Brevet FR2482969A1 — publié le 19811127

La presente invention est relative à un nouveau glucanne hydrolyse à un procédé pour sa préparation ainsi qu'à des compositions pharmaceutiquement acceptables le contenant. Le glucanne suivant l'invention est utilisable notamment comme agent immunomodulateur dans le traitement des cancers et du rhumatisme articulaire. On sait que les fongi de la classe des Basidiomyetes peuvent produire des polysaccharides qui agissent sur les cancers et autres tumeurs Toutefois, ces polysaccharides sont peu solubles dans l'eau et, même s'il est possible d'obtenir une solution aqueuse de n'importe lesquels d'entre eux, cette solution se transforme aisément en gel. Il s'ensuit qu'il est tres difficile d'effectuer des essais pharmacologiques avec ces polysaccharides et encore plus difficile d'utiliser les polysaccharides à des fins thérapeutiques. Le rhumatisme articulaire est une maladie incurable et, bien qu'on ait étudié de nombreux médicaments afin d'essayer de la guérir, les essais effectués n'ont pas été couronnés de succès Les traitements connus (par exem ple: traitement avec des stérodes, des agents non-steroï- des et des agents anti-inflammatoires , des médicaments à base d'or, etc.) sont tous des traitements symptomatiques et n'agissent pas sur la cause du mal. Le brevet japonais n 828.248 décrit un procédé de préparation d un polysaccharide ayant une activité antitumeur, consistant à cultiver un microcrganisme-producteur de glucanne du genre Corticium ou du genre Hypochnus, puis puis à sépares du bouillon de culture un glucanne présentant des liaisons dans sa channe principale et des liaisons dans ses ramifications. Toutefois, comme décrit ci-dessus, le glucanne résultant, bien qu'ayant une activité anti-tumeur, est difficile à utili- ser en pratique car ses solutions aqueuses ont tendance- à gélifier.Toutefois, la Demanderesse a maintenant découvert de façon surprenante qu'en traitant des glucannes de c type par l'acide formique puis en hydrolysant le produit résultant, on peut obtenir un glucanne ayant une hydroso lubilité sensiblement améliorée et en outre, de façon inattendue, une activité anti-tumeur très ameliorée. C'est ainsi que la pressente invention a pour objet un glucanne présentant des liaisons dans sa chaine principale et des liaisons dans ses ramifications, le rapport de motifs glucose dans les ramifications à motifs glucose dans la chaine principale étant de 2/7 environ, le glucanne étant caractérisé par les pro priétés suivantes:: (a) le produit lyophilisé se présente sous la forme d'un produit solide amorphe blanc; (b) il est soluble dans l'eau, dans le diméthyl sulfoxyde et dans le diméthylformamide, et il est insoluble dans I'éthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, le benzène et l'éther diéthylique; (c) son analyse élémentaire correspond essentiellement aux valeurs calculées pour un polysaccharide hydraté detype hexoside répondant à la formule (C6H1005)n.nH20 /dans laquelle n est un nombre, calculé d'apres la propriété (e), supérieur à 800 /; (d) il a un spectre infrarouge (poudre de KBr) correspon dant essentiellement à celui représenté au dessin annexé; et (e) on n'observe qu'un pic unique à l'analyse spectrosco pique par ultracentrifugation, et il a une masse molé culaire de 150.000 à 160.Q00, calculéed'apres la constante de sédimentation; le glucanne pouvant être préparé en traitant par l'acide formique un polysaccharide produit par un fongus de la famille des Corticiacées , puis en hydrolysant le produit traité. L'invention vise également un procédé de préparation du glucannehydrolysé suivant l'invention, consistant à traiter par l'acide formique un polysaccharide produit par un fongus de la famille des Corticiacées, puis en hydrolysant le produit traité. L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique contenant, à titre de principe actif, le glucanne hydrolysé suivant la présente invention en mélange avec un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable. Le polysaccharide utilisé comme substance de départ pour le procédé suivant l'invention est un produit métabolique d'un fongus de la famille des Cortiçiacées (Basidiomycètes), par exemple un fongus du genre Corticium ou Hypochnus. On peut obtenir ce polysaccharide de départ en cultivant le fongus choisi, comme décrit de façon plus détaillée dans le brevet japonais nO 828.248. On prépare de préférence le glucanne hydrolysé suivant la présente invention en ajoutant une solution aqueuse d'acide formique à 70-90 pds/pds au polysaccharide de départ et en chauffant le mélange résultant, de préférence en agitant. La température à laquelle on porte le mélange réactionnel n'est pas particulièrement critique, bien qu'une température de 80 à 1000C soit préférable. Le temps nécessaire à cette réaction dépend des conditions réactionnelles, en particulier de la température, mais la réaction est normalement menée à bonne fin en un laps de temps de 5 minutes à 1 heure.Il est préférable que l'excès d'acide formique soit ensuite éliminé par évaporation sous pression réduite, après quoi on ajoute de l'eau afin d'hydrolyser le résidu. I1 est préférable d'effectuer l'hydrolyse en chauffant le mélange au reflux jusqu'à ce que la déformylation soit terminée. Le materiau gélatineux produit peut être sépare par centrifugation, et on ajoute un solvant organique à la liqueur-mère afin d'obtenir un précipité qu'on recueille. La nature du solvant utilisé à ce stade n'est pas particulièrement limitée, tant qu'il ne dissout pas le polysaccharide hydrolysé; il est préfé- rable d'utiliser un alcool comme le méthanol ou 1 D ehanol. On dissout ou disperse le précipité dans de l'eau, et on lyophilise la solution ou dispersion, obtenant ainsi le polysaccharide hydrolyse cherché sous la forme dgun produit solide blanc amorphe. Ce produit solide amorphe est soluble dans l'eau, le diméthyl sulfoxyde et le diméthylformamide et est insoluble dans l'éthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, le benzène et l'éther diéthylique. I1 est thermo-résistant. Les résultats de l'analyse élémentaire correspondent à ceux calculés pour un polysaccharide hydraté de type hexoside et répondant à la formule (C6H1005)n.nH20. Le spectre infrarouge du produit (dans la poudre de bromure de potassium) est illustré à la Fig.l. I1 a un pouvoir rotatoire 7p = -15 + 50 (c = 0,1, diméthyl sulfoxyde).On n'observe qu'un pic unique à l'analyse spectroscopique par ultracentrifugation du produitset,d'après la constante de sédimentation, sa masse moléculaire s'avère comprise entre 150.000 et 160.000, d'après quoi il est possible de calculer que la valeur de n dans la formule ci-dessus est de 833à 889. Les saccharides constitutifs de ce glucanne hydrolysé peuvent être identifiés comme suit. On dissout le glucanne hydrolysé dans une solution aqueuse d'acide sulfurique 1N puis on hydrolyse à 1000C pendant 120 minutes dans un tube scellé. Puis on neutralise le produit à l'aide d'hydroxyde de baryum et on le soumet à une chromatographie sur papier. Lorsqu'on développe le papier de chromatographie à l'aide d'une solution aqueuse ammoniacale de nitrate d'argent, on n'observe qu'une tache unique. Le produit représenté par cette tache unique peut être identifié comme étant du glucose en le comparant avec un essai identique sur un échantillon témoin. Le mode de liaison des motifs glucose constituant le glucanne hydrolysé suivant la présente invention peut être déterminé en méthylant complètement le glucanne par des moyens classiques, en hydrolysant le glucanne méthylé afin d'obtenir du glucose méthylé, en réduisant le glucose méthylé et en acétylant le produit réduit. La chromatographie gazeuse identifie le mélange résultant comme étant constitué par des acétates de 2,3,4, 6-tétra-O-méthylglycitol, de 2,4,6-tri-O-méthylglycitol et de 2,4-di-O-méthylglycitol en un rapport molaire d'en viron 1/2,5/1. Ce résultat confirme que le glucanne suivant la présente invention contient environ deux ramifica tisons (constituées chacune par un seul motif glucose) liées par une liaison pour 7 motifs glucose, et présentant des liaisons dans la chaîne principale du glucanne. En outre, il se confirme que toutes les. liai- sons glucose sont en la configuration /3 , par observation de produits décomposés par l'endo-1,3-glucanase et l'exo -ss-1,3-glucanase. Le glucanne hydrolysé suivant la présente invention est plus hydrosoluble et moins gélifiable en solution aqueuse que le polysaccharide à partir duquel on l'a préparé. En outre, ses activités immunomodulatrices (par exemple son activité anti-cancer et son activité suppressive de l'arthrite) sont très fortes et ne s'accompagnent que d'une faible toxicité. En particulier, la forte activite suppressive de l'arthrite et la faible toxicité n' au- raient pas pu être prévues d'après les activités de polysaccharides produits directement à partir de fongi de la classe des Basidiomycètes. Il s'ensuit que le glucanne hydrolysé suivant la présente invention est notamment utilisable pour traiter des maladies résultant de troubles du système immune, comme par exemple le rhumatisme articulaire. Les activités biologiques et la toxicité du glucanne hydrolysé suivant l'invention sont mises en évidence par les essais suivants. (1) Activité anti-néoplasique On effectue les essais sur des souris mâles de 7 semannes, de souche YCP On greffe 2 ., 106 cellules cancéreuses de Sarcome 180 sur la peau de la région axillaire chaque souris. bout de 6 et 7 jours après greffage, on administre un échantillon du glucanne hydrolysé suivant l'invention (produit comme décrit dans exemple 1 ciaprès) dans du sérum physiologique par injection dans l'abdomen; la concentration de la solution physiologique de glucanne hydrolysé est de 0,1% pds/vol. 25 jours après Quantité administrée Taux de suppression Régression tng/kg de poids corpo- de la tumeur (%) complète rel/jour) 0,1 47 1/5 1,0 85 3/4 10,0 100 5/5 (2) Activité anti-arthritigue On effectue les essais suivant les modes opératoires de Winder et al./C.V. Winder, L.A. Lambke et M.D, Stephens, Arth.Rheum., 12, 472 (1969/ permettant de mesurer le pouvoir qu'ont des composés de supprimer l'arthrite à l'adjuvant chez le rat, cet essai étant classiquement utilisé pour l'évaluation des agents anti-néoplasiques. A des rats Lewis on injecte l'adjuvant par voie souscutanée dans la face plantaire de la patte arrière droite, le greffage, on mesure le diamètre de la tumeur. On effectue un essai identique sur un lot de souris témoin auxquelles on n'a pas administré de glucanne hydrolysé, et on calcule le taux de suppression de la tumeur (%) d'après la formule suivante: do -d x x 100 d o dans laquelle d représente le diamètre moyen de la tumeur -o (en mm) du lot témoin et d représente le diamètre moyen de la tumeur du lot traité. Les résultats obtenus sont rapportés au tableau 1, qui montre l'effet, sur le taux de suppression de la tumeur, des variations des quantités de glucanne hydrolysé administrées par jour. 45 jours après le greffage t on examine soigneusement toutes les souris, afin de déterminer le nombre de souris présentant une régression complète-de la tumeur. Les résultats de cet examen sont également rapportés au tableau i, dans lequel le nombre de souris présentant une régression complète est rapporté en proportion du nombre total de souris testées dans Ele groupe concerné. Tableau 1 afin de provoquer la maladie. Puis on injecte une solution du glucnne hydrolysé suivant l'invention, chaque jour, dans l'abdomen, pendant 15 jours après l'inoculation de l'adjuvant. On effectue des essais identiques sur un lot témoin d'animaux auxquels on n'administre pas le glucanne hydrolysé. 18, 20, 24, 28 et 32 jours après l'inoculation de l'adjuvant, on compare le gonflement des -pattes des rats traités avec celui des pattes des rats non traités et, en utilisant une formule similaire à celle utilisée pour calculer le taux de suppression de la tumeur, on calcule le taux de suppression pour chaque dose du glucanne hydrolysé. Les résultats (moyennes) sont rapportés au tableau 2 suivant. Tableau 2 Quantité administrée Nombre Taux de (mg/kg de poids cor- d'ani- suppression dol50 porelZjour) maux 0,1 5 36,8 + 3,6 0,33 1,0 10 59,0 + 3,9 (3) Toxicité aigue On effectue un test de toxicité aigue (une semaine d'observation) en injectant des échantillons du glucame hydrolysé dans l'abdomen de souris mâles ddy. Après administration du produit a des doses de 100 et 300 mg/kg, on n'observe pas de mortalité et le poids augmente de façon normale. Il découle des résultats ci-dessus que le glucanne hydrolysé suivant la présente invention est très précieux comme agent immunomodulateur . I1 est préférable d'administrer l'agent par voie parentérale (par exemple par injection sous-cutanee, intraveineuse ou intramusculaire). La posologie journalière varie suivant la maladie à traiter, la voie d'administration et la fréquence d'administration mais, d'une façon générale, la posologie journalière chez l'adulte est de préférence de 0,5 à 50 mg, par exemple de 5 mg environ. On peut l'administrer en une seule dose ou en doses fragwntees. Le glucanne hydrolysé suivant l'invention peut être présenté sous une forme convenant à la voie d'administration choisie, en utilisant tout type de composition couramment utilisé pour d'autres agents immunosuppresseurs. Par exemple, on peut présenter une composition dans une ampoule, sous forme de dose unitaire, ou la présenter dans un récipient pour plusieurs doses, de préférence en association avec une substance antiseptique. La composition peut être sous la forme d'une suspension, d'une solution ou d'une émulsion dans un véhicule huileux ou aqueux, et peut comprendre des adjuvants classiques, par exemple des agents de mise en suspension et/ou stabilisants et/ou dispersants. L'ingrédient actif peut également être présenté sous la forme d'une poudre à dissoudre avant l'administration dans un véhicule approprié, par exemple de l'eau stérile apyrogène. Lorsque la composition suivant l'invention est présentée sous la forme de doses unitaires, elle contient de préférence de 0#5 à 10 mg d'ingrédient actif par dose unitaire. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de la présente invention. L'exemple 1 illustre la préparation du glucanne hydrolysé suivant l'invention et l'exemple 2 illustre la préparation d'une composition pharmaceutique le contenant. EXEMPLE 1 A 3g- de Corticane (polysaccharide produit par un fongus de la famille des Corticiacées comme décrit dans la préparation du Corticane donnée ciaprès) on ajoute 240 ml d'une'solution aqueuse d'acide formique à 90%/pds. On-porte le mélange à 950C pendant 20 minutes, en agitant. Après avoir évaporé l'acide formique sous pression réduite, on ajoute 600 ml d'eau au résidu et on chauffe le mélange aqueux résultant au reflux. Puis on centrifuge le mélange réactionnel pendant 15 minutes à 10.000 tours/min. Au liquide surnageant ainsi séparé on ajoute 2,4 litres d'éthanol, et on recueille le précipité résultant par centrifugation. On ajoute 500 ml d'eau au précipité, puis on lyophilise le mélange aqueux, obtenant ainsi 2,0 g du glucanne hydrolysé cherché, sous la forme d'un produit solide amorphe blanc. Le produit présente les caractéris- tiques suivantes: Analyse élémentaire, pour (C6H10O5)n nH2O C H Eau Calculé %: 40,00 6,71 10,00 Trouvé %e 40,22 6,52 9,63 Pouvoir rotatoire /cL/D = 150 (c = 0,1, diméthyl sulfoxyde). Spectre d'absorption IR (KBr) # cm-1 : 3400, 1640, 1080, 1040. Masse moléculaire (analyse par ultracentrifugation, tampon phosphate, pH 6,5): 159.000. EXEMPLE 2 On dissout 5 mg du glucanne hydrolysé obtenu à l'exemple 1 dans 2 ml de sérum physiologique, puis on stérilise la solution en chauffant de la manière habituelle afin d'obtenir une solution injectable PREPARATION DU CORTICANE Dans cinq flacons de Sakaguchi de 500 ml on introduit 100 mi d'un milieu glucose-pomme de terre contenant 2 % en poids de glucose dans une soupe bouillie contenant 200 g par litre de pommes de terre, et on stérilise les contenus. On inocule ces flacons avec une culture de Corticium vagum F-31-9 (FERM N0 302) et on effectue une culture sous agitation à 260C pendant 8 jours. A la fin de la culture on ajoute 800 mi d'eau distillée à 400 mi de bouillon de culture et on ajuste le pH à 7,4 .On homogénéise le mélange dans un homogénéiseur et on élimine les substances solides par centrifugation Al litre du surnageant on ajoute 3 litres d'éthanol et le précipite résultant est recueilli par centrifugation et dissout dans de l'eau distillée Puis on ajoute 162 mi d'une solution aqueuse 0,1 N de bromure de cétyltriméthylammonium et 13 ml d'une solution aqueuse 0,5 M d'hydroxyde de sodium pour ajuster le pH de la solution à 12,6 , ce qui provoque la précipitation des polysaccharides.On ajoute 300 ml d'une solution aqueuse à 10 % poids/volum2 d'acide acétique au précipité résultant afin de le dissoudre et on ajoute 1,2 litre d'éthanol à la solution . On dissout le précipité résultant en 350 ml d'eau distillée et l'on introduit la solution dans un tube en cellulose et on effectue une dialyse avec de l'eau distillée. A 500 ml du dialysant on ajoute 2 litres d'éthanolpour précipiter à nouveau les polysaccharides. On dissout le précipité résultant dans 100 ml d'eau distillée et on effectue une lyophilisation ce qui donne 2g de glucanne brut. On dissout 13,5 mg de ce glucanne brut dans 27 ml d'eau distillée et on fait passer la solution à travers une colonne de Sephadex G-200 . On élue la colonne avec de l'eau distillée et on recueille l'éluat sous forme de fractionsde 20 ml. Le glucanne présente un pic dans la troisième fraction et on récupère 75,3 % du polysaccaharide total dans les fractions 2 à 11 inclus. On réunit ces fractions de 2 à 11 et on ajoute 800 ml d'éthanol à la solution résultante pour provoquer la précipitation. On dissout le précipité résultant dans de l'eau distillée et on lyophilise ;on obtient ainsi 9,2 mg d'un glucanne appelé "Corticane ". Le Corticane est une substance neutre blanche. REVENDICATIONS 1. Glucanne hydrolysé utilisable notamment comme agent immunosuppresseur et présentant des liaisons dans sa chaîne principale et des liaisons dans ses ramifications, caractérisé en ce que le rapport de motifs glucose dans les ramifications à motifs glucose dans la chaîne principale est d'environ 2/7 et le glucanne a les propriétés suivantes: (a) le produit lyophilisé est un matériau solide amorphe blanc; (b) il est soluble dans l'eau, le diméthyl sulfoxyde et le diméthyl formamide, et insoluble dans 1'méthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, le benzène et l'éther diéthylique; (c) son analyse élémentaire correspond essentiellement aux valeurs calculées pour un polysaccharide hydraté de type hexoside répondant à la formule (C6H1005)n.nH20 dans laquelle n est un nombre, calculé d'après la propriété (e), supérieur à 800; (d) ila un spectre infrarouge (poudre de KBr)-correspondant essentiellement à celui représenté au dessin; et (e) on n'observe qu'un pic unique à l'analyse spectroscopique par ultracentrifugation, et il a une masse moléculairede 150.000 à 160.000, calculée d'après la constante de sédimentation; le- glucanne pouvant être préparé par traitement par l'acide formique d'un polysaccharide produit par un fongus de la famille des Corticiacées, puis par hydrolyse du produit traité. 2. Procédé de préparation d'un glucannehydrolysé, caractérisé en ce qu'on traite par l'acide formique un polysaccharide produit par un fongus de la famille des Corticiacées, puis on hydrolyse le produit traité. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'acide formique utilisé est une solution aqueuse d'acide formique à 70-90% pds/pds. 4. Procédé suivant la revendication 2 ou 3, caracté -risé en ce qu'on fait réagir le polysaccharide avec lgaci- de formique à une température de 80 à 1000C. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse en chauffant au reflux un mélange d'eau et dudit produit traité, jusqu'à bonne fin de la déformylation. 6. Composition pharmaceutique ayant notamment une activité immunomodulatrice et comprenant un agent immunosuppresseur en association avec un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable, caractérisée en ce que l'agent immunosuppresseur est un glucmne hydrolysé suivant la revendication 1. 7. Composition suivant la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est présentée sous une forme appropriée pour l'administration par voieparentérale.