Brevet FR2486802A1 — publié le 19820122

La purification de HBsAg dérivé de plasma par combinaison spécifique avec l'anticorps de surface de l'hépatite B (HBsAb) fixé par covalence sur une colonne d'immuno-adsorbant est connue. L'éluat contenant le HBsAg désorbé, toutefois, contient des protéines résiduelles de sérum humain normal. La présente invention a pour but de fournir un procédé pour purifier l'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) produit à partir de cellules qui fournissent HBsAg in vitro. Un autre but est de fournir un procédé pour séparer HBsAg des constituants de milieux de culture de cellules in vitro. D'autres buts et avantages de l'invention résulteront encore de la description ci-après. L'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) qui est libéré par des cellules infectées cultivées in vitro est combiné spécifiquement à HBsAb fixé par covalence sur une colonne d'immuno-adsorbant et est ainsi séparé des autres constituants qui sont entraînés par lavage. HBsAg est ensuite désorbé de la colonne et recueilli dans une forme pure immunologiquement active. La présente invention concerne la purification de HBsAg produit in vitro par des cellules qui libèrent HBsAg. De telles cellules sont connues et sont, par exemple, des cellules d'hépatomes humains, des clones très productifs de tels hépatomes humains et des cellules du foie de chimpanzés -infectés d'hépatite B. Un exemple particulier d'une cellule d'hépatome humain est la cellule d'Alexander, dont une culture a été déposée avec l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL 8024. Ces cellules peuvent être cultivées in vitro d'une manière appropriée quelconque. Une manière particulièrement appropriée consiste à cultiver les cellules dans des unités capillaires à fibres creuses comme décrit dans la demande de brevet des E.U.A. NO 90 169, déposée le 2 novembre 1979, dont le contenu est incorporé ici par référence. Selon la présente invention, HBsAg obtenu par culture in vitro de cellules qui libèrent HBsAg est séparé des constituants du milieu de culture des cellules par combinaison spécifique avec HBsAb. Le milieu de culture de cellules contenant HBsAg est centrifugé pour élimination des débris de cellules et le liquide surnageant est chargé directement sur une colonne à immuno-affinité sur laquelle HBsAb est fixé par covalence. La colonne à immuno-affinité est constituée de gammaglobuline immune spécifique anti-HBsAg d'origine humaine ou animale liée par covalence à un dextrane réticulé, par exemple à l'agarose. Après adsorption de l'antigène, les constituants du milieu de culture des cellules sont séparés par lavage extensif de la colonne avec un tampon neutre. HBsAg est ensuite désorbé de la colonne par, par exemple, une solution 3M de thiocyanate d'ammonium ou de thiocyanate de sodium. On obtient le HBsAb en injectant HBsAg à un état de grande pureté à une espèce sensible de mammifère, par exemple des chèvres, des cobayes, des grivets ou des chimpanzés, pour stimuler la formation de sérum positif à HBsAb. L'utilisation de HBsAb hétérogène (non humain) améliore la purification de HBsAg en excluant la présence possible de constituants humains comme impuretés. Une technique d'immunisation appropriée est, par exemple, celle décrite dans le brevet des E.U.A. NO 4 181 713, incorporé ici par référence.Les animaux sont saignés après qu'un titre approprié s'est formé et la fraction globuline est recueillie à partir du sérum, par exemple en traitant le sérum avec du sulfate d'ammonium pour précipiter la fraction globuline, en dissolvant la fraction glubuline dans un tampon approprié tel qu'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et en éliminant le sulfate d'ammonium par des moyens appropriés comme par filtration sur gel ou dialyse. La fraction globuline est ensuite purifiée encore par chromatographie dans une matière telle que l'agarose, un dextrane réticulé (Sephacryl(R)) ou une résine échangeuse d'ions (DEAE Sephadex(R)). Le HBsAb est separé de la fraction globuline purifiée par formation d'un complexe HBsAg-BHsAb.Cela peut s'effectuer en faisant passer la fraction globuline purifiée à travers une colonne immuno- adsorbante de HBsAbg hautement purifié lié par covalence à de l'agarose, cela étant suivi de l'élution de HBsAb de la colonne. Le HBsAb est relargué, par exemple par passage à travers une colonne chromatographique telle que de dextrane réticulé , et est combiné avec un agarose activé comme de l'agarose activé par CNBr. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans, toutefois, la limiter. Exemple 1 A. Formation d'une colonne à immuno-affinité de HBsAb Du HBsAg préparé conformément à l'exemple 1 du brevet des E.U.A. NO 4 017 360 est adsorbé sur de l'alun. 3 Des doses de 10 cm3 chacune, contenant 40 pg/cm , sont injectées à des boucs et chèvres adultes aux jours 0, 29, 56 et 84. Ensuite, les doses de rappel sont administrées tous les 60 jours. Les animaux sont saignés chaque semaine. Les sérums provenant de quatre saignées (258 cm3) sont combinés et la fraction de globuline est précipitée par un volume égal de solution saturée à 80 % de sulfate d'ammonium. La boulette précipitée est lavée une fois avec une solution sature à 40 % de sulfate d'ammonium et redissoute dans 75 cm3 de 0,1 M Tris HC1, pH 8,0, + 0,5 M NaCl (Tris-Cl). La globuline est passée ensuite à travers une colonne de 5 x 84 cm d'allyl-dextrane réticulé par covalence avec de l'acrylamide (Sephacryl S-200(R)) en 3 portions aliquotes égales. Les fractions d'IgG provenant dè chacun des trois passages à travers le Sephacryl S-200(R) sont ensuite chargées sur une colonne à immuno-affinité de HBsAg lié par covalence à de l'agarose réticulé à 4 %. Après adsorption de l'IgG anti-HBsAg (HBsAb), la colonne est lavée soigneusement avec une solution 0,1 M de phosphate de sodium, pH 7,2, % 0,5 M de chlorure-de sodium. Le HBsAb lié est ensuite élué de la colonne au moyen de 0,1 M phosphate de sodium + 0,5 M chlorure de sodium + 3 M thiocyanate d'ammonium. Les 3 fractions de HBsAb sont relarguées dans une solution 0,1 M de bicarbonate d'ammonium par passage à travers une colonne de dextrane réticulé G-25 (R) (Sephadex G-25(R) (R) grossier). Le HBsAb purifié est ensuite combiné avec de l'agarose activé par CNBr (Sépharose 4B conformément aux directives du fabricant. B. Purification de HBsAg Une unité à àfaisceaux de capillaires (unité à capillaires creux H 10X 100 Vitafiber(R) Amicon de 300 cm3), un flacon-réservoir de 250 cm3, une pompe actionnée à la main et un tube de Silastic (environ 2 mètres) sont passés à l'autoclave et assemblés dans des conditions aseptiques de la manière suivante E- BOUTEILLEB POMPE SE LA~MAIN ~~~~~~~ CAPIL A r RESERVOIR A LA POMPE I |CAPILLAIRES} A 3 Dans l'espace extérieur au capillaires (175 cm3), on introduit une suspension de 3 x 106 cellules d'une souche de cellules d'hépatome humain fraîchement récoltées, PLC/PRF/5, MacNab et autres, Br. J. Cancer 34 (1976) 509-515 (ATCC CRL 8024). Les cellules sont laisséesen repos pendant 2 heures et ensuite l'unité assemblée entière est placée dans un incubateur humidifié à 370C, 5 % de CO2. Le milieu dit Eagle's Minimum Essential Medium contenant 10 % de sérum foetal de veau, de la L-glutamine (2mM) et de la 3 Néomycine (50 Vg/cm3) est mis en circulation à travers l'unité à capillaires à un débit de 275 cm3/min. Le développement des cellules est contrôlé par utilisation du glucose. On recueille le fluide extra-cellulaire jusqu'à accumulation de 3 600 cm3. On centrifuge ce fluide pendant 20 minutes à 15 000 x g pour éliminer les débris de cellules et on le charge directement sur une colonne à immuno-affinité constituée d'IgG anti-HBsAg de chèvre spécifique liéepar covalence à de l'agarose réticulé à 4 %. Après adsorption de l'antigène, la colonne est lavée de manière extensive avec un tampon neutre phosphate de sodium-chlorure de sodium. HBsAg est désorbé de la colonne par l'addition de 3M thiocyanate d'ammonium. Le thiocyanate et les sels du tampon sont ensuite éliminés par passage à travers une colonne de Sephadex G-25 mise en équilibre avec une solution 0,1 M de bicarbonate d'ammonium. Le HBsAg est dialysé de manière complète contre une solution saline tamponnée au phosphate et soumis à une filtration à travers un filtre Gelman à 0,2 pm. Exemple 2 La concentration en protéine du HBsAg purifié provenant de l'étape B de l'exemple 1 est réglée à 40 pg/cm3 par l'addition de 21 cm3 de PBS. Le volume final est de 51 cm3, dont 50 cm3 sont traités au formaldéhyde et adsorbés sur de l'alun pour donner une matière utilisable comme vaccin. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la purification de HBsAg caractérisé en ce qu'on recueille le fluide extra-cellulaire d'une -cul- ture in vitro de cellules qui libèrent HBsAg, on élimine les débris de cellules du fluide extra-cellulaire, on fait passer le fluide extra-cellulaire à travers une colonne immuno-adsorbante à laquelle HBsAb est lié par covalence, on désorbe le HBsAg, on sépare les sels de l'antigène et on dyalise l'antigène dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture de cellules in vitro comprend des cellules Alexander. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le HBsAb est dérivé d'une espèce non humaine. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le HBsAb est dérivé de chèvres. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la colonne immuno-adsorbante comprend un dextrane réticulé. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le dextrane est de l'agarose. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le HBsAg est désorbé au moyen d'un sel de l'acide thiocyanique. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le sel est le thiocyanate d'ammonium. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sels sont éliminés par filtration sur gel. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène est dialysé contre une solution saline tamponnée au phosphate.