Brevet FR2491493A1 — publié le 19820409

La production de L - isoleucine, L - valine et autres aminoacides par fermentation a été le sujet de recherches considérables.-De nombreuses espèces de microorganismes ont été employées avec divers analogues de Lisoleucine, thréonine, valine et autres. On sait, par le brevet U. S. 3 893 888, que la L-valine peut être produite à partir de souches mutantes deBrevibacterium résistant à l'acide o-amino-e-hydroxy valérique (AHV). Les voies de biosynthèse dansBrevibacterium,pour la production de Lisoleucine utilisant l'éthionine et AHV comme antagonistes, ont aussi également été étudiées. On peut voir: Ikeda, S., I. Fujita et Y. Hirose. (1976). "Culture condi_ tions of L-isoleucine fermentation from acetic acid". Agr. Biol. Chem., 40(3), 517-522. Ikeda, S., I. Fujita et F. Yoshinaga. (1976). " Screening of L-isoleucine producers among ethionine resistant mutants of L-threonine producing bacteria". Agr. Biol. Chem., 40(3), 511-51t6. Shiio, Isamu, A. Sasaki, S. Nakamori et K. Sano. (1973). " Production of L-isoleucine by AHV resistant mutants of Brevibacterium flavum ". Agr. Biol. Chem. 3(9) 2053-2061. Plusieurs articles généraux sur les voies de biosynthèse pour la production de L-isoleucine ainsi que d'autres aminoacides ont également été publiés. On peut voir: Szentirmai, A. et I. Hovath o (1976). "Regulation of branched-chain amino acid biosynthesis". Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung., 2, 137-149. Umbarger, H. E. (1974). "The elements involved in the multivalent regulation of the isoleucine and valine bio- synthetic enzymes of the enterobacteriaceae". Proceedings of the 1st. IntersectionalCongress of IAMS, Tokyo. Umbarger, H. E. (1973). "Genetic and physiological regulation of isoleucine, valine and leucine formation in the Enterobacteriaceae". de " Genetics of Industrial 2 2491493 Micro- organisms". La voie de biosynthèse pour la production de L-isoleucine dans Serratia marcescens a également été étudiée de façon intensive en utilisant divers antago - nistes comme isoleucine hydroxamate, et 1 acide o- aminobutyrique. Les voies de production de L-isoleucine dans E.coli ont également été étudiées en utilisant des antagonistes comme la thiaisoleucine. L'acide Alpha- aminobutyrique a également été employé comme antagoniste pour l'étude de la production de L-isoleucine dans Bifido- bacterium. La production de L-isoleucine a également été étudiée dans le micro-organisme du genre Pseudomonaq Salmonella ( en utilisant la 51, 51, 51-trifluoroleucine comme antagoniste) et dans Streptomyces rimosus. En plus de ce qui a été décrit ci-dessus, de nombreux procédés ont été brevetés pour la production de L-isoleucine. Voir le brevet U. S. NO 3 058 888 (souches de Pseudomonas nécissitant 1' acide "-aminobutyrique); le brevet U. S. NO 3 231 478 (Brevibacterium nécessitant la thréonine); le brevet U. S. N 3 262 861 (Brevibacteri=n nécessitant l'acide "aminobutyrique); le brevet Uo S. N 3 532 600 (Arthrobacter citreus nécessitant l'acide "-aminobutyrique); le brevet U. S. 3 671 396 (Brevibac - terium nécessitant l'acide "-aminobutyrique, l'acide "- hydroxybutyrique ou la thréonine) et le brevet U. S. N 3 841 968 (Serratia marcescens nécessitant la L-thréonine, la L-homosérine ou l'acide L-aspartique avec résistance à 1' isoleucine hydroxamate et/ou l'acide "-aminobutyrique). La présente invention concerne un procédé de préparation de L-isoleucine, qui consiste à mettre en culture, en conditions aérobies, une souche mutante de brevibacterium thiogenitalis résistant à un analogue de la Lisoleucine. La mise en culture, c'est-à-dire la fermentation, est effectuée en présence d'un précurseur biosynthétique post-thréonine de la L-isoleucine pour accumuler la L-isoleucine dans le bouillon de fermentation 3 2 4 92491493 Les souches sauvages de Brevibacterium thiogenitalis ( c'est-à-dire,ATCC 19240)choisies pour la mutation sont caractérisées par une surproduction de l'acide glutamique. Les souches mutantes utiles dans l'invention ne nécessitent pas de précurseur pour la croissance mais nécessitent le précurseur pour la production de L-isoleucine. En l'abscence du précurseur, la production passe à L-valine. La voie de la biosynthèse selon laquelle des micO.organismes produisent la L-isole.- cine est généralement connue. On peut par exemple se référer à Umbarger, "'Amino Acid Biosynthesis and Its Regulation", Ann. Rev. Biochem. 1978. 47:533-606. Comme cela est indiqué dans cette référence, on pense que la synthèse se passe par les stades qui suivent: thréonine; "-cGtobutyrate; "-ac - méthylvaldrate; "-ceto-g-méthylvalérate; L-isoleucin6 Le terme "précurseurs post-thréonine" est destiné à inclure les précurseurs de la L-isoleucine subséquents à la thréonine et composés semblables, c'est-à-direl'aci- de c-hydroxy butyrique et l'acide "-amino-n-butyrique. En général, les précurseurs peuvent être employés sous la forme d'acides ou de leurs sels solubles dans l'eau, comme des sels de métaux alcalins, en préférant le sel de sodium. Les mutants décrits ci-dessus sont caracté - risés en ce que la conversion de thréonine en i- cétobutyrate est empêchée, en effet pour produire la L- isoleucine plutôt que la L-valine, le précurseur post- thréonine deLisoleucine doit être présent. Certains analogues des aminoacides se présentant naturellement sont appropriés à un isole- ment des souches mutantes suivant l'invention. Ces analogues sont toxiques vis àvasdes souches qui ne surproduisent pas la L-isoleucine. De tels analogues comprennent l'acide "-amino-p-hydroxyval6rique; la méthylglycine; la gamma-déshydroisoleucine; la 3-cyclo- pentine-l-glycine; la 2-cyclopentène-l-glycine> la o- méthylthréonine; et la e-hydroxyleucine. Le mutant résistant à l'analogue d'isoleucine 4- 2491493 peut être obtenu par irradiation aux ultra-violets, d'une souche du type sauvage de Brevibacterium thiogeni- talis ou en traitant la souche sauvage avec un mutagène comme de l'éthyl méthane sulfonate, de la N-méthyl-N1- nitro-N-nitrosoguanidine et autres. Ensuite la souche peut être mise en culture en présence de l'.analogue pour isoler les colonies qui surproduisent la L-isoleucine. Par exemple, la souche non en rapport peut être mise en culture à 300C pendant 2 à 7 jours sur des plaques d'agar ayant la composition qui suit: peptone d'hydrolysat de gélatine: 5,0 g/l; extraits de boeuf: 3,0 g/l; agar, 15 g/l; sels de sodium de l'acide 2 Hydroxy-A-valérique, 25 g/l. Une culture viable d'une souche mutante produisant la L-isoleucine de Brevibacterium thiogenitalis résistant à l'acide (-amino-bhydroxyvalérique a été déposée au " American Type Culture Collection ", 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, sous le N ATCC 31723. La fermentation des souches mutantes isolées de Brevibacterium thiogenitalis peut être accomplie par mise en culture avec secousses ou fermentation submergée en conditions aérobies. La fermentation est effectuée à à 45 C et à un pH de 5 à 9. On peut employer du carbonate de calcium et de l'ammoniac pour l'ajustement du pH du milieu. Le milieu de fermentation contient une source de carbone, une source d'azote et autres éléments. On peut citer comme sources appropriées de carbone pour la fermentation, des sucres fermentables, des hydrolysats de protéines et des protéines. On peut citer comme exemple de sources appropriées d'azote, l'urée, les sels d'ammonium d'acides organiques ( comme l'acétate d' ammonium et l'oxalate d'ammonium) et des sels d'ammonium d'acides inorganiques ( comme le sulfate d' amxaniun, le nitrate d' ammonium ou le chlorure d'ammonium). Les quantités des sources de carbone et d'azote dans le milieu sont comprises entre 0,001 ec20.en poids/volLume pour cent. De mtme des aliments nutritifs ( comme de la liqueur de trempage de maiside la peptone, des extraits de levure) et/ou des éléments inorganiques ( comme du phosphate de potas- sium, du sulfate de magnésium, des vitamines comme la biotine et la thiamine, et des aminoac des comme la. L- isoleucine et la valine) peuvent être ajoutés au milieu. La quantité de précurseur de L-isoleucine est comprise en- tre 0,001 e20 Epoids/mbme pour cent du milieu.La fermenta- tion est accomplie en 16 à 176 heures,et la L-isoleucine s'accumule dans le bouillon de fermentation. Quand la fermentation est terminée, c'est à dire que de 0,1 à 6 %enpoids/volume de L-isoleucine se sont accumulés dans le bouillon, les cellules et autres composants solides de la culture sont retirés du bouillon de fermentation par des processus tradi - tionnels comme un chauffage suivi d'une filtration ou d'une centrifugation. Des processus connus peuvent être employés dans la récupération et/ou la purification de la L-isoleucine à partir du filtrat ou de la solution du liquide surnageant. Par exemple, le bouillon filtré de fermentation est traité avec une résine échangeuse de cations forte. Alors la résine est éluée au moyen d'une solution alcaline diluée comme de l'ammoniaque aqueuse. Les éluats contenant la L-isoleucine sont combinés et concentrés. On ajoute à la solution concen- trée, un alcanol tel que du méthanol ou de l'éthanol. Les cristaux précipités peuvent être recristallisés dans un alcawl aqueux comme du méthanol aqueux et de l'éthanol aqueux pour donner des cristaux purs de L-isoleucine. Les exemples qui suivent illustrent les modes de réalisation préférés de l'invention Exemple 1. Des éprouvettes contenant chacune10 ml d'un tampon de phosphate à 0,1 M ( pH7,0) ont été inoculées 6 2491493 de cultures de Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 19240). On a agité vigoureusement la suspension résultante et 9 ml de chaque tube ont été transférés à un tube stérile de centrifugeuse o l'on a ajouté 10 ml d'ethyl méthane sulfonate ( EMS), pour produire une concentration de EMS de 0,06 M dans la suspension. Les suspensions ont été incubées à 30 Cpendant 18 heures et centrifugées pour isoler les cellules qui ont été remises en suspension dans de l'eau désionisée et de nouveau centrifugée. Ce processus a été répété plusieurs fois pour retirer 1' EMS. Exemple 2. Les micro-organismes mutés de 1 tl'exemple 1 ont été plaqués sur des plaques à gradient se composant de deux couches. La couche inférieure comprenait de l'acide - amino--hydroxy valérique (AHV), 25 g/l, et avait la composition qui suit: peptone hydrolysat de gélatine, ,0 g/l; extraitsde boeuf, 3,0 g/l; agar, 15 g/1l. La couche supérieure avait une composition semblable mais sans contenir d' AHV. Des colonies représentatives ont été choisies du côté " faible croissance " de la plaque et on les a utilisées pour inoculer les milieux qui suivent: peptone hydrolysat de gélatine, 5,0 g/l; extraits de boeuf, 3,0 g/l; et agar, 15 g/l. La fermentation a été effectuée pendant quatre jours à une température de 30 C dans des ballons de Erlenmeyer de 250 ml, tournant à 300 t/mn. Les milieux contenaient du glucose, 100 g/l; KH2P04, 3 g/l; Mg S04' 7 H20, 14 g/l; FeSO4' 7 H20,0,01 g/l; MnS04: 4 H20 0,01 g/l; (NH4)2S04, 50 g/l; biotine 100 mg/l; Thiamine HCl, 1000 mg/l; soytone, 0,64 g/l; CaC03, 50 g/l; pH 7,2 ajusté avec NaOH; et 10 g/l d'acide 0 -amino-n-butyrique. Les cultures lyophilisées obtenues par la technique de fermentation cidessus ont été déposées à l'American Type Culture Collection sous le N ATCC 31723. A l' analyse par chromatographie liquide à haute pression, les bouillons de fermentation de l' ATCC 31723 mis en culture comme on l'a décrit ci-dessus contiennent généralement 6 mg/ml de L-isoleucine. En l'abscence de l'acide DL-Vi-amino-n-butyrique, la production de Lisoleucine est fortement diminuée, par exemple à environ 0,2 mg/ml. Exemple 3 Selon le processus donné à l'exemple 2, le précurseur utilisé était l' tJcétobutyrate (sel de sodium) et la production de L-isoleucine obtenue était de 6 g/l. Exemple 4 La fermentation de B. thiogenitalis ATCC N 31723 a été effectuée sur un milieu consistant en: glucose, 10%; (NH4)2S04, 5%; KH2PO4, 0,30 %; MgS040 7H20, 0,04 %; Ca C03, 5%; soytone, 0,3%; biotine, 100pg/l; thiamine, 1, &g/1; 30 g/l d'acide o4-hydroxybutyrique, sel de sodium; et 1 ml/l d'une solution aqueuse de traces consistant en *: ZnS04 * 7 H20, 8,8 g/l; FeS04 ' 7 H20, 10,0 g/l; CaSO4 '5 H20, 0,06 g/l; Na2B407 10 H20, 0,088 g/l; Na2Mo204 ' 2 H20, 0,053 g/l, MnSO4 * H20,75g/l1 CoC12 ' 6 H20, 0,12 g/l; CaCl2, 0,055 g/l; a ster le pH à 2,0 avec H2SO4. A la suite du mélange, le pH du "bouillon" a été ajusté à 7,8 avec NaOH. ml du milieu ont été distribués dans des ballons d'Erlenmeyer empreints de 250 ml, qui ont été inoculés et que l'on a agités à 300 t/mn pendant cinq jours à 30 C. L'analyse par chromatographie liquide à haute pression a montré que 15,8 g/l de L-isoleucine amnt contente sdans le bouillon de fermentation filtré. 8 a 2491493 REVENDICATIONS R E V E N D I C A. T I 0 N S 1. Procédé de préparation de L-isoleucine, caracté- risé en ce qu'il consiste à mettre en culture, en conditions aérobies, une souche mutante de Brevibacterium thiogenitalis résistant à un analogue de L-isoleucine, 2adite mise en cultu- re étant effectuée en présence d'un précurseur biosynthétique postthréonine de L-isoleucine pour donner un bouillon de fermentation, et à récupérer la L-isoleucine accumulée dudit bouillon de fermentation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant précité est Brevibacterium thiogenitalis ATCC 31723. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration du précurseur dans les milieux avant fermentation est comprise entre 40X et15% en paidt me 4. Procédé selon la revendication 1, Caractérisé en ce que la fermentation précitée est effectuée à une tempé- rature comprise entre 20 et 45 C pendant 8 à 176 heures,. 5. Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que le pH des milieux de fermentation précités pendant la mise en culture est compris entre 5 et 9. 6. Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que le mutant précité est Brevibacterium thiogenitalis ATCC 31723 et en ce quela fermentation précitée est effectuée à une température comprise entre 20 et 45 C pendant 8 à 176 heures et à un pH de 5 à 9. 7. Procédé selon la revendication-1,caractérisé en ce que le précurseur précité est choisi dans le groupe consistant en acide "-hydroxy butyrique, acide o(-acéto-o- hydroxy butyrique, acide c, p-dihydroxy-p-méthylvalérique, acide c-c6to butyrique, et acide D,L -*-amino-n-butyrique et leurs sels de métaux alcalins. 8. Procédé selon la revendication 7,caractérisé en ce que le précurseur précité est l'acide e-céto butyrique ou son sel de métal alcalin. 9. Procédé selon la revendication $ caractérisé en ce que le précurseur précité est l'acide: D,L- -amino-n-butyrique ou son sel d'un métal alcalin. 10. Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que l'analogue précité est l'acide "-amino->-hydroxy valérique; la methylglycine; la gamma-deshydroisoleucine; la 3-cyclopentine-1-glycine; la 2-cyclopentène1-glycine; la o-methylthréonine; et la P-hydroxyleucine. 11. Procédé selon la revendication 10,caractérisé en ce que l'analogue précité est l'acide "-amino-p-hydroxy valérique.