Brevet FR2487197A2 — publié le 19820129

FR 2487197 A2 19820129 FR 7912040 A 19790511 La présenteaddition est relative à un procédé d'extraction de glycoprotéines et/ou mucopolysaccharides et substances qui les accompagnent à partir de matières naturelles, ainsi qu'aux extraits stables obtenus par ce procédé. Au brevet principal et dans ses trois additions, on a décrit un procédé d'extraction de protéines thermostables et des corps qui les accompagnent (glycoprotéines, mucopolysaccharides, sucres aminés divers, peptides thermostables, etc...) à partir d'organes, tissus ou cellules d'animaux ou humains, de végétaux ou de microorganismes ou de liquides d'origine biologique. Ce procédé comprend un broyage des matières premières d'origine naturelle énumérées ci-dessus, l'extrac- tion en une ou plusieurs étapes par utilisation d'un tampon alcalin ayant un pH compris entre 7,5 et 9,5, un chauffage ultérieur du produit d'extraction à une température comprise entre 60 et 110 OC et éventuellement une restérilisation. Ce procédé s'appliquait particulièrement au traitement de cordons ombilicaux, de placentas humains ou animaux, de salive, de lait et de moelle osseuse rouge. La poursuite de recherches portant sur l'extraction et le traitement des glycoprotéines, des mucopolysaccharides et des substances qui les accompagnent, notamment des complexes protéo-glucido-lipidiques 9u nucléiques, dans leurs associations naturelles, à partir de certains organes animaux, en particulier cerveau, placenta, etc..., a permis de simplifier et de perfectionner certains stades des procédés et de techniques antérieurement décrits au brevet principal et ses trois additions. I1 s'agit, par chauffage en milieu basique, d'éliminer les protéines thermosensibles et de conserver les substances thermostables associées; de façon naturelle à l'état de complexes. It processus dans ses aspects généraux et les buts à atteindre sont les mêmes que ceux définis au brevet principal et ses additions; les simplifications et perfectionnements techniques portent sur le traitement des organes et la préparation de leurs extraits, soit à l'état liquide, soit à l'état sec. La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'extraction et de traitement de glycoprotéines et/ou mucopolysaccharides (protéoglycane, glycosaminoglyeane) et des substances qui les accompagnent de manière naturelle (protides thermorésistants, acides nucléiques, lipides, glucides et leurs dérivés), à partir de matières biologiques, notamment de tissus d'organistes animaux, par broyage de ces matières > puis extraction en milieu tamponné basique à un pH de 7,5 à 9,5 > suivi d'un chauffage à une température de 60 à ll00C et d'une récupération de l'extrait, caractérisé en ce que le broyage des matières premières d'origine biologique est réalisé directement dans le milieu d'extraction ayant un pH compris entre 7,5 et 9,5, puis l'extrait est séparé par centrifugation ou filtration des déchets fibreux et des protéines thermosensibles qui ont précipité lors du chauffage. Ainsi, selon le procédé de la présente invention, on peut réunir en une seule étape le broyage dans un milieu d'extraction approprié qui est tamponné au pH désiré par des agents qui seront définis ci-après. Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, des matières organiques telles que des tissus d'animaux, sont lavées de leurs souillures, par exemple le sang et débarasséesde leurs enveloppes; elles sont broyées par un broyeur à grande vitesse dans un mélange tampon qui constitue le liquide d'extraction. La proportion est, par exemple, de 33 % en poids d'organes dans le tampon. Le liquide d'extraction peut être le tampon glycine 7,5 g dans l'eau distillée, quantité suffisante pour 1000 ml, auquel est ajoutée de la soude normale jusqu'à pH 8,50; ou le même tampon auquel est ajouté du phosphate disodique (0,01 M); ou encore selon les conditions : laurate de potassium à 2,5 g pour 1000 ml dans l'eau distillée, pH 8s15, ou laurate de triéthanolamine à 5 g pour 1000 ml dans l'eau distillée, pH 7,60. Le broyat ainsi obtenu est chauffé au bain-marie à au moins 600C, pendant au moins une heure, en enceinte close, avec agitation continue. Après refroidissement, ce mélange est centrifugé en continu, ou filtré, de telle sorte que soient éliminés sous forme de culot, les déchets fibreux et les matières thermosensibles qui ont été précipitées par le chauffage préalable au bain-marie. Ce broyat centrifugé est traité alors de façon à obtenir, soit un extrait liquide stérile, soit un extrait sec, comme cela est décrit ci-dessous. Dans le cas d'extrait liquide, il est préférable d' ajouter au broyat, des corps ayant un effet antioxydant, soit hydrosolubles, soit liposolubles, mais dans ce dernier cas qui puissent s'y incorporer. Parmi les nombreux corps antioxydants possibles, l'a-tocophérol est favorable. Il peut être ajouté sous forme d'huile de germes, par exemple de mais qui en est riche, et qui s'incorpore dans les extraits lipido-protéiques à la dose de 5 ml par litre, par exemple. Du propylène glycol (propanediol-1,2) peut être ajouté aussi, à la dose de 20 à 50 g par litre, par exemple. L'extrait liquide ainsi préparé est alors stérilisé à l'autoclave à 1050 pendant 30 minutes, par exemple. On obtient un liquide épais, blanc crème, homogène, onctueux, stérile, de bonne conservation. Lorsqu'il s'agit de la préparation de extrait sec, le broyat peut recevoir un antioxydant comme l'acétate du DLa-tocophérol, à la dose de 0,5 g par litre. Le broyat est alors soit désséché à 500C sous vide, par exemple, puis réduit en poudre, ou directement réduit en poudre par atomisation (nébulisation), ou encore par lyophilisation. Les poudres obtenues se conservent bien, elles ne sont pas hygroscopiques. Mais, plongées dans l'eau, elles gonflent et s'émulsionnent lentement; cette émulsion est obtenue rapidement et au mieux par dispersion par un broyeur à grande vitesse : on obtient alors des solutions-suspensions stables, qui, par exemple, à la concentration de 10 %, sont crémeuses, de pH 7,3. De plus, de telles préparations supportent sans dommage la stérilisation à l'autoclave, par exemple à 1050,pendant 30 minutes. Les préparations soit liquides, soit sèches et remises à 11 état liquide, ont les mêmes propriétés que celles décrites au brevet principal. Elles ont notamment les meil leurs effets dermatologiques et cosmétologiques : elles lubrifient, hydratent et tonifient la peau, restaurent le film protéo-glucido-lipidioue protecteur, favorisent le développement normal du collagène, augmentent le pouvoir perméant. L'augmentation de la pénétration percutanée est rendue objective et se trouve directement démontrée par rapport à des témoins, d'une part par le test du marquage des extraits considérés, d'autre part par l'analyse biochimique. Les extraits à la concentration de 30 % par exemple, cerveau-placenta, sont couplés à la peroxydase (en présence de glutaraldéhyde à 1 % en tampon phosphate, dialysés, centrifugés, séparés par chromatographie, le premier pic qui contient la fraction couplée étant concentré à froid). Les extraits ainsi marqués sont appliqués par onction douce sur la peau rasée sans irritation de l'animal testé, par exemple pendant 3 jours consécutifs, matin et soit. Un jour après la fin de ces 6 onctions, la peau ointe est prélevée et comparée à la peau témoin. L'analyse histologique montre que I1 extrait couplé à la peroxydase est précipité dans les tissus, au'il y ait ou non révélation de la peroxydase par diaminobenzidine, sous forme de fins granules noirs, depuis le seuil de la visibilité jusqu'à de petites enclaves vacuolaires noires. Or, on constate que 11 extrait a traversé l'épiderme et a pénétré très profondément dans le derme, non seulement autour des gaines pileuses, mais aussi loin d'elles, en plein tissu dermique dépourvu de gaines. Ces grains sont soit isolés, soit amassés en groupes ou plages parfois très importants. La pénétration de extrait est diune part directe, et d'autre part suit le trajet des gaines pileuses : il les traverse et se répand dans le derme. Corrélativement, par exemple chez le lapin, les analyses histologiques et par microscopie électronique, ainsi que biochimiques conjointes, montrent, après de telles onctions, avec les extraits à 30 r cerveau-placenta, par exemple 12 onctions en 6 jours, que l'épiderme est riche en mitoses et dépourvu de pycnoses, son épaisseur staecrott de 64 %, ses organelles cytoplasmiques et nucléaires étant parfaitement normales; dans le derme le réseau des fibres élastiques est riche, le collagène très développé, la largeur de ses fibres, dont la striation est normale, est augmentée de 31 , démontrant leur hydratation; corrélativement, l'augmentation du collagène acétosoluble est de 34 % et du taux d'hydroxyproline de 31 . Enfin, les augmentations relatives des taux des composants fondamentaux sont : acide désoxyribonucléique 40 %, acide ribonucléique 33 %, protéines solubles 45 %, protéines solubles thermorésistantes après chauffage à 1100C 86 %, hexoses totaux, jusqu'à 209 %. Les exemples de préparation ci-après sont donnés à titre indicatif; ils ne sont nullement limitatifs, ni en ce qui concerne les matériaux d'extraction, biologiques et chimiques, ni les modalités, ni les quantités. Ils peuvent subir, à volonté, pourvu que les buts indiqués et ci-dessus définis, soient atteints, des adaptations diverses. ExemPle 1 - Extraction à t > artir du cerveau Des cerveaux de bovins stockés à l'état congelé à -25 C, sont lavés à l'eau courante, débarassés des caillots et des méninges, puis grossièrement fragmentés. Ils sont plongés dans un liquide tampon composé de glycine 7,5 g pour 1000 ml d'eau distillée, portée à pH 8,50 par de la soude normale, à raison de 1 kg de cerveau pour 2 litres de tampon. Ils sont réduits en pulpe fine par un broyeur à grande vitesse. Cette pulpe est chauffée à 60 OC, pendant une heure, en bain-marie clos, avec agitation continue. Après refroidissement, le produit est centrifugé en continu, de façon à éliminer sous forme de culot, les déchets fibreux et les matières thermosensibles qui ont été précipitées par le chauffage. Lorsque le produit est préparé pour rester à l'état liquide, on lui ajoute un antioxydant sous forme d'huile de germe de mais, à la dose de 0,5 ml par litre; on ajoute encore 25 ml de propylène glycol par litre. Le produit est ensuite stérilisé à l'autoclave à 1050C pendant 30 minutes. Lorsque le produit est préparé pour être porté à ltétat sec, on lui ajoute 0,5 g par litre d'acétate de D La-tocophérol, puis on le soumet à la dessication par atomisation (nébulisation). La poudre obtenue peut être utilisée à l'état de solution-suspension à 10 % dans l'eau distillée, le pH final étant 7,3. Exemple 2 Le processus est le même que celui indiqué à l'exemple 1, mais le liquide d'extraction est formé de laurate de potassium à 2,5 g pour 1000 ml d'eau distillée à pH = 8,15. Exemple 3 Le processus d'extraction est réalisé comme aux exemples 1 t 2, à partir de cerveau, mais le liquide d'extraction est formé de laurate de triéthanolamine à 5 g pour 1000 ml d'eau distillée, à pH 7,60. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction et de traitement de glycoprotéines et/ou mucopolysaccharides (protéoglycan glyco- saminoglycans)et des substances qui les accompagnent de manière naturelle (protides thermorésistants, acides nucléiques, lipides, glucides et leurs dérivés), à partir de matières biologiques, notamment de tissus d'organismes animaux, par broyage de ces matières, puis extraction en milieu tamponné basique à un pH de 7,5 à g,5, suivi d'un chauffage à une température de 60 à l100C et d'une récupération de extrait, caractérisé en ce que le broyage des matières premières d'origine biologique est réalisé directement dans le milieu d'extraction ayant un pH compris entre 7,5 et 9,5, puis l'extrait est séparé par centrifugation ou filtration des déchets fibreux et des protéines thermosensibles qui ont précipité lors du chauffage. 2. Procédé selon la revendication 1, cåractérisé en ce que le milieu d'extraction est constitué d'une solution aqueuse de laurate de potassium à 2,5 g pour 1000 ml d'eau, à un pH de 8,15. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu d'extraction est constitué d'une solution aqueuse de laurate de triéthanolamine à 5 g pour 1000 ml d'eau, à pH 7,60. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on ajoute un antioxydant aux extraits. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'antixoydant est un produit riche en a-tocophérol tel que l'huile de germe de mais, ajouté à raison de 0,5 ml par litre d'extrait, ou l'acétate de Dba-tocophéro; ajouté à raison 0,5 g par litre d'extrait. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications poécédentes, caractérisé en ce qu'on ajoute à extrait liquide obtenu un corps stabilisant, tel le propylèneglycol, à raison de 25 ml par litre d'extrait, puis on stérilise à l'autoclave le mélange obtenu, 7. Procédé se'on l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'extrait liquide obtenu est porté à siccité par dessication simple ou par atomisation ou lurophilisation, pour obtenir une poudre. 8. Extrait sec ou liquide de glycoprotéines et/ou mucopolysaccharides et des substances qui les accompagnent, caractérisé en ce qu'ils sont obtenus par un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 9. Composition à usage pharmaceutique ou cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait liquide ou un extrait sec auquel on a incorporé de l'eau pour obtenir des solutions-émulsions stables.