Brevet FR2480943A1 — publié le 19811023

La présente invention concerne d'une manière géné- rale la technique de microscopie en fluorescence récemment mise au point en tant qu'outil intéressant pour la recherche biologique. La microscopie de fluorescence est un procédé extraordinairement sen- sible pour déceler des quantités minimes de substances qui peuvent être marquées avec des colorants qui sont fluorescents lorsqu'on les excite par de la lumière incidente. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour déceler divers organismes dans des échantillons biologiques. La détection de ces organismes est facilitée par les propriétés de marquage des acides nucléiques des colorants fluorescents décrits. Il ressort de la littérature scientifique que divers composés ont été utilisés pour marquer sélectivement des acides nucléiques. Von Bertalanffy et Bickis, J. Histochem., Cytochem., volume 4 p. 481-493 (1956) ont indiqué que l'orange d'acridine pouvait être utilisée pour l'identification des basophiles cyto- plasmiques (ARN) par microscopie de fluorescence. En particulier ils ont trouvé que l'orange d'acridine permet l'identification d'inclusions cytoplasmiques et de basophiles dans-l'état supravital et que les inclusions cytoplasmiques fluorescentes rouges corres- pondent à celles marquées par la technique au bleu de toluidine et dont la ribonucléase a indiqué qu'elles consistent principalement en ARN. Rossell et collaborateurs ont indiqué dans Nature, volume 253, p. 461, (1975) que le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) s'est révélé posséder des propriétés intéressantes de fixation de l'ADN. En particulier, ils ont trouvé que le DAPI peut être utilisé comme agent de marquage fluorescent fortement spécifique dans la levure à la fois pour 1'ADN nucléaire et celui des mito- chondries. Hilwig et Gropp dans Experimental Cell Research 75, p. 122-126 (1972) discutent d'un procédé simple et direct de marquage par fluorescence utilisant un dérivé de benzimidazole (produit de la société Hoechst identifié sous le n0 33258) pour visualiser les segments d'hétérochromatine des chromosomes et (chez la souris) les sites d'ADN répétitif. Bien que les colorants de la technique antérieure semblent être largement utilisés dans la microscopie fluorescente, l'histologie et la microfluométrie de fluorescence, ils ont des propriétés indésirables concernant les spectres d'excitation/émission, le rendement quantique et la fluorescence du fond, qui ont incité les chercheurs à rechercher d'autres colorants fluorescents des acides nucléiques. Il semble donc qu'il existe un besoin de colorants spéci- fiques des acides nucléiques, excitables dans les longueurs d'ondes du visible, qui soient sensiblement non fluorescents à l'état libre, mais fortement fluorescents lorsqu'ils sont fixés à des acides nucléiques. Il a été trouvé que les colorants décrits ci-après pos- sèdent ces propriétés. Les composés utiles dans la présente description sont connus généralement comme colorants depuis le brevet des Etats- Unis d'Amérique 3 833 863 et la Defensive Publication T88 9016. Cependant, aucune de ces références ne décrit ni ne suggère la nou- velle utilisation de ces colorants. Plus particulièrement, l'invention concerne un nouveau procédé pour déceler les acides nucléiques, qui consistent à marquer lesdits acides avec un colorant fluorescent de formule z R- o(=CH-CH) =C-(Cll=R)m R3 dans laquelle n représente un entier ayant une valeur de 0 ou 1; m représente un entier ayant une valeur de 1 ou 2; R représente un reste choisi parmi les radicaux alkyle en C1-C4 qui peut être substitué par un groupe di(alkyl en C -C4)amino; R1 et R2 représentent chacun des restes choisis parmi l'hydrogène, les alkyles inférieurs et les halogénoalkyles inférieurs; R3 représente un reste choisi parmi l'hydrogène, les alcoxy inférieurs, les alkyles et le reste amino; Z représente les atomes non métalliques nécessaires pour compléter un noyau hétérocyclique choisi parmi les noyaux benzothiazole, indolénine, naphtothiazole, benzosélénazole, benzoxazole, quino- léine et pyridine, l'un quelconque de ces noyaux pouvant être substitué par un halogène, un groupe alkyle inférieur, un groupe nitro et un groupe dialkylamino; Preprésente un anion. Les colorants décrits sont sensiblement non fluores- cents en solutions aqueuses mais présentent un accroissement marqué parce qu'ils sont liés à l'ADN à double nappe. Certains de ces colo- rants ne présentent pas cet accroissement parce qu'ils sont liés à l'ARN à une seule nappe; cependant, un accroissement notable de fluorescence est apparent avec la plupart des colorants parce qu'ils sont liés à 'ARN. A cause de l'absence de fluorescence à l'état libre, on peut utiliser de grandes quantités de colorant sans avoir à séparer ou éliminer l'excès de réactif. Cette propriété est im- portante dans certaines applications lorsqu'il y a une mauvaise absorption du colorant. En outre, a cause du rendement quantique de fluorescence élevé de certains des colorants, on peut si on le désire utiliser de faibles quantités de colorant. Les colorants suivants ont été préparés et essayes pour l'utilisation selon l'invention. Colorant n Nom chimique 1 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-p-diméthylamino- À 25 4 styrylbenzothiazolium iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-p-diméthylamino- styrylbenzoxazolium iodure de l-y-diméthylaminopropyl-2-p-diméthylamino- styryl-3,3-diméthyl-3H-indolium iodure de 3-méthyl-6-diméthylamino-2-p-diméthylamino- styrylbenzothiazolium iodure de 3-I-diméthylaminoéthyl-2-p-diméthylamino- styrylbenzothiazolium iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-p-diéthylamino- styrylbenzothiazolium iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-5-chloro-2-p- diméthylaminostyrylbenzothiazolium iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-p-diméthylamino- styryl-a-naphtothiazolium 2480943' 9 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-p-diméthylamino- styrylbenzosélénazolium iodure de 3-7-diméthylaminopropyl-5-méthyl-2-p-di- méthylaminostyrylbenzothiazolium 11 iodure de 3-3-diéthylaminoêthyl-2-pdiméthylamino- styrylbenzothiazolium 12 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-p-(N-2-chloro- éthyl-N-éthyl)-aminostyrylbenzothiazolium 13 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-E-NN-bis-(2- chlorcéthyl)-amino-o-méthylstyrylbenzothiazolium 14 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-p-N,N-bis-(2- chloroéthyl)-aminostyrylbenzothiazolium iodure de 3-(f-pyrrolidinoéthyl)-2-p-diméthylamino- stytylbenzothiazolium 16 iodure de 3-(P-morpholinoéthyl)-2-p-diméthylamino- styrylbenzothiazolium 17 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-(4-p-diméthyl- aminophényl-1,3-butadiényl)-benzothiazolium 18 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-(4-p-diméthyl- aminophényl-1,3-butadiényl)-benzoxazolium 19 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-(4-p-diméthyl- aminophényl-1,3-butadiényl)-5-méthylbenzothiazolium iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-(4-p-diméthyl- aminophényl-1,3-butadiényl)-a-naphtothiazolium 21 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-(4-p-diméthyl- aminophényl-1,3-butadiényl-5-chlorobenzothiazolium 22 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-(4-p-diméthyl- aminophényl-1,3-butadiényl)-6-nitrobenzothiazolium 23 iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-(4-p-diméthyl- aminophényl-1,3-butadiényl)-benzosélénazolium 24 iodure de 3-y-diéthylaminopropyl-2-(4-p-diméthyl- ami.nophényl-1,3-butadiényl)-benzothiazolium iodure de 1-y-diméthylaminopropyl-4-p-diméthyl- aminostyrylquinolinium 26 iodure de 1-y-diméthylaminopropyl-2-p-diméthyl- aminostyrylquinolinium 27 iodure de 1-Y-diméthylaminopropyl-4-(4-p-diméthyl- amrinophényl-1, 3-butadiényl)-quinolinium 28 iodure de 1-y-diméthylaminopropyl-4-p-diméthylamino- styryipyridinium 29 iodure de 3-propyl-2-p-diméthylaminostyrylbenzothia- zo.i!.m iodure de 1-éthyl-4-p-diéthylaminostyrylquinolinium 31 hydroxyde d'anhydro-3-y-sulfopropyl-2-p-diméthyl- aminostyrylbenzothiazolium 32 iodure de 3-3-carboxyéthyl-2-p-diméthylaminostyryl- benzothiazolium 33 iodure de 1-méthyl-2-diméthylamino-4-p-diméthylamino- styrylpyridinium 34 iodure de 1-méthyl-2-diméthylamino-4-p-diéthylamino- styrylpyridinium 35 iodure de 1-éthyl-2-diéthylamino-4 -pdiéthylamino- styrylpyridinium 36 iodure de 1-méthyl-2-diméthylamino-4-p-N,N-bis- (2-chloroéthyl)-aminostyrylpyridinium 37 iodure de 1-méthyl-2-diméthylamino-4-p-N,N-bis- (2-chloroéthyl)-amino-o-méthylstyrylpyridinium 38 iodure de 1-éthyl-2-diéthylamino-4-p-diméthylamino- styrylpyridinium Les colorants identifiés ci-dessus ont été irradiés pour déterminer leur longueur d'ondes d'excitation et l'émission fluorescente résultante. Ensuite, on a marqué des échantillons d'ADN et d'ARN avec chaque colorant. On a irradié les échantillons à la longueur d'ondes appropriée et observé l'accroissement de la fluores- cence. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau ci- après. TABLEAU Excitation (nm) À Emnission (nri) Accroissement colorant-ADN ran1 n-r nt ] 21 il de la fluorescence colorant+ARN tn1 nrmnn f Fluorescence relative du colorant dans une solution d'ADN 0,15 0,08 0 21 0,43 0,67 0,96 0,88 0, 83 1,14 0,13 0.75 0,32 0)65 0,08 0 * 09 I. Colorant i1 Co %D 4P LM TABLEAU (suite) F Excitation Colorant (n:) 21 620 22 610 23 621 24 620 586 26 565 27 623 28 515 29 540 585 31 525 32 520 3 420 34 430 455 3G -375 37 390 38 425 >, Emission (nm) Accroissement de la fluorescence Fluorescence relative jui I colorant+ADN colorant+ARN colorant dans une solution colorant colorant d'ADN... 3 0)15 2 3 0,05 6' 3 0,13 19 12 12 14 14 4 11 6 0703 28 7 0724 36 7 0)02 2 2 1 1 4 2 0X07 4 1 0,09 1 0,12 2 1 0;19 4 1 0;09 2 0,10 -4 r%) o0 oC Tous ces renseignements ont été obtenus avec un spectrophotomètre de fluorescence Perkin-Elmer NPF 43-A, en utili- sant 0,1 micromole de colorant dans 3 ml de sérum physiologique tamponné par 10 mmole de phosphate (STP), à pH 7,3. Les rapports décrivant l'accroissement de fluores- cence sont obtenus en prenant le rapport de l'intensité de fluores- cence d'une solution de colorant contenant 100 microgrammes par ml d'ADN type I de thymus de veau et d'ARN type III de levure à celle de la solution du colorant libre. La fluorescence relative est obtenue simplement à partir du rapport de l'intensité de fluorescence d'une solution de colorant contenant 100 microgrammes par ml d'ADN type I de thymus de veau à celle du colorant 1 contenant la même quantité d'ADN. Les résultats ne sont pas corrigés pour la réponse de l'instrument aux différentes longueurs d'ondes. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 On ajoute 5>1l d'une solution de colorant 1 (2 mg/ml dans le sérum physiologique à 0,9 %) à 100 l de sang complet frais (EDTA). On agite le mélange et on prépare immédiatement une plaque humide pour examen sous le microscope de fluorescence (filtre d'exci- tation à large bande à 540 nm, filtre d'émission à large bande à 590 nm; grossissement 400 fois). On observe les noyaux des leucocytes de sang périphérique (LSP) et ils sont marqués en orange intense sur fond noir. En outre, on observe des plaquettes marquées avec une intensité moyenne. Il n'y a pas de marquage visible des érythrocytes ou du cytoplasme des LSP. Exemple 2 On ajoute 20,ul d'une solution de colorant 1 (2 mg/ml dans le sérum physiologique à 0,9 %) à 2 ml d'une suspension de E. coli (10 cellules/ml). On agite le mélange et on prépare une plaque humide que l'on examine comme décrit à l'exemple 1. On observe les bactéries sous forme de bâtonnets orange brillant sur fond noir. ExemDle 3 A 2 mld'mesuspension de E. coli (environ 10 cellules par ml) on ajoute 20 il d'une solution à 2 mg/ml du colorant 25. On agite le mélange et on prépare une plaque humide. On observe la plaque comme décrit à l'exemple 1. On observe les bactéries sous forme de bâtonnets rouge brillant sur fond noir. Exemple 4 9 A 100 p1 de suspensions de phages (phage PICM 5 x 10 8 10 u.f.p.'ml; stade microphage T6, 4 x 10 u.f.p./ml; 2 x 10 u.f.p./ml, u.f.p. = unités formant la plaque), on ajoute 10 pl d'une solution du colorant 1 (1,6 mg/ml dans le sérum physiologique à 0,9 %; filtrée sur un filtre stérile de 0,3 um). On agite le mélange et on prépare une plaque humide. On observe la plaque sous le microscope de fluores- cence comme décrit à l'exemple 1. On peut observer les PICM et T6 sous forme de petites têtes d'épingles orange clair sur fond noir. Exemple 5 On mélange des solutions de réserve d'ADN et de colorant 1 dans le tampon au phosphate 50 nM à pH 6,8 de sorte que les concentrations finales soient de 1-100 nM des paires d'ADN et 1 uM du colorant dans un volume final de 2 ml. On mesure la fluorescence des solutions sur un appareil Perkin-Elmer MPF 43A. L'excitation est à 555 num (bande passante de 4 nm); l'émission est à 605 nm (bande passante 4 nm). On obtient dans cette gamme une courbe linéaire de fluorescence en fonction de la concentration d'ADN. Exemple 6 A 0,5 ml d'une solution de colorant 28 (50 pg/ml dans le sérum physiologique à 0,9 7/; filtréesur filtre stérile de 0,3,um), on ajoute 5 ul de sang complet frais (EDTA). On agite le mélange et on prépare une plaque humide pour l'examen sous microscope de fluorescence (excitation à large bande 450 - 490 nm, filtre d'émission à large bande 530nm; grossissement 400 fois). Les noyaux des leucocytes de sang périphérique sont observés marqués en orange brillant, le réticulum endoplastique marqué en jaune, le cytoplasme et la membrane marqués en vert. Les plaquettes sont marquées en orange. Les Crythrocytes et réticulocytes peuvent facilement être distingués par le réticulum des réticulocytes marqué en jaune-orange intense et la membrane des érythrocytes faiblement marquée en verdâtre. Io Exemple 7 On répète les modes opératoires décrits dans l'exem- ple 6 en utilisant une solution de colorant 33. Les noyaux et le réticulum endoplastique des leucocytes du sang périphérique sont marqués en jaune intense, le cytoplasme et la membrane en vert-jaune intense. Les érythrocytes et les réticulocytes peuvent aussi être distingués facilement par le réticulum des réticulocytes marqués en jaunâtre intense et la membrande des érythrocytes marquée en vert- jaune uni. Il est entendu d'après les exemples précédents que les colorants présentant l'intérêt pour l'utilisation selon l'invention peuvent être utilisés pour déceler une variété presque illimitée de micro-organismes dans des échantillons biologiques. Outre les utilisations évidentes dans la cytologie de micnrluorescence, ces colorants peuvent être utilisés dans les instruments de cyto- fluorimétrie d'écoulement pour rechercher des teneurs élevées en bactériesdans des échantillons d'urine et d'eau. Le sang complet pourrait aussi être analysé pour donner un profil de constituants parce que ces colorants marquent par fluorescence les plasmides, les réticulocytes, les leucocytes et les plaquettes. R E V E N D I CA T I 0 N S 1. Procédé pour déceler des acides nucléiques dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il consiste à marquer lesdits acides par un colorant fluorescent de formule S = R- n=CH-C C-(CH=CH)m- X R2 R3 dans laquelle n représente un entier ayant une valeur de O ou 1; mn représente un entier ayant une valeur de 1 ou 2; R représente un reste choisi parmi les radicaux alkyle en C1 -C4 qui peut être substitué par un groupe di(alkyl en C1-C4)amino; R, et R, représentent chacun des restes choisis parmi l'hydrogène, les alkyles inférieurs et les halogénoalkyles inférieurs; R. rctóésente un reste choisi parmi l'hydrogène, les alcoxy inférieurs, les.lkyles et le reste amino; Z représente les atomes non métalliques nécessaires pour compléter un noyau hétérocyclique choisi parmi les noyaux benzothiazole, indolénine, naphtothiazole, benzosélénazole, benzoxazole, quino- léine et pyridine, l'un quelconque de ces noyaux pouvant être substitué par un halogène, un groupe alkyle inférieur, un groupe nitro et un groupe dialkylamino; D'représente un anion. 2. Procédé pour déceler des acides nucléiques dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il consiste à marquer lesdits acides par un colorant fluorescent de formule -H-C C-CH=CH X1 XE)S2 R3 dans laquelle n, R R1, R2, R3, Z et Psont tels que définis à la revendication 1. 3. Procédé pour la détection d'acides nucléiques dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il consiste à marquer lesdits acides par un colorant fluorescent de formule R-N -CH=CH N// R1 's2 dans laquelle R, R1, R2, Z et sont tels que définis à la reven- dication 1. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le colorant fluorescent est l'iodure de l-y-diméthylamino- -propyl-4-p-diméthylaminostyrylquinoléinium, l'iodure de 3-y-diméthyl- aminopropyl-2-Z-diméthylaminostyrylbenzothiazolium, l'iodure de 3-ydiméthylaminopropyl-5-chloro-2-diméthylaminostyrylbenzothiazolium, l'iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-p-diméthylaminostyryl-a-naphto- thiazolium, l'iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-2-p-diméthylamino- styrylbenzosélénazolium, l'iodure de 3-y-diméthylaminopropyl-5-méthyl- 2-p-diméthylaminostyrylbenzothiazolium> l'iodure de l-y-diméthylamino- propyl-4-p-diméthylaminostyrylpyridinium ou l'iodure de 1-méthyl-2- diméthylamino-4-p-diméthylaminostyrylpyridinium.