Brevet FR2475573A1 — publié le 19810814

La présente invention est relative à un procédé pour la préparation d'alcaloïdes de l'ergot de seigle et en particulier d'ergccornine et de eergocryptine, à l'aide d'une nouvelle souche de Claviceps purpurea. Il est connu que la-dihydroergotoxine, qui est un constituant actif de médicaments et qui est obtenue par hydrogénation de l'ergotoxine, est un mélange de dihydro- ergocristine, de dihydroergocornine et de dihydroergo- cryptine (cf. Brevet hongrois numéro 129 061). On sait depuis 1967 que l'ergocryptine existe sous deux formes: à côté de l'a-ergocryptine déjà identi- fiée précédemment, on peut également isoler la e-ergocryptine de l'extrait végétal de l'ergot de seigle _. Schliern etl Mia: Experientia 23, 991 (1967L7. La e-ergccryptine préparée par hémisynthèse ou par extraction de plantes a été examinée sur le plan pharmacologique et s'est avéréecomme propre à influencer l'activité adrénolytique, l'antagonisme de sérotonine, la motilité de l'utérus et le tonus vasculaire. La première souche de Claviceps purpurea, qui produit principalement de la e-ergocryptine, a été décrite dans le Brevet belge numéro 824 987. Cette souche est dési- gnée sous le numéro FI 7374 dans la Collection personnelle de la Societa Farmitalia. Si l'on cultive cette souche à 24 C sous aération, dans un milieu nutritif contenant comme source de carbone par exemple du saccharose, du glucose, du mannitol, comme source d'azote par exemple de l'asparaginedes peptones,de la caséine hydrolysée, et des sels d'ammonium, l'on peut atteindre en l'espace de 10 à 16 jours, un taux total d'alcaloidesde 9501240 gamma/ml. Le mélange d'alcaloïdes, qui contient principalement de la e-ergocryptine,est toute- fois riche en ergosine et ne peut,de ce fait,pas être utilisé directement (sans séparation de l'ergosine), pour la préparation d'ergotoxine. Au cours d'expérimentations effectuées par la Demanderesse, celle-ci a cultivé le champignon provenant de Claviceps sclerotium qui pousse dans un champ de seigle inoculé non artificiellement et elle a obtenu à partir de ce champignon, conformément au Brevet hongrois n 151 724, un mutant stable de la souche Claviceps purpurea, par sélection répétée en isolant alternativement les colonies et en enrichissant la culture liquide., Le principe de la sélection consiste en ce que la souche qui produit les alcaloïdes forme sur le milieu nutritif décrit dans le Brevet précité, des colonies colo- rées qui peuvent être distinguées nettement des colonies blanches des souches qui ne produisent pas d'alcaloïdes. Les colonies de la nouvelle souche qui produit des alcaloïdes sont isolées et sont ensemencées sur un milieu nutritif de différenciation, dans le but de réaliser l'enrichissement. Le milieu nutritif de différenciation contient outre des phosphates minéraux et d'autres sels minéraux, principalement du saccharose, de l'acide succini- que et de la glycine. En répétant à plusieurs reprises les étapes d'isolement et d'enrichissement, l'on obtient le nouveau mutant de la souche. Le mutant qui est désigné sous le nom de CLY par la Demanderesse - se développe plus lentement que la culture de la souche de Claviceps du champ, il ne produit pas de conidies et il est analogue morphologiquement à la levure dans tous les milieux nutritifs, c'est-à-dire qu'il ne comporte pas les hyphes filiformes qui sont carac- téristiques du mycélium. Description macroscopique de la souche Sur le milieu gélose contenant de l'amidon et du tryptophane utilisé pour la sélection, au bout de 10 jours les colonies présentent une surface ridée et une cou- leur orange-rosé, elles sont délimitées par des contours nets et leur diamètre est de 6 à 8 mm. Au bout de 20 jours, les colonies ont un diamètre de 20 à 25 mm, elles présen- tent une éminence e n leur milieu et elles sont ridées radialement; leur couleur est rosé-lilas. La face inférieure des colonies est brun-foncé, le milieu nutritif qui les entoure est de couleur lilas. Sur de la gélose de malt, la souche forme au bout de 10 jours, des colonies de couleur b e i g e clair, de 1 à 2 mm de diamètre et qui présentent la forme de demi-sphères régulières. A 20 jours, les colonies ont un diamètre de 2 à 4 mm, leur croissance est faible, leur couleur a foncé vers le brunâtre. Sur de la gélose ST, les colonies de la souche sont délimitées par des contours nets, à l'âge de 10 jours; elles sont ridées en direction du milieu, elles comportent une élévation pointue en leur milieu et leur diamètre est de l'ordre de 8 à 12 mm. La pointe a 3 à 5 mm de haut. La couleur des colonies est beige à brun clair. Au bout de 20 jours, la surface des colonies est fortement sillonnée et se ramifie en direction de leur bord; leur pointe est en forme de cratère. Les colonies sont de couleur brun clair avec une nuance couleur cacao; leur diamètre est divers et est compris entre 25 et 40-mm, leur hauteur est de 6 à 8 mm. Les colonies sont difficiles à détacher de la surface de la gélose. Elles ne forment pas de spores. Caractérisation microscopique de la souche en culture liquide Culture en milieu nutritif GK au bout de 40 heures Il se forme des colonies comportant peu de cellules ou en majeure partie des cellules uniques. Les cellules ont 4-8 x 8-20 lim, elles sont cylindriques, ar- rondies ou de forme irrégulière. On peut fréquemment obser- ver également une division à l'extrémité des cellules ou par ramification latérale. Les séries de cellules sont courtes et sont constituées par des cellules uniques. Au microscope à contraste de phase, les cellules apparais- sent fortement granulées, les cellules les plus vieilles contiennent des vacuoles. Il ne se forme pas de spores. Dans le milieu de culture ST, au bout de 40 heures de culture: L'image microscopique est identique à celle dé- crite plus haut à la différence que sur ce milieu nutritif, la formation de colonies ou de séries de cellules est plus fréquente. Les cellules uniques sont plus grandes, les cellules les plus anciennes et les plus grosses-ne contiennent pas de vacuoles. Les milieux nutritifs utilisés pour l'examen de l'aspect macroscopique et microscopique sont indiqués en partie dans ce qui va suivre, tandis que les milieux nutri- tifs ST-milieu nutritif, ST-gélose et GK sont décrits dans les Exemples. Gélose-amidon-tryptophane Amidon 20 g Tryptophane 1 g Chlorure de potassium 1 g Phosphate diammonique 2 g Le pH est ajusté à 6,6-6,8 et le volume est complété à 1000 ml à l'aide d'eau; on ajoute 25 g de poudre de gélose (Difco) au liquide, on porte le milieu nutritif à ébullition, on l'introduit dans des bouteilles par fractions de 150 ml et on le stérilise. Milieu nutritif à la gélose de malt Extrait de malt 60 g Eau q.s.p. 1000 ml Poudre de gélose (Difco) 25 g On porte le milieu nutritif à ébullition, on l'introduit dans des bouteilles par fractions de 150 ml et on le stérilise. Caractéristiques biochimiques de la souche Elle décompose le saccharose à l'aide de l'enzyme e-fructo-furanosidase et elle forme des oligosaccharides de transfert; elle utilise l'acide citrique de façon satis- faisante; elle produit un pigment de type anthraquinonique, principalement constitué par des hydroxyanthraquinones. Si l'on cultive la nouvelle souche sur des milieux nutritifs connus dans la Littérature, qui contiennent des sucres et le sel d'ammonium d'un acide organique, elle produit des alcaloïdes. 25 à 30 % du mélange d'alcaloïdes qui se forme sont de la e-ergocryptine, et la quantité principale, soit 55 à 60 %, est de l'ergoc.ornine, la frac- tion restante est de l'a-ergocryptine. En plus des alcaloïdes peptidiques caractéristiques, la souche ne forme que de l'ergométrine. La nouvelle souche mutante de Claviceps purpurea décrite ci-dessus a été déposée le 9 Mai 1979 dans la Collection Nationale Hongroise sous la désignation 00186 MNG. Lors de l'étude des domaines d'utilisation de la souche déposée sous la désignation MNG 00186, la Demanderesse a trouvé que la souche produit certains composants de l'ergotoxine, à savoir l'ergocornine, l'a- et la $-ergo- cryptine, par fermentation dans des conditions aérobies, sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux et éventuellement d'autres additifs. La Demanderesse a en outre trouvé que la quantité des alcaloïdes produits dans le jus de fermentation augmente si l'on ajoute à celui-ci pendant la fermentation, de la valine et/ou de l'isoleucine en tant que précurseurs des composés qui se forment. La présente invention a en conséquence pour objet un procédé de préparation d'alcaloïdes de l'ergot de seigle, en particulier d'ergocornine et de e-ergocryptine, par fermentation dans des conditions aérobies de Claviceps purpurea, sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux et éventuellement d'autres additifs. La caractéristique de ce procédé réside en ce que l'on utilise comme souche cultivée, la souche mutante de Claviceps purpurea!ING 00186. Conformément à l'invention, la fermentation est menée en culture immergée, dans des conditions aérobies, dans un milieu nutritif liquide contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux et éventuellement d'autres additifs. La fermentation est réalisée à des températures comprises entre 20 et 260C, à un pH compris entre 5,2 et 6,8, pendant 4 à 8-jours. Pendant la fermentation, on utilise éventuellement des additifs (précurseurs) qui augmentent la quantité d'alcaloïdes formés, par exemple de la valine et/ou de l'isoleucine. Le précurseur est ajouté au bouillon de culture à raison de 0,05 à 0,5 g/100 ml, et de préférence à raison de 0,1 à 0,3 g/100 ml, sous la forme d'une solution aqueuse éventuellement faiblement acide, après la stérilisation du milieu nutritif. Le précurseur peut-être ajouté en une seule fois, en plusieurs fractions ou de façon continue pendant l'une des périodes de la fermentation. - Dans la Littérature, la production est fréquemment caractérisée par les valeurs obtenues par spectrophotométrie, pour la teneur totale en alcaloïdes. Dans les essais effectués dans le cadre de la présente invention, les valeurs totales d'alcaloides ont également été mesurées par photométrie sur la base de réactions colorées; elles se sont cependant avérées comme étant non spécifiques. Pour caractériser la fermentation, les -différents composants de l'ergotoxine ont été identifiés par chroma- tographie par élution ou par chromatographie quantitative en phase liquide. L'utilisation de la souche présente par rapport aux procédés connus jusqu'à présent, les avantages suivants 1o- la production par fermentation est plus moderne que les procédés par extraction de plantes. Les inconvénients géné- raux de la coopération-avec l'agriculture sont éliminés et le procédé peut être contrôlé par interventions techniques directes pour chaque charge. 2 - Si on le compare au procédé semi-synthétique qui comprend une longue série de réactions, le procédé par fermentation permet de préparer la molécule compliquée à partir de substances simples, facilement disponibles (saccharose, sels d'ammonium), à l'aide des cellules vivantes, à 240C, par introduction d'air. De plus, le procédé semi-synthétique n'a résolu que la synthèse de la partie peptidique, la partie acide lysergique doit être édifiée sans modification, par fermentation. 3 - La souche ne produit pratiquement que les composants de l'ergotoxine. La faible quantité d'ergométrine présente peut aisément être séparée des alcaloïdes peptidiques qui doivent être pris en considération pour la prépara- tion de l'ergotoxine, du fait que l'ergométrine est so- luble dans l'eau. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du com- plément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 La culture de Claviceps purpurea MNG 00186 déve- loppée sur un milieu nutritif gélose-ST, est ensemencée sur 100 ml de milieu nutritif GK qui se trouve dans un Erlenmeyer de 500 ml, et elle est incubée pendant 4 jours à 240C sur une table à secousses (secouée à une fréquence de 300/minute). Des portions de 10 ml de la culture obtenue sont ensemencées dans au total 8 autres ballons qui contien- nent chacun 100 ml de milieu nutritif ST. Ces cultures sont fermentées pendant 7 jours à 240C, sur une table à secousses. On n'ajoute pas de précurseur à quatre des ballons, on ajoute au contenu des quatre autres ballons, 2 g de valine en tant que précurseur, au début de la fermentation. Au 7ème jour, on interrompt la fermentation. Les bouillons de culture sans précurseur sont réunis, leur teneur en alcaloldes est déterminée. La teneur en ergocornine est de 80 y/ml, la teneur en c-ergocryptine est de 15 y/ml, et la teneur en e-ergocryptine est de 30 y/ml. Les bouillons de culture contenant du précurseur sont également réunis, et leur teneur en alcaloïdes est déterminée. Ils contiennent 250 y/ml d'ergocornine, 25 y/ml d' a-ergocryptine et 30 y/ml de e-ergocryptine. Les milieux nutritifs utilisés sont les suivants: Milieu nutritif GR: Trypcasine 7,0 g Acide citrique 4,1 g Phosphate monopotassique 0,3 g Sulfate de magnésium 0,3 g Ammoniaque jusqu'à pH 5,7-5,8 Eau q.s.p. 840 ml Des fractions de 84 ou de 840 ml de milieu nutri- tif sont introduites dans des ballons et on leur ajoute respectivement 16 et 160 ml d'une solution de glucose à %, dans des conditions stériles. Milieu nutritif ST: Saccharose 100,0 g Acide succinique 10,0 g Phosphate monopotassique 0,25 g Sulfate de magnésium 0,25 g Nitrate d'ammonium 1,0 g Chlorure de calcium 1,0 g Ammoniaque jusqu'à pH 5,2-5,3 Eau q.s.p. 1000 ml Le milieu nutritif est introduit par fractions de 100 ml dans des Erlenmeyeisou il est stérilisé à raison de 100 litres dans un fermenteur semi-industriel. Le milieu nutritif gélose-ST (Blake) se distingue du milieu nutritif ST liquide par le fait qu'on lui ajoute g de poudre de gélose par litre. Après l'addition de la gélose, on porte le milieu nutritif à ébullition, on l'intro- duit dans des flacons par fractions de 150 ml et on le stérilise. EXEMPLE 2 Les colonies spécifiques de Claviceps purpurea MNG 00186 qui se sont développées au bout de 20 jours sur le milieu nutritif gélose-ST, sont séparées de la surface de la gélose, elles sont homogénéisées dans 20 ml d'une solution physiologique stérile de chlorure de sodium,et ml de la suspension sont ajoutés à 100 ml de milieu nutritif ST préstérilisé qui se trouve dans des Erlenmeyer de 500 ml. La culture est cultivée pendant 6 jours à 24 C sur une table à secousses, puis elle est ensemencée sur 100 ml de milieu nutritif TC-54 qui se trouve dans un Erlenmeyer de 500 ml. Au bout de 3 jours de fermentation sur la table à secousses, on ensemence 10 ml de la culture sur un milieu nutritif ST stérilisé qui se trouve dans un Erlenmeyer de 500 ml. Cette culture est cultivée pendant 7 jours sur la table à secousses, dans les conditions mentionnées plus haut. Elle contient ensuite les quantités suivantes d'alcaloïdes: Ergocornine: 150 y/ml, a-ergocryptine: 40 y/ml et e-ergocryptine: 90 y/ml. La composition du milieu nutritif ST et du milieu nutritif gélose-ST (Blake) a déjà été donnée dans l'Exemple 1. Le milieu nutritif TC-54 a la composition suivante: Saccharose 100,0 g Acide citrique 10,0 g Chlorure de sodium 10,0 g Phosphate monopotassique 0,5 g Sulfate de magnésium 0,5 g Ammoniaque jusqu'à pH 5,7-5,8 Eau q.s.p. 1000 ml Le milieu nutritif est introduit par fractions de 100 ml dans des Erlenmeyersde 500 ml, ou bien il est stérilisé par fractions de 10 litres dans des fermenteurs de laboratoire de 15 litres de volume. EXEMPLE 3 Une culture de Claviceps purpurea MNG 00186 de jours sur du milieu nutritif gélose-ST est séparée de la surface de la gélose par raclage et elle est homogénéisée dans 100 ml d'une solution physiologique de chlorure de sodium. On ensemence 1 litre de milieu nutritif GK (pré- stérilisé dans un Erlenmeyer de 3 litres) de la suspension obtenue. La culture est secouée pendant 44 heures à 24 C, puis l'on introduit la culture dans un fermenteur de litres dans lequel se trouvent 10 litres de milieu nutritif TC-54. La fermentation a lieu à 24 C en introdui- sant 0,25 litre/par litre.minute d'air à une vitesse de 240 min.Au bout de 3 jours, la culture est transférée dans un fermenteur de laboratoire (de 150 litres) résistant aux acides, dans lequel se trouvent 100 litres de milieu nutritif ST. Cette culture est cultivée pendant 6 jours à 22 C, à une vitesse de 150 min et en introduisant une quantité d'air de 0,35 litre/litre.minute. On ajoute des portions de 100 g de valine et de 20 g d'isoleucine au bouillon de culture aux 2ème, 3ème et 5ème jours de la fermentation. Au bout de 6 jours de fermentation, le bouillon de culture contient 320 y/ml d'ergocornine, 60 y/ml d'a-ergocryptine et 160 y/ml de $-ergocryptine. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'in- vention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'es- prit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. Z475573 REVENDICATIONS 1i- Procédé de préparation d'alcaloldes de l'ergot de seigle, en particulier d'ergocornine et de e-ergocryptine, par fermentation de Claviceps purpurea dans des conditions aérobies, sur un milieu nutritif conte- nant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux et éventuellement d'autres additifs, lequel procédé est caractérisé en ce que l'on utilise comme souche cultivée, la souche mutante de Clavîceps purpurea MNG 00186. 2 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la fermentation est réalisée à une température de à 26 C et à un pH de 5,2 à 6,8. 3 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute comme additif au jus de fermentation, des composés précurseurs des alcaloïdes produits par la fermentation de la souche selon la Revendication 1.