Brevet FR2487375A1 — publié le 19820129

Procédé de production de l'enzyme cholestérase et d'hydrolyse des esters de cholestérol d'acides gras en utilisant l'enzyme elle-même. Cette invention concerne un procédé de production de l'enzyme cholestérase (E.C.3.1.1.13) en cultivant un micro- organisme du genre Achromobacter, et l'hydrolyse des esters d'acides gras de cholestérol en utilisant l'enzyme elle-même. Le cholestérol, un constituant essentiel de l'organisme humain, est un composé de base dans la constitution des membranes cellulaires de tous les tissus, et dans la production de nombreuses hormones. Comme on le sait, la détermination du choles- térol total présent dans le sang a une grande importance dans le diagnostic médical, et comme il est présent dans le sérum prin- cipalement sous forme estérifiée par des acides gras, l'enzyme cholestérase est nécessaire afin de le libérer et ensuite de le déterminer. Seules quelques publications décrivent des procédés enzymatiques d'hydrolyse des esters de cholestérol utilisant des enzymes provenant de micro-organismes des genres Fusarium, Nocardia, Pseudomonas, Saccharomyces et Streptomyces, puisque l'enzyme est obtenue à partir des tissus animaux. On a maintenant trouvé un procédé, et cela constitue l'objet de la présente invention, pour produire l'enzyme cholestérase à partir d'un nouveau micro-organisme sélectionné par la demanderesse et appartenant au genre Achromobacter. Un avantage important du procédé conformément à la présente invention est le fait que l'enzyme produite par ce micro-organisnmdans les conditions de culture données ci-après est exocellulaire, et il n'est, par conséquent, pas nécessaire de l'extraire mais seulement de le concentrer. De plus, ledit micro-organisme, comme une bactérie, a une période de reproduction inférieure à celle des moisissures et des Actinomycètes, et ceci constitue un avantage de mise en oeuvre important. Ce micro-organisme isolé à partir de détritus végétaux du bord du Tibre, a été catalogué comme Achromobacter delicatulus SM-1307, et a été classé au Centre Régional du Nord, Département U.S. de l'Agriculture, Peoria (J 11) sous le numéro NRRL.B.-12115. Ses caractéristiques de culture, morphologiques et physio- logiques sont données ci-après. A-CARACTERISTIQUES DE CULTURE 1) Milieu solide: a) Sur agar-agar nutritif: colonies de 2 mm de diamètre après 24 heures d'incubation à 30 C, avec des bords complets qui ont tendance à onduler après 7 jours de vieillissement. Des colonies convexes, blanches légè- rement teintées, de consistance crémeuse, humide, légè- rement brillantes. Pas de grouillement en milieu agarisé. b) Sur agar-gélatine; colonies brillantes, douces, gélatineu- ses. 2) Milieu liquide: a) Sur bouillon salé + extrait de levure: turbidité crémeuse avec petit dépôt. b) Sur eau peptonisée: bonne turpidité après 24 heures à C. Dépôt et film superficiel non évidents. B-CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES 1) Bâtonnet gram négatif de longueur moyenne 2 gm. 2) Mobilité positive (observation gouttelette en suspension). 3) Cils vibratiles Petrichous. Densification aux pôles non observée. C-CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES 1) Température de développement optimum entre 25 et 30 C. Croît bien à 20 C. Aucun développement à 42 C. 2) N'attaque pas l'agar-agar. 3) Ne produit pas d'acide ni de gaz à partir du glucose. 4) N'utilise pas l'urée. 5) Ne possède pas d'oxydase cytochrome-C. 6) Réduit les nitrates en nitrites. 7) Ne réagit pas au test OX/F. 8) Ne produit pas d'indole à partir du tryptophane. 9) Rouge de méthyle: négatif. 10) Catalyse positive. 11) Ne produit pas d'acide ni de gaz à partir du lactose. 12) Liquéfie la gélatine. 13) Lait de tournesol: légère acidification après 7 jours. Pour l'identification, les procédés utilisés furent ceux indiqués dans "Méthodes de détection et d'identification de bactéries" par B.M. MITRUKA et M.J. BONNER, CRC PRESS INC. 1976, et dans "Manuel de Bergey de détermination bactério- logique" 7ième édition. La souche conformément à la présente invention peut être cultivée dans des conditions aérobie par culture immergée en utilisant des fermenteurs agités. Un milieu de culture liquide contient une source de carbone assimilable, une source d'azote, et des sels minéraux. Les sources de carbone qui peuvent être utilisées comprennent les aminoacides, le glucose, l'acide oléique, l'acide lino- léique, les esters de cholestérol et l'acétate de sodium. Les sources d'azote quipeuvent être utilisées comprennent des composés d'azote organiques et inorganiques tels que l'extrait de viande, l'extrait de levure, la peptone, le triptane, les aminoacides, la caséine hydrolysée, la farine de soja, les nitrates et les sels de NH4 Un milieu de culture convenable a par exemple la compo- sition suivante: extrait de levure 1-5 g/l farine de soja 1-5 g/l K2HP04 fTraces jusqu'à NaNO3, MgS04 1 g/l Le domaine de pH pour la culture se situe entre 6 et 8, de préférence entre 6,8 et 7,2. Le domaine de température se situe entre 20 et 370C, de préférence entre 28 et 320C. L'enzyme est produite en ajoutant de l'oléate de cholestéryle ou des huiles végétales naturelles au milieu de culture avant inoculation. L'hydrolyse desdits esters dans le milieu de culture par la cholestérase produite à partir de la souche de Achro- mobacter delicatulus SM 1307 constitue un objet supplémentaire de la présente invention. La période d'induction peut varier de 24 à 72 h, de préférence de 40 à 48 heures. Le bouillon de culture recueilli pendant ou à la fin de la fermentation peut être utilisé tel quel. Ou encore, on peut utiliser la partie surnageante du bouillon de culture filtrée ou centrifugée. Enfin, une amélioration technique et économique supplé- mentaire peut être apportée en immobilisant l'enzyme par combinaison avec des composés macromoléculaires, pour former des liaisons chimiques avec la matrice, ou des liaisons ioniques. Les exemples donnés ci-après décrivent des méthodes opérationnelles supplémentaires concernant la présente invention, mais ne la limitent pas. EXEMPLE 1 Un bouillon de culture est préparé ayant la composition suivante: NaNO3 2 g/l K2HPO4 2 g/l KC1 0,5 g/l MgSO4, 7 H20 0,5 g/l Extrait de levure 10 g/l Oléate de cholestéryle 5 g/l en ajoutant les composés précités à de l'eau déionisée. Le pH dudit bouillon est ajusté à 7,0 avec HCl dilué. Le milieu ainsi préparé est réparti dans des ballons de 250 ml en mettant 50 ml de bouillon dans chaque ballon; ils sont stérilisés à 1160C pendant 30 minutes. Au contenu de ces ballons on inocule 1 ml d'une suspension de la souche Achromobacter delicatulus SM-1307 obtenue en lavant avec 10 ml de solution physiologique la patine d'une culture de 20 ml d'agar-agar nutritif dans des tubes de 200x20 mm, qui s'était développée pendant 48 h à 30C. Les ballons de fermentation sont mis en incubation sous agitation orbitale (180-200 tpm) à 300C. Les bouillons de culture sont rassemblés 48 h après l'inoculation, et testés tels quels quant à l'activité enzy- matique. 1 ml de bouillon de culture contient 0,2 unité d'enzyme. L'activité enzymatique est déterminée de la façon sui- vante: - lml de bouillon de culture convenablement dilué dans un tampon phosphate 0,1 M de pH 6,7 est ajouté à 5 ml d'une solution d'oléate de cholestéryle contenant 0,3/mole/ml dans un tampon phosphate 0,1 M de pH 6, 7 contenant 0,5% de Triton X-100. La réaction est réalisée à 37 C pendant minutes dans un bain-marie agité et est arrêtée en faisant bouillir des échantillons soustraits au mélange réactionnel pendant 3 minutes. La concentration du cholestérol produit par hydrolyse de l'oléate de cholestéryle est déterminée par la méthode colorimétrique, dans laquelle le cholestérol libre est oxydé par l'oxydase du cholestérol en cholest-4en-3-one avec production simultanée de peroxyde d'hydrogène, qui réagit par oxydation avec le 4-aminoantipyrine et le phénol en présence de peroxydase pour engendrer un chromogène qui a son absorption maximum à 500 m. La densité optique des échantillons colorés est mesurée dans un spectrophotomètre à grille DB-GT de Beckmann, dans lequel la cuve a une trajectoire optique de 0,1 dm à une longueur d'onde de 500 xnp. Si une unité est définie comme la quantité d'enzyme qui produit 1 lmole de cholestérol par minute dans les conditions d'expérience décrites cidessus, le nombre d'unités d'enzyme par ml de bouillon de culture est calculé par la formule suivante: U 4 x 6 x (E10 - E0) ml de bouillon 5,45 x 0,1 x D dans laquelle: E10 = densité optique de l'échantillon soustrait au bout de min. EO = densité optique de l'échantillon soustrait à O min. , 45 = densité optique d'une solution de cholestérol de l mole/ml D = dilution de l'enzyme. EXEMPLE 2 Un bouillon de culture est préparé ayant la composition suivante: NaNO3 K2HP03 KC1 MgSO4, 7 H20 Extrait de levure Huile d'olive 2 g/l 2 g/l 0,5 g/l 0,5 g/l g/l g/i en ajoutant les composés précités à de l'eau déionisée et en ajustant le pH à 6,7 avec de l'acide chiorhydrique. On met à incuber des cultures de souche Achromobacter delicatulus SM-1307 préparées comme dans l'exemple 1, dans ledit bouillon, sous agitation orbitale (180 tpm) à 30 C. Les bouillons de culture sont rassemblés 72 h après l'inoculation et testés tels quels quant à l'activité choles- térase. 1 ml de bouillon de culture contenait 0,4 unité d'enzyme. EXEMPLE 3 Un bouillon de culture est préparé selon la composition de l'exemple 2. Des cultures de souche Achromobacter delicatulus SM-1307 dans ledit bouillon, et préparées comme dans l'exemple 1,sont mises à incuber sous agitation orbitale (180 tpm)à 30 C. Les bouillons de culture furent rassemblés 72 h après l'inoculation, centrifugés et la cholestérase de la partie surnageante est.utilisée pour déterminer le cholestérol total présent dans un échantillon de sérum de sang humain. Pourcela, on prépare le réactif suivant: Cholate de sodium 6 mM Triton X100 15 g Phénol 7,5 mM 4-aminoantipyrine 0,5 mM Peroxydase 16 400 U (N Boehringer 127361 dans le catalogue) Phosphate de sodium tampon 0,1 M pl 7,0 1 000 ml Le cholestérol est déterminé de la manière suivante: 501pl de sérum humain et 0,25 ml de bouillon de culture furent ajoutés à 2,5 ml de réactif. La réaction eut lieu directement dans la cuve de verre, qui avait une trajectoire optique de 1 cm, et le déve- loppement du chromogène est suivi directement dans un spectrophotomètre à grille DB-GT de Beckmann à une longueur d'onde de 500 m jusqu'à conversion totale du cholestérol présent dans le sérum. Dans ces conditions, on obtient une densité optique finale de 0,500, correspondant à 164 mg de cholestérol total par 100 ml d'échantillon de sérum humain testé. REVENDICATIONS 1. procédé de production de l'enzyme cholestérase caractérisé en ce que l'enzyme est produite en cultivant un micro-organisme du genre Achromobacter delicatulus identifié par le nombre NRRL B-12115. 2. Procédé de production de l'enzyme cholestérase selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro- organisme est cultivé dans un intervalle de pH compris entre 6 et 8, de préférence entre 6,8 et 7,2. 3. Procédé de production de l'enzyme cholestérase selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le micro-organisme est cultivé dans un intervalle de température compris entre 20 C et 37 C, de préférence entre 280C et 32 C. 4. Procédé d'hydrolyse des esters de cholestérol d'acides gras, consistant à amener lesdits esters en contact avec des bouillons de culture d'une souche Achromobacter délicatulus NRRL B-12115.