Brevet FR2491762A1 — publié le 19820416

i La présente invention concerne un nouvel antibiotique appelé stubomycine et sa préparation. Les inventeurs de la présente invention ont trouvé que la souche de microorganisme n KG-2245, nouvellement isolée-à partir d'un échantillon de sol, appartenant au genre Streptomyces, produit un nouvel antibiotique, la stubomycine. Les propriétés taxonomiques de la souche KG-2245 sont les suivantes: (a) Propriétés morphologiques: Le mycélium aérien de KG-2245 est surtout Rectus Flexibilis avec des crochets. Les spores sont cylindriques et la surface est lisse avec de faibles irrégularités (ni lisse ni typiquement verruqueuse ou épineuse), et leur taille est de 0,47-0,67 x 1,2-1,6 microns. (b) Caractères culturaux sur divers milieux: Les caractères culturaux sont donnés au Tableau 1 (observation à 27 C, 10 à 14 jours de cul- ture), Tableau 1. Caractères culturaux de la souche n KG-2245 Milieu Croissance Mycélium aérien Envers Pigment soluble Gélose saccharose Faible Cendre (5fe) Gris argenté Bambou (2fb) nitrate (3fe) Gélose glucoseModérée Gris rosâtre Orange Orange pastel nitrate clair (5dc) poussiereux (4ic) (41c) Gélose glycérol- Modérée Erable (41e) Rose corail malate de calcium clair (6ga) Gélose glucose- Bonne Souci (3na) Erable jaune Ambre (31c) asparagine (3ng) Gélose glycérol- Bonne Jaune colonial Ambre (3pe) Mais (2hb) asparagine (2ga) Gélose Sels Très faible - Teinte inorganiquesd'orchidée amidon (10Oba) Gélose à la Bonne Farine d'avoine Erable jaune MaSs (2hb) tyrosine (2ec) (3ng) Gélose extrait Modérée Beige rosê (4gc) Rouge brique Rose pêche de levure - (5ne) (5ea) extrait de malt IIX ISS,"I _I __ No -r- 0% I -. m M M (OT^^ uosed GuLeJo uoteaw auner +Oe IT.e[DeToq ('aT7) ( ci ?) (qtqz) noqtueú alqms (ost) avoa a TGOE ( qo L.) oepTtiooip 01U.Te. (OP ) GaTOAI leinJre eagipoW a9gipow appox agagpow eATTaqnu asolaD auo. dad -esoon12 esolae zej alrla L ap %Tzxqxa -euo;ded 8sol9r auToAe. p euTiej ep esolaD (el.Tns) t nualq. r4 o', (%àI I eaqn[os %uew2TId Sea Uae:e juT'lo-B| aouessToD n:' eTtl: i i O i j (c) Propriétés physiologiques (1) Température de croissance: possible à 37 C, croissance optimum à 27-30 C; (2) Liquéfaction de la gélatine: positive; (3) Hydrolyse de l'amidon: positive; (4) Peptonisation du lait: négative; (5) Production de mélanine sur gélose à la tyrosine: négative; (6) Réduction des nitrates: positive; (7) Activité cellulolytique: probable; (d) Utilisation des sources de carbone Utilisation: D-glucose, i-inositol Négative: L-arabinose, saccharose, raffinose, D-mannitol, D-fructose, cellulose Douteuse: D-xylose, rhamnose. (e) Composition de la paroi cellulaire L'analyse des parois cellulaires se fait par le procédé de Becker et all, (Appl. Microbiol., 13. 236-243, 1965) et l'on trouve de l'acide LL-diaminopimélique. Diverses propriétés taxonomiques ci-dessus révè- lent clairement que la souche KG-2245 est un microorganisme appartenant au genre Streptomyces, et on appelle ce micro- organisme Streptomyces sp 2245. La souche a été déposée à l'Institute for Microbial Industrial and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, M. I. T. I., au Japon et s'est vu attribuer le n de dépôt permanent FERM-P 5675. Cette stubomycine antibiotique possède une acti- vité anti-tumorale et a les propriétés physico-chimiques suivantes: (1) Formule moléculaire: C29H35N05 Analyse élémentaire: C % H% N% Trouvé: 72, 33 7,35 2,83 Calculé (pour C29H35N05) 72,58 7,47 2,80 (2) Poids moléculaire: 477 (par spectrométrie de masse) (3) Point de fusion: 2432450C (décomposition) (4) Rotation optique: + 246 (C = 0,5, diméthylsulfoxyde) (5) Spectre d'absorption UV: cf. Figure 1 pic d'absorption à 300 nm (a = 44500) dans MeOH. Le pic d'absorption ne se déplace pas dans des conditions acides ou alcalines. (6) Spectre d'absorption infra-rouge: cf. Figure 2 pic d'absorption à 3470, 3260, 3040, 2925, 2870, 1640, 1605, 1540, 1455, 1440, 1385, 1350, 1330, 1260, 1220, 1195, 1160, 1120, 1090, 1005, 975, 930, 890, 835, 750, 700 cm-1 dans KBr. (7) Solubilité: soluble dans le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide, la pyridine, légèrement soluble dans le méthanol, insoluble dans l'éthanol, le benzène, l'acétone, le chloroforme, l'acétate d'éthyle et l'eau. (8) Réaction colorée: positive: réactions de Rydon-Smith, de Dragendorff, du chlorure ferrique et de la 2,4-dinitriphénylhydrazine négative: réactions de la ninhydrine, d'Ehrlich et de l'anisaldéhyde-H2SO4. (9) Nature: substance acide lipophile. (10) Forme cristalline: plaque incolore (à partir du méthanol) (11) Stabilité: stable dans des conditions neutres et acides, légèrement instable dans des conditions alca- lines. (12) Chromatographie en couche mince: Rf = 0,5 (gel de silice 60 F254, Merck; Solvant, CHC13-MeOH-AcOH, 91,5:7:1,5). On compare la stubomycine aux antibiotiques antérieurement connus ayant une absorption UV autour de 300 nm. On examine plusieurs antibiotiques comme: la la pecilocine (J. Antibiotics, 12A, 109 (1959)), l'ikarugamycine (J. Antibiotics, 25, 271 (1972)), la viridénomycine (J. Antibiotics, 28,-(3), 167 (1975)) et l'asukamycine (J. Antibiotics, 29, (9), 876 (1976)). Cependant, la formule moléculaire de la pecilocine est C17H25N03, et le point de fusion et le poids molécu- laire de la pecilocine diffèrent de ceux de la stubomycine. Les points de fusion et les poids moléculaires de l'ikaru- gamycine (253 C, 478), de la vîridénomycine (169 C, 566) et l'asukamyclne (188 C, 542) diffèrent également de ceux de la stubomycine. On pense donc que la stubomycine est un nouvel antibiotique. On produit la stubomycine en cultivant un micro- organisme appartenant au genre Streptomyces qui produit l'antibiotique stubomycine et en l'isolant du bouillon cultivé. Selon l'invention, on peut utiliser non seulement Streptomyces KG-2245, mais aussi ses mutants naturels ou artificiels, obtenus par action du rayonnement UV ou des rayons X ou au moyen d'agents mutagènes chimiques, ainsi que d'autres microorganismes appartenant au genre Streptomyces ayant une activité de production de stubomy- cine pour produire la stubomycine. Dans l'application de l'invention, on cultive Streptomyces sp n KG-2245 qui produit la stubomycine dans des milieux classiques habituellement employés pour la production d'antibiotiques. La culture peut s'effectuer de préférence en milieu liquide; cependant, une culture aérobie en immersion est intéressante pour la production industrielle. Dans l'invention, la culture peut s'effectuer dans des milieux classiques. Pour les sources de carbone des milieux, on peut utiliser des sources de carbone 7. assimilables, comme le glucose, le saccharose, le maltose, le lactose, l'amidon et la mélasse. Pour la source d'azote, on peut utiliser des sources d'azote organique comme la liqueur de mals macérée, la farine de soja, la farine de coton, les glutènes de blé, la peptone, l'extrait de vian- de, l'extrait de levure, les hydrolysats de caséine, les sels d'ammonium, les sels de nitrates, etc. En cas de besoin, on peut utiliser des sels inor- ganiques comme des phosphates, des sels de magnésium, des sels de calcium, des sels de sodium, des sels de cuivre, de zinc, de fer, de manganèse, etc. Le pH des milieux de culture est habituellement de 6,8 à 7,0. La température de culture peut être modifiée pour autant qu'elle permette la croissance du microorganisme qui produit la stubomycine; on préfère 27300C. Bien que la durée de fermentation dépende des conditions de cultu- re, on peut y mettre fin lorsque le milieu a acquis sa capacité maximum de production de stubomycine, et cette durée est habituellement de 2 à 7 jours. Lorsqu'on isole et qu'on purifie la stubomycine à partir des milieux ainsi cultivés, comme il est dit ci- dessus, et comme la stubomycine est sous forme de solution dans le filtrat cultivé ou son surnageant, ou est sous forme de fractions insolubles dans les mycelia, il est intéressant d'utiliser les caractères de la stubomycine, par exemple sa nature acide lipophile, sa solubilité pour les solvants et I'adsorption sur un support comme Sephadex LH-20, Diaion HP-20 et le gel de silice. La stubomycine peut être dosée par des procédés classiques de microbiodosage, en utilisant Bacillus subtilis comme organisme expérimental, l'absorption UV à 300 nm, et la réaction colorée de la 2,4-dinitrophènyl- hydrazine. Un exemple d'isolement et de purification de la stubomycine est donné ci-dessous: On filtre le bouillon entier par un filtre à tambour ou un filtre à presse, ou on retire les cellules cultivées par une centrifugeuse du type panier. On peut recueillir la stubomycine à partir du filtrat de bouillon obtenu par extraction avec divers solvants lipophiles non miscibles à l'eau et capables d'extraire la stubomycine comme l'acétate d'éthyle, le chloroforme et le chlorure de méthylène dans des conditions acides. On peut également isoler la stubomycine à partir du tourteau mycénien avec un solvant hydrophile et capable d'extraire la stubomycine comme le méthanol et l'acétone, dans des conditions acides. On concentre ces extraits sous vide, et on dissout le résidu résultant dans le méthanol. On fait passer cette solution méthanolique à travers une colonne de Sephadex LH-20, et on adsorbe la fraction active sur une colonne de gel de silice traitée à l'acide sulfuri- que que l'on développe avec du chlorure de méthylène pour obtenir la stubomycine purifiée. On peut isoler la stubomycine sodique en ajoutant un excès de méthoxyde de sodium, d'acétate de sodium ou de 2-éthylhexanoate de sodium à un solvant organique dissol- vant la stubomycine comme le méthanol. La stubomycine sodique est facilement transformée en stubomycine par traitement avec une solution diluée d'acide chlorhydrique ou d'acide sulfurique. Après que la stubomycine sodique soit isolée de la matière brute contenant la stubomycine par le procédé décrit ci-dessus, puis purifiée, on peut obtenir la stubomycine à partir de la stubomycine sodique par trai- tement avec une solution acide. On peut également obtenir la stubomycine potassi- que, calcique et aluminique sous forme de sels de stubomy- cine non toxiques pharmacologiquement acceptables. Les propriétés biologiques de la stubomycine sont les suivantes: (1) Activité antimicrobienne: La concentration minimale inhibitrice (CMI, microgramme/ml) vis-à-vis de divers microorganismes par un procédé de dilution sur gélose est donnée au Tableau 2. Tableau 2 - Activité antimicrobienne de la stubomycine (2) Toxicité aiguë: Toxicité aiguë (DL50) chez la souris: environ 400 mg/kg (i.p.) et au-dessus de 1000 mg/kg (p.o.) (3) Activité antitumorale: (a) Mode opératoire: 1. On inocule à des souris CDF males par voie Organisme expérimental CMI (Pg/ml) Bacillus subtilis PCI 219 0,4 Staphylococcus aureus FDA-209P 3,1 Mycobacterium smegmatis 3,1 Sarcina lutea ATCC 1001 0, 4 Escherichia coli NIHJ >200 Pseudomonas aeruginosa >200 Santhomonas oryzae >100 Candida albicans >100 Saccharomyces sake >200 Aspergillus niger >100 Trichophyton interdigitalis 6,3 Piricularia oryzae 3,1 Alternaria kikuchiana 6,3 Microspcum gypseum 12,5 _ III intravéritonéal (i.p.) 1 x 105 cellules de leucémie P-388, et 24 heures après l'inoculation de letume r e administre aux souris la stubomycine i. p. une fois epar jour pendant 9 jours. 2. On inocule à des souris ddy mdles i.Lp 2,5 x 106 cellules de carcinome d'ascite d'Ehrlcâh, et 24 heures après l'inoculation, on commence le traitement selon le même schéma d'administration que ci-dess. (b) Evaluation: On calcule l'efficacité thérapeutique de la stubomycine sur les deux tumeurs en observant lem nmbre de jours de survie des souris, cette efficacité étant donnée par la formule suivante: nb moyen de Jours de survie du groupe traité (T) x 100 = taux de murvie (TIC% nb moyen de Jours de survie du groupe témoin (C) Le tableau 3 donne le résultat de Ilefflcacité thérapeutique sur la leucémie p-388 et le carclzme de l'ascite d'Ehrlich. Tableau 3 - Activité antitumorale de la stubomycine sur le carcinome de l'ascite d'Ehrlich et la leucémie P-388 NJS =nombre moyen de Jours de survie ADV = augmentation de la durée de vie, rapport aux souris témoins non t: * - nombre de souris traitées. exprimée en pourcentage d'augmentation par Dose Dose NJS ADV Schéma de (mg kg/ totale traitement Jour) (mg/kg) Ehrlich P 388 Ehrlich P 388 Non traitées - - 19 12 - Jour 1 75 75 28(1) 17 47 42 150 51 17 168 42 300 300 21 17 il 42 Jours 1, 5, 9 25 75 33(1) 16 74 33 150 16 15 -16 25 Jours 1"9 8,8 75 21 15 il 25 16,7 150 50(1) 11 163 -8 33,3 300 33(1) 9 74 -25 A_7 -2__5 ru \o Ils Les exemples suivants précisent la préparation et l'isolement de la stubomycine. EXEMPLE 1 On dispose 100 ml de milieu (glucose 2,0 %, farine de soja 1 %, peptone 0, 3 %, NaCl 0,3 %, CaC 0,3 %, Na2S04 0,2 %, K2HPO4 0,1 %, KCl 0,05 %, MgS04 0,05 %, FeSO4 0,01 % en poids, pH 6,9) dans un ballon de Sakaguchi de 500 ml et on stérilise à 121 pendant 30 minutes. On cultive Streptomyces sp KG-2245 sur milieu de Kreinsky à 28 C pendant 10 Jours que l'on inocule et que l'on cultive en agitant à 27 C pendant 4 jours. Au bout de 4 Jours de culture, on transfère le contenu du ballon dans un fermen- teur de 200 litres contenant 150 litres de milieu stérilisé décrit cidessus. On continue la fermentation pendant 54 heures à 28 C, en agitant à 200 tpm tout en aérant (150 l/ min). On inocule 130 litres de la semence cultivée dans un fermenteur de 2000 litres contenant 1500 litresde milieu stérilisé (glucose 2 %, farine de soja 1 %, NaCl 0,3 %, CaC03 0,3 %, levure sèche 0,3 5%9 pH 6,5). On continue la fermentation pendant 148 heures à 28 C, on agite à 200 tpm et on aère à 1500 1/minute. Après la fermentation, on filtre le bouillon entier, et l'on ob- tient 212 kg de tourteau mycénien humide et 1300 litres de filtrat. On mélange le tourteau mycélien avec 1500 litres de méthanol et on acidifie avec de l'acide chlorhydrique dilué à pH 2,0 après avoir agité pendant 1 heure, on filtre le mélange et on fait passer l'extrait de méthanol à tra- vers une colonne de Diaion HP-20 (100 l,Mitsubishi Kasei Co., Ltd). On concentre la fraction active incolore sous vide et on traite la matière gommeuse résiduelle avec du diisopropyléther pour obtenir 171 g de poudre brute. On acidifie le filtrat du bouillon (1300 litres) avec de l'a- cide chlorhydrique dilué à pH 2,0 et on mélange avec 650 1 d'acétate de butyle que l'on agite pendant 30 minutes. On déshydrate la phase organique séparée puis on concentre sous vide. On traite la matière gommeuse résiduelle avec du n-hexane pour obtenir 6,3 g de poudre brute. On met en suspension la poudre brute (150 g) obtenue à partir du mycélium et du filtrat de bouillon dans 1 litre de solu- tion d'EDTA 0,05 M, et on agite la suspension pendant 1 heure. On met en suspension la matière insoluble dans 1 litre d'eau et on agite à pH 2, en ajustant avec de l'acide chlorhydrique dilué pendant 30 minutes. On fait passer la matière insoluble sur du papier-filtre, on lave à l'eau, et on sèche pour obtenir 69 g de poudre jaune pale. On chromatographie la poudre obtenue (1,5 g) dissoute dans le méthanol (200 ml) sur une colonne de Sephadex LH-20 (1,7 1), et on développe avec du méthanol. On concentre la fraction active sous vide pour obtenir des cristaux de stubomycine (760 mg), que l'on recristallise à partir du méthanol (rendement: 450 mg). EXEMPLE 2 A la poudre jaune pâle (17 g) obtenue dans l'exemple 1 dissoute dans le méthanol chaud (5 litres), on ajoute 20 ml de 2-éthylhexanoate de sodium à 44,3 % (p/v) dans la méthylisobutylcétone, et on agite pendant 1 heure à la température ambiante. On filtre le mélange et on lave le précipité avec du méthanol et on sèche sous vide pour donner 1,2 g de cristaux. On concentre la solution résiduelle à environ la moitié de ce volume, et on agite pendant 3 heures à la température ambiante. On sépare le précipité obtenu, on le lave avec du méthan'Nl et on sèche pour donner 10,4 g de cristaux. On met ces cristaux en suspension dans 200 ml d'HCl 1 N, et on agite pendant 30 minutes à 550C. On recueille le précipité sur le papier filtre, on lave à l'eau, et on sèche pour obtenir une poudre blanche. On dissout cette poudre dans 5 litres de méthanol chaud et on y ajoute 5 ml (23 mmoles) de méthoxyde de sodium. On concentre cette solution à la moitié de ce volume, et on filtre, on lave avec du méthanol et on sèche pour obtenir 7 g de stubomycine sodique. Analyse élémentaire: Calculé pour C29H34NO5.Na.H20 C% H% N% Trouvé: 66,98 7,33 2,53 Calculé: 67,27 7,01 2,71 UV:MeOH = 300 nm (%m 900) UV:Max lem 9o IR: 1620, 1480, 1450 cm-1 EXEMPLE 3 On met en suspension la stubomycine sodique (5,5 g) obtenue dans l'exemple 2 dans 100 ml d'HCl 1 N, et on agite pendant 1 heure à 50-60 C. On recueille la matière insoluble sur du papier filtre, on lave à l'eau et on sèche pour obtenir 4,68 g de poudre blanche. Après recristallisa- tion à partir du méthanol chaud, on obtient 3,33 g de stubomycine. 4. Brève légende des dessins: - Figure 1: spectre d'absorption UV de la stubomycine (M4eOH) - Figure 2: spectre d'absorption infrarouge de la stubomycine (KBr). RTfl? J,7)CATI0'TS 1. Stubomycine antibiotique ayant les proprié- tés physico-chimiques suivantes et ses sels non toxiques pharmacologiquement acceptables: (a) formule moléculaire C29 35 NO analyse élémentaire: Cm.}t,9 NT, trouvé: 72 33 7,35 2,83 Calculé (pour C29H35N05):72,58 7,47 280 (b) poids moléculaire: 477 (par spectrométrie de masse) (c) forme cristalline: plaque incolore (à partir de MeOH) (d) point de fusion t 243-245oC (décomposition) (e) rotation optiqlle] + 2460 (C=0,5, diméthyl- sulfoxyde) (f) spectre d'absorption UV (dans MePH) (g) spectre d'absorption IR (XBr) (h) solubilité i soluble légèrement soluble insoluble (i) réaction: positive coloréee négative comme dans la figure 1 comme dans la figure 2 diméthyl-sulfoxyde, diméthyl- formamidee pyridine méthanol éthanol, benzène, acétnne, chloroforme, acétate d'éthyle, eau réactions de Rydon-Smiith, Dragendorff, chlorure ferrique, et 2 4-dinitrophénylhydrazine réactinns ninhydrine, Ehrlich, et anisaldéhyde H2S., substance acide. (J nature 2. Procéd4 de production de stubomycine antibio- t-qule, impliquant de cultiver le microorganisme produisant ]. stubomrvcine appartenant au genre Streptomyces ou ses mltants dans un milieu nutritif, et dtisoler la stubomycine atihbo-ique à pitrtir du miliceu cultivé. - 3, Procédé tel que revendiqué dans la revendi- cation 2 o ledit microorganisme producteur de la stubomycine -:ntibiotirlle est Streetomrces sp. KG-2245 FE:1:-P no 5675.