Brevet FR2486961A1 — publié le 19820122

La présente invention concerne un procédé de production de phénylalanine et de nouvelles souches d'une espèce de -est microorganisme capable, lorsqu'il/soumis à des conditions de culture appropriées, de produire la phénylalanine nettement plus rapidement que les souches connues de ce microorganis- me. - La phénylalanine est un acide aminé de formule C6H 5CH2CH-(NH2)CO2H que l'on considère comme un acide aminé essentiel chez de nombreux animaux, mais qui peut être synthétisé par certains microorganismes. L'Escherichia coli est un microorganisme dont on sait depuis un certain temps qu'il est capable de synthétiser la phénylalanine. Dans l'organisme de type sauvage, seule une quantité suffisante de phénylalanine est produite pour satisfaire les propres besoins de l'organisme. La quantité de phénylalanine qui est excrétée par l'organisme de type sauvage est insuf- fisante pour être détectée par des techniques analytiques normales. L'Escherichia coli produit de la phénylalanine par une voie biosynthétique commençant par un carbohydrate approprié et en le convertissant en des substances inter- médiaires comprenant l'érythrose 4-phosphate et le phos- phoénolpyruvate. Ces intermédiaires sont ensuite convertis en 3-dêoxy-Darabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP) par une enzyme connue sous le nom de DAHP synthase. La DAHP est à son tour convertie en chorismate au moyen d'un certain nombre d'étapes comprenant la formation de shikimate. Le chorismate est ensuite converti en phénylalanine par une voie terminale. La figure 1 annexée représente les trois facteurs principaux ayant un effet sur la conversion d'ensemble de l'érythrose 4-phosphate et du phosphoénolpyruvate en phé- nylalanine. Tout d'abord, plusieurs enzymes provenant de la voie commune de la biosynthèse aromatique conduisant au chorismate et des enzymes de la voie terminale de la phé- nylalanine qui bifurque du chorismate sont sensibles à la répression (R) de la synthèse de l'enzyme. En second lieu, aussi bien les isoenzymes DAHP synthases du début de la voie commune que la chorismate mutase Ppréphénate déhydratase (CMP-PDH) du début de la voie phénylalanine sont sensibles à une inhibition (I) par rétroaction. En troisième lieu mais de façon moins importante, on peut faire diverger le choris- mate selon des voies qui sont différentes de la voie phé- nylalanine. La présente invention concerne une souche mutante d'Escherichia coli dans laquelle: i) La constitution génétique du microorganisme est telle qu'au moins une forme de l'enzyme 3-déoxy-D-arabino- heptulosonate-7-phosphate (DAHP) synthase est sensiblement exempte d'inhibition par la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane; ii) La constitution génétique du microorganisme est telle que l'enzyme complexe chorismate mutase P-préphénate déhydratase est sensiblement exempte d'inhibition par la phénylalanine; iii)(a) le site opérateur pheAo est tel que la formation de l'enzyme chorismate mutase P-préphénate déhydratase (CMP-PDH) est sensiblement exempte de répression par la phénylalanine, ou (b) le microorganisme est modifié autrement de manière que le niveau de l'enzyme chorismate mutase P-préphénate déhydratase contenue dans le microorganisme augmente par rapport à celui que l'on trouve dans les souches du microorganisme avec régulation de type sauvage de la formation de chorismate mutase P-préphénate déhydratase; iv)(a) la constitution génétique du microorganisme est telle que la formation d'au moins la forme de l'enzyme DAHP synthase qui est exempte d'inhi- bition est rendue sensiblement exempte de répression, ou (b) le microorganisme est modifié autrement de manière que le niveau de l'enzyme DAHP synthase dans le microorganisme augmente par rapport à celui que l'on trouve dans les souches du microorganisme à régulation de type sauvage pour la formation de DAHP synthase; et v) (a) la constitution génétique du microorganisme est telle que la formation de l'enzyme shikimate kinase est sensiblement exempte de répression, ou (b) le microorganisme est modifié autrement de manière que le niveau de l'enzyme shikimate kinase dans le microorganisme soit augmenté par rapport à celui trouvé dans les souches du microorganisme ayant une régulation de type sauvage pour la formation de la shikimate synthase. Dans ce qui suit, cette souche mutante est appelée "microorganisme selon l'invention". La présente invention consiste en outre en un procédé de production de phénylalanine comprenant les étapes de la culture de microorganismes selon l'invention dans des milieux appropriés, et la récupération de la phénylalanine de ce milieu de culture et/ou du microorganisme cultivé. Les inventeurs de la présente demande ont démontré qu'on augmentait sensiblement la production de phénylalanine si la présence de niveaux élevés de DAHP synthase rendue insen- sible à l'inhibition par rétroaction était combinée au retrait à la fois des contrôles dé répression et d'inhibi- tion au cours de la première étape au moins des voies terminales de la phénylalanine. L'homme de l'art comprendra que l'inhibition d'une enzyme se réfère à la diminution de l'activité de l'enzyme, alors que la répression de la formation d'une enzyme se réfère à une diminution du taux auquel l'enzyme est synthétisée par le microorganisme. La notation utilisée ci-après pour désigner les gènes structurels, les gènes régulateurs et les sites opérateurs du chromosome circulaire unique de l'E. Coli est basée sur celle décrite par Bachmann et Law dans Microbiology Reviews 1980. Le type sauvage E. coli produit la DAHP synthase sous trois formes au moins qui sont respectivement soumises à l'inhibition par rétroaction par la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane. On a constaté que la constitu- tion génétique du microorganisme pouvait être modifiée de manière que soit produite au moins une forme de l'enzyme,- c'est-à-dire une isoenzyme qui ne soit pas sujette à l'in- hibition par rétroaction par l'un des trois acides aminés mentionnés cidessus. On préfère que l'inhibition par rétroaction aussi bien par la phénylalanine que par la tyrosine soit éliminée, ce qui peut être obtenu par mutation de leurs gènes structurels respectifs aroG et aroF et pour obtenir respectivement les gènes aroG(FBI R) et aroF(FBIR). La formation des diverses formes de DAHP synthase est soumise à répression dans le type sauvage du fait de la production par le microorganisme d'une protéine régulatrice qui est le produit d'un gène opérateur ou régulateur tyrR. Dans le microorganisme selon l'invention, on surmonte cette répression par une mutation du gène régulateur tyrR de manière à éliminer la répression. L'homme de l'art compren- dra que l'augmentation du niveau d'enzymes que l'on obtient en utilisant des mutants tyrR peut être facilement obtenue en ayant recours à des approches différentes. Un exemple est offert par l'utilisation de plasmides multi-copies contenant les gènes structurels appropriés à la production de l'enzyme. Quand on utilise ce dernier procédé, il y a toujours répres- sion mais on peut élever le niveau d'enzymes à un niveau satisfaisant en obtenant une multiplicité de gènes struc- turels dont chacun est actif pour la formation de l'enzyme désirée. Le gène opérateur tyrR contrôle la formation de deux formes de DAHP synthase, y compris la DAHP synthase Phe et la DAHP synthase Tyr. Il est préférable qu'une mutation quelconque du gène opérateur TyrR ait pour effet d'éliminer la répression sur ces deux formes de DAHP synthase. Mais le champ d'application de l'invention couvre le fait de produire dans le microorganisme une forme mutante de tyrR qui élimine la répression de la production de l'une des formes de la DAHP synthase, telle que la production de DAHP synthase Phe, et d'introduire dans le microorganisme des plasmides multi-copies contenant les gènes structurels nécessaires à la production d'autres formes de l'enzyme, tels que des plasmides contenant le gène aroF qui code la DAHP synthase Tyr. Le E. coli de type sauvage produit l'enzyme chorismate mutase Ppréphénate déhydratase (CMP-PDH) qui catalyse les deux premières étapes de la voie terminale qui produit la phénylalanine à partir du chorismate. Cette enzyme dans le microorganlsme de type sauvage est sujette à inhibition par la phénylalanine. La production de cette enzyme est comman- dée par le gène structurel PheA. La mutation de ce gène en pheA(FBIR) permet à l'organisme de produire l'enzyme sous une forme qui n'est pas soumise à cette inhibition par rétroaction par la phénylalanine. La formation de CMP-PDH est soumise à répression dans le type sauvage de l'E. coli due à la présence du gène opéra- teur pheAo. On peut surmonter cette inhibition, comme expliqué ci-dessus, par une mutation de pheAo ou par l'utilisation de plasmides multi-copies portant des gènes pheAo pheA, un exemple d'un tel plasmide étant constitué par un dérivé du plasmide ColE 1. Les substances érythrose 4-phosphate et phosphoénolpy- ruvate et le shikimate intermédiaire sont des métabolites impliqués dans la production du chorismate. Un autre inter- médiaire intervenant dans la formation du chorismate est le shikimate-3phosphate qui est formé à partir de shikimate au cours d'une réaction catalysée par l'enzyme shikimate- kinase. La production de l'enzyme shikimate kinase est soumise à répression mettant en oeuvre le produit du gène tyrR dela manière soulignée ci-dessus en ce qui concerne la répression de la formation de DAHP synthase Phe et de DAHP synthase Tyr. On peut surmonter cette répression soit par une mutation en tyrR, avec ou sans effet simultané sur la répression d'une ou plusieurs DAHP synthases isoenzymes, ou par l'utilisation de plasmides multi-copies. Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, le microorganisme selon l'invention est en outre modifié de manière à bloquer les voies métaboliques conduisant du chorismate a des produits finals autres que la phénylalanine. Une mutation du gène tyrA peut bloquer la production de tyrosine à partir de chorismate alors qu'une mutation de tipE peut bloquer la production de tryptophane. Les microorganismes selon l'invention peuvent être corisl:rii.ts dà noyen d'une techni.ue génétique classique et en utilisant un matériau génétique pré-existant par des techniques telles que la conjugaison et la transduction par bactériophage. Une mutagénèse localisée facilite l'isolation de souches portant les mutations décrites grâce aux connaissances disponibles sur l'emplacement chromosomique des loci des gènes. On peut optimaliser la culture d'une souche donnée d'un microorganisme selon l'invention par des essais de routine au moyen de facteurs de l'environnement tels que la tempé- rature, le pH, la concentration en oxygène et analogues. Le milieu de culture comprend de préférence du glucose comme source de carbone, bien qu'on puisse utiliser d'autres substrats. Ces autres substrats comprennent, sans que cela constitue une limitation, le glycérol, le maltooe, le xylose, le lactose, les lactates et l'acide acétique. Le milieu de culture doit également contenir des sels minéraux nutritifs appropriés et des oligo-éléments. Il est préférable que l'organisme soit soumis initia- lement à une culture lui permettant de croître à un pH compris entre 5 et 8, et de préférence entre 6 et 7, et à une température comprise entre 25 et 420C, et mieux encore entre 33 et 370C. De préférence, le fermenteur est secoué et aéré de manière que la tension de l'oxygène dissous ne tombe pas en dessous d'une saturation à 20%. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre sous forme d'une culture par lots ou d'une culture continue. Dans ce dernier cas, le taux de dilution de la culture, qui est le rapport entre le débit et le volume de la réaction, est compris de préférence entre-0,01 et 0,5 par heure, et mieux encore entre 0,05 et 0,15 par heure. Le milieu de culture doit contenir du carbone et de l'azote en excès pour permettre à l'organisme de continuer la production de phénylalanine. Ceci pourrait conduire à une production incontrôlée de biomasse à moins qu'on ne prenne des mesures pour l'éviter. On peut éviter cette biomasse en limitant la quantité de certains des organismes essentiels aux exigences de croissance dans le milieu de culture. Ce résultat est obtenu le v-lus avantageusement en contrôlant -2486961 la quantité de phosphate présent dans le milieu de culture. On décrira maintenant à titre d'exemple non limitatif un mode de réalisation préféré de l'invention, avec référence à la figure 2 des dessins qui représente la cinétique typique de la formation de phénylalanine en culture par lots et en utilisant un microorganisme selon l'invention. EXEMPLE 1 Dans cet exemple, on a utilisé une souche de E. coli connue sous l'appellation de NST 37 et portant sept muta- tions ayant un effet sur la production de phénylalanine, à R R R savoir: aroF(FBIR) aroG(FBI) tyrR pheA(FBI) pheAo tyrA et trpE. On a cultivé cette souche de E. coli à 37 C et à un pH de 6,5 dans le milieu MMT5 dans lequel avaient été ajoutés 2% en poids par volume de glucose et une solution d' oligo-élé- ments. Le milieu MMT5 consistait en, par Litre: NH4Cl - 1,93g K2SO4 - 0,122g- MgCl2 - 0,27g K2HPO4 K2HPO4 - 0,153g Na CITRATE - 0,294g Fe Cl3 - 0,032g solution d'oligoéléments - 1 ml La solution d' oligo-éléments contenait: (NH4)6(Mo 07) - 3 M B H3 BO3 - 400 pM Mn Cl2 -80 pM Zn SO4 - 10pM On a brassé et aéré le milieu de culture dans un fer- menteur de conception classique pour éviter le développement de conditions anaérobiques. On a inoculé le milieu avec approximativement 5% en volume de culture. La figure 2 montre que cette souche présente une acti- vité métabolique de proportions inhabituellement élevées et conduisant à la production de phénylalanine. EXEMPLE 2 La souche E. Coli NST 70 a pour description génétique aroF(FBIR) aroG(FBIR) tyrR pheA(FBIR) pheAo tyr A trpE et elle porte de plus un plasmide p UNT 21 qui est un plasmide multi-copies portant des gènes mutants phe Ao phe A (FBIR)phe Pour comparer l'activité des souches NST 37 et NST 70, on a fait croître les deux souches séparément dans le milieu MMB à 20 g/l de glucose plus mg/1 de tyrosine et de tryptophane dans des flacons à secouer à 37 C. Après 24 heures, on a effectué des essais concernant la croissance des cellules et la phénylalanine. Pour faciliter la compa- raison, les résultats sont exprimés en production de phé- nylalanine en % par gramme de matière sèche de cel- lules. Souche Production (%) NST 37 75 NST 70 129 La composition du milieu MMB est la suivante: K2HPO4 10,6 g/l NaH2PO4 6,1 g/l (NH4) 2S4 2,0 g/l MgSO4.7H20 0,2 gl Ca(NO3)2 0,01 g/l Fe C13.6H20 0, 054 g/l Trisodium citrate 2H20 2,94 g/l + 1 ml d'une solution d'oligo-éléments. Composition de la solution d' oligo-él6éments: (NH4)6 (Mo 07)24 3 FM H3 BO3 400 FM Mn Cl2 80 pM Zn SO4 10 FM EXEMPLE 3 La souche NST.74 de l'E. coli a pour description géné- tique: aroF(FBIR) aroG(FBIR) tyrR pheA (FBIR) pheAo. Cette souche a été cultivée de façon continue à 33 C et à un pH de 7,0 dans un fermenteur de 5 1. Le pH a été contrôlé par addition d'une solution alcaline contenant: 450 ml de 5 M NaOH 250 ml de 5 M KoH 300 ml de 3,5 M NH4OH L'organisme a été cultivé dans un milieu comprenant: glucose 70,0 g/l vitamine B1 0, 017% 4,0 g/l citrate 3,0 g/l Fe Cl3 3,0 g/l Solution d' oligo-éléments 0, 04 g/1 0,105 M K2 SO4 20,0 g/l 0,2 M NH4Cl 20,0 g/l 2,7 M NH4Cl 47,0 g/1 0,264 M K2HPO 13,2 g/l 32 4/ Le milieu de culture a été aéré avec de l'air (800 ml/min) et de l'oxygène (200 - 250 ml/min) pour obtenir une tension de l'oxygène dissous à une saturation d'au moins %. Le taux de croissance spécifique constaté pour l'orga- nisme cultivé était de 0,05 par heure, ce qui correspond à un taux de dilution de 5 ml par litre de fermenteur à l'heure. Comme on le voit à la figure 3, la culture a permis d'obtenir une production élevée et sensiblement régulière de phénylalanine pendant 204 heures. REVENDICATIONS 1. Souche mutante d'Escherichia coli, caractérisée en ce que: i) i) La constitution génétique du microorganisme est telle qu'au moins une forme de l'enzyme 3-déoxy-D-arabino- heptulosonate-7-phosphate (DAHP) synthase est sensi- blement exempte d'inhibition par la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane; ii) La constitution génétique du microorganisme est telle que l'enzyme complexe chorismate mutase P-préphénate déhydratase est sensiblement exempt d'inhibition par la phénylalanine; iii)(a) le site opérateur pheAo est tel que la formation de l'enzyme chorismate mutase Ppréphénate déhydratase (CMP-PDH) est sensiblement exempte de répression par la phénylalanine, ou (b) le microorganisme est modifié autrement de manière que le niveau de l'enzyme chorismate mutase P- préphénate déhydratase contenue dans le microorga- nisme augmente par rapport à celui que l'on trouve dans les souches du microorganisme avec régulation de type sauvage de la formation de chorismate mutase P-préphénate déhydratase; et iv)(a) la constitution génétique du microorganisme est telle que la formation d'au moins la forme de l'enzyme DAHP synthase qui est exempte d'inhibition est rendue sensiblement exempte de répression, ou (b) le microorganisme est modifié autrement de manière que le niveau de l'enzyme DAHP synthase dans le microorganisme augmente par rapport à celui que l'on trouve dans les souches du microorganisme à régula- tion de type sauvage de la formation de DAHP synthase. 2. Souche mutante de E. Coli selon la revendication 1, caractérisée en ce que: (a) la constitution génétique du microorganisme est telle que la formation de l'enzyme shikimate kinase est sensiblement exempte de répression, ou (b) le microorganisme est modifié autrement de manière i1 que le niveau de l'enzyme shikimate kinase dans le microorganisme soit augmenté par rapport à celui trouvé dans les souches du microorganisme ayant une régulation de type sauvage de la formation de la shikimate kinase. 3. Souche mutante de E. Coli selon la revendication 1, caractérisée en ce que la constitution génétique du micro- organisme est telle que la DAHP synthase est rendue exempte d'inhibition à la fois par la phénylalanine et par la tyrosine. 4. Souche mutante de E. Coli selon la revendication 1, caractérisée en ce que la formation de DAHP synthase est rendue exempte de répression par mutation du gène opérateur tyr R. 5. Souche mutante de E. Coli selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'on augmente la formation des enzymes DAHP synthase, ou CMP-PDH, ou shikimate kinase en introdui- sant dans le microorganisme des plasmides multi-copies comprenant un gène structurel pour la production de DAHP synthase, de CMP-PDH ou de shikimate kinase respectivement. 6. Souche mutante de E. Coli selon la revendication 1, caractérisée en ce que la constitution génétique du micro- organisme est en outre modifiée de manière à bloquer les voies métaboliques conduisant du chorismate à des produits finals autres que la phénylalanine. 7. Souche mutante de E. Coli selon la revendication 6, caractérisée en ce que les voies métaboliques sont bloquées par mutation du gène tyr A de manière à bloquer la produc- tion de tyrosine et/ou par mutation du gène trp E de manière à bloquer la production de tryptophane. 8. Procédé de production de phénylalanine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture de micro- organismes selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans un milieu approprié contenant un carbohydrate, et de récupération de la phénylalanine du milieu de culture et/ou du microorganisme cultivé. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le carbohydrate est une substance choisie dans le groupe comprenant le glucose, le glycérol, le xylose, le maltose, le lactose, les lactates et l'acide acétique. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le milieu contient plus d'azote et de carbone qu'il n'est nécessaire à sa croissance et une quantité limitée d'un élément essentiel à la croissance du microorganisme de sorte telle Aue l'on évite la production en excès de biomasse. 11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le microorganisme est soumis à une culture continue. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la culture est réalisée de manière que le taux de dilution soit compris entre 0,01 et 0,05 par heure.