Brevet FR2496692A1 — publié le 19820625

249669; La présente invention est relative à un procédé de dosage de la peroxyde-dismutase (abrégàaci-après en POD). Plus particulièrement, elle est relative au procédé de dosage immunologique par voie enzymatique pour le POD en utilisant une technique de concurrence. La POD est un enzyme qui catalyse la dismutation ou la dissociation d'anions peroxydes à radicaux libres (02) et, ces dernières années, son dosage a beaucoup retenu l'attention d'un point de vue clinique. C'est ainsi notam- ment qu'on a élucidé la relation entre l'artériosclérose et le peroxyde lipidique. On dit que le peroxyde lipidique augmente avec l'âge. Dans ces conditions, la microanalyse de la POD dans les tissus, telle que le foie et le poumon, est très souhaitable. De même, la POD en vient à être utilisée en tant qu'agent thérapeutique, de sorte que l'on souhai- te pouvoir déterminer quantitativement la POD dans divers animaux et pouvoir effectuer la mesure du taux de la POD dans les tissus. Pour ce qui concerne le dosage classique de la POD, on a proposé le procédé quantitatif de McCord et collabora- teurs (J. Biol. Chem., 244, 6049-6055 (1969)) dont le proto- cole opératoire est fastidieux et dont la sensibilité de mesure est insuffisante. On a maintenant trouvé qu'il y a moins de sensibi- lité croisée entre les diverses POD provenant d'espèces différentes d'animaux lorsque l'on conjugue la POD avec un accepteur qui se conjugue spécifiquement avec elle et l'on a ainsi mis au point un procédé satisfaisant pour doser la POD en utilisant un produit conjugué PODenzyme obtenu par la conjugaison de la POD à un enzyme de marquage. Aux dessins annexés, donnés uniquement à titre d'exemple: la figure 1 représente une courbe illustrant le titre en anticorps d'un antisérum contre l'orgotéine; la figure 2 représente une courbe illustrant le titre en anticorps d'un antisérum contre la POD humaine la figure 3 représente une courbe d'étalonnage de l'orgotéine; et la figure 4 représente une courbe d'étalonnage de la POD humaine. Tout d'abord, la POD utilisée suivant l'invention peut être n'importe laquelle de celles ayant l'activité de catalyser la dismutation ou la dissociation d'anions per- oxyde à radicaux libres. C'est ainsi, par exemple, qu'on peut faire appel à la POD provenant du boeuf, en particu- lier à l'orgotéine qui est une POD provenant du foie de boeuf, à de la POD provenant de l'homme et à d'autres POD provenant de divers animaux. Ces POD peuvent être séparées et purifiées suivant le procédé classique. Ensuite, on conjugue la POD obtenue à un enzyme de marquage. Comme enzyme, on peut utiliser commodément une oxydoréductase, une hydrolase, une invertase, une lyase, une isomérase et une ligase. On peut citer comme exemples la lactate.déhydro- génase, la maléate déhydrogénase, la malate déhydrogénase, la maltose déhydrogénase, la lactate oxydase, la maléate oxydase, la peroxydase, la glucose oxydase, la choline oxydase, la xanthine oxydase, l'amino acide oxydase, la sarcosine oxydase, la catalase, l'a- amylase, la 0-galacto- sidase, le lysozyme, la lipase, l'alcali phosphatase, l'amino peptidase, la trypsine, la papalne, l'-chymotryp- sine, l'amidase, l'hexokinase, la glycérokinase, etc. En outre, on peut introduire à l'avance dans ces enzymes n'im- porte quel agent d'encombrement. Les enzymes peuvent être modifiés par introduction de groupes aldéhydes,amino ou thiol en utilisant un agent d'encombrement, par exemple un dialdéhyde tel que le glutaraldéhyde, un dérivé réactif tel qu'un chlorure d'w-amino acide, un dialdéhyde ou un chlorure d'acide dicarboxylique additionné d'une diamine telle que l'hexaméthylènediamine ou la décaméthylènediamine, de l'anhydride Sacétylmercaptosuccinique, un dialdéhyde additionné de 2-aminoéthanethiol, etc. De même, on peut également modifier la POD à l'avance en y introduisant éventuellement un agent d'encombrement. Lorsque l'on prépare le produit conjugué POD-enzyme, par conjugaison de la POD et d'un enzyme de marquage, on - peut effectuer la conjugaison par un groupe amino, hydroxy, thiol ou carboxy de la POD ou de l'enzyme de marquage, ou par un groupe aldéhyde, amino, thiol ou carboxy qui a été introduit dans la POD ou dans l'enzyme. La conjugaison des deux constituants peut s'effectuer directement ou indirecte- ment en utilisant un agent de conjugaison. C'est ainsi, par exemple, qu'un groupe carboxy ou amino de l'enzyme de mar- quage peut être mis à réagir sur un groupe amino ou carboxy de la POD dans un milieu inerte en la présence d'un agent de condensation,tel qu'un carbodiimide soluble dans l'eau. En variante, on peut effectuer la réaction en se basant sur la réactivité entre des groupes aldéhyde et amino. Lors- qu'on prépare le produit conjugué POD-enzyme, en utilisant un agent de condensation, ce dernier peut être n'importe lequel de composés multifonctionnels connus, par exemple des diisocyanates tels que le diisocyanate d'hexaméthylène et le 2,4-diisocyanate de toluène; des diisothiocyanates tels que le diisothiocyanate d'hexaméthylène; des dialdé- hydes tels que le succinaldéhyde, le glutaraldéhyde et l'adipaldéhyde; le N,N'-éthylènebismaléimide; le N,N'-o- phénylênedimaléimide; la bisdiazobenzidine; la N,N'-poly- méthylènebisiodoacétamide; le malonimidate de diéthyle; l'adipinimidate de diméthyle; des acides sulfidocarboxyli- ques tels que l'acide 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)propioni- que, l'acide 3-(2'-pyridyl-N-oxydo-dithio)propionique et l'acide 6-N[3(2'-benzothiazolyl-dithio)propionyl]caproique et leurs dérivés réactifs tels que leurs esters succinimi- diques, leurs esters p-nitrophényliques, leurs chlorures d'acides et leurs imidates (cf. demande de brevet au Japon No. 85900/1978); et des acides maléimidocarboxyliques tels que l'acide maléimidobenzoique, l'acide maléimidophé- nylacétique, et l'acide maléimidophénylpropionique, et leurs dérivés réactifs. Pour obtenir le produit conjugué, on peut effec- tuer habituellement la réaction dans une solution-tampon de pH 6 à 8 en la présence d'un solvant organique tel que le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le dioxane, le diméthyl- sulfoxyde, le diméthylacétamide, le tétrahydrofuranne, etc., ou dans un tel solvant organique à une température de O à 40 C. Apres la réaction, on peut purifier le produit conjugué par une chromatographie d'absorption ou par un processus de filtration sur gel, comme on le souhaite. Comme accepteur conjugué spécifiquement à la POD, on peut utiliser en général un anticorps obtenu quand on inocule de la POD, servant d'antigène,à un autre type d'animal ou un antisérum contenant un tel anticorps. C'est ainsi, par exemple, que l'on peut injecter une émul- sion d'orgotéine provenant du boeuf dans de l'adjuvant ca- plet de Freund à un type différent d'animal,tel que le lapin et le cobaye, plusieurs fois en une période définie, pour obtenir une immuno-sensibilisation. Ensuite on recueil- le le sang et on le traite par un procédé classique,tel que la centrifugation,pour obtenir un antisérum. En outre, on peut séparer l'anticorps de l'antisérum par un procédé classique tel que par relargage, par précipitation au point isoélectrique, par dialyse, par chromatographie, par filtra- tion sur gel et autres. On peut utiliser l'anticorps obtenu sur un support insoluble,si nécessaire, par exemple sur un support protéi- nique insolubletel que l'albumine et la gélatine; sur un support insoluble semi-synthétique de masse moléculaire élevée,tel que l'agarose, la cellulose et le dextrane, traité par l'épichlorhydrine ou le bromure de cyanogène, ou trai- té encore par un agent d'amination; et sur un support insolu- ble synthétique de masse moléculaire iélevée,tel que des polymères ou des copolymères d'acrylonitrile, d'acide acrylique, d'acrylate, d'acide méthacrylique, de méthacry- late de méthyle, d'alcool vinylique, d'acétate de vinyle, d'aminostyrène, d'acrylamide, d'éthylène, d'anhydride maléique, etc. On peut fixer l'anticorps sur ces supports par un composé multifonctionnel, tel que décrit ci-dessus. Lorsqu'on effectue le procédé suivant l'invention en utilisant un produit conjugué POD-enzyme, on mélange une solution contenant une quantité définie du produit conjugué POD-enzyme, une solution contenant un accepteur se conju- guant spécifiquement au POD et un échantillon dont on doit 249669; doser la teneur en POD et on laisse réagir pendant une nuit, en général à une température de 40C. Dans cette réac- tion, on peut utiliser un milieu aqueux, de préférence une solutiontampon telle qu'une solution-tampon au phosphate de 0,01 M (pH 7,2) contenant 0,25 % d'albumine sérique de boeuf (BSA), 0,1 % de NaN3 et 0,15 M de NaCL. On peut également utiliser le milieu aqueux comme milieu de dilu- tion pour chaque agent mentionné ci-dessus. Après la réac- tion, on sépare les phases solide et liquide l'une de l'autre. Dans un mode de réalisation préféré, on peut ajouter une immunoglobuline provenant de l'espèce animale dont provient l'accepteur se conjuguant spécifiquement à la POD, et un anticorps contre la globuline de cette espèce d'animal, ou un antisérum en contenant et on laisse le mélange réagir pendant une nuit à une température de 40C. La réaction achevée, on sépare les phases solide et liquide l'une de l'autre par un processus de séparation, tel que par centrifugation. Ensuite, on peut doser l'activité enzymatique dans la phase solide (constituant B) ou dans la phase liquide (constituant F). Lorsque l'on dose l'activité enzymatique, on peut mesurer le constituant consommé, ou le constituant formé, en utilisant un substrat correspondant à la réaction enzy- matique utilisée. C'est ainsi, par exemple, que dans le cas d'une oxydase, on peut doser le POD en mesurant l'enzy- me consommé ou l'eau oxygénée formée, après que le substrat a été oxydé par la réaction enzymatique. De cette valeur de l'activité enzymatique, on obtient la quantité de POD dans le constituant B ou du POD-enzyme qui n'a pas réagi dans le constituant F, afin de déterminer la quantité du produit conjugué POD-enzyme consommé après la réaction. Dans le cas d'une réductase, il vaut mieux mesurer le co- enzyme consommé après la réaction enzymatique. Dans le cas d'une hydrolase, on peut mesurer l'hydrolysat formé après l'action enzymatique. A partir de ces mesures, on peut utiliser diverses méthodes connues, par exemple les mesures directes en utilisant une électrode à l'oxygène, une élec- trode à l'eau oxygénée, la colorimétrie ou une mesure indi- recte en utilisant le changement de couleur après la réac- tion en mettant en oeuvre un mélange d'eau oxygénée-agent colorant et ces méthodes peuvent être choisies convenable- ment suivant le type d'enzyme utilisé. Lorsque l'on met en pratique l'invention, tel que mentionné ci-dessus, on peut doser le POD d'un échantil- lon d'une manière tout à fait satisfaisante. Ainsi, l'inven- tion procure un procédé favorable de dosage de la POD dans lequel les divers agents utilisés sont sûrs et stables. L'exemple suivant illustre l'invention. EXEMPLE (1) POD. 1) POD provenant du boeuf (orgotéine): fournie par la Société Diagnostic Data Incorporated. 2) POD provenant de l'homme (POD humaine): séparée d'érythrocyte humain et purifiée par le procédé décrit dans J. Biol. Chem., 234, 46 (1959). 3) POD provenant d'autres animaux: séparée et purifiée suivant un procédé semblable à la séparation et à la purification de la POD humaine. (2) Accepteur se conjuguant spécifiquement à la POD. 1) On mélange de l'orgotéine (5 mg/me) à un volume égal d'adjuvant complet de Freund pour préparer une émulsion. Chaque aliquot de 0,5 mt de l'émulsion est injecté par voie sous-cutanée à des lapins, dans le dos, trois fois par deux semaines et après un intervalle de trois semaines, trois fois par deux semaines, pour obtenir la sensi- bilisation immunologique. On recueille ensuite tout le sang quand son titre en anticorps atteint 800 U pendant le déroulement du dosage, suivant la fixation complémentaire, et on obtient l'antisérum contre l'orgotéine suivant le procédé classique. 2) On injecte de la POD humaine (5 mg/mZ) à des lapins de la même manière que l'orgotéine au paragraphe 1 ci-dessus. On recueille le sang et on obtient l'anti- sérum contre la POD humaine. 3) On recherche les réactivitéscroisées entre chaque anti-sérum obtenu et la POD provenant de différents types d'animaux. Les résultats obtenus sont donnés au tableau 1 qui montre que les réactivités croisées entre les anti- sérums obtenus et la POD provenant des divers types d'ani- maux sont inférieures à 1/1000. TABLEAU 1 Antisérum Antisérum contre contre orgotéine POD humaine Orgotéine 1 inférieur 1 POD humaine inférieur 11 1OOO POD de cochon inférieur 1inférieur 1 1000 1000 POD de lapin inférieur 5000 inférieur 1 5000 1000 POD de rat inférieur 1 inférieur 1 5000 1000 POD de cheval inférieur 1 inférieur 1 1000 1000 (3) Produit conjugué POD-enzyme. 1) On fait réagir, pendant une heure, en agitant sous de la neige carbonique, un mélange d'une solution-tam- pon au phosphate 50 mM (pH 8,0) contenant 30 mg d'orgotéine et 1 mM d'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) sur 360 VZ de diméthylformamide contenant 100 ig de 3-(2'-benzo- thiazolyl-dithio)propionate de succinimide. Puis, a 2 m/ de la solutiontampon au phosphate 100 mM (pH 7,0), on ajoute 20 pt du mélange réactionnel, puis 5 mg de e-galacto- sidase. On laisse le mélange réagir pendant 30 heures en agitant sous de la neige carbonique. La réaction achevée, on charge le mélange dans une colonne de Cephadex G-150 (2 x 70 cm), on élue et on filtre sur gel par une solution- tampon au phosphate 100 mM (pH 7,0) pour recueillir une fraction de 68 à 77 mú ayant une activité e-galactosidasi- que. On obtient le produit conjugué orgotéine-B-galactosi- dase en lyophilisant la fraction (96 % de rendement en activité $-galactosidasique). On détermine l'activité e-galactosidasique à partir de l'extinction à 420 nm, en utilisant de l'o-nitrophényl- e-galactosidase comme substrat. 2) Suivant le procédé décrit dans J. Biochem., 79, 233-236 (1976), on ajoute, à une solution de 30 mg de POD humaine dans 1 mI d'une solution-tampon au phosphate 50 mM (pH 7,0), 1 mú d'une solution tétrahydrofurannique conte- nant 5 mg de méthamaléimidobenzoate de succinimide et on laisse le mélange réagir pendant 30 minutes à la températu- re ambiante. On charge le mélange dans une colonne Cephadex G-25 (1 x 70 cm) et on filtre sur gel en utilisant une solution-tampon de phosphate 50 mM (pH 7,0) comme solvant pour recueillir une fraction de 16 à 22 mt(contenant 22 mg de POD). On lyophilise la fraction et on dissout un ali- quot de 0,7 mg de la substance sèche dans 0,2 mi d'une solution-tampon au phosphate 50 mM (pH 7,0). A la solution obtenue, on ajoute 0,3 m. d'une solution-tampon au phospha- te 50 mM (pH 7,0), puis 0,5 mg de 0-galactosidase. On laisse le mélange réagir pendant 2 heures à la température ambiante. La réaction achevée, on filtre le mélange sur gel et on le lyophilise pour obtenir un produit conjugué POD humaine-0-galactosidase (rendement de 78 % en activité e-galactosidasique). (4) Anticorps contre la Y-globuline de lapin. On mélange de la y-globuline de lapin (10 mg/ml) à un volume égal de l'adjuvant complet de Freund, pour ob- tenir une solution. On injecte par voie sous-cutanée à des chèvres, en 4 endroits du dos, chaque fois 0,5 mt de cette émulsion. Après avoir immunisé 6 fois pendant 2 semaines, suivi d'un intervalle de 2 semaines, on recueille tout le sang à partir duquel on obtient du sérum de chèvre contre la #-globuline de lapin, suivant le procédé classique. (5) Dosage du titre en anticorps des antisérums contre l'orgotéine et la POD humaine. 1) Dosage de l'antisérum contre l'orgotêine. On laisse réagir pendant une nuit, à une température 249669; de 4 C, un mélange de 100 Pl d'une solution contenant le produit conjugué orgotéine-e-galactosidase de 100 P d'une solution diluée d'antisérum contre l'orgotéine et de 100 pî d'une solution contenant de l'orgotéine, puis on y ajoute 100 Pt d'une solution contenant de l'IgC de lapin à raison de 50 pg/mt et 100 pl d'un sérum de chèvre contre la '-globuline de lapin (dilué 8 fois), et on laisse le mélange réagir pendant une nuit à une température de 4 C. [Tous les sol- vants utilisés sont une solution-tampon au phosphate 10 mM (pH 7,0) contenant 0,25 % d'albumine sérique du boeuf, 0,1 % de NaN3 et 0,15 M de NaC1]. La réaction achevée, on ajoute au mélange 4 mt de sérum physiologique et on centri- fuge à 3000 tours/minute pendant 15 minutes, pour recueil- lir la substance solide sous forme du précipité. A la subs- tance solide, on ajoute 0,2 ml d'une solution-tampon au phosphate 0,03 M (pH 7,0) contenant 4 mg/ml de o-nitro- phényl-e-galactoside, 20 mM de mercaptoéthanol et 10 % de méthanol. On laisse réagir le mélange pendant une heure à une température de 37 C, puis on ajoute au mélange 2,3 ml d'une solution-tampon de glycine-NaOH (pH 11,5). On mesure le changement de coloration par l'extinction à la longueur d'onde de 420 nm. Les résultats donnent le titre en anticorps de l'antisérum contre l'orgotéinetel qu'illustré à la figure 1, dans laquelle la courbe représente le titre en anticorps de l'antisérum contre l'orgotéine. 2) Dosage du titre en anticorps de l'antisérum contre la POD humaine. En utilisant 100 Vú d'une solution contenant le produit conjugué POD humaine-e-galactosidase, 100 Pl d'une solution diluée d'un antisérum contre la POD humaine et pl d'une solution contenant la POD humaine, en procé- dant sinon de la même manière que pour le dosage de l'anti- sérum contre l'orgotéine tel que mentionné ci-dessus, on dose le titre en anticorps de l'antisérum. Les résultats sont tels qu'illustrés à la figure 2, dans laquelle la courbe représente le titre en anticorps de l'antisérum contre la POD humaine. (6) Dosage de la POD. 1) Dosage de l'orgotéine (courbe d'étalonnage). En procédant de la même manière que dans le dosage du titre en anticorps de l'antisérum contre l'orgotéine, on fait réagir pendant une nuit, à une température de 4 C, un mélange de 100 pú d'une solution contenant le produit conjugué orgotéine-e-galactosidase (1,22 ng/mt d'orgotéine), de pZ d'antisérum contre l'orgotéine (dilué 512.000fois) et de 100 pú d'un échantillon liquide (contenant de 0 à 100 ng/mZ d'orgotéine). On ajoute ensuite au mélange 100 lt d'une solution contenant 50 pg/mt d'IgG de lapin et 100 pt de sérum de chèvre contre la Y-globuline de lapin (dilué 8 fois) et on laisse le mélange réagir pendant une nuit, à une température de 4 C. La réaction achevée, on ajoute au mélan- ge 4 mî de sérum physiologique et on le centrifuge à 3000 - tours/minute pendant 15 minutes. Au précipité recueilli, on ajoute 0,2 mit d'une solution-tampon au phosphate 0,03 M (pH 7,0) contenant 4 mg/ml de o-nitrophényl-e-galactoside, mM de mercaptoéthanol et 10 % d'éthanol, et on laisse le mélange réagir à une température de 37 C pendant 1 heure. La réaction achevée, on ajoute au mélange 2,3 mt d'une solution-tampon de glycine-NaOH (pH 11,5) et on mesure le changement de coloration par l'extinction à la longueur d'onde de 420 nm. On obtient comme résultat une courbe d'étalonnage excellente de l'orgotéine, telle qu'illustrée à la figure 3. 2) Dosage de la POD humaine (courbe d'étalonnage). En utilisant 100 pe d'une solution contenant le pro- duit conjugué POD humaine-e-galactosidase (1,14 ng/mú de la POD provenant de l'homme), 100 pú d'un antisérum contre la POD humaine (dilué 640.000 fois) et un échantillon li- quide(contenant de O à 100 ng/mt de la POD humaine) et en procédant sinon de la même manière que dans le dosage de l'orgotéine mentionné ci-dessus, on dose la POD humaine dans l'échantillon. On obtient ainsi une excellente courbe d'étalonnage, telle qu'illustrée à la figure 4. 3) Dosage de l'orgotéine. On administre de l'orgotéine à des chevaux, à leur articulation du genou (les doses sont données au tableau 2). En utilisant le sérum provenant de ces chevaux comme échan- tillons,et en opérant sinon de la môme manière que dans le dosage de l'orgotéine (étalonnage) mentionné ci-dessus, on dose le taux de l'orgotéine dans le sérum de cheval après l'administration de l'orgotéine, et on calcule cette dose sur la base de la courbe d'étalonnage. Les résultats obtenus sont donnés au tableau 2. TABLEAU 2 (Limite de détection: 0,5 ng/mt). Teneur en orgotéine du sérum Dose (ng/mt) No. d'orgotéine (mg) Temps (en heures) au bout duquel on recueille le sérum 0,5 1 2 4 8 24 72 1 20 1,5 2,6 10,4 10,8 8,1 2,17 0,5 2 10 1,6 2,3 3,8 6,9 7,0 2,3 3 10 2,21 2,4 4,3 7,8 6,2 2,45 4 20 3,9 6,1 7,5 13,0 9,4 2,6 0,96 10 1,0 2,04 2,52 2,6 1,8 0,67 6 10 O O O O O O O REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage de la peroxyde dismutase, ca- ractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un produit con- jugué peroxyde dismutase-enzyme obtenu en conjuguant la peroxyde dismutase et un enzyme de marquage. 2. Procédé de dosage de la peroxyde dismutase sui- vant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre à réagir un produit conjugué peroxyde dismutase- enzyme, un échantillon et un accepteur se conjuguant spé- cifiquement à la peroxyde dismutase, à séparer les phases solide et liquide du mélange de réaction l'une de l'autre, et à mesurer l'activité enzymatique dans la phase solide ou dans la phase liquide.