Brevet FR2491922A1 — publié le 19820416

La présente invention concerne de nouveaux hexapeptides, un procédé pour leur préparation et leur application comme médicaments. La présente invention a pour objet les produits de for- mule générale (I) Cys - X - Y - Dlys - Z (I), dans laquelle X représente la séquence Ala - Ala ou la séquence Glu - His, Y représente Cys ou Phe et Z représente Phe lorsque Y repré- sente Cys ou Cys lorsque Y représente Phe, les deux radicaux Cys présents dans la molécule étant reliés par un pont di- sulfure, ainsi que les dérivés fonctionnels desdits produits de formule (I). La nomenclature utilisée dans la présente demande est la nomenclature IUPAC, dont les règles sont publiées notamment dans Biochem. J. (1972) 12, 773-780. Conformément aux règles de cette nomenclature, les pepti- des désignés seulement par une abréviation à 3 lettres sont sous la forme L, existant naturellement. Lorsque ces peptides se présentent sous la forme D, la configuration (D) est préci- sée avant l'abréviation à 3 lettres. Les symboles suivants ont donc été utilisés pour désigner les acides "amino carboxyliques: Cys: cystéine Ala alanine Glu: acide glutamique His: histidine Phe: phenylalanine Le terme "dérivés fonctionnels" de peptides de formule (I) peut désigner: - des sels de bases,de préférence une base dérivée d'un métal alcalin, telle que par exemple l'hydroxyde de sodium, le car- bonate de sodium, ou le carbonate acide de sodium, - des esters d'alcoyle dont le radical alcoylecomporte de pré- férence de 1 à 5 atomes de carbone, comme les radicaux méthyl, éthyl, propyl par exemple, - des amides primaires ou des amides alkyl-substitués dans les- quelles le (s) groupe (s) alkyl renferme (n.) 1 à 5 atomes de carbone. Parmi les produits,objet de l'invention, on cite les pro- duits tels que définis par la formule (I) ci-dessus dans la- 4Oquelle X représente la séquence Ala-Ala, ainsi que les dérivés ( fonctionnels desdits produits de formule (I), dans laquelle X représente la séquence Glu-His, ainsi que les dérivés fonc- tionnels desdits produits de formule (I). Parmi ces produits, on retient plus particulièrement: - le disulfure cyclique (1 7 6) de N-(cysteinylalanylalanyl phenylalanyl-D-lysyl) cystéine et son acétate, - le disulfure cyclique (1 - 4) de N(cysteinylalanylalanyl cysteinyl-D-lysyl) phénylalanine et son acétate, - le disulfure cyclique (1 - 4) de N (cysteinylglutamyl his- tidylcysteinyl-D-lysyl) phénylalanine. L'invention a également pour objet les complexes métal- liques des peptides de formule (I) ou de leurs dérivés fonc- tionnels ci-dessus. Les complexes métalliques peuvent être préparés de façon connue et classique, en mettant les pepti- des au contact de sels métalliques (tels que par exemple les phosphates métalliques), d'hydroxydes métalliques ou d'oxydes métalliques. Les métaux utilisables sont par exemple le cobalt, le nickel, le cuivre, le fer et de préférence le zinc. On peut préparer, par exemple, un complexe métallique en mélangeant le peptide et un sel, hydroxyde ou oxyde métalli- que en milieu aqueux. Selon l'invention, les produits de formule (I) ci-dessus et leurs dérivés fonctionnels peuvent être préparés par un procédé, caractérisé en ce que l'on réalise des réactions de condensation d'acides U-amino carboxyliques successives dans l'ordre convenable, les acides a-amino carboxyliques étant protégés par des groupes de blocage qui sont ensuite éliminés, et que l'on transforme, si désiré, le produit de formule (I) obtenu en un dérivé fonctionnel Pour maîtriser de telles réactions, il est nécessaire de bloquer le groupe amino de l'un des acides et le groupe carboxy- lique de l'autre, et les groupes de blocage doivent pouvoir être facilement éliminés par la suite. De nombreuses méthodes ont été mises au point pour la synthèse des peptides. Une des méthodes pouvant être utilisée est la technique de MERRIFIELD décrite dans JOURNAL OF AMERICAN. CHEMICAL SOCIETY 85, pages 2149-2154,(1963) Selon cette technique, on commence par lier un amino-acide à une particule de résine solide, par exemple par une liaison ester, et le peptide est produit en plusieurs étapes par fixa- tion successives d'amino-acides protégés à la chaîne en déve- loppement. Les réactifs et les sous produits sont éliminés par filtration. Lorsque la séquence souhaitée a été assemblée, le pepti- de est enlevé du support solide. Selon l'invention, les produits de formule (I) ci-dessus et les dérivés fonctionnels desdits produits peuvent être préparés selon un procédé de condensations successives d'ami- no-acides, dans lequel on utilise un support en phase solide. Les amino-acides peuvent être attachés à tout polymère adapté qui doit simplement pouvoir facilement être séparé des réactifs n'ayant pas réagi. Il doit contenir un groupement fonctionnel auquel le premier amino-acide protégé peut être lié, par une liaison covalente. Divers polymères conviennent pour cela, comme la cellulose, l'alcool polyvinylique, le polyméthacrylatq,le polystyrène sulfoné par exemple. Lors de la préparation des produits donnés en exemple ci-après, on a utilisé une résine chlorométhylée de styrène et de divinyl- benzène. D'une manière générale, tous les groupes fonctionnels constitutifs peuvent être protégés d'une manière dont le prin- cipe est connu. Les groupes amino en position alpha peuvent être protégés par exemple par les groupes t-butyloxycarbonyle, carbobenzoxy, adamantyloxycarbonyl ou isobornéyloxycarbonyle. On utilise essentiellement le groupe tbutyloxycarbonyle. Les amino-acides trifonctionnels peuvent être également protégés sur la fonction latérale. Pour la synthèse des différents produits objet de l'invention, on utilise Cys, Ala, Glu, His, Dlys. Le groupe SH de la cystéine peut être protégé par exemple par un groupe 4-méthoxybenzyl. Le groupe imidazole de l'histidine peut être protégé par exemple par un groupe 2,4-diuitrophényl. Le groupe gamma carboxyl de l'acide glutamique peut être protégé par un radical benzyloxy. Le groupe E NH2 de la D-lysine peut être protégé par un radical 2,4-dichlorobenzyloxycarbonyl. Dans les exemples de synthèse donnés ci-après, le premier amino-acide est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son sel de césium (cf B.F. GISIN, Helv. Chem. Acta vol 56, fasc 5, p 1476 (1973). Les amino-acides ont été couplés par la méthode au dicyclo- hexylcarbodiimide. Les déblocages du radical butyloxycarbonyl ont été effectués par l'acide trifluoroacétique en solution à 50% dans le chlorure de méthylène. En fin de synthèse, on a éliminé le groupe de blocage 2-4, dinitrophényl de l'imidazol de l'histidine par le merca- ptoéthanol. Le peptide obtenu a été séparé de la résine par l'acide fluorohydrique, ce qui a éliminé tous les autres blo- cages des fonctions latérales. La transformation des produits de formule (I) en dérivés fonctionnels peut comprendre la formation des: - sels formés par réaction du produit de formule (I) avec une base telle que l'hydroxyde de sodium, le carbonate acide de sodium, l'hydroxyde de potassium, - esters, formés par réaction du produit de formule (I) avec un alcool tel que par exemple le méthanol, l'éthanol, le pro- panol, l'isopropanol, le butanol, -amides, ou amides alkyl substituées dans lesquelles le (s) groupe (s) alkyl renferme (nt) I à 5 atomes de carbone selon des méthodes connues (cf. par exemple HOUBEN-WEYL, Methoden der organischen Chemie, 4e edition, vol. XVI, 1 pages315 et suivantes). Les tesb à l'acide picrique donnant les titres d'amines libres ont été effectués d'après B.F. GISIN - Anal Chim. Acta 58, 248 (1972). Les analyses des amino-acides des peptides synthétisés ont été effectuées à l'aide d'un analyseur d'amino-acides BECKMAN. Les produits de formule (I) ci-dessus, et les dérivés fonctionnels desdits produits de formule (I) possèdent d'intéressantes propriétés pharmacologiques: notamment, ils retardent l'extinction de la réponse d'évitement conditionné, ils retardent la disparition de la réponse apprise. Ils favo- risent l'attention, la vigilance, la mémorisation. Ces propriétés Justifient leur application en thérapeu- tique, et l'invention a également pour objet, à titre de mé- dicaments, les produits tels que définis par la formule (I) ci-dessus, ainsi que les dérivés fonctionnels pharmaceutique- ment acceptables desdits produits de formule (I). L'invention a ainsi pour objet des médicaments, tels que définis cidessus, caractérisés en ce que dans la formule (I) X représente la séquence Ala-Ala, ainsi que les dérivés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables desdits produits de formule (I), caractérisés en ce que dans la formule (I), X représente la séquence Glu - His, ainsi que les dérivés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables desdits produits de formule (I). L'invention a tout particulièrement pour objet, à titre de médicaments: le disulfure cyclique (1 - 6) de N-(cysteinylalanylalanyl phénylalanyl-Dlysyl) cystéine et son acétate, - le disulfure cyclique (1 i 4) de N (cysteinylalanylalanyl cysteinyl-D-lysyl) phénylalanine et son acétate, - le disulfure cyclique (1 4 4) de N-(cysteinylglutamylhisti- dylcystelnyl-D-lysyl) phénylalanine. La présente demande a également pour objet, à titre de médicaments, les complexes métalliques pharmaceutiquement acceptables, des peptides de formule (I) ou de leurs dérivés fonctionnels tels que définis ci-dessus. Les produits de l'invention peuvent Otre utilisés par exemple dans le traitement des asthénies intellectuelles ou nerveuses, les défaillances de la mémoire, les troubles vas- culaires cérébraux majeurs ou mineurs, la sénéscence, le surmenage intellectuel. Les produits de l'invention peuvent être administrés de préférence par vois intranasale, orale, parentérale, sublin- guale ou rectale. La dose usuelle est variable selon l'affection en cause, le produit utilisé, le sujet traité et la voie d'administration. La dose quotidienne peut être par exemple par la voie parenté- rale de 0,01 lg à 500 g par kilo de poids corporel, pour les voies orale, intranasale et sublinguale de 0,1 mg à 500 mg par kilo de poids corporel. L'invention s'étend aux compositions pharmaceutiques ren- fermant à titre de principe actif, l'un au moins des médica- ments précités. Ces compositions sont réalisées de façon à pouvoir être administrées par voies digestive, parentérale ou intranasale. Pour cela, on transforme les peptides en une forme convenant à l'administration par la voe choisie. De préférence, on les dissout, les met en suspension ou les émulsifie dans un liquide approprié. On peut également présenter ces peptides sous une forme convenant à l'administration orale, rectale, intranasale, parentérale ou sublinguale, en les mélangeant avec des exci- pients classiques. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple, les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les suppositoires, les préparations injectables; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le/ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lac- tose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. On obtient des préparations particulièrement intéressantes en mettant les peptides de l'invention sous une forme o ils ont une activité prolongée, par exemple en les transformant en complexes métalliques, selon ce qui est indiqué plus haut. Les exemples donnés ci-après illustrent l'utilisation de la technique en phase solide de MERRIFIELD, mais, comme il a été indiqué plus haut, d'autres techniques classiques de préparation des Deptides peuvent être utilisafs pour la pré- paration des produits objet de l'invention. Les produits de l'invention peuvent par exemple être pré- parés en couplant des amino-acides isolés ou des peptides, convenablement protégés, à des amino-acides isolés ou à des peptides, également convenablement protégés, au moyen de substances activatrices de la fonction acide carboxylique, comme décrit dans Houben-Weyl: Methoden der organischen Chemie 15/2, Synthesen von Peptiden p. 2-364, (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, par exemple au moyen de dicyclo- hexylcarbodiimide, de N-éthyl-N'-(diméthylaminopropyl)-car- bodiimide, d'o-nitrophénol, de p-nitrophénol ou de pentachlo- rophénol, avec ou sans addition de substances catalytiques. Dans les exemples donnés ci-après les abréviations sui- vantes ont été employées: Boc = t-butyloxycarbonyle 4 MeO Bn = méthoxybenzyl 2,4-DNP 2,4 dinitrophényl OBn = benzyloxy EMF = diméthylformamide DCC = dicyclohexylcarbodiimide HPLC chromatographie liquide préparative à haute performance. Les exemples donnés ci-après illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Exemple 1: Acétate de disulfure cyclique (1 - 6) de N-/cystei- nylalanylalanyl phénylalanyl-D-lysyl/ cystéine. Pe2ptide de formule: Cys -A la - Ala - Phe - Dlys -Cys Boc - (S-4-MeOBn) Cys - R (R = résine) La fixation du premier amino-acide sur la résine est réalisée sur 10 g de résine de polystyrène à 1 % de divinyl- benzène chlorométhylée (capacité de la résine: 0,87 meq par gramme de résine), dans 200 cm3 de DMF, à l'aide de 4,73 g de sel de césium -de la Boc S (4-MeOBn) L cystéine (ledit sel de césium a été préparé en mélangeant de la Boc S (4 - MOB) L-cystéine, de l'éthanol, de l'eau, et du carbonate de césium à pH = 7 en agitant à température ambiante pendant une heure. On agite 18 heures à 60 C puis on essore la résine et lave avec trois fois 200 cm3 de DMF, deux fois 200 cm3 de méthanol, trois fois 200 cm3 de chlorure de méthylène, puis sèche la résine sous vide et obtient 13 g de résine titrant 0,4 meq de L cystéine bloquée par gramme de-résine finale. Les 13 g de la résine obtenue ci-dessus sont traités successivement par deux fois 150 cm3 d'acide trifluoroacétique à 50% dans le chlorure de méthylène pendant 10 minutes, deux fois 150 cm3 de chlorure de méthylène, une fois 150 cm3 d'iso- propanol, deux fois 150 cm3 de chlorure de méthylène, deux fois 150 cm3 de triéthyl amine à 12% de chlorure de méthylène pendant 10 minutes, deux fois 150 cm3 de chlorure de méthylène, une fois 150 cm3 d'isopropanol, une fois 150 cm3 de méthanol, et six fois 150:m3 de chlorure de méthylène. Na-Boc-N_ i24 dichloro benzloxxcarbonyl2_ D lsine -Cys-R Sur Cys-R obtenu précédemment on ajoute 15,8 moles de Na -Boc-NO (2,4-dichloro benzyloxycarbonyl) D Lysine dissoutes dans 150 cm3 de chlorure de méthylène, puis 18 cm3 de DCC dans le chlorure de méthylène. Le couplage étant complet après minutes (test à la ninhydrine négatif). On lave alors par 2 fois 150 cm3 de chlorure de méthylène, 1 fois 150 cm3 de méthanol, 1 fois 150 cm3 d'isopropanol et 5 fois 150 cm3 de chlorure de méthylène. Ly --y On débloque la D Lys en opérant comme pour le déblocage de Cys ci-dessus. CouElages suivants On réalise ensuite les couplages, lavagedéblocages, comme pour les couplage, lavages déblocage du deuxième amino-acide cidessus D-Lys, dans l'ordre suivant, avec les amino-acides protégés suivants: - - Boc L phénylalanine - Boc L Alanine - Boc L Alanine - Boc S (4-méthoxybenzyl) L Cystéine. Après déblocage du dernier amino-acide, le cystéine, on obtient 16,8 g de résine finale. Séparation du reptide de la résine. Dans un réacteur à acide fluorhydrique, on place les 16,8 g de résine obtenue précédemment, 18 cm3 d'anisole, condense 80 cm3 d'acide fluorhydrique, agite une heure à 0 C, évapore sous vide, lave la résine avec 3 fois 200 cm3 d'ace- tate d'éthyle, extrait alors le peptide: Cys - Ala - Ala - Phe - D Lys Cys de cette résine avec successivement 4 fois 20 cm3 d'acide acétique, 4 fois 20 cm3 d'eau, 4 fois 20 cm3 d'acide acétique à 50% d'eau, réunit les extraits, lyophilise et obtient 3,9 g d'acétate de Cys - Ala- Ala - Phe - D Lys - Cys. On dissout immédiatement le produit dans 100 cm3 d'eau, filtre, recueille le filtrat qui est immédiatement utilisé pour l'étape suivante. Cyclisation du peptide Dans 500 cm3 d'eau contenant 4 g de ferricyanure de potassium, on ajoute goutte à goutte en une heure trente minu- tes la solution de peptide obtenue précédemment en maintenant le pH à 7,5 avec de l'ammoniaque 1 M. On passe ensuite la solution jaune obtenue sur 500 g de résine DOWEX (Cl-), lave la résine par 2 fois 300 cm3 d'eau bidistillée, lyophilise la solution incolore obtenue et obtient 6,6 g de Cys - Ala - Ala - Phe - D Lys - Cysibrut. Purification On purifie le produit brut par chromatographie liquide préparative à haute performance (HPLC) sur cartouche de silice portant des chaînons hydrocarbonés en C18, en éluant successi- vement: 1/ avec 10 litres d'un mélange méthanol, eau bidistillée (15/85) contenant 3 g d'acétate d'ammonium par litre. 2/ avec 2,5 litre d'un mélange méthanol - eau bidistillée /80 contenant 3 g d'acétate d'ammonium par litre. On lyophilise le dernier éluant pour obtenir: Cys - Ala - Ala - Phe - D Lys - Cys,' reprend plusieurs fois avec de l'eau bidistillée, lyophilise jusqu'à poids constant, et obtient ainsi 1,91 g du peptide attendu purifié. - Analvse Amino-Acides en théorie: Cys: Ala: Phe: Lys = 2: 2: 1: 1 On obtient en fait = 2.02: 2,12: 1,02: 1 - /a/D (eau) = -50 - ichroisi Circulaire (eau) max 220 nm DE = + 5,8 max 270 nm DE = - 0,25 Exemple 2: Acétate de disulfure cyclique (1 4 4) de N-/cys- teinylalanylalanylcystéinyl-D-lysyl/ phénylalanine. 1Czs - Ala - Ala - Cs_ - Dlys - Phe CH fOOH Boc - Phe - R (R = Résine) La fixation du premier amino acide sur la résine est réa- lisée sur 7,5 g de résine de polystyrène à 1% de divinylben- zène identique à celle utilisée lors de la préparation du pro- duit de l'exemple 1, à l'aide de 4,46 g de sel de césium: Boc - Phe - OCs, en agitant dans 95 cm3 de DMF à 55C pendant une nuit. Phe - R Le groupement protecteur Boc est éliminé par action pen- dant 10 minutes d'acide trifluoroacétique en solution dans % de chlorure de méthylène. La teneur en Phe de la résine, évaluée par le test à l'acide picrique est de 0,76 meq par gramme de résine. La résine est ensuite lavée avec successive- mernt du DMF, du chlorure de méthylène, de l'lsopropanol, en finissant par du chlorure de méthylène. Boc - D LXs - Phe - R On réalise le couplage suivant de 4,49 g de N - Boc - Ne (2,4-dichlorobenzyloxy-carbonyl) - D Lys -, à,l'aide de 13 cm3 d'une solution molaire de DCC dans le chlorure de méthylène. La réaction de coupage est complète au bout d'une heure (le test à la ninhydrine étant alors négatif), on réalise des lavages successifs par 150 cm3 de chlorure de méthylène, 150 cm3 de méthanol, 150 cm3 d'isopropanol et 5 fois 150 cm3 de chlorure de méthylène. On élimine le groupement Boc par action pendant 10 mi- nutes de l'acide trifluoroacétique en solution dans 50% de chlorure de méthylène, puis lave à nouveau par DMF, chlorure de méthylène, méthanol. Boc2_S- 4 MeO Bn- Cys - Dlys - Phe -R On réalise ensuite le couplage suivant, en fixant 3,41 g de Boc-(S-4 MeOBn) -Cys dans 13 cm3 d'une solution molaire de DCC dans le chlorure de méthylène. Après une heure le test à la ninhydrine est négatif. On laisse ainsi sous agitation pendant 20 heures. On réalise les lavages, élimination de Boc et lavages comme après les deux couplages précédents. Couplages suivants: On réalise ensuite les couplages, lavages, déblocages, lavages, comme pour les étapes précédentes, en utilisant dans l'ordre, les amino-acides protégés suivants: - Boc Ala (deux fois) - Boc - (S-4-MeO Bn) - Cys, et obtient 14,5 g de résine, por- tant l'hexapeptide formé. jX:- Ala - Ala - CXsZ_- DlysZ - Phe - R Séparation du peptide de la résine (avec déprotection des chaînes latérales). Les 14,5 g de résine obtenue ci-dessus sont hydrolysés par l'acide fluorhydrique dans un réacteur à acide fluorhy- drique. On place dans le réacteur 14,5 g de résine peptide, 14,5 cm3 d'anisole, complete à 100 cm3 d'acide fluorhydrique condensé à environ 800C sous pression réduite, agite 45 minutes à 0OC, évapore 90 minutes sous pression réduite, L alduaxal ap %Tnpoid np uoTeaedaid el anod aesTT. n -alTTao O e anbT4uapT aal qelgoaolqo auazuaqlXuTATp ap %l e auaoiI Alod ap aulsea eunp 2 5 apTpos %toddns amwoo asTIln uo (eUçS3eI = T) U '-iS, eçd - SXTU -,SX0 - 8TH - nto- SX)1 *aUTUetBt&u94ct ILO l - a t UFT-+WxTAPP.9T4tÀ gç -eInlT TAuTalsAo/-N ap (l ( I) *anbTToo anjlnsTQ: ú aldwaxa '0+ = 3a mu g8Z xem 0'9- = saQ mu 6?ZZ xe L'1+ = 3a wu IIZ xem (nea) aJTelnoaTD amsTOqODTa - O0 (aaalTTj UoTInlos ans nea '(%5'0 = o) 91 + - /a/ - : 80'1: 90'Z: 96'1: 4Te$ ua %uaTqo uo L: L:: z = aeq: s&A:eIy: s D : laTOgq. ua : sapToe-ouwmep esXteuy z *npuale nd I.TnpoJd ap 2 59 '0 euaTqo uo (LL: Z) nea/loueqlgm a2uel9w un - ( (L: zz) nea/loueqgm auelT9m un - ( (6L: Z) nea/loueqwam auelTm un - (Z (5: 5z) nea/loueqgm aguelTm un - (L OZ a;Tt jed wnTuommep aeeoe,p 2 ú sno; %ueuauoo nea/Toueqam sae2uelgm sap aed uama Tesseaoons:Tnpoad al %ueuauoo suoToeaj sal uenlT ua tLD - aOTTTS ap aqono4aeo aun,p Tunm SgI'VA 0054doad Taiedde un ans D1dH jed 9T;Tand %s %n.q %Tnpod ae 5L UoITOST.cJJI aqd - SATl -Isck - eTV - eTv - sÀD @p aeoe4aop 2 9 %uaT.qo %a asTtTqdo l 'nea,l @p aed puaadai aTnppa uoTssaid snos DogZ e oas e euame 'ailFTj '(_TD) XUMOQ auçsgi el ap oaeAS uoTnlos el aFT2e 'anbTIo9e apToe,l Ol ap jed ç e Hd al aeTnsua auqme uo ' anbeTuowue,l ap jed L %a 5'9 aa4ua Hd al %ueua;uTew ua wnTsseod ap ainueAoTiae; ap w Zo'o UoTnlos aun,p mo 057 suep %elIT al asJaA aI;Tj 'neeap mo 05 suep nuaqo apT.dad ael aT2e uo u-o;T4eiijlUX5 ç aqd - sXla - s D - elv - elv - sAD ap aeqpoep 2 z'i7 uaT4qo %a '4el-TT; al asTITqdoXl 'aalT; 'anbT%,oe apTOe,l B a aolITTsTP nea,l g %uamaAT. eumaele!ueAej ua apT4dad al aJTeaxa,p 4ueAe alxqa9,P aepeoe8t I auTs9j el aAeT Z6L6tZ - 1- 2491922 La condensation du premier amino-acide Phe est réalisée à l'aide de 2,978 g de Boc - Phe - OCs dissous dans 50 cm3 de DMF. On chauffe à 50'C SOUS agitation pendant 20 heures. Le déblocage de Phe est réalisé comme à l'exemple 1. CouElaaes suivants On réalise ensuite les couplages successifs, comme lors de la préparation du produit de l'exemple 1, en utilisant successivement les amino-acides protégés suivants: - Na - Boc - Ne (2,4dichloro-benzyloxycarbonyl) D - Lys (on opère comme à l'exemple 1) - Boc (S - 4 MeO Bn) Cys (on opère comme à l'exemple 1) - a Boc - (2,4 DNP) His (le groupement a Boc est éliminé par action de l'acide trifluoracétique à 50% dans le chlorure de méthylène et le groupement 2,4-dinitrophényl est éliminé en fin de synthèse par le 2-mercaptoéthanol comme indiqué ci- dessous: - a Boc - Glu (0 Bn) - Boc -(S 4 MeO Bn) Cys On obtient ainsi 10 g de Cys - Glu - (2,4 DNP) His - Cys - Dlys - Phe - R Déblocage de 2_4 DNP de His On mélange la totalité de la résine obtenue ci-dessus, cm3 de DMF, 100 cm3 de 2-mercaptoéthanol, ajuste à pH = 8 avec de la triéthylamine, laisse sous agitation à température ambiante pendant 18 heures, essore la résine, lave au DMF, acétate d'éthyle, chlorure de méthylène, méthanol, et chlorure de méthylène, sèche sous pression réduite et obtient 9,75 g de l'hexapeptide attendu lié à la résine. Séparation du eRptide de la résine On mélange 4,875 g du produit obtenu ci-dessus, 5 cm3 d'anisole, 50 cm3 d'acide fluorhydrique redistillé, sous agi- tation, à 0OC / + 50C pendant 5/4 d'heure, élimine l'acide fluorhydrique et l'anisole sous pression réduite, lave la résine à l'acétate d'éthyle, puis récupère le produit en la- vant à l'acide acétique pur puis à l'eau, filtre, lyophilise le filtrat, et obtient 2,143 g d'acétate de: Cys - Glu - His - Cys - Dlys - Phe Cyclisation On opère comme à l'étape de cyclisation décrite ci-dessus à l'exemple 2, et obtient 1,704 g de produit attendu brut. If Purification On purifie le produit brut sur carboxyméthylcellulose. On dissout le produit brut dans une solution d'acétate d'ammonium 0,025 M à pH = 4 et fait passer cette solution sur la colonne en éluant avec une solution d'acétate d'ammo- nium 0,025 M à pH 4 puis une solution d'acétate d'ammonium 0,05 M à pH = 4. Après lyophilisation on obtient: 422 mg de peptide attendu - Analyse d' amJno-acides: en théorie Cys: Glu: His: Dlys: Phe = 2:1:1:1:1 On obtient en fait: 1,6: 1: 1,02: 1,12: 1,12 - /l/D (c = 0,5%, H20) = +11 0+2 Dichroisme circulaire (eau) max - 222 nm De " - 2,8 max 260 nm DE - 0,2 ETUDE PHARMACOLOGIQUE Action sur l'extinction d'un apprentissage d'évitement actif à renforcement négatif. Le protocole et l'appareil utilisés ont été décrits par DE WIED (Proc. Soc. exp. Biol. Med. 1966, 122, 28). L'apprentissage est effectué dans une boite équipée d'une lampe de 60 W (stimulus conditionnel: SC), d'un mât et d'un plancher électrifiable relié à un stimulateur élec- trique qui permet de délivrer un choc douloureux de 75 volts (stimulus inconditionnel: SIC). Le stimulus conditionnel (SC) est présenté seul pendant secondes, puis est associé au stimulus inconditionnel (SIC) jusqu'à ce que l'animal s'agrippe au mat réalisant ainsi la réponse d'évitement recherchée. La réponse conditionnée (RC) est acquise lorsque l'animal répond au stimulus conditionnel. Dix essais à 60 secondes d'intervalle sont effectués quotidiennement pendant 3 jours. L'examen de l'extinction de l'apprentissage réalisé avec suppression du stimulus incondi- * tionnel (SIC) est suivi le 4 ème Jour au cours de trois essais à 2 heures d'intervalle sur les animaux présentant au moins 7 réponses conditionnées (RC). 1"L 249 1922 Le composé est injecté par voie sous cutanée sous forme de complexe phosphate - zinc aussitôt après le premier essai d'extinction de l'apprentissage à des lots de 5 rats. Les résultats sont comparés à ceux obtenus chez un lot d'animaux témoins. L'évolution des réponses conditionnées au cours de la période d'extinction de l'apprentissage 2 et 4 heures après l'injection du composé est exprimée en pourcentage de varia- tion par rapport au nombre de réponses conditionnées, observé au cours du premier essai d'extinction, avant traitement On a obtenu les résultats suivants Produit Dose % de réponses conditionnées (RC) au administré p.g/Rat cours de la période d'extinction de l'apprentissage. Neant 60 30 Produit de l'exemple 1 1 51 49 76 71 Produit de I'empie 2 1 59 35 71 75 Produit de l'exemple 3 1 75 29 70 50 Conclusion On voit que par rapport aux résultats observés chez les animaux témoins, les produits de l'invention retardent l'ex- tinction de l'apprentissage qui apparait au cours du temps en l'absence de renforcement (le renforcement, qui est un ren- forcement négatif, étant constitué par le stimulus incondition- nel SIC). après 2 heures et 4 heures REVENDICATIONS 1) - Les produits de formule générale (I) Cys - X - Y - Dlys - Z (I) dans laquelle X représente la séquence Ala - Ala ou la séquence Glu - His, Y représente Cys ou the et Z représente Phe lorsque Y représente Cys ou Cys lorsque Y représente Phe, les deux radicaux Cys présents dans la molécule étant reliés par un pont disulfure, ainsi que les dérivés fonctionnels desdits produits de formule (I). 2) - Les produits tels que définis par la formule (I) de la revendication 1, dans laquelle X représente la séquence Ala- Ala, ainsi que les dérivos fonctionnels desdits produits de formule (I). 3) - Les produits tels que définis par la formule (I) de la revendication 1, dans laquelle X représente la séquence Glu - His, ainsi que les dérivés fonctionnels desdits produits de formule (I). 4) - Le disulfure cyclique (1 4 6) de N-(cysteinylalanylala- nyl phénylalanyl-D-lysyl) cystéine et son acétate. ) - Le disulfure cyclique (1 4 4) de N-(cysteinylalanylalanyl cysteinyl-D-lysyl) phénylalanine et son acétate. 6) - Le disulfure cyclique (1 4 4) de N-(cysteinylglutamyl histidylcysteinyl-D-lysyl) phénylalanine. 7) - Complexes métalliques des peptides de formule (I) ou de leurs dérivés fonctionnels tels que définis à la reven- dication 1. 8) - Procédé de préparation d'un produit selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on réalise des réactions de condensation d'acides a-amino carboxy liques successives dans l'ordre convenable, les acides a- amino carboxyliques étant protégés par des groupes de blocage qui sont ensuite éliminés, et que l'on transforme, si désiré, le produit de formule (I) obtenu en un dérivé fonctionnel. 9) - Procédé de préparation selon la revendication 8>caracté- risé en ce que l'on utilise un support en phase solide. ) - A titre de médicaments, les produits tels que définis par la formule (I) de la revendivation 1 ainsi que ies déri- vés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables desdits pro- duits de formule (I). 11) - Médicament selon la revendication 10, caractérisé en ce que dans la formule (I), X a la valeur indiquée à la revendication 2, ainsi que les dérivés fonctionnels pharma- ceutiquement acceptables desdits produits de formule (I). 12) - Médicament selon la revendication 10, caractérisé en ce que dans la formule (I), X a la valeur indiquée à la re - vendication 3, ainsi que les dérivés fonctionnels pharmaceu- tiquement acceptables desdits produits de formule (I). 13) - A titre de médicament, l'un quelconque des produits définis aux revendications 4, 5 ou 6. 14) - A titre de médicament, les complexes métalliques pharma- ceutiquement acceptables définis à la revendication 7. ) - Compositions pharmaceutiques renfermant à titre de prin- cipe actif, l'un au moins des médicaments tels que définis à l'une quelconque des revendications 10 à 14.