Brevet FR2476321A1 — publié le 19810821

L'invention concerne un procédé de préparation d'une matière première et son procédé d'utilisation pour augmenter le pourcentage de la descendance des mammifères de l'un ou l'autre sexe, et plus particulièrement un procédé immunologique pour augmenter le pourcentage de la descendance des mammifères de l'un ou l'autre sexe. La technique antérieure décrit des procédés mécaniques pour augmenter le pourcentage de la descendance des mammifères de l'un ou l'autre sexe en fournissant des liquides séminaux contenant un surplus de sper matozoides déterminant le sexe mâle ou de spermatozoides déterminant le sexe femelle, grâce à la différence de densité entre les spermatozoides déterminant le sexe mâle et les spermatozoides déterminant le sexe femelle, voir à ce sujet la demande de brevet US nO 814 906 et un article de E. Schilling 1,Séparation du sperme de taureaux par sédImentation et centrifugation, et le sexe de leur descendance", Zeitschrift für Saugertierkunde, 31, nO 4, pp. 314-323 (1960). Mais ces procédés sont connus pour avoir une possibilité de survie réduite du sperme et une viabilité réduite du sperme survivant. L'hypothèse selon laquelle un moyen immunologique pourrait autre utilisé pour augmenter le pourcentage de la descendance des mammifères de l'un ou l'autre sexe est discutée dans un article de Bennett et 3oyse "Sex Ratio In Progeny of Mice Inseminated with Sperm Treated with H-Y Antiserum", Nature, 246, 30 Nov. 1973, pp. 308309. Un procédé immunologique pour augmenter le pourcentage de la descendance des mammifères de l'un ou l'autre sexe est décrit dans le brevet US 3 687 806 de Gustaaf J. van den Boevenkamp, du 20 août 1972. Ce procédé exige comme matériau de départ une fraction de sperme contenant un surplus de spermatozoides déterminant le sexe mâle ou de spermatozoides déterminant le sexe femelle, isolée selon les techniques décrites dans la demande de brevet US 814 906 ou dans l'article de Schilling, précités, ou par des procédés mécaniques étroitement apparentés. C'est ainsi que le procédé décrit dans le brevet US 3 687 806 précité est nécessairement associé, à un degré plus ou moins grand, aux inconvénients de ces procédés mécaniques, c'est-à-dire survie réduite du sperme et viabilité réduite du sperme survivant. L'électrophorèse et d'autres procédés sont également connus dans la technique pour la séparation du sperme et ont tous leurs défauts respectifs. En conséquence, l'invention a pour but de fournir un procédé immunologique pour augmenter le pourcentage de la descendance des mammifères de l'un ou l'autre sexe, sans soumettre le liquide séminal nécessaire à des techniques de séparation mécaniques basées sur la tres faible différence de densité entre les spermatozoides déterminant le sexe mâle et les spermatozoides déterminant le sexe femelle. De façon générale, l'invention a pour but de fournir un procédé satisfaisant pour préséleetionner le sexe de la descendance d'un mammifère, lequel procédé utilise un anticorps monospécifique, mâle-spécifique, préparé selon le procédé décrit ici. L'invention a encore pour but de fournir un produit utilisable dans l'insémination artificielle des mammifères femelles, préparé à partir d'anticorps monospécifiques, mâle-spécifiques ou femelle-spécifiques, contenant une prépondérance très substantielle de sper matozoides déterminant le sexe mâle ou de spermatozoldes déterminant le sexe femelle. L'invention a encore pour but de préparer un anticorps spécifique de l'antigène Y (appelé parfois ciaprès "anticorps mâle-spécifique" ou "anticorps anti-Y") et de l'associer à un matériau immunoabsorbant. Conformément à un autre but de l'invention, on utilise un matériau immunoabsorbant en phase solide associé à un anticorps mâle-spécifique, pour fixer sélectivement et uniquement les spermatozoides déterminant i sexe mâle (appelés parfois ci-après "sperme Y") contenus dans une suspension de sperme, de telle sorte que les spermatozoides déterminant le sexe femelle (appelés parfois ci-après "sperme X") puissent être directement récupérés. Conformément à un autre aspect de l'invention, on fournit un moyen pour libérer le sperme Y associé à l'immunoabsorbant, afin de pouvoir recueillir le sperme Y. Mais un des principaux buts de l'invention consiste à fournir un anticorps mâle-spécifique associé à un immunoabsorbant, capable de se lier sélectivement et uniquement à l'antigène Y et à aucun autre antigène, exprimé sur les membranes superficielles du sperme de mammifère. Conformément à un autre aspect de l'invention, on fournit un procédé et un appareil pour déterminer l'efficacité d'un lot donné d'un matériau immunoabsorbant associé à un anticorps mâle-spécifique avant de l'utiliser pour le fractionnement du sperme d'un mammifère. Un autre but de l'invention concerne l'isolement d'un produit désigné comme un anticorps monospécifique, mâle-spécifique. D'autres buts- et avantages de l'invention appa raieront à la lecture de la description ci-après. En conséquence, l'invention comprend plusieurs opérations dont l'une ou plusieurs d'entre elles sont en rapport avec chacune des autres, des combinaisons et arrangements d'éléments adaptés à la conduite de ces opérations, et le matériau qui possède les caractéristiques et propriétés qui font l'objet de la discussion ci-après. La description qui va suivre se réfère aux dessins annexés qui représentent respectivement la Fig. 1, un schéma illustrant le procédé de préparation de l'anticorps monospécifique, mâle-spécifique, selon l'invention la Fig. 2, un schéma illustrant de façon plus générale le procédé d'obtention de la matière première utilisable dans le procédé pour la sélection de la descendance des mammifères. Tel que représenté plus particulièrement sur la Fig. 2, le procédé selon l'invention consiste à:préparer un anticorps mâle-spécifique (appelé parfois un "anticorps spécifique de l'antigène Y" ou un "anticorps anti-Y") associer l'anticorps mâle-spécifique à un matériau immunoabsorbant en phase solide ; ajouter des spermatozoides non-séparés à l'anticorps mâle-spécifique associé à un matériau immunoabsorbant en phase solide et éluer directement les spermatozoides déterminant le sexe femelle traiter le matériau immunoabsorbant en phase solide contenant le sperme associé déterminant le sexe mâle, pour inhiber la liaison des spermatozoides déterminant le sexe mâle; et éluer les spermatozoldes déterminant le sexe mâle du matériau immunoabsorbant en phase solide. L'asso- ciation de l'anticorps mâle-spécifique après la préparation à un matériau immunoabsorbant et l'utilisation de cette préparation pour une insémination artificielle sont décrites dans la demande de brevet US nO 841 207, du Il décembre 1977 du Demandeur, publiée sous le numéro 4 191 749. L'expérience relative au procédé selon l'invention amène à supposer que l'utilisation de ce procédé permet de fournir des liquides séminaux Lc'est-à-dire des liquides utilisables dans une insémination artificielle, contenant une prépondérance substantielle de spermatozoi- des déterminant le sexe mâle ou de spermatozovies déterminant le sexe femelle (sperme Y ou sperme x)~7, qui comprennent 10 % ou moins de spermatozoldes indésirés, et que ces liquides séminaux sont fertilisants dans une insémination artificielle et sont fortement présélectifs pour le sexe désiré pour la descendance.L'expérience montre également qu'un anticorps mâle-spécifique préparé dans une espèce mammifère par le procédé selon l'invention peut entre utilisé pour séparer- des spermatozoides déterminant le sexe d'autres espèces mammifères, c'est à dire que l'anticorps mâle-spécifique est en quelque sorte immunologiquement capable d'une réaction croisée entre espèces. En se reportant maintenant à la Fig. 2, on voit un exemple généralisé illustrant la pratique du procédé global selon l'invention, alors que la Fig. 1 fournit plus de détails dtune partie du procédé global de la Big. 2. Il est cependant évident que l'invention n'est pas limitée aux procédés, à l'immunoabsorbant et aux liquides séminaux particuliers décrits en détail ci-après, car de nombreuses modifications des procédés spécifiques décrits ci-dessous et des constituants apparaîtront possibles aux spécialistes en immunologie. La technique d'isolement d'un anticorps mâlespécifique choisie pour appliquer le mode opératoire généralisé du procédé selon l'invention est la technique d'immunisation d'un animal avec l'antigène Y. Comme on le sait dans la technique, un anticorps mâle-spécifique peut être isolé des sérums sanguins dans lesquels il est présent, par plusieurs autres techniques bien connues en immunologie. Cependant, ces techniques ne sont pas monospécifiques. C'est à dire que les procédés de la technique antérieure permettent de préparer des anticorps mâle-spécifiques qui contiennent ou comprennent de nombreux, ou tous les anticorps indésirés, c'est à dire d'autres anticorps qui inter fèrent et se combinent avec d'autres antigènes sur les surfaces des cellules mâles et femelles. C'est ainsi que la technique antérieure ne permet pas d'obtenir une monospécificité vis-à-vis du sexe mâle. La technique suivante dtimmunisation d'un animal, basée sur le fait qu'un antigène Y capable de provoquer un anticorps mâle-spécifique dans le sang de récepteurs femelles est trouvé sur les cellules épidermiques et d'autres cellules et sur les têtes du sperme de petits rongeurs et d'autres animaux mâles, peut être utilisée pour fournir l'anticorps mâle-spécifique nécessaire pour appliquer le procédé d'association avec un immunoabsorbant. Des lapins femelles sont hyperimmunisés par injection intra-péritonéale de 500 millions de cellules épidermiques dissociées par la trypsine, provenant de lapins mâles, selon une série de 2 injections par semaine pendant 6 semaines. Six jours après la dernière injection,- les lapins femelles sont exsanguinés. On laisse les échantillons de sang ainsi obtenus coaguler, puis on isole les antisérums, on inactive le complément par chauffage à 560C pendant 30 minutes, et on les rassemble.Tous les autres anticorps sont alors séparés de l'antisérum brut réuni, par une série de 15 absorptions répétées contre un culot de cellules de rate de lapins femelles, lavé, provenant de plusieurs individus. l'antisérum réuni, absorbé, est fina lement fractionné par filtration sur gel d'agarose selon le procédé de Rannon (Journal of Immunological Methods, 1975, 8, 23).La fraction représentant la gamma globuline G est isolée et conservée à -20 C jusqu'à son utilisation dans le procédé selon l'invention, tel que représenté sur la Fig. 2, où l'antisérum monospécifique mâle-spécifique, ou anticorps mâle-spécifique, tel qu'il est souvent appelé, est associé à un matériau immunoabsorbant en phase solide, selon le stade 18 de la Fig. 2. Après avoir décrit de façon résumée la préparation de l'antisérum, celle-ci sera maintenant exposée en détail. Spécifiquement, on voit que le procédé de préparation de l'anticorps monospécifique, mâle-spécifique, en tant que produit, requiert d'abord la préparation de cellules mâles et la détermination de leur nombre et de leur viabilité. Après avoir compté les cellules, on les introduit comme antigène dans le corps d'une femelle de l'espèce, telle qu'un lapin femelle. Bien qu'on ait utilisé des lapins dans les travaux de laboratoire, tout rongeur peut également être employé, surtout pour une raison d'économie. Mais, il est évident que toute femelle mammifère peut être utilisée. En fait il n'est pas nécessaire que le genre de mammifère qui sera artificiellement inséminé en utilisant l'immunoabsorbant associé, soit le même que celui dans lequel on introduit l'antigène. On obtient des cellules mâles à partir de lapins tels que des mâles adultes de Nouvelle Zélande, en retirant la peau, telle que la peau du thorax facilement détachable, d'animaux fraîchement tués. On place la peau dans une solution de sel équilibrée de pH pratiquement neutre, telle qu'une solution de sel équilibrée de Han, un produit commercial courant, et qui a un pH voisin de 7,4. On utilise cette solution représentative dans plusieurs stades du procédé et pour plus de facilité on la désignera ultérieurement par les initiales MESS. A la HBSS, on ajoute un agent de dissociation des cellules et on laisse incuber les segments de peau jusqu'ce que les cellules soient dissociées en cellules individuelles, soit environ pendant 1 heure, en chauffant modérément. Tout agent de-dissociation compatible peut être utilisé, bien qu'on ait recours ordinairement à une addition de 0,1 r de trypsine. Un autre agent de dissociation utilisable ici est la désoxyribonucléase, mais en raison de son coût élevé(environ 20 à 30 fois plus chère que la trypsine) la désoxyribonucléase est généralement utilisée pour la rupture des cellules résiduelles après un prétraitement à la trypsine et un tamisage ou une filtration sur une fine toile de Nylon à plusieurs couches et une centrifugation.Ce traitement secondaire avec la désoxyribonucléase dissocie tout aggrégat cellulaire restant et les petits agglomérats. Evidemment, cette technique secondaire est une technique facultative pour obtenir de meilleurs rendements. On peut également utiliser deux agents de dissociation des cellules, différents, pour l'opération initiale de rupture, si on le désire. C'est ainsi que la pronase s'avère également être un réactif approprié pour la dissociation des cellules. Après incubation et filtration, on centrifuge les cellules épidermiques ou on les sépare par un autre moyen. Bien qu'on puisse effectuer une séparation par sédimentation à 1 g, la séparation par centrifugation est réalisée de préférence entre 10 et 5 000 g et avantageusement vers 100 g. Après un lavage et une remise en suspension dans HBSS, on introduit une partie aliquote dans un compteur de cellules, tel qu'un hémocytomètre pour déterminer la concentration en cellules de l'échantillon. La concentration en cellules appropriées pour l'immunisation est obtenue par dilution, par addition supplémentaire de solution de sel, afin d'atteindre une concentration d'environ 200 millions de cellules épidermiques par ml. Ce premier produit est appelé la suspension de cellules épidermiques. Pour déterminer la viabilité des cellules, on dilue une partie aliquote de la suspension de cellules à une concentration d'environ 0,2 million de cellules par ml. On ajoute un indicateur coloré, tel que le bleu trypan, commercialisé par Grand Island Biological Co., à une petite quantité de la suspension diluée et on laisse un peu au repos. On compte alors le nombre de cellules dans ce petit échantillon au moyen de l'hémocytomètre. Le colorant ne traverse pas les parois cellulaires des cellules viables (vivantes) et celles-ci restent donc incolores et ne sont pas comptées. La séparation des cellules viables des cellules mortes de la suspension n'est pas effectuée. Comme on peut le voir au stade(2) de la Fig.1, ltopération suivante consiste à introduire la suspension de cellules en tant qu'antigène dans le corps de la femelle. On injecte les cellules épidermiques de lapin mâle dissociées à de jeunes lapins adultes, femelles, ici de la souche Nouvelle Zélande, plusieurs fois par semaine, pendant 4 à 8 semaines, selon le mode opératoire programmé standard, afin d'obtenir l'hyperimmunisation pour constituer les titres d'anticorps. La quantité totale de cellules mâles injectées est d'environ 100 millions (1,0 ml) par kg de poids corporel. Au troisième stade représenté sur la Fig. 1, on utilise les lapins femelles pour isoler l'antisérum brut. A cet effet, on immunise d'abord les animaux selon le stade (2) ci-dessus puis on les tue lorsque le taux d'immunoglobuline G (IgG) dans le sang a atteint un pic, soit environ 5 à 15 jours après la dernière injection de cellules épidermiques mâles immunisantes, selon les espèces utilisées. Naturellement, il est bien évident que des conditions aseptiques sont appliquées pour minimiser la contamination de l'antisérum. L'exsanguination des lapins est la façon de tuer les animaux en recueillant le sang dans une série de récipients appropriés tels que des seringues de 50 ml dans lesquelles on admet une quantité mineure d'air pour faciliter la formation d'un caillot dans chaque seringue.On incube-les seringues contenant le sang à la température corporelle de l'espèce, soit 370C pour les lapins, pendant plusieurs heures. jusqu'à formation d'un caillot qui tombe dans le fond du récipient et est recouvert du liquide surnageant. Ce liquide surna geant qui est l'antisérum, est centrifugé ou traité d'une autre façon pour éliminer toute cellule sanguine résiduelle. On rassemble les différents échantillons d'antisérum surnageant clarifié et on inactive le complément, c'est à dire qu'on lldécomplémentefl I'antiserum, en chauffant dans un bain à circulation d'eau ou dans un autre appareil approprié. Cette technique est un procédé immunologique classique. L'antisérum brut décomplémenté peut alors être utilisé immédiatement ou conservé par réfrigération avant l'absorption contre des cellules de rate de lapin femelle le jour suivant, lesquelles cellules de rate sont préparées selon le procédé décrit ci-après. L'opération d'inactivation du complément n'est pas ph.ysiquement séparée, mais on incube seulement biologiquement le complément dans 1' antisérum. le culot de cellules de rate de lapin femelle est préparé selon le stade (4), en excisant les rates de lapins femelles morts, les découpant en petits morceaux et les dispersant dans une solution de sel neutre dans un malaxeur à une vitesse relativement faible pour obtenir une suspension de cellules simples. Pour faciliter les opérations, on a trouvé commode de mélanger 4 à 6 rates de lapins avec le HBSS dans un rapport poids/volume de 1:5 pour obtenir des résultats satisfaisants. On filtre la suspension de cellules pour en séparer les débris et on traite par un agent facilitant la sédimentation, dont le plus usuel est une solution de sulfate de dextrane à 5 ffi qui rassemble les cellules rouges et en provoque l'agglutination grâce à quoi les cellules rouges sédimentent.On utilise le sulfate de dextrane dans un rapport sulfate de dextrane/suspension de cellules de 1:9 à 1:10 selon les recommandations du fabricant. On centrifuge alors le liquide surnageant riche en cellules sanguines blanches (leucocytes) et on obtient un culot de leucocytes de rate. Eventuellement, avant cette opération de centrifugation, on peut avoir recours à une seconde sédimentation pour obtenir des rendements plus importants, si on le désire. On conauit la centrifugation pendant un temps approprié de 10 minutes par exemple à 100 g, une ou deux fois. Le liquide surnageant au-desus du culot de cel'ules ne doit pas être soutiré avant cue l'antisérum du culot de cellules ne soit rrêt pour l'absorption au stade ultérieur. De préférence, on ne doit pas laisser passer plu de 4 heures environ avare l T absorption pour réduire au minimum la mort des cellules. 10 stade (5) est une opération d'absorption en série pour séparer l'anticorps monospécifique mâle-spécifique. C'est ainsi qu'en a piquant des techniques dlab- sorption classiques, ia-z lesquelles de 5 à 10 volumes d'antisérum brut non-di1ié, tel que préparé au stade (5), sont ajoutés dans chaque tube de c lot de leucocytes senel- les, qu'ils proviennent de cellules de rate comme ci-deis, ou de cellules de moelle osseuse ou épidermiques, femelles, les leucocytes sont dispersés dans l'antisérum.On effectue l'absorption en incubant le mélange cellules en sus pension/antisérum à 9 température corpcrelle, puis en agi+ant le mélange à basse température dans un bain à secousses. On centrifuge ensuite les cellules pendant un temps approprié à une force g adéqaate, par exemple 10 minutes à 100 g. On transfère l'antisérum partiellement absorbé dans un nouveau tube ou un nouveau récipient contenant un culot de leucocytes femelles et on répète le procédé d'absorption. On conserve le liquide et on jette chaque fois les leucocytes qui absorbent le matériau à partir du liquide. On note chaque réutilisation du liquide et aux 5ème, 10ème et 15ème réutilisations, ou absorptions, on détermine sur des petites quantités aliquotes en série la spécificité vis-à-vis de l'antigène mâle, tel que décrit ci-dessous. On a trouvé que le liquide restant après la 15ème absorption en série est monospécifique pour l'antigène mâle, tel que décrit ci-dessous. Il est évident que, si celà s'avère nécessaire, le procédé d'absorption en série peut être interrompu à la fin d'une absorption individuelle en conservant le mélange cellules/antisérum à une température d'environ 4 C. Le stade(6) est la détermination de la spécificité vis-à-vis de l'antigène mâle de l'antisérum. Pour déterminer cette spécificité, il est nécessaire de disposer d'échantillons témoins de leucocytes. C'est ainsi qu'on prépare des lots séparés de leucocytes mâles et femelles, soit par le procédé préalablement décrit au stade(4), de la Fig. 1, pour les leucocytes femelles, soit par un procédé similaire en introduisant dans ce procédé un matériau de contrepartie mâle pour préparer les leucocytes mâles ; ou bien un procédé séparé connu dans la technique peut être utilisé à cet effet, dans la mesure où on constitue des lots séparés de 100 % de cellules femelles et de 100 % de cellules mâles.On applique le procédé décrit ci-dessus ou tout autre procédé jusqu'à ce qu'on obtienne un culot de cellules par centrifugation (ci-dessus). le culot de cellules séparées, ici des cellules de moelle osseuse mâles et des cellules de moelle osseuse femelles, est remis en suspension dans une solution appropriée, dont le pH est légèrement acide, et étalé sur des lamelles pour microscopie. On prépare un troisième échantillon contenant 50 % de cellules de moelle osseuse femelles et 50 % des mêmes cellules mâles, en mélangeant des quantités exactes des deux échantillons séparés pour obtenir un rapport de 50:50. On colore alors ces trois séries de lamelles pour microscopie drun fluorochrome et sur chaque échantillon on compte le pourcentage de cellules qui deviennent fluorescentes sous l'effet du colorant. Comme exemples typiques d'agents de remise en suspension connus dans la technique dans le but ci-dessus, on peut citer une solution de sérum albumine de bovin, une solution saline tamponnée au phosphate, l'acide éthylène-diamine tétraacétique (EDTA) et le bicarbonate de sodium à un pH d'environ 6,8. Comme colorant fluorochrome utilisable ici, on peut citer une globuline de mammifère anti-espèce du mammifère utilisée conjuguée à l'isothiocyanate de fluorescéine. Ici le conjugat est une globuline de chèvre anti-lapin conjuguée, commercialisée par Miles Laboratories, Elkhart, Indiana.Le traitement antérieur des lamelles avec l'anticorps male-spécifique et le lavage des anti sérums est jugé spécifique pour l'antigène mâle si on observe une fluorescence spécifique dans pratiquement 100 ffi des leucocytes mâles ; 50 % des cellules obtenues à partir du mélange 50:50 de cellules mâles et femelles ; et O % des cellules provenant des leucocytes de rate femelles. Ces résultats sont obtenus après 15 essais. Le stade(7) de la Fig. 1 concerne la séparation de la fraction d'immunoglobuline G de l'antigène mâlespécifique préalablement évalué. L'opération de séparation consiste à éliminer les produits indésirés tels que le complément, l'albumine et les lipoprotéines, et a lieu au moyen de diverses techniques acceptées. Une de ces techniques est connue dans le domaine immunologique comme le relargage. Dans une telle technique de séparation, toutes les fractions d'immunoglobine A à M sont séparées sous forme d'une large fraction. Mais le fractionnement sur gel s'est avéré plus spécifique et est donc recommandé ; o'est une autre technique classique pour isoler la fraction la plus large d'immunoglobuline désirée, la fraction G, dont le poids moléculaire est voisin de 150 000. Comme on le sait dans la technique, on agite du sulfate de dextrane et du chlorure de calcium dans de faibles quantités, soit de 50 à 100 ml, d'antisérum mâlespécifique pour précipiter et séparer les lipoprotéines qui sont supposées être des substances interférant dans l'usage prévu du produit final selon l'invention. les lipoprotéines sont éliminées par centrifugation. le liquide surnageant provenant de l'opération de centrifugation ci-dessus est introduit dans une colonne de séparation contenant un gel ou des perles capables de séparer les immunoglobulines en fractions de poids moléculaires différents. Un matériau typique parmi ceux qui sont utilisables à cet effet, est le Bio-gel A-5m, fabri qué par Bio-Rad laboratories. Pour créer une solution isotonique, on ajoute une faible quantité de chlorure de sodium. Après avoir recueilli les diverses fractions, on prépare un profil des densités optiques à partir-de lectures spectrophotométriques, selon un mode opératoire bien connu dans la technique. On ras-semble toutes les fractions d'immunoglobulines G (IgGr pour le stockage.On pense que si on appliquait une technique de relargage telle qu'une fraction mixte d'immunoglobulines totales soit obtenue, le rendement serait de 10 à 15 On concentre les fractions d'IgG rassemblées ou la fraction large d'Ig A - M, par ultrafiltration et on ajuste à une cor-entration finale après une détermination spectrophotométrique de la concentration en protéine, à un taux de 1 mg d'IgG/ml, par addition de PBS (solution saline tamponnée au phosphate). On fait passer à travers une membrane pour éliminer toute impureté et la concentration d'IgG est conservée jusqu'à l'emploi par réfrigération à -200C, Le mode opératoire décrit ci-dessus permet d'obtenir des rendements de 0,5 à 1,5 mg d'IgG spécifique de l'antigène anti-mâle/ml d'antisérum brut de départ. La fraction totale d'imminoglobulines A à M, telle qutob-tenale par la technique de relargage, contient le produit désiré l'anticorps monospécifique mâle-spécifique. Le procédé de fractionnement sur gel, souvent appelé filtration sur gel, permet d'obtenir l'immunoglobuline (:- qui contient le même anticorps monospécifique, mâlespécifique. Mais les immunoglobulines ne sont pas des anticorps mâle-spécifiques purs. En fait, tous les anticorps qui sont capables de réagir avec des cellules femelles, ont été éliminés. Il reste donc un large spectre d'anticorps parmi lesquels se trouve l'anticorps monospécifique mâle-spécifique. Par exemple, les anticorps nonéliminés dans le fractionnement de l'immunoglobuline IgG, comprennent peut-être des anticorps contre les antigènes des groupes sanguins et des anticorps réactifs vis-à-vis des pathogènes présents chez l'individu, qui sont tous des matériaux protéiques. G'est ainsi que la fraction d'immunoglobuline ou l'immunoglobuline G séparée contient l'anticorps monospécifique, mâle-spécifique exempt d'anticorps interférant avec la spécificité pour le sexe mâle. Ceci permet alors d'expliquer pourquoi on effectue l'absorption de l'antisérum brut en série, de façon qu'il ne reste plus de matériaux interférant avec la spécificité. Cependant, le procédé global décrit ici im plique l'utilisation de 11 anticorps monospécifique, mâlespécifique, trouvé dans l'immunoglobuline-pour l'associer à un immunoabsorbant.Pour éviter qu'une protéine n' inter- férant pas avec la spécificité, c'est-à-dire l'albumine, les glycoprotéines, etc.., présente dans l'antisérum après l'absorption en série, puisse interférer avec la réaction d'association avec l'immunoabsorbant, on a inclus l'opération de séparation de la fraction d'immunoglobuline ou IgG de l'antisérum, afin d'obtenir un produit contenant l'anticorps mâle-spécifique désiré qui est alors exempt d'anticorps interférant avec la spécificité et de protéines interférant avec la réaction d'association. Les exemples non-limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. EXEMPLE 1 Préparation de la suspension de cellules épidermiques On tue par exsanguination de jeunes lapins adultes mâles, de souche Nouvelle Zélande, (de 3 à 5 kg de poids corporel). On rase la peau du thorax, on lave avec de l'éthanol à 70 %, on excise, on élimine la graisse et on introduit cette peau dans une solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) de pH 7,4. On découpe la peau en petits morceaux de 1 à 2 mm et on incube pendant 1 heure à 370C dans HBSS contenant 0,1 % de trypsine. On agite les produits incubés à faible vitesse dans un bain à secousses. Après l'incubation, on filtre les cellules épidermiques sur une fine toile de Nylon à plusieurs épaisseurs et on centrifuge à 100 g pendant 10 minutes. On jette le liquide surnageant et on remet le culot en suspension dans HBSS contenant 10 mg/l de désoxyribonucléase. Puis on replace les cellules dans le bain à secousses pendant 20 minutes. Ce traitement a pour effet de dissocier les aggrégats cellulaires et les petits amas restants. On lave deux fois les cellules dissociées (centrifugées comme dessus et remises en suspension dans H3SS) et on les réunit. Sur une partie aliquote, dans un hémocytomètre, on détermine la concentration en cellules et leur viabilité. Selon ce procédé, on estime que les préparations de cellules sont viables à au moins 70 . On règle la concentration en cel lules pour l'immunisation, par additionwde HBSS, à 100 millions de cellules épidermiques/ml. Détermination de la yiabilité des cellules On dilue une partie aliquote de la suspension de cellules dans H3SS à une concentration de 0,2 million de cellules/ml. Dans une fiole en verre de 4 ml, on introduit 0,5 ml de la suspension diluée et 0,1 ml de bleu trypan et on laisse a la température ambiante pendant 5 minutes. On compte alors le nombre de cellules vivantes dans la suspension dans un hémocytomètre. On calcule le pourcentage de cellules vivantes en supposant que les cellules non colorées sont vivantes , alors que les cellules colorées sont mortes. Immunisation et isolement de l'antisérum brut On injecte 500 millions (5,0 ml) de cellules épidermiques de lapin mâle dissociées à de jeunes lapins adultes femelles, de souche Nouvelle Zélande, (poids corporel de 4 à 6 kg). Les injections ont lieu par voie intrapéritonéale deux fois par semaine (3 à 4 jour entre des injections successives) pendant 6 semaines consécutives. On exsanguine les lapins femelles 6 jours après la dernière injection de cellules épidermiques mâles immunisantes. Les exsanguinations sont pratiquées par une ponction cardiaque au moyen d'une aiguille fixée à une seringue jetable de 50 ml. On retire l'aiguille de la seringue dès que la collation du sang est terminée. On tire légèrement le piston en arrière pour admettre une faible quantité d'air dans le canon de la seringue.On laisse les seringues debout dans un ratelier dans un incubateur à 370C pendant 2 heures. Pendant ce temps, il y a formation d'un caillot qui se rétracte dans le fond du canon. On verse le liquide surnageant dans une série de tubes à centrifugation coniques de 40 ml. On élimine les cellules sanguines résiduelles de l'antisérum par centrifugation à 800 g pendant 15 minutes. On prélève l'antisérum surnageant, on réunit dans un flacon et on inactive le complément en chauffant dans un bain à circulation d'eau à 560e pendant 30 minutes. On refroidit pendant une nuit l'antisérum brut "décomplémenté" avant de le soumettre'le jour suivant à une série d'absorptions contre des cellules de rate de lapin femelle. PréParation du culot de cellules de rate On tue par fracture du cou des lapins adultes femelles encore jeunes, souche Nouvelle Zélande, (3 à 6 kg de poids corporel). On excise les rates, rince dans HBSS, découpe en morceaux d'ur. cm dans HBSS, transfère dans un mélangeur Waring R et on disperse à faible vitesse afin d'obtenir une suspension de simples cellules. On utilise de 4 à 6 rates de lapin par lot ayant un rapport XBS/tissu splénique (volume/poids) d'environ 5:1. On filtre la suspension de cellules résultante sur une fine toile de Nylon à plusieurs épaisseurs pour éliminer l'ensemble des débris agglutinés. A une solution à 5 ffi de sulfate de dextrane (poids moléculaire 250 000), on ajoute la suspension de cellules filtrée dans un rapport volumique de 1:9, respectivement.On laisse les cellules sanguines rouges décanter pendant 40 minutes. On transfère le liquide surnageant riche en cellules sanguines blanches (leucosytes)'dans une série de tubes à centrifugation de 50 ml. On remet les cellules sanguines rouges sédimentées en suspension dans un égal volume de HBSS contenant 0,5 % de sulfate de dextrane et on laisse sédimenter une seconde fois pour augmenter le rendement en leucocytes. On rassemble les leucocytes, on centrifuge à 100 g pendant 10 minutes et on lave deux fois dans HBSS comme ci-dessus. On obtient un culot de leucocytes de rate par une centrifugation finale à 100g pendant 10 minutes, après quoi on refroidit les tubes à 40C. On ne retire pas le liquide surnageant au-dessus des culots de cellules avant que l'antisérum ne soit prêt pour 1' absorption. Il ne- faut pas attendre plus de 4 heures entre la formation du culot final de leucocytes de rate femelle et son utilisation dans la série d'absorption afin d'éviter la mort des cellules. Absorption en série de l'antisérum brut Dans des tubes à la température ambiante, à chaque volume de culot de leucocytes, on ajoute environ 10 volumes d'antisérum brut non-dilue, dont on a inactivé -le complément. On disperse les leucocytes dans l'antisérum en retirant plusieurs fois le culot de cellules dans une pipette. On effectue l'absorption en incubant d'abord le mélange cellules en suspension/antisérum pendant 30 minutes à 37 C, puis en agitant pendant 2 heures à 400 dans un bain à secousses. On centrifuge les cellules pendant 10 minutes à 100 g. On transfère l'antisérum partiellement absorbé dans un nouveau tube contenant un culot de leucocytes de rate femelle et on répète l'absorption. Ce processus en série peut être interrompu si nécessaire en refroidissant le mélange cellules/antisérum à 40C pendant une nuit.On prélève une partie aliquote de l'antisérum après 5, 10 et 15 absorptions en série pour déterminer la spécificité vis-à-vis de l'antigène mâle. L'essai sur l'antigène mâle après la 15ème absorption en série indique la spécificité pour le sexe mâle, telle que désirée. Cet essai est effectué selon le mode opératoire décrit ciaprès. Détermination de la spécificité On prépare des cellules de moelle de lapins mâles et femelles et on les conserve séparément tel que ci-dessus jusqu'au stade du -culot de cellules dans HBSS. On remet en suspension les culots de cellules d'échantillons mâles et femelles séparés, dans un égal volume d'une solution contenant 20 ml de sérum albumine de bovin à 20 , 60 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,1 M, 8 mol d'acide éthylène diaminetétraacétique à 5 Vo et la quantité nécessaire de bicarbonate de sodium pour obtenir un pH de 6,8. On prépare une troisième suspension en mélangeant des volumes égaux des cellules de moelles mâles et femelles en suspension. On étale des gouttes de chaque suspension sur des lamelles de verre pour microscopie, séparées, on sèche à l'air, on code et on conserve dans des boîtes fermées à -20 C jusqu'à leur utilisation pour la détermination.Pour cette détermination, on place les lamelles pendant 30 minutes dans un bain de solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 (PBS), on agite avec un agitateur magnétique. On place de nouveau les lamelles sur une surface horizontale et on les recouvre pendant 30 minutes avec une dilution de l'antisérum dans le PBS 1:10. On place les lamelles dans un bain de PBS agité pendant encore 30 minutes, puis on les remet sur une surface horizontale et on les recvre d'une dilution à 1:10 dans le P3S de globuline de chèvre antilapin conjuguée à l'isothiocyanate de fluorescéine, cm- mercialisée par Miles Laboratories.On lave finalement les lamelles pendant 1 heure dans un bain de PBS agité, on monte dans du glycérol contenant 10 C/o de PBS en volume et on compte le pourcentage de cellules fluorescentes sous un microscope à lumière fluorescente. Ce teste permet d'évaluer la spécificité vis-à-vis de l'antigène mâle des échantillons dtantisérum après le 15ème essai d'absorption en série. Fractionnement de l'antisérum les antisérums absorbés dont on a préalablement déterminé la spécificité vis-à-vis de l'antigène male sont fractionnés par un système de filtration sur gel qui isole la fraction de la classe d'immunoglobuline G (IgG) des protéines du sérum. Dans ce procédé, on utilise des quantités de 50 ml d'antisérum mâle-spécifique qu'on agite d'abord doucement avec un mélange de 1,0 ml de sulfate de dextrane (poids moléculaire 500 COO) et 5,0 ml de chlorure de calcium 1 M pendant 15 minutes à la température ambiante. On centrifuge les lipoprotéines précipitées à 6000 g pendant 10 minutes.On applique des quantités de 10 ml du liquide surnageant sur le dessus d'une colonne de 4 x 60 cm contenant du Bio-Gel A-5m, et on équilibre avec un tampon Tri- HCl 0,1 M, pH 8,0, contenant 0,2 M de chlorure de sodium. On élue les fractions avec le même tampon à 6 ml/heure. On recueille des fractions de 3 ml et on prépare un profil de densités optiques par des lectures spectrophotométriques à 280 mp. On réunit les fractions provenant du large pic comprenant l'IgG. On les met de côté pour l'association avec l'agent immunoabsorbant. Utilisation de 1' anticorps monospécifique mâle-spécifique Comme on ltexpliquera en détail ci-après, la fraction totale d'immunoglobuline ou son segment dtimmuno- globuline G contiennent le produit désiré, l'anticorps monospécifique mâle-spécifique, dans ces fractions. Grâce au procédé préalablement décrit, la ou les fractions) ont été débarrassées des autres matériaux protéiques qui pourraient, ou auraient tendance à interférer avec la spécificité pour le sexe mâle, nécessaire pour la séparation des spermatozoides déterminant le sexe mâle d'avec les spermatozoides déterminant le sexe femelle. Selon l'invention, l'anticorps mâle-spécifique n v a pas besoin d'être isolé. Comme le comprendront facilement les spécia- listes en immunologie, la technique décrite ici pour concentrer ou purifier lvantisérum mâle-spécifique ou antisérum anti-Y requis permet de garantir la monospécificité de l'antisérum, c'est-à-dire que l'antisérum ainsi concentré et purifié et destiné à être utilisé dans le fractionnement du sperme, contient un anticorps capable de se lier à l'antigène Y, mais pas à d'autres antigènes, exprimés par les membranes superficielles du sperme. Des anticorps anti-sperme autres qu'un anticorps anti-Y ou mâlespécifique pourraient diminuer la précision du procédé de fractionnement du sperme selon l'invention et la fertilité du matériau de liquide séminal résultant, selon l'invention. Si l'anticorps mâle-spécifique est congelé avant d'être utilisé pour une association avec un immunoabsorbant selon un autre aspect de l'invention, une perte de spécificité pourrait résulter de plus d'un cycle de gel-dégel pendant le stockage. Pour vérifier la spécificité, on peut effectuer le test de spécificité préalablement décrit ou un autre test similaire à développer de manière courante. La monospécificité de l'antisérum mâlespécifique peut être déterminée en associant une partie de lvantisérum à de l'isothiocyanate de fluorescéine. En effectuant ce test, lvantisérum marqué au produit fluorescent est combiné avec des spermatozoides humains dans une préparation microscopique de fluorescence directe. Une vive fluorescence d'environ 50 % du sperme indique une fixation spécifique de l'antisérum mâle-spécifique marqué avec un produit fluorescent, par le sperme Y. L'absence de coloration des autres 50 % du sperme restant approximativement c'est-à-dire le sperme X, indique la monospécificité es sentielle de l'anti-sérum produit par la technique décrite ci-dessus pour l'antigène Y. La possibilité de marquer spécifiquement l'antigène monospécifique mâle-spécifique peut aider l'opérateur à déterminer la qualité du produit désiré dans des échantillons inconnus. En se référant maintenant à la Fig. 2 du dessin annexé, la technique de préparation d'un antisérum ou anticorps mâle-spécifique, décrite ci-dessus, est représentée par les rectangles 10, 12, 14 et 16 de la Figure. Il est également évident pour les spécialistes de la technique que le test de monospécificité de l'antisérum, décrit juste ci-dessus, s'il était indiqué sur la Fig. 2, suivrait immédiatement la chromatographie sur gel d'agarose indiquée par la référence 18. Après le test de monospécificité décrit cidessus, l'antisérum purifié est associé à un matériau immunoabsorbant en phase solide, tel qu'indiqué au stade 18. Il faut noter, que conformément à un aspect particulier de l'invention, il est préférable de modifier la concentration de la partie globale de l'antisérum à 1 mg/ml dans la solution saline tamponnée par un phosphate, pH 7,4, avant l'association avec l'immunoabsorbant. L'association-avec l'immunoabsorbant, ç'est-à- dire lvassociation des anticorps mâle-spécifiques préalablement produits avec un matériau immunoabsorbant en phase solide peut être effectuée comme suit. EXEMPLE 2 On tamise des perles de Sephadex G-200 (Pharmacia) pour obtenir 60 ml de perles d'une dimension comprise entre 80 et 120 microns. On "active" les perles ainsi classées avec 100 mg de bromure de cyanogène à pH 10,2 pendant 10 minutes, grâce à quoi on constate une diminution de 20 à 30 % du volume. Ce traitement d'activation permet au matériau immunoabsorbant d'accepter les molécu- les de protéine par une liaison covalente. On lave les perles activées dans une solution saline tamponnée au borate, pH 8,3. On ajoute 20 mg (20 ml) d'anticorps monospécifique, mâle-spécifique, aux perles activées et lavées qu'on a préalablement laissé reposer à la température ambiante pendant 4 heures sans agitation mécanique. Le matériau de Sephadex G-200, chargé avec l'anticorps mâle est appelé un conjugat.On lave le conjugat d'anticorps anti-Y avec une solution saline tamponnée au phosphate, sans aspiration, en mélangeant toutes les 15 minutes avec une baguette de verre. On utilise le conjugat anti-Y ainsi lavé pour préparer une série de colonnes en garnissant des seringues jetables en matière plastique de 12 ml, munies d'un disque de retenue en polyéthylène dans le fond à la place d'un piston, avec 8 à 10 ml du conjugat. Bien qu'on puisse utiliser toute autre colonne, celle-ci s'avère commode à ltemploi. On lave ces colonnes avant de fractionner le sperme avec le milieu 199 auquel on ajoute 50 % en volume de sérum de foetus de veau, 2,5 mM en poids d'acide éthylène diamine tétraacétique et 1 % en volume de pénicilline streptomycine (appelé ci-après "milieu n01"). Après avoir ainsi préparé les colonnes de frac- tionnement (référence 20 sur la Fig. 2), on peut alors préparer le sperme vivant (référence 22 sur la Fig. 2) pour le fractionnement selon le procédé de l'invention, par la technique suivante. On disperse le sperme vivant dans le milieu n01 et on centrifuge modérément. On décante le liquide surnageant non-cellulaire du récipient de centrifugation, puis on remet le sperme sédimenté en suspension dans du milieu nO 1 frais. On centrifuge modérément la suspension de sperme dans le milieu nO 1 frais et on décante de nouveau le matériau non-cellulaire de la cuve de centrifugation. On met de nouveau en suspension le sperme sédimenté de la seconde opération de décantation dans un nouveau milieu appelé ici "milieu nO 2". C'est un mélange d'un milieu commercial appelé milieu nO 199 auquel on ajoute 50 ffi en volume de sérum de foetus de veau et 2,5 mM en poids d'acide éthylène diamine tétraacétique. Ce nouveau milieu nO 2 a un pH de 7,4. Le sperme sédimenté dans le milieu nO 2 a une concentration de 10 à 20 millions de cellules par ml. Cette suspension de sperme, parfois appelée ci après "suspension de sperme préparée est directement utilisable dans les colonnes dvimmunoabsorbant préparées. Tel qu'indiqué par la référence 24 sur la Fig.2, la suspension de sperme préparée peut alors être appliquée aux colonnes de fractionnement préalablement préparées, selon la technique suivante. Charge à séparer A laide d'une seringue, on introduit une portion de 5 à 10 mm de la suspension de sperme préparée décrite ci-dessus dans plusieurs colonnes de 8 ml à la température ambiante. On recueille les éluats comprenant la fraction de sperme X, en éluant graduellement les colonnes avec des quantités de 15 ml du milieu nO 2 cidessus, à un débit de 0,3 à 0,5 ml par minute, environ, jusqu'à ce que l'effluent soit virtuellement exempt de cellules. Cette élution du sperme déterminant le sexe femelle est indiquée par la référence 26 sur la Fig. 2. Tout liquide éluant, à condition quvil ne nuise pas au sperme déterminant le sexe mâle, peut être utilisé pour séparer le sperme femelle qui est logé dans les vides entre les perles. Après avoir élué pratiquement la totalité des spermatozoides déterminant le sexe femelle des colonnes de fractionnement, on peut récupérer les spermatozoides déterminant le sexe mâle dans les colonnes de fractionnement, selon la technique suivante. A une quantité donnée du milieu n . 2, on ajoute 10 mg d'anticorps mâle-spécifique par ml. Ce nouveau milieu est appelé milieu nO 5. On recueille les éluats comprenant les sperma tosoides déterminant le sexe mâle des colonnes de fractionnement par une élution graduelle avec des quantités de 15ml du milieu nO 3. Comme on peut le voir au dessin, une telle élution avec le milieu nO 3 facilite les deux opérations d'addition d'anticorps libres dans les colonnes de frac-tionnement (référence 28) et d'élution des spermatozoides déterminant le sexe mâle des colonnes de fractionnement (référence 30). Comme il paraîtra évident aux spécialistes en immunologie, la fraction de sperme déterminant le sexe mâle est é1zlée des colonnes de fractionnement, selon les principes Qe l'invention, en utilisant le principe bien connu de l'inhibition compétitive de la liaison cellulaire. Conformément à un autre aspect de l'invention, de préférence on mélange doucement les contenus des colonnes de fractionnement pendant lvélution de la fraction de sperme déterminant le sexe mâle en donnant un mouvement de va-et-vient aux perles d'immunoabsorbant avec une pipette de Pasteur. De plus, selon l'invention, cette action de mélangeage modéré avec une pipette est de préférence poursuivie jusqu'à ce que l'effluent des colonnes de fractionnement soit virtuellement exempt de cellules, comme on peut le déterminer au microscope. Conformément à un autre aspect de l'invention, on préfère que les éluats des spermes déterminant le sexe mâle et le sexe femelle soient tous deux lavés, c'est-àdire centrifugés et remis en suspension, trois fois dans un milieu nO 199 contenant 5 ffi en volume de sérum de foetus de veau, ce mélange étant appelé milieu nO 4", avant de déterminer la teneur restante en sperme indésiré. Ce procédé place le sperme dans un milieu de maintien pour le stockage avant l'insémination artificielle. Bien que la technique décrite ci-dessus qui consiste à libérer le sperme déterminant le sexe mâle lié à l'immunoabsorbant des colonnes de fractionnement, en appliquant le principe de l'inhibitioncompétitive, puisse être utilisée avec succès en employant le procédé de l'in- vention, il est évident que le procédé selon l'invention n'est pas limité à l'utilisation de cette technique dtin- hibition compétitive particulière, car d'autres techniques sont bien connues des spécialistes en immunologie. Comme autres techniques, on peut citer à cet effet la digestion enzymatique de 1'immunoabsorbant et la modification du pH ou de la concentration en sel du milieu. Les spécialistes en immunologie trouveront d'autres techniques. Les liquides séminaux pour le matériau dtinsé- mination artificielle selon l'invention, préparés par les opérations et techniques décrites ci-dessus, ont été examinés quant à (i) ltefficacité de séparation des suspensions de sperme préparées à partir d'une espèce de mammifère et (ii) la fertilité des fractions de sperme séparées dans une seconde espèce de mammifère. On mesure ltefficaeité suivant (i)par les critères de récupération totale des cellules et du degré de séparation du sperme X et Y atteint dans les fractions. On utilise dans ce test le fluorochrome de quinacrine, un colorant cellulaire connu dans la technique antérieure pour sa spécificité à la présence du chromosome Y dans le sperme humain. Les résultats de ce test montrent que des fractions Y contenant 89 % ou plus de cellules positives Y et des fractions X contenant 6 g0 ou moins de cellules positives Y sont obtenues avec une perte de sperme de 28% ou moins (Tableau I). On mesure la fertilité selon (ii) par des essais de présélection du sexe chez les souris. On fractionne du sperme d'épididyme et de canal déférent réuni provenant de souris mâles et on ajuste à une concentration de 5 millions de sperme par 0,1 ml dans le milieu nQ 4. On insémine des femelles réceptrices avec 5 millions de sperme dans les 24 à 30 heures du post partum. On accouple des souris femelles témoins à des souris mâles dans les 24 à 30 heures du post partum. Les résultats indiquent que l'insémination avec des liquides séminaux déterminant le sexe mâle. ou des liquides séminaux déterminant le sexe femelle préparés selon le procédé de l'invention permet de présélectionner fortement le sexe de la descendance, avec un résultat de moins de 10 % d'erreur par sexe désiré (Tableau II). Ces données ont une signification statistique au taux de 0,001 pour le test- deux 2. Le fait qu'un taux de conception de 60 % est obtenu dans ce test parle en faveur de la fertilité des liquides séminaux ou des matériaux d'insémination artificielle produits par le procédé selon l'invention, par comparaison avec les difficultés techniques bien connues dans 11 insémination artificielle des souris, tel qu'indiqué par les taux de conception comparables obtenus dans des essais avec une suspension de sperme de souris non-fractionné.Les rapports des sexes de la descendance atteints dans ces tests (Tableau II) sont très voisins des rapports des sexes attendus en tenant compte de la eontamination résiduelle des fractions inséminées par du sperme du type de chromosome sexuel désiré, tel qu'observé dans des essais de fluorescence d'anticorps mâle-spécifiques, mentionnés ci-dessus. On suppose alors que le rapport des sexes qu'il est possible d'obtenir pour un lot particulier de liquide séminal ou de matériau d'insémination artificielle selon l'invention, peut donc être prédit par un tel essai. La discussion ci-dessus met en évidence le fait qu'un anticorps spécifique de lapin, anti-mâle, développé dans des lapins femelles,traité selon un procédé de l'in- vention pour produire des matériaux d'insémination artificielle selon l'invention, peut effectuer une séparation des spermatozoldes déterminant le sexe male et des spermatozoides déterminant le sexe femelle dans la semence de souris et d'hommes. Ce résultat concorde avec les données de la littérature scientifique qui indiquent que l'antigène Y des mammifères est capable d'une réaction croisée immunologique intense entre espèces. Il faut noter en particulier que le procédé selon l'invention, utilisant comme il le fait un système dvimmunoabsorbant en phase solide qui permet de séparer le sperme X et Y de mammifères par liaison différentielle du sperme Y à l'immunoabsorbant, plutôt que par des procédés mécaniques basés sur la très faible différence de densité entre le sperme X et le sperme Y, est totalement réversible de telle sorte que le sperme Y, ou sperme déterminant le sexe mâle, peut être récupéré sans la dégradation cellulaire associée à une agglutination cellulaire classique, une cytolyse ou tout autre technique d1inacti- vation des cellules. On suppose que l'importance de ces propriétés dont fait preuve le procédé selon l'invention, eu égard à la fertilite et à la précision dans les fractions de sperme séparées pour une insémination artificielle avec présélection du sexe, ne peut pas être sures timée. Si on fixe le sperme Y à la surface de la perle, celui-ci peut être facilement séparé en ajoutant un excès d'anticorps libre en solution, dans la colonne. Ceci illustre l'inhibition compétitive de la fixation. Les données d'essai du test d'efficacité (i) et du test de fertilité (ii) mentiounés ci-dessus sont les suivantes : TABLEAU I Spermes X et Y humains avant et après le fractionne ment avec un conSugat anticorps anti-Y-immunoabsorbant Essai Récupération Cellules positives Y (%) N du sperme(%) Non frac- fraction X fraction Y Récupération tionné totale du sperme 1 47 2 92 82 2 48 5 93 82 3 45 4 90 88 4 48 6 89 89 (1) D'après les comptages de 200 cellules colorées à la quinacrine par catégorie (2) Obtenu en divisant les cellules dans les fractions combinées par l'apport en cellules dans les co lonnes. TABLEAU II Capacité de pré sélection du sexe de sperme de souris fractionné au moyen d'un immunoabsorbant recouvert d'antiY Naissances mâles Témoin Fraction X Fraction Y 46,6 4,2 92,3 (1) Calculé sur 150 naissances ou plus par catégorie. Dv après ce qui précède, il devient clair que le procédé totalement immunologique et non mécanique selon l'invention a une grande utilité dans le choix du sexe de la descendance des mammifères. Il est également évident que le procédé,ltéquipement et le matériau d'insémination artificielle selon l'invention, sont particulièrement importants dans une application commerciale dans le domaine de l'élevage par exemple, en permettant à ltéleveur ou au fermier de choisir le sexe de la descendance animale. A titre d'illustration, un fermier spécialisé dans les produits laitiers peut décider de n'avoir qu'unie production de femelles et de n'élever que des vaches laitières, plu tot que des taureaux.En ce qui concerne la procréation humaine, l'invention fournit aux parents un moyen simple. pour choisir ou déterminer le sexe de leur descendance, en ce qu'ils peuvent satisfaire le désir d'avoir un enfant d'un sexe donné, limitant ainsi l'étendue des familles et contribuant à la réduction des problèmes relatifs à la population mondiale. Il faut noter que dans la préparation de l'an- ticorps monospécifique mâle-spécifique, différents matériaux peuvent remplacer ceux utilisés dans les divers stades du procédé. C'est ainsi qu'on peut obtenir des cellules mâles d'épiderme, de rate, de moelle osseuse, de thymus, de ganglion lymphatique et peut être d'autres tissus de mammifères mâles, à la portée des connaissances d'un immunologiste. Les cellules femelles pour 11 opération d'absorption peuvent provenir de l'un quelconque des types cidessus de cellules d'un mammifère femelle. Il est évident que l'opération d'absorption doit être conduite contre des cellules femelles de la même espèce que celle à partir de laquelle on a obtenu les cellules mâles d'origine. De plus, cette même condition de similitude de l'espèce est valable pour le mammifère femelle qui reçoit l'antigène. C'est ainsi que si on dispose de cellules râles de lapin, l'antigène doit être placé dans un lapin fenelle et les absorptions effectuées contre des cellules de lapin femelle. Cette condition de similitude des espèces n'test applicable qu'à l'espèce et non pas a la souche. Be produit d'anticorps mâle peut être utilisé avec n'importe quel mammifère et son emploi n'est pas li mité à la même espèce de mammifère que celle à partir de laquelle on obtient les cellules mâles d'origine qui produisent 11 anticorps monospécifique mâle-spécifique. Il est donc possible que des cellules provenant d'un-rat mâle puissent être utilisées pour la procréation de chats mâles, si désiré. Bien qu'aucun essai n'ait été effectué à ce sujet, on pense en outre qu'étant donné que l'anticorps mâle-spécifique n'est pas spécifique de l'espèce, l'anticorps mâle produit à partir de lapins pourrait être utilisé pour la séparation du sperme mâle du sperme humain femelle par la technique d'immunoabsorption décrite ici. Dans le mode opératoire du test de spécificité, on peut utiliser la plupart des types de cellules appropriées, moelle, thymus, etc. qui donnent des résultats d'essai corrects. Bien qu'on pense que les cellules utilisées ici peuvent provenir d'une espèce de mammifère quelconque, ltopérateur peut préférer utiliser des cellules de la même espèce que celles dans lesquelles l'antigène a été implanté pour la préparation de l'antisérum. Dans le procédé de préparation de l'anticorps, il est possible à tout spécialiste d'apporter des modifications à chaque stade du procédé. C'est ainsi que l'opé- ration d'absorption en série ne doit pas être nécessairement conduite telle que décrit en détail contre des femelles pré-tuées pour obtenir le culot de cellules spléniques décrit ci-dessus. Eventuellement, on peut avoir recours à une splénectomie par un spécialiste de la technique, pour obtenir la rate d'un donneur comme source de culot de cellules spléniques. De plus, il est possible, et celà entre dans le cadre de l'invention, d'absorber en série contre une série d'animaux femelles vivants de la même espèce, in vivo, puis de permettre à l'antigène de réagir in vivo avec la femelle pendant une période de temps appropriée, et enfin de tuer la femelle en question afin d'en obtenir le sérum qu'on utilise dans l'absorption en série suivante. Il est ainsi évident que le fonctionnement du procédé appartient plus au concept de l'absorption en série contre des cellules femelles, en soi, qu'à un mode spéci fique d'absorption. A cet effet, pour illustrer encore la portée de l'invention, en se référant à nouveau à une combinaison des stades(1) et (2), une greffe solide de tissu mâle peut être implantée dans ou sur une femelle réceptrice de la même espèce, pour remplacer 1' injection de cellules mâles dissociées afin d'obtenir l'antisérum brut. L'im- plant provoque ici une synthèse d'immunoglobuline, qui se développe au stade suivant. Dans la discussion ci-dessus, on voit que la technologie concerne la préparation d'un anticorps, c'est à-dioee l'anticorps monospécifique mâle-spécifique qu'on associe ensuite avec un immunoabsorbant, et on utilise cette combinaison pour fractionner les spermatozoides tel que discuté ici. Il faut remarquer que dans la seconde partie de l'invention un autre anticorps ayant une spécificité différente, c'est-à-dire une spécificité anti-globuline, peut être associé avec l'immunoabsorbant. Un tel immunoabsorbant associé à une anti-globuline "reconnaît11, et se lie au sperme déterminant le sexe mâle qui a été pré-fixé à un anticorps monospécifique mâlespécifique. C'est ainsi que la colonne dont il est question au stade 20 de la Fig. 2, consiste en un immunoabsorbant associé avec une ant-i-globuline auquel on ajoute, au stade 22, le sperme vivant, mais seulement après avoir traité le sperme vivant avec l'anticorps monospécifique mâle-spécifique. Le sperme déterminant le sexe mâle se fixe de préférence sur la colonne et le sperme déterminant le sexe femelle non-fixé est ensuite élué au stade 26 de la Fig. 2. L'équilibre du procédé, c'est-à-dire les stades 28 et 30, sera le même. L'opération du stade 28 peut être effectuée en utilisant un anticorps monospécifique mâle-spécifique qu'on ajoute à la colonne pour séparer le sperme déterminant le sexe mâle, fixé, par inhibition compétitive de liaison. Il serait également possible de séparer le sperme déterminant le sexe mâle par addition à la colonne d'une plus grande quantité d'anticorps anti-globuline. Pour appliquer ce mode de mise en oeuvre, on peut se procurer l'anti-globuline dans le commerce. REVNJ)I CATI ONS 1.- Procédé de préparation dlun anticorps monospécifique mâle-spécifique, caractérisé en ce qu'il consiste à a. préparer des cellules de mammifère mâles, b. introduire les cellules mâles en tant qu'antigène dans le corps d'un mammifère femelle, c. permettre l'accumulation d1 immunoglobuline dans le mammifère femelle, d. obtenir un antisérum brut à partir du sang du mammifère femelle, e. décomplémenter l'antisérum, f. absorber en série l'antisérum brut contre des cellules femelles pour obtenir un antisérum contenant un anticorps monospécifique mâle-spécifique, g. vérifier éventuellement la monospécificité vis-à-vis de antigène anti-mâle, h. séparer la fraction d'immunoglobuline de l'antisérum du stade f, pour obtenir une composition contenant un anticorps monospécifique mâle-spécifique exempte de protéines interférant avec la conjugaison avec 1'immunoabsorbant. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stade h comprend un fractionnement sur gel pour isoler l'immunoglobuline G qui contient un anticorps monospécifique mâle-spécifique exempt d'anticorps interférant avec la spécificité. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stade h comprend un relargage des immunoglobulines A à M des autres protéines présentes, pour obtenir une fraction totale dtimmunoglobuline contenant un anticorps monospécifique mâle-spécifique exempt d'anticorps interférant avec la spécificité. 4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'opération qui consiste à associer le produit du stade h à un immunoabsorbant. 5.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les absorptions en série du stade f sont effectuées contre des culots de cellules femelles préalablement obtenus. 6.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les stades a et b comprennent la préparation d'une suspension de cellules de mammifère mâles, dissociées, et l'introduction de la suspension de cellules mâles en tant qu'antigène dans le corps d'un mammifère femelle. 7.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au stade f, l'absorption en série est effectuée in vivo contre des animaux femelles de la même espèce, suivie de la collection du sérum pour l'absorption suivante. 8.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les stades a et b comprennent ensemble la greffe d'un tissu mâle solide à un récepteur femelle de la même espèce pour provoquer une synthèse d'immunoglobuline. 9.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le test facultatif de monospécificité visà-vis de l'antigène mâle est effectué. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le test de spécificité consiste à lier une antiglobuline marquée avec un fluorochrome à un anticorps mâle-spécifique qui a été fixé à l'avance sur des cellules mâles. 11.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le test de spécificité consiste à marquer avec un fluorochrome une partie de l'anticorps mâle-spécifique et à la laisser se fixer directement sur les cellules mâles. 12.- Procédé pour séparer le sperme déterminant le sexe mâle et le sexe femelle à partir d'une semence pré-traitée, caractérisé en ce qu'il consiste à : a. associer un anticorps spécifique d'antiglobuline à un substrat immunoabsorbant en phase solide pour former un conjugat, b. charger une colonne de séparation avec le conjugat spécifique anti-globuline, c. faire passer à travers la colonne la semence contenant le sperme déterminant le sexe mâle et le sexe femelle, la semence ayant é; prétraitée ave un anticorps monospécifique maie spécifique, d. séparer de la colonne le sperme déterminant le sexe femelle, et e. séparer de la colonne le sfle déterminant le sexe mâle. 13.- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'opération de séparation du sperme déterminant le seve mâle comprend le passage à ravers la colonne dlun e composition consistant essen, el ez.ent en un anticorps monospécifique mâe-spécifique. 14.- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'opération de séparation du sperme déterminant le sexe mâle comprend le passage à travers la colonne d'une composilion consistant essentiellement en un anticorps anti-globuline. 15.- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'opération d'association a) consiste à : activer le matériau immunoabsorbant en phase solide pour le rendre capable d'acceD9er une protéine par liaison covalente, et y ajouter une solution d'un anticorps spécifique d'une anti-globuline. 16.- Composition d'aniticorps contenant un anticorps monospécifique mâle-spécifique sans anticorps interférant avec la spécificité. 17.- Conjugat dvun matériau immunoabsorbant en phase solide, activé, avec un anticorps spécifique d'une anti-globuline capable de fixer le sperme mâle-spécifique réparti sur la surface du matériau immunoabsorbant et associé à celui-ci. 18.- Procédé de sélection de spermatozoïdes, caractérisé en ce quvil consiste à séparer sélectivement les spermatozoïdes déterminant le sexe mâle par traitement d'un corps de semence avec un anticorps mâle-spécifique, et par mise en contact de la semence traitée avec un anticorps anti-globuline capable de fixer le sperme mâle-spécifique, l'anticorps anti-globuline étant associé à un matériau immunoabsorbant. 19.- procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séparation comprend le relargage de la fraction totale d'irlimunoglobuline de lvantisérum. 20.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séparation comprend la filtration sur gel de lvantisérum pour isoler l'immunoglobuline G, afin d'obtenir un anticorps monospécifique mâle-spécifique. 21.- Procédé de préparation d'un anticorps monospécifique mâle-spécifique, caractérisé en ce quvil consiste à a. préparer des cellules de mammifère mâles, b. introduire les cellules mâles en tant qu'antigène dans le corps d'un mammifère femelle, c. permettre l1accumulation de l'immunoglobuline dans le mammifère femelle, d. obtenir un antisérum brut à partir du sang du mammifère femelle, e. décomplémenter l'antisérum, f. absorber en série l'antisérum brut contre des cellules femelles pour obtenir un antisérum contenant un anticorps monospécifique mâle-spécifique, afin de produire une composition contenant un anticorps monospécifique mâle-spécifique, exempt d'anticorps interférant avec la spécificité. 22.- Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'au stade f, l'absorption en série est effectuée in vivo contre des animaux femelles de la même espèce, suivie de la collection du sérum pour l1absorp- tion suivante. 23.- Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la séparation comprend la filtration sur gel de l'antisérum pour isoler l'immunoglobuline G, afin de produire un anticorps monospécifique mâle-spécifique. 24.- Conjugat d'un matériau immunoabsorbant en phase solide, active, avec des anticorps monospécifiques, mâle-spécifiques capables de fixer le sperme mâlespécifique réparti sur la surface du matériau immunoabsorbant et associé à celui-ci. 25.- Conjugat selon la revendication 24, caractérisé en ce que le matériau immunoabsorbant en phase solide, activé, se trouve sous la forme de multiples perles distinctes. 26.- Conjugat selon la revendication 25, caractérisé en ce que les perles multiples sont des perles de polysaccharide disposées dans une colonne. 27.- Conjugat selon la revendication 24, caractérisé en ce que le matériau immunoabsorbant a été activé pour le rendre capable d'accepter des molécules de protéine par liaison covalente, par un traitement avec un halogénure de cyanogène. 28.- Conjugat selon la revendication 26, caractérisé en ce que les perles de polysaccharide ont été activées pour les rendre capables d'accepter des molécules de protéine par liaison covalente, par un traitement avec un halogénure de cyanogène. 29.- Conjugat selon la revendication 28, caractérisé en ce que l'halogénure de cyanogène est le bromure de cyanogène. 30.- Procédé de séparation du sperme déterminant le sexe mâle et le sexe femelle dans une semence native, caractérisé en ce qu'il consiste à a) associer des anticorps monospécifiques mâlespécifiques à un substrat dvimmunoabsorbant en phase solide pour former un conjugat, b) charger une colonne de séparation avec le conjugat monospécifique mâle-spécifique, c) faire passer la semence contenant le sperme déterminant le sexe mâle et le sexe femelle sur la colonne, d) séparer de la colonne le sperme déterminant le sexe femelle, et e) séparer de la colonne le sperme déterminant le sexe mâle. 31.- Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'opération de séparation du sperme déterminant le sexe mâle comprend le passage à travers la colonne d'une composition consistant essentiellement en un anticorps monospécifique mâle-spécifique. 32. - Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'opération d'association a) consiste à activer le matériau immunoabsorbant en phase solide pour le rendre capable d'accepter une protéine par liaison covalente, et y ajouter une solution d'un anticorps mono spécifique m le - spécifique. 33. - Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le corpus de semence contient le rapport naturel de spermatozoides déterminant le sexe male aux spermatozoides déterminant le sexe femelle, avant la séparation des spermatozoides déterminant le sexe maIe. 34. - Procédé de sélection de spermatozoides, caractérisé en ce qu'il comprend l'opération qui consiste à séparer sélectivement les spermatozoides déterminant le sexe male en mettant un corps de semence en contact avec un anticorps male-spécifique capable de fixer le sperme male-spéciùque, l'anticorps étant associé à un matériau immunoab sorbant. 35. - Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'opération qui consiste à modifier le matériau immunoabsorbant pour libérer les spermatozoides déterminant le sexe male.