Brevet FR2490673A1 — publié le 19820326

Procédé de fabrication de l'uricase. La présente invention concerne un procédé pour la fabrication de l'enzyme uricase (EC 1.7.3.3.) ayant une activité élevée qui peut 'etre utilisé dans les diagnostics cliniques pour déterminer l'acide urique dans le sérum sanguin ou dans l'urine. L'uricase est une enzyme qui catalyse l'oxydation de l'acide urique en allantoine et n'est pas présente dans les tissus des mammifères supérieurs tels que l'homme - elle est présente, par contre, dans les tissus et particulièrement dans les organes internes des mammifères inférieurs, et en quantité plus ou moins grande dans quelques micro- organismes.Les auteurs de la présente invention ont maintenant découvert, et cela est le premier objet de la présente invention, que l'uricase peut être fabriquée par le Micrococcus roseus, un micro-organisme qui n'était pas connu jusqu'ici comme producteur de ladite enzyme et qui, de plus, possède, comparativement à d'autres micro-organismes de type connu, l'avantage de fabriquer de grandes quantités d'uricase dans des milieux de culture qui contiennent de faibles concentrations d'acide urique. En outre, les inventeurs ont découvert d'une façon tout à fait surpre- nante que l'optimum de l'activité de l'uricase telle que fabriquée par le Micrococcus roseus NRRL B 12196 est, contrai- rement à l'uricase fabriquée par d'autres bactéries, voisine des valeurs de pH des liqueurs physiologiques et ceci est un avantage dans la mesure o il n'est pas nécessaire de modifier le pH de l'échantillon biologique dans lequel l'acide urique doit être déterminé, de sorte que les risques éventuels de modifications chimiques de l'échantillon en cours d'essai sont éliminés. Ce micro-organisme a été isolé à partir d'une terre cultivable dans la région de Monterotondo (Rome) et possède les propriétés morphologiques et biologiques suivantes Morphologie microscopique. Sphères ayant un diamètre de 1 à 2,5 microns, de forme fixe et grampositive, se divisant sur plus d'un plan, de paquets cubiques ou de groupements irréguliers et quelque fois elles apparaissent par paires ou isolées. Morphologie macroscopique Colonies sur Agar nutritif: bord soulevé, continu, couleur rosée, surface lisse, diamètre 1 à 2 mm. Culture d'Agar nutritif, patine d'une teinte rose pâle, lisse et brilante. Propriétés biochimiques Développement dans bouillon de glucose: léger trouble avec dépôt mucolde, légèrement rose, pH = 6,5. Le micro-organisme se développe à 10 C plutôt qu'à C,l'optimum se trouvant entre 25 C et 35 C. - Il se développe avec du bouillon de glucose contenant NaCl à 5% et à 10% mais non à 15%. Il ne se développe sur l'agar contenant du citrate de Simmons. La production aerobie de l'acidité à partir des sucres dans une base de bouillon de Purple (DIFCO): xylose, glycérol, mannitol, lactose, maltose, sorbose, ribose, ara- binose, raffinose, cellobiose, négative; avec le glucose, le saccharose, le fructose, l'acidification est légèrement retardée (7-10 jours). hydrolyse de l'arginine: négative hydrolyse de l'amidon: positive hydrolyse de la gélatine: négative uréase: positive H2S: négatif catalase: positive nitratase: positive indole: négatif acétoine: négative rouge de méthyle: négatif lécithinase: négative lipase (beurre et huile d'olive): négative Par comparaison de ces résultats avec les descriptions contenues dans le manuel de"Bergey's Determinative Bacteriology VIII Ed., le micro-organisme selon la présente invention appar- tient à la famille des Micrococcace, genre Micrococcus, espèce roseus. Il a été déposé au "Northern Regional Research Center" de Peoria Illinois U. S.A. o on lui a attribué le symbole NRRL B-12196. La culture du Micrococcus roseus NRRL B-12196 peut être effectuée d'une façon aérobie avec un quelconque procédé classique, telque les cultures en surface, ou mieux, les cultures en immersion utilisant des appareils de fermentation agités. Le milieu de culture qui peut être solide ou liquide contient une source de carbone assimilable, une source d'azote, une source de phosphore ainsi que des sels minéraux et des vitamines. Les cultures peuvent être obtenues à des températures comprises entre 100C et 40'C, de préférence à partir de 250C jusqu'à 350C, pendant un temps allant de 10 à 48 heures, de préférence de 20 à 30 heures, à un pH allant de 6 à 9 et de préférence de 7 à 8. Comme sources de carbone, on peut utiliser par exemple le glucose, le lactate, l'acétate, le saccharose, le fumarate, l'acide urique, la liqueur de macération du mais, le glycérol. Comme sources d'azote, on peut utiliser par exemple les hydrolysats de viande, la caséine ou les hydrolysats de soja, les sels ammoniacaux, l'urée, les nitrates, l'acide urique. L'extraction et la purification éventuelles de l'uricase à partir de la pâte bactérienne est faite selon des procédés qui sont classiques dans l'enzymologie. L'uricase extraite du Micrococus roseus NRRL B-12196 peut être immobilisée avanta- geusement dans des matrices polymères par formation de liaisons chimiques avec la matrice concernée, ou de liaisons de type ionique, ou par une simple immobilisation physique. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. Exemple 1 On prépare un bouillon de culture ayant la composition suivante: extrait de levure 15 g/l (grammes par litre) acide urique 2 g/l Le pH est réglé-à 7,2 avec NaOH et le milieu est divisé en portions de 200 ml chacune dans des ballons de 500 ml. Après stérilisation à 116'C pendant 30 minutes; les ballons sont inoculés avec une culture de la souche NRRL B-12196 à partir de culture contenant le m!eme milieu avec 2% d'agar et mis en incubation pendant 24 heures à 30'C avec agitation orbitale à 200 tours/minute. Les cellules sont ensuite recueillies par centrifugation et à partir de 200 ml de bouillon on obtient 3 g de pâte (poids humide). La pâte de cellule ainsi obtenue est mise en suspension dans 60 ml d'un tampon phosphate (0,1 M; pH = 8,5) et passée à travers la "French Pressure Cell Press" jusqu'à ce que l'on ait obtenu une rupture complète des cel- lules. L'activité enzymatique est déterminée dans l'extrait ainsi obtenu; on trouve 1 g de cellules humides contenant 100 unités uricase. Dosage de l'uricase L'activité de l'uricase est déterminée par spectro- photométrie en suivant la disparition de l'acide urique à 283 nm (selon le procédé décrit par Mahler et Col. dans J. Biol. Chem., 1955) 216 625, modifié comme décrit ci-après. 7 ml d'une solution contenant 20 mg d'acide urique dans 100 ml de tampon phosphate (0,1 M, pH = 8,5) sont placés dans un petit ballon de 50 ml et mis en incubation sur un bain-marie agité. La réaction est mise en route en ajoutant une petite quantité de l'extrait enzymatique. Immédiatement après l'addition de l'extrait et également après 10 minutes de réaction, des échantillons de 0,5 ml du mélange réactionnel sont prélevés et ajoutés à 4 ml d'HCl 0,1 M. L'absorption des solutions ainsi obtenue est lue à 283 nm. Une unité uricase est définie comme étant la quantité d'enzyme qui peut dégrader une micromole d'acide urique par minute dans ies conditions d'essai qu'on vient de spécifier. Exemple 2 Un extrait de cellules de Micrococcus roseus NRRL B-12196 est préparé comme spécifié dans l'exemple 1. L'extrait brut est centrifugé et, sur le liquide surna- geant, l'activité de l'uricase est déterminée comme décrit ci-dessus, en utilisant l'acide urique dissous dans des solutions de phosphates à 0,1 M et avec des valeurs de pH différentes, comme milieu réactionnel. On détermine simulta- nément les activités d'extrait enzymatique obtenu à partir des cultures de Bacillus fastidiosus dans les mêmes conditions de culture que pour le micrococcus roseus en question. Les résultats qui ont été obtenus sont rassemblés dans le tableau 1 o les activités des extraits des deux microorganismes, à pH 91sont reportées égales à 100. TABLEAU I Activité de l'uricase en fonction du pH dans les extraits de B. fastidiosus et M.roseus.. pH du mélange réactionnel E x t r a i t d e M. roseus B. fastidiosus 6,5 71 13,5 7,0 94 35 7,5 103 57 8,0 106 85 8,5 103 95 9,0 100 100 REVENDICATIONS 1. Procédé pour la fabrication d'uricase, caractérisé par le fait qu'il comprend le stade de la culture du micro- organisme Micrococcus roseus NRRL B-12196 dans des conditions aérobie en présence d'un milieu de culture contenant une source de carbone assimilable, une source d'azote, une source de phosphore et des sels minéraux. 2. Procédé pour la fabrication d'uricase selon la reven- dication 1, caractérisé par le fait que la température de la culture est comprise entre 100C et 40C. 3. Procédé pour la fabrication d'uricase selon la reven- dication 2, caractérisé par le fait que la température de la culture est de préférence comprise entre 250C et 350C. 4. Procédé pour la fabrication d'uricase selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le pH du milieu de culture est compris entre 6 et 9. 5. Procédé pour la fabrication d'uricase selon la reven- dication 4, caractérisé par le fait que le pH du milieu de culture est de préférence compris entre 7 et 8.