Brevet FR2490674A1 — publié le 19820326

La présente invention concerne un procédé pour produire la L-arginine par fermentation. On sait que la L-arginine est produite par un procédé de fermentation dans lequel on utilise des mutants du genre Brevibacterium ou Corynebacterium résistants à un médicament du type sulfamide ou à un antagoniste de l'arginine (demande de brevet japonaise publiée sans examen no 48189/1975). On a maintenant trouvé que la productivité de L-arginine est notablement accrue lorsque l'on rend résistants à l'acide céto malonique, l'acide fluoro-malonique, à l'acide monofluoro acétique ou à un antagoniste des aspartates les mutants connus qui appartiennent au genre Brevibacterium ou Corynebacterium et qui sont capables de produire la L-arginine. Les micro-organismes utilisés selon l'invention sont les mutants qui appartiennent au genre Brevibacterium ou Corynebacterium, qui sont résistants à l'acide céto-malonique, à l'acide fluoro-malonique, à l'acide monofluoroacétique ou aux antagonistes des aspartates et qui sont capables de produire la L-arginine. Les mutants tels que définis ci-dessus peuvent être produits à partir des souches mères du genre Brevibacterium ou Corynebacterium par des procédés classiques de mutation tels qu'irradiation par les ultraviolets ou exposition à la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso- guanidine et ensuite récolte des colonies qui sont formées sur le milieu à la gélose contenant la quantité des agents chimiques inhibant la croissance de la souche mère. Comme souches mères on peut utiliser des mutants capables de produire la L-arginine ou des souches sauvages du genre Brevibacterium ou Corynebacterium. Lorsque l'on utilise comme souches mères des souches sauvages, la productivité de L-arginine est donnée aux souches sauvages avant ou après la résistance aux agents chimiques de l'invention. Pour donner la productivité de la L-arginine aux microorganismes du genre Brevibacterium ou Corynabacterium, collure on le sain, on donne aux micro-organismes la résistance aux antagonistes de la t-arginitte tels que 2-thiazole alanine et arginine hydroxamate, ou aux médicaments du type sulfamide. Les antagonistes de l'arginine sont des substances chimiques qui inhibent la croissance des micro-organismes du genre Brevibacterium et Corynebacterium et l'inhibition est supprimée lorsque le milieu contient de la L-arginine. Les sources sauvages préférées appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium sont des bactéries productrices d'acide t-glutamique coryne-formes, par exemple Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium roseur ATCC 13825, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium lilium ATCC 15990 et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Les antagonistes des aspartates de l'invention inhibent la croissance des micro-organismes du genre Brevibacterium ou Corynebacterium et l'inhibition est supprimée partiellement ou complètement lorsque le milieu contient du L-aspartate, on peut citer par exemple la ss-aspartylhydrazine, l'acide diamino succinique et l'hadacidine. Des exemples des mutants de l'invention sont les smuivants Brevibacterium flavum AJ 11337, FERN-P 4940, NRRL B-12 235 (SDr, AspHdr) Brevibacterium flavum AJ 11338, FERM-P 4941, NRRL B-12 236 (SDr > ASr) Brevibacterium flavum AJ 11339, FERM-P 4942, NRRL B-12 237 (SDr, HDr) Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11341, FERM-P 4944, NRRL B-12 238 (SDr, AspHdr) Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11342, FERN-P 4945, NRRL B-12-239 (SDr, ASr) Brevibacterium flavum AJ 11343, FERM-P 4946, NRRL B-12240 (2TAr, SGr, His-, HDr) Brevibacterium flavum AJ 11595, FERM-P 5637, NRRL B-12242 (SDr, KMr) Brevibacterium flavum AJ 11596, FERM-P 5638, NRRL B-12243 (SDr, FMr) Breviba cterium flavum AJ 11597, FERM-P 5639, NRRL B-12244 (SDr, FAr) Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11598, FERM-P 5640, NRRL B-12245 (SDr, KMr) Brevibacterium flavum AJ 11344, FERM-P 4947, NRRL B-12241 (2TAr, SGr, His-, HDr) Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11599, FERM-P 5641, NRRL B-12246 (SDr, FAr) Brevibacterium flavum AJ 11600, FERM-P 5642, NRRL B-12247 (2TAr, SGr, His-, FAr) SDr : : résistance å la sulfadiazine 2TAr: résistance à la 2-thiazolealanine SGr: résistance à la sulfaguanidine His-: histidine nécessaire à la croissance Asp Hdr : résistance B l'aspartylhydrazine ASr: résistance à l'acide disminosuccinique HDr: résistance à l'hadacidine KMr: résistance à l'acide céto-malonique FMr: résistance à l'acide fluoro-malonique FAr: résistance à l'acide monofluoro-acétique. On indique ci-dessous la méthode de production des mutants de l'invention Expérience 1 On traite Brevibacterium flavum AJ 3277 (SDr), dérivé de ATCC 14067, avec 250 g/ml de N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine b 30 C pendant 30 minutes. On étale ensuite les cellules microbiennes sur un milieu de gélose contenant la quantité d'acide céto-malonique qui inhibe la croissance de la souche mère. Après la culture, on reprend les colonies sur le milieu de gélose et on examine leur productivité de L-arginine. Parmi les mutants ainsi obtenus on choisit B. flavum AJ 11595 qui peut produire une plus forte quantité de L-arginine que tous les autres mutants. Les autres mutants de l'invention sont obtenus de manière analogue. Le degré de résistance des mutants de l'invention aux agents chimiques est déterminé par 11 expérience suivante. Expérience 2 On lave chacune des souches d'essai avec le milieu de culture aqueux indiqué dans le tableau I ci-apsès, on met les cellules en suspension dans le mme milieu (la densité optique à 562 nm de la suspension à la dilution 26 fois est de 0,3 à 0,33), et on place 0,1 ml de la suspension dans 40 ml du meme milieu qui contient en outre la quantité des agents chimiques indiqués dans les tableaux Il et III et on place dans un-petit tube a essais. TABLEAU I Composition du milieu à la gélose (pH : 7,2) Composant concentration composant concentration Glucose 2,0 g/dl FeSO4,7H20 10 mg/dl Urée 0,3 g/dl NnS04,4H20 1,0 mgldl Sulfate d'ammonium 1,0 g/dl Biotine 10 mg/dl KH2PO4 0,1 g/dl Thiamine, HCl 100 g/l MgS04, 7H20 0,04 g/dl On cultive a 31,50C pendant 48 heures en agitant. On détermine ensuite la croissance de chaque souche en mesurant la densité optique à 562 nm des bouillons résultants et les résultats sont indiquées dans les tableaux Il et III. Dans les tableaux II et III, le degré de résistance est représenté par les valeurs relatives de la croissance du témoin. TABLEAU II Degré de résistance Agent chimique Souches concentration (g/dl) essayées 0 1 2 4 5 10 acide cétomalonique AJ 3277 100 59 8 5 AJ 11595 " 100 100 20 AJ 3278 " 44 5 O AJ 11598 " 100 95 25 acide fluoro- AJ 3277 " 54 5 0 malonique AJ 11596 " 103 - 102 60 acide mono- AJ 3277 " 45 0 0 60 fluoroacétique AJ 11597 " 110 100 100 AJ 11193 " 53 4 0 AJ 11600 " 110 100 90 AJ 3278 " 47 0 0 AJ 11599 " 110 90 90 TABLEAU III Degré de résistance gent chimique Souches Concentration essayées 0 0,1 0,5 - 1,0 (g/dl) -aspartyl- AJ 3277 100 50 18 8 hydrazine AJ 11337 100 90 63 27 AJ 3278 100 45 23 8 AJ 11341 100 93 51 19 AJ 11193 100 48 12 7 ÀJ 11343 100 91 83 13 2,6-diamino AJ 3277 100 55 22 10 succinate AJ 11338 100 92 65 25 AJ 3278 100 43 19 5 AJ 11342 100 91 55 23 Hadacidine AJ 3277 100 55 16 9 AJ 11339 100 85 65 23 AJ 11344 100 92 79 17 AJ 11193 100 41 8 4 On cultive les mutants en conditions aérobies dans un milieu de culture classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote et des ions organiques et si nécessaire des oligoéléments. Comme sources de carbone, on peut utiliser de préférence des saccharides tels que glucose, fructose et saccharose et des mélasses et l'amidon hydrolyse contenant ces saccharides, des acides organiques tels qu'acide acztique et acide propionique et des alcools. Les sources d'azote sont, par exemple,le sulfate d'ammonium, le gaz ammoniac et l'urée. La culture est effectuée de préférence en condition aérobies pendant 2 à 7 jours et la température du milieu de culture est réglée entre 24 et 37"C, en ajustant de préférence le pH du milieu 8- 5,0-9,0 au moyen d'un acide ou d'un alcali organique ou inorganique. A cet effet on peut aussi utiliser l'urée, le carbonate de calcium ou le gaz ammoniac. La L-arginine accumulée dans le bouillon de culture peut etre récupérée par une méthode tout a fait classique, utilisant par exemple une résine échangeuse d'ions. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 Dans des fioles de 500 ml on place 25 ml du milieu de culture (A) dont la composition est donnée dans le tableau IV ci-après, et on chauffe à llO"C pendant 5 minutes pour stériliser. On ajoute ensuite dans chaque fiole 1,0 g de CaC03 stérilisé séparément. TABLEAU IV Composition du milieu de culture Composant Milieu B B C D Glucose (g/dl) 10,0 3,0 - Ethanol (g/dl) - - 1,0 1,5 Sulfate d'ammonium (g/dl) 6,0 2,0 0,5 Acétate d'ammonium (g/dl) - 0,5 - 0,3 Urée (g/dl) - 0,2 0,2 KH2PO4 (g/dl) 0,1 0,1 0,1 0,1 MgS04 (g/dl) 0,04 0,04 0,04 0,04 FeSO4 (mg/dl) 1,0 1,0 1,0 1,0 MnSO4 (mg/dl) 1,0 1,0 1,0 1,0 Biotine ( g/1) 50 50 50 50 Thiamine, HC1 (pg/l) 20 20 50 200 Hydrolysat de protéines de soja (7,0 %) (mlldl) 1,0 2,5 2,5 1,5 CaCO3 (g/dl) 5,0 - - pH 7,0 7,5 7,5 7,5 On inocule Brevibacterium flavum AJ 11600 et AJ 11343 préalablement cultivés sur des tranches de gélose au bouillon dans chaque lot du milieu de culture et on cultive en agitant 3 310C pendant 72 heures.Après 72 heures de culture, on détermine par colorimétrie la L-arginine accumulée dans le bouillon de culture résultant et les résultats sont indiqués dans le tableau V cidessous. TABLEAU V Souche L-arginine accumulée AJ 11600 3,6 g/dl AJ 11343 3,5 g/dl On recueille un litre de bouillon de culture de AJ 1160G préparé de la même manière que ci-dessus et on centrifuge pour séparer les cellules microbiennes et le CaCO3 solide. On fait passer 1 litre de solution surnageante ainsi obtenue sur une colonne de résine Amberlite C 50 sous la forme NH4+, la L-arginine étant adsorbée sur la résine, et on élue par l'ammoniaque aqueuse de 2N. On evapore l'éluat et on refroidit la solution concentrée à faible température, suffisamment pour cristalliser la L-arginine. Lorsque la cristallisation est terminée, on sépare de la liqueur mère 23,3 g de L-arginine cristallisée. De manière semblable, on obtient 22,7 g de L-arginine cristallisée à partir du bouillon de culture de AJ 11343. Exemple 2 On cultive de la mème manière que décrit à à l'exemple 1 chacune des souches énumérées dans le tableau V ci-après, précédem- ment cultivées sur une tranche de gélose au bouillon et on détermine la quantité de L-arginine accumulée dans le bouillon de culture. Les résultats sont indiqués dans le tableau ci-dessous. TABLEAU VI Souche L-arginine accumulée (g/dl) AJ 3277 1,80 AJ 11595 1,92 AJ 11596 1,84 AJ 11597 1,90 AJ 11337 2,00 AJ 11338 1,90 AJ 11339 1,85 AJ 3278 1,70 AJ 11598 1,86 AJ 11599 1,91 AJ 11341 1,90 AJ 11342 1,85 AJ 11193 3,30 AJ 11600 3,60 AJ 11344 3,45 Exemple 3 On place 300 ml de milieu (C) indiqué dans le tableau IV dans un fermenteur de 1,0 1 et on chauffe à 110C pendant 5 minutes pour stériliser. On l'inocule ensuite avec 15 ml de bouillon de culture d'ensemencement de Brevibacterium flavum AJ 11599 préalablement cultivés dans le milieu (D) en conditions aérobies à 31"C avec agitation et aération. Pendant la culture, on maintient le pH du milieu dans l'intervalle de 7,2 à 8,0 avec addition d'acide acétique et de solution diacide acétique. Après 55 heures de culture, il stest accumulé dans le bouillon de culture 4,24 g/dl de L-arginine. Le volume de solution d'acide acétique utilisé pendant la culture est de 20 % du volume initial du milieu de culture. A partir de 300 ml du bouillon de culture ainsi préparé, on obtient 9,20 g de L-arginine cristallisée de la meme manière que décrit à l'exemple 1. Exemple 4 On cultive Brevibacterium flavum AJ 11343 dans le milieu (D) indiqué dans le tableau IV a 31"C pendant 18 heures avec agitation et aération pour préparer un bouillon de culture d'ensemencement. On place ensuite 300 ml de milieu (C) dans un fermenteur de 1,0 litre, on stérilise à 11000 pendant 5 minutes, on inocule avec 15 ml du bouillon de culture d'ensemencement et on maintient à une température de 31"C avec agitation et aération. Pendant la culture on maintient le pH du milieu entre 7,2 et 7,8 au moyen de gaz ammoniac. La concentration de l'éthanol dans le milieu est déterminée par chomatographie gazeuse et on introduit de petites portions d'éthanol dans le milieu lorsque la concentration en éthanol atteint environ 0,3 %. Après 48 heures de culture, on a consommé 48 g d'éthanol et on trouve 2,57 g/dl de L-arginine dans le bouillon de culture. On récupère 4,75 g de L-arginine de la manière indiquée b l'exemple 1. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus a titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production de L-arginine par èr- mentation, consistant (a) à cultiver en conditions aérobies dans un milieu de culture un mutant capable de produire la L-arginine appartenant au genre Brevibacterium ou Coryneba cterium, et (b) à récupérer la L-arginine accumulée dans le milieu de culture5 caractérisé en ce que ledit mutant est résistant à l'acide céto- malonique, à l'acide fluoro-malonique, à l'acide monofluoro-acétique ou aux antagonistes des aspartates. 2. Procedé selon la revendication 1, caractérisé an ce que ledit mutant appartient à l'espèce Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divaricatum, Coryne bacteriun glutamicum ou Corynebacterium acetoacidophilum. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant à l'aspartylhydrazine, à l'acide diaminosuccinique ou l'hadacidine. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant aux médicaments du type sulfa- mide ou aux antagonistes de l'arginine. 6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit mutant est resistant aux médicaments du type sulfa mide ou aux antagonistes de l'arginine. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant aux médicaments du type sulfadiazine, sulfaguanidine ou 2-thiazolealanine. 8. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant aux médicaments du type sulfadiazine, sulfaguanidine ou 2-thiazolealanine. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant à la 2-thiazolealanine et la sulfaguanidine. 10. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant à la 2-thiasolealanine et la sulfaguanidine. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant à la sulfadiazine et à la ss-aspartyl- hydrazine, à la sulfadiazine et à l'acide diaminosuccinique, à la sulfadiazine et l'hadacidine, à la 2-thiazolealanine et à la sulfaguanidine et à la ss-aspartylhydrazine, ou à la 2-thiazolealanine, à la sulfaguanidine et à l'hadacidine. 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant a la sulfadiazine et à l'acide cétomalonique, à la sulfadiazine et à l'acide fluoro-malonique, à la sulfadiazine et à l'acide monofluoro-acétique, ou à la 2-thiazolealanine et à la sulfaguanidine et à l'acide monofluoro-acétique.