Brevet FR2489690A1 — publié le 19820312

La présente invention concerne un procédé pour l'obten- tion de la fraction ovomucolde de l'oeuf de caille. Elle a aus- si pour objet l'obtention d'un extrait d'ovomucolde de l'oeuf de caille et son application à titre de médicament. Elle concer- ne également les compositions pharmaceutiques contenant, à titre de principe actif, la fraction ovomucolde ou l'extrait d'ovomu- colde d'oeuf de caille. Les vertus thérapeutiques de l'oeuf de caille, notamment de l'espèce Coturnix coturnix japonicavis-à-vis de l'asthme et autres affectionsfont partie de la pharmacopée traditionnelle dans les pays de l'Est, plus particulièrement en Pologne et en Union Soviétique. A cet effet, on peut se référer à l'article de GAJEWOJ / Pticew. 5, 14, 1968_7 qui fait état de résultats de recherches effectuées dans le cadre de l'Institut Soviétique de l'Alimentation et Polyclinique du Ministère de la Santé; des ré- sultats positifs ont été obtenus avec l'oeuf de caille dans les traitements de l'asthme, de l'anémie et des ulcères. En France, une expérimentation de ce type a été entre- prise et a donné des résultats sensiblements identiques "Ap- proche thérapeutique de la maladie allergique de l'oeuf de cail- le" par J.C. TRUFFIER dans "LA CLINIQUE", tome 3, N0 2 22 pages 2-4,Mars 1978_7. Cette expérimentation, effectuée sur plus d'u- ne centaine de cas, a montré que le blanc de l'oeuf de caille permettait de traiter des cas récidivants d'allergie, d'asthmes, de bronchites chroniques, de rhinites et d'eczéma. Le brevet FR 76.19.751 concerne une fraction ovomucoi- de du blanc de l'oeuf de caille ayant des propriétés antiprotéa- siques et un procédé pour son obtention. Le procédé décrit dans ce brevet FR 76.19.751, pour l'ob- tention de cette fraction ovomucolde, consiste: 1) à ajouter à du blanc d'oeuf de caille de l'acide trichloroacétique en solution dans de l'acétone; 2) à faire précipiter la fraction antiprotéasique par addition d'acétone au surnageant obtenu au cours de l'étape 1 ); 3) à dissoudre le précipité ainsi obtenu dans de l'eau, puis à effectuer une nouvelle précipitation avec del'acétone après dialyse contre de l'eau; et enfin, 4) à laver et sécher le précipité ainsi obtenu. La fraction ovomuco de ainsi obtenue est constituée es- sentiellement par une postovalbumine et par une protéine cor- respondant à la protéine Y, cette composition ayant été déter- minée par le protéinogramme de ladite fraction par électropho- rèse sur gel d'amidon. Une électrophorèse de cette fraction ovomucoïde,réali- sée sur une colonne de cellulose selon la méthode classique de FLODIN et J. PORATHBiochim. Biophys. Acta 13 (i954) 175 a montré qu'en fait cette fraction ovomucolde était constituée de 7 fractions, dont deux présentent une activité anti-trypsine. L'électrophorèse a été réalisée sur une colonne constituée d'un tube en "Pyrex" de 35 mm de diamètre et 600 mm de long, rempli de cellulose sur une hauteur de 500 mm; le tampon utiliséétait un tampon acétate 0,1 M pH = 6,0; la durée de l'électrophorèse a été de 42 heures sous 160 volts. La courbe d'élution résultan- te est représentée sur la figure 1 des dessins annexés sur la- quelle on a porté en ordonnées, d'une part, la densité optique à 278 nm (à gauche) et d'autre part les unités antitrypsiques (à droite) et, sur l'axe des abscisses, les fractions obtenues.La courbe en trait plein est la densité optique à 278 nm et la cour- be en pointillés est l'activité antitrypsique en unités par fraction. Par ailleurs, des dosages simples ont montré que la fraction ovomucolde obtenue selon le brevet FR 76.19.751 conte- nait d'autres protéines que l'ovomucoïde: - La détermination spectrofluorométrique de la capacité de liaison avec la riboflavine selon la méthode de LUCOTTE et KAMINSKI / Journal of Heredity, 68, 201-202, 1977_ 7 a montré que cette fraction contient une préovalbumine. - Le test au Micrococcus Lysodeikticus / LUCOTTE et KAMINSKI Biochemical Systematics and Ecology Vol. 6, p.145-147, 1978_7 a montré que cette fraction contenait du lysozyme. - La capacité d'inhibition de la croissance de Saccha- romyces cerevisiae / LUCOTTE et KAMINSKI Theorical and applied Genetics 48, 261-253, 1976_/ a montré quecette fraction conte- nait également de la conalbumine. Ainsi, le procédé selon le brevet FR 76.19.751 ne per- met pas d'obtenir une fraction ovomucolde purifiée. Une telle fraction impure ne se prête pas à l'administration humaine. In- jectée telle quelle, cette fraction peut se montrer extrêmement toxique et dangereuse par effet de choc protéique. On a maintenant trouvé un nouveau procédé d'extraction de l'ovomucolde de l'oeuf de caille permettant d'obtenir une fraction ovomucolde pure qui est essentiellement constituée par l'ovomucolde. Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivan tes qui consistent: (1) à ajouter à du blanc d'oeuf de caille de l'acide trichloroacétique en solution dans de l'acétone; (2) à séparer le surnageant du milieu réactionnel; (3) à ajouter de l'acétone au surnageant ainsi obtenu; (4) à dissoudre dans l'eau le précipité obtenu à l'éta- pe (3) età dialyser la solution obtenue contre de l'eau; (5) à filtrer la solution résultante sur une membrane ayant un pouvoir de coupure de]0.000 environ; (6) à soumettre ensuite la solution filtrée à une fil- tration moléculaire, et à recueillir toutes les fractions ayant une activité antitrypsique. La première étape du procédé selon l'invention est avan tageusement réalisée à une température comprise entre environ 2 et 100C, de préférence à 40C environ. L'addition de l'acide tri chloroacétique en solution dans l'acétone doit être effectuée lentement et sous agitation. On utilise en général 1 volume d'ac de trichloroacétique 0,5 M pour 2 volumes d'acétone. On laisse ensuite le milieu réactionnel décan- ter jusqu'à l'obtention d'un surnageant clair. On sépare ensui- te le surnageant de la fraction solide. On ajoute ensuite de l'acétone au surnageant obtenu à raison de 1 à 2 volumes par volume de surnageant.Le précipité obtenu par addition d'acétone au surnageant est ensuite dissous dans de l'eau. On dialyse la solution aqueuse résultante contre de l'eau distillée contenant éventuellement un tampon phosphate; à cet effet,on peut utiliser par exemple un tampon phosphate 0,05 M pH = 7,40 + 0,05 KC1, EDTA 10-3. La solution dialysée est ensuite filtrée sur une membrane ayant un pouvoir de coupure de l'ordre de 10.000, c'est-à-dire retenant les substances de poids moléculaire supérieur à 10.000 environ et laissant passer les substances de poids moléculaire inférieur à 10.000 environ. Cette étape constitue une étape de désalage. On peut utiliser par exemple pour cette filtration une cellule "Diaflo Amicon" munie d'une membrane PM-10. La fraction recueillie est ensuite traitée par filtra- tion sur gel,par exemple sur "Sephadex G-50"1 qui est constitué d'un gel de dextrane. On recueille toutes les fractions qui présentent l'activité antitypsique. Dans la pratique,on collecte les diverses fractions et on mesure sur chacune d'elles,d'une part la quantité de protéines à 280 nm,et d'autre part l'activité antitrypsique. On obtient,selon le procédé de l'invention, de l'ordre de 600 mg d'ovomucolde pour 100 cm3 de blanc d'oeuf. La fraction ainsi obtenue présente un seul cerne en immunoélectrophorbse et immunodiffusion contre un antisérum spécifique antiovomucoïde. Le poids moléculaire de la fraction obtenue,évalué en milieu dénaturant par la méthode de WEBER et OSBORN (1969 J. Biol. Chem.244, 4406-4412,est de l'ordre de 28000. Les différents dosages effectués sur la fraction ovo- mucoïde obtenue ont donné les résultats suivants -dosage des glucides a) hexoses,selon la méthode de LUSTING et LANGER 1931) Biochem. Z.242,320337 à l'orcinol sulfurique;on a déterminé une quantité de 16,4%. b)hexose-amines et osamines: on les a préalablement libérées par hydrolyse acide dans HC1 4 N à 110 C puis dosées selon la méthode de BOAS(1953)J. Biol. Chem.Q_,553-563 7;on a trouvé une quantité de 17,8% d'hexose-amines et d'osamines. c)acides sialiques: la méthode de BOHM et BAUMEISTER (1955) Z. Physiol. Chem,300,153-156,en utilisant une gamme étalon d'acide N-acétylneuraminique,a donné une valeur de 2,9%. -dosage des acides aminés: a) par dosage spectroscopique selon la méthode d'EDELHOCH /-1967 Biochem. 6, 1948-1954_7 on a trouvé que la fraction ovomucolde obtenue par le procédé selon l'invention ne contenant pas de tryptophane. b)le dosage des cystéines et demi-cystéines par dosage à l'analyseur de l'acide cystéique après oxydation et performiquq'le dosage des résidus carboxyméthylcystéine formés après alkylation par l'acide iodoacétique de la fraction réduite par le mercaptoéthanol et dénaturée par l'urée et par titration avec le DTMB ont montré que la fraction ovomucoide obtenue par le procédé selon l'invention contenait 9 ponts disulfure. Le N terminal de cette fraction,déterminé par le 2,4-dinitrofluorobenzène,est une valine. Il est connu que l'ovomucoide de caille présente une activité antitrypsine humaine,une activité anti-trypsine bovine et qu'elle n'inhibe pas la chymotrypsine bovine / R. FEENEY et al. The Journal of Biological Chemistry,p. 1957-1960,1969_7. On a vérifié que la fraction obtenue selon le procédé de l'invention présentait bien une activité anti-trypsine humaine,une activité antitrypsine bovine et pas d'activité anti-chymotrypsine bovine. L'inhibition de la chymotrypsine et de la trypsine bovine avec la fraction ovomucoide obtenue selon l'invention est représentée sur la figure 3,sur laquelle on a porté en abscisses la quantité de fraction ovomucoide utilisée,et en ordonnées le pourcentage d'inhibition pour 100g de chymotryp- sine ou de trypsine. Le dosage a été effectué au spectrophotom&tre à 395nm par mesure de l'acide libéré pendant l'hydrolyse des substrats estérifiés par la trypsine et la chymotrypsine. La solution de trypsine ou de chymotrypsine bovine était de 50g/ml dans 0,004 M d'acide acétique contenant 0,02 M de CaC12;la solution de fraction ovomucolde était à 20lig/ml dans O,006M de tampon tris pH = 8,6;la solution indicateur pour la trypsine était l'ester méthylique de p-toluène sulfonyle arginine 0,01 M dans 0,006 M de tampon tris avec 0,02% de m-nitrophénol à pH = 8,2. La solution indicateur pour la chym3trypsine était l'ester éthylique de benzoyl-L- trypsine O,OlM dans du tampon tris contenant 30% de méthanol et 0,02% de m-nitrophénol pH- 8,2. L'unité antitrypsique a été définie en prenant pour standard la trypsine cristallisée:une unité antitrypsique correspondait alors à la quantité d'ovomucoide qui diminue de 50% la vitesse d'hydrolyse de substrat par 50gg de cette trypsine. La fraction ovomucoXde obtenue selon le procédé de l'invention peut être utilisée à titre de médicament pour lutter contre les allergies,et en particulier dans le traite- ment de l'asthme,des rhinites allergiques,des sinusites, des bronchites chroniques,de l'eczéma,de l'urtiîire,du prurigo,des migraines allergiques, de l'emphysème etc. La présente invention concerne aussi un extrait d'ovomucolde, un procédé pour son obtention et son applica- tion à titre de médicament. On a en effet trouvé que la fraction ovomucoide obtenue selon l'invention donnait,par hydrolyse acide en présence de pepsine,un extrait d'ovomucoïde libérateur dthis- tamine et inhibiteur de protéase. Le procédé pour l'.obtention d'extrait d'ovomuccide selon l'invention consiste: 1)à ajouter à du blanc d'oeuf de caille de l'acide trichloroacétique en solution dans de l'acétone; 2)à séparer le surnageant du milieu réactionnel; 3) à ajouter de l'acétone au surnageant ainsi obtenu 4)à dissoudre dans l'eau le précipité obtenu à l'étape 3) et à dialyser la solution obtenue contre de l'eau; ) à filtrer la solution résultante sur une membrane ayant un pouvoir de coupure de 10.000 environ; 6) à soumettre ensuite la solution filtrée à une filtration sur gel,par exemple sur Sephadex G-300,et à re- cueillir les fractions qui présentent l'activité antitrypsique, -à procéder à une hydrolyse acide de la fraction obtenue à l'étape 6 ) en présence de pepsine, -à récupérer l'extrait d'ovomucolde par filtra- tion sur gel,par exemple un gel de dextrane tel que Sephadex G 300, en recueillant le premier pic,quantitative- ment le plus important,qui présente l'activité antitrypsique. On réalise de préférence l'hydrolyse acide en pré- sence d'acide chlorhydrique dilué en quantité suffisante pour ajuster le pH en milieu acide. On peut également utiliser l'acide sulfurique. La température d'hydrolyse est avantageusement de l'ordre de 370 ( La.courbe d'élution obtenue est représentée sur la figure 4 sur laquelle sont portées, en ordonnées,la densité optique à 280 nm (ordonnées à gauche) et l'inhibition de la trypsine humaine en % (ordonnées à droite),et en abscisses leE fractions recueillies après chromatographie. La constante de dissociation de l'extrait d'ovomucof- de selon l'invention avec la trypsine humaine est de 2,1.10 L'extrait d'ovomucoïde selon l'invention forme avec la trypsine humaine un complexe qui résiste extraordinairement, pendant de longues durées, aux agents dissociants-habituels. L'extrait d'ovomucolde selon l'invention a un poids moléculaire de 14000 environ. Le N terminal,déterminé selon le mode opératoire cité ci-dessus au sujet de la fraction ovomucolde,est la valine. Il possède par ailleurs 6 ponts disulfure. Il est en outre caractérisé par un seul cerne en immu noélectrophorèse. Par ailleurs,les analyses ont montré qu'il ne possède pas de tryptophane. L'extrait d'ovomucoide selon l'invention est libéra- teur d'histamine et inhibiteur de protéase. Il peut être utili sé comme agent actif pour lutter contre l'asthme,les rhinites allergiques (pollinoses),les sinusites allergiques,les bron- chites chroniques,l'eczémal'urticaire,le prurigo,les migraine: allergiques,l'emphysèle et l'oedème de Kincke. Il peut être également utilisé pour les hépatites (cirrhose)les états in- flammatoires (rhumatisme et goutte),mucoviscosidose et pancréa tites. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant, à titre d'agent actif,la fraction ovomucolde ou l'extrait d'ovomucoide selon l'invention. En faisant digérer à des volontaires l'extrait ovomucoXle ou la fraction ovomucolde purifiée selon l'invention, on remarque,dès le lendemain,dans le sang des patientsque l'ovomucolde ou sa fraction sont présents en quantité décelable. Ceci peut se démontrer par immunoélectrophorèse ou immuno- diffusion en se servant d'anticorps spécifiques des fractions purifiées inoculées à des lapins. Les plaques de gélose présen- tent alors le cerne caractéristique de la réaction antigène- anticorps. Le motif antigénique de la molécule a donc été conservé au terme de la digestion. L'intégrité de la molécule a donc été maintenue. Cette propriété inattendue est extrêmement avantageuse car elle permet l'utilisation par voie orale des compositions pharmaceutiques contenant les produits de l'invention. Ce fait est d'autant plus surprenant que l'on admet généralement que toutes les protéines ingérées sont dé- truites par les enzymes protéolytiques au niveau de la barrière digestive. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent se présenter sous la forme de compositions orales,ou injectables. On utilise comme véhicule dans les compositions pharmaceutiques un véhicule approprié pour la forme d'administra- tion choisie,qui est pharmaceutiquement acceptable et inerte vis-à-vis de l'extrait d'ovomucoïde. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à titre illustratif et nulle- ment limitatif par les exemples ci-après. EXEMPLE 1-Obtention de la fraction ovomucoideo On a utilisé 600 mg de blanc d'oeuf. On a ajouté à ce blanc d'oeuf 1 vol.d'une solution d'acide trichloroacétique (TCA) 0,5 M dans l'acétone (1 volume de TCA,2 volumes d'acétone). On a centrifugé le milieu réactionnel résultant et recueilli le surnageant que l'on a fait précipiter avec 2 volumes d'acétone. On a ensuite dissous le précipité dans de l'eau et dialysé la fraction résultante contre le tampon phosphate 0,05M pH = 7,40 + 0,05 KC1, EDTA 10- 3,puis on a concentré la fraction résultante dans une cellule "DIAFLO AMICON"munie d'une membrane PM-10. On a ensuite chromatographié la fraction concentrée sur une colonne de gel SEPHADEX G 50 équilibrée avec le tam- pon ci-dessus et on a élué les fractions à activité anti- trypsique. La courbe d'élution de cette fraction est représen- tée sur la figure 2 sur laquelle on a porté en ordonnées la densité optique à 280 nm (à gauche),l'activité antitrypsine humaine (à droite),et en abscisses le nombre de tubes du collecteur contenant les fractions recueillies. A la figure 2,la courbe en traits pleins représente le dosage des protéines présentes dans les tubes du collecteur et la courbe en pointillés représente l'activité antitrypsine dans ces mêmes tubes. Chaque tube contenait 1,2 ml de liquide. EXEMPLE 2- On a soumis à une hydrolyse acide la fraction obtenue selon l'exemple l,en présence de pepsine. On a réalisé l'hydrolyse pendant 1 heure à 37 C avec de l'acide chlorhydrique 0,032 N en quantité suffisante pour obtenir un pH de 1,5 en présence de 0,01% de pepsine de porc. On a recueilli,après filtration sur Sephadex G-300, les fractions à activité antitrypsine. La courbe d'élution du produit obtenu par hydrolyse est représentée sur la figure 4. De même qu'à la figure 2,on a porté en ordonnées, sur la figure 4, à gauche,la densité optique à 280 nm.et à droite l'activité antitrypsique, et en abscisses le nombre de tubes du collecteur. Chaque tube contenait 1, 5 ml. La courbe en traits pleins représente le dosage des protéines et présente un grand pic et un petit pic. L'activité antitrypsique (cour- be en pointillés) correspond essentiellement au grand pic. Propriétés pharmacologiques A-Etude toxicologique Elle a été effectuée à court terme sur 100 souris et sur quatre semaines chez 10 rats. La DL50 aiguë est de 600 à 900 mg/kg,soit environ 250 fois la dose thérapeutique. B-Activité libératrice d'histamine de l'extrait d'ovo- mucoide selon l'invention. L'administration intraveineuse de l'extrait d'ovomu- coide selon l'invention à la concentration de 15 mg/ml a provo- qué chez le rat un érythème localisé prurigineux,et un oedème périphérique. In vitro sur une biopsie de tissu conjonctif sous-cutané coloré au bleu de toluidine,les mastocytes obser- vés au microscope optique (x 350)étaient intensément colorés;le dépôt d'une solution de l'extrait d'ovomucoïde à la concentration de 3 mg/ml a provoqué une intense dégranula- tion observable par la décharge de granules à partir des mas- tocytes. Le dosage de l'histamine par fluorimétrie a permis de mettre en évidence la libération du médiateur. Chez l'homme non allergique,l'injection intra-veineuse d'une dose liminaire de cet extrait d'ovomucoide a provoqué le déclenchement de phénomènes anaphylactoides:picotements géné- ralisés,peau couverte d'érythème et devenant brilante et pru- rigineuse,apparition de plaques d'urticaire,accélération du pouls et migraine. Chez le sujet allergique en période de rémission, l'injection de cet extrait a déclenché le tableau typique de sa maladie:chez un urticarien par exemple,on a observé une poussée importante et généralisée d'urticaire qui a persisté plusieurs heures;chez un asthmatique,il y a eu une crise d'asthme. Le traitement prolongé répété,tant chez le rat que l'homme sain et le sujet allergiquesa fini par provoquer,par tachyphylaxie,un état d'insensibilité de l'individu à cet extrait. C- Expérimentation en double aveugle L'expérimentation a été effectuée sur 160 malades (urticaire,asthme,pollinose,bronchite,rhinite...)des deux sexes et âges (hommes,femmes,enfants auxquels ont été distri- bués pendant deux périodes de huit jours,séparées par une se- maine sans traitement,des doses journalières de 3 mg de l'ex- trait d'ovomucoîde;la solution étant incolore et absolument indistingable des placébos,les distributeurs ignoraient la composition des solutions dans les tubes. Les résultats positifs obtenus sont très nettement supérieurs (de l'ordre de 60% de guérison chez les adultes, et de 80% chez les enfants)aux résultats positifs obtenus par les placébos,les observateurs voyant progressivement disparaitre chez les malades les signes des affections. 11i 2489690 Le silence clinique est de l'ordre de 6 mois en moyen- ne, et, dans les cas de rechute, un nouveau traitement identi- que permet de faire disparaitre les signes. D - Expérimentation sur animal Sur 20 chiens présentant un eczéma d'origine allergi- que provoqué, l'addition journalière dans l'eau de boisson de doses de 3 à 5 mg de l'extrait d'ovomucoîde selon l'invention pendant deux semaines a procuré dans la plupart des cas, au bout de quelques jours, une atténuation, puis une disparition des signes cutanés. E - Mécanismes d'action et indications a) Supplérmentation en inhibiteur de protéase On sait,depuis la publication de LAUREU et ERIKSON (Scand. Clin. Lab. Invest. 15,132, 1963), que les individus gé- nétiquement déficients en a, antitrypsine sont prédisposés à l'emphysème. Dans les populations humaines, certaines varian- tes du systèmeT I sont, soit sous forme homozygote, soit sous forme hétérozygote, déficients en inhibiteur, ou ont leur taux d'antienzyme notablement abaissé. On saitrde plusy(GERBEAUX et coll. La nouvelle Presse Médic. 43, 3045-50,1975; LAURELL et coll.,Acta Pediatr. Scand. 63, 855-857,1974; LIEBERMAN New York State J. Med. USA, 2, 181-186, 1976) que les individus à taux sérique bas en alpha1 antitrypsine sont prédisposés à la bron- chite chronique et à l'asthme (KATZ et coll. J. Allergy Clin. Immunol. 57, 41 1976; ARNAUD et coll (Clin. Res. 244,488,1978; SCISLICKI et coll. Gruzlica Chor. Pluc. Polska 43, 10,929-935, 1975) en particulier l'asthme non allergique de l'enfant. Dans ces deux cas,l'extrait d'ovomucoîde selon l'inven- tion remplit une fonction pour apporter, chez les individus gé- nétiquement prédisposés, un supplément en inhibiteurs de la tryl sine dont ils sont héréditairement déficients. La figure 5 don- ne l'allure de la migration électrophorétique de l'extrait d'o- vomucolde selon l'invention, de la trypsine humaine, et du com- plexe extrait d'ovomucolde/trypsine en gel d'amidon et en gra- dient de pH. La figure Sa représente la mobilité de l'extrait d'ovo- mucolde selon l'invention (1), de la trypsine humaine (2) et du complexe extrait/trypsine (3) en gel d'amidon (pH = 8,6 en système tampon discontinu et en gel d'urée 2M révélé par le noir amide. La figure 5b représente la mobilité de la trypsine, de l'extrait d'ovomucoldeetdu complexe extrait/trypsine en gra- dient de pH. Dans ce type de mode d'action, la stabilité du com- plexe serait responsable de la rémission des symptones à long terme. La dose d'extrait ovomucoide par jour de traitement est de l'ordre de 3 mg/kg. Ce même type de mécanisme peut également agir au ni- veau du complément. On sait en effet que les composantes C3 et C5 du complément peuvent être scindéesdonnant les fractions C3a et C5a qui sont les anaphylatoxines; or, la trypsine (BOKISCH et coll. J. Exp. Med. 129, 1109, 1969, BUDZKO et coll. Biochemistry 10, 7, 1971) est un activateur de ces fractions.Il en résulte que les individus déficients en antitrypsine produi- sent des anaphylatoxines de façon accrue / il a déjà été signa- lé que les asthmatiques présentaient un dépôt de C3 sur la mu- queuse bronchique (COVLET et Coll. Rev. Fr. mal. Resp. 6, 55-60, 1978) _/ et que dans ce cas également la supplémentation en in- hibiteur de trypsine peut pallier la production en anaphylatoxi- nes. b) tolérance immunitaire On sait que les protéases, la trypsine en particulier, se fixent à la surface des lymphocytes et altèrent leur mobili- té électrophorétique (BONA et coll. Clin. Exp. Immunol. 12, 377- 390, 1972eurs propriétés de migration (BERNEY et coll. Immu- nology, 18, 681-691, 1970); de plus (VISCHER, J. Immunol. 113 583 1974) la trypsine provoque la transformation blastique des lymphocytes B et non des T. L'extrait d'ovomucolde selon l'invention se fixe sur les lymphocytes humains. Les lymphocytes sont obtenus par frac- tion veineuse et centrifugation en gradient de densité en sys- tème FICOLL-HYPAQUE (BOYUM, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, 31, 1968) et cultivés en milieu essentiel minimum de EAGLE (GIBCO) S6 à une concentration de l'ordre de 106 cellules/ml. L'agent mito- gène utilisé est la Con A (Pharmacia) et la concentration de 50 gg/ml, les lymphocytes transformés et non transformés étant ob- servés en présence de la grosse fraction ovomucolde après trois jours d'incubation, et la détection de la fraction à la surface des lymphocytes se faisant par immunofluorescence observée en microscopie optique. Il a été démontré dans ces conditions que la pas fraction ovomucolde ne se fixe/sur les lymphocytes humains sti- mulés par la Con A; elle peut donc participer au contrôle de 1'- activité protéolytique à la surface de la membrane cellulaire, et en particulier lors de la blastogénèse. L'injection de l'extrait d'ovomucolde(de 25 à 100 gg) à des rats sensibilisésà l'ovalbumine provoque une nette diminu- tion ou une suppression dans certains cas de la production des Ig E spécifiques anti-ovalbumine (déterminée par RAST) en présen- ce de cet allergène. L'inhibition est dépendante de la dose, la production IgE obtenue dépendant de la concentration de la frac- tion ovomucolde utilisée. Cet effet a été retrouvé in vitro en ajoutant la fraction à une culture de cellules de rate de l'ani- mal, et il a pu être démontré par lavage que la suppression n'é- tait pas directement due à l'antigène; cependantsa présence est indirectement responsable de la production d'IgE spécifiques. Ce résultat important montre que l'extrait d'ovomucor- de selon l'invention agit in vivo et in vitro chez le rat comme suppresseur de la réponse immunitaire. *1b REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de la fraction ovomucolde de l'oeuf de caille, caractérisé en ce qu'il consiste: (1) à ajouter à du blanc d'oeuf de caille de l'acide trichloroacétique en solution dans de l'acétone; (2) à séparer le surnageant du milieu réactionnel; (3) à ajouter de l'acétone au surnageant ainsi obtenu; (4) à dissoudre dans l'eau le précipité obtenu à l'é- tape (3) et à dialyser la solution obtenue contre de l'eau; (5) à filtrer la solution résultante sur une membrane ayant un pouvoir de coupure de 10. 000 environ; (6) à soumettre ensuite la solution filtrée i une fil- tration moléculaire et à recueillir toutes les fractions qui ont une activité antitrypsique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (1) du procédé est réalisée à une température com- prise entre environ 2 et 10 C, de préférence de 4 C environ, et en ce qu'on utilise environ 1 volume d'acide trichloroacétique pour 2 volumes d'acétone. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, carac- térisé en ce que la dialyse de l'étape (4) est réalisée contre de l'eau distillée contenant un tampon phosphate. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la chromatographie de l'étape (6) est réalisée sur un gel de dextrane tel qu'un gel Séphadex G 50. 5. Fraction ovomucolde obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 i 4, ladite fraction ayant un poids moléculaire de l'ordre de 28.000, contenant 16,4% d'- hexoses, 17,8% d'hexose-amines et d'osamines, 2,9% d'acide siali- ques, ne contenant pas de tryptophane, ladite fraction possédant en outre 9 ponts disulfure, son N terminal étant la valine, la- dite fraction étant en outre caractérisée par un seul cerne en immunoélectrophorèse. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour l'obtention d'un extrait d'ovomucolde de l'oeuf de cail- le, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes supplémentaires consistant à: - procéder à une hydrolyse acide de la fraction obte- nue à l'étape (6) en présence de pepsine. - récupérer l'extrait d'ovomucolde par filtration sur gel, par exemple un gel de dextrane tel que Sephadex G 300, en recueillant le premier pic, quantativement le plus important, qui présente l'activité antitrypsique. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on utilise de l'acide chlorhydrique dilué au cours de 1'- hydrolyse acide à une température voisine de 37 C. 8. Extrait d'ovomucolde d'oeuf de caille obtenu selon l'une des revendications 6 ou 7. 9. Extrait d'ovomucolde d'oeuf de caille, caractérisé en ce qu'il y a un poids moléculaire d'environ 14.000, son N terminal est la valine, et en ce qu'il présente un seul cerne en immunoélectrophorèse et ne possède pas de tryptophane. 10. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre d'ingrédient actif, une quantité ef- ficace de la fraction ovomucolde d'oeuf de caille selon la reve dication 5, ou bien de l'extrait d'ovomucolde d'oeuf de caille selon la revendication 8 ou 9. 11. Application de la composition selon la revendica- tion 10 au traitement des états allergiques, la voie d'adminis tration étant orale ou injectable.