Brevet FR2484408A1 — publié le 19811218

('('lt t. illVenlt i.Onl C(.)1c(LIrno die (OUV(.i UX COmlposés anti- foncjiques semi-synthétiques que l'on prépare par acylation de noyaux peptidiques cycliques obtenus par désacylation enzymatique de l'antibiotique peptidique cyclique correspondant. L'antibiotique peptidique cyclique est un composé antifongique ayant la formule générale: Hg HRa. R 4 H CH' H. IN-R H. HO R HzC H**'- H--N\ H *H - À.'-ô*= 1=5 HH - H OH \, H *_._X_-, /,_ R1 ' OH. __ C H * I H 1 2 3 4-dso. dans laquelle R, R, R, R et R sont définis ci-dessous. Dans touLe cette demande, les formules des peptides cycliques, comme la formule I, supposent que les amino-acides représentés sont en configuration L. Les facteurs A, B, D et H de A-30912 sont des antibiotiques peptidiques cycliques de formule générale I o R est le groupement linoléoyle [cis,cis CH3 (Ci2) 4-CH=CHCH2CH= Cil- (Cil2) 7-CO- ' Le facteur A de A-30912 a la formule I dans laquelle, 1R, t RH sont tous OH et R est I. Le facteur B de A-30912 a la formule I dans laquelle R et R sont tous deux Il et R3 et R sont'tous deux ORH. - Le facteur D de A-30912 a la formule I dans laquelle i 2 3 4 R,R, R et R sont tous H. Le facteur H de A-30912 a la formule I dans laquelle i 4 2 3sntosdxORetleesC3 R et RZ sont tous deux OH, R est Hl et R est CH30. 2484-408 tL'aiiLibiotiquetc S 31794/F-1 est Iun pepLtide cyclique antifonqique de formule I dans laquelle R est un groupement I 3 4 2 -ON myristoyle et R, R et R sont OH et R est -CO-NH2. Chaque facteur est isolé du complexe A30912 qui contient les autres facteurs arbitrairement appelés facteurs B, C, D, E, F et G. Le complexe A-30912 et les facteurs A à G individuels sont décrits par M. Hoehn et K. Michel dans le'brevet des E.U.A. N 4.024.245. Le facteur A de l'antibiotique A-30912 est identique à l'antibiotique A-22802 qui est décrit dans le brevet des E.U.A. N 4.024.246. Il a également été trouvé que le facteur A est identique à l'échinocancdine B antibiotique [voir F. Benz et al., Helv. Chim. Acta, 57, 2459 (1974) et brevet suisse N 568.386] et à l'antibiotique SL 7810/F [voir C. Keller-Juslen et al. Tetrahedron Letters, 4147 (1976) et brevet belge N 834.2891. Le [acteur A de l'antibiotique A-30912 est préparé par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir: (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113; (b) Aspergillus nidulans NRRL 8112; (c) Asperqillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860; (d) Aspergillus rugulosus NRRL 8039; ou (e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440. On a également trouv é-que le facteur Best identique à l'échinocandine C antibiotique [voir R. Traber et al., Helv. Chim. Acta, 62, 1252 (1979)] et à l'antibiotique SL 7810/F-II [voir le brevet belge N' 834.289]. On prépare le facteur B de l'antibiotique A-30912 par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir: (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113; (b) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860; (c) Aspergillus ruqulosus NRRL 8039; ou (d) Asperqillus nidulans var. roseus NRRL 1440. On a également trouvé que le facteur D est identique à l'échinocandine D antibiotique [voir R. Traber et al., Helv. Chim. Acta, 62, 1252 (1979)] et à l'antibiotique SL 7810/F-III1 voir le brevet belge NQ 834.2891. On prépare le facteur D de l'antibiotique A-30912 par frrlnELtation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir: (a) Aspergillus k rugulosus NRRL 8113; (b) Asperoillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860-; (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 (voir le brevet beige N 834.289); ou (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440. Le facteur.Il est un facteur de l'antibiotique A-30912 découvert plus tard, et il est décrit dans la demande de brevet français N 80]2212dont la description est incorporée ici par voie de référence. Le facteur H de A-30912 est préparé par fermentation en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir: (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113; ou (b) Asprgillus nidulans var. roseus NRRL 11440. Une sous-culture de A. nidulans var. roseus a été déposée et fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, o elle est disponible au public sous le numéro NRRL 11440. Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 1.1440 pour produire l'un quelconque des facteurs A-30912, on obtient un ensemble complexe de facteurs--qui pour des raisons de commodité est appelé complexe antibiotique A-42355. Le facteur A de A30912 est le facteur principal du complexe antibiotique A-42355, tandis que les facteurs B, D et Il sont des facteurs mineurs. Les préparations 2 à 7 suivantes illustrent la préparation du complexe A-42355 et l'isolement et la purification des différents facteurs de A-30912. Dans la molécule antibiotique de formule I, la chaîne latérale linoléoyle (R) est fixée au noyau peptidique cyclique sur le groupement a-amino du reste ornithine. On a trouvé de façon surprenante que la chaîne latérale linoléoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans modifier l'intégrité chimique du noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme de la famille Actinoplanaceae, de préférence le micro-organisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052 ou un de ses variants. 248440e Pour-effecLuer la désacylation, on ajoute le facteur approprié de l'antibiotique A-30912 à une culture du micro-organisme et on laisse la culture incuber avec le substrat jusqu'à ce que la désacylation soit pratiquement complète. Le noyau cyclique ainsi obtenu est séparé du bouillon de fermentation par des procédés connus dans le domaine. Au contraire des facteurs A, B, D et H de l'antibiotique A-30912, le noyau celique (ne possédant pas la chaîne latérale linolêoyle) est essentiellement exempt d'activité antifongique. L'antibiotique S31794/F-1, qui est décrit dans la. demande de brevet allemand publiée après examen N 2.628.965 et dans le brevet des E.U.A. Ne 4.173.629, est produit par Acrophialophora limonispora nov. spec. DreyfuSs et Muller NRRL 8095. S31794/F-1 a les caractéristiques suivantes: p.f. 178-180 C (avec décomposition) (amorphe) ou 181-183 C (avec décomposition) (cristallisé); [aID - 24 (c 0,5, Cil3O01) ou + 37 (c 0,5, pyridine) (cristallisé); maxima 3 1 %_ d'absorption UV dans le méthanol à 194 nm (E1 cm =' 807), 1 % 11%c' 225 nm (épaulement) E _m = 132), 276 nm (E 1 cm 12,8), 228nm(cpaulement) 284 nm (épaulement) El = 10,5); un spectre RMN du 13 c carbone C dans le deuterométhanol (190 mg dans 1,5 ml de deuteromnéthanol, en utilisant le tétraméthylsilane comme étalon interne) ayant les caractéristiques suivantes (à l'état cristallisé): PPM PPM PPM 176,2 75,5 51,2 ,0 74.0 39,7 173,7 71,0 38,8 172,6 70,5 36,6 172,0 69,7 34,8 171,8 68,0 32,8 171,7 62,2 30,6 168,6 58,3 26,7 157,7 57,0 23,5 132,5 56,2 19,7 129,0 55,4 14,3 ,9 52,9 11,1 76,6 cyc, l.iu,( i iiin:;i c)b.Letut esL séparé ducl boui.l Ion de ffermentLation par des 1)-occeds connus dans le domaine. Au contraire de l'antil)ioLiqlue S31794/F-1, le noyau cyclique (ne présentant pas la chaîne latérale myristoyle) est essentiellement exempt d'activité antifongique. Les noyaux peptidiques cycliques fournis par les réactions de désacylations enzymatiques susmentionnées des antibiotiques de formule I sont représentés par la formule générale II. CHOQ R R4 CH3 H H./ H H.... HO\ -R- V H H-N. CH3 e/-' = I 0 =. H OH 1 '-OH H1-. T T0O H Il Le composé de formule Il o R, R3 et R sont tous des groupements hydroxy et R2 est HI est le noyau du facteur A de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau de A-30912A". Le noyau de A30912A a une formule brute de C34 1 N7015 et un poids moléculaire de 797,83. ILe composé de formule II o R et R sont tous deux 3 4' Il et R3et R4 sont tous deux OH est le noyau du facteur B de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau de A-30912B". Le noyau de A- 30912B a une formule empirique de C34 H 51N7O14 et un poids moléculaire de 781,81. unt.î1rî I;':;' particulier contre Candida albicans. On prépare l'antibiotique S31794/F-1 par culture aérobic en immersion de Acrophialophora limncnispora NRRL 8095 comme décrit dans les préparations 8 et 9. Ce micro- organisme fait partie de la collection de cultures permanentes clu Northern Reqional Researchl Coenter, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, o elle est disponible au public sous]le numéro d'accès NRRL i(ndiqut. I,'antibiotique S31794/F-1 a une activité anti- fongique, en particulier contre les souches Candida comme Candicla albicans. Ainsi, la production et l'isolement de l'antibiotique peuvent être contrôlés par bioautographe en util]isant une espèce Candida comme Carndida a]bicans. Dans la molécule de l'antibiotcijue S31794/F-1 cde formuJle I, o RI, i3 et R4 sont tous dles groupements hydroxy et R est un groupement -CO-N112, la chaine latérale myristoy].e (R) est fixée au noyau peptidique cyclique sur le groupement,1-amino du reste dihydroxyornithine. On a trouvé do façon surprenante que la chaine latérale myristoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans nu.ire à l'intégrité chlimÀiqluce idu noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction dle désacylation est produite par un micro-organisme de la famille Actinoplanaceae, de préférence le micro- organisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052 ou un- de ses variants. Pour effectuer la désacylation, on ajoute l'anti)bioit:que S31794/F-] à une culture clu micro-organisme et- on]a i sse la culture incuber avec le substrat jusqu' à ce que la dcésacylation soit pratiquement complète. Le noyau Le composé de formule II o R 1 R2 R3 et R4 sont tous des atomes d'hydrogène est le noyau du facteur D de A-30912 et sera appelé ici pour des raisons de commodité "noyau de A-30912D". Le noyau de A-30912D a une formule brute de C341151N7012 et-un poids moléculaire de 749,83. Le composé de formule II o R1 et R4 sont tous deux OH, R2 est H et R3 est CH30- est le noyau du facteur H de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelî ici "noyau de A-30912-H". Le composé de formule II dans laquelle R, R et R sont Ol! et R est -CONH2 est le noyau de l'antibiotique S 31794/F-1-et sera appelé ici "noyau de S 31794/F-1". Le noyau de S 31794/F-1 a une formule brute de C35H52N8016 et. - un poids moléculaire de 840,87. L'enlèvement de la chaîne latérale fournit un groupement c-amino primaire libre dans le reste ornithine du peptide cyclique. Comme le verra l'homme de l'art, les noyaux peuvent être obtenus sous la forme de l'amine libre ou sous la forme d'un sel d'addition d'acide. Bien que l'on puisse utiliser un quel-conque sel d'addition d'acide approprié, on préfère ceux qui sont rdon toxiques et acceptables sur le plan pharmaceutique. Le procédé de préparation de chaque noyau à partir de l'antibiotique approprié à l'aide d'une fermentation utilisant Actinoplanes utahensis NRRL 12052 est décrit dans la demande de brevet déposée le-même jour que la présente demande de brevet sous le N 80 26 218. Des cultures d'espèces représentatives d'aIQiima - 2nanaceae sont mises à la disposition du public au Nrtherma Regional Research Laboratory sous les numéros d'acids suivants: Actinoplanes utahensis NRRL 120%2 Actinoplanes missouriensis NRRL 120)53 Actinoplanes sp. NRRL 8122 Actinoplanes sp. NRRL 12065 Streptosporanqciumn roseum var. hollandensis NRRL 12-064 2484408- L]'efficacité d'une quelconque souche donnée de micro-organismes appartenant à la famille des Actinoplanaceae pour la mise Cen oeuvre- de la désacylation de cette invention est déterminée par le mode opératoire suivant. On inocule avec le micro-organisme un milieu de culture approprié. On fait incuber la culture à-environ 280C pendant deux ou trois jours sur un agitateur rotatif. Puis on ajoute à la culture l'un des antibiotiques utilisés comme substrat. On maintient le pHl du milieu de fermentation à environ 6,5. On contrôle la culture pour son activité en utilisant une.analyse.par Candida albicans. La perte de l'activité antibiotique est'une indication que le micro-organisme a produit l'enzyme nécessaire pour la désacylation. Ceci doit creéendant être vérifié en utilisant l'un des procédés suivants: 1) analyse. par chromatographie liquide sous pression élevée pour déterminer la présence du noyau intact; ou 2) réacylation avec une chaîne latérale appropriée (par exemple linoléoyle, stéaroyle, palmitoyle ou myristoyle) pour rétablir l'activité. On sait que d'autres substances antibiotiques possèdent le même noyau que celui de facteur A de l'antibio- tique A-30912.. Ces antibiotiques différent du facteur A de l'antibiotique A-30912 en ce que des groupements acyle différents sont présents à la place du groupement linoléoyle (R) de la formule I. De tels antibiotiques sont: (a) le 25. facteur A de A-30912-t6trahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F -; tétrahydro échlinocandïne B)-décrit dans le brevet belge N 834.289 et par F. Benz et al., IlIelv. Chim. Acta, 57- 2459 (1974), composé qui est décrit par la formule I quand R est un groupement stéaroyle;-et (b) l'aculaécine A, qui est un composant du complexe d'aculaécine (préparée par fermentation en utilisant Aspergillus aculeatus NRRL8075) et est décrit dans le brevet des E.U.A. -N 3.978.210. Comme décrit dans le brevet belge N 859.067, dans l'aculaécine A, la chaîne latérale palmitoyle est présente a la place du groupement linoléoyle. Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur A de A-30912 par hydrogénation catalytique en utilisant PtO2 dans l'éthanol, sous une pression positive. Le facteur A de A-30912 sous une pf-ession positive. Le facteur A de A-30912 q Lé tr;nll l en utilisant lesmodes opératoires décrits ici. On'sait également qu'une autre substance antibiotique possède le même noyau que le facteur B de l'antibiotique A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur B de l'antibiotique A-30912 en ce qu'un groupement aGyle différent est présent à la place du groupement linoléoyle R de la formule I, est le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-II; tétrahydro échinocandine C) décrit par R. Ttaber et al., lHelv. Chim. Acta, 62 1252 (1979). Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné est décrit par la formule I quand R est un groupement stéaroyle. Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur B de A30912 par hydrogénation catalytique en utilisant PtO2 dans l'éthanol sous pression positive. Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné peut être utilisé comme substrat à la place du facteur B de l'antibiotique A-30912 pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici. On sait en outre qu'une autre substance antibiotique possède le même noyau que le facteur D de A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur D de l'antibiotique A-309].2 en ce qu'un groupement acyle différent est présent à la place du groupement linoléoyle (R) de la formule I, est le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-III; tétrahydro-échinocandine D) décrit par R. Traber et al., Ilelv. Chim. Acta, 62 1252 (1979). Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné est décrit par la formule I quand R est un groupement stéaroyle. Le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur D de l'antibiotique A-30912 par hydrogénation catalytique en utilisant PtO2 dans l'éthanol sous pression positive. Le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut être utilisé comme substrat à la place du facteur D de A-30912 antibiotique pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici. Dans le facteur Hl de l'antibiotique A-30912, le 248440* I 0 rou[t m,'l '-Il-h -ydroxy prdsel dans le rei-c;te dtillhydroxy- ornithinie dit noyau peptidique est méLliylé, tandis que dans le facLtur A de l'antibiotique A-3091.2, le groupement 5- hydroxy n'est pas substitué. On verra donc que l'on peut préparer le facteur H de façon synthétique en méthylant le facteur A selon des procédés classiques pour préparer un éther aliphatique à partir d'un alcool. On verra également quç le facteur A peut être alkylé avec d'autres groupements alkyle inférieur pour former des homologues à groupements alkyloxy de la molécule du facteur H. Les homologues à groupements alkyloxy du facteur H que l'on peut préparer par synthèse à partir du facteur A, sont connus sous le nom d'homologues du type facteur H de A-30912. Les composés de formule Il o R1 et R4 sont tous deux OH, R2 est H et R est un groupement alkyloxy en C2-C sont ici appelés comme les 2 6 "noyaux du type A-309121I". On verra également que la chaîne latérale linoléoyle du facteur Il de A30912 ou des homologues de type facteur H de A-30912 peut être hydrogénée selon des techniques classiques pour former le facteur H de A-30912 tétrahydrogéné ou le dérivé tétrahydrogéné correspondant des homologues à groupements alkyloxy (R est un groupement stéaroyle). On peut également préparer les dérivés tétrahydrogénés en hydrogénant d'abord le facteur A de l'antibiotique A-30912 pour obtenir le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné puis en formant le dérivé alkyloxy désiré. Il est entendu que le facteur il de l'antibiotique A-30912, le facteur HI de A-30912 tétrahydrogéné, un homologue à groupements alkyloxy en C2-C du facteur H ou un dériv6 tétrahydrogéné d'un homologue du facteur H à groupement alkyloxy en C2-C6 peuvent être utilisés comme substrat pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici. . L'invention qui fait l'objet de la présente demande décrit de nouveaux composés obtenus par acylation d'un noyau peptidique cyclique de formule II. Les composés de la présente invention ont la structure chimique décrite par la formule III HOH R R4 c Ha.. H H I H-OuINR "%,X /.=O =O H.....o-e. À H / \ \ _H _ R2-H2CH t-H H N H CH e ^ O 2Y 0OH __. \OH /-%. 2 0.. o H dans laquelle R5 III est un groupement de formule: (a) -_ (W) m(A') ---(A) 0R6 / (w)m-(A)n 4 (ApiX "\4.A "(A) ou -0-(W) m -i t(A)pR6 p (b) (c) dans lesquelles A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle; A1 est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle, sulfonyle ou -NH-; X est un radical hydrogène, chloro, bromo, iodo, nitro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alcoxy en C1-C3, mercapto, alkylthio-en C-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1- C3; X est un atome de chlore, de brome ou d'iode; R est un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle en Ci-C18 ou alcényle en C2-C18;West un groupement alkylène en Ci-C10 ou alcénylène en C2-C10; m, n et p valent 0 ou 1, mais si m = 0, n doit être égal à zéro; pourvu que: la somme des atomes de carbone des groupements R et W soit supérieure à 4 mais ne puisse pas dépasser 21; que, quand X est un groupement-mercapto, A et A1 ne puissent pas être un groupement sulfinyle ou sulfonyle; et que, quand A et A sont des groupements sulfinyle ou sulfonyle, ils soient dans des états d'oxydation égaux. Un sous-groupe préféré de composés de formule III sont ceux o R a la formule (a) o met n = 0, p = 1 et R6 est un groupement alkyle en C5-C18 ou alcényle en C5-C18. 18 5 18, L'homme de l'art verra que, dans le noyau - substitué du groupement R5, la fonction O -C-W-A - et la fonction -AR peuvent être placées sur le noyau benzène en position ortho, méta ou para l'une par rapport à l'autre. On préfère que ces groupements soient en position para. Le substituant représenté par X peut être placé en une quelconque position disponible du noyau benzène non occupée par ces deux groupements. Tels qu'utilisés ici, les termes "alkyle" ou "alcényle" désignent les chaines hydrocarbonées ramifiées ou droites. Par "alcényle", on désigne un groupement hydrocarboné insaturé contenant une, deux ou trois doubles liaisons qui peuvent être en configuration cis ou trans. Des exemples de radicaux alkyle enC5-CC18 que l'on préfère pour R pour les besoins de la présente invention sont: (a) -(CH2)nCH3 o n' est un entier de 4 à 17; et CH (b) -(CH2)rCH(CH2)sCH3 o r et s sont indépendamment un entier de 0 à 15, pourvu que la somme r + s ne soit pas supérieure à ou inférieure à 2. Des exemples de radicaux alcényle en C5-C18 que 6 5 18 l'on préfère pour R pour les besoins de cette invention sont: (a) -(CH2)tCH=CH-(CH2)n,,-CH3 o t est un entier de 1 à 15 et n'' est un entier de 0 à 15, pourvu que t + n'l ne soit pas supérieur à 15 ou ne soit pas inférieur à 2 (b) -(CH2)V-CH=CH-(CH2)y-CH=CH-(CH2)z-CH3 o v et z sont indépendamment un entier de 0 à 12 et y est un entier de 0 à 13 pourvu que v + y + z ne soit pas supérieur à 13. Des exemples de radicaux alkylène en Cl-C10, qui sont les groupements W préférés pour les besoins de cette invention sont: (a) -(CH2)n,,,- ou n': est un entier de 1 à 10; (b) les groupements méthylène et éthylène; et CH3 (c) -(CH2)r,-CH(CH2)s,- o r' et s' sont indépendamment des entiers de 0 à 8 pourvu que r' + s' ne soit pas supérieur à 8 ou ne soit pas inférieur à 1. Des exemples de radicaux alcénylène en C2-C10 qui sont des groupements W préférés pour les besoins de cette invention, sont: (a) -(CH2)t,-CH=CH(CH2)v,- o t' et v' sont indépendamment des entiers de 0 à 8D pourvu que t' + v' ne soit pas supérieur à 8; (b) -(CH2)X,-CH=CH-(CH2)y,-CH=CH-(CH2) z,- o x' et z' sont indépendamment des entiers de 0 à et y' est un entier de 1 à 5, pourvu que x' + y' + z' ne puisse pas être supérieur à 10. L'invention fournit en particulier un composé de formule: dans laquelle R est H ou OH et quand R est H, R est H et R et R sont tous deux H ou tous deux OH, et quand R est OH, R est H, R est OH ou un groupement alkyloxy en C-C et R est OH, ou 2 4 bien R est -CO-NH2 et R3 et R sont tous deux OH, et R est un groupement de formule: e (a) - --(W) -(A')n -- f.---(A) R6 (b) - m(W) -(A1)-4-J-(A) R6 f 01. P OU (c) (-(W)- ---I-; Re SSN o A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle; A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle, sulfonyle ou -NH-; X est un atome d'hydrogène ou un radical chloro, bromo, iodo, nitro, alkyle en C1-C3 hydroxy, alcoxy en C1-C3, mercapto, alkylthio en-C1-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1- C; est un atome de 6 1 3 X chlore, de brome ou d'iode; R est un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C18 ou alcényle en C2-C18; W est un groupement alkylène en C1-C10 ou alcénylène en C2-C; m, net p sont 0 ou i mais si m = 0, n doit être égal à zéro; pourvu: que la somme des atomes de carbone dans les groupements R6 et W soit supérieure à 4 mais. ne puisse dépasser 21; que, quand X est un groupement mercapto, A et A1 ne puissent pas. être des groupements sulfinyle ou sulfonyle; et que, quand A et A1 sont des groupements sulfinyle ou sulfonyle, ils soient dans des états d'oxydation égaux. Les composés de formule III inhibent la croissance des champignons pathogènes comme le montrent les modes opératoires d'essai biologique classiques. Les composés sont donc utilisables pour lutter contre la croissance des champignons sur les surfaces environnementales (en tant qu'antiseptiques) ou dans le traitement des infections provoquées par des champignons. L'activité antifongique des composés a été démontrée vis-àvis de Candida albicans in vitro dans des essais de diffusion de disque sur plaque de gélose ou des ess'ais de diffusion sur tube de gélose, ou dans des essais in vivo chez des souris infectées par C. albicans. Les composés sont donc particulièrement utilisables pour le traitement d'infections provoquées par des souches de C. albicans (candidose). Les composés de formule III ont également présenté une activité in vitro dans des essais de diffusion de disque sur plaque de gélose vis-à-vis de Tricophyton mentagrophytes, un organisme dermatophyte. On a également trouvé une activité dans les essais de diffusion de disque sur plaque de gélose in vitro vis-à-vis de Saccharomyces pastorianus et de Neurospora crassa. Certains composés (comme indiqué dans l'Exemple 24, Tableau 11) donnent des taux significatifs dans le sang après administration par voie orale chez les souris. Quand on l'administre à un chien par administration intraveineuse à raison de 100 mg/kg par jour pendant cinq jours, le composé de formule III o R5 est un groupement _- (n-octyloxy)benzoyle, ne présente aucun signe extérieur de toxicité, bien que l'on observe des taux accrus en transaminase glutamo-pyruvique sérique. On prépare les composés de formule III en acylant un noyau approprié sur le groupement a-amino de l'ornithine avec la chaîne latérale appropriée, en utilisant les procédés classiques dans le domaine pour la formation d'une liaison amide. L'acylation est généralement effectuée en faisant réagir le noyau avec un'dérivé activé du composé substitué de formule IV (a), (b) ou (c), correspondant au groupement chaîne latérale acyle désiré (R5). IV (a) H0- -(W) -(A) -(A) R- m n. IV HO- fia-(W) - (A, A1, W, m, n, p et R6 sont tels que définis précédemment). Par l'expression "dérivé activé", on désigne un dérivé qui rend la fonction carboxy de l'agent d'acylation réactive à la copulation avec le groupement amino primaire pour former la liaison amide qui lie la chaiîne latérale au noyau. Des dérivés activés appropriés, leurs procédés de préparation et leurs procédés d'utilisation comme agents d'acylation d'une amine primaire sont connus de l'homme de l'art. Les dérivés activés préférés sont: (a) un halogénure d'acide (par exemple un chlorure d'acide) , (b) un anhydride d'acide (par exemple un anhydride d'acide alcoxyformique ou un anhydride d'acide aryloxyformique) ou (c) un ester activé (par exemple un ester 2,4,5-trichlorophénylique, un ester de N-hydroxybenzotriazole ou un ester de N-hydroxy- succinimide). D'autres procédés d'activation de la fonction carboxy comprennent la réaction de l'acide carboxylique avec un carbonyldiimide (par exemple le N,N'-dicyclohexylcarbo- diimide ou le N,N'-diisopropylcarbodiimide) pour donner un intermédiaireréactif qui, en raison de son instabilité, n'est pas isolé, la réaction avec l'amine primaire étant alors effectuée in situ. Un procédé préféré de préparation des composés de formule III est le procédé par l'ester actif. On préfère nettement l'utilisation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide correspondant à la chaine latérale désirée (formule IV) comme agent d'acylation. Dans ce procédé, on fait réagir un excès de l'ester actif avec le noyau à la température ambiante dans un solvant organique non réactif comme le diméthylformamide (DMF). La durée de la réaction n'est pas déterminante, bien que l'on préfère une durée d'environ 24 à environ 120 heures. A la fin de la réaction, on enlève le solvant et on purifie le résidu par chromatographie, par exemple sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol, ou par chromatographie liquide sous pression élevée (CLPE) à phase inversée en utilisant une résine à phase inversée de gel de silice/C18 comme phase fixe et un mélange d'eau, de méthanol et d'acétonitrile comme mélange solvant. On prépare commodément les esters 2,4,5-trichloro- phényliques en traitant l'acide constituant la chaîne latérale (formule IV) par le 2,4,5-trichlorophénol en présence d'un agent de copulation, comme le NN'-dicyclohexylcarbo- diimide. D'autres procédés de préparation des esters actifs apparaitront à l'homme de l'art. Les acides substitués de formule IV et leurs dérivés activés sont des composés connus ou bien peuvent être préparés à partir de composés connus par des'procédés connus dans le domaine. Les acides benzoiques, phénylalkyl- carboxyliques, phénylalcénylcarboxyliques, phénoxyalkyl- carboxyliques, phénoxyalcénylcarboxyliques, phénylthioalkyl- carboxyliques, phénylthioalcénylcarboxyliques, phényl- sulfinylalkylcarboxyliques, phénylsulfinylalcénylcarboxyliques, phénylsulfonylalkylcarboxyliques, phénylsulfonylalcényl- carboxyliques, pyridinylcarboxyliques, pyridinylalkyl- carboxyliques et pyridinylalcénylcarboxyliques de formule IV sont préparés par des modes opératoires similaires. Pour illustrer ces modes opératoires, on donne une description de la préparation du sous-groupe des acides benzo0ques. Les acides alcoxybenzoiques ou alcényloxy- benzo;ques peuvent être commodément préparés à partir d'un acide hydroxybenzoique approprié en faisant réagir un halogénure d'alkyle ou d'alcényle approprié avec le sel disodique de l'acide hydroxybenzoique approprié. Les acides (alkylthio)benzoiques ou (alcénylthio)benzoiques peuvent être préparés commodément par traitement du diméthylthiocarbamate de S-(4-carbométhoxyphényle) substitué de façon appropriée de formule générale CH3CO2C6H3XS(CO)N(CH3)2 par l'hydroxyde de sodium aqueux à 65-85 %, puis addition du bromure d'alkyle ou d'alcényle approprié et poursuite du chauffage pendant 2 à 4 heures. On peut préparer les diméthylthiocarbamates de S-(4-carbométhoxyphényle) à partir des acides hydroxy- benzoiques appropriés par le procédé de M. Newman et H. Kanes, J. Org. Chem., 31, 3980 (1966).. Quand on désire préparer un composé de formule III o A est un groupement sulfinyle ou sulfonyle, on peut utiliser pour l'acylation du noyau le dérivé sulfoxyde ou sulfone approprié de l'acide (alcénylthio)- ou (alkylthio)- benzolque (formule IV). Les sulfoxydes ou sulfones appropriés peuvent être préparés par oxydation du thioéther correspon- dant, en utilisant des agents d'oxydation classiques, comme l'acide mchloroperbenzoique, l'hypochlorite de t-butyle, lemétaperiodatede sodiumou le peroxyde d'hydrog6ne. Si une double liaison est présente dans le thioéther, il faut utiliser des conditions très modérées pour éviter l'époxydation. Si l'on utilise des quantités équimolaires des réactifs, le produit est un sulfoxyde (A est un groupement sulfinyle) que l'on oxyde facilement en sulfone (A est un groupement sulfonyle) par une mole supplémentaire d'agent d'oxydation. Les acides hydroxybenzoiques et leurs dérivés substitués utilisés comme substances de départ dans les procédés décrits ici sont des composés connus ou bien ils peuvent être préparés par des procédés classiques connus dans le domaine. Quand ils sont utilisés de façon systémique, la dose des composés de formule III variera selon le composé particulier que l'on utilise, la sévérité et la nature de l'infection et l'état physique du sujet que l'on traite. La thérapeutique doit être amorcée à de faibles doses, la dose étant augmentée jusqu'à ce que l'on obtienne l'effet antifongique désiré. Les composés peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire par injection sous la forme d'une solution ou suspension aqueuse stérile à laquelle on peut ajouter, si on le désire, divers agents classiques pharmaceutiquement acceptables comme des agents de conservation, des tampons, des agents de solubilisation ou des agents de mise en suspension. D'autres additifs, comme du sel ou du glucose, peuvent être ajoutés pour rendre les solutions isotoniques. Les proportions et la nature de ces additifs seront évidentes pour l'homme de l'art. Certains composés de formule III donnent des taux dans le sang significatifs après administration orale (voir l'Exemple 24, Tableau 11) et peuvent être administrés de façon systémique par voie orale. Pour l'utilisation par voie orale, de tels composés peuvent être administrés en combinaison avec des supports ou excipients pharmaceutiquement acceptables, sous forme de capsules, comprimés ou poudres. La nature et la proportion de ces supports ou excipients sont bien connues de l'homme de l'art. Quand on les utilise pour traiter des infections vaginales dues à Candida, les composés de formule III peuvent être administrés en combinaison avec des excipients classiques pharmaceutiquementacceptables convenant pour l'utilisation intravaginale. Les compositions conques pour l'administration intravaginale sont connues de l'homme de l'art. ILa préparation et l'utilisation des composés de la présente inven tion sont illustrées dans les exemples suivants: Préparation]. Fermentation d'Actinoplanes utahensis NRRL 12052 On prépare une culture mère d'Actinoplanes utahensis NRRL 12052 et on l'entretient sur une culture inclinée de gél]ose. Le milieu utilisé pour préparer la culture inclinée est choisi parmi l'un des suivants: Milieu A Ingrédient Quantité Farine d'avoine pour bébé 60,0 g Levure 2,5 g K2IlPO4 1,0 g Solution minérale de Czapek:: 5,0 ml Gélose 25,0 g Eau clésionisée q.s.p. 1 litre le plI avant passage à l'autoclave est environ 5,9; on ajuste le pH à 7,2 par addition de NaOIl; après passage à l'autoclave, le pIl est d'environ 6,7. :: La solution minérale de Czapek a la composition suivante: Ingrédient Quantité FeSO4.71120O (dissous dans 2 ml d'lIIC1 concentré) 2 g KC1 MgSO 4'.71120 Eau désionisée Milieu B Ingrédient Dextrine de pomme de terre Extrait de levure Hlydrolysat enzymatique de caséine:: Extrait de boeuf Dextrose Amidon de aiys Peptone de viande Mélasse noire MGSO 4. 71120 CaCO3 g g q.s.p. 1 litree Quantité ,0 g 0,5 g 3,0 g 0,5 g 12, 5 g ,0 g ,0 g 2,5 g 0,25 g 1,0 g SoluL.ion min&ra]e de Czapek 2,0 ml Gélose 20,0 g Eau clésionisée qc.s.p. 1 litre :: N-Z-Amine A, Hlumko Sheffield Chemical, Lyndhurst, New Jersey, U.S.A. On inocule la culture inclinée avec Actinoplanes utahensis NRRL 12052, et on fait incuber la culture inoculée à.30 C pendant environ 8 à 10 jours. On utilise à peu près la moitié de la culture pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante Ingrédient Quantité Farine d'avoine pour bébé 20,0 g Saccharose 20,0 g Levure 2,5 g Grains séchés de distillation: 5,0 g K2 HPO4 I, g Solution minérale de Czapek 5,0 ml Eau désionisée q.s.p. 1 litre ajuster à pll 7,4 avec NaOII; après passage à l'autoclave, le pH est d'environ 6,8. :: National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, New York, U. S.A. On fait incuber le milieu végétatif inoculé cans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à large encolure à 30 C pendant environ 72 heures sur un agitateur tournant sur un arc de 5 cml de diamètre à 250 tours par minute. On peut utiliser ce milieu vg6Ctatif incubé directement pour inoculer un milieu végétatif de second stade. Ou bien et de préférence, on peut le conserver pour un usage ultérieur en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour une telle conservation dans de nombreuses petites ampoules comme suit dans chaque ampoule, on place 2 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol et de lactose [voir W.A. Dailey et C.E. HIliggens, "Preservation and Storage of Micro- organisms in the Gas Phase of Liquid Nitroqen, Cryobiol 10, 364-367 (]973) pour les détails]. Les suspensions ainsi préparées snl t conservées clans la phase vapeur de 1' azote liquide. On utilise une suspension conservée (1 ml) ainsi préparée pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif de premier stade (ayant la composition décrite ci-avant). On fait incuber comme décrit précédemment le milieu végétatif de premier stade inoculé. Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on ufilise 10 ml du milieu végétatif de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de second stade ayant la même composition que le milieu végétatif de premier stade. On fait incuber le milieu de second stade dans un flacon Erlenmeyer de 2 litres à large encolure à 30 C pendant environ 48 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute. On utilise le milieu végétatif de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, pour inoculer 1 d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants: Milieu I Ingrédient Quantité (g/l) Farine d'arachide 10,0 Pop Loue dle viande so]lub].e 5,0 Saccharose 20,0 KHi2PO4 0,5 K21104 1,2 * MgSO4. 71120 0,25 4 025 Eau du robinet q.s.p. 1 litre Le, pli du milieu est environ 6,9 après stérilisation par passage à]l'autoclave à 121 C pendant 45 minutes sous une pression d'environ 1,1 à 1,24 bar. Milieu II Ingrédient Quantité (g/l) Saccharose 30,0 Peptone 5,0 K21P4 1,0 KC1 0,5 MgSO4.71120 0,5 FcSO(X) 711 O( 0(,002 Eau désionisé& -q.s.1.1 litre On ajuste le pHli à 7,0 avec IIC1; après passage à l'autoclave, le pli est d'environ 7,0. Milieu III Ingrédient Quantité (g/l) Glucose 20,0 NI! Cl 3,0 Na S4 2,0 ZnCl2 0,019 MgCl2 611 0,304 FeCl,.6H2 - 0,062. MnC12.411 O 0,035 CuC]2. 221120,0,005 CaCO3 6,0 KH2PO 4 0,67 Eau du robinet q.s.p. 1 litre Stérilisé séparément et ajouté de façon aseptique Le pH final est d'environ 6,6. On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans une cuve de fermentation de 165 1 à une température d'environ 30 C pendant environ 42 heures. On agite le milieu de fermentation avec des -agitateurs classiques à environ 200 tours par minute et on l'aère avec de l'air stérile pour maintenir le taux d'oxygène dissous supérieur à 30 % à la saturation par l'air à la pression atmosphérique. Préparation 2 Préparation du mélange antibiotique A-42355 A. Fermentation en flacon agité On prépare une culture d'Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 et on la maintient sur une gélose inclinée de 18 x 150 ml, préparée avec un milieu ayant la composition suivante: Inqrédient Quantité Glucose 5 g Extrait de levure 2 g CaCO3 3 g Jus de légumes:: 200 ml Gélose: 20 g Eau lésionisée q.s.p. 1 litre (pH initial 6,1) Jus V-8, Campbell Soup Co., Camden, N.J., U.S.A. :::: Meer Corp. La culture inclinée est inoculée avec Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 puis on fait incuber la culture à 25 C pendant environ sept jours. On recouvre d'eau la culture inclinée mûre et on la gratte avec une anse stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile. On utilise 1 ml de la culture inclinée en suspension pour inoculer 55 ml de milieu végétatif dans un flacon de 250 ml. Le milieu végétatif a la composition suivante Inqré die nt Quantité Saccharose 25 g Mélasse noire 36 g Liqueur de macération de mais 6 g Extrait de malt 10 g K2HIPO4 2g 2 4 Ilydrolysat enzymatique de caséine:: 10 g Eau du robinet 1100 ml (pli initial 6,5-6,7) :: N-Z-Case, Ilumko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NoJog U.S.A. On fait incuber le milieu végétatif inoculé à 25 C pendant 48 heures, à 250 tours par minute, sur un agitateur de type rotatif. Apr0s 24 heures, on homogénéise le milieu pendant une minute à faible vitesse dans un mélangeur (de type Waring), puis on le fait incuber àt nouveau pendant les 24 heures restantes. Ou bien,-on peut faire incuber le milieu végétatif inoculé pendant 48 heures puis l'homogénéiser pendant 15 secondes à faible vitesse. Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour inoculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité ou pour inoculer un milieu végétatif de second stade., On peut également le conserver pour une utilisation ultérieure, en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour cetLe conservation dans de nombreuses pet ites ampoules, comme suit On m1élange les cultures végétatives volume/volume avec une solution de suspension ayant la composition suivante: Ingrédient Quantité Glycérol 20 ml Lactose 10 g Eau désionisée q.s.p. 100 ml - On répartit les suspensions préparées dans de petits tubes stériles à bouchon vissé (4 ml par tube). On conserve ces tubes dlans]a phase vapeur de l'azote liquide. On peut utiliser une suspension conservée ainsi préparée pour inoculer des cultures inclinées ou des milieux d'ensemencement liquides. On fait incuber les cultures inclinées à 25 C à la lumière pendant 7 jours. B. Fermentation en réservoir Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml de la culture végétative de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif de second stade ayant la même composition que celui du milieu végétatif. Le milieu de second stade est incubé dans un flacon Erlenmeyer à large ouverture de deux litres, à C pendant 24 heures, 'sur un agitateur tournant d'un arc de cm de diamètre à 250 tours par minute. Le milieu de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus,. est utilisé pour inoculer 100. litres d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants Milieu IV ngcp- édient Quantité ZnSO4.7H20 0,00455 g/l Peptone de viande soluble: 30,5 g/1 Farine de soja].5,5 g/l Dextrine de tapioca:::: 2,0 g/l Mélasse noire 10,5 g/1 lycdrolysat enzymatique de caséine:::::: 8,5 g/l Na2IIPO4 4,5 g/l Mti1;O4.71120 5,5 g/l 4' 2/ - 2484408 FeSO4.71120 0,1./1 IIui. Lded coton '1 0,0 ml Ant imoussant::::::::,0 ml Eau du robinet 1000,0 ml (pH initial 6,8-7,0) :: Peptone, Amber Laboratories, Juneau Wisconsin, U.S.A. ::: Stadex]1, A.E. Staley Co., Decatur, Illinois, U.S.A. : N-Z-Amine A, Hlumko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J. U.S.A. :::::::: P2000, Dow Corning, Midland, Michigan, U.S.A. Milieu V Ingrdiê. In l Quantité Glucose 2,5 % Amidon 1,0 % Peptone de viande soluble:: 1,0 % Mélasse noire 1,0 % CaCO3 0,2 % MgSO4. 7H20 0,05 % Hlydrolysat enzymatique de caséine:::: 0,4 % Antimoussant::'::: 0,02 % Eau du robinet q.s.p. volume :: O.M. Peptone :::: N-Z-Amine A :::::: Antifoam "'A", Dow Corning On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 165 1 à une température de 25 C pendant 7 jours. On aère le milieu de fermentation avec de - l'air stérile, en maintenant le niveau d'oxygène dissous su.îpérieur à environ 50 % de la saturation en air. C. Milieu végétatif de troisième stade Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus grands que ceux utilisés pour la fermentation par litres, il est recommandé d'utiliser une culture végétative de troisième stade pour ensemencer le réservoir plus grand. Un milieu végétatif de troisième stade préféré a la composition suivante _fn9e'd i en'i)ua n tité Sa:ccl:a r-ose 25 (j Mélasse noire 25g Liqueur de macération de mais 6 Hydrolysat enzymatique de caséine:: 10 g Extrait de malt 10 g K2HPO4 - 2 Eau du robinet 1000 ml (Il initial 6,1) :: N-Z-Case Préparation 3 Séparation du mélange antibiotique A-42355 On agite soigneusement le bouillon de fermentation entier (4127 litres), obtenu par le procédé décrit dans l'Exemple I en utilisant le milieu de production II, avec 4280 litres de méthanol pendant une heure, puis on filtre, en utilisant un adjuvant de filtration (Ilyflo Supercel, une terre de diatomées, JohnsManville Products Corp.). On ajuste le pH du filtrat à 4,0 par addition d'HCl 5 N. On extrait le filtrat acidifié deux fois avec des volumes égaux de chloroforme. On réunit les extraits chloroformiques et on les concentre sous vide jusqu'à un volume de 20 litres. On ajoute ce concentré à 200 litres d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355. On sépare le précipité par filtration et l'on obtient 2775 g du mélange A-42355 sous forme d'une poudre blanc gris. Séparation et identification des facteurs de A-30912 Préparation 4 Séparation du facteur A de A-30912 On dissout 1 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 7 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit dans une colonne en verre de 3,7 cm de diamètre intérieur et de 35 cm de longueur [Colonne de Chromatographie CLFPCE (chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées) Michel- Miller, Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ 08360] garnie de résine à phase inverse de gel de silice LP-I/C18 (10-20 microns), qui a été préparée comme décrit dans la Préparation , par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie dans le système 7:2:1 de t méthanol, d'eau et d'acétonitrile, à l'aide du mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11. Une pompe F.M.I. avec une conception de piston sans vannes (débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le solvant dans la colonne à un débit de 9 ml/minute à 7 bars, des fractions étant recueillies toutes les minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6). Préparation 5 Séparation du facteur B de A-3a912 On sépare le mélange A42355 comme décrit dans la Préparation 3, mais on chromatographie les extraits chloroformiques concentrés (285 1) sur une colonne de gel de silice (150 1 de gel de silice Grace, qualité 62) à un débit de 2 1/minute. On lave la colonne avec 200 litres de chloroforme, on l'élue avec 500 litres d'acétonitrile, puis on l'élue continuellement avec un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau à un débit de 1 1/minute. On recueille des fractions ayant un volume de 200 litres et on les analyse séparément pour déterminer leur activité biologique. L'analyse biologique est effectuée par une analyse sur disque de papier sur plaque de gélose, ensemencée par Candida albicans. On réunit les fractions 77 à 103 (1365 litres) et on les concentre sous vide. La solution concentrée (4,5 litres) contient un précipité qu'on enlève par filtration et l'on. obtient 119 g de mélange A-42355 enrichi en facteur Bo On concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprié de méthanol. On ajoute la solution méthanolique à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B. On sépare également ce précipité par filtration et on le sèche, et l'on obtient 24 g supplémentaires de mélange A-42355 enrichi de facteur B sous forme d'une poudre grise. Le mélange A-42355 enrichi en facteur B ainsi obtenu (1,0 c;) est dissous dans 8 mil d'un mélangce de 7:2:1 de- méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution k et on l'introduit sur une colonne de 'qel de silice (Colonne Michel-Miller de 3, 7 cm de diamètre intérieur x 33 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie d'une résine à phase inversée de gel de silice LP-1/C18 (10-20 microns) préparée comme décrit dans la Préparation 10, à l'aide du mélanae 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, comme décrit dans la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonie à un débit de 10 ml/ minute à environ 7 bars, en utilisant une pompe FMI à piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les minutes. On contrôle]'éluLion de l'antibiotique à 280 nm comme dans la Préparation 15. On réunit les fractions 102-110 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui donne 22 mg du facteur B de A-30912. Préparation 6 Isolement du facteur D de A-30912 On réunit et on chromatographie sur une colonne de gel de silice (Grace, qualité 62) les extraits chloroformiques concentrés de deux essais de fermentation (3800 1 et 4007 1) obtenus par le procédé décrit dans la Préparation 3. On lave la colonne avec du chloroforme puis on é].ue avec de l'ac6to- nitrile et tun mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau. On recueille des fractions ayant un volume d'environ 200 1 et on les soumeLt L une alnalyse bioloc4iqcue sur disque del plapier sur gélose ensemencée avec Candida albicans. On réunit]les fractions actives (850 1) et on les concentre sous vide. On ajoute la solution concentrée (0,7 1) à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur D. On enlève ce précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 32 g de mélange A-42355 enrichi en facteur D sous forme d'une poudre grise. On dissout le mélange A-42355 enrichi en facteur D ainsi obtenu (l,0 g) dans 5 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de cel de silice (colonne Michel- Miller, 3,7 cm de diamètre intérieur x 30 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne a étéL6 garnie de résine à phase inversée de gel de silice IP1/C18 (10-20 microns) préparée commne décrit dans la Préparation 10. Le garnissage a été effectué clans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, selon le mode opératoire de garnissage de la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 3,1 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les 2 minutes. L'élution de].'antibiotique est contrôlée à 280 nm comme décrit dans la Préparation 4. On réunit les fractions 96-108 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout cette huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 89 mg du facteur D de A-30912. Préparation 7 Séparation du facteur Hl de A-30912 On dissout 5,0 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 35 ml du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, on filtre la solution résultante et on l'introduit sur une colonne de verre de 3,7 cm de diamètre intérieur x 4,2 cm (colonne Michel-Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système de vannes. La colonne est garnie de résine à phase inversée de gel de silice LP-i/C18 (10-20 microns) (Préparation 10) dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme décrit dans la Préparation II. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 13 ml/ minute à environ 8,3 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes, et l'on. recueille une fraction toutes les deux minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans la Préparation 19, paragraphe C. On réunit les fractions 112-132 avec les fractions 106-117 d'une seconde purification similaire. Les fractions réunies sont concentrées sous vide jusqu'à une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on]yophilise pour obtenir 173 mg du fActeur Il brut de A-30912. On dissout le facteur Il brut de A-30912 (150 mg) dans 8 ml d'un mélange 7:2:1-de méthanol, d'eau et' d'acétonitrile; on filtre la solution résultante et on la réintroduit sur une colonne de verre de 2,0 cm de diamètre intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ ,5 bars, et on recueille une- fraction toutes les 3 minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm. On réunit les fractions 17 et 18 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 29 mg du facteur Il de A-30912. Identification des facteurs de A-30912 Les différents facteurs de A-30912 peuvent être identifies par chromatographie sur couche mince (CCM). LesRf des facteurs A à G deA-30912, en utilisant la CCM sur gel de silice (Merck, Darmstadt),un système solvant 7:-3 de benzène et de méthanol et un bioautographe par Candida albicans sont indiqués dans le Tableau VII. 20. TABLEAU VII - Facteur-de A-30912 R _ _ _ _ f A 0,35. B 0,45 - C 0,54 D 0,59 E 0,27 -' F 0,18 G 0,13 Les Rf approximatifs des facteurs A, B, C, D et H de A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant une CCM sur gel de silice (plaques de gel de silice n 60 de Merck Darmstadt, 20 x 20 cm) et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau VIII. Facteur de A-30912 L TABLEAU VIII Rf - SystWïies a Facteur A Facteur B Facteur C Facteur D Facteur Il 0,28 0,39 0,46 0,50 0,42 b 0,14 0,21 0,31 0,38 0,27 Systèmes solvants s a: acétate d'éthyle:méthanol (3:2) b: acétate d'éthyle:méthanol (7:3) c: acétonitrile:eau (95:5) d: acétate d'éthyle:éthanol:acide acétique (40:60:',25) On peut également identifier les facteurs A, B, D et H de A30912, par chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevée (CLPFCE) analytique, dans les conditions suivantes: Colonne Garnissage verre, 0,8 x 15,0 cm Nucleosil 10-C18 (Machery Nagel and Company); garni en utilisant le mode opératoire de garnissage en suspension de la Préparation Solvant Mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile Volume de 1'échantillon Dimension de l'échantillon Température de la colonne Débit Pression Détecteur Po0l)pe 8 i1 8 pg ambiante 1,8 ml/minute environ 14 bars UV à 222 nm (ISCO Model 1800 Variable Wavelenjth UV-visible Absorbance Monitor) LDC Duplex Minipump solvants c d 0,28 0,42 0,51 0,57 0,36 0,43 0.47 0,58 0,61 0,53 2484408- Injection injection sur boucle Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A, k B, D et II de A-30912 dans ces conditions sont résumées dans le Tableau IX. TABLEAU IX Facteur de A-30912 Temps de rétention (s) A 792 B 870 Il 990 D 1.140 Préparation 8 Préparation de l'antibiotique S31794/F-1 On produitl'antibiotique S31794/F-1 par culture en immersion d'Acrophialophora limonispora NRRL 8095, en agitant, remuant et/ou aérant à pli 3-8, de préférence 5-7, et à 15-30 C, de préférence à 18-27 C, pendant 48 à 360 heures, de préférence pendant 120 à 288 heures. On isole l'antibiotique S31794/F-1 par traitement du bouillon de culture (90 L) avec un mélange 4:1 (90 L) d'acétate d'éthyle et d'isopropanol et en homogénéisant pendant 30 minutes à la température ambiante. On sépare la phase orcaniqlue et on l'évapore sous vide à environ 40 C. On chromatographie le résidu ainsi obtenu sur environ dix fois sa quantité de gel de silice, en utilisant des mélanges'de chloroforme et de méthanol (95:5 à 60:40). On réunit les fractions qui ont une activité antifongique et on les chromatographie sur 100 fois leur quantité de "Sephadex LII-20" avec du méthanol. Les fractions provenant de la colonne de Sephadex et qui ont une activité antifongique sont réunies et rechromatographiées sur 100 fois leur quantité de gel de silice (0,05-0,2 mm) avec un système solvant 71:25:4 de chloroforme, de méthanol et d'eau. Les fractions éluées qui ont une activité antifongique sont réunies et évaporées sous vide pour obtenir l'antibiotique brut S31794/F-1. On dissout ce produit dans de petites quantités de méthanol et on le précipite avec de l'éther diéthylique pour obtenir S31794/F-1 sous forme d'une poudre amorphe blanche,)p. I. 178-180 C (dCcomiposit.ion) alpI-s sdchage sous vide poussé à 25-30 C. La cristallisation dans dix fois son volume de mélange 80:12:8 d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'eau donne S31794/F-1 cristallisé, p.f. 181-183 C avec décomposition après séchage sous vide poussé à 20 C. Préparation 9 Séparation de l'antibiotique S31794/F-1 On introduit l'antibiotique S31794/F-1 brut, obtenu comme décrit dans la Préparation 8 après chromatographie sur Sephadex, sur une colonne de gel de silice (colonne Michel- Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. On utilise le mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11. On déplace le solvant dans la colonne en utilisant une pompe FMI avec une conception de piston sans vannes. On contrôle l'élution de l'antibiotique en utilisant un appareil de contrôle UV à 280 nm comme dans la Preparation 22. On réunit les fractions ayant une activité antifongique et on les concentre sous vide pour obtenir l'antibiotique S31794/F-1. S31794/F-1 a les Rf suivants par chromatographie sur couche mince de gel de silice (Merck, 0,25 mm): Système solvant Rf Ch]oroforme:méthanol:eau (71:25:4) 0,17 Chloroforme:méthanol:acide acétique concentré (70:29:1) 0,19- Chloroformie:méthanol (2:1) 0,27 S31794/F-1 peut également être détecté par de la vapeur d'iode. Préparation 10 Preparation de la résine à phase inversée de-gel de silice/ C18 Etape 1: Hydrolyse On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (Quantum Corp., maintenant Whatman) à un mélange de 1650 ml d'acide sulfurique concentré et de 1650 ml d'acide nitrique Qoncentré dans un ballon à fond rond de 5 1 et on agite pour obtenir une suspension appropriée. On chauffe le mélange sur un bain de vapeur penldant une nuit (16 heures) avec un réfrigérant à refroidissement d'eau fixé sur le ballon. On refroidit le mélange dans un bain de glace et on le filtre soigneusement en utilisant un entonnoir en verre fritté. On lave le gel de silice avec de l'eau désionis6e jusqu'à pli neutre. Puis, on lave le gel de silice avec 4 1 d'acétone et on le sèche sous vide à 100 C pendant deux - jours. Etape 2 Première silylation Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans un ballon à fond rond et mis en suspension dans 3,5 1 de toluène. On chauffe le ballon au bain de vapeur pendant deux heures pour chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On ajoute 321 ml d'octadécyl- trichlorosilane (Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pendant une nuit (16 heures) avec une lente agitation mécanique à 60 C. On prend soin d'éviter que l'agitateur ne soit trop près de la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules de gel de silice.- -- On laisse le mélange refroidir. On recueille le gel de silice silanisé, on le lave avec 3 1 de toluène et 3 1 d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures) On met le gel de silice séché en suspension dans 3,5 1 d'un mélange 1:1 d'acétonitrile et d'eau dans un ballon de 5 1, on agite soigneusement à la température ambiante pendant deux heures, on filtre, on lave avec 3 1 d'acétone et on sèche à l'air pendant une nuit. - Etape 3: Deuxième silylation On répète le mode opératoire de la première silylation en utilisant 200 ml d'octadécyltrichlorosilane. On chauffe la suspension à reflux à 60 C pendant deux heures, tout en agitant soigneusement. On recueille le produit final par filtration, on lave avec 3 1 de toluène et 6 1 de méthanol, puis on le sèche sous vide à 50 C pendant une nuit (16-20 heures). Préparation Il Mode opratoire de arnissaqe en suspension our les colonnes Michel-Miller liensei(jn? nents.sc.5n6raux On utilise ce mode opératoire pour garnir une k colonne de résine à phase inversée de gel de silice/C18 comme celle préparée par le procédé de la Preparation 10. En général, une pression inférieure à 14 bars et des débits compris Entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette technique de garnissage en suspension; ceci dépend du volume et des dimensions de la colonne. La pression de garnissage doit être supérieure à la pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars; ceci assure qu'il ne se produit pas de tassement ultérieur de l'adsorbant pendant les séparations. Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des craquelures ou des canaux dans le matériau de garnissage, ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. Il est donc important de laisser la pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe. Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre de Ace, Catégorie No., non garnies): 5795-04, 1.2 ml; 5795-10, 110 ml; 5795-16, 300 ml; 5795-24, 635 ml; et 5796- 34, 34 ml. Le temps nécessaire pour garnir une colonne en verre peut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimension de la colonne et l'expérience de l'opérateur. Etapes: 1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par un accouplement (le volume de la colonne réservoir doit être deux fois celui de la colonne). Placer les deux colonnes verticalement avec la colonne réservoir au-dessus. 2. Peser le matériau de garnissage (100 g pour 200 ml de colonne). 3. Ajouter environ 5 volumes de solvant au matériau de garnis- sage; utiliser un mélange de 70-80 % de méthanol et de 20- 30 % d'eau. 4. Bien a(,iter jusqu'à ce que toutes les particules soient mouil]..6es,] aisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour assurer une imprégnation complite des particules par le solvant. Décanter la liqueur surnageante. 5. Délayer la résine avec suffisamment de solvant pour t remplir la colonne réservoir. Verser rapidement dans le réservoir. La colonne doit être préremplie avec le même solvant et la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant avant de verser la suspension. L'utilisation de volumes de suspension plus grands peut également donner de bons résultats; cependant, ceci nécessite (a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de garnissage. 6. Fermer le réservoir avec le bouchon de Teflon en-dessous de la colonne (voir la Figure 1 du brevet des E.U.A. N 4.131.547, bouchon N 3); relier à la pompe; et commencer immédiatement le pompage du solvant dans les dispositifs au débit maximum si l'on utilise une pompe Ace Cat. No. 13625-25, ou un système de distribution de solvant similaire (20 ml/minute). 7. Continuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement remplie de l'adsorbant. La pression ne doit pas dépasser la tolérance maximale de la colonne pendant cette opération (14 bars pour les colonnes importantes et 21 bars pour les colonnes analytiques). Dans la plupart des cas, des pressions inférieures à 14 bars seront suffisantes. 8. Si la pression dépassait les valeurs maximales, réduire le débit et la pression diminuera. 9. Après remplissage de la colonne par]'adsorbant, arrêter la pompe; laisser la pression tomber à zéro; débrancher le réservoir; remplacer le réservoir par une pré-colonne; remplir la pré-colonne de solvant et d'une petite quantité d'adsorbant, et pomper à la pression maximale jusqu'à ce que la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire général. Toujours laisser la pression descendre lentement après arrêt de la pompe; ceci empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux préférentiels dans le matériau de garnissage. 10. Supprimer la pression et débrancher soigneusement la pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques mlil l. i.mlI r"; (2-4) de qarnissaqe au somml d oi onne;a nplacer 1 ou 2 illt-res au sommet de la colonne; appuyer doucement jusqu'au sommot du matériau de qarnissage', et placer un bouchon de Teflon au sommet de la colonne jusqu'à confirmation de l'étanchéité. Relier la colonne à la pompe, introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par la paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse davantage. Si le matériau de garnissage doit continuer à se déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée. Préparation 12 Préparation du noyau de A-30912A A. Désacylation du facteur A de l'antibiotique A-30912 On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation I, en utilisant le milieu de culture inclinée A et le milieu de production I et en faisant incuber le milieu de production pendant environ 42 heures. On ajoute au milieu de fermentation une quantitë de facteur A de A-30912 (340 g de substrat brut qui contient environ 19,7 g de facteur A deA30912, dissous dans 15 1 d'éthanol). On contrôle la désacylation du facteur A de A- 30912 par titrage vis-à-vis de Candida alhicans. On laisse la fermentation-se poursuivre jusqu'à désacylatiOn complete comme le montre la disparition de l'activite vis-à-vis de C. albicans. B. S!éparation du noyau de A-30912A On filtre le bouillon de fermentation entier (100 litres), obtenu comme décrit dans le paragraphe A et contenant le noyau provenant d'environ 20 g de facteur A de A-30912. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu (environ 93 1) sur une colonne contenant 4,5 1 de résine HP (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) à un débit de 200 ml/minute. On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes (volume de colonne) d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on (due la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de m6hanol (8E 1.) à un clélbiL de 200-300 mll/,inut. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluêe. On concentre l'une de ces parties jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristo].le. Ce pr-oduit et l'autre partie non traitée sont tests pour déterminer leur adtivité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote t0 acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912A. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-30912A, sous vide jusqu'à un petit volume, et on 'yophilise pour obtenir environ 97 a du noyau brut. C.- Purification du noyau de A-30912A par chromatorahie liquide sur phase inversée On dissout 25 g du noyau de A-30912A brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans 300 mi d'un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne d'acier inoxydable de 4 1 (8 cm x 80 cm) remplie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal,91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On - contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumention Specialties Co., 4700 Superior Ave. Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6). On recueille par minute des fractions ayant un volume d'environ 500 ml. En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912A, on les évapore sous vide et on les lyophilise, ce qui donne 2,6 g du noyau. La quantité de solvant nécessaire pour achever ce mode opératoire de séparation chromatographique varie de 7 à 8 1. D. Caractéristiclues du noyau de A-30912A (a) formule brute: C34 I1N705. (b) poids mo1éculaire: 797,83. (c) solide amorphe blanc, soluble dans l'eau, le diméthylformamide, le diméLhylsulfoxyde et].e méthanol; insoluble dans le chloroforme, le toluène et l'éther diéthylique. (d) Spectre d'absorption infrarouge (pastille de KBr) présente des maximas d'absorption à: 3340 large (Off, liaison hydrogène); 2970, 2930 et 2890 (étirement de C[I, groupements CH3, CH2, CH aliphatiques), 1660 et]625 (plusieurs groupements carbonyle C=O); 1510- 1550; 1430-1450 (déformation de CHi "wag"), 1310-1340; 1230- 1260; 1080; 835, 650 large et 550 large, cm lo (e) le tiLragce électrométrique dans le dimnéthyl- formamide aqueux à 66 % indique la présence d'un groupement titrable avec un pKa d'environ 7,35 (pH initial 7,32). (f) durée de rétention en chromatographie liquide sous pression élevée (K'): 1.1,52 minutes dans les conditions suivantes Colonne: 4 x 300 mm Garniture: gel de silice/C38 Solvant: mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium, d'acétonitrile et d'eau Débit: 3 ml/minute Pression: 172,5 bars Détecteur: UV à longueur d'onde variable, à 230 nm Sensibilité: 0-0,4 A.U.F.S. Préparation 13 On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de la Préparation 12, mais on utilise comme substrat A-30912A tétrahydrogéné. Préparation 14 On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de la Préparation 12 mais en utilisant comme substrat l. 'aculéacine A. jIjparation 115 P réparaLion du noyau de A-30912B A. DCsacylaLion du facteur B de l'antibiotique A-30912 On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production T. Après incubation de la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur B de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation du facteur B -de A- 30912 par essai sur disque de papier vis-a-vis de Candida albicans ou cle Neurospora crassa. On laisse La fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité. B. Séparation du noyau de A-30912B ]5 On filtre le bouillon de fermentation ainsi obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine IIP-20 (polymère très poreux DTAION, 1iP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pli 6,5-7,5 pour enlever le boui.llon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle ['élution selon le mode opératoire suivant: on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide commne le chlorure de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont titrés pour déterminer leur activité visà-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activitY, la fraction contient le noyau de A-30912B. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-30912B sous vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Pur-if:iiLation du noyau de A-30912B par chromatographie lili i-. pl) h1ast inversée un di uni. Le noyau de A-309121Hi î:ut;, obtenu comme 2484 48 décrit cdans le paragraphe C, dans un mOlcanqo 96(:2::1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturinq Chemists, Inc. E/M, Cincihnati, 011). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16- 18 rue du Canal, Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml par minute, en utilisant le mnme solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68501) avec une unité optique (TSCO Type 6>) En se basant sur l'absorption à 280 nmn, on runit les fractions contenant le noyau de A-30912B, on les évapore: sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912B purifié. Préparation 16 On prépare le noyau de A-30912B et on le purifie par le procédé de la Préparation 15, mais on utilise comme substrat A-30912B tétrahydrogéné. Préparation 17 Préparation du noyau de A-30912D A. Désclaion du facteur D de A-30912 On effectue une fermentation de A. utahensis, comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production IL. Apres avoir fait incuber la culture pendant environ 4.8 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur D de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation du facteur D de A-30912 par essai sur disque de papier vis-à]-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité. B. Séparation du noyau de A-30912D On filtre le bouillon de fermentation entierobtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau 2484408- mycélien. On fait passer le fi]trat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant de la résine I11-20 ( Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à plI 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'5 un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie non traitée pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912D. L'éluat contenant le noyau de A-30912D est concentré sous vide jusqu'à un petit volumeet lyophilisé pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de A-30912D par chromnatographie liquide en phase inversée On dissout dans un mélange 96:2:]1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de A-30912D brut obtenu comme décrit dans le paragraphe C. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, 011). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal, 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, ce qui donne un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6). E.n se basant sur l'absorption à 280 nm, on combine les fractions contenant]e noyau de A-30912D, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir Le noyau de A-309t2D pur-ifié. préparation 18 On prépare le noyau de A-30912D1) et on-le purifie par le procédé de la Préparation 17, mais on utilise comme substrat A-30912D1) tétrahydrogéné. Préparation 19 Préparation du noyau de A-3091211 A: Désacyl.ation du facteur HI de l'antibiotiquc A-30912 On effectue une fermentation de A. utahlensis comme décrit dans la P'réparation 1, en utilisant le milieu de production T. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur Il de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation du facteur tI de A-30912 par une analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida ali:icans ou Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité. B. Spar-aion du noyau de A-3091211 On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycé6lien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine IIP-20 (polymère très poreux DIA'ON, liP- Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pli 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue lao colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle i'lution en utilisant le mode opératoire suivant: on prélè]ve deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre] 'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide comme le chlorure de imyrist:oyl.e. On détermine l'activité do ce produit et de 1 'aul re lartlle Llquote non traitée vis;-h-vis de Candi.dl aill i ans. Si la parLtie aliclquote 1oi0 'traiitee n'a pas d'activit P, (pltlie la partie al i.tuote aeline a lline activité, la fraction contient le noyau de A-3091211. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-301]121i sois vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de A-309121 pal chromatographie liquide en phase inversée On dissout le noyau de A-30912H11 brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatocgraphie cette solution sur une co] lonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturinq Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, O11). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant: un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, InstrumenLation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6). * Préparation 20 On prépare le noyau de A-3091211 et on le purifie par le procédé de la Préparation 19 mais on utilise comme substrat A-3091211 tétrahydrogén6. Prparation 21 PréRaration du noyau S31794/F-1 A. Désacylltl.on de l 'antibiotique S3]794/F-i On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit clans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production r. Après avoir fait incuber la culLure pendant environ 418 hleures, on ajoute au milieu de fermentation l'antibiotique S31794/F-1 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation de S31794/F-1 par analyse avec discque de papier vis-à-vis de Candida aliicans. On lais se la 1',,o- ilil incm se poursuivre j;qu'fl ce que la d(cs;(acyl l i oil s;o i t. compl tCe cormme le moi t i-' la (le l'activi 1. B. S6paraLin dt. noyau de S31794/F-1. On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien, on fait passer le filtrat limepide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine lIP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. On lave ensuite la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pl 6,5-7,5 pour chasser le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de mêthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: on prélève deux parties aliquotes à partir de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie aliquote non traitée pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de S31794/F-1. On concentre 'éluat contenant le noyau de S31794/F-1, sous vide jusqu'à un petit volume, et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de S31794/F-] piar chromatographie 1uiLd en ? hase inversée On dissout dans un mélange 96:-2:-:1 d'eau, d'ac6tonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de S31794/F-I brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B. On chromatocraphie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufactuririqn Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, 011). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobiii Yvon, 16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner l a colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml./minute, en utilisant le même solvant. On con:réle la s;Cparation a 280 nii en utilj.ilntL un appareil de cont. rl e UV (I,CO Ablsorptlion Monitor Model IlIA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6). En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de S31794/F-1, on les évapore sous vide et on les lyophilise pourobtenir le noyau de S31794/F-1 purifié. Préparation 22 Preparation de A-30912A têtrahydrogéné On dissout le facteur A de A-30912 dans l'éthanol. On réduit PtO2 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur A de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912A tétrahydrogéné. Préparation 23 Préparation de A-30912B tétrahydrogéné On dissout dans l'éthanol le facteur B de A-30912. On réduit PtO2 dans de l'éthanol absolu pour former du platine que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur B de A30912 par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce-que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures}. On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912B tétrahydrogéné. Préparation 24 Préparation de A-30912D tétrahydrogéné On dissout dans de l'éthanol le facteur D de A-30912. On réduit PtO2 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur D de A-30912, par hydrogénation sous pression positive-jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 hleures>. On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le rèsidu dans une petite quantité de t-butanol et on le]. yophilise pour k obtenir A-30912D tétrahydrogéné. Préparation 25 Préparation de A-3091211 tétrahydrocgéné On dissout le facteur HI de A-30912 dans de l'éthanol. On réduit PtO2 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur H de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantiL.t6 de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-3091211 tétrahydrogéné. Préparation 26 La préparation des acides de formule IV est exemplifiée par les composés des Tableaux 1 à 7 ci-dessous qui donnent la préparation de divers acides alcoxy- benzoiques, acides (alkylthio)benzoiques, acides alcoxy- phénylacétiques, acides alcoxyphénylpropanolques, acides alcoxycinnamiques, acides alcoxyphénoxyacétiques et acides alcoxynicotiniques. La préparation de ces acides de formule IV est exemplifiée par la préparation des acides alcoxybenzoïques du Tableau 1 et des acides (alkylthio)benzoiques du Tableau 2. Le mode opératoire général pour la préparation de ces acides est décrit dans les paragraphes suivants. On prépare les acides alcoxybenzolques du Tableau 1 selon le mode opératoire général suivant: On dissout de l'acide p-hydroxybenzolque dans de l'hydroxyde de sodium aqueux à 10 % (deux équivalents) et on ajoute la solution résultante à 200 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). On ajoute un équivalent du bromure d'alkyle à la solution à 65-80 C. Puis on agite la solution pendant deux heures, après quoi on la verse dans un grand volume (600 ml) d'eau et on l'acidifie avec de l'acide chlorhydrique. On recueille par filtration et on cristallise dans le méthanol l'acide alcoxybenzolque qui précipite de la solution. Les acides (alkylthio)benzolques du Tableau 2 sont préparés selon le mode opératoire général suivant: A une suspension d'hydrure de sodium (un équivalent, disper- sion à 50 % dans de l'huile minérale) dans du DMF (100 ml pour 50 mmoles), refroidie à 0 C, on ajoute lentement un équivalent de Q-hydroxybenzoate de méthyle. On agite le mélange réactionnel sous atmosphère d'azote jusqu'à ce que le dégagement d'hydrogène s'arrête. A la solution de 4- carbométhoxyphénolate de sodium ainsi obtenue, on ajoute du chlorure de N, N-diméthylthiocarbamoyle [(CH3)2N(CS)Cl] (un équivalent) en une fois. On chauffe la suspension résultante à 70 C pendant 1-3 heures puis on la verse dans une solution aqueuse (1 %) d'hydroxyde de potassium (en grand excs). On extrait la suspension deux fois avec un mélange 4:1 en volume de toluène et d'hexane. Après séchage sur sulfate de magnésium, on filtre les extraits t organiques et on les évapore jusqu'à une huile. On purifie l'huile par chromatographie sur gel de silice en utilisant 2 % de méthanol dans du chlorure de méthylène pour obtenir le diméthylthiocarbamate de O-(4-carbométhoxyphényle) [p-CH3CO2C6H4O(CS) N(CH3)2], p.f. 97-102 C. On chauffe ce produit sous atmosphère d'azote à 220 C pendant 30 à 60 minutes pour obtenir le diméthylthiocarbamate de S-(4- carbométhoxyphényle) [R-CH3CO2C6H4S(CO)N(CH3)2] que l'on cristallise dans le méthanol. Au diméthylthiocarbamate de S-(4-carbométhoxyphényle), dissous dans le DMSO, on ajoute 2 équivalents d'hydroxyde de sodium (solution aqueuse à %). On chauffe le mélange à 65-85 C et on ajoute le bromure d'alkyle (1 équivalent). On poursuit le chauffage pendant 2 à 4 heures après quoi on verse le mélange dans un grand volume d'eau. Par acidification, il se forme un précipité que l'on recueille par filtration. On cristallise l'acide (alkylthio)benzoique dans le méthanol. oc o %'% si 8189 Hz OD-ê/0= \#- CÉt(HD)úIi o 6 19 Je BJCI JsIU Tzlo) Clio _. e-- 6t19 uZo-'.o(.oD' 6'9 '2 ço1tt3.6( z.o) u gI{9 HZOD-e,/,oOZ(ZHO)úRI, 'U.6,9. _9{ R-Zi:{ p9 ozd qanuoooe on-ozuaqPxozpOqdp$T- esp n=oo .'"OPTop........... À nbozuqAxooI oppo% TK{IWp uean,,oaE sotlozuqAçxooTe SOpTOV sop UOctvxedv 1In..r Bromure d'alkyle Formule Poid v CH3(CH2)7Br 9y1 CH3(CH2)9Br 10t8 Ci13(CH2)llBr lr7 CH3(CH2)13Br 13 Tableau 2 Préparation des acides alkylthiobenzoiques Poids de dimnthylthio- Bromure d'alkyle Poids de diméthylthio-Acide alkylthiobenzoique carbamate de S-(4-carbo- Formule Poids méthoxyphényle) Formule Poids *--e CH3(C2)7Br CH3(CIH2)7 Br 3./ 2 CH3(CH2)9Br1177 g. 791 g. CH(CH)S- -C H 34 g. CH3(C H2)9S 2 lr34 g. 0--e CH3(CH2)11Br1199 g. 1,99 g. CH3(CH2)1S-\ /-CO2H l18 g. CH3(CH2)13Br2,22 g. 1191 g. CH3.(CH2)13S-0\/-CO2H2,3 g. oe o 4N c" Bromure d'alky: Formule Pl CH3(CU2)7Br CH3(CH2)11Br CH3(CH2) 7Br CH3(Cil2)11Br CII3(Cil2)7Br 3t 3e 4, Tableau 3 Préparation des acides alcoxyphênylacétiques lePodd'id l e Poids d'acide Acide alcoxyphénylacetique ids. hydroxyphénylacétique Formule Poids gaies FormulePid 86 g. 3t04 g. CH3(CH2)70-* -CH2Co2H 2156 e-2 98 g. 3f04 g. CH3(Ci2)110- /-C112C02H 3' l7 86 g. 3104 g. CH(CH)-2 2H 372 98 g. 3 04 g. CH3(CH2)70-. \ 2 2 2 72 56 g. 3T 04 g. C13(C12 0I O*"i 287 HO3 C-CH2 / H0 C-CH/ g. g. g. g. g. n-I Ln co CD Co i i i i i i Bromure d'alkyle Formule Poids -.- Cll3 (C}{2) 3Br Cl13 (Ci2l) 4Br Cl3 (CH2)5Br Cl3 (Cil2) 6Br CIl3 (Cl2) 7Br Cl 3(CIl2)11Br 2t74 g. 3,02 g. 3t30 g. 3158 g. r79 g. 7147 g. Tableau 4 Prd2aration des acides alcoxyphênylpropanoIgues Acide alcoxyphénylpropanoZque Poids d'acide 2-hydroxy- phénylpropanolque Formule 3r32 a.2 2 3,32. g. 'H3(CH2)430-. -(CH2)2-C02H 3t32 C g3(H)4 0 -(CH) -Co H 32.3 2 - 2 3r32 g. CH3(CH2)50':*: /-(CH2)2-C02H 3t32 g.H3(CH2 0- -(c22-C2 CH3 (CH2) 60-e(CH -(CH22-C02H 4298 g. 2 e3 g.(CH2)70-'\ _/-(C112)2-CQ2H 4r98 g. CH3 (CH2) 11-c_\ _ (CH2)2 CO2H Poids 2t97 g. 2180 g. 3r53 g. 2r90 g, Ln cQ 4165 g. 4; 01 g. r> m,, co o i Bromure d'alkyle Formule Poids CH3(CH2)5Br CH3(CH2)7Br CH3(CH2)9Br 3130 g. 3f86 g. 4142 g. Tableau 5 Préparation des acides alcoxycinnamiques Poids d'acide - Acide alcoxycinnamique p-hydroxycinnamique Formule Poids 0-e 3728 g. CH3(C}2)50- -CH=CH-CO2H 204 g. * =0 3728 g. CH75 g. 328 g.CH 3(CH2)7 0-e\ /-CHCH-CO2H 2175 e- no 3(28 g. CH(CH) -CH=CH-C02H 148 g. 1 C3(C2)90 \= 2 Ln -J o CO Bromure d'alkyle Formule Poids Tableau 6 Préparation des acides alcoxyphénoxyacétiques Poids de l'acide EAcide alcoxyphénoxyacétique hdroxyphnoxyactiue Formule lPacide - hydroxyphnoxyactiqueFormule Poids CH3(CH2)7Br CH3(CH2)9Br 3186 g. 4t42 g. 2,36 g. 2136 g. Cil3 (CH 2) 7 _/ -OCH2Co2H 0=O CH3 (CH 2)9-O-6 \* e-OCHC ul co N co 4> Co Bromure Formule CH3(CIl2)7Br CH3(CH2)11Br d'alkyle Poids 3.86 g. 4.98 g Tableau 7 Préparation des acides alcoxynicotiniques Poidsd'acide Aide alcoxynicotinique * Poids d'acide 6-hydroxynicotinique Formule Poids * 278 g. CCH3(CH2) -O--*\ -CO2 3 6 g. -e 278 gCH3(CH2)11- N - C2H 24 2,.78 g. CH3(CH2)1f0-"\ X /tC021 t g Ln %0 cO Co O Go Prparation 27 On prépare les esters 2,4,5-trichlorophényliques des acides de formule IV, y compris les acides alcoxy- benzoiques et les acides alkylthiobenzoiques selon le même mode opératoire général. Le Tableau 8 ci-dessous donne la préparation des esters 2,4,5-trichlorophényliques d'un certain nombre d'acides de formule IV, y compris les acides alcoxybenzolques du Tableau 1 et les acides (alkylthio)- benzoúques du Tableau 2. Les composés décrits dans le Tableau 3 sont préparés selon le même mode opératoire général. Le mode opératoire suivant est donné à titre illustratif On dissout dans du chlorure de méthylène une mole d'acide alcoxybenzoique ou d'acide (alkylthio) benzolque, 1,1 mole de 2,4,5-trichlorophénol et 1 mole de N,N'-dicyclo- hexvlcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 15-18 heures, après quoi on le filtre. On évapore le filtrat à siccité sous pression réduite et on cristallise le résidu dans un mélange d'acétonitrile et d'eau. On sèche le produit sous vide. Tableau 8 Préparation des esters 2,4,5-trichlorophényliques Acide de formule IV Poids de l'ester 2,4,5- Formule Poids trichlorophénylique (g) CH3(CH2)70-\. /.-C02H 6r18 5!32 Ci3(i 2/9; 0 -CO 2 6179 1,93 3(C112)il \ C2U2 il -CC12)110-e__o2 706 2o20 * == e-e Ci3(Cl 2)130-. o-C02H e mQe CH3(C102)7S-\ /.- C21 m --o Cil3(CH 2)9 S-1\ / C 2 --0 CH3(C1i2)9S-'\ /-C02 - > CH3 (CH2) 11S-e\ /-Co2 0=0--- 6 90 5.91 ! 7 98 1F42 1.8 ! 2t3 * Disponible dans le commerce. C: c-o Co Préparation des Acide de formule IV Formule Poids v -*e CH3(CH2) 7-O-e\ i. 3,75 3 2 7- 34175 2il *-s 3 c2> 9l \*.='-'CU. o== -COH Ci3(CH2) --. 0. 41,59 =e-CO il 2. e-. Cil3(CH2)13-0- ' - /. Si 9C2Il * -1 e- -eCO2H CH3(CH2) 7O-e / e-CH2Co 2H 2 12 0=S Cil3(CHl2)1-O- \ C/ 2 CO2Il 3-2 C1i3(CH2)7-.-'. 2164 \CH CO H 2 2 Tableau 8 (suite) esters 2,4,5-trichlorophényliques Poids de l'ester 2,4,5- trichlorophénylique (g) '7 1r91 2 36 2e86 "M 0%Il Co Co cov Tableau 8 (suite) Préparation des esters 2,4,5-trichlorophényliques Acide de formule IV - defomuePoids de l'ester 2,4,5- Formule Poids trichlorophênylique (g) C3 2l(CH2) 11-1- db 210 1165 0113(CI2), -o-' 11 \,==,/C!2Co02il Ce3 (CH2) 7-0-,\/t i, 8173 HO CCH 2 2 Ci3(C1l2) -0-\-1-(CH2) -Co2H 2'8 3798 3 2 3 \ 6=0 2.2 2 13 9 CH3 (CI{l2)4-0-*\/-(CH2)2-CO02 2736 2r82 CH3(CH2) 5-O-re/-(Cil2)2-0C02H 34 4 -* Ci3(CH2)6 -i /.'(CH2)2 -C02H 2 73 2o,01 CH3(CH12) 7-0-->\_ - -(Cl 2)2-CO2H2 t 78 4,3 CH3 (CH2)9-- e-Ci=CI-CO2H \245.826 Co Préparation des Acide de foznule IV Formule Cil3 ( CH21QX /- (CHa CO 2oH Cil 3(C19 2) 500 s*-CO 2il ::- e /-(CH 2)10-CO 2H Cil 3(CH 2)5-0-0 EtCHmCIICO 2H 32 70 22 \, m. --o CH3 (CH2) 11-0- -__eC02H *\Disponible dans e commerceC2 C113 CH3 (CH2) l--O d C 1 :: Disponible dans le commerce Tableau 8 (suite) esters 2,4,5-trichlorophényliques i r,,... mtl,, ..,... Poids de l'ester 2,4,5- Poids trichlorophdnyligue (i) 3,34 4f86 2,22 276 2t65 2f0 2t75 2r8 3 08 2f5 2t84 3f7 2t7 2,.6 co o, CO C:> CO Cr% EXEMPLE 1 Préparation des dérivés de A-30912A Le Tableau 9 ci-dessous donne la préparation des dérivés du noyau de A-30912A prépares à partir des esters 2,4,5-trichlorophényliques du Tableau 8. On prépare les dérivés du noyau de A-30912, indiqués dans le Tableau 9, en général selon le mode opératoire suivant: Au noyau de A-30912A dissous dans 10 à 50 ml de DMF, on ajoute l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide alcoxybenzoique ou de l'acide (alkylthio)benzoique (rapport molaire 1:2). On agite le mélange réactionnel pendant 15 à 18 heures, après quoi on l'amène à siccité pour obtenir un résidu. On lave le résidu deux fois avec un mélange d'éther diéthylique (50 ml) et de chlorure de méthylène (50 ml). On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu résultant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une colonne de ml de gel de silice (Woelm, 99-210 p) en utilisant le système solvant susmentionné comme éluant. On contrôle les fractions de la chromatographie par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on chasse le solvant pour obtenir le produit sous forme d'un résidu. On peut analyser le produit par CLPE à phase inversée comme suit: pour les composés à groupement alcoxy et pour les composés à groupement alkylthio en C12 et C14, on dissout l'échantillon dans un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On injecte la solution d'échantillon (1 mg/ml) dans une colonne en acier inoxydable de 0,63 cm x 30 cm garnie de résine C18 Micro Bondapak (Waters Associates, Milford, Mass., U.S.A.), et on élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Pour les composés à groupement alkylthio en C et C le PourlescomosS rouemet akylhioen 8 etC18, le système solvant est un mélange 2:1:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 103,5 bars avec un débit de 30 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600A (Waters Associates, Inc.) et une vitesse du papier de 0, 5 cm/minute. On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm. Les produits peuvent également être analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ (MSDC). Tableau 9 Préparation des dérivés de formule III du noyau de A-30912A H3 HO HO*. OH H I si, N/ oe H I H--OmN-R H Ha, '=O \ H-* --ile=O HaC H >Q -H H-N\ /CHa /. -.----0 / oH q=.. H OH *--'-N H OH Il O H H V ru Co Go C80t 06t ZIT.t 99Z 7ztt C6Z 960. 8!Z 9901 99Z Ctt 65t LOIT Z9 OSOI tOI LZ OT! O9T ! t ak.-g p a 00O 00O 00t 00? 00f (-uM) VZV6O -Y op nGAON 6 noT1eLL E-OOtD=HO-*,./ " -06 (zHE) ú: OCS. _00-iDII_ -0 _S111) HOi ODH&1 _0DuI{)O#s6 (z1D) CHD e__e/ eI--". --, "'.,-: tuj ls aTntuxo ; av 5E /e=e Z.5i -o-. \",o(H)H QD co QD ('J ç Jz Lt 9L s1, çg E Edtio ue R de formule V CH3 (CH2)70-'\ /-- e---eCO c113(C112)90 -* e H2 C--. */e--(CCH2 CO- CH3 (CH2)170-0\ / CH 3(Cil) 7 -CHCO- e3 -- C2co- CH3(CH2)1 0-e o 2 *_- --e-CHl2Co0- Cil3 (CH2)1i-e0 / 2 s---. Tableau 9 (suite) Réactif ester Noyau de A- (mg) 30912A (mg) Produit 800 800 920 800 800 740 800 800 780 (mg) M[Na] Rétention en CLPE (cm) 8?8 23T7 8t5 1X5 2 r%) Co Co R de formule V H2CO- CH3l (Cl 2) 0-e e cil 3(CH 2) 0-. c-Co- % (%o-.-(CH') -Co- 3o(Cl.2)7 \ /'-CliCH-co- *e-s CHi3 (CH2) 70-e\ /0-CH2- ci3(Cil2)9-\ /---Ci2 Co Cil /(CH -l ( C1-C0- C3 (12) 70e *C11- Réactif ester (mq) Tableau 9 (suite) Noyau de A- Produit 1mg! Rétention + + en CLPE M [Na] (cm) 1066 4.4 1.2 2r4 3t2 1r8 2r7 1,0 o Co c>, Co No Tableau 9 (suite) Réactif Peter A,, A _ w> -" a- fen k'iier Rde formule V (mg) 30912A (mg) Produit (mg) M [Na] (cm) CH3(CH2)110-% _ 487 400 270 1109 2r O-e *_ C113(CHi2)7-0\/-Co-0 800 800.460 1036 3T6 CIH3 (CH 2) 7- e*-CO- 922 800 145 1083 lr. s--e 9 zz CH 3 (CH 2)3 _-S -e\ 2/ -CO- 804032124f CH3(CH2)40)0- / (CH2)2 CO 831 400 245 1038 112 * =0 Cil 3(CH 2)5 \--/e(CU(C2)2** o858,400 303 1052 216 CHl 3(CH2)6Os\/e H2)2-C0o-. 888 400 391 1066 1{, e--e% CH3 (CH2) 0-e,,- (CH2) CO- 914 400 335 1081 2i e--4 3 2 76 - Cl13(C112)110-\_ / -(Ci{2)2-CO-1030 400 360 1136 3r0 : On utrilise dans ce cas le chlorure de p-(n-octyl)benzoyle (disponible dans le commerce), en faisant réagir le chlorure d'acide avec le noyau dans la pyridine à la température ambiante sous azote pendant 24 heures. Rétention -J ro cQ' o co EXEMPLE 2 Préparation des dérivés de A-30912B On prépare les dérivés du noyau de A30912B en général à partir des esters-2,4,5-trichlorophénvliaues décrits dans la Préparation 27, selon le mode opératoire suivant: Au noyau de A30912B dissous dans 10 à 50 ml de DMF, on ajoute l'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide alcoxybenzoique ou de l'acide (alkylthio) benzoique (rapport molaire 1:2). On agite le mélange réactionnel pendant 15-18 heures, après quoi on l'amène à siccité pour obtenir un résidu. On lave le résidu (deux fois chaque) avec un mélange de 50 ml d'éther diéthylique et de 50 ml de chlorure de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu restant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une colonne de 100 ml de gel de silice (Woelm, 90-210 p) en utilisant comme éluant le système solvant susmentionné. On contrôle les fractions de la chromatographie par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un - mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on chasse le solvant pour obtenir le produit sous forme d'un résidu. Le produit peut être analysé par CLPE à phase -inversée comme suit: dans les composés à groupement alcoxy et les composés à groupement alkylthio en C12-C14, on dissout l'échantillon dans un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On injecte la solution - d'échantillon (I mg/ml) dans une colonne en acier inoxydable de 0,63 cm x 30 cm garnie de résine C8 Micro Bondapak (Waters Associates Inc.) et on élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Pour les composés à groupement alkylthio en C8 et C10, le système solvant est un mélange 2:1:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 103,5 bars à un débit de 3 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600 A (Waters Associates, Inc.) et une vitesse de papier de 0,5 cm/minute. On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm. Les produits peuvent également être analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ (MSDC). - En suivant ce mode opératoire général, on obtient les composés suivants de formule III o R et R sont tous deux H, R et R sont tous deux OH et R est: p-(n-octylthio)benzoyle p-(n-décylthio)benzoyle R-(n-dodécylthio) benzoyle p-(n-tétradécylthio)benzoyle p-(n-octyl)benzoyle: 3-[p-(nhexyloxy)phényl]propanoyle 3-[p-(n-octyloxy)phényllpropanoyle 3-[- (ndodécyloxy)phényll]propanoyle - (n-hexyloxy)cinnamoyle - (n-octyloxy) cinnamoyle [p-(n-octyloxy)phényl]acétyle [-(n-dodécyloxy)phényl]acétyle 3[P-(n-pentyloxy)phényl]propanoyle 3-[2-(n-heptyloxy)phényl]propanoyle p(n-octyloxy)phénoxyacétyle R-(n-décyloxy)phénoxyacétyle 6-(n-octyloxy) nicotinoyle 6-(n-dodécyloxy)nicotinoyle :: Mieux préparé par le procédé au chlorure d'acide, par exemple en faisant réagir le chlorure de p-(n-octyl)- benzoyle avec le noyau dans la pyridine à la température ambiante sous azote pendant 24 heures. EXEMPLE 3 Préparation des dérivés de A-30912D On prépare les dérivés du noyau de A30912D en général à partir des esters 2,4,5-trichlorophényliques illustrés dans la Préparation 27, selon le mode opératoire suivant: Au noyau de A-30912D dissous dans 10 à 50 ml de DMF, on ajoute l'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide alcoxybenzoique ou de l'acide (alkylthio) benzoique (rapport molaire 1:2). On agite le mélange réactionnel pendant 15-18 heures, après quoi on l'amène à siccité pour obtenir un résidu. On lave le résidu (deux fois chaque) avec un mélange de 50 ml d'éther diéthylique et de 50 ml de chlorure de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu restant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une colonne de 100 ml de gel de silice (Woelm, 90-210 p) en utilisant comme éluant le système solvant susmentionné. On contrôle les fractions de la chromatographie par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on chasse le solvant pour obtenir le produit sous forme d'un résidu. Le produit peut être analysé par CLPE à phase inversée comme suit: pour les composés à groupement alcoxy et les composés à groupement alkylthio en C12-C14, on dissout l'échantillon dans un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On injecte la solution d'échantillon (1 mg/ml) dans une colonne en acier inoxydable de 0,63 cm x 30 cm garnie de résine C18 Micro Bondapak (Waters Associates Inc.) et on élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Pour les composés à groupement alkylthio en C8 et C10, le système solvant est un mélange 2:1:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 103,5 bars à un débit de 3 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600 A (Waters Associates, Inc.) et une vitesse de papier de 0,5 cm/minute. On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm. Les produits peuvent également être analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ (MSDC). En suivant ce mode opératoire général, on obtient 1 2 3 4 les composés suivants de formule III o R, R, R et R sont tous H et R est: - (n-octylthio)benzoyle p-(n-décylthio)benzoyle p-(n-dodécylthio) benzoyle p-(n-tétradécylthio)benzoyle p-(n-octyl)benzoyle 3-[p-(nhexyloxy)phényllpropanoyle 3- r- (n-octyloxy)phényllpropanoyle 3-[Rp-(ndodécyloxy)phényllpropanoyle p-(n-hexyloxy)cinnamoyle p-(n-octyloxy) cinnamoyle [p-(n-octyloxy)phényllacétyle [R- (n-dodécyloxy)phényllacétyle 3-[p-(n-pentyloxy)phényllpropanoyle 3-[p-(n-heptyloxy)phényl]propanoyle p(n-octyloxy)phénoxyacétyle p-(n-décyloxy)phénoxyacétyle 6-(n-octyloxy) nicotinoyle 6-(n-dodécyloxy)nicotinoyle :: Mieux préparé par le procédé au chlorure d'acide, par exemple en faisant réagir le chlorure de p-(n-octyl)- benzoyle avec le noyau dans la pyridine à la température ambiante sous azote pendant 24 heures. EXEMPLE 4 Préparation des dérivés du noyau de A-30912H On prépare les dérivés du noyau de A-30912H1 ou de ses homologues à groupement alkyloxy, en général à partir des esters 2,4,5-trichlorophényliques illustrés dans la Préparation 27, selon le mode opératoire suivant: Au noyau de A-30912H dissous dans 10 à 50 mI de DMF, on ajoute l'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide alcoxybenzolque ou de l'acide (alkylthio) benzoique (rapport molaire 1:2). On agite le mélange réactionnel pendant 15-18 heures, après quoi on l'amène à siccité pour obtenir un résidu. On lave le résidu (deux fois chaque) avec un mélange de 50 ml d'éther diéthylique et de 50 ml de chlorure de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu restant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une colonne de 100 ml de gel de silice (Woelm, 90-210 H) en utilisant comme éluant le système solvant susmentionné. On contrôle les fractions de la chromatographie par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme syst!me solvant un m16aiege 3-2 e clumeé diócétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions contena.nt le produit désiré et on chasse le solvant pour obtenir le produit sous forme d'un résidu. Le produit peut être analysé par CLPE à phase inversée comme suit: dans les composés à groupement alcoxy et les composés à groupement alkyIthio en C12-C14, on dissout l'téchantillon dans un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On injecte la solution d'échantillon (1 mg/ml) dans une colonne en acier inoxydable de 0,63 cm x 30 cm garnie de résine C18 Micro Bondapak (Waters Associates Inc.) et on élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Pour les composés à groupement alkylthio en C8 et C1O, le système solvant est un mélange 2:1:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 103,5 bars à un débit de 3 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600 A (Waters * Associates, Inc.) et une vitesse de papier de 0,5 cm/minute. On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm. Les produits peuvent également être analysés par spectrométrie de masse a désorption de champ (MSDC). Selon ce mode opératoire général, on obtient les composés suivants de formule III o R et sont OH, R2 est H, R est un groupement alkyloxy en C1C6 et R est p-(n-octylthio)benzoyle p-(n-décylthio)benzoyle ú-(ndodécylthio)benzoyle E-(n-tétradécylthio)benzoyle Z-(n-octyl)benzoyle:: 3[p-(n-hexyloxy)phényllpropanoyle 3-[r-(n-octyloxy)phénylIpropanoyle 3-[r(n-dodécyloxy)phényllpropanoyle p-(n-hexyloxy)cinnamoyle p-(n-octyloxy) cinnamoyle -. (n-octyloxy),phényl1]acétyle [p- (n&-Qdpcyloxy)phényl] acétyle 3- Lp- -pentyloxy) phênyl] propanoyle 3-[2-(n-heptyloxy)phényl] propanoyle -(n-octyloxy)phénoxyacétyle I-(n-décyloxy)phénoxyacétyle 6-(noctyloxy)nicotinoyle 6-(n-dodécyloxy)nicotinoyle x Mieux préparé par le procédé au chlorure d'acide, par exemple en faisant réagir le chlorure de p-(n-octyl)- benzoyle avec le noyau dans la pyridine à la température ambiante sous azote pendant 24 heures. EXEMPLE 5 Préparation des dérivés de S31794/F-1 On prépare les dérivés du noyau de S31794/F-1 en général à partir des esters 2,4,5-trichlorophényliques illustrés dans la Préparation 27 selon le mode opératoire suivant: Au noyau de S31794/F-1 dissous dans 10 à 50 ml de DMF, on ajoute l'ester 2,4, 5-trichlorophénylique de l'acide alcoxybenzoique ou de l'acide (alkylthio) benzoique (rapport molaire 1:2). On agite le mélange réactionnel pendant 15-18 heures, après quoi on l'amène à siccité pour obtenir un résidu. On lave le résidu (deux fois chaque) avec un mélange de 50 ml d'éther diéthylique et de 50 ml de chlorure de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu restant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une colonne de 100 ml de gel de silice (Woelm, 90-210 p) en utilisant comme éluant lesystème solvant susmentionné. On contrôle les fractions de la chromatographie par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on chasse le solvant pour obtenir le produit sous forme d'un résidu. Le produit peut être analysé par CLPE à phase inversée comme suit: dans les composés à groupement alcoxy et les composés à groupement alkylthio en C12-C14, on dissout l'échantillon dans un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On injecte la solution d'échantillon (1 mg/ml) dans une colonne en acier inoxydable de 0,63 cm x 30 cm garnie de résine C18 Micro Bondapak (Waters Associates Inc.) et on élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Pour les composés à groupement alkylthio en C8 et C10, le système solvant est un mélange 2:1:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 103,5 bars à un débit de 3 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600 A (Waters Associates, Inc.) et une vitesse de papier de 0,5 cm/minute. On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm. Les produits peuvent également être analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ (MSDC). En suivant ce mode opératoire général, on obtient 1 3 4 les composés suivants de formule III o R1, R et R sont tous OH, R est CO-NH2 et R est: p-(n-octylthio)benzoyle p-(n-décylthio)benzoyle R-(ndodécylthio)benzoyle p-(n-tétradécylthio)benzoyle r (n-octyl)benzoyle:: 3[p-(n-hexyloxy)phényl]propanoyle 3-[E-(n-octyloxy)phényl]propanoyle 3-[E(n-dodécyloxy)phényl]propanoyle p-(n-hexyloxy)cinnamoyle p-(n-octyloxy) cinnamoyle [p-(n-octyloxy)phényl]acétyle Ip-(n-dodécyloxy)phényl]acétyle 3-[p-(n-pentyloxy)phényl]propanoyle 3-[p-(n-heptyloxy)phényl]propanoyle p(n-octyloxy)phénoxyacétyle p-(n-décyloxy)phénoxyacétyle 6-(n-octyloxy) nicotinoyle 6-(n-dodécyloxy)nicotinoyle :: Mieux préparé par le procédé au chlorure d'acide, par exemple en faisant réagir le chlorure de p-(n-octyl)- benzoyle avec le noyau dans la pyridine à la température ambiante sous azote pendant 24 heures. Le mode opératoire suivant illustre la préparation des composés de rormu] c III. Les composés particuliers préparés 2-484408 par le mode opératoire donné ci-dessous sont les composés de formule III o R5 est un groupement R-(n-octyloxy)- benzoyle. Préparation 28 Préparation de l'acide p-(n-octyloxy)benzoique On ajoute une solution de 19,2 g (150 mmolesY d'acide E-hydroxybenzoique dans 120 ml d'hydroxyde de sodium aqueux à 10 % à 480 ml de DMSO préalablement chauffés à C. On ajoute goutte à goutte à la solution 28, 95 g (150 mmoles) de bromure de n-octyle. On agite le mélange réactionnel pendant 4 heures à la température ambiante, après quoi on le verse dans 1200 ml d'eau glacée. On ajoute ml d'acide chlorhydrique concentré et on laisse le mélange reposer jusqu'à la fin de la précipitation. On recueille le précipité, on le sèche et on le cristallise dans un mélange d'acétonitrile et d'eau, p.f. 97-99 C. Analyse pour C15H2203: Calculée: C, 71,97; H, 8,86 Trouvée: C, 71,72; H, 9,10. Préparation 29 Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzoique On dissout dans 200 ml de chlorure de méthylène 6,18 g (24,7 mmoles> d'acide ú-(n-octyloxy)benzoique, 5,39 g (27,2 mmoles) de 2,4,5-trichlorophénol et 4,94 g (24,7 mmoles) de N,N'dicyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 18 heures puis on le filtre. On évapore le filtrat pour obtenir une huile que l'on cristallise dans un mélange d'acétonitrile et d'eau pour obtenir l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide R- (n-octyloxy)benzoique. Analyse RMN: 6 4,02 (2H, t, J = 3Hz), 6 7,0 (1H, d, J = 4 Hz), 7,23 (s, 1H), 7,3 (s, 1H), 8,08 (d, 1H, J = 4 Hz). EXEMPLE 8 Acylation du noyau de A-30912A On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 14,2 g (]17,8 mmoles) du noyau de A-30912A et 15,32 g (35,7 mmoles) de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(n- octyloxy)benzolque. On agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de - méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml de 25 % d'acétate d'éthyle dans du méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc.,) en utilisant du gel de silice comme phase stationnaire. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants contenant de 20 % à 40 % de méthanol dans de l'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912A et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912A. On en obtient 7,13 g; + 23 = 1052 (par SMDC). EXEMPLE 9 Acylation du noyau de A-30912B - On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles du noyau de A-30912B et 35,7 mmoles d'ester 2,4,5- trichlorophénylique d'acide p-(n-octyloxy)benzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange à 25 % d'acétate d'éthyle dans du méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc.) en utilisant le gel de silice comme phase stationnaire. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants contenant de 20 % à 40 % de méthanol dans de l'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau A-30912B et on les lyophilise pour obtenir -le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912B. EXEMPLE 10 En suivant le mode opératoire de l'Exemple 9 mais en substituant le bromure d'alkyle approprié, l'acide p- (alkyloxy)benzoique approprié et l'ester 2,4,5-trichloro- phénylique de l'acide E-(alkyloxy)benzoique approprié, on obtient les composés suivants de formule III R. p-(n-décyloxy)benzoyle p-(n-dodécyloxy)benzoyle p-(ntétradécyloxy)benzoyle p-(n-hexyloxy)benzoyle EXEMPLE 11 Acylation du noyau de A-30912D On dissout dans 150 ml de DMF 17,8 mmoles du noyau de A-30912D et 35,7 mmoles de lester 2,4,5- trichlorophénylique de l'acide 2-(n-octyloxy)benzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange de 25 % d'acétate d'éthyle dans du méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc.) en utilisant du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants contenant de 20 % à 40 % de méthanol dans de l'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau A-30912D et on les lyophilise pour obtenir le dérivé n-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912D. EXEMPLE 12 En suivant le mode opératoire de l'Exemple11 mais en substituant le bromure d'alkyle approprié, l'acide p-alkyloxybenzoique approprié et l'ester 2,4,5-trichloro- phénylique de l'acide p-alkyloxybenzoique approprié, on obtient les composés suivants de formule III R5 p-(n-décyloxy)benzoyle p-(ndodécyloxy)benzoyle R-(n-tétradécyloxy)benzoyle p-(n-hexyloxy)benzoyle EXEMPLE 13 Acylation du noyau de A-30912H On dissout dans 150 ml de DMF 17,8 mmoles de noyau de A-30912H et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5-trichloro- phénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange contenant 25 % d'acétate d'éthyle et du méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc.) en utilisant du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants contenant de 20 % à 40 % de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912H et on les lyophilise pour-obtenir le dérivé 2-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912H. EXEMPLE 14 En suivant le mode opératoire de l'Exemple 13 mais en utilisant le bromure d'alkyle approprié, l'acide R- alkyloxybenzolque approprié et l'ester 2,4,5-trichloro- phénylique d'acide p-alkyloxybenzoique approprié, on obtient les composés suivants de formule III R5 p-(n-décyloxy)benzoyle p-(n-dodécyloxy) benzoyle p-(n-tétradécyloxy)benzoyle p-(n-hexyloxy)bcnzoyle EXEMPLE 15 Le mode opératoire suivant illustre la préparation du dérivé R-(noctyloxy)benzoylé du noyau de A-30912H à partir du noyau de A-30912A. On traite le noyau de A-30912A par le p-(n-octyl- oxy)benzoate de 2,4,5-trichlorophényle selon le mode opératoire de l'Exemple 1. On méthyle le dérivé ainsi obtenu en traitant le produit (20 mg) avec 0,06 ml de 3 % d'HCl dans du méthanol dans 1 ml de DMF. On laisse la solution reposer sous agitation pendant 16 heures, après quoi on chasse le solvant sous pression réduite et on obtient un résidu. On purifie le résidu par CLPE à phase inversée en utilisant une résine gel de silice/C18. EXEMPLE 16 Acylation du noyau de S31794/F-1 On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles du noyau de S31794/F-1 et 35,7 mmoles de l'ester 2, 4,5-trichlorophénylique de l'acide -(n-octyloxy)benzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 16- heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange contenant 25 % d'acétate d'éthyle dans du méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité-"Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc.) en utilisant du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants contenant de 20 % à 40 % de méthanol dans de l'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCMen utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de S31794/F-1 et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy>- benzoylé du noyau de S31794/F-1. EXEMPLE 17 En suivant le mode opératoire de l'Exemple 16 mais en utilisant le bromure d'alkyle approprié avec l'acide R- alkyloxybenzoique approprié et l'ester 2,4,5-trichloro- phénylique de l'acide p-alkyloxybenzoique approprié, on obtfent- es cóomposés suivants de formule III R5 R p-(n-décyloxy)benzoyle R-(ndodécyloxy)benzoyle E-(n-tétradécyloxy)benzoyle - R-(n-hexyloxy)benzoyle Le mode opératoire suivant illustre la préparation des composés de formule III o A est un groupement sulfonyle ou sulfinyle. Préparation 30 Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(alkylsulfonyl)benzoique A une solution de 970 mg (2 mmoles) de,-(n- décylthio)benzoate de 2,4,5-trichlorophényle dans 20 ml de chlorure de méthylène refroidie dans un bain de glace, on ajoute 442 mg (2,0 mmoles) d'acide m-chloroperbenzoique. Après avoir laissé le mélange réactionnel se réchauffer jusqu'à la température ambiante (15 minutes), on le lave deux fois avec 25 ml d'hydroxyde de sodium 0,1 N. On cristallise dans l'acétonitrile la phase organique après l'avoir séchée sur sulfate de sodium anhydre. On obtient 470 mg de produit. On réoxyde le produit comme décrit précédemment en utilisant 108 mg d'acide perbenzoique dans ml de chlorure de méthylène et une durée de réaction de 50 minutes. Le produit est purifié comme décrit ci-dessus et l'on obtient 260 mg de produit. Analyse pour C23H 2704C13S: Calculée: C, 54,61 %; H, 5,38 % Trouvée: C, 54,90 %; H, 5,45 % On peut préparer d'autres esters 2,4,5-trichloro- phényliques d'acides E-(alkylsulfonyl)benzoiques par le mode opératoire décrit ci-dessus, les produits obtenus étant tels qu'indiqués ci-dessous: p-Alkylsulfonyl- Poids de Poids d'a- Poids de benzoate de 2,4,5- réactif ester gent oxydant produit trichlorophényle (mg) (mg) (mg) n-octyle 850 451 68,8 n-dodécyle 1260 686 400 n-tétradécyle 1150 651 400 EXEMPLE 18 Acylation du noyau de A-30912A Oh laisse sous agitation à la température ambiante pendant 18 heures une solution de 400 mg (0,5 mmole) du noyau de A-30912A et de 260 mg (0,514 mmole) de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(n-décylsulfonyl)- benzoique dans 50 ml de diméthylformamide. On évapore le mélange réactionnel à siccité sous vide et on extrait le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et du chlorure de méthylène. Puis on applique le résidu, dissous dans une quantité minimale d'un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol, sur une colonne de gel de silice (50 ml) et on élue avec le même système solvant. On suit le cours de la chromatographie par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions contenant le produit (Rf - 0,6), on les évapore à siccité et on les lyophilise. On obtient 415 mg du dérivé p-(n- décylsulfonyl)benzoylé du noyau de A-30912A. L'analyse de spectre de masse avec désorption de champ indique que (M+ + 23) = 1128. La CLPE analytique montre que le produit est constitué par un seul composant. En suivant le mode opératoire précédent, on peut préparer comme indiqué ci-dessous d'autres dérivés p-(alkyl- sulfonyl)benzoylés du noyau de A-30912A. Dérivé p-Alkyl- sulfonyl- benzoylé n-octyle n-dod&cyla n tetradecy1 n-tetradecyle-- Poids de noyau (mqg) Poids de réactif ester Poids de produit (mq) M +Nal Co Co Préparation 31 Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(alkylsulfinyl)benzoique A une solution de 2,23 g (5 mmoles) de E-(n- octylthio)benzoate de 2,4,5-trichlorophényle dans 50 ml de chlorure de méthylène, refroidie dans un bain de glace, on ajoute goutte à goutte une solution de 1,39 g (8 mmoles) d'acide m-chloroperbenzoique dans 50 ml de chlorure de méthylène. On agite la solution à 5 C pendant environ deux heures puis à la température ambiante pendant environ deux heures. Après addition de 2 à 3 gouttes d'un solution à 20 % de Na2SO3, on lave le mélange réactionnel une fois avec une solution à 10 % de NaHCO3 et deux fois avec de l'eau. On sèche la couche organique sur sulfate de magnésium et on la concentre sous vide, ce qui donne un résidu qu'on cristallise dans un mélange 1:4 d'éther diéthylique et d'éther de pétrole, pour obtenir 1,7 g d'un produit qui est un mélange des dérivés sulfinylé et sulfonylé. EXEMPLE 19 Acylation du noyau de A-30912A On fait réagir une solution de 800 mg (1 mmole) de noyau de A-30912A dans 25 ml de DMF avec le produit obtenu dans la Préparation 31 (922 mg, 2 moles) comme décrit dans l'Exemple 18 pour obtenir 952 mg de produit mixte. On chromatographie ce produit sur gel de silice (100 g d'une dimension de 74-149 p), en utilisant un système solvant 3:2 d'acétate d'éthyle et de méthanol. On rechromatographie sur gel de silice les premières fractions obtenues de cette colonne (554 mg), en utilisant comme solvant d'élution de l'acétate d'éthyle auquel on ajoute des quantités croissantes de méthanol. On réunit les fractions en se basant sur les résultats obtenus en CCM. Après élution du dérivé p-(n- octylsulfonyl)benzoylé du noyau de A-30912A (58 mg), on élue le dérivé p(n-octylsulfinyl)benzoylé du noyau de A-30912A et l'on obtient 145 mg de ce produit. EXEMPLE 20 Acylation du noyau de A-30912B On effectue l'acylation du noyau de A-309] 2B par le mode opératoire décrit dans l'Exemple 18 en utilisant l'ester 2, 4,5-trichlorophénylique de l'acide alkylsulfonylbenzoique approprié. Des exemples des dérivés à groupement p-(alkyl- sulfonyl)benzoyle du noyau de A-30912B sont ceux de formule III dans laquelle R est un groupement p-(n-octylsulfonyl)- benzoyle, p-(n-décylsulfonyl)benzoyle, p-(n-dodécyisulfonyl)- benzoyle et p-(n-tétradécylsulfonyl)benzoyle. Quand A est un groupement sulfinyle, on modifie en conséquence les conditions précédentes. Quand la réaction donne un mélange de produits, par exemple le produit sulfinylé et le produit sulfonylé, des séparations chromatographiques peuvent être nécessaires pour obtenir le produit sulfinylé désiré. Le composé de formule III ou R est un groupement p-(noctylsulfinyl)benzoyle est un exemple d'un tel produit. EXEMPLE 21 Acylation du noyau de A-30912D On effectue l'acylation du noyau de A30912D par le mode opératoire décrit dans l'Exemple 18, en utilisant l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide alkylsulfonyl- benzolque approprié. Des exemples des dérivés p-alkylsulfonylbenzoylés du noyau de A-30912D sont ceux de formule III dans laquelle R est un groupement R-(n-octylsulfonyl)benzoyle, E-(n- décylsulfonyl)benzoyle, p-(n-dodécylsulfonyl)benzoyle et - (n-tétradécylsulfonyl)benzoyle. Quand A est un groupement sulfinyle, les conditions précédentes sont modifiées en conséquence. Quand la réaction donne un mélange de produits, par exemple le produit sulfinylé et le produit sulfonylé, des séparations chromatographiques peuvent être nécessaires pour obtenir le produit sulfinylé désiré. Le composé de formule III dans laquelle R5 est un groupement p-(n-octylsulfinyl)benzoyle est un exemple d'un tel produit. EXEMPLE 22 Acylation du noyau de A-30912H On effectue l'acylation du noyau de A30912H par le mode pratire décrit dans l'Exemple 18, en utilisant l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide alkylsulfonyl- benzoique approprié. Des exemples des dérivés p-alkylsulfonylbenzoylés du noyau de A-30912H sont ceux de formule III o R est un groupement 2-(n-octylsulfonyl) benzoyle, p-(n-décylsulfonyl)- benzoyle, p-(n-dodécylsulfonyl)benzoyle et R-(n-tétra- décylsulfonyl)benzoyle. Quand A est un groupement sulfinyle, on modifie en conséquence les conditions précédentes. Quand la réaction donne un mélange de produits, par exemple le produit sulfinylé et le produit sulfonylé, des séparations chromatographiques peuvent être nécessaires pour obtenir le produit sulfinylé désiré. Le composé de formule III dans laquelle R5 est un groupement p-(n-octylsulfinyl)benzoylé et R3 un groupement méthoxy, est un exemple d'un tel produit. EXEMPLE 23 Acylation du noyau de S31794/F-1 On effectue l'acylation du noyau de S31794/F-1 par le mode opératoire décrit dans l'Exemple 18, en utilisant l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide alkylsulfonylbenzolque approprié. Des exemples des dérivés p-alkylsulfonylbenzoylés du noyau de S31794/F-1 sont ceux de formule III dans laquelle R5 est un groupement p-(n-octylsulfonyl)benzoyle, p-(n- décylsulfonyl)benzoyle, p-(n-dodécylsulfonyl)benzoyle et 2-(ntétradécylsulfonyl)benzoyle. Quand A est un groupement sulfinyle, on modifie en conséquence les conditions précédentes. Quand la réaction donne un mélange de produits, par exemple le produit sulfinylé et le produit sulfonylé, des séparations chromatographiques peuvent être nécessaires pour obtenir le produit sulfinylé désiré. Le composé de formule III dans laquelle R est un groupement p-(n-octylsulfinyl)benzoyle est un exemple d'un tel produit. EXEMPLE 24 On peut démontrer et mettre en évidence l'activité antifongique des composés de formule III in vitro dans des essais de (lifrtisi.on de disque et (les essais de dilution sur gélose classiques, et in vivo dans des essais classiques sur les souris qui montrent l'efficacité vis-à-vis d'une infection fongique systémique. Les résultats des essais antifongiques de composés types de formule III (Exemples 3 et 4) sont donnés dans les Tableaux 10, 11, 12 et 13. Les Tableaux 10 et 11 donnent les résultats de l'essai in vitro des composés des Exemples 3 et 4 par les méthodes de diffusion de disque sur plaque de gélose. Dans le Tableau 10, l'activité est mesurée par la dimension (diamètre en mm) de la zone d'inhibition du micro-organisme observée que produit le composé d'essai. Dans le Tableau 11, l'activité est mesurée par la concentration inhibitrice minimale (CIM) de la substance (pg/disque) nécessaire pour inhiber la croissance de l'organisme d'essai. Le Tableau 12 donne les résultats de l'essai in vitro du dérivé p-(n- octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912A [Formule III, 5 est un groupement p-(n-octyloxy)benzoyle] vis-à-vis de cinq souches de Candida albicans par la méthode de dilution sur gélose. Dans le Tableau 12, l'activité est mesurée par la CIM de la substance (pg/ml) nécessaire pour inhiber l'organisme d'essai. Les résultats d'essais in vivo destinés à démontrer l'efficacité des composés des Exemples 1 et 18 vis-à-vis d'une infection provoquée par Candida albicans A-26 chez les souris sont donnés dans le Tableau 13, o l'activité est mesurée par la DE50 (dose en mg/kg nécessaire pour guérir 50 % des animaux d'essai). Dans un essai sépare, dont les résultats sont également résumés dans le Tableau 13, l'activité est indiquée par la plus faible dose à laquelle on observe un essai antifongique significatif. Dans cet essai, on infecte par voie intraveineuse avec Candida albicans A26 des groupes de souris albinos mâles (exemptes de pathogènes particuliers) pesant 18 à 20 g. On traite les animaux par rayons X 24 heures avant l'infection à environ 50 roentgens par minute pendant 8 minutes*(dose totale de 400) pour réduire leurs réactions immunologiques aà l'organisme infectieux. A 0, 4 et 24 heures après 1'infecLion, on donne à chaque groupe de souris des doses progressives sous-cutanées du composé d'essai sous forme d'une suspension dans un mélange à 33 % de polyéthylène- glycol (PEG) dans de l'eau. On note le jour de la mort pour chaque animal. Une comparaison statistique par l'essai "t" de Student du jour moyen de la mort est effectuée entre chaque groupe d'animaux infectés-traités à une dose particulière et un groupe de dix animaux infectés-non traités pour déterminer si le traitement prolonge de façon significative la durée de survie. Le Tableau 14 donne les résultats de l'essai des composés des Exemples 1 et 18 en vue de leur absorption après administration par voie orale. Dans cet essai, on gave des souris avec une dose de 416 mg/kg de composé d'essai en suspension dans un mélange à 33 % de PEG 400 dans de l'eau. A des intervalles de temps, on prélève des échantillons de sang du sinus orbital et on détermine leur activité antibiotique comme suit: on place un disque de 7 mm contenant 20 pl de sang entier sur de la gélose ensemencée avec Aspergillus montevidensis A35137. Après 40 heures d'incubation à 30 C, on compare les zones d'inhibition provenant des échantillons de sang à une référence obtenue à partir du composé d'essai et l'on calcule la quantité de composé dans l'échantillon de sang. Q Composé R de formule Y TABLEAU 10 Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose Zone d'inhibition (mm) eaJ Saccharomyces Neurospora Trichophyton Candida - pastoranius X-52 crassa 846 mentagraphytes A-23 albicans A-26 CI3 (C2 70 \ /0 O *--o Ci 3(C112) il0- o * =0 00-0 Ci{3(CH2)130-S\ *-Co- 0--o cil3(CH 2)13 S-o -Co- *_ O--s Cil3(Cil2>9 SO2-0 /0 00o 23* 24* 19* Ci3Cl)iO2- 37 26 Cil 3(Cil) 1 S0 2- -C0- 23 29 23 0-0 (a) Les composés sont testés sous forme d'une suspension dans le méthanol. Les concentration de 1 mg/ml en plongeant un disque de 7 mm dans la suspension surface de la gélose. Incubation: 24-48 heures à 25-37 C. composes sont testés à une et en le plagant sur la Zone d'inhibition mesurable avec nouvelle croissance de l'organismeeàtour du disque. 4- Co 4:s c> c: TABLEAU 11 Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose Composé CIM (jg/disque)(a) R5 de formule V Candida albicans A-26 Tricophyton mentagrophytes 6 Cl3(Cll2)70-. -'/.C0 07156 3 i 0==-- Cl (CH 2) 130- -C0- 07625 CH (CH2) 1S-9.'-- 0---0 Cl3 (CH2)13 -- / Cil3(Cl9)7S02- \ / Ci3 (Cil2) 1So2-e e-- * _=. Ci3 (Cil12) So2-e\-- O---- 3;C il) S2 \*8 e--C Cil3(C1l9)13 S2 \2 _- * __=e Cû --* 3 2) 7 \ Tableau 1l1 (suite) Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose CIM (pg/disque)(a) Candida albicans A-26 Triconhvton mentaqrophytes 6: -CO- 2r5 7CO- 20.0 À -CO- 20 0X312 e-CO- %/,-CO- /*-C 0- /0C aCo- 2!5 0or 625 0t156 01 078 0O039 >40 r%) Co Co Tableau 1i1 (suite) Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gdlose Composé CIM (.g/disque)(a) R de formule V Candida albicans A-26 Tricophyton mentagrophytes 6; _ /-'xqc0 Cil13 (CH2)90-e\ /0 25 >40 o0--O-.o CH (CH) 0-sv Dû\\ 21S >40 Cil3(CH2) 30-. _ 40 40 //--ea 0 CH3(CH2)50-e\ /-C- 2r5 0/312 Ci3(CH2)7(SO) -oê /ûC0 5 1>25 0-0 CHl3(CH2)j\ /_* C0o 0 625 0 156 C}13(Cil2)30-o\ (C/12)2-C- 20 25 * =0% À --%c Tableau 11 (suite) Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose J....... ,......... Composé R de formule V.. Cil3 (CH2)50- /- (CH2)2'GO 0== eo--%.,\ CHI3(Cl 2)7 O-* /- (CH2)2 CO- O--. Cil 3(Cil 2> 7 \ O (CiH2)2-CO- 0== CH3(Ci 2)10 ê\, */ ( 2)112CO e--e C3 (C1i2) 0-. =. -CHC'-C0- *_=0 CH3(CH2)70-\ /-CHUCII-C0- --*-CH CO- \\ 2 ClI3(CH2)70\6= /D CIM (Jg/disue) (a) Candida albicans A-26, Tricophyton mentagrophytes 6' 0 625 01156 01078 0f156 01312 0156 ' it25 Ot156 M' o Co Tableau 11 (suite) Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose Composé CIM (ig/disque) (a) D Rde formule V Candida albicans A-26Tricophyton mentagrophvtes6C Cil (Ci2lô\d Co2- 0 312 0,625 Cil3(CH2)4 -(C_2dû (Ci2)5 0 1156 CH3(CH12)6110-_/(CH)2- 01625 016 *--. CH--(CH)O-,00-C CHi3(Ci2)90-S\/e-(-CIH2CO- 01565 07156 0=0O e-s CH3(CH2)70-- Dû/ 2C 80 2 5 e--e- la) (Cod)u9m,\pH 7,CII2CLes016 c0po156 Sit3 (CH2) 70-o\ /CO8 0= a) Les composés sont en suspension dans une solution 0,1 M de borate de sodium, pH 7,5. Les composés sont essayés à 20 Pg/disque au niveau supérieur et à des doubles dilutions jusqu'à ce qu'on atteigne des points finals. Incubation: 24 heures à 30 C. : Zones d'inhibition mesurables avec nouvelle croissance de l'organisme autour du disque. C> co Tableau 12 Activité in vitro de dérivés du noyau de A-30912A contre cinq souches de Candida albicans Composé CIM (ig/ml) R de formule V -*-SO Cil3(Cil2) 8 \_ /000 CiI3 (CH 2)11S-\ __ / C- * -0 CiI3 (Cil 2>13S\ /000- A-26 SBH16 SBH31 SBH28 0;312 0,312 0r625 01625 0T625 01625 0;625 2,5 2;5 2;5 SBH29 2V5 r-J CO Co 0,312 Tableau 13 Activité thérapeutique vis-à-vis de Candida albicans A-26 chez lessouris: Composé Dose active Rdeformule DE50 (mg/kg) la plus faible (mg/kg) R de formule V 50 O--* \ *CH3 (CH2)7O-\ /-CO- 13 10 e==e 22v 2 CH'3(CHl2)1îO-o. -Co- 319 215 À--e. CH 3(CI 2)13 " CO_. 3 5 (CH3(l2) 130''(--e/'-0' e.o. CHj(CI2)7S-e.,O- 37X4:0 CH3(CH2)9S- *-O- 28 20 *. -,, &-.- cO -e- R de fc CH3(CH2)1l CH3 (CH2) 11 CU3 (Ctt2) 1. CH. (C}lh) 'S Tableau 13 Activité thérapeutique vis-&-vis de Candida albicans A-26 chez les sourisó orm lu leV DEC^( m /k g):::t D osea ctiv e1, mule V gluDs0 (mg/kg) s-. e-.c.,- @-_@ lsfabe( S-sv&&-C0- 2 C1 t 25 S-0 /-Co- 20 2t5 O^^$> %-@-CO- 57 -'3 '-Z'/ '/ \o_=,, 0--e CH3 (CH2) 9S02-\ ==/'-CO- e-. CH3 (ClH2) 1S02-0 - 9-C0- --.\ CIL3 (CH2) 13 SO2-z *-Co- a m2!g!.... o o oe Tableau 13 Activité thérapeutique vis-à-vis de Candida albicans A-26 chez les souris: R de formule V e--eCO- Cil ( Cil)0O^ Cl3 (CH2)70-e\ /e 0-0 cie-l-0C0- CH3 (0112)93 -ê\ /- CH3(CH2) 90-\ /0 --e m--o CH3 (CH2)7 (SO)-\ -/-C0- Co -- DE50 (mg/kg):: >50 >50 >50 >50 56,6 Dose active la plus faible (mg/kg) > 40 >40 >40 >40 O l'a Co C.D Co Tableau 13 Activité thérapeutique vis-à-vis de Candida albicans A-26 chez les souris" R de formule V CH3(CH2)7. \ -',-CO- 0--e- A@-0 CH (Cil) 0-0 /@ t-(CH)- 3 2 3 2 2 z - Cil (Cil O----" CH3 (C2)5 (CH2)2-co- CH3 (Ci2)l*-(CH2)2 Cl3 (C12) 0-0 /0- (CH 2)2-CO- 03 (2 10 0 (_/2 11 - DE50 (mg/kg):: >40 4r5 4T5 >40 Dose active la plus faible (mg/kg) o OI Co Co Tableau 13 Activité thérapeutique vis-à-vis de Candida albicans A-26 chez les sourisX: R de formule V CH3(CH2)50- e-'-. CH3(CH2)7 0-.- -.-CH=CH-C0- --.-CH CO- CH3 (CH2)7 0\ / *=0 --s CH3 (CH2)110-,\; -/ CH2CO- CHs(CH)0'\ / * 0 Cil(CH)7 0 / -0-CH2-CO- --.*-CH CO- CHs (Cil2) n-o- 40 8t4 74, Dose active la plus faible (mg/kg) :: - Programmes de doses: A = 40, 20, 15 et 10 heures après l'injection, sous forme d'une à 30 % de PEG dans l'eau. Nombre de souris 6 souris par groupe. Nonbre de souris dans mg/kg; les doses sont administrées 0, 4 et 24 suspension du composé d'essai dans un mélange recevant les composés d'essai pour chaque dose: le groupe témoin (non traitées): 10 souris. ::: Telle que mesurée par l'augmentation de la durée de survie des animaux traités par rapport aux témoins, calculée par la méthode de Reed v Mueuch, American J. Hygiene, 27, 493 (1938). CO CO CO w Tableau 14 Taux dans le sang après administration orale chez les souris Composé *R5 de formule V CH{ (CH2) 70o\ __sC0- Cil (CH0)90,e %*-CO- CH 3(Cil2)9 -0 -/ %-CO- CH3 (CH2) 90-\ /-C00 @- * C3 (C2)10il /C CH (CH) O\__\ CO0 3 2 13 00 CHS (CHI S-*// %*-CO-' CH13(CH2) 9S O\ _/ CO- Cil3 (CH) 9S-ê O0C0- 32 13 =0 Taux dans lsang le intervalle de 4 plus élevé déterminé pendant un heures (Ug/ml) déterminée par essai biologique vis-à-vis d'Aspergillus montevidensis A35137. Co co CO REVENDICATIONS 1. Composé de formule: H III dans laquelle R1 est H ou OH et quand R est H, R est H et R et - deux H ou tous deux OH, et R sont tous quand R1 est OH, R2 est H, R3 est OH ou un groupement alkyloxy en C1-C6 et R est OH, ou bien 2 3 14 R est -CO-NH2 et R et R sont tous deux OH, R5 est un groupement de formule: (a) -t--()m- (A1)n- I]_ (A) R6 P (b) m A) n-( e /. >.1 ou et (c) ---(W)m(A)R N o A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle; Ai est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle, sulfonyle ou -NH-; X est un atome d'hydrogène ou un radical chloro, bromo, iodo, nitro, alkyle en C-C3, hydroxy, alcoxy en C1-C3, mercapto, alkylthio en Ci-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1-C3; X1 est un atome de chlore, de brome ou d'iode; R6 est un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle en Cl-C18 ou alcényle en C2-C18; W est un groupement alkylène en Cl-CO10 ou alcénylène en C2-C1; m, n et p sont 0 ou 1, mais si m = 0, n doit être égal à zéro; pourvu que la somme des atomes de carbone des groupements R6 et W soit supérieure à 4 mais ne puisse dépasser 21; que, quand X est un groupement mercapto, A et A1 ne puissent être des groupements sulfinyle ou sulfonyle et que, quand A et A sont des groupements sulfinyle ou sulfonyle, ils soient dans des états d'oxydation égaux. 2. Composé selon la revendication 1, o R5 est un groupement benzoyle substitué de formule: o Il / o A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle, X est un atome d'hydrogène, de chlore, de brome ou d'iode ou un groupement nitro, alkyle en C -C3, hydroxy, alcoxy en C1- C3, mercapto, alkylthio en Cl-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1-C; et R6 est un groupement alkyle en C1-C18 ou alcényle en C5-C18. 3. Composé selon l'une ou l'autre des revendica- tions] et 2, o A est un atome d'oxygène. 4. Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce que R est un atome d'hydrogène et R6 est un groupement alkyle en C5-C18 à chaîne droite. 5. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R5 est un groumement p-(n-octyloxy)benzoyle, p-(n- décyloxy)benzoyle, p-(n-dodécyloxy)benzoyle, p-(n-tétra- décyloxy)benzoyle ou p-(n-hexyloxy)benzoyle. 6. Composé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que A est un atome de soufre. 7. Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce que X est un atome d'hydrogène et R6 est un groupement alkyle en C5-C18 à chaîne droite. 8. Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce que R5 est un groupement p-(n-octylthioybenzoyle, R-(n- décylthio)benzoyle, ú-(n-dodécylthio)benzoyle ou p-(n- tétradécylthio)benzoyle. 9. Composé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que A est un groupement sulfonyle. 10. Composé selon la revendication 9, caractérisé en ce que X est un atome d'hydrogène et R6 est un groupement alkyle en C5-C8 à chaine droite. 11. Composé selon la revendication- 9, caractérisé en ce que R5 est un groupement p-(n-octylsulfonyl)benzoyle, p-(n-décylsulfonyl)benzoyle, 2-(ndodécylsulfonyl)benzoyle ou p-(n-tétradécylsulfonyl)benzoyle. 12. Composé selon la en ce que R5 a la formule (a), m, n et p sont égaux à zéro. 13. Composé selon la en ce que R5 est un groupement 14. Composé selon la en ce que R5 a la formule (a), l'oxygène et n est zéro. 15. Composé selon la en ce que R est un groupement propanoyle, 3-Ip-(noctyloxy)pI revendication 1, caractérisé X est un atome d'hydrogène et revendication 12, caractérisé E-(n-octyl)benzoyle. revendication 1, caractérisé X est l'hydrogène, A est revendication 14, caractérisé 3-[p-(n-hexyloxy)phényl - hiénylJpropanoyle, 3-lp-(n- dodécyloxy-phénylipropanoyle, E-(n-hexyloxy)cinnamoyle, p- (n-octyloxy)cinnamoyle, [p-(n-octyloxy)phényllacétyle, [e- (n-dodécyloxy)phényl]acétyle, 3-|p-(n-pentyloxy)phényll- propanoyle ou 3-[p-(n-heptyloxy)phényl]propanoyle. 16. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce,que R a la formule (a), X est un atome d'hydrogène et A et A1 sont tous deux des atomes d'oxygène. 17. Composé selon la revendication 16, caractérisé en ce que R est un groupement p-(n-octyloxy)phénoxy- acétyle ou p-(n-décyloxy)phénoxyacétyle. 18. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R a la formule (c). 19. Composé selon la revendication 18, caractérisé en ce que R est un groupement 6-(n-octyloxy)nicotinoyle, 6-(n-dodécyloxy)nicotinoyle ou p-(n-décyloxy)cinnamoyle. 20. Procédé de préparation d'un composé de formule III, caractérisé en ce qu'il consiste à acyler'un noyau peptidique cyclique de formule H R R4 CHs R I4zN Ho...- À.' HO\ R2-CH2 H -H / CH3 1 s. on. H A,/* *- I 0. H OH * - -0_ H *H \ ______ H * * ***O H O5H HQ e-- H H0 -H H. CH 44/Hs *H H' ' II dans laquelle R est H ou OH et quand R est H, R2 est H et R et Hl ou tous deux OH, R sont tous deux et quand R1 est OH, R est H, R est OH ou un groupement alkyloxy en C1-C et R est OH, ou 2 6 bien R est un groupement O i 3 4 -C-NH2 et R et R sont tous deux OH, avec un dérivé activé du composé substitué de formule IV (a), (b) ou (c) correspondant à la chaîne latérale acyle désirée (R) o R a la formule: (a) --(W)m -(A1) -(A) R6 (b) M- (A') n4 A-(A)R6; OU (C W)- M -(A) R6 N o A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle; A1 est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle, sulfonyle ou -NH-; X est un atome d'hydrogène ou un radical chloro, bromo, iodo, nitro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alcoxy en C1-C3, mercapto, alkylthio en C1-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1-C3; Xest un atome de chlore, de brome ou d'iode; R6 est un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C18 ou alcényle en C2-C18; W est un groupement alkylène en C1-C10 ou alcénylène en C2-C10; m, n et p sont 0 ou 1, mais si m = 0, n doit être égal à zéro; pourvu que la somme des atomes de carbone des groupements R6 et W soit supérieure à 4 mais ne puisse dépasser 21; que, quand X est un groupement mercapto, A et 1]0 A ne puissent être des groupements sulfinyle ou sulfonyle et que, quand A et A sont des groupements sulfinyie ou sulfonyle, ils soient dans des états d'oxydation égaux. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R est un groupement benzoyle substitué de formule: D0 dans laquelle A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle, X est un atome d'hydrogène, de chlore, de brome ou d'iode ou un groupement nitro, alkyle en C1-C3, hydroxy, alcoxy en C1-C3, mercapto, alkylthio en C1-C3, carbamyle ou alkylcarbamyle en C1-C3; et R6 est un groupement alkyle en C5-C18 ou alcényle en C5-C18. 22. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 20 et 21, caractérisé en ce que A est un atome d'oxygène. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que X est un atome d'hydrogène et R6 est un groupement alkyle en C5-C18 à chaîne droite. 24. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que R est un groupement p-(n-octyloxy)benzoyle, p-(n- décyloxy)benzoyle, p-(n-dodécyloxy)benzoyle, R-(n-tétra- décyloxy)benzoyle ou p-(n-hexyloxy)benzoyle. 25. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 20 et 21, caractérisé en ce que A est un atome de soufre. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que X est un atome d'hydrogène et R6 est un groupement alkyle en C5-C18 à chaine droite. 27. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que R est un groupement p-(n-octylthio)benzoyle, R-(n-décylthio)benzoyle, Rp-(n-dodécylthio)benzoyle ou p-(n- tétradécylthio)benzoyle. 28. Procédé selon l'une ou l'autre des III revendications 20 et 21, caractérisé en ce que A est un groupement sulfonyle. 29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que X est un atome d'hydrogène et R5 est un groupement alkyle en C5-C18 à chaîne droite. 30. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que R5 est un groupement p-(n-octylsulfonyl)benzoyle, p-(n-décylsulfonyl) benzoyle, p-(n-dodécylsulfonyl)benzoyle ou p-(n-tétradécylsulfonyl) benzoyle. 31. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R5 a la formule (a), X est un atome d'hydrogène et m, n et p valent zéro. 32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que R5 est un groupement 2-(n-octyl)benzoyle. 33. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R a la formule (a), X est un atome d'hydrogène, A est un atome d'oxygène et n est zéro. 34. Procédé selon la revendication 33, caractérisé en ce que R est un groupement 3-[2-(n-hexyloxy)phényl]- propanoyle, 3-[p-(n-octyloxy)phényllpropanoyle, 3-[R-(n- dodécyloxy)phényllpropanoyle, P-(n-hexyloxy)cinnamoyle, 2- (n-octyloxy)cinnamoyle, [p-(n-octyloxy)phényllacetyle,.[- (n-dodécyloxy)phényljacétyle, 3-[p-(n-pentyloxy)phényl]- propanoyle ou 3-[p-(n-heptyloxy>phényljpropanoyle. 35. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R a la formule (a), X est un atome d'hydrogène et A et A1 sont tous deux un atome d'oxygène. 36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que R5 est un groupement ú-(n-octyloxy)phénoxyacétyle ou p-(n-décyloxy)phénoxyacétyle. 37. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R a la formule (c). 38. Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que R5 est un groupement 6-(n-octyloxy)nicotinoyle, 6-(n-dodécyloxy)nicotinoyle ou p-(n-décyloxy)cinnamoyle. 39. Composition antifongique contenant comme ingrédient actif un composé selon la revendication 1.