Brevet FR2477176A1 — publié le 19810904

7e La présente invention révèle et décrit des réactifs et des procédés intéressants pour la mise en oeuvre de dosages immuno- logiques d'enzymes. En particulier, l'invention décrit un procédé pour la stabilisation du produit de réaction d'une peroxydase et de son substrat. La stabilisation de ce. produit permet la détermi- nation précise d'immunoréactifs tels qu'antigènes, anticorps, protéines de fixation et haptènes. Dans le dosage immunologique classique d'enzymes, on a introduit dans le milieu de réaction une enzyme telle qu'une peroxydase sous forme d'enzyme fixée ou liée à un immunoréactif (produit de conjugaison de l'enzyme). L'immunoréactif marqué par l'enzyme participe à la réaction de dosage comme s'il était à l'état non marqué; cependant, on peut déceler sa présence en ajoutant un substrat qui réagit avec l'enzyme et en observant le produit de réaction résultant. Pour mesurer avec précision le pro- duit de réaction, il était nécessaire d'arrêter la réaction enzyme- substrat au point optimal en introduisant dans le système un dana- turant de l'enzyme ou inhibiteur irréversible tel que HC1, H2S04' NaN3 ou NaF. Ces dénaturants agissent en détruisant l'enzyme et ne sont pas satisfaisants simplement à cause de leur risque poten- tiel dans les circuits commerciaux. Ce danger a été largement éliminé par la mise au point d'un procédé pour la stabilisation du produit de réaction du substrat et de la peroxydase qui consiste à introduire dans le mélange de réaction une quantité efficace comme stabilisant d'un selréducteur soluble choisi parmi les métabisulfites (S2052) et les thiosulfates (S2032). L'invention sera mieux comprise à la lecture de la des- cription qui suit en référence aux dessins annexé, dans lesquels - la figure 1 représente la stabilisation du produit de réaction de la peroxydase de raifort (HPO) et de la o-phénylène- diamine (OPD) par le métabisulfite de sodium et par le thiosulfate de sodium, mise en évidence par la densité optique uniforme pendant une certaine durée; et - la figure 2 représente l'inaptitude d'un agent réduc- teur faible, l'afsénite de sodium, pour stabiliser le produit de réaction de la peroxydase de raifort (HPO) et de la o-phénylène- diamine (OPD), comme le montre l'augmentation de la densité optique au cours du temps. Dans la figure 1, les points marqués --e correspondent au métabisulfite de sodium, les points nmarqués A - correspondent au thiosulfate de sodium; et dans la figure 2, les points marqués D-i_ correspondent au tampon citrate-phosphate, les points marqués.... correspondent à l'arsénite de sodium et les points marqués X X correspondent au métabisulfite de sodium. La peroxydase, en particulier la peroxydase de raifort, est largement utilisée dans les dosages immunologiques d'enzymes pour faciliter la détection de très faibles quantités d'immunoréactifs. Sa présence dans le mélange de réaction peut être décelée et quan- tifiée selon le schéma réactionnel suivant: Réaction enzyme-substrat (1) Peroxydase + H20 2- complexe d'enzyme (2) Complexe d'enzyme + ophénylènedlamine [AH2] [A] produit décelable + enzyme + H20 Schéma de stabilisation (3) Complexe d'enzyme + BH2 (agent réducteur) -, B + enzyme + H20 (4) H20 + BH2) 20 + B 2 2 2 Le composé A, produit décelable, est un composé jaunâtre qui peut être dosé par spectrophotométrie. La quantité du composé A produite dans l'étape (2) est directement liée à la quantité de peroxydase présente. Lorsque la peroxydase est conjuguée avec un immunoréactif, la quantité de ce composant peut être déterminée dans n'importe quelle phase du dosage par détection de l'intensité de la réaction enzyme-substrat. Pour déterminer avec précision la quantité du produit de réaction décelable produit par la séquence réactionnelle selon l'invention, on ajoute au milieu de réaction un agent réducteur tel qu'n métabisulfite (S205 2-) ou un thiosulfate (S2032-) après les 2 5 2 3 étapes (1) et (2) pour remplacer le substrat par un donneur d'élec- trons. Le potentiel de réduction de l'agent réducteur doit être tel qu'il maintienne la concentration du produit de réaction à une 2477 1 76 3. valeur constante pendant la durée de la détermination, Ce schéma de réaction est indiqué dans les étapes (1) et (2) et représenteé dans les figures 1 et 2. Les exemples ci-après illustrent en particulier les avantages de l'invention; cependant, il est entendu que l'intérêt de l'invention ntest pas limité à l'enzyme et au substrat particu- liers utilisés. Par exemple, on peut envisager que d'autres peroxy- dases telles que la lactoperoxydase, la verdoperoxydase et la cytochromeperoxydase soient aussi appropriées que la peroxydase de raifort et que d'autres substances telles que mésidine, pyro- gallol, benzidine, p-phénylènediamine, 2,7-diaminofluorène, p-toluidine et diméthylaniline soient aussi appropriées que la o-phénylènediamine. EXEMPLE 1 On ajoute 10 ng de peroxydase de raifort (HPO) à 0,3 ml d'une solution de tampon citrate-phosphate O,lM à pH 0,5 contenant 0,02 % de H202 et 3 mg/ml de o-phénylênediamine (OPD). On laisse reposer le mélange de réaction pendant 30 min à la température ambiante. On ajoute ensuite 1 ml de ce mélange à 9 ml de Na2S205 0,1lM. Le maximum d'absorption de ce mélange de réaction est à 450 nm. EXEMPLE 2 Cette fois-ci on ajoute 30 ng de peroxydase de raifort à 6 ml de la solution de peroxydase, OPD et tampon citrate-phosphate préparée à l'exemple 1. On laisse à nouveau reposer le mélange de réaction pendant 30 min à température ambiante. On ajoute ensuite 1 ml du mélange de réaction à des tubes contenant 9 ml de Na2S205 O,lM et 9 ml du même sel 0, 5 M et 9 ml de tampon citrate-phosphate et on suit l'absorption des mélangsde réaction à 450 nm pendant 5 ho Les résultats montrent que les solutions de métabisulfite stabilisent le produit de réaction décelable pendant au moins 5 h. L'absorption du complexe activé dans le tampon au citrate augmente dans un rapport 2 en une heure. EXEMPLE 3 On ajoute 100 ng de peroxydase de raifort a trois tubes contenant chacun 1 ml de la solution de peroxydase, OPD et tampon citrate-phosphate preparée à l'exemple 1. On laisse reposer le mélange de réaction à la température ambiante pendant 30 min. Pour arrêter les réactions, on ajoute à chacun des tubes de réaction 5 ml de solutions 0,01M, 0,05M et 0, 1M de Na2S205 respect ivement. On suit l'absorption des mélanges de réaction à 450 nm pendant 24 h. Les résultats montrent que les solutions de Na2S205 OjO5M et O,iM sta- bilisent la couleur du produit pendant cette durée, mais que la solution 0,01M n'est pas un agent réducteur suffisamment fort. EXEMPLE 4 On ajoute 4 ng de HPO à la solution de H202, OPD et t a m pon citrate-phosphate. On laisse reposer le mélange de réac- tion à la temperature ambiante pendant 5 min. Au moment de l'arrêt, on ajoute 0,3 ml du mélange de réaction à quatre tubes contenant 1 ml de Na3AsO3 O,1M, de Na2S205 O,lM, de KI 0,1M et de Na2S203 0,1M. On suit le spectre d'absorption des mélanges à 450 nm pendant 22 h. Les résultats indiquent que Na2S203 et Na2S205 stabi- lisent le complexe activé. L'iodure de potassium n'est pas appro- prié parce que l'iode produit gêne dans la détermination à 450 nm. Par contre, Na3AsO3 n'est évidemment pas un agent réducteur assez fort puisqu'il laisse augmenter l'intensité de couleur au cours du temps. EXEMPLE 5 On ajoute à des billes de polystyrène préenduites par l'antigène à noyau d'hépatite B (HBcAg) dans une plaque à réaction, 0,2 ml de dilutions en série d'un échantillon positif anti-HBc. On laisse réagir les immunoréactifs pendant 2 h à 45 C. On retire les billes des godets de réaction et on les lave deux fois avec 5 ml d'eau. On ajoute aux billes lavées 0,2 ml de produit de conjugaison anti-HBc:HRP. On laisse reposer les billes et le produit de conju- gaison marqué pendant 1 h à 45 C. On retire à nouveau les billes des godets de réaction, on lave quatre fois avec 5 ml d'eau et on trans- vase dans des tubes à réaction contenant 0,3 ml de la solution de H202, OPD et tampon citrate-phosphate. Après 30 min à la tem- pérature ambiante, on ajoute 1 ml de Na2S205 O,IM pour arrêter la réaction et on détermine le spectre d'absorption à 450 nm avec un analyseur de longueur d'onde double. La courbe de titrage résultante montre que Na2S205 est approprié, pour l'utilisation dans un milieu de dosage immunologique. 2477 1 7 6 R E V E N D 1 CATI ONS 1. Procédé pour la stabilisation du produit de réaction d'un substrat et du peroxydase, caractérisé en ce que l'on introduit dans le mélange de réaction une quantité efficace comme stabilisant d'un sel réducteur soluble choisi parmi les métabisulfites (S205 2) et 2-2 les thiosulfates (S203), 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite enzyme est la peroxydase de raifort. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que o ledit sel réducteur est Na2S205. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit sel réducteur est Na2S203. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit substrat est la o-phénylènediamine. 6. Procédé pour la stabilisation du produit de réaction de la ophénylènediamine et de la peroxydase de raifort, caractérisé en ce que l'on introduit dans le mélange de réaction une quantité efficace comme stabilisant d'un sel réducteur soluble choisi parmi les métabisulfites (S205 2) et les thiosulfates (S2032). 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit sel réducteur est Na2S205. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit sel réducteur est Na2S203.