Brevet FR2488895A1 — publié le 19820226

La présente invention concerne un nouvel anti- biotique, le SF-2103A et ses sels ainsi qu'un procédé pour sa production. On savait que divers microorganismes pouvaient produire des antibiotiques par culture dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote as- similables. Cependant, il existe encore une demande pour des antibiotiques nouveaux et utiles. A la suite d'études approfondies destinées à découvrir des antibiotiques nouveaux et utiles ayant un effet antibactérien vis-à-vis de diverses bactéries gram-positives et gram-négatives, y compris des bac- téries qui résistent aux antibiotiques connus, il a été découvert qu'un nouvel antibiotique, désigné ci-après sous le nom de SF-2103A, pouvait être obtenu par culture d'une souche appartenant au genre Streptomyces dans un milieu nutritif. L'antibiotique SF-2103A a été isolé et ses propriétés physiques et chimiques ainsi que ses carac- téristiques biochimiques ont été déterminées. Par conséquent, la présente invention fournit un nouvel antibiotique, le SF-2103A, répondant à la for- mule: CH CH l so SOH HO3SO Of N / COOH ainsi que ses sels, et un procédé pour la production de l'antibiotique SF-2103A et de ses sels. Les figures 1, 2 et 3 représentent respecti- vement un spectre d'absorption ultraviolet. un spectre d'absorption infrarouge et un spectre de résonance ma- gnétique nucléaire de l'antibiotique SF-2103A (sel de sodium). Comme exemple de souches produisant l'anti- biotiques SF-2103A telles que celle utilisée ici, on citera la souche Actinomyces SF-2103 isolée à partir d'un échantillon de sol recueilli à Katsuura, Préfecture de Wakayama, Japon. On met en suspension quatre grammes de l'échan- tillon de sol dans quarante millilitres d'eau stérilisée dans un Erlenmeyer de cent millilitres, on agite sur un agitateur rotatif pendant 10 minutespuis on laisse reposer pendant 15 minutes. Une fois cette période écou- lée, on dilue quatre millilitres du liquide surnageant 10.000 fois avec de l'eau'stérilisée. On place ensuite 0,5 millilitre du liquide ainsi diluée sur une assiette de Pétri préalablement stérilisée, on le mélange à 20 millilitres d'un milieu constitué d'agar-agar afin d'effec- tuer une séparation de la façon décrite ci-après, on le maintient à 45 -50 C puis on le laisse se solidifier. On cultive l'assiette de Pétri à 28 C pendant jours et on transfère les colonies de souche SF-2103 se développant sur-le milieu d'agar-agar vers une culture inclinée de levure-amridon (extrait de levure: 0,2 %, amidon soluble: 1,0 %, agar-agar: 2,0 %; pH: 7,0). La composition du milieu d'agar-agar destinée à la séparation est la suivante: - extrait de levure: 0,05 %; - amidon soluble: 0,25 %; - agaragar: 2,0 %; - reste: eau courante; - pH: 7,0 Les caractéristiques de la souche -Actinomyces SF-2103 sont les suivantes: (I) Caractéristiques morphologiques: Le mycélium et les spores se forment dans des milieux de culture tels que l'amidon, les flocons d'avoine, et la levure-malt. La ramification du mycélium aérien est monopodique et l'on ne constate pas de ramification spiralée. A l'extrémité supérieure du mycé- lium aérien, les spores constituent des chaînes prati- quement droites. Des structures particulières telles que le sclérotium et le sporangium ne sont pas observées. L'observation au microscope montre que des spores présentant une surface lisse, une forme ovale ou ovoide, et une taille de 0,7 à 0,8 x 1,0 à 1,5 microns forment généralement une chaîne de 10 spores ou davantage. ou davantage. (II) Caractéristiques de la culture Les caractéristiques de culture de la souche SF-2103 sur divers milieux de culture sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous. L'observation a été effectuée après culture à 280C pendant 14 à 21 jours. La couleur indiquée dans le tableau 1 a été identifiée sur la base de l'étalon de couleur du Color Harmony Manual, 4ième Edition, publié par la Container Corporation of America, Chicago, Illinois (1958). La couleur rose pale du mycélium aérien sur la culture d'amidon, la culture de flocon d'avoine et la culture de levure-malt disparaît rapidement lorsque l'ap- titude à la formation de spores diminue. En outre, le mycélium aérien présente une forte tendance à fondre et disparaître au fur et à mesure que la culture s'effectue sur un certain la-os de temps. - Milieu de culture avec de l'agar-agar Saccharose-nitrate Glucoseasparagine Glycérol-asparagine Amidon Flocons d'avoine Levure-malt Tyrosine Agar-agar nutritif Maléate de calcium Milieu de Bennett TABLEAU I Croissance et couleur inverse Croissance très faible incolore Croissance faible in- colore Croissance faible in- colore Croissance modérée beige pale Croissance modérée beige pale Forte croissance beige pâle Croissance faible incolore Croissance faible incolore Croissance faible incolore Forte croissance ridée Mycélium aérien Aucun Aucun Aucun Modéré rose pâle (5cb) Modéré rose pale (5cb) Modéré rose pale (5cb) Aucun Aucun Aucun Aucun Pigment soluble Aucun Aucun Aucun Légèrement gris-rose Aucun Aucun Aucun Aucun Aucun Aucun oe tu o n. (III) Caractéristiques physiologiques: (1) Gamme de températures de croissance: la croissance s'effectue sur un milieu d'amidon dans une gamme de 15 C à 45 C, la gamme de températures optimales étant de 25 C à 35 C. (2) Liquéfaction de la gélatine: positive (3) Hydrolise de l'amidon: positive (4) Coagulation du lait écrémé: négative Peptonisation du lait écrémé: positive (5) Réduction du nitrate: négative (6) Tolérance NaCZ: la croissance s'effectue sur un milieu de culture auquel on a ajouté 3 % de NaCk mais pas sur un milieu auquel on a ajouté 5 % de NaCú. (7) Production de pigment mélanoide: négative (IV) Utilisation de sources de carbone (Milieu d'agar-agar de Pridham and Gottlieb à 28 C) (1) Utilisables: D-Glucose, L-Rhamnose, D-Fructose, D-Xylose, L-Arabinose, DMannitol, Saccharose (2) Non utilisables: Raffinose, I-Inositol (V) Composition de la paroi cellulaire: L'analyse effectuée conformément à la méthode proposée par Becker et al., dans Applied Microbiology, Vol.13, p. 236 (1965) montre que l'acide diaminopimélique contenu dans la composition de la paroi cellulaire est du type LL. Pour résumer les caractéristiques décrites ci- dessus, la souche SF-2103 appartient au genre Streptomyces, l'extrémité supérieure du mycélium aérien est droite et la structure superficielle des spores est régulière. La nuance de couleur du mycélium aérien arrivé maturation appartient à la classe des couleurs rouges de H.D. Tresner and E.J. Backus, Applied Microbiology, Vol.11, p. 335 (1963), et la couleur inverse est le beige pâle. La formation de pigment mélanolde n'est pas observée. En comparant les caractéristiques taxonomiques ci-dessus de la souche SF-2103 à celles des souches con- nues appartenant au genre Streptomyces, on a pu identifier la nouvelle espèce constituée par la souche SF-2103. Il a été observé que bien qu'on ne connaisse pas de souche présentant des propriétés identiques à la souche SF-2103, la souche Streptomyces alborubidus (Inter- national Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 22, pp. 271-273 (1972)> était pratiquement semblable à celle-ci. On a donc comparé la souche étalon Streptomyces alborubidus, ISP No. 5464 CISP: International Streptomy- ces Project (International Journal of Systematic Bacterio- logy, Vol.18, p.69 (1968)), à la souche SF-2103. Celles-ci se distinguent nettement en ce qui concerne leur croissance sur divers milieux à l'agar-agar bien qu'elles soient relativement identiques en ce qui concérne la nuance de couleur du nwycélium aérien et l'utilisation de sucre. En effet, la croissance du Streptomyces alborubidus sur un milieu de saccharose-nitrate et sur un milieu de glucose-asparagine est satisfaisante, et la formation de mycélium aérien est satisfaisante, alors que la croissance de la souche SF-2103 sur les milieux décrits ci-dessus est très faible et que l'on n'observe pas de formation de mycélium aérien. Au contraire, sur un milieu de flo- cons d'avoine, la souche SF-2103 se développe d'une façon satisfaisante et il se produit une formation de mycélium aérien alors que la croissance de Streptomyces alborubidus est faible. En outre, on observe souvent que l'extrémité supérieure du mycélium aérien du Streptomyces alborubidus présente une forme de boucle ou de crochet, alors que celui de la souche SF-2103 est toujours droit. De plus, on ne connaît pas de souche qui présente la nuance de couleur du mycélium aérien, dans la classe des couleurs rouges, la forme droite du mycélium aérien, et la surface de spore régulière que l'on observe sur la souche SF-2103. En conséquence, on a conclu que la souche SF-2103 est différente de toute les espèces apparte- nant au genre Streptomyces qui ont été décrites jusqu'à présent et qu'elle constitue une nouvelle souche, de sorte que la souche SF-2103 a été dénommée Streptomyces sulfonofaciens sp. nov. Cette souche a été déposée sous le non de Streptomyces sp. SF-2103 à l'Institut de Recherche sur la fermentation, Agence pour la Science et la Technolo- gie Industrielle, Ministère du Commerce International et de l'Industrie du Japon sous le numéro matricule FERM-P No 5636 (21 Juin 1980) [ce numéro matricule est actuelle- ment FERM-BP No 5 (ler Mai 1981) (conformément au TRAITE DE BUDAPEST SUR LA RECONNAISSANCE INTERNATIONALE DU DEPOT DE MICROORGANISME A DES FINS DE DEPOT DE BREVET)] et à l'American Type Culture Collection (ATCC) sous le numéro matricule ATCC 31892 (9 Mai 1981). La souche SF-2103 présente des propriétés va- riables comme c'est-le cas pour d'autres souches appar- tenant au genre Streptomyces. Ces variations peuvent être provoquées par une irradiation par exemple par des rayonne- ments ultraviolets, par des rayons X, par des ravonnements radioactifs, et par des substances chimiques. En conséquence, toutes ces variantes et tous ses mutants peuvent être utilisés dans le procédé de l'invention pour autant qu'ils soient capables de produire le SF-2103A. Le procédé de l'invention consiste à cultiver la souche décrite ci-dessus dans un milieu contenant des agents nutritifs pouvant être assimilés par les microorga- nismes connus. Ces agents nutritifs peuvent être des produits connus couramment utilisés pour la culture des souches Actinomyces. Comme exemples de sources de carbone pouvant être utilisées, on citera le glucose, le glycérol l'amidon, la dextrine,- la sirop de maltose, la mélasse et l'huile de soja. Comme exemples de sources d'azote pouvant 248889S être utilisées, on citera la farine de soja, le germe de blé, la farine de graines de coton, l'extrait de viande, la peptone, l'extrait de levure, la liqueur de macération du maïs, le sulfate d'ammonium et le nitrate de sodium. En outre, on peut, si on le souhaite, ajouter des sels minéraux tels que le carbonate de calcium, le chlorure de sodium, le sulfate de magnésium, le sulfate de sodium, le chlorure de cobalt, le sulfate ferreux, et des phosphates (on préfère plus particulièrement le sulfate de sodium et le chlorure-de cobalt), ainsi que les substances organiques et inorganiques qui favo- risent la croissance microbienne et la production du SF-2103A souhaité. En outre, on peut si on le souhaite ajouter un agent antimousse (tel que le Silicone KM68-2F (produit par la Shin-Etsu Chemical Industry Co, Ltd, Tokyo)). Pour la culture du Streptomyces sp. SF-2103, la méthode de culture liquide, et en particulier la méthode de culture immergée dans des conditions d'aé- ration; est la plus appropriée, comme cela est souvent le cas pour la production d'antibiotiques connues. La gamme de températures appropriée à la culture est de 'C à 350C. Dans de nombreux cas, on préfère effectuer la culture dans une gamme de températures de 230C à 300C. La production de SF-2103A atteint généralement un maximum au bout de un à dix jours, que ce soit dans un bouillon de culture agité ou dans un bouillon de culture en réservoir (culture immergée), bien que la durée optimale varie en fonction du milieu et de la méthode de culture utilisés. Le SF-2103A peut être déterminé quantitative- Fient en mesurant son activité antibactérienne par une technique de test biologique en utilisant une souche adéquate comme organisme d'essai, comme cela est le cas des antibiotiques classiques, car elle est une substance antibactérienne et présente une activité anti- bactérienne vis-à-vis des bactéries gram--positives et gram-négatives. Cependant, comme le SF-2103A est une substance caractérisée par le fait qu'elle présente une forte activité inhibitrice de la e-lactamase ainsi qu'une activité antibactérienne, on peut également uti- liser une méthode d'essai de l'activité inhibitrice de la e-lactamase de la façon décrite ci-après pour déter- miner sa quantité avec rapidité et précision. La nouvelle méthode d'essais mise au point consiste à utiliser comme 0-lactamase une endo-e-lacta- mase produite par Proteus vulgaris M-8243.On inocule de l'endo-elactamase dans un bouillon de culture de Kyokuto à 2 % (pH 7 avant stérilisation) et on la fait incuber à 32 C. Immédiatement après le début de l'in- cubation, et deux heures et quatre heures après le début de l'incubation, on ajoute un sel de potassium de benzylpénicilline en tant que substance d'induction de la e-lactamase de façon à ce que sa concentration soit de 250 pg/mú et on poursuit l'incubation pendant sept à huit heures après le début de celle-ci. A la fin de cette période, on interrompt l'incubation et on recueille la souche par séparation par centrifugation. On met en suspension la masse de cellules mouillées ainsi obtenue dans une solution tampon de phosphate 0,1 M (pH 7,0) dont le volume est le double de celui des cellules et on l'introduit dans un broyeur de cel- lules (par exemple une cellule sous pression française) o les cellules subissent une rupture. La suspension obtenue est soumise à une séparation par centrifugation (10 000 tours par minutes, 10 minutes) et le précipité de fragments cellulaires est éliminé. On dialyse le liquide surnageant ainsi obtenu pendant une nuit à l'aide d'une solution tampon de phosphate 0,1 M (pH 7,0) à 50C, et l'on obtient la solution de dialysat sous forme d'une solution brute de l'enzyme 0-lactamase. La solution de dialysat présente une activité de e- lactamase, déterminée par une variante de la méthode de Sergeant destinée à mesurer l'activité enzymatique décrite ci-après, de 5 000 6 000 unités (li/mZ). La 0-lactamase ainsi préparée est utilisée pour préparer une plaque d'essai. On stérilise une solution à 2,3 % d'agent nutritif Nutrient Agar (produit par la Difco Corp.) dans un autoclave et on la refroidit à 450C. A 250 mú de cette solution, on ajoute 5 mt d'une semence de Bacillus subtilis=ATCC 6633 ayant été préa- lablement cultivée dans le but d'un ensemencement, et une quantité de 125 unités de la solution de e-lactamase ci-dessus, puis on mélange ces ingrédients. Le mélange ainsi obtenu est versé dans une assiette plate de 250 mm x 320 mm et se solidifie dans celle-ci. Pour effectuer l'essai, on place 20 p9t d'une solution à- examiner sur un disque de papier (d'un dia- mètre de 8 mm) sur lequel on a versé 20 ut d'une solution dans de l'acétone aqueuse à 50 % de sel de Sodium de Cefalotine à une concentration de 50 pg/ mt puis on la laisse sécher à l'air. Le disque de papier ainsi préparé est placé dans l'assiette d'essai et après l'avoir maintenu à 370C pendant quinze à dix-sept heures, la zone inhibitrice apparaît en s'étendant sur une surface dépendant de la concentration en SF-1203A. Par cette méthode de détermination, le loga- rithme de la concentration en SF-2103A et le diamètre de la zone inhibitrice présentent une relation linéaire dans la gamme de 0,03pg/mt à 1g/mú de concentrations en SF-2103A. Par conséquent, on peut déterminer avec précision la quantité de SF-2103A. Le SF-2103A s'accumule principalement dans un filtrat de bouillon de culture. On peut extraire le SF-2103A contenu dans le bouillon de culture et le purifier en utilisant ses caractéristiques physiques et chimiques telles qu'elles sont décrites ci-après. Pour cette extraction et cette purification, on peut utiliser la méthode suivante. On filtre un bouillon de culture contenant les substances souhaitées pour éliminer les matières solides, et on adsorbe le filtrat obtenu sur du charbon activé que l'on élue ensuite avec une solution aqueuse à 50 % d'acétone. Les fractions contenant les substances souhaitées sont recueillies et concentrées. Apres éli- mination de l'acétone par distillation, on extrait les substances souhaitées par un haloalkane, tel que le dichlorométhane, contenant un sel d'ammonium quater- naire, tel que le le chlorure de benzyldiméthylcétyl ammonium ou le chlorure de benzyldiméthyltétradécyl ammonium, puis on les soumet de nouveau à une extrac- tion avec de l'eau contenant de l'iodure de sodium et on les soumet à une lyophilisation, ce qui donne le SF-2103A sous forme d'un produit brut. Pour purifier davantage le SF-2103A brut, on répète la chromatographie en utilisant des supports échangeurs d'anions tels que le DEAE-Sephadex A-25, le QAE-Sephadex A-25, la DEAE-cellulose, et le Dowex 1 x 2. En outre, on peut utiliser pour purifier davan- tage le SF-2103A brut des milieux filtrants sur gel tels que le Biogel P2, des résines poreuses telles que l'Amberlite WAD, des colonnes de cellulose, etc. L'analyse du SF-2103A pulvérulent ainsi puri- fié par chromatographie sur couche mince en utilisant divers solvants et d'autres méthodes analytiques (par exemple l'électrophorèse sur papier sous tension éle- vee et la chromatographie en phase liquide à vitesse élevée) confirment qu'il s'agit d'une substance unique. Le SF-2!03A est très instable à des températures supérieures à la température ambiante ou à l'état acide ou alcalin, comme on va le décrire ci-après. En isolant le SF-2103A du bouillon de culture, on doit éviter que la solution ne devienne acide ou basique et toutes les opérations doivent être effectuées rapidement et à basse température. En outre, il est difficile d'isoler le SF-2103A sous forme d'acide libre car, comme on l'a décrit ci-dessus, il est très instable à l'état acide. Le SF-2103A est donc obtenu sous forme d'un sel de celui-ci à l'état d'une poudre amorphe jaune pale ou blanche par lyophilisation d'une solution aqueuse neutte de celui-ci. La pureté du SF-2103A obtenue varie en fonction de la concentration du bouillon de culture. Le-type de sel est déterminé par le cation utili- sé pour la purification. A titre d'exemple, lorsqu'on effectue la purification par chromatographie en utilisant du DEAE-Sephadex A-25 et avec de l'eau contenant du NaCL comme.éluat, on obtient le SF-2103A sous forme d'un sel de sodium de celui-ci. Comme sels pharmaceutiquement acceptable autres que le sel de sodium, on citera-des sels de métaux alcalin (tels que le potassium), des sels de métaux alcalino-terreux (tels que le calcium), des sels minéraux (tels que des sels d'aluminium et d'ammonium) et des sels organiques -(tels qu'un sel d'am- monium substitué) qui peuvent être préparés de la même façon que pour la préparation du sel de sodium. En outre, la conversion du sel de sodium en un autre sel peut être effectuée en faisant passer une solution aqueuse du sel de sodium à travers une résine échangeuse de cations telle que la Dowex 50W, qui a été préalablement chargée par les cations que l'on souhaite échanger. Dans ce qui suit, on décrira les propriétés phy- siques et chimiques du sel de sodium du SF-2103A que l'on pense être le produit le plus pur obtenu jusqu'à présent. On notera cependant que le sel de sodium du SF-2103A peut contenir de l'eau et d'autres impuretées car il est obte- nu sous forme d'une poudre lyophisisée. Les caractéristiques du nouvel antibiotique SF-2103A et de ses sels sont indiquées ci-après. Les carac- téristiques du sel de sodium du SF-2103A sont les sui- vantes: (1) Couleur et forme: obtenu sous formé d'une poudre blanche par lyophilisation. (2) Point de fusion le point de fusion n'est pas clairement déterminé. Une décoloration vers le brun et une décomposition donnant naissance à des bulles se produisent à 1680C. (3) Pouvoir rotatoire: [a]2:16,3 (c 1, eau) (4) Composition élémentaire et formule molécu- laire (l'échantillon est séché sous vide sur du pento- xyde de phosphore à la température ambiante pendant 27 heures puis est soumis à la mesure) Calculé pour C9H8N0OIS2Na3.2H20 Trouvé (%) (%) C 23,53 23,62 H 2,61 2,44 N 3,05 3,00 O 41,83 42,16 (équilibre) S 13,94 13,81 Na 15,03 14,97 (Déterminé par spectroscopie d'absorption atomique) On estime que la masse moléculaire est d'environ 450 sur la base des valeurs de l'analyse de la composition élémentaire et du spectre de résonnance magnétique nucléaire. (5) Spectre d'absorption ultraviolet: le spectre d'absorption ultraviolet tel qu'il est déterminé sur un tampon de phosphate de 0,02M (pH 7,2) présente des maxi- 1% mas d'absorption à 266 - 267 nm (EC1 = 126) et à 1% 'lcm 230 nm (E1m = 118) comme le montre la figure 1. 1cmn (6) Spectre d'absorption infrarouge: le spectre d'absorption infrarouge, tel qu'il est déterminé par la méthode de la pastille de bromure de potassium, est re- présenté sur la figure 2 et présente des bandes d'absorption à 3450, 1755, 1610, 1390, 1220, 1080, 1040, 940, 900, 780 cm -1 (7) Spectre de résonnance magnétique nucléaire: le spectre de résonnance magnétique nucléaire à 100 MHz tel qu'il est déterminé dans de l'eau lourde avec du tétraméthyl silane en temps qu'étalon externe, est représenté sur la figure 3 et présente des signaux à 6 1,55 (d, 3H), 6 2,99 (dd, 1H), 6 3, 44 (dd, 1H), 6 3,94 (dd, 1H), 6 4,48 (m, 1H), et 6 4,94 (m, 1H). (8) Chromatographie sur couche mince: (a) Les valeurs Rf telles qu'elles sont déterminées sur une couche mince de cellulose (Cellulose F254, produite par Merck and Co.) avec le solvant indiqué ci-dessous à 5 C, sont les suivantes: Solvant Rf n-bufanol/isopropanol/eau 0,30 (7/7/6 en volume) Solution aqueuse à 70 % en 0,52 volume de n-propanol Solution aqueuse à 70 % en 0,62 volume d'éthanol Solution aqueuse à 80 % en 0,37 volume d'acétonitrile (b) Lorsqu'on effectue une mesure sur une DEAEcellulose (Polygram CEL 300 DEAE, produite par Mercherry Nagel Corp.) avec un tampon de phosphate 0,02M (pH 7,2) contenant du chlorure de sodium 0,1M à 5 C, MC 696-SY2-A utilisé comme témoin (cette substance décrite dans The Journal of Antibiotics, Vol. 30, p. 770 (1970)) et est identique à la substance MM 4550 (décrite dans The Journal of Antibiotics, Vol. 32, p. 295 (1979)), présente un Rf de 0,31 alors que le Rf de la substance 2103A de l'invention est de 0,14. (9) Electrophorèse sur papier sous haute tension: Lorsqu'on effectue une électrophorèse sur un pa- pier filtre, Toyo Filter Paper n 51 (produit par la Toyo Roshi Co., Ltd.) , d'une largeur de 15 cm avec le tampon décrit ci-après sous une tension constante de 2.800 volts pendant 15 minutes dans un appareil pour électrophorèse sur papier sous tension élevée (produit par la Servant Instrument Corp., source de haute tension électrique: HV 5000 A; réservoir d'électrophorèse: modèle LT 48A), le MC 696-SY2-A jouant le rôle de témoin (décrit dans la publication du brevet Japonais (OPI) n 14594/79 (le terme "OPI" tel qu'il est utilisé ici dési- gne "une demande de brevet Japonais non examinée publiée")) se déplace vers le côté de l'anode de 9,3 cm, alors que le SF-2103A de l'invention se déplace du côté de l'anode de 15,3 cm. La solution tampon est préparée en ajoutant de l'eau à 200 mú de pyridine et à 8 mî d'acide acétique de façon à ce que le volume total soit de 3 litres, et que son pH soit de 6,4. (10) Chromatographie en phase liquide à haute vitesse: D'après une chromatographie en phase liquide à haute vitesse dans les conditions décrites ci-après, le temps de rétention du MC 696-SY2-A (tel qu'il a été dé- crit ci-dessus) est de 5 minutes 40 secondes, alors que le SF-2103A de l'invention présente un temps de rétention d'environ 20 minutes. Conditions: Chromatographie en phase liquide à vitesse élevée Appareil.: ALC/GPC Modèle 244 (produit par la Waters Corp.) Colonne: ZIPAX SAX (produit par la Du Pont Co., diamètre interne: 7,9 nmm, longueur: 50 cm) Eluat: Préparé par dissolution de nitrate de sodium dans un tampon de phosphate de 0,05M (pH 7,2) à la concentration de 0,05M. Débit: 3 mZ/minute Longueur d'onde de détection de l'absorption ultraviolette: 313 nm and 254 nma Température: température ambiante (environ 20"C) (11) Solubilité: lrès soluble. dans l'eau, soluble dans le méthanol, et insoluble dans l'acétate d'éthyle, le chloroforme et le benzène. (12) Réactions colorées: Positive aux réactifs de Lemieux et Ehrlich, et négative à la Ninhydrine. Sur la base des propriétés physiques et chimiques décrites ci-dessus, on a conclu que cette substance (sous forme du sel trisodique de celle-ci) présente. la structure suivante: CH3CH C 3c 'I ±SO'Ka NaO3SO N 3 COONa Le SF-2103A présente des effets synergétiques lorsqu'on l'utilise en association avec les antibiotiques pénicilline et céphalosporine, qui ne sont pas efficaces vis-a-vis des bactéries résistantes produisant de la e- lactamase, puisqu'elle présente une activité inhibitrice de la e-lactamase qui est considérée comme étant la prin- cipale caractéristique du SF-2103A, ainsi qu'une activité antibactérienne. Dans ce qui suit, plusieurs résultats expérimen- taux sont décrits pour illustrer ces effets du SF-2103A. L'effet antibactérien du SF-2103A sous forme de sel de sodium a été déterminé par la méthode de dilution du milieu à l'agar-agar onforméent à la méthode normale recommandée par l'Association Japonaise de Chimiothérapie (voir Chemotherapy, Vol. 22, pp. 1126-1128 (1974)), et les résultats sont indiqués dans le tableau 2 ci-dessous. TABLEAU 2 Concentration inhibitrice Organisme d'essais minimale (pg/mf) Staphylococcus aureus 209P 25 Staphylococcus aureus Smith 25 Bacillus subtilis ATCC 6633 50 Escherichia coli No. 29 3,13 Escherichia coli NIHJ JC-2 12,5 Klebsiella pneumoniae PCI 602 50 Proteus mirabilis GN 310 50 Proteus vulgaris GN 76/C-1 25 Proteus morganii Kono 25 Shigella dysenteriae Shigae 3,13 Citrobacter freundii GN 346 6,25 Serratia marcescens No. 1 50 Pseudomonas aeruginosa E-2 >100 Pour cette mesure,on a utilisé un milieu de culture Heart Infusion Agar (produit par la Eiken Chemical Co., Ltd) en tant que milieu de culture. La détermination de l'effet inhibiteur de 8- lactamase du SF-2103A par la méthode de Sargent's (voir M.G. Sargent, Journal of Bacteriology, Vol. 95, p. 1493 (1968)) a révélé qu'elle présentait un puissant effet inhibiteur de e-lactamase. 348889S Détermination de l'activité de g-lactamase par la méthode de Sargent: La méthode de Sargent a été partiellement modi- fiée de la façon suivante: Réactifs Réactif A: solution d'enzyme diluée de façon appropriée avec une solution tampon de phosphate de 0,1M (pH 7,0) de façon à ce que la densité optique de consom- mation d'iode soit de 0,6 à 490 nm lorsqu'on la mesure dans les conditions mentionnées ci-dessous. Réactif B: solution aqueuse à 1,3 % du sel de potassium de la pénicilline G pour la détermination de la pénicillinase. - solution aqueuse à 1,3 % du sel de sodium de cephalotine pour la détermination de la cepha- * losporinase (e-1actamase de Proteus Vulgaris M-8243 ou de Citrobacter freundii GN 346) Réactif C: Tampon de phosphate 0,1M (pH 7,0) Réactif D:Solution tampon d'acétate d'iode préparée par addition de 5 mZ d'une solution d'iode du commerce à 95 mZ du tampon d'acétate de pH 4,0 (80g d'a- cétate de sodium anhydre ajusté à pH 4,0 avec de l'acide acétique et complété à 2 litres avec de l'eau distillée). Méthode de détermination On fait pré-incuber pendant 5 minutes à 30 C un mélange réactionnel constitué de 0,5 m2 du réactif B et de 2 mZ du réactif C et on y ajoute 0,5 mZ du réactif A puis on le maintient pendant 30 minutes à 30 C. Une fois la réaction achevée, on ajoute 5 mZ du réactif D en mélangeant rapidement et on maintient le mélange * La solution d'iode du commerce contient 0,32N d'iode et 1,2M d'iodure de potassium, préparée par disso- lution de 20,3cr d'iode et de 100 g de KI dans 500 mt d'eau distillée. pendant 10 minutes a 30 C puis on mesure la densité op- tique à 490 nm. Comme essai témoin; on maintient un mélange d'incubation contenant 0,5 mi du réactif B et 2 mX du réactif C à 30 C pendant 30 minutes, puis on y ajoute mX du réactif D et 0,5 mZ du réactif A. On mesure ensuite de la même manière la densité optique. Détermination de l'activité inhibitrice de la $-lactamase La détermination de l'activité inhibitrice de la 0-lactamase s'effectue de la même manière que pour la détermination de l'activité de la e-lactamase telle qu'elle a été décrite ci-dessus, excepté que l'on utilise comme réactif C une solution préparée par dilution d'une substance inhibitrice avec le réactif C tel qu'il est décrit ci-dessus. L'essai témoin s'effectue de la même façon que dans le cas de la détermination de l'activité de la 0- lactamase en utilisant le réactif C contenant l'inhibi- teur. Ainsi, on détermine la concentration de SF-2103A nécessaire pour provoquer une inhibition de 50 % de la pénicillinase. Pour étudier l'activité inhibitrice de l'anti- biotique SF-2103A vis-à-vis d'autres 0-lactamases, à savoir un enzyme produit par Proteus Vulgaris M-8243 et un enzyme produit par Citrobacter freundii GN 346 (tous deux ont été préparés par la méthode de préparation décrite ci-dessus), on utilise le même mode opératoire que pour la pénicillinase, excepté que les B-lactamases décrites ci-dessus sont utilisées au lieu de la pénicil- linase dans le réactif A, et qu'un sel de sodium de céfa- lotine est utilisé au lieu du sel de potassium de la pénicilline G dans la solution B. Les résultats sont indiqués dans le tableau 3. Une unité d'activité de 0-lactamase conformé- ment à la méthode de Sargent telle qu'elle est utilisée ici est définie comme étant la quantité d'enzyme néces- saire pour décomposer 1 p mole d'un sel de potassium de pénicilline G ou d'un sel de sodium de céfalotine en minutes dans les conditions utilisées pour la pré- sente méthode de détermination. TABLEAU 3 Activité inhibitrice de la 0-lactamase excercée par le SF-2103A e-lactamase Substrat Rapport d'inhibition Pénicillinase Pénicilline G Sel de potassium % 10 g/ Proteus vulgaris flotne concentration C&falotine M8243 Sel de sodi inhibitrice à 50 % (I50): 0,013 pg/mt Citrobacter concentration freundii GN 346 idem inhibitrice à 50 % (I50): 0,18 pg/Mz L'effet du SF-2103A en tant qu'agent inhi- biteur de la 0-lactamase vis-à-vis des souches bac- tériennes productrices de e-lactamase a été étudié par comparaison à l'ampicilline, la carbénicilline, la céfalotine et la céfaloridine. Comme souches pro- ductrices de B-lactamase, on a utilisé le Proteus vulgaris M-8243 (produisant une large gamme de céphalo- sporinases), le Proteus rettgeri GN 624 (produisant une céphalosporinase typique) et le- Citrobactor freundii GN 346 (produisant une céphalosporinase typique). On prépare des plaques d'agar-agar d'essai contenant ces souches par un procédé classique. On place successive- ment sur un disque de papier d'un diamètre de 8 Inm 10 pg d'ampicil- line 2 pg de carbénicilline, 2 pg de céfalotine et 5 pg de céfaloridine et de plus, on ajoute lpg, 0,2 pg et 0,04 pg de SF-2103A comme cela est indiqué dans le tableau 4. Ces disques de papier ont été placés sur les plaques d'agar-agar des souches productrices de e-lactamase et l'incubation a été effectuée à 37 C pendant 16 heures afin d'étudier la présence de la zone d'inhibition. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Effets synergétiques - du SF-2103A en association avec des antibiotiques au $-lactam Diametre de la zone d'inhibition (nm) Proteus Proteus Citrobacter vulgaris rettgeri freundii Antibiotiques M-8243 GN 624 GN 346 Akicilline (10 pg) "+ SF-2103A " + SF-2103A 20,9 14,6 19,7 (1 pg) + SF-2103A (0,2 pg) 20,0 10,0 11,3 "I + SF-2103A (0,04 pg) 18,0 o à Car),nicilline (2 pg) "+ SF-2103A (1 pg) 15,2 16,7 13,6 + SF-2103A 13,3 11,1 11,7 (0, 2 lig) + SF-2103A (0,04 pg) 12,1 0 0 Céfalotine 0 0 0 (2 pg) "+ SF-2103A " + SF-2103A 15,3 11,5 16,6 " + SF-2103A 14,8 11,0 (O' 2lig) 14,8 0 11,0 (0,2 ig) + SF-2103A (0,04 pg) 14,1 0 9,0 (0,04 pg) Cefaloridine (5 ig) "+ SF-2103A " + SF-2103A 16,2 14,3 17,3 (1 pg) + SF-2103A SF-2103A 0 0 (1 pg) Dans le cas des disques de papier ne contenant pas de SF-2103A, on n'observe pas de zone d'inhibition, alors que pour les disques de papier contenant le SF-2103A en association avec les antibiotiques au e-lactame, on observe une zone d'inhibition variant en fonction de la concentration du SF-2103A. Cela indique que le SF-2103A inhibe la e-lactamase produite par l'organisme d'essai et qu'il en résulte que l'antibiotique au elactame peut exercer son activité antibactérielle. Lorsqu'il est utilisé seul, le SF-2103A ne présente pas de zone d'inhibition vis-à-vis des organismes d'essais même à la concentration maximale (1 pg). I1 apparait donc clairement que le SF-2103A présente un effet, antibactérien et simultanément, qu'il produit des effets synergétiques lorsqu'il est combiné aux antibiotiques au e-lactame. L'activité antibactérielle du SF-2103A a été étudiée à l'aide d'un essai de protection de la souris mettant en jeu des souris de la façon décrite ci-après, et il a était découvert que le SF-2103A est un antibio- tique présentant une efficacité suffisante pour une uti- lisation pratique comme agent de traitement des infections, qu'il soit utilisé seul ou en association avec un autre agent antimicrobien approprié (tel qu'un antibiotique au e-lactame). On utilise des souris mâles agées de 4 semaines de la souche ICR-JCL (poids moyen: 20,6 g) par groupes de cinq. On inocule les microorganismes Escherichia coli GN206 ou Proteus vulgaris GN76/C-1 sur une plaque de milieu -à base d'infusion de coeur (produit par Eiken Chemicals Co., Ltd.) et on les cultive à 37 C pendant heures. Les cellules ainsi formées sont recueillies et mises en suspension dans une solution de sérum physio- logique dans le but de préparer une suspension de cellules contenant un nombre prédéterminé de cellules. On mélange des volumes égaux de la suspension de cellu- les et d'une solution à 5 % de mucine (produite par Nakarai Chemicals Co., Ltd.) afin de préparer une solu- tion de cellules ayant une concentration de cellules de 7,1 x 107 UFC/mZ (UFC = Unité de Formation de colonies). On injecte ensuite par voie intrapéritoneale à la souris 0,5 mú de la solution de cellules préparée ci-dessus. Une fois, au bout d'une heure, ou deux fois, au bout de une et de deux heures après l'injection, on administre par voie sous cutanée l'antibiotique d'es- sai. On observe ensuite les souris pendant 7 jours. Expérience I On utilise Escherichia coli GN206 en tant que bactérie infectieuse et on administre en une seule fois une heure après l'injection de la bactérie une dose de 2 mg/souris de SF-2103A dissous dans un tampon de phosphate 1/75 M (pH 7,0, contenant 0,85 % de chlorure de sodium) puis on administre deux fois au bout d'une heure et de deux heures après l'injection une dose de 1 mg/souris de SF-2103A. Dans le premier cas, deux des cinq souris ont survécu et dans le second cas, quatre des cinq souris ontsurvécu. Par ailleurs, dans le cas du groupe témoin o on administre seulement 0,2 mú de tampon de phosphate de la façon décrite ci-dessus, on n'observe aucune survie. Expérience II On utulise Proteus vulgaris GN-76/C-1 comme bactérie infectieuse et on administre un mélange 1 de SF-2103A et de Cefalotine (produite par Shionogi et Co., Ltd.). Le mélange a été administré deux fois (au bout de une et de deux heures après l'injection de la bactérie), chaque fois à la dose de 0,5 mg/souris, ou deux fois (au bout d'une et de deux heures après l'injec- tion), chaque fois à la dose de 1 mg/souris. Dans le premier cas, trois des cinq souris ont survécu et dans le deuxième cas, la totalité des cinq souris ont survécu. D'autre part, dans le cas du groupe témoin o l'on a seulement administré de tampon de phosphate, aucune survie n'a été observée. La toxicité du SF2103A sous forme du sel sodique a été mesurée par administration orale, injection intra- musculaire ou injection intraveineuse chez la souris ou le rat. Les DL50 par administration orale, injection intramusculaire et injection intraveineuse sont toutes supérieures à 2.000 mg/kg. Le SF-2103A est un antibiotique de grande valeur qui non seulement présente des effets antimicrobiens vis-à-vis de diverses bactéries grampositives et gram-négatives, mais qui agit également contre les bactéries résistantes productrices de 0-lactamases. Par conséquent, il peut être utilisé comme médicament chez l'être humain et les animaux domestiques et de plus, comme agent de stérilisation pour le stockage de la nour- riture et des instruments ou dispositifs médicaux. Le SF-2103A et ses sels peuvent être adminis- trés par voie orale, localement ou par voie parentéra- le. sous forme d'une préparation telle que des comprimés, des capscules, des crèmes, des sirops, de.s suspensions, des préparations liquides, des poudres ou des injections ainsi que sous formes d'injections destinées à une stéri- lisation. Bien que le SF-2103A puisse être utilisé seul, il est efficace lorsqu'il utilisé en association avec d'autres antibiotiques, et en particulier, avec des an- tibiotîques au e-lactame, car il produit avec ceux ci des effets synergétiques. Lorsque le SF-2103A ou ses sels est utilisé en association avec des antibiotiques au C-lactame, le rapport pondérai du SF-2103A ou de ses sels aux antibiotiques au e-lactame, peut aller d'environ 20: 1 à environ 1 12, de préférence de 10: 1 à 1: 10, et mieux encore de 3: 1 à 1: 3. Le SF-2103A ou ses sels peut être administré à la dose de 50 à 6.000 mg, et généralement de 500 à 3.000 mg par jour. Lorsqu'on compare les propriétés physiques et chimiques et les caractéristiques biochimiques décri- tes ci-dessus à celles d'antibiotiques connus, on peut constater que le SF-2103A représente un nouvel antibio- tique. Les exemples non limitatifs suivants sont don- nés à titre d'illustration de l'invention. Les pourcen- tages donnés dans ces exemples sont des pourcentages pondéraux, sauf indication contraire. Exemple 1 On ajuste à 7 le pH d'un milieu liquide conte- nant 1 % de glucose, 1 % d'amidon, 2 % de poudre de soja, 0,5 % de gAteau de graines de coton, 0,2 % de sulfate de sodium, 0,2 % de carbonate de calcium et 0,0001 % de chlorure de cobalt. On introduit ensuite séparément des portions de 80 mk du milieu liquide dans cent Erlen- meyers de 500 mú, tous bouchés par un bouchon de conton et stérilisé sous pression à 120'C pendant 10 minutes. On fait croître complètement le SF-2103A (FERM-P No. 5636) dans un milieu de préculture contenant 1 % de glucose, 1 % d'amidon, 0,2 % de poudre de soja, 0,5 % de peptone, 0,3 % d'extrait de levure, 0,2 % d'extrait de viande et 0,2 % de carbonate de calcium pour préparer une culture ensemencement. On,nocule ensuite des portions de 1,5 % de la culture d'ensemencement ainsi préparée dans le milieu liquide et on la fait incuber sur un agitateur à 280C pendant 3 jours, ce qui donne 7 litres d'un mi- lieu contenant 3,5 pg/mL du SF-2103A. Exemple 2 On prépare un milieu liquide contenant 1 % de glucose, 1 % d'amidon soluble, 0,2 % de poudre de soja, 0,5 % de peptone, 0,3 % d'extrait de levurei 0,2 % d'ex- trait de viande, et 0,2 % de carbonate de calcium, et on ajuste son pH à 7,0. On introduit ensuite séparement des portions de 80 mX du milieu liquide dans trois Erlenmeyers de 500 mú obturés par un bouchon de coton et stérilisés dans un autoclave à 120 C pendant 15 minutes. On inocule une quantité de SF-2103A correspondant à une boucle de platine (FERM-P No 5636) dans chacun des milieux liquides et on le fait incuber sur un agitateur à 28 C pendant 2 jours pour préparer une culture d'ensemencement. On intro- duit ensuite séparement des portions de 600 mZ du milieu décrit ci-dessus dans trois Erlenmeyers de 5 litres que l'on obture à l'aide d'un bouchon de coton et que l'on stérilise dans un autoclave. Chacune des cultures d'ense- mencement préparée dans un flacon de 500 mt ci-dessus est inoculée dans chacun des flacons de 5 litres. Apres incubation sur un agigateur à 28 C pendant 2 jours, on observe une croissance suffisante. On prépare ensuite 200 litres d'un milieu de culture contenant 2,0 % de sirop d'amidon, 1,2 % de poudre de soja, 1,2 % de germe de blé, 0,3 % d'huile de soja, 0,02 % de sulfate de sodium, 0,0005 % de sulfate ferreux, 0,00005 % de chlorure de cobalt et 0,1 % de carbonate de calcium, dans un réservoir de fermentation de 300 litres (produit par la Marubishi Co., Ltd.) (pH avant stérilisa- tion: 7,0) et on le stérilise sous pression à 120 C pen- dant 30 minutes. Après refroidissement du milieu de cul- ture, on inocule la culture préparée ci-dessus (c'est- à-dire la totalité des trois Erlenmeyers de 5 litres) dans le milieu de culture et on effectue la culture en aérant et en agitant à 28 C. La vitesse de rotation est de 100 tours par minute au début et est portée à 150 tours par minute au bout de 40 heures. Le degré d'aération est de 200 litres/minute tout au long de la période de cultu- re. Au bout de 68 heures, on interrompt la culture et le bouillon de culture obtenu contient 4,1 pg/mt de SF- 2103A. Exemple 3 (i) On répète le mode opératoire de l'exemple 2 en utilisant 3 réservoirs de fermentation de 300 litres, ce qui donne 450 litres d'un filtrat de culture de SF- 2103A (FERM-P No 5636). L'unité moyenne de SF-2103A est de 2,1 pg/Im9. (ii) On isole le SF-2103A de la façon sui- vante: Après ajustement du pH de 425 litres de fil- trat de culture tel qu'ils ont été obtenus ci-dessus à 5,0 avec de l'acide chlorhydrique 6N, on ajoute 12,7 Kg de charbon activé (produit par Wako Pure Chemical Industries Ltd.) et on agite pendant 30 minutes dans un réservoir agité pour provoquer l'adsorption sur celui-ci des ingré- dients actifs. Le charbon activé est éliminé par filtra- tion puis, après lavage par 50 litres d'eau, on ajoute litres d'acétone aqueuse à 50 %. On ajuste le pH du mélange obtenu à 8,0 avec une solution d'hydroxide de sodium 5N et on l'agite pendant 30 minutes pour éluer les ingrédients efficaces. Après séparation et élimination du charbon activé, on concentre 100 litres de la solution ainsi éluée à 45 litres par élimination par distillation de l'acétone. On ajoute ensuite à la solution concentrée ci-dessus 30 litres de dichlorométhane contenant 0,2 % (poids/volume) de chlorure de benzyldiméthylcétyl ammonium et on l'agite pour extraire les ingrédients actifs. A l'extrait ainsi obtenu, on ajoute 4 litres d'une solution aqueuse contenant 1 % (poids/volume) d'iodure de sodium afin de transférer les ingrédients actifs dans une couche aqueuse. On fait passer la couche aqueuse à travers une 248889S colonne garnie de 1,5 litre de DEAE-Sephadex A-25 (pro- duit par Pharmacia Co.) préalablement tamponné par une solution tampon de phosphate ayant un pH de 7,4 afin de provoquer l'adsorption sur celui-ci des ingrédients actifs. Après lavage préliminaire par 5 Q d'une solution aqueuse de NaCú 0,1M dissoute dans un tampon de phosphate mM (pH 7,4) on élue les ingrédients actifs avec une solution aqueuse de NaCk 0,2M dissoute dans le même tampon que celui utilisé ci-dessus. On divise l'éluat en fractions de 100 mt et on obtient les fractions 108 à 132 sous forme des fractions actives. On fait ensuite passer 24 litres des fractions actives à travers une colonne garnie de 240 mt de charbon activé pour provo- quer l'adsorption sur le charbon activé des ingrédients actifs. Après lavage de la colonne avec 400 mX d'eau, on élue les ingrédients actifs avec un litre d'une solu- tion aqueuse à 50 % d'acétone. On concentre l'éluat sous pression réduite. Par lyophilisation du liquide concentré, on obtient 709 mg d'une poudre de SF-2103A brute (pureté: environ 24 %>. (iii) On répète la même opération qu'en (i), en utilisant deux réservoirs de fermentation de 300 li- tres, ce qui donne 285 litres (2,6 pg/mú) d'un filtrat de culture. On ajuste le pH du filtrat de culture à 6,2 avec de l'acide chlorhydrique 6N. Au filtrat on ajoute litres de dichlorométhane contenant 0,2 % (poids/ volume) de chlorure de benzyldiméthyltétradécyl ammonium, et l'on agite le mélange obtenu pendant une heure afin d'extraire les ingrédients actifs. A l'extrait ainsi obtenu, on ajoute 8,5 litres d'une solution aqueuse à 0,7 % (poids/volume) d'iodure de sodium et l'on agite le mélange obtenu pendant 20 minutes pour transférer les ingrédients actifs dans une couche aqueuse. On con- centre la couche aqueuse sous pression réduite par élimination du dichlorométhane par distillation. On fait passer le liquide ainsi concentré à travers une colonne garnie de 400 mi de charbon activé (produit par Wako Pure Chemical Industries Ltd.) dans laquelle on a intro- duit de l'eau puis on lave le charbon activé avec 300 mú d'eau. On combine le liquide et l'eau de lavage que l'on a fait passer dans le charbon activé et on fait passer 8,3 litres du liquide combiné dans une colonne garnie de 1 litre de DEAE-Sephadex A-25 (produit par Pharmacia Co. ) ayant été tamponné à l'aide d'un tampon de phosphate ayant un pH de 7,4, afin de provoquer l'ad- sorption sur celui-ci des ingrédients actifs. Après lavage préliminaire avec 10 litres d'une solution aqueuse de NaCZ 0,2M dissoute dans un tampon de phosphate 2OmM (pH 7,4), on élue les ingrédients actis avec une solution aqueuse de NaCQ 0,3M dissoute dans le même tampon que celui utilisé ci-dessus. L'éluat est divisé en fractions de 150 mX, et on confirme l'activité des fractions 17 à 53. On combine ces fractions actives et on fait passer ,5 litres des fractions actives combinées dans une co- lonne garnie de 1,2 litre de charbon activé (produit par Wako Pure Chemical Industries Ltd.), dans laquelle on a introduit de l'eau, pour provoquer l'adsorption sur celui-ci des ingrédients actifs. Après lavage de la colonne avec 2,3 litres d'eau, on élue les ingrédients actifs avec 5,5 litres d'acétone aqueux à 50 %. L'éluat ainsi obtenu est concentré sous pression réduite. Par lyophilisation..du liquide concentré, on obtient 540 mg d'une poudre de SF-2103A brute (pureté: environ 40 %). (iv) On dissout la poudre de SF-2103A brute obtenue en celui-ci des ingrédients actifs. Après lavage avec 200 mt- d'un tampon de phosphate 20 mM (pH 7,2), on élue les ingrédients actifs avec une solution aqueuse de NaCt 0,2M dissoute dans le même tampon que celui utilisé ci-dessus. On divise l'éluat en fractions de 20 mú et on confirme l'activité des fractions 110 à 165. On combine ces fractions actives et on les fait passer dans une colonne garnie de 175 mú de charbon activé pour provo- quer l'adsorption sur celui-ci des ingrédients actifs. Après lavage du charbon activé avec 300 mú d'eau, on élue les ingrédients actifs avec 800 mZ d'une solution aqueuse à 50 % d'acétone. Par concentration de l'éluat sous pression réduite et lyophilisation, on obtient 206 mg du sel de sodium du SF-2103A (pureté: environ 64 %) sous forme d'une poudre jaune pâle. On dissout ensuite 200 mg de la poudre dans 2 mt d'eau et l'on fait passer la solution obtenue dans une colonne garnie-de 250 mL de Diaion HP- 20AG (produit par Mitsubishi Chemical Industries Ltd.). Après dévelop- pement à l'eau, on divise l'éluat en fractions de 7 mk et on confirme que les fractions 18 à 26 contiennent des ingrédients actifs. Parmi ces fractions actives, on choisit et on combine les fractions 22 à 24, on les concentre sous pression réduite et on les lyophilise, ce qui donne 60 mg du sel de-sodium de SF-2103A (pureté: environ 77 %) sous forme d'une poudre légère- ment jaune. (y] Dans 1 mX d'eau, on dissout 60 mg de la poudre légèrement jaune obtenue en (iv) ci-dessus. On fait passer la solution obtenue dans une colonne garnie de 200 m. de Sephadex G-10 (produit par Pharmacia Co.) et on la développe à l'eau. On divise l'éluat en fractions de 7 mú et on confirme que les fractions Il à 16 sont actives. On combine les fractions 12 et 13, on les concentre sous pression réduite et les lyophilise, ce qui donne 32 mg d'un sel de sodium de SF-2103A pur, sous forme d'une poudre blanche. Les opérations (ii) à (v) ci-dessus ont été effectuées en présence de faibles températures (d'envi- ron 40C). 246889S REVENDICATIONS 1. Antibiotique SF-2103A ou sel de celui-ci, caractérisé en ce que son sel trisodique présente les propriétés suivantes: (1) Couleur et aspect: obtenu sous forme d'une poudre blanche par lyophilisation; (2) Point de fusion: ne présente pas de fusion distinct, et brunit et se décompose en naissance à des bulles à 168 C; e20-1, ( (3) Pouvoir rotatoire: 20 _16,3 (c (4) Composition élémentaire: calculé C9HsNO lS2Na32H20 Calculé de point donnant 1, eau); pour Trouvé (%) 23,53 2,61 3,05 41,83 13,94 ,03 (%) 23,62 2,44 3,00 42,16 (équilibre> 13,81 14,97 tdéterminé par ana- lyse de l'absorption atomique) (5) Spectre d'absorption ultraviolet: repré- senté sur- la figure 1; les maximas d'absorption dans un tampon de phosphate 0,02M (pH 7,2) sont observés à 1D% =118 266-267 nm (E 1% 126) et 230 nm (D1% = 118); 266-267 inm l lm (6) Spectre d'absorption infrarouge: le spectre d'absorption infrarouge, déterminé par la méthode de la pastille de bromure de potassium, est représenté sur la figure 2 avec des bandes d'absorption à 3450, 1755, -1 1610, 1390, 1220, 1080, 1040, 940, 900, 780 cm1; - C H N O S Na (7) Spectre de.Résonance Magnétique Nuclé- aire: le spectre de résonance magnétique nucléaire à 100 MHz, déterminé dans de l'eau lourde avec du tétraméthylsilane comme étalon externe, est représenté sur la figure 3 et présente des signaux à ô 1,55 (d, 3H), 6 2, 99 (dd, 1H), 6 3,44 (dd, 1H), 6 3,94 (dd, 1H), 6 4,48 (m, 1H), et 8 4,94 (m, 1H) (8) Chromatographie sur couche mince (a) Les valeurs du Rf sur une couche mince de cellulose (Cellulose F254, produit par Merck et Co.), obtenues à 5 C par développement avec les solvants sui- vants, sont les suivantes: Solvant Rf n-butanol/isobutanol/eau 0,30 réactifs de Lemieux et d'Ehrlich, et négative vis-à- vis de la ninhydrine. 2. Antibiotique SF-2103A répondant à la formule: CH CH H03SO C N / COOH C00Hq ou un sel de celui-ci. 3. Procédé pour la préparation d'un antibio- tique SF-2103A ou d'un sel de celui-ci, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche productrice du SF-2103A appartenant au genre Streptomyces dans un milieu nutritif, et à recueillir le SF-2103A ou son sel dans le bouillon de culture. 4. Procédé selon la revendication 3, caracté- r-isé en ce que la souche productrice du SF-2103A est la souche Streptomyces sp. SF-2103. 5. Composition antibiotique caractérisée en ce qu'elle comprend-un antibiotique SF-2103A ou un sel de celui-ci selon la revendication 1 ou 2. 6. Composition antibiotique selon la revendi- cation 5, caractérisée en ce qu'elle comprend également un produit antibiotique à base de pénicilline ou de céphalosporine. 7. Culture biologiquement pure de la souche Streptomyces sp. SF-2103 dont le numéro matricule FERM est FER4-P n 5636 et le numéro matricule ATCC est le n ATCC 31892.