Brevet FR2481704A1 — publié le 19811106

L'invention concerne un extrait obtenu à partir de plantes herbeuses appartenant au genre Epimedium sp. de la famille des Berberidacées, un procédé pour la préparation de cet extrait, un agent immunostimulant comprenant cet extrait comme composant actif, et une immunothérapie obtenue en utili- sant cet extrait. Comme plantes appartenant au genre Epimedium sp., on connaît l'Epimedium macranthum, var. M. et D., violaceum, Fr., l'Epimedium sagittatum Bak, l'Epimedium macranthum M. et D., l'Epimedium koreanum Nak, et autres. Ces plantes sont des herbes vivaces, croissant naturellement au Japon, en Chine, en Corée, etc. Les tiges, les feuilles et les racines sont appelées "Inyokaku" dans la médecine dhinoise. On fait infuser ces plan- tes et les utilise comme boisson médicinalecordiale ou tonique. Il n'ya pas de différences essentielles entre les effets des espèces de plantes appartenant au genre Epimédium sp.. On trouve dans le commerce une espèce unique ou un mélange de deux ou plusieurs espèces comme drogue brute,sous la désignation de "Barren-wort". Les composants de ce'Barrenwort ont été étudiés depuis longtemps, et il a été publié des rapports à leur sujet, par exemple par Akai et ai. (Yakugaku Zasshi, 55, 537, 705, 719, 788 et 1139 (1935)), Tomita et al. (Yakugaku Zasshi, 77, 114 et 212 (1957)), Maeda (Tokyo Iji Shinshi, 2133 et 2795 (1932)), Miyake (Okayama Igakukai Zasshi, 49, 44 et 2043 (1937)) et Hirashima et ai. (Clinical Report, 4, 139 (1970)). Mais les détails donnés manquent encore de clarté sur beaucoup de points. La demanderesse a fait des recherches sur ce Barren- wort, et a trouvé qu'un extrait, obtenu en soumettant à une extraction des plantes du genre Epimedium sp., au moyen d'un solvant composé d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau, ou au moyen d'eau, et en recueillant la fraction conte- nant des composés à haut poids moléculaire de l'extrait aqueux obtenu, fait preuve d'une excellente activité immuno-stimulante. La demande présente est basée sur les constatations faites. L'invention est décrite en détail ci-après. On soumet à extraction une plante appartenant au genre Epimedium sp. avec un solvant mixte, eau et solvant orga- nique miscible à l'eau, ou avec de l'eau, et on concentre l'extrait obtenu sous pression réduite. Comme solvant organique miscible à l'eau, on peut utiliser, par exemple, des alcools 248 1 704 inférieurs tels que les méthanol, éthanol et isopropanol, des cétones comme l'acétone et des éthers miscibles à l'eau, comme le dioxane et autres analogues. On peut aussi utiliser deux ou plusieurs de ces solvants miscibles à l'eau. De plus, on peut aussi utiliser, comme solvants pour l'extraction, des acides aliphatiques inférieurs tels que l'acide acétique ayant une concentration inférieure à 1 N, des amines inférieures miscibles à l'eau telles que l'éthanolamine à une concentration de 1 mol/e, et des hydroxydes alcalins facilement solubles dans l'eau tels que l'hydroxyde de sodium ayant une concentration inférieure 1 N. En ce qui concerne le rapport de mélange entre l'eau et le solvant organique. Il est préférable que la proportion de solvant organique soit inférieure à 50 % en volume. Si on con- sidère l'opération de concentration, il y a avantage à ce que l'opération qui tend à obtenir l'extrait aqueux recherché soit effectuée en utilisant un solvant mixte composé d'un solvant organique miscible à l'eau et de l'eau. Dans l'invention, les plantes que l'on trouve dans le commerce sous le nom de Barren-wortpeuvent être utilisées telles qu'elles se présentent, mais on a avantage à les utiliser après les avoir hachées finement. On décrira maintenant ci-après un mode de réalisation de l'opération d'extraction. On laisse reposer le Barren-wort dans le solvant d'extraction mentionné ci-dessus, à la température ambiante, pendant une durée pouvant aller de plusieurs heures à plusieurs dizaines d'heures, et on effectue ensuite une filtration de façon à obtenir un filtrat. Le résidu est soumis à une extraction et à une filtration, de la même manière, et on répète ces opé- rations. Tous les filtrats obtenus sont combinés et concentrés sous pression réduite, pour obtenir un extrait aqueux. L'extrac- tion est habituellement effectuée à la température ambiante, mais on peut l'effectuer aussi en chauffant pour raccourcir sa durée. Cette extraction à chaud est de préférence effectuée au bain-marie et sous une température du bain-marie de 35 à 550C, pendant 4 à 6 heures, en utilisant un condenseur à reflux. Elle peut être effectuée suivant la méthode de percolation. La quan- tité de solvant utilisée est de 5 à 15 fois celle de la plante appartenant au genre Epimedium sp.. Le résidu d'extraction est de préférence soumis à extraction, dans les mêmes conditions, trois fois ou plus, en utilisant le solvant dans la proportion de 0,4 à 0,6 fois en volume celle du solvant utilisé en premier. La séparation peut être effectuée par filtration surpapier ou par centrifugation ou autre, mais les résultats les meilleurs sont obtenus par filtration sous aspiration en utilisant l'aide de filtres que l'on peut trouver dans le commerce par exemple Radiolite (fourni par Showa Chemical Industry CO, Ltd, Japan), Celite (fourni par Wako Junyaku Industry Co., Ltd, Japan) ou Fibra Cel (fourni par Johns Manville Co. Ltd, - USA) etc. La réduction de la pression est assurée par des moyens courants, par exemple au moyen d'un aspirateur ou d'une pompe à vide ou autre. On utilise un vase d'extraction dont la surface intérieure est garnie de verre ou couverte d'émail, ou un vase d'extraction en acier inoxydable. L'extrait aqueux ainsi obtenu est ensuite dégraissé. L'opération de dégraissage est ordinairement réalisée en ajou- tant un ou plusieurs solvants organiques, choisis parmi les esters aliphatiques inférieurs tels que l'acétate d'éthyle, les hydrocarbures halogénés tels que le chloroforme, les éthers non- miscibles à l'eau tels que le diéthyléther, et les hydrocarbu- res aliphatiques tels que le n-hexane et autre, puis en agitant suffisamment le mélange et en recueillant la couche aqueuse seule. La couche aqueuse obtenue est à nouveau soumise à la même opération, puis chauffée au bain-marie pour éliminer le solvant organique qui serait resté, et enfin filtrée pour obte- nir l'extrait aqueux dégraissé. Il est recommandé que le solvant soit utilisé dans une proportion de 0,5 à 1,5 fois, en volume, celui de l'extrait aqueux pour chacune des opérations, et de répéter cette opération 3 à 5 fois. On peut adopter un mode opératoire o l'on procède d'abord au dégraissage, et ne procède qu'ensuite à l'opération d'extraction avec un solvant constitué d'un mélange d'eau et de solvant organique miscible à l'eau, ou avec de l'eau. On recueille ensuite, à partir de l'extrait aqueux dégraissé, la fraction contenant les composés à haut poids molé- culaire par précipitation fractionnée, dialyse ou d'une autre manière courante. Ces méthodes connues peuvent être utilisées en combinaison de façon à recueillir la fraction contenant les composés à haut poids moléculaire. La fraction collectée est 248 1 704 concentrée sous pression réduite de façon à obtenir l'extrait recherché Cette opération sera décrite en détail ci-après avec référence aux modes de réalisation spécifiques suivants. (1) On ajoute un solvant organique miscible à l'eau à l'extrait aqueux dégraissé, à la température ambiante, pour provoquer la précipitation. La proportion de solvant utilisé n'est pas infé- rieure à celle de l'extrait aqueux (V/V). Le précipité déposé est séparé par filtration et lavé avec un solvant organique mis- cible à l'eau dans la proportion de 5 à 20 fois (volume/poids) (V/P) celle du précipité. Le précipité lavé est versé dans de l'eau, dans la proportion de 20 à 50 fois (V/P) celle du préci- pité. Ensuite, on ajoute à la solution un solvant organique mis- cible à l'eau, dans la proportion de 3 fois ou plus (V/V) celle de la solution pour provoquer à nouveau une précipitation. Le précipité formé est recueilli par filtration et séché sous pres- sion réduite pour obtenir l'extrait recherché. Comme solvant organique miscible à l'eau, on peut utiliser, par exemple, des alcools inférieurs tels que le méthanol et l'éthanol, et des cétones telles que l'acétone et autres. On peut utiliser aussi un mélange de deux au moins de ces solvants organiques. L'ex- trait ainsi obtenu peut être purifié par extraction avec de l'eau. Plus spécialement, on mélange l'extrait avec de l'eau dans une proportion d'au moins 20 fois (V/P) celle de l'extrait, à la température ambiante, on agite suffisamment le mélange, et filtre ensuite. On concentre le filtrat jusqu'à siccité sous pression réduite pour obtenir l'extrait purifié. Pour cette opération, la séparation du précipité et du filtrat est effec- tuée par filtration sur papier ou par centrifugation. (2) L'extrait aqueux dégraissé est chargé dans une membrane semi- perméable, telle qu'un tube de cellulose pour dialyse, et la dialyse est effectuée en utilisant de l'eau distillée, ou l'eau du réseau urbain comme liquide extérieur, et on recueille le liquide interne (portion qui comprend la fraction contenant les composés à haut poids moléculaire). Les meilleurs résultats sont obtenus quand on agite le liquide externe avec un agita- teur, ou le maintient en circulation. Il y a avantage à pour- suivre la dialyse pendant environ une semaine si l'opération est effectuée en maintenant le liquide externe en circulation. En plus de la dialyser on peut aussi adopter la filtration sur gel, 248 1704 1'ultrafiltration, l'ultracentrifugation, et l'osmose inverse. On peut adopter une combinaison de deux, ou plus, de ces procé- dés. Au point de vue industriel, il est préférable que l'opéra- tion de dialyse soit effectuée en utilisant un appareil de dialyse comprenant une membrane à base de fibres creuses, par exemple le PVA Hollow Fiber Dialyzer (fourni par Kuraray Co. Ltd. Japan) le SF Filtration System (fourni par Kuraray Co Ltd, Japan) ou le Nitto Module (fourni par Nitto Denko Co. Ltd. Japan ou autre. Le traitement de déssalement peut être effectué comme traitement préliminaire avant l'opération de dialyse. Plus spécialement, on ajoute un sel soluble à l'eau connu à l'extrait aqueux dégraissé, à la concentration de saturation, récupère le précipité déposé, dissout dans l'eau, et procède ensuite à l'opération de dialyse. Comme sel que l'on peut uti- liser pour l'opération de dessalement on peut utiliser, par exemple, des chlorures tels que le chlorure de sodium, le chlorure de calcium et le chlorure d'aluminium, des nitrates tels que le nitrate de potassium, le nitrate de calcium et le nitrate d'aluminium, et des sulfates tels que le sulfate d'am- monium et le sulfate de magnésium, et autres. Le liquide interne ainsi obtenu (portion qui comprend la fraction contenant les composés à haut poids moléculaire) est concentré jusqu'à environ 1/10. On ajoute un solvant miscible à l'eau au liquide concentré dans la proportion de 3 fois au moins (V/V) celle de liquide concentré. Le précipité qui se forme est repris par filtration et séché sous pression réduite afin d'obtenir l'extrait recherché. Comme dans le cas du mode de réalisation décrit ci- dessus sous (1), l'extrait ainsi obtenu peut être purifié par extraction avec de l'eau. L'extrait ainsi obtenu suivant l'invention présente les caractéristiques suivantes. (1) Propriétés: (a) poudre brune (b) légèrement acide (pH environ 6,5) (quand on dissout mg de l'extrait dans 50 ml d'eau). (2) Solubilité: (a) soluble dans l'eau, (b) insoluble dans les méthanol, éthanol, acétone, acétate d'éthyle, diéthyléther,hexaic et chloroforme. (3) Réactions colorées: Positive pour, (a) la réaction anthrone-acide sulfurique, (b) la réaction de Bial, (c) la réaction de Molisch, et (d) la réaction au skatol, mais négative pour, (a) la réaction à la ninhydrine, (b) la réaction au 2,4-DNP, (c) la réaction de Seliwanoff et (d) la réaction au naphtorésorcinol. (4) Composition en saccharides: Quand on hydrolyse 20 mg de l'extrait en ajoutant de l'acide sulfurique (H2S04 lN, 5 ml) à la solution pour amener à l'unité la normalité de la solution, chauffant pendant 2 heu- res à 100 C, puis neutralisant en ajoutant de l'hydroxyde de baryum à la solution, et soumettant à une analyse chromatogra- phique sur papier, on détecte de l'arabinose et du galactose. (5) Absorption des rayons infra-rouges: Le spectre d'absorption des infrarouges est illustré dans la figure 1: KBr (cm 1) 3 400, 1 600, 1 400, 1 100 max (6) Absorption des rayons ultra-violets: Le spectre d'absorption des ultra-violets est donné par la figure 2: H20 2 \ (nm) 280, 325 max On a procédé aux essais suivants afin de confirmer l'utilité de l'extrait suivant l'invention. (1) Essai de fonctionnement comme macrophage phagocytique. C Phagocytose sur Staphylococcus aureus: Comme animal pour les expériences, on a utilisé la souris de souche ICR/JCL, femelle, de 7 à 10 semaines (pesant 27 + 3g). Deux jours après le traitement de l'animal par injec- tion péritonéale des souris du groupe traité avec l'échantillon et des souris du groupe témoin [traité avec une solution saline physiologique tamponnée avec un phosphate, et-ayant un pH de 7, (qu'on désignera ciaprès comme PBS)], et on a lavé avec le milieu RPMI-1640 [G.E Moore, Jal of Amer. Med. Assoc., 199 pages 519 à 524, (1967)] ( fourni par Nissui Seiyaku Co. Ltd, Japan) pour collecter des cellules de la cavité péritonéale (qué l'on désignera ci-après par PEC), et l'on a rassemblé respectivement les cellules collectées. On a ensuite lavé les PEC une fois avec le milieu RPMI-1640, puis les a mises en sus- pension dans un milieu RPMI-1640 avec 10 % FBS (milieu de cul- ture formé en ajoutant 10 % de sérum foetal de bovin (FBS) au milieu RPMI-1640). La suspension de cellules a été ajustée à 1 x 106 cellules par ml, en utilisant la solution de TUrk. On a intro- duit ensuite 2 ml de la suspension de PEC ainsi obtenue, dans un flacon TD-15 portant quatre lamelles de verre qui y sont fixées, et on a conduit une culture à 37 C pendant 60 minutes, dans un incubateur à 5 % de C02, et on a ajouté 0,1 ml d'une suspension de Staphylococcus aureus 209-P, ayant une concentra- tion de 4 x 108 cellules par ml, et l'on a continué la culture pendant 20 min, pour effectuer la phagocytose. La culture terminée, on a lavé le liquide de culture 3 fois avec la solu- tion de Hanks CJ. H. Hanks et R. E. Wallace, Proceeding of the Society for Experimental Biology and Medicine, 71, page 196 (1949)], (fournie par Nissui Seiyaklu CoLtdoJapan). Les lamel- les de verre portant le macrophage ont été fixées au méthanol et soumises à une coloration au Giemsa pour obtenir des échan- tillons permettant de compter le nombre des bactéries phagocy- tées, et on a compté 200 macrophages sur chaque lamelle de verre sous observation microscopique avec un objectif à immer- sion dans l'huile (grossissement 1000 à 2000) pour déterminer le rapport de phagocytose, et le nombre moyen des cellules phagocytées (nombre I de bactéries phagocytées). D'autre part, on a compté le nombre de bactéries phagocytées pour 100 macro- phages phagocytants, pour déterminer le nombre moyen de bacté- ries phagocytées (Nombre II de bactéries phagocytées). Nombre de macrophages phaqocytants Rapport de phagocytose= 200 (macrophages) x 100 ( Nombre I de bactéries phagocytées-= mbre de bactéries phaqocytées Nm r I dep35 ha o s 200 (macrophages) Nombre II de bactéries phagocytées- Nombre de bactéries phagocytées oIbrne100(macrophages phagocytants) Indite d'activation= chaque valeur () mesurée du gupe traité chaque valeur (1) mesurée du groupe non-trait Les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau I. 8 2481704 @ Essai de phagocytose sur Salmonella Enteritidis L'essai a été fait de la même manière qui est décrite sous si ce n'est que l'on a utilisé Salmonella enteritidis 116-45 comme bactérie d'essai, et que l'on a poursuivi la cul- ture pendant 60 min après addition de la suspension de bacté- ries. Le calcul a été fait de la même manière qui est décrite en O ci-dessus. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau I TABLEAU I: Résultat de l'essai de phagocytose par le macrophage ç I 1 - - Staphylococcus almonelcculas (uJaureus À Salmonella Souris Rort de phagocose (%) 28.670. 29(1 témoin re e bactéries pagocytées 1.249!.__ 14 0.486 0. - Essai 1 Nombre Il de bacteries phagocytees.r55033 1.7820.1- 1) Souris traitée RnDL2 rhagOCyO - 73 4.25 1 40. -2 141) avec l'échan-Nombre I de bactéries phagocvtées2.79-0.47 2.18; 0.93:-0.18 194 _ _ tillon N.ombre Il de bactéries phagocvtées4.99-0.57 1.42.3. 27 O-32 15 Souris R ort dehaoctose 24.8 2.1 1 0À - 1 témoin Nombre I de bactéries ohaocvtées 0.590. 20.0 -25 Esa2Nombre II de batéries 2ha9oc-tes2. 3 -07. 1 Essai 2ISouris traitée Rapport de ohagoc1ose (%) 33 8.9 -.34 - -8.+5:. 51.v avec l'échan-Nombre I de bactéries phaqocytées0.91 61.54 0.360.02 1. 1 0.9+ 0. 6- 0.26+1 44 tillon Nombre II de bactéries Phaqocytées2.59-0.39 1.08 1.57:0.06 1.05) Souris 342.5 1;5)3 1 témore I d e ' baàtéries' pha9ocyt6es 0.76:0.11 i, 0. 48-+0.06(l témoinj NombrIde bacteries phagocytees 1 t.7a+0!3 i i Essai 3Souris traitée Rapport de phagocytose (%)42T6 1.59 5.50-5.10 i2 avec l'échan-Nombre I de bactéries.phaoc0t5es 1.1 .68:O.06. 1.42 1t_ VionINôibre II de bactéries. phagocytées ___1.'0102 Notes: 1. Dans le tableau 1, chaque valeur indique une valeur moyenne + une valeur de déviation standard. 2. Chacune des valeurs entre parenthèses est un indice d'activation. 3. Dans l'essai I, l'extrait, préparé dans l'exemple 12 décrit ci-après, a fait l'objet d'une injection sous-cutanée sur le dos d'une souris à raison de 32,tg/O,l ml (PBS)/souris, chaque groupe étant constitué de 10 souris. 4. Dans l'essai 2, l'extrait, préparé suivant l'exemple 25 décrit ciaprès, a fait l'objet d'une injection sous-cutanée sur le dos d'une souris à raison de 48LLg/0,1 ml (PBS)/souris, chaque groupe étant constitué de 10 souris. 5. Dans l'essai 3, l'extrait préparé suivant l'exemple 36 décrit ci-après a fait l'objet d'une injection sous-cutanée sur le dos d'une souris, à raison de 40,5Lg/O,l ml (PBS)/souris, chaque groupe étant constitué de 10 souris. 9%) 4Q o 4.- ! I Essai de fonctionnement réticuloendothélial: L'échantillon a été administré par injection intra- péritonéale sur des souris mâles de sept semaines, provenant de la souche ICR/JCL (poids 30 + 2 g), tous les jours pendant 5 jours. Afin d'examiner les effets sur la phagocytose dans le système réticuloendothélial, on a injecté du carbone colloïdal (Pelikan acting carbon C11/1431a, fourni par GUnther Wagner Co Ltd, West Germania) dans les veines de la queue des différentes souris du groupe traité et du groupe témoin après qu'il se soit écoulé 24 heures après le traitement précédent, et on a examiné la purification du sang par les méthodes suivantes. Plus spécia- lement, on a dilué du carbone colloïdal avec une solution saline physiologique contenant 3 % de gélatine, de façon que la concen- tration en carbone soit réduite de moitié et on a injecté cette dilution dans la veine de la queue à raison de 10 ml/kg. En- suite, on a prélevé 0,010 ml de sang au moyen d'une micropipette traitée à l'héparine par le procédé de piqûre de l'orbite de l'oeil, et de l'a transféré immédiatement dans 2 ml de Na2C03 à 0,1 % pour dissoudre le sang. On a alors mesuré l'absorption à 650 nm au moyen du Hitach Double Beam Model 124 (fourni par Hitachi Co Ltd, Japan). L'indice phagocytique a été déterminé en injectant la dilution de carbone colloïdal dans la veine, en collectant le sang après écoulement de 2 min (t 1) et de 20 min (t2), et en réalisant le calcul basé sur les concentrations en carbone (C1 et C2: après écoulement de 2 min et de 20 min res- pectivement) dans les échantillons de sang, suivant les formules suivantes: _ (log C1 - (log C2-) Indice phagocytique: K2 t tl 2 t2 - t1 Durée nécessaire pour arriver à la moitié de la valeur dans le sang: T 1/2 = 0,301 K2 Les rsultats obtenus sont rsums dans le tableau 2. Les résultats obtenue sont résumés dans le tableau 2. tats de l'essai de fonctionnement réticuloendothélial j K20 T 1/2 (min.) I in 0.0137 0.0039 23.945 + 7.793 tée avec l'échantillon 0.0224 0.0096 16.281+7.762 Oin 0.0163-+ 0.0081 23.505 13.595 i,.____._ tée avec l'échantillon 0.0219 +0.0104 15.948+ 5.430 l in 0.0063 + 0.0009 48.550+ 6. 899 rin......, tée avec l'échantillon 0.0115 + 0.0020 27.120 5.111 in 0O. 0165 0.0064 21.377 10.619 tée avec l'échantillon 0.0223 + 0.0095 15.834 + 5.969 t6e a.e. chnio que chiffre indique une valeur moyenne + une valeur de déviation standard. ie groupe était constitué de 12 souris, et l'extrait obtenu de l'exemple 12 ! administré à raison de 65Jg/0,l ml (PBS)/souris/jour. e groupe était constitué de 12 souris et l'extrait obtenu de l'exemple 25 é administré à raison de 97,eg/0,1 ml (PBS)/souris/jour. e groupe était constitué de-6 souris et l'extrait obtenu de l'exemple 26 e administré à raison de 132/g/01,l ml (PBS)/souris/jour. e groupe était constitué de 22 souris et l'extrait de l'exemple 36 décrit istré à raison de 82J. g/0,l ml (PBS)/souris/jour. r r A) Di I. D _- D I j D r1 fi D -s. H H CI CD x PJ PJ _ CD X re Pi U1 oi* O J s I çF oiC CD r5 (D çt -. -os P Pi : oC Ln çt o a CD CD Oj 0 io PO rF CD llt CCD CDC I CD P' CD' C CD CD M CD' 0 >4 CD1 O o CD (D ta r-h oi I-J H M 1-I- i- rF Ma CD t- M o O CD CD çt C CD P' M çt (D ta, I. C o CD o CD o C CDCD P. M pu j.J. CD I-h o o rF PJ' ta D C Pi CP P (D H H I o0 Co il 1. ! I -1 w F- i LI tq r -w-! Exemple 3: visé et pro àOn ajoute 20 i d'éthanol à 50 % (V/y), à 2 kg d'Epi- marie pd 6 j herer, n uilisat unt vor eur, Fr provenant d'àune l, 12_ divisé, et procede à une extraction à chaud à 50 C, au bain- marie, pendant 6 heures, en utilisant un condenseur à reflux. Après extraction, on filtre le mélange pendant qu'il est encore chaud, et extrait à nouveau le résidu deux fois, de la même manière que ci-dessus, en utilisant chaque fois 16 1 d'acétate d'éthyle frais0 Le résidu restant après élimination de la por- tion soluble à l'acétate d'éthyle est séché à l'air, et on y ajoute 16 1 d'eau. On extrait ce mélange pendant 6 heures à 503C, au bain-marie, en utilisant un condenseur à reflux. En- suite on extrait et filtre à nouveau 2 fois le résidu, de la A - " 1+1. P -F4C-A1 AI= 248 1704 concentration de 8 x 104 cellules vivantes par mi. (c) Sur un microplateau du type à fond horizontal destiné à la culture de cellules [Modèle Núl480 portant 96 trous (creux), fourni par NUNC Co Ltd, SuèdeJ on dépose par trou 0,1 ml de suspension de PEC (3,2 x 104 cellules) et 0,1 ml de suspension de cellules (8 x 103 cellules) de BC 47 cultivées dans le tube à essai, et soumet à une culture à 370C pendant 24 heures dans un incubateur à 5 % de C02, et ensuite, on ajoute 0,05 Ci de thymidine C dans chaque trou et continue la culture dans les mêmes conditions pendant 24 heures. (d) La culture terminée, on lave chaque trou avec PBS, et recueille les cellules de BC-47 adhérant et croissant sur la face du fond du trou, sur du papier filtre, au moyen d'un appareil de récolte des cellules du type dit mini-mush (fourni par Dynaetech Co Ltd, England). La quantité de 14C capté par les cellules de BC-47 dans chaque trou [nombre d'ato- mes de 14C détruits par minute (dpm)3a été mesurée au moyen d'un compteur à scintillations dans un liquide (Modèle LSC-673 fourni par Aloka Co Ltd, Japan). Le taux d'inhibition de la propagation a été calculé par la formule suivante: - A - * xl100( %) o A indique la quantité (M) (dpm/trou) de 14C capté par les cellules BC-47 cultivées isolément, et B indique la quantité (M) (dpm/trou) de 14C captée par les cellules de BC-47 cultivées en commun avec les PEC de souris normales de souris immunisées, et de souris immunisées et traitées avec l'échantillon. L'indice d'activation a été calculé suivant la for- mule ci-dessous c D o C désigne le taux d'inhibition de la propagation (M) des souris immunisées et traitées avec l'échantillon et D signifie le rapport d'inhibition de la propagation (M) des souris seule- ment immunisées (l'échantillon n'a pas été administré). Les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau 3. TABLEAU 3: Augmentation de l'action d'immunité cellulaire I Quantité capt6e 14C (dmp) ILau dcl' inhlbiLionu de Ila propagation (%) d acdti tu d'activation I......., Cellules de BC-47 cultivées isolém. 30884.3 349.7 0 _ _ Essai 1 Souris normale 27365.3 926.3 11.39 _ Souris immunisée 22284.3 939.1 27.85 Souris irfmunisees et traitées avec l'echant llon 16862.8 725.8 45.40,1. 673 Cellules de BC-47 cultivées isolém. 11208.2 4.11.1 0. _ lSouris normale 9905.4 429 6 11.62 1 Essai 2"-'I Essi 2Souris"'immunisée !Essai 2souris immunisée6081.6 819.0 45.74 1.00 Souris immunisées et traitées avec 2920.3176. 1 1 échant-J 1lnn 2920.7 3 ].76.1. 73.95 16 -- 739 1.62 ICellules de BC-47 cultivées isolém.11208.2 411.1 0 _ I Souris normale 9905.4429.6.62 Essai 3 9905.4: 429.6 11.].62- Essai 3 _ EsI 3Souris immunisée 6649.83 819.0o 40.67 1.00 Sguris mrunisées et traitées avec 960.23107 64.67 1.59 1.-.s'Tiun 3960.2 3 10.7. 64.67 1 Notes: 1. Dans l'essai 1, on a fait une injection sous-cutanée de décrit plus loin, sur le dos de chaque souris, à raison groupe étant constitué de 10 souris. 2. Dans l'essai 2, on a fait une injection sous-cutanée de décrit plus loin, sur le dos de chaque souris, à raison groupe étant constitué de 10 souris. l'extrait préparé dans l'exemple 12 de 32 "g/0,1 ml (PBS)/souris, chaque l'extrait préparé dans l'exemple 25 de 32/ g/O,l ml (PBS)/souris, chaque 3. Dans l'essai 3, on a fait une injection sous-cutanée de l'extrait préparé dans l'exemple 36 décrit plus loin sur le dos de chaque souris, à raison de 40,5 ' g/O,l ml (PBS)/souris, chaque groupe étant constitué de 10 souris. I> IN or Co 24 81704 D'après les résultats indiqués ci-dessus, il a été confirmé que,grâce au traitement avec l'extrait suivant l'inven- tion, la propagation des cellules de BC-47 a été inhibée chez la souris, et que l'immunité cellulaire aux cellules de BC-47 peut être augmentée. (3) Essai de toxicité aigUe On a examiné la toxicité aigUe suivant la méthode Lichfield-Wilcoxon [J. Pharm. Exp. Ther., 96, 99 (19493 en utilisant des souris mâles de souche ICR/JCL. On a constaté que la valeur LD50 (mg/kg) de l'extrait préparé suivant les exem- ples 12 à 36 décrits plus loin est de 1990 à 2050. (injection intrapéritonéale). D'après les résultats des essais indiqués plus haut, on comprendra facilement que l'extrait suivant l'invention peut être efficacement utilisé pour prévenir et inhiber les désordres infectieux chez des patients dont l'immunoactivité est réduite, par exemple des patients agés ou des patients souffrants de cancers, quand on administre cet extrait en combinaison avec des agents carcinostatiques, ou pour remédier à des désordres infectieux dus à des bactéries, quand on l'administre en combi- naison avec des agents chimiothérapeutiques, ou l'extrait sui- vant l'invention peut être administré-à des patients chez qui -le fonctionnement du foie pour l'élimination des substances étrangères (des médicaments par exemple) est réduit, afin de remédier à la réduction de cette fonction. Les extraits suivant l'invention peuvent être adminis- trés à l'homme oralement, par injection (intraveineuse, sous- cutanée ou intramusculaire), ou de toute autre manière. Quand les extraits suivant l'invention sont utilisés sous la forme de préparations solides, pour l'administration orale, on pourra choisir la forme de comprimés, granulés, poudre, capsules ou autres. Les préparations pourront contenir des addi- tifs, par exemple un excipient tel qu'un saccharide ou une pré- paration à base de cellulose, un liant tel qu'une pâte d'amidon ou de méthylcellulose, une charge inerte, un désintégrateur ou autre, tous ces produits étant habituellement utilisés dans la - fabrication des préparations médicales. Si les extraits suivant l'invention sont utilisés sous la forme de préparations orales liquides, elles pourront se présenter sous une forme quelconque choisie parmi les préparations aqueuses à usage interne, suspen- sions, émulsions, sirops, etc., et en outre ces préparations pourront avoir la forme de produits secs que l'on devra dis- soudre avant usage. Quand les extraits suivant l'invention seront adminis- trés oralement à des adultes, ils pourront être employés à la dose de 3 à 20 mg/kg par jour. Naturellement, la dose peut ici être augmentée ou diminuée convenablement suivant les conditions des troubles, l'âge du patient, la forme de la préparation administrée, etc. Les extraits suivant l'invention pourront être injec- tés sous la forme de solutions aqueuses, de suspensions, ou d'émulsions huileuses ou aqueuses, mais habituellement les injec- tions sont préparées en dissolvant ou mettant en suspension l'extrait dans des milieux liquides aqueux tels que de l'eau stérile ou des solutions salines physiologiques. Si nécessaire, on pourra ajouter dans les injections des agents couramment utilisés pour la dissolution, des stabilisants, des conserva- teurs, des additifs permettant de préparer des solutions isoto- *niques, etc. Les préparations pour injection ainsi obtenues pour- ront être administrées par la voie intraveineuse, intramuscu- laire, sous-cutanée ou de toute autre manière appropriée. Quand les injections sont faites à des adultes par la voie parenté- rale, elles peuvent se monter à 0,1 à 5 mg/kg par jour. Naturel- lement ce taux de dosage peut être augmenté ou diminué suivant les conditions des troubles, l'âge du patient, la forme de la préparation administrée, et le mode d'administration. L'invention sera décrite ci-après en détail avec référence aux exemples qui suivent, qui ne peuvent être considé- rés en aucune façon comme représentant une limitation de l'in- vention. Exemple I On ajoute 40 1 d'éthanol à 50 % (V/V) à 5 kg d'Epime- dium Koreanum nak. obtenu en Corée, et qu'on trouve sous la désignation de Barren-wort, disponible dans le commerce, fine- ment divisé, et effectue une extraction à chaud à 50C pendant 6 heures, sur un bain-marie, en utilisant-un condenseur à reflux. Après extraction, on filtre le mélange pendant qu'il est encore chaud, et extrait le résidu 3 fois de la même manière que ci- dessus, en utilisant chaque fois 20 1 d'éthanol 50 % (V/V) frais. 248 1704 On combine tous les filtrats obtenus, et concentre ensuite à 450C, sous pression réduite, de façon à obtenir 30 1 d'un extrait aqueux. On charge cet extrait par un entonnoir séparé et y ajoute 20 1 d'acétate d'éthyle, puis agite suffisamment le mélange et reprend seulement la couche aqueuse. On extrait à nouveau la couche aqueuse, 3 fois, de la même manière que ci- dessus, en utilisant chaque fois 20 1 d'acétate d'éthyle frais. On concentre la couche aqueuse sous pression réduite, élimine l'acétate d'éthyle résiduel par distillation et filtre enfin le résidu pour obtenir 22,5 1 d'un extrait aqueux dégraissé. Exemple 2: On ajoute 20 1 d'eau à 2 kg d'Epimedium Koreanum nak. obtenu dans le commerce sous la désignation de\'Barren-wori et procède à une extraction à chaud à 50C, pendant 6 heures, au bain-marie, en utilisant un condenseur à reflux. Après extrac- tion, on filtre le mélange pendant que le mélange est encore chaud, et extrait à nouveau le résidu, 3 fois, de la même manière que ci-dessus, en utilisant chaque fois 10 1 d'eau. On combine tous les filtrats et concentre ensuite à 450C sous pres- sion réduite, de façon à obtenir 12 1 d'un extrait aqueux. Ensuite, on obtient 9 1 d'un extrait aqueux dégraissé à partir de l'extrait aqueux ainsi obtenu, en opérant de la m9me manière qui est décrite dans l'exemple 1. Exemple 3: On ajoute 20 1 d'éthanol à 50 % (V/V), à 2 kg d'Epi- medium macranthum, var. M. et D., violaceum, Fr provenant d'une culture japonaise, que l'on trouve dans le commerce sous la désignation de Barenwort, et laisse reposer le mélange pendant la nuit à la température ambiante. Ensuite on filtre le mélange, et extrait le résidu à nouveau, 3 fois, de la même manière que ci-dessus, en utilisant chaque fois 10 1 d'éthanol 50 % (V/V) frais. On combine tous les filtrats et concentre ensuite à 450C sous pression réduite, pour obtenir 12 l.d'extrait aqueux. On obtient ensuite 9 1 d'extrait aqueux dégraissé, à partir de l'extrait aqueux obtenu, en opérant de la même manière qui est décrite dans l'exemple 1. Exemple 4: On ajoute 20 1 d'eau à 2 kg d'Epimedium Macranthum, var. M et D, violaceum, FR, provenant d'une culture japonaise que l'on trouve dans le commerce comme Barren-wort, laisse 248 1704 reposer le mélange à la température ambiante toute une nuit, filtre, et extrait à nouveau 3 fois le résidu de la même manière que ci-dessus, en utilisant chaque fois 10 1 d'eau fraiche. On combine tous les filtrats et concentre à 450C de façon à obtenir 12 1 d'un extrait aqueux. On obtient ensuite 9 1 d'extrait aqueux dégraissé à partir de l'extrait aqueux obtenu en procédant de la même manière qui est décrite dans l'exemple 1. Exemple 5 On ajoute 16 1 d'acétate d'éthyle-à 2 kg d'Epimedium sagittatum, bak, provenant de cultures China Lueta, que l'on "/ trouve dans le commerce sous le nom de Barren-wort, finement divisé, et procède à une extraction à chaud à 500C, au bain- marie, pendant 6 heures, en utilisant un condenseur à reflux. Après extraction, on filtre le mélange pendant qu'il est encore chaud, et extrait à nouveau le résidu deux fois, de la même manière que ci-dessus, en utilisant chaque fois 16 1 d'acétate d'éthyle frais. Le résidu restant après élimination de la por- tion soluble à l'acétate d'éthyle est séché à l'air, et on y ajoute 16 1 d'eau. On extrait ce mélange pendant 6 heures à 500C, au bain-marie, en utilisant un condenseur à reflux. En- suite on extrait et filtre à nouveau 2 fois le résidu, de la même manière que ci-dessus, en utilisant chaque fois 16 1 d'eau fraiche. On combine les filtrats, concentre sous pression réduite à 451C et filtre de façon à obtenir 9 1 d'extrait aqueux. Exemples 6 à 11: On traite, de la même manière qui est décrite dans l'exemple 1, 2 kg de Barren-wort disponible dans le commerce, finement divisé, si ce n'est que l'on change les solvants d'extraction et de dégraissage comme il est indiqué ci-dessous. Les résultats obtenus sont aussi donnés ci-dessous Exemple Solvant d'extraction Solvant de Quantité No dégraissage d'extrait aqueux dégraissé (1) à______ - - -- - -- -- - - -- - -- -- -- - - _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ -- - -- - -- - -- - - -- 6 méthanol à 50 % (V/V) acétate d'éthyle 9 7 acétone à 50 % (V/V) acétate d'éthyle 9 8 dioxane à 50 % (V/V) acétate d'éthyle 9 9 éthanol à 50 % (V/V) chloroforme 9 éthanol à 50 % (V/V) diéthyle éther 9 11 éthanol à 50 % (V/V) n-hexane 9 24 8 17 04 Exemple 12 on ajoute 13,5 1 d'éthanol à 4,5 1 d'extrait aqueux dégraissé obtenu dans l'exemple 1, agite le mélange, laisse reposer pendant la nuit, et récupère le précipité formé par filtration. On lave le précipité avec 100 mil d'éthanol, et le dissout dans 400 mil d'eau, puis ajoute 1,6 1 d'éthanol à la solution et récupère le précipité déposé par filtration. orn sèche le précipité recueilli sous pression réduite, de façon à obtenir 10 g de l'extrait recherché. On procède ensuite à une extraction sur cet extrait, avec 500 ml d'eau et filtre, con-- centre le f iltrat et sèche sous pression réduite de façon a obtenir 8 g d'extrait purifié sous forme de poudre brune. Exemples 13 à 22 Les extraits suivant l'invention, et les extraits purifiés suivant l'invention ont été obtenus à partir de 4,5 1 de chacun des extraits aqueux dégraissés obtenus dans les exemples 2 à 11, de la m9me manière qui est décrite dans l'exem- ple 12. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau ci-dessous; Exemple Extrait aqueux Quantité Quantité No dégraissé utilisé d'extrait d'extrait - - recherché uifé' 13 extrait aqueux obtenu 17,5 14,0 dans l'exemple 2 14 extrait aqueux obtenu 8,8 7,0 dans l'exemple 3 extrait aqueux obtenu 10,5 7,5 dans l'exemple 4 16 extrait aqueux obtenu 9,3 7fi,5 dans l'exemple 5 17 extrait aqueux obtenu 9,3 7,5 dans l'exemple 6 18 extrait aqueux obtenu 8,9 7,1 dans l'exemple 7 19 extrait aqueux obtenu 8, 8 7,0 dans l'exemple 8 extrait aqueux obtenu 8,9 7,1 dans l'exemple 9 21 extrait aqueux obtenu 9,0 7,2 dans l' exemple 10 22 extrait aqueux obtenu 8,1 6,5 dans l'exemple ll Exemple 23 On traite l'extrait aqueux dégraissé (4,5 1) obtenu dans l'exemple i de la même manière qui est décrite dans l'exem- ple 12, si ce n'est qu'on utilise le méthanol comme agent de précipitation au lieu de l'éthanol, de façon à obtenir 4,6 g de l'extrait recherché et 2,6 g de l'extrait purifié. Exemple 24: On traite l'extrait aqueux dégraissé (4,5 1) obtenu dans l'exemple 1, de la même manière qui est décrite dans l'exemple 12, si ce n'est qu'on utilise l'acétone comme agent de précipitation au lieu de l'éthanol, de façon à obtenir 8,8 g de l'extrait recherché et 6,4 g d'extrait purifié. Exemple 25: On traite l'extrait aqueux dégraissé (4,5 1) obtenu suivant l'exemple 1, en le chargeant dans un tube de cellulose pour dialyse (tube Visking, fourni par Union Carbide Co Ltd, USA), et poursuit la dialyse pendant une semaine en faisant pas- ser de l'eau. Le liquide interne (portion qui comprend la fraction contenant les composés à haut poids moléculaire), est concentré sous pression pour arriver à 500 ml. On ajoute 2 1 d'éthanol au liquide concentré, et recueille par filtration le précipité qui s'est déposé. Ce précipité est séché sous pres- sion réduite, ce qui donne 12 g de l'extrait recherché. Ensuite on soumet cet extrait à une extraction avec 500 ml d'eau et filtre, concentre le filtrat et sèche sous pression réduite, ce qui donne 10 g d'extrait purifié sous la forme de poudre brune. Exemples 26 à 33: De la même manière qui est décrite dans l'exemple 25, on traite les extraits aqueux dégraissés (4,5 l chaque), obtenus dans les exemples 2 à il, de façon à obtenir les extraits recherchés et les extraits purifiés suivant l'invention. Les résultats obtenus sont donnés ci-dessous: Exemple, Extrait aqueux Quantité Quantité No dégraissé utilisé d'extrait d'extrait recherché (g) purifié (g) 26 extrait aqueux obtenu 12,0 10,0 dans l'exemple 2 27 extrait aqueux obtenu 10,0 8,0 dans l'exemple 5 28 extrait aqueux obtenu 11,2 10,0 dans l'exemple 6 29 extrait aqueux obtenu 10,6 9,0 dans l'exemple 7 extrait aqueux obtenu 10, 6 8,6 dans l'exemple 8 31 extrait aqueux obtenu 10,6 8,8 dans l'exemple 9 32 extrait aqueux obtenu 10,8 8,6 dans l'exemple 10 33 extrait aqueux obtenu 9,8 8,0 dans l'exemple 11 Exemple 34 On dialyse l'extrait aqueux dégraissé (4,5 1) obtenu dans l'exemple 3 au moyen d'un dialyseur à fibre creuse PVA, comprenant une membrane de fibres creuses d'alcool polyvinylique (Modèle KL-1-30 fourni par Kuraray Co Ltd, Japan). On ajoute 1,6 1 d'éthanol à ce que l'on vient d'obtenir sous forme de liquide concentré (400 ml), et récupère le précipité déposé par filtration. Le précipité ainsi récupéré est séché sous pression réduite de façon à obtenir 10,6 g de l'extrait recherché. En- suite cet extrait est soumis à nouveau à une extraction avec 500 ml d'eau et filtré; on concentre le filtrat et le sèche sous pression réduite pour obtenir 8,5 g d'un extrait purifié. Exemple 35: On traite, de la même façon qui est décrite dans l'exemple 34, l'extrait aqueux dégraissé obtenu dans l'exemple 4, de façon à obtenir 6,1 g de l'extrait recherché, et 4,5 g d'un extrait purifié. Exem2le 36: L'extrait aqueux dégraissé (4,5 1) obtenu dans l'exemple 1 est mélangé graduellement, tout en agitant, avec du sulfate d'ammonium jusqu'à saturation et on laisse le mélange reposer pendant la nuit. Le précipité déposé est récupéré par filtration, séché à l'air et extrait avec 6 1 d'eau. On intro- duit cet extrait dans un tube à dialyse en cellulose (Tube Visking fourni par Union Carbide Co Ltd USA), et on poursuit la dialyse en faisant passer de l'eau pendant 6 jours. Le liquide interne (portion qui comprend la fraction contenant les composés à haut poids moléculaire) est concentré sous pression réduite à 500 ml. On ajoute 2 1 d'éthanol au liquide concentré et l'on recueille le précipité qui se dépose par filtration. Le filtrat recueilli est séché sous pression réduite de façon à obtenir 8,1 g de l'extrait recherché. Ensuite cet extrait est soumis à une extraction avec 500 ml d'eau et filtré, et le filtrat est concentré et séché sous pression réduite de façon à obtenir 6 g d'extrait purifié. - -- Il a été confirmé que les extraits recherchés obtenus dans les exemples 12 à 36 possèdent les caractéristiques indi- quées plus haut. R E V E N D I C A T I 0 N S 1 ) Extrait de plantes pouvant Utre utilisé comme agent immunostimulant2 contenant des composés à haut poids molé- culaire, caractérisé en ce qu'on l'obtient par extraction de plantes appartenant au genre Epimedium sp, en dégraissant l'extrait aqueux obtenue et en recueillant la fraction conte- nant les composés à haut poids moléculaire de l'extrait aqueux dégraissé, cet extrait ayant les caractéristiques suivantes: (1) Propriétés (a) poudre brune (b) légèrement acide (pH environ 6,5) (quand on dissout mg de l'extrait dans 50 ml d'eau). (2) Solubilité: (a) soluble dans l'eau (b) insoluble-dans les méthanol, éthanol, acétone, acétate d'éthyle, diéthyléther, hexane et chloroforme (3) Réactions colorées: Positive pour, (a) la réaction anthrone-acide sulfurique, (b) la réaction de Bial, (c) la réaction de Molisch, et (d) la réaction au skatol, mais négative pour, (a) la réaction à la ninhydrine, (b) la réaction au 2,4=DNP, (c) la réaction de Seliwanoff et (d) la réaction au naphtorésorcinol; (4) Composition en sccharides Arabinose et galactose (5) Absorption des rayons infra-rouges KBr (cm-1) 3400, 1600, 1400, 1100 max (6) Absorption des rayons ultraviolets H20 (nm) 280, 325 max 2 ) Extrait suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise, pour l'opération d'extraction, un solvant choisi dans le groupe constitué par l'eau et les solvants mixtes, mélanges d'eau et d'un solvant miscible à l'eau. 3 ) Extrait suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le solvant miscible à l'eau est choisi dans le groupe formé par les alcools inférieurs, les cétones et les éthers mis- cibles à l'eau. 4 ) Extrait suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant utilisé pour l'opération de dégraissage t4481704 est choisi dans le groupe constitué par les esters aliphatiques inférieurs, les hydrocarbures halogénés, les éthers non-misci- bles à l'eau, et les hydrocarbures aliphatiques. ) Extrait suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on récupère la fraction contenant les composés à haut poids moléculaire par précipitation fractionnelle. 6 ) Extrait suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on récupère la fraction contenant des composés à haut poids moléculaire par dialyse. 70) Procédé pour la préparation d'un extrait de plan- tes appartenant au genre Epimedium sp, caractérisé en ce qu'il comprend l'extraction d'une plante appartenant au genre Epime- dium sp. pour obtenir un extrait aqueux, le dégraissage de cet extrait aqueux et la récupération de la fraction de l'extrait aqueux dégraissé contenant des composés à haut poids moléculaire afin d'obtenir un nouvel extrait. ) Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le solvant utilisé pour l'opération d'extraction est choisi dans le groupe comprenant l'eau et un solvant mixte composé d'un solvant organique miscible à l'eau et d'eau. ) Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le solvant organique miscible à l'eau est choisi dans le groupe constitué par les alcools inférieurs, les cétones et les éthers miscibles à l'eau. 100) Procédé suivant la revendication 7, caractérisé- en ce que le solvant utilisé pour dégraisser l'extrait est choisi dans le groupe constitué par les esters aliphatiques inférieurs, les hydrocarbures halogénés, les éthers non-misci- bles à l'eau et les hydrocarbures aliphatiques. 11 ) Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que la fraction contenant des composés à haut poids molé- culaire est récupérée par précipitation fractionnelle. 12 ) Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que la fraction contenant les composés à haut poids molé- culaire est récupérée par dialyse. 13 ) Agent immunostimulant caractérisé en ce qu'il contient, comme composant actif un extrait d'une plante apparte- nant au genre Epimedium sp. selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6. 14 ) Application en immunothérapie de l'extrait obtenu par le traitement de plantes appartenant au genre Epime- dium sp, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.