Brevet FR2481314A1 — publié le 19811030

La présente invention concerne un procédé de culture de Streptococcus Eyogenes hémolytique (appelé plus brièvement dans ce qui suit St. pyogenes), plus particulièrement un procédé donnant avec de hauts rendements des cellules bactériennes qui ont un grand pouvoir de production de Streptolysine-S (désignée ci-après par l'abréviation SLS) et une activité antitumorale.Les St. pyogenes sont des bactéries pathogènes de l'érysipèle, de la septicémie, de la fièvre puerpérale ainsi que de diverses autres maladies, mais certains sont connus depuis longtemps pour avoir une activité antitumorale et sont utilisés en clinique depuis quelques années comme agents anticancéreux.Cette activité antitumorale est étroitement liée à leur pouvoir de production de SLS, et même parmi les sou ches de St. pyogenes qui se trouvent dans la nature, seules les souches qui sont aptes à la production de SLS ont une activité antitumorale. On sait aussi que même pour St. pyogenes apte à la production de SLS, l'activité antitumorale est perdue si la culture est effectuée dans des conditions qui suppriment le pouvoir de production de SLS. Cet exemple a été bien étudié dans le cas de culture de St. pyogenes en présence de glucose, et l'on sait que Si l'on ajoute du glucose au milieu de culture, même en petites proportions, la production de SLS s'abaisse rapidement, que si la proportion de glucose atteint 0,3 % ou plus il n'y a quasiment plus production de SLS, ce qui entraîne la perte d'activité antitumorale, et enfin que si l'on ajoute au milieu de culture non seulement du glucose, mais aussi du lactose, dufructose, du mannose ou du glycéraldéhyde, le pouvoir de production de SLS des cellules bactériennes s'en trouve inhibé (voir H. Okamoto et al. Japon. J. Exp. Med., Vol. 34, NO 3, pages 109-118, 1964 ; et H. Ohtsuki Annual Reports of the Research Institute for Cancer, Kanazawa University, Vol. 1, pages 141-153, 1967). Des recherches entreprises par la présente Demanderesse ont confirme le fait que si l'on ajoute à des milieux de culture de St. pyogenes des sources de carbone fermentables, comme le glucose, la production de SLS par les cellules bactériennes en est notablement abaissée ou même supprimee, de même que l'activité antitumorale des cellules. Pour les raisons que l'on vient d'indiquer, on était obligé d'employer des milieux de culture sans de telles sources de carbone pour obtenir des cellules bactériennes douées d'une forte action antitumorale (voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique N" 3 477 914). Il en est resulté que pour obtenir par culture des cellules bactériennes ayant une activité antitumorale élevée, des propositions ont été faites en vue d'employer des-milieux d'extraits de levure sans sources de carbone fermentables, et il a été signalé qu'avec un extrait de levure comme milieu de culture on pouvait obtenir des cellules dont le pouvoir de production de SLS est relativement grand (voir le brevet britannique NO 1 157 947), mais ce procédé n'est cependant pas satis-- faisant car la multiplication des cellules est beaucoup plus basse. La présente invention concerne un procédé d'incubation de St. pyogenes donnant avec de hauts rendements des cellules bactériennes de cet organisme qui ont un grand pouvoir de production de SLS et une forte action antitumorale. Plus précisément,cette invention concerne un procédé de culture pour obtenir avec de hauts rendements des cellules bactériennes ayant un grand pouvoir de production de SLS, malgré que le milieu de culture contienne des sources de carbone fermentables, sources que l'on considère normalement comme étant le facteur de l'abaissement marqué ou même de la suppression du pouvoir de production de SLS. L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de streptococcus pyogenes dans un milieu pour la multiplication de cellules bactériennes douées d'activité antitumorale, procéde caractérisé en ce que (A) on utilise un milieu de culture contenant des sources de carbone fermentables , et (B) on maintient le pH du milieu à 5,6 ou plus au cours de la culture. D'après les publications de H. Okamoto et al. ci-dessus et les brevets des Etats-Unis d'Amérique et britannique également précités, on a dejà des informations très détaillées sur des procédés de culture de St. pyogenes dans des milieux donnant une multiplication de cellules douées d'activité antitumorale , par exemple sur les milieux de culture , les conditions de la culture etc.. H. Okamoto et al , recommandent d'employer des milieux sans sources de carbone fermentables, comme par exemple le glucose, et en particulier des milieux d'ex- traits de levure dont on sait qu'ils ne contiennent pas de sources de carbone fermentables. Au contraire, selon la présente invention, non seulement on utilise des milieux de culture contenant des sources de carbone fermentables, mais on ajoute de telles sources à des milieux qui n'en contiennent pas, et ceci est une caractéristique de cette invention. Dans l'exécution de la présente invention on peut employer une très grande variété de milieux de culture de base, par exemple des milieux naturels tels qu'un bouillon nutritif, un bouillon de Todd-Hewitt, un bouillon de caséine et de peptone de soja, un bouillon d'extrait de citrouille ou d'extrait de levure, un bouillon de peptone de soja etc..., ou bien des milieux semi-synthétiques. Par milieux de culture de base on entend ici des milieux per mettant la multiplication de St pyogenes, que cet organisme soit apte Ûu non à la production de SLS.Dans le cas, comme cela sera dit ci-après, d'un milieu de culture de base sans source de carbone fermentable originelle, ce milieu peut être utilisé tel quel ou apres addition de quantités appropriées de sources de carbone fermentables. Toute source de carbone dont St. pyogenes peut produire la fermentation peut être ajoutee au milieu de culture de base, mais sont préférables les glucides ou leurs dérivés tels que le glucose, le mannose, le fructose, le lactose, le saccharose, le maltose, le glycéraldéhyde, le tréhalose, la dextrine, l'amidon soluble, les mélasses etc..., et parmi eux sont encore particulièrement préférables des monoholosides et des diholosides, le glucose pouvant être avantageusement employé comme monoholoside et le saccharose comme diholoside. Le milieu de culture peut être tout milieu permettant la multiplication de St. pyogenes et contenant de telles sources de carbone fermentables. Ainsi, un milieu de culture contenant originellement certaines sources de carbone fermentables, comme le bouillon de Todd-Hewitt Que l'on ajoute ou non au milieu des sources carbone fermentables, il devra de préférence contenir de telles sources dans une proportion de 0,1 à 5 % en poids par volume, de préférence de 0,1 à 2 % et mieux encore de 0,3 à 2 %, et dans le cas du glucose, par exemple, sa proportion pourra être de 0,1 à 3 % en poids par volume, notamment de 0,3 à 2 %. L'expression "poids par volume" désigne ici le poids des sources de carbone fermentables rapporté au volume du milieu de culture, et dans ce qui suit toutes les teneurs des milieux en sources de carbone,en pourcentages, correspondent à cette définition. Ainsi, que les milieux de base contiennent ou non originellement des sources de carbone fermentables par St. Pyogenes, on opèrera avantageusement avec des milieux dont les concentrations en telles source s seront comprises entre les limites qui ont été indiquées. Pour l'exécution de la présente invention, des milieux de culture particulièrement préférables sont les suivants 1) un bouillon d'extrait de levure auquel on a ajouté 0,1 à 5 %, de préférence 0,3 à 2 %, de sources de carbone fermen tables, en particulier de glucose ou de saccharose, ou encore 2) un bouillon de peptone de soja auquel on aura ajouté 0,1 à 5 %,de préférence de 0,1 à 5 8, de sources de carbone fermen tables, notamment de glucose ou de saccharose. Si cela est nécessaire, on peut ajouter aux présents milieux de culture de 1'ARN ou de la ribonucléase. Le pH initial du milieu permettant la multiplication de St. pyogenes, et contenant des sources de carbone fermentables aux concentrations indiquées, est ordinairement de l'ordre de 7,1 à 7,4, mais il s'abaisse progressivement au cours de la culture, et quand on arrive au stade où les cellules bactériennes du micron-organisme se sont considérablement multipliées, il est d'environ 5,3 ou moins et le plus souvent de 5,2 ou moins, et même il n'est pas rare qu'il soit inférieur à 5,0, suivant le milieu choisi. La présente Demanderesse pense que cela est dû au fait que la fermentation des sources de carbone par St. pyogenes conduit à la formation de certains acides organiques dans le milieu de culture. La présente Demanderesse a cherché une relation entre le changement de pH du milieu qui se produit au cours de la culture et la production de SLS par les cellules bac atériennes de St. pyogenes qui se multiplient dans un milieu contenant de telles sources de carbone fermentables, et elle a trouvé qui si le pH s'abaisse au-dessous de 5,6, en genéral la production de SLS par les cellules diminue rapidement, alors que si l'on poursuit la culture en maintenant le pH à 5,6 ou plus, d'une manière assez surprenante, des cellules qui sont très aptes à la production de SLS se multiplient très rapidement. On sait couramment que si l'on prend le maltose comme source de carbone fermentable, la production de SLS par les cellules bactériennes se maintient à un certain degré en dépit du fait que le pH du milieu de culture s'abaisse à 5 ou au voisinage de 5 Vol. 1, p. 141-153, 1967), et par suite personne n'a essayé d'améliorer la formation de SLS en réglant le pH au cours de la poursuite de la culture. Conformément à la présente invention, dans le cas de sources de carbone autres que le maltose , il est indispensable de maintenir le pH du milieu à 5,6 ou plus, en particulier à 6 ou plus, lors de la poursuite de l'incubation, pour la multiplication de cellules St. pyogenes ayant un haut pouvoir de production de SLS, et même si l'on emploie le maltose comme source de carbone, on peut obtenir avec un plus haut rendement, en réglant le pH aux valeurs ci-dessus, des cellules plus aptes à la production de SLS. Dans l'exécution de cette invention, la culture se fait par inoculation de St. pyogenes au milieu contenant la source de carbone fermentable ou auquel on a ajouté cette source, et tout en maintenant le pH du milieu à 5,6 ou plus, de préférence entre 5,6 et 7,5 et mieux encore entre 6 et 7. Une température de 30 à 400C, mieux de 35 à 370C, est suffisante, tandis que le temps de culture est variable et dépend de la nature du milieu, de la propor tion des sources-de carbone, de la dimension de l'inoculum etc..., mais il peut être de 8 à 72 heures, et l'on peut normalement obtenir en 12 à 4a heures des cellules bactériennes qui satisfont aux exigences de multiplication,, d'aptitude à la formation de SLS et d'activité antitumorale. Mais dans ces limites de temps de culture le temps est de préférence prolongé à mesure qu'on élève la teneur du milieu en source de carbone. On règle le pH du milieu de culture de manière connue, par exemple avec une solution de tamponnage, par neutralisation ou par un autre moyen. On peut par exemple ajouter une solution tampon de phosphate On recueille les cellules bactériennes de St. pyogenes en centrifugeant la solution de culture tout en refroidissant. La multiplicatiôn des cellules est très bonne, de même que leur activité antitumorale. La présente invention sera expliquée plus en détail dans les exemples d'exécution qui suivent, dans lesquels, à moins d'indications contraires, le signe "" signifie "% en poids/volume'l et la multiplication cellulaire, le pouvoir de production de SLS et activité antitumorale in vivo sont déterminés par les méthodes qui sont décrites ciaprès. Multiplication cellulaire (DO660) (DO = densi té optique. On lave deux fois avec du soluté physiologique les cellules bactériennes obtenues par centrifugation d'une quantité déterminée de solution de culture, puis on dilue avec le même soluté pour atteindre une absorbance de 0,1 à 0,2 à 660 nm (DO660). On mesure la DO660 de la solution diluée et on obtient la Duo660 de la solution de culture en multipliant la valeur trouvée par le facteur de dilution. Pouvoir de production de SLS. On prélève dans des tubes à essais 5 ml de chacune des solutions de culture des exemples qui sont donnés ci-après, après des temps de culture appropriés, on refroidit dans de la glace puis on centrifuge à froid à 3500 tours/minute pendant 10 minutes, on lave ensuite avec un milieu de base de Bernheimer (milieu comprenant 675 mg de maltose, 6 ml d'une solution aqueuse à 20% de dihydrogénophosphate de potassium, ajustée à pH 7,0 au moyen d'hydroxyde de sodium, 12 ml de solution aqueuse à 2 % de sulfate de magnésium heptahydraté et 66 ml d'eau distillée, milieu désigné ci-après par l'abréviation MBB), et on met en suspension dans 2 ml de MBB frais.On ajoute ensuite 0,06 % de noyau de ribonucléase (préparé à partir d'une digestion de ribonucléase pancréatique de Yeast-Sodium Ribonucleate (levure-sodium) "Merck"), on fait incuber à 370C pendant 60 minutes puis on centrifuge à 3500 tours/minute pendant 10 minutes à basse température, et on prélève 1 ml du surnageant que l'on dilue par la méthode de dilution au double avec une solution tampon froide à pH 6,5, dont 1 litre contient 7,^ g de chlorure de sodium', 3,17 g de dihydrogénophosphate de potassium et 3,59 g d'hydrogénophosphate disodique dodécahydraté. A 1 ml de chaque solution diluée on ajoute 1 ml d'érythrocytes de lapin préalablement lavé plusieurs fois avec la solution tampon et ajusté avec cette solution à 3 % en volume par volume, et on maintient à 370C pendant 60 minutes. On détermine te rapport ou facteur de dilution de la solution initiale de MBB auquel il se produit une hémolyse de 50 %, et on le multiplie par 0,4. L'unité hémolytique (UH) de la solution de culture est la valeur maximale des échantillons observée au cours de la culture. Activité antitumorale in vivo. On prélève 250 mi de la solution de culture de chacun des exemples suivants, on centrifuge à froid, on lave deux fois avec du soluté physiologique froid, puis on met en suspens ion dans une solution de MBB froide et on ajuste à l'absorbance 10,0 à 660 nm (D0660). On ajoute ensuite à la solution de MBB le cinquième de sa quantité d'une solution de 200 000 unités du sel potassique de penicilline G dans 1,25 mi de solution physiologique, on maintient 370C pendant 20 minutes puis à 450C pendant encore 30 minutes, on verse des quantités de 1 ml dans des flacons stérilisés et on lyophilise. On a ainsi 5 mg de cellules sèches par flacon. La préparation lyophilisée ainsi obtenue est mise en suspension dans 5 ml de solution saline et elle est administrée par la voie intrapéritonéale,chaque fois à raison de 0,2 mi pendant 4 jours successifs, à des souris auxquelles on a inoculé lejour précédent par la voie intrapéritonéale 106 cellules du carcinome ascitique d'Ehrlich (un groupe de cinq souris femelles ddY d'environ 5 semaines), tandis que l'on garde comme témoins des souris n'ayant reçu par la voie intrapéritonéale que 0,2 ml de la solution saline physiologique. L'activité antitumorale est définie par le nombre de souris qui survivent pendant 20 jours ou 30 jours après l'inoculation du carcinome ascitique d'Ehrlich. Dans les présents essais, le nombre de souris qui survivent pendant 20 ou 30 jours après l'inoculation est nul pour tous les groupes témoins EXEMPLE 1 Milieu de culture de base (bouillon d'extrait de levure à 5 %). On dissout 50 g d'extrait-de levure (Oriental Kogyo Co., Ltd.) dans 500 ml d'eau distillée, après avoir ajusté à pH 7,2 - 7,4 on fait bouillir à 1000C pendant 1 heure puis on refroidit à l'eau, on sépare par filtration le précipité formé, on réajuste le filtrat à pH 7,2 - 7,4 et on fait bouillir de nouveau à 1000C pendant 30 minutes. On refroidit ensuite dans de l'eau et on filtre, on ajoute de l'eau distillée au filtrat pour le compléter à 1 litre et on stérilise à 120dC pendant 20 minutes, ce qui donne le milieu de base. Procédé selon la présente invention. A 500 ml de ce milieu de culture de base placé dans un fermenteur de 1500 ml on ajoute une solution de glucose stérilisée pour avoir une teneur en glucose de 0,4 % de la quantité totale de la solution de culture, et on inocule 25 ml (5 % V/V) d'une solution de St. pyogenes (COLLECTION AMERICAINE DE CULTURES DE TISSUS ATCC NO 21060) préalablement cultivée dans le bouillon nutritif de Kyokuto Seikaku, Ltd.. Au cours de la culture on ajoute goutte à goutte une solution aqueuse 5N d'hydroxyde de sodium stérilisée pour maintenir le pH à 6,5, et on poursuit la culture à 370C pendant 20 heures tout en agitant à 170 tours/minute. Témoin A. Au même-milieu de culture de base que dans l'exemple 1 on ajoute également la solution de glucose et on inocule de la même manière la solution de culture de St. pyogenes, et on cultive dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, mais sans ajuster le pH du milieu. Témoin B. On inocule de la même manière le même milieu de culture de base que dans l'exemple 1, mais sans ajouter la solution de glucose et sans ajuster le pH, et on opère une culture au repos à 370C pendant 20 heures. Sur les diverses solutions de culture on détermine la multiplication cellulaire, le pouvoir de production de SLS et l'activité antitumorale in vivo. Le tableau I ci-après donne les résultats obtenus. TABLEAU I Conditions Source de Ajuste- Multipli- Production production Activité antitumorale et carbone ment du cation SLS par SLS par uni- Nombre de souris survi Résultats (Concen- pH cellulai- unité du té de con- vantes tration (pH) re milieu de centration Nombre de souris testées Essais %) (DO660) culture cellulaire rapport) (UH/ml) (UH/DO660) Après 20 Après 30 (rpport) (rapport) jours jours Exemple 1 glucose oui 2,3 570 248 5/5 5/5 (0,4) (6,5) (2,6) (2,7) (1,03 Témoin A glucose non 1,2 4 4 0/5 0/5 (0,4) (-) * (1,3) (0,02) (0,02) Témoin B - non 0,89 214 240 5/5 5/5 (-) (-) * (1,0) (1,0) (1,0) (Notes) (1) Dans tous les essais la souche employée est la souche N 21060 de l'ATCC, et le milieu de culture de base est le bouillon d'extrait de levure. (2)* Le pH final du milieu de culture pour les témoins A et B est respectivement 5,2 et 6,6. Comme le montrent les résultats du tableau I, les cellules qui sont obtenues par le procédé selon cette invention (exemple 1) sont à peu près identiques, aussi bien en ce qui concerne la production de SLS par unité de concentration cellulaire qu'en ce qui concerne leur activité antitumorale, à celles obtenues par la culture habituelle au repos (témoin B), mais dans le premier cas la multiplication cellulaire est environ 2,6 fois plus elevée, ce qui représente une amélioration considérable. Par ailleurs, en présence de glucose mais sans réglage du pH (témoin 1), on observe sans doute une certaine élévation de la multiplication cellulaire, mais la production de SLS est notablement abaissée et l'activité antitumorale à peu près totalement perdue. EXEMPLES 2, 3 et 4 En effectuant la culture de la même manière que dans l'exemple 1, mais en remplaçant la souche ATCC NO 21060 de St. pyogenes de cet exemple respectivement par les souches ATCC NO 21059 (exemple 2), IID S-43 (exemple 3) et IID T-3 (exemple 4), on a obtenu les résultats-qui sont groupés dans le tableau II ci-après. Pour les essais témoins C, D et E, la culture a été effectuée de la même manière que pour le témoin B de d'exemple 1, sauf pour ce qui concerne les diverses bactéries choisies. (Voir tableau II page suivante) TABLEAU II Conditions Souche Source Ajuste- Multipli- Production Production Activité antiet de car- ment du cation SLS par uni- SLS par uni- tumorale Résultats bone pH celluaire té du milieu té de concen- Nombre de souris (concen- (pH) (DO660) de culture tration cellu- survivantes Essais tration (rapport) (UH/ml laire (UH/DO660) Nombre de souris %) (rapport) (rapport) testées Après 20 Après 30 jours jours Exemple 2 ATCC glucose OUT 2.4 672 280 5/5 5/5 Vo. 21059 (0,4) (6,5) (2,6) (3,7) (1,4) Témoin C ATCC - NON 0,91 184 202 5/5 5/5 Vo. 21059 (-) (1,0) (1,0) (1,0) Exemple 3 IID glucose OUI 2.3 437 190 5/5 5/5 S-43 (0,4) (6,5) (2,6) (2,2) (0,86) Témoin D IID - NON 0,88 195 222 5/5 4/5 S-43 (-) (1,0) (1,0) (1,0) Exemple 4 IID glucose OUI 2,3 575 230 T-3 (0,4) (6.5) (2,5) (3,3) (1,2) 5/5 5/5 Témoin E IID - NON 0,92 178 194 5/5 4/5 T-3 (-) (1,0) (1,0) (1,0) (Note) Dans tous les essais le bouillon d'extrait de levure le milieu de culture de base. EXEMPLES 5, 6 et 7 On effectue la culture exactement comme dans l'exemple 1, sauf que le pH du milieu est maintenu respectivement à 5,0 (Témoin F), 6,0 (exemple 5), 7,0 (exemple 6) et 7,5 (exemple 7) au cours de la culture. Le tableau III donne les resultats obtenus et il reproduit aussi ceux de l'essai témoin B de l'exemple 1. I1 ressort du tableau III que le pH du milieu de culture doit de préférence être compris entre 6 et 7. (Voir tableau III page suivante) TABLEAU III Conditions Source de Ajuste- Multipli- Production Production Activité antitumorale et carbone ment du cation SLS par SLS par uni- Nombre de souris survi Résultats (Concen- pH cellulai- unité du té de con- vantes tration (pH) re milieu de centration Nombre de souris testées Essais %) (DO660) culture cellulaire rapport) (UH/ml) (UH/DO660) Après 20 Après 30 (rpport) (rapport) jours jours Exemple 5 glucose OUI 2,3 455 198 5/5 5/5 (0,4) (6,0) (2,6) (2,1) (0,8) Exemple 6 glucose OUI 2,4 490 204 5/5 5/5 (0,4) (7,0) (2,7) (2,3) (0,9) Exemple 7 glucose OUI 2,3 414 180 4/5 3/5 (0,4) (7,5) (2,6) (1,9) (0,8) Témoin F glucose OUI 1,2 4 4 0/5 0/5 (0,4) (5,0) (1,3) 0,02) ( 0,02) Témoin B - NON 0,89 214 240 5/5 5/5 (-) (1,0) (1,0) (1,0) (Note) Dans tous les essais la souche utilisée est la souche ATCC N 21060 et le milieu de culture de base est le bouillon d'extrait de levure. EXEMPLES 8 à 12 Le tableau IV ci-après donne les résultats de cultures conduites de la même manière que dans l'exemple 1, sauf que la teneur en glucose est de 0,1 % pour l'exemple 8, 0,3 % pour l'exemple 9, de 0,8 % pour pour l'exemple 10, de 2,0 % pour l'exemple 11 et de 5,0 % pour l'exemple 12, et que le temps de culture est de 30 heures dans l'exemple 11 et de 40 heures. dans l'exemple 12. Ce tableau reproduit aussi à titre comparatif les résultats de l'essai témoin B de l'exemple 1.Comme le montre le tableau IV, par rapport au procédé usuel (essai témoin B de l'exemple 1), dans tous les essais effectués conformément à la présente invention, c'est-à-dire dans les exemples 8 à 12, la multiplication cellulaire est de 2 à 4 fois supérieure, tandis que la production de SLS par unité de concentration cellulaire se maintient à un taux suffisant et que l'on observe une amélioration remarquable de la production totale de SLS. On peut aussi noter d'après ces résultats, qu'il y a une gamme préférée de proportions de glucose, la multiplication cellulaire augmentant à mesure que prélève la quantité de glucose ajoutée, mais par contre la production de-SLS par unité de concentration cellulaire a tendance à être plus faible. (Yoir tableau IV page suivante) TABLEAU IV Conditions Source de Ajuste- Multipli- Production Production Activité antitumorale et carbone ment du cation SLS par SLS par uni- Nombre de souris survi Résultats (Concen- pH cellulai- unité du té de con- vantes tration (pH) re milieu de centration Nombre de souris testées Essais %) (DO660) culture cellulaire rapport) (UH/ml) (UH/DO660) Après 20 Après 30 (rpport) (rapport) jours jours Exemple 8 glucose OUI 1,6 406 254 5/5 5/5 (0,1) (6,5) (1,8) (1,9) (1,1) Exemple 9 glucose OUI 2,2 545 248 5/5 5/5 (0,3) (6,5) (2,5) (2,5) (1,0) Exemple 10 glucose OUI 2,5 540 216 5/5 5/5 (0,8) (6,5) (2,0) (2,5) (0,9)] Exemple 11 glucose OUI 2,8 504 180 5/5 5/5 (2,0) (6,5) (3,1) (2,4) (0,8) Exemple 12 glucose OUI 3,9 581 149 5/5 5/5 (5,0) (6,5) (4,4) (2,7) (0,6) Témoin B - NON 0,89 214 240 5/5 5/5 (-) (1,0) (1,0) (1,0) (Note) Dans tous les essais on a utilisé la souche ATCC N 21060 et le bouillon d'extrait de levure comme milieu de culture de base. EXEMPLES 13 à 16 Les résultats qui sont groupés dans le tableau V ont été obtenus par culture de la même manière que dans l'exemple 1, sauf qu'à la place du glucose on a employé comme source de carbone fermentable 0,4 % respectivement de maltose dans l'exemple 13, de mannose dans l'exemple 14, de saccharose dans l'exemple 15 et de lactose dans l'exemple 16. De plus, pour leurs essais témoins ses- pectifs G, H, I et J, on opère la culture comme dans l'essai témoin A de l'exemple 1 mais en remplaçant le glucose respectivement par les sources de carbone ci-dessus, et le tableau reproduit aussi les résultats de l'essai témoin B de l'exemple 1 effectué sans source de carbone. Dans l'exécution conforme à la présente invention, avec l'une quelconque des sources de carbone ci-dessus, la multiplication cellulaire augmente notablement et de plus on peut obtenir d'excellentes cellules bactériennes en ce qui concerne la production de SLS aussi bien que leur activité antitumorale. Par ailleurs, en présence de la source de carbone mais sans réglage du pH, la multiplication cellulaire augmente sans doute à un certain degré mais la production de SLS et l'activité antitumorale sont notablement réduites, voirmême supprimées. (Voir tableau V page suivante) TABLEAU Conditions Source de Ajuste- Multipli- Production Production Activité antitumorale et carbone ment du cation SLS par SLS par uni- Nombre de souris survi Résultats (Concen- pH cellulai- unité du té de con- vantes tration (pH) re milieu de centration Nombre de souris testées Essais %) (DO660) culture cellulaire rapport) (UH/ml) (UH/DO660) Après 20 Après 30 (rpport) (rapport) jours jours Exemple 13 maltose OUI 2,6 785 302 5/5 5/5 (0,4) (6,5) (2,9) (3,7) (1,6) Témoin G maltose NON 1,4 210 150 3/5 2/5 (0,4) (1,6) (1,0) (0,6) Exemple 14 mennose OUI 2,2 475 216 5/5 5/5 (0,4) (6,5) (2,5) (2,2) (0,9) Témoin H mannose NON 1,2 4 4 1/5 0/5 (0,4) (1,3) ( 0,02) ( 0,02) Exemple 15 saccharo- OUI 2,6 624 240 5/5 5/5 se (0,4) (6,5) (2,9) (2,9) (1,0) Témoin I Saccharo- NON 1,3 4 4 0/5 0/5 se (0,4) (1,5) ( 0,02) ( 0,02) (suite du tableau V page suivnte) TABLEAU V (suite et fin) Conditions Source de Ajuste- Multipli- Production Production Activité antitumorale et carbone ment du cation SLS par SLS par uni- Nombre de souris survi Résultats (Concen- pH cellulai- unité du té de con- vantes tration (pH) re milieu de centration Nombre de souris testées Essais %) (DO660) culture cellulaire rapport) (UH/ml) (UH/DO660) Après 20 Après 30 (rpport) (rapport) jours jours Exemple 16 lactose OUI 2,3 580 252 5/5 5/5 (0,4) (6,5) (2,6) (2,7) (1,1) Témoin J lactose NON 1,2 4 4 0/3 0/5 (0,4) (1,3) ( 0,02) ( 0,02) Témoin B - NON 0,89 214 240 5/5 5/5 (-) (1,0) (1,0) (1,0) (Note) Dans tous les essais on a utilisé la souche ATCC N 21060 et le bouillon d'extrait de levure comme milieu de culture de base. EXEMPLES 17 et 18 Les résultats du tableau VI ont été obtenus par culture de la même manière que dans l'exemple 1, sauf que l'extrait de levure employé dans cet exemple comme milieu de culture de base a été remplacé dans l'exemple 17 par un bouillon de polypeptone (préparé par ajustement à pH 7,2 - 7,4 de 1000 ml d'une solution aqueuse de 5 g de peptone (BBL), 5 g d'extrait de levure et 5 g de chlorure de sodium et stérilisation à 1200C pendant 20 minutes), et dans l'exemple 18 par un bouillon de peptone de soja préparé par ajustement à pH 7,2-7,4 de 1000 mi d'une solution aqueuse de 30 g de peptone (BBL), puis stérilisation à 1200C pendant 20 minutes. Le tableau VI donne aussi les résultats de cultures effectuées comme dans l'essai témoin B de l'exemple 1 mais avec le bouillon de polypeptone (témoin K) et le bouillon de peptone de soja (témoin L) à la place du bouillon d'extrait de levure à 5 %. (Voir tableau VI page suivante) TABLEAU VI Conditions Milieu Source Ajuste- Multipli- Production Production Activité antiet de de car- ment du cation SLS par uni- SLS par uni- tumorale Résultats culture bone pH celluaire té du milieu té de concen- Nombre de souris de (concen- (pH) (DO660) de culture tration cellu- survivantes Essais base tration (rapport) (UM/ml) laire (UH/DO660) Nombre de souris %) (rapport) (rapport) testées Après 20 Après 30 jours jours Exemple 17 Bouillon glucose OUI 2,3 685 298 5/5 5/5 de poly- (0,4) (6,5) (4,8) (5,4) (1,1) peptona Témoin K Bouillon - NON 0,48 126 262 5/5 4/5 de poly- (-) (1,0) (1,0) (1,0) peptone Exemple 28 Bouillon glucose OUI 2,4 643 268 5/5 5/5 de pep tone de (0,5) (6,5) (2,5) (40,1) (16,8) sojax Témoin L Bouillon - NON 0,96 16 16 1/5 0,5 de pep tone de (-) 1,0) (1,0) (1,0) soja * (Notess) (1) * Ce bouillon de peptone de soja contient environ 0,4 % de sucre réducteur. (2) Dans tous les essais on a utilisé la souche ATCC N 21060. Avec le bouillon de polypeptone et le bouillon de peptone de soja, dans l'exécution conforme à la présente invention la modification cellulaire augmente respectivement de 4,8 fois et de 2,5 fois par rapport à la culture au repos sans glucose (témoins et L), et la production de SLS et l'activité antitumorale sont meilleures. Dans l'essai témoin L, la production de SLS est abaissée bien que l'on n'ait pas ajouté de glucose, le sucre fermentable originellement contenu en très forte proportion dans la peptone de soja étant considéré comme responsable de ce résultat. EXEMPLE 19 Les résultats du tableau VII ci-après ont été obtenus par culture de la même manière que dans l'exemple 18, avec la meme peptone de soja que dans cet exemple mais sans addition de glucose. Les résultats de L'vessai témoin L du tableau VI sont également indiqués à titre comparatif. (Voir tableau VII page suivante) TABLEAU VII Conditions Milieu Source Ajuste- Multipli- Production Production Activité antiet de de car- ment du cation SLS par uni- SLS par uni- tumorale Résultats culture bone pH celluaire té du milieu té de concen- Nombre de souris de (concen- (pH) (DO660) de culture tration cellu- survivantes Essais base tration (rapport) (UM/ml) laire (UH/DO660) Nombre de souris %) (rapport) (rapport) testées Après 20 Après 30 jours jours Exemple 19 Souillon - OUI 1,2 312 260 5/5 5/5 de pep tone de (-) (6,5) (1,3) (19,5) (16,3) soha # Témoin L Bouillon - NON 0,96 16 16 1/5 0/5 de pep tone de (-) (1,0) (1,0) (1,0) soja * (Notes) (1) * Ce couillon de peptone de soja contient environ 0,4 % de sucre réducteur. (2) Dans tous les essais on a utilisé la souche ATCC N 21060. D'après les résultats du tableau VII, on peut noter que dans le cas d'un milieu de culture de base contenant originellement des sources de carbone fermentables, on peut obtenir avec un bon rendement des cellules ayant un haut pouvoir de production de SLS ainsi qu'une bonne activité antitumorale, mais cela seulement en réglant le pH du milieu de culture Une comparaison entre l'exemple 19 du tableau 7 et l'exemple 18 du tableau 6 montre que l'on peut obtenir de meilleurs résultats avec une addition supplémentaire de glucose, même dans le cas d'un milieu de culture de base contenant originellement des sources de carbone fermentables. EXEMPLE 20 On mélange 500 ml d'un bouillon d'extrait de levure à 10 % (préparé par dissolution de 100 g d'extrait de levure dans 500 ml d'eau distillée, ajustement à pH 7,2 - 7,4 puis ébullition à 1000C pendant une heure, refroidissement dans de l'eau, filtration pour éliminer le précipité, nouvelle ébullition à 1000C pendant 30 minutes après avoir réajusté le p à 7,2 - 7,4, refroidissement à l'eau et filtration puis oomplément à 1000 ml dans une fiole) avec 500 mi d'une solution tampon de phosphate 300 mM à pH 7,3, on stérilise le mélange à 1200C pendant 20 minutes puis on lui ajoute une solution de glucose stérilisée pour avoir une teneur finale en glucose de 0,4 % par rapport à la quantité totale de la solution de culture, on inocule 50 ml (5 % V/V) d'une solution de culture de St. pyogenes ATCC NO 21060 préalablement cultivé dans le bouillon nutritif et on opère la culture au repos à 370C pendant 20 heures. Cette culture donne une multiplication bactérienne coreespondant à une DO660 de 2,2, ce qui environ 2,5 fois supérieur au résultat obtenu par la culture classique au repos qui aboutit à une DO660 de 0,89 (Témoin B). On obtient des valeurs élevées pour la production de SLSjaussi bien par unité de solution de culture (UH/ml) que par unité de concentration cellulaire (UH/DO660), valeurs qui sont respectivement de 466 et 212, et dans des essais d'activite antitumorale in vivo sur les préparations lyophilisées, toutes les souris examinées (un groupe de cinq souris) survivent 30 jours après une inoculation du carcinome ascitique d'Ehrlich par la voie intrapéritonéale. REVENDICATIONS 1.- Procédé de culture de Streptococcus pyogenes dans un milieu pour la multiplication de cellules bactériennes douées d'activité antitumorale, procédé carac térisé en ce que (A) on opère dans un milieu de culture conte nant des sources de carbone fermentables et (B) on maintient le pH du milieu à 5,6 ou plus au cours de la culture. 2.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la proportion des sources de carbone fermentables est de 0,1 à 5 %. 3.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la proportion des sources de carbone fermentables est de 0,1 à 2 %. 4.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la proportion des sources de carbone fermentables est de 0,3 a 2 %. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 a 4 dans lequel le milieu est maintenu à un pH de 5,6 à 7,5 au cours de la culture. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le milieu est maintenu à un pH de 6 à 7 au cours de la culture. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel les sources de carbone fermentables.sont des glucides fermentables. 8.- Procédé selon la revendication 7, dans lequel les glucides fermentables sont des mono-holosides ou des di-holosides fermentables. 9.- Procédé selon la revendication 8, dans lequel le mono-holoside fermentable est le glucose. 10.- Procédé selon la revendication 8, dans lequel le di-holoside fermentable est le saccharose. 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2, 5 et 7, dans lequel le milieu de culture est préparé par addition de 0,3 à 2 % de sources de carbone fermentables à un bouillon d'extrait de levure. 12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 7, dans lequel le milieu de culture est préparé par addition de 0,1 à 1,5 % de sources de carbone fermentables à un bouillon de peptone de soja.