Brevet FR2497229A1 — publié le 19820702

La présente invention concerne l'industrie chimi- copharmaceutique et se rapporte plus précisément à un pro- cédé de préparation d'un dérivé polysaccharidique de fibri- nolysine qui possède une activité thrombolytique prolongée et trouve des applications en médecine. La fibrinolysine est largement utilisée en méde- cine à titre de produit thrombolytique dans la thérapeuti- que d'affections telles que l'infarctus du myocarde, les thromboses et la thrombo-embolie des artères pulmonaires. On administre ce produit par voie intraveineuse pendant plusieurs jours. Toutefois, la thérapeutique à la fibrino- lysine est compliquée par les circonstances suivantes. Premièrement, la fibrinolysine ne présente pas de caracté- ris'eiques spécifiques par rapport au substrat. Elle hydro- lyse non seulement la fibrine mais encore d'autres protides: le fibrinogène, la caséine et certains protides du système coagulateur du sang. Deuxièmement, la mise en oeuvre de la fibrinolysine peut provoquer non seulement un accroissement de l'activité fibrinolytique, mais encore une activation du système coagulateur à la suite de quoi une réapparition des caillots est possible. Troisièmement, comme tous les produits enzymatiques, la fibrinolysine est rapidement rendue inactive dans les conditions physiologiques sous l'action du pH, de la température, des protéases endogènes et des inhibiteurs naturels. La fibrinolysine est rapide- ment éliminée de la circulation sanguine, ce qui rend néces- saire l'administration de fortes doses de ferment pendant une période prolongée. Dans ce cas, le traitement des mala- des souffrant de thromboses de dimensions considérables ou présentant de faibles anticoagulateurs du sang n'a pas donné de résultats positifs. On connait à l'heure actuelle des procédés pour faire réagir les ferments sur des polymères, ce qui permet d'obtenir des produits qui présentent par comparaison aux ferments naturels une stabilité sensiblement accrue vis-à- vis de diverses actions désactivantes, qui sont éliminés lentement de l'organisme et qui manifestent des propriétés antigènes réduites. C'est ainsi qu'on connait un procédé de préparation d'un dérivé de fibrinolysine par formation de liaisons covalentes entre la fibrinolysine et un copo- lymère éthylène-anhydride maléique à une température de O à 4 C pendant plusieurs heures. On obtient en définitive des produits ayant de 15 à 30 % d'activité (Fresenius Zeitschrift fUr analytische Chemie, 1968, volume 243, N 2, page 457). Le dérivé de fibrinolysine obtenu par ce procédé est incompatible avec les tissus vivants étant donné que le copolymère éthylène-anhydride maléique n'est pas biodé- gradable et il ne peut pas trouver d'applications médicales. On connait d'autre part un procédé de préparation d'un dérivé de fibrinolysine avec un polysaccharide aldéhy- dique qui consiste à faire réagir la fibrinolysine sur du Séphadex aldéhydique modifié au sein d'un tampon au phos- phate à une température de 4 C pendant plusieurs heures. On sépare par lavage l'enzyme qui n'est pas entrée en réac- tion. Ces lavages se font successivement avec un tampon au phosphaté glacial, avec une solution 0,001 N d'acide chlor- hydrique, avec une solution 1 M de chlorure de sodium, avec de l'eau et avec un mélange d'eau et d'acétone, après quoi on sèche le produit par l'acétone (Kardiologuiya, Moscou, 1977, N 11, pages 139 à 142). Le composé obtenu par le procédé ci-dessus est insoluble dans l'eau et dans les solutions aqueuses, ce qui limite ses possibilités d'utilisation dans des buts médicaux. On s'est donc proposé d'obtenir, par mise en oeu- vre d'un réactif nouveau, un dérivé polysaccharidique de fibrinolysine qui présente une haute activité thrombolytique prolongée, une bonne stabilité dans les conditions physiolo- giques et qui soit utilisable en médecine. On a résolu ce problème en ce que, dans un procédé de préparation d'un dérivé polysaccharidique de fibrino- lysine comprenant la réaction de la fibrinolysine sur un polysaccharide aldéhydique aboutissant à la formation d'une liaison covalente et la séparation subséquente du produit final, suivant l'invention on utilise à titre de polysac- charide aldéhydique un aldéhydodextrane d'une masse molécu- laire de 20 OO0 à 110 000, on effectue la réaction à un pH de 8,0 à 9;5 et à une température de 5 à 300C et, avant de séparer le dérivé polysaccharidique de fibrinolysine qui se forme, on le soumet à une réduction par le borohydrure de sodium. On prend de préférence le borohydrure de sodium dans un rapport avec le dérivé polysaccharidique de fibri- nolysine de 1,5 à 2,0/1 respectivement. Le dérivé polysaccharidique de fibrinolysine ob- tenu présente une activité thrombolytique, une stabilité accrue et une durée de circulation prolongée dans l'orga- nisme. Sa constitution schématique peut être représentée de la façon suivante: o' t4t l02rX c CH2OH FI représentant la fibrinolysine; n = 100 % en moles de motifs glucopyranosiques de dextrane; y = 10 à 25 % en moles de motifs glucopyranosiques de dextrane oxydés; et p = % en moles de groupements NH2 de fibrinolysine qui prennent part à la réaction de combinaison. La teneur en protides du produit est de 10 à 30 % et la teneur en dex- trane est de 90 à 70 %. Le dérivé polysaccharidique de fibrinolysine obte- nu a été étudié par expérimentation sur des animaux du point de vue de son activité thrombolytique prolongée et de sa toxicité. L'étude de l'activité spécifique (thrombolytique) du dérivé polysaccharidique de fibrinolysine a été effec- tuée sur des thromboses modèles de la veine jugulaire chez le lapin et de la veine ou de l'artère fémorale chez le chien. On a formé chez ces animaux des thromboses de 1 à 2,5 cm de dimension de façon à oblitérer entièrement le passage à travers le vaisseau sanguin. On a commencé l'ad- ministration du produit à expérimenter de pair avec de l'héparine une heure après la formation d'un caillot. En partant de l'effet fibrinolytique prolongé at- tendu du produit de l'invention, on a dissous la dose étu- diée du produit (de 400 à 4000 unités par kilogramme de poids corporel) dans du sérum physiologique, à savoir pour le lapin dans 20 à 30 cm et pour le chien dans 50 à 100 cm3, et on l'a administré par injection pendant 20 minutes par voie intraveineuse de façon continue, c'est-à-dire non-con- formément aux instructions sur l'administration de la fi- bririolysi.ne (par voie intraveineuse goutte-à-goutte à la cadence de 10 à 12 gouttes par minute). On a observé la dynamique de la formation et de la lyse d'un caillot de façon visuelle et en palpant à la suite d'une expérimentation de 6 heures, après 24, 48 et 72 heures. On a effectué une angiographie et une fluométrie avant le commencement du traitement et 24 heures après l'ad- ministration du Droduit. Les résultats de l'étude de l'activité thromboly- tique du dérivé polysaccharidique de fibrinolysine suivant l'invention sont résumés dans le tableau I. TABLEAU I Groupe Produit Nombre Dose de produit Efficacité de la d'ani- expérid'ani- par kg de poids thérapeutique maux menté maux (lyse du thrombe) Lapin Fibrino- lysine Lapin Fibrino- lysine i Dérivé de fibrino- lysine de l'inven- tion Chien Fibrino- lysine (veine fémorale) 1 d 1 d 1 d 600 unités 800 unités unités unités unités unités unités unités unités unités unités unités Pas de lyse Lyse totale Pas de lyse Lyse totale Lyse totale Lyse totale (mort par hémorragie) Lyse totale Lyse totale Pas de lyse Pas de lyse Lyse totale Lyse totale Dérivé de fibrino- lysine de l'inven- tion 3(veine 6 fémorale) 3 d 00 unités 600 unités Lyse totale Lyse totale Il découle des données expérimentales que le trai- tement du lapin par la fibrinolysine ne donne pas d'effet thrombolytique dans tous les cas ou l'on administre la dose curative minimale (800 unités/kg). On observe dans ces cas une tendance à l'hémorragie, des altérations pathologiques au cours de la troisième phase de la coagulation du sang et une chute jusqu'à zéro de la teneur en fibrinogène pendant les premières heures après l'administration. Un accroisse-- ment de la dose jusqu'à 4000 unités entraîne la mort de l'a- nimal sous l'effet de la fibronolysine. A la différence de la fibrinolysine naturelle le traitement par le dérivé de fibrinolysine de l'invention est plus efficace même lors- qu'on applique la dose thérapeutique minimale de 400 unités/ kg. En outre, l'action fibrinolytique du dérivé de fibrino- lysine de l'invention est observée pendant une longue pé- riode jusqu'à 2 jours après l'administration. Ce produit ne provoque pas de modifications brutales au cours de la troi- sième phase de coagulation du sang et pour cette raison ne s'accompagne pas d'hémorragie. Les résultats obtenus sur le chien ont confirmé les modalités de la thérapeutique throm- bolytique qui avait été établies sur le lapin. L'activité fibrinolytique lors de l'administration du dérivé de fibrinolysine de l'invention est également observée pendant le deuxième jour qui suit l'administration du produit à l'organisme, alors que l'administration de fi- brinolysine naturelle provoque un effet qui est limité à un jour. La durée proloncée d'action du dérivé de fibrino- lysine de l'invention a été étudiée sur le chien par compa- raison avec les effets de la fibrinolysine naturelle. Les résultats des essais sont résumés dans les tableaux Il et III. TABLEAU II Variation du temps de lyse (en minutes) de la fraction euglobulique du sang chez le chien atteint d'une thrombose expérimentale dans le cas de l'administration du dérivé de fibrinolysine de l'invention et de la fibrinolysine natu- relle. Produit Nombre Indice Temps d'étude après l'adminis- d'ani- initial tration du produit maux 2 heures 1 jour 2 jours après après après Produit de l'in- vention 6 70 90 1 10 Fibrino- lysine natu- relle 4 38 3 105 90 TABLEAU III Variations du temps de thrombine (en secondes) chez le chien atteint d'une thrombose expérimentale après adminis- tration de la fibrinolysine naturelle et du dérivé de fibrinolysine de l'invention. Produit Nombre Indice Temps d'étude après l'adminis- d'ani- initial tration du produit maux 2 heures 1 jour 2 jours après après après Produit de l'in- vention 6 35 90 92 210 Fibrino- lysine natu- relle 4 22 195 95 27 La toxicité aiguë du dérivé de fibrinolysine de l'invention a été étudiée sur la souris blanche, le rat, le lapin et le chien. Les résultats des essais sont repré- sentés au tableau IV. Les résultats obtenus montrent que la DL50 des différents lots de dérivé de fibrinolysine de l'invention varie dans une plage assez étroite de 5000 à 6000 unités/kilogramme. La toxicité du dérivé de fibrino- lysine de l'invention s'est trouvée être analogue à la to- xicité de la fibrinolysine naturelle. L'administration uni- que aux animaux du dérivé de fibrinolysine de l'invention à des doses dépassant de 4 à 5 fois la dose thérapeutique n'a pas provoqué la mort de ces animaux. Le produit ne pro- voque pas, lorsqu'on le prend à des doses étudiées, de dé- térioration des vaisseaux et n'entralne aucune modification macroscopique ou microscopique des organes internes. Aux doses thérapeutiques, il n'agit pas sur le système nerveux central ni sur la tension sanguine. TABLEAU IV Toxicité du dérivé de fibrinolysine de l'invention chez les différents genres d'animaux dans le cas d'une adm'inis- tration par voie intraveineuse. Genre Nombre Doses en unités/kg et résultats des essais d'ani- d'ani- maux maux 500 1000 1500 2000 2500 3750 5000 6250 DL50Urntés uukg Souris 34 0/6 0/6 1/5 2/4 6/0 5000 Rat 30 0/6 0/6 2/4 3/3 6/0 4586 Lapin 30 0/6 1/5 2/4 2/4 6/0 1834 Chien 7 0/3 0/3 0/1 Les résultats des essais qui viennent d'être expo- sés montrent que: 1. Le traitement d'une thrombose expérimentale par perfusion intraveineuse unique continue du produit de l'in- vention est efficace à une dose minimale de 400 unités/kg de poids, alors que la dose curative minimale de la fibri- nolysine naturelle qui est de 800 unités/kg de poids ne provoque pas toujours la lyse d'un caillot. 2. La normalisation des modifications du système coagulateur du sang provoquées par l'administration du dérivé de fibrinolysine de l'invention intervient au deu- xième jour chez les animaux testés, ce qui témoigne d'une prolongation de l'action du produit de 2 à 3 fois par com- paraison à la fibrinolysine naturelle. 3. Le produit de l'invention n'entraîne pas de modifications brutales au cours de la troisième phase de coagulation du sang et permet par conséquent d'éviter les hémorragies qui sont fréquemment observées dans les appli- cations des fibrinolytiques. 4. Le dérivé de fibrinolysine de l'invention pré- sente une faible toxicité. L'administration intraveineuse du produit à des doses 4 à 5 fois plus fortes que la dose thérapeutique n'entraîne pas la mort des animaux. La mise en oeuvre du dérivé de fibrinolysine de l'invention qui est caractérisé par son action prolongée permettra de remplacer le procédé d'administration par goutte-à-goutte intraveineux échelonné sur plusieurs jours par un procédé d'administration unique continue, de réduire la dose de traitement et de ce fait d'abaisser le nombre de complications tout en augmentant l'efficacité de la théra- peutique thrombolytique. Le dérivé de fibrinolysine de l'invention peut être utilisé dans les thrombo-embolies aiguës ainsi que les throm- boses des artères pulmonaires, des vaisseaux cérébraux, des artères périphériques (avant la propagation de la gangrène), les thrombo-phlébites, dans les thromboses des veines péri- phériques, dans les infarctus aigus du myocarde et dans la thrombose de la veine centrale ou de l'artère de la rétine de l'oeil. Le procédé de préparation du dérivé polysacchari- dique de fibrinolysine suivant l'invention est mis en oeuvre de la façon suivante. On prépare un dialdéhydodextrane d'une masse molé- culaire de 20 000 à 110 000 par un procédé connu quelconque d'oxydation du dextrane jusqu'à la formation de groupements aldéhydiques dans le motif glycopyranosique, par exemple par oxydation du dextrane par l'acide périodique ou par son sel potassique. On ajoute au dialdéhydodextrane, au sein d'un tampon à pH = 6 à 9,5 et à une température de 5 à 30 C, une solution de fibrinolysine et on effectue la réaction de combinaison pendant 30 à 120 minutes.Après l 'entrée en combinaison de la fibrinolysine avec le dextrane oxydé les groupements aldéhydiques non entrés en réaction se trans- forment aisément en groupements hydroxyles inertes sous l'action d'un réducteur ménagé, notamment du borohydrure de sodium. Le dérivé polysaccharidique de fibrinolysine se sépare de l'excès de sels minéraux par déminéralisation sur membranes, en particulier par dialyse contre de l'eau. On soumet la solution du produit obtenue à une lyophilisa- tion. On obtient le produit final qui se présente sous la forme d'une poudre de coloration jaunâtre, sans odeur ni saveur. Le produit est hygroscopique, facilement soluble dans l'eau et dans une solution isotonique à 0,9 %0 de chlo- rure de sodium, pratiquement insoluble dans l'alcool à 95 %, dans l'éther et le chloroforme. L'activité spécifique du produit est de 20 à 25 unités/milligramme; le rendement en produit final est de 25 à 30 %. Le procédé suivant l'invention de réaction entre la fibrinolysine et le dextrane oxydé avec formation de liaisons covalentes satisfait aussi bien aux conditions cliniques qu'aux conditions techniques de préparation des produits médicinaux: la matrice ne contient pas de grou- pements toxiques, car afin d'empêcher la réaction des grou- pements aldéhydiques réactifs excédentaires avec les proti- des contenus dans l'organisme, on réduit ceux-ci en groupe- ments hydroxyle. On n'utilise pas dans le procédé de sub- stances fortement toxiques; les procédés de préparation du dextrane activé et de combinaison subséquente du dialdéhydo- dextrane avec la fibrinolysine se déroulent dans des condi- tions ménagées en milieu aqueux; il n'est pas indispensa- ble d'utiliser des solvants: le procédé est réalisé dans des conditions dans lesquelles il y a combinaison prati- quement totale de la fibrinolysine avec le polymère; pour cette raison, les étapes complémentaires de séparation des protides non entrés en réaction avec les protides combinés sont superflues; de cette manière, toutes les étapes de préparation du dérivé polysaccharidique sont techniquement simples et peuvent être réalisées dans l'industrie pour la préparation du produit médicinal qu'est le dérivé polysac- charidique de fibrinolysine. D'autres caractéristiques et avantages de la pré- sente invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de la préparation du dérivé po- lysaccharidique de fibrinolysine. Exemple 1. On dissout 1,25 g de dextrane d'une masse molécu- laire de 20 000 dans 25 cm3 d'eau et on ajoute 0,71 g de periodate de potassium. On effectue l'oxydation à une tem- pérature de 22+ 3 C et sous une agitation constante pen- dant 1 heure. On fait passer la solution obtenue de dextrane oxy- dé à travers une colonne garnie de 6 g de résine échangeuse d'anions, cycle acétate, on jette un volume d'éluat égal à la capacité morte de la colonne (3 à 5 cm3) et on recueille les 20 cm3 restants dans une éprouvette à pied graduée. On mélange 20 cm3 de dextrane purifié et oxydé d'une masse moléculaire de 20 000 avec 110 cm3 d'une solu- tion tampon 0,2 M sodique à pH = 9,5 (jusqu'à une concentra- tion de polyglucine oxydée de 7,5 mg/cm3) et on ajoute sous agitation ménagée 6,5 g de fibrinolysine. On abandonne le mélange réactionnel à raison de cm3 à pH = 8,4 à 8,9 à une température de 20+ 3 C pen- dant 1 heure, puis on refroidit à 10+ 5 C et on ajoute 40 cm3 d'une solution à 0,5 % de borohydrure de sodium. La réaction de réduction se déroule pendant 30 minutes à pH = 8,5 - 9,0. On conditionne la solution du dérivé polysacchari- dique de fibrinolysine dans des sachets de Cellophane (deux de 85 cm3 chacun) et on effectue une dialyse à la tempéra- ture de 6+ 2 C contre 17 1 d'eau distillée pendant 24 heu- res. On dilue la solution dialysée de dérivé polysacchari- dique de fibrinolysine avec de l'eau apyrogène jusqu'à 350 cm3 on la fait passer à travers un filtre stérile (diamètre des pores 0,22 micromètres) et on la soumet à une lyophilisation. Le rendement en produit est de 2275 mg. L'activité fibrinolytique spécifique est de 21,2 unités/milligramme de produit d'une activité globale de 48 230 unités, ce qui représente 31,0 %s de la valeur initiale. Le produit obtenu est une poudre de couleur jaunâtre, sans odeur ni saveur. Le produit est hygroscopique, il est soluble dans l'eau et dans une solution isotonique à 0,9 % de chlorure de sodium; il est pratiquement insoluble dans l'alcool à 95 %, dans l'éther et dans le chloroforme. ExemDle 2. On dissout 10 g de dextrane d'une masse moléculaire de 11.0 000 dans 200 cm3 d'eau distillée et on ajoute 5,65 g de periodate de potassium. On effectue l'oxydation à la tem- pérature de 20 3WC avec agitation permanente pendant 1 heu- re. On fait passer la solution obtenue de dextrane d'une masse moléculaire de 110 000 et à un taux d'oxydation de + 2 % à travers une colonne de verre garnie de 50 g de résine échangeuse d'anions, cycle acétate, pour la sépara- tion complète du dextrane oxydé des anions HICOO-, I04, HC03. A la sortie de la colonne, on rejette un volume d'é- 3' 3 * luat de 50 cm (la capacité morte de la colonne), tandis qu'on récolte 50 cm3 de solution contenant du dextrane oxydé d'une masse moléculaire de 110 000 à la concentration de 50 mg/cm3 dans une éprouvette à pied graduée. On mélange 150 cm3 de la solution de dextrane oxy- dé avec 425 cm3 d'une solution tampon 0,2 M sodique à pH 9,5. On mélange la solution obtenue de dextrane oxydé avec une solution de fibrinolysine naturelle préparée par dis- solution de 45 g de fibrinolysine dans 425 cm3 d'eau dis- tillée. On abandonne le mélange réactionnel, d'un volume de 1000 cm3, à la température de 20+ 3 C pendant 40 minutes et on ajoute 310 cm3 d'une solution à 0,5 % de borohydrure de sodium, refroidie jusqu'à une température de 6+ 2 C. La réaction de réduction se déroule pendant 30 minutes. Ensui- te, on procède à une dialyse de la solution du dérivé poly- saccharidique de fibrinolysine contre de l'eau distillée en prenant un rapport solution dialysée/eau égal à 1/150 respectivement pendant 24 heures à une température de 4 à 7 C et on la soumet à une lyophilisation. Le rendement en produit est de 12,5 g d'une activité spécifique de 24 uni- tés/milligramme et d'une activité globale de 300 000 unités, ce qui correspond à 30 % de la valeur initiale. Le produit obtenu est une poudre d'une coloration jaunâtre sans odeur ni saveur. Le produit est hygroscopique, il est facilement soluble dans l'eau et dans une solution isotonique à 0,9 % de chlorure de sodium; il est pratique- ment insoluble dans l'alcool à 95 %, dans l'éther et dans le chloroforme. Exemple 3. On mélange une solution de 2 g de dialdéhydodextra- ne d'une masse moléculaire de 50 OO0 dans 40 cm3 d'eau dis- tillée avec 200 cm3 d'une solution tampon sodique 0,2 M (pH = 9,5) et on ajoute à la solution, sous agitation, 13 g de fibrinolysine. On abandonne le mélange réactionnel à pH 9,5 à une température de 5 C pendant une heure, puis on ajoute une solution refroidie de borohydrure de sodium (so- lution à 0,5 %, 100 cm3) dans un tampon sodique à pH 8,5. On effectue la réaction de réduction pendant 30 minutes à la température de +4 C et à un pHde 8,5à9,0. On conditionne la solution de dérivé polysaccharidi- quede fibrinolysine dans des sachets de Cellophane et on ef- fectue la dialyse à la température de 4+ 20C contre de l'eau distillée pendant 24 heures. On fait passer la solution dia- lysée de dérivé polysaccharidique de fibrinolysine diluée à l'eau apyrogène jusqu'à 700 cm3 à travers un filtre sté- rile (diamètre des pores: 0,22 micromètres) et on la soumet à une lyophilisation. Le rendement en produit est de 4500 milligrammes. Le produit obtenu est une poudre tirant sur le jaunâtre, sans odeur ni saveur. L'activité fibrinolytique spécifique est de 20 unités/milligramme de produit, d'une activité globale de 90 000 unités, ce qui correspond à 30 % de la valeur initiale. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un dérivé polysaccha- ridique de fibrinolysine comprenant une réaction entre la fibrinolysine et un polysaccharide aldéhydique avec forma- tion d'une liaison covalente et la séparation subséquente du produit, caractérisé en ce qu'on utilise, à titre de polysaccharide aldéhydique, un dialdéhydodextrane d'une masse moléculaire de 20 000 à 110 000, on effectue la réac- tion à un pH de 8,0 à 9,5 et à une température de 5 à 300C, et on réduit le dérivé polysaccharidique de fibrinolyse par du borohydrure de sodium avant de procéder à sa séparation. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on prend le borohydrure de sodium dans un rapport vis-à-vis du dérivé polysaccharidique de fibrinolysine de 1,5 à 2,0/1 respectivement.