Brevet FR2479262A1 — publié le 19811002

Procédé et réactif de détermination de l'endotoxine à l'aide d'un lysat d'amibocytes de limule La présente invention concerne un procédé amélioré de détermination de la présence d'endotoxines à l'aide d'un lysat de limule, ainsi que des réactifs améliorés à base d'un tel lysat. L'hémolymphe du limule ou Limulus Polyphemus contient des amibocytes. La lyse de ces amibocytes libère une substance qui réagit avec l'endotoxine-en formant un gel. Cette réaction entre le lysat d'amibocytes de limule (qui sera parfois désigné ci-après par les initiales "LAL" ou par le mot "lysat") et l'endotoxine a été utilisée comme base pour des procédés de détection et/ou de détermination de l'endotoxine dans divers fluides d'intérêt pharmaceutique ]5 et/ou médical. Cependant, quand on utilise cet essai pour déterminer la présence d'endotoxines dans certains produits tels que les émulsions de lipides, les solutions de sels et les produits à base de plasma sanguin, ces produits peuvent modifier la réactivité des endotoxines éventuellement présentes, en diminuant leur disponibilité pour réagir avec le lysat. Cette diminution de réactivité conduit à une détection incorrecte de l'endotoxine dans ces produits. L'un des objectifs de l'invention est de procurer un procédé LAL convenable pour détecter ou déterminer la présence d'endotoxine dans les produits qui tendent à intervenir dans la réaction entre l'endotoxine et le LAL. Conformément à l'invention, il est procuré une amélioration à un procédé d'essai in vitro permettant de déterminer la présence d'une endotoxine dans des conditions propres à déterminer la présence d'endotoxines, à l'aide du LALdans certains liquides qui interviennent dans la réaction entre les endotoxines éventuellement présentes et le LAL, en donnant ainsi une détermination incorrecte. Cette amélioration consiste à conduire ledit procédé en présence d'une quantité, propre à réduire ladite intervention, d'un agent, soluble dans l'eau, "de réduction d'interférence", pour réduire ladite intervention ou interférence, et d'une quantité suffisante d'un cation divalent pour vaincre la capacité de chélation de l'agent de réduction d'interférence. Les liquides utilisés dans la mise en oeuvre de la présente invention sont normalement administrés par voie parentérale et comprennent les émulsions de lipides pour injection intraveineuse, par exemple les émulsions aqueuses d'huile végétale, par exemple d'huile de soja, disponibles à des concentrations de 5 à 30 % en poids; les solutions de sels, par exemple les solutions de chlorure de sodium administrées par voie parentérale, y compris le chlorure de sodium pour injection USP (pharmacopée des Etats-Unis), le chlorure de sodium pour irrigation USP, le chlorure de sodium pour inhalation, et la solution lactée de Ringer; et les dérivés sanguins, par exemple la sérum-albumine normale, disponible à une concentration de 5 % à 25 % en poids/volume, la fraction protéinique du plasma et le facteur anti- hémophilique USP, l'immunoglobuline, l'immunoglobuline Rho(D), et la sérum-globuline "anti-humaine". Les "agents de réduction d'interférence" utilisables dans cette invention sont des polyélectrolytes dont le poids moléculaire moyen est au moins égal à 1.000, de préférence compris entre 1.600 et 200.000, ou mieux entre 1.600 et 50.000, et comportant une chaîne carbonée continue sensiblement linéaire dérivant de la polymérisation d'un groupement insaturé aliphatique. C'est ainsi que les poly- électrolytes de ce type sont des polymères éthyléniques comportant de nombreuses chaînes latérales réparties le long d'une chaîne moléculaire continue et sensiblement linéaire d'atomes de carbone. Les chaînes latérales peuvent être des radicaux hydrocarbonés, des fonctions acide carboxylique ou des dérivés de celles-ci, des radicaux aminoalkyle, des radicaux alcoxy ou d'autres radicaux organiques, le nombre de ces radicaux et les proportions relatives des radicaux hydrophiles et hydrophobes étant propres à donner un composé polymère soluble dans l'eau comportant un grand nombre de radicaux ionisables. L'expression "polymère soluble dans l'eau" telle qu'elle est utilisée ici comprend les polymères qui forment des mélanges homogènes avec l'eau, ainsi que les polymères difficilement solubles qui gonflent en présence d'eau et se dissolvent tout au moins dans une certaine mesure. Des polymères polyélectrolytiques convenables sont les polymères des dérivés de l'acide acrylique, par exemple l'acide acrylique lui-même, les sels de métaux alcalins, de sodium et de potassium par exemple, et les sels d'ammonium de l'acide acrylique, l'acrylamide, l'acrylonitrile, les N-alkylamides, les N-aminoalkylamides, et les N- alkylaminoalkylamides correspondants, les acrylates d'amino- alkyle, les méthacrylates d'aminoalkyle et les esters N- alkylamino-alkyliques des acides acryliques. Ces compositions polymères peuvent être sous forme d'homo- polymères ou de copolymères avec d'autres monomères copolymérisables tels que l'éthylène, le propylène, l'iso- butylène, le styrène, l'alpha-méthylstyrène, l'acétate de vinyle, le formiate de vinyle, les éthers alkyliques, l'acrylonitrile, le méthacrylonitrile, le chlorure de vinyle, le chlorure de vinylidène, les maléates d'alkyle et les fumarates d'alkyle, ainsi que d'autres monomères oléfiniques copolymérisables avec eux. Les radicaux alkyle susmentionnés contiennent de un à six atomes de carbone. Les copolymères de ce type, comportant au moins 20 moles pour cent, de préférence 50 moles pour cent ou mieux 80 moles pour cent des dérivés de l'acide acrylique, sont préférés, surtout lorsque le co-monomère est hydrophobe ou ne comporte pas de groupements ioniques. Les polymères de ce type peuvent être préparés directement par polymérisation ou copolymérisation de monomères appropriés, par exemple ceux qui contiennent un groupement hydrophile tels que les radicaux carboxyle. D'autres polymères polyélectrolytes peuvent être préparés par réactions ultérieures de polymères et de copolymères. Par exemple, les polymères contenant des groupements nitrile peuvent être hydrolysés pour former des polymères solubles dans l'eau qui contiennent des fonctions amide et carboxyle, ou bien être hydrogénés pour former des polymères contenant des fonctions amine. Lorsque de tels polymères ou copolymères sont hydrolysés, ils le sont dans une proportion de 25 % à 100 %, et de préférence dans une proportion d'au moins 80 % des groupements qui peuvent être hydrolysés. Les polymères préférés particuliers comprennent l'acide polyacrylique dont le poids moléculaire moyen est égal à 2000 environ; un copolymère de 75 moles pour cent d'acide acrylique et de 25 moles pour cent de sel de sodium d'acrylamide, ayant un poids moléculaire de 1600-; et un copolymère d'acrylonitrile hydrolysé à 50 moles pour cent environ aveu l'acide acrylique pour fonnr-un -copol-yrère d'acrylo- nitrile et d'acide acrylique. Lorsque de tels polyélectrolytes sont utilisés sous la forme acide, ils sont transformés en la forme saline pendant la méthode d'essai au LAL. Comme indiqué, t-'agent susmentionné de réduction d'interférence "chélate' habituellement les cations divalents. Aussi est-il nécessaire d'inclure un cation divalent pour diminuer ou surmonter la capacité de chélation- de l'agent de réduction d'interférence. Habituellement, il s'agit d'une quantité suffisante pour vaincre cette capacité, soit généralement d'environ 0,05 à 1,0 mole, de préférence de 0,1 à 0,5 mole, par mole de groupements carboxyle de l'agent de réduction d'interférence. Cela s'ajoute aux cations divalents éventuellement utilisés pour augmenter la sensibilité du lysat dont il sera question plus loin. Normalement, le cation divalent se combine à l'agent de réduction d'interférence. C'est ainsi que dans le cas d'un agent de réduction d'interférence constitué par un sel de métal alcalin, la combinaison avec le cation divalent forme un sel mixte, par exemple un sel de sodium et de calcium d'un copolymère comprenant environ 75 moles pour cent d'acide acrylique et environ 25 moles pour cent d'acrylamide, ayant un poids moléculaire de 1600. Conformément à la présente invention, il est procuré un réactif contenant du LAL et ayant une sensibilité appropriée, d'au moins 0,25 nanogramme par ml par rapport à la norme américaine EC-2 d'endotoxine, une quantité, propre à réduire l'interférence, de l'un des agents susmentionnés de réduction d'interférence, et une quantité suffisante d'un cation divalent pour vaincre la capacité de chélation de l'agent de réduction d'interférence. Ce réactif est de préférence lyophilisé. Le LAL peut être préparé selon le mode opératoire décrit dans le brevet britannique N 1.522.127 qui est incorporé ici à titre de référence. Par exemple, on recueille dans une solution saline d'anti-coagulant l'hémolymphe de spécimens sains de Limulus polyphemus, de la manière générale décrite par Levin et Bang -- "Clottable Protein in Limulus: Its Localization and Kinetics of Its Coagulation by Endotoxin", Thromb. Diath. Haemorrh 19: 186 - 197 (1968) --. On recueille les amibocytes et on les lave avec la solution saline d'anti- coagulant puis on centrifuge. t15 On met les amibocytes séparés en suspension dans de l'eau et on complète la rupture osmotique des cellules par expositions multiples à une agitation mécanique. On sépare les débris cellulaires du lysat au moyen d'une centrifugeuse et on rassemble les fractions de lysat puis on les entrepose à 0-4 C. On ajuste la sensibilité du lysat vis-à-vis de l'endotoxine au niveau de sensibilité désiré, par dilution ou par mélange avec un autre lot de lysat de sensibilité différente. On tamponne généralement la solution à un pH compris entre 6,5 et 7,5 au moyen d'un tampon convenable, par exemple la trométhamine [tris-(hydroxyméthyl)amino- méthane] et le chlorhydrate de trométhamine. On répartit la solution de lysat ainsi tamponnée, préparée comme décrite ci-dessus, dans plusieurs fioles à sérum, contenant par exemple 1,2 ou 5, 2 ml de la solution, et on lyophilise chaque fraction de solution. Apres lyophilisation, on ferme hermétiquement les fioles et on les réfrigère. Le lysat lyophilisé prend la forme d'une poudre blanche ou d'une pastille blanche et friable. On augmente la sensibilité du lysat vis-à-vis de l'endotoxine en ajoutant de faibles concentrations de cations divalents et monovalents. Les ions calcium sont les ions divalents préférés, mais on peut utiliser d'autres ions alcalino-terreux tels que les ions magnésium ou d'autres ions divalents. Les ions sodium sont les ions monovalents préférés, mais on peut utiliser d'autres ions monovalents, notamment les ions de métaux alcalins tels que les ions lithium. Les chlorures (CaCl2, NaCl, etc.) sont des sources commodes de ces ions ajoutés, mais on peut utiliser d'autres sels. On ajoute de préférence ces électrolytes en quantités propres à augmenter la sensibilité vis-à-vis des endotoxines, par exemple des quantités telles que, lorsqu'on reconstitue le lysat lyophilisé, la concentration des cations divalents (Ca2+ par exemple) sera comprise entre 0,0001 et 0,1 mole par litre, et la concentration en cations monovalents (Na par exemple) sera comprise entre 0,001 et 0,1 mole par litre. Toutes les opérations décrites ci-dessus sont effectuées dans des conditions propres à garantir que le produit final sera stérile et dépourvu d'endotoxine. Les méthodes propres à garantir l'absence d'endotoxines sont connues dans la technique. Par exemple, on peut débarrasser des endotoxines les additifs minéraux (CaCl2, NaCl) en chauffant les sels secs à 2500C pendant au moins 120 minuLte. Les additifs organiques, à cause de leurspoints de fusion par exemple, doivent d'ordinaire être dissous, et il faut mettre la solution en autoclave à 1210C pendant 60 minutes ou davantage pour détruire les endotoxines éventuellement, présentes. Une description générale du mode opératoire de détermination des endotoxines peut être trouvée dans le brevet britannique susmentionné. On reconstitue habituellement le lysat lyophilisé avec une quantité suffisante d'eau stérile et dépourvue de substances pyrétogènes. On le répartit en fractions aliquotes, de 0,1 ml par exemple, dans des tubes à essai, et on le mélange avec une quantité égale du liquide à soumettre à l'essai des endotoxines. La formation d'un gel indique la présence d'endotoxine. On met en oeuvre ce mode opératoire dans des conditions de détermination des endotoxines en utilisant une quantité suffisante de lysat, par exemple de 0,01 à 1 ml de lysat reconstitué d'activité appropriée, par exemple de 0,01 à 0,25 ng/ml de l'étalon américain EC-2 de l'endotoxine. De telles conditions comprennent des durées de réaction appropriées, par exemple de 10 minutes à 60 minutes, une température de réaction appropriée, de 360C à 400C par exemple, l'emploi d'un tampon, le "Tris HCl" par exemple, pour maintenir le pH entre 6,0 et 8,0 environ pendant la détermination. Conformément à la présente invention, l'agent de réduction d'interférence est présent pendant la réaction entre le lysat et l'endotoxine, de préférence pendant toute la réaction. Il est avantageux d'ajouter l'agent de réduction d'interférence au liquide à essayer avant le lysat, ou bien de l'incorporer dans le réactif.LAL avant lyophilisation. On l'utilise en quantités propres à réduire l'interférence, par exemple, dans le cas o on l'ajoute au lysat avant de l'essayer, on l'utilise dans une proportion de 0,05 90i en poids/volume à 3,0 % en poids/volume, de préférence de 0,4 % en poids/volume sur la base du volume total de l'échantillon d'essai et, dans le cas o on l'incorpore au réactif et on le lyophilise, on l'utilise dans une proportion d'environ 0,05 % en poids/volume à environ 3,0 % en poids/volume, de préférence de 0,4 % en poids/ volume, sur la base du volume de la solution de lysat. Les exemples suivants servent à illustrer l'invention. Toutes les parties sont exprimées en poids sauf indication contraire. EXEMPLES Toutes les opérations décrites sont mises en oeuvre dans des conditions propres à garantir que le produit final sera stérile et dépourvu d'endotoxine. EXEMPLE 1 On recueille l'hémolymphe de spécimens sains de Limulus polyphemus dans une solution saline d'anti-coagulant, de la manière générale décrite par Levin et Bang (1969 - voir ci-dessus). On recueille les amibocytes et on les lave avec la solution saline d'anticoagulant dans une centrifugeuse. On met les amibocytes séparés en suspension dans de l'eau et on complète la rupture osmotique des cellules par expositions multiples à une agitation mécanique. On sépare les débris cellulaires du lysat au moyen d'une centrifugeuse et on rassemble les fractions de lysat et on les entrepose à 0-4 C. On ajuste au niveau de sensibilité voulu la sensibilité du lysat vis-àvis de l'endotoxine. On tamponne la solution à un pH compris entre 6,5 et 7,5 au moyen de trométhamine [tris-(hydroxyméthyl)aminométhane] et de chlorhydrate de trométhamine, et on la rend 0,01 molaire dans le chlorure de calcium et 0,077 molaire dans le chlorure de sodium, tous les additifs ayant au préalable été débarrassés des endotoxines. On répartit ensuite le lysat tamponné (I) dans des fioles à sérum, contenant chacune 5,2 ml de la solution, puis on lyophilise chaque fraction de solution. Apres lyophilisation, on ferme hermétiquement les fioles et on les réfrigère. On prépare l'agent de réduction d'interférence (II) en ajoutant 5 ml d'eau stérile pour injection USP et mg de chaux à 5 ml d'une solution à 43 % en poids/volume de sel de sodium de copolymère d'acide polyacrylique et de polyacrylamide (75 moles pour cent de l'acide et 25 moles pour cent de l'acrylamide) dans de l'eau, P.M. 1.600. On met cette solution à l'autoclave pendant 30 minutes à 121 C pour la "dépyrogéner", puis on l'ajuste à pH 7,5 avec 0,2 ml de HCl 12N. On ajoute ensuite 4,0 ml de II à 200 ml de la solution tamponnée de lysat (I), préparée comme décrit ci- dessus, préalablement à la lyophilisation. On répartit ensuite la solution résultante de lysat réducteur d'interférence (III) dans des fioles à sérum contenant chacune 5,2 ml de la solution, et on lyophilise chaque fraction de solution. Après lyophilisation, on ferme hermétiquement les fioles et on les réfrigère. On a mis en oeuvre les opérations suivantes dans des conditions conçues pour assurer l'asepsie et l'absence -d'introduction étrangère d'endotoxine. On a préparé dès solutions d'endotoxine diluées en série à partir d'une endotoxine de E. coli 055:B5 dans chacune des solutions suivantes: eau stérile pour injection USP; émulsion de lipides à 20 % ("Intra Lipid" commercialisée par Cutter Labs); et fraction protéinique de plasma (commercialisée par Cutter Labs). On a ensuite essayé ces échantillons d'endotoxine dilués en série, d'une part avec le lysat (I) et d'autre part avec le lysat réducteur d'interférence (III). On a procédé aux essais en reconstituant les lysats (I) et (III) avec 5,2 ml d'eau stérile pour injection USP, puis en agitant doucement pendant quelques secondes pour dissoudre complètement le résidu. On a réparti des fractions aliquotes de 0,1 ml des lysats reconstitués (I) et (III) dans des tubes à essai de mm x 75 mm; à chaque tube on a ajouté 0,1 ml des solutions d'endotoxine, diluées en série, appropriées, préparées ci-dessus. On a agité doucement les tubes pour mélanger puis on les a fait incuber sans les remuer à 370C pendant 60 minutes. Au bout de ce temps, on a déterminé un titre comme étant la plus faible concentration d'endotoxine qui donnait un résultat positif dans l'essai au LAL. On enregistrait un essai comme positif si le lysat formait un caillot qui conservait son intégrité quand on retournait le tube de 180 , et comme négatif si le gel se cassait avant le retournement total de 1800. Comme cela est coutumier dans la technique, les liquides qui n'interfèrent pas avec la détection des endotoxines par le LAL donnaient un titre qui ne différait de celui de l'eau stérile pour injection USP que d'une double dilution en plus ou en moins. Les résultats des essais concernant les concentrations d'endotoxine dans les solutions appropriées sont indiqués ci-dessous: TABLEAU I Solution essayée Titre obtenu avec Titre obtenu avec le le lysat (I) lysat réducteur d'interférence (III) Eau stérile pour 25 pg/ml 25 pg/ml injection USP Emulsion de >100 pg/ml 50 pg/ml lipides à 20 % Fraction > 100 pg/ml 50 pg/ml protéinique du plasma EXEMPLE 2 On a préparé le lysat (I) et l'agent de réduction d'interférence (II) comme déjà décrit dans l'Exemple 1 ci- dessus. On a préparé des solutions d'endotoxine diluées en série soit à partir de l'endotoxine de E. coli 055:B5 soit à partir de l'endotoxine de référence EC-2, dans une ou plusieurs des solutions suivantes: eau stérile pour injection USP; albumine à.5 % (Cutter Labs); NaCl USP à 0,9 % (Travenol); émulsion de lipides à 10 % (Cutter); et fraction protéinique du plasma (Cutter). On a prélevé un échantillon de chacune des solutions diluées en série appropriées, et on l'a essayé avec le lysat (I). Apres avoir prélevé ces échantillons, on a ajouté l'agent de réduction d'interférence (II) pour obtenir une concentration finale de 2 % en v/v (0,1 ml de II plus 5 ml d'échantillon). On a soigneusement mélangé les solutions puis on les a une fois encore essayées avec le lysat (I). Les résultats des essais concernant les concentrations d'endotoxine dans les solutions appropriées sont indiqués ci-dessous. TABLEAU II Endotoxine 055:B5 Endotoxine EC-2 Solution sans II avec 2 % II sans II avec 2 % II essayée Eau stérile 50 pg/ml 25 pg/ml 60 pg/ml 30 pg/ml pour injec- tion USP Emulsion de >100 pg/ml 25 pg/ml lipides à % Fraction >100 pg/ml 25 pg/ml > 250 pg/ml 30 pg/ml protéinique de plasma Albumine >100 pg/ml 25 pg/ml > 250 pg/ml 30 pg/ml à 5 % Solution > 250 pg/ml 60 pg/ml saline USP :: non essayée EXEMPLE 3 On a préparé le lysat (I) comme déjà décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. On a préparé un copolymère d'acide polyacrylique et d'acrylonitrile hydrolysé à 50 moles pour cent environ (IV) en ajoutant 15 ml d'eau et 50 ml d'acide sulfurique concentré à 2 g de polyacrylonitrile dans un bêcher de 100 ml. On a mélangé la solution pendant 20 heures à 25 C à l'aide d'un agitateur magnétique. On a ensuite fait précipiter le polymère résultant (IV) en ajoutant 100 ml d'éthanol. On a recueilli le solide par centrifugation et on l'a lavé quatre fois avec 200 ml d'éthanol. On a ensuite séché le polymère résultant (IV) à 60 C sous vide pendant 8 heures. On a préparé un agent réducteur d'interférence (V) en dissolvant 50 mg du polymère (IV) dans une solution de 10 ml d'eau et de 0,5 ml de soude 5N. A cette solution on a ajouté 25 mg de chaux, puis on a mis le mélange résultant en autoclave pendant 30 minutes à 121 C. On a refroidi la solution et on a ajusté le pH à 7,0 avec de l'acide chlorhydrique 12 N. On a préparé une endotoxine diluée en série à partir de l'endotoxine de référence EC-2 dans une solution saline normale USP à 0,9 % (Travenol) et dans de l'eau stérile pour injection USP. 'On a ensuite essayé les solutions d'endotoxine diluées en série appropriées avec le lysat (I) comme décrit dans l'Exemple 1. Après avoir essayé avec le lysat (I) les solutions d'endotoxine diluées en série, on a ajouté l'agent réducteur d'interférence (V) à une concentration finale de % en v/v (0,6 ml de V + 5 ml d'échantillons. On a soigneusement mélangé les solutions et on les a essayées une fois encore avec le lysat (I). Les résultats des essais sont indiqués ci-dessous. TABLEAU III Echantillon essayé Titre sans V Titre avec 10 Z de V Eau stérile pour 30 pg/ml 30 pg/ml injection USP Solution saline 500 pg/ml 125 pg/ml normale USP à 0,9 Z EXEMPLE 4 On a préparé un -lysat comme déjà décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. On a préparé un agent réducteur d'interférence (VI) en mélangeant 25 ml d'une solution aqueuse à 65 % d'acide polyacrylique (p.m. 2.000) avec 75 ml d'eau, 7,5 g de soude et 107 mg de chaux. On a mis cette solution en autoclave pendant 30 minutes à 121 C, puis on a ajusté le pH à 8,0 avec de l'acide chlorhydrique 5N. On a préparé une solution d'endotoxine diluée en série à partir d'endotoxine de référence EC-2 dans une solution saline USP normale à 0,9 % et dans de l'eau stérile pour injection USP. On a ensuite essayé les solutions d'endotoxine diluées en série appropriées avec le lysat (I) comme décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. Apres avoir essayé avec le lysat (I) les solutions d'endotoxine diluées en série, on a ajouté l'agent réducteur d'interférence (VI) à une concentration finale de 7 % et on a essayé une fois encore les solutions avec le lysat (I). Les résultats des essais sont indiqués ci-dessous: TABLEAU IV Echantillon essayé Titre sans VI Titre avec VI Eau stérile pour 30 pg/ml 30 pg/ml injection USP Solution saline 500 pg/ml 30 pg/ml normale USP à 0, 9 % EXEMPLE 5 On a préparé le lysat (I) comme déjà décrit dans l'Exemple 1. On a préparé un agent réducteur d'interférence (VII) en dissolvant 2,1 g d'un copolymère d'acide acrylique et d'acrylamide (p.m. 200.000) dans une solution de 19 ml d'eau pour injection et de 100 mg de chaux. On a mélangé cette solution jusqu'à ce que tous les solides soient dissous, puis on a ajusté le pH à 8,0 avec 0,7 ml d'acide chlorhydrique N. On a préparé une solution d'endotoxine diluée en série à partir d'endotoxine de référence EC-2 dans une solution saline normale USP à 0,9 % et dans de l'eau stérile pour injection USP. On a ensuite essayé les solutions d'endotoxine diluées en série appropriées avec le lysat (I) comme décrit dans l'Exemple 1. Après avoir essayé les solu- tions d'endotoxine diluées en série avec le lysat (I), on a ajouté l'agent réducteur d'interférence (VII) à une concentration finale de 4 % en v/v (0,2 ml de VII + 5 ml d'échantillon). On a soigneusement mélangé les solutions et on les a essayées une fois encore avec le lysat (I). Les résultats des essais sont indiqués ci-dessous: TABLEAU V Echantillon essayé Titre sans VII Titre avec VII Eau stérile pour 60 pg/ml 30 pg/ml injection USP Solution saline 500 pg/ml 30 pg/ml normale USP à 0,9 % REVENDICATIONS 1. Méthode d'essai in vitro permettant de déterminer l'endotoxine, dans des conditions propres à une telle détermination, à l'aide d'un lysat d'amibocytes de limule,dans certains liquides, comprenant les émulsions de lipides pour injection, les solutions de chlorure de sodium administrées par voie parentérale, la solution de Ringer lactée, la sérum- albumine normale, la fraction protéinique du plasma, et le facteur antihémophilique USP, qui interviennent dans ou interfèrent avec la réaction entre les endotoxines éventuellement présentes et ledit lysat, en donnant ainsi une détermination incorrecte, caractérisée en ce qu'elle consiste à opérer en présence de (1) une quantité réductrice d'interférence d'un agent réducteur d'interférence soluble dans l'eau formé par une chaîne polymère sensiblement linéaire, de façon à réduire ladite interférence, ledit agent ayant un poids moléculaire au moins égal à 1000 et pouvant être un copolymère d'acide acrylique et d'acrylamide, un copolymère d'acide acrylique et d'acrylonitrile, l'acide polyacrylique, un sel de métal alcalin de l'acide polyacrylique, un poly- acrylamide hydrolysé, un sel de métal alcalin de poly- acrylamide hydrolysé, un polyacrylonitrile hydrolysé ou un sel de métal alcalin du polyacrylonitrile, et (2) une quantité suffisante d'un cation divalent qui est l'ion calcium ou l'ion magnésium, de façon à vaincre la capacité de chélation dudit agent réducteur d'interférence. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent réducteur d'interférence est présent dans une proportion d'environ 0,05 % à environ 3 %, et le cation divalent est présent dans une proportion d'environ 0,05 à 1,0 mole par mole de groupements carboxyle dudit agent réducteur d'interférence. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent réducteur d'interférence est l'acide poly- acrylique, le sel de sodium d'un acide polyacrylique, un copolymère d'acide acrylique et d'acrylamide, un polyacryl- amide hydrolysé, le sel de sodium d'un polyacrylamide hydrolysé, un polyacrylonitrile hydrolysé ou le sel de sodium d'un polyacrylonitrile hydrolysé, et en ce que le cation divalent est l'ion calcium. 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit liquide est une émulsion de lipides pour injection. 5. Méthode selon la revendication- 3, caractérisée en ce que ledit liquide est une solution de chlorure de sodium administrée par voie parentérale. 6. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit liquide est de la sérum-albumine normale, une fraction protéinique de plasma ou un facteur anti- hémophilique. 7. Réactif d'essai in vitro permettant de déterminer l'endotoxine, comprenant un iysat d'amibocytes de limule dont la sensibilité est au moins égale à 0,25 nq/ml environ vis-à-vis de l'endotoxine EC-2 de référence des Etats- Unis d'Amérique, une quantité réductrice d'interférence d'un agent réducteur d'interférence soluble dans l'eau formé par une chaîne polymère sensiblement linéaire, dont le poids moléculaire est au moins égal à 1000, qui est un copolymère d'acide acrylique et d'acrylamide, un copolymère d'acide acrylique et d!acrylonitrile, un acide polyacrylique, un sel de métal alcalin ou d'ammonium d'un acide polyacrylique, un polyacrylamide hydrolysé, un sel de métal alcalin ou d'ammonium d'un polyacrylamide hydrolysé, unpolyacryloni- trile hydrolysé ou un sel de métal alcalin ou d'ammonium d'un polyacrylonitrile, et une quantité'suffisante d'un cation divalent qui est l'ion calcium ou l'ion magnésium. 8. Réactif selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agent réducteur d'interférence est présent dans une proportion d'environ 0,05 % à environ 3 %. 9. Réactif selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'agent réducteur d'interférence est un acide polyacrylique ou un sel de sodium de celui-ci, un copolymère d'acide acrylique et d'acrylamide, un polyacrylamide hydrolysé ou son sel de sodium, ou un polyacrylonitrile hydrolysé ou son sel de sodium.