Brevet FR2496693A1 — publié le 19820625

La présente invention est relative à un procédé de dosage de la peroxyde dismutase (abrégée ci-après en POD). Plus particulièrement, l'invention est relative à un pro- cédé de dosage immunologique par voie enzymatique de la POD en utilisant une technique de sandwich. La POD est un enzyme qui catalyse la dismutation ou la dissociation d'anions peroxyde à radicaux libres ( 2') Ces dernières années, son dosage a retenu de plus en plus l'attention du point de vue clinique et on souhaite beau- coup pouvoir effectuer la microanalyse de la POD dans des tissus,tels que le foie et le poumon. La POD en est venue aussi à être utilisée comme agent thérapeutique, de sorte que l'on souhaite pouvoir en effectuer le dosage du taux dans le sang. Pour ce qui concerne le dosage classique de la POD, on a proposé le procédé de McCord et collaborateurs [J. Biol. Chem. 244, 6049-6055 (1969)] qui, cependant, est fastidieux dans son protocole opératoire et insuffisant dans sa sensibilité de mesure. Le dessin annexé représente la courbe d'étalonnage de l'orgotéine. Après de nombreuses recherches d'un procédé simple et précis de détermination de la POD, on a maintenant trouvé qu'il y a moins de réactivités croisées entre les diverses POD provenant de différents types d'animaux pour le produit conjugué spécifique de la POD et d'un accepteur qui se conjugue spécifiquement à la POD et l'invention vise donc un procédé de dosage quantitatif de la POD en ajoutant un échantillon liquide à une matière en phase solide prépa- rée à partir d'un accepteur, se conjuguant spécifiquement à la POD, pour provoquer une réaction, puis en ajoutant au produit de réaction un produit conjugué accepteur-enzyme pour provoquer une réaction et ensuite en déterminant l'acti- vité enzymatique dans la matière en phase solide. Tout d'abord, la POD utilisée suivant l'invention peut être n'importe laquelle de celles ayant l'activité de catalyser la dismutation ou la dissociation des anions peroxyde à radicaux libres. C'est ainsi, par exemple, que l'on peut mentionner la POD provenant du boeuf, en particu- lier l'orgotéine, qui est une POD provenant du foie du boeuf, la POD provenant de l'homme et d'autres POD provenant de diverses espèces animales. On peut séparer et purifier la POD d'un animal choisi correctement par le procédé décrit dans J. Biol. Chem., 234, 46 (1959). Pour obtenir l'accepteur se conjuguant spécifique- ment à la POD, on peut utiliser en général un anticorps obtenu alors que la POD servant d'antigène, est injectée à un autre type d'animal. C'est ainsi, par exemple, qu'une émulsion d'orgotéine provenant du foie de boeuf dans l'adju- vant complet de Freund peut être injectée à un type diffé- rent d'animaltel que le lapin et le cobaye, plusieurs fois pendant une période définie pour obtenir une immunosensibi- lisation. On recueille ensuite le sang et on le traite sui- vant le procédé classique, tel que par centrifugation, re- largage, précipitation au point isoélectrique, dialyse, chromatographie, filtration sur gel, etc., pour séparer et purifier l'anticorps. En outre, l'accepteur ainsi obtenu, qui se conjugue spécifiquement à la PODest fixé sur un support insoluble directement ou indirectement en utilisant un agent de fixation, pour obtenir la matière en phase solide. Les supports insolubles utilisés pour obtenir la matière en phase solide peuvent être ceux ayant un radical fonctionnel, par exemple des supports protéiniques insolu- bles,tels que l'albumine et la gélatine traités par le glutaraldéhyde, des supports insolubles semi-synthétiques de masse moléculaire élevée, tels que l'agarose, la cellu- lose et le dextrane, traités par l'épichlorhydrine ou le broaure de cyanogène, ou ceux traités en outre par un réactif d'amina- tion, des supports insolubles synthétiques de masse molécu- laire élevée, tels que des polymères et des copolymères d'acrylonitrile, d'acide acrylique, d'acrylate, d'acide méthacrylique, de méthacrylate de méthyle, d'alcool vinyli- que, d'acétate de vinyle, de styrène, d'aminostyrène, de divinylbenzène, d'acrylamide, d'éthylène, d'anhydride maléique, d'acide crotonique, etc., et ceux traités en outre par un réactif d'amination et des supports minéraux insolu- bles tels que des composés silaniques traités par un réac- tif d'amination. On peut utiliser n'importe lequel des divers procédés connus pour introduire un groupe amino sur le support insoluble. C'est ainsi, par exemple, que l'on peut faire appel à l'amination par la réduction du groupe nitro, à l'introduction d'un groupe aminoalcoyle par la réaction d'un groupe hydroxy sur un y-aminopropyltriéthoxy- silane, à l'introduction du groupe amino par la transforma- tion du groupe hydroxyméthyle en le groupe aldéhyde par oxydation au periodate, suivie de la réaction de l'aldéhyde sur une diamine,telle que l'hexaméthylènediamine et la décaméthylènediamine, à la transformation du groupe hydroxy d'un polysaccharide en un groupe imidocarbonate par réac- tion sur le bramure de cyanogène, à la transformation du groupe amide en un groupe iminohalogénure par un composé halogéné du phosphore. On peut faire réagir ces groupes fonctionnels sur un agent pour introduire un nouveau groupe fonctionnel, par exemple sur un dialdéhyde,tel que le glutaraldéhyde et l'adipaldéhyde, sur un dérivé réactiftel qu'un chlorure de w-amino acide et sur l'anhydride d'acide S-acétylmercapto- succinique. Pour préparer la matière en phase solide, on peut fixer un accepteur se conjuguant spécifiquement à la POD au support insoluble par le groupe fonctionnel de la molécule tel que le groupe amino, aldéhyde, carboxy, hydroxy, thiol, imidocarbonate, iminohalogénure et autres. On peut fixer les deux-constituants l'un à l'autre directement ou indirecte- ment en utilisant un agent de fixation. Pour la fixation directe, on peut faire réagir le groupe carboxy ou imido- carbonate d'un support insoluble sur le groupe amino d'une molécule d'accepteur dans un milieu inerte, si nécessaire en la présence d'un carbodiimide soluble dans l'eau. Pour obtenir la matière en phase solide par la fixation indirec- te en utilisant un agent de fixation, ce dernier peut être n'importe lequel des composés multifonctionnels bien connus, par exemple des composés diisocyanatestels que le diisocya- nate d'hexaméthylène et le 2,4-diisocyanate de toluène; des diisocyanates tels que le diisocyanate d'hexaméthylène; des dialdéhydes tels que le succinaldéhyde, le glutaral- déhyde et l'adipaldéhyde; le N,N'éthylènebismaléimide; le N,N'-ophénylènedimaléimide; la bisdiazobenzidine; le N, N'polyméthylènebisiodoacétamide; le malonimidate de diéthyle; l'adipinimidate de diméthyle; des acides sulfi- docarboxyliques tels que l'acide 3-(2'-benzothiazolyl- dithio)propionique, l'acide 3-(2'-pyridyl-N-oxydo-dithio)- propionique, l'acide 6-N[3-(2'-benzothiazolyl-dithio)pro- pionyl]caproique et leurs dérivés réactifs tels que leurs esters succinimidiques, leurs esters p-nitrophényliques, leurs chorures d'acides et leurs imidates (voir demande de brevet au Japon No. 85900/1978); et des acides maléimi- docarboxyliques tels que l'acide maléimidobenzoique, l'aci- de maléimidophénylacétique et l'acide maléimidophénylpropio- nique et leurs dérivés réactifs. Comme enzyme utilisé pour obtenir le produit conju- gué avec un accepteur se conjuguant spécifiquement à la POD, on peut utiliser une oxydoréductase, une hydrolase, une invertase, une lyase, une isomérase et une ligase. On peut citer à titre d'exemple la lactase déhydrogénase, la maleate déhydrogénase, la malate déhydrogénase, la maltose déhydrogénase, la peroxydase, la lactate oxydase, la maleate oxydase, la glucose oxydase, la choline oxydase, la xanthine oxydase, l'amino acide oxydase, la sarcosine oxydase, la catalase, l'a-amylase, la e-galactosidase, le lysozyme, la lipase, l'alcali phosphatase, l'aminopeptidase, la trypsine, la papaine, l'a-chymotrypsine, l'amidase, l'hexokinase, la glycérokinase, etc. En outre,on peut intro- duire à l'avance dans ces enzymes un agent d'encombrement. On peut modifier l'enzyme en y introduisant un radical aldéhyde, amino ou thiol en utilisant un agent d'encombre- ment, par exemple un dialdéhyde tel que le glutaraldéhyde, un dérivé réactif tel qu'un chlorure d'w-amino acide, un dialdéhyde ou un chlorure d'acide dicarboxylique additionné d'une diamine telle que l'hexaméthylènediamine et la déca- méthylènediamine,de l'anhydride d'acide S-acétylmercapto- succinique, un dialdéhyde additionné de 2-aminoéthanethiol, etc. De même, on peut modifier l'accepteur à l'avance en y introduisant un agent d'encombrement. Pour préparer le produit conjugué accepteur-enzyme, on peut conjuguer les deux constituants par l'intermédiaire d'un groupe amino, hydroxy, thiol ou carboxy de l'accepteur ou de l'enzyme, ou par l'intermédiaire d'un groupe aldéhyde, amino, thiol ou carboxy qui a été produit dans l'accepteur ou dans l'enzyme. On peut aussi conjuguer les deux consti- tuants en utilisant l'agent de fixation multifonctionnel tel que mentionné ci-dessus. Pour obtenir la matière en phase solide, ou le pro- duit conjugué accepteur-enzyme, on peut effectuer habituel- lement la réaction dans une solution-tampon de pH 6 à 8 en la présence d'un solvant organique tel que le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le dioxane, le tétrahydrofuranne, la diméthylacétamide, la diméthylsulfoxyde, etc., ou dans un tel solvant organique à une température de O à 400C. La réaction achevée, on peut laver le produit et le purifier si nécessaire. On effectue de préférence la purification en utilisant une chromatographie d'adsorption ou une filtra- tion sur gel. Lorsqu'on effectue le procédé suivant l'invention, on fait réagir l'un sur l'autre une quantité définie de la matière en phase solide préparée à partir d'un accepteur se conjuguant spécifiquement à la POD et d'un échantillon dont on doit doser la valeur de la POD. On peut effectuer en général la première réaction à une température de 40C et dans un milieu aqueux, par exemple dans une solution-tampon au phosphate 10 mM (pH 7,2) contenant 0,25 % d'albumine sérique du boeuf (BSA), 0,1 % de NaN3 et 0,15 M de NaCt. La réaction achevée, on peut de préférence laver la matière en phase solide et lui ajouter alors une certaine quantité d'un produit conjugué d'un enzyme et d'un accepteur se con- juguant spécifiquement à la POD. On laisse le mélange réa- gir en milieu aqueux, en général à une température de 40C, pendant une nuit. Ensuite, on recueille la matière en phase solide, on la lave et on en dose l'activité enzyma- tique. En dosant l'activité enzymatique, on peut mesurer le constituant consommé ou le constituant formé en utilisant un substrat correspondant à la réaction enzymatique emplo- yée. Dans le cas d'une oxydase par exemple, on peut doser la POD dans l'échantillon en mesurant l'enzyme consommé ou l'eau oxygénée formée après que le substrat a été oxydé par la réaction enzymatique et déterminer l'activité enzy- matique à partir de cette valeur. Dans le cas d'une réduc- tase, il vaut mieux mesurer le coenzyme consommé après la réaction enzymatique. Dans le cas d'une hydrolase, on peut mesurer l'hydrolysat formé après la réaction enzy- matique. Pour ces mesures, on peut utiliser divers procédés connus, par exemple les mesures directes utilisant l'élec- trode à oxygène, l'électrode à eau oxygénée et la colori- métrie, ou la mesure indirecte utilisant le changement de coloration après la réaction sur le mélange eau oxygénée- agent colorant et on peut choisir convenablement ces procé- dés suivant la nature de l'enzyme utilisé. En pratiquant comme mentionné ci-dessus, on peut doser la POD d'un échantillon d'une manière tout à fait satisfaisante. C'est pourquoi l'invention est un procédé très favorable de dosage de la POD, les divers agents uti- lisés étant surs et stables. L'exemple suivant illustre l'invention. EXEMPLE (1) POD. 1) POD provenant du boeuf (orgotéine): fournie par la Société Diagnostic Data Incorporated. 2) POD provenant de l'homme (POD humaine): séparée d'érythrocyte humain et purifiée par le procédé décrit dans J. Biol. Chem., 234, 46 (1959). 3) POD provenant d'autres animaux: séparée et purifiée suivant un procédé semblable à la séparation et à la purification de la POD humaine. (2) Accepteur se conjuguant spécifiquement à la POD. 1) On mélange de l'orgotéine (5 mg/me) à un volume égal d'adjuvant complet de Freund pour préparer une émulsion. Chaque aliquot de 0,5 mn de l'émulsion est injecté par voie sous-cutanée à des lapins, dans le dos, trois fois par deux semaines et après un intervalle de trois semaines, trois fois par deux semaines, pour obtenir la sensi- bilisation immunologique. On recueille ensuite tout le sang quand son titre en anticorps atteint 800 U pendant le déroulement du dosage, suivant la fixation complémentaire, et on obtient l'antisérum contre l'orgotéine suivant le procédé classique. 2) On injecte de la POD humaine (5 mg/mt) à des lapins de la même manière que l'orgotéine au paragraphe 1 ci-dessus. On recueille le sang et on obtient l'anti- sérum contre la POD humaine. 3) on recherche les réactivitéscroiséesentre chaque antisérum obtenu et la POD provenant de différents types d'animaux. Les résultats obtenus sont donnés au tableau 1 qui montre que les réactivités croisées entre les anti- sérums obtenus et la POD provenant de divers types d'ani- maux sont inférieures à 1/1000. TABLEAU 1 (3) Matière en phase solide préparée à partir de l'accepteur se conjuguant spécifiquement à l'orgotéine. On lave au benzène soixante-quinze pièces (100 g) de grains de Nylon-6,6 (de forme cylindrique de 9 mm de Antisérum Antisérum contre contre orgotéine POD humaine Orgotéine 1 inférieur 1OOO POD humaine inférieur 1OO0 1 POD de cochon inférieur 1 inférieur POD de lapin inférieur 500o inférieur Tooo 5000 1000 POD de rat inférieur 000 inférieur 1 dchvi5000éi 1000 POD de cheval inférieur 1 inférieur 1000 1000 diamètre et de 5 mm d'épaisseur) et on leur ajoute 200 gram- mes de benzene contenant 18 grammes de pentachlorure de phosphore, et on laisse réagir les grains pendant deux jours en agitant à température ambiante, puis on les lave bien au benzène. On lave encore les grains à l'aide d'une petite quantité de tétrahydrofuranne, puis on leur ajoute ml de tétrahydrofuranne contenant 29 grammes d'acide adipique. On laisse le mélange réagir pendant une nuit à tem- pérature ambiante. On lave ensuite à fond les grains par du diméthylformamide et on les met dans 100 niml d'une solu- tion au diméthylformamide contenant 2,3 grammes de N-hydro- xysuccinimide et 4 grammes de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide. On laisse le mélange réagir pendant 6 heures à la tempéra- ture ambiante. On lave les grains par du diméthylformamide et on leur ajoute 100 ml d'une solution aqueuse de 200 mg d'hexaméthylènediamine (pH 11,0). On laisse les grains réagir pendant une nuit à la température ambiante, puis on les lave par de l'eau salée 0,5 M et à nouveau par du sérum physiologique, puis on les met à réagir en ajoutant une solution contenant du glutaraldéhyde, puis on les lave. D'autre part, on obtient une fraction de y-globuline du lapin contenant l'anticorps contre l'orgotéine, à partir de l'antisérum contre l'orgotéine mentionné ci-dessus par fractionnement au sulfate d'ammonium, suivant le procédé classique. On ajoute la fraction aux grains en une quantité correspondant à 100 pg par pièce de grains et on laisse réagir. (La quantité de y-globuline fixée est de 65 pg par pièce en moyenne). (4) Produit conjugué d'un enzyme et d'un accepteur se conjuguant spécifiquement à l'orgotéine. En utilisant la fraction de y-globuline de lapin contenant l'anticorps contre l'orgotéine,obtenoetel que men- tionné ci-dessus, et de la 0-galactosidase, on obtient une solution du produit conjugué de l'anticorps contre l'orgo- téine et de la e-galactosidase suivant le procédé décrit dans J. Biochem., 84, 93-102 (1978) (en utilisant le N,N'- o-phénylènedimaléimide comme agent multifonctionnel). (5) Dosage de l'orgotéine (courbe d'étalonnage). A une pièce des grains,obtenue tel que mentionné ci-dessus, (la matière en phase solide de l'anticorps contre l'orgotéine), on ajoute 100 Pt d'un échantillon liquide (contenant de O à 100 mg/me d'orgotéine) et 100 Pt d'une solution-tampon au phosphate 10 mM (pH 7,2) contenant 0,25 % d'albumine sérique du boeuf, 0,1 % de NaN3 et 0,15 M de NaCe et on laisse la pièce réagir pendant une nuit à une température de 4 C. La réaction achevée, on lave la pièce par la même solution-tampon, on lui ajoute 100 wt d'une solution contenant un produit conjugué de l'anticorps contre l'orgotéine et dela e-galactosidase,préparé comme mentionné ci-dessus (diluée 50 fois), et on laisse la pièce réagir pendant une nuit à une température de 4 C. La réaction achevée, on lave la pièce par du sérum physiolo- gique, on lui ajoute 0,2 ml d'une solution-tampon au phos- phate 30 mM (pH 7,0) contenant 4 mg/me de o-nitrophényl-B- galactoside, 20 mM de mercaptoéthanol et 10 % d'éthanol et on laisse la pièce réagir pendant 1 heure à une température de 37 C. A la pièce on ajoute 2,3 mi d'une solution-tampon de glycine-NaOH (pH 11,5) et on mesure le changement de coloration par l'extinction à la longueur d'onde de 420 nm. On obtient ainsi une excellente courbe d'étalonna- ge pour l'orgotéine, comme le montre le dessin. (6) Dosage de l'orgotéine. En utilisant, comme échantillons, des sérums obtenus à partir de rats, après injection sous-cutanée à chacun d'eux de 1 mg d'orgotéine, on répète le même procédé de dosage de l'orgotéine (pour la courbe d'étalonnage) pour doser le taux d'orgotéine dans le sérum des rats, après adminis- tration de l'orgotéine, puis on fait suivre d'un calcul basé sur la courbe d'étalonnage. Les résultats obtenus sont donnés au tableau 2. TABLEAU 2 Taux de l'orgotéine dans les sérums (pg/mZ) No. Temps (en heures) au bout duquel on recueille le sang 0,25 0,5 1 2 3 5 7 1 0,72 0,91 0,85 1,22 1,51 0,66 0,65 2 2,94 1,33 1,35 1,70 2,30 2,29 2,22 3 0,90 1,20 3,52 2,32 2,30 2,23 1,05 4 0,75 0,80 1,14 3,52 2,50 2,25 2,20 0,76 0,90 0,92 1,95 0,76 0,72 0,64 REVENDICATION Procédé de dosage de la peroxyde dismutase, caracté- ris6 en ce qu'il consiste à ajouter à un échantillon une matière en phase solide préparée à partir d'un accepteur se conjuguant spécifiquement à la peroxyde dismutase, à lais- ser les deux constituants réagir l'un sur l'autre, à ajou- ter au produit de réaction un produit conjugué d'un enzyme et d'un accepteur se conjuguant spécifiquement à la per- oxyde dismutase, à les laisser réagir l'un sur l'autre et à déterminer l'activité enzymatique de la matière en phase solide.