Brevet FR2484258A1 — publié le 19811218

1.- 1,_ 2484258 L'invention concerne un nouvel agent immunothérapique pour tumeurs. Récemment, des tentatives ont été effectuées pour extraire des composés, efficaces comme remède cnntre le cancer, & partir des cellules de diverses bactéries et de produits bactériens. En particulier, des essais très poussés ont été effectués pour obtenir des agents carcinosta- tiques moins toxiques, par extraction de composés ayant une activité carcinostatique, à partir de cellules de mycobactéries. De plus, des recherches chimiques pour guérir le cancer ont été menées avec vigueur, en utilisant les composés de cellules BCG ou de cellules d'autres mycobactéries, comme agents immunothérapiques pour divers cancers d'animaux. Néanmoins, les cellules de BCG contiennent des composés qui causent des effets secondaires, et augmenter l'administration de la cellule elle-même est très dangereux. De ce fait, on a souhaité développer des agents d'immunothérapie en éliminant les composés causant des effets secondaires de la cellule, et en extrayant sélectivement les composés actifs seuls ou par promotion de l'activité de ces composés par traitement ou autre. Ainsi, on a développé un composant de squelette de paroi cellulaire BCG (voir demande de brevet japonaise n 28813:1979), murannyl dipeptide (voir demandes japonaises n 156812/1977 et 98922/1978), et un glycolipide contenant un acide gras à longue chaine dans une substance cireuse D (voir demandes japonaises n 3514/1978 et 28830/1979). L'objet principal de l'invention est de proposer un agent immunothérapique efficace contre les tumeurs et notamment un agent, sans effets secondaires. On a découvert que, lorsqu'une cellule jet et faible du bacille tuberculeux humain, le mycobactériun tubercurosis, de souche Aoyama B ou le Mycobactérium tubercurosi souche H 7RV est extrait avec de l'eau chaude, et que le 37 V composé lipopolysaccharide récupéré est purifié par purificatior fractionnée, on peut obtenir le lipoarabinomannan ayant une activité anti-tumeur et pas d'effet secondaire. On a également découvert que. lorsque ce lipoarabinomannan, ou arabinomannan exempt de lipide obtenu par élimination d'acides gras du lipoarabinomannan par saponi- fication, est modifié chimiquement par un acide gras, on obtient 2.- 2484258 un lipoarabinomannan chimiquement modifié, qui est comparable ou supérieur au lipoarabinomannan, extrait et purifié de la cellule, concernant l'activité anti-tumeur, et ne produit pas d'effet secondaire. Les composants de l'agent immunothérapique pour tumeurs de l'invention, le procédé pour sa préparation, et l'action thérapeutique qu'il produit, seront décrits en détail à l'aide des exemples et expériences, sans limiter l'étendue de l'invention. EXEMPLE 1 - Cet exemple illustre le procédé d'extrac- tion du lipopolysaccharide. (1-1) On inocule, dans un milieu de culture Sauton, le Mycobac- térium tubercurosis, souche Aoyama B, et l'on conduit une cul- ture aérobie durant 14 jours. La cellule est récupérée par filtration et lavée à l'eau froide, puis l'on ajoute de l'eau distillée à la cellule, pour faire flotter la cellule dans l'eau. La dispersion de cellule est chauffée à 100 C durant minutes, et filtrée, afin d'obtenir une solution aqueuse de l'extrait de cellule. On ajoute à la solution de l'acide sulfosalicylique, pour précipiter le composant protéiné, et la solution est séparée par centrifugation. Le produit qui surnage est dialysé en utilisant une membrane à dialyse, et le liquide interne est mélangé à de l'éthanol, dans une proportion 9 fois supérieure à la quantité de liquide interne, et le mélange est séparé par centrifugation, et l'on récupère le lipopolysaccharide brut précipité. On charge le lipopolysaccharide brut dans une colonne remplie de DEAESephadex A-25 (forme bicarbonatée) et l'on recueille une fraction élevée à l'eau distillée. La fraction est concentrée et mélangée avec une quantité équivalente d'éthanol, et l'on opére la séparation du mélange par centrifu- gation. Le produit qui surnage est concentré, et tamisé sur un tamis moléculaire, selon une chromatographie en phase liquide à performance élevée, sur une colonne remplie de TSK Gel 4000 SW, TSK Gel 3000 SW et TSK Gel 2000 SW, chaque produit proenant de Toyo Soda K-K, et l'on recueille une tfraetio de poids moléculaire compris entre 10.000 et 16.000. La fraction est dialysée et concentrée, puis purifiée encore 3.- 2484258 par chromatographie dlaffinité, sur lit d'agarose-concanavalin. fourni par les laboratoires E.Y, pour obtenir un lipopolysaccha ride purifié. (1-2) Le mycobacterium tubercurosis, souche H37RV est cultivé dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1-T. La cellule récupérée est soumise aux mêmes traitements, pour obtenir un lipopolysaccharide brut, qui est purifié par les mêmes procédés que ceux de l'exemple 1-1, en lipopolysaccharide purifié. EXPERIENCE 1 - ANALYSE DES COMPOSANTS MONOSACCHARIDE DU LIPOPOLYSACCHARIDE - (1-1). Le lipopolysaccharide purifié obtenu dans l'exemple 1-1 est hydrolysé avec de l'acide sulfurique, neutralisé par de l'Amberlite IR-45 (forme hydroxylée) et identifié par chromato- graphie en couche mince. On détecte de l'arabinose, mannose et glucose (arabinose: mannose_: glucose = 6: 4: traces). Le produit obtenu cidessus par hydrolyse et neutralisation, est réduit et acetylé selon les procédés connus, et le mélange d'acétate d'alditol résultant est déterminé par chromatographie gazeuse, en utilisant trois types de colonne. On confirme ainsi que le mélange est constitué de 61 % d'arabinose, 38 % de mannose et 1 % de glucose. Ainsi, il est confirmé que le compo- sant saccharide de ce lipopolysaccharide est de l'arabinomannan (1-2). Le compQsant monosaccharide du lipopolysaccharide prifié obtenu dans l'exemple 1-2 est analysé par les mêmes proc6dés qui ceux de l'expérience 1-1. Le résultat confirme que l'échantilloi purifié est constitué par 56 % d'arabinose et 44 % de mannose. Ainsi, il est confirmé que le composant saccharide de ce lipopo lysaccharide est de l'arabinomannan. EXPERIENCE 2 - ANALYSE DE LA STRUCTURE DE LA CHAINE SACCHARIDE DU LIPOPOLY- SACCHARIDE - (2-1). Le lipopolysaccharide purifié obtenu dans l'exemple 1-1, est methylé complètement selon le procédé Hakomori, et le lipopolysaccharide methylé est hydrolysé avec de l'acide sulfu- rique,neutralisé par de l'Amberlite IR-45 (forme hydroxylée), puis réduit et acetylé selon des procédés connus. Le mélange d'acétate d'alditol partiellement méthylé résultant est déter- miné par chromatographie gazeuse sur quatre sortes de colonne chargée et de colonne capillaire SCOT. Les pics détectés sont comparés avec les pics d'acétates d'alaitl partiellement méthy comparés avec les pics d'acétates d'alditèl partiellement m'éthy témoins, synthétisés séparément, et les composants saccharide partiellement méthylés respectifs sont identifiés et déterminés. En outre, les composants saccharide respectifs sont confirmés et identifiés à partir de parties des pics respectifs par GC - MS. La relation quantitative de l'alditol partiellement méthyle, déterminé par chromatographie gazuse, et des liaisons indiquées, est représentée dans le tableau 1. (2-2). Le lipopolysaccharide purifié obtenu dans l'exemple 1-2 est traité comme dans l'expérience 2-1. La relation quantitative de l'alditol partiellement méthyle, déterminé par chromatogra- phie gazeuse, et des liaisons indiquées, est représentée dans le tableau 2. Tableau 1 Saccharide déteotée, Liaison indique Rapport À aux -. 2-0- Methyl-Arabinose (= 1.o...) Remarmues 2,3,5-tri-O-methyl-D-arabinose 2,3di-O-methyl-D-arabinose 3,5.di-O-methyl-D-arabinose 2-O-methyl-Darabinose (Araf)1 > (Araf)1 > 2(Arafl.... 2,3,4,6-tetra-O-methy!-Dmannose (Manp)! - 2.5 12.8 3,4,6-tri-O-methy'l-D-mannose À>2(Man-p) 1,2 6. 1 40.5% 2,3,4-tri-0-methyl-D-mannose - 6(Manp)l- - 1.4 7.2 3,4-di-0methyl-D-mannose 2 g(Manp)l - 2.8 14.4 19.5 Total Q 1.2 8.0 1,4 1.0 6.2 41.0 7.2 5.1 59.5% r'> co CO ln ! 6'6z F ' I 0'6 L'.(u).u- '6I T' (uN su-'--- a- L'L 0'* O'I 6'0 oeouVq'eV-tRt:q.eX 7- -o- O e) O U T c U a B - c -I R 4 8 - Oq - T P- 0 èE 'E (jiaay) ç -E -E e T(iexv)z EXPERIENCE 3 - ANALYSE DES ACIDES GRAS DANS LE LIPOPOLYSACCHARIDE - (3-1). A lmg du lipopolysaccharide obtenu dans l'exemple 1-1, on ajoute 1 ml de méthanol contenant 100 p g de méthyl laurate comme référence interne, et 3,3 % d'acide chlorhydrique, et l'on décompose le mélange par méthanolyse dans un tube scellé rempli d'azote. Le mélange résultant est concentré à basse température, et dissout dans le chlorure de méthylène. Par chromatographie gazeuse utilisant deux sortes de colonnes chargées, les consti- tuants acides gras sont identifiés et déterminés par la durée de rétention du méthyl ester de l'acide gras. Les pics des esters méthyliques des acides gras respectifs sont identifiés par GC-MS. Les résultats de l'identifbation par chromatographie gazeuse sont représentés dans le tableau 3. TABLEAU 3 Methyl laurate (référence interne) (100> g) Metyl myristate 10.4>.g 42.9 x 10-9 mol Methyl palmitate 89.5>.,g 330.9 x 109 mol Methyl heptadecanoate 0.5g 1.8 x 10-9 mol Methyl stearate 37.3>,g 125.0 x 109 mol Methyl oleate 0O.2 g 0.7 x 10'9 mol Methyl tubercurostearate 12.8,g 41.0 x 109 mol Total 150.7/,g 542.3 x 10 mol Les résultats expérimentaux ci-dessus confirment que la teneur en acide gras de l'échantillon de lipopolysaccharide est d'environ 15 %/ (150,7y-g pour 1 mg de polysaccharide) et l'on peut supposer que le lipopolysaccharide (poids moléculaire moyen 13.000) qui a été obtenu dans l'exemple 1-1, contient environ 7,6 acides gras (1950 équivalents-grammes), (3-2). Le lipopolysaccharide purifié obtenu dans l'exemple 1-2 est traité comme dans l'exemple 3-1, de façon à identifier et déterminer le constituant acide gras. Les résultats de l'iden- tification sont représentés dans le tableau 4. 8.-- TABLEAU 4 Methyl laurate (référence interne) (100 g. Methyl myristate 6.6 1g 27.2 x 109 mol Methyl palmitate 39.6>,g 146.4 x 109 mol Methyl heptadecanoate 0.4 g 1.4 x 10-9 mol Methyl stearate 13.2>g 44.2 x 10-9 mol Methyl tubercurostearate 19.8 g 67.4 x 10 9 mol Total 79. 6>1.g 282.6 x 10- 9 mol - Les résultats expérimentaux ci-dessus confirment que la teneur en acide gras de l'échantillon de lipopolysaccharide est d'environ 8 % (79,6> g par mg de polysac- charide) et l'on peut supposer que le lipopolysacchar-ide (poids moléculaire moyen 12.000) qui a été obtenu dans l'exemple 1-2 contient environ 3,9 acide gras (1000 équivalent-grammes). EXPERIENCE 4 - ANALYSE DE LA STRUCTURE DE L'ACIDE GRAS DANS LE LIPOPOLYSAC- CHARIDE - (4-1). Le lipopolysaccharide purifié obtenur dans l'exemple 1-1 est traité avec de l'éther méthylvinylique dans le diméthyl- sulfoxyde, en présence d'acide p-toluène-sulfonique comme catalyseur pour methoxyéthyler les groupes hydroxyl libres. Les acides gras sont éliminés par saponification et les groupes hydroxyl, qui ont été libérés, sont méthylés suivant le procédé Hakomori. Puis-les groupes methoxyéthyl sont éliminés par hydrolyse, avec du méthanol contenant un acide, et un mélange de monosaccharides partiellement méthylés est obtenu par hydro- lyse acide. Le mélange est réduit et acetylé suivant des procédés connus, et les acétates sont analysés par chromatographie gazeuse, en utilisant trois wrtes de colonne chargée et du xylitol comme référence interne, et l'identification et la détermination sont effectuées par comparaison avec des acétates d'alditol standards de monosaccharides libres et partiellement méthylés. Les pics identifiés sont représentés dans le tableau 5. TABLEAU 5 -m6thyl-D-arabinitol 6.I4% 2-méthyl-D-arabinitol 2.48% 59. aa% 3-méthyl-Darabinitol 0.33% D-arabinitol 50.27% ______-____________________________________________________ 2-méthyl-D- mannitol 0.02% 3-ou 4-méthyl-D-mannitol 0.22% 40.78 % 6-méthyl-D-amnnitoI 1.04% D-mannitol 39.50% total 100 % (comprenant 10, 23% d'ester d'acide gras de monosaccharide). Les résultats expérimentaux ci-dessus suggèrent qi'environ un acide. gras est lié par 10 molécules du constituant monosaccharide, et la plupart des positions de liaison sont les positions 5 des unités arabinose, le reste étant les positions 2 des unités arabinose, les positions 6 des unités mannose, et autres. A partir des résultats analytiques obtenus dans les expériences 1-1, 2-1, 3-1 et 4-i, on peut s'attendre à ce que le lipopolysaccharide obtenu dans l'exemple 1-1 soit un lipopolysaccharide ayant un poids moléculaire moyen d'environ 13.000 qui est constitué d'arabinomannan ayant un poids molé- culaire moyen d'environ 11.000, composé d'environ 47 unit{s d'arabinose et environ 30 unités mannose et environ 8 acides gras ayant 14 à 19 atomes de carbone ( principalement de l'acide palmitique) qui sont liés à l'arabinomannan. (4-2). Le lipopoly- saccharide purifi6 obtenu dans l'exemple-1-2 est traité comme dax l'expérience 4-1. Les pics de l'acétate d'alcitol partiellement méthyle résultants sont identifiés comme le montre le tableau 6. 1o.- 2484258 TABLEAU 6 -métliy-D-arabinitol 3.29 % 2-méthyl-D-arabinitol 1.60 % i 1.60 - J 55.49 % 3-méthyl-Darabinitol 0.03 % D-arabinitol 50.57 % J -2-méthyl-D-mannitol 0. 1f % 3- or 4-mêthyl-D-mannitol 0.03 % 44.51 % 6-méthyl-D-mannitol 1.00 % D-mannitol 43.47 % Total 100 % (comprenant 5, 96 % d'ester d'acide gras de monosac- charide) -15 Les résultats expérimentaux ci-dessus suggèrent qu'environ I acide gras est lié par 16 molécules as monosaccharides constituants, et la plupart des positions de liaison sont les positions 5 et 2 des unités arabinose et les positions 6 des unités mannose. Les résultats analytiques obtenus dans les expériences 1-2, 2-2, 3-2 et 4-2, laissmit penser que le lipopo-ly- saccharide obtenu dans l'exemple 1-2 est un lipopolysaccharide ayant un poids moléculaire moyen d'environ 12.000, qui est constitué d'arabinomannan ayant un poids moléculaire moyen d'environ 11.000, composé d'environ 42 unités arabinose et environ 34 unités mannose et avec, en moyenne, 4 ou 5 acides gras ayant 14 à 19 atomes de carbone (principalement acide palmitique) qui sont liés à l'arabinomannan. Un procédé pour obtenir un lipopolysacch- aride en liant un acide gras au polysaccharide, est connu. Selon l'invention, le lipoarabinomannan plus actif dans l'immu- nothérapie des tumeurs, peut être préparé en liant un acide gras approprié à l'arabinomannan exempt de lipide ou faiblement lipidique, par ce procédé connu. EXEMPLE 2 - Cet exemple illustre le procédé pour la préparation de lipoarabinomannan, à partir d'arabinomannan exempt de ( Z-l) lipide La cellule utilisée dans l'exemple 1-1 est 4 extraite à l'aleali, et de l'arabinomannan ayant un poids molé- cunire d'environ 8.500 à 14.000 est obtenu par tamisage molécu- 1.- "_2484258 laire, de la même façon que dans l'exemple 1-1. L'arabinomannan ainsi obtenu est purifié encore par chromatographie affinitaire et séché; et l'on fait réagir 10 mg de ltarabinomannan séché avec 10 mg d'anhydride palmitique à 50 C durant 20 heures, pour obtenir la N,Ndimethylformamide-pyridine. On ajoute de l'éther au mélange réactionnel, et récupère le précipité par centrifugati le lave à l'éther et le sèche, pour obtenir 11 mg de lipoarabi- nomannan. Le résultat de l'analyse confirme que la structure de la chaine saccharidique du lipoarabinomannan obtenu ci-dessus est essentiellement la même que celle détectée dans les expériences 1-1 et 2-1. En particulier, il est confirmé que l'acide palmitique est lié surtout en position 5 à l'unité arabinose dans la chaîne arabinomannan, dans une proportion d'environ 9,8 %/ en poids, et que le poids moléculaire moyen est d'environ 12.500. EXEMPLE 3 - Cet exemple illustre le procédé de prépa- ration de lipoarabinomannan à partir d'arabinomanann faiblement lipidique. mg d'arabinomannan ayant une teneur en acide gras d'environ 3 %, qui a été obtenu comme dans l'exemple 1-1, est traité aux ultrasons, avec 10 mg de chlorure de palmi- toyl dans la pyridine, et la réaction est effectuée à 37 C durant 18 heures. On ajoute de l'éthanol au milieu réactionnel et recueille le précipité, le lave à l'éther et-le sèche, pour obtenir 4,3 mg de lipoarabinomannan. Le résultat de l'analyse confirme que la structure de chatne saccharidique est essentiellement la même que celle détectée dans les expériences 1-1 et 2-1. En parti- culier, il est confirmé que lacide palmitique est liée essentiel lement un position 5 de l'unité arabinose et en position 6 de l'unité mannose, dans la chaine arabinomannan, dans une propor- tion d'environ 28 o% en poids, et le poids moléculaire moyen est d'environ 14.000. Du lipoarabinomannan semblable à celui obtenu dans les exemples 2 ou 3, peut être obtenu en employant de l'arabinomannan exempt de liquide ou faiblement lipidique, extrait et purifié à partir de la cellule du Myoobacterium tubercurosis, souche H37RV. De plus, de l'acide stearique peut 12.- être utilisé à la place de l'acide palmitique dans les exemples 2 ou 3. EXPERIENCE 5 - Dans cette expérience, on teste l'activité anti-tumeur. Des cellules (1 x 10 6) de tumeur Sarcoma- sont transplantées de façon sous-cutan6e sur souris ddY (femelle âgée de 10 semaines) qui a été sensibilisée par BCG. A partir du lendemain, du lipoarabinomannan présenté dans le tableau 7, qui est dissout de façon stérile dans du sérum physiologique, est administré par voie hypodermique à des groupes de souris (chaque groupe étant constitué de 8 souris) en quantité de 0,02 Mg à 2,0 g par souris, chaque jour suivant, 8 fois en tout. Lorsque 30 jours-sont passés, après la transplantation des cellules de tumeur, on tue les animaux et pèse les tumeurs. L'activité anti-tumeur de chaque lipoarabinomannan est évaluée à partir du poids de tumeur mesuré. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 7. Quantité Administrée (,,g) 0.02 0.2 2.0 13.- Tableau 7 Poids de la tumeur 2.71 + 2.54 + 1.78 + 1.70 + s.E. (r) 0.32 0.43 0.26* 0.29* Témoin- - 2.82 + 0.40 - ArMn-2b) 0.02 1.90 + 0.52 67.4 di.tto 0.2 1.62 + 0.24** 57.4 ditto 2.0 1. 74 + 0.25** 61.7 Témoin - 2.53 + 0.33 - Arm-3C) 0.02 1.87 + 0.40 73.9 ditto 0.2 1.53 + 0.27* 60.5 ditto 2.0 1.54 + 0.27* 60.9 Témoin - 2.85 + 0.21 - (d) Ar-4d) 0.02 1.52 + 0.82** 53.3 ditto 0.2 1.40 + 0.15** 49.1- ditto 2.0 1.83 + 0.17** 64.2 Témoin - 2.93 + 0.25 - ArMn-5e) 0.02 2.03 + 0.43 69.3- ditto 0.2 1.83 + 0.31* 62.5 ditto 2.0 1.77 + 0.20** 60.4 Group e Témoin Ar4Mn-1a) ditto ditto TL2 m() 93.7 65.7 62.7 14.- Nota: a) Lipoarabinomannan extrait et purifié par le procédé décrit dans l'exemple 1-1 (teneur en acide gras = 3%>. b) Lipoarabinomannan extrait et purifié dans l'exemple 1-1 (teneur en acide gras = 15 %). c) Lipoarabinomannan formé en liant de l'acide palmitique à un arabinomannan exempt de lipide, par une liaison ester, dans l'exemple 2 (teneur en acide palmitique = 10 %). d) Lipoarabinomannan formé en liant de l'acide palmitique & un lipoaVabinomannan faiblement lipidique, par une liaison ester dans l'exemple 3 (teneur en acide palmi- tique = 28 %). e) Lipoarabinomannan extrait et purifié dans l'exemple 1-2 -teneur en acide gras = 8 %). T/C (%).: le rapport du poids de la tumeur dans le groupe traité au lipopolysaccharide au poids de la tumeur dans le groupe témoin. *: P.0,05 **: P 4 0,01 Comme il apparalt des résultats présentés dans le tableau 7, les lipopolysaccharides de ltinvention, ctest- à-dire le lipoarabinomannan formé en liant un acide gras à un arabinomannan exempt de lipide ou faiblement lipidique, et le lipoarabinomannan extrait et purifié à partir de la cellule, ont une action inhibitrice élevée vis-à-vis de l'accroissement de la tumeur, en administrant de petites quantités. L'arabinomannan ayant une teneur en acide gras plus élevée, présente une action anti-tumeur spécialement élevée, en administrant de plus faibles quantités. Lorsque le lipopolysaccharide de l'inven- tion est administré au corps humain comme agent immunothéra- pique pour tumeurs, c'est sous la forme d'injection hypodermique. Un exemple de préparation de l'injection hypodermique est décrit cidessous. EXEMPLE 5 - 1 mg de lipopolysaccharide de l'invention (obtenu dms les exemples 1, 2 ou 3) est dissout dans une quantité appropriée de sérum physiiogique pour injection, pour former ml de solution. La solution est traitée pour donner une injection hypodermique contenant 10 g/ml du lipopolysaccharide, selon les procédés habituels. L'injection est administrée par voiL hypodermique 1 à 3 fois (10 à 30>, g de lipopolysaccharide) par semaine. Une cellule de bacille de tuberculose, ou des extraits de cette cellule, dont l'activité anti-tumeur a été évaluées sont un mélange de composés chimiques complexes. Par contre, le lipoarabinomannan de l'invention est un lipopolysac- charide ayant une composition chimique définie, et qui est isolé et purifié. De plus, le lipopolysaccharide de l'invention est caractérisé en ce que les effets secondaires, que donne la cellule, peuvent être éliminés. En conséquence, on peut s'attendre à ce que le lipopolysaccharide de l'invention soit un agent immunothérapique valable pour tumeurs. 16.- 2484258 REVENDICATIONS 1.- Agent immunothérapique pour tumeurs, caractérisé en ce que le composant actif est un lipopolysaccha- iide, constitué par de l1arabinomannan comme polysaccharide et des acides gras liés à l'arabinomannan par des liaisons ester, la teneur en acide gras dans le lipopolysaccharide étant de 1 à 28 %, le lipopolysaccharide étant obtenu par extraction à lteau chaude et purification de la cellule de bacille de tuberculose humaine, Mycobacteria tubercurosis, souche Aoyama B ou Mycobactérium tubercurosis, souche H37Rv. 2.- Agent immunothékapique pour tumeurs, suivant la revendication 1, dont le composant actif est un lipopolysaccharide préparé en liant un acide gras à l'arabino- mannan par une liaison ester, caractérisé en ce que l'arabino- mannan est obtenu par extration à l'alcali et purification de la cellule de bacille de tuberculose humaine, Mycobactérium tubercurosis souche Aoyama B ou Mycobactérium tubercurosis souche H 37Rv, la teneur en acide gras dans le lipopolysacchgride étant de 1 à 28 %. 3.- Agent immunothérapique pour tumeurs, suivant la revendication 1, dont le composant actif est un lipopolysaccharide préparé en liant un acide gras à un lipoara- binomannan à travers une liaison ester, caractérisé en ce que le lipoarabinomannan est obtenu par extration à l'eau chaude et purification de la cellule du bacille de la tuberculose humaine, Mycobactérium tubercurosis souche Aoyama B ou Mycobactérium tubercurosis souche H 37R, la teneur en acide gras dans le lipopolysaccharide étant de I à 28 %. 4.- Agent immunothérapique pour tumeurs, selon la revendication 1, caractérisé en ce que les acides gras sont les acides palmitique, myristique, stearique, tuber- curostearique, heptadecanoique, oleique et linoleique, et que le lipoarabinomannan a une composition monosaccharidique de à 74 % d'arabinose, 20 à 50 % de mannose, O à 10 % de glucose et O à 13 % de galactose. 5.- Agent immunothérapique pour tumeurs, selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que l'acide gras appartient au groupe constitué par l'acide palmiti- que et l'acide stearique, et que le lipopolysaccharide a une composition monosaccharidique de 30 à 74 % d'arabinose, 20 à 50 % de mannose, O à 10 % de glucose et O à 13 % de galactose.