Brevet FR2490675A1 — publié le 19820326

La présente invention concerne le domaine de la technologie de l'ADN recombinant, c'est-à-dire les procédés utilisés dans la technologie de l'ADN recombinant et les produits obtenus par ces procédés. Dans un aspect plus détaillé, l'invention concerne des poly- peptides, en particulier de l'interféron de fibroblaste humain mûr, les compositions pharmaceutiques qui les contien- nent et un procédé pour leur préparation qui implique de Faire croître une culture d'un micro-organisme transformé par un véhicule d'expression microbienne réplicable capable 1 d'exprimer lesdits polypeptides, et d'exprimer lesdits polypeptides. L'invention comprend également les véhicules d'expression utilisés dans ce procédé et les nouveaux microorganismes contenant ces véhicules d'expression ainsi que les procédés pour leur preparation. &nFin, l'invention concerne des séquences d'ADN comprenant des séquences codant pour la séquence d'acides aminés d'un interféron de Fibro- blaste humain mur. L'interFéron de fibroblaste humain [FIF) est une protéine qui présente une activité antivirale ainsi qu'un large éventail d'autres activités biologiques Con en trouvera une étude dans W.E. Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag, New York-Wien, 127d]. Il a été signalé qu'il a été purifié jusqu'à homogénéité sous la Forme d'un seul polypeptide avec un poids moléculaire de 19UOU-eU00 ayant une activité spécifique de:-l0 x 10d unités/mg CE. Knight, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, a0-S_3 [1S76]; W. derthold et col., J. Biol. Chem. a53, 06-51 [1 S7)]]. un a déter- miné que la séquence des treize acides aminés NH -terminaux de FIF est Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg- Ser-Ser- CE. Knight et col., Science 207, 525-526 (1980))]o Houghton et col. (Nucleic Acides Res. 8, 1913-1931 (1980)) ont utilisé des désoxyoligonucléotides de synthèse (prédits à partir de cette séquence d'acides aminés) pour déterminer la séquence des'276 nucléotides 5'terminaux de l'ARNm de FIF. Taniguchi et col. (Nature 285, 547-549 (1980); Gene 10, 11-15 (1980) et Derynck et col. [Nature 285, 542-547 (19803) ont pu récemment identifier la séquence de nucléotides de copies d'ADNc clonées d'ARNm de FIF chez E. coli et en ont déduit la séquence complete d'acides aminés du FIF humain y compris une séquence signal de 21 acides aminés. Le peptide mûr a 166 acides aminés de long. Enfin, Taniguchi et col. (Proc. Natl Acad Sci. USA 77, 5230-5233 (1980]) ont construit un plasmide qui dirige l'expression chez E. Coli du gène de FIF humain donnant le FIF mûr. Avec l'avènement de la technologie de ltAON recombinant, la production microbienne modulée d'une énorme variété de polypeptides utiles est devenue possible. On dispose déjà de bactéries modifiées par cette technique pour permettre la production de produits polypeptidiques tels que la somatostatine, les chaînes A et B de l'insuline humaine, l'hormone de croissance humaine [Itak ra et col., Science 198, 1056-1063 (1977); Goeddel et col., Nature X81, 544-548 (1979)). Plus récemment, on a utilisé les techniques de l'ADN recombinant pour occasionner la production bacté- rienne de proinsuline, de thymosine OC et d'interféron de leucocyte. La cheville ouvrière de la technologie de l'AON recombinant est le plasmide, boucle non chromosomique d'ADN à deux brins que l'on trouve chez les bactéries et d'autres microbes, souvent à de multiples exemplaires par cellule. Dans l'information encodée dans l'ADN du plasmide - i 2490675' est incluse celle qui est nécessaire pour reproduire le plasmide dans les cellules filles c'est-à-dire un "réplicon") et, ordinairement, une ou plusieurs caractéris- tiques de sélection comme, dans le cas des bactéries, la résistance aux antibiotiques qui permet à des clones de la cellule-hôte contenant le plasmide intéressant d'etre reconnus et cultivés de façon préférentielle dans des milieux sélectifs. L'utilité des plasmides tient au fait qu'on peut les cliver de façon spécifique par lt'une ou lautre des endonucléases de restriction ou "enzymes--de restriction", dont chacune reconnaît un site différent sur l'ADN plasmidique. On peut ensuite insérer des gènes ou fragments de gènes hétérologues dans le plasmide en les adjoignant à la suite au site de clivage ou aux extrémités reconstruites adjacentes au site de clivage. La recombinai- son de ltADN s'effectue à l'extérieur de la cellule, mais le plasmide "recombinant" qui en résulte peut y être intro- duit par un processus connu sous le nom de transformation et l'on obtient de grandes quantités de plasmide recombi- nant contenant le gène hétérologue en cultivant le transfor- mant. De plus lorsque le gène est correctement inséré par rapport aux fractions du plasmide qui gouvernent la trans- cription et de traduction du message le véhicule d'expres- sion obtenu peut &tre utilisé pour produire effectivement la séquence polypeptidique pour laquelle le gène inséré code, processus appelé expression. L'expression est amorcée dans une région connue sous le nom de promoteur qui est reconnue par et liée par l',ARN polymérase. Dans certains cas, comme dans le promo- teur de tryptophane ou "trp" préféré dans la pratique de l'invention, les régions promotrices se chevauchent avec des régions "opératrices" pour former un promoteur-opérateur combiné. Les opérateurs sont des séquences d'ADN qui sont reconnues par ce qu'on appelle des protéines répresseurs servant à régler la fréquence d'initiation de transcription à un promoteur partioulier. La polymérase se déplace le long de l'AON, transcrivant l'inFormation conotenue dans les brins d1encodage de son extrémité 5S à son extrémité 3' dans un ARN messager qui est à son tour traduit en un polypepti- de ayant la séquence d'acides aminés pour laquelle lt'ADN code. Chaque acide aminé est encodé par un triplet de nucléotides ou "codon' au sein de ce qu'cn peut appeler dans l'optique présente le "gèlne de structure", cest-à- dire la partie qui encode la séquence dencides aminés du produit exprimé. Après s'etre liée au promoteur-, lARN polymérase commence par transcrire les nucléotides qui encodent un site de liaison rlboszmique, puis un signal d'initiation de traduction ou signal 'd"part Cordinaire- ment ATG, qui dans 1'ARN messager résultant devient AUGI, puis les codons de nucléotides dans le gène de structure lui-même. Ce qu'on appelle des codons d'arrêt sont transcrits à l'extrémité du gène de structure, après quoi la polymérase peut Former une séquence additionnelle d9ARN messager qui, à cause de la présence du signal d'arrêt, restera non traduite par les ribosomes. Les ribo- somes se fixent au site de liaison ménagé sur 1ARN messagers chez les bactéries ordinairement au Fur et à mesure que VARNm est Formé, et produisent eux-memes le polypeptide encodé, commençant au signal de départ de traduction et finissant au signal d'arrêt mentionné ci- dessus. Le produit désiré est produit si les séquences qui encodent le site de liaison ribosomique sont positionnées correctement vis-à-vis du codon d'initiation AUG et si tous les codons restants suivent le codon d'initiation en phase. Le produit résultant peut être obtenu en lysant la cellule-hôte et en recueillant le produit par une purification appropriée à partir d'autres protéines bactériennes. Bien que l'isolement à partir de Fibroblastes de donneurs ait fourni suffisamment de matière pour une - S caractérisation partielle et des études cliniques limi- tées avec de l'interféron de leucocyte homogène, c'est une source totalement inadaptée aux quantités d'interféron nécessaires pour des essais cliniques à grande échelle et pour une utilisation prophylactique et/ou thérapeutique à grande échelle ultérieurement. De fait, les recherches cliniques employant des interférons humains dérivés de Fibroblastes dans des essais antitumoraux et antiviraux se sont principalement limitées jusqu'ici à des prépara- tions brutes Cpures à moins de 1%) de la matière, et de longs délais de fabrication de quantités suffisantes, sans même tenir compte du prix, ont retardé de façon critique les recherches sur un front étendu. On s'est appergu que l'application de la techno- logie de l'AON recombinant serait la manière la plus efficace de fournir de grandes quantités d'interféron de fibroblaste qui, en dépit de l'absence dans la matière ainsi produite de la glycosylation caractéristique de la matière d'origine humaine, pourrait être employé clinique- ment dans le traitement d'une large gamme de maladies vira- les et néoplasiques, et on a réussi à produire de l'inter- féron de fibroblaste humain mûr par un moyen microbien, en construisant un gène à cet effet susceptible d'être alors inséré dans des véhicules d'expression microbienne et exprimé sous le contrôle de commandes régulatrices des gènes microbiens. L'approche adoptée pour obtenir un gène de fibroblaste comprend les travaux suivants: 1. On utilise des séquences partielles d'acides aminés d'interféron de fibroblaste humain pour construire des ensembles d'échantillons d'AON de synthèse dont les codons, dans l'agrégat représentent toutes les combinaisons possibles capables d'encoder les séquences partielles d'aci- des aminés. 2. On prépare des banques de colonies bactériennes contenant de l'AON complémentaire CADNc) à partir d'ARN messager induit..On utilise les échantillons de Cl] pour amorcer la synthèse d'AONc à un seul brin à marquage radio- actif aux fins d'utilisation comme échantillons d'hybrida- tion. Les échantillons de synthèse doivent s'hybrider avec l'ARNm induit comme modèle, et être étendus par transcrip- tion inverse pour former de V'AONc induit radiomarquéo On a poursuivi les recherches sur des clones de la banque de colonie hybridée à de l'ADNc radiom3qué cobtenu de cette manière pour confirmer la présence d'un gène encodeur d'interféron dans toute sa longueur. Tout fragment obtenu dont on pense qu'il s'agit d'une partie de la longueur du gène est lui-même utilisé comme échantillon du gène entier. 3. On adapte le gène entier obtenu, en utilisant de l1'ADN de synthèse, pour éliminer-toute séquence diri- geante susceptible d'empêcher l'expression microbienne du polypeptide mûr et pour permettre un.poktionnement approprié dans un véhicule d'expression par rapport aux signaux de départ et au site de liaison ribosomique d'un promoteur microbien. On a purifié l'interféron exprimé à un point permettant la confirmation de son caractère et la détermination de son activité. En appliquant les procédés de la technologie de 1'ADN recombinant tels qu'exposés ci-dessus, on a cons- truit une série de véhicuies d'expression plasmidique réplicables qui dirigent la synthèse de haut niveau dans does micro-organismes transformants d'un polypeptide mûr ayant les propriétés de l'interféron de fibroblaste humain authentique. Le polypeptide produit présente la séquence d'acides aminés d'un tel interféron et est actif dans des expériences in vitro en dépit du manque de glycosyla- tion caractéristique de la matière d'origine humaine. La référence ici faite à l"'expression de l'interféron de fibroblaste mIr" implique la production bactérienne ou par un autre moyen microbien d'une molécule d'interféron ne contenant pas de groupes glycosyle ou d'une préséquence qui se met immédiatement au service de la traduction par l'ARNm du génome de l'interféron de Fibroblaste humain. L'interféron de fibroblaste mur, selon l'invention, est immédiatement exprimé à partir d'un signal de début de traduction CATU) qui encode également le premier codon acide aminé du produit naturel. La présence ou l'absence du premier acide aminé méthionine dans le produit exprimé par voie microbienne est gouvernée par un phénomène cinétique dépendant des conditions de croissance fermentatives et/ou des nivea î d'expression chez l'hôte transformant. On a pu exprimer l'interFéron de Fibroblaste mûr avec une protéine conjuguée autre que la protéine dirigeante classique,le conjugué étant spécifiquement clivable dans un environnement intra- ou extra-cellulaire [voir brevet anglais n0 2 007 676 A). EnFin, on a pu produire l'inter- féron mûr en conjonction avec un peptide "signal"' micro- bien qui transporte le conjugué vers la paroi cellulaire, o le signal est prélévé et traité et o le polypeptide mur est sécrété. Les figures. à 5 ci-jointes sont décrites en détail dans le texte qui suit. La figure 6 représente de façon schématique la construction de plasmides donnant le code de l'expression directe de l'interféron de fibroblaste mûr. Les sites de restriction et les résidus sont tels que le montre la figure ["Pst I", etc). "Ap " et "To " représentent des fractions du plasmide qui expriment, respectivement, la résistance à l'ampicilline et à la tétracycline. La légende "p o" est l'abréviation de "opérateur de promoteur". B A. Micro-organismes employés Les travaux décrits impliquent d'utiliser le micro-organisme E. coli K-12 souche 294 [extrémité A, thi, her, hsnk J, tel que décrit dans le brevet englais nO 2 055 382 A. Cette souche a été déposée à l'Americn Type Culture Collection, ATCC nQ 31446. Tous les travaux sur l'ADN recombinant ont été effactus sn accord avec les directives applicables des Instituts Mtionaux de la Santé. Lé-inventions bien qua dcrite dans ses modes de réalisation les plus appréciés avec référence à E. coli K-12 souche 294 définie ci-dessus, comprend également toutes les autres souches connues d'E. coli comme E. coli B, E. coli x 1776 et E. coli W 3110, ou d'autres souches micro- biennes dont beaucoup sont déposées dans des institutions reconnues de dépôt de Micro-organismes, comme l'American Type Culture Collection CATCC), et y sont Cpotentielle- ment) disponibles. Voir également la demande de brevet publiée en Allemagne sous le n 2 644 43a. Ces autres micro-organismes comprennent, par exemple, des bacilles comme Bacillus subtilis et d'autres entérobactériacées parmi lesquelles on peut mentionner comme exemples Salmonella typhimurium et Serratia marcescens, utilisant des plasmides qui peuvent répliquer et exprimer les séquences de gènes hétérologues qui s'y trouvent. Il peut être également intéressant d'employer une levure, comme Saccharomyces cerevisiae, comme organisme hôte dans la préparation de la présente protéine d'interféron par expression de gènes qui en donnent le code sous la commande d'un promoteur de levure. B. Procédés généraux Les enzymes de restriction sont fournis par New England Biolabs et utilisés selon leurs directives. On prépare l'AON du plasmide par un procédé classique de libération de lysat CD.B. Clewell, J. Bacteriol. 110, 667-676 (1972)) et on purifie par chromatographie sur colonne sur Biogel A-50M. La détermination des séquences de l'AON s'effectue en utilisant le procédé de Maxam et Gilbert (Methode Enzymol. 65, 499-560 (1980)). On isole des fragments de restriction d'ADN à partir de gels de polyacrylamide par électroélution. On attache un marqueur radioactif à des fragments d'AON aux fins d'utilisation comme échantillons d'hybridation par le procédé d'amorçage au hasard de ltADN de thymus de veau de Taylor et col. C8iochim. Biophys. Acta 442, 324-330 C1976)). Les hybrida- tions de colonies in situ sont effectuées selon le procédé de GrunsteinHogness (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-1965 [1975)). C. Synthèse chimique des désoxyoligonucléotides On synthétise les désoxyoligonuoléotides par le procédé du phophotriester modifié en solution (Ores et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765-5769 (1978)), en utili- sint des tridésoxynucléotides comme constituants (Hirose et col., Tetrahedron Letters 28, e449-C45e T1978)]. Les matériaux et les procédés généraux sont semblables à ceux qui sont décrits par Cre et col., Nucleic Acids Res. 8, 2331-2348 (1980). Les six lots d'amorces [Figure 1) conte- nant quatre dodécanucléotides chacun sont obtenus en cou- plant séparément deux lots d'hexamères Ode deux séquences '-terminales différentes chacune) avec trois lots d'hexa- mères différents Ode deux séquences 3-terminales différentes chacune). 0. Induction des fibroblastes On cultive des fibroblastes humains (lignée cellulaire GM-2504A] selon la description antérieure de Pastha et col., Proc. Natl. Acad. Soi. USA 72, 3898-3901 [19753. On retire du milieu de culture [milieu essentiel minimum d'Eagle contenant 10% de sérum de foetus de veau) de rouleaux [850 cm 3) et on le remplacse par 50 ml de milieu de culture contenant 50 microgrammes/ml de poly[l): polyCI) et 10 micràgremmes/ml de cycloheximide. On retire ce milieu d'induction au bout de 4 heures à 370C et on lave les couches monocellulaires Qvec du sel physiologique tamponné au phosphate [STP; NaOl t,14 M, KCl 3 mM: KM O,4 1S5 mMs Na2HPO4 8 mM). On Fait incuber toutes les bouteil- les à 37 C avec 10 ml d'une solution de trypsine-EDTA CGibco 610-5305) jusquVà ce que des cellules se détachent, et on ajoute du sérum de foetus de veau jusqutà une concen- trat ion de 10%. On centrifuge les cellules pendant 15 miRu- tes à 500 g et on remst les pastilles en suspension dans le TP, on rassemble et on resédimente. On congèle les cellu- les dans l'azote liquide. On obtient environ 0,17 g de cellules par rouleau. E. Préparation et dosage de l'ARFNm d'interféron On prépare de 1'ARNm contenant du poly[A) à partir de fibroblastes humains par des extractions au phenol et par chromatographie sur oligoCdT)-cellulose comme il est dit dans Green et col. [Arch. Biochemo Biophys. 172, 74-89 (1975)). On enrichit l'ARN contenant du polyCA) en un AfNm d'interféron par centrifugation sur un gradient linéaire de saccharose 5-20% (p/v). On chauffe les échantillons d'tARN à 80 0C pendant 2 minutes, on refroidit rapidement, on stratifie selon le gradient, et on centrifuge pendant heures à 30 000 tpm à 40C dans un rotor Beckman SW-40. On recueille les fractions, on les précipite à l'éthanol, et on dissout dans H20. On injecte des échantillons d'un microgramme d'ARNm dans des oocytes de Xenopus laevis comme il est dit dans Cavalieri et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3287-3291 [1977)]. On fait incuber les oocytes injectés pendant 24 heures à 21 C, on homogénéise, et on centrifuge pendant 5 minutes à 10 000 g. On détermine l'interFéron dans le surnageant par le dosage de l'inhibition de l'eFfet cytopathique COPE] [Stewart, The InterFeron System, Springer-Verlag, New-York-Wien, 1979) en utilisant le virus Sindbis et des cellules diploïdes humaines CWISH). On obtient communément des titres d'interFéron de 1000 à 6000 unités recueillies [norme de référence NIH) par microgramme d'ARN injecté pour l'espèce 12S d'ARNm. F. Synthèse et clonage de l'ADNc On prépare de l'AONc à un seul brin dans des réactions de 100 microlitres contenant 5 microgrammes d'ARNm fraction 12S, a0 mM de Tris-HCl [pH 8,3), ?0 mM de KCl, 8 mM de Mgcl2, 30 mM de (mercaptoéthanol, 100 LCi de C(3 P]dCTP et 1 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP. L'amorce est le décamère HindIII de synthèse dCCAAGCTTGG (Scheller et col. , Science 196, 177-180 [1977]], agrandi à l'extrémité 3' avec d'environ 20 à 30 résidus désoxythymidine en utilisant la désoxynucléotidyle transférase terminale Chang et col., Nature 275, 617-624 [1978)). On ajoute unités de transcriptase inverse et on Fait incuber le mélange réactionnel à 420C pendant 30 minutes. On procède à la synthèse du second brin d'ADN comme il est dit ci- dessus [Goeddel et col., Nature 281, 544-548 (1979)]. On traite l'ADNc à deux brins avec 1200 unités de nucléase SI pendant 2 heures à 37 C dans 25 mM d'acétate de sodium [pH 4,5], I mM de ZnCl2, 0,3 M de NaCl. Après extraction au phénol, on sépare le mélange par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 8%. On recueille par électro- élution de l'ADNc [0,5 Hg] de taille comprise entre 550 et 1500 paires de bases. On agrandit une fraction de 20 ng avec des résidus de désoxyC en utilisant la désoxynucléoti- dyl-transFérase terminale [Chang et col., supra), et on cyclise avec 100 ng de pBR322 préalablement clivé avec PstI et à la queue duquel on accroche des résidus désoxyS [Chang et col., supra). On utilise le mélange cyclisé pour transformer E. coli K-12 souche 294 par un procédé publié CHershfield et col., Prcc. Natl. Acad. Soi. USA 71, 3455-3459 [19743). . A S. Préparation d'échantillons de 32P-ADNc induits et non- induits On combine 5 microgrammes deARNm 12S avec soit 2 microgrammes d'oligo dT)]12 l8 soit 5 microgrammes de chaque lot d'amorce5de synthèse (figure 1) dans 60 micro- litres de Tris-HCl 10 mM [pH 8), EOTA 1 mM. On fait bouillir les mélanges pendant 3 minutes, et on les éteint sur de la glace. On ajoute à chaque mélange modèle-amorce à OOC 60 microlitres de Tris-HCl 40 mM (pH 8,3), KCl 40 mM, MgCl2 16 mM, e-mercaptoéthanol 60 mM, I mM dATP, dGTP, dTTP et 5 x 10-7 M de ( 32 p] dCTP [2000 - 3000 Ci/mM). Après addition de 100 unités de transcr ptase inverse, on Fait incuber les réactions à 421C pendant 30 minutes et on purifie par passage sur des colonnes de 10 ml de Sephadex G-50. On traite les produits avec NaOH 0,3 N pendant 30 minutes à 701C, on neutralise, et on précipite à l'éthanol. On combine les 32P-AONc avec 100 microgrammes d'ARNm poly[A) provenant de fibroblastes non induits dans microlitres de phosphate de sodium 0,4 M [pH 6,8], dodécylsulfate de sodium CSDOS) à 0,1%. On chawffe les mélanges à 98 C pendant 5 minutes et on les laisse se cycliser pendant 15 heures à 45 C. On sépare les hybrides ADN-ARN [contenant des séquences d'AONc non induites) de ltAON à un seul brin [séquences d'AONc induites) par chromatographie sur hydroxyapatite comme il est dit dans Galau et col. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1020-1023 (1977]). On traite les hybrides ADN-ARN avec un alcali pour retirer l'ARN. H. Tri des plasmides recombinants avec des échantillons de P-AONc On prépare des échantillons d'environ 1 micro- gramme d'ADN de plasmide à partir de transformants indi- viduels par un procédé publié [Birnboim et col., Nucleic Acides Res. 7, 1513-1523 (1979)). On linéarise les échan- tillons d'AON par digestion avec EcoRI, on les dénature dans un alcali, et on les applique à trois Filtres à la nitrocellulose par le procédé d'hybridation ponctuelle [KaFatos et col., Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552 [1979)). On hydride les filtres avec les échantillons de 3P-AONc pendant 16 heures à 42 C dans le formamide à 50%, 10 x solution de Denhardt [Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 641-646 [1966], SxSSC, 40 mM de Tris-HCl [pH 7,5], 2 mM d'EDTA, 40 microgramme/ml d'ARN de levure. On lave les filtres avec 0,lxSSC, 0,1% de SDS deux fois pendant minutes à 420 C, on sèche et on expose à une pellicule pour rayons X Kodak XR-2 en utilisant des écrans d'intensi- Fication DuPont Lightning-Plus à -SO C (le SSC contient du NaCl 0,15 M et du citrate de sodium 0,015 M, pH 7,0). I. Construction de plasmides pour l'expression directe de FIF On phosphoryle les amorces de synthèse I [dATGAGCTACAAC) et II [dCATGAGCTACAAC] en utilisant de la T4 polynucléotide kinase et du C[ -3 P]ATP à une activité spécifique de 700 Ci/mM comme il est dit dans Goeddel et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 106-110 [1979). Les réactions de réparation des amorces s'effectuent comme suit: on combine 250 pM des amorces au 32p avec 8 microgrammes (10 pM) d'un fragment de restriction 1200 bp HhaI contenant la séquence d'AONc du FIF. On précipite le mélange à l'éthanol, on le remet en suspension dans 50 microlitres d'H,0, on fait bouillir pendant 3 minutes, on l'éteint dans un bain de glace carbonique et d'éthanol, et on le combine avec une solution de 50 microlitres de Tris-HC1 20 mM (pH 7,5), MgCl2 14 mM. NaCl 120 mM, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 0,5 mM à O C. On ajoute 10 unités de Fragment d'AON polymérase I de Klenow et on Fait incuber le mélange à 37 C pendant 4 h S. Après extraction aevoc du phénol/CHCl13 et restric- tiontavec PstI, on purifie les produit désiré sur un gel de polyacrylamide à 6%. Les ligations ultérieures se Font à la température ambiante [extrémité agglutinante) ou à 4 C (extrémités non agglutinantes) dans les conditions mentionnées ci-dessus (Goeddel et al., supra). J. Dosage de l'expression d'interféron chez E. cli On prépare des extraits bactériens pour des dosages IF comme suit: On cultive des cultures de I ml pendant la nuit dans le milieu LB [Luria-Bertani] contenant microgrammes/ml de tétracycline, puis on dilue dans E5 ml de milieu M9 auquel on ajoute 0,2% de glucose, 0,5% d'acides casamino et 5 microgrammes/ml de tétracycline. On recueille des échantillons de 10 ml par centrifugation lorsque l'ab- sorption à 550 nm [A550) atteint 1,0. On congèle rapidement les pastilles cellulaires dans un bain de glace carbonique et d'éthanol et on prépare les lysats clarifiés comme il est dit dans Clewell (supra). On détermine l'activité d'interFéron dans les surnageants par comparaison avec les normes de FIF NIH en utilisant des dosages d'inhibition CPE. On utilise deux dosages diFférents: Ca) On ensemence des cellules WISH [amnios humain) dans des boites de micro- titrage. On ajoute des échantillons 16 à 20 heures plus tard et on les dilue par une série de dilutions au double. On ajoute le virus Sindbis au bout d'au moins 3 heures d'incubation. On colore les plaques 20 à 24 heures plus tard avec du violet de gentiane. (b) On ensemence une lignée cellulaire MOBK (rein de boeuf] simultanément avec des dilutions au double d'échantillons. On ajoute le virus de la stomatite vésiculaire au bout de 2 à 3 heures d'incu- bation et on colore les plaques avec du violet de gentiane 16 à 18 heures plus tard. Pour tester la stabilité à pH 2, On dilue des extraits bactériens et des témoins dans le milieu essentiel minimum à une concentration de 1000 unités/ml. On ajoute des Fractions d'1 ml à pH 2 avec HCl 1 N, on fait incuber à 4 C pendant 16 heures, et on neutralise par addition de NaOH. On détermine l'activité IF par le dosage d'inhibition CPE en utilisant des cellules d'amnios humain. Pour établir l'identité antigénique, on fait incuber des fractions de 25 microlitres des échantil- lons d'interféron à 1000 U/ml (non traités) avec a5 micro- litres d'interféron de leucocyte antihumain de lapin pen- dant 60 minutes à 37 C, on centrifuge à 12 000 g pendant minutes et on dose le surnageant. Les standards d'interfé- ron de Fibroblaste et de leucocyte proviennent des Insti- tuts nationaux de la Santé. L'interféron de leucocyte antihumain de lapin provient de l'Institut national de l'Allergie et des Maladies infectieuses. K. Synthèse chimique de lots d'amorces complémentaires de l'ARNm de FIF La séquence protéique amino-terminale connue de l'interféron de fibroblaste humain nous permet de déduire les 24 séquences possibles d'ARNm susceptibles de donner le code des quatre premiers acides aminés. Onsynthétise les 24 désoxyoligonucléotides complémentaires en 6 lots de 4 dodécamères chacun (figure 1). On synthétise les 6 lots de 4 désoxycligo- nucléotides chacun par le procédé du phosphotriester modi- fié en solution et sur phase solide [Crea et col., supra). La stratégie de base consiste à faire réagir deux trimères bloqués en 3e différents avec un excès d'un seul trimère protégé en 5' pour donner un lot de deux hexamères, chacun également représentSé. Le couplage do deux lots, contenant chacun deux hexamères, aboutit alors à un lot de 4 dodéca- mères. L. Identification des clones d'ADNc de FIF En utilisant de 1'ARNm 12S provonant de fibroblas- tes humains induits [1000 unités dvactivité IF par micro- gramme dans le dosage d'oocyte) on prépare un ADNn à deux brins et on l'insère dans pBBR32 au sitc PstI par le procédé classique dG:dO d'allongament de queue camne il est dit dans Chang et col. suproz On obtient une 9'biblio- thèque" dtAONc de fibroblasta consistant an 30 000 trans- Formants sensibles à l!ampicillines rsistants à la tétracycline, d'E. coli K-12 souche 294 à partir de 20 ng dIAONc de taille comprise entre 550 et 1300 paires de bases. On prépare l'AON de plasmide à partir de 600 des transfor- mants et on l'applique à trois ensembles de filtres de nitrocellulose comme il est diQ ci-dessus. L'approche adoptée dans l'identification des plasmides hybrides contenant des séquences d'ADNc d'inter- féron de fibroblaste est semblable à celle que l'on utilise pour identifier les plasmides recombinants d'interféron de leucocyte humain CGoeddel et col., Nature Z87, 411-418 (1980]). On prépare des échantillons d'hybridation d'AONc radiomarqués en utilisant soit les 24 dodécamères de synthèse soit les oligo[dT])_ 18 comme amorces et l'ARN 12S à partir de fibroblastes induits [5000 unités/mg dans les oocytes) comme modèle. On hydride les -P-AONc [activité spécifique 5 x 10 cpm/microgramme3 obtenus avec un large excès d'ARNm isolé à partir de Fibroblastes humains non induits, et on sépare les hybrides ARNm-ADNc de l'ADNc n'ayant pas réagi par chromatographie à l'hydroxyapatite [Galau et col., supra). Les fractions d'ADNc à un seul brin doivent atre enrichies en séquences qui sont présentes dans les fibroblastes induits mais absentes dans les cellules non induites, et les hybrides ARNm-AONc doivent représen- ter les séquences communes aux cellules induites et non induites. On obtient environ 4 x 10 cpm d'AONc à un seul brin Céchantillon d'hybridation A) et B x 10 cpm d'hybrides AONc-ARNm en utilisant de l'AONc amorcé avec oligoCdT]12:; on obtient 1,5 x 10 cpm de brin simple Céchantillon d'hybridation SI et 1,5 x 10 cpm d'hybrides à partir d'AANc amorcé en utilisant des lots de dodécamères de synthèse 1-6. On combine les hybrides ADNc-ARNm des deux fractionnements, on hydrolyse l'ARN par traitement avec un alcali, et on utilise le 32P-ADNc comme échantil- lon d'hybridation C. Un grand nombre des 600 échantillons de plasmide s'hybrident avec les deux échantillons A et C, indiquant que les réactions d'hybridation entre l'ARNm non induit et le 3 P-ADNc [avant l'étape de fractionnement à l'hydroxyapatite) n'ont pas été jusqu'à leur terme. Cependant, un seul des 600 plasmides CpF526) s'hybride fortement avec l'échantillon B d'ADNc induit, spécifiquement amorcé [figure 2). Le plasmide pF526 s'hybride également avec l'échantillon A total amorcé avec oligoCdT)1l_16s induit à l'ADNc, et ne donne pas d'hybridation détectable avec l'échantillon non induit combiné C. La digestion au PstI de pF526 montre que l'insert d'AONc cloné a environ 550 paires de bases de longueur, ce qui est probablement trop court pour contenir la totalité de la région dtencodage de l'interféron de fibroblaste. On prépare donc un échantillon d'ADN marqué au 3aP à partir de ce fragment de PstI par amorçage aléatoire avec de l'ADN de thymus de veau CTaylor et col., supra) . On utilise cet échantillon pour trier 2000 colonies différentes prove- nant d'une "bibliothèque" d'ADNc de fibroblaste nouvelle- ment construite Con prépare la nouvelle "bibliothèque" ,: d'ADNc en utilisant de l'ARNm 12S provenant de Fibroblaste induit ayant un titre de 6000 unités/ml dans le système de dosage des oocytes). Seize clones s'hybrident à l'échantillon. Oes plasmides préparés à partir de la majori- té de ceux-ci libèrent deux Fragments lorsqu'on les clive avec PstI, ce qui indique que l'AONc contient un site de PstI interne. C'est le clone pFIF3 qui contient le plus grand insert d'AONc, environ 800 paires de bases. On déter- mine la séquence dtAON de l'insert par le procédé de Maxam- Gilbert (supra], et elle est exposés dans la Figure 3. La séquence d'acides aminés de leinterféron de fibroblaste humain prédit à partir de la séquence de nucléotides est identique à celle citée récemment par Taniguchi et col. (Gene 10, 11-15 (1980)) et par Derynck et col. (supra] d'après détermination à l'AON des clones d'AONc de FIF. Un précurseur ou peptide signal de 21 acides aminés est suivi par une séquence de 166 acides aminés représentant l'interféron mûr, une section de 196 nucléotides non tra- duits en 3' et une queue polyCA). Les 20 acides aminés NH2-terminaux du FIF mur sont déterminés directement par microséquengage protéique et sont les mêmes que ceux qui sont prédits d'après la séquence d'AONo M. Expression directe d'interféron de Fibroblaste Pour exprimer de grandes quantités d'interféron de fibroblaste mûr chez E. coli, l'initiation de la synthèse protéique doit se produire au codon ATG du polypaptide mUr [acide aminé 1] plutôt qu'à 1'ATG du peptide signal [acide aminé SI) CFigure 3). Notre procédé pour enlever le peptide signal codant des régions de pFIF3 est décrit dans la Figure 4. On isole un Fragment d'AON à 1200 bp qui contient l'insert d'ADNc en entier à partir d'un gel de polyacrylamide après avoir digéré pFIF3 avec HhaI. On prépare deux amorces désoxy- oligonucléotides de synthèse, dATGAGCTACAAC CI) et dCATGAGCTACAACCII]. Les deux amorces contiennent la séquence d'encodage des quatre premiers acides aminés de l'interFéron de fibroblaste mûr; l'amorce II possède un C additionnel à l'extrémité 5'. Les réactions de répa- ration des amorces et les liaisons ultérieures sont efFec- tuées séparément pour les amorces I et II, et donnent des résultats presque identiques. Seules les réactions utili- sant l'amorce I sont donc examinées ici en détail. On Fait subir aux amorces un marquage radioactif en 5' en utilisant du [Ct3- P)ATP et de la T4 polynucléotide kinase, on combine avec le Fragment d'ADN HhaI à 100 bp et on dénature les mélanges en les faisant bouillir. Après avoir hybridé l'amorce au Fragment d'ADN HhaI dénaturé, on utilise un fragment de Klenow d'AON polymérase I d'E. coli [Klenow et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65, 168-175 [1070) pour catalyser la synthèse de réparation du brin plus Csupérieur) Cfigure 4). En outre, l'activité de 3' ---->5' exonucléase associée du fragment de Klenow retire l'extré- mité 3' saillante du brin moins Cinférieur), ce qui laisse une extrémité agglutinante. L'analyse des échantillons du mélange réactionnel par électrophorèse sur gel de poly- acrylamide indique que la synthèse de réparation n'est pas allée à son terme, mais s'est arrêtée à plusieurs sites discrets. On traite donc le mélange réactionnel entier avec PstI et on purifie le fragment à 141 bp désiré C1SO 000 Cerenkow cpm; env. 0,3 pM) par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La liaison de ce Fragment à 1 microgramme Cenv. 4 pM) du fragment PstI-BglII à 363 bp isolé à partir de pFIF3 CFigure 4), suivie par digestion à BglII, donne 50 000 Cerenkov cpm Cenv. 0,1 pM, env. 30 ng) du fragment d'ADN à 504 bp contenant toute la séquence d'encodage de ltinterféron de bibroblaste mûr. Les mêmes réactions utilisant l'amorce II donnent 83 000 cpm Cenv. 0,15 pM, env. 50 ng] de produit à 505 bp. La construction des plasmides qui dirigent la synthèse de l'interféron de fibroblate humain est donnée dans la figure S. On construit des plasmides d'expression séparés qui placent la synthèse de FIF sous la commande des systèmes promoteur-opérateur lac ou trp d'ô. coli. Ces deux systèmes se sont révélés utiles pour l'expres- sion directe des gènes eucaryotiques chez E. coli: l'hor- mone de croissance humaine a été efficacement synthétisée en utilisant le système lac [GSoeddel et col., Nature 2E1 544-548 [1979]] et l'interféron de leucocyte humain a été produit en grandes quantités en utilisant le système trp CGoeddel et col., Nature 287, 411 C1980)]o On digère le pBRH trp avec l'enzyme de restriction EcoRI et onisole le fragment obtenu par PAGE et électro- élution. On combine le plasmide pSom il disgéré avec EcoRI [Itakura et col., Science 193, 1056-106O3 [1977); brevet anglais n 2.007 676 A] avec le fragment ci-dessus. On lie le mélange avec l'ADN ligase T4 et on transforme l'AON obtenu dans EL coli K-12 souchs 294 comme il est dit cidessus. On choisit- les bactéries transformantes sur des plaques contenant de l'ampicilline. On trie les colonies résistantes à l'ampicilline obtenues par hybrida- tion des colonies [Grunstein et col., supra) en utilisant comme échantillon le promoteur-opérateur trp contenant le Fragment ci-dessus isolé à partir de pBRHtrp, qui a subi un marquage radioactif avec P. On choisit plusieurs colonies que l'hybridation des colonies monrtreicomme positives, on isole l'ADN de plasmide et on détermine l'orientation des fragments insérés par analyse de restriction en employant les enzymes de restriction BglII et BamHI en double diges- tion. On cultive E. ccli 294 contenant le plasmide appelé pSom7/2, qui a le Fragment promoteur-opérateur trp dans l'orientation désirée dans un milieu LB contenant microgrammes/ml d'ampicilline. On cultive les cellules à une densité optique de I Cà 550 nM], on les recueille par centrifugation et on les remet en suspension dans le milieu M9 dilué à dix fois son volume. On cultive les cellules pendant 2 à 3 h, là encore à la densité optique 1, puis on les lyse et on analyse les protéines cellulaires totales par PAGE à SOS urée C15%) [Maizel et col., Methods Virol. 5, 180-246 [1971)). On digère le plasmide pBR3a2 avec Hind III et on digère à leur tour les extrémités Hind III saillantes avec la 1SI nucléase. La digestion à la S1 nucléase implique de traiter 10 microgrammes de pBR322 clivés avec HindIII dans 30 microlitres de tampon SI [0,3 M NaCl, 1 mM ZnCl2, 25 mM d'acétate de sodium, pH 4,5) avec 300 unités de Si1 nucléase pendant 30 minutes à 15aC. On arrête la réaction par addition de 1 microlitre de solution d'arrêt de 30 x SI nucléase CO,8 M de base tris, 50 mM d'EDTA). On extrait le mélange au phénol, on l'extrait au chloro- forme et oh le précipite à 1'éthanol, puis on le digère avec EcoRI comme il est dit ci-dessus et on obtient le grand fragment E1) par un processus de PAGE suivi par une électroélution. Le fragment obtenu possède une première extrémité EcoRI agglutinante et une seconde extrémité non agglutinante dont le brin d'encodage commence avec la thymi- dine du nucléotide. On digère le plasmide pSom7,2, tel que préparé ci-dessus, avec BglII et on transforme les extrémités BglII agglutinantes obtenues en extrémités à deux brins par le procédé de la polymérase I de Klenow en utilsant les quatre désoxynuoléotide- triphosphates. Le clivage avec EcoRI du produit obtenu suivi par PAGE et électro- * élution du petit fragment C2) donne un fragment linéaire d'ADN contenant le promoteur-opérateur tryptopbane et les codons de la séquence LE' "proximale" en amont à partir du site BglII ["Le' [p]"]. Le produit a une extrémité EcoRI et une extrémité non agglutinante résultant du remplissage du site BglII. Cependant, le site BglII est reconstitué par liaison de l'extrémité non agglutinante du Fragment [2) avec l'extrémité non agglutinante du fragment (t1]. Ainsi, on lie les deux fragments en présence d'ADN ligase T4 pour former le plasmide recirculé pHKY 10 que l'on propage par transformation dans les cellules compétentes d'E. coli souche 294. Le plasmide pGMI porte l'opéron tryptophane d'E. ccli contenant la délétion &LEt413 CMiozarri et col., J. Bacteriology i33, 1457-1466 [1978J) et exprime donc une protéine de fusion comprenant les six premiers acides aminés du directeur trp et environ le dernier tiers du polypeptide E trp [appelé ci-dessous concurremment LE'), ainsi que le polypeptide 0 trp dans son entier, le tout sous la commande du système promoteur- opérateur trp. On digère le plasmide, 20 microgrammes, avec l'enzyme de restriction PvuII qui segmente le plasmide en cinq sites. On combine ensuite les fragments de gène avec des protéines de liaison EcoRI Consistant en un oligonucléotide auto-complémentaire de séquence: pCATGAATTCATG) fournissant un site de clivage EcoRI pour un clonage ultérieur dans un plasmide contenant un site EcoRI. On traite les 20 micro- grammes de fragment d'ADN obtenus à partir de pGMI avec unités d'AON ligase T4 en présence de 200 picomoles de l'oligonucléotide de synthèse 5'-phosphorylé pCATSAATTCATG et dans 20 microlitres de tampon ADN ligase 4 C20 mM de Tris, pH 7,6, 0,5 mM d'ATP, 10 mM de MgCl, mM de dithiothréitol) à 40C pendant la nuit. On chauffe alors la solution pendant 10 minutes à 70OC pour arrêter la liaison. On segmente les protéines de liaison par digestion avec EcoRI et on sépare les fragments, comportant alors des extrémités EcoRI, en utilisant PAGE à 5X et on isole du gel les trois plus grands fragments en commençant par colorer avec du bromure d'éthidium, en mettant en place les fragments à la lumière ultraviolette, et en découpant à partir du gel les parties intéressantes. Chaque fragment de gel avec 300 microlitres de 0,1 x TBE, est disposé dans un fragment de dialyse et soumis à une électrophorèse à 100 V pendant une heure dans un tampon 0,1xTBd ile tampon TBE contient: 10,8 g de base Tris, 5,5 g d'acide borique, 0,09 g de NaeEDTA dans I litre dIHR0] . On recueille la solution aqueuse à partir du sac de dialyse, on l'extrait au phénol et on la rend 0,2 M avec du chlorure de sodium, et on recueille l'AON dans l'eau après précipitation à l'éthanol. On identifie le gène contenant le promoteur- opérateur trp avec extrémités agglutinantes EcoRI dans le procédé décrit ci-dessous, qui comporte l'insertion de fragments dans un plasmide sensible à la tétracycline quis après insertion du promoteur-opérateur, devient résistant à la tétracycline. Le plasmide pBRH1 [Rodriguez et col., Nucleic Acids Research 6, 3267-3287 -1979)) exprime la résistance à l'ampicilline et contient le gène de la résistance à la tétracycline mais, comme il n'y a pas de promoteur associé, n'exprime pas cette résistance. Le plasmide est donc sensible à la tétracycline. En introduisant un système promoteur-opérateur dans le site EcoRI, on peut rendre le plasmide résistant à la tétracycline. On digère le pBRH1 avec EcoRI et on retire l'en- zyme par extraction au phénol suivie par extraction au chloroforme et on la recueille dans l'eau après précipita- tion à l'éthanol. La molécule d'ADN résultante est, dans des mélanges réactionnels séparés, combinée avec chacun des trois fragments d'AON obtenus ci-dessus et liée avec l'ADN ligase T4 oomme il est dit ci-dessus. On:utilise lPADN présent dans le mélange réactionnel pour transformer l'E. coli K-12 souche 294 compétente par des techniques classiques [Hershfield et col., supra) et on dépose les bactéries sur des plaques LB contenant 20 microgrammes/ml d'ampicilline et 5 microgrammes/ml de tétracycline. On choisit plusieurs colonies résistantes à la tétracycline> on isole l'ADN du plasmide et on confirme la présence du Fragment désiré par analyse à l'enzyme de restriction. Le plasmide obtenu est désigné par pBRHtrp. On obtient un produit de digestion EcoRI et BamHI du génome viral de l'hépatite B par des moyens classiques et on le clone dans les sites EcoRI et BamHI du plasmide pGH6 CGoeddel et col., Nature g81, 544-548 [197B]] pour former le plasmide pHS32. On segmentz le plasmide pHS32 avec XbaI, on l'extrait au phénol, on leextrait au chloroforme et on le précipite à l'éthanol. On le traite alors avec I microlitre dIEo coli polymérase 1, fragment de Klenowdans 30 microlitres de tampon de poly érase [50 mM de phosphate de potassium pH 7,4, 7 mM de MgCla I mM de fl-mercmaptoéthanol] contenant 0,1 mM de dTTP et 0,1 mM de dCTP pendant 30 minutes à ODC puis pendant a h à 37:C. Ce traitement provoque l'introduction de deux des quatre nucléotides complémentaimes de l'extrémité saillante ' du site de clivage XbaI: S' CTAGA- 5' CTAGA- 3' T- 3' TCT- On incorpore deux nucléotides, dC et dT, donnant une extrémité avec deux nucléotides saillants 5'. On segmente ce résidu linéaire de plasmide pHS32 [après extraction au phénol et au chloroforme et récupération dans l'eau après précipitation à l'éthanol] avec EcoRI. On sépae le grand fragment de plasmide du plus petit fragment EcoRI-XbaI par PAGE et on l'isole après électroélution. On lie ce fragment d'ADN provenant de pHS32 [C,2 microgrammes), dans des conditions semblables à celles qui sont décrites ci- dessus, au fragment EcoRI-Taq I de l'opéron tryptophane [env. 0,01 microgrammes], provenant de pBRHtrp. Dans le processus de liaison du fragment provenant de pHS32 au fragment EcoRI-Taq I, comme il est dit ci- dessus, on lie l'extrémité saillante Taq I à l'extrémité saillante restante XbaI même si elle n'a pas une structure complète de paires de base selon Watson-Crick: -T + CTAGA- -TCTAGA- o-AC TCT AGCTCT- On transforme une Fraction de ce mélange réac- tionnel de ligajon dans des cellules d'E. coli P94, on traite à la chaleur et on dépose sur des plaques La contenant de l'ampicilline. On choisit 24 colonies, on les cultive dans 3 ml du milieu LB, et on isole les plasmides. On trouve que six de ceux-ci ont le site XbaI régénéré par réparation de l'ADN catalysé par E. coli et réplication. -TCTAGA-TOTAGA- AGCTCT- AGATCT- On trouve que ces plasmides se segmentent égale- ment à la Fois avec EcoRI et HpaI et donnent les Fragments de restriction attendus. On utilise un plasmide, désigné pTrp14, pour l'expression des polypeptides hétérologues, comme on l'examine ci-dessous. Le plasmide pHGH 107 CLoeddel et col., Nature e81, 544-548 [1979)) contient un gène pour l'hormone de croissan- ce humaine constitué de 23 codons d'acides aminés produits à partir de Fragments d'ADN de synthèse et 163 codons d'acides aminés obtenus à partir d'ADN complémentaire produit par transcription inverse d'ARN messager d'hormone de croissance humaine. Ce gène, bien qu'il lui manque les codons de la "pré" séquence de l'hormone de croissance humaine, ne contient pas un codon d'initiation de traduction aTG. On isole le gène à partir de 10 microgrammes de pHGH 107 après traitement avec _coRI suivi par un Fragment de Klenow de polymérase I d'E. coli et par dTTP et dATP comme il est dit ci-dessus. Après extraction au phénol et au chloroforme et précipitation à l'éthanol, on traite le plasmide avec BamHI. On isole le fragment contenant le gène de l'hormone de croissance humaine CHGH) par PAGE puis par électroélution. Le Fragment d'ADN obtenu contient égale- ment lés 350 premiers nucléotides du gêne de structure de résistance à la tétracycline mais est dépourvu du système promoteur-opérateur de la tétracycline si bien que lorsqu'on le clone ultérieurement dans un plasmide d'expressions les plasmides contenant l'insert peuvent être mis en place par restauration de la résistance à la tétracycline. Etant donné que l'extrémité EcoRI du fragment a été introduite par le procédé de la polymérase I de Klenow, le fragment possède une extrémité non agglutinante et une extrémité agglutinante, ce qui garantit une orientation correcte lorsqu'on l'insère ensuite dans un plasmide d'expression. On prépare ensuite le plasmide d'expression pTrpl4 à recevoir le fragment contenant le gène HGH préparé ci-dessus. On digère ainsi le pTrpl4 avec XbaI et on intro- duit les extrémités agglutinantes obtenues par le procédé de la polymérase I de Klenow en employant dATP, dTTP, dGTP et dOCfP. Après extraction au phénol et au chloroforme et précipitation à l'éthanol, on traite l'ADN résultant avec BamHI et on isole le grand fragment de plasmide obtenu par PAGE et électroélution. Le fragment dérivé de pTrpI4 a une extrémité non agglutinante et une extrémité agglutinante, ce qui permet la recombinaison dans une orientation correcte avec le fragment contenant le gène HGH décrit ci-dessus. On combine le fragment du gène HGH et le fragment pTRP14 dXba-BamHI et on les lie ensemble dans des conditions semblables à celles qui sont décrites ci-dessus. On lie ensemble les extrémités XbaI et EcoRI introduites par liaison de 'extrémité non agglutinante pour recréer à la Fois le site XbaI et le site EcoRI: XbaI introduit ccoRI introduit Initiation du gène HSH TCTAG AATTCTAT- - CTAATTCTAT-G... + --AGATC TTAAGATAC- -A3AT TAA ATA;- XbaI EcoRI Cette construction recrée également le gène de résistance à la tétracycline. Comme le plasmide pHGH 107 exprime la résistance à la tétracycline à partir d'un promoteur situé en amont à partir du gène HGH Cle promo- teur lac), cette construction, désignée pHGHû07, permet l'expression du gène de résistance à la tétracycline sous la commande du promoteuropérateur tryptophane. Ainsi le mélange de laison est transformé en E. coli 94 et les colonies sont choisies sur des plaques LB contenant S miorogrammes/ml de tétracycline. On digère le plasmide pHGH 207 avec EcoRI et on recueille le promoteur trp contenant le fragment EcoRI par PAGE suivie par électroélution. On digère le plasmide pBRHA avec úcoRI et on traite les extrémités segmentées avec la phosphatase alcaline lbactérienne [BAP, I micro- gramme, dans 50 mM de Tris, pH 8, et 10 mM de MgCl- pendant 30 minutes à S5 C) pour retirer les groupes phos- phate sur les extrémités EcoRI saillantes. On retire l'excès de phosphatase alcaline bactérienne par extrac- tion au phénol, extraction au chloroforme et précipita- tion à l'éthanol. L'ADON linéaire obtenu, comme il est dépourvu de phosphates sur ses extrémités saillantes, n'accepte en liaison que les inserts dont les extrémités agglutinantes complémentaires sont phosphorylées mais ne se recircularise pas lui-même, ce qui permet un tri plus facile des plasmides contenant les inserts. On combine le fragment EcoRI dérivé de pHSH 207 et l'ADN linéaire obtenu à partir de pBRH1 en présence de T4 ligase comme il est dit ci-dessus et on les lie. On transforme une fraction du mélange obtenu dans úd coli souche a94 comme il est dit ci-dessus, on dépose sur un milieu LB contenant 5 microgrammes/ml de tétracycline, et on choisit 12 colonies résistantes à la tétracycline. On isole le plasmide de chaque colonie et on l'examine pour y détecter la présence dtun insert d'AOtN par analyse à lendonucléase de restriction employant EcoRI et XbaI. Un plasmide contenant l'insert est désigné plKY1. Le plasmide pHKYIO, décrit ci-dessus, est un dérivé de p.81322 qui contient un site B[111 entre le promoteur de la résistance à la tétracyclines tTo et le gène de structure. Le grand framgment dtAD,4 isolé après avoir digéré pHKYIO avec PstI et BglII contient donc une partie du gène de résistance à la'mpicilline [Ap H) et la totalité du gène de structura Tc mais est dépourvu du promoteur Ta [figure 8]. On digère le plasmide pSH6 [Goeddel et col., Nature 281, 544-548 [197933 avec EcoRI, on introduit les extrémités à un seul brin obtenues avec l'AON polymérase I, et on segmente le plasmide avec PstI. On isole le petit fragment, contenant une partie du gène ApD, un double site de liaison promoteur lac et ribosome lac, mais dépourvu d'un triplet d'initiation ATG. On peut isoler un fragment promoteur trp analogue, contenant le site de liaison ribosomique directeur trp, mais dépourvu de séquence ATG [Soeddel et sol., Nature 287, 411-416 ú1980)) à partir du pHKY1 décrit ci-dessus. Le fragment trp que l'on vient de mentionner est un analogue de l'opéron tryptophane d'E. coli dont on a enlevé ce qu'on appelle l'atténuateur trp [Miozzari et col., J. Bact. 133, 1457-1466 [1978]] pour accroître de façon modulable les niveaux d'expression. On peut faire croître le plasmide d'expression contenant le régulon trp modifié à des niveaux prédéterminés dans des milieux nutritifs contenant du tryptophane supplémentaire dans des quantités suffisantes pour réprimer le système promoteur-opérateur, puis les priver de tryptophane de manière à déréprimer le système et occasionner l'expression du produit visé. Les plasmides d'expression peuvent être assemblés par des réactions de liaison en trois parties comme le montre la figure S. On lie 15 ng Cenv. 0,05 pM] du gène FIF assemblé C504 ou 505 bp), 0,5 microgrammes [env. 0S2 pM) du grand fragment PstI--glII de pHKY40 et 0,a micro- grammes [env. 0,3 pM) du fragment promoteur approprié et on utilise le mélange pour transformer E. coli 294 [Soeddel et col., Nature 287, 411416 [19803). on prépare l'ADN du plasmide à partir de transformants individuels et on l'analyse par cartographie par restriction. La jonc- tion correcte du gène assemblé au fragment promoteur doit restaurer les séquences de reconnaissance EcoRI (lac) ou XbaI [trp). La majorité des plasmides donnmntiles schémas de digestion par enzyme de restriction attendus. On cultive des clones isolés [12 contenant le promoteur trp et 12 contenant le promoteur lac) et on prépare des extraits pour le dosage de l'interféron comme il est dit ci-dessus. Lorsqu'on les dose sur des cellules d'amnios humain CWISH] pour déterminer l'activité antivirale par le dosage de l'inhibition CPE, cinq des transformants trp sont positifs (chacun approximativement éauivalent]; onze des transformants lac donnent des activités IF équivalentes. On choisit donc un transformant de chaque série [pFIFlac9 et pFIFtrp69] aux fins d'étude ultérieure (Tableau 1. L'analyse de la séquence de l'AO;4 montre que le rattache- ment souhaité du promoteur au gène de structure de FIF s'est produit dans les deux cas. Tableau 1. Activité d'interféron dans les extraits d'E. coli _. coli K-12 Activité IF souche 294 Densité [unités/l Molecules de transformée par: cellulaire de culturel FIF par [cellules/ml] cellule pBR322 3,5 x 10 - - pFIFlacS 3,5 x 10 9,0 x l a s50 pFIFtrp6s9 35 x 108 1,8 x 107 4 500 pFIFtrp369 3,5 x O10 8,1 x 107 Z0 200 On cultive les cellules et on prépare les extraits comme il est dit ci-dessus. Qn utilise la lignée cellulaire d'amnios humain CWISH) pour le dosage d'inhibition CPE. Les activités données sont la moyenne de trois expériences indépendantes. Pour déterminer le nombre de molécules de IF par cellule on utilise une activité spécifique FIF de 4 x 108 unités/mg [Knight, supra). Les quantités d'interféron de fibroblaste produi- tes par pFIFlac9 et pFIFtrpSB sont données au Tableau 1. Le promoteur trp donne un niveau d'expression FIF mesurable supérieur à ce que donne le promoteur lac. Dans un essai pour accroître encore les niveaux d'expression FIF, on segmente pFIFtrp69 avec EcoRI et deux fragments d'EcoRI de 300 paires de bases contenant le promoteur trp [Coeddel et col., Nature 287, 411-416, T1980)). 3q Le plasmide obtenu, pFIFtrp369, contient trois promoteurs trp successifs qui se lisent en direction du 9gne FIF. La quantité de FIF synthétisée par E. coli K-12 souche 294/pFIF trp369 est 4 à 5 fois supérieure à celle produite par pFIFtrpS9 (Tableau 1]. Ceci est apparemment dû à la dérépression du promoteur trp qui se produit lorsque les niveaux de répresseur trp sont titrés par les multiples exemplaires de l'opérateur trp. Le FIF produit par E. coli K-1c souche 294/ pFIFtrp69 se comporte comme le FIF humain authentique. Comme le montre le Tableau 2, son activité antivirale est environ 30 fois plus forte sur les cellules humaines que sur les cellules de boeuf. En outre, le FIF produit par voie bactérienne est stable vis-à-vis du traitement à pH a pendant la nuit et n'est pas neutralisé par les anticorps d'interféron de leucocyte antihumain de lapin (Tableau 33. Tableau 2. Activités d'interféron mesurées sur différents types cellulaires Activité d'interféron (unités/ml) Cellules LeIF FIF Extrait d'E. coli K-12 souche 2S4/pFIFtrpê9 Amnios humain 20 000 10 000 1280 Rein de boeuf 13 000 400 40 LeIF et FIF sont des solutions standard des NIH ayant 20 000 unités/ml et 10 000 unités/ml respectivement. Les dosages sont effectués comme il est dit ci-dessus. Tableau 3. Comparaison de l'activité d'extraits d'E. coli K-12 souche 294/pFIFtrp9SS avec des interférons humains standard de leucocyte et de fibroblaste S Activité d'interféron Cunités/ml] LeIF FIF ú. coli K-12 souche 294/pFIFtrpE9 Non traité 1000 1000 1000 pH 2 1000 1000 1000 Anticorps LeIF antihumains de lapin /16 1000 1000 Les procédés expérimentaux sont décrits ci-dessus. Oosage par inhibition CPE utilisant des cellules WISH/virus Sindbis. N. Purification Le procédé de purification pour l'interféron de fibroblaste d'origine bactérienne est le suivant: 1. On met en suspension des cellules congelées dans 12 fois leur volume par rapport au noids, avec un tampon de lyse au saccharose [100 mM de Tris-HCl, % de saccharose, 0,2 M de NaCI, 50 mM d'cOTA, 0,Z mM de PMSF [ohlorure de phénylméthyl-sulfonyle3, pH 7,9] conte- nant du lysozyme à 1 mg/ml. On agite la suspension cellulaire pendant I h à 4 C et on centrifuge. L'activité d'interféron de fibroblaste reste dans le surnageant. 2. On ajoute de la polyéthylènimine [5%S, v/v) au surnageant traité aux ultrasons jusqu'à une concentration finale de 0,5% Cv/vy. On agite la solution pendant I h à 4 C et on centrifuge. L'activité dtinterFéron reste dans le surnageant. 3. On ajoute du sulfate dtammonium solide au surnageant polyéthylèneimine à une concentration Finale de saturation à 50%, on agite pendant 30 minutes à 4 C et on centrifuge. L'activité d'interféron est dans la pastille à 50%. 4. On met en suspension la pastille de sulfate d'ammonium à 50% dans la moitié du volume de la suspension de sulfate d'ammonium à 50% avec du STP (20 mM de phosphate de sodium, 0,15 M de NaCl, pH 7,4). On ajoute du polyéthy- lèneglycol 6000 Cà 50%, p/v, dans le STP) jusqu'à une concentration finale de 12,5.% Cv/v), on agite à 40C pendant 2 h et on centrifuge. L'activité d'interféron est dans la pastille. On met la pastille en suspension dans un volu- me minimal de tampon de lyse au saccharose et on clarifie par centrifugation. Ce procédé initial d'extraction aboutit à une purification de l'interféron de fibroblaste de 0,001% de la protéine totale à 0,05% de la protéine totale. On peut purifier cette matière plus avant jusqu'à l'homogénéité par les étapes de chromatographie sur colonne suivantes: 5. Chromatographie d'afinité sur Bleu Amicon B dans le tampon de lyse au saccharose. 6. Chromatographie d'échange d'anions sur Sephadex QAE dans le tampon de lyse au saccharose en l'absence de NaCl 0,2 M. 7. Chromatographie d'exclusion de taille sur Sephadex G-75 dans le tampon de lyse au saccharose. S. Chromatographie en phase liquide à haute pression en phase inverse. O. Administration parentérale On peut administrer FIF par voie parentérale à des sujets nécessitant un traitement antitumoral ou antiviral. La posologie et la fréquence d'administration peuvent reproduire celles que l'on utilise couramment dans les recherches cliniques sur les matières d'origine humaine, p. ex. environ Cl-10) x 10 unités par jour, et dans le cas des matières de pureté supérieure à 1%, éventuel- lement jusqu'à, p. ex., 15 x107 unités par jour. Les posologies de FIF obtenus par voie bactérienne pourraient être augmentées de façon significative pour obtenir un effet plus fort étant donné l'absence essentielle de protéines humaines autres que FIF, protéines qui dans les matières dérivées de fibroblastes peuvent jouer le rôle de pyrogènes, présentant des effets nocifs, comme un malaise, une élévation iX de température, etc. A titre d'exemple d'une forme posologique appro- priée au FIF bactérien pratiquement homogène sous forme parentérale, on peut dissoudre 3 mg de FIF d'activité spécifique, p. ex., de 2 x 10 U/mg dans Z5 ml de sérum- albumine humaine à 5%, on fait passer la solution à travers un filtre bactériologique et on subdivise aseptiquement la solution filtrée en 100 flacons, contenant chacun s x 106 unités d'interféron pur convenant à l'administra- tion parentérale. Il est préférable de garder les flacons à froid C-200C3 avant l'emploi. Les composés de l'invention peuvent être formulés selon des procédés connus pour préparer des compositions pharmaceutiquement utiles, par lesquels on combine le pré- sent polypeptide sous forme de mélange avec un support pharmaceutiquement acceptable. Les véhicules appropriés et leur formulation sont décrits dans Remington Pharmaceutical Sciences par E.W. Martin, cité ici à titre de référence. Ces compositions contiennent une quantité efficace de la présente protéine d'interféron avec une quantité efficace de véhicule afin de préparer des compositions pharmaceuti- quement acceptables appropriées à l'administration efficace à l'hôte. Le mode d'administration préféré est parentéral. REV31DICATI0NS 1. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés d'un interFéron de Fibroblaste humain mur, produit par un moyen microbien et ne s'accompagnant d'aucune séquence.ou partie de préséquence correspondante. 2. Polypeptide selon la revendication 1, ne s'accompagnant pas d'une glysolyation associée. 3. Polypeptide selon la revendication 1, contenant éventuel- lement 1' amide aminé méthionine comme acide aminé venant ordinairement en premier dudit interFéron. 4. Polypeptide selon la revendication 1, contenant éventuel- lement un conjugué clivable ou une protéine signal micro- bienne attachées) à l'extrémité i de l'acide aminé.venant ordinairement en premier dudit interFéron. 5. Séquence d'ADN comprenant une séquence donnant le code du polypeptide selon les revendications 1, 3 ou 4. 6. Séquence d'AUN selon la revendication 5 liée de Fagon opératoire avec une séquence d'ADN capable de réaliser l'expression microbienne d'un polypeptide selon les revendications 1, 3 ou 4. 7. Véhicule d'expression microbienne réplicable capable, dans un micro-organisme transFormant, d'exprimer un poly- peptide selon les revendications 1, 3 ou 4. 8. Véhicule d'expression microbienne selon la revendication 7 qui est un plasmide. 9. Plasmide choisi dans le groupe constitué par pFIFlac9s, pFIFtrpS9 et pFIFtrp 69. 10. Micro-organisme transformé par un véhicule d'expres- sion selon l'une quelconque des revendications 7-9. 11. Micro-organisme selon la revendication 10, obtenu en transformant une souche d'E. colio 12. Micro-organisme transForme selon la revendication 11 o ladite souche d'E. coli est E. coli K-12 souche 294. 13. Micro-oroanisme transformé selon la revendication 10 obtenu en transformant Bacillus subtilis. 14. Micro-organisme transformé selon la revendication 10 obtenu en transformant Saccharomyces cerevisiae. 15. Composition de matière comprenant une Fraction thérapeu- Is tiquement active d'un polypeptide constitué essentiellement de la séquence d'acides aminés d'un interféron de Fibro- blaste humain mûr, le reste de ladite composition comprenant une protéine microbienne soluble à partir de laquelle on peut purifier ledit polypeptide à un degré suffisant pour une application thérapeutique eFFicace. 1C. Extrait bactérien comprenant un.polypeptide pur à plus de 95% constitué essentiellement de la séquence d'acides aminés d'un interféron de fibroblaste mûr selon l'une quelconque des revendications 1-4. 17. Composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un interféron de fibroblaste humain mûr selon les revendications 193 ou 4, appropriée à l'administration pharmaceutique. 18. Composition selon la revendication 17 appropriée à 1tadministration parentérale. 19. Culture de cellules microbiennes capable de produire un interféron de Fibroblaste humain sous Forme mûre. 20. Application d'un interféron de fibroblaste humain mûr selon les revendications 1, 3 ou 4, au traitement anti- tumoral ou antiviral ou à la préparation de compositions pharmaceutiques utiles pour un tel traitement. 21. Procédé de production d'un polypeptide revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1-4, procédé qui implique de Faire croltre un micro-organisme, transFormé avec un véhicule d'expression microbienne réplicable capable d'exprimer ledit polypeptide, et de lui Faire exprimer ledit polypeptide et de le recueillir. 22. Procédé de production de micro-organismes capables d'exprimer un polypeptide revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1-4, procédé qui implique de transformer un micro-organisme avec un véhicule d'expression microbienne réplicable capable d'exprimer ledit polypeptide et de cultiver le micro-organisme transformé. 23. Procédé de production d'un véhicule d'expression micro- bienne réplicable capable dans un micro-organisme transFor- mant d'exprimer un polypeptide tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1-4, procédé qui implique de construire une première séquence d'AON donnant le code dudit polypeptide et de lier de Façon opératoire I. ladite première séquence d'ADN avec une seconde séquence d'AD: capable de réaliser l'expression microbienne de ladite première séquence d'ADN. 24. Procédé de la revendication 23 o ladite seconde séquence d'ADiJcomprend un promoteur-opérateur trp multiple.