Brevet FR2474863A1 — publié le 19810807

1. La présente invention concerne une nouvelle composition thérapeutique ayant une activité anti- agrégante plaquettaire et anti-thrombotique. On sait, depuis 1976, que la paroi vasculaire contribue de façon primordiale au maintien des pla- quettes dans un état inactive, en produisant la prosta- cycline, PGI2. La PGI2 est synthétisée à partir de l'acide arachidonique dans les cellules de la paroi vasculaire. Ce même précurseur, dans les plaquettes, est converti en prostaglandines E2, D2 et F2 et en thromboxane A2 qui est un métabolite extrêmement agrégant. Ces deux voies métaboliques antagonistes au plan fonctionnel, passent par les mêmes produits intermédiaires, les endopéroxydes PGG2 et PGH2. Cette double synthèse des prostaglandines à par- tir de l'acide arachidonique (AA) dans les cellules pa- riétales de la paroi vasculaire et dans les plaquettes peut être illustrée par le schéma représenté sur la fig. 1. Le métabolisme de l'acide arachidonique en pros- taglandines et thromboxanes est inhibé par l'aspirine dès la première étape (cyclo-oxygénase). Ce produit empêche donc l'agrégation plaquettaire par la voie des thromboxanes, mais inversement, en réduisant la synthèse de la prostacycline par la paroi vasculaire, il augmente la sensibilité des plaquettes aux agents thrombogènes. Il es apparu préférable de bloquer la formation des thromboxanes dans les plaquettes plus en aval dans la cascade métabolique et l'on a cherché à inhiber la thromboxane synthétase. A cet effet, on a déjà proposé différents pro- duits et notamment l'imidazole (Moncada et col. Prosta- glandines 13 611-618, 1977). Tai et Yuan (Biochem. Biophys. Res. Comm. 80 236-242, 1978) ont étudié divers dérivés de l'imidazole 2. et ont montré que cette activité inhibitrice était importante pour les dérivés substitués en position 1 par une chaine alkyle ou aryle. La présente invention est basée sur la découverte que les composés de formule générale / t (I) dR dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un reste d'éther ou d'ester, ainsi que leurs sels d'addition avec des acides phar- maceutiquement acceptables, possèdent une forte acti- vité inhibitrice spécifique sur la thromboxane synthé- tase tout en permettant d'augmenter la synthèse de prostacycline PGI2. Les études pharmacologiques ont confirmé que cette activité inhibitrice se traduisait par une acti- vité anti-agrégante plaquettaire et une activité anti- thrombotique. La présente invention a en conséquence pour objet une composition thérapeutique ayant une activité inhibitrice sur la thromboxane synthétase, une activité anti-agrégante plaquettaire et une activité anti-throm- botique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif un compose de formule I ou l'un de ses sels d'addition avec des acides pharmaceutiquement ac- ceptables. Les sels d'addition peuvent notamment être ceux formés avec les acides halohydriques sulfurique, ni- trique, phosphorique, formique, acétique, fumarique, malique, méthane sulfonique, lactique, succinique, tar- trique, pamolque et les sels métalliques acides tels 3. quel'orthophosphate disodique et le sulfate monopotas- sique. Les esters sont notamment les composés de for- mule (TI) dCOR' et les éthers les composés de formule. (III) OR' formules dans lesquelles R' désigne un radical alkyle en C1 à C5, un radical aryle, aryl(alkyle en C1-C5) ou (alkyl en C1-C5) aryle, le terme aryle désignant un ra- dical hydrocarboné aromatique ou hétéroaromatique ayant de 6-à 10 atomes de carbone. Les composés de formule I peuvent être utilisés sous forme de mélange racémique ou d'isomères optiques. Le (E) (hydroxy-3 octényl-l)-l imidazole (racé- mique) a été décrit par Pailer et Gutwillinger (Monat- shefte fUr Chemie 108 653-664, 1977) sans qu'aucune appli- cation thérapeutique n'ait été envisagée. Le chlorhydrate du racémique est une poudre blan- che F = 98-100 C. On donnera ci-après des résultats de l'étude pharmacologique et toxicologique effectuée avec le chlo- rhydrate dui (E) (hydroxy-3 octényl-1)-l imidazole dit ci-après "composé A", préparé comme décrit par Pailer et Gutwillinger avec salification subséquente par barbo- tage de HC1 gazeux. 4. 1 - Pharmacologie biochimique 1.1. Inhibition de la thromboxane synthétase plaquettaire Du plasma riche en plaquettes (PRP) est préparé par centrifugation à 150 g x 10 min. de sang veineux. Les plaquettes sont sédimentées par centrifu- gation à 2000 g x 20 min. et lavées dans un tampon tris- HC1 pH 7.5 (15 mM) contenant: EDTA (1,5 mM), NaCl (150 mM) et KC1 (5 mM). Le culot plaquettaire est en- suite mis en suspension dans un volume de tris-HCl (50 mM) pH 7.5 correspondant à la moitié du volume de PRP initial. Des parties aliquotes de suspension pla- quettaire (0,5 ml) sont incubées avec 1 pg d'acide 14C- arachidonique (AS = 50 mCi/mmole) sous forme de sel de Na pendant 10 min. à 37 C en présence ou en absence de produit à tester. A la fin de la réaction, l'incubat est porté à 0-4 C, acidifié et salé par addition d'acide citrique et de NaCl et extrait par 2 fois 2 ml d'acétate d'éthyle. Un standard de PGE2 est ajouté à l'extrait qui, après évaporation à sec est soumis à une chromato- graphie bidimensionnelle sur couche mince de silice (Merck F 254) dans les systèmes: 1) benzène, dioxane, acide acétique (60:30:3); 2) chloroforme, méthanol, acide acétique eau (90/8/1/0,8). Le standard de PGE2 est relevé par l'acide phosphomolybdique à chaud. La radioactivité correspondant aux métabolites de l'acide arachidonique est mesurée grâce à un scanner Berthold. Les résultats rapportés sur la fig. 2 montrent que le composé A selon l'invention, comme l'imidazole, inhibe la formation du thromboxane A2 mesuré par son produit de dégradation stable, le thromboxane. Parallèlement à cette inhibition, des quantités croissantes de PGE2 sont for- mées. Cette observation indique que les agents pharmaco- logiques testés n'inhibent pas parallèlement la cyclo- oxygénase. La comparaison des ci50 montre que le composé A 5. selon l'invention est beaucoup plus actif que l'imida- zole dans ces conditions expérimentales. 1.2. Utilisation des endoperoxydes plaquettaires par la prostacycline-synthétase des microsomes vascu- laires Une aorte d'un lapin mâle pesant 2,5 kg est finement coupée, broyée en tampon Tris-HCl (50 mM, pH 7.5), puis homogénéisée à 0-4 C. L'homogénat est centrifugé à 10000 g x 10 min. et le surnageant est centrifugé à 100 000 g x 60 min. Le culot de microsomes est suspendu et homogénéisé dans du Tris-HCl (50 ST) à raison de 1,5 mg protéines/ml (les protéines sont déter- minées par la méthode de Lowry et al.). Une suspension de plaquettes humaines est préparée et incubée comme précédemment en présence ou en absence de microsomes aortiques (100 g protéines/incubat) et de produit tes- té (10o5M). A la fin de la réaction, l'incubat est cen- trifugé, le surnageant est extrait après acidification et chromatographié sur couche mince de silice dans la phase organique du système: acétate d'éthyle, 2,2,4- triméthylpentane, acide acétique, eau (110:50:20:100) en présence d'un standard de 6-ceto PgFl. Les radiochromatogrammes correspondant aux dif- férents incubats sont représentés dans les fig. 3 à 6. 1) Suspension plaquettaire (fig. 3): 60 % de la radioactivité extraite présentent un Rf = 0,25- 0,27 correspondant au thromboxane B2 (TXB2) produit de dégradation du thromboxane A2. D'autres métabolites, un produit polaire non identifié, la PGD2 et un produit de Rf = 0,47 sont également séparés. 2) Microsomes d'aorte (fig. 4): dans les conditions expérimentales décrites, l'acide arachido- nique (AA) n'est pas métabolisé. Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés par Moncada et al. (Nature, 26_ 663-665 (1976). 3) Suspension plaquettaire + microsomes (fig. 5): lorsque des plaquettes sont incubées en 6. présence de microsomes d'aorte, le profil métabolique est qualitativement modifié. Un pic de radioactivité apparatt au Rf = 0, 14 correspondant au 6-ceto PgFl, produit de dégradation de la PGI2. Ce pic ne représente toutefois que 18 % de la radioactivité extraite et ap- parait au détriment du thromboxane B2 (TXB2) essentiel- lement. 4) Composé A + suspension plaquettaire + microsomes (fig. 6): lorsque l'incubation précédente est effectuée en présence du composé A (0, 01 mM), la plus grande partie (65 %) de l'acide arachidonique est métabolisée en 6 ceto PgFl1, alors que la radiocacti- vité correspondant au thromboxane B n'en représente que 2 - %. On observe parallèlement une quasi-suppression des produits les moins polaires. Ces résultats montrent, d'une part, que le composé A inhibe fortement la synthèse du thromboxane A2, qui est un agrégant, et, d'autre part, qu'il favo- rise dans ce système la synthèse de protacycline PGI2 qui est elle-même un anti-agrégant. 2 - Pharmacologie fonctionnelle 2.1. Agrégation plaquettaire ex vivo chez le lapin - Des groupes de trois lapins mâles sont traités par voie souscutanée deux jours consécutifs et leur plasma est prélevé deux heures après la seconde administration. L'agrégation plaquettaire induite à l'acide arachidonique (2 mM) est mesurée par la méthode turbidimétrique de Born. L'analyse des courbes d'agrégation rappor- tée dans le tableau I, montre que le composé A selon l'invention à la dose de 5 mg/kg diminue de façon très sensible l'agrégation plaquettaire induite par l'acide arachidonique chez le lapin. 7. TABLEAU I Aer6éation nlaauettaire ex vivo ehez 2.2. Temps de saignement à l'oreille chez le la2in Des groupes de trois lapins mâles sont traités par voie sous-cutanée par les produits àtaster. Leur temps de saignement (TS) est déterminé juste avant, puis deux heures et quatre heures après leur adminis- tration selon un protocole standardisé par un expéri- mentateur agissant "en aveugle". Les temps de saignement mesurés sont rap- portés dans le tableau II. Les animaux traités par une dose unique de composé A selon l'invention (5 mg/kg) présentent un doublement de leur TS au temps deux heures après traitement: cet allongement est hautement signi- ficatif et se poursuit au temps quatre heures. le lanin Vitesse Vitesse de Traitement d'agrégation Maximum désagrégation _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _() (x) (*) Témoins 56 40 5 Composé A 32 28 3 (5mgxkg 1) (X) moyennes pour des groupes de trois animaux 8. TABLEAU II saignement à l'oreille chez le lapin 3 - Toxicité aigUe *La DL50 du composé A a été déterminée par voie intrapéritonéale chez le rat Wistar et la sourie Swiss. Les DL50 mesurées sont rapportées dans le ta- bleau III. TABLEAU III DL50 du composé A par voie intrapéritonéale chez le rat v- et la souris Temps de Traitement Temps de saignement (secondes) Temps 0 Temps 2 h. Temps 4 h. Témoins 70 23 85 31 87 29 Composé A 80 + 27 165 + 38 102 + 19 (5mgxkg1) moyenne + écart type pour des groupes de trois animaux Espèce Sexe - Espèe Sexe DL50 (mg x kg 1) Rat M 270 + 12 " F 250 + 16 Souris M 166 t 7 " F 164 6 moyenne + ci à 5 % a 9. Les compositions thérapeutiques selon l'inven- tion peuvent être utilisées notamment pour le traite- ment et la prévention des thromboses, en particulier des thromboses chez les diabétiques et des thromboses rétiniennes, ainsi que pour le traitement de la réti- nopathie diabétique. Ces compositions thérapeutiques selon l'inven- tion sont administrables à l'homme par voie orale (sous forme de comprimés ou gélules) ou par voie parentérale (sous forme de solutions aqueuses, notamment pour perfu- sion intraveineuse). Sous forme de doses unitaires pour l'adminis- tration par voie orale, elles peuvent contenir de 20 à 100 mg de principe actif. La posologie journalière peut varier de 80 à 400 mg de principe actif. 10. REVENDICATIONS 1. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif un compo- sé de formule OR dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un reste d'éther ou d'ester, ou l'un des sels d'addition avec des acides pharmaceu- tiquement acceptables. 2. Composition selon la revendication 1, carac- térisée en ce qu'elle contient à titre de principe ac- tif le (E) (hydroxy-3 octényl-l)-l imidazole ou l'un de ses sels d'addition avec des acides pharmaceutiquement acceptables.