Brevet FR2486098A1 — publié le 19820108

La présente invention concerne le domaine de la technique de l'ADN recombinant, c'est-à-dire des procédés utilisés dans la technique de l'ADN recombinant et les pro- duits obtenus par ces procédés. Sous un aspect plus détaillé, l'invention con- cerne des polypeptides, en particulier des interférons de leucocytes humains mûrs, les compositions pharmaceutiques qui les contiennent et un procédé pour leur préparation qui implique de faire crottre une culture d'un micro-orga- nisme transformé au moyen d'un véhicule d'expression micro- bien réplicable capable d'exprimer lesdits polypeptide, a- fin que cette culture puisse exprimer lesdits polypeptides. La présente invention comprend également les véhicules d'expression utilisés dans ce procédé et les nouveaux micro- organismes contenant ces véhicules d'expression ainsi que les procédés pour leur préparation. Enfin, l'invention con- cerne des séquences d'ADN comprenant des séquences détermi- nant la séquence d'acides aminés d'un interféron de leuco- cyte humain mûr. L'interféron de leucocyte humain (LeIF) a été dé- couvert pour la première fois et préparé sous forme de pré- cipités très peu purifiés par Isaacs et Lindermann (Proc. R. Soc. B 147, 258-267) (1957); brevet américain n0 3 699 222). Les efforts pour purifier et caractériser ce produit se sont poursuivis depuis lors, et ont abouti à la préparation d'interférons de leucocyte relativement homo- gènes provenant de leucocytes de donneurs normaux ou leucé- miques (demande de brevet publiée en Allemagne sous le n0 2 947 134). Ces interférons sont une famille de protéines dont on sait qu'elles possèdent l'aptitude à conférer une résistance aux virus à leurs cellules cibles. En outre, l'interféron peut agir pour inhiber la prolifération cellu- laire et moduler la réponse immunitaire. Ces propriétés ont incité à utiliser en clinique l'interféron de leucocyte com- me agent thérapeutique pour le traitement des infections virales et des états malins. On a purifié des interférons de leucocyte jusqu'à ce qu'ils soient pratiquement homogènes (Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 640-644 LT9797; Zoon et al., ibid. 76, 5601-5605 /T9797), qui indiquent des poids moléculaires variant d'environ 17 500 à environ 21 000. L'activité spécifique de ces préparations est remarquable- ment élevée, 2 x 108 à 1 x 109 unités/mg de protéine, mais les rendements obtenus dans les procédés de culture cellu- laire sont restés bas malgré tous les efforts. Cependant, les progrès effectués dans les tecbhniques de détermination des séquences protéiques ont permis la détermination par- tielle des séquences d'acides aminés (Zoon et al., Scien- ce 207, 527 LT9807; Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 5102-5104 /9807). L'élucidation de la glyco- sylation de divers interférons de leucocytes est actuelle- ment incomplète, mais il est aujourd'hui clair que les dif- férences de glycosylation entre membres d'une même famille ne suffisent pas à rendre compte du spectre de poids molé- culaire observé. Au contraire, les interférons de leuco- cyte diffèrent nettement dans la composition et la séquen- ce des acides aminés, et l'homologie des acides aminés est dans certains cas inférieure à 80%. Bien que l'isolement à partir de leucocytes de donneurs ait fourni un matériau suffisant pour une caracté- risation partielle et des études cliniques limitées avec un interféron de leucocyte homogène, il s'agit là d'une source tout à fait insuffisante pour les quantités d'interféron né- cessaires aux essais cliniques à grande échelle puis pour une généralisation de l'emploi prophylactique et/ou théra- peutique. De fait, les investigations cliniques actuelles employant des interférons dérivés de leucocytes humains dans des expériences anti-tumorales et antivirales se sont sur- tout limitées à des préparations brutes (pures à moins de 1%) du produit, et les longs délais nécessaires pour pré- parer des quantités suffisantes, même sans tenir compte du prix, ont retardé de façon cruciale le lancement de re- cherches plus étendues. Cependant, avec l'apparition de la technique de l'ADN recombinant, il est devenu possible de maîtriser la production microbienne d'une énorme variété de polypepti- des utiles. On dispose déjà de bactéries modifiées par cette technique de manière à permettre la production de produits polypeptidiques comme la somatostatine, les chat- nes A et B de l'insulin humaine et l'hormone de croissan- ce humaine (Itakura et al., Science 198, 1056-1063.L.9777; Goeddel et al., Nature 281, 544-548 j19797). Plus récem- ment, on a utilisé les techniques de l'ADN recombinant pour réaliser la production bactérienne de la proinsuline et de la thymosine alpha 1 et plusieurs auteurs ont signalé avoir obtenu l'ADN permettant de produire l'interféron de leuco- cyte humain et les protéines résultantes ayant une activi- té d'interféron de leucocyte (Nagata et al., Nature 284, 316-320 LT9807; Mantei et al., Gene 10, 1-10 LT9807; Tani- guchi et al., Nature 285, 547-549 È19807). La cheville ouvrière de la technique de l'ADN recombinant est le plasmide, boucle non chromosomique d'ADN à deux chaînes que l'on trouve chez les bactéries et d'autres microbes, souvent à plusieurs exemplaires par cellule. Dans l'information transcrite dans l'ADN du plas- mide est comprise celle qui est nécessaire pour reproduire le plasmide dans les cellules-filles (c'est-à-dire un "re- plicon") ainsi que, ordinairement, une ou plusieurs caracté- ristiques de sélection comme, dans le cas des bactéries, la résistance aux antibiotiques qui permet à des clones de la cellule-hôte contenant le plasmide auquel on s'intéresse d'être reconnus et cultivés de façon préférentielle dans des milieux sélectifs. L'utilité des plasmides tient au fait qu'on peut les segmenter de façon spécifique par une endonu- cléase de restriction ou "enzyme de restriction" quelconque, dont chacune reconnaît un site différent sur l'ADN plasmidi- que. On peut ensuite insérer des gènes ou fragments de gè- nes hétérologues dans le plasmide par jonction aux extrémi- tés sur le site de segmentation ou à des extrémités recons- tituées adjacentes au site de segmentation. La recombi- naison de l'ADN s'effectue en-dehors de la cellule, mais le plasmide "recombinant" obtenu peut y être introduit par un procédé connu sous le nom de transformation et l'on obtient de grandes quantités du plasmide recombinant con- tenant le gène hétérologue en cultivant le transformant. De plus, lorsque le gène est correctement inséré par rap- port aux parties du plasmide qui gouvernent la transcrip- tion et la traduction du message d'ADN encodé, le véhicule d'expression résultant peut être utilisé pour produire effectivement la séquence polypeptidique déterminée par le gène inséré, procédé que l'on appelle expression. L'expression est amorcée dans une région connue sous le nom de promoteur qui est reconnue et liée par l'ARN polymérase. Dans certains cas, comme dans le promo- teur au tryptophane ou "trp" préféré dans la pratique de l'invention, les régions promotrices sont en partie recou- vertes par des régions "opératrices" pour former un combi- né promoteur-opérateur. Les opérateurs sont des séquences d'ADN qui sont reconnues par ce qu'on appelle les protéi- nes répresseurs qui servent à régler la fréquence de l'i- nitiation de la transcription à un promoteur particulier. La polymérase se déplace le long de 1'ADN, en transcrivant l'information contenue dans les chaînes d'encodage de son extrémité 5' à son extrémité 3' dans un ARN messager qui à son tour est traduit en un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés correspondant au code de l'ADN. Chaque acide aminé est encodé par un triplet de nucléotides ou "codon" au sein de ce qu'on peut appeler dans ce but le "gène de structure", c'est-à-dire la partie qui encode la séquence d'acides aminés du produit exprimé. Après s'être liée au promoteur, l'ARN polymérase commence par trans- mettre les nucléotides qui encodent un site de liaison ri- bosomique, puis un signal d'initiation de traduction ou de "départ" (ordinairement ATG, qui devient AUG dans 1'ARN messager résultant), puis les codons de nucléotides au sein du gène de structure lui-même. Ce qu'on appelle les codons d'arrêt sont transcrits à l'extrémité du gène de structure, après quoi la polymérase peut former une séquence supplé- mentaire d'ARN messager qui, à cause de la présence du si- gnal d'arrêt, restera non traduite par les ribosomes. Les ribosomes se lient au cycle de liaison ménagé sur l'ARN messager, sur les bactéries ordinairement au fur et à me- sure que l'ARN est formé, et produisant eux-mêmes le poly- peptide encodé, en commençant au signal de départ de tra- duction et en terminant au signal d'arrêt mentionné ci-des- sus. On obtient le produit désiré si les séquences qui encodent le site de liaison ribosomique sont positionnées correctement par rapport au codon d'initiation AUG et si tous les autres codons suivent le codon d'initiation en phase. Le produit résultant peut être obtenu en lysant la cellule hôte et en récupérant le produit par une purifica- tion appropriée à partir d'autres protéines bactériennes. Il est apparu que l'application de la technique de l'ADN recombinant (c'est-à-dire l'insertion de gènes d'interféron dans les véhicules d'expression microbienne et leur expression sous la dépendance d'éléments de régu- lation du gène microbien) serait la manière la plus effi- cace de fournir de grandes quantités d'interféron de leu- cocyte qui, en dépit de l'absence dans le matériau ainsi produit de la caractéristique de glycosylation du maté- riau d'origine humaine, pourrait être employé en clinique dans le traitement d'un large éventail de maladies virales et néoplasiques. L'approche permettant d'obtenir un premier gène - de leucocyte selon l'invention fait intervenir les étapes suivantes: (1) On utilise des séquences partielles d'aci- des aminés d'interféron de leucocyte humain purifiées jus- qu'à l'homogénéité pour construire des ensembles d'échan- tillons d'ADN de synthèse dont les codons, dans l'agrégat, représentent toutes les combinaisons de nucléotides possi- bles capables d'encoder les séquences partielles d'acides aminés. (2) On prépare des banques de colonies bacté- riemnnes contenant de l'ADN complémientaire (ADNc) à par- tir d'ARN messager induit. On hybride un autre ARNm, ayant été préalablement marqué par une substance radio- active, à de l'ADNc de plasmide provenant de cette banque. On élue l'ARIlm hybridant et on le teste pour observer sa traduction en interféron dans une étude d'oocytes. On examine en outre l'hydridation en échantillons préparés comme il est dit en (1) ci-dessus d'ADN de plasmides pro- venant de colonies dont on a montré qu'elles induisent une activité d'interféron de cette manière. (3) Parallèlement à l'approche de la partie (2) ci-dessus, on utilise de l'ADNc provenant d'un ARNm induit dans des plasmides pour former une banque indépendante de colonies transformantes. On utilise les échantillons de la partie (1) pour amorcer la synthèse d'ADNc à une seule chaîne étiqueté par un produit radioactif aux fins d'utili- sation comme échantillons d'hydridation. On hydride les échantillons de synthèse avec de 1'ARNm induit comme mo- dèle et on les prolonge par une transcription inverse pour former de l'ADNc induit, étiqueté avec un élément radioac- tif. On poursuit les expériences sur des clones provenant de la banque de colonies ayant servi à hydrider l'ADNc mar- qué par un élément radioactif obtenus de cette manière, afin de confirmer la présence d'un gène entier d'encodage d'interféron. N'importe quel fragment de gène putatif de longueur partielle obtenu dans les parties (1) ou (2) peut lui-même être utilisé comme expérimentation pour le gène entier. (4) On adapte le gène entier obtenu ci-dessus, en utilisant de l'ADN de synthèse, pour éliminer toute séquence directrice susceptible d'empêcher l'expression mi- crobienne du polypeptide mûr et pour permettre un position- nement approprié dans un véhicule d'expression par rapport aux signaux de départ et au site de liaison ribosomique d'un promoteur microbien. On purifie l'interféron exprimé jusqu'à un point permettant la confirmation de son carac- tère et la détermination de son activité. (5) Le fragment de gène d'interféron préparé de la manière précédente est utilisé lui-même pour faire des études, par hybridation, d'autres espèces d'interfé- ron de leucocyte partiellement homologues. En appliquant les procédés de la technique de l'ADN recombinant tels qu'esquissés ci-dessus, on obtient une production microbienne avec un haut rendement et une grande pureté de la famille des interférons de leucocyte homologues (non glycosylés) sous forme de polypeptides mûrs,pratiquement non accompagnés par la préséquence cor- respondante ou l'une quelconque de ces fractions. Ces in- terférons peuvent être directement exprimés, recueillis et purifiés à des niveaux qui permettent de les utiliser dans le traitement des maladies virales et malignes chez l'animal et chez l'homme. Les éléments d'une famille ex- primés jusqu'ici se sont révélés efficaces dans les expé- riences in vitro, et aussi, dans la première démonstra- tion de ce genre, dans une expérience in vivo, cette der- nière faisant intervenir le premier interféron de leucocyte mûr ayant été produit par voie microbienne. L'expression "interféron de leucocyte mûr" uti- lisée dans le contexte de la présente demande, définit une molécule d'interféron produite par voie microbienne (p ex. bactérienne) et dépourvue de groupes glycosyle. L'interfé- ron de leucocyte mûr, selon l'invention, est immédiatement exprimé à partir d'un signal de départ de traduction (ATG) juste avant le premier codon acide aminé du produit natu- rel. Le polypeptide "mûr" peut ainsi contenir comme pre- mier acide aminé de sa séquence la méthionine (encodée par ATG) sans altérer son caractère de façon essentielle. D'un autre côté l'hôte microbien peut traiter le produit de traduction pour supprimer la méthionine initiale. L'in- terféron de leucocyte mûr pourrait être exprimé avec une protéine conjuguée différente de la protéine directrice classique, le conjugué étant spécifiquement segmentable dans un environnement intra- ou extracellulaire (cf brevet an- glais n0 2 007 676 A). Enfin, l'interféron m r pourrait être produit concurremment avec un peptide "signal" mi- crobien qui transporte le conjugué vers la paroi cellu- laire, qui le traite de manière à retirer le signal et à sécréter le polypeptide mûr. "Expression" de l'interféron de leucocyte mûr désigne la production par voie microbienne (bactérienne ou autre) d'une molécule d'interféron ne con- tenant pas de groupe glycosyle ou d'une préséquence qui accompagne immédiatement la traduction l'.Arm d'un génome d'interféron de leucocyte humain. Ainsi des protéines particulières d'interféron de leucocyte ont été définies au moyen d'un gène d'ADN dé- terminé (figures 3 et 8) et de la détermination par déduc- tion d'une séquence d'acides aminés (figures 4 et 9). On comprendra que pour ces interférons particuliers, et de fait pour toutes les protéines appartenant à la famille des interférons de leucocyte comprises dans l'invention, il existe et on peut trouver d'un individu à l'autre des va- riations alléliques naturelles. Ces variations peuvent être mises en évidence par une ou plusieurs différence(s) d'acides aminés dans la séquence globale ou par des délé- tions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'un ou de plusieurs acide(s) aminé(s) dans ladite séquence. Pour chaque protéine d'interféron de leucocyte, étiquetée LeIF A à LeIF J ces variations alléliques sont comprises sous l'étiquette ou le terme définissant ainsi cette in- vention. La figure 1 représente deux séquences d'acides aminés communes à toutes les espèces d'interférons isolées à partir de leucocytes humains et purifiées jusqu'à homo- généité, désignées T-1 et T-13. Toutes les séquences Do- tentielles d'ARNm donnant le code de ces peptides sont présentées, ainsi que les séquences d'ADN correspondantes. Les lettres A, T, G, C et U, respectivement désignent les nucléotides contenant les bases adénine, thymine, guanine, cytosine et uracile. La lettre N désigne l'un quelconque des nucléotides A, G, C et U. Les polynucléotides sont décrits comme se lisant dans la direction allant de 5' (gauche) à 3' (droite) et, lorsque l'ADN à double chaîne ("d.s.") est représenté, vice-versa pour la chatne du bas, ou chaîne non codante. La figure 2 est un autoradiogramme montrant l'hy- bridation de plasmides de LeIF potentiels avec des désoxyo- ligonucléotides de synthèse étiquetés au 32po La figure 3 présente la séquence de nucléotides (chalne d'encodage) de huit fragments de gène isolés com- me candidats à l'utilisati n dans l'expression des inter- férons de leucocyte, désignés respectivement par "A', à "H". Le codon d'initiation de traduction ATG et le triplet de terminaison de chaque LeIF sont soulignés. Les codons d'arrêt ou triplets de terminaison sont suivis par des régions non traduites en 3'. Le gène entier de LeIF A inclus manque d'un codon que l'on trouve dans les autres qui sont présentés, comme l'indique la troisième ligne A de la figure 3. Isolé, le fragment E manque de la pré- séquence entière de la protéine directrice mais comprend le gène entier du LeIF E mûr putatif. Le fragment G iso- lé manque de la pleine séquence d'encodage. La figure 4 est une comparaison des huit séquen- ces protéiques de LeIF prédites d'après les séquences de nucléotides. On emploie les abréviations à une lettre re- commandées par la commission de l'IUPAC-IUB sur la nomen- clature biochimique: A, alanine; C, cystéine; D, acide aspartique; E, acide glutamique; F, phénylalanine; G, gly- cine; H, histidine; I, isoleucine; K, lysine; L, leucine; M, méthionine; N, asparagine; P, proline; Q, glutamine, R, arginine; S, sérine; T, thréonine; V, valine; W, trypto- phane; et Y, tyrosine. Les numéros se réfèrent aux posi- tions des acides aminés (S dénote le peptide signal). Le tiret dans la séquence LeIF A à l'acide aminé 165 en po- sition 44 est introduit pour aligner la séquence LeLF A avec les séquences d'acides aminés 166 des autres LeIF. On détermine la séquence LeIF E en négligeant le nucléo- tide supplémentaire (position 187 de la figure 3) dans sa région d'encodage. Les astérisques indiquent des codons de terminaison en phase. On voit également les acides aminés communs à tous les LeIF (sauf le pseudo-gène LeIF E)o Les résidus soulignés sont des acides aminés qui sont également présents dans l'interféron de fibrolaste humain. La figure 5 représente des cartes d'endonucléase de restriction des huit types d'ADNc clonés avec LeIF (A à H). On construit les plasmides hybrides par le procédé d'ac- crochage dC:dG (Goeddel, D.V. et al, Nature 287, 411-416 /19807). On peut donc exciser les insertions d'ADNc en utilisant PstI. Les lignes à l'extrémité de chaque inser- tion d'ADNc représentent les queues de flanquement homopo- lymériques dC:dG. Les positions des sites de restriction PvuII, EcoRI et BglII sont indiquées. Les régions teintées de la figure représentent les séquences d'encodage des LeIF mûrs; les régions hachurées indiquent les régions d'en- codage de peptides signaux; et les régions blanches mon- trent les séquences de non-encodage 352 et 5'. La figure 6 représente de façon schématique la construction d'un gène qui donne le code de la synthèse microbienne directe du LeIF A mûr. Les sites de restric- tion et les résidus sont tels que présentés ("Pst I", etc). Le terme "b.p." désigne une "paire de bases". La figure 7 (qui n'est pas à l'échelle) représen- te de façon schématique une carte de restriction de deux fragments de gène employés pour exprimer l'interféron de leucocyte mûr LeIF B. Les séquences de codons indiquées sont les extrémités de chaînes d'encodage résultant de la digestion par l'enzyme de restriction Sau3a dans les deux cas présentés. Les figures 8 et 9 fournissent les séquences d'ADN et d'acides aminés (voir la figure 4 ci-dessus pour les abré- viations d'une lettre correspondantes) de cinq protéines LeIF de l'invention, y compris les types I et J. Dans la figure 9, l'astérique indique un codon de terminaison dans la séquence d'ADN correspondante et le tiret et une-délétion *ou un trou dans la séquence. A. Microorganismes employés Les travaux ici décrits font appel à deux micro- organismes: E. coli x 1776, tel que décrit dans le brevet américain n0 4 190 495, et E. coli K-12 souche 294 (ex- trémité A, thi, hsr, hsm) tel que décrit dans le brevet anglais n0 2 055 382 A. Tous deux ont été dépo- sés à l'American Type Culture Collection (NO ATCC 31537 et 31446 respectivement). Les travaux d'ADN recombinant ont été faits selon les ordonnances édictées par les Instituts nationaux de la santé. L'invention, dans ses modes de réalisation préfé- rés, est décrite en se référant à E. coli, y compris non seulement les souches d'E. coli x 1776 et E. coli K-12 souche 294, définies ci-dessus, mais aussi d'autres sou- ches connues d'E. coli comme E. coli B, ou d'autres sou- ches microbiennes, dont beaucoup sont déposées et peuvent être retirées dans des institutions reconnues de dépôts de microorganismes, comme l'American Type Culture Collec- tion. Voir aussi la demande de brevet allemand publiée sous le n0 2 644 432. Ces autres microorganismes com- prennent, p ex., des bacilles comme Bacillus subtilis et d autres entérobactéries parmi lesquelles on peut mentionner à titre d'exemples Salmonella thyphimurium et Serratis marcescens, en utilisant des plasmides qui peu- vent y répliquer et exprimer des séquences de façon in- téressante une levure comme Saccharomyces cerevisiae com- me organisme hôte dans la préparation des présentes pro- téines d'interféron par expression de gènes donnant leur code sous le contrôle d'un promoteur de levure. B. Source et purification de l'ARNm de LeIF On peut obtenir l'ARNm de LeIF à partir de leuco- cytes humains, ordinairement ceux de malades atteints de leucémie myélogène chronique, qu'on a induit à produire l'interféron avec le virus de la maladie de Sendai ou de Newcastle, comme il est dit p. ex. dans la demande de bre- vet allemand n 2 947 134. L'une des sources particulière- ment appréciées, est une lignée cellulaire désignée KG-I provenant d'un malade atteint d'une leucémie myélogène aiguë. La lignée cellulaire, décrite par Koeffler, H.P. et Golde, D.W., Science 200, 1153 (1978), croit facilement dans un milieu de culture comprenant du RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 plus 10/o de SFV (sérum foetal de veau) inactivé à la chaleur, 25 mM de tampon HEPES (a- cide N-2-hydroxy-éthyl-pipérazine-N'-2-éthanesulfonique) et 50 microgrammes/ml de gentamycine, et est répartie en- tre plusieurs sous-cultures par 1 à 3 divisions deux fois par semaine. Les cellules peuvent être congelées à par- tir du milieu de croissance précédent auquel on ajoute 10% de diméthylsulfoxyde. KC-1 a été- déposé à l'American Type Culture Collection (nO ATCC CRL 8031). On induit des cellules KG-1 à produire de lI'ARNm d'interféron de leucocyte avec le virus de la maladie de Sendal ou de Newcastle en suivant le procédé décrit par Rubinstein et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 640- 644 /19797. On récolte les cellules 5 heures après l'in- duction et on prépare l'ARN par le procédé du thiocyanate de guanidinechlorhydrate de guanidine (Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294-5299 /19797. On isole de la même manière l'ARNi provenant de cellules sur lesquelles on n'a pas réalisé d'induction. On utilise la chromatographie à 1'oligo-désoxythymidine (dT)-cellulose et l'ultracentrifuga- tion au gradient de saccharose pour obtenir la fraction 12 S de l'APIdm poly(A) tel que décrite par Green et al. (Arch. Biochem..Biophys. 172, 7489 /19767 et Okuyuma et al. (Arch. Biochem. Biophys. 188, 98-104 _/9787. Cet ARM a un titre d'interféron de 8 000 à 10 000 unités par micro- gramme dans le dosage de l'oocyte de Xenopus laevis (Cava- lieri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 3287-3291 /9777). C. Préparation de banques de colonies contenant des sé- quences d'ADNc de LeIF On utilise 5 microgrammes d'ARNm pour préparer de l'ADNc à double chaîne par des procédés classiques (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483-2495 /19787 et Goeddel et ai., Nature 281, 544-548 /19797). On divise en fragments classés selon leur taille l'ADNc par électropho- rèse sur un gel de polyacrylamide à 6% et on recueille 230 ng de produit dont la taille varie de 500 à 1 500 p.b. par électroélution. On accroche à une fraction de 100 ng de cet ADNc des résidus de désoxycytidine (dC) de la manière décrite par Chang et al., Nature 275, 617-624 (1978), on cyclise avec 470 ng de plasmide pBR322 auquel on a accroché des résidus de désoxyguanosine (dG) au site PstI (Bolivar et al., Gene 2, 95-113 _9777), et que l'on a utilisé pour transformer E. coli x 1776. On obtient environ 130 trans- formants résistant à la tétracycline et sensibles à l'ampi- cilline par ng d'ADNc. Dans une seconde expérience similaire, on obtient environ 1000 transformants d'E. coli K-12 souche 294 ré- sistant à la tétracycline et sensibles à l'ampicilline par ng d'ADNc. Dans ce cas on recueille un ADNc fractionné par taille avec des tailles variant de 600 à 1300 p.b. par é- lectroélution pour obtenir les queues de dC. D. Préparation des oligonucléotides de synthèse et leur application La connaissance de la séquence d'acides aminés de plusieurs fragments tryptiques d'interféron de leucocy- te humain a permis de concevoir des désoxyoligonucléotides complémentaires de différentes régions de l'ARNm de LeIF. On a choisi les deux peptides tryptiques T1 et T13 parce qu'ils ont des séquences d'acides aminés ne nécessitant que la synthèse de douze et quatre undécanères, respective- ment, pour avoir toutes les séquences d'encodage possibles (figure 1). On synthétise quatre ensembles d'échantillons de désoxyoligonucléotides pour chaque séquence, contenant chacun soit trois (T-1A, B, C, D) soit un (T13A, B, C, D) oligonucléotide. Les désoxyoligonucléotides complémentai- res indiqués, de 11 bases de longueur, sont chimiquement synthétisés par le procédé du phosphotriester (Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 5765-5769 _/9787). On prépare quatre échantillons différents dans la série T-13. Les douze échantillons T-1 sont préparés en quatre lots de trois échantillons comme le montre la figure 1. Les quatre échantillons différents de la série T-13 et les douze échantillons T-1 préparés en quatre lots de quatre amorces chacun sont utilisés pour amorcer la synthèse d'ADNTc à une seule chatne étiqueté par un élément radioactif aux fins d'utilisation comme échantillons d'hy- bridation. L'ARNm modèle est ou bien l'ARN 12 S des cellules KG-1 induites par le virus de la maladie de Sendai (8 000 unités d'activité IF par microgramme) ou bien l'ARNm poly(A) total provenant de leucocytes n'ayant pas subi d'induction (moins de 10 unités par microgranmme). On prépare de l'ADNc étiqueté au 32p à partir de ces amorces en employant des conditions réactionnelles connues (Noyes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1770-1774 /T97 97). Les réactions à microlitres sont conduites dans du Tris-HCl 20 mM (pH 8,3), KC1 20 mM, MgCl2 8 my, et du bêta-mercaptoéthanol 30 mM. Les réactions comprennent 1 microgranmme de chaque a- morce (c'est-à-dire 12 microgrammes au total pour la série T-1, 4 microgrammes aut total pour la série T-13), 2 micro- grammes de fractions 12 S "induites" d'ARNm (ou 10 micro- grammes d'ARNm poly(A) non induit), de l'ATPd, du CTPd, du TTPd 0,5 M, 200 microcuries de CTP ( d32 P)d (Amersham, 2-3000 Ci/mmole), et 80 unités de transcriptase inverse (Bethesda Research Laboratories). On sépare le produit du marqueur non incorporé par filtration sur gel sur une co- lonne de 10 ml de Sephadex G-50, on traite avec NaOH 0,3 N pendant 30 min à 70 C pour détruire I'ARN, et on neutralise avec HC1. On effectue les hybridations comme il est dit dans Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552 (1979). E. Identification des clones pL1-pL30 On emploie le procédé d'isolement rapide de plasmide de Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513- 1523 (1979) pour préparer I microgramme d'ADN de plasmide à partir de 500 transformants d'E. coli K-12 souche 294 (voir C). On dénature tous les fragments d'ADN et on les applique à des filtres de nitrocellulose en trois exem- plaires en suivant le procédé de Kafatos et al. (voir ci-dessus). On hydride les trois ensembles de filtres de nitrocellulose contenant les 500 échantillons de plasmi- de avec a) de I'ADNc induit amorcé avec l'ensemble d'amorceurs T-1, b) l'ADNc induit amorcé avec T-13, et c) I'ADNc non induit préparé en utilisant les deux ensem- bles d'amorces. Les clones sont considérés comme posi- tifs s'ils s'hydrident plus fortement à l'un des échantil- lons d'ADNc induit ou aux deux qu'à l'échantillon total non induit. On choisit 30 clones "positifs" (PL1-pL30) parmi les 500 aux fins d'analyse ultérieure. F. Identification des clones pL31-pL39 Isolement d'un plasmide (N 104) contenant un fragment de gène de LeIF On trie les transformants d'E. coli x 1776 par le procédé d'hybridation des colonies de Grunstein et Hog- ness (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961-3965 _/9757 en utilisant comme échantillon l'ARNm induit étiqueté au 32p. On mélange à l'échantillon de l'ARNm non étiqueté provenant de cel ules non induites dans un rapport de 200 à 1 pour qu'il entre en compétition avec l'ARNm non induit présent dans la préparation étiquetée au 32 P. L'hybrida- tion de l'ARFi étiqueté doit s'effectuer de préférence sur des colonies contenant des séquences induites. On obtient trois classes de transformants: (1) 2 à 3% des colonies s'hybrident très fortement à I'ARNm 32p (2) 10% s'hybrident nettement moins que la classe 1, et (3) le reste ne donne pas de signal d'hybridation détec- table. On recherche dans les colonies positives (clas- ses (1) et (2)) la présence de séquences spécifiques de l'interféron par un dosage qui-dépend de l'hybridation de 1'ARNm d'interféron de façon spécifique à l' ADN de plas- mide. On commence par cultiver isolément 60 colonies for- tement positives (classe 1) dans 100 ml de milieu M9 au- quel on ajoute de la tétracycline (20 microgrammes/ml), de l'acide diaminopimélique (100 microgrammes/ml), de la thymidine (20 microgrammes/ml), et de la d-biotine (1 mi- crogramme/ml). Le milieu M9 contient dans un litre du Na2HP04 (6 g), du KH2PO4 (3 g), du NaCl (0,5 g) et du NH4Cl (1 g). Après avoir passé dans l'autoclave on ajou- te 1 ml de MgS04 1 M stérile et 10 ml de CaCl2 0,01 M stérile. On rassemble dix cultures et on isole l'ADN de plasmide à partir des six lots comme il est dit dans Cle- wel- et al., Biochemistry 92, 4428-440 /19707. On segmente microgrammes de chaque lot d'ADN de plasmide avec Hind III, on dénature et on lie de façon covalente à du papier au DBM (diazobenzyloxyméthyle). On hydride à chaque fil- tre I microgramme d'ARNm purifié provenant de cellules in duites. On retire par lavage l'ARNm non hybridé. On élue l'ARNm spécifiquement hybridé et on le traduit dans les oocytes de Xenopus laevis. Avec ce dosage, tous les six lots sont négatifs. On constitue cinq lots de 10 colonies chacun et 1 lot de 9 colonies à partir de 59 colonies fai- blement positives (classe 2), et on prépare des plasmides à partir des lots et on examine comme ci-dessus. Parmi les six lots testés, l'un (KO10) s'hybride à l'ARNm d'interféron à des niveaux nettement au-dessus des niveaux moyens cha- que fois qu'on le teste. Afin d'identifier le clone d'ADNc d'interféron spécifique, on prépare des ADN de plasmide à partir des 9 colonies du lot K10 et on les examine séparé- ment. Deux des neuf plasmides (n 101 et n 104) lient l'ARNm d'interféron bien au-dessus des niveaux de base. A partir du plasmide n 104 on isole un fragment de restric- tion Bgl II unique contenant 260 p.b., on le marque avec du 32p en utilisant le procédé décrit par Taylor et al., Bio- chim. Biophys. Acta 442, 324-330 (1976), et on l'utilise comme échantillon pour trier de façon indépendante 400 transformants d'E. coli 294 par un procédé de triage de colonies in situ (Grunstein et Hogness, Proc. Natl. Sci. U.S.A. 72, 3961-3965 j19757). On identifie neuf colonies (pL31-pL39) qui s'hybrident plus ou moins avec cet échan- tillon. En outre, on utilise le fragment étiqueté à 260 p.b. pour tamiser de façon indépendante 4 000 trans- formants d'E. coli 294 de la même manière. On identifie colonies qui s'hybrident plus ou moins avec cet échan- tillon. L'une contient le fragment de LeIF G,une autre contient le fragment de LeIF H, et une contient un frag- ment désigné LeIF H1, allèle apparent de LeIF H. Les plasmides hybrides qui en résultent sont désignés "pLeIF", etc. G. Isolement et détermination de la séquence d'un premier gène entier de LeIF. On prépare de l'ADN de plasmide à partir de tous les 39 clones potentiels d'ADNc de LeIF et on retrie avec le même échantillon d'ADN 260 p.b. en utilisant le procédé d'hybridation de Kafatos et al. (voir ci-dessus). Trois plasmides (pL4, pL31, pL34) donnent de très forts signaux d'hybridation, quatre (pL13, pL30, pL32,pL36) s'hybrident modérément, et trois (pL6, pL8, pL14) s'hy- brident faiblement avec l'échantillon. On trie également les 39 plasmides recombinants Anc de LeIF potentiels en utilisant des undécamères de synthèse marqués au 32p (lots séparés d'amorce T-I ou amorces T-13 séparées) directement comme échantillons d'hybridation. On choisit les conditions d'hybridation de manière qu'un parfait appariement des bases soit né- cessaire pour des signaux d'hybridation détectables (Wa- llace et al., Nucleic Acids Res. 6, 3543-3557 f9797. Ainsi, on prépare de l'ADN de plasmide à partir de 39 clones par un procédé classique de lysat clarifié (Cle- well et al., voir ci-dessus) et on purifie par chromato- graphie sur colonne d'agarose Biorad A-50. On linéarise des échantillons (3 microgrammes) de chaque préparation par traitement avec Eco RI, on dénature dans une base et on répartit en gouttes sur 2 filtres de nitrocellulose séparés, à raison de 1,5 microgrammes par goutte (Kafa- tos et al. voir ci-dessus). On phosphoryle diverses amor- ces et lots d'amorces désoxyoligonucléotides de synthèse avec du (y 32 P) ATP comme suit: on combine 50 pmoles d'oligonucléotide et 100 pmoles de ( '32P)ATP (New England Nuclear, 2500 Ci/mmole) dans 30 microlitres de TrisHCl m1, MgCl2 10 mlI et du a -mercaptoéthanol 15 mM. On a- joute 2 unités de polynucléotide kinase T4 et, au bout de 30 minutes à 370C, on purifie des amorces étiquetées au 32P ar chromatographie sur des colonnes de 10 ml de Sephadex G-50. On effectue des hybridations en utilisant 106 ppm d'amorce T-13C ou 3 x 106 cpm de lot d'amorce T-IC. Les hybridations sont effectuées à 15 C pendant 14 h dans 6 x SSC (1 x SSC = NaCl 0,15 M, citrate de sodium 0,015 M, pH 7,2), 10 x de solution de Denhardt (sérum-albumine de boeuf à 0,2%, polyvinylpyrrolidone à 0,2%, Ficoll à 0,2%), telle que décrite par Wallace et al. (voir ci-dessus). On lave les filtres pendant 5 min (3 fois) à O C dans 6 x SSC, on sèche et on expose à une pellicule à rayons X. Les ré- sultats sont donnés en figure 2 pour le lot d'amorce T-13C au 32p et l'amorce T-1C. On trouve que l'ADN de plasmide provenant du clone 104 donne une hybridation significative avec le lot d'amorces T-1C et l'amorce T-13C, mais pas d'hybrida- tion détectable avec les autres undécamères. Comme le montre la figure 2, plusieurs des 39 plasmides de LeIF potentiels (pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) s'hybrident également avec ces deux échantillons. Cependant, l'ana- lyse des restrictions montre qu'un seul de ces plasmides, pL31, contient également un fragment BglII interne à 260 p.b. La digestion de pL31 par PstI montre que la taille de l'insertion est d'environ 1000 p.b. On détermine la séquence de toute l'insertion au PstI de pL31 à la fois par le procédé chimique de Maxam-Gilbert (Methods Enzymol. 65, 499-560 /19807 et par le procédé de l'extrémité de chaîne didésoxy (Smith,Me- thods Enzymol. 65, 560-580 /19807 après avoir sub-cloné des fragments de Sau3a dans un vecteur M13. La séquence d'ADN est montrée ("A") dans la figure 3. On peut prédire le cadre de lecture approprié pour la traduction à partir de l'information dont on dispose sur la séquence protéique, l'intervalle connu de poids moléculaire de LeIF, et l'in- cidence relative des triplets d'arrêt dans les trois ca- dres de lecture possibles, et ceci à son tour permet de prédire toute la séquence d'acides aminés du LeIF, y com- pris un prépeptide ou peptide signal. On trouve le pre- mier codon d'initiation de traduction ATG à 60 nucléotides de l'extrémité 5' de la séquence et il est suivi, 188 co- dons plus tard, par un triplet de terminaison TGA; il y a 342 nucléotides non traduits à l'extrémité 3', suivis par une séquence poly(A). Le peptide signal putatif (dont on suppose qu'il joue un rôle dans la sécrétion du LeIF mûr à partir des leucocytes) a 23 acides aminés de long. Les acides aminés constituant le LeIF mûr ont un poids molé- culaire calculé de 19 390. On appelle le LeIF encodé par pL31 "LeIF A". On voit d'après les données de séquence ("A") dans la figure 4 que les peptides tryptiques Ti et T13 de LeIF B correspondent aux acides aminés 145-149 et 57-61, respectivement de LeIF A. Les séquences d'en- codage d'ADN réelles trouvées dans ces deux régions sont celles représentées par le lot d'amorce T1-C et l'amorce T13-C (voir figure 8). H. Expression directe de l'interféron de leucocyte mr A (LeIF A) 1. Généralités Le mode opératoire suivi pour exprimer LeIF A directement comme polypeptide d'interféron mûr est une variante de celui employé antérieurement pour l'hormone de croissance humaine (Goeddel et al., Nature 281, 544- 548 /T9797), dans la mesure o il fait intervenir la com- binaison d'ADN de synthèse (N-terminal) et complémentaire. Comme le montre la figure 6, il est commode qu'un site d'endonucléase de restriction soit situé entre les codons 1 et 3 de LeIF A. Deux désoxyoligonucléotides de syn- thèse sont désignés, incorporant un codon d'initiation de traduction ATG, restaurant le codon pour l'acide aminé 1 (cystéine), et créant une extrémité adhésive EcoRI. Ces oligomères sont liés à un fragment Sau3aAvaII à 34 p.b. de pL31. Le produit à 45 p.b. obtenu est lié à deux fragments d'ADN supplémentaires pour construire un gène hybride na- turel-synthétique qui donne le code pour LeIF A et qui est lié par les sites de restriction EcoRI et PstI. Ce gène est inséré dans pBR322 entre les sites EcoRI et PstI pour donner le plasmide pLeIF A1l 2. Construction de l'élément de contrôle tryptophane (contenant le promoteur trp, l'opérateur et le site de liaison ribosomique directeur trp d'E. coli mais manquant d'une séquence ATG pour l'initiation de la traduction) Le plasmide pGMI porte l'opéron tr-yptophane d'E. coli portant la délétion LE1413 (Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457-1466 _/9787 et exprime donc une protéine de fusion comprenant les six premiers acides ami- nés du directeur trp et environ le dernier tiers du poly- peptide E trp (appelé concurremment ci-dessous LE'), ain- si que le polypeptide D trp en son entier, le tout sous le contrôle du système promoteur trp-opérateur. Le plasmide, microgrammes, est digéré avec l'enzyme de restriction PvuII qui coupe le plasmide en 5 sites. On combine en- suite les fragments de gène avec des agents de couplage EcoRI (constitués d'un oligonucléotide autocomplémentaire de séquence: pCATGAATTCATG) fournissant un site de coupure EcoRI pour un clonage ultérieur dans un plasmide contenant un site EcoRI. On traite les 20 microgrammes de fragments d'ADN obtenus à partir de pGM1 avec 10 unités d'ADN liga- se T4 en présence de 200 pmoles d'oligonucléotide de syn- thèse phosphorylé en 5' pCATGAATTCATG et dans 20 microli- tres de tampon ADN ligase T4 (20 mM de Tris, pH 7,6, 0,5 mM d'ATP, 10 mM de MgC12, 5 mM de dithiothréitol) à 4 C pen- dant la nuit. On chauffe alors la solution pendant 10 min à 70 C pour arrêter la liaison. On coupe les agents de couplage par digestion EcoRI et on sépare les fragments, ayant maintenant des extrémités EcoRI, en utilisant une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5% (appelée ci- dessous PAGE) et on isole du gel les trois plus grands fragments en commençant par colorer avec du bromure d'é- thidium, en situant les fragments à la lumière ultravio- lette, et en découpant dans le gel les fractions intéres- santes. Tous les fragments de gel, avec 300 microlitres 0,1 x TBE, sont disposés dans un sac de dialyse et soumis à une électrophorèse à 100 V pendant une heure dans un tampon 0,1 x TBE (le tampon TBE contient: 10,8 g de base Tris, 5,5 g d'acide borique, 0,09 g de Na2EDTA dans 1 litre d'eau). On recueille la solution aqueuse du sac de dialyse, on l'extrait au phénol, on l'extrait au chloro- forme et on la rend 0,2 M avec du chlorure de sodium, et on récupère l'ADN dans l'eau après précipitation à l'étha- nol. On identifie le gène contenant le promoteur trp-opé- rateur avec des extrémités adhésives EcoRI dans le procédé décrit ensuite, qui comporte l'insertion de fragments dans un plasmide sensible à la tétracycline qui, après inser- tion du promoteur-opérateur, devient résistant à la tétra- cycline. Le plasmide pBRHI (Rodriguez et al., Mcleic Acids Res. 6, 32673287 /19797 exprime la résistance à l'ampicilline et contient le gène de la résistance à la tétracycline mais, comme il n'y a pas de promoteur asso- cié, n'exprime pas cette résistance. Le plasmide est donc sensible à la tétracycline. En introduisant un sys- tème promoteur-opérateur dans le site EcoRI, on peut rendre le plasmide résistant à la tétracycline. On digère le pBRH1 avec EcoRI et on retire l'enzyme par extraction au phénol suivie par une extrac- tion au chloroforme et on la recueille dans l'eau après précipitation à l'éthanol. On combine la molécule d'ADN résultante, dans des mélanges réactionnels séparés, avec les trois différents fragments d'ADN obtenus ci-dessus et on lie avec l'ADN ligase T4 comme il est dit ci-des- sus. On utilise l'ADN présent dans le mélange réaction- nel pour transformer la souche 294 compétente d'E. coli K-12 par des techniques classiques (Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 3455-3459 /197A7) et on dépo- se les bactéries sur des plaques LB (Luria-Bertani) conte- nant 20 microgrammes/ml d'ampicilline et 5 microgrammes/ml de tétracycline. On choisit plusieurs colonies résistant à la tétracycline, on isole d'ADN de plasmide et on con- firme la présence du fragment désiré par analyse à l'enzyme de restriction. Le plasmide obtenu est appelé pBRHtrp. On obtient par des moyens classiques un produit de digestion EcoRI et BemHI du génome viral de l'hépatite B et on clone dans les sites EcoRI et BamHI du plasmide pGH6 (Goeddel et al, Nature 281, 544 /19797) pour former le plasmide pHS32. On coupe le plasmide pHIS32 avec XbaI, on extrait au phénol, on extrait au chloroforme et on précipite à l'éthanol. On le traite avec I microlitre d'ADN polymérase I d'E. coli, le fragment de Klenow (Boehringer-Mannheim) dans 30 microlitres de tampon de polymérase phosphate de potassium 50 mM pH 7,4, MgC12 7 mM, bêta- mercaptoéthanol 1 mM) contenant du dTTP 0,1 mM et du dCTP 0,1 mM pendant 30 minutes à 0 C puis 2 h à 37 C. Ce traitement permet d'introduire 2 des 4 nu- cléotides complémentaires de l'extrémité 5' saillante du site de coupure XbaI en: ' CTAGA - 5' CTAGA 3' T - 3' TCT On incorpore 2 nucléotides, dC et dT, ce qui donne une extrémité avec deux nucléotides saillants en 5'. On cou- pe avec EcoRI ce résidu linéaire de plasmide pHS32 (a- près extraction au phénol et au chloroforme et récupéra- tion dans l'eau après précipitation à l'éthanol). On sépare le grand fragment de plasmide du petit fragment EcoRI-XbaI par PAGE et on isole après électroélutiono On lie ce fragment d'ADN provenant de pHS32 (0,2 micro- gramme), dans des conditions semblables à celles décrites ci-dessus, au fragment EcoRI-TaqI de l'opéron tryptophane (env. 0,01 microgramme) dérivé du pBRHtrp. Dans le processus de liaison du fragment prove- nant de pHS32 au fragment EcoRI-TaqI, comme il est dit ci- dessus, on lie l'extrémité saillante TaQI à l'extrémité saillante restante XbaI même si les bases ne sont pas com- * plètement appariées selon Watson-Crick: T CTAGA - - TCTAGA - AC TT AGC +TCT -AGCTCT- On transforme une fraction de ce mélange réac- tionnel de liaison dans des cellules E. coli 294, on traite à la chaleur et on dépose sur des plaques LB contenant de l'ampicilline. On choisit 24 colonies, on les cultive dans 3 ml de milieu LB (Luria-Bertani), et on isole les plasmi- des. On trouve que six d'entre eux ont le site XbaI régé- néré par réparation et réplication de l'ADN catalysées par E. coli: - TCTAGA - - TCTAGA - - AGCTCT - - AGATCT - On trouve également que ces plasmides se coupent à la fois avec EcoRI et HpaI et donnent les fragments de restriction attendus. L'un des plasmides, appelé pTrp14, est utilisé pour l'expression de polypeptides hétérologues, comme on le verra ci-dessous. Le plasmide pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544 ff997_ contient un gène pour l'hormone de crois- sance humaine constitué de 23 codons d'acide aminé pro- duits à partir de fragments d'ADN de synthèse et 163 co- dons d'acides aminés obtenus à partir de l'ADN complémen- taire produit par une transcription inverse de l'ARN mes- sager de l'hormone de croissance humaine. Ce gène, bien qu'il soit dépourvu des codons de la "pré" séquence de l'hormone de croissance humaine, contient bien un codon d'initiation de traduction ATG. On isole le gène à par- tir de 10 microgrammes de pHGH 107 après traitement avec EcoRI suivi par un fragment d'ADN polymérase I Klenow d'E. coli et par dTTP et dATP comme il est dit ci-dessus. Après extraction au phénol et au chloroforme et précipi- tation à l'éthanol, on traite le plasmide avec BamHI. On isole le fragment contenant le gène de l'hor- mone de croissance humaine (HGH) par PAGE puis par électro- élution. Le fragment d'ADN obtenu contient également les 350 premiers nucléotides du gène de structure de résistan- ce à la tétracycline, mais est dépourvu du système promo- teur-opérateur de tétracycline si bien que, lorsqu'on clone ensuite dans un plasmide d'expression, les plasmides con- tenant l'insertion peuvent être mis en place par restaura- tion de la résistance à la tétracycline. Etant donné que l'extrémité EcoRI du fragment a été remplie par le procédé de la polymérase -I de Klenow, le fragment possède une ex- trémité non-agglutinante et une extrémité agglutinante, ce qui permet une orientation correcte lorsqu'on l'insère ul- térieurement dans un plasmide d'expression. On prépare ensuite le plasmide d'expression pTrp14 pour recevoir les fragments contenant le gène HGH préparé ci-dessus. Ainsi, on digène pTrp14 avec XbaI et on remplit les extrémités agglutinantes obtenues par le procédé de la polymérase I de Klenow en employant dATP, dTTP, dGTP et dCTPo Après extraction au phénol et au chloroforme et précipitation à l'éthanol on traite l'ADN obtenu avec BamHI et on isole le grand fragment de plasmide obtenu par PAGE et électroélution. Le fragment dérivé de pTrp14 a une extrémité non-agglutinante et une extrémité agglutinante, ce qui permet une recombinaison dans une orientation correcte avec le fragment contenant le gène HGH décrit ci-dessus. On combine le fragment de gène HGH et le frag- ment pTrp14 Xba-BamHI et on les relie l'un à l'autre dans des conditions semblables à celles qui sont décri- tes ci-dessuso Les extrémités XbaI et EcoRI introduites sont reliées l'une à l'autre par une liaison à extrémité non-agglutinante pour recréer à la fois le site XbaI et le site EcoRI: XbaI introduit EcoRI introduit initiation de gène HGH - TCTAG AATTCTATG - - TCTAGAATTCTATG - - AGATC + TTAAGATAC - -- AGATCTTAAGATAC - XbaI EcoRI Cette construction recrée également le gène de résistance à la tétracycline. Comme le plasmide pHGH 107 exprime la résistance à la tétracycline à partir d'un promoteur se situant en amont du gène HGH (le promoteur lac), cette construction appelée pHGH 207 permet l'expression du gène de résistance à la tétracycline sous le contrôle du promo- teur au tryptophane-opérateur. On transforme ainsi le mé- lange de liaison dans E. coli 294 et les colonies choisies sur des plaques LB contenant 5 microgrammes/ml de tétra- cyclineo On digère le plasmide pHGH 207 avec EcoRI et on recueille un fragment à 300 p.b. contenant le promoteur trp, l'opérateur et le site de liaison ribosomique directeur trp mais dépourvu de séquence ATG pour l'initiation de la traduction, en procédant par PAGE puis par électroélu- tion. On clone ce fragment d'ADN dans le site EcoRI du pLeIF A. On peut faire croître les plasmides d'expres- sion contenant le régulon trp modifié ci-dessus (opéron trp d'E. coli dont on a enlevé la séquence d'atténuation pour augmenter de façon contrôlable les niveaux d'expres- sion) à des niveaux prédéterminés dans des milieux nu- tritifs contenant une quantité supplémentaire de tryptopha- ne dans des quantités suffisantes pour réprimer le sys- tème promoteur-opérateur, puis on peut leur enlever le tryptophane de manière à déréprimer le système et à occa- sionner l'expression du produit recherché. Plus particulièrement, et en se référant à la figure 6, on digère 250 microgrammes de plasmide pL 31 avec PstI et on isole l'insertion à 1000 p.b. par élec- trophorèse sur gel sur un gel de polyacrylamide à 6%. On électro-élue environ 40 microgrammes d'insertion à partir du gel et on divise en 3 fractions aux fins de digestion ultérieure: a) on digère partiellement un échantillon de 16 microgrammes avec 40 unités de BglII pendant 45 minutes à 37 C et on purifie le mélange réac- tionnel sur un gel de polyacrylamide à 6%. On recueille environ 2 microgrammes du fragment à 670 p.b. désiré. b) On restreint un autre échantillon (8 microgrammes) de l'insertion PstI à 1000 p.b. avec AvaII et BglII. On recueille I microgramme du fragment à 150 p.b. indiqué après électrophorère sur gel. c) On traite 16 microgram- mes de la pièce à 1000 p.b. avec Sau3a et AvraII. Après électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10%, on recueille environ 0,25 microgramme (10 pmoles) du frag- ment à 34 p.b.. On synthétise les deux désoxyligonuclé- otides indiqués, 5'-dAATTCATGTGT (fragment 1) et 5'- dGATCACACATG (fragment 2) par le procédé du phosphotries- ter. On phosphoryle le fragment 2 comme suit. On des- sèche 200 microlitres (environ 40 pmoles) de ( 32P)ATP (Amersham, 5000 Ci/mmole) et on remet en suspension dans microlitres de Tris-HCl 60 mM (pH 8), MgC12 10 mM, bêta-mercaptoéthanol 15 mM, contenant 100 pmoles de fragment d'ADN et 2 unités de T4 polynucléotide kinase. Au bout de 15 min à 37 C, on ajoute 1 microlitre d'ATP 10 mM et on laisse la réaction continuer pendant encore 15 min. On chauffe alors le mélange à 70 C pendant 15 min, on le combine avec 100 pmoles de fragment 1 5'-OH et 10 pmoles de fragment Sau3a-AvaII à 34 p.b. On effectue la liaison pendant 5 h à 4 C dans 50 microlitres de Tris- HCl 20 mM (pH 7,5), MgC12 10 mM, dithiothréitol 10 mM, ATP 0,5 mM et 10 unités de T4 ADN ligase. On fait subir au mélange une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 6% et on recueille le produit à 45 p.b. par électro-élu- tion. On combine environ 30 ng (1 pmole) du produit à p.b. avec 0,5 microgramme (5 pmoles) du fragment AvaII- BglII à 150 p.b. et 1 microgramme (2 pmoles) du fragment BglII-PstI à 670 p.b. On effectue la liaison à 20 C pen- dant 16 h en utilisant 20 unités de T4 ADN ligase. On inactive la ligase en la chauffant à 65 C pendant 10 mi- nutes. On digène alors le mélange avec EcoRI et PstI pour éliminer les polymères du gène. On purifie le mélan- ge par PAGE à 6%o On isole environ 20 ng (0,04 pmole) du produit à 865 p.b.. On lie la moitié (10 ng) de ce- lui-ci dans pBR322 (0,3 microgramme) entre les sites EcoRI et PstI. La transformation d'E. coli 294 donne 70 trans- formants résistant à la tétracycline et sensibles à l'am- picilline. On digère l'ADN de plasmide isolé à partir de 18 de ces transformants avec EcoRI et PstIo 16 des 18 plasmides ont un fragment EcoRI-PstI- de 865 pob. de lon- gueur. On digère 1 microgramme de l'un d'entre eux, pLeIF A1, avec EcoRI et on lie au fragment EcoRI à 300 p.b. (0,1 microgramme) contenant le promoteur trp d'E. coli et le site de liaison ribosomique directeur trp, préparé comme il est dit ci-dessus. On identifie le transformant contenant le promoteur trp en utilisant un échantillon 32p_ trp concurremment avec le procédé de triage de colonies Grunstein-Hogness. Un site XbaI situé de façon asymétrique dans le fragment trp permet la détermination des recombi- nants dans lesquels le promoteur trp est orienté dans la direction du gène LeIF A. I. Activité in vitro et in vivo de LeIF A On prépare des extraits pour le dosage IF comme suit: on cultive des cultures d'1 ml dans un bouillon L contenant 5 microgrammes/ml de tétracycline à une valeur de a550 d'environ 1,0, puis on dilue dans 25 ml de milieu M9 contenant 5 microgrammes/ml de tétracycline. On ré- colte des échantillons de 10 ml- par centrifugation lorsque A550 atteint 1,0 et on met en suspension des pellets de cellules dans 1 ml de saccharose à 15%, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 50 mrM. On ajoute 1 mg de lysozyme et, au bout de 5 min à 0 C, on brise les cellules par traitement aux ultrasons. On centrifuge les échantillons pendant 10 min (15 000 tpm) et on détermine l'activité d'interféron dans les surnageants par comparaison avec les standards LeIF par le dosage de l'inhibition de l'effet cytopathique (CPE). Pour déterminer le nombre de molécules d'IF par cellule on utilise une activité spécifique LeIF de 4 x 108 unités/mg. Comme on le voit au Tableau 1, le clone pLeIF A trp , o le promoteur trp est inséré avec l'orientation dési- rée, donne de hauts niveaux d'activité (allant jusqu'à 2,5 x 108 unités par litre). Comme le montre le Tableau 2, l'IF produit par E. coli K12 souche 294/pLeIF A trp 25 se compor- te comme un authentique LeIF humain; il est stable au trai- tement à pH 2 et est neutralisé par les anticorps de leuco- cyte de lapin anti-humains. L'interféron a un poids molé- culaire apparent d'environ 20 000. L'efficacité in vivo de l'interféron nécessite la présence de macrophages et de cellules tueuses naturelles (NK) et le mode d'action in vivo semble faire intervenir une stimulation de ces cellules. Ainsi, il reste possible que l'interféron produit par E. coli 294/pLeIF A 25, tout en ayant une activité antivirale dans le dosage de culture cellulaire, ne soit pas actif chez les animaux infectés. De plus, l'activité antivirale in vivo du LeIF A non glyco- sylé produit par bactérie pourrait être différente de celle du LeIF glycosylé dérivé de leucocytes "buffy coat" humains. On compare donc l'activité biologique du LeIF A synthétisé par bactérie (à 2% de pureté) avec celle du LeIF "buffy coat" (à 8% de pureté) dans l'infection virale léthale encé- phalomyocardite (MEC) de singes-écureuils (Tableau 3) Tableau 1: Activité d'interféron dans les extraits d'E.coli È.coli K-12 densité Molécules de souche 294 cellulaire Activité IF LeIF par transformée (cellules/ml) unités/ml de cellule par culture pLeIF A trp 25 3,5 x 10 36 000 9 000 pLeIF A trp 25 1,8 x 109 250 000 12 000 Tableau 2. Comparaison de l'activité d'extraits d'E.coli 294/pLeIF A 25 avec LeIF standard* Activité d'interféron (unités/ml) non traité pH 2 anticorps de leuco- cytes de lapin extrait de 294/pLeIF A trp 25 500,500 294/pLeIF A trp 25 décrit au Tableau I avec du milieu es- sentiel minimum ce qui donne une activité spécifique de 500 unités/ml. On dilue également jusqu'à une concentra- tion finale de 500 U/ml un interféron de leucocyte standard (Wadley Institute) préalablement titré contre l'interféron de leucocyte NIH standard. On ajuste des fractions d'1 ml i à pH 2 avec HCl I N, on fait incuber à 4 C pendant 52 heu- res, on neutralise par addition de NaOH et on détermine l'ac- tivité IF par le dosage d'inhibition CPE standard. On fait incuber des fractions de 25 microlitres des échantil- lons à 500 unités/ml (non traitées) avec 25 microlitres d'interféron de leucocyte de lapin antihumain pendant 60 min à 37 C, on centrifuge à 12 000 g pendant 5 min et on dose le surnageant. Tableau 3. Effet antiviral de diverses préparations de LeIF contre l'infection de singes-écureuils par le virus EMC. Sérum Unités formatrices de plaques/ml Traitement Survi- 2eojour 3e.jour 14e.jour vants Témoin 0/3 10 1 3xl2 10@t'1 (protéines 4 4 bactérien- 3 0 51 2 >3,4x10 !nes) 0 j 2 0 0 LeIF A 3/3 0O 0 bactérien 0 0 0 0 LeIF 3/3 O 0 0 j standard 0 t O O j Tous les singes sont des mêles (poids moyen 713 g) et n'ont pas d'anticorps anti-virus EMC avant l'infec- tion. On infecte les singes par voie intramusculaire avec 100 fois la DL50 de virus EMC (déterminée chez la souris). Les singes traités témoins meurent 134, 158 et 164 h après infection. Les traitements à l'interféron avec 106 unités se font par voie intraveineuse à -4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 et 240 heures par rapport à l'infection0 L'interféron de leucocyte bactérien est une fraction de chromatographie sur colonne provenant d'un lysat d'E. coli 294/pLeIF A 25 à une activité spécifique de 7,4 x 106 unités/mg de pro- téine. Les protéines bactériennes témoins sont une frac- tion de colonne équivalente provenant d'un lysat d'E. coli 294/pBR 322 à deux fois la concentration totale de pro- téine. L'interféron de leucocyte standard est l'interfé- ron induit par le virus de Sendai provenant de cellules "buffy coat" humaines normales, purifié par chromatogra- phie jusqu'à une activité spécifique de 32 x 106 unités/mg de protéine. Les singes témoins présentent une léthargie pro- gressive, une perte d'équilibre, une paralysie flasque des membres postérieurs et un mouillement des yeux commençant environ 8 heures avant la mort. Les singes traités à l'in- terféron ne présentent aucune de ces anomalies; ils res- tent actifs à tout moment et ne présentent pas de virémie. Le seul singe du groupe témoin qui ne présente pas une vi- rémie au bout de 4 jours meurt en dernier (164 h après l'infection) mais présente un titre élevé de virus dans le coeur et le cerveau à l'autopsie. Les singes traités à l'interféron ne développent pas d'anticorps contre le vi- rus EMC selon des déterminations faites 14 et 21 jours a- près l'infection. Ces résultats montrent que les effets anti-viraux des préparations de LeIF chez les animaux in- fectés peuvent être attribués à l'interféron seul car les protéines contaminantes sont tout à fait différentes dans les préparations de bactéries et de "buffy-coat". En ou- tre ces résultats indiquent que la glycosylation n'est pas nécessaire à l'activité anti-virale in vivo de LeIF A. J. Isolement d'ADNc pour interférons de leucocyte supplé- mentaires On excise avec PsT I de l'ADN provenant du plas- mide contenant l'ADNc de LeIF A pleinement caractérisé, on isole par électrophorèse et on étiquette avec 32P. On utilise l'ADN à marquage radioactif obtenu comme échantillon pour trier une quantité supplémentaire de transformants d'E. coli 294, obtenus de façon identique à ceux de la partie C, par le procédé de triage de colonies in situ de Grunstein et Hogness (voir ci-dessus). On isole des colonies qui s'y- brident plus ou moins à l'échantillon. On isole de l'ADN de plasmide de ces colonies et les dix-colonies hybridantes mentionnées en partie G cidessus par clivage au Pst I et on les caractérise par trois procédés différents. Tout d'abord, on caractérise ces fragments de Pst par leur schéma de digestion de l'endonucléase de restriction avec les enzymes Bgl II, Pvu II et Eco Ri. Cette analyse per- met la classification d'au moins 8 types différents (LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeiF G et LeIG H), montrés dans la figure 5, qui donne une approxi- mation de la situation de divers clivages de restriction par rapport à la pré-séquence alors connue et à la séquence d'encodage du LeIF A. On pense que l'un d'entre eux, LeIF D, est identique à celui mentionné par Nagata et al., Nature 284, 316-320 (1980). En second lieu, on teste certains des ADN par le dosage de sélection d'hybridation décrit par Cleveland et al., Cell 20, 95-105 (1980) quant à la capacité à retirer de façon sélective l'ARNm de LeIF A de l'ARN cellulaire KG-1 contenant du poly-A. LeIF A, B, C et F sont positifs avec cette expérience. En troisième lieu, on insère les derniers fragments de Pst dans un plasmide d'expression, on trans- forme E. coli 294 avec le plasmide, et on exprime les frag- ments. Les produits d'expression dont on pense qu'il s'a- gissait de préinterférons, sont tous positifs au dosage CPE de l'activité d'interféron, quoique marginalement actifs dans le cas du fragment de LeIF E. Outre ce qui précède, tous les types de LeIF décrits voient leur séquence déter- minée. K. Expression directe d'un second interféron de leucocyte mur (LeIF B) La séquence du fragment isolé comprenant le gène du LeIF B mûr montre que les 14 premiers nucléotides des ty- pes A et B sont identiques. On isole donc un fragment de pLeIF A25 portant le promoteur trp-opérateur, le site de liaison ribosomique et le début du gène de LeIF A (=B) et on le combine avec la fraction restante de la séquence B dans un plasmide d'expression. La carte des principales restrictions du fragment Pst de pL4 (plasmide comprenant le gène à terminaison Pst de LeIF B décrit dans la figu- re 5) et de pLeIF A 25 est donnée, respectivement, dans les figures 7a et 7b. Pour obtenir le fragment Sau3a à PstI d'environ 950 p.b. provenant de la séquence montrée dans la figure 7a, plusieurs étapes sont nécessaires à cause de la pré- sence d'un ou plusieurs sites de restriction Sau3a qui interviennent, c'est-à-dire que: 1. On isole les fragments suivants: a) 110 p.b. de Sau3a à EcoRI; b) 132 p.b. d'EcoRI à Xba; c) plus de 700 p.b. de Xba à Pst. 2. On lie les fragments (la) et (lb) et on les clive avec Xba et BglII pour exclure toute auto-polymérisation par les terminaisons de Sau3a et Xba (le site de Sau3a perti- nent est à l'intérieur d'un site de BglII; BgiLL clive pour laisser une extrémité Sau3a agglutinante). On isole un fragment à 242 p.b. 3. On lie le produit de (2) et (1c) et on le clive avec PstI et BglII, là encore pour empêcher une auto-polyméri- sationo On isole un fragment d'environ 950 pob., Sau3a à PstI de la figure 7a. Ce fragment comprend la partie du gène de LeIF B qui n'est pas commune avec LeIF A. 4. On isole à partir de pLeIF A25 unlm fragment d'environ 300 pob. (HindIII à Sau3a) comprenant le promoteur trp-opéra- teur, le site de liaison ribosomique, le signal de départ ATG et le codon de cystéine du LeIF A. 5. On isole un fragment d'environ 3 600 p.b. PstI à HindIII à partir de pBR322. Ceci comprend le réplicon et la tétra- cycline encodée mais non la résistance à l'ampicilline. 6. On fait une triple liaison entre les fragments obtenus dans les étapes 3, 4 et 5 et on transforme le plasmide obtenu en E. coli K-12 souche 294. On effectue un mini-tri des transformants (Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513(1523 /19797) et on digère les échantillons de plasmide avec EcoRI. Les fragments de digestion donnent trois fragments caractéris- tiques de: 1) Le fragment promoteur trp EcoRI-EcoRI; 2) Le fragment EcoRI à EcoRI interne de pL4; et 3) le signal de départ de traduction protéique au fragment EcoRI de pL4. Dans le dosage CPE, les extraits bactériens de clones réalisés de la manière qui précède se dosent typi- quement à environ 10 x 106 unités d'activité d'interféron par litre à A550 = 1. Un clone représentatif préparé de cette manière est E. coli 294/pLeIF B trp 7. L. Expression directe d'autres interférons de leucocytes mûrs (LeIF C, D, F, H, I et J) On peut découper d'autres fragments de gène en- tiers comprenant d'autres types de LeIF et les placer dans des véhicules d'expression aux fins d'expression comme dans le cas de LeIF A. Une détermination complète de la sé- quence par des moyens classiques révélera si un site de restriction se situe suffisamment près du premier codon acide aminé du type d'interféron mûr pour permettre d'a- voir recours commodément à l'approche employée dans la partie H ci-dessus pour l'expression du LeIF A mûr, c'est- à-dire l'élimination des pré-séquences en coupant les restrictions et en remplaçant les codons des acides aminés N-terminaux perdus dans l'élimination de la pré-séquence par liaison d'un fragment d'ADN de synthèse. Si ce n'est pas le cas, on peut employer le procédé suivant. En bref, il s'agit de cliver le fragment contenant la pré-séquence juste avant le point auquel commence le codon pour le pre- mier acide aminé du polypeptide mûr, en-: 1. Transformant l'ADN à double chaîne en ADN à une seule cha ne dans une région entourant ce point; 2. hybridant à la région à une seule chatne formée dans l'étape (a) une longueur d'amorce complémentaire d'ADN monocaténaire, l'extrémité 5' de l'amorce se situant à l'opposé du nucléotide avoisinant le site de clivage prévu; 3. rétablissant la partie de la seconde chaine éliminée dans l'étape 1. qui se situe dans la direction 3' à par- tir de l'amorce par réaction avec de l'ADN polymérase en présence de désoxynucléotide-triphosphates contenant de l'adénine, de la thymine, de la guanine et de la cytosine; et 4. en digérant la longueur d'ADN monocaténaire restante faisant saillie au-delà du point de clivage visé. On peut alors lier une courte longueur d'ADN de synthèse se terminant, à l'extrémité 3' de la chaîne d'en- docage, par le signal de début de traduction ATG au moyen, p ex., d'une liaison de l'extrémité non agglutinante au gène des interférons mûrs adapté obtenu et au gène inséré dans un plasmide d'expression et amené sous le contrôle d'un promoteur et de son site de liaison ribosomique asso- cié. De manière analogue à celle que l'on a employé dans la partie K cidessus, on donne à des fragments de gène encodant LeIF C et LeIF D une configuration appropriée à l'expression bactérienne directe. La stratégie d'expres- sion de ces interférons de leucocytes supplémentaires im- plique, dans chaque cas, d'avoir recours au fragment d'en- viron 300 p.b. (HindIII à Sau3a) comprenant le promoteur trp-opérateur, le site de liaison ribosomique, le signal de départ ATG et le codon cystéine de LeIF A provenant de pLeIF A25. A ceci on combine des fragments de gène prove- nant de gènes d'interféron supplémentaires encodant leurs séquences d'acides aminés respectives au-delà de la cys- téine initiale commune à tous. Tous les plasmides obtenus sont utilisés pour transformer E. coli K-12 souche 294. Les liaisons pour former les gènes respectifs sont les suivantes: LeIF C Isoler les fragments suivants à partir de pLeIF C: (a) 35 p.b. de Sau 3a à Sau 96 (b) plus de 900 p.b. Sau 96 à Pst I (c) isoler un fragment d'environ 300 p.b. (Hind III - Sau 3a) à partir de pLeIF A-25 comme dans la partie K (4) ci-dessus. (d) isoler le fragment d'environ 3 600 p.b. de la partie K (5) ci-dessus. Construction: (1) Lier (a) et (c). Couper avec BglII, HindIII et isoler le produit d'environ 335 p.b. (2) Lier de façon triple (1) + (b) + (d) et transformer E. coli avec le plasmide obtenu. Clone représentatif réalisé de cette manière: E. coli K-12 souche 294/pLeIF C trp 35. * LeIF D Isoler à partir de pLeIF D: a) 35 pob. de Sau3a à AvaI b) 150 p.b. d'AvaII à BglII c) environ 700 p.b. de BglII à PstI. Isoler de pLeIF A 25: d) 300 p.b. de HindIII à Sau3a. Isoler à partir de pBR322: e) environ 3 600 p.bo de HindIII à PstI. Construction (1) Lier (a) + (b), couper avec BglII et purifier un pro- duit à 185 p.b. (1) (2) lier (1) + (d), couper avec HindIII, BglII et purifier le produit d'environ 500 p.b. (2). (3) lier (2) + (c) + (e) et transformer E. coli avec le plasmide obtenu. Clone représentatif réalisé de cette manière: E. coli K-12 souche 294/pLeIF D trp 11. LeIF F On peut adapter le fragment contenant LeIF F aux fins d'expression directe par un réassemblage rendu commode par l'homologie complète des acides aminés 1-13 de LeIF B et LeIF F. On obtient un fragment contenant un promoteur trp (a) avec des extrémités de configuration appropriée à partir de pHGH207, décrit ci-dessus, via digestion avec Pst I et Xba I suivie par isolement du fragment d'environ 1050 p.b. On obtient un second frag- ment (b) sous la forme du plus grand des fragments obtenu par digestion avec PsT I et BglII du plasmide pHKY 100 Le fragment (a) contient environ la moitié du gène qui enco- de la résistance à l'ampicilline; le fragment (b) contient le reste de ce gène et tout le gène de la résistance à la tétracycline sauf le promoteur associé. Les fragments (a) et (b) sont combinés via la T4 ligase et on traite le produit avec XbaI et BglII pour éliminer la diméri- sation, formant un fragment (c) comprenant le promoteur trp-opérateur et les gènes de la résistance à la tétracy- cline et à l'ampicilline. On obtient un fragment (d) d'environ 580 p.b. par digestion avec AvaII et BglII de pLeIF F. Ceci com- prend des codons pour les acides aminés 14-166 de LeIF F. On obtient un fragment (e) (49 p.b.) par diges- tion avec XbaI et AvaII de pLeIF B. Le fragment (e) en- code les acides aminés 1-13 de LeIF F. Les fragments (c), (d) et (e) sont triplement liés en présence de T4 ligaseo Les extrémités cohésives des fragments respectifs sont telles que le plasmide com- posite se circularise correctement, amenant le gène de résistance à la tétracycline sous le contrôle du promoteur trp-opérateur avec le gène du LeIF mûr, de manière que les bactéries transformées avec le plasmide désiré puissent être choisies sur des plaques contenant de la tétracycline. Clone représentatif préparé de cette manière: E. coli K-12 souche 294/pLeIF F trp 1. LeIF H On peut donner au gène LeIF H complet la confi- guration permettant son expression comme interféron de leucocyte mûr comme suit: 1. On soumet le pLeIF H de plasmide à une digestion à HaeII et RsaI en isolant le fragment à 816 p.b. s'éten- dant de l'acide aminé 10 du peptide signal à la région de non encodage 3'. 2. On dénature le fragment et on le soumet à une synthèse de réparation avec le fragment de Klenow de l'ADN poly- mérase I (Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 168 /T9707), en employant l'amorce désoxyribooligo- nucléotide de synthèse 5'-dATG TGT AAT CTG TCT. 3. On coupe le produit obtenu avec Sau3a et on isole un fragment de 452 p. b. représentant les acides aminés 1 à 150. 4. La digestion avec Sau3a et PstI de pLeIF H et l'iso- lement du fragment à 500 p.b. obtenu donne un gène encodant les acides aminés depuis le numéro 150 jusqu'à la fin de la séquence d'encodage. 5. On lie les fragments isolés dans les étapes (3) et (4) pour former un fragment: I 166 met cys aso arrêt ATG TGT.. -4-...GAT TGA -... -Pst I Sau3a encodant les 166 acides aminés de LeIF H. 6. On digère pLeIF A trp 25 avec XbaI, on forme une extre- mité non agglutinante avec l'ADN polymérase I et on digè- re le produit avec Pst I. Le grand fragment obtenu peut être isolé et lié avec le produit de l'étape (5) pour for- mer un plasmide d'expression capable, après transformation d'E. coli K-12 souche 294 ou d'autres bactéries hôtes, d'exprimer le LeIF mur. LeIF I On trie la "bibliothèque" de recombinants Charon 4A phase du génome humain construite par Lawn et al., Cell 15, 1157 (1978), pour identifier les gènes d'interfé- ron de leucocyte par des procédés décrits par Lawn et al. (supra) et Maniatis et al., Cell 15, 687 (1978). On utilise un échantillon de LeIF radioactif dérivé du clone d'ADNc de LeIF A pour trier environ 500 000 plaques. On obtient dans ce tri 6 clones de génome de LeIF. Après retriage et purification des plaques, on choisit un de ces clones, HLeIF2, aux fins d'analyse ultérieure. En utilisant le procédé décrit ci-dessus, on peut avoir intérêt à utiliser d'autres échantillons pour isoler des clones de LeIF supplémentaires à partir du génome hu- main. Ceux-ci, à leur tour, peuvent être utilisés pour produire d'autres protéines d'interféron de leucocyte selon l'invention. 1. On subclone le fragment EcoRI à 2 000 p.b. du clone HLeIF2 dans pBR325 au site EcoRI. On coupe le plasmide LeIF I obtenu avec EcoRI et on isole le fragment à 2 000 p.b. On lie le désoxyoligonucléotide dAATTCTGCAG (conver- tisseur EcoRI - PstI) au fragment EcoRI à 2 000 p.b. et on coupe le produit obtenu avec PstI pour donner un frag- ment à 2 000 p.b. contenant les extrémités PstI. On coupe celui-ci avec Sau96 et on isole un fragment à 1 100 p.b. qui a une extrémité PstI et une extrémité Sau96. 2. On digère le plasmide pLeI C trp 35 avec PstI et XbaI. On isole le grand fragment. 3. On digère le petit fragment XbaI-PstI de pLeIF C trp avec XbaI et Sau96. On isole un fragment XbaI-Sau96 à p.b. 4. On lie les fragments isolés dans les étapes (1), (2) et (3) pour former le-plasmide d'expression pLeIF trp 1. LeIF J 1. Le plasmide pLeIF J contient un fragment HindIII de 3,8 kilobases d'ADN de génome humain qui comprend la sé- quence de gène LeIF J. On isole à partir de ce plasmide un fragment DdeIRsaI de 760 p.b. 2. On coupe le plasmide pLeIF B trp 7 avec Hind III et DdeI et on isole un fragment HindIII-DdeI à 340 p.b. 3. On coupe le plasmide pBR322 avec PstI, on obtient une extrémité non agglutinante par incubation avec l'ADN polymérase I (fragment de Klenow) puis on digère avec HindIII. On isole le grand fragment (env. 3 600 p.b.). 4. On lie les fragments isolés dans les étapes (1), (2) et (3) pour former le plasmide d'expression pLeIF J trp 1. M. Purification On peut augmenter la teneur en interféron de leucocyte dans les extraits bactériens en effectuant successivement: 1. Une précipitation au polyéthylène-imine, dans laquelle la plus grande partie de la protéine cellulaire, y compris l'interféron, reste dans le surnageant. 2. Un fractionnement au sulfate d'ammonium, o l'interfé- ron sort de la solution dans le sulfate d'ammonium saturé à 55%. 3. Une suspension du pellet de sulfate d'ammonium dans du phosphate de potassium 0,06 M14, du Tris-HCl 10 mM, pH 7,2,et une dialyse contre du Tris-HCl 25 mM, pH 7,9 (l'activité d'interféron reste en solution). 4. Une chromatographie du surnageant ci-dessus, ajusté à un pH de 8,5, sur une colonne de DEAE-cellulose (en éluant avec un gradient linéaire de O à 0,2 M de NaCl dans du Tris-HCl 25 mM, pH 8,5). 5. Une adsorption sur agarose bleu Cibachrome ou hydroxy- lapatite et une élution avec du KCl 1,5 M ou une solution de phosphate 0,2 M14 respectivement (si on le désire). 6. Un tamisage moléculaire sur une colonne de Sephadex R G-75. 7. Une chromatographie d'échange de cations sur CM-cellu- lose dans 25 mM d'acétate d'ammonium à pH 5,0 développée avec un gradient d'acétate d'ammonium (à l'acétate d'am- monium 0,2 M). Le procédé ci-dessus donne un produit pur à plus de 95%. On peut également purifier le produit par chro- matographier d'exclusion de taille, chromatographie en phase liquide à haute pression à phase inversée (RP-8) ou chromatographie d'affinité sur anticorps antiinterfé- ron immobilisés. On peut également introduire le produit de l'é- tape 4 ci-dessus sur une colonne d'anticorps monoclonal, préparée comme il est dit dans Milstein, Scientific Ame- rican 243, 66 (1980), et en éluant avec de l'acide acéti- que 0,2 M, du Triton à 0,1% et du NaCl 0,15 M. Dans un autre mode de réalisation préféré, on peut purifier l'interféron de leucocyte produit par le procédé décrit ci-dessus par les étapes suivantes: 1. On brise manuellement ou avec un équipement de réduc- tion de taille approprié des pellets de cellules congelées contenant l'interféron de leucocyte exprimé. On met en suspension les cellules partiellement dégelées dans 4 volumes de tampon A, contenant du Tris 0,1 M ajusté à pH 7,5-8,0, du saccharose à 10% (p/v), du NaCl 0,2 M, de l'EDTA 5 mM, du PMSF 0,1 mM et du MgC12 10 à 100 mM. On maintient la suspension à environ 4 C. On fait passer la suspension à travers un homo- généiseur à environ 420 kg/cm puis on effectue un second passage à moins de 70 kg/cm2. On refroidit dans un bain glacé l'effluent provenant des deux passages dans l'homo- généiseur. 2. On ajoute lentement à l'homogénat de la polyéthylène- imine jusqu'à une concentration d'environ 0,35% et on laisse reposer pendant environ 30 min. On retire les solides par centrifugation ou filtration. On effectue cette étape en contrô1ant la température ou en procédant de façon suffisamment rapide pour maintenir le surnageant (filtrat) à - de 10 C. On concentre le surnageant (fil- trat) par ultrafiltration à environ 1/10e du volume d'origi- ne. On peut retirer les matières en particules ou le trouble dans le rétentat au moyen d'un filtre approprié comme une membrane microporeuse. 3. On charge directement la solution clarifiée dans une colonne d'anti-corps monoclonal à un flux de 5 à 8 cm/heu- re (c'est-à-dire 25 à 40 ml/h sur une colonne de 2,6 cm de diamètre). Après l'avoir chargée on lave la colonne avec environ 10 volumes de colonne de Tris-HCl 25 mM, pH 7,5-8,5, comprenant du NaCl (0,5 M) et un agent tensio- actif comme le Triton X-100 (0,2%) ou l'équivalent. Après le lavage on rince la colonne avec environ 10 volumes de colonne de solution contenant du NaCl 0,15 M et de l'agent tensioactif comme le Triton X-100 (0,1%) ou l'équivalent. On élue la colonne avec de l'acide acétique 0,2 M contenant un agent tensioactif comme le Triton X-100 (0,1%) ou l'é- quivalent. On rassemble le pic protéique de la colonne d'anticorps monoclonal (déterminé par absorption UV ou un autre dosage commode) et on ajuste le pH à environ 4,5 avec NaOH 1 N ou une base Tris 1,0 M. 4. On charge le pic d'interféron rassemblé dans un échan- geur cationique comme la cellulose Whatman CM52 ou l'é- quivalent que l'on a équilibré avec un tampon approprié comme l'acétate d'ammonium pH 4,5 (50 mM). Après char- gement, on lave la colonne avec un tampon équilibrant jus- qu'à ce que l'absorption UV de l'effluent ait atteint un plateau si bien qu'on élue peu de protéine supplémentaire à partir de la colonne. On élue alors la colonne avec de l'acétate d'ammonium 25 mnN:chlorure de sodium 0, 12 M ou une combinaison qui optimise la récupération d'interfé- ron et donne un tourteau lyophilisé ayant -un aspect et des propriétés de solubilité satisfaisants. On peut préparer les anticorps monoclonaux emplo- yés dans le mode de réalisation préféré décrit ci-dessus par le procédé décrit par Staehelin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 1848-52 (1981). On purifie les anticorps monoclonaux et on les lie de façon covalente à de l'Affi- gel-10 comme il est dit ci-dessous: Préparation et purification d'anticorps monoclo- naux à partir de liquide ascitique On inocule à 5 souris Balb/c femelles de 5 à 10 x 106 cellules d'hybridome en phase de croissance mé- dio-logarithmique. On inocule par voie intrapéritonéale environ 5 x 10 cellules viables obtenues à partir du li- quide de production des souris à 10 souris ou plus. On recueille le liquide ascitique de façon répétée (2 à 4 fois) chez chaque souris. On peut effectuer jusqu'à trois transferts et récupérations d'un groupe de souris au suivant. On rassemble le liquide ascitique des souris à chaque transfert. On retire les cellules et les débris du liquide ascitique par centrifugation à basse vitesse (500 à 1000 g) pendant 15 min. Puis on effectue une centrifugation pendant 90 min à 18 000 tpm. On gèle le surnageant et on le garde à -200C. Après dégel, on retire une quantité supplémentaire de fibrine et de matière en particules par centrifugation à 35 000 tpm pendant 90 min. On teste l'activité d'anticorps spécifique de lots de liquide as- citique provenant de chaque transfert par un dosage de liaison anticorps en phase solide (Staehelin et al, supra) et on rassemble si on trouve le résultat satisfaisant. On estime la concentration protéique dans les solutions rassemblées par l'approximation selon laquelle 1 mg de protéine donne une absorbance de 1, 2 à 280 nm dans une cuvette avec une longueur de parcours de 1,0 cm. Les liquides ascitiques ayant de hauts niveaux d'anticorps con- tiennent de 30 à 35 mg de protéine/ml. Ceci est équiva- lent à 4 à 7 mg d'anticorps spécifique/ml. On dilue le liquide avec du sel physiologique tamponné au phosphate (phosphate de sodium 0,01 M, pH 7, 3, NaCl 0,15 M) jusqu'à une concentration protéique de 10 à 12 mg/ml. Pour 100 ml de solution diluée, on ajoute lente- ment 90 ml de solution de sulfate d'ammonium saturée à la température ambiante en agitant vigoureusement à 0 C. On maintient la suspension dans de la glace pendant 40 à 60 min, puis on centrifuge pendant 15 min à 10 000 tpm à C. On décante et on draine soigneusement le surnageant. On dissout les pellets de protéine dans du Tris.HCl 0,02 M (pH 7,9)/NaCl 0,04 M (tampon I). On dialyse la solution protéique pendant 16 à 18 heures à la température ambian- te contre 100 volumes de tampon I avec au moins un change- ment de tampon. On centrifuge la solution dialysée à 15 000 tpm pendant 10 min pour retirer le produit non dis- sous. On recueille, selon l'estimation par absorption à 280 nm, environ 30 à 35% de la quantité d'origine de pro- téines totales dans le liquide ascitique. On introduit la solution contenant 30 à 40 mg de protéine par ml dans une colonne de DEAE-cellulose équili- brée avec du tampon I. On utilise un volume de lit de colonne d'au moins 100 ml pour chaque gramme de protéine introduit. On élue l'anticorps de la colonne avec un gradient linéaire de NaCl contenant du Tris.HCl 0,02 M, pH 7,9, du NaCi 0,04 M à 0,5 M. On concentre les frac- tions de pic rassemblées s'éluant entre NaCl 0,06 et 0,1 M par précipitation avec un volune égal de sulfate d'ammo- nium saturé à la température ambiante et par centrifugation. On dissout les pellets de protéine dans NaHC02 0,02 M (pHenv. 8,0)/NaCl (tampon II) puis on dialyse contre 3 bains successifs du même tampon à la température ambiante. On centrifuge les solutions dialysées à 20 000 g pendant min pour retirer toute matière insoluble éventuellement présente. On ajuste la concentration protéique à 20 à 25 mg/ml avec le tampon II. Préparation des immunoadsorbants On lave de l'Affigel-10 (BioRad Laboratories, Richmond, Californie) trois fois sur un filtre en verre fritté avec de l'isopropanol glacé puis on lave 3 fois avec de l'eau distillée glacée. On transfère la bouillie de gel (à environ 50% dans l'eau glacée) dans des tubes de plastique et on sédimente par une brève centrifuga- tion. On aspire le surnageant. On mélange le gel tassé avec un volume égal de solution d'anticorps purifiée et on fait tourner en renversant à 41C pendant 5 ho Après réaction, on centrifuge le gène, puis on le lave 2 fois avec du tampon III (NaHCO3 0,1 M/NacL 0,15 M) pour reti- rer l'anticorps non couplé. La détermination protéique des eaux de lavage combinées révèle que plus de 90% de l'anticorps est couplé au gel. Pour bloquer les sites qui n'ont pas réagi, on mélange le gel avec un volume égal d'éthanolamine.HCl 0,1 M (pH 8) et on fait tourner en renversant à la tempé- rature ambiante pendant 60 min. On lave la bouillie de gel pour la débarrasser des réactifs avec du sel physiolo- gique ramponné au phosphate et on la garde dans du sel physiologique tamponné au phosphate en présence d'azothy- drure de sodium à 0,02% (p/v) à 40C. N. Administration parentérale On peut administrer le LeIF par voie parentérale à des sujets ayant besoin d'un traitement antitumoral ou antiviral, et à ceux qui sont dans un état immuno-suppres- sif. Le dosage et la posologie peuvent être parallèles à ceux qui sont couramment employés dans les recherches cliniques sur des matériaux d'origine humaine, p ex. d'en- viron (1-10) x 10 unités par jour, et dans le cas de ma- tières de pureté supérieure à 1%, probablement jusqu'à, p ex., 5 x 107 unités par jour. A titre d'exemple de posologie appropriée pour du LeIF bactérien essentiellement homogène sous forme pa- rentérale, on peut dissoudre 3 mg de LeIF d'une activité spécifique de, p ex., 2 x 108 unités/mg dans 25 ml de sé- rum-albumine humaine 5 N, on fait passer la solution à -travers un filtre bactériologique et on répartit de façon aseptique la solution filtrée dans 100 flacons, contenant chacun 6 x 106 unités d'interféron pur approprié à l'ad- ministration parentérale. Il est préférable de garder les flacons à froid (-20 C) avant l'emploi. On peut formuler les composés de l'invention se- lon des procédés connus pour préparer des compositions phar- maceutiquement utiles, en mélangeant le présent polypeptide avec un support pharmaceutiquement acceptable. Les sup- ports appropriés et leur formulation sont décrits dans Re- mington's Pharmaceutical Sciences par E.W. Martin, ici mentionné à titre de référence. Ces compositions contien- nent une quantité efficace de la présente protéine d'inter- féron avec une quantité efficace de support afin de pré- parer des compositions pharmaceutiquement acceptables ap- propriées à une administration efficace à l'hâte. Le mode d'administration préféré est parentéral. REVENDICATIONS 1) Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés d'un interféron de leucocyte humain mûre sans l'accompagnement d'aucune préséquence. 2) Polypeptide selon la revendication 1, sans l'accompagnement d'une glycosylation associée. 3) Polypeptide comprenant la séquence d'acides ami- nés d'un interféron de leucocyte humain mûr, contenant l'acide aminé méthionine attaché à l'extrémité N de l'a- cide aminé venant ordinairement en premier dudit inter- féron. 4) Polypeptide comprenant la séquence d'acides ami- nés d'un interféron de leucocyte humain mûr, contenant une protéine signal conjuguée ou microbienne détachable attachée à l'acide aminé venant ordinairement en premier dudit interféron. ) Polypeptide selon l'une quelconque des revendica- tions I à 4 o la séquence d'acides aminés dudit interfé- ron comprend la séquence partielle Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Arg- Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser. 6) Polypeptide selon l'une quelconque des revendi- cations I à 4 o la séquence dudit interféron comprend les acides aminés spécifiés et positionnés comme il est indi- qué dans la séquence "All" de la figure 4. 7) Polypeptide selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6 choisi dans le groupe constitué par l'inter- féron de leucocyte humain (LeIF) A, B, C, D, F, H, I et J. 8) Interféron de leucocyte humain A (LeiF A). 9) Interféron de leucocyte humain B (LeIF B). 10) Interféron de leucocyte humain C (LeIF C). 11) Interféron de leucocyte humain D (LeIF D). 12) Interféron de leucocyte humain F (LeIF F). Interféron de leucocyte humain H (LeIF H). 14) Interféron de leucocyte humain I (LeIF I). ) Interféron de leucocyte humain J (LeIF J). 16) Polypeptide d'interféron de leucocyte humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 produit - par voie microbienne. 17) Polypeptide d'interféron de leucocyte humain selon l'une quelconque des revendications I à 15 produit par voie bactérienne. 18) Polypeptide d'interféron de leucocyte humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 produit par E. coli. 19) Séquence d'ADN comprenant la séquence donnant le code de la séquence d'acides aminés d'un interféron de leucocyte humain mûr sans accompagnement d'une quelconque préséquence. ) Séquence d'ADN comprenant la séquence donnant le code de la séquence d'acides aminés d'un interféron de leucocyte humain m r contenant l'acide aminé méthionine attaché à l'extrémité N de l'acide aminé venant ordinai- rement en premier dudit interféron. 21) Séquence d'ADN comprenant la séquence donnant le code de la séquence d'acides aminés d'un interféron de leu- cocyte humain mar contenant une protéine signal conjuguée ou microbienne détachable attachée à l'extrémité N de l'a- cide aminé venant ordinairement en premier dudit inter- féron. 22) Séquence d'ADN telle que revendiquée dans l'une quelconque des revendications 19 à 21 contenant une sé- quence donnant le code de la séquence partielle d'acides aminés Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser. 23) Séquence d'ADN telle que revendiquée dans l'une quelconque des revendications 19 à 21 contenant des codons donnant le code des acides aminés d'un interféron spécifié et positionné comme il est indiqué dans la séquence "All" de la figure 4. 4.9 24) Séquence d'ADN telle que revendiquée dans l'une quelconque des revendications 19 à 23 donnant le code d'un polypeptide choisi dans le groupe constitué par l'in- terféron de leucocyte humain (LeIF) A, B. C, D, F, He I et J. ) Séquence d'ADN donnant le de leucocyte humain A (LeIF A). 26) Séquence d'ADN donnant le de leucocyte humain B (LeIF B). 27) Séquence d'ADN donnant le de leucocyte humain C (LeIF C). 28) Séquence d'ADN donnant le de leucocyte humain D (LeIF D). 29) Séquence d'ADN donnant le de leucocyte humain F (LeIF F). ) Séquence d'ADN donnant le de leucocyte humain H (LeIF H). 31) Séquence d'ADN donnant le de leucocyte humain I (LeIF I). 32) Séquence d'ADN donnant le de leucocyte humain J (LeIF J). 33) code de l'interféron code de l'interféron code de l'interféron code de l'interféron code de l'interféron code de l'interféron code de l'interféron code de l'interféron Séquence d'ADN choisie dans le groupe constitué par les séquences A, B, C, De, et H de la figure 3. 34) Séquence d'ADN choisie dans le groupe constitué par les séquences A, C, H. I et J de la figure 8. ) Séquence d'ADN selon l'une quelconque des reven- dications 19 à 34 liée de manière à former un opéron avec une séquence d'ADN capable d'effectuer l'expression micro- bienne d'un polypeptide selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 15. 36) Séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendi- cations 19 à 34 liée de manière à former un opéron avec une séquence d'ADN capable d'effectuer l'expression d'un poly- peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 dans une bactérie. 37) Séquence d'ADN selon l'une quelconque des reven- dications 19 à 34 liée de manière à former un opéron avec une séquence d'ADN capable d'effectuer l'expression d'un 5.polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à chez E. coli. 38) Véhicule d'expression.microbienne réplicable ca- pable, dans un microorganisme transformant, d'exprimer un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 15. 39) Véhicule d'expression bactérienne réplicable ca- pable, dans une bactérie transformante, d'exprimer un poly- peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 15. ) Véhicule d'expression chez E. coli réplicable capable, dans une E. coli transformante, d'exprimer un poly- peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 15. 41) Véhicule d'expression microbienne selon l'une quelconque des revendications 38-40 qui est un plasmide. 42) Plasmide choisi dans le groupe constitué par pLeIF A trp 25, pLeIF B trp 7, et pLeIF F trp 1. 43) Plasmide choisi dans le groupe constitué par pLeIF C trp 35 et pLeIF D trp 11. 44) Plasmide choisi dans le groupe constitué par pLeIF G et pLeIF H. 45) Plasmide choisi dans le groupe constitué par pLeIF I trp 1 et pLeIF J trp 1. 46) Microorganisme transformé avec un véhciule tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 38 à 45. 47) Bactérie transformée avec un véhicule tel que revendiqué dans l'une-quelconque des revendications 38 à 48) Souche d'E. coli transformée avec un véhicule tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 38 à 45. 49) E. coli K-12 souche 294 transformé avec un vé- hicule tel que revendiqué dans l'une quelconque des reven- dications 38 à 45. 50) Composition comprenant une fraction thérapeuti- quement active d'un polypeptide constitué essentiellement de la séquence d'acides aminés d'un interféron de leuco- cyte humain mûr, le reste de ladite composition comprenant une protéine microbienne soluble à partir de laquelle on peut purifier ledit polypeptide dans une mesure suffisante pour une application thérapeutique efficace. 51) Extrait bactérien comprenant un polypeptide d'une pureté de plus de 95% constitué essentiellement de la séquence d'acides aminés d'un interféron de leucocyte humain mûr tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 18. 52) Composition pharmaceutique contenant une quanti- té thérapeutiquement efficace d'un interféron de leucocyte humain mûr tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 18 et un-support approprié à l'adminis- tration pharmaceutique. 53) Composition pharmaceutique telle que revendiquée dans la revendication 52 pour l'administration parentérale. 54) Culture de cellules microbiennes capable de produire de l'interféron de leucocyte humain mûr. ) Culture de la revendication 54, qui est une cul- ture d'un microorganisme revendiqué dans l'une quelconque des revendications 46 à 49. 56) Application de composés revendiqués dans l'une quelconque des revendications 1 à 18 au traitement des tu- meurs et des infections virales ou-à la préparation de compositions pharmaceutiques utiles pour un tel traitement. 57) Application des séquences d'ADN revendiquées dans l'une quelconque des revendications 19 à 37 à la production microbienne d'un composé revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 15. 58) Application d'un véhicule d'expression tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 38 à à la production microbienne d'un composé revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 15. 59) Application d'un microorganisme tel que revendi- qué dans l'une quelconque des revendications 46 à 49 ou d'une culture de cellules microbiennes telle que revendi- quée dans les revendications 54 ou 55 à la production d'un composé revendiqué dans l'une quelconque-des revendications 1 à 15. ) Les composés revendiqués dans l'une quelconque des revendications 1 à 18 lorsqu'ils sont utilisés pour le traitement des tumeurs et des infections virales ou pour préparer des compositions pharmaceutiques utiles pour un tel traitement. 61) Les séquences d'ADN revendiquées dans l'une quelconque des revendications 19 à 37 lorsqu'elles sont utilisées dans la production microbienne d'un composé revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 15. 62) Véhicule d'expression tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 38 à 45 lorsqu'il est utilisé à la production microbienne d'un composé revendi- qué dans l'une quelconque des revendications 1 à 15. 63) Microorganisme tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 46 à 49 ou culture de cellules microbiennes telle que revendiquée dans les re- vendications 54 à 55 tels qu'ils sont utilisés dans la production d'un composé revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 15. 64) Procédé de préparation d'un polypeptide reven- diqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 15, procédé qui implique de faire croître une culture d'un microorganisme, transformé avec un véhicule d'expression microbienne réplicable capable d'exprimer ledit polypeptide, et de lui faire exprimer ledit polypeptide et de recueillir ledit polypeptide. ) Procédé de préparation de microorganismes capa- bles d'exprimer un polypeptide revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 15, procédé qui impli- que de transformer un microorganisme avec un véhicule d'expression microbienne réplicable capable d'exprimer ledit polypeptide, et de cultiver le microorganisme trans- formé. 66) Procédé de préparation d'un véhicule d'expression microbienne capable, dans un microorganisme transformant, d'exprimer un polypeptide tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 15, procédé qui implique de construire une première séquence d'ADN donnant le code dudit polypeptide et de lier de manière à former un opéron ladite première séquence d'ADN avec une seconde séquence d'ADN capable de réaliser l'expression microbienne dudit polypeptide. 67) Les produits et procédés pour leur préparation tels que décrits ci-dessus.