Brevet FR2493310A1 — publié le 19820507

La thymosine 01 est une hormone peptidique biologiquement active connue, de Formule: H3 C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr- Lys-Asp-Leu-Lys-ilu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn- OH. La thymosine o1 et son analogue désacétyle ont été synthétisés selon le procédé en phase solide par Wong et Merrifield [Biochem. 19, 3e33-8 [1980)) en passant par les produits intermédiaires protégés CLysCTFa) 14,17,l9,CU)- thymosine (1 ou [LysCTfa) 1417,19',])-désacétylthymosine W la technologie de l'ADN recombinant. La présente invention concerne un procédé de préparation de thymosineO(1 à partir de désacétylthymosine Dû par acétylation sélective de son groupe N -amino en utilisant des préparations ribosomiques biologiquement actives à activité de transacétylase. Dans le cadre de l'invention, on peut utiliser n'importe quelle préparation ribosomique biologiquement active obtenue selon des procédés connus à partir de matières végétales ou animales. Chaque préparation riboso- mique biologiquement active possède une activité de trans- acétylase. Comme sources de préparations ribosomiques de ce genre, il faut mentionner par exemple le thymus, le Foie, les réticulocytes, lthypophyse, le coeur, les reins, le cerveau, les muscles, la peau ou les germes de blé. Le thymus et les germes de blé sont les sources préférées. Un peut détruire selon l'un des procédés connus la paroi cellulaire de la matière de départ et ainsi extraire les ribosomes de Façon classique. Il est préférable de prépa- rer les ribosomes fratchement chaque jour pour éviter les pertes d'activité de transacétylase dues au stockage. Pour isoler les ribosomes (sous-unité 30 5) à partir des germes de blé, le procédé de Hoberts et coll. [Proc. Natl. Acad. Soi. USA 70, a330-4 [1973)) convient particulièrement, tandis que l'isolement à partir du thymus s'effectue de Fagon particulièrement intéressante selon Shackelford et coll. CJ. Biol. Chemo 254, 4eO-b [[1979]). En général on obtient la préparation ribosomique par homogénéisation de la matière cellulaire dans un tampon approprié, comme le chlorhydrate de Tris-Chydroxyméthyl)- aminométhane [Tris-HCl), le phosphate ou l'acide N-a-hydroxy- éthyl-pipérazine-N-2-éthanesulfonique [HEPES), dans un à Mb pH d'environ 6,5-7,5, de préférence à environ 7,5, en présence de MgCla (environ 2-5 mM, de préférence 3 mM) et de dithiothréitol CDTT, environ 0,5-10 mM, de préférence 1 mM). On centrifuge l'homogénat à basse température. On soumet le surnageant Csans la couche grasse superficielle), qui correspond à la fraction 30S, à une filtration sur gel, par exemple sur Sephadex G-25,dse façon grossière, et on rassemble les fractions troubles. On centrifuge les frac- tiens réunies à 10 000 g. Le précipité contient les ribosomes désirés et peut être utilisé directement. Per ailleurs on peut à partir de cela isoler la transacétylase par un traitement plus poussé. En liaison avec l'invention on a utilisé le précipité dans un tampon Tris-HC1 aqueux CpH environ 7,5] contenant du OTT Cenviron 0,5-10 mMs de preference 1 mM] et du KCl [environ 0,53 mM, de préfé- rence 1,5 mM) ainsi qu'éventuellement du MgCla Cenviron 2-5 mM, de preférence 3 mM). Le pH optimum du milieu se situe peu en-dessous de 7,5. Au=dessus de pH 7,5, l'acétyla- tien NH, terminale décroît fortement, tandis queen-dessous de pH 3,5 apparatt un mélange de produits secondaires indé- sirables. On a trouvé de facon surprenante que la présence de KC1 dans le milieu réactionnel augmente fortement la sélectivité de l'acétylation NH. terminale de la désacétyl- thymosine c1' Comme agents acétylants il faut mentionner tous les composés acétyle activés appropriés, par exemple l'acétyl-CoA et la Nacétyl-thioéthanolamine, de préférence l'acétyl-CoA. L'utilisation de l'acétyl-CoA tritié C 3H- acétyl-CoA) Facilite la localisation du produit Final désiré dans la purification du mélange réactionnel. Etant donné que l'on peut théoriquement acétyler la molécule de désacétylthymosine O 1 en plusieurs endroits, il est surprenant que l'acétylation se produise selon le procédé de l'invention sélectivement sur l'extrémité 4NH - terminale de la molécule. Dans une variante typique, le procédé selon l'invention comprend les mesures suivantes: [a) Lyophilisation d'une solution aqueuse d'acétyl-CoA et de désacétylthymosine Ct dans un micro-tube à essais en polypropylène (environ 1-200 uM, de préférence environ tM de substrat et environ 1-500 tM, de préférence envi- ron 200 LM d'acétyl-CoA). (b) Addition d'une solution tamponnée de ribosomes (de préférence environ 13 ig de ribosomes pour 10 el de mélange réactionnel). Cc) Incubation du mélange réactionnel à une température d'environ 30-37 C, de préférence à 35 C. Dans ces conditions, la réaction se développe à environ 10-20% pendant a0 minutes. Cd) Addition d'une solution alcaline, p. ex. de NaOH, jusqu'à une concentration finale qui suffit pour détruire l'excès d'acétyl-CoA mais qui ne nuit pas au produit réactionnel, de préférence jusqu'à une concentration de 1 N. Au bout d'environ 15 minutes à 35 C on neutralise le mélange réactionnel avec un acide minéral concentré, par exemple HC1. D'un autre côté on peut utiliser de l'acide trichloracétique à 1S pour précipiter les protéines. Ce] Isolement du produit réactionnel désirée selon un procédé classique, de préférence par chromatographie. Un procédé chromatographique préféré est la chromatographie en phase liquide haute pression à inversion de phase [cf p. ex. Rubinstein, Anal. Biochem. SU, 1-7 [1979])). Les exemples suivants précisent l'invention sans la limiter. Exemple 1 [a) Préparation de l'extrait de germe de blé L'isolement des fractions de ribosomes à partir de germes de blé s'effectue selon le procédé décrit par Roberts et coll. avec quelques modifications. Un broie des germes de blé 6 g9) dans un mortier refroidi pendant 1 minute avec la même quantité en poids de sable dans ?0 ml de Tris-HCl [50 mM, pH 7,5) contenant 3 mM de MgCl2 et 1 mM de OTT. On centrifuge l'homogénat à O-20 C pendant A0Dminutes à 30 000 g et on introduit le surnageant séparé de la couche grasse superficielle dans une colonne [grosse, de 60 x ? cm) de Sephadex G-25 équilibrée avec du Tris-HCI (50 mM, pH 7,5), contenant 1 mM de OTT, avec une vitesse de 1,4 ml par minute. On rassemble les Fractions troubles et on centri- Fuge à 2OC pendant 2 heures à 180 000 g. On met le précipité en suspension dans 0,75 ml de la solution de Tris-HCl ci- dessus et on obtient une préparation ribosomique appropriée. h[b Acétylation de la désacétylthymosine t 1 Dans un micro-tube à essais en polypropylène on lyophilise une solution contenant 2,1 nM de H-acétylCoA et 0,4 nM de désacétylthymosine 0( 1. Un déclenche l'acé- tylation en ajoutant 10 el de la préparation ribosomique préparée selon [a). Au bout de CU minutes d'incubation à 35 C on ajoute 40 microlitres d'une solution aqueuse 24933 1 0 contenant 80 microgrammes C24 nMi] de thymosine " 1 comme support. Un ajoute ensuite NaOH jusqu'à une concentration finale de 1 N et on Fait incuber 15 minutes à 35 C pour détruire l'excès d'acétyl-CoA. On neutralise ensuite la solution avec HCl concentré. L'acétylation de la désacétyl- thymosine 1 s'effectue à 15%. Cc] Chromatographie en phase liquide haute pression avec inversion de phases On effectue la chromatographie en phase liquide haute pression CCLHP) sur une colonne à inversion de phases CLichrosorb RP-8, 10 Lm; 250 x 4,U mm)], comme il est dit par Rubinstein. On élue la colonne pendant 2 h avec un mélange de n-propanol et d'acide formique 1 M/ pyridine 0,2 M CpH 2,8) à un gradient linéaire de 0-40% CV/V) de n-propanol et un débit de 0,33 ml par minute. On rassemble des fractions de 2 minutes %. Toutes les secondes on ajoute des échantillons de 5 Ll d'un dispositif de détection par fluorescence. On mesure égale- ment la radioactivité dans l'éluat. L'analyse par CLHP montre un, pic radioactif que l'on élue avec la thymosine 1 utilisée comme support et qui démontre l'absence de thymosine o?1 acétylée sur les groupes _-NtH2 de la lysine. On observe une Faible acétylation des protéines ribosomiques. Le produit radioactivement marqué du pic de la thymosine de la séquence d'acides aminés du fragment H3C-GO-Ser-Asp- Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys comme étant la thymosine 1. Exemple [a) Préparation d'un extrait de thymus Un homogénéise des thymus de veau fraichement obtenus [12 g) dans un homogeneiseur de Dounce avec î volumes de tampon Tris-HC1 [2C mM, pH 7,5) contenant 3 mM de MgC1e mM de NaCl, 1 mM de DTT et 5O mM de saccharose. On centrifuge Ilhomogénat pendant 10 minutes à 30 000 g. On introduit les fractions riboeomiques 30 S dans une colonne équilibrée avec du Tris-HCI CEG mM, pH 7,5) conte- nant I mM de OTT et 3 mM de MgCla, à un débit de 1,4 ml par minute. Les Fractions troubles servent de source de l'activité de transacétylase. Toutes les opérations s'effec- tuent à 0-20C. [b] Acétylation de la désacétylthymosineC( 1 1S On lyophilise dans des micro-tubes à essais en polypropylène des solutions contenant du 3Hacétyl-CoA [1,05 nM) et aD4 pM ou pas du tout de désacétylthymosine 0 On amorce les réactions en ajoutant à chaque fois 5 L1 [4,1 Lg) de la préparation ribisomique obtenue selon [a). Au bout de 20 minutes d'incubation à 350C on arrête les réactions en ajoutant 2 ml d'acide trichloracétique à %. On rassemble les précipités sur des filtres Millipore [0,45 em), on lave avec de l'acide trichloracétique à 5%, on sèche et on rocherche la radioactivité dans 10 ml 2a d'Aquasol. Leacétylation s'élève à 0,3%. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de thymosine O en ce qu'on acétyle de Façon sélective le groupe Ne- amino de la Nl -désacétylthymosine 0 activité de transacétyl1ase. 2. Procédé selon la revendication 1, lu que la préparation ribosomique vient laire végétale. 3. Procédé selon la revendication 1, que la préparation ribosomique vient 4. Procédé selon la revendication 1, que la préparation ribosomique vient animale. 5. Procédé selon la revendication 1, que la préparation ribosomique vient caractérisé en ce d'une matière cellu- caractérisé en ce de germes de blé. caractérisé en ce de matière cellulaire caractérisé en ce de thymus animaux. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le pH du milieu réectionnel se situe juste en- dessous de 7,5. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu réactionnel contient du dithiothréitol et du KCl. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le milieu réactionnel contient en outre du MgCla.