Brevet FR2483912A1 — publié le 19811211

La orsentn invention concerne une série de nouveaux dérivés du comoosé ML- 236B connu, des procédés pour la proaration de ces dérivés et des compositions pharmaceu- tioues les contonant. Le MiL-236B Qui a la structure chimique suivante: IJ o O H3C O CH3 CH3 est décrit dans le brevet US 3 983 140. Il a ét. isolé et purifié 2 partir des produits de métabolisme de microorga- nismes du genre Penicillium, plus précisément Penicillium citrinum, une espèce de moisissure bleue. On a démontré qu'il inhize la biosynthèse du cholestérol par des enzymes ou des cellules cultivées, séparées d'animaux expérimentauxen riva- liscnt avec l'enzyme limitant la vitesse, active dans la synthèse du cholestérol, à savoir la 3-hydroxy-3-méthyl- glutaryl-coenzyme A réductase et, an conséquence, il réduit de façon significative les taux d cholestérol sérique chez les animaux [Journal of Antibiotics, 29, 1346 (1976)]. On a également découvert plusieurs composés de structure sem- blable à celle du ML-236E, lesquels s'avèrent être capables d'inhiber la synthèse du cholestérol. La demanderesse a maintenant découvert de nouveaux composés qui peuvent 9tre préparés par l'hydroxylation du ML-236B ou de ses dérivés par voie enzymatique, et qui pos- sedent une aptitude à inhiber la biosynt-ièse du cholestérol, qui est au moins comparable à, et dans certains cas dépasse substantiellement celle du ML-235B lui-même. Les composés selon l'invention sont des acides hydmoxy- carboxyliques de formule (I): unnA \ FOH (I} R (dans laquelle R représente un groupe de formule HO ou ) -OH et des lactones cyliques, des sels et des esters de ces aci os. L'invention fournit également un procédé pour préparer un composé de formule (I) ou une lactone cyclique, un sel ou un ester de ce composé par l'hydroxylation par voie enzymatique du ML-236B, ou du ML-236B acide carboxylicue, ou d'un sel ou: eter de c'%t acide. Le ML-236B acide carboxylicue r-pond a la formule: - 3 - )H H3C ' CH3 Une classe de composés par les composés de formule R10ooc HO. selon l'invention est représentée (II): OH i t (I) H31 (dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyla en C1-C5), les sels pharmaceutiquement accep- tables de l'acide o R représente un atome d'hydrogène et la lactone correspondante de formule (III): O0, -OH (ilI) CH3 i - i HO - 4 - Etant donné le nombre d'atomes de carbone asymétrique dans ces composés, divers isomères géométriques sont possibles. Parmi ceux-ci, les isomères les plus importants sont les suivants: Composés de formule (IV): R1O OC- - 'H ' * HO (IV) Ho 0 0,,,,,. 1o. mm, l'Hc hdoya xiuefmu(VI I CH3 H nH X Xd'i L'acide hydroxycarboxylique de formule (IV) dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène, est appelé ici M-4 et les dérivés de cet acide, spécifiquement les sels et esters, sont apoelés dcrivés du M-4, alors qu'la lactone correspondante de formule (V) est appelée ici la M-4 lactone. De même, l'acide hydroxy-carboxylicue de formule (VI) dans lecuel R représznte un atome d'hydrogène, est appelé-M-4' et des dérivés de cet acide sont appelés dérivés du M-4', alors que la lactonE correspondante de formula (VII) est appelée la M-41' lactonE. Une autre classe préférée de composés selon l'invention est représentée par les composés de formule (VIII): A 01 R1 0 C HO..I O| ( V III) H3 -- 6 _- (dans laquelle R est tel que défini ci-dessus) et les sels pharmaceutiquement acceptables de l'acide o R représente un atome d'hydrogène, et la lactone correspondante de formule (IX): n nu (IX) H31 CH3 Divers isomères géométriques de ces composés sont possibles, les plus importants étant les suivants: comcosés de formule (X): à -, _._..... _ v... R10 C HO H (XI H3CC (dans laquelle R est tel que défini ci-dessus) e les sels pharmaceutiquement acceptables de l'acide o R1 raepré- sente un atoms d'hydrogène, et la lactone correspondante d.e formule (XI) : -7- (XI) CH3 H3s et composés de formule (XII): R10 O C HO H il v -",OH i t e. 1 -, (dans laquelle R est tel que défini ci-dessus) et les si pharmaceutiquement acceptables de l'acide o R1 - représente un atome d'hyorogène et la lactone correspon- dante de formule (XIII): B1s OH H3C' IXIII) "'>/ '-"OH L'. cide de formule (X) eso appelé ici IsoM-4 et ses dérivés tsls que des sels et esters, sont appelés dérivés d'Isoi-!-4, a!ors que la lactone correspondante de formule OH OH (XII) } i l (XI) est appelée ici IsoM-4 lactone. L'acide de formule (XII) dans lequel R représente un atome d'hydrogène est ap: elé ici IsoM-4' et ses dérivés sont appelés des dérivés d'IsoM-4', alors que la lactone correspondante de formule (XIII) est appelée ici IsoM-4' lactone. Parmi les esters des acides hydroxycarboxyliques de formule (I), on préfère les esters d'alkyle en C1-C5. Ces groupes alkyle peuvent être des groupes à chaîne droite ou ramifiée et comprennent par exemple les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle et isobutyle, parmi lesquels on préfère en particulier le groupe méthyleo Les acides hydroxy-carboxyliques forment également des sels avec divers cations, en particulier des métaux et de préférence des métaux alcalins tels que le sodium et le potas- sium. Les sels de sodium sont particulièrement préférés. Parmi les composés de l'invention, les composés que l'on préfère le plus sont la M-4 lactone, le sel de sodium du M-4, l'ester méthylique du M-4, l'IsoM-4'lactone, le sel de sodium d'IsoM-4' et l'ester méthylique d'IsoM4, le sel de sodium du M-4 étant particulièrement préféré. Les composés de l'invention peuvent être préparés par- l'hydroxylation, par voie enzymàtique, du ML-236B ou d'un de ses dérivés, spécifiquement le ML-236B acide carboxylique ou un sel ou ester de cet acide. Cette hydroxylation par voie enzymatique peut être effectuée comme une partie du métabolisme du ML-236B ou d'un deses dérivés par un mammifère, par exemple en adminis- trant du ML-236B à un animal approprié, recueillant un produit de métabolisme, par exemple l'urine, puis en sépa- rant le composé ou les composés désirés, selon l'invention, à partir de l'urine. Alternativement, le foie ou un extrait du foie, contenant une enzyme, peut être utilisé au lieu de l'animal vivant, Mais, les procédés utilisant le métabolisme animal ou des produits animaux ont une productivité relati- vement faible et sont difficiles à reproduire. En conséquence, la demanderesse proftre utiliser des microorganismes ou des extraits des microorganismes, contenant une enzyme. La procéd.' selon l'invention est donc de préference appliqué en ut''isant un micrcorganisme capable de convsrti% le ML-2365 ou un de ses d-rivés en un composé selon l'in- vsnticn, ou -n utilisant un extrait d'un tel microorganisme, cont-nant une enzyme. Les microorganismes particulièrement pr-férés sont ceux qui appa rtiennent aux genres suivants: M1ucoz, Rhizcopus, Zygorynchus, Circinella, Actinomucor, Gongro- nella, Phycomyces, Martierella, Pycnoporus, Rhizoctonia, Absidia, Cunninghamella, Syncephalastruri et Streptomyces. On pr."fèrs en particulier les espèces suivantes: i5 Absiiia coerulea Cunninghamella echinulata SynceDhalastrum racemosum Strentomyces roseochromogenus Mucor hiemalis f. hiemalis Mucor bacillifor;is Mucor circinelloides f. circinelloices Mucor hiemalis f. corticolus Mucor dimorDhosnorus Mucor fracilis M'Iucor genevensis Mucor globosus Mucor circinelloides f. griseo-cyanus Mucor heterosoorus Mucor spinescens RhizoDus chinensis Rhizcpus circinans Rhizopus arrhizus Zygorynchus moelleri Circinella muscae - I1 - Circinella rigida Circinella umbeilata Actinomucor elegeans Phycemvces blakesieeanus _Martierella isabellina Gongronella butieri Pycnooorus coccineus Rhizoctonia solani SynceDhalastrum niaricans 0 Absidia olauca var. paradoxa Parmi les souches des espèces ci-dessus, on prFfère en particulier: Absidia coerulea IF0-4423 Cunninghamella echiulata IF0-4445. Cunninghamella echinulata IF0-4444 Cunninchamellia echinulata ATCC-9244 Syncephalastrum racemosum IF0-4814 Syncephalastrum racemosum IF0-4828 Streptomrnyces roseochromoaenus NRRL-1233 Streptomvces roseochromogenus IF0-3353 StreDtomyces roseochromogenus IF0-3411 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-SS34 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-5303 Mucor hiemalis f. hiemrnalis IF0-8567 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-S449 Mucor hiemalis f. hiemialis IFO-8448 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-8565 Mucor hiemails f. hiemalis CBS-117.08 Mucor heiemalis f. hiemalis CBS-109.19 3 0 Mucor hiemalis f. hiemails CBS-200.28 Mucor hiemalis f. hiemais C3BS-242.35 Mucer hiemalis f. hiema-is CSS-ilO.Si9 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201. 65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circrinciloides IFO-.z; - 11 - Mucor circinelloides f. circinelloides IF0-5775 aucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 Mucor dimorphosporus IF0-4556 Mucor fragilis CBS236.35 Mucor genevensis IF0-4585 Mucor globosus HRRL 12474 Mucor circinelloides f. griseo-cyanus IF0-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 1 0 Mucor sDinescens IAM-6071 Rhizopus chinensis IF0-4772 Rhizoous circinans ATCC-1225 Rhizonus arrhizus ATCC-11145 Zygorynchus moelleri IF0-4833 j 5 Circinella muscaeIF0-4457 Circinella rigida NRRL-2341 Circinella umbellata NRRL-1713 Circinella umbellata IF0-4452 Circinella umbellata IF0-5842 2O0 2 0 Phycomyvces blakesleeanus NRRL-12475 Martierella isabellina IF0-6739 Gongronella butleri IF0-8080 Pycnooorus coccineus NRRL-12476 Rhizottonia solani NJRRL-12477 SynceDhalastrum nigricans NRRL- 12478 SynceDhalastrum nioricans IRRL-12479 Synceohalastrum nigricans NRRL- 12480 Absidia glauca var. paradoxa IF0-4431 Actinomucor elegans ATCC-6476 Les microoroanismes énumérés ci-dessus peuvent 9tre ob-:enus auprès de International Culture Collections, tel - 12- qu'indiqué par les codes joints è leur numéro d'entrée, lesquels codes ont les signific-.ticns suivantes: IFO = Institute for Fermentation, Dsaka,Japon NRRL = Agricultural Fesearch Culture Collection, Illinois, USA CES = CsEntral Bureau voor Schimmelcultures, Pays Bas IAM = Instit,ute of Applied Microbizlogy, Tokyo, Japon ATECC = American Type Culture Collection, Maryland, USA. Parni les espèces indiquées ci-dessus, on préfère en particulier: Absidia coerulea Cunninghamella echinulata SynceDhalastrum raceraosun Mucor hiemalis f. hiemails _! Mucor bacilliformis Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor hieSalis f. corticolus rLucor dimorphosporus Mucor fragilis Mucor genevensis Mucor gTobosus Mucor circinelloides f. griseocvyanus Mucor heterosoorus Plucor spinescens Pvncoorus coccineus Rhizoctonia solani S Synephal astrum nigricans et les souches sont s12s suivantes: particulièrement pr2frt:s des espèces Absidia coerulea IFO-4423 Cunnin; hamel a echinulata IFO-4445 Cunninahamrnella echinulata IFO-4444 Cunninahamella echinulata ATCC-9244 Syncepnalastrum racemosu IF0-.4814 Syncenhalastrum racemrosun IF-4328 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5834 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5303 -13 - tlucor hiemalis f. hiemalis IFO5304 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-8557 Mucor hiemalis f. hiemaiis IFO8449 -5.1Mucor hieqalis f. hienalisIFO-8448 Mucor hiemalis f. hiemaais:F08565 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-117.08 Mucor hiemaiis f. hiemalis CBS109.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-200.28 Mucor hie.males f. hiPemals CBS-Z42.iS 0 Mucor hiemalis f. hiemalis C"S-110.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201.S5 Mucor bacilliforsis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides iF0-4554 * Mucor circinelloides f. circirunloides IF0-5775 rirluccr hiemalis f. corticolus r4RRL-12473 Mucor dimorphosprus IF0-4556 Mucor frjgilis CSS-236.35 Mucor genevensis IF0-4585 ucor globosus NRRL 12474 *ucor circinelloides f. griseo-cyanus IF0-4563 2 0 Mucor heterosporusN'RRL-3154 Mucor spinescens IA1-6071 Pycnoporus coccineus I1RRL-12476 Rhizoctonia solani!IRRL-i2477 Syncephalastrum nigricans NRRL12478 Synceohalastrun nigricans NRRL-12479 2 5 Synceohalastrun ninricans NRRL-12480 Pour la pr'paration des composés de formules (IV) et (V) et de leurs sels, on préfère les espèces suivantes: Mucor hiemalis f. hiemali ilucor circinelloides f. circinelloides Mucor fraqilis Mucor cenevensis Mucor circinelloides f. qriseo-cyanus PvcnorDorus cccineus Rhizoctonia solani. - 14 - Pour la préparation des composés de formule (VI) et (VII) et de leurs sels, on préfère les espèces Svnceohalas- trum nioricans et Synceohalastrum racemosum. Pour la préparation des composés de formule (VIII) et (IX) et de leurs sels, on préfère les espèces Absidia cceru- lea et Cunninqhamella echinulata. Parmi toutes les espèces énumérées ci-dessus, on préfère en particulier Mucor hiemalis f. hiemalis, car elle est capable de convertir le ML-236B et ses dérivés en les compo- sés désirés de formule (I) à un taux de conversion de 90 % ou mime plus. La conversion du ML-236B ou de ses dérivés en des compo- sés de formule (I) peut être obtenue en mettant le micro- organisme cellulaire complet ou, dans certains cas, un extrait sans cellules du microorganisme, en contact avec le ML-236B ou un de ses dérivés. La forme du composé produit dépend des conditions de culture et de la forme du micro- organisme utilisé. C'est ainsi, par exemple, que si le microorganisme cellulaire complet est cultivé en présence de ML-236B ou d'un de ses dérivés, le produit est l'acide carboxylique, la lactone ou un sel de métal alcalin, selon les conditions de culture, en particulier selon le pH. D'autre part, si le ML-236B ou un de ses dérivés est simple- ment mis en contact avec un système cellulaire résiduel ou avec un extrait sans cellules, ie composé de l'invention est obtenu sous la forme d'un sel de métal alcalin. Le progrès de la réaction de conversion peut être déter- miné en prélevant des échantillons du mélange réactionnel au cours de la réaction pour évaluer le degré de conversion. Par exemple, la présence de la M-4 lactone peut être vérifiée par chromatographie en phase liquide en utilisant comme suoport le Micro bondak C18 (fabriqué par Waters Co. USA) et comme solvant du méthanol aqueux è 62 en volume/volume a raison de 1 ml/mn. En le détectant à l'aide de son absorp- tion ultraviolette à 237 nm, le M-4 donne un pic à un temps - 15 - dz rétention de 10 minutes,et cette donnée peut être utili- sée pour la vérification. Des techniques semblables sont applicables pour déterminer les autres composés de l'in- vention. Lorsque les microorganismes doivent être cultivés en présence du ML-236B ou d'un de ses dérivés pour produire les composés de l'invention, les conditions de culture et les milieux de culture utilisés doivent être choisis en fonction du microorganisme particulier à cultiver. Etant donné que les espèces de microorganismes proposées pour être utilisées dans le procédé selon l'invention sont bien connues, les con- ditions de culture et les milieux de culture à utiliser avec ces microorganismes sont également bien connus. Les composés de l'invention peuvent être séparés du mélange réactionnel selon des moyens classiques, par exemple par séparation par filtration des cellules microbiennes.(si nécessaire), puis purification du mélange restant. par toute combinaison de chromatographie en couche mince, chromato- graphie sur colonne ou chromatographie en phase liquide à haute performance. Les différents composés de l'invention, lorsqu'au moins deux de ces composés sont préparés ensemble, peuvent être séparés l'un de l'autre au cours d'une ou de plusieurs de ces opérations de purification chromatographique. En plus des composés selon l'invention, il est possible dans certains cas de préparer également un composé que la demanderesse a appelé M-3 et qui est connu sous le nom de 3',5'-dihydroxy-(dihydro-ML-236B) dans une demande de brevet intitulée 'Dérivés d'hydronaphtalène, leur préparation et leurs applications". Celui-ci peut également être séparé de la même manière. La demanderesse a trouvé que les composés de l'invention donnent une inhibition à 50 %, de la biosynthèse du choles- térol à des concentrations comparables ou, dans certains cas, bien inférieures aux concentrations requises par le ML-236B et certains autres composés similaires connus. Les - 16 - activités inhibitrices des composés de l'invention, en termes de la concentration en pg/ml requise pour inhiber à 50 % la biosynthèse du cholestérol Cmesurée par le procédé décrit dans le Journal of Biological Chemistry, 234, 2835 (1959.)] sont les suivantes: Ester méthylique du M-4 0,001 Sel de sodium du M-4 0,0008 M-4 lactone 0,016 Ester méthylique d', IsoM-4' 0,007 IsoM-4' lactone 0,013 M-4' 0,019 Sel de sodium du M-4' 0,00049 L'invention eût encore illustrée par les exemples suivants. EXEMPLE 1 Préparation de la M-4 lactone On inocule 20 flacons de Sakaguchi de 500 ml, contenant ml d'un milieu ayant la composition décrite ci-dessous, avec des spores d'Absidia coerulea IFO 4423. On soumet les flacons à une culture avec agitation à 26 C et 120 chocs/mn pendant 2 jours. A la fin de cette période, dans chacun des flacons on ajoute le sel de sodium du ML-236B à une concen- tration finale de 0,05 % en poids/volume. On poursuit la culture à 260C et 120 cbocs/mn pendant encore 5 jours. La composition du milieu est la suivante (les pour- centages sont indiqués en poids/volume): Glucose 2,0 % K2HP04 0,15 % MgSO4.7H20 0,15 NH4NO 0,1 % 4 3 Peptone 0,1 % Liqueur de macération de maïs 0.2 q- Extrait de levure ZnSO4..7H20 Eau ordinaire 0,1 % 0,001 % le complément (ajusté à pH 7,0) - 17 - Lorsque la culture Est terminée, on filtre la liqueur de réactcion et on ajuste le filtrat à pH 3 avec de l'acide trifluoroac-tique. On extrait le mélange résultant avec 3 portions d'un litre d'acétate d'éthyle pour obtenir des extraits cont:nant le M-4. Ce composé montre une valeur Rf de 0,45 par chromatographie en couche mince (plaque: gel de silice Merck Art 5715; solvant: un mélange 50:50:3 en volume de benzène, d'acétone et d'acide acétique). On lave lesjxtraits rassemblés avec une solution aqueuse, saturée, de chlorure de sodium, puis on ajoute une quantité cata- lytique d'acide trifluoroacétique pour la formation d'une lactone. On lave alors le mélange résultant avec une solu- ticn aqueuse de bicarbonate de sodium à 1 % en poids/volume, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on évapore à sec sous pression réduite. On soumet le résidu à une chromatographie en phase liquide pour préparation, Système 500 utilisant une cartbuche de Prep PAK-500/C18, fabriqués par Waters Associates (Prep PAK est une marque déoosée). On purifie avec une solution aqueuse de méthanol à 55 5 volume/volume et on recueille 50,1 mg de M-4 lactone. La M-4 lactone présente les propriétés physiques suivantes. 1) Spectre de résonance magnétique nucléaire: On mesure le spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) à 60 MHz dans du chloroforme deuterié en utilisant le tétraméthylsilane comme étalon interne, voir la figure 1 des dessins annexes. 2) Spectre d'absorption ultraviolette (solution de mé- thanol) x nm: 230, 236,7, 244,6. 3) Spectre d'absorption infrarouge (film liquide) -1 ) cm: 3400, 2950, 1725. 4) Chromatographie en couche mince (TLC) Plaque pour TLC: gel de silice Merck Art 5715; Solvant: benzène, acétone, acide acétique (50:50:3 en volume) Valeur Rf: 0,62 - l - EX^cIPLE 2 On prepare 48 mg de Mi-4 lactone selon las procédés décrits dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise Cunninchamella echinulata IFO 4445. EXEPLE 3 On prépare 30 mg de M-4 lactone selon lea procédés décrits dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise Streotomyces roseochromoqenus NRL 1233. EXEM1PLE 4 On prépare 5 mg de M-4 lactone selon les procédés décrits dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise SynceiDhalastrum racemosum IFO 4814. EXEMPLE 5 On prépare 6 mg de M-4 lactone selon les procédés décrits dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise Syncephalastrum. racemosum IFO 4828. EXEMPLE 6 Préparation de l'ester méthylique de l'IsoM-4' On inocule 20 flacons de Sakahuchi de 500 ml, contenant chacun 1GO ml d'un milieu ayant la composition ci-dessous, avec.es spores d'Absidia coerulea IFO 4423. On soumet les flacons à une culture avec agitation a 120.tours/mn et 26 C pendant 2 jours. A la fin de cette période, on ajoute dans chacun des flacons le sel de sodium du ML-236B à une concen- tration finale de 0,05 % en poids/volume. On poursuit la culture à 120 chocs/mn et 26"C pendant encore 5 jours. La composition du milieu est. la suivante (pourcen- tages indiqués en poids/volume): Glucose 2,0 % K2HPO4 0,15 % MgSO 4.7H20 0,15 % NH4NO3 0,1 % Peptone 0,1 Infusion de mais 0,2 Extrait de levure 0,1 - 19 - ZnS04.7HO 20,001 % ZnSO 4.?H20 O 0 Eau ordinaire le complément (ajusté à pH 7,0) Lorsque la culture est terminée, on filtre la liqueur de réaction et on ajuste le fil!rat à pH 3 avec de l'acide tri- fluoroactique. On extrait le mélange réactionnel avec trois portions d'un litre d'acétate d'éthyle pour obtenir des extraits contenant l'IsoM-4'. Ce composé à une valeur Rf de 0,45 par chromatographie en couche mince (plaque: gel de silicc lercK Art 5715; solvant: un mélange 50:50:3 en volume de benzène, d'acétone et d'acide acétique)o On lave l'extrait avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, puis on ajouta une solution éthérée de diazométhane. On laisse le mélange au repos pendant 30 minutes, puis on évapore à sec sous pression réduite. On place le résidu sur une colonnede Lobar (Merck Si 60, dimension A) et on purifie en utilisant comme système solvant un mélange 1:1 en volume de benzène et d'acétate d'éthyle. On obtient ainsi mg d'une fraction d'ester méthylique d'IsoM-4'. On purifie de nouveau cette fraction sur une colonne Lobar (Merck RP-8, dimension A) en utilisant une solution aqueuse d'acétonitrile à-35 % en volume/volume comme éluant et on obtient 78 mg d'ester méthylique de l'IsoM-4' pur, ayant les caractéristiques suivantes: 1) Spectre de résonance magnétique nucléaire: Le spectre de RMN mesuré à 100'MHz dans le chloroforme deuterié en utilisant le métraméthylsilane comme étalon interne est représenté sur la figure 2 des dessins annexés. 2) Spectre de masse: La mesure est effectué-e au moyen d'un spectromètre de masse, type D-300, fabriqué par Nippon Electronics!après silylation avec le N,O-bis(triméthylsilyl)trifluoroacétamid'E M/e: 654 (M+), 552, 462, 372, 272, 233, 231. 3) Spectre d'absorption ultraviolette (solution dans le méthanol) > nm: 229, 234,8, 244,5. max - 20 - 4) Spectre d'absorption infrarouge (film liquide): Tel que renrésenté sur la figure 3 des dessins annexés. ) Chromatographie en couche mince: Plaque pour TLC: gel de silice Merck Art 5715; Solvant: benzène, acétone (1:1 en volume); Valeur Rf: 0,88. En travaillant tel que décrit ci-dessus, mais en rempla- çant le diazométhane par un autre diazoalcane approprié, il est possible de produire d'autres esters d'Iso-r-4'. EXEMPLE 7 Preoar-tion de l'IsoM-4' lactone On répète le procédé décrit dans l'exemple 6 jusqu'à et y compris l'extraction avec de l'acétate d'éthyle pour obte- nir l'IsoM-4'. On lave les extraits réunis avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, puis on évapore à sec pour obtenir le produit de lactone. On place le résidu résultant sur une colonne Lobar (Merck Si 60, dimension A) et on purifie en utilisant comme système solvant un mélange 1:1 en volume de benzène et d'acétate d'éthyle, on obtient ainsi 198 mg d'IsoM-4' lactone. On purifie de nouveau ce prod'iit au moyen d'une colonne Lobar (Merck RP-8, dimension A) qu'on élue avec une solution aqueuse d'actonitrile à % en volume/volume, pour obtehir 82 mg d'IsoM-4' lactone pure, présentant les caractéristiques suivantes: 1) Spectre de résonance magnétique nucléaire: Le spectre de RMN mesuré à 100 MHz dans le chloroforme deutérié en utilisant le tétraméthylsilane comme étalon interne est représenté sur la figure 4 des dessins annexés. 2) Spectre d'absorption ultraviolette (solution dans le méthanol) /a nm: 229, 234,8, 244,5. max 3) Spectre d'absorption infrarouge (film liquide): Tel que représenté sur la figure 5 des dessins annexés. EXEMPLE 8 On prépare 63 mg d'IsoM-4' lactone, selon les procédés de l'exemple 7, mais en utilisant Cunninohameila echinulata IFO 4445. - 21 - r, E PLE 9 On prCpare 24 mg d'IsoM;-4' lactone salon les procédés de l'exemple 7, mais en utilisant Svncephalastrum race- rosum IFO 4814. EXE-:PLE 1 0 Un prépare 35 mg d'IsoM-4' lactone selon les procédés de l'exemple 7, mais en utilisant Syncashalastrum race- mosum 4828. E A.PLE 11 On prépare 12 mg d'IsoMi-4' lactone salon les procédés de l'exemple 7, mais en utilisant Streptomyces roseochromo- qenus NRRL 1233. EA'2DL r1 2 Pr4oarat-on du-sel de sodium de l'IsoM-4' On dissout 10 mg d'IsoM-4' lactone dans une faible quantité d'acétone. A la solution, on ajoute une quantité équivalente d'hydroxyde de sodium et on laisse le mélange au repos pendent 1 heure. On ajuste le pH du mélange résultant à une valeur de 8,0 avec de l'acide chlorhydrique 0,1 N. On élimine l'acétone mar distillation et on place le résidu sur une colonne XAD-20 (environ 20 ml). On lave la colonne avec de l'eau distillée, puis on élue avec 50 ml d'une solu- tion aqueuse d'acétone à 50 % en volume/volume. On élimine de nouveau l'acétone par distillation et on lyophilise le résidu pour obtenir 6 mg du el de sodium de l'IsoM-4', présentant les caractéristiques suivantes: 1) Spectre d'absorption ultraviolette 'solution dans le m!thanol) kM nm: 229 (épaulement), 235, 245 (épau- max lament). -1 2) Spectre d'absorption infrarouge (KBr) cm: 3400, 2850, 1710, 1580. 3) Chromatographie en couche mince: Plaque pour TLC: gel de silice Merck Art 5715; Solvant: benzène, acétone, acide acétique (50:50:3 en volume); Valeur Rf: 0,45. - 22 - EXEMPLE 13 Préparetion de l'ester méthvlioue du M-4 On inocule 20 flacons de Sakaguchi de 500 ml, contenant chacun 100 ml d'un milieu de la même composition que dans l'exemple 1, avec des spores d'Absidia coerulea IFO 4423. On soumet les flacons à une culture avec agitation à 26 C et tours/mn pendant 2 jours. Dans chacun des flacons, on ajoute alors le sel de sodium du ML-236B à une concentration finale de 0,05 % en poids/volume. On poursuit la culture à 26 C et 120 chocs/mn pendant encore 5 jours. Lorsque la culture est terminée, on filtre la liqueur de réaction et on ajuste le filtrat à pH 3 avec de l'acide trifluoroacétique. On extrait le iélange résultant avec 3 portions d'un litre d'acétate d'éthyle pour obtenir des extraits contenant du M-3, du M-4 et de l'IsoM-4'. Le M-4 et ltIsoM-4' montrent une valeur Rf de 0,45 oar chromatogra- phie en couche mince (Plaque: gel de silice Merck Art 5715; sclvant: un mélange 50:50:3 en volume de benzène, d'acétone et d'acide acétique). On lave les extraits réunis avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, puis on ajoute une solution éthérée de diazométhane. On laisse le mélange au repos pendant 30 minutes et on évapore à sec sous pression réduite. On place le résidu sur une colonne Lobar (Merck Si 60, dimension A) et on purifie en utilisant un mélange 1:1 en volume de benzène et d'acétate d'éthyle, on sépare alors une fraction contenant l'ester méthylique de l'IsoM-4' et une fraction contenant l'ester méthylique_ du M-4. On obtient 185,3 mg de la dernière fraction active dont on recueille 20 mg d'ester méthylique du M-4 pur, sous forme d'une huile en utilisant une colonne Lobar (Merck RP-8, dimension A) et en éluant avec une solution aqueuse * d'ac.tonitrile à 35 a, en volume/volume. L'ester méthylique du M-4 presente les caractéristiques suivantes: 1) Spectre de résonance magnétique nucléaire: - 23 - On effectue la mesure à 200 MIHz dans le chloroforme deutérié en utilisent le tétraméthylsilane comme étalon intesrne. b pDm: 0,88 (3H, triplet, J = 7,3 Hz); 0,89 (3H, doublet, J = 6,5 Hz); 1,12 (3H, doublet, J = 6,8 Hz); 1,1 - 1,7 (10H, multiplet); 2,34 (1H, sextuplet, J = 7 Hz); 2,3 - 2,5 (2H, multiplet); 2,49 (2H, doublet, J = 6,4 Hz); 2,58 (1H, multiplet); 3,72 (3H, singulet); 3,78 (1H,.multiplet); 4,25 (1H, quintet, J = 7 Hz); 4,4 (1H, multiplet); ,42 (1H, multilet); ,56 (1H, multiplet); , 90 (1H, doublet double, J = 9,8 et 5,6 Hiz); 5,99 (1H, doublet, d = 9,8 Hz). 2) Spectre de masse: On effectue la mesure avec un spectromètre de masse, type D-300, fabriqué par Nippon Electronics (après silylation avec le N,O-bis(trim6thylsilyl)trifluoroacétamide). M/e: 654 (M+), 552, 462, 372, 290, 272, 233, 231. 3) Spectre d'absoption ultraviolette (solution idans l'Stha- nol) \max nm: 230,1,237,3, 246,4. max 4) Spectre d'absorption infrarouge (fiUm liquide) -I cm: 3400, 2950, 1730. 5) Chromatographie en couche mince: Plaque pour TLC: gel de silice Merck Art 5715; Solvant: benzène et acetone (1:1 an volume); Valeur Rf: 0,88 En travaillant comme ci-dessus, mais en remplaçant le diazométhane par un autre diazoalcane approprié, il est possible de produire d'autres esters de M-4. -24 - EXEi.PLE 14 Pr=oar=tion des sels de sodium dsM-4 et IsoM-4' Cn répète le procédé décrit dans l'efenple 1,.excepté que l'cn utili- se NaHPO4 au lieu de K2HPO4 jusqu'à et y inclus la filtration de la liqueur de réaction. On adsorbe alors le filtrat sur:une colonne HP-20 (fabriquée par Mitsubishi Chemical Industries).Aorès avoir lavé la colonne avec de l'eau,cn élueles fractions contenant le sel de sodium du M-4,'le sel de sodium de l'IscM-4' et le sel de sodium du M-3, avec une solution aqueuse d'acétone à 50 % en volume/volume. On lyophilise les fractions actives et on obtient 830 mg d'un produit lyophilisé qu'on purifie en le soumettant plusieurs fois à une chromatographie en phase liquide à haute performance (colonne: Micro.Bondapack C1iV solution aqueuse de méthanol à 40 % en volume/volume, 1 ml/mn) pour obtenir 32 mg du sel de sodium du M-4 et 280 mg du sel de sodium de l'IsoM-4'. Les propriétés du sel de sodium de l'IsoM-4' sont iden- tiques à celles du produit de l'exemple 12 et les propriétés du sel de sodium du M-4 sont les suivantes: 1) Spectre de résonance magnétique nucléaire: On effectue la mesure à 200 MHz dans le méthanol deuté- rié en utilisant le t4traméthylsilane comme étalon interne. _ ppm:. 0,91 (3H, triplet, J = 7,5 Hz); 0,92 (3H, doublet J = 7 Hz); 1,12 (3H, doublet, J = 7 Hz); 1,1 - 1,8 (10H, multiplet); 2,25 (1H, doublet double, J = 15 et 7,6 Hz); 2,34 (1H, doublet double, J = 15 et 5,5 Hz); 2,2 - 2,4 (3H, multiplet); 2,48 (1H, multiplet); 3,68 (1H, multiplet); 4,07 (1H, multiplet); 4,28 (1H, multiplet); 5,36. (1H, multiplet); - 25 - ,48 (1H, doublet double, J = 3 et 3 Hz); ,88 (1H, doublet double, J = 9,6 et 5,3 Hz); ,98 (1H, doublet, J = 9,8 Hz). 2) 5pectre d'absorption ultraviolette (solution dans le mE:thano!) À max nm: 230,0, 237,2, 245,0. max 3) Spectre d'absorption infrarouge (KBr) ? cm 3400, 2900U, 1725, 1580. 4) Chromatographie en couche mince: Plaaue pour TLC: gel de silice Merck Ait 5715; Solvant: benzène, acétone et acide acétique (50:50:3 en volume); Val-ur Rf: 0,45. EXE.-'PLE 15 On prépare 18 mg d'ester méthylique du M-4, selon les procédés décrits dans l'exemple 13, mais en utilisent Cunninn hamella echinulata IFO 4445. EXE:PLE 16 On prépare 33 mg d'ester méthylique du M-4, selon les procédés décrits dans l'exemple 13, mais en utilisant Streo- tomyces roseochromoqenus NRRL 1233. EXEMPLE 17 On prépare 12 mg d'ester méthylique du M-4, selon les procédés décrits dans l'exemple 13, mais en utilisant 5nce- phalastrum. racemosum IFO 4814. EXEMPLE 18 On prépare 16 mg d'ester méthylique du M-4, selon les procédés décrits dans l'exemple 13, mais en utilisant Syncs- phalastrum racemosum IFO 4828. EXE;MSPLE 19 Préparation de l'ester méthylique du M-4 A 5 briquets (mâles, poids moyen 10 kg), on administre du ML-236B à une dose de 200 mg/kg/jour et on collecte leur urine pendant 3 jours. On fait passer 3 litres d'urine collec- tée sur une colonne XAD-2 de 50C ml, on élue avec 500 ml d'une solution aqueuse d'acétone à 50 % en volume/volume, puis, après avoir éliminé l'acétone par distillation sous pression - 26- on ajuste le liquide résiduel à pH 3 en ajoutant de l'acide triflucroacntique. On extrait alors trois fois le m6]ange, avec 3 portions d'un litre d'acétate d'éthyle afin d'obte- nir le M-4. Ce composé a une valeur Rf de 0,45 par chromato- graphie en couche mince (plaque pour TLC: gel de silice Art 5715, fabriqué par Merck & Co., Inc.; solvant: un m-lange 50:50:3 en volume de benzène, d'acétone et d'acide acétique). On leve l'extrait avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, et après addition d'une solution éthérée de diazométhane, on laisse au repos pendant minutes. Puis on évapore à sec sous pression réduite, On dissout le résidu dans 10 ml d'une solution aqueuse de métha- nol à 55 t, en volume/volume et on fait passer sur une colonne chromatogra-hique (Produit de Merck & Co., Inc., RP-8, dimen- sion B). Après avoir fait passer 200 ml d'une solution aqueuse de méthanol à 55 % en volume/volume, on élue avec une solution aqueuse de méthanol à 60 % en volume/volume. On élimine les 240-premiers ml de l'éluat et on recueille les 120 ml sui- vants. On évapore cette fraction à sec et on dissout le résidu dans 2,5 ml d'une solution aqueuse de méthanol à % en volume/volume, puis on purifie par chromatographie en phase liquide à haute performance (JASCO-Trirotar, colon- ne: -- Bondapak C18). On sépare la portion qui présente le quatrième pic et on élimine le solvant par distillation pour obtenir l'ester méthylique du M-4 sous la forme d'une huile incolore ayant les propriétés indiquées dans l'exemple 13. On obtient 4 mg de produit. E, Pré6arat-ion du M-4 Dans cet exemple, on utilise un fois de lapin homogéné- isé pour obtenir le M-4 à partir du ML-236B. (a) Solution d'enzvme A un volume de foie de lapin, on ajoute 3 volumes d'une solution quiest constituée de 1,15 ?È en poids/volume de chlorurs de potassium et de 10 mM de tampoh de phosohate - 27 - (1-H 7,4) et on homogénéise le mélange. On centrifuge alors le mdlange homogénéisé pendant 20 minutes à 9 000 g et on prlève la fraction surnageante comme solution d'enzyme. (b) Solution du co-facteur -Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate de forme r6duite (NADPH) 3 mg Solution de MgC12 (508 mQ/lO ml) 0,1 ml Solution de KC1 à 1,15 % en poids/volume 0,3 ml Solution de tampon de phosphate 0,2 M (pH 7,4) 0,6 ml On mélange les substances ci-dessus jusqu'à un volume total de 1 ml pcur obtenir la solution du co-facteuro (c) Solution de réaction On mélange 80 pl de la solution d'enzyme cidessus, 20 jil de la solution du co-facteur ci-dessus et 2 ul d'une solution de êIL-236B dans le méthanol pour obtenir une con- centration finale en ML-136E de 1 mM. On agite la solution résultante pendant 30 minutes à 370C. Le M-4 se forme dans le mélange réactionnel et on l'identifie par chromatogra- phie en couche mince ( dans les mêmes conditions que dane l'exemple 19). EXEMPLE 21 Préparation du sel de sodium du M-4 On dissout 2 mg de l'ester méthylique de M-4 dans 1 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 N 't on soumet à hydrolyse à 3G C pendant 1' heure. On lave le mélange réactionnel avec 1 ml de chloroforme et on ajuste la Dhase aqueuse résultante à pH 8 par addition d'acide chlor- hydrique 0,1 N, puis on fait passer sur une colonne XAD-2 (environ 5 ml). On lave la colonne avec 20 ml d'eau distil- lée et on élue le produit recherché avec 15 ml d'une solution aqueuse d'ac tone à 50 % en volume/volume. On élimine l'acé- tone par distillation à partir de l'èluat. Par chromatogra- phie en phase liquide à haute performance, le résidu con- firme ne donner qu'un seul pic (temps de rétention 13 minutes, élution avec unesolution aqueuse de méthanol à 40 % -28- - en volume/volume à 1 ml/mn). On lyophilise le résidu et on obtient alors 0,8 mg de sel de sodium du M-4 ayant les pro- priétés du produit de l'exemple 14. EXEMPLE 22 Préparation de l'ester méthylique du M-4 On inocule 20 flacons Erlenmeyer de 500 ml contanant chacun 100 ml d'un milieu ayant la composition indiquée ci- après, avec des spores de Mucor hiemalis-f. hiemalis IFO- 5834. On soumet l'inoculum-à une culture avec agitation à 26 C et 220 clocs /mn. Après 4 jours, on ajoute du ML-236B à une concentration finale de 0,05 % en poids/volume et on poursuit la culture à 26"C et 220 chocs/mn pendant 6 autres jours. La composition du milieu est la suivante (pourcentages En poids/volume): Glucose 1,0 % Peptone 0,2 % pH Extrait de viande 0,1% non- Extrait de levure 0,1 % Lajusté Infusion de mais 0,3 % Eau ordinaire le complément Lorsque la culture est terminée, on ajuste le filtrat à pH 3 avec de l'acide trifluoroacétique. On extrait trois fois le mélange, avec des portions de 100 ml d'acétate d'éthyle. On obtient une fraction contenant le M-4 qui a une valeur R de 0,45 par chromatographie en couche mince f (plaque: gel de silice Merck Art 5715; solvant: un mélange :50:3 en volume de benzène, d'acétone et d'acide acétique). Le taux de conversion atteint 90 %. On lave cet extrait avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, après quoi on ajoute une solution éthérée de diazométhane. On laisse le mélange résultant au repos pendant 30 minutes, puis on concentre à sec sous pression réduite. On place le résidu sur une colonne Lobar (Merck Si 60, dimension A) et on purifie avec un mélange 1:1 en volume de benzène et d'acétate d'éthyle. On obtient alors environ 600 mg d'ester méthylique du M-4, ayant les mêmes, propriétés que le - 29 - produit de l'exemple 13. EXEMPLE 23 r-'Dareten de la M-4 lactone On répète le procéd( décrit dans l'exemple 22 jusqu'à et y compris le lavage des trois extraits à l'acétate d'éthyle avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. On évaeoore ensuite la solution résultante à sec pour obtenir un produit de lactons. On cristallise le produit dans l'acétate d'éthyle et on recueille environ 560 mg (56 %) de M1-4 lactone, ayant les mêmes propriétés que le produit de l'exemple 1. EXEi.,PLE 24 Préoarmtion du sel de sodium du M-4 On répète -le procédé décrit dans l'exemple 22 pour obt:nir 1,9 litre du filtrat provenant de la réaction de conversion. On extrait trois fois ce filtrat, avec des portions d'un litre d'?cétate d'éthyle pour obtenir des fractions ccntenant le M-4. En transférant immédiatement ces fractions dans une solutiun aqueuse de bicarbonate de sodium à 5 % en poids/volume, on obtient une fraction conte- nant le sel de sodium du M-4. Puis on ajuste la fraction du sel de sodium de M-4 à pH 7,0 avec de l'acide chlorhydri- que 2N et on adsorbe sur une colonne HP-2D (fabriquée par Mitsubishi Chemical Industries). Par lavage à l'eau et élution avec une solution aqueuse d'acétone à 50 % en volume/ volume, on obtient une fraction contenant le sel de sodium du M-4 dont on recueille 570 mg (52 %) d'un produit lyophi- lisé ayant les propriétés décrites dans l'exemple 14. EXEMPLE 25 Préparation du M-4 On répète le procédé décrit dans l'exemple 22, si ce n'est qu'on utilise les microorganismes suivants, la conver- sion en M-4 étant indiquée par les codes adjoints: Microoroanisme Conversion en M-4 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5303 +4 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8567 +4 - 30 - Microorqanisme (suite) Mucor Mucor Muucor Mucor Mucor Mucor Muccor P ucor hiemalis hiemalis hiemalis hiemalis hiemalis hiemalis hiemalis hiemalis f. hiemalis iF0-8449 f. hiemalis IF0-8448 f. hiemalis IF0-8565 f. hiemalis CBS-117.1 f. hiemalis CBS-109.1 f. hiemalis CBS-2CO.; hiemalis CBS-242. f. hismalis CBS-110.1 Mucor hiemalis f. hiemalis Conversinen' [1-4 +4 +4 + 4 +4 +4 +4 +4 +4 +4 la CBS-201. Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides IF0-4554 MIcor circinelloides f. circinelloides IF0-5775 Mucor hièmalis f. corticolus NRRL-12473 Mucor dimozphosporus IF0-4556 Mucor fraoilis CBS-236.35 Mucor qenevensis IF0-4585 Mucor qlobosus NRRL12474 Mucor circinelloides f. griseo-cvanus IF0-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor soinescens IAM-6071 Mucor chinensis IFO-4772 Rhizoous circinans ATCC-1225 Rhizopus arrhizus ATCC-11145 Zycorvnchus moelleri IF0-4833 Circinella muscae IFO-4457 Circinella riqida NRRL-2341 Circinella umbellata NRL-1713 Circinella umbellata IFC- 4452 Circinella umbellata IF0-5642 Actinomucor elecans ATCC-6476 Phycomyces blakesleeanus NRRL-12475 trace +1 +1 trace trace +1 +1 trace + 1 trace trace trace +1 +1 +1 +1 trace +1 +1 +1 +1 trace - 31 - M'artierella isbellina IFO-6739 ronoronella butleri IFO-8080 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani NRRL-12477 Les codes représentant les cons signific-;tions suivantes: trace = 0,5 - ou moins +1 = 0,5 - 5 % +2 = 5, - 10,0 % +3 = 10,0 - 30,0 % trace +1 +3 +2 versions en M-4- ont les +4 = 70,0 - 90,0 % EXEM-PLE 26 Préparation de l'IsoM-4' lactone On inocule 20 flacons de Sakaguchi de 500 ml, contenant chacun 100 ml d'un milieu de la composition décrita dans l'exemple 22 avec des spores de Circinella muscae IFO-4457. On soumet l'inoculum à une culture avec agitation à 26 C et cdhocs /mn. Après 4 jours, on ajoute du ML-236B jusqu'à une concentration finale de 0, 05 %, en poids/volume et on poursuit la culture à 26 C et 120 chocs /mn pendant encore 6 jours. Lorsque la culture est terminée, on filtre le mélange de réaction de conversion et on ajuste le filtrat à pH 3,0 avec de l'acide triflueroac6tique. On extrait ensuite trois fois le mélange avec des portions d'un litre d'acé- tate dtéthyle pour obtenir une fraction contenant de l'IsoM-4'. On lave cet extrait avec une solution aqueuse saturOe de chlorure de sodium, puis on évapore à sec.On obtient ainsi un produit de lactone. On place le rsidu sur une colonne Lobar (Merck Si 60, dimension A) et on purifie avec un système à l'acétate d'èthyle pour recueillir 12 mg d'IsoM-4' lactone ayant les propriétés décrites dans l'exemple 7. EXEMPLE 27 Préparation de la M-4' lactone On inocule 20 flaccns Erlenmeyer de 500 ml, contenant - 32 - chacun 100 ml d'un milieu ayant la composition indiquÉe ci- dessous, avec des spores de SvnceDhalastrum nioricans NRRL-12478. On soumet l'inoculum à une culture avec agitation à 26 C et 220 tours/mn. Après 3 jours, on ajoute du ML-236B jusqu'à une concentration finale de 0, 05 % en poids/volume et on poursuit la culture à 260C et 220 tours/mn. La composition du milieu est la suivante (pourcentages en poids/volume): Glucose 1 % Peptone 0,2 % Extrait de viande 0,1 % Extrait de levure 0,1 % Infusion de mais 0,3 % (pH non-ajusté) Lorsque la culture est terminée, on filtre le mélange de réaction de la conversion et on ajuste le filtrat à pH 3 avec de l'acide trifluoroacétique. On extrait trois fois le mélange avec des portions d'un litre d'acétate d'éthyle pour obtenir une fraction contenant le M-4t qui a une valeur Rf de 0,46 par chromatographie en couche mince (Plaque: gel de silice Merck Art 5715; solvant: un mélange 50:50:3 en volume de benzène, d'acétone et d'acide acétique), On lave cet extrait avec une solution aqueuse saturée de chlo- rure de sodium, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on soumet à une lactonisation en ajoutant une quantité catalytique d'acide trifluoroacetique. On lave alors le mélange résultant avec une solution aqueuse de bicarbonate_de sodium à 5 % en poids/volume, on déshydrate avec du sulfate de sodium anhydre et on évapore à sec. On cristallise le résidu dans l'acétate d'éthyle et on recueille environ mg de M-4' lactone ayant les propriétés physiques suivantes: t) Spectre de résonance magnétique nucléaire: mesuré dans le chloroforme deut#rié à 100 MHz, en utilisent le titra:néthylsilane comme étalon interne. ppm: - 33 - 6,01 (1H, doublet); ,90 (1H, quartet); ,75 (1H, multiplet); ,50 (1H, multiple'); 4,60 (1H, multiplet); 4,25 (1H, multiplet). 2) Spectre d'absorption ultraviolette (methanol) /Max nm: 23C, 237, 245. 3) Spectre d'absorption infrarouge (KBr) -1 r cm: 3500, 1720. 4) Spectre de masse: M/e: 406 (M+), 304, 286. ) Rotation optique: f.]21 = +310 9 (c = 0,66, méthanol). 6) Point de fusion: 141 - 1430C. 7) Analyse élémentaire: Calculé: C 67,95 %; H 8,43 Trouvé: C 68,05 %; H 8, 37 % 8) Chromatographie en couche mince: Plaque pour TLC: cel de silice Merck Art 5715. Solvant: benzène-acétcne (1:1 en volume) Valeur R: 0,64. f EXEMPLE 28 Prparatticn du sel de sodium du M-4' En suivant pratiquement les mêmss procédés de culture que dans l'exemple 27, on obtient un mélange de réaction de conversion. Lorsque la culture est terminée, on filtre le mélange de réaction de conversion, et on ajuste le filtrat à pH 3 avec de l'acide trifluoroacétique. On extrait alors 3 fois avec des portions d'un litre d'acétate d'éthyle pour obtenir une fraction contenant le M-4' qu'on lave avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium et on traite immédiatement avec une solution aqueuse de bicarbonate de - 34 - sodium à 5 % en poids/volume poir obtenir une fraction contenant le sel de sodium du ?-4'. On ajuste la couche aqueuse ainsi obtenue à pH 8,0 avec de l'acide chlorhydrique 0,1 N et on adsorbe sur une colonne de résine Diaion HP 20 (fabriquée par Mitsubishi Chemical Industries). On élue ensuite avec une solution aqueuse d'acétone à 50 5% en volume/ volume. Un élimine l'acétone par distillation et on lyophi- lise le résidu, grâce à quoi on recueille 1,41 g du sel de sodium du M-4' ayant les propriétés physiques suivantes: 1) Spectre de résonance magnétique nucléaire: Niesuré dans le chloroforme deutérié à 60 MHz, en utili- sans le tétraméthylsilane comme étalon interne. ppm: 6,00 (1H, doublet); 5,C5 ('IH, quartet); ,70 (1H, large singulet); - 5,50 (1H, large singulet). 2) Spectre d'absorption ultraviolette (méthanol) ÀMax nm: max 230, 238, 246. -1 3) Spectre d'absorption infrarouge (KBr) cm: 34G0O, 29OC, 1680. EXEMPLE 29 Préparation de l'ester méthylique du M-4' En suivant pratiquement les mêmes procédés de culture que dans l'exemple 27, on obtient un mélange de réaction de conversion. Lorsque la culture est terminée, on filtre le mélange de conversion et on ajuste le filtrat à oH 3 avec de l'acide trifluoroacétique. On extrait ensuite trois fois avec des portions d'un litre d'acétate d'éthyle. On lave les extraits réunis avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium et on y ajoute une solution éthérée de diazométhane. On laisse le mélange résultant au repos pendant 30 minutas, puis on concentre à sec sous pression rduite. On purifie le résidu en utilisant une colonne Lobar (Merck RP-8, dimension A) et un mélange 1:1 en volume de benzène et d'acétone comme - 35 - solvant de développement. On obtient 150 mg d'ester méthy- liquc du M-4' sous la forme d'une substance huileuse, ayant les propriétés suivantes: 1) Spectre de résonance magnétique nucléaire: Mesuré dans le chloroforme deutérié à 60 MHz, en utili- sant le tétraméthylsilane comme étalon interne. à ppm: 6,01 (1H, doublet); ,9D (1H, quartet); 5,75 (1H, large singulet); , 50 (1H, large singulet); 3,70 (3H, singulet)., 2) Spectre d'absorption ultraviolette (màthanol)} max nhm: 230, 238, 246. 3) Spectre d'absorption infrarouge (film liquide) -1 cm: 3400, 1730. 4) Analyse de masse: On effectue la mesure apres silylation avec le N,O-bis- (triméthylsilyl)trifluoroacétamide, en utilisant un spectro- mètre de masse, type D-300, fabriqué par Nippon Electronics: M/e: 654 (M + )o - 36 - REVENDIC ATI ENS 1. Composés de formule (.): HOOCH i ) I (I' i R (dans laquelle R représente un groupe de formule ou CH3 et des lactones cycliques, des sels et des esters de ces composés. 2. Composés selon la revendication 1, ayant la formule (II): i - 7 - Rl0o0C,,-, OH HO cHH3 I H CH, HO / i (dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un grcupe alkyls an C -C!) et les sels pharmaceutiquement accep- _E tnbles dz l'acide o R reporésente un atome d'hydrogène. 3. Composés selon la revendication 2, caractérisés en ce que R représents un atome d'hydrogène. 4. Composés selon la revendication 2, caractérisés an ce que R représente un griupe alkyle en C1-C5. 5. Composés selon la revendication 2, caractérisés en ce que R1 rsoprsente un grcupe méthyle. 6. Composés selon la revendication 2, sous la forme de sels de métaux alcalins. 7. Composés selon la revendication 6, sous la forme du sel de sodium. 8. Composé salon la revendication 1, ayant la formule (III): O OH II 0X/ 0 O| IIII] - 38 - 9. Composés selon la revendication 2, ayant la confi- ourat-on indiques dans la formule (IV): Rlooc nH * HO H 9 O H H 3 C 0-- e (lvi CH3 H!CH !.0 X - c ' (dans laquelle R est tel que défini dans la revendication 2) et-leurs sals pharmacautiquement acceptables. 10. Composés salon la revendication 9, caractérises en ce que R représente un atome d'hydrogène. 11. Composés selon la revendication 9, caractérisés en ce que R représente un groupe alkyle en C1-C5. 12. Composés selon la revendication 9, caractérisés en ce que R repr5sente un groupe méthyle. 13. Composés selon la revendication 9, sous la forme des sels de métaux alcalins. 14. Composés selon la revendication 13, sous la forme du sel de sodium. 15. Composé selon la revendication 8, ayant la configu- ration indinuée dans la formule (V): H3C CH3 7- ACH3 16. Composés salon la ravsndication 2, ayant la configu- - 39 - ration indicu6s dans la formule (VI): R100 C,,' H l 0 C,HOH RO OC (i H Q H3C - H CH3 CH3 HO (dans laquelle R est tel que défini dans la revendication 2) et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. 17. Composés selon la revendication 16, caractérisés en ce que R1 représ:nte un atome d'hydrogène. 18. Composés selon la revendication 16, caractérisés en ce que R1 représente un groupe alkyle en C-'Cso 19. Composés selon la revendication 16, caractérisés en ce que R reDrésents un groupe méthyle. 20. Composés selon la revendication 16, sous la forme des sels de métaux alcalins. 21. Composés selon la revendication 20, sous la forme du sel de sodium. 22. Composé selon la revendication 8, ayant la confi- guration indiquée dans la formule (VII): 0 X "'H,VIII CH3 - - 40 - 23. Composés selon la revendication 1, ayant la formule (VIII): H R100C Xl fl. HCO CH3 J>"X>Y/ CH3 OH (dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C5) et les sels pharmaceutiquement acceptables de l'acide o R représente un atome d'hydrogène. 24. Composés selon la revendication 23, caractérisés en ce que R' représente un atome d!hydrogène. 25. Composés selon la revendication 23, caractérisés en ce que R représente un groupe alkyle en C1-C5. 26. Composés selon la revendication 23, caractérisés en ce que R représente un groupe méthyle; 27. Composés selon la revendication 23, sous la forme des sels de métaux alcalins. 28. Composés selon la revendication 27, sous la forme du sel de sodium. 29. Composé selon la revendication 1, ayant la formule (IX): ou -O. H3C CH jl X CH3 n.i - 41 - 30. ProcédJ cour la preparation d'un composé de formuie (I): HOOC OH R (dans laquelle R reprOsanta un groupe de formule 0O C-3 CH3 CuH OH ou d'une lactone cyclique, d'un sel ou d'un ester de ce composé, caractérisé en ce qu'on hydroxyle par voie enzyma- ticue un substrat choisi parmi'le ML-236B, ou le ML-236B acide carooxylique ou un de ses sels ou esters. 31. Procédé selon la revendication 30, caractéris& en ce que l'hydroxylation par voie enzymatique est effectuée par un micoorganisme choisi parmi les microorganismes des genres Mucor, Rhizopus, Zygorynchus, Circinella, Actinomucor, Gongronella, Phycomyces,;Mvartieoella, Pycnoporus, Rhizoc- tonia, Absidia, Cunninghamella, Syncephalastrum ét Strepto- myces ou avec un extrait contenant une enzyme, sans cellules, obtenu à partir de ces microorganismes. 32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en de que le microorganisme est cnoisi parmi: - 42 - Absidia coerulea Cunningha'nella ecninulata Syncephalastrum racemosum StreDtomyces roseochromnogenus Mucor hiemalis f. hiemalis Mucor bacilliformis Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor hiemalis f. corticolus Mucor dimorDhosDorus Mucor fragilis Mucor cenevensis Mucor alobesus Mucor circinelloides f. griseo-cyanus Mucor heterosporus Mucor sDinescens Rhizopus chinensis Rhizopus circinans RhizoDus arrhizus Zygorynchus moelleri Circinella muscae Circirella riaida Circinella umbellata Actinomnucor elegans Phycomyces blakesleeanus Martierella isabellina Gongronella butleri Pycnoporus coccineus Rhizoctonia solani SynceDhalastrum nigricans Absidia glauca var. paradoxa 33. Procdé selon la revendication 32, caractérisé en ce aue ie microorganisme Est cboisi parmi: - 43 - Absidia coerulea IF0-4423 Cunninghamella echinulata IFO-4445 Cunninghamella echinulata IFO-4444 Cunninghamella echinulata ATCC-9244 Syncephalastrum racemosum IFO-4814 Syncephalastrum racemosum IF0-4828 Streptomyces roseochromoQenus NRRL-1233 Streptomyces roseochromogenus IF03363 Streptomyces roseochromogenus IF0-3411 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-5834 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-5303 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-8567 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-8449 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8448 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-8565 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-117.08 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-109.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-200.28 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-242.35 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-110.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201.65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides IF0-4554 Mucor circinelloides f. circinelloides IF0-5775 Mucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 Mucor dimorphosporus IF0-4556 Mucor fragilis CBS236.35 Mucor genevensis IF0-4585 Mucor globosus NRRL-12474 Mucor circinelloides f. griseo-cyanus IF0-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor spinescens IAM-6071 Rhizopus chinensis IF0-4772 Rhizopus circinans ATCC-1225 Rhizoous arrhizus ATCC-11145 Zygorynchus moelleri IF0-4833 Circinella muscae IF0-4457 Circinella rigida NRRL-2341 Circineila umbellata NRRL-1713 Clrcinella umbellata IF0-4452 Circinella umbellata IF0-5842 Phycomyces blakesleeanus NRRL-12475 Hartierella isabellina iF06739 Gongronella butleri IFO-8080 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani ?IRRL-12477 Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 Syncephalastrum nigricans NRRL-12479 Syncephalastrun nigricans NRRL-12480 Absidia glauca var. paradoxa IF0-4431 Actinomucor elegans ATCC-6476 34. Procédé selon la revendication 33, caractérisé en en ce qu'on sépare du mélange réactionnel un composé choisi parmi le M-4, le M-4', l'IsoM-4, l'IsoM-4I, un sel, un ester ou une lactone de M-4, M-4', IsoM-4 ou IsoM4' ou un mélance de ces composés. 35. Procédé s-lon la revendication 34, caractm2risé en ce que ltester est un ester d'alkyleaen C1-C5. 36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que l'ester est l'ester méthylique. 37. Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que le sel est un.sel de métal alcalin. 38. Procédé selon la revendication 34,caractérisé en ce que le sel est un sel de sodium. 39. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi: - 45 - Absidia ccerulea Cunningham_,lla echinulata Syncephalastrum racemosum Mucor hiemalis f. hiemalis Mucor bacilliformis Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor hiemalis f. corticolus Mucor dimorphosporus Mucor fragilis Mucor genevensis Mucor globOsus Mucor circinelloides f. griseocyanus Mucor heterosporils Mucor spinescens Pycnoporus coccineus Rhizoctonia solani Syncephalastrumn niericans 40. Procedj selon la revendication 31, c.aracterisé en co que le microorganisme est choisi parmi: Absidia coerulea IF0-4423 Cunninohamella echinulata IFO-4445 Cunninghamella echinulata IFO-4444 Cunninghamella echinulata ATCC-9244 SynceDhalastrum racemosum IF0-4814 Syncephalastrum racemosum IFO-4828 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-5834 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-5303 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-8567 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-8449 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-8448 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-8565 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-117.08 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-109. 19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-200.28 -46- Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-242.35 Mucor hiemalis f. hiermalis CBS-110.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201.65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides IF0-4554 Mucor circinelloides f. circinelloides IF0-5775 Mucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 Mucor dimorphosporus!F0-4556 1 O Mucor fragilisCBS-236.35 Mucor genevensis IF0-4585 Mucor globosus NRPRL12474 Mucor circinelloides f. griseo-cyanus IF0-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor spinescens IAM4-6071 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani NRRL-12477 Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 41. Procéd- selon la revendication 31, caractErisé en ce ce que le microorganisme sst choisi Parmi: Mucor hiemalis f. hiemalis Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor fragilis Mucor genevensis Mucor circinelloides f. griseo-cyanus Pycnoporus coccineus and Rhizoctonia solani. 42. Procédé selon la revendication 31, caracterisé en ce qu'on prépare un composé choisi parmi les composés de formule (VI): - 47 - (VI) H3C' CH3 CJ, (dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C5}, les sels pharmaceutiquement accep- tables de l'acide o R représente un atome d'hydrogène, et les composés de formule (VII): O. (Vr.II H31 HO et le microorganisme est choisi parmi Syncephalastrum nioaricans et Synceohalastrum racsmosum. 43. Procédé selon la revendication 42, caractérisé ce que R représente un atome d'hydrogène. 44. Procédé selon la revendication 42, caractérisé ce que R1 represente un groupe alkyle en C1-C5. 45. Procédé salon la revendication 42, caractérisé i ce que R raprésente un groupe méthyle. 46. ProcAdé selon la revendication 42, caractérisé ce oue le sel est un sel de métal alcalin. 47. rrocéde selon la revendication 46, caractérisé ce que le sel est un sel de sodium. en en en en - 48 - 48. Procdé selon la revendication 31, caractérisé en ce qu'cn prépare un composé choisi parmi les composés de formule (VIII): (VIII) - CH3 OH (dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène ou un gro:pe alkyle en C1-C5), les ols pharmaceutiquement accep- tables de l'acide o R représente un atome d'hydrogène, et les composés de formule (IX): 0 H - 8I (IX) st l1 microorganisme est choisi parmi Absidia coerulsa et Cunninahameila echinulata. 49. Procéd6 selon la revendication 48, caractérisé E ce aue R représente un atome d'hydrogène. 50. Frocéd selon la revendica2tion 48, caractrisé ce que R représente un groupe alkyle en C1-C5. 51o Procèd- salon la revendicLation 48, caract-ris E en en en - 49 - c- que R représente un grouDe méthyle. 52. Procedt' selon la revendication 48, caractérisé en ce que le sel est un sel de mrtal alcalin. 53. Procédé salon la revendication 52, carzctclisé an ce que le sel est un sel de sodium. 54. Médicament ayant notamment une activité inhibitrice de la synthèse du cholestérol caractérisé en ce qu'il con- tient à titre de principe actif un composé selon l'une des revendications 1 à 29.