Brevet FR2497577A1 — publié le 19820709

DISPOSITIF D'ANALYSE DE FLUIDES BIOLOGIQUES La présente invention concerne la chimie analyti- que et elle porte plus particulièrement sur des dispositifs analytiques perfectionnés pour l'analyse de liquides et en particulier de fluides biologiques tels que le sang. On connaît de nombreux systèmes d'analyse de liqui- des. Des systèmes automatisés destinés à accomplir l'analyse chimique de fluides biologiques, et en particulier l'analyse quantitative du sang, se sont avérés particulièrement avan- tageux dans les laboratoires d'analyses cliniques. Certains de ces systèmes mélangent l'échantillon à analyser avec un volume important de diluants et de réactifs pour l'analyse, tandis que d'autres systèmes analytiques emploient des élé- ments de support de réactifs sur lesquels on dépose un échan- tillon du liquide à analyser. Les brevets U.S. 3 552 928 et 4 042 335 montrent des exemples de ce dernier type de système. On a besoin de dispositifs analytiques perfection- nés qui utilisent de petites quantités de liquide et qui ne nécessitent qu'un nombre minimal d'opérations exigeant une manipulation. De plus, dans le cas du sang complet,des difficultés analytiques peuvent survenir du fait de la pré- sence de constituantsqui risquent deperturber gravement l'ana- lyse. L'invention consiste en un dispositif analytique unitaire,non réutilisable,qui comprend une structure de support pour la manipulation manuelle, une structure défi- nissant un canal de dosage à auto-remplissage et une struc- ture feuilletée qui comprend une couche de réactif et une couche filtre d'un côté de la couche de réactif. Le canal de dosage est en communication pour les fluides avec la matière réactive, par l'intermédiaire de la couche filtre, et il est limité en partie par la structure de support et en partie par la couche filtre. La couche de réactif comprend de la matière réactive dans une matrice de support et cette matière réactive constitue un réactif spécifique du consti- tuant intéressant dans le fluide à analyser. Par une seule opération simple consistant à toucher simplement une goutte du liquide avec l'entrée du canal de dosage, le dispositif analytique dose automatiquement une quantité précise du liquide et répartit cette quantité en position adjacente à la matière réactive, et la couche filtre permet le passage d'une partie du liquide de façon qu'il vienne en contact avec la matière réactive, pour réagir avec celle-ci. Dans l'utilisation pour l'analyse du sang complet, on obtient de façon simple un échantillon de sang à analy- ser en touchant une goutte de sang avec l'extrémité d'entrée du canal de dosage, le sang étant aspiré dans le canal de dosage par une action capillaire, ce qui permet de doser rapidement et commodément un échantillon de volume précis (moins de 10 mm3), à partir d'une goutte de sang, en moins de 10 s. La couche filtre retient les globules rouges dans le canal de mesure et permet seulement à la partie consti- tuant le plasma ou le sérum d'entrer en contact avec la cou- che de réactif, ce qui minimise l'effet d'hématocrite, c'est-à-dire l'effet des globules rouges. Le changement détectable qui en résulte dans la couche de réactif est détecté du c8té opposé du dispositif et est mesuré, habi- tuellement au moyen d'un dispositif spectrophotométrique. Dans un mode de réalisation particulier, on mesure l'inten- sité de couleur développée par une réaction spécifique entre le réactif chimique et un constituant intéressant dans le sang, en procédant par densitométrie par réflexion, tandis que dans un autre mode de réalisation, on utilise la fluo- rescence par réflexion pour mesurer le changement détectable. Dans des modes de réalisation particuliers, le canal de dosage du dispositif analytique comporte un orifice de mise à l'air libre à l'extrémité du canal opposée à son extrémité d'entrée, de façon que l'air s'échappe du canal au fur et à mesure que le liquide échantillon pénètre dans le canal; la structure de support est un substrat transpa- rent, de façon qu'on puisse observer visuellement le liquide échantillon qui se trouve dans le canal de dosage; la cou- che filtre de la structure feuilletée comprend une membrane à micro-pores, avec des pores d'une taille inférieure à 1 pm; une surface réfléchissante est établie entre la mem- brane filtre et la couche de réactif pour réfléchir un faisceau de rayonnement qui tombe sur la couche de réactif et la matière réactive comprend de l'oxydase de 'glucose, de la peroxydase, et une composition indicatrice comprenant un composé oxydable en présence de peroxyde d'hydrogène et de peroxydase, pour former un colorant. La structure feuilletée peut également comprendre un élément protecteur qui recouvre la couche de réàctif et qui comporte une région d'observa- tion de réactif. Dans un mode de réalisation particulier, on obtient une répartition plus uniforme du plasma dans la couche de réactif grâce à des régions de canal supplémen- taires allongées qui s'étendent le long des côtés du canal de dosage central. Des dispositifs analytiques conformes à l'inven- tion peuvent être adaptés pour la réalisation d'une grande variété d'analyses chimiques, non seulement dans le domaine de la chimie médicale, mais également dans la recherche chi- mique et dans les laboratoires de surveillance de processus chimiques. Dans le domaine de l'analyse sanguine, par exem- ple, le dispositif analytique peut être adapté pour la réa- lisation d'analyses quantitatives d'un grand nombre des cons- tituants du sang qu'on mesure de façon courante. Le disposi- tif peut par exemple être adapté aisément pour l'utilisation dans l'analyse-de constituants du sang tels que la créatini- ne, l'acide lactique, l'azote de l'urée, le glucose, ainsi que de nombreux autres constituants, par un choix approprié du réactif ou d'autres matières interactives. On voit donc que de nombreux dispositifs analytiques différents, en fonction de l'analyse particulière, peuvent M. tre préparés conformément à l'invention. On peut donner à ces dispositifs diverses formes et on peut adapter des dispositifs particu- liers à différents types de tests. L'invention permet un dosage et un positionnement précis d'un échantillon à analyser qui peut être obtenu directement à partir de la source de liquide, sans aucune opération de manipulation intermédiaire, le canal étant empli de façon caractéristique en moins de quatre secondes. Le dispositif répartit l'échantillon de façon uniforme dans la zone de dosage pour l'exposer à la matière réactive, et on peut voir la position de l'échantillon de sang dans le canal à travers le substrat de support. La membrane filtre isole la couche de réactif vis-à-vis de constituants suscep- tibles de produire des perturbations, comme des structures cellulaires de l'échantillon de sang à analyser. Le canal de dosage peut comporter des régions adjacentes destinées à améliorer la répartition des constituants de l'échantillon de sang par rapport à une région de mesure optique. L'invention permet de disposer d'un système d'ana- lyse chimique simple et fiable, convenant à l'utilisation manuelle, dans lequel une très petite quantité de liquide à analyser est dosée avec précision, filtrée et positionnée pour la réaction et la mesure en une seule opération de manipulation simple. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre de modes de réalisation, donnés à titre non limitatif. La suite de la description se réfère aux dessins annexés sur lesquels: La figure 1 est une vue en perspective d'un dispo- sitif analytique conforme à l'invention; La figure 2 est une vue en plan de l'élément de support du dispositif représenté sur la figure 1; La figure 3 est une vue en perspective agrandie de la partie de pointe de prélèvement d'échantillon du dis- positif de la figure 1; La figure 4 est une représentation en perspective éclatée des éléments du dispositif de la figure 1; La figure 5 est une coupe selon la ligne 5-5 de la figure 1; La figure 6 est une vue en perspective, similaire à la figure 1, d'un autre dispositif analytique conforme à l'invention; La figure 7 est une représentation schématiqueen perspective éclatée,d'éléments du dispositif représenté sur la figure 6; La figure 8 est une vue en perspective d'un autre dispositif analytique conforme à l'invention; La figure 9 est une vue d'extrémité du dispositif analytique représenté sur la figure 8; La figure 10 est une coupe selon la ligne 10-10 de la figure 8; et La figure 11 est une représentation schématique,en perspective éclatée,d'éléments du dispositif représenté sur la figure 8. Le dispositif analytique représenté sur la figure 1 comprend un support transparent 10 en résine acrylique qui a une épaisseur d'environ 1,25 mm, une largeur d'environ 2,5 cm et une longueur d'environ 2,25 cm. Une pointe de pré- lèvement d'échantillon 12 qui se trouve sur la paroi avant 14 du substrat 10 présente une configuration triangulaire et fait saillie vers l'avant sur environ 1 mm à partir de la paroi avant 14. Une cavité de canal de dosage 16 est formée dans le substrat 10 et s'étend vers l'arrière à partir de la pointe de prélèvement d'échantillon 12 (comme le montrent les figures 2, 3 et 4), et cette cavité a une largeur d'envi- ron 0,8 mm, une profondeur (à partir de la surface supérieure 18 du substrat 10) d'environ 0,7 mm et une longueur d'environ 1 cm. La cavité de canal de dosage 16, qui définit un volume d'environ 5 mm3, est définie par des parois latérales 20 (séparées par une distance d'environ 0,8 mm) et une surface inférieure 22 (située à environ 0,7 mm au-dessous de la sur- face supérieure 18). Des canaux auxiliaires 24,qui s'étendent de chaque côté du canal 16,sont définis par des parois laté- rales 26 (séparées par une distance d'environ 2,2 mm) et par une surface inférieure 28 (située à environ 0,4 mm au-dessous de la surface supérieure 18). Une cavité 30 (définie par des parois latérales 32 et une surface inférieure 34) est formée dans la partie avant de la surface 18 et elle mesure environ 0,9 cm de côté, avec une profondeur d'environ 0,33 mm. Une fente 36 qui mesure environ 1 cm de longueur s'étend vers l'arrière sous la forme d'un prolongement du canal 16. Une membrane feuilletée 40 est positionnée dans la cavité 30 au moyen de bandes adhésives à double face, 38, et cette membrane comprend, comme l'indique la figure 5, une couche filtre 42, une couche de réactif intermédiaire 44 et une couche supérieure protectrice transparente 46. Une bande adhésive opaque 48 recouvre la structure feuilletée 40 de façon à la protéger et à la fixer dans la cavité 30. Une fenêtre d'observation 52 (d'environ 0,25 cm de largeur et 0,5 cm de longueur) met à nu la surface supérieure de la couche transparente 46 au-dessus du canal de dosage 16. Les éléments constitutifs de la structure feuille- tée 40 et de ses diverses couches dépendent de l'utilisation analytique prévue. Dans un mode de réalisation particulier pour l'analyse du glucose, la couche filtre 42 est une mem- brane filtre du type VCWP de la firme Millipore Corporation, ayant une porosité d'environ 74%, avec une taille de pore moyenne de 0,1 pm et une épaisseur d'environ 0,1 mm. La cou- che de réactif 44 comprend les substances suivantes, dans une matrice de gélatine: oxydase de glucose, 4-amino anti- pyrine, 2-(N-éthyl-m-toluidino)-éthanol et peroxydase; et cette couche a une épaisseur d'environ 0,02 mm. La couche 46 est un film de polyester (téréphtalate de polyéthylène) d'environ 0,1 mm d'épaisseur. On dépose un mélange gélatine- réactif sous la forme d'un revêtement sur le film 46, et, après lissage, on place la membrane filtre 42 au sommet de la couche de réactif 44, avec le côté mat de la couche filtre 42 face à la couche de réactif 44. On fixe la struc- ture feuilletée 40 résultante dans la cavité 30 au moyen de la bande adhésive à double face 38 et de la bande adhésive opaque 48. Pour l'utilisation, on obtient une goutte de sang, par exemple en piquant le bout du doigt ou le talon d'un patient avec une lancette, on extrait un dispositif analyti- que de son enveloppe protectrice 52, et on touche la goutte de sang avec l'orifice d'entrée du canal de dosage 7 de ce dispositif, au niveau de la pointe 12. Le sang est aspiré dans le canal de dosage 7 par action capillaire, et le canal s'emplit de sang en une durée qui est de façon caractéristi- que inférieure à quatre secondes. On soumet ensuite le dis- positif analytique chargé à une incubation pendant une durée prédéterminée. Le plasma traverse la membrane filtre 42 pour atteindre la couche de réactif 44, tandis que cette membrane filtre empêche le passage des globules. Lorsque le sang sèche, il y a tendance à avoir une migration des globules vers les canaux de répartition auxiliaires 24, ce qui produit une répartition plus uniforme du plasma dans la couche de réactif. Dans la couche 44, en principe, le glucose est tout d'abord oxydé par l'oxydase de glucose, ce qui conduit à une formation stoechiométrique de peroxyde d'hydrogène,. qui produit alors un pigment pourpre en réagissant avec la 4-amino antipyrine et le 2-(N-éthyl-m- toluidino)-éthanol en présence de peroxydase. La surface supérieure de la couche filtre 42 est réfléchissante et la couche de support 46 est transparente. Ainsi, la couleur produite peut être mesurée par un densitomètre à réflexion, soit manuellement,soit auto- matiquement, le faisceau de détection du densitomètre étant dirigé de façon à traverser la fenêtre d'observation 50 pour effectuer la mesure portant sur la couche de réactif 44. Le système mesure les concentrations de glucose dans la plage de 0 à 4 g/l. Les figures 6 et 7 représentent une seconde forme de dispositif analytique. Ce dispositif analytique comporte un support 10' équipé d'un sous-ensemble rapporté 60 ayant la forme qui est représentée sur la figure 7. Ce sous-ensemble rapporté 60 est détaché d'une structure en bande qui com- prend une bande de base 62 en matière plastique acrylique transparente,qui a une largeur d'environ 1,6 cm et qui com- porte des surfaces 22', 28' et 34' définissant une cavité de configuration similaire à celle du mode de réalisation des figures 1-5. Une bande feuilletée de réactif 64 est fixée sur les surfaces 34' de la bande 62 par des moyens de fixation appropriés et cette bande 64 comporte une couche supérieure transparente 46', une couche de filtre inférieure 42' et une couche de réactif intermédiaire 44'. Cette structure de bande formée par la base 62 et la bande de réactif 64 est découpée pour former une série de sous- ensembles rapportés 60, ayant chacun une longueur d'environ 0,9 cm. Le support de manipulation 10' comporte une cavité 66 qui est définie par des parois latérales 68 (séparées par une distance d'environ 1,6 cm) et des surfaces de support 70 (ayant chacune une largeur d'environ 1 mm). Le sous-ensemble rapporté 60 est appliqué sur les surfaces de support 70 et il est fixé par une fouille protectrice de recouvrement 48', comme l'indique la figure 6. Une encoche 72 définit un ori- fice de mise à l'air libre en communication avec l'extrémité du canal de dosage 16' qui est éloignée de son extrémité d'entrée. On utilise le dispositif analytique représenté sur les figures 6 et 7 d'une manière similaire à celle selon laquelle on utilise le dispositif analytique des figures 1-5. On touche la goutte de sang ou d'autre liquide à analy- ser avec l'extrémité d'entrée 74 du canal de dosage 16', ce liquide est introduit dans le canal en quantité détermi- née par action capillaire, et il est placé en alignement avec la fenêtre d'observation 50' pour donner lieu à une interaction avec les réactifs contenus dans la couche 44'. Les figures 8 à 11 représentent encore une autre forme de dispositif analytique. Ce dispositif analytique est logé dans une enveloppe protectrice 52" et il comporte une bande de support transparente 10",qui a une longueur d'envi- ron 7,5 cm, une largeur d'environ 0,9 cm et une épaisseur d'environ 0,8 mm. Un sous-ensemble de mesure 80,situé à une extrémité de la bande de support 10",comporte une structure qui définit un canal de dosage 16", avec un orifice d'entrée rectangulaire 74',qui mesure environ 1,9 mm de largeur et environ 0,3 mm de hauteur, et un orifice de mise à l'air libre 72' (figure 10) de mêmes dimensions. Les parois latéra- les du canal 16" sont définies par des éléments de limitation de canal 84, 86, chacun d'eux consistant en une bande médica- le à base de polyester revêtue d'adhésif sur ses deux faces (type nO 193 de la firme Minnesota Mining and Manufacturing Co.) qui a une épaisseur d'environ 0,3 mm. On peut ajuster la forme du canal 16" en utilisant d'autres épaisseurs de bande. Chaque élément 84, 86 (figure 11) comporte des surfaces planes de limitation de canal d'entrée et de sortie, 22", qui sont reliées par une surface courbe en retrait 88. Les éléments 84, 86 sont disposés sur le support 10" de façon que les surfaces 22" soient séparées par une distance de 1,9 mm. Les surfaces courbes en retrait 88 définissent une région d'analyse cir- culaire 82 d'environ 4,4 mm de diamètre. Un sous-ensemble de réactif à structure feuilletée, 40" est appliqué sur les éléments 84, 86, consistant en bandes adhésives double face, et il est fixé à ces éléments. Le sous-ensemble 40" comprend une couche filtre 42" consistant en fibres synthétiques hydrophiles (de la marque "Celguard" de la firme Celanese Corporation) ayant des ouvertures d'une taille d'environ 0,2 - 0,4 pim, avec une épaisseur d'environ 0,02 mm; une couche réfléchissante intermédiaire 90, du type dioxyde de titane-gélatine, d'environ 0,05 mm d'épaisseur; et une couche de réactif. 44" de moins de 0,02 mm d'épaisseur. La couche réfléchissante de dioxyde de titane-gélatine 90 et la couche de réactif -gélatine 44" sont coulées sur la cou- che filtre 42" et sont réalisées sous la forme d'une bande allongée 64' à partir de laquelle on peut détacher des sous- ensembles de réactif' 40" pour obtenir des sous-ensembles de réactif individuels, ayant chacun une longueur d'environ 0,9 cm. Une bande de vinyle adhésive et opaque 48" recouvre le sous-ensemble à structure feuilletée 40" et elle comporte une fenêtre d'observation circulaire 50" d'environ 0,4 cm de diamètre qui met à nu la surface supérieure de la couche de réactif 44", au-dessus du canal de dosage 16". Dans ce mode de réalisation particulier, le canal de dosage 16" a un volume total d'environ 7,2 mm. Comme l'indique la figure 11, les éléments de limitation de canal 84, 86 et la bande de recouvrement 48" peuvent être supportés par des bandes de support respectives 92 et 94 au moyen d'un adhésif, et détachés ensuite de ces bandes. Les dispositifs analytiques représentés sur les figures 6 à 11 sont utilisés d'une manière similaire à celle du dispositif analytique des figures 1 à 5. On touche la goutte de sang ou d'autre liquide à analyser avec l'extrémi- té d'entrée 74, 74' du canal de dosage 16', 16", ce liquide est introduit dans le canal en quantité déterminée par action capillaire, et il est placé en alignement avec la fenêtre d'observation 50', 50", pour donner lieu à une interaction avec les réactifs contenus dans la couche 44', 44" et permettre une mesurepar exemple par densitométrie par réflexion. Dans chacun de ces modes de réalisation, la cou- che de réactif peut prendre diverses formes, en fonction du type d'analyse, elle peut être séparée du canal de dosage par plus d'une couche intermédiaire, et elle peut par exem- ple réagir avec un constituant du liquide à analyser ou avec un produit de réaction de ce constituant. On peut utiliser diverses techniques d'analyse, parmi lesquelles, par exemple, les types d'analyses faisant intervenir les vitesses de réaction et les conditions finales après réaction. Les com- posants d'une couche particulière dépendent de l'utilisation à laquelle le dispositif analytique est destiné. Ainsi, un dispositif analytique unitaire corres- pondant à l'invention permet de prélever lui-même un échan- tillon, et l'échantillon prélevé est visible d'un côté du dispositif tandis que les résultats de réaction apparaissent du côté opposé. Les dispositifs analytiques peuvent être adaptés pour la mise en oeuvre d'une grande variété d'analy- ses chimiques et ils sont particulièrement utiles dans le domaine de la chimie clinique et pour le test ou l'analyse de fluides biologiques, en permettant de disposer des résultats des tests peu de temps après le prélèvement d'un échantillon. Il va de soi que de nombreuses modifications peuvent être apportées au dispositif décrit et représenté, sans sortir du cadre de l'invention. il REVENDICATIONS 1. Dispositif d'analyse de fluides biologiques et similaires comprenant une structure feuilletée qui comporte une couche de réactif (44, 44', 44") qui contient une matière réactive dans une matrice de support, et une couche filtre (42, 42', 42") d'un c8té de la couche de réactif, cette matière réactive réagissant de façon spécifique avec un constituant intéressant du fluide à analyser, caractérisé en ce qu'il comporte une structure de support (10, 10', 10") destinée à la manipulation manuelle et sur laquelle la structure feuilletée est fixée, et une structure définissant un canal de dosage (16, 16', 161') de dimensions capillaires et s'emplissant automatiquement, ce canal de dosage étant limité en partie par la couche filtre et en partie par la structure de support, de façon à être en communication sélective avec la matière réactive, à travers la couche filtre. 2. Dispositif selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le canal de dosage comporte une extrémité d'entrée (74) et un orifice de mise à l'air libre (72) distant de l'extrémité d'entrée. 3. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 1 ou 2, caractérisé en ce que la structure de support (10, 10', 10") est transparente, ce qui permet d'observer la position de l'échantillon à analyser dans le canal de dosage. 4. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que le volume du canal de dosage (16, 16', 16") est inférieur à 10 mm3. 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisé en ce que la structure feuille- tée comporte en outre une région d'observation de réactif (50, 50', 50") du côté de la couche de réactif qui est opposé à la couche filtre. 6. Dispositif selon la revendication 5, caractéri- sé en ce que la structure feuilletée comprend des moyens réfléchissants (90),adjacents au côté de la couche de réac- tif qui fait face à la couche filtre, et ces moyens réfléchissants réfléchissent,vers la région d'observation de réactif, le rayonnement qui tombe sur la couche de réactif au niveau de cette région d'observation, en vue de la détection par un appareil de mesure. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6, pour l'analyse du sang complet, caractérisé en ce que la couche filtre (42, 42', 42") est en un poly- mère et comporte des pores d'une taille inférieure à 1 pm. 8. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 7, caractérisé en ce que la matière réactive comprend de l'oxydase de glucose, de la peroxydase et une composition indicatrice qui comprend un composé oxydable en présence de peroxyde d'hydrogène et de peroxydase, pour former un colorant. 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte une struc- ture qui définit un canal de répartition (24),de profondeur inférieure à celle du canal de dosage (16),qui s'étend de part et d'autre du canal de dosage pour contribuer à la répartition des composants du sang complet dans la région de mesure. 10. Dispositif selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte une struc- ture à pointe (12) destinée à venir en contact avec le fluide à analyser, qui fait saillie à partir de l'extrémité d'entrée du canal de dosage.