Brevet FR2495939A1 — publié le 19820618

-1- 2495939 La présente invention a pour objet un procédé de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae. L'invention a également pour objet un vaccin contre les infections provoquées par des bactéries Streptococcus pneumoniae à base de polyosides ainsi purifiés. On sait que plusieurs types de Streptococcus pneumoniae provoquent diverses infections telles que des méningites, des pneumonies, des otites et diverses bactériémies. Il est connu également que la purification de polyoside capsulaire purifié extrait de bactéries Streptococcus pneumoniae permet de réaliser des vaccins pour l'immunisation contre les infections provoquées par lesdites bactéries. La demande de brevet européenne n078.400185.1 décrit notamment un procédé de purification de polyoside de Strepto- coccus pneumoniae par précipitation fractionnée à l'alcool puis élimination des protéines et des acides nucléiques. Liélimination des protéines et des acides nucléiques est effectuée soit par des traitements à l'aide d'enzymes soit par des traitements à l'aide de tensio-actif cationique, ces traitements étant suivis d'une diafiltration. Dans cette demande de brevet européenne, la précipita- tion fractionnée par l'alcool est appliquée directement au milieu de culture, sans lyse préalable, et, en raison de la présence d'impuretés variées, les divers traitements de purification nécessitent la réalisation systématique sur chaque lot d'essais préliminaires de détermination des quantités de matières pre- mières à utiliser pour les précipitations alcooliques fraction- nées et pour le traitement par le tensio-actif cationique. Le procédé de la présente demande est effectué sur un produit de départ lysé dont les débris cellulaires ont été éliminés (clarification). Ce procédé permet d'éviter la réalisation d'essais préliminaires systématiques. D'une façon générale, ce procédé permet de raccourcir de façon importante la durée de l'ensemble des étapes de purifi- cation des molyobides de Streptococcus pneumoniae. La présente invention a pour objet un procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae, carac- térisé par le fait que le produit de départ est une solution aqueuse dudit polyoside, contenant des impuretés protéiques, -2- 2495939 obtenue par lyse d'une culture de Streptococcus pneumoniae puis clarification et concentration du polyoside, que l'on ajoute de 5 à 50% en volume de phénol, à température de 5 à 300C environ, que l'on agite, puis sépare et recueille la phase aqueuse, et que l'on répète, si nécessaire, le traitement au phénol jusqu'à ce que la teneur en protéines de la phase aqueuse soit inférieure à un seuil prédéterminé. Ce procédé de traitement au phénol permet donc de réaliser l'élimination de la majeure partie des protéines présen- tes dans la solution impure de départ. On a découvert que ce traitement au phénol ne modifie pas la structure moléculaire et donc l'activité biologique du polyoside. Selon des modes de réalisation particuliers actuel- lement préférés, ce procédé présente encore les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison: - la solution aqueuse de départ contient de 1 à 30g/ litre de polyoside impur; - on opère à température de 10 à 200C environ; - on ajoute le phénol sous la forme d'un mélange, phénol-eau; - le mélange phénol-eau est constitué par du phénol dans lequel l'eau est dissoute; - on effectue le traitement au phénol à un pH de 6,9 + 0,5 environ; - la solution de polyoside de départ est une solution tamponnée; - la solution tamponnée est par exemple un tampon acétate de sodium; - le phénol est ajouté sous la forme d'un mélange phénol-solution tamponnée; - on ajoute de 10 à 60% vol/vol du mélange phénol-eau ou phénol-solution tamponnée; - - la quantité d'eau ou de solution tamponnée dudit mélange correspond sensiblement à la quantité maximum pouvant être dissoute dans le phénol; ledit seuil correspond à une teneur en protéines de % en poids, c'est-àdire de 5g de protéines pour 100g de polyo- side brut; - on soumet la phase aqueuse recueillie à une dialyse pour éliminer le phénol résiduel. Pour mettre en oeuvre ce procédé de déprotéinisation par un phénol, on procède avantageusement de la façon suivante: on ajoute le phénol à la solution de polyoside à purifier puis on soumet le mélange à une ultracentrifugation. On obtient ainsi une séparation en trois phases: une phase inférieure phénolique, une interphase protéique et une phase aqueuse supérieure contenant le polyoside. Cette phase aqueuse est recueillie et soumise si nécessaire à un nouveau traitement au phénol. Le processus peut être ainsi recommencé jusqu'à l'obtention d'une teneur en pro- téines inférieure au seuil fixé. La détermination du taux de contamination protéique peut être réalisée après isolement, par précipitation alcoolique puis dessication sous vide, d'une quantité aliquote de polyoside contenu dans la phase aqueuse, par dosage colorimétrique selon la technique de Lowry et coll. décrite dans J. Biol. Chem. 143, 265 (1951) avec la sérum-albumine bovine comme étalon. Toutefois, l'expérience a montré qu'en utilisant des techniques constantes de culture, il est possible de déterminer une fois pour toutes le nombre de traitements au phénol (géné- ralement 1 ou 2) nécessaires pour chaque type de polyoside. Afin de purifier davantage le polyoside, on peut effectuer, outre le traitement de déprotéinisation par le phénol, d'autres traitements, et notamment des traitements permettant d'éliminer les contaminants nucléiques. Selon un mode de réalisation du procédé tel que défini ci-dessus, et afin d'éliminer les contaminants nucléiques, on ajoute en outre à la solution de polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité puis on ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside. Selon des modes de réalisation particuliers, ce trai- tement supplémentaire par un alcool en présence d'ions calcium, présente encore les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison: - on effectue cette précipitation fractionnée à l'al- cool généralement après le traitement au phénol; il est toutefois possible de l'effectuer avant le traitement au phénol, comme illustré à l'exemple 17 ci-après; - l'alcool utilisé est l'éthanol; - on effectue la précipitation fractionnée à l'alcool à une température de O à + 15 C environ; - on ajoute l'alcool jusqu'à une concentration de 10 à % environ (vol/vol) pour précipiter les contaminants nucléi- ques, puis on ajoute encore de l'alcool au surnageant jusqu'à précipitation complète du polyoside; - on opère en présence d'ions calcium à une molarité de 0,25-2M environ. Selon un autre mode de réalisation du procédé de purification de l'invention, pour éliminer les contaminants nucléiques, il est encore possible de soumettre la solution à purifier à un traitement supplémentaire au charbon actif en quantité suffisante pour adsorber la majeure partie des conta- minants nucléiques, puis d'éliminer le charbon actif sur lequel les contaminants nucléiques sont adsorbés. Généralement, on ajoute de 0,1 à 12% (poids/volume) de charbon actif. Si la teneur en acides nucléiques, après un premier traitement au charbon actif, est supérieure au seuil que l'on s'est fixé, on peut répéter ledit traitement. Ce traitement au charbon actif peut être effectué soit à la place du traitement à l'alcool en présence d'ions calcium, soit en complément de ce traitement. Si le taux initial de contamination nucléique est supérieur à 15% en poids, on effectue d'abord la précipitation fractionnée à l'alcool en présence d'ions calcium. Si, après la précipitation fractionnée à l'alcool, la teneur en acide nucléique du polyoside est supérieure au seuil fixé (par exemple supérieure à 1 ou 2% en poids), on peut remet- tre en solution le précipité de polyoside et le soumettre alors à un traitement au charbon actif tel que décrit précédemment. Si le taux initial de contamination nucléique est inférieur à 15% en poids, l'élimination des acides nucléiques est de préférence réalisée uniquement par un traitement au charbon actif. Le taux de contamination nucléique peut être apprécié par mesure spectrophotométrique de l'absorption à 260nm d'une solution aqueuse polyosidique préparée par redissolution dans l'eau distillée d'une quantité aliquote de polyoside obtenu par dessiccation du précipité provenant du traitement à l'éthanol d'une partie aliquote de la solution obtenue après le traitement -5- 2495939 au phénol et dialyse. Une valeur égale à 1 est attribuée à l'absorbance de 50 microgrammes d'acide nucléique dans iml d'eau, dans une cuve ayant un trajet optique de lcm. Toutefois, l'expérience a montré qu'en utilisant des techniques constantes de culture, il est possible de déterminer une fois pour toutes le type et le nombre de traitements néces- saires pour une élimination satisfaisante des contaminants nucléiques. La concentration optimale en charbon actif, qui est celle qui permet la plus forte réduction du taux d'acides nucléi- ques, est déterminée par des essais préliminaires sur chaque lot de polyoside à purifier. Cette concentration en charbon actif varie en pratique de 0,1 à 12% (poids/volume). Pour la purification finale du polyoside, on peut soumettre le polyoside à une précipitation puis laver le pré- cipité. On peut effectuer par exemple la précipitation avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium ou avec un alcool. On lave ensuite le précipité avec au moins un agent de lavage choisi dans le groupe constitué par un alcool (tel que l'éthanol), l'acétone ou l'éther éthylique. Généralement, pour obtenir la solution aqueuse de polyoside de départ, on ajoute à une solution aqueuse de polyo- side à purifier (obtenue après lyse, clarification et concen- tration) un alcool miscible à l'eau de façon à précipiter le polyoside puis l'on remet le précipité en solution. On peut effectuer cette précipitation en plusieurs étapes (généralement deux étapes) en ajoutant l'alcool en quantités croissantes de façon à précipiter d'abord des impuretés puis le polyoside. On peut également dans certains cas, en particulier lorsque le polyoside précipite pour une concentration d'alcool relativement faible, effectuer une précipitation alcoolique directe. C'est en particulier le cas pour les polyosides des types 3 et 8, comme cela est illustré ci-après dans la partie expérimentale. De préférence la précipitation à l'alcool est effectuée en présence d'un sel soluble dans le milieu, afin d'augmenter la force ionique. On peut utiliser par exemple un sel de sodium. On peut également effectuer cette précipitation préliminaire à l'alcool en présence de sels de calcium. Dans ce cas ce stade préliminaire permet d'éliminer la majeure partie des contaminants nucléiques, avant le stade d'élimination des protéines par le phénol. La concentration du sel peut varier de 0,1 à 2M. -6- 2495939 La précipitation directe consiste en l'addition d'un volume d'alcool suffisant pour permettre d'obtenir l'insolubi- lisation du polyoside. Celui-ci est récupéré par centrifugation avec ou sans décantation préalable du surnageant. La précipitation alcoolique fractionnée est réalisée de préférence en deux temps. Dans un premier temps on ajoute un volume d'éthanol permettant la précipitation sélective des contaminants (principalement protéines et acides nucléiques). Au surnageant obtenu après centrifugation, on ajoute dans un deuxième temps le volume d'alcool suffisant pour provoquer la précipitation complète du polysaccharide. Après centrifugation le sédiment est remis en solution en vue du traitement par le phénol. Généralement une concentration en alcool de 10 à 30% (vol/vol) est suffisante pour insolubiliser une partie des contaminants protéiques et nucléiques. Une concentration finale variant selon les cas entre 30 et 80% est généralement nécessaire pour la précipitation des polyosides. Toutefois, lorsque le polyoside précipite déjà pour une faible concentration en alcool (par exemple pour une concentration de 15-20%) on effectue alors une précipitation directe du polyoside. L'alcool utilisé est de préférence l'éthanol. On effec- tue la précipitation à l'alcool généralement à une température de 0 à +15'C environ. Cette précipitation préliminaire à l'alcool peut être remplacée par une précipitation avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de concentration suffisante pour précipiter le polyoside. Comme il a été indiqué ci-dessus, le produit de départ a été soumis à une concentration préalable après lyse du milieu de culture et élimination des débris de culture cellulaire par clarification. Pour réaliser cette concentration on opère de préférence par ultrafiltration. Le facteur de concentration peut varier de 4 à 15 environ, suivant le volume et la viscosité du surnageant à concentrer. L'ultrafiltration est réalisée par exemple à l'aide de membranes retenant les substances de poids moléculaire supérieur à 10.000. Il est également possible d'uti- liser des membranes qui retiennent les substances de poids moléculaire supérieur à 50.000, ou supérieur à 100.000. Selon un mode de réalisation préféré, pour obtenir la -7- 2495939 solution de polyoside de départ, on effectue la culture de Streptococcus pneumoniae en milieu semi-synthétique exempt de protéines. La culture comporte de préférence trois étapes de préculture de 3-4 heures chacune. L'utilisation d'un milieu semi-synthétique pour une culture industrielle de Streptococcus pneumoniae n'avait jamais été réalisée. Elle permet de simplifier les purifications ulté- rieures en évitant l'addition de protéines étrangères difficiles à éliminer. Les précultures liquides et la culture industrielle sont effectuées en milieu semi-synthétique. Pour la culture en grand fermenteur, il est avantageux de prévoir une régulation du pH et une addition de glucose automatiques. Le pH est, suivant les cas, régulé entre 6,0 et 7,4 environ par addition de soude 5N ou de toute autre solution alca- line. Afin d'obtenir un taux optimal en polysaccharide, il y a lieu d'arrêter- la culture après complet développement des corps microbiens, soit environ après 12-18 heures à température de 37+ 0,20C. En fin de cycle, la culture est stérilisée par exemple par addition d'une faible quantité de phénol (par exemple 0,5%) et les germes sont lysés par addition d'un agent lysant tel que le désoxycholate de sodium. Pour la culture on utilise comme milieu de base, le milieu suivant: Hydrolysat acide de caséine 22,230g - L Cystine 0,166g - L Tryptophane 0, 022g - L tyrosine 0,220g - Phosphate bipotassique K2H PO4 5,560g - Eau distillée q.s.p lOOOml Le pH est ajusté à 7,6 par addition de soude. Le milieu complet utilisé pour effectuer la deuxième préculture et les suivantes ainsi que la culture industrielle correspond à la formule suivante: - milieu de base 900m1 - solution de glucose à 50% 25ml solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance 50ml -8- 2495939 - solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique ml. Le pH est ajusté à 7,6. La solution de glucose à 50% est préparée par dis- solution de 50g de glucose anhydre dans 10Oml d'eau distillée. On stérilise pendant 30 minutes à 120 C. La solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance a la formule suivante: - solution de vitamines 200ml - solution de sels 40ml L-Glutamine 12,5g - Asparagine 2 g - Chlorhydrate de choline 0,2g - eau distillée q.s.p 1000ml Cette solution filtrée stérilement est conservée à + 4 C. La solution de vitamines peut avoir la composition suivante: Biotine 0,15mg - Ac. Nicotinique 10Omg - Pyridoxal 100mg - Calcium pantothenate 500mg - Thiamine 100mg - Riboflavine lOOmg - Adenine sulfate 0l00mg - Uracil 1000lmg - Eau distillée froide qsp 1000ml La solution de sels a la formule suivante: - Sulfate de magnésium Mg S04,7H O20 250g Sulfate ferreux Fe S047H20 2,5g - Sulfate de zinc Zn S047H O 0,400g Sulfate de manganèse Mn SO4, H 0 0,180g - Acide chlorhydrique 10ml - Eau distillée q.s.p 1000ml La solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique a la formule suivante: - bicarbonate de sodium 40g - acide thioglycolique 10% 40ml - eau distillée q.s.p 1000lml On donne ci-après le schéma d'une technique de culture: -9- 2495939 Préculture I On ensemence des boites de gélose à 5% de sang de cheval avec le Streptococcus pneumoniae choisi lyophilisé. On dilue le contenu de l'ampoule lyophilisée avec lml de bouillon trypticase soja et on répartit à la surface des boites de Pétri. On place à l'étuve pendant 16-17 heures à 36 C. Préculture II Dans des récipients contenant 45ml de milieu de base on ajoute stérilement 1,25ml de la solution de glucose à 50%, 2,50m]. de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance et 1,25ml de la solution de bicarbonate et d'acide thioglyco- lique. On ensemence à partir du produit de la préculture I et on cultive à 360C pendant 3 à 4 heures sous agitation lente. Préculture III Dans un flacon de 51 renfermant 2,4 litres de milieu de base, on ajoute 60ml de la solution de glucose, 120ml de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance et ml de la solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique. On ensemence avec 500ml de la préculture II, puis on cultive pendant 3 à 4 heures en agitant à 360C. Culture proprement dite On utilise 361 de milieu de base stérilisés que l'on sature en gaz carbonique. On ajoute à ce milieu de base 1 litre de la solution de glucose, 21 de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance, et 1 litre de la solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique. On ramène le pH à 7,6 avec de la soude 5N. On cultive à température de 360C, en agitant, sans aération, de préférence sous gaz inerte ou sous gaz carbonique, le pH étant régulé entre 6,0 et 7,4 avec de la soude 5N. Au bout de 8 heures de culture environ, on ajoute le mélange suivant: - 1 litre de la solution de glucose à 50% - 0,3351 d'une solution d'acétate d'ammonium à 46,2g% Arrêt de la culture L'arrêt de la culture est fonction de la lyse des germes: a) lyse naturelle: elle survient au bout de 60 à 96 heures de culture et on peut la suivre par l'examen microscopique -io2495939 de la morphologie des germes; b) lyse provoquée au bout de 12-17 heures de culture: à la culture refroidie et transvasée dans un récipient, on ajoute sous agitation 10% d'une solution de désoxycholate de sodium à 10%, soit une concentration finale de 1%. On agite pendant 30 minutes. - Clarification Pour éliminer les débris cellulaires, on effectue une centrifugation et on récupère le surnageant clarifié. Comme il a été indiqué ci-dessus, les polyosides purifiés de Streptococcus pneumoniae permettent de réaliser des vaccins. L'invention a également pour objet un vaccin pneu- mococcique contenant au moins un poiyoside purifié selon le procédé décrit dans la présente demande. Uin exemple de réalisation et d'utilisation d'un tel vaccin est donné ci-après dans la partie expérimentale. Un vaccin pneumococcique monovalent est constitué par dissolution d'un polyoside purifié dans un soluté isotonique tamponné. Un vaccin pneumococcique polyvalent est constitué d'au moins 2 polyosides purifies dissous dans un soluté isotonique tamponné. On sait que l'on peut distinguer plusieurs types sérologiques de Streptococcus pneumoniae, qui sont répertoriés selon la nomenclature rappelée dans le Tableau I ci-après. -11- TABLEAU I ! TYPE Nomenclature danoise j Nomenclature américaine I I 6 A 6 B 7 F 9 N 12 A 12 F 18 C 19 F 23 F -12- Dans la ?resente Uemande, on a utilise la nomenclature Oanoise. Or. donne ci-apres des iodes ' execution non linitatif s au proceue Be l'invention pour certalns poLyosides particuliers- as - Procide ie purification d'un polyoside de Streptococ- cus pneu.oniae du type 1. 4, 5, 12 F, 1 C, 23 F ou 25, carac- terise par le fait qu'aprés lyse, clarification et concentration, on ajoute d'aLord à laaite solution aqueuse de départ un alcool miscible A l'eau en quantites croissantes pour précipiter d'abord lu des irapuretus, puis apres élimination de celles-ci, pour pré- cipiter le polyosice,,ue l'on redissout le précipité de polyo- side et som.et la solution obtenue au traitement avec un phénol pour reauire la teneur en protéines, et que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'elimination des contaminants nucluiques par précipitation fractionne avec un alcool en presence d'ions calcium puis par le traitement au charbon actif - Proceae de purification d'un polyoside de Strep- tococcus pneumoniae du type 2, 6A, 6 B ou 19 F, caractGrisé par le fait qu'apres lyse, clarification et concentration, on ajoute d'abord a ladite solution aqueuse de départ un alcool miscible à l'eau en quantités croissantas pour précipiter d'abord des lmpuretes, puis aprèe élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le precipite de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour À5 réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en presence d'ions calcium. - Procédé de purification d'un polyoside de Strep- tococcus pneumoniae du type 7 F, 9 N, 12 A ou 14, et selon la revendication 17, caractârise par le fait qu'après lyse, cla- rification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible a 1'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés puis, après élimination de 3S celles-ci, pour prècipiter le polyoside, que l'on dissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au trai- tement avec un pnenol pour réduire la teneur on protéines, puis que li 'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d 'ê- limination des contaminants nucléiques par le charbon actif. - Procédé de purification d'un polyoside de Strep- tococcus pneumoniae du type 3 ou 8, caractérise par le fait qu'apres lyse, clarification et concentration, on ajoute A ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible a l'eau en quantité suffisante pour précipiter directement le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protAines, puis que l'on soumet la phase atueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par le charbon actif. - Procéde de purification d'un polyoside de Strep- tococcus pneumoniae du type 6 B, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute A ladite solution aqueuse du polyoside, en présence d'ions calcium, un aloool miscible a l'eau en quantité suffisanto pour précipiter les contaminants nuoléiques, on élimine le précipité et ajoute a nouveau ledit alcool en quantite suffisante pour préclpiter le polyoside, que l'on rodissout le précipité de polyoside puis que l'on soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour rduire la teneur en protéines. L'invention a également pour objet un procé6dé de purification presentant tout ou partie des caractéristiques des procedes décrits dans les exemples non limitatifs suivants. Dans ces exemples l'acetate de sodium utilisé est l'acetate ae sodium hydraté Acta, 3H20. L'acide acetique utilis, est l'acide acétique pur ajpele acide acetique glacial. On rappelle que l'eau physiologique est une solution aqueuse apyrogâne de chlorure de sodiuma a 8g/1. D'une façon générale, pour les précipitations à l'étha- nol, on utilise de l'ethanol pre-refroidi a -20 C afin d'é- viter une augmentation notable de température due a la disso- lution de l'êthanol. XkLMPLk; Nel: Purification du polyoside pneumaococcique type 1 3b Stade 1: Culture Precultures lere préculture; -13- -14- 2495939 A partir de germes lyophilisés on ensemence des boîtes de Roux de 2 1 renfermant de la gélose à 5% de sang de cheval. On laisse incuber 16h à 360 C + 1, de préférence en atmosphère humide et sous gaz carbonique. 2ème préculture: Apres un contrôle de pureté on ensemence, avec la suspension obtenue à partir de ces 6 boites de gélose, 6 erlens renfermant 500ml de milieu complet. On cultive pendant 2 à 2h30mn à 36 C + 1 avec une agitation modérée, 3ème préculture: On utilise à ce stade soit un fermenteur soit un récipient comportant un système permettant une légère agitation de l'ordre de 50 rpm. Apres un contrôle de pureté, on transfère la culture obtenue à partir des erlens dans 12 1 de milieu complet frais et on laisse incuber à 36 C + 1 pendant 3 à 3h30mn. Culture On utilise un fermenteur de capacité utile de 200 1 comportant une agitation de type Vortex. Apres la stérilisation du milieu et l'introduction des facteurs de croissance, on procède à un balayage par du gaz car- bonique jusqu'à stabilisation du pH à 6,2 + 0,2. On ramène le pH à 7,6 avec de la soude sN et on ensemence à raison de 6% d'inocu- lum. On maintient la culture à 36 C + 1 sous une agitation de 600 rpm avec une régulation de pH à 6,8 avec de la soude 5N. Au bout de 8h de culture on procède à une addition de glucose et d'acé- tate d'ammonium à raison respectivement de 12,50g et 4g par litre de milieu. Au bout de 16h de culture on vérifie la pureté et l'identité de la culture puis on procède à la lyse des germes par addition de 1% d'une solution de desoxycholate de sodium à 10%. Apres une demi-heure de contact sous agitation on vérifie que la lyse est totale. On ajoute 0,5% de phénol aqueux puis on centrifuge. Le surnageant est collecté dans une cuve préalablement stérilisée et refroidie. Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique Concentration Le surnageant de culture (3 x 200 litres) préparé comme précédemment décrit est concentre, lavé avec 3 x 60 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré par ultra- filtration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de -15- 2495939 substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10000 (type Amicon ou Romicon). Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée (110 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5% (poids/ volume). Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale d'alcool comprise entre 15 et 35% (préféren- tiellement 20%). L'agitation est poursuivie pendant 20 minutes à + 4 C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35000 rpm à + 4 C. La concentration en acétate de sodium du surnageant alcoolique (153 litres) est amenée à 5g% (poids/volume) et le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique glacial. On ajoute, sous agitation, de l'éthanol absolu déshy- draté pré-refroidi à -20 C jusqu'a une concentration finale en alcool de l'ordre de 40-65% (préférentiellement 44,4%). Apres une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,8 avec l'acide acétique. Le mélange est laissé au repos à +4 C pendant 16 heures, le précipité est alors recueilli par décan- tation et centrifugation à 4200 rpm, à + 4 C. Il constitue le polyoside brut. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (1900g poids humide) est mis en solu- * tion dans environ 40 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,2 à 0,4 volume (préférentiel- lement 0,33 volume) du mélange phénol-tampon acetate de sodium 0,3M pH 6,9 (1: 0,4 vol/vol). Apres agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur on soumet l'émulsion obtenue à une ultracentrifu- gation à 35000 rpm, à + 14 C. La phase aqueuse contenant le polyoside est à nouveau soumise à un deuxième traitement phéno- lique. Le processus est recommence, si nécessaire, jusqu'à ce que la phase aqueuse contienne moins de 5g% de protéines (géné- ralement 2 cycles sont suffisants). Le dosage des protéines est effectué selon la technique de Lowry et coll., J; Biol. Chem. 143, 265 (1951). La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4 C pour éliminer le phénol -16- 2495939 résiduel. Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée A la solution dialysée obtenue au stade 3 (44,7 litres) on ajoute lentement 6,4 litres d'une solution aqueuse de CaCl2 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lente- ment, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une concentration finale comprise entre 10 et 30% (préférentiellement %). L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à + 40C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 30000 rpm à + 40C. La concentration éthanolique du surnageant est, sous agitation vive, amenée à une valeur comprise entre 40 et 60%, généralement 44,4%. Après 30 minutes d'agitation, la solution est laissée - au repos à + 40C pendant 16 heures puis centrifugée en continu à 15000 rpm, à + 40C. Le précipité ainsi obtenu (430g poids humide) est remis en solution dans 40 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M. b) Traitement au charbon actif On ajoute rapidement, sous agitation, à la solution polyosidique le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9, pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 8g% (préférentiel- lement 3g%). Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à +40C. Le charbon est ensuite éliminé par filtration. Le filtrat est dialysé contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 40C. Stade 5 Obtention du polyoside purifié A la solution polyosidique dialysée (57 litres) on ajoute 3420g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi à -200C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale comprise entre et 65% (préférentiellement 44,4%). Après 30 minutes d'agita- tion, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 et la solution est laissée au repos à + 40C pendant 16 heures. Le polyoside est -17- 2495939 récupéré par décantation et centrifugation à 4200 rpm à + 40C. Le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu prérefroidi à -200C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à 2 lavages successifs par 3 x 500ml d'acétone pré-refroidi à -20 C et par 3 x 500ml d'éther éthylique pré- refroidi à -200C. On filtre sur verre fritté de porosité 5. Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché sous vide durant une nuit à 00C. Le polyoside déshydraté est réduit en poudre. On obtient ainsi 80g de polyoside purifié type 1. EXEMPLE N02: Polyoside pneumococcique type 4 Stade 1: Culture Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant sont analogues à celles décrites dans l'exemple n'l, exception faite de la régulation pH qui est réalisée à un pH égal à 7,2 + 0,2. Stade 2: Purification préliminaire Concentration Le surnageant de culture (600 litres) est réduit à un volume d'environ 50 litres et lavé plusieurs fois par dilution- concentration avec 100-200 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette opération est réalisée par filtration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10000. Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors à nouveau concentré par ultrafil- tration. Le facteur de concentration dépend du volume et de la viscosité du surnageant initial, il est compris généralement entre 4 et 15. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée (47 litres), on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 6% (poids/ volume). Le pH est ajusté à 5,40 par l'acide acétique et on ajoute lentement, sous agitation vive, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une concentration finale en alcool com- prise entre 30 et 50% (préférentiellement 37,5%) Après 30 minutes d'agitation à + 40C, le mélange est ultracentrifugé. La concentration en acétate de sodium du surnageant (73 litres) est amenée à 7,5g% et le pH ajusté à 5,80 par l'acide -18- 2495939 acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 60-80% (préférentiellement 75%). Au bout d'une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 avec l'acide acétique et le mélange est laissé au repos à + 4 C pendant 16-18 heures. Le surnageant est éliminé par décantatiorn et le précipité de polyoside brut récu- péré par centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (530g poids humide) est mis en solution dans environ 20 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,2 à 0,5 volume, géné- ralement 0,25 volume, du mélange phénol-tampon acetate de sodium 0,3M, pH 6,9 (1: 0,4 vol/vol). Après agitation vive pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, le mélange est ultracentrifugé comme à l'exemple 1. La phase aqueuse contenant le polyoside est soumise à un deuxième cycle de traitement phénolique. Le processus est recommencé, si néceszaire, jusqu'à l'obtention d'une solution polyosidique contenant moins de 5g% de protéines. La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4 C. Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée A la solution dialysée obtenue au stade 3 (18,5 litres) on ajoute lentement 2,65 litres d'une solution de CaC12 4M. Après i5 minutes d'agitation à + 4 0C, on ajoute lentement, sous agi- tation vive. de l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une concentration finale comprise entre 15 et 35% (préférentiellement 25%). L'agi- tation est poursuivie pendant 30 minutes à +4 C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35000 rpm, à + 4 C. La concentration en éthanol du surnageant est, sous agitation, amenée à une valeur comprise entre 60 et 80%, géné- ralement 75. Après une demi-heure d'agitation le mélange est laissé au repos à +40C pendant 16 heures. Après décantation, le précipité est récupéré par centrifugation à 420U rpm à + 4 C puis dissous dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9 (8 litres). b) Traitement au charbon actif A la solution polyosidique on ajoute rapidement, sous -19- 2495939 agitation, le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans du chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9 pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 5g% (préférentiellement 0,5%). Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à + 40C. Le charbon est ensuite éliminé par filtration. Le filtrat est dialysé contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 40C. Stade 5 * Obtention du polyoside purifié A la solution obtenue après dialyse (11 litres) on ajoute 1320g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,40 par addition d'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi à - 200C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique comprise entre 60 et 80% (préférentiellement 75%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 + 0,1 et la solution est laissée au repos à + 40C pendant 16-18 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centrifugation. Il est mis en suspension par agitation manuelle dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -200C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à 2 lavages successifs par 3 x 300ml d'acétone pré-refroidi à -20'C et par 3 x 300 ml d'éther éthylique pré-refroidi à -200C. On filtre sur verre fritté de porosité 5. Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché à 00C et réduit en poudre. On obtient ainsi 64g de polyoside purifié type 4. EXEMPLE N03: Polyoside pneumococcique type 5 Stade 1: Culture Les conditions de culture et de préparation du sur- nageant de culture sont identiques à celles utilisées pour la préparation du polyoside pneumococcique type 4 (exemple 2). Stade 2: Purification préliminaire Concentration Le surnageant de culture (43 litres) est concentré, lavé avec 3 x 12 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré par ultrafiltration de façon à retenir les substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10000. Le facteur de concentration varie de 4 à 10 suivant le volume et la -20- 2495939 viscosité du surnageant initial. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée (8 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g% (poids/volume). Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale comprise entre 15 et 40%. L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à 4- 40C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35000 rpm à + 4"C. La concentration en acétate de sodium du surnageant alcoolique (11,1 litres) est amenée à 7,5g% et le pH est ajusté à ,8-6,0 par addition d'acide acétique. On ajoute, sous agitation, un volume d'éthanol per- mettant la précipitation complète du polyoside (concentration finale comprise entre 40 et 80%). Après une demi-heure d'agi- tation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 + 0,2 avec l'acide acétique glacial. Le mélange est laissé au repos à + 40C pendant environ 24 heures. Le précipité de polyoside brut est recueilli par décantation et centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (400g poids humide) est mis en solution dans environ 3 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6, 9. A cette solution est ajouté 0,2 à 0,6 volume du mélange phénol-tampon acétate de l'exemple 1. Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, on soumet la dispersion à une ultracentrifugation comme à l'exemple 1. La phase aqueuse contenant le polyoside est à nouveau soumise à un deuxième traitement phénolique. Le processus est éventuellement recommencé jusqu'à l'obtention d'une solution polyosidique contenant moins de 5g% de protéines. La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 40C pour éliminer le phénol résiduel. Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée A la solution dialysée obtenue au stade 3 (2,1 litres), on ajoute lentement 0,3 litre de solution aqueuse de CaCl2 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une concentration finale comprise entre 10 et 35%. L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à + 40C puis le mélange est ultra- -21- 2495939 centrifugé à 10000 rpm pendant 20 minutes à + 40C. On dilue le surnageant avec un à deux volumes d'éthanol pour précipiter complètement le polyoside. Le mélange est laissé au repos pendant environ 24 heures à + 40C puis on recueille le précipité par centrifugation. b) Traitement au charbon actif Le précipité (2g) est mis en solution dans 0, 6 litre de tampon NaCl 0,14 M pH 6,9 + 0,2 puis on ajoute rapidement sous agitation le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans une solution de chlorure de sodium 0,14 M pH 6,9 pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g%. Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à + C. Le charbon est éliminé par centrifugation et/ou par filtration. Le filtrat est dialysé contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 40C. Stade 5 * Obtention du polyoside purifié La concentration en acétate de sodium de la solution dialysée obtenue précédemment est amenée à une valeur comprise entre 6 et 12g% (poids/volume) et le pH est ajusté à 5,45,8 par l'acide acétique glacial. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi à -200C permettant la précipitation complète du principe actif. (concentration finale en alcool comprise entre 40 et 80%). Après une demi-heure d'agi- tation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 avec l'acide acétique et la solution est laissée au repos à + 40C pendant 24 à 48 heures. Le polyoside est récupéré par ultracentrifugation en continu à 35000 rpm, à + 40C. Le précipité est mis en suspension dans de l'éthanol absolu pré-refroidi à -200C puis centrifugé à 4200 rpm à +40C. Cette opération est recommencée une fois puis le précipité est lavé successivement par l'acétone et l'éther, comme décrit aux exemples précédents. Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché bous vide à 00C. Le polyoside purifié est réduit en poudre. -22- 2495939 EXEMPLE N 4: Polyoside pneumococcigue type 12 F Stade 1: Culture Les conditions expérimentales de culture et de prépa- ration du surnageant sont analogues à celles décrites dans l'exemple n l, exception faire du pH qui est régulé à 7,2-7,4 avec la soude 5N. Stade 2: Purification préliminaire du polvoside pneumococcique Concentration Le surnageant de culture (2 x 220 litres) préparé comme précédemment décrit est concentre, lavé avec 2 x 60 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré, par ultra- filtration, comme décrit à l'exemple 1, stade 2. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée (91 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5,2% (poids/volume). Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol, jusqu'à une concentration finale d'alcool comprise entre 15 et 35% (préférentiellement 25%), puis on centrifuge. La concentration en acétate de sodium (AcNa, 3H20) du surnageant (131 litres) est amenée à 6,9g% (poids/volume) et le ph est ajusté à 5,8 par l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 45-75% (préférentiellement 56,5%). Apres une demi-heure d'agitation, le mélange est laissé au repos à + 4 C pendant 16 heures; le précipité est alors recueilli par centrifugation. Il constitue le polyoside brut. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (1100g poids humide) est mis en solution dans environ 50 litres de tampon acetate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,4 volume (préféren- tiellement 0,25 volume) du mélange phénol-tampon acetate de l'exemple 1. Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, on soumet la dispersion à une ultracentrifu- gation. Le processus est recommencé plusieurs fois, si néces- saire, jusqu'à l'obtention d'une phase aqueuse contenant moins de g% de protéines (généralement 1 ou 2 cycles sont suffisants). La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau -2 3- 2495939 déminéralisée. Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée A la solution dialysée (60,4 litres) on ajoute lente- ment 8,6 litres d'une solution aqueuse de CaC12 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentement, sous agi- tation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale comprise entre 10 et 35% (préférentiellement 20%). L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à + 40C puis le mélange est ultracentrifugé. La concentration éthanolique du surnageant est amenée entre 45 et 70%, généralement 56,5%. Après 30 minutes d'agitation, la solution est laissée au repos à + 40C pendant 16 heures puis centrifugée. Le précipité ainsi obtenu est remis en solution dans 50 litres d'une solution de chlorure de sodium 0,14M pH 6,9. b) Traitement au charbon actif On opère comme à l'exemple 1, stade 4b, avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 8g% (préférentiellement 2g%)6 Stade 5: Obtention du polyoside purifié A la solution polyosidique dialysée (70 litres) on ajoute 6400g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol suffisant pour obtenir une concentration alcoo- lique finale comprise entre 45 et 75% (préférentiellement 56,5%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 et la solution est laissée au repos à + 40C pendant 16 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centri- fugation. Le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu prérefroidi à -200C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1. On obtient ainsi 76g de polyoside purifié type 12 F. EXEMPLE N05: Polyoside pneuinococcique type 18 C Stade 1: Culture Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant de culture sont analogues à celles -24- 2495939 utilisées à l'exemple 2. Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique Concentration Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 35 litres, lavé avec 3 x 40 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à 60 litres par ultrafiltration sur Amicon H10 P10. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée, on ajoute 3000g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,40 avec l'acide acétique. De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 20- % (préférentiellement 28,5%) et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,14g%, le pH est ajusté à 5,80 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50- % (préférentiellement 63,6%). Apres une demi-heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,8 avec l'acide acétique. Le précipité est ensuite recueilli par centrifugation. Il constitue le polyoside brut. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (1143g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,33 volume) du mélange phénol-acetate de l'exemple 1 stade 3, et on opère comme à l'exemple 1. Stade 4: Elimination des acide nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée A la solution dialysée (26,1 litres) on ajoute len- tement, sous agitation, 8,7 litres d'une solution de chlorure de calcium 2M. On effectue ensuite la double précipitation à l'étha- nol, comme à l'exemple 1, stade 4a, d'abord avec une concen- tration en alcool de 15-35% (préférentiellement 25%), puis de 45- %, généralement 63,6%. b) Traitement au charbon actif Le précipité (400g poids humide) est dissous dans 40 litres de chlorure de sodium 0,14M et on opère ensuite comme à l'exemple 1, stade 4b, avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 10g% (préférentiellement 2g%). -25- Stade 5: Obtention du polyoside purifié A la solution dialysée (51 litres) on ajoute 2560g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acé- tique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-80% (préférentiellement 63,6%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,6-6,8 avec l'acide acétique et le mélange est laissé au repos 16 heures à + 40C. Le précipité est récupéré par décantation et centrifugation puis mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -200C. Après centrifugation, le processus est recommencé une fois. On procède ensuite -à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1. On obtient ainsi 108g de polyoside purifié type 18C. EXEMPLE N06: Polyoside pneumococcique type 23 F Stade 1: Culture Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant de culture sont identiques à celles de l'exemple 2. Stade 2: Purification préliminaire Concentration Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à un volume d'environ 80 litres, lavé plusieurs fois par dilution- concentration avec 240 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré (facteur de concentration = 5,6). Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration respectivement sur Ailicon type H]0 PIO et sur Romicon PM 10. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée (71,4 litres) on ajoute 3570g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique. De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 17- 37% (préférentiellement 28%), et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,20g%, le pH est ajuste à 5,90 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-75% (préférentiellement 60%). Après une demi-heure d'agitation à + 40C, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80. Le précipité est ensuite récupéré -26- 249593v par centrifugation. Il constitue le polyoside brut. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (500g poids humide) est mis en solution dans 42 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préfé- rentiellement 0,2 volume) du mélange phénol-tampon acétate de so- dium et l'on opère comme à l'exemple 1, stade 3. Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a. A la solution polyosidique obtenue après dialyse (56 litres) on ajoute 7, 9 litres de solution CaC12 4M. On effectue ensuite le fractionnement à l'éthanol, avec une concentration en alcool de 10-35'o (préférentiellement 25%), puis de 50-75% (géné- ralement 60%). Le précipité (350g poids humide) est récupéré par centrifugation puis dissous dans 36 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M pH 6,9. b) Traitement au charbon actif De façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on traite la solution obtenue au charbon actif avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 10g% (préférentiellement 1,5%), puis on élimine le charbon et on dialyse. Stade 5: Obtention du polyoside purifié A la solution obtenue après dialyse (47,7 litres) on ajoute 5700g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une con- centration finale de 50-70% (préférentiellement 60%). Après 30 minutes d'agitation, et repos à + 40C pendant 16-18 heures, le précipité est recueilli par centrifugation, puis mis en sus- pension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20'C et centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1. On obtient ainsi 100g de polyoside purifié type 23 F. EXEMPLE Nc7: Polyoside pneumococcique type 25 Stade 1: Culture Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1, exception faite de la régulation du pH qui est -27- réalisée à un pH égal à 7,2 + 0,2. Stade 2: Purification préliminaire Concentration Le surnageant de culture (600 litres) est réduit à un volume d'environ 100 litres et lavé plusieurs fois par dilution- concentration avec 200 à 300 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette opération est réalisée par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10000 (typé Amicon ou Romicon). Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible * poids moléculaire est alors concentré à 96 litres par ultra- filtration. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5, 6g%. Le pH est ajusté à 5,70 par l'acide acétique. De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une con- centration de 20-35% (préférentiellement 28,5%), et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,14g%, le pH est ajusté à 5,80 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une con- centration finale de l'ordre de 40-70% (préférentiellement 62%). Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par ultracentrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (335gpoids humide) est mis en solution dans 48 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,2 à 0,5 volume (géné- ralement 0,29 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et l'on opère comme à l'exemple 1, stade 3. Stade 4: Elimination des acides nucléiques a) Précipitation alcoolique fractionnée On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a. A la solution dialysée obtenue au stade 3 (55,7 litres) on ajoute lentement 8 litres de CaCi2 4M. On effectue ensuite la double précipitation à l'éthanol, d'abord avec une concentration de 15-35% (préférenteiellement 30%), puis de 40-70% (généralement 62%). Après décantation, le précipité est récupéré par centrifu- gation puis dissous dans une solution aqueuse de chlorure de -28- 2495939 sodium 0,14M pH 6,9 (20 litres). b) Traitement au charbon actif De façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on traite la solution obtenue par le charbon actif en quantité comprise entre 0,1 et 8g% (préférentiellement 2g%), puis on élimine le charbon et on dialyse. Stade 5: Obtention du polyoside purifié A la solution obtenue après dialyse (27,76 litres), on ajoute 2760g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,80 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concen- tration de 40-70% (préférentiellement 62%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 + 0,1 et on laisse au repos à + 4 C pendant 16-18 heures. Le précipité est récupéré par décantation et centrifugation, mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20 C puis cen- trifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages successifs par l'acétone et par l'éther éthylique, puis on sèche, comme décrit à l'exemple 1. On obtient ainsi 35g de polyoside purifié type 25. EXEMPLE N 8: Polyoside pneumococcique type 2 Stade 1: Culture Les conditions expérimentales de fermentation sont celles décrites à l'exemple n 2. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation. Stade 2: Purification préliminaire Concentration Le surnageant de culture (200 litres) est concentré à litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré à 34,5 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 7,5g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 10-30% (préférentiellement 18%), et, après ultracentrifugation, jusqu'à une concentration finale de 45-65% -29- (préférentiellement 55,5%). Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par décantation et centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (690g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0,3 volume) du mélange phénol-tampcn acétate de sodium et on opère comme à-l'exemple 1, stade 3. Après dialyse, le principe actif est extrait de la solution par précipitation éthanolique (concentration finale=45- %) en présence d'acétate de sodium. Le précipité est récupéré par centrifugation (430g poids humide) et mis en solution dans 12 litres d'eau distillée stérile apyrogène. Stade 4: Elimination des acides nucléiques On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a. A la solution obtenue au stade 3 (12 litres) on ajoute lentement, sous agitation, 4 litres de solution de CaC12 2M. On effectue ensuite la double précipitation à l'éthanol, d'abord avec une concentration de 15- 35% (généralement 25%), puis, après ultracentrifugation, avec une concentration finale de 45-65% (préférentiellement 55,5%). Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation. Stade 5 Obtention du polyoside purifié Le précipité obtenu au stade 4 est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -200C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, et on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 69g de polyoside purifié. EXEMPLE N09: Polyoside pneumococcique type 6 A Stade 1: Culture Les conditions expérimentales de culture et de prépa- ration du surnageant sont identiques à celles décrites dans l'exemple nol, exception faite du pH qui est régulé à 7,2-7,4 avec la soude 5N. -30- Stade 2: Purification préliminaire Concentration Le surnageant de culture (2 x 200 litres) préparé comme précédemment décrit est concentré à 40 litres, lavé à l'eau phy- siologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré (volume fi- nal=33,6 litres), sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000 (type Amicon H10 P10). Le facteur de concentration varie de 4 à 15 suivant le volume et la viscosité du surnageant à ultrafiltrer. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g%. Le pH est ajusté à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 20- % (préférentiellement 27%), puis, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 8,75g%, le pH est ajusté à 5,6 par l'acide acétique, et l'on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 40-70% (préférentiellement 60%). Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (469g poids humide) est mis en solution dans 16 litres de tampon acetate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,25 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et cn opère comme à l'exemple 1, stade 3. Stade 4: Elimination des acides nucléiques On opère de façon analogue à l'exemple 1, stade 4a. Pour cela à la solution dialysée obtenue au stade 3 (18,2 litres) on ajoute lentement 6 litres de solution aqueuse CaC12 2M. Apres agitation on ajoute l'éthanol (concentration finale comprise entre 15 et 35%, généralement 25%) puis le mélange est ultracentrifugé, et on ajoute au surnageant de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 40-70% (préférentiellement %). Le précipité est récupéré par décantation et centrifu- gation. Stade 5: Obtention du polyoside purifié Le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20 C puis centrifugé comme -31- indiqué ci-dessus. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, et on sèche le précipité comme décrit à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 119g de polyoside purifié type 6A. EXEMPLE N010: Polyoside pneumococcique type 19 F Stade 1: Culture Les conditions expérimentales de fermentation sont celles utilisées à l'exemple n02. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation. Stade 2: Purification préliminaire Concentration Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 50 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré à 40,3 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une con- centration de 15-35% (préférentiellement.27%), et, après ul- tracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant recueilli est amenée à 7,3%, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 55-75% (préférentiellement 63,5%), et le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (427g poids humide) est mis en solution dans 16 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0,25 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et on opère comme décrit à l'exemple 1, stade 3. Stade 4: Elimination des acides nucléiques On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a. A la solution obtenue au stade 3 (18,9 litres) on -32- ajoute 2,7 litres de solution de CaC12 4M. On ajoute de l'éthanol (concentration finale en alcool comprise entre 15 et 35%, généralement 25%), et, après ultracentrifugation, on ajoute au surnageant de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 55- 75% (préférentiellement 63,5%), et le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation Stade 5: Obtention du poiyoside purifié Le précipité est mis en suspension dans trois litres d'éthanol absolu prérefroidi à -20 C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 120g de polyoside purifié, type 19 F. EXEMPLE N 11: Polyoside pneumlococcique type 7 F Stade 1: Culture Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple 1, stade 1, exceptions faites de la régulation pH (6,2-6,8) et de l'addition de glucose (addition toutes les - 2h30mn). Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique Concentration Le surnageant de culture (200 litres) est concentré, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000 (Type Amicon ou Romicon). Le facteur de concentration varie de 4 à 10 suivant le volume et la viscosité du surnageant à ultrafiltrer. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée (41 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 7g%. Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une con- centration de 35-55% (préférentiellement 45%), et, après ultra- centrifugation, la concentration en acetate de sodium du sur- nageant est amenée à 8,2g% et le pH est ajusté à.6,8 par l'acide acétique, puis on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de l'ordre de 60-80% (préférentiellement 75%). Apres une demi- heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,8 avec l'acide acétique glacial. Le mélange est laissé au repos à + 4 C pendant 16 -33- 2495939 heures, le précipité de polyoside brut est alors récupéré par centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (110g poids humide) est mis en solution dans environ 30 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,4 volume (préfé- rentiellement 0,15 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9 (1:0,4 vol/vol). Après agitation douce (manuelle ou magnétique) pendant environ 10 minutes pour créer l'émulsion, la solution phénolée est ultracentrifugée. La phase aqueuse contenant le polyoside est, si nécessaire, soumise à un deuxième traitement phénolique, mais généralement 1 cycle est suffisant. La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à i 40C pour éliminer le phénol résiduel. Stade 4: Elimination des acides nucléiques On ajoute rapidement, sous agitation, à la solution polyosidique dialysée (36 litres) le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans du chlorure de sodium 0, 14M pH 6,9 ou dans l'eau distillée apyrogène pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g% (préférentiellement 1,5g%). Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à + 40C. Le charbon est ensuite éliminé par filtration. Le filtrat est dialysé contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 40C. Stade 5: Obtention du polyoside purifié A la solution polyosidique dialysée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à l'obtention d'une concentration de g% et on ajuste le pH à 6,00 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi à -20'C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale de 60-80% (préférentiellement %). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,9 et la solution est laissée au repos à + 40C pendant 16 heures. Le polyoside est récupéré par centrifugation. Le précipité est mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu prérefroidi à -200C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus. -34- Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages successifs par l'acétone et par l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 20g de polyoside purifié type 7F. EXEMPLE N 12: Polyoside pneumococcique tpe 9N Stade 1: Culture Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple n 2, stade 1. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation. Stade 2: Purification _ réiminaire Concentration Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à litres, lavé à l'eau physiologique phénol!e à 0,5% puis à nouveau concentré à 42 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000. Précipitation alccolique fractionnée A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 6g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On opère coLmme à l'exem- ple 1, stade 2, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concen- tration de 20-40% (préférentiellement 33%), puis, après ultra- centrifugation, la concentration en acetate de sodium du sur- nageant est amenée à 6g%, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-65% (préférentiellement 55,5%). Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par décantation et centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (660g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acetate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0,3 volume) du mélange phénol-tampon acetate de sodium, et on opère comme à l'exemple 1, stade 3. Stade 4: Elimination des acides nucléiques On effectue un traitement au charbon actif, suivi d'une dialyse, en opérant de façon analogue à celle de l'exemple 1, stade 4b. On ajoute, à la solution polyosidique dialysée (30 -35- litres) obtenue au stade 3, la suspension de charbon actif Norit jusqu'à une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,2 et 8g% (préférentiellement 3,33%). Stade 5: Obtention du polyoside purifié A la solution obtenue au stade 4 (38 litres) on ajoute 3420g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-65% (préférentiellement , 5%). Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation, et mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à 200C puis centrifugé. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acé- tone et à l'éther éthylique, puis on sèche le précipité, comme à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 68g de polyoside purifié type 9N. EXEMPLE N013. Polyoside pneumococcique type 12 A Stade 1: Culture Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple 4. Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique Concentration Le surnageant de culture (40 litres) est concentré à 10 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à 9 litres par ultrafiltration à l'aide d'un système Amicon supportant 5 colonnes H10 P10. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée on ajoute 468g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,8 avec l'acide acétique. En opérant comme à l'exemple 1, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une con- centration de 15-35% (préférentiellement 25%), puis, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,1g%, le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 45-75% (préférentiellement 58,5%). Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le précipité précédemment obtenu (174g poids humide) est mis en solution dans 8 litres de tampon acétate de sodium -36- O,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 0,5 volume (préf éren- tiellement 0,5 volume) du mélange froid phénol-acétate de l'exem- ple 1, stade 3, et on opère comme à l'exemple 1. Stade 4: Elimination des acides nucléiques En opérant de façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse. A la solution dialysée obtenue au stade 3 (7,6 litres) on ajoute la suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 1 et 7g% (préférentiellement 3g%j. Stade 5: Obtention du polyoside purifié A la solution dialysée obtenue au stade 4 (9 litres) on ajoute 450g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concen- tration de 45-75% (préférentiellement 66,6%), et on ajuste le pH, si nécessaire, à 6,6-6,8. Le polyoside est ensuite récupéré par centrifugation, puis mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu prérefroidi à -20 C et centrifugé. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche le précipité, comme décrit à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 2g de polyoside purifié type 12 A. Le polyoside 12 A, ainsi obtenu, se distingue du polyoside type 12 F par l'absence de galactose dans sa compo- sition chimique. La détermination quantitative des hexosamines et des oses (glucose, galactose) a été effectuée, après hydrolyse ménagée, respectivement par dosage colorimétrique selon la technique de G. Ashwell, "Methods in Enzymology" 3 (1957) pages 95-97, S. P. Colowick & N. O. Kaplan, Eds. Academic Press, N. Y. et par dosage spectrophotométrique des co-enzymes réduits (NADH et NADPH) obtenus après action enzymatique de la galactose déshydrogénase pour le dosage du galactose et du système pluri- enzymatique hexokinase-glucose 6 phosphate déshydrogénase pour le dosage du glucose. Le polyoside type 12 A ainsi obtenu contient 33-38% d'hexosamines et 23-28% de glucose (poids/poids). EXEMPLE N 14: Polyoside pneumococcique type 14 Stade 1: Culture Les conditions expérimentales de fermentation sont analogues à celles utilisées à l'exemple 2, stade 1. Stade 2: Purification préliminaire du polyoside pneumococcique Concentration Le surnageant de culture (30 litres) est concentré, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à un volume égal à 9 litres, par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000 (type Amicon H10 P10). Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g%. Le pH est ajusté à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 15- % (préférentiellement 20%), et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 8g% et le pH est ajusté à 5,8, puis on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-70% (préférentiellement 60%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,6-6,8. Le mélange est laissé au repos à + 40C pendant 16 heures, le pré- cipité de polyoside brut est alors récupéré par centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (llOg poids humide) est mis en solution dans environ 4 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume rentiellement 0,3 volume) de mélange phénol-tampon acétate de sodium, et on opère comme à l'exemple 1, stade 3. Stade 4: Elimination des acides nucléiques En opérant de façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse. Pour cela la concentration en chlorure de sodium de la solution obtenue après dialyse au stade 3 (4,3 litres) est amenée à 0,14M puis on ajoute la suspension de charbon-actif Norit à 20g% pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g% (préférentiellement 3,6g%). Stade 5: Obtention du polyoside purifié A la solution dialysée (6 litres) obtenue au stade 4 on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration de 10g% et on ajuste le pH à 5,8 par l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 50-70% (préférentiellement %). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,8. Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation, mis en sus- -38- pension dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20 C puis centrifugé. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche le précipité, comme à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 4,4g de polyoside purifié type 14. EXEMPLE N 15: Polyoside pneumococcique type 3 Stade 1: Culture Les conditions expérimentales sont analogues à celles décrites dans l'exemple n l, stade 1, exception faite de la régulation pH qui est effectuée à un pH voisin de 7,2. Stade 2: Purification préliminaire Concentration Le surnageant de culture (200 litres) est réduit à un volume d'environ 80 litres et lavé plusieurs fois à l'eau physio- logique phénolée à 0,5%. Cette opération est réalisée par ultra- filtration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10.000. Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors concentré à 50 litres. Précipitation alcoolique directe A la solution concentrée on ajoute 2500g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une concentration finale de 15-40% 33,3%). Apres 30 minutes d'agitation, le mélange est laissé au repos pendant 16 heures à + 4 C. Le précipité est récupéré par centrifugation. Le précipité recueilli est remis en solution dans litres de tampon acétate de sodium 0,37M, pH 5,4, puis est à nouveau précipité par addition, sous agitation, de 0,15 à 0,7 volume (préférentiellement 0,5 volume) d'éthanol. Apres 30 minutes d'agitation et 16 heures de repos à + 40C, le précipité de polyoside brut est récupéré par centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (2180g poids humide) est dissous dans litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,2 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium, en opérant comme à l'exemple 1, stade 3. -39- Stade 4: Elimination des acides nucléiques Comme à l'exemple 1, stade 4b, on effectue un trai- tement au charbon actif suivi d'une dialyse. Pour cela la con- centration en chlorure de sodium de la solution obtenue au stade 3 après dialyse (115 litres) est amenée à 0,14M et on ajoute la suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g% (préféren- tiellement 4g%). Stade 5: Obtention du polyoside purifié A la solution dialysée (139 litres) obtenue au stade 4 on ajoute 6950g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concen- tration de 15-40% (préférentiellement 33,3%). Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation puis mis en suspension dans dix litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -200C. Après centrifugation, le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi. 235g de polyoside purifié type 3. EXEMPLE N016: Polyoside pneumococcique type 8 Stade 1: Culture Les conditions expérimentales sont analogues à celles décrites dans l'exemple n'1, stade 1 exception faite de la régulation pH qui est effectuée à un pH voisin de 7,2. Stade 2 Purification préliminaire Concentration Le surnageant de culture (400 litres) est réduit à un volume d'environ 60 litres et lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette concentration est réalisée par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10.000. Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors concentré à 51,5 litres. Précipitation alcoolique directe A la solution concentrée (51,5 litres) on ajoute 3090g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 par l'acide acé- tique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une concentration finale de 18-40% (préfé- rentiellement 33,3%). -40- Après 30 minutes d'agitation, le mélange est laissé au repos pendant 16 heures à + 4 C. Le précipité de polyoside brut est récupéré par décantation et centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (2260g poids humide) est dissous dans 32 litres de tampon acetate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,25 vo- lume) du mélange phénol-tampon acetate de sodium, en opérant comme à l'exemple 1, stade 3. En outre, après dialyse, le polyoside est extrait de la phase aqueuse par précipitation éthanolique en présence de 10g% d'acétate de sodium (pH=5,4), avec 0,15 à 0,7 volume (préféren- tiellement 0,37 volume) d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi *à -20 C. Stade 4: Elimination des acides nucléiques Le précipité du stade 3 (1400g poids humide) est mis en solution dans 27 litres de tampon de sodium 0, 14M pH 6,9. Sur cette solution on effectue un traitement au charbon actif, suivi d'une dialyse, comme à l'exemple 1, stade 4b, en ajoutant une suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 1 et 10g% (préférentiel- lement 10g%). Stade 5: Obtention du polyoside purifié A la solution obtenue au stade 4 après dialyse (27 litres) on ajoute 1350g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à ,4-5,6 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 18-40% (préférentiellement 33,3%), et, après centrifugation, le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20 C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 52g de polyoside purifié type 8. EXEMPLE N 17: Polyoside pneumococcique type 6 B Stade 1:Culture Les conditions expérimentales de fermentation sont analogues à celles décrites dans l'exemple 9, stade 1, exception faite de la durée de la culture qui est prolongée à 42 heures. La culture est alors stérilisée par le phénol et les germes entiers et les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation. -41- Stade 2: Purification préliminaire Concentration Le surnageant de culture (40 litres) est concentré à 10 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à 8,2 litres. Ces opérations sont effectuées par ultrafiltration sur fibres creuses Amicon type H10 PIO. Précipitation alcoolique fractionnée A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de cal- cium jusqu'à une concentration finale de 5g%, et le pH est ajusté à 5,4 avec l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 10- % (préférentiellement 25%), et, après ultracentrifugation, on ajoute au surnageant le volume d'éthanol nécessaire à la pré- cipitation complète du polyoside (concentration éthanolique finale comprise entre 45 et 70%, généralement 50%). Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par décantation et centrifugation. Stade 3: Déprotéinisation Le polyoside brut (40g poids humide) est mis en so- lution dans quatre litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préféren- tiellement 0,5 volume) du mélange phénol-tanpon acétate de sodium 0,3M pH 6,9 (1:0,4 vol/vol). Après agitation vigoureuse pendant secondes à l'aide d'un disperseur, le mélange est ultracen- trifugé. La phase aqueuse supérieure est récupérée puis soumise à un deuxième traitement au phénol froid. Le processus est recommencé au total 3 fois. La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 18 heures à + 40C. Stade 4: Obtention du polyoside purifié A la solution dialysée obtenue au stade 3 (5,2 litres), on ajoute 260g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir la précipitation complète du polyoside (concentration finale en alcool comprise entre 45 et % (préférentiellement 55,5%). Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation, puis mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu pré-re- froidi à -200C et centrifugé. Cette opération est recommencée une -42- 2495939 fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis séché comme à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 9g de polyoside purifié type 6 B. Remarque: Le polyoside pneumococcique type 6 B peut être éga- lement purifié selon les techniques décrites dans l'exemple 9. EXEMPLE N 18: Polvoside 7F Cet exemple illustre la purification finale par pré- cipitation du polyoside (7F) au sulfate d'ammonium. La solution de départ sur laquelle est effectuée la précipitation au sulfate d'ammonium est la solution dialysée obtenue après traitement au charbon actif, c'est-à-dire la solution obtenue à l'exemple 11 stade 4. La concentration en NaCl est amenée à 0,85g%. Le pH de cette solution est ajusté à 6,5 par l'acide acétique dilué et on ajoute lentement, sous agitation, le volume nécessaire d'une solution saturée de sulfate d'ammonium, ou la quantité de (NH4)2S04 suffisante pour obtenir une concentration finale en (NH4)2SO4 comprise entre 30 et 80g%, préférentiellement 74g%. Le mélange est laissé au repos (30 minutes à 4 heures) puis ultracentrifugé à 15.000 rpm pendant 30 minutes. Le précipité est récupéré et mis en solution dans environ 10 litres d'eau distillée apyrogène. Les sels résiduels sont éliminés par dialyse ou diafiltration. Le principe actif est ensuite récupéré par precipi- tation directe à l'éthanol en présence de sels de sodium comme décrit à l'exemple 11, stade 5. EXEMPLE N019: Réalisation et utilisation d'un vaccin Exemple de formule vaccinale - Polyoside purifié de Streptococcus pneumoniae................. .........50 microgrammes de chacun des 14 types suivants: 1, 2, 3, 4,..DTD: 6A, 7F, 8, 9N, 12F, 14, 18C, 19F, 23F, 25 - Soluté tamponné isotonique, q.s.p..... 0,5ml - Phénol (conservateur). au maximum 1,25mg Le soluté tamponné isotonique a la formule suivante: Chlorure de sodium.................... 4,15mg - Phosphate disodique (Na2HPO4, 2H20)... 0,065mg - Phosphate monosodique (NaH2PO4, 2H20). 0, 023mg - Eau pour préparations injectables.... 0,5ml Mode et voie d'administration Voie sous-cutanée ou intramusculaire. Exemple de posologie Adultes: 25 à 1OOpg de chaque polyoside en une seule injection. Enfants: 10 à 50pg de chaque polyoside en une ou plusieurs injections, à quelques semaines d'intervalle. Indications thérapeutiques Prévention de l'infection pneumococcique en fonction de l'épidémiologie. Elles concernent plus particulièrement: - les personnes âgées de plus de 50 ans d'une façon générale, - les bronchitiques chroniques, insuffisants respira- toires et tabagiques, - les patients fragilisés par une maladie chronique (insuffisance cardiaque, diabète, insuffisance hépatique ou rénale, cancer viscéral ou alcoolisme chronique), - les splénectomisés, - les enfants drépanocytaires homozygotes, - les personnes exposées aux méningites à pneumocoque en raison d'un traumatisme crânien avec fistule osteo-méningée ou d'une otite chronique, - et probablement les enfants sujets aux infections otitiques récidivantes ou atteints de syndromes néphrotiques. Contre-indications Par prudence, il convient de ne pas utiliser le vaccin antipneumococcique chez la femme enceinte. Il en est de même pour les personnes présentant une infection aigue en évolution, en particulier pneumococcique, pour les enfants de moins de 2 ans qui ne s'immunisent pas réguliè- rement contre plusieurs sérotypes souvent en cause dans l'in- fection pneumococcique à cet âge, et pour les personnes atteintes d'un déficit immunitaire (cancer - chimiothérapie) et en parti- culier d'une agranulocytose ou d'une aplasie médullaire. -44- 2495939 REVENDICATIONS 1. Procédé de purification d'un polyoside de Strepto- coccus pneumoniae, caractérisé par le fait que le produit de départ est une solution aqueuse dudit polyoside, contenant des impuretés protéiques, obtenue par lyse d'une culture de Strep- tococcus pneumoniae, clarification et concentration du polyoside, que, dans le but de réduire la teneur en protéines, l'on ajoute de 5 à 50% en volume de phénol,_ à température de 5 à 300C en- viron, que l'on agite, puis sépare et recueille la phase aqueuse, et que l'on répète, si nécessaire, le traitement au phénol jusqu'à ce que la teneur en protéines de la phase aqueuse soit inférieure à un seuil prédéterminé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on opère à température de 10 à 200C environ. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on ajoute le phénol sous la forme d'un mélange phénol-eau. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que ledit mélange est constitué par du phénol dans lequel l'eau est dissoute. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on effectue le trai- tement au phénol à un pH de 6,9 + 0,5 environ. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la solution de polyoside de départ est une solution tamponnée. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'on ajoute le phénol sous la forme d'un mélange phénol- solution tamponnée. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé par le fait que l'on ajoute de 10 à 60% vol/vol dudit mélange. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit seuil correspond à une teneur en protéines de 5% en poids. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on soumet la phase aqueuse recueillie à une dialyse pour éliminer le phénol ré- - siduel. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 0 précédentes, caractérisé par le fait qu'en outre, on ajoute à la solution de polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité puis on ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que l'on effectue la précipitation fractionnée à l'alcool en présence d'ions calcium après le traitement au phénol. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 et 12, caractérisé par le fait que ledit alcool est l'éthanol. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé par le fait que l'on effectue la préci- pitation fractionnée à l'alcool à une température de 0 à +15'C environ. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications Il à 14, caractérisé par le fait que l'on ajoute l'alcool jusqu'à une concentration de 10 à 35% environ (vol/vol) pour précipiter les contaminants nucléiques, puis que l'on ajoute encore de l'alcool au surnageant jusqu'à précipitation complète du po- lyoside. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications il à 15, caractérisé par le fait que l'on opère en présence d'ions calcium à une molarité de 0,25-2M environ. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on soumet en outre la solution à purifier à un traitement au charbon actif en quantité suffisante pour éliminer la majeure partie des contaminants nucléiques, puis que l'on élimine le charbon actif. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que l'on ajoute de 0,1 à 12% 19.-Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisé par le fait que, si la teneur en acides nucléiques du polyoside est supérieure à 1 ou 2% en poids après la précipitation fractionnée à l'alcool, on remet en solution le précipité de polyoside et le soumet à un traitement au charbon actif selon l'une quelconque des revendications 17 et 18. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification -46- 2495939 et concentration l'on ajoute un alcool miscible a l'eau à une solution aqueuse de polyoside à purifier, de façon à précipiter le polyoside, puis que l'on remet le précipité en solution pour obtenir la solution aqueuse de polyoside de départ. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé par le fait que l'on ajoute l'alcool en quantités croissantes de façon à précipiter d'abord des impuretés avant de précipiter le polyoside. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé par le fait que le polyoside est précipité directement par addition d'une quantité suffisante d'alcool. 23. Proc"édé selon l'une quelconque des revendications à 22, caractérisé par le fait que la précipitation à l'alcool est effectuée en présence d'un sel dissous. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ladite concentration est effectuée par ultrafiltration, le facteur de concentration étant de 4 à 10 environ. 25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé par le fait que l'ultrafiltration est réalisée à l'aide de membranes retenant les substances de poids moléculaire supérieur à 10.000. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé par le fait que lesdites membranes retiennent les substances de poids moléculaire supérieur à 50.000 ou supérieur à 100.000. 27. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la culture de Strep- tococcus pneumoniae est effectuée en milieu semi-synthétique exempt de protéines, sans aération sous gaz inerte ou sous gaz carbonique, avec régulation de pH et addition des métabolites automatiques. 28. Procédé de purification d'un polyoside de Strep- tococcus pneumoniae du type 1, 4, 5, 12 F, 18 C, 23 F ou 25, selon les revendications 12, 19 et 23, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute d'abord à ladite solution aqueuse de départ un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés, puis après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, et que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par pré- cipitation fractionnée avec un alcool en présence d'ions calcium puis par le traitement au charbon actif. 29. Procédé de purification d'un polyoside de Strepto- coccus pneumoniae du type 2, 6 A, 6 B ou 19 F, selon la reven- dication 12, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute d'abord à ladite solution aqueuse de départ un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés, puis après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au trai- tement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'éli- mination des contaminants nucléiques par précipitation frac- tionnée avec un alcool en présence d'ions calcium. 30. Procédé de purification d'un polyoside de Strep- tococcus pneumoniae du type 7F, 9N, 12A ou 14, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, et selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour pré- cipiter d'abord des impuretés puis, après élimination de celles- ci, pour précipiter le polyoside, que l'on dissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par le charbon actif. 31. Procédé de purification d'un polyoside de Strep- tococcus pneumoniae du type 3 ou 8, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, et selon la revendication 17, caractérisé par'le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter directement le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléi- ques par le charbon actif. 32. Procédé de purification d'un polyoside de Strep- tococcus pneumoniae du type 6B, selon l'une quelconque des -48- 2495939 revendications I à 10 et selon la revendication 11, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité et on ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside puis que l'on soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines. 33. Vaccin pneumococcique, caractérisé par le fait qu'il contient au moins un polyoside purifié selon le procédé de l'une quelconque des revendications précédentes.