Brevet FR2483621A2 — publié le 19811204

FR 2483621 A2 19811204 FR 8011689 A 19800527 La présente Addition est relative à des perfec tionnements au réactif de fixation et de coloration rapi des, simultanées, nécessaire à la mise en oeuvre du procé dé dc diagnostic qui fait l'objet du Brevet principal, à des perfectionnements au procédé de préparation de ce réactif de diagnos tic , à des perfectionnements au taon non destructeur à l'égard des cellules basophiles et à des perfectionnements au kit de diagnostic, conformes au Brevet principal. Conformement au Brevet principal,la fixation et la coloration rapides,simultanées,de la lame de diagnostic,dans les puits de laquelle a été introduit le réactif de diagnostic soit seul, soit associé à différentes concentrations de l'antigène spécifique de la parasitose ou de l'allergie à diagnostiquer, sont réalisées à l'aide d'une solution comprenant un colorant métachromatique qui colore sélectivement les granules cytoplasmiques des ba- sophiles, du sulfate d'aluminiura, du chlorure de cétylpyridinium, du glutaraldéhyde, du formaldéhyde, dans un mélange de méthanol, d'éthanol et d'eau. Les Inventeurs ont mis au point,à présent,de nouvelles so lutions de fixation et de coloration rapides, simultanées, des lames préparées, qui améliorent encore la coloration de ces dernières. Selon un mode de réalisation avantageux des solutions de fixation et de coloration rapides, simultanées, conformes à la présente Addition, ces solutions présentent la composition quantitative suivante Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % Glutaraldéhyde 1,5 à 2,5 % Formaldéhyde à 30 % 270 à 330 ml Méthanol 270 à 330 ml Ethanol 270 à 330 ml Eau q.s.p. 1000 ml Selon un autre mode de réalisation de ces solu tions de fixation et de coloration rapides, simultanées, celles-ci présentent la composition qualitative et quantitative suivante Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Halogénure de cdtylpyridinium 0,3 à 0,8 % Formaldéhyde à 30 % 300 ml + 10 % Méthanol 300 ml + 10 % Ethanol 300 ml + 10 % Eau q.s.p. 1000 ml Selon encore un autre mode de réalisation de ces solutions de fixation et de coloration rapides, simultanées, celles-ci présentent la composition qualitative et quantitative suivante Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % Méthanol 830 à 990 ml Eau q.s.p. 1000 ml. Selon encore un autre mode de réalisation des solutions de fixation et de coloration rapides, simultanées, celles-ci se distinguent par le fait qu'elles sont dépourvues de formaldéhyde, de glutaraldéhyde et d'éthanol et qu'elles contiennent comme agent de fixation le propylèneglycol. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la composition qualitative et quantitative de ces solutions est la suivante Bleu de toluidine ou colorant méthachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % Propylèneglycol 250 ml à 600 mol +10 % Méthanol 200 ml à 750 mol+10 % Eau q.s.p. 1000 ml. Conformément à la présente Addition, l'halo- génure de cétylpyridinium mis en oeuvre est le chlorure ou le bromure de cétylpyridinium. La présente Addition a également pour objet de proposer une variante de la composition du tampon Hépès non destructeur à l'égard des cellules basophiles, à l'aide duquel la couche leucocytaire séparée par centrifugation est reprise, dans laquelle la teneur en tampon Hépès est considérablement réduite et la teneur en NaCl augmentée par rapport aux teneurs en ces substances dans le tampon Hépès selon le Brevet principal Selon une disposition avantageuse de la présente Addition, la composition quantitative dudit tampon Hépès est de préférence la suivante Tampon Hépès solution molaire 4 à 25 ml KCl 10 % 0,932 mi' Caca, 10 % Op550 ml MgCl2 10 % 0,510 mi NaCl 9 %0 850 à 900 ml Eau q.s.p. 1000 mi pH 7,4-7,6 La présente Addition a également pour objet d'apporter des perfectionnements au procédé de préparation du réactif de diagnostic des parasitoses et des allergies qui fait l'objet du Brevet principal. Conformément à ces perfectionnements, le prélèvement d'un échantillon de sang chez un patient humain supposé atteint d'une parasitose ou d'une allergie est effectué sur de l'acide éthylènediamine-tétraacétique, sous la forme de l'un de ses sels, et de préférence sous la forme de son sel de potassium (EDTA h ), après quoi le sang total ainsi prélevé, qui peut être conservé sous cette forme pendant 24 heures, est mélangé à un volume égal d'un tampon Hépès de composition appropriée, contenant de l'héparine à raison de 5 à 20 unités/ml,puis l'on peut soit injecter sous ce mélange un liquide de densité 1,079-1,085 dont l'osmolmrité est comprise entre 280 et 320 milli-osmoles, constitué par un mélange de métrizoate de sodium et de "Ficoll" (Marque déposée par SIGMA), ou de "Percol" (Marque déposée par PHARMACIA),soit transférer le mélange sang/tampon Hépès hépariné dans un tube rempli au préalable du liquide de densité 1,079-1,085 susdit, pour séparer les basophiles,après quoi l'on centrifuge pendant une durée et à une vitesse appropriées pour obtenir un anneau contenant les basophiles et les lymphocytes, que l'on prélève et qu'on lave soigneusement avec le tampon Hépès hépariné susdit quc l'on rejette,après centrifugation, pour ne conserver que le culot cellulaire qui,après remise en suspension, est prét à etre déposé dans les puits d'une lame ou d'une botte de lecture de diagnostic. Grâce au procédé modifié conforme à la présente Addition, il est possible de traiteur du sang prélevé de la veille avec des résultats tout-à-fait satisfaisants ; en outre, la première centrifugation qui,dans le procédé de préparation du réactif de diagnostic selon le Brevet principal, suit immédiatement le prélèvement de l'écliantlllon de sang, est inutile, permettant une réduction de la durée du test de diagnostic à moins d'une heure. Le tampon Hépès hépariné mis en oeuvre, de préférence, dans le procédé modifie conformément à la présente Addition, de préparation du réactif de diagnostic présente avantageusement la composition ci-après Tampon Hépès, solution molaire 4 à 25 ml KCl 10 % 0,932 ml CaCl2 10 % 0,550 ml MgCl2 10 % 0,510 ml NaCl 9 %0 850 à 900 ml Héparine 10 unités/ml Eau q.s.p. 1000 ml pH 7,4 - 7,6 ou la composition suivante Tampon Hépès, solution molaire 4 à 25 ml KCl 10 % 0,932 ml NaCl 9%, 850 à 900 ml Eau q.s.p. 1000 ml pH 7,4 - 7,6 dans ce dernier cas le calciun et le magnésium sous la forme ae leurs sels appropriés, sont déposés en quantités prêdéter- minées sur les lames ou les botes de lecture de diagnostic. La présente Addition a en outre pour objet des variantes du kit ou ensemble prêt à l'emploi pour la réalisation du test de diagnostic conforme au Brevet principal, qui sont caractérisées en ce que les seringues à aiguille contenant chacune du liquide de densité 1,079 1,085 sont remplacées par des récipients adaptés, par exemple des ampoules,des tubes ou des seringues, contenant ledit liquide de densité, ou/et en ce que le tampon Hépès contenu en quantités prédosées dans des ampoules ou des tubes appropriés comprend de 4 à 25 ml d'une solution molaire de tampon Hépès, 0,932 ml de KCl à 10 %, 0,550 ml de CaCl2 à 10 %, 0,510 ml de MgCl2 à 10%, de 850 à 900 ml de NaCl à 9 %o, en solution dans une quantité d'eau suffisante pour porter la solution à 1000 ml, ou/et en ce que la solution de fixation et de coloration rapides, simultanées, des préparations antigéniques (ou témoins) portées par les lames de lecture du diagnostic, contenue dans le récipient correspondant, présente la composition suivante Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % Glutaraldéhyde 1,5 à 2,5 % Formaldéhyde à 30 % 300 ml + 10 % Méthanol 300 ml + 10 % Ethanol 300 ml + 10 % Eau q.s.p. 1000 ml ou la composition suivante. Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % Formaldéhyde à 30 % 300 ml + 10 % Méthanol 300 ml + 10 % Ethanol 300 ml + 10 % Eau q.s.p. 1000 ml ou bien la composition suivante Bleu de toluidine ou colorant métacbromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % méthanol 830 à 990 ml Eau q.s.p. 1000 ml ou encore la composition suivante Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % Propylèneglycol 250 ml à 600 ml + 10 % Méthanol 200 ml à 750 ml + 10 % Eau q.s.p. 1000 ml Selon un mode de réalisation avantageux du kit prêt à l'emploi conforme à la présente Addition, pour la réalisation du test de diagnostic, celui-ci se compose d'un coffret qui comprend : - une pluralité de récipients adaptés tels que des ampoules ou des tubes contenant des quan tités predosées d'un tampon Hépès approprié, et notamment du tampon Hépès tel que défini plus haut, une pluralité d'ampoules, de tubes ou de seringues,contenant chacun des quantités prédosées d'un liquide de densité 1,079-1,085, - une pluralité de lames ou de boites de lecture de diagnostic présentant chacune un certain nombre de puits, dont la majeure parti, à exception d e s p u i t s t é- moins, sont destinées à recevoir des quantités prédéterminées variables d'un antigène spécifique d'une allergie ou d'une parasitose à diagnostiquer, - et une pluralité d'ampoules ou de tubes, ren-Eermant des quantités prédosées d'une solution de fixation et de coloration rapides, simultanées, du type des solutions définies ci-dessus Selon un autre mode de réalisation avantageux du kit prêt à l'emploi conforme à la présente Addition, celui-ci se compose de deux coffrets séparés dont l'un, qui est destiné à la séparation des cellules basophiles, comprend : - une pluralité de récipients adaptés tels que des tubes ou des ampoules contenant des quantités prédo- sées d'un tampon approprié, et notamment du tampon Hépès tel que défini plus haut, - une pluralité d'ampoules ou de tubes contenant chacun des quantités prédosées d'un liquide de densité 1,079-1,085; et dont l'autre coffret comprend : - une pluralité de lames ou boites de lecture de diagnostic présentant chacune un certain nombre de puits, dont la maeure partie à l'exception des puits témoins, sont destinés à recevoir des quantités pré déterminées variables d'un antigène spécifique d'une allergie ou d'une parasitose à diagnostiquer, - et une pluralité d'ampoules ou de tubes renfermant des quantités prédosées d'une solution de fixation et de coloration rapides, simultanées, du type des solutions définies ci-dessus, pour la réalisation du test de diagnostic proprement dit. Selon encore un autre mode de réalisation avanta geux du kit prêt à l'emploi en un coffret ou en deux cof frets, conforme à la présente Addition, le tampon Hépès contenu en quantités prédosées dans une pluralité de ré cipients adaptés,tels que des tubes ou des ampoules, pré sente la composition suivante Tampon Hépès, solution molaire 4 à 25 ml KC1 10 % 0,932 ml CaC12 10 % 0,550 ml MgCl2 10 % 0,510 ml NaCl 9 %0 850 à 900 ml Héparine 10 unités/ml Eau q.s.p. 1000 ml pH 7,4 - 7,6 Selon un autre mode de réalisation avantageux du kitprêt à l'emploi en un coffret ou en deux coffrets, conforme à la présente Addition, le tampon Hépès contenu en quantités prédosées dans une pluralité de récipients adaptés, tels que des tubes ou des ampoules, présente la composition suivante Tampon Hépès, solution molaire 4 à 25 ml KC1 10 % 0,932 ml NaCl 9 %0 850 à 900 ml Eau q.s.p. 1000 ml pH 7,4 - 7,6 auquel cas les lames ou les boites pour la lecture du diagnostic comDor- tent, dans chacun de leurs puits destinés à recevoir de l'antiqene, une quantité prédéterminée de calcium et de magnésium sous la forme de leurs sels et notamment de leurs chlorures. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le calcium est présent à raison d'environ 1 mmole/litre et le magnésium est présent à raison d'environ 1 mmole/litre. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente Addition. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de la présente Addition, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES I- Exemples de solutions de fixation et de coloration rapi des, simultanées Exemple 1 Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Chlorure ou bromure de cétyl pyridinium 0,3 à 0,8 % Glutaraldéhyde 1,5 à 2,5 % Formaldéhyde à 30 % 300 ml + 10 % Méthanol 300 ml + 10 % Ethanol 300 ml + 10 % Eau q.s.p. 1000 ml Exemple 2 Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Chlorure ou bromure de cétyl pyridinium 0,3 à 0,8 % Formaldéhyde à 30 % 300 ml + lo % Méthanol 300 ml + 10 % Ethanol 300 ml + 10 % Eau q.s.p. 1000 ml Exemp~le~3 Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Chlorure ou bromure de cétylpyridinium 0,-3 à 0,8 % Méthanol 900 ml + 10 % Eau q.s.p. 1000 ml Exemple 4 Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,5 % Chlorure ou bromure de cétylpyridinium 0,5 % Sulfate d'aluminium 5 % Propylèneglycol 750 ml + 10 % Méthanol 250 ml # 10 % Exemple 5 Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,5 % Chlorure ou bromure de cetylpyridinium 0,5 % Sulfate d'aluminium 5 % Méthanol 750 ml + 10 % propylèneglycol 250 ml + 10 % Exemple 6 Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,3 % Chlorure ou branure de cétylpyridinium 0,5 % Sulfate d'aluminium 5 % Propylèneglycol 400 ml + 10 % Eau 200 ml + 10 % Méthanol 400 ml + 10 % Exemple 7 Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,5 % Chlorure ou bromure de cétylpyridinium 0,5 % Sulfate d'aluminium 5 % Propylèneglycol 400 ml + 10 % Eau 200 ml + 10 % Méthanol 400 ml + lo % Exemple 8 Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,3 % Chlorure de cétylpyridinium 0,5 % Sulfate d'aluminium 5 Prolylèneglycol 400 ml + 10 % Eau 400 ml + 10 % Méthanol 200 ml + 10 % Exemple 9 Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,5 % Chlorure de cétylpyridinium 0,5 % Sulfate d'aluminium 5 % Propylèneglycol 400 ml + 10 % Eau 400 ml + 10 % Méthanol 200 ml + 10 % II - Exemples de compositions de tampon Hépès Exemple 10 Hépès 1 Molaire lo ml KC1 lo % 0,932 ml MgCl2 10 % 0,510 ml NaCl 9 %0 871 mi CaCl2 10 % 0,550 mi Eau q.s. p. looo ml pH 7,4 - 7,6 L'osmolaritE du tampon est contrôlée de manière à être sensiblement voisine (au moins à 20 % près) de celle du plasma. Exemple 11 Hépès 1 M 5 mi KC1 10 % 0,932 ml MgCl2 lo % 0,510 ml NaCl 9 %0 880 ml CaCl2 10 % 0,550 ml Eau q.s.p. 1000 ml pH 7,4 - 7,6 L'osmolarité du tampon est contrôlée de manière à être sensiblement voisine (au moins à 20 % près) de celle du plasma. Exemple 12 Tampon Hépès, solution molaire 4 à 25 ml KC1 10 % 0,932 ml CaCl2 10 % 0,550 ml MgC12 10 % 0,510 ml NaCl 9 %0 850 à 900 ml Héparine 10 unités/ml Eau q.s.p. 1000 ml pH 7,4 - 7,6 L'osmolarité du tampon est contrôlée de manière à être sensiblement voisine (au moins à 20 % près) de celle du plasma. Exemple 13 Tampon Hépès, solution molaire 4 à 25 ml KC1 10 % 0,932 ml NaCl 9 %0 850 à 900 ml Eau q.s.p. 1000 ml pH 7,4 - 7,6 L'osmolarité du tampon est contrôlée de manière a être sensiblement voisine (au moins à 20 % près) de celle du plasma. Exemple 14 Préparation d'un réactif de diagnostic de parasitoses et d'allergies conforme à la présente Addition. 1) On reconstitue un milieu tampon Hépès tel que décrit à l'Exemple 11 ci-dessus, c'est-à-dire qu'on prélève 2 ml de milieu tampon concentré dix fois contenu dans une ampoule, auxquels on ajoute 18 ml d'eau distillée. L'on obtient ainsi 20 ml de tampon dit reconstitué dont on prélève 5 ml, qu'on distribue dans un tube centrifugeable de 20 ml. On ajoute à ces 5 ml de tampon Hépès reconstitué 50 à 250 unités internationales d'héparinate de calcium, de lithium ou de sodium . Le tube ainsi préparé est le tube (1). 2) On vide le contenu d'une ampoule de milieu de séparation de basophiles (MSB) prêt à l'emploi, qui est le liquide de densité 1,079-1,085 mentionnée dans le Brevet principal, dans un tube de 20 ml à fond rond centrifugeable. Le tube ainsi préparé est le tube (2). 3) On prélève à jeûn 5 ml de sang veineux sur de l'EDTA K3 ["Vacutainer" (Marque déposée), "Venoject" (Marque déposée) ou à l'aide d'une aiguille à plateau reliée à un tube contenant une quantité d'EDTA K3 telle que la concentration finale d'EDTA K3 dans le sang sera de 1,5 mg/ml de sang]. 4) On transfère ce sang dans le tube (1) qui contient le tampon Hépès hépariné (voir 1)ci-dessus) et l'on homo-généise doucement. 5) On dépose doucement dans le tube (2) (voir 2) cidessus), à l'aide d'une pipette Pasteur, le mélange de sang et de tampon Hépès homogénéisé à la surface du-MSB. 6) On centrifuge ce tube pendant 30 minutes à 400 g à l'interface. On obtient à la limite entre le MSB et le milieu tampon un anneau blanchâtre que l'on prélève en totalité (1 à 3 ml) à l'aide d'une pipette Pasteur montée sur seringue ou poire. 7) Le milieu cellulaire ainsi obtenu est déposé dans un tube à centrifuger contenant le reste du milieu tampon Hépès hépariné et est lavé par une centrifugation de 10 minutes à 150 g. Le surnageant est prélevé jusqu'à la rupture de pente du tube (volume restant + 0,5 ml). 8) Après une homogénéisation douce d'une durée de 30-50 secondes par agitation à la main ou au vortex, le culot cellulaire prêt à l'emploi est prêt pour l'étape suivante de dépôt sur les lames de lecture du diagnostic. A noter que toutes les opérations ci-dessus, et notamment la centrifugation, sont réalisées à la température ambiante, 2O0C environ. 9) Réaction de déqranulation Dans chacun des puits d'une lame de lecture de diagnostic, on dépose 20 pl de suspension cellulaire (culot resuspendu). La lame est ensuite mise dans une boîte couverte (type boîte de Pétri) contenant un morceau de coton humide. L'ensemble est placé à l'étuve à 370C pendant 20 minutes. Puis le couvercle de la bote et le coton sont enlevés. La lame, toujours à l'étuve, est ainsi séchée en environ 15 minutes. On peut aussi sécher les lames au sèchecheveux. La fixation/coloration est obtenue en recouvrant chacun des puits d'une solution de coloration et de fixation rapides, simultanées conformes à l'un des Exemples I à 9 ci-dessus. La lame est laissée sur la paillasse pendant 15 minutes, puis est rincée sous un filet d'eau du robinet (30 secondes), déshydratée dans un bain d'éthanol absolu (30 secondes) et plongée une seconde dans un bain de xylène pour faciliter le montage. Une goutte de milieu de montage est deposée sur une lamelle. Celle-ci est ensuite appliquée sur la lame. lo à 15- minutes sont nécessaires pour sécher l'ensemble (on peut accélérer le séchage en mettant la lame à l'étuve ou sous un sèche-cheveux). 10) Lecture du test Elle est réalisée au microscope optique ordinaire. Il est préférable de disposer d'objectifs et d'oculaires "grand-champ" et de qualité suffisante pour procurer une mise au point parfaite sur l'ensemble du champ. Le grandissement utilisé est variable avec le nombre de basophiles. En général de 400 , il peut être porté à 1000 (immersion) en cas de grande richesse en basophiles,ou au contraire à 250 si l'observateur est habitué. Les basophiles sont reconnus grâce à leur coloration foncée par rapport aux autres cellules (essentiellement lymphocytes et monocytes) et surtout à la teinte violette parfois rouge différente de la coloration bleue (claire ou foncée) des autres cellules. Les basophiles sont comptés sur chacun des puits; Dans le grande majorité des cas, vingt champs microscopiques sont suffisants (dix champs au hasard dans un diamètre vertical et dix champs au hasard dans un diamètre horizontal). L'important est, bien entendu, qu'un même nombre de champs soit examiné sur chacun des puits. En ajoutant les nombres de basophiles trouvés dans les puits identiques A et B, on obtient T = nombre de basophiles sans antigène Ag (1, 2, 3 ou 4) = nombre de basophiles avec antigène. On détermine l'index de dêgranulation (I.D.J pour chaque dilution d'antigène par la relation suivante I.D % = T-Ag x 100 T Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite : elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente Addition. REVENDICATIONS 10) Réactif de fixation et de coloration rapides1 simultanées, nécessaire à la mise en oeuvre du procédé de diagnostic selon la Revendication 3 ou la Revendication 4 du Brevet principal, caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0î2 à 0î8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % Glutaraldéhyde 1,5 à 2,5 % Formaldéhyde à 30 % 270 à 330 ml Méthanol 270 8330 ml Ethanol 270 à 330 ml Eau q.s.p. 1000 ml 2") Réactif de fixation et de coloration rapides, simultanées, nécessaire à la mise en oeuvre du procédé selon la Revendication 3 ou la Revendication 4 du Brevet principal, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de glutaraldéhyde et contient comme agent de fixation le méthanol éventuellement associé à du formaldéhyde et/ou à de l'éthanol. 30) Réactif selon la Revendication 2, caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à 10 % Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % Méthanol 300 ml + 10 % Formaldéhyde à 30 % 300 ml + 10 % Ethanol 300 ml t 10 % Eau q.s.p. 1000 ml 4 ) Réactif selon la Revendication 2, caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à lo % Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % Méthanol 830 à 990 ml Eau q.s.p. 1000 ml 50) Réactif de fixation et de coloration rapides, simultanées, nécessaire à la mise en oeuvre du procédé de diagnostic selon la Revendication 3 ou la Revendication 4 du Brevet principal, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de glutaraldéhyde, de formaldéhyde et d'éthanol et contient comme agent de fixation du propylèneglycol associé à du méthano 1. 60) Réactif selon la Revendication 5, caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante Bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue 0,2 à 0,8 % Sulfate d'aluminium 3 à lo Halogénure de cétylpyridinium 0,3 à 0,8 % Propylèneglycol 250 ml à 600 ml + 10 % Méthanol 200 ml à 750 ml + 10 % Eau q.s.p. 1000 ml 70) Réactif selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'halogénure de cétylpyridinium mis en oeuvre est le chlorure ou le bromure de cétylpyridinium. 80) Tampon Hépès, non destructeur à l'égard des cellules basophiles, nécessaire à la mise en oeuvre du procédé de diagnostic selon la Revendication 3 ou la Revendication 4 du Brevet principal, caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante Tampon Hépès, solution molaire 4 à 25 ml KCl lo % 0,932 mi Caca2 lo % 0,550 ml MgCl2 10 % 0,510 ml NaCl 9 %0 850 à 900 ml Eau q.s.p. 1000 ml pH 7,4 - 9 ) Procédé de préparation du réactif de diagnostic selon la Revendication 1 du Brevet principal, caractérisé en ce que le prélèvement d'un échantillon de sang chez un patient humain supposé atteint d'une parasitose ou d'une allergie, est effectué sur de l'acide éthylènediamine- tétraacétique sous la forme de l'un de ses sels, et de préférence sous la forme de son sel de potassium (EDTA après quoi le sang total ainsi prélevé, qui peut être conservé sous cette forme pendant 24 heures, est mélangé à un volume égal d'un tampon Hépès de composition appropriée, contenant de l'héparine à raison de 5 à 20 unités/ml,puis ou bien l'on injecte sous ce mélange un liquide de densité 1,079-1,085 dont l'osmola- rite est comprise entre 280 et 320 milli-osmoles, avantageusement constitué par un mélange de métrizoate de sodium et de "Ficoll" (Marque déposée par SIGMA) ou de "Percol" (Marque déposée par PHARMACIA), ou bien l'on transfère le mélange sang/tampon Hépès hépariné dans un tube rempli au préalable du liquide de densité 1,079-1 ,oes susdit,pour séparer les basophiles, puis l'on centrifuge pendant une durée et à une vitesse appropriées,pour obtenir un anneau contenant les basophiles et les lyitpho- cytes, que l'on prélève et qu'on lave soigneusement avec le tampon Hépès hépariné susdit,que l'on re jette, après centrifucation, pour ne conserver que le culot cellulaire qui,après remise en suspension,est prêt à etre déposé dans les puits d'une lame ou d'une botte de lecture de diagnostic. 100) Tampon Hépès non destructeur à l'égard des cellules basophiles,nécessaire à la mise en oeuvre du procédé de diagnostic selon la Revendication 9, caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante. Tampon Hépès, solution molaire 4 à 25 ml KC1 10 % 0,932 ml CaC12 10 % 0,550 ml MgC12 10 % 0,510 ml NaCl 9 %o 850 à 900 ml Héparine 10 unités/ml Eau q.s.p. 1000 ml pH 7,4 - 7,6 110) Procédé de préparation du réactif de diagnostic selon la Revendication 1 du Brevet principal, caractérisé en ce que le prélèvement d'un échantillon de sang chez un patient humain supposé atteint d'une parasitose bu d'une allergie1 est effectué sur de l'acide éthylènediamine-tétraacétique sous la forme de l'un de ses sels,et de préférence sous la forme de son sel de potassium (EDTA K3), puis en ce qu'on mélange le sang total ainsi prélevé,qui peut être conservé sous cette forme pendant 24 heures, à un volume égal d'un tampon Hépès de composition appropriée dépourvu de sels de calcium et de magnésium et d'heparine,en ce que ou bien l'on injecte sous ce mélange un liquide de densité l,079-l,085 dont-l'osmolarité est comprise entre 280 et 320 milli-osmoles,avantageusement constitué par un mélange de métrizoate de sodium et de "Ficoll" ou de "Percol",ou bien on transfère le mélange sang/tampon Hépès hépariné dans un tube repli au préalable du liquide de densité 1,079-1,C85 susdit,en ce qu'on centrifuge pendant une durée et à une vitesse appropriées,pour obtenir un anneau contenant les-basophiles et les lymphocytes,en ce que l'on prélève ledit anneau et on le lave avec le meme tampon Hépes que cidessus , que 1 'on rejette pour ne conserver que le culot cellulaire qui,après remise en suspension, est pret à être déposé dans les puits d'une lame ou d'une boîte de lecture du diagnostic qui contiennent le calcium et le magnésium sous la forme d'un de leurs sels appropriés, qui sont déposés en quantités prédéterminées. 120) Tampon Hépès non-destructeur à l'égard des cellules basophiles, nécessaire à la mise en oeuvre du procédé de diagnostic selon la Revendication 11, caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante Tampon Hépès, solution molaire 4 à 25 ml KCl 10 % 0,932 ml NaCl 9 %0 850 à 900 ml Eau q.s.p. 1000 ml pH 7,4 - 7,6 auquel cas le calcium et le magnésium sous la forme de leurs sels appropriés sont déposés en quantités prédéterminées sur les lames ou les bottes de lecture du diagnostic. 130) Kit ou ensemble prêt à l'emploi pour la réalisation du test de diagnostic des parasitoses et des allergies selon l'une quelconque des Revendications 3 ou 4 du Brevet principal, caractérisé en ce que les seringues à aiguille contenant chacune du liquide de densité 1,079- 1,085 sont remplacées par des récipients adaptés tels que des ampoules ou des tubes de centrifugation contenant ledit liquide de densité, ou/et en ce que le tampon Hépès contenu en quantités prédosées dans des ampoules ou des tubes appro priés comprend de 4 à 25 ml d'une solution molaire de tam pon Hépèsa 0,932 mi de KCl à 10 %, 8,550ml de CaCl2 à 10 %, 0,510 ml de MgCl2 à 10 %, de 850 à 900 ml de NaCl à 9 %o, en solution dans une quantité eau suffisante pour la por ter à 1000 ml, ou/et en ce que la solution de fixation et de coloration rapides, simultanées des préparations anti géniques (ou témoins) portées par les lames de lecture du diagnostic,contenue en quantités predosées dans des ampoules ou des tubes unitaires appropriés, présente la composition selon l'une quelconque des Revendications l à 7. 140) Kit ou ensemble prêt à l'emploi selon la Revendication 13, caractérisé en ce qu'il se compose d'un coffret qui comprend : - une pluralité de récipients adap tés tels que des ampoules ou des tubes contenant des quan tités prédosées d'un tampon Hépès approprié, et notamment du tampon Hepès selon la Revendication 8, - une pluralité d'ampoules, de tubes ou de seringues contenant des quantités prédosées d'un iatiie de densité 79-1,085, -une pluralité de lames ou de boites de lecture de diagnostic , présentant chacune un certain nambre de nib0, dont la majeure partie, à l'exception des Puits t é moins1 sont destinés à recevoir des quantités prédétermi nées variables d'un antigène spécifique d'une allergie ou d'une parasitose à diagnostiquer, - etune pluralité d'ampoules ou de tubes renfermant des quantités prédosées d'une solution de fixa tion et de coloration rapides, simultanées, selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7. 150) Kit ou ensemble prêt à l'emploi selon la Revendication 13, caractérisé en ce qu'il se compose de deux coffrets séparés dont l'un, qui est destiné à la sé paration des cellules basophiles, comprend : - une plura lité de récipients adaptés, tels que des ampoules ou des tubes contenant des quantités prédosées d'un tampon appro prié, et notamment de tampon Hépès selon la Revendication 8. - une pluralité d'ampoules ou de tubes contenant chacun des quantités prédosées de liquide de densité 1,079-1,085;et dont l'autre coffret comprend : - une pluralité de lames ou de boutes de lecture de diagnostic, présentant chacune un certain nombre de puits dunt la majeure partie, à l'exception des puits témoins, sont destinés à recevoir des quantités prédéterminées variables d'un antigène spécifique d'une allergie ou d'une parasitose à diagnostiquer, - et une pluralité d'ampoules ou de tubes renfermant des quantités préposées d'une solution de fixation et de coloration rapides, simultanées, du type des solutions selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, pour la réalisation du test de diagnostic proprement dit. 160) Kit ou ensemble prêt à l'emploi selon la Revendication 13, en un ou en deux coffrets, caractérisé en ce que le tampon Hépès contenu en quantités prédosées dans une pluralité de récipients adaptés tels que tubes ou ampoules, présente la composition selon la Revendication 10. 170) Kit ou ensemble prêt à l'emploi selon la Revendication 13, en un ou en deux coffrets,caractérisé en ce que le tampon Hépès contenu en quantités prédosées dans une pluralité de récipients adaptés tels que tubes ou ampoules, présente la composition selon la Revendication 12 et en ce que les lames ou les boîtes de lecture de diagnostic comportent,dans chacun de leurs puits destinés a recevoir de l'antigene,une quantité predéterminee de calcium et de magnésium sous la forme de leurs sels et notamment de leuls chlorures. 180) Kit ou ensemble prêt à l'emploi selon la Revendication 17, caractérisé en ce que le calcium est présent sur les lames ou es boites de lecture du diagnostic à raison d'environ 1 mmole/litre, et le magnésium est présent à raison d'environ 1 mmole/litre.