Brevet FR2480782A1 — publié le 19811023

Anticorps, clones pour la production de ces anticorps, procédé pour produire ces anticorps et ces clones et procédé de déter- mination immunologique utilisant ces anticorps. L'invention concerne un anticorps ayant une grande spé- cificité et une faible réactivité croisée, un clone capable de produire un tel anticorps, un antisérum comprenant un tel anti- corps et un procédé pour leur préparation. L'invention concerne également un procédé de détermination utilisant l'anticorps ou un antisérum comprenant l'anticorps. De plus l'invention concer- ne un procédé pour préparer un anticorps spécifique par emploi dudit clone. Les laboratoires cliniques sont capables de mesurer de nombreuses substances présentes dans l'organisme des animaux vivants telles que des hormones selon des méthodes de détermina- tion immunologique très spécifiques et très sensibles. Ces mé- thodes utilisent une réaction compétitive antigène-anticorps et emploient une quantité donnée d'un anticorps et diverses quanti- tés d'antigène. Par exemple, une détermination radio-immunologi- que comporte habituellement les quatre stades suivants: 1) Préparation d'un antigène marqué et d'un anticorps spécifique. 2) Réaction de l'antigène marqué avec l'anticorps spéci- fique en présence d'un antigène non marqué. 3) Séparation de l'antigène marqué du complexe immunolo- gigue de l'antigène marqué et de l'anticorps spécifique. 4) Détermination de la radioactivité, puis détermination de la teneur avec une courbe d'étalonnage. On peut également utiliser un anticorps marqué et un antigène non marqué. Parmi ces stades, le stade 1 est le plus important et l'anticorps utilisé comme réactif pour la détermination doit être spécifique de la substance à déterminer. Cependant cette condition qu'exige cette méthode n'est pas toujours remplie car, même lorsque la spécificité semble maximale, elle tend à être altérée par une réaction croisée avec diverses substances ayant une structure analogue à celle de la substance à déterminer. Pour résoudre cette difficulté on a utilisé diverses améliorations qu'on peut de façon générale diviser en les caté- gories suivantes: 2 2480782 1) Avant la détermination, on élimine les diverses subs- tances à réaction croisée des échantillons contenant la substan- ce à déterminer selon des techniques physico-chimiques. 2) On élimine avant l'emploi l'anticorps à réaction croisée contenu dans l'antisérum par emploi d'un immuno-adsor- bant. Sinon on peut utiliser un anticorps très purifié ayant une spécificité très élevée pour la substance à déterminer. Pour obtenir un anticorps ayant la spécificité la plus élevée possible, on a proposé de fixer un antigène, avant l'in- jection à un animal hôte, sur une protéine support en un site approprié de sa structure chimique pour que le (ou les) site déterminant approprié de l'antigène, que l'anticorps doit re- connaitre, apparaisse à la surface de la molécule support. La présence en surface d'un site déterminant spécifique stimule la formation d'un anticorps ayant une faible réactivité croisée. Cependant les procédés connus de ce type demeurent non satisfai- sants car ils nécessitent des opérations compliquées et un stade de synthèse. De plus dans certains cas il demeure diffici- le d'éviter, selon ces procédés, la production d'anticorps à réaction croisée et ces problèmes peuvent rendre très difficile la détermination immunologique de la substance désirée. L'invention repose sur la découverte que l'on peut, pour réduire au minimum la quantité d'anticorps à réactivité croisée et également pour obtenir un anticorps ayant une excellente spé- cificité pour une substance, par exemple une substance à déter- miner, utiliser un copolymère d'acide D-glutamique et de D- lysine (appelé ci-après D-GL) qui induit fortement l'absence de réponse immunologique (induction d'une tolérance) des cellules B servant de précurseurs à la production d'anticorps. Lorsqu'on administre à un animal un antigène couplé au D-GL, les D-amino- acides ne sont généralement pas facilement métabolisés dans l'organisme vivant et de plus le-D-GL n'induit pratiquement pas de réponse immunologique des cellules T de l'organisme vi- vant. Il semble donc que lorsqu'on administre un antigène con- jugué au D-GL à un animal, le conjugué antigène-D-GL se fixe de façon spécifique aux récepteurs superficiels des immunoglobuli- nes des lymphocytes B et confère à ces cellules une tolérance irréversible. L'invention concerne ainsi un procédé pour produire un 3 2480782 anticorps ayant une grande spécificité vis-à-vis d'un premier antigène désiré et ayant une faible réactivité croisée vis- à-vis d'au moins un autre antigène, ce dit autre antigène com- prenant au moins un déterminant antigénique dont la structure est apparentées à celle du déterminant antigénique désiré du premier antigène, ce procédé consistant à administrer à un mam- mifère un copolymère d'acide D-glutamique et de D-lysine couplé audit autre antigène de façon à induire une tolérance immunolo- gique très efficace puis à immuniser le mammifère avec ledit premier antigène. Le procédé de l'invention produit dans le mammifère vi- vant, des cellules de même constitution génétique (appelées ci- après des clones) qui sont capables de produire ledit anticorps. L'invention permet donc d'obtenir un clone capable de produire un anticorps ayant une faible réactivité croisée et une spécificité élevée pour un ou plusieurs déterminants spéci- fiques, par administration à un animal du conjugué de D-GL et d'un antigène à réactivité croisée de façon à induire une tolé- rance immunologique très importante spécifique de l'antigène à réactivité croisée puis à immuniser à l'animal avec un antigène désiré, c'est-à-dire un antigène qui comprend le ou les détermi- nants antigéniques spécifiques. Un tel animal est capable de produire des clones et un anticorps ayant une faible réactivité croisée et une grande spécificité. On peut obtenir l'anticorps à grande spécificité précé- demment défini, sous forme d'un anticorps purifié ou sous forme d'un antisérum contenant cet anticorps. Cependant si on le dési- re, on peut produire l'anticorps à partir d'un clone que l'on a rendu immortel par hybridation avec une cellule tumorale ap- propriée. On notera que si on le désire, on peut utiliser les clones obtenus selon l'invention pour produire l'anticorps dési- ré après les avoir isolés du mammifère vivant. Donc dès qu'on a obtenu les clones on peut produire à la demande l'anticorps désiré en l'absence des mammifères vivants de départ. L'invention concerne donc-un procédé pour produire cet anticorps par emploi d'un clone obtenu selon le procédé précé- demment décrit. Il est bien connu que, lorsqu'on dispose d'un clone ap- proprié, il est facile de combiner ce clone à une cellule tumo- 4 2480782 raie appropriée pour obtenir une cellule hybride (hybridome). Par exemple, on a décrit dans la littérature des cellules hybri- des formées par combinaison d'un certain clone et de cellules de myélome (Nature, vol. 256, 495-497 (1975) et European J. of Immunol., vol. 6, 511519 (1976) par Kôhler et coll.; Nature, vol. 266, 550-552 (1977) par Milestein et coll.; Nature, vol. 266, 495 (1977) par Walsh).Lorsqu'on transplante ou implante,à un autre animal ces cellules hybrides, elles se propagent en continu dans l'organisme vivant de cet animal (par exemple dans le liquide d'ascite de la souris) pour produire en continu une quantité importante d'anticorps spécifique. On peut donc utili- ser l'hybridome comme une nouvelle source de l'anticorps désiré. Selon une autre de ses caractéristiques, l'invention concerne un procédé pour la détermination immunologique d'une substance, qui consiste à utiliser un anticorps produit selon un procédé comme précédemment défini ou un antisérum contenant un tel anticorps, cet anticorps étant spécifique de ladite subs- tance pour que la détermination soit effectuée par réaction de l'anticorps et de ladite substance. On notera que la substance à déterminer est utilisée comme antigène. On peut effectuer la détermination immunologique selon des procédés connus en soi, par exemple par détermination radio- immunologique ou par détermination avec des marqueurs non iso- topiques, par exemple des enzymes, des radicaux libres, des cel- lules, des virus, des ions métalliques et des groupes fluores- cents ou chimiluminescents. Le procédé de discrimination immuno- logique de l'invention permet d'effectuer la détermination même en présence d'un antigène à réaction croisée. On préfère, dans l'invention, utiliser un D-GL ayant un poids moléculaire d'environ 27.000 à environ 120.000. Le rapport molaire de l'acide Dglutamique à la D-lysine est de préférence compris entre 70/30 et 30/70, par exemple 60/40. Des copolymères de ce type sont commercialisés, par exemple, par Miles-Yeda,USA, bien qu'il soit possible de les préparer de façon habituelle par exemple par copolymérisation d'un anhydride Ncarboxylique de y-alkyl-D-glutamate et l'anhydride N-carboxylique de l'c-N-car- bobenzyloxy-L-lysine en présence d'une amine appropriée, puis élimination des groupes protecteurs. 2480782 On peut utiliser diverses substances naturelles pour produire l'anticorps utilisé pour la détermination immunologi- que. On peut citer comme exemples de matières préférées à cet effet, des stéroïdes, les glucuronates et.sulfates correspon- dants; les catécholamines; des peptides, leurs sous-unités et les fragments apparentés; et divers agents pharmaceutiques. Parmi les exemples particulièrement préférés de stérol- des, figurent la testostérone (appelée ci-après T), la 5a-di- hydrotestostérone (appelée ci-après DHT), l'androstérone, l'étiocholanolone, la progestérone, la 17a-hydroxyprogestérone, la pregnénolone, la déhydroépiandrostérone, l'oestradiol, l'oestrone, l'oestriol, l'aldostérone, la désoxycorticostérone, le cortisol, la cortisone, la corticostérone, le 11-désoxycor- tisol, l'acide cholique, l'acide désoxycholique, l'acide litho- cholique et leurs conjugués. On peut citer comme exemples de catécholamines, la dopa- mine, la norépinéphrine, l'épinéphrine et similaires. On peut citer comme exemples d'hormones peptidiques la gastrine et la cholécystokinine-pancréozyme, l'insuline, la pro- insuline, le C-peptide, le glucagon, la folliculostimuline (FSH), la lunéinostimuline (LH), la gonadotrophine chorionique humaine (HCG), la somatostatine, la thyréostimuline (TSH), leurs sous- unités et les peptides apparentés correspondants. On peut citer comme exemples d'agents pharmaceutiques le 1-propranolol comme agent a-bloquant, la ú- ou la d-cyclazo- cine comme agent anesthésique. Par exemple, lorsqu'on prépare selon une technique clas- sique d'immunisation un anticorps ou un antisérum anti-T, le DHT se comporte comme un antigène à réaction croisée en raison de l'étroite similitude des structures de la T et de la DHT. De façon semblable, lorsqu'on prépare un anticorps ou un antisérum anti-DHT, T se comporte comme un antigène à réaction croisée. De la sorte, divers stéroldes se comportent comme des antigènes à réaction croisée pour d'autres stéroïdes. Les substances précitées sont en général des haptènes ou similaires, c'est-à-dire des substances qui sont capables de se combiner avec un anticorps, mais incapables ou faiblement capables d'induire des réponses immunologiques lorsqu'elles ne sont pas couplées à un support avant leur administration à un 6 2480782 animal vivant. Il est donc nécessaire de les coupler à un sup- port approprié pour induire la formation d'un anticorps. Par exemple, pour induire un anticorps spécifique d'un certain anti- gène tel qu'un anticorps antitestostérone (appelé ci-après anti- corps anti-T), on doit coupler cet antigène à un support appro- prié et l'utiliser pour l'immunisation. Cependant les clones et anticorps anti-T ainsi obtenus ont généralement une forte réac- tivité croisée avec les substances ayant une structure analogue telles que la DHT. Selon l'invention, on peut inhiber de façon spécifique la formation de ces clones et anticorps anti-DHT à réactivité croisée par traitement de l'animal avec une substan- ce qui est le produit du couplage d'un copolymère du D-GL et d'un antigène à réactivité croisée, dans ce cas la DHT. De plus, on a également découvert que l'on obtient un anticorps capable de réagir avec le déterminant indiqué de l'an- tigène désiré lorsqu'on traite un animal avec un conjugué du D-GL et d'un peptide analogue dudit antigène et qui a une struc- ture partielle commune à celle de l'antigène désiré. Un exemple illustrant l'avantage qu'apporte l'invention est celui des anti- corps dirigés contre un octapeptide constitué des huit amino- acides C-terminaux de la cholécystokinine-pancréozyme (appelée ci-après CCK-PZ) qui est une hormone gastro-intestinale. Les structures (séquences des amino-acides) de la gastrine (humaine), de la CCK-PZ et de leurs fragments figurent dans le tableau 1. TABLEAU 1 Gastrine (humaine) (Pyro)Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu- Glu-Glu-Glu-AiA-Tyr-Gly-Trp-Mét- (S03H) Asp-Phé-NH2. CCK-PZ Lys-Ala-Pro-Sér-Gly-Arg-Val-Sér-Met- Ile-Lys-Asn-Leu-Gln-Sér-Leu-Asp-Pro- Sér-His-Arg-Ile-Sér-Asp-Arg-Asp- Tyr-Mét-Gly-Trp-Mét-Asp-Phé-NH2 bO-H CCK-8-P Asp-Tyr-Mét-Gly-Trp-Mét-AspPhé-NH2 S03H Pentagastrine Gly-Trp-Mét-Asp-Phé-NH2 7 2480782 La cholécystokinine-pancréozyme (CCK-PZ) est un type d'hormones sécrétoires des voies gastro-intestinales, principa- lement de l'intestin grêle, qui stimule la sécrétion des enzy- mes pancréatiques et qui provoque la contraction de la vésicule biliaire. La CCK-PZ est un polypeptide connu constitué de 33 amino-acides et son activité biologique se situe dans le frag- ment C-terminal de 8 amino-acides du peptide (CCK-octapeptide, appelé ci-après CCK-8-P). La séquence des cinq amino-acides C- terminaux est la même que la séquence des cinq amino-acides C- terminaux de la gastrine qui est une hormone capable de stimuler la sécrétion d'acide dans l'estomac. Il est donc bien connu qu'un anticorps anti-CCK-8-P présente une forte réactivité croi- sée avec la gastrine. D'autre parts on a récemment découvert que le CCK-8-P et son récepteur réactif sont également présents dans le cerveau et il est intéressant d'étudier la fonction de cette hormone comme neurotransmetteur ainsi que sa sécrétion et ses actions sur diverses maladies des organes gastrointestinaux. A cet égard, il est très important de disposer d'un anticorps capable de réagir spécifiquement avec le CCK-8-P. Selon l'invention, pour obtenir des clones produisant des anticorps capables de réaction spécifique avec le CCK-8-P, on peut administrer à un animal des conjugués de D-GL et de pentagastrine (c'est-à-dire les cinq amino-acides C-terminaux de la gastrine et du CCK-8-P), de façon à inactiver les clones produisant les anticorps ayant une réaction croisée avec la pen- tagastrine et/ou les composés semblables à la gastrine, puis immuniser l'animal avec du CCK-8-P. Donc, selon l'invention, pour produire un anticorps spé- cifique de la gastrine et inhiber la formation des clones pré- sentant une réaction croisée avec le CCK-PZ, on peut aussi trai- ter un animal avec un conjugué de D-GL et de pentagastrine, qui est le fragment C-terminal de l'antigène désiré, puis immuniser l'animal avec la gastrine. Il ressort des exemples de l'invention que l'on peut également obtenir un antigène spécifique désiré par administra- tion à un animal présentant des réactions immunitaires d'un con- jugué de D-GL et d'un peptide à réactivité croisée, même dans le cas o on ne peut pas facilement séparer du peptide global, 8 2480782 par fragmentation peptidique, les déterminants antigéniques spécifiques. Par exemple, Attasi et coll. ont mis en évidence la com- position des déterminants antigéniques du lysozyme par emploi de peptides synthétisés selon leur "modèle de stimulation de surfa- ce" [Attasi M.Z., Immunochemistry, vol. 15, 909-936 (1978)]. Dans ce cas, le déterminant antigénique est formé des amino- acides situés à des intervalles irréguliers (supposons, par exem- ple, que le déterminant soit formé des amino-acides A, B, C et D et qu'il existe un peptide ayant une séquence d'amino-acides entièrement différente qui, cependant, comprend accidentellement les amino-acides B-C qui servent à former un déterminant anti- génique stéréochimiquement commun) et on peut facilement dévelop- per sélectivement un clone spécifique dirigé contre le détermi- nant antigénique A-D de façon à former un anticorps dirigé contre le site spécifique par administration à un animal d'une substan- ce formée par couplage d'un déterminant antigénique constitué des amino-acides B-C avec D-GL et éliminer ainsi les clones pré- sentant une réactivité croisée avec le déterminant antigénique constitué des amino-acides B-C. On peut, pour obtenir un tel produit combiné de D-GL et d'un antigène à réactivité croisée, soit (1) coupler l'antigène directement à D-GL, soit (2) coupler l'antigène indirectement à D-GL en formant un pont entre l'antigène et D-GL. Pour cela, di- vers dérivés d'antigènes, en particulier des antigènes stérol- des, ont été préparés par Erlanger et coll., par exemple des dé- rivés de type oxime, des dérivés succinyliques et des dérivés d'acide chlorocarboxylique [B.F. Erlanger et coll., J. Biol. Chem., 228, 713 (1957)], des dérivés de type carboxyméthylthio- éther [A. Weinstein et coll., Steroid, 20, 789 (1972)], des dé- rivés de type carboxyméthyléther [P.N. Rao et coll., J. Steroid Biochem., 9, 539 (1978)], etc. Les procédés de couplage préfé- rés sont par exemple le procédé au carbodiimide, le procédé à l'anhydride mixte, le procédé de Schotten-Baumann et le procédé à l'isoxazolium. Lorsqu'on introduit un radical NH2 dans un tel composé, on effectue la réaction de couplage selon le procédé au gluta- raldéhyde et, lorsqu'on introduit un radical NH2 ou SH dans un tel composé, on peut effectuer la réaction selon le procédé qui utilise l'ester m-maléimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidique, le 4-(Nmaléimidométhylcyclohexane)-l-carboxylate de succinimidyle, le 4-(pmaléimidophényl)butyrate de succinimidyle et similaires, ou le 3-(2-pyridyldithio)propionate de N-succinimidyle, le (4- azidophényldithio)propionate de N-succinimidyle et similaires. De plus on peut utiliser, pour coupler le D-GL avec des antigènes, divers autres procédés utilisés dans le domaine de la chimie des peptides pour coupler des peptides à d'autres substances. Les antigènes que l'on peut utiliser dans l'invention sont en général des haptènes ou similaires et il est donc néces- saire, avant de l'utiliser, de coupler l'antigène à un support approprié utilisé dans les procédés classiques d'immunisation. On peut citer comme exemples de supports préférables utiles à cet effet l'hémocyanine de patelle (dit "keyhole limpet") (KLH), la y-globuline et l'albumine provenant du sérum de diverses es- pèces animales utilisées pour l'immunisation, telles que l'homme la chèvre, les bovins et similaires. On doit coupler les antigènes, leurs sous-unités ou leurs fragments apparentés à une protéine support d'une façon semblable à celle utilisée pour coupler un antigène à réaction croisée, une sous-unité ou un fragment apparenté avec le D-GL. * On peut effectuer le couplage directement ou indirectement. Dans le second cas, on doit utiliser pour coupler l'antigène désiré avec une protéine support, le même intermédiaire que celui uti- lisé pour coupler le D-GL à l'antigène à réaction croisée. On peut effectuer le traitement d'immunisation de façon classique. Selon la nature des animaux utilisés, on administre à l'animal par injection intrapéritonéale une solution salée d'un antigène (un produit combiné d'un haptène ou similaires et d'un support). Sinon, on peut injecter la solution d'antigène dans le coussinet plantaire ou dans un site souscutané du dos de l'animal. Lors de l'immunisation primaire et de l'immunisa- tion secondaire, on administre de préférence la solution d'anti- gène respectivement en association avec l'adjuvant complet de - Freund et avec l'adjuvant incomplet de Freund. Ensuite, on admi- nistre de préférence la solution d'antigène seule dans le cas de la souris, tandis que dans le cas d'un gros animal tel qu'un lapin, on.peut utiliser successivement l'adjuvant complet de Freund et l'adjuvant incomplet de Freund avec la solution d'an- tigène. La dose peut varier selon le rapport de combinaison de l'haptène ou similaires et du support, le poids moléculaire du support et similaires. Cependant, on préfère généralement immu- niser les animaux avec l'antigène à une dose unitaire de 1 à pg/petit animal, par exemple la souris ou de 0,1-1 mg/gros animal, par exemple le lapin, que l'on peut répéter par exemple deux à cinq fois à des intervalles de 2 à 4 semaines. Générale- ment deux à trois jours avant l'immunisation primaire, on peut administrer à l'animal un conjugué de D-GL et d'un antigène à réaction croisée bien que, dans certains cas, on puisse égale- ment administrer le conjugué de D-GL après l'immunisation prizai- re ou secondaire. La dose du conjugué de D-GL et de l'antigène à réaction croisée peut varier selon le rapport de combinaison de l'antigène à réaction croisée (haptène ou similairelà à D-GTî, les sites de couplage, la nature du composé intermédiaire et si- milaires, et de préférence, on utilise une dose de 100 à 500 ag/ petit animal, par exemple la souris, ou de 2 à 10 mg/gros unimnt% par exemple le lapin. On peut dissoudre le conjugué de D-GL -ams un soluté salé et l'administrer par voie intrapéritonéale. Comme il est avantageux de coupler l'antigène à réa-ctioi croisée avec le D-GL de façon à obtenir la même forme que -celle utilisée dans le cas de l'antigène immunisant et du support, au préfère à cet effet utiliser le même intermédiaire pour la for- mation de la combinaison correspondante. Comme précédemment décrit, pour conférer une forte tolé-- rance immunologique spécifique à un certain antigène à réaction croisée, on peut administrer à un animal un conjugué de D-GL et de l'antigène à réaction croisée. Ensuite on immunise l'animal avec un antigène désiré contenant les déterminants antigéniques spécifiques. On peut ainsi obtenir un clone capable de produire un anticorps ayant une faible réactivité croisée et une excellen- te spécificité vis-à-vis des déterminants antigéniques spécifi- ques concernés et un antisérum contenant cet anticorps. On notera que les découvertes précitées ont fait l'ob- jet d'essais non seulement sur de petits animaux tels que la souris mais également sur des animaux plus gros tels que le la- pin. Il est important que l'on ait observé les mêmes résultats chez de petits animaux et chez de gros animaux malgré les il 2480?82 différences prévisibles entre les espèces animales. A cet égard, on obtient une quantité nettement plus importante d'anticorps lorsqu'on utilise de gros animaux tels que le lapin que lorsqu'on utilise des animaux relativement petits tels que la souris. L'invention est particulièrement avantageuse car il était auparavant difficile de préparer un anticorps capable d'effec- tuer la discrimination de structures analogues telles que celles de la T et de la DHT. Le procédé de l'invention permet d'obtenir un grand nom- bre de clones capables de produire un anticorps pouvant effec- tuer la discrimination spécifique entre un antigène et d'autres antigènes à réaction croisée. Par suite de l'accroissement de la productivité du clone produisant un antigène spécifique, on peut en pratique séparer et isoler un clone déterminé. On sait par la littérature que la probabilité de séparation et d'isolement d'un clone capable de 6 7 reconnaître un antigène déterminé est d'environ 1/10 à 1/10 Donc, en pratique, cette séparation et cet isolement étaient impossibles. Le procédé de l'invention permet d'obtenir des clones produisant un anticorps spécifique capable d'effectuer la dis- crimination spécifique d'un certain déterminant antigénique désiré, et de déterminants antigéniques de structure apparentés, même lorsqu'on effectue l'immunisation avec un antigène conte- nant des déterminants à réaction croisée. Le procédé de l'inven- tion permet d'obtenir de tels anticorps spécifiques avec une pro- babilité accrue et par conséquent il est également possible d'ac- croître la probabilité de production de ces clones produisant un anticorps spécifique. Le procédé de l'invention peut s'appliquer à tous les procédés de production d'anticorps par modification du procédé de couplage du D-GL à un antigène à réaction croisée, de la na- ture du produit de couplage et similaires. Selon une autre de ses caractéristiques, l'invention concerne un procédé simple pour déterminer une certaine substan- ce dont la quantité contenue dans l'échantillon est inconnue, par emploi d'un anticorps ou d'un antisérum obtenu selon le pro- cédé précédemment décrit. Les réactifs et le mode de détermination que l'on utilise dans les exemples ci-après vont maintenant être expli- qués. (1) Synthèse de la DHT-3-(o-carboxyméthyl)oxime (appelée ci- après DHT-3-CMO): (A) Formule réactionnelle: OH + H2N-O-CH2 -C H OH Reflux NaOH/éthanol O OX> C-CH2 -O HO H (B) Matières premières utilisées: 3H-DHT (Radiochemical Centre, Amersham) 6 pci (0,015 pg en DHT). DHT (Sigma Chemical Co., U.S.A.) 0,3 g (1 mmole). O-carboxyméthyl-hydroxylamine, hémihydrochlorhydrate (Tokyo Kasei Kogyo K. K., Japan) 0,3 g (2,7 mmoles) NaOH 2N 1,25 ml Ethanol 15 ml (C) Mode opératoire. On place les matières premières dans un ballon à fond rond muni d'un appareil de reflux et on chauffe à reflux pen- dant 3 heures. On ajoute 45 ml d'eau distillée au mélange réac- tionnel et on ajuste le pH de la solution à 8 avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium. On transfère la solution dans une 13 2480782 ampoule à décanter, on ajoute environ 30 ml d'acétate d'éthyle et on agite. On sépare ensuite la couche d'acétate d'éthyle pour éliminer la DHT n'ayant pas réagi. On refroidit la couche aqueuse par addition de glaçons et on acidifie avec de l'acide chlorhydrique dilué pour obtenir un pH d'environ 4. On extrait la DHT-3-(o-carboxyméthyl)oxime ainsi produite par addition d'acétate d'éthyle froid. On utilise classiquement du sulfate anhydre pour sécher la couche d'acétate d'éthyle, puis on chasse l'acétate d'éthyle par évaporation. On recristallise le résidu dans le méthanol chaud pour obtenir le produit désiré. (2) Synthèse de la testostérone-3-(o-carboxyméthyl)oxime (appelée ciaprès T-3-CMO): Pour obtenir le produit désiré, on répète le mode opé- ratoire de (1), si ce n'est qu'on utilise la H-T et la T au lieu de la H-DHT et de la DHT en les mêmes quantités molaires. (3) Synthèse d'haptène-D-GL: (A) Synthèse de DHT-3-(o-carboxyméthyl)oximeD-GL (appelé ci-après DHT-3-D-GL). On opère selon la procédé à l'anhydride d'acide mixte d'Erlangen et coll. Formule réactionnelle: OH HOOCCH2__O _N + ClCOO-C09 OH-i OH HOOC -CH -O0-N- i (C4H9)3N O Dioxane C CH2 O -H i-C4H9- Co20 14 2480782 OH D-GL I Dioxane/eau D-GL-NH- C -CH20- H Matières premières utilisées: - DHT-3-CMO contenant de la H-DMT-3-CMO comme marqueur 20 mg - Dioxanne (séché) 6ml - Tri-n-butylamine 20 pi Chloroformiate d'isobutyle 10 p1 - Eau distillée 6 ml - D-GL (PM = 49.000) 30 mg - NaOH 1N 150 i1 Mode opératoire: On dissout 20 mg de DHT-3-CMO dans 1 ml de dioxanne sé- ché. On agite le mélange avec addition de 20 P1 de tri-n-butyl- amine, puis on agite à 11 C pendant 5 minutes. Ensuite, on ajoute 10 P1 de chloroformiate d'isobutyle à la solution que l'on fait réagir à 11 C pendant une heure avec agitation. Sépa-. rément, on dissout 30 mg de D-GL dans 6 ml d'eau distillée et on ajoute au mélange 150 p1 d'hydroxyde de sodium 1N. On ajoute progressivement 5 ml de dioxanne au mélange. On ajoute cette solution de D-GL au mélange réactionnel précité en une seule fois et en agitant. Dix minutes après, on ajuste le pH du mélan- ge à 6,5-7,0 par addition de gouttes de solution 1N d'hydroxyde de sodium et on agite la solution à environ 10 C pendant environ 2 heures. Ensuite, on dialyse la solution réactionnelle contre de l'eau à 4 C pendant une nuit. Le lendemain matin, on ajuste le pH de la solution à 4,5 avec de l'acide chlorhydrique dilué pour former un précipité. La précipitation est complète lors- qu'on laisse la solution reposer à 4 C pendant 7 heures. On cen- trifuge le mélange réactionnel à 4 C pendant 20 minutes (3.000 tours/minute) et on sépare le surnageant. On ajoute 10 ml d'eau distillée au précipité et on ajuste le pH à environ 7,0 avec de 2480782 l'hydroxyde de sodium 1N pour dissoudre le précipité. Ensuite, on dialyse la solution contre de l'eau distillée à 4 C pendant une nuit, puis on lyophilise. Selon la radioactivité de 1 mg de la 3H-DHT-3-CMO utili- sée comme marqueur et la radioactivité de 1 mg du produit réac- tionnel, on détermine le nombre de moles de DHT combinées à une mole de D-GL. Le rapport molaire de la DHT au D-GL dans le pro- duit réactionnel est de 30/1. Lorsque les quantités d'eau et de dioxanne utilisées sont égales aux quantités correspondantes calculées pour la méthode à l'anhydride mixte d'Erlangen et coll. [J. Biol. Chem., 228, 713 (1957)] appliquée à la sérumalbumine bovine, le mélan- ge commence à se gélatiniser. On ajoute donc de grandes quanti- tés d'eau et de dioxanne au mélange pour éviter la gélatinisa- tion du D-GL qu'il contient et pour que la réaction s'effectue de façon appropriée. On peut ainsi effectuer la conjugaison du D-GL et de l'oxime selon la méthode à l'anhydride mixte avec combinaison d'une quantité suffisante de l'oxime au D-GL. (B) Préparation de testostérone-3-(o-carboxyméthyl)- oxime-D-GL (appelé ci-après T-3-D-GL).o On reprend le mode opératoire précité, si ce n'est qu'on utilise de la T-3-oxime contenant de la 3H-T-3oxime confae marqueur pour obtenir du T-3-D-GL présentant un rapport molaire T/D-GL de 30/1. (4) Synthèse d'haptène-KLH - (A) Préparation de DHT-3-(o-carboxyméthyl)oxime-KLH (appelée ci-après DHT-3-KLH). Matières premières utilisées: - DHT-3-CMO (contenant de la H-oxime comme marqueur) 12 mg - Dioxanne séché 3,0 ml - tri-n-bultylamine 10 pl Chloroformiate d'isobutyle 5 pl - Eau distillée 4 ml - KLH (PM = 100.000) 150 mg - NaOH 1N 75 -1 Mode opératoire: On obtient la DHT-3-KLH présentant un rapport molaire 16 2480782 DHT/KLH de 10/1 selon le mode opératoire décrit ci-dessus. (B) Préparation de testostérone-3-(o-carboxyméthyl)- oxime-KLH (appelée ci-après T-3-KLH). Matières premières utilisées: - T-3-CMO (contenant de la 3H-oxime comme marqueur) 40 mg - Dioxanne séché 7 ml - Tri-n-butylamine 40 P1 Chloroformiate d'isobutyle 20 i1 - Eau distillée 10 ml - KLH 300 mg - NaOH 1N 300 pl. Mode opératoire: Selon le mode opératoire ci-dessus, on obtient la T-3- KLH présentant un rapport molaire T/KLH de 8/1. (5) Mode de détermination radio-immunologique. Réactifs: 1) Solution standard de 3H-T. On dilue de la 1,2-3H-T (58 Ci/mmoles) avec de l'étha- nol pour obtenir une solution éthanolique correspondant à 20.000 dpm/10 41 (45 pg de T); (dpm est le symbole habituel de désintégration/minute). 2) Solution standard de 3H-DHT. On dilue avec de l'éthanol de la 5a-dihydro-1,2,4,5,6, 7- H-T (114 Ci/mmoles) pour obtenir une solution éthanolique correspondant à 40.000 dpm/10 pl (45 pg de DHT). 3) Solution 0,05 M de tampon Tris (pH 8,0); contenant 0,05 % de sérumalbumine bovine (appelée ci-après SAB) et 0,1 % de sérum y-globuline bovine (appelée ci-après GGB). 4) Solution saturée de sulfate d'ammonium. ) Solution standard de T non marquée. 6) Solution standard de DHT non marquée. Mode opératoire 1 Détermination du titre d'anticorps antitestostérone. On introduit 10 ul de solution standard de 3H-T dans un tube de verre et on concentre à sec par évaporation. On ajoute 0,2 ml d'un antisérum (dilué par paliers successifs avec une solution de tampon Tris) et on mélange soigneusement. On laisse 17 2480782 reposer le mélange à la température ordinaire pendant 2 heures, puis on ajoute 0,2 ml de solution saturée de sulfate d'ammonium. On agite soigneusement la solution et on centrifuge (3000 tours/ minuté) pendant 20 minutes pour obtenir un surnageant dont on introduit 0,2 ml dans un flacon de comptage. On détermine la radioactivité de l'échantillon après addition de 2 ml d'un scin- tillateur préparé par dissolution de 2,0 grammes de PPO (2,5- diphényloxazole) dans 1 litre de toluène. Mode opératoire 2 Détermination de la réactivité croisée avec la DHT d'anticorps antitestostérone. On introduit 10 pl de solution standard de 3H-T dans des tubes de verre et on divise les tubes en deux groupes. On ajoute respectivement des solutions standards non marquées de T et de DHT aux tubes contenant la solution standard de 3H-T des deux groupes. Dans chaque cas, on accroit graduellement la quantité de stéroides non marqués. On sèche toutes les solutions par évaporation. On ajoute à chaque résidu 0,2 ml d'antisérum et on mélange soigneusement. On utilise l'antisérum à la dilu- tion qui fixe 60 % du H-T (45 pg). Mode opératoire 3 Détermination du titre d'anticorps anti-DHT. On reprend le mode opératoire 1 avec de la 3H-DHT, au lieu de 3H-T. Mode opératoire 4 Détermination de la réactivité croisée avec la T d'anticorps anti-DHT. On reprend le mode opératoire 2 avec de la 3H-DHT, au lieu de 3H-T. EXEMPLE 1 Préparation d'un anticorps antitestostérone spécifique ayant une faible réactivité croisée (souris). On utilise trois groupes de souris (chaque groupe étant constitué de 4 à 5 souris femelles; souche C57BL/6; 8 à 10 semaines). On administre à chaque souris du premier groupe (groupe témoin) du soluté salé seul et on n'administre pas de DHT-3-D-GL. Trois jours avant une immunisation primaire avec la T-3-KLH, on administre 500 pg de DHT-3-D-GL à chaque souris du 18 2480782 second groupe par injection intrapéritonéale. On administre à toutes les souris (par voie intrapéri- tonéale) 100 pg de T-3-KLH/souris dans du soluté salé avec de l'adjuvant complet de Freund et, trois semaines après, on admi- nistre la même quantité de T-3-KLH dans du soluté salé avec de l'adjuvant incomplet de Freund. Egalement après 5, 7, 9 et 17 semaines, on administre la même quantité de T-3-KLH dans du soluté salé. Trois jours avant l'immunisation secondaire et trois jours avant l'immunisation tertiaire (5 semaines après l'immu- nisation primaire) avec la T-3-KLH, on administre 500 ig du DHT-3-D-GL aux souris du troisième groupe. On recueille du sérum par ponction du plexus rétro- orbitaire des souris à des intervalles de 2 semaines pour déter- miner le titre et la réactivité croisée de l'anticorps. On dé- termine la réactivité croisée selon la méthode d'Abraham. Les résultats figurent dans le tableau 1. Comme le montre ce tableau, le titre en anticorps du second groupe est légèrement inférieur à celui du premier grou- pe (groupe témoin), et la cinétique de la formation d'anticorps du second groupe est analogue à celle du groupe témoin. D'autre part, dans le troisième groupe on n'observe pas de formation significative d'anticorps pendant la totalité de la période. La réactivité croisée avec la DHT du second groupe qui a été pré- traité avec le DHT-3-D-GL est nettement inférieure à celle du groupe témoin. On a tracé un graphique de la relation entre le titre d'anticorps et la réactivité croisée de l'anticorps obtenu pour chaque souris soumise aux essais. Bien que ces ré- sultats ne figurent pas ici, on n'a pas observé de relation si- gnificative entre le titre en anticorps et la réactivité croi- sée. En général, on a constaté que le traitement par le DHT-3- D-GL provoque une diminution de la réactivité croisée avec la DHT sans qu'il y ait de corrélation avec la diminution du titre en anticorps. En d'autres termes, une diminution de la réacti- vité croisée n'entraîne pas une diminution significative du titre. TABLEAU 1 (A) Titre en anticorps* antitestostérone, et (B) réactivité croisée avec la DHT**. Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 Semaines Prétraité avec (Non prétraité) du DHT3-D-GL (Non (500 pg, ip.) prétraité)*** 9 A 3331 1004*** Formation d'anticorps:+ B 30,3 + 4,9 7,1 +1,9*** 11 A 4320 1711 B 54,1 + 24,1 11,2 + 6,2 13 A 2886 819 B 43,0 + 12,5 7,9+ 4,5 19 A 1494 461 B 30,8 + 10,1 7,4 + 4,1 *1 On exprime le titre par l'inverse de la dilution du sérum capable de se combiner avec 50 % de la 3H-testo- stérone (45 pg). *2 On exprime la réactivité croisée (%) par [quantité (ng) de testostérone nécessaire pour inhiber de 50 % la fixation]/[quantité (ng) de DHT nécessaire pour inhiber de 50 % la fixation] x 100. *3 On exprime la valeur moyenne du titre en anticorps par la moyenne géométrique et on exprime la réactivité croisée par la moyenne arithmétique + l'écart-type. *4 On n'utilise pas de DHT-3-D-G1 pour le prétraitement, mais on l'administre après l'immunisation primaire. 2480782 On peut conclure de ces faits que, lorsqu'on élimine les clones ayant une réactivité croisée avec la DHT par prétraite- ment avec le DHT-3-D-GL, l'immunisation ultérieure avec la T-3- KLH peut accroître sélectivement la formation de clones forma- teurs d'anticorps ayant une spécificité accrue vis-à-vis de-T. Cette capacité de formation spécifique d'anticorps ayant une faible réactivité croisée, selon le procédé de l'invention, est importante du point de vue pratique. EXEMPLE 2 Préparation d'anticorps anti-DHT spécifique ayant une faible réactivité croisée (souris). On utilise dans cet exemple cinq groupes de souris (chaque groupe étant constitué de 5 à 7 souris femelles; sou- che C57BL/6; 8 semaines). On n'administre pas de T-3-D-GL au premier groupe (groupe témoin) et on effectue une immunisation primaire avec de la DHT-3-KLH. Trois et cinq semaines après, on effectue les immunisations secondaire et tertiaire, puis on effectue les immunisations additionnelles à des intervalles de deux semaines. On immunise également les souris des autres grou- pes de cette façon, en même temps que les souris du groupe témoin. Trois jours avant l'immunisation primaire avec la DHT-3-RLH, on administre 500 pg de T-3-D-GL/souris aux souris du second groupe par injection intrapéritonéale. On administre aux souris du troisième groupe (autre groupe témoin) 500 pg de DHT-3-D-GL/souris par injection intrapéritonéale trois jours avant l'immunisation primaire avec la DHT-3-KLH. Trois jours avant l'immunisation secondaire que l'on effectue trois semaines après l'immunisation primaire avec la DHT-3-KLH, on administre par voie intrapéritonéale, aux souris du quatrième et du cinquième groupes, respectivement du T-3-D- GL et du DHT-3-D-GL (dans les deux cas 500 pg/souris). Sept semaines après l'immunisation primaire, on recueille le sérum de chaque souris des cinq groupes à des intervalles de 2 semai- nes pour déterminer le titre en anticorps et la réactivité * croisée dans le sérum. Les résultats obtenus avec le sérum re- cueilli treize semaines après l'immunisation primaire figurent dans le tableau 2. 21 2480782 Le tableau 2 montre que l'on obtient l'anticorps anti- DHT ayant une faible réactivité croisée par trétraitement avec le T-3-DGL (second groupe). Dans cet exemple, on n'observe pas de formation significative d'anticorps anti-DHT dans le quatriè- me et le cinquième groupes que l'on a traités par le T-3-D-GL ou par le DHT-3-D-GL après l'immunisation primaire. Dans le troisième groupe on soumet les souris à un pré- traitement avec le DHT-3-D-GL, puis on les immunise avec la DHT-3-KLH et l'anticorps anti-DHT ainsi formé présente une réac- tivité croisée élevée avec la T comme c'est le cas des souris témoins, bien qu'on observe des titres en anticorps presque aussi importants dans le deuxième et le troisième groupes. Ces résultats permettent de conclure qu'on obtient de façon effica- ce un anticorps anti-DHT ayant une faible réactivité croisée avec T par traitement avec le T-3-D-GL. TABLEAU 2 EXEMPLE 3 Préparation d'anticorps anti-T ou anti-DHT (lapin). On utilise six groupes de lapins femelles (chaque grou- pe étant constitué de deux lapins; poids environ 3 kg). Trois jours avant l'immunisation primaire avec 100 pg de DHT-3-KLH émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund, on administre par voie intrapéritonéale aux lapins du premier groupe, 10 pg de T-3-D-GL/lapin et, trois semaines après, on administre aux lapins, par voie sous-cutanée, une immunisation Titre Réactivité Groupe des anticorps* croisée** 1 3457 90,3 + 12,9 2 1286 38,2 + 14,6 3 1079 86,3 + 23,7 4 O O *1 et *2: voir nota du tableau 1. 22 2480782 secondaire avec 200 pg de DHT-3-KLH dans l'adjuvant incomplet de Freund. On effectue ensuite quatre rappel sous-cutanés consécu- tifs avec 200 pg de DHT-3-KLH alternativement dans de l'adju- vant complet de Freund et dans de l'adjuvant incomplet de Freund à des intervalles d'un mois. On immunise également avec de la DHT-3-KLH les lapins témoins (deuxième groupe) de la même façon que le premier grou- pe. Cependant, on n'administre pas de T-3-D-GL. On administre aux lapins du troisième groupe, par voie intrapéritonéale, 10 mg de T-3-D-GL/lapin trois jours avant les immunisations secon- daire et tertiaire avec la DHT-3-KLH, effectuées 3 et 7 semai- nes après l'immunisation primaire. On administre par voie intrapéritonéale aux lapins du quatrième groupe, 10 mg de DHT-3-D-GL/lapin trois jours avant l'immunisation primaire avec la T-3-KLH. On effectue l'immunisa- tion avec la T-3-KLH comme pour le premier groupe. On immunise les lapins du cinquième groupe (groupe témoin) avec la T-3KLH comme le quatrième groupe. Cependant, on n'administre pas de DHT-3-D-GL. On administre par voie intrapéritonéale aux lapins du sixième groupe 10 mg de DHT-3-D-GL/lapin trois jours avant les immunisations secondaire et tertiaire avec la T-3-KLH effec- tuées 3 et 7 semaines après l'immunisation primaire. Dix jours après chacune des injections de rappel préci- tées, on recueille le sérum de chaque lapin et on l'analyse pour obtenir les résultats suivants. Dans le troisième et le sixième groupe, on n'observe pas de formation significative d'anticorps pendant la totalité de cette période. Les anticorps anti-DHT et anti-T obtenus à partir du deuxième et du cinquième groupe (groupes témoins) présentent pratiquement la même réactivité vis-à-vis des haptè- nes utilisés pour l'immunisation et de l'haptène à réaction croisée. Ainsi, les anticorps anti-DHT des lapins du deuxième groupe présentent une réactivité croisée de 100 % vis-à-vis de T et les anticorps anti-T des lapins du cinquième groupe présentent une réactivité croisée de 95,2 % vis-à-vis-de DHT. D'autre part, les lapins du premier et du quatrième groupes présentent des réactivités croisées significativement faibles et les anticorps anti-DHT des lapins du premier groupe présen- tent une réactivité croisée de 11,9 % vis-à-vis de T et les anticorps anti-T des lapins du quatrième groupe présentent une réactivité croisée de 22,0 % vis-à-vis de DHT. EXEMPLE 4 Détermination de T et de DHT dans du sang humain par emploi d'anticorps spécifiques anti-T et anti-DHT obtenus à partir de lapins. 1) On obtient des anticorps anti-T et anti-DHT ayant une faible réactivité croisée à partir des lapins des groupes 1 et 4 des exemples précités. On effectue les essais suivants pour étudier la possibilité pratique de détermination avec ces anticorps de la T et de la DHT présentes dans le sérum humain. Pour cela, on ajoute respectivement des quantités données de T et de DHT à des échantillons de sérum humain et on étudie la relation entre la quantité ajoutée de T ou de DHT et la quanti- té mesurée par détermination radio-immunologique. Pour détermi- ner la teneur en T d'un sérum humain, on ajoute de la T (1, 2 et 4 ng) ou de la DHT (0,1, 0,2 et 0,3 ng) à 1 ml d'un mélange de sérums (provenant de femmes et ayant une faible teneur en T) auquel on a ajouté de la 3H-T (2.000 dpm) ou de la 3H-DHT (2.000 dpm) pour déterminer la récupération lors du stade d'ex- traction. Dans tous les cas, on agite soigneusement le mélange et on ajoute 3 ml d'un mélange 3/2 d'hexane et d'éther, puis on agite pendant une minute avec un mélangeur à vortex. Ensuite, on laisse le tube à essai reposer dans un bain de glace carboni- que et d'acétone pendant 10 secondes et on transfère la couche de solvant organique dans un autre tube à essai. On évapore le solvant organique et on ajoute au résidu 2 ml d'éthanol en agi- tant. On introduit une partie de la solution éthanolique dans un petit tube à essai. La quantité de solution que lon trans- fère dans le tube à essai est telle qu'elle permette la déter- mination de T avec la courbe étalon d'inhibition obtenue avec l'antisérum précité. On concentre la solution à sec par évapo- ration et on effectue la détermination radio-immunologique avec l'anticorps anti-T à faible réaction croisée que l'on a obtenu par traitement par le DHT-3-D-GL. D'autre part, on 24 2480782 introduit 0,5 ml de la solution éthanolique dans un flacon et on concentre à sec par évaporation. On ajoute un scintillateur au résidu et on fait un comptage pour déterminer la récupéra- tion dans le stade d'extraction. On utilise le taux de récupéra- tion pour corriger la valeur obtenue par la détermination radioimmunologique. Pour déterminer la concentration de la DHT présente dans le sérum, on ajoute à 1 ml du mélange de sérums de femmes 0,2 ou 0,5 ng de DHT ou 0,2 ou 0,5 ng de T et on ajoute de la 3H-T (2.000 dpm) ou de la 3H-DHT (2.000 dpm) pour déterminer la récupération. On ajoute au mélange 3 ml d'un mélange 3/2 d'hexa- ne et d'éther et on extrait, comme précédemment décrit. On ajoute au résidu de l'extrait 2 ml d'éthanol et on introduit une partie de la solution éthanolique dans un petit tube à essai. On ajuste la quantité de la solution introduite dans le tube à essai pour qu'elle soit suffisante pour permettre la détermination de la DHT avec la courbe d'inhibition de la DHT obtenue avec l'antisérum précité. On concentre la solution à sec par évaporation et on effectue la détermination radio-immu- nologique avec l'antisérum à faible réactivité croisée obtenu par traitement avec le T-D-GL. D'autre part, on introduit 0,5 ml de la solution éthanolique dans un flacon et on chasse l'éthanol par évaporation. On ajoute un scintillateur au résidu et on fait un comptage pour déterminer la récupération dans le stade d'extraction. On utilise le taux de récupération pour corriger la valeur obtenue par la détermination radio-immuno- logique. On constate que, lorsqu'on utilise un anticorps anti-T ayant une faible réactivité croisée pour mesurer la quantité de T (1, 2 ou 4 ng) ajoutée à un sérum humain normal prélevé à des femmes contenant au départ 0,30 ng de T, la valeur mesurée de T est respectivement de 1,15, 2,30 et 4,60 ng. D'autre part, lorsqu'au lieu de T on ajoute de la DHT (0,1, 0,2 ou 0,3 ng) au sérum de femme pour étudier l'effet de la DHT sur la quantité déterminée de T, on n'observe pas d'in- fluence significative et la teneur de T dans le sérum normal de femme est pratiquement inchangée. Dans une expérience séparée, on ajoute de la DHT (0,2 2480782 ou 0,5 ng) à du sérum de femme normal et on déterminera quan- tité de DHT présente dans le sérum avec un anticorps anti-DHT ayant une faible réactivité croisée. On constate que la quanti- té de DHT présente dans le sérum normal de femme avant l'addi- tion est de 0,21 ng et qu'après l'addition cette valeur s'élève respectivement à 0,41 et à 0,72 ng. Ces valeurs concordent suffisamment avec les quantités de DHT ajoutées. D'autre part, lorsqu'on ajoute au sérum de femme normal de la T (0,2 ou 0,5 ng) au lieu d'ajouter de la IHT pour étu- dier l'influence de T sur la teneur déterminée de la DHT, cette addition de T ne provoque pas de changement significatif de la teneur en DHT du sérum normal de femme. On voit donc que l'on peut déterminer exactement les teneurs en T et en DHT dans le sérum par l'emploi des anticorps ayant une faible réactivité croisée décrits dans l'exemple 3. 2) Analyse d'un échantillon contenant un mélange d'anti- gène spécifique et d'antigène à réaction croisée. On détermine à nouveau la teneur en DHT du sang humain avec un anticorps à faible réactivité croisée provenant de la- pins, comme décrit ci-dessus. Dans chaque cas, on ajoute simul- tanément à 0,1 ml d'un mélange de sérums de femmes de la DHT et de la T (5 et 10 ng; 10 et 5 ng ou 10 et 10 ng respectivement) et on effectue la détermination comme décrit en (1) ci-dessus. On constate que, comme le montre le tableau 3, même lorsque l'échantillon contient une quantité importante de T, c'est-à- dire un antigène à réaction croisée, les quantités de DHT sont respectivement de 5,67, 10,17 et 9,20 ng. On peut donc dire que l'on peut déterminer de façon précise la DHT par emploi de l'anticorps anti-DHT à faible réaction croisée obtenu dans l'exemple 3, même lorsque l'échantillon contient une quantité importante de T qui est un antigène à réaction croisée. TABLEAU 3 Quantité Quantité DHT trouvée de DHT ajoutée de T ajoutée (ng) (ng) (ng) 10 5,67 5 10,17 10 9,20 26 248G782 De façon analogue, on ajoute de la T et de la DHT (respec- tivement 5 et 10 ng; 10 et 5 ng ou 10 et 10 ng) à 0,1 ml du sérum et on détermine les teneurs en T avec l'anticorps anti-T à faible réactivité croisée. Les quantités déterminées de T sont respectivement de 6,80, 10,3 et 10,5 ng, comme indiqué dans le tableau 4 qui montre également que, lorsqu'on utilise l'anticorps anti-T à faible réactivité croisée précité, on détermine de façon précise T en présence de DHT qui est un antigène à réaction croisée. TABLEAU 4 3) Analyse d'un échantillon humain (méthode directe). On entend par "méthode directe", une méthode de détermi- nation ne nécessitant pas la séparation préalable de T et de DHT. A titre comparatif, les valeurs obtenues selon une méthode classique sont également indiquées. Dans cette dernière méthode, on sépare T et DHT par chromatographie sur papier avant la détermination. 3.1) Détermination.de T dans le sérum humain. (A) Préparation de l'échantillon. On introduit dans des tubes à essai des portions de 0,1 ml de sérum d'homme et de 0,5 ml de sérum de femme et on ajoute du 3H-T (3.000 dpm) pour déterminer la récupération dans le stade d'extraction ou le stade d'extraction-chromato- graphie. On ajoute au sérum d'homme 0,5 ml d'eau distillée. On ajoute aux échantillons de sérum 3 ml d'un mélange 3/2 d'hexane et d'éther et on mélange soigneusement avec un mélangeur à vortex pendant une minute. On place les tubes à essai dans un bain de glace carbonique et d'acétone pendant 10 secondes pour congeler les fractions de sérum. On transfère la couche de Quantité Quantité T trouvée de T ajoutée de DHT ajoutée (ng) (ng) (ng) 10 6,80 5 10,3 10 10,59 27 248O782 solvant organique dans un autre tube à essai et on chasse le solvant organique par évaporation. (B) Méthode directe. On ajoute 0,4 ml d'éthanol à chaque résidu des échantil- lons de sérum d'homme et on mélange soigneusement, puis on transfère la solution dans un tube de détermination radio-immu- nologique. On ajuste la quantité de la solution dans le tube à essai pour qu'on obtienne une valeur comprise dans la gamme de à 400 pg, c'est-à-dire à 100 pl dans le cas de la gamme nor- male et à 50 pl dans le cas d'un sérum à teneur élevée en T, comme c'est le cas des essais Nos. 1, 2 et 3 du tableau 5 ci- après. Pour déterminer la récupération lors du stade d'extrac- tion, on introduit 100 pl de la solution dans un flacon et on concentre à sec par évaporation. Après addition d'un scintilla- teur, on fait un comptage du résidu. Dans le cas du sérum de femme, on ajoute 0,7 ml d'étha- nol à chaque résidu et on transfère 0,5 ml de la solution étha- nolique dans un tube de détermination radio-immunologique. Pour déterminer la récupération lors du stade d'extraction, on intro- duit 100 pl de la solution dans un flacon et on concentre à sec par évaporation. On fait un comptage du résidu après addition du scintillateur. Dans les deux cas ci-dessus, on chasse l'éthanol par évaporation sous un courant d'azote et on utilise l'extrait sec obtenu pour la détermination radio-immunologique. (C) Chromatographie sur papier. On applique l'extrait sec préparé comme dans la méthode directe à un papier avec trois portions de 50 pl de chloroforme de rinçage. Sur une bande de papier identique, on applique 10 pg de T comme référence et on utilise une telle bande avec cha- que groupe de détermination. On place les bandes de papier dans une cuve de chromatographie contenant du Bush A (système solvant constitué d'un mélange 10/8/2 de cyclohexane, de méthanol et d'eau). Après deux heures d'équilibrage, on développe dans la couche supérieure du Bush A. Après 16 heures de développement, on détecte la tache de T utilisée comme référence par l'absorp- tion ultraviolette à 254 nm et on découpe, dans le papier cor- respondant à l'essai, une section longue de 3 cm correspondant 28 2480782 à l'emplacement de la tache du marqueur de référence et on ex- trait avec 3 ml d'éthanol. On chasse l'éthanol par évaporation sous un courant d'azote et on soumet le résidu à une détermina- tion radid-immunologique semblable à celle décrite dans la mé- thode directe. (D) Détermination radio-immunologique. Pour préparer une courbe standard de T, on introduit en double dans des tubes à essai, une solution éthanolique con- tenant 0, 20, 50, 100, 200 ou 400 pg de T. On ajoute aux tubes à essai contenant les échantillons à étudier, 10 pl d'une solu- tion éthanolique contenant 20.000 dpm de 3H-T/10 Pl et on chasse l'éthanol par évaporation. On dilue un antisérum anti-T provenant de lapins avec une solution de tampon Tris 0,05 M (pH = 8,0; contenant 0,05 % de SAB et 0,1 % de GGB) à la con- centration (B0 = 60 %) capable de fixer 60 % de 20.000 dpm de H-T (45 pg de T) et on introduit 0,2 ml de cette solution d'antisérum dans chaque tube à essai, puis on mélange avec un mélangeur à vortex. Séparément, on transfère 0,2 ml de cette solution de tampon Tris dans deux tubes à essai contenant cha- cun 20.000 dpm de3H-T seule et on mélange soigneusement pour obtenir la valeur totale exprimée en dpm (B0 = 100 %). Apres deux heures de repos à la température ordinaire, on ajoute à la solution 0,2 ml de sulfate d'ammonium saturé et on mélange soi- gneusement. On centrifuge à 3.000 tours/minute pendant 10 minu- tes, puis on transfère 0,2 ml de surnageant dans un flacon. Après addition de 0,2 ml d'un scintillateur, on compte l'activité et on la calcule sous la forme B/B0 (%). 3.2) Détermination de la DHT dans le sérum de femme. Les opérations de prélèvement du sérum, d'extraction et de séparation de la DHT et de la T par chromatographie sur papier sont les mêmes que pour la détermination de la T sur des échantillons de sérum de femme. On détecte I'emplacement d'un marqueur de référence constitué de DHT par pulvérisation d'une solution de volumes égaux de m-dinitrobenzène à 1 % dans l'éthanol absolu et d'hydroxyde de sodium 2,5 N dans l'éthanol absolu. On effectue la détermination radio-immunologique de la DHT avec la solution standard éthanolique de DHT et une solu- tion éthanolique de 3H-DHT (40.000 dpm/10 pl) d'une façon semblable à celle utilis-ée pour la détermination radio-immuno- logique de T. Dans tous les cas, on corrige le résultat de la détermination radio-immunologique en fonction du taux de récu- pération. M Les résultats figurent dans les tableaux 5 et 6. (E) Résultats et analyse. TABLEAU 5 Essai Sérum utilisé Quantité de T trouvée (ng/ml) Essai (* homme; No. ** femme) Méthode directe Chromatographie ____ ____ ____ sur papier * * * * * * * * ** ** ** ** ** ** ** ** ______.1 ______________ j ___________________ Ce tableau montre que les résultats des deux méthodes de détermination concordent entre eux. X Dans le procédé direct, le taux de récupération de T ou de DHT est compris dans la gamme de 95 à 100 % et par consé- quent pour un3travail de routine, il peut ne pas être nécessai- re d'ajouter H-T ou H-DHT pour établir la correction de récupération. ,35 13,34 22,84 8,92 4,40 ,00 8,20 7,43 0,88 0,310 0,180 0,160 0,340 0,500 0, 250 0,154 9,60 ,36 19,08 9,16 4,38 4,90 7,95 7,10 0,740 0,292 0,191 0,158 0,356 0,490 0,240 0,218 2480782 TABLEAU6 (Sérum de femme) Ce tableau montre que les résultats des deux méthodes concordent entre eux. Comme le montrent ces résultats expérimentaux, la métho- de directe de l'invention qui utilise un anticorps à faible ré- action croisée permet la détermination simple et précise de la substance désirée, même en présence d'un antigène à raction croisée. Dans ce cas, il n'est plus nécessaire d'effectuer la séparation préalable par chromatographie sur papier de l'anti- gène à réaction croisée que l'on effectue dans les méthodes classiques. Dans le procédé de l'invention, on obtient un anticorps spécifique, ainsi qu'un clone capable de produire un tel anti- préalable corps, par traitement d'un animal avec un conjugué d'un anti- gène à réaction croisée et de D-GL de façon à conférer une ab- sence de réponse immunologique à un antigène à réaction croisée, Ce principe n'est pas limité aux modes de réalisation particu- liers précités dans lesquels on utilise T-3-D-GL et DHT-3-D-GL et on peut l'appliquer à d'autres cas tels que celui de l'exem- ple 5 suivant qui montre que l'on obtient pratiquement les mêmes DHT trouvée (ng/ml) Essai No. Méthode directe Chromatographie sur papier 1 0,175 0,154 2 0,210 0,201 3 0,198 0,200 4 0,195 0,190 0,280 0,280 6 0,250 0,260 7 0,221 0,232 8 0,201 0,198 31 2480782 résultats même lorsqu'on couple T et DHT à un site différent des supports. Dans l'exemple suivant, on utilise à nouveau T et DHT comme systèmes modèles et on transfère leurs sites de couplage de la troisième à la quinzième positions pour que la structure de l'haptène à la surface de la molécule support soit différente. EXEMPLE 5 Propriétés d'un antisérum obtenu par emploi d'un conjugué de e-carboxyéthylmercaptotestostérone (appelée ci-après 15e-CEM- T) et de 15e-carboxyéthylmercapto-5a-dihydrotestostérone (appe- lée ci-après 15-CEM-5a-DHT) avec de la KLH et du D-GLo Dans cet exemple, on synthétise la 15e-CEM-T selon le procédé décrit par Rao, P.N. et Coll. [Steroid, 28, p. 101 (1976)] et on synthétise la 15e-CEM-5cE-DHT selon le procédé décrit par Rao P.N. et coll. [Steroid, 299 p. 171(1977)]. On effectue la conjugaison de la 15e-CEM-T au D-GL et à la KLH et la conjugaison de la 150-CEM-5a-DHT au D-GL et à la KLH comme la conjugaison précitée de la DHT-3-CMO ou de la T-3-CMO au DOGL ou à la KLH. Les conjugués ainsi obtenus sont appelés respectivement T-15-D-GL, T-15-KLH, DHT-15-D-GL et DHT-15-KLH. Dans cet exemple, on utilise six groupes de souris (chaque groupe comportant 7 souris; souche C57BL/6; 8 à 10 semaines). Le premier groupe est un groupe témoin et on administre aux souris du soluté salé (sans DHT-15-D-GL). On administre ause- condgroupe 500 pg de DHT-15-D-GL/souris trois jours avant l'im- munisation primaire. Le troisième groupe est un groupe témoin et on administre aux souris, par voie intrapéritonéale 500 pg de T-15-DGL/souris trois jours avant l'immunisation primaire avec la T-15-KLH. On utilise 100 pg de T-15-KLH/souris pour l'immunisation du premier, du second et du troisième groupe Après trois semaines, on effectue l'immunisation secondaire de ces souris, puis des immunisations de rappel toutes les deux * semaines après l'immunisation secondaire. On immunise le qua- trième, le cinquième et le sixième groupe de souris avec la DHT- -KLH. Trois jours avant l'immunisation primaire avec la DHT- -KLH, on administre par voie intrapéritonéale aux souris du 32 2480782 cinquième groupe, 500 pg de T-15-D-GL/souris. Simultanément au cinquième groupe, on administre par voie intrapéritonéale aux souris du quatrième groupe servant de groupe témoin du soluté salé au lieu de T-15-D-GL. On administre aux souris du sixième groupe (un autre groupe témoin) par voie intrapéritonéale, 500 pg de DHT-15-D- GL/souris trois jours avant l'immunisation primaire avec la DHT-15-KLH. Sept semaines après l'immunisation primaire, on recueil- le lesérum de chaque souris à des intervalles de deux semaines pour mesurer le titre en anticorps et la réactivité croisée. L'antisérum obtenu treize semaines après l'immunisation primai- re a le titre maximal en anticorps et les résultats ci-après lui correspondent. Les propriétés des antisérums anti-T du pre- mier, du second et du troisième groupe sont les suivantes. Lorsqu'on les exprime par l'inverse de la dilution de l'antisérum capable de fixer 50 % de la 3H-T (45 pg), les ti- tres en anticorps anti-T des souris du premier groupe (témoin) et du second groupe sont compris respectivement dans les gammes de 1.600 à 9. 000 et de 1.000 à 3.500, et on n'observe pas de formation d'anticorps chez les souris du troisième groupe ayant reçu le T-15-D-GL. Lorsqu'on utilise la méthode d'Abraham, l'antisérum des souris du premier groupe présente des réactivités croisées com- prises dans la gamme de 4,1 à 8,2, tandis que l'antisérum des souris du second groupe présente des réactivités croisées com- prises dans la gamme de 0,27 à 0,94. Les résultats du second groupe sont supérieurs aux réactivités croisées avec la DHT obtenues avec d'autres antisérums anti-T connus décrits par d'autres auteurs. On peut donc dire que la réactivité croisée avec la DHT de l'antisérum obtenu selon l'invention est pratique- ment négligeable. On sait que 1,81 % est la réactivité croisée la plus faible avec la DHT d'un antisérum anti-T quelconque dé- crit dans la littérature antérieure et que Rao et coll. Ont obtenu cette valeur minimale par emploi d'un antisérum anti-T préparé par immunisation de lapins avec la 158-CEM-T-SAB [P.N. Rao et coll. et P.H. Moore Jr.: Steroid, 28 (1976)] que l'on utilise également dans l'exemple précité. Les réactivités croisées des souris du premier groupe de cet exemple sont prati- quement égales à la valeur minimale. Propriétés des antisérums anti-DHT des quatrième, cinquième et sixième groupe. Lorsqu'on les exprime par l'inverse de la dilution capa- ble de fixer 50 % de la 3H-DHT (45 pg), les titres en anticorps anti-DHT du quatrième groupe (groupe témoin) sont compris dans une gamme de 1.500 à 5.600 et ceux du cinquième groupe auquel on a administré le T-15-D-GL sont compris entre 1.000 et 7.600. On n'observe pas de formation d'anticorps chez les souris du sixième groupe ayant reçu le DHT-15-D-GL. Lorsqu'on étudie selon la méthode d'Abraham les anti- sérums provenant des souris du cinquième groupe que l'on a trai- tées avec le T-15-D-GL, les réactivités croisées avec T des anti- sérums ainsi obtenus sont comprises dans la gamme de 6,5 à 19,0 % alors que les réactivités croisées des antisérums des souris du quatrième groupe (groupe témoin) sont comprises entre 48,3 et 68,5 %O. Ces faits indiquent que l'administration de T- -D-GL réduit de façon significative la réactivité croisée avec T. On n'a pas observé de formation d'anticorps chez les souris du sixième groupe auxquelles on a administré DHT-15-D-GL. La raison semble en être l'inactivation spécifique des clones pro- ducteurs d'anticorps anti-DX? par l'administration de DHT-15-D-G. Les réactifs et les modes de détermination utilisés dans les exemples 6 à 9 suivants sont expliqués ci-après. Dans ces exemples, on applique le principe précité de l'invention à des déterminants peptidiques. (6) Préparation de conjugué pentagastrine-D-GLo (Référence: Liu et coll., Biochemistry, vol. 18, 690 (1979). (6-A) Synthèse de S-acétylmercaptosuccinyl-D-GL (appelé ci-après Ac-S-D-GL). On dissout du D-GL (p.m. = 34.300; 40 mg = 1,166 pmole) dans 900 pl de solution de tampon phosphate 0,125 M (pH 7,2) et on ajuste le pH à 7,2 avec une solution 1 N d'hydroxyde de so- dium. Après addition de 50 pl (57,44 pmoles) d'une solution dans le diméthylformamide (appelé ci-après DMF) d'anhydride S-acétyl- mercaptosuccinique (200 mg/ml), on agite le mélange à la tempé- 34 24Me782 rature ordinaire pendant 30 minutes. Pendant la réaction, on maintient le pH du mélange à 7,2. Lorsque la réaction est ache- vée, on applique la solution à une colonne de Sephadex G-25 équi- librée avec du soluté salé 0,01 M en tampon phosphate (pH = 7,2) 0,01 M de Na2-EDTA pour séparer le produit réactionnel de l'anhydride Sacétaylmercaptosuccinique n'ayant pas réagi. On ajoute à une fraction (100 pl) de la solution contenant le pro- duit réactionnel, 100 p1 (50 pmoles) d'hydroxylamine 0,5 M (pH = 7,3) et on incube à 37 C pendant 20 minutes pour éliminer le radical acétyle protecteur. On détermine le nombre de radi- caux sulfhydryles introduits dans le D-GL selon la méthode de Ellman et coll. [Arch. Biochem. Biophys., vol. 82, p. 70 (1959)] de la façon suivante. On ajoute à 50 pil de la solution réaction- nelle 0,1 ml d'une solution 0,01 M de 5,5'-dithio bis-(acide nitro-2 benzoique) dans le méthanol (désoxydée) et 1 ml de solu- tion de tampon Tris (pH = 8,0), on fait réagir pendant 20 minu- tes et on mesure l'absorbance à 412 nm. Le nombre des radicaux Sacétylrmercapto introduits dans une molécule de D-GL est d'environ 15. On appelle ci-après le S-acétylmercaptosuccinyl- D-GL ainsi obtenu Ac-S15-D-GL. Le rendement est d'environ 77 %. Comme le D-GL n'absorbe pas à 280 nm, il est difficile de déter- miner la récupération et la fraction contenant le dérivé de D- GL par l'absorbance à 280 nm. Donc, pour déterminer la récupéra- tion, on utilise comme substance de contrôle un produit réaction- nel obtenu par réaction du 3-(4-hydroxyphényl)propionate de N- succinimidyle et du D-GL et application à une colonne de Sepha- dex G-25. Comme ce produit absorbe à 280 nm, on effectue facile- ment la détermination par mesure de l'absorbance à 280 nm. (6-B) Préparation de m-maléimidobenzoyl-pentagastrine (appelée ci-après MB-pentagastrine.) On dissout 11 mg (16,1 pmoles) de pentagastrine dans 9, 5 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH = 8,0), puis on ajoute en une seule fois à 25,3 mg (80,5 pmoles) d'ester N-hydroxysucci- nimidique de l'acide m-maléimidobenzoique (appelé ci-après MBS) en solution dans le DMF (1 ml). On agite le mélange et on suit la réaction par chromatographie en couche mince avec un système solvant constitué d'un mélange en volumes égaux de cyclohexane et d'acétate d'éthyle. Vingt- cinq minutes après le début de la 2480782 réaction, on ajoute 3 ml de dichlorométhane au mélange réaction- nel pour éliminer le MBS n'ayant pas réagi. On agite soigneuse- ment le mélange et on centrifuge. On introduit la couche supérieure de la solution tampon dans un autre tube à essai. On ajoute à la couche de dichloro- méthane (couche inférieure) une petite quantité d'un tampon phosphate, on mélange bien et on centrifuge. On combine la cou- che supérieure avec cette solution. La chromatographie en couche mince confirme que le MBS n'ayant pas réagi a été presque tota- lement éliminé de la fraction de solution tampon contenant la MBpentagastrine. Séparément on ajoute 20 pl de la solution tampon préci- tée contenant la MB-pentagastrine à 20 p! d'une solution aqueu- se de 2-mercaptoéthanol (70 nmoles) désoxydée par un courant d'azote. On fait réagir à la température ordinaire pendant 20 minutes et on détermine selon la méthode d'Ellman la quantité molaire de 2-mrercaptoéthanol consommée qui correspond à la quantité de radicaux maléimidobenzoyles introduits dans la pen- tagastrine. Le nombre de radicaux maléimidobenzoyles introduits dans une molécule de pentagastrine est de 0,9. On appelle ci- après ce composé MBo 9-pentagastrine. (6-C) Préparation de conjugué de pentagastrine et de D-GL. On mélange une solution de Ac-S15-D-GL préparée en 6-A et une solution de MBo,9 -pentagastrine préparée en 6-B pour les faire réagir de la façon suivante: après désoxydation com- plète dans un courant d'azote, on ajoute au mélange 500 1pl d'une solution aqueuse 5 M d'hydroxylamine (pH = 7,3) et on agite à la température ordinaire pendant une heure. On prélève une partie de la solution réactionnelle pour rechercher la pré- sence de radicaux sulfhydryles n'ayant pas réagi. On constate l'absence de ces radicaux, ce qui indique qu'il n'en existe pas qui ne soit pas fixé à la MB-pentagastrine. Ceci confirme que tous les radicaux SH que porte le D-GL ont réagi avec la MB- pentagastrine. Deux heures après l'addition de la solution aqueuse d'hydroxylamine, on ajoute au mélange réactionnel du 2-mercapto- éthanol pour obtenir une concentration finale de 1 mM, puis on 36 2480782 agite pendant 20 minutes. On dialyse ensuite le mélange réac- tionnel contre une solution 0,01 M de tampon phosphate (pH = 7,2) pendant environ 24 heures avec une membrane de cellulose, puis on utilise la solution ainsi obtenue avec ou sans dilution. Le rapport molaire de la pentagastrine au D-GL dans le conjugué pentagastrine-D-GL ainsi obtenu est de 15/1. On appel- le ci-après ce produit: pentagastrine15-D-GL. (7) Préparation de CCK-8-P-hémocyanine de patelle (appelée ci-après CCK-8-P-KLH- (7-A) Préparation de S-acétylmercaptosuccinyl-KLH (appelée ci-après Ac-S-KLH). On opère selon un mode opératoire semblable à celui uti- lisé pour la préparation de l'Ac-S-D-GL décrite en 6-A. Avant la synthèse, on dissout 70 mg de KLH dans 1,4 ml d'une solution à 1 % de carbonate de potassium et on dialyse contre une solution 0,125 M de tampon phosphate (pH = 7,2) et on mesure l'absorbance à 280 nm pour déterminer la quantité de KLH. On ajoute 6,5 imoles d'anhydride S-acétylmercaptosucci- nique à 0,7 ml de la solution contenant 26,0 mg de KLH (ce qui correspond à 260 nmoles si l'on considère que le poids molécu- laire est d'environ 100.000; pH = 7,2) et on effectue la syn- thèse comme décrit en 6-A. Le rapport molaire des radicaux S- acétylmercapto à la KLH dans le produit est de 6,8 (on appelle ci-après ce produit Ac-S6,8-KLH). (7-B) Préparation de m-maléimidobenzoyl-CCK-8-P (appelé ci-après MB-CCK-8-P). On effectue la préparation comme celle de la MB-penta- gastrine. On dissout 0,42 mg (385 nmoles) de CCK-8-P synthétisé selon le procédé de condensation de fragments dans 0,5 ml de tampon phosphate 0,2 M, puis on fait réagir avec 600 ig (1,9 pmole) de MBS par emploi de 50 pl d'une solution constituée de 1,2 mg de MBD dissous dans 100 1pl de DMF. Dans le produit réac- tionnel le rapport des moles de CCK-8-P et des radicaux maléimi- dobenzoyles est de 1/1,0 (on appelle ci-après ce produit MB1,O- CCK-8-P). (7-C) CCK-8-P-KLH. On mélange 2,3 ml (75,9 nmoles) d'une solution de 248g0782 Ac-S6, 8-KLH préparée en 7-A et une solution de MB1 o-CCK-8-P pré- parée en 7-B et on ajoute 0,3 ml (150 pmoles) d'hydroxylamine 0,5 M. On effectue ensuite un traitement analogue à celui décrit en 6-C. Le rapport du CCK-8-P à la KLH dans le produit obtenu est d'environ 5/1. (8) CCK-8-P-sérumalbumine bovine (appelée ci-après CCK-8-P-SAB). (8-A) Préparation de S-acétylmercaptosuccinyl-SAB. On synthétise ce composé comme décrit en 6-A à partir de 25 mg (351 nmoles) de SAB et 1,5 mg (8,8 pmoles) d'anhydride Sacétylmercaptosuccinique. Le rapport de la SAB aux radicaux S-acétylmercapto du produit est de 7,6/1. (8-B) Préparation de MB-CCK-8-P. On dissout 0,5 mg (457 nmoles) de CCK-8-P dans 0,5 ml de solution de tampon phosphate 0,1 M (pH = 8,0) et on fait réagir avec 700 pg (2,29 pmoles) de MBS par emploi de 50 pl d'une solution de 1,4 mg de MBS dissous dans 100 pi de DMF com- me décrit en 6-B. Le rapport de MB à CCK-8-P est de 1,0/1. On appelle ci-après ce produit MB1,o-CCK-8-P. (8-C) Préparation de CCK-8-P-SAB. On mélange 1,9 ml (84 nmoles) de la solution obtenue en 8-A et de la solution obtenue en 8-B et on ajoute 0,35 ml (1,75 pmole) d'hydroxylamine 0,5 M. On traite le mélange comme décrit en 6-C pour obtenir un conjugué dans lequel le rapport de CCK-8-P à la SAB est d'environ 5/1 (appelé ci-après CCK-8-P-SAB). (9) Préparation de pentagastrine-SAB. (9-A) Préparation de MB-pentagastrine. On dissout 0,5 mg (750 nmoles) de pentagastrine dans 0,5 ml de solution de tampon phosphate 0,1 M (pH = 8,0) et on fait réagir avec 1,05 mg (3,3 pmoles) de MBS par emploi de 50 pl d'une solution préparée par dissolution de 2,1 mg de MBS dans 100 pl de DMF. On effectue la réaction comme décrit en 6e. Le rapport de MB à la pentagastrine est de 1,O/1. On appel- le ci-après ce produit MB1,o-pentagastrine. (9-B) Préparation de pentagastrine-SAB. _ 35 On mélange 2,54 ml (112 nmoles) de la solution préparée en 8-A avec la solution préparée en 9-A. On ajoute au mélange 0,4 ml (200 pmoles) d'hydroxylamine 0,5 M et on traite comme décrit en 6-C. Le rapport de la pentagastrine à la SAB dans le 38 248C782 produit est d'environ 5/1. On appelle le produit obtenu penta- gastrique-SAB. (10). On opère selon un mode opératoire semblable à celui dé- crit en 6 ci-dessus, si ce n'est qu'on utilise un D-GL ayant un poids moléculaire de 115.000 au lieu de 34.300 (le rapport mo- laire réactionnel est le même que celui décrit en 6. On obtient le pentagastrine33-D-GL ayant la même densité en déterminant antigénique combiné au D-GL sur la surface moléculaire. EXEMPLE 6 A. Schéma d'immunisation et récolte du sérum. On immunise des groupes de six souris femelles (C57BL/ 6J x DBA/2) F1. On immunise chaque souris de tous les groupes avec 10 pg de CCK-8-P-KLH dans l'adjuvant complet de Freund (0,2 ml) et, trois semaines après, on effectue une nouvelle immunisation avec 10 pg de CCK-8-P-KLH dans l'adjuvant incomplet de Freund (0,2 ml). Deux semaines après l'immunisation secondaire, on effectue une immunisation de rappel avec 10 ig de CCK-8-P-KLH en mélange avec 2 mg de gel d'hydroxyde d'aluminium. Deux et quatre semaines après, on effectue deux autres immunisations par injection chaque fois de 0,2 ml de soluté salé contenant pg de CCK-8-P-KLH. On effectue tous les traitements par in- jection intrapéritonéale. Trois jours avant l'immunisation primaire, on adminis- tre par voie intrapéritonéale à toutes les souris du second groupe 0,5 ml de soluté salé contenant 300 pg de pentagastrinel5- D-GL. Les souris du premier groupe servent de témoins et reçoi- vent 0,5 ml de soluté salé sans pentagastrinel5-D-GL. Trois jours avant l'immunisation secondaire et trois jours avant l'immunisation tertiaire, on administre par voie in- trapéritonéale à toutes les souris du troisième groupe 0,5 ml de soluté salé contenant 300 pg de pentagastrine15-D-GL. Pour préparer le sérum, on recueille du sang par ponction du plexus rétro-orbitaire de chaque animal. B. Détermination du titre en anticorps. On effectue une détermination radio-immunologique. Dans chaque godet à fond rond d'une microplaque en matière plastique polyvinylique pour détermination radio-immunologique en phase 39 2480782 solide, on introduit 100 p1 d'une solution de tampon phosphate 0,01 M (pH = 7,2; 0,15 M en NaCil; appelée ci-après tampon PBS) contenant 10 pg/ml d'un antigène (tel que la CCK8-P-SAB ou la pentagastrine-SAB) et on fixe l'antigène à la surface de la plaque en matière plastique polyvinylique par incubation à la température ordinaire pendant 2 heures. On rejette la solution d'antigène contenue dans les godets et on lave quatre fois les godets à l'eau du robinet. Après avoir secoué la plaque pour chasser l'excès d'eau, on introduit dans chaque godet 200 pi de soluté salé à 1 % de SAB et on laisse séjourner à 40C pendant une nuit pour que la capacité de combinaison avec les protéines de la plaque en matière plastique polyvinylique soit complète- ment neutralisée. Ensuite, on élimine la solution des godets et on rince quatre fois la plaque à l'eau du robinet. On utilise la plaque pour la détermination radio-immunologique après l'avoir secouée pour éliminer l'excès d'eau. On introduit dans chaque godet 0,1 ml d'antisérum dilué avec du tampon PBS à 1 %a de SAB et on laisse séjourner à 40C pendant une nuit, on lave soigneusement trois fois à l'eau du robinet, on lave 6 fois avec du tampon PBS 2M en NaCl, puis on lave à l'eau du robinet. Après avoir secoué pour chasser l'eau, on dilue avec du tampon PBS à 1 % de SAB des anticorps de lapin anti-IgG Fab de souris que l'on a spécialement purifiés avec un immuno-adsorbant et marqués avec du 125I. On introduit 0,1 ml (50,000 dpm/20 ng d'anticorps protéiques spécifiques) de la solution diluée dans chaque godet et on laisse séjourner à 40C pendant une nuit. S'il n'y a pas d'anticorps capables de se fixer à un antigène à la surface de la matière plastique polyvinylique, l'anticorps est couplé à l'antigène. On peut détecter la présenoe ou l'ab- sence d'un tel anticorps par le degré de couplage des anticorps de lapin anti-IgG Fab de souris marqués au 125I. On prélève dans chaque godet avec une pipette chaque solution isotopique. Après avoir soigneusement lavé à l'eau, on place la plaque flexible sur une plaque de matière plastique rigide et on décou- pe la partie supérieure de la plaque flexible avec un fil chaud puis on compte la radio-activité dans chaque godet. 2480782 C. Résultats. Chaque fois-que l'on récolte du sérum, on détermine le titre en anticorps du mélange de sérum des souris de chaque groupe. Les échantillons recueillis Il semaines après l'immuni- sation primaire contiennent les teneurs maximales en anticorps. Donc, on soumet à une analyse complémentaire détaillée les anti- corps des antisérums recueillis 11 semaines après l'immunisation primaire. Dans cette mesure, on utilise comme antisérum standard le mélange des antisérums du groupe 1 recueillis 7 semaines après l'immunisation primaire. On exprime la quantité d'anti- corps dans l'échantillon prélevé à chaque souris individuelle à la onzième semaine par le rapport à la quantité d'anticorps contenus dans l'antisérum standard qu'on choisit comme unité. Le titre du sérum standard est le suivant: lorsqu'on le déter- mine selon une méthode radio-immunologique en phase liquide avec de la CCK-8, ce sérum (dilué au 1/600) est capable de fixer 0,0015 pmole de cholécystokinine (CCK-33). Dans les anticorps provenant des souris du premier groupe, la quantité d'anticorps ayant réagi avec le CCK-8-P et la quantité d'anticorps ayant réagi avec la pentagastrine sont presque égales. Les anticorps provenant des souris auxquelles on a administré du pentagastrine-15-D-GL présentent une très faible réactivité croisée avec la pentagastrine. En particulier les anticorps provenant des souris du troisième groupe auxquel- & après les on a administré le pentagastrine-15-D-GL / l'immunisation primaire, c'est-à-dire trois jours avant les immunisations se- condaire et tertiaire, présentent une réactivité croisée extrê- mement faible avec la pentagastrine. Ces résultats montrent que l'invention permet d'obtenir un anticorps présentant une spécificité pour la séquence spéci- fique d'amino-acides de CCK-8, c'est-à-dire S 3H 1 Asp Tyr Met 41 2"480782 EXEMPLE 7 On détermine les réactivités croisées des anticorps ob- tenus ci-dessus selon un système de radio-immuno-détermination en phase liquide permettant la coexistence de CCK-8-P et de pentagastrine. On marque le CCK-8-P avec du 125I avec le réactif de Bolton-Hunter [H. Sankaran et coll., J. Biol. Chem., vol. 254, 9349-9351 (1979)] et on l'appelle ci-après 125I-BH-CCK-8-P. Dans de petits tubes à essai, on introduit 50 pil d'une solution de tampon phosphate 0,02 M (pH = 8,0; contenant 1 % de géla- tine) contenant des quantités diverses de CCK-8-P non marqué pour établir une courbe standard de CCK-8-Po Séparément dans de petits tubes, on introduit 50 pl de solution tampon contenant diverses quantités de pentagastrine pour établir une courbe standard de pentagastrine. Dans chaque cas, on ajoute aux tubes à essai, 50 p1 d'antisérum dilué avec du sérum de souris, puis on ajoute 50 pl de la même solution de tampon phosphate contenant le 125I-BH CCK-8 (environ 5.000 cpm) et on mélange soigneusement la solu- tion avec un mélangeur à vortex, puis on incube à 4 C pendant 24 heures. Ensuite, on ajoute aux tubes à essai 50 pl d'anti- corps de lapin anti-IgG Fab de souris dilués au 1/2 avec le même tampon phosphate, on mélange et on incube à 4 C pendant 24 heures. Ensuite, on centrifuge les tubes à essai (3.000 tours/minute) pendant 25 minutes. On aspire le surnageant et on compte dans un compteur la radioactivité du précipité. Au lieu des solutions standards de CCK-8-P et de pentagastrine, on utilise le même tampon phosphate pour déter- * miner la radioactivité totale de 125I-BH-CCK-8-P (comptage, BO0 auquel on attribue la valeur 100) et on calcule les rapports de fixation (B/BO %) de l'anticorps avec le 125I-BH-CCK-8-P en présence de CCK-8-P ou de pentagastrine à différentes concen- trations. Les quantités molaires des divers peptides nécessaires pour inhiber à 50 % la fixation de l'anticorps avec le 125I-BH- CCK-8-P sont les suivantes. Dans le premier groupe, la quantité de CCK-8 est de 1,1 pmole et la quantité de pentagastrine est de 20,1 pmoles. Donc la réactivité croisée calculée par la méthode d'Abraham 42 2480782 est de 5,5 % (1,1/20,1 x 100). Dans le second groupe, correspondant aux souris aux- quelles on a administré le pentagastrine- 15-D-GL avant l'immunisa- tion primaire, la réactivité croisée est de 2,7 % (4 pmoles/ 150 pmoles x 100). Dans le troisième groupe, correspondant aux souris auxquelles on a administré du pentagastrine-15-D-GL après l'immunisation primaire, c'est-à-dire trois jours avant l'immu- nisation secondaire et l'immunisation tertiaire, on n'observe pas de réactivité croisée avec la pentagastrine. Il faut 1,7 pmole de CCK-8-P pour obtenir une inhibition de 50 % lorsqu'on utilise ledit anticorps, mais on n'observe pas d'inhibition avec 10.000 pmoles de pentagastrine. Ceci indique que la pentagas- trine est incapable, en pratique, de réagir avec l'anticorps produit par les souris du troisième groupe. Ces résultats montrent que l'on peut déterminer de façon spécifique le CCK-8-P sans que la coexistence de penta- gastrine ait un effet significatif lorsqu'on utilise des anti- corps provenant des souris du troisième groupe auxquelles on a administré du pentagastrine-15-D-GL. EXEMPLE 8 On reprend un mode opératoire semblable à celui décrit dans l'exemple 6, si ce n'est qu'on remplace les souris par des lapins. Lorsqu'on utilise l'adjuvant complet de Freund ou l'ad- juvant incomplet de Freund contenant 100 pg de CCK-8-P-KLH et ml de soluté salé contenant 10 mg de pentagastrine-15-D-GL, les résultats sont pratiquement semblables à ceux obtenus avec les souris. EXEMPLE 9 On reprend le mode opératoire de l'exemple 6, si ce n'est qu'on remplace le pentagastrine15-D-GL par le pentagas- trine33-D-GL.(Poids -olculare 115.000).Les rsultats sont pra- tiquer-ent les:.aê.es zue ceux obtenus dans l'exemple 6. la Sur la figure unique annexée,/quantité des anticorps ayant réagi avec la pentagastrine est représenté en abscisses etquantité des anticorps ayant réagi avec le CCK-8-P est re- présentéeen ordonnées. Les marques "o" correspondent aux 43 2480782 anticorps provenant des souris (premier groupe) auxquelles on n'a pas administré de pentagastrine-15-D-GL. Les marques "A" correspondent aux anticorps obtenus à partir des souris (deuxiè- me groupe) auxquelles on a administré le pentagastrine- 15-D-GL avant l'immunisation primaire. Les marques"e" correspondent aux anticorps provenant des souris (troisième groupe) auxquelles on a administré du pentagastrine-15-D-GL après l'immunisation primaire. De façon pratique, on a exprimé chaque valeur par le rapport de chaque quantité en anticorps à celle présente dans le mélange des sérums prélevés aux souris du premier groupe sept semaines après l'immunisation primaire. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisa- gées et sans s'écarter pour cela du cadre de l'invention. 44 2480782 REVENDICATIONS 1. Procédé pour produire un anticorps ayant une grande spécificité pour un premier antigène comprenant un déterminant antigénique désiré et ayant une faible réactivité croisée vis- d'au à-vis / moins d'un autre antigène, cet autre antigène compre- nant au moins un déterminant antigénique dont la structure est apparentée à celle du déterminant antigénique désiré du premier antigène, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste à administrer à un mammifère un copolymère d'acide D-glutamique et de D-lysine couplé audit autre antigène pour induire une to- lérance immunologique très efficace, puis à immuniser le mam- mifère avec ledit premier antigène. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on obtient l'anticorps sous forme d'un antisérum le conte- nant. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on obtient l'anticorps à partir d'un clone capable de le produire. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on choisit le mammifère parmi la souris, le rat ou le cobaye. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on choisit le mammifère parmi le lapin, le mouton, la chèvre, le cheval, le porc et les bovins. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le copolymère d'acide D-glu- tamique et de D-lysine a un poids moléculaire d'environ 27.000 à 120.000. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le rapport molaire de l'aci- de D-glutamique à la D-lysine du copolymère est d'environ 70/30 à 30/70. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit autre antigène est un stéroïde, une catécholamine, un peptide, un agent pharmaceuti- que, ou le-cas échéant une sous-unité ou un fragment correspon- dant. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on choisit le stéroide parmi la testostérone, la 5a-dihydro- testostérone, l'androtestostérone, l'6thiocholanolone, la pro- gestérone, la 17a-hydroxyprogestérone, la pregnénolone, la déhydroépiandrostérone, l'oestradiol, l'oestrone, l'oestriol, l'aldostérone, la désoxycorticostérone, le cortisolg la corti- sone, la corticostérone, le li-désoxycortisol, l'acide cholique, l'acide désoxycholique, l'acide lithocholique et leurs conjugués. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on choisit la catécholamine parmi la dopamine, la norépiné- phrine, l'épinéphrine et leurs dérivés. 11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on choisit le peptide parmi la gastrine, la cholécysto- kinine, l'insuline, la pro-insuline, le C-peptide, le glucagon, la folliculostimuline (FSH), la lutéinostimuline (LH), la gona- dotrophine chorionique humaine (HCG), la somatostatine, la thyréostimuline -XTHS), leurs sous-unités et les peptides apparentés. 12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'agent pharmaceutique est le 1-propanolol ou la L- ou d- cyclazocine. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 12, caractérisé en ce que l'anticorps comme défini dans la revendication 1 est isolé de l'antisérum. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 12, caractérisé en ce qu'on isole, desdits mammifères, un clone capable de produire un anticorps comme dé8fni dans la revendication 1. 15. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on l'a préparé selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 13. 16. Antisérum contenant un anticorps comme défini selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on l'a préparé selon le procédé de l'une quelconque des revendications 2 à 12. 17. Clone capable de produire un anticorps comme défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'on l'a préparé selon le procédé de la revendication 3. 18. Clone capable de produire un anticorps comme défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'on l'a préparé selon le procédé de la revendication 14. 46 24%782 19. Procédé pour produire un anticorps comme défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à for- mer une cellule hybride à partir d'un clone comme défini dans la revendication 18 ou dans la revendication 19, et à implanter cette cellule hybride à un mammifère pour produire un anticorps comme défini dans la revendication 1. 20. Procédé de détermination immunologique d'une subs- tance, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un anticorps produit selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 13, ou un antisérum contenant un tel anticorps, cet anti- corps étant spécifique de ladite substance, pour effectuer la détermination par réaction de l'anticorps avec ladite substance.