Brevet FR2497951A1 — publié le 19820716

La présente invention concerne les analyseurs de polarisation en fluorescence et, en particulier, un appareil optique perfectionné destiné à un semblable analyseur. Les instruments de polarisation en fluorescence et leur utilisation dans des applications cliniques sont décrits par exemple dans "Design, Construction, and Two Applications for an Automated Flow-Cell Polarization Fluorometer with Digital Read Out: etc.", R.D. Spencer, F.D. Toledo, B.T. Williams et N.L. Yoss; Clinical Chemistry, 19/8, pages 838- 344 (1973). Ces instruments permettent d'analyser rapidement des échantillons de fluide corporel marqués au moyen d'une substance fluorescente. Dans l'article mentionné ci-dessus, il est illustré un instrument de polarisation en fluorescence qui comporte un échan- tillon fluorescent frappé par deux faisceaux de lumière excitatrice polarisés chacun linéairement, l'un verticalement et l'autre hori- zontalement. Une excitation de l'échantillon en polarisations alter- nées est réalisée par un miroir découpeur à secteurs qui laisse alternativement passer jusqu'à l'échantillon la lumière verticale- ment polarisée et la lumière horizontalement polarisée. La lumière excitatrice est monochromatique et correspond au pic du spectre d'absorption de l'échantillon. L'échantillon fluorescent éclairé devient une source rayonnante secondaire qui émet de la lumière suivant un spectre dont le maximum se trouve à une longueur d'onde plus grande que la lumière excitatrice. Un polariseur vertical situé dans le trajet lumineux d'émission laisse passer une lumière verticalement polarisée jusqu'à un tube photomultiplicateur pour permettre la mesure de la lumière émise résultante venant de l'échantillon. Le signal de sortie du tube photomultiplicateur est analysé de manière à produire le dégré de polarisation, soit P, qui est déterminé par l'expression: P 5 [I(VV)-I(HV)]/[I(VV)+I(HV)] o I(VV) est l'intensité mesurée pour le signal du photomultipli- cateur lorsque la lumière polarisée verticalement excite l'échan- tillon et que la composante verticale de la lumière émise est analysée, et I(HV) est le signal du photomultiplicateur lorsque la lumière polarisée horizontalement excite l'échantillon et que la composante verticale de la lumière émise est analysée. Les instruments connus de ce type demandent des sources lumineuses intenses à puissance relativement élevée, par exemple des lampes à décharge au mercure ou au xénon de 200 à 250 W pour faire produire par l'échantillon l'émission de rayon- nement voulue avec un rapport signal-bruit suffisant pour permettre la détection et l'amplification par un tube photomultiplicateur à faible bruit et l'électronique associée. Ces lampes brillantes à puissance élevée demandent également un refroidissement important pour que l'intégrité de l'appareillage optique soit maintenu. On peut donc souhaiter que soit produit un appareillage optique perfectionné pour instruments de polarisation en fluorescence qui puisse utiliser des lampes de moindre puissance et de moindre inten- sité et qui donne néanmoins une sensibilité égale ou supérieure à celle des dispositifs de la technique antérieure. L'invention se rapporte à un appareil optique perfectionné pour instrument de polarisation en fluorescence qui comporte une source de lumière focalisée de faible intensité et de basse puissance, un filtre à largeur de bande étroite, un pola- riseur, et un cristal liquide à effet de champ dans le trajet d'excitation focalisant la lumière excitatrice sur l'échantillon liquide fluorescent. Si aucun champ électrique n'est appliqué au cristal liquide, ce dernier fait tourner de 90 le plan de pola- risation de la lumière excitatrice, tandis que, si un champ élec- trique est appliqué au cristal, le plan de polarisation ne tourne pas de 90 , Ainsi, le fait d'appliquer alternativement un champ électrique au cristal liquide provoque l'application alternative de la lumière d'excitation à l'échantillon suivant des angles de polarisation qui sont perpendiculaires l'un à l'autre. La lumière émise par l'échantillon est filtrée, polarisée et focalisée sur un photomultiplicateur en vue du traitement. La source lumineuse de faible intensicé et de basse puissance est une lampe à halogène au tungstène de 50 W dotée d'un réflecteur qui focalise la lumière sur une ouverture qui est dimensionnée de façon à fournir une quantité suffisante de lumière en fonction de la quantité de l'échantillon liquide. Un dispositif d'absorption de chaleur est placé dans le trajet d'excitation afin d'absorber le rayonnement infrarouge émis via l'ouverture par la lampe et, ainsi, minimiser les effets de la température sur l'échantillon et les éléments se trouvant dans le trajet d'excitation. Une série d'écrans formés de minces bandes métal- liques noires, sont placés autour de l'échantillon afin de réduire les réflexions superficielles de la lumière d'excitation qui pour" raient,sinon, s'introduire de manière non souhaitable dans le trajet d'émission. Des moyens sont également prévus pour contrôler la lumière d'excitation et régler l'alimentation électrique de la lampe de manière à maintenir un niveau sensiblement constant d'inten- sité lumineuse excitatrice. La description suivante, conçue à titre d'illustra- tion de l'invention, vise à donner une meilleure compréhension de ses caractéristiques et avantages; elle s'appuie sur le dessin unique dont la figure est un schéma de principe simplifié illustrant un appareillage optique perfectionné pour instrument de polarisation en fluorescence selon les principes de l'invention. Comme le montre la figure unique, il est illustré une lampe à halogène au tungstène 10 de faible puissance et de faible intensité, qui comporte un réflecteur 12 permettant de focaliser la lumière venant de la lampe sur une ouverture 14 formée dans un élé- ment 16 opaque à la lumière. Le réflecteur 12 a la forme d'un miroir elliptique. L'élément 16 opaque à la lumière comprend une plaque métallique mince d'une épaisseur d'environ 0,75 mm possédant, des deux côtés, une surface noire non réfléchissante. L'ouverture 14 a un diamètre d'environ 3 mm qui donne une quantité suffisante de lumière pour un échantillon liquide fluorescent 18 d'environ 1 ml contenu dans un tube à essai rond 20. La lampe 10 et le miroir elliptique 12 peuvent être constitués d'un projecteur à halogène au tungstène de 50 W d'un type connu, que l'on peut se procurer, tel quel,dans le commerce. De part et d'autre de l'élément 16 opaque à la lumière et percé d'un trou, il se trouve un dispositif 22 de réflexion de chaleur, ou de suppression de rayonnement infrarouge, et un dis- positif 24 d'absorption de chaleur servant respectivement à réfléchir et absorber le rayonnement infrarouge émis par la lampe, afin de minimiser tous les effets de la température sur l'échan- tillon et les éléments constitutifs du trajet d'excitation. Le réflecteur de chaleur peut être constitué par in réflecteur multi- couches à pellicules dichroiques. Le dispositif d'absorption de chaleur peut être constitué par un verre coloré absorbant du type "BG-38" produit par la Société Corion Corporation. Une lentille plan-convexe 26 effectue la collimation de la lumière venant de l'ouverture 14. Le faisceau lumineux colli- maté traverse ensuite unl filtre 28 à bande étroite correspondant à peuprès au pic d'absorption de l'élê.ment fluorescent. Un élément 30 séparateur de faisceau en verre transparent réfléchit environ 4% de la lumière incidence sur une lentille plan-convexe 32, laquelle focalise le faisceau lumineux sur un de,éccteur de référence 34, Le signal de sortie du détecteur de référence sert à contrôler et régler l'intensité de la lampe via son alimentation électrique 36. Le filament de la lampe est réglé par l'intermédiaire de l'alimen- tation électrique 36 en fonction du niveau de signal de référence mesuré venant du détecteur de référence 34 afin de maintenir un niveau constant pour l'intensité lumineuse excitatrice dirigée sur l'échantillon 18, L'élément 30 séparateur de faisceau peut être eonstitué par un couvreobjet de microscope qui est transparent et transmet 96% de la lumière incidente en en réfléchissant donc 4% environ. La lumière qui est transmise au travers du sépara- teur de faisceau arrive ensuite sur la combinaison d'un polariseur 38 et d'un cristal liquide 40 qui fait fonction de plan de rotation de la polarisation. Le polariseur 33 présente un plan de polarisa- tion fixe, qui peut être par exemple le plan horizontal H. Le cristal liquide 40 est du type obturateur de transmission en ce qu'il fait tourner la lumière qu'il reçoit de 90e lorsque aucun champ électrique n'est appliqué au cristal et qu'il ne produit aucune rotation du plan de polarisation de la lumière incidente lorsqu'un champ électrique lui est appliqué. L'application sélective du champ électrique au cristal 40 est schématiquement indiqué sur la figure unique par la fermeture d'un commutateur 42, lequel applique une tension et, par conséquent, un champ électrique au cristal. Ainsi, dans le mode de réalisation présenté sur la figure unique, la combinaison polariseur horizontal et cristal liquide sert à alternativement exciter l'échantillon fluorescent 18 au moyen d'une lumière verticalement polarisée et d'une lumière horizontalement polarisée en ce que, lorsqu'on laisse initia- lement le commutateur 42 ouvert, le cristal liquide fait tourner de 90 la lumière qui lui parvient et, par conséquent, l'échantillon est excité par une lumière verticale, après quoi on ferme le commutateur 42, si bien qu'il n'y a aucune rotation et qu'une lumière horizontale excite l'échantillon. La lumière excita- trice polarisée et collimatée est ensuite focalisée par une len- tille plan-convexe 44 sur le centre de l'échantillon fluorescent 18 se trouvant dans le tube à essai rond 20. De la lumière parasite peut s'introduire dans l'optique émettrice par suite de réflexions au niveau des interfaces air-verre et verre-liquide du tube 20 contenant l'échantillon. Pour minimiser cet effet, le filament de lampe 10 est focalisé au centre du tube 20 de manière que tous les rayons (incidentset réfléchis) puissent entrer du tube et en sortir perpendiculairement à sa surface. Puisque l'optique d'émission qui sera décrite ci-après forme l'image de la région centrale de l'échan- tillon fluorescent 18 avec une efficacité optimale, le fait de focaliser le filament de lampe sur le centre du tube augmente le rendement de l'appareillage et maximalise donc le rendement global. C'est le rendement de l'appareillage de l'invention qui permet d'utiliser comme source lumineuse une lampe à halogène au tungstène de faible puissance et de faible intensité. On pourra se reporter au brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 4 195 932, o il est présenté un spectrophotomètre d'absorption dans lequel la lumière est foca- lisée sur le centre d'un tube A essai rond afin de réduire grande- ment les erreurs dues aux écarts du tube à essai. La combinaison du polariseur 38 et du cristal liquide 40 située dans le canal lumineux excitateur constitue un important aspect de l'invention. L'utilisation de dispositifs électro-optiques dans le canal d'émission a été proposée par d'autres. Toutefois, il a été trouvé que les erreurs de rotation inhérentes obtenues dans le cristal liquide soumis à un spectre de composante de polarisation dans le cnnal d'émission entraînaient des valeurs de polarisation mesurées qui n'étaient pas précises. Selon ces propositions, il a été suggéré que les erreurs de rota- tion inhérentes, dans le cas d'utilisation d'un cristal liquide dans le canal d'émission, pouvaient être notablement réduites par utilisation de données de référence initiale appropriées compen- sant les erreurs de rotation de polarisation ultérieurement mesu- rées. Toutefois, le moyen de compensation ainsi suggéré nécessite des éléments constituants supplémentaires de stockage de données, ainsi qu'un certain temps passé à l'étalonnage initial pour l'obten- tion des données de compensation. Au contraire, les erreurs ressenties dans la technique antérieure sont éliminées selon l'invention par la mise en place du cristal liquide dans le canal d'excitation et par 'uti- lisation d'un polariseur plan fixe en avant du cristal liquide, de sorte qu'un seul plan de polarisation tombe sur le cristal liquide. Ainsi, le cristal liquide fait tourner l'unique plan de polarisa- tion sans erreur notable. Une série d'écrans 46 constitués de bandes minces de matière plastique ou de métal possédant des surfaces noires sensiblement non réfl4chissantes sont disposés autour de l'échantil- lon 18 afin d'empocher que les réflexions grossières de la lumière d'excitation par le tube à essai 20 et les aires avoisinnantes ne pénètrent dans l'optique d'émission sous forme de lumière parasite. Ainsi que cela est illustré sur la figure unique, le canal de l'optique d'excitation et le canal de l'optique d'émission sont perpendiculaires l'un à l'autre de manière à réduire l'éventualité que la lumière excitatrice ne pénètre de manière non souhaitable dans le canal d'émission. Puisque la quantité de rayonnement émis par l'échantillon fluorescent est très basse, il est souhaitable de réduire le plus possible la lumière d'excitation parasite dans le canal d'émission. Il a été montré que, en l'absence des écrans 46 bordant l'échantillon fluorescent, la lumière excitatrice parasite contribuait notablement à la valeur de polarisation mesurée aussi bien en augmentant la valeur absolue qu'en altérant la reproduc- tibilité, tandis que, avec]'utilisation des écrans, ces effets non souhaitables étaient sensiblement éliminés. L'échantillon 18 peut par exemple contenir un fluide corporel auquel a été ajoutée une substance marquée à l'aide d'un marqueur fluorescent, comme la fluorescéine de sodium. Les molécules biologiques marquées sont ensuite excitées par la lumière incidente venant du canal de lumière d'excitation afin d'émettre de la lumière avec une longueur d'onde plus grande. Une lentille plan-convexe 48 réalise la collimation de la lumière émise, laquelle traverse ensuite un filtre 50 à interférence d'émission à large bande correspondant à peu près au pic d'émission de l'échantillon fluorescent, et un polariseur vertical 52 ayant un plan fixe de polarisation verticale. La lumière d'émission verticalement pola- risée et collimatée est ensuite focalisée par une lentille plan- convexe 54 sur une ouverture 56 formée dans un élément 58 opaque à la lumière sensiblement non réfléchissant se trouvant à l'entrée d'un tube photomultiplicateur 60 destiné à poursuite le traitement en fonction de techniques connues. L'ouverture de l'émission 56 a des dimensions de 3,0 mm sur 8,0 mm, qui sont adaptées à la quantité de lumière tombant sur le volume du conteneur 20 de l'échan- tillon. Dans un mode de réalisation de prototype selon l'invention, o l'échantillon a été marqué à l'aide de fluorescéine de sodium, le filtre d'excitation 28 est centré sur une longueur d'onde de 485 nm, avec une largeur à mi-puissance de 10 nm. Le filtre d'émission 50 présente une longueur d'onde centrale de 540 nm avec une largeur à mi-puissance de 30 nm. Toutes les len- tilles apparaissant sur la figure unique portent une couche anti- réfléchissante et ont une distance focale de 16,7 mm, un diamètre de 15 mm, une distance focale postérieure de 14,4 mm et un indice de réfraction de 1,785. Avec le prototype ainsi construit, on obtient une sensibilité de l'ordre de 10 il mole de fluorescéine de sodium. Bien entendu, l'homme de l'art sera en mesure d'imaginer, à partir de l'appareil dont la description vient d'être donnée à titre simplement illustratif et nullement limitatif, diverses variantes et modifications ne sortant pas du cadre de l'invention. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Appareil optique pour analyseur de polarisation en fluorescence, o un échantillon liquide fluorescent est irradié au moyen d'une lumière d'excitation et rayonne une lumière d'émission à partir desquelles on détermine la polarisation P sur la base de l'expression [I(Z)-I(Y)]/jIi(Z) +I(Y)I, I(Z) étant l'intensité mesurée d'une composante de polarisation de la lumière émise suivant un premier angle de polarisation lorsque l'échantillon liquide est irradié au moyen de la lumière d'excitation polarisée suivant le premier angle de polarisation, et I(Y) étant l'intensité mesurée de la composante de polarisation de la Lumière émise suivant le premier angle de polarisation lorsque l'échantillon liquide est irradié au moyen de la lumière d'excitation polarisée suivant un deuxième angle de polarisation perpendiculaire au premier angle de polarisation, l'appareil optique étant caractérisé en ce qu'il comprend: une source de lumière focalisée (10) servant à irradier ledit échantillon liquide au moyen de la lumière d'excitation focalisée sensiblement sur le centre dudit échantillon (18), la source de lumière focalisée comprenant une lampe (10) à halogène au tungstène de faible puissance et de faible intensité: un filtre à bande étroite (28) placé entre la source de lumière focalisée et l'échantillon de façon à laisser passer la lumière d'excitation en correspondance sensible avec la bande d'absorption de l'échantillon fluorescent; un premier polariseur (38) disposé entre le filtre à bande étroite et l'échantillon, le polariseur ayant un plan de polarisation fixe suivant ledit premier angle de polarisation; un cristal liquide à effet de champ (40),disposé entre le polari- seur et l'échantillon, comportant un moyen (42) permettant d'appli- quer alternativement un champ électrique au cristal liquide afin d'appliquer alternativement la lumière d'excitation polarisée suivant le premier ou le deuxième angle de polarisation à l'échan- titlon liquide; un détecteur photomultiplicateur (60) comportant une ouverture d'entrée (56) qui limite la lumière d'émission vue par ledit photomultiplicateur; des lentilles (48, 54) de focalisation de la lumière d'émission disposées entre l'échantillon et le photomultiplicateur de manière à focaliser la lumière émise sur l'ouverture d'entrée du photo- multiplicateur; un deuxième polariseur (52) disposé entre l'échantillon et le photo- multiplicateur et ayant un plan de polarisation fixe suivant ledit premier angle de polarisation; et un filtre (50) à bande large disposé entre l'échantillon et le photomultiplicateur afin de laisser passer la lumière émise en correspondance sensible avec la bande d'émission de l'échantillon fluorescent. 2 - Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier et le deuxième polariseur sont des polariseurs verticaux. 3 Appareil selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte des écrans (46) voisins de l'échantillon liquide afin de sensiblement empêcher que des réflexion de la lumière d'excitation ne pénètrent dans le trajet de la lumière d'émission allant Jusqu'à l'ouverture d'entrée du photomultiplicateur. 4 - Appareil selon la revendication 3, caractérisé en ce que la source de lumière focalisée comprend en outre: un réflecteur (12) associé à ladite lampe (10) à halogène au tungstène; un élément (16) opaque à la lumière possédant une ouverture (14) qui reçoit la lumière d'excitation réfléchie depuis la lampe; et des lentilles (26, 44) de focalisation de la lumière d'excitation disposées entre l'ouverture de l'échantillon afin de focaliser la lumière d'excitation sur le centre de l'échantillon. - Appareil selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comporte un élément (24) d'absorption du rayonnement infrarouge disposé entre ladite ouverture et lesdites lentilles de focalisation de la lumière d'excitation. 6 - Appareil selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte un moyen (32, 34, 36) de contrôle de la lumière d'excitation, ce moyen permettant de contrôler l'intensité de la lumière d'excitation afin de maintenir l'intensité lumineuse sensiblement constante.