Brevet FR2488409A1 — publié le 19820212

i Actuellement on détermine de façon quantitative de nombreuses substances biologiques en utilisant des procédés immunologiques. Le procédé d'analyse radio- immunologique, qui s'est imposé en tant que premier procédé d'analyse d'une nouvelle génération de procédés de détermination de traces avec sa sensibilité s'étendant jusque dans le domaine moléculaire, est aujourd'hui supplanté dans une large mesure par des procédés non radio- actifs de détection, qui possèdent une sensibilité à peu près équivalente. L'un de ces procédés est désigné sous le nom d'analyse par immunofluorescence. L'utilisation de la lumière flash ou lumière éclair pour la technique d'analyse par immunofluorescence (analyse impulsionnelle par immunofluorescence ou PFIA), du type décrit dans la demande de brevet allemand publiée sous le numéro provisoire P 25 23 209.1, présente de nombreux avantages par rapport à d'autres procédés d'immuno-analyse non isotopiques. L'objet de la présente invention est d'utiliser une lumière flash et la polarisation de fluorescence pour la technique de l'immuno-analyse. D'après la littérature (Parker, CW "Weir, manuel d'immunologie expérimentale", troisième édition, volume 1, pages 18.1 et suivantes), on sait que des molécules, aptes à fournir une fluorescence et excitées par une lumière polarisée, émettent une énergie lumineuse dont les valeurs de polarisation dépendent de façon décisive de la taille des molécules, mais, à part cela, également d'autres paramètres (par exemple du nombre et du type de ces molécules, de l'état des molécules - fixées dans une position ou bien non fixées -). Dans toutes les immunoréactions, la taille des molécules est modifiée lors de la formation du complexe antigène-anticorps. Par conséquent, sous l'effet de l'immunoréaction, les caractéristiques de polarisation de fluorescence d'une substance immunologique marquée par fluorescence subissent une modification. L'évaluation de l'intensité de la fluorescence à polarisation dans les plans de polarisation permet-- même dans le cas o l'on ne prend pas en compte les valeurs obtenues sans lumière polarisée -, de détecter de façon simple des immunoréactions. L'utilisation de la lumière flash permet alors, par rapport à des sources usuelles de lumière ininterrompue intense, d'utiliser de façon impulsionnelle des quantités de lumière extrêmement intenses pour réaliser l'excitation de la fluorescence et de ne progresser en général par conséquent que jusqu'aux limites de la sensibilité théoriquement possible, et ce, sans que l'échantillon soit endommagé par un développement excessif de chaleur associée, ou sans que la valeur mesurée soit influencée d'une manière mesurable par l'effet de blanchiment fluorophotographique. A titre d'exemple, on a décrit ci-dessous et illustré schématiquement aux dessins annexés une forme de réalisation d'un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. La figure 1 représente une forme de réalisation du dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon - l'invention; et La figure 2 montre un diagramme reproduisant les résultats obtenus dans le cas d'un exemple de réalisation pratique. Ci-après, en référence à la figure 1, on va décrire la constitution et expliciter le fonctionnement d'une forme de réalisation simple, éprouvée et confirmée d'un -ppa-ril pour la mise en oeuvre uu procédé d'analyse par immuno-fluorescence à polarisation selon l'invention. La lumière parvenant d'une source de lumière flash ou éclair 1 (dans le cas le plus simple une lampe au xénon) est mise sous forme monochromatique par le filtre d'excitation 2 (dans le cas le plus simple, un filtre interférentiel), est polarisée par le filtre de polarisation 3 et atteint la cuvette 5 après avoir traversé une fente 4. Suivant une direction située d'un câté et décalée à 900 de la direction d'incidence du rayonnement, la lumière fluorescente traverse une fente 6, un filtre interférentiel 7 conçu en fonction de la longueur d'onde d'émission, et un filtre de polarisation 8 et atteint ensuite un multiplicateur photonique 9. Suivant une direction située de l'autre côté et décalée à 900 de la direction d'incidence du rayonnement, la lumière fluorescente traverse la fente 10, un filtre inter- férentiel 11 conçu en fonction de la longueur d'onde d'émission, et un filtre de polarisation 12 et ensuite le multiplicateur photonique 13. Les signaux délivrés par les multiplicateurs photoniques 9 et 13 sont comparés entre eux dans le système d'exploitation 14 et sont finalement évalués et affichés. Un commutateur 15 permet de débrancher l'un des deux multiplicateurs photoniques, de-sorte que - pour une orientation correspondante du filtre de polarisation 3 -, l'appareil peut être utilisé sous la forme d'un simple fluorimètre à polarisation ne déterminant pas une différence, ou bien sous la forme d'un fluorimètre non polarisé dans le cas o ce filtre est pivoté. Dans le système d'exploitation 14, les impédances des signaux impulsionnels provenant des multi- plicateurs photoniques 9 et 13 sont d'abord réduites selon une technique classique connue pour les amplificateurs opérationnels à gain unité, puis les signaux sont convertis, dans des amplificateurs opérationnels respectifs montés en intégrateurs, en une tension dépendant de l'énergie impul- sionnelle, et sont utilisés pour charger des condensateurs respecrLjL. Les tensions, qui aepenaent ces signaux et sont appliquées aux deux condensateurs, sont introduites dans un amplificateur opérationnel équipé d'une entrée à transistor à effet de champ FET. A la sortie de l'amplificateur opérationnel apparaît une tension dont l'amplitude dépend linéairement de la différence des signaux reçus par les multiplicateurs photoniques. Les filtres analyseurs de polarisation 7 et 11 sont pivotés de façon appropriée de 900 l'un par rapport à l'autre; le filtre de polarisation 3 est monté de façon appropriée de manière à pouvoir pivoter dans le trajet d'incidence du rayonnement d'excitation, afin de pouvoir garantir une utilisation optimale de l'appareil même dans le cas du passage d'une utilisation à une autre - uniquement grâce à un réglage correspondant des filtres. On va décrire ci-après un exemple d'utilisation. De nombreux médicaments modernes puissants ont pour défaut de ne présenter qu'un domaine d'action biologique réduit et une demi-vie biologique variant fortement d'un patient à un autre. Des contrôles permanents du taux sanguin sont obligatoires dans le cas de ces médicaments afin de pouvoir effectuer d'une manière aussi précoce que possible des corrections de dose afin d'obtenir une protection vis-à-vis d'effets secondaires fatals intervenant, conditionnés par des taux sanguins trop élevés. Quelques-unes de ces substances sont par exemple connues sous les noms de DIGOXINE, NORPACE, AMIKACINE, KANAMYCINE et GENTAMICINE. La détermination du taux sanguin de gentamicine peut être effectuée, conformément à la présente invention, d'une manière simple, rapide, fiable et moyennant une précision extrêmement élevée 1). A respectivement 2 ml d'une solution de gentamicine, marquée à la fluorescéine possédant une concen- tration appropriée dans un liquide tampon TRIS possédant une molarité égale à 0,05 et possédant une valeur du pH réglée à la valeur de 7,1, on ajouteé: pl (Pl = microlitre) A; d'an sérum de patient B) d'un sérum témoin ne comportant pas de gentamicine C) d'un sérum témoin comportant 1 pg de gentamicine/ml D) d'un sérum témoin comportant 2 pg de gentamicine/ml E) d'un sérum témoin comportant 4 pg de gentamicine/ml F) d'un sérum témoin comportant 8 pg de gentamicine/ml G) d'un sérum témoin comportant 16 pg de gentamicine/ml. et on soumet l'ensemble à l'incubation pendant 10 minutes à la température ambiante. 2). On introduit les échantillons successivement dans une cuvette de mesure 5 située dans l'appareil. Au moyen d'un flash ou éclair on détermine et on lit la valeur différentielle de fluorescence. 3). On compare la valeur différentielle de fluorescence du sérum de patient à la courbe étalon formée par les sérums témoins B à G; de ce fait, on obtient aussitôt la teneur en gentamicine du sérum de patient. - Lors du présent essai, on a obtenu les valeurs suivantes: A. Sérum de patient 6,513 V B. Sérum témoin à 0 Pg/ml 9,144 V C. Sérum témoin à 1 pg/ml 7,974 V D. Sérum témoin à 2 pg/ml 7,037 V E. Sérum témoin à 4 Pg/ml 6,045 V F. Sérum témoin à 8 lg/ml 4,665 V G. Sérum témoin à 16 Pg/ml 4, 534 V Sur la figure 2, on a représenté graphiquement les valeurs sur un papier semi-logarithmique. La représenta- tion graphique reproduit la courbe étalon. D'après la courbe étalon, il ressort que le taux en gentamicine dans le sérum du patient était égale à 2,8 Pq/ml. Ci-après, on va indiquer les possibilités d'utilisation du procédé. Tous les immunocomplexes caractérisés par une substance de marquage fluorescente peuvent être évalués en utilisant le procédé d'immunofluorescence à polarisation. Ce procédé peu.t cre utilise auSSi oien pour i'immuno-analyse compétitive que pour l'immuno-analyse "en sandwich". L'utilisation de l'immuno-analyse à polarisation peut être appliquée notamment à la détection et à la détermination quantitative, lors desquelles des éléments participant à l'immunoréaction et présentant des molécules de taille réduite et moyenne jouent un rôle et o l'on attache une valeur importante à une manipulation simple et surtout à une exécution extrêmement rapide des déterminations, lorsque l'on s'efforce d'obtenir une sensibilité et une précision élevées et même extrêmement élevées. La nécessité de séparer les participants liés d'une immunoréaction par rapport aux participants non liés de l'immunoréaction, ce qui est l'un des plus grands inconvé- nients de toutes les immuno-analyses hétérogènes, est supprimée dans le cas de la présente immuno-analyse homogène, lors de laquelle la taille des molécules influe sur le signal de mesure; en effet, les substances immunologiques, dont les molécules possèdent une taille réduite, sont, dans des liquides, soumises beaucoup plus fortement au mouvement moléculaire brownien que les molécules de grande taille. Par conséquent, la disposition spatiale de petites molécules varie déjà au cours du bref intervalle de temps entre l'excitation de la fluorescence et l'émission de la lumière fluorescente et il apparaît par conséquent des molécules beaucoup moins polarisées que les grosses molécules, dont la disposition spatiale et par conséquent, la direction de polarisation d'émission varient seulement de façon minimale pendant cet intervalle de temps. Une solution de substances immunologiques constituées par de petites molécules fluorescentes qui, en lumière non polarisée, est entièrement équivalente à une solution de grosses molécules fluorescentes de substances immunologiques, du point de vue de leurs propriétés de fluorescence, possède, conformément à la lumière polarisée, une polarisation seulement minimale par rapport à la solution des grosses molécules. Cependant, dès que -par exemple, par suite d'une immunoréaction - les petites molécules se réunissent à d'autres substances (- pour former un immuno- complexe -) et par conséquent augmentent de taille, elles sont beaucoup moins soumises au mouvement moléculaire brownien et peuvent par conséquent être détectées de façon simple - et d'une manière quasiment quantitative -dans la lumière de polarisation. On va décrite ci-après les avantages du procédé conforme à l'invention. Le procédé d'analyse par immunofluorescence à polarisation conforme à la présente invention présente un nombre important d'avantages par rapport à des procédés usuels d'immuno-analyse. Grâce à la technique de la lumière flash et à la technique différentielle, ce procédé réduit de plusieurs ordres de grandeur le fond par rapport aux meilleurs procédés classiques d'immuno-analyse et atteint par conséquent aisément leurs niveaux de sensibilité. Ce procédé n'est pas entaché des risques et d'autres inconvénients des procédés d'analyse radio- immunologique. Il peut être mis en oeuvre moyennant une dépense extrêmement faible et de façon correspondante sans difficultés, et ce, rapidement et avec une précision très élevée. Il peut être utilisé également sans difficulté, à la place de déterminations de fins de réaction, pour des déterminations cinétiques et, par conséquent, pour la détermination de la vitesse de l'immunoréaction. L'un des avantages les plus importants par rapport à la plupart des procédés immunologiques usuels est son aptitude à être utilisé en tant que procédé d'immuno- analyse homogène. Pour de nombreuses déterminations, on peut utiliser le procédé conforme à l'invention en évitant la l'opération pénible et très critique, extrêmement complexe, qui nécessite beaucoup de temps et qui est habituellement nécessaire avant la mesure, en vue de séparer des substances immunologiques liées par l'immunoréaction de substances immunologiques non liées par cette réaction. 2488409- REVENDICATIONS 1. Procédé pour déterminer la portée d'une immunoréaction et par conséquent le pourcentage des partenaires prenant part à l'immunoréaction, au moyen d'un procédé d'analyse par immunofluorescence à polarisation, caractérisé en ce qu'on utilise comme source de lumière (1) une lumièreéclair ou un flash électronique produit par exemple par une lampe éclair au xénon. 2. Procédé de détermination d'immunoréactions dans des solutions selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on détermine le niveau de la valeur de fluorescence d'un échantillon (en 5) au moyen de deux capteurs de lumière (9, 13), disposés de manière à faire chacun un angle par rapport à la direction du rayon lumineux polarisé d'excita- tion mis sous forme monochromatique (en 2) et tombant sur l'échantillon (en 5), et équipés chacun d'un filtre coloré (7, 11) et d'un filtre analyseur de polarisation (8, 12) pouvant être réglé dans son plan, à savoir par exemple des multiplicateurs photoniques, en tenant compte de la différence des valeurs mesurées par les deux capteurs (9, 13). 3. Procédé de détermination d'immunoréactions selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on utilise, à la place de deux capteurs réglables (9, 13), dans des plans respectifs de polarisation différents l'un de l'autre, un seul capteur de lumière équipé d'un filtre coloré et d'un filtre de polarisation, par exemple un multiplicateur photonique, et que l'on fait pivoter ce filtre analyseur de polarisation ou bien le tiltre ae polarisation situé dans le faisceau de lumière d'excitation, d'une certaine valeur entre les mesures et qu'on tire de la différence des valeurs de mesures provoquée par la rotation, des conclusions concernant l'échantillon. 4. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la lumière polarisée, mise sous forme mono- chromatique, traverse la cuvette (5) contenant l'échantillon sur une distance comptée longitudinalement, qui est égale à un multiple du diamètre de la cuvette, tandis que les capteurs sont disposés sur les côtés et déterminent, avec un grand champ angulaire, les informations de fluorescence disponibles sur des surfaces étendues situées sur les côtés de la cuvette. 5. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 4, caractérisé en ce qu'un transformateur d'impédance, un intégrateur et un condensateur pour la mémorisation des valeurs de mesure maximum sont branchés en série et en aval de chaque capteur (9, 13) et qu'un seul dispositif (14) d'affichage de valeurs différentielles permettant d'établir les différences entre les données de polarisation est branché en série et en aval des deux capteurs (9, 13).