Brevet FR2478124A1 — publié le 19810918

Depuis plus de 20 ans, on sait que l'interféron empêche la production des virus. Des recherches récentes ont montré en- outre que l'interféron inhibe également la division des cellules et règle de nombreuses réactions du système immun. Tous ces ré- sultats mettent en relief la grande importance médicale de ltin- terféron. Les quantités d'interféron qui ont pu jusqu'à présent ê- tre utilisées pour des recherches scientifiques et thérapeuti- ques, ont été obtenues à partir de cultures de fibroblastes et de lymphocytes. Mais aucun de ces deux procédés n'a permis de préparer des quantités d'interféron plus importantes ou même suf- fisantes pour des problèmes isolés. C'est également la raison pour laquelle l'état des connaissances dans le domaine de l'in- terféron ne progresse que très lentem2nt et seules quelques re- cherches très souhaitées dans le domaine du cancer ont pu être entreprises. Il s'avère donc indispensable de s'engager dans de nouvelles voies pour la production d'interféron. La présente invention propose donc une telle voie. Elle concerne l'isolement de séquences de nucléotides qui contiennent le code génétique pour l'interféron, la synthèse de l'ADN avec ces séquences de nucléotides spécifiques et le transfert de cet ADN dans un microorganisme choisi comme hôte, dans lequel ont lieu la réplique et l'expression de cet ADN. La présente invention concerne en particulier la prépara- tion de gènes pour l'interféron de leucocytes, le transfert de ces gènes dans un hôte microbien, la réplique de l'hôte et du gène et l'expression du gène par l'hôte. On obtient alors une protéine d'interféron ayant les propriétés biologiques et immuno- logiques caractéristiques pour cette protéine. Pour atteindre le but de l'invention, on peut procéder de la manière suivante, la voie décrite étant donnée à titre d'exemple parmi plusieurs autres possibles. On dénature les cellules contenant de l'interféron de leucocytes humain et on obtient l'ARN scus forme d'un précipité après une centrifugation dans le chlorure de césium. Après une 2478 124 autre précipitation, on sépare le mARN de cet ARN sur une colon- ne d'oliao-dT-cellulose. Le mARN obtenu est complété en une dou- ble chaîne ARN-ADN au moyen de l'enzyme réverse transcriptase. Après digestion de la chaîne d'ARN, la chaîne d'ADN (ADN complé- mentaire = cADN) est complétée en une double chaîne ADN-ADN (dsADN) au moyen de la réverse transcriptase ou de l'enzyme po- lynérase I. Cet ADN à double chaîne doit alors être incorporé dans un plasmide. Dans ce but, on doit prolonger l'extrémité 3' de l'ADN avec des restes dCMP (désoxycytosine monophosphate) par exemple. Le plasmide (par exemple pBR 322) est scindé avec la nucléase de restriction PstI et prolongé par exemple avec des restes dGMP (désoxyguanidine monophosphate). Il résulte de la réunion de l'ADN ainsi prolongé avec le plasmide prolongé de fa- çon correspondante un appariement de base entre l'ADN et le plas- mide. Cette molécule rendue circulaire est alors transformée dans des microorganismes (avant tout des bactéries, de préféren- ce E. coli, tel que E. coli K 12 ou X 1776); les liaisons non encore fermées sont liées de façon covalente par les enzymes du microorganisme. Les microorganismes transformés sont étalés sur des plaques de gélose et sélectionnés quant aux résistances aux antibiotiques, conférées par le plasmide choisi et la nucléase de restriction utilisée. A l'aide. de tests immunologiques et biologiques, on cherche les clo- nes qui expriment des protéines contenant de l'interféron. On culti- ve ces clones, on sépare la masse de microorganismes par centri- fugation, on extrait et on détermine la teneur en interféron.-La solution obtenue par extraction du clone produisant de l'inter- féron contient la protéine d'interféron. Les procédés selon l'invention peuvent être mis en oeu- vre de la manière suivante: 1. Procédé d'isolement de 'ARN a) L'obtention de cellules de lymphoblastes productrices d'in-- terféron D'une manière connue en soi, on multiplie des cellules de la lignée de cellules de lymphoblastes Namalvar jus- qu'à une concentration en cellules de 1 à 6 x 10 cel- lules/mlo. Pour l'induction de l'interféron, on reprend les cellules dans un milieu frais et, à une concentra- tion de 1 à 10 x 106 cellules/ml, on infuse avec le vi- rus de la Maladie de Newcastle ou le virus Sendai (mul- tiplicité de l'infection > 1,0). Après 4 à 24 heures d'incubation à 37 C, on sépare les cellules par centri- fugation. b) Obtention des leucocytes produisant de l'interféron Pour obtenir les leucocytes produisant de l'interféron, on part de suspensions de leucocytes obtenues à partir du sang d'un donneur en bonne santé. A cet effet on met la couche de leucocytes entre des érythrocytes et du sé- rum d'échantillons de sang centrifugés, en suspension dans des solutions tampons appropriées et on sépare les érythrocytes et les thrombocytes par sédimentation frac- tionnée, par exemple par dépôt à 1 g ou centrifugation à faible vitesse. Puis on met les leucocytes en suspen- sion dans un milieu nutritif usuel et on induit tel que décrit ci-dessus. c) Obtention de l'ARN On fixe les cellules obtenues dans un "milieu dénatu- rant" (thiocyanate de guanidinium 4 M, mercaptoéthanol 1 M, acétate de sodium 0,15 M - pH 5,5) et on homogénéi- se pendant 1 minute à O C avec une Ultra-Turrax. On centrifuge l'homogénéisat pendant 15 minutes à 4 OC et 000 tours/minute. On verse ensuite le produit surnageant sur une solution ("coussin") de 5 ml de CsCl 5,7 M, tris-hydroxyamino- méthane (Tris) 10 mM, acide éthylène diamine tétraacéti- que (EDTA) 10 mM de pH-7,6 et on centrifuge dans un ro- tor Beckman-SW 27 pendant 36 heures à 20 C et 22 000 tours/minute. On a trouvé que, contrairement aux indications de la littérature, il faut éviter d'ajouter du CsCl au lysat pour obtenir une séparation la plus totale possible du mARN au stade réactionnel suivant. Lorsque la centrifu- gation est terminée, on réfrigère les petits tubes de polyallomère dans de l'azote liquide et on découpe le fond du tube dans lequel se trouve le précipité d'ARN. On reprend le précipité dans une solution de 10 mM de tris, 10 mM d'EDTA et 1 % de "Sarcosyl" (sel de sodium de la N-lauryl sarcosine) de pH 7,6 et on sépare la sus- pension par centrifugation à 20 000 tours/minute pen- dant 20 minutes. On reprend encore une fois le précipi- té dans le même tampon, on chauffe pendant 5 minutes à 65 C et on centrifuge de nouveau. On ajoute de l'acé- tate de sodium aux produits surnageants réunis de façon à avoir une concentration 0,3 M en acétate de sodium, on ajoute 2,5 fois le volume d'éthanol et on conserve à -20 C. 2. Obtention du mARN On sépare i'ARN par centrifugation à partir de la solu- tion éthanolique (20 000 tours/minute, 30 minutes, -5 C) et on dissout dans NaCl 0,5 M et 10 mM de tris à pH 7,5. On verse cet- te solution sur une colonne d'oligo-dT-cellulose (fabricant: Collaborative Research, type 3), équilibrée avec le même tam- pon et on élue avec 1 mM de tris à pH 7,6 ou de l'eau distillée. On peut suivre 1' élution de l'ARN contenant des poly-A (mARN) par une mesure de l'extinction à 260 nm. A i'ARN ainsi obtenu, on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration fi- nale de 0,3 M, on ajoute 2,5 fois le volume d'éthanol et on con- serve la solution à -20 C. 3. Obtention du cADN a) Obtention du cADN à simple cha ne On effectue la conversion du mARN en l'ADN correspon- dant (cADN) à l'aide de l'enzyme réverse transcriptase. La pre- paration d'incubation contient: 50 mM de tris à pH 8,3, 10 mM de MgC12, 30 mM de 2-mer- 2476 1 2 4 captoéthanol, 0,5 mM au total des 4 désoxyribonucléosi- de triphosphates usuellement présents (soit les tri- phosphates correspondants d'adénine, de guanine, de cy- tosine et de thymidine), 100 pg/ml d'oligo-dT12_18 (fa- bricant: Boehringer Mannheim), environ 100 mg/ml d'ARN polyadénylé et 800 unités/ml de réverse transcriptase (fabricant: Life Science Inc., St-Petersburg, USA). Pour suivre la réaction, on peut ajouter à la prépara- tion un désoxyribonucléoside triphosphate marqué au 32P en position e (activité spécifique: 50 Ci/mMole). On incube le mélange pendant 60 minutes à 42 C, après quoi on arrête la réaction par addition de 20 mM d'EDTA. On extrait la solution avec un même volume de phénol sa- turé d'eau, on sépare le phénol par agitation avec de l'éther et on chasse le reste d'éther par évaporation à l'azote. Les désoxyribonucléoside triphosphates non-in- corporés sont séparés par chromatographie sur colonne de Sephadex G50 dans 10 mM de tris, pH 9,0, 100 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA. On précipite le cADN par addition d'acétate de sodium jusqu'à une concentration de 0,3 M et de 2,5 fois le volume d'éthanol. Après avoir centrifugé, on re- prend le précipité dans NaOH 0,1 M et on incube pendant minutes à 70 C ou dans NaOH 0,3 M pendant une nuit à la température ambiante. On ajuste le pH du mélange à une valeur de 7,6 avec HC 1 M et du tris 1 M. b) Formation du cADN à double chaîne (ds ADN) Pour synthétiser la seconde chaîne d'ADN, on peut utili- ser de nouveau l'enzyme réverse transcriptase ou l'en- zyme polymérase I. Formation du dsADN avec la réverse transcriptase: La préparation d'incubation (pH 8,3) contient 50 mM de tris, 10 mM de MgC12, 30 mM de 2-mercaptoéthanol, 0,5 mM des 4 désoxyribonucléoside triphosphates mentionnés ci- dessus, 50 pg/ml de cADN et 800 unités/ml de réverse transcriptase. On effectue la réaction pendant 120 mi- nutes à 42 C et on l'arrête par une addition d'EDTA jusqu'à une concentration finale de 20 mM. On extrait ensuite au phénol et on effectue une chromatographie par perméation de gel sur Sephadex G50 tel que décrit ci-dessus. Formation du dsADN avec la polvmérase I: La préparation d'incubation (pH 6,9) contient 200 mM d'Hepes, 0,5 mM des 4 désoxyribonucléoside triphosphates mentionnés ci-dessus, 10 mM de MgC12, 30 mM de 2-mercap- to-éthanol et 70 mM de KC1. On peut suivre la réaction en ajoutant des désoxyribonucléotides marqués au 32p (en les positions c) à la préparation d'incubation. La réaction est déclenchée avec 800 unités/ml de poly- mérase I et effectuée pendant 2 heures à 15 OC. On ar- rate la réaction en ajoutant 0,1 % de dodécylsulfate de sodium et 100 pg/ml d'ARN. On extrait la solution tel que décrit ci-dessus. On transfère la solution obtenue après l'extraction sur une colonne de Sephadex G50 et on effectue la chromatographie avec 10 mM de tris à pH 9,0, 100 mM de NaCl et 1 mM d'EDTA. On peut détermi- ner l'ADN élue par mesure de la radioactivité et on pré- cipite par addition de 0,3 M d'acétate de sodium et 2,5 fois le volume d'éthanol. On reprend le précipité dans l'éthanol dans une solution (pH 4, 5) de 300 mM de NaCl, 30 mM d'acétate de sodium et 3 mM de ZnC12 et on ajoute 1 500 unités/ml de nucléase S1 (Boehringer Mannheim). On arrête la réaction après 1 heure à 37 C en ajoutant de 1,EDTA jusqu'à une concentration finale de 20 mM.On extrait au phénol et on précipite à l'éthanol tel que décrit ci-dessus. c) Obtention du cADN dans un "procédé en un seul stade" D'une façon différente des réactions décrites, on peut également obtenir le dsADN à partir du mARN dans un "procédé en un seul stade". On effectue alors la réac- tion avec la réverse transcriptase tel que décrit, mais 2 4 78124 on ajoute encore à la préparation d'incubation 140 mM de KC1. Lorsque la réaction est terminée, on chauffe le mélange pendant 4 minutes à 100 C et on sépare le précipité formé par centrifugation. Au produit surna- geant, on ajoute le même volume de tampon d'Hepes 0,4 M (pH 6,9), les 4 désoxvyribonucléotides ci-dessus étant alors présents dans le tampon à une concentration de 0,5 mM. En ajoutant 800 unités/ml de polymérase I, on effectue la réaction à 15 C tel que décrit et on arrê- te la réaction par addition de dodécyl sulfate de so- dium et d'ARN. Puis on procède tel qu'indiqué en 3.b) "formation du dsADN avec la polymérase I". 4. Prolongement des extrémités 3' du cADN avec le dCTP (déso- xycytosine triphosphate) Pour l'introduction dans le plasmide, il faut prolonger l'extrémité 3' de 1'ADN avec l'un des 4 désoxynucléotides men- tionnés ci-dessus. On prolonge en outre les extrémités 3' du plasmide scindé avec le désoxynucléotide complémentaire. En réu- nissant l'ADN et le plasmide, il se forme un appariement de ba- se entre l'ADN et le plasmide. Cette molécule rendue de nouveau circulaire peut être utilisée pour la transformation des bacté- ries; les liaisons non encore fermées sont liées de façon co- valente par un système d'enzymes dans la bactérie. On peut par exemple prolonger les extrémités 3' du cADN avec des restes de dCMP (restes de désoxycytosine monophosphate) et le plasmide avec des restes de dGMP (restes de désoxyguanidi- ne monophosphate). En utilisant ces désoxynucléotides selon le procédé décrit et en ouvrant le plasmide par l'enzyme de res- triction Pst I, après l'incorporation d'ADN étranger, il se for- me de nouveau un site de scission de Pst I sur chaque site d'in- sertion, de sorte qu'après la multiplication du plasmide, l'ADN inséré peut être de nouveau "découpé" facilement avec l'enzyme de restriction Pst I pour une autre étude. On dissout le précipité résultant de la précipitation par un alcool après dégradation par la nucléase Sl dans une so- lution aqueuse (pH 6,7) contenant 30 mM de tris, 1 mMl de CoC12, mM de cacodylate de potassium, 150.M1 de dCTP, 100.g d'hy- drolysat de gélatine autoclavé et 0,1 M de dithioérythrite. Pour suivre la réaction, on peut utiliser un dCTP marqué au P. La réaction est déclenchée par addition de désoxynucléotidyle trans- férase terminale et effectuée pendant 10 minutes à 37 C. Lors- que la réaction est terminée, on place l'échantillon dans la gla- ce et on détermine le nombre de restes de dCMP incorporés, par mesure de la radioactivité dans le précipité obtenu par addi- tion d'acide trichloracétique. Au cours de la réaction, on de- vrait ajouter environ 10 % des nucléotides initialement présents; si tel n'est pas le cas, la réaction est poursuivie en ajoutant une autre quantité d'enzyme. Si un trop grand nombre de restes de dCMP ont été incorporés, la chaîne formée peut être raccour- cie à l'aide de l'enzyme nucléase Sl. 5. Procédé d'intégration d'ADN dans un Dlasmide On scinde un plasmide circulaire approprié, par exemple le pBR 322, avec une endonucléase de restriction qui ne recon- naît qu'une séquence sur le plasmide. Il est avantageux que ce site de scission se trouve derrière un promoteur puissant ou inductible et/ou soit localisé de façon à influencer une résis- tance aux antibiotiques. Ce plasmide ainsi linéarisé est alors prolongé par un des 4 désoxynucléotides aux extrémités 3'. Ceci a lieu par exemple de la manière suivante: on incube 30 g de plasmide avec 50 unités d'endonucléase de restriction Pst I en présence de 50 mMl de NaCl, 6 mM de tris, 6 mM de MgC12, 6 mM de 2-mercapto-éthanol et 0,1 mg/ml de géla- tine pendant 40 minutes à 37 C et à une valeur de pH de 7,5. On extrait ensuite au phénol et à l'éther tel que décrit ci-des- sus et on précipite le plasmide scindé par l'éthanol en présen- ce de 0,3 M d'acétate de sodium. Le prolongement des extrémités 3' du plasmide avec le dGTP (désoxyguanidine triphosphate) se fait selon le procédé de prolongement du cADN avec le dCTP, dé- crit ci-dessus. On mélange l'ADN plasmique prolongé dans une solution (pH 8,0) contenant 0,1 M de NaC1, 10 mM de tris et 1 mM d'EDTA, avec le ds cADN prolongé, on chauffe pendant 2 minutes à 56 C, on incube pendant 2 heures à 42 C, puis on refroidit lentement à la température ambiante. L'ADN hybride ainsi obtenu est alors utilisé pour la transformation de E. coli. 6. Clonage du plasmide hybride dans E.coli On laisse proliférer les bactéries, par exemple E.coli )(1776, à 37 C dans 50 ml d'un milieu nutritif usuel jusqu'à une densité optique de A600 = 0,5 - 0,6, on sédimente, on lave une fois avec du tris 10 mM à pH 7,5, puis on remet en suspen- sion dans 40 ml d'une solution contenant 75 mM de CaCl2, 5 mM de M4C12 et 5 mM de tris de pH 8,0 et on incube pendant 20 minutes dans la glace. On sédimente ensuite les cellules et on remet en suspension dans 2 ml d'une solution contenant 75 mM de CaC12, mM de MgC12 et 5 mM de tris à pH 8,0. On mélange 0,2 ml de cette suspension de bactéries avec 0,1 ml de la solution d'ADN hybride et on incube sur de la glace pendant 45 minutes. On chauffe pendant 90 secondes à 42 C et on mélange avec 0,2 ml d'un milieu nutritif. On étale 50 à 75 ul de cette suspension sur des plaques de gélose contenant de la tétracycline et de l'ampicilline.et on sélectionne quant à la résistance aux antibiotiques. 7. Isolement de souches qui produisent des protéines contenant de l'interféron a) Détection immunologique A l'aide d'un système d'essai élaboré par Broome et Gil- bert (Broome S. et Gilbert E., PNAS 75, 2746, 1978), on étudie les clones quant à l'expression des protéines con- tenant de l'interféron. Les clones qui expriment des pro- téines contenant de l'interféron, sont reconnaissables par fixation d'anticorps radioactifs sur ces protéines et autoradiographie ultérieure, par le fait que le film Rbntgen est noirci en ces sites. Dans ce but, on laisse se développer jusqu'à 50 clones par filtre de nitrocellu- lose pendant 2 jours à 37 C. Puis on place les filtres sur un bloc de gélose qui contient 1 mg/ml de lysozyme; sur la colonie de bactéries, on applique une feuille de chlorure de polyvinyle (PVC) enduite d'anticorps opposés à l'interféron, puis on incube pendant 2 à 3 heures à 4 C. On incube ensuite la feuille de PVC pendant 15 heures à 4 C dans une solution d'anticorps opposés à l'interféron marqué à 132I. L'activité spécifique de la solution est d'environ 1 x 106 cpm/ml. Après lavage et séchage de la feuille, on procède à l'autoradiogra- phie. b) Détection biologique On cultive les clones dans 50 ml d'un milieu nutritif usuel pendant une nuit à 37 C. On sédimente les bacté- ries, on lave deux fois avec 10 mM de tris (pH 8,0) et mM de NaCl froids et on remet en suspension dans du saccharose à 20 % dans 30 mM de tris à pH 8,0 et 1 mM d'EDTA. On agite alors à la température ambiante pendant minutes, on sédimente, on remet en suspension dans H H20 glacée et on incube pendant 10 minutes dans un bain de glace. On sédimente les bactéries et d'une manière connue en soi on détermine la teneur en protéine conte- nant de l'interféron dans le résidu, dans un test d'inhi- bition des virus. 8. Obtention de la protéine d'interféron Les clones qui montrent une activité en interféron dans les différents tests, sont cultivés dans des milieux nutritifs usuels, les bactéries sont séparées par centrifugation et ex- traites avec des tampons aqueux. La solution d'extraction con- tient la protéine d'interféron. il R B V B N D I C A T I 0 N S 1 - Polypeptide préparé par voie microbiologique, carac- térisé en ce qu'il contient totalement ou partiellement la sé- quence d'acides aminés de l'interféron humain. 2 - Polypeptide préparé par voie microbiologique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient totalement ou partiellement la séquence d'acides aminés de l'interféron de leucocytes humains. 3 - cADN codant pour la séquence d'acides aminés de l'in- terféron humain selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est préparé au moyen de mARN à partir de limnées de cellu- les de leucocytes humains. 4 - Plasmide, codant pour les séquences d'aciles aminés de l'interféron de leucocytes humains selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est préparé à partir du cADN selon la revendication 3 et d'un plasmide, de préférence le plasmide pBR 322. - Microorganisme, en particulier E. coli, avec l'infor- mation génétique pour la biosynthèse du polypeptide selon la re- vendication 1 ou 2. 6 - Procédé de préparation du polypeptide selon la re- vendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à obtenir l'information génétique pour la biosynthèse du polypeptide au moyen de mARN de leucocytes, à introduire le gène obtenu, d'une manière connue en soi, dans les microorganismes et à sélectionner et à cultiver d'une manière connue en soi les microorganismes qui produisent ce polypeptide. 7 - Procédé de préparation du cADN selon la revendica- tion 3, caractérisé en ce qu'on obtient l'ARN à partir de leuco- cytes, on en isole le mARN et au moyen de ce dernier on prépare le cADN d'une manière connue en soi. 8 - Procédé de préparation du plasmide selon la reven- dication 4, caractérisé en ce qu'on combine un plasmide, de préférence le plasmide pBR 322, avec le cADN selon la revendica- tion 3. 9 - Procé-dé de preparation dun microoraanismne selon la * revendication 5, caractérisé en ce cu'on zransforme un micro- organismle, de préference E. coli, avec un plasmide selon la re- vendication 4.