Brevet FR2495160A1 — publié le 19820604

1. La présente invention se rapporte à un dérivé de bisglucosylmoranoline représenté par la formule développée suivante (I) qui est un remède pour le diabète sucré: AH kH H CH (I) La demanderesse a réalisé des études importantes avec, pour objet, la mise au point d'un remède sûr et effi- cace pour le diabète sucré, elle a trouvé que le dérivé de bisglucosylmoranoline représenté par la formule développée (I) présente une action d'inhibition marquée contre l'aug- mentation du sucre dans le sang, quand le sang est chargé de sucre, et que c'est une substance qui est très utile comme produit pharmaceutique. Elle est ainsi arrivée à la 2. 2495160 présente invention. La moranoline, qui est représentée par la formule développée suivante (II) : HO OH HO H (II) HO a été isolée à partir de Mori Cortex (so-haku-hi) qui est un produit pharmaceutique brut d'origine naturelle (voir Yagi et collaborateurs: Nippon Nogei Kagaku Kaishi, volume , page 571, 1976 et la demande de brevet japonais mise à la disposition du public n0 Sho-52-83951). Ultérieurement, la demanderesse a réussi à fabriquer la substance (II) par fermentation en utilisant un microor- ganisme appartenant au genre Streptomyces (voir demande de brevet japonais mise à la disposition du public nu Sho-54- 84094). Bien que la moranoline elle-même présente déjà une action d'inhibition contre l'augmentation de sucre dans le sang, quand le sang est chargé de sucre,et qu'elle soit uti- le comme remède pour le diabète sucré, la demanderesse a réa- lisé des études pour trouver des dérivés de moranoline encore meilleurs, elle a mis au point la 4-(a-D-glucosyl)-moranoline et les 4-(a-D-glucosyl)-N-alkyl(inférieur)moranolines repré- sentées par la formule développée (III) CH2OH CH2OH / R H 0 H H H H OH H H (o R, représente H ou un groupe alkyle inférieur) et a dépo- sé des demandes de brevets à ce sujet (voir demande de bre- 3-. 2 2495160 vet japonais no Sho-54-159417 déposée le 8 décembre 1979, sous le titre: Dérivés de moranoline et leur production"; au nom de la société dite Nippon Shinyaku Co., Ltd. et n Sho-55-76838 déposée le 6 juin 1980; sous le titre: "Dérivés de moranoline et leur production"; au nom de la société dite Nippon Shinyaku Co., Ltd.). Ensuite, la demanderesse a continué ses études sur un nouveau type de dérivés de 4-(a-D-glucosyl)-moranoline et, par suite, elle a trouvé un nouveau dérivé de moranoline (I) qui est beaucoup plus puissant que la 4-(a-D-glucosyl)-mora- noline et que les 4-(a-D-glucosyl)-N-alkyl(inférieur)morano- lines. Elle est ainsi arrivée à la présente invention. (Action d'inhibition contre l'augmentation de su- cre dans le sang) Le composé expérimenté a été administré oralement avec 2 g/kg de saccharose à un groupe (chaque groupe se com- posant de quatre animaux) de rats de souche SD (âgés de 5 se- maines; poids corporel: 100 à 120 grammes). A des interval- les de temps constants, le sang a été rassemblé à partir de la veine de la queue jusqu'à ce que 180 minutes se soient écoulées à partir de l'administration et on a mesuré les ni- veaux de sucre dans le sang. Ensuite, on a mesuré la surface (AAUC) sous la courbe de l'augmentation de sucre dans le sang en fonction du temps. Quand la surface obtenue dans le cas o seule de l'eau a été administrée est définie comme étant la "base" et que celle obtenue lorsque seul du saccharose a été administré est définie sous le nom de "contrôle", le rapport d'inhibition vis-à-vis de l'augmentation de sucre dans le sang dans le groupe qui a reçu le composé expérimental est calculé. par l'équation suivante: Rap- port (AAUC du contrôle) - (AAUC du groupe expérimental) d'in- = (AAUC du contrôle) - (AAUC de la base) xlO0 hibition Le rapport d'inhibition calculé comme ci-dessus é dans le tableau suivant. est donné dans le tableau suivant. 4. Le composé (I) est une nouvelle substance qui n'a pas été indiquée dans la littérature antérieure jus- qu'à présent, et il peut être synthétisé par diverses voies. La voie l'a plus générale, est indiquée comme suit. Ainsi,un dérivé activé d'une substance du type alcool bisallylique dérivée du benzène, tel que, par exemple, le bis(3-halo-1- prop.ényl)benzène représenté par la formule développée sui- vante (IV) (IV) X o X représente un atome d'halogène, est amené à réagir avec la 4-(a-Dglucosyl)-moranoline, représentée par la formule développée suivante (V) CH2OH CH2OH / H O H H O H HO v HoO H OH H OH dans un solvant convenable, tel que le diméthylsulfoxyde,en présence d'agents retirant les acides, tels que, par exemple, le carbonate de sodium ou le bicarbonate de sodium. La 4-(a-D-glucosyl)-moranoline peut être préparée par un couplage de la moranoline avec l'a-cyclodextrine en Nom du composé Dose Rapport l oranoline 10 mg/kg 19 % 4-(a-D-glucosyl)-moranoline 10 44 4-(a-D-glucosyl)-N-méthylmora- noline 5 56 Composé (I) 1 65 5. présence de cyclodextrine glucosyltransférase, suivi de la réaction de l'oligoglucosylmoranoline résultante avec la glucoamylase, après avoir été adsorbée dans une résine échan- geuse d'ions, fortement acide (voir demande de brevet japo- nais n Sho-55-131949 déposée le 22 septembre 1980; sous le titre: "Production de dérivés de glucosylmoranoline"; au nom de la société dite Nippon Shinyaku Co.,Ltd.). Ainsi on obtient les réactions suivantes: CH2OH H H --éN H HO OH H OH a-cyclodextrine Cyclodextrine gluco- 3 syltransférase CH OH HO 0 H OH CHOH N H O H H -O H OH CH20H /H H N 0,OH H H OH n Oligoglucosylmoranoline (n est O ou un nombre entier) CH20H CH2OH /H H À_ NH U 9 Ns W x 2(H+) Glucoamylase > HO H (V) H OH Le procédé de fabrication du composé de la présen- te invention sera illustré dans l'exemple suivant avec plus de détails. EXEMPLE (i) (Synthèse du chlorure de benzène-1,4-bisallyle) Du bromure de vinylmagnésium, préparé à partir de g du bromure de vinyle et de 14 g de magnésium métallique, 6. 2495160 a été dissous dans du tétrahydrofurane (désigné ci-après en abréviation par THF) pour préparer environ 200 ml de solution. Après agitation, une solutionde 25 g de téréphta- laldéhyde dans 200 ml de THF a été ajoutée goutte à goutte durant 30 minutes. Après que l'addition goutte à goutte a été achevée, la solution réactionnelle a été agitée pendant minutes de plus, avec chauffage au reflux. Après avoir été refroidie, on y a ajouté une petite quantité d'eau avec refroidissement par de la glace, afin que le composé soit décomposé. Dans le produit réactionnel, on a ajouté de l'acétate d'éthyle, la matière insoluble a été retirée, la couche d'acétate d'éthyle a été lavée avec de l'eau et con- centrée pour donner 21 g de produit réactionnel jaune pâle huileux. Le produit a été dissous dans 250 ml d'acétate d'éthyle, 30 g de chlorure de thionyle y ont été ajoutés goutte à goutte avec agitation et chauffés au reflux pendant 2 heures après l'addition goutte à goutte. Après refroidis- sement, le mélange réactionnel a été évaporé à sec sous pres- sion réduite et la substance cristalline résiduelle a été re- cristallisée dans une petite quantité d'acétate d'éthyle pour donner 15,8 g de chlorure de benzène-1,4-bisallyle, p.f. 124- 1290C. (ii) Fabrication de 4-(a-D-glucosyl)-moranoline (a) Culture de Bacillus macerans On a introduit dans un ballon d'Erlenmeyer (volume de 500 ml) 150 ml de bouillon de culture (pH 7) se composant de 1 % de liqueur de mais macérée, de 1 % d'amidon soluble, de 0,5 % de sulfate d'ammonium et de 0,5 % de carbonate de calcium, et le ballon a été stérilisé par chauffage à 1201C pendant 15 minutes. Trois boucles de platine de la souche de Bacillus macerans IFO 3490, qui s'étaient bien développées sur un milieu en pente se composant de 1 'O de peptone, de 0,5 % de levure, de 0,3 '% de glucose, de 1,5 A de glycérol, de 0,3 'O' de chlorure de sodium, de 0,1 de poudre de foie (connue sous la marque déposée OXOID, pour un produit de di- gestion de foie neutralisé) et 1,5 % d'agar-agar, ont été ino- culées et cultivés à 370C pendant 3 jours. La solution de culture (300 ml) a été inoculée dans un dispositif de fermen- tation en forme de bocal (volume de 15 litres), dans lequel on a introduit 9 litres de la même composition de milieu et on a cultivé à 370C pendant 3 jours avec suffisamment d'aéra- tion et d'agitation pour donner environ 130-150 unités (la définition de l'unité est indiquée ci-après) de solution d'enzyme sous forme de liquide surnageant après centrifuga- tion. (b) Unité d'activité de cyclodextrine glucosyltrans- férase De l'amidon soluble (0,7 %) (produit de la société dite Nakarai Kagaku Co., pour des études biochimiques) a été dissous dans du tampon d'acétate 0,05 M (pH 5,5) et a été utilisé en tant que solution de substrat. A 950 pl du subs- trat, on a ajouté 50 pl de la solution d'enzyme, le tout a été amené à réagir à 400C pendant 10 minutes, et la réaction a été amenée à cesser par addition de 0,5 ml d'acide acéti- que 0,5N. 100 pl de la solution réactionnelle ont été pris et 3 ml d'eau et 0,8 ml de solution d'iode ont été ajoutés, et l'iode a été dissous afin d'amener une solution de KI 0,25M à une molarité de 0,OlM; puis, le mélange total a été agité et la capacité d'absorption (AT) a été mesurée à 660 nm.De manière semblable, 100 pl de la solution o 50 pl d'eau et 0, 5 ml d'acide acétique 0,5N ont été ajoutés à 950 pl de la solution de substrat ont été pris, la solution d'iode y a été ajoutée et la capacité d'absorption (AR) à 660 nm a été mesurée. A ce moment, une unité est représentée par l'équa- tion AR - A Une unité R T x 100 x 2 AR et ceci correspond à l'activité pour laquelle 1 ml de la so- lution d'enzyme provoque une diminution de 1 % de la capaci- té d'absorption en 1 minute à 400C. (c) Préparation de la solution d'enzyme brute La solution cultivée de Bacillus macerans IFO 3490 a été centrifugée et le liquide surnageant a été pris, Il a été lyophilisé, puis dissous dans une petite quantité d'eau, et la solution d'enzyme concentrée a été obtenue. Elle a été 8. bien dialysée à 50C par rapport à de l'eau distillée et la solution interne, d'o les substances à faible poids molé- culaires ont été retirées, a été utilisée comme solution d'enzyme brute. (d) Réaction et traitement 6,5 g de moranoline ont été dissous dans une peti- te quantité d'eau et la solution a été réglée à un pH de ,7 avec de l'acide chlorhydrique 3N. Après réglage de pH, le volume était 32,5 ml. De l'a-cyclodextrine (26 g) a été dissoute dans 1.300 ml de solution de l'enzyme brute cons- tituée de cyclodextrine glucosyltransférase (460 unités/ml), une solution aqueuse de moranoline y a été ajoutée, et le mélange a été réglé à un pH de 5,67. Ce mélange a été agité à 390C pendant 3 jours, afin que la réaction soit réalisée. La solution réactionnelle a été centrifugée, le liquide sur- nageant a été passé à travers une colonne (volume de la ré- sine: 50 ml) de produit dit Dowex 50W x 2 (H+) afin que les substances basiques y soient adsorbées. Après avoir été bien lavée avec de l'eau,la résine a été mise en suspension dans 1.200 ml d'eau,120 mg d'a-1,4glucanglucohydrase (environ 22 unités/mg) provenant du Rhizopus niveus ont été ajoutés, le mélange a été soumis à l'incubation à 400C, et l'état de déroulement de la réaction a été suivi avec un échantillon intermittent, suivi de détermination quantitative du gluco- se produit durant la réaction. On a trouvé que la quantité de glucose augmentait rapidement après la réaction, et durant la réaction pendant 5 heures, il a atteint 89 A de la valeur de la fin de la réaction. La réaction a été encore poursui- vie et, après 25 heures, la réaction a été arrêtée. Après la réaction, la résine a été rassemblée par filtration, bien lavée avec de l'eau, éluée avec de l'ammoniaque 0,5N, l'éluat a été concentré à sec sous vide, la poudre résultan- te a été dissoute dans une petite quantité d'eau,passée à travers une colonne (diamètre 12 cm x 30 cm) de produit dit Sephadex G-15, les fractions désirées ont été rassemblées et séchées par congélation pour donner 5,8 g de 4-(a-D-glu- cosyl)-moranoline, p.f. 138-1480C. [aID = 121,60 (eau). 9-. 2495160 (iii) Synthèse du composé (I) De la 4-(a-D-glucosyl)-moranoline (1 g) et 1 g de bicarbonate de sodium ont été dissous dans 15 ml de diméthyl- sulfoxyde (désigné ci-après par DMSO0) à 22-24DC et une solu- tion de 380 mg de chlorure de benzène-l,4-bisallyle dans 15 ml de DMS0 préparée avec agitation y a été ajoutée goutte à goutte durant 60 minutes. Le mélange a été agité à 22-25 C pendant 4 heures de plus. Ensuite, la matière insoluble a été retirée par filtration, le filtrat a été dilué avec 300 ml d'eau, lavée avec du chloroforme et passé à travers une colonne de produit dit Dowex 50W x 2 (H+) (20 ml). Après que la colonne a été bien lavée avec de l'eau, elle a été éluée avec de l'ammoniaque à 0,2 %, et puis le produit désiré a été élué avec une solution aqueuse de méthanol contenant 5 % d'am- moniaque. L'éluat a été évaporé à sec sous vide et les cris- taux résultants ont été recristallisés dans du méthanol à %o pour donner 300 mg du composé (I), p.f. 169-173 C, 24 0 [a]436 = -28,0 (eau). L'analyse élémentaire calculée pour C36H56018N2. 2H30 est la suivante: C 51,52 %; H 7,15 %; N 3,24 %; Trouvé: C 51,42 %, H 7,20 %, N 3,33 %. La présente invention n'est pas limitée aux exem- ples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaltront à l'homme de l'art. 10. 2495160 REVENDICATIONS 1 - A titre de produit industriel nouveau, dérivé de bisglucosylmoranoline représenté par la formule dévelop- pée suivante (I) OH HO OH HO O H CH20H CH2OH PJ 2 CH OH CH2OH () H T OH HO OH OH 2 - Composition pharmaceutique pour le traitement du diabète sucré, caractérisée en ce qu'elle renferme, en tant qu'ingrédient actif, le composé indiqué dans la reven- dication 1.