Brevet FR2487199A1 — publié le 19820129

La présente invention concerne une préparation anti- hémorragique ou thromboplastique à base de protéines humaines contenant les facteurs de coagulation II, VII, IX et X et possédant une activité de by-passage de l'inhi- biteur du facteur VIII. On connaît des préparations thromboplastiques compor- tant une activité de by-passage de l'inhibiteur du fac- teur VIII, abrégée en ''FEIBA'' (Factor Bight Inhibitor- Bypassing Activity). Dans le brevet autrichien N 350 726 (correspondant au brevet des E.U.A. N 4 160 025 ou à la demande de brevet allemand DOS 27 34 821) on a décrit la fabrication de telles préparations. On utilise ces préparations avec succès pour le traitement de patients qui souffrent d'hémophilie A et dont le sang contient une substance antagoniste (inhibiteur) du facteur VIII. La structure chimique du facteur à EtA est inconnue jusqu'à présent. On sait seulement qu'il s'agit d'une protéine avec un poids moléculaire de l'ordre d'environ 100.000. La fabrication de la préparation s'effectuait, conformé- ment auKbrevets susmentionnés, au départ de plasma humain contenant des ions citrate, en l'absence d'ions calcium libres par traitement avec des substances inorganiques, insolubles dans l'eau, physiologiquement tensioactives et thromboplastiques, comme le gel de silice ou le kaolin, et adsorption et élution subséquente% de manière à obtenir un mélange des facteurs II, VII, IX et X, du facteur à FEIBA et d'autres protéines, dont la composition n'a pas encore été décrite jusqu'à présent. Bien que, comme on l'a mentionné, la préparation conforme à la demande de brevet allemand DOS 27 34 821 se soit révélée être intéressante pour le traitement de patients à inhibiteur du facteur VIII, il est nécessaire d'élargir le domaine d'utilisation et la compatibilité de préparations à FEIBA, en particulier de réduire les réactions secondiares indésirables, comme des activités thrombogènes et vaso actives, à un minimum. Conformément à la présente invention, on a résolu le problème posé avec une préparation thromboplastique à base de protéines humaines comprenant les facteurs throm- boplastiques II, VII, IX et X et une activité de by-passage de l'inhibiteur du facteur VIII, laquelle préparation est caractérisée en ce que: - elle est exempte d'activité thrombogène jusqu'à au moins deux unités FEIBA par kilo de lapin lors du test de l'activité inductrice de thrombose selon Wessler, - elle est exempte d'activité de kallicréine et elle est exempte d'activité d'activateur de la prékallicréine mesurée dans une solution aqueuse de la préparation avec une concentration en FEIBA allant jusqu'à au moins 10 unités par ml, - elle est séparable par chromatographie d'affinité sur -du sulfate de dextrane-agarose, à l'aide d'un gradient de NaCl, de telle sorte que la protéine à activité de facteur IX s'élue à une concentration en NaCl inférieure à celle o s'élue la protéine à FEIBA, - les éluats contenant la protéine à activité de facteur IX et la protéine à FEIBA contiennent des a- et p-glo- bulineslors de la séparation électrophorétique, o la courbe dé séparation présente, dans le domaine a, un pic principal correspondant à 60 à 80 % de la protéine glo- bale, un épaulement contigu de 10 à 20 % de la protéine globale, comme aussi un pic peu prononcé contigu à l'épaulement présenté par la courbe de séparation dans le domaine de la P-globuline, correspondant à une teneur de 10 à 20 % de la protéine globale. Les caractéristiques ci-dessus définies, à savoir l'absence d'activité thrombogène de la préparation et l'absence d'activité de kallicréine et d'activité d'acti- vateur de la prékallicréine--ces dernières étant respon- sables des activités vaso-actives-, signifie que la pré- paration possède une compatibilité remarquable. Le test de l'activité inductrice de thrombose et le test concernant l'activité de kallicréine et l'activité d'activateur de la prékallicréine sont bien connus des spécialistes. Ces tests seront en particulier plus précisément décrits à propos des exemples. La troisième caractéristique de la préparation confor- me à l'invention, à savoir la séparabilité par voie chroma- tographique d'affinité sur du sulfate de dextrane-agarose à l'aide d'un gradient de NaCl est concrétisée sur la figure I des dessins annexés,à la lumière d'un exemple. Le procédé de chromatographie d'affinité sur du sulfate de dextraneagarose est connu des spécialistes (D.S.Pepper and C. Prowse, Thrombosis Research 11 (1977), 687-692). Pour ce faire, on couple du sulfate de dextrane (poids moléculaire: 500. 000) à du sépharose 4 B activé au CNBr (Pharmacia Fine Chemicals AB, Upsala, Suède). Le sulfate de dextrane sépharose ainsi obtenu est équilibré dans une solution à 0,4 % de citrate trisodique.2H20 (pH 7,4) et est ensuite chargé dans une colonne. L'échantillon à exa- miner est alors introduit dans la colonne pour être subsé- quemment élué avec une solution de NaCl dans du citrate trisodique.2H20 à 0,4 % (pH 7,4) à concentration en NaCl croissante. Sur l'axe des abscisses du graphique représenté sur la figure 1, on a porté les numéros des fractions d'éluat. Sur l'axe des ordonnées de gauche, on a porté les activités des facteurs de coagulation ou thromboplastiquesen unités par ml et sur l'axe des ordonnées de droite, on a porté la concentration du gradient de chlorure de sodium en moles/l. L'allure linéaire du gradient est représentée par la ligne G. Ainsi qu'il ressort de toute évidence de la figure 1, la protéine à activité de facteur IX s'élue dans le domaine de 0,1 à 0,5 (molaire) avec un maximum à 0,3 (molaire), la protéine à FEIBA s'élue à une concentration en NaCl dans le domaine de 0,3 à 0,5 (molaire) avec un maximum à 0,4 (molaire). La concentration croissante en NaCl ressort du gradient de NaCl G qui va d'une concentration 0 molaire 24871 9 à 0,65 molaire en NaCl. Enfin, comme quatrième caractéristique de la prépara- tion conforme à l'invention, on peut citer la teneur en globuline qui lui est particulière lors de la séparation électrophorétique, ce qui est illustré par la figure 2. La partie supérieure de la figure 2 concrétise la courbe de séparation des éluats de la chromatographie sur sulfate de dextrane-sépharose, conforme à l'invention, contenant les protéines à activité de facteur IX et à FEIBA, àl'aide d'un exemple, tandis que la partie inférieure de la figure 2 représente la courbe de séparation électrophorétique d'un plasma humain natif. Il faut remarquer quedans le cas de cet exemple> le pic principal dans le domaine des a-globulines comporte 70 % des protéines totales. Au pic principal se raccorde un épaulement dans le domaine des a-globulines qui représente 14 % de la teneur totale en protéine, épaulement auquel se raccorde dans le domaine des P-globulines, un pic moins prononcé qui comporte 16 % du total des protéines. La préparation conforme à la présente invention comporte avantageusement une caractéristique supplémentaire conformément à laquelle la FEIBA est maintenue à au moins % après une incubation d'une heure dans du plasma inhi- biteur de facteur VIII. Cette propriété indique une acti- vité longuement soutenue lors de son administration à des patients à inhibiteur de facteur VIII. La préparation conforme à l'invention possède avanta- geusement une autre propriété encore>caractérisée par le fait que l'activité de facteur IX est conservée à au moins 50 % après incubation d'une heure dans du plasma manquant de facteur IX. Ceci signifie que la préparation ne contiezt que peu ou une fraction très réduite en facteur IX activé. Il est connu que le facteur IX activé est inactivé dans le plasma humain. Le facteur IX activé pourrait provoquer des activités thrombogènes nuisibles. On sait, par la littérature (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74, No 7, 3028-3032, Juillet 1977, ''In vitro and in vivo correlation of clotting protease activity: Effect of heparin'' de S.N. Gitel, R.C. Stephenson et S. Wessler) que c'est surtout le facteur IXa qui possède l'activité thrombogène la plus élevée par rapport aux autres fac- teurs de coagulation activés, comme les facteurs Xa et IIa (thrombir), Enfin, la préparation thromboplastique conforme à la présente invention possède avantageusement la propriété caractérisée par une teneur en inhibiteur d'inter-a-trypsine(ITI) de 0,05 à 5 mg par unité FEIBA. La teneur en ITI assure que la thrombogénicité de la préparation conforme à l'invention demeure faible selon le test de Wessler. La présente invention a également pour objet un pro- cédé de préparation de la nouvelle préparation thrombo- plastique à base de protéine humaine contenant les fac- teurs de coagulation II, VII, IX et X et une activité de by-passage de l'inhibiteur du facteur VIII, caractérisé en ce que l'on traite du plasma humain par des hydrates de carbone hautement polymérisés et sulfatés et/ou par des échangeurs d'ions basiques et en ce que l'on adsorbe le mélange de protéines à FEIBA engendrée et en ce qu'on l'obtient ensuite par élution et concentration. Lors de la mise en oeuvre du procédé suivant l'inven- tion, il faut veiller à maintenir le plasma et les parti- cipants à la réaction exempts de substancessusceptibles d'élever l'activité d 'antithrombine III, comme l'héparine ou leshéparinoldes. Selon une forme de réalisation de l'invention, on traite d'abord brièvement le plasma par des hydrates de carbone hautement polymérisés et sulfatés, on adsorbe ensuite le mélange de protéines à FEIBA engendrée sur un échangeur d'ions à base de dextrane et on l'élue et concentre ensuite immédiatement. Selon une autre forme de réalisation encore de l'in- vention, on traite le plasma par un échangeur d'ions à base de dextrane et après au moins 2 heures de traitement, on élue et concentre ensuite le mélange de protéines à FEIBA engendrée adsorbé sur-l'échangeur d'ions. Confor- mément à cette forme de réalisation, la création de la FEIBA dépend de la durée du traitement. Ce traitement peut demander jusqu'à 48 heures. Les conditions opératoires mises en oeuvre ne sont pas critiques et peuvent varier entre de larges limites; c'est ainsi que le pH peut fluctuer entre 6 et 9, la température peut se situer entre O et 40 C, les quantités de sulfate de dextrane employées peuvent varier de 0,1 à 500 mg/l de plasma et les quantités de DEAE-séphadex peu- vent fluctuer de 0,01 à 10 g/l de plasma. Comme matière de départ pour la mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, on peut non seulement se servir de plasma humain natif, mais aussi de fractions de plasma, par exemple le cyo-résidu et le résidu Cohn-I (alcool 8 %). La préparation conforme à l'invention et son procédé d'obtention seront illustrés de manière plus détaillée dans les exemples qui suivent. A la suite des exemples, on illustre les procédés de détermination employés et on donne les résultats obtenus sous forme de tableau. EXEMPLE 1 On décongèle 1000 1 de plasma humain citraté congelé jusqu'à O à +4 C et on sépare ensuite le crp-précipité par centrifugation à +2 C. Au "cryo-résidu'' ainsi re- cueilli, on ajoute 10 g de sulfate de dextrane (poids moléculaire: 500. 000 d'un pH originel de 7,7 et on agite le tout pendant 15 minutes à +4 C, si bien que la substance à FEIBA est engendrée. Après cela, on ajoute 500 g de l'échangeur d'anions qu'est le DEAESéphadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Upsala, Suède) et on agite le tout pendant 1/2 heure à +4 C, de manière à adsorber la substance à FEIBA engendrée en même temps que les facteurs du complexe à prothrombine (II, VII, IX, X) et les protéines inertes sur le DEAE- séphadex insoluble. Après le processus d'adsorption, le DEAE-séphadex est immédiatement soumis à une séparation par centrifu- gation ou filtration; le plasma surnageant peut être utilisé pour l'obtention de gamma-globuline et d'albumine. On soumet le DEAE-séphadex à un double processus de lavage; pour ce faire, on agite d'abord le DEAEséphadex avec 50 1 d'une solution, constituée de 4 g/l de citrate trisodique.2H20, de 7 g/il de chlorure de sodium et de 18 g/l de phosphate hydrogéné disodique.12H20 dans de l'eau distillée, d'un pH de 7, 5, pendant 15 minutes, à +4 C. Après la séparation par filtration, on agite le DEAE-séphadex avec 50 1 d'une solution constituée de 4g/l de citrate trisodique.2H20 et de 7 g/l de chlorure de sodium dans de l'eau distillée, d'un pH de 7,5, pendant minutes, à +15 C et on le resépare ensuite par l'in- termédiaire d'une nouvelle filtration. En vue de lëlution, on agite le DEAE-séphadex avec 1 d'une solution, constituée de 30 g/l de chlorure de sodium et de 1 g/l de citrate trisodique.2H20 dans de l'eau distillée, d'un pH de 7,0, pendant 20 minutes, à +4 C. On recueille l'éluat, contenant la substance à FEIBA engendrée, les facteurs du complexe à prothrombine (II, VII, IX, X) comme aussi des protéines inertes, par filtration et on rejette le DEAEséphadex. On dialyse l'éluat jusqu'au lendemain vis-à-vis de 1000 1 d'eau distillée à +4 C, on le congèle ensuite et on le soumet à un premier processus de lyophilisation. On détermine la FEIBA dans la matière en vrac obtenue par le procédé o décrit dans la demande de brevet allemand DOS 27 34 821. En vue de la fabrication d'une préparation à FEIBA harmaceutiquement utilisable, on dissout la matière en vrac dans une quantité d'eau distillée apyrogène telle que la FEIBA se situe entre 10 et 50 unités FEIBA par ml (dans le cas présent 25 unités FEIBA par ml). Après addition des sels nécessaires à l'obtention de l'isotonie et réglage de la valeur du pH entre 7,0 et 7,5, on limpidifie la solution à travers un filtre à membrane et on la filtre finalement jusqu'à stérilité à travers un filtre à membrane de 0,2 y. On introduit la solution dans des conditions stériles à raison de ml dans le récipient final, on la surgèle et on la lyophilise. EXEMPLE 2 On décongèle 1000 1 de plasma humain citraté,fraiche- ment congelé>jusqu'à O à +4 C et on sépare le cryo-préci- pité formé par centrifugation à +2 C. On additionne le "cryo-résidu'' ainsi obtenu à un pH originel de 7,7, de 500 g de l'échangeur d'anions qu'est le DEAE-séphadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Upsala, Suède) et on agite le tout pendant 1/2 heure à +4 C, si bien que les facteurs du complexe à prothrombine (II, VII, IX, X) et des pro- téines inertes sont adsorbés sur le DEAE-séphadex. On laisse reposer le mélange pendant 12 heures à +4 C et la substance à FEIBA est engendrée au cours de cette '" durée de contact't'. Le DEAE-séphadex est séparé par centrifugation ou filtration après la ''durée de contact'' de 12 heures; on peut utiliser le plasma surnageant pour l'obtention de gamma-globuline et d'albumine. Le traitement ultérieur du DEAE-séphadex (double lavage, élution, etc.) s'effectue de la même manière que celle décrite à l'exemple 1. Le test de l'activité inductrice de thrombose selon Wessler qui est décrit dans la littérature, plus parti- culièrement dans J. Appl. Physiol. 14 (1959), 943-946, Biologic assay of a thrombosis-inducing activity in human serum'' de Stanford Wessler, Stanley M. Reimer et Mindel C. Sheps.se réalise de la manière suivante. Par essai, on utilise 3 lapins. On soumet les animaux à une narcose au nembutal; après anesthésie locale additionnelle, on dénude la veine jugulaire du côté du coeur et on prépare 2 ligatures à une distance de 1 à 2 cm. On inJecte la préparation à examiner, à la dose souhaitée, en l'espace de 15 secondes, dans la veine otique opposée à la veine jugulaire dénudée. De 10 à 25 secondes après l'achèvement de l'injection de la préparation, on ferme les ligatures préparées. Le segment de veine isolé demeure alors 10 minutes in situ dans le lapin. Ensuite, on prélève le fragment de veine de l'animal et on le découpe dans une boite de Petri dans une solution à 5 % de citrate de sodium et on en évalue le contenu selon le système de cotation suivant. O = pas de coagulation 1 = peu de particules de fibrine macroscopiquement visibles 2 = quelques petits thrombus 3 = 2 ou plus de 2 gros thrombus 4 = un thrombus unique remplissant tout le segment de veine isolé. Le test est dit positif dans le cas de la réaction à cote 4. Dans le cas de la préparation conforme à l'inven- tion, il est essentiel qu'il ne se produise pas de ré- action de cote 4 lors de l'injection de la préparation contenant jusqu'à au moins 2 unités FEIBA par kg d'animal expérimental. La détermination de l'activité de kallicréine et de l'activité d'activateur de la prékallicréine se réalise de la manière suivante. KALLICREINE 1. Méthode La kallicréine provoque par voie amidolytique la scission de para-nitroaniline (pNA) d'un substrat chromo- gène spécifique. La concentration en pNA est mesurée photométriquement à une longueur d'onde de 405 nm. 2. Réactifs Tampon: Solution A: 3,03 g de ''TRIS'' et 1,7 g d'imidazole sont dissous dans 500 ml d'acide chlor- hydrique 0,1N et amenés à 1000 ml avec de l'eau. Solution B: 4,04 g de "TRIS" et 2,27 g d'imidazole sont dissous dans 500 ml d'acide chlor- hydrique O,1N et amenés à 1000 ml avec de l'eau. Solution C: on dissout 11,69 g de chlorure de sodium avec de l'eau jusqu'à obtenir un volume de 1000 ml. On mélange les solutions A et B jusqu'à l'obtention d'un pH de 7,9. Au mélange on ajoute le même volume de solution C. Substrat chromogène S2302 (Firma Kabi, Stockholm): H-D-Prolyl-L-phénylalanyl-L-arginine-p-nitroanilide- dichlorhydrate. Solution 1 millimolaire de S-2302: 25 mg dans 41 ml d'eau. Echantillon: On dissout l'échantillon jusqu'au volume initial et on l'utilise dans- le test à l'état non dilué. 3. Test On pipette 1,0 ml de tampon, préalablement amené à 37 C, 0,1 ml d'échantillon, 0,2 ml de substrat chromogène S-2302 dans un petit tube en matière plastique, au bain- marie, à une température de 37 C. On introduit ce mélange dans un spectrophotomètre amené à 37 C et on mesure l'élé- vation de la densité optique par minute (ADO/mn) à une longueur d'onde de 405 nm, sur une épaisseur de couche de mm. On exprime l'activité d'n échantillon en (ADO/mn). ACTIVATEUR DE LA PREKALLICREINE 1. Méthode On engendre de la kallicréine (KK) à partir d'une préparation de prékallicréine purifiée (PKK) à l'aide d'un activateur de prékallicréine (PKKA). La kallicréine provoque la scission amidolytique de para-nitraniline (pNA) d'un substrat chromogène spécifique. On mesure photométriquement la concentration en pNA à une longueur d'onde de 405 nm. 2. Réactifs Le tampon et le substrat chromogène correspondent aux réactifs décrits à propos de la détermination de la kallicréine. Préparation de la prékallicréine La réalisation de la préparation s'effectue selon les prescriptions de Harpel, modifiées par M.S. Horowitz (New York Blood Center). Pour ce faire, on traite du plasma humain citraté par de la DEAE-cellulose. La fraction non liée à la DEAE-cellulose contient la prékallicréine. Contrôle positif (standard) Comme standard (= valeur de référence) on utilise une préparation d'albumine du Bureau of Biologics (BoB) de la Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland 20205, E.U.A. Cette préparation contient un activateur de prékallicréine. La création de kallicréine à l'aide de ce standard du BoB correspond à une valeur de réfé- rence de 1 ou est établie comme étant égale à 100 %. Echantillon On dissout l'échantillon Jusqu'au volume initial et on l'utilise dans le test à l'état non dilué. 3. Test On pipette 0,05 ml de préparation de prékallicréine, 0,05 ml d'échantillon a) standard du BoB pour la valeur de référence, b) échantillon à tester (dans un second dispositif d'essai), dans un petit tube en matière plastique, au bain-marie, à une température de 37 C. Apres incubation de 10 minutes à 37 C, on introduit par pipettage 0,7 ml de solution tampon, 0,1 ml de substrat chromogène S-2302. On introduit ce mélange dans un spectrophotomètre amené à 37 C et on mesure l'élévation de la densité optique par minute (ADO/mn) à une longueur d'onde de 405 nm, pour une épaisseur de couche de 10 min. On exprime l'activité d'un échantillon(ADO/mn) sous forme de facteur-par rapport au standard du BoB correspondant à une valeur de référence de 1 ou sous forme de % du standard du BoB. La caractérisation de la préparation conforme à l'invention par séparation chromatographique d'affinité de la préparation sur du sulfate de dextrane-sépharose a déjà été décrite en relation avec la figure 1. La séparation électrophorétique des protéines avec activité de facteur IX et avec FEIBA, décrite en relation avec la figure 2, peut se réaliser de la manière suivante. Comme support pour la séparation électrophorétique des diverses protéines, on se sert d'une membrane d'acé- tate de cellulose, humidifiée d'un tampon pour électro- phorèse (pH 8,6, force ionique 0,075). Sur cette membrane, on dépose les échantillons à analyser -en même temps qu'un plasma humain normal servant de standard- et on les soumet ensuite à une séparation dans un champ électrique; la sé- paration s'effectue parce que les protéines diversement chargées se déplacent à des vitesses différentes dans le champ électrique. A cette fin, la membrane pourvue des échantillons est soumise, dans une cellule spéciale, remplie de tampon pour élevtrophorèse, pendant 16 à 18 mi- nutes, à une tension de 250 volts et à une intensité de courant initiale de 4 à 6 milliampères. Après la fin du processus de séparation, on visibilise les diverses protéines par introduction de la membrane dans une solution de fixateur ou de coloration. Après avoir passé dans quelquesbains de rinçage, on rend la membrane transparente dans un autre bain, on la dépose sur une plaque de verre et on la sèche à l'étuve à 100oC. On analyse ensuite la membrane séchée dans un densi- tomètre à enregistrement et intégration automatiqueset on obtient les courbes de séparation telles que représentées sur la figure 2. Les diverses protéines y apparaissent sous forme de bandes de forces diverses dont les surfaces et les valeurs des pourcentages relatifs des protéines correspondantes sont proportionnelles, les surfaces étant déterminées par l'intégration automatique du densitomètre. La coordination des diverses bandes ou protéines de l'échantillon d'essai en protéines ou groupes de protéines bien définis s'effectue par comparaison avec les bandes du plasma humain normal co-analysé à titre de standard. Ce dernier est séparé au cours de l'analyse électropho- rétique en 5 groupes de protéines qui, par définition -par ordre successif de vitesse de déplacement décroissante dans le champ électrique- se caractérisent comme suit: albumine, a-globulines, P-globuline, fibrinogène et y- globuline. La définition de l'unité FEIBA comme aussi sa déter- mination (test d'activité) sont décrites dans la litté- rature, notamment dans le brevet autrichien NO 350 726 (brevet des E.U.A. 4 160 025, demande de brevet allemand DOS 27 34 821). La détermination de l'activité des fac- teurs de coagulation II, VII, IX et X est également décrite dans la littérature susmentionnée. La détermination de l'activité résiduelle de la FEIBA après incubation dans du plasma inhibiteur du facteur VIII se réalise de la manière suivante. 1. Réactifs Les réactifs à utiliser sont en corrélation avec la détermination des unités FEIBA (test d'activité) dont il est question dans le brevet autrichien NO 350 726 (brevet des E.U.A. 4 160 025, demande de brevet allemand DOS 27 34 821). 2. Test A partir d'une préparation réglée à 50 unités FEIBA/ml on a réalisé les dilutions suivantes à l'aide d'une solu- tion de 7 g/il de chlorure de sodium et de 7 g/li de citrate de sodium. 2H20 servant de diluant: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 et 1:64. De ces 6 dilutions, on a chaque fois réa- lisé une dilution 1:10 dans du plsama inhibiteur de facteur VIII (0,05 ml d'échantillon prédilué + 0,45 ml de plasma inhibiteur de facteur VIII). On analyse ces dilutions 1:10 dans du plasma inhibi- teur de facteur VIII "mélanges d'incubation'", immédia- tement et après 1 heure d'incubation à 370C, selon le schéma d'essai suivant: 0,1 ml de "mélange d'incubation'" 0,1 ml de suspension de phospholipide-kaolin 1 minute d'incubation à 370C 0,1 ml de chlorure de calcium 0,025 molaire On mesure la durée de l'addition de chlorure de calcium jusqu'à la formation du caillot avec un chronomètre, comme au cours du test d'activité. 3. Calcul de l'activité résiduelle D'une manière analogue à celle décrite à propos du test d'activité, on établit à présent une courbe d'étalon- nage à l'aide des durées de coagulation des dilutions déterminées immédiatement après leur préparation (échan- tillon non dilué = 50 unités FEIBA/ml). On calcule les activités (unités F3IBA/ml des différentes dilutions incubées pendant 1 heure en se servant de la courbe d'étalonnage et on les exprime en % des activités res- pectives des dilutions non incubées. Les valeurs moyennes- des activités ainsi calculées donnent alors l'activité résiduelle moyenne de l'échantillon après une incubation de 1 heure, exprimée sous forme de pourcentage de l'acti- vité initiale avant l'incubation. La détermination de l'activité résiduelle du facteur IX après incubation dans du plasma manquant de facteur IX se réalise de la façon suivante. 1. Réactifs Plasma manquant de facteur IX: plasma citrate d'un pa- tient à hémophilie B grave (facteur IX en-dessous de 1%). Suspension de phospholipide/kaolin: réactif PTT de la firme Immuno Diagnostica Ges.m.b.H. Pour l'essai, on mélange la quantité nécessaire de plasma manquant de facteur IX à un égal volume de suspension de phospholi- pide/kaolin, on incube le tout 5 minutes à 37 C et on le conserve ensuite au cours de la période d'essai au bain de glace. Solution de citrate/sel de cuisine comme diluant pour les échantillons: 7 g/l de citrate trisodique.2H20, 7 g/l de chlorure de sodium, chlorure de calcium M/20 (0,05 molaire): conserver à 37 C au cours de la période d'essai. 2. Test A partir d'une préparation réglée à 50 unités de fac- teur IX/ml, on réalise 7 dilutions géométriques (1:2, 1:4, etc. Jusqu'à 1:128) avec une solution de citrate/sel de cuisine. On réalise chaque fois une dilution 1:10 dans du plasma manquant de facteur IX à partir des échantillons non dilués comme aussi des 7 dilutions géométriques (0,05mld'échantillon prédilué + 0,45 ml de plasma manquant de facteur IX). On soumet ces dilutions 1:10 dans du plasma manquant de facteur IX (' 'mélange d'incubation'' immédiatement et après une incubation de I heure à 37 C à une analyse selon le schéma d'essai suivant o chaque mélange d'incubation est dilué avant la détermination à 1:10 avec une solution de citrate/sel de cuisine: 0,2 ml de mélange de plasma manquant de facteur IX et de phospholipide/kaolin 0,1 ml de '"'mélange d'incubation' ', dilué à 1:10 avec une solution de citrate/sel de cuisine 1 minute d'incubation à 37 C 0,1 ml de chlorure de calcium M/20 (0,05 molaire). On mesure la durée de l'addition de chlorure de calcium jusqu'à la formation du caillot à l'aide d'un chronomètre. 3. Calcul de l'activité résiduelle A l'aide des durées de coagulation mesurées sur les dilutions immédiatement après leur réalisation, on établit une courbe d'étalonnage (échantillon non dilué = 50 unités de facteur IX/ml) en portant les durées de coagulation vis-à-vis des dilutions correspondantes sur du papier millimétré doublement logarithmique. On calcule ensuite les activités (unités de facteur IX/ml des diverses dilu- tions incubées pendant 1 heure en utilisant la courbe d'étalonnage et on les exprime en % des activités res- pectives des dilutions non incubées. Les valeurs moyennes des activités ainsi calculées donnent ensuite l'activité résiduelle moyenne de l'échantillon après 1 heure d'in- cubation, exprimée sous forme de % de l'activité initiale avant l'incubation. Détermination immunologique de l'inhibiteur d'inter-alpha- trypsine (ITI) 1. Méthode La détermination s'effectue selon la technique d'Ouchterlony, conformément à laquelle un anticorps spé- cifique diffuse vis-à-vis d'un échantillon contenant un antigène dans un milieu à base de gélose. L'antigène réagit spécifiquement sur l'anticorps et forme une bande * d'immun précipité que l'on considère comme réaction posi- tive. 2. Réactifs Antisérum contre ITI de lapins, Behringwerke AG, Marburg/Lahn, RFA. Gélose: on fait brièvement bouillir une solution de 1,35 g de gélose, de 0,9 g de chlorure de sodium et de mg d'azoture de sodium dans 100 ml d'eau et on verse la solution chaude, homogène, sur des plaques avec une épaisseur d'environ 2 mm. Dans le gel refroidi, solidifié, on estampe des trous d'une dimension d'environ 2 mm en 2 rangées à une distance de 5 mm. Standard ou échantillon: Comme substance étalon on se sert d'un sérum standard en protéine de la firme Behring avec une teneur définie en ITI. A partir de ce sérum de référence, on prépare une série de dilutions géométriques dans une solution de chlorure de sodium physiologique (9 g de NaCl/1. On procède avec l'échantillon à tester comme avec le standard. 3. Test Dans une série de trous de la gélose, on introduit les dilutions de la substance étalon et de l'échantillon à tester. Dans la série de trous voisine, on pipette l'antisérum spécifique non dilué. On incube la plaque de gélose ainsi garnie pendant 15 heures à 37oC. On pro- cède ensuite à la lecture des précipitations d'immun. 4. Calcul de la concentration en ITI La mesure de la concentration en ITI d'un échantillon est l'échelon de dilution pour lequel une précipitation est encore juste visible ('"titre'" de l'échantillon). La concentration en ITI de l'échantillon soumis à l'essai se calcule de la manière suivante: titre de l'échantillon soumis à l'essai x la concentration titre du standard en ITI du stan- dard La concentration en ITI est donné en mg % (mg/100 ml). Les préparations réalisées conformément aux exemples 1 et 2 possédaient les caractéristiques suivantes après la mise en oeuvre des méthodes de détermination susmentionnées. Les représentations graphiques des figures 1 et 2 des dessins ci-annexés correspondent aux données suivantes de l'exemple 2 en ce qui concerne la séparation par chromato- graphie d'affinité et par électrophorèse. Préparation à FEIBA réalisée selon _I i i i i i Exemple 1 Exemple 2 Unités FEIBA/ml 26,0 24,2 Unités de facteur II/ml 25,8 23,0 Unités de facteur VII/ml 24,0 26,5 Unités de facteur IX/ml 28,2 27,4 Unités de facteur X/ml 24,1 22,1 Activité thrombogène au cours du test de Wessler: exempt d'activité thrombogène Jusqu'à un dosage de 10 U FEIBA/kg 4 U FEIBA/kg Chromatographie d'affinité sur sulfate de dextrane-sépharose Activité de F. IX éluée à 0,14-0,49 m NaCl 0,13-0,50 m NaCI Activité de F. IX maximale éluée à 0,31 m NaCl 0,30 m NaCI FEIBA élude à 0,33-0,49 m NaCi 0,31-0,50 m NaCl FEIBA maximale éluée à 0,41 m NaCl 0,40 m NaCl O- oo o Co I VEI& fl/2m Z'O VEIE fi/Sm 9g0 a na-qTQtuI XI '& ap quenbuem mmsuld sUBp uoTeqnouI % % 09 a %55e% 09 anet I se d XI neaios ep elIenPTFs9,aATOsp % IIIA ' op fleTqTquT Bmsuid suBp UOTBqnouI % 5 9% 59 eanoq I s.adB ellenPTsg9 VSI&& op % 0 O 0uT9JoTgIIe9ad BI op JnaqeAT4;OP 9ITAT oV O O euT9aoTIT op 91%TAT%-OV % 9 % auTfInqoI-d % sn % 91L iuamelned9 'euTInqol3-m % oz % L9 IdTouTJd OTd 'auTIlnqoIl-m VaIgi i 1@ XI * op 91%.TITO OGAB euT9qoJd el ep enbT%9aoqdoaoael9 uoTsaudgS z eldmexa l edmexa uo0les e9sTIUgaJ vaIA q UOTI.adgad O> -r- r-4 Co or I'N OL ii REVENDICATIONS 1. Préparation thromboplastique à base de protéines humaines comprenant les facteurs throm- boplastiques II, VII, IX et X et une activité de ly-passage de l'inhibiteur du facteur VIII, laquelle préparation est caractérisée en ce que: - elle est exempte d'activité thrombogène jusqu'à au moins deux unités FEIBA par kilo de lapin lors du test de l'activité inductrice de thrombose selon Wessler, - elle est exempte d'activité de kallicréine et elle est exempte d'activité d'activateur de la prékallicréine mesurée dans une solution aqueuse de la préparation avec une concentration en FEIBA allant jusqu'à au moins 10 unités par ml, - elle est séparable par chromatographie d'affinité sur du sulfate de dextrane-agarose, à l'aide d'un gradient de NaCl, de telle sorte que la protéine à activité de facteur IX s'élue à une concentration en NaCl inférieure à celle o s'élue la protéine à FEIBA, - les éluats contenant la protéine à activité de facteur IX et la- protéine à FEIBA contiennent des a- et P-glo- buline lors de la séparation électrophorétique, o la courbe de séparation présente, dans le domaine a, un pic principal correspondant à 60 à 80 % de la protéine glo- bale, un épaulement contigu de 10 à 20 % de la protéine globale, comme aussi un pic peu prononcé contigu à l'épaulement présenté par la courbe de séparation dans le domaine de la P-globuline, correspondant à une teneur de 10 à 20 % de la protéine globale. 2. Préparation suivant la revendication 1, caractéri- sée en ce que la protéine à activité de facteur IX s'élue à une concentration en NaCl de 0,1 à 0,5 (molaire) et la protéine à FEIBA s'élue à une concentration en NaCl de 0,3 à 0,5 (molaire), si bien que l'activité de facteur IX maximale s'élue à 0,3 (molaire) et que la FEIBA maximale s'élue à 0,4 (molaire). 3. Préparation suivant l'une quelconque des revendi- cations 1 et 2, caractérisée en ce que la FEIBA est conservée à au moins 50 % après incubation de 1 heure dans du plasma inhibiteur de facteur VIII. 4. Préparation suivant l'une quelconque des revendi- cations 1 et 2, caractérisée en ce que l'activité de facteur IX est conservée à au moins 50 % après incubation de 1 heure dans du plasma manquant de facteur IX. 5. Préparation suivant l'une quelconque des revendi- cations I à 4, caractérisée en ce qu'elle comporte une teneur en inhibiteur d'inter-a-trypsine (ITI) de 0,05 à mg par unité FEIBA. 6. Procédé d'obtention d'une préparation thromboplas- lique suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on traite du plasma humain par des hydrates de carbone hautement polymérisés et sulfatés et/ou par des échangeurs d'ions basiques et en ce que l'on adsorbe le mélange de protéines à FEIBA engendrée et en ce qu'on l'obtient ensuite par élution et concentration. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'on traite d'abord le plasma brièvement par des hydrates de carbone hautement polymérisés et sulfatés, en ce que l'on adsorbe ensuite le mélange de protéines à FEIBA engendrée sur un échangeur d'ions à base de dextrane et on l'élue et concentre ensuite immédiatement. 8. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'on traite le plasma par un échangeur d'ions à base de dextrane et en ce qu'après une durée de traite- ment d'au moins 2 heures, on élue le mélange de protéines à FEIBA engendrée adsorbé sur l'échangeur d'ions et on le concentre immédiatement.