Brevet FR2484448A1 — publié le 19811218

La présente invention concerne un procédé pour pro- duire de la L-arginine par fermentation. La plupart des souches sauvages de micro-organismes ne produisent pas de L-arginine dans les milieux. Pour rendre une souche sauvage capable de produire de la L-arginine à partir des hydrates de carbone, il a été nécessaire d'induire des mutants arti- ficiels a partir des souches sauvages. On connaît de nombreux mutants artificiels produisant de l'arginine. Les mutants connus producteurs d'arginine les plus typiques sont les suivants: Mutants résistant à la thiazole-2 alanine du genre Brevibacterium ou Corynebacterium (brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 723 249 et n 3 878 044), mutant résistant a la canavanine du genre Corynebacterium (brevet britannique n 1 351 518) , mutant résistant à l'arginine-hydroxamate du genre Bacillus (brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 734 829) et mutant résistant a la cana- vanine du genre Escherichia (demande de brevet japonais publiée non - examinée n 38115/1977). Cependant il est devenu difficile d'accroître ies rendements en L-arginine par emploi de techniques de mutation arti- ficielle. Il demeure donc nécessaire de mettre au point un nouveau procédé pour produire de la L-arginine avec des rendements élevés. Un des objets de l'invention est un procédé pour produire de la L-arginine avec des rendements élevés. Selon le procédé de l'invention, on cultive un micro-organisme producteur de L-arginine du genre Escherichia dans un milieu de culture et on récupère la L-arginine accumulée dans le milieu de culture, un ADN vecteur dans lequel on a inséré un gène arg A obtenu a partir d'un ADN chromosomique du genre Escherichia ayant été incorporé au micro-organisme producteur de L-arginine. Les modes de réalisation préférés de l'invention vont maintenant être décrits de façon détaillée. Le gène arg A qui contrôle la synthèse du N-acétyl- glutamate (Bacteriological Reviews, vol 40, 116-167, mars 1976) est obtenu à partir d'une souche donneuse d'ADN du genre Escherichia ayant le gène arg A. Il est souhaitable que la souche donneuse d'ADN ait une activité enzymatique élevée de synthèse du N-acétylglutamate et/ou ait une N-acétyl-glutamate-synthétase moins inhibée par la L-argi- nine. Ces souches donneuses d'ADN souhaitables ont généralement une forte productivité de la L-arginine et on peut les obtenir sous forme de mutants résistant à l'a-méthylméthionine, la p-fluoro-phénylalanine, la Darginine, l'acide arginine-hydroxamique, la S-(amino-2 éthyl)- cyctéine, l'a-méthylsérine, la P-thiényl-2 alanine, la sulfagua- nidine ou la canavanine. On extrait l'ADN chromosomique de la souche donneuse d'ADN de façon classique. Les ADN vecteurs peuvent être des plasmides de E. coli ou des phages capables de réplication dans E.coli. Parmi les plasmides utiles on peut citer les suivants: Col El, pSC 101, RSF 2124, pMB8, pMB9, pACYC 177, pCK1, R6K, le phage X, pBR 312, pBR 313, pBR 317, pBR 318, pBR 320, pBR 321, pBR 322, pBR 333, pBR 341, pBR 345, pBR 350, pBR-351, pML 2, pMl4L 21, Col ElAp, RSF 1010, pVH 151, pVH 153 (Recombinant Molecules: Impact on Science and Society: Beers, R.F., and Bassett, E.G Eds., - Raven Press, New York (1977)). D'autres plasmides sont le pBR 327, le pBR 325 et le pBR 328 (Soberon et coll., Gene 9: 287305 (1980); d'autres sont également décrits dans "DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes", Bukhari et coll (eds), Cold Spring Harbor Laboratory (1977). Un plasmide préféré est le pBR 322. On traite l'ADN chromosomique et l'ADN vecteur avec une endonucléase de restriction selon un procédé bien connu (Biochem. Biophys. Acta 383: 457 (1975)). On peut utiliser divers types d'endonucléases de restriction si on effectue une digestion partielle de l'ADN chromosomique. Ensuite on soumet à une réaction d'union l'ADN chromosomique et l'ADN vecteur digérés. Les souches receveuses de l'ADN hybride appartien- nent au genre Escherichia. Bien qu'on puisse utiliser un type quel- conque de souches d'Escherichia comme receveur, il est pratique de choisir un mutant nécessitant de la L-arginine (en particulier déficient en gène arg A) pour le transformer en producteur de L-arginine. On obtient des résultats souhaitables lorsqu'on utilise comme receveurs des souches ayant une forte productivité en L-arginine. Comme ces producteurs de L-arginine ne nécessitent pas de L-arginine pour leur développement, ils résistent généralement aux agents précités et/ou sont des mutants déficients en arg R. Naturellement le receveur doit avoir une faible activité de décom- position de la L-arginine. Il est particulièrement souhaitable d'insérer de plus dans l'ADN hybride, le gène ar_ B, le gêne ar C, le gène rg D, le gène arg E, le gène ar gne, _ G le gène earg H et/ou le gène ar I (les gènes arg B, C, D, E, F, G, H et I sont décrits dans Bacteriological Reviews, vol 40, 116-167, mars 1976). Les procédés de culture des souches productrices de L-arginine ainsi obtenues sont classiques et sont semblables aux procédés de culture des micro-organismes connus producteurs de L-arginine. Donc le milieu de culture utilisé est un milieu classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions minéraux et, lorsqu'il est nécessaire, des substances organiques nutritives secondaires telles que des vitamines ou des amino-acides. On peut citer comme exemples de sources de carbone appropriées, le glucose, le saccharose, le lactose, l'hydrolysat d'amidon, la mêlasse et le petit-lait. On peut utiliser comme source d'azote, l'ammoniac gazeux, l'ammoniaque et les sels d'ammonium ainsi que d'autres matières azotées. On effectue la culture du micro-organisme recom- binant en conditions aérobies en ajustant le pH et la température du milieu a une valeur appropriée et on poursuit la culture jusqu ' ce qu'il n'y ait plus de formation de L-arginine. On peut récupérer la L-arginine accumulée dans le milieu de culture selon des procédés classiques Selon le procédé de l'invention, on peut produire la L-arginine avec des rendements supérieurs à ceux obtenus dans les procédés connus qui utilisent des mutants artificiels de Escherichia.De plus, il se forme peu d'amino-acides comme sous- produits et on peut effectuer de façon simple la récupération de la L-arginine. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE 1 (1) Préparation d'ADN chromosomique possédant le gène arg A. On cultive a 37 C pendant 3 heures en agitant Escherichia coli AJ 11534 (NRRL B-12424) qui est un mutant dérivant de K-12 (ATCC 10798)> résistant au L-argininehydroxamate et déficient en gène arg A, dans 1 litre de milieu L contenant lg/dl de peptone, O,5g/dl d'extrait de levure, 0,1 g/dl de glucose et 0,5 g/dl de chlorure de sodium (on a ajustéle pH à 7,2) et on recueille les cellules bactériennes dans la phase de croissance exponentielle On extrait l'ADN chromosomique selon un procédé classique au phénol et on obtient 4,8 mg d'ADN purifié. (2) Préparation d'ADN vecteur On prépare comme vecteur de la façon suivante l'ADN de pBR 322: On incube a 37 C une souche d'Escherichia coli K-12 hébergeant le plasmide pBR 322 dans 1 litre d'un milieu contenant 2 g de glucose, 1 g de chlorure d'ammonium, 6 g de phosphate diso- dique, 3 g de phosphate monopotassique, 5 g de chlorure de sodium, 0,il g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,015 g de chlorure de calcium dihydraté, 20 g de "casamino acid" (hydrolysat de caséine), 0,05 g de thymine, 0,05 g de L-tryptophane et 1 000 g de chlorhydrate de thiamine par litre (le pH.a été ajustéâ 7,2). Après avoir incubé la souche jusqu'à la phase logarithmique tardive, on ajoute 170,ug/ml de chloramphénicol au milieu de culture. On poursuit la culture pendant 16 heures après addition du chloramphénicol. On recueille les cellules puis on les lyse par traitement avec le lysozyme et le dodécylsulfate de sodium. On cen- trifuge le lysat a 30 000 g pendant une heure pour obtenir un sur- nageant. Après avoir concentré le surnageant, on obtient 490 pg d'ADN du plasmide pBR 322 par fractionnement par centrifugation avec un gradient de densité à l'équilibre de chlorure de césium et de bromure d'éthidium. (3) Insertion du fragment d'ADN chromosomique dans le vecteur. On traite 30 pg de l'ADN chromosomique avec l'endo- nucléase de restriction Eco RI, Hind III, Bam HI ou Sal I à 37 C pendant 15, 30, 60 ou 120 minutes pour cliver les chaînes d'ADN puis on chauffe à 65 C pendant 5 minutes. On traite également l'ADN vecteur avec chacune des endonucléases de restriction précitées Es a 370C pendant 120 minutes pour cliver complètement l'ADN puis on chauffe à 650C pendant 5 minutes. On mélange la solution d'ADN chromosomique digéré et la solution d'ADN vecteur clivé et on effectue une réaction d'union des fragments d'ADN par l'ADN-ligase du phage T4 en présence d'ATP et de dithiothréitol à 10C pendant 24 heures. On chauffe ensuite le mélange réactionnel à 650C pendant 5 minutes et on ajoute un volume double d'éthanol. On recueille l'ADN recombinant précipité. (4) Transformation génétique avec le plasmide hybrique hébergeant le gène arg A. Comme receveur du plasmide hybride, on utilise un auxotrophe nécessitant de l'arginine dont la N-acétylglutamate'syn- thêtase qui est le produit du gène Arg A a été inactivée (Arú A-)., Comme le gène arg A est proche du gène lys A (qui contrôle la synthèse de la lysine) sur la carte chromosomique des gènes, on choisit la souche déficiente en arg A parmi les mutants nécessitant de l'arginine car les gènes arg A et Us A sont cotraduits par le phage Pl. On ensemence 10 ml de milieu L du mutant déficient en arS A n0 13 (NRRL B12425) ainsi obtenu et on cultive à 370C en agitant. On recueille les cellules en phase de croissance exponentielle et on les met en suspension dans une solution 0,1 M en chlorure de magnésium puis dans une solution 0,1 M en chlorure de calcium dans un bain-marie glacé, pour préparer des cellules "compétentes" ayant la capacité de fixer liADN. On ajoute à la suspension de cellules compétentes, l'ADN obtenu dans le stade (3) qui contient l'ADN de plasmide hybride. On maintient la suspension au bain-marie glacé pendant 30 minutes puis on chauffe à 420C pendant 2 minutes et on laisse à nouveau reposer au bain-marie glacé pendant 30 minutes puis on ensemence du milieu L avec les cellules ayant ainsi incorporé l'ADN de plasmide hybride et on agite le milieu à 370C pendant 3 heures pour achever la réaction de transformation. On recueille les cellules, on les laves et on les remet en suspension. On étale une petite portion de la suspension cellulaire sur une boite de gélose contenant 2 g de glucose, 1 g de sulfate d'ammonium, 7 g de phosphate dipotas- sique, 2 g de phosphate monopotassique, 0,1 g de sulfate de magné- sium heptahydraté, 0,5 g de citrate de sodium dihydraté et 20 g de gélose par litre(on ajuste le pH à 7,2). On incube la botte à 37 C pendant 3 jours. On prélève les colonies apparues sur la botte et on les purifie. On soumet les souches purifiées à un essai de la résistance à l'ampicilline avec du milieu L additionné de 20 ug/ml d'ampicilline, Ensuite on étudie la productivité de l'arginine de 17 souches ne nécessitant pas d'arginine et résistant à l'ampicilline et on constate que les 17 souches produisent toutes de la L-arginine dans le milieu de culture. Ceci indique que le gène arg A de i'ADN chromosomique a été incorporé au plasmide pBR 322 et que les souches transformées par le plasmide hybride ont une productivité accrue en L-arginine. On choisit parmi les 17 souches le producteur le plus efficace d'arginine appelé AJ 11593 (FERM-P 5616) (NRRL B-12426). (5) Production de L-arginine par les nouvelles souches productrices d'arginine. Le tableau ci-après montre les résultats expérimen- taux de la production par fermentation de la L-arginine avec la souche AJ 11593. Le milieu de fermentation contient 5 g/dl de glucose, 2,5 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,2 g/dl de phosphate monopotassique, 0,1 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,05 g/dl d'extrait de levure, lOOug/dl de chlorhydrate de thiamine, 1 mg/dl de sulfate ferreux heptahydraté, 1 mg/dl de sulfate de man- ganèse tétrahydraté et 2,5 g/dl de carbonate de calcium (stérilisé séparément) et on ajuste le pH à 7,0.- On introduit des portions de 20 ml du milieu de fermentation dans des flacons de 500 ml, on ensemence avec une anse d'inoculum du microorganisme étudié et on cultive a 30 C pendant 3 jours. On détermine selon une technique microbiologique la quantité d'arginine présente dans le surnageant du bouillon de fermentation. Le résultat figure dans la rangée A du tableau ci-après. EXEMPLE 2 - On sépare comme dans le stade (2) de l'exemple 1 le plasmide hybride de la souche AJ 11593 et on l'incorpore à la souche AJ 11534 (qui ne nécessite par d'arginine, déficiente en arg R et résistante au L-argininehydroxamate) comme indiqué dans le stade (4) de l'exemple 1. Comme le marqueur arg A du receveur ne peut pas 8tre utilisé dans cette opération, on utilise le marqueur de pBR 322 (résistance a l'ampicilline), et on obtient des transforo mants par culture sur du milieu L contenant 20 mg/ml d'ampicilline. On cultive selon le procédé indiqué dans le stade (5) de l'exemple 1 la souche productrice d'arginine AJ 11594 (FERM-P 5617) (NRRL B-12427) ainsi obtenue pour étudier la productivité de la L-arginine. Le résultat figure dans la rangée B du tableau ci-après. A titre comparatif on cultive la souche Ai 11534 de la même façon que cidessus, les résultats figurent dans la rangée C du tableau ci-après. Le poids moléculaire du plasmlde hybride est de 3,7 mégadaltons et le poids moléculaire du gène Ag A insdré est de 1,1 rmégadaltoa puisque le poids moléculaire du plasmide pBR 322 est de 2,6 mégadaltons. TA B LE AU Essai de productivité de la L-arginine. Souche étudiée Lrinine produite (mg/dl) A AJ 11593 6 B AJ 11594 190 C AJ 11534 75 Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. R E V E N D I C A T I ON S 1. Procédé pour produire de la L-arginine par fer- mentation consistant à cultiver dans un milieu de culture un micro- organisme producteur de L-arginine et à récupérer la L-arginine accu- mulée dans le milieu de culture, caractérisé en ce qu'on a incorporé au micro-organisme producteur de L-arginine un ADN vecteur dans lequel on a inséré un gène arg A obtenu à partir d'un ADN chromo- somique du genre Escherichia. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche receveuse appartient à Escherichia coli. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche donneuse appartient à Escherichia coli. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche receveuse est Escherichia coli K-12 ou un de ses mutants. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche donneuse est Escherichia coli K-12 ou un de ses mutants. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN vecteur dérive de pBR 322.