Brevet FR2497232A1 — publié le 19820702

La présente invention concerne un procédé pour produire de l'acide L-glutamique par fermentation. L'acide L-glutamique dont le sel de monosodium a été utilisé comme assaisonnement a été produit selon un procédé de fermen- tation dans lequel on utilise des souches sauvages ou des mutants artificiels de bactéries productrices d'acide L-glutamique, en parti- culier du genre Brevibacterium ou Corynebacterium. On connaît à ce jour divers mutants artificiels du genre Brevibacterium ou Corynebacterium produisant de l'acide L-glutamique. Des exemples de tels mutants artificiels sont les mutants nécessitant de la L-arginine, de la L-histidine, de la pyrimidine, de l'hypoxanthine, du glycérol, un composé chimique ayant une liaison disulfure ou un acide gras insaturé tel que l'acide oléique (brevets japonais publiés examinés n 507/1967, 508/1967, 509/1967, 27 390/1970, 27 391/1970, 19 632/1975, 33 997/1976, 2 998/1977, 6 233/1978, 6 234/1978 et 8798/1978), les mutants résistant au ehloramphénicol, à la strepto- mycine, à la chlortétracycline, à la S-(amino-2 éthyl)cyst4ine, à l'acide monofluoroacétique, à l'acide fluorocitrique, à l'acide céto- malonique, à l'acide a-amino g-hydroxyvalérique, à l'hydroxamate de DLthréonine, à l'acide amino-2 phospho-3 propionique, à l'acide amino-5 lévulinique, à un analogue de l'acide glutamique, à la benzo- pyrone, à la naphtoquinone, à l'acide pyridinedicarboxylique-2,6 ou aux inhibiteurs du système respiratoire tels que l'acide malonique, NaN3, KCN, l'arsénîte de sodium, le dinitro-2,4 phénol, l'hydroxyl- amine, et la guanidine, (demandes de brevets japonais publiées non examinées na 4 398/1966, 126 877/1975, 38 088/1977, 89 085/1979, 21 763/1980, 21 764/1980, 124 492/1980, 1889/1981, 35 981/1981, 39 778/1981 et 48 890/1981), les mutants sensibles à l'acide N-palmi- toylglutamique, au lysozyme ou à une température supérieure à 34 C (demandes de brevet japonais publiées non examinées na 64 486/1975, 32 193/1978, 66 687/1977, 122 794/1979 et 114 293/1980)et un mutant ayant une activité réduite d'acide pyruvique-déshydrogénase (demande de brevet japonais publiée non examinée no 21 762/1980). La demanderesse a découvert que l'on peut accroître la capacité de production de l'acide L-glutamique lorsqu'on confère une résistance à la Décoyinine ou la Tubercidine, à des micro-organismes connus producteurs d'acide L-glutamique. Les micro-organismes que l'on utilise selon l'invention sont des mutants qui appartiennent aux genres Brevibacterium ou Coryne- bacterium, résistent à la Décoyinine ou à la Tubercidine et sont capables de produire de l'acide L-glutamique. Des exemples de mutants de l invention sont: Brevibacterium lactoferminentumn AJ 11638 FERM-P 5812 FERM BP-74 (Décr) Brevibacterium lactofermentum AJ 11637 FERM-P 5811 FERM BP-73 (TuDr) Corynebacterium glutamicum AJ 11645 FEPM-P-5819 FERM BP-75 (Décr) Décr: résistance à la Décoyinine Tubr: résistance à la Tubercidine Les mutants identifies cidessus par les références FEReI-BP ont été à l'origine déposés avec les références FERM-P le 22 décembre 1980 à l'Institut de Recherches sur les Fermentations, Agence des Sciences et Technologies Industrielles, Ministère du Commerce International et de l'Industrie (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaragi-Ken 305, Japon et ces dépôts ont été transformés en un dépôt selon le traité de Budapest du 9 décembre 1981, le FRI ayant acquis le statut d'autorité dépositaire internationale le ler mai 1981. Les mutants indiqués ci-dessus ont été induits à partir des souches parentes du genre Brevibacterium ou Corynebacterium selon un procédé classique. Le premier stade de l'induction consiste à faire muter la souche parente avec un mutagène chimique approprié tel que la N-méthyl N'-nitro N-nitrosoguanidine (désignée ci-après par l'abré- viation NG) et l'acide nitreux ou par irradiation par ia lumière ultraviolette. Le second stade consiste à sélectionner un mutant résis- tant aux antibiotiques par prélèvement des colonies cultivées sur des boites de gélose nutritives contenant une quantité des antibiotiques inhibant le développement de la souche parente. Enfin on évalue la capacité de production de l'acide L-glutamique des mutants selon une méthode classique. La Décoyinine (Angustzmycine) et la Tubercidine que l'on utilise dans l'invention font partie des antibiotiques apparentés à la purine et à la pyrimidine. Les mutants de l'invention résistant à la Décoyinine et à la Tubercidine résistent pratiquement aux autres antibiotiques apparentés à la purine et à la pyrimidine tels que la Psicofuranine (Angustmycine C), la Formycine, la Toyocamycine et la Sangivamycine, et les mutants de l'invention peuvent également être induits par emploi de ces antibiotiques au lieu de la Docoyinine, de la Tuberci- dine et de la Cordicépine. Comme souches parentes, on utilise une souche sauvage quelconque qui est capable de produire de l'acide L-glutamique, du genre Brevibacterium ou Corynebacterium. Les souches sauvages préfé- rées sont les bactéries corynéformes productrices d'acide glutamique dont on peut citer comme exemples: Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 Brevibacterium flavum ATCC 14 067 Brevibacterium divaricatum ATCC 14 020 Brevibacterium saccharoliticum ATCC 14 066 Corynebacterium glutamicum ATCC 13 032 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13 870 Comme autre type de souches parentes, on utilise de préférence des mutants du genre Brevibacterium ou Corynebacterium induits A partir de souches sauvages comme précédemment indiqué et ayant des caractéristiques biologiques connues pour etre efficaces pour la production de l'acide L-glutamique, telles que la résistance a l'acide fluoromalonique, à l'acide fluorocitrique, à l'acide céto- malonique et à l'acide pyridinedicarboxylique-2,6 et la sensibilité au lysozyme et au glutamate de N-palmitoyle. Ces caractéristiques utiles pour la production d'acide L-glutamique peuvent être conférées avant ou après que l'on ait conféré la résistance aux antibiotiques aux souches sauvages. Le procédé selon lequel on induit les mutants de l'inven- tion et le degré de résistance aux antibiotiques figurent dans les expériences 1 et 2 suivantes. Experience 1 On recueille par grattage Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 cultivé sur une gélose nutritive inclinée et on le met en suspension dans de l'eau stérilisée contenant 250/ug/ml de NG et on laisse reposer la suspension à 300 C pendant 30 min. On lave les cellules microbiennes ainsi traitées avec une solution de tampon phosphate puis on ensemence sur des bottes de gélose au milieu GM ayant la composition indiquée dans le tableau 1 et contenant de plus 200 mg/ml de Décoyinine. TABLEAU 1 Composition du milieu GM Composants Concentration Composants Concentration Glucose 0,5 g/dl Ca C22 0,1 mg/dl Sulfate d'ammonium 015 " Mn C2)4 H20 0,36 " Urée 5 i Urée 0,15" Na2B407) 10 H20 0,44 " K2H P04 0 1 Cu SO4 5 H20 1195 ' I KH2 PO4 0,3 " Zn S04> 7 H20 44 " Mg SO04; 7 H20 0 0l " Biotine 3 ps/ml Fe Ct3 6 H20 4;85 Thiamine, HCL 10 (NH4) Mo7024 4 H20 0; 18 " On incube ensuite les bottes è 30C pendant 2 à 4 jours Jusqu'à ce que des colonies apparaissent. On prélève les colonies des mutants résistant & la Décoyinine et on en évalue la capacité de production de l'acide L-glutamique selon une méthode classique. On constate que l'on obtient avec une fréquence élevée des mutants ayant une capacité de production de l'acide L-glutamique supérieure à celle de la souche parente. Parmi ces mutants on choisit B. lactofermentum AJ 11 638 FERM BP-74qui produit plus d'acide L-glutamique que les autres mutants. On obtient de façon semblable les mutants de l'invention résistant à la Tubercidine. Expérience 2 On introduit dans des tubes à essai de petite taille du milieu GM aqueux du tableau L contenant de plus là 3 mg/ml dntibiot!que. On lave chaque souche étudiée avec le milieu GM et on la met en suspension dans du milieu GM pour préparer une suspension de cellules bactériennes ayant une densité optique de 0,1 à 562 nm après dilution au 1/26. On transfère ensuite les suspensions cellu- laires (0,1 ml) dans chaque portion de milieu GM placée dans un tube à essai. On cultive à 30 C pendant 24 heures en agitant. Après culture, on détermine le degré de développement de chaque souche par mesure de la densité optique à 562 nm du bouillon de culture dilué au 1/26; les résultats obtenus figurent dans le tableau 2. T A B L E A U 2 Degré de résistance aux antibiotiques. Anti- S O U C H E N bioti- Cone. ques mg/rml ATCC 12869 AJ 11637 AJ 11638 ATCC 13032 AJ 11645 0 100 100 -For. 1 63 101 2 23 110 3 5 95 0 100 100 1 95 110 Cord. 2 87 101 3 77 98 0 100 100 Tub. 1 52 112 2 32 120 3 0 105 0 100 100 100 100 1 30 109 61 115 Déc. 2 8 103 5 102 3 0 82 0 89 Dec._ _I O 100 100 100 100 1 92 105 99 107 Pei. 2 32 110 23 95 3 10 84 0 78 ,, ,,,, _, _,__ I Dans le tableau 2, le degré de résistance aux anti- biotiques est représenté par la valeur relative de la croissance par rapport au témoin. On cultive les mutants en aérobiose dans un milieu de culture classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote, et des ions minéraux ainsi que des substances nutritives secondaires lorsqu'elles sont nécessaires. Comme sources de carbone, on peut utiliser de préférence des saccharides tels que le glucose, le saccharose, la mélasse et l'hydrolysat d'amidon, des acides organiques tels que l'acide acétique et l'acide propionique et un alcool tel que l'éthanol. Les sources d'azote sont par exemple le sulfate d'ammonium, l'ammoniac gazeux et l'urée. S'il est nécessaire, on ajoute au milieu de culture les ions minéraux K,Na+, Ca, Fe Mn, Mg, Zn, S04, Ci et P04 Lorsqu'on utilise une source de carbone ne contenant pas de biotine, telle que l'hydrolysat d'amidon, on ajoute de la biotine au milieu de culture et on doit limiter sa concentration dans le milieu de culture pour qu'elle soit inférieure à la quantité convenant à la croissance du mutant. D'autre part, lorsqu'on utilise une source brute de carbone telle que la mélasse de canne à sucre, contenant une quantité de biotine supérieure à la quantité appropriée à la croissance du mutant, on doit ajouter au milieu un agent anti-biotine tel que la pénicilline, un acide gras supérieur ou un agent tensio-actif. On effectue la culture en conditions aérobies pendant à 80 h à une température comprise entre 30 et 380C et on ajuste le pH du milieu de culture entre 6,0 et 8,0 par addition d'un acide organique ou minéral ou d'un alcali. On utilise de préférence à cet effet l'urée, le carbo- nate de calcium ou l'ammoniac gazeux. On peut récupérer l'acide L-glutamique accumulé dans le bouillon de culture selon un procédé de récupération totalement classique. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE 1 On introduit dans des ballons de 500 ml des portions de ml d'un milieu de culture aqueux ayant la composition indiquée dans le tableau 3 et on chauffe à 115'C pendant 10 min pour stériliser. TABLEAU 3 Composition du milieu de culture On ensemence le milieu avec chacune des souches d'essai figurant dans le tableau 4, cultivées sur gélose nutritive et on cultive a 31,50C en agitant. Pendant la culture, on introduit dans le milieu une petite quantité d'une solution aqueuse contenant 450 mg/ml d'urée pour maintenir le pH du milieu de culture dans la gamme de 6,5 à 8,0. Après 30 h de culture, on détermine la quantité d'acide L-glutamique accumulée dans le bouillon de culture; les résultats obtenus figurent dans le tableau 4. TABLEAU 4 Souche n Acide L-glutamique Rendement (%) accumulé (g!l) ATCC 13869 16,3 45,3 | AJ 11637 16,7 46,4 AJ 11638 16,9 46,9 1 ATCC 13032 15,5 43,1 l AJ 11645 17,8 49,4 _.,________________________._______...._____ _ i EXEMPLE 2 On prépare un milieu de culture contenant, par milli- litre, 100 mg de sucre (mélasse de canne à sucre), 1 mg de phosphate monopotassique, 1 /ug de chlorhydrate de thiamine et 1 mg de sulfate de magnésium heptahydraté ayant un pH de 7,0. On introduit des portions de 20 ml de milieu dans des ballons de 500 ml et on chauffe pour stériliser. On ensemence ensuite avec chacune des souches d'essai indiquées dans le tableau 3 ci-dessus et on cultive à 31,50C en agitant. Pendant la culture, on introduit dans le milieu une petite quantité d'une solution aqueuse d'urée pour maintenir le pHi du milieu dans la gamme de 6,5 à 8,0 et on ajoute au milieu du mono- palmitate de polyéthylènesorbitanne lorsque la densité optique d'ure dilution au 1/26 du milieu de culture atteint 0,300. Apres 36 h de culture, on détermine la quantité d'acide L-glutamique accumulée dans le bouillon de culture; les résultats figurent dans le tableau 5. TABLEAU 5 Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. - Souche ne Acide L-glutamique Rendement (%) accumulé (g/l) ATCC 13869 49,3 49,3 AJ 11637 50,1 50,1 AJ 11638 49,5 49,5 ATCC 13032 47,2 47,2 AJ 11645 49,3 49,3 ______________________________ ____________________________________ I _________________________1, R E V E N D I C A T IONS 1. Procédé pour produire de l'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver en aérobiose dans un milieu de culture un mutant du genre Brevibacterium ou Corynebacterium résistant à la Décoyinine ou à la Tubercidine et capable de produire de l'acide Lglutamique et à récupérer l'acide L-glutamique accumulé dans le milieu de culture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant appartient aux espèces Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum ou Corynebacterium acetoacidophilum.