Brevet FR2478633A1 — publié le 19810925

I L'invention concerne l'industrie pharmaceutique, et notamment les composés biologiquement actifs, possédant une activité antitumorale, et plus précisément les déri- vés de la rubomycine. On connait un antibiotique rubomycine (Revue "Les antibiotiques" N9, 1966, Edt "Meditsina", Moscou, M.G. Brazhnikova, N.V. Konstantinova et al. "Propriétés physico-chimiques de l'antibiotique rubomycine antitumorale, produit par Actinomyces Coeruleorubidus", p.763-766, en russe). L'antibiotique indiqué à la dénomination inter- nationale "Daunorubicine". Les synonymes de la rubomycine sont également "Daunomycine" et "Rubidomycine". La rubomycine est largement appliquée à l'heure actuelle pour le traitement des leucémie aigUes, du chorio -épithéliome de l'utérus, des réticuloses tumo- rigènes (N.I. Perevodchicova "Chimiothérapie clinique des affections tumorales (maladies cancéreuses)", publié en 1976, Edt. "Meditsina", Moscou, p.37). Toutefois, la rubomycine présente divers types d'effets secondaires, notamment, elle est cardiotoxique, inhibe l'hématopoièse, possède un spectre d'action limité et une activité antitumorale insuffisamment élevée. On connait également des dérivés, à savoir les hydrazones substitués de la daunorubicine (rubomycine) de formule générale suivante: CH4 O téch-H I H 03OH5C=--HR QI (1) CH5O O 0e11 0 > o OHz dans laquelle R est COCH3,COC2H5,COCH(CH3)21CO(CH2) 14CH3, COC6H5, COC6H4N,COC6H4(pOCH3),CHO, qui sont dotés d'une activité antitumorale. La majorité de ces composés conserve l'activité de la daunorubicine, certains autres présentent une toxicité plus faible. Parmi ceux-ci le benzoylhydrazone de daunorubicine est le meilleur antibiotique (rubidazone, R=COC6H5), qui possède une plus faible cardiotoxicité (brevet français n 1578722, publié en 1967, cl. CO 7 d). La présente invention se propose de synthétiser un nouveau composé plus efficace, possédant une faible toxicité, une activité antitumorale plus élevée et un spectre d'action plus large comparativement aux composés connus. La solution consiste en ce qu'on propose un nouveau dérivé de la rubomycine, à savoir, le 13-(1-hydro- xy-2, 2,6,6-tétraméthyl-pipérylidényl-4)hydrazone du chlor- hydrate de rubomycine à centre paramagnétique, de formule: H3C CH3 V 0OH - li C t413 I}IIICSIk. H3C CH3 OH J l i' CH3O O OH " SHAW Race D'après sa structure chimique, le composé indiqué est une hydrazone-bis non symétrique que l'on peut con- sidérer également comme une azine non symétrique, il apparaît donc que ce composé est un nouveau type de dérivés de la rubomycine, qui n'était pas décrit dans la littérature. Une autre particularité de ce composé est la présence dans sa molécule du centre paramagnétique. Le nouveau composé indiqué est conventionnellement nommé le "Ruboxyl". Le composé revendiqué est doté d'une activité anti- tumorale. Il inhibe la croissance de tumeurs malignes et peut être appliqué dans la pratique oncologique pour le traitement des affections malignes du sang et des tumeurs de diverses localisations. Le composé indiqué présente une faible toxicité ainsi qu'une activité antitumorale plus élevée et un spectre d'action plus large, comparativement aux composés indiqués connus. Les données de la toxicité et de l'activité antitumorale du composé proposé et des composés connus sont résumées dans le tableau donné ci- après. La présence du centre paramagnétique dans le com- posé en question permet d'effectuer les études pharmaco- cinétiques par RPE (résonance paramagnétique électronique). Cela permet de contrôler l'accumulation et l'élimination du médicament contenant à titre de principe actif le composé revendiqué à partir des organes et des tissus des animaux et de l'homme, sans recours à la synthèse du composé marqué, présentant un isotope actif. Le nouveau composé à centre paramagnétique se présente sous forme d'une substance cristalline rouge, soluble dans l'eau, l'éthanol, le chloroforme. Le spectre de RPE présente un triplet C.XN égal à 15,6 Gs. Le point de fusion est de 175-176 C (avec décomposition). nD20 +264 . Analyse élémentaire: Trouvée, %:C:59,02; 58,80; H:6,42; 6,57; N: 7,60; 7,55; pour C36H45N401oHC1. Calculée, %: C 59,20; H 6,36; N 7,68. Le spectre infra-rouge (KBr): la bande à 1720 cm 1, caractéristique au groupe C=0 en C13 de la rubomycine est absente, la bande à 1680 cm1, caractéristique au groupe C=N, est présente. L'invention vise également un procédé de prépara- tion du 13-(1-hydroxy-2,2,6,6-tétraméthylpipérylidényl-4) hydrazone du chlorhydrate de rubomycine, consistant en ce qu'on traite le chlorhydrate de rubomycine avec un agent alcalin pour faire passer le chlorhydrate en base de rubomycine, puis on fait réagir la base de rubomycine avec l'hydrazone de 1-hydroxy-2,2,6,6-tétraméthylpipéri- done-4, dans un rapport molaire de 1/1,5 à 2 respective- ment, dans un mélange chloroforme-méthanol de 8/1 en volume respectivement, en présence d'acide acétique pris en excès molaire quadruple par rapport à la base de rubo- mycine, à une température de 20 à 25 C, on sépare le précipité formé, on traite la solution restante après séparation du précité, contenant le produit de réaction, par une solution alcoolique de HC1, pris en excès molaire double par rapport à la base de rubomycine, on précipite le produit visé obtenu par de l'éther diéthylique. La réaction entre la base de rubomycine et l'hydrazone de l-hydroxy-2,2,6, 6-tétraméthylpipéridone-4 et le traitement ultérieur du produit de réaction obtenu avec le chlorure d'hydrogène se déroulent suivant le schéma ci-dessous. H3C CH3. C 33 sa c o, N N= z) HCe O OH Il l CH3 O. H Y H,2HCt L'invention est illustrée ci-après par un exemple de synthèse du nouveau composé proposé, à savoir le 13-(1-hydroxy-2,2,6,6-tétraméthylpipérylidényl-4)hy- drazone du chlorhydrate de rubomycine. Exemple A une solution de 1,5 g (2,66 moles) de chlo- rhydrate de rubomycine dans 50 ml d'eau, on ajoute 25 ml d'une solution 0, 2N, de Na2C03, on extrait la base de rubomycine avec 250 ml de chloroforme, on évapore l'extrait sous vide jusqu'à un volume de 75 ml et on ajoute 0,9 g (4,9 mmoles) d'hydrazone de 1-hydroxy-2,2, 6,6tétraméthylpipéridone-4, 0,5 ml d'acide acétique et ml de méthanol. On maintient la solution à une tem- pérature de 20-25 C pendant 2 jours, on sépare par fil- tration le précipité, on ajoute au filtrat 10 ml d'une solution 0,6 N de HCl dans le méthanol et on précipite le produit par l'éther diéthylique. On obtient 800 mg de 13-(1-hydroxy-2,2,6,6- tétraméthylpipérylidényl-4)hydrazone du chlorhydrate de rubomycine(le rendeament est de 41,5% du chlorhydrate de la rubomycine de départ). Dans un système chloroforme-méthanol-eau(rap- port en volume 13/6/1), le Rf pour le produit visé est égal à 0,64, pour le chlorhydrate de rubomycine le Rf est de 0,55. L'activité vis-à-vis de Bacillus mycoides est de 26% de l'activité du chlorhydrate de rubomycine. Le composé revendiqué a été testé sur des ani- maux en vue de déterminer son activité biologique. La toxicité aiguë et chronique du composé indiqué a été déterminée sur des souris blanches bâtardes et a été évaluée par la méthode de Berens. Par toxicité aiguë, on entend l'administration unique du composé et par toxicité chronique, l'administration quotidienne à plu- sieurs reprises dans nos expériences répétées 7 fois. Le 13-(1-hydroxy-2,2,6,6-tétraméthylpipérylidényl-4) hydrazone du chlorhydrate de rubomycine a été administré par voie intrapéritonéale, dans une solution physiologique, la concentration du composé indiqué étant dans la solu- tion de 0,1%. On a déterminé les doses provoquant la mort de 50% des animaux DL50) et des doses tolérées maximales (DTM). Les données de la toxicité du composé revendiqué par comparaison à celle la rubomycine et de la rubi- dazone sont résumées dans le tableau donné ci-après. L'activité antitumorale a été mise en évidence sur des types de leucémies expérimentales La, P-388, L-1210, greffées sur les souris BDF1 et sur tumeur solide, l'érythromyélose de Schvez chez des rats. Dans tous les cas, le composé revendiqué et les composés connus (rubo- mycine et rubidazone) ont été utilisés sous forme de dissolutions dans la solution physiologique, et administrés par voie intrapéritonéale. On a commencé l'administration des composés indiqués le jour suivant la greffe des tumeurs. Les doses employées du composé proposé et de la rubomycine étaient équitoxiques pour tous les modèles. Dans le type de la leucémie La, le composé de l'invention était administré à la dose de 5 mg/kg quotidiennement pendant 7 jours, la rubomycine suivant le même schéma à la dose de 0,5 mg/kg. La leucémie P- 388 était traitée avec le composé suivant l'invention à la dose de 15 mg/kg, administrée toutes les 72 heures 7 fois. La rubomycine était administrée à la dose de 1,4 mg/kg suivant le même schéma. La rubidazone était administrée quotidiennement à la dose de 4 mg/kg pendant 9 jours (Cancer Treatment Report, vol. 63, N5, publié en mai de 1979, D.W. Henry "Structure-Activity Relationships Among Daunorubicin and Adriamycin Analogs", p.845-848). L'érythromyélose de Schvez était traitée avec le composé revendiquée, admi- nistré à la dose de 14 mg/kg, toutes les 72 heures après la greffe, 7 fois. La rubomycine était introduite sui- vant le même schéma à la dose de 1,8 mg/kg. La leucémie L-1210 était traitée par le composé suivant l'invention à la dose de 20 mg/kg. On a réalisé 4 injections, l'in- tervalle entre les injections étant de 6 jours. La ru- bomycine était administrée à la dose de 2,8 mg/kg d'après le même schéma. La rubidazone était administrée à la dose tolérée maximale de 1,5 mg/kg, quotidiennement, pendant 9 jours (International Congress of Chemotherapy, 9-th, publié en 1975, Londres, Abstracts, G. Jolles, R. Maral, M.Messer, G. Ponsinet "Antitumor Activity of Daunorubicin Derivatives", p.63-65). Signalons que dans les essais, la leucémie L-1210 était greffée à l'aide cellules leucémiques prises à raison de 105, tandis que pour l'étude de l'activité antitumorale de rubidazone, la leucémie L-1210 était greffée avec une plus petite quantité de cellules, à savoir 103. La présence de la quantité plus petite de cellules leucémiques crée des conditions plus favorables pour la chimiothérapie dans le cas de l'emploi de n'importe quel agent antitumoral, y compris la rubidazone (cf. la référence précédente). Le critère de l'activité antitumorale sur les types de P-388 et L-1210 était l'augmentation de la sur- vie moyenne des animaux traités comparativement à ceux de contrôle (en %) qui était calculée d'après la formule: L _ t-é. 1OD-100 L LCon L étant la valeur exprimée en % sur laquelle la survie moyenne des animaux traités a augmenté par compa- raison avec les animaux de témoins Ltr est la survie des animaux dans le lot expérimental (traité), LCon est la survie des animaux dans le groupe témoin (non traités). Le critère de l'activité antitumorale sur le type de la leucémie La est le critère cinétique (f), qui indique combien de fois est inhibé le processus de leucémie après l'emploi du composé revendiqué et de la rubomycine comparativement au témoin. L'activité des composés en cas d'éryhromyélose de Schvez est évaluée suivant le pourcentage de l'inhibition de la croissance des tumeurs dans les lots d'animaux traités comparativement au lot d'animaux témoin. TABLEAU Composés s DTM, mg/kg DL50, mg/kg nombre d'administrations ___________________________________ 7 1 __________________________________________________________ 1 2 3 4 5 __________________________________________________________ Composé objet de l'invention (ruboxvl) 20 5 44 8 Rubom.ycine 3,7 0,5 5,5 1,4 _ _ _ _ _.. . ... _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rubidazone 1,5 4,4 Augmentation de survie moyenne Inhibition de la des animaux, en % par rapport croissance de la au témoin tumeur, en % par ___--_--_--_-_--__--__- -rapport au témoin P-388 L-1210 Erythromyélose de Schvez 6 7 8 153,0 76,0 80,0 68,0 25,0 0,0 92 39 90,0 la DL50 pour la rubidazone est déterminée après une administration Quintuple (C.R. Acad. Sc. Paris, N1, publié le 10 Juillet 1972. R. Maral, G. Ponsinet, G. Jolles "Etude de l'activité antitumorale d'un nouvel antibiotique semi- synthétique: la rubidazone", p.301-304). Il ressort du tableau que, les toxicités aiguë et chronique du composé revendiqué sont considérablement plus basses que celles des composés comparés. Le composé revendiqué augmente sensiblement la survie moyenne des animaux ayant une leucémie expérimentale P-388, comparativement à l'action de la rubomycine et de la rubidazone, et dans le cas du type L-1210, augmente la survie moyenne des animaux par comparaison avec l'action de la rubomycine. Les conditions de l'essai dans le cas du traitement de la leucémie L-1210 avec la rubidazone, comme indiqué ci-dessus, étaient moins sévères que dans la présente expérience ( la greffe était réalisée avec une quantité de cellules 100 fois plus faible et le traitement était quotidien et non 1 fois en 6 jours, comme dans l'essai décrit),d'o un résultat plus élevé de la survie moyenne des animaux égal à 90% (le pourcentage correspondant du composé revendiqué, confor- mément au tableau, est égal à 76). L'emploi de la rubida- zone dans les conditions de notre essai conduirait, de toute 'évidence, à un indice de survie moyenne plus bas par rapport à l'action du composé revendiqué. Après l'emploi du composé revendiqué pour le traitement de l'érythromyélose de Schvez, la croissance de la tumeur est inhibée à 80% par comparaison avec le témoin. L'emploi de la rubimycine ne donne aucun effet. Sur le dessin ci-joint sont présentées des courbes de dépendance du poids (P) de la rate, exprimé en g en fonction du temps (t jours) de développement du processus de leucémie La chez le témoin (courbe I), lors de l'emploi de la rubomycine (courbe Il) et du composé proposé (courbe III). Comme on le voit l'administration répétée 7 fois du composé revendiqué inhibe entièrement le processus de la leucémie (2t= 1,0) qui ne recommence pas après l'achèvement de l'administration du composé revendiqué. L'inhibition de la leucémie par l'administra- tion de la rubomycine est incomplet et cesse après la fin de l'administration de la rubomycine. De ce fait, le nouveau composé revendiqué est doté d'une toxicité plus faible et d'une activité anti- tumorale plus élevée par comparaison avec les composés analogues connus et présente un intérêt considérable pour l'utilisation dans l'industrie pharmaceutique et en thérapeutique. REVENDICATIONS R E V E N D I C A T I O N S 1. 13-(1-hydroxy-2,2,6,6-tétraméthylpipérylidé- nyl-4) hydrazone du chlorhydrate de rubomycine à centre paramagnétique de formule: NN= D-RO' H3>CCH3 0 OH H3C CH3 C H3C H 2. Procédé de préparation de 13-(1-hydroxy-2,2, 6,6tétraméthylpipérylidényl-4)hydrazone du chlorhydrate de rubomycine suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite.le chlorhydrate de rubomycine par un agent alcalin pour transformer le chlorhydrate en base de rubomycine, puis on fait réagir la base de rubomycine et l'hydrazone de 1-hydroxy-2,2,6,6-pipéridone-4 dans un rapport molaire de 1/1,5 à 2 respectivement, dans un mélange de chloroforme-méthanol pris dans un rapport en volume de 8/1 respectivement, en présence d'acide acétique pris en excès molaire quadruple par rapport à la base de rubomycine, à une température de 20-25 C, on sépare le précipité formé, on traite la solution restante après séparation du précipité, contenant le produit de la réaction par une solution alcoolique de chlorure d'hydro- se en excès molaire double par rapport à la base gène, prise en excès molaire double par rapport à la base 247863_ de rubomycine, on précipite le produit visé obtenu par de l'éther diéthylique. 3. Médicament ayant notamment une activité d'inhibition des tumeurs malignes et de traitement des leucémies, caractérisé en ce au'il contient à titre de principe actif le composé selon la revendication 1.