Brevet FR2492260A1 — publié le 19820423

La présente invention concerne une composition pharmaceutique-pour l'administration orale contenant le facteur de coagulation VIII. Plus particulièrement, l'invention concerne une nouvelle composition pharmaceutique convenant au traitement ou à la prophylaxie de l'hémophilie A par administration oralè, qui contient le facteur de coagulation VIII et un inhibiteur de protéase qui sont incorporés à des liposomes et éventuellement lyophilisés et/ou encapsulés dans des capsules entérosolubles. Il est bien connu que l'hémophilie est un trouble héré- ditaire de la coagulation dû à des anomalies des facteurs antihémo- philiques et chez l'homme l'hémophilie atteint une personne sur 22 000 et peut être observée à la naissance dans un cas sur environ 8 000. Parmi ces troubles de la coagulation, l'hémophilie A.est due à une absence héréditaire du facteur de coagulation VIII. On peut, pour porter remède à cette maladie, fournir le facteur de coagulation aux malades auxquels il manque. On a effectué l'apport du facteur de coagulation nécessaire par perfusion de sang frais,- maisrécemment,depuis l'apparition de préparations dans lesquelles le facteur est très concentré, on utilise couramment de telles préparations qui contiennent des quantités importantes du facteur de coagulation et des quantités moindres d'autres facteurs tels que le fibrinogène. Cependant, on administre généralement ces préparations par voie intraveineuse et on cherche donc à mettre au point une préparation convenant à l'administration orale plus facile à manier que les préparations injectables. Lorsqu'on incorpore simplement le facteur de coagulation VIII à des préparations orales classiques telles qu'une préparation aqueuse, un comprimé ou une capsule, il est décomposé par l'acide chlorhydrique ou la pepsine dans l'estomac ou par des enzymes telles que la trypsine ou la chymotrypsine dans le suc intestinal ou pancréatique et, par conséquent, il ne peut pas être absorbé de façon efficace par les voies intestinales en conservant son activité.- L'administration orale du facteur de coagulation VIII a été signalée pour la première fois par Hemker et coll. qui ont traité le facteur VIII avec des liposomes [voir H.C. Hemker et coll., Lancet, 8159, 70 (1980) et PCT Internation Publication n0 W080/01456]. La demanderesse a réexaminé la méthode de Hemker mais n'a pas pu obtenir de résultats satisfaisants. Donc, même lorsqu'on incorpore le facteur de coagulation VIII à des liposomes, il est facilement décomposé par les diverses enzymes contenues dans le suc gastrique ou le suc intestinal lorsqu'on l'administre par voie orale et, par conséquent, il ne peut pas être absorbé par les voies intestinales en conservant son activité. Donc, on ne connaît pas de préparation orale du facteur de coagulation VIII que l'on puisse administrer par voie orale afin que le facteur soit absorbé de façon efficace par les voies intesti- nales sans être décomposé dans les voies gastro-intestinales. A la suite d'études importantes, la demanderesse a découvert que l'on peut obtenir une.préparation orale améliorée du facteur de coagulation VIII par incorporation du facteur à des lipo- somes avec un inhibiteur de protéase, éventuellement suivie d'une lyophilisation et/ou d'une encapsulation dans des capsules entéro- solubles. Un des objets de l'invention est une composition pharma- ceutique améliorée du facteur de coagulation VIII convenant a l'administration orale, qui est utile pour le traitement et la prophylaxie orales de l'hémophilie A. Un autre objet de l'invention est une nouvelle composition pharmaceutique du facteur de coagula- tion VIII permettant l'absorption efficace du facteur par les voies intestinales sans qu'il soit décomposé dans les voies gastro-intes- tinales. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit. La composition pharmaceutique de l'invention contient le facteur de coagulation VIII et un inhibiteur de protéase qui sont incorporés ào des liposomes. De préférence, la composition est encapsulée dans des capsules entérosolubles pour être moins altérée par le suc gastrique et le suc duodénal. De plus, de préférence, la composition est lyophilisée pour accroître la stabilité au stockage. Dans un autre mode de réalisation, le facteur de coagulation VIII, l'inhibiteur de protéase et la matière utilisée pour former des liposomes sont lyophilisés séparément et les matières lyophilisées sont mélangées puis encapsulées dans des capsules entérosolubles. La composition pharmaceutique de l'invention peut éventuellement contenir des stabilisants tels que le mannitol, l'albumine, le dextrane, etc., et de plus d'autres additifs pour améliorer la fluidité du produit lyophilisé tel que le glucose, le lactose, le mannitol, etc. Le facteur de coagulation VIII provient de l'homme et d'autres mammifères tels que le porc et les bovins. L'inhibiteur de protéase utilisé dans l'invention est constitué d'aprotinine, de mésylate de p-(p-guanidinobenzoyloxy)- phénylacétate de diméthylcarbamoylméthyle, etc. On incorpore de préférence l'inhibiteur de protéase à raison de 10 à 100 unités par unité du facteur de coagulation VIII. Pour que le facteur de coagulation VIII soit absorbé de façon efficace dans les cellules d'absorption, les liposomes ont de préférence une taille d'environ l/um et sont de préférence constitués de plusieurs lamelles telles que deux ou trois lamelles. De plus, la phase aqueuse incluse dans les liposomes a une pression osmotique supérieure à celle des cellules d'absorption. Les liposomes peuvent être formés d'une matière classique quelconque. Des exemples de matières préférables sont un phospholipide comprenant essentiellement de la lécithine de jaune d'oeuf avec addition d'une quantité appropriée d'acide phosphatidique ou de phosphatidylsérine pour améliorer la capacité de formation des liposomes ou la stabilité des liposomes. De plus, on peut également incorporer du cholestérol pour renforcer la membrane des liposomes et ajouter de la lysolécithine pour améliorer la fusion de la membrane liposomique à la biomembrane des cellules d'absorption. L'acide phosphatidique augmente la taille des particules de liposomes, ce qui augmente la quantité des matières qui y sont incluses. La phosphatidylsérine améliore la capacité de formation de la membrane. Les liposomes utilisés dans l'invention doivent avoir les propriétés suivantes. (1) Même si on sépare la phase de liposomes par centri- fugation, et que la phase extérieure n'a qu'une faible teneur en eau, les liposomes peuvent conserver leur forme fondamentale. - 2 492260 (2) Lorsqu'on lyophilise les liposomes obtenus par centrifugation comme en (1) ci-dessus, on peut facilement redonner aux liposomes leur état d'origine par addition d'eau au produit lyophilisé. (3) Lorsqu'on lyophilise le facteur de coagulation VIII, l'inhibiteur de protéase et la matière productrice de liposomes, le mélange de ces matières lyophilisées peut facilement former des liposomes désirés par addition d'eau. On peut inclure dans les liposomes le facteur de coagulation VIII et l'inhibiteur de protéase selon un procédé clas- sique comme décrit dans la littérature par exemple dans "Methods in Cell Biology" publiéepar David M. Prescott, Vol. XIV, page 34, Pour éviter une diminution indésirable de l'activité du facteur de coagu- lation VIII pendant l'incorporation aux liposomes, on préfère utiliser une solution tampon neutre. Lorsqu'on administre par voie orale la composition pharmaceutique de l'invention dans laquelle le facteur de coagulation VIII et un inhibiteur de protéase sont incorporés à des liposomes, elle atteint la zone d'absorption (cellules épithéliales) de l'intestin grêle o elle est absorbée sans qu'il y ait de décomposition du facteur VIII, même par contact avec les sucs digestifs dans les voies gastro-intestinales. Lorsque la composition est encapsulée dans des capsules entérosolubles, elle atteint l'intestin grêle par passage à travers l'estomac et le duodénum, telle quelle et la capsule est dégradée dans l'intestin grêle à un pH neutre ou alcalin pour libérer son contenu dans les voies intestinales. Par suite de la coexistence d'un inhibiteur de protéase, le facteur VIII est protégé contre la décomposition dans l'intestin grêle et est absorbé de façon efficace. Donc, la composition pharmaceutique de l'invention est utile pour le traitement et la prophylaxie orales de l'hélophilie. La posologie de la composition pharmaceutique de l'invention peut varier selon l'âge, le poids corporel et le sexe des malades ainsi que la gravité du symptOme, mais elle est généralement telle que l'ingrédient actif (facteur de coagulation VIII) soit administré à raison de 500 à 3 000 unités par jour. Les excellents effets thérapeutiques de la composition pharmaceutique de l'invention sont confirmés par les essais cliniques suivants. Essai 1 On administre a une malade atteinte d'hémophilie A le facteur de coagulation VIII dans les préparations suivantes à des jours différents. Administration orale. 1) On administre par voie orale la composition (20 capsules entérosolubles) obtenue dans l'exemple 4. 2) On administre par voie orale la composition (50 ml) obtenue dans l'exemple de référence 1. Injection intraveineuse. On administre par voie intraveineuse 250 unités d'une préparation injectable du facteur de coagulation VIII du commerce: Concoeight (fabriquée et commercialisée par Green Cross Co. au Japon). Avant et après l'administration des préparations, on prélève du sang à des intervalles fixes et on détermine l'activité du facteur VIII dans le sang selon la méthode directe de Matsuoka (voir Matsuoka, M.; "Laboratory methods of blood coagulation", Kanahara, pages 61-165,. Tokyo, 1977) selon laquelle la quantité du facteur de coagulation VIII est exprimée par un pourcentage (%) calculé de telle sorte que la quantité du facteur de coagulation VIII d'un sujet normal soit de 100%7. et celle d'un sujet n'ayant pas de facteur de coagulation VIII soit de 0%. Les résultats figurent dans le tableau 1. TABLEAU 1 Moment des prélèvements de sang (heures) Préparations Voie O 2 4 6 8 10 Composition de p.o. 2,0 3,4 3,3 3,3 - - l'exemple 4 Composition de p.o. 2,0 1,8 2,0 1,9 1,7 - l'exemple de référence 1 Préparation i.v. 2,0 11,0O 3,0 2,0 2,0 2,0 injectable 6 2492260 Comme le montrent les résultats ci-dessus, lorsque le facteur de coagulation VIII est simplement incorporé à des liposomes, il n'est pas absorbé de façon efficace par les voies intestinales en conservant son activité, tandis que, lorsqu'il est incorporé dans des liposomes avec de l'aprotinine (inhibiteur de protéase), il est bien absorbé par les voies intestinales en conservant son activité. Essai 2 A deux malades du sexe masculin atteints d'hémophilie A, on administre le facteur de coagulation VIII dans les préparations suivantes à des jours différents. 1) On administre par voie orale la composition (20 capsules entérosolubles) obtenue dans l'exemple 4. 2) On administre par voie orale la composition (20 capsules entérosolubles) obtenue dans l'exemple de référence 3. Avant et après administration des préparations, on prélève du sang à des intervalles fixes et on détermine l'activité du facteur VIII dans le sang de la même façon que dans l'essai 1. Les résultats figurent dans le tableau 2. TABLEAU 2 Les résultats ci-dessus montrent nettement que la préparation de facteur VIII additionnée d'aprotinihe est bien absorbée par les voies intestinales en conservant son activité, tandis que, d'autre part, la préparation de facteur VIII ne contenant pas d'aprotinine n'est pas absorbée par les voies intestinales en conservant son activité. Moment des prélèvements de sang (heures) Préparations O 2 4 6 8 Composition de 1,4 1,8 2,1 1,8 1,9 l'exemple 4 Composition de 1,4 1,3 1,3 1,4 1,3 l'exemple de référence 3 Essai 3 On administre à un jeune malade du sexe masculin atteint d'hémophilie A le facteur de coagulation VIII dans les préparations suivantes à des jours différents. 1) On administre par voie orale la composition (20 capsules entérosolubles) obtenue dans l'exemple 4. 2) On administre par voie orale la composition (20 gélules) obtenue dans l'exemple de référence 2. Avant et après administration des préparations, on prélève du sang à des intervalles fixes et on détermine l'activité du facteur VIII de la mdme façon que dans l'essai. 1. Les résultats figurent dans le-tableau 3. TABLEAU 3 Il ressort nettement des résultats ci-dessus que la préparation de facteur VIII contenant de l'aprotinine est bien absorbée par les voies intestinales en conservant son activité, tandis que la préparation de facteur VIII ne contenant pas d'apro- tinine n'est pas absorbée par les voies intestinales en conservant son activité. La préparation de la composition pharmaceutique de l'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE 1 On dissout dans 40 ml d'éthanol 2 g de lécithine de jaune d'oeuf contenant 5%h d'acide phospatidique. On introduit la solution dans un ballon de 1 litre et on la concentre sous pression réduite pour que la lécithine se dépose sous forme d'une couche mince sur Moment des prélèvements de sang (heures) Préparations _ O 2 4 6 Composition de 2,0 2,8 2,8 3,5 l'exemple 4 Composition de l'exemple 2,0 1,9 1,9 2,0 de référence 2 la paroi interne du ballon. Après dessiccation sous pression réduite, on ajoute 50 ml d'une solution de tampon -phosphate (pH 7,0) contenant - 3 000 unités de facteur de coagulation VIII et 150 000 unités d'apro- tinine et on agite doucement le ballon pour obtenir une suspension de liposomes. On introduit la suspension de liposomes ainsi obtenue dans un tube à centrifuger, on refroidit à 10C puis on centrifuge à 27 000 G pendant 20 min pour obtenir à la partie supérieure des liposomes crémeux. On traite à nouveau la couche aqueuse transparente avec de la lécithine et on traite le mélange dans le ballon comme ci-dessus. On répète trois fois ces opérations. On combine les liposomes crémeux obtenus lors des trois opérations ci-dessus et on les met en suspension dans 50 ml de soluté salé physiologique pour laver la couche extérieure des liposomes. Après refroidissement à C, on centrifuge la suspension à 40 000 G pendant 10 min pour recueillir les liposomes et on sèche les liposomes pour éliminer autant que possible l'eau contenue dans la couche extérieure. Les liposomes ainsi obtenus ont un volume d'environ 10 ml et contiennent 1 000 unités du facteur de coagulation VIII et 50 000 unités d'apro- tinine. On introduit les liposomes obtenus ci-dessus dans des gélules (taille n0 0, dont la paroi interne est revêtue d'une couche mince d'huile comestible) que l'on introduit elles-mêmes dans des capsules entérosolubles pour obtenir une structure à double capsule. On rend le joint des capsules extérieures totalement étanche par traitement avec une solution de la matière formant les capsules entérosolubles dans l'acétone. Les capsules contiennent chacune unités du facteur de coagulation VIII. Lorsqu'on maintient les capsules à l'abri de la chaleur et à l'obscurité, l'activité du facteur VIII ne diminue pas rapidement. EXEMPLE 2 Comme décrit dans l'exemple 1, on dissout dans 40 ml d'éthanol 2 g de lécithine de jaune d'oeuf contenant 10% d'acide phosphatidique et on concentre la solution sous pression réduite dans un ballon de 1 litre pour déposer la lécithine sous forme d'une couche mince sur la paroi interne du ballon. Après dessiccation sous pression réduite, on ajoute 50 ml d'une solution de tampon phosphate (pH 7,0) contenant 3 000 unités du facteur de coagulation VIII et 000 unités d'aprotinine et on agite légèrement le ballon pour obtenir une suspension de liposomes. On introduit la suspension de liposomes dans un tube à centrifuger, on refroidit à 100C puis on centrifuge à 27 000 G pendant 20 min pour obtenir des liposomes crémeux à la partie supérieure. On traite à nouveau la couche aqueuse transparente avec de la lécithine et on traite le mélange dans le ballon de la même façon que ci-dessus. On répète trois fois ces opérations. On combine les liposomes crémeux obtenus dans les trois opérations ci-dessus, on les met en suspension dans 50 ml de soluté salé physiologique et on ajoute une quantité appropriée d'eau distillée dans laquelle on disperse uniformément les liposomes. On congèle rapidement le mélange par refroidissement entre -40 et -601C et on lyophilise sous pression réduite avec sublimation de l'eau. Pendant la lyophilisation, on peut ajouter des sucres aux particules liposomiques comme stabilisants. Les liposomes lyophilisés ainsi obtenus contiennent 1 000 unités du facteur de coagulation VIII et 50 000 unités d'apro- tinine. On fragmente doucement les liposomes lyophilisés sous un courant d'azote sec puis on les introduit dans des capsules entéro- solubles (taille n0 O). Après avoir rendu le joint des capsules totalement étanche par traitement avec une solution dans l'acétone de la matière formant les capsules entérosolubles, on sèche les capsules à l'air. Chaque capsule entérosoluble ainsi obtenue contient unités du facteur de coagulation VIII. On peut conserver ce produit pendant une durée prolongée lorsqu'on le maintient à l'abri de la chaleur et à l'obscurité. Les liposomes de ce produit peuvent facilement reprendre leur forme d'origine par addition d'eau. EXEMPLE 3 On lyophilise séparément 2 000 unités du facteur de coagulation VIII, 5 g de la lécithine de jaune d'oeuf contenant 15% d'acide phosphatidique et un liquide injectable contenant 50 000 unités d'aprotinine, le facteur VIII étant lyophilisé tel quel, la lécithine étant lyophilisée sous forme d'une solution dans le benzène 2492260 et le liquide injectable contenant l'aprotinine étant lyophilisé tel quel. On mélange les poudres lyophilisées sous un courant d'azote sec et on introduit le mélange dans des capsules entérosolubles (taille n0 O). Pour améliorer la fluidité du mélange, on peut lui ajouter une quantité appropriée de sucres tels que le glucose, le lactose ou le mannitol. Pour rendre le joint des capsules étanche, on les traite avec une solution dans l'acétone de la matière formant les capsules entérosolubles, comme dans les exemples 1 et 2. Chaque capsule entérosoluble contient 100 unités du facteur de coagulation VIII. Ce produit est très stable et on peut le conserver pendant une durée prolongée. Les liposomes de ce produit peuvent facilement reprendre leur forme d'origine par addition d'une petite quantité d'eau et une quantité assez importante du facteur VIII est incorporée aux liposomes. EXEMPLE 4 On dissout 2 g de lécithine de jaune d'oeuf contenant 5% d'acide phosphatidique dans 40 ml d'éthanol et on concentre la solution sous pression réduite dans un ballon de 1 litre pour déposer la lécithine sous forme d'une couche mince sur la paroi interne du ballon. Après dessiccation sous pression réduite, on ajoute 50 ml d'une solution de tampon phosphate (pH 7,0) contenant 3 000 unités du facteur de coagulation VIII et 50 000 unités d'aprotinine et on agite légèrement le ballon pour obtenir une suspension de liposomes. On traite la suspension de liposomes comme décrit dans l'exemple 1 pour obtenir environ 10 ml de liposomes contenant 1 000 unités de facteur de coagulation VIII et 17 000 unités d'aprotinine. On introduit les liposomes ainsi obtenus dans des capsules entérosolubles comme dans l'exemple 1. Chaque capsule ainsi obtenue contient 50 unités du facteur VIII. On peut conserver ce produit à l'abri de la chaleur et à l'obscurité sans que l'activité du facteur VIII diminue. EXEMPLE DE REFERENCE 1 On dissout 250 mg de lécithine de jaune d'oeuf contenant % d'acide phosphatidique dans 40 ml d'éthanol et on concentre la solution sous pression réduite dans un ballon de 200 ml pour déposer h1 2492260 la lécithine sous forme d'une couche mince sur la paroi interne du ballon. A près dessiccation sous pression réduite, on ajoute une solution aqueuse de 4 000 unités du facteur de coagulation VIII et on agite légèrement le mélange pour obtenir une suspension de lipo- somes. On introduit la suspension de liposomes dans un tube à centrifuger, oh refroidit à 100C puis on centrifuge à 27 000 G pendant min pour obtenir des liposomes crémeux à la partie supérieure. On traite à nouveau la couche aqueuse transparente avec de la lécithine et on traite le mélange dans le ballon comme ci-dessus. On répète deux fois ces opérations. On combine les liposomes crémeux obtenus dans les deux opérations ci-dessus et on les met en suspension dans 50 ml de soluté salé physiologique pour laver la couche externe des liposomes. En refroidissant à 10C, on centrifuge le mélange à 000 G pendant 20 min pour recueillir les liposomes. On dilue les liposomes avec du soluté salé physiologique pour obtenir un volume total de 50 ml. La suspension ainsi obtenue (50 ml) contient 800 unités du facteur de coagulation VIII. EXEMPLE DE REFERENCE 2 On dissout 2 g de lécithine de jaune d'oeuf contenant 5% d'acide phosphatidique dans 40 ml d'éthanol et on concentre la solu- tion sous pression réduite dans un ballon de 1 litre pour déposer la lécithine sous forme d'une couche mince sur la paroi interne du ballon. Après dessiccation sous pression réduite, on ajoute 50 ml de solution de tampon phosphate (pH 7,0) contenant 3 000 unités de facteur de coagulation VIII et on agite légèrement le mélange pour obtenir une suspension de liposomes. On traite la suspension de liposomes comme décrit dans l'exemple 1 pour obtenir 10 ml de liposomes. On introduit les liposomes dans des gélules. Chaque capsule contient 50 unités de facteur de coagulation VIII. EXEMPLE DE REFERENCE 3 On introduit des liposomes (10 ml) contenant le facteur de coagulation VIII obtenus de la même façon que dans l'exemple de référence 2 dans des gélules (taille n0 O, la paroi interne étant recouverte d'une couche mince d'huile comestible), qu'on introduit elles-mêmes dans des capsules entérosolubles pour obtenir des capsules à structure double. On rend complètement étanche le joint des capsules externes par traitement avec une solution dans l'acétone de la matière formant les capsules entérosolubles. Chaque capsule contient 50 unités du facteur de coagulation VIII. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. - 13 2492260 REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique pour l'administration orale qui comprend le facteur de coagulation VIII et un inhibiteur de protéase qui sont incorporés à des liposomes. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est encapsulée dans des capsules entérosolubles. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'un produit lyophilisé. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que la composition est encapsulée dans des capsules entérosolubles. 5. Composition pharmaceutique pour l'administration orale, caractérisée en ce qu'elle comprend le facteur de coagulation VIII, un inhibiteur de protéase et une matière productrice de liposomes qui sont chacun lyophilisés séparément. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que les produits lyophilisés sont encapsulés dans des capsules entéro- solubles. 7. Composition pharmaceutique pour l'administration orale sous une forme encapsulée dans des capsules entérosolubles, caracté- risée en ce qu'elle comprend le facteur de coagulation VIII et de l'aprotinine qui sont incorporés h des liposomes formés h partir d'un mélange d'un phospholipide et d'acide phosphatidique. 8. Composition pharmaceutique lyophilisée pour l'adminis- tration orale sous une forme encapsulée dans des capsules entérosolu- bles, caractérisée en ce qu'elle comprend le facteur de coagulation VIII et de l'aprotinine qui sont incorporés h des liposomes formés à partir d'un mélange d'un phospholipide et d'acide phosphatidique.