Brevet FR2484651A1 — publié le 19811218

La présente invention est relative à un procédé d'obtention d'une solution d'acides aminés et de peptides d'origine animale, par voie enzymatique. On prépare un produit pharmaceutique présentant une activité spécifique à l'égard des cellules nerveuses, qui est utilisable pour le traitement des affections de ce type de cellules, sous la forme d'une spécialité pharmaceutique injectable, à l'aide d'une solution d'origine biologique obtenue par digestion enzymatique de produits biologiques déterminés. De façon classique, l'obtention de solutions d'aminoacides et de peptides d'origine animale, donne lieu à des produits constitués par des complexes naturels, qui ne sont pas bien définis, dont on peut s'attendre à ce qu'ils présentent des effets secondaires indésirables lorsque l'on recourt à la voie injectable ; la caractéristique nouvelle du procédé proposé conformément à la présente invention réside dans l'obtention et le fractionnement de ces complexes naturels. Par rapport aux procédés classiques anterieurs, le procédé proposé conformément à la présente invention con sistre à effectuer une protéolyse dans des conditions appropriées, de solutions aqueuses d'origine animale, soumises à des purifications ou à des fractionnements qui garantissent la constance de leur composition et leur aptitude à l'emploi par voie intramusculaire dans le traitement des affections des cellules nerveuses. La mise en oeuvre du procédé qui fait l'objet de la présente invention comporte les phases opérationnelles suivantes On part, pour l'obtention du produit recherché, de liquides d'origine animale, par exemple, de fractions de lait d'animaux parfaitement sains, dont la conservation préalable dans des conditions extr8mes de stérilité est fondamentale pour éviter les dégradations possibles par autolyse. On détermine les- constantes de ce liquide et on procède à 1'é1Eminaton de ses constituants gras, par extraction à l'aide de solvants appropriés ou par centrifugation, l'éli- mination totale du solvant étant indispensable, par application d'un vide à température réduite, avant de pouvoir passer à la phase suivante. On ajuste le pH à 6-6,8 par addition d'une quantité suffisante d'un acide organique (tel que l'acide citrique, lactique, etc...) et on concentre auxdeux tiers de son volume, sous pression réduîte,sans que la température dépasse 450C. La phase opérationnelle suivante consiste à effectuer un ajustement du pK à 4-5 et de la température à 45-55"C, ainsi qu'à éliminer par filtration stérile, le sédiment qui s'est formé. On obtient ainsi une solution dont on détermine la teneur en azote, en cendres,etc... et on procède, au cours de la phase opérationnelle suivante, à l'incorporation d'une quantité proportionnelle de ferments d'origine animale dont le pouvoir enzymatique (protéolytique, lipolytique et amylolytique) est ajusté de façon exacte en rapport avec le substrat. Comme ferment d'origine animale, on utilise la muqueuse gastrique de porc en suspension aqueuse, jusqu'à obtention du volume initial. La muqueuse gastrique obtenue dans les conditions maximales de stérilité et à basse température, est conservée à l'état lyophilisé jusqu'au moment de son emploi, après avoir déterminé au préalable son pouvoir enzymatique. Après avoir ajusté le pH à 5-6 et la température à 40-550C, on maintien la digestion dans des conditions sté- riles pendant un temps approprié, pour obtenir le degré de digestion optimum ; on arrête la digestion susdite, on ajuste le pH à 5-6 et on concentre sous vide approximativement au 2/3 de son volume, puis on élimine le résidu insoluble par ultracentrifugation. On procède aux vérifications requises du pH, du résidu sec-, de l'azote, de la densité, etc... On détermine sa teneur finale en acides aminés et en peptides et on conser ye la solution à l'état stérile et au froid jusqu'au moment de son emploi, On obtient-à l'aide de ce procédé, un produit qui présente les valeurs normales suivantes Couleur : ambre foncé Densité : 1,04Q - 1,060 pH : 4,9 - 5,2 Résidu sec : 0,140 - 0,16Q g/cm3 Protéines totales ; 5,9 - 6,9 g% Polypeptides et amino-acides : 2,10 - 2,90 g% Protéoses et peptones : 3;48 - 4,0 gt Chromatographie a) chromatographie sur colonne quantité d'échantillon 2 ml Colonne :K 26/70 Garnissage : Séphadex G-10 Eluant : Acide formique à 5 % Débit ; 8 - 9 ml/heure On obtient le chromatogramme représenté à la figure 1. b) Chromatographie en couche mince : on utilise une plaque de cellulose. Eluant ; n-butanol/acétone/acide acétique/eau (35/35/7/23), 3 cm3 de solution de ninhydrine 0,4 M dans du n-butanol/acétone pour chaque fraction de 40 cm de I'éluant. On effectue une lecture au densitomètre pour déterminer les pourcentages. On obtient le chromatogram me de la figure 2. Acides aminés totaux : voir Tableau I Activité biologigue ; récupération a 100 t TABLEAU I ACIDES AMINÉS TOTJX - Valeurs normales exprimées en e Asp 10,5560 Thr 2,7037 Ser 3,9367 Glu 13,3255 Pro 13,1496 Gly 18,3892 Ala 8,6542 Val 2,9502 Met 1,3072 Ile 2,Q330 Leu 4,1119 Tyr 1,3540 Phe 2,2774 Lys 5,4244 His 1,5557 Arg 8,0640 On admet une variation de ces valeurs de + 15 %. L'action pharmacologique du produit obtenu confor mément a l'invention, est représentée par la capacité de faire disparaXtre la symptomatologie obtenue expérimentalement chez des animaux de laboratoire par administration d'agents neuro-toxiques tels que la nitrofurantoine et l'acrylamide Une telle intoxication produit chez les animaux une Sncoordination motrice, la débilité et une paralysie à régression difficile. L'admintstratison de la solution d'acides aminés et de peptides qui fait l'objet de la présente invention détermine la régression de la névropathie provoquée et la disparition des symptômes décrits. L'étude approfondie de ces névropathies toxiques expérimentales, ainsi que des névropathies de caractère traumatique comme celles qui sont produites, par exemple, par écrasement des nerfs chez des animaux de laboratoire, au moyen d'enregistrements électromyographiques (vitesse de conduction et potentiels évoqués du nerf) montre également l'effet exercé par le produit sur l'évolution et la récupération des valeurs normales desdits paramètres physiologiques chez des animaux atteints de névropathies graves. La comparaison des effets exercés par le produit avec ceux des autres produits présentant des actions thérapeutiques similaires, tels que la co-enzyme B12 par exemple, met en valeur la plus grande capacité de régénération et l'efficacité thérapeutique plus grande du produit conforme à l'invention. Le produit obtenu ne présente pas d'activité antiinflammatoire specifique. Cette absence d'activité antiinflammatoire a été vérifiée sur les oedèmes induits chez le rat à l'aide de sérotonine, de levure de bière, d'albumine et de dextrane, aussi bien en ce qui concerne les propriétés inhibitrices que les propriétés curatives. Les essais effectués sur le rat, comparés avec un analgésique classique,(par exemple le diméthyloxyquinazine méthylèneméthylaminosulfonate de magnésium) démontrent l'absence d'action analgésique directe susceptible d'être exercée par le produit obtenu conformément à l'invention. I1 ressort de ce qui précède que le procédé conforme à la présente invention, qui vise à l'obtention d'une solution d'acides aminés et de peptides d'origine animale, par fractionnements successifs et hydrolyse partielle, en vue de son emploi en médecine, présente les avantages signalés pré- cédemment, Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente in invention, Il doi.'t être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Pour l'utilisation thérapeutique de la solution d'acides aminés et de peptides d'origine animale obtenue par voie enzymatique en mettant en oeuvre le procédé qui vient d'être décrit, on prépare des formes pharmaceutiques usuelles en thérapeutique,dont les indications principales sont les suivantes : névropathies périphériques, névralgies, et névrites et polynévrites. Ces formes pharmaceutiques peuvent contenir le principe actif associé à d'autres produits présentant une action métabolique sur les neurones, ou bien être constituées par le principe actif lui-même sans association aucune. a) Forme pharmaceutigue non associee La solution du principe actif qui répond aux spécifications mentionnées plus haut, est soumise à une filtration stérilisante (dimension de pores : 0,2 micron) et est introduite dans des ampoules stériles, dans des conditions de stérilité et en atmosphère inerte. Le produit est apte à l'emploi par voie intramusculaire, après contrôle. b) Forme EhBrmaceutìgue associée La solution de principe actif qui répond aux spécifications indiquées plus haut, est utilisée comme solvant d'autres substances thérapeutiques présentant une action métabolique sur les neurones (vitamines du groupe B, par exemple vitamines B1, B6 ou B12 à doses élevées). La solution, préparée en atmosphère inerte, est soumise à une filtration stérilisante (dimension de pores : 0,2 micron) et est introduite dans des ampoules stériles, dans des conditions de stérilité, en atmosphère inerte. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 10- Procédé d'obtention d'une solution d'acides aminés et de peptides d'origine animale, par voie enzymatique, caractérisé en ce que l'on élimine, par extraction ou centrifugation, les constituants gras d'une solution aqueuse d'origine animale, en ce que l'on ajuste le pH et la température de la solution provenant de l'étape précédente à une valeur appropriée et en ce que l'on élimine par filtration ou centrifugation, le sédiment qui s'est formé. 20r Procédé d'obtention d'une solution d'acides aminés et de peptides d'origine animale, par voie enzymatique, selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute la quantité proportionnelle de ferments digestifs à la solution provenant de l'étape antérieure, pour réaliser la protéolyse, dans des conditions appropriées, en ce que l'on maintient la digestion jusqu a ce que l'on ait atteint le degré de digestion désiré, et en ce qu'on élimine le résidu insoluble du produit provenant de l'étape précédente, par filtration ou centrifugation, après quoi on ajuste le résidu sec à la valeur voulue. 30- Solution d'acides aminés et de peptides d'origine animale, caractérisée en ce qu'elle est obtenue en mettant en oeuvre le procédé selon les Revendications 1 et 2. 49- Solution d'acides aminés et de peptides d'origine animale, caractérisée en ce qu'elle présente la composition en acides aminés suivante Asp 10,5560 g Thr 2,7037 % Ser 3,9367 % Glu 13,3255 % Pro 13,1496 t Gly 18,3892 % Ala 8,6542 % Val 2,9502 % Met 1,3Q72 % île 2,0330 % Leu 4,1119 % Tyr 1,3540 % Phe 2,2774 % Lys 5,4244 % His 1,5557 % Arg 8,0640 % 5 - Composition pharmaceutique caractériséeen ce qu'elle content en tant que constituant actif, une solution d'acides aminés et de peptides d'origine animale selon l'une quelconque des Revendications 3 et 4.