Brevet FR2489692A1 — publié le 19820312

La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'anticorps spécifiques, servant à la déter- mination de l'évolution d'affections malignes, mammaires, humaines Elle se rapporte notamment à la production di anticorps dirigés contre des particules virales mammaires, humaines, supposées. L'invention comprend les anticorps spécifiques, ainsi obtenus. Le cancer du sein est une des néoplasies les plus fréquentes de l'espèce humaine. La connaissance de l'anamnèse de ce cancer influe sur la décision thérapeu- tique. On estime que le cancer du sein se propage de fa- çon ordonnée à partir d'un des foyers présents dans le sein, vers les ganglions lymphatiques régionaux, et que ce n'est qu'après une période de plusieurs mois à plusieurs années qu'il peut atteindre des organes éloignés. Malheu- reusement les indicateurs généraux de la maladie sont pra- tiquement inconnus, et le problème du diagnostic précoce, et/ou de la surveillance de la maladie pendant le traite- ment, demeure non résolu. Depuis la découverte d'un oncornavirus, le virus de la tumeur mammaire de la souris (MMTV), capable de pro- voquer des tumeurs mammaires chez la souris, on a tenté de trouver un agent semblable au cours de la maladie humaine. Ces dix dernières années, un faisceau de preuves suggère que les tumeurs mammaires, humaines, sont semblables à la néoplasie de la souris. Les similitudes, indiquées dans la littérature, concernent les particules isolées de tumeurs humaines qui ont des propriétés biochimiques et biophysi- ques d'oncornavirus. De plus on a démontré que les tumeurs mammaires, humaines, contiennent des molécules d'ARN avec des quantités détectables d'une séquence homologue au MMTV. On a également signalé que le sérum de certains malades hu- mains, atteints d'un cancer du sein, contient des anticorps présentant une réaction croisée avec les antigènes MMTV. Les demandeurs ont mis en évidence une réactivité immunologique croisée, plus directe, entre les tumeurs hu- maines et le rAVTV, montrant que certaines tumeurs mammai- res, humaines, contiennent un antigène présentant une ré- action croisée avec l'enveloppe glycoprotéique du virus de la tumeur mammaire de la souris (glycoprotéine gp52 ayant un poids moléculaire de 52 000 daltons). De plus ils ont démontré que la réactivité immunologique, croisée, est due au fragment protéique de cette molécule et non à la fraction glycidique. Ces découvertes sont très encoura- geantes,si l'on considère les découvertes obtenues dans la maladie de/la souris. Le groupe de Spiegelman à New York a montré que la glycoprotéine virale gp52 constitue un excellent indicateur de l'état de la maladie de la sou- ris. Les teneurs plasmatiques en gp52, mesurées par déter- mination radio-immunologique, pourraient être en corréla- tion avec l'existence, le volume et la tendance à la réci- dive de la tumeur mammaire de la souris, après excision chirurgicale, souvent sans signe physique de maladie. Malheureusement l'application de cette voie d'ap- proche à la maladie humaine ne semble pas possible pour plusieurs raisons: (1) les tumeurs humaines sont moins prolifiques que celles de la souris; (2) les volumes sanguins sont dans un rapport de 1 à 1000, et (3) il existe une homologie partielle avec l'antigène gp52, si bien que la sensibilité de la détermination radio- immunologique, dont on dispose actuellement, ne permet pas la détection d'un tel antigène dans le plasma hu- main. La présente invention comporte donc l'établisse- ment des lignées de cellules tumorales, mammaires, humai- nes, et l'isolement des virus ou des antigènes les plus en rapport avec la maladie humaine. L'établissement d'une lignée de cellules tumora- les, mammaires, humaines (47D) à partir de l'épanchement pleural d'un malade atteint de cancer du sein, et sa ca- ractérisation, ont été effectués et publiés. Les cellules en culture expriment le môme antigène que celui qui fut mis en évidence dans les tumeurs humaines. Au cours des travaux, ayant conduit à la pré- sente invention, on a isolé un virus de la lignée secon- daire (Ci 10) de cellules tumorales mammaires, humaines g on l'a fait se reproduire, on l'a caractérisé et on a mis au point un essai pour la détection et la détermination d'une telle particule virale, dans les liquides de l'orga- nisme humain; ainsi a-t-on appliqué cette particule com- me moyen pour la détection et l'établissement d'un pro- nostic de la maladie. Selon l'invention, on prépare des anticorps di- rigés contre le virus en question et, plus particulière- ment, contre le virus Ci 10. Des essais utilisent de tels anticorps. Les essais selon l'invention reposent sur des techniques sérologiques classiques. On a mis au point un essai spécifique, très sensible, qui utilise des staphy- locoques contenant la protéine A à leurs surfacesces sta- phylocoques étant capables de fixer les immunoglobulines par leurs récepteurs Fc, si bien que leur portion Fab de- meure libre ourufixr les antigèn s correspondants. Les ainsu que d autres caractéristiq es de 1 inveption détails de cette détermination/sont exposes dans ce qui suite L'objectif principal de l'invention est l'isole- ment d'un virus à partir d'une lignée cellulaire, la re- production de ce virus, sa caractérisation et soeVitilisa- tion comme marqueur pour la détection précoce de la mala- die ou comme élément de pronostic dans la conduite du traitement. Comme la lignée cellulaire 47D d'origine n'ex- prime l'antigène présentant une réaction croisée que dans % de la population cellulaire, on isole, suivant l'in- vention, des clones monocellulaires susceptibles de conte- nir l'antigène. Les cellules 47D sont clonées selon la technique classique en gélose molle, décrite par I. Mac- pherson. L'emploi de cette technique repose sur le fait que les cellules transformées se développent dans la gé- lose molle, tandis que- les cellules normales ne s'y déve- loppent pas. Les clones monocellulaires peuvent être iso- lés de la façon suivante: on prépare une couche de base à 0,5% de gélose contenant du Bacto Agar (Dibco) dans du RPMI-1640 (Gibco) additionné de 10% de sérum foetal de veau, 0,2 UI d'insuline/ml et des antibiotiques. Des frac- tions de 7 ml sont coulées dans des bottes de Pétri en ma- tière plastique de 5 cm et laissées durcir à la températu- re de la pièce. Entre-temps, on prépare des portions de 1,5 ml de la couche supérieure contenant 0,33% de gélose dans du RPMI-1640 et on ajoute environ 100 à 500 cellules bien séparées en suspension. On coule chaque portion sur une couche de gélose de base durcie. Les bottes sont exa- minées pour mettre en évidence les cellules isolées qui ont été marquées, puis les bottes sont incubées à 370C dans une atmosphère humidifiée, contenant du C02, pendant 21 jours. Chaque colonie, provenant d'une cellule unique, est culti- vée sur de petites bottes puis reclonée sur gélose comme décrit plus haut. Selon cette méthode on a obtenu plusieurs lignées secondaires monocellulaires isogènes et parmi elles le Clo- ne 10. Une caractérisation complémentaire de cette li- gnée secondaire a montré qu'elle contenait des/zécepteurs hormonaux cytoplasmiques des oestrogènes, de la progestéro- ne et de la Dexaméthasone. L'induction de la production de particules virales a été effectuée uniquement avec des hor- mones stéroïdes et non avec les inducteurs connus des oncor- navirus. L'addition d'oestrogène 10-99 lors de la mise en culture et le quatrième jour, puis le remplacement quoti- dien du sixième jour au vingt et unième jour par un milieu contenant de la progestérone 10c8M a provoqué un fort ac- croissement du rendement au virus. On a pu obtenir 500/"q de protéines de virus purifiés par litre de milieu de cul- ture de tissu. Les particules virales ont les propriétés suivan- tes. Elles ressemblent aux oncornavirus connus. Ce sont des virus à ARN contenant de l'ARN 70S, ainsi que l'enzyme transcriptase-reverse (exclusivement spécifique de ce grou- pe de virus), et ils forment une bande dans la région de 1,17-1,20 g/ml des gradients isopycniques de saccharose, Les virus contiennent le même antigène M&TV gp52, à réac- tion croisée, que les tumeurs humaines. Par détermination radioimmunologique par compétition, on a pu montrer que cet antigène est simplement apparenté à l'antigène viral de la souris, mais ne lui est pas identique. De plus, des études d'hybridation moléculaire ont exclu la possibilité que les virus, libérés par les cul- tures tissulaires humaines, soient des virus des tumeurs mammaires de la souris contaminants. On a obtenu des anticorps dirigés contre le virus Cl 10 par immunisation de deux espèces animales différen- tes s (1) lapins blancs, néo-zélandais; (2) poules pondeuses leghorn, blanches. On a injecté à des lapins, par voie intrascapu- laire, des préparations de virus purifiés, désintégrés. A chaque lapin 200 />g de protéines virales ont ainsi été ino- culées. Des poulettes ont été immunisées par injection in- traveineuse et on a recueilli les anticorps dans les jaunes d'oeufs une semaine après l'immunisation des poulettes. Cha- que poulette a reçu deux injections correspondant à un to- tal de lOOfig de protéines virales. Dans les jaunes des oeufs, pondus après l'immu- nisation des poulettes, on a recherché la présence d'anti- corps dirigés contre le virus Cl 10. Les jaunes d'oeufs 6- taient traités comme décrit par Bar Joseph et Malkinson. A chaque jaune d'oeuf, on ajoutait 20 ml de tampon salé, phosphaté. Le mélange était agité à fond et centrifugé à 12 000 x g avec un centrifugeur Sorvall, pendant 20 minu- tes à 40C. Au surnageant recueilli on ajoutait un volume égal de glycérol, avant la conservation à -20 C. Les jaunes des oeufs, pohdus par les poulettes immunisées ayant des titres élevés en anticorps, furent utilisés pour l'essai ELISA (essai avec une enzyme immo- bilisée sur un immuno-absorbant). On effectuait de la façon suivante la détection des antigènes correspondant au virus du Clone 10, dans les liquides de l'organisme de sujets humains atteints d'un cancer du sein. ESSAI I L'essai utilisé pour la détection est un essai ELISA. On effectue l'essai dans des microplaques de poly- styrène comportant 96 godets. Chaque godet est revêtu d'immunoglobulines IgG de lapin, purifiées par affinité, dirigées contre le virus Cl 10. Pour former le revêtement, on utilise 2/ug d'IgG dans du tampon carbonate à pH 9,6 incubé pendant 3 heures à 370C, puis maintenu à 4"C jusqu'à l'emploi. Lors de l'emploi, on lave quatre fois les microplaques avec du tampon salé, phosphaté, (PBS), contenant 0,05% de Tween 20. On introduit dans les godets des dilutions des sérums des malades dans du tampon salé, phosphaté - Tween 20, addi- tionné de 2% de sérum-albumine bovine (BSA) et de 0,2% de PVD (PBS-PVBBSA) et on incube pendant 2 heures à 37"C, puis on lave quatre fois dans le même tampon. Le jaune d'oeuf traité est dilué au 1/50 dans du PBS-PVP- BSA et on ajoute 200 jul de la dilution dans chaque godet. Après deux heures d'incubation à 37"C, on lave les pla- ques comme précédemment et on ajoute 2OO001 de conjugué phosphatase alcaline-IgG de lapin anti-poule à raison de 4 pg de conjugué par godet. On incube à 4 C pendant 18 heu- res. Le lendemain on lave les plaques et on ajoute le sub- strat (0,6 mg de phosphate de p-nitrophényle dans du Tris- HCl 1 M à pH 8,0) pendant 30 à 60 minutes à la températu- re ordinaire. On arrête la réaction enzyme-substrat par addition de 50, NaOH 3 M. Les résultats sont exprimés par l'absorbance à 405 nm mesurée avec un appareil "titer- tek Multiskan" (Flow lab.). Pour chaque plaque on utilise les témoins sui- vants: (1) virus du Clone 10 à raison de 2-0,2/Ag/godet $ (2) liquide de l'organisme tel que sérum, plasma, lait ou urine de malades non atteints d'un cancer du sein ou de malades atteints de maladies bénignes du sein et de malades atteints d'affections malignes d'organes autres que le sein $ (3) liquides de l'organisme de donneurs masculins $ (4) jaune d'oeuf de poules non immunisées. Il est possible de détecter l'équivalent de 1 à 2ug d'antigène dans les sérums de malades atteints de mala- dies avancées. ESSAI II Pour les malades ayant des teneurs plus faibles en antigène, l'essai additionnel suivant a été mis au point. Le Staphylococcus aureus, contenant la protéine A (souche Cowan I) à sa surface, est capable de fixer lewtmmunoglobu- lines par leurs récepteurs Fc, si bien que leur portion Fab demeure libre pour fixer les antigènes correspondants. Des Staphylococcus aureus, dans du tampon salé, phosphaté, contenant 0,2% d'azide de sodium de densité optique de 0,3 à 490 nm, sont revêtus d'IgG de lapin antivirus Cl 10 ou d'IgG du même lapin avant l'immunisation. On centrifuge la suspension bactérienne dans un Microfuge B de Beckman, pen- dant une minute, puis on lave deux fois dans du tampon sa- lé, phosphaté, à l'azide avec centrifugation. On élimine le tampon salé, phosphaté, et on remet les cu- lots bactériens en suspension dans du même tampon conte- nant 10,&g d'IgG/ml; on agite pendant une heure à la tem- pérature de la pièce. Après l'incubation, les bactéries, revêtues d'IgG, sont soumises à la centrifugation et l'on lave trois fois les culots avec du tampon salé, phosphaté, contenant 10% de sérum normal de lapin et 0,2% d'azide de sodium. On utilise les staphylocoques revêtus pour"pêcher" le ou les antigènes; pour cela, on ajoute les bactéries revêtues à un liquide de l'organisme d'un malade, notam- ment à un sérum ou une urine (dilution au 1/10 dans le tam- pon ci-dessus), puis on agite pendant une heure à la tem- pérature de la pièce, on lave trois fois dans le tampon avec centrifugation, puis on ajoute aux culots 200,/g de jaune d'oeuf au 1/50 (le même que pour l'essai ELISA)o On effectue l'incubation avec les anticorps, le conjugué an- ticorps de lapin anti-poule-phosphatase alcaline, le sub- strat et les lectures dans des tubes de la même façon que pour l'essai ELISA. Cette méthode permet de détecter entre 0,1 et 1,/ d'antigène. Revendications 1. Procédé de préparation d'un anticorps pour le diag- nostic précoce d'une affection maligne, mammaire, caracté- risé en ce qu'il consiste à établir des lignées de cellu- les tumorales, mammaires, à en isoler les virus ou les antigènes le plus en rapport avec l'affection, et à pré- parer des anticorps dirigés contre ces virus ou antigè- nes. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé eJce que le virus isolé est le Cl 10 obtenu à partir de la lignée secondaire des cellules tumorales, mammaires. 3. Procédé suivant la revendication 1 Ou 2, caracté- risé en ce que l'on isole des clones monocellulaires, sus- ceptibles de contenir l'antigène, à partir de l'épanche- ment pleural du malade. 4. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les anticorps sont obtenus par l'ino- culation à des animaux des virus purifiés. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que les animaux étant des poules pondeuses, on retire de leurs oeufs les anticorps voulus. 6. Anticorps, destiné à la détermination d'une affec- tion maligne, mammaire, caractérisé en ce qu'il est obtenu par la réaction immunologique d'un organisme animal contre des clones monocellulaires, produisant des particules vi- raies, ces clones étant obtenus à partir des cellules du sujet atteint de l'affection malignemammaire.