Brevet FR2476126A1 — publié le 19810821

1. Beaucoup des avantages potentiels entrevus comme conséquence de l'application de la technologie de recombinaison de l'ADN à des problèmes médicaux nécessitent l'insertion dans des organismes-hôtes de gènes capables de diriger la biosynthèse de protéines recherchées. Dans la plupart des cas, une protéine offrant un intérêt est normalement synthétisée dans des cellules animales et ne se rencontre pas à l'état naturel dans des levures ou dans d'autres eucaryotes inférieurs. Bien qu'il ait été possible de cloner plusieurs gènes animaux différents renfermant l'infor- mation nécessaire au codage pour des protéines, les renseignements sur l'expression de ces protéines dans des bactéries et dans d'autres organismes unicellulaires sont en nembre limité. Certaines de celles qui ont été exprimées dans E. coli sont l'hormone polypeptidique humaine appelée somatostatine (K. Itakura, T. Hirose, R. Crea, A.D. Riggs, H.L. Heyneker, F. Bolivar et H.W. Boyer (1977) Science 198: 1056-10G3J, la proinsuline du rat et les chaînes de l'insuline humaine. On a déjà obtenu des résultats dans l'expression du gène de l'ovalbumine de poulet chez E. coli HB101 par fixation de ce gène à proximité des régions d'initiation de la transcription et de la traduction. (Voir Proceedings of National Academy of Sciences (1978) 75: 5936-5940). On est parvenu, dans la présente invention, à l'expression du gène d'ovalbumine de poulet dans une levure par fixation de ce gène avec l'orientation correcte par rapport à une région d'initiation transcriptionnelle. Rien n'indique, dans l'art antérieur, qu'un gène eucaryotique étranger quelconque ait été exprimé dans des eucaryotes inférieurs, par exemple dans une levure. Selon la méthodologie de recombinaison de l'ADN, décrite ci-dessous, le gène structural de l'ovalbumine de poulet a été soudé à une région d'initiation transcriptionnelle chez S. cerevisiae. Lorsqu'un plasmide renfermant le gène hybride est introduit dans S. cerevisiae, une protéine identi- fiée comme une ovalbumine par immuno-réactivité et par électrophorèse sur gel de polyacrylamide est synthétisée. 2. L'ovalbumine de poulet élaborée dans la levure est entière (poids moléculaire 43 000) et est constituée d'environ 1500 molécules par cellule. Il s'agit de la première protéine animale exprimée dans une levure. Selon son aspect le plus large, le procédé de la présente invention est conçu comme un procédé pour l'expres- sion d'un gène, étranger à l'organisme-hôte, codant pour une protéine dans un véhicule convenable, qui consiste à prendre ce gène et à le souder près d'une région d'initiation transcriptionnelle présente dans ledit véhicule, et à insérer ce véhicule dans un hôte eucaryotique inférieur. Des exemples d'autres protéines qui entrent dans le cadre de la présente invention sont la sérum-albumine humaine, les interférons humains, les anticorps humains, l'insuline humaine, des facteurs de coagulation du sang, des peptides cérébraux, des enzymes, des antigènes viraux et des protéines d'origine végétale. La figure unique du dessin annexé illustre les étapes du procédé de préparation du plasmide pUC 1014 de levure lié à la production d'ovalbumine. Bien que les abréviations utilisées sur le dessin soient classiques et bien connues de l'homme de l'art, elles sont redéfinies ciaprès de manière à faciliter la compréhension de l'invention. Endonucléases de restriction: Sal I (dans les exemples) Tcr - gène de résistance à la tétracycline ampr - gène de résistance à l'ampicilline gène his 3 de levure - gène codant pour un enzyme nécessaire à la biosynthèse de l'histidine dans la levure ligase d'ADN de T4 - enzyme pour lequel code le bactériophage T4 YEp - plasmide épisomal de levure pUC désignation officielle d'un plasmide propriété de la firme The Upjohn Company pOV - ovalbumine de plasmide gène de l'ovalbumine - désigne le gène structural de l'ovalbumine de poulet. Les plasmides YEp 6, pOV 230 et pUC 1014 décrits dans le présent mémoire ont été déposés dans des hôtes 3. consistant en E. coli dans la collection permanente du Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, E.U.A. Les numéros sous lesquels ils sont déposés auprès de cet organisme sont les suivants: HB 101 - NRRL B-11 371 HB 101 (pOV 230) - NRRL B-11 354 HB 101 (YEp 6) - NRRL B-12 093 HB 101 (pUC 1014) - NRRL B-12 094 Le plasmide pUC 1014 a également été déposé dans la souche SHY 3 de S. cerevisiae qui est un hôte HV 2 approuvé par les NIH Guidelines. Les numéros matricules de ces dépôts de levure sont les suivants: Souche SHY 3 de S. cerevisiae - NRRL Y-12 095 SHY 3 (pUC 1014) - NRRL Y-12 096. NRRL B-11 371 et NRRL B-11 354 ont été déposés respectivement le 9 août et le 26 juillet 1978. Les autres dépôts ont tous été effectués le 31 janvier 1980. Les dépôts ci-dessus sont accessibles au public après la délivrance d'un brevet. Il y a lieu de remarquer que le fait qu'un dépôt soit mis à la disposition du public n'autorise pas pour autant à exploiter la présente invention, en dérogation aux lois de la propriété industrielle. Le plasmide YEp6 (K. Struhl, D.T. Stinchcomb, S. Scherer et R.W. Davis (1979), Proc. Nat. Acad. Sci. 76: 1035- 1039) renferme un marqueur d'origine de réplication de E. coli et de résistance à l'ampicilline dérivé de pBR322, en sorte qu'il peut être maintenu dans E. coli. De plus, il renferme une origine de réplication de plasmide de levure et un gène His3 de levure, si bien qu'il peut être maintenu dans des auxotrophes his de levure. Le plasmide YEp6 présente également un site remarquable d'endonucléase de restriction Sal I qui peut être utilisé pour le clonage d'un ADN étranger. L'édification du plasmide lié à l'ovalbumine de YEp6, à savoir le plasmide pUC 1014, s'effectue de la manière indiquée sur le dessin annexé. Le plasmide YEp6 est sectionné avec Sal I et la molécule linéaire résultante est traitée, avantageusement, avec une phosphatase alcaline pour éliminer les groupes 5'-phosphate aux extrémités de la molécule. 4. Le plasmide pOV 230 renferme la quasi-totalité de la séquence de l'ARNm de l'ovalbumine, renfermant la totalité de l'information nécessaire au codage pour la séquence d'amino-acides de l'ovalbumine de poulet (L.A. McReynolds, J.F. Catterall et B.W. O'Malley (1977) gène 2: 217-231). Ce plasmide est sectionné par Sal I, réuni avec YEp 6 sectionné par Sal I, traité à la phosphatage alcaline, puis transformé en E. coli. Des transformants sont choisis sur des plaques à l'ampicilline et leurs ADN plasmidiques sont analysés. Il y a deux orientations possibles du gène de l'ovalbumine par rapport au plasmide YEp6g et ces orientations peuvent être distinguées par digestion de l'ADN par Bam Hl et par électrophorèse sur gel d'agarose. On effectue des préparations des ADN de plasmide par croissance dans E. coli et on les utilise pour transformer S. cerevisiae. Des transformants His + sont sélectionnés sur des plaques renfermant le milieu minimal supplémenté dans des conditions dans lesquelles les cellules parentales His ne peuvent pas se développer. Les transformants sont ensuite cultivés en bouillon et lysés par passage à travers une cellule à pression de French. Les extraits sont soumis à une analyse d'immunoréactivité de l'ovalbumine par une méthode d'analyse radio-immunologique en phase solide avec 125I. Comme déterminé par cette analyse immunologique, une seule des deux orientations possibles du gène de l'ovalbu- mine par rapport au plasmide YEp6 est capable de diriger la synthèse de l'ovalbumine dans la levure. Le plasmide hybride présentant cette orientation, appelé pUC 1014, nécessite la transcription du gène de l'ovalbumine-dans la direction (en sens inverse des aiguilles d'une montre) du plasmide illustré sur le dessin. L'autre orientation nécessite la transcription dans le sens des aiguilles d'une montre. Ainsi, le gène de l'ovalbumine n'est exprimé dans la levure que s'il est incorporé au plasmide YEp6 avec l'orientation correcte par rapport à la région d'initiation transcriptionnelle de la levure. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide de l'ovalbumine de poulet élaborée dans la levure indique que 5. cette substance émigre avec une mobilité pratiquement identique à celle de l'ovalbumine dont la synthèse est effectuée dans l'oviducte du poulet. On devrait s'attendre à certaines différences de mobilité, à cause de modifications incomplètes, à la suite de la traduction, de l'ovalbumine élaborée dans la levure. Ainsi, le site normal d'initiation de la traduction du gène de poulet est très probablement utilisé par le mécanisme de traduction de la levure. Le procédé et les produits de la présente invention sont illustrés par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. Tous les pourcentages sont exprimés en poids et toutes les proportions des mélanges de solvants sont exprimées en volume, sauf spécification contraire. EXEMPLE 1 Préparation de l'ADN L'ADN de plasmide pOV 230 provenant de NRRL B- 11 354 est isolé par la technique de précipitation au sel décrite par Guerry et collaborateurs (P. Guerry, D.J. LeBlanc et S. Falkew (1973) J. Bact. 116: 1064-1066). On inocule du bouillon L (E.S. Lennox (1955) Virology 1: 190-206) contenant ]ig/mrl de tétracycline avec une culture en bouillon de NRRL B-11 354, âgée d'environ 18 heures. Les cultures sont agitées énergiquement par secousses à 37 C jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteigne 0,8; le nombre de répliques du plasmide est ensuite amplifié pendant 18 heures au chloramphé- nicol (250 pg/ml). Les cellules sont lavées une fois au chlorhydrate de tris 50 mM, pH 8,0, additionné d'EDTA 20 mM, et elles sont remises en suspension dans 33 ml de saccharose à 25 % en milieu TE (chlorhydrate de tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 m4) par litre de culture. Après l'addition de 1 mg/ml de lysozyme, on fait incuber la suspension sur de la glace pendant 5 minutes, puis on y ajoute un tiers en volume d'EDTA 0,25 M, pH 8,0 et on procède à une nouvelle incubation de 5 minutes sur de la glace. Les cellules sont lysées par l'addition de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % dans du chlorhydrate de tris 37 mM, pH 8,0, additionné d'EDTA 67 mM, jusqu'à une concentration finale de 1,3 %, l'opération étant suivie d'une incubation à 37eC pendant 30 minutes. 6. On relargue l'ADN chromosomique en ajustant la concentration en NaCl à 1 M, puis en refroidissant à 4 C pendant environ 18 heures. Le SDS et l'ADN chromosomique sont séparés par centrifugation à 17 000 x g- pendant 30 minutes à 4 C. La liqueur surnageante résultante est précipitée à l'éthanol, le précipité est centrifugé, puis il est redissous en TE. Cette matière est extraite deux fois au phénol, extraite à l'éther, précipitée à l'éthanol, centrifugée et remise en suspension en TE. On purifie encore l'ADN de plasmide par centrifugation en présence de chlorure de césium et de bromure d'éthidium selon des gradients de densité. On dissout du chlorure de césium dans la solution d'ADN dans un rapport de 1:1 (poids:volume), puis on ajoute 550 pg/ml de bromure d'éthidium. On centrifuge des gradients pendant environ heures à environ 100 000 x g. L'ADN de plasmide est enlevé du gradient par ponction à l'aide d'une aiguille, et le bromure d'éthidium est extrait au 1-butanol saturé d'eau. L'ADN est ensuite dialysé en milieu chlorhydrate de tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM, et la dialyse est suivie d'une précipitation finale à l'éthanol. L'ADN de plasmide purifié est dissous en milieu chlorhydrate de tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM. Si l'on remplace la tétracycline par l'ampicil- line dans le procédé décrit ci-dessus pour la préparation d'ADN de pOV 230, on peut aussi utiliser ce procédé pour préparer l'ADN de YEp6 et l'ADN de pUC 1014 dans E. coli. D'autres ADN de plasmides peuvent être préparés par ce procédé, si une substance convenablement choisie (c'est-à- dire un autre antibiotique) est utilisée pour maintenir le plasmide dans la culture. L'homme de l'art est également en mesure de faire varier les conditions ci-dessus pour la préparation d'un ADN de plasmide. EXEMPLE 2 Digestions par des endonucléases de restriction La digestion par Sal I de l'ADN de YEp6 et de l'ADN de pOV 230, préparés comme décrit dans l'exemple 1, est 7. conduite dans un mélange réactionnel contenant 6 mM de chlorhydrate de tris, pH 8,0, 6 mM de MgCl2, 150 mM de NaCl, 6 mM de emercapto-éthanol, 100 pg/ml de gélatine autoclavée, pg/ml d'ADN et 80 unités/ml d'endonucléase de restriction Sal I. Après incubation pendant 60 minutes à 37 C, le mélange réactionnel est extrait au phénol, extrait à l'éther et précipité à l'éthanol. Il y a lieu de remarquer que l'utili- sation d'un autre véhicule pourrait nécessiter le choix d'une endonucléase de restriction différente. L'homme de l'art est en mesure de faire varier les concentrations des réactifs, des substrats et des enzymes de même que les conditions réactionnelles pour obtenir les clivages désirés. EXEMPLE 3 Traitement à la phosphatase alcaline Ce mode opératoire est mis en oeuvre essentiellement de la manière décrite par Ullrich et collaborateurs (A. Ullrich, J. Shine, J. Chirgwin, R. Pictet, E. Tischer, W.J. Rutter et H.M. Goodman (1977) Science 196: 1313-1319) avec quelques modifications mineures. On fait pre- incuber à 70 C pendant 10 minutes 12 unités/ml de phosphatase alcaline bactérienne (BAPF, Worthington) dans du chlorhydrate de tris 20 mM à pH 8, 0. On ajoute ensuite 100 pg/ml d'ADN de YEp6 scindé par Sal I, préparé comme décrit dans l'exemple 2, et on poursuit l'incubation à 70 C pendant 15 minutes. Le mélange réactionnel est ensuite extrait trois fois au phénol, extrait à l'éther et précipité à l'éthanol. Cette opération est facultative dans la préparation de pUC 1014. Toutefois, son utilisation offre un rapport élevé de pUC 1014 au plasmide parental YEp6 parmi les transformants résistant à l'ampicil- line, ce qui facilite donc l'isolement de pUC 1014. EXEMPLE 4 Ligase de l'ADN de T4 Le mélange réactionnel destiné à lier l'ADN de pOV 230 à l'ADN de YEp6 traité par la phosphatase alcaline, préparé comme décrit dans l'exemple 3, contient 50 mM de 8. chlorhydrate de tris, pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 20 mM de dithio- thréitol, 1 mM d'ATP, 30 Pg/ml d'ADN de YEp6, 6 Pg/ml de pOV 230 scindé par Sal I et 15 unités/ml de ligase de l'ADN de T4. Après incubation pendant 16 heures à 12,5 C, le mélange réactionnel est précipité par l'éthanol et le culot est dissous en milieu-TCM (chlorhydrate de tris 10 mM, pH 8,0, CaCl2 10 mM, MgCl2 10 mM). L'homme de l'art est à même de faire varier les concentrations des réactifs, des substrats et des enzymes, ainsi que les conditions réactionnelles pour obtenir les liaisons désirées. EXEMPLE 5 Transformation de E. coli On inocule 120 ml de bouillon L (1 % de tryptone, 0,5 % d'extrait de levure, 0,5 % de NaCl) avec une culture, âgée de 18 heures, de HB101 NRRL B-11371 et on laisse croître jusqu'à une densité optique, à 600 nm égale à 0,6. On lave les cellules dans une solution froide de MgSO4 10 mM et on les remet en suspension pendant 15 minutes dans 20 ml de solution refroidie de CaCl2 50 mM. Les bactéries sont ensuite concentrées au dixième de ce volume dans CaCl2 et mélangées dans le rapport de 2:1 (volume à volume) avec l'ADN lié préparé comme décrit dans l'exemple 4. Après refroidissement du mélange de cellules et d'ADN pendant 15 minutes, on soumet ce mélange à un choc thermique à 42 C pendant 2 minutes, puis on le laisse s'équilibrer à la température ambiante pendant minutes avant l'addition de bouillon L en quantité de deux fois et un tiers le volume de la suspension d'ADN et de cellules. On fait incuber les cellules transformées dans le bouillon à 37 C pendant une heure avant l'inoculation d'un milieu sélectif (gélose L + 20 pg/ml d'ampicilline) à raison de 200 pl par plaque. On fait incuber les plaques à 37 C pendant 48 heures pour permettre le développement des transformants. Bien que le processus de transformation soit essentiel pour l'amplification des molécules de recombinaison de l'ADN édifiées par voie biochimique, l'homme de l'art est en mesure de faire varier le choix des conditions de mise en oeuvre de ce processus pour atteindre l'objectif recherché. 9. EXEMPLE 6 Transformation de NRRL Y-12095 en NRRL Y-12096 La souche SHY 3 de Saccharomyces cerevisiae (ura trp-leu-his-ade-), NRRL Y-12095, est transformée comme suit 20 ml de culture en phase logarithmique en bouillon YEPD (1 % d'extrait de levure, 2 % de peptone, 2 % de glucose) jusqu'à une densité optique à 600 nm de 2,0 (3 x 107 cellules/ml) sont centrifugés et le culot est remis en suspension dans un dixième en volume de milieu contenant du sorbitol 0,9 M, un tampon au KPO4 50 mM, pH 7,5 et du 0-mercapto-éthanol 14 mM. Des sphéroplastes sont formés par l'addition de 1 % de Glusulase (Endo Laboratories) et incubation à 30 C pendant minutes. Après lavage trois fois dans du sorbitol 1M, les sphéroplastes sont remis en suspension dans 1/100 du volume initial de culture, de milieu contenant du sorbitol 1M, du chlorhydrate de tris 10 mM, pH 7,5 et du CaC12 10 mM. De l'ADN de pUC 1014 est ajouté jusqu'à une concentration finale de [ig/ml. Après incubation pendant 5 minutes à la température ambiante, on ajoute dix volumes de milieu contenant 40 % de polyéthylèneglycol 4000, du chlorhydrate de tris 10 mM, pH 7,5 et du CaCl2 10 mM, puis on conduit une incubation pendant minutes à la température ambiante. Des transformants de His sont choisis par recouvrement de gélose minimale (0,7 % de base azotée pour levure (Difco), 2 % de glucose, 2 % d'agarose, supplémenté avec 20 pg/ml d'uracile, d'adénine et de tryptophane et 30 pg/ml de leucine) avec 0,2 ml de suspension de cellules dans 10 ml de milieu de régénération fondu (45 C) (milieu minimal contenant du sorbitol 1M, 2 % de YEPD et 3 % d'agarose). On fait incuber les plaques à 28 C pendant 5-6 jours. EXEMPLE 7 Préparation d'un extrait cellulaire de levure Des cellules de levure, cultivées dans 100 ml de milieu minimal à 28 C jusqu'au début de la phase stationnaire, sont lavées dans une solution physiologique de sel (Gibso) tamponnée au phosphate de Dulbecco et elles sont remises en suspension dans un tampon d'extraction (chlorhydrate de tris 10. 1 mM, pH 7,4, MgCl2 1 mM, NaCl 5 mM) dans un rapport de 1:1 (volume en ml divisé par le poids cellulaire en grammes). On fait passer la suspension deux fois à travers une cellule à pression de French, sous une pression de 105 MPa pour lyser les cellules. EXEMPLE 8 Analyse radio-immunologique en phase solide On effectue cette analyse selon une version légèrement modifiée de la méthode décrite par Broome et Gilbert (Proc. Nat. Acad. Sci., 75: 2746-2749 (1978) j. On fait flotter des feuilles en chlorure de polyvinyle {0,203 mm d'épaisseur, produites par la firme Dora May Co., provenant de Woolworth) de 8 cm de diamètre, pendant 2 minutes à la température ambiante, sur 10 ml de solution de NaHCúO 0,2 M (pH 9,2) contenant 600 pg de la fraction d'IgG de sérum de chèvre anti-ovalbumine. On retourne ensuite le chlorure de polyvinyle pour revêtir l'autre côté. On le 'lave ensuite avec une solution (tampon de lavage) contenant du sel tamponné au phosphate, 0,5 % de sérum normal de lapin et 0,20 % de sérum- albumine de boeuf. Après lavage, on place les feuilles en contact avec la protéine à analyser pour détecter la présence d'ovalbumine immunoréactive. Si l'on doit analyser des lysats cellulaires, la méthode la plus pratique consiste à déposer une goutte du lysat sur une matrice en gel d'agarose. Des protéines renfermées dans une matrice de gel de polyacrylamide peuvent aussi être dosées après avoir été séparées par électrophorèse. On place le polyvinyle revêtu d'IgG au contact des matrices de gel d'agarose ou de gel de polyacrylamide et on les fait incuber au réfrigérateur (environ 4 C) pendant plusieurs heures. La feuille de polyvinyle est ensuite mise en contact avec une IgG anti- ovalbumine marquée à l'iode ( 125IJ et on la fait incuber pendant environ 18 heures au réfrigé- rateur. Après rinçage dans un tampon de lavage, les feuilles sont autoradiographiées à -70 C avec un film Kodak XR-5 et un écran de renforcement Cronex Hi- plus duPont. 1 1. EXEMPLE 9 Préparation et clonage des gènes Des gènes structuraux codant pour des protéines eucaryotiques peuvent généralement être préparés à partir de leurs ARN messagers purifiés (ARNm). Un ADN complémentaire (ADNc), copie de l'ARNm, est synthétisé par voie enzymatique puis disposé en double hélice par l'action d'un enzyme. Ce gène est ensuite lié à un véhicule convenable de clonage, habituellement par la méthode d'attache poly dA:poly dT (D.A. Jackson, R.H. Symons et P. Berg (1972>, Proc. Nat. Acad. Sci. 69: 2904-2909), bien que cela ne soit pas toujours nécessaire. Le véhicule renfermant le gène structural est ensuite amplifié dans des bactéries. Cette méthode a été utilisée pour préparer le plasmide pOV 230, de même que des plasmides renfermant des gènes de globine et des gènes d'insuline. EXEMPLE 10 Autres véhicules, hôtes et sources de gènes Des exemples d'autres véhicules qui peuvent être utilisés dans l'invention comprennent tous ceux qui sont susceptibles de réplication à l'intérieur de la levure, tels que YEp2, YEp4, YRp7, YEp2O. On mentionne également des vecteurs qui sont susceptibles de réplication dans d'autres hôtes eucaryotiques inférieurs. Des exemples d'autres hôtes pour le véhicule comprennent toutes formes dérivées de S. cerevisiae ou d'autres champignons. Il est reconnu que ces derniers hôtes doivent avoir été approuvés par les NIH Guidelines. L'invention s'étend à des protéines animales, ce qui couvre les vertébrés, au nombre desquels comptent les vertébrés homéothermes, comprenant les oiseaux, par consé- quent les poulets. Comme indiqué ci-dessus, l'invention couvre au sens large des protéines qui sont étrangères à l'organisme de l'hôte. Son cadre pourrait donc être étendu à des protéines pour lesquelles codent des gènes provenant de plantes et de virus végétaux et animaux. 12. EXEMPLE il Purification de l'ovalbumine Les cellules de levure transformées de l'exemple 6 sont cultivées dans le milieu minimal (0,7 % de base azotée pour levure, 2 % de glucose, supplémenté avec mg/ml d'uracile, d'adénine et de tryptophane, et 30 pg/ml de leucinej jusqu'au début de la phase stationnaire et elles sont lavées dans la solution physiologique de sel tamponnée au phosphate de Dulbecco (Gipco). Les cellules, renfermant l'ovalbumine, sont ensuite remises en suspension dans un tampon d'extraction (chlorhydrate de tris 1 mM, pH 7,4, MgCl2 1 mM, NaCl 5 mM) dans un rapport de 1:1 (volume en ml: poids cellulaire en grammes). On fait passer la suspension à travers une cellule de French fonctionnant sous pression de 105 MPa pour lyser les cellules. La purification en vue d'obtenir de l'ovalbumine cristalline destinée à être utilisée dans l'industrie de la boulangerie ou à des fins de recherche peut être effectuée de la manière décrite par V. Shepherd et R. Montgomery (1976) dans Methods in Carbohydrate Research, volume VII, édition R.L. Whistler et J.W. BeMiller, Academic Press, New York, pages 172-174. L'ovalbumine cristalline figure sur les catalogues de vente de divers fournisseurs de produits chimiques de grande pureté. Les travaux décrits dans le présent mémoire ont tous été effectués en conformité avec les règles de protection physique et biologique spécifiées dans les NIH Guidelines. 24 76 12 6 REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'expression d'un gène étranger à l'organisme hôte codant pour une protéine animale ou végétale dans un véhicule convenable, caractérisé en ce qu'il consiste à prendre ce gène et à le fixer dans l'orientation correcte par rapport à une région d'initiation de transcription présente dans ledit véhicule et à insérer ce dernier dans un hôte eucaryotique. 2. - Procédé pour l'expression du gène structural de l'ovalbumine de poulet dans un véhicule convenable, caractérisé en ce qu'il consiste à prendre ce gène et à le fixer dans l'orientation correcte par rapport à une région d'initiation de transcription présente dans ledit véhicule et à insérer ce dernier dans un hôte eucaryotique. 3. - La souche SHY 3 (pUC 1014) déposée sous le numéro matricule NRRL Y-12096. 4. - Le plasmide pUC 1014. 5. - Procédé de préparation d'ovalbumine de poulet, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la souche SHY 3 (pUC 1014) de S. cerevisiae, déposée sous le numéro matricule NRRL Y-12096, dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions déterminées. 6. - Procédé pour l'expression d'un gène d'un virus végétal codant pour une protéine dans un véhicule convenable, caractérisé en ce qu'il consiste à prendre ce gène et à le fixer dans l'orientation correcte par rapport à une région d'initiation de transcription présente dans ledit véhicule, puis à insérer ce dernier dans un hôte eucaryotique. 7. - Procédé d'expression d'un gène d'un virus animal codant pour une protéine dans un véhicule convenable, caractérisé en ce qu'il consiste à prendre ce gène et à le fixer dans l'orientation correcte par rapport à une région d'initiation de transcription présente dans ledit véhicule, puis à insérer ce dernier dans un hôte eucaryotique.