Brevet FR2497799A1 — publié le 19820716

La présente invention est relative au sulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl- L-arginine aldéhyde extrêmement stable en solution aqueuse et à un procédé pour le prépa- rer. Il est connu que l'héparine, des polyanions de structure apparentée (des héparinoides) et des dérivés de la coumarine, sont principalement appliqués à l'heure actuelle en thérapie anticoagulante. Une caractéristique commune de ces agents, est qu'ils ne réussissent pas à induire une inhibition directe de la réaction protéolytique, déclenchant la coagulation du sang. L'héparine, à titre de catalyseur, accélère l'action inhibitrice de l'un des inhibiteurs du plasma, l'antithrombine III, sur les enzymes impliquées dans le procédé de coagulation, surtout celle de la thrombine, tandis que les dérivés de la coumarine inhibent la biosynthèse des protéines contenant des par- ties "acide y-carboxy-glutamique" (Gla). Il existe quatre protéines de ce type qui sont impliquées dans le procédé de coagulation du sang, l'une de celles-ci étant la pro- thrombine. Des facteurs de-coagulation du sang dépourvus de résidus Gla ou en ayant un nombre inférieur à la valeur normale, sont inactifs et ne participent pas au procédé de coagulation. Il faut remarquer, cependant, que cette inhibition couvre la synthèse de toute la gamme des pro- téines contenant du Gla, c'est-à-dire que l'un des inhibi- teurs naturels du procédé de coagulation, la protéine C (ou facteur XIV) est aussi synthétisée sous forme inactive en présence de dérivés de la coumarine, ce qui constitue plutôt un inconvénient. Il est également un aspect carac- téristique à noter, à savoir que l'héparine est administrée principalement par injection intraveineuse, car celle-là est pratiquement inactive par voie orale, tandis que les dérivés de la coumarine ne peuvent être appliqués que par voie orale. En conséquence, l'effet exercé par l'héparine peut être rapidement enregistré, en une courte période de temps, tandis, que celui que fournissent des dérivés de la coumarine étant des inhibiteurs de synthèse - n'apparaît qu'après une période de 24 à 36 heures. De plus, il est connu qu'il existe des tripeptide- aldéhydes qui présentent aussi une activité anticoagulante; cependant, contrairement aux agents ci-dessus, ils entrent en réaction directe avec la thrombine, en inhibant ses réac- tions protéolytiques même en l'absence d'antithrombine III. L'acétate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde, décrit dans le Brevet hongrois n 169 870, ainsi que le D-phénylalanyl-L-prolyl-NGcarboxy-L-arginine aldéhyde, décrit dans le Brevet belge n 880 844,sont tous deux de puissants inhibiteurs de thrombine. Il est observé que l'activité antithrombine des sels synthétiques cidessus d'arginine-peptide aldéhyde - en particulier de ceux des composés portant un groupe amino- terminal libre - c'est-à-dire l'acétate ou le chlorhydrate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginie - est variable et qu'elle diminue rapidement lorsque le com- posé reste en solution aqueuse, rendant impossible unie application thérapeutique. Bien que le dérivé NGcarioxy- des tripeptide aldéhydes libres, c'est-à-dire le D-phényl- alanyl-L-prolyl-NG-carboxy-L--arginine aldéhyde, conserve pendant 20 à 24 heures son activité dans une solution tal- pon aqueuse, après plusieurs jours, cependant, on observe déjà une notable réduction de l'activité et après plusieurs mois, il y a perte de l'activité initiale, meme sous forme solide. La présente invention est relative à un nouveau sel de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde, qui, contrairement aux autres produits connus jusqu'à maintenant, est stable également en solution aqueuse, et à un procédé pour le préparer. On a constaté que la stabilité des divers sels de D-phénylalanyl-L-prolylL-arginine aldéhyde est variable en solution aqueuse, c'est-à-dire dans une solution saline isotonique et cela de façon significative. Au cours des tests réalisés par la Demanderesse, les peptides sont dissous a la concentration de 10 mg/ml, conservés a 5 C et la modi- fication concomitante de l'activité antithrombine est enregistrée pendant 180 jours. L'activité est évaluée dans un système contenant les composants suivants: 0,2 ml de fibrinogène de bovin à 0,5 % dans une solution à 0,9 % de chlorure de sodium, 0,1 ml de tampon au chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)- aminométhane-acide chlorhydrique (pH: 7,2) conte- nant la solution de peptide, 0,1 ml de Thrombine Humaine Standard US (NIH, Bethesda, Maryland, USA), solution à 10 unités/ml. Le temps de thrombine du système dépourvu de thrombine est de 15s, mesuré dans le "Schnither-Gross Coagulometer". On attribue arbitrairement la valeur de 100 à l'activité de la solution de tripeptide aldéhyde, si le mélange réactionnel induit un temps de thrombine rela- tif cinq fois plus long pour une concentration finale de 3,5 x 10-7 M, dans le cas du sulfate de tripeptide aldéhyde à la concentration de 0,175 pg/ml. Les données d'essai sont rassemblées dans le Ta- bleau I. Il est apparent que le sulfate de D-phénylalanyl- L-prolyl-L-arginine aldéhyde conserve son activité anti- thrombine pendant 90 jours, alors que l'activité du chlorhydrate correspondant en solution saline isotonique commence a diminuer au bout de 5 jours et que celle de l'acétate, du citrate, du tartrate et du tosylate est réduite déjà après quelques jours (de même que celle du dérivé NG-carboxy- du tripeptide aldéhyde libre ayant des propriétés apparentées). Dans des essais de stabilité pro- longée, le sulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde se révèle stable même pendant 180 jours en milieu aqueux et, sous forme solide, il ne perd pas de même son activité pendant 6 mois. w W r.. I Ln eni o j o enl Q TABLEAU I Activité antithrombine des sels de tripeptide aldéhyde en solution saline isotonique --__--------------_----m-___________________________________________________________________ activit b relative après Peptide aldéhydea 0 5 10 15 20 40 90 jours D-PhePro-Arg-H,2 CH COOHCd 70-50 60-40 40-30 40-30 40-30 35-25 30-20 D-Phe-ProArg-H,2HC1 90-60 90-60 80-50 70-40 60-40 50-30 40-30 e D-Phe-Pro-Arg(COOH) -H 100 80 60 50 30 25 20 D-Phe-Pro-Arg-H#H2S04 100 100 100 100 100 100 100 a) Les abréviations utilisées sont conformes a celles qui sont établies dans la littérature Zc'est-à-dire dans J. Biol. Chem. 247, 977 (19721/, Z représentant des groupes benzyloxy- carbonyles, Arg(COOH) et resp., Arg--) représentant des groupes NGcarboxy- et NG-benzyloxycarbonyl-L-arginine resp.) b) Le peptide aldéhyde induisant un temps de thrombine relatif quintuple a une concentration finale de 3,5 x 10-7 M dans le mélange de réaction, a une activité antithrombine de 100 c) Produit obtenu par hydrogénolyse du Z-D-Phe-Pro-Arg(Z)-H en présence d'une quantité équi- valente d'acide d) L'activité antithrombine des citrate, tartrate et tosylate correspondants varie de la même façon que celle de l'acétate e) Produit synthétisé selon le procédé qui est décrit dans le Brevet belge no 880 844 f) Produit préparé conformément au procédé de la présente invention Afin de simuler des conditions physiologiques, on évalue l'activité antithrombine des sels de tripeptide aldéhyde ainsi que celle des dérivés d'acide carbamique, également sur du plasma humain dans le système suivant: 0,2 ml de plasma humain citraté, 0,1 ml d'une solution tampon de chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)-aminométhane-acide chlorhydrique (pH: 7,2) contenant la solution de peptide, et 0,1 ml de Thrombine Humaine Standard US (NIH, Bethesda Maryland, USA), solution à 10 unités/ml. Le temps de thrombine du système dépourvu de peptide est de 15 s, mesuré dans le "Schnither-Gross Coagulometer". TABLEAU 2 Activité antithrombine des dérivés de tripeptide aldéhyde dans du plasma humain _____________________________________________________________ quantité de peptide(pg/ml+) nécessaire pour doubler le acti- Peptide aldéhyde temps de thrombine immédia- vité tement après dissolution du rela- 20............ ..... eptide tive D-Phe-Pro-Arg-H,H2SO4 0,020 100 D-PhePro-Arg(COOH)-H 0,042 45 D-Phe-Pro-Arg-H,2 CH3COOH 0,065 - 0,140 35-14 DPhe-Pro-Arg-H,2 HCl 0,060 - 0,130 33-15 Héparinea 0,105 19 a) Valeur mesurée avec de l'héparine industrielle (132,2 U/mg, U.S. Ph. XVII) + Quantité de peptide dans le mélange réactionnel. Les données du Tableau 2 montrent clairement que la quantité de peptide nécessaire pour doubler le temps de thrombine par rapport au témoin, varie en fonction du lot utilisé dans le cas de l'acétate et du chlorhydrate et qu'elle est un multiple - dans le cas du dérivé d'acide carbamique, elle est le double - de la quantité requise dans le cas du sulfate du tripeptide aldéhyde. L'essai in vivo des dérivés de tripeptide aldéhyde est résumé dans le Tableau 3. Le sulfate de D-phénylalanyl- L-prolyl-L-arginine aldéhyde présente une activité anti- thrombine valable in vivo. Lorsqu'il est appliqué par voie intraveineuse et sous-cutanée, son activité est semblable à celle de l'héparine, appliquée généralement en thérapie, cependant, il offre des avantages majeurs par rapport à celle-ci. Alors que i'héparine est inactive par voie orale, l'effet thérapeutique du sulfate peut être obtenu avec des doses orales de 25 mg/kg, tandis qu'il faut des doses de mg/kg dans le cas du dérivé d'acide carbamique. W W K) S- b H TABLEAU 3 Dose requise pour l'obtention d'un effet thérapeutiquea __________________________________________________________________________ __________________ mg/kg heure mg/kg Peptide aldéhyde injection par voie sous cutanée per os intraveineuse lapin chien lapin chien lapin chien __________________________________________________________________________ ___________________ D-Phe-Pro-Arg-H,2 CH3COOH - - - 100 100 D-Phe-Pro-Arg-H,2 HCl - - - D-Phe-Pro-Arg(COOH)-H - 3,0 10,0 6,0 50 50 D-Phe-Pro-Arg-H,H2SO04 1,0 0,5 6,0 6,0 25 25 Héparine 0,6 0,5 5,0 2,0 - - a) L'effet thérapeutique est caractérisé par la dose qui est nécessaire pour prolonger le temps de thrombine de 1,5 A 2,5 fois dans le sang entier ZNies, A. S. (1978) dans Clinical Pharmacology (Melmon, K. L. et Morrelli, F. F. Eds.) 2nd Ed. pp. 303 A 306, Macmillan Publ. Co. Inc. New York; et Versraete, M. et Verwilghan, R. (1980) dans Drug Treatment, Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 2nd Ed., Avery G. S. Ed. (1980) pp. 889 à 952, Edinburgh and London7. No %O Les données de toxicité fournies par le sulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde sont éga- lement plus avantageuses que celles de l'acétate ou du dérivé d'acide carbamique. Les données de toxicité aiguë sont rassemblées dans le Tableau 4. Dans le cas du sulfate de tripeptide aldéhyde administré par voie orale, celle-ci se monte à 2 g/kg. TABLEAU 4 Données de toxicité aiguë chez la souris à.... DL50 mg/kg Peptide aldéhyde i.v. i.p. s.C. P.O. i.v. i.p. s.c. p.o. grosse pilule D-Phe-Pro-Arg-H,2CH3COOH 9 38 - 960 D-Phe-Pro-Arg(COOH)-Ha - - 1200 D-Phe-Pro-Arg-H,H2SO4 45 230 1800 >2000 Héparine aucune donnée disponible dans la littérature à*à a) Etant donné la médiocre solubilité des produits, les données de toxicité obtenues pour des applications autres qu'orales, sont plutôt incertaines. b) Pour l'injection intraveineuse, la DL50 atteint 58 mg/kg chez le lapin Etant donné la faible toxicité et la forte activité du sulfate du Dphénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde, l'indice thérapeutique, tenant compte de ces deux données, et étant l'indicateur le plus caractéristique de l'intérêt thérapeutique d'un médicament, est plus favorable que ceux des autres dérivés de tripeptide aldéhyde. A partir d'essais de perfusion intraveineuse chez les chiens, on évalue à 1 à 2 mg/kg/heure la dose de la perfusion intraveineuse pour l'homme. On a constaté que le sulfate de D-phénylalanyl-L- prolyl-L-arginine aldéhyde peut être préparé selon une méthode connue en elle-même, en soumettant du benzyloxy- carbonyl-D-phénylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxy-carbonyl- L-arginine aldéhyde (Z-D-Phé-Pro-Arg(Z)-H) à une hydro- génolyse, en présence de quantités équivalentes d'acide sulfurique. De plus, il peut être simplement préparé avec une pureté suffisante, à partir de son dérivé sensible à l'acide contenant un groupe protecteur triphénylméthyle ou t-alkyloxycarbonyle, c'est-à-dire à partir de l'hémi- sulfate du t-butyloxycarbonyl-D-phénylalanyl-L-prolyl-L- arginine alkyde ou du t-butyloxycarbonyl-D-phénylalanyl- L-prolyl-NG-carboxy-L- arginine aldéhyde, avec de l'acide sulfurique 1 à 12N. En même temps, les méthodes suivantes, connues en elles-mêmes, ne fournissent pas de résultats satisfaisants: a) Acidolyse du groupe tbutyloxycarbonyle avec de l'acide sulfurique dissous dans de l'acide acétique ZBeyerman et coll.: dans Peptides, 1970 (Ed. H. NESVADBA), p. 138, North Holland, Amsterdam, 19737. b) Conversion directe du dérivé d'acide carbamique D-Phé-Pro-Arg-(COOH)-H selon le Brevet Belge n 880 844 avec de l'acide sulfurique en sulfate de tripeptide aldéhyde non protégé. c) Transformation de divers autres sels de tripeptide aldéhyde non protégés, c'est-à-dire de l'acétate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde selon le Brevet hongrois n 169 870 en son sulfate, soit avec une résine échangeuse d'ion, soit avec de l'acide sul- furique. Les produits obtenus conformément à l'une des métho- des a à c, s'avèrent présenter une médiocre homogénéité et/ou stabilité en solution aqueuse. A partir de ces faits, la présente invention est relative au sulfate de Dphénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde et à un procédé pour le préparer à partir de l'hémisulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde ou du D-phénylalanyl-L-prolyl-NG-carboxy-L-arginine aldéhyde, ] (1 contenant un groupe prctecteur sensible à l'acide sur son groupe aminotermninal,selon lequel le groupe protecteur placé sur le groupe amincterminalet sensible à l'acide et éventuellement le groupe N -carboxy- est éliminé avec de l'acide sulfurique 1 à 12N, appliqué en 1 à 12 quanti- tés équivalentes et le sulfate de tripeptide aldéhyde libre résultant est isolé. Confonnément à un procédé préféré de la présente invention, le L-arginine lactame, dont le groupe guanidino- est protégé avec un groupe benzyloxycarbonyle, est condensé avec de la tbutyloxycarbonyl-D-phénylalanyl-L-proline, le tripeptide lactame bloqué résultant est réduit et le groupe benzyloxycarbonyle sur le groupe guanidino- du tripeptide aldéhyde protégé obtenu est soumis à une hydrogénolyse dans de l'éthanol ou du tétrahydrofurane contenant 30 à % d'eau, en présence d'une quantité équivalente d'acide sulfurique. L'hémisulfate de tripeptide aldéhyde résultant, dont le groupe aminoterminalest toujours protégé, est dissous dans 8 à 12 équivalents, de préférence 10 équiva- lents d'acide sulfurique 4 à 6N, de preférence 5N et chauf- fé pendant 20 à 40 minutes, de préférence 30 minutes à -60 C, de préférence à 50'C; la solution est ensuite neutralisée avec du carbonate de calcium, filtrée et de préférence lyophilisée. Le produit préparé de cette façon peut éventuellement contenir 4 à 6 % de sulfate de calcium, qui cependant n'affecte ni son activité biologique, ni son application thérapeutique. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemplea de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'illus- tration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Les valeurs Rf indiquées dans les exemples sont déterminées par chromatographie en couche mince sur gel de silice (Kieselgel G, Reanal, Budapest) dans les sys- tèmes suivants: 1) Acétate d'éthyle-pyridine-acide acétique-eau: 480:20:6:11 2) Acétate d'éthyle-pyridine-acide acétique-eau: :20:6:11 3) Acétate d'éthyle-pyridine-acide acétique-eau: :20:6:11. EXEMPLE1 _________ Sulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde De l'hémisulfate de t-butyloxycarbonyl-D-phényl- alanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde (2,74 g, 5 mmoles) est dissous dans 5 ml d'eau, additionné de 5 ml d'acide sulfu- rique UON sous agitation constante et le mélange est chauf- fé à 500C. La solution est agitée pendant 15 minutes à 500C, puis diluéeavec de l'eau glacée (25 ml) et son pH est ajusté à 6,5 avec du carbonate de calcium (environ 2,25 g), tandis que le système est refroidi par de la glace. Le sulfate de calcium précipité est filtré et lavé deux fois avec de l'eau (5 ml). Le filtrat est extrait à deux reprises avec du n-butanol (10 ml), concentré à environ 30 ml, filtré si nécessaire et lyophilisé. Le rendement est de 2,25 g (79 %) du produit du titre, contenant 4,8 % de sulfate de calcium. Rf = 0,35 à 0,40 - -20 -'_0 = -117 1 (c = 1, eau) Analyse calculée pour C20H3003N6,H2SO4,3 H20,O,2 CaSO4 (565,85): Valeurs calculées: C 42,45, H 6,77, N 14,85, SO4 20,37, Ca 1,41, H20 9,55 % Valeurs trouvées: C 42,2, H 6,9, N 14,85, SO4 19,8, Ca 1,3, H20 9,75 % Les matières de départ sont synthétisées conformé- ment à la procédure suivante. Etape 1: t-butyloxycarbonyl-D-phénylalanyl-L-prolyl- NG-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame Du t-butyloxycarbonyl-NGbenzyloxycarbonyl-L- arginine lactame (8,6 g, 22 mmoles, Brevet belge n 880 844) est mis en suspension dans de l'acétate d'éthyle (20 ml) et à 5 C et sous agitation constante. Une solution d'acide chlorhydrique 4N dans l'acétate d'éthyle (40 ml)- est ajoutée. Le mélange réactionnel est agité pendant 30 minutes sous refroidissement par de la glace, dilué avec de l'acétate d'éthyle froid (100 ml); le précipité formé est filtré, lavé avec de l'acétate d'éthyle et séché sous pression réduite dans un dessica- teur sur hydroxyde de potassium. Le chlorhydrate de NG- benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame résultant est dissous dans du diméthylformamide (20 ml) et additionné à -10 C, de triéthylamine (6,2 ml, 44 mmoles). La suspension for- mée est ajoutée à l'anhydride mixte suivant. On dissout de la t-buty!oxycarbonyl-D-phénylalanyl- L-proline ZU. Ludescher et R. Schwyzer: Helv. Chem. Acta 55, 2052 (197217 à raison de 7,25 g, 20 nioles, et de la N-méthyl-morpholine (2,22 ml, 20 mmoles), dans du diméthylformamide (20 ml). La solution est refroidie à 15 C, additionnée de chloroformate d'isobutyle (2,64 ml, mmoles) sous agitation; puis, cinq minutes après, la solution ci-dessus dans le diméthylformamide est ajou- tée. L'agitation est poursuivie pendant une heure à -15 C et pendant une heure à 0 C, puis le mélange réactionnel est dilué avec du benzène (30 ml) , les sels précipités sont filtrés et lavés à deux reprises avec du benzène (10 ml). La solution de benzène-diméthylformamide est diluée avec de l'eau (50 ml) et les phases sont séparées. La couche aqueuse est extraite à deux reprises avec du benzène (10 ml), puis les extraits benzéniques réunis sont lavés trois fois avec une solution de carbonate de sodium à 10 % (30 ml), de l'eau (30 ml), trois fois avec de l'acide sulfurique 0,5N (30 ml), deux fois avec de l'eau (30 ml) et la solution est évaporée sous pression réduite après séchage sur sulfate de sodium anhydre. Le résidu d'évapo- ration est homogénéisé avec de l'éther de pétrole, filtré, lavé avec de l'éther de pétrole et séché à l'air. Rende- ment: 9,65 g (76 %) du produit du titre. Rf = 0,81 à 0,89. Etape 2: t-butyloxycarbonyl-D-phénylalanyl-L-prolyl-N - benzyloxycarbonyl-L-arginine aldéhyde Du tripeptide lactame (9,52 g, 15 mmoles), étape 1) est dissous dans du tétrahydrofurane (45 ml) et à -20 C sous agitation vigoureuse, de l'hydrure aluminolithique (11,25 mmoles) est ajouté dans du tétrahydrofurane (envi- ron 28 ml d'une solution 0,4M). Le déroulement de la réduc- tion est suivi par chromatographie en couche mince LRf = 0,71 à 0,77 (lactame) et Rf = 0,31 à 0,39 (aldéhyde/. Si nécessaire une autre position de la solution d'hydrure est ajoutée. Lorsque la réaction est achevée, la solution dans du tétrahydrofurane est acidifiée avec précaution, avec de l'acide sulfurique 0,5N à un pH de 3, puis diluée de telle sorte qu'il n'apparait pas de précipité (environ ml). La solution aqueuse de tétrahydrofurane est extrai- te à trois reprises avec du chlorure de méthylène (75 ml) et les extraits réunis de chlorure de méthylèhe sont lavés trois fois avec une solution de carbonate de sodium à 10 % (10 ml), puis deux fois avec de l'eau (10 ml). La solution de chlorure de méthylène est ensuite séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporé sous pression réduite. Le résidu d'évaporation est dissous dans du benzène (50 ml) et la solution est à nouveau évaporée sous pression réduite. La dissolution et l'évaporation sont répétées une fois de plus. Le résidu d'évaporation est travaillé avec de l'éther, filtré, lavé avec du diéthyléther et séché à l'air. Rende- ment: 6,9 g (72 %) du composé du titre. R1 = 0,3 0,4. R = 0,3 à 0,4. f Etupe,: H}6misulfate de..... ', L-prolyl-L-argir.nr.' ald6hy'; Le tripeptide aldéhyde d rsJ-é %, 4 ', if -,eE étape 2) est dissous dans un--- ea -..V z, z a tétrahydrofurane (50 ml) et d'ar!de - ':lf e, r,.-ial (10 ml) et soumris a une hydrou y.ii.TLse;r.e d'un catalyseur (1 g) constitu- par du c?.arf/ny i k % palladium. Le déroulermen.t de la rêatlcn est út'i:aX chromatographie en couche mince t E,-.., aldéhyde dont le grcupe -uan...- est. e. R = 0,45 a 0,54 (tripeptide ady la réaction est achevée,e catal.s..r est Iti a- avec une solution (30 ml) de tr rsrae a',:eux - % et les filtrats réunis scnt ccncentr6s St-_us 5 rssn réduite à environ 60 ml. Le résIdu est extrait à.-='w reprises avec du n-butanol. Les couches n--ta.-.z. sont combinées et évaporées A sec, sous press:oc n dut. Le résidu d'évaporation est travailie av-ec téa de diéthylétherdiisopropyléther (*:1;, fi tr, ' v^=. ec le mélange ci-dessus, puis séche s-ous pressi.o zfdw te dase un dessicateur. Rendement: 4,4 g -0 iJ du cczcsé -_/D = -65 +1 (c = 1, eau). Analyse calculée pour C25H33.N6, C,5 i4 (5V,E4;: Valeurs calculées À C 54, 43, à,13, i I5,23, S;L _.% Valeurs trouvées: C 54,5 7,, N 1:,2 S" 4 S2, EXEMPLE 2 Sulfate de D-phvnlalar._c_ i-Zr'_ --_._ _r. aldéhyde Du t-butyloxvcarbhn l--;hlaa-i--rl'.'- G NG-carboxy-L-arginine aldëhyde 2,,5 ', S rles' *st d's- sous dans de l'eau (5 mi); de 'a_-e sulfuriue iN (5 ml) est ajouté et le systàre est eau f f -:C. L solution est agitée pendant 15 nutes A f: Fuis. avec de l'eau mélanzne n de ia case -5 -ec 5rrp est ajusté à 6,5 à l'aide d'hydroxyde de calcium solide (envi- ron 1,6 g) tandis qu'un refroidissement par la glace est assure. Le sulfate de calcium précipité est filtré et lavé deux fois à l'eau (5 ml). Le filtrat est extrait à deux reprises avec du n-butanol (10 ml), concentré sous pression réduite à environ 30 ml, filtré si nécessaire et ensuite lyophilisé. Rendement: 2,3 g (81 %) du composé du titre, contenant 4,9 % de sulfate de calcium. R = 0,35 à 0,40 f -20 t a-/D = -117 1 (c = 1, eau). La matière de départ est préparée selon la procé- dure suivante. Du t-butyloxycarbonyl-D-phénylalanyl-L-prolyl-N - benzyloxycarbonyl-L-arginine aldéhyde (6,4 g, 10 mmoles, exemple 1, étape 2) est dissous dans de l'éthanol aqueux à 75 % (100 ml) et soumis à une hydrogénolyse en présence d'un catalyseur (1 g) constitué par du charbon portant % de palladium. Le déroulement de la réaction est suivi par chromatographie en couche mince LRf = 0,90 à 0,95 (tripeptide aldéhyde protégé) et 0,45 à 0,55 (dérivé NG-carboxy)7. A la fin de la réaction, le catalyseur est filtré, lavé à l'eau (30 ml) et le filtrat est concentré à 30-40 ml sous pression réduite. Le résidu est dilué avec de l'eau (100 ml) , extrait à deux reprises avec du chlorure de méthylène (20 ml) et lyophilisé. Rendement: 5,1 g (85 %) du composé du titre. 2 = 0,45 à 0,55. Rf, Analyse des amino-acides: Phe = 0,96, Pro = 1 (amino-acide de référence). PM en fonction de l'analyse des amino-acides: 570. EXEMPLE 3 Préparation d'une composition pharmaceutique Une préparation en deux ampoules, convenable pour 6 à 12 heures de perfusion intraveineuse, est préparée de la façon suivante. Du sulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde (420 à 840 mg) et de l'albumine humaine Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven- tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au con- traire -toutes les variantes qui peuvent venir a l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. RE\TND1CATIONS 1 - Nouveau sel de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde caractérisé en ce qu'il s'agit du sulfate extrê- mement stable en solution aqueuse. 2 - Procédé de préparation du sulfate de D-phényl- alanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde:3 partir de l'hémi- sulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde G ou du Dphénylalanyl-L-prolyl-N -carboxy-L-arginine aldéhyde dont le groupe amino-terminalest protégé par un groupe protecteur sensible à l'acide, caractérisé en ce qu'on élimine le groupe protecteur sensible à l'acide du groupe amino-terminal et éventuellement le groupe NG-carboxy-, à l'aide d'acide sulfurique 1 à 12N, appliqué en 1 à 12 quan- tités équivalentes et en ce que l'on isole le sulfate de tripeptide aldéhyde libre résultant. 3 - Procédé selon la Revendication 2, caractérisé en ce qu'un groupe t-alcoxycarbonyle, de préférence le grou- pe t-butyloxycarbonyle, est appliqué à titre de groupe pro- tecteur sensible à l'acide de la matière de départ. 4 - Procédé de préparation d'une composition phar- maceutique anticoagulante, caractérisé en ce que du sulfate de Dphénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde est converti, avec des supports pharmaceutiques, selon des méthodes con- nues en elles-mêmes pour préparer des médicaments, en com- primés, capsules, solutions à injecter ou compositions similaires.