Brevet FR2497099A1 — publié le 19820702

La présente invention concerne un procédé pour la production de facteur leucopolétique humain, ci-après désigné en abrégé par FLh. Il est connu que FLh est uneiormone stimulante, qui active la différentiation des cellules de lignée hu- maine en leucocytes. Ces derniers temps, on a utilisé de plus en plus fréquemment l'irradiation et l'administration d'agents carcinostatiques pour le traitement des maladies malignes que l'on considère maintenant comme une des cau- ses principales de décès; mais ces thérapies aboutissent inévitablement à une diminution indésirable du nombre des leucocytes et à un abaissement de la résistance physique du patient, ce qui rend, par voie de conséquence, la pour- suite de ces thérapies très difficiles. L'utilisation de FLh, en combinaison avec une ou plusieurs des thérapies in- diquées plus haut, constituerait sans aucun doute un trai- tement plus efficace des maladies malignes, aussi bien que de la leucémie, maladie qui a été considérée comme incu- rable. A ce jour, on connait plusieurs voies possibles pour obte- nir du FLh, comme par exemple sa récupération à partir de sécrétions humaines ou de certains tissus humains, par des procédés très compliqués; ou la multiplication de cellu- les humaines productrices de FLh par culture in vitro de tissus, dans un milieu de culture contenant les principes nutritifs nécessaires, ou bien la transplantation in vivo de ces cellules dans le corps d'un animal à sang chaud, préalablement immuno-supprimé avec de l'antisérum ou une substance supprimant l'izmmuno-réaction, suivie de la sou- mission des cellules multipliées, résultantes, à l'induc- tion; mais toutefois, la préparation de FLh obtenue par l'un des procédés ci-dessus, est d'ordinaire immunologique- ment inactive, et même lorsqu'elle est active, le taux de FLh y est extrêmement bas. En raison de ces inconvénients, cette substance n'est pratiquement pas utilisée, en dépit du fait reconnu de sa grande potentialité. La présente invention a pour objet la produc- tion eu quantités suffisantes de FLh homogène, en vue d' applications médicales comme utilisations cliniques et thérapeutiques. Elle est basée sur la constatation inat- tendue que la production de FLh, à partir de cellules d'hybridome formé par fusion de cellules humaines, capa- bles de produire ce facteur, avec des lymphoblastodes humains, conduit habituellement à des rendements 2 à 10 fois supérieurs à ceux que l'on atteint avec des cellules productrices de FLh, seules; lorsque ces cellules d' hybridome sont multipliées dans le corps d'un animal à sang chaud, leur production de FLh est 4gale à 2 à 50 fois, ou plus, celle que l'on obtient par multiplication des mê- mes cellules par culture de tissus-in vitro, ou à l'aide de cellules humaines, normales ou tumorales, capables de produire du FLh, cultivées in vivo ou in vitro. Le nouveau procédé selon l'invention de oroduc- tion de FLh consiste à fusionner des lymphoblaszoîdes hu- ma.ins avec toute cellule humaine capable de prc!uire du FLh, à multiplier les cellules dhybrid.ome{/ Olransplan- tation dans. le corps d'un animal à sang chaud, ou en fours nissant à ces cellules, à!laide d'un dispositif, le fluil te corporel nutritif d'un animal à sang chaud, puis à lais- ser les cellules cd'hybridome: multipliées par l'un ou 1I autre de ces procédés de multiplication, libérer le FLh. Le procédé,selon l'invention,de multiplication des cellu- les d'hybridome humain, aboutit à une production supérieu- re en FLh, n'exige que peu ou pas de milieu nutritif conte- nant du sérum co teux, et ilpermet de maintenir plus faci- lement que dans le cas de la culture de tissu in vitro, la culture des cellules. En particulier, tous les lympho- blastoides humains, dotés de l'aptitude 2 produire du FLh, Dar fusion avec des cellules humaines oroductrices de FLh, peuvent -tre facilement multipliées.ar transplantation de ces cellules d'hybridome dans le corps d'un animal à sang 24970! chaud, ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion éelpée pour recevoir le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud, l'animal étant alimen- té de manière habituelle. Ce procédé est également caractérisé par une multiplica- tion des cellules plus stable et plus élevée, et par une production FLh par cellule, 2 à 10 fois, ou même plus, supérieure à celle que l'on obtient par des procédés clas- siques, comme celui qui consiste à transplanter des cellu- les humaines, normales ou tumorales, capablesde produire du FLh, dans le corps d'un animal immuno-déficient, par exemple la souris nue, afin de réaliser in vivo la multi- plication de ces cellules,puis à cultiver ces cellules pour produire le FLh. Les cellules d'hybridome, utilisées conformément à l'invention, qui peuvent être obtenues par fusion de cellules humaines, capables de produire FLh avec des lym- phoblastoldes humains, par des modes opératoires bien con- nus, sont aptes à produire du FLh, et se multiplient faci- lement, lorsqu'on les transplante dans le corps d'un ani- mal à sang chaud. En ce qui concerne les cellules humaines, produc- trices de FLh, utilisables pour l'hybridation avec les lym- phoblastoldes humains, conformément à l'invention, convien- nent toutes les cellules humaines dans la mesure o elles sont capables de produire ce facteur, sans que soit prise spécialement en considération leur origine. On peut,par exemple, utiliser avantageusement des cellules de poumon, rate; cellules sanguines périphériques; leucocytes, cel- lules de rein foetal, de glande sous-maxillaire, de moelle osseuse, lymphocytes-T ou -B, cellules placentaires ou uté- rines; des cellules tumorales qui sont des cellules men- tionnrées plus haut, transformées par des virus, des agents carcinogbnes ou des radiations; des cellules de tumeurs malignes provenant de patients souffrant de carcinone du poumon, leucémie, lymphome, carcinome de l'utérus, car- cinome du rein ou carcinome gastrique; ainsi que des li- gnées de cellules établies des cellules citées plus haut. En ce qui concerne les lymphoblastoides auxquels on transmet l'aptitude à produire FLh des cellules capa- bles de produire ce facteur, comme décrit dans l'inven- tion, on peut utiliser tout lymphoblastoide humain s'il forme, avec les cellules productrices de FLh, des cellu- les d'hybridome capables de produire ce facteur. L'utili- sation d'une lignée de lymphoblastoides humains bien éta- blie, qui peut être facilement repiquée, s'avère plus ef- ficace pour la production à l'échelle industrielle de FLh, car cette lignée établie peut se multipliertlus rapidement, et présente en général une aptitude à produire FLh plu- sieurs fois ou plusieurs dizaines de fois supérieure. Com- me la transplantation de la lignée bien établie de lympho- blastoTdes humains, mentionnée plus haut, dans le corps d'un animal à sang chaud aboutit à la formation d'une tu- meur massive, et cette tumeur massive est difficilement contaminée par les cellules de l'h8te animal, les lympho- blasto!des humains, viables, multipliés, peuvent être facilement isolésde l'animal et désagrégés. Conformément à l'invention, toutes les techni- ques de fusion conviennent pour la fusion des lymphoblas- todes humains avec les cellules humaines, capables de pro- duire du FLh, mentionnées plus haut; on peut utiliser par exemple des procédés HVJ, tels que procédé de fusion parasite-erythrocyte, des procédés avec ribosome associé à des pointes de HVJ et des procédés avec addition de HVJ, ainsi que le procédé utilisant du polyéthylène gly- colo Les sites génétiques,codant la production de FLh, peuvent être introduits dans les lymphoblastoldes humains par des techniques de recombinaison de gène, au moyen de ADN ligase, nucléase et ADN polymérase: on obtient des résultats similaires à ceux que donne la tech- nique de fusion cellulaire mentionnée plus haut. Conviennent comme animaux utilisables dans le procédé selon l'invention tous ceux, dans lesquels les cellules d'hybridome peuvent se multiplier, par exemple des volailles comme poulet et pigeon, des mammifères com- me chat, chien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. Comme cette transplantation cellulaire provoque une immunoréaction indésirable, il s'avère souhaitable d'utiliser des ani- maux nouveau-nés ou en bas âge, ou encore au stade le plus jeune possible, comme oeuf, embryon ou foetus. Afin de réduire l'immunoréaction, l'animal peut être traité, avant la transplantation des cellules,par irradiation aux rayons-X ou aux rayons-)., d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'antisérum ou d'agent immunodépresseur préparé selon un procédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente l'immunoré- action la plus faible, même à l'âge adulte, on peut l'u- tiliser avantageusement sans prétraitement, pour y trans- planter et y multiplier rapidement des lignées de cellules humaines établies. Une multiplication cellulaire de l'hybridome, stabilisée, et une augmentation de la production de FLh, peuvent être à la fois réalisées par transplantation ré- pétée, utilisant des combinaisons de différents animaux à sang chaud: par exemple on peut implanter d'abord les cellules d'hybridome chez le hamster, o elles se multi- plient, puis réimplanter les cellules d'hybridome multi- pliées chez un autre animal comme la souris nue. En outre, on peut effectuer la transplantation successive chez des animaux de la même classe ou division, aussi bien que chez ceux de la même espèce ou du même genre. En ce qui concerne la localisation de l'implan- tation des cellules d'hybridome conviennent tous les sites de l'animal, pourvu que ces cellules puissent s'yhulti- plier, par exemple la cavité allantolque, ou les voies intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée. A cOté de cette transplantation directe des cellules d'hybridome au corps de l'animal, existe la possibilité de faire se multiplier aisémeint les lignees classiques de cellules d'hybridome, capables de produire FLh, en utilisant le fluide corporel nutr-itif provenani de l'animal, grace à ltinclusion, par e;zemple par voie intrapéridonéale dans le corps de ianimal d'une chambre de diffusion classique, de taille etlde forme appropri4ese munie d'une membrane poreuse, filtrante, d'un ultra-fil- tre ou de fibre creuse d'un dia-ètre d pore de l'ordre de -7 à 0d5 m., qui empêche la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'hte tout en persttant l'apport du fluide corporel nutritif dz lîaninl aux ce!- lules d'hybridome. De plus, comwe la chambre de diffusion peut re conç.ue, si nécessaire, pour %tre placee suir ' h6te animal et permettre au fluide corporel de ce dernier de circulzr dans la charbre, les patois de cel!=ci peu- vent être munies de fonetres latérales, transpsaenter.. permettant l'observation de la suspension de cellules, ainsi que le remplacement ej/' tchange a-et une chambre- fralche - la multiplication cellulaire est ainsi augmen- tée à un niveau encore supérieur, rapporte à la durée- de vie de l'animal, et la production par animal est encore accrue sans sacrifice de 'h te En outre. lorsqu on uti- lise cette chambre de diffusion, comme les cellules d'hyh bridome multipliées peuvent être facilement récoltées, e qu'il n'y a pas manifestation d'immunoréaction. du f-ait de l'absence de contact direct entre les cellules d'hybri- -dome et celles de l'hôte anima-, on peut utiliser comme hSte, conformement à l'invention, sans prêeraitement des- -iné à réduire l'immunoréaction, tout animal à sang chaudo L'alimentation de l'hôte animal, auquel on a im- 2497( planté des cellules d'hybridome, peut s'effectuer facile- ment par procédé classique, même après la transplantation cellulaire, et elle ne nécessite pas de soins particuliers. La multiplication cellulaire maximale est at- teinte environ 1 à 20 semaines après l'implantation des c jles. Toutefois, lorsqu'on implante une lignée de cellules d'hybridorne établi, la multiplication cellulaire maximale est atteinte en 1 à 5 semaines, après la trans- plantation, en raison des vitesses de multiplication cel- lulaire trèÄs élevées de ce type de lignée. Conformément à l'invention on obtient 107 à 1012 ou plus, de cellules d'hybridome par hôte. Autrement dit, le nombre de cellules d'hybridome implantées chez l'hôte animal s'accroît 102 à 1 fois ou plus, ou bien est d'en- viron 101 à 1o6 fois ou plus celui que l'on obtient avec un procédé de culture de tissu in vitro, utilisant un mi- lieu nutritif, aussi ces cellules d'hybridome sont-elles avantageusement utilisables pour la production de4Lh, En ce qui concerne le procédé pour libérer FLh, on peut employer tout moyen permettant sa libération par les cellules d'hybridome, obtenues par le mode opératoire mentionné plus haut. Par exemple, les cellules d'hybri- dome, obtenues par multiplication en ascite, en suspen- sion, et récolte à partir de cet ascite, ou par extrac- tion de tumeur massive, formée sous la peau, et récolte après désagrégation de la tumeur, sont mises en suspension pour atteindre une concentration de 10 à 1i8 cellules par ml dans un milieu nutritif, maintenues à une température mises de l'ordre de 20WC à 400C, puis/à incuber à cette tempé- rature pendant 1 à quelques semaines. Afin d'augmenter la production de FLh par les cellules d'hybridome, on peut ajouter au milieu nutritif, mentionné plus haut, tout a,-ent inducteur de ce facteur; par exemple des agents bien connus comme ARN naturel à double brin; ARN synthé- tique à double brin corume Poly I:C; lipopolysaccharides microbiens; des mitogènes comme pbytohemagglutinine, cancanavaline A, tuberculin (PPD), ou mitogène de phy- tolaque; polymère chimiquement modifié comme sulfate de dextrane; polymère synthétique comme copolym.re de pyranne ou acide polyacrylique; différents composés cationiques à bas poids moléculaire; différentes endo- toxines; et des composés du lithium comme Li2C0O3 et LiCI. Le FLh, ainsi obtenu, peut être recueilli fa- cilement grâce à des techniques de purification et de sé- paration utilisant des modes opératoires classiques, tels que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, con- centration et lyophilisationo Quand on souhaite un pro- duit encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supérieure par combinaison des techniques mention- nées plus haut avec d'autres modes opératoires classiques, tels qu'adsorption et désorption avec échange d'ions, frac- tionnement par poids moléculaire, chromatographie par af- finité, fractionnement au point isoélectrique et électro- phorèse. Comme la préparation de FLh, ainsi obtenue, est identique aux points de vue immunologique et physiochimique, à cel- les que l'on obtient par des procédés classiques à partir de la culture de tissus humains, et elle est moins conta- minée par les virus de l'hépatite ou les pyrogènes que les préparations obtenues à partir de sérum, elle peut être avantageusement utilisée, seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, pour injection, administra- tion externe, interne ou de diagnostic, pour la préven- tion ou le traitement de maladies humaines. Le dosage de la production de FLh, dans cette description, est réalisé conformément au procédé / tlesiint des cellules de moelle osseuse de souris, décrit par S. Asano et coll. dans Br. J, Cancer, Vol. 41, pp. 689-694 (1980). Comme défini dans cet article, 1 unité de FLh forme une colonie de 5x10 cellules de moelle osseuse de souris dans 0,1 ml d'échantillon de préparation d'essai. Les exemples suivants illustrent quelques formes de réalisation du procédé selon l'invention; en aucune maniàre ils n'en limitent le cadre. EXEMPLE 1 Des cellules de carcinome du poumon humain, haché et dé- sagrégé, obtenues par extraction à partir d'un patient souffrant d'un carcinome du poumon et une lignée de lym- phoblastoldes leucémiques, humains, de Namalwa, sont mises en suspension ensemble dans un récipient avec une solution saline de 140 mM de NaCI, 54 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4 et 2 mM de CaC12, de manière à obtenir des con- centrations cellulaires respectives de l'ordre de 103 cellules/ml. La suspension de cellules, refroidie à la glace, est mélangée avec une préparation fratche de la même solution saline, contenant du virus de Sendal préa- lablement inactivé par irradiation à l'ultra-violet, le tout est transféré 5 minutes après le mélange dans un in- cubateur à 370C, et y est agité pendant 30 minutes pour réaliser la fusion cellulaire, introduisant l'aptitude à produire du FLh dans la lignée des lymphoblastoldes leu- cémiques, humains. Après clonage selon un procédé clas- siqueci la lignée de cellules cl'hybridome, capable de produire le FLh, on l'implante par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs mas- sives, résultantes, pesant environ 14 g chacune, formées dans les corps des hôtes animaux, sont extraites puis mi- ses en suspension dans une solution saline contenant de la trypsine, afin de les désagréger. Les cellules désagrégées sont lavées avec du milieu RPMI 1640, pH 7,2, additionné de 10W en volume/volume de sérum foetal bovin, et ensuite elles sont remises en suspension dans une préparation frai- che du même milieu, à une concentration del'ordre de 1 x 105 cellules/ml, et rmises à incuber à 37 C pendant 7 jours, afin de-ibérer le FLh, avec remiplacement périodique du mi]Jeu par du milieu frais. A la fin de la période d'in- cubation, la suspension est traitée par les ultra-sons, et la partie surnageante est essayée quant à sa teneur en FLh. Le taux de FLh est voisin de 2500 unités / ml de suspension. L'experimentation témoin est r4alisee par traitement de cellules dio carcinome du poumon humain, non fusionnées, comme dLcrit plus haut pour la lib4ration de FLh. La Drc- ductionr. de FLh n:est que de 12 unités/l d3 suspension. En outre, la lignie de cell!ules d'iybridcmQ ?.entionné plus haut, et les cellules de carcinome du pooumone humain sont mises en suspension et à incuber yn--;e in vi- t,'o, dons du milieu RPi 640, pH 7t,2 c,:u... é de 1% en volume/volume de sérumn -foetal bovinn, puis raitées séparément de nmanière identique è clle,ui est décrita plus haut pour ia libraion de FLho Les taux- de FLh darns les milieux ne suorn respectivenet que de 9Q r't 85.:uié/ ml de suspensin ce!!ulaire, ce oqui est 2 %e infètie r] ce qu'on attein-t lors de lexpérimesntation t. oin mention- née plus haut. EXEMPLE 2 Après injection à des nhamers nouveau-nes dantiîerr,- preparé à l aide de lapin selon un procède cla-ssiue, afin de réduire liDl.munoreactrn' on iasplan:e, - r voie sous- cutanee, cez Cez arlnimaux, une.ignée e Jl2phoblasodes leucémiques, humains, NALL_1 dans laquelle l'aptitude à produire FLh des lymphocytes-B humains a été introduite comme dans 'L'exemple 1, puis on les nourrit de mani're habituel- le pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau, et pesant environ 9 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple ' pour libérer FLh. La production est de l'ordre de 3500 unités/ml de sus- pension cellulaire. 24970S EXEK;PLE 3 L'aptitude à produire FLh des cellules tumorales de la glande sousmaxillaire humaine, provenant d'un patient souffrant de cette tumeur, est introduite, conformément à la technique de fusion cellulaire décrite dans l'exem- ple 1, dans une lignée de lymphoblastotdes leucémiques humains, JBL. Après clonage, selon un procédé classique, de la lignée de cellules d'hybridome capable de produire du FLh, on implante celle-ci, par voie intraveineuse, dans des rats nouveau-nés, que l'on nourrit de manière habituelle pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, ré- sultantes, pesant environ 37 g chacune, sont enlevées et traitées comme dans l'exemple 1 pour libérer FLh. La pro- duction est voisine de 2900 unités/ml de suspension cel- lulaire. EXEMPLE 4 On opère comme dans l'exemple 3, mais avec addition au milieu de culture de 102.g de phytohemagglutinine/ml. La production de FLh est voisine de 4500 unités/ml de sus- pension cellulaire. EXEMPLE 5 Une lignée de lymphoblastoldes leucémiques, humains, TALL-1, est fusionnée avec des cellules de carcinome gastrique provenant d'un patient souffrant d'un carcinome de l'estomac, à l'aide d'une technique de fusion cellu- laire classique, utilisant du polyéthylèneglycol. Après * clonage, selon un procédé classique, de la lignée de cel- lules d'hybridome capable de produire du FLh, on trans- plante cette lignée, par voie sous-cutanée, dans des sou- ris adultes dont l'immunoréaction a été supprimée par irradiation de 400 rems environ de rayonsy Y Puis on nourrit les souris de manière habituelle,pendant 4 semai- nes. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau et pesant 15 g chacune, environ, sont extraites et traitées comme décrit dans l'exemple 1, pour libérer le FLh. La production est d'environ 3500 unités/ml de sus- pension cellulaire. EXEMPLE 6 Une lignée de lymphoblastoydesleucémiques, humains, TALL-1 dans laquelle l'aptitude à produire du FLh, des cellules de carcinome humain, provenant d'un patient souffrant de cette maladie a été introduite par la technique de fu- sion cellulaire décrite dans l'exemple 5, est mise en suspension dans du sérum physiologique,puis le tout est transféré dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique, dont le volume intérieur est de l'or- dre de 10 ml, munie d'une Membrane filtrante ayant une di- mension de pore voisine de 0,5/. Après inclusion, par voie intrapéritonéale, de cette chambre dans un rat adulte, on nourrit celui-ci de manière habituelle pendant 4 semai- nes, puis on enlève la chambre. La densité en cellules humaines dans la chambre, atteinte au cours de l'opéra- tion ci-dessus, est d'environ 2x109 cellules/ml, ce qui est environ 103 fois supérieur, ou même plus, à ce qu'on atteint avec une culture in vitro à l'aide d'un incubateur à C02. Les cellules humaines,multipliées, ainsi obtenues, sont traitées comme dans l'exemple 1. La production de FLh est de l'ordre de 4200 unités/ml de suspension cellu- laire. EXEMPLE 7 On reprend l'expérimentation de l'exemple 6, mais en ajou- tant au milieu de cet essai, environ 5/tg d'ARN synthé- tique à double brin, Poly I:C. La production de FLh est de l'ordre de 7300 unités/ml de suspension. EXEMPLE 8 Une lignée de lymphoblastoides leucémiques, hrum-ins, de Namalwa, dans laquelle l'aptitude à produire du FLh a été introduite comme dans l'exemple 1, est implantée dans la cavité allantoîque d'oeufs embryonn-s, préalablement mis à incuber à 37 C pendant 5 jours. Apres incubation de.s oeufs embryonn6s à cette température, pendant 1 semaine supplémentaire, lesellules humaines, multipliées, sont récoltées et traitées comme dans l'exemple 1 pour in- duEre le FLh, à ceci près qu'on ajoute au milieu environ 10/Ag de tuberculine PPD. La production de FLh est voi- sine de 5700 unités/ml de suspension. Revendications 1. Procédé pour la production du facteur leucopolé- tique humain (FLh) par multiplication de cellules humai- nes, capables de le produire, suivie de libération de ce facteur à partir des dites cellules, caractérisé en ce qu'on utilise comme cellules productrices de FLh, des cellules d'un hybridome formé par fusion de lrymphoblas- toTdes humains avec des cellules humaines, capables de produire ce facteur. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les lymphoblastoTdes humains sont des lymphoblas- toTdes leucemiques, de pzéférence de Namilwa BklL-19 NALL-1, TALL1 ou JBL. 3. Procédé selon la revendication 1 au 2, caracté- risé en ce que les cellules humaines capables de produire le F-Lh, fusionnées avec les lymphoblastoïdes humains, sont des cellules de carcinome du poumon, du rein ou de l'es- tomac. 4. Procédé selon la revendication i ou 2, caractéri- sé en ce que les cellules humaines, capables de produire du FLh, fusionnées avec les i%,Iphoblastetdes humains, sont des lymphocytes-B ou des cellules tumoralsG de glande sous- maxillaire 5. Procédé selon l'une des revendications 1 4, ca- ractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réa- lisée par implantation des cellules d'hybridome dans le corps d'un animal à sang chaud. 6. Procédé selon l'une des revendications I à 4, ca- ractérisé en ce que la multiplication cellulaire es*éa- lisée à l'aide d'un dispositif, dans lequel le fluide cor- porel, nutritif, d'un animal à sang chaud est fourni aux cellules d'hybridome humaines. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion équipée de manière.à ce que les cellules de l'hÈte animal ne la contaminent pas. 8. Procédé selon une des revendications 1 à 7, ca- ractérisé en ce que la libération de FLh est réalisée en présence de l'un ou de plusieurs des composés suivants: ARN naturel à double brin, ARN synthétique à double brin, lipopolysaccharide microbien, agent mitogène, polymère naturel chimiquement modifié, comme le sulfate de dex- trane, polymère synthétique, composé cationique à bas poids moléculaire, endotoxine et composé du lithium. 9. Procédé selon une des revendications 1 à 8, ca- ractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poulet ou pigeon, ou un mammifère, notam- ment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, la- pin, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.