Brevet FR2490646A1 — publié le 19820326

TRICliLOROl ETHYLENEAMINO-2 DI-(ETHYLENEAMIDO) THIOPHOSPHONYLIMlNO-2 ETHANE La présente invention a trait à un composé nouveau, consistant en trichloro-l éthylèneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino -2éthane. Elle se rapporte également à l'application pharmacologique de ce composé, et notamment à son application anticancéreuse ainsi qu'aux médicaments comportant en tant que principe actif ce composé destiné au traitement des néoplasies d'origine épithéliale et mésenchymateuse, ainsi que pour l'inhibition de la croissance des cellules lymphodes. Le produit, conforme à la présente invention, consistant en trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane,est nouveau et n'a pas jusqu'à present eté décrit dans la littérature technique. Le trichloro-l éthylèneamino-2 di-(ethylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane selon l'invention présente la formule suivante Le composé sus-mentionne se présente sous forme d'une poudre cristalline incolore, soluble dans l'acétone et le méthanol, soluble à chaud dans l'éthanol, le chloroforme, le benzène, le diméthylsulfoxyde et l'éther, mais insoluble dans l'eau et l'hexane. La température de fusion dudit composé est de l'ordre de 137 à 138 C (avec décomposition). Réchauffé à une température supérieure a la température de fusion, le composé précité prend une couleur de plus en plus foncée et, à la température de 165 à 1700C, il se décompose avec explosion. Dans le spectre infrarouge du composé faisant l'objet de l'invention, on observe une absorption intense:pour les longueurs d'onde de 942 cm1 et de 1272 cm-1, qui correspondent respectivement aux oscillations pulsatoires et non-symétriques des noyaux éthylène-imines; pour la longueur d'onde de 515 cm-', correspondant à la liaison P = S, ainsi que pour la longueur d'onde de 1623 cm1, correspondant à la liaison C = N. L'activité antitumorale et les propriétés toxiques du trichloro-1 éthyl9neamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane ont été étudiées dans des expériences portant sur des souris et des rats. L'activité antitumorale a été vérifiée sur quatre souches de tuteurs ascitiques transplantables chez les souris: - le carcinome d'Erlich, - le sarcome 37, - la lymphadénose NK/LI, - la lymphadénose L 5178 de Fischer, ainsi que sur une souche de tumeurs solides du Rat: - le carcinome de Guérin. Les souches de tumeurs ascitiques transplantables des souris ont été greffées sur des souris blanches n'ayant pas de descendance et d'un poids moyen allant de 20 à 23g. Le liquide ascitique natif de 6-7 jours a été dilué dans dusérum physiologique stérile dans le rapport 1/10, et la solution ainsi obtenue a été injectée par voie intrapéritonéale aux souris, en un volume de 0,5 ml. Les animaux de laboratoire ont été divisés en deux lots: un lot d'animaux servant de témoins et un lot d'animaux soumis à l'expérience. A partir du second jour apres la greffe tumorale, on commence à administrer aux animaux soumis à l'expérience, du trichloro-1 éthylèneamino-2 di(éthyl#- neamido) thiophosponylimino-2 éthane sous forme de suspension à 0,1% dudit produit dans du sérum physiologique. On injecte le produit, objet de l'invention, par voie sous-cutanée, à la dose de 1/14 de la LD50r une fois tous les deux jours, de façon à faire au total trois injections. Le 8-9ème jour apres la greffe tumorale, les animaux sont sacrifiés. On détermine le volume de liquide ascitique, accumulé chez les animaux témoins et chez ceux appartenant au lot des animaux soumis à l'expérience. Chez des rats de lignée Wistar, dont le poids varie de 80 à lZ5g, on réalise la greffe d'une suspension à- 30% de cellules de carcinome de Guérin au volume de l ml. A partir du 7-8ème jour, après la greffe tumorale, on administre le composé, conforme à l'invention, en une dose qui représente 1/10 de la LD50. Les animaux du lot soumis a l'expérience ont été répartis en quatre lots: - Chez les animaux du premier lot, le composé est injecté en une seule fois. - Chez les animaux des second et troisième lots, le composé est injecté une fois tous les deux jours à 4-5 reprises. - Les animaux du lot témoin ne reçoivent pas le composé selon l'invention. TABLEAU I - Activité antitumorale du trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane - Espèce Souche Nombre Taux Indice Taux des tumorale Dose d'injections d'inhibition d'efficacité de guérison animaux tumorale primaire 1 2 3 4 5 6 7 Souris Sarcome 37 1/14 LD50 3 97,2 35,5 52,9 Souris Carcinome d'Erlich 1/14 LD50 3 92,6 13,4 33,4 Souris Lymphadènose NK/LI 1/14 LD50 3 90,0 10,0 27,3 Souris Lymphadénose L 5178 de Fischer 1/14 LD50 3 62,0 2,6 6,2 Rats Carcinome de Guérin 1/10 LD50 1 68,0 3,1 Rats Carcinome de Guérin 1/10 LD50 4 99,85 285 50 Rats Carcinome de Guérin 1/10 LD50 5 100 - 100 A titre d'indices de l'activité antitumorale, on retient: le taux d'inhibition de la croissance tumorale, l'indice d'efficacité, et le taux de guérison primaire. Les résultats des expériences, déterminés par la méthode statistique de Montsévitshuté-Eringuéné, sont consignés dans le Tableau I, ci-dessus. t Le compose faisant l'objet de l'invention s'est avéré le plus efficace dans les expériences effectuées sur des rats avec la souche transplantable du carcinome de Guérin, après cinq injections dudit composé. Les rats qui, à la suite de l'administration de trichloro-1 éthylèneamino2 di- (éthylèneamido) thiophosphonyl imino-2 ethane, témoignent d'une résorption totale de la tumeur, se sont révélés par la suite réfractaires à l'égard d'une nouvelle greffe de carcinome de Guérit. La toxicité aiguë du composé faisant l'objet de l'invention, a été étudiée chez des souris blanches sans descendance, d'un poids moyen de 20 à 239, et des rats de lignée Wistar d'un poids moyen de 80 à 125g, ledit composé étant administré par les voies sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonale et per os . Le trichloro-l éthylèneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane a été préparé par voie extemporanée dans du sérum physiologique, et il a été administré sous la forme d'une suspension fine, dont la concentration ne depassait pas 4%. La dose du composé employé est égale à 1500 - 10 mg/kg de poids corporel. Chacune des doses choisies a été administrée à au moins 5-6 animaux. On enregistre la mort des animaux, soumis à l'expérience, aux 8-l0emes jours après administration du composé. La toxicité est exprimée en mg de substance active/kg de poids corporel de l'animal de laboratoire. Les résultats de ces expériences, traites par la méthode statistique de Litshfield et Wilcoxon modifiée selon Rote, sont consignés dans le Tableau Il, ci-après. Dans les expériences aigues, portant sur les rats, les resultats obtenus sont les suivants: en injection sous-cutanée : LD50 - 200 mg/kg en injection intramuscuLaire : LD50 - 150 mg/kg en administration per os : LD50 - 220 mg/kg en injection intrapéritonéale :LD50 - 35 mg/kg. On effectue l'étude de l'action du trichloro-l ethyleneamino-2 di-(ethy léneamido) thiophosphonylimino-2 éthane sur le taux des éléments contenus dans le sang périphérique, ainsi que sur la morphologie des cellules médullaires chez les rats de lignée Wistar, dont le poids moyen variait de 80 à 125g. TABLEAU II Toxicite du trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane en expérience aigue chez les souris. Voie d'administration LD10 LD16 LD50 LD84 LD90 1 2 3 4 5 6 . Sous-cutanée ........ 200 215 285 380 410 . Intramusculaire ........ 160 175 250 360 400 . Per os ........ 165 180 260 375 410 . Intrapéritonèale ........ 40 45 64 90 100 Le composé, objet de l'invention, a eté administré sous la forme de suspension à 0,1 dans du serum physiologique, à raison de 1/10 de LO50, une fois tous les deux jours, soit au total quatre administrations. On determine dans le sang périphérique des animaux, soumis à l'expe- rience, le taux de leucocytes, d'hématites, de plaquettes, de réticulocytes, la formule leucocytaire, la teneur en sucre, urée, hémoglobine, la vitesse de coagulation sanguine, la sédimentation sanguine, l'activité enzymatique du sérum sanguin et l'activité de la cholinestérase. Tous les taux sus-mentionnés ont été determinés avant administration du composé, et au cours du traitement, à l'aide du composé selon l'invention. A la fin du traitement, une partie des animaux ont été sacrifiés dans le but d'effectuer l'examen de la composition morphologique des cellules médullaires, tandis que l'autre partie des animaux est conservée pour une observation ul térieure. Chez les rats non-sacrifiés, on analyse le sang périphérique après 20, 30 et 60 jours suivant la dernière administration du composé. Les rats témoins, porteurs de tumeurs, meurent environ 20 à 25 jours après la greffe tumorale. L'administration en une seule fois de la dose correspondant à 1/10 de la Lu501 ne produit pas de modification nette de la composition morphologique du sang, d'après les valeurs des taux sus-mentionnés. L'activité de cholines térase sanguine ne se voit pas réduite, même après la quatrième administration du produit. Dans les experiences n vitro, le composé, objet de l'invention, ne presente également pas d'action sur l'activité des cholinestérases vraies et fausses. Les changements de la composition morphologique du sang périphérique apparaissent à la suite de la troisième administration du produit, atteignant des chiffres importants après la quatrième administration. Ainsi, le nombre de globules blancs est réduit de 28% après la troisième injection, et de 44,7% après la quatrième, arrivant à 7240 + 1140. Dès le quatrième jour après l'arrêt du traitement, le nombre de globules blancs commence à s'élever, et deux semaines après la dernière injection, ce nombre regagne son niveau initial. a composition morphologique des éléments cellulaires de la moelle osseuse fut étudiée chez des rats porteurs de tumeurs, le sixième jour après 4 administrations successives du composé faisant l'objet de l'invention. Cette étude montre que le clone médullaire reste sans changement. Chez la majorite des animaux, on ne remarque également pas, à l'analyse, de modifications visibles de la morphologie des cellules de la série myéloblastique. La division mitotique reste préservée. TABLEAU III Activité de la cholinestérase Toxicité, Valeur de la C O M P O S E Toxicité, dose LD50 thérapeutique en mg/kg molaire du cholinestérese, composé % 1 2 3 4 5trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane 285 10-2 - 1/14 LD50 N-benzoyl-N',N',N"nN"-diéthylènetriamide de l'acide phosphorique. 35 3,9x10-2 76 1/5 LD50 trichloro-1 éthyléneamino-2-di-(éthylènea@ido) phosphonylimino-2 éthane 42 3x10-3 50 1/10 LD50 Cependant, chez 20.e; des animaux, soumis au traitement sus-mentionné. on observe une fine vacuolisation homogène au stade des myélocytes, sans écartement du noyau et modification du volume des cellules, ce qui entrain des ramaniements dystrophiques du cytoplasme et du noyau des cellules de la série myéloSde. Dans la moelle osseuse de ces animaux, on rencontre plus rarement des cellules présentant une division mitotique. On réalise l'étude de la toxicité, de l'activité de cholinestérase et de la valeur de la dose thérapeutique de trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(éthy leneamido) thiophosphonylimino-2 éthane par comparaison avec l'action de produits connus, tels que le N-benzoyl-N',N',N",N"-diéthylène-triamide de l'acide phosphorique, et le trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(ethyleneamido) phosphonvlimino-2 éthane. Les données comparatives de-l'action de ces trois produits sont consi gnées dans le TabLeau III, ci-avant. t Les donnees figurant dans ce Tableau III montrent que le trichloro-l éthyl èneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 ethane présente une toxicité nettement inférieure (de 7 à 8 fois) et un éventail d'action thérapeutique nettement plus large que les produits déjà connus, et qu'il ne montre pas d'action sur le système nerveux végétatif. Le trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimind-2 éthane est préparé par le procedé d'amidation, procedé qui est utilisé pour-l'obtention de composés de phosphore, comportant un ou plusieurs noyaux éthyl éne-imines. Ce procédé est basé sur la réaction d'interaction du chlorure de l'acide N-dichlorothiophosphonyl-imino-trichloracétique avec 1 'éthylène-imine, en presence du triéthyl-amine, qui constitue l'accepteur d'hydrogène chlore. On effectue la réaction dans un milieu de solvants organiques inertes, à une température de O à 5 C. Le procédé est mis en oeuvre comme suit: On utilise à titre de matières premières l'anhydride chlorique de l'acide N-dichloro-thio-phosphonyl-imino-trichloracétique, que l'on met au contact d'éthylène-imine en présence de triéthyl-amine agissant en tant qu'accepteur de l'hydrogène chloré. On effectue la réaction dans un milieu formé de solvants organiques inertes, par exemple de benzène, toluène, éther diéthylique ou tétrachlorure de carbone, à la température de O à 50C. On élimine le chlorure de triéthyl-amine qui se depose sous forme de résidu, puis on extrait par les procédés connus le produit fini, qui se trouve dans le solvant organique. Le rendement en ce produit recherché atteint environ 31% en poids. il est avantageux de préparer la substance de base, c'est-à-dire l'anhydride chlorique de l'acide N-dichlorothiophosphonyl-imino-trichlor- acétique, de la façon suivante: On fait entrer en reaction l'anhydride chlorique de l'acide N -dichlorothiophosphonyl-imino-trichloracétique avec le phosphore pentasulfureux à la température de 140-170 C. On sépare le produit recherché par distillation sous vide. On obtient l'anhydride chlorique de l'acide N-dichlorothiophos- phonyl-imino-trichloracétique, qui se présente sous forme d'un liquide limpide jaune-clair, dont le poids spécifique est égal à 1,7346. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaitront à la lecture des exemples illustratifs suivants de préparation du nouveau composé, soit le trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(ethyleneamido) thiophosPhonylimino-2 éthane, faisant l'objet de l'invention. EXEMPLE 1 On prépare la matière première,qui est le chlorure de l'acide N-dichloro thiophosphonyl-imino-trichloracétique, de la façon suivante: On mélange doucement en réchauffant par un bain d'huile à 140-170iC, 34,69 de chlorure de l'acide N-dichlorophosphonyl-imino-trichloracétique et 6,59 de phosphore pentasulfureux. Après 1h à 1 h 30, il se forme une substance qui distille facilement et qui s'égoutte du réfrigérant à refluxaucours de 4 heures. Ensuite, on remplace le réfrigérant à reflux par un réfrigérant descendant, et on distille sous le vide d'une pompe à eau la fraction qui distille lentement - le CCl3CN (trichloracétonitrile) et le PSCl3 (chlorure de thiophosphoryle). On distille le résidu sous le vide créé par une pompe à huile et on extrait la fraction après distillation répétée à 75-760C (0,1 mm de mercure). On obtient ainsi 17,39 (48%) de chlorure de l'acide N-dichloro-thiophosphonylimino-trichloracetique. L'analyse du produit pour la formule brute C2CLsNPS conduit aux teneurs suivantes (en %): N P S Cl C MRD rouvé 4,52-4,65 9,88-9,59 10,66-10,62 68,21-68,37 8,72-7,92 60,9 Calculé: 4,47 9,81 10,19 67,88 7,65 60,3 On met en solution 7,59 d'imine-éthylène et 17,09 de triéthyl-amine dans 250 ml de benzène. On additionne à la solution ainsi obtenue, goutte à goutte et en mélangeant de façon continue à l'aide d'un mélangeur mecanique, la solution de 17,39 de chlorure de l'acide N-dichlorothiophosphonyl-iminotrichloracétique dans 200 ml de benzène, tout en maintenant la température dans les limites de O à 5 C. Après l'introduction totale de la solution sus-mentionnée, on maintient pendant 7 heures le milieu réactionnel à la température de 25 C. On filtre et on élimine le résidu solide de chlorure de triéthyl-amine formé, puis on concentre par évaporation sous vide la solution du composé recherché dans le benzène jusqu'à élimination complète de ce dernier. On obtient comme résidu, après évaporation, un liquide limpide, de couleur jaune-clair, que l'on cristallise et qui forme le compose recherché. Dans le but d'elever la pureté dudit composé, on effectue une recristallisation dans un mélange hexane/acétone (1/5). On obtient ainsi 5,6g (31%) de trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(ethyleneamiåo) thiophosphonylimino-2 éthane. La température de fusion dudit composé est de 137 à 1380C (avec decomposition). L'analyse du produit obtenu pour la formule brute C8Hl2Cl3N4PS conduit aux teneurs suivante (en %): N s trouvé : 16,37-16,54 9,71-9,67 calculé: 16,82 9,62 EXEMPLE 2 On prépare le composé de base, soit le chlorure de l'acide N-dichlorothiophosphonyl-imino-trichloracétique, selon le proccédé décrit dans l'Exemple 1. Le composé recherché, soit le trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane , est préparé selon le même procédé que celui qui est décrit dans l'Exemple 1, si ce n'est que l'on utilise à titre de solvant organique inerte le toluène. Le rendement en le composé obtenu s'élève à 5,06g (28%). EXEMPLE 3 On prépare le composé de base, soit le chlorure de l'acide N-dichlorothiophosphonyl-imino-trichloracétique, selon le procédé décrit dans l'ExempLe 1. Le composé recherché, c'est-à-dire:trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane, est obtenu selon le même procédé que celui qui est décrit dans l'Exempte 1. si ce n est que l'on utilise à titre de solvant organique inerte l'éther diéthylique. Le rendement en le composé obtenu s'élève à 4,79 (26%). EXEMPLE 4 Le composé de base, soit le chlorure de l'acide N-dichloro-thiophosphonyl-imino-trichloracétique, est prépare selon le procédé décrit dans 'Exemple 1. Le composé recherché, c'est-à-dire le trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(éthyleneamido) thiophosphonylimino-2 éthane, est préparé selon le même procédé que celui décrit dans 1'Exemple 1, si ce n'est que l'on utilise à titre de solvant organique inerte le tétrachlorure de carbone. Le rendement en le composé recherché s'élève à 4,39 (24%). Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée aux exemple et modes de mise en oeuvre mentionnés ci-dessus; elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans que l'on ne s'écarte de l'esprit de l'invention. REVENDICATION5 1.- A titre de produit industriel nouveau, le Xrichloro-1 éthylèneamino- 2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane,-de formule suivente 2.- A titre de médicament nouveau, notamment pour le traitement des néoplasies d'origine épithéliale et mésenchymateuse ainsi que pour l'inhibition de la croissance des cellules lympholdes, toute composition contenant en tant que principe actif trichloro-1 éthylèneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 ethane ,de formule 3.- Procédé de préparation de trichloro-1 éthyieneamino-2 di-(éthylèneamido) thiophosphonylimino-2 éthane, de formule consistant à faire réagir le chlorure de l'acide N-.dichlorothiophosphonylimino trichloracetique avec l'éthylène-imine en présence de tri-éthyl-amine dans un milieu de solvants organiques inertes à une température de O à 5 C.