Brevet FR2497231A1 — publié le 19820702

La présente invention concerne un procédé pour produire de la L-lysine par fermentation. La L-lysine, que l'on utilise comme aliment pour ani- maux, a été produite industriellement selon un procédé de fermenta- tion dans lequel on utilise des mutants producteurs de L-lysine du genre Brevibacterium ou Corynebacterium et on connaît divers mutants producteurs de L-lysine induits par mutation artificielle à partir de souches sauvages du genre Brevibacterium ou Corynebacterium. Des exemples de tels mutants artificiels sont les mutants résistant à la S-(amino-2 éthyl)-cystéine (appelée ci-après AEC), les mutants dont la croissance nécessite un L-amino-acide tel que la L-homosérine, la Lthréonine, la L-leucine ou la L-méthionine (demandes de brevets japonais publiées examinées n 28078/1963, n 26639/1977, n 28677/1973 et brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 707 441 et n 2 979 439), les mutants résistant à 1'AEC et nécessitant de plus un amino-acide tel que la L-leucine, la L-homo- sérine, la L-proline, la L-sérine, la L-arginine, la L-alanine ou la Lvaline (demandes de brevets japonais publiées examinées n 36888/1974, n 21078/1976, n 34836/1979 et n 1040/1980 et les brevets des Etats- Unis d'Amérique n 3 708 395 et n 3 825 472), les mutants producteurs de L-lysine résistant à l'acide a-amino P-hydroxyvalérianique, à l'a-chlorocaprolactame, aux analogues de la leucine, A l'a-amino- lauryllactame, aux analogues de l'acide aspartique, aux sulfamides, aux quinotdes, à la N-lauroylleucine ou aux inhibiteurs de l'oxalo- acétate-décarboxylase ou des enzymes du système respiratoire (demandes de brevets japonais publiées non examinees n 31093/1975, n 102498/1977, n 9394/1978, n 86089/1978, n 9785/1980, n 9759/1980, n 32995/1981 et n 39778/1981, et demandes de brevets japonais publiées examinées n 43591/1978 et n 1833/1978), les mutants producteurs de L-lysine néces- sitant de l'inositol ou de l'acide acétique (demandes de brevets japonais publiées non examinées n 9784/1980 et n 8692/1981) et les mutants producteurs de L-lysine sensibles à l'acide fluoropyruvique ou à une température supérieure à 34 C (demandesde brevets japonais publiées non examinées n 9783/1980 et n 86090/1978). La demanderesse a découvert que l'on peut accroître la capacité de production de la L-lysine lorsque l'on confère une résis- tance à l'éthylèneglycol à des micro-organismes producteurs de L-lysine connus du genre Brevibacterium ou Corynebacterium. Les micro-organismes utilisés selon l'invention sont des mutants appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium qui ont des caractéristiques nécessaires pour la production de la L-lysine, telles que le besoin d'homosérine, la résistance à l'AEC et la résistance à l'a-chlorocaprolactame (CCL) et qui de plus pré- sentent une résistance a l'éthylèneglycol. Des exemples de mutants de l'invention sont: Brevibacterium lactofermentum AJ 11657 FERM-P 5838 FERM-BP (AECr, CCLr, Ala-, EGr) Brevibacterium flavum AJ 11658 FERM-P 5839 FERM-BP (Hse, EGr) Corynebacterium acetoglutamicum AJ 11656 FERM-P 5837 FERM-BP (AEC, Ala, EG) AECr: résistance à la S-(amino-2 éthyl)-L-cystéine CCLr: résistance à l'a-chlorocaprolactame Use: dont le développement nécessite de la L- homosérine EGr: résistance à l'éthylèneglycol Ala: dont le développement nécessite de la L-alanine. Les mutants identifiés ci-dessus par les référence FERM-BP ont été à l'origine déposés avec les références FERM-P le 27 décembre 1980 à l'Institut de Recherche sur les Fermentations, Agence des Sciences et Technologies Industrielles, Ministère du Commerce International et de l'Industrie (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukaba-gun, Ibaragi-ken 305, Japon et ces dépôts ont été transformés en un dépôt selon le Traité de Budapest de décembre 1981, le FRI ayant acquis le statut d'Autorité Dépositaire Interna- tionale le ler mai 1981. Les mutants précédemment indiqués ont été induits à partir des souches parentes selon un procédé classique quelconque. Le premier stade d'induction consiste à faire muter les souches parentes avec un mutagène chimique approprié, tel que la N-méthyl N'-nitro Nnitrosoguanidine (désignée ci-après par l'abréviation NG) et l'acide nitreux ou par irradiation par la lumière ultraviolette. Le second stade consiste à 'sélectionner les mutants résistants par prélèvement des colonies sur des boîtes d'un milieu gélosé nutritif contenant une quantité d'éthylèneglycol inhibant la multiplication des souches parentes. On évalue ensuite la capacité de production de la Llysine des mutants selon un procédé standard. Les mutants résistant à l'éthylèneglycol sont à peu près résistantsà une solution aqueuse concentrée de chlorure de sodium, de chlorure de potassium, de chlorure d'ammonium, de sulfate d'ammonium, de sulfate de potassium, de sulfate de sodium, de glucose, de fructose, de saccharose et de maltose qui inhibent la multiplica- tion des souches parentes. Comme souches parentes, on emploie des mutants capables de produire de la L-lysine ou des souches sauvages du genre Brevibacterium ou Corynebacterium. Lorsque l'on utilise des souches sauvages, on confère la capacité de production de la L-lysine aux souches sauvages avant ou après avoir conféré la résistance à l'éthylèneglycol aux souches sauvages. Comme il est connu, pour conférer aux micro-organismes la capacité de production de la L-lysine, on leur confère la xsistanceàl'AECouau CLoulebesin d'hcméimne. Les souches sauvages préférées du genre Brevibacterium ou Corynebacterium sont des bactéries corynéformes productrices d'acide glutamique dont on peut citer comme exemples: Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15086. Le procédé selon lequel on induit les mutants de l'invention et le degré de résistance à l'éthylèneglycol sont illus- trés par les expériences 1 et 2. Expérience 1 On cultive sur un milieu gélosé nutritif à 30 C pen- dant 24 heures, Brevibacterium lactofermentum AJ 11082 FERM-P 3840 NRRL-B 11470 (AEC, CCL, Ala') dérivant de B. lactofermentum ATCC 13869. On recueille par grattage les cellules développées sur le milieu gélosé et on les met en suspension dans de l'eau stérilisée à 250 g/ml de NG et on laisse la suspension reposer à 30 C pendant minutes. On lave les cellules microbiennes ainsi traitées avec une solution de tampon phosphate, on ensemence une boite de milieu de culture minimal dont la composition figure dans le tableau 1 conte- nant 30 g/dl d'éthylèneglycol et on cultive à 30 C en agitant pen- dant 2 à 4 jours jusqu'à ce que les mutants résistant à l'éthylène- glycol se soient propagés dans le milieu de culture. On étale ensuite le milieu de culture sur des boites de milieu de culture minimal gélosé et on incube les boîtes à 30 C pendant 4 jours. Tableau 1 - Composition du milieu minimal (pH 7,2) Apres la culture, on évalue la capacité de production de la L-lysine des colonies de mutants résistant à l'éthylèneglycol. On constate que les mutants capables de produire plus de lysine que la souche parente sont obtenus avec une fréquence élevée et on choi- sit B. lactofermentum AJ 11657 FEPM-P 5838 FERM-BP qui peut produire plus de L-lysine que tout autre mutant. Les autres mutants de l'invention, c'est-à-dire C. acétoglutamicum AJ 11656 et B. flavum AJ 11658 ont été obtenus respectivement de façon semblable. Expérience 2 On introduit dans des tubes à essai des portions de 3,0 ml du milieu minimal du tableau 1 contenant de plus de l'éthy- lèneglycol aux concentrations indiquées dans le tableau 2 et on sté- rilise. On lave chaque souche étudiée avec le milieu minimal et on en ensemence les milieux contenus dans les tubes à essai. On incube ensuite les tubes à 30C pendant 24 heures en agitant. Après Composants Concentration Composants Concentration glucose 2,0 g/dl ln S04, 4 H20 1,0 mg/dl urée 0,25 " L-alanine 50 " sulfate d'ammonium 1,0 " nicotinamide O, 5 " KH2PO4 KH P4 0,1 " biotine5,0 g Mg S04, 7 H20 0,04 " thiamine, HCI 10 " Fe SO 4, 7 H20 1,0 mug/dl _chlorure de sodium 50 mg/dl culture on détermine le développement de chaque souche par mesure de la densité optique à 562 nm des bouillons de culture obtenus; les résultats figurent dans le tableau 2. Le degré de résistance à l'éthy- lèneglycol est représenté par le degré de développement relatif par rapport au témoin. Tableau 2 - Degré de résistance On cultive les mutants en aérobiose dans un milieu de culture classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote et des ions minéraux ainsi que les substances nutritives secondaires éventuellement nécessaires. Comme source de carbone, on peut utiliser de préférence des saccharides tels que le glucose, le fructose et le saccharose et des mélasses et de l'hydrolysat d'amidon contenant ces saccharides, des acides organiques tels que l'acide acétique et l'acide propio- nique et des alcools. Les sources d'azote sont par exemple le sul- fate d'ammonium, l'ammoniac gazeux et l'urée. On effectue de préférence la culture en conditions aérobies pendant 2 à 7 jours à une température comprise entre 24 et 370C en ajustant de préférence le pH du milieu de culture entre 5,0 et 9,0 avec un acide ou un alcali organiques ou minéraux. A cet effet, on peut utiliser l'urée, le carbonate de calcium et l'ammo- niac gazeux. On peut récupérer la L-lysine accumulée dans le milieu de culture selon un procédé de récupération entièrement classique par exemple par emploi d'une résine échangeuse d'ions. L'invention est illustrée de façon plus détaillée par les exemples suivants. Concentration AJ AJ AJ AJ Aj AJ de 1'E.G (%) 11082 11657 11094 11656 11275 11658 O 100 100 100 100 100 100 70 100 80 100 70 100 40 90 40 85 50 100 O 70 10 60 20 80 O 50 O 40 O 50 O 10 O 10 O 10 Exemple 1 On introduit dans des flacons de 500 ml des portions de 20 ml du milieu de culture A dont la composition figure dans le tableau 3 et on chauffe à 110 C pendant 5 minutes pour stériliser. On ajoute dans chaque flacon 1,0 g de carbonate séparément. Tableau 3 - de calcium stérilisé Composition du milieu de culture Milieu Composant Concentration -- A B C D À,,,. ,. glucose ( g/dl) 15 1,5 2,0 15* sulfate d'ammonium ( ") 4,5 - - 4,5 acétate d'ammonium ( ") - 0,3 0,5 - urée ( ") - 0,1 0,2 - KH2Po4 ( ') 0,1 0,1 0,1 0,1 Mg S04, 7 H20 ( ") 0,04 0,04 0,04 0,04 Fe S04, 7 H20 (mg/dl) 1,0 1,0 1,0 1,0 Mn S04, 4 B20 (") 1,0 1,0 1,0 1,0 biotine (Pg/dl) 5,0 5,0 5,0 5,0 thiamine, HC1 ( ") 20 20 5,0 20 nicotinamide ( ") - _ 0,1 - hydrolysat de protéines de soja (NT 7%, ml/dl) 1,5 2,0 3,0 1,5 PH 7,0 7,5 7,2 7,0 * On utilise la mélasse de betterave comme source de carbone. On cultive au préalable chaque souche étudiée figurant dans le tableau 5 sur de la gélose nutritive inclinée puis on en ensemence chaque lot de milieu de culture et on cultive en agitant à 31 C pendant 72 heures. Après la culture, on détermine par colori- métrie la L-lysine accumulée dans chaque bouillon cultivé; les résul- tats figurent dans le tableau 4. Tableau 4 On recueille le bouillon de culture d'AJ 11656 préparé comme ci-dessus et on centrifuge pour éliminer les cellules micro- biennes et le carbonate de calcium solide. On fait passer 1,0 litre de la solution surnageante ainsi obtenue à travers une colonne d'Amberlite IR120 sous la forme H', pour adsorber la L-lysine sur la résine et on élue avec de l'ammoniaque à 3%. On évapore l'éluat et on refroidit la solution concentrée à une température suffisamment basse pour que la L-lysine cristallise; on obtient 36,7 g de chlorhy- drate de L-lysine dihydraté sous forme de cristaux. Exemple 2 On introduit dans des flacons de 500 ml des portions de ml du milieu de culture B dont la composition figure dans le tableau 3 et on chauffe à 1100C pendant 4 minutes pour stériliser. On cultive B. lactofermentum AM 11657 sur une gélose nutritive incli- née et on en ensemence les flacons puis on cultive à 310C pendant 18 heures en agitant pour préparer un bouillon de culture d'ensemen- cement. On introduit 300 ml de milieu de culture C dont la composition figure dans le tableau 3 dans un fermenteur de 1,0 litre et on chauffe pour stériliser. On ensemence ensuite avec 15 ml de bouillon de culture d'ensemencement et on cultive à 310C en agitant et en aérant. Pendant la culture, on maintient le pH du milieu dans la gamme de 7,2 à 8,0 par addition d'une solution composée d'acide acétique et d'acétate d'ammonium. Après 55 heures de culture, on détermine la L-lysine accumulée dans le bouillon de culture; le résultat obtenu figure dans le tableau 5. L-lysine accumulée Souche (en L-lysine, HC1) (g/dl)Rendement (X) Ai 11802 5,0 33 AJ 11657 6,0 40 AJ 11094 4,4 29 AJ 11656 5,1 34 AJ 11275 4,2 28 AJ 11658 5,3 35 Tableau 5 Exemple 3 On introduit des portions de 20 ml de milieu de cul- ture D dans des flacons de 500 ml et on chauffe à 110 C pendant minutes puis on ajoute dans chaque flacon 1,0 g de carbonate de calcium stérilisé séparément. On cultive sur une g lose nutritive inclinde chacune des souches indiquées dans le tableau 6 et on ensemence des lots de milieu de culture puis on cultive 3 10C pendant 72 heures en agi- tant. Apres la culture, on détermine la L-lysine accumulée dans le bouillon de culture; les résultats figurent dans le tableau 6. Tableau 6 Souche a0 L-lysine accumulée endement (en lysine, HC!) (g/dl)endement (%) AJ 11082 4,8 32 AJ 11657 5,6 37 AJ 11094 4,1 27 AJ 11656 4,7 31 AJ 11275 4,2 28 AJ 11658 4,8 32 Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limita- tifs sans sortir du cadre de l'invention. Souche n0 L-lysine accumulée Rd (en lysine, HC1) (g/dl) ement () AJ 11657 8,5 32 AJ 11082 7,2 29 (parente) R E V E N D I CATIONS 1. Procédé pour produire de la L-lysine par fermentation, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver en aérobiose dans un milieu de culture un mutant du genre Brevibacterium ou Corynebacterium qui résiste à l'éthylèneglycol et qui est capable de produire de la L-lysine et à récupérer la L-lysine accumulée dans le milieu de cul- ture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant appartient aux espèces Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum ou Corynebacterium acetoglutamicum. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant résiste à la S-(amino-2 éthyl)-L-cystéine. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant nécessite de la L-homosérine pour se développer.