Brevet FR2488618A1 — publié le 19820219

L'invention concerne une nouvelle oxydase de nucléoside et son procédé de production, ainsi qu'un pro- cédé de production d'acide nucléoside-5-carboxylique, fon- dés sur la spécificité de substrat et l'action enzymati- que de l'oxydase de nucléoside; elle concerne également une nouvelle méthode d'essai de nucléoside, qui utilise l'oxydase de nucléoside, ainsi qu'un système de composi- tions pour l'essai sur un nucléoside contenu dans un échan- tillon. L'invention est fondée sur la découverte qu'une souche de microorganisme B-0781, appartenant au genre Pseu- domonas, isolée dans un échantillon du sol d'un lit d'oi- gnons (à Ono-shi, Hyogoken, Japon), produit dans ses cellu- les bactériennes une nouvelle enzyme (oxydase de nucléoside) présentant les propriétés biochimiques suivantes: Spécifi- cité du substrat: action spécifique au moins sur les subs- trats de nucléosides, ou leurs dérivés, de formules (I) (Ib) et (Ic) Base EOH2O O Base Bise H H g z / L [] > \ | t Ib d o | Ic OH 0:.H o "Base" représente le résidu d'une base nucléique, ou ses dérivés; Action enzymatique: activité catalytique au moins sur les réactions enzymatiques suivantes de formules (II), (III), (IV), (V), (VI), et/ou (VII): pour le substrat (I): H ZoVA+ - $ -4OeH +oD+ 0 00tH HO esea es] [qi] HHO H HO H' H (^-D Z-H + o + esot10)H O? -: (qI) %Laqsqns ei anodI HO HO HO HO H (3 1ZH o+ 0o2 + + est 01 es. [I] BD H0O H HO 5 HH ) ZOZH + I OO ^^H0 es-es esot:n 8L988Z M' pour le substrat (Ic) Base Base HOH20 1/ \C EY0 + H20c2 OH H OH H [Ici Base Base OHCO | HOOC O -H 0 + c2 + 20 1 $H+10 H H OH H OH E La nouvelle enzyme catalyse une réaction d'oxyda- tion sur le résidu sucre du nucléoside comme substrat, avec consommation d'oxygène et formation d'eau oxygénée, ladi- te enzyme étant désignée sous le nom d'oxydase de nucléosi- de. La spécificité du substrat, l'action enzymatique et la méthode d'essai sont décrites ci-après. (1) Spécificité du substrat: On mesure les acti- vités enzymatiques relatives à divers substrats (nucléosi- des, bases nucléiques, sucres et nucléotides, chacun à une concentration de 1 mM), les résultats étant donnés au Ta- bleau I. On voit que l'enzyme de la présente invention réa- git sur un résidu de sucre, et non sur un nucléoside compor- tant la ribose, la déoxyribose et l'arabinose comme résidu de sucre et la réaction n'est pas limitée à une nature par- ticulière du résidu de base nucléique du nucléoside. On n'observe aucune réaction sur les nucléotides. En conséquence l'enzyme de l'invention présente au moins une spécificité de substrat vis à vis des nucléo- sides, ou leurs dérivés, de formules (I), (Ib) ou (Ic). Tableau I Substrat Activité relative (%) adénosine 100 guanosine 97,1 thymidine 94, 3 cytidine 65,7 inosine 91,4 xanthosine 14,3 uridine 94,3 arabinosylcytosine (1-bêta-D-arabinofuranosylcytosine) 8,1 arabinosyladéhine (1-bêta-D-arabinofuranosyladénine)67,2 2'déoxyadénosine 99,1 brédinine* 48,2 adénine 0 thymine 0 xanthine 0 uracile o CdoC m i hypoxanthine 0 D-ribose 0 alpha-D-ribose-1-phosphate 0 '-AMP 0 '-GMP 0 '-CMP 0 '-IMP 0 o 5'-XMP 0 o 5'-UMP 0 '-ADP 0 '-ATP 0 Mélange d'adénine et de D-ribose 0 * 4-carbamoyl-1-bêta-Dribofuranosylimidazolium-5-olate o 0) Id ri %a> HO o (2) Action enzymatique: (A) Identification du produit de la réaction: on prépare un mélange réactionnel (100 ml) composé de 10 ml de tampon (pH 6,0) diméthylglutarate-soude, 0,2M, de 500 mg d'adénosine, de 180 U d'oxydase de nucléoside, de 15000 U de catalase et de 90 ml d'eau distillée; on agite ce mélan- ge tout en l'aérant et en réglant son pH à 6 (au cours de la réaction, le pH décroît, ce qui indique la formation d'u- ne substance acide). Après 90 minutes à 37 C, on ajuste le pH à 2,0 par addition-de HC1. On recueille par centrifuga- tion une substance précipitée, qu'on lave avec HCl aqueux (pH3). On dissout la substance lavée, par addition de NaOH 1N, le pH étant ainsi ramené à 8,5. On ajuste alors le pH à 3 par addition de HCl et on recueille une substance insolu- ble. Analyse élémentaire- C = 42,62%, H = 3,93%, N = 24,9%, 0 = 28,55%. Poids moléculaire: 281, Formule: C10H11N505. Spectre infra-rouge et spectre UV identique à ceux d'un é- chantillon identifié d'acide adénosine-5'-carboxylique. (B) Chromatographie en couche mince du produit de réaction formé au cours de la réaction: On prépare un mé- lange réactionnel composé de 10 ml du tampon (pH6) diméthyl- glutarate-NaOH 0,2N, 5 ml d'adénosine 10 mM, 20 U d'oxydase de nucléoside, 1000 U de catalase et 45 ml d'eau distillée; on fait incuber le mélange à 37 C et on recueille le produit formé respectivement après 0, 5, 10, 20 et 60 mn. On chauffe chaque échantillon à 100 C pendant 2 mn, puis on le soumet à l'ultrafiltration. Chromatographie en couche mince effectuée sur une plaque de gel de silice: Agent de développement: acétonitrile: chlorure d'ammonium aqueux à 0,1% = 7:3. Echantillon témoin identifié: adénosine (abréviation Ad), acide adénosine 5'-carboxylique (abréviation Ad-A). L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit et à l'examen des exemples et dessins annexés qui représentent, à titre non limitatif, divers mo- 6 2488618 des de réalisation de l'invention. Comme le montre la figure 1, l'existence d'un composé correspondant à l'oxydation du groupe 5'-hydroxy- méthyle de l'adénosine en groupe aldéhyde est confirmée par une tache. Puis, au cours de la réaction, se produit l'oxydation du groupe 5'carboxylique et la formation du produit final, acide adénosine 5'-carboxylique est confir- mée. (C) Quantité de l'oxygène consommé et de l'eau oxygénée formée au cours de la réaction: On ajoute 3 U d'oxydase de nucléoside à un mélange réactionnel (1,0 ml) composé de 0,4 ml du tampon (pH 6,0) de diméthylglutarate- NaOH 0,2M, 0,1 ml de N,N-diéthyl-m-toluidine à 0,2%, 0,1 ml de 4aminoantipyrine à 0,3%, 0,1 ml de peroxydase (50 U/ml), 0,05 ml d'adénosine 1,0 mM et 0,25 ml d'eau distillée. On mesure la quantité d'eau oxygénée formée (essai colorimé- trique) à 545 nm). On trouve que 0,05 pmoles d'adénosine consomment 0, 097pumoles d'oxygène et produisent 0,101amoles d'eau oxygénée. Ce résultat permet de calculer que 1 mole d'adénosine consomme 2 moles d'oxygène et forme 2 moles d'eau oxygénée. (D) Formation d'ammoniac: On n'observe aucune formation d'ammoniac dans cette réaction. Comme décrit ci-dessus, l'enzyme de la présente invention catalyse une réaction de formation, à partir de l' adénosine, d'acide adénosine-5'carboxylique, en passant par l'adénosine-5'-aldéhyde, suivant le schéma: NIH2 OHOH O W + A > +B 20k t\8) H?0 CH OR OH OH adénosine adenosine-5'-al ehyde $ OGCSO H.ooc o0 on 0E o O +o *0 adenosine-5'-a lde/hyde acide adénosine-5'carboxylique L'enzyme de l'invention présente une action spé- cifique vis à vis des substrats des divers nucléosides du Tableau I et de formules (I), (Ib) et (Ic). L'enzyme exer- ce aussi un effet catalytique au moins sur les réactions (II), (III), (IV) , (V), (VI) et/ou (VII). L'enzyme est donc une enzyme nouvelle, présentant une action enzymatique et une spécificité de substrat, nouvelles. On peut aussi représenter les réactions enzymati- ques, selon l'invention, par les schémas généraux (VIII), (IX) et (X) suivants: 8 2488618 Pour le substrat [I] Base Base HOO& o + 202 + 12W+ 2H2o2 OH OH OH OH pour lesubstrat [Ib] Base Base lIOH i 0- HOOC5 o | - 2 02+ H20-+ + 2H202 OH H OH H pour le substrat [Ic] Base Base Hoo, O | + H20- 2202 ± OH H oH (3) Méthode d'essai: On prépare un mélange réac- tionnel (0,5 ml) composé de 0,2 ml du tampon (pH 6,0) de diméthylglutarate-NaOH 0,2M, 0,05 ml de N,N-diéthyl-m-to- luidine à 0,2% en poids, 0,05 ml de 4-aminoanitipyrine à 0,3% en poids, 0, 05 ml d'adénosine 10 mM, et 0,10 ml d'eau distillée; et on fait pré-incuber ce mélange à 37 C pen- dant 3 mn. Après addition d'une solution d'enzyme (20 ul), on fait incuber le mélange à 37 C pendant 10 mn, puis on a- joute, pour arrêter la réaction, 0,5 ml d'une solution d'u- rée 4M contenant 0,2% de chlorure de cétylpyridinium. On mesure la densité optique à 545 nm dans une cellule de 1,0 cm, 5 mn après avoir ajouté 2,0 ml d'eau distillée, (den- sité optique désignée par As). On remplace la solution d'enzyme par de l'eau distillée (20 pl), comme témoin (den- sité optique désignée par AB). La différence (As - AB) des densités optiques de la solution d'enzyme (As) et du témoin (AB) représente l'acti- vité de l'enzyme. L'activité enzymatique doit être mesurée avec un intervalle des valeurs de As inférieures à 0,15. Une unité (1 U) d'activité enzymatique est déter- minée par la quantité d'enzyme produisant 1 pmole d'eau oxy- génée en 1 mn à 37 C, avec l'adénosine comme substrat, sui- vant l'équation: Activité enzymatique (U/ml) = 1,25 x (As-AB) x rapport de dilution. La nouvelle enzyme de l'invention présente les propriétés physico-chimiques et biochimiques suivantes: Valeur Km: 4,7 x 10-5M (pour l'adénosine); Point isoélectrique: pH 4,5 (par électrophorèse en utili- sant une substance porteuse ampholite); Poids moléculaire: environ 240 000 (selon la méthode de filtration sur gel en utilisant la substance vendue sous la dénomination commerciale de "Sepharose CL-6B); pH optimum: (représenté à la figure 2) pH 5-6 mesuré avec le tampon glycine-HCl; sur la figure: o-o: tampon de glycine HCl (40 mM), e-e: tampon diméthylglutarate-NaOH (40 mM), A-&: tampon de phosphate (40 mM). On mesure la consommation d'oxygène avec une élec- trode à oxygène, la température optimale étant de 45-55 C, comme représenté à la figure 3. On mesure l'activité résiduelle à diverses tempé- ratures selon la méthode d'essai décrite ci-dessus. Stabilité à la chaleur: stable à 60 C pendant 10 mn, comme représenté à la figure 4; Activité enzymatique mesurée après 10 mn d'incubation dans le tampon au phosphate (pH 6,0, 40 mM); pH de stabilité: pH 8-9, comme représenté à la figure 5, o: o-o: tampon dit de Britton-Robinson (150 mN) , À-.: tampon de diméthylglutarate-NaOH (150 mM), A-A: tampon de phosphate (150 maM), -A: tampon de tris-HCl (150 mM). Après incubation pendant 60 mn à 37 C, on dilue le mélange réactionnel 40 fois, puis on prélève 20 ul pour l'essai. L'effet de divers ions, métalliques et autre, est indiqué au Tableau II. L'effet de divers agents tensio-actifs est indiqué au Tableau III. Tableau III Activité relative (%) Néant 100 % en poids 0,1 Triton X-100* 104 " Bridge 35* 100 " Sulfate de sodium dodécyle 66 " Sulfonate de sodium laurylbenzène 38 " Déoxychàlate de sodium 102 " Cation FB-500* 70 Tableau II ions métalliques et Activité relative (%) autres témoin 1 0 0 Mg2 ++ 1 0 4 Ba2 + 1 00 Ca2+ 1 0 2 Mn2 + 1 10 Zn2 + 9 4 Co2+ 1 04 E D T A 98 P C M B 1 02 11 2488618 % en poids 0,1 Cation DT-202* 60 Chlorure de cétyl-triméthylammonium 78 * Dénomination commerciale La souche bactérienne B-0781 présente les propriétés suivantes: A- Observations macroscopiques: Culture à 300C pendant 18-24 h. (1) Culture inclinée en tube d'agar-agar: Croissance linéaire, de couleur gris pâle jaunâtre à blanc gris. Pas de formation de pigment soluble. (2) Culture d'agar-agar en plaque: Colonies rondes protubérantes à bords lisses, semi- fluorescentes, gris pâle jaunâtre à blanc gris. Pas de formation de pigment soluble. (3) Culture liquide: Formation de sédiments après trouble total. Formation de pellicules minces, facilement détruites par légères se- cousses. (4) Milieu de gélatine à couches multiples: Croissance en ligne interrompue. Pas d'hydrolyse de la gélatine. (5) Culture dans du lait BCP Faiblement alcaline. Pas de peptisation. (6) Croissance anaérobie: Pas de croissance. B. Observations microscopiques Baguettes droites ou légèrement incurvées et coc- cus. Isolés ou doubles ou en chaînes courtes. Mobiles avec flagelles polaires. 0,5 x 0,1 - 1,5pu. Pas de forma- tion de spores. Pas de polymorphisme. C. Propriétés physiologiques 1) Coloration Gram: 2) Colorant acide fort: 3) Essai OF: et biochimiques: 4) Formation de catalase: + ) Formation d'oxydase: + 6) Formation d'uréase: en milieu dit de Stuart, van Stratum & Rustigian: en milieu dit de Christenssen: 7) Hydrolyse de la gélatine - 8) Hydrolyse d'amidon 9) Hydrolyse de la caséine - ) Hydrolyse de l'esculine - 11) Hydrolyse de la cellulose- 12) Hydrolyse de l'arginine + 13) Accumulation de Poly-bêta- hydroxybutyrate 14) formation d'Indole: - ) formation de H2S: + 16) formation d'acétoïne: - 17) réduction de nitrate: - 18) réaction de dénitration - 19) utilisation de citrate: + ) teneur en GC du DNA: 595 21) formation d'acides à partir acide Sucre: adnitol L(+) arabinose cellobiose dulcitol méso-érythritol fructose fucose galactose glucose glycérine (décomposition par oxyda- tion) ? de sucres. :az: (+) (+) + + + Sucre: acide: gaz: inositol inuline - - lactose (+) - maltose - mannitol mannose + méléditose - mélibiose + - raffinose - - L(+) rhamnose (+) - salicine L(-) sorbose - - sorbitol amidon - - sucrose - tréhalose - xylose + - 22) pH de croissance: pH 4,5 - 9,0 23) Température de croissance: 10 37 C 24) Utilisation de l'azote de l'ammoniac: + ) Utilisation de l'azote de nitrate: + On établit les propriétés taxonomiques de la souche B-0781 comparativement à "Bergey's Manual of Deter- minative Bacteriology, 8th Ed. 1974" et à "Identification of Medical Bacteriology, 1974". On établit que la souche B-0781 appartient à l'espèce Pseudomonas, d'après ses propriétés gram-négati- ves, de formation positive de catalase et d'oxydase, de décomposition par oxydation du glucose, de mobilité par coccus à flagelles polaires, et de croissance satisfaisan- te sur milieu de culture d'agar-agar à pH 7 (en tube in- cdiné). Une comparaison plus détaillée montre que la sou- che B-0781 est identique à Pseudomonas putida. Souche B-0781 Formation de catalase.oxidase: Formation de pigment fluorescent (Milieu dit de King B): Hydrolyse de gélatine-amidon-caséine Décomposition de l'arginine: Accumulation de poly-b8ta-hydroxy- butyrate: Formation d'indole acétoine: Réduction de nitrate: Utilisation de citrate Galactose (acide): Glucose (acide): Mannose (acide): Xylose (acide): L(+) arabinose (acide): Fructose (acide): Glycérine (acide): Inositol (acide): Lactose: Mannitol: Salicine: Sucrose: Maltose: Teneur en GC du DNA: Pseudomonas putida + + + + + + + + + + (+) + d d + + + + d d d - ou (d) (d) (d) - 63% (+) 59% 59% d: différent D'après les données taxonomiques décrites ci-des- sus, la souche B-0781 est désignée par Pseudomonas putida B-0781, qui a été déposée le 29.07.80 auprès du "Fermenta- tion Institute, Agency of Industrial Technology and Science, M.I.T.I. "Japon, comme collection permanente de culture FERM-P N 5664. La présente invention a été étendue, sur la base *des données décrites ci-dessus. 2488618 L'invention a donc pour objet une nouvelle enzyme d'oxydase de nucléoside, d'une spécificité de substrat au moins vis à vis des nucléosides de formule (I) et qui ca- talyse au moins les réactions (II) et/ou (III). L'invention a aussi pour objet un procédé de pro- duction d'oxydase de nucléoside selon lequel on effectue une culture d'un micro-organisme, produisant l'oxydase de nucléoside, appartenant au genre de Pseudomonas, dans un milieu de culture, et on sépare l'oxydase de nucléoside des cellules cultivées. 1 L'invention a encore pour objet une méthode d'es- sai de nucléoside par mesure de l'oxygène consommé et de l'eau oxygénée formée. L'invention a de plus pour objet un procédé de préparation d'acide nucléoside-5'-carboxylique. L'invention a également pour objet un système de compositions convenant à la mesure des nucléosides. L'oxydase de nucléoside de l'invention, qui pré- sente au moins la spécificité de substrat et l'action enzy- matique précédemment décrites, n'est pas limitée à cette enzyme particulière et les enzymes présentant de faibles différences, comme par exemple le poids moléculaire, de valeur de Km ou d'effet d'ions métalliques et d'agents tensio-actifs entrent aussi dans le cadre de l'invention. Comme précédemment mentionné, on peut former l'a- cide nucléoside-5'-carboxylique par action de l'oxydase de nucléoside de l'invention sur des nucléosides, dans des conditions aérobies, en un milieu aqueux. En outre, étant donné que l'enzyme de l'invention agit sur le groupe 5'hydroxyméthyle du nucléoside dans un échantillon, par son action enzymatique et son effet de spé- cificité envers le substrat, on peut mesurer le nucléoside ou l'activité enzymatique dans des systèmes de nucléosides, en évaluant la quantité d'oxygène consommé ou d'eau oxygé- née formée. 16 2488618 Le microorganisme de l'invention n'est pas limité au genre de Pseudomonas et en conséquence, on peut utiliser des microorganismes producteurs d'oxydase de nucléoside, appartenant au genre de Pseudomonas, ainsi que des mutants naturels et artificiels dudit micro-organisme. Les techniques génétiques de production d'oxydase de nucléoside, comme la transformation des gènes correspondants à la sou- che de l'invention, en cellules différentes, peuvent aussi être appliquées et entrent également dans le cadre de l'in- vention. Pour la production de l'enzyme, on cultive le microorganisme produisant l'oxydase de nucléoside, apparte- nant au genre Pseudomonas, dans un milieu usuel, les cul- tures liquides ou solides pouvant être utilisées. La cul- ture aérée immergée est préférable pour la production in- dustrielle. On peut utiliser les milieux nutritifs usuels, comme les sources d'azote assimilable, telles que les li- queurs d'extraction de mals, les extraits de viande, la poudre de soja, la caséine, la peptone, l'extrait de le- vure, le chlorure ou le sulfate d'ammonium. On peut utili- ser des sources de carbone assimilable, comme les acides gras supérieurs, les mélasses, et les hydrolysats de glu- cose ou d'amidon. On peut aussi ajouter au milieu, si né- cessaire, des sels minéraux comme le chlorure de sodium ou de potassium, le sulfate de magnésium, les phosphates aci- des de potassium. On peut encore améliorer la production de l'oxydase de nucléoside par addition de 0,5-1% d'un acide gras supérieur, comme l'acide oléique ou l'acide pal- mitique. La température de la culture, qui varie en fonc- tion de la croissance des microorganismes, est de préfé- rence de 25-351C. La durée de la culture, variable en fonction des conditions de culture, est de 15-50 h. On arrête la culture quand une haute productivité d'oxydase de nucléoside est obtenue dans le milieu. L'oxydase de nucléoside s'accumule dans les cel- lules des micro-organismes. L'extraction de l'enzyme des cellules est décrite ci-après. On recueille les cellules cultuvées et les cel- lules humides obtenues sont mises en suspension dans un tampon au phosphate ou un tampon de tris-HC1, puis traitées suivant les techniques usuelles de décomposition des cel- lules, comme le traitement par la lysozyme, la sonication, ou la pression, pour obtenir une liqueur brute d'oxydase de nucléoside. Cette solution brute d'enzyme peut être purifiée selon les méthodes usuelles de purification des protéines. On soumet, par exemple, le liquide contenant l'enzyme à la sédimentation dans l'acétone, le méthanol, l'éthanol ou l'isopropanol ou au relargage par le sulfate d'ammonium, le chlorure de sodium ou le sulfate d'aluminium, pour re- cueillir l'enzyme déposée. On purifie la poudre ainsi ob- tenue jusqu'à ce qu'elle ne présente qu'une seule bande par électrophorèse. Par exemple, l'enzyme déposée est mise en suspension dans un tampon au phosphate, puis chromato- graphiée en utilisant un échangeur d'ions comme un gel de diéthylamino éthyl-dextrane, de diéthylaminoéthyl-cellulose ou de triéthylaminoéthyldextrane, et la filtration sur gel comme un gel de dextrane ou un polyacrylamide. On peut obtenir une poudre d'enzyme purifiée par lyophilisation. On peut préparer l'acide nucléoside-5'-carboxyli- que par réaction de nucléosides avec l'oxydase de nucléosi- de sous forme brute ou purifiée. On peut utiliser l'enzyme en solution ou sous forme immobilisée. Des exemples de nu- cléosides convenant à l'invention sont donnés par les nu- cléosides, ou leurs dérivés, comportant un groupe 5'-hydro- xyméthyle, tels que les asénosine, guanosine, thymidine, inosine, xanthosine, uridine, arabinosylcytosine, arabino- syladénine, 2'-déoxyadénosine ou 2'-déoxyguanosine. Le milieu aqueux convenant pour la réaction est un milieu d'un intervalle de pH stable pour l'oxydase de nucléoside, comme par exemple un milieu aqueux de pH 6-9, un tampon de diméthylglutarate-NaOH, de phosphate, ou de tris-HCl. On obtient des conditions aérobies par dissolu- tion d'oxygène dans un milieu aqueux ou par pré-aération par l'air ou l'oxygène du milieu. Etant donné que deux moles d'oxygène par mole de nucléoside comportant un groupe 5'-hydroxyméthyle sont re- quises, il est nécessaire que les conditions aérobies soient telles qu'au minimum un excès d'oxygène de plus de deux moles soit présent. La température d'incubation doit être une tempé- rature de stabilité pour l'enzyme, qui est généralement la température ambiante. Les concentrations d'oxydase de nucléoside et de nucléoside ne sont pas limitées. La durée de l'incubation dépend de la concentration de l'enzyme et du substrat, ain- si que d'autres conditions de la réaction, et elle est, de préférence, de plus de 20 mn. On détermine la fin de la réaction par observation du substrat subsistant ou de l'a- cide nucléoside-5'-carboxylique produit dans un échantillon, suivant la technique de la chromatographie en couche mince. Dans la réaction, il se forme de l'eau oxygénée et il est préférable d'ajouter préalablement de la catalase pour décomposer l'eau oxygénée en molécules d'eau et d'oxy- gène. On peut isoler l'acide nucléoside-5'-carboxyli- que du mélange réactionnel, par addition d'acides chlorhy- drique ou sulfurique aqueux, en ajustant le pH à 2-3, pour précipiter l'acide nucléoside-5'-carboxylique. Pour puri- fier davantage, on peut appliquer la technique de chroma- tographie par adsorption sur un échangeur d'ions ou de re- cristallisation. Selon ces méthodes, on peut préparer l'acide nu- cléoside-5'-carboxylique à partir de divers nucléosides comportant un groupe 5'-hydroxyméthyle. 19 - 2488618 L'application de l'oxydase de nucléoside de l'in- vention, basée sur sa spécificité vis à vis du substrat et sur son action enzymatique, à une nouvelle méthode d'essai et à un système de compositions d'essai de nucléosides, est décrite ci-après. Les échantillons à analyser contiennent au moins un nucléoside comportant un groupe 5'-hydroxyméthyle, de formule HO 2 Base -0 ' R11 Rs o R1, R2 et R3 sont des atomes d'hydrogène ou des groupes hydroxy et "Base" a la même signification que précédemment. Des exemples d'échantillons convenant à la métho- de de l'invention sont donnés par: - échantillon de réactif contenant les nucléosides précé- demment décrits; - échantillon pour mesurer l'activité de la ribonucléase ou déoxyribonucléase, dans lequel ARN, ADN ou son oligonu- cléotide-est hydrolysé par les hydrolases correspondantes, telles que la ribonucléase ou déoxynucléase, pour former le nucléotide qui est traité par une nucléotidase ou une alcalino-phosphatase pour produire un nucléoside, ou pour essayer le substrat de ARN ou de ADN; - échantillon pour mesurer l'activité de nucléotidases dans lequel un nucléotide, tel que AMP est hydrolysé par la nucléotidase pour libérer le nucléoside, ou pour essa- yer le substrat de AMP; - échantillon pour mesurer l'activité de l'enzyme qui li- bère le nucléoside, par exemple la formation d'adénosine par action de la S-adénosyl-L-homocystéine hydrolase, ou de la guanosine ou de la déoxyguanosine par action de la 2488618 guanosine phosphorylase, ou pour l'essai du substrat; - échantillon pour mesurer l'activité des enzymes qui dé- composent le nucléoside comme substrat, par exemple l'hy- drolyse du nucléoside par la nucléosidase, l'hydrolyse de l'inosine par l'inosinase, l'hydrolyse de l'uridine par l'uridinenucléosidase, la décomposition de l'uridine par l'uridine phosphorylase, ou la décomposition de la thymidi- ne par la thymidine phosphorylase; - échantillon pour essayer l'enzyme sur le groupe phospho- rylate-5'-hydroxy d'un nucléoside comme substrat, par exem- ple la phosphorylation du groupe 5'-hydroxy de l'adénosine par l'adénosinekinase, la phosphorylation du groupe 5'-hy- droxy de l'uridine par l'uridinekinase ou la phosphoryla- tion du groupe 5'-hydroxy de la thymidine par la thymidine- kinase; - échantillon pour l'essai quantitatif de nucléoside de pu- rine dans un système réactif de phosphorylase de nucléoside ou pour mesurer l'activité enzymatique de la phosphorylase d'un nucléoside de purine. La température d'incubation de ces échantillons et de l'oxydase de nucléoside est généralement de 37 C et la durée de l'incubation n'est pas limitée. La réaction s'ef- fectue suivant les formules (II), (III), (IV), (V), (VI) et/ou (VII) ou (VIII), (IX) et/ou (X) précédentes, et on mesure les quantités d'oxygène consommé ou d'eau oxygénée formée. On mesure l'oxygène de préférence par l'électrode à oxygène et l'eau oxygénée par des moyens électriques com- me l'électrode à eau oxygénée ou des moyens chimiques, com- me par exemple, en utilisant des réactifs usuels pour la mesure quantitative de l'eau oxygénée, tels que la combinai- son de phénol, 4-aminoantipyrine et de peroxydase, ou de phénol, 4-aminophénazole et de peroxydase, ou de N,N'-dié- thyl-m-toluidine, 4-aminoantipyrine et de peroxydase. On mesure ainsi la quantité de nucléoside dans l'échantillon d'après le phénomène de la consommation de deux moles d'oxygène et de deux moles d'eau oxygénée aux 2 2488618 dépens d'une mole de nucléoside. On effectue l'essai de nucléoside dans l'échan- tillon en dissolvant un échantillon aliquote dans un tam- pon et en l'ajoutant à une solution d'oxydase de nucléosi- de (1-20 U), en faisant incuber le mélange à 370C et en mesurant l'oxygène consommé avec une électrode à oxygène et l'eau oxygénée avec une électrode à eua oxygénée. On peut aussi mesurer l'eau oxygénée produite en ajoutant de la N,N-diéthyl-m-toluidine, 4-aminoantipyrine et de la pe- roxydase, en faisant incuber le mélange à 37WC, puis en effectuant une mesure calorimétrique à 545 nm. Selon une variante de l'essai d'activité enzymatique, après la réac- tion enzymatique d'une durée convenable, or mesure le nucléo- side consommé ou produit suivant les techniques décrites ci- dessus. On peut mesurer l'adénosinekinase par la mesure de la quantité d'adénosine consommée, après incubation du mélange d'adénosinekinase, de ATP et d'adénosine. On peut mesurer la nucléotidase par mesure de la quantité d'oxygè- ne consommé ou d'eau oxygénée formée dans la réaction d'o- xydase de nucléoside et d'adénosine,qui est formée par ac- tion enzymatique sur un substrat d'ATP. Pour la mesure de la teneur en ARN ou de l'activité de la ribonucléase dans l'é- chantillon, on fait réagir l'ARN avec la ribonucléase pour former un nucléotide, qui est transformé en nucléoside par action de la nucléotidase ou l'alcalinophosphatase, le nu- cléoside étant alors quantitativement mesuré par l'oxydase de nucléoside. Comme déjà mentionné, la nouvelle enzyme, oxydase de nucléoside, de l'invention peut être avantageusement appliquée à l'analyse quantitative de divers nucléosides, à la mesure de l'activité enzymatique sur les nucélosides comme substrats, ou à la mesure de l'activité enzymatique formant un nucléoside ou son substrat. L'invention est encore illustrée par les exemples pratiques suivants. Exemple 1 On prépare un milieu (100 ml, pH 7,0) composé de 1,0% en poids de peptone, 1,0% en poids de caséine, 1,0% en poids d'acide oléique, 0,5% en poids de poudre d'extrait de levure, 0,2% en poids de KCl, 0,1% en poids de K2HP04, 0,05% en poids de MgS04, 7H20, qu'on stérilise à 120 C pendant 20 mn; dans un flacon d'Erlenmeyer, on innocule le milieu avec Pseudomonas putida B-0781 FERM-P N 5664 et on cultive à 30 C pendant 1 jour. On innocule cette culture de semence dans le même milieu que décrit ci- dessus (20 1 contenant 0,1% du produit vendu sous la dénomination commerciale de "Desfoam BC-51Y), dans une cuve de fermentation de 30 1, et on cultive sous aération stérile à 30 C pendant 42 h, à 350 tours/mn, aération: 20 1/mn. On recueille les cellules cultivées, par cen- trifugation à 5000 tours/mn, pendant 10 mn. On lave les cellules ainsi recueillies à l'eau (7 l) puis on les re- cueille à nouveau dans les mêmes conditions. Aux cellu- les en suspension dans un tampon au phosphate 20 mM (pH 7,0, 5 l) contenant EDTA 10 mM, on ajoute de la lysozyme (sous la concentration finale de 0,5 mg/ml) et on agite à 37 C pendant 5 h, pour la destruction des cellules. On obtient un liquide surnageant (4,2 1, 2,86 U/ml), par cen- trifugation à 5000 tours/mn pendant 10 mn. On ajoute de l'acétone froide (-20 C, 2,5 l) au liquide surnageant et on fait sédimenter par centrifugation à 5000 tours/mn pen- dant 10 mn, pour recueillir un liquide surnageant -11150 U). On ajoute encore de l'acétone froide (2,5 l) au liquide sur- nageant, et on centrifuge à 5000 tours/mn pendant 10 mn pour recueillir la substance déposée. On dissout le précipité dans un tampon au phosphate 20 mM (pH 7,0, 1,0 1), et on centrifuge à 5000 tours/mn pendant 15 mn pour séparer tou- tes substances insolubles. On traite le liquide surna- geant (9700 U) à 500C pendant 20 mn et on sépare la protéi- ne dénaturée par la chaleur, par sédimentation à 5000 tours/ 23 2488618 mn pendant 10 mn, pour obtenir un liquide surnageant (9400 U). On ajoute du sulfate d'ammonium (319 g) à la solution surnageante, jusqu'à saturation de 0,42 et on fait sédimen- ter à 15000 tours/mn pendant 10 mn, pour séparer le préci- pité, puis on ajoute du sulfate d'ammonium (140 g) pour faire précipiter. On dissout le précipité dans un tampon au phosphate 20 mM (pH 7,5, 50 ml) et on centrifuge à 15000 tours/mn pendant 10 mn pour séparer les substances insolubles. On dialyse la solution surnageante (7800 U) dans un tube de cellophane, contre un tampon au phosphate mM pendant la nuit. On introduit la solution dialysée dans une colonne (2,6 x 60 cm) garnie du produit vendu sous la dénomination commerciale de "DEAE-cellulose" par la Société dite Selver Co, équilibré avec un tampon de Tris-HC1 20 mM (pH 7,5) et on élue sous un gradient li- néaire de HCl 0-0,5 M dans un tampon de Tris-HC1 20 mM (pH 7,5), pour recurillir la fraction éluée à la concentra- tion de KC1 0,15-0,25 M (5760 U), puis on concentre avec une membrane du produit vendu sous la dénomination commer- ciale de "Amicon PM-10. On introduit ledit concentré dans une colonne (2, 6 x 90 cm) garnie du produit vendu sous la dénomination commerciale de "Sephacryl S-200 par la Société dite Pharmacia Co. On recueille les fractions actives dont l'activité enzymatique correspond à une absorption à 280 nm et on lyophilise pour obtenir une poudre d'oxydase de nucléoside purifiée (51,0 mg, 3675 U). Exemple 2 - On prépare un mélange d'adénosine (500 mg), d'oxy- dase de nucléoside (180 U), de catalase (15000 U) et d'eau distillée (90 ml), on l'ajoute à un tampon de diméthylglu- tarate-NaOH 0,2M (pH 6,0 10 ml) et on fait incuber sous agi- tation de 150 tours/min et aération de 20 ml/mn, à 37 C pen- dant 90mn, (on ajuste le pH d'incubation). Après incuba- tion, on ajuste le pH à 2,0 par addition de HCl 0,1 N, pour obtenir un sédiment. On recueille le précipité par centri- fugation (15000 tours/mn, 10 mn), on lave avec HCl aqueux (pH 3), on dissout dans NaOH 1N et on précipite à nouveau en ajustant le pH à 3 par addition de HC1, pour recueillir des cristaux (465 mg). Le produit est reconnu semblable à un échantillon identifié d'acide adénosine-5'carboxylique, par analyse élémentaire, son poids moléculaire, son spectre IR, son spectre UV et par chromatographie en couche mince. Exemple 3 - On remplace dans l'exemple 2 l'adénosine par les guanosine, thymidine, cytidine, inosine, xanthosine, uridine, arabinosylcytosine, arabinocyladénine, 2'-déoxyadénosine et 2'-déoxyguanosine (300 mg pour chacune), pour obtenir l'a- cide 5'-carboxylique, comme indiqué dans le tableau suivant: Substrat Produit guanosine thymidine inosine xanthosine uridine arabinosylcy- tosine arabinosyla- - dénine 2'-déoxyadéno- sine acide guanosine-5'-carboxylique (268 mg) acide thymidine-5'carboxylique (245 mg) acide inosine-5'-carboxylique (254 mg) acide xanthosine-5'-carboxylique (265 mg) acide uridine-5'-carboxylique (258 mg) acide arabinosylcytosine-5'-carboxylique (220 mg) acide arabinosyladénine-5'-carboxylique (267 mg) acide 2'-déoxyadénosine-5'carboxylique (270 mg) 2'-déoxyguanosi- acide 2'-déoxyguanosine-5'carboxylique ne (266 mg) Exemple 4 - On fait pré-incuber à 37 C un mé;ange composé des ingrédients suivants: tampon de diméthylglutarate-NaOH 0,2 M (pH 6,0) 0,2% en poids de N,Ndiéthyl-m-toluidine 0,3% en poids de 4-aminoantipyrine peroxidase (50 U. /ml) oxidase de nucléoside eau distillée Total (0,95 ml) 0,4 ml 0,1 ml 0, 1 ml 0,1 ml U. 0,25 ml 0,95 ml A cette solution, on ajoute des concentrations variables d'une solution d'adénosine (0,05 ml) et d'eau distillée (2,0 ml) et on effectue une mesure colorimétrique à 545 nm. Les résultats sont donnés à la figure 6 qui montre qu'on mesure la teneur en adénosine avec une bonne précision. Exemple5 - Un mélange (0,95 ml) semblable à celui de l'exem- ple 4 est soumis à une pré-incubation à 37 C. On ajoute des concentrations variables d'une solution (0,05 ml) d'un é- chantillon d'adénosine, on fait incuber à 37 C pendant mn et on mesure l'oxygène consommé, avec une électrode à oxygène (produite par Ishikawa Mfg. Co). Les résultats obtenus sont représentés à la figure 7 qui montre que l'on obtient quantitativement de l'adénosine d'une bonne préci- sion. Exemples 6-12 - La solution d'adénosine de l'exemple 4 est rempla- cée par diverses concentrations des guanosine, thymidine, inosine, uridine, 2'-déoxyadénosine, arabinosyladénine ou bredinine (4-carbamoyl-1-bêta-D-ribofiranosyl-imidazolium- -olate), dans des conditions de réaction semblables à celles des exemples 4 ou 5. Les résultats obtenus avec une bonne précision sont représentés à la figure 8 (guanosine), figure 9 (thymidine), figure 10 (inosine), figure 11 (uridine), figure 12 (2'-dé- oxyadénosine), figure 13 (arabinosyladénine) et figure 14 (bredinine) (par la méthode de l'électrode à oxygène). Exemple 13 - * On prépare un mélange composé des ingrédients suivants: Tampon de diméthylglutarate-NaOH 0,2 M (pH 6,0) 0,4 ml 0,2% en poids, N,N-diéthyl-mtoluidine 0,1 ml 0,3% en poids, 4-aminoantipyrine 0,1 ml peroxidase (50 U. /ml) 0,1 ml Oxidase de nucléoside 5 U. Eau distillée 0,25 ml Total 0,95 ml On prépare une solution d'adénosinekinase (0,1 ml) suivant la méthode décrite dans J. Biol. Chem. 193, 481-495 (1951); qu'on ajoute à un tampon de diméthylgluta- rate-NaOH 0,2 M (pH 6,0) (contenant ATP 5mM, adénosine mM et MgC12 10 mM) (0,4 ml) et on fait incuber à 37 C. On prélève 0,02 ml du mélange après 0,5 et 10 mn, on chauf- fe l'échantillon à 70 C et on l'ajoute au mélange réac- tionnel ci-dessus qu'on fait incuber à 37 C pendant 20 mn; on effectue une mesure colorimétrique à 545 nm, dont les résultats sont représentés à la figure 15. Exemple 14 - Tampon de diméthylglutarate-NaOH 0,2 M (pH 6,0) 0,4 ml 0,2% e, poids N,Ndiéthyl-m-toluidine 0,1 ml 0,3% en poids 4-aminoantipyrine 0,1 ml peroxidase (50 U./ml) 0,1 ml mMl AMP 0,05 ml oxidase de nucléoside 10 U. Eau distillée 0,2 ml Total 0,95 ml On fait pré-incuber à 37 C le mélange réactionnel ci-dessus (0,95 ml). On lui ajoute une solution de nucléo- tidase (vendue par Sigma Co) (0,05 ml), on fait incuber à 37 C pendant 20 mn et on effectue une mesure colorimétrique à 545 nm. Les résultats obtenus sont indiqués à la figure 16 qui montre que la nucléotidase est analysée quantitati- vement avec une bonne précision. Exemple 15 - Un mélange réactionnel (0,95 ml) contenant de l'ARN et de la nucléotidase, est incubé avec une solution de ribonucléase (0,05 ml) à 37 C pendant 30 mn. On chauf- fe à 80 C, 0,05 ml de ce mélange, qu'on ajoute à 0,95 ml d'un mélange réactionnel semblable à celui de l'exemple 4. On fait incuber à 37 C pendant 20 mn et on effectue une 27 2488618 mesure calorimétrique à 545 nm. Les résultats obtenus sont indiqués à la figure 17 qui montre que la ribonu- cléase est analysée avec une bonne précision. 28 2488618 REVENDICATIONS 1) Oxydase de nucléoside caractérisée en ce qu'elle présente les propriétés biochimiques: - de spécificité envers au moins les substrats de nucléosi- des, ou de leurs dérivés, de formule (I) Base HOH2C O H OR OH om "Base" représente le résidu d'une base nucléique, ou de ses dérivés; et d'action enzymatique ayant pour effet - une activité catalytique au moins sur les réactions enzy- matiques (II) et/ou (III) suivantes: Base Base + Oy $ +H202 (IF + / COH OE OH O Base Base OH, O HOOOC oH H 30[ + QZ + EliO- v +H20 agi OHR o OH O 2) Oxydase de nucléoside selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente les caractéristiques pyisico-chimiques suivantes: valeur de Km: 4,7 x 10-5 (pour 1'adénosine); point iso-électrique: pH environ 4, 5 par électrophorèse avec l'ampholite comme substance porteuse); poids moléculaire: environ 240 000; pH optimum: pH 5-6; température optimale: 45-55 C; stabilité à la chaleur: stable au-dessous de 60 C pendant mn; pH de stabilité: stable jusqu'à pH 8-9; 3) Procédé de production d'oxydase de nucléoside, caractérisée en ce qu'on cultive un microorganisme, pro- duisant une oxydase de nucléoside, appartenant au genre de Pseudomonas, dans un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, et un sel minéral, et on sépare l'oxydase de nucléoside ainsi formée des cellules cultivées. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le microorganisme produisant l'oxydase de nu- cléoside est Pseudomonas putida B-0781 déposée le 29 07.80 comme souche de microorganisme FERI-P No 5664. ) Procédé de production d'acide nucléoside-5'-car- boxylique, caractérisé en ce qu'on fait incuber l'oxydase de nucléoside avec un nucléoside comportant un groupe 5'- hydroxyméthyle, en milieu aqueux,dans des conditions aé- robies, et on séparé l'acide nucléoside-5'-carboxylique ainsi formé. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le nucléoside comportant un groupe 5'-hydroxy- méthyle est l'adénosine, la guanosine, la thymidine, la cytidine, l'inosine, la xanthosine, l'uridine, l'arabinosyl- cytosine, l'arabinosyladénine, la 2'-déoxyadénosine ou la 2'déoxyguanosine. 7) Méthode d'essai d'un nucléoside dans un échantil- lon liquide caractérisé en ce qu'on fait incuber ledit é- chantillon avec l'oxydase de nucléoside, qui consomme de l'oxygène et produit de l'eau oxygénée et de l'acide nu- cléoside-5'-carboxylique, par action sur le nucléoside, et on mesure quantitativement l'oxygène consommé ou l'eau oxygénée formée. 8) Méthode d'essai selon la revendication 7, carac- térisé en ce que l'oxydase de nucléoside est telle que définie dans la revendication 1. 9) Méthode d'essai selon la revendication 7, carac- térisé en ce que l'échantillon liquide contient un nucléo- side ou un système générateur de nucléoside. 10) Méthode d'essai selon la revendication 9, carac- térisé en ce que l'échantillon liquide contenant un système générateur de nucléoside, contient au moins un nucléoside libéré par l'action d'un nucléotidase sur un nucléotide. 11) Méthode d'essai selon la revendication 9, carac- térisé en ce que l'échantillon liquide contenant un système générateur de nucléoside contient au moins un nucléoside libéré par l'action de la ribonucléase ou de la déoxyribonu- cléase et d'une nucléotidase ou de la phosphatage. 12) Système de compositions pour l'essai d'un nucléo- side caractérisé en ce qu'il contient au moins une oxydase de nucléoside qui consomme l'oxygène et produit de l'eau oxygénée et de l'acide nucléoside-5'-carboxylique, par ac- tion sur le nucléoside. 13) Système selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il contient au moins une oxydase de nucléoside et un réactif pour mesurer la quantité d'eau oxygénée pro- duite. 14) Système selon la revendication 13, caractérisé en ce que le réactif est une composition qui réagit avec l'eau oxygénée et la convertit en substance détectable. ) en ce que tenant au Système selon la revendication 14, caractérisé la composition est une composition chromogène con- moins une peroxydase.