Brevet FR2496466A1 — publié le 19820625

La présente invention concerne un procédé de production d'hormone lactogène, placentaire, humaine, ou somatolactostimuline chorionique, humaine, ci-après dé- signée en abrégé par HLPh. HLPh est une hormone sécrétée par les cellules syncytiotrophoblastiques, humaines, des villosités chorio- niques, qui stimule la croissance et présente une activité antiinsulinique. A ce jour, il n'existe pas de procédé de production à l'échelle industrielle de HLPh à bas prix. La présente invention est basée sur la constata- tion inattendue que certains lymphoblastoides humains, ca- pables de produire cette hormone, conviennent pour la pro- duction industrielle de HLPh, en raison de leur vitesse de multiplication, et de leur taux de production d'hormone par cellule, très élevés. Le nouveau procédé selon l'invention de produc- tion de HLPh consiste à multiplier des lymphoblastoldes hu- mains, capables de produire cette hormone, par transplanta- tion de ces cellules dans le corps d'un animal à sang chaud, ou en fournissant à ces cellules, à l'aide d'un dispositif, le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud, et à laisser les cellules humaines, ainsi multipliées, libérer l'hormone HLPh. Le procédé selon l'invention, tout en aboutissant à une.roduction supérieure en HLPh,n'exige que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum coCteux pour la mul- tiplication cellulaire, et il permet de maintenir, plus facilement que dans le cas de la culture de tissu in vitro, le milieu de culture au cours de la multiplication cellu- laire. En particulier, tous les lymphoblastoides humains, capables de produire HLPh, peuvent être facilement multi- pliées, grâce à l'utilisation de fluide corporel nutritif, provenant d'un animal à sang chaud, par transplantation des cellules en question dans le corps de l'animal, ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion équi- pée pour recevoir le fluide corporel nutritif, l'animal étant alimenté de manière habituelle. Ce procédé est également caractérisé par une multiplica- tion des cellules plus stable et plus élevée, et par une production supérieure de HLPh par cellule. Conviennent, conformément à l'invention, tous les lymphoblastotdes humains dans la mesure o ils pro- duisent HLPh et se multiplient aisément dans le corps d' un animal à sang chaud. Les lymphoblastoldes humains pré- férés sont ceux qui sont dotés de sites génétiques, com- mandant la production de HLPh,des cellules humaines qui produisent par nature cette hormone, comme les syncytiotro- phoblastes des villosités chorioniques, ou des cellules d' épithélioma chorionique, ou ceux qui produisent de lHLPh ectopique comme les cellules de carcinome du poumon; ces sites peuvent être introduits au moyen de la fusion cel- lulaire, utilisant des agents tels que polyéthylène glycol ou virus de Sendat, ou par des techniques de recombinaison génétique avec de l'ADN ligase, nucléase ou ADN polymérase; conviennent aussi des lymphoblastoïdes humains, qui pro- duisent de 1' HLPh ectopique. Comme l'utilisation de ces lymphoblastotdes humains aboutit à la formation de tumeurs massives, pouvant 4tre facilement désagrégées, et que ces tumeurs ne sont guère contaminées par les cellules de 1' hôte animal, la récolte des cellules de lymphoblastotdes humains, multipliés, vivantes, est facile. Conviennent comme animaux utilisables dans le procédé selon l'invention tous ceux, dans lesquels les lymphoblastoïdes humains peuvent se multiplier, par exem- ple des volailles comme poulet et pigeon, des mammifères comme chat, chien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, la- pin, cobaye, hamster, souris ou souris nue. Comme cette transplantation cellulaire provoque une immunoréaction in- désirable, il s'avère souhaitable d'utiliser des animaux nouveau-nés ou en bas âge, ou encore au stade le plus jeune 249646i possible, comme oeuf, embryon ou foetus. Afin de réduire l'immunoréaction, l'animal peut être traité, avant la transplantation des cellules, par irradiation aux rayons- X ou aux rayons- Y, d'environ 200 à 600 rems, ou par in- jection d'antisérum ou d'agent immunodépresseur préparé selon un procédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente l'immunoréaction la plus faible, m4me à l'âge adulte, on peut l'utiliser avan- tageusement sans prétraitement, pour y transplanter et y multiplier rapidement des lignées de lymphoblastoldes hu- mains. Une multiplication cellulaire, stabilisée, et une augmentation de la production de HLPh, peuvent être à la fois réalisées par transplantation répétée, utilisant des combinaisons de différents animaux à sang chaud s on peut atteindre ces objectifs en implantant d'abord les cellules chez le hamster, o elles se multiplient, puis en les réimplantant chez la souris nue. En outre, on peut effectuer la transplantation successive chez des animaux de la même classe ou division, aussi bien que chez ceux de la même espèce ou du même genre. En ce qui concerne la localisation de l'implan- tation des lymphoblastoldes humains, conviennent tous les sites de l'animal, pourvu que les cellules puissent s'y multiplier, par exemple la cavité allantoïque, ou les voies intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée. A côté de cette transplantation directe des lym- phoblastotdes humains, au corps de l'animal, existe la possibilité de faire se multiplier aisément les lignées classiques/lymphoblastoIdes humains, capables de produire HLPh, en utilisant le fluide corporel nutritif provenant de l'animal, gr9ce à l'inclusion, par exemple par voie in- trapéritonéale, dans le corps de l'animal d'une chambre de diffusion classique, de taille et de forme appropriées, mu- nie d'une membrane poreuse filtrante, d'un ultra-filtre ou de fibre creuse d'un diamètre de pore de l'ordre de -7 à 10-5 m, qui empoche la contamination de la cham- bre de diffusion par les cellules de l'hôte tout en per- mettant l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut 4tre conçue, si nécessaire, pour 4tre placée sur l'hôte animal et permettre au fluide corporel de ce dernier de circuler dans la chambre, les parois de celle-ci peuvent être munies de fenêtres latérales, transparentes, permet- tant l'observation de la suspension de cellules, ainsi que le remplacement et l'échange avec une chambre frai- che: la multiplication cellulaire est ainsi augmentée à un niveau encore supérieur, rapporté à la durée de vie de l'animal, et la production par animal est encore accrue sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu'on utilise cet- te chambre de diffusion, comme les cellules humaines mul- tipliées peuvent être facilement récoltées, et qu'il n'y a pas manifestation d'immunoréaction, du fait de l'absen- ce de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'hôte animal, on peut utiliser comme hôte, conformé- ment à l'invention, sans prétraitement destiné à réduire l'immunoréaction, tout animal à sang chaud. L'alimentation de l'hôte animal, auquel on a implanté des lymphoblastoldes humains, peut s'effectuer facilement par procédé classique, même après la transplan- tation cellulaire, et elle ne nécessite pas de soins par- ticuliers. La multiplication cellulaire maximale est at- teinte environ l à 20 semaines après l'implantation des cellules, en général au bout de 1 à 5 semaines. Conformément à l'invention on obtient 107 à 101 ou plus, de lymphoblastoïdes humains par hôte. Autrement dit, le nombre de cellules humaines implantées chez l'hô- te animal s'accroit 102 107 fois ou plus, ou bien est d'environ 101 à 106 fois ou plus celui que l'on obtient avec un procédé de culture de tissu in vitro, utilisant un milieu nutritif, aussi ces cellules sont-elles avanta- geusEment utilisables pour la production d'HLPh. En ce qui concerne la libération de l'hormone HLPh par les lymphoblastotdes humains, tout moyen appro- prié peut 4tre employé. Par exemple, les lymphoblastoides humains obtenus par multiplication en ascite, en suspen- sion, et récolte à partir de cet ascite, ou par extrac- tion de tumeur massive, formée sous la peau, et récolte après désagrégation de la tumeur, sont mises en suspen- sion pour atteindre une concentration de 104 à 108 cel- lules par ml dans un milieu nutritif, préchauffé à une température de l'ordre de 20WC à 400C, puis mises à in- cuber à cette température pendant 1 à 50 heures, pour pro- duire HLPh. L'augmentation de la production de HLPh peut être réalisée par la présence d'une ou de plusieurs sub- stances comprenant des amino-acides comme leucine, lysine, arginine ou cystéine; des sels minéraux comme chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, et sulfate de ma- gnésium; et des hormones comme celle qui libère l'hormone lutéinisante.En outre, au cours de la production de HLPh, il peut, conformément à l'invention, y avoir production si- multanée de gonadotropine chorionique, humaine, désignée ci-après par l'abréviation GCh. L'HLPh, ainsi obtenue, peut être recueillie fa- cilement grâce à des techniques de purification et de sé- paration utilisant des modes opératoires classiques tels que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, con- centration et lyophilisation. Quand on souhaite un pro- duit encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supérieure par combinaison des techniques mention- nées plus haut avec d'autres modes opératoires classiques, tels qu'adsorption et désorption avec échange d'ions, fil- tration sur gel, chromatographie par affinité, fractionne- ment au point isoélectrique et électrophorèse. La préparation d'HLPh, ainsi obtenue, peut ê- tre avantageusement utilisée, seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, pour injection, administra- tion externe, interne ou de diagnostic, pour la préven- tion ou le traitement de maladies humaines. Au cours de la présente description, la produc- tion d'HLPh est dosée par le procédé de radio-immuno essai décrit par P. Bech. et coll., J. Clin. Endocrinol., Vol. , pp. 1457-1462 (1965); elle est exprimée en poids par rapport à la préparation étalon de HLPh disponible au National Institutes of Health (USA). De même, la produc- tion de GCh est dosée par le procédé de radio-immuno essai décrit par A.R. Midgley Jr., Endocrinology, Vol. 79, pp. -18 (1966), et exprimée en Unités Internationales (UI). L'invention est illustrée ci-après par plusieurs formes de réalisation non limitatives. EXEMPLE 1 Des cellules d'épithelioma chorionique humain désagrégé, obtenues par extraction d partir d'un patient souffrant d'épithelioma chorionique, suivie de hachage et une li- gnée de lymphoblastoldes leucémiques, humains, de Namalwa, sont mises en suspension ensemble dans un récipient avec une solution saline de 140 mM de NaCl, 54 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4 et 2 mM de CaCl2, de manière à obtenir des con- centrations cellulaires respectives de l'ordre de 104 cel- lules/ml. La suspension de cellules, refroidie à la glace, est mélangée avec une préparation fratche de la même solu- tion saline, contenant du virus de Sendal préalablement inactivé par irradiation à l'ultra-violet, le tout est transféré 5 minutes après le mélange dans un incubateur à 37 C, et y est agité pendant 30 minutes pour réaliser la fusion cellulaire, introduisant l'aptitude à produire l'HLPh des cellules d'épithelioma chorionique, humain, dans la lignée des lymphoblastoldes leucémiques, humains. Après clonage selon un procédé classique de la souche de cellules d'hybridome, capable de produire l'HLPh, on l' implante par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau et pesant chacune environ 15 g, sont extraites, désagrégées par hachage et mises en sus- pension dans du sérum physiologique contenant de la tryp- sine. Après lavage des cellules avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de veau, les cellules sont remises en suspension, à une concentration de 10 cellules/ml, dans une prépa- ration fratche du même milieu qui contient 30 mM de L-ar- ginine, et l'on met à incuber à 350C pendant 20 heures environ pour obtenir HLPh. Les cellules sont ensuite sou- mises aux ultra-sons, et la quantité d'HLPh présente dans la partie surnageante est dosée. La production d'HLPh est d'environ 340,,Ag/ml de suspension cellulaire. La produc- tion simultanée de GCh dans la partie surnageante est de l'ordre de 230 IU/ml de suspension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues par implantation dans la souris nue de cellules d'4pithelioma chorionique humain, suivie d'une alimentation normale des animaux pen- dant 5 semaines,puis d'une extraction des tumeurs massi- ves résultantes se formant sous la peau et pesant 5 g cha- cune qui sont désagrégées, sont traitées comme plus haut pour induire HLPh. La production de cette hormone n'est que de 3/ g/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 2 Des cellules de carcinome du poumon humain, désagrégé, ob- tenues par extraction à partir d'un patient souffrant de carcinome pulmonaire, suivie de hachage, et une lignée de lymphoblastotdes leucémiques,humains, JBL, sont mises à fusionner comme dans l'exemple 1; on introduit ainsi l' aptitude à produire de l'HLPh des cellules de carcinome du poumon humain, dans la lignée des lymphoblastotdes leu- cémiques, humains. Après clonage à la manière classique de la souche de cellules d'hybridome capable de produire l'HLPh, on l'implante par voie sous-cutanée chez des hamsters nouveau-nés, ayant préalablement reçu de l'anti- sérum, préparé à partir d'un lapin par un procédé clas- sique, afin de réduire leur immunoréaction; ces animaux sont nourris de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau et pesant environ 10 g chacune, sont extraites et désagrégées par hachage, puis mises en suspension dans du sérum phy- siologique contenant de la collagénase. Après lavage des cellules avec du milieu essentiel, minimal, d'Eagle (pH 7,2), additionné de 5% vole/vol. de sérum humain, ces cel- lules sont remises en suspension à la concentration de 1' ordre de 105 cellules/ml, dans une préparation fraiche du même milieu, contenant 20 mM de L-lysine et 10 mM de sul- fate de magnésium; elles sont ensuite mises à incuber à 37 C pendant 15 heures pour produire de l'HLPh. La produc- tion de cette hormone est de 150,ug/ml de suspension cel- lulaire. Les cellules témoins, obtenues par implantation de cellu- les de carcinome du poumon humain à des hamsters, que 1' on nourrit de manière habituelle pehdant 3 semaines, sui- vie de l'extraction des tumeurs massives, résultantes, qui se forment sous la peau, de 3 g chacune environ, et de la désagrégation de ces tumeurs, sont traitées comme plus haut. La production d'HLPh n'est que de 0,9/kg/ml de sus- pension cellulaire. EXEMPLE 3 - A des rats nouveau-nés on implante, par voie intraveineuse, une lignée de lymphoblastoldes leucémiques humains BALL-1, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLPh de cellules d'épithelioma chorionique humain a été introduite, comme dans l'exemple 1; puis on nourrit les rats de manière ha- bituelle, pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, ré- sultantes, environ 30 g chacune, sont extraites et désa- grégées. Après lavage des cellules avec du milieu RPMI 1640 (pH 7,4), additionné de 10% en volume/volume de sé- rum de veau foetal, ces cellules sont remises en suspen- sion, à la concentration de l'ordre de 1 cellules/ml, dans une préparation fratche du même milieu, contenant mM de L-arginine; on met alors à incuber à 300C pen- dant 40 heures pour produire lPHLPh. La production d'HLPh est de l'ordre de 410xq/ml de suspension cellulaire. La production simultanée de GCh est voisine de 870 UI/ml de suspension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues par implantation de cel- lules d'épithélioma chorionique humain à des rats, que l'on nourrit de manière habituelle pendant 4 semaines, sui- vie de l'extraction des tumeurs massives résultantes (en- viron 5 g chacune) et de leur désagrégation, sont traitées comme plus haut. La production d'HLPh n'est que de 2>pg/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 4 Après avoir subi une irradiation de 400 rems environ de rayons-X, pour la réduction de ltimmunoréaction, des sou- ris adultes reçoivent, par voie sous-cutanée, des implants de lignée de lymphoblastoldes leucémiques humains NALL-1, dans laquelle l'aptitude à produire l'HLPh des cellules de carcinome du poumon humain a été introduite comme dans l'exemple 2; puis on nourrit les souris de manière habi- tuelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résultan- tes, formées sous la peau et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et désagrégées. Les cellules obtenues sont traitées comme dans l'exemple 2 pour produire l'HLPh. La production de cette hormone est d'environ 210^, /g/ml de suspension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues par implantation de cellu- les de carcinome du poumon humain à des souris, que l'on nourrit de manière habituelle pendant 3 semaines, suivie de l'extraction des tumeurs massives résultantes (5 g environ chacune) et de leur désagrégation, sont traitées comme plus haut. La production d'HLPh n'est que de 1 g/ ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 5 Une lignée de lymphoblastoldes leucémiques, humains, TALL-1, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLPh des cellules d'épithélioma chorionique humain, a été in- troduite comme dans l'exemple 1, est mise en suspension dans du sérum physiologique, puis le tout est transféré dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plas- tique, dont le volume intérieur est de l'ordre de 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant des pores d'environ 0,5, de diamètre. Après inclusion, par voie intrapéritoné- aie, de cette chambre dans un rat adulte, on nourrit ce- lui-ci de manière habituelle pendant 4 semaines, puis on enlève la chambre. La densité en cellules humaines dans la chambre, atteinte au cours de l'opération ci-dessus, est d'environ 7 x 108 cellules/ml, ce qui est environ 102 fois supérieur, ou même plus, à ce qu'on atteint avec une culture in vitro à l'aide d'un incubateur à C0o. Les cellu- les humaines, ainsi obtenues, sont traitées comme dans 1' exemple 3, pour induire l'HLPh. La production en HLPh est de l'ordre de 380/ug/ml de suspension cellulaire. La production simultanée du GCh est voisine de 750 IU/ml de suspension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues par mise en suspension dans du sérum physiologique de cellules d'épithélioma chorioni4- que humain, transfert de la suspension de cellules résul- tante dans la chambre de difusion, inclusion par voie in- trapéritonéale de la chambre dans un rat, alimentation de ce dernier de manière habituelle pendant 4 semaines, et récolte des cellules de lymphoblastoides humains, multi- pliées à une densité environ 1 cellules/ml, sont traitées comme plus haut. La production en HLPh n'est que de 1kug/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 6 Une lignée de lymphoblastotdes leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLPh des cellu- les syncytiotrophoblastiques, humaines, a été introduite comme dans l'exemple 1, est implantée dans la cavité al- lantolque d'oeufs embryonnés, préalablement mis à incuber à 370C pendant 5 jours. Après incubation des oeufs embryon- nés à cette température,pendant 1 semaine supplémentaire, les cellules humaines, multipliées, sont récoltées et trai- tées comme dans l'exemple 1, pour induire l'HLPh. La pro- duction d'HLPh est voisine de 190/q/ml de suspension cel- lulaire. La production simultanée de GCh est de l'ordre de 210 U I/ml de suspension cellulaire. Lors de l'expérimentation témoin, au cours de laquelle des syncytiotrophoblastes humains sont implantés dans les cavités allantoIques d'oeufs embryonnés, on n'observe pas *de multiplication cellulaire. Revendications 1. Procédé pour la production d'hormone lactogène, placentaire, humaine (HLPh), par multiplication de lym- phoblastoTdes humains, capables de produire HLPh et libé- ration de cette hormone par les cellules multipliées, ca- ractérisé en ce qu'on utilise, pour la multiplication cel- lulaire, un animal à sang chaud. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée par im- plantation des cellules humaines dans le corps de l'animal à sang chaud. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée à l'ai- de d'un dispositif, dans lequel le fluide corporel nutri- tif d'un animal à sang chaud est fourni aux cellules hu- maines. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion équipée de manière à ce que les cellules de l'hôte animal ne la contaminent pas. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que les lymphoblastoldes humains, capables de produire HLPh, sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoTdes humains, avec des cellules humaines capables de produire HLPh. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoïdes humains avec des cellules d'épithélioma chorionique humain. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastotdes humains avec des cellules syncytiotrophoblastiques, humaines, prove- nant des villosités chorioniques. 8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fu- sion cellulaire d'une/ignée de lymphoblastoldes humains avec des cellules de carcinome du poumon humain. 9. Procédé selon une des revendications 1 à 8, carac- térisé en ce que la lignée de lymphoblastoldes humains est une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques, humains. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoïdes leucémiques, humains est une lignée de Namalwa, de NALL-1, de BALL-1, de TALL- 1 ou JBL. 11. Procédé selon une des revendications 1 à 10, ca- ractérisé par la production simultanée d'hormone gonadotro- pique, chorionique, humaine (GCh). 12. Procédé selon une des revendications 1 à 11, ca- ractérisé en ce qu'on laisse les lymphoblastoTdes humains, multipliés, libérer l'HLPh, en présence d'un ou de plu- sieurs des produits suivants s leucine, lysine, arginine, cystéine, chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlo- rure de calcium, sulfate de magnésium et hormone libéra- trice d'hormone lutéinisante. 13. Procédé selon une des revendications 1 à 9, ca- ractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volail- le, en particulier poulet ou pigeon, ou un mammifère, no- tamment chien, chat, singe, châvre, porc, vache, cheval, lapin, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.