Brevet FR2484446A1 — publié le 19811218

Le traitement de l'infection herpétique représente un problème important a différents points de vue. Les infections récidivantes sont non seulement pénibles, mais elles peuvent aussi aboutir, lorsqu'elles se manifestent dans certaines régions, à des altérations néoplasiques graves, par exemple au cancer des organes génitaux de la femme. Pour le traitement des infections herpétiques, on applique des chimiothérapies, ainsi que des vaccins herpétiques à base de virus inactivés, c'est-à-dire tués, de l'nerpès simplex, de type 1 ou de type 2. Mais l'efficacité de ces moyens n'est pas satisfaisante dans bien des cas. L'invention concerne un procédé pour la double mutation de virus de l'herpès, les mutants ainsi obtenus et leur appli- cation à la fabrication de vaccins. L'invention consiste en ce que par le traitement avec l'acide phosphonoformique en une phase de mutation et avec la -éthyl-2'désoxyuridine en une autre phase de mutation, des virus d'herpès de type 1 et de type 2 sont amenés à une double mutation, par laquelle ils perdent certes leur caractère pathogène, mais conservent leur propriété antigénique. Les virus mutants de l'herpès ainsi obtenus sont vivants, contrairement aux vaccins utilisés jusqu'ici pour le traitement de l'herpès, et ils produisent ainsi une meilleure immunisation. Certes, on sait que le traitement du virus d'Aujeszky, appartenant au groupes des virus de l'herpès, par la 5-iodo-2- désoxyuridine peut aboutir à un affaiblissement du caractère pathogène de ce virus (Zentralblatt fEr Veterinârmedizin, vol. 15, 847-853, 1968), mais le virus ainsi obtenu est encore beaucoup trop virulent pour pouvoir être utilisé comme vaccin. Le procédé de l'invention consiste en ce que des virus de l'herpès ordinaire de type (souche C 42) et de type 2 (souche CAM 13), qui ont été prélevés sur des organismes humains et animaux et peuvent contenir différents mutants dans des propor- tions variables, sont traités en deux.phases de mutation par exemple tout d'abord avec de l'acide phosphonoformique, puis-avec de la 5-éthyl-2'désoxyuridine. Mais l'ordre dans lequel est effectué le traitement par l'acide phospfhnoformique et par la -éthyl-2'-désoxyuridine n'a pas d'importance. Les virus de l'he6rpès ordinaire, utilisés comme matériel de départ, sont connus et ils peuvent être cultivés ou enrichis de façon connue en soi, àa partir d'isolats humains ou animaux, soit "in vitro", soit dans des conditions "in vivo". La préparation de tels virus de l'herpès, utilisables comme matériel de départ, est décrite par exemple dans l'ouvrage de référence suivant: Mayr, A., Bachmann, P., A Bibrack, B., Wittmann, G., Virologische Arbeitsmethoden, vol. 1, pp. 25 sqq., 1974 G. Fischer Verlag, Stuttgart. L'exécution du procédé de l'invention s'effectue de la manière suivante: des virus d'herpès simplex du type 1 et du type 2 sont élevés in vivo ou in vitro, de préférence in vitro (en cultures de tissus), en deux phases, par exemple d'abord en présence d'acide phosphonoformique, puis en présence de 5-9thyl-2'- désoxyuridine, et ils sont transférés en plusieurs passages en présence de ces substances. Mais le traitement par la 5-éthyl-2'- désoxyuridine peut être aussi effectué en tant que première phase, suivie du traitement par l'acide phosphonoformique. Le traitement par l'acide phosphonoformique est en général effectué en 3 à 6 passages et le traitement par la 5-éthyl-2'-désoxyuridine en 3 a 10 passages. En tant que cultures de tissus pour l'élevage, on peut utiliser les cultures usuelles convenant pour la multiplication de virus, et en particulier pour la multiplication de virus de l'herpès. De telles cultures sont décrites par exemple dans Mayr, A. et ses collaborateurs, Virologische Arbeitsmethoden, vol. 1, pp. 43 sqq.; Mauersberger, B., Aktuelle Probleme der Zellzlchtung, 1971, G. Fischer Verlag, Stuttgart. On peut par exemple envisager l'utilisation des cultures suivantes pour la multiplication et l'élevage: cultures de fibroblastes de poussins embryonnaires; cultures cellulaires VERO (cultures de cellules rénales de cellitriche africain); cultures de cellules rénales de lapin; cultures BHK-21 (rein de Syrian Baby Hamster). L'acide phosphonoformique est utilisé par exemple dans des concentrations de 20 à 50 ug/ml, la 5-éthyl-2'-désoxyuridine par exemple dans des concentrations de 5 à 20 /ug/ml. La concentration des virus d'herpès utilisés doit être assezforte pourinfecter unepopulation de cellules suffisante et pour permettre le maximum-possible de cycles de multiplication virale; mais elle ne doit pas être assez élevée pour qu'après quelques cycles de multiplication virale, la population complète des cellules disparaisse et que la durée d'action des substances provoquant la mutation soit ainsi limitée. De préférence, la concentration des virus d'herpès utilisés se situe entre 1 DI50et 1000 DI50. Le traitement par l'acide phosphonoformique et par la -éthyl-2'désoxyuridine est mené à une température comprise entre et 40 C, de préférence entre 25 et 37 C, et notamment entre 30 et 37 C. En tant que virus de départ pour le procédé de l'inven- tion, on utilise des virus de l'herpès simplex du type 1 et du type 2,r provenant d'isolats humains ou animaux naturels, sans que les mutants naturels qui y sont contenus soient éliminés. Le tableau suivant montre l'immunisation de souris avec un vaccin d'herpès simplex qui a été obtenu en procédant suivant l'exemple 1. Pour la préparation des vaccins, on a utilisé le virus d'herpès simplex de type 1, souche C 42. L'immunisation a été effectuée par injection.intramusculaire. L'évaluation de l'immu- noprotection a été effectuée 30 jours après l'inoculation par infection intracérébrale par le virus d'herpès simplex type 1 de la souche initiale C 42, avec différents titres de virus. En conséquence de l'infection par le virus initial, il apparait une encéphalite chez les animaux non immunisés. 4 2484446 Les résultats sont présentés dans le tableau suivant Rapport du nombre des souris mortes au nombre total des souris Titre de la souche C 42 de Témoins non Animaux immunisés virus d'herpès simplex immunisés par des'vaccins utilisée pour la réinfec- suivant l'exemple tion 50 jours après 1 1' immunisation - -. 3/3 o/3 O10 -33 0/3 - 1/2 0/2 -3 1/2. o/3 - 4- 3/3- o0/3 CoAme le-montrent les résultats du tableau, tous les aninaux qui ont été immunisés avec les virus mutants atténués survivent. En cas de nouvelle infection par la souche de virus initiale, ces- animaux sont donc complètement immunisés. L'utilisation des mutants obtenus d'après l'invention pour la lutte contre les affections herpétiques s'effectue de la manière habituelle pour des vaccins, par exemple par injection, par ingestion, sous forme de pulvérisations (sprays), mais aussi sous forme de gouttes, de collyres, de gouttes nasales. En particulier, les mutants de l'herpès préparés sui- vant l'invention assurent une immunisation à l'égard du virus qui qui a été utilisé comme virus initial. Pour la fabrication de vaccins, les virus mutants obtenus d'après l'invention sont purifiés par les techniques classiques (filtration, en particulier filtration-moléculaire et filtra- tion sur geI, séparation, centrifugation à gradient, adsorption suivie d'une-élution, etc.).; ils sont éventuellement concentrés (centrifugation de zone, filtration moléculaire, adsorption suivie. d'une élution), stabilisés par addition de stabilisants et rendus conservables par des agents de conservation appropriés (par exemple alcool benzylique, chlorobutanoi, thiomersal, phénol, crésol). - En outre, la propriété antigénique des vaccins peut être renforcée par addition d'adjuvants ou on peut obtenir un effet de retard. A ce sujet, on mentionnera par exemple l'adjuvant de Freund, des adjuvants haiîleux et autres adjuvants organiques, mais en particulier des- composés de l'aluminium, comme l'oxyde, l'hydro- xyde et le phosphate d'almmininm. Les mutants viraux de lherpès peuvent Htre également utilisés en tant qu'élément de vaccins combinés. Exemple 1. Le virus de l'herpès simplex, type 1, souche C 42, utilisé comme virus initial a-été isolé à partir d'un patient (atteint de kératite) et transféré huit fois dans des cellules rénales de baby-hamster (BHK), avec utilisation de milieu d'Eagles à 7 % de sérum de veau foetal (flouw). Le titre du virus d'herpès a été déterminé au moyen du test des plaques ou par titrage de l'effet cytopathique sur des fibroblastes primaires de poussins embryonnaires (voir aussi B. Eriksson et B. Oberg, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 197g, pp. 758 sqq.). La souche de virus ainsi obtenue est alors inoculée, a raison d'une unité formatrice de plaque par cellule, sur mono- couche de fibroblastes embryonnaires de poussins dans des flacons de cultures tissulaire, jusqu'à ce que la dose de 100 DI50 (dose infectante moyenne: il s'agit de la dose qui produit une infec- tion chez 50 % des animaux) soit atteinte. Puis de l'acide phosphonoformique, en solution dans le milieu de base d'Eagles ayant une teneur de 2 % en sérum de veau foetal, est ajouté dans une concentration de 5 à 50 /ug, de préférence 20 à 50 /ug par ml. Dès que les cellules manifestent un effet cytopathique, les cultures sont congelées et dégelées et on en utilise 2 ml pour infecter de nouvelles monocouches de fibroblastes embryonnaires de poussins. Cette opération est répétée cinq fois encore, ce qui fait que six passages au total sont effectués. Les concentrations de l'acide phosphonoformique dans les différents passages sont les suivantes: dans le premier passage 20 à 50 /ug/ml dans le deuxième passage 20 à 50 1ug/ml dans le troisième passage 20 à 50 /ug/ml dans le quatrième passage 20 ug/ml dans le cinquième passage 20 /ug/ml dans le sixième passage 10 pg/ml. Avec les mutants oitenus âà la suite du sixième passage, on procède alors au transfert en présence d'a- ou f-5-éthyl-2'- désoxyuridine (EdU) dans des concentrations-de 5 à 20 ug/ml en 3 à 5 passages. Concentration de la 5-étry1-2'-désoxyuridine: dans le premier passage 20 ug/ml dans le deuxième passage 20 ugml dans le troisième passage 5 iug/l Tous les passages mentionnés dans cet exemple sont effectués à 37 C. Le virus vivant résultant convient comme antigène pour l'inmmunisation contre les affections herpétiques. Chez la souris par exemple, cet antigène ne provoque aucun état pathogène, mais il déclenche le développement d'une immunité, ce qui fait que les animaux sont protégés contre l'infection intracérébrale par les virus d'herpès ordinaire de type 1. Si on utilise, à la place du virus de l'herpès simplex type 1, souche C 42, le virus de l'herpès simplex type 2, souche CAM 13 comme virus initial, mais en effectuant par ailleurs le traitement indiqué ci-dessus, on obtient également des virus mutés qui peuvent être utilisés en tant que vaccins pour l'immu- nisation contre les infections herpétiques. REVENDICATIONS - 1. Procédé pour la double mutation de virus de l'herpès, caractérisé en ce qu'on traite des virus de l'herpès simplex de type 1 ou des virus- de l'herps s implex de type 2 en deux phases par l'acide phosphonoformique et par la 5-éthyl-2'-désoxyuridineo 2. Virus ce l'herpès umutés, prépares suivant la reven- dication 1. 3. Vaccins pour la lutte contre les infections herpé- tiques, contenant des mutants de virus de l'herpès qui sont obtenus suivant la revendication 1. 4. Procédé pour la fabrication de vaccins, caractérisé en ce que des mutants de virus- de l'hÉrpès, qui sont obtenus suivant la revendication 1, sont transformes de façon connue en soi en vaccins. 5. Utilisation de mutants de virus de l'herpès, obtenus suivant la revendication 1, pour la fabrication de vaccins.