Brevet FR2477572A1 — publié le 19810911

La présente invention consiste essentiellement en un procédé de production d'éthanol comprenant la culture d'une souche de Zymomonas mobilis spécifique. L'éthanol est conventionnellement produit par la fermentation des sucres par des levures. De tels procédés sont employés dans la production de boissons alcooliques telles que la bière et le vin. Il est cependant également connu que certaines bactéries ont également la capacité de fermenter des sucres et des hydrolysats d'amidon en éthanol. Une de ces bactéries est Zymomonas mobilis. Zymomonas mobilis utilise le passage Entner D.oudoroff pour le métabolisme du glucose et peut produire, jusqu'à 1,9 moles d'éthanol par mole de glucose fermenté. Un corollaire du procédé par lequel Zymomonas mobilis fermente le glucose est que seulement une mole de ATP est produite par mole de glucose en comparaison avec les deux moles de ATP produites par mole de glucose fermenté par des levures en employant le passage glycolytique. L'énergie inférieure disponible à Zjmomonas mobilis à partir du procédé de fermentation signifie que moins de biomasse est produite pendant le procédé de fermentation. Ces avantages naturels n'ont pas été suffisants pour ZYomonas mobilis, pour être employé à une échelle importante commerciale de production d'éthanol à cause de la faible productivité des souches précédemment étudiées de Z3momonas mobilis, leur faible tolérance à l'alcool, et le taux spécifique faible de conversion de sucre. Les présents inventeurs ont été capables d'isoler des souches de Zymomonas mobilis qui montrent une amélioration suffisante dans tous les trois de ces critères pour l'emploi de Zymomonas mobilis pour montrer des avantages sur les levures conventionnelles pour la production d'éthanol. Tandis qu'il est surprenant que même l'un des critères répertoriés ci- dessus peut être amélioré de manière marquée il en est encore davantage pour le fait que tous les trois de ces critères ont été capables d'être améliorés simultanément et sans des modifications néfastes sérieuses sur l'organisme. La présente invention consiste ainsi dans un procédé pour la production d'éthanol à partir d'un milieu contenant du glucose ou un autre carbohydrate fermentable, caractérisé en ce qu'il comprend la culture dans le milieu d'une souche de Zymomonas mobilis qui a une productivité en éthanol spécifique à 30 C, pH 5 et dans un milieu contenant 200 grammes par litre de glucose, d'au moins 4,0 g/g/h, un taux spécifique de conversion de glucose à 30 C, p4 5 et dans un milieu contenant 200 grammes par litre de glucose, d'au moins 8,0 g/g/h à 30 C et un niveau de tolérance d'éthanol à 30 C, ph 5 et dans un milieu contenant 300 grammes par litre de glucose, d'au moins 120 grammes par litreàl'éthanol dans une culture par lot ou d'au moins 100 grammes par litre d'éthanol dans une culture en continu à 30 C, pH 5 et dans un milieu contenant grammes par litre de glucose, et la récupération de l'éthanol ainsi produit. Le procédé selon la présente invention peut être réalisé en culture par lot ou discontinue du micro- organisme ou alternativement par un procédé en continu ou semi-continu soit avec ou sans recyclage des cellules. Le procédé selon la présente invention est de préférence réalisé à une température allant de 20 C à 5CPC, encore de préférence de 25 à 40 C, et à un pH compris entre 3,7 et 8, encore de préférence 4,5 à 6,5. Le milieu contient de préférence de 100 à 400 grammes par litre d'un carbohydrate fermentable, encore de préférence de 150 à 300/1. Les carbohydrates préférés pour l'emploi comme substratsfermentables dans le milieu de culture incluent, en plus du glucose, des sucres simples tels que le lactose fructose et le sucrose, l'amidon et des hydrolysats d'amidon, et des matériaux bruts cellulosiques. On reconnaîtra que n'importe laquelle souche de Zymomonas mobilis probablement ne fermentera pas tous ces substrats et par conséquent pour toute souche particulière un substrat approprié, fermentable devrait être sélectionné. On préfère que les souches de Zymomonas mobilis employées dans le procédé selon la présente invention aient une productivité en éthanol spécifique d'au moins 5,0 g/g/h et une conversion en glucose spécifique d'au moins 10 g/g/h dans les conditions définies. La souche préférée de Zymomonas mobilis pour emploi dans le procédé selon la présente invention est la souche CP4 tenue dans la collection de culture type de: Prof. J. de Ley, Laboratoire de Microbiologie, Ledeganckstraat 35, B-900 Gent Belgium Des souches mutantes de cette souche ont également été trouvées pour être particulièrement utiles dans la réalisation du présent procédé et en particulier en un domaine plus vaste de substrats fermentables que la souche CP4 elle-même. Les souches mutantes peuvent être produites par mutations d'une souche existante comme par l'emploi de radiations ultraviolet ou la nitrosoguanidine. Des propriétés souhaitables peuvent également être introduites dans les souches de Zymomonas mobilis par transfert plasmide à partir d'autres bactéries en employant, par exemple des techniques d'accouplage par filtre à membrane. Les souches de Zymomonas mobilis référencées ici dans cette description ont été déposées dans l1 "American Type Culture collection" (ATCC), 12301 Park Lawn Drive Rockville, Maryland 20852, U.S.A., conformément aux formalités du Traité de Budapest du 28 Avril 1977, et il leur a été assigné les numéros et dates de dépôt suivants: Nom de référence Dépôt Date de de description ATCC N dépôt ATCC CP4 31821 26.02.1981 ZM481 31823 2(.02. 981 Les exemples suivants sont donnés simplement à titre d'illustration et ne sauraient donc en aucunefaçon limiter la portée de la présente invention. Exemples Dans les exemples suivants on réalise une comparai- son entre le Zymomonas mobilis ATCC 10988 précédemment étudié et la souche sélectionnée CP4 selon la présente invention qui a été isolée originellement à partir de jus de canne à sucre. Les souches de Zymomonas mobilis sont tout d'abord propagsà 300C pendant 24 heures sans agitation par transfert de colonies uniques à partir de la de cultureenstoek incliné à 50 ml de milieu de culture de pré-semencé contenant 100 g/l de glucose et 10 g/l d'extrait de levure. Dix millilitres du bouillon de culture sont ensuite transférés dans 90 ml de milieu de culture de semence Après 12-18 heures d'incubation, on l'innocule à 900 ml de milieu de fermentation contenant: 100-300 g/l de glucose; g/l d'extrait de levure; I g/l de KH2PO4; 1 g/l (NH4)2 S04; 0,5 g/l de Mg S04.7H20. On fait croître la culture dans des conditions non-aérées à 30 C et pH 5. Le tableau 1 montre une comparaison entre les paramètres cinétiques de la levure S.Cerevisiae, de Zymomonas mobilis ATCC 10988 et de Zymomonas mobilis CP4 que l'on a fait croitre dans les conditions précitées à la concentration de glucose mentionnée. TABLEAU 1 SCerevisiae Z.mobilis Z.mobilis (ATCC 26602) (ATCC (CP4) 10988) Production en éthanol spécifique, qp (g/g/h) 250 g/l glucose) 0,87 2,5 5, 4 Conversion en glucose spécifique %qs (g/h25041lucose) 2,1 5,5 11,9 Conc. maximum en éthanol (g/l) (300 g/l glucose) 115 102 127 Une comparaison supplémentaire entre les deux souches est réalisée à la figure unique annexée qui représente graphiquement les paramètres cinétiques de la culture en continue de Zymomonas mobilis ATCC 10988 et Zymomonas mobilis CP4. On notera que dans la figure unique annexée en abscisses on a mentionné la concentration en éthanol en grammes par litre tandis qu'en ordonnées on a représenté pour le graphique le plus près du haut de la page le taux de production en éthanol spécifique en grammes/gramme/heure et pour le diagramme le plus près du bas de la page le taux de croissance spécifique en H-1 Par rapport à ces derniers les résultats d'état stable ont été recueillis pour 60, 100, 135 et 170 grammes par litre de milieu de glucose. Comme il est évident à partir de la figure 1 à la fois le taux de croissance spécifique et le taux spécifique de production d'éthanol sont supérieurs pour la souche CP4 et moins influencés par une concentration donnée d'alcool. Une autre souche de Zymomonas mobilis à productivité élevée est développée à partir de la souche CP4 comme suit: On fait croître statiquement la souche CP4 à 30 C jusqu'à ce qu'elle est dans la phase de croissance expo- nentielle. On ajoute ensuite de la nitrosoguanidine jusqu'à une concentration finale de 50 /jA.g/ml et on incube la culture pendant 30 minutes à 30 C. On lave ensuite les cellules deux fois dans un tampon de phosphate salin et on fait recroitre toute la nuit à 30 C. On plaque ensuite la cellule sur des plaques contenant de l'éthanol à 10% (volume/volume). Après plusieurs jours d'incubation à 30 C, des colonies mutantes apparaissent à une fréquence d'approximativement 10-7, et cellesci sont purifiée sur un milieu similaire et ensuite testées pour les taux de croissance et de production d'éthanol avec 100, 200 et 250 g/l de glucose, à 30 C dans des tubes. La culture ayant produit le niveau le plus élevé d'éthanol dans le temps le plus court est dénommes ZM48. Une seconde mutagénèse similaire est réalisée avec la souche ZM48 mais les cellules sont plaquées avec de l'éthanol à 15% (volume/volume). La souche mutante qui produit le niveau le plus élevé d'éthanol dans le temps le plus court est dénommée ZM481, et est laissée comme souche tolérante d'éthanol dans la collection de culture type de l'Ecole de Biotechnologie, Université de New South Wales, Sydney, New South Wales, Australie. Le tableau 2 montre une comparaison des concentra- tions d'éthanol d'état stable maximum mis à réagir avec diverses souches de Zymomonas mobilis dans une culture -1 en continu à un taux de dilution, D = 0,1 heure TABLEAU 2 Souche G(con.centration de Concentration Glucose (g/l) d'éthanol (g/l) Z. mobilis ATCC10988 150 60 Z. mobilis CP4 170 70 Z. mobilis ZM481 180 85 Le tableau 3 montre une comparaison de la viabilité de souches de Zymomonas mobilis après 24 heures de fermentation sur 250 g/1 de milieu de glucose en culture par lot ou en discontinu. TABLEAU 3 Souche Concentration % de viabilité en éthanol Z. mobilis CP4 120 40 Z. mobilis ZM481 120 100 Le tableau 4 montre par voie de comparaison les paramètres cinétiques de Zymomonas mobilis ATCC10988 et de Zymomonas mobilis CP4 sur divers milieux de glucose dans une culture de bain non-aérée. TABLEAU 4 Paramètres cinétiques (1) 150 g/l glucose taux de conversion spécifique de glucose qs (g/g/h) taux de production d'éthanol spécifique qp (g/g/h) Concentration d'éthanol maximum (g/l) (2) 200 g/il glucose qs Concentration d'éthanol (3) 250 g/l glucose qs qp Concentration d'éthanol (4) 300 g/1 glucose qs Cqp Concentration d'éthanol ATCC 10988 ,2 2,5 77,0 ,2 Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre de la protection comme revendiquée. 2,5 CP4 9,3 4,2 78,0 ,4 ,0 11,9 ,4 ,5 2,5 8,1 3,6 R E VE N D I C A T I 0 N S 1.- Procédé de production d'éthanol à partir d'un milieu contenant du glucose ou un autre carbohydrate fermentable, caractérisé en ce qu'il comprend la culture dans ledit milieu d'une souche de Zymomonas mobilis quia une productivité en éthanol spécifique à 30 C, PH 5 et dans un milieu contenant 200 g/l de glucose, d'au moins 4,0 g/g/h, un taux spécifique de conversion de glucose à 30 C, p-5, dans un milieu contenant 200 g/l de glucose d'au moins 8,0 g/g/h à 30 C et un niveau de tolérance à l'éthanol à 30 C pH5, dans un milieu contenant 300 g/l de glucose, d'au moins 120 g/l d'éthanol dans une culture par lot ou en discontinu ou d'au moins 60 g/l d'éthanol dans une culture en continu à 30 C, pH5 et dans un milieu contenant 150 g/l de glucose, et la récupération de l'éthanol ainsi produit. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche de Zymomonas mobilis a une productivité en éthanol spécifique à 30 C, pHl5,. dans un milieu contenant 200 g/l de glucose d'au moins 5,0 g/g/h. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la souche de Zymomonas mobilis a un taux de conversion spécifique en glucose à 30 C, pÉ5 dans un milieu contenant 200 g/l de glucose d'au moins 10 g/g/h. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que le substrat est choisi parmi le groupe comprenant le glucose, le lactose le fructuose,le sucrose,l'amidon et des hydrolysats de cellulose. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé ne ce que la souche de Zvmomonas mobilis est la souche CP4. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la souche de Zymomonas mobilis est la souche ZM481. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le procédé est réalisé sous forme de procédé par Iot ou discontinu ou semi-discontinu. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le procédé est réalisé sous forme d'un procédé continu ou semi- continu. 9.- Ethanol, caractérisé en ce qu'il est produit par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.