Brevet FR2484452A1 — publié le 19811218

La présente invention est relative à un procé- dé de mesure par dosage immunologique enzymatique (dénom- mé ci-après procédé EIA) de la teneur du sérum humain en un anticorps dirigé contre une lipoprotéine de membrane spécifique du foie (dénommée ci-après LSP) ou un anti- corps d'une antilipoprotéine de Imemrare spécifique du foie (dénommé ci-après anticorps anti-LSP), ce procédé é- tant remarquable en ce qu'il consiste à utiliser comme antigène dans le procédé EIA un LSP provenant du foie d'un mammifère. L'anticorps anti-LSP est un autoanticorps de la lipoprotéine de membrane spécifique du foie apparais- sant dans le sérum des malades souffrant de maladies du foie.En mé- surant le taux du sérum en anticorps anti-LSP, on peut détecter l'importance de l'hépatite., Cette détection peut donc servir à diagnostiquer ces maladies du foie. L'anticorps anti-LSP peut produire un comple- xe antigène-anticorps lorsqu'il se fixe sur le LSP pro- venant du foie d'un mammifère, mais il ne peut pas se fixer sur des protéines d'organes autres que-le foie. Suivant l'invention, on utilise du LSP provenant du foie d'un mammifère. Toutefois, on peut utiliser comme anti- gène dans le procédé EIA suivant l'invention tout LSP qui peut se fixer sur un anticorps d'anti-LSP de l'homme. Le LSP suivant l'invention est une lipoprotéine ayant une masse moléculaire de cinq millions de dalton à cin- quante millions de dalton environ. On a déjà proposé un procédé de mesure de la teneur en l'anticorps anti-LSP par =m dosage radio- immunologique (dénommé procédé RIA). Mais ce procédé RIA comporte le danger de provoquer une maladie par irradia- tion et de polluerpuisque l'on utilise des isotopes radio- actifs. En outre, dans le procédé RIA, on a besoin d'un appareillage spécial et coûteux pour stocker les échantil- lons et ceux-ci ne peuvent pas l'être pendant une durée prolongée. 2 2484452 En revanche, le procédé EIA n'a pas les incon- vénients mentionnés ci-dessus. On n'a pas décrit jusqu'ici un procédé de me- sure du taux du sérum humain en anticorps d'anti-LSP par le procédé EIA. Suivant l'invention, on propose un procédé de mesure du taux du sérum humain en anticorps d'anti-LSP par le procédé EIA,en utilisant du LSP comme antigène. Dans le procédé EIA, on emploie les deux types de modes opératoires suivants. (1) Procédé par compétition combinant l'anticorps anti- LSP à l'anticorps marqué par un enzyme Dans ce procédé, en tenant compte du fait que LSP est un antigène, on fait se combiner d'une manière compétitive une quantité donnée à-l'avance d'un anti- corps anti-LSP marqué par un enzyme et une quantité inconnue d'un anticorps anti-LSP qui existe dans le sérum sanguin et l'on mesure l'activité enzymatique de l'anticorps marqué par un enzyme et combiné à l'anti- gène ou l'activité enzymatique de l'anticorps marqué par un enzyme qui ne se combine pas avec l'antigène, de manière à mesurer quantitativement l'anticorps anti- LSP qu'il y a dans le sérum sanguin. (2) Procédé sandwich Dans ce procédé, l'anticorps anti-LSP à mesu- rer quantitativement est fixé en utilisant le LSP qui est un antigène. On fait se combiner l'anticorps anti-LSP ainsi fixé à un anticorps anti-IgG de 1'hcomme marqué par un enzyme ou à l'antigène marqué par un enzyme et l'on mesure l'ac- tivité enzymatique de l'anticoprs anti-IgG de l'homme marqué par un enzyme ou de l'antigène marqué par un enzyme, de ma- nière à mesurer quantitativement l'anticorps anti-LSP. Les exemples suivants illustrent l'invention. 1. Préparation de LSP de porc Moins de 5 heures après le sacrifice d'un porc, 3.5 on met 100 g du foie de ce porc dans une solution de sac- charose 0,25 M (pH 8,0). On remplace cette solution de saccharose par une nouvelle solution de saccharose toutes les 30 minutes. 5 heures après,on malaxe le foie dans un mélangeur Waring, puis on le broie dans un homogénéi- seur. On ajoute une solution de saccharose au foie broyé jusqu'à ce que la concentration du mélange en foie broyé soit de 50% (poids/volume). On centrifuge le mélange en y appliquant une accélération de 105 000 G pendant une heure. On soumet 100 ml du surnageant à une filtration sur gel en utilisant une colonne de Sepharose 6B avec un lit de gel de 5 cm x 100 cm (fourni par la société Pharma- cia Co., Ltd),qui est équilibré par une solution tampon tris-HCl 0,1 M (pH 8,0 dénommé ci-après liquide A) conte- nant 0,2 M de NaCl et 1 mM d'acide éthylènediaminetétra- cétique (EDTA). On recueille le LSP qui est élué dans des por- tions vides de la colonne et on le concentre jusqu'à ob- tention d'une concentration en protéine de 5 mg/ml. 2. Préparation du complexe de peroxydase et de IgG de chèvre.anti-IgG de l'homme On dissout 5 mg de peroxydase dans 1 ml d'une solution tampon au bicarbonate de sodium 0,3 M (pH 8,1 dénommé ci-après liquide B). Au mélange,on ajoute 0,1 ml d'une solution éthanolique à 1% de dinitrofluoroben- zène. On laisse réagir à température ambiante pendant une heure. On ajoute 1 ml de periodate de sodium 0,06 M au mélange réactionnel et on laisse réagir pendant 30 minutes. On ajoute 1 ml d'une solution d'éthylèneglycol 0,16 M au mélange réactionnel pour décomposer l'excès de peroxydase de sodium et on laisse le mélange réactionnel reposer pendant 1 heure. On dialyse ensuite le mélange réactionnel à 4 C pendant une nuit contre une solution tampon de carbonate de sodium 0,01 M (pH 9,5). On ajoute 5 mg de l'IgG de chèvre anti-IgG de l'homme au mélange réactionnel et on laisse réagir à 4 C pendant 3 heures. En ajoutant 5 mg d'hydroborure de sodium au mélange réac- tionnel, on laisse la réaction se poursuivre à 40C pen- dant une nuit. On dialyse ensuite le mélange réactionnel contre une solution tampon de phosphate de sodium de 0,01 M (pH 7,0). On soumet ensuite le mélange réactionnel à une filtration de gel en utilisant du Sephadex G-200 (fourni par la société Pharmacia Co., Ltd) qui est équi- librér par une solution tampon de phosphate 0,01 M (pH 7,0). On recueille le complexe peroxydase-IgG qui a été élue dans les portions vides du Sephadex G-200 et on le conser- ve à 40C. 3. Mesure quantitative d'un anticorps anti-LSP en utili- sant le complexe de peroxydase et d'IgG de chèvre anti- - IgG de l'homme On effectue cette mesure quantitative de la ma- nière suivante On-ajoute une solution de LSP de porcayant une concentration de 200 pg/ml à des perles de polystyrène qui ont été nettoyées-. On abandonne le mélange à la tem- pérature ambiante pendant une heure. Puis on l'abandonne à 46C pendant une nuit. Du mélange, on retire par décan- tation la solution de LSP. On lave les perles par une solution de sérum physiologique et on les immerge dans le liquide A contenant de l'albumine du sérum de boeuf, puis on les abandonne à la température ambiante pendant une heure. Par la suite, on dénommera les perles de polysty- rène ainsi traitées perles de LSP. On place chaque perle de LSP dans un tube à essai et on verse dans chaque tube à essai 400 1.l du liquide A contenant 1% d'albumine de sérum de boeuf (dénommé ci-après liquide C). Au mélange onajoute pul de sérum humain à traiter. On abandonne le mé- lange à température ambiante pendant trois heures. On lave chaque perle de LSP trois fois par le liquide A. Dans chaque tube à essai, on verse 500 ml du complexe peroxydase-IgG de chèvre anti-IgG de l'homme. On aban- 2484452 donne le-mélange à la température ambiante pendant deux heures. On lave chaque perle de LSP trois fois par le liquide A. On place les perles de LSP respectivement dans des tubes à essai. Dans le tube à essai, on verse 500 1l d'une solution tampon d'acide citrique 20 mM (pH 4,5 dénommée ci-après liquide D) contenant 1% de 2,2'-azino-di- ú-é- thylbenzothiazoline sulfonate (6)_7 (dénommé ci-après ABTS) et 1 mM d'eau oxygénée. On laisse le mélange réa- gir à température ambiante pendant une heure. Au mélange réactionnel,on ajoute 1,5 ml d'une solution d'acide oxa- lique 10 mM qui sert d'agent d'arrêt. On mesure l'ab- sorbance à la longueur d'onde 418 nm du mélange réaction- nel et on détermine la quantité d'anticorps anti-LSP du sérum testé à partir d'une courbe étalon. On peut obtenir la courbe étalon en reprenant le procédé mention- né ci-dessus9tout en utilisant du sérum contenant une quantité connue d'anticorps anti-LSP. REVENDICATION Procédé de mesure pas dosage immunologique enzymatique de la teneur du sérum humain en un anticorps dirigé contre une lipoprotéine de membrane spécifique du foie, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser, comme antigène, une lipoprotéine de membrane spécifique du foie d'un mammifère, qui se combine à un anticorps..dirig contre la lipoproté!ne de membrane sp6- cifique du foie à détecter.