nutritif, par exemple ascite et/ou sang, puis on recueille les anticorps résultant à partir de ce fluide corporel, ou bien les cel- lules d'hybridome multipliées sont alors soumises à une culture in vitro de faible durée, dans un milieu exempt de sérum, pendant 1 à 5 jours, suivie de la récolte des anticorps résultants à partir du milieu de culture. Les anticorps ainsi obtenus peuvent être recueil- lis facilement par des modes de purification et de sépa- ration classiques, comme relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et/ou lyophilisation. Lors- qu'on souhaite disposer d'un anticorps encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supérieure par combinaison des modes opératoires mentionnés plus haut avec d'autres modes opératoires classiques comme adsorp- tion et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie par affinité et/ou électrophorèse. La préparation d'anticorps,obtenue conformément à l'invention, peut être avantageusement utilisée pour une administration de diagnostic, prophylactique ou thé- rapeutique, en vue de la prévention et du traitement des maladies humaines, aussi bien que lors d'une chromatogra- phie par affinité, utilisant comme ligand un anticorps im- mobilisé. Tout au long de la présente description, les an- ticorps qui réagissent de manière spécifique avec la pro- téine humaine sont dosés par les procédés suivants: pour l'immunoglobuline G, il s'agit de la réaction d'hémoag- glutination passive (HAP) décrite dans Japan J. Med, Sci. Biol., Vol. 28, page 127 (1975); et pour l'immunoglobu- line E. de la réaction d'anaphylaxie cutanée passive (ACP) décrite dans Life Science, Vol. 8, page 813 (1969). Plusieurs formes de réalisation non limitatives de l'invention sont décrites dans les exemples ci-après. EXEMPLE 1 Anticorps-humain à base d'interféron A. Préparation d'interféron humain L'interféron humain, utilisé dans cet exemple, est obtenu conformément au procédé décrit dans le brevet U.S. no 4 276 282. Après injection préalable à des hamsters nouveau-nés, afin de réduire leurs immunoréactions possibles, d'antisérum préparé à partir de lapin selon un procédé classique, on implante dans ces animaux par voie sous-cutanée, une li- gnée de lymphoblastoldes leucémiques humains, BALL-1, puis on les nourrit de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau et pesant environ 30 g chacune, sont extraites et désa- grégées par hachage et mise en suspension dans du sérum physiologique contenant dejla trypsine. Après mise en suspension, des cellules soumises à l'action de la trypsine, dans du milieu RPMI additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de veau, pour aboutir à une concentration de 107 cellules/ml, on ensemence cette sus- pension cellulaire avec un interféron de lymphoblastolde humain, 100 UI/ml de milieu, et on y ajoute du virus de Senda!, 500 titres d'hémoagglutination/ml de milieu, puis on laisse incuber pendant 20 heures à 370C pour produire l'interféron humain. Les cellules sont alors centrifugées, et la partie surnageante est recueillie. Après inactivation du virus de Sendal résiduaire dans la partie surnageante, par repos à pH 2, le produit résultant est adsorbé à pH 4 sur SP-Sephadex C-25 (fabriqué par Phar- macia Fine Chemicals AB, Suède), puis on élue à pH 8. Le produit d'élution est soumis à une filtration sur gel avec Sephadex G-100, du même fabricant, pour donner une fraction contenant l'interféron humain. Cette fraction est lyophili- sée, et le produit résultant est dissous et appliqué sur SP-Sephadex C-25. Le produit d'élution résultant, contenant l'interféron humain, est finalement dialysé et lyophilisé, pour donner une préparation d'interféron ayant une activité spécifique d'environ 5 x 107 UI/mg de protéine. Le rende- ment en interféron est de l'ordre de 0,8 mg par animal. B. Préparation d'un produit de con iuaison vullulane- interféron humain. Une solution aqueuse, préparée par dissolution de 5 g de pullulane, de poids moléculaire moyen voisin de 140 000, dans 400 ml d'eau, est ajustée à pH 10,7 avec NaOH iN, puis on y ajoute progressivement 3 g de BrCn tout en maintenant le pH à cette valeur, et on laisse reposer pendant -i heure dans ces conditions pour que se produise la réaction d'activation par BrCN. Cette so- lution est ensuite ajustée à pH 5 avec HCl iN, et est dialysée contre de l'eau froide à même pH pour obtenir une solution de pullulane activé par BrCN. On ajoute à cette solution 50 mg d'interféron humain dans 50 ml d'eau, et le mélange résultant est soumis à une réaction de conjugaison dans les conditions ambiantes pendant 24 heures. Le produit résultant est précipité avec 3 fois son volume d'acétone, et le précipité est recueilli et dissous dans du tampon phosphate 0,01 N (pH 7) et le tout est centrifugé pour éliminer les substances insolu- bles. La partie surnageante est soumise successivement à une filtration sur gel, une filtration minutieuse avec une membrane filtrante, et une concentration, afin de don- ner un produit de conjugaison pullulane-interféron humain. Le rendement est d'environ 70%, ramené à l'interféron hu- main utilisé. C. Préparation d'un anticorps humain à base d'interféron Après préparation d'une solution isotonique de produit de conjugaison pullulane-interféron humain, à l'ai- de de solution saline, on injecte par voie intraveineuse à des hamsters des portions de 0,2 ml de cette solution, en- viron 30y g; cette injection est renouvelée 7 jours après, et l'alimentation est poursuivie pendant 10 jours supplé- mentaires, puis les animaux sont saignés. Les sangs sont réunis et centrifugés pour donner du sérum qui est ensuite précipité avec du sulfate d'ammonium. La fraction,obtenue à une saturation de 30 à 50%, est recueillie et dyalisée. Le produit résultant est purifié par chromatographie par affinité, en utilisant de l'interféron humain immobilisé, préparé par réaction de copulation d'interféron humain avec du gel de Sépharose activé par BrCN à température ambiante, pour obtenir une fraction contenant l'anticorps d'inter- féron anti-humain. Cette fraction est dialysée et lyophi- lisée pour donner l'anticorps humain à base d'interféron cherché. comme comme L'anticorps témoin est obtenu/plus haut, sauf que l'on remplace le produit de conjugaison par de l'interféron humain intact. La préparation d'anticorps de cet exem- ple contient plus d'immunoglobuline G, environ 30 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et elle contient peu d'immunoglobuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline gâans l'anticorps témoin. Cet anticorps peut être avantageusement utilisé pour la purification chromatographique par affinité dans la pro- duction à l'échelle industrielle d'interféron humain hau- tement purifié, lorsqu'il est immobilisé sur un support. EXEMPLE 2 Anticorps humain à base d'urokinase A. Préparation d'urokinase humaine Une urokinase d'urine humaine fournie par Sigma Che- mical Company, Saint Louis, Missouri, USA, est purifiée comme dans l'exemple 1-A, par adsorption et désorption au moyen de SP-Sephadex C-25 et filtration sur gel à l'aide de Sephadex G-100. La fraction contenant l'urokinase humaine estinsuite lyophilisée pour donner une préparation d'uroki- nase ayant une activité spécifique de l'ordre de 4 unités par g de protéine. B. Préparation d'un pEroduit de conjugaison elsinane- urokinase humaine. Une solution aqueuse d'elsinane, préparée par dissolu- tion de 8 g d'elsinane de poids moléculaire proche de 800 000, dans 200 ml d'eau chaude, suivie de refroidisse- ment à la température ambiante, est additionnée de 10% en poids/volume de chlorure de cyanuryle dans 40 ml de dimé- thyl formamide. Ce mélange est ensuite soumis à une réac- tion d'activitation à température ambiante pendant 2 heures, le niveau du pH étant maintenu à 7 à l'aide de carbonate de sodium IN, et le produit résultant est dialysé à cette valeur de pH et à 40C, contre de l'eau, une nuit durant, pour donner une solution d'elsinane activé. On ajoute à cette solution 30 mg d'urokinase humaine dans ml d'eau, et le mélange résultant est agité à pH 9 pen- dant 2 heures, afin que s'effectue la réaction de conjugai- son. Le produit résultant est purifié et concentré comme dans l'exemple 1B pour donner un produit de conjugaison elsinane-urokinase. Le rendement est de Mlordre de 60%, ramené à l'urokinase humaine utilisée. C. Preparation d'un anticorps humain à base d'urokinase On injecte par voie sous-cutanée à des rats des portions de 0,3 ml d'adjuvant total de Freund de produit de conjugaison elsinane-urokinase humaine, teneur en pro- téine environ 20/ug, puis l'on traite comme dans l'exemple 1-C pour obtenir leurs sérums. Les sérums sont réunis et soumis successivement à relargage, dialyse, purification chromatographique par affinité, dialyse, et lyophilisa- tion, pour obtenir l'anticorps humain à base d'urokinase voulu. L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, à ceci près que le produit de conjugaison est remplacé par une prépa- ration d'urokinase humaine intacte. La préparation d'anticorps obtenue conformément à linven- tion contient plus d'immunoglobuline G, environ 16 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et peu d'immuno- globuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'im- muAnoglobuline E dans l'anticorps témoin. Cet anticorps peut être avantageusement utilisé comme ligand pour la purifica- tion chromatographique par affinité, au cours de la produc- tion à l'échelle industrielle d'une préparation d'urokinase humaine hautement purifiée, lorsqu'on l'immobilise sur un support* EXEMPLE 3 Anticorps humain à base de lymphocyte A. Préparation d'une protéine de lymphoblastolde humain Une lignée de lymphoblastoldes leucémiques hu- mains, BALL-1, est multipliée dans du milieu de Eagle, ad- ditionné de 5% en volume/volume de sérum humain, et les cellules humaines multipliées sont récoltées par centrifu- gation; on les soumet pendant 10 minutes aux ultrasons, KHz, et les centrifuge à 5 000 x g pendant 20 minutes. La partie surnageante résultante est alors précipitée avec duulfate d'ammonium, et la fraction obtenue à 25-80% de saturation, est recueillie, dialysée, concentrée et lyophi- lisée pour donner une protéine de lymphoblastolde humain. B. Préparation d'un prod uit de conDu2aison hydrolysat partiel depullulane-protéine de lymphoblastotde humain Une solution de pullulane,préparée par dissolu- tion de 5,2 g d'hydrolysat partiel de pullulane, de poids moléculaire moyen voisin de 10 000, dans 110 ml de diméthyl formamide, avec chauffage, suivi de refroidissement à la température ambiante, est additionnée de 10 ml de pyridine. On ajoute en outre, sous agitation, à cette solution de pul- lulane, 1 g de chlorure de p-nitrobenzoyle, et on laisse re- poser 17 heures à température ambiante, Puis le mélange ré- actionnel est additionné de 2 fois son volume de n-propanol, et le précipité résultant est recueilli et dissous dansYla diméthyl formamide. Les opérations ci-dessus de précipitation et de dissolution sont répétées à 3 reprises. Le précipité obtenu finalement est dissous dans 100 ml de solution aqueu- se de dithionite de sodium, et mis à incuber dedans à 80OC pendant 30 minutes. Le produit résultant est décoloré avec du charbon activé, puis précipité avec 2 fois son volume de n-propanol. Le précipité obtenu est dialysé contre de l'eau une nuit durant. La solution aqueuse du précipité est refroidie au-dessous de 21C et est additionnée de HC1 pour donner une concentra- tion voisine de O,1N, puis on ajoute peu-à-peu 0,1 g de nitrite de sodium. Le mélange est alors soumis à une ré- * action de diazotation pendant 30 minutes. Le sel de dia- zonium résultant est dialysé contre de l'eau distillée pendant 2 heures, au-dessous de 2 C, afin d'obtenir un dé- rivé de d1azonium d'hydrolysat partiel de pullulane. On ajoute à la solution 2 g de protéine de lymphoblastoî- de humain dans 70 ml d'eau, et le mélange résultant est ajusté à pH 8,5 par addition de solution de carbonate de sodium, puis on laisse pendant 2 heures sous agitation, à 40C, au même pH, pour que sz'effectue la réaction de co- pulation. Le produit résultant est purifié et concentré comme dans l'exemple 1-B, pour donner un produit de con- jugaison hydrolysat partiel de pullulane-protéine de lym- phoblastolde humain. Le rendement est de l'ordre de 4fh, ramené à la protéine de lymphoblastotde humain. C. Préparation d'un anticorps humain à base de lympho- citie- On injecte par voie sous-cutanée à des souris des portions de 0,2 ml d'adjuvant total de Freunddi produit de conjugaison hydrolysat partiel de pullulane-protéine de lymphoblastoîde humain, teneur en protéine environ 20/g,. puis l'on traite comme dans l'exemple 1-C afin d'obtenir leurs sérums. Les sérums sont réunis et soumis successive- ment à relargage, dialyse, purification chromatographique par affinité, dialyse et lyophilisation, pour donner l'an- ticorps humain à base de lymphocyte cherché. L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, à ceci près que le produit de conjugaison est remplacé par une prépa- ration de protéine de lymphoblastolde humain intact. L'anticorps obtenu conformément au mode opératoire de cet exemple, contient plus d"immunoglobuline G, environ 24 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et peu d'im- munoglobuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline E dans l'anticorps témoin. Comme cet anticorps présente une immunoréaction compara- ble avec les lymphocytes humains provenant du sang péri- phérique aussi bien qu'avec la protéine de lymphoblastol- de humain, il peut être avantageusement utilisé comme im- munosuppresseur lors de la transplantation d'organes hu- mains ou de peaux. EXEMPLE 4 Anticorps humain à base de gonadotrophine chorionique A. Préparation de gonadotrophine chorioniue h.u- maine _GCh) GCh utilisée dans cet exemple, provient de Calbiochem Co. Ltd. San Diego, Californie, U.S.A., et son activité spécifique est de l'ordre de 11 500 UI/mg de protéine. B. Préparation de produit conutgé elsinane-GCh Une solution aqueuse d'elsinane, préparée par dissolution de 10 g d'elsinane de poids moléculaire moyen de l'ordre de 200 000, dans 200 ml d'eau distillée, avec chauffage, est refroidie à température ambiante, addition- née de 5 g d'hexaméthylène diamine,puis ajustée à pH 11I avec NaOH 1N. On ajoute à ce mélange 5 g de BrCN, et l'on soumet à la réaction d'activation pendant 30 minutes tout en maintenant à valeur constante le niveau de pH, et la température au-dessous de 20 C grace à un bain d'eau gla- cée. Le mélange réactionnel est dialysé contre de l'eau distillée à 4eC pendant 1 heure, ce qui donne une solu- tion d'elsinane activé. On ajoute à cette solution 2 ml de solution aqueuse à 25% en poids/volume de glutaraldéhyde et 10 mg de GCh, pour aboutir à un volume total d'environ 20 ml, puis on y ajoute 10 ml de tampon acétate 1M (pH 5). Ce m4lange est soumis à la réaction de conjugaison à 40C pendant 24 heures, sous agitation, puis l'on suspend la réaction par addition de glycine jusqu'à une concentration finale voisine de 1M, et on laisse reposer 24 heures dans les conditions ambiantes. Puis on centrifuge le produit ré- sultant, on purifie et concentre la partie surnageante comme dans l'exemple 1-B, pour obtenir le produit con- jugué elsinane-GCh. Le rendement est de l'ordre de 60% rapporté au GCh utilisé, C. Préparation d'anticorps à base de GCh On injecte par voie intraveineuse à des souris, des portions de 0,2 ml de solution saline isotonique de produit conjugé elsinane-GCh, teneur en protéine voisine de 20lg, puis on les traite comme dans l'exemple 1-C pour obtenir leur sérum. Les sérums sont ensuite réunis et soumis successivement à relargage, dialyse, purifica- tion chromatographique par affinité, dialyse et lyophili- sation, pour obtenir l'anticorps à base de GCh, cherché. L'anticorps témoins, est obtenu comme décrit plus haut, à ceci près que l'on remplace le produit conjugué par une préparation de GCh intacte. La préparation d'anticorps obtenue dans cet exemple, con- tient plus d'immunoglobuline G, environ 20 fois plus par animal,que l'anticorps témoin, et peu d'immunoglobuline E. Par contre,on trouve une grande quantité d'immunoglobu- line E dans l'anticorps témoin. Leanticorps,préparé dans cet exemple; peut être avantageu- sement utilisé pour un essai clinique de gonadotrophine chorionique de l'urine humaine. EXEMPLE 5 Anticorps humain à base d'interféron A. Prparati dinterfron di f humain L'interféron humain,utilisé au cours de cet exem- ple, est obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 1-A. B. Préparation d'unproduit conIusué dextrane-inter- féron humain On prépare un produit conjugué dextrane-interfé- ron comme dans l'exemple 1-B, mais en remplaçant le pul- lulane de cet exemple par du dextrane de poids moléculaire moyen voisin de 70 000. Le rendement est de l'ordre de %, rapporté à l'interféron humain utilisé. C. PrLDaration d'anticorps humain à base d'interféron On injecte à des souris une solution saline iso- tonique de produit conjugué dextraneinterféron, puis on traite leurs sérums de manière similaire à ce qui est dé- crit dans l'exemple 1-C pour obtenir l'anticorps humain à base d'interféron cherché. L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, mais avec remplacement du produit conjugué par une préparation d' interféron humain intact. L'anticorps,obtenu dans le présent exemple, contient plus d'immunoglobuline G, environ 12 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et peu d'immunoglobuline E. Par con- tre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline E dans l'anticorps témoin. L'anticorps peut 4tre avantageusement utilisé comme li- gand pour la purification chromatographique par affinité. EXEMPLE 6 Anticorps humain à base de lymDhocyte Après avoir fortement induit, comme dans l'exem- ple 3, la production d'anticorps humain à base de lympho- cyte, dans les cellules de souris capables de produire cet anticorps, par injection d'un produit conjugué hydrolysat partiel de pullulane-protéine de lymphoblastolde humain, on extrait les rates des animaux, les hache et les désa- grège. On met ensemble en suspension dans un récipient renfermant une solution saline contenant 140 mM de NaCl, 54 mM de IC1, 1 mM de NaH2P04 et 2 mM de CaCl2, les cel- lules spléniques et une lignée de myéloma MPC-ll, ATCC CCL-167 de la souris, de manière à avoir pour chacune une concentration cellulaire voisine de 104 cellules/ml. En- suite, ces cellules sont mélangées sous refroidissement à la glace avec une préparation fraiche de la même solution saline contenant du virus de Sendat préalablement inac- tivé par irradiation aux UV, puis l'on transfert le tout dans un incubateur à 37 C environ, 5 minutes après le mélange, et on agite doucement pendant 30 minutes afin de réaliser la fusion cellulaire. Des souris reçoivent une injection par voie intrapéritoné- ale des cellules d'hybridome résultant, à raison de 106 cellules/animal, environ, puis sont nourries pendant 2 se- maines, après quoi ces animaux sont sacrifiés et on re- cueille leurs fluides corporels, y compris sang et ascite. Le fluide corporel ainsi obtenu est purifié et lyophilisé comme dans l'exemple 3-C, afin de donner l'anticorps hu- main à base de lymphocyte, cherché. L'anticorps témoin est obtenu comme indiqué plus haut, à ceci près que les souris dont on extrait la rate, n'ont pas reçu d'injection de produit conjugué, mais une injec- tion de préparation de protéine de lymphoblastotde humain intact. L'anticorps, préparé dans cet exemple, contient plus d' immunoglobuline G, jusqu'à environ 570 fois plus par ani- mal, que l'anticorps témoin, et sans formation d'immuno- globuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline E dans l'anticorps témoin. EXEMPLE 7 Anticorps à base de GCh On induit fortement, comme dans l'exemple 4, la production d'anticorps à base de GCh dans des cellules de souris capables d'en produire, par injection d'un produit conjugué elsinane-GCh, puis on extrait les rates des ani- maux, on les hache et les désagrège. Les cellules spléni- ques sont fusionnées avec une lignée hybride de myélome de la souris P3X63-Ag8, provenant de Flow Laboratories Inc., Maryland, USA, par mise en suspension à 4 C dans un réci- pient contenant du milieu essentieVminimal de Eagle, exempt de sérum, (pH 7,2), renfermant 50% en poids/volume de poly- 1,7 éthylène glycol 1000, de manière à avoir des concentra- tions respectives de 104 environ, cellules/ml, et l'on maintient ce milieu dans les mêmes conditions pendant 5 minutes, avant de diluer 20 fois à l'aide d'une prépa- ration fratche du même milieu. Les cellules d'hybridome qui poussent dans un milieu de culture contenant hypoxanthine, aminoptérine esthymidine, sont clonées à partir de ce milieu conformément au pro- cédé décrit par Davison et coll. dans Somatic Cell Gene- tics, Vol. 2, pp. 175-176 (1976). Les cellules d'hybridome clonées sont alors implantées par voie sous-cutanée chez des souris, qui sont nourries com- me dans l'exemple 6, puis sacrifiées pour recueillir leurs fluides corporels. Ces fluides corporels sont ensuite pu- rifiés et lyophilisés comme dans l'exemple 4-C, pour don- ner l'anticorps à base de GCh cherché. L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, à ceci près que les souris dont on extrait la rate, ne reçoivent pas d'injection de produit conjugué, mais une injection de pré- paration de GCh intacte. L'anticorps préparé conformément à cet exemple, contient plus d'immunoglobuline G. jusqu'à environ 440 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et sans formation d' immunoglobuline E. Par contre, on trouve dans l'anticorps témoin une grande quantité d'immunoglobuline E. EXEMPLE 8 Antiorps humain à base d'interféron Après avoir fortement induit, comme dans l'exem- ple 5, la production d'anticorps humain à base d'interfé- ron dans des cellules de souris capables clen produire, par injection d'un produit conjugué dextrane-interféron, on extrait les rates des animaux, les hache et les désagrège. Puis les cellules spléniques sont fusionnées comme dans 1' exemple 7 avec une lignée de plasmacytoma de souris MOPC- 31-C, ATCC OCL-130. Les cellules d'hybridome résultant sont alors implantées par voie intrapéritonéale chez des souris, à raison d' environ 5 x 105 cellules par animal, et les animaux sont nourris pendant 2 semaines. Passé ce délai, les cellules d'hybridome multipliées sont récoltées à partir des ascites, et mises en suspension dans du milieu essentiel minimal de Eagle (pH 7,2), préchauffé à 370C, de manière à obtenir une concentration de 5 X 106 cellules/ml. Cette suspension est alors placée dans un incubateur à C02 con- tenant 5% en volume/volume de C02, ou la culture se dé- roule pendant 2 jours. Le produit de cette culture est ensuite centrifugé, et la partie surnageante est préci- pitée avec du sulfate d'ammonium. La fraction,obtenue à -50% de saturation, est recueillie, dialysée, et soi- gneusement filtrée à l'aide d'une membrane filtrante, et le filtrat résultant est lyophilisé pour donner l'anti- corps humain à base d'interféron cherché. L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, à ceci près que les souris dont on extrait les rates ne reçoivent pas d'injection de produit conjugué, mais une injection d' une préparation d'interféron humain intact. L'anticorps,préparé conformément à cet exemple, contient plus d'immunoglobuline G. jusqu'à environ 160 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et sans formation d' immunoglobuline E. Par contre, on trouve une grande quan- tité d'iimmunoglobuline E dans l'anticorps témoin. Revendications 1. Procédé pour la production d'anticorps humains protéiniques, qui consiste à induire cette production dans des cellules d'animaux à sang chaud, capables de produire ces anticorps, par injection de la protéine hu- maine, puis récolte des anticorps protéiniques humains résultants, caractérisé en ce que la protéine humaine in- jectée, est urproduit conjugué saccharide-protéine humai- ne, obtenu par liaison de covalence entre les deux cons- tituants. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine humaine est enzyme, hormone, lympho- kine, immunoglobuline, sétum, constituants du sang, tumeur maligne, urine, sueur, endomètre, placenta ou fluide sé- minal. 3. Procédé selon une des revendications 1 ou 2, ca- ractérisé en ce que le saccharide est amidon, amylose, polysucrose, pullulane, elsinane, curdlane, gomme arabi- que, gomme adragante, gomme guar, gomme xanthane, cellu- lose, glucomannane, chitosane, ou leurs hydrolysats par- aD tiels. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le poids moléculaire moyen du saccharide est com- pris dans l'intervalle de 1 000 à 10 000 000, de préfé- rence de 10 000 à 1 000 000. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que l'anticorps protéinique humain, est un anticorps à base d'interféron humain, d'urokinase humaine, de lymphocyte humain ou de gonadotrophine chorionique hu- maine. 6. Procédé selon une des revendications 1 à 5, ca- ractérisé en ce que l'animal à sang chaud est poulet, pi- geon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, rat nu,hamster, souris ou souris nue. 7. Procédé selon une des revendications 1 à 6, carac- térisé en ce que les cellules d'animal à sang chaud capa- bles de produire l'anticorps, sont des cellules d'hybri- dome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de mye- loma de souris avec des cellules spléniques de souris provenant de l'animal dans lequel a été réalisé l'induc- tion de la production d'anticorps. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la lignée de myeloma de souris est MPO-ll, P3-X63- Ag8 ou MOPC-31-C.