Brevet FR2484649A1 — publié le 19811218

La présente invention concerne un diluant du sang particulièrement adapté à une utilisation dans la numéra- tion électronique et le dimensionnement des globules du sang, la détermination de l'hémoglobine et leurs indices collectifs et lee paramètres des plaquettes dans un simple échantillon de globulesdu sang au moyen dtune instrumentation électronique appropriée. En partîculier7 il est souhaitable de développer des réactifs et des procédés à utiliser avec le eompteur automatisé do sang Coulter Counter (marque déposée) Modèle S Pluss fabriqué par Coulter Electronics, InCo Hialeah, Floride, E.U.Ao. pouvant permettre a:ux données de voluae des globules accumulées dans un appareil Chane=elyser (marque déposée) Coulter d'effectuer la discrimination entre deux popula tions de leucocytes O (1) une population de lympholdes (lymphocytes) et (2) une population de y4lol!des (neutro- philes, monocytes, Eosinophlleo et basophiles)o De telles données sont utiles comme outil de détermination pqur repérer les rapports de leucocytes anormaux. Les situations anormales signalées par ce procédé donnent une information de l'importance du diagnostic, et pour urne plus ample étude. La séparation des leucocytes humains normaux par une distributionvolumique en uwilisant le principe du comptage et du dimensionnement développé par Wallace H. Coulter et employé dans les instruments Coulter Counter (marque déposée) s'applique maintenant comme procédé de diagnostic clinique0 Ce procédé est basé sur la propriété fondamentale de toutes les cellules vivantes de régler leur volume par une information de code génétique. Chaque type de cellule ou globule dans le sang en circulation a son propre volume caractéristique compris entre une valeur aussi faible que 3 p au cube pour les plaquettes et 450 p au cube pour les eellules polymorpho- nucléaires. Les instruments CouLter Counter avances ont été conçus pour utiliser cette différence de volume dans le 'out de compter et de déterminer la distribution de dimension des plaquettes et des érythrocytes afin de détecter et de surveiller des états pathologiques. Les érythrocytes et les leucocytes lympholdes se chevauchent malheureusement considérablement par leur dimension de cellules ou globules, et il n'est pas possible de compter l'un en présence de l'autre par une discrimination seule. La pratique traditionnelle consiste à utiliser un réactif lytique-tensio-actiffort qui stromatolyse les érythrocytes, les réduisant à de très petites particules ou provoquant une solubilisation des membranes, et extrait le cytoplasmedes leucocytes lympho!des et myélo!des, ne laissant que les noyaux à compter qui résistent à la lyse. Comme le volume original des cellules est dramatiquement affecté et réduit à un minimum, seule une simple population est visible par une analyse de distribution de dimension. Le compteur automatisé des globules du sang Coulter Counter Modèle S Plus est conçu pour diluer un échantillon de sang entier dans un diluant isotonique, ajouter un agent lysant et ensuite commencerà compter au bout de 7,5 secondes. Les données sont recueilliespendant 4 secondes pour les érythrocytes et les leucocytes et jusqu'à 20 secondes pour les plaquettes. Ainsi, un système diluant-lysant doit produire une énergie cinétique lysant les érythrocytes suffisamment rapide. pour effectuer une stromatisation complète pendant la période de lyse, mais sans extraire totalement les leucocytes pendant ce temps. De plus, les changements du volume des leucocytes doivent être au minimum pendant l'étape o l'on recueille les données, et de façon idéale, ils doivent être stables pendant plusieurs minutes. Le système réactif doit également préserver l'intégrité du nombre et de la distribution de dimension des érythrocytes et des plaquettes, de la courbe d'absorbance de l'hémoglobine et du compte total des leucocytes. Les sangs prélevés par des piqtIres au bout des doigts doivent être stables quand ils sont prédilués dans le diluant isotonique, pendant au moins deux heures. Pour obtenir une analyse des populations relatives des cellules lympho!des e myéloldes dans le sangv lvhistogramme du volume des leucocytes doit montrer nettement les crêtes séparées des lymphoïdes et des myéloldes, avec peu de débrit d'érythrocytes, permettant des vallées très proches de la ligne de base. L'intégra- tion de chaque crête donnera les populations relatives des cellules lymphoïdes et myéloldes. On a démontré que la crête lympholde contenait des lymphocytes et des petits lymphocytes atypiques, tandis que la crête des myélo!des contient des cellules polymorphonucléaires, des bandes, des monocytes, des éosinophiles, des basophiles et de grands lymphocytes atypiques. Dans le brevet US No. 3 874 852 (1975) au nom de Coulter Diagnostics, Inc. ,est incorporée une formule pour une composition contenant un sel d'ammonium quaternaire détergeant et un cyanure à employer comme réactif lysant et formant un chromagéne pour obtenir un compte d'un seul volume de leucocytes et la détermination de l'hémoglobine dans le compteur Coulter Modèle S. Il a fallu une plus ample recherche pour utiliser les sels d'ammonium quaternaire comme agents lysantspour obtenir le compte des deux populations de leucocytes. Dnla demamd de b=t E 096 697 au nom de Coulter Electronics, Inc, un diluant lytique pour la lyse rapide des globules rouges dans du sang entier pour effectuer une détermination différentielle des populations lympholdes/myéloldes des leucocytes, et également mesurer l'hémoglobine par formation de chromagène, contient un mélange d'une solution saline aqueuse d'au moins un sel d'ammonium quaternaire ayant des propriétés tensio-actives, et certains additifs comme le 2-phénoxyéthanol. Une analyse de distribution desdeux volumes est difficile parce qu'avec de nombreux diluants, les deux populations se transforment rapidement en une seule, il n'y a donc pas suffisamment de temps pendant lequel les calculs peuvent être faits pour l'analyse. La présente invention se rapporte à un diluant iso- tonique du sang à usages multiples et à un procédé pour utiliser ce diluant avec un système réactif lysant pour permettre une numération de routine des valeurs traditionnelles d'hémogramme, et également l'affichage et le calcul de l'histogramme lympholdesyéloldesdes leucocytes et leurs concentrations relatives, en particu- lier dans des systèmes de comptage automatique comme l'équipement automatisé Coulter Counter avec programmation non modifiée et la capacité d'un instrument "Channelyzer" pour les leucocytes, externe ou interne. Ce diluant isotonique à usages multiples pour le sang comprend un mélange de tampons organiques, de produits anesthésiques, et de germicides en une solution osmotique- ment équilibrée et sensiblement neutre, et il sert à ralentir l'énergie cinétique de l'extraction cytoplasmique des leucocytes, tout en stabilisant les paramètres traditionnels de l'hémogramme. Le réactif lysant est un mélange d'une solution aqueuse d'au moins un sel d'ammonium quaternaire ayant des propriétés tensio-actives, et d'un cyanure d'un métal alcalin à une gamme de concentration efficace pour donner des histogrammes des leucocytes en deux volumes. La présentation des données peut être accomplie en utilisant un équipement Coulter Counter standard avec un "Channelyzer, et un abaque en X-Y. Des dispositifs accessoires de calcul et de traitement de données sont souhaitables pour une automa- tisation complète, mais ne sont pas essentiels à l'accomplissement des mesures Selon l'invention, on prévoit: -un procédé pour la détermination différentielle des populations de lympholdes et de myéloldes des leucocytes, et également pour la mesure des valeurs d'hémogramme, en particulier dans des systèmes de comptage automatique, o l'on utilise, en combinaison: A. Un diluant isotonique contenant un mélange d'une solution aqueuse de 1. des composés anesthésiques comprenant des dérivés de l'ester de l'acide 4-aminobenzolque; 2. des tampons organiques; et 3. des germicides ajustée à un pH de 7,0 + 0,1 avec une solution de soude ou d'acide chlorhydrique, selon la nécessité, et à une osmolalité de 320 + 5 milliosmoles par kilogramme avec du sulfate de sodium et du chlorure de sodiumet B. Un réactif lysant comprenant unmelange d'une solution aqueuse d'au moins un sel dammonium quaternaire ayant des propriétés tenioactives et un cyanure dun métal alcalin à une gamme de concentration efficace pour donner des histogrammes des deux volumes des leucocytes. -un procédé de détermination des leucocytes et de l'hémoglobine dans le sang o u agent lysant contenant une. solution aqueuse d'un sel d'ammonium quaternaire ayant des propriétés tensio-actives etu cyanure d'um métal alcalin est utilisé pour stromatoly ser les érythrocytes et les plaquettes et pour convertir lthêmoglobine en un cbromagène, à ltazote de ce sel dîammonim quaternaire étant attachés trois groupes alcoyles à chaîne court et un gzoupe alcoyle à chatne longue, et selon 1'invention le sel dîamoni]m quaternaire et le sel diru métal alcalin sont présents à une gamme de concenbration- qui est efficace pour donner des histogrammesdes deux vMmes des leucocytes et pour permettre un calcul de routine de lhistograe des lympholdes/mryeloldes des leucocytes et leurs concentrations relatives, en particulier dans des systèmes de comptage automatique -u diluant isotrnique à usages multiplesoomposé d'une solution aqueuse de: 1. des tampon.s organiques 2. des produits anesthésiques, comprenant des dérivés de l'ester de l'acide 4-aminobenzoquea 3. des germicides ce diluant étant ajusté à un pH de 7,0 + 0,1 avec une solution de soude ou dlacide chlorhydrique, selon la nécessité, et à une osmolalité de 320 + 5 milliosmoles par kilogramme avec du chlorure de sodium et du sulfate de sodium. La formule préférée du diluant isotonique est la suivante: Ingrédient Gamme effective c Chlorhydrate de procaine Acide N-(2-acétamido)iminodia- cétique (ADA) Diacétate de chlorhexidene Diméthylolurée Sodium 1hydroxypyridine-2-thione Soude Sulfate de sodium anhydre Chlorure de sodium Eau le concentration 0,11 g/l 1,40 g/l 0,02 g/il 1,00 g/I 0,50 g/1 0,50 g/1 9,72 g/1 4,50 g/l en quantité suffisante pour 1 litre Ce diluant est ajusté à un pH de 7,0O +0,1 avec une solution de soude ou d'acide chlorhydrique selon la nécessité. L'osmolalité est ajustée à 320 + 5 m!lliosmoles par kilogramme avec du chlorure de sodium. On sait que les globules du sang contiennent des enzymes ATPase qui transportent les cations de métaux alcalins associés à de petits anions (comme du chlorure) dans et hors du globule par un mécanisme nécessitant de l'énergie afin de maintenir l'équilibre osmotique, la tergidité de la cellule ou du globule et les bons potentiels des membranes. Les ions sodium associés à l'anion sulfate bien plus grand ne sont apparemment pas transportés aussi facilement du fait des plus grandes différences de densité de charge entre les anions sulfate et chlorure et le changement de potentiel de la charge de la membrane quand des ions sont transportés dans et hors de la cellule ou du globule. L'équilibre de la pression osmotique interne dans la cellule est maintenu par inclusion d'environ 30 milli- osmoles de chlorure de sodium.On conn.aftle sulfate de sodium pour sa capacité à solubiliser les globulines anormales du plasma et à réduire ou éliminer la turbidité dans la solution duhémoglobine du fait des comptes élevés des leucocytes Le chiorhydrate de procaene faisant partie dune classe de produits esneThsices comprenant lesdéerivés de l'ester de l'acide 4-aminobenzoique et leurs sels a été rapporté comme ayan-t ne influence stabilisante sur la membrane des' érythrocytes mais le mode d'action est incertaine L'utilisation de l'acide - ( 2-acétamido) iminodiacétique (ADA) tampon organique dans la présente inventionq est préve pour sa capacité d'aider les agents lysants au sel dîammonium quaternaire faible à réduire les débris dé:rythrocytes lysés à des dimensions de particules électriquement plus petites que 45 p au cube, afin d'empêcher ainsi une interférence des érythrocytes avec la numération et la distribution des leucocytes en deux populations distinctes (lymphoydes et myéloldes)o Bien que le mécanisme de l'action de ADA neait pas été rigoureuxement recherché on sait que c'est un ligand modér.ment úort pour les métaux alcalins du groupe Il et les métaux de transition du groupe IIBe ainsi qu'un tampon raisonnablement efficaceo Ressemblaet à un amino-acide à un fort degré6 1'ADA est apparamment attiré vers les protéines des membranes des globules avec lesquelaesil agit. Il est alors coordonnée avec les cations de métaux pour donner à la surface de la membrane externe un "aspect" de charge plus positive pour la solution environnante, encourageant ainsi la solvatation et l'attraction des anions avtour de la membrane externe. Ce revêtement des molécules de solvant et des anions empêche efficacement l'approche et l'interaction par agglutination avec d'autres cellules en suspension L'action de tampon de l'ADA empêche les changements de cet environnement "local". empêchant toute désolvatation et perte de stabilité. Ce mécanisme, en liaison avec l'action d'un produit anesthésique local tel que le chlorhydrate de procaRne, et le sulfate de sodium, aide à la stabilisation des composants cellulaires de l'échantillon de sang, les rendant essentiellement inchangés par rapport à leur état d'origine dans l'échantillon de sang en terme du nombre, de la distribution de dimension et de la forme. Ce facteur a une forte importance diagnostique pour l'interprétation des paramètres traditionnels de l'hémo- gramme. Le diacétate de chlorhexidène, bien qu'il soit habituellement utilisé comme virocide et germicide, n'est que marginalement efficace en lui-même à la concen- tration utilisée, mais il aide de façon importante 1'ADA pour réduire les débris de fond interférant avec la numération de distribution de dimension des leucocytes. Le chlorhexidène a également une certaine ressemblance avec les amines arginine et guanidine et on peut s'attendre à ce qu'il agisse avec les protéines des membranes par coordination et liaison d'hydrogène. Tel quel, il aide apparemment les agents lysants à stromatolyser-totalement les membranes des érythrocytes. On pense que la diméthylolurée, condensat de formaldéhyde et d'urée, réagit très lentement en solution à un pH neutre avec les membranes des leucocytes pour donner une mesure de la stabilité au repos, qui n'est pas évidente lors de l'enlèvement de ce composé. Elle est connue comme composé bactériostatique antiseptique, empochant la croissance des microorganismes à des concentrations modérées. D'autres composés qui ont été Joints pour stabiliser les leucocytes sont l'hexaméthylène- tétramine et le N-hydroxyméthylacétamide. La sodium 1-hydroxypyridine-2-thione est connue pour son utilisation comme fongicide et bactéricides dans des shampooingsanti-pelliculaires. On l'utilise ici comme bactériocide et fongicide qui ne présente pas d'effet néfaste apparent sur la forme, la distribution de dimension ou le nombre des composants cellulaires dans le sang humain entier. L'utilisation de la combinaison de diméthylolurée et de sodium 1hydroxypyridine-2-thione donne un produit très bactéri$iéde qui est supérieur à celui pouvant. &tre obtenu avec chaque substance utilisée seule. Cette combinaison donne unhémogramme stable pour des 6chan- tillons normaux et anormaux tout en permettant simultanément de recueillir une information de distribution volumique des globules blancs par un système automatisé d9instru- mentation. Ce système diluant a pour but principal de stabiliser la dimension des cellules, la forme et l'intégrité de tous les composants cellulaires du sang à une étendue que l'on ne pouvait précédemmont atteindre afin de favoriser la précision du diagnostio des hémogrammes du sang dérivés dvune analyse automatisée de distribution volumique et de le. nurtiono La présenite invention permet lîextrension et laméliorat!on de lart antérieur en rendant les conditions de courazt sangnin des cellules relativement incanggées lors due dilution et d9une préparation pour vn comptage et vu dinensionnement automatisés des globules ou cellules du sang Quuand on l'utilise avec un agent lysant approprié, l'art antérieur peut tre étendu pour donner une information de distribution de deux -olumes conoernant les leucocytes. Le diluant décrit reproduira des hemogrames précis avec tout competur de globules ou cellules du sang du type Coulter seri-automatisé ou automatisé, mais produira des histogrammes des leucocytes en deux volmes uiquement quand on l'utilisera avec le réactif lysant selon 1tinventîon. L'agent lysant est une solution aqueuse d'au moins un sel d'ammoniurm quaternaire, ayant des propriétés tensio-actives, et d'tu cyanure dun métal alcalin, comme cela est gnééralement décrit dans le brevet US No. 3 874 852, pour n'obtenir queun compte dun seul volume de leucocytes. La gamme et la concentration efficaces des ingrédients indiqués ici doivent être suivies particulièrement afin d'obtenir le compte des deux populations de leucocytes selon l'invention. Dans les compositions préférées, l'alcoyle à chaine longue de la formule qui suit a de 12 à 16 atomes de carbone, les chaînes courtes-sont du triméthyle et X représente un chlorure ou un bromure. Le sel d'ammonium quaternaire détergeant a pour formule: Rl /R2 o R2 est un radical alcoyle à chaîne longue ayant de à 18 atomes de carbone, R2, R3 et R4 sont des radicaux alcoyles à chaine courte ayant de I à 6 atomes de carbone, et X est un radical formant un sel tel que Cl, Br, I, P04 et CH3S04. Une formulation préférée pour l'agent lysant est la suivante: Ingrédient Gamme effective de concentration Solution à 50% de chlorure de dodécyltriméthylammonium 60 g/l 40-70 g/l Bromure de tétradécyltriméthyl- ammonium (marque déposée) 6 g/l 4-7 g/l Cyanure de potassium 300 mg/1 250500 mg/1 Eau En quantité suffisante pour 1 litre L'agent lysant ci-dessus est beaucoup plus faible et plus lent par la vitesse de réaction, que celui couramment utilisé Lyse S II (marque déposée). On peut citer comme autresselsd'ammonium quaternaire qui sont également efficaces, Cetrimide (marque déposée) (bromure d'hexadécyl-triméthylammonium) et Bretol (marque déposée) il (bromure de cétyldiméthyléthylammonium), aussi bien seuls queen combinaison avec du chlorure de dodécyltriméthyl= ammonim Le syst-me diluant est apparemment capable de stabiliser la membranee des leucocytes stufisament pour ralentir 1l ê teergie ciné6tique de la réaction de l vagent lysant à un point o il est possible de distinguer le plus petit volume des cellules lymphoïdes du plus grand volume de la serie myeloîdes (neutrophiles, monocytesq 6osinophiles et bfsophiles)0 Des esures répétées de la distribution de dimension des leucocytes ont montré que aes histogrammes étaient stables jusquuà secon.des avant dégénérat îOno Des résultats expérimentaux ont indiqué que les cellules lyphoides étaient réduites essentiellement à leur voltme cellulsire minimuM pendant le temps de lyse de 7,95 secondeso Les cellules myéloîdes apparaîssent à deux à trois foiG leur volume terminal pendait un temps porvant atteindre 30 secondes après addition de 1lagent lysant, et ensuite le volume se réduit lent-ement jusqu'a ce que la fraction myéloïde se confonde avec la fracbion lymphoïdeO En utilisant un cor l telr Co ulte:r odèle S Pl:us calibré pour les érythrocytes et uxn Chaaelyzer@ Modèle C-100 cîibré de Coulter. les volumes des crStes des lymphotdes et des myélordes après traitem-nt avec le système réactif se sont révéeleés tre à proximité de P au cube et 260 u au cube respectivementr avec des largeurs étroites de distribution0 Des leucocytes obtenu.s de sang entler frais par simple sédimentation sur un gradienrt de Ficoll-Paque (marque déposée) se sont révélés présenter des volumes de l'ordre de 260 au cube pour la cr8te des lymphoïdes et de 500 au cube pour la crête des myéloïdes avec des largeurs bien plus importantes de distribution. Un échantillon de sang frais séparé par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Paque en utilisant une technique standard a produit des cellules mononucléaires (lymphocytes et monocytes) séparées des granulocytes (neutrophiles, éosinophiles et basophiles). Les lymphocytes se sont révélés coIncider avec la crête des lympho!des à 260 i au cube tandis que les monocytes se sont révélés être centrés autour de 550 t au cube. La fraction des granulocytes a formé une crête assez large centrée sur 500 j au cube. La séparation des deux populations était bien plus distincte avec le sang chimiquement lysé des expériences du compteur Coulter Modèle S Plus qu'avec les leucocytes viables obtenus par le procédé de Ficoll-Paque (marque déposée). Il est par conséquent apparent que l'agent lysant endommage sensiblement les leucocytes, car leurs volumes sont réduits de deux à trois fois en comparaison aux leucocytes obtenus dans la séparation de Ficoll-Paque du même échantillon de sang. Dans la présente invention, l'incorporation du chlorure de dodécyltriméthylammonium s'est révéléeréduire préférentiellement le volume des cellules lympholdes (c'est-à-dire une réduction de trois fois en volume de 260 au cube à 85 au cube) tout en influençant le volume des cellules myélo!des à un moindre point (c'est-à- dire réduction de volume de deux fois de 500 p au cube à 260 ji au cube). Le chlorure de dodécyltriméthylammonium est en réalité en lui-même un mauvais agent lysant. Il semble modérer le fort effet lytique de Mytab (marque déposée), ralentissant la cinétique de la lyse à un degré permettant la mesure des volumes différents des noyaux des cellules. L'incorporation du bromurede dodécyltriméthyl- ammonium donne également une lyse bien plus nette et plus rapide des érythrocytes et une conversion plus rapide de l'hémoglobine avec de plus faibles concentrations de Mytab, pour donner ainsi une meilleure stabilité aux populations de leucocytes. Des données préliminaires concernant plus d'une centaine d'échantillons normaux et anormaux de sang frais obtenus d'un centre de donneursdu sang et d'hôpitaux locaux ont indiqué un degré élevé de corrélation entre les données concernant les populations des leucocytes obtenuEs par le système compteur Coulter Modèle S Plus-Channelyzer et 100 différences manuelles de cellules. Bien que l'on ait observé une légère variation des fractions myéloldes et lympho!des.'on n' a noté aucun écart important de la corrélation. En utilisant la combinaison du diluant et du réactif lysant selon l'invention, des exploratiens specttro- photométriques (longueurd'onde an fonction d'absorbance) du sang lysé à partir du bain de leucocytes du compteur Coulter Modèle S Plus ont produit des courbes d2hémoglobine essentiellement identiques à celles produites par Lyse S Il;I cependant, l'absorbande à 540 nm et les valeurs résultantes calculées d'hémoglobine sont environ de 0;2 g/l sup6rieures à celles obtenues avec la combinaison d'Isoton Il (marque déposée) et Lyse S II (marque déposée)0 Les valeurs moyennes des volumes des cellules ont également été notées comme éta2t de 1,0 à 125 p au cube plus grandes dans lenoweau système à deux réactifs0 Tous les autres paramètres s-ont virtuellement ideitiques à ceux produits avec la combinaison d Isoton II et de Lyse S IIo REVENDICATIONS R E v E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé pour la détermination différentielle des populations lympholdes et myéloldes des leucocytes, et également pour mesurer des valeurs d'hémogramme, en parti- culier dans des systèmes de comptage automatique, caractérisé en ce qu'on utilise en combinaison: A. Un diluant isotonique comprenant un mélange d'une solutionaqueuse de: 1. composés anesthésiques comprenant des dérivés de l'ester de l'acide 4-aminobenzolque 2. tampons organiques; et 3. germicide qui est ajustée à un pH de 7,0 + 0,1 avec une solution de soude ou d'acide chlorhydrique, selon la nécessité, et à une osmolalité de 320 + 5 milliosmoles par kilogramme avec du sulfate de sodium et du chlorure de sodium, et B. Un réactif lysant comprenant un mélange d'une solution aqueuse d'au moins un sel d'ammonium quaternaire ayant des propriétés tensio-actives, et un cyanure d'un métal alcalin à une gamme de concentration efficace pour donner deshistogrammes des deux volumes des leucocytes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu!on utilise en combinaison: A. Un diluant isotonique comprenant un mélange d'une solution aqueuse de: 1. chlorhydrate de procaine 2. acide N-(2-acétamido) iminodiacétique (ADA) 3. diacétate de chlorhexidène 4. diméthylolurée 5. sulfate de sodium et chlorure de sodium. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on incorpore de la sodium 1-hydroxypyridine-2-thione coie aget antibactérien. 4. Procédé selon l'une: l u L revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agent lysant précité comprend un ou p--iierssels d'ammonium quaternaire détergents choisis dans un groupe de composés ayant pour formule R R2 Ik / N N o R1l est un radical alcoyle à chaîne longue ayant de à 18 atomes de carbone et R2? R3 et R4 sont des radicaux alcoyles à chaine courte ayant de 1 à 6 atomes de carbone et X- est un radical formant un sel, comme Cl, Br, Ig PO40 HS04 et CH3S04, et un cyanure d'un métal alcalin à une gamme de concentration efficace pour donner des histogrammes des deux volumes de leucocytes. 5. Procédé selon l1une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le sel d'ammonîum quaternaire précité est au moins choisi parmi le chlorure d hexadécyltriméthylammonium, le bromure d hexadcyltrmethyl ammonium, le chlorure de tétradécyltriméthylammonium, le bromure de tétradécyltriméthylammonium ou le chlorure de dodécyltriméthylammonium ou leurs mélanges. 6. Procédé selon l'ide quelconque des revendications précédente, caractérisé en ce que le sel deammonium quaternaire précité est un mélange de chlorure de dodécyltriméthylammonium et de bromure de tétradécyltri- méthylammonium. 7. Diluant isotonique à usages multiples, caractérisé par une solution aqueuse de: 1. tampons organiques; 2. produits anesthésiques, comprenant des dérivés de l'e.ter de l'acide 4-amino-benzolque; et 3. germicides ledit diluant étant ajusté à un pH de 7,0 + 0,1 avec une solution de soude ou d'acide chlorhydrique, selon la nécessité, et à une osmolalité de 320 + 5 milliosmoles par kilogramme avec du chlorure de sodium et du sulfate de sodium. 8. Diluant selon la revendication 7, caractérisé par une solution aqueuse de: 1. chlorhydrate de procaihe 2. acide N-(2-acétamido)iminodiacétique (ADA) 3. diacétate de chlorhexidène 4. diméthylolurée, et 5. sulfate de sodium et chlorure de sodium. 9. Diluant selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il contient de la sodium 1-hydroxypyridine-2-thione comme agent anti bactérien. 10. Diluant selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il est combiné avec- un réactif lysant qui est un mélange de dodécyltriméthyl- ammonium et de bromure de tétradécyltriméthylammonium. 11. Diluant isotonique et réactif lysant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'onl'utilise avec un compteur Coulter Modèle S Plus équipé d'un "Channelyzer" externe et d'un abaque X-Y pour produire des hémogrammes comprenant le compte des érythrocytes, le compte des plaquettes et la distribution de dimension, la concentration en hémoglobine, le volume moyen des cellules, l'hématocrite, l'hémoglobine corpusculaire moyenne, la concentration en hémoglobine corpusculaire moyenne, la largeur de distribu- tion des érythrocytes, le volume moyen des plaquettes, le compte des leucocytes et les populations relatives des lymnpholdes et des myéloldes des leucocytes dans un seuléchantillon de sang. 12. Procédé pour la détermination des leucocytes et de l'hémoglobine dans le sang, o un agent lysant contenant une solution aqueuse d'un sel d'ammonium quaternaire ayant des propriétés tensio-actives et un cyanure d'un métal alcalin est utilisé pour stromatolyser les érythrocytes et les cellules des plaquettes et pour convertir l'hémoglo- bine en un chromagéne, à l'azote dudit sel d'ammonium quaternaire étant attachéstrois groupes alcoylées à chaîne courte et un groupe alcoyle à chaîne longue, caractérisé en ce que ledit sel d'ammonium quaternaire et ledit cvye.mre d'in métal alcalin sont présents à une gamme de concentration efficace pour donner des histogrammes des deux volumes des leucocytes etpDur permettre un calcul de routine de l'histogramme des lympholdes/myéloldes des leucocytes et leurs concentrations relatives, en particulier dans des systèmes de comptage automatique. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le sel d'ammonium quaternaire précité est un mélange de chlorure de dodécyltriméthylammonium et de bromure de tétradécyltriméthylammonium.