Brevet FR2475226A1 — publié le 19810807

La présente invention concerne un réactif et une méthode pour le dosage quantitatif direct de l'ion chlorure dans le sérum sanguin. Il est depuis longtemps reconnu dans les sciences biologiques que l'ion chlorure constitue 1'anlon extra- cellulaire dominant dans des liquides biologiques. Le va-et- vient de l'ion chlorure à travers la membrane des érythrocytes est essentiel au transport des ions bicarbonate en réponse à des quantités variables d'anhydride carbonique. Des taux élevés de chlorure dans le sérum indiquent habituellement une déshydratation, une hyperventilation, un défaut cardiaque par congestion, une obstruction urinaire de type prostatique ou d'un autre type. De faibles taux de chlorure dans le sérum se rencontrent dans le cas de br lures étendues, de vomissements excessifs, d'acidose métabolique, de néphrite, d'obstruction intestinale, de crise addisonienne et de diarrhée. La technique la plus ancienne pour l'analyse de l'ion chlorure a été proposée par T. Volhard en 1974 (J. Prakt. Chem., 9, 217 th iocyanate mer cur ique. P.W. West et H. Coll ont rapporté dans Anal. Chem., 28 (1956) une méthode spectrophotométrique directe de dosage de l'ion chlorure dans la plage de 0,02-0,2 meq/1. B.Fingerhut a adopté plus tard cette méthode non mercurimétrique pour le dosage de l'ion chlorure dans le sérum, comme décrit dans Clin. Chem. Acta., 41, 247 (1972>. Etant donné que le réactif est en milieu perchlorique de forte acidité, la dialyse est utilisée pour prévenir les problèmes dus à la précipitation des protéines. Cette méthode n'a pas eu beaucoup de succès au laboratoire clinique, pourtant la méthode colorimétrique directe n'implique pas l'utilisation de mercure qui engendre des problèmes indésirables d'évacuation tels qu'on en rencontre dans d'autres méthodes coloni- métriques. Il y a lieu de remarquer également que dans 2. l'article original de West et Coli, aucune variation observable de l'absorption n'a été mentionnée au-dessous d'une concentration en acide de 2,ON. On vient de trouver qu'en utilisant un réactif dépourvu de mercure qui contient de perchlorate ferrique et de l'acide perchlorique en quantités diluées, et de préférence en présence d'un surfactant non ionique, on peut obtenir des résultats fiables dans le dosage quantitatif direct de l'ion chlorure. En conséquence, la mise en pratique de l'invention permet d'atteindre un ou plusieurs des objectifs suivants. L'un des buts de l'invention est de trouver une méthode et un réactif nouveaux pour le dosage quantitatif direct de l'ion chlorure dans le sérum. Un autre but de l'invention est de trouver un réactif pour le dosage de l'ion chlorure, qui utilise la réaction entre les ions chlorure et les ions ferriques. Un autre objectif de la présente invention est de trouver un réactif qui ne renferme pas de mercure. L'invention a en outre pour but de trouver une méthode qui utilise un réactif renfermant de l'acide perchlorique à des concen- trations inférieures à celles qui ont été utilisées jusqu'à présent. Un autre but de l'invention réside en outre dans une méthode de dosage de l'ion chlorure qui présente une grande plage de linéarité pour ce dosage. L'invention a aussi pour objectif de trouver une méthode de dosage de l'ion chlorure qui se soustrait à l'interférence de la part des composants présents dans le sérum sanguin. L'invention a enfin pour but de trouver une méthode bichromatique qui facilite le dosage de l'ion chlorure sur un analyseur spectrophotométrique centrifuge. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre. L'invention concerne dans son ensemble un réactif et une méthode pour le dosage quantitatif direct de l'ion chlorure dans le sérum. La méthode, utilisant le réactif, implique les étapes suivantes: 3. (a) mise en contact d'un échantillon de sérum avec le réactif pour former une solution, le réactif renfermant: (i) de l'acide perchlorique à une concentration d'environ 0,01N à environ 2,ON dans l'eau désionisée, (ii) du perchlorate ferrique à une concentration d'environ 0,01N à environ 1, ON dans l'eau désionisée, et (iii) une proportion d'environ 0,1 à environ 20 % en poids d'un surfactant non ionique capable de mini- miser la précipitation des protéines sans interférer avec l'absorption de la solution, (b) mesure de l'absorption de la solution après une période d'incubation, (c) comparaison de l'absorption de la solution avec celle que donnent des solutions contenant des quantités connues de chlorure, et (d) détermination de la quantité de chlorure dans le sérum. La figure unique du dessin annexé représente une série de semcstres meusurés chaque seconde sur un spectro- photomètre d'analyse à balayage après mélange de l'échantillon et du réactif. L'axe des abscisses indique la longueur d'onde en naiiometres et l'axe des ordonnées indique l'absorption. Comme le fait apparaître l'analyse, l'absorption due à la bilirubine présente un maximum à 450 nm qui, avec le temps, est déporté à 370 nm. La lecture d'absorption effectuée en 4 secondes à 420 nm est égale à la lecture d'absorption finale mesurée à 340 nm. On a trouvé que l'ion chlorure pouvait être dosé quantitativement dans le sérum sanguin par une méthode nouvelle qui utilise la réaction entre les ions chlorure et les ions ferriques en présence d'un surfactant non ionique. Comme indiqué ci-dessus, l'art antérieur a fait connaître l'utilisation de perchlorate ferrique et d'acide perchlorique à une concentration de 2N8,5N dans le dosage de petites quantités d'ion chlorure dans des échantillons aqueux. Les complexes chlorés de fer-(III) de couleur jaune présentent une bande intense d'absorption au voisinage de 340 nm tandis que 24752f6 4. le réactif contenant du perchlorate de- fer- donc à une mesure quantitative. Il est bien connu que l'acide perchlorique est un bon agent de précipitation des protéines du sérum. Toutefois, en vue de déterminer la concentration en ion chlorure dans le sérum, une opération de séparation des protéines du sérum telle que la méthode de dialyse décrite par Fingerhut doit être utilisée avant que la méthode ne puisse être adaptée à une opération automatique. L'urée a été utilisée pour empêcher la précipitation des protéines dans le milieu à l'acide perchlorique d'une réaction colorée différente, mais, on a observé que l'urée formait un produit coloré avec les ions Fe- (III) près de 340 nm et on n'a donc pas pu l'utiliser dans une réaction directe. Toutefois, en contraste avec les méthodes de l'art antérieur, on a constaté que le perchlorate ferrique et l'acide perchlorique pouvaient être utilisés à des concen- trations très diluées et que l'utilisation d'un surfactant éliminait une opération individuelle de séparation des protéines. A partir de là, on a découvert par une étude systé- matique de la relation de dépendance des complexes de chlorure de Pe-(III) avec le pH, que le chlorure ferrique se formait dans des conditions bien définies de faible acidité. Par exemple, on a observé que ce composé absorbait de façon linéaire à 340 nm dans toute la plage physiologique de chlorure dans le sérum et au-delà de cette plage, la courbe d'étalonnage obéissant donc à la loi de Beer. La méthode donne également une sensibilité qui est comparable à celle du réactif qui renferme, de l'acide perchlorique concentré. De plus, on a observé que dans la méthode de la présente invention, le complexe de chlorure se formait rapidement en moins d'une minute. Comme on l'a déjà indiqué, l'acide perchlorique et le perchlorate ferrique sont utilisés sous la forme de solutions diluées. La méthode de préparation du réactif est indiquée dans l'exemple 1. Toutefois, dans la pratique, on a constaté que l'on pouvait faire varier la composition du 5. réactif pour obtenir de bons résultats avec une sensibilité différente. En conséquence, on peut faire varier la compo- sition du réactif de l'invention de la manière indiquée ci- après: 1. Acide perchlorique (HCO104) - environ 0,01N à environ 2,01 2. Perchlorate ferrique, (Fe(ClO.)] sans couleur jaunne - 4 X J- - -_-- environ 0,01N à environ 1,0N 3. Ether polyoxyéthylénique de lauryle (ou surfactants non ioniques similaires) - environ 0,1 à environ 20 % en poids. N Dans la pratique réelle, impliquant l'utilisation de l'analyseur particulier mentionné ci-après, le réactif reconstitué contenait Fe(C104) 3 0,0378Ne 9,65 % d'éther polyoxyéthylénique de lauryle et HC104 0,246N. Comme indique, la méthode et le réactif de l'invention utilisent un surfactant non ionique pour supprimer et/ou pour eliniier la précipitation des protéines du sang. En contraste avec l'utilisation d'urée, le surfactant non ionique ne forme pas de produit coloré avec les ions Fe-(III) près de 340 nm et, en conséquence, il convient très bien à cet usage. bans la pratique, les seules conditions auxquelles le surfactant doit satisfaire sont les suivantes: 1il doit être non ionique, il doit interdire ou éliminer la précipitation des protéines du sang et, naturellement, en contraste avec l'urée, il ne doit pas interférer avec la mesure d'absorption. Des surfactants appréciés appartiennent à la famille des éthers polyoxyéthyléniques ayant 2 à motifs oxyde d'éthylène et dérivés d'alcools primaires et secondaires ayant 8 à 18 atomes de carbone. Un surfactant non ionique particulièrement apprécié qui convient bien à l'appli- cation de l'invention est l'éther polyoxyéthylénique de lauryle vendu par la firme Atlas Chemical Industries sous la marque déposée "Brij 35". D'autres surfactants non ioniques peuvent être utilisés, du moment qu'ils possèdent les propriétés mentionnées ci-dessus. Etant donné que le réactif utilisé dans la présente invention est un agent oxydant qui oxyde la bilirubine, il crée un problème d'interférence dynamique aux 6. échantillons de sérum. Une étude de l'interférence a démontré que la stratégie générale de préparation d'un blanc de sérum, de modification chimique ainsi que de séparation par extraction était ou bien trop compliquée ou bien trop longue. Une particularité importante de la méthode bichromatique de l'invention réside dans l'utilisation d'un filtre de 420 nm pour la conduite de l'essai dynamique à blanc. Par conséquent, l'invention couvre l'utilisation de filtres dans la plage de 380 à 450 nm aux fins de l'essai bichromatique à blanc. Le filtre de 420 nm est préférable à cause de son aptitude à éliminer simultanément les interférences de la part de la bilirubine et de l'hémoglobine. Le blanc de sérum varie avec le temps du fait que le pic d'absorption de la bilirubine se déplace lentement de 450 à 370 nm. Une absorption à blanc qui concorde avec celle qui est mesurée à 340 nm tant pour l'hémolyse statique que pour les interférences dynamiques de la bilirubine peut être obtenue à 420 nm dans l'intervalle de temps correct comme déterminé expérimentalement et comme représenté sur le dessin. Ce blanc du sérum est ensuite mémorisé et soustrait de la lecture finale faite à 340 nm. Cette méthode est simple, elle évite la conservation d'un blanc de sérum et elle élimine le problème de l'interférence de la part de la bilirubine. Bien que la méthode de l'invention puisse être utilisée avec tout instrument capable d'une mesure bichro- matique, elle est particulièrement utile avec l'analyseur de marque déposée "CentrifiChem" de la firme Union Carbide Corporation, qui utilise un champ de force centrifuge pour le mélange et le transfert des réactifs. Si une analyse est effectuée manuellement au moyen d'un spectrophotomètre thermostaté à 300C, il est préférable de prévoir une cellule d'écoulement. Lorsqu'on utilise l'analyseur "CentrifiChem", on introduit les échantillons et les réactifs à la pipette dans le disque de transfert avec un facteur de dilution de l'échantillon de 1:40. Les paramètres de l'analyseur peuvent être introduits à l'aide d'un cadran manuel ou bien l'ordinateur peut être programmé de manière à accomplir les étapes expérimentales automatiques. Le disque est placé à 7. l'intérieur de l'analyseur, les paramètres sont introduits et la source de force centrifuge est mise en marche. Après la sortie sur imprimante, l'analyseur est remis dans son état initial et la longueur d'onde est changée pour l'obtention des résultats finals. Les exemples suivants illustrent le mode le plus apprécié pour la mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE 1 Préparation du réactif On prépare une solution-mère de perchlorate ferrique (0,7N) en dissolvant 360 g de perchlorate ferrique, en cristaux sans couleur jaune, dans 1 litre d'eau désionisée. On filtre ensuite cette solution et on la titre au bichromate de potassium. On prépare une solution-mère d'acide perchlo- rique 5N en diluant 450 ml d'acide perchlorique à 70 % avec 1 litre d'eau désionisée et en titrant la solution à l'hydroxyde de sodium. Les solutions de travail sont préparées comme suit: on prépare la solution A à partir des solutions-mères de manière qu'elles contiennent du perchlorate ferrique 0,0756N et de l'acide perchlorique 0,492N. On prépare la solution B sous la forme d'une solution aqueuse contenant 19,3 % en volume d'éther polyoxyéthylénique de lauryle produit sous la marque déposée "Brij 35" par la firme Atlas Chemical Industries. Le surfactant est vendu sous la forme d'une solution à 30 % en poids, et on en effectue la dilution correcte. On mélange les solutions A et B dans un rapport en volume de 1:1 pour obtenir le réactif de travail. Méthode manuelle En pratique, on introduit à la pipette 2 ml de solution B dans un tube à essai de 13x100 mm, puis on ajoute au tube à l'aide d'une pipette 70 lil d'échantillon et on mélange le contenu. Un trouble de couleur blanche peut apparaître dans les échantillons de sérum, mais il disparaît après mélange. On ajoute ensuite 2 ml de solution A et on fait tourbillonner le tube pour assurer le mélange. 8. On prépare également une solution à blanc contenant les réactifs en introduisant dans un tube à essai de 13x100 mm 2 ml de solution B, 70 pl d'eau désionisée et 2 ml de réactif A, puis en agitant. Pour l'échantillon de sérum, on prépare également une solution de sérum à blanc en introduisant à la pipette 4 ml d'eau désionisée dans un tube à essai de 13x100 mm et en ajoutant 70 pl d'échantillon de sérum, puis en agitant. La procédure d'essai utilisant la méthode manuelle consiste à placer toutes les solutions dans un bain- marie ou sur un bloc chauffant à 301C et à les laisser incuber pendant 5 minutes. Les solutions sont ensuite introduites dans le spectrophotomètre et les lectures sont effectuées lorsque l'absorption est stable (environ 15 secondes). Méthode bichromatigue Tout instrument ayant la capacité de mesure bichromatique tel que l'analyseur 'CentrifiChem" peut être utilisé avec cette méthode. Conformément au mode d'utilisation de l'analyseur, des échantillons et des réactifs sont introduits à la pipette dans le disque de transfert avec un facteur de dilution des échantillons de 1:40. Les paramètres de l'analyseur peuvent être introduits à l'aide d'un cadran manuel ou bien l'ordinateur peut être programmé de manière à accomplir automatiquement les étapes expérimentales. Le disque est placé à l'intérieur de l'analyseur, les paramètres sont chargés et la source de force centrifuge est mise en marche. Après la sortie sur imprimante, l'analyseur est remis dans sa position initiale et la longueur d'onde est changée de manière à exprimer les résultats finals. EXEMPLES 2-9 En utilisant les réactifs préparés conformément à l'exemple 1, on analyse divers échantillons de sérum de sang humain pour doser l'ion chlorure sur l'analyseur "CentrifiChem". Le type d'échantillon de sérum et les résultats obtenus sont reproduits sur le tableau I suivant. 9. TABLEAU I Type d'échantillon (Cl-) déter- miné par Corning 920M (meq/l) (Cl-) trouvé (meq/l) Méthode utilisée 2 Sérum normal 3 Sérum ictérique 4 Sérum hémolysé Sérum trouble 6 Sérum témoin (additionné de 500 mg/dl d'hémoglobine) 7 Sérum témoin (additionné de 43,5 mg/dl de bilirubine) 8 Eau désionisée (40 meq/. de Br) 9 Sérum témoin (très trouble) Bichromatique Bichromatique Bichromatique Bichromatique 106 Bichromatique 104 Bichromatique 1 Bichromatique Bichromatique EXFMPLE 10 Dans cet exemple, on a effectué une comparaison des divers paramètres de l'invention en utilisant la méthode bichromatique et les paramètres de la méthode manuelle. On indique également les paramètres de l'essai à blanc. Les chiffres sont reproduits sur le tableau II ci-après. Ex. TABLEAU II Paramètres Bichromatique Blanc Manuelle 1. Linéarité 0-120 meq/1 0-120 meq/l 0-180 meq/l 2. Précision le jour même d'un jour à l'autre 3. Précision {récupération, %) 4. Stabilité 5. Corrélation avec la méthode coulométrique -103 % 1 an à 25 C 0,9743 0 968 0,9256 6. Interférences Br F Bilirubine Hémoglobine Turbidité Nulle jusqu'à 40 meq/l Nulle jusqu'à 40 meq/l Nulle Nulle jusqu'à 5 mg/dl Nulle jusqu'à 300 mg/dl Nulle jusqu'à 300 mg/dl Nulle jusqu'à un trouble Nulle jusqu'à un trouble intense intense Nulle jusqu'à 100 meq/l Nulle jusqu'à 40 meq/l Nulle jusqu'à 5 mg/dl r Nulle jusqu'à 500 mg/dl -. Nulle jusqu'à un trouble P intense M Méthode 1,54 % 0,8 % 1,7 % 1,4 % 1,3 % 1,8 % o1 o i1. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. 12. REVENDICATIONS 1. - Méthode de dosage quantitatif direct de l'ion chlorure dans du sérum sanguin, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: - (a) mise en contact d'un échantillon de sérum avec le réactif pour former une solution, le réactif renfermant (i) de l'acide perchlorique à une concentration d'environ 0,01N à environ -2,0N dans l'eau désionisée, (ii) du perchlorate ferrique à une concentration d'environ 0,01N à environ 1, ON dans l'eau désionisée, et (iii) une proportion d'environ 0,1 à environ 20 % en poids d'un surfactant non ionique en solution aqueuse, capable de minimiser la précipitation des protéines sans interférer avec l'absorption de la solution, (b) mesure de l'absorption de la solution après une période d'incubation, (c) comparaison de l'absorption de la solution avec celle que donnent des solutions contenant des quantités connues de chlorure, et (d) détermination de la quantité de chlorure dans le sérum. 2. - Méthode suivant la revendication 1, carac- térisée en ce que l'absorption de ladite solution est mesurée à 340 nm. 3. - Méthode suivant la revendication 1, carac- térisée en ce que l'interférence due à la présence de bilirubine dans des blancs de sérum est éliminée par un processus bichromatique qui implique la mesure à 420 nm du pic d'absorption de la bilirubine pendant sa dérive de 460 à 370 nm et par soustraction de cette mesure de la mesure finale d'absorption à 340 nm effectuée sur ledit échantillon de sérum sanguin. 4. - Méthode suivant la revendication 1, carac- térisée en ce que le surfactant non ionique est un éther polyoxyéthylénique de lauryle. 5. - Méthode suivant la revendication 3, carac- térisée en ce que le sérum sanguin est utilisé en une quantité de 70 microlitres. 13. 6. - Méthode suivant la revendication 5, carac- térisée en ce qu'on utilise un mélange de volumes égaux de solutions désionisèes contenant du perchlorate ferrique 0,0756N et de l'acide perchlorique 0,492N, en une quantité totale de 2 ml. 7. - Méthode suivant la revendication 6, carac- térisée en ce qu'on utilise une solution aqueuse contenant 19,3 % en poids d'éther polyoxyéthylénique de lauryle en une quantité de 2 ml. 8. - Réactif utile pour le dosage quantitatif direct de l'ion chlorure dans du sérum sanguin, caractérisé en ce qu'il comprend: (i) de l'acide perchlorique à une concentration d'environ 0,01 à environ 2,0 N dans l'eau désionisée, (ii) du perchlorate ferrique à une concentration d'environ 0,0i à environ 1,O0N dans l'eau désionisée, et (iii) une proportion d'environ 0,1 à environ 20 % en poids d'une solution aqueuse d'un surfactant non ionique, capable de minimiser la précipitation des protéines dudit sérum sanguin sans interférer avec la mesure d'absorption de l'ion chlorure.