Brevet FR2487376A1 — publié le 19820129

La présente invention concerne un procédé pour la production de polysaccharides. On connaissait un procédé pour la production de poly- saccharides utilisant Bacillus polymyxa n' 271 dans le Japanese Kokoku 677600. Bacillus polymyxa n' 271 a été déposé au Fermentation Researche Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry sous le numéro de dépôt FERM-P n' 1824. Japanese Kokoku 67-7600 décrit un procédé pour la préparation d'un polysaccharide fortement visqueux par culture de Bacillus polymyxa n' 271 dans un milieu de culture contenant une source de carbone assimilable telle que glucose, saccharose et lactose. Le polysaccharide obtenu à partir du bouillon de fermentation vis- queux est composé de glucose, mannose, galactose et acide glucuro- nique. On savait également que le mélange du polysaccharide acide décrit ci-dessus avec le polysaccharide neutre était obtenu à partir du milieu contenant du saccharose comme source de carbone. Le poids moléculaire du polysaccharide élaboré par Bacillus polymyxa n0 271 dans le milieu contenant du glucose a été déterminé par la formule de Staudinger et on a trouvé qu'il est d'environ 1 300 OO0,comme décrit dans Journal of Agricultural Chemical Society of Japan, volume 42, n' 7, page 431-434 (1968). Un objet de l'invention est de fournir un procédé produisant un polysaccharide ayant un poids moléculaire de plus de 200 000 et une activité d'inhibition d'une élévation du choles- térol dans le sérum et dans le foie et de l'indice athérogène. Un autre objet de l'invention est de fournir un pro- cédé pour produire un sel de polysaccharide avec un cation ayant un degré de substitution par le cation de plus de 0,2 et une acti- vité d'inhibition d'une élévation des taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie et de l'indice athérogène. Ces objets de l'invention peuvent être atteints au moyen d'un procédé pour produire un polysaccharide dans lequel on cultive Bacillus polymyxa n 271 dans un milieu de culture contenant une source de carbone assimilable jusqu'à ce que le polysaccharide fortement visqueux s'accumule dans le milieu et on récupère ledit polysaccharide du milieu. On cultive de préférence Bacillus polymyxa n0 271 dans le milieu pendant plus de 20 h. Le polysaccha- ride accumulé peut être purifié par ultrafiltration et/ou précipi- tation par l'alcool. Un autre objet de l'invention peut être atteint au moyen d'un procédé pour produire un sel de polysaccharide avec un cation, dans lequel on cultive Bacillus Polymyxa n0 271 dans un milieu de culture contenant une source de carbone assimilable et une quantité suffisante de cations pour produire un sel de poly- saccharide ayant un degré de substitution de plus de 0,2 jusqu'à ce que le sel fortement visqueux de polysaccharide s'accumule dans le milieu et on récupère ledit sel de polysaccharide du milieu. Le milieu de culture contient de préférence un équi- valent total de cation d'au moins 0,05 par litre du milieu et maintient un pH de plus de 4,5.' Si les conditions de culture ne sont pas appropriées pour la production du sel désiré de poly- saccharide,ou si le sel accumulé de polysaccharide est sujet à la décationation pour produire le sel désiré de polysaccharide, le sel désiré du cation peut être ajouté au bouillon de fermentation ou au polysaccharide libre et agité pendant une durée suffisante pour produire un sel de polysaccharide avec le cation ayant un degré de substitution de plus de 0,2. Le sel de polysaccharide accumulé dans le milieu peut être purifié directement ou après le traitement avec le sel du cation par ultrafiltration et/ou précipitation par l'alcool. Ces polysaccharides ayant un poids moléculaire de plus de 200 000 et le sel de polysaccharide avec le cation ayant un degré de substitution de plus de 0,2 ont un effet remarquable pour abaisser la teneur en cholestérol dans le sérum et le foie et l'indice athérogène et sont intéressants dans un traitement thérapeutique ou prophylactique de l'artériosclérose ou de l'hyper- cholestérolémie. La présente invention concerne un procédé pour la production de polysaccharides et de leurs sels par culture de Bacillus polymyxa n 271 dans un milieu de culture. Ces polysaccha- rides et leurs sels ont une activité remarquable d'abaissement de l'élévation du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie et de l'indice athérogène. Il est bien connu que le taux de cholestérol dans le sang est fortement influencé par la quantité et les types d'aliments. On pense que la cholestérémie est l'un des facteurs dan- gereux provoquant un début d'artériosclérose tel que l'infarctus du myocarde. Le polysaccharide, l'un des composants des aliments, a été négligé du point de vue de la diététique, sauf les poly- saccharides digestibles et absorbables tels que l'amidon. La demanderesse a effectué des essais avec des rats pour mettre au point un agent pour abaisser la teneur en cholesté- rol dans le sérum et le foie à partir du polysaccharide élaboré par Bacillus polymyxa n' 271. (Le polysaccharide produit par Bacillus polymyxa n0 271 est dénommé ci-après en abrégé B.p.) On a trouvé que le B. p ayant un poids moléculaire moyen de plus de 200 000 a une activité remarquable d'abaissement du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie et une activité d'augmentation étonnante du taux de cholestérol des lipoprotéines h haute densité (ci-après en abrégé HDL) qui étaient connues comme facteur empêchant l'artériosclérose. L'activité d'augmentation du taux de cholestérol de 1HDL indique l'activité d'abaissement de l'indice athérogène qui peutêtre représentée comme ci-dessous; Cholestérol du sérum - cholestérol HDL Cholestérol HDL Ceci est un effet imprévisible du B.p. Le poids moléculaire moyen (ci-après en abrégé simplement poids moléculaire) du B.p. a été mesuré par la méthode de Ninomiya et col. dans J. Agr. Chem. Soc. Japan 42 (7), page 431 (19'68). On peut élaborer le polysaccharide de la présente invention en cultivant Bacillus polymyxa n0 271 (FERM-P n0 1824) en conditions aérobies dans un milieu de culture aqueux contenant 3-57. de source de carbone telle que glucose, saccharose, lactose, mêlasses et autres saccharides, avec une source d'azote telle que peptone, liqueur de trempage de mais, extrait de levure et urée, et des sels tels que le sulfate de magnésium. Le polysaccharide visqueux accumulé est purifié par précipitation par l'alcool et par ultrafiltration. Il est essentiel que le poids moléculaire du B.p soit de plus de 200 000 pour qu'il diminue l'augmentation du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie. On a étudié totalement les conditions de culture des microbes et de purification du B.p, car le bouillon de fermentation est très visqueux et le traitement, tel que filtration, concentra- tion et séchage dans le procédé de purification,est très difficile. La durée de culture est ordinairement de plus de 20 h pour obtenir le polysaccharide ayant un poids moléculaire moyen de plus de 000. On obtient un polysaccharide d'un poids moléculaire de 000 par culture des microbes pendant 16 h. On peut également obtenir le polysaccharide ayant un poids moléculaire moyen de plus de 200 000 si l'on traite.le polysaccharide ayant un poids moléculaire de moins de 200 000 avec des alcools de faible concentration. Le polysaccharide de poids moléculaire plus élevé précipite par des alcools à faible concen- tration etcelui de faible poids moléculaire précipité avec des alcools à concentration élevée. Des sels tels que chlorure de sodium ou chlorure de potassium peuvent faciliter la précipitation du polysaccharide avec un alcool de faible concentration. Le poly- saccharide de bas poids moléculaire précipite par l'addition de sels plus facilement que sans addition de sels lorsque l'on utilise de l'alcool à la même concentration. Le polysaccharide de poids moléculaire élevé peut être hydrolysé par un acide ou un alcali pour obtenir le poly- saccharide de bas poids moléculaire. Il est préférable d'hydrolyser le polysaccharide avant l'élimination des cellules du bouillon par filtration, puisque la résistance à la filtration est diminuée. Le polysaccharide produit par la méthode de l'inven- tion présente une activité de diminution du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie dans l'examen des rats nourris avec l'aliment contenant 5% de B.p. Le B.p de l'invention peut être utilisé sous forme de poudre ou de solution aqueuse ou de suspension dans l'eau. On l'utilise seulement ou on l'incorpore dans l'alimentation ou dans divers types d'aliments C'aliments pour la santé"). On a trouvé en outre que les sels de polysaccharide élaborés par Bacillus polymyxa n' 271 ont également une activité de diminution du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie. L'étude a été effectuée en combinant le polysaccharide acide avec divers cations pour-trouver la relation entre l'activité de diminu- tion du taux de cholestérol, le type de cation à introduire par substitution dans le B.p et le degré de substitution de ces cations. Les sels du polysaccharide avec des cations d'au moins un élément choisi parmi les métaux alcalins, les métaux alcalino- terreux, les métaux de LTansition, le manganèse, l'aluminium, le zinc, le cuivre et les ions ammonium et ayant un degré de substitu- tion de plus de 0,2 ont une activité remarquable d'abaissement du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie. Les sels de B.p avec des cations peuvent être produits en cultivant en conditions aérobies Baccilus polymyxa n0 271 dans - un milieu de culture contenant 3-5% d'une source de carbone telle que glucose, galactose, lactose, mélasses et autres saccharides, addi- tionnée d'une source d'azote,telle que peptone, liqueur de trempage de mais, extrait de levure et urée,et des sels combinés avec des cations tels que phosphate, sulfate de magnésium. Le polysaccharide accumulé dans le milieu est fortement visqueux et se compose de D-glucose, de D-mannose, de D-galactose. et d'acide D-glucuronique, le rapport de ces composants étant de 3:3:1:2. A partir du rapport des sucres et de la combinaison de deux cations avec le poids moléculaire de 1 500, on calcule le degré de substitution par les cations comme ci-dessous; degré de substitution L(i) 10-0 Ni 75 Mi = teneur en cation g/kg Ni = équivalent-gramme de cation. Les métaux alcalins comprennent le sodium et le potassium et les métaux alcalino-terreux comprennent le calcium et le magnésium. La quantité de cationscontenue dans le milieu de culture est de préférence d'au moins 0,005 par litre du milieu comme valeur de l'équivalent total et il est nécessaire d'ajuster le pH du milieu à plus de 4,5, de préférence entre 6 et 7. Si le milieu de culture ne convient pas pour la pro- duction du sel désiré de B.p, le sel de B.p accumulé peut ne pas avoir le degré de substitution prédéterminé. Le B.p ainsi obtenu ou le polysaccharide soumis au traitement de décationation tel qu'échange d'ions ou électrolyse peut être traité par les sels désirés et agité pendant une durée suffisante pour produire le sel de B.p désiré ayant un degré de substitution de plus de 0,2, avant le raffinage par ultrafiltration ou précipitation par l'alcool. Comme tous les cations ne sont pas toujours néces- saires pour la culture des microbes, il est préférable de traiter le B.p par les sels désirés après avoir éliminé les cations du sel de B.p par échange d'ions ou électrolyse pour obtenir exclusivement le sel de B.p avec le cation spécial. Le sel de polysaccharide produit par la méthode de l'invention ayant un degré de substitution de plus de 0,2 présente une activité de diminution du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie à l'examen avec des rats nourris avec l'aliment conte- nant 5% de sel de B.p. Le sel de B.p de l'invention peut être utilisé sous forme de poudre ou de solution ou de suspension dans l'eau et il est utilisé comme ingrédient dans divers aliments qui sont appelés "aliments pour la santé". Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On ajoute 600 ml du bouillon précultivé de Bacillus polymyxa n0 271 (FERMP n0 1824) pendant 24 h à 12 1 (pH 7,0) du bouillon de culture contenant 4e. de glucose, 0,1%. de peptone, 2% de liqueur de trempage de maïs, 0,2% de sulfate de magnésium et 6 ppm de sulfate de manganèse. On effectue la culture à la température de 280C avec aération à 0,8 vol.vol. 1 min- 1 pendant 72 h. Le bouil- lon de culture a une viscosité de 9 500 cP. On dilue le bouillon par cinq fois sa quantité d'eau chaude et on chauffe jusqu'à 70-80'C. Les cellules mocrobiennes sont filtrées et séparées du bouillon avec un papier-filtre préenduit de terre d'infusoires. On traite 40 1 du bouillon filtré par ultrafiltration (ultrafiltre UF-SWM-85V-1, module à membrane Abcor SWM-85M fabriqué par la Société Bioengineering Co.. LTD), on le purifie par filtration à volume constant jusqu'à W/Wo = 5 (rapport de la quantité d'eau ajoutée à celle du bouillon initial), on concentre et on lyophilise pour obtenir 50 g de poly- saccharide en poudre (échantillon 1). EXEMPLES 2-4, témoin 1. On ajuste à pH 1,5 par l'acide chlorhydrique quatre échantillons de 40 1 du bouillon filtré obtenu à l'exemple 1 et on les chauffe à 80'C pendant 5 min (exemple 2), 15 min (exemple 3), 45 min (exemple 4) et 2 h (exemple 5), respectivement, et ensuite on neutralise par l'hydroxyde de sodium. On soumet ensuite chaque échantillon à l'ultrafiltration comme à l'exemple 1, on sèche pour obtenir 48 g de polysaccharide en poudre (échantillon 2), 47 g (échantillon 3), 45 g (échantillon 4) et 40 g (échantillon 5), res- pectivement, dans les exemples 2 à 4 et le témoin 1. Le poids moléculaire et les données analytiques des exemples 1-4 et du témoin 1 sont indiqués dans le tableau I ci-après. EXEMPLE 5 On obtient le bouillon filtré en cultivant les microbes comme à l'exemple 1 avec le milieu de culture (pH 7,0) contenant 4% d'hydrol en matières sèches obtenu comme sous-produit dans la produc- tion de glucose cristallisé, 0,11% de peptone, 2% de liqueur de trempage de mais et 0,2% de sulfate de magnésium et 6 ppm de sulfate de manganèse. On ajoute à 40 1 du bouillon filtré deux fois son volume d'éthanol. On recueille le précipité fibreux ainsi formé par centrifugation. On déshydrate le précipité, on le sèche et on le dissout à nouveau dans 15 1 d'eau. Après avoir chauffé la solution aqueuse jusqu'à 70-80C et avoir filtré, on ajoute 25 1 d'éthanol au filtrat. On recueille à nouveau le précipité ainsi formé, on sèche sous vide à 5O0C et on le broie pour obtenir 50 g de polysaccharide en poudre (échantillon 6). EXEMPLE 6 On traite 40 1 du bouillon filtré obtenu à l'exemple 5 avec l'ultrafiltre (UF-SWM-85V-1, module à membrane Abcor SWM-85V fabriqué par la Société Bioengineering Co., LTD), on purifie par filtration à volume constant jusqu'à W/Wo=5 (rapport de la quantité d'eau-ajoutée à celle du bouillon initial), on concentre et on lyophilise pour obtenir 50 g de polysaccharide en poutre (échan- tillon 7). EXEMPLE 7 On ajoute 600 ml du bouillon de préculture de Bacillus polymyxa n 271 pendant 24 h h 12 1 (pH 7,0) du bouillon de culture contenant 5% de glucose cristallisé, 0,3% d'extrait de levure en poudre,,0,05% d'urée, 0, 2% de sulfate de magnésium et 6 ppm de sulfate de manganèse. On effectue la culture à la tempé- rature de 28 C avec aération à 0,8 vollvol/min pendant 120 h. On obtient 40 1 du bouillon filtré comme à l'exemple 1 et on effectue la purification également comme à l'exemple 1, sauf qu'on utilise le méthanol comme précipitant, pour obtenir 40 g de polysaccharide en poudre (échantillon 8). Le poids moléculaire et les données analytiques des échantillons 6-8 dans les exemples 5-7 sont indiqués dans le tableau II ci-après. EXEMPLE 8 On ajoute 600 ml du bouillon de préculture de 24 h de Baccillus polymyxa n 271 à 12 1 (pH 7,0) du milieu de culture contenant 4%7. de glucose cristallisé, 0,5% peptone, 0,5% de phos- phate primaire de potassium, 0,1% de sulfate de magnésium (7H20), 6 ppm de sulfate de manganèse (4-6H20) et 0,1% de silicone anti- mousse. La culture est effectuée à la température de 28 C avec aération de 0,8 vol/vol/min pendant 96 h. La viscosité du bouillon de culture est de 14 000 cP. On dilue le bouillon par cinq fois son volume d'eau chaude et on traite comme à l'exemple 5 pour obtenir 53 g de polysaccharide en poudre (échantillon 9). EXEMPLE 9 On ajoute comme précipitant 40 ml de solution aqueuse saturée de NaCl à 40 1 de bouillon filtré obtenu à l'exemple 7, on ajoute encore 80 1 d'étbanol au bouillon et on traite comme à l'exemple 5 pour obtenir 55 g de polysaccharide en poudre (échan- tillon 10). Témoin 2. On dilue 40 1 du bouillon filtré obtenu à l'exemple 8 avec la même quantité d'eau et on ajoute au bouillon filtré dilué 300 ml de résine échangeuse d'ions Amberlite 200 (type i) et 600 ml de résine échangeuse d'ions Amberlite IRA-411 (type OH'). On agite le mélange résultant pendant 3 h à la température de 40 C. On purifie le liquide ainsi traité avec un ultrafiltre (UF-SWM-85V-1, module à membrane Abcor SWM-85V fabriqué par la Société Bioengineering Co., LTD), jusqu'à W/Wo = 5 (rapport de la quantité d'eau ajoutée à celle du bouillon initial), on concentre et on lyophilise pour obtenir 50 g de polysaccharide en poudre (échantillon 11). EXEMPLE 10 On traite le bouillon filtré obtenu à l'exemple 8 avec la résine échangeuse d'ions comme dans le témoin 2 et on ajoute au bouillon 50 ml d'une solution aqueuse contenant 5% de chlorure de potassium. On laisse reposer le mélange résultant pen- dant une nuit et on traite comme dans le témoin 1 pour obtenir 51 g de polysaccharide en poutre (échantillon 12). EXEMPLE 11 On effectue le même traitement du bouillon qu'à l'exemple 10 avec 20 ml de solution aqueuse contenant 5% de NaCl au lieu de chlorure de potassium dans l'exemple 10 pour obtenir 51 g de polysaccharide en poudre (échantillon 13). Le poids moléculaire, les données analytiques, la teneur en cations, le degré de substitution par les cations des échantillons 9-13 sont indiqués dans le tableau III ci-après. EXEMPLE 12 On ajoute 600 ml du bouillon de préculture de 24 h de Bacillus polymyxa n 271 à 12 1 (pH 7,0) du bouillon de culture contenant 5% de glucose cristallisé, 0,625% de peptone, 0,5% de phosphate primaire de potassium, 0,2% de sulfate de magnésium (7H20), 0,5% de carbonate de calcium, 6 ppm de sulfate de manganèse (4-6H20) et 0,1% d'huile de soja. La culture est effectuée à la température de 28 C avec aération à 0,8 vol/vol/min pendant 96 h. La viscosité du bouillon de culture est de 16 000 cP. On traite 40 1 de bouillon filtré comme à l'exemple 5 pour obtenir 58 g de polysaccharide en poudre (échantillon 14). EXEMPLE 13 On traite 40 1 du bouillon filtré obtenu à l'exemple 12 par ultrafiltration dans les mêmes conditions que dans le témoin 2 pour obtenir 62 g de polysaccharide en poudre (échantillon 15). EXEMPLE 14 On dilue 40 1 du bouillon filtré obtenu à l'exemple 12 avec la même quantité d'eau et on déminéralise en faisant passer le bouillon à un débit (SV =3) dans une tour (diamètre 5 cm) garnie avec un mélange de 300 ml d'Amberlite 200 (type H+) et 600 ml d'Amberlite IRA-411 (type OHR). Le mélange des sels (35 g de phos- phate primaire de potassium et 15 g de sulfate de magnésium 7H20), dont la quantité est calculée à partir des sels contenus dans le milieu de culture initial est dissous dans une faible quantité d'eau. On l'ajoute au bouillon déminéralisé. On neutralise ensuite le mélange résultant par l'hydroxyde de sodium et on laisse reposer pendant une nuit, puis on traite par ultrafiltration selon la méthode décrite dans le témoin 2 pour obtenir 60 g du polysaccharide en poutre (échantillon 16). Témoin 3. Après traitement du bouillon par échange d'ions dans l'exemple 14, on traite par ultrafiltration sans addition de sels pour obtenir 56 g du polysaccharide en poudre (échantillon 17). Le poids moléculaire, les données analytiques, la teneur en cations et le degré de substitution par les cations dans les exemples 12-14 et le témoin 3 sont indiqués dans le tableau IV ci-après. EXEMPLE 15 On ajoute 600 ml du bouillon de préculture de 24 h de Bacillus polymyxa n' 271 à 12 1 (pH 7,0) du milieu de culture contenant 47. de glucose cristallisé, 0,5% de peptone, 0,57. de phosphate primaire de potassium, 0, 57% de carbonate de calcium, 0,1% de sulfate de magnésium (7 20), 6 ppm de sulfate de manganèse et 0,17. de silicone antimousse. On effectue la culture à la température de 280C avec aération à 0,8 vol/vol/min pendant 72 h. La viscosité du bouillon de culture est de 10 000 cP. On dilue le bouillon par cinq fois son volume d'eau chaude et on chauffe jusqu'à 70-80C. On filtre les cellules microbiennes et on les sépare du bouillon 1l au moyen d'un papier-filtre préenduit par de la terre d'infusoires. On traite 40 1 du bouillon filtré par ultrafiltre (UF-SWM-85V-1, module à membrane Abcor SWM-85V fabriqué par la Société llioengineering Co., Ltd), on purifie jusqu'à W/Wo = 5 (rapport de la quantité d'eau ajoutée à celle du bouillon initial), on concentre et on lyophilise pour obtenir 50 g de polysaccharide en poudre (échantillon 18). EXEMPLES 16-20 On prélève 6 échantillons de 40 1 du.bouillon filtré sur le bouillon obtenu à l'exemple 15. On dilue chaque échantillon par la même quantité d'eau, et on déminéralise par passage du bouil- lon à un débit SV=3) dans une tour (diamètre 5 cm) garnie d'un mélange de 300 ml d'Amberlite 200 (type H) et 600 ml d'Amberlite IRA-411 (type OHR). L'un des 6 échantillons est l'échantillon 19 et l'on ajoute à chacun des 5 autres échantillons 1 litre de solu- tion aqueuse à 10o de NaCI, de KCI, de MgCl2, de CaCl2 et de NH4Cl, respectivement. On laisse reposer chaque échantillon pendant une nuit et on traite par ultrafiltration selon la méthode de l'exemple 1 pour obtenir 40-45 g des sels spéciaux de polysaccharide, respec- tivement (échantillons 19-24). EXEMPLE 21 On ajoute 1 litre de solution aqueuse à 10% de chlo- rure ferrique au bouillon après traitement par la résine échan- geuse d'ions, comme à l'exemple 16. On laisse reposer le mélange résultant pendant une nuit en agitant de temps en temps. On recueille le précipité formé par centrifugation, on le lave deux fois par l'eau déminéralisée et on sèche sous vide pour obtenir le sel fer- rique du polysaccharide (échantillon 25). EXEMPLE 22 On ajoute 1 litre de solution aqueuse à 10%. de chlo- rure d'aluminium au bouillon après traitement par la résine échan- geuse d'ions, comme à l'exemple 16. On ajuste le pH à 4,5. On laisse reposer le mélange résultant pendant une nuit en agitant de temps en temps. On traite le précipité produit comme à l'exemple 21 pour obtenir le sulfate d'aluminium du polysaccharide (échantillon.26). Le poids moléculaire, la teneur en cation, l'équi- valent total de cations et le degré de substitution des échantil- lons 18-26 sont indiqués dans le tableau V ci-après. 24873 76 EXPERIENCE 1 Sept groupes de cinq rats chacun, élevés pendant 4 semaines sont nourris avec un aliment d'essai pendant 4 jours pour étudier l'influence du poids moléculaire du B.p sur l'acti- vité d'abaissement de la teneur en cholestérol. On établit sept groupes d'essai. Ce sont le groupe d'aliment standard (sans choles- térol), le groupe d'aliment témoin (avec cholestérol) et les groupes d'aliments d'essai (avec cholestérol et 5% de B.p de chacun des échantillons 1-5 dans le tableau I). La composition de l'aliment est indiquée dans le tableau VI ci-après. Les rats sont nourris à volonté avec l'aliment et l'eau. Après l'essai, on ouvre l'abdomen des rats sous anesthésie à l'éther et on recueille le sang de l'artère abdominale. On prélève le foie et on le pèse. On centrifuge le sérum et on le recueille à partir du sang. On congèle et on conserve le foie et le sérum. On mesure directement la teneur en cholestérol du sérum par l'appa- reil Determiner TC fabriqué par la Société KYOWA HAKKO CO., LTD. On saponifie le foie et l'on sépare la matière insaponifiable. On mesure la teneur en cholestérol de la matière insaponifiable au moyen du même appareil Determiner TC. La teneur en cholestérol HDL est mesurée par le stérozyme HDL fabriqué par la Société FUJI ZOKI SEIYAKU CO., LTD. Les résultats sont indiqués dans le tableau VII ci- après. Comme le montre clairement le tableau VII, le B.p ayant un poids moléculaire de plus de 200 000 (échantillons 1-4) a une activité remarquable d'abaissement de la teneur en choles- térol dans le sérum et dans le foie. L'aspect du foie des rats nourris avec l'aliment standard est brun rougeâtre et le foie des rats nourris avec l'ali- ment témoin est brun jaunâtre. Ceci est nettement la couleur caractéristique du foie gras. D'autre part, le foie des rats nourris avec le B.p des échantillons 1-4 a une couleur brun rougeâtre saine. Le foie des rats nourris avec l'échantillon témoin 5 est brun jaunâtre comme un foie de rat nourri avec l'aliment témoin. Ceci est nettement la couleur caractéristique d'un foie gras. EXPERIENCE 2 On effectue l'essai avec les rats nourris avec les échantillons 6-8 du tableau Il pour prouver l'activité d'abaissement du taux de cholestérol. On établit 8 groupes d'aliment dans cette expérience. La composition de l'aliment de l'expérience est la mâme que dans l'expérience 1. Les résultats sont indiqués dans le tableau VIII ci-après. Comme lemontre à l'évidence le tableau VIII, le B.p de l'invention manifeste une activité remarquable d'abaissement de l'élévation de la teneur en cholestérol dans le sérum et dans le foie, et d'abaissement de l'indice athérogène,lorsque l'on ajoute à l'aliment 3% ou 5% de B.p. Ces activités sont spécialement évidentes avec le B.p (échantillon 7) qui a été traité par ultra- filtration. L'échantillon 8 ayant le plus fort poids moléculaire de 1 360 000 a presque les mêmes activités que l'échantillon 6 ayant un poids moléculaire de 1 040 000. * Il semble vrai que les activités du B.p n'augmentent pas à la valeur du poids moléculaire d'environ 1 000 000. Le foie des rats nourris avec l'échantillon de l'invention a une couleur brun rougeâtre comme celui de l'aliment standard. EXPERIENCE 3 On effectue l'essai sur les animaux avec les échantillons indiqués dans le tableau III pour prouver la relation entre le degré'de substitution et l'activité d'abaissement du taux de cholestérol. On ajoute 5% de l'échantillon à l'aliment. Le détail de la méthode de l'essai est le même que dans l'expérience 1. Les résultats sont indiqués dans le tableau IX ci-après. Comme le montre nettement le tableau IX, les échan- tillons 9, 10, 12 et 13 ayant chacun un degré de substitution de plus de 0,2 et un degré de 0,73, 0,48, 0,47 et 0,25 respectivement, ont une activité remarquable d'abaissement du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie. Le B.p (échantillon 11) ayant un degré de substitution de 0,039 a un effet semblable à celui du groupe d'aliment témoin. Les échantillons 12 et 13 qui sont additionnés de sels après déminéralisation ont une activité assez bonne, comme les échantillons 9 et 10. L'existence du cation combiné avec le B.p est le facteur essentiel pour présenter l'activité d'abaissement du taux de cholestérol. Le seul mélange du cation avec le B.p ne donne pas l'activité indiquée dans le tableau VI o le mélange de sels de Harper a été ajouté au groupe d'aliment témoin et au groupe d'aliment d'essai. Ces groupes ne présentent pas d'activité. Dans l'observation du foie des animaux d'essai, le foie des rats nourris avec l'aliment standard et avec l'aliment d'essai avec le B.p de l'invention est brun rougeâtre et celui de l'aliment témoin est brun jaunâtre. L'aspect du foie du rat nourri avec le B.p de l'invention est très supérieur à celui de l'aliment témoin, comme décrit dans les expériences 1 et 2. EXPERIENCE 4 On effectue l'essai sur des animaux avec les rats nour- ris avec les échantillons 14-17 indiqués dans le tableau IV préparés dans les exemples 12-14 et témoin 3. On établit 10 groupes d'aliment qui sont le groupe d'aliment standard, le groupe d'aliment témoin et8 groupe d'aliments d'essai (avec cholestérol et échantillons 14-17 dans le tableau IV à 3% et à 5%,respectivement). La composition de l'ali- ment et la méthode de l'essai sont les mêmes qu'à l'expérience 1. Les résultats sont indiqués dans le tableau X ci- après. Comme le montre clairement le tableau X, les échan- tillons 14, 15 et 16 sont supérieurs au témoin et l'échantillon 17 ayant un degré de substitution de 0,16 possède une activité réduite. L'échantillon 16, degré de substitution 0,95, préparé par addition de sels à du B.p déminéralisé et par ultrafiltration, a presque le même effet que l'échantillon 15, degré de substitution 0,95, pré- paré par ultrafiltration sans déminéralisation. L'activité d'abais- sement du taux de cholestérol est totalement rétablie par l'addition de sels. La couleur et l'aspect du foie des rats nourris avec le B.p de l'invention sont très supérieurs au témoin, comme décrit dans les expériences l à 3. EXPERIENCE 5 On effectue l'essai sur les animaux avec les échan- tillons 18-25 (tableau V) obtenus dans les exemples 15-22 pour démontrer les activités des sels de B.p avec divers cations. La quantité du sel de B.p ajoutée à l'aliment est de 47.. L'expérience est effectuée comme l'expérience 1. Les résultats sont indiqués dans le tableau XI ci-après. Comme indiqué dans le tableau XI, l'aliment avec les sels de B.p avec des cations combinés présente un effet remarquable d'abaissement de la teneur en cholestérol du sérum, de la teneur en cholestérol du foie, de l'indice athérogène et du taux de choles- térol accumulé dans le foie, par rapport à l'aliment témoin. Ceci montre que les cations combinés dans le sel de B.p ont une plus forte activité d'abaissement du taux de cholestérol. Les sels d'ammonium, de calcium et de magnésium du B.p ont des activités spécialement élevées d'abaissement de l'indice athérogène,qui est étroitement lié à un début d'artériosclérose. L'indice présente une valeur identique ou inférieure à celle obtenue à partir de l'aliment standard. Dans l'observation sur le foie des rats nourris avec les sels de B.p de l'invention, la couleur et l'aspect du foie sont très supérieurs à ceux du témoin, comme décrit dans les expériences précédentes. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustra- tion et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. TA B LEAU I Echantillon Poids moléculaire Protéine brute Cendre j n (%) (%) j 1 93 x 104 1,16 7,6 2 54 x 10 1,02 7,5 3 36 x 104 0,87 7,2 4 25 x 10 0,89 8,1 16 x 10 0,78 8,2 TA B LEAU II TAB L'E A U III Echantillon!Poids molé-Protéine Cendre Teneur en cations (ppm d'équiEquivalent Degre de culaire ibte " 7 valent de cation/kg) no Iculaire îbrute, | % Na K de cation/kCa total substitution _ _ _ _ _ _ 0 _ _ I _ _ _ _ 9 114 x 104 1 1,46 1 7,4 5 400 18 000 3 400 /'50 - i 1! I700 0000,230,46 0, 2.' 0,002 0,97 0,73 98 x10 ' 1,23 7,2 15 000 9 700 2 700 '.50 i 'E. 0,65 0,25 0,22 0,002 1,12 0,84 11 118 x 10 0,74 3,0 590 120 270 /50 - :4 " 0,0250,003 0,022 0,002 0,052 0,039 12 118 x 10 0,73 4,5 550 22 300 260 /,50 - 0,024 0,57 0,021 0,002 0,62 0,47 13 116 x 104 0,73 4,9 6 900 130 270 0,30 0,003 0,022 0O002 0,33 0,25 làa Co AM, -j TABLEAU IV Echantillon Poids molé- Protéine Cendre Teneur en cations (ppm d'équiEquivalent Degré de no culaire brute, % % valent de cation/k ttal substitution Na K Mg Ca 14 104 x 10 2,0 8,1 5 470 18 800 7 850 4 250 0,24 0,48 0,65 0,21 1,58 1,18 100O x 104 1,4 8,9 6 670 15 600 4 420 4 120 - 0,29 0,40 0,36 0,21 1,26 0,95 16 89 x 104 0,9 6,1 5 610 16 350 6 700 920 - 0,24 0,42 0,55 0,046 1,26 0,95 17 91 x 104 0,9 1,2 670 70 310 3 190 - 0,029 0,002 0,025 0,16 0,216 0,16 , _ ...DTD: oo O.4 TABLEAU V Echantilloni Poids Teneur en cations (ppm d'équivalent Équivalent ! i Traitement K de cation/kg); total de Degré de in j + molèculalre Na -Mg Autres i cations substitution 18 ultrafiltra- 89 x 104!5 860 3 000 3 720 2 850 1tion 0,225 0,33 0,31 0,14 1,03 0,78 19 deminérali- 59 x 104 660 85: 250 1 750 sation 0,03 0,62 0,02: 0,09 0,14 0,10 substitué 63 x 104 19 500 210 70 380 par Na 0,85 0,005 0,005 0,02 0,88 0,66 21 substitué 54 x 104 1 150 3 400 70 280 par K 0,05 0,60 0,005 0,01 0,67 0,50 22 substitué 68 x 104 78 130 13 700 200 par Mg 0,003 0,003 1,13 0>01 1,15 0,86 23 substitué - 250 110 130 19 500 par Ca 0,01 0,003 0,01 0,98 1,00 0,75 24 substitué 70 x 10 1 090 75 32 280 NH4 18 600 par NHl4 0,05 0,002 0,002 0, 01 1,03 1,09 0,82 substitué - 93 120 50 75 Pe 24 30 par FeII!0,004 0,003 0,004 0,004 1,30 1,32 0,99 26 substitué - 25 70 3 25 A1 11 600 _ par Ali 0,001 0,002 0,001 1,29 1,29 0,97 %Oa ru Co O TABLEAU VI Composition de l'aliment (% en poids) Aliment Alimenti Aliment Composition standard témoin j d'essai 4) Caséine 22 22 22 MGlange de sels 1) 4 4 4 Mélange vitaminé2) 85 0,85 O,85 (hydrosoluble) Huile de soja3)1 1 1 (en mélange avec une vitamine oleosoluble) Choline 0,15 0,15 0,15 Lard 10 10 10 Cholestérol 0 0,5 0,5 Sel de sodium d'acide cholique0 0,25 0,25 B. p. 0 0 5 (3) Saccharose 62 61,25 56,25 (58,25) Total 100 100 100 1) Mélange de sels de Harper 2) Mélange vitamine de Harper 3) En mélange avec: vitamine A(3000UI), vitamine D(300UI) et vitamine E.(100 mgpar kg d'aliment) 4) La valeur entre parenthèses montre l'addition de 3 % de B. p. à l'aliment. Mélange de sels de Harper: CaCO3 29,29, CaHP04,2H20o: 0,43, KH2P4: 34,31, NaCl 25,06, MgSO4,7H20: 9,98, et autres TABLEAU VII Groupe Taux de cholestérol (mg/dl) Indice Taux de cholesterol accu- d'aliment athérogène mulé dans le foie Sérum HDL foie (mg/g) Aliment 91+ 16 59,6+16,0 3,7+1,2 0,6+0,4 standard Aliment 291+53 31,6+7,0 22,2+0,6 8, 2+2,0 50,4+4,7 témoin Aliment d'essai % de B.p de 116+16 39,5+4,8 7,6+1,1 1,9+0,3 14,2+1,7 l'échantillon 1 % de B.p de 129+40 38,9+8,4 10,2+,1;9 2, 4+1,0 16,6+6,4 l'échantillon 2 % de B.p de 165+41 34,5+4,7 9,6+2,5 3,8+1, 2 15,9+4,7 l'échantillon 3 % de B.p de 190+37 40,1+9,7 12,9+0,9 4,2+2,6 20,6+6,0 l'échantillon 4 % de B.p de 243+35 30,5+4,8 20,6+1,7 7,0+2,0 35, 4+5,3 l'échantillon 5 1) Cholestérol dans le foie dans le groupe d'aliment d'essai Cholestérol dans le foie dans le groupe d'aliment standard absorption de cholestérol r3 x 100 N Co --4 o T A B L E A U VIII Taux de cholestérol (mg/dl) Indice Taux de cholestérolaccu- Groupe athérogène mulé dans le foie d'aliment Sérum MHDL foie (mg/g) Aliment 96+13 61,8+4,5 2,9+02 0,6+0,2 standard. Aliment 323+19 36,3+1,2 22,4+1,O 8,3+0,4 52,4+3,8 témoin Aliment i d'essai t 3 % de B.p de! 213+ 11 32,1+1,5 11,9+0,6 5,7-tO,5 19,8+2,5 l'échantillon 6 % de B.p de 1 150+ 11 39,7+2,1 9,5+0,5 2,9+0,5 14,6+1,4 l'échantillon 6 3 % de B.p de 138+11 34,9+1,2 7,9+0,5 3,0+0,3 9,9+1,1 l'echantillon 7 I % de B.p de 90+3 45,0+ 2,4 5,4+0,6 1,0+0,1 3,8+1,3 l'echantillon 7 3 %. de B.p de 201+8 35,8+2,2 11,3*0,8 4,5+0,3 18,8+2,0 l'echantillon 8; . -- % de B.p de 155+14 37,1+1,9 9,6+0,3 3,0+0,5 14,7+1,5 l'échantillon 8] -: . u4 o4 Wa! 0% T A B L E AU IX Groupe Taux de cholestérol (mg/dl) Indice Taux de cholestérol d'aliment athérogène accumulé dans le foie Serum HDL foie (mg/g)i Aliment 88+5 50,9+ 4,2 3,2+0,3 0,7+0,1 standard Aliment 251+26 28,9+2,7 20,6+0,5 8,2+1,8 49, 8+2,2 temoin Aliment d'essai % de B.p de 106+6 49,9+6,0 7,7+1,1 1,3+0,3 8, 6+2,9 l'échantillon 9 % de B.p de l 116+16 41,0+6,1 7,4+1,4 2,2+0,7 7,8+4, 2 l'échantillon 10 % de B.p de 291+47 31,5+3,2 23,4+0,5 8,4+1,3 51,4+1,8 l'échantillon 11 i % de B.p de 105+11 32,0+4,2 8,3+1,6 2,3+0,7 7,5+3,1 l'échantillon 12 % de B.p de 154+21 28,1+2,7 9,8+1,6 4,8+1,1 12,9+4,0 l'échantillon 13 w N CA -NI LM TABLEAU X Groupe Taux de cholestérol (mg/dl) Indice Taux de cholestérol aceu- d'aliment |Sérum f HDL foie (mg/g) athérogène mule dans le foie fi.m g / g. Aliment standard Aliment témoin Aliment d'essai 3 % de B.p de l'échantillon 14 % de B.p. de l'échantillon 14 3 % de B.p de l'échantillon 15 % de B.p de l'échantillon 15 3 % de B.p de l'échantillon 16 % de B.p de l'échantillon 16 3 % de B.p de l'échantillon 17 % de B.p de l'echantillon 17 96+13 323+19 213+11 +11 138+11 +3 127+16 91+8 251+17 227+12 61,8+4,5 36,3+1,2 32,1+1,5 39,7+2,1 34,9+1,2 ,0+2,4 42,2+1,0 , 1+4,3 33,9+1,2 32,4+1,6 2,9+0,2 22,4+1,0 11,9+0,6 9,5+0,5 7,9+0,5 , 4+0, 6 6,6+0,4 ,3+0,4 , 6+1,5 ,5+1,3 0,6+0,2 8,3+0,4 ,7+0,5 2,9+0,5 3,0+0,3 1,0+0, 1 2,0+0,4 1,1+0,3 6,4+0,4 6,1+0,4 52,4+3,8 19,8+2,5 14,6+1,4 9,9+1,1 3,8+1,3 6,5+1, 1 2,5+1,2 31,3+3,4 29, 1+3,2 41' cr O4 o- Co 1 1 T A B L E A U XI Groupe Taux de cholestérol (mg/dl) Indice Taux de cholestérol accumulé d'aimntathérogène dans le foie d'aliment Sérum HDL foie (mg/g) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Ij. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Aliment standard Aliment témoin Aliment d'essai B.p ultrafiltré de l'échantil- lon 18 Sel de Na de l'échantillon 1 Sel de K de l'échantillon 2 Sel de Mg de l'échantillon 21 Sel de Ca de l'échantillon 22 Sel de NH4 de l'échantillon 23 Sel de Fe de l'échantillon 24 Sel de A1 de l'échantillon 25 92+14 284+31 114+16 106+13 92+25 88+35 +24 72+17 102+17 +17 43,3+7,3 31,8+5,4 39,1+13,9 34,6+6,5 ,7+12,7 ,3+13,2 47,8+11,7 46,9+4,9 37,0+6,1 42,5+17,0 2,5+0,3 17,7+0,6 7,3+1,1 7,8+1,0 6,5+2,2 6,2+1,8 ,8+1,6 4,6+1,8 7,7+1,3 6, 5+1,9 1,2+0,5 8,1+1,8 1,9+0,3 1,8+0,6 1,6+1,4 1,1+1,7 0,9+0,9 0,5+0,2 i, 8+0,7 1, 9+1, 1 I '__ _ _ _ _ _ _ y. 44,1+3,1 12,2+2,4 12,8+342,7 8,5+5,3 7,7+5,0 6, 1+3,9 3,9+5,0 12, 1+3,3 8,_6+5,6 U oe N b. os i i ti i R E V E N D I C A T IO N S 1 - Procédé pour la production de polysaccharides ayant un poids moléculaire de plus de 200 000 et une activité d'abaissement de l'élévation du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie et de l'indice athérogène, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver Bacillus polymyxa n' 271 dans un milieu de culture aqueux contenant des saccharides assimilables jusqu'à ce que ledit polysaccharide s'accumule dans ledit milieu, et à récu- pérer ledit polysaccharide accumulé dudit milieu. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on cultive Bacillus polymyxa n0 271 dans ledit milieu, pen- dant plus de 20 h. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit polysaccharide accumulé dans le milieu est soumis à l'ultrafiltration avant la récupération dudit polysaccharide. 4 - Procédé de production d'un sel cationique de polysaccharide ayant un degré de substitution par des cations de plus de 0,2, et une activité d'abaissement de l'élévation du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie et de l'indice athé- rogène, caractérisé en ce que l'on cultive Bacillus polymyxa n0 271 dans un milieu de culture aqueux contenant des saccharides assimi- lables et des cations jusqu'à ce que ledit sel cationique de poly- saccharide s'accumule dans ledit milieu et on récupère ledit sel cationique de polysaccharide dudit milieu. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit cation comprend au moins un ion choisi parmi les ions de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux, de métaux de tran- sition, les ions manganèse, aluminium, zinc, cuivre et l'ion ammo- nium. 6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit milieu de culture contient un équivalent total de cations d'au moins 0, 005 par litre du milieu et. en ce que l'on cultive Bacillus polymyxa n0 271 dans ledit milieu de culture, à un pH de plus de 4,5. 7 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on ajoute des sels au bouillon de fermentation avant de récupèrer ledit sel de polysaccharide. 8 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit sel de polysaccharide accumulé est soumis à l'ultra- filtration avant la récupération dudit sel de polysaccharide. 9 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit sel de polysaccharide accumulé est récupéré du milieu par addition d'alcool comme précipitant au milieu de fermen- tation.