Brevet FR2475901A1 — publié le 19810821

Procédé de production d'interféron La présente invention concerne des procédés et des substances pour la production d'interféron. L'interféron est une protéine antivirale et antitumorale importante produite par l'organisme. En raison de sa spécificité vis-à-vis de l'espèce, l'utilisation clinique de l'interféron nécessite de l'interféron humain. La quantité limitée d'interféron que l'on peut produire à partir des cellules de cultures tissulaires ou à partir des leucocytes frais est insuffisante pour l'emploi clini- que généralisé. L'introduction de l'information génétique relative à l'interféron humain dans un micro-organisme bac- térien, pourrait permettre la production en grande quantité d'un polypeptide ayant une activité d'interféron. On sait que de telles techniques ont été mises au point pour l'hormone somatotrope humaine et l'insuline. Les deux tyDes d'interféron, c'est à dire le type leucocytaire (IFN-a) et le type fibroblastique (IFN-e) semblent être codés par des ARN messagers diffé- rents (Cavallieri et coll., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 74, 4415-19). L'isolement de ces mARN sous une forme pure n'a pas encore été réalisé. Cet isolement semble être d'autant plus difficile que la cellule hôte est susceptible de synthétiser le mARN de l'interféron uniquement lorsqu'on l'a exposé à des facteurs exogènes appropriés, par exemple une infection virale ou des polynucléotides expérimentaux particuliers, tels que le poly(rI:rC), et les quantités synthétisées sont très faibles. Par conséquent, on a pré- cédemment suggéré d'utiliser un mARN extrait de cellules hôtes que l'on a préalablement induites à produire de l'interféron et de traduire ce mARN in vitro dans un système dépourvu de cellules et contenant tous les ingré- dients, en particulier les amino-acides naturels permet- tant d'obtenir une préparation protéique ayant une activi- té d'interféron, mais comme le mARN de l'interféron ne constitue qu'une très faible proportion des mARN tra- duits, la préparation protéique finale ayant une activité d'interféron est le plus fortement contaminée Dar d'autres protéines Donc l'emploi de préparations de mARN, dans l'art antérieur, comme matière de départ pour la transfor- mation directe en ADN bicaténaire susceptible d'être cloné après son insertion dans un vecteur approprié, poserait des difficultés de sélection insolubles en pratique. La présente invention a pour objet: principalemnet de résoudre au maximum les dif- ficultés précédentes, en particulier d'établir un procédé pour isoler le mARN traduisible en interféron, plus parti- culièrement d'origine humaine ainsi qu'en les ADN cor- respondants; un procédé pour isoler un matériau génétique (ADN) contenant les séquences de nucléotides codant pour l'interféron dans les cellules humaines; un procédé de ce type selon lequel on transcrit l'ARN messager en ADN et qui comprend le clonage de 1'ADN dans un vecteur approprié. Un vecteur préféré est un plas- mide et on préfère un plasmide de type pBR322; un procédé pour détecter la séquence génétique différente exprimée dans des cellules humaines lorsqu'elle est induite pour produire de l'interféron. Un mode de réa- lisation préféré comprend la réalisation d'une hybridation différentielle des clones bactériens d'abord avec de l'ADN dérivant d'ARN de cellules induites, et ensuite avec de l'ADN identique dérivant d'ARN de cellules non induites; et un procédé de génie génétique pour produire, à partir d'une souche bactérienne, un polypeptide de type interféron qui comprend l'introduction de l'ADN d'interféron cloné dans un vecteur-support approprié. De façon avantageu- se, l'ADN d'interféron cloné est obtenu comme précédemment indiqué. Un vecteur préféré est E coli ou un autre micro- organisme approprié. Un autre type de vecteur-support appro- prié est une cellule eucaryote. L'invention concerne: - un procédé pour isoler un matériau génétique (ADN) contenant la séquence de nucléotides codant pour l'interféron dans les cellules humaines, caractérisé en ce qu'il comprend la culture des cellules produisant de l'inter- féron lorsqu'on les expose à un inducteur de l'interféron, l'exposition de ces cellules à cet inducteur, l'extraction de l'ARN messager de ces cellules induites, la purification de l'ARN messager d'interféron, la transcription de l'ARN messager en ADN et le clonage de l'ADN en un vecteur approprié. - un procédé dans lequel les cellules humaines sont des cellules diploïdes humaines de prépuce, c'est-à- dire des cellules fibroblastiques. - un procédé dans lequel l'inducteur est de l'ARN bicaténaire. - un procédé dans lequel on effectue la purifi- cation de l'ADN par centrifugation avec un gradient de saccharose après la traduction in vitro de l'ARN messager en interféron actif. - un procédé dans lequel on séapre l'ARN en ARN produisant finalement de l'interféron humain IFN-$1 et en ARN produisant finalement de l'interféron humain IFN-e2. - un procédé dans lequel le vecteur est un plasmide. - un procédé dans lequel le plasmide est pBR322. - un procédé pour détecter la séquence généti- que différente exprimée dans une cellule humaine lorsqu'elle est induite à produire de l'interféron caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer une hybridation différentielle des clones bactériens d'abord avec de l'ADN d'ARN de cel- lules induites et ensuite avec de l'ADN identique dérivant d'ARN de cellules non induites. - un procédé de manipulation génétique d'une souche bactérienne pour produire un polypeptide de type interféron caractérisé en ce qu'il consiste à introduire un ADN d'interféron cloné dans un vecteur-support approprié. - un procédé dans lequel le vecteur-support est E coli. - un procédé dans lequel le vecteur-support est une cellule eucaryote. - un procédé d'enrichissement de mARN d'inter- féron ou de mARN (mARN inductible) d'une autre protéine ou d'un autre polypeptide dont la production peut être induite dans des cellules hôtes par des facteurs exogènes, compre- nant les étapes suivantes: a) exposer une culture de ces cellules hôtes à ce facteur exogène pour induire dans ces cellules la synthèse de ce mARN inductible; b) extraire les mARN, y compris le mARN inductible, formés dans la culture de cellules induites ainsi que les mARN d'une culture témoin non induite des mêmes cellules hôtes; c) synthétiser des cADN sondes des mARN de la culture induite et de la culture témoin non induite en utilisant les mARN correspondants comme matrices (cADN induits et cADN non induits); d) synthétiser des cADN bicaténaires dérivant du mARN ex- trait de la culture induite, insérer ces cAdN dans des vec- teurs appropriés, transfecter des micro-organismes appro- priés avec les vecteurs modifiés obtenus et cultiver ces micro-organismes dans des conditions appropriées pour provoquer le développement sélectif des colonies de micro- organismes de ces vecteurs modifiés (colonies initiales); e) former des colonies secondaires de ces colonies initia- les; f) provoquer la libération in situ des ADN des colonies initiales et secondaires; g) hybrider les ADN des colonies initiales d'une part et des colonies secondaires d'autre part respectivement avec les cADN sondes induits et les cADN sondes non induits (ou inversement); et h) récupérer les ADN des clones qui s'hybrident avec les cADN sondes induits et qui ne s'hybrident pas avec les cAD sondes non induits pour obtenir des ADN hybridables avec le mARN pouvantêtre traduit en la protéine ou le polypeptide inductibles en particulier l'interféron. - un procédé dans lequel le mARN de départ du stade a) de la revendication est d'origine humaine. - un procédé consistant à introduire les ADN récupérables dans le stade h) ci-dessus indiqué dans un micro-organisme pour former des cellules de micro-organis- mes contenant des copies multiples de ces ADN. L'invention concerne également - un vecteur contenant un ADN hybridable avec l'ARN d'une protéine inductible telle que l'interféroni - un vecteur qui dérive de pBR322 et qui contient un insert d'ADN hybridable avec du mARN humain et renfermant jusqu'à 900 à 1 000 nucléotides; - un vecteur dans lequel l'insert d'ADN est constitué d'environ 720 nucléotides; - un procédé pour séparer le mARN correspondant à une protéine inductible telle que l'interféron des mARN produits par une cellule en particulier d'origine humaine, lorsque cette cellule est exposée à un facteur exogène approprié, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre les mARN formés par cette cellule préalablement extraits, en contact avec le vecteur d'ADN immobilisé sur un support dans des conditions convenant à l'hybridation puis à éluer le mARN fixé du vecteur d'ADN immobilisé; - un mARN d'interféron humain sous une forme très purifiée; - un mARN d'interféron humain e1 sous une forme très purifiée; - un mARN d'interféron humain e2 sousune forme très purifiée; - un mARN d'interféron humain caractérisé en ce qu'il comporte environ 900 à environ 1 000 nucléotides pour l'IFN-e1 et 1 250 à 1 350 nucléotides pour l'IFN-e2 et en ce qu'il est traduisible en des polypeptides pratiquement uniques ayant respectivement un poids moléculaire d'environ 000 ou d'environ 23 000 à activité d'interféron; un ADN codant pour un polypeptide ayant une activité d'interféron pouvant être inséré dans un vecteur tel que le plasmide pBR322; - un interféron humain e1 sous une forme très purifiée; - un interféron e2 sous une forme très purifiée. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit. Selon un de ses aspects préférés, l'invention concerne un procédé pour isoler un matériau génétique (ADN) contenant la séquence de nucléotides codant pour l'interféron dans des cellules humaines, de préférence des cellules fibroblastiques, ce procédé comprenant la culture de cellules produisant de l'interféron, lorsqu'on les expose à un inducteur de l'interféron, l'exposition de ces cellules à un tel inducteur, l'extraction de l'ARN messager à partir de ces cellules induites, la purification de l'ARN messager de l'interféron, la transcription de 'ARN messager en ADN et le clonage de l'ADN dans un vec- teur approprié. Selon un mode de réalisation préféré, les cellules sont des cellules diploïdes humaines de prépuce. Selon un autre mode de réalisation préféré, l'inducteur est de l'ARN bicaténaire. Le procédé selon l'invention d'enrichissement en mARN d'interféron ou en mARN (mARN inductible) d'autres protéines ou d'autres polypeptides dont la production peut être induite dans les cellules hôtes par des facteurs exogènes comprend: a) l'exposition d'une culture des cellules hôtes à ce facteur exogène, pour induire dans ces susdites cellules hôtes la synthèse du mARN inductible; b) l'extraction des mARN, y compris le mARN inductible, formés dans cette culture de cellules induites ainsi que les mARN d'une culture témoin non induite des mêmes cellules hôtes; c) la synthèse des cADN sondes de la culture induite et de la culture témoin non induite, en utilisant les mARN correspondants comme matrices (cADN induits et cADN non induits): d) la synthèse des cADN bicaténaires dérivant du mARN extrait de la culture induite, l'insertion de ces cADN dans des vecteurs appropriés, la transfectation des micro-organismes appropriés avec les vecteurs modifiés obtenus et la culture de ces micro- organismes dans des conditions convenant au développement sélectif des colonies de micro-oroanismes de ces vecteurs modifiés (colonies initiales) ; e) la formation de colonies répliquées à partir des colonies initiales: f) la libération in situ des ADN des colonies initiales et des colonies repliquées: g) l'hybridation des ADN des colonies initiales d'une part et des colonies répliquées d'autre part res- pectivement avec les cADN sondes induits et les cADN sondes non induits (ou inversement); h) la récupération des ADN des clones hybridés avec les cADN sondes induits et non hybridés avec les cADN sondes non induits, pour obtenir des ADN hybridables avec le mARN pouvant être traduit en ladite protéine induc- tible ou ledit polypeptide inductible, en particulier l'interféron. Le procédé de l'invention s'applique, de préférence, à la production de mARN d'interféron d'origine humaine très purifié. On notera qu'il n'est pas nécessaire d'effectuer certaines des étapes précédemment définies dans l'ordre exact o elles ont été indiquées.C'est particulièrement le cas de l'étape c) concernant la synthèse des cADN sondes. En pratique cette étape c) ne constitue pas en soi une étape du procédé de l'invention. On peut utiliser des sondes analogues provenant d'autres sources cellulaires. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, on effectue les étapes c) et d), comme précédemment définies, sur des fractions des nARN que l'on a extraits de cellules, qu'elles aient été induites ou non induites. A cet égard, on peut tirer parti du fait que les nARN comprennent une fraction poly-A qui permet la séparation du mARN à partir du ARN total, par fixation à de l'oligo-T-cellulose. Ensuite de façon avantageuse, on soumet la fraction éluée de mARN à un fractionnement par centrifugation avec un gradient de saccharose, les diffé- rentes bandesétant ensuite traduites séparément dans un système approprié ne contenant pas de cellules, tel qu'un lysat de réticulocytes, chacun des produits de tra- duction étant ensuite analysé pour déterminer sa capacité d'immunoprécipitation par un sérum anti-interféron. On conserve, pour effectuer les deux étapes c) et d) précitées, les bandes de mARN dont les produits de traduc- tion donnent une réaction positive dans ce test d'immuno- précipitation. Un autre aspect de ce mode opératoire est qu'on peut isoler deux mARN différents codant pour l'inter- féron, à partir de cellules fibroblastiques humaines, si on induit ces cellules comme en a) ci-dessus.- Le plus netit mkWN sédimente à ils et produit, par traduction dans un système dépourvu de cellules, une protéine ayant un poids moléculaire de 20 000 qui est précipité sélective- ment par les anticorps préparés contre un des interférons que l'on peut purifier à partir de ces cellules. Cette protéine est de l'interféron humain (IFN)-61. - Le plus gros mARN sédimente à 14S et produit une protéine ayant un poids moléculaire de 23 000 qui est précipitée-par les anticorps dirigés contre une prépara- tion moins purifiée d'interféron fibroblastique. Cette protéine est appelée interféron-e2 humain. On utilise dans l'étape d) ci-dessus les fractions de mARN produi- sant ces deux protéines. On peut ainsi produire à la demande de l'IFN-01 ou de 1'IFN-e2 sous une forme pra- tiquement pure. L'hybridation ( étapes c), d), e), f), g), et h) précédemment définies) permet donc d'identi- fier exactement les colonies isolées de E. coli contenant un des deux cAmY d'interféron IFN-6l ou e2. En particulier, on notera que les colonies qui s'hybrident uniquement avec les cADN sondes "induits" et non avec les cADN sondes "non induits" ne peuvent être que les colonies ayant incorporé un vecteur modifié ayant le cADN correspondant au mARN de l'interféron, étant donné que: a) l'ADN qui n'est pas hybridable avec le cADN sonde "non induit" ne correspond à aucun des mARN normalement produits par une cellule non induite et- b) la seule différence entre les deux sondes que l'on utilise est que le cADN sonde induit diffère uniquement de l'autre par le fait qu'il contient un cADN dérivant d'un des mARN de l'interféron. Il est évident pour l'homme de l'art que l'on peut prépa- rer ces cADN sondes selon un procédé quelconque connu en soi, en particulier par transcription en présence d'une transcriptase-reverse. Il est avantageux d'utiliser un vecteur bactérien très productif tel que le plasmide pBR322. Pour obtenir l'expression ultérieure dans un micro- organisme des vecteurs modifiés par le cADN de l'interféron, on peut utiliser un ensemble de vecteurs comme défini par Patrick Charney et coll. , dans "Bacteriophage Lambda and Plasmid Vectors Allowing Fusion of Cloned Genes in each of the three translational phases". Nucleic Acids Res., 1978 - 5(12), 4 479-94. Selon un autre stade important de l'invention, on peut utiliser le vecteur modifié ci-dessus, quelle que soit sa phase de traduction, pour extraire le mARN de l'interféron du mélange d'ARN produit par les cellules "induites", ce procédé consistant à mettre ces ARN en contact avec un vecteur modifié par le cADN de l'inter- féron préalablement immobilisé sur un support, dans des conditions convenant à l'hybridation puis à éluer le mARN fixé du vecteur de l'ADN immobilisé. On obtient ainsi du mARN de l'interféron humain (IFN-61 ou IFN-82) sous une forme très purifiée. On peut apprécier le degré élevé de purification par le fait que le produit de traduction, dans un système in vitro approprié, est constitué dans chaque cas essen- tiellement d'un composé polypeptidique unique ayant une activité d'interféron et que l'on peut précipiter par lesdits anticorps dirigés contre l'interféron humain. L'invention concerne également ces mARN purifiés qui contiennent normalement jusqu'à 900 - 1 000 nucléo- tides pour l'IFN-e1 et jusqu'à 1 250 - 1 350 nucléotides pour l'IFN-U2. De façon semblable, l'invention concerne le cADN correspondant que l'on peut obtenir par transcrip- tion de ces ARN. L'invention concerne également l'exis- tence de deux mARN de l'interféron différents et par conséquent des fragments protéiques qui peuvent également présenter une importance biologique différente. Il va sans dire que chacune des étapes d'hybridation précédemment indiquées est précédée, lorsqu'il convient, d'une déna- turation des acides nucléiques bicaténaires éventuels afin de faire en sorte qu'aucun acide nucléique bicaténaire susceptible d'induire une activité d'interféron dans les cellules) ne demeure dans des mAiN purifiés lorsqu'on uti- lise ces derniers pour la production, par traduction, d'une protéine pratiquement pure ayant une activité d'interféron in Vitro. L'invention est illustrée de façon non limitative par la description détaill'e d'un mode de réalisation pré- féré faite en regard des dessins et du tableau annexés. Sur les dessins: La figure 1 illustre le fractionnement du mARN avec un gradient de saccharose et la traduction de ces fractions de mARN provenant de cellules induites pour produire une activité d'interféron humain dans des ovocytes de Xenopus laevis et pour produire des protéines présentant une immunoprécipitation spécifique dans des lysats de réticulocytes, ce procédé séparant les mkRN de l'IFN-B1 et de l'IFN-B2. La figure 2 illustre le résultat d'une opération d'hybridation différentielle des ADN des mêmes colonies bactériennes avec les deux sondes précitées provenant respectivement de cellules "induites" et de cellules "non induites". La fiugre 3 illustre une purification du mARN de l'interféron IFN-f2 par hybridation avec de l'ADN immo- bilisé, à partir du clone bactérien A341, avec mise en évidence par traduction dans un lysat de réticulocytes. La figure 4 montre que l'ADN du clone bactérien A341 est complémentaire d'un mARN comportant jusqu'à 1250 - 1350 nucléotides qui apparait dans les cellules humai- nes uniquement après induction de la synthèse de l'in- terféron. Le tableau annexé montre que ce mARN, après tra- duction dans des ovocytes de Xenopus Zaevis, produit de l'interféron à activité biologique inhibant le dévelop- pement d'un virus dans des cellules humaines. a) Purification de deux mARN de l'interféron provenant de fibroblastes diploides humains. On extrait de l'ARN de cultures en couche mono- cellulaire de fibroblastes humains de la souche FSll (isolée à l'Institut des Sciences Weizmann). Ces cel- lules diploides provenant d'explants du prépuce d'un individu normal âgé de 8 jours, ont été choisies parmi isolements séparés en raison de leur capacité à produire des titres élevés d'interférons. On peut si- non utiliser des cultures d'un clone de cellules hu- maines SV80. On maintient les cultures dans du milieu minimum de Eagle additionné de 10 % de sérum foetal de veau, dans des flacons de culture sur bâti à rou- leaux de 2,2 litres ou dans des plateaux en matière plastique de 22 x 22 cm sous une atmosphère constituée de 5 % de C02 et 95 % d'air à 37 C. Trois jours après la confluence, on induit la production d'interféron par les cultures par exposition à 100 pg/ml de poly (rI: rC) et de 50 pig/ml de cycloheximide (qui bloque la synthèse des protéines par l'hôte) pendant 3,5 heures. On ajoute 1 pg/ml d'actinomycine D (qui bloque la synthèse de l'ARN cellulaire) et une heure apres, on lyse les cellules avec du détergent Nonidet-P40 tamponné et on extrait l'ARN cytoplasmique avec un mélange phénol-crésol selon Kirby (1965). On isole les mARN de l'ARN total par fixation à de l'oligo-DT-cel- lulose en tirant parti du fait que les mARN contien- nent le fragment poly par fixation à de l'oligo-DT- cellulose. On fractionne ensuite la fraction de mARN par centrifugation dans un gradient de saccharose. On identifie les fractions contenant du mARN de l'inter- féron par micro-injection à des ovocytes de Xenopus Zaevis selon Raj N.K. B. et Pitha P.M. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1483-1487, 1977) et mesure 24 à 40 heures apres de l'activité antivirale de l'interféron libéré dans le milieu d'incubation des ovocytes. Pour mesurer l'activité antivirale, on expose des cellules FS11 à des dilutions du milieu d'incubation des ovocy- tes, on infecte ces cellules avec le virus de la sto- matite vésiculaire et on observe d'inhibition de l'ef- fet cytopathologique provoqué nar le virus. On calcule les titres d'interféron par comparaison avec une solu- tion connue, par détermination de la dilution minimale efficace. On identifie également les fractions conte- nant du mARN de l'interféron par traduction dans un lysat de réticulocytes puis immunoprécipitation du produit selon la méthode de Weissenbach et coll., (Eur. J. Biochemistry 98, 1-8, 1979). La figure la montre les deux pics d'activité du mARN de l'interféron détectée par injection à des ovo- cytes. La figure lb montre les lignes d'immunoprécini- tation que l'on obtient entre les produits de traduc- tion et un sérum anti-interféron, les deux flèches montrant les deux polypeptides avant un poids molécu- laire de 23 000 (23K) et de 20 000 (20K). La figure la montre les fractions, séparées avec un gradient de saccharose, codant pour les polypeptides immunopréci- pités de 23K et 20K et on voit que ces fractions cor- respondent aux deux pics de l'activité du mARN de l'in- terféron. On détecte également l'activité d'interféron dans les produits de traduction formés dans des lysats de réticulocytes, par mesure de l'induction de la (2'- ')oligo-isoadénylate-synthétase dans des cellules hu- maines. Les deux procédés montrent que le pic le plus important de mARN de l'interféron code pour le poly- pentide de 23K tandis que le pic le plus petit du mARN de l'interféron code Dour le polyneptide de 20K. On isole ainsi les deux mARN de l'interféron et on les utilise pour le clonage dans E. Coti. b) Clonaqe du cADN de l'interféron 82 dans E. Coli. On détermine la quantité de mARN purifié de cellules induites contenant environ 1 à 3 % du mARN produisant le polypeptide ayant un poids moléculaire de 23 000 et on l'utilise comme matrice pour synthéti- ser du cADN avec le virus de la myéloblastose aviaire de la transcriptasereverse et de l'oligo-DT comme initiateur. Après avoir éliminé l'ARN par traitement alcalin, on pourrait synthétiser le second brin de l'ADN avec de la trascriptase-reverse ou de l'ADN- polymérase I. On hydrolyse l'ADN monocaténaire avec la nucléase Sl et on allonge les extrémités 3' de l'ADN avec de la nucléotide terminaltransférase avec du dGTP comme substrat. On hybride ensuite de l'ADN de plasmide avec le cADN humain dC-allongé et on l'uti- lise Dour la transfection de E. colIi DP50. Pour iden- tifier les colonies bactériennes transfectées, on les cultive sur une boite de gélose contenant du milieu de Luria, de l'acide diaminopimélique, de la thymidine et de la tétracycline. On soumet les colonies à un essai complémentaire sur des boites de gélose semblables, mais contenant de l'ampicilline comme seul antibioti- que. On cultive les colonies bactériennes sensibles à l'ampicilline et résistant à la tétracycline sur un filtre de nitrocellulose déposé sur une boite de gélo- se comme ci-dessus avec 10 pg/ml de tétracycline. On transfère une partie des 2000 colonies et plus trans- formées obtenues sur d'autres filtres de nitrocellu- lose disposés sur des boîtes de gélose comme précédem- ment indiqué, chacune des colonies repliquées étant associée (en particulier par un numérotage commun) à une des colonies initiales. Lorsque les colonies ont atteint un diamètre de 3 à 5 mm, on transfère chaque filtre (cultures initiales et secondaires) sur le des- sus d'une pile de papiers-filtres imprégnée d'abord d'hydroxyde de sodium 0,5 N puis de chlorure de sodium 0,15 N et d'hydroxvde de sodium 0,1 N pour libérer in situ les ADN respectifs. On neutralise les filtres et on les sèche. Pour détecter les colonies bactériennes contenant les séquences d'ADN de l'interféron, on hy- bride les filtres avec deux 32 P2cADN sondes diffé- rents. On nrépare un cADN sonde par traitement par la transcriptasereverse du mARN de la fraction séparée avec un gradient de saccharose des cellules induites (flèche 23K de la figure 1). On prépare la seconde sonde de façon identique à partir de la fraction sem- blable de la préparation de cellules non induites. On synthétise les deux cADN sondes en utilisant les quatre 32Pj-désoxynucléoside triphosphates très radio-actifs comme substrats et de l'ADN de thymus de veau fragmenté comme initiateur. On obtient ainsi une représentation aléatoire des séquences de mARN dans les cADN sondes. On effectue l'hybridation entre 62 et 640C pendant 18 heures dans du tamoon NaCl 0,9 M-citrate de sodium 0,09 M à pH 7,0, les colonies initiales étant hybri- dées avec les cADN sondes des cellules induites et les colonies répliquées avec les cADN sondes des cel- lules non induites (ou inversement). Après lavage abon- dant, on met les filtres en contact avec une pellicule radiographique et on identifie les colonies bactérien- nes capables de s'hybrider avec le cADN induit et non avec le cADN non induit. On isole ainsi 20 colonies bactériennes différentes sur un total de nlus de 2000 colonies transformées triées. Toutes ces 20 colonies bactériennes contiennent des copies multiples d'un plasmide o figurent des séquences insérées de mARN humain exprimées uniquement après que la production d'interféron par les cellules a été induite par du poly(rI:rC). Un exemple de cette technique est illustré par la figure 2 relativement à 15 paires de colonies (ini- tiales et répliquées) traitées par un alcali sur leurs filtres de nitrocellulose, dont l'ADN a été hybridé avec du 3 P7-cADN préparé contre la fraction de mARN correspondant au polyoeptide 23K de la figure 1, à partir de cellules induites (i) ou non induites (N i) par du ooly(rI:rC) à produire de l'interféron. Les flèches montrent deux colonies, numérotées 5 et 13 qui contiennent les séquences induites. La colonie n 13 a été appelée E. coli DP50/A341. c) Isolement de mARN de l'interféron de fibroblastes humains. On isole du mARN de l'interféron (et on démontre la présence de séquences de cADN de l'interféron dans l'ADN de plasmide du clone A341) de la façon suivante: on utilise une culture de 500 ml de ce clone bactérien * pour préparer 50 pg d'ADN de plasmide. On unit par co- valence cet ADN (après dénaturation préalable) à de la poudre de diazobenzyloxyméthylcellulose selon les mé- thodes de Aldwine et coll. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74, 5350). Parallèlement, on unit de façon sem- blable à de la cellulose de l'ADN du plasmide pBR322 (ne contenant pas de séquences d'ADN humain). On hy- bride du mARN contenant le fragment poly A, provenant de fibroblastes humains que l'on a induit à produire de l'interféron, avec les deux préparations d'ADN- cellulose dans du formamide à 50 % à 52 C et on élue par élévation de la concentration en formamide à 100 % à 700C. On traduit l'ARN récupéré après l'élution, dans le système dépourvu de cellules réticulocytaires (figure 3) et on constate que le produit essentiel de la traduction du mARN sélectionné sur l'ADN A341-cel- lulose est essentiellement le polypeptide ayant le poids moléculaire de 23 000. Au contraire, on ne récu- père pas de mARN d'interféron humain à partir de l'ADN pBR322-cellulose. Par comparaison avec les produits de traduction du mARN humain avant l'hybridation avec l'ADN A341-cellulose, on voit que l'ADN A341 cloné n'est complémentaire que d'une faible partie du mARN du mélange. Le produit du mARN sélectionné sur l'ADN A341-cellulose est immunoprécipité par le sérum de l'interféron de fibroplaste anti-humain. On pourrait également isoler le mARN de l'inter- féron selon un mode opératoire semblable mais consis- tant à unir l'ADN du plasmide A341 à des filtres de nitrocellulose, hybrider avec l'ARN et éluer par ébul- lition pendant une minute dans l'eau. On a mis en évidence l'activité de codage pour de l'interféron humain à forte activité biologique de ce mARN nurifié par injection à des ovocytes de Xenopus laevis puis mesure de l'inhibition de la mul- tiplication des virus dans des cellules humaines en contact avec le milieu d'incubation des ovocytes (ta- bleau). On a également mis en évidence l'activité de production d'interféron du mARN q2 par induction de la (2'-5')oligo-isoadénylate synthétase dans des cellules humaines par les produits de traduction ovocytaire (tableau). L'établissement avec une enzyme de restriction de la carte de l'ADN de plasmide A341 a montré qu'il contient un insert d'ADN humain comportant environ 900 nucléotides dans le site Pst. L'ADN A341 s'hybride également avec trois fragments du génome humain ayant subi une digestion par l'Eco R1 nucléase. On sépare ces fragments par électrophorèse sur gel d'agarose. L'hybridation avec des électrophorégrammes sur gel d'agarose du mARN de fibroblastes humains montre de plus que l'ADN A341 est complémentaire des séquences d'ARN qui sont exprimées uniquement dans les cellules exposées à l'inducteur d'interféron qu'est le poly (rI:rC) (figure 4a). Même une exposition d'une heure des cellules au poly(rI:rC) provoque l'accumulation d'un ARN comportant 1 250 à 1 350 nucléotides s'hybri- dant avec l'ADN A341 qui représente le mARN d'IFN-. 2. Les résultats ci-dessus montrent que le clone bactérien E. coli DP50/A341 contient dans le site Pst de son plasmide pBR322 un insert d'environ 900 nucléo- tides de séquences de cADN humain qui sont comolémen- taires de mARN d'interféron humain. On a obtenu plu- sieurs clones préparés de façon semblable. La figure 4b montre que les clones correspondant à l'IFN- 2 s'hy- brident avec le pous gros mARN comportant 1 250 à 1 350 nucléotides tandis que les clones correspondant à l'IFN-B 1 s'hybrident avec le mARN plus petit compor- tant 900 à 1 000 nucléotides. On peut utiliser le procédé pour obtenir des clones d'ADN d'interféron de différents types (a, 8, y) provenant de cellules humaines. Légendes des figures. Figure 1: Gradient sur saccharose d'ARN à poly A+ de cellules humaines induites pour produire de l'interfé- ron (a). La sédimentation va de la droite à la gauche. On injecte dix ovocytes de Xenopus avec 0,4 pg d'ARN de chaque fraction et après 40 heures, on détermine l'activité d'interféron du milieu entourant les ovocy- tes sur des cellules FSll (échelle de gauche). On tra- duit également chaque fraction d'ARN (0,24 pg) dans des lysats de réticulocytes et on précipite les pro- duits marqués à la 35S-méthionine avec un sérum anti- interféron. Les produits analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide figurent dans la partie i de (b). La partie n de (b) représente les produits immuno- précipités du mARN non fractionné à partir de cellules non induites. A l'extrémité droite de (b) figurent des marqueurs du poids moléculaire (de haut en bas, 68, 46, , 18 et 14 daltons x 10-3). On note la position et l'intensité des protéines 23K et 20K (flèches) et on les indique graphiquement sur l'échelle de droite. Le plus lourd des deux mARN de l'interféron est traduit en la protéine 23K tandis que le plus petit des mARN d'interféron est traduit en la protéine 20K. Fiqure 2: Détection d'un clone bactérien transformé contenant de l'ADN d'interféron. On hybride 15 colonies traitées par un alcali sur des filtres de nitrocellu- lose avec du 732PcADN préparé contre la fraction de mARN correspondant à la protéine 23K (voir figure 1) à partir de cellules induites (i) ou non induites (N i) pour la production d'interféron par du poly(rI:rC). La flèche montre deux colonies contenant des séquences induites. La colonie n 13 est E. coli DP50/A341. Fiqure 3: Démonstration du fait que le clone E. coli DP50/A341 contient de l'ADN d'interféron. Du mARN à poly A à partir de fibroblastes humains induits pour la production d'interféron est hybridé avec de l'ADN du plasmide A341 uni par covalence à de la cellulose et est traduit. L'électronhorèse sur gel des produits de traduction montre que le mARN qui code pour le poly- peptide de type interféron (IF) est sélectionné exclu- sivement à partir du mélange des mARN totaux. L'ADN de pBR n'est pas capable de sélectionner ce mARN. La posi- tion du polypeptide de type IF est représentée après l'immunoprécipitation avec de l'anti-interféron (ipt). Fiqure 4: a) l'ADN de plasmide du clone bactérien A341 s'hybride avec un 148 mARN (comportant 1 300 nu- cléotides) présent dans les cellules induites pour la production d'interféron (i) mais non dans les cellules non induites (n). L'ADN du plasmide nBR ne s'hybride pas tandis que le cADN total (tot) non cloné s'hybride avec de nom-reux mARN présents également dans les cel- lules non induites. Une électrophorèse sur gel d'aga- rose de l'ARN suivie d'une hybridation avec les trois 32P-ADN est représentée. b) On utilise l'ADN de plasmide à partir de différents clones d'ADN d'interféron dans une expérience sembla- ble d'hybridation avec des électrophorégrammes de mARN. Les clones contenant l'ADN de IFN- 2 s'hybrident avec le mARN comportant 1 300 nucléotides tandis que les clones contenant l'ADN d'IFN-01 s'hybrident avec le mARN d'interféron plus petit comportant 900 nucléotides. TABLEAU 1 HY,R!CATION-TRADUCTION DE mnARN D'INTERFERON U2 Expérience 1 Expérience 2 : Détermination radio- : immunologique : avec le virus de la stomatite : vésiculaire, cpm : Induction: : de l'oligo-isoadénylate: :32 synthétase: : (32P)-A2'pS'A, cpm Titre en IF (calculé] Surnageant d'ovocytes (dilué au 1/10) : Extrait d'ovocytes : (dilué au 1/15) -Pas d'injection -Avec de l'ARN hybridé avec un plasmide de type IF-62 -Avec de l'ARN hybride avec un plasmide sans rapport Standard d'interféron 100 U/ml 7 445 I 920 6 015 I 700 4 700 U/ml I 500 800 SI U1 x Dans l'expérience 1, on utilise de l'ADN de clone E474 et dans l'expérience 2, on utilise un ensemble de plasmidesSO à ADN de type IF-$2. 0 ------------------------:------------------------:------------------------ 2475901 REVENDICATIONS 1 - Procédé pour isoler un matériau génétique (ADN) contenant la séquence de nucléotides codant pour l'interféron dans les cellules humaines, caractérisé en ce qu'il comprend la culture des cellules produisant de l'interféron telles que des cellules diploïdes humaines de prépuce, c'està-dire des cellules fibroblastiques, lorsqu'on les expose à un inducteur de l'interféron, l'ex- position de ces cellules à cet inducteur, l'extraction de l'ARN messager de ces cellules induites, la purification de l'ARN messager d'interféron, notamment par centrifugation' dans un gradient de saccharose, la transcription de l'ARN messager en ADN et le clonage de l'ADN dans un vecteur approprié, notamment du type plasmide, tel que pBR 322. 2 - Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'inducteur est de l'ARN bicaténaire. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2 caractérisé en ce que l'étape de purifi- cation de l'ARN messager comprend une séparation de l'ARN conduisant à la production finale d'interféron humain IFN- el et de l'ARN conduisant à la production finale de l'interféron humain IFN-a 2. 4 - Procédé selon la revendication 2 ou selon les revendications 2 et 3 combinées pour aussi détecter la séquence génétique différente exprimée dans une cellule humaine, lorsqu'elle est induite à produire de l'interféron, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer une hybridation tion différentielle des clones résultant du susdit clonage dans un vecteur approprié,d'une part,avec de l'ADN déri- - vant d'ARN de cellules induites et,d'autre part,avec de l'ADN identique dérivant d'ARN de cellules non induites. - Procédé de manipulation génétique d'une souche bactérienne pour produire un polypeptide de type interféron caractérisé en ce qu'il consiste à introduire un ADN d'interféron cloné, selon la revendication 2 dans un hôte approprié, tel qu'une culture bactérienne notamment E.coli, ou qu'une culture de cellules eucaryotes. 6 - Procédé d'enrichissement de mARN d'inter- féron ou de mARN (mARN inductible) d'une autre protéine ou d'un autre polypeptide dont la production peut être induite dans des cellules, notamment d'origine humaine, par des facteurs exogènes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on expose une culture de ces cellules hôtes à ce facteur exogène pour induire dans ces cellules la synthèse de ce mARN inductible; b) on extrait les mARN, y compris le mARN inductible, formés dans la culture de cellules induite ainsi que les mARN d'une culture témoin non induite des mêmes cellules hôtes; c) on synthétise des cADN sondes à partir des mARN de la culture induite et de la culture témoin non induite en utilisant les mARN correspondants comme matrices (cADN induits et cADN non induits); d) on synthétise des cADN bicaténaires dérivant du mARN extrait de la culture induite, on insère ces cADN dans des vecteurs appropriés, on transfecte des micro-organis- mes appropriés avec les vecteurs modifiés obtenus et on cultive ces micro-organismes dans des conditions appro- priées pour provoquer le développement sélectif des colonies de microorganismes de ces vecteurs modifiés (colonies initiales); e) on forme des répliques ou colonies secondaires de ces colonies initiales; f) on provoque la libération in situ des ADN des colonies initiales et secondaires; g) on hybride les ADN des colonies initiales d'une part et des colonies secondaires d'autre part respectivement avec les cADN sondes induits et les cADN sondes non induits (ou inversement) et h) on récupère les ADN des clones qui s'hybrident avec les cADN sondes induits et qui ne s'hybrident pas avec les cADN sondes non induits pour obtenir des ADN hybri- dables avec le mARN pouvant être traduit en la protéi- ne ou le polypeptide inductibles, en particulier l'interféron et, le cas échéant, 22 2475901 on introduit les ADN ainsi récupérés dans un micro- organisme pour former des cellules de micro-organismes contenant des copies multiples de ces ADN. 7 - Vecteur contenant un ADN hybridable avec l'ARN d'une protéine inductible telle que l'interféron. 8 - Vecteur qui est dérivé de pBR322 et qui contient un insert d'ADN hybridable avec du mARN humain et renfermant jusqu'à 900 à 1 000 nucléotides, notamment un insert d'ADN constitué d'environ 720 nucléotides. 9 - Procédé pour séparer le mARN correspondant à une protéine inductible, telle que l'interféron,des autres mAPN produits par une cellule,en particulier d'origine humaine, lorsque cette cellule est exposée à un facteur exogène ap- proprié, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre les mARN formés par cette cellule, préalablement extraits, en contact avec un vecteur renfermant un ADN selon la revendication 7 ou la revendication 8, ce vecteur étant immobilisé sur un support dans des conditions convenant à l'hybridation, puis à éluer le mARN fixé sur le vecteur immobilisé à partir de celui-ci. - mARN d'interféron humain sous une forme très purifiée. 11 - mARN soit d'interféron humain6 1 sous une forme très purifiée, soit d'interféron humain P 2 sous une forme très purifiée. 12 - mARN d'interféron humain caractérisé en ce qu'il comporte, soit d'environ 900 à environ 1 000 nucléotides pour l'IFN- JI1, soit d 'environ 1 250 à environ 1 350 nucléotides pour l'IFN-912 et en ce qu'il est traduisible en un polypeptide pratiquement unique possèdant une activité d'interféron ayant un poids moléculaire, selon le cas, soit d'environ 20 000, soit d'environ 23 000. 13 - ADN codant pour un polypeptide ayant une activité d'interféron pouvant être inséré dans un vecteur tel que le plasmide pBR322. 14 - Interféron humain sous une forme très purifiée, soit de type R1, soit de type P2.