Brevet FR2480781A1 — publié le 19811023

Suite à l'apparition de la technologie de l'a- cide désoxyribonucléique (ADN) recombinant, la produc- tion bactérienne contrôlée d'une énorme variété de poly- peptides utiles est devenue possible. I1 existe déjà des bactéries modifiées par cette technologie et permet- tant la production de produits polypeptidiques tcels que la somatostatinc (K. Italkura et al., Science 198, 1056 [1977]), les chalnes A et B (composantes) de l'insuline humaine (D.V. Goeddel et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., E.U.A. 76, 106 [1979]) et].'lioiione de eroissance hu- mniaine (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]). Plus récemment, on a adopté des techniques à l'ADN re- combinant pour assurer la production bactérienne de la thymosine alpha 1, qui est une substance de potentiali- sation iiimune produite par le thymus (demande de brevet (les Etats-iJnis dlAmérique de lRoberto Crea et Ronald Wetz(el, déposée le 28 Février!9S80 au nom de la Deman- deresse). Le pouvoir de cette technologie est tel que pratiquement n'importe quel polypeptide utile peut être produit par voie bactérienne, tout en permettant la fabrication contrôlée d'hormones, dl'enzymes, d'anti- corps et de vaccins contre une large variété de mala- dies. La littérature précitée o l'on décrit plus en détail les exemples représent;atil's mentionnés ci-dessus est reprise ici à titre de référence, au même titre que (T'autres publications mentionnées dans la présente spé- cification, afin de clarifier le fondement de l'inven- tion. Le cheval de bataille de la technologie de 1tADN recombinant est le plasmide, c'est-à-dire une boucle non chromosomique dle l'ADN bicaténaire que l'on trouve dans les bactéries et, très souvent, en copies multiples par cellule bactérienne. Les informations codées dans 1'ADN du plasmide englobent celle requise pour reproduire le plasmide dans cldes cellules filles (c' est-à-dire un t"réplicon") et habituellement une ou plusieurs caractéristiques de selection telles que la résistance aux antibiotiques, permettant aux clones de la cellule hôte contenant le plasmide concerné d'être reconnus et de croître de manière préférentielle dans des milieux sélectifs. L'utilité des plasmides bacté- riens réside dans le fait qu'ils peuvent être clivés specitiquCmen1t par l'une ou l'autre endonucléase de rest-'iction ou "enzyme de resUriction'i reconnaissant chacune un emplacement différent sur l'ADN plasmidique. Ensuite, des fragments de gènes ou des gènes hétérolo- gues peuvent être insérés dans le plasmide en étant réunis bout à bout à l'emplacement du clivage ou à des extrémités reconstruites près de ce dernier. Telle qu'elle est utilisée dans la présente spécification, l'expression "!hétérologue" désigne un gène que l'on ne trouve habituellement pas dans E. coli ou une séquence de polype(pt.i.dós qui n'est hab itueLlenient pas produite pap cette bactférie, tandis q(ue l'expression "homologue" désigne un gène ou un polypeptide produit dans E. coli de type sauvage. La recombinaison de 1'ADN s'effectue à l'extérieur de la bactérie, mais le plasmide "recom- binant" obtenu peut être introduit dans la bactérie par un procédé connu sous le nom de "transformation", tandis que d'importantes quantités du plasmide recombi- nant contelnant un gène ht6U'oloauc peuvent être obentiues pa1t li a croissance du transLomnajtL. De plus, lorsqlue. le gCène est inséré de manière adéquate en référencc it des parties du plasmide qui cldéterminent la traiiscrip- tion et la traduction du message codé de l'ADN, le véhicule d'expression obtenu peut être utilisé pour produire réellement la séquence de polypeptides pour laquelle le gène inséré effectue le codage; ce procédé est appelé "expression". L'expression est amorcée dans une zone connue sous le nom de "promoteur" qui est reconnu et fixé par la polyvinrase de l'acide ribonucléique (RNA). Dans certains cas, par exemple, dans l'opéron de trD dont il sera question dans la présente spécification, des zones de promoteurs sont chevauchées par des zones d'"opérateurs" pour former une combinaison promoteur/opérateur. Les opérateurs sont des séquences d'ADN qui sont reconnues par des protéines dites "répresseurs" servant à régler la fréquence du déclenchement de la transcription sur un promoteur particulier. La po]yliérase Voyage le long dle ltADN on transcrivant les informations contenues dans le brin de codage entre les extrémités 5' et 3' de ce dernier, en RNA messager qui est à son tour traduit en un polypeptide comportant la séquence d'acides ami- nés pour laquelle l'ADN effectue le codage. Chaque acide aminé est codé par un triplet de nucléotides par- ticulier ou "codon" à l'intérieur de ce que l'on peut appeler, pour l'objet de la présente invention, le "gène structural", c'est-à-dire la partie qui encode ] a séquence d'acides aminés (lu produit exprimé. Après sa fixation sur le promoteur, la polymérase de RNA transcrit tout d'abord les nucléotides encodant un em- placement de fixation de ribosomes,puis un déclenche- ment de traduction ou un signal de "démarrage" (habi- tuellement ATG qui, dans le RNA messager obtenu, de- vient AUG) et ensuite les codons de nucléotides dans le gène structural lui-même. Les codons dits d'arrêt sont transcrits à la terminaison du gène structural, après quoi la polymérase peut former une séquence sup- plémentaire de RNA messager qui, par suite de la pré- sence du signal d'arrêt, reste non traduit par les ri- bosomes. Les ribosomes se fixent à l'emplacement de fixation prévu sur le RNA messager (dans les bactéries, habituellement à mesure que le mRNA se forme) et ils produisent eux-mêmes le polypeptide encodé, en commen- çant au signal de démarrage de traduction pour se ter- miner au signal d'arrêt mentionné ci-dessus. Le pro- duit désiré est obtenu si les séquences encodant le point de fixation des ribosomes sont placées de ma- nière adéquate par rapport au codon initiateur d'AUG et si tous les codons restant s suivent le codon initia- teur en phase. Le produit formé peut être obtenu en lysant la cellule hôte et en récupérant le produit d'une autre protéine bactérienne moyennant une purification appropriée. Les polypeptides exprimés par l'adoption de la technologie de l'ADN recombinant peuvent être entière- mllent hétérologues comme c'est le cas pour l'expression directe de l'hormone de croissance humaine ou, en va- riante, ils peuvent comporter un polypeptide hétérolo- gue auquel est fusionnée au moins une partie de la sé- quence d ' acides aminés d'un peptide homologue, comme c'est le cas pour la production de produits intermé- diaires pour la somatostatine et les composants de l'insuline humaine. Dans ce dernier cas, par exemple, le polypeptide homologue fusionné comprend une partie (le la séquence d'acides aminés pour la P-galactosidase. Dans ce cas, le produitblo-actif| envisagé est bio-inacti- vé par le polypeptide homologue fusionné jusqu'à ce que ce dernier soit clivé dans un environnement extracellu- laire. Les protéines de fusion telles que celles 'qui viennent d'être mentionnées, peuvent être conçues pour permettre un clivage hautement spécifique de la protéi- ne précurseur hors du produit envisagé, par exemple, par l'action; du bromure (de cyailogèrne sur la méthioninc ou, en variante, par clivage enzymatique (voir, par exemple, le brevet britanniquc publié n 2.007.676 AI Si la technologie à i 'ADN recombinant doit tenir pleinement ses promesses, il convient d'élaborer des systèmes optimalisant l'expression des gènes insé- rés de telle sorte que l'on puisse obtenir les produits polypeptidiques envisagés avec un haut rendement. Quoi- que utiles, les systèmes promoteurs/opérateurs de P- lactamase et de lactose que l'on a le plus couramment utilisés antérieurement, n'ont pas exploité pleinement la capacité de cette technologie du point de vue rende- ment. Il s'est avéré nécessaile d(le trouver un véhicule d'expression bactérienne capable d'assurer l'expression contrôlée de produits polypeptidcliques désirés avec un rendement plus élevé. Le tryptophanne est un acide aminé produit par les bactéries et que l'on utilise conmme partie constitu- tive des polypeptides homologues dans un cycle bio- synthétique se déroulant contmme suit: acide chorismique acide anthranilique > acide phosphoribosyl- anthranilique -> CDRP [énrI,)i-1--(o-carboxyphénylamino)- l-désoxy-D-ribulose-5-phosphate_] - indol-3-glycérol- phosphate et, finalement, le tryptophanne lui-même. Les réactions enzymatiques de ce cycle- sont catalysées par les produits du tryptophanne ou opéron "trp" qui est un segment polycistronique d'ADN, lequel est trans- crit sous la direction du système promoteur/opérateur de trp. Le RNA messager polycistronique obtenu encode la séquence dite directrice de trp puis, dans l'ordre, les polypeptides désignés par trp E, trp D, trp C, trp B et trp A. Ces polypeptides catalysent et contrô- lent de diverses manières les étapes individuelles du c)ycle acide chorismique -> tryptophanne. Dans E. coli de type sauvage, leopéron de tryp- tophanne est sous au moins trois formes distinctes de contrôle. Dans le cas de la répression promoteur/opé- rateur, le tryptophanne agit comme corépresseur et il vient se fixer sur son aporépresseur pour former un complexe répresseur actif qui, à son tour, vient se fixer sur l'opérateur, fermant ainsi la totalité du cycle. En deuxième lieu, par un processus d'inhibi- tion de rétro-action, le tryptophanne vient se fixer sur un complexe des polypeptides trp E et trp D, empê- chant ainsi leur participation au cycle de synthèse. Enfin, le contrôle est effectué par un procédé connu sous le nom d'atténuation" sous le contrôle de la "zone d'atténuation" du gène, cette zone se trouvant dans la séquence directrice (le ti'p. (Voir, d'une mnia- nière générale, G.F. Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457 (1978); The Operon z63-302, Cold Spring Harbor Laboratory (1978), Miller et Reznikoff, éds. F. Lee et ail, Proc. Natl. Acid. Slci. E.U.A. 74, 4365 (1977) et K. Bertrand et ai, J. 5;ol. Biol. 103, 319 (1976)). Le degré d'atténu.:ti-in semble être gouverne par la concentration intracel! tl ire du tryptophanne et, dans E. coli de type saUv.ac, dans environ neuf cas sur dlix, latténuateur termine l'expression proba- blement par]la formation d'une structure secondaire ou "boucle de terminaison" dans le RNA messager, donnant ainsi lieu au désengagement prématuré de la polymérase de RNA vis-à-vis de l' ADN associé. D'autres chercheurs ont utilisé ltopéron de trp pour obtenir une certaine mesure de ltexpression des polypeptides hétérologues. On pense que ces travaux ont eu pour but de tenter de résoudre les problèmes de répression et d:atténuation par addition d'acide indole- acrylique, qui est un inducteur et un analogue entrant en compétition avec le tryptophanne pour les molécules de répresseurs de trp tendant vers une dérépression par inhibition compétitive. En même temps, l'inducteur diminue l'atténuation en inhibant la transformation enzymatique de l'indole en tryptophanne, mettant ainsi efficacement la cellule en état de carence de trypto- phllannie. En conséquence, une plus grande quantité de polymérases sont lues cfficacement par l'atténuateur. Toutefois, cette méthode semble être problématique en ce qui concerne l'obtention d'une traduction logique et d'tun rendement élevé, étant donné que la synthèse des séquences de protéines contenant du tryptophanne est prématurément arrêtée suite à l'absence de trypto- phanne utilisable, En fait, une réduction efficace de l'atténuation par cette méthode dépend entièrement d( 'lune carence importante Cn ti.ypt.ophanne. L a présente invention aborde les problèmes associés] l'atténuation eL l 1.. eépression du triypto- pliannec d'lunÀe maniere di fé rent.e et elle prévoit: (1) un procédé en vue d'obtenir un véhicule d'expression conçu pour l'expression directe de gènes hétérologues à partir du promoteur/opérateur de trp, (2) des procé- dés en vue d'obtenir des véhicules conçus pour l'ex- pression, au départ de l'opérateur/promoteur de tryp- tophanne, de polypeptides spécifiquement clivables et codes par des fusions dle gènes hlomologues-hétérologues et (3) un procédé en vue d'exprimer des polypeptides hétérologues d'une manière contrôlable, efficace et avec un haut rendement, de même que les éléments as- sociés à ce procédé. Suivant la présente invention, on prévoit de nouveaux véhicules d'expression plasmidique pour la 'pro- duction, dans les bactéries, de produits de polypepti- des hétérologues, ces véhicules comportant une séquence d'ADN bicaténaire comprenant, en phase depuis une pre- mière extrémité 5' jusqu'à une deuxième extrémité 3' du brin de codage, un promoteur/opérateur de trp, des nucléotides assurant le codage de l'emplacement de fixation des ribosomes directeurs de trp, ainsi que des nucléotides encodant le début de traduction pour l'ex- pression d'un gè'ne structural encodant la séquence d'acides aminés du polypeptide hétérologue. La séquence d'ADN dont il question, ne contient ni une zone d'atté- nuateur de trp, ni des nucléotides codant l'emplacement de fixation des ribosomes E de trp. Au contraire, l'em- placement de fixation des ribosomes directeurs de trp est utilisé efficacement pour effectuer l'expression de llinformnation codée par un gène inséré. Les cellules sont transformées par l'addition des plasmides de l'invention contenant le promoteur/ opérateur de trp et dépourvus d'atténuateur, tandis qu'elles croissent en présence de tryptophanne com:. e additif. L'utilisation de milieux riches en trypto- phanne fournit une quantité dle tryptophanne suffisante pOUr' rtpl'i.mer cssenticLl]cim(i(. 'ncmplètement le promiot(ur'/ operateuttl' dtc trp par des int.vl.,a(:(.ions trp/rpl-csseu]', si bien que la croissance (des cellules peut se dérouler sans être inhibée par l'expression prématurée d'impor- tantes quantités de polypeptides hétérologues codés par une insertion par ailleurs sous le contrôle du système promoteur/opérateur de trp. D'autre part, lorsque la culture du recombinant s'est développée jusqu'aux niveaux appropriés pour la production industrielle du polypeptide, on élimine la source extérieure de trypto- phanne, la cellule ne dépendant alors que du trypto- phanne qu'elle peut elle-même produire. Il en résulte une limitation modérée du tryptophanne et, par consé- quent, le cycle subit une dérépression et l'on obtient une expression hautement efficace de l'insertion hiétérologue sans aucune inhibition par atténuation, puisqu'aussi bien la zone d'atténuateur a été supprimce du système. De la sorte, les cellules ne subissent jamais une privation gtrave de tryptophanne et toutes les protéines (qu'elles contiennent du tryptophanne ou non) peuvent être produites avec de hauts rendements. En outre, l'invention fournit des moyens per- mettant de cliver l'ADN bicatènaire en n'importe quel point désiré, même en absence d'un emplacement d'enzyme de restriction, cette technique étant utile, entre autres, pour la création d'opérons de trp comportant des délétions d'atténuateurs et différents de ceux ob- tenus antérieurement par sélection de mutants. Enfin, l'invention fournit une variété de pro- duits intermédiaires et de produits finals utiles, y compris des protéines de fusion hêtérologues/homolo- gues spécifiquement clivables et stabilisées contre la dégradation dans les conditions d'expression. La façon de réaliser ces différents objets et avantages de l'invention, ainsi que d'autres, apparai- tra plus clairement-à la lecture de la description détaillée ci-après donnée crin se référant aux dessins annexés dans lesquels: les figures 1 et 9 illustrent chacune un sche- ma préféré pour la formation de plasmides capables d'ex- primer des gènes hétèrologues sous forme de fusions avec une partie du polpTepticde D de trp, fusions desquelles ils peuvent être clivés ultérieurement; la figure 3 montre le résultat de la ségréga- tion, sur tIcl de polyacrylamide, de protéines de fusion homologue (trp D')/hétérologuc (.somatostatine ou thymo- sine t 1) contenant des protuines cellulaires; les figures 4, 5 et 6 i] lustrent des stades successifs d'un schéma préféréel' pour la création d'un plasmide capable d'exprimer directement un gène hétéro- logue (hormone de croissance humaine) sous le contrôle du système promoteur/opérateur de trp; la figure 7 illustre le résultat de la ségré- gation, sur gel de polyacrylamide,de l'hormone decrois- sance humaine contenant des protéines cellulaires, ex- primée directement sous le contrôle du système promo- teur/opérateur de trp; les figures 8, 9(a-b) et.10 illustrent les sta- des successifs d'un schéma préféré pour la création de plasmides capables d'exprimer des gènes hétérologues (dans le cas illustré, pour la somatostatine) sous forme de fusions avec une partie du polypeptide E de trp, fusions desquelles ils peuvent être clivés ultérieurement; la figure 11 illustre le résultat de la ségré- gation, sur gel de polyacrylamide, de protéines de fu- sion homologue (trp E)/hétérologue contenant des pro- téines cellulaires, respectivement pour la production de somatostatine, de thymosine C 1, de pro-insuline hu- maine et des chaînes A et B de l'insuline humaine; les figures 12 et 13 illustrent les stades successifs de la méthode par laquelle on manipule le plasmide créé selon les schémas des figures 8 à 10 inclus pour former un système dans lequel d'autres gè- nes lhétérologues peuvent ctrc exp. imés de manière in- tcrchln.gceabtlc sous forme de l'usiotis avec des séquences de polypeptides E de trp. Dans les dessins annexés, pour la clarté de l'illustration, dans la plupart des cas, on ne repré- sente que le brin de codage du plasmide bicaténaire et des acides désoxyribonucléiques linéaires. Les gènes d encodage de résistance aux ant ihiotiques sont désignés R par ap (ampicilline) et par teI (tétracycline). La légende tce désigne un gène pour la résistance à la tétracycliue, qui n'est pas suus le contr6le dlun sys- tème promoteur/opérateur, de sorte que]les plasmides contenant ce gène seront néanmoins sensibles à la té- tracycline. La légende "lapS désigne la sensibilité à l'amnipicilline résultant de la délétion d'une partie du gène encodant la sensibilité à l'ampici]line. Les promoteurs et opérateurs plasmidiques sont désignés par l"p"l et 'o". Les lettres A, T, G et C désignent respec- tivement les nucléotides contenant les bases adénine,- thymine, guanine et cytosine. D'autres légendes des figures apparaitront dans le texte de la présente spé- cification. Les formes de réalisation préférées de l'in- vention qui seront décrites ci-après, impliquent l'uti- lisation d'un certain nombre d'endonucléases de restric- tion habituellement disponibles, qui seront identifiées ci-après avec leurs séquences correspondantes de carac- térisation et leurs types de clivage (indiqués par des flèches). XbaI: TCTAGA TaqI: TCGA AGATCT AGCT EcoRI: GAATTC IlindII: AAGCTT CTTAAG TTCGAA t BglII: AGATCT HpaI: GTTAAC TCTAGA CAATTG f1 t PvuI]: GAGCTG PstI: CTGCAG GTCGAC GACGTC t il 1 1 BamHI: GGATCC CCTAGG Ir Lorsque les points de clivage sont espacés sur les brins respectifs, les extrémités clivées seront "collantes", c'est-à-dire qu'elles pourront être mises ou remises sous forme de bicaténaires avec un autre ADN à extrémi- tés "collantes" complémentaires par appariement-de bases selon WatsonCrick (A à T et G à C) à la manière d'un assemblage à tenons et mortaises. Certaines en- zymes de restriction telles que HpaI et PvuII ci-dessus subissent un clivage en laissant des extrémités "épointées". Les séquences de nucléotides ci-dessus sont représentées suivant la convention adoptée partout: le brin supérieur est le brin d'encodage des protéines et, Cn allant de gauche à droite sur ce brin, on se déplace de son extrémité 5' à son extrémité 3', c'est- à-dire dans le sens de transcription d'un point "proxi- mal" vers un point "Idistal". Enfin, à propos des conventions, le symbole ikt désigne une délétion. C'est ainsi que, par exem- ple, la désignation d'un plasmide, par exemple, par "AEcoRI-XbaI" décrit le plasmide duquel la séquence de nucleotides comprise entre les emlplacements d'enzymes de restriction EcoRI et XbaI a été éliminée par diges- tionl avec ces enzymes. Pour plus dle commodité, cer6ai- nes délétions sont désignées par un nombre. C'est ainsi que, en commençant par la première paire de bases ("bp") de l'emplacement de caractérisation de EcoRI qui précède le gène pour la résistance à la tétracycli- ne dans le plasmide parental pBR322, "A1" désigne la délétion de bpl-30 (c'est-à-dire AEcoRI-Hind III), rendant ainsi inopérant le système promoteur/opérateur de la tétracycline; "A2" désigne la délétion de la pairc (le bases 1-375 (c'est-à-dire A EcoRI-BamHI) avec, pour conséquence, l'élimination à la fois du promoteur/ opérateur de la tétracycline et du gène structural qui 1' encode la résistance à la tetracycline; par ailleurs, "A 3" désigne la délétion de la paire de base 3611-4359 (c'est-à-dire APstI-EcoRI) et l'élimination de la ré- sistance à 1'ampicilline. "A 4" est utilisé pour désigner 1'élimi- nation dela pairede basesDde trp,-900 - e 1.500 du fragment de l'opéron de trp (figure 1) avec élimination du gène structural pour le polypcptLdle 1) de trp. La séquence directrice de trp est constituée de paires de bases ("bp") 1162 en commençant par le point de départ prévu pour trp mRNA. Un polypeptide directeur putatif de trp à 14 acides aminés est encodé par la paire de bases 27-71 suivant les nucléotides ATG qui encodent le signal de déclenchement de traduc- tion. La zone d'atténuateur de trp comprend des séquen- ces successives riches en GC et en AT se situant entre les paires de bases 114 et 156 et l'atténuation est ap- pareimmnet effectuée sur les nucléotides de mRNA codés par la paire de bases -J 134 -141 de la séquence direc- trice. Pour exprimer un polypeptide hétérologue sous la direction de l'emplacement de fixation des ribosomes directeurs de trp et en même temps prévenir l'atténua- tion, il convient d'observer les critères suivants: 1. les paires de bases 134-141 ou au-delà doivent être supprimées; 2. le codon ATG du gène inséré doit être po- sitionne en relation correcte avec un emplacement de fixation de ribosomes de façon bien connue (voir, par exemple, J.A. Steitz "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA" dans "Biological Regulation * and Control" (éd. R. Goldberger) Plenum Press, N.Y. (1978). 3. Lorsqu'une protéine de fusion homologue- hétérologue doit être produite, le signal de déclen- chement dle traduction d'une séquence de polypeptides homologues doit rester disponibl1e et les codons prévus pour la partie homologue dle la protéine de fusion doi- vent être insérés en phase.sans l'intervention de si- gnaux d'arrêt de traduction. Par exemple, la délétion de toutes les pai- res de bases renfermées dans la séquence directrice distale de la paire de bases 70 élimine la zone d'atté- nuateur en laissant la séquence ATG qui encode le si- gnal de déclenchement de traduction en éliminant l'in- te. vellt:iil (lu signal (l;u',ai% (lC d 'aduictioln codé( pa. TCA (pairs (le bases 69-71) pal I élimination des nueiéo- tides A et suivants. Cette délétion entraîne l'expres- sion d'une protéine de fusion commençant par le poly- peptide directeur, se terminant par celui encodé par l'une ou l 'autre insertion hOtérologue et comportant une zone distale d'un des polypeptides post-directeurs de l'opéron de trp, lesquels sont déterminés par le degré de délétion dans la direction 3eo Dès lors, une délétion s'étendant dans le gène E conduit à l'expres- sion d'un précurseur homologue comprenant la séquence L et la zone distale de E (au-delà du point final de délation) fusionnées à la séquence encodée par n'impor- te quelle insertion,suivante et ainsi de suite. Deux plasmides particulièrement utiles dont la zone d'atténuateur a été éliminée, sont les plasmi- des pC-Ml et pGM3 (G.F. 3iiozzari et al, "J. Bacteriolo- gy 133" 1-157 (1978)). Ces plas!ides portent respectivement les d1lé- tions tipT ALE 1413 et trp ALE 1417 et ils expriment (sous le contr6le du promoteur/opérateur de trp) un polypeptide comprenant àa peu près les six premiers acides aminés des zones distales et directrices de trp du polypeptide E. Dans le cas de loin préféré, pGMl, à peu près le dernier tiers seulement du poly- peptide E est exprimé, tandis que pGM3 exprime presque la moitié distale des codons du polypeptide E. coli K-] 2 SOtLchIC W3110 tna 2-trp- AlO2 contenant pGMl1 a été déposée à ll'"Amcricaîî Type Culture Collec- tion" (AICC n 31622). p(;l peutit être éliminé de lat manière habituelle de cette souche pour être utilisé dans les procédés décrits ci-apr's. En variante, des délétions peuvent être effec- tuées par des moyens fournis par la présente invention afin de cliver spécifiquement l'ADN bicaténaire à n'im- porte quel emplacement désiré. Un exemple de cette technique de clivage est donné dans la partie IV de l'exposé expérimental ci-après. C'est ainsi que l'ADN bi c;tténaiirlCe est transformé crn ADN monocaténaire dans la zone entourant le point de clivage envisagé, par exem- ple, par réaction avec la -exonucléase. Une matrice synthétique ou autre d'ADN monocaténaire est ensuite hybridée à la longueur monocaténaire formée antérieure- ment et ce, par appariement de bases selon Watson-Crick, la séquence de matrice étant prévue de telle sorte que son extrémité 5' soit coterminale avec le nucléotide sur le premier brin immédiatemnent avant le point de clivage envisagé. La matrice est ensuite étendue dans la direction 3' par réaction avec la polymérase d'ADN en recréant, avant le clivage envisagé, la partie de l'ADN bicaténaire initial qui avait été perdue lors de la première étape. Simultanément ou par la suite, la partie du premier brinqui se situe au-delà du point de clivag-e envisagé, est éliminée par digestion. En résumé, si l'on désigne par!V^ le point de clivage envisagé, on a: a)...... v point de clivage envisagé XI! b)...... v monocaténaire autour de _ Vi c)...... v hybridation de la matrice d)...... v extension à partir de la 35...... matrice e)......v digestion du monocaté- naire Dans la forme de réalisation de loin préférée, on effectue les étapes (d) et (e) simultanément en uti- lisant une polymérase qui digère simultanément l'extré- mité monocaténaire en saillie dans la direction 3 l- 51 en étendant la matrice (en présence de dATP, dGTP, dTTP et dCTP) dans la direction 5' -> 3'. La matière pré- férée à cet effet est la polymérase I de Klenow, c'est- à-dire le fragment obtenu par clivage protéolytique de la polymérase I dIADN qui contient l'activité de poly- mérisation 5' -> 3' et l'activité exonucléolytique 31 -- 5i de l'enzyme parentale, cependant que son ac- tivité exonucléolytique 5' -- 3' fait défaut (A. Kornberg, DNA Synthesis, 98, W.H. Freeman et Co., SF0 (1974)). En adoptant le procédé décrit ci-dessus, les délétions dtatténuateurs peuvent être effectuées de n'importe quelle manière désirée dans un plasmide con- tenant l'opéron de trp, qui est tout d'abord linéarisé, par exemple, par clivage à un emplacement de restric- tion situé en aval du point auquel la molécule doit avoir des extrémités épointées ("v" ci-dessus). La recircularisation suivant la délétion de la zone d'at- ténuateur peut être effectuée, par exemple, par liga- ture des extrémités épointées ou selon d'autres métho- des bien connues de l'homme de métier. Bien que l'invention englobe l'expression directe du polypeptide hétérologue sous la direction du promoteur/opérateur de trp, le cas préféré comporte l'expression de protéines fusionnées contenant à la fois des séquences homologues et des séquences hétéro- logues, ces dernières étant, de préférence, spécifique- ment clivables des premières dans les environnements extracellulaires. Sont particulièrement préférées, les fusions dans lesquelles la partie homologue com- prend un ou plusieurs acides aminés du polypeptide directeur de trp et environ un tiers ou plus de la séquence d'acides aminés E de trp (extrémité distale). Les- protéines de fusion ainsi obtenues semblent être remarquablement stabilisées contre la dégradation dans les conditions d'expression. La bactérie E. coli K-12, souche W3110 tna 2-trp A102 (pGM1), ATCC N 31622 peut être utilisée pour amplifier les stocks du plasmide pGM1 que l'on emploie de préférence pour construire les systèmes promoteurs/opérateurs de trp déficients en atténuateurs suivant l'invention. Cette souche est phénotypiquement trp+ en présence d'anthranilate et elle peut être déve- loppée dans.des milieux minima tels que LB complétés de ,g/ml d'anthranilate. Toutes les souches bactériennes utilisées dans l'expression dirigée par le promoteur/opérateur de trp ++ suivant l'invention sont le répresseur de trp ("trp R+"), tout coumme dans le cas de E. coli de type sauvage de façon à assurer la répression jusqu'à ce que l'on envi- sage l'expression hétérologue. Dans la forme de réalisation préférée, la re- combinaison d'ADN est effectuée dans E. coli K-12 souche 294 (terminaison A, thi-, hsr-, hsmk), ATCC n 31446, c'est-à-dire une souche bactérienne dont les membranes comportent des caractéristiques facilitant les transformations. Les plasmides producteurs de poly- peptides hétérologucs se dleveloppant dans la souche 294 sont extraits de la manière habituelle et maintenus en solution (par exemple, lO0mn de tris, lmM d'acide éthylène-diamnine-tétracétique-, pIf 8) à une températurec comprise entre environ -200C et environ 4 C. D'autre part, pour effectuer une expression dans des conditions industrielles, il est préfcérable d'utiliser une souche plus robuste, c'est-à-dire E. coli K121- F RV 308 strr, gal 308-, ATCC n 31608. Du point de vue nutri- tif, RV 308 est de type sauvat.( et se développe bien dans des milieux minima en synthétisant toutes les macromolécules nécessaires à partir de mélanges clas- siques de sels d'ammonium, de sels phosphates et de sels de magnésium, de métaux à l'état de traces et de glucose. Après transformation de la culture RV 308 avec le plasmide dérivant de la souche 294, on dépose la culture en plaques sur des milieux sélectifs pour un marqueur (par exemple, la résistance aux antibioti- ques) porte par le plasmide, puis on prélève une colonie de transformants que l'on développe dans une culture en ballon. On congèle des parties aliquotes de cette culture dans une solution de glycérol ou de diméthyl- sulfoxyde à 10% dans des fioles stériles de Wlheaton et dans un bain d'éthanol et de glace carbQnique à -80 C. Pour produire le polypeptide hétérologue codé, on déve- loppe les échantillons de la culture dans des milieux contenant du tryptophanne afin de réprimer le promo- teulr/opérateur de trp, après quoi, on prive le système de l' additif tryptophanne pour provoquer l' expression. Pour le premier stade de croissance, on peut employer, par exemple, le milieu LB (J.Ho Miller, Experiments in Molecular Genetics, 433, Cold Spring Harbor Laboratory 1972) qui contient, par litre de so- lution aqueuse, 10 g de tryptone Bacto, 5 g d'extrait de levure Bacto et 10 g de NaCl, De préférence, l'ino- culant croit jusqu'à une densité optique de 10 ou plus (à 550 nl), plus avantageusement, jusqu'à une densité optique de 20 ou plus et, lmieuxencore, jusqu'à une densité optique de 30 ou plus, quoique à une valeur moindre qu'en phase stationnaire, Pour la dérépression et l'expression, on fait ensuite croître l'inoculant dans des conditions privant la cellule de l'additif tryptophanne. Un milieu appro- prié pour cette croissance est le milieu M9 (voir J.H, Miller ci-dessus à 431), préparé comme suit (par litre): K1l2PO4 3 g 2 4 Na2IIPO4 6 g NaCl 0, 5 g NH4C 1 g On traite en autoclave, puis on ajoute: ml de CàCl2 0,01M 1 ml-de MgSO4 1M ml de glucose à 20% Vitamine B1 1 /g/mInl Acides aminés Humko hycase amino ou DIFCO cas. amine 40 1g/ml. Le suppléiecnt d'acides aminées est un hydrolysat acide de caséine dépourvu de tryptophanne. Pour commencer l'expression du polypeptide hétérologue, l'inoculant dont la croissance a eu lieu dans un milieu riche en tryptophanne, peut être, par exemple, dilué dans un volume plus important d'un mi- lieu ne contenant pas d'additif tryptophanne (par exem- ple, une dilution de 2-10 fois), après quoi on le lais- se croître jusqu'à n'importe quel niveau désiré (de pré- férence, en deçà de la phase de croissance stationnaire), tandis que le produit recherché peut être obtenu de la manière habituelle par lyse, centrifugation et purifica- tion. Au stade de croissance prive de tryptophanne, il est préférable de laisser croître les cellules jusqu'à une densité optique supérieure à 10, plus avantageuse- ment, jusqu'à une densité optique supérieure à 20 et, mieux encore, jusqu'à une densité optique de 30 ou plus (toutes à 550 nM) avant de procéder à la récupéra- tion du produit. Toutes les expériences de recombinaison d'ADN décrites dans l'exposé expérimental ci-après ont été effectuées à la "Genentech Inc." conformément aux di- rectives des "National Institutes of Health Guidelines for Recombinant DNA research". I. Expression de la pratéine de fusion du polypeptide D. En se référant aux figures 1-3, on décrira un procédé préféré pour l'expression de protéines de fu- sion comprenant des polypeptides désirés auxquels est fusionnée une partie de la séquence d'acides aminés du polypeptide D de trp qui est séparable in vitro grâce à un acide aminé de méthionine spécifiquement sensible au clivage par CNBr. A. Construction de pBRHtrp. Le plasmide pGM1 (1, figure 1) porte l'opéron de tryptophanne de E. coli contenant la délétion ALE1413 (G.F. Miozzari, et al., (1978) J. Bacteriology 1457-1466) et, partant, il exprime une protéine de fu- sion comprenant les six premiers acides aminés du di- recteur de trp et à peu près le dernier tiers du poly- peptide E de trp (que l'on désignera ci-après conjoin- tement par LE'), de même que la totalité du polypeptide D de trp et ce, sous le contrôle du système promoteur/ opérateur de trp. Le plasmide (20 1g) est mis à digé- rer avec l'enzyme de restriction PvuII qui clive le plasmide en cinq emplacements. Les fragments de gènes 2 sont ensuite combinés avec cldes agents de liaison EcoRI (constitués d'un oligonucléotide autocomplémen- taire 3 de la séquence: pCATGAATTCATG) en formant un emplacement de clivage de EcoRI pour un clonage ulté- rieur en un plasmide contenant un emplacement de EcoRI (20). Les 20 Zig des fragments 2 d'ADN obtenus à partir de pGM1 sont traités avec 10 unités de ligase de T4 ADN en présence de 200 picomoles de loligonucléotide syn- thétique 51'-phosphorylu pCATGAATTCATG (3) et dans 20/il de tampon de ligase de T4 ADN (20 mM de tris, 1)11I 7,6, 0,5 iiM d'ATP, 10 miM dce M.gCI2, 5 mM de dithio- thréitol) à 4 C pendant une nuit. Ensuite, on chauffe la solution pendant 10 minutes à 70 C pour arrêter la ligature. Les agents de liaison sont clivés par diges- tion avec EcoRI et les fragments comportant à présent des terminaisons EcoRI, sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5;, tandis que les trois plus gros fragments sont isolés du gel en procédant tout d'abord à une coloration avec du bromure d'éthi- dium, en localisant les fragments avec de la lumière ultraviolette et en coupant, du gel, les parties con- cernées. On dépose chaque fragment de gel avec 300 microlitres de OlxTBE, dans un sac de dialyse et on le soumet à une électrophorèse à 100 v pendant une heure dans le tampon OlxTBE (le tampon TBE contient: 10,8 g de base tris, 5,5 g d'acide borique, 0,09 g de Na2EDTA dans 1 litre de H20)., On recueille la solution aqueuse du sac de dialyse, on l'extrait au phénol, puis au chlo- roforme et on l'amène à une concentration de 0,2Z1 au chlorure de sodium, puis on récupère l'ADN dans l'eau après précipitation à l'éthanol. [Toutes les isola- tions des fragments d'ADN décrites ci-après sont effec- tuées en utilisant une électrophorèse sur gel de poly- acrylamide suivie du procédé d'électroélution qui vient d'être décrit]. Le gène contenant le promoteur/opéra- teur de trp avec les extrémités collantes 5 de EcoRI est identifié dans le procédé deëcrit ci-après, provo- quant ainsi l'insertion de fragments dans un plasmide 6 sensible à la tétracycline et qui, lors de l'inser- tion du promoteur/opérateur, devient résistant à la tétracycline. B. Création du plasmide pBlUtrp exprimant la résistance à la tétracycline sous le contrôle du promoteur/opé- rateur de trp, ainsi que l'identification et l'am- plification du fragment 5 d'AI)N contenant le promo- teur/opérateur dc tri] et isolé sub) (A) ci-dessus. Le plasmide pBRI1I (6) (R.I. Rodriguez et al., Nucleic Acids Research 6, 3267-3287 [1979]) exprime la résistance à l'ampicilline et il contient le gène pour la résistance à la tétracycline mais, n'ayant au- cun promoteur associé, il n1exprime pas cette résistan- ce. En conséquence, ce plasmide est sensible à la tétracycline. En introduisant un système promoteur/ opérateur dans l' emplacement de EcoRI, le plasmide peut être rendu résistant à la tétracycline. On met pBRH1 à digérer avec EcoRI et on éli- mine l'enzvyme par extraction au phénol suivie d'une extraction au chloroforme, puis on procède à une récu- pération dans l'eau après précipitation à l'éthanol. La molécule 7 d'ADN ainsi obtenue est combinée, dans des mélanges réactionnels séparés, avec chacun des trois fragments d'ADN obtenus comme décrit sub (A) ci-dessus, puis elle est ligaturée avec la ligase de T4 ADN comme décrit précédemment, LIADN présent dans le mélange réactionnel est utilisé pour transformer la bactérie compétente E0 coli K-12 souche 294, K. Backman et al., Proc, Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 73, 4174-4198 [1976] ) (ATCC no 31448) par des techniques classiques (V. Hershfield et al., Proc. Nat'l Acad. Sci, EoUoA. 71. 3455-3459 [19741), puis on dépose la bactérie sur des plaques de LB contenant 20 g/ml d'ampicilline et 5/ g/ ml de tétracycline. On sélectionne plusieurs colonies résistant à la tétracycline, on isole l'ADN du plasmide et lon confirme la présence du fragment désiré par analyse de l'enzyme de restriction. Le plasmide 8 ob- tenu désigné par pBRPtrp, exprime la 3-lactamase con- ferant la résistance à l'ampicilline et il contient un fragment dlADN comportant le promoteur/opérateur de trp et encodant une première protéine comprenant une fusion des six premiers acides aminés du directeur de trp et environ le dernier tiers du polypeptide E de trp (ce polypeptide est désigné par LEI), ainsi qu2une deuxième protéine correspondant à peu près à la première moitié du polypeptide D de trp (ce polypeptide est dé- signé par DI) et une troisième protéine codée par le gène de résistance à la tétracycline. C. Gènes de clonage pour différents polypeptides de produits finals et expression de ces derniers sous forme de protéines de fusion comprenant le produit final et le précurseur de polypeptide D de trp spécifiquement clivable (figure 2). Un fragment d'ADN comprenant le promoteur/opc- rateur de trp et les codons pour les polypeptides LE' et Dl est obtenu à partir dlu plasmide pBRHtrp et il est inséré dans des plasmides contenant des gènes structuraux pour différents polypeptides désirés dont des. exemples seront donnés ci-après pour le cas de la somatostatine (figure 2). Le plasmide pBRHtrp est mis à digérer avec l'enzyme de restriction EcoRI, tandis que le fragment 5 obtenu est isolé par électrophorèse sur gel de poly- acrylamide et par électroélution. Le plasmide pSom 11 mis à digérer avec lienzy- me EcolI (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); brevet britannique publié n 2 007 676 A) est combiné avec le fragment 5. Le mélange est ligaturé avec la ligase de T4 ADN comme décrit précédemment et l'ADN obtenu est transformé en E. coli K-12 souche 294 égale- ment comme décrit précédemment. Les bactéries trans- formantes sont sélectionnées sur des plaques contenant de l'ampicilline. On sélectionne les colonies obtenues résistant à l'ampicilline par hybridation (M. Gruerinstein et ai., Piroc. Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 72, 3951-3965 [1975J) en utilisant, conmme sonde, le fragment 5 conte- nant le promoteur/opérateur de trp isolé du plasmide O pBRHtrp qui a été marqué radioactivement par p32. On sélectionne plusieurs colonies que l'hybridation a révélées positives, on isole l'ADN du plasmide et l'on détermine l'orientation des fragments insérés par ana- lyse de restriction en utilisant les enzymes de restric- tion BglII et BamHI dans une d(itcstiondouble. On laisse croître la bactérie E. coli 294 contenant le plasmide désigné pSOM7 A2, 11, comportant le fragment de promo- teur/opérateur de trp dans l'orientation désirée, dans un milieu LB contenant 10 g/ml d'ampicilline. On laisse croître les cellules jusqu'à la densité optique de 1 (à 550 nM1), on les recueille par centrifugation et on les remet en suspension dans un milieu M9 en une dilution de 10 fois. On laisse croître les cellules pendant 2-3 heures, à nouveau jusqu'à une densité opti- ue (Ide 1, puis on les soumet a une lyse et on analyse la teneur totale en protéines cellulaires par électro- phorèse sur gel de polyacrylamide/urée (15%)/dodécyl- sulfate de sodium (J.V. Maizel Jr. et al., Meth. Viral , 180-246 [1971]). La figure 3 illustre une analyse de protéines sur gel dans laquelle on sépare toutes les protéines de différentes cultures selon leurs dimensions. La densité des bandes individuelles reflète la quantité dans laquelle]es protéines respectives sont présentes. En figure 3, les couloirs 1 et 7 sont des témoins et ils comprennent une variété de protéines d'une dimen- sion préalablement déterminée servant de points de réfé- rence à titre de comparaisono Les couloirs 2 et 3 sépa- rent la protéine cellulaire des colonies de E. coli 294 transformées avec le plasmide pSom7 A2 et que l'on a laissé croître dans les milieux LB (couloir 2) et M9 (couloir 3). Les couloirs 4 et 5 séparent la protéine cellulaire obtenue de cellules semblables transformées avec le plasmide pTha7,2, qui est un plasmide d'expres- sion de thymosine obtenu par des procédés essentielle- ment identiques à ceux déjà décrits, en commençant avec le plasmide pThal (voir la demande de brevet des Etats- Unis d'Amérique déposée le 28 février 1980 aux noms de Roberto Crea et Ronald B. Wetzel pour la "production de thymosine alpha 1", dont la description est men- tionnée ici à titre de référence). Lec couloir 4 sépare la protéine cellulaire de E. coli 294/pThx 7A2 que l'on a laisse croître dans le milieu LB, tandis que le cou- loir 5 sépare la protéine cellulaire du même transfor- mant que l'on a laissé croître dans le milieu M9.Lecou- loir 6 (qui est un autre témoin) représente le type de protéine de E. coli 294/pI31322 que l'on a laissé croître dans le milieu LB. Une comparaison vis-à-vis des témoins démontre que les deux bandes supérieures les plus prononcées de chacun des couloirs 3 et 5 sont des protéines de la dimension anticipée dans le cas de l'expression d'une protéine de fusion comprenant le polypeptide Di et respectivement la somatostatine et la thymosine (lVautre bande prononcée représente le polypeptide LE' résultant de la délétion de l'atténuateur). La figure 3 confirme que l'expression est réprimée dans un mi- lieu riche en tryptophanne, mais qu'elle est déréprimée dans des conditions déficientes en tryptophanne. D. Clivage au bromure de cyanogène etradio-immunotitra- ge pour un produit hormonal. A la fois pour le cas de la thymosine et de la somatostatine, toutes les protéines cellulaires sont clivées au bromure de cyanogène, tandis que le produit du clivage est récupéré et, après séchage, il est re- mis en suspension dans un tampon et soumis à une analy- se par radio-immunotitrage confirimant que 1' expression du produit est, du point de vue immunologique, identi- que à la somatostatine et à la thymosine respectivement. Le clivage au bromure de cyanogène a été décrit par D.V. Goeddel et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 76, 106-110 [1979]). II. Construction de plasmides pour l'expression direc- te de gènes hétérologues sous le contrôle du sys- tème promoteur/opérateur de trp. La stratégie adoptée pour l'expression directe a donné lieu à la création d'un plasmide contenant un emplacement de restriction particulier distal de tous les éléments de contrôle de l'opéron de trp dans lequel des gènes hétérologues pourraient être clonés au lieu de la séquence directrice de trp et à une distance ap- propriée vis-à-vis de l'emplacement de fixation des ri- * bosomes du polypeptide directeur de trp. La méthode d'expression directe sera décrite ci-après à titre d'exemple pour le cas de l'expression de l'hormone de croissance humaine. Le plasmide pSom7 Z (10ug) est clivé avec EcoRI et le fragment 5 d'ADN contenant les éléments génétiques de tryptophanne est isolé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et par électroélution. Ce fragment (2 9g) est mis à digérer avec l'endonucléase de restriction Taq I (deux unites) pendant 10 minutes à 37 C de telle sorte que, en moyenne, on ne clive qu'un des cinq (environ) emplacements de Taq I de chaque molécule. Ce mélange partiellement digéré de fragments est séparé par électrophorèse sur gel de polyacrylamnide, tandis qu'un fragment 12 d'environ 300 paires de bases (figure 4) contenant une extrémité de EcoRI et une ex- tréminité de Taq I est isolé par électroélutiono L'em- placement correspondant de Taq I est situé entre l'em- placement du déclenchement de transcription et l'em- placement du déclenchement de traduction, tandis qu'il devance, de 5 nucléotides, le codon ATG du peptide direc- teurde trp.La figure 4 illustre la séquence d'ADN existant autour de cet emplacement. En procédant de la manière décrite, on pourrait isoler un fragment contenant tous les élé1ments de contrôle de 1'opéron de trp, c2est-à- dire le système promoteur/opérateur, le signalde déclen- chellientde transcription et l'emplacement de fixation des ribosomes directeurs de trpo Le résidu de Taq I à l'extrémité 39 du frag- ment obtenu près du signal de déclenchement de -traduc- tion pour la séquence directrice de trp est ensuite transformé en un emplacementdcXlhaI connme représenté en figure 5. Cette transformation est effectuée en liga- turanrt le fragment 12 obtenu ci-dessus a un plasmide contenant un emplacement particulier (ceest-à-dire un seul emplacement) de EcoRI et un emplacement particu- lier de XbaI. A cet effet, on peut utiliser essentiel- lement n'importe quel plasmide contenant, dans l2ordre, un réplicon, un marqueur pouvant être sélectionné, par exemple: une résistance aux antibiotiques, ainsi que des emplacements de EcoRI, XbaI et BamHIo C:est ainsi que, par exemple, un eil.placemelt deXbaI peut être intro- duit entre les emplacements EcoRI et BamHII de pBR322 (F. Bolivar et al., Gene 2, 95-119 [1977]), par exem- ple, en effectuant le clivage à l'emplacement particu- lier Ilind III du plasmide avec Ilind III, ce clivage 2480781. étant suivi de la digestion, par la nucléase monocaté- naire spécifique, des extrémités collantes obtenues avec ligature des extrémités épointées d'un nucléotide synthétique bicaténaire se mettant de lui-même sous cette forme bicaténaire et contenant l'emplacement de caractérisation, par exemple, CCTCTAGAGG. En variante, tout comme dans le cas présent, on peut utiliser des fragments naturels d'ADN contenant un seul emplacement de XbaI entre les résidus de clivage de EcoRI et BamHI. Dès lors, un produit de digestion, par EcoRI et BamHI, du génome viral de l'hépatite B est obtenu par des moyens classiques et il est cloné en emplacements EcoRI et BandlI du plasmide pGH16 (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]) pour former le plasmide pHS32. On cli- ve le plasmide pHS32 avec XbaI, on l'extrait au phénol, puis au chloroforme et ensuitce on le précipite à lé- thanol. On le traite ensuite avec 1 /l de polymérase I de E. coli, fragment de Klenow (Boehringer-Mannheim) dans 301il d'un tampon de polymérase (50 mIl de phosphate de potassium, pH 7,4, 7 nel de MgC.12, 1 mM de 3-mercapto- ethanol) contenant 0,1 mîM de dTTP et 0,1 mMl de dCTP pendant 30 mLinutes à 0 C, puis pendant 2 heures à 37 C. Suite à ce traitement, deux des quatre nucléotides complémentaires à llextréimit( en saillie 5t de llempla- cement de clivage au XbaI v(ieinent s'insérer dans: $ CTAGA- 5' CTAGA- 31 TD - 31 TCT On incorpore deux nucléotides (dC et dT) pour obtenir une extrémité comportant deux-nucléotides ressortant en 5'. On clive ce résidu linéaire du plasmide pHS32 (après extraction au phénol et au chloroforme et récu- pération dans l'eau après précipitation à l'éthanol) avec EcoRI. On sépare le grand fragment 13 du plasmidc du plus petit fragment de EcoRI- XbaI par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et on l'isole après électro- élutionl. Cc fragment d'ADN provenant de pHS32 (0,2 /ig) est ligaturé, dans des conditions analogues à celles décrites ci-dessus, au fragment EcoRI-Taq I de l'opéron de tryptophanne (;..0,01,g) comme représenté en figure 5. Dans ce procédé, l'extrémité saillante de Taq I est ligaturée à l'autre extrémité saillante de XbaI bien qu'elle ne soit pas complètement appariée par bases suivant Watson-Crick: T + CTAGA- -TCTAGA- -AGC TCT -AGCTCT- On transforme une partie de ce mélange de réaction de ligature en cellules de E. coli 294 comme décrit dans la partie I ci-dessus, puis on soumet ces cellules à un traitement thermique et on les dépose sur des plaques de LB contenant de l'ampicilline. On sélectionne 24 colonies quzon laisse croître dans 3 ml de milieu LB, puis on isole les plasmides. On constate que six de ces plasmides comportent l'emplacement de XhaI régénéré par réparation et roplication d'ADN, cataly- sées par E. coli: --TCTAGA- TCTAGA- -AGCTCT- - - AGATCT - On constate également que ces plasmides donnent également lieu à un clivage avec EcoRI et HpaI pour donner les fragments de restriction escomptés. Un plas- mide 14, désigné par pTrp 14, est utilisé pour l'expres- sion de polypeptides hétérologues, ainsi qu'on le décri- ra ci-après. Lo plasmide pIIGII 107 (18 on figure 6, D.V. Goeddel et al., Nature, 281, 544, 1979) contient un gène pour l'hormone de croissance humaine comportant 23 codons d'acides aminés produits par des fragments synthétiques dtADN et 163 codons d'acides aminés obte- nus à partir d'ADN complémentaire produit via une trans- cription inverse du RNA messager de l'hormone de crois- sance humaine. Quoique dépourvu des codons de la "pré"- séquence de l'hormone de croissance humaine, ce gène 21 contient un codon de déclenchement de traduction dlATG. On isole le gène de 10o/g de pHGH107 après traitement avec EcoRI, puis avec la polymérase I de E. coli, fragment de Klenow, ainsi qu'avec dTTP et dATP, comme décrit ci-dessus. Après extraction au phénol et au chloroforme, ainsi qu'après précipitation à l'éthanol, on traite le plasmide avec BamHI. (Voir figure 6). Le fragment 21 conLcnaib le gène de l'hormnonc de croissance humaine ("IIGII") est isolé par électro- phorèse sur gel de polyacrylamide, suivie d'une élec- troélution. Le fragment d'ADN obtenu contient égale- ment les 350 premiers nucléotides du gène structural de résistance à la tétracycline, mais il est dépourvu du système promoteur/opérateur de tétracycline si bien que, lorsqu'il est ultérieurement cloné en un plasmide d'expression, les plasmides contenant l'insertion peuvent être localisés par rétablissement de la résis- tance à la tétracycline. Etant donné que la terminai- son EcoRI du fragment 21 a été insérée par le procédé à la polymérase I de Klenow, le fragment comporte une extrémité épointée et une extrémité collante,assurant ainsi l'orientation adéquate lors de l'insertion ulté- rieure dans un plasmide d'expression (voir figure 6). Le plasmide d'expression pTrpl4 est ensuite préparé pour recevoir le fragment contenant le gène de l'hormone de croissance humaine préparé comme décrit ci-dessus. C'est ainsi que l'on fait digérer pTrp14 avec XbaI, tandis que l'on insère les extrémités col- lantes obtenues par le procédé àl la polymérase I de Klenow en employant dATP, dTTP, dGTP et dCTP. Après extraction au phénol et au chloroforme, ainsi qu'après précipitation à l'éthanol, on traite l'ADN 16 obtenu avec Bani et l'on isole le grand fragment 17 de pias- mnide obtenu p a r électrophorèse sur gel de poly- acrylamide et électroéiution. Le fragment 17 dérivant de pTrpl4 comporte une extrémité épointée et une extré- mité collante, permettant ainsi la recombinaison dans l'orientation appropriée avec le fragment 21 contenant le gène de l'hormone de croissance humaine que l'on a décrit ci-dessus. On combine le fragment 21 du gène de l'hormone de croissance humaine et le fragment 17 AXbaI-BamHI de pTrpl4, puis on les ligature ensemble dans des conditions analogues à celles décrites ci-dessus. Les terminaisons XbaI et EcoRI insérées sont ligaturées ensemble par li- gature des extrémités épointées afin de recréer à la fois les emplacements de XbaI et EcoRI: XbaI inséré EcoRI inséré Initiation du gène de l'hormone de croissance humaine -TCTAG + AATTCTATG- CTAGkATTCTATC-- -AGATC TTAAGATAC- - A'TTAGATAC- XbaI EcoRI Cette construction recrée également le gène de resistance à la tétracyclineO Etant donné que le plas- mide pHGH 107 exprime la résistance à la tétracycline à partir d'un promoteur situé en amont du gène de 1hOE- mone de croissance humaine (promoteur lac), cette cons- truction 22, désignée par pHGH 207, permet l'expression du gène pour la résistance à la tétracycline sous le contrôle du promoteur/opérateur de tryptophanneo Dès lors, le mélange de ligature est transformé en Eo coli 294 avec des colonies sélectionnées sur des plaques de LB contenant 5 pg/ml de tétracyclineo Afin de confirmer l'expression directe de l'hormone de croissance humaine à partir du plasmide pHGH 207, tout cotmie dans le cas décrit dans la partie I ci-dessus, on soumet, à une électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium, la totalité des protéines cellulaires dérivant de E, coli 294/pHGH 207 que l'on a laissé croître jusqu'à une densité optique de 1 dans un milieu LB contenant 1 rg/ml d'ampicilline et que l'on a dilué de 1 à 10 fois dans un milieu M9, pour le laisser à nouveau croître jusqu'à une densité optique de 1; ensuite, on a effectué une comparaison avec des données d'électrophorèse analogues obtenues pour l'hormone de croissance humaine telle qu'elle a été exprimée antérieurement par d'autres chercheurs (D.V. Goeddel et ai., Nature, 281, 544 (1979)). La figure 7 est une photographie du gel coloré obtenu dans lequel: les couloirs 1 et 7 contiennent des marqueurs de protéines d( difr. cntes dimensions connues; le couloir 2 est un témoin séparant toutes les protéines cellulaires dc E. coli souche 294 pBR322; le couloir 3 sépare la protéine de E. coli 294/pHGI-G 107 que l'on a laissé croître dans un milieu LB; le couloir 4 sépare la protéine de E. coli 294/pHGH 107 que l'on a laissé croître dans le milieu)19; le couloir 5 sépare la protéine de E. coli 294/pHGH 207 que l'on a laissé croître dans le milieu LB et le couloir 6 sépare la protéine de E. coli 294/pHGH 207 que l'on a laissé croître dans le milicu M9. La bande dense du cou] oir 6 est l'hormone de croissance humaine comme indiqué par comparaison avec les bandes semblables des couloirs 2-4. Selon les prévisions de la présente invention, lorsqu'on laisse croître l'organisme E coli 294/pHGH 207 dans un milieu LB riche en tryptophanne, il pro- duit moins d'hormone de croissance humaine en raison des interactions répresseur/opérateur de tryptophanne et, lorsqu'on laisse croître cet organisme dans un mi- lieu M9, il produit beaucoup plus d'hormone de crois- sance humaine que 'organisme E. coli 294/pHGH 107 sui- te à l ' induction du système promoteur/opérateur de tryptophanne plus puissant que le système promoteur lac/opérateur dans pHGH 107. III. Création d'un plasmide général d'expression pour l'expression directe de gènes hétérologues sous le contr6le du système prombteur/opérateur de tryptophanne. Le plasmide pHGIH 207 créé dans le paragraphe précédent est ensuite utilisé pour obtenir un fragment d'ADN contenant les cléments de contrôle de l'opéron de tryptophanne (avec délétion de l'atténuateur), de même que pour créer un "vecteur d'expression" de plasmides approprié pour l'expression directe de différents gènes structuraux insérés. La stratégie adoptée pour la créa- tion du plasmide général d'expression implique l'élimi- nation, de pHGH 207, de la zone de contrôle de trypto- phanne par digestion avec EcoRI et insertion dans le plasmide pBRH1 que l'on a mis à digérer avec EcoRI et que l'on a utilisé dans la partie I cidessus. Comme on l'ta indiqué précédemment, pBRH1 est un plasmide ré- sistant à l'ampicilline et contenant le gène de résis- tance à la tétracycline, cependant qu'il est sensible à la tétracycline par suite de l'absence d'un système promoteur/opérateur approprié. Le plasmide obtenu, pHKY 1, dont la construction est décrite plus particu- lièrement ci-après et illustrée en figure 8, résiste à la fois à l'ampicilline et à la tétracycline, il con- tient le système promoteur/opérateur de tryptophanne, il est dépourvu de l'atténuateur de tryptophanne et il contient un emplacement particulier de XbaI distal du système promoteur/opérateur de tryptophanne. Le sys- tème promoteur/opérateur de tryptophanne et l'emplace- ment particulier de XbaI sont fixés par les emplace- ments de EcoRI, si bien que le fragment renfermant le système promoteur/opérateur et XbaI peut être éliminé pour être inséré dans d'autres plasmides contenant des gènes structuraux. En variante, des gènes structuraux hétérologues peuvent être insérés soit dans l'emplace- ment de XbaI, soit (après digestion partielle avec EcoRI) dans l'emplacement de EcoRI distal de la zone de contrô- le de tryptophanne de façon à venir se placer, dans l'un ou lVautre cas, sous le contrôle du système promoteur/ opérateur de tryptojhanne. Le plasmide pHGH 207 est mis à digérer avec EcoRI, tandis que le fragment 23 de EcoRI contenant le promoteur de trp est récupéré par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, suivie d'une électroélution. Le p]asmicle pBRH1 est mis à digérer avec EcoRI et les extrémités clivées sont traitées avec une phospha- tase alcaline bactérienne (1 1ig, dans 50 m de tris, pH 8 et 10 mMd de MgCl2 pendant 30 minutes à 65 C) afin d'é- liminer les groupes phosphates se trouvant sur les ex- trémités en saillie de EcoRI. On élimine l'excès de phosphatase alcaline bactérienne par extraction au phé- nol, extraction au chloroforme et précipitation à l'é- thanol. Etant donné qu'il est dépourvu de phosphates sur ses extrémités saillantes, l'ADN 7a linéaire obtenu n'acceptera, lors de la ligature, que les insertions dont les extrémités collantes complémentaires sont phosphorylées, mais il ne se recircularisera pas, per- mettant ainsi une sélection plus aisée pour les plasmi- des contenant les insertions. Le fragment de EcoRI dérivant de pHGH 207 et l'ADN linéaire obtenu à partir de pBRH1 sont combinés en présence de ligase T4 comme décrit précédemment et ils sont ligaturés. Une partie du mélange obtenu est transformée en E. coli souche 294 comme décrit précédemment, puis elle est déposée sur des plaques du milieu LB contenant 5 pg/ml de tétracycline avec sélection de 12 colonies résistant à la tétracycli- ne. On isole le plasmide de chaque colonie et on l'exa- mine pour déterminer la présence d'une insertion d'ADN par analyse à l'endonucléase de restriction en employant EcoRI et XbaI. Un plasmide contenant l'insertion est désigné par pHKY1. IV. Création d'un plasmide contenant l'opéron de tryp- tophanne capable d'exprimer une protéine de fusion spécifiquement clivable comprenant 6 acides aminés du peptide directeur de trp et le dernier tiers du polypeptide E de trp (désigné par LE'), ainsi qu'un produit de gènes structuraux hétérologues. La stratégie adoptée pour la création d'un plasmide d'expression de protéine de fusion LE' compor- te les étapes suivantes: a. Formation d'un fragment dc gène comprenant des codons pour la zone distale du polypeptide LE? com- portant les extrémités collantes Bgl If et EcoRI respec- tivement aux extremités 5' et 31 du brin de codage b. élin.ination des codons de la zone distale du fragment de gLne LE' et de ceux prevus pour le gène D de trp hors dlu plasmide SOM 7 A Z avec insertion du fragmnent formei lois dc.1 étape 1, reconstituant ainsi la séquence de codons LEI i mmiédiatemlent ci anonlt de celle prévue pour le gène hétérologue de la soinatosta- tine. 1 En se référant à la figure 9(a), on met le plasmide pSom7 A2 à digérer avec Hind III pour pro- céder ensuite à une digestion avec la lambda-e-:ronucléase (une exonucléase de 52 à 31) dans des conditions choisies de façon a obtenir une digestion auldelà de l'emplace- ment de restriction de Bgl II dans la zone d2encodage LE'o On dissout 20 i du plasmide pSom 7A2 que l'on a mis à digérer avec Hind III, dans un t. amnpon ZO mM de tampon de glycine, pi 9,6, i m1 de M4gCl2, 1 n4 de mercaptoéthanolo On traite le mélange obtenu avec unités de lambdaexonucléase pendant 60 minutes à la temprérature ambianteo Ensuite, on soumet le mélange réactionnel obtenu à une extraction au phénol, à une extraction au chloroforme et à une précipitation a 1 éthanoi. Afin de créer-finalement un résidu de EcoPRI à l'extrémité distale du fragment de gène LE, on syn- thétise une matrice 32pCCTGTGCATGAT par le procédé per- fectionné au phosphotriester (Ro Crea et al., ProcO Nat'1 Acad. Sci. EoU. Ao 75, 5765 [1978]) et on lthybride en extrémité monocaténaire du fragment de gène LE' résultant de la di.estion à la lambda-exonucléaseo On effectue l'hybridation comme décrit ci-après. On dissout ZO /g du produit de digestion au Hind III du plasmide pSom7zi2, que l'on a traité à la lambda-exonrucléase, dans '20 li de 11o et on les combine avec 6 1 d'l une solution contenant environ 80 picoiioles de l'oligonucléotide 5'-phosphorylé décrit ci-dessus. On hybride le fragment synthétique sur l'extrémité 3' de la séquence de codage de LEt et l'on insère la partie monocaténaire restante du fragment de LE' par le procédé à la polymérase I de Klenow décrit ci-dessus en utilisant dATP, dTTP, dGTP et dCTP. On chatuffe le mélange réactionnel à 50 C et on le laisse refroidir lentement à 10 C, après quoi on ajoute 4 1 de l'enzyme de Klenow. Après incubation pendant 15 minutes à la temperature ambiante, suivie d'une incubation pendant 30 minutes à 37 C, on arrête la réaction par addition de 5 p1 d'acide éthylène-diamine- tétracétique O,25M. On soumet le mélange réactionnel à une extraction au phénol, à une extraction au chlorofor- me et à une précipitation à l'éthanol. On clive ensuite l'ADN avec l'enzyme de restriction Bgl II. On sépare les fragments par électrophorèse sur gel de polyacryla- mide. Un autoradiogramme obtenu à partir de ce gel 32) révèle un fragment marqué 2p de la longueur escomptée d'lenviron 470 paires de bases que l'on récupère par électroélution. Comme on l'a souligné ce fragment LE'(d) comporte une extrémité Bgl Il et une extrémité épointée coïncidant avec le début de la matrice. Le plasmicle pThcl décrit dans la partie I(C) ci-dessus porte un gène structural pour la thymosine a1 cloné, à l'extrémité 5' de son brin dle codage, en un emplacement de EcoRI et, à son extrémité 31, en un emplacement dle BamHI. Comme représenté en figure 9, le gène de thymosine contient également un emplacement de Bgl II. Le plasmide pThDl contient également un gène spécifiant la résistance à l'ampicilline. Afin de créer un plasmide capable d'accepter le fragment LE'(d) préparé ci-dessus, on met le plasmide pThal à digérer avec EcoRI, puis on procède à la réaction de polymérase I de Klenow avec d(TTP et dATP pour épointer les résidus de EcoRI. En mettant le produit obtenu à digérer avec Bgl II, on crée un fragment linéaire 33 d'ADN contenant le gène pour la résistance à l'ampicilline et, à ses extrémités opposées, un résidu collant de Bgl II et une extrémité épointée. Le produit obtenu peut être recir- cularisé par réaction avec le fragment LE' (d) contenant une extrémité collante Bgl II et une extrémité épointée en présence de la ligase T4 pour former le plasmide pTrp24 (figure 9b). En procédant (de 1a sorte, on re- crée un emplacement d(le EcoRI à l'endroit o a eu lieu la ligature des extrémités épointées. En se référant à la figure 10, en mettant pTrp24 à digérer successivement avec Bgl II et EcoRI, pour procéder ensuite à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide et à une électroélution, on obtient un fragment comportant des codons pour le polypeptide LE'I(d) avec une extrémité collante de Bgl Il et une extrémité collante de EcoRi près de sa terminaison de codage 3'1 Le fragment 38 de LE'(d) peut être cloné en empla- cement Bgl II du plasmide pSomn7 ?Z pour former une pro- téine de fusion de polypeptide LE'/somatostatine expri- mée sous le contr6le du système promoteur/opérateur de tryptophanne, comme indiqué en figure 10o A cet effet, il convient: (1) de mettre le plasmide pSom7?2 à di- gérer partiellement avec EcoRI afin de cliver l'emplace- ment de EcoRI distal du système promoteur/opérateur de tryptophanne, comme indiqué en figure 10, et (2) de choisir judicieusement la séquence de matrice (figure 9) afin de maintenir l'unité de lecture des codons de ma- nière adéquate et également afin de recréer un emplace- ment de clivage de EcoRI. Clest ainsi que l'on dilue 16,ig du plasmide pSom7A2 dans 200 1l d'un tampon contenant 20 nimM de tris, pH 7,5, 5 nM de MgC12, 0,02 mM de détergent NP40 et 100 mM de NaCl, puis on effectue un traitement avec 0,5 unité de EcoRI. Après 15 minutes à 37 C, on soumet le mélange réactionnel à une extraction au phénol, à une extraction au chloroforme et à une précipitation à l'étha- nol, puis on le met à digérer avec Bgl II. On isole le grand fragment 36 ainsi obtenu par le procédé dtélectro- phorèse sur gel de polyacrylamide, suivi d'une électro- élution. Ce fragment contient les codons "LEt(p)" pour l'extrémité proximale du polypeptide LEI', c'est-à-dire ceux situés en amont de l'emplacement de Bgl II. On ligature ensuite le fragment 36 avec le fragment 38 en présence de ligase T4 ADN pour former le plasmide pSom7A2A4 qui, lors de la transformation en E. coli souche 294, comme décrit précédemment, produit efficace- ment une protéine de fusion constituée du polypeptide LE' entièrement reconstitué, ainsi que de somatostatine, sous le contr6le du système promoteur/opérateur de tryp- tophanne. La protéine de fusion dont la somatostatine peut être spécifiquement clivée par suite de la présence d'une méthionine à l'extrémité 5t de la séquence de so- matostatine, est séparée par électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium/polyacrylamide comme décrit précédemment. Le produit constitué de la protéine de fusion est représenté par la bande la plus distincte que l'on aperçoit dans le couloir 6 de la figure 11, ainsi qu'on le décrira de manière plus détaillée dans la partie VI ci-après. V. Création d'un système d'expression pour des fusions de polypeptides LE' de trp en plaçant la résistance à la tétracycline sous le contrôle du système pro- moteur/opérabeur de tryptophanne. La stratég-ie adoptée pour la création d'un véhicule d'expression capable de recevoir une large variété de gènes de polypeptides hétérologues pour l'expression sous forme de protéines de fusion LE' de trp sous le contrôle de ltopéron de tryptophanne, donne lieu à la construction d'un plasmide présentant les ca- ractéristiques suivantes: 1. La résistance à la tétracycline qui serait perdue en cas d'cxcision du système promoteur/opérateur contrôlant les gènes spécifiant cette résistance. 2. Elimination du système promoteur/opérateur qui contrôle la résistance à la tétracycline et recircu- larisation par ligature avec un gène hétérologue et un système promoteur/opérateur de tryptophanne dans la phase de lecture appropriée, et en référence à celle- ci, rétablissant ainsi la résistance à la tétracycline, tout en permettant, dès lors, l'identification de plas- mides contenant l'insertion de gènes hétérologueso En résumé et, en compatibilité avec la nature des insertions envisagées,, le but est de créer une par- tie linéaire d'ADN comportant un résidu de Pst à son extrémité 31 et un résidu de Bgl II à son extrémité 5', fixant ainsi un gène capable de spécifier la résistance à la tétracycline sous le contr6le d'un système promo- teur/opérateur. Ceest ainsi que, en se référant à la figure 12, on met le plasmide pBR322 à digérer avec Hind III et l'on mets à leur tour, les extrémités saillantes de Hind Il! à digérer avec ila nucléase SIo La digestion à la nucléase SI1 consiste à traiter!O/ g de pBR322 clivé avec Hind III dans 30pl de tampon S1 (NaCl 0,3M, 1 mMn de ZnCl2 25 mM d'acétate de sodium, pH 4,5) avec 300 unités de nucléase Si pendant 30 minutes à 5S Co On arrête la réaction par addition de 1 /1 de solution d'arrêt de nucléase 30 X Si (base tris 0,8M, 50 mM dfacide éthylènediamine-tétracétique)o On soumet le mélange à une extraction au phénol, puis à une extrac- tion au chloroforme et à une précipitation à l'éthanol et ensuite, on le met à digérer avec EcoRI comme décrit ci-dessus, tandis que l'on obtient le grand fragment 46 par le procédé d'électrophorèse sur gel de polyacryla- mide, suivi d'une électroélution. Le fragment obtenu comporte une première extrémité collante de EcoRI et une deuxième extrémité épointée dont le brin de codage commence par le nucléotide thymidine. Comme on le dé- crira ci-après, le résidu de Hind III que l'on a mis à digérer à la nucléasc SI et qui commence par la thymii- dine, peut être réuni à un résidu de Bgl II traité à la polymérase I de Klenow afin de reconstituer ltemplace- ment de restriction de Bgl II sur la ligature. Le plasmide pSom7 A2, préparé comme décrit dans la partie I ci-dessus, est mis à digérer avec Bgl II, tandis que les extrémités collantes de Bgl II qui en résultent, sont rendues bicatenaires par le procédé à la polymérase I de Klenow en utilisant les quatre triphos- phates de déoxynucléotides. Par clivage du produit obtenu avec EcoRI, puis par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et électroélution du petit fragment 42, on obtient une partie linéaire dtADN contenant le pro- moteur/opérateur de tryptophanne et des codons de la séquence "proximale" de LE' en amont de l'emplacement de Bgl II ("LE' (p)"). Le produit comporte une extrémité de EcoRI et une extrémité épointée résultant de l'inser- tion de l'emplacement de Bgl II. Toutefois, llemnplace- ment de Bgl II est reconstitué par ligature de l'extre- mité épointée du fragment 42 avec l'extrémité épointée * du fragment 46. Dès lors, les deux fragments sont liga- turés en présence de la ligase de T ADN pour former le plasmide recircularisé pHKY 10 (voir figure 12) qui est propagé par transformation en cellules compétentes de E. coli souche 294. On laisse croître les cellules résistant à la tétracycline et portant le plasmide re- combinant pHKY 10, on extrait l'ADN du plasmide et on le met, à son tour, à digérer avec Bgl Il et Pst, après quoi on l'isole par le procédé d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide et par électroélution du grand frag- ment, s o i t une partie linéaire d'ADN comportant des extrémités collantes de Pst et de Bgl II. Ce frag- ment 49 dtADN contient l'origine de réplication et il s'avère ultérieurement utile comme premier composant dans la construction de plasmides dans lesquels les gènes codant les protéines de fusion du polypeptide LE' de trp et le gène de résistance à la tétracycline sont contrô- lés par le promoteur/opérateur de trp. Le plasmide pSom7A 2 A4 préparé comme décrit dans la partie IV ci-dessus, pourrait être manipulé pour fournir un deuxième composant pour un système capa- ble de recevoir une large variété de gènes structuraux hétérologues. En se référant à la figure 13, on soumet le plasmide à une digestion partielle avec EcoRI (voir partie IV), puis à une digestion avec Pst et l'on isole le fragment 51 contenant le promoteur/opérateur de trp par le procédé d'électrophorèse sur gel de polyacryla- mide, suivi d'une électroélution. La digestion par- tielle avec EcoRI est nécessaire pour obtenir un frag- ment qui est clivé près de l'extrémité 5'du gène de somatostatine, mais qui n'est pas clivé à l'emplacement de EcoRI présent entre le gène de résistance à lampi- cilline et le promoteur/opérateur de trp. La résistance à l'ampicilline perdue par le Pst I coupé dans le gène R ap pourrait être rétablie par ligature avec le frag- ment 51. Dans une première démonstration, on obtient le troisième composant, à savoir un gène structural pour la thymosine c1, en mettant le plasmide pThcl à digérer avec EcoRI et BamHI. On purifie le fragment 52 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et par électro- élution. Les trois fragments de gènes 49, 51 et 52 pour- raient alors être ligaturés ensemble dans l'orientation appropriée comme représenté en figure 13 pour former le plasmide pTha7 A1A 4 qui pourrait être sélectionné en raison du rétablissement de la résistance à l'ampi- cilline et à la tétracycline. Lorsqu'il est transformé en E. coli souche 294 qu'on laisse croître dans des conditions analogues à celles décrites dans la partie I ci-dessus, le plasmide exprime une protéine de fusion du polypeptide LE' de trp de laquelle la thymosine al pourrait être spécifiquement clivée par traitement au bromure de cyanogène. Lorsque d'autres gènes structu- raux hétérologues comportant des terminaisons EcoRI et BamHI sont ligaturés de la même manière avec les com- posants dérivant de pHKY 10 et pSOM7I2i2A4, on obtient efficacement de la même manière les protéines de fusion du polypeptideLE' de trp contenant les polypeptides pour lesquels ces gènes hétérologues effectuent le codage. La figure 11 illustre une séparation entre toutes les protéines cellulaires et les transformants de E. coli souche 294 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide/ dodécyl-sulfate de sodium, la bande la plus foncée re- présentant, dans chaque cas, le produit des protéines de fusion qui est obtenu sous le contrôle du système promoteur/opérateur de tryptophanne. En figure 11, le couloir 1 est un témoin qui sépare toutes les protéines cellulaires de E. coli 294/pBR322. Le couloir 2 con- tient le produit de fusion de la somatostatine obtenu à partir du plasmide pSom7 2 A24 préparé dans la partie IV ci-dessus. Le couloir 3 est le produit dtexpres- sion de pSom7 A1 A4 contenant de la somatostatine. Le couloir 4 contient le produit d'expression de pTha7A1A,4, tandis que le couloir 5 contient le produit exprimé à partir d'un plasmide obtenu lorsque les fragments décrits ci-dessus dérivant de pHKY-10 et de pSom7 A2/k4 sont ligaturés avec un gène structural terminé par EcoRI/BamHI encodant la pro-insuline humaine et pré- paré en partie par la Demanderesse. Les couloirs 6 et 7 contiennent respectivement (sous forme de la bande la plus foncée) une protéine de fusion du polypeptide LE' detrp de laquelle on peut cliver les chaines B et A de l'insuline humaine. On obtient les gènes structu- raux B et A de l'insuline en mettant à digérer, avec EcoRI et BamHI, les plasmides pIB1 et pIA11 respective- ment dont la construction est décrite par D.V. Goeddel et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 76, 106 [1979]. Le couloir 8 contient des marqueurs de dimensions comme décrit précédemment. Bien que l'invention ait été décrite dans sa forme de réalisation de loin préférée en référence à E. coli, d'autres entérobactériacées pourraient égale- ment servir de cellules hôtes pour l'expression et éga- lement de sources pour les opérons de trp; parmi ces entérobactériacées, on peut mentionner, par exemple, Salmonellatyphimurium et Serratia marcesans. Dès lors, l'invention n'est nullement limitée aux formes de réalisation préférées décrites ci-dessus mais uni= quement par le cadre légitime des revendications ci- après, REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'un produit poly- peptidique par l'expression, dans les bactéries, d'un gène structural effectuant le codage à cet effet, ca- ractérisé en ce qu'il consiste à: (a) prévoir un inoculant bactélien transformé avec un véhicule d'expression plasmidique réplicable ayant une séquence drADN bicaténa.ire comprenant, en phase depuis une première extrémité 51 jusqu'à une deu- xième extrémité 3' de son brin de codage, les élé- ments suivants: (i) un système promoteur/opérateur de trp bac- térien; (ii) des nucléotides assurant le codage pour un emplacement de fixation de ribosomes pour la traduction de l'élément (iv), (iii) (les nucléotides assurant le codage pour un signal de déclenchement de traduction de l'élément (iv); et (iv) un gène structural encodant la séquence d'acides aminés d'un polypeptide hétéro- logue; cette séquence ne comportant ni une zone d'atténuation de trp, ni des nucléotides assurant le codage pour l'em- placement de fixation des ribosomes E de trp; o) placer l'inoculant transforme dans une cuve de fer- mentation et le laisser croîtr.e jusqu'à un niveau pre- déterminé dans un milieu nutrJtif approprié contenant 1 T'additif tryptophanne en u,]n: quantité suffisante pour réprimer ce système promotetur/opérateur; et (c) priver cette bactérie de cet additif de façon à déréprimer ce système et provoquer l'expression du produit pour lequel le gène structural précité assure le codage. 2. Procédé suivant la revendication 1, ca- ractérisé en ce que le polypeptide exprimé par ce gène structural est entièrement hétérologue. 3. Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que le polypeptide exprimé est une protéine de fusion comprenant un polypeptide hétérologue et au moins une partie de la séquence d'acides aminés d'un polypeptide homologue. 4. Procédé suivant la revendication 3, carac- térisé on ce que cette partie est une partie de la sé- quence d'acides aminés d'une enzyme intervenant dans le cycle biosynthétique allant de l'acide chorismique au tryptophanne. 5. Procédé -suivant la revendication 4, carac- térisé en ce que le polypeptide hétérologue est un poly- peptide bio-actif, tandis que le polypeptide homologue fusionné est un polypeptide de bio-inactivation spéci- fiquement clivable. 6. Procédé suivant la revendication 3, carac- térisé en ce que le polypoptide homologue est le poly- peptide E de trp, tandis que l'emplacement de fixation des ribosomes est ltemplacement de fixation des ribo- somes pour le polypeptide directeur de trp. 7. Procédé suivant la revendication 3, carac- térisé en ce que le polypeptide homologue est le poly- peptide D de trp. 8. Procédé suivant la revendication 6, carac- térisé en ce que la protéine de fusion comprend un poly- peptide hétérologue et un polypeptide homologue qui constitue lui-même une fusion à peu près des six pre- miers acides aminés du polypeptide directeur de trp et de la séquence d'acides aminés encodée par au moins à peu près le tiers distal du gène de polypeptide E de brp. 9. Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que la privation de tryptophanne est assu- rée en cessant d'ajouter cet additif et en diluant le milieu de fermentation dans lequel on a tout d'abord laissé croître l'inoculant pru(cité. 10. Procédé suivant la revendication 9, ca- ractérisé en ce que la bactérie hôte est E. coli. - 11. Véhicule d'expression plasmidique pour la production, dans la bactérie E. coli, d'un produit polypeptidique hétérologue, ce véhicule comportant une séquence d'ADN bicaténaire comprenant, en phase depuis une première extrémité 5' jusqu'à une deuxième extrémité 31 de son brin de codage, les éléments suivants: (a) un système promoteur/opérateur de trp bac- térien; (b) des nucléotides assurant le codage pour un emplacement de fixation de ribosomes pour la traduction de l'élément (d); (c) des nucléotides assurant le codage pour un signal de déclenchement de traduction del'él1ment (d);et (d) un gène structural encodant la séquence d'acides aminés d'un polypeptide hétérologue; cette séquence ne comportant ni une zone dlatténuation de trp, ni des nucléotides assurant le codage pour l'em- placement de fixation des ribosomes E de trp. 12. Véhicule suivant la revendication 11, ca- racterisé en ce que le polypeptide exprimé par ce gène structural est entièrement hétérologue. 13. Véhicule suivant la revendication 11, ca- ractérisé en ce que le polypeptide exprimé est une protéine de fusion comprenant un polypeptide hétéro- logue et au moins une partie de la séquence d'acides aminés d'un polypeptide homologue. 14. Véhicule suiv;ant l;. revendication 13, ca- ractérisé en ce que cette plirtie est une partie de La séquence d'acides aminés d 'un( enzyme intervenant cldans le cycle biosynthétique allant de l'acide chorismique au tryptoplhanne. 15. Véhicule suivant la revendication 14, ca- ract é'is (11 (ce que le p ypt i liétér ologue est utiI polypeptide bio-actifLtandlis qu{e le polypeptide llimol)o- gue flusionné est un polypeptidc de bio-inactivatiorn 24 Pl78 spécifiquement clivable. 16. - Véhicule suivant la revendication 13, caractérisé en ce que le polypeptide homologue est le poly- peptide E de trp, tandis que l'emplacement de fixation des ribosomes est l'emplacement de fixation des ribosomes pour le polypeptide directeur de trp. 17. - Véhicule suivant la revendication 13, caractérisé en ce que le polypeptide homologue est le polypeptide D de trp. 18. - Véhicule suivant la revendication 16, caractérisé en ce que la protéine de fusion comprend un polypeptide hétérologue et un polypeptide homologue qui constitue lui-même une fusion à peu près des six premiers acides aminés du polypeptide directeur de trp et de la séquence d'acides aminés encodée par au moins à peu près le tiers distal du gène de polypeptide E de trp. 19. - Les plasmides pBRHtrp, pSOM7LS2, pEGH207, pHKYl, pSOM7A2 A4, pThya7 A1l 4 et pTha7 A2. 20. - Procédé de création d'un plasmide d'expression pour l'expression d'un gène hétérologue, ce procédé consistant à ligaturer simultanément, en phase: (a) un premier fragment linéaire d'ADN bicaténaire contenant un réplicon et un gène exprimant une caractéristique sélectionnable lorsqu'il est placé sous la direction d'un promoteur bactérien, ce fragment étant dépourvu' de tout promoteur de ce type; (b) un deuxième fragment linéaire d'ADN bicaténaire comprenant ce gène hétérologue; et (c) un troisième fragment d'ADN bicaténaire comprenant un promoteur bactérien; les extrémités de ces fragments, qui peuvent être ligaturées, ayant une configuration telle que, lord de la ligature en vue de former un plasmide réplicable, le gène prévu pour la caractéristique sélectionnable et le gène hétérologue viennent se placer sous la direction du promoteur, permettant ainsi d'utiliser la caractéristique sélectionnable pour la sélection des colonies de bactéries transformantes capables d'exprimer le gène hétérologue. 24po78 I 21. - Procédé suivant la revendication 20, caractérisé en ce que la caractéristique sélectionnable est la résistance aux antibiotiques. 22. - Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en ce que la caractéristique sélectionnable est la résistance à la tétracycline, tandis que le promoteur bactérien est le promoteur de trp. 23. - Procédé suivant la revendication 22, caractérisé en ce que la ligature reconstitue également un opéron pour l'expression de la résistance à l'ampicilline. 24. - Procédé de clivage d'ADN bicaténaire en n'importe quel point donné, caractérisé en ce qu'il consiste a: (a) transformer l'ADN bicaténaire en ADN monocaténaire dans une zone entourant ce point; (b) hybrider, sur la zone monocaténaire formée lors de l'étape (a), une longueur de matrice complémentaire d'ADN monocaténaire, l'extrémité 5' de cette matrice étant opposée au nucléotide adjacent à l'emplacement de clivage envisagé; (c) rétablir la partie du deuxième brin qui a été éliminée lors de l'étape (a) et qui est située dans la direction 3' à partir de cette matrice, par réaction avec la polymérase d'ADN en présence de triphosphates de déoxynucléotides contenant de l'adénine, de la thymine, de la guanine et de la cytosine; et (d) mettre à digérer la longueur monocaténaire restante d'ADN faisant saillie au-delà du point de clivage envisagé. 25. - Procédé suivant la revendication 24, caractérisé en ce qu'on effectue simultanément les étapes (c) et (d) par réaction avec la polymérase d'ADN qui polymérise dans la direction 5'-> 3', qui est exonucléolytique dans la direction 3' - 5', mais qui est non exonucléolytique dans la direction 5' -) 3'. 26. - Procédé suivant la revendication 25, caractérisé en ce que la polymérase est la polymérase I de Klenow. 27. - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue comprend un polypeptide récupérable choisi parmi le groupe comprenant l'hormone de croissance humaine, la pro-insuline humaine, la somatostatine, la thymosine al, la chaîne A de l'insuline humaine et la chaîne B de l'insuline humaine. 28. - Véhicule suivant la revendication 11, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue comprend un polypeptide récupérable choisi parmi le groupe comprenant l'hormone de croissance humaine, la pro-insuline humaine, la somatostatine, la thymosine al, la chaîne A de l'insuline humaine et la chaîne B de l'insuline humaine.