Brevet FR2496690A1 — publié le 19820625

Procédé pour préparer de la levure alimentaire et/ou de l'alcool éthylique, à partir de sous-produits végétaux. LFlnvention concerne un procédé pour préparer de la levure alimentaire et/ou de l'alcool éthylique à partir de sous-produits végétaux. Les plantes, plus exactement 25 - 40% de l'extrait sec des sous-produits végétaux sont constitués par de la cellulose. Elles renferment en outre encore de la lignine dans une proportion d'environ 20 -40% et en plus faible quantité des polymères du pentose, des polymères de 1 'hexose ainsi que d'autres matières organiques et inorganiques. On connatt deux processus pour utlliser des plantes et des résidus de plantes par fermentation. L'un de ceux-ci consiste en une fermentation directe de la cellulose à l'aide de microorganismes qui décomposent la cellulose (cellulolytiques). La deuxième possibilité consiste à dégrader par un acide, ou bien de façon enzymatique, la cellulose en glucose et de faire fermenter le glucose obtenu. I1 n'existe que peu de microorganismes qui sont capables de faire fermenter directement la cellulosetde plus ces microorganismes n'arrivent d décomposer la cellulose que très lentement. Des microorganlsmes qui décomposent la cellulose sont par exemple, parmi les bactéries, les espèces cellulomonas et cella+ibrio, parmi les levures, par exemple des Myrrothécium, verrucaria des Trichoderma viride, etc. Des expérences ont été menées par Ch.E. Dunlap (A. Chem. Soc. Symp. 1970) avec les souches cellulomonas et Alcaligenes afin de préparer un protide microbien par l'utlllsa- tion de microorganismes qui décomposelit la cellulose. F. Kargi et M.L. Schuler (Biotechn et Bioeng. Vol. XXII, 1567-1600, 1980) ont fait des expériences avec un mutant de Pseudomonas fluorescens. Les essais pour préparer un protide microbien (Protéine monocellulaire ou en langage anglo-saxon Single Cell Protein, SCP) à l'aide de bacétries et de moisissures perdent peu à peu leur importance parce que l'utilisation de ces microorganismes en tant que protide d'alimentation est criticable du point de vue de la médecine vétérinaire. Les possibilités pour utiliser la cellulose par fermentation sont bien plus nombreuses lorsqu'on transforme tout d'abord la cellulose par hydrolyse en glucose parce que le glucose est assimilé par pratiquement tous les microorganismes. Sholler et Thornes ont mis les premiers au point, autour de 1900, un procédé pour hydrolyser totalement la cellulose. Dans ce procédé on utilise des acides minéraux de concentration moyenne et des température dépassant 100 C. En conséquence, le procédé consommait beaucoup d'énergie et nécessait pour sa réalisation des dispositifs résistants aux acides et à la pression. Le procédé a bien été modernisé plus tard (la concentration de l'acide et la pression ont pe réduites) mais de nouvelles usines t,ravaill nt sur ce procédé n'ont plus été construites. Depuis 1950 des essais sont en cours pour hydrolyser la cellulose à l'aide de l'enzyme Cellulase obtenue à partir de champignons (B. Hagerdal et d'autres Bîotechn. et Bioeng. XXII, 1515-1526 et 1527-1542, 1980). Pour hydrolyser la cellulose on utilise en général le système enzymatique du Trichoderma viride (D. Sternberg, Biotechn. et Bioeng. Symp. N 6, 35-53, 1976). L'hydrolyse enzymatique de la cellulose est un prp- cédé comateux. En général elle n'est rentable que lorsque la solution de glucose obtenue par l'hydrolyse peut être transformée en un produit coûteux. Lors de l'élaloration du procédé selon l'invention on tire de cela que pour préparer eu SCP on ne peut utiliser que des microorganismes qui sont acceptables b des fins d'alimentation animale et qui, mis à part la lignine, peuvent mettre en valeur un grand nombre de composants végétaux. On utilise depuis des dizaines d'années en tant que levures d'alimentation les espèces utills qui appartiennent aux genres Candida et Torulopsis. Ces espèces connues de levure peuvent décomposer soit la lignine soit la cellulose. La littérature n'a également Jusqu'd présent décrlt aucune espèce de levure capable de décomposer la cellulose. I1 a été découvert auJourd'hui selon l'lnvention que la souche de Candida utilis isolée en 1978 par des méthodes génétiques et de sélection des souches est capable de dégrader la cellulose hydratée et partiellement dégradée. Pour hydrateretdégrader la cellulose on a mis au point un procédé simple de traitement préalable à l'aide duquel il est possible de préparer à partir de la matière qui renferme la cellulose, une solution nutritive qui convient à la souche de levure mentionnée. L'objet de l'invention est par conséquent un procédé pour préparer de la levure d'alimentation et/ou de l'alcool éthylique à partir de sous-produits végétaux. I1 est caracté ristique du procédé que l'on fasse fermenter d'une manière connue en soi, dans des conditions aérobie ou de non-aérobie, le sous-produit végétal traité au préalable avec un acide minéral dilué et/ou une lessive alcaline diluée, avec la souche Candida utilis var. cellulolytica déposée au Musée National Hongrois des collections de souches (OKI) le 23 Septembre 1980 sous la numéro CU 28 00199. La souche CU 28 a été isolée à partir d'un tronc d'arbre . On a homogénéisé environ 1 g de bois putrérié avec 9 ml d'une solution de sel de cuisine physiologique stérile. On a préparé avec cette solution une série de dilutions décimales, avec lesquelles on a ensemencé du Sabouraud-Agar renfermant de la CMC. (Le Sabouraud Agar qui renferme de la carboxyméthylcellulose correspond dans sa composition au milieu nutritif Oxoid CM 41 à la différence près qu'il renferme de la carboxyméthylcellulose à la place de dextrose). On fait incuber les lamelles à respectivement 25, 30 et 370C, pendant 72 heures.On choisit par des méthodes de morphologie cellu laire les cultures de levure qui se sont développées sur les lamelles et on erEemence un milieu nutritif qui renferme du glucose et de la carboxyméthylcellulose, dont la composition est la suivante Extrait de boeuf (Diflo) 5,0 g Glucose 7,5 g Carboxyméthylcellulose 7,5 g Bacto pepton (Difco) 4,0 g Extrait de levure (oxoid L 21) 1,0 g Phosphate de potassium primaire 0,2 g Phosphate de potassium secondaire 0,15 g Phosphate de sodium primaire 2,0 g Phosphate de sodium secondaire 1,5 g Sulfate de magnésium 0,3 g Sulfate de zinc 0,1 g Sulfate d'ammonium 3,o g Chlorure de fer III 0,1 mg Sulfate de cuivre 0,6 mg Chlorure de manganèse 0,l5mg Ioduré de potassium 0,05 mg Acide borique 0,1 mg Agar-agar 15 g Eau Jusqu'à 1 litre Ave les procédés de purification classiques, on nourrit des cultures qui sont issues d'une cellule unique et on les maintien dans un milieu nutritif qui renferme du glucose et de la carboxyméthylcellulose, Parmi ces isolats, on sélectionne la culture qui décompose le mieux la carboxyméthylee lulose. La culture synchrone de cette souche a été soumise en 1978 à un traitement qui déclenche une mutation eton a utilisé précisémment une concentration de N-méthyl-N-nitroso-N'-nitroguanidine à laquelle le nombre des germes vivants diminuait au malns de trois ordres de grandeur. Les cellules survivantes furent rassemblées dans un milieu nutritif liquide -renfermant de la carboxyméthylcellulose et introduites dans des milieux nutritifs solides de Sabouraud renfermant de la CMC. L'acti- vité cellulase (c'est-à-dire la capacité de décomposer la cellulose) des colonies mutantes obtenues fut déterminée avec de acide dinitrosalicylique, et la souche présentant l'activité cellulase la plus grande (Candida utilis var.Cellulolytica) fut sélectionnée et déposée sous le nO 00199 au Musée des microorganismes National de l'institut Agricole pour la Santé Publique (Oarszagos Kozgészségügyi Intézet Mikroorganiszmusok Nemzeti Gytljteménye). Les cellules de la souche mentionnée ont une forme ellipsoldale, le petit diamètre se situe entre 2,5 - 4,6 Am, le grand diamètre entre 4,5 - 7,5 Am . La souche forme des colonies banches convexes présentant une surface brillante et des bords lisses. Pour hydrater et dégrader partiellement la cellulose, on la traite avec un acide minéral dilué et/ou avec de la lessive alcaline diluée, à des températures comprises entre 80 et 1000C, selon la nature du résidu végétal, pendant 0,5 - 5 heures. L'acide Bt la lessive alcaline ont une concentration de 0,5 10 en poids. La concentration optlmale ainsi que la température et la durée du traitement préalable sont déterminées en liaison avec la composition chimique et la structure du résidu végétal, pour chacun des cas. Suivant la nature du résidu végétal, il est possible d'an transformer au moins 25 - 60% en levure d'alimentation, respectivement en alcool éthylique, par bioconversion. Dans ce qui suit, on fait une comparalson entre la souche Torulopsis utilis courante pour la préparation de levure d'alimentation et la souche Candida utilis var. cellulolytica utilisée selon l'invention. 94ns le tableau on donne la quantité de levure alimentaire séchée qu'on peut tirer de 100kg de matière première sèche, en kg, et la quantité d'alcool éthylique qu'on peut tirer de 100 kg de matière première séchée, en hl" (rendement exprimé en litre d'alcool absolu). Matière première et produit Rendement Candida utilis Torulopsis var.celluloly- utilis tica Levure alimentaire issue de la 9,6 - 11,2 6,4 - 7,8 paille Alcool éthylique issu de la 12,0 - 13,0 8,2 - 9, paille Levure alimentaire issue du papier Journal lDSS - 14,0 8,6 - 9,2 Alcool éthylique issu du papier Journal 13,6 - 14,0 8,6 - 9,2 Levure alimentaire issue du Kénaf 16,0 - 18,0 9,2 - 10,0 Alcool éthylique issu du Kénaf 20,0 - 22,0 11,4 - 12,2 Levure alimentaire et alcool 9,0 - 10,0 4,0 - 5,0 éthylique issus du Rénal 8,0 - 10,0 3,5 - 4,5 Levure alimentaire issue du mélange résidu de canne à sucre et bagas 18,0 - 19,0 9,8 - 10,6 préparé dans b rapport 75::25 Alcool éthylique issu du mélange résidu de canne à sucre et Bagas 22,0 - 23,6 12,2 - 13,6 préparé dans le rapport 75:25 Le Kénaf est une plante textile, le Bagas est le résidu qui demeure après avoir exprimé la canne à sucre. L'invention est expliquée de façon plus poussée à l'aide des exemples suivants elle ne se limite cependant pas à ces exemples. Exemple 1 On broie dans un broyeur à marteaux 1000 parties en poids de kénaf de façon à ce que la taille des particules soit de 1 - 2 mm. On aJoute à la matière 9000 parties en poids d'acide sulfurique à 3,2 % et on traite le mélange à chaud dans un récipient qui résiste à l'acide, à 960C pendant 120 minutes. Puis on ajoute 7,2 parties en poidsdé perphosphate et 4,0 parties en poids de sulfate d'ammonium technlque et on les dissout. La solution est centrifugée, la valeur de son pH est ajustée à 6,5 à l'aide d'une lessive de soude technique. On refroidit à 370C la solution nutritive ainsi préparée et on lui inocule dans un rapport 1:100, une première culture de Candida utilis var. cellulolytica qui renferme 108 cellules par millimètre. La première culture a été préparée de la manière sulvante Glucose 7,5 g Ca rboxyméthylce llulose (soluble dans l'eau) 7,5 g Phosphate de potassium primaire 0,2 g Phosphate de potassium secondaire 0,15 g Phosphate de sodium primaire - monohydraté 2,0 g Phosphate de sodium secondaire 1,5 g Sulfate de magnésium - heptahydraté 0,3 g Sufate de zinc 0,1 g Sulfate d'ammonium 3,0 g Extrait de boeuf (Difco) 5,0 g Bacto pepton 4,0 g Extrait de levure (Oxoid L 21) 1,0 g Chlorure de fer III hexahydraté 0,1 mg Sulfate de cuivre pentahydraté 0,6 mg Chlorure de manganèse tétrahydraté 0,15 mg Iodure de potassium 0,05 mg Acide borlque 0,1 mg sont dissous dans 1 litre d'eau distillée. On stérilise la solution dans un ballon fermé avec un tampon d'ouate, à 1050C pendant une heure. On inocule à la solution nutritive, à 370C, 10 ml d'une suspension vieille de 24 heures de Candida utilis var. cellulolytica et on laisse ensuite incuber à 370C. La solution nutritive de la culture principale est ensemencée avec la suspension qui renferme 108 cellules par ml. La fermentation se produit sous aération avec un excès d'oxygène de 1-2 mg de 02/1. Dans le cas d'une fermentation discontinue, la fermentation dure 36 - 40 heures. Une fois la fermentation terminée (après avoir atteint le nombre de germes maîimal)/e1st possible de séparer par filtration la levure sur un filtre de tambour à vide ou bien sur un filtre-presse ou bien il est possible de la sécher dlrectement par un séchage par vaporisation. I1 est possible de tirer de la manière décrite 16 - 18kg de levure d'alimentation sèche à partir de 100 kg de kénaf. Exemple 2 On opère de la façon décrite dans l'exemple 1 à cette différence près qu'on effectue la fermentation sans aération, dans des conditions d'anaérobie. La fermentation dure 46 à 50 heures. La quantité d'alcool séparé par dlstlllatlon du bouillon de fermentation s'élève à 20,0 - 22,0 litres calculé en alcool absolu -. Exemple 3 On opère de la façon décrite dans l'exemple 1 mais on utilise de la paille en tant que matière première à la place du kénaf. On a traité auparavant avee-de l'acide sulfurique à 3,7%, à 980C pendant 38 minutes. Après avoir été filtré, le résidu est traité avec une lessive de soude à 2,8 %, à 980C, pendant 42 minutes. On utilise l'acide comme la lessive alcaline dans une quantlté de 4500 parties en poids. On fait fer- menter pendant 46 heures à un pH de 6,3. On obtient à partir de 100 kg de paille séehée, 9,6 - 11,2 kg de levure d'alimentation sèche. Exemple 4 On opère de la façon décrite dans l'exemple 3 à cette différence près qu'on réalise la fernientation sans aération, dans des conditions anaérobiques. Après avoir laissé fermenter pendant 52 heures, on distille le bouillon de culture. On obtient à partir de 100 kg de paille, 12 - 13 litres d'alcool, rapportés à de l'alcool absolu. Exemple 5 On opère de la façon décrite dans l'exemple 1 mais on utilise en tant que matière première à la place du kénaf, du papier Journal. On traite celui-ci tout d'abord avec de la lessive de soude à 3,6 %, à 98 C, pendant 68 minutes. La fermentation dure 54 heures. On obtient à partir de 100 lg de papier Journal, 13,2- - 14,0 kg de levure d'alimentation sèche. Exemple 6 On opère de la façon décrite dans l'exemple 5 à cette différence près que l'on réalise la fermentation sans aération, dans des conditions anaérobiques. Après avoir laissé fermenter pendant 60 heures, il est possible d'obtenir à partir de 100 kg de papier Journal, de l'alcool dans une quantité de 13,6 - 14,0 litres (abs.). Exemple 7 On opère de la façon décrite dans exemple 1 à cette différence près qu'on utilise en tant que matière première un mélange constitué par 75 parties de canne à sucre - résidus de récolte et par 25 parties de bagas. On traite au préalable à 96"C pendant 150 minutes avec de acide sulfurique à 2,8%. La fermentation dure 40 - 44 heures. On prépare à partir de 100 kg du mélange mentionné, 18 - 19 kg de levure d'alimentation sèche. Exemple 8 On opère de la façon décrite dans l'exemple 7 à cette différence près qu'on entreprend la fermentation dans des conditions anaérobiques, sans aération. La fermentation dure 50 - 56 heures. I1 est possible de préparer à partir de 100kg de matière premier, 22,0 - 23,6 lites d'alcool absolu. Exemple 9 On opère de la façon décrite dans l'exemple 1 mais on aère la culture avec un excès d'oxygènede 0,2 mg d'O2/l. Dans ce cas on obtient à partir de 100 ig de kénaf, 9 - lOkg de levure d'alimentation sèche et 8 - 10 litres d'alcool éthylique absolu. RE5JENDICATIONS 1. Procédé pour préparer de la levure alimentaire et/ ou de l'alcool éthylique à partir de résidus végétaux, agricoles et/ou industriels, caractérisé en ce qu'on traite au préalable le résidu avec un acide minéral dilué et/ou de la lessive alcaline diluée et ensuite en ce qu'on le fait fermenter d'une façon connue en soi, dans des conditions adrobiques ou anaérobiques avec la souche Candida utilis var. cellulolytica déposée le 23 Septembre 1980 sous le n CU 28 00199 au Musée NationalHongrois des colleetions de souches (01). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise en tant que matière première des plantes utiles agricoles et/ou des plantes sauvages, ou bien leurs résidus. 3 Procédé selon la revendication 1, caractSrlsé en ce qu'on utilise en tant que matière première un résidu industriel qui contient de la cellulose. 4. Procédé selon l'une des revcndicationslà3, caractérisé en ce qu'ontL'aire au préalable les plantes, le résidu agricole et le résidu industriel qui contient de la cellulose, avec un acide minéral à 0,5 - 10 %, de préférence 0,5 - 4,0% et/ou avec de la lessive alcaline à 0,5 , 10 %, de préférence 0,5 - 4,0 . 5. Procédé selon l'une des revendlcatlons 1 à 4, caractérisé en ce qu'on effectue le traitement préalable à 80 1000C, de préférence à 90 - 980C. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on traite au préalable pendant 0,5 - 5 heures, de préférence 0,5 - 7 heures. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on effectue la fermentation à 33-390C, de préférence à 35-370C. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce quon effectue la fermentation de façon continue ou bien discontinue. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, dans le cas d'une fermentation discontinue, la durée de la fermentation s'élève, selon la matière première, à 16-72 heures, de préférence 16-50 heures. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que pour préparer la levure alimentataire, la teneur du bouillon de fermentation en oxygène libre s'élève à 1,0 - 4,0 mg 02/1, de préférence à 1,5 - 2,5 mg d'O2/1, pendant la fermentation. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on effectue la fermentation dans des conditions anaérobiques pour préparer de l'alcoo' éthylique, 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que pour préparer en même temps de la levure alimentaire et de l'alcool éthylique, le bouillon de fermentation est aéré de façon à ce que sa teneur en oxygène libre s'élèvre à 0,1 mg d'O2/1.