Brevet FR2477571A1 — publié le 19810911

La présente invention concerne essentiellement un procédé de production d'éthanol (alcool) en utilisant la bactérie Zymomonas mobilis. Il est connu d'utiliser la bactérie ZyMomonas mobilis pour la production d'éthanol, et en fait cette bactérie est utilisée pour la production de vin. de palme ou palmier et d'autres boissons alcooliques dans les pays tropicaux. Il est également connu que théoriquement la production d'éthanol en utilisant cette bactérie a certains avantages en comparaison des levures qui sont conventionnellement employées pour produire de l'alcool par fermentation des sucres, des amidons et d'autres substrats de carbohydrate ou hydrate de carbone. Ces avantages incluent le fait que ZyMomonas mobilis produit moins de biomasse que les levures dues à l'énergie inférieure disponible pour la croissance inhérente dans le passage Entner-Doudoroff utilisé par la bactérie qui produit seulement une mole de ATP par mole de glucose métabolisée en comparaison du passage glycolytique utilisé par des levures qui produit deux moles de ATP par mole de glucose. Un avantage supplémentaire potentiel est que ZYMomonas mobilis croit de manière anaérobie. Les inventeurs de la présente invention ont découvert qu'une productivité d'éthanol grandement améliorée peut être réalisée par culture en continu de Znomonas mobilis avec recyclage des cellules. On a découvert et ceci ne pouvait pas être prévu à _ni:ori, qu'une culture en continu avec recyclage des cellules de Zymuomonas mobilis ne soufre pas des difficultés rencontrées dans la culture en continu avec recyclage des cellules des levures conventionnelles. Ces difficultés incluent la nécessité de fournir de l'oxygène stérile pour maintenir la viabilité des cellules de levure à des concentrations de levure élevées, et la probabilité de contamination par des bactéries non désirées pendant la période prolongée d'opération en continu. Avec une fermentation par Zymomonas mobilis en utilisant une culture en continu avec un recyclage des cellules ainsi qu'en réalisant des productivités d'éthanol supérieures en comparaison aux autres techniques pour la fermentation de Zymomonas mobilis et en comparaison avec la fermentation des levures, on a trouvé qu'il n'y a pas d'exigence pour l'oxygène pour maintenir la viabilité à des concentrations cellulaires élevées. En outre, à cause des vitesses plus rapides é ccnversion dessucreetune teinice del'éthanolaccrueencamparainauuxleves on atrouvé qu'il ne se produit pas de contamination pendant des périodes prolon- gées d'opération en continu. La présente invention consiste ainsi dans un procédé pour la production d'éthanol à partir d'un milieu contenant un carbohydrate fermentable, caractérisé en ce qu'il comprend la culture en continu de Zymomonas mobilis dans le milieu de culture, le sou- tirage en continu ou périodiquement d'une partie du milieu de culture et le remplacement de cette partie avec du milieu de culture frais, la séparation de la partie soutirée du milieu de culture des cellules de Zymomonas mobilis contenuesdans celui-ci, le recyclage ou retour des cellules au milieu de culture, et la récupération de l'éthanol contenu dans la partie du milieu de culture à partir duquel les cellules ont été enlevées. Le procédé selon la présente invention est de préférence réalisé à une température allant de 20 C à C, encore de préférence à 25 à 40 C, et un pH compris entre 3,7 et 8, et encore de préférence entre 4,5 et 6,5. Le milieu contient de préférence de 100 à 400 g/l d'un carbohydrate fermentable, encore de préférence de 150 à 300 g/l. Les carbohydrates préférés pour emploi comme substrats fermentables dans le milieu de culture incluent, en plus du glucose, des sucres simples tels que le fructoase,le lactose et le sucrose, l'amidon et des hydrolysats d'amidon, et des matériaux bruts cellulosiques. On reconnaîtra que n'importe quelle souche de Zymomonas mobilis probablement ne fermentera pas tous ces substrats et par conséquent pour toute souche particulière un substrat approprié, fermentable devra être sélectionné. On préfère que la souche de Zymomonas mobilis employée dans ce procédé soit une souche ayant une produc- tivité en ftanol spérie éevéetntaux spécifique élevé de conversion de glucose et une tolérance à l'alcool élevée. Un organisme particulièrement approprié est le CP4 de la collection de culture type du Docteur J. De Ley Laboratoire de Microbiologie Ledeganckstraat 35, B - 900 GENT Belgique Des mutants de cette souche ont également été trouvés pour être particulièrement utiles dans la réali- sation du présent procédé et peuvent avoir un domaine plus vaste de substrats fermentables que le CP4 lui-même. Les souches mutantes peuvent être produites par mutations- d'une souche existante comme par l'emploi de radiations ultraviolet ou de la nitrosoguanidine. Des propriétés souhaitables peuvent également être introduites dans les souches Zymomonas mobilis par transfert plasmide à partir d'autres bactéries en utilisant, par exemple, des techniques d'accouplage ou appareillage par filtre à membrane. La séparation des cellules à partir de la partie enlevée ou soutirée du milieu de culture peut être réalisée de toute façon appropriée. Les cellules peuvent être enlevées par l'emploi d'un système de membrane par microfiltration à écoulement transversal, de préférence en utilisant une membrane ayant une dimension de pores de l'ordre de 0,6 microns. Alternativement les cellules peuvent être séparées dans une centrifugeuse ou dans une série d'hydroclones. Si des floculants de cellules Zymomonas mobilis sont employés ceux-ci peuvent être enlevés à partir du milieu de culture en les laissant sédimenter ou précipiter dans un récipient de sédimenta- tion ou une série d'hydrodones. Les souches de Zymomonas mobilis référencées ici dans cette description ont été déposées à l'" American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Park Lawn Drive Rockville, Maryland 20852, USA conformément aux forma- lités du traité de Budapest du 28 Avril 1977 et on leur a assigné les numéros et dates de dépôt suivants: Nom de référence Dépôt Date de dépôt ATCC de description ATCC 1 CP4 31821 2.02.191 ZM481 31823 2..I81 ZM401 31822 2E.02.1981 Les exemples suivants sont donnés simplement à titre d'illustration et ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de la présente invention. Exemples Dans les exemples suivants on cultive la bactérie Zymomonas mobilis dans un milieu de fermentation compre- nant les concentrations de composants nutritifs suivants: -300 g/l glucose g/l d'extrait de levure I g/l de (NH4) 2 S04 1 g/l KH2P04 0,5 g/l MgSO4 7H20 Les cultures des diverses souches de Zymomonas mobilis sont maintenues en transférant à de agar incliné frais contenant 20g de glucose, 10 g d'extrait de levure et 20 g d'agar à pH 5,0 chaque semaine et en stockant a la température ambiante. oUn On contrôle le système de fermentation en continu à une température de 300C et à un pH de 5,0 dans un récipient de fermentation de litre.On contrôle le pH par addition de NaOH 2N. Dans ces expériences on réalise le recyclage des cellules en employant un système de membrane de micro- filtration par écoulement transversal incluant une membrane BD "Millipore" ayant une dimension de pore nominale de 0,6 microns. Cette membrane retient toutes les cellules et le perméat passant au travers de la membrane est dépourvu de cellules et contient la même concentration d'éthanol que le contenu du fermenteur. La figure unique annexée représente l'arrangement du fermenteur et du système de recyclage des cellules. Dans cette figure le numéro de référence 10 est un récipient de fermentation pourvu d'un agitateur 11. Le milieu de culture est introduit dans le fermenteur par la conduite 12 et est soutiré par la conduite 13 vers une pompe 14 et de là à un microfiltre 15 d'écou- lement tangentiel. Le perméat à travers le filtre 15 est déchargé par la conduite 16 au stockage avant de récupérer l'éthanol à partir de celui-ci tandis que le concentrat de cellules retenu est retourné par la conduite 17 au fermenteur 10. Une conduite 18 de soutirage du surplus ou du liquide débordant est prévue. Le tableau 1 représente la productivité d'éthanol maximum grandement améliorée de ces souches de Zymomonas mobilis cultivées en continu, avec un recyclage des cellules en comparaison avec deux souches de la levure o Saccharomyces Cerevisiae. TABLEAU 1 Organisme co;Qncentration (onsentration Productivité a( Glucose d'Ethanol maximum (g/l) (g/l) (g/1/h) S. Cerevisiae 100o 43 29 (ATCC 4126) S. Cerevisiae 150 61 32 (NRRL Y-132) Z. Mobilis 100 45 120 (ATCC 10988) Z. Mobilis 140 65 200 (CP4) Z. Mobilis 180 85 85 (ZM 481) A partir du tableau ci-dessus il est clair que la culture en continu de Zymomonas mobilis avec un recyclage des cellules peut donner des productivités qui sont de à 30î/o supérieures à celles des fermentations par levure réalisées dans des conditions similaires. Ceci signifie que la dimension des récipients de fermentation pour produire de l'éthanol peut être réduite d'une quantité équivalente. L'organisme Zvmomonas mobilis ZIM 481 a été développé à partir de la souche CP4 comme suit: On fait croître statiquement la souche CP4 à 30 C Jusqu'à ce qu'elle soit dans la phase de croissance exponentielle. On ajoute ensuite la nitrosoguanidine à une concentration finale de 50 ig/ml et on incube la culture pendant 30 minutes à 30 C. On lave ensuite les cellules deux fois dans un tampon de phosphate salin et on fait recroitre toute la nuit à 30 C. On plaque ensuite-la culture sur des plaques contenant 10% d'éthanol (volume/volume). Après plusieurs jours d'incubation à 30 C, des colonies mutantes apparaissent à une fréquence d approximativement 10-7, et celles-ci sont purifiées sur un milieu similaire et ensuite testées pour les taux de croissance et de production d'éthanol avec 100, 200 et 250 g/l de glucose, à 30 C dans des tubes. La culture qui produit le niveau le plus élevé d'éthanol dans le temps le plus court est dénommée ZM48. Une seconde mutagénèse similaire est réalisée avec la souche ZM48 mais les cellules sont plaquées avec de l'éthanol à 15% (volume/volume). La souche mutante qui produit le niveau le plus élevé d'éthanol dans le temps le plus court est dénomméeZM481, et est gardé comme souche tolérant l'éthanol dans la collection de culture type dans l'école de Biotechnologie, Université de "New South Wales, Sydney, New South Wales, Australie". L'emploi de souches floculantes de Zymomonas mobilis dans la présente invention est avantageuse. Le tableau 2 rapporte l'emploi d'une souche floculante de y momonas miobilis a 1' aide d'un récipient de sédimentation er compz- raison avec urm sorne floculante de Sacchromyces Cerevisiae. Dans le tableau suivant les résultats avec une souche floculante de Zvmomonas mobilis sont comparés avec les résultats d'une souche floculante de Saccharomyces Cerisiae. TADLEAU 2 Le mutant floculant ZM 401 est isolé comme suit: on fait croltre une culture de souche CP4 dans un milieu riche, RM, (20 g/il de glucose, 10. g/l d'extrait de levure, 2 g/i de KH2P04) statiquement à 30 C jusqu'à ce qu'elle est dans la phase de croissance exponentielle. Ensuite on ajoute de la nitrosoguanidine (NTG) jusqu'à une concen- tration finale de 50 "g/ml et on incube en outre la culture pendant I heure. On lave ensuite les cellules deux fois dans un tampon de phosphate salin, et on incube statiquement toute la nuit dans RM à 30 C. Après ce temps, quelques petits flocs granulaires sont visibles au fond du flacon. Le milieu surnageant, avec la majorité des cellules est enlevé soigneusement, et on ajoute du milieu frais. Après sous-culture répétée toutes les 24 heures de cette façon pendant 7 jours, on obtient une culture apparemment pure de flocs granulaires. Cette culture est striée sur des plaques RM deux fois pour davantage la purifier par isolation d'une colonnie unique. Une colonnie unique est ensuite retestée dans le milieu Organisme Concentration Concentration ProductivitSé de Glucose d'Ethanol maximum (g/l) (g/l) - (g/l/h) S.Cerevisiae 100 43 29 (ATCC 4126) Z. Mobilis 100 45 51 (ZM 401) liquide, et est encore floculante. Celle-ci est choisie comme souche floculante, et est dénommée ZM 401. A partir du tableau il est clair que la souche ZM 401 présente des avantages considérables, en termes de productivités améliorées, par rapport à des souches de levure floculante. Le tableau 3 représente la productivité d'éthanol grandement améliorée en utilisant une culture en.continu avec un recyclage des cellules de Zymomonas mobilis (ATCC 10988) en comparaison avec la culture par lot ou charge et la culture en continu avec un recyclage des cellules du même organisme tout dans le milieu contenant g/l de glucose. TABLEAU 3 Type de culture Productivité d'éthanol (g/1/h) par lot 5 en continu il en continu avec recyclage 120 des cellules On peut voir qu'il y a une augmentation de dix fois dans la productivité d'éthanol entre la culture en continu de l'organisme et la culture en continu avec recyclage des cellules. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, l'inven- tion comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont effectuées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre de la protection comme revendiquée. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'éthanol à partir d'un milieu contenant un carbohydrate fermentable, caractérisé en ce qu'il comprend la culture en continu de Z-momonas mobilis dans le milieu de culture, le soutirage en continu ou périodiquement d'une partie du milieu de culture et le remplacement de cette partie avec du milieu de culture frais, la séparation de la partie SuLtirée du milieu de culture des cellules de Zvmomonas mobilis contenues dans celui-ci, le recyclage ou retour de ces cellules au milieu de culture, et la récupération de l'éthanol contenu dans la partie du milieu de culture à partir duquel les cellules ont été enlevées. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le carbohydrate fermentable précité est choisi parmi le groupe comprenant le glucose, le fructose et le sucrose. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le Zymomonas mobilis précité est une souche choisie parmi le groupe comprenant CP4, ZM 481 et ZM 401. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les cellules précitées sont récupérées à partir de la partie soutirée du milieu de culture par filtration. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les cellules sont floculantes ou floculeuses et sont récupérées à partir de la partie soutirée du milieu de culture dans un récipient de sédimentation. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu de culture est maintenu à une température comprise entre 200C et Oc. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu de culture est maintenu à un pH compris entre 3,7 et 8. 1 1 8. Ethanol, caractérisé en ce qu'il est produit par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.