Brevet FR2495184A1 — publié le 19820604

La présente invention concerne un procédé et un réactif pour clarifier un liquide biologique trouble. L'invention concerne en particulier un procédé pour cla- rifier de façonefficace un échantillon biologique trouble -5 tel que du sérum humain et un réactif utilisé à cet effet. Plus particulièrement l'invention concerne un réactif consti- tué d'un agent tensio-actif et d'une enzyme ainsi que son application comme agent clarifiant. Le trouble d'un échantillon biologique peut poser des problèmes graves. Il entraîne des lectures médiocres ou erro- nées et par conséquent des déterminations très douteuses. Le trouble des échantillons de sérum et de plasma pose généralement un problème grave en analyse photométrique cli- nique. Il conduit à des résultats erronés et provoque souvent des déterminations photométriques trompeuses des constituants du sérum. Le trouble semble da principalement à une élévation des triglycérides dans le sérum des sujets présentant une hyperlipoprotéinémie avec ou sans élévation du cholestérol total. On a montré qu'il existait une corrélation entre une élévation anormale du cholestérol sérique et un risque élevé d'atérosclérose. La détermination du cholestérol et des tri- glycérides est importante car des résultats précis aident le médecin à identifier les sujets atteints d'hyperlipoprotéi- némie et à prévoir certaines affections cardiaques. D'autres analyses telles que la détermination de l'aspartate-amino- transférase (GOT), de l'alanine-aminotransférase (GPT) et de la lacticodéshydrogénase {LDH), etc. ont également souf- fert des mômes difficultés que les déterminations du choles- térol ou des triglycérides, comme précédemment exposé, lors- qu'on examine des échantillons troubles. Pour effectuer des analyses cliniques des sérums troubles on a traité les échantillons avec une concentration élevée d'agents tensio-actifs tels que l'acide laurique polyoxy- éthylé (brevets US no 3 853 465 et no 4 184 848). Comme on utilise uniquement des agents tensio-actifs, une concentration assez élevée d'agent tensio-actif est nécessaire pour qu'on obtienne une clarification efficace. Une concentration élevée d'agents tensio-actifs entraîne souvent des interactions avec des réactions chimiques ou enzymatiques et complique l'analyse. Dans l'invention, on utilise une concentration relative- ment faible d'agent tensio-actif. Ceci est du à l'action d' une enzyme (cholestérol-estérase ou lipase) ajoutée au réactif clarifiant. Le mécanisme exact de la clarification selon l'invention n'est pas encore connu. On peut cependant penser que, dans les cas de sujets présentant une hyperlipémie, le trouble des échantillons de sérum est dû principalement à une élévation de la teneur en triglycérides. Les triglycérides sont insolubles dans l'eau et ils sont généralement enfouis dans la partie centrale grasse avec des ester du cholestérol dans les complexes constituant les lipo- protéines. On doit effectuer la clarification d'un échantillon lipémique par décomposition des lipoprotéines avec un agent tensio-actif tel que diéthanolamide de l'acide laurique (DEA), suivie par l'hydrolyse des triglycérides par la base enzyma- tique. L'agent tensio-actif contribue également à la disso- lution des acides gras qui sont libérés. Sans enzyme, il n'y a pas de clarification. L'invention a pour objet un réactif efficace pour clari- fier des échantillons biologiques troubles et un procédé pour effectuer cette clarification en particulier dans le cas o l'échantillon doit être soumis à une détermination ou à une analyse par photométrie d'un composant particulier tel que le cholestérol. L'invention concerne un réactif efficace pour clarifier un échantillon biologique trouble comprenant un agent tensio- actif de formule: O (CH2CH2O) H R-C-N ----(CH2CH20) E y o R représente un radical alkyle ou alcényle contenant 5 à 17 atomes de carbone, x et y sont chacun égaux à 1; et une enzyme choisie parmi la cholestérol-estérase, une lipase ou un de leurs mélanges. De préférence le réactif ci-dessus sous une forme aqueuse tamponnée est constitué d'environ 0,05 g/dl à environ 2,5 g/dl d'agent tensio-actif et de préférence de 0,1 g/dl à environ 0,5 g/dl, et d'au moins environ 0,025 U/ml d'enzyme (choles- térol-estérase) par rapport à la composition totale. La compo- sition obtenue a un pH compris entre environ 5,5 et environ 7,0. Lorsque la composition contient comme enzyme une lipase, l'agent lensio-actif est présent à raison d'environ 0,05 g/dl à environ 2,5 g/dl et de préférence de 0,1 g/dl à environ 0,5 g/dl et l'enzyme est présente à raison d'au moins environ 1,0 U/ml de la composition obtenue, cette composition ayant un pH compris entre environ 5,5 et environ 8,0. Dans les deux compositions enzymatiques, le tampon utili- sé peut être un maléate, sous forme du sel de sodium ou de potassium; un phosphate; un borate; un citrate; un succinate; un tampon imidazole-acétate; le Tris; etc. Ce- pendant on peut utiliser un tampon approprié quelconque. Ce tampon consiste en un tampon quelconque maintenant un pH constant dans la gamme désirée sans influence sur l'un quel- conque des composants. Lorsqu'on utilise un tampon maléate, par exemple le sel de potassium ou de sodium, on l'ajoute en des quantités telles qu'on obtienne une concentration d'environ 0,05 M à environ 0,5 M et le pH de la composition obtenue est d'environ 5,0 à environ 7,0. On utilise des concentrations semblables pour les autres tampons. En plusdes composants ci-dessus, on peut incorporer à ces compositions enzymatiques un agent accroissant la solubi- lité. Cet agent accroissant la solubilité est constitué d'une matière quelconque qui-vient aider l'agent tensio-actif dans la solubilisation. Par exemple des sels biliaires, tels que le cholate de sodium, le désoxycholate de sodium, etc. sont particulièrement efficaces. Dans un autre mode de réalisation préféré, l'agent tensio- actif répond à la formule ci-dessus o R représente un radical alkyle tel que le diéthanolamide de l'acide laurique ou le diéthanolamide de l'acide oléique. L'enzyme est d'origine animale, par exemple elle dérive du tissu pancréatique d'un animal, ou d'origine microbienne. Parmi les échantillons biologiques que l'on traite de façon appropriée figurent le sérum et le plasma humains.- Le réactif précédemment décrit, lorsqu'on le combine avec un échantillon biologique trouble, a pour effet de le clarifier. Le réactif est couramment présenté sous une forme aqueuse tamponnée. L'invention concerne également un réactif efficace pour clarifier un échantillon biologique troubI destiné à subir une détermination ou une analyse par photométrie qui comprend au moins un agent tensio-actif de formule: o /(CH (CHIC0)) xH -(CH2CH2O)yH o R représente un radical alkyle ou alcényle comprenant 5 à 17 atomes de carbone, x et y sont des nombres entiers dont la somme ne dépasse pas 11, et une enzyme choisie parmi la cho- lestérol-estérase, une lipase ou leurs mélanges. Un réactif préféré contient un agent tensio-actif répon- dant à la formule ci-dessus o R représente un radical alkyle, de préférence un radical lauryle, la somme de x et de y est 5 et l'enzyme est une lipase. Il est souhaitable que les compo- sitions de ce réactif contiennent de éther p-isooctyl- phényllique de polyéthylèneglycol ou d'autres agents tensio- actifs appropriés. Un autre réactif préféré qui provoque une clarification efficace d'échantillons troubles dans la gamme des pH de 2 à est un mélange de deux agents tensio-actifs, le diéthanol- amide de l'acide laurique (x = y = 1) et d'acide laurique époxylé (x + y = 5). On prépare les compositions enzymatiques comme précédem- ment décrit en utilisant l'agent tensio-actif ci-dessus. Parmi les agents tensio-actifs appropriés répondant à la formule cidessus figurent le diéthanolamide de l'acide laurique, le diéthanolamide de l'acide myristique, le diétha- nolamide de l'acide caprique, le diéthanolamide de l'acide oléique et le diéthanolamide d'acides de copra. Ce réactif, lorsqu'on le combine à un échantillon biolo- gique trouble, le clarifie de façon efficace et permet d'en effectuer de façon précise la détermination ou l'analyse par photométrie. On traite ainsi de façon avantageuse un échan- tillon destiné à l'analyse photométrique du cholestérol. L'invention va maintenant être décrite de façon détail- lée. L'invention, selon un de ses aspects, concerne un réac- tif et un procédé pour clarifier de façon efficace un échan- tillon trouble par emploi d'un agent tensio-actif particulier et d'une enzyme particulière. Cet agent tensio-actif répond à la formule X R-?-NI"" X \ '(CH2CH 20) H y o R représente un radical alkyle ou alcényle comportant 5 à 17 atomes de carbone et x et y sont chacun égaux à 1. De préférence R représente un radical alkyle comme c'est le cas par exemple du diéthanolamide de l'acide laurique. Le composant enzymatique est la cholestérol-estérase, une lipase ou un de leurs mélanges. La composition obtenue s'est révélée de façon très sur- prenante être très efficace pour clarifier un échantillon biologique trouble. Elle est donc extrêmement utile pour transformer unéchantillon biologique trouble en un échantil- lon biologique limpide. On peut soumettre l'échantillon ainsi traité à une déter- mination ou à une analyse colorimétrique d'un composant parti- - culier tant que les réactifs utilisés pour la détermination n'inhibent pas l'interaction entre l'agent tensio-actif et l' enzyme ou n'interfèrent pas avec elle et vice versa. Parmi les déterminations typiques que l'on peut effectuer en utilisant le réactif ci-dessus, figurent les déterminations du cholestérol, des triglycérides et de la créatine-phospho- kinase. Le composant enzymatique peut provenir d'une source ani- male, telle que le tissu pancréatique, ou d'une source micro- bienne. Selon un second aspect, l'invention concerne un réactif et un procédé qui clarifient de façon efficace un échantillon biologique trouble soumis à une détermination photométrique. Le réacteur comprend au moins un agent tensio-actif défini de façon plus large que ci-dessus, répondant à la formule S (CH2CH20) xH (CH2CH2O) yH o R représente un radical alkyle ou alcényle comportant 5 à 17 atomes de carbone, x et y sont des nombres entiers dont la somme n'est pas supérieure à 11, et une enzyme choisie parmi la cholestérol-estérase, une lipase ou leurs mélanges. Dans un mode de réalisation préféré, l'agent tensio- actif répond à la formule ci-dessus o R représente un radical alkyle et x et y sont chacun égaux à 1. On peut citer comme exemples d'un tel agent tensio-actif, le diéthanolamide de l'acide laurique, le diéthanolamide de l'acide myristique et le diéthanolamide de l'acide caprique. On préfère également les agents tensio-actifs dans lesquels R représente un radical alcényl et x et y sont égaux chacun à 1, tels que le diéthanol- amide de l'acide oléique et le diéthanolamide des acides de copra. Dans un autre mode de réalisation préféré, l'agent tensio-actif répond à la formule ci-dessus o R représente un radical alkyle et la somme de x et de y est 5. Le composant enzymatique peut provenir d'une source animale telle que le tissu pancréatique ou d'une source micro- bienne. Lorsqu'on utilise le réactif ci-dessus pour des déter- minations, on le combine sous une forme aqueuse tamponnée à un échantillon biologique. L'échantillon trouble est clarifié et est prêt à être soumis à la détermination. Parmi les échantillons qu'on clarifie et prépare de façon efficace pour une détermination, figurent le sérum et le plas- ma humains. Le procédé et le réactif de l'invention sont remarquables au moins à deux égards. Ils permettent la détermination de composants d'échantillons biologiques sous une forme libre limpide sans qu'on soit gêné par le trouble et de plus par suite de l'interaction entre l'agent tensio-actif particulier et l'enzyme particulière utilisés, ils permettent d'utiliser des quantités d'enzyme inférieures à celles qu'on utilise normalement pour la détermination du cholestérol. A ce dernier égard, l'emploi de quantités plus faibles sans diminution des vitesses de réaction peut être considéré comme une améliora- tion de la vitesse de la réaction enzymatique. La détermination la plus courante du cholestérol dans un liquide biologique est la détermination du cholestérol total qui est la somme du cholestérol libre et des esters de choles- térol. Le cholestérol et ses esters sont présents dans le sé- rum avec d'autres lipides et diverses protéines dans des com- plexes micromoléculaires appelés lipoprotéines et les esters du cholestérol constituent normalement le composant principal (60-80%) du cholestérol-total. Ils sont généralement insolu- bles dans l'eau et normalement cachés à l'intérieur du comple- xe et inaccessibles aux enzymes. Pour déterminer le cholesté- rol total selon une méthode entièrement enzymatique, qu'elle soit automatique ou manuelle, on doit tout d'abord libéré le cholestérol et les esters de cholestérol avec un agent tensio- actif approprié. On hydrolyse ensuite les esters de cholesté- rol par la cholestérol-estérase pour obtenir le cholestérol libre qu'on oxyde à son tour par la cholestérol-oxydase pour former la cholesténone et du peroxyde d'hydrogène. Le procédé précédemment décrit peut également être utili- sé de façon automatique par exemple avec un analyseur automa- tique ou être réalisé manuellement. Pour préparer les compositions utiles dans une détermi- nation selon le procédé de l'invention, on prépare une solu- tion aqueuse contenant, en plus de l'agent tensio-actif et de l'enzyme, d'autres matières de référence connues dans l'art et utilisées à une telle fin. Par exemple, pour la détermination du cholestérol on utilise les composants suivants dans les gammes indiquées ci- dessous. Composants Détermination du cholestérol Peroxydase 0,8 - 2,0. U/1 Cholestérol-oxydase 0,025 - 0,3 U/ml Cholestérol-estérase 0,025 - 0,3 U/ml Tensio-actif 0,05 - 0,5 g/dl Cholate de sodium 0,05 - 0,5 g/dl phydroxybenzoate de sodium 2,5 - 6 g/dl Amino-4 antipyrine 0,5 - 2,0 mM Acide maléique 0,1 - 0,5 M pH 5,5 - 7,0 Rapport échantillon/réactif 100 400 Dans la composition ci-dessus, on préfère utiliser une cholestérolestérase d'origine animale, provenant par exemple du pancréas; cependant on obtient des résultats équivalents avec une cholestérol-estérase d'origine microbienne. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE I Clarification avec de la cholestérol-estérase. On mélange 3 ml de réactif clarifiant contenant du malate de potassium (0, 1 M), du cholate de sodium (0,25 g/dl), du diéthanolamide de l'acide laurique (0,2 g/dl) et de la choles- térol-estérase (0,08 U/ml à 0,8 U/ml) avec un pH final de 6,0 avec 0,025 ml de sérum lipémique (environ 1400 mg/dl de tri- glycérides). Le mélange réactionnel se clarifie en 10 minutes à 45 C. La cholestérol-estérase utilisée pour la clarification peut provenir de pancréasou de micro-organismes. EXEMPLE II Emploi pour la détermination du cholestérol. Pour effectuer la réaction chimique illustrée dans cet exemple, on incorpore les ingrédients nécessaires à la déter- mination du cholestérol au réactif clarifiant. On utilise 3 ml d'une composition contenant de la choles- térol-estérase (0,125 U/ml), de la cholestérol-oxydase (0,125 U/ml), de la peroxydase (1,6 U/ml), de l'amino-4 anti- pyrine (0,6 mM), de l'hydroxybenzoate de sodium (25 mM), du cholate de sodium (0,25 g/dl), du diéthanolamide de l'acide laurique (0,2 g/dl) et du maléate de potassium (0,1 M) à pH 6,0. On mélange la totalité du réactif avec 0,025 ml d'échan- tillon de sérum lipémique. On incube ensuite le mélange à 45 C pendant 4 à 5minutes. On détermine ensuite le cholestérol total par mesure de l'intensité de la coloration à 520 nm. Sans l'effet de clarification du diéthanolamide de l'acide laurique et de de la cholestérol-estérase, la détermination du cholestérol dans des échantillons troubles conduit toujours à des résul- tats erronés. EXEMPLE III Clarification par la lipase de Candida(Candida cylindracea). On mélange 3 ml d'un réactif clarifiant contenant du diéthanolamide de l'acide laurique (0,2 g/dl), du cholate de sodium (0,25 g/dl), de la lipase (25 U/ml) et du tampon maléate (0,1 M) à pH 6,0 avec 0,025 ml de sérum lipémique. L'échantillon trouble se clarifie après 5 minutes d'incuba- tion à 45 C. Lorsqu'on utilise une quantité équivalente d'un agent clarifiant comprenant un mélange de diéthanolamide d'acide laurique et d'acide laurique époxylé (x + y = 5) on obtient des résultats de clarification comparables. EXEMPLE IV On mélange 3 ml d'un réactif clarifiant contenant un agent tensio-actif de formule: 0 (CH2CH20) H Cil 25 2(CH2CH2O) H y o x + y = 5 (0,2 g/dl), du Triton X-100 (0,4 g/dl), du ma- léate de potassium (0,2 M) et de la lipase (25 U/ml) à pH 6,0 avec 0,05 ml d'échantillon lipémique et on incube à 45 C. L' échantillon trouble se clarifie après 3 minutes. La vitesse de clarification est accrue lorsqu'on augmente la concentration du tampon. On obtient des résultats semblables lorsqu'on utilise des concentrations plus élevées d'acide laurique époxylé (x + y = 5) sans l'aide de Triton X-100. EXEMPLE V A. Composition On prépare un litre d'une solution aqueuse de réactif de diagnostic avec les ingrédients suivants: Ingrédients Concentration Acide malique 11,6 g KOH 10,0 g EDTA (K2) 2,7 mM Cholate de sodium 5,8 mM phydroxybenzoate de sodium 25,0 mM Amino-4 antipyrine 0,6 mM Diéthanolamide de l'acide laurique 2,0 g Cholestérol-estérase 125 unités Cholestérol-oxydase 125 unités Peroxydase de raifort 800 unités On ajustele pH à 6,0. On peut conserver le système réactif et l'utiliser sous forme d'une solution aqueuse ou on peut lyophiliser la solu- tion de façon classique et la reconstituer avec de l'eau lors de l'emploi. B. Détermination du cholestérol total On mélange 3 ml du réactif cidessus avec 0,025 ml de sérum ou de sérum standard reconstitué contenant jusqu'à 500 mg/dl de cholestérol. On effectue la réaction à 45 C pendant 4 à 5 minutes. On mesure l'absorbance des échantillons à 525 nm relativement à un blanc constitué du réactif. EXEMPLE VI Clarification dans la détermination de l'activité créatinine- phosphokinasique (CPK) du sérum lipémique. On mélange 2 ml de tampon imidazole-acétate 0,1 M à pH 6,7 contenant du diéthanolamide de l'acide laurique (0,4 %), de la cholestérol-estérase pancréatique (25 U/dl), du cholate de sodium (0,25 g %) et du thioglycérol (20 mM) avec 0,05 ml de sérum lipémique. Après 15 minutes d'incubation à 37 C, la turbidité à 340 nm s'abaisse de 2,3 D.O. à 0,02 D.O. On mélan- ge ensuite l'échantillon limpide avec 1 ml de réactif pour la détermination de la CPK contenant du créatine phosphate (116,7 mM), de l'ADP (6,7 mM), de l'AMP (16,7 mM), de i'EDTA (6,7 mM), du NADP (6,7 mM), de l'hexokinase (125 U/dl et de la glucose-6-phosphaste-déshydrogénase, G6PDH (100 U/dl) préparé dans du tampon imidazole-acétate 0,1 M à pH 6,7. Pour déter- miner l'activité de la CPK, on suit l'évolution du mélange à 340 nm et à 37 C comme dans le procédé classique. Bien entendu l'invention est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Réactif pour clarifier un échantillon biologique trouble, caractérisé-en ce qu'il comprend un agent tensio- actif de formule O /(CH2CH20) H R-C-IN (CH2CH20) H o R représente un radical alkyle ou alcényle comprenant 5 à 17 atomes de carbone et x et y sont chacun égaux à 1 et une enzyme choisie parmi la cholestérol-estérase, une lipase ou leurs mélanges. 2. Réactif selon la revendication 1, sous une forme aqueuse tamponnée caractérisé en ce que ledit agent tensio- actif a une concentration d'environ 0,05 g/dl à environ 2,5 g/dl et ladite enzyme, qui est la cholestérol-estérase a une concentration d'au moins environ 0,025 U/ml relativement à la composition obtenue, cette composition ayant un pH compris entre environ 5,5 et environ 7,0. 3. Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce que le tampon est un maléate utilisé à une concentration d' environ 0,05 M à environ 0,5 M et en ce que le pH de la com- position obtenue est d'environ 5,0 à environ 7,0. 4. Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient un agent accroissant la solubilité. 5. Réactif selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent accroissant la solubilité est le cholate de so- dium ou le désoxycholate de sodium en une quantité telle que sa concentration soit d'environ 0,25 g/dl par rapport à la composition totale. 6. Réactif selon la revendication 1, sous une forme aqueuse tamponnée, caractérisé en ce que ledit agent tensio- actif a une concentration d'environ 0,05 g/dl à environ 2,5 g/dl et ladite enzyme qui est une lipase a une concentration d'environ 1,0 U/ml par rapport à la composition obtenue, cette composition ayant un pH compris entre environ 5,5 et environ 8,0. 7. Réactif selon la revendication 6, caractérisé en ce que le tampon est un maléate utilisé à une concentration d' environ 0,05 M à environ 0,5 M et en ce que le pH de la compo- sition obtenue a une valeur d'environ 5,0 à environ 7,0. 8. Réactif selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il contient un agent accroissant la solubilité. 9. Réactif selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'agent accroissant la solubilité est du cholate de so- dium ou du désoxycholate de sodium en une quantité telle que sa concentration soit d'environ 0.,25 g/dl dans la composition totale. 10. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le symbole R dans la formule dudit agent tensio-actif représente un radical alkyle. 11. Réactif selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif est le diéthanolamide de l'acide laurique. 12. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite enzyme est d'origine animale ou microbienne. 13. Réactif selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite enzyme est la cholestérol-estérase dérivant d'un tissu pancréatique animal. 14. Procédé pour clarifier de façon efficace un échantil- lon biologique trouble caractérisé en ce qu'il consiste à com- biner à cet échantillon biologique un réactif selon la reven- dication 1. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite combinaison est sous une forme aqueuse tamponnée. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sérum humain. 17. Réactif pour clarifier un échantillon biologique trouble destiné à être soumis à une détermination ou une ana- lyse par photométrie, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un agent tensio-actif de formule: 0 (CH2CH2O) XH R-C-N (CH2CH2O)yH o R représente un radical alkyle ou alcényle comprenant 5 à 17 atomes de carbone, x et y sont des nombres entiers dont la somme n'est pas supérieure à 11 et une enzyme choisie parmi la cholestérc-estérase, la lipase ou leurs mélanges. 18. Réactif selon la revendication 17, sous une forme aqueuse tamponnée, caractérisé en ce que ledit agent tensio- actif répondant à la formule ci-dessus o x + y ne dépasse pas a une concentration d'environ 0,05 g/dl à environ 2,5 g/dl et ladite enzyme qui est la cholestérol-estérase a une con- centration d'au moins environ 0,025 U/ml par rapport à la composition obtenue, cette composition ayant un pH compris entre environ 5,5 et environ 8,0. 19. Réactif selon la revendication 18, caractérisé en ce que le tampon est un maleate utilisé à une concentration d' environ 0,05 M à environ 0,5 M et le pH de la composition ob- tenue a une valeur d'environ 5,0 à environ 7,0. 20. Réactif selon la revendication 17, sous une forme aqueuse tamponnée caractérisé en ce que ledit agent tensio- actif a une concentration d'environ 0,05 g/dl à environ 0,5 g/dl et ladite enzyme qui est une lipase, a une concentration d'au moins environ 1,0 U/ml par rapport à la composition obtenue, cette composition ayant un pH compris entre environ 2,0 et environ 10,0. 21. Réactif selon la revendication 20, caractérisé en ce que le tampon est choisi parmi un maleate, un citrate, un succinate, le Tris ou un borate utilisé à une concentration d' environ 0,05 M à environ 0,5 M et en ce que le pH de la com- position obtenue a une valeur d'environ 2,0 à environ 10,0. 22. Réactif selon la revendication 17, caractérisé en ce que le symbole R de la formule de l'agent tensio-actif veut représenter un radical alkyle et x et y sont chacun égaux à 1. 23. Réactif selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif est le diéthanolamide de l'acide laurique. 24. Réactif selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif est le diéthanolamide de l'acide myristique. 25. Réactif selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif est le diéthanolamide de l'acide caprique. 26. Réactif selon la revendication 17, caractérisé en ce que dans la formule dudit agent tensio-actif, R représente un radical alcényle et x et y sont chacun égaux à 1. 27. Réactif selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif est le diéthanolamide de l'acide oléique. 28. Réactif selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif est le diéthanolamide d'acides de copra. 29. Réactif selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite enzyme est d'origine animale ou microbienne. 30. Réactif selon la revendication 29, caractérisé en ce que ladite enzyme est la cholestérol-estérase dérivant de tissu pancréatique animal. 31. Réactif selon la revendication 17, caractérisé en ce que dans la formule dudit agent tensio-actif R représente un radical alkyle et la somme de x et de y est égale à 5 et en ce que ladite enzyme est une lipase. 32. Réactif selon la revendication 31, caractérisé en ce qu'il contient de l'éther p-isooctylphénylique du polyéthylène- glycol (Triton X-100). 33. Procédé pour clarifier de façon efficace un échantil- lon biologique trouble destiné à être soumis à une détermina- tion photométrique, caractérisé en ce qu'il consiste à combi- ner cet échantillon avec un réactif selon la revendication 17. 34. Procédé selon la revendication 33, caractérisé en ce que ladite combinaison est sous une forme aqueuse tamponnée. 35. Procédé selon la revendicatbn 34, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est un échantillon de sérum humain. 36. Procédé selon la revendication 33, caractérisé en ce que ledit échantillon est soumis à une détermination photo- métrique du cholestérol. 37. Réactif selon la revendication 17, sous une forme aqueuse tamponnée caractérisée en ce que ledit agent tensio- actif ayant la forme indiquée est constitué d'un mélange de diéthanolamide de l'acide laurique et d'acide laurique épo- xylé (x + y = 5) ce mélange ayant une concentration d'environ 0,05 g/dl à environ 2,0 g/dl par rapport à la composition obtenue, cette composition ayant un pH compris entre environ 2,0 et environ 10,0. 38. Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif a une concentration d'environ 0,1 g/dl à environ 0,5 g/dl par rapport à la composition ob- tenue. - 39. Réactif selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif a une concentration d'environ 0,1 g/dl à environ 0,5 g/dl par rapport à la composition obtenue.