Brevet FR2494717A1 — publié le 19820528

La présente invention est relative a des perfectionnements aux procédés de préparation de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes, aux préparations de spores ainsi obtenues et aux applications phytosanitaires de ces préparations. De façon plus spécifique, la présente invention est relative & un nouveau procédé de formation, de maturation et de germination de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes, et aux spores obtenues par ce procédé, ainsi qu'à l'utilisation de ces dernières notamment dans des compositions phytosanitaires. Les Entomophthorales sont des champignons entomopathogènes très répandus dans le monde entier, qui infectent divers insectes nuisibles, notamment en agriculture, et exercent une action pathogène particulièrement efficace à l'égard des aphides. Comme on le sait, les Entomophthorales produisent deux types de spores : les conidies, dont la durée de vie est brève et qui sont à l'origine de l'infection et de la propagation de la maladie, et les spores durables ("resting spores") - zygosporesou azygospores suivant l'espèce - qui assurent la conservation du champignon d'année en année, sont résistantes aux conditions climatiques adverses et fournissent l'inoculum pour l'infection primaire des insectes au début de leur cycle de pullulation. Les spores durables,en raison de leur résistance, représentent actuellement les propagules les mieux adaptées pour l'emploi des Entomophthorales dans la lutte contre les insectes nuisibles, et notamment contre les aphides (cf. Bull. Soc. Pathol. Exot., vol. 71, p. 196-203, 1978, J.P. Latge, G. Remaudiere & B. Papierok) L'infection des insectes est en outre possible à partir du mycélium (corps hyphaux) et des coniaies proauits in vitro,en particulier dans le cas des espèces qui ne donnent pas de spores durables en culture corne par exemple Erynia neoaphidis Remaudière & Keller. Les procédés de préparation de spores durables d'Entomophthorales connus consistent à fermenter, pendant 5 à 15 jours, sous agitation et insufflation d'air, à une température comprise entre 10 et 30C (variable suivant l'espèce), un inoculum constitué par des corps hyphaux d'Entomophthorales âgés de 1 à 8 jours dans un milieu de culture liquide approprié, (cf. Biotechnol. Bioengin. vol. 19, p. 1269-1284, 1977, J.P. Latgé, R.S. Soper & C.D. Madore et Canad. J. Microb., vol. 26,p. 1038-1048,1980,J.P. Latgé). La première phase de fermentation est une phase de croissance. L'affamement du mycélium déclenche la sporulation dans le milieu de culture. Les spores immatures sont appe lées 'wprespores(voir figure unique). La maturation de ces préspores a lieu au cours d'une deuxième phase de fermentation liquide. Les spores mûres sont généralement caractérisées par un globule lipidique central dont le diamètre est compris entre 1/3 et 2/3 du diamètre sporal et une paroi dont l'épaisseur est au moins égale au 1/10 du diamètre sporal. Les spores sont séparées de la phase liquide, par exemple par centrifugation, puis rincées à l'eau, avant stockage à l'état humide ou séchage à l'air, suivant les espèces. La production des spores durables peut être effectuée sur milieu solide,notamment chez Zoophthora radicans (Brefeld) BathD.un procède de production sur vermiculite a été développé chez Canidiobolus thromboldes Drechsler (=Entomophthora virulenta Hall & Dunn). I1 a pu être établi que la croissance et le développement des cultures ainsi réalisées étaient considérablement augmentés, et que, après conservation pendant 6 mois à -200C, ces cultures étaient encore vivantes (cf.Lantbrukshögskolans Annaler, Vol. 35, p. 235-274, 1969, M. Gustafsson; Ces cultures ont cependant été réalisées avec des espèces dont la conservation in vitro est très facile. Plus récemment, (cf. Brevet français Sandoz 2 317 882), il a été proposé d'enrober des préparations de virus obtenues par broyage dans l'eau de larves infectées ou par extraction par l'acétone, d'une matrice solide comprenant une matière protéique inerte solide et/ou de l'argile, pour réaliser des compositions insecticides microbiologiques sous forme de fines particules mouillables, dures, de dimensions inférieures 150 pm. I1 a, par ail leurs,été proposé (cf. Brevet français INRA-REmS nO 2 3n4 606 et Smn. Zool. Ecol. anim.,1979,11, p. 247-257, Fargues,J., Robert,P. & Reisinger,O) ,de protéger et de conserver des microorganismes utilisables en tant qu'insecticides de lutte contre les insectes nuisibles en agriculture et en arboriculture en les enrobant d'argile, en assurant en même temps le maintien de leur efficacité lors d'un stockage prolongé. Le procédé décrit consiste à mélanger une préparation aqueuse de microorganismes tels que virus, champignons ou bactéries obtenus sur milieu nutritif et préalablement lavés pour éliminer toute trace d'un tel milieu, avec une suspension aqueuse d'argile, I soumettre ce mélange à agitation, puis à éliminer l'eau en excès, notamment par séchage par atomisation ou par lyophilisation, ce qui permet d'obtenir des propagules, notamment des spores fongiques entomopathogènes, enrobées d'argile, stabilisées par la combinaison du traitement de déshydratation, de l'enrobage par l'argile et de la conservation à basse température (+ 50C) et qui conservent leur pouvoir infectieux au bout d'un mois de conservation, ce pouvoir subissant une diminution au bout de 3 a 5 mois de conservation. L'on sait, par ailleurs, que les espèces d'Entomophthorales se distinguent par leurs comportements différents en ce qui concerne la croissance mycélienne, la formation et la germination des spores durables. Certaines espèces telles Neozygites fresenii (Nowak) Remaudière & BR Keller, n'ont jamais été cultivées in vitro. Des espèces, notamment c. obscurus (Hall & Dunn) Remaudière & -Keller ou c. thromboldes Drechsler f o r m e n t d é s spores durables in vitro, en culture liquide, alors que d' a u t r e s , n o t a m m e n t Z. radicans produisent des spores sur substrat solide après ou sans développement mycélien en culture liquide agitée.Les spores durables de certaines espèces, notamment c. thromboldes germent immédiatement lorsqu'elles sont placées dans l'eau à température ambiante, alors que d'autres espèces, notamment C. obscurus et z radicans produisent d e s spores dormantes qui requièrent un séjour de longue durée à basse température pour lever leur dormance et ensuite germer lorsqu'elles sont remises dans l'eau I température ambiante.La dénomination des espèces d'Entomophthorales est conforme aux travaux de Remaudière & Hennebert (1980, Mycotaxon, 11, 269-321) et Remaudière & Keller (1980, Mycotaxon, 11, 323-338) La présente invention s'est donné pour but de pourvoir à un procédé de préparation de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes nuisibles, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés visant au même but proposés dans l'Art antérieur, notamment en ce qu'il réduit la durée de fermentation du champignon, en ce qu'il diminue considérablement les échecs de fermentation par contamination tardive dans les cuves de culture, en ce qu'il donne lieu à des spores mûres obtenues par maturation des pré spores dans des conditions non stériles, en présence d'un support inerte, en ce que ces spores se conservent pendant des durées prolongées et en ce que leur germination ultérieure est activée, en ce que les spores germées obtenues conservent une activité pathogène, en ce que les spores ainsi traitées permettent des applications phytosanitaires plus souples que les préparations entomopathogènes proposées conformément I l'Art antérieur. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes, nuisibles notamment en agricul ture, caractérisé en ce qu'il comprend les etapes suivantes: - une première étape de fermentation d'un inoculum composé de corps hyphaux d'Entomophthorales dans un milieu de fermentation approprié contenant une source de carbone et une source d'azote, sous agitation et insufflation d'air, à un pH variable selon les especes et de préférence compris entre 6 et 7, ladite étape de fermentation donnant lieu, après une durée de 2 à 5 jours suivant les espèces, à la formation de pré spores sphériques présentant une paroi composée de deux couches, la couche interne isolant la spore du milieu ambiant ; - une deuxième étape, réalisée dans des conditions non stériles, au cours de laquelle les préspores sont séparées du milieu de fermentation et lavées abondamment et soigneusement ; - une troisième étape au cours de laquelle les pré spores sont mélangées avec un support inerte humide tel que de l'argile ; - une quatrième étape d'évolution des pré spores mélangées audit support inerte humide, à une température comprise entre 15 et 250C, pendant un temps suffisant pour o b t e n i r 1 e s s p o r e s d u r a b 1 e s présentant une épaisseur de paroi au moins égale au 1/10 du diamètre sporal et comprenant un seul globule lipidique de diamètre minimum égal au 1/3 du diamètre sporal ; - une cinquième étape au cours de laquelle lesdites spores durables, en mélange avec le support inerte, sont gardées au froid I une température moyenne comprise entre 2 et 70C,et -une sixième étape ol les spores enrobées du support inerte sont éventuellement mélangées à des composés usuels pour l'obtention d'une composition phytosanitaire entomopathogène à l'égard des insectes nuisibles, notamment en agriculture, laquelle composition présente un pouvoir infectieux élevé. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, particulièrement adapté I la maturation des spores d'Entomophthorales présentant un temps de dormance, l'étape de maturation des préspores mélangées I un support inerte humide, en spores durables fournit des spores dormantes qui sont soumises I une étape supplémentaire de traitement qui a pour but de lever leur dormance et qui consiste I maintenir le mélange de spores durables et d'argile humide a une température moyenne de l'ordre de 2 à 70C pendant une durée d'au moins deux mois pour obtenir des spores mûres dont la dormance est levée. Selon un autre mode de realisation avantageux du procédé conforme à l'invention, les préspores sont séparées du milieu de culture a leur sortie du fermenteur, dans la deuxième étape, par centrifugation ou par filtration, et lavées soigneusement. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, la séparation des préspores du milieu de culture est réalisée par filtration éventuellement en présence d'un adjuvant de filtration approprié. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, le support inerte utilisé dans la troisième étape est une argile choisie dans le groupe qui comprend notamment la rhyolite, la terre de diatomées, l'attapulgite, l'argile complexe "Le Buisson" à base essentiellement de bentonite et d'attapulgite. Selon une disposition préférée de l'invention, les Entomophthorales mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention pour la production et/ou la maturation et/ou la germination de spores-azygospores ou zygospores -, sont choisies notamment dans le groupe qui comprend C. osmodes, C. obscurus, C. thrcmboîdes, N. fresendi et Z. radicans. Le procéde conforme à la présente invention comprend la totalité des étapes ci-dessus ou seulement certaines de ces dernières. En particulier, les spores durables, formées in vivo, d'une espèce non cultivable (telle que N. fresenii) ou celles produites en milieu solide pour les espèces ne sporulant pas en milieu liquide, notamment z. radicans, peuvent subir les étapes 3, 4, 5 et 6. D'un autre cté, les spores ne présentant pas de dormance comme notamment celles de c. thromboides peuvent subir en particulier les étapes 1, 2, 3 et 4. Selon un mode de réalisation préféré du procédé objet de la présente invention, la maturation des préspores en spores en mélange avec un support inerte, est réalisée en présence d'eau, la proportion des constituants du mélange préspores: eau: support inerte étant fonction de l'argile et de l'espèce (ou souche) considérée et comprise dans les limites suivantes Pré spore (poids humide) Eau Argile (poids sec) 2-6 1-7 2-15 Selon un mode de réalisation préféré de l'étape supplémentaire de levée de la dormance des spores dormantes obtenues à l'issue de la quatrième étape, cette étape supplémentaire comprend le maintien pendant au moins deux mois à une température moyenne de 2 à 70C d'un mélange de spores, d'un support inerte et d'eau présents dans des proportions variables suivant le support et l'espèce (ou souche) considérés. La présente invention a en outre pour objet en tant que produit intermédiaire nouveau utilisé pour la production de spores d'Entomophthorales présentant un pouvoir entomopathogène élevé, un mélange de préspores sphériques présentant une paroi bituniquée obtenues par fermentation dans un milieu de culture approprié, et d'une argile choisie dans le groupe qui comprend notamment la rhyolite, la terre de diatomées, l'argile "Le Buisson" (mélange complexe naturel à base de bentonite et d'attapulgite) et l'attapulgite. La présente invention a également pour objet en tant que produit nouveau, un mélange d'argile et de spores dont la dormance a été levée par maintien du mélange pendant au moins deux mois à une température moyenne comprise entre 2 et 70C. La présente invention a également pour objet une composition phytosanitaire entomopathogène, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un mélange de spores présentant un pouvoir infectieux élevé à l'égard des insectes nuisibles, notamment en agriculture, et d'argile, obtenu par le procédé de l'invention, associé aux composés usuels pour la préparation d'une telle composition tels qu'agents collants, mouillants, dispersants, propres à faciliter la pulvérisation ou l'aspersion ultérieure desdites compositions en plein champ, et I favoriser le collage des spores sur le substrat végétal. Selon un mode de réalisation avantageux de la composition phytosanitaire conforme à la présente invention, son constituant actif est constitué par des spores enrobées d'argile, à pouvoir entomopathogène élevé obtenues par maturation de préspores sphériques issues d'une fermentation. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la composition phytosanitaire conforme à la présente invention,son constituant actif est constitue par des spores enrobées d'argile, à pouvoir entcOOpathogène élevé obtenues par maturation de préspores sphériques issues d'une fermentation et maintien des spores résultantes pendant au moins deux mois à 2 à 70C, pour lever la dormance desdites spores. La présente invention a en outre pour objet un procédé de traitement de cultures à l'aide de la composition phytosanitaire entomopathogène conforme l'invention, lequel procédé consiste à appliquer sur la plante et/ou au sol, par pulvérisation ou aspersion, la composition phytosanitaire conforme à l'invention, pour contrdler des populations d'insectes nuisibles importantes déjà établies sur la plante, dans le cas où le constituant actif, c'est-àdire la spore, est à germination rapide (environ 48 heures), ou avant l'apparition des insectes ou dès la détection des premiers insectes, pour contrôler la population d'insectes avant qu'elle n'ait atteint un seuil dommageable pour la culture, dans le cas où le constituant actif, c'est-à-dire la spore, est à germination lente (8 à 15 jours ou plus). Les spores mûres peuvent être incubées dans l'eau pendant plusieurs jours avant formulation définitive et application.Par ce traitement, les spores ayant une germination lente peuvent être uti lisées dans les mêmes conditions que celles à germination rapide. Parmi les Entomophthorales qui sont susceptibles d'être utilisées dans le cadre de l'invention, on peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, c. obscurus, C. osmodes, C. thromboides, étant cependant bien entendu que tout au tre représentant du groupe des Entomophthorales que ceux qui viennent d'être mentionnés peut être utilisé dans le cadre de la présente invention Pour la mise en oeuvre du procédé conforme à las présente invention, on procède avantageusement comme suit, les modalités du procédé précisées ci-après étant applicables en particulier dans le cas de c. obscurus:: La figure unique annexée schématise les différentes étapes du développement de c. obscurus réalisé en mettant en oeuvre le procédé conforme à la présente invention, depuis l'inoculation du mycélium dans le milieu de culture du fermenteur jusqu'à l'obtention des spores germées qui exercent directement ou par l'intermédiaire des conidies qu'elles projettent dans l'air, leur action entomopathogène sur les insectes nuisibles notamment I l'égard des plantes. I - Conditions de culture 1. Inoculum L'inoculum choisi est, de préférence, un mycé lium agé de 24 I 72 heures, et plus particulièrement âgé de 24 heures, développé en fermenteur sur un milieu de culture approprié, notamment sur un milieu agité contenant 1 a 2 % d'extrait de levure (Difco) et 3 à 6 % de glucose, et cet inoculum représente 1 à 20 % (v/v) du milieu de cul ture ensemencé. 2. Milieu de culture Le milieu de culture utilisé pour réaliser la sporulation, est un milieu solide ou liquide aqueux qui contient essentiellement une source de carbone et une source d'azote, la source de carbone étant constituée par exemple par du glucose ou d'autres sucres commercialisés notatrt sous les Marques "XslBREX", "GLOBE", "FLEURINE", "CERELOSE" (commercialisés par la SOCIETE DES PRODUITS DU MAIS), ou e n c o r e p a r une huile végétale telle que l'huile de tournesol ou l'huile de mais non raffinée,commercialisée notamment par la SOCIETE Urus PRODUITS DUS MAÏS et la source d'azote par exemple par de 1 'extrait de levure ou de l'extrait soluble de mals (Produit commercialisé par la SOCIETE DES PRODUITS DU MAIS).Le rapport C/N doit être au moins egal à 5. La teneur en carbone du milieu est,de préférence, de l'ordre de 1,2 à 2,4 %, et sa teneur en azote de l'ordre de 0,1 à 0,2 %. Il est avantageux de lui ajouter un agent antimousse approprie. Ce milieu est inoculé par le mycélium mentionné en 1. ci-dessus. 3. Conditions de fermentation La fermentation est réalisée dans un fermenteur contenant un milieu de culture tel que l'un de ceux décrits en 2. ci-dessus La température de la fermentation est continuellement régulée à + 200C + 10C. L'agitation est comprise entre 400 et 1200 tpm et l'aération comprise entre 0,1 et 1,0 volume d'air/volume de milieu/minute (vvm). Le pH optimal est compris entre 6 et 7. Il est ajusté à 6,5 avant autoclavage et peut être régulé à 6,5 pendant toute la fermentation. Dans un milieu de culture contenant 3 I 4 % de glucose ou analogue et 1 % d'extrait de levure, la phase de latence, ou phase stationnaire, dure 6 à 8 heures ; à la suite de cette phase de latence, il s'instaure dans le milieu une phase de croissance linéaire qui atteint son maximum 40 à 50 heures après l'inoculation du milieu de culture. Le mycélium se développe toujours sous forme d'éléments unicellulaires plurinuclés,les corps hyphaux (1) ,séparés ou en amas,plus ou moins importants suivant le temps de fermentation et l'espèce considérée. La sporulation débute dès la fin de la phase de croissance qui correspond à la métabolisation quasicomplète de la source de carbone et/ou d'azote, et le nombre de préspores augmente pendant une vingtaine d'heures. Le début de la sporulation est caractérisé par la condensation du protoplasme en un endroit précis (centre de sporulation) du corps hyphal (2). Ce centre de sporulation (2a) peut avoir une position terminale, latérale ou médiane (comme représenté au dessin) sur l'élément mycélien. Une vacuole se forme aux extrémités distales et propulse le protoplasme granuleux vers le centre de sporulation en même temps que des cloisons successives isolent la préspore. Il se forme ainsi une préspore sphérique (3-4) à protoplasme granuleux. La paroi unituniquée de la préspore très jeune est de composition similaire I celle du mycélium et est essentiellement constituée de glucanes. Le nombre de préspores est maximal entre la 60ème et la 84ème heure et après ce temps, le nombre des préspores n'augmente plus. Celles-ci évoluent ensuite pendant 3 I 5 jours : de s g 1 o bu 1 e s 1 i p i d iq u e s s'individualisent au centre de la préspore 5. Le nombre de globules lipidiques va progressivement diminuer en même temps que leur taille augmente et que la paroi de la préspore s'épaissit. Les jeunes préspores contiennent plus de 50 globules lipidiques individualisés, de 3,5 I 5 pm de diamètre et présentent une épaisseur de paroi inférieure I 1 pm. L'augmentation de l'épaisseur de la paroi résulte de la synthèse d'une couche interne (CI) qui comprend essentiellement de la chitine et des protéines et qui est différente de la couche externe (CE) qui est surtout constituée de glucanes. La préspore devient alors insensible I toute variation du milieu extérieur, alors que les corps hyphaux (mycélium) ou les préspores en formation sont, eux, très dépendants du milieu ambiant. La mise en évidence du fait que le nombre des préspores n'augmente plus après la 60ème I la 84ème heure et que la seconde couche pariétale interne caractéristique de la préspore isole celle-ci du milieu ambiant, a permis aux Inventeurs d'en tirer parti en libérant le fermenteur au bout de 3,5 jours i 12 heures pour réaliser la maturation des préspores I l'extérieur du fermenteur, ce qui permet une réduction de moitié du temps d'utilisation du fermenteur. Le nombre de pré spores produites est de 5 x 105 à 2 x 106 préspores par ml pour les milieux indiqués en 2. ci-dessus. Il - Formation des spores durables à partir des pré- spores 1. Recupération des préspores La fermentation étant alors arrêtée 3,5 jours i 12 heures après l'inoculation, lorsque les préspores ont une paroi bituniquée, les préspores sont récupérées par centrifugation ou filtration et abondamment lavées I l'eau ordinaire. La filtration peut être éventuellement réalisée en présence d'un adjuvant de filtration tel qu'une perlite de filtration par exemple, ou tout autre adjuvant de filtration approprié, pour séparer les préspores. 2 Conditionnement des Erespores Ear de l'argile Les préspores sont alors mélangées de façon homogène dans un malaxeur approprié, I palette par exemple, dans des conditions non stériles, avec une argile, en présence d'eau, notamment une argile prise dans le groupe qui comprend, en particulier, la rhyolite, la terre de diatomées, l'attapulgite, l'argile "Le Buisson". Les proportions respectives de préspores, d'argile et d'eau dans le mélange ne sont pas critiques, bien que certaines proportions soient optimales en ce qu'elles donnent des spores de meilleure qualité. De plus, les proportions optimales du mélange préspores:argile:eau, varient selon le type d'argile. Lesdites proportions sont entendues en poids humide pour les préspores et en poids sec pour l'argile et sont données dans ce qui va suivre, dans l'ordre qui vient d'être indiqué. Les [] 7 expriment des concentrations en grammes C'est ainsi qu'il a été constaté que la meilleure maturation est obtenue avec l'attapulgite (Clarsol BBC, Ceca) dans le mélange suivant : préspores:eau:argile: 1:2:5. L'attapulgite est un support qui permet les écarts de concentration les plus importants. Ainsi, une bonne ma turation est obtenue dans les limites de concentration suivantes Pré spore Eau Argile 2 à 6 1 à 7 5 à 15 à condition de respecter la condition suivante : [préspores] # [argile] I1 a été constaté, par exemple, qu'avec la rhyolite (Cecaperl AM, Ceca), on obtient des spores de qualité satis faisante à partir d'un mélange Pré spores Eau Argile 2 1 à 2 2 dans lequel (eau] # [Argile] (préspores] 4 [argile] I1 a été constaté qu'avec l'argile "Le Buisson" (Clarsol STF, Ceca), le mélange optimal est un mélange Pré spore Eau Argile 2 à 12 1 I 2 5 à 15 dans lequel :: eau7 3. Evolution des Eréspores Eroprement dite Les préspores enrobées d'argile comme il vient d'être décrit, sont alors maintenues pendant 3 à 7 jours à + 20 C i 10C jusqu'à l'achèvement de la formation des spores. Lors de cette- é v o l u t i o n, le nombre des globu les lipidiques diminue, alors que leur taille augmente. Par ailleurs, le dépôt de la couche interne de la spore s'inten sifie. Ainsi, lorsque le nombre des globules est compris contre 5 et 10, leur taille est de 5 à 12 um et la paroi sporale a alors une épaisseur de 1 à 2 ijm. La spore (6) fina lement obtenue est caractérisée par un globule unique de 20 I 25 pm de diamètre et son épaisseur de paroi est d'abord de l'ordre de 2,5 pm à 3 llm pour attelndre parfois 4 pm. Elle presente toutes les caractéristiques d'un organe de résistance : faibles teneurs en acides nucléiques, protéines, glycogène et sucres acidosolubles et fortes teneurs en lipides et polyosides (chitine incluse). III - Levee de la dormance des spores Lorsque les spores durables obtenues sont des spores dormantes, comme c'est le cas r.o ment des spores de C. obscurus, il est alors nécessaire de les traiter pour lever leur dormance et les rendre aptes I germer. Il s'est avéré qu'aucun des chocs physicochimiqes utilisés habituellement pour stimuler la germination des spores fongiques, n'est capable de lever la dormance des spores durables de C. obscurus. Conformément I la présente invention, les spores dormantes résultant de la maturation des pré spores telle que décrite en II.3. ci-dessus, ou effectuée en culture liquide agitée, doivent être stockées dès la fin de la maturation dans une enceinte humide à 2 à 70C pendant deux mois minimum. Ainsi, ces spores sont capables de germer au bout de trois mois de stockage I une HR supérieure I 90 % et à 40C t 1QC ou 60C + 10C, le taux de germination étant maximum après 5 mois de stockage à 40C + 10C I 100 % d'HR et étant supérieur I 80 %.Le taux de germination ne varie pas de façon significative jusqu'à 10 mois de stockage pour des spores stockées à 100 z d'HR. Des spores stockées à 60C + 10C sont capables de germer après 3 mois de stockage à des humidités relatives supérieures à 95 %. A 95 % d'HR, le taux de germination atteint 20 % après 5 mois de stockage, puis devient nul au-delà de cette durée. A 100 % et 9o % d'HR, la germination dépasse 40 % même après 10 mois de stockage à 60C et 40C (cf Tableau I). Cette levée de la dormance est réalisable sur le plan industriel, conformément à l'invention, grâce à l'enrobage des spores par un support inerte tel que l'argile. De plus, l'enrobage des spores par de l'argile est important pour la conservation ultérieure des spores. La conservation et la levée de la dormance sont fonction de l'argile considérée. Ainsi, un taux de germination maximum de 80 8 a été obtenu avec des spores enrobées d'attapulgite, d'argile "Le Buisson" et de rhyolite, stockées à 40C i 10C à 100 8 d'humidité relative, l'attapulgite permettant la meilleure conservation des spores : les spores sont capables de germer après 3 mois de stockage, le maximum de germination de 80 % est atteint à 5 mois de stockage et ce taux se maintient sensiblement au même niveau jusqu'à une durée de 10 mois de stockage.Avec les deux autres substrats, les temps de survie des spores sont plus courts : 6 mois avec la rhyolite et 7 mois avec l'argile "Le Buisson" (Tableaux II, III). Aucun changement morphologique n'est décelable en microscopie optique entre des spores dormantes et des spores dont la dormance est levée. Les proportions du mélange spores:eau:argile soumis au traitement de levée de la dormance décrit ci-dessus, peuvent être légèrement différentes de celles indiquées pour les mélanges préspores:eau:argile utilisés pour la maturation des préspores en spores durables. IV - Germination des sEores durables obtenues confor- mement I l'invention A - Les spores durables d'Entomophthorales comme par exemple celles de c. thromboîdes qui sont aptes I germer immédiatement après 1 e u r f o r m a t i o n, peuvent être utilisées immédiatement après le processus de maturation des préspores en spores conforme à l'invention après 48 heures dans l'eau, le taux de germination peut atteindre ou dépasser 50 %, ce qui permet d'utiliser ces spores I germination rapide pour lutter contre des populations d'aphides importantes déjà établies sur la plante. B - Les spores d'Entomophthorales qui présentent une dormance et dont c. obscurus constitue un exemple, ne sont pas capables de germer avant d'avoir subi un traitement d'au moins 2 mois I 2-70C et généralement même d'au moins 3-4 mois, en milieu humide. A l'issue de ce traitement, la germination de ces spores mures débute après 5 à 15 jours d'incubation dans l'eau entre 6 et 200C,de préférence entre 12 et 160C. La spore mûre (7) prête à germer, placée dans des conditions de germination appropriées (humidité et température) subit des transformations morphologiques au cours desquelles la paroi sporale s'amincit et le volume du globule lipidique diminue (spore 8) ; puis des granulations denses apparaissent dans le cytoplasme, la spore augmente de volume, la réduction du globule lipidique et la lyse de toutes les couches internes de la paroi se poursuivent. Au stade de gonflement maximal de la spore, le globule lipidique a disparu et le protoplasme est entièrement granuleux. Un tube germinatif(9a) apparaît. Il forme au contact de l'air un conidiophore qui projettera une conidie. V - Prearation de compositions phytosanitaires I1 est avantageux d'associer les spores durables préparées conformément I la présente invention, a des agents collants, mouillants et/ou dispersants, afin de rendre la pulvérisation ou l'aspersion ultérieure des compositions phytosanitaires I base de ces spores entomopathogènes, plus facile et plus efficace sur les sols ou sur les plantes à traiter, de tels agents étant présents aux doses usuelles dans les compositions phytosanitaires. - - Modalites d'application des compositions Ehyto- sanitaires conformes à l'invention Les compositions phytosanitaires conformes I la présente invention peuvent être appliquées suivant différentes modalités, selon que les spores durables qui en sont les constituants actifs sont des spores d'Entomophthorales à germination rapide ou I germination lente a) les compositions phytosanitaires à base de spores dura bles d'Entomophthorales à germination rapide (telle c. thromboldes) qui germent au bout de 48 heures, peu vent être pulvérisées sur les plantes porteuses de po- pulations d'aphides relativement importantes, déjà éta blies sur la plante, en raison de l'action entomopathogene rapide qu'elles sont aptes 9 exercer b) les compositions phytosanitaires à base de spores dura bles d'Entomophthorales dont la germination débute seule ment 8 à 15 jours après l'application, mais se prolonge pendant au moins un mois dans la nature bl) peuvent être pulvérisées sur la plante dès l'appari tion des premiers insectes nuisibles : les popula tions d'aphides se développeront en même temps que les processus de germination se débloqueront et per mettront de contrôler la population d'aphides avant que celle-ci n'ait atteint un seuil dommageable pour la culture b2) peuvent être appliquées sur le sol cultivé avant la sortie de la plante : la présence des spores à la surface du sol ou à une faible profondeur, joue un rôle préventif, les spores étant prêtes I germer et I contaminer les aphides nuisibles dès leur appa rition sur la culture. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise plus particulièrement les procédés de préparation de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes nuisibles, notamment en agriculture, les préparations de spores durables ainsi obtenues, les compositions phytosanitaires contenant lesdites préparations et les procédés de traitement de cultures l'aide desdites compositions, conformes aux dispositions qui précèdent, ainsi que les moyens pour la mise en oeuvre de ces procédés et la préparation de ces produits, préparations et compositions et pour l'application desdites compositions phytosanitaires au traitement de cultures. Les caractéristiques de l'invention énoncées plus haut, sont mises en évidence dans les Tableaux qui vont suivre. TABLEAU I INFLUENCE DE LA TEMPERATURE ET DE L'HUMIDITE SUR LA LEVEE DE LA DORMANCE DES SPORES DURABLES DE C. OBSCUR US (1) Température % % H.R Nombre de mois OC 1 2 3 3 4 5 6 7 8 7 8 9 10 Témoin (2) 100 0 100 99 96 79 Temoin 10 60 80 76 80 80 70 80 100 5 60 80 60 70 70 4 98 20 60 90 80 60 40 30 40 Témoin 10 60 85 90 80 70 60 50 100 5 50 75 ; 90 70 60 50 50 6 98 10 55 50 40 50 40 40 40 95 20 79 Témoin 100 98 12 93 Témoin 79 Témoin 100 92 79 Témoin III 100 18 98 91 79 (1) Exprimée en pourcentage de germinatiom après 16 jours d'incubation dans l'eau à 14 + 10C. (2) Spores maintenues dans un sol à 40 8 de sa capacité de rétention d'eau (*) Les barres représentent la viabilité des spores estimée par observa- tion en microscopie photonique;la germination est nulle dans toutes les cases ne contenant pas de chiffres TABLEAU II INFLUENCE DE LA TEMPERATURE ET DU SUBSTRAT ENROBAGE SUR LA LEVEE DE LA DORMANCE ET LA CONSERVATION DES SPORES DURABLES DE C.OBSCURUS STOCKEES A 98 % H.R. (1) Température Nombre de mois C Substrat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Rhyolite (*) Argile Le Buisson Attapulgite Trerre de diatomées Témoin (2) Argile 30 30 40 30 30 30 20 4 Attapulgite 20 60 80 60 70 70 70 60 Terre de 30 50 diatomées Témoin 10 60 80 70 80 80 : 70 80 Rhyolite = 40 50 10 Argile 30 40 40 40 30 30 20 Le Buisson Attapulgite 50 70 70 60 70 60 60 60 6 Terre de 20 20 diatomées Témoin 10 60 85 90 70 60 50 Rhyolite Argile Le Buisson 12 Attapulgite Terre de diatomées Témoin Rhyolite Argile Le Buisson 15 Attapulgite Terre de diatomées Le Buisson 18 Attapulgite Terre de diatomées (1) Exprimée en pourcentage de germination apres 16 jours d'incubation dans l'eau à 14 + 1 C. (2)Spores maintenues dans un sol à 40 % de sa capacité de rétention d'eau. (*) Les barres représentent la viabilité des spores estimée par observa tion en microscopie photonique ; la germination est nulle dans toutes les cases ne contenant pas de chiffres. TABLEAU III INFLUENCE DE LA TEMPERATURE ET DU SUBSTRAT D'ENROBAGE LORS DU TRAITEMENT DE LEVEE DE LA DORMANCE ET LA CONSERVATION DES SPORES pE DE C.OBUSCURUS STOCKEES A 100 % H.R. (1) température Substrat ! Nombre de mois C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Rhyolite Argile 0 Le Buisson Attapulgite Terre de diatomées Témoin (2) 50 80 40 10 Argile 50 80 40 10 80 70 70 30 30 30 80 80 70 70 Attapulgite 15 60 80 80 80 80 70 70 4 Terre 30 50 50 10 Témoin 5 60 80 60 70 80 70 70 Rhyolite 40 30 10 Argile 30 50 30 20 20 Le Buisson Attapulgite 50 80 70 60 60 60 Terre de diatomées 30 30 Témoin 10 60 85 90 80 70 60 50 Argile Le Buisson Le Buisson Attapulgite Terre de 12 diamotées Témoin Rhyolite Argile Le Buisson Attapulgite 15 Terre de diatomées Témoin Rhyolite Argile 18 Attapulgite Terre de diatomées. Témoin (1) Exprimée en pourcentage de germination apres 16 jours d'incubation dans l'eau a 14 + 10C. (2)Spores maintenues dans un sol a 40 % de sa capacité de rétention d'eau. (*) Les barres représentent la viabilité des spores estimée par observa tion en microscopie photonique ; la germination est nulle dans toutes les cases ne contenant pas de chiffres. L'invention sera mieux comprise à l'aide du com plément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement I titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE I. - Conditions de culture 1. Inoculum La souche utilisée dans cet exemple est la souche IP I 015 de c. obscurus déposée dans la Collection Nationale des Cultures Microbiennes (CNCM) de l'Institut Pasteur; elle porte aussi les nO IPLB 542 et 722 (Laboratoire de lutte biologique contre les Insectes, Institut Pasteur). L'inoculum est constitue par du mycélium agé de 24 heures, developpé sur un milieu agité à base de 6 % de glucose et 2 % d'extrait de levure (Difco). I1 est ajoute au milieu à la dose de 10 % (v/v). 2. Milieu de culture Le milieu de culture a la composition suivante Dextrose 3 % Extrait de levure (Difco) 1 % Antimousse "Rhodorsil 426R" 1 % Eau Q.S.P. 3. Conditions de la fermentation La fermentation est réalisée dans un fermenteur contenant le milieu de culture ci-dessus, par exemple un fermenteur "Biolafitte", lequel milieu de culture est inoculé par le mycélium identifié en 1. ci-dessus. La température est continuellement régulée à 200C i 0,50C. L'agitation du milieu est maintenue à 700 t/m, l'aération est de 0,5 volume d'air/volume du milieu/minute (vvm) ; le pH est continuellement régulé pour être maintenu à 6,5. Après une phase stationnaire, ou phase de latence, de 6-8 heures, la phase de croissance linéaire dure jusqu'à la 40ème heure + 4 heures, puis elle est suivie d'une phase de sporulation multiplicative pendant laquelle il se forme des préspores dont le nombre augmente, jusqu'à la 68ème heure + 4 heures. il. - Formation des spores l'extérieur du fermenteur 1. On arrête la fermentation après 3 à 4 jours de culture, I la fin de la phase de formation des préspores, lorsque toutes les préspores sont sphé riques, à paroi bituniquée,c'est-à-dire après le dbut de coalescence des globules lipidiques (dont le diamètre est alors supérieur I 3 pm). On évacue la masse liquide du fermenteur, on en sé pare les préspores par centrifugation ou filtra tion, dans ce dernier cas après mélange éventuel avec un adjuvant de filtration tel, par exemple, qu'une perlite. Les préspores sont lavées abondam ment I l'eau du robinet. 2. On mélange ensuite les préspores de façon homogène avec une argile appropriée, telle que de l'atta pulgite (Clarsol BBC, Ceca) par exemple, et de l'eau, dans des conditions non stériles, dans un malaxeur palette (de type Lodige par exemple), pendant 2 minutes, sans échauffement, les propor tions du mélange préspores (poids humide)/eau/ attapulgite étant par exemple, 1:1:1,5. 3. On laisse mûrir les préspores ainsi enrobées d'argile pendant 3 à 7 jours dans des cuves fer mées ou des sacs fermés, à 200C + 0,50C jusqu'à l'achèvement de la formation des spores, qui pré sentent alors un seul globule lipidique central vo lumineux et une paroi de 2,5 pm d'épaisseur mini male. III. - Levee de la dormance des azygosEores On incube le mélange de spores enrobées avec de l'argile humidifiée, en sacs fermés, à 40C + 10C dans une chambre froide pendant 4 mois minimum. La proportion spores:eau:argile du mélange est maintenue à 1: 1:1,5. On effectue des prélèvements tous les mois pour évaluer le taux de germination dans de l'eau à 140C + 10C, en effectuant des évaluations tous les 2 jours pendant 16 jours, au bout desquels la germination maximum est habituellement e n r e g i s t r é e. T o u t e s le s évaluations ont été effectuées sur des champs oculaires contenant plus de 100 spores, en comptant 100 spores et en reproduisant chaque contrôle à trois reprises ; la germination est enregistrée lorsque la longueur du tube germinatif est supérieure I la moitié du diamètre de la spore (environ 20 pm). Les préparations de spores enrobées sont alors des spores mures prêtes à l'emploi dans des copositions phytosanitaires dont le constituant actif est à genBiation lente. Ainsi que cela ressort de ce qui precède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes nuisibles, notamment en agriculture, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - une première étape de fermentation d'un inoculum composé de corps hyphaux d'Entomophthorales, dans un milieu de fermentation approprié contenant une source de carbone et une source d'azote, sous agitation et insufflation d'air, à un pH variable selon les espèces et de préférence compris entre 6 et 7, à une température variable suivant les espèces, ladite étape de fermentation, après une durée de 2 à 5 jours suivant les espèces et le milieu employés, donnant lieu à la formation de préspores sphériques présentant une double paroi ; - une deuxième étape réalisée dans des conditions non stériles, au cours de laquelle les préspores sont séparées du milieu de fermentation et lavées abondamment ; - une troisième étape au cours de laquelle les préspores sont mélangées avec un support inerte humide tel que de l'argile ; - une quatrième étape de maturation des pré spores mélangées audit support inerte humide, à une température comprise entre 15 et 250C suivant les espèces, pendant un temps suffisant pour obtenir l'evolution desdites préspores en spores durables présentant une épaisseur de paroi égale ou supérieure au 1/10 du diamètre sporal et comprenant généralement un seul globule lipidique de diamètre minimum compris entre 1/3 et 2/3 du diamètre sporal ; - une cinquième étape au cours de laquelle lesdites spores durables en mélange avec le support inerte susdit, sont gardées au froid à une température moyenne comprise entre 2 et 70C, et - une sixième étape où les spores enrobées du support inerte sont éventuellement mélangées à des composés usuels pour l'obtention d'une composition phytosanitaire entomopathogène à l'égard des insectes nuisibles, notamment en agriculture, laquelle composition présente un pouvoir infectieux élevé 20- Procédé selon la Revendication 1 particulière ment adapté à la maturation des spores d'Entomophthorales présentant un temps de dormance, caractérisé en ce que l'étape de maturation des préspores mélangées I un support inerte humide, en spores durables, fournit des spores dormantes qui sont soumises une étape supplémentaire de traitement qui a pour but de lever leur dormance et qui consiste à maintenir le mélange de spores durables et d'argile humide à une température moyenne de l'ordre de 2 à 70C pendant une durée d'au moins deux mois pour obtenir des spores mûres dont la dormance est levée 30- Procedé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les pré spores sont séparées du milieu de culture à leur sortie du fermenteur, dans la deuxième étape, par centrifugation ou par filtration, et lavees abondamment avec de l'eau. 40- Procédé selon la Revendication 3, caractérisé en ce que lorsque la séparation des pré spores du milieu de culture est réalisée par filtration, elle peut l'être en présence d'un adjuvant de filtration approprié. 5 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le support inerte utilisé dans la troisième étape est une argile choisie dans le groupe qui comprend notamment la rhyolite, la terre de diatomées, lattapulgite, l'argile complexe l'Le Buisson1, à base essentiellement de bentonite et d'attapulgite. 60- Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les Entomophthorales mises en oeuvre pour la production et/ou la maturation et/ou la germination de spores azygospores ou zygospores - sont choisies notamment dans le groupe qui comprend C. osmodes, C. obscur us, C. thromboîdes, N. fresenji et Z. radicans. 7 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la maturation des préspores en spores en mélange avec un support inerte, est réalisée en présence d'eau, la proportion des constituants du mélange préspores:eau:support inerte étant comprise entre 2-6:1-7:2-15, en fonction du type d'argile et de l'espèce (ou souche) considérés. 80- Procédé selon les Revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'étape supplémentaire de levée de la dormance des spores obtenues à l'issue de la quatrième étape, comprend le maintien pendant au moins deux mois à une température moyenne de 2 I 70C, d'un mélange de spores, d'un support inerte et d'eau présents dans des proportions variables suivant l'espèce (ou souche) et le type d'argile considérés. 90- Produit intermédiaire nouveau utile pour la production de spores d'Entomophthorales présentant un pouvoir entomopathogène élevé, caractérisé en ce qu'il est constitué par un mélange de préspores sphériques à paroi bituniquée obtenues par fermentation dans un milieu de culture approprié, et d'une argile choisie dans le groupe qui comprend notamment la rhyolite, la terre de diatomées, l'argile "Le Buisson1, et l'attapulgite, selon la Revendication 1. 100- Produit présentant un pouvoir entomopathogène élevé, caractérisé en ce qu'il est constitué par un mélange d'argile et de spores d'Entomophthorales dont la dormance a été levée par maintien dudit mélange pendant au moins deux mois à une température moyenne comprise entre 2 et 70C, obtenu selon la Revendication 1 et la Revendication 2. 110 - Composition phytosanitaire entomopathogène caractérisée en ce qu'elle est constituée par un mélange de spores présentant un pouvoir infectieux élevé à l'égard des insectes nuisibles, notamment en agriculture, et d'argile, obtenu selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, associé aux composés usuels pour la préparation d'une telle composition tels qu'agents collants, mouillants, dispersants, propres à faciliter la pulvérisation ou l'aspersion ultérieure desdites compositions en plein champ. 120- Composition phytosanitaire selon la Revendication 11, caractérisée en ce que son constituant actif est constitué par des spores enrobées d'argile, à pouvoir entomopathogène élevé, obtenues par maturation de préspores sphériques issues d'une fermentation. 130- Composition phytosanitaire selon la Revendication 11, caractérisée en ce que son constituant actif est constitué par des spores enrobées d'argile, & pouvoir entomopathogène élevé, obtenues par maturation de préspores sphériques issues d'une fermentation, et maintien des spores résultantes pendant au moins deux mois à 2-70C, pour lever la dormance desdites spores. 140- Procédé de traitement de cultures à l'aide de la composition phytosanitaire selon l'une quelconque des Revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer sur la plante et/ou au sol, par pulvérisation ou aspersion, ladite composition phytosanitaire pour contrôler des populations d'insectes nuisibles importantes déjà établies sur la plante, dans le cas ol le constituant actif est à germination rapide (environ 48 heures), ou avant l'apparition des insectes ou dës la détection des premiers insectes nuisibles, pour contrôler la population d'insectes avant qu'elle n'ait atteint un seuil dommageable pour la culture, dans le cas où le constituant actif est à germination lente (8 à 15 jours ou plus).