Brevet FR2477417A1 — publié le 19810911

La présente invention est relative à de nouvelles fractions antigéniques isolées de virus grippal, et notamment isolées de l'hémagglutinine et de la neuraminidase de virus grippal, à leur procédé de préparation et à leur application thérapeutique en tant qu'agents vaccinants. Les virus Influenza de type A sont responsables d'affectipns grippales épidémiques interpandémiques ou pandémiques à la fois chez l'homme et chez les animaux, et c'est peut-être la seule maladie pour laquelle on ait pu démontrer que l'apparition de pandémies était fonction de celle de virus antigéniquement différents de ceux ayant précédemment circulé dans une population t(cf. J.J. SKEHEL (1974) Symp. Soc.Genl. Microbiol., 24, 321-342/. Schématiquement, deux principaux groupes d'antigènes constituent le virus Influenza - le premier fixe et qui est interne,dit de nucléocapside,définit les trois types de virus : A,B,C - le second,variable et superficiel,est constitué de deux éléments de structure changeante : l'hémagglutinine et la neuraminidase. Deux types de variations peuvent se produire au niveau des antigènes de surface - la variation due au changement génétique ponctuel ou mutations mineures appelées "glissements"(le "drift" des Anglo-saxons) dues probablement à une sélection des mutants résultant de la pression anittunologique, et - la variation due au changement radical des motifs anti géniques (le "shift" des Anglo-saxons), variations majeures appelées "cassures" ou "sauts". L'hémagglutinine est une glycoprotéine qui peut représenter j u s q u ' à 25 % de la protéine virale Lcf. en particulier COMPANS et Alia "Virology" (1970) 42,880-889 et W.C. LAVER "Virology" (1971) 45, 275-288/ Elle se présente sous la forme d'un trimère qui a la configuration de pointes ou de baronnets à la surface de l'enveloppe du virus, que l'on appelle projections ou spicules. Elle est codée par une seule espèce de RNA Zcf. SKEHEL et SCHILD "Virology" 44 (1971), 396-4087. L'hémagglutinine contient deux sous-unités reliées par un pont disulfure S-S ZSKEHEL et SCHILD-"Virology" 44 (1971), 396-4087 d'un poids moléculaire d'environ 55000 (HA 1) et 250Q0 (EA 2) res pectivement. La position exacte du clivage peut varier,mais le poids moléculaire total est toujours aux environs de 80000 (J.J. SKEHEL, référence citée). La sous-unité lourde (HA 1) contient les sites antigéniques fonctionnels, tamis que la sousunité légère est impliquée dans la fixation de l'hémagglutinine à la membrane du virus Zcf. SKEHEL et WATERFIELD "Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1975) 72, 93-9Z?. Les chaînes hydrocarbonées latérales de cette glycoprotéine sont synthétisées par les glucotransférases spécifiques de l'Hôte Lcf. LAVER et WEBSTER "Virology" (1966), 30, 104-115?, ce qui semble contribuer à l'antigénicité (antigène de cellule-hôte, spécifique du substrat cellulaire dans lequel s'est multiplié le virion). Il est très vraisemblable que ces g 1 i s s e ments résultent de substitutions d'acides aminés dans l'hemagglutinine Lcf. LAVER et WEBSTER "Virology" (1972),34, 193-202/. Les variations majeures ou les "sauts" résultent probablement de l'extension du processus de glissement, lorsque des changements radicaux dans la séquence des aminoacides aboutissent à des altérations dans la structure secondaire de l'hémagglutinine, permettant l'émergence des nouveaux sites déterminant l'antigénicitécf. les travaux de FAZEKAS de SAINT-GROTH, Arch. Environmental Health (1970),21, 293-303?. LAVER et WEBSTER g"Virology" (1973), 51, 383-391? émettent une autre hypothèse selon laquelle cette variation brutale ou "sauts antigéniques" est due à une recombinaison génétique entre souches humaines et souches animales : il peut s'agir soit de réassortiment au hasard de segments entiers d'ARN, qui entraine une haute fréquence de recombinaison, soit de recombinaison intragénique entre les segments homologues d'ARN, qui entraine des recombinaisons à faible fréquence. Quelle que soit l'origine de l'apparition de ce nouveau soustype viral par cassure, il est à l'origine de nouvelles pan démies. L'hémagglutinine du virus grippal possède selon LAVER et Collab. ''J. Immunology" (1976), 116, 336-341?, au moins deux et selon YEWDELL et Collab. L"Nature" (London) (1979), 279, 246-248? très probablement trois déterminants antigéniques différents, lesquels peuvent varier d'une manière indépendante. C'est le déterminant "commun" ou dit de "réaction croisée qui demeure relativement constant lors des variations mineures ou glissements, et ce sont les déterminants "spécifiques" qui subissent les variations antigéniques majeures CLAVER et Collab. "J. Immunology" (1976), 116, 336-341?. Ces modifications antigéniques des sérotypes des souches de virus grippaux d'une année à l'autre, créent donc des problèmes difficiles pour l'immunisation, car il eSt évident que pour que l'efficacité d'un vaccin soit la meilleure possible, il est nécessaire que l'antigène vaccinant soit aussi près que possible de celui du virus dominant. I1 serait donc du plus haut intérêt pour pouvoir suivre les changements de structure des déterminants antigéniques et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le processus de "glissements" et même, si possible, dans le processus de "cassure" antigénique, d'isoler les peptides des régions antigéniques qui se trouvent à la surface de l'hémagglutinine des souches de virus Influenza. Plusieurs tentatives ont eu lieu dans ce sens LLAVER "Virology'1 (1971), 45, 275-288 ; SKEHEL et WATERFIELD "Proc. Natl. Acad. Sci.USA" (1975), 72, 93-97 ; JACKSON et Alia "Virology" (1978), 89, 199-205? : elles consistaient à cliver les ponts disulfure de l'hémagglutinine (par incubation avec des sucres réducteurs en présence de chlorhydrate de guanidine) pour séparer les deux sous-unités (HA 1) et (HA 2), puis à produire des peptides, par exemple par clivage à l'aide de BrCN : aucun des peptides ainsi obtenus ne présentait activité antigénique. I1 en a été de même lors de tentative d'attaque des particules de virus par des proteines ou des détergents ZBACHMAYER et SCHMIDT (1972) "Med. Microbiol. Immunol. 158 9194 ; et BRAND et SKEHEL, Nature New Biol. (1972) 238 145-147?: aucun des peptides obtenus ne présentait une activité antigénique. La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à une méthode de purification des glycoprotéines de surface, et plus particulièrement de 1 'hérnagglutinine, sous leur forme antigéniquement active et à pourvoir à un prociMe d'isolement des peptides des régions antigêniques de glycoproteine de surface de souches de virus grippaux présentant une activité antigénique. La présente invention a pour objet un procédé de préparation des peptides antigéniques à partir de glycoprotéines de surface des virus Influenza (pour toutes les souches du virus grippal,aussi bien pour les souches humaines que pour les souches animales), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - purification du virus ; - traitement du virus par une protéinase pour la séparation de la neuraminidase ; -extraction et purification de l'hémagglutinine native ; - digestion de l'hémagglutinine par la trypsine - séparation et purification des fractions peptidique-antigéniques. Suivant un mode de réalisation avantageux de l'objet de l'invention, la purification du virus est obtenue en réalisant sa culture dans la cavité allantoique d'oeufs de poule embryonnés, en clarifiant le liquide allantoîque infecté,par centrifugation puis en récoltant le virus sous forme de culot par ultra-centrifugation, en mettant le virus en suspension dans des tampons appropriés et en le sédimentant sur des gradients de saccharose dans le méme tampon, en reprenant le virus des bandes de densité convenable et en terminant la purification par précipitation par un solvant approprié. Suivant une modalité particulière de ce mode de réalisation, le virus récolté est mis en suspension dans un tampon phosphates-sel physiologique (PBS), sédimenté sur un gradient de saccharose (15 - 60 % de saccharose dans le tampon PBS) et concentré par centrifugation continue (environ 26000 g) durant 15 heures environ. Suivant une autre modalité particulière de ce mode de réalisation, le solvant de précipitation de virus purifié est constitué par le polyéthylèneglycol dans un tampon Tris/HCl contenant environ 0,5 M de NaCl. Le traitement du virus en vue de la séparation de la neuraminidase est effectué suivant un processus connu, à savoir à l'aide de la bromélaîne, à raison de 1 mg environ de bromélaine pour 3 mg environ de virus, le traitement par la bromélarne étant effectué dans un tampon Tris/HCl contenant environ lmM d'EDTA et environ 0,5 mM de dithio threitol. Ce sont, en effet, les travaux de BACHMAYER et SCHMIDT /Med. Microbiol. Immunol. (1972) 158 91-94? qui ont démontré que la bromélarne libère la neuraminidase sans détruire l'hémagglutinine, qui demeure attachée à la surface du virus. L'extraction et la purification de l'hémagglutinine sont effectuées selon les techniques connues, en incubant aux environs de 370C les particules de virus privées de neuraminidase, dans un tampon approprié en présence de lauroylsarcosinate de sodium, en absorbant le surnageant après centrifugation,sur des colonnes de dextrane du type DEAE-Sephadex, en éluant l'hémagglutinine absorbée et en terminant la purification par filtration sur gel. I1 est préférable - que la concentration finale en lauroyl-sarcosinate de sodium (SARKOSYL) pendant l'extraction de l'hémagglutinine soit de l'ordre de 2,5 z - que la solution contenant l'hémagglutinine soit dialysée contre une solution-tampon Tris/HCl contenant environ 0,5 % de Sarkosyl - que l'hémagglutinine absorbée sur la colonne de dextrane du type DEAE-Sephadex soit éluée par un gradient linéaire 0 - 1,5 % de NaCl contenant environ 0,05 % de Sarkosyl - que les fractions contenant l'hémagglutinine avant la fil tration sur gel soient dialysées contre une solution de bicarbonate d'ammonium. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la digestion de l'hémagglutinine par la trypsine est effectuée dans des conditions respectant le pont du sulfure S-S de cette dernière, à savoir - citraconylation de l'hémagglutinine afin d'éviter le cliva ge des liaisons lysine-peptides - démineralisation de la solution d'hémagglutinine par passa ge sur une colonne de tamis moléculaires - addition de la trypsine à l'hémagglutinine citraconylée à un pH alcalin et clivage des liaisons arginine-peptides - abaissement du pH afin de débloquer les groupes citra condyles - alcalinisation de la solution et poursuite de la digestion, et clivage des liaisons lysine-peptides. Suivant une modalité particulière de ce mode de réalisation, la trypsine est ajoutée en deux fractions à une solution de bicarbonate d'ammonium (50 mM, pH 7,8 environ) contenant l'hémagglutinine citraconylée, la réaction étant poursuivie environ 16 heures à une température voisine de 370C. Suivant une autre modalité particulière de ce mode de réalisation, le pH est abaissé aux environs de 3,5, et la réaction de déblocage est maintenue à ce pH pendant 3 à 4 heures à la température ambiante. Le blocage reversible des groupes amines par la citraconylation à l'aide de l'anhydride citraconique est effectué suivant la méthode décrite par DIXON et PERHAM dans Biochem. J. (1968) 109 312-314. La digestion par la trypsine en deux étapes a été adaptée à l'hémagglutinine en s'inspirant de la méthode utilisée par ATASSI et Alia pour le lysozyme tBiochem. Biophys. Acta (1973) 303 203-209?. Conformément à l'invention, les fractions peptidiques antigéniques sont séparées et purifiées à l'aide des étapes successives suivantes - le mélange de peptides résultant de la digestion de l'hemag- glutinine est lyophilisé, puis on le remet en solution dans un faible volume et on le chranatographie sur une colonne de gel approprié - on teste les fractions sortant de la colonne pour leur activité de blocage d'anticorps d'hémagglutinine et on réu nit les fractions riches - on passe les fractions rassemblées contenant le peptide antigéniquement actif à travers une colonne contenant du '1Sépharose"couplé à des anticorps - on élue la colonne par l'acétate d'ammonium et les frac tions riches sont réunies et lyophilisées. Suivant une modalité particulière de ce mode de réalisation, le mélange de peptides résultant de la digestion de l'hémagglutinine est dissous dans l'acide formique à environ 5 %,avant son passage sur la colonne contenant le gel. Suivant une autre modalité particulière de ce mode de réalisation, l'élution de la colonne "Sépharose-anticorps après le passage des peptides, est effectuée par l'acétate d'ammonium 0,6 M et à un pH de 7,5, puis, quand la D.O. 280 revient a sa valeur initiale, par l'acide acétique 1 M. La présente invention a également pour objet la fraction de peptide antigéniquement actif obtenue par la digestion des glycoprotéines de surface. Par exemple, en partant de la souche A/NT6U(3QB)/68(H3N2), le peptide isolé antigéniquement actif est un peptide à 16 aminoacides,présentant la camposition suivante : Ile1 Vall Asx2 ThrI Ser2 2 Pro1 Gly3 Ala1 Leu1 Lys1. La présente invention a en outre pour objet les vaccins contenant des peptides antigéniquement actifs préparés conformément à la présente invention, couplés et/ou associés à des substances permettant d'augmenter le pouvoir immunogène. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise plus particulièrement l'isolement et la purification d'un peptide à partir de la région antigénique de l'h & agglutinine, lequel demeure antigéniquement actif sans dénaturation. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention. I1 doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple ainsi que le dessin annexé représentant les courbes de chromatographie et d'analyse, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, mais n'en constituent en aucune manière une limitation. I.- PURIFICATION DE VIRUS L'expérience a été effectuée avec la souche A/NT60(3QB)/68 (H3N2) [FAZEKAS de ST. GROTH et C. H~ffEXN C.R. Acad. Sci 276 Série D (1973) 1917-192 du type A Influenza Virus A/H0NG K0NG/68 (H3N2).Ce virus a été cultivé dans la cavité ailantoîque d'oeufs embryonnés de poule pendant 10 jours.Au bout de ce temps,on a prélevé le liquide al- lantoSque infecté par ce virus 3QB et on a centrifugé pendant 20 minutes à 10 000 g.Le liquide a été ensuite soumis à une centrifugation de l'ordre de 80 000 g pendant 90 minutes. Le virus sédimenté sous forme de culot est ensuite remis en suspension dans le tampon PBS (NaCl 1,6 g ; KC1 0,4 g; Na2EPO4 2,3 g ; KH2PO4 0,4 g; eau distillée 520-550 ml pH environ 6,4). On centrifuge ensuite le virus sur un gradient de saccharose de 15 à 60 % de saccharose dans le PBS, par centrifugation continue pendant 15 heures à 26 000 g. La fraction contenant le virus est diluée par le tampon PBS puis le virus est concentré par centrifugation à 100 000 g pendant une heure. Le virus subit ensuite une nouvelle purification par précipitation à l'aide d'une solution à 7 % de polyéthylèneglycol 6000 dans le tampon 0,1 M Tris/HCl (pH 7,4) ,ledit tampon contenant 0,5 M de Nazi. Le mélange réactionnel est-agité pendant 2 heures à 40C,puis centrifugé à 5 000 g pendant 15 minutes Les culots de virus obtenus sont remis en suspension et le virus est à nouveau centrifugé sur le gradient de saccharose, comme décrit plus haut. II.- TITRAGES DE L'HEMAGGLUTININE ET DE LA NEURAMINIDASE Le titrage de l'hémagglutinine est effectué suivant la méthode standard décrite par WEBSTER et DARLINGTON (J. Virology (1969) 4 182-187), et celui de la neuraminidase par la méthode à l'acide thiobarbiturique,avec la fetuine commé substrat LWARREN J. Biol. Chem. (1959) 234 1971-19757. III.- TEST DE BLOCAGE DES ANTICORPS ANTI-HEMAGGLUTININE C'est celui de WEBSTER et DARLINGTO1-; précédemment cités 4 unités d'anticorps inhibiteur d'hémagglutinine d a n s 25 pl sont mélangées avec des fractions provenant des colonnes de chromatographie (diluées deux fois) puis incubées pendant une heure à la température ambiante. On ajoute alors 4 unités d'hémagglutinine de virus dans 25 p1. Ce mélange est alors incubé pendant 30 minutes; puis on ajoute une solution (25 l) à 5 % d'érythrocytes de poule le titre de l'activité de blocage d e 1 ' a n t i c o r p s e s t exprimez par la plus forte dilution du matériel testé présentant une hémagglutination. IV- PREPÂRATION DE L'ANTISERUM Des lapins sont inoculés par la voie intrlmusculai- re par l'hémagglutinine purifée,-conformëent à l4tinventidn "15 pg" contenue dans de l'adjuvant complet de Freund : trois fois de suite avec chaque fois un intervalle de temps de quatre semaines. Le sérum est collecté io jours après la dernière inoculation. V- PREPARATION DE LA COLONNE SEPHAROSE-ANTICORPS La fraction IgG de l'antisérum est purifiée par précipitation par le sulfate d'ammonium (50 % pH 7,8) puis mise en suspension dans le tampon PBS. Cette opération est répétée deux fois. Le précipité final est resuspendu dans un volume (10 % du volume initial) de bicarbonate de sodium o,t M contenant 0,5 M de NaCl (pH 8,3). La suspension est passée à travers une colonne (30 cm x I cm) de Séphadex G 25 qualité "mediane" dans le même tampon, puis centrifugée à tO OOO tours par minute pendant 15 minutes. Le précipite est éliminé.Les anticorps (20 mg) sont alors couplés au Sepharose 4 B ("Pharmacia") activé par le BrCN La colonne est lavée abondamment afin d'éliminer complètement toutes traces de protelne liée de manière non-covalente. Ce lavage est effectué à l'aide d'acide acétique 1 M suivi d'un lavage par l'acétate d'ammonium 0,6 M (pH 7,5). On poursuit le lavage jusqu'à ce que la densité optique D.O. 280 demeure égale à O. VI- TRAITEMENT A LA BROMELAINE Le virus est mis en suspension dans du tampon 0,-1 M Tris/HCl (pH 7,4) contenant 1 mM d'EDTA et 0,1 mM.. de dithiothreitol. La concentration finale en virus est de 3 à 4 mg/ml. On détermine ensuite les conditions optimales du trait tement en utilisant différentes concentrations de bromé la ine sur des parties aliquotes de la solution et à des temps variant de 1 à 24 heures. Les surnageants et les précipités sont testés pour leur activité en neuraminidase et en activité hémagglutinante et on procède également a des électro phorèses sur gel de polyacrylamide SDS (12 % dans l'acrylamide).Après avoir déterminé la concentration optimale de bromélalne, on prépare une suspension de bromélaine (10 mg/ml) dans un volume déterminé de sulfate d'ammonium, on la centrifuge et on la redissout dans du tampon Tris/HCl. Cette solution est alors ajoutée à la suspension du virus de manière à avoir une concentration finale de 1 mg/ml de bromélaine pour 3 mg/ml de virus. La digestion se poursuit pendant 3 heures à 370C. Les particules virales résiduelles sont collectées par centrifugation à 110 000 g pendant une heure. La figure 1 représente trois courbes obtenues après passage sur la colonne Sephadex : la courbe A représente les pourcentages de transmission à 280 nm, la courberepré- sente l'activité de la neuraminidase et la courbe c l'activité de blocage des anticorps. VII.- PURIFICATION DE L'HEMAGGLUTININE Après le traitement à la bromélaine et la séparation de la neuraminidase, la majeure partie de l'hémagglutinine demeure fixée au virus apparemment sans changement. Les particules virales (qui ont sédimenté après le traitement à la bromélaine) sont mises en suspension dans 10 ml de tampon Tris/HCl (0,1 M pH 8). On ajoute alors une solution aqueuse à 10 % de lauroyl-sarcosinate de sodium gSARKOSYL NL 97 de Ciba-Geigy?, de manière à obtenir une concentration finale de 2,5 % en Sarkosyl. On laisse incuber cette suspension pendant 50 minutes à 370C, puis on dialyse contre du tampon Tris/HCl contenant 0,05 % de Sarkosyl. La suspension est ensuite centrifugée à 150 000 g pendant une heure, et le surnageant contenant l'hémagglutinine est absorbé sur une colonne (12 cm x 2,5 cm) de DEAE-Sephadex A-50. On introduit alors sur la colonne, par fractions de 120 ml, un gradient de NaCl (de 0 à 1,5 M) dans du tampon 0,1 M Tris/HCl (pH 7,4) contenant 0,05 % de Sarkosyl. Les fractions éluées sont testées pour déterminer leur teneur en hémagglutinine (le Sarkosyl interfère sur le dosage des protéines). On réalise sur les fractions recueillies, une électrophorèse sur gradients de gel de polyacrylamides(8-20 % d'acrylamide). L'hémagglutinine passe aux environs de 0,8 M NaCl. Les fractions riches en hémagglutinine sont réunies, dialysées contre le bicarbonate d'ammonium (50 mM; pH 7,8), puis lyophilisées. Le lyophilisat est redissout dans 3 ml de ce tampon, puis purifié par gel-filtration sur Séphadex G 100 de qualité superfine (colonne 100 cm x 2,5 cm équilibrée avec du bicarbonate d'ammonium 50 mM, pH 7,8). L'hémagglutinine obtenue est pratiquement pure. Le Tableau I ci-après donne le rendement en hémagglutinine à chaque-étape de la purification. TABLEAU I HEMAGGLUTININE Etape en poids en unités HAU inhibitrice Virus 62 mg 6 x 10 Traitement a la bromélaine 300 vg (4mol) 6 x Traitement au Sarkosyl et au DEAE Sephadex 14,4 mg 3 x 105 Traitement au Sephadex G100 9 mg (112 nmol) 1,8 x 105 VIII.- DIGESTION DE L'HEMAGGLUTININE PAR LA TRYPSINE La solution d'hémagglutinine obtenue au cours de l'étape précédente est tout d'abord dialysée contre du bicarbonate d'ammonium (50 mM), puis lyophilisée.La poudre obtenue est redissoute dans 4 ml d'eau et le pH ajusté à 8,2 par la soude 1 M. On ajoute alors par petites quantités (de l'ordre de 2 pl) de l'anhydride citraconique en un laps de temps d'environ 20 minutes, le pH étant toujours maintenu entre 8 et 9 par addition de Na OH j M. Quand l'absorption de l'anhydride citraconique parait complète, on arrête les additions de cet anhydride et on laisse lè mélange sous agitation pendant encore 90 minutes. Au bout de ce temps on dessale la solution par passage sur colonne de Sephadex G25, qualité médiane, et l'on reçoit dans une solution de bicarbonate d'ammonium (50 mM ; pH 7,8). On procède ensuite à la digestion de l'hémagglutinine citraconylée, par la trypsine. Dans ce but,on ajoute 0,2 mg de trypsine à la solution de l'hémagglutinine dans le bicarbonate d'ammonium, et on maintient à 370C pendant 2 heures. Au bout de ce temps, on rajoute o,1 mg de trypsine et on laisse l'bydrolyse se poursuivre 16 heures encore. Au bout de ce temps on abaisse le pH à 3,5 à l'aide d1HCl 0,5 M, et la réaction de déblocage des groupes citroconyle se poursuit pendant 3 à 4 heures à la température ambiante. Au bout de ce temps, le pH est réajusté à 8,2 par la soude et on répete une deuxième digestion à la trypsine dans les mêmes conditions que précédemment. A-la fin de la réaction de digestion la solution contenant les peptides est concentrée par lyophilisation, puis la poudre obtenue est dissoute dans l'acide formique à 5 %. Cette solution acide de peptide est passée ensuite sur une colonne (90 cm x 1 cm) contenant le gel Séphadex G50, qualité superfine, et les fractions recueillies sont lyophilisées.Chacune de ces fractions est ensuite testée pour ses propriétés de blocage des anticorps de l'hémagglutinine. La figure 2 représente la courbe de séparation des peptides de l'hémagglutinine sur cette colonne : la courbe a montre le pourcentage de transmission (échelle de gauche) et la courbe b l'actiyité de blocage des anticorps (échelle de droite). Les fractions riches en activité antigénique sont rassemblées puis passées sur une colonne (9 cm x 0,5 cm) Sépharose-anticorps (préparée comme indiqué en V ci-dessus). Cette colonne est ensuite lavée d'abord par l'acétate d'ammonium (0,6 M ; pH 7,5) jusqu'à ce que la D.O. 280 retrouve sa valeur initiale, puis par l'acide acétique 1 M. La figure 3 représente le dEroulement de cette opération. La courbe a représente la densité optique des fractions et la courbe b l'activité de blocage des anticorps.La flèche indique le commencement du lavage à l'acide acétique. X - OBTENTION DU PEPTIDE ANTIGENIQUEMENT ACTIF Les fractions contenant le peptide décroché de la colonne par lavage à l'acide acétique sont réunies et conge lées. Le P.M. de ce peptide est d'environ 1600 et sa composition figure dans le Tableau 2 ci-après. gLes analyses ont été effectuées sur l'analyseur JEOL suivant la méthode préconisée par AITKEN et STANIER dans J. Gen. Microbiol. (1979) 112 219-223?. TABLEAU 2 Composition en acides aminés du peptide conforme à la présente invention (pour la souche A/NT 60 (3QB)/68 (H3N2) Acide aminé Rapport molaire Nombre Lysine 1,06 1 Acide aspartique 2,06 2 Thréonine 1,14 1 Sérine 1,87 2 Acide glutamique 2,07 2 Proline 1,13 1 Glycine 3,04 3 Alanine 1,01 1 Valine 0,75 1 Isoleucine 0,78 1 Leucine 1,09 1 I1 ressort de la description qui précède que l'on obtient pour la première fois par digestion enzymatique du virus grippal,des pep tides antigéniquement actifs isolés à partir des régions antigéniques de i 'hémagglutinine,et ceci pour tous les sous-types du virus grippal. L'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre,de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite;elle en entrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière,sans s'écarter du cadre,ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation des peptides antigéniques à partir de glycoprotéines de surface des virus Influenza (pour toutes les souches du virus grippal,aussi bien pour les souches humaines que pour les souches animales), caractérisé en ce gu'il comprend les étapes suivantes : - purification du virus' ; - traitement du virus par une protéinase pour la séparation de la neuraminidase ; - extraction et purification de l'hémagglutinine native ; - digestion de l'hemag- glutinine par la trypsine ; - séparation et purification des fractions peptidique-antigéniques. 2 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ee que la digestion de l'hémagglutinine par la trypsine est effectuée dans des conditions respectant le pont disulfure S-S de cette dernière, à savoir : - citraconylation de l'hémagglutinine afin d'éviter le clivage des liaisons lysine-peptides ; - déminéralisation de la solution d'hémagglutinine par passage sur-une colonne de tamis moléculaires ; - addition de la'trypsine à l'hémagglutinine citraconylée à un pH alcalin et clivage des liaisons arginine-peptides - abaissement du pH afin de débloquer les groupes citraconylés ; - alcalinisation de la solution et poursuite de la digestion, et clivage des liaisons'lysine-peptides. 3 - Procédé selon la Revendication 2, caractérisé en ce que la trypsine est ajoutée en deux fractions à une solution de bicarbonate d'ammonium (50 mM, pH 7,8 environ) contenant l'hémagglutinine citraconylée, la réaction étant poursuivie environ 16 heures à une température voisine de 370C. 4 - Procédé selon la Revendication 2, caractérisé en ce que le pH est abaissé aux environs de 3,5, et la réaction de déblocage est maintenue à ce pH pendant 3 à 4 heures à la température ambiante. 5 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les fractions peptidiques antigéniques sont séparées et purifiées à l'aide des étapes suivantes : - on mélange'les peptides résultant de la digestion de l'hémagglutinine et lyophilisés,puis on les remet en solution dans un faible volume et on les chromatographie sur une colonne de gel approprié ; - on teste les fractions sortant de la colonne pour leur activité de blocage d'anticorps d'hémagglutinine et on réunit les fractions riches - on passe les fractions rassemblées contenant le peptide antigéniquement actif, à travers une colonne contenant du "Sépharose"coupléà des anticorps ; - on élue la colonne par l'acétate d'ammonium et les fractions riches sont réunies et lyophilisées. 60- Procédé selon la Revendication 5, caractérisé en ce que le mélange de peptides résultant de la digestion de l'hémagglutinine est dissous dans l'acide formique à environ 5 % avant son passage sur la colonne contenant le gel. 70- Procédé selon les Revendications 5 et 6, caractérisé en ce que l'élution de la colonne"Sepharose"-anticorps apres le passage des peptides est effectué par l'acétate d'ammonium 0,6 M et à un pH de 7,5, puis, quand la D.O. 280 revient à sa valeur initiale, par l'acide acétique 1 M. 8. - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la purification du virus est obtenue en réalisant sa culture dans la cavité allantolque d'oeufs de poule embryonnés, en clarifiant le liquide allantolque infecté par centrifugation, puis en récoltant le virus sous forme de culot par ultra-centrifugation, en mettant le virus en suspension dans des tampons appropriés et en le sédimentant sur des gradients de saccharose dans le meme tampon, en reprenant le virus des bandes de densité convenable et en terminant la purification par précipitation par un solvant approprié. 90- Procédé selon la Revendication 8, caractérisé en ce que le virus récolté est mis en suspension dans un tampon phosphates-sel physiologique (PBS), sédimenté sur un gradient de saccharose (15 - 60 % de saccharose dans le tampon PBS) et concentré par centrifugation continue (environ 26 000 g) durant 15 heures environ. 10 - Procédé selon la Revendication 8, caractérisé en ce que le solvant de précipitation de virus purifié est constitué par le polyéthylèneglycol dans un tampon Tris/HCl contenant environ 0,5 M de Nazi. 110- Peptides antigéniquement actifs obtenus par le procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 10. 120- Peptide antigéniquement actif selon la Revendication 11, caractérisé en ce qu'il est isolé de la souche A/NT60(3QB)/68(H3N2) et comprend les aminoacides suivants isoleucine, valine, acide aspartique, thréonine, sérine, acide glutamique, proline, glycine, alanine, leucine, lysine, présents suivant la formule : Ilel Val1 Asx2 Thrl Ser2 G1x2 Pro Gly3 Alal Leul Lysl. 130- Vaccins comprenant les peptides selon la Revendication Il ou la Revendication 12, couplés et/ou associés à des substances permettant d'augmenter le pouvoir immunogène.