Brevet FR2496691A1 — publié le 19820625

La présente invention concerne un procédé de production de l'antibiotique connu appelé nocardicine, par culture d'une souche de Microtetraspora caesia sp. nov. ayant les caractéristiques d'identification ATCC N 31 724 ou N" 31 725, dans des conditions aérobies en immersion dans un milieu aqueux jusqu'à ce qu'une quan- tité notable de nocardicine ait été produite dans le milieu de culture, duquel la nocardicine est éventuellement re- cueillie. Comme dans le cas des procédés de l'art antérieur, ce procédé donne un mélange de nocardicine (composant principal) et de nocardicine B (composé secondaire) qui, le cas échéant, peuvent être aisément séparés par des procédés connus. A) La nocardicine a été décrite pour la première fois par H. Aoki et collaborateurs à l'occasion de la 15ème Conférence Interscience sur les Agents Antimicrobiens et la Chimiothérapie (Abstract 97) en 1975. Elle a ensuite été nommée d'après le numéro de code FR-1923 et constituait un antibiotique de structure inconnue (on savait toutefois qu'elle contenait un noyau de bêta-lactame) produit par culture de Nocardia uniformis var. tsuyamanensis ATCC 21 806. B) Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 923 977 fait connattre et revendique l'Antibiotique FR-1923 (de structure alors inconnue, mais dont on sait à présent qu'il s'agit de nocamycine) et son procédé de préparation par fermentation sous l'action de Nocardia uniformis var. tsuyamanensis ATCC 21 806. C) H. Aoki et collaborateurs, J. Antibiotics, 29 492-500 (1976), dans une publication faisant suite à celle qui a été mentionnée ci-dessus, changent la désignation de FR-1923 en nocardicine A,donnent sa structure et décrivent sa séparation et sa caractérisation. Ils mentionnent éga- lement d'autres composants secondaires non identifiés contenus dans le bouillon de fermentation. D) M. Hashimoto et collaborateurs, J. Am. Chem. Soc., 98, 3023-5 (1976), rapportent les structures des nocardicines A et B produites par Nocardia uniformis var. tsuyamanensis ATCC 21 806. Les composés sont des stéréo- isomères au niveau de la fonction oxime; la nocardicine A est le composé pour lequel les portions oxime et acylamino sont en relation syn tandis que la nocardicine B présente ces portions en relation trans. E) M. Kurita et collaborateurs, J. Antibiotics, 29, 1243-5 (1976), décrivent l'isolement et la caractérisation de la nocardicine B élaborée par Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21 806. F) Le brevet japonais publié sous le n 54-151 196 (Derwent 02700C) fait connaltre la préparation de la nocar- dicine A par culture d'une nouvelle souche basophile de Streptomyces appelée Streptomyces alcalophilus ATCC 31 393. G) Le brevet japonais publié sous le no 55-45327 (Derwent 35223C) fait connaître la préparation des nocar- dicines A et B par culture d'une souche de Nocardia sp. N C-14509 (FERM-P 4642). H) Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 212 944 fait connaître et revendique un procédé de production de nocardicine A par fermentation de Nocardiopsis atra Huang sp. nov. ATCC 31511. L'antibiotique nouveau appelé nocardicine de formule HOOC-CH-CH2-CH2-O - COH-N- H NH2 OH O OOH est produit par fermentation de certaines espèces nouvelles du genre Microtetraspora dans des conditions aérobies en immersion dans un milieu de culture aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote. Au cours de travaux sélectifs de recherche d'anti- biotiques produisant du bêta-lactame, deux souches inhabi- tuelles d'actinomycètes, portant les n G432-4 et G434-6, qui produisent de la nocardicine, ont été isolées d'échan- tillons de sol recueillis en Inde. Les deux souches se développent bien sur des milieux naturels ou des milieux organiques chimiquement définis, à des températures comprises entre 20 et 500C. La souche N0 G432-4 porte un mycélium aérien épais sur lequel de courtes chaînes de spores sont produites. Les chaînes de spores comportent 2 à 6 spores par chaîne et se développent en une masse épaisse sur des sporophores, agglomérés. La couleur de la masse aérienne est d'un bleu pale ou d'un bleu verdâtre tirant sur le gris. Deux types de vésicules enveloppant les spores, de même que des spores motiles à un seul flagelle polaire, sont formés dans le substrat mycénien.Un pigment vert grisâtre foncé, se diffusant légèrement dans la gélose, est produit dans la plupart des milieux gélosés. A la différence de la souche No G432-4, la souche No G434-6 ne produit pas de mycélium aérien ou en produit peu et ne produit pas de pigment verdâtre. Elle form deux vésicules envelopant les spores et produit des spores flagellées dans le substrat mycénien - épais, comme on en observe dans le cas de la souche G432-4. Les parois cellulaires des deux souches possèdent, comme composants servant à l'identification, de l'acide méso-diaminopimélique, du glucose et une petite quantité de mannose et de rhamnose. L'acide nocardomycolique est absent dans le mycélium végétatif. Comme résultats d'études comparatives portant sur plusieurs genres d'Actinomycetales, les souches No G432-4 et G434-6 sont apparues comme une espèce nouvelle du genre Microtetraspora. Le nom spécifique nouveau Microtetraspora caesia est proposé pour les souches G432-4 et G434-6 en raison de la couleur gris bleuâtre du mycélium aérien. Des cultures des souches G432-4 et G434-6 ont été déposées auprès de l'American Type Culture Collection, Washington, D.C. et cet Institut les a ajoutées à sa collection permanente de micro-organismes sous les numéros respectifs ATCC 31724 et 31725. Les micro-organismes utilisés dans des études comparatives comprennent les suivants: Actinomadura madurae (Vincent), Lechevalier & Lechevalier 1968; Micropolyspora angiospora Zhukova, Tsyganov & Morozov 1967 KCC A- 0109; Micropolyspora caesia Kalakoutskii 1964 KCC A-0098;-Micropolyspora faeni Cross, Maciver & Lacey 1968 KAA A-0099; Nocardia corallina (Berger et collabo- rateurs) Waksman & Henrici 1948; Nocardia lutea Castellani & Chalmers 1919; Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis Aoki et collaborateurs 1967 ATCC 21806; Nocardiopsis dassonvillei (Brocq-Rousseu) Mever 1976 ATCC 23218; Microtetraspora viridis Nonomura & Ohara 1971 KCC A-0112; et Saccharopolyspora hirsuta Lacey & Goodfellow 1975 KCC A-0170. Les références utilisées pour les études cultu- rales et physiologiques sont les suivantes: (1) E.B. Shirline & D. Gottlieb: Methods for characterization of Streptomyces species, Int. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340 (1966). (2) S. A. Waksman: The Actinomycetes, Vol. 2, (1961). (3) G. M. Luedemann: Micromonospora purpureochromogenes (Waksman & Curtis 1916) comb. nov. (synonyme subjectif: Micromonospora fusca Jensen 1932), Int. J. Syst. Bacteriol., 21, 240-247 (1971). Les références utilisées pour les analyses chimi- ques de la paroi cellulaire sont les suivantes: (1) T. Yamaguchi: Comparison of the cellwall composition of morphologically distinct actinomycetes, J. Bacteriol., 89, 444-453 (1965). (2) M. P. Lechevalier et H. Lecbavalier: Chemical methods as criteria for the separation of nocardiae from other actinomycetes, Biology of the Actinomycetes and Related Organisms, 11, 78-92 (1976). Les références utilisées pour les descriptions taxonomiques sont les suivantes: (1) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8ème édition (édité par R. E. Buchanan et N. E. Gibbons) 599-861, 1974. (2) Actinomycetales: characteristics and practical importance (édité par G. Sykes et F. A. Skinner), Symposium de la Society for Applied Bacteriology, 2ème série, 11-91, 1973. 249669' Les hyphes du substrat mycélien, de diamètre compris entre 0,4 et 0,8 dm, se développent à la surface de la gélose ou pénètrent dans la gélose et s'y ramifient de manière dichotomique. On observe une fragmentation par- tielle du substrat mycélien qui produit de courts filaments après 3 à 4 semaines sur milieux solides. Cela s'observe encore plus nettement dans le cas de la souche G434-6 manquant de mycélium aérien. Les hyphes aériennes de la souche G432-4 sont longues et modérément ramifiées. De courtes chaînes de spores sont formées uniquement sur le mycélium aérien. Deux à six et le cas échéant huit spores sont portés par une chaîne, et des chaînes de spores ramifiées sont souvent formées. Les chaînes de spores sont portées directement sur le côté des hyphes ou sur de courts sporophores à ramification monopode. La sporulation se développe à partir de la ramification monopode des sporo- phores et du bourgeonnement basipétal dans la gaine hyphale. Les sporophores qui s'agglomèrent le long de l'axe hyphal se développent en masses épaisses de spores lorsque la culture vieillit. Les spores ont une forme sphérique ou ovale, elles ont des dimensions de 0,7-1,0 sur 0,7-1,6 gm et leur surface est lisse. Le cas échéant, des pointes hyphales aériennes sont segmentées comme une chaîne de spores, et des hyphes à spirales sporogènes sont uniquement formées dans le mycélium aérien. On trouve dans le substrat mycé- lien des capsules (vésicules)translucides sphériques ou ovales qui enveloppent des spores individuelles ou des chaînes rectilignes de deux à six spores. En outre, on observe le cas échéant des chaînes de spores à enroulement irrégulier ou serré. Les structures décrites ci-dessus sont formées dans des milieux riches du point de vue nutritionnel tels que malt-levure ou gélose de Bennett après 3 à 4 semaines d'incubation à 280C. Des spores motiles ovales ou en forme de banane sont formées dans la suspen- sion aqueuse de la masse mycénienne. Les spores motiles ont un unique flagelle polaire allongé et forment des tubes de germination après incubation. Les souches G432-4 et G434-6 sont des aérobies obligés et croissent modérément dans la plage de 20 à 500C. La souche G432-4 se développe même à 550C, ce qui n'est pas le cas de la souche G343-6. Les colonies sur gélose au malt et à la levure sont circulaires et épaisses, elles présentent des rides radiales ou irrégulières et acquièrent un diamètre de 3 à 5 mm après incubation à 370C pendant une semaine. La souche G432-4 forme un mycélium aérien abon- dant, porte des masses de chaînes de spores de couleur bleu pâle ou bleu verdâtre tirant sur le gris sur gélose de Czapek, gélose à la levure et au malt, gélose à la farine d'avoine, gélose au glycérol et à l'asparagine et gélose à la tyrosirse,et produit un pigment vert se diffusant faiblement dans la plupart des milieux gélosés. La souche G434- 6 ne produit pas de mycélium aérien, de spores ou de pigment dans des milieux gélosés ordinaires (milieu ISP No 2, 4, 5 et 6 et gélose de Bennett), mais elle. for- me.. des mycéliums aériens allant de peu abondants à modérés et des spores dans la gélose de Czapek et dans les milieux ISP No 3 et 7. Les caractéristiques culturales des souches G432-4 et G434-6 sont récapitulées sur le tableau I suivant. TABLEAU I Caractéristiques culturales * Souche n G432-4 Gélose de Czape Gélose au saccharose et au nitrate Bouillon tryptone- extrait de levure: Gélose à l'extrait de levure et à l'extrait de malt G limitée R incolore A vert bleuâtre terne D néant sédimenté, non trou- ble, pas de pro- duction de pigment G abondante R orangé vif A faible, d'abord blanc puis bleu verdâtre tirant sur le gris D néant Souche n G-434-6 peu abondante brun jaunAtre clair bleu pâle faible néant sédlimenté, membra- neux, non trouble, pas de production de pigment abondant brun jaunâtre clair néant néant Micropolyspora caesia KCC A-0098 néant sédimenté, non trou- ble, production d'un pigment diffusible légèrement vert modérée vert grisâtre foncé peu abondant, gris clair néant Nocardia unifor- mis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 abondante orangé vif néant néant floconneux, pas de production de pigment modérée orangé jaunâtre intense néant néant -J no Os a' O do TABLEAU I (suite) Caractéristiques culturales * Souche n G432-4 gélose à la farine d'avoine: Milieu ISP N 3 Gélose aux sels inor- ganiques et à l'amidon: milieu ISP N 4 Gélose au glycérol et à l'asparagine: milieu ISP N 5 G moddérée R brun jaunâtre clair A faible, d'abord blanc puis bleu grisâtre clair D rose jaunâtre pâle G modérée R orangé clair A bleu grisâtre, formd tardivement D orangé clair G peu abondante R incolore A médiocre, bleu ciel pâle D néant Souche n G-434-6 abondante jaune terne néant ou peu abon- dant Pd'abord blanc puis grisâtre néant faible incolore néant néant faible incolore néant néant Micropolyspora caesia KCC A-0098 peu abondant peu abondante peu abondante incolore néant néant Nocardia unifor- mis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 moddér orangé jaunâtre intense néant néant nmodérée orangé jaunatre néant oe néant peu abondante incolore néant néant o o' cr" %O C> C.> TABLEAU I (suite) Caractéristiques culturales Gélose à la peptone, à l'extrait de levure et au fer: milieu ISP N 6 Gélose à la thyro- sine: milieu ISP N 7 Gélose au glucose et aux sels d'ammonium Souche n G432-4 peu abondant e incolore A néant D néant G limitée R brun jaunâtre clair A modéré,vert gri- sâtre clair D néant G modérée R incolore A néant ou peu abondant D orangé rougeâtre intense Souche n G-434-6 néant ou traces néant faible brun jaunâtre clair peu abondant,d'abord blanc puis vert pale néant limitée orangé jaunâtre intense néant néant Micropolyspora caesia KCC A-0098 modéré e incolore ou vert olive néant néant peu abondante bleu grisâtre néant néant faible vert olive-grisâtre foncé néant néant Nocardia unifor- mis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 limité e incolore néant néant faible jaunâtre vif néant rose jaunâtre limitée brun jaunâtre foncé néant néant * G R r8s "0 TABLEAU I (suite) Caractéristiques culturales * Souche n G432-4 Gélose de Bennett G abondante R brun jaunâtre clair A faible, d'abord blanc puis bleu gri- satre clair D néant Souche n G-434-6 modérée incolore néant néant Micropolyspora caesia KCC A-0098 modérée incolore à vert olive grisâtre néant néant Nocardia unifor- mLis subsp. tsuyamnanensis ATCC 21806 modérée orangé jaun&tre néant néant Incubation en vue de l'observation: 1 à 3 semaines à 28 C. G = croissance, R = couleur du revers, A = mycélium aérien, D = pigment diffusible. o ro m-Z o o 0% Les souches G432-4 et G434-6 résistent à l'action du lysozymne. Leur croissance est limitée en présence de NaCl à 3 % et totalement inhibée à 5 %. Les nitrates ne sont pas réduits en nitrites en bouillon peptoné ou en bouillon glucosé de Czapek. La gélatine est liquéfiée par la souche G432-4 mais non par-la souche G434-6. Le lait est peptonisé totalement par la souche G432-4 mais en partie seulement par la souche G434-6. De l'hydrogène sulfuré est produit à partir de cystéine. Des pigments mélanoides ne sont pas produits dans les milieux ISP N 1, 6 et 7. Dans le test sur morceau de pomme de terre selon Luedemann, la croissance n'est pas inhibée à pH 5,7. Il n'est pas produit d'acide à partir du glucose, du fructose ou du glycérol. Les caracté- ristiques physiologiques des souches G432-4 et G434-6 scnt représentées sur le tableau II suivant. 2496691 - TABLEAU II Réactions physiologiques Essai Nitrite à partir de nitrate Nitrite à partir de nitrate Résistance au chlorure de sodium Résistance au lysozyme Effet du pH: acidité sur morceau de pom- de terre Acide à partir de glycérol, de fructose et de glucose Hydrolyse de la caséine en mi- lieu gélosé Réactions dans une solution de lait écrémé Plaque de géla- tine Réponse Négative Négative Croissance limi- tée à 3%, pas de croissance à 5% Résistant Croissance nor- male tant sur des morceaux acides que sur des morceaux neutres N6gative Positive Méthode et milieu Milieu inorganique: bouillon glucose-nitrate de Czapek Milieu organique: 0,5% d'extrait de levure, 1,0% de glucose, 0, 5% de KNO3, 0,1% de CaCO3 Milieu de base: 1% d'ex- trait de levure, 2% d'amidon soluble, 1,5% de gélose Bouillon au glycérol de Gordon. Lysozyme à 0,001 %. Gélose à la pomme de terre de Luedemann Milieu de base: 0,1% de (NH4) 21WO4, 0,02% de KC1, 0,02% de MgSO4, 0,2% de peptone, 1,5% de gélose. Indicateur: violet de bromocrésol. Milieu gélosé de Luedemann faiblement coa-- gulée et/ou pepto- nisée dans le cas de la souche G432-4. Croissance nulle ou peu abon- dante dans le cas de la souche G434-6. Liquéfiée dans le cas de la souche G432-4. Non liqué- fiée dans le cas de la souche G434-6. Essai Production ae H2S à partir de L- cystéine Hydrolyse de la tyrosine Formation de pigments mêla- noides TABLEAU II Réponse Positive (suite) Méthode ou milieu Addition de L-cystéine (0,1%) à du bouillon tryptone-extrait de levurE (milieu ISP N 1) addi- tionné de gélose. Détec- tion de H2S à l'aide d'un ruban de papier contenant une solution aqueuse à % d'acétate de plomb. La L-asparagine a été omise dans la gélose à la tyrosine de manière à inclure de la L-tyrosine comme unique source d'azote. Bouillon à la tryptone et à l'extrait de levure, gélose à la peptone, à la levure et au fer et gélose à la tyrosine. Faiblement hydrolysée Négative Effet de la tem- Croissance mode- Gélose à l'extrait de pérature rée ou abondante levure et à l'extrait à 20-50 C. Pas de de malt. croissance à 10 C. La souche G432-4 se développe mo- dérément à 55 C mais non à 60 C. La souche G434-6 ne se développe pas à 55 C. Les schémas d'utilisation des sources de carbone des souches G432-4 et G434-6 sont reproduits sur le tableau III. Les deux souches utilisent le glycérol, le L-arabinose, le D-xylose, le L-rhamnose, le D-glucose, le Dgalactose, le D-fructose, le D-mannose, le lactose, le cellobiose, le mélibiose, le tréhalose, l'amidon et le D-mannitol pour leur croissance. Le L-sorbose, le D-mélézitose, le dulcitol, l'inositol et le D-sorbitol ne sont pas utilisés par l'une ou l'autre des souches. De plus, le saccharose et le raffinose ne sont pas utilisés par la souche G432-4. Glycérol (-)Arabinose (+)Arabinose Xylose Ribose Rhamnose Glucose Galactose Fructose Mannose (-)-Sorbose Saccharose Lactose Cellobiose Mélibiose Tréhalose Raffinose (+)-Mélézitose Sc G432 + + + + + + + + + + + + + + TABLEAU III Utilisation de sources de carbone Micropolyspora ouches N caesia 2-4 G434-6 KCC A-0098 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + N. uniformis suEsp. tsuyaman- ensis ATCC 21806 + + + + + + + + + + + + + Microtetraspora viridis KCC A-0112 + + + + + + + + + + + + + - f%) -4 r0 mo os TABLEAU III(suite) Utilisation de sources de carbone Micropolyspora N. uniformis Microtetraspora Souches N caesia subsp. tsuyaman- viridis G432-4 G434-6 KCC A-0098 ensis ATCC 21806 KCC A-0112 Amidon + + + + + Dulcitol. Inositol -.. D-mannitol + + + + + D-sorbitol - - - + - Salicine + - + Cellulose - - - + Chitine - - + Kératine - - + Incubation en vue de l'observation: 2 semaines à 28 C Milieu de base: milieu de Luedemann composé de 0,5 % d'extrait de levure, 0,1 % de CaCO3 et 1,5 % de gélose. os Comme indiqué sur le tableau IV, la paroi cellulaire de la souche G434-6 contient de l'acide méso- diaminopimélique et des traces de glycine comme amino- acides servant à la caractérisation. L'hydrolysat cellu- laire entier contient du glucose, du mannose et des traces de ribose et de rhamnose comme sucres neutres. Ainsi, l'acide méso-diaminopimélique (DAP) est considéré comme étant l'unique composant caractéristique dans la composi- tion de la paroi cellulaire de la souche G434-6. La paroi cellulaire de la souche G434-6 pout or- re cs---- dérée comme appartenant au type IIIc. L'absence d'acides nocardomycoliques dans la fraction lipidique de la paroi cellulaire de la souche G434-6 a été indiquée conformément à la méthode Mordarska, Mordarski & Goodfellow, J. Gen. Microbiol., 71, 77-86 (1972). Souche NI G434-6 M6so-DAP LL-DAP Glycine Galactose Glucose Mannose Madurose Arabinose Xylose Ribose Rhamnose ++ TABLEAU IV Composition chimique de la paroi cellulaire Microtetraspora Micropolyspora Micropolyspora Actinomadura viridis caesia angiospora madurae KCC A-0112 KCC A-0098 KCC A-0109 ++ ++ ++ ++ TR ++ ++ + + ++ + + TR + TR ++ ++ TR TR TR TR TR TR ++ TR -à -4 os o A des fins taxonomiques, les souches n G432-4 et G434-6 ont été comparées avec six genres de l'ordre des Actinomycetales, à savoir Nocardia, Micropolyspora, Microtetraspora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora et Actinomadura, qui possèdent des chaînes de spores sur un mycélium aérien et qui contiennent de l'acide méso- diaminopimélique dans la paroi cellulaire. Les souches G432-4 et G434-6 ressemblent à quelques espèces du genre Micropolyspora dans la formation de masses d'un bleu ver- datre de courtes chaînes de spores sur le mycélium aérien et dans la sporulation par bourgeonnement basipétal, mais elles diffèrent de ces espèces par le manque d'amas de chaînes de spores dans le substrat mycélien, par leur résistance au lysozyme, par leur sensibilité au chlorure de sodium et par l'absence d'arabinose et de galactose dans la paroi cellulaire. Les genres Nocardiopsis et * Saccharopolyspora portent des spores dans les parties en- tières du mycélium aérien. Les spores aériennes de ces genres sont formées de façon telle que les hyphes se divi- sent en segments allongés qui se subdivisent ensuite en fragments plus petits de taille irrégulière. Compte tenu de ces mécanismes distincts de sporulation, les souches G432-4 et G434-6 se distinguent aisément des genres Nocardiopsis et Saccharopolyspora. En outre, les deux souches nouvelles diffèrent du genre Nocardiopsis par leur résistance au lysozyme; et elles diffèrent du genre Saccharopolyspora par la surface lisse de leurs spores, par le manque d'arabinose dans la paroi cellulaire, par la résistance au lysozyme et par la sensibilité au chlorure de sodium. Les souches G432-4 et G434-6 ressemblent à quelques espèces du genre Actinomadura qui forment un mycélium aérien de couleur vert-bleu et de courtes chaînes aériennes de spores, mais diffèrent de ce dernier genre par le type de sporulation par bourgeonnement basipétal, la formation d'un moins grand nombre de spores dans une chaîne, les amas de chaînes de spores et l'absence de madurose dans l'hydrolysat des cellules entières. Les espèces sporogènes du genre Nocardia telles que Nocardia Mediterranea ou Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ont certaines affinités avec les nouvelles souches de l'invention, dans la formation de courtes chaînes de spores, dans l'absence de production d'acide à partir de glucose, de fructose et de glycérol, dans la résistance au lysozyme et dans la sensibilité du chlorure de sodium. Toutefois, le bourgeonnement basipétal, les spores sphéri- ques, l'amas distinct de chaZnes de spores comprenant de nombreux sporophores ramifiés, les chatnes soudées d'une à plusieurs spores et le mycélium aérien épais de couleur bleu-vert des souches G432-4 et G434-6 sont faciles à dis- tinguer des espèces sporogènes du genre Nocardia qui portent des spores en forme de bâtonnets apparaissant par segmen- tation des hyphes et qui sont capables de former des chaînes individuelles de spores et un mycélium aérien rudimentaire de couleur blanche ou pâle. Conformément aux descriptions de Thiemann et collaborateurs, J. Gen. Microbiol., 50, 295-303 (1968), le genre Microtetraspora (M. fusca et M. glauca) est caractérisé par le fait qu'il porte de courtes chaînes de spores (principalement 4 spores par chaîne) uniquement sur le mycélium aérien, et par la présence de méso-DAP, de glycine, de lysine.de traces de LL-DAP et l'absence de sucre caractéristique dans la paroi cellulaire. Nonomura et Ohara, J. Ferment. Technol., 49, 1-7 (1971) et 49, 887- 894 (1971), ont rapporté deux autres espèces du genre Microtetraspora, à savoir M. viridis et M. niveoalbida, qui ne possèdent que l'acide mésoDAP comme composant caractéristique de la paroi cellulaire. Comme indiqué sur le tableau V, les souches G432-4 et G434-6 sont étroitement apparentées au genre Microtetraspora par les caractéristiques principales comprenant la chaine de spores et la morpholo- gie des spores, le mode de sporulation, les réactions au lysozyme et au chlorure de sodium et la composition de la paroi cellulaire. Par conséquent, les souches G432-4 et G434-6 ont été comparées avec quatre espèces connues de Microtetraspora. Aucune des quatre espèces ne se développe à 45 C, mais les souches G432-4 et G434-6 se développent - à 500C. La série de couleurs de la masse aérienne est le gris pour M. fusca et M. glauca, le vert pour M. viridis et le blanc pour M. niveoalba, tandis que la couleur de la masse aérienne de la souche G432-4 est placée dans la série bleue. TABLEAU V Caractéristiques principales d' organismes producteurs de nocardicine et de genres apparentés, dont la paroi cellulaire renferme le méso-DAP Souches N G432-4 & G434-6 Présent; peu abondant à abondant Bleu verdâtre Amas consistant en spores uni- ques, paires longitudinales de spores et chaînes de 2 à 8 spores Basipétal, bourgeonne- ment Nocardia Micropolyspora Absent ou rudimen- taire Blanc Cha nes courtes (non en amas) Segmenta- tion des hyphes Présent; peu abondant à abondant Blanc, jaune, bleu, vert, gris Amas consis- tant en spores uniques et en chaînes de 2 à 20 spores Basipétal, bourgeonne- ment Microtetraspora Nocardiopsis Présent; peu Présent; abondant à épars à abondant épais Blanc, gris, vert Amas consistant en chanes de plusieurs spores (principalement 4 spores) Basipétal, bourgeonne- ment Blanc, jaune, gris -50 spores dans une chaîne. Hyphes divisées en longs seg- ments, se subdivisant en spores plus petites de taille ir- régulière Segmentation en hyphes Saccharcpolyspora Présent; épars Blanc à 50 spores dans une chaine. Chaque spore d'une chaîne sou- vent séparée par des segments d'hyphes vides. Segmentation en hyphes Actinomadura Présent; peu !abondant à abondant Tous les types de couleus à 15 spores dans une chaîne. ' Segmentation en hyphes os r% %O C%0 Formation de mycélium aérien: Couleur Chaîne de spores Mode de spo- rulation TABLEAU V (suite) Surface des spores Souches N G432-4 & G434-6 Lisse Nocardia Micropolyspora Microtetraspora Nocardiopsis Lisse Lisse, verru- queuse ou épi- neuse Lisse Lisse Saccharopolyspora Touffes de poils longs ou incurvés Actinctadura Lisse, verru-queuse ou épineuse Substrat mycé- lien: degré de fragmenta- tion en bâton- nets ou cocci Chaînes de spores dans le substrat mycélien Morphologie spéciale + Absentes Deux types de vésicules por- tant des spores et spores mo- tiles ++ Absentes Présentes Fragmen- tation du substrat mycélien M. angiospora forme une capsule trans- lucide.., enve- loppant des spores Absentes Une espèce porte des hyphes seg- mentées + Absentes Mycélium. en zigzag au début de la sporulation aérienne, qui a lieu dans le my- célium total + Absentes La sporulation a lieu dans des parties totales du mycéllum aérien Absentes rN Mucilage en- veloppant des crochets ou des spi- rales fermées; pseudosporanges 0'. C'. TABLEAU V (suite) Souches N G432-4 & G434-6 Nocardia MicropolYspora Microtetraspora Nocardiopsis Saccharopolyspora Actinomadura Composition de la paroi cellulaire: aminoacide & sucre (type) caractéris- tiques Méso-DAP, glucose, man- nose Méso-DAP, arabinose, galactose (IVA) Méso-DAP, arabinose, galactose. ('VA) Méso-DAP, glu- cose, traces de glycine, acide asparti- que, rhamnose (IIIC) Méso-DAP (IIIc) Méso-DAP, arabi- nose, galactose (PVA) Acide nocar- - domycolique (CN-A) Résistance au lysozyme (0,001%) NaCl (7%) Acide à par- tir de glu- cose, fructose et glycérol * Le signe (-) est indiqué dans la littérature, l'essai selon l'invention. mais on trouve un résultat positif (+) dans + + + Méso-DAP, madurose ("',B) + + + + + + lo w + * o. oc O _- 24 La souche G434-6 produit deux types de vésicules dans le substrat mycélien: on observe d'une part des vésicules translucides enveloppant une ou plusieurs spores suivant une ligne droite et les autres vésicules forment une masse de chaînes de spores à enroulement irrégulier et serré. Des spores motiles à un seul flagelle polaire sont également produites dans le substrat mycénien. D'après la littérature, Micropolyspora angiospora comporte une capsule translucide enveloppant des spores. Toutefois, la formation de spores motiles n'a été signalée pour aucun des genres appartenant aux familles des Micromono- sporaceae et des Nocardiaceae (Bergey's Mnual 8ème édition, 1974). La formation d'une vésicule fructifère, d'une vési- cule cartilagineuse et d'éléments flagellés motiles (isogamètes motiles) a été rapportée paur Streptomyces sindenensis par Nakazawa, Ann. Rep. Takeda Res. Lab., 25, 24 (1966). Bien que des spores motiles aient été observées de façon inégale dans la souche G434-6, la relation mor- phologique concernant des vésicules fructifères ou des éléments motiles dans S. sindenensis et la souche G434-6 n'est pas évidente. Par conséquent, les deux types de vésicules et les spores motiles ne sont pas considérés comme étant des structures morphologiques significatives pour la détermination d'un taxon. Sur la base des caracté- ristiques principales mentionnées ci-dessus, les souches N G432-4 et G434-6 ont été déterminées comme représentant une espèce nouvelle du genre Microtetraspora. Ces deux souches ont été appelées Microtetraspora caesia sp. nov.; la souche typique est la souche no 432-4. Etant donné que les souches G432-4 et G434-6 de Microtetraspora caesia subissent aisément une mutation naturelle ou artificielle, il y a lieu de remarquer que la présente invention n'est pas limitée àces souches originales. Elle couvre spécialement tous les mutants et variants naturels et artificiels produisant de la nocardicine, qui peuvent être engendrés à partir des souches décrites par des moyens tels que les rayons X, les rayons ultra- violets, un traitement avec des moutardes d'azote, l'exposition à des phages, etc. Comme dans le cas d'autres micro-organismes et antibiotiques, on présume qu'une meilleure production de nocardicine peut être obtenue par le choix de souches très productrices après une simple sélection de colonies, par traitement avec divers mutagènes ou par les méthodes génétiques de recombinaison, de trans- formation ou de transduction. La nocardicine est produite par culture d'une souche de Microtetraspora caesia présentant les caracté- ristiques d'identification des souches G432-4 (ATCC 31724) ou G434-6 (ATCC 31725) dans des conditions aérobies en immersion dans un milieu nutritif aqueux.-Les méthodes générales utilisées pour la culture d'autres actinomycètes sont applicables à la culture de Microtetraspora caesia. Le milieu nutritif doit contenir une ou plusieurs sources assimilables de carbone telles que glycérol, glucose, fructose, mannose, amidon, dextine, maltose, mannitol, mélasses, huiles graisses, etc., à l'état purifié ou à l'état brut. Le milieu nutritif doit aussi renfermer une ou plusieurs sources assimilables d'azote telles que, par exemple, de la farine de soja, de la farine de poisson, de l'extrait de malt, de la peptone, de l'extrait de levure, des extraits solubles de distillerie, de la farine de gluten, un extrait soluble de mals, de la farine de graines de cotonnier, de la caséine, des substances pro- téiniques hydrolysées, des nitrates, des sels d'ammonium, de l'urée, etc. Des sels inorganiques nutritifs tels que chlorure de sodium, phosphate de potassium, sulfate de magnésium, carbonate de calcium et des traces de sels de métaux lourds tels que cuivre, zinc, manganèse, fer, etc., peuvent aussi être ajoutés au milieu nutritif. Un agent anti-mousse tel que de la paraffine liquide, de l'huile de soja, une graisse ou une silicone peut être ajouté à la culture aérobie en immersion. La température de fermentation doit être comprise dans la plage d'environ 20 à environ 500 (550 dans le cas de la souche G432-4), de préférence dans la plage -d'environ 25 à environ 40 et notamment dans la plage d'environ 25 à environ 35 . Le pH du milieu de fermenta- tion doit se situer dans la plage d'environ 5 à environ et la plage préférée va d'environ 6 à environ 8,5. Ordinairement, la production optimale de nocardicine est obtenue en 3 à 7 jours, selon la température. Lorsque la fermentation doit être effectuée en cuvetil est dési- rable de produire un inoculum végétatif dans un bouillon nutritif par inoculation du bouillon avec une culture inclinée ou une culture de sol ou une culture lyophilisée du micro-organisme. Lorsqu'un inoculum actif a été obtenu de cette manière, il est transféré dans des conditions aseptiques dans le milieu contenu dans la cuve de fermen- tation. L'activité antibiotique dans le bouillon de fer- mentation peut être déterminée par une épreuve sur plaque de gélose avec des disques de papier, en utilisant la souche Pa-49 de Pseudomonas aeruginosa comme organisme d'essai (qui a une sensibilité spécifique aux antibiotiques du type bêta-lactame) ou par des procédés connus décrits dans l'art antérieur pour la production de nocardicine. On peut recueillir la nocardicine dans le milieu de culture par des procédés déjà décrits dans la littéra- ture /par exemple dans J. Antibiotics, 29, 492-500 et 1243-5 (1976)7 ou comme décrit dans les exemples ci-dessous. L'utilité de la nocardicine, les doses et les modes d'administration sont décrits dans la littérature. On peut consulter par exemple la demande de brevet britanni- que publiée sous le n 2 035 081A qui décrit son utilisa- tion contre diverses espèces du genre Mycobacterium, telles que Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium Kansasii, Mycobacterium intercellulare etc. EXEMPLE 1 Fermentation de la souche G432-4 Une culture inclinée sur gélose, convenablement développée, de la souche G432-4 a été utilisée pour ino- culer 100 ml de milieu végétatif liquide dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml qui contenait les ingrédients suivants: 3 % de glycérol, 1 % de "Pharmamedia", 1,5 % d'extrait soluble de distillerie (Santory), 1 % de farine de poisson et 0,6 % de CaCO3. Le pH du milieu a été ajusté à 7,0 avant la stérilisation. On a fait incuber la culture d'ensemencement à 340C pendant 3 jours sur une secoueuse rotative (250 tr/min) et on a transféré 2 ml de la culture dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml du même milieu. La production maximale d'antibiotique a été obtenue après 6 jours d'incubation à 280 sur une secoueuse rotative. Le pH du bouillon s'est élevé graduellement à mesure de la progression de la fermentation, jusqu'à envi- ron 8,5, valeur pour laquelle l'activité antibiotique de 150 gg/ml a été atteinte. EXEMPLE 2 Isolement et purification de la nocardicine Un bouillon de fermentation obtenu par culture sur une grande échelle de la souche G432-4 dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 (4 litres, environ ig/ml) a été filtré avec un auxiliaire de filtration. Le gâteau mycélien recueilli a été extrait au méthanol (2 fois 1 litre) et l'extrait (1,8 1) a été concentré sous vide à un volume de 300 ml de solution aqueuse. Ce concentré aqueux a été réuni avec le filtrat du bouillon et lavé avec 2 fois 800 ml d'acétate d'éthyle, à pH 8,2. La phase aqueuse a été séparée, concentrée sous vide puis agitée avec du carbone activé,-à pH 4. Le carbone a été filtré et le principe actif a été élué du carbone par agitation avec 2 fois 600 ml d'acétone aqueuse à 80 %. L'éluat actif a été concentré sous vide et lyophilisé en donnant environ 7 g de matière brute. La matière solide a été dissoute dans une petite quantité d'eau et la solu- tion a été chargée sur une colonne contenant 200 ml de résine "Diaison HP20", traitée à l'acide. La colonne a été lavée avec de l'eau (1 litre) puis développée avec 1,6 1 de méthanol aqueux à 30 %. Les fractions actives ont été rassemblées, concentrées sous vide et lyophilisées en donnant 1,5 g de matière partiellement purifiée. La matière solide ainsi obtenue a encore été purifiée par chromatographie sur colonne de "HP-20". Le pH du concentré aqueux actif a été ajusté à 2,0 et le concentré a été conservé au réfrigérateur en donnant une préparation pure d'antibiotique Bu-2445A sous la forme d'une poudre inco- lore (35 mg). L'antibiotique Bu-2445A est très soluble en solution alcaline, peu soluble dans le méthanol et inso- luble dans les solvants organiques usuels. Il donne une réaction positive dans le test à la ninhydrine mais un résultat négatif dans les réactions d'Ehrlich et de Tollens. L'analyse élémentaire de Bu-2445A correspond à la formule C23 H24N309H20. C(%) HfP%) N(%) Calculé 53,28 5,05 10,79 Trouvé 53,33 4,54 10,83. Le spectre ultraviolet de Bu-2445A présente les maximums d'absorption suivants >- en nm(El% Solvant max cm Tampon au phosphate M/15 à pH 8 273(276) Solution de NaOH N/10 245(376) 283(232) Le spectre infrarouge de Bu-2445A dans KBr présente des absorptions caractéristiques à 1730, 1650, 1605 et 1520 cm 1. Le spectre de résonance magnétique nucléaire de Bu2445A présente dans la partie basse du champ huit signaux de protons pouvant être attribués à des protons aromatiques et neuf signaux de protons corres- pondant aux groupes méthylène et méthine dans la région de 2,0-5,2 ppm. Le spectre infrarouge, le spectre ultraviolet et le spectre PMN, de même que l'analyse élémentaire pour l'antibiotique Bu-2445A, sont typiques de ceux que l'on obtient pour les nocardicines A et B. Cela a été confirmé par la chromatographie en couche mince de l'antibiotique Bu-2245A, qui a montré la présence de deux composants secondaires (A1 et A2) qui (comme indiqué ci-dessous) sont respectivement identiques aux nocardicines A et B. Rf Bu-2445 A Nocardicine Système A1 A2 A B Cellulose:n-BuOH - HOAc - H20 (4:1:2) 0,27 0,38 0,27 0,38 Cellulose:propanol à 70% 0,14 0,23 0,14 0,23 EXEMPLE 3 Fermentation de la souche G434-6 Dans les mêmes conditions de fermentation (milieux, volume d'inoculum, température) que dans l'exemple 1, la souche G434-6 a été utilisée comme organisme producteur. La production maximale d'antibiotique de 200 gg/ml a été obtenue après 5 jours de fermentation à 28 C sur une secoueuse rotative. EXEMPLE 4 Isolement et purification de la nocardicine Un bouillon de fermentation obtenu dans une culture à grande échelle de la souche G434-6 dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3 (10 litres, environ gg/ml) a été filtré avec un auxiliaire de filtration. Le gâteau mycélien a été extrait au méthanol (0,75 1 x 2) et l'extrait (1, 5 1) a été concentré sous vide en une solution aqueuse. Cette solution a été réunie avec le fil- trat de bouillon et le mélange a été agité avec du carbone activé (85 g) à pH 4. Le carbone a été recueilli par fil- tration et le principe actif a été élué du carbone par agitation avec de l'acétone aqueuse à 60 % contenant 1 % de NH4OH concentré (3 fois 600 ml). L'éluat actif a été concentré sous vide à 500 ml. Cette solution a été chargée sur une colonne de résine " Diaion HP-20" (700 ml) traitée à l'acide. La colonne a été lavée avec de l'eau (2 1) et l'activité a ensuite été éluée avec 1,2 1 de méthanol aqueux à 8 %. Les fractions actives ont été rassemblées, concentrées sous vide et lyophilisées en donnant 2,3 g de matière partiellement purifiée. La matière solide ainsi obtenue a encore été purifiée par chromatographie sur colonne de "HP-20". La solution aqueuse active a été 249G691 recueillie.concentrée, ajustée à pH 2 et conservée dans un réfrigérateur en donnant une préparation pure sous la forme d'une poudre incolore (80 mg). L'analyse infrarouge, ultraviolette et par résonance magnétique nucléaire a montré que cette matière était identique à celle qui a été produite dans l'exemple 2. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un mélange de nocardicines A et B, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche de Microtetraspora caesia sp. nov. ayant les caractéristiques d'identification ATCC n 31724 ou 31725 dans des conditions aérobies en immersion dans un milieu aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote à une température d'environ 20 à envi- ron 50 C jusqu'à ce qu'une quantité notable du mélange de nocardicines ait été produite et se soit accumulée dans le milieu de culture. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape additionnelle consistant à séparer le mélange de nocardicines du milieu de culture. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le micro-organisme est Microtetraspora caesia ATCC N 31724 ou 31725. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la culture est conduite à une température d'envi- ron 25 à environ 35 C. 5. Une culture biologiquement pure du micro- organisme Microtetraspora caesia ATCC N 31724 ou 31725 capable de produire un mélange de nocardicines A et B par culture dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote.