Brevet FR2480306A1 — publié le 19811016

La présente invention concerne un procédé pour la production de L- méthionine par fermentation et, en particulier, un procédé pour produire la L-méthionine avec un micro-organisme construit par une technique de recombinaison de gènes. La plupart des souches sauvages de micro-organismes ne produisent pas de L-méthionine dans le milieu. Pour rendre une souche sauvage capable de produire la L-méthionine à partir des hydrates de carbone, il a été nécessaire d'induire des mutants artificiels à partir de la souche sauvage. Il existe de nombreux mutants artificiels producteurs de méthionine connus. Les mutants connus caractéristiques producteurs de méêtionine sont les suivants: 1) Escherichia coli résistant à l'éthionine, Candida utilis résistant 2y-3) à l'éthionine, Salmonella typhimurium résistant à l'éthionine3 3) Salmonella typhimurium résistant à l'améthylméthionine, Salmonella 3) typhimurium résistant à la norleucine, Escherichia coli résistant à la norleucine 4), Corynebacterium alutamicum résistant à l'a-méthyl- ) méthionine, et Brevibacterium flavum résistant à l'éthionine6). 1) J. Bacteriol., 76,326 (1958), 2) Folia Microbiol., 9,374 (1964), 3) Genetics, 58,473 (1968), 4) Compt. Rend., 248,3490 (1959), ) Brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3.729.381, 6) Publication pour opposition de la demande de brevet japonais na 6753/1976. Le producteur de méthionine le plus efficace jusqu'à prébent, à la connaissance de la demanderesse, est Corynebacterium gEluamicium ATCC 21608 qui a produit 3,4 mg/ml de L-méthionine à partir de 10 g/dl de glucose. Il est devenu cependant difficile d'augmenter les rendements de Lméthionine en utilisant les techniques de mutation artificielle. On a donc constamment besoin de mettre au point un nouveau procédé pour la production de L-méthionine avec des rendements élevés. L'invention a donc pour objet un procédé pour la production dLe L-mêthionine avec des rendements élevés. Cet objet et d'autres objets de l'invention qui appa- raîtront plus facilement ci-après ont été obtenus par un procédé qui consiste: à cultiver dans un milieu de culture un micro-organisme producteur de L-méthionine qui est obtenu par incorporation, dans une souche réceptrice du-genre Escherichia, d'un plasmidehybride dans lequel est inséré un fragment d'ADN portant l'information génétique relative à la production de L-méthionine, qui provient d'une souche de donneur d'ADN du genre Escherichia qui est résistante à l'éthionine et à récupérer de la L-méthionine accumulée dans le milieu de culture. La souche de donneur d'ADN utilisée pour construire le producteur de Lméthionine de l'invention est un mutant du genre Escherichia résistant à l'éthionine et possède l'information génétique relative à la production de L-méthionine. On utilise de préférence comme donneur d'ADN des souches ayant une productivité supérieure de L-méthionine. Le mutant résistant à l'éthionine utilisé comme donneur d'ADN peut être obtenu par des techniques classiques de mutation. L'ADN chromosomique est extrait du donneur d'ADN de manière bien connue et traité avec une endonucléase de restriction par un procédé bien connu (Biochem. Biophys. Acta 383, page 457 (1975)). Le plasmide-ADN ou ADN-phage utilisé comme vecteur dans le procédé de synthèse est également traité de manière analogue par une endonucléase de restriction. On peut utiliser divers types d'endo- nucléases de restriction, si la digestion de l'ADN chromosomique est effectuée partiellement. Ensuite, l'ADN chromosomique digéré et i'ADN vecteur sont soumis à une réaction de "ligation" (fixation). La recombinaison de l'ADN pour préparer le plasmide recombinant peut etre effectuée par introduction,avec la transférase terminale, d'acide désoxyadénylique et d'acide désoxythymidylique ou d'acide désoxyguanylique et d'acide désoxycytidylique dans le fragment d'ADN chromosomique et l'ADN vecteur scindé, et en soumettant le fragment d'ADN chromosomique modifié et 1'ADN vecteur scindé à une réaction d'annellation. Comme ADN vecteur convenable, on peut utiliser un vecteur classique tel que Col El, pSC 101, pBR 322, pACYC 177, pCR 1, R6K ou X-phage, ou leurs dérivés. 248 30 6 L'ADN hybride ainsi obtenu peut être incorporé dans un micro-organisme du genre Escherichia par des techniques classiques de transformation, voir J. Bacteriol., 119, page 1072 (1974) Le transformant désiré est sélectionné en utilisant un milieu sur lequel ne peut pousser qu'un clone ayant les caractéristiques de production de L-méthionine provenant du fragment d'ADN chromosomique ou celles provenant de l'ADN vecteur, ou les unes et les autres. Comme micro-organisme récepteur de l'ADN hybride, on utilise ordinairement un auxotrophe de L-méthionine puisqu'il est classique de distinguer le transformant producteur de méthionine du récepteur. Il est souhaitable, pour obtenir de meilleurs résultats, d'utiliser commle récepteur un mutant possédant déjà une productivité supérieure de L-snéthionine. Les procédés de culture des souches productrices de L-méthionine ainsi obtenues sont classiques et semblables aux procédés pour la culture des micro-organismes producteurs de L-méthionine connus. Donc, le milieu de culture utilisé est un milieu classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions inorganiques et, si nécessaire, de plus faibles quantités d'agents nutritifs organiques, tels que vitamines ou aminoacideso Des exemples de sources de carbone appropriées comprennent le glucose, le saccha- rose, le lactose, l'hydrolysat de mais et les mélasses. On peut utiliser comme sources d'azote l'ammoniac gazeusex, lammoniaque aqueuse et les sels d'ammonium et d'autres substances azotées. La culture des micro-organismes recombinants est effectuée en conditions aérobies, le pH et la température du milieu étant ajustés à une valeur convenable et maintenus jusqu'à ce que la formation de L-méthionine cesse. La L-néthionine accumulée dans le milieu de culture peut itre récupérée par des procédés classiques. Par le procédé de la présente invention, on peut produire la L-méthionine avec des rendements plus élevés que ceux obtenus dans les procédés connus précédemment,dans lesquels on utilise des mutants artificiels d'Escherichiao Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 (1) Préparation d'ADN chromosomique possédant l'information génétique relative à la production de L-méthionine Dans 1 litre de milieu L contenant 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl d'extrait de levure, 0,1 g/dl de glucose, 0,5 g/dl de NaCl (ajusté à pH 7,2), on cultive à 37 C, pendant 3 h en agitant, Escherichia coli EG-20 (NRLL B-12392), mutant résistant à la S-(2-aminoéthyl)-cystéine (AEC) et à l'éthionine et dérivé de K-12 (ATCC 10798) par exposition de cellules K-12 à 250 y/ml de N-méthyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidine dans un tampon à l'acide citrique à pH 5,5 à 0 C pendant 60 min, et en séparant la colanie qui apparaît sur le milieu de gélose, et on récolte les cellules bactériennes dans la phase de croissance exponentielle. On extrait-l'ADN chromosomique par une méthode classique au phénol et on obtient 3,4 mg d'ADN purifié. (2) Préparation d'ADN vecteur On prépare comme vecteur l'ADN de pBR 322 de la manière suivante On fait incuber à 370C une souche d'Escherichia coli K-12 recevant le plasmide pBR 322 dans 1 litre d'un milieu contenant 2 g de glucose, 1 g de NH4C1, 6 g de Na2HP04, 3 g de KH2P04 5 g de NaCI. 0,1 g de MgSO 4,7H120 0,015 g de CaC12 2H20, 20 g de "casamino- acide" (hydrolysat de caséine), 0,05 g de thymine, 0,05 g de L-trypto- phane et 100 y de chlorhydrate de thiamine par litre (ajusté à pH 7,2). Après avoir fait incuber la souche jusqu'à la fin de la phase loga- rithmique, on ajoute au milieu de culture 170 Ty/ml de chloramphénicol. Par ce procédé, l'ADN de plasmide s'est développé et accumulé abondam- ment dans les cellules bactériennes. Après 16 h d'incubation, on récolte les cellules que l'on lyse par traitement par le lysozyme et le dodécylsulfate de sodium. On centrifuge le lysat à 30.000xg pendant 1 h pour obtenir la liqueur surnageante. Après concentration de la liqueur surnageante, on obtient 480 y de l'ADN de plasmidepBR 322 en utilisant la centri- fugation dans un gradient de densité chlorure de césium-bromure d'éthidium jusqu'à l'équilibre. (3) Insertion du fragment d'ADN chromosomique dans le vecteur On traite 10 y de l'ADN chromosomique avec l'endo- nucléase de restriction Hind III à 37 C pendant 5; 10, 20, 30 ou min pour scinder les chaînes d'ADN, et on chauffe à 65 C pendant 5 min, respectivement. On traite également 10 y de l'ADN vecteur avec chacune des endonucléases de restriction mentionnées ci-dessus A 37 C pendant 1 h pour scinder complètement l'ADN,- et on chauffe ensuite a 65 C pendant 5 min. On mélange la solution d'ADN chromosomique digéré et la solution d'ADN vecteur scindé et on soumet à la réaction de ligation de fragments d'ADN par une ligase de l'ADN-phage T4 en présence d'ATP et de dithiothréitol à 10 C pendant 24 h. On chauffe ensuite le mélange de réaction à 65 C pendant 5 min, et on ajoute deux fois son volume d'éthanol. On récupère l'ADN recombinant précipité. (4) Transformation génétique par le plasmidehybride recevant l'information génétique relative à la production de L-méthionine On induit les souches réceptrices suivantes à partir d'Escherichia coli K-12 par exposition à 250 y/ml de N-méthyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidine dans un tampon à l'acide citrique à pH 5,5 à 0 C pendant 60 min. N 2 (NRRL B-12393) (résistant à la S-(2-aminoéthyl)cystéine) No 30 (NRR B-12395) (résistant à la norleucine) N 77 (NRRL B12397) (résistant à la 2-thiazoléalanine) N 283 (NRRL B-12398) (résistant à la p-fluorophényl- alanine) On inocule chacune des souches réceptrices dans 10 ml de milieu L et on cultive à 37 C en agitant. On récolte les cellules dans la phase de croissance exponentielle et on les met en suspension dans une solution de MgC12 O,lM et ensuite dans une solution de CaC12 O,1M au bain de 2 2' glace; on prépare ainsi les cellules "'compétentes" capables de fixer 1'ADN. Dans la suspension de cellules compétentes, on ajoute l'ADN obtenu à l'étape (3) qui contient l'ADN de plasmidehybride. On maintient la suspension au bain de glace pendant 30 min, puis on chauffe à 40 C pendant 2 min, et on laisse à nouveau reposer au bain de glace pendant 30 min; les cellules dans lesquelles l'ADN de plasmidehybride est ainsi incorporé sont inoculées dans le milieu L et on agite le milieu A 37 C pendant 2 h; la réaction de transforma- tion est ainsi terminée. On récolte les cellules, on les lave et on les remet en suspension. On étale une faible portion de la suspension de cellules sur une plaque de gélose contenant 2 g de glucose, 1 g de (NH4)2S04, 7 g de K2HP04, 2 g de KH2P04, 0,1 g de MgS04,7H20, 0,5 g de citrate de sodium,2H20, 0,5 g de S-(2aminoéthyl)-cystéine, y/ml d'ampicilline et 20 g de gélose par litre (ajustée à pH 7,2). On fait incuber la plaque à 37 C pendant 3 jours. On prélève les colonies apparaissant sur la plaque et on obtient des souches résitantes à la fois à l'ampicilline, à la S-(2-aminoéthyl)-cystéine et à l'éthionine. On obtient les clones hybrides produisant la L-méthio- nine AJ 11539 (FERM-P 5479, NRRL B-12399), AJ 11540 (FERM-P 5480, NRRL B12400), AJ 11541 (FERM-P 5481, NRRL B-12401) et AJ 11542 (FERM-P, NRRL N12402) à partir des souches réceptrices n 2, 30, 77 et 283, respectivement. (5) Production de la L-méthionine par la nouvelle souche productrice de Lméthionine Le tableau ci-après indique les résultats expérimentaux de la production par fermentation de L-méthionine en utilisant les nouvelles souches productrices de L-méthionine et la souche de donneur d'ADN EG-20. Le milieu de fermentation contient 5 g/dl de glucose, 2,5 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,2g/dLde KH2P04, 0,1 g/dl de MgSO 4, 7H20 0,05 g/dl d'extrait de levure, 100 y/dl de chlorhydrate de thiamine, 1 mg/dl de FeSO 4,7H20, 1 mg/dl de MnSO4,4H20 et 2,5 g/dl de CaCO3 (stérilisé séparément) et le pHli est ajusté à 7,0. On place des lots de 20 ml de milieu de fermentation, inoculés au moyen d'une boucle de platine avec l'inoculum du micro- organisme d'essai, et on effectue la culture à 31 C pendant 72 h. La quantité de méthionine dans la liqueur surnageante du bouillon de fermentation esL déterminée par dosage microbiologique. TABL7AU TABLEAU Micro-organisme essayé EG-20 AJ 11539 AJ 11540 AJ 11541 Ai 11542 N 2 No 30 Nl 77 N 283 L-méthionine produite (mg/dl) REVENDICATIONS R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé pour la production de L-méthionine par fermentation, caractérisé en ce que l'on cultive dans un milieu de culture un microorganisme producteur de L-méthionine et on recueille la L-méthionine accumulée dans le milieu de culture, ledit micro- organisme étant obtenu par incorporation dans une souche réceptrice du genre Escherichia, d'un plasmide hybride dans lequel est inséré un fragment d'ADN portant l'information génétique relative à la production de L-méthionine, ledit fragment étant dérivé d'une souche donneur du genre Escherichia qui est résistante à l'éthionine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche réceptrice appartient au genre Escherichia coli. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche donneur appartient au genre Escherichia coli. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche réceptrice est Escherichia coli K-12 ou un de ses mutants. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche donneur est Escherichia coli K-12 ou un de ses mutants. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit plasmid hybride est dérivé de pBR 322.