Brevet FR2481713A1 — publié le 19811106

La présente invention concerne un procédé de production d'oxydase de L-amino-acides. L'oxydase de L-amino-acides est une enzyme, classification N EC 1.4.3.2., une oxydoréductase du système L-amino-acide/oxygène (déamination), qui agit selon,l'équation suivante: COOH COOH I I H2N-C-H + H20 + 02 CO + NH3 + H202 I R R L-amino-acide 2-oxo-acide On savait jusqu'à présent que l'on trouve cette enzyme dans le venin de serpent, les reins de rats et de souris, le foie des oiseaux, des animaux invertébrés et dans Neurospora crassa [Arch. Biochem. Biophys., 146, pp. 54-63 (1971); J. Bacteriol., 121, pp. 656-663 (1975), Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Vol. 17, pp. 42-55 (1'972)]. Selon la présente invention, on a trouvé que l'on peut obtenir l'oxydase de L-amino-acides dans le mycélium d'une moisissure M5073,isolée des graines de Calophyllum inophyllum à Hahajima, Bonin Islands, Tokyo, Japon, et ladite enzyme en a été isolée. Sur les dessins annexés, les Figures 1 à 4 montrent le pH optimum, la stabilité au pH, la stabilité thermique et la température optimale de l'oxydase de L-amino-acides selon la présente invention. L'observation de la moisissure M5073 sur divers milieux de culture à l'oeil nu et au microscope révèle les caractéristiques suivantes: A. Croissance sur divers milieux de culture 1. Milieu gélosé d'extrait de malt Croissance très rapide, recouvrant toute la surface d'une boite de Petri (de diamètre interne de 85 mm) en cinq jours quand on fait incuber à 26 C. Hyphes aériens blanc duveteux pendant la période initiale d'incubation mais 248 1713 devenant crayeux (presque gris 1 dc) lorsque le micro- organisme se développe. Exsudations claires sur les colonies. L'envers est essentiellement abricot (teinte 4 ga) et partiellement brun (teinte 2 nl). 2. Milieu gélosé de pomme de terre et de glucose - Croissance très rapide, occupant toute la surface d'une boite de Petri (d'un diamètre intérieur de 85 mm) en cinq jours quand on fait incuber à 260C. Hyphes aériens duveteux, blancs dans la période initiale de l'incubation mais devenant grège (presque gris 1 fe) ou gris olive (presque gris 1 ih). Des exsudations claires se produisent légèrement sur les colonies. L'envers est essentiellement rose perle (teinte 3 ca), et partiellement bleu brouillard (teinte 14 ig). 3. Milieu gélosé de Czapeck Croissance rapide, atteignant 75 à 80 mm de diamètre en sept jours quand on fait incuber à 260C. Hyphes aériens duveteux, les hyphes se dressant de façon relativement épaisse. Blancs au début de l'incubation mais devenant progressivement gris olive (presque gris 1 ih), le changement se faisant depuis la partie centrale vers la partie périphérique lorsque le micro-organisme se développe. L'envers est rose chair (teinte 4 ca), partiellement chocolat (teinte 4 nl). Les descriptions de couleurs précédentes sont faites selon la méthode de description de couleurs décrite dans Color Harmony Manual (Container Corporation of America 1958). B. Caractéristiques physiologiques 1. Conditions de croissance optimum pH optimum: 4-8 température optimum: 24-30'C. 2. Conditions tolérables pour la croissance pH auquel le micro-organisme peut se développer 2,5-11 température à laquelle le micro-organisme peut se développer: 8-420C. C. Caractéristiques morphologiques Acervules bruns, en forme de paillettes ou de coussins, éparpillés sur le milieu. Plusieurs soies brunes au bord des -. 2481713 acervules ou entre les conidiophores. Les conidiophores s'étirent droits à partir de stromas simples et bien développés. Surface des parois lisse et incolore, avec 1-2 segments. 10 - 60 x 3 - 4 p. Les soies sont brun foncé ou olive foncé, d'une longueur de 50 à 150 p et d'une largeur de 5 à 7 p à la base, ayant une surface de paroi lisse avec un ou plusieurs segments. Les conidies sont à une seule cellule, 10 - 20 x 3 - 5 p, ovales et légèrement effilées à la base. Les surfaces des parois sont lisses et les conidies forment une masse à l'extrémité des conidiophores. Présence de mucus orange. Les conidies séparées sont incolores ou vert- jaunâtre pâle. La présente moisissure M45073 a été identifiée comme appartenant au genre Colletotrichum, en se basant sur ces caractéristiques, en particulier sur le fait que la moisissure M5073 forme des colonies brun foncé, que les acervules avec soies sont bien développés et que les conidies forment une masse à l'extrémité de conidiophores simples et bien développés. Le nom de l'espèce n'a pas encore été identifié car un micro-organisme appartenant au genre Colletotrichum est parasite sur la plante et l'identification de l'espèce sur la base de la culture est difficile (von Arx, J.A., The Genera of Fungi Sporulating Pure Calture, pp. 315, 1974; J. Cramer, Barron, G.L., The Genera of Hyphomycetes from soil, pp. 364, 1968, The Williams & Wilkins Co.; Tiffany, L.H. and J.C. Gilman, Species of Colletotrichum from Legumes, Mycologia 46: 52-75, 1954). En se basant sur les présents résultats, la présente moisissure a été appelée Colletotrichum sp. M5073 et déposée au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japon, le 6 mars 1980 et a reçu le numéro de dépôt FERM-P N 5441. La présente invention fournit un procédé de production d'oxydase de Lamino-acides, par culture d'un micro-organisme appartenant au genre Colletotrichum et pouvant produire de l'oxydase de L-amino-acides dans un milieu de culture approprié, et de récupération de l'oxydase de L- amino-acides résultante à partir des cellules cultivées. 248 1713 Le micro-organisme à utiliser dans la présente invention peut être l'un quelconque de ceux appartenant au genre Colletotrichum et pouvant produire l'oxydase de L-amino- acides. L'organisme Colletotrichum sp. M5073 ci-dessus en est un exemple. Comme on le sait, les micro-organismes peuvent muter de façon artificielle ou naturelle. Les micro-organismes utilisables dans la présente invention ne sont évidemment pas exceptionnels. Tout variant peut être utilisé dans la présente invention pour autant qu'il ne perde pas son aptitude à produire une oxydase de L-amino-acides. Dans le présent procédé, le micro-organisme est d'abord cultivé dans un milieu de culture d'une manière classique. La culture peut être effectuée sur un milieu solide ou dans un milieu liquide, mais il est avantageux d'un point de vue industriel de cultiver le micro-organisme dans un milieu de culture industriel avec agitation et aération. Les sources nutritives du milieu peuvent être celles utilisées de façon classique pour la culture des micro-organismes. Une source de carbone peut être l'un quelconque d'un composé organique assimilable, par exemple le riz, le son de riz, l'amidon, le glucose, le maltose, la glycérine, la mélasse, l'amidon soluble, etc. Une source d'azote peut être un quelconque composé de l'azote assimilable, par exemple la peptone, la poudre de soja, la liqueur de macération de mais, l'extrait de viande, l'extrait de levure, les amino-acides, les nitrates, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, etc. On peut également utiliser en tant que de besoin des sels comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le sulfate de magnésium, le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, etc. On peut faire varier la température de culture dans l'intervalle de température dans lequel le micro- organisme se développe en produisant de l'oxydase de L-amino- acides, mais de préférence entre 20 et 350C. La durée de culture peut varier également selon les conditions de culture, mais elle est habituellement de deux à quatre jours. On peut arrêter la culture après un temps suffisant en prenant en considération l'activité, c'est-à-dire quand l'activité de l'oxydase de L-amino-acides vient au niveau le plus élevé. Dans le bouillon de culture obtenu, l'oxydase de L-amino- acides est contenue et accumulée dans le mycelium. L'oxydase de L-amino-acides peut être obtenue, par exemple, selon les modes opératoires suivants: On sépare d'abord le bouillon en une partie solide et une partie liquide, et on met les cellules humides ainsi obtenues dans une solution tampon Tris-HCl ou une solution tampon de phosphate, si nécessaire. Puis on extrait l'oxydase de L-amino-acides à partir des cellules en appliquant de façon adéquate des procédés de traitement de cellules sélectionnés et, si nécessaire, combinés, comme un traitement par le lysozyme, un traitement aux ultrasons, un traitement à la presse, etc., grâce à quoi on obtient un liquide brut contenant l'oxydase de L-amino-acides. On soumet ensuite le liquide brut à un procédé de purification, dans lequel on traite le liquide brut par des modes opératoires d'isolement et/ou purification connus pour les protéines ou les enzymes, en vue d'obtenir l'oxydase de L-amino-acides purifiée. Par exemple, on peut recueillir l'oxydase de L-amino-acides brute à partir du liquide brut la contenant, en ajoutant du sulfate d'ammonium au liquide pour relarguer l'oxydase de L-amino-acides. On peut également ajouter des solvants organiques comme l'acétone, l'éthanol, l'isopropanol, etc., pour précipiter l'oxydase de L-amino- acides. En outre, le produit brut peut être raffiné à un degré tel que l'on peut obtenir par électrophorèse une protéine homogène, en tenant compte des propriétés de l'oxydase de L-amino-acides. Par exemple, on dissout l'oxydase de L- amino-acides brute dans un milieu approprié, comme une solution tampon Tris-HCl, on la traite par une résine échangeuse d'ions comme la diéthylaminoéthyl-cellulose (appelée ci-après "DEAE-cellulose"), un gel de diéthylamino- éthyl-dextrane réticulé, etc., et des gels de filtration comme un gel de dextrane, un gel de polyacrylamide, etc., puis, si nécessaire, on effectue un traitement avec des membranes de dialyse, des fibres creuses, des membranes d'ultrafiltration, etc. Le produit purifié ainsi obtenu est ensuite séché par un procédé approprié, comme la lyophilisation, pour donner des poudres purifiées d'oxydase de L-amino-acides. L'oxydase de L-amino-acides fournie par la présente invention a les propriétés physiques suivantes. On se référera d'abord aux procédés de détermination de son activité ou de sa puissance. (1) Mesure de l'activité de l'enzyme On place dans un petit tube à essai 0,9 ml d'une solution de réaction ayant la composition suivante et on la chauffe à 37 C. L-Leucine 0,2M 0,1 ml Tampon Tris-HCl 0,2M (pli 7,5) 0,2 ml 4Aminoantipyrine à 0,3 % 0,1 ml Phénol à 0,2 % 0,1 ml Peroxydase (50 U/ml) 0,1 ml Eau 0,3 ml On y ajoute 0,1 ml d'un liquide contenant de l'oxydase de L-amino-acides et on laisse réagir exactement pendant 10 minutes à 37 C. On arrête la réaction en ajoutant 2,0 ml d'éthanol. Puis on détermine par colorimétrie la quantité de peroxyde d'hydrogène formé, à partir de l'absorbance mesurée à 480 nm. On détermine l'activité enzymatique à partir de la quantité de peroxyde d'hydrogène formé, selon l'équation suivante: U/ml = AA 480 nm x 0,699 x taux de dilution La quantité de l'enzyme qui produit 1 p mole de peroxyde d'hydrogène à 37 C en une minute est définie comme étant une unité (1 U). (2) Action En présence d'oxygène, elle catalyse des réactions dans lesquelles le groupement a-amino d'un acide L-amino-acides est désaminé par oxydation pour donner un acide a-cétonique, de l'ammoniac et du peroxyde d'hydrogène. a COOH COOH I I H2N-C-H + H20 + O2 + CO + NH3 + H202 I I R R L-amino-acide 2-oxo-acide (3) pH optimum On mesure l'activité enzymatique de l'oxydase de L-amino-acides à plusieurs pH en utilisant une solution tampon acide diméthylglutarique/NaOH (pH 4-7,5), une solution tampon de phosphate (pH 6,5-8,0), une solution tampon Tris- HC1 (pH 7,5-9,0) et une solution tampon glycine-NaOH (pH 8,8- 9,6). Les résultats sont donnés sur la Figure 1 annexée qui montre que le pH optimum est 7,0 à 8,5. (4) Stabilité au pH Après avoir conservé l'enzyme dans une solution tampon acide diméthylglutarique/NaOH (pH 4,5-7,5), une solution tampon-de phosphate (pH 6,5-8), une solution tampon Tris-HCl (pH 7,5-9) et une solution tampon glycine-NaOH (pH 9-10) à 37 C pendant 24 heures, on mesure son activité enzymatique. Les résultats sont indiqués sur la Figure 2, qui montre qu'elle est stable à pH 8 ou plus. (5) Stabilité à la chaleur On mesure la stabilité à la chaleur de l'enzyme en conservant l'enzyme dans une solution tampon Tris-HCl de pH 7, 5 pendant 10 minutes. Les résultats sont donnés sur la Figure 3. L'enzyme est considérée comme stable à 60 C ou à des températures inférieures. (6) Température optimale On mesure la température optimale en utilisant la même solution de réaction que celle utilisée pour la mesure de l'activité de l'enzyme. Les résultats sont donnés sur la Figure 4. On considère que la température optimale de l'enzyme est de 40 à 50 C. (7) Spécificité vis-à-vis des substrats On mesure les activités enzymatiques de l'enzyme vis-à-vis de divers substrats indiqués dans le Tableau 1 ci-dessous, avec le même mode opératoire que pour la mesure de l'activité de l'enzyme, en utilisant 5 mmoles de substrat et 0,007 U d'enzyme. Les résultats sont donnés dans le Tableau 1 ci-dessous. TABLEAU 1 Activité Activité Substrat relative Substrat relative (%) (%) L-Leucine 100,0 L-Histidine 11,8 L-Méthionine 93,6 L-Cystéine 6,4 LPhénylalanine 70,0 D-Phénylalanine 0,0 L-arginine 39,9 L-Glycine 0,0 LLysine 29,6 L-Cystéine 0,0 L-Isoleucine 29,1 L-Sérine 0,0 DL-Tryptophane 27,1 Acide L- aspartique 0,0 L-Tyrosine 22,2 Acide L-gluta- mique 0,0 DL-Isoleucine 15,3 D-Alanine 0,0 L-Alanine 12,3 L'enzyme de la présente invention agit non seulement sur la L-leucine mais également sur divers autres L-amino-acides. (8) Inhibition et activation On mesure les activités enzymatiques de l'enzyme selon le même mode opératoire que pour la mesure de l'activité de l'enzyme, et en ajoutant à la solution de réaction 1 mM de divers ions métalliques ou d'autres additifs indiqués dans le Tableau 2 ci-dessous. Les résultats sont également indiqués dans le Tableau 2. L'ion cyanure a un effet inhibiteur fort sur l'enzyme et on n'a pas trouvé d'ions ayant un effet d'activation sur l'enzyme. X en utilisant 0,01 U d'enzyme TABLEAU 2 (9) Point isoélectrique pH 3,9 (10) Valeur Km 1,7 x 10-4 M (sur la Lleucine) (11) Poids moléculaire Environ 200 000; mesuré par filtration sur gel en utilisant Sephacryl S-200. D'après les caractéristiques physiologiques précédentes, on voit que l'enzyme de la présente invention est l'oxydase de L-amino-acides. L'oxydase de L-amino-acides fournie par la présente invention est utilisable pour une analyse quantitative des amino-acides, pour une analyse clinique dans laquelle on détermine la quantité d'amino-acides obtenue à partir d'un substrat synthétique pour la mesure des peptidases comme la leucine-amino-peptidase, pour la production d'acides a- cétoniques utilisables pour les patients souffrant d'urémie, etc. L'exemple suivant est donné pour illustrer de façon plus précise la présente invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 On fait incuber Colletotrichum sp. M5073 (FERM-P N 544]) dans deux flacons de 500 ml dans lesquels on a placé ml de milieu de culture (pH 6, 7, stérilisé à 120 C 1 0 Activité Activité Additif relative Additif relative (%) (%) Aucun 100 LiCl 97,5 NaN3 100 NH4Cl 97,1 MnC12 97,1 IMgCl2 99,2 NaF 97,9 BaC12 97,1 EiTA 100 CaC12 95,4 KCN 14,1 ZnCl2 94,2 COCl2 50,6 pendant 20 minutes) ayant une composition de 1,0 % de maltose, 1,0 % d'extrait de levure, 0,5 % de NaCl, 0,05 % de MgSO4.7H20, 0,05 % de K2HPO4, 1,0 % de son de riz et 0,5 % d'agent antimoussant et on fait incuber à 30 C pendant trois jours en agitant pour obtenir des cultures d'ensemencement. Ces deux cultures d'ensemencement sont inoculées dans un litre du même milieu de culture que précédemment, dans un fermenteur de 30 litres et on les cultive à 30 C pendant trois jours en agitant à 300 tours par minute et avec une aération de 20 1/minute. Puis on isole les cellules de microorganismes humides en centrifugeant le milieu pendant minutes à 5 000 tours par minute. On met les cellules humides isolées en suspension dans deux litres de solution tampon Tris-HCl 10 mM (pH 7,5). On détruit les cellules avec un appareil de destruction approprié (marque de fabrique DYNOMIL) et on les centrifuge à 15 000 tours par minute pendant 10 minutes pour obtenir 1,55 1 de liqueur surnageante (2 700 U). On soumet cette liqueur surnageante à une précipitation fractionnée avec du sulfate d'ammonium à une saturation de 0,61 et on centrifuge à 15 000 tours par minute pendant 10 minutes pour obtenir une liqueur surnageante. On soumet à nouveau la liqueur surnageante à une précipitation fractionnée par du sulfate d'ammonium à une saturation de 0,88 et on centrifuge à 15 000 tours par minute pendant 10 minutes pour obtenir des précipités. On dissout les précipités dans 400 ml d'une solution tampon Tris-HCl mM (pH 7,5) et on chauffe à 60 C pendant 10 minutes. On enlève les précipités résultants par centrifugation (15 000 tours par minute, 10 minutes) et l'on obtient 385 ml de liqueur surnageante. On lui ajoute 456 ml d'acétone froide. On recueille les précipités résultants et on les dissout dans 150 ml d'une solution tampon Tris-HCl 0,2M (pH 7,5). On enlève par centrifugation les matières non dissoutes et l'on obtient 112 ml de liqueur surnageante. On dialyse ce liquide pendant une nuit visà-vis de cinq litres de solution tampon Tris HICl 10 mM (pHi 7,5) avec un tube en acetate de cellulose puis on l'introduit dans une colonne de DEAEcellulose (4,0 x 30 cm) en utilisant une solution tampon Tris-HC1 10 mM (pH 7,5) et on élue en utilisant KCl 0 à 0,5 M avec un gradient de concentration linéaire et on recueille les fractions qui présentent une activité avec KC1 environ 0,4 M. On concentre ces fractions actives avec une membrane d'ultrafiltration XM-50 (produite par Amicon), on les introduit dans une colonne (3,6 x 80 cm) garnie de Sephacryl S-200 et on élue avec une solution tampon Tris- HCl 10 mM (pH 7,5). On recueille l'éluant qui sort après recueil de 580 ml d'éluant, jusqu'à ce que 640 ml d'éluant soient sortis. On lyophilise l'éluant recueilli et l'on obtient 152 mg (621 U) d'oxydase de L-amino-acides en poudre. Z481713 RÉPUBLIQUE FRAN AISE INSTITUT NATIONAL DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE PARIS 2481 714 BREVET D'INVENTION CERTIFICAT D'UTILITÉ CERTIFICAT D'ADDITION Aucun titre n'est publié sous ce numéro REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'oxydase de L-amino- acides, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver, dans un milieu de culture, un micro-organisme qui peut produire de l'oxydase de L-aminoacides et qui appartient au genre Colletotrichum, et à recueillir l'oxydase de L-amino-acides à partir des cellules cultivées. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qué le micro-organisme producteur d'oxydase de L- amino-acides est Colletotrichum sp. M5073, numéro de dépôt FERM-P N 5441.