Brevet FR2488510A1 — publié le 19820219

On sait isoler l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg) à partir du plasma ou du sérum positif par ultracentrifugation, chromatographie sur colonne, etc. Lorsqu'on a recours à l'ultracentrifugation, la petite taille de la particule de HBsAg (environ 20 nm) nécessite environ 18 heures par lot pour l'étape de centrifugation. Etant donné ce délai nécessaire, la centrifugation devient l'étape limitante dans la production de l'HBsAg. La présente invention a pour objet de fournir un procédé perfectionné pour préparer l'HBsAg. Elle a égale- ment pour objet de fournir un procédé par lequel on peut réduire la durée de la centrifugation dans une mesure si- gnificative. Ces objets, et d'autres, de l'invention, appa- rattront d'après la description qui suit. On concentre un liquide contenant du HBsAg par ultrafiltration pour réduire son volume tout en gardant presque tout l'HBsAg et en retirant de nombreuses impure- tés. Comme la concentration est accrue, on peut traiter par unité de temps plus d'antigène pour donner un produit final. La présente invention a trait à la séparation du HBsAg du liquidecontenant l'HBsAg et plus particulièrement un procédé pour concentrer le liquide avant purification plus poussée. On a maintenant trouvé que le volume de liquides contenant du HBsAg comme par exemple, le plasma ou le sérum, peut être grandement réduit et concentré par ultrafiltration si bien qu'on peut traiter une plus grande quantité d'anti- gène pour une même durée de centrifugation. Le liquide contenant l1HBsAg peut être, par exem- ple, du plasma, du sérum, des liquides de culture cellu- laire, ou une fraction contenant l'HBsAg d'un ou de plu- sieurs des liquides précédents, par exemple un précipité de plasma à l'éthanol ou au sulfate d'ammonium. On peut séparer l'HBsAg du liquide contenant l'HBsAg ou de son dérivé par ultracentrifugation. L'ultra- centrifugation peut s'effectuer par production isopycnique de bandes puis par production de bandes par zones de vitesse. Comme chaque étape de production de bande néces- site environ 18 heures, la durée totale de centrifugation pour isoler l'HBsAg à partir d'un seul lot de plasma ou de sérum est d'environ 36 heures. Cette longue durée combinée au coût très élevé des machines ultracentrifugeuses elles- mêmes rend l'étape de centrifugation très coûteuse et en fait l'étape limitante dans la séparation du HBsAg. La séparation du HBsAg par production isopycnique de bandes et par production do bandes par zones de vitesse est décrites plus en détail dans les brevets américains nO 4 024 243 et 4 088 748, ici mentionnés à titre de référence. En concentrant le liquide avant toute autre puri- fication selon l'invention, on peut traiter jusqu'à environ 25 fois plus de liquide contenant du HBsAg sans augmenter la durée de centrifugation. Une centrifugeuse typique, l'"Electronucleonics K", peut traiter environ 1,7 litre à la fois. Cependant, en faisant application de l'invention, cette même centrifugeuse peut traiter dans la même unité de temps une matière ayant un volume initial (avant concentra- tion) d'environ 40 litres. Comme l'ultracentrifugation peut réduire le volume de liquide contenant l'HBsAg à environ 1/25e au moins de son volume d'origine, on peut traiter 25 lots ou plus dans le temps ordinairement nécessaire pour traiter un seul lot non concentre. Il s'agit là d'une amélioration significative car elle multiplie la capacité de toutes les centrifugeuses par un facteur d'environ 25. Etant donné que les ultra- centrifugeuses constituent un élément d'équipement très coûteux et que la durée de centrifugation est le goulot d'étranglement ou l'étape limitante de la production d'HBsAg, la présente invention augmente de façon signifi- cative la production sans accroissement de l'investisse- ment en ultracentrifugeuses. Bien que le degré de concen- tration puisse varier, généralement, on concentre le liquide au plus 3 environ 1/5e de son volume initial et de prf rene au plus à environ 1/25e de son volume initial et de préfé- rence au plus à environ 1/25e de son volume initial. En employant un filtre qui laisse passer la ma- tière ayant une taille inférieure à celle de l'HBsAg, l'antigène est purifié en même temps que le concentré. Il est préférable que le filtre ait une taille de pore lais- sant passer les matières en-dessous d'environ 1 000 000 de dalton. L'exemple suivant précise l'invention sans cepen- dant la limiter. EXEMPLE On transforme en sérum (42 litres) du plasma HBsAg positif (40 litres) ayant une teneur total-en pro- téines de 2760 g, et une teneur total en HBsAg de 11,3 x 106 unités de fixation du complément (CF). On ajoute un volume égal de solution de sulfate d'ammonium (450 g/l) au filtrat que l'on agite alors doucement pendant la nuit à 5 C. On recueille le précipité qui se forme par centri- fugation par lots à 7000 g pendant 30 minutes en utilisant le rotor JA-10 (3 litres de capacité par lot). On met les pastilles obtenues après centrifugation en suspension dans environ 4,5 litres de sel physiologique tamponné au phos- phate (PBS), on dilue A un volume de 21 litres dans le PBS et on clarifie en faisant passer à travers un filtre (Millipore AP 2593). On concentre la solution clarifiée à un volume de 1,2 + 0,4 litre en utilisant une cassette d'ultrafiltration de 4,6 m2 (Millipore PSVP). On réalise la diafiltration du concentré avec 4 x 1,5 litres de PBSo Après que l'on ait recueilli le concentré diafiltré, on rince la cassette avec 3 x 250 ml de PBS et on ajoute le liquide de rinçage en plusieurs fois au concentré pour donner un volume final de 1,7 + 0,05 1 ayant une teneur en protéines de 306 g. On réduit le volume final d'environ 25 fois par rapport au volume de sérum initial (42 1 à 1,7 1) et on -488510 réduit-la teneur en protéines de 89 % (de 2760 g à 506 g). Quant au produit de sulfate d'ammonium, les réductions de volume et de teneur en protéine sont de 12 fois et de 47 % (de 21 1 à 1,7 I et de 717 g à 306 g) tandis guon garde environ 94 % du HBsAg d'origine (de 7,16 x 10 unités CF à 6,75 x 106 unités CF). On peut purifier plus avant le conoentré d'HBsAg produit, par exemple par ultracentrifugation comme il est dit dans les brevets américains mentionnés ci-dossus.-La capacité efficace d'ultracentrifugation est accrue daun facteur voisin de 25. R E V E N D I C A T I 0 N S 1. - Procédé de séparation du HBsAg d'un liquide contenant du HBsAg, caractérisé en ce qu'il comprend une première étape de concentration du liquide par ultrafiltra- tion à un volume ne dépassant pas environ 1/5e du volume initial. 2. - Procédé selon la revendication 1 o le liqui- de est concentré à environ 1/25e de son volume initial. 3. - Procédé selon la revendication 1 o le liquide est du plasma, du sérum ou un liquide de culture cellulaire, ou un de leurs dérivés. 4. - Procédé selon la revendication 3 o le déri- vé est un précipité protéique de sérum. 5. - Procédé selon la revendication 4 o l'on obtient le précipité en traitant le sérum avec du sulfate d'ammonium. 6. - Procédé selon la revendication 1 o le filtre a une taille de pores retenant les matières au- dessus d'environ 1 000 000 de dalton. 7. - Procédé pour enlever les impuretés d'un liquide contenant de l'HBsAg qui implique de soumettre le liquide à une ultrafiltration en utilisant un filtre lais- sant passer les matières en-dessous d'environ 1 000 000 de dalton.