Brevet FR2482308A1 — publié le 19811113

La présente invention concerne un procédé pour la détermination immunologique d antigènes ou de matières à potentialité antigénique, telles que les hormones protéiques, les stéroïdes ou les drogues Un antigène est une substance capable de se fixer de façon spécifique a un anticorps Les déterminations immunologiques sont des procédés pour établir la quantité d'une matière particulière dans un échantillon tel qu'un échantillon de sang. ou d'urine Ces procédés sont sensibles (par exemple on peut facilement ddtecter des quantités de stéroïdes de de 1 gordre du rico gramme) et spécifiques.La mesure précise de petites quantités dans le stade final du procédé confère la sensibilité tandis que le choix du réactif immunologique (anticorps) confère la spécificité. Pour effectuer une détermination immunologique d un antigène particulier, on doit disposer d'un anticorps dirigé contre cet antigène ainsi que de l'antigène pur marqué comme marqueur.On peut, pour effectuer le marquage, rempla- par un ou plusieurs atomes non radio-actifs (par exemple rempla- cer l'hydrogène. par du tritium ou remplacer le carbone-12 par du carone-i4), ou ajouter un atome radio-acti (tel que l'iede-125) ou ajouter à l'antigène une matière quel- conque que l'on peut détecter grâce à une propriété déter- minée mesurable (par exemple une enzyme). Pour effectuer la détermination, on mélange une quantité connue de l'antigène marqué à l'anticorps approprié et à l'antigène non marqué dont on désire déterminer la quantité. Lorsqu'un équilibre s'est établi, une certaine proportion des molécules d'antigène marqué est fixée aux molécules d'anticorps et une certaine proportion des molécules d'antigène non marqué est également fixée aux molécules d'anticorps. La proportion relative de chaque variété d'an tigène fixé à l'anticorps ou du reste de chaque variété non fixée à l'anticorps reflète la quantité d'antigène non marqué présente au départ.Il est donc. nécessaire de séparer les antigènes non fixés (libres) des antigènes fixés puis de mesurer l'antigène marqué présent dans l'une des fractions séparées ou dans les deux pour déterminer la quan titd d'antigène marqué présente au départ. Les techniques connues de détermination immunologique ont de nombreuses exigences particulières. Elles nécessitent une période d'incubation et également un procédé de séparation de l'antigène libre de l'antigène fixé à l'anticorps. On utilise divers procédés de séparation tels que l'adsorption sur charbon de la fraction libre, l'emploi d'une technique i double anticorps (dans laquelle on utilise un anticorps complémentaire pour qutil se combine avec des complexes antigène-anticorps) ou une technique en phase solide. Comme exemple de cette dernière technique on peut citer un procédé dans lequel on fixe l'anticorps dirigé contre l'anti génie à la surface intérieure de tubes en matière plastique; après une période d'incubation, on peut séparer par décantation et doser la fraction d'antigène non fixée (libre). Un des objets de l'invention est un procédé de détermination immunologique qui ne nécessite pas le stade précité qui est long et emploie un appareillage et que l'on peut mettre en pratique de façon relativement simple et rapide. Selon le procédé de l'invention, pour effectuer la détermination immunologique d'un antigène, on fait s'écouler sur et/ou à travers une base, une matrice ou un substrat où sont immobilisés des anticorps dirigés contre antigène, un mélange liquide contenant a) une quantité connue (qui peut titre nulle) d'antigène mar qué avec b) 1 "antigène non marqué à déterminer, si bien que l'antigène marqué et l'antigène non marqué sont éliminés par combinaison avec les anticorps, puis on détermine la distance parcourue par l'antigène marqué dans le mélange pour obtenir une indication quantitative de l'antigène non marqué dans le mélange. Le taux d'élimination de l'antigène marqué et par consaquent de l'antigène détectable dépend de la quantité d'antigène non marqué présente et on comprend que comme le déplacement est en liaison avec la quantité totale d'antigènes, sa mesure permette de calculer les proportions relatives dans 'le mélange d'origine. Dans le procédé de l'invention, on peut utiliser un antigène marqué comme précédemment décrit On peut provoquer l'écoulement du mélange d'antigène marqué et d'antigène non marqué selon une technique chromas tographique dans laquelle le mélange s'écoule dans une me- che constituée par exemple de papier sur laquelle les anti corps spécifiques de l'antigène sont immobilises. Après la chromatographie, on peut determiner la distribution de 1 ' an tigène marqué le long de la mèche pour calculer la quantité initiale d'antigène non marque. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne un dispositif pour la-détermination immunologique d'un antigène constitué d'une base, d'une matrice ou d'un substrat où sont immobilisés des anticorps spécifiques de l'antigène et d'un moyen pour établir un écoulement de liquide contenant l'antigène marqué et l'antigène non marqué sur et/ou à- tra- vers la base, matrice ou substrat. L'invention est illustrée par les exemples non limita- tifs suivants. Supposons que l'antigène a > déterminer soit l'oestriol 16a~glucuronide (E3G). C'est un stéroide dont les concentrations sont élevées lors de la grossesse- humaine normale. Les variations de ces concentrations sont liées à la santé du foetus. On utilise comme anticorps spécifique de 1'E3G, de 1' antioestriol-l6-glucuronide (titre : 1/200) préparé selon des procédés immunologiques classiques et qui est immobilisé sur une base, matrice ou substrat consistant en une mèche de papier. Pour cela on active tout d'abord le papier pour qu'il reçoive l'anticorps. Le papier utilisé est du papier- filtre Whatman et on l'active avec du bromure de cyanogène. On découpe le papier en bandes, par exemple de 8 cm de long et de 1 cm de largeur et on dispose ces bandes sur des supports constitués de vis parallèles espacées en une matière re plastique appropriée, dont les tiges font saillie à travers des trous correspondants de chaque bande, les bandes étant maintenues séparées par des rondelles placées sur les tiges. On place les bandes de papier ainsi maintenues dans un récipient contenant du tampon carbonate 2M (pH 11,0) et on les maintient entre 4 et 6oC avec un mélange de glace-et d'eau. On ajoute goutte à goutte au papier de façon à ce qu'il n'y ait pratiquement pas d'élévation detempérature, du bromure de cyanogène dissous dans un volume minimal de N-méthyl pyrrolidone-2. On laisse le papier dans le mélange de tampon et d'activateur pendant environ 15 minutes en agitant de temps en temps avant de transférer le papier dans un entonnoir à plaque frittée refroidi où on le lave alternativement avec un mélange refroidi à 5 X en volume d'acétone dans l'eau et une solution de tampon bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 0,5). On mélange l'anticorps anti-oestriol-16 -glucuronide avec 5 ml de tampon bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 9,5) et on le maintient à 40C jusqu'd ce qu'on y plonge le papier activé lavé. On incube à 4C en agitant constamment pendant au minimum 15 heures. 'Après élimination de la solution d'anticorps (quoi conserve pour la réutiliser), on lave le papier à fond- avec une solution tampon appropriée (jusqu'à ce qu'od n'observe plus de moussage après agitation énergique) pour éliminer les protéines non absorbées par covalence. On laisse le papier sécher à la température ordinaire puis on le conserve à l'état sec dans un flacon à bouchon vissé jusqu'à l'emploi. On divise ensuite chaque bande de papier de façon à obtenir deux mèches longues chacune de 8 cm et larges de 0,5 cm que l'on marque sur leur longueur: à des intervalles de 0,5 cm. Bien entendu l'anticorps est immobilisé sur chacune de ces bandes. En pratique, les mèches seraient protes à ltemploi et feraient partie d'un ensemble approprié à la mise en oeuvre du procédé de l'invention. On prépare ensuite une solution d'E3G marqué par exemple par dissolution d'oestriol-16 -glucuronide tritié dans le méthanol pour que 5 ul contiennent environ 1 000 opm (ce qui correspond à environ 14 pg de stérolde), le tritium constituant le marqueur de cet antigène. On applique ensuite cette solution et une quantité prédéterminée de l'antigène à analyser à une des mèches précédemment décrites soit sous forme d'un mélange, soit séparément, par exemple sous forme de dépôts ponctuels dont l'ordre de réalisation ne modifie pas les résultats finals. On dispose ensuite la mèche verticalement et on laisse un solvant approprié, par exemple un mélange en parties égales de glycérol et d'eau, s'élever par capillarité du bas de la mèche vers le haut. On retire ensuite la mèche et on la sèche, et bien entendu la distribution du E3G marqué dans la mèche reflète la uantité de E3G non marqué présente te au départ Pour déterminer facilement cette distribu- ton, on traite à nouveau la mèche avec une solution tampon appropriée.On effectue ensuite une chromatographie dans un flacon de comptage pendant environ 5 à 10 minutes, On retire la mèche du flacon et on la découpe an morceaux de 0,5 cm et on détermine la radio-activité de chacun de ces morceaux après addition de 4 mi du liquide de scintilla- tion NE 260 Scintillation Fluid. La somme des comptage des morceau constitue le nombre total eau de comptages de départ On calcule le pourcentage par rapport à la totalité de chaque morceau et on en trace le graphique en fonction de la position dans la mèche. il convient de noter que lorsque la solution mixte d'E3G marqué et d'E3G non marqué (qui, si on le désire, peut avoir été mélangée au préalable avec le solvant constitué de glycérol et d'eau au lieu autre placé sous forme d'un dépôt ponctuel comme précédemment décrit) se déplace le long de la mèche entraînée par le solvant, 1'E3G marqué et 1'E3G non marqué sont éliminés de la solution par combinaison avec les anticorps immobilisés et que la proportion des molécules dE3G marqué éliminées dépend de la quantité de mo- lécules d'E3G non marqué présentes. Pour des quantités dif- férentes d'E3G non marqué, une quantité donnée d'E3G marqué presente une modification de la distribution le long de la mèche. La technique décrite constitue un procédé très simple, rapide et pratique de détermination de l1antigène. Ce pro cédé rend inutile une période d'incubation et la séparation des antigènes libres des antigènes fixés. Ces stades sont remplacés par la chromatographie décrite. On peut utiliser le procédé de l'invention avec une grande diversité d'antigènes, tels que des stérordes, des progestérones, des hormones et l'insuline. Contrairement aux procédés d'électrophorèse, on peut l'utiliser avec des antigènes sans charge-électrique et on peut l'appliquer b de petits antigènes. L'invention en raison de sa simplicité, en particulier de l'inutilité de la séparation des antigènes libres des antigènes marqués en un stade quelconque, constitue un procédé qu'il est facile d'automatiser. Un autre avantage est qu'il est simple de combiner plusieurs déterminations d'antigènes différents en une opération unique.Dans ce dernier procédé on peut utiliser une mèche unique ayant des sections différentes portant des anticorps correspondan't aux déterminations différentes. I1 convient de noter que le paramètre que l'on mesure n'est pas l'activité enzymatique, la radio-activité ou une autre propriété qualitative due au marqueur; le paramètre que 1 'on mesure est la distance parcourue le long de la matrice. tour mettre en pratique le procédé de l'invention, on peut effectuer le marquage de l'antigène marqué autrement qu'avec du tritium. Par exemple on peut coupler l'antigène à une enzyme ou une enzyme photo-émettrice telle que la luciférase ou à un agent fluorescent pour permettre son évaluation selon des techniques photométriques. On peut même incorporer un détecteur électronique capable d'effectuer la commutation de transistors ou de portes incorporés à la matrice si bien que les résultats sont directement fournis par la matrice. D'autres variantes sont possibles. Bien que le procédé de l'invention ait été décrit relativement à l'emploi d'une mèche, on peut utiliser comme matrice pour immobiliser les anticorps, d'autres éléments par exemple une bande ou un tube revêtus d'une substance polymère appropriée. Revendications 1.- Procédé pour la détermination immunologique dpun antigène, caractérisé par le fait qu'on fait s'écouler sur et/ou a travers une base, matrice ou substrat où des -anti- corps dirigés contre l'antigène sont immobilisés, a) une quantité connue (qui peut être nulle) d'antigène marqué avec b) l'antigène non marqué à déterminer, de façon que l'antigène marqué et l'antigène non marqué soient éliminés par combinaison avec les anticorps, puis on détermine la distance parcourue par l'antigène marqué dans le mélange pour obtenir une indication quantitative de l'antigène non marqué dans le mélange. 2.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel on effectue le marquage par substitution d8un ou plusieurs ato mes non radio-actifs de l'antigène par un ou plusieurs atomes radio-actifs, ou par addition d'un atome radio-actif à l'antigène ou par addition d'une matière détectable selon des techniques photométriques ou électroniques. 3.- Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel la base, matrice ou substrat est sous forme dsu- ne mèche. 4.- Procédé selon la revendication 3, dans lequel la mèche est en papier. 5.- Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, dans lequel, pour immobiliser les anticorps sur la mèche, on active tout d'abord la matière de la mèche par application de bromure de cyanogène puis application de la solution d'anticorps et séchage. 6.- Procédé selon la revendication 5, dans lequel on effectue 1' activation par immersion dans un tampon puis addition goutte à goutte du bromure de cyanogène en solution. 7.- Procédé selon la revendication 6, dans lequel, après l'activation, on lave alternativement la mèche avec un mé- lange refroidi d'acétone et d'eau et une solution tampon de bicarbonate de sodium. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 5, 6 ou 7, dans lequel on effectue l'application de l'anticorps par immersion de la mèche activée dans une solution d'anticorps. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, dans lequel on lave la mèche avec une solution tampon appropriée (PBSM), pour éliminer les protéines non absorbées par covalence. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on fait s'écouler le mélange d'antigènes le long de la mèche au moyen d'une solution de glycérol et d'eau. 11.- Procédé selon la revendication 10, dans lequel on effectue un dépôt ponctuel du mélange d'antigènes sur la mèche puis on place la mèche verticalement avec son extrémité inférieure trempant dans la solution de glycérol et d'eau. 12.- Base, matrice ou substrat pour effectuer une détermination immunologique d'un antigène selon l'une quelconque des revendications précédentes,sous forme d'une matrice sur laquelle des anticorps dirigés contre l'antigène ont été immobilisés. 13.- Matrice selon la revendication 12, sous forme d'une mèche de papier.