Brevet FR2488137A1 — publié le 19820212

La pré sente invention concerne essentiellement une composition favorisant la croissance des bifidobactéries, et un procédé pour la fabrication de celle-ci. De nombreuses substances capables de favoriser la croissance des bifidobactéries (dénommées ci-après facteurs de croissance du Bifidus) ont été proposées, ainsi que de nombreux et variés procédés de fabrication de ces subRtances,ndSmment des laits en poudre contenant lesdites substances, comme cela a été décrit dans les brevets Japonais N- 32908/66, 6510/70, 6865/70, 21606/70, 40956/74 et 40957/74.Cependant, l'efficacité de la plupart des facteurs de croissance du Bifidus déjè proposés a été seulement testée dans des cultures réalisées dans un milieu non vivant (conduites i l'extérieur du corps vivant), l'activité de ces facteurs i l'extérieur du corps vivant n'est donc pas élucidée de manière satisfaisante. Les bifidobactéries sont des bactéries utiles vivant dans les intestins humains et possèdant une signification biologique très bien connue. De grands efforts ont été déjè réalisés pour augmenter la proportion de ces bactéries dans le nombre de bactéries vivant dans les intestins des nourrissons alimentés artificiellement. Outre l'utilisation des facteurs de croissance du Bifidus pour la croissanés des bifidobactéries en milieu non vivant, ces facteurs de croissance du Bifidus contenus volontairement dans la nourriture ou un milieu de culture doivent aussi montrer des effets positifs et significatifs dans les corps vivants. Les facteurs de croissance du Bifidus proposés par l'invention permettent de satisfaire cette demande et possèdent des effets, en milieu vivant, grandement améliores. Un objet de la présente invention est de procurer des facteurs de croissance du Bifidus qui montrent une grande activité en milieu vivant et donc répondent è la demande ci-dessus. Cet objet peut être atteint par une composition de la présente invention pour favoriser la croissance des bifidobactéries contenant comme constituant efficace un oligosaccharide de formule générale Gal-(Gal)n -Glc, dans laquelle Gal représente un résidu de galactose, Glc un résidu de glucose, et n un nombre entier de 1 9 4. La présente invention propose également un procédé pour la fabrication de cette composition pour l'accélra- tion de la croissance des bifidobactdriescaractérisd en ce que le lactose ou un produit contenant du lactose est traité avec de la j-galactosidase produit par l'Aspergillus oryzae. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle ci apparaitront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux graphiques et exesples annexis donnés uniquement è titre d'exemple illustrant un mode de réalisation de l'invention et dans lesquels - la figure 1 est un graphique montrant la relation entre le rendement en saccharide et le temps de réaction, dans le cas où le lactose est traité avec la-galactosi- dase - la figure 2 est un graphique montrant les résultats de lexpérience de filtration artel par les oligosaccharides;; - la figure 3 est un graphique montrant les résultats de 1'expérience de exemple 2 - la figure 4 est un graphique illustrant les résultats de l'expérience de l'exemple 3 - la figure 5 est un graphique illustrant les résultats de l'expérience de l'exemple 4 ; et - la figure 6 est un graphique montrant les résultats de l'expérience de l'exemple 5. La plupart des oligosaccharides cités ci-dessus, et qui sont les constituants efficaces de la composition de l'invention permettant de favoriser la croissance des bifilobactéries ou explicitement lesfacteuns de croissance du Bifidus, ont été découverts par les inventeurs de la présente invention au cours de leurs recherches sur les réactions de transfert se produisant avec une réaction d'hydrolyse quand le lactose est soumis à l'action de la -galactosidase. De nombreuses communications ont été faites sur ces réactions de transfert par exemple par Wallenfels en 1951.Les oligosaccharides transférés, dont leurs propriétés d'isolation ont été déjà étudiées, sont les disaccharides et principalement Gal-( -1,2)-Glc, Gal-(ss- 1,3)-Glc, Gal-(B-1,6)-Glc, Gal-( -1,3)-Gal et Gal-( -1,6)-Gal et les trisaccharides, principalement Gal-(ss-1,6)-Gal-(ss-1,4)-Glc et Gal-( - ss-1,6)-Gal-( -1,6)- Glc, dans lesquels le type de liaison entre les galactosides est indiqué dans les parenthèse. La présence de tétrasacharrides a été confirmée par Hubert et autres, mais la structure de ceux-ci n'a pas été clairement établie. La production de polysaccharides comprenant des pentasaccharides n'a pas ét révélée.Le contenu de ces rapports sont limités à l'explication du mécanisme de transfert et à l'étude des structures des oligosaccharides, donc aucune communication n'a été réalisée sur la relation entres oligosacharrides transférés et la croissance des bifidobactéries. L'oligosaccharide, facteur de croissance du Bifidus, de formule générale mentionnée ci-dessus (ci-après, cet oligosaccharide spécifique sera désigné par le terme oligosaccharidei peut être produit par traitement de la lactose avec la ss -galactosidase produit par l'Aspergillus oryzae. Après ce traitement, le milieu réactionnel comprend de la lactose qui n'a pas réagi et également du galactose et du glucose produits par hydrolyse. Donc, pour obtenir un produit ayant une grande activité comme facteur de croissance du Bifidus, il est nécessaire d'élever la concentration en oligosacharride dansune étape convenable de raffinage après le traitement enzymatique, ou par un choix des conditions du traitement enzymatique pour produire une proportion la plus haute possible d'oligo- sacharridesou par une. combinaison de ces deux étapes. Le procédé de la présente invention pour la fabrication d'une composition pour favoriser la croissance des bifidobactéries est expliquée en détail ci-dessous. On peut utiliser le lactose disponible dans le commerce, sans effectuer une purification spéciale. On peut également utiliser comme produit de départ contenant du lactose du lait entier ou du lait crémé. Pour le traitement enzymatique, la concentration du substrat est de 10 à 5096, le pH de 3 à 8 environ, la concentration en enzyme de 1 à 100 unités environ, et la température préférée de 20 à 500C. Le temps de réaction a une influence importante sur le rendement en oligosacharride. La figure 1 illustre la relation entre le temps de réaction T en heure et la concentration en sacharride obtenue C sac dans un traitement enzymatique spécifique. La courbe G représente la variation de concentration du glucose en fonction du temps de réaction, la courbe H celle du galactose, la courbe O correspond à la variation de la concentration en oligosaccharide au cours de la réaction et la courbe L correspond à la concentration en lactose pendant cette réaction. Les concentrations en glucose, galactose et oligosacharride augmentent rapidement et linéairement au début de la réaction puis ses variations décrivent des courbes assez complexes, il est à noter que la concentration en oligosaccharide diminue après un certain temps de réaction. La durée de réaction pour laquelle la concentration en oligosaccharide est le maximum dépend également d'autres facteurs, mais le facteur de durée de réaction maximum est préfrablement choisi pour les expériences suivantes. Les oligosaccharides contenus dans le milieu réactionnel sont séparés des autres constituants par chromatographie en couche mince et déterminés par la méthode Anthrone. La réaction enzymatique peut être achevée par chauffage du milieu réactionnel pendant 5 à 10 mn environ à une température supérieure à 90-C. Le milieu réactionnel produit par le traitement enzymatique peut être utilisé comme facteur de croissance du Bifidus ou en solution dans des produits laitiers par exemplelles contenant, avec une concentration conve nablelou séchée sous forme de poudre. Le milieu réactionnel peut être purifié pour augmenter la concentration du constituant efficace, principalement les oligosaccharides. On peut réaliser cette purification suivant de nombreuses voies telles que par exemple, par une purification préliminaire du milieu réactionnel avec une résine échangeuse d'ions après passage dans une colonne de charbon actif pour l'adsorption des oligosaccharides, et solution par une solution aqueuse d'alcool. Il est également possible d'inoculer des micro-organismes de fermentation de mono et disaccharides dans le milieu réactionnel pour la culture et la consommation des mono et disaccharides pour faciliter l'isolation des oligosaccharides. Un exemple an ytique d'une composition de l'invention contenant des oligosaccharides est décrit ci-dessous en référence principalement à l'exemple 1, décrit ci-après et mis en oeuvre sous des conditions standards. a) Distribution des poids moléculaires. La figure 2 montre le résultat de la filtration sur gel avec un bio-Gel P-2. Cette courbe représente l'absorbance à 660 mm des différentes fractions recueillies. Les pics, A, B et C correspondent respectivement au tri-, tétras, pentasaccharides. La proportion de chacun de ces composés est calculée par mesure de l'aire de chaque pic et est égale environ à 5596 pour le trisaccharide, environ 32% pour le tétrasaccharide, et environ 13% pour le pentasaccharide et les polysaccharides: b) Composant saccharide. Le lactose, les oligosaccharides (non séparés en leurs constituants) et les tri- et tétraa-accharides de l'oligosaccharide sont hydrolysés à 100 C pendant 4 heures dans une solution HCl 0,5 N. Le même produit est aussi hydrolysé à 500C pendant 4 heures avec de la 6 -galactosi dase. Les proportions molaires dessaccharides obtenus sont rassemblées dans le tableau 1 suivant pour les différents cas. Ce tableau montre que le rapport molaire glucose sur galactose pour les tri- tétra- et pentasaccha- rides de l'oligosaccharide est égal respectivement à 1:2, 1:3 et 1:4. Tableau 1. galactose/glucose Hydrolyse Décomposition acide enzymatique Lactose 0,98 0,98 Oligosaccharide 2,44 2,42 Trisacoharide 1,94 1,92 Tétrasaccharide 2,88 2,84 Pentasaccharide 3,82 3,80 c) Mode de liaison des différents saccharides. On a confirmé la présence de lactose et Gal-(-1,6)- Gal en addition avec le glucose et le galactose dans un produit obtenu par hydrolyse acide partielle des composés principaux de la trisaccharide (séparés par chromatographie sur colonne à charbon actif). A partir de ce résultat, le rapport glucose sur galactose dans le produit entièrement hydrolysé étant de 1:2, la structure estimée du trisaccharide e est GalAss1,6)-Gal-( (ss-1,4)-Glc. Suivant le résultat de nos analyses similaires de nombreux constituants oligosaccharides, nous avons découvert que l'oligosaccharide a la formule générale mentionnée ci-dessus et que les liaisons galactosegalactose sont des liaisons ss-1,3;ss-1,4 avec une liaison r8 -1,6 prédominante, et les liaisons galactose glucose sont des liaisons ss -1,3 tus1,4 ou p -1,6 avec une liaison p -1,4 prédominante. Comme discuté ci-dessus, et dans la mesure où les oligosaccharides de la composition de l'invention sont isolés, on peut affirmer que les oligosaccharides élémentaires agissent chacun comme des facteurs de croissance du Bifidus, et bien entendu un mélange de divers oligosaccharides pourra agir de manière excellente pour faciliter la croissance doebifidobactéries. L'avantage particulier de l'oligosaccharide contenu dans la composition de l'invention et qucil opère avec une très grande efficacité non seulement dans un milieu extérieur au corps vivant mais également à l'intérieur dudit corps vivant. Les opérations facilités de croissance de la bifidobactérie particulières propres à la composition de la présente inve ton,n'ont substantiellement aucune relation avec les espèces de bifidobactéries et peuvent être efficaces pour les bifidobactérium breve, bifidobactérium bifidum, bifidobactérium infantis, Bifidobactérium adolescentis etc vivant dans les intestins humains. La composition de l'invention peut être des produits de réaction obtenus par traitement d'oligosaccharides hautement purifiés ou d'autres mélanges contenant des oligosaccharides tels'que le lactose,ou un produit contenant du lactose, avec la p -galactosidase. Du lait fermenté ou en poudre ou des aliments analogues ou médicaments comprenant un produit secondaire tel qu'un produit de réaction ou d'autres aliments désirés ou médicaments sont additionnés aux oligosaccharides purifiés. La présente invention est mieux décrite en référence aux différents exemples dans lesquels la bifidobactérie est dénommée par "B". Ces exemples ne doivent en aucun cas, être considérés comme limitant le cadre de la présente invention, parce que de nombreuses variations et modifications sont possibles. Exemple 1. On dissout 3,6 kg de lactose dans environ 6 litres d'eau chaude, et on additionne 50 ml d'une solution tampon d'acide acétique 1 M (pH de 4,6), 100.000 unités de -galactosidase et une quantité d'eau pour obtenir une solution de 10 litres. Cette solution réagit pendant 5 heures à 370C. On chauffe cette solution réactionnelle pour dénaturer les enzymes; les protéines dénaturées étant extraites par filtration. La solution- réactionnelle restante est versée dans une colonne à résine échangeuse d'anions et une colonne à résine échangeuse de cations. Le filtrat est laissé en contact pendant une nuit dans une colonne de dimension de 30x30 cm rempli avec du charbon actif. Le charbon actif est lavé avec 60 litres d'eau désionisée pour éluer les monosaccharides.On lave le charbon actif par-sucoessivement 60 litres d'eau contenant 5% d'éthanol et 60 litres d'eau contenant 50% d'éthanol. L'éluat obtenu à partir de la solution d'élution contenant 50% dpéthanol, est concentré jusqu'à environ 7 litres, et filtré de manière axénique sur une membrane filtrante (dimension de pore 0,2 r), et est passé de nouveau dans une colonne échangeuse d'ions pour obtenir une solution transparente de saccharide. Cette solution est concentrée sous vide Jusqu'd obtenir une solution visqueuse, d'environ 2,5 litres qui est à nouveau filtré sur une membrane filtrante ; la solution de filtrat esthéepar congdla- tion pour donner une poudre blanche d'oligosaccharide (ci-après appelée TOS). Exemple 2. On administre à 6 rates adultes axéniquesde Fischer 10 différentes bactéries (comprenant la B. breve) extraites des excréments humains. Ces bactéries se fixent dans les intestins. On administre ensuite a) une solution aqueuse de 3,' de lacturose, b) une solution aqueuse de 3,' de TOS obtenue dans l'exemple 1 ci-dessus et, c) une solution aqueuse de 3% de lactose, journellement pendant une période d'une semaine suivant a ' ordre à c. Ces solutions sont administrées en quantités de 0,6 g par jour comme produit solide, et on observe des périodes intermédiaires d'une semaine entre chaque changement de solutions administrées. Durant cet intervalle, les excréments des rats sont prélevés pour déterminer le nombre de B. breve bactéries vivantes contenues dans ceux-ci.Le résultat est rassemblé dans la figure 3. Cette figure représente le logarythme décimal dru nombre de bifidobactéries dans 1g d' exeréments des rates en fonction du nombre de jours è partir de la première administration d'une solution selon l'invention. Cette courbe est divisée en différents secteurs qui correspondent à l'administration d'eau ou des solutions a, d et o décrites ci-dessus. Comme cela est visible sur cette figure, le nombre de B. breve est environ multiplie par 10 pendant la période d'administration de la solution (b) de TOS. Une augmentation mineure du nombre de bactéries peut être notée pendant la période d'administration de la solution (c) de lactose, tandis que ce nombre ne varie pas pendant la période d'administration de la solution (a) de lacturose. ExesDle 3. L'expérience suivante a été réalisé avec une série de six rats communs adultes de Fishser. Les bifidobactéries utilisées sont B. breve ou B. infantis qui sont obtenues de telle manière que les bactéries résultantes d'une culture sur milieu VL-G de 48 heures, et après séparation centrifuge sont mises en suspension dans un milieu de culture laitier et administrées sous cette forme. La quantité administrée est de 2 x i08 par jour, exprimée en nombre de bactéries, ou de 20 ml par jour d'une solution aqueuse à 5,' de TOS. a) les rats boivent uniquement la solution bactéries pendant un seul jour. b) chaque jour de la deuxième semaine seulement on administre à chaque rat la solution de bactéries. c) Pendant la troisième semaine on administre chaque jour et simultanément la solution de bactéries et la solution TOS. d) Pendant la quatrième semaine on administre chaque jour seulement la solution TOS. La figure 4 illustre les résultats et le nombre mesuré de bactéries vivantes de B bactéries (de l'espèce de celles administrées) contenues dans les excréments des rats. Cette figure 4 représente le logarythme décimal du nombre de bactéries contenues danslg d'excréments des rats en fonction du nombre de jours écoulés depuis la première administration d'une solution de bactéries. La courbe D représente le nombre de B. breve et la courbe E le nombre de B. infants. De plus cette figure est divisée en secteurs correspondant chacun à l'administration de la solution de bactéries(e) ou de la solution TOS(d). Comme illustré par cette figure 4, le nombre de B. bactéries dans les intestins augmente remarquablement lors de l'administration de la solution de bactéries (e) et de la solution TOS (d) et il est également remarquable que le nombre de bactéries peut être maintenu à une valeur élevée au-delà de l'interruption de l'administration de la solution de bactéries (e). Exemple 4. L'expérience suivante est conduite avec 5 hommes adultes en bonne santé. Les solutions de bactéries administrées sont les solutions de B. breve obtenues de manière analogue à celles décrites dans l'exemple 3. Le déroulement de l'expérimentation est - première semaine : administration de la solution de bactéries (f) seule, - seconde semaine : administration de la solution de bactéries(f) et de la solution TOS(d)(dose : 3 g par jour), - troisième semaine : administration de la solution de bactéries(f) et de la solution TOS(d) (dose:lOg par jour). Nombre de bactéries administrées : 109 par jour. Mode d'administration de la solution TOS(d) étendue dans de l'eau tiède et bue après déjeuner. Mesure : au troisième, cinquième et septième jour de chaque semaine, le nombre de bactéries B. breve est mesuré dans les excréments de chaque homme soumis autest. Une valeur moyenne est calculée pour chaque semaine respective. Les résultats de ces expérimentations sont illustrées par la figure 5. Ce graphique représente le logarythme décimal du nombre de B. breve contenués dans lg d'exc * ents en fonction du nombre de jours écoulés après la première administration. Ce graphe est divisé en trois secteurs correspondant aux trois semaines d'expérience et aux différentes administrations de solutions. D'après omette figure on conclue que le nombre de B bactéries est remarquablement augmenté par l'administration de la solution TOS(d). Exemple 5. L'expérimentation suivante est conduite avec 5 hommes adultes bien portants. Déroulement de l'expérimentation - première semaine : aucune administration, - deuxième semaine : administration de 3 grammes par jour d'une solution TOSÇd), - troisième semaine : administration de 10 grammes par jour d'une solution TOS(d), Le mode d'administration de la solution TOS est identique au mode décrit dans l'exemple 4. Mesure : le nombre total debifidobactéries contenues dans les excréments est mesuré comme dans l'exemple 4. Les résultats de cette expérimentation sont résumés dans la figure 6. Comme les figures 3 à 5, cette figure représente le logarythme du nombre de bifidobactéries contenuesdansîgd' excréments en fonction du nombre de jours écoulés après la première administration, et chaque secteur de ce graphe correspond aux différentes semaines d'expérimentation et aux différents produits administrés. Cette figure montre que le nombre de bifidobactéries vivants dans les intestinshimains peut tre augmenté par l'administration d'une solution de TOS. Exemple 6. On additionne à 1000 litres de lait écrémé réduit dix millions d'unités de ss- galactosidase de Aspergillus oryzae. Le mélange réactionnel est maintenu à 40 C pendant 2 heures et chauffé pour désactiver les enzymes et stériliser la solution. Le produit résultant est transféré dans un réservoir de culture. Après avoir inoculé un initiateur de prolifération de bifidobactéries, on maintient la culture à 37 0C pendant 24 heures, et on additionne des édulcorants etc1 puis on homogénéise la solution pour former un lait fermenté contenant des oligosaccharides et des bifidobactéries. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée auemodesde réalisation décrit et représenté qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre de la protection comme revendiquée. REVENDICATIONS 1. Composition pour favoriser la croissance de bifidobactéries,caractérisée en ce qu'elle contient comme constituant efficace un oligosaccharide de formule générale Galal)nGlc, dans laquelle Gal représente un résidu de galactose, Glc un résidu de glucose et n un nombre entier de 1 à 4. 2. Procédé pour la fabrication de la composition pour favoriser la croissance de bifidobactéries selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lactose ou un produit contenant du lactose est traité avec la ffi -galactosidase produit par l'Aspergillus oryzae. 3. Composition pharmaceutique notamment utilisée pour augmenter le nombre de bifidobactéries dans le corps humain, caractérisée en ce-qu'elle comprend une dose thérapeutiquement efficace d'une composition selon la revendication 1, dans un véhicule pharmaceutique acceptable pour l'organisme et compatible avec lui.