Brevet FR2476676A1 — publié le 19810828

La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'une culture de spores d'une nouvelle souche virulente de Claviceps purpurea sur des plantes de seigle, produisant de l'ergocristine. A ce jour, on connaît deux voies distinctes pour la préparation d'alcaloldes d'ergot de seigle. I1 existe d'une part un procédé classique dans lequel des drogues cultivées et recueillies sur des plantes de seigle sont utilisées en tant que substances de départ et les alca bides sont obtenus a partir de celles-ci par extraction. D'autre part, on sait produire des alcaloldes à partir de souches de Claviceps appropriées par fermentation stérile. A ce jour on connaît déjà plusieurs procédés réalisables industriellement pour la mise en oeuvre de cette seconde méthode (voir par exemple les brevets hongrois nO 150 631, 151 724, 152 238 et 164 816). Cependant, la culture de drogues d'ergot de seigle a conservé toute sa valeur. En effet, une partie importante de la production mondiale d'alcaloldes peptidiques est encore aujourd'hui obtenue par différentes drogues cul tivées, enrichies du type alcaloïde. Ceci est en particulier le cas de la production d'ergocristine et d'ergotamine. La chaîne latérale d'alcaloldes peptidiques consiste en proline, un groupe d'amino-acides caractéristiques ainsi que d'un amino-acide caractéristique spécifique dudit alcaloïde ( l'intérieur du groupe précité) Le groupe amino-acide caractéristique relatif aux deux alcaloïdes précités (ergocristine et ergotamine) est la phénylalanine.Il est cependant extrêmement difficile d'assurer le développement et la surproduction de phénylalanine pendant la biosynthèse fermentative qui se déroule à l'intérieur d'un intervalle de temps de quelques jours, étant donné que pendant la même période de temps se déroule également la genèse biosynthétique de la fraction acide lysergique de la molécule d'alcaloïde et que de surcroît, d'importantes quantités de tryptophanes sont nécessaires a la synthèse des amino-acides aromatiques. Au cours de l'entretien de la souche et des réinfestations successives, la fraction initialement présente de la souche produisant l'ergotamine et l'ergocristine peut être décalée par la régulation d'égalisation des voies de métabolisme dans le sens de la production d'ergocornine puis ensuite d'alcaloïdes hydrosolubles. Cette circonstance particulière a également contribué au fait que divers procédés de fermentation n'ont pas pu être reproduits par la suite avec succès (voir par exemple brevet tchécoslovaque nO 104 613, brevet allemand nO 1 215 637 et brevet britannique nO 1 192 912).Etant donné que dans les procédés fondés sur le traitement de drogues on ne rencontre pas de telles difficultés, ces procédés seront certainement utilisés à une grande échelle dans l'avenir et il subsiste la nécessité d'apporter certains développements technologiques à de tels procédés. La condition fondamentale d'un tel développement consiste cependant en la production de souches de Claviceps purpurea dotées d'une aptitude élevée à la production d'alcaloïdes. Différents procédés pour la production de souches de Claviceps purpurea ayant une bonne aptitude à la production d'alcaloldes d'ergoline sont aéja décrits dans de nombreux brevets. Diverses voies ont déjà été proposées pour obtenir des souches dotées d'aptitude de production élevée. Conformément au procédé décrit dans le brevet soviétique nO 232 468, une souche pour la production d'ergotoxine a été sélectionnée en tenant compte des propriétés morphologiques de colonies particulières, ainsi que des caractéristiques des spores. Dans le brevet soviétique nO 232 467 se trouvedécrite une souche produisant 80 % d'ergocryptine, qui présente des propriétés morphologiques sensiblement voisines de celles précédemment évoquées lorsqu'elle est cultivée sur des milieux de culture synthétiques Dans le brevet hongrois nO 154 035 se trouve décrit un procédé qui peut etre mis en oeuvre rapidement et de façon efficace, selon lequel les cultures aptes à produire de lergotoxine peuvent être enrichies en fonction de la couleur des colonies par rapport aux représentants produisant lflergo tamine. Pour la préparation de souches à production élevée d'alcaloides, il est nécessaire d'observer les principales étapes suivantes 1. la culture d'une souche de Claviceps purpurea améliorée; 2. la préparation de spores appropriégpour infestations de plantes de seigle par multiplication fermentative de la souche 3. la conservation de ces spores jusqu'à leur utilisation. La presente invention a eu pour but de préparer nne telle souche particulière présentant une aptitude élevée de production d'ergocristine, pareille souche présentant en particulier les propriétés avantageuses suivantes - la souche présente une bonne sporulation sur des milieux de culture synthetiques, aussi bien que sur des surfaces agar ainsi que sur des cultures submergées et aérées - les spores sont suffisamment résistantes et par suite sont dotées de bonnes propriétés de conservation - les spores sont viables et virulentes, de sorte que lorsqu'elles sont à nouveau amenées dans un milieu de culture, elles germent à raison d'environ 98 à 100 % et lorsqu'elles sont appliquées à la plante elles produisent une infestation efficace de cette dernière - la quantité de drogues produite par unité de surface est élevée, et - la drogue présente une teneur élevée en alcaloldes principaux et contient à côté de ces alcaloldes principaux seulement des quantités insignifiantes d1 alcaloïdes secondaires. Selon la présente invention, la nouvelle souche est obtenue par utilisation combinée d'une amélioration sexuée et sélective, de la manière suivante A partir de la souche de départ, qui est enregistrée sous le nO 661/1974 dans la collection de l'institut de Recherche hongrois de plantes officinales, on sélectionne en se plaçant d'un point de vue morphologique des sclérotes présentant une surface lisse, qui sont susceptibles d'un bon développement et qui sont parfaitement exempts de défaut. Ces sclérotes sont posés sur du sable humide et sont maintenus pendant environ 6 semaines à une température environ comprise entre 0 et 50C. Les sclérotes sont ensuite lavés et déposés sur une éponge humide maintenue dans des conditions stériles. Après 12 jours commence le développement de stromata;les stromata apparus se sont entièrement développés en environ 6 jours. Pour l'obtention de spores on a sélectionné les stromata des sclérotes qui n'ont produit que quelques (3 à 4) tetes de champignon ou têtes à peritheces ; parmi ceux-ci on a prélevé les stromata présentant un diamètre supérieur à 4 > om et dont l'analyse miCrOSCDpiqUe révèle en surface les plus grands bombements de peritheces. Ces stromata sont ensuite amenés dans des conditions de sporulation sur un milieu nutritif liquide de malt , dans des conditions stériles et sous l'influence de la chaleur. Sous contrôle microscopique, un liquide contenant des ascospores est ensuite amené dans des conditions de propagation sur un milieu nutritif solide malt -agar.Les colonies obtenues à partir d'unetelle spore sont alors sélectionnées au vue de leur rythme de développement et de leur aptitude à la formation de spores. Les spores des colonies sélectionnées sont isolées selon leur multiplication et placées dans des conditions parasites, c'est-à-dire que les épis des plantes de seigle avant l'anthèse sont infestés avec ces spores à l'aide de seringues d'inoculation. A partir de ces plantes de seigle sont alors sélectionnés les sclérotes parmi lesquels le développement de sclérotes est obtenu à I'intérieur d'une courte période après apparition du miellat. Les grains sélectionnés de cette manière sont alors analysés par chromatographie en couche mince. La sélection ultérieure a été réalisée en tenant compte de la teneur en ergocristine ainsi que de la teneur en alcaloïdes secondaires non purs présents. Les cultures de sclérotes obtenues de cette manière par amélioration sexuée sont alors soumises à une autre série de sélections; à partir des particules de sclérotes, des colonies sont cultivées sur des milieux de culture solides et à l'aide de ceux-ci des milieux de culture liquides sont inoculés. A partir de ces cultures submergées ainsi réalisées on sélectionne alors dans des essais en plein champ des cultures qui sporulent le mieux et qui présentent la plus grande viabilité et la plus forte virulence,en tenant compte de la quantité et de la teneur moyenne des alcaloïdes produits par la drogue. Conformément à ce processus, on réalise une autre série de sélections comprenant des étapes successives de cycles de multiplication, ce qui permet d'obtenir une nouvelle souche de Claviceps purpurea dotée de propriétés bien supérieures à celles des souches précédemment-connues. La nouvelle souche, enregistrée sous le nO 00163 auprès de l'institut National hongrois pour l'hygiène publique (OKI), s'est révélée particulièrement appropriée pour la production industrielle de préparation de spores d'inoculation, étant donne qu'elle permet d'élever considérablement la production de spores de la fermentation. On notera également que cette souche présente des propriétés tout particulièrement intéressantes dans la production en plein champ de drogues, elle augmente en effet le rendement de la production de drogues et en améliore la qualité de façon notable. Dans les tableaux figurant ci-après on a rassemblé un certain nombre de résultats obtenus avec la nouvelle souche OKI 00163 et, à titre de comparaison, avec la souche de départ nO 661/1974 de l'institut de Recherche hongrois de plantes officinales. Les essais réalisés sont des essais de fermentation et des essais en plein champ. OKI 661/1974 00163 Aptitude à la production 1-2.10 0,5-1.10 de spores sur la surface Nombre de spores du bouil lon de fermentation, 4-5.108 1-2.108 spores/ml Pouvoir germinatif de la péparation de spores 95-99 90-96 d'inoculation, % Virulence (conception dans le Phytotron, en % des 70-80 50-60 piqures) Poids de 1000 grains,g 175-200 140-170 production de drogues kg/ha (au pilote) 200-350 150-220 Teneur en ergocristine ng/g 5,0-6,2 2,6-3,6 Alcaloïdes secondaires Ergometrine, mg/g 0,2-0,3 0,1-0,2 Ergotamine, mg/g traces O,05-0,1 Teneur en huiles grasses,% 15-20 16-18 Production d 'ergocristine g/ha [moyenne kg/ha..moyen- ne mg/gg 1540 590 Caractérisation morphologique de la nouvelle souche obtenue par la sélection faite dans le cadre de l'invention, ainsi que de la souche de départ Souche ORI 00163 - a) Malt-agar Après 28 jours colonies blanches, de grandeur allant de 0,5 à 0,6 cm, avec de courtes mycelles aériennes formation de conidies à partir du douzième jour ; ré partition des grandeurs de conidies : 1,3 à 3,8 um avec une grandeur la plus fréquente de 2,5 m. b) Mannitol-citrate-agar Après 28 jours colonies plissees, planes, de couleur crème et de grandeur-allant de 1,0 à 1,5 cm ; formation de conidies débutant à partir du quinzième jour c) Grandeur moyenne des conidies (d partir de 100 grainE pris au hasard) 2,5 m , surface lisse. Souche de départ 661/1974 a) Maît-agar Après 28 jours colonies blanches-grises, de grandeur allant de 0,8 à 12,0 cm avec des mycelles aériennes déployées ; formation de conidies à partir du quinzième jour ; grandeur moyenne des conidies : 3,4 pm. b) Mannitol-citrate-agar Après 28 jours colonies blanches, de grandeur allant de 1,5 à 2,0 cm, feutrées et déployées ; formation de conidies à partir du vingtième jour ; grandeur moyenne des conidies : 4 pm. c) Grandeur moyenne des sclérotes (à partir de 10G grains pris au hasard) 18 mm, surface extérieure fendillée. La production de spores d'inoculation de a -ermen- tation se trouve multipliée par deux du fait de l'uLilisa- tion de la nouvelle souche ; la production des droguets se trouve améliorée de 50 g et la teneur en alcaloïdes de la drogue obtenue se trouve améliorée de presque 100 %. Le rendement en alcaloïdes se trouve également très favorablement influencé du fait de la teneur essentiellement plus élevée en alcaloïdes. A titre d'exemple d'autres avantages, on peut encore mentionner sue l'aìg- mentation de la teneur en alcaloldes n'est pas accompa qnée d'une augmentation correspondante de matières grasses, de sorte que la quantité relative de matières grasses présentes dans la drogue devient très faible. Le procédé selon l'invention sera illustré plus en détail à l'aide des exemples non limitatif de mise en oeuvre particuliers mentionnés ci-après. Exemple 1 Dans un fermenteur en verre d'une capacité de 5 litres, on inocule une culture de souche OKI 00163 malt-agar vieille de 24 jours sur un milieu de culture répondant à la composition suivante extrait de malt ....................... 2,0 % poudre de pomme de terre 1,0 % glucose ............................... 0,5 % pH du milieu de culture ............... 6,0 La culture est incubée pendant 3 jours à 240C, sous une agitation de 440 Tr/min., sous aération à l'aide de 0,5 litre d'air par litre de liquide de fermentation et par minute. A l'aide de la culture d'inoculum obtenue comme indiquée ci-dessus, on inocule alors 100 litres d'un milieu de culture répondant à la composition suivante mannitol .............................. 8,0 % acide citrique ........................ 0,7 % liqueur de trempage de maïs (calculée en % de substance sèche) .............. 0,1 % phosphate dihydrogéné de potassium .... 0,025 % sulfate de magnésium .................. 0,025 % La fermentation est réalisée dans une cuve de fermentation d'une capacité de 160 litres, résistante aux acides et équipée d'un dispositif d'agitation. L'incubation est poursuivie pendant 6 jours à 240C, sous agitation à 230 Tr/min., sous aération à l'aide de 1,0 litre d'air par litre de liquide de fermentation et par minute, et dans des conditions de pH de 4,5 à 5,0. La valeur du pH du liquide de fermentation est maintenue dans les limites indiquées par addition d'hydroxyde ammonium. A la fin de l'opération de fermentation, le liquide de fermentation présente un nombre de spores de 4,2 108/ml. La biomasse obtenue est séparée, diluée à l'aide de 30 litres d'une solution à 10 % de saccharose, placée dans des bouteilles et conservée sous réfrigération à basse température. La préparation de spores d'inoculation obtenue comme indiqué ci-dessus présente un pouvoir germinatif de 99 %. Cette préparation de spores d'inoculation est alors diluée jusqu'à une concentration de 30 000 spores/mm3 et utilisée dans cet état pour l'infestation de plantes de seigle avant la formation d'épis. A partir du produit de la récolte on obtient ainsi 250 kg de drogue par ha ; la teneur de la drogue en huiles grasses atteint 20 %. Teneur en ergocristine : 6,2 mg/g Teneur en ergotamine : 0,1 mg/g Teneur en ergometrine : 0,2 mg/g Exemple 2 La souche OKI 00163 est incubée pendant 21 jours à 240C sur malt-agar. Les spores obtenues sont lavées à partir de la surface de la culture avec une solution physiologique stérile de sel de cuisine. Au moyen de cette solution saline contenant des spores, on infeste alors des plantes de seigle cultivées au phytotron. Les spores sont apportées au corps des plantes au moyen d'une seringue d'injection, à raison de 5 piqûres par épi. A titre de comparaison, on effectue le même processus dans les mêmes conditions à l'aide de la souche de départ 661/1974. A chaque fois 100 épis ont été infestés à partir de chaque souche. Les sclérotes entièrement développés ont été collectés à l'état de maturité. Les résultats obtenus au cours de l'expérimentation ont ét rassemblés dans le tableau suivant Souche nombre de Poids total teneur sclérotes les sclérotes ergocristine mg/g OKI 00613 470 79 g 5,9 661/1974 420 Exemple 3 Une culture de la souche OKI 00163, vieille de 28 jours, cultivée sur makt-agar est lavée avec une solution stérile de sel de cuisine, et le nombre de spores du liquide de lavage est réglé à 30 000 spores/mm3.A l'aide de cette solution, on infeste des parcelles d'essai de plantes de seigle d'une surface de 30 m2 chacune au cours de quatre essais parallèles. A titre de comparaison, on réalise, dans des conditions identiques, des essais parallèles avec une culture préparée de façon rigoureusement identique à partir de la souche de départ 661/1974. L'infestation a été réalisée à la main, l'aide de plateaux d'infestation. Les sclérotes mûrs ont été collectés à la main sans aucune perte. Les résultats comparatifs obtenus ont eté rassemblés dans le tableau suivant Souche Poids de teneur en produit de rendement en 1000 ergocris- la récolte ergocristine grains (g) tíne(mg/g) (kg/ha) (g/ha) OKI 0016 190 6,10 - 390 2380 661/1974 160 3,26 210 685 REVENDICATIONS 1/ Procédé pour la préparation de cultures de spores, utilisables dans la production de drogue, d'une souche virulente de Claviceps purpurea sur seigle produisant de l'ergocristine, caractérisé en ce que l'on réalise la culture de spores en cultivant la souche Claviceps purpurea enregistrée à l'institut National hongrois pour l'Hygiène Publique sous le nO OKI 00163. 2/ Application de la souche Claviceps purpurea, enregistrée à l'institut National hongrois pour l'Hygiène Publique sous le nO OKI 00163, à la production d'ergocristine.