Brevet FR2490240A1 — publié le 19820319

On connais divers procédés de production de L-aminoacides par réactions enzymatiques avec le substrat approprié (c'est-à-dire précurseur). Par exemple, la L-alanine peut être préparée mettant en culture un micro-organisme produisant la décarboxylase de l'acide L-aspartique dans un milieu nutritif et en faisant réagir le bouillon de culture avec de l'acide L-aspartique (Publication du Brevet Japonais No. 7560/1971). Alternativement, on peut préparer la L-alanine en extrayant l'aspartate décarboxylase d'un micro-organisme en faisant réagir l'enzyme avec le L-aspartate (voir par exemple Biochimica et BioPhysica Acta, volume 67 (1963). L'acide L-aspartique peut être produit par des processus semblables. On peut par exemple se référer aux Brevets US Nos. 2,927,057 2,971,890 ; 3,198,712 ; 3,214,345 ; 3,310,475 ; 3,999,586 4,013,508 ; 4,048,018 ; au Brevet Britannique No. 880,234 et au Brevet Canadien No. 697,310. Dans le Brevet US No. 3,214,345 sont employées des cellules de E. Coli pour produire l'acide L-aspartique à partir de fumarate d'ammonium. Cependant, Les L-aminoacides produits selon ces procédés sont inévitablement contaminés par l'enzyme, les cellules microbiennes, les sources d'aliment du milieu et/ou des protéines. En conséquence, afin de préparer des L-aminoacides de haute pureté, il faut des étapes supplémentaires pour retirer l'enzyme et d'autres contaminants de la réaction.Fréquemment, quand la réaction est terminée, on fait bouillir la solution réactionnelle et/ou on l'acidifie pour précipiter l'enzyme ou le micro-organisme et le précipité est enlevé par filtration. Ainsi, on ne peut utiliser l'enzyme ou le micro-organisme qu'une seule fois et ensuite on doit le jeter. Pour surmonter les inconvénients ci-dessus, on a suggéré une encapsulation des micro-organismes dans des véhicules polymériques. On peut par exemple se référer au Brevet US No. 3 898 128 qui décrit l'encapsulation dans des membranes semi-perméables en polyacrylamide. On peut également voir le Brevet US No. 3 458 400 décrivant la conversion enzymatique de l'acide L-aspartique en L-alanine en utilisant Pseudomonas dacunhae ou Achromobacter pestifer, comme sources d'aspartate décarboxylase.Dans la publication du Brevet Japonais No. 6 870/1970 est décrite la liaison de l'aspartase à un polysaccharide adsorbant échangeur d'anions. Dans la publication du Brevet Japonais No. 17 587/1970, des polyacrylates sont utilisés pour encapsuler des micro-organismes produisant l'aspartase pour la production de l'acide L-aspartique. On peut également se référer aux Brevets US Nos. 3 649 457 3 791 926 et 3 898 128. L'utilisation de carroghenine comme véhicule est décrite par Sato dans Biochemica et Biophysica Acta, 570, 179-186 (1979).Dans les publications desBrevetsRussesSU 423 976 et SU 451 483 est décrite l'immobilisation de cellules de E. coli dans des gels de polyacrylamide, et 1a production d'acide L-aspartique à partir de fumarate d'ammonium. L'encapsulation des micro-organismes dans des mousses de polyuréthandhydrophile a également été suggérée. On peut voir le Brevet US No. 3 905-923 (Klug) et la demande de Brevet US No. 362 488 (déposée le 21 Mai 1973) de Louis L. Wood et autres, intitulée "Preparation and Use of Enzymes Bound to Polyurethane". La liaison des enzymes au polyuréthane est également décrite dans le Brevet US No. 3672 955 (Stanley), en particulier à la colonne 5, lignes27-35. Des polymères hydrophiles ont également été utilisés comme véhicule pour des produits chimiques, comme des bactériostats et des fongicides. On peut voir le Brevet US No. 3 975 350 (Hudgin). On sait également immobiliser les cellules bactériennes dans des polyuréthanes hydrophobes.On peut par exemple voir l'exemple 4 du Brevet Britannique No. 953 414. L'immobilisation d'un grand nombre d'enzymes dans des polyuréthanes hydrophiles est également décrite dans la demande de Brevet US No. 849 999 (Hartdegen et autres) déposée le 9 Novembre 1977 et intitulée "Immobilized Biological Material". On peut citer comme autres références intéressantes Sonomoto et autres (Anric. Biol. Chem., 44(5), 1119-1126, 1980), où des conversions de stéroides sont accomplies en utilisant des cellules bactériennes piégées dans des polyuréthanes préparés à partir de prépolymères d'uréthane. Fukui et autres (Biochimie, 1980, 62, 381-386) décrivent l'utilisation d'enzymes immobilisés dans des prépolymères photo-réticulables et des prépolymères d'uréthane pour préparer des L-amlnoacides. L'immobilisation de cellules bactériennes en utilisant des prépolymères d'uréthane est également décrite. A une "Gordon Research Conference" récréée (11-15 Août 1980), l'immobilisation de cellules entières (c'est-à-dire E. Coli produit génétiquement contenant de grandes quantités de pénicilline amidase) en utilisant des prépolymères d'uréthane a été discuté3 Des systèmes de biotransformation ont également été mentionnés comme "sous évaluation" pour la préparation de L-sérine et de L-tryptophane. La présente invention concerne une mousse de poly éthertolyuréthane hydrophile où au moins 50% en mole des unités d'oxyde d'alcoylène dans les segments de polyéther du polyuréthane sont de l'oxyde d'éthylène, cette mousse ayant un micro-organisme produisant du L-aminoacide qui y est immobilisé. Le terme "micro-organisme produisant du L-aminoacide" est destiné à désigner des micro-organismes qui, quand ils sont mis en contact avec un substrat, convertissent le substrat en un L-aminoacide. La présente invention s'applique à la fois aux organismes qui produisent les enzymes appropriés par voie intracellulaire et/ou extracellulaire. Un exemple spécifique de l'invention est la conversion de l'acide L-aspartique (ici, un substrat plutôt qu'un produit) en L-alanine comme on le décrira ci-après.La présente invention concerne également un procédé de préparation de la mousse ainsi gluon procédé d'utilisation de la mousse pour former des L-aminoacides. De préférence, les segments de polyéther de la mousse contiennent au moins 90% en mole d'unitésd'oxyde d'éthylène. Selon la quantité de l'agent de réticulation employé, la mousse peut être soit rigide ou flexible. En se basant sur le poids à sec du microorganisme employé, le rapport pondéral du polymère de polyuréthane aux micro-organismes dans la mousse est compris entre environ 1:10 et 10:1, et de préférence entre environ 2:1 et 4:1. Avant mélange de la culture avec le prépolymère, le poids sec des micro-organismes dans la culture peut être déterminé par évaporation de la culture à siccité à une température appropriée telle que 500C.Ensuite, au mélange d'une culture semblable avec le prépolymère, on a trouvé que l'on pouvait immobiliser, dans la mousse, 10-90% (par exemple 50-90%) en poids des micro-organismes. Dans des mousses iraichement préparées, on a observé un certain enlèvement des cellules par lavage, généralement moins d'environ 15% en poids de la culture. En général, l'enlèvement par lavage augmente, tandis que la charge de la culture augmente. De même, pendant le mélange, si des "amas " sont présents dans le mélange du fait d'un mélange incomplet, la quantité de l'enlèvement par lavage sera accrue. Le terme "immobilisation" signifie que les micro-organismes sont retenus dans la mousse plutôt; que d'en être lixiviés lors d'un contact avec de l'eau ou une solution aqueuse du substrat. On pense que les micro-organismes sont'encapsulés dans la mousse pour accomplir l'immobilisation. Il est également probable que pendant le processus de la formation de mousse, une liaison se produise entre les groupes isocyanates du prépolymère et les groupes à la surface des micro-organismes c'est-à-dire les groupes amino. Les mousses sont préparées en mélangeant une culture des micro-organismes produisant le L-aminoacide, directement, avec un prépolymère d'uréthane en présence de suffisamment d'eau pour favoriser la formation de mousse. Traditionnellement, l'eau se trouve dans la culture, en effet les cultures appropriées contiennent généralement de l'ordre de 10 à 90% en poids d'eau, la teneur en eau de la culture particulière étant déterminée par évaporation d'un échantillon de la culture à siccite comme on l'a décrit ci-dessus. Du fait de la présence d'eau, le prépolymère subira une formation de mousse et simultanément les micro-organismes s'immobilisentt dans la mousse. Pour optimiser l'immobilisation, le pH de la culture aqueuse est compris entre environ 4 et environ 11 et il est de préférence supérieur à 7.Pendant l'immobilisation, le rapport pondéral prépolymre /eau est généralement compris entre 2:1 et 1:2 et de préférence entre 3:2 et 2:3, cette eau étant amenée par la culture ou par la combinaison de la culture et de l'eau ajoutée avant ou pendant le mélange. A la suite du mélange, la réaction de formation de mousse est généralement complétée en 5 à 10 minutes et la mousse est durcie à sa forme finale rigide ou flexible en 5 à 10 minutes supplémentaires. Cependant, avec des masses importantes de mousse, il est concevable que les durées de formation de mousse et de durcissement puissent être considérablement étendues. Les L-aminoacides qui peuvent btre produits en utilisant les mousses selon l'invention, avec les microorganismes à immobiliser et le substrat correspondant sont indiqués dans le tableau qui suit. Le terme "substrat correspondant" est destiné à désigner un composé chimique qui est fermenté par un micro-organisme immobilisé pour produire le L-aeinoacide souhaité. Tableau L-aminoacide Micro-organisme Substrat L-aanine Pseudomonas dacunhae acide L-aspartique (ATCC 21192) L-alanine Alcaligenes faecalis acide L-aspartique (ATCC 25094) Tableau (suite) L-aminoacide Miero-Organisme Substrat L-histidine Brevibacterium imidazole thiogenitalis acide pyruvique (ATCC 19240) L-hi stidine Corynebacterium glucose glutamicum (ATCC 21604) et (ATCC 21607-) L-histidine i) Brevibacterium flavum 1) glucose (ATCC 21319) 2) Producteur d'acide 2) histidinol glutamique (comme cornebacterium ou Brevibacterium, comme Brevibacterium flavum, ATCC 14067) L-isoleueine Serratia marcescens glucose (ATCC 21740) L-isoleucine Serratia marcescens glucose (ATCC 21741) L-isoleucine Serratia marcescens glucose (ATCC 21810) Tableau (suite) L-amioacide Micro-organisme Substrat L-isoleucine Brevibacterium acide hydroxy- thiogenitalis butyrique (ATCC 19240) L-isoleucine Brevibacterium acide&alpha; -céto-ss-methyl thiogenitalis n-valerique (ATCC 19240) L-leucine Brevibacterium acide&alpha;;-céto- thiogenitalis isocarroique (ATCC 19240) L-leucine Brevibacterium glucose thiogenitalis (ATCC 1924G) L-sérine espèce de micro- glycine bacterium formaldéhyde (ATCC 21376) L-sérine Norcardabutanica glycine/ (ATCC 21197) formaldéhyde L-sérine Corynebacterium glycine/ glycinophilum formaldéhyde (ATCC 21341) L-théonine Brevibacterium flavum glucose (ATCC 21269) L-théonie Corynebacterium glucose acetoacidophilum (ATCC 21270) Tableau (suite) L-aminoacide Micro-organisme Substrat L-théonine E.Coli (ATCC 13070) glucose L-proline Corynebacterium glucose glutamicum (ATCC 19223) L-proline Microbacterium glucose ammoniaphilum (ATCC 15354) L-proline Brevibacterium glucose ammoniagenes (ATCC 13746) L-arginine Bacillus subtalis glucose (ATCC 21742) L-arginine Brevibacterium flavum glucose (ATCC 21742) L-arginine Corynebacterium glucose glutamicum (ATCC 21659) L-tryptophane Brevibacterium acide indole thiogenitalis pyruvique (ATCC 19240) L-tryptophane proteuo rettgerii indole + acide (Ajinomoto pyruvique (ou (AJ 2770 surine L-tryptophame E. Coli (ATCC 27553) indole + acide pyruvique (ou serine) L-tryptophane E.Coli (ATCC 8724) indole + acide pyruvique (ou sérine) Tableau (suite) L-aminoacide Micro-organisme Substrat L-phénylalanine Brevibacterium acide nhényl thagenitalis pyruvique (ATCC 19240) L-phylalan.ine Rhodosporidium acide trans toruloides cinnamique (ATCC 10788) L-tyrosine Brevibacterium acide hydroxy thiogenitalis phenyl pyruvique (ATCC 19240) L-tyrosine Erwinia herbicola phenol + acide (ATCC 21434) pyruvique L-tyrosine Erwinia herbicola phenol + acide (ATCC 21433) pyruvique L-lysine Brevibacterium flavum glucose (ATCC 21127-21129) L-lysine Corynebacterium glucose glutamicum (ATCC 13826) L-lysine Corynebacterium glucose glutamicum (ATCC 13827) L-lysine Bacillus megaterium glucose (ATCC 21209) Tous les micro-organismes ci-dessus sont publiquement disponibles aux numéros de culture indiqués.Cependant, on notera que la présente invention n'est pas limitée à ces exemples spécifiques. Pour préparer le L-aminoacide, la mousse du microorganisme immobilisé est mise au contact avec une solution aqueuse d'un substrat, et le mélange est incubé à une température de 15 à 60 C tout en agitant, jusqu'à ce que la réaction soit terminée. Quand la réaction est terminée, la mousse est séparée et peut être stockée sous réfrigération pour un usage subséquent. L'aminoacide est récupéré par des procédés traditionnels. Alternativement, la réaction enzymatique peut être accomplie par un procédé en colonne, par exemple sur une base continue. Par exemple, la mousse est introduite dans une colonne à une densité suffisante pour rester perméable pour permettre l'écoulement du substrat à travers elle. La solution du substrat, ayant un pH compris entre 3 et 11, traverse à une température de 15 à 600C et à un débit approprié. On obtient, comme effluent, une solution aqueuse contenant le L-aminoacide souhaité. Cette solution peut être remise en circulation si on le souhaite. Des prépolymères d'uréthane utiles pour préparer la mousse de polyuréthane sont préparés en coiffant un polyoxyalcoylène polyol avec un excès d'un polyisocyanate comme du diisocyanate de toluène. Avant d'être coiffé, le polyol doit avoir un poids moléculaire de l'ordre de 200 à environ 20 000 et de préférence de 600 à environ 6 000. La fonctionnalité hydroxyle du polyol et la fonctionnalité d'isocyanate correspondante à la suite du coiffage est comprise entre 2 et environ 8. Si des mousses sont formées à partir de prépolymères ayant une fonctionnalité d'isocyanate de l'ordre de 2, le produit résultant est essentiellement linéaire et n'a pas une résistance à la traction aussi importante que s'il était réticulé. En conséquence, une teneur en hydroxyle supérieure à 2 par molécule est souhaitée. Cela peut être obtenu en utilisant des mélanges de diols avec des trois ou autres polyol de fonctionnalité supérieure, cu des triols ou d'autres polyols d'ordre supérieur, en eux-memes, peuvent être coiffés avéc des di- ou polyisocyanates. On peut citer comme exemples de polyols appropriés (à coiffer par des polyisocyanates) : (A) des polyols essentiellement linéaires formés par exemple par réaction d'oxyde d'éthylène avec de l'éthylène glycols comme initiateur. Des mélanges d' oxyde d'éthylène avec d'autres oxydes d'alcoylène peuvent être employés tant que le pourcentage molaire de l'oxyde d'éthylène est d'au moins 50%. Si les polyéthers linéaires sont des mélanges d'oxyde d'éthylène avec, par exemple, de l'oxyde de propylène, le polymère peut être soit statistique ou séquencé, et les unités terminales peuvent être soit de l'oxyéthylène ou de l'oxypropylène. Une seconde classe de polyol (B) contient ceux ayant une fonctionnalité hydroxyle 3 ou plus.De tels polyols sont couramment formés par réaction d'oxydes d'alcoylène avec un initiateur polyfonctionnel comme le triméthylolpropane, le pentaérythritol et autres. En formant le polyol B, l'oxyde d' alcoylène utilisé peut etre de 11 oxyde d'éthylène ou des mélanges d'oxyde d'éthylène avec d'autres oxydes d'alcoylène. Les polyols peuvent de plus être représentés par (C) des polyols polyfonctionnels linéaires et ramifiés représentés en A et B ci-dessus avec un initiateur ou un agent réticulant. On peut citer comme exemple spécifique de C, un mélange de polyéthylène glycol (poids moléculaire d'environ 1000) avec du triméthylolpropane, du triméthyloléthane ou de la glycérine. On peut faire subséquemment réagir ce mélange avec un polyisocyanate en excès pour donner un prépolymère utile dans l'invention. Alternativement, on peut faire réagir les polyols linéaires ou ramifiés (comme du polyéthylène glycol), séparément, avec un polyisocyanate en excès. On peut également faire réagir l'initiateur tel que du triméthylolpropane, séparément, avec un polyisocyanate. Subséquemment, les deux matériaux coiffés peuvent être combinés pour former le prépolymère. Des polyisocyanates et initiateurs appropriés sont indiqués dans le Brevet US No. 3 903 232 décrit ci-dessus et incorporé ici à titre de référence. Les initiateurs sont généralement des agents réticulants solubles dans l'eau ou dispersibles dans l'eau comme cela est décrit dans le Brevet US No. 3 903 232. Préparation du prépolymère A Le prépolymère A est préparé en mélangeant deux équivalents molaires de polyéthylène glycol ayant un poids moléculaire moyen de 1000 (PEG - 1000) et 0,66 équivalent molaire de triméthylolpropane (TMOP). Le mélangeestsédieà100-1100C sous une pression de 666,52000 N/m2 pour retirer l'eau. Le mélange séché résultant est lentement ajouté, sur une période d'environ une heure,àun récipient contenant 5,7 équivalents molaires de diisocyanate de toluène (TDI), tout en agitant le mélange de TDI et de polyol. La température est maintenue à 600C tout en agitant pendant trois heures supplémentaires. Alors, on ajoute une quantité supplémentaire de 0,92 équivalent molaire de TDI, tout en agitant, sur une période d'environ une heure, tout en maintenant la température à 600C. Le mélange réactionnel final contient un excès molaire de 5% de TDI. Tous les groupes hydroxyles sont coiffés d'isocyanate et une certaine extension de chaine se produit du fait d'une réticulation des polyoles avec le TDI. Exemple 1. Des cellules d'alcaligenes faecalis (ATCC 25094) ont été mélangées à 5 g du prépolymère A. Pour former le mélange, on a utilisé huit grammes de la culture récoltée. Sur une base de poids sec, la culture contenait un gramme de cellule Du fait de l'eau dans la culture, on a formé une mousse de polyuréthane hydrophile flexible qui a durci pendant environ 15 minutes. Les cellules ont été encapsulées dans la matrice de mousse de polyuréthane où y était liées. Exemple 2. La mousse préparée à l'exemple 1 a été insérée dans une colonne coiffée à chaque extrémité d'un filtre Millipore. Au fond de la colonne, on a placé 50 g d'acide L-aspartique dans un récipient, en contact avec la colonne. Ensuite, on a fait passer une solution (4 1) de NH4OH (40 ml) et de Tween 80 (marque déposée) (10 ml) ayant un pH ajusté à 10 avec 50% de H3P04, en contact avec l'acide aspartique et ensuite vers le haut à travers la colonne. La température de la solution était d'environ 250 et le débit de l'ordre de 0,67 ml/mn. Pendant les 40 premières heures de l'opération, la colonne donna environ 0,90 mg/ml, c'est-à-dire 0,60 mg/mn de L-alanine. Ensuiteàundébit de 0,34 ml/mn, le taux de conversion était de 1,62 mg/ml et à 0,17 ml/mn, le taux de conversion était de 2,66 mg/ml. Une analyse pour la L-alanine a été effectuée sur un auto-analyseur Technicon en utilisant de la L-aminoacide oxydase pour convertir la L-alanine en i-cétoacide correspondant, NH3 et H202. Ensuite, on a fait réagir le péroxyde avec du 2,4 - dichlorophénol et du 4-aminoantipyrène en présence de péroxydase de raifort. Le produit réactionnel résultant, un colorant de quinoneimine, a été lu colorimétriquement à 505 nm. Exemple 3. La mousse particulaire préparée à l'exemple 1 a été introduite dans une colonne équipée d'une chemise d'eau. La température était maintenue à diverses valeurs et on a fait passer le substrat à travers elle à 0,67 ml/mn. Le substrat se composait de 500 ml d'eau désionisée contenant 10 ml de NH4OH concentré, 2,5 ml de Tween 80 et 53 g d'acide L-aspartique solide à la température ambiante. En passant à travers la colonne, le substrat a été chauffé à 270C et a ensuite été refroidi à la température ambiante avant retour au récipient de récupération du substrat contenant l'acide L-aspartique solide en équilibre avec la solution du substrat. Le substrat était continuellement en recirculation du récipient de récupération, à travers la colonne et le serpentin de refroidissement, pour retourner au récipient de récupération. On a répété le processus ci-dessus à des températures de 370C et 500C. On a continué l'essai à 270C pendant 20 heures ;l'essai à 370C pendant 72 heures; et l'essaià 500C pendant environ 24 heures. Les taux de conversion pour la L-alanine, analysés comme à l'exemple 2, étaient de 112,5 mg/h (270C), 334 mg/h (à 370C) et O mg/h (à 500C). Exemple 4. On a mélangé vingt six g de cellules recueillies de Pseudomonas dacunhae (ATCC 21192), à 20 grammes du prépolymère A avec ensuite formation de mousse comme à l'exemple 1. La mousse a été coupée en cubes d'environ I cc, et a été introduite dans une colonne de 100 cc. On a fait passer, à travers la colonne, un substrat contenant environ 0,5 équivalent molaire d'acide L-aspartique. Le pH du substrat était de 5,3 (ajusté au moyen de H2S04) et 10 mg/l de pyridoxal-5-phosphate étaient également présents avec 2,5 g/l de Tween 80. La colonne fonctionnait à un débit de 0,65 ml/mn, donnant une conversion en L-alanine (analysée comme à l'exemple 2) de 14 à 17 mg/ml. Le substrat ne fut pas remis en circulation, c'est-à-dire que l'essai a été entrepris sur une base de "une passe". Après avoir recueilli 700 cc du substrat, la L-alanine a été isolée en chauffant la solution du substrat à 850C, en ajustant le pH à 5,5, en refroidissant à 150C pour précipiter l'acide L-aspartique et la L-alanine, en dissolvant ensuite le précipité dans de l'eau ionisée pour former une solution de Lsalanine, l'acide L-aspartique étant enlevé par filtration sous forme d'un précipité insoluble. L'eau a été retirée sous vide, du filtrat, pour donner des cristaux de L-alanine. Le rendement en produit brut était de 151,4 g. Exemple 5. Au bout d'environ deux semaines d'utilisation, le substrat utilisé avec la colonne de l'exemple 4 a été changé pour une solution à un équivalent molaire d'acide L-aspartique contenant 125 cc de NH4OH/litre. Le pH du nouveau substrat a été ajusté à 5,3 en utilisant 60% de H2S04. Le débit était de 0,65 ml/mn. Le taux initial de conversion était de l'ordre de 14 mg/ml. En remplaçant par un substrat ne contenant qu'environ 0,05 mole d'acide L-aspartique/litre, le niveau de conversion était réduit à 4 à 5 mg/ml. Des essais subséquents avec un substrat à un équivalent molaire ont donné des niveaux de-conversion de 27 à 32 mg/ml. Lors d'un recyclage, les niveaux de conversion ont atteint 45 et 50 mg/ml. Lors d'addition de pyridoxal-5-phosphate ("P-5-Pn) (12,5 mg/l), les taux de conversion atteignirent en moyenne environ 36 mg/ml. Les essais subséquents sans pyridoxal-5-phosphate, mais avec circulation, ont permis aux niveaux de conversion d'atteindre 45 mg/ml. Après que la colonne ait fonctionné continuellement pendant environ 45 jours, le niveau de conversion tomba à environ 16 mg/ml. Cependant, la plus grande partie du temps de fonctionnement étaitsans P-5-P, etaiadécouvertqu' en ajoutant P-5-P (12,5 mg/ml), le niveau de conversion augmentait à environ 40 mg/ml. Subséquemment, lors d'un recyclage du même lot du substrat pendant 24 jours, le pH du substrat augmenta à environ 8,72, indiquant un niveau de conversion supérieur à 90%. La solution de l'effluent fut déterminéepsr B recherche de L-alanine en utilisant le processus automatisé de l'exemple 2. On trouva que 94% de l'acide L-aspartiqueavaient été convertis en L-alanine. Exemple 6. Des cellules de E. Coli (ATCC 11303) en suspension dans un tampon de phosphate (pH 8,0) ont été centrifugées à 5000 t/mn pendant 30 minutes. La masse des cellules a été placée sous réfrigération et drainée pendant une nuit. Les cellules (11 g) ont été mélangées à Il g du prépolymère A. Du fait de l'eau dans la masse des cellules, il se forma une mousse de polyuréthane hydrophile et flexible qui durcit en environ 15 minutes. Les cellules ont été encapsulées dans la matrice de mousse de polyuréthane ou lui ont été liées. Exemple 7. La mousse de l'exemple 6 a été placée sous réfrigération et a été ensuite coupée en petits morceaux (cubes d'environ 6,35 mm) pour un usage ultérieur. Un milieu formant substrat a été préparé à partir de la recette qui suit : 11,6 g d'acide fumarique et 20,3 mg de MgCl2 : 6H20, dissous dans de l'ammoniaque à 25% avec un ajustement du pH 8,5 au moyen d'ammoniaque concentrés De 1'eau d6slonisée en quantité suffisante a été ajoutée pour amener le volume à 100 cc. La température du substrat a été maintenue à 370C et on a placé environ 1,4 g (poids sec) de mousse dans la solution du substrat. Au bout de 30 minutes, une analyse des échantillons par chromatographie en couche mince a indiqué que des quantités considérables d'acide L-aspartique avaient été produites.D'autres résultats analytiques ont indiqué que 95% de l'acide fumarique avaient été utilisés, ctest-à-dire convertis en acide L-aspartique. Exemple 8. La mousse particulaire préparée à exemple 6 a été introduite dans une colonne de 75 cc équipée d'une chemise d'eau. La température a été maintenue à 370C et on a fait passer le substrat à divers débits. La composition du substrat était comme suit : 400 cc de NH40H, 1200 cc d'eau désinisée, 232 g d'acide fumarique, 406 mg de NgCl2. 6H20, en ajoutant de l'eau désKnisée pour amener le volume à deux litres (pH 9,0) (en deux lots). Le volume du lit de liquide dans la colonne (c'est-à-dire la partie de la colonne non occupée par la mousse) était de 31,25 cc. On a fait passer environ 3500 ml du substrat à travers la colonne à un débit constant de 0,6 ml/mn à un pH 9. Des échantillons ont été périodiquement prélevés et analysés à la recherche de l'acide fumarique, par chromatographie liquide à haute pression. Le pourcentage de conversion en acide L-aspartique par rapport au nombre d'heures pendant lesquelles la colonne avait fonctionné au moment de l'échantillonnage est indiqué au tableau qui suit Etude de stabilité (370C) Conversion fumarique/L-aspartique Temps (heures) % Conversion ( à 0,6 cc/mn) 5 71 46 69 150 61 218 61 Exemple 9. Après que la colonne de l'exemple 8 a été en fonctionnement pendant environ 54 heures, le débit a été établi à 0,28 cc/mn et un échantillon de 288 ml a été recueilli sur la période suivante de 16 heures et 50 minutes. L'acide L-aspartique a été isolé d'une partie de 250 ml de l'échantillon, et on a trouvé que le taux réel de conversion de l'acide fumarique en acide L-aspartique (en se basant sur l'analyse directe de l'acide L-aspartiqueséché par chromatographie gaz-liquide) était de l'ordre de 85%. Exemple 10. On a recueilli environ 3500 ml du substratayantpassé par la colonne de l'exemple8àundébit de 0,60 ml/mn. L'échantillon a été chauffé à 900C et le pH a été réduit à 2,8 (le point isoélectrique pour l'acide L-aspartique) en ajoutant 200 ml de H2S04 à 60%. Le mélange acidifié a été refroidi à 150C pour précipiter l'acide L-aspartique qui a été enlevé par filtration, séché et lavé dans 95% d'éthanol et de l'eau à 300C. L'acide fumarique n'ayant pas réagidissousdans l'éthanol a été jeté en solution. L'acide L-aspartique insoluble a été retiré et séché sous vide. Un échantillon de la poudre a été analysé à 97% d'acide L-aspartique pour un rendement de 89% (en se basant sur la valeur théorique) de poudre purifiée. Exemple 11. De la mousse a été préparée corse à l'exemple 6 et un échantillon de 1 g a été placé dans un ballon et mélangé à 100 cc de substrat (126 mg/ml d'acide fumarique) à environ 370C et à un pH de 9 pendant 15 minutes. Ensuite, on a répété trois fois le processus en utilisant un lot frais du substrat, à chaque fois. Dans le premier lot (en se basant sur l'analyse de l'acide fumarique résiduel), la conversion en acide L-aspartique était de l'ordre de 57% dans le premier lot et de l'ordre de 35% pour chacun des trois lots suivants. On pense que la différence entre le premier lot et les lots subséquents est due à l'enlèvement par lavage des cellules non liées. Exemple 12. Une colonne a été préparée et on l'a fait fonctionner comme à l'exemple 8 (116 mg/cc d'acide fumarique, pH de 9,04), mais à une température de 500C. Le substrat était continuellement en recirculation à travers la colonne. En se basant sur la réduction des niveaux d'acide fumarique, la conversion en acide L-aspartique était essentiellement complète au bout de 120 heures. Des niveaux d'accomplissement de 33% et 10% ont été obtenus au bout d'environ 30 et environ 50 heures, respectivement. Le niveau de 50% est une valeur extrapolée. Exemple 13. Cinq grammes de cellules récoltés de Brevibacterium thiogenitalis (AHV résistantes) ont été mélangés avec 5 grammes du prépolymère A contenant 2% en poids de Pluronic L-62, avec ensuite formation de mousse comme dans l'exemple 1. La mousse a été découpée en cubes ayant environ 2 cc de dimension, et des parties pesées (correspondant à 0,42 g de cellules, poids humide) ont été ajoutées à 25 cc de la solution du substrat (substrat 1,64 M. moles d'acide &alpha; -cetoisocaproSque, 1,70 M.moles d'acide L-glutamique, 5 x 10 5 M de pyridoxal-5-phosphate, pH ajusté à 8 ou 9 avec 2 N de NH4OH). Avec un mélange constant (barremagnétique d'agitation) et à la température ambiante, des échantillons ont été retirés à des intervalles pendant 1 jour et déterminés pour la production de leucine. Typiquement, la mousse était en contact avec le substrat pendant 8 heures par jour, et stockée pendant une nuit dans un tampon à 0,05 MK phosphate, à 4-100C, et le cycle a été répété pendant 4 jours. L'analyse de la leucine a été effectuée par chromatographie semi-quantitative en couche mince, et chromatographie liquide quantitative à haute pression. La stabilité mousse/cellule aux températures ambiantes a été déterminée àdeux pH,8,0 et 9. (le pH de 7,0 a été déterminé comme étant néfaste à l'activité). Etude de stabilité à pH 9.0 Conversion &alpha; -cétoacide/leucine Jours Heures M.moles leucine/ (temps échantillon) poids humide cellules liées, g 1 4 27,22 5 27 22 6 40,83 2 4 31,76 6 45,36 7 45,36 3 3 27Z22 4 45,36 5 49J91 4 4 45y36 après 72 heures 6 72,13 de stockage dans un tampon. à 4-10 c 22 285Z85 Les cellules immobilisées conservaient l'activité de la transaminase sur la période de 4 jours aux températures ambiantes.On pense que l'augmentation graduelle du taux de production de leucine pour chaque jour est le résultat de "l'activation", c'est-à-dire que l'on pense que les cellules immobilisées se lysent,permettant ainsi une diffusion plus facile du substrat produit vers et au loin du site actif de la transaminase. Cette "activation" apparente est plus dramatique pour l'étude à pH 0,8. Aux deux premiers jours, la mousse/cellules ont montré très peu d'activité. Cependant, au jour 3, l'activité était dramatiquement accrue comme le montrent les données qui suivent Etude de stabilité à pH 8.0 Conversion &alpha; -cétoacide/leucine Jours Heures M.Moles leucine/ (temps échantillon) poids humide cellules liées (70-85% eau),g 1 4-6 ND 2 4-6 ND 3 4 186,01 5 245,02 6 249,50 4 4 163,32 (Après 72 heures 5 294,88 de stockage dans 4-10 C) 6 267,64 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un L-aminoacide, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact le substrat correspondant avec une mousse de polyéther polyuréthane hydrophile où au moins 50% en moles des unités d'oxyde d'alcoylène dans les segments du polyéther du polyuréthane sont de l'oxyde d'éthylène, un microorganisme étant immobilisé dans ladite mousse, capable de convertir le substrat en L-aminoacide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat est une solution aqueuse ayant un pH de 3 à 11. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la température du substrat est comprise entre 15 et 600C. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est effectué sur une base continue. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est effectué sur une base discontinue. 6. Mousse de polyéther polyuréthane hydrophile, caractérisée en ce qu'au moins 50% en moles des unités d'oxyde d'alcoylène dans les segments de polyéther du polyuréthane sont de l'oxyde d'éthylène, un microorganisme producteur de L-aminoacide étant immobilisé dans ladite mousse. 7. Mousse selon la revendication 6, caractérisée en ce que au moins 90% en moles des unités d'oxyde d'alcoylène sont de l'oxyde d'éthylène. 8. Mousse selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est préparée en faisant réagir un prépolymère de polyéther uréthane hydrophile avec de l'eau dans des conditions de formation de mousse, ladite eau étant mélangée avec une culture d'un micro-organisme produisant l'aspartate décarboxylase, et en ce qutau moins 50S/o en moles des unités d'oxyde d'alcoylène dans le segment polyéther du prépolymère sont de l'oxyde d'éthylène. 9. Mousse selon la revendication 6, caractérisée en ce que le prépolymère est un mélange d'un polyoxyéthylène glycol avec un alcool polyhydrique de faible poids moléculaire, ledit mélange réagissant avec un excès molaire d'un polyisocyanate. 10. Mousse selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est rigide. 11. Mousse selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est flexible. 12. Mousse selon la revendication 6, caractérisée en ce que le rapport pondéral, sur une base anhydre, du polymère de polyuréthane avec la culture de micro-organismes est de 10:1 à 1:10. 13. Procédé de préparation d'une mousse de polyéther polyuréthane hydrophile, caractérisé en ce qu'une culture d'un micro-organisme produisant du L-aminoacide est mélangée avec un prépolymère de polyéther uréthane hydrophile où au moins 50% en moles des unités d'oxyde d'alcoylène dans le segment polyéther du prépolymère sont de oxyde d'éthylène, suffisamment d'eau étant présente dans le mélange pour forcer le prépolymère à subir la formation de mousse pour piéger et immobiliser les cellules microbiennes de la culture. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la teneur en eau dans la culture est comprise entre 10 et 90% en poids. 15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le-pH du mélange est supérieur à 7. 16. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que, sur une base pondérale, le rapport pondéral prépolymère/culture dans le mélange est compris entre 10:1 et 1:10, le poids de ladite culture étant calculé sur une base sèche.