Brevet FR2489321A1 — publié le 19820305

La présente invention se rapporte à un procédé pour estérifier sélectivement l'c-L-aspartyl-L-phénylalanine en les esters alkyliques correspondants a l'aide d'une enzyme protéolytique poss-;édant une activité estérasique spécifique. L'estérification de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine par des techniques chimiques a été décrite dans les brevets des Etats- Unis d'Amérique n 3 933 781 et 4 173 562. Un inconvénient de ces techniques chimiques réside en ce que l'estérification se produit sur le groupe carboxyle du radical aspartyle et sur le groupe car- boxyle de la phénylalanine, avec formation de produits secondaires indésirables de formule I du schéma A ci-après (en abrégé ci-après "le diester") et de formule Il du schéma A ci-après (en abrégé ci- après l"'ester aspartique"). Si l'on veut parvenir au produit recherché, il faut éliminer le diester et l'ester aspartique par des opérations de puri- fication. Les procédés antérieurs d'estérification enzymatique visent a l'estérification d'aminoacidessimples. Iasne concernent pas des problèmes d'estérification sélective rencontrés avec des di- peptides, an particulier l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine qui contient plus d'un groupe carboxyle. Ainsi par exemple, Ingalls et col., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING 17, 1627-1637 (1975) décrivent l'estérification d'un aminoacide simple, la Nacêtyltyrosine, à l'aide de chymotrypsine immobilisée ou de subtilisine Carlsberg à l'état libre, non modifié, dans un système solvant constitué d'eau, d'éthanol et de glycérol. Ce procédé présente un inconvénient: on forme des quantités impor- tantes de l'ester de glycérol de l'aminoacide. Klibanov et col., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING 19, 1351-1361 (1977) décrivent l'estérification d'un aminoacide simple, le N-acétyltryptophane, à l'aide de la chymotrypsine immobilisée dans un système biphasé constitué d'eau et d'un solvant non miscible à l'eau, le chloroforme. Un avantage de la présente invention réside en ce que le groupe carboxyle de la partie phénylalanine est alkylé sélectivement par estérification enzymatique dans un système à une seule phase, 248932 1 avec formation d'un ester alkylique de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine à l'exclusion du diester et de l'ester aspartique indésirables. Cette estérification est réalisée par contact du dipeptide avec un alcool en présence d'une protïnase alcaline du type sérine-protémnase, une estérase qui présente une préférence pour les aminoacides aromatiques. L'invention concerne donc un procédé de préparation des esters alkyliques de l'a-Laspartyl-L-phênylalanine qui possède des utilisations en tant qu'agents édulcorants. Plus particulièrement, le dipeptide, a-L-aspartyl-Lphénylalanine, est estérifié pa r contact avec un alcool en présence d'une enzyme protéolytique pré- sentant une activité esterasique spécifique dans un système solvant eaualcool dans lequel la concentration en alcool est suffisante pour inverser l'effet hydrolytique de l'enzyme. Lorsqu'on parle d'une activité esterasique spécifique, on désigne par là l'aptitude de l'enzyme protéolytique à alkyler sélectivement le groupe carboxyle de la partie phénylalanine de la molécule. Les esters alkyliques de l'a-L-aspartyl-Lphénylalanine obtenus dans ces conditions sont utilisables comme agents édulcorants. Ces utilisations sont décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 492 131. On peut également estérifier par le même procédé une a-L-aspartyl-Lphénylalanine protégée à l'azote, formant l'ester alkylique correspondant de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine protégée à l'azote. Le groupe protecteur de l'azote peut être éliminé par des techniques classiques et on obtient alors l'ester alkylique de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine. Le groupe préféré en tant que groupe protecteur de l'azote dans l'invention est le groupe carbobenzoxy. L'invention concerne donc un procédé pour estérifier sélectivement l'a-Laspartyl-L-phénylalanine par contact de cette dernière ou d'une a-Laspartyl-L-phénylalanine protégée à l'azote avec un alcool en présence d'une enzyme protéolytique possédant une activité estérasique spécifique. On met le dipeptide en contact avec l'enzyme dans un milieu hydroalcoolique dans lequel la concentration en alcool est suffisante pour s'opposer à l'activité hydrolytique. Conformément à l'invention, on estérifie l'a-L-aspartyl-L- phénylalanine par un procédé qui consiste à la mettre en contact ou à mettre en contact une a-L-aspartyl-L-phénylalanine protégée l'azote avec un alcool en présence d'une quantité efficace en tant qu'agent estérifiant d'une protéinase alcaline du type sérine-pro- téinase dans un milieu hydroalcoolique dans lequel la concentration en alcool est suffisante pour inverser l'activité hydrolytique de la protéinase alcaline du type sérine-protéinase. Lorsqu'on estérifie une aL-aspartyl-L-phénylalanine protégée à l'azote, on élimine le groupe protecteur de l'azote après l'estérification et on obtient l'ester alkylique de l'c-L-aspartyl-L-phénylalanine. Les alcools qu'on préfère répondent à la formule R-OH dans laquelle R représente un groupe alkyle inférieur en C1-C. Parr.i ces groupes alkyles inférieurs on citera les groupes méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle, heptyle et leurs isomères ramifiés. Le groupe amino de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine peut être protégé au moyen de groupes protecteurs usuels. On citera en particulier, sans qu'il s'agisse là d'une limitation, des groupes aryl-alkyle inférieur tels que les groupes diphénylméthyle ou tri- phénylméthyle éventuellement substitués par des halogènes, des groupes nitro, alkyle inférieur ou alcoxy inférieur et par exemple les groupes benzhydryle, trityle et di-p-méthoxybenzhydryle; des groupes acyles tels que formyle, trifluoracétyle, phtaloyle, benzène -sulfényle et onitrophénylsulfényle; des groupes dérivés de l'acide carbonique ou de l'acide thiocarbonique comme les groupes carbobenzoxy éventuel- lement substitués sur le radical aromatique par des atomes d'halogène, des groupes nitro ou alkyle inférieur, alcoxy inférieur ou carbal- coxy inférieur, et par ex e m ple carbobenzoxy, p-bromocarbobenzoxy ou pchlorocarbobenzoxy, p-nitrocarbobenzoxy et p-méthoxycarbobenzoxy; des groupes benzyloxycarbonyle de colorant comme les groupes p-phényl- azobenzyloxycarbonyle et p-(p-méthoxyphénylazo)benzyloxycarbonyle, tolyloxycarbonyle, 2-phényl-2-propoxycarbonyle, 2-tolyl-2-propoxy- carbonyle et 2-(p-biphénylyle)-2-propoxycarbonyle; et des groupes aliphatiques en oxycarbonyle tels que tert-butoxycarbonyle, alcoxy- carbonyle, cyclopentoxycarbonyle, tert-amyloxycarbonyle. Le groupe carbobenzoxy constitue un groupe protecteur de l'azote particulière- ment apprécié dans l'invention. Les groupes amino peuvent également être protégés par formation d'énamines obtenuespar réaction du groupe amino avec des 1,3-dicétones, par exemple la benzoylacétone ou l'acétylacétone. Les groupes protecteurs sont éliminés avantageusement par des réactions telles que l'hydrogénolyse (par exemple en pré- sence d'un catalyseur au noir de palladium} un traitement par un hydracide halogéné (comme l'acide bromlydrique, l'acide fluorhy- drique ou l'acide chlorhydrique)-dans l'acide acétique ou un traite- ment par l'acide trifluoracétique. La réaction conduisant à la formation de la liaison ester peut être réalisée dans une solution hydroalcoolique tamponnée à un plH de auquel l'activité enzymatique se maintient. Pour les protéinases alcalines du type sérine-protéinase, ce pH est d'environ 4 à 7. Parmi les solutions tampons courantes,on citera la solution tampon au pyrophosphate de sodien, la solution tampon à l'acide citrique, la solution tampon à l'acide acétique, ou la solution tampon Tris-RCI. L'estérase utiliséedans l'invention est une protéinase alcaline du type sérine-protéinase. Ces enzymes présentent une haute activité estérasique et agissent sélectivement sur les aminoacides aromatiques. Parmi les protéinases alcalines typiques de ce genre on citera la subtilisine et des protéinases alcalines obtenues à partir de souches variées de Bacillus Aspergillis, Streptomyces, Penicillium et Arthobacter. La subtilisine Carlsberg qu'on trouve dans le commerce constitue une protéinase alcaline du type sérine- protéinase particulièrement appréciée. L'enzyme est utilisée dans le procédé selon l'invention en quantité catalytique, de préférence de 10 à 500 mg/mmole de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine éventuel- lement protégée à l'azote. On peut également ajouter un sel de calcium pour favoriser l'activité enzymatique. L'enzyme peut être présente à l'état libre ou à l'état immobilisé par fixation sur un support approprié tel que du verre poreux, un gel de polyacrylamide, la carboxyméthylcellulose ou l'aminoéthylcellulose. On trouvera la description de techniques variées d'immobilisation d'enzymes dans l'ouvrage "IMMOBILIZED ENZYMES", Vol. 44, METHODS IN ENZYMOLOGY, de Klaus Mosback. La température de réaction est habituellement de 10 à 500C, et cette température est suffisante pour que l'activité enzy- matique se maintienne. L'intervalle de température préféré est de à 400C. La réaction est effectuée dans un milieu hydroalcoolique dans lequel la concentration en alcool est suffisante pour s'opposer à l'activité hydrolytique de l'enzyme. Cette concentration en alcool peut aller de 10 à 907% en volume. De préférence elle est de 30 à % en volume et mieux encore de 50 à 60% et tout particulièrement de 60% d'alcool en volume. Dans un mode de réalisation particulièrement recommandé de l'invention, la protéinase alcaline du type sérine-protéinase est la subtilisine Carlsberg, une protéinase qui possède une acti- vité estérasine spécifique, et l'alcool est le méthanol, présent à une concentration de 60% en volume. Le mélange hydroalcoolique contient 5,0 mmolesde chlorure de calcium et présente un pH de ,0 et la réaction est effectuée à une température de 250C. Dans ces conditions, la réaction se déroule régulière- ment jusqu'à achèvement. Les durées de réaction préférées vont de 1 à 260 heures et plus spécialement de 1 à 90 heures. Pour séparer le produit de réaction du mélange on peut faire appel à des techniques classiques de chromatogaphie et à d'autres techniques connues. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples les indications de parties et de pourcentage s'entendent en poids. Exemple 1 On dissout de la subtilisine Carlsberg (Proteaêe Type VIII de la firme Sigma Chemical Co.) dans l'eau distillée à une concentration de 40 mg/ml et on dialyse contre de l'eau distillée à 50C. On mélange 0,1 partie en volume de la solution d'enzyme avec 0,9 partie en volume d'une solution hydrométhanolique contenant 0,0056 partie en poids d'a-L-aspartyl-Lphénylalanine. La solution hydrométhanolique a été préparée par mélange de 0,6 partie en volume de méthanol avec 0,075 partie en volume d'acétate de sodium 0,33 M, 0,225 partie en volume d'acide acétique 0,33 M et 0,002 partie en volume de chlorure de calcium 2,5M. Avant addition de l'enzyme, on soumet la solution hydrométhanolique à l'effet d'ultrasons pendant 1 minute pour disperser l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine. On règle le pH global à 5,0 par l'acide chlorhydrique dilué. Le mélange de réaction final contient 4 mg/ml d'enzyme, 5,0 mmolesde chlorure de calcium, O,1 mole de tampon a l'acide acétique, 60% de mithanol et 0,02 mole d'a-Laspartyl-L-phénylalanine; on le laisse réagir a 25 C environ sous agitation permanente pendant 4 jours. Pour séparer l'enzyme du dipeptide, on jette le mélange de réaction sur une colonne de Sephadex LH-20. On recueille les fractions contenant le dipeptide et on traite par un halog6nhydrate comme décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 798 207 et 4 173 562 afin de précipiter et de purifier l'ester méthylique de l'a-L-aspartyl-L- phdnylalanine répondant à la formule III. Exemple 2 On répète l'opération de l'exemple 1 mais en utilisant comme catalyseur une enzyme immobilisée. L'enzyme est immobilisée par des liaisons covalentes sur de la DEAE-cellulose.activée par du bromure de cyanogène. La DEAE-cellulose (gonflée au préalable, DE52, Whnatman) est activée par lavage en quantité de 0,075 partie par du bicarbonate de sodium O, lM et réaction avec 3 parties en volume de solution de bromure de cyanogène (à 25 mg/ml). On règle le pH et on maintient à 11,O par l'hydroxyde de sodium 2M et on agite modérément pendant 6 minutes à 25 C. On filtre le gel et on lave par 100 parties en volume de bicarbonate de sodium O, 1M. On mélange avec un gel activé par le bromure de cyanogène dans un tube de polypropylène fermé (sous argon) à 5 C pendant 17 heures 0,25 par- tie de subtilisine Carlsberg en solution dans 0,25 partie en volume de bicarbonate de sodium O,lM et dialysgependant 4 heures contre le même tampon à 5 C. L'enzyme fixée est ensuite lavée par l'eau dis- tillée et est mise à réagir avec 5 parties en volume d'éthanolamine M (pH 9,0) sous agitation modérée pendant 2 heures a 25 C. On lave le gel à deux reprises par l'eau distillée et on remet en suspension dans 0,3 partie en volume d'eau distillée. On mélange la suspension d'enzyme immobilisée avec 0,7 partie en volume d'un mélange eau/mé- tanol dans des conditions telles que le mélange de réaction final contienne les mêmes concentrations de substance que dans l'exemple 1. La réactionl est effectuée comme décrit dans l'exemple 1 sauf que l'enzyîue immobilisée est éliminée par centrifigation avant purifi- cation du produit. Exemple 3 On obtient l'éther éthylique de l'a-L-aspartyl-L-phényl- alanine répondant à la formule IV par les modes opératoires des exemples 1 et 2 en remplaçant le méthnaol par la quantité équiva- lente d'éthanol. Exemple 4 On répète les opérations des exemples 1 et 2 en rempla- çant l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine utilisée dans ces exemples par 0,0125 partie de N-carbobenzoxy-"-L-aspartyl-L-phénylalanine; on obtient l'ester méthylique de la N-carbobenzoxy-a-L-aspartyl-L-phényl- alanine. La réduction de ce composé par le mode opératoire décrit par M. Bergmann et L. Zervs, Ber. 65: 1192 (1932) provoque l'élimi- nation du groupe carbobenzoxy protecteur de l'azote avec formation de l'ester méthylique de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine. SCHlEMA A CH 2-C-O-alkyle 2 l. NH 2-CH-C-NH-CH-C-O-alkyle 2 l j 9 CH2 o O Il CH2 -C-O-alkYle l I I NH - CH-C-NH- CH-C-OH 2 l 1 O CH2 Q N 2 3H ilH o CH2-C-OlI O 2-CH-C-Ni-CH--COCH2CH3 - Il I O CH2 oA REVENDICATIONS 1. Procédé pour estérifier l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine caractérisé en ce qu'on met l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine en con- tact avec un alcool en présence d'une quantité efficace d'une enzyme protéolytique possédant une activité estérasique spécifique dans un milieu hydroalcoolique a un pH de 4 à 7 et dans lequel la concentration en alcool est suffisante pour s'opposer à l'activité hydrolytique de la protéase. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme protéolytique possédant une activité estérasique spécifique est une protéinase alcaline du type sérine-protéinase. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la protéinase alcaline du type sérine-protéinase est la subtilisine Carlsberg. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'alcool est le méthanol à une concentration de 10 à 90%. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on met l'a-Laspartyl-L-phénylalanine en contact avec le méthanol en présence de subtilisine Carlsberg dans un milieu hydrométhanolique à pH 5,0 dans lequel la concentration en méthanol est de 60%. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on part d'une a-L-aspartyl-L-phénylalanine protégée à l'azote caractérisé en ce que, après l'estérification enzymatique, on élimine le groupe protecteur à l'azote. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on part de la N-carbobenzoxy a-L-aspartyl-L-phénylalanine qu'on met en contact avec le méthanol en présence de subtilisine Carlsberg dans un milieu hydrométhanolique à pH 5,0 dans lequel la concentra- tion en méthanol est de 60%, après quoi on élimine le groupe pro- tecteur carbobenzoxy.