Brevet FR2497809A1 — publié le 19820716

La présente invention concerne un nouveau poly- saccharide MPS-80, de masse moléculaire élevée, ainsi qu' un procédé pour son obtention. Ce polysaccharide, qui pré- sente une viscosité élevée, est fortement actif sur des tumeurs. Le nouveau polysaccharide MPS-80, de poids molé- culaire élevé, selon la présente invention, peut ètre6b- tenu par culture de bactéries productrices de MPS-80,ap- partenant à la famille des Lactobacillus et Streptococcus. Conviennent notamment le Lactobacillus Jugurti NO 851 "FERM BP-66 (FERM-P NO 5851)N et le Streptococcus thermophilus N0 127 "FERM BP-65 (FERM-P NO 5850)", déposés au Fermen- tation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (Japon). Lorsque la culture est terminée, on isole la fraction liquide par centrifugation et la traite avec de l'éthanol ou autre solvant organique; le précipité obtenu, mis à plusieurs reprises en solution dans l'eau donne le MPS-80 qui sera ultérieurement purifié. Conviennent pour la culture tous les milieux, de diverses compositions, mais on préfère un milieu de cul- ture pour bactérie lactique, contenant du lait écrémé ou du petit-lait. En ce qui concerne les conditions de culture, on obtient des résultats satisfaisants, par exemple par cul- ture statique à 200-45oC. Elle peut être réalisée dans les conditions qui permettent aux bactéries génératrices de MPS-80 de croître, entraînant de ce fait la production de MPS-80. Lorsque la culture est terminée, le milieu est divisé par centrifugation, en une fraction liquide et une fraction bactérienne. On recueille à partir de ces fractions le MPS-80 doué d'effets anti-tumoraux. MPS-80 est recueilli à partir de la fraction liquide par une opération classique telle que filtration sur gel, chromatographie par échange d'ions, relargage, dissolution fractionnée, dialyse, et similaires. Ces techniques peuvent être utilisées isolé- ment ou en combinaison. A partir de la fraction bacté- rienne,MPS-80 peut être recueilli, par exemple par ex- traction avec de l'eau, suivie du traitement de l'extrait de la manière indiquée plus haut pour la récolte à partir de la fraction liquide. En général, conformément à l'invention, les bac- téries génératrices de MPS-80 sont cultivées dans un mi- lieulde petit-lait, et l'on sépare le liquide surnageant du mélange de culture, par centrifugation. On ajoute alors un solvant organique à ce liquide pour former un précipi- té. D'autre part, la fraction bactérienne, obtenue par cen- trifugation, est extraite à l'eau, et4'on soumet l'extrait à la centrifugation, pour séparer le liquide surnageant que l'on traite également avec un solvant organique produi- sant un précipité. Les deux précipités sont dissous dans l'eau, et on y ajoute un solvant organique pour reprécipiter le produit. Les pré- cipités sont dissous dans une solution tampon convenable et sont chargés dans un échangeur d'ions qui a été suffi- samment tamponné avec la même solution tampon. Puis on fait passer la même solution tampon à travers l'échangeur d'ions. On recueille un liquide, contenant MPS-80 qui n'a pas été adsorbé sur l'échangeur d'ions, et on le dialyse au moyen d'eau désionisée. La solution dialysée est séchée par congélation, ce qui donne du MPS-80 purifié. MPS-80 ainsi obtenu exerce une excellente action anti-tumorale et constitue donc un intéressant agent con- tre les tumeurs; sa forte viscosité le rend également u- tile comme agent épaississant. Les propriétés physicochimiques du polysacchari- de de haut poids moléculaire MPS80, obtenu conformément à l'invention, sont indiquées ci-après. 1) Analyse él4mentaire: C: 42,2 % H = 6,9 % 0 = 50,4 % 2) Détermination de la masse moléculaire: a) par ultrafiltration: les résultats de l'ultrafiltration à l'aide de Sepharose 2 B sont indiqués dans la figure 1; le po- lysaccharide est fractionné près du volume des vides, dans des conditions comprenant une colonne de 2,5 x 40,5 cm, une fraction de 5 g, un échantillon chargé de 2,5 mg (1 ml) et une solution tampon phosphate 0,05 M (pH 6) u- tilisée pour développer; b) par ultracentrifugation un échantillon est dissous dans une solution tampon phosphate 0,2 M (pH 7,3) et la solution résultante, ayant une concentration de 0,1%, est soumise à l'ultra- centrifugation (vitesse de rotation 51 200 tours/mninute) poui6btenir une constante de sédimentation de 7,98 S (S = unité Svedberg). (La sédimentation est simple). 3) Point de fusion (point de décomposition) Ce polysaccharide commence à se colorer vers 262 C et noircit à 263 -264 C. 4) Pouvoir rotatoire spécifique z lO/D = + 33,2 (C = 0,5 %) ) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet: donné par la figure 2. 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge: indiqué sur la figure 3. 7) Solubilité dans les solvants: soluble dans l'eau mais insoluble dans méthanol éthanol, acétone et éther. 8) Réactions colorées: Réaction de Molisch: + Réaction à l'anthrone i + Réaction cystéine-acide sulfurique: + Réaction aniline-acide chlorhydrique: - Réaction carbazole-acide sulfurique: - Réaction de Elson-Morgan: - Réaction du biuret: - 9) Basicité, acidité ou neutralité: solution aqueuse à 0,1-0,5% de ce polysaccharide a un pH neutre. ) Coloration: le polysaccharide séché par congélation se présente sous la forme de fibres blanches. 11) Saccharides entrant dans la constitution de MPS-80: on examine la constitution de MPS-80 par chromatographie gazliquide utilisant 5% SE-52 (colonne de 2 mètres). La colonne est chauffée à 150 -230 C (3 C/minute). L'échan- tillon est hydrolysé avec S04H2 2N dans l'eau bouillante, pendant 4 heures, puis neutralisé avec du carbonate de baryum et soumis à filtration. Le filtrat est déminérali- sé avec Amberlite IRA-410 et Amberlite IR-120B, concentré à siccité, et soumis à un traitement TMS suivi par une chromatographie gaz-liquide. On constate que glucose et galactose sont les saccharides entrant dans la constitu- tion de MPS_80. 12) Proportions des saccharides constituant MPS-80: l'é- chantillon est hydrolysé avec S04H2 2N dans l'eau bouil- lante pendant 4 heures, neutralisé avec du carbonate de baryum et filtré. On examine ce filtrat pour déterminer les proportions des différents saccharides. On constate que le rapport glucose/galactose est de 2,2 à 1,9. 13) Spectre de RMN-13C (dans D20, TMS Standard) 'ppm): indiqué dans lfigure 4. 14. Décomposition par les enzymes: on dissout le poly- saccharide dans une solution tampon d'acétate 0,05 M, et on soumet le résultat à l'action de différentes enzymes; la décomposition par les enzymes est appréciée d'après 1' augmentation en sucre réducteur mesurée par la méthode de Somogyi-Nelson; les enzymes utilisées et les conditions de réaction sont: a. a-Amylase pH 5,9 37 C 4 heures b. P-Amylase pH 4,8 30 C 4 " c. P-Galactosidase pH 4,8 300C 4 " d. Amyloglucosidase pH 4,8 30QC 4 h. e. a-Galactosidase pH 4,8 300C 4 h. (toutes ces enzymes sont produites paf Boehringer); dans ces conditions, on ne constate aucune augmentation de la quantité de sucre réducteur pour les enzymes étudiées. ) DL50: on utilise des souris ddY 5 w femelles, pesant en moyenne 21,3 g,chaque groupe comportant 7 souris. Un échantillon en solution dans du sérum physiologique est administré par voie intrapéritonéale une seule fois, en différentes quantités, à des souris, que l'on observe pendant 10 jours pour déterminer la DL50; celle-ci est inférieure à 200 mg/kg de poids de l'animal. Les essais expérimentaux et les exemples non li- mitatifs suivants permettent de mieux comprendre l'inven- tion. EXEMPLE 1 On inocule 10 litres d'un milieu de petit-lait, comprenant % en poids /volume de poudre de petit-lait + 0,5% en poids/volume d'extrait de levure de bière, avec du Lacto- bacillus Jugurti NO 851 "FERM BP-66 (FERM-P NO 5851)", et l'on effectue une culture statique à 37 C pendant 24 heures. Lorsque l'opération est achevée, le mélange de culture est centrifugé à 10 000 tours/minute pendant 15 minutes,ce qui donne 9,2 litres d'un liquide de culture surnageant. On y ajoute de l'alcool éthylique à 99,5%, en quantité telle que sa concentration finale soit de 35% (volume/volume). Il se forme un précipité qui est centrifugé à 10 000 tours/minute, pendant 5 minutes, et donne 1,2 g de produit. Pour obtenir une solution, on ajoute à ce précipité de l'eau adoucie par échange d'ions. On élimine par centrifugation à 10 OOC tours/minute, pendant 15 minutes, de cette solution une ma- tière insoluble. Ce traitement est répété à 3 reprises, et l'on obtient 800 mg de produit grossièrementÀ,urifié. Ce dernier est dissous dans une solution tampon phosphate 0,05 M (pH 6), qui est introduite dans une colonne chargée de diéthylaminoéthyl cellulose (DEAE-cellulose) suffisam- ment tamponnée avec la même solution tampon. On fait pas- ser dans la colonne la solution tampon, puis on recueille la solution contenant une substance qui n'a pas été adsor- bée par la DEAE-cellulose. Cette solution, contenant la substance non adsorbée, est séchée par congélation, dis- soute dans de l'eau adoucie par échange d'ions et dialy- sée au moyen d'un tube de dialyse utilisant de l'eau adou- cie, à 10 C, pendant 4 jours. Lorsque la dialyse est ter- minée, la solution, ainsi traitée, est séchée par congéla- tion, et l'on obtient 500 mg d'un échantillon de polysac- charide à haut poids moléculaire MPS_80. EXEMPLE 2 On ajoute 0,5% en poids/volume d'extrait de levure de bière, à 10 litres d'une solution de poudre de petit-lait à 10% en poids/volume, pour obtenir un milieu de culture. On ensemence ce milieu avec des Streptococcus Thermophilus N 127 "FERMBP-65 (FERM-P N 5850)" et l'on cultive à 37 C pendant 20 heures. Lorsque la culture est achevée, on centrifuge le milieu à 10 000 tours/minute, pendant 15 minutes, pour obtenir 9 litres de liquide surnageant. On ajoute à ce liquide de l'éthanol à 99,5%, en quantité tel- le que sa concentration finale soit de 50% en volume/volume. Par centrifugation à 10 000 tours/minute,pendant5 minutes, on obtient 1,7 g de précipité, auquel on ajoute de l'eau adoucie par échange d'ions,pour former une solution. Par centrifugation de cette solution h 10 000 tours/minute pendant 15 minutes, on élimine une matière insoluble; ce traitement est répété au total 3 fois et donne 1,2 g de produit grossièrement purifié. Le produit, ainsi obtenu, est dissous dans une solution tampon phosphate 0,05 M (pH 6), et cette solution est introduite dans une colonne chargée de DEAE-cellulose, tam- ponnée avec la même solution tampon. On fait passer la solution tampon à travers la colonne, et on recueille la solution contenant une substance non adsorbée par la DEAE-cellulose. La solution recueillie est séchée par congélation, dissoute dans de l'eau adou- cie, et dialysée contre de l'eau adoucie à 100C, pendant 4 jours. A la fin de la dialyse, la solution, ainsi trai- tée, est séchée par congélation et donne 800 mg d'un é- chantillon de polysaccharide à haut poids moléculaire MPS-80. Après chromatographie sur colonne avec Sépharose 2 B et analyse par ultracentrifugation, on constate que les 2 échantillons ci-dessus constituent une seule eMfn9me substance. Par dissolution dans l'eau on obtient une solu- tion incolore et transparente. EXPERIMENTATION 1 Effets sur des ascites de carcinome d'Ehrlich On utilise des souris femelles ddY agées de 8 semaines. Chaque groupe comprend 7 souris. 105 cellules de tumeurs d'ascite d'Ehrlich, qui ont été soumises à des cultures successives pendant 1 semaine, sont introduites par voie intrapéritonéale chez des souris ddY. A partir du jour suivant, on administre,par voie intrapéritonéale pendant de suite, 9 jours/, au sérum physiologique au groupe témoin, et une solution de MPS-80, obtenu dans l'exemple 1, dans du sérum physiologique, aux groupes d'essai; pour ces groupes les doses sont respectivement de 15 mg/kg/jour et 60 mg/kg/ jour. Les effets de MPS-80 sur les ascites de carcinome d'Ehrlich sont jugés à partir du degré de prolongation de vie compa- ré avec le groupe témoin. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1. (Voir tableau 1 à la page suivante). TABLEAU 1 Doses Durée de survie Degré de Nombre de (mg/kg/jour) intermédiaire prolongation survivants (jours) de vie (%) après 60 jo __jours Témoin 28 100 0/7 28 100 3/7 >60 >214 5/7 Il ressort des résultats de ce tableau que MPS-80 exerce une forte action anti-tumeur sur les ascites de carcinome d'Ehrlich. EXPERIMENTATION 2 Effets sur les ascites de carcinome d'Ehrlich On opère comme dans l'expérimentation 1 pour introduire des cellules de tumeurs ascites d'Ehrlich dans des souris ddY; le jour de cette introduction, on commence l'adminis- tration par voie intrapéritonéale, de sérum physiologique au groupe témoin, et d'une solution de MPS_80, obtenu dans l'exemple 2, dans du sérum physiologique, aux groupes d'essai; cette administration est poursuivie pendant 3 jours; les doses pour les groupes d'essai sont respecti- vement de 12,5, 25 et 50 mg/kg/jour. Les résultats sont indiqués dans le tableau 2. TABLEAU 2 Doses Durée de survie Degré de Nombre de (mg/kg/jour intermédiaire prolongation survitants (mg/kg/jour (jours) de vie (%) apres 60 __________ _ _ __ jours Témoin 29 100 0/7 12,5 33 114 1/7 ,0 39 134 3/7 50,0 29 124 2/7 i, Il ressort des résultats de ce tableau que MPS-80 exerce son effet en ce qui concerne le nombre de survivants après jours, bien qu'ii n'y ait pas d'effet remarquable sur le degré de prolongation de vie. EXPERIMENTATION 3 Effets sur le carcinome d'Ehrlich implanté par voie sous-cutanée On utilise des souris femelles ddY agées de 8 semaines, chaque groupe comprenant 8 souris 10 cellules de tumeurs d'ascite d'Ehrlich, qui ont été soumises à des cultures successives pendant 1 semaine, sont introduites par voie sous-cutanée chez les souris. A partir du jour suivant, on administre pendant 8 jours de suite, par voie intrapéritonéale, du sérum physiologique au groupe témoin, et une solution de MPS-80 de l'exemple 1 dans du sérum physiologique aux groupes d'essai; pour ces groupes les doses sont respectivement de 12,5 et 25 mg/kg/jour. Les effets sont appréciés par le nombre de souris pour lesquelles il y a régression complète de la tumeur solide. Les résultats sont indiqués au tableau 3. TABLEAU 3 Doses Nombre de souris ayant une tumeur solide (mcZkq/iour) en régression 50 jours après le trans- plant. Témoin 0/8 12,5 3/8 ,0 4/8 Il ressort des résultats de ce tableau que MPS-30 agit de façon remarquable sur le carcinome d'Ehrlich implanté par voie sous-cutanée. EXPERIMENTATION 4 Effets sur des ascites de Sarcome-180 On utilise des souris femelles ddY, agées de 8 semaines, chaque groupe comportant 5 souris. 105 cellules de tumeurs ascites de sarcome-180, qui ont été soumises à des cultu- res successives pendant 1 semaine, sont injectées par voie intrapéritonéale aux souris. A partir du jour suivant, on administre pendant 9 jours de suite, par voie intrapéritonéale, au groupe témoin, et une solution MPS-80 de l'exemple 1 aux groupes pes les doses sont respectivement kg/jour. Les effets sont jugés à partir du de vie, comparé à celui du groupe sont réunis dans le tableau 4. TABLEAU 4 du sérum physiologique dans ce même sérum de d'escai; pour ces grou- de 12,5, 25 et 50 mg/ degré de prolongation témoin. Les résultats Doses (mq/kq/jour) Témoin 12,5 25,0 0 Durée de survie intermédiaire (jours) > 60 Degré de prolongation de vie (%) >261 Nombre de survivants après 60 _our s 0/5 2/5 3/5 2/5 Il ressort des résultats de ce tableau que MPS-80 présente une forte activité anti-tumorale sur les ascites de sar- come-180. EXPERIMENTATION 5 Effets sur la leucémie lymphocytlque P-388 Dans cette expérimentation, chaque groupe comprend 8 sou- ris màles CDF1 agées de 6 semaines3 5xiO3 cellules de P-388, qui ont été soumises à des cultures successives sur souris DBA pendant une semaine, sont transplantées par voie intrapéritonéale. On examine les effets d'une combinaison de Mitomycine C avec MPS-80 de l'exemple 1. Le jour suivant la transplantation, on commence l'adminis- tration au groupe témoin de sérum physiologique par voie intrapéritonéale. L'administration est poursuivie pendent jours. Un groupe d'essai ne reçoit que de la Mitomycine C, en une seule dose de 1 mg/kg. Dans les autres groupes d'essai,qui reçoivent Mitomycine C et MPS_80, la Mitomy- cine C est administrée en unefois (1 mg/kg), le jour suivant la transplantation, et les 9 jours suivant cette 1 1 administration, on introduit MPS-80 par voie intrapérito- néale, la dose quotidienne étant selon les groupes de 12,5, , 50 et 77,5 mg/kg. Les effets obtenus sont jugés à partir du degré de prolon- gation de vie, et du nombre de survivants après 70 jours. Les résultats sont indiqués dans le tableau 5. TABLEAU 5 Doses (mg/kg/jour) Durée de Degré de Nombre de survie in- prolongasurvivants termédiai- tion de après 70 re (jours) vie-%) jours Témoim 14, 0 100 0/8 Mitomycin C 1 mg 18,0 129 0/8 Mitomycin C 1 mg 12,5 21,0 150 0/8 + 25,0 19,5 139 0/8 50,0 20,5 146 0/8 MPS-80 77,5 21,5 154 2/8 Il ressort de ce tableau que les degrés de prolongation de vie, et les nombres de survivants après 70 jours, montrent les effets obtenus par la combinaison de MPS-80 avec la Mitomycine C. Dans les dessins annexés ciaprès, la figure 1 est un diagramme de développement de polysaccharide à haute masse mol.MPS-80 d'après l'ultrafiltration, dans lequel a représente MPS-80 et b le bleu de dextrane; figure 2 montre le spectre d'absorption ultraviolet de MPS-80; figu- re 3 montre le spectre d'absorption infrarouge de MPS-80; figure 4 est le spectre de résonnance magnétique nucléaire de 13C de MPS-80. Revendications 1. Polysaccharide de masse moléculaire élevée MPS-80, caractérisé par l'analyse élémentaire z C: 42,2% H: 6,9% o: 50,4% un pouvoir rotatoire spécifique J18_ + 33,2 (C = 0,5%); un point de fusion avec décomposition voisin de 262 -2640C; une solubilité dans l'eau et insolubilité dans méthanol, éthanol, acétone et éther; des spectres d'absorption dans l'ultraviolet et l'infrarouge (figures 2 et 3); des réac- tions colorées positives pour réaction de Molisch, réaction à l'anthrone et réaction cystéine-acide sulfurique, et né- gatives pour réactions aniline-acide chlorhydrique carba- zole-acide sulfurique, d'Elson-Morgan et du biuret; une neutralité de pH en solution aqueuse à 0,1 à 0,5%; un aspect de fibres blanches lorsqu'il est obtenu séché par congélation; comme saccharides constitutifs du glucose et du galactose dans la proportion de 1,9 à 2,2/1; un spectre de résonnance magnétique nucléaire de 13C repré- senté dans la figure 4; une stabilité vis-à-vis des a et p-amylase, o-et P-galactosidase, amyloglucosidase; a une DL50 inférieure à 20C mg/kg par voie intrapéritonéale. 2. Procédé pour la production du polysaccharide MPS- selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cul- tive des bactéries génératrices de ce polysaccharide, appartenant à la famille des Lactobacillus et des Strepto- coccus, puis on recueille le MPS-80 à partir du mélange de culture. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la bactérie utilisée est le Lactobacillus Jugurti N 851 "FERM BP-66 (FERM-P NO 5851)". 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la bactérie est le streptococcus the-mophilus N 127 "FERM BP-65 (FERM-P N 5850)". 5. Agent anti-tumeur caractérisé en ce qu'il comprend comme constituant actif le polysaccharide MPS_80 selon la revendication 1.