Brevet FR2485373A1 — publié le 19811231

*l. La présente invention concerne une substance antivirale contenant comme constituant actif un mélange de polysaccharides et de substances ayant une activité de cytokinine.,principalement formées de substances apparentées à la zéatine qui sont extraites du milieu de culture et du milieu tissulaire de Basidiomycètes tels que le Lentinus edodes et conditionnées telles quelles,sans fractionnement en fractions spéciales, ainsi que le procédé de préparation de cette substance. Il est bien connuLue les virus sont des agents pathogè- nes filtrants, d'une grosseur de 20 à 60 umplus petits que les rickettsies,que ce sont des parasites d'organismes autres que les virus et qu'ils peuvent seulement proliférer dans des cellules vivantes. Les virus sont les agents de maladies telles que l'encé- phalite japonaise,la grippe et l'hépatite chez les animaux, et une théorie qui a pris de l'importance depuis quelque temps est que l'agent pathogène du cancer est peut-être un virus. Récem- ment, un important arti cle intitulé "Mechanism of carcinogenesis", par Eiichi Soeda,membre du National Genetics Laboratory,a paru dans la revue scientifique anglaise "Nature" en date du 31 Janvier 1980. Selon cet article,le cancer n'est pas causé par l'incubation d'un virus carcinogène,mais un gène cancéreux héréditaire (une cellule normale comporte un gène cancéreux et environ 90% des humains le possèdent peutêtre)est excité par des rayons X ou par certaines substances chimiques (substances carcinogènes)et produit ainsi une protéine cancéreuse ressemblant à une protéine cancéreuse de grosseur moyenne de virus cancéreux et qui a un lien avec la carcino- génèse.Le présent demandeur est d'avis que maîtriser un virus,c'est maîtriser le cancer, sur la base de la théorie ci-dessus. On a défini plusieurs centaines de virus et on utilise des vaccins contre l'encéphalite japonaise et la grippe mais on n'a pas encore élaboré un médicament satisfaisant pour le traitement de ces maladies. \ Le présent demandeur a étudié des mycéliums de champignons comestibles, tels que des Basidiomycètes comme le Lentinus edodes, et a fait de nombreuses inventions concernant le procédé d'extrac- tion de constituants pharmacologiquement actifs contenus dans les mycéliums;il a trouvé aussi qu'une substance active du système cytokinine est contenue dans l'extrait du mycélium et que l'extrait est efficace contre les virus des végétaux. En développant davantage les observations ci-dessus,il est arrivé à la présente invention et il a sOrement découvert le premier la présence de cytokinine (zéatine,zéctine -riboside, etc.) dans l'extrait du milieu nutritif et du milieu tissulaire des Basidiomycètes. L'invention a pour objet une substance antivirale que l'on prépare en cultivant à l'état pur des mycéliums de Basidiomycètes par culture solide ou profonde,en les chauffant ou en les homogénéi- sant pour extraire simultanément du solvant aqueux3le constituant des mycéliums et le constituant du métabolitelet en raffinant l'ex- trait par filtration,condensation ou lyophilisation,ainsi que le procédé de fabrication de cette substance. On sait déjà que certains polysaccharides ont une activité antivirale et on a déjà proposé des polysaccharides provenant de Basidiomycètes; le présent demandeur a remarqué l'hormone végétale produite par les Basidiomycètes et a pu établir qu'il s'agit d'une substance ayant une activité de cytokinine principalement formée d'une substance apparentée à la zéatine; en outre,il a trouvé qu'un mélange comprenant le polysaccharide contenu dans le milieu nutritif et le milieu tissulaire des Basidiomycètes et de la substance ayant une activité de cytokinine est très efficace contre - les virus des animaux et c'est sur cela que repose la présente invention. Le polysaccharide tiré des Basidiomycètes qui a été étudié par certains chercheurs est un constituant des corpuscules reproduc- 1 2485373 \ teurs ou du mycélium,mais on jette comme déchet,dans le processus d'extraction,la substance produite par le mycélium qui est un métabolite. L'inventeur a remarqué la substance produite par le mycélium, donc le métabolite,et un produit de décomposition partielle de la lignine par le mycélium,ainsi que le constituant dumycélium, et il est arrivé à la présente invention. Dans l'invention,le constituant actif comprend non seulement le constituant du mycélium,mais le constituant métabolite produit par le mycélium et le constituant contenu dans le produit de décompo- sition partielle de la lignine et le présent demandeur considère le polysaccharide azoté de l'extrait comme l'un des constituants antiviraux; le polysaccharide a un poids moléculaire assez bas,de 3000 à 10 000. D'après la composition en sucres et en aminoacides de l'extrait,le polysaccharide n'est pas celui du mycélium,mais celui du métabolite synthétisé par le mycélium. En outre,le polysaccharide est tout à fait différent de celui qui provient du corpuscule repro- ducteur ou du mycélium et il contient des constituants structuraux différents de ceux de ce dernier. Le produit de décomposition par- tielle de la lignine possède bien entendu une activité antivirale. Ces constituants semblent agir de manière à accroître l'immu- nité tout en empêchant l'infection virale;autrement dit,une substance antivirale entre en contact avec la protéine tissulaire,dégradant celleci, interceptant et inactivant le virus avant qu'il cause la maladie. Dans le métabolite,il s'est confirmé que l'on trouve des substances ayant une activité de cytokinine,formées d'hormones végé- tales telles que la zéatine et le zatine'-riboside et une substance ayant une activité anticytokinine,analogue à l'acide abscisique, et qu'elles contribuent peut Atre à empêcher la synthèse de l'ADN. La substance antivirale de l'invention est caractérisée par le fait qu'elle est formée de l'extrait du milieu nutritif et du milieu tissulaire de Basidiomycètes,tel quel et non fractionné en fractions spéciales. Le but principal de l'invention est de fournir des substances antivirales qui soient sans danger et qui soient efficaces contre les maladies causées par des virus comme l'hépatite virale,la grippe et le cancer. Un autre but est de fournir des substances antivirales qui soient faciles à fabriquer à bas prix. La figure 1 est un chromatogramme de phase gazeuse du développement en fractions (le numéro de fraction se lisant en abscisse) d'une substance ayant une activité de cytokinine (portée en ordonnée)selon l'invention; La figure 2-1 un chromatogramme de phase gazeuse montrant les pics de substances déjà connues ayant une activité de cytokinine ne,les valeurs de base étant indiquées sur cette figure; La figure 2-2 montre le pic de la fraction II de la figure 1, développé par chromatographie gazeuse; La figure 2-3 montre le pic de la fraction III de la figure l,développé par chromatographie gazeuse; La figure 3 montre le développement en fractions du consti- tuant sucre selon l'invention,par chromatographie gazeuse. - Pour chacune des figures 2-1,2-2, 2-3 et 3,on peut lire en abscisse la durée de rétention,en minutes,tandis qu'est portée en ordonnée la réponse du détecteur. La substance de l'invention est tirée du métabolite de mycéliums et de la solution cellulaire donnée par l'autodigestion de mycéliums,une fois que l'on a cultivé en milieu solide ou liquide les mycéliumsd champignons faisant partie des Basidiomycètes comme le Lentinus edodes. Les Basidiomycètes utilisés dans l'invention sont le Lentinus edodes (shiitakie),le Pleuratus ostreatus (hiratake),le Pholiota nameko (nameko) et le Lyophyllum aggregatum (shimeji) et c'est l'extrait du mycélium de Lentinus edodes qui présente la plus grande activité. On peut utiliser un milieu solide ou liquide. Dans le premier cas,on peut utiliser le.milieu principalement formé de bagasse (résidu de canne à sucre) élaboré par l'inventeur (bagasse:son de riz, lO:l),le milieu principalement formé de rési- du de betteraves (résidu de betteraves: son de riz,12:1) ou le milieu de rognures,habituellement usagées (rognures:son de riz, 3:1). Le plus souvent,on brOle la bagasse parce qu'on n'en a pas l'usage et elle est donc facilement accessible à bon marché. Dans le deuxième cas,on a le milieu GPL(milieu liquide synthétique formé de glucose,dd peptone et de levure)et le milieu ML (milieu liquide synthétique formé de poudre d'extrait de malt et de levure):il est préférable d'ajouter un constituant fibreux végétal. On rutilise pas de procédé spécial pour la culture des mycéliums. L'invention est caractérisée par le fait que l'on cultive les mycéliums de Basidiomycètes ci-dessus dans un milieu solide ou liquide et que l'on extrait la substance active contenue dans le métabolite des mycéliums et les mycéliums du mélange de mycéliums et de milieu (appelé ci-après milieu nutritif et milieu tissulaire), sans séparer les mycéliums et le milieu. La chromatographie du mi- lieu nutritif et du milieu tissulaire ci-dessus sur colonne de "Sephadex LH" fait apparaître six substances ayant une activité de cytokinine et identifiées comme étant principalement formées de zéatine et de zéatine riboside d'après la chromatographie gazeuse et on observe aussi la présence de poly- saccharides. La substance antivirale selon l'invention s'est révélée efficace contre les maladies causées par des virus,comme l'hépatite virale,la grippe et le cancer,et on a trouvé aussi que sa toxicité est extrêmement faible,dans l'essai d'innocuité. En outre,l'essai de toxicité par voie orale d'une poudre lyophilisée indique 3,84 g/kg/jour x 90 chez le rat mâle et 7,98 g/kg/jour x 90 chez le rat femelle. - 6 EXEMPLE 1 On a stérilisé de façon usuelle un milieu solide comprenant % de bagasse, 5% de son de riz et 5% de matières nutritives comme le son et on l'a inoculé avec un mycélium solide d'ensemencement de Lentinus edodes. On a alors mis le milieu inoculé dans une enceinte de culture maintenue à une température de 18 à 20'C et à une humidité de 60% par conditionnement d'air et on a commencé la culture du mycélium. Une fois la culture terminéeon a transféré le milieu dans une enceinte de culture o on l'a laissé reposer. Lorsque des corpuscules reproducteurs commençaient à se développer à la surface du milieu,on a retiré le milieu de l'enceinte de culture et on l'a divisé en morceaux gros comme le doigt. On a-entassé le milieu fragmenté dans une cuve,o l'on a ajouté 5 litres d'eau propre par 600 g de milieu,puis on a mélangé entre 60 et 130C. pendant 4 à '5 heures en agitant. Les constituants actifs du métabolite des mycéliums et de la solution cellulaire ont été libérés dans l'eau par l'agitation. On a introduit la suspension obtenue dans un sac filtrant en flanelle et on a comprimé pour la filtrer:on a filtré à nouveau le filtrat obtenu au moyen d'un filtre à membrane pour éliminer les champignons et on a extrait la substance active contenue dans le métabolite du mycélium et dans la solution cellulaire. On a alors comprimé l'extrait pour le condenser à travers une membrane d'ultra- filtration et on l'a lyophilisé pour obtenir une poudre brune. On a cultivé des mycéliums de Flammulina velutipes sing,de Pleurotusostreatus,de Coriolus versicoloretc et on a obtenu les extraits mycéniens correspondants par des moyens semblables à ceux qui sont décrits ci-dessus,puis on a identifié la cytokinine et le polysaccharide. 1)Séparation et purification des substances ayant une activité de cytokine: On a dissous dans l'eau la poudre brune obtenue par lyophi- lisation de l'extrait du milieu nutritif et du milieu tissulaire de Lentinus edodes et on a laissé reposer une nuit à 5 C, puis on a jeté la partie insoluble. On a ensuite ajusté le filtrat à pH 1,5 au moyen de HC1 et on l'a mélangé à une quantité égale d'acéta- te d'éthyle;on a éliminé la substance transférée dans l'acétate d'éthyle. On a ajusté la phase aqueuse à pH 8,7 en ajoutant de l'ammoniaque,on a extrait par une quantité égale de n-butanol satu- ré d'eau;on a adsorbé la phase n-butanol sur du "Dowex 50-X4" et on a obtenuaprès avoir chassé l'ammoniac,une substance ayant une activité de cytokinine. On a traité la substance active ci-dessus par chromatographie sur colonne de "Sephadex LH-20" pour la diviser en six constituants actifs que l'on a identifiés,par chromatographie gazeuse,comme étant principalement composés de zéatne et de zéatine -riboside;à l'analyse quantitative,on a obtenu 50 mg de zéatine et de zéatine -riboside par gramme de poudre. Les résultats de la chroma- tographie sur colonne de "Sephadex LH-20" et de la chromatographie gazeuse sont représentés respectivement par les figures 1 et 2. On a examiné biologiquement la présence ou l'absence de l'activité au moyen de cotylédons de radis. Comme le montre la figure 1, l'activité de cytokinine est reconnue dans la fraction I-VI. La figure 2-1 est un graphique o A correspond à la cytokinine déjà connue, B correspondant à l'isopentényladénine, C à la dihydrozéa- thine, D à la zéatine, E à i'isopentényladénosine et F au zéatine riboside. La figure 2-2 est un graphique correspondant à la fraction II de la figure l;étant donné qu'il coincide avec F de la figure 2-1,on considère qu'il s'agit de zéatine -riboside. La figure 2-3 est un graphique correspondant à la fraction III de la figure 1 et étant donné qu'il coincide avec D de la figure 2-1, on considère qu'il s'agit de zéatine. La substance ayant une activité de cytokinine selon l'invention est une substance purifiée par échange d'ions avec le "Dowex 50-X 4" et c'est un mélange de six constituants ayant une activité de cytokin.r. 2)Séparation et purification du polysaccharide. On a dissous dans l'eau la poudre brune lyophilisée tirée du Lentinus edodes de façon semblable à la précédente,on y a mélangé 10% de trichloracétate (TCA),on a agité et on a centrifugé. Au surnageant obtenu,on a ajouté un volume triple d'éthanol à 95%, on a agité et on a centrifugé. On a séché ensuite le précipité, on l'a dissous à nouveau dans l'eau et on l'a dissous aussi dans un volume triple d'acétone;on a centrifugé la solution et on a séché le précipité obtenu. Résultats Groupe Quantité Valeur d'électro- Taux d'inhibi- ajoutée coagulation tion,% Témoin O -132 - Cytokini n e O,2PPM 36 72,7 Polysaccharide O,5PPM 14 89,4 Cytokinine + polysaccharide -0,2PPM + O,5PPM 2 9 8 " -985 Dans chaque groupe traité,le taux d'inhibition virale était élevé,mais c'est dans le groupe cytokinine + polysaccharide qu'il était le plus élevé. Dans le groupe contenant de la cytokinine,la vitesse de prolifération des cellules avait tendance à être plus grande que dans le groupe témoin. Experience 2 Activité de protection de la souris contre le virus de l'herpès:sur la base du résultat de l'expérience 1,on a trouvé \ que l'effet de cytokinine + polysaccharide était excellent et on a conduit le traitement avec un mélange de cytokinine et de polysaccharide. On a administré-par voie intrapéritonéale le mélange de cytokinine et de polysaccharide à des souris de 2 semaines et on a déterminé le taux de survie au bout de 14 jours. Quantité de virus inoculée: 2 x 10 UFP, dose du mélange: 2 mg de cytokaînine et 5 mg de polysaccharide, Groupe formé de 10 soues:on a répété l'essai à 5 reprises. Taux de survie:souris/10 groupes. Résultats: Groupe Taux de survie 1. Recevant seulement le virus de l'herpès 0 1 2. Recevant le virus de l'herpès,la cytokini.- nine et le polysaccharide. ...........7 10 3. Inoculé avec le virus 48 heures après l'administration de la cytokinine et du polysaccharide.-;9 10 4. Recevqnt la cytQkinine et le polysacchari- de 48 heures après l'inoculation du. yirus....... . Le traitement par la cytokinne et le polysaccharide a permis de bien prévenir l'infection virale et présentait aussi des effets thérapeutiques satisfaisants. Expérience 3 On a demandé au professeur Nobuhiko Kanno,Laboratoire de Biologie,Département de Pharmacologie,Université Médicale et Pharmacologique de Toyama,de déterminer l'activité de la substance antivirale selon l'invention pour la régression du cancer du foie chez le rat. Méthode: 1. Sujets: on a nourri pendant 5 jours de la façon usuelle des rats Wistar mâles de 4 semaines et on les a soumis à l'expérience. 2. Substance carcinogène: 3'-méthyl-4-diméthylamino-azobenzène (3'-Me-DAB) . CH CH3 N=N N CH Le 3'-Me-DAB est connu comme ayant une affinité pour le foie du rat et une propriété carcinogène spécifique et énergique. Il a été dit que le processus carcinogène réside dans une liaison du 3'Me-DAB avec la protéine du cytoplasme du foie, amorçant la formation du cancer du foie. 3.Groupes: (1) groupe témoin:alimentation normale (2) groupe L:alimentation normale + L (3) groupe L + DAB: alimentation contenant 0, 06% de 3'-Me-DAB + L (4) groupe DAB: alimentation contenant 0,06% de 3L Me-DAB. Note: L est une poudre lyophilisée de l'extrait du milieu nutritif et du milieu tissulaire de Lentinus edodes. DAB= 3'-Me -DAB. 4. Quantité et mode d'administration de la poudre lyophilisée d'extrait du milieu nutritif et du milieu tissulaire de Lentinus edodeso...... Période (jours) Intervalle (jours) Dose.Concentration (poi;ds/volume) 0 à 20 2 1,0 g/kg 20% 21 à 41 3 150mg/par su-.20% .... jet 42 b 100 3 50 mg/par sujet 6,67% 101 à.... 5 50mg/par sujet 6,67% il On a dissous la poudre lyophilisée du milieu nutritif et du milieu tissulaire de Lentinus edodes dans du soluté physiologi- que et on l'a administrée par voie intrapéritonéale;au groupe témoin, on a donné de façon similaire la même dose de soluté physiologique. 5. Procédé et résultats. (1) Observation macroscopique: En 5 semaines environ,une dépilation apparaissait sur l'abdo- men de certains rats du groupe DAB,elle s'étendait graduellement et le degré de dépilation progressait oussi. En 15 semaines environ,certains rats ont commencé à présenter une dépilation au cou ou sur le côté du corps. Il n'apparaissait pas de dépilation dans le groupe L + DAB. (2)Autopsie. Dans la dissection du groupe DAB au bout de 14 semaines et de 18 semoines,on a trouvé sur tout le foie des particules blanc jaunâtre qui semblaient être du tissu cancéreux. Chez le groupe L + DAB,le foie ne montrait aucun aspect anormal. Tous les rats o l'on a fait des constotations/anormales sur le foie étaient ceux qui présentaient une dépilation. 3)Constatations microscopiques sur le tissu du foie. On a coloré le tissu du foie par l'hénatoxine-éosine,on l'a fixé dans la cire et on en a préparé une section de 8 Pm d'épaisseur pour l'examiner au microscope. Le tissu du foie du groupe DAB o il apparaissait des particules blanc jaunâtre présentait une grave perturbation des cellules et la structure glandulaire spécifique du cancer du foie (adénocarcinome);le nucléole était nettement coloré par l'éosine et il était agrandi;des cellules cancéreuses étaient bien visibles. Dans le tissu du foie du groupe L+ DAB,l'arrange- ment des cellules était légèrement perturbé,mais on ne voyait pas d'adénocarcinome,ni de modifications du nucléole;on a donc jugé que c'étaient des cellules normales. D'après les résultats ci-dessus,la poudre lyophilisée du milieu nutritif et du milieu tissulaire du Lentinus edodes inhibait nettement l'activité carcinogène du 3'-Me-DAB sur le rat et avait une activité carcinostatique. (4) On a dissous dans 100 ml d'eau 6g de la poudre brune obtenue par le procédé décrit à l'exemple 1 et on a administré le tout à un patient atteint d'hépatite virale,une fois par jour avant le petit- déjeuner et on a obtenu les effets thérapeutiques suivants: Sujet: un patient du sexe féminin de 50 ans,infirmière en chef dans un hopital et chez qui on avait diagnostiqué une hépatite virale. On a déterminé l'activité de transaminase dans le sérum pour observer les résultats thérapeutiques qui sont indiqués ci-après. Valeur normale: TGO, 8 à 40; TGP, 5 à 35; Kunkel, 4 à 12. TGP a) au début, le 12 mai 1978: TGO, 170;/270; Kunkel, 5; b)lors de l'hospitalisation le 7 Juin 1978: TGO, 756; TGP,793; Kunkel,7; c) administration d'une dose quotidienne du mélange à partir du Juin 1978, comme décrit plus haut, d) lors de la détermination du 21 Juin 1978: TGO, 230, TGP, 320, Kunkel,7; e) détermination du 6 Juillet 1978: TGO, 140; TGP,230; Kunkel,7; f)lors de la détermination du ler AoOt 1978: TGO, 22; TGP,19; Kunkel,7; g) la patiente était complètement guérie et est sortie le 2 AoOt 1978;elle a repris son travail le même jour. 25 h)lors de la détermination du 19 Août 1978: TGO,27; TGP;Kunkel,7. Cas 2: L'inventeur a demandé à l'hopital Nishitetsu (Fukuoka), d'essayer la substance selon l'invention;celle-ci a été administrée à un patient atteint d'hépatite virale chronique avec les résultats suivants. On a commencé à administrer la poudre lyophilisée,par voie buccale,le 25 Septembre,à la dose de 5 g. Date 1979 Taux 27.8 10.9 17.9 27.9 8.10 15.10 Indice de jaunisse (MG) 5 5 5 4 5 4 Transaminase TGO. 46 43 33 44 50 65 sérique _______ TGP 46 40 44 40 42 54 Réaction Réaction réaction du cobalt colloidale sérique.. T.T.T. t7,1 6. '.6,0 6,t9 6,4 7,5 7,8 _______________ iZn T.T. 8,0 9,5 8, 5 8,3 9,4 8,6 Protéine totale 7,8 7,7 7,3 7,3 8,1 7,9 Proportion: Albumine 6 5,6 /,, 61 63, 68,4 Protéine de la de la 7",1,5,2 "3,i. .... 3, 0' 3,'3 3,53 du fraction. . :2.9,3 9,2 9,1 8,6 9,4 9,2 :globuline.c.2 sérum protéi-:: P 7,1 7,9 7,1 7,3 8,0 7,1 nique: nique: 1A,....1.1,7.... 13,5 13,5.. 14,9 11,9 _ -I'., f: A/G 1,91 2,11 2,04 2,04 1,77 2,161 AL-P 1.1,0..9,6 10,3 10,7 11,7 10,6 cholestérol total 193......188...... 185 191 195 203 L.Do. H. LAP 215 203 185 186 193 210 r4 oo VL 1J4 Suite Date 1979 Taux 27.8 10.9 17.9 27.9 8.10 15o10 Taux -TGP 24,9 23,7 22,8 21,7 26,2 24,84 c * protéinique.:. sérumprotéinique A/3 7,3 8,0 7,5 '7,3,7,4 7,3 sérum *: à 14,3 15,6 14,6 15,7 18,2 16,0 A/G '"........l6.1.9.. A/GO 1,96 1,94 1,91 1,84 1,75 1,77 AL-P 10,2 2 9,2 11,7 11,4 14,2 10,4 cholestérol total 173 201 188 195 194 208 L.D.H. L A P 215 215 219 257 250 228 -TOP 24,0 31,5 30-5 33,7 37,3 37,4 _oFP. (-) (-) --. (-) antigène HB (-) (-) (-) - - (-) s,o ... . u-rl (>4 Date 17.12 Taux 2'i.1 28.1 7.1 4.2 Indice de jaunisse (MG) 6 7 5 6 6 5 Transaminase TGO 104 67 57 38 38 35 Transaminase.... sérique TGP 71 64 48 35 30 28 réaction réaction du cobalt collonda _T.T.T. 9,1 9,4 9,9 9, 1 8,0 9l,1 crlldale Zn.T.T. 11,9 12,4 11,9 1ll 10,6 11,2 Protéine totale 7,6 7,9 8,0 8,1 7,4 8,1 Proportion Albumine 53,1 64,8 63,8 61,8 65,6 63,5 de la: 3,2 2,9 3,8 3,9 3,2 2,9 Protéine: rcin lfrbuctnon 2 8,2 7,6 9,0 9, 1 8,4 9,8 Protéine globuline 2 du protéini-7,6 7,7 7 8,7 8,0 8,2 que - sérum que y 17,6 16,7 15,4 16,3 14,5 15,3 A/G 1,71 1,84 1,76 1,61 1,91 1,74 AL-P 13,4 10,6 15,5 13,2 10,2 14,5 Choles$érol total.'189 197.209 206 177 191 L.D. H. L A P 219 245 223 193 180 199 "-IGP 36,3 37,7 33,6 29,2 26,1 27,1 C-FP - - - - - (-) antigène HB - - - (-) s Co 9tl In wN 24.12 Date 18.2 Taux Indice de jaunisse (MG) 6 Transaminase TGO 34 sérique TGP 26 r.to réaction du cobalt reaction colloïdale ToToT. 7,9 sérique Zn.T.T..9.7 : Protéine totale 7,9 :Proportion: Albumine 64,9 Protéine d la 1 de la:3,5 Protuine fraction 9,2 du: ,.. globuline 2 ' sérum protéini-.9,2 que 14,1 A/G 1,85 AL-P 9,7 Cholestérol total 221 LoD. _ l... . LAP 183 _. ,. . , , . -TGP 23,4 i -FP (-) antigène HB (-)- $ k', N> co Ln w U4 1-" On a administré chaque jour par voie orale une dose de 5g de la poudre lyophilisée et, comme le montrent les résultats ci- dessus,l'essai d'antigène HB est devenu négatif au bout de s jours environ,puis le patient a été guéri complètement. L'inventeur a demandé à l'Hopital de la Croix-Rouge de Nagahama d'essayer la substance selon l'invention;on l'a administrée à un patient atteint d'hépatite virale aiguë (cas 3) et à un patient atteint d'hépatite virale grave (cas 4),avec les résultats suivants. Cas 3:(hépatite virale aiguë) Nom | Date | AIP t TGO | TGP | LDH Patient masculin de 42 ans, sorti au début de Mars OM 17/1 27,5 561 522 876 25.1 On a commencé l'administration orale d'une dose de 5 g de poudre lyophilisée d'un extrait du mi- lieu nutritif et du milieu tissulaire de Lentinus edodes 28,1 26,0 533 471 780 4,2 22,7 96 122 362 11,2 21,1 79 90 477 18,2 16,7 B9 - 93 435 ,2 13,5 80 64 358 3,3 13,8 Cas 4: (hépatite virale grave) Nom Date AIP TGO TGP LDH Patient masculin de 45 ans hospitalisé EM 16,1 19,1 4550 3730 3832 19,1 18,6 4420 3690 3660 ,1 On a commencé l'administration orale d'une dose de g de poudre lyophilisée d'un extrait du milieu nutritif et du milieu tissulaire de Lentinus edodes. 26,1 18,9 3460 3720 3560 2,2 13,8 391 471 604 9,2 15,0 380 129 352 16,2 19,2 43 - 73 311 23,2 14,9 36 40 278 1,3 31,9 25. 3.1. 270 8,31 10,1 280 2 2 8,3 10,1 28. 29 - 292 Comme on le voit clairement dans les cas ci-dessus, plusieurs jours après l'administration,TGO et TGP ont tous deux diminué et, en particulier chez le patient atteint d'une hépatite virale grave qui était dangereuse lors de son hospitalisation, les deux chiffres ont diminué en quelques jours. Les deux patients ont été complètement guéris,ce qui indique que la substance a un effet thérapeutique étonnamment élevé. Cas 5:patient masculin de 74 ans atteint d'hépatite sérique. En Mars 1979, il a été frappé d'un infarctus cérébral, puis d'une hépatite déglutive, il a subi une trachectomie le 20 Septembre. Etant donné que l'excrétion orale était importante et ne pouvait pas être supprimée,on a commencé l'alimentation nasale le 29 Septembre. Il s'est produit une anémie par suite d'un déficit de calories et on a fait de fréquentes transfusions sanguines. Les valeurs TGO 30, TGP 26,5 et Ai-P 7, 0 en Septembre 1979 ont été portées respectivement à 62, 131 et 34,2 le 3 Décembre;le patient a commencé à vomir à chaque alimentation nasale (800 cal de jus de fruit + boisson commercialisée sous la dénomination Tang, étc), alors qu'il ne vomissait pas précédemment:on a alors porté la trans- fusion sanguine à 1500 cm3 (par jour)et son état est devenu incurable. On a alors dissous dans de l'eau une dose journalière de 5g de la poudre lyophilisée-du milieu nutritif et du milieu tissulaire de Lentinus edodes, que l'on a administrée par le nez, du 19 Décembre au 18 Février. Le 21 Décembre,les résultats de laboratoire étaient améliorés, à savoir TTT 1,8, ZnTT 9,1, TGO 39, TGP 45,5 et Al-P 17, et simultanément les vomissements avaient dis- paru et l'état général s'était graduellement amélioré. Le 16 Janvier,les chiffres étaient; TGO 28, TGP 22, et AI-P 14, et le 13 février on trouvait: TGO 26, TGP 14, et AI-P 12. Les chif- fres ont ensuite augmenté et les symptômes subjectifs ont disparu. Cas 6:patient masculin de 73 ans atteint d'hépatite sérique. Anamnèse: en septembre 1944,on a diagnostiqué chez ce patient un cancer du rectum et il a subi l'opération de l'anus artificiel en 1945. Le 28 Août 1978,il a été frappé d'un infarctus cérébral et admis à l'Hopital Miyake à Toshincho. Le 25 Janvier 1979, il a présenté une complication de péritonite cancéreuse (avec paralysie intestinale),mais il a guéri sans traitement chirurgical. En outre, il avait une infaction urinaire incurable et un prurit cutané sénile et, en octobre 1979, une pneumonie aigle. On lui a fait une transfusion sanguine pour anémie et bientôt la P.C.R. est arrivée à 5+;le 19 Novembre.1979,on obtenait: TTT 4,7; ZnTT 8,9, TGO 192, TGP 230, P-TM 7,08/dl,A/G 0,55% et gamma-globuline ,00%. Les cellules T étaient à 847/1,284= 64%0 On a administré pendant 2 mois, à partir du 30 Novembre 1979, une dose quotidienne de 5g de la poudre lyophilisée du milieu nutritif et du milieu tissulaire de Lentinus edodes. Les résultats étaient: cellules T 847/1,284= 64% le 21 novembre, 590/1, 311 = 45% le 12 Décembre, TTT 6,5 ZnTT 19,8, TGO 21,5, TGP 21,5,gamma- globuline 36,33% et A/G 0,64 le 18 Décembre. La disorexie,en tant que sympt8me * subjectif, a disparu et il a pu s'alimenter beaucoup par voie orale. Il avait TTT 3,9, ZnTT 20, TGO 17,0, TGP 10, A/G=0,67,gamma globuline 33, 33% et cellules T 773/1,120=- 69% le 22 Janvier, et TTT 4,2, ZnTT 18, TGO 18,5 et TOP 9,5 le 19 Févriero Il n'a plus présenté d'aggravation ensuite et ne se plaignait pas particuliè- rement de sympt8mes subjectifs. On a administré au patient 2 comprimés de KW une semaine sur deux,ce qui a causé l'état général décrit ci-dessus et l'accroissement de TGO et TGP; il a pu guérir d'un état dangereux résultant d'un mauvais état général. EXEMPLE 2 On a mélangé un milieu TGP à une solution de bagasse bouillie et on a mis le tout dans un récipient que l'on a stérilisé à l'auto- clave à 121 C pendant 30 minutes. On a inoculé ce milieu avec un anneau de platine porteur d'hyphes de Lentinus edodes,on a secoué fois par minute sur une secoueuse dans une enceinte de culture à 25 C et on a conduit la culture profonde pendant 7 à 8 jours. Des mycéliums se développaient alors dans le milieu sous une forme semblable à des pastilles,indiquant une bonne croissance. On a homogénéisé 1 litre du milieu nutritif et tissulaire ob- tenu comme ci-dessus,on a filtré la suspension obtenue et on l'a extraite. On a ensuite filtré l'extrait et on l'a condensé à travers une membrane d'ultrafiltre pour obtenir un extrait que l'on a lyophi- lisé pour obtenir une poudre brune, Le rendement était de 10g de poudre brune par litre d'extrait. De la matière obtenue comme ci-dessus, on a séparé la substance ayant une activité de cytokinine et le polysaccharide, on les a purifiés comme indiqué à l'exemple 1 et on a trouvé alors que cette matière contenait de la zéatine et du zéatine - riboside du système cytokinîne. On a déterminé de façon semblable à l'exemple 1 l'effet antiviral de la matière obtenue comme ci-desus et on a obtenu des résultats presque similaires. L'inventeur a examiné l'effet antitumoral de la poudre ob- tenue comme ci-dessus et a obtenu d'excellents résultats théra- peutiques. On a transplanté des cellules tumorales de sarcome 180 dans 1' abdomen d'une souris et, lorsqu'elles ont proliféré suffi- samment,au bout de 8 jours,on a transplanté 10 cellules par voie souscutanée dans l'avant-bras d'une autre souris pour former une tumeur solide;au bout de 24 heures après la transplantation,on a commencé à administrer à la souris la poudre ci-dessus On l'admi- nistrait par voie intrapéritonéale à une dose de 10 mg/kg,soit 0,2 mg/20g (poids de la souris),une fois par jour, 12 fois un jour sur deux;par voie orale,on a administré une dose de 10mg/kg soit 0,2 mg/20g (poids de la souris),une fois par jour,23 fois. A la suite de cela,on a trouvé que la substance antivirale (poudre brune ci-dessus)de l'invention avait une excellente activité antivirale et qu'elle était efficace comme médicament anticancéreux. Cas l:patient masculin de 65 ans. envoyé par un médecin et chez qui on a diagnostiqué un cancer de l'oesophage. - a) 1974: sympt8mes subjectifs:propension à boire des liquides froids. Il a reçu de quelques-uns des autres patients la poudre brune selon l'invention,décrite plus haut,et l'a prise une fois par jour avant le petit-déjeuner à la dose de 3g. b)Décembre 1976: on l'a examiné aux rayons X dans une clinique pour confirmer son propre diagnostic et on a fait des constatations dans l'oesophage. Immédiatement,il a été soumis à l'endoscopie à l'Ecole Féminine de Médecine de-Tokyo et on a diagnostiqué un can- cer de l'oesophage,étant donné qu'on a trouvé dans l'oesophage des cellules atypiques. c)Février 1977: il a refusé l'opération chirurgicale: i pesait 38kg,sa taille était de 152 cm et il se plaignait d'une grande fatigue avec pesanteur et perte d'appétit. d)Féviier 1977:on a trouvé à l'endoscopie que la lésion était restreinte dans les cellules épithéliales régénérées. e)Décembre 1977:l'appétit a diminué brusquement,le patient et sa famille en étaient très inquiets. f)Janvier 1978:on a porté la dose de poudre brune à 6g une fois par jour. L'appétit s'est amélioré 1 semaine plus tard. g) Mars 1978: il présentait une amélioration et un gain de poids. i) Septembre 1978:1'examen radiologique et endoscopique n'a rien fait apparaître d'anormal dans l'oesophage. Cas 2: patient masculin de 45 ans. a)Avril 1977: il a été atteint d'une vive douleur.à gauche de l'abdomen, on a trouvé deux masses grosses comme le poing et on a diagnostiqué un cancer migrateur malin et un cancer du pancréas, d'après l'examen radiologique et l'examen du sang et des urines. b) Mai 1977:on a administré une fois par jour avant le petit- déjeuner une dose de 6g de la poudre brune selon l'invention,décrite plus haut. c) Juin 1977:plusieurs jours après le début de l'administration, on a libéré les flatuosités pour apaiser la sensation de compression et le malaise à gauche de l'abdomen. On a seulement administré la poudre selon l'invention en cessant les autres médicaments. Le pa- tient avait des mouvements intestinaux et se sentait mieux. d)Juillet 1977:i1 ne sentait plus de douleur,mais un malaise dans l'abdomen et parfois des picotements. On lui a dit de ne pas s'en inquiéterparce que cela était dû au commencement des mouvements du duodénum et de l'intestin grêle. Il avait souvent des grondements et de la flatuosité. L'examen du sang,l'examen radiolo- gique et les autres examens indiquaient la guérison du cancer. Après les vomiscements, une grande quantité de flatuosités se libé- rait chaque jour;on a estimé que la cause des vomissements résidait dans l'intestin" e)Aout 1977:On lui a fait une opération chirurgicale et on a trouvé une suppuration du diaphragme. On évacuait le pus chaque jour par aspiration à travers un tube. On a commencé l'administration de la poudre,qu'on avait arrêtée quelque temps avant et après l'opération. f)Septembre 1977:il a commencé à se sentir affamé et se trouvait,. bien et prenait du poids;il a commencé à s'exercer à la marche. g)octobre 1977:11 est sorti et est venu à l'hopital en tant que patient ambulant. Il a alors été complètement guéri et n'est plus revenu à l'hopital ensuite. EXEMPLE 3 On a cultivé le mycélium de Flammulina velutipes sing comme indiqué à l'exemple 1 et on a tiré du milieu nutritif et tissulaire,de façon similaire,un extrait contenant le constituant actif décrit plus haut,on l'a filtré pour le condenser,on l'a lyophilisé et on a obtenu une poudre. On a examiné la matière obtenue comme ci-dessus,en ce qui concerne l'activité antivirale et antitumorale,et on a obtenu des résultats presque semblables à ceux des exemples précédents. EXEMPLE 4- On a cultivé le Pholiota nameko comme indiqué à l'exemple 1 et on a obtelnu de façon similaire,à partir du milieu nutritif et tissulaire,un extrait contenant le constituant actif décrit plus haut,on l'a filtré pour le condenser et on l'a lyophilisé pour obte- nir une poudre brune. On a déterminé les activités antivirales et antitumorales de la matière obtenue comme ci-dessus et on a obtenu des résultats semblables à ceux des exemples précédents. Innocuité de la substance antivirale de l'invention: La substance de l'exemple 1 a été analysée par le Nomura Consolidated Laboratory,en vue de déterminer son innocuité:les résultats sont les suivants: (1)Toxicité aiguë(orale) DL50 g/kg (poids du sujet) rat (mâle) 16,5 rat (femelle) 15, 6 souris (mâle) 19,6 souris (femelle) 17,7 (2)Toxicité pour le poisson TLM carpe, 48 heures environ 1,02% carpe, 72 heures 1,07% puce d'eau,3 heures 0,56% Résultats:TLM correspond à la DL50 de toxicité aiguë (rat et souris). Les engrais synthétiques usuels donnent 10 ppm chez la carpe et aussi de faibles valeurs en ppb chez la puce d'eau:ainsi, il se confirme que la substance antivirale selon l'invention a une toxicité extrêmement faible. REVENDICATIONS 1) Substance antivirale caractérisée en ce qu'elle est formée d'un milieu nutritif et tissulaire d'un Basidio- mycète pouvant être le Lentinus edodes, le Pleurotus ostre- atus, le Pholiptq nameko, le Lyophyllum aggregatum, le Corio-. lus versicolor ou autre et contenant comme constituant actif un mélange de polysaccharide et de substance ayant une acti- vité de cytokinine., principalement formée de substances ap- parentées à la zéatine, produites par le milieu nutritif et tissulaire. 2) Substance selon la revendication 1, caractéri- sée en ce que le mélange de polysaccharide et de substance ayant une activité de cytokinine est principalement formé de substances apparentées à la zéatine produites par le milieu nitritif et tissulaire et qu'elle est administrée par voie orale. 3) Substance antivirale caractérisé en ce qu'elle est mise en oeuvre de façon à être efficace contre l'hépa- tite virale, le cancer et la grippe. 4) Substance antivirale caractérisé en.ce qu'elle a un poids moléculaire de 3000 à 10 000 et que la substance ayant une activité de cytokinine est formée de zéatine et de zéatine -riboside. ) Procédé de fabrication d'une substance antivirale, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive des hyphes de Basidiomycètes dans un milieu solide ou liquide, que l'on mélange le milieu nutritif et le milieu tissulaire obtenus à un solvant aqueux, que l'on extrait le constituant actif et que l'on filtre l'extrait. 6) Procédé de fabrication de la substance selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on mélange les ma- tières et qu'on les agite entre 60 et 130 C pendant 4 à 5 heu- res pour extraire le constituant actif. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on utilise l'eau comme solvant aqueux. 8.) Procédé de fabrication de la substance selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on comprime l'ex- trait et qu'on le filtre sur une membrane d'ultrafiltration. 9) Procédé de fabrication de la substance selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on utilise la bagas- se comme matière principale du milieu solide ou liquide. ) Procédé de fabrication de la substance selon la révendication 6, caractérisé en ce que l'on lyophilise l'ex- trait filtré.