Brevet FR2490241A1 — publié le 19820319

On sait que l'aspartase a la capacité de convertir le fumarate d'ammonium en acide L-aspartique. Divers procédés de production d'acide- L-aspartique par la réaction enzymatique de l'aspartase avec du fumarate d'ammonium sont connus. Par exemple l'acide L-aspartique peut être préparé en mettant en culture un micro-organisme produisant 1 'aspar- tase dans un milieu nutritif contenant de l'acide fumarique ou l'ion fumarate. On peut par exemple se référer aux brevets US nO 2.927.050 ; 2.971.899 ; 3.198.712 ; 3.214.345 ; 3.310.475; 3.999.586 ; 4.013.508 ; 4.048.018, au brevet britannique nO 880.234 et au brevet canadien nO 697.310.Dans le brevet US nO 3.214.345 sont employées des cellules de E. coli pour produire l'acide L-aspartique à partir de fumarate d'ammonium. Alternativement, l'acide L-aspartique peut être préparé soit par réaction de cellules entières contenant l'activité de l'aspartase avec du fumarate d'ammonium ou en extrayant l'enzyme et en chauffant avec du fumarate d'ammonium. Cependant, ces procédés sont désavantageux parce que l'acide résultant est contaminé soit de l'enzyme, des cellules microbiennes, de sources d'aliment et autres. En conséquence, afin de récupérer de l'acide L-aspartique de haute pureté, des étapes supplémentaires pour retirer l'enzyme et d'autres contaminants sont requises. Fréquemment, ces procédés détruisent l'enzyme et/ou le micro-organisme, et ces sources ne peuvent donc être utilisées qu "une seule fois. Pour surmonter les inconvénients ci-dessus, on a suggéré d'immobiliser l'aspartase en l'alliant à un polysaccharide adsorbant échangeur d'anions On peut se référer à la publication du brevet japonais nO 6.870/1970. On sait également encapsuler les micro-organismes dans des véhicules polymériques. On peut se référer à la publication du brevet japonais nO 17.587/1970 où des polyacrylates sont utilisés comme véhicules polymériques. S'y rapportent également les brevets US nO 3 649.457, 3.791.926 et 3.898.128. L'utilisation de carroghenine comme véhicule polymérique est décrite par Sato dans Biochemica et Biophysica Acta, 570, 179-186 (1979). Dans les publications des brevets russes SU 423.976 et SU 451.483 est décrite l'immobilisation de cellules de E. Coli dans des cellules de polyacrylamide et la production d'acide L-aspartique à partir de fumérate d'ammonium. L'encapsulation des micro-organismes dans des mousses de polyuréthane hydrophile a également été suggérée. On peut se référer au brevet US nO 3.905.923 (Klug) et à la demande de brevet US 362.488 (déposée le 21 mai 1973) de -Louis L. Wood et autres, intitulée "Preparation and use of enzymes bound to polyurethane". La liaison des enzymes au polyuréthane est également décrite dans le brevet US nO 3.672.955 (Stanlev), en particulier à la colonne 5, lignes 27-35. Dans le brevet US nO 4.000.040 est décrite la préparation de l'acide L-aspartique à partir de substrats autres que l'acide fumarique comme l'acide acétique, l'alcool éthylique et des carbohydrates. Des polymères hydrophiles ont également été utilisés comme véhicules pour des produits chimiques, comme des bactériostats et des fongicides.On peut se référer au brevet US nO 3.975.350 (Hudgin). On sait également immobiliser les cellules bactériennes dans des polyuréthanes hydrophobes. pe voir l'exemple 4 du brevet britannique nO 953.414. L'immobilisation d'un grand nombre d'enzymes dans des polyuréthanes hydrophiles est également décrite dans la demande de brevet US nO 849.999 (Hartdegen et autres déposée le 9 novembre 1977 et intitulée "Immobilîzed Biological Material". On peut citer comme autres références d'intérêt, Sonomoto et autres(Agric. Biol. Chem. 44(5), 1119-1126, 1980) où des conversions de stéroïdes sont accomplies en utilisant des cellules bactériennes piégées dans des polyuréthanes préparés à partir de prépolymères d'uréthane. Fukui et autres (Biochimie, 1980 , 62, 381-386) décrivent l'utilisation des enzymes immobilisés dans des prépolymères photo-réticulables et des prépolymères d'uréthane pour préparer des L-amincr acides. L'immobilisation de cellules bactériennes en utilisant des prépolymères d'uréthane est également décrite.A une récente "Gordon Research Conference" (11-15 août 1980), l'immobilisation de cellules entières (c'est-à-dire E. coli génétiquement produites contenant de grandes quantités de pénicilline amidase) en utilisant des prépolymères d'uréthane a été discutée. Les systèmes de biotransformation ont également été mentionnés comme "sous-évaluation" pour la préparation de L-stérine et de L-tryptophane. La présente invention concerne une mousse de polyéther polyuréthane hydrophile où au moins 50 i en mole des unités d'oxyde d'alcoylène dans les segments de polyéther du polyuréthane sont de l'oxyde d'éthylène, un micro-organisme produisant de l'aspartase y étant immobilisé. La présente invention concerne également un procédé de préparation de la mousse ainsi qu'un procédé d'utilisation de la mousse pour produire de l'acide aspartique. De préférence, les segments de polyéther de la mousse contiennent au moins 90 % en mole d'unités d'oxyde d'éthylène. Selon la quantité de l'agent réticulant employé, la mousse peut être soit rigide ou flexible. En se basant sur le poids sec du micro-organisme employé, le rapport pondéral du polymère de polyuréthane aux micro-organismes dans la mousse est de l'ordre de 1:10 à 10:1, et de préférence de l'ordre de 2:1 à 4:1.Avant mélange de la culture avec le prépolymère, le poids sec du micro-organisme dans la culture peut être déterminé par évaporation de la culture à siccité à une température appropriée, telle que 500C. Ensuite, lors du mélange d'une culture semblable avec le prépolymère, on a trouvé que de 50 à 90 % des micro-organismes pouvaient être immobilisés dans la mousse. Par le terme "immobilisation", on indique que les micro-organismes sont retenus dans la mousse plutôt que d'en être lixiviés lors d'un contact avec de l'eau ou d'une solution aqueuse d'un substrat. On pense que les micro-organismes sont encapsulés dans la mousse pour accomplir l'immobilisation. I1 est également probable que pendant le processus de formation de mousse, une liaison se produise entre les groupes isocyanates du prépolymère et les groupes sur la surface des micro-organismes, c'est-à-dire les groupes amino. Les mousses sont préparées en mélangeant une culture des micro-organismes produisant l'aspartase directement avec un prépolymère d'uréthane en présence de suffisamment d'eau pour favoriser la formation de mousse. Traditionnellement, l'eau est portée dans la culture, en effet les cultures appropriées contiennent généralement de l'ordre de 10 à 90 % en poids d'eau, la teneur en eau de la culture particulière étant déterminée par évaporation d'un échantillon de la culture à siccité comme on l'a décrit ci-dessus. Grâce à la présence d'eau, le prépolymère subira la formation de mousse et simultanément les micro-organismes seront immobilisés dans la mousse. Pour optimiser l'immobilisation, le pu de la culture aqueuse est compris entre environ 4 et environ 11 et de préférence il est supérieur à 7.Pendant l'immobilisation, le rapport pondéral prépolymère/eau est généralement de 2:1 à 1:2 et de préférence de 3:2 à 2:3, cette eau étant amenée par la culture ou par la combinaison de la culture et de l'eau ajoutée avant ou pendant le mélange. Pendant le mélange, la culture doit être suffisamment dispersée dans l'eau du prépolymère pour qu'aucun grumeau ou amas discernable à l'oeil ne soit présent. Ce mélange est facilement obtenu après contact de la culture avec l'eau selon la description ci-dessus. A la suite du mélange, la réaction de formation de mousse est généralement terminée en 5 à 10 minutes et la mousse est durcie à sa forme finale rigide ou flexible en 5 à 10 minutes supplémentaires.Cependant, avec des masses importantes de mousse, il est concevable que les temps pour la formation de mousse et le durcissement puissent être considérablement étendus. Des microrganismes produisant l'aspartase sont employés dans le cadre de la présente invention. On peut citer comme exemple de micro-organismes produisant l'aspartase, des souches appropriées de ce qui suit où la capacité de production de l'aspartase peut facilement être déterminée en consultant un catalogue d'um agence telle que ATCC Pseudomonas fluoresceus Serratia marcescens Bacterium succincum Bacillus megaterium Bacillus subtilisa Bacillus natto Micrococcus sp. Escherrichia coli. Aerobacter aerogenes. Tous les micro-organismes ci-dessus sont publiquement disponibles auxlieuxde culture indiqués Cependant, on notera que la présente invention n'est pas limitée à l'utilisation de ces micro-organismes spécifiques mais dans son cadre sont incorporés tous les micro-organismes producteurs d'aspartase. L'acide L-aspartique peut être préparé en contactant la mousse avec du fumarate d'ammonium ou un mélange d'acide fumarique ou son sel et d'un sel d'ammonium inorganique. On peut citer comme exemples appropriés du sel de l'acide fumarique, ses sels de métaux alcalins tels que le fumarate de sodium et le fumarate de potassium. Le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium et le phosphate d'ammonium sont préférés comme sels d'ammonium inorganiques. Quand un mélange d'acide fumarique ou de son sel et d'un sel d'ammonium inorganique est. employé dans la réaction enzymatique, les proportions préférées du sel d'ammonium inorganique dans le mélange sont de l'ordre de 1 à 2 moles pour une mole de l'acide fumarique ou du sel d'acide fumarique.Un ion d'un métal divalent doit être ajouté à la solution de la réaction enzymatique (c'est-à-dire la solution du substrate) pour améliorer l'activité enzymatique et la stabilité du microorganisme immobilisé, bien que l'on ait découvert que cette amélioration d'activité était fréquemment inutile ou pour de courtes périodes de temps. On peut citer comme exemples appropriés des ions de métaux divalents que l'on peut employer, les ions de calcium, magnésium, manganeux et de strontium. Si on l'emploie, la concentration de l'ion d'un métal divalent dans la solution du substrat est de 0:1 à 10 millimoles/litre. La concentration du substrat employé n'est pas critique, en effet, du fumarate d'ammonium ou un mélange d'acide fumarique ou son sel etc'un sel d'ammonium inorganique est dissous dans l'eau à toute concentration. Ensuite, le pH est ajusté à 8 à 10. La mousse du micro-organisme immobilisé est mise en contact avec le substrat, et le mélange est incubé à une température de 15 à 600C tout en agitant, jusqu'à ce que la réaction soit terminée. Quand la réaction est terminée, la mousse est séparée et peut être stockée sous réfrigération pour un usage subséquent. L'acide L-aspartique est récupéré du substrat par des procédés traditionnels. Alternativement, la réaction enzymatique peut être accomplie par un procédé en colonne, par exemple sur une base continue. Par exemple, la mousse est introduite dans une colonne à une densité suffisante pour rester perméable à la traversée du substrat. La solution du substrat, ayant un pH de 8 à 10 et contenant l'ion fumarate et le sel d'ammonium, passe à une température de 15 à 600C et à un débit approprié. Une solution aqueuse contenant l'acide L-aspartique est obtenue comme effluent. Cette solution peut être remise en circulation si on le souhaite. L'acide L-aspartique peut être libéré de la solution en ajustant le pH à environ 2,8-3, avec de l'acide sulfurique concentré. On obtient ainsi l'acide L-aspartique sous forme d'un précipité cristallin. La pureté du produit peut être améliorée par lavage dans l'éthanol si on le souhaite. Les prépolymères d'uréthane utiles pour la préparation de la mousse de polyuréthane sont préparés en coiffant un polyoxyalcoylène polyol avec un excès d'un polyisocyanate, tel que du diisocyanate de toluène. Avant de le coiffer, le polyol doit avoir un poids moléculaire de l'ordre de 200 à environ 20.000 et de préférence de l'ordre de 600 à environ 6.000. La fonctionnalité hydroxyle du polyol et la fonctionnalité de l'isocyanate correspondante après avoir été coiffé est comprise entre 2 et environ 8. Si des mousses sont formées de prépolymères ayant une fonctionnalité d'isocyanate de l'ordre de 2,le produit résultant est essentiellement linéaire et n'a pas une résistance à la traction aussi importante que s'il était réticulé. En conséquence, une teneur en hydroxyle supérieure à 2 par molécule est souhaités Cela peut être obtenu en utilisant des mélanges de diols avec des triols ou autres polyols de fonctionnalité supérieure ou des triols ou autres polyols d'ordre supérieur, tels quels, peuvent etre coiffés avec des di- ou polyisocyanates. On peut citer comme exemple de polyols appropriés (à coiffer des polyisocyanates) : (A) des polyols essentiellement linéaires formés par exemple par réaction d'oxyde d'éthylène avec de l'éthylène glycol comme initiateur. Des mélanges d'oxyde d'éthylène avec d'autres oxydes d'alcoylène peuvent être employés tant que le pourcentage molaire de l'oxyde d'éthylène est d'au moins 50 %. Si les polyéthers linéaires sont des mélanges d'oxyde d'éthylène avec par exemple de l'oxyde de propylène, le polymère peut être soit statistique ou séquencé et les unités terminales peuvent être soit de l'oxyéthylène ou de I'oxypropylène. La seconde classe de polyols (B) contient ceux ayant une fonctionnalité hydroxy de 3 ou plus. De tels polyols sont couramment formés par réaction d'oxydes d'a'Goylène avec un initiateur polyfonctionnel comme le triméthylolpropane, le pentaérythritol, et autres. En formant le polyol B, l'oxyde d'alcoylène utilisé peut être de l'oxyde d'éthylène ou des mélanges d'oxyde d'éthylène avec d'autres oxydes d'alooylènes. Des polyols utiles peuvent etre de plus représentés par (C) des polyols polyfonctionnels linéaires et ramifiés comme indiqué en A et B ci-dessus avec un initiateur ou un agent réticulant. On peut citer comme exemple spécifique de C, un mélange de polyéthylène glycol (poids moléculaire de l'ordre de 1,000) avec du triméthylolpropane, du triméthyloléthane ou de la glycérine.On peut faire subséquemment réagir ce mélange avec du polyisocyanate en excès pour produire un prépolymère utile dans la présente invention. Alternativement, on peut faire réagir les polyols linéaires ou ramifiés (comme du polyéthylènglycol) séparément avec un polyisocyanate en excès. On peut également faire réagir séparément l'initiateur tel que le triméthylolpropane, avec le polyisocyanate. Subséquemment, les deux matériaux coiffés peuvent être combinés pour former le prépolymère. Des polyisocyantes et initiateurs appropriés sont indiqués dans le brevet US nO 3.903.232 incorporé ici à titre de référence. Les initiateurs sont généralement des agents réticulants solubles dans l'eau ou dispersibles dans l'eau comme cela est décrit dans le brevet US nO 3.903.232. Préparation du prépolymère A Le prépolymère A est préparé en mélangeant deux équivalents molaires de polyéthylène glycol ayant un poids moléculaire moyen de 1.000 (PEG - 1.000) et 0,66 équivalent molaire de triméthylolpropane (TMOP). Le mélange est séché à 100-1100C sous une pression de666,5 - 2.000 N/m2 pour retirer 1 'eau. Le mélange séché résultant est lentement ajouté, sur une période de l'ordre de 1 heure, à un récipient contenant 5,52 équivalents molaires de diisocyanate de toluène (TDI), tout en agitant le mélange de TDI et de polyol. La température est maintenue à 600C tout en agitant pendant 3 heures supplémentaires. Alors, une quantité supplémentaire de 0,78 équivalent molaire de TDI est ajoutée tout en agitant, sur une période de l'ordre de 1 heure tout en maintenant la température à 600C. Le mélange réactionnel final contient un excès molaire de 5 pour cent de TDI. Tous les groupes hydroxyles sont coiffés d'isocyanate et il se produit une certaine extension de chaine du fait de la réticulation des polyols avec le TDI. EXEMPLE 1 Des cellules de E. coli (ATCC, 11.303) en suspension dans un tampon de phosphate à 0,1 M (pH 8,0) ont été centrifugées à 5.000 t/mm pendant 30 minutes. La masse des cellules a été placée sous réfrigération et a été drainée pendant une nuit. Les cellules (11 g) ont été mélangées à 11 g du prépolymère A. Du fait de l'eau dans la masse des cellules, il s'est formé une mousse de polyuréthane flexible et hydrophile qui a durci en environ 15 minutes. Les cellules ont été encapsulées dans ou liées à la matrice de mousse de polyuréthane. EXEMPLE 2 La mousse a été placée sous réfrigération et a été ensuite découpée en petits morceau (cubes d'environ 6,45 mm) pour un usage ultérieur. Un milieu formant substrat a été préparé à partir de la recette qui suit : 11,6 g d'acide fumarique et 20,3 mg de MgC12. 6 H20, dissous dans 25 % d'ammoniaque avec ajustement du pH à 8,5 au moyen d'ammoniaque concentrée On a ajouté suffisamment d'eau désionisée pour amener le volume à lOOcc. La température du substrat a été maintenue à 370C et on a placé, dans la solution du substrat, environ 1,4 g (base de poids sec) de mousse. Au bout de 30 minutes, l'analyse des échantillons avec une chromatographie en couche mince a indiqué que des quantités considérables d'acide L-aspartique avaient été produites. D'autres résultats d'analyse ont indiqué que 95 % de l'acide fumarique avaient été utilisés (c'est-à-dire convertis en acide L-aspartique). EXEMPLE 3 La mousse particulaire préparée à l'exemple 1 a été introduite dans une colonne de 75 cc équipée d'une chemise d'eau. La température a été maintenue à 370C et on a fait passer le substrat à divers débits. La composition du substrat était comme suit :qD3cc de WH40H, 1200 d'eau désionisée, 232 g d'acide fumarique, 406 mg de Mec12. 6 H20, avec adjonction d'eau désionisée pour amener le volume à 2 litres (pH 9,0). (fait en deux lots). Le volume du lit de liquide dans la colonne (c'est-à-dire la portion de la colonne non occupée par la mousse) était de 31,25 cc. On a fait passer environ 3500 ml du substrat à travers la colonne à un débit constant de 0,6 ml/mn à un pH de 9 et à 370C. Des échantillons ont été prélevés périodiquement et analysés à la recherche de l'acide fumarique, par chromatographie liquide à haute pression. Le pourcentage de conversion en acide L-aspartique par rapport au nombre d'heures où la colonne avait fonctionné au moment de l'échantillonnage est indiqué au tableau qui suit et illustre la stabilité de la colonne Conversion acide fumarique/L-aspartique Temps (heures) (a O cc/mn) , 5 71 46 69 150 61 218 61 EXEMPLE 4 Après que la colonne de l'exemple 3 ait fonctionné pendant environ 54 heures, le débit a été établi à 0,28 c/mn et un échantillon de 288 ml a été recueilli sur la période suivante de 16 heures et 50 minutes.L'acide L-aspartique a été isolé d'une portion de 250 ml de l'échantillon, et on a trouvé que le taux réel de conversion de l'acide fumarique en acide L-aspartique (en se basant sur l'analyse directe de l'acide L-aspartique séché par chromatographie gaz-liquide) était de l'ordre de 85 %. EXEMPLE 5 On a recueilli environ 3.500 ml du substrat ayant passé par la colonne de l'exemple 3 à un débit de 0,60 ml/mn. L'échantillon a été chauffé à 900 C et le pH a été réduit à 2,8 (le point isoélectrique pour l'acide Laspartique) en ajoutant 200 ml de H2S04 à 60 %. Le mélange acidifié a été refroidi à 150C pour précipiter l'acide L-aspartique qui a été enlevé par filtration, séché et lavé dans 95 % d'éthanol dans l'eau à 300C. L'acide fumarique n'ayant pas réagi dissous dans l'éthanol a été jeté en solution. L'acide L-aspartique insoluble a été retiré et séché sous vide.Un échantillon de la poudre a été analysé à 97 % d'acide L-aspartique, ce qui représente 89 % de la production théorique. EXEMPLE 6 De la mousse a été préparée comme à l'exemple 1 et on a placé 1 g d'échantillon dans un ballon et on a mélangé à 100 cc du substrat (126 mg/ml d'acide fumarique) à environ 370C et à pH de 9 pendant 15 minutes. Ensuite, on a répété le processus trois fois en utilisant un lot frais du substrat à chaque fois. Dans le premier lot (basé sur l'analyse de l'acide fumarique résiduel), la conversion en acide L-aspartique était de l'ordre de 57 % dans le premier lot et de l'ordre de 35 % pour chacun des trois lots suivants. On pense que la différence entre le premier lot et les lots suivants est dûe aux cellules non liées enlevées par lavage. EXEMPLE 7 Une colonne a été préparée et on l'a fait fonctionner comme à l'exemple 3 (116 mg/cc d'acide fumarique , pH 9,04) mais à une température de 200C. Le substrat a été continuellement remis en circulation à travers la colonne. En se basant sur la réduction des niveaux d'acide fumarique, la conversion en acide L-aspartique était essentiellement complète au bout de 120 heures. Les niveaux d'accomplissement de 33 et de 50 % ont été obtenus au bout d'environ 30 et 50 heures respectivement. Le niveau de 50 % est une valeur extrapolée. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'acide L-aspartique caractérisé en ce qu'un substrat contenant l'ion fumarate est mis en contactavecwe moEs de polyéther polyuréthane hydrophile ou au moins 50 % en mole des unités d'oxyde d'alcoylène dans les segments de polyéther du polyuréthane sont de l'oxyde d'éthylène, un micro-organisme produisant l'aspartase étant immobilisé dans ladite mousse. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le substrat a un pH de 8 à 10. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la température du substrat est de 15 à 600C. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat contient du fumarate d'ammonium. 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le substrat contient l'ion magnésium. 6. Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce qu'il est effectué sur une base continue. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu' il est effectué sur une base discontinue. 8. Mousse de polyéther polyuréthane hydrophile caractérisée en ce qu'au moins 50 % en mole des unités d'oxyde d'alcoylène dans les segments de polyéther du polyuréthane sont de l'oxyde d'éthylène, un micro-organisme produisant l'aspartase étant immobilisé dans ladite mousse. 9. Mousse selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'au moins 90 % en mole des unités d'oxyde d'alcoylène sont de l'oxyde d'éthylène. 10. Mousse selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est préparée par réaction d'un prépolymère de polyéther uréthane hydrophile avec de l'eau dans des conditions de formation de mousse, ladite eau étant mélangée avec une culture d'un micro-organisme produisant l'aspartase, et en ce qu'au moins 50 % en mole des unités d'oxyde d'alcoulène dans le segment de polyéther du prépolymère sont formés d'oxyde d'éthylène. 11. Mousse selon la revendication 10 caractérisée en ce que le prépolymère est un mélange de polyoxyéthylène glycol avec un alcool polyhydrique de faible poids moléculaire, ledit mélange réagissant avec un excès molaire d'un polyisocyanate. 12. Mousse selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est rigide. 13. Mousse selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est flexible. 14. Mousse selon la revendication 8, caractérisée en ce que le rapport pondéral, sur une base anhydre, du polymère de polyuréthane à la culture du micro-organisme est compris entre 1:1() et 10:1. 15. Procédé de préparation dTune mousse de polyéther polyuréthane hydrophile caractérisé en ce qu'une culture d'un micro-organisme produisant l'aspartase est mélangée à un prépolymère de polyéther uréthane hydrophile où au moins 50 % en mole des unités d'oxyde d'alcoylène dans les segments de polyéther du prépolymère sont de l'oxyde d'éthylène, suffisamment d'eau étant présente dans le mélange pour forcer le prépolymère à subir la formation de mousse pour piéger et immobiliser les cellules microbiennes de la culture. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la teneur en eau de la culture est de l'ordre de 10 à 90 % en poids. 17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le pH du mélange est supérieur à 7. 18. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que sur une base pondérale, le rapport pondéral prépolymère/culture dans le mélange est de 1:10 à 10:1, le poids de ladite culture étant calculé sur une base sèche.