Brevet FR2497798A1 — publié le 19820716

La px6sente invention a pour (,bj-t de nouveaux peptides portant un fluorophore, leur procédé de préparation et leur application au dosage fluorimftrique des endotoxines (lipopolysaccharides ou lipopolyosides bactériens) et de certaines enzymes protéolytiques. Il est connu de doser les endotoxines par mesure de l'élévation de température provoquée chez le lapin (cf par exemple Pharmacopée Française, IXè édition, II-235 à II238), par Incsure du temps de formation d'un gel à partir de lysat d'amCbocyte du Limule (cf par exemple COOPER, LEVIN, WAGNER, J. Lab. Cli. Med, july, 1971, 138-148) et par colorimétrie à ltaide de la pnitroaniline (cf IWANAGA et al., Hacostasis 7, 183-108, 1978; HARADA et al., Progress in clinical and biological research, vol. 29, 1979, 209-220) . Généraleinent ces méthodes ne sont pas quantitatives d'une part et leur sensibilité est insuffisante pour permettre de détecter de très faibles quantités (quantités de l'ordre du picogramme) d'endotoxines d'autre part. Il a maintenant été trouvé, conformément à la présente invention, de nouveaux peptides portant un fluoro- phore, qui permettent de déterminer quantitativement les endotoxines avec une sensibilité très supérieure à celles obtenues avec les méthodes indiquées plus haut. Ces nouveaux peptides peuvent Ctre représentés par la formule générale: [Pept} NH-CH2-CO-NH-CH-CO {NH-Ar] (I) (CH2)n X) B dans laquelle [Peptj désigne une chaîne peptidique hydrer:hobe, ":n" est égal a 1, 2, 3, 4 nu 5, Fi t-It un radic.l NESra2 R. 1 X- NH - A 2ou - N-R2, R1, R2 et R3 désignant des NH2 3 atomes d'hgiydrogène ou des yroupes méthyle, -NH - AW dasigne le res:te d'une amine aromatique ou hftéroaromatiqun A - NH2 fluorescente, dont le spectre de fluorescernce est fortemrnent d-plat:é par acyl.ition de l'amine, et X' désigne un anion, an part:teiculier l'anion C13. Par a:,)ine fluorescente Am - NHl2 dont le spectre de fluorescence est fortement déplac, par acylatio:n de lt Vamine on entend, dans le cadre de la présente invention, toute amine Ax,'H2 dont lintensité de flurrscence à la 1.ongueur dtondce d'émission de ladite amnine libre e:st au moins t100 fois plus grande que l'intensité de fluorescence, à cette m1me longueur d'onde, des composés de formule (I) correspondants. Comme amines AxNH2 remplissant cette condition on peut citer par exemple l'tamino-? múthyl-4 coumtiJne, lidmino-7 trifluoro- méthyl-4 coumarine, l'amino-7 nitrc-4 oxa-2 benzodiazole-1,3 et plus particulièrement l'amino-3 éthyl-9 carbazole. Dans la formule (I) ci-dEssus, "ln" est de préféren- ce égal à 3 et B est de préférence un groupe @NH 4'2 - NH - C ' NH Le nombre des chaînons acides aminés de la chaîne peptidique EPept'} des peptides de formule (J) rn'est pas limité. Ce niomibre es toutefois -égal de préférence a i ou 2. Commre exemples de chaîne peptidique hydrophobe lPept- on peut citer les chaînes suivants: [Val - LeuP Ser (OBz) 4 [Ile - Glu (T - OCH3) [Val]+ [Leu]- [Val- Seri chaînes dans lesquelles Val désigne le chaînon valine, Leu le chaînon leucine, Ile le chaînon isoleucine, Ser le chaînon sérine, Ser (OBz) le chaînon sérine dans lequel le groupe CH20H est remplacé par le groupe CH2 - O - CH2 - C6H5, et Glu (à - OCH3) le chaînoa; acide glutamique dans lequel le groupe COOH on position est remplacé par le groupe COOCH3. Dans les exemples de chaîne peptidique hydrophobe [Pept- ci-dessus, le groupe amine NH2 du chaînon acide aminé, lorsqu'il n'y a qu'un seul chaînon, et le groupe amine NH2 du chaînon acide aminé de gauche, lorsqu'il y a deux chaînons, peuvent être non substitués ou substitués par un groupe tertiobutyloxycarbonyle (t Boc), benzyloxycarbonyle, benzyle, tosyle ou acyle, en particulier acétyle ou benzoyle. Les peptides de formule générale (I) peuvent être préparés par action, en présence d'un composé activeur du groupe COOH, de l'amine aromatique ou hétéroaromatique Ar - NH2 sur les peptides de formule générale: [Pept T NH-CH2-CO-NH-CH-COOH (II) (CH2)n B dans laquelle [Pepti, "n", B et X ont les mêmes significa- tions que dans la formule (I). Comme composés activeurs du groupe COOH utilisables on peut citer ceux mentionnés par KONIG W., GEIGER R., Chem. Ber., 103, (1970), 788-798 et par GROSS E., MEIENHOFER J. (The peptides: Analysis, synthesis and biology. I. Major methods of peptide bond formation, Academic Press, 1979, p 435), et en particulier le dicyclohexylcarbodiimide. Les peptides de formule générale (II) sont des produits connus qui peuvent être obtenus par les procédés classiques de synthèse peptidique (cf KONIG W., GEIGER R. et GROSS E., MEIENHOFER J., déjà cités). Les peptides de formule (I) permettent de doser les endotoxines dans des liquides divers (solutitinns injecta- bles de produits naturels ou de synthse, solutions de pro- téines, liquides physiologiques tels que sérum, plasma, urine, etc.). La méthode de dosage des endotoxines est base sur la propriété que possèdent les end;ooxinps de rendre active une protéase contenue dans le lysat d'amébocytes du limule (Limulus polyphemus). En l'absence d'endotoxine, la protéase n'agit pas sur les peptides de formule (I). En présence d'en- dotoxine, la protéase réalise l'hydrolyse des peptides de formule (I) avec libération d'une Rart des peptides de formu- le (II) et d'autre part des amines aromatiques ou hétéroaro- matiques Ar-NH. L'activité de la protéase est strictement proportionnelle à la concentration en endotoxine du milieu. Par suite la concentration du milieu en amine ArNH2 libérée et l'intensité de fluorescence mesurée à la longueur d'onde d'émission de ladite amine libre sont, à un moment déterminé après la mise en contact du liquide contenant l'endotoxine, du lysat d'amébocytes du limule et du peptide de formule (I) (par exemple 30 minutes après), strictement proportionnelles à la concentration en endotoxine du milieu. Pour doser les endotoxines dans un liquide, il suffit donc ce mélanger ce liquide avec le lysat d'amébocytes du limule et une solution d'un peptide de formule (I), de régler le pli et la temperature du milieu ainsi réalisé à des valeurs convenables (c'est-à-dire des valeurs telles que la réaction d'hydrolyse ait lieu), de régler le temps d'hydrolyse et de mesurer l'intensité de fluorescence à la longueur d'onde d'émission de l'amine libre ArNH2 correspondant au peptide utilisé. De la comparaison du résultat obtenu avec celui obtenu, dans les mêmes conditions, en remplaçant au départ le liquide par une solution étalon d'endotoxine on déduit la teneur en endotoxine du liquide. La méthode de dosage selon l'invention est parti- culièrement sensible. Elle permet de détecter des quantités d'endotoxine de l'ordre du dixième de picogramme. De plus elle est quantitative (la précision est de l'ordre de quelques pour cent), rapide et elle peut être rendue automatique. A titre de comparaison, la méthode basée sur la mesure du temps de formation d'un gel ne permet pas de détecter des quantités d'endotoxine inférieures à 30 picogrammes, est relativement longue (durée: 1 heure) et n'est que semi-quantitative. Les peptides de formule (I) permettent également de doser des enzymes à action protéolytique, comme par exemple la trypsine, la papaine et la cathepsine. Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. EXEMPLE 1 Prporation des peptides de formJlee. Une millimole du peptide de formula: -L(t toc) Val - Lu{NIi-4h2-CO-NH-HCOH (III) (CH2)3 NH Cl C x \ H 2A NH2 dans laquelle Leu désigne le chainon letucine et (t Doc) Val le chaînon valine dans lequel le groupe amino NH2 est substi- tué par un groupe tertiobutyloxyo.rbonyle, et une mnillimole d'acide ptoltièunesulfoniquje sont dissout.es dans 2 ml de diméthylformamide redistillé dépourvu d'ami.nes. A crtte so- lution, refroidie L 0 C et maintenue sous atmosph.r dazote, on ajoute une millimole d'aminc-3 éthyl-9 carbazole, une millimole d'thydroxy-1 benzotriazole et une millimole de dicycl.ohexylcarbodi.iniide. Le mélsnge réactionne1 est maintenu 2 heures à 0 C, puis 10 heures à 25 C. La dicyclohexylurée formée est précipitée en maintenant le mélange à O0C pendant 24 heures, puis est séparée par filtratiorn ou centrifugation. Lu dim6thylformamide est éliminé par évaporation sous pres- sion réduite. Le résidu obtenu, qui contient, è l'état brut, le peptide portant le fluorophore, est dissous dans un mélan- ge contenant ú0 parties en volume de chloroforme, 20 parties en volume de méthanol et 3 parties en volume d'eau, puis est fixé sur une colonne de gel de silice, et on élue avec le mélange ci-dessus. Les fractions contenant le peptide portant le fluorophore sont évaporées sous pression réduite. On obtient ainsi, à l'état pur, le peptide de formule: [ // \ C2 5 H2NG NH2 La pureté et l'identité du produit obtenu sont prouvées par, entre autres, l'analyse par chromatographie en couche mince et les spectres d'absorption et de fluores- cence. Contrairement à l'amino-3 éthyl-9 carbazole qui, lorsqu'il est excité à 362 nm, présente une fluorescence très intense (200 unités de fluorescence) à 460 nm, le pepti- de de formule (IV), lorsqu'il est excité à 362 nm, ne présente qu'une fluorescence très faible (1 unité de fluorescence) à 460 nm. EXEMPLES 2 à 4 Préparation des peptides de formule (I). En opérant comme dans l'exemple 1, mais en rempla- çant l'amino-3 éthyl-9 carbazole par l'amino-7 méthyl-4 coumarine, l'amino-7 trifluorométhyl-4 coumarine ou l'amino-7 nitro-4 oxa-2 benzodiazole-1,3, on obtient respectivement les peptides de formules (V), (VI) et (VII) ci-après. Il n [(t Boc) Val - Leu NH-CH2-C0-NH-CH-CO-NH = 0 (CH2) 3CH NH Ce (V) C Ci " CH3 H2N NH2 L(t Boc) Val - Leu NH-CH2-Co--C:H-H-CO- H (CH2)3 (VI) C HHN Ci e NH2 [(t Boc) Val - Leu NH - CH2 - CO - NH - CH - CO (C H2)3 (CHM)3 - NH N H2N > Nil \ / NH2 NN C1 1NH2NO e EXEMPLE 5 ^Application des des endotoxines. neotides de formul.e (1) au dosace On dissout dans l'eau une quantité de peptide de formule (IV) telle que la solution obtenue présente, en cuve d'épaisseur 1 cm et à la longueur d'onde de 340 nm, une absorption égale à 0,1. A 400 R1 de cette solution on ajoute 200 i1 de lysat d'amébocytes de limule {lysat pour test Limulus commercialisé par MALLENKRODT) et 200 A1 du liquide à analyser contenant des endotoxines, liquide dont le pH est ajusté au préalable, si nécessaire, à une valeur comprise entre 6 et 7,5. Le mélange ainsi obtenu est alors traité suivant l'un ou l'autre des modes npéra- toires a) et b) suivants: a) Le mélange est maintenu à 250C (ou 370C) pendant Ci = 0 /H C Lr3 (VII) NH ! minutea;, puis on tjoute 0,2 ml d'une solution 25 mM de benzamidine dans le diméthylformarnide pour arrêter la réaction d'hydrolyse, et on lit, dans l'heure qui suit, l'intensitéi de fluorescence à la longueur d'onde 460 nm, la longueur d'onde d'excitation étant 362 nm et la solution étant maintenu à température constante (par exemple 25 C) au moment de la lecture. b) Le mélange est maintenu à 37 C et l'on enre- gistre en continu l'intensité de fluorescence à la longueur d'onde de 460 nm, la longueur d'onde d'excitation étant 362 nm. Dans les deux cas, l'intensité de fluorescence obtenue est comparée à celle fournie, dans les mêmes condi- tions, par un mélange réactionnel contenant 400 Ll de la solution du peptide de formule (IV), 200 il de lysat d'amé- bocytes du limule et 200 il d'une solution étalon d'endoto- xine à 50 pg/ml. Si le liquide analysé est un liquide physiologique, il est recommandé d'effectuer l'un des deux essais suivants, qui ont pour but d'éliminer l'interférence éventuelle sur le dosage des endotoxines de protéases contenues dans le liquide physiologique: 1 ) Le liquide physiologique, dont le pH est ajusté si né- cessaire à 7,0, est porté à l'ébullition à 100 C pendant 10 minutes. Le précipité formé éventuellement est éliminé par centrifugation et la partie surnageante est utilisée pour le dosage des endotoxines suivant la technique décrite précédemment. Si le résultat obtenu est le même que celui obtenu en utilisant le liquide physiologique non traité 5 100 C, le résultat obtenu avec le liquide non traité est COi'OCt:t. Si I, rsulttt, Lternu avec le liquide traité à 1000C est inférieur '? cxlui obtenu avec le liquide non trai- té, seul sera retenu le résultat obtenu avec le liquide trai- té à 1000C. 2 ) 200!l dlu liquide physiologique, dornt le pHli eut ajusté si nécessaire à 7,0, sont incubés en présence de 400 cl de la solution du peptide de foirmul. (IV) et de 200 ul de tampon phosphate pli 7,0 pendait 30 minutles dans les conditions in- diquées préc:édr.ment en a) (est--dire température 25 C ou 37 C et addition, au bout des 30 minutes, de 0,2 ml d'une solution 25 mM de benzamidine dans le DHF). On lit alors l'intensité de fluorescence à 460 nm, la longueur d'onde d'excitation atant 362 rim. La vl.eur ubtvenue, si _elle n'est pas nulle, doit 8tre soustraite de la valeur de l'intensité de fluorescence obtenue lors de lanalyse de l'échantillon de liquide physiologique en présence du lysat d'amtbocyte. EXEMPLES 6 à 8 Apl)ication des peptides de formule Iî=.U do des endotoxines. On opère comme à l'exemple 5 en remplaçant au départ le peptide de formule (IV) par l'un des peptides de formules (V), (VI), (VII). La longueur d'onde d'excitation et la longueur d'onde à laquelle s'effectue la mesure de l'intensité de fluorescence, longueur d'onde qui est la longueur d'onde d'mt'ission de l'amine libre, sont aldors les suivantes: 1 1 tdutlislo ngueur longueur d'onde à peptidu sd'onde utid'excitation laquelle est mesurée l'intensité de fluo- rescence formule (V) 354 nm ou 370 nm 430 nm formule (VI) 302 nm ou 400 nm 480 nm formule (VII) 464 nm 512 nm R E V E N D I C A T I 0 N 5 1. Peptides de formule générale: [Pept3 NH-CH2-CO-NH-CH-CO{ NH - AT] (I) t (CH2)n x B dans laquelle [Pept} désigne une chaîne paptidique hydrophobe, "n" est égal à 1, 2, 3, 4 ou 5, B est un radical NH R -NH -C u N-R N- R2 R1, R2 et R3 désignant des NH2 R3 atomes d'hydrogène ou des groupes;éthyle, INH - Arj désigne le reste d'une amine aromatique ou hétéroaromatique Arz-MH2 fluorescente, dont le spectre de fluo esc-nce est fortement déplacé par acylation de l'amine, et X 8 désigne un anion. 2. Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce que "n" est égal à 3 et B est le groupe GNH -NH - -C NH2 3. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisés en ce que la chaîne peptidique [Pept a 1 ou 2 chaînons acides aminés. 4. Peptides selon la revendication 3, caract6érisés en ce que la chaîne peptidique hydrophobe [Peptj-est choisie parmi les chaînes [Val - I.eu}', [Ser (OBz)}, [Ile - Glu(t-OCH3)t, 1! 1] Y-.- Ser, chaîntes dans lesquelles le groupe amine du chaînon acide arniné, lorsqu'il n'y a qu'un seul cha5dnon, et le groupe amino du chaînon acide aminé de gauche, lor:squ'il y a deux chaînons, sont non substitués ou substitués par un groupe tertiobutyloxycarbonyle, benzyloxy- carbonyle, benzyle, tosyle ou acyle. 5. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce queNH - A est le reste de l'amino-7 méthyl-4 coumarine. 6. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que NH - Arj est le reste de l'amino-7 trifluorométhyl-4 coumarine. 7. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que 4NH - A] est le reste de l'amino-7 nitroe-4 oxa-2 benzodi.azole-1,3. 8. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que fNH - A] est le reste de l'amjno-3 éthyl-9 carbazole. 9. Peptide selon la revendication 8, caractérisé on ce qu'il a pour formule Et Boc) Val - Leu+ NH-CH2-C0-NH-CH-C0-NH I ( (CH2)3 NH C Cl CH ci C2H5 H2N NH 24, *2 darî2. li q 1 LreLe lu est le f-:1ir;on let;ciL:i et (t VYc> Val le chiinorn valine dans lequel le lgroupe a-f3:io 'H2 est subltitui par un groupe tertiobutyloxycarbonyle. 10. Procéd, de prfparaLion des peptides selon la revendica- tion 1, caract(drise en ce quc l'on fait agir, en pri'sence d'un compose activeur du grotne COlO}I, une amine aroriatique ou btéroaror atique A L- L, telle q, e dffinie 3 la revendica- tion 1 sur un peptide rIpondi]nt à la formule géncrale [Éept 4NH - CH2 Co H - Ci - CUOoH (I> (ClH2)n dans laquelle [Pept "en", B et X 4 oit les significations indiquoées à la revendicatino 1. 11. Application des peptides selon!'une quelconque des revendications 1 à 9 au dosage des endotxines et des enzymes protéolytiques.