Brevet FR2496694A1 — publié le 19820625

La présente invention se rapporte à un procédé de détermination de l'activité de l'enzyme transformant l'angio- tensine et, plus particulièrement à un procédé de détermina- tion de l'activité de l'enzime transformant l'angiotensine -5 consistant à mélanger un liquide contenant (i) un substrat synthétique de X-hippurylL-dipeptide de formule X O O O C-NH-CH2- C -NH -CH- C -NH -CH--COOH I i R1 R2 dans laquelle X est OH, NH2 ou N(CH3)2, et dans laquelle le couple de substituants (R1, R2) est soit (a).(H,H), soit H (b). H -CH2CH(CH, (ii) de l'hippuricase et (iii) de la 4-aminoantipyrine, à un liquide contenant un enzyme transformant l'angiotensine et à mesurer colorimétriquement la concentration d'un colo- rant quinoniminique qui se forme en ajoutant un agent oxy- dant au mélange ci-dessus. L'enzyme transformant l'angiotenzine (abrégé ci- après en ACE) agit sur l'angiotensine I de l'organisme de l'homme et libère un dipeptide à terminaison C (c'est-à- dire de la L-histidyl-L-leucine) à partir de l'angiotensine I, en produisant une angiotensine II de type actif qui a pour effet d'augmenter la pression sanguine. L'ACE joue un rôle important dans l'organisme humain en association avec un groupe enzymatique rénine-angiotensine, ou avec un groupe enzymatique quinine-kallikréine. En outre, en con- trôlant le taux de 'ACE dans le sang, on peut effectuer le diagnostic de la sarcoidose. C'est pourquoi la mesure de l'activité enzymatique de l'ACE a une grande signification du point de vue physiologique et du point de vue clinique. On a proposé les procédés suivants de mesure de l'activité enzymatique de lACE: (1) Un procédé employant un radioisotope, (2) un procédé employant une substance fluorescente, et (3) un procédé employant une chromatographie en phase liquide. Mais tous ces procédés exigent un appareillage spécial. Outre les procédés mentionnés ci-dessus, on connaît un procédé proposé par Cushman et collaborateurs. Suivant ce procédé, on fait réagir le substrat synthétique hippuryl- L-histidyl-L-leucine sur un échantillon d'essai contenant de PACE, par exemple sur du sérum ou un fluide de l'orga- nisme, pendant une période prescrite afin de donner de l'acide hippurique, puis on ajoute de l'acide chlorhydrique au mélange réactionnel pour arrêter la réaction. On extrait l'acide hippurique ainsi formé par de l'acétate d'éthyle. On évapore ensuite l'acétate d'éthyle de la solution ex- traite, ce qui laisse un solide séché. On dissout le solide séché dans de l'eau distillée et on détermine l'absorbance de la solution dans la région ultraviolette, ce qui déter- mine la concentration de l'acide hippurique et, à partir de celle-ci, on calcule l'activité de PACE. Ce procédé met en oeuvre des stades compliqués et n'est donc pas toujours pratique. L'invention vise donc un procédé de détermination de l'activité de l'enzyme transformant l'angiotensine (ACE) qui est améliorée pour ce qui concerne la précision de mesure et le coût et qui, à la différence des procédés classiques, n'exige pas des stades de mesures compliqués. Suivant l'invention, on mélange à un liquide conte- nant de lACE un réactif d'essai comprenant (i) du X- hippuryl-L-dipeptide servant de substrat synthétique tel que défini cidessus, (ii) de l'hippuricase, (iii) de la 4-aminoantipyrine, et (iv) un agent oxydant, par exemple de l'acide periodique,de l'acide perchlorique, du ferricya- nure de potassium, du nitrate cérique et d'anmnium de la chloramine T, de la chloramine B ou du trioxyde de chrome. On forme un colorant quinoniminique en mélangeant le réac- tif d'essai au liquide contenant 'ACE. On mesure ensuite colorimétriquement la concentration du colorant quinonimini- que, ce qui détermine l'activité de 'ACE. La disposition essentielle de l'invention est que l'on peut déterminer l'activité de l'ACE plus précisément et d'une manière moins coûteuse que dans les procédés classiques, parce que les agents d'oxydation pouvant être utilisés suivant l'invention ont des propriétés stables et sont peu coûteux. On explicite ci-dessous la manière de mettre en oeuvre le procédé de détermination de l'activité de 'ACE suivant l'invention. On ajoute du X-hippuryl-L-dipeptide à un liquide contenant de 'ACE, par exemple à du sérum ou à un fluide de l'organisme. Il se forme donc de l'acide X-hippurique et du L-dipeptide. A ce mélange, on ajoute de l'hippuricase, ce qui forme de l'acide X-benzoique et de la glycine. On oxyde l'acide X-benzolque par l'agent oxydant, en la pré- sence de 4-aminoantipyrine et on le condense à la 4-amino- antipyrine pour former un colorant quinoniminique. On mesure colorimétriquement la concentration du colorant quinoniminique et de la concentration du colorant quinoni- minique on calcule l'activité de 'ACE. On peut résumer le procédé suivant l'invention par les équations suivantes: ACE X-hippuryl-L-dipeptide - acide X-hippurique + L-dipeptide hippuricase acide X-hippurique * acide X-benzoique + glycine agent oxydant acide X-benzoique + 4-aminoantipyrine colorant quinoni- mique Suivant l'invention, comme X-hippuryl-L-dipeptide servant de substrat synthétique, on fait appel particuliè- rement à la p-hydroxyhippurylglycyl-glycine de formule 249f69Ji 0 0 0 Il 'il il_ HO C--NH -CH2- -NH-CH- C -NH- CH -COOH l i H H et à la p-hydroxyhippuryl-L-histidyl-L-leucine de formule if l cil HO CNH-dH2- C -NH -CH- C _NH _CH- COOH I I CH2 CH2CH (CH3) 2 N tandis que,comme agent oxydant, l'acide périodique est par- ticulièrement utile. L'exemple suivant illustre l'invention. A 0,5 ml d'un réactif d'essai contenant 5,6 mM de p-hydroxyhippuryl-Lhistidyl-L-leucine, 1 U d'hippuricase, 2 mM de 4-aminoantipyrine, 0,5 M de chlorure de sodium et 0,1 M d'acide borique, on ajoute 50 p1 de sérum. On laisse réagir le mélange à 37 C pendant 20 minutes. A ce mélange réactionnel, on ajoute 0,5 ml d'une solution arrêtant la réaction et contenant 3 mM d'acide éthylènediaminetétra- acétique (EDTA) et 17,5 mM de periodate de sodium..On main- tient le mélange à 37 C pendant 5 minutes, ce qui forme un colorant quinoniminique. On mesure l'absorbance du mélange réactionnel à une longueur d'onde de 505 nm, et on la dési- gne Absorbance A. Séparément, on prépare un essai-témoin (de comparai- son) en ajoutant 0,5 ml d'une solution contenant 0,1 M d'acide borique à 0,5 ml de la solution mettant fin à la réaction, puis on ajoute au mélange réactionnel 0,05 ml de sérum. De la même manière que décrit ci- dessus, on mesure l'absorbance du réactif d'essai témoin à la longueur d'onde de 505 mn. Cette absorbance est désignée Absorbance B. On peut calculer l'unité d'activité (mU) de l'ACE par l'équation suivante: A-B I I 1,05 4xO mU Coefficient d'extinction' Durée de réaction x Longueur du X 0,05 moléculaire (ú) (20 minutes) trajet de la lumière (cm) dans laquelle e = 12.000 (coefficient d'extinction molécu- laire du colorant quinoniminique). En répétant 20 fois l'essai décrit ci-dessus, on obtient le résultat suivant: - Unité d'activité (mU) = 20 + 0,3 (nmole/ml/mn). - Coefficient de variation (CV) = 1,5 %. REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination de l'activité de l'en- zyme transformant l'angiotensine, caractérisé en ce qu'il consiste à: (1) mélanger un liquide contenant (i) un X- hippuryl-L-dipeptide de formule X O O O R R C--NH ^^CH2-- C--NH--CH -C --NH- H-CO R1 R2 dans laquelle X est OH, NH2 ou N(CH3)2î et dans laquelle le couple de substituants (R1, R2) est (a). (H,H,) ou (b). H ( CH2 Q, CH2CH(CH3) (ii) de l'hippuricase et (iii) de la 4-aminoantipyrine, à un liquide contenant l'enzyme transformant l'angiotensine pour former un mélange réactionnel; (2) à ajouter un agent oxydant au mélange réac- tionnel dans des conditions de réaction propres à former un colorant quinoniminique, et (3) à mesurer colorimétriquement la concentra- tion du colorant quinoniminique. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le X-hippuryl-L-dipeptide est unreX-hippuryl- glycyl-glycine de formule X 0 0 0 -- NH- CH2- C -NH-CH C- NH-CH-COOH. I i H H 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le X-hippuryl-L-dipeptide est ureX-hippuryl-L- histidyl-L-leucine de formule X O O O C -NH - CH - 2- C- NH-CH- C-NH -CH -COOH I i CH2 CH2CH (CH3)2. N. H N--- 4. Procédé suivant la revendication 1, 2, ou 3, caractérisé en ce que l'agent oxydant est l'acide periodi- que, l'acide perchlorique, le ferricyanure de potassium, le nitrate d'ammonium et cérique,la chloramine-T, la chlora- mine B ou le trioxyde de chrome.