Brevet FR2479817A1 — publié le 19811009

-1- La présente invention concerne un amide de la formule R -CH-CO-R () NH2 dans laquelle R1 est un groupe alcoyle inférieur et R2 est un groupe méthylamino substitué ou un résidu de D-amino-acide ou d'un sel correspondant, et un procédé de détermination de la leucine aminopeptidase utilisant ce composé. La leucine aminopeptidase /a-aminoacyl-peptide hydrolase (cytosol), EC 3. 4. 11. 1., désignée ci-après par LAP; anciennement L-leucylpeptide hydrolase, EC 3. 4. 1.1. est distribuée dans n'importe quels tissus et dans le sérum et il est connu qu'elle aggrave les états des malades. On utilise la détermination de la LAP pour des diagnostics cliniques dans diverses maladies et pour observation concernant un pronostic. Les résultats d'analyse concernant LAP en chimie clinique sont exprimés en unités G-R (Goldbarg Rutenburg). Unité G-R = 2,72 x unité internationale de LAP (mU/cm3). /Cancer. 11, 283 (1958)7. On connaît déjà un certain nombre de procédés de détermination de LAP. Toutefois, chacun de ces procédés présente des inconvénients. Des procédés classiques de détermination sont la colorimétrie du composé aminé produit par action enzymatique sur un substrat synthétique constitué de L-leucine et d'une amine. Quand un substrat synthétique tel que le L-leucine-p-nitroanilide est mis à incuber avec LAP, une longueur d'onde de la couleur jaune de la p-nitro- aniline formée par l'action enzymatique est masquée à l'essai colorimétrique, et de plus la composition du sérum, spécialement le pigment bilirubine, a une influence sur la colorimétrie. De plus, quand le L-leucine-B-naphtylamide est utilisé comme substrat, la couleur formée est mesurée colorimétriquement, par exemple, en faisant copuler la -naphtylamine formée avec le diazotate de 5-nitro-2-amino- -2- méthoxybenzène; en faisant copuler la e-naphtylamine diazotée par le nitrate de sodium avec la N-(l-naphtyl)- éthylènediamine; ou en condensant la 8-naphtylamine avec le pdiméthylaminobenzaldéhyde ou le p-diméthylamino cinnamaldéhyde. Ces procédés de détermination colorimé- trique présentent un certain nombre d'inconvénients, tels qu'un processus de réaction complexe et un mode opératoire strict. De plus, la 0-naphtylamine formée est d'une haute toxicité et est cancérigène pour la vessie. Un autre procédé de détermination enzymatique de l'activité de LAP est celui dans lequel le L-leucinamide est utilisé comme substrat pour LAP et on fait incuber l'ammoniac formé avec de l'a-cétoglutarate, de la glutamate déshydrogénase et NADH2 pour transformer l'acide glutamique, puis le NADH2 oxydé est mesuré spectrophotométriquement. Quand on utilise le substrat L-leucyl-L-alanine, la L-alanine libérée par LAP est mise à incuber avec 1' a-cétoglutarate et la transaminase glutamique-pyruvique pour former de l'acide pyruvique qui est transformé en acide lactique par la lactate déshydrogénase, et le NaDH2 consommé est soumis à une détermination spectrophotométrique. On connaît un autre procédé de détermination utilisant la L-leucine déshydrogénase. La L-leucine libérée à partir de la L- leucyl-glycine par LAP est mise à incuber avec la L-leucine déshydrogénase, puis on mesure spectrophotométriquement NaDH2 (brevet japonais N 54-119290). De plus, on utilise le L-leucinamide comme substrat et la L-leucine formée est mise à incuber avec la L-amino-acide oxydase pour libérer de l'eau oxygénée qui est soumise à une détermination colorimétrique. /Pharmacia, 14, 872 (1978)7. Ces procédés connus antérieurs de détermination enzymatique présentent un certain nombre d'inconvénients. Par exemple, le système de réaction enzymatique est com- pliqué et le pigment bilirubine ou le sérum émulsionné ont une influence sur la détermination colorimétrique. Dans le -3- procédé de détermination utilisant la L-amino-acide oxydase, le L-amino-acide dans le sang empêche la détermination de la L-leucine libérée par LAP, de plus la quantité de L- amino-acide dans le sang n'est pas constante, ce qui est une cause d'inconvénients dans la détermination. On a trouvé que LAP hydrolyse les substrats formés par synthèse à partir de méthylamine substituée, que l'on ne trouve pas dans le sang, comme la benzylamine, la tyramine ou la butylamine, ou un D-amino-acide comme la D-méthionine ou la D-leucine, et la L-leucine ou la L-alanine pour libérer avec un bon rendement une méthylamine substituée comme la tyramine ou le D-amino-acide. La méthylamine substituée ou le D-amino-acide libérés sont oxydés par l'oxydase correspondante et on mesure une quantité d'oxygène consommé ou d'eau oxygénée libérée, déterminant ainsi l'activité de LAP. De plus, on a trouvé un nouveau substrat synthétique utile qui est un amide de la formule (I) R. -CH-CO-R2 (I) NH2 dans laquelle R1 et R2 ont les mêmes significations que ci-dessus. Un mode de réalisation du substrat synthétique est un amide de la formule (I) qui est formé par synthèse à partir de L-leucine ou de L-alanine et de mélamine subs- tituée ou de D-amino-acide, o R1 est un groupe alcoyle inférieur tel qu'un groupe isobutyle ou méthyle et R2 est un groupe méthylamino substitué de la formule (II) -NH-CH2-R3 (II) dans laquelle R3 est un groupe organique, ou R2 est le résidu de D-aminoacide de la formule (III) R -NH-tH/ (III) R5 dans laquelle l'un des substituants R4 et R5 est un groupe carboxyle, l'autre est un résidu organique et t est un -4- atome de carbone D-asymétrique. Des exemples du groupe organique R3 sont les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, amyle, p-hydroxybenzyle, 3,4-di- hydroxybenzyle, 5-imidazolméthyle, 3-indolméthyle ou phényle. Des exemples des groupes R4 et R5 sont ceux dans lesquels l'un des groupes R4 et R5 est un groupe carboxyle et l'autre est un groupe méthylthioéthyle, isobutyle ou phényle. Des exemples de méthylamine substituée ou de D- amino-acide sont, entre autres, l'éthylamine, la n-propyl- amine, la n-butylamine, l'iso-butylamine, la n-amylamine, la n-hexylamine, la tyramine, la 3,4-dihydroxyphényléthyl- amine, l'histamine, la tryptamine, la benzylamine, la D- méthionine, la D-leucine, la D-alanine ou la D-phénylglycine. Des exemples de l'amine substituée sont un composé constitué de L-leucine et de méthylamine substituée comme le L-leucine-benzylamide, le L-leucine-p-hydroxyphényléthyl- amide et le L-leucine-n-butylamide, un composé constitué de L-leucine et de D-amino acide comme la L-leucyl-D-méthionine et la L-leucyl-D-leucine ou un composé constitué de L-alanine et de méthylamine substituée comme le L-alanine-p-hydroxy- phényléthylamide. Ces amines substituées peuvent être uti- lisées sous la forme d'un sel soluble comme le chlorhydrate, le bromhydrate, le phosphate, le formiate, l'acétate, le propionate ou l'oxalate. Un amide selon la présente invention peut être produit par une synthèse classique de peptide, comme par protection et élimination du groupe protecteur et réaction de condensation. Des exemples du groupe protecteur pour le groupe a-amino dans le L-amino-acide, comme la L-alanine et la L- leucine, de la formule (IV) R -CH-COOH (IV) NH2 dans laquelle R1 a les mêmes significations que ci-dessus, sont des groupes protecteurs classiques tels que les groupes -5- t-butoxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, adamantyloxycarbo- nyle, benzyloxycarbonyle, o-nitrophénylthio ou nitro- benzyloxycarbonyle. Le groupe carboxyle peut être trans- formé en une forme activée telle que azide d'acide, anhy- dride mixte, acidimidazolide ou ester activé, par exemple ester de cyanométhyle, ester de p-nitrophényle, ester de 2,4-dinitrophényle, ester de N-hydroxysuccinimide ou ester de N-hydroxyphtalimide, ou il peut être activé par utili- sation de carbodiimide, de N,N'-carbonyldiimidazole ou de sel d'isoxazolium comme le réactif de Woodward. Ces formes activées du Lamino-acide sont mises à réagir avec une méthylamine substituée ou un Damino-acide par une réaction de condensation comme dans la méthode au carbodiimide, la méthode à l'ester activé ou la méthode à l'anhydride d'acide. La réaction est conduite dans un solvant inerte comme le diméthylformamide, le diméthylacétamide, le diméthylsulfoxyde et le tétrahydrofuranne, avec un rapport équimolaire des composés, entre -30 C et la température ambiante, tandis qu'on agite. La réaction peut être terminée en 5 à 50 heures. Ensuite, le groupe protecteur peut être éliminé. Le groupe t-butoxycarbonyle peut être éliminé par l'acide trifluoroacétique et le groupe benzyloxycarbonyle est éliminé par réduction catalytique avec un catalyseur palladium-carbone. Le produit ainsi obtenu est transformé en un sel, par exemple un sel inorganique comme le chlorhydrate, le bromhydrate ou le phosphate ou un sel organique comme le formiate, l'acétate, le propionate ou l'oxalate. L'oxydase correspondant à la méthylamine substituée et au-D-amino-acide libérés par une action de LAP sur le substrat synthétique ci-dessus selon la présente invention est au moins une enzyme qui hydrolyse la méthylamine subs- tituée ou le D-amino-acide comme substrat pour consommer de l'oxygène et libérer de l'eau oxygénée dans une réaction enzymatique. Des exemples de l'enzyme pour la méthylamine substituée sont des amines oxydases comme une monoamine - -6- oxydase, une diamine oxydase ou une polyamine oxydase et un exemple d'enzyme pour le D-amino-acide est une D-amino- acide oxydase. Ces oxydases ne sont pas limitées, toutefois la monoamine oxydase est une enzyme obtenue à partir de sérum porcin ou bovin et d'Aspergillus niger; la tyramine oxydase est une enzyme de Sarcina lutea IAM 1099 /Biochem. Biophys. Res. Commn., 27, 350 (1967), Methods in Enzymology, 17, 722 (1971)/; et la D-amino-acide oxydase est une enzyme provenant de tissus d'animaux ou de Trigonopsis variavillis. Ces oxydases peuvent être utilisées dans une forme immobilisée. L'enzyme immobilisée peut être assemblée dans un analyseur automatique, et est utilisée en combinaison avec une électrode à oxygène ou une électrode à eau oxy- génée. La forme immobilisée présente des avantages pour réduire une certaine quantité d'enzyme intéressante et coûteuse. Le détecteur répondant à la combinaison de l'en- zyme immobilisée de l'électrode à enzyme et des électrodes ci-dessus peut être utilisé pour des mesures rapides et multiples sans divers réactifs. Le détecteur peut aussi être utilisé avantageusement dans des échantillons colorés pour déterminer l'activité de LAP. L'enzyme immobilisée peut être préparée par des techniques connues d'immobilisation, par exemple emprison- nement au moyen d'acrylamide, réticulation avec des pro- téines par mélange avec de l'albumine, emprisonnement au moyen de collagène et de fibrolne ou enchaînement par liaison covalente avec ces matières, adsorption ou enchaî- nement par liaison covalente avec un polymère organique poreux ou emprisonnement au moyen d'une réserve photo- sensible. Ces enzymes immobilisées sont mises sous la forme de membranes, de fibres, de pastilles ou de tubes convenables pour des électrodes à enzyme. Un mode de mise en oeuvre du procédé de détermina- tion de l'activité de LAP est le'suivant. Une portion ali- -7- quote de solution de substrat synthétique est mise à incuber avec l'échantillon pour détermination de LAP tel que du sérum dans un tampon. L'incubation est effectuée à 370C. La durée de l'incubation n'est pas limitée et est de préférence une durée convenable pour libération d'amine substituée ou de D-amino-acide à partir du substrat par LAP. La méthylamine substituée ou le D-amino-acide ainsi libérés sont oxydés par l'o2ydase correspondante pour consommer de l'oxygène ou pour libérer de l'eau oxygénée. On conduit la réaction en ajoutant la solution d'oxydase correspondante ou en mettant en contact le mélange de réaction avec l'oxydase immobilisée à 370C. L'oxygène ainsi consommé ou l'eau oxygénée libérée sont mesurés de préférence par une électrode à oxygène ou une électrode à eau oxygénée. Cette détermination est effectuée avantageusement par l'électrode à enzyme comprenant une combinaison de l'enzyme immobilisée et d'électrode. Le signal de sortie est enregistré ou présenté sous la forme de variation électrique à transformer en activité de LAP. La quantité d'eau oxygénée est mesurée de manière classique au moyen d'un réactif de coloration constitué de 4-amino- antipyrine, de phénol et de peroxydase ou d'un réactif luminescent comme le luminol. Un mode de réalisation du système de détermination de l'activité de LAP est un système de réaction-détection comprenant l'injection d'un réactif de mesure d'activité de LAP, d'une solution de substrat et d'un tampon dans un récipient à réaction pour détermination de LAP dans lequel a lieu la libération de la méthylamine substituée ou du D- amino-acide à partir du substrat synthétique, l'oxydation de la méthylamine substituée ou du D-amino-acide formés par l'oxydase correspondante et la détection de la quantité d'oxygène ou d'eau oxygénée. Dans le système de réaction-détection, la partie colonne d'enzyme immobilisée pour réaction avec l'oxydase et la partie électrode de détection peuvent de préférence -8- être séparées, ou construites sous la forme d'une unité, c'est-à-dire une électrode à enzyme dans laquelle l'enzyme immobilisée est attachée au détecteur de l'électrode. Le système de détermination peut être un système réacteur- détecteur multiple dans lequel, par exemple, le prélèvement d'échantillons est effectué à partir de réacteurs multiples de production de LAP pour injection dans le récipient de réaction-détection, cela étant suivi de détections et de lavages. Dans les exemples, on se réfère à un système de détermination utilisant une électrode à oxygène; toutefois, dans la présente invention on peut utiliser avantageusement une électrode à eau oxygénée. Le procédé de détermination de LAP selon la pré- sente invention est très simple, rapide et donne des résul- tats reproductibles et est très utile pour diagnostic clinique. Les abréviations dans la présente invention ont les significations suivantes: Boc: t-butoxycarbonyle HOSu: N-hydroxysuccinimide OSu:ester de Nhydroxysuccinimide DCC:N,N'dicyclohexylcarbodiimide THF: tétrahydrofuranne DCU:N,N'-dicyclohexylurée DMF:diméthylformamide NMM:N- méthylmorpholine TFA:acide trifluoroacétique Z: benzyloxycarbonyle Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais ne doivent pas être considérés comme la limitant. Exemple 1 L-Leu-NH-CH2-C6H5(-L-leucine-benzylamide): On dissout Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) et de la -9- benzylamine (1,07 g, 10 mM) dans DMF (30 cm3), on règle le pH à 7 par addition de NMM, on agite la solution pendant toute une nuit à la température ambiante. On chasse DMF par distillation et on dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle. On lave la solution trois fois avec une solution à 5% en poids de bicarbonate de sodium, deux fois avec une solution 1N de HCl et deux fois à l'eau, on la déshydrate avec du sulfate de sodium, puis on chasse par distillation l'acétate d'éthyle. On charge le résidu sur une colonne de gel de silice (100 g) et on l'élue avec un mélange benzene- acetate d'éthyle (1: 1) pour obtenir Boc-Leu-NH-CH2-C6H5 (1,3 g). On dissout ce composé (1,2 g) dans TFA (3 cm3) et on agite la solution pendant 30 minutes. Apres élimination de TFA par distillation, on dissout le résidu dans une so- lution 0,1 N d'acide acétique. On charge la solution sur une colonne de Sephadex LH-20 (97,0 x 3,0 cm) et on la sépare en fractions de 6,3 cm3 chacune. On recueille les fractions N 28 à 36 et on les lyophilise pour obtenir de l'acétate de L-leucine-benzylamide (900 mg). Rendement: 32,1% (acétate) Formule moléculaire: C13H20N2O-CH3COOH Analyse élémentaire: C% H% N% calculé: 64,26 8,63 9,99 trouvé: 64,22 8,68 10,01 Valeur de RF: plaque de gel de silice (n-butanol: acide acétique: eau = 3: 1: 1), RF = 0,80 IR (Nujol): 1690, 1620 cm 1 (-CO-NH-) Exemple 2 L-Leu-D-Met-OH (L-leucyl-D-méthionine) On ajoute D-Met-OH (1,4 g, 10 mM) et du bicarbonate de sodium (1,68 g, 20 mM) dans un mélange d'eau (15 cm3) et de DMF (5 cm3). On y ajoute Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) dans DMF (30 cm3) et on agite le mélange pendant toute une nuit -10- à la température ambiante. Après refroidissement à-0 C, on règle le 1p à 6,5-u moyen d'une solution 1N de HCl et la solution est concentrée sous vide. On dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle en mélange avec 1N-HCl (50 cm3 - 50 cm3). La couche d'acétate d'éthyle est lavée à l'eau, séchée par addition de sulfate de sodium et on chasse l'acé- tate d'éthyle par distillation. On charge le résidu sur une colonne de gel de silice (100 g) et on l'élue au moyen de benzène-acetate d'éthyle (1: 1) pour obtenir Boc-Leu-D- Met-OH (1,6 g). On dissout le produit (1,5 g) dans TFA t4 cm3) et on agite le résidu à la température ambiante pendant 30 minutes. Apres élimination de TFA par distillation, on dissout le résidu dans une solution 0,1 N d'acide acétique et on le charge sur une colonne de Sephadex LH-20 (97,0 x 3,0 cm) et on recueille des fractions de 6,3 cm3 chacune. On combine les fractions N 28 à 36 et on les lyophilise pour obtenir de l'acétate de L-leucyl-D-méthionine (1,3 g). Rendement: 40,4% Formule moléculaire: CllH22N2SO3 CH3COOH Analyse élémentaire: C% H% N%- S% calculé: 48,43 8,13 8,69 9,94 trouvé: 48,40 8,15 8,65 9,95 Valeur de RF: plaque de gel de silice (n-butanol: acide acétique: eau = 3: 1: 1), R = 0, 50 IR (Nujol): 1687, 1620 cm (-CO-NH-) Exemple 3 L-Leu-NH-CH2-CH2-C6H5-OH (L-leucine-p-hydroxy- phényléthylamide): On dissout Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) et de la tyramine (1,37 g, 10 mM) dans DMF (30 cm3), on règle la solu- tion au pH 7 au moyen de NM! à 0 C et on l'agite toute une nuit à la température ambiante. Après avoir chassé DMF par distillation, on dissout le résidu dans de l'acétate -11- d'éthyle (50 cm3), on lave la solution trois fois avec une solution à 5% en poids de bicarbonate de sodium, deux fois avec une solution 1N de HCl et deux fois à l'eau, puis on la sèche par addition de sulfate de sodium. Apres avoir éliminé l'acétate d'éthyle par distillation, on charge le résidu sur une colonne de gel de silice (100 g), on l'élue avec un mélange benzene-acétate d'éthyle 1l:1) pour obtenir Boc-Leu-CH2-CH2-C6H4-OH (1,58 g). On dissout le composé (1,4 g) dans TFA (5 cm3), on agite la solution pendant 30 minutes à la température am- biante et on chasse TFA par distillation. Le résidu dissous dans de l'acide acétique 0,1 N est chargé sur une colonne de Sephadex LH-20 (97,0 x 3,0 cm) pour fractionnement en frac- tions de 6,3 cm3 chacune. On recueille les fractions N 30 à 38 et on les lyophilise pour obtenir de l'acétate de L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide (1,25 g). Rendement: 40,3% (acétate) Formule moléculaire: C14H22N202 CH3COOH Analyse élémentaire: C% H% N% calculé: 61,92 8,44 9,03 trouvé: 61,90 8,45 9,02 Valeur de: plaque de gel de silice (n-butanol: acide acétique: eau = 3: 1: 1), RF = 0,75 IR (Nujol) : 1685, 1615 cm-1 (-CO-NH-) Exemple 4 L-Leu-NH-(CH2)3-CH3 (L-leucine-n-butylamide) On dissout Boc-Leu-OH (2,5 g), 10 mM), de la n- butylamine (1 cm3, lmM) et du 1-hydroxybenztriazole (2,7 g) dans THF (25 cm3) et on refroidit la solution dans un bain d'eau glacée. On y ajoute du carbodiimide soluble dans l'eau (1,83 cm3, lmM) et on agite le mélange toute une nuit. Apres avoir éliminé THF par distillation, on dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle (50 cm3), on lave la solution trois fois avec une solution à 5% en poids de bicarbonate de -12- sodium, deux fois avec une solution iN de HC1 et deux fois à l'eau, puis on la sèche sur du sulfate de sodium et on chasse l'acétate d'éthyle par distillation. On charge le résidu sur une colonne de gel de silice (100 g) et on l'élue avec un mélange benzène-acétate d'éthyle (1: 1) pour obtenir Boc-Lau-NH-(CH2)3 (1,4 g). On dissout le composé (1,2 g) dans TFA (3 cm), on agite la solution pendant 30 minutes à la température am- biante et ensuite on chasse TFA par distillation. On dissout le résidu dans une solution 0,1 N d'acide acétique et on le charge sur une colonne de Sephadex LH-20 (97,0 x 3,0 cm) et on le fractionne en fractions de 6,3 cm3 chacune. On re- cueille les fractions N 30 à 35 et on les lyophilise pour obtenir de l'acétate de L-leucine-n-butylamide (800 mg). Rendement: 32,5% (acétate) Formule moléculaire: C10H22N2OCH3COOH Analyse élémentaire: C% H% N% calculé: 58,5 10,6 11,4 trouvé: 58,4 10,58 11,4 Valeur de RF: plaque de gel de silice (n-butanol: acide acétique: eau = 3: 1: 1), RF = 0,52 IR (Nujol): 1690, 1620 cm-1 (-CO-NH-). Exemple 5 L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide: On dissout Boc-Leu-OH-H20 (49,9 g, 0, 2 M) et HOSu (23,0 g, 0,2 M) dans THF (300 cm3) dans un ballon rond de 1 litre. Une solution de DCC (41,3 g, 0,2 M) dans THF (200 cm3) est ajoutée goutte à goutte à -10 C en 10 minutes environ et on agite le mélange à la température ambiante toute une nuit. DCU précipité est séparé par filtration et on concentre le filtrat. On dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle (300 cm3), on lave la solution avec N-HC1, une solution de NaCl et une petite quantité d'eau et on la sèche au moyen de sulfate de sodium anhydre. Après -13- élimination de l'agent desséchant, on concentre la solution et on y ajoute du n-hexane pour obtenir Boc-Leu- OSu sous la forme d'une poudre incolore (point de fusion 106-110 C, 59,11 g, rendement: 90%). A de la tyramine (1,51 g, 11 mM) dissoute dans DMF (15 cm3), owajoute BocLeu-OSu (3,28 g, 10 mM) et DMF (5 cm3) et on agite le mélange toute une nuit en le neutralisant par addition de NMM. On chasse NMM par distil- lation sous vide et on ajoute de l'acétate d'éthyle (100 cm3) au résidu, puis on lave le mélange avec une solution à % en poids de bicarbonate de sodium, une solution de NaCl, N-HC1, une solution de NaCL et une petite quantité d'eau et on le sèche au moyen de sulfate de sodium anhydre. On élimine l'agent desséchant et on concentre la solution. On ajoute du n-hexane au résidu pour obtenir la poudre préci- pitée (3,01 g). Après séchage, on dissout la poudre dans du dioxane (5 cm3), on ajoute encore un mélange 4,3N-HCl/ dioxane (dioxane absorbé avec acide chlorhydrique anhydre) (5 cm3) à 5 C et on agite le mélange pendant 2 heures à la température ambiante. On chasse l'acide chlorhydrique et le dioxane par distillation sous vide. On ajoute du n-hexane dans le résidu huileux à 0 C pour obtenir le précipité. On sèche le précipité sous vide pour obtenir de la poudre de L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide-HCl (2,23 g). Rendement: 78,0% (à partir de Boc-Leu-OSu) Formule moléculaire: C14H22N202 HCl Analyse élémentaire: C% H% N% calculé: 58,63 8,88 9,77 trouvé: 58,35 8,23 9,50 Point de fusion: 125130 C Spectre IR: figure 8 Chromatographie sur couche mince: plaque de gel de silice (Merck, N 5715), solvant de développement: (n-butanol: pyridine: acide acétique glacial: eau = : 10: 3: 12), RF = 0,70 Z479817 -14- Exemple 6 L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide: On ajoute du chloroformiate d'éthyle (0,94 cm3, mM) dans Z-Leu-OH (2,7 g, 10 mM) et NMM (1,0 g, 10 mM) dissous dans THF (30 cm3) à -20 C et on agite le mélange à -15 C pendant 2 minutes. On y ajoute de la tyramine (1,4 g, 10 mM) dans DMF (20 cm3) et on agite le mélange à la température ambiante toute une nuit. On élimine le solvant sous vide, on ajoute de l'acétate d'éthyle (100 cm3), on lave le mélange avec une solution à 10% de citrate, une solution aqueuse à 5% en poids de bicarbonate de sodium et à l'eau et on le sèche au moyen de sulfate de sodium anhydre. Apres élimination de l'agent desséchant, on ajoute du n- hexane dans le résidu huileux. On recristallise le précipité à partir d'acétate d'éthyle-n-hexane pour obtenir une poudre blanche (3,0 g, 78%). On dissout la poudre dans de l'éthanol aqueux à 50% V/V (600 cm3), on y ajoute un catalyseur à 5% en poids de palladium sur carbone (600 cm3) et N-HCl aqueux (5 cm3) et on introduit de l'hydrogène gazeux en agitant à la température ambiante. Apres cessation du dégagement d'anhydride carbonique, on élimine le catalyseur et on concentre le filtrat. Le produit huileux incolore est séché sous vide pour donner du L-leucine-p-hydroxyphéhyléthylamide- HCl (1,8 g, 62,7%). Exemple 7 L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide: On dissout Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) et de la tyramine (1,37 g, 10 nmM) dans DMF (30 cm), on règle la solution au pH 7 par addition de NMM et on l'agite à la tem- pérature ambiante toute une nuit. Apres élimination de DMF, on dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle (50 cm3) et on lave la solution trois fois avec une solution aqueuse à % en poids de bicarbonate de sodium, deux fois avec lN-HCl, deux fois avec de l'eau et du sulfate de sodium. On élimine l'acétate d'éthyle et on charge le résidu sur une colonne de gel de silice (100 g), puis on l'élue avec un mélange -15- benzène-acétate d'éthyle (1: 1) pour obtenir Boc-Leu- NHCH2-C6H4-OH (1,58 g). On dissout le composé (1,4 g) dans de l'acide trifluoroacétique (5 cm3), on agite la solution pendant 30 minutes à la température ambiante et on élimine l'acide trifluoroacétique. On dissout le résidu dans de l'acide acétique 0,1 N et on le charge sur une colonne de Sephadex LH-20 (07,0 x 3,0 cm), puis on le fractionne en fractions de 6,3 cm3 chacune. On recueille les fractions N à 38 et on les lyophilise pour obtenir de l'acétate de L-leucine-p-phényléthylamide /1,25 g, rendement: 40,3%, formule moléculaire: C14H22N202 CH3COOH, chromatographie sur couche mince: (plaque de gel de silice, n-butanol: acide acétique: eau = 3: 1: 1) ' = 0,757. Exemple 8 L-alanine-p-hydroxyphénylamine: On dissout Boc-Ala-OH (37,8 g, 0,2 M) et HOSu (23,0 g, 0,2 M) dans THF (300 cm3) dans un ballon rond de 1 litre. Une solution de DCC (41,3 g, 0,2 M) dans THF (200 cm3) est ajoutée goutte à goutte à -10 C pendant 10 minutes environ et on agite le mélange à la température ambiante toute une nuit. DCU précipité est séparé par fil- tration et on concentre le filtrat. On dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle (300 cm3), la solution est lavée avec N-HC1, une solution de NaCl et une petite quantité d'eau et séchée au moyen de sulfate de sodium anhydre. Apres élimination de l'agent desséchant, on concentre la solution et on y ajoute du n-hexane pour obtenir une poudre incolore (52,7 g, point de fusion 140-143 C, rendement: 91%). On ajoute Boc-Ala-OSu (2,86 g, 10 mM) et DMF (5 cm3) à de la tyramine (1,51 g, 11 nmM) dissoute dans DMF et on agite le mélange toute une nuit en le neutralisant par addition de NMM.On chasse DMF par distillation sous vide et on ajoute de l'acétate d'éthyle (100 cm3) au résidu, puis on lave le mélange avec une solution à 5% en poids de -16- bicarbonate de sodium, une solution de NaCl, N-HC1, une so- lution de NaCl et une petite quantité d'eau et on le sèche au moyen de sulfate de sodium anhydre. On élimine l'agent desséchant et on concentre la solution. On ajoute du n- hexane au résidu huileux pour obtenir la poudre (2,55 g). On dissout la poudre dans du dioxane (5 cm3), on ajoute une solution 4,3 N-HCl/dioxane (5 cm) à 5 C, puis on agite le mélange à la température ambiante pendant 2 heures. On chasse l'acide chlorhydrique et le dioxane par distillation sous vide. On ajoute du n-hexane au résidu huileux à 0 C pour obtenir le précipité. On sèche le préci- pité sous vide pour obtenir une poudre de L-alanine-p- hydroxyéthylamide-HCl (1,81 g). Rendement: 74,0% (à partir de Boc-Ala-OSu) Formule moléculaire: CllH16N202 HC1 Analyse élémentaire: C% H% N% calculé: 53,99 6,95 11,45 trouvé: 53,78 7,11 11,23 Point de fusion: 105110 C Spectre IR: figure 9 Chromatographie sur couche mince: plaque de gel de silice (Merck, N 5715), solvant de développement (n-butanol: pyridine: acide acétique glacial: eau = 15: 10: 3: 12): RF = 0,64 Exemple 9 L-alanine-p-hydroxyphényléthylamide: On ajoute du chloroformiate d'éthyle (0,94 cm3) à Z-Ala-OH (2,2 g, 10 mM) et NMM (1,0 g, 10 mM) dans THF à 20 C et on agite le mélange à -15 C pendant 2 minutes. De la tyramine (1, 4 g, 10 mM) dans DMF (20 cm3) y est ajoutée et on agite le mélange à la température ambiante toute une nuit. On chasse THF par distillation et on ajoute de l'acé- tate d'éthyle (100 cm3). On lave la solution avec une solu- tion aqueuse à 10% en poids de citrate, une solution -17- aqueuse à 5% en poids de bicarbonate de sodium et une petite quantité d'eau et on la sèche au moyen de sulfate de sodium anhydre. Après élimination de l'agent desséchant, on ajoute du n-hexane au résidu huileux obtenu à -partir de la solution concentrée. On recristallise le précipité à partir d'acétate d'éthyle - n-hexane pour obtenir une poudre blanche. On dissout la poudre dans de l'éthanol aqueux à 50% (600 cm3), on ajoute un catalyseur 5% palladium/carbone (600 mg) et N-HCl (5 cm3) et on introduit de l'hydrogène gazeux en agitant à la température ambiante. Après cessation du dégagement d'anhydride carbonique, on élimine le cataly- seur, on concentre le filtrat et on le sèche sous vide pour obtenir du L-alanine-p-hydroxyphényléthylamide-Hcl (1lt g. 46,1%). Exemple 10 Détermination de l'activité de LAP en utilisant le L-leucine-benzylamide et de l'amine oxydase: Une solution dans un tampon phosphate (pH 7,0, 1 cm3) de L-leucine-benzylamide (50 mM) est ajoutée dans un récipient à réaction assemblé avec une électrode à oxygène. On y ajoute un échantillon de LAP (50 pl, 50 U/cm3, 100 U/ 3 3 3 3 cm3, 150 U/cm3, 200 U/cm3 et 250 U/cm3)(Boehringer G.m.b.H.) et on met le mélange à incuber à 37 C pendant 15 heures en l'agitant. On ajoute de l'amine oxydase (2 U/cm3, Miles Lab., 50 pil) et on fait incuber pendant une minute à 37 C. La benzylamine formée par LAP est oxydée et la quantité d'oxygène consommé est mesurée par l'électrode à oxygène sous la forme d'une variation du courant électrique. Le résultat est représenté sur la figure 1 o chaque variation de courant électrique est proportionnelle à l'acti- vité de LAP. On peut déterminer l'activité de LAP en mesurant la variation du courant électrique. Exemple 11 Détermination de l'activité de LAP en utilisant le L-Leucine-phydroxyphényléthylamide et la tyramine oxydase: La solution de substrat et l'enzyme de l'exemple -18- sont remplacées par une solution 0,1M dans un tampon phosphate (pH 7,0, 1 cm3) de L-leucine-p-hydroxyphényl- éthylamide (50 mM) et de tyramine oxydase (3 U/cm3) produite par Sarcina lutea IAM 1099, 50 Il), et on continue ensuite de la même manière que dans l'exemple 10 pour la détermination d'activité de LAP. Le résultat est présenté sur la figure 2 qui indique un bon résultat. Exemple 12 Détermination d'activité de LAP en utilisant la L-leucyl-D-méthionine et de la D-amino-acide oxydase La solution de substrat et l'enzyme de l'exemple sont remplacées par une solution 0,1M dans un tampon phosphate (pH 7,0, 1 cm3)- de -L-leucyl-D-méthionine (50 mM) et de la D-amino-acide oxydase (11,5 U/cm3, Boehinger, G.m.b.H., 10 1l) et le procédé est mis en oeuvre de la même manière que dans l'exemple 10 pour la détermination d'acti- * vité de LAP. Le résultat est présenté sur la figure 3. Exemple 13 Détermination d'activité de LAP en utilisant le L-leucine-n-butylamide et de l'amine oxydase: La figure 4 illustre le schéma de principe pour le système de détermination d'activité de LAP. L'échantillon pour détermination de l'activité de LAP ajouté par l'injecteur à échantillon (1) et la solution de substrat (2) sont introduits dans le récipient (3) du réacteur à LAP. On introduit l'échantillon en utilisant une micropipette ou un échantillonneur automatique et on ajoute la solution de substrat au moyen d'une pompe à volume constant (4). Apres incubation, on transfère le mélange de réaction à une colonne à enzyme immobilisée (5) dans laquelle simultanément la solution tampon provenant du récipient à tampon (6) est introduite par une pompe à volume constant (7). La solution sortant de la colonne à enzyme immobi- lisée est transférée dans une cellule à écoulement dans -19- laquelle est montée une électrode (8) telle qu'une élec- trode à oxygène ou une électrode à eau oxygénée pour mesurer l'oxygène consommé ou l'eau oxygénée libérée par action enzymatique. La température est maintenue Qonstante dans le récipient à température constante (10). La varia- tion électrique détectée par l'électrode est enregistrée dansun enregistreur (12), un compteur numérique (13) ou un enregistreur numérique (14) à travers un amplificateur (11). Dans le schéma de principe ci-dessus, on utilise les éléments suivants: solution de substrat: 0,1 M dans tampon phosphate (pH 7,0) de L-leucine-nbutylamine (50 mM); échantillon pour détermination d'activité LAP: solution de LAP de diverses concentrations (50 U/cm3, 100 U/cm3, 150 U/cm3, 200 U/cm3 et 250 U/cm3); colonne à enzyme immobilisée: 2,8 x 30 mm contenant 100 mg d'amine oxydase immobilisée (15 U/g de support), avec enchaînement par covalence de l'amine oxydase et d'un polymère poreux (support: poly- acrylonitrile, agent de réticulation: glutaraldéhyde, brevet britannique N 215 001); et cellule à écoulement: volume intérieur L0,1 cm3, assemblée avec une électrode à oxygène. L'échantillon de LAP (10 pl) est ajouté dans une solution de substrat (50 pl) et mis à incuber à 37 C pendant 15 minutes. On fait circuler un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) à un débit de 1 cm3/min pour introduction dans la colonne à enzyme immobilisée à partir du récipient à tampon. Une fois que la quantité d'oxygène dissous détectée par l'électrode à oxygène est devenue constante dans la cellule à écoulement, On transfère le mélange d'incubation (10 pil) dans la colonne à enzyme immobilisée. La n-butylamine formée par LAP est oxydée par l'enzyme immobilisée et la quantité consommée d'oxygène dissous dans la réaction enzymatique est mesurée par l'électrode à-oxygène assemblée dans la cellule à écoulement sous la forme d'une variation du -20- courant électrique qui est enregistré à travers l'ampli- ficateur. Le résultat est représenté sur la figure 5 et montre que l'on obtient un bon résultat qui est avantageux pour une analyse automatique. Exemple 14 Détermination d'activité de LAP en utilisant la L-leucyl-D-méthionine et de la D-amino-acide oxydase 3 3 Un échantillon de LAP (50 U/cm, 100 U/cm, 150 U/ 3 3 3 cm3, 200 U/CM et 250 U/cm3) (10 pi) est ajouté dans une solution dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0, 50 pi) de L-leucyl-D-méthionine (50 mM) et mis à incuber à 37 C pen- dant 15 minutes. L'activité de LAP est mesurée par le sys- tème représenté sur la figure 6. Sur la figure 6, la réfé- rence 15 désigne un injecteur de mélange d'incubation de LAP, la référence 16 désigne un récipient à tampon phosphate 0,1 M, la référence 17 désigne une pompe à volume constant qui transfère le tampon à un débit de 1 cm3/min et la réfé- rence 18 désigne une cellule à écoulement. La cellule à écoulement est constituée d'un réacteur-détecteur assemblé avec une électrode à oxygène 20 assemblée avec une membrane à enzyme immobilisée de D-amino-acide oxydase 19 (support: membrane de polyacrylonitrile contenant des groupes amino, agent de réticulation: glutaraldéhyde, brevet britannique N 215 001 (30 U/g de support, diamètre 5 mm, 0,8 mg, activité de D-amino-acide oxydase 2,4 mU). La variation de courant électrique détectée par l'électrode à oxygène est enregistrée dans l'enregistreur 22 à travers l'amplifi- cateur 21. La référence 23 indique une sortie pour évacuation. Dans l'appareil ci-dessus, un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) s'écoule à 1 cm3/min et, une fois que l'oxy- gène dissous est stabilisé, le mélange ci-dessus d'incubation de LAP (10 pl) est injecté par l'injecteur. La D-méthionine libérée par l'action de LAP est oxydée par l'action enzyma- tique de la membrane à enzyme immobilisée pour consommer de Q -21l'oxygène dissous, ce qui est détecté par l'électrode à oxygène et la variation de courant électrique est enre- gistrée. Le résultat est présenté sur la figure 7; on voit qu'un bon résultat est obtenu pour un système de détermi- nation automatique. De plus, on effectue d'une manière continue 100 déterminations d'activité de LAP en utilisant des échan- tillons pour détermination d'activité de LAP (100 U/cm3 et 200 U/cm3). Après chaque détermination, la quantité d'oxygène dissous reprend immédiatement (une minute après la fin de la détection) la valeur stable initiale et cha- cune des 100 déterminations révèle les bons résultats et la reproductibilité. Exemple 15 Spécificité du substrat, dans le cas de divers substrats synthétiques, pour LAP et l'aminopeptidase: On utilise les substrats synthétiques suivants: L-leucinamide (50 mM), L-leucine-p-nitroanilide (50 mM), L-leucine-B-naphtylamide (solution saturée), L-leucine-n- butylamine (50 mM) et L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide (50 rM). Une solution au tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0, - 10 P1) contenant LAP (300 U/cm3) est ajoutée dans une solu- tion au tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0, 50 pl) du substrat ci-dessus et le mélange est mis à incuber à 37 C pendant 15 minutes. On utilise aussi de l'aminopeptidase (20 U/cm3, pl, Boehringer G.m.b.H.) dans les mêmes conditions. La L-leucine libérée par LAP et l'aminopeptidase sont mesurées par le système dont le schéma de principe est représenté sur la figure 4 dans l'exemple 13. (On utilise de la L-amino-acide oxydase au lieu de l'amine oxydase). Du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) est refoulé à 1 cm3/min par une pompe à volume constant et, une fois que l'oxygène dissous dans la cellule à écoulement a atteint l'état stable, -22- on injecte le mélange d'incubation ci-dessus (10 pi). On utilise une colonne de fibres à L-amino-acide oxydase immo- bilisée (28 U/g de support, 100 mg, 2,8 x 30 mm). L'oxygène consommé correspondant à la formation de L-leucine par la L-amino-acide oxydase est détecté par l'électrode à oxygène dans la cellule à écoulement, le signal est amplifié et changé en variation de courant électrique et on détermine l'action de LAP et de l'aminopeptidase sur divers substrats. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. Tableau 1 LAP aminopeptidase L-leucinamide +++ +++ L-leucine-pnitroanilide + +++ L-leucine-0-naphtylamide + +++ L-leucine-n-butylamide + ++ + L-leucine-p-hydroxyphényl- éthylamide +++ ++ Comme on le voit dans le Tableau 1, le L-leuci- namide, le N-L-leucyl-p-nitroaniline et le L-leucine-0- naphtylamide sont hydrolysés non seulement par LAP, mais aussi par l'aminopeptidase, et en conséquence ces substrats sont moins préférables pour détermination de l'activité de LAP dans le sérum car ce dernier contient LAP et de l'amino- peptidase. Au contraire, comme le L-leucine-n-butylamide et le L-leucinep-hydroxyphényléthylamide selon la présente invention sont hydrolysés par LAP et ne sont presque pas hydrolysés par l'aminopeptidase, ces substrats sont préfé- rables pour détermination de LAP dans le sérum. Exemple 16 - Détermination d'activité de LAP en utilisant la L-leucine-phydroxyphényléthylamide et de l'amine oxydase On prépare une solution de substrat (50 mM) en dissolvant du chlorhydrate de L-leucine-p-hydroxyphényl- éthylamide obtenu dans l'exemple 5 dans du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) . On prépare la solution (I) suivante: -23- Tampon 0,2 M Tris-HC1 (pH 8,0) 0,1 cm3 0,3% 4-aminopyridine 0,05 cm3 0,2% phénol 0,05 cm3 0,5 mg/cm3 peroxydase (Sigma Chem. Co. Type I) 0,05 cm 0,1 M chlorure de magnésium 0, 025 cm Solution 50 mM de substrat 3 (L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide) 0,025 cm Eau distillée 0,1 cm Solution (1) Total 0,4 cm3 On prépare une solution (II) de composition pour réaction (0,45 cm3) en ajoutant de l'amine oxydase (5 U/cm3, Miles Lab., 50 pl) dans la solution (I) ci-dessus (0,4 cm3). Du sérum de rat normal, du sérum de rat de type à maladie parenchymateuse du foie et du sérum de rat de type à cholestase extra-hépatique, chacun à raison de 50 1i, sont ajoutés dans la solution (II) de composition pour réaction ci-dessus (0,45 cm3), le mélange est mis à incuber à 37 C pendant 30 minutes et mesuré spectrophotométriquement à 480 nm. sérum de rat Wister mâle pesant environ 250 g. un mélange à 5% tétrachlorure de carbone-huile d'olive (V/V)(1 cm3/kg/jour) est injecté par voie sous- cutanée deux fois par semaine pendant 4 semaines dans le dos d'un rat Wister mâle pesant environ 250 g. Le sérum est re- cueilli après 48 heures pour l'administration finale. *un rat Wister mâle, pesant environ 29 g, est anesthésié à l'éther et on ligature le canal biliaire commun. On recueille le sérum 48 heures après l'opération de ligature. -24- Un sérum ayant une activité connue de LAP (Sera- clea N, 122 unités G-R, Nihon Shoji Co.) est traité de la même manière que ci-dessus et on calcule l'activité de LAP. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2. A titre de comparaison avec le procédé de déter- mination ci-dessus, un procédé antérieur connu de détermi- nation d'activité de LAP (Wako Pure Chem. Co., Code 274- 41901, substrat: L-leucine-p-diéthylaminoanilide) est appliqué au même échantillon de sérum. Le résultat est donné dans le Tableau 2. Tableau 2 Substrat L-leucine-p-hydroxy- L-leucine-p- phényléthylamide diéthylamino- Echantillon anilide de sérum (unités G-R) (unités G-R) rat normal 331 148 rat de type à maladie parenchymateuse du foie 2486 237 rat de type à cholestase extra-hépatique 379 241 Comme on le voit d'après le tableau, le L-leucine- p-hydroxyphényléthylamide selon la présente invention est un substrat avantageux pour le diagnostic de la maladie parenchymateuse du foie. Exemple 17 Détermination de LAP en utilisant le L-alanine-p-hydroxy- phényléthylamide et de l'amine oxydase: Du chlorhydrate de L-alanine-p-hydroxyphényléthyl- amide obtenu dans l'exemple 8 est dissous dans du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) pour préparer une solution de substrat (50 mM). On utilise cette solution de substrat (0,025 cm3) au lieu de la solution de substrat de l'exemple 16 et on prépare la solution (I) et la solution de compo- sion pour réaction (II) de la même manière que dans l'exemple 16. On détermine l'activité de LAP de la même manière que dans l'exemple 16. Le résultat est présenté dans le Tableau 3. -25- Substrat Sérum rat normal rat de type à maladie parenchymateuse du foie rat de type à cholestase extra-hépatique Tableau 3 L-alanine-p-hydroxy- phényléthylamide (unités G-R) Comme on le voit d'après le tableau, le L-alanine- p-hydroxyphényléthylamide selon la présente invention est un substrat synthétique préférable pour des diagnostics concernant la cholestase extra-hépatique. Exemple 18 Tampon 0,2 M Tris-HCl (pH 8,0) 0,3% 4-aminoantipyrine 0,02% phénol 0,05% peroxydase (Sigma Chem. Co. Type II 0,1 M chlorure de magnésium mM L-leucine-p-hydroxyphényl- éthylamide amine oxydase (7,6 U/cm3) eau distillée 0,1 cm 0,05 cm3 0,05 cm3 0,05 cm 0,05 cm3 0,025 cm3 0,025 cm3 3. 0,01 cm 0,14 cm3 Total 0,45 cm3 On ajoute du sérum normal /Wako Pure Chem. Co., sérum normal pour détermination de LAP, LAPC-Test Wako (méthode à substrat de L-leucine-pdiéthylaminoanilide), pi/ dans la solution de composition pour réaction ci- - dessus et le mélange est mis à incuber à 37 C pendant 30 minutes. On ajoute de l'éthanol (2,5 cm3) pour arrêter la réaction. On sépare la substance qui se dépose et on mesure colorimétriquement à 480 nm la solution surnageante. La courbe normale est présentée sur la figure 10. On observe une relation linéaire entre l'activité de LAP et l'absorption à 480 nm. Le procédé peut être utilisé comme procédé de -26- détermination quantitative de l'activité de LAP dans le sérum et avec une trousse de détermination. L'activité de LAP dans le sérum de patients humains a été déterminée en utilisant la courbe normale ci- dessus. Coefficient de corrélation y = 0,984 (nombre d'échantillons = 24) et équation de régression Y = 1,024 X - 2,898, on a observé un bon résultat. La courbe de corrélation est présentée sur la figure 11. Brève explication des dessins: Fig. 1: Détermination de LAP par électrode à oxygène en utilisant le L-leucine-benzylamide et de l'amine oxydase. Fig. 2: Détermination de LAP par électrode à oxygène en utilisant le Lleucine-p-hydroxyphényléthylamide et de la tyramine oxydase. Fig. 3: Détermination de LAP par électrode à oxygène en utilisant la Lleucyl-D-méthionine et de la D-amino-acide oxydase. Fig. 4: Schéma de principe d'un système de détermination d'activité de LAP: 1: injecteur pour échantillons soumis à détermination de LAP 2:solution de substrat 3:réacteur à LAP 4:pompe à volume constant :colonne à enzyme immobilisée 6:récipient à tampon 7:pompe à volume constant 8: électrode 9: cellule à écoulement : coffret à température constante 11: amplificateur 12: enregistreur 13: compteur numérique 14: enregistreur numérique -27- / Fig. 5: Détermination de LAP en utilisant une électrode à oxygène dans le schéma de principe (Fig. 4) et le L-leucine-n-butylamide et de l'amine oxydase. Fig. 6: Equipement pour détermination de LAP. 15: injecteur pour mélange pour détermination de LAP 16: solution tampon 17: pompe à volume constant 18: cellule à écoulement 19: membrane à enzyme immobilisée : électrode à oxygène 21: amplificateur 22: enregistreur 23: tuyau d'évacuation Fig. 7: Détermination de LAP en utilisant une électrode à enzyme assemblée avec de l'enzyme immobilisée et une électrode à oxygène, la L-leucyl-D-méthionine et du D-amino-acide. Fig. 8: Spectre IR du L-leucine-p-hydroxyphényl- éthylamide. Fig. 9: Spectre IR du L-alanine-p-hydroxyphényl- éthylamide. Fig. 10: Courbe normale utilisant le L-leucine-p- hydroxyphényléthylamide. Fig. 11: Courbe de corrélation utilisant le L- leucine-p-hydroxyphényléthylamide et un échantillon du commerce. -28-. REVENDICATIONS 1. Amide de la formule (I) R -CH-CO-R (I) NH2 dans laquelle R1 est un groupe alcoyle inférieur et R2 est un groupe méthylamino substitué ou un résidu de D-amino- acide, ou un sel d'un sel amide. 2. Un amide 1, caractérisé en ce 3. Un amide 1, caractérisé en ce 4. Un amide 1, caractérisé en ce la formule (II) (I) que (I) que (I) que ou R1 ou R1 ou R2 son est son est son est sel selon un groupe sel selon un groupe sel selon un groupe la revendication isobutyle. la revendication méthyle. la revendication méthylamino de dans laquelle R3 est 5. Un amide 4, caractérisé en ce -NH-CH2-R3 (II) un groupe organique. (I) ou -son sel selon la revendication que R3 est un groupe méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, amyle, p-hydroxybenzyle, 3,4dihydroxybenzyle, 5-imidazolméthyle, 3-indolméthyle ou phényle. 6. Un amide (I) ou-son sel selon 1, caractérisé en ce que R est un résidu - 2 -de la formule (III) - /R -NH-CH la revendication de D-amino-acide (III) dans laquelle l'un des substituants R4 et R5 est un groupe carboxyle, l'autre est un groupe résiduel organique et C est un atome de carbone D-asymétrique. 7. Un amide (I) ou son sel selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'un des substituants R4 et R5 est un groupe carboxyle, l'autre est un groupe méthylthioéthyle, isobutyle, méthyle ou phényle et C est un atomè de carbone -29- D-asymétrique. 8. Procédé de détermination pour la leucine aminopeptidase, caractérisé en ce qu'on fait réagir un substrat qui est.un amide ou sel d'amide de la formule R1 -CH-CO-R2 (I) NH2 dans laquelle R1 est un groupe alcoyle inférieur et R2 est un groupe méthylamino substitué ou un résidu de D-amino- acide, avec un échantillon pour détermination de la leucine aminopeptidase, on fait incuber le produit de réaction mélamine substituée ou D-amino-acide avec l'oxydase corres- pondante et on mesure l'oxygène ainsi consommé ou l'eau oxygénée libérée. 9. Procédé de détermination selon la revendication 8, caractérisé en ce que R1 dans l'amide (I) est le groupe isobutyle. 10. Procédé de détermination selon la revendication 8, caractérisé en ce que R1 dans l'amide est le groupe méthyle. 11. Procédé de détermination selon la revendication 8, caractérisé en ce que R2 dans l'amide est un groupe méthylamino substitué de la formule -NH-CH2-R3 (II) 2 3 (Il) dans laquelle R3 est un groupe organique. 12. Procédé de détermination selon la revendication 11, caractérisé en ce que R3 dans le groupe (II) est un groupe méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, amyle, p-hydroxybenzyle, 3,4-dihydroxybenzyle, 5-imidazole- méthyle, 3-indoleméthyle ou phényle. 13. Procédé de détermination selon la revendication 8, caractérisé en ce que R2 dans l'amide de formule (I) est un résidu de D-amino-acide de la formule R4 -NH-CH (III) R5 -30- dans laquelle un des substituants R4 et R5 est un groupe carboxyle, l'autre est un groupe résiduel organique et C est un atome de carbone D-asymétrique. 14. Procédé de détermination selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'un des groupes R4 et R5 dans le résidu de D-amino-acide est un groupe carboxyle, l'autre est un groupe méthylthioéthyle, isobutyle, méthyle ou phényle et C est un atome de carbone D-asymnétrique. 15. Procédé de détermination selon l'une des revendications 8, 9, 10, 11, 12, 13 et 14, caractérisé en ce que l'oxydase est une enzyme immobilisée. 16. Procédé de détermination selon l'une des revendications 8, 9, 10, 11, 12, 13 et 14, caractérisé en la détermination est effectuée par une électrode à oxygène ou une électrode à eau oxygénée, ou une électrode à enzyme qui en dérive. 17. Procédé de détermination selon l'une des revendications 8, 9, 10, 11, 12, 13 et 14, caractérisé en ce que le procédé comprend la mesure de l'eau oxygénée par un réactif de coloration ou un réactif luminescent.