Brevet FR2484650A1 — publié le 19811218

-1- La présente invention concerne les antigènes nucléolaires que l'on trouve dans une large gamme de cancers humains et que l'on ne trouve pas dans les tis- sus non tumoraux correspondants, et les anticorps et antisera spécifiques de ce(s) antigène(s) nucléolaire(s) dans des buts diagnostiques. Des découvertes antérieures chez des animaux expérimentaux ont indiqué la présence dans les tumeurs d'antigènes nucléaires et nucléolaires non trouvés dans les tissus non-tumoraux (R. E. Busch et coll., Cancer Res.3, 2362, 1974; Yeoman et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA n, 3258, 1976; Busch & Busch, Tumori 6, 347, 1977; Davis et coll., Cancer Res. M, 1906, 1978; Marashi et coll., Cancer Res. à_, 59, 1979). Dans ces études antérieures dues aux inventeurs, on prépare des anticorps contre les nucléoles de cellules normales et néoplasiques de rats par immunisation de lapins (R. K. Busch et coll.., supra; Busch & Busch, sura; Davis et coll., supra). On trouve une fluorescence.nucléolaire brillante dans les cellules fixées & l'acétone par le procédé d'immuno-fluorescence indirecte. On trouve également que les bandes d'immuno-précipitine dans les gels d'Ouchterlony formés avec les antisera contre les antigènes nucléolaires d'hépatome de Novikoff extraits de nucléoles d'hépatome de Novikoff de rat diffèrent des bandes d'immuno-précipitine correspondantes pro- duites avec des antigènes nucléolaires de foie et des antisera nucléolaires anti-foie (Busch & Busch, supra). On démontre une spécificité plus poussée lorsque l'antisérum nucléolaire anti-tumoral absorbé avec les extraits nucléaires de foie produisent une 2- fluorescence nucléolaire positive dans les cellules d'ascite d'hépatome de Novikoff mais non dans les cel- lules de foie. Inversement, un antisérum nucléolaire anti-foie absorbé avec des extraits nucléolaires tumo- raux ne produit pas de fluorescence nucléolaire tumo- rale détectable mais produit bien une fluorescence po- sitive dans les nucléoles du foie (Davis et coll., supra). Dans la mesure o l'analyse par immunofluores- cence indique que des différences sont observables dans les frottis tumoraux fixés à l'acétone et les frottis de cellules de rats normaux (en particulier après ab- sorption des antisera avec les noyaux et nucléoles de foie normaux), on a fait des essais pour utiliser ces antisera contre les antigènes nueléolaires de tumeurs de rats en testant des échantillons de tissus corres- pondants dérivés de tumeurs humaines. Des études faites avec des anticorps contre les nucléoles tumoraux de rongeurs ont montré qu'on ne trouve pas d'immunofluo- rescence positive dans les nucléoles de tumeurs hu- maines. De ce fait les inventeurs ont commencé une nouvelle série d'expériences pour trouver des anti- gènes nucléolaires humains. On a alors trouvé une immunofluorescence positive dans des tissus tumoraux humains avec des antisera et des anticorps contre ces nouvelles préparations nucléolaires tumorales humaines. Dans ces études, on a absorbé les anticorps avec des extraits nucléaires placentaires soumis aux ultra-sons ainsi qu'avec du sérum de foetus de veau.(Busch et coll, 39, 3024, 1979; Davis et coll, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 892, 1979; Smetana et coll, Life Sci. 25, 227, 1979). La présente invention résulte d'études visant à utiliser ces nouveaux antigènes nucléolaires humains pour la détection d'une large gamme de néoplasmes hu- mains. -3- Le tableau I ci-dessous présente un résumé des tumeurs humaines dans lesquelles on a trouvé une immuno- fluorescence nucléaire brillante avec les anticorps contre les nucléoles tumoraux humains. Ces études ont été le support de la découverte surprenante et inatten- due selon laquelle de nombreuses tumeurs humaines con- tiennent un antigène nueléolaire commun qui présente une immunofluorescence positive avec les antisera ou les fractions d'immunoglobuline de tels antisera (Busch et coll. supra). TABLEAU I IIvMIJ-NOFLIUORESCEICE NUCLEOLAIRE BRIILINTE DANfS IES TUMEURS HUMIAINES (d'après: Busch et Coll, 1979) I. Carcinomes 1. Vessie, cellule de transition 2. Cerveau astrocytome glioblastome 3. Colon, adénocarcinome (4) métastase: foie carcinome transplantable (GWi-39) 4. Glande exocrine, carcinome 5. Oesophage, carcinome des cellules squameuses 6. Foie, carcinome primaire 7. Poumon: - adénocarcinome (2) cellules en "grains d'avoine" (2) cellules squameuses (5) 8. Mélanome malin, métastases cérébrales 9. Prostate, adénocarcinome (4) 10. Peau: carcinome des cellules basales (2) carcinome des cellules squameuses (7) métastase: ganglion lymphatique 11. Estomac, adénocarcinome métastase: foie métastase: ganglion lymphatique 12. Thyroide, carcinome (2). II. Sarcomes 1 Myoblastome malin de la lèvre métastase vers les ganglions lymphatiques cer- vicaux 2. Sarcome ostéogène (3), biopsie, culture de tissu 3. Sarcome synovial 4. Lymphome (4), non-Hodgkins III. Néoplasmes hématologiques 1. Maladie de Hodgkins (Reed Sternberg 5) 2. Leucémie: CLL (5), cellules ciliées (rate) 3. Lymphome, lymphocytaire, rate 4. Myélome multiple (5) 5. Mycosis fongoide 6. Leucémie myélocytaire aiguë (5) 7. Leucémie myélocytaire chronique (5) 8. Leucémie monocytaire aiguë (2) IV. Cultures - 1. Carcinome du sein 2. Adénocarcinome du colon 3. HeLa 4. HEp-2 5. Prostate, carcinome (3) 6. Carcinome des cellules squameuses (3) t Les chiffres entre parenthèses représentent le nombre de cas. Dans les tissus non tumoraux, les tumeurs bénignes et les états inflammatoires, on obtient géné- ralement des résultats négatifs comme l'indique le tableau II ci-dessous (Busch et coll., supra). TABLEAU II tIm.0UNOFLUORESCEITCE NsEGATIVE DANS LES TISSUS HUMAINS (d'après Busch et coll., 1979) I. Tissu normal 1. Vessie 2. ioëlle osseuse (lignée hémoblastique, 5)* Sein 4. Couche leucocytaire du sang (3) 5. Vésicule biliaire 6. Intestin grêle, glandes de LieberktUhn 7. Gros intestin 8. Rein 9. Foie (2) 10. Poumon (adjacent à la tumeur) 11. Ganglion lymphatique 12. Lymphocytes normaux (2) 13. Pancréas 14. Epiphyse 15. Hypophyse 16. Placenta 17. Prostate 18. Peau 19. Estomac 20. Glande thyroide. II. Tissus à croissance bénigne 1. Sein, adénome 2. Parathyroide, adénome (2) 5. Prostate, hyperplasie (3) 4. Thyroide, adénomes (3) goitres nodulaires (2) III. Maladies inflammatoires 1. Rectocolite hémorragique chronique 2. Glomérulonéphrite 3. Granulome et fibrose du poumon v5 4. Foie - cirrhose, hépatite -6- 5. Lupus profundus (glande mammaire et peau) 6. Pemphigus bulleux 7. Ulcère gastrique 8. Hyperplasie inflammatoire des ganglions lympha- tiques (4) 9. Monocléose infectieuse (5) IV. Cultures 1. Fibroblaste du sein 2. Lymphocytes stimulés à la SE& * Les chiffres entre parenthèses représentent le nombre de cas. Ces résultats, originellement obtenus par immunofluorescence, ont été vérifiés et étendus par des procédés à l'immunoperoxydase. La présente invention se fonde sur la décou- verte surprenante et inattendue selon laquelle on trouve des antigènes nucléolaires communs dans une large gamme de cellules de cancer humain mais on ne les trouve pas dans les cellules humaines normales. Les antigènes sont des protéines qui peuvent commander des gènes ou avoir d'autres fonctions et persistent dans toute la mitose en situation périchromosomique. Les aspects importants de l'invention sont la décou- verte des antigènes nueléolaires communs trouvés dans les cellules cancéreuses humaines, l'isolement et la purification des antigènes nucléolaires, la production d'antisera et d'anticorps spécifiques de ces anti- gènes, les procédés de test diagnostique utilisant des antisera et des anticorps spécifiques de ces antigènes pour détecter les cellules cancéreuses humaines, et un nécessaire diagnostique contenant soit des anticorps soit des antisera, ou les deux, qui soient spécifiques de ces antigènes nucléolaires. On a trouvé les antigènes dans une large gamme de cancers humains y compris les cancers du -7- système nerveux central, de l'appareil gastro-intesti- nal, de l'appareil génito-urinaire, du poumon, de la peau, des tissus hématopoiétiques et des glandes endo- crines et exocrines. Ainsi, les cellules humaines ma- lignes comprennent les cellules HeLa, le carcinome de la prostate, d'autres carcinomes, sarcomes et néoplas- mes hematologiques. Les antigènes peuvent 9tre extraits des noyaux ou des nucléoles de cellules malignes hu- maines. Les antigènes n'ont pas été trouvés dans les tissus non tumoraux correspondants. En utilisant les procédés diagnostiques de l'invention pour détecter les cellules malignes, on a détecté environ 1 % de faux négatifs et 3 % de faux positifs. Les faux néga- tifs représentent des tissus tumoraux nécrotiques ou des tumeurs ne réagissant pas pour des raisons incon- nues. Les faux positifs représentent deux cas de 'tis- sus prénéoplasiques" et faiblement positifs dans quel- ques regions focales dans una "tissu hyperplasique". Deux régions positives focales ont été identi- fiées comme "régions prénéoplasiques" ou transformation néoplasique focale dans les tissus inflammatoires gastro-intestinaux. Les antigènes comprennent une espèce princi- pale et au moins une espèce secondaire d'antigène, et peut-être plus. L'espèce d'antigène principale des cellules cancéreuses humaines (a) a un point isoélec- trique discret de 6,0 à 6,7 et environ 6,3 lorsqu'on le détermine par focalisation isoélectrique, pH 3-10, gel de polyacrylamide; (b) a un poids moléculaire ap- C proximatif de 50 000 à 60 000 dalton par détermination à l'électrophorèse sur gel bidimensionnelle avec une seconde dimension au bOS (dodécylsulfate de sodium); (c) est en partie étroitement reliée à une ribonucléo- protéine nucléaire et nucléolaire et en partie-soluble dans le Tris-HC1 0, 01 M, pHl 8; (d) et est à la fois -8- nucléolaire et extranucléolaire mais reste "intranu- cléaire" ou associée aux chromosomes durant la division cellulaire. La seconde espèce d'antigène qui a été détec- tée a un pI d'environ 6,0 (détecté par les mSmes procé- dés que pour la principale espèce d'antigène) et son poids moléculaire est également de 50 000 à 60 000 dalton. Il se peut qu'elle représente un produit modi- fié de l'antigène principal, mais on n'a pas déterminé si elle a ou non une relation de structure avec lui. L'espèce d'antigène secondaire est à une concentration relativement plus faible que l'espèce d'antigène princi- pale. Les antigènes sont également présents dans les particules de ribonucléoprotéine (RNP) nucléolaires obtenues par ultracentrifugation des extraits de Tris, décrite ci-dessous. L'antigène présent dans ces parti- cules est plus étroitement lié aux protéines et à l'a- cide ribonucléique (ARN) que l'antigène dans la frac- tion soluble dans le tris. On ne sait pas encore clairement si les antigènes de la particule de RlP sont identiques à ceux de la fraction surnageante mais leur point isoélectrique est le même et ils absorbent les anticorps spécifiques des antigènes. Les antigènes nucléolaires présents dans les fibrilles, probablement du réseau ribonucléoprotéique nucléaire, se voient également dans les cellules cancéreuses par microscopie optique immunologique. Il s'agit de structures extra- nucléolaires qui peuvent représenter des éléments dont sont dérivées les particules de RUP. Il reste à déterminer si les antigènes repr6- sentent une substance qui est présente â des concen- trations élevées dans les cellules cancéreuses et à des très faibles concentrations dans les cellules non cancéreuses, ou s'ils sont des antigènes foetaux comme on l'a trouvé plut8t dans les études comparées sur les antigènes nucléaires de l'hépatome de Novikoff du rat et des cellules hépatiques du rat normal (Yeoman et coll., 1976). Toutes les étapes visant à obtenir et à ana- lyser des échantillons de tissu humain, de sang et de sérum de tumeurs humaines et d'autres tissus de malades supposés cancéreux ont été approuvées par le Comité de Recherche sur l'Homme de l'Ecole de médecine Baylor, Houston, Texas, et des hôpitaux qui en dépendent. Les coupes de tumeurs humaines ont été obtenues à partir de coupes en congélation de spécimens chirurgicaux, de biopsies, ou de spécimens de cryostat préservés, prove- nant surtout du département de pathologie du Houston Veterans Administration liedical Center, ainsi que de la Michigan Cancer Foundation à Détroit, Michigan, et du Département de Médecine interne de l'Université Charles à Prague en Tchécoslovaquie. Ces coupes ont été analysées pour y détecter la présence d'antigènes nucléolaires par des techniques d'immunofluorescence indirecte et à l'immuno-peroxydase. La purification des antigènes a été effectuée par extraction dès noyaux ou nucléoles avec Tris HCl O1mM/FMSF 0,1 mM/pH 8 en 6 lois dans un rapport de 20 volumes pour I volume de noyaux ou de nucléoles. On centrifuge l'extrait tout d'abord à 27 000 g pendant minutes puis à 100 000 g pendant 16 heures. On uti- lise du sulfate d'ammonium saturé à 40 % pour retirer les impuretés. On recueille la fraction sulfate d'amamo- nium à 40-100 % par centrifugation et on dialyse contre Tris HCl 20 mM/pH 7,6. On chromatographie les antigènes sur des colonnes de DE-52 (1 x 10 cm). On élue les antigènes dans la fraction NaCI 0,15 M/lISF 0,1 mM/pH 7, 6. On emploie des gels de focalisation isoélectrique pour identifier et purifier les antigènes. Ces gels -10- contiennent: acrylamide à 4 %/urée 8M/ampholines à 2 % (pH 5,5-10). On découpe dans les gels les antigènes, pI 6,3 et 6,0 respectivement. Sur les gels SD! (dodécyl- sulfate de sodium), on trouve une tache principale pour chacun de ces antigènes. On prépare des noyaux ou des nucléoles de cellules HeLa en recueillant des cellules HeLa à partir de flacons de culture de Spinner (7-8 1). Les cellules doivent être et sont en phase logarithmique de crois- sance, 7-8 x 105 cellules/ml. On centrifuge les cellu- les à 800 g pendant 8 minutes pour former des boulettes cellulaires. On met les boulettes cellulaires en suspen- sion dans du sel physiologique tamponné au phosphate (NaCl 0,15 M, phosphate 0,01 M, pH 7,2) en homogénéi- sant avec précaution avec un pilon souple en téflon et on centrifuge à 800 g pendant 8 minutes. On lave les cellules une seconde fois avec du sel physiologique tamponné au phosphate et on pèse les boulettes cellu- laires. On met en suspension les boulettes cellulaires en homogénéisant avec précaution dans 20 volumes de tampon standard de reticulocyte (RSB), pH 7,4 et on laisse gonfler pendant 50 minutes sur de la glace. On centrifuge alors les cellules à 1000 g pendant 8 mi- nutes et on remet en suspension en homogénéisant avec précaution dans un tampon RSB auquel on ajoute 1/20e de volume du détergent Nonidet P40 (à 10 % dans le RSB). Le volume final de Nonidet est de 0,5 %. On homogénéise les cellules avec un homogénéisat de Dounce à 20 à 60 battements jusqu'à ce que les cellules soient brisées et que les noyaux soient libérés et débarrassés du cytoplasme. On centrifuge alors les cellules à 1000 g pendant 8 minutes, on remet en suspension en homogénéi- sant doucement dans du saccharose 0,88 M, de l'acétate de Mg 0,5 mÉ (20 x poids-volume) et on centrifuge à 1500 g pendant 20 minutes La boulette obtenue contient _11 - les noyaux HeLa que l'on a utilisé pour préparer les extraits antigéniques décrits ci-dessous. On peut obte- nir de manière analogue des noyaux provenant d'autres cellules malignes humaines. Pour isoler les noyaux, on met ensuite en sus- pension la boulette nucléaire telle que préparée ci- dessus par homogénéisation douce dans du saccharose 0,34 M, de l'acétate de lig 0,5 maM en utilisant 2 ml de saccharose pour chaque gramme des cellules d'origine. On traite les noyaux aux ultra-sons (avec un appareil de Branson) avec des salves de 10 secondes (et des temps de repos de 10 secondes). Le temps total est compris entre 60 et 110 secondes. On suit les nucléoles libérés par examen microscopique. Pour visualiser les nucléoles, on les colore avec de l'Azure C (la solution se compose de 1 'o d'Azure U dans du saccharose 0,;5 M). La prépa- ration doit etre libérée des noyaux à la fin du traite- ment aux ultra-sons. On étoffe la fraction traitée aux ultra-sons avec 5 fois son volume de saccharose 0,88 M (sans acétate de Mg) et on centrifuge à 1500 g pendant minutes. La boulette obtenue contient les nucléoles HeLa qui peuvent utilisés comme immunogènes. Le procédé ci-dessus donne généralement une purification satisfaisante (Busch et bmetana, 1970), et la microscopie optique montre que la qualité de ces préparations est satisfaisante pour l'essentiel. Ce- pendant, l'analyse par microscopie électronique indique la présence de chromatine et d'impuretés nucléaires. Le-problème clé pour obtenir une purification adéquate de ces préparations est la quantité limitée de cellules HeLa d'origine dans les cultures, ce qui limite le nombre d'étapes de purification. Les nucléoles préparés à partir de 5 à 10 g de préparations de cellules HeLa, plutôt que les quantités de 0,5 à 1 g utilisées dans les études antérieures, fournissent matière suffisante -12- à une purification adéquate. Les conditions de culture des cellules HeLa et d'isolement des noyaux placentaires sont essentiellement les mémes que celles qui sont mentionnées auparavant (Davis et coll., 1979). On prépare un extrait de-HeLa Tris en mettant en suspension les noyaux de HeLa dans un tampon NaCl- EDTA 10 x poids/volume, I g de noyaux/10 ml de tampon. (Tampon = NaCl 0,075 M, EDTA Na 0,025 M/pH 8, lvISF I mM). On complète le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) à une concentration de 100 mnM dans l'alcool isopropy- lique. On l'ajoute à chaque solution avant l'extraction. On homogénéise la suspension avec un homogénéiseur de Dounce à 20 battements et on centrifuge à 3000 g pen- dant 5 minutes. On recueille le surnageant. On répète les extractions précédentes sur la boulette nucléaire 2 fois de plus. On n'utilise pas l'extrait NaCl-EDTA dans le présent travail sur les antigènes; on le jette donc. On met la boulette nucléaire en suspension dans un tampon Tris HCl 0,01 M 10 x poids/volume; pH 8, PMSF I mM et on homogénéise avec un homogénéiseur de Dounce pendant 20 battements, bien qu'un Tris HCl 0, 01 M, pH 7-9 soit satisfaisant. On recueille le surnageant et on le garde sur de la glace. Pendant les extractions au Tris, les noyaux se brisent et la chro- matine est libérée. On suit ce phénomène par examen au microscope. On remet la boulette en suspension dans le tampon Tris et on laisse les noyaux "gonfler" pendant minutes sur de la glace. On les homogénéise alors à l'appareil de Dounce pendant 20 battements et on - centrifuge à 12 000 g pendant 10 minutes. On garde le surnageant. On remet la boulette en suspension; elle a un aspect duveteux blanchâtre. On l'homogénéise à nouveau à l'appareil de Dounce et on centrifuge à 27 000 g pendant 30 minutes. On recueille le surnageant et on le combine avec les surnageants antérieurs prove- -13- nant des extraits de Tris. On concentre alors les extraits de Tris avec une membrane Amicon UM-10 ou PM-10 Diaflo. Généralement, le volume se situe au début autour de 50 ml et on le concentre à 4-5 ml. La concentration finale de protéine est autour de 4-5 mg/ml. On peut immuniser le lapin avec cet extrait de Tris. En suivant le procédé ci-dessus, on peut éga- lement préparer des extraits de nucléoles HeLa et de noyaux ou de nucléoles d'autres cellules malignes hu- maines. Pour l'immunogène Tris, diluer 250 microlitres d'extrait de Tris (4-5 mg/ml) tel que préparé ci- dessus avec 250 microlitres de sel physiologique tam- ponné au phosphate. On combine ceci avec l'adjuvant de Freund comme il est dit pour l'immunogène nucléolaire ci-dessous. On prépare des anticorps par immunisation de lapins avec des préparations nueléolaires de cellules HeLa comme suit: on pèse les nucléoles HeLa (20-30 mg, poids humide) et on les met uniformément en suspension dans 0,5 ml de sel physiologique tamponné au phosphate 0,01 M, pH 7,2. On les mélange alors avec 0,6 ml d'ad- juvant de Freund complet (GIBCO) comme suit: On dis- pose les nucléoles en suspension dans une seringue de ml et l'adjuvant de Freund dans une seconde seringue. A chaque seringue on attache une aiguille n 18 dont on a enlevé l'extrémité. On relie alors les aiguilles par un morceau de tuyau de polyéthylène de diamètre inté- rieur 0,047 (Clay-Adams)o On mélange le contenu des seringues jusqu'à ce que la préparation s'épaississe et qu'il soit difficile de la faire passer à travers le tube. On rase le lapin dans le dos et on lui injecte par voie intra-dermique, en 6 endroits différents, -14- 0,1 ml par endroit. On injecte les 0,4-0,5 ml restant, moitié par voie sous-cutanée (sous la peau lâche en haut du dos) et moitié par voie intra-musculaire (dans le muscle de la cuisse). On procède aux injections une fois par semaine pendant 3 semaines avec des quantités similaires de nucléoles à chaque fois. On effectue le premier saignement 7 à 10 jours après la troisième se- maine d'immunisation. On utilise une ventouse à oreille pour lapin (Bellco) et une pompe à vide pour recueillir le sang. On laisse le sang (environ 45-50 ml) se coagu- ler pendant 3-4 heures à la température ambiante. On retire du tube la fraction sérum et on la centrifuge à 1000 g pendant 30 minutes (ceci permet aux hématies libres éventuellement présentes de se sédimenter). On recueille le sérum clair puis on l'absorbe (ou on le maintient gelé jusqu'à ce qu'il soit prêt pour la procédure d'absorption). On.peut réfrigérer le caillot sanguin pendanea nuit. Ceci libère quelques ml supplé- mentaires de sérum. On dose le sérum de chaque saigne- ment pour rechercher la présence d'anticorps nucléo- laires par le procédé d'immunofluorescence indirecte. On peut immuniser d'autres hôtes non-humains (comme les chèvres, les moutons, les chevaux, les pou- lets, etc) avec des préparations de nucléoles de cel- lules malignes humaines pour obtenir les antisera ou anticorps spécifiques des antigènes nucléolaires de l'invention. On peut également préparer des antisera par immunisation d'animaux-hôtes non-humains avec des extraits (par exemple des extraits au Tris) de noyaux ou de nucléoles de cellules malignes humaines. On réalise l'absorption de l'antisérum anti- nueléolaire en absorbant tout d'abord l'antisérum de lapin avec du sérum humain normal à 20 5D et du sérum de foetus de veau à 20 % (GIBCO). On ajoute du sérum humain normal à 20 % à l'antisérum de lapin (4 mll -15ml) et on fait incuber pendant I heure dans un bain d'eau agitée à 37 C. On retire le flacon, on ajoute du sérum de foetus de veau à 20 % (4,8 ml/24 ml), et on effectue l'incubation pendant I heure dans un bain d'eau agitée à 37 0 On retire le flacon et on fait incuber encore I heure à la température ambiante tout en mélangeant en tournant doucement toutes les 15 minutes. On centrifuge alors à 15 000 g pendant 50 minutes, et on retire et on garde le surnageant (sérum absorbé). On transforme le sérum absorbé sous la forme immuno- globuline ( Ig) en suivant le procédé donné pour la précipitation par (lH4)2S04 du sérum, décrite ci- dessous. On absorbe alors avec un tissu humain normal (placenta ou foie) la préparation d'Ig de l'antisérum nucléolaire qui a été absorbée avec du sérum humain normal et du sérum de foetus de veau. On ajoute à l'immunoglobuline nucléolaire absorbée un volume égal de "sonicat" (produit traité aux ultrasons) nucléaire placentaire dans le sel physiologique tamponné au phosphate à pH 7,2 (10-15 mg de protéine par ml) (10 ml d'Ig + 10 ml de sonicat nucléaire) et on fait incuber pendant I heure dans un bain d'eau agité à 57 C. On fait alors incuber pendant encore I heure à la température ambiante tout en mélangeant en tournant doucement le flacon toutes les 15 minutes puis en cen- trifugeant à 15 000 g pendant 50 minutes. On recueille le surnageant et on reprécipite l'Ig absorbée avec (.Â14)2S04 de la manière décrite. Cette Ig peut être utilisée comme produit anticorps final, ou on peut la purifier plus avant par chromatographie à la diéthyl- amino6thyl (DEAE) cellulose comme suit: On dialyse l'Ig qui est contenue dans le sel physiologique tamponné au phosphate 0,01 NI à pH 7,2 contre un tampon phosphaté 0,0175 M à pE 6,3 (sans sel -16- physiologique). Après dialyse, on centrifuge à 2500 g pendant 20 minutes. On ajoute le surnageant à la co- lonne de DEAE (20 mg de protéine par g de cellulose, Wharman DE52). On élue l'IgG de la colonne avec le tampon phosphaté 0,0175 M. Après élution, on dialyse la fraction IgG contre le sel physiologique tamponné au phosphate 0,01 M à pH 7,2. On suit le même procédé pour le sérum témoin qui se compose de sérum préimmune que l'on obtient en saignant le lapin (ou autre animal hôte nonhumain) avant que l'immunisation ne commence. On prépare l'immuno-globuline Ig de lapin comme suit: On prépare une solution saturée de (NH4)2S04 (760 g/l) et on ajoute goutte à goutte à l'antisérum, tout en agitant, un volume égal de (NHR4)2S0 saturé froid. Il se forme un précipité blanc et on laisse le précipité s'agréger pendant I heure 1/2 à 2 heures sur un agitateur magnétique à froid. On cen- trifuge l'antisérum précipité à 3000 g pendant 20 mi- nutes. On retire le surna-geant et on remet la boulette en suspension dans le sel physiologique tamponné au phosphate, pH 7,2 (environ la moitié du volume du sérum original). On place la boulette solubilisée dans un sac dedialyse et on dialyse contre 100 volumes de sel phy- siologique tamponné au phosphate pendant la nuit à froid (tout en agitant par un moyen magnétique). On place le bas de dialyse dans le sel physiologique tamponné au phosphate frais (100 x volume) le matin suivant et on continue la dialyse pendant 6 heures. On retire soigneusement l'immunoglobuline du sac de dialyse et on centrifuge à 2500 g pendant 20 minutes. On recueille le surnageant. On utilise dans cette étude le procédé dûcrit ci-dessus (RK Busch et coll. , 1974; Piliers et coll., 1972) pour l'immunofluorescence, comm:e nuit: on dispose -17- microlitres d'antisérum antinucléolaire dilué au e sur des cellules HeLa fixées à l'acétone ou sur des spécimens de tissu fixés.(d'après Hilgers et coll. 1972; RK Busch et coll., 1974). Il peut être nécessaire d'utiliser plus de150 microlitres si le spécimen de tissu recouvre une large partie de la lame. La dilution de l'antisérum (As) dépend du titre de l'anticorps (Ac). On peut utiliser d'autres dilutions jusqu'au point o les dilutions d'As ou d'Ac aboutissent à une teneur trop faible pour donner une réponse positive à des cel- lules positives connues (par exemple HeLa). On fait in- cuber les lames dans une chambre humide pendant 45-50 minutes à 370C. (La chambre humide peut être constituée par une grande boîte de Pétri à laquelle on a ajouté une serviette en papier humide). Après l'incubation, on retire l'antisérum de la lame par lavage en ajoutant doucement du sel physiologique tamponné au phosphate puis on place les lames dans un portelames et on lave dans le sel physiologique tamponné au phosphate pendant 1 heure. On change 3 fois le sel physiologique, au bout de 15 minutes, de 30 minutes et de 45 minutes. On retire les lames du sel physiologique tamponné au phosphate et on les plonge dans de l'eau distillée ou désionisée 10 fois avec des mouvements rapides vers le haut et vers le bas. On sèche les lames avec de l'air froid provenant d'un séchoir ou d'un sèche-cheveux (2-3 minutes), en prenant garde de ne pas trop sécher. On dispose sur les lames et on fait incuber dans la chambre humide pendant 30-35 minutes à la température ambiante 150 microlitres d'antisérum de chèvre anti- lapin marqué à la fluorescéine (Hyland ou Cappel) et on fait incuber dans la-chambre humide pendant 30-35 minutes à la températureambiante. On retire le second anticorps de la lame en lavant doucement avec du sel physiologique tamponné au phosphate. On lave alors les -18- lames dans le sel physiologique tamponné au phosphate * pendant I heure en changeant 5 fois, au bout de 15 mi- nutes, de 30 minutes et de 45 minutes; on peut aussi, après le premier lavage au bout de 15 minutes, les mettre dans le sel physiologique tamponné au phosphate frais et les laisser dans le-réfrigérateur pendant la nuit. Après le lavage final au sel physiologique tam- ponné au phosphate, on plonge une dizaine de fois les lames dans l'eau désionisée ou distillée avec des mouvements rapides vers le haut et vers le bas et on sèche avec de l'air froid provenant d'un séchoir ou d'un sèche-cheveux (2-3 minutes). On ajoute aux cel- lules ou au spécimen de tissu une solution de glycérol et sel physiologique tamponné au phosphate dans un rap- port 1:1 et on couvre avec une lamelle. On peut garder le spécimen pendant plusieurs mois si la lamelle est scellée avec un agent d'étanchéité, comme du vernis à ongles clair et on maintient à froid. On examine alors la lame avec un microscope à fluorescence. On n'ob- serve pas de fluorescence nucléolaire avec l'immuno- globuline pré-immune ou les fractions d'IgG pré- immunes. Les autres techniques immunologiques utilisées sont les mêmes que celles qui ont été utilisées dans des études antérieures (Kendall, 1938; iowry et coll, 1951; Dale & Latner, 1969; Laurell, 1972; Wallace et coll., 1974; Marashi et coll., 1979). Pour l'analyse de la localisation nucléolaire de l'immunofluorescence, on met et on enlève les échantillons en illumination par contraste de phase pendant l'observation par fluo- rescence. Au lieu de la chèvre antilapin marquée à la fluorescéine, on peut utiliser le procédé à l'immuno- peroxydase. Par exemple, on ajoute 150 microlitres de chèvre antilapin marquée à la peroxydase à une dilu- tion au 1:10 ou au 1:20. On peut montrer une activité -19- de peroxydase localisée avec un certain nombre de sys- tèmes de teinture redox pour l'examen en microscopie optique ou électronique. D'autres enzymes peuvent servir de marqueurs pour le procédé indirect et on peut utiliser directement de la peroxydase et d'autres en- zymes en étiquetant l'anticorps primaire. Préparer le milieu d'incubation de Karnofsky comme suit: prélever et peser suffisamment de diamino- benzidine (DAB) (sigma) et mettre en suspension dans le Tris HCl 0,05 M, pH 7,6 pour que la -concentration soit de 0,5 mg/ml. Préparer une solution de peroxyde d'hy- drogène à 0,02 % (dans le tampon Tris-HC1 0,05 E). Mélanger la DAB à 0,5 mg/ml et 1IH202 à 0,02 % en pro- portions égales dans un rapport 1:1 (on prépare cette solution chaque fois qu'on l'utilise et on la garde à froid pendant la préparation). Ajouter 200-300 micro- litres du mélange de DAB et d'H202 à la lame et incu- ber pendant 50 minutes dans une chambre humide à la température ambiante. Après cette incubation, retirer le mélange de DAB et d'H20 en lavant la lame avec le Tris-HlC1 0,05 M pH 7,6 auquel on a ajouté du NlaCl 0,1 M. On fait subir aux lames deux lavages de 10 minutes dans le Tris-HCl 0,05 M pH 7,6 - NaCl 0,1 M. On finit le traitement des lames comme il est indiqué aux étapes 11-14 (sauf qu'on remplace le sel physiologique tamponné au phosphate (STP) par du Tris-HClO). On examine la lame préparée par microscopie optique. On prépare des lames de cellules HeLa pour l'immunofluorescence comme suit: on prépare une ré- serve de cellules HeLa fixées en retirant et en lavant avec du STP à pi 7,2, en cultivant activement les cel- lules du flacon de culture HeLa. On met les cellules en suspension de manière qu'il y ait au moins j5 1,5 x 106 cellules/ml. On place une goutte de suspen- -20- sion de cellules HeLa sur chaque lame lavée (lavée avec du detergent, rincée avec de l'eau distillée ou désionisée, lavée à l'alcool, rincée et séchée avec de l'air chauffé provenant d'un sèche-cheveux) et on l'étend légèrement puis on laisse sécher à la tempéra- ture ambiante (ou à froid pendant la nuit). On fixe les cellules séchées en plaçant les lames à 4 Cdans l'acétone pendant 12 minutes. On numérote les lames avec un crayon marqueur sur verre à pointe de diamant. On utilise les lames comme témoins positifs pour l'im- munofluorescence. Les présentes études confirment que les anti- gènes nucléolaires sont présents dans les cellules tumorales mais ne se trouvent pas dans les tissus non tumoraux. Des études initiales ont montré que, aussi bien dans les cultures cellulaires de tumeurs humaines que dans les spécimens provenant d'échantillons d'au- topsie ou de biopsie, une fluorescence nucléolaire brillante est produite par la technique du double anticorps (immunofluorescence indirecte), et qu'on n'obtient pas de résultat correspondant avec une série de tissus non tumoraux (Davis et coll., 1979). Dans des études plus récentes, on a étudié plus de 60 tu- meurs malignes et également évalué divers témoins tis- sulaires. Il est très intéressant de noter que cette large gamme de tumeurs malignes d'origine ectodermique, endodermique et mésodermique témoigne de la présence d'un ou plusieurs antigènes nucléolaires communs (ta- bleau I). Exemple I Tissus normaux - Dans 17 tissus non tumoraux il n'y a pas de fluorescence nueléolaire après incubation des antisera ou des anticorps avec les diverses prépa- rations cellulaires fixées. Il est particulièrement intéressant de noter que ni la couche malpighieune de -21 - la peau, ni les cellule4de la moelle osseuse, ni les cryptes de Lieberkihn ne présentent une immunofluores- cence positive avec ce procédé. De plus, les divers tissus non tumoraux adjacents aux néoplasmes sont également négatifs; ils comprennent de nombreux tissus de types variés. Un groupe de tumeurs bénignes évaluées, y compris plusieurs types d'adénomes thyroïdiens, est également négatif (tableau II). Exemple 2 Lésions inflammatoires - Pour déterminer si une réponse inflammatoire est en relation avec l'apparition de ces antigènes, on fait des études sur 8 types de tissus inflammatoires. Dans la plupart d'entre eux, il n'y a pas de fluorescence notable dans les nucléoles des cellules étudiées. Cependant, on trouve dans les spécimens de rectocolite hémorragique et d'ulcère gas- trique des coupes qui présentent bien une fluorescence nucléolaire positive. En particulier, 2 des 3 coupes de rectocolite hémorragique sont négatives et. l'une présente une fluorescence nucléolaire positive indiscu- table. Dans l'ulcère gastrique, l'une des deux coupes analysées présente une fluorescence nueléolaire posi- tive. Ces résultats sont particulièrement intéressants lorsqu'on songe à la propension connue de ces lésions à subir une évolution maligne. Il est spécialement in- téressant d'examiner les régions focales positives et négatives de ces lames dans les couches colorées à l'hématoxyline-éosine; elles montrent qu'il y a en fait des régions dans ces lésions qui ne présentent pas seulement une silhouette mitotique mais aussi une accumulation de revêtement épithélial. Cette découverte suggère que ces cellules pourraient constituer des lé- sions prénéoplasiques ou un carcinome in situ. Il est possible que la découverte de ces régions fluorescentes contribue à la décision d'intervenir sur le plan chirur- -22- gical avec des résections locales ou plus générales des lésions affectées. Exemple 3 Artéfacts - Dans l'épithélium gastrique, on note une région de fluorescence, dans chaque cellule, qui est non-nucléolaire et qui semble représenter une locali- sation non spécifique de l'anticorps fluorescent. Dans une crypte de l'intestin grole, une localisation non spécifique de l'anticorps semble apparaître sous la forme d'agrégats; dans la plupart des cas, une pré- filtration des anticorps à travers un filtre Millipore de 0,45 micromètre élimine ces agrégats. Dans un échantillon de tissu mammaire, o la fluorescence nu- cléolaire est négative, de petits points immunofluores- cents non spécifiques sont répartis çà et là sans ca- ractère de localisation spécial par rapport à la mor- phologie cellulaire. Le diamètre de ces petits précipi- tés non spécifiques est de 0,5 à 0,l micromètre par opposition aux diamètres nucléolaires dans les noyaux et nucléoles qui sont de 4 à 6 micromètres. Exemple 4 Fluorescence au cours des phases du cycle cellulaire - On visualise facilement la fluorescence nucléolaire dans les nucléoles à l'interphase. Dans la métaphase, la fluorescence nucléolaire n'est pas vue comme une entité distincte, mais elle est visible entre les chromosomes et dans la zone de jonction entre le "noyau5' et le cytoplasme. Dans la mesure o le nucléole disparaît pour une grande part au cours de la méta- phase et o la synthèse de l'ARNr cesse à la fin de la prophase, il n'est pas surprenant que la fluorescence nucléolaire ne soit pas visible comme entité distincte dans ces cellules (Tan et Lerner, 1972). Cependant, la découverte selon laquelle des restes de produits immunofluorescents persistent dans toute la mitose suggère que ce sont les substructures nucléolaires (plutSt que les produits nucléolaires) qui contiennent les antigènes qui persistent épigénétiquement. Exemple 5 Tumeurs malignes négatives - Dans la série de tumeurs malignes, on trouve des lésions négatives dans une mesure variable dans toutes les lames. En général, elles sont en corrélation avec des parties nécrotiques ou abcédées du néoplasme. Dans un échantillon de tumeur du cerveau, la masse qui ne présentait pas de fluores- cence positive était nécrotique; de nombreux leucocytes étaient présents mais il n'y avait pas de structure dé- finie. L'un des adénocarcinomes, qui envoyait des méta- stases vers le cerveau, ne présentait pas de fluores- cence positive; les raisons n'en étaient pas claires. Dans la mesure o 61 tumeurs sur 65 étudiées avaient une fluorescence nucleolaire positive, 97 7o de la série étudiée étaient positives. Ces études ont maintenant été largement étendues à plus de 300 spécimens de cancers humains y compris une série de cancers du sein, de la prostate, du poumon et de tumeurs hématologiques avec des résultats très semblables. Exemple 6 I;Iarquage - Les procédés immunochimiques directs pour montrer les anticorps comprennent le marquage de l:an- ticorps primaire avec un ou plusieurs des marqueurs suivants: un radioisotope pour l'autoradiographie comme 125I, 131I, 14C ou 3H; une teinture fluorescente comme la fluorescéine ou la tétraméthyl-rhodamine pour la microscopie par fluorescence, une enzyme qui pro- duit un produit fluorescent ou coloré pour la détection par fluorescence ou microscopie optique, ou qui produit un produit opaque aux électrons pour la démonstration par microscopie électronique, ou une molécule opaque aux électrons comme la ferritine pour la visualisation -24- directe en microscopie 61ectronique. Les procédés immunochimiques indirects impli- quent de marquer le second anticorps ou autre protéine fixatrice spécifique du premier anticorps avec une teinture fluorescente, un composé opaque aux-électrons, une enzyme qui produit un produit détectable à l'examen en microscopie optique, par fluorescence ou électronique ou un radioisotope détectable par autoradiographie. Les procédés immunochimiques indirects de vi- sualisation des anticorps comprennent l'application d'anticorps ou de fragments d'anticorps primaires ou secondaires hybrides LF(ab')2] o une partie de la préparation d'anticorps hybride est spécifique des antigènes nucléolaires, (anticorps primaire hybride) ou de l'anticorps primaire (anticorps secondaire hybri- de) et une partie est spécifique d'un marqueur, comme ceux qui sont mentionnés au paragraphe précédent. Les anticorps conjugués et non conjugués marqués peuvent être conditionnés séparément dans le STP ou d'autres agents suspenseurs tamponnés aux fins de distribution comme nécessaires diagnostiques. Les agents suspenseurs appropriés comprennent la glycérine, l'héparine ou le saccharose. Les tampons appropriés comprennent les tampons au barbital, les tampons à la morpholine, l'acide MOPS-3-(N-morpholino)propanesulfo- nique, l'acide hepes-I-2-hydroxyéthylpipérazine-NI-2- êthanesulfonique, le Tris carbonate, etc. - REVEDIICATION1S - 1 - Procédé de détection immunologique du cancer dans les coupes, frottis et préparations cytolo- giques exfoliatives de tissus humains employant des anticorps obtenus contre les nucléoles de cellules hu- maines malignes ou des extraits de noyaux ou de nuclé- oles de telles cellules, selon lequel on met en contact des spécimens avec lesdits anticorps, et on démontre la localisation desdits anticorps dans les nucléoles de cellules malignes mais non de cellules normales. 2 - Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les anticorps sont obtenus contre des nucléoles isolés à partir d'un élément de la-famille de cellules humaines malignes constituée par les cela lules HeLa, les carcinomes, les sarcomes et les néo- plasmes hématologiques. - 3 - Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les anticorps sont produits contre des nucléoles isolés à partir d'un élément du groupe cons- titué par les cellules HeLa ou les cellules de carcinome de la prostate humaine. 4 - Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les anticorps sont produits contre des extraits de noyaux ou de nucléoles de cellules humaines malignes de la famille constituée par les cellules HeLa, les carcinomes, les sarcomes et les néoplasmes hématologiques. - Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les anticorps sont produits contre des extraits de noyaux ou de nucléoles d'un élément du groupe constitué par les cellules HeLa ou les cellules de carcinome de la prostate chez l'homme. 6 - Procédé selon la revendication 1s caracté- risé en ce que les anticorps sont produits contre des extraits de noyaux ou de nucléoles de cellules humaines malignes obtenues par extraction avec du Tris HCl 0,01 M, pH 7-9. 7 - Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les anticorps sont produits contre des extraits de noyaux ou de nucléoles du groupe constitué par les cellules HeLa ou le carcinome de la prostate chez l'homme obtenus par extraction avec du Tris-HC1 0,01 M, pH 7-9. 8 - Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la localisation de l'anticorps est dé- montrée par l'un des procédés immunochimiques directs ou indirects. 9 - Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la détection immunologique du cancer se fait par des anticorps selon la revendication 1 et comporte le marquage des anticorps primaires avec un ou plusieurs des marqueurs suivants, un radioisotope détectable par autoradiographie, une teinture fluorescente détectable à la microscopie par fluorescence, une enzyme qui produit un produit fluorescent ou co- loré détectable par fluorescence ou par microscopie optique, une enzyme qui produit un produit opaque aux électrons détectable par microscopie électronique, et une molécule opaque aux électrons détectable par vi- sualisation en microscopie électronique directe. - Procédé selon la revendication 9, caracté- risé en ce que la radioisotope est choisi dans le groupe constitué par 125I 131I, 140 et 3H. 11 - Procédé selon la revendication 9, caracté- risé en ce que la teinture fluorescente est choisie dans le groupe constitué par la fluorescéine et la tétra- méthylrhodamine. -,7 - 12 - Procédé selon la revendication 9, caracté- risé en ce que l'enzyme qui produit un produit fluores- cent ou coloré détectable par fluorescence et par mi- croscopie optique est la peroxydase, la P-galactosidase, une phosphatase alcaline ou le cytochrome C. 13 - Procédé selon la revendication 9, caracté- risé en ce que la molécule opaque aux enzymes détec- table par visualisation en microscopie électronique directe est la ferritine, l'hémocyanine, des particules virales ou des sphères de latex. 14 - Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la détection immunologique du cancer se fait par démonstration immunochimique indirecte des anticorps incluant l'application d'au moins un second anticorps marqué ou une autre protéine fixatrice spé- cifique des anticorps primaires ou de leurs modifica- tions. - Procédé selon la revendication 14, ca- ractérisé en ce que le marqueur est choisi dans le groupe constitué par une teinture fluorescente, un composé opaque aux électrons et une enzyme. qui produit un produit détectable à l'examen en microscopie optique, à fluorescence ou électronique, et un radioisotope dé- tectable par autoradiographie. 16 - Procédé immunochimique indirect pour la visualisation des anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'application d'au moins un anticorps primaire ou secondaire hybride ou fragment d'anticorps [F(ab')2], o une partie de la préparation d'anticorps hybride est spécifique des antigènes nucléolaires (anticorps primaire hybride) ou de l'anticorps primaire (second anticorps hybride) et est en partie spécifique d'un marqueur, pour in- clure un composé opaque aux électrons aux fins de dé- monstration en microscopie électronique, une enzyme - a _. s.. _.*-1 -28 - qui donne des produits détectables par microscopie op- tique, & fluorescence ou électronique, ou un composé marqué au radioisotope aux fins d'autoradiographie. 17 - Procédé de détection immunologique du cancer dans les coupes, frottis et préparations ex- foliatives de tissus humains employant des anticorps modifiés ou fragmentés obtenus contre des nucléoles de cellules humaines malignes ou des extraits de no- yaux ou de nucléoles de telles cellules, selon lequel on met en contact les spécimens avec lesdits anti- corps modifiés ou fragmentés, et on démontre la locali- sation des anticorps modifiés ou fragments d'anticorps par microscopie optique, microscopie & fluorescence, microscopie électronique ou autoradiographie par au moins un moyen immunochimique direct ou indirect, la localisation s'effectuant dans les nucléoles des cel- lules humaines malignes mais non dans les nucléoles des cellules normales. 18 - A titre de moyen pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 17, les antigènes associés aux cellules du cancer hunainayant une espèce prin- cipale et une secondaire, l'espèce principale ayant les carac- téristiques suivantes, un pI après focalisation isoélectrique d'environ 6, 0 à 6,7'?, et un poids moléculaire d'environ 50 000 à environ 000 dalton, une solubilité dans le Tris HC1 0,01 M, pH 8 et une localisation principale dans les nucléoles. 19 - Espèce d'antigène principal selon la revendication 18 sous forme pratiquement purifiée. - Procédé de préparation d'anticorps ayant une spécificité contre les antigènes que l'on trouve dans les nucléoles et les noyaux de cellules du cancer huuain, caractérisé en ce qu'on immunise des animaux hôtes non humains avec les antigènes selon la revendi- -29- cation 18, et on r6colte les anticorps de l'animal -immunisé. 21 Procédé de préparation d'anticorps ayant une spécificité contre les antigènes que l'on trouve dans les nucléoles de cellules de cancer humain, ca- ractérisé en ce qu'on immunise des animaux hôtes non humains avec les antigènes selon la revendication 18, et on récolte les anticorps de l'animal immunisé. 22 - Procédé de préparation et d'isolement d'antigènes nucléolaires selon l'une des rerendic ions 18 et 19, caractérisé en ce qu'on extrait les antigènes des noyaux ou des nucléoles de cellules de cancer humain avec du Tris-HCl 0,01M, pH 7-9. 23. Préparation nucléaire comprenant des extraits au Tris-HCl de noyaux ou de nucléoles provenant de cellules de cancer humain, obtenue par la mise en oeuvre du procédé de la revendication 22. 24. Procédé de purification d'un antigène niucléo- laire, selon l'une des revendications 18 et 19, caractérisé en ce qu'il comprend sa purification séquentielle par préci- pitation au sulfate d'ammonium, chromatographie sur colonne de DEAE, chromatographie d'exclusion sur gel Sephadex, d'échange de cations et sur gel de phosphate de calciumn et focalisation isoélectrique préparative. 25. 25. Procédé de purification des anticorps récoltés chez un animal hôte non humain induits par immunisation avec un antigène nucléolaire selon l'une des revendications 18 et 19. 26. Nécessaire diagnostique pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 17, comprenant des anticorps caractérisés par leur spécificité contre les antigènes nucléolaires que l'on trouve dans les cellules du cancer humain ayant un marqueur détectable par microscopie optique, à fluorescence ou électronique, par un procédé de dosage indirect ou par autoradiographie, dans un agent suspenseur ou une solution tamponné(e). -30- 27 - Nécessaire diagnostique pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 17, contenant des anticorps primaires non marqués caractérisés par leur spécificité contre les antigènes nucléolaires que l'on trouve dans les cellules malignes du cancer humain dans un agent suspenseur ou une solution tam- ponné(e), et des réactifs marqués ou non marqués appro- priés pour la détection des anticorps primaires dans - les cellules malignes humaines fixées par un procédé choisi dans le groupe constitué par la microscopie optique, la microscopie à fluorescence, la microscopie électronique et l'auto-radiographie. 28 - Antigènes associés aux cellules du cancer humain ayant une espèce principale et une secondaire, l'espèce principale ayant les caractéristiques sui- vantes un pI après focalisation isoélectrique d'environ 6,0 à 6,7, et un poids moléculaire d'environ 50 000 à environ 60 000 dalton, une solubilité dans le Tris-HCl 0,01 M pH 8, et une localisation principale dans les nucléoles, préparés par le procédé de la revendication 22. 29 - Espèce principale d'antigène selon la re- revendication 18 sous forme substantiellement purifiée, préparée par le procédé de la revendication 24.