Brevet FR2495161A1 — publié le 19820604

La présente invention concerne un procédé de sépa- ration de vitamine B12 à l'état pur à partir-d'un liquide con- tenant cette vitamine avec des impuretés, par- exemple un liquide résultant d'une opération de fermentation ou d'une extraction de cellules. Elle concerne plus précisément un procédéde sépa- ration de la vitamine B12 permettant de séparer et de récupé- rer cette vitamine à l'état de haute pureté avec un rendement et un degré de récupération élevés, par exemple de plus de 98% environ et pouvant atteindre parfois 100%, par des opérations faciles d'adsorption et d'élution et au moyen d'un appareil simple, sans aucune autre opération telle qu'une purification supplémentaire ou une purification préalable, tout en conser- vant de bonnes vitesses d'adsorption et d'élution et une bonne durée de service de l'adsorbant. Plus précisément, cette invention a pour objet un procédé de séparation de la vitamine B12 dans un état pur, se- lon lequel on met un liquide contenant cette vitamine avec des impuretés en contact avec une résine choisie parmi (A) un co- polymère divinyl benzène/styrène à pores ayant un diamètre modè.le au moins égal à 200A environ et un volume total de pores dépassant 0,6 ml/g, et (B) un copolymère divinyl benzène/ styrène/ester alkylique insaturé d'un acide polycarboxylique aromatique de formule & COOR)n, R en représentant un alkyle insaturé en C3-C10 avec une double liaison carbonecarbone et n le nombre 2 ou 3, ce copolymère (B) ayant une surface spé- cifique d'au moins 700 m2/g-environ, pour faire adsorber la vitamine B12 sur la résine, puis on élue cette vitamine avec un éluant et on recueille l'éluat actif. On sait que l'on peut séparer la vitamine B12 d'un liquide la contenant avec des impuretés par une opération d' adsorption-élution avec des adsorbants tels que du charbon actif, de l'alumine activée, le produit Sephadex et des rési- nes d'échange d'ions. Cette méthode s'est toutefois révélée insatisfaisante dans l'industrie en raison de la faible pro- portion de vitamine B12 adsorbée par rapport à la quantité de l'adsorbant, et du peu de sélectivité des adsorbants. De plus, le degré de pureté de la vitamine dans la fraction active reste bas, et même avec un moyen de purification supplémentaire, il est encore difficile de séparer la vitamine B12 avec une pureté satisfaisante. En outre, une méthode de purification qui nécessite la combinaison de plusieurs opérations a le dé- faut d'augmenter les pertes de vitamine au cours de la puri- fication, la résistance physique des adsorbants employés dans une telle méthode est faible également, et à la suite de plu- sieurs opérations répétées adsorption-élution, les adsorbants peuvent se colmater et le débit voulu ne peut être maintenu. En-vue de remédier à ces inconvénients il a été appliqué des méthodes pour purifier la vitamine B12 brute avec des résines du groupe Amberlite. XAD (résines styràne/vinylben- zène fabriquées par Rohm & Haas Co.), mais les résines de ce genre n'ont pas donné satisfaction non plus. Les recherches entreprises par la présente demande- resse ont montré que les résines de la série Amberlite XAD ont un diamètre de pores mDdè le d'endraa 50 à lOOA et un volume to- tal de pores de 0,3 à 0,6 ml/g, mais que leur capacité d'adsor- ption pour la vitamine B12 est insuffisante et que ce défaut est plus prononcé dans le cas de liquides contenant cette vi- tamine avec des proportions d'impuretés relativement importan- - tes, par exemple un liquide résultant d'une fermentation ou d'une extraction de cellules, leur pouvoir adsorbant étant con- sidérablement réduit pour ces liquides contenant de la vitami- ne B12 brute; et aussi que ces résines sont des résines non ioniques à haute porosité, leur surface spécifique étant d'en- viron 700 m2/g, mais comme leur surface adsorbante est formée de molécules hydrophobes ou non polaires, ce n'est sans doute que la partie hydrophobe de la vitamine B12, comportant dans sa structure moléculaire à la fois une partie hydrophobe et une partie hydrophile, qui entraîne l'adsorption, et l'inconvénient indiqué d'un pouvoir adsorbant réduit est fondamentalement dif- ficile à supprimer. La présente demanderesse a effectué des études en vue de pallier ces problèmes techniques liés à la séparation de vitamine B 12 purifiée par une technique d'adsorption-élution, d'un liquide contenant cette vitamine avec des impuretés, et de trouver un procédé permettant de séparer une v. tamine B12 à une haute pureté avec un rendement élevé et un avantage industriel, d'un liquide contenant de la vitamine B12 brute. Ces études ont conduit à la découverte qu'une résine choisie parmi (A) un copolymère divinylbenzène/styrzne ayant un diamètre de pores modèle d'au mevins 200A et un volume total de pores dépassant 0,6 ml/g, et (B) un copolymère divinylben- zène/styrène/ester alkylique insaturé d'un acide polycarboxy- lique aromatique de formule _ (COOR)n, R représentant un alkyle insaturé en C3-C10 avec une double liaison carbone-car- bone et n le nombre 2 ou 3, la résine (B) ayant une surface spécifique d'au moins 700 m /g environ, a une excellente sélec- tivité d'adsorption pour séparer une grande quantité de vita- mine Bu d'un liquide contenant cette vitamine avec des impure- tés, et que la vitamine B12 ainsi purifiée peut être séparée avec un degré de récupération élevé, dépassant 98% et pouvant même atteindre 100%, par des opérations faciles d'adsorption- élution et au moyen d'un appareil simple, sans aucun autre moyen de purification supplémentaire et/ou de purification préa- lable. On a aussi trouvé qu'avec les adsorbants spécifiés selon cette invention, on pouvait avoir des débits satisfai- sants pour l'adsorption et l'élution dans le traitement d'un liquide contenant de la vitamine B12 avec des impuretés, et que dans des opérations répétées on pouvait éviterle colmatage de la résine, et que celle-ci, ayant ainsi une longue durée de service, pouvait avantageusement conduire à l'amélioration dans l'industrie de la purification et de la séparation de la vïita- mine B12 d'un liquide contenant cette vitamine avec des impu- retés. Il a de plus été trouvé, conformément à la présente invention, que l'on peut séparer la vitamine B12 avec une hau- te pureté sans aucun moyen de purification supplémentaire et/ ou de purification préliminaire, avec un degré de récupération élevé dépassant 98% et atteignant parfois 100%, alors que ce degré de récupération n'est que de 75 à 90 % pour des récupé- rations connues avec des solvants organiques comme le phénol, ou de 63 à 95 % par une opération connue d'adsorption et d'élu- tion avec des adsorbants usuels tels que charbon actif, alumine activée ou résine échangeuse d'ions, et de plus que la résine qui est employée selon cette invention conserve cet excellent pouvoir de purification et de séparation même au cours d'une centaine de telles opérations répétées. La présente invention apporte ainsi un procédé per- fectionné pour séparer de la vitamine B12 à l'état pur. La résine (A) cidessus mentionnée est,comme on l'a dit,un copolymère divinylbenzène/styrène ayant un diamètre de o pores mndèe d'au moins 200A environ et un volume total de pores supérieur à 0,6 ml/g. Cette résine adsorbante (A), qui satis- fait à ces conditions de diamètre et de volume total des pores, a une structure macroréticulaire homogène et elle est très po- reuse, et elle adsorbe à peu près deux à quatre fois plus de vitamine B12 que les résines adsorbantes non ioniques précédem- ment utilisées comme l'Amberlite XAD-2. o Le diamètre des pores est d'au moins 200A environ, o de préférence d'au moins 250A, par exemple de l'ordre de 200 à O O 1200A et de préférence de 250 à 1200A, tandis que le volume total des pores dépasse la gamme de 0,6 à 1,2 ml/g environ, de préférence de 0,68 à 1,2 ml/g. En plus des paramètres ci-dessus, il est préférable que dans la résine cidessus, les pores ayant un diamètre d'au O moins 200A environ représentent un volume d'au moins 0,1 ml/g,- de préférence de 0,2 à 1,0 ml/g. La résine (B) qui est employée dans le présent pro- cédé est un copolymère divinylbenzène/styrène/ester alkylique insaturé d'un acide polycarboxylique aromatique de formule ci- dessus, et elle a une surface spécifique d'au moins 700 m2/g environ. Alors que les résines connues du type Amberlite XAD n'ont pas de surface polaire, la résine (B) a une surface mo- dérément polaire de -à l'ester alkylique de l'acide polycarbo- xylique aromatique. Cette résine (B) adsorbe environ 4 à 8 fois plus de vitamine B12 que les résines habituelles connues, et sa surface spécifique est d'au moins 700 m /g environ, de préfée- rence d'au moins 800 m2/g environ, par exemple de l'ordre de 700 à 1200 m /g et de préférence de l'ordre de 800 à 1200 m2/g. La forme des résines (A) et (B) peut être librement choisie, et elles peuvent être par exemple à l'état de poudres, de granules, de pastilles, etc... Le diamètre et le volume total des pores de la résine (A) et la surface spécifique de la résine (B) sont mesurés par les méthodes suivantes. Les résines (A) et (B) sont placées dans une colonne de 8 mm de diamètre et 500 mm de longueur, dans laquelle on fait passer des solutions chloroformiques de 10 sortes de po- lystyrène à longueurs de chaines moléculaires connues et une solution chloroformique de styrène, respectivement, et on dé- termine le volume de chaque polystyrène élué, en ml, volume désigné par Vi. 4 0 Chaque polystyrène a une longueur de chaîne de 10 A à 102 A et la distribution des longueurs de chaînes est très étroite. o D'après la longueur de chaine (A) et le volume élué Vi (ml) et le poids P (g) d'une résine placée dans une colonne, on calcule par les relations suivantes le volume total des po- res (V ml/g), le volume de pores (V200 ml/g) des pores ayant un diamètre d'au moins 200A environ, ainsi que la surface spé- cifique (S m2/g): (1) Vi (ml/g) = (Vm - Vn)/P (2) Si (m /g) = 8.Vi.104/(m + n) i = 8000 (3) V (ml/g) = E Vi i = 15 i = 8000 (4) V200 (ml/g) = E Vi i = 200 i = 8000 (5) S (m2/g) = E Si i = 15 O O Vi: volume de pores de MA à nA on Vm: volume de polystyrène de mA élué O Vn: volume de polystyrène de nA élué O O Si: surface spécifique de mA à nA m et n: longueur de chaîne moléculaire Le diamètre de pores modèle est défini par le volume de (m + n)/2 à une valeur maximale de Vi sur un histogramme établi par report de Vi en ordonnées et de (. + n)/2 en abzis- ses. Les résines (A) et (B) peuvent être obtenues par Ces techniques connues de polymérisation en suspension dans m. aqueux, mais la résine (A) se trouve sur le marché sous les noms de marque Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 et HP--0 (pro- duits de Mitsubishi Chemical Co., Ltd.). La résine (A) peut dériver du divinylbenzène et du styrène ou de leurs dérivés fonctionnels, et la résine (B) du divinyibenzène, du styrène ou de leurs dérivés fonctionnels, et de l'ester alkylique insaturé d'un acide polycarboxylique aromatique. Des exemples de dérivés fonctionnels du styrène comprennent les dérivés de substitution par des alkyles en C1-C6, tels que le méthyl-styrène,l'éthylstyrène, le diméthyl- styrène et le propylstyrène, tandis que des exemples de l'es- ter alkylique insaturé d'un acide polycarboxylique aromatique sont des diesters ou des triesters alcenyliques en C3-C10 com- me le 1,2,4-benzène-tricarboxylate de triisopropényle et le téréphtalate de diisopropényle. Pour former la résine (B) on peut prendre un ou plusieurs monomères styreniques parmi le styrène et ses dérivés fonctionnels, et un ou plusieurs esters alkyliques insaturés d'acides polycarboxyliques aromatiques. Dans les résines (A) et (B), la teneur en monomère styrénique ou en ester alkylique insaturé peut être convenable- ment choisie et modifiée, mais la proportion du monomère styré- nique sera de préférence d'environ 30 à 80 % en poids, en par- ticulier de l'ordre de 45 à 70 %, de la quantité totale du monomère styrénique et du divinylbenzène, et la proportion de l'ester alkylique insaturé pourra s'élever de préférence jus- qu'à environ 30 % en poids, mieux encore elle pourra être d'en- viron 0,1 à 30 % et en particulier de l'ordre de 1 à 10 %, par rapport à la quantité totale du divinylbenzène, du monomère styrénique et de l'ester alkylique. Le divinylbenzène que l'on trouve dans le commerce contient en général environ 40 à 70 % en poids de m- et de p- divinylbenzène et environ 30 à 60 % de o-, m- et p-éthylsty- dae et ce divinylbenzène du commerce peut être aussi utilisé tel quel comme divinylbenzène et monomère styrénique ci-dessus indiqués. La réaction de copolymérisation peut se faire suivant des techniques connues. On peut par exemple fabriquer la résine (A) ou (B) en copolymérisant en suspension le divinylbenzène avec le styrène ou son dérivé fonctionnel, avec en plus l'ester alkylique insaturé d'acide polycarboxylique dans le cas de la résine (B), en présence d'un inducteur de polymérisation. On peut choisir des inducteurs de polymérisation ra- dicalaires connus qui sont solubles dans les monomères, et dont des exemples comprennent le peroxyde de benzoyle,le peroxye lauroy le peracétate d tertbtyle, le perpivalate de tert-butyle et l'azo-bisisobutyronitrile, et la proportion de l'inducteur peut être par exemple d'environ 0,1 à 10 % en poids, de préférence d'environ 0,5 à 3 %. On ajoute de préférence un agent dispersant pour la copolymérisation en suspension aqueuse afin d'obtenir un copo- lymère granulaire. Des exemples de tels dispersants compren- nent des sels de métaux peu solubles d'acides minéraux tels que le sulfate de baryum, le carbonate de calcium et le phosphate tricalcique; des argiles peu solubles comme la bentonite et l'argile; ainsi que des matières polymères hydrosolubles, na- turelles ou synthétiques, telles que l'amidon, la méthyl-cellu- lose, la gélatine, l'alcool polyvinylique, un alcool polyviny- lique partiellement saponifié et des sels d'acide polyacrylique comme le polyacrylate de sodium ou de potassium. La proportion de l'agent dispersant peut être par exemple d'environ 0,1 à 10% en poids, de préférence de l'ordre de 0,5 à 7 %, du poids total du mélange des monomères. On peut aussi ajouter un stabilisant de la dispersion pour la copolymérisation en suspension aqueuse, par exemple le dodécylbenzènesulfonate de sodium ou autres agents surfactifs divers, mais,avec ou sans stabilisant, la présence de l'agent dispersant empêche l'accroissement de dimension d'un gel causé par une coalescence du solvant et des monomères,et elle per- met d'obtenir facilement un copolymère divinylbenzène/styrène ou divinylbenzène/styrène/ester alkylique insaturé en particules de dimension régulière, et de plus, la distribution des dimen- sions des particules de la résine formée s'en trouve meilleure et l'on peut obtenir des particules de résine (A) ou de résine (B) qui ont un excellent pouvoir d'adsorption pour la vitamine B12 Si l'on veut, on peut aussi utiliser un mélange de solvants, qui deviennent de bons solvants pour au moins le di- vinylbenzène ou l'ester alkylique insaturé d'acide polycarbo- xylique aromatique,ou pour les deux. Des exemples de tels bons solvants sont des dérivés de substitution alkylique du benzène comme le diéthylbenzène, letriméthylbenzène et le méthylisopropylbenzène pour le divi- nylbenzène; et des alools aliphatiques tels que l'alcool tert- isoamylique et l'alcool tert-butylique pour les estersalkyliques insaturés d'acides polycarboxyliques aromatiques. Si par exemple on prend comme solvant un mélange d'alcool tert-isoamylique et de diéthylbenzéne, il agit en bon solvant pour l'un des monomè- res, mais en solvant médiocre pour l'autre, et il sert donc à communiquer une structure macroréticulaire égale aux particules de la résine formée et à accroître la porosité de la totalité' de la résine. Ceci est efficace pour réduire le degré de gon- flement des résines adsorbantes qui sont employées dans cette invention, et confère à ces résines un meilleur pouvoir de sé- paration de la vitamine B12. De préférence, la copolymérisation en suspension aqueuse est effectuée de lamanière habituelle dans une atmos- phère de gaz inerte tel que l'azote, à une température et pen- dant une durée convenables qui dépendent du type de l'inducteur de polymérisation et autres facteurs, par exemple à une tempé- rature d'environ 0 à 110 C, de préférence d'environ 50 à 100 C, et pendant un temps de l'ordre de 8 à 16 heures, à titre d'exem- ples. Dans le présent procédé, on met en contact avec la résine (A) et/ou avec la résine (B) un liquide contenant de la vitamine B12 avec des impuretés, pour que la vitamine B12 soit a corbée sur la résine, puis la vitamine est éluée avec un élu- ant et l'éluat actif est recueilli. On peut ainsi séparer de la vitamine B12 très pure avec un haut rendement par des opérations Z495161 faciles d'adsorution et d'élution et avec un appareil simple,sans aucun moyen de purification supplémentaire et/ou de purific-- tion préalable, et tout en maintenant des débits satisfaisants dans l'adsorption et l'élution et une excellente durée de ser- vice de la résine adsorbante. Le liquide contenant la vitamine B12 avec des impure- tés, à traiter par a sorption et élution par le présent procédé, est par exemple un liquide contenant de la vitamine B12 brute, résultant de l'extraction de la vitamine B12 accumulée dans un bouillon de culture ou de cellules microbiennes obtenues par culture dans un milieu nutritif d'un micro-organisme connu pro- duisant la vitamine B12, avec de l'eau ou un alcool tel que le méthanol, éthanol ou I'isopropanol, ou bien un liquide contenant de la vitamine B12 brute obtenu par destruction, par broyage ou un autre moyen mécanique ou par les ultrasons, des membranes cel- lulaires des cellules microbiennes cultivées contenant la vita- mine B12, ou encore un liquide contenant de la vitamine B12 brute obtenu par extraction avec de l'eau ou un alcool d'un li- quide tel que ci-dessus résultant de la destruction des membra- nes cellulaires. La production de vitamine B12 par une méthode de fer- mentation ainsi que les micro-organismes produisant cette vita- mine sont connus et peuvent être utilisés pour obtenir les li- quides à traiter par le présent procédé, contenant de la vita- mine B12 brute. Des exemples des micro-organismes connus produisant la vitamine B12 sont ceux appartenant aux genres Propionibacté- rium, Streptomyces, Arthrobacter, Corynebacterium, Rhodopseudo- monas, Mycobacterium et Pseudomonas, des exemples particuliers de ces micro-organismes étant indiqués ci-après,eton peut se les procurer auprès des organismes de dépot de souches que l'on indique-également: Propionibacterium freudenreichii (ATCC 6207), Propionibacterium shermanii (ATCC 8262), Streptomyces alivaceux (ATCC 3335), Arthrobacter hyalinus (ATCC 31263), Arthrobacter simplex (ATCC 6946), RhDdopseudomonas spheroides (ACC I1167), Rhodopseudomonas capsulata (ATCC 11166), Corynebacterium sp. (IFO 12320), Mycobacterium smegmatis (IFO 3082, et Pseudomonas denitrificans (ATCC 13867). On connaît également un procédé de production de la vitamine B12 par fermentation avec des micro- organismes connus dont on vient de donner des exemples, procédé qui est décrit par exemple dans l'ouvrage Microbial Technology, 2ème Edition, vol. 1, pages 497 - 519, 1979, Academic Press, Inc.. Dans le procédé selon cette invention, on met en con- tact avec l'adsorbant résineux (A) et/ou l'adsorbant résineux (B) un liquide tel que ci-dessus contenant de la vitamine B12 brute, pour que la vitamine soit adsorbée sur la résine, puis on élue de la résine la vitamine adsorbée, avec un éluant, et on recueille l'éluat actif. L'opération de mise en contact peut se faire par tout moyen approprié. On peut par exemple mélanger la résine avec le liquide contenant la vitamine B12, et le cas échéant agiter le mélange pour réaliser un bon contact entre les deux. On peut aussi opérer par une méthode chromatographique sur colonne en garnissant une colonne appropriée de la résine et en faisant passer le liquide sur celle-ci. Dans le cas de la première mé- thode, on ajuste le pH du liquide à une valeur appropriée, par exemple entre 5 et 8 environ, de préférence aux environs de 7, et on lui ajoute une quantité appropriée de l'adsorbant, par exemple 1 à 50 parties en volume environ par partie en volume du liquide contenant la vitamine Bi12 brute, puis on agite dou- cement le mélange pendant environ 10 minutes à 2 heures, en gé- néral pendant une durée de l'ordre de 20 mihutes à 1 heure. Cette opération d'adsorption peut se faire à la température or- dinaire mais on opérera à la température la plus basse possible, par exemple entre 10 et 30 C environ. On peut aussi exécuter la méthode chromatographique sur colonne en faisant passer le li- quide contenant la vitamine B12 à travers la couche d'adsorbant dans des conditions de pH et de température semblables à celles qui ont été indiquées pour la première méthode. 1l Après l'adsorption on lave la résine puis on élue, le lavage étant effectué de préférence avec de l'eau ou un al- cool aqueux assez dilué, par exemple avec du méthanol aqueux à %, de l'éthanol aqueux à 2 % ou de l'isopropanol aqueux à 1%. L'élution de la vitamine B12 de la résine donne un éluat contenant cette vitamine purifiée. On peut choisir des éluants ordinaires, par exemple des solutions aqueuses d'alcoolsaliphatiques inférieurs, d'a- cides, de substances alcalines ou de sels, des exemples parti- culiers d'éluants comprenant des alcanols inférieurs tels que le méthanol, l'éthanol et l'isopropanol; des acides, par exem- ple acides minéraux comme l'acide phosphorique, borique ou chlo- rhydrique, ou des acides carboxyliques aliphatiques comme l'a- cide acétique; des substances alcalines comme l'hydroxyde de sodium, le phosphate monoammonique ôu diammonique et le nitrate d'ammonium; et des sels tels que le carbonate, l'acétate et le phosphate de sodium et le phosphate de potassium. L'éluant peut être aussi convenablement choisi suivant la nature et les pro- portions des impuretés et le type d'adsorbant résineux, mais cependant les solutions aqueuses d'alcools aliphatiques infé- rieurs sont préférables, par exemple des alcools aqueux à une teneur en alcool inférieure à 50 % environ, par exemple du mé- thanol à une concentration de 25 à 50 %, de l'éthanol à 15-40% ou de l'isopropanol à 6-20 %. L'élution peut se faire à la température ordinaire, * et un chauffage ou un refroidissement ne sont pas particulière- ment nécessaire, mais si l'on veut on peut cependant chauffer ou refroidir. L'élution peut être par exemple effectuée à une température d'environ 30 à 80'C. Le procédé ci-dessus donne l'éluat actif, que, si l'on veut, on peut concentrer, recristalliser ou traiter d'une autre manière. Les exemples qui suivent illustrent plus précisément la présente invention. EXEMPLE 1 On place dans une colonne en verre 100 ml d'un copo- lymère cgraduaire divinylbenzène/styrène à pores d'un diamètre 2495 161 o modèle de 320 A et dont le volume total des pores est de 0,91 ml/g, qui a été obtenu par une polymérisation en suspension aqueuse d'un divinylbenzène industriel à 55 % de pureté envi- ron, la partie restante étant de l'éthylvinylbenzène. Les pores de cette résine ayant un diamètre d'au o moins 200A environ ont un volume de 0,50 ml/g. On extrait par ailleurs, avec de l'éthanol aqueux à % contenant du cyanure de potassium, un broyat de cellules microbiennes contenant de la Vitamine B12, résultant d'une sé- paration par centrifugation d'un bouillon de culture de Propio- nibacterium shermanii (IFO 12391), organisme produisant la vi- tamine B12, on concentre au dixième le liquide ainsi obtenu, contenant cette vitamine avec des impuretés, puis on ajoute au concentré 10 fois sa quantité d'eau, ce qui donne un liquide contenant la vitamine B12 et les impuretés, à 23 ppm de vita- mine B12 On verse un litre de ce liquide sur la couche de ré- sine qui a été placée dans la colonne pour qu'il s'écoule à un débit de 4 ml/minute, pour réaliser l'adsorption, et on fait passer en continu sur la résine deux litres d'eau désionisée pour faire passer les impuretés dans le liquide résiduaire d'adsorption. On verse ensuite sur la colonne 3 litres de méthanol aqueux à 40 % pour en éluer la vitamine B12, au débit de 3 ml/ minute. On recueille un litre d'éluat actif, dont on détermine la concentration en vitamine B12 par une méthode micro-biologi- que, ce qui donne 23 ppm. Le taux de récupération de la vita- mine B12 du liquide qui la contenait avec des impuretés est ainsi de 100 %. EXEMPLE 2 On met dans une colonne en verre 100 ml d'un copoly- mère du commerce divinylbenzène/styrène (Diaion HP-20, diamè- o tre des pores 460A, volume total des pores 1,08 ml/g) et à travers cette couche de résine on fait passer au débit de 4 ml/ minute, pour adsorber la vitamine, 1 litre du même liquide qu'à l'exemple 1, contenant 23 ppm de vitamine B12 et des impuretés. On fait passer en continu dans la colonne deux litres d'eau désionisée au débit de 4 ml/minute pour faire passer les impu- retés dans le liquide résiduaire, puis on dilue la vitamine B12 avec du méthanol aqueux à 40 %. On recueille 1 litre d'éluat actif,dont on détermine la concentration en vitamine B12 par une méthode microbiologique, ce qui donne 23 ppm comme dans l'exemple 1. Le taux de récupération de la vitamine B12 du liquide qui la contenait avec les impuretés est ainsi de 100 A. EXEMPLE 3 Dans un récipient agité de 150 litres on met 5 kg d'un divinylbenzène industriel à 55 % de pureté environ, la partie restante étant de l'éthylvinylbenzène, avec 1 kg de 1,2,3-benzène-tricarboxylate de tripropényle, 6 kg de diéthyl- benzène, 3 kg d'alcool isoamylique, 80 kg de peroxyde de benzoyle; litres d'eau, 4 kg de phosphate tricalcique et 6 g de dodécylbenzène-sulfonate de sodium, et tout en agitant on sou- met le mélange à une polymérisation en suspension pendant 8 heures à la température de 800C, ce qui donne un polymère ré- ticulé granulaire. On sépare ce polymère par filtration, on le lave dans une colonne avec du méthanol et du chloroforme, puis on le filtre à nouveau et on le sèche sous pression réduite entre et 80 C, ce qui donne 5,3 kg d'un polymère granulaire blanc non transparent. Ce polymère a une surface spécifique de 874 m2/g et un volume total de pores de 1,7 ml/g. a Les pores ayant un diamètre d'au moins 200A environ ont un volume de 0,30 ml/g. Cette résine donne une absorption dans l'infra-rouge à 1740 cm-1, caractéristique du groupe carbonyle, ce qui montre que le 1,2,4-benzène-tricarboxylate de triptopényle a été ef- fectivement incorporé dans le polymère par la copolymérisation. On centrifuge par ailleurs un produit contenant de la vitamine B12,obtenu par culture de Propionibacterium shermanii (IFO 12391), micro-organisme produisant cette vitamine, et on extrait la vitamine B12 avec les impuretés des cellules micro- biennes séparées, au moyen d'éthanol aqueux à 80 % contenantdu cyanure de potassium. On concentre Au dixième par évaporation la solution ainsi obtenue pour avoir une liqueur de culture de itamine B12 à 500 ppm de cette vitamine, et on fait passer ml de cette liqueur au débit de 200 ml/minute dans une colonne garnie de 3 litres de grains de la résine cidessus, par une méthode ascendante, pour adsorber la vitamine, et on fait passer en continu à travers la colonne 10 litres d'une solution aqueuse à 1 % d'acide acétique pour faire passer les impuretés dans le liquide résiduaire. On élue ensuite la vita- mine B12 avec du méthanol aqueux à 30 %, et on recueille 8 li- tres d'éluat actif que l'on sèche, ce qui donne la vitamine B12 en poudre à 80 % de pureté. Le rendement en vitamine, de- puis la liqueur de culture jusqu'à l'éluat, est de 100 %. EXEMPLE 4 Dans un récipient agité de 150 litres on met 5 kg d'un divinylbenzène industriel à 55 % de pureté environ, la partie restante étant de l'éthylvinylbenzène, avec 0,25 kg de 1,2,4-benzène-tricarboxylate de tripropenyle, 4 kg de diéthyl- benzène, 2 kg d'alcool isoamylique, 80 g de peroxyde de benzoyle, litres d'eau, 4 g de phosphate tricalcique et 45 g d'un surfactif polymère du type acide polycarboxylique (Caribon-B, nom de marque), et tout en agitant, on soumet ce mélange à une polymérisation en suspension pendant 8 heures à 90'C, ce qui donne un polymère réticulé -granulaire. On sépare ce polymère par filtration, on le lave avec du méthanol et du chloroforme dans une colonne, puis on le fil- tre de nouveau et on le sèche entre 60 à 80'C sous pression ré- duite, ce qui donne 4,9 kg d'un polymère granulaire blanc non transparent. Le polymère ainsi obtenu a une surface spécifique de 902 m 2/g et un volume total de pores de 1,6 ml/g, et les pores ayant un diamètre d'au moins 200A environ ont un volume de 0,30 ml/g. Cette résine a une bonne affinité pour l'eau, qui s'écoule bien dans une colonne qui en est garnie, et l'on peut ainsi préparer facilement une colonne de résine pour chromato- graphie. On centrifuge par ailleurs un produit contenant de la vitamine B12, obtenu par culture de Propionibacterium shermanii (IFO 12391), microorganisme produisant cette vitamine, et on extrait la vitamine B12 avec des impuretés au moyen d'éthanol aqueux à 80 % contenant du cyanure de potassium, des cellules microbiennes séparées. On concentre au dixième par évaporation la solution ainsi obtenue pour avoir une liqueur de culture de vitamine B12 brute, à 500 ppm de vitamine B12, on fait pas- ser 100 ml de cette solution à travers une colonne garnie de 3 litres de particules de la résine ci-dessus, au débit de 200 ml/minute, par une méthode ascendante, pour adsorber la vitamine B12, et on fait couler en continu dans la colonne 10 litres d'une solution aqueuse à 1 % d'acide acétique pour faire passer les impuretés dans le liquide résiduaire. - On élue ensuite la vitamine B12 avec de l'isopropanol aqueux à 20 %, et on recueille 6 litres d'éluat actif, que l'on sèche pour obtenir la vitamine B12 en poudre. Le rendement, depuis la liqueur de culture jusqu'à l'éluat, est de 98 %. 2495 1 6 1 REVENDICATIONS 1.- Procédé de séparation de vitamine B12 à l'état pur, selon lequel on met un liquide contenant cette vitamine avec des impuretés en contact avec une résine choisie parmi (A) un copolymère dixinylbenzène/styrène à pores ayant un dia- mètre modèle au moins égal à 200A environ et un volume total de pores dépassant 0,6 ml/g) et (B) un copolymère divinyl- benzène/styrène/ester alkylique insaturé d'un acide polycarbo- xylique aromatique de formule F - COOR)n,' R en représen- tant un alkyle insaturé en C3-C10 avec une double liaison carbone-carbone et n le nombre 2 ou 3, ce copolymère (B) ayant une surface spécifique d'au moins 700 m2/g environ, pour faire adsorber la vitamine B12 sur la résine, puis on élue cette vi- tamine avec un éluant et on recueille l'éluat actif. 2.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel le liquide contenant la vitamine B12 est à un pH d'environ 5 à 8. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans le- quel l'éluant est une solution aqueuse d'un composé choisi parmi des alcools aliphatiques inférieurs, des acides, des alcalis et des sels.