Brevet FR2498426A1 — publié le 19820730

La présente invention concerne des enzymes protéolytiques et plus particulièrement l'emploi des enzymes protéolytiques dans le but d'empe- cher la coagulation du sang. Plus spécifiquement encore, la présente invention concerne l'emploi de la papa!ne comme agent protéolytique pour empêcher la coagulation du sang. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un concentré de protéine à partir du sang entier. Il est bien connu que le sang frais est recueilli et utilisé de- puis longtemps pour divers procédés industriels, telsque la production de col- le et l'emploi du sang pour la production d'engrais et d'aliments pour animaux. Très récemment, des chercheurs ont conçu l'idée d'utiliser le sang frais com- me source de protéines pour la consommation de l'homme. Cependant, l'utilisa- tion du sang rencontre de grandes difficultés du fait de la rapide modification que le sang subit quelques minutes après qu'il soit recueilli, modification qui conduit à la formation de coagulats et de caillots. La phase principale de ce phénomène consiste en la transforma- tian du fibrinogène en fibrine sous la forme de fins filaments insolubles. Ces filaments représentent un des plus sérieux problème qui limite le domaine d' application du sang. Afin de prévenir ce phénomène ou du moins de diminuer son ampleur pour le ramener à des limites acceptables, on a utilisé de très nom- breux systèmes. En vue du fait que la présence d'ions calcium est essentielle à la coagulation, une des méthodes les plus communes pour empêcher la coagu- lation consiste à utiliser des substances chimiques, telles que le citrate de sodium, l'acide citrique ou l'acide oxalique ou les sels de l'acide oxalique qui précipitent les ions calcium sous la forme de sels insolubles. De même, l'héparine qui est un anticoagulant naturel produit par le foie trouve des applications utiles, mais du fait de son coût élevé l'emploi de l'héparine est surtout limité aux applications pharmaceutiques. Les autres substances qui ont été utilisées comme anticoagulants sont les phosphates, l'éthylènediaminetétraacétate et l'allylisothiocyanate. Une autre méthode basée sur un principe différent pour empêcher la formation de coagulats consiste à effectuer la défibrination du sang. Pour obtenir ce résultat, le sang doit être agité immédiatement après sa collecte et la fibrine doit être séparée dès sa formation. Très récemment, on a porté une attention particulière au problè- me de la coagulation du sang. Parmi les méthodes les plus utilisées récement, on peut mentionner l'emploi de courant électrique produit par une batterie à un faible potentiel anodique et cathodique (Andersen, 1971) ; cette méthode convient également pour la décoagulation de sang qui a déjà coagulé. Un autre procédé de grand intérêt consiste en l'homogénéisation (Haughey, 1973) qui permet la transformation des coagulants en une très fine dispersion qui peut ensuite être séchée sur un lit fluidisé. Enfin, on peut mentionner l'emploi de l'ozone (Summer, 1976) qui est produit par les radiations ultraviolettes dans l'air. Toutes ces méthodes utilisées jusqu'à présent ou proposées dans le but d'empêcher la coagulation du sang à des fins industrielles, présentent un ou plusieurs des inconvénients suivants: Coût très élevé des agents nécessaires; Emploi de substances chimiques qui sont toxiques ou inadéquates à l'utilisation subséquente du sang pour la consommation humai- ne; Nécessité d'utiliser des appareils compliqués et une technolo- gie de pratique difficile. On a à présent trouvé, de façon surprenante, qu'il est possible d'empêcher la coagulation du sang en ajoutant une enzyme protéolytique conve- nable. Le procédé selon la présente invention est basé sur la découver- te que le mécanisme impliqué dans la coagulation du sang fait intervenir plu- sieurs facteurs typiques des protéines et que la coagulation peut être évitée en utilisant une hydrolyse enzymatique partielle des protéines au moyen d'une enzyme protéolytique convenable. On connait plusieurs enzymes capables d'at- teindre ce résultat. Parmi ces enzymes on peut mentionner la fibrinolysine ou plasmine qui agit sur le fibrinogêne,une enzyme présente dans le sang sous une forme inactive et qui peut être activée par l'urokinase, une enzyme extraite de l'urine. D'autres enzymes protéolytiques qui conviennent dans le domaine de la présente invention sont la broméline, la trypsine et la papalne.Toutes ces enzymes ont donné- d'excellents résultats dans la présente invention. L'enzyme préférée est la papaine qui contrairement aux autres enzymes est facilement disponible, stable, peut être extraite avec relativement de facilité et est donc obtenue à un prix acceptable pour les quantités nécessaires à l'emploi. Pour cette raison, et bien que l'invention s'applique en général à toute enzy- me protéolytique, la description ci-après se fera avec référence particulière à l'utilisation de papa!ne qui est l'enzyme protéolytique préférée. La papaIne est communément utilisée sous sa forme soluble dans l'eau. Cependant, on doit noter qu'outre ces formes solubles dans l'eau,on connait des formes immobilisées de la papaine. Les tests effectués dans le dé- veloppement de la présente invention ont montré que les deux formes de la pa- palne donnent d'excellents résultats comme agent pour empêcher la coagulation iaqadma inod sluae aumoD sanbllúloglood samuzua saline sap la auluded el ap îoldma., V 9Tl eajepuo as aouelaodml,p svd isau;nb 'aSeVuVAe un ieo uo1luaA -ui aiuasaid el uolas aeaolIgme luepuada 1s@ anuuoD apoqlgm el (8961 4I*l la $s'V IllaUe - 0ssoH) axnvl2 -gllI el suep a iDap apoqlgm el Dea paov ua Z anblplqaolqD apiep ZZI O aDueagalgd aP 'zcO - I0 op uolilppe aaoe D.O aeuaia;lid ap 'aanlexadmai as -seq t IoustpIl ap no auol1oe8l ap DauB gSueîim lsa liTell tsute Sues aI sns - sap-l llap,1' e elaD aumoo alqelnSIoDul Sues al aipuai ap inq al suep aas -Iltqomil s Tub amao; aun suos am6zua,1 Dae no alqnios amzual aaAe lemtu - eI ap 1aom sl sg2ade TlletnDai 3so ITnb sep Sues al luestllln ua gpaaoid ao OC iania;la inad uo-atlua Sues ap t;laud e aulgloid ap leiluauoD unp uoTluai -qop gpgooid un lumalsuaI auxauuoi uolluaAuT aluasild el ',uoq *auTe3oid ap galuaouoo un inod lied -,p p lnpoad aoa luamaielln3liaed la suTj sas5aaAp e alqeln2eozuî Sues au aasTlnp laulad alqeln2eoDui Sues al aipuai Q als$suoo Inb gpgoid al suep çz a3"l;;a la anbluouo-ag apoqlgm aun aesaTIunp,lTllqusuod ei *ues np sau$lgoid sap sallaUUoTiuol sanbîisTîlizavv sal aaelut alqjssod anb 3uvine v iaasuoo ap luamaleS2 zamaad ssmu 'anbtlilúolold amlzua,p aî1uenb el V ajae;q as uo.nb lueine mnod aiqlssod ailQuem ainaTiiam el ap galosp lei -Insoa al ilua9qo p aSe3uei",I luanalnas sed aiaodmoo au saaglald suol$puoa 0z sal luele amoo sa2uuotluaw saAlWs2ido sUOiIPUOo3 sap ioldma *01:1 8sa Sues np amnloA al la anbpl -luLzua uotinlos el op anmlo, al aiua mrnido laoddea al anb atnol no 'uotl -eiual uoe alae ap aouzua.p uollnlos aun asulltn uo puenb *Z9' 1lia agai2gad uo$lelluaeuoa e -quaauo I-Foe aalumeaed aa anb luelne anod auri sslsaz xnaq Si -mou ap suep sanualqo aig 1uo emlldo sinaleA sausaltmul salseA ap suep SaTeAA inad anblleuzua uotlnlos el ap uo$lelluaouoz Be 001:Z V inalatul aeit sed 3lop au lealsqns:awLzua 'lioddea a3 uoejlnSeoo ap qpqoad al ianloa;la inod ailessaau sdmai ap apoTlad el anb a2noD snld sduae ap apoîaid aun suep alqelnSeoiul Sues al aipuai inod aiTessaDu inaIeA el ap snossap ne tos unb 01 lzoddei un aasol; ln sed au ap ealessoaou lsa I1 aiaTue alno aa *sanblmouoa suosjea sa3uaptAap inod esmTeuTW a:12 top lioddea ao lealsqns al la am6zua 1 allua lioddei al sa aoueliodml apueiS ap anal3e; aulne ufn ZL ap Hd un e snualqo juos emudo slllnsai sae 'alqeuauoa snld el aolauem el ap L la L ailua anls as Hd np aulemop al anb luanbjpu 'sgnz3aj;a slsal sal talîlelnau ap jujod npsuoilAua xne aitp e isa1o anb;SoloTstqd Rd un e ianlva;;a1s 1$op auleded el aaualaj -oad ap isanbitIloalod saumzua sap zaau Sues np luamalievl al *Sues np C 9Z9869Z la formation de coagulats,est le suivant: l'enzyme protéolytique rend la li- aison hème-globine plus labile.Le résultat est qu'au couirs de la phase d'ex- traction de l'hème, la consommation de l'agent d'extraction, acétone ou étha- nol, est moindre que la consommation nécessaire jusqu'a présente En fait, se- lon cette invention il est suffisant d'utiliser un rapport de 1.20. Le procé- dé selon la présente invention permet d'obtenir avec beaucoup de facilité un précipité sans couleur qui est un matériau protéique. Le rendement du procédé décrit ci-dessus est très élevé car avec les pratiques actuelles, il est possible de récupérer de manière très économi- que toute la matière protéique du sang. Le produit possède un contenu protéique élevé dérivé des protéi- nes de la fraction des corpuscules du sang (70%> et une bonne valeur biolo- gique (21) dérivée essentiellement des protéines du plasma qui ont un indice chimique de 58 par rapport à la valeur 7 de la globine. Les exemples suivants sont donnés pour illustrer et non limiter la présente invention. EXEPLE 1 Détermination de la valeur minimum du rapport Enzymel Substrat protéique (ElS) La valeur minimum de E/S est la valeur pour laquelle la période de temps requise pour rendre le sang incoagulable est plus courte que la pé- riode de temps nécessaire pour permettre le procédé de coagulation. La papaine est dissoute dans de l'eau distillée à une concentra- tion variable par rapport au substrat protéique afin de déterminer la valeur inhibitrice minimum de E/S. Afin de permettre l'homogénéisation de la solution de l'enzyme dans un grand volume de sang, on a utilisé un récipient convenable à cet effet,qui est muni d'un système qui permet de réaliser le contact de 1' enzyme à différents niveaux avec le sang à traiter. Les résultats des tests montrent les conditions optimales sui- vantes de l'emploi de la papaïne: pH 7,2 Rapport E/S 2:100 Concentration de l'enzyme 1,6% Rapport de volume de la solution enzymatique au sang 1:10 EXEMPLE 2 Préparation du sang incoagulable Un échantillon de sang frais est soumis à un traitement immédiat avec une solution aqueuse de papaXne à une concentration de 1,6%. Le rapport en volume entre la solution enzymatique et le sang traité est 1:10. Ce rapport zgçl e2apuaD Sú S.I.pUSD O zçcg'i fiplmH oz ZmIL'' anbTllod uou alozv ZO'! Ttlo3 3o2v :SZUVATns s bilnsal sal anuop asxj -*ul! luop enb$gloid iu3uawuoe un luaTq o 'uo sta'ui l0s3 a *sadod Bl I uoileatTIj aun aed 2losJ Isa;ldp9ad aJ *8ues np sau çl lezoad ssaine Sel 3aAB cuelq pildl3gid un auo; tnb aulqolS eP op muq,l ased -pe UO sa2liJtum a33a au *ZZo op uoli2.aua3uo3 aun V NZ anblaplqaolqo apa.,I op a3no[ ú uo *.o0 ap ain3aedsl3 aun V (A/A) oZ:I op iiodd. un sueploueq3,a, ap no auoiev,l ep eAw glja siol, jss a sLIoapúq luaulla3lled 919 e Inb Sues el *.lllliaed aslloapúq aun aanzze;s,p u;e iuapgDad Z aldmxal suBp 01 slla3gp salImt3do Suo-3zpUo ssl suBp auluded Pl ap oAi TTllTan3ai l3 2jOA -B s$ade 3uem;3lpgm- 93]9j Ise S]lui Sues ap uoTTZluq0q ufi anbl-ioad lualUazuo3 np uollpezdgai c lifflza suelnseoz sap uopemo; vl ap lueuaAoid sluaeugAuo3ui sal ç lueslA ua 1nol s9uanbasqns luamsl3eal sap B s.mnos aa_ hnad la aSuesjjlns *dmi ap apoTted aun mnod elqels aissa Sues aI a aqTquT Duop Isa Sues np uol - eTlnlso ap gpaoid l *Z'L V gsnfe isa luamalleil np luamom ne Sues np Rd ae 001:Z ap enbgloid lealsqns el pa samÀzua sal alua lioddea un Q puodsaaou ç 9Z.86 Z REVENDICATIONS 1- Procédé permettant de rendre le sang incoagulable caractéri- sé en ce qu'il consiste à traiter le sang avec une enzyme protéolytique dès qu'il est recueilli et à permettre l'hydrolyse partielle. 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 1' enzyme protiolytique est choisie dans le groupe constitué par la papaine, la fibrinolysine, la plasmine, la broméline et la trypsine. 3- Procédé selon la revendication 2,caractérisé en ce que l'en- zyme protéolytique est la papatne sous une forme soluble dans l'eau ou sous une forme immobilisée. 4- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le traitement s'effectue à un pH de 7,2, le rapport entre l'enzyme et le substrat protéique est de 2:100, on utilise une solution d'enzyme à une concentration de 1,6% et le rapport en volume de la solution d'enzyme au sang est de 1:10. 5- Procédé de préparation d'un concentrat de protéine à partir de sang entier caractérisé en ce qu'il consiste à traiter le sang entier avec l'enzyme protéolytique ce qui rend le sang incoagulable et immédiatement après à traiter le sang incoagulable avec un agent capable de précipiter les protéi- nes du sang en présence d'un acide, à séparerpar une filtration à la pompe les protéines de l'hème et à isoler le concentré de protéine. 6- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que 1' enzyme protéolytique est la papaine sous une forme soluble ou sous une forme immobilisée. 7- Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'agent capable de précipiter les protéines est l'acétone ou l'éthanol. 8 -Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le traitement avec l'agent capable de précipiter les protéines s'effectue à O C, l'acide chlorhydrique 2N est ajouté dans une quantité de 0,2Z et le rapport entre le sang incoagulable et l'agent capable de précipiter les protéines est de 1-20. 9- Concentrat de protéine à partir de sang entier préparé par le procédé selon la revendication 5, 6, 7 ou 8.