Brevet FR2483780A1 — publié le 19811211

Les vaccins contre l'echtyma du mouton et de la chèvre connus jusqu'à maintenant étaient préparés a partir de croûtes prélevées sur des-animaux auxquels on avait inoculé le virus c'était des vaccins vivants qui devaient être administrés par voie dermique, c'est-à-dire par scarification de la peau à la face interne de la cuisse. Les risques de développement d'infections bactériennes par pénétration de germes pathogènes (tels que staphylocoques) au niveau de la plaie de scarification étaient élevés. L'infection des croates de scarification par des staphylocoques pathogènes prédisposait d'ailleurs, fréquemment, les brebis ou chèvres laitières à des réactions d'hypersensibilité, avec retentissement sur l'état général, dans le cas où une vaccination était pratiquée avec un vaccin staphylococcique. On a préparé, selon l'invention5 un nouveau vaccin vivant contre l'echtyma dont l'une des caractéristiques reside dans le fait qu'il peut être administré par voie sous-cutanée ou intradermique, ce qui représente un réel avantage par rapport à la voie classique par scarification, les voies sous-cutanée ou intradermique étant faciles à pratiquer et absolument sans risque pour les animaux vaccinés. Le vaccin selon l'invention est préparé à partir dTune nouvelle souche de virus avirulente récoltée sur des moutons et passée au préalable dix fois sur cultures cellulaires de muscle d1embryon de mouton ; la souche au dixième passage est conservée en ampoules scellées sous azote liquide et à -250C, et constitue ainsi le stock-mère à partir duquel est faite la multiplication du virus en vue de la production de vaccin. La nouvelle souche avirulente d'echtyma utilisée selon l'invention est stable, et incapable de devenir pathogène ; elle a été déposée à la collection de culture de l'institut Pasteur sous le nOI-115, le 20 février 1980. La production du virus est faite après trois à quatre passages supplémentaires sur cellules de muscles d'embryon de mouton, à partir du stock-mère ; des stocks de production aux demsieme et troisième passages sont réalisés annuellement et conservés à -250C avant utilisation pour la culture du virus qui est effectuée en flacons roulants sur monocouches de cellules de muscle embryonnaire avec un milieu MEM modifié par Eagle contenant 3 % de sérum de veau. Une autre caractéristique du vaccin selon l'invention est qu'il comprend, associé à la culture virale, un adjuvant d'immunité minéral, irrésorbable, qui est de préférence le kaolin. Cet adjuvant augmente les propriétés immunogènes du virus vaccinal et permet d'obtenir, avec le vaccin selon l'invention, une protection efficace des animaux. Le procedé de préparation du vaccin selon l'invention comporte les étapes suivantes a) - Production de cellules de muscle d'embryon de mouton : Les cellules utilisées sont des cellules de première explantation obtenues par trypsination de la masse crurale d'un foetus de mouton, puis cultivée en boîtes de Roux ou en flacons roulants pour obtenir la quantité nécessaire à la production de virus. Le milieu de culture est du milieu MEM modifié par Eagle avec 10 % de sérum de veau, auquel on ajoute du bicarbonate (de préférence 0,35 g/litre) et des antibiotiques (par exemple 50 mg/litre de colimycine et de spiramycine). L'ensemencement se fait à raison de 200.000 cellules/ml et de 200 ml par flacon roulant. Les cellules en culture doublent leur nombre en 7 à 8 jours. Elles peuvent être conservées en azote liquide lors des premiers passages. Les cultures industrielles ne dépassent pas le dixième passage. b) - Production du virus : On réalise une dilution à partir du stock de production de virus pour obtenir un titre viral d'au moins 5.106 UFP/ml. Cette dilution, en milieu de culture virale (milieu MEM modifié par Eagle contenant 3 % de sérum de veau et des antibiotiques dans les mêmes proportions que le milieu de culture cellulaire) est inoculée sur des flacons roulants avec tapis préformé de cellules de muscle d'embryon de mouton, à raison de 20 ml par flacon. Après deux heures de contact, à 370C, l'inoculum est éliminé et remplacé par 70 ml de milieu de culture. La culture virale dure quatre jours à 37"C ; le tapis cellulaire est alors totalement lysé par le virus.Le milieu de culture contenant l'antigène vivant est récolté et centrifugé pendant dix minutes à 4.000 tours pour le débarrasser des débris cellulaires. Des prélèvements sont effectués pour contrôleur la stérilité bactériologique et le titre sur culture cellulaire, la culture virale étant conservée g 40 ou à -250C pendant la durée de ces contrles. c) - Préparation du vaccin lyophilisé : lorsqu'on a déterminé le titre, on distribue la culture dans des flacons de façon que chacun reçoive, par dose - de 2,5.102 à 2,5.107 (de préférence de 2,5.104 à 2,5.106) unités UFP de virus ; - de 0,001 ml à 0,1 ml de sérum de veau stérile ; - de 0,001 g à 0,4 g de kaolin, sous forme d'une suspension stérile. On distribue, par exemple, dans des flacons de 50 doses 1,25.107 UFP de virus, 0,5 ml de sérum de veau et 1 ml de suspension de kaolin à 20 %. Pour les flacons de 40, 30, 20 et 10 doses, les quantités d'ingrédients distribués dans les flacons sont directement proportionnelles au nombre de doses. le sérum de veau est stérilisé par filtration sur membrane d'acétate de cellulose de porosité 0,22 Le kaolin officinal est mis en suspension dans de l'eau purifiée dans la proportion de- 20 pour 100. L'ensemble est stérilisé par chauffage dans un grignard avec agitation à 1200C pendant 30 minutes. Sur les flacons remplis, on place stérilement des bouchons de lyophilisation à moitié enfoncés, puis les flacons sont placés dans le lyophilisateur. la lyophilisation est entièrement automatique. Elle dure environ 18 heures. Le programme de marche de l'appareil a été fixé en fonction des divers caractères physiques de la suspension à lyophiliser et du temps disponible pour cette opération. En fin de lyophilisation, les flacons sont bouchés sous vide dans l'appareil. Au moment de l'utilisation, le vaccin lyophilisé est remis en suspension dans un solvant contenant, pour 1 ml d'eau purifiée, 0,1 ml de glycérine et 8,5 mg de chlorure de sodium. Le vaccin lyophilisé est repris par le solvant à raison de 1 ml de solvant par dose pour l'administration par voie sous-cutanée et à raison de 0,1 ml de solvant par dose pour l'administration par voie intradermique. Le vaccin selon l'invention s' est révélé très efficace, d'une part pour la prévention de l'echtyma contagieux des ovins et caprins en élevages cliniquement indemnes (protection des sujets âgés de plus de six semaines, protection des agneaux et chevreaux destinés à un allaitement artificiel par la vaccination de la mère pendant la gestation, protection des agneaux ou chevreaux destinés à un allaitement naturel par la vaccination de la mère lors du traitement) et, d'autre part pour l'eradication de l'echtyma dans les troupeaux contaminés. L'innocuité du vaccin est très satisfaisante à tous les âges, pour les deux espèces destinataires : ovine et caprine. L'inoculation même à double dose (2 ml) par voie sous-cutanée à des agneaux réceptifs à la maladie ne provoque aucune réaction locale ou générale, si ce n'est l'apparition d'un petit granulome dû à l'adjuvant d'immunité qui disparaît en huit jours sans laisser de traces. REVENDICATIONS 1. Vaccin vivant contre l'echtyma du mouton et de la chèvre, administrable par voie sous-cutanée ou intradermique, caractérisé en ce qu'il comprend du virus d'echtyma multiplié à partir de la souche avirulente déposée à la collection de culture de l'institut Pasteur sous le n I-115 et un adjuvant minéral insoluble, irrésorbable. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'adjuvant est le kaolin. 3. Vaccin selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend, par dose vaccinale, de 2,5.102 à 2,5.107 unités UFP de virus et de 0,001 à 0,4 g de kaolin. 4. Vaccin selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il contient également de 0,001 ml à 0,01 ml de sérum de veau. 5. Vaccin selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce qu'il titre de 2,5.104 à 2,5.106 unités UFP de virus. 6. Procédé de préparation d'un vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme matière première virale un stock de virus obtenu par trois à quatre passages sur cellules de muscle d'embryon de mouton, de la souche de virus déposée sous le n I-115, qu'on multiplie le virus atténué en flacon roulant sur monocouches de cellules de muscle d'embryon de poulet dans un milieu de culture HEM modifié par Eagle et contenant 3 % de sérum de veau, jusqu'à lyse totale du tapis de cellules, qu'on récolte ensuite le milieu de culture contenant l'antigène vivant et le centrifuge pour éliminer les débris cellulaires, puis qu'on ajoute à la culture virale obtenue, du sérum de veau et une suspension de kaolin, et qu'on lyophilise ce mélange.