Brevet FR2480304A1 — publié le 19811016

L'invention concerne un procédé pour la production de conidies de cryptogames entomophages par culture superficielle (en surface) sur milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote assimilables et des sels minéraux nutritifs. On sait que les spores de cryptogames entomophages possèdent une activité insecticide marquée contre les fléaux de l'agriculture. L'intérêt porté aux cryptogames entomophages n'a cessé de croitre, en particulier en rapport avec les exigences modernes de lutte pour la protection de l'environnement (C.M. Ignoffo, Environm. Lett. 8, 23, 1975 N.V. Lappa et al., Zashtchitarastenii 24, 1977). Les pesticides chimiques utilisés actuellement ont un spectre relativement large d'action et par conséquept ils compromettent l'équilibre naturel ; les organismes nuisibles développent rapidement une résistance aux pesticides, dont les résidus contaminent les produits agricoles.Des applications réussies de cryptogames entomophages ont mis en lumière les avantages de certaines espèces, en particulier de la classe des Deutéromycètes. Une de ces espèces est par exemple, le fungus Beauveria Bassiana (Bals.) Vuill. (J. Kral, S. Neubauer, Zool. ent. Listy 1953, 241 ; V.M. Goral, N.V. Lappa, Zachist. roslin 20, 51, 1974 P. Ferron, Entomophaga 19, 103, 1974 ; A. Samsinakova, A. Cermakova, Sbornik Cs. akad. zem. ved, Rostlinna vyroba 6, 163, 1960). Les tentatives faites pour arriver à une réalisation sur une grande échelle ont rencontré, jusqu'à présent, des difficultés liées aux procédés techniquement acceptables pour obtenir des masses importantes de spores nécessaires pour la production d'une préparation efficace dans des conditions économiquement favorables (McCoy et al., J. Invert. Pathol. 19, 370, 1972 ; Entomophaga 20, 229, 1975 ; O.A. Alioshine et al., Mikrobiol; Promyshlennost 5, 18, 1976 ; J. Leopold et al., Zbl. Bakt. Abt. II, 128, 31, 1973). La culture en immersion des spores dans un milieu nutritif synthétique à l'échelle industrielle est possible mais on a constaté que dans ces conditions, il ne se formait que les hastoarthrospores, qui perdent considérablement de leur virulence au cours des opérations de mise au point et de conservation du produit. Par suite, ce procédé a dû être abandonné, et les spores obtenues en immersion ne servent, en particulier que pour gagner du temps, pour l'inocu lation du milieu nutritif pour culture en milieu stable de spores aériens. Les spores aériens, produits par prélèvement des pointes conidiophores, gardent même après séchage leur complète activité pendant de longues durées (A. Samsinakova, J. Invert. Pathol. 8, 395, 1966 ; N.A. Telenga, V.M. Goral, Biol. met. borby 1967, 171). Pour la production de conidies aériennes du fungus Beauveria bassiana, on a utilisé des substrats solides naturels variés, comme les pommes de terre, la betterave à sucre, les céréales, et autres, et le rendement de la culture a été souvent évalue en termes de masse sèche du mycélium produit, sans considération du nombre de spores ni d'aucune autre spécification plus précise de la préparation biologique finale. Selon la première donnée quantitative, un produit infectieux s'est développé avec succès sur une pâte de pommes de terre dans des boites de Petri, avec une teneur de 1,5 x de conidies par gramme de biomasse sèche. Le rendement par 2 100 cm de surface cultivée était de î4xî09 conidies. Pour le 2 traitement d'un hectare (10.000 m ) de champ de pomme de terre, il a fallu utiliser 4 kg de cette préparation (J. Kral, S. Neubauer, Zool. Listy V. 178, 1956). Des résultats similaires ont été obtenus sur un milieu contenant de la mélasse, une décoction de berterave à sucre, et un milieu à base d'agaragar solide ( N.A. Telenga, V.M. Goral, 1. c. ; A.A. Yevlakhova, L.G. Tarasov, Biol. Method of Plant Pest Control, Riga 1968, 131 ; E.V. Kononova, Proc. First Joint US/USSR Conference, Kiev 1979, 173). Sur la base de ces expériences, on a commencé la production d'une préparation commerciale, ayant un titre standard de 6 109 spores par gramme (C.M. Ignoffo et al. J. Econ. Ent. 72, 562, 1979). Néanmoins, pour une application efficace et économique dans les conditions de la production agricole à grande échelle, les possibilités de tous les procédés appliqués jusqu'à présent ont été extrêmement limitées, et les produits obtenus étaient trop coûteux. L'invention a permis d'éliminer tous ces inconvénients par la mise au -point d'un procédé pour la production de conidies de cryptogames entophomages, par exemple de l'espèce Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., par culture superficielle (en surface) sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote assimilables, procédé caractérisé en ce que la culture est conduite sur milieu nutritif liquide, ayant un pH compris entre 4 et 6, de préférence 5, contenant comme source de carbone assimilables un mils nutritif dont le taux d'assimilation est inférieur à celui du glucose ou du sucrose 9 par exemple des sucres alcooliques, de préférence le sorbitol et/ou le mannitcl à la concentration de 0,5 à 3 , de préférence 1 %, et comme source d'azote assimilable, une substance azotée organique naturelle, par exemple de la bouillie de mais, de la caseine hydrolysée ou de la peptone, à la concentration de 0,8 à 2 p'. Un autre avantage de la culture en surface selon l'invention, sur un milieu liquide, réside en la possibilité de la mise en pratique sur de grandes surfaces, selon les procédés pour la culture de microorganismes décrits dans le brevet tchèque n 172 557 , selon ce document, la culture s'effectue dans un sac scellé, stérile, gonflé fait d'une feuille plastique transparente, de préférence en feuille de polyéthylène, muni d'au moins un orifice pour l'introduction de matières liquides, gazeuses et/ou solides (sous forme de boue), qui servent comme éléments nutritifs et/ou 8noculum, et/ou de l'air pour la culture.Les sacs à culture sont soumis à une incubation appropriée sur une plaque support horizontale pourvue d'une régulation de la température. Une caractéristique particulièrement intéressante de l'invention consiste en ce qu'on a réussi à atteindre sur le milieu liquide une production de spores, par unité de surface, diane ordre de grandeur supérieur de deux décimaux aux rendements obtenus actuellement avec les substrats solides, piteux ou en poudre, actuellement utilisés et l'on a 11 2 pu obtenir 1 x1011 conidies aerobies pures par 100 cm de surface. L'intensité de la production de spores est considérablement influencée par le choix dsune source de carbone appropriée. Se sont avérés inappropriées les hexoses directement assimilables (glucose ou fructose) mais aussi les sucrose, maltose et l'amidon soluble dans l'eaux Cette expérience démontre les activités élevées des -D- fructofuranosidase, amylase, et maltase qui permettent une glycolyse illimitée et acce'lcront ainsi la croissance du mycélium fongique aux devens de la products de spores. La production maximale de spores a été atteinte lorsqu'on a utilisé une source de carbone lentement assimilable, et avant tout, le sorbitol. A part les sources d'azote disponibles en quantités industrielles, certains mélanges organiques naturels se sont révélés excellents, comme la peptone, la caselne hydrolysée ou la bouillie de mals. De même qu'avec l'espèce Beauveria bassiana, des spores d'autres cryptogames entomophages peuvent être obtenus9 par exemple ceux des espèces Paecilomyces, TTerticillium et Cudicinomyces. Il faut porter à l'actif du procédé selon l'invention sa possibilité d'être appliqué sur une grande échelle, sans équipement de production compliqué, dans des sacs de culture en feuille de polyéthylène2 même sur des surfaces de plusieurs mètres carrés (brevet tchèque nO 172 552). Ce procédé Tend possible en outre une séparation simple de la biomasse hautement riche en conidies, du milieu restant, que l'on laisse simplement s'écouler plus tard, après la fin de l'incubation. La biomasse restante est alors pressée, broyée et séchée par courant d'air. L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exemple décrit ci-après. EXEMPLE - On a utilisé pour la culture la souche n0 30 de Beauveria bassiana de la collection mycologique de l'Insect Pathology Department, Institut Entomologique de l'Aca- démie des Sciences de Tchécoslovaquie. La souche a été isolée à partir d'un imago de la famille des Chrysomelidae, et elle présente une efficacité maximum contre le parasite Colorado de la pomme de terre (Leptinotarsa decemlineata Say). Après 14 jours de culture sur agar-agar de Sabourand, à 270 C, les conidies ont été reprises sur la surface et mélangées avec du charbon absorbant stérile. Une réserve préparée de cette façon et stockée à 7 à 100 C, garde sa viabilité et sa virulence durant plusieurs années. Le produit conservé a été utilisé pour inoculer un milieu nutritif liquide ayant la composition suivante (en ,; en poids) 2,5 C/v' de glucose, 2,5 r% d'amidon soluble, 2,0 8/o de bouillie de mais, 0,2 Col de CaCO3, Ois % de NaCl, pH5. Le milieu inoculé a été cultivé sur un agitateur à secousses à 270 C durant 72 heures. Avec 25 ml de cet inoculum, 2000 ml de milieu de sporulation préalablement refroidi et stérilisé ont été inoculés et transférés dans un sac de culture ayant une surface de 0,1 m2(préparé suivant le brevet tchéque n 172 552). Le milieu de sporulation contenait 1 /0 de sorbitol et 2,5 % de peptone (Bactopeptone Spofa @) ; pH 5. Les sacs en feuille de polyéthylène ont été soumis à l'incubation en position horizontale à 270 C durant 12 jours. A partir du 3ème jour, un courant d'air passait en continu sur le mycélium en croissance, producteur de conidies, à raison de 400 ml/min. Après séparation et séchage de la biomasse, 1 x 10 3 conidies aériennes ont été obtenues dans chaque sac. REVENDICATIONS 1.- Procédé pour la production de conidies de cryptogames entophomages, par exemple de l'espèce Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., par culture superficielle (en surface) sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote assimilables, procédé caractérisé en ce que la culture est conduite sur milieu nutritif liquide, ayant un pH compris entre 4 et 6, de préférence 5, contenant comme source de carbone assimilable, un milieu nutritif dont le taux d'assimilation est inférieur à celui du glucose ou du sucrose, par exemple des sucres alcooliques, de préférence le sorbitol et/ou le mannitol, à la concentxEtion de 0,5 à 3 %, de préférence 1 76, et comme source d'azote assimilable, une substance azotée organique naturelle, par exemple de la bouillie de mais, de la caséine hydrolysée ou de la peptone, à la concentration de 0,8 à 2 /0. 2. Procédé pour la production de conidies du cryptogame Beauvaria bassiana (Bals.) Vuill. par culture superficiélle sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote assimilables, et des sels minéraux nutritifs, procédé caractérisé en ce que la culture est conduite sur un milieu nutritif liquide ayant un pH compris entre 4 et 6, de préférence de 5, contenant comme source de carbone assimilable, un agent nutritif dont le taux d'assimilation est inférieur à celui du glucose ou du sucrose, par exemple des sucres alcooliques, de préférence le sorbitol et/ou le mannitol, à la concentration de 0,5 à 3 fio de préférence 1 /0, et comme source d'azote assimilable, une substance azotée organique naturelle, par exemple de la bouillie de mais, de la caserne hydrolysée ou de la peptone, à la concentration de 0,8 à 2 /0.