Brevet FR2487642A2 — publié le 19820205

FR 2487642 A2 19820205 FR 8016970 A 19800731 La présente invention se rapporte à des changements, additions et perfectionnements apportés au brevet français- nO 79/08555 pris le 4 avril 1979 pour "Procédé de préparation de protéines animales ou végétales, particulièrement de lactoprotéines, et nouveaux produits ainsi obtenus. Dans le brevet principal, on décrit un procédé de préparation de protéines animales ou végétales, en particulier de lactoprotéines, en utilisant la chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions. Avant ce traitement chromatographique, on soumet les matières premières à des prétrai- tements physico-chimiques judicieusement choisis,conduisant à l'isolement et au fractionnement des protéines présentes sous un état original. Ces isolats protéiques sont ensuite traités par des opérations leur conférant des propriétés particulièrement intéressantes et valorisantes dans l'industrie alimentaire. Ainsi, on transforme les protéines pour leur conférer des propriétés originales et un meilleur inté rét économique, en stabilisant, en exacerbant ou en révélant certaines de ces propriétés. Les matières premières utilisées dans le procédé du brevet principal sont choisies dans le groupe se composant de lait, de lait écrémé, de lactosérum doux ou acide, de babeurre, de colostrum, de toute autre matière protéique issue d'un lait de mammifère et de tout autre produit issu de la fermentation du lactose. En ce qui concerne les traitements physico-chimiques de la matière première, on utilise soit des traitements physiques, tels quel'action de la température, du pH, le passage sur résines, la concentration par des moyens acceptables dans l'industrie alimentaire (evaporation,ultrafiltraticn, ultracentrifugation,etc. ..), 1 'électrophorèse, la fonte et l'bxtru- sion, soit des traitements chimiques tels que l'action d'agents chimiques (par exemple, acides, sels, bases) et l'action d'enzymes (par exemple présure). Parmi les traitements physico-chimiques, il appa raît qu'un des traitements les plus prometteurs est le passage sur une membrane d'ultrafiltration. Un objet de la présente invention est de prévoir un procédé de préparation de fractions protéiques en associant, de manière appropriée, des techniques d'ultrafiltration et des techniques de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions. Un autre objet de la présente invention est d'associer les techniques d'ultrafiltration et les techniques de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions pour augmenter le rendement de ces différentes techniques, prises iso lément,et pour améliorer la qualité des produits obtenus. D'autres objets apparaîtront d'après la description suivante de la présente invention. Ces objets sont maintenant atteints, selon la présente invention, par un procédé de préparation de fractions protéiques en utilisant des techniques de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions, selon le brevet français nO 79/08555, dans lequel, avant ou après passage sur un système de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions sur résine, on soumet la matière première à un procédé d'ultrafiltration sur membrane. La matière première employée dans le procédé de la présente invention est choisie dans le groupe se composant d'au moins un des produits constitués par le lait écré mé, le lactosérum doux, le lactosérum acide, le babeurre, le colostrum et toute autre matière protéique animale ou végétale. Du point de vue quantitatif, l'association des techniques d'ultrafiltration et de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions permet d'augmenter les rendements d'ultrafiltration, en récupérant les fractions protéiques du perméat d'ultrafiltration sur l'appareil de chromatographie d'exclusion et d'augmenter le rendement de cet appareil en y traitant un produit ultrafiltré, car un avantage du prétraitement de la matière première par passage sur un dispositif d'ultrafiltration, avant la chromatographie, est de diminuer les cycles de passages de la matière première sur ce dernier appareil. En outre, on utilise les techniques d'ultrafiltration comme moyens de concentration de l'éluat provenant du passage dans l'appareil de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions.L'avantage de cette concentration est de ne pas dénaturer thermiquement les protéines comme c'est le cas avec les autres procédés de concentration, notamment l'évaporation sous vide. Du point de vue qualitatif, grâce à l'association des techniques d'ultrafiltration et de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions, on peut utiliser l'ultrafiltration comme moyen de concentration de l'effluent obtenu après passage sur une colonne de chromatographie, ce qui ne dénature pas les protéines et, en outre, ce qui isole sélectivement certaines fractions protéiques, telles que les a-lac talbumines. De plus, grâce a cette association, on peut r6- cupérer sélectivement les fractions protéiques du perméat d'ultrafiltration passées sur un système de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions, et on peut séparer les constituants des protéines, en particulier des protéines laitières ayant des applications particulières, ces constituants (tels que les peptides, les lactotransférines, les sérumalbumines et toutes autres fractions présentes en quantité minime) ne pouvant pas être récupère~ par d'autres procé- dés. On peut encore améliorer cette technique en faisant subir a la matière première, avant ou durant le traitement d'ultrafiltration, une protéolyse par voie enzymatique,chimique ou thermique, afin de couper la matière de départ en constituants à poids moléculaires inférieurs, ce qui augmente ainsi la teneur en fractions azotées à faibles poids moléculaires (moins d'environ 15.000) du perméat. Ce dernier procédé, dans un exemple de réalisation préféré, est tel qu'on associe l'ultrafiltration et le traitement de protéolyse en fixant l'enzyme sur la membrane d'ultrafiltration, ce qui entraine une nette amélioration de la productivité. En associant les techniques d'ultrafiltration et de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions, on obtient des fractions protéiques sous forme native (non dénaturée), conservant ainsi leurs propriétés d'origine. Si on veut conférer à ces fractions protéiques des propriétés spécifiques, on leur ajoute des substances spécifiques telles que définies dans le brevet principal, ou on leur fait subir des traitements physico-chimiques tels qu'indiqués dans le brevet principal. Les produits obtenus en partant d'une matière première lactique sont principalement :: les peptides, les protéines-peptones, les acides aminés, les lactotransférines, les ss-lactoglobulines, les a-lactalbumines, les sérumalbumines, les immunglobulines -, ou tout autre produit présent en quantité peu importante dans la matière première. Les fractions protéiques obtenues peuvent être employées dans les industries-alimentaires, chimiques ou phar maceutiques pour leurs propriétés fonctionnelles, thérapeutiques ou nutritives. En particulier, par suite de leurs propriétés moussantes -, gélifiantes, émulsionnantes et séquestrantes, on peut employer les fractions protéiques dans les industries alimentaires (produits de boulangerie, de patisserie, de confiserie, de charcuterie, de fromagerie, produits pour crèmes glacées, etc...) et dans les produits cosmétiques. Par suite de leurs propriétés nutritives et thérapeutiques, les fractions protéiques peuvent être avantageusement employées dans les industries pour l'alimentation ani male (suppléments d'aliments pour animaux), dans les industries pour l'alimentation humaine (produits diététiques, laits maternisés et pour enfants) et dans les industries pharmaceutiques et vétérinaires (emploi des immunglobulines dans les médicaments). Des essais indiquent que les immunglobulines pour raient être utilisées dans des traitements préventifs des nouveaux nés qui sont à la naissance totalement dépourvus d'anticorps. En effet, ces immunglobulines pourraient fournir une protection contre la septicémie au cours des premières vingt-quatre heures de vie du nouveau né (période pendant laquelle la barrière intestinale des veaux, comme celle des agnelets, est totalement perméable). Après cette période, les immunglobulines "tapissent" la paroi interne de l'intestin et peuvent, de ce fait, prévenir ou même traiter les diar rhées. La présente invention sera maintenant décrite à l'aide des exemples suivants qui ne sont donnés qu'a titre d'illustration et non pas de limitation de la présente invent ion. EXEMPLE 1 On récupère le perméat (2.600 litres) provenant de l'ultrafiltration du lait ou du sérum (8.000 litres de lactosérum), dont la composition moyenne est la suivante Extrait sec 37,9 g/l Matière azotée N x 6,39 1,8 g/l Ce perméat peut être concentré ou non par des techniques classiques, et ensuite refroidi à 50C. On le percole directement sur deux colonnes de chromatographie en série une colonne anionique, suivie d'une colonne cationique. Une variante peut consister à modifier l'ordre de passage, le nombre et la qualité des colonnes mises en jeu. Après passage d'acide chlorhydrique 1N (50 litres), on isole à partir de la première colonne un éluat dont la teneur en protéines est voisine de 70 z et dont la composition indique la présence d'une grande quantité de sérumalbumine (500 g de protéines récupérées dont environ 5 % de sé rumalbumine. EXEMPLE 2 Une variante peut être apportée en ajoutant, au cours de ou avant l'opération d'ultrafiltration, une proté"- ase que l'on fait agir sur le lait ou le lactosérum (1.200 litres) en ajutant les paramètres d'hydrolyse. On peut ainsi choisir une alcalase (2 g pour 30 litres de lait), que l'on laisse agir à un pH de 5 à 8,5, préférentiellement de 7 à 8 pendant plusieurs heures. Be perméat qui resulte de l'ultrafiltration du produit protéolysé, est riche en peptides.La mise en oeuvre de la chromatographie d'échanges d'ions et d'exclusion permet, de la même façon que dans l'exemple 1, de récupérer une matière protéique concentrée (environ 4 kg de protéines), plus ou moins chargée en fractions peptidiques selon le degré d'avancement de l'hydrolyse (80 % de peptides dans les conditions précédentes). En fonction de la qualité et de l'action des protéases mises en jeu, on isole ainsi des fractions dont les propriétés technologiques (moussantes, émulsionnantes...) les rendent utilisables dans l'industrie alimentaire, en cosmétologie ou dans les domaines des thérapies humaines ou vétérinaires. EXEMPLE 3 On concentre un lactosérum (150 litres) au moyen de-l'ultrafiltration jusqu'à un facteur de concentration voisin de 5 de façon à obtenir un produit (30 litres de reten- tat) dont la teneur en protéines est voisine de celle d'un lait. La composition de ce rétentat est approximativement la suivante Extrait sec 97,5 % Matière azotée 36,3 % Cendres 8,25 % On le refroidit à environ 50C. On percole successivement sur les colonnes anionique et cationique, comme dans les exemples du brevet principal. Toutefois, par rapport au fonctionnement habituel mis au point sur du lactosérum, on peut diminuer la quantité de liquide injecté proportionnellement au facteur de concentration, et diminuer ainsi la durée des cycles de travail. Ceci peut permettre d'augmenter, de ce fait, la productivité globale de l'installation. De plus, en ajustant le facteur de concentration de façon à apporter une quantité de protéines suffisante pour saturer les sites de fixation, il est possible de travailler en lit fixe. De même, un gain de productivité peut être observé du fait de l'augmentation du rapport protéines/cendres. En effet, lors de l'échange d'ions, l'ensemble des anions entre en compétition avec les protéines au niveau des sites de fixation. La valeur du facteur de concentration pour travailler en lit fixe est de 10 et le gain de productivité est de 15 %. EXEMPLE 4 On percole successivement sur colonnes anionique, puis cationique, une quantité de lactosérum (240 litres) en excès par rapport a la capacité de fixation (10 kg) des résines. Les p-lactoglobulines se fixant préférentiellement aux o-lactalbumines, on peut parvenir à obtenir un effluent ne contenant plus que cette dernière fraction. Cet effluent étant très dilué, l'ultrafiltration permet de récupérer et de concentrer sélectivement la fraction a-lactalbumine - soit pour se placer à la composition d'un équi valent sérum débarrassé de p-laetoglobuline à 12 ou 13 % de protéines, - soit pour obtenir un concentré protéique de a-lactalbumine pouvant aller jusqu'à des puretés protéiques supérieures à 60 %. Dans les deux cas, ce type de produit est particulièrement adapté à l'utilisation dans les laits maternisés. Ainsi, dans les conditions précédentes, on recueille les 80 derniers litres d'effluent et, la capacité de fixation de la résine étant de 90 mg/g, on récupère - 0,9 kg de p-lactoglobuline par élution - 0,4 kg d'a-lactalbumine dans l'effluent. Le même type de traitement et d'application peut être effectué sur un effluent n'ayant pas subi de percolation sur une colonne cationique, contenant donc le mélange de a-lactalbumine et d'immunglobulines, ou bien sur un effluent de colonne cationique ne contenant plus que les im munglobul ines seules. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de fractions protéiques en utilisant des techniques de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions sur résines, selon le brevet français nO 79/08555, caractérisé en ce qu'avant ou après passage sur un système de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions sur résine, on soumet la matière première à un procédé d'ultrafiltration sur membrane. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matière première est choisie dans le groupe se composant d'au moins un des produits constitués par le lait écrémé, le lactosérum doux, le lactosérum acide, le babeurre, le colostrum et toute autre matière protéique animale ou vé gétale. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'on récupère sélectivement les fractions protéiques du perméat d'ultrafiltration pas sées sur un système de chromatographie d'exclusion et d'échan- ge d'ions, et on sépare les constituants des protéines à applications particulières, présentes en quantité minime dans la matière première. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'avant ou durant le traitement d'ultrafiltration,la matière première est soumise à une protéolyse par voie enzymatique, chimique ou thermique, afin d'augmenter, dans le perméat, la teneur en fractions protéiques à poids moléculai- res inférieurs à environ 15.000. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'enzyme est fixée sur la membrane d'ultrafiltration. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que,dans le cas ot l'on emploie une matière première lactique, les fractions protéiques obtenues sont choisies parmi des peptides, des protéines-peptones, des acides aminés, des lactotransférines, des (3-lac- toglobulines, des a-lactalbumines, des sérumalbumines , des immunglobulines et d'autres produits présents en quantité minime dans la matière première. 7 - A titre de produits industriels nouveaux,fractions protéiques obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 a 6. 8 - Produits selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus sous forme native (non dSna- tubée). 9 - Produits selon la revendication 7, caractéri- sés en ce qu'on confère aux produits des propriétés spécifiques en leur faisant subir des traitements physico-chimiques ou en leur ajoutant des composés spécifiques, tels que definis dans le brevet français nO 79/08555. 10 - Utilisation des produits indiqués dans l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce que ces produits sont employés dans l'alimentation humaine ou animale, en pharmacie ou en cosmétologie, en raison de leurs propriétés fonctionnelles, thérapeutiques ou nutritives.