Brevet FR2491086A1 — publié le 19820402

La présente invention concerne un procédé pour produire des bactéries ayant une forte activité nitrilasique. Ces dernières années, par suite des progrès rapides dans les domaines des enzymes immobilisées et des microbes immobilisés, on a beaucoup tenté d'utiliser des microbes ou des enzymes pour catalyser diverses réactions. On sait que la nitrilase est une enzyme qui hydrate les nitriles pour former les amides correspondants. Comme exemples typiques de telles réactions, on indique que des bactéries du genre Corynebacterium et du genre Nocardia dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 4 248 968 et des bactéries du genre Bacillus, du genre Bacteridium au sens de Prévot, du genre Micrococcus et du genre Brevibacterium au sens de Bergey dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 4 001 081 ont une telle activité nitrilasique et hydratent l'acrylonitrile pour former de l'acrylamide. A la suite d'études importantes portant sur un procédé pour produire des bactéries ayant une forte activité nitrilasique avec un rendement élevé pour la production industrielle de ces sources d'enzyme, la demanderesse a découvert que le rendement en nitrilase s'accroit remarquablement lorsqu'on incube les bactéries précédemment décrites avec un milieu de culture contenant un composé de fer soluble dans l'eau. L'invention concerne donc un procédé pour produire des bactéries ayant une forte activité nitrilasique qui comprend l'incu- bation de bactéries capables de produire la nitrilase, présentant le perfectionnement qui consiste à utiliser un milieu de culture conte- nant un composé de fer soluble dans l'eau. Comme bactéries utilisées dans la présente invention, on peut utiliser toute bactérie quelle que soit sa classification taxo- nomique sous réserve qu'elle soit capable d'hydrater l'acrylonitrile pour former de l'acrylamide. On peut en citer comme exemples préférés Corynebacterium souche N-771 (n0 de dépôt à l'Institut de Recherche sur les Fermentations (FERM NO 4445), Corynebacterium souche N-774 (FERM NI 4446) et Nocardia souche N-775 (FERM N0 4447) décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique nô 4 248 968 précité. Le compose de fer soluble dans l'eau utilis4 dans l'inven- tion est choisi parmi les sels de fer minéraux et organiques et les 2 4 9 1 c 8 6 complexes organiques du fer. On peut en citer comme exemples des sels minéraux tels que les sulfates, chlorhydrates, etc. et des sels organiques tels que les acétates, fumarates, etc. du fer divalent ou du fer trivalent, et des complexes organiques du fer, composés d'acide citrique, d'acide tartrique et d'acide éthylènediaminotétraacétique ou d'acide nitrilotriacétique et de fer. On préfère particulièrement, pour accroître l'activité enzymatique des bactéries, utiliser des complexes organiques de fer de façon que le fer soit présent dans le milieu de culture sous forme d'un complexe organique, La quantité de ces composés de fer que l'on ajoute au milieu de culture est généralement d'au moins 0> 2 mg/l et de préférence de 0,2 à 500 mg/l et mieux de 1 à 100 mg/l en fer, bien que l'on puisse observer l'effet pour l'addition d'une quantité inférieure à 0,2 mg/l. Plus particulièrement, pour mettre en pratique le procédé de l'invention, on incube une souche des bactéries précédemment décrites avec un milieu de culture comprenant des sources de carbone telles que le glucose, le maltose, le saccharose, etc., des sources d'azote telles que l'ammoniac, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'urée, etc., des substances nutritives organiques telles que l'extrait de levure, l'extrait de viande, l'extrait de malt, l'hydrolysat de caséine, la peptone, etc. et des substances nutritives minérales telles que des sels d'acide phosphorique, des sels de potassium, des sels de magnésium et d'autres sels métalliques, comme substances minérales secondaires, etc. Il est nécessaire d'ajouter aux substances précitées, un composé de fer soluble dans l'eaucomme précédemment décrit, pour accroître l'activité nitrilasique des bactéries. On effectue généralement la culture à une température de 25 à 300C à un pH de 5 à 8 et en condi- tions aérobies pendant 30 à 100 heures. L'invention est illustrée de façon plus détaillée par les exemples non limitatifs suivants. Dans les exemples, on mesure l'activité enzymatique nitrilasique d'hydratation de l'acrynonitrile selon le procédé suivant. On sépare les bactéries du milieu de culture par centrifu- gation et on les lave avec une solution de tampon phosphate 0,05 M (pH 7,5) pour obtenir des cellules bactériennes lavées. En les uti- lisant comme source d'enzyme, on ajoute une quantité appropriée d'une solution d'enzyme (cellules lavées: a 5 mg) à 5 ml d'une solution de tampon phosphate 0,05 M (pH 7,5) contenant 2,5 % d'acrylonitrile. Après avoir porté le volume total à 10 ml avec la solution de tampon phosphate précédemment décrite, on fait réagir à 10 C pendant 10 min. On mesure quantitativement par chromatographie gazeuse l'acryloni- trile formé dans cette réaction et on prend comme unité le poids exprimé en mg (milligrammes) de bactéries formant 1/umol d'acrylamide par min dans les conditions décrites ci-dessus. Les pourcentages pondéraux des exemples sont exprimés en poids. EXEMPLE 1 On place dans des tubes à essai de taille moyenne des portions de 10 ml d'un milieu de base (pH 7,5) constitué de 1 % de glucose, 0,5 % de sulfate d'ammonium, 0,1 % de phosphate monopotas- sique, 0,1 % de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,01 % de chlo- rure de sodium, 0,01 % de chlorure de calcium dihydraté, 0,000004 % de sulfate cuivrique pentahydraté, 0,00001 % d'iodure de potassium, 0,00002 % de chlorure ferrique hexahydraté, 0,00004 % de sulfate de manganèse tétrahydraté, 0,00002 % de molybdate de sodium dihydraté, 0,00004 % de sulfate de zinc hexahydraté, 1 % de Casamino acid (produit par D i f c o Laboratories, Etats-Unis d' Amérique) et 0,0002 % de chlorhydrate de thiamine. On ajoute du sulfate ferreux ou du sulfate ferrique en une quantité comprise entre 0 et 500 mg/1 en fer soluble, comme indiqué dans le tableau I et on stérilise les échantillons ainsi préparés à 120 C pendant 15 min. Après refroidis- sement, on ajoute du carbonate de calcium stérilisé à raison de 2 % pour ajuster le pH. On ajoute 0,05 ml d'un milieu de culture de Coryne- bacterium souche N-774 (FERM N 4446) que l'on a préalablement incubé dans le milieu de culture précédemment décrit (contenant 0,001 % de sulfate ferreux) et on cultive en agitant à 30 C pendant 3 jours. Après achèvement de la culture, on sépare les bactéries par centrifu- gation et on lave avec une solution de tampon phosphate 0,05 M (pH 7,5) pour obtenir des cellules bactériennes lavées. Avec ces cellules bactériennes lavées, on mesure l'activité enzymatique nitri- lasique d'hydratation de l'acrylonitrile. Les résultats figurent dans le tableau I ci-après. Comme le montre le tableau I, dan# lP eas o l'on n'a pas ajouté le composé de fer soluble dans l'eau au milieu de culture de 2491C86 base, la production de l'enzyme se produit à peine, bien que la croissance des bactéries soit bonne. On voit également que l'acti- vité enzymatique des bactéries s'accroit beaucoup en présence du composé de fer soluble dans l'eau et qu'une quantité importante d'enzyme est produite à l'intérieur des bactéries. EXEMPLE 2 On introduit des portions de 10 ml du milieu de culture de base utilisé dans l'exemple 1, dans quatre tubes à essai de taille moyenne. Ensuite on ajoute respectivement rien, du sulfate ferreux, du citrate ferrique ou le complexe sodium éthylènediaminotétraacétato- fer puis on stérilise à 1200C pendant 15 min. Aprèq refroidissement on ajoute du carbonate de calcium stérilisé à raison de 2 % pour ajuster le pH, on ajoute 0,05 ml du milieu de culture de Corynebac- terium souche N-774 (FERM N0 4446) utilisé dans l'exemple 1 et on cultive en agitant à 300C pendant 3 jours. Après achèvement de la culture, on sépare les bactéries comme dans l'exemple 1 et on en mesure l'activité enzymatique comme dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau II ci-après. Comme le montre le tableau Il ci-après, le rendement de l'enzyme s'accroit considérablement lorsqu'on incube les bactéries avec un milieu de culture auquel on a ajouté le composé de fer soluble dans l'eau par rapport au cas o on incube les bactéries dans le milieu de culture sans addition. On voit que la présence de l'ion fer sous forme d'un complexe organique est particulièrement efficace. EXEMPLE 3 On introduit dans six tubes à essai des portions de 10 ml d'un milieu de culture (pH 7,5) constitué de 1,0 % de glucose, 0,5 % de peptone, 0,3 % d'extrait de levure, et 0,3 % d'extrait de malt. On ajoute du sulfate ferreux à trois des tubes à raison de 2 mg/i en fer soluble puis on stérilise à 1200C pendant 15 min. Après refroidisse- ment, on ajoute aux tubes à essai, comme indiqué, 0,05 ml d'un milieu de culture de Corynebacterium souche N-774 (FERM NO 4446), de Nocardia souche N-775 (FERM NO 4447) ou de Brevibacterium impériale IAM 1654; obtenu par incubation préalable (avec le milieu de culture précédem- ment décrit auquel on n'a pas ajouté le composé de fer soluble dans l'eau) et on cultive en agitant à 300C pendant 48 heures. Après achèvement de la culture, on sépare les bactéries et on mesure leur activité enzymatique comme dans l'exemple 1. Les résultats figurent dans le tableau III ci-après. Comme le montre le tableau III, les bactéries incubées dans le milieu de culture auquel on a ajouté le composé de fer soluble dans l'eau présentent une activité enzymatique accrue par rapport aux bactéries incubées avec le même milieu de culture sans addition d'un composé de fer soluble dans l'eau, une quantité importante de l'enzyme étant produite à l'intérieur'des bactéries. TABLEAU I Composé de fer soluble dans l'eau Quantité ajoutée Croissance Activité enzymatique (ion Fe mg/l) cellulaire (unités/mg de cellules) (mg/ml) Pas d'addition (témoin) 5,29 0,1 Sulfate ferreux 0,05 4,83 0,2 0,2 5,06 3,9 0,5 5,16 25,9 1,0 5,66 36,4 2,0 5,33 38,7 5,66 38,6 5,82 43,7 5,58 43,0 5,58 43,1 500 5,33 42,8 Sulfate ferrique 1,0 5,06 38,4 2,0 5,29 40,6 5,16 42,2 TABLEAU II Composé de fer soluble dans l'eau Quantité ajoutée Croissance Activité enzymatique Agent (ion Fe mg/l) cellulaire (unités/mg de cellules) (mg/ml) pas d'addition (témoin) 5,29 0,1 Sulfate ferreux 10 5,66 38,7 Citrate ferrique 11 5,66 53,3 Complexe sodium éthylènediamino- tétraacéto-fer 16 5,33 54,4 TABLEAU III Quantité de sulfate Croissance Activité enzymatique Microorganisme ferreux ajoutée cellulaire (unAcités/mg de cellules) (ion Fe mg/1) (nmg/ml) itsmg de cellules) Corynebacterium N-774 0 5,37 23,9 2 5,34 38,2 Nocardia N-775 O 4,96 7,8 2 5,04 15,2 Brevibacterium imperiale 0 4,63 0,3 2 4,54 1,5 ,, ,,,,= Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir de cadre de l'invention. 2 49 108 6 REVENDICATIONS 1. Procédé pour produire des bactéries ayant une forte activité nitrilasique, comprenant l'incubation de bactéries capables de produire la nitrilase, caractérisé en ce qu'on utilise un milieu de culture contenant un composé de fer soluble dans l'eau à raison d'au moins 0,2 mg/I en fer. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit le composé de fer soluble dans l'eau parmi les sels de fer minéraux et organiques et les complexes organiques du fer. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient le composé de fer soluble dans l'eau à raison de 0,2 à 500 mg/l en fer. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'incubation à un pH de 5 à 8. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient le composé de fer soluble dans l'eau à raison de 1 à 100 mg/l en fer.