Brevet FR2482108A1 — publié le 19811113

La présente invention concerne des dérivés nouveaux des istamycines A et B, plus particulièrement la formiei- doylistamycine A et la, formimidoylistamycine B et leurs sels d'addition d'acide, qui sont utiles comme antibioti- ques aminoglycosidiques semi-synthétiques. Elle concerne aussi la préparation de ces substances. Au cours de recherches entreprises en vue d'amélio- rer l'efficacité d'antibiotiques utiles, les iotamycines A et BI qu'ils avaient déjà obtenus par fermentation d'un mi- cro-organisme nouveau9 StreptoEces tenjimariensi FEM P- 4932 (ATCC N 31603) (brevet japonais KOKAI N 145697/80, "Journal of Antibiotics" 32, 964-966 (septembre 1969); de- mande de brevet britannique 2 048 855A, publi&e le 17 dé- cembre 1980), les auteurs de l'invention ont constaté que la formimidoylfortimicine A /lubstance SP-2052; Journal of Antibiotics, 32, 1354-1356 (1979)7 ponsède une activité an- tibactérienne oup6rieure A celle de la fortimicine A et ils ont essayé d'appliquer leur découverte aux istmmycines9 est-A-dire de transformer le groupe amino de la partie gly- cine des istamycines A et B en un groupe amidine; ils sont ainsi parvenu à préparer des composés nouveaux, la formimi- doylistamycine A et la formimidoylistamycine B, qui présen- tent une activité antibactérienne supérieure à colle de la fortimicine A et égale A celle des istamycines A et B, tout en ayant une toxicité inférieure A celle de ces deux subs- tances. Sous un premier aspect, l'invention fournit deux composés nouveaux, les formimidoylistamycines A et B, qui ont pour formule: H CN H 6' Y (1) X 3' -OH NCH 1 3 COCH2NiHCH=NH dans laquelle X et Y représententchacun soit un groupe amino, soit un atome d'hydrogène, X étant un groupe amino lorsque Y est un atome d'hydrogène (formimidoylistamycine A) et vice versa (formimidoylistamycine B), ainsi que les sels d'addition d'acide de ces composés. Les propri6tés physico-chimiques et biologiques des formimidoylistamycines A et B sont indiquées respectivement aux Tableaux I et II. Tableau I - Proprihtés i.cochimi ies dimulfate odisulfate trihydrate de dihydrate de formimidoyl- formimidoyl ietamycine A iïsamycine B Aspect Point de d6ceapo- sition eOtatio.s Sp6ciúque alyo eieenre (%) H N chro.ntographie en couch mînce sur cell1l@o IR * * i poudre incolore 202 à 2080C a 27 +82o D (c 19 H20) 6,52 (6,95) * 11,82 (12960)* 9,69 ( 9,62)* 0,39 (tache iqu) 202 A 2100C (C 2' N 2 ) 6, ( 4) 9 (p 9G)D O,î,p (tache m:i= que) vace uro calclées pour C lsH36N60502H2@o2 î1 *le valeurs calculees pouir C H N 20 00oh25%o20 y e uol propa:p i i a1e36 (15 = IO' 3z 12, em volume) r(âactf colorés 1 Dînhydrine Tableau II - Propriétés biologiques (spectre antibactérien) concentrations minimales inhibitrices (mg/ml)*** Formimidoyl- Formimidoyl- Micro-organismes utilisés pour istamycine A* istamycine B** les essais Staphylococcus aureus FDA 209P 1,56 0,39 " fi Smith ( " " K-12 ML1410 R81 3,13 1,56 " n K-12 LA290 R55 6,25 1,56 n n K-12 LA290 R56 3,13 1,56 " " K-12 LA290 R64 3,13 1,56 n " W677 3,13 1,56 n n JR66/W677 6,25 1,56 n " K-12 0600 R135 100 50 n " JR225 3,13 1,56 Klebsiella pneumoniae PCI602 3,13 1,56 " " 22W3038 6,25 3, 13 Shigella dysenteriae JS11910 12,5 3,13 Shigella flexneri 4B JS11811 6,25 3,13 2482 1 08 Shizella sônnei -JS51756 Salmonella typhi T-63 Salmonella enteritidis 1891 Proteus vulgaris OX19 Proteus rettgeri GN311 " t GN 466 Serratia marcescens Serratia sp. SOU Serratia sp. 4 Providencia sp. Pv16 Providencia sp. 2991 Pseudomonas aeru isa A3 " N N12 te te Q Pseudom et " Hil n nHîl "tte" TI-13 " "t GN315 a e 99 et n B-13 " " 21-75 et n PST1 t" ' ROS134/PU21 n n K-Ps 102 nonas malthilia GN907 12,5 1,56 3, 13 1,56 6,25 12,5 > 100 12,5 6,25 >100 >100 > 100 > 100 > 100 >100 0,78 1, 56 0,78 12,5 6,25 6,25 > 100 12,5 6,25 12,5 >100 >100 > 100 > 100 > 100 > 100 * sous la forme de disulfate.trihydrate ** sous la forma de disulfate. dihydrate ** d6termin6e par la méthode standard de dilution en g6- lose en boites de Pétri avec incubation à 37 C pendant 17 heures. Les formimidoylistamycines A et B sont caractéri- sées par leur faible toxicité. Ainsi, une détermination de la toxicit6 aige de ces composés et de l'istamycine B sur des souris par administration intraveineuse a montri qu'a une dose de 150 mg/kg de disulfateotrihydrate de form- imidoylistamycine A ou de disulfate.dihydrate de forwimi- doylistamycine B, toutes les souris survivent, alors qu'el- les meurent toutes à une dose de 150 mg/kg d'istamycine B. Les formimidoylistamycines A et B selon l'invention peuvent être obtenues habituellement sous la forme d'une base libre, d'un hydrate ou d'un carbonate et elles peu- vent être transformées, de préférence eu égard à leur sta- bilité, en un sel d'addition d'acide non toxique, de ma- nière connue, par addition d'un acide pharmaceutiquement acceptable. Comme exemples d'acides pharmaceutiquement ac- ceptables on peut citer des acides inorganiques, comme l' acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfuri- que, l'acide phosphorique et l'acide azotique, et des aci- des organiques, comme l'acide acétique, l'acide malique, l'acide citrique, l'acide ascorbique et l'acide méthane- sulfonique. Sous un second aspect, l'invention fournit un procé- dé de préparation de la formimidoylistamycine A ou B, de formule (I): HCN 6' 3H o 4' ', 2' x (I) 3' 2 o 5 2 NCH OC3 1 3 COICH2NHCH=NH dans laquelle X et Y représentent chacun un groupe amino ou un atome d'hydrogène, X étant amino lorsque Y est hydro- gène (formimidoylistamycine A) ou vice versa (formimidoyl- istamycine B), ou d'un sel d'addition d'acide de ces déri- vés, qui consiste à faire réagir un composé de formule (V): H 3CN R4' yv XI R OH (v) Co'CH2 N2 dams laqeelle SV r se mm ungpe -PM et Ye GepP$eéEà te uM ntEuG peu lm 4rîQ Ayeie A Du VACG vemse eset un ateuee, hy soU-ae tee e t es mm c-zt epGe Iîuh peurIn05l_ s te,emyefe m GZRQjeepe Cee_=me oeC un GPe ae et E f- efme elm eIeo@ Cee& de H}CT R a -j3 GCHI: NCH} C:3 X Mv) 248210o dans laquelle X', Y' et R ont les mêmes définitions que cidessus, puis à éliminer les groupes amino-protecteurs aux positions 1, 2' et 6' de manière comnnue. Les composés de formule (V) à utiliser comme matiè- re de départ dans le procédé selon l'invention correspon- dent au dérivé 1,2',6'-tri-N-protégé des istamycines A et B et peuvent être tirés des istamycines A0 et B0 (cf. de- mande de brevet Japonais NO 117912/79, demande de brevet britannique 1048855A, demande de brevet U.S. N 141,492), respectivement, de formule (II): HCN 6C 2' N2X i( 6 OH OH(À HNCH3 dans laquelle X et Y représentent chacun un groupe amino ou un atome d'hydrogène, X étant amino lorsque Y est hy- drogène (istamycine AO) ou vice versa X étant hydrogène lorsque Y est amino (istamycine B0). Ainsi, les composés de formule (V) sont préparés en protégeant simultanément les groupes amino et méthylamino aux positions 1, 2' et 6' de l'istamycine A0 ou B0 avec un groupe amino- protecteur connu, pour former un composé de formule (III): 2 4 8 2 1 0 8 H CN 6' O OH RR 5'O2 4' 2' x' 6 (III) R 5 2 H3 HCH HNCH3 dans laquelle X' et Y' représemtent chacn un groupe -a ou un atome d'hydroane, X' étant -NH lorsque Y' est hy- drogèmne (6rie istaycine A) et XI étant hydrogène loro= que Y' eot -NHR (s6rio i2tamycine B), R repr&Gentant un groupe amîno-protecteur monovalent, eni faisant r6air le composé de formule (III) avec une glycine ?-preoté&e dont le groupe amrino-protecteur est diff6rent de ceux des po- sitions 1, 2a et 6' ou avec un d6rivé r6énctif de celle-ci pour acyler le groupe 4-m6thylamino et former ainsi un composé de formule (IV): H3C:N 6' I R\ R 5 \2 NC cOCH, C3 A COCHIN B 2t y$ dans laqueltsX' Y' et R ont les mimes dFfinitions que ci-, dessus, A reprôsente un atome d'hydrogène et B repr6cente un groupe.irno-protecteur monovalent ou A et B pris en- semble forment un groupe amino-protecteur divalent, et en éliminant ensuite le groupe amino protecteur qui se trouve sur le groupe amino de la partie glycine pour donner le composé de formule (V) qui correspond à un composé de for- mule (IV) à condition que A et B représentent tous deux un atome d'hydrogène. Des formes de mise en oeuvre préférées de la prépa- ration du composé de départ de formule (V) sont indiquées ci-après. On utilise comme matière de départ pour cette prépa- ration l'istamycine A0 ou B0 de formule-(II). Au cours d' une première étape, on protège simultanément les groupes 1- et 2'-amino et le groupe 6'-méthylamino avec un groupe amino-protecteur monovalent sans que cela affecte le grou- pe 4-méthylamino. Comme groupe amino-protecteur monovalent utilisé habituellement & cette fin, on peut citer un grou- pe alcoxycarbonyle, ayant en particulier de 2 A 7 atomes de carbone, comme le groupe tert-nutoxycarbonyle ou tert- amyloxycarbonyle, un groupe cycloalkyloxycarbonyle, ayant en particulier de 4 A 7 atomes de carbone, comme le grou- pe cyclohexyloxycarbonyle, un groupe aralkyloxycarbonyle, comme le groupe benzyloxycarbonyle, et un groupe acyle, en particulier un groupe alcanoyle ayant de 2 à 7 atomes de - carbone, comme le groupe trifluoracétyle et le groupe o- -nitrophénoxyacétyle. L'introduction de ce groupe amino- protecteur peut être effectuée d'une manière connue dans la synthèse des peptides, par exemple en utilisant un a- gent introducteur de groupe amino-protecteur connu, par exemple un halogénure d'acide, un azide d'acide, un ester actif, un anhydride d'acide, etc.. En utilisant cet réac- tif d'introduction de groupe amino-protecteur dans une pro- portion de 2,5 à 3,5 moles par mole d'istamycine A0 ou Bo il est possible de former de façon préférentielle une is- tamycine A0 ou B0 1,2',6'-tri-N-protégée de formule (III) par suite de la différence de réactivité des groupes amino et méthylaminorespectifs de l'istamycine A0 ou Ba. Comme variante, on peut obtenir l'istamycine 1,2',6'-tri-N-pro- 2482 0 8 tégée A0 ou B0, de for mule (III) avrec u ruen ect pl-e élevré en faisant réagir!'istamycinme A0 on t aBvez e qui= valent molaire d'un cation divalent, coeme ceux des uataux de transition divealents, tels que le civre le iniehal et le cobalt, et de zinco (Il) pour former un cOplezo oramno= mitallique et em Taisant réagir ce compleze avec de 3 5 WcOles d u r2.(ctif d'introduction de $grope agar.-protec teur, puis en cliin-ant le cation setallique en produit do la r6ceatonm L1'6tapeaiLvante de 7lycylatioa {ooA:tdire dn acyla %:1n avec la glycine) du groupe -tolax e e 1 is tawycie 0on B 0 192',6'FtrtiN-pretégé o forale (âXX) peZt " effe uer en faisant r6.aSir le c@,LsD0 avec la Ly'= ciue o aveC Un rivé réactif de celloe-i eG utilîsamt nUi}orte quel prGoCQ5 Conun de N=aclot ion p la E3 dyn tseS dGe peptoio D eoneG le pro*Gc&û5 au icyco 'l carbodiîuîde, le procédé. Ilauydrida d.acMoe9 lo POcdG 3 la-îdeG celui à l'ester ectiîf, ot c. l oct o &table que e l @pe amino de la nlycido nutlice coo.G r6ctA2if 2: soit praotgG et le Cnp rocpoe ut% liîoà cette fin doit être different de CeGuS qui proeGent eo roMpes amino en 1 et on 2' et le groupe methylaomin em.,de Il istalycúnn Aa o B0 il doit i 3re facile à ltieoa im- Big le (quui a-protect peotaGG le Croppo oui de la glycieé c hoieLe Cooee reactif peut tre coiso poarmi les 51azL ce a.e-6prec5 ur cr& plus a t et uel- quos groupec nEMîrç -Xte'eure dCivatleFnte D cooe cous da type base de chiffo La 8action acayltiom aavec u n aG= tif ly cine oSt efẻcee de a eufncemf@ am&uenm prcódt. a!'eeter actif9 dans ut colvant oraiq o e le dioxanne en chauffant à une température de %00 à 609C et l'on obtient le compoes de formule (IV)o IDaMM une forMe de mise en oeuvre préférée, on acyle ioacimyciîme, -12,6 tri-N-protégée sur le groupe 4-u&thylamino avec laeter de N-hydrcysmciniaide de la lma Nte t-butozycar oylgly cine, ea forEaent ainos un conipoc ins eriEare prot de foraule (6I1W) R 5tant ug;roupee AmenzylomrcOr oEReD étant l'hydrogène et T le groupe tert-butoxycarbonyle. Dans une forme de mise en oeuvre préférée, on acyle la 1,a'e6'-tri-N-tert-butoxycarbonylistamycine B0 sur le grou- pe 4-méthylamino avec l'ester formé par le N-hydroxysucci- nimide avec la N-benzyloxycarbonylglycine et l'on obtient ainsi un composé intermédiaire N-protégé de formule (IV), R étant le tert-butylcarbonyle, A l'hydrogène et B le grou- pe benzyloxycarbonyle. L'étape suivante consiste en l'élimination sélecti- -protecteuJ ve du groupe amino a artie glycine du composé de formule (IV) amino-et méthylaminoprotégé pour obtenir le composé de départ de formule (V) désiré, qui correspond à l'istamycine A ou B 1,2',6'-tri-N-protégée. L'élimination du groupe amino-protecteur associé au groupe amino de la partie glycine du composé de formule (IV) peut habituelle- ment s'effectuer de manière connue, par exemple par hydro- génolyse en présence de palladiumn d'oxyde de platine, etc. comme catalyseur pour l'élimination d'un groupe aralkyloxy- carbonyle, ou par hydrolyse dans une solution aqueuse d'a- cide trifluoracétique, d'acide acétique, etc. ou une solu- tion aqueuse diluée d'un acide tel que l'acide chlorhydri- que, pour l'élimination d'autres groupes amino-protecteurs. Des formes typiques de mise en oeuvre du procédé selon l'invention sont maintenant expliquées. Dans la pre- mière étape de ce procédé, on fait réagir le composé de formule (V) avec un iminoéther pour transformer le groupe amino de la partie glycine de l'istamycine A ou B 1,2',6'- tri-N-protégée en groupe amidine. Le réactif iminoéther peut en être un de formule: R'OCH=NH, dans laquelle R' représente un groupe alkyle inférieur ou un groupe aralkyle comme le benzyle, ou un sel d'addition d'acide correspondant, comme un chlorhydrate et un sulfate. L'utilisation d'un chlorhydrate d'iminoéther, comme l'é- thylformimidate chlorhydrate ou le benzylformimidate chlur- hydrate est préférable. La réaction peut être conduite dans un solvant organique comme le dioxanne et le méthanol 2482 1 08 ou dans une solution aqueuse à une température inférieure à 30 C, d'une manière connueo Le composé de formule (VI) qui en résulte, la formimidoylistamycine A ou B 192',6'- tri-N-protégée, ou un sel d'addition d'acide de celle=ci, peut être purifié par chromatographie sur colonne en uti- lisant un gel de silice ou autre adsorbant convenable. Dans la seconde étape du procédé selon l'invention, les groupes aminoprotecteurs restants sur le composé de fúor mule (VI) peuvent être éliminés d'une mani&re connue, en procédant co.me décrit plus haut, pour donner la foruimiî doylistamyciae A ou B désirée de formule (1) sous la forme d'un sel d'addition d'acideo Donc, en combinant le procédé oelon linvention a- vec le procédé de préparation du composé de départ de for- mule (V)9 on obtient un procëdC de préparation de la form imidoylistanayene A ou B à partir de l istaanycino A o Bo@ procdé& qui consiste en bref à acyler le gSoupe s&ÄyLa mino de l'istamycine A0 ou Bo avec la forsi9id clyci e0 La processes général pour cela consiste à proté&gr les l ron. pes 1- et 2'-amino et le groupe 6-méathylamimno de lista- mycine A0 ou Bo avec un groupe amino-protecteur9 à intro= duire un groupe glycyle sur le groupe 4-méthylamino de 1' istamycine A. ou BO 1,2',6e-triN-protégée, à convertir ce groupe glycyle en groupe formimidoglycyle, puis à en- lever leur protection & tous les groupes amino et m6thyl- amino protégés du composé obtenu. Les formimidoylistamycines A et B selon l'invention ont une forte activité antibactérienne et présentent une faible toxicité pour les animaux. En conséquence, ces for- mimidoylistamycines A et B peuvent, comme les antibioti- ques connus, être utilisées comme agents antibactériens et peuvent être présentées sous des formes pharmaceutiques connues et administrées de la même façon que les antibio- tiques déjà existants. Sous un autre aspect, leinvention fournit done une composition pharmaceutique comprenant u- mne proportion d'une efficacité antibactérienne certaine d'au moins un des composés du groupe comprenant la formi- 14 - midoylistamycine A, la formimidoylistamycine B et un sel d'addition d'acide de cellesci, en combinaison avec un support pharmaceutiquement acceptable. Selon un autre as- pect encore de l'invention, il est prévu un procédé pour inhiber la croissance des bactéries, qui consiste A admi- nistrer une proportion d'une efficacité antibactérienne d' au moins un des composés du groupe formé par la formimi- doylistamycine A, la formimidoylistamycine B et les sels d'addition d'acide de celles-ci à un animal sensible à la prolifération bactérienne. On comprendra que les propor- tions préférées réelles peuvent varier selon la composition particulière mise en formule, le mode d'application, le si- te et l'organisme traité. De nombreux facteurs suscepti- bles de modifier l'action du remède seront pris en considé- ration par l'homme de l'art, par exemple l'ge, le poids du sujet, son sexe, le régime alimentaire, le moment de 1' administration, le taux d'excrétion, les combinaisons de m&dicaments, les sensibilités aux réactions et la gravité de la maladie. Les posologies optimales pour une série de conditions donnée peuvent être déterminées par l'homme de l'art au moyen d'épreuves de posologie classiques en te- nant compte des directives ci-dessus. A titre de directive générale, les dosages appropriés des formimidoylistamycines A et B administrées par injection intramusculaires pour un traitement efficace d'infections bactériennes varient entre 50 et 500 mg par personne de deux A quatre fois par jour. Les exemples suivants illustrent la préparation des composés selon l'invention et en embrassent toutes les é- 3O tapes A partir de l'istamycine A0 ou B. Exemple 1 Préparation de la formimidoylistamycine A (1) 1,2',6'-tri-Nbenzyloxycarbonylistamycine A (formule (III), dans laquelle R = benzyloxycarbonyl, X' = -NHR et Y' = hydrogène). On ajoute à une solution de 1 g (3 moles) d'istamy- cine A dans 40 ml de méthanol 0,72 ml de triéthylamine, ea20 puis une solution de 2,1 g (8 1 noles) de Nlbenycarbo- nyloxysuccinrûide dans 12 nl de mtthano tout eno agtlan.t On agite le mélange qui en résulte à la teuperatue a.mbian te pendant 2 heures. On concentre ensuite la solutîen r6 actionnelle à siccit6 et l'on fait dissoudre l rsAdu dans 60 1l de chloroforFe. On lave cette 001ntion dans le chloro-f Pe arve 60 mal d'eau et on concentre la c che de chleorofofre à siccité, ce qui donne une poudre bute (a0 27)o a 0 t diAascoudre cette poudre dams 3 al de di- naO ehcelroa&taane at l'on Lait paacaer la solution a Uravarz E ae olonnee de 35,5 do gae de silice (CC_7? prodUit par - ll I lae ii aD). @nul Iavu eansuite la colo avec 560 ml d-%Ean nlane aei nt@.mmehauan et d ze:!e dan o IuEa)o PUAS e n 61MCa zzvec un delan2 ds 3 gaae. 02rnnta :I5(2O/iI, Gan vow t l'no in 9 n dI pirodmît dca le Jan ansaaat22 6 2)! 2 o 2ee 6 9 3 Zc'àrl9éle3r 2te l$3 %e:rJ;a= nylisc'anyciea A unenmula XV}) dens Xaqo ele al = beamn3l= o:aJcarbo!ylea A = dryoeSSmea E = tearyeTobe: smenycns le9 2e= 9 = hyrogène @On ria; disseudre 93: mç? g:,27 roaLe)) de 2,6 = tir. [.;aonesyle:ca benmylicuEat iay e o eàtamnsa V Glsmae de 119o tape (1) dans 30 MI de ed io:an9 puis eOn ajeC-tla an eselm- ieio e 0 2 u l da 8Fahlie elna t c éo a50 mg. 39@ 0lem) d'00,ter du.Iy ILIai avGc la 1arStozyD aar n3ylSlyScine dans S ml de óileoarme et ':IO af ite lae mc lane à 6@0C pendeant 5 hemeSoa On-e ecara la aslîte'ien r&ac iomelle3a à si62ccit. atl 'tos eeletIt@ Une peodre arute0 Oi faît disseeaPe cette pouedre dans 5 l dce d ei lcata-a Do ne et ' or, fait passeOr a solution à tarms 150 g dSe Srta deC silice (CC07V produit par E2linceYrotn Xnco)o On 6le es.l iee la Celonae avec mun rmlaie dl e itcle ae t el:6tPel (aee/29 en valnea)o on úait disseondra la pondre brE% eui ean Persnle danes 5 21 dEe.tam l t l'On L2,ait ?5 PnoGaLsse ceatt seolutîion à taerzs male colonn e de O0 {I de Sepla{ed: aLï2 {due!it par FaFni3a Co o Sde) On @ 6ime a0ao n-t uanl det Von êGt;ans ce cn m-5 pur recherché, sous forme de poudre. Rendement: 39%. (3) Formimidoylistamycine A (formule (I), dans laquelleX= amino, Y = hydrogène). On fait dissoudre 388 mg (0,44 mmole) de 1,2',6'- tri-N-benzyloxycarbonyl-2"-tert-butoxycarbonylistamycine A obtenue à l'issue de l'étape (2) dans 5 ml d'une solution aqueuse A 90% d'acide trifluoracétique et on laisse repo- ser la solution à la temp6rature ambiante pendant 45 minu- tes, après quoi on la concentre A siccité. On lave le ré- sidu à l'éther ordinaire (20 ml) et l'on obtient 375 mg de trifluoracétate de 1,2',6'-tri-N-benzyloxycarbonylista- mycine A. On fait dissoudre ce trifluoracétate dans un mé- lange de 60 ml de méthanol et de 8 ml d'eau, puis on y a- joute goutte A goutte unesolution de 426 mg (2,5 mmoles) de benzylformimidate chlorhydrate dans 10 ml de méthanol I * pendant environ 15 minutes en refroidissant avec de la gla- ce, tout en réglant le pH de la solution à 8,5 par addi- tion d'une solution aqueuse à 0,5 N d'hydroxyde de potas- sium. On agite le mélange r6actionnel pendant encore une heure en refroidissant à la glace pour achever l'introduc- tion du groupe formimidoyle -CH=NH, puis on règle le pH à 3,7 en ajoutant de l'acide chlorhydrique à 1IN et l'on con- centre A siccité. On fait dissoudre le résidu à siccité dans 100 ml de chloroforme et on lave avec 2 fois 30 ml d' eau, après quoi on concentre à siccité la couche chloro- forme séparée, ce qui donne 411 mg d'une poudre brute.On fait dissoudre cette poudre dans 3 ml d'un mélange de chlo- roforme et de méthanol (20/1 en volume) et on purifie la solution par chromatographie en la faisant passer à travers une colonne de 20 g de gel de silice (CC-7), après quoi on élue avec un mélange de chlorofore e r ie i.,thanol (20/1 en volume). On obtient ainsi 193 mg de chlorhydrate de 1, 2',6' -tri-N-benzyloxycarboi.yl-2" -N-fornimindoylistamycine A sous la forme d'une poudre. Rendement: 54%. On fait dissoudre les 193 mg (0,24 mmole) de poudre obtenus dans 12 ml d'un mélange de méthanol, d'acide acéti- que et d'eau (2/1/1 en volume) auquel on a ajouté 100 mg de catalyseur à 5% de palladium sur du carbone, puis on soumet le mélange à hydrogénolyse dans un courant d'hydro- gène à la température ambiante pendant 4 heures pour êli- miner les groupes amino-protecteurs restants. Après élimi- nation du catalyseur par filtration, on concentre la solu- tion réactionnelle à siccité et on fait dissoudre le rési- du dans 1 ml d'eau. On fait passer cette solution à tra- vers une colonne de 12 ml d'une résine anionique fortement basique, Amberlite IRA 400 (forme SOi4; produite par IRohm & Haas Co.). L'élution avec de l'eau suivie d'une concen- tration de l'éluat à siccité donne 134 mg du produit re- cherché sous la forme de disulfate.triîydrate, qui a l'as- peet d-'une poudre. Le rendement est de 82%Qo Exe P ation de la form tidoyflis ci e (1) 1, 2', 6 ' -tri-N-butoxycarbonyliotamycine B0 (forule (III), dans laquelle R = tert-butoxycarbonyle, X' = hy- drogène, Y = -NHR) A.une solution de 500 mg (1,5 cole) d'istntayoime B0 dans 20 ml de méthanol, on ajoute 500 mg (2,3 =ole) d'a- cétate de zinc et l'on agite le mélange a la température ambiante pendant 5 heures. On ajoute ensuite au m'lange 17,1 g (6,9 mmoles) de 2-(tert-butoxycarbonyloxyimino)- 2-phénylacétonitrile (produit par Aldorich Co., U.SoA. sous l'appellation de BOC-ON) et on agite le m5lange toute une nuit à la température ambiante. On concentre la solu- tion réactionnelle à siccité et 1 'on purifie la poudre ob- tenue par chromatographie sur colonne de gel de silice (gel de silice: 100 g de Wako gel C-200, produit par Ilako Junyaku K.Ko; éluant: mélange de chloroforie et de métha- nol à raison de 10/1 en volume), ce qui donne 412 msg du composé recherche sous la forme d'une poudre. Rendement: 44%. Point de décomposition 71 à 74'C. Pouvoir rotatoire Ca22 + 50 (c 1,0, méthanol); Rf 0,28 dana le gel de si- lice TLC (mélange de chloroforme et de méthanol à raison de 4/1 en volume) .e (2)2 N-benzyloxycarbonyl-1, 2',6' -tri-N-tert-butoxycarbonyl- istamycine B (formule (IV), dans laquelle R = tert- butoxycarbonyle, A = hydrogène, B = benzyloxycarbony- le, X' = hydrogène, Y' = -NHR). On fait dissoudre 200 mg (0,32 mmole) de 1,2',6'- tri-N-tert-butoxycarbonylistamycine B0 obtenue à l'issue de l'étape (1) dans 6 ml de dioxanne et l'on ajoute à la solution 0,10 ml de triéthylamine et 235 mg (0,76 mmole) de l'ester de N-hydroxysuccinimide avec la N-benzyloxy- carbonylglycine. On agite le mélange à 60'C pendant 2 heu- res, puis on concentre A siccité pour obtenir une poudre brute. On purifie cette poudre par chromatographie sur co- lonne de gel de silice (gel de silice: 30 g de Wako gel C-200; éluant: mélange d'acétate d'éthyle et de toluène & raison de 3/2 en volume) et l'on soumet la poudre purifiée A une purification plus poussée en la faisant dissoudre dans du méthanol et en faisant passer cette solution A tra- vers une colonne de 30 ml de Sephadex LH-20 (produit par Pharmacia Co., SuAde), ce qui donne, après concentration A siccité, une poudre du produit recherché (246 mg). Le ren- dement est de 94%. Point de décomposition 104 A 1101C. Pou- voir rotatoire:. D23 + 440 (c 1, méthanol); Rf 0,45 en gel de silice TLC (mélange d'acétate d'éthyle et de toluè- ne à raison de 7/2 en volume). (3) 1,2',6'-tri-N-tert-butoxycarbonylistamycine B (formule (V), dans laquelle R = tert-butoxycarbonyle, X' = hy- drogène, Y' = -NHR) On fait dissoudre 237 mg (0,29 mmole) de la 2"-N- benzyloxycarbonyl-1,2',6'-tri-N-tert-butoxycarbonylista- mycine B obtenue à l'issue de l'étape (2) dans 15 ml de mé- thanol à 80% et 0,01 ml d'acide acétique. On soumet la so- lution A hydrogénolyse dans un courant d'hydrogène en pré- sence de 50 mg de catalyseur à 5% de palladium sur du car- bone A la température ambiante et sous la pression atmos- phérique pour éliminer le groupe benzyloxycarbonyle. La concentration à siccité de la solution donne une poudre brute (237) du produit recherché, sous la forme de l'acé- tate. 2482108 - (4) Formimidoylistamycine B (formule (1)) On fait dissoudre 200 -mg de la poudre bute deéota- te de 1, 2 ', 6 '-tri-N-tert-butoxycarbonylistamycine B obtGnu' à l'issue de l'étape (3) dans 20 ml de méthanol et 233 ag (291 Ienoles) d' thylformimidate chlorhydrate $ent snmsuite ajoutés à la so1ution. On agite le mIlange à la tesragt re ambiante peadant 4 heures pour introduire un 3roupG formimidoyle -CH=NH On coneentre la solution réactiom e2l le à Siócite et l'eon purifie la poudre Li en ralEte par IO uchro.atograp'ic 5Pr Colonne de gSl de Silice (gel de 0iliL ce: %2 g de %akXo gel C-200; euano Eelane de Chlorolfor- me et de Felthamel = 7/1 en velmaeh De Ca i nd e c2 _ do une poudre qui' ost da chlrhydrate de!2%6V rioet lbutoBcgazb ztylfrii7Lsde-sta,ycia B. Le remdeEaent eGot de 1538% 0 On fmAt idîoeourG 51 (093 r071. aie) de cette pou- dre dans 2 Gil d'acide triflurEOctiUe I 90% e t 1on mainml tient la Go!aion I@ ur n e ctemaepe,r.ise ente 0 et 5 0 pen,-at 2 homaos per pocem a la acetiom cltoio de la pro@tectioe ars$' quoi on cemetre i acxXs c On f9i.t dLss 3dre m l.a mudre bsr e aisai o btonne dams do leeau et on fait pa0oGr l 2ol ion à rQareo ue Mcolonne de % 1 M d'tnna Frsîne anioaîqqae î'na o9Eo tG ETP, 4%00 (forme $P0c. rpo nite pnaxv MoAr. tC Cas' uCo)o LQlvteiO aVsc de l eau0 siv ne eoncetrai o n s l luant r cioci% daonn 4"D sîg du coEîoPS reG r c'Guo; e GT Mla ?oreG d diedu r la= te. dihydrate9 qui a IaePCt d'2n e POdZ-0o LOs rosmnLGneGMt est de 97%- - REVENDICATIONS - 1.- Dérivés nouveaux des istamycines A et B, carac- térisés en ce qu'ils ont pour formule: 6' - OH3C 11lé6 X 3' NH2 O OH (I) CH NCH3 COCH NHCH=NH dans laquelle X et Y représentent chacun un groupe amino ou un atome d'hydrogène, X étant un groupe amino lorsque Y est un atome d'hydrogène (formimidoylistamycine A) et inversement X 6tant un atome d'hydrogène lorsque Y est un groupe amino (formimidoylistamycine B), et leurs sels d' addition d'acide. 2.- Dérivés nouveaux selon la revendication 1, ca- ractéris6s en ce qu'ils sont la formimidoylistamycine A et un sel d'addition d'acide de celle-ci. 3.- Dérivés nouveaux selon la revendication 1, ca- ractéris6s en ce qu'ils sont la formimidoylistamycine B et un sel d'addition d'acide de celle-ci. 4.- Procédé de pr6paration des dériv6s nouveaux selon la revendication 1, caract6ris6 en ce qu'il consiste à faire réagir un composé de formule: H3CN- R1 Y' (V) NCH. COCH2 NH2 dans laquelle X'et Y' représentent chacun soit un groupe -NHR, soit un atome d'hydrogSne, X' étant un g'oupe -HER lorsque Y' est un atome d'hydrogène (série istawycine A) et inversement X' éitant un atome d'hydrogène lorsque Y' est un groupe -NHR (série istamycine B), et R repraaente un groupe aminlo-protecteur onovralenlt, avec tun iwinolther, pour convertir le groupe amino dans la partie glycine du compos6 de formule (V) en un groupe amidine, et former ainsi un composé de formule: 6' H CN R Y, 3' X' (VI) OH OCH- NCH3 COCHI2NHCH-=NH dans laquelle X', Y' et R ont les m'mes définitions que dans la formule (V) puis A éliminer les groupes amino- protecteurs des positions 1, 2' et 6' du composé de for- mule (VI). 5.- Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une proportion d'une efficacité anti- bactérienne sgre d'au moins un des dérivés nouveaux selon la revendication 1 ou de leurs sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables, en combinaison avec un support pharmaceutiquement acceptable.