Brevet FR2482858A1 — publié le 19811127

PRODUIT DE NATURE PEPTIDIQUE DOUE DE PROPRIETES IdUNOSUPPRESSIVES L'invention est relative à un produit hautement purifié et doué de propriétés inimunosuppressives non spécifiques d'espèce. I1 peut etre défini comme étant constitué d'une ou plusieurs substances, et plus particulièrement comme étant caractérisé en cé que - il est essentiellement exempt de constituants qui sont à la fois biologiquement inactifs dans les tests ci-après définis et séparables des constituants biologiquement actifs, par electrophorèse sur couche mince de cellulose d'une solution de ce produit dans un mélange pyridine/ acide acétique/acétone/eau dans des proportions volumiques respectivement de 1/2/8/40, pH 4,4 sous une tension de 500 V - il a un poids moléculaire inférieur à 5.000 - il est de nature peptidique (totale ou partielle) ;; - il n'est révélable ni par le réactif ninhydrine collidine, ni par la fluorescamine, à une dose de 5 nanomoles par couche mince de 20 cm - il contient un acide aminé N-terininal bloqué par un groupe pyroglutamyle - il contient un acide C-terminal constitué par la lysine ou l'arginine ;; - il est inactivé sous l'action des enzymes suivantes pronase, trypsine, pyroglutamate-aminopeptidase, carboxy peptidases A et B - il n'est pas inactivé par la leucine-amino-peptidase ni par la chymotrypsine - il n1 est pas inactivé par traitement aux DNases et RNases - il présente une affinité spécifique réversible pour les IgG (fixation sur IgG immobilisées à pH neutre ; élution à pH acide) - il ne présente pas d'affinité sélective pour les IgM (pas de fixation sur IgM immobilisées à pH neutre) - il inhibe in vitro et in Vivo la formation de cellules porteuses des immunoglobulines IgM (19S) et IgG (75) di rigées contre des antigènes, tels que des globules rouges de mouton en réponses primaire et secondaire ; - il n'est pas cytotoxique à l'égard de cultures de lympho cytes ; - il possède des propriétés inhibitrices de la réaction de greffons d'origine allogénéique, notamment de cellules de rat allogénéique, contre l'hôte - il n'affecte pas sensiblement la capacité de cellules de rate de souris, incubées au préalable en sa présence et administrées à des souris ayant elles-memes été pre-ala-. blement soumises à une irradiation vitale, de former des colonies spléniques dans les rates de ces souris - il est sensiblement dépourvu d'effet inhibiteur à l'égard des antigènes T indépendants", tels que les trinitr-o- phényl-lipopolysaccharides ; - il n'inhibe pas l'incorporation n vits de la 3H-thymidine dans des cultures de lymphocytes stimulés par des mitogènes, tels que le PHA et LPS. Le produit selon l'invention peut être préparé à partir de la fraction active dénommée 11FAC", telle que de-- finie dans l'article de M. LENFANT et al, publié dans "Molecular Immunology, vol. 17, pp. 119-126) (Pergamon Press Ltd, 1980)" et intitulé "The purification of an immunosuppressive factor extracted from bovine spleen III" (Purification d'un facteur immunosuppresseur extrait de rate de boeuf III) et en ayant notamment recours à la technique d'électrophorèse, telle qu'elle a ét définie cidessus. Elle concerne notamment un produit tel que cidessus défini, caractérisé en ce que tous ses constituants soit ne migrent pas, soit migrent vers l'anode dans le susdit système électrophorétique. Elle concerne également plus particulièrement encore des produits ayant toutes les caractéristiques susindiquées et étant essentiellement constitues par - une substance biologiquement active, sensiblement homo gène eu égard à la technique d'électrophorèse susdite, lorsque celle-ci est répétée au moins une fois supplé mentaire, soit à pH 4,4, soit à pH 6,5, ladite substance migrant vers l'anode et étant caractérisée à pH 6,5 par une mobilité à pH 6,5, de l'ordre de -0,5 à -0,8, notam ment de -0,54 à -0,79 vis-à-vis de la mobilité considé rée égale à -1 de l'acide aspartique soumis à une élec trophorèse dans les mêmes conditions ;; - une substance biologiquement active, sensiblement homo gène eu égard à la technique d'électrophorèse susdite, lorsque celle-ci est répétée au moins une fois supplé mentaire, soit à pH 4,4, soit à pH 6,5, ladite substance migrant vers la cathode et étant caractérisée par une mobilité, à pH 6,5, de l'ordre de +0,8 à +1,1, notamment de +0,83 à +1,07 vis-à-vis de la mobilité considérée égale à -1 de l'acide aspartique soumis à une electropho rèse dans les mêmes conditions ;; - une substance biologiquement active, sensiblement homo gène eu égard à la technique d'électrophorèse susdite, lorsque celle-ci est répetée au moins une fois supplé mentairess soit à pH 4,4, soit à pH 6,5, ladite substance ne migrant sensiblement pas dans les conditions sus définies de l'électrophorèse - une substance biologiquement active, sensiblement homo gène eu égard à la technique d'électrophorèse susdite, lorsque celle-ci est répétée au moins une fois supplé mentaire, soit à pH 4,4, soit à pH 6,5, ladite substance étant caractérisée par une mobilité de migration vers la cathode nulle ou ne dépassant sensiblement pas 0,1 vis-à-vis des mobilités de l'urée et de l'acide aspar tique respectivement égales à O et -1 dans des systèmes consistant à respectivement soumettre à électrophorèse sur couche mince de cellulose des solutions dudit pro duit dans des mélanges (proportions volumiques) : - acide formique/acide acétique/eau (1/4/45) > pH 1,9 ; - pyridine/acide acétique/acétone/eau (1/2/8/40),pH 4,4; - pyridine/acide acétique/eau (20/1/180), pH 6,5. D'autres caractéristiques de l'invention appa raieront encore au cours de la description qui suit de modes de mise en oeuvre préférés pour obtenir le produit selon l'invention et des conditions dans lesquelles ont été réalisés les analyses de structure et les essais biologiques dont les résultats permettent une caractérisation du produit selon l'invention. Obtention de produits selon l'invention. On soumet une fraction FAC, elle-même obtenue selon la technique déjà décrite dans l'article susmentionné à une chromatographie sur couche mince de cellulose "MN 300" dans le système butanol/acide acétique/eau (60/15/25). Les fractions actives sont localisées à des Rf respectivement compris entre 0,2 et 0,32 ; 0,45 et 0,53 0,73 eut 0,83. Celles-ci sont recueillies et soumises à leur tour à une électrophorèse sur couche mince de cellulose commercialisée sous la désignation "MN cell-300 uv 254 " dans le tampon pyridine/acide acétique/acétone/eau (1/2/8/40) -pH 4,4, sous une tension de 500 V. Les fractions actives se scindent en plusieurs sous-fractions dont deux substances actives qui migrent vers l'anode et flne qui ne-migre pas. Les deux substances actives qui apparaissent absorber légèrement la lumière ultraviolette n'ont pu être révélées ni par le réactif ninhydrine collidine ni par la fluorescamine, eompte.tenu de leur faible abondance. Les substances contenues dans les deux fractions ayant migré vers l'anode ont été réunies. Elles forment le produit selon l'invention, dit "SDIP" dans ce qui suit (abréviation de l'expression anglaise "Spleen Derived Immunosuppressive Peptide"). D'une façon générale, on a également eu recours pour caractériser ou repérer les fractions actives aux essais consistant à dénombrer le nombre (valeur moyenne) de plages d'hémolyse pour 106 cellules selon les tests de JERNE (JERNE et NORDLIN, Science 140, 405, 1963) ou de CUNNINGHAM (CUNNINGHAM et SZENBERG, Immunology, 14, 599, 1968) appliqués à des souris âgées de 8-12 semaines de la souche DBA/2 x C57B1/6 ou de la souche Balb C. Dans chaque cas, les souris ont été sensibilisées avec 0,5 ml d'une suspension de globules rouges de mouton (GRM) (4 x 108 cellules), et les cellules productrices d'anticorps ont été dénombrées quatre jours plus tard. Selon les cas, les animaux ont reçu une ou deux injections de 0,2 à 0,5 ml d'une solution de C1Na physiologique contenant la substance à étudier (ou de solution physiologique seulement pour les témoins) 24 ou 24 + 1 heures avant leur sacrifice. Dans de nombreux cas, c'est par référence aux résultats obtenus à l'aide de ces tests que l'on a déterminé l'impact sur l'activité biologique des substances étudiées de divers agents chimiques ou biologiques. Propriétés chimiques. Il a ainsi été constaté que le SDIP était inactivé par la pronase, la trypsine ; qu'il n'était pas inactivé par la leucine-amino-peptidase, par les DNases et RNases, et plus particulièrement-que : - le traitement à la pyroglutamate aminopeptidase (tampon phosphate 0,05 M, mercaptoéthanol -0,01 M, EDTA 0,001 M, 2 heures, 370C) induit la perte totale d'activité biolo gique ; le groupement NH2 terminal est donc bloqué par tm cycle pyroglutamyle.Ce résultat est confirmé par la présence dans le spectre de masse du produit dérivé, d'un pic de fragmentation important à m/e 84 .caractéristique de ce groupement ; - les traitements par les carboxypeptidases A et B (tam pon N. éthyle morpholine acétate 0,2 N, pH 8,5, 2 heures, 370C) induisent une perte d'activité. Ceci indique que la molécule porte un groupe 'COOH" terminal libre et que l'acide aminé terminal est soit la lysine, soit l'argi nine. Propriétés biologiques. 10) Etude de l'affinité du SDIP vis-à-vis des IgG et IgM immobilisées. a) Fixation d'IgG et d'IgM de laEin sur support ("SEPHAROSE 4B"). Le SEPHAROSE "activé" est préparé à partir de 30 ml de support par traitement à 40C dans 120 ml d'eau (pH 10,2) par 60 mg de BrCN. Le support est ensuite lavé avec 2 litres de tampon borate (0,2 M, pH 8,4) et le couplage est effectué dans ce tampon à 40pendant 24 heures avec 23 mg d'IgG. Après filtration-lavage avec 500 ml de tampon PBS (tampon phosphate 0,1 M, NaCl 8,5 g, pH 7), le support est conservé à 40C sous azoture. La fraction d'immunoglobuline a été fixée à raison de 0,3 mg/ml de gel. On réalise dans les mêmes conditions la fixation des IgM de lapin sur le même support. b) Chromatographie de la fraction active sur une colonne "d'IG SEPHAROSE". Le gel (10 ml) est équilibré avec du tampon acétate de pyridinium (0,02 M, pH 7). 20 doses (soit 20 fois la dose qui produit une réduction de 50 % du nombre de plages d'hémolyse dans le test de JERNE).de fraction active sont appliquées dans ce tampon sur colonne. La colonne est éluée successivement avec 20 ml du tampon acétate de pyridinium (Fraction- 1), puis 20 ml d'acide acétique (0,20 M, pH 2,8) (Fraction 2). Les deux fractions ont été testées après lyophilisation, remises en solution dans une solution physiologique, et administration à des souris pour leur-étude selon le test de JERNE. La fraction (1) (produit élué avec l'acétate de pyridinium)ntentraîne pas de réduction vis-à-vis de cultures témoins, du nombre des plages d'hémolyse dans le test de JERNE. Au contraire, la fraction (2) (produit élué avec l'acide acétique, pH 2,8) induit une forte réduction du nombre de plages d'hémolyse par 106 cellules, réduction qui témoigne de la réversibilité de la fixation des fractions actives sur les IgG immobilisées. Au contraire, on n'a constaté aucune fixation des fractions actives selon l'invention sur les IgM immobilisées à pH neutre, dans les conditions sus-indiquées, en rapport avec les IgG. 20) Activité du SDIP sur la formation de cellules produc trices d'IgM. a) Activité in vitro. Le SDIP a été mis en oeuvre dans une variante du test in vitre de MISHELL et DUTTON (Science, 153, 10041005 (1966)). Ce test consiste à induire la formation de cellules porteuses d-'IgM lors d'une culture de lymphocytes de rate de souris (6 x 106 cellules/ml). La culture est effectuée pendant cinq jours à 3700 dans une atmosphère air C02 à 5 %. Le milieu de culture est constitué de RPMI 1640, complémenté par des antibiotiques 1 %, sérum de veau foetal 10 %, de cheval 1 %, glutamine 1 %, mercaptoéthanol 1O5N. Les nombres de cellules portant des IgM sont révélés par le dénombrement des plages d'hémolyse ou PFC (abréviation de l'expression anglaise correspondante "Plaque forming cells") dans le test de CUNNINGHAM dans des cultures dis- tinctes après des durées distinctes, exprimées en jours. Les résultats obtenus ont ét-é les suivants a) Le SDIP est actif en fin de période de différenciation des lymphocytes (quatrième jour de culture) ; b) -La réponse effet dose montre un effet inhibiteur maximum (90 % > pour des doses variant de 5 à 0,5 pg/ml. Une inhibition de 50 % de la réponse est observée pour des doses de l'ordre de 10 -4 pg (dosages effectues à l'analy- seur d'acides aminés). b) Activité in vivo. Des doses de 0,2 ng de SDIP ont été administrées par voie intrapéritonéale à des souris Balb C qui avaient auparavant été sensibilisées par une injection de GRAM; à des temps distincts à compter de cette sensibilisation. Quatre jours plus tard, on sacrifie les animaux et on -dé- nombre le nombre de plages d'hémolyse par 106 cellules dans les conditions du test de CUNNINGHAM. Les résultats obtenus font apparaître que le SDIP n'est pas actif lorsqu'il est administré avant au en même temps que les GRM (ou pendant la période correspondante). Par contre, on observe une inhibition à 90 %, lorsque le SDIP a été administré trois jours après la sensibilisation, c'est-à-dire dans la phase finale de différenciation des lymphocytes. 30) Action du SDIP sur les lymphocytes. Le SDIP n'est pas cytotoxique à l'égard de cultures de lymphocytes dont il ne modifie pas les conditions de croissance. Enoutre, il n'inhibe pas l'incorporation de 3H-thymidine dans des cultures de lymphocytes stimulés aux mitogènes PHA ou LPS. Des cellules de rate de souris Balb C ont été cultivées 48 heures en présence d'un mitogène ; la thymidine radioactive a été ajoutée pendant les 6 dernières heures de culture ; le SDIP a été ajouté soit au moment de la mise en culture, soit 24 heures après. Aucune activité sur la prolifération des lymphocytes B (stimulés au LPS) ou des lymphocytes T (stimulés à la PHA) n'a été détectée. 40) Inhibition de la réaction du greffon contre l'hôte sous l'action du SDIP. Les effets du SDIP ont été étudiés sur la splénomégalie qui se développe chez des souris Fl(C57BL/6 x DBA/2) irradiées à 400 R, chez laquelle une réaction du greffon contre l'hôte a été induite par la greffe de cellules spléniques de la lignée C57BL/6. Le SDIP s'est révélé être inhibiteur de cette réaction soit in Vivo s'il est administré aux receveurs simultanément à la greffe, soit in vitre quand les cellules sont incubees avec cette fraction avant la greffe (à des doses de l'ordre du pico gramme./ml). Les cellules spléniques soumises à ce traitement n'ont présenté aucune diminution de leur capacité de former des colonies spléniques (CFUs) dans la rate de souris C57BL/6 irradiées létalement.Le SDIP n'exerce donc aucun effet inhibiteur ou cytoxique sur les précurseurs hémopolétiques. 50) Inactivité du SDIP vis-à-vis d'un antigène "T indépen dant i le TNP-LPS. Aucun effet du SDI?n'a pu être noté sur la formation d'anticorps dirigés contre le radical trinitophényle, ceci dans des cultures de trois ou quatre jours en présence de l'antigène. Les substances biologiquement actives sensiblement homogènes qui peuvent être obtenues dans les conditions qui ont été définies plus haut à partir du SDIP possèdent les mêmes propriétés biologiques dans les différents tests qui ont été exposés dans ce qui précède. Les produits de l'invention constituent donc des réactifs biologiques qui > en raison de leur activité considérable (à la dose du pg), peuvent être utilisés comme étalon de référence pour apprécier les activités immunosuppressives de substances étudiées différentes. En outre, ils peuvent être associés à des véhicules pharmaceutiques appropriés à tous modes dEadministra- tion, en vue de la préparation de compositions pharmaceutiques, notamment de solutions injectables, appropriées à la prévention ou au traitement de maladies mettant en jeu une production non contrôlée d'anticorps, telles que les maladies auto-immunes, certaines formes de rhumatismes, etc. En raison de leur totale absence de cytotoxicité, y compris à l'égard des précurseurs hémopolétiques, leur utilisation peut être indiquée dans les cas de prévention de la réaction secondaire du greffon contre l'hôte, comme suite à la réalisation de greffes, notamment de greffes de moelle osseuse. L'invention concerne donc toutes les compositions pharmaceutiques contenant une dose efficace des produits de l'invention, notamment, mais non exclusivement, celles se présentant sous forme de solutions stériles injectables. REVENDICATIONS 1 - Produit hautement purifié et doué de propriétés immunosuppressîves non spécifiques d'espèce, constitué d'une ou plusieurs substances, caractérisé-en ce que: - il est essentiellement exempt de constituants qui sont à la fois-biologiquement inactifs dans les tests ci après définis et séparables des constituants biolog-ique ment actifs, par électrophorèse sur couche mince de cel lulose d'une solution de ce produit dans un mélange pyri dine/acide acétique/acétone/eau dans des proportions vo lumiques respectivement de 1/2/8/40, pH 4,4, sous une tension de 500 V ;; - il a un poids moléculaire inférieur à 5.000 - il est de nature peptidique, totale ou partielle - il n'est révélable ni par le réactif ninhrssrine cilidin, ni par la fluorescamine, à une dose de 5 nanomoles par couche mince de 20 cm ; - il contient un acide aminé N-terminal bloqué par un groupe pyroglutamyle ; - il contient un acide C-terminal constitué par la lysine ou l'arginine - il est inactivé sous l'action des enzymes suivantes pronase, trypsine, pyroglutamate-aminopeptidase, carboxy peptidases A et B ;; - il n1 est pas inactivé par la leucine-amino-peptidase ni par la chymotrypsine ; - n'est pas inactivé par traitement aux DNases et RNases ; - il présente une affinité spécifique réversible pour les IgG (fixation sur IgG immobilisées à pH neutre ; élution à pH acide) ; - il ne présente pas d'affinité sélective pour les IgM (pas de fixation sur IgM immobilisées à pH- neutre) - il inhibe in vitro et in vivo la formation de cellules porteuses des immunoglobulines IgM (19S) et IgG (7S) di rigées contre des antigènes, tels que des globules rouges de mouton, en réponses primaire et secondaire - il n'est pas cytotoxique à l'égard de cultures de lympho cytes ; - il possède des propriétés inhibitrices de la réaction de greffons d'origine allogénéique, notamment de cellules de rat allogénéique, contre l'hôte ;; - il n'affecte pas sensiblement la capacité de cellules de rate de souris, incubées au préalable en sa présence et administrées à des souris ayant elles-mêmes été préala blement soumises à une irradiation létale, de former des colonies spléniques dans les rates de ces souris - il est sensiblement dépourvu d'effet inhibiteur à l'égard des antigènes "T indépendants", tels que les trinitro phényl-lipopolysaccharides ; - il n'inhibe pas l'incorporation in vitre de la 3H-thymidine dans les cultures de lymphocytes stimulés par des mitogènes, tels que le PHA et LPS. 2 - Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que tous ses constituants soit ne migrent pas, soit migrent vers l'anode dans le susdit système électrophorétique. 3 - Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce qui il est essentiellement constitué par une substance biologiquement active, sensiblement homogène eu égard å la technique d'électrophorèse susdite, lorsque celle-ci est répétée au moins une fois supplémentaire, soit à pH 4,4, soit à pH 6,5, ladite substance migrant vers l'anode et étant caractérisée à pH 6,5 par une mobi- lité à pH 6,5, de l'ordre de -0,5 à -0,8, notamment de -0,54 à -0,79 vis-à-vis de la mobilité considérée égale à -1 de l'acide aspartique soumis à une électrophorèse dans les mêmes conditions. 4 - Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par une substance biologiquement active, sensiblement homogène eu égard à la technique d'électrophorèse susdite, lorsque celle-ci est répétée au moins une fois supplémentaire, soit à pH 4,4, soit à pH 6,5, ladite. substance migrant vers la cathode et étant caractérisée par une mobilité à pH 6,5, de l'ordre de +0,8 à +1,1, notamment de +0,83 à +1,07 visà-vis de la mobilité considérée égale à -1 de l'acide aspartique soumis à une électrophorèse dans les mêmes con ditions. 5 - Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par une substance biologiquement active, sensiblement homogène eu égard à la technique d'électrophorèse susdite, lorsque celle-ci est répétée au moins une fois supplémentaire-, soit à pH 4,4, soit à pH 6,5, ladite substance ne migrant sensiblement pas dans les conditions sus-définies de ltélectrophorè-se. 6-- Produit selon la revendication 1, caractérisé par une mobilité de migration vers la cathode nulle ou ne dépassant sensiblement pas 0,1 vis-à-vis des mobilités de l'urée et de l'acide aspartique respectivement égales à O et -1 dans des systèmes consistant à respectivement soumettre à électrophorèse sur couche mince de cellulose des solutions dudit produit dans des mélanges (proportions volumiques) - acide formique/acide acétique/eau (1/445), pH 1,9 ; - pyridine/acide acétique/acétone/eau (1/2/8/40), pH 4,4 ; - pyridine/acide acétique/eau (20/1/180), pH 6,5. 7 - Réactif biologique contenant le produit selon l'une quelconque des revendications i à 6. 8 8 - Composition contenant le produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 associée à un véhicule pharmaceutique. 9 - Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce quelle est injectable.