Brevet FR2479850A1 — publié le 19811009

I La présente invention se rapporte à des enzymes de restriction à partir de bifidobactéries ainsi qu'au procédé de fabrication d'enzymes. Les enzymes de restriction sont ees endonucléases qui reconnaissent des séquences spécifiques de nucléotide sur un acide désoxyribonucléique (ADN) à deux branches et le scindent sur ou à proximité des séquences, pour donner des fragments uniques d' ADN. Depuis la découverte d'un enzyme de restriction dans 4aemoihilus influenzae, un certain nombre d'enzymes de restriction ont été isolés d'une large gamme de bactéries (Roberts, 1980). Du fait de leur propriété unique pour disséquer ou découper 1' ADN en des sites spécifiques, ces enzymes ont trouvé leur utilité dans une grande variété d'applications dans la recherche d' ADN, comprenant la cartographie physique des gènes, les analyses de séquences.d'ADN l'isolement des gènes et la technique d!ADN recombinant. Tandis que de nombreux enzymes de restriction de spécificité différente sont connus, il faut encore avoir de nouvelles spécificités pour une plus ample caractérisa- tion des molécules d'ADN et pour la construction de molécules d 'ADN. recombinant in vitro, et pour avoir de meilleures sources de certains des enzymes connus dans des buts pratiques. De nombreuses espèces de bactéries intestinales non pathogènes ont été examinées, à la recherche de la présence d'enzymes de restriction, et on a trouvé que Bifidobactéria ou les bifidobactéries produisaient une grande variété de ces enzymes avec des propriétés avanta- geuses pour un usage pratique. Il est facile de faire croltre les bifidobactéries à grande échelle, et les enzymes peuvent être purifiés directement du fait de leur stabilité remarquable et du faible niveau d'activitésde nucléase interférant dans les extraits bruts. Parmi les bifidobactéries déterminées pour les úL 't, 3 enzymes de restriction, 8 sur 15 souches de 9 espèces ont montré des activités d'enzyme. Ces souches sont indiquées ci-dessous: B. bifidua YIT4007 FERMP 5871 B. breve YIT4006 FERM-P 3906 B. infantis 659 ATCC25962 B. infantis S76e ATCC15702 B. longum E194b ATCC15707 B. thermophilum RU 326 ATCC258bb B. breve SI ATCC15700 B. breve S50 ATCC15698 La présente invention concerne un procédé de fabrication d'enzymes de restriction de spécificité différente à partir des bactéries intestinales non patho- gènes, les bifidobactéries. Ces enzymes ont été détectés en 8 souches de 5 espèces, et certains d'entre eux ont été partiellement purifiés et caractérisés. La culture d'une souche produisant un enzyme de restriction selon l'invention peut être effectuée de toute façon traditionnelle dans tout milieu traditionnel. Par conséquent, le procédé de culture et le milieu utilisés ici ne doivent pas être particulièrement limitées. Pour la préparation des enzymes de restriction à partir de bifidobactéries, on a fait croître des cellules à 37eC dans un milieu anaérobie approprié, Jusqu'à une phase stationnaire précoce. Cela signifie que la culture n'a pas à être surveillée avec soin. Les cellules ont été recueillies par centrifugation, et stockées à -20eC Jusqu'à leur utilisation. On décrira ci-après un procédé typique de purifica- tion des enzymes de restriction à partir de bifidobactéries. Des boulettes de cellulescongelées ont été dégelées et mises en suspension dans 4 volumes de 10 mM de K2HP04-KH2P04, pH 7,0, 7 mM de 2mercaptoéthanol, 1 mM de EDTA (tampon A) contenant 25 /a--g de phénylméthyl sulfonyl- fluorure (PMSF), 1 mN de NaN3 et 0,4 M de NaCl. La suspension des cellules a été traitée sur de la 247985O glace avec un lysozyme (100 pg/ml) pour les rendre sensibles à une sonication. La sonication fut effectuée jusqu'à ce que plus de 90% des cellules sadentinterrompues. On prit soin de maintenir la température en-dessous de IOC. Toutes les opérations subséquentes ont été effectuées en-dessous de 5 C. La suspension de cellules soniquées a été centrifu- gée à 10.000 g pendant 1 heure et le liquide surnageant a été décanté. Une solution à 10% (poids/volume) de sulfate de streptomycine a été lentement ajoutée jusqu'à une concentration finale de 1,2%. Après agitation pendant au moins 30 minutes, les acides nucléiques précipités ont été retirés par centrifugation lente. Le liquide surnageant sans ADN a été fractionné avec du sulfate d'ammonium, et la fraction contenant l'activité de l'enzyme de restriction a été encore purifiée par des combinaisons de filtration sur gel, échange d'ions et chromatographies d'affinité. Habituellement, deux ou trois étapes de chromatographie en colonne sont suffisantes pour obtenir un enzyme partiellement purifié essentielle- ment dépourvu de nucléases de contamination. Les enzymes de restriction purifiés à partir de bifidobactéries partagent certaines propriétés en commun. L'une des propriétés avantageuses est leur remarquable stabilité, et ainsi ces enzymes peuvent être purifiés sans perte sensible de l'activité en l'absence de glycérol ou d'albumine du sérum. Comme on l'a décrit ci-dessus, 8 sur 15 souches de 9 espèces examinées ont montré des activités d'enzymes de restriction, et ces enzymes ont été nommés selon la nomenclature de Smith et Nathans (1973) (tableau 1). Tous les enzymes indiqués au tableau 1 n'ont pas encore été purifiés et caractérisés, mais certaines propriétés générales ont été observées pour des enzymes partiellement purifiés. (1) Spécificité du substrat Des enzymes de restriction à partir de 8 souches de bifidobactéries ont été examinés pour leur spécificité du substrat avec des ADN standards. Les ADN utilisés étaient E. C1li phage A ADN, Eo coli phage 0X174 RFI ADN, virus adénovirus animal type 2 ADN et virus animal SV40 ADN. Les produits de digestion d'enzymes de ces ADN ont été analysés par électrophorèse sur du gel agarose et les motifs de digestion ont été photographiés sous la lumière ultraviolette. Comme le montre le tableau 2, la plupart de ces enzymes semblent être différents par leur spécifi- cité du substrat. (2) pH optimum Le pH optimum de ces enzymes est compris entre 6,8 et 8,0. (3) Température optimale La température optimale de ces enzymes est de l'ordre de 37C. (4) Inhibition, activation et stabilisation La présence de Mg2+ est essentielle, mais il ne faut ni adénosine triphosphate ni S-adénoxylméthyonine. Des cations monovalents ne sont pas requis et inhibent l'activité de l'enzyme à des concentrations supérieures. Tableau 1 Enzymes de restriction dans Bifidobacteria Souche Source Enzyme Bbi I B. bifidum YIT 4007 Bbi II B. breve S1 ATCC 15700 Bbe SI B. breve S50 ATCC 15698 Bbe AI B. breve YIT 4006 Bbe I Bbe II B. infantis b59 ATCC 25962 Bin I B. infantis S76e ATCC 15702 Bin SI B. longum E194b ATCC 15707 Blo I B. thermophilum ATCC 25866 Bth I TABLiAU 2 Enzymes de restriction dans Bifidobacteria Souche Source Enzyme S6quence I ombre de sites de scission B.bifidum B. breve S1 B. breve S50 B. breve B. infantis 659 B. infantis S76e B. longum E194b B. thermophilum YIT 4007 ATCC 15700 ATCC 15698 YIT 4006 ATCC 25962 ATCC 15702 ATCC 15707 ATCC 25866 Bbi I BbiII Bbe SI Bbe AI Bbe I Bin I Bin SI Blo I Bth I CTGCAG GRCGYC GGCGCC CCYRGG CTCGAG Lambda Ad2 ) 14 + + >14 + + I >18 + + + + + + I 6 SV40 o + o 0 x 1714 1 I UJ N Ul o La présente invention sera mieux illustrée par les exemples qui suivent qui ne doivent en aucun cas la limiter. Exemple 1 On a fait croître une souche de bifidobacterium thermophilum (ATCC 25866) sur un milieu VL-G modifié (Azuma & Suto, 1970) préparé selon la méthode modifiée de Hungate (Azuma & Suto, 1970; Hungate, 1969). Le milieu VL-G modifié contient dans I litre: 75 ml de r:P, 01% (solution de sel I), 75 ml de solution de sel II consistant en 0,6% de KH2P04, 1,2% de (NH4)2SO4, 1,2% de NaCl, 0,12% de MgS04.7H20 et 0,12% de CaC12.2h20, o, d m1 ce % résazuline à 0,1 ml, I g de Trypticase, 0,5 g d'extrait de levure, 0,2 g d'extrait de viande, 0,5 g de glucose, 5 ml de Na2CO3 à 8%, I ml de cystéine-HCl à 3% et de l'eau distillée, 790 ml. Pour la préparation à une petite échelle, le milieu VL-G modifié (6 x I litre) a été inoculé du 250ème de son volume de la culture pendant une nuit de B. thermo- philum et on a fait croître les cellules à 37?C pendant environ 15 heures Juscu'à une phase stationnaire précoce, on les a recueilltspar centrifugation et stockées à -20C. La production était de l'ordre de 25 g. L'extrait de celluleasans ADN a été préparé comme on l'a décrit ci-dessus. Du sulfate d'ammonium solide a été aJouté à l'extrait sans ADN sur une période de minutes pour donner 55% de saturation. Après agitation pendant 1 heure à 0 C, le précipité a été recueilli par centrifugation à 12.000 t/mn pendant 25 minutes, mis en suspension dans un volume minimum de tampon A, et dialysé avec trois changements du tampon. Le dialysat fut introduit sur une colonne en phosphocellulose Whatman P11 (1,5 x 25 cm), precédemment équilibréedu tampon A. Après lavage avec 90 ml du tampon, la colonne fut développée avec un gradient linéaire de 300 ml de 0-0,5 M NaCl dans le tampon A. L'activité enzymatique a été éllér- à 0,05-0,15 M de NaCl. Les fractions actives ont 'té rassemblées et dialysées avec trois changements de tampon Tris-HCl à mM, pH 7,4, 7 mM de 2-mercaptoéthanol, 1 mM de EDTA (tampon B). Le produit fut applique à une colonne Whatman DEAEcellulose DE52 (1,0 x 20 cm) précédemment équilibrée avec le tampon B. Après lavage avec 30 ml du tampon, la colonne fut éluée avec 150 ml de gradient linéaire de 0,05 M NaCl. Les fractions contenant l'activité enzyma- tique éluant à 0,25-0,35 M NaCl ont été combinées, dialy- sées avec un tampon B contenant 0,2 M de NaCl, et introduites dans une colonne d'héparine-Sépharose CL-6B (1,0 x 7 cm) précédemment équilibrée avec le même tampon. Après lavage, la colonne fut développée avec un gradient linéaire de 60 ml de NaCl dans le tampon B. L'activité enzymatique élua à 0,4-0,5 M NaCl. Les fractions actives ont été rassemblées, concentrées par dialyse avec un tampon B contenant 50% de glycérol et stockées à -20eC. Après incubation avec de l'enzyme en excès pendant une période prolongée, le produit digéré de BthI de A ADN a donné des bandes nettes, sans souillure, sur du gel agarose. Comme cela est indiqué au tableau 2, SV40 ADN n'est pas scindé par BthI. En incubant de l'ADN SV40 super-hélicoldal avec de l'enzyme en excès pendant une longue période, on ne peut voir aucune conversion importante de cet ADN pour la forme circulaire interrom- pue. Ces résultats indiquent-aucune contamination détectable de BthI partiellement purifié avec des nucléases non spécifiques. Une comparaison des produits de scission obtenus avec plusieurs molécules d'ADN a montré que BthI était un isoschizomère de XhoI, connu comme reconnaissant la séquence de nucléotide 5'-CTCGAG-3'. ExemDle 2 On a fait croltre B. breve YIT4006 comme on l'a décrit pour B. thermonhilum. Le rendement était de l'ordre de 35- à partir d'une culture de b litres. L'extrait sans ADN a été préparé comme pour BthI, et fractionné avec du sulfate d'ammonium. La plupart de l'activité enzymatique fut trouvée dans une coupe à 40-bO% et mise en suspension dans le tampon A contenant 0,1 M de NaCl. Après dialyse avec le même tampon, le dialysat fut appliqué sur une colonne en phosphocellulose P-11 de whatman (1,5 x 35 cm), précédemment équilibrée avec le tampon A contenant 0,1 M de NaCl. La colonne fut rincée et développée avec un gradient linénaire de 450 ml de 0,1-0,6 M NaCl dans le tampon A. L'activité enzymatique éluant à 0,25-0, 35 M NaCl fut rassemblée et dialysée avec le tampon B. Une colonne en DEAE-cellulose DE52 de Whatman (1,0 x 15 cm) a été préparée et équilibrée avec le tampon B. Les fractions de phosphocellulose ont été introduites dans la colonne. Après lavage, la colonne a été éluée avec un gradient de 120 a1 de 0-0,5 M NaCl dans le tampon B. Les fractions actives éluant à 0, 20-0,25 M NaCI ont été combinées, dialysées au tampon B contenant 0,25 m de NaCl, appliquées sur une colonne d'héparine- Sépharose CL-6B (1,0 x 5 cm), précédemment équilibrée avec le même tampon. Après lavage, la colonne fut développée avec un gradient de 40 al de 0,25-0,75 NaCl. L'activité enzymatique fut récupérée en fractions à 0,4-0,5 M de NaCl. Ces fractions ont été rassemblées, concentrées par dialyse avec un tampon B contenant 50% de glycérol, et stockées à -20eC. L'enzyme partiellement purifié, BbeI s'est révélé être essentiellement dépourvu de nucléases non spécifiques contaminants, parce qu'après incubation prolongée avec de l'enzyme en excès, le produit digéré de BbeI de 3 ADN a donné le motif de fragments ne montrant pas d'élargisse- ment de bande sur du gel agarose, et seule une trace de SV40 ADN non-substrat a été convertie de la forme super- helicoidale à la forme relaxée. BbeI scinde plusieurs ADN standards comme cela est indiqué sur le tableau 2. En se basant sur ces motifs de scission, on peut en déduire que la séquence de reconnaissance pour BbeI est probablement un hexanucléotide palindromique GGCGCC. Comme cet enzyme présente une nouvelle spécificité de séquence, il doit être particuliè- rement valable dans la recherche de l'ADN. Exemple On a fait croîtreB. bifidum YIT4007 dans un milieu de VL-G modifié comme décrit pour B.thermophilum. Le rendement était de l'ordre de 25 g à partir de 6 litres de culture. L'extrait dépourvu d'ADN, a été préparé comme décrit ci-dessus, et on a ajouté du sulfate d'ammonium solide pour obtenir 65%, de saturation. Le précipité a été recueilli par centrifugation, dissous dans 100 mM de K2HP04-KH2POZL, pH 7,4, 7 mM de 2-mercaptoéthanol, 1 mM de EDTA (tampon C), et a été dialysé avec le tampon. Une colonne en phosphocellulose P-11 Whatman (1,5 x 35 cm) a été préparée et équilibrée avec le tampon C, et le dialysat a été appliqué à la colonne. Après lavage, la colonne a été éluée avec un gradient de 450 ml de 0-0,7 M NaCl dans le tampon C. Au moins deux activités enzymatiques ont été résolues, et appelées BbiI et BbiII, respectivement. BbiI s'écoula à travers la colonne tandis que]biII élua à 0,1-0,2 M NaCl. f On a recueilli les écoulements et les produits de lavage contenant BbiI, que l'on a précipitésen ajoutant du sulflte d'ammonium pour donner 60% de saturation, et on l'a mis en suspension dans un volume minimul de tampon B contenant 0,1M14 de NaCI. On introduisit dans une colonne -ô cde Séphadex G-200 (2,5 x 55 c), précédemment équilibrée avec le tampon ci- dessus, et on fit fonctionner la colonne avec le tampon B contenant 0,1 - de NaCl. L'activité de Bbii élue à 0,6-0,8 volume du lit, fut recueillie et dialysée de façon exhaustive avec le tampon B. Une colonne en DEAEcellulose DE-52 de lhatman (1,0 x 10 cm) a été préparée et équilibrée avec le tampon B. Une fraction de B. BiiI Sephadex a été appliquée à la colonne. Après lavage, la colonne a été développée avec un gradient de 80 ml de 0-0,5 Li NaCl dans le tampon B. L'activité enzymatique élua à 0,250,30 M de NaCl, fut combinée et dialysée avec le tampon A contenant 0,2 MT de NaCl. Le dialysat fut introduit dans une colonne ' hydroxylapatite (1,0 x 10 cm), précédemment équilibrée avec le tampon A contenant 0,2 M de NaCl. La colonne fut lavée et éluée avec un gradient de 80 ml de 0,01- 0,5 M de phosphate de potassium dans le tampon A contenant 0,2 M de NaCl. BbiI élua à 0,1-0,25 M de phosphate de potassium. La spécificité de BbiI a été examinée avec plusieurs ADN standards et on l'a comparée aux motifs de digestion d'enzymes connus. On a observé la similitude de motifs de digestion de BbiI et PstI. Les motifs de fragments obtenus à partir de À ADN ou adénovirus type 2 ADN digéré avec BstI seul étaient identiques à ceux obtenus avec les mêmes ADN digérés avec BbiI suivi de PstI. Cela indique que BbiI est un isoschizomère de PstI, reconnaissant un hexanuclédide symétrique CTGCAG. BbiI est bien plus stable que PstI, et est avantageux dans un usage pratique. Des fractions actives de BbiII ont été combinées et dialysées avec le tampon A contenant 0,2 M de NaCl. On introduisit dans une colonne d'hydroxylapatite (1,0 x cm), précédemment équilibrée avec le tampon ci-dessus. Après lavage, la colonne a été développée avec un gradient de 80 ml de 0, 01-0,5 M de phosphate de potassium dans le tampon A contenant 0,2 M de NaCl. L'activité enzymatique élua à 0,05-0,1 M de phosphate de potassium. Des expériences préliminaires ont montré que BbiII est un isoschizomère de AcyI, reconnaissant unhlexanucléo- tide en rapport GRCGYC o R est une base purine et Y est une base de pyrimidine. AcyI est isolé à partir de Anabaena cvlindrica, souche d'algue bleue-verte. La culture de ce microsranisme est laborieuse et prend du temps. Ainsi, B. bifidum YIT4007 est une bien meilleure source pour cet enzyme que A. cylindrica. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre de la protection comme revendiquée. R E V E N D I C A T I 0 N Procédé de fabrication d'enzymes de restriction, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en culture une souche produisant des enzymes de restriction appartenant à Bifidobactérium choisie parmi le groupe consistant de: B. bifidum YIT4007 FEIU,-P 5871 B. breve YIT4006 FERM-P 3906 B. infantis 659 ATCC25962 B. infantis S76e ATCC15702 B. longum E194b ATCC15707 B. thermophilum RU 326 ATCC25866 B. breve S1 ATCC15700 B. breve S50 ATCC15698 et à récupérer l'enzyme de restriction des bactéries ainsi mises en culture.