Brevet FR2485038A1 — publié le 19811224

L'invention concerne des produits et des procé- dés utilisant ces produits, pour effectuer des immunotests. On a toujours eu besoin d'essais de filtration de grand volume pour identifier la présence ou l'absence d'anti- gènes, anti-corps et analytes dans un grand nombre de tests. Divers procédés ont été utilisés dans le passé, comme la chro- matographie en phase gazeuse, la spectromètrie de masse, la chromatographie en phase liquide et divers procédés d'essai bio- logiques. Souvent ces procédés nécessitent beaucoup de temps, sont coûteux et ne peuvent être appliqués de façon efficace à un programme de filtration à grande échelle. On a suggéré que les procédés d'essais immunolo- giques pourraient être utilisées pour ces filtrations, puisque les essais d'immunologie sont connus pour être spécifiques, hautement sensibles et simples à mettre en oeuvre. Les essais radio-immunologiques (RIA) par exemple, ont trouvé un vaste domaine d'application en liaison avec les diagnostiques clini- ques. Néanmoins, les procédures RIA sont souvent incompatibles avec des programmes à grande échelle. Les radiotraceurs utili- sés limitent la stabilité et l'on a souvent recours à des pro- cédés de filtration spéciaux, et à des instruments sophistiqués. Pour certaines applications, les procédés RIA peuvent crier des dangers potentiels, comme dans l'environnement de traitements de produits alimentaires. D'autres techniques ont été développées comme les essais d'immunologie fluorescents ou enzymatiques, dont l'utilité réside en ce que des réactifs potentiellement dange- reux sont évités. Cependant, ces procédés nécessitent fréquem- ment des étapes de séparation par filtration ou centrifugation. Ces séparations rendent les essais plus lents et difficiles à automatiser. Selon un développement plus récent, on utilise un antigène marqué par un enzyme ce qui ne nécessite pas de sé- paration exempt de liaison et peut donc être réalisé avec une excellente sensibilité. Un système de ce type peut être automa- tisé pour des essais de grand volume, comme le système EMIT dé- crit par Rosenthal, A.P., Vargas, M.G. et Elass, C.8. (1976) Clin Chem. 22, 1899Z Ce système utilise un mode d'association antigène-enzyme qui est tout à fait critique et peut conduire à un système qui n'est pas tout à fait adapté à différentes 1.- 2.- 2485038 analyses, sans un développement extensif pour chaque nouveau système. Récemment, on a vu paraltre des publications sur des liposomes qui peuvent porter des enzymes ou substrats et peuvent être marqués par des antigènes ou anticorps. Les lipo- somes porteurs d'antigènes sur leur surface externe et conte- nant un enzyme enfermé dans leur volume interne, sont mélangés avec un anticorps correspondant, un complément, un substrat d'en- zyme et un échantillon d'essai, pour déterminer si les liposo- mes permettent ou non de libérer l'enzyme enfermé. Cette déter- mination s'effectue par détection de l'activité enzymatique en présence de substrat, après exposition à un échantillon d'essai. Voir Uemura, K. et Kinsky S.C. (1972) Biochemistry, 11, 4085- 4094 et Kataoka, T., Williamson, J. et Kinsky, S. (1973) Bioche- mics et Biophysica Acta 298, 158-179. Néanmoins, il n'a pas été démontré que ces liposomes, lorsqu'ils sont convenablement for- més, avec des rapports convenables du signal au bruit de fond, peuvent être utiles pour des procédés d'essais immunologiques, ce qui évite l'utilisation d'étapes de séparation, et permet des tests en phase réactionnel homogène. De plus, des difficultés ont été signalées dans la préparation de liposomes immuno-spé- cifiques selon la technique antérieure, G.H. Strejan, P.M. Smith, C.W. Grant et D. Surlan, "Naturally Occurring Antibodies To Liposomes", The Journal of Immunology, Vol. 123, No 1, Juillet 1979, 370-378. De plus, on a constaté depuis longtemps, que la diffusion de macromolécules comme les enzymes à travers des lé- sions produites par le complément dans des membranes bicouches, est bien plus lente que celle de petites molécules (green, H. Barrow, P. et Goldberg, B. (1959) J. Bxp. Ned. 110, 699). L'invention a pour objectif de proposer des produits et des procédés d'essais immunologiques pour applica- tion dans des processus de test rapides et simplifiés, qui peu- vent déterminer, de façon quantitative et/ou qualitative la présence ou l'absence d'antigènes ou d'anticorps. Il s'agit également de proposer des procédés pouvant être mis en oeuvre par un personnel relativement peu qua- lifié, avec des résultats de tests déterminés en une seule éta- pe, avec facilité de lecture des résultats et sans nécessiter 4P une étape de séparation après la réaction de test. L'invention se propose également de fournir-une réaction en phase homogène, dans laquelle on agit sur des lipo- somes chargée d'enzyme, attachés à un antigène ou anticorps, pour qu'ils libèrent de façon immunospécifique l'enzyme, en pré- sence d'anticorps ou d'antigène correspondant, et de complément actif, Un autre objectif de l'invention est de propo- ser des liposomes marqués d'un antigène ou anticorps et porteurs d'un enzyme, ayant cependant un rapport du signal au bruit de fond, qui n'est pas inférieur à 10, et ayant, de préférence, une stabilité d'au moins 60 jours au sein d'un liquide. Conformément à l'invention, un liposome est marqué d'un antigène ou anticorps, et porte un enzyme, et présente ce- pendant un rapport du signal au bruit de fond qui n'est pas in- férieur à 10. De préférence, le liposome se trouve au sein d'un milieu liquide, et il est stable pour une période d'au moins jours. De préférence, le rapport du signal au bruit de fond est élevé et supérieur à 65, avec une stabilité de plus de six mois à 400C, sous atmosphère de gaz inerte. Le liposome de l'in- vention est vendu sous forme de kit, avec des fibles d'antigène ou anticorps apparenté, qui sont immunospécifiques pour l'anti- gène ou l'anticorps attachés à la surface du liposome et le complément. Selon le procédé de l'invention, le procédé d'essai immunologique comprend la formation d'un mélange de s (a) liposomes exhibant un antigène ou anticorps, porteurs d'un enzyme et présentant un rapport du signal au bruit de fond qui n'est pas inférieur à 10, (b) un substrat pour l'enzyme, (c) une matière d'essai devant 8tre testée pour l'activité spécifi- que d'antigène ou anticorps et (d) le complément. le mélange est observé et la présence d'activité enzymatique est détectée par changement de coloration visible à l'oeil nu, par observa- tion spectroscopique ou autre. De préférence, l'antigène ou l'anticorps apparenté additionnel, attaché aux liposomes, est amalgamé au mélange et le test est effectué pour le m8me anti- gène ou anticorps que celui attaché aux liposomes. Si un anti- gène ou anticorps immunospécifique testé est présent dans la matière du test, l'anticorps ou antigène libre, selon le cas, réagit dans le mélange avec l'antigène ou anticorps, laissant le liposome intact, empêchant ainsi la libération de l'enzyme, 3.- tandis que si l'anticorps apparenté n'est pas présent dans la matière du test, 1' "étiquette" du liposome réagit et l'enzyme est relâché. La quantité de corps apparenté dans l'échantillon de test, s'il y en a, peut-permettre une certaine libération d'enzyme, si elle est insuffisante pour réagir avec tous le produit apparenté libre dans le mélange de test. Dans certains cas, le procédé d'essai d'immuno- logie peut être employé directement pour détecter l'un des élé- ments du groupe antigène, anticorps ou complément. Dans la mé- thode directe, on prépare un mélange incomplet o manque un élément du groupe antigène, anticorps ou complément, et la présence de l'élément manquant dans un échantillon de test est évaluée par la proportion dans laquelle l'addition de l'échan- tillon au mélange incomplet, favorise la lyse du liposome. Lors- que la matière de test doit être testée pour l'antigène ou anti- corps correspondant à celui qui agit comme marquage pour le li- posome, il n'est pas nécessaire d'ajouter un antigène ou anti- corps au mélange. Une méthode d'immunologie directe pour anti- gène ou anticorps comprend le mélange suivant: (a) liposomes ayant pour marquage un antigène ou son anticorps apparenté, porteurs d'un enzyme et présentant un rapport du signal au bruit de fond qui n'est pas inférieur à 10, (b) un substrat pour l'enzyme (c) une matière à tester pour l'antigène ou l'anticorps apparen- té (d) le complément. Si l'objectif de l'immunotest direct est d'éva- luer le complément actif dans un échantillon de-test, alors le procédé doit comprendre un mélange de: (a) liposomes ayant comme marquage un antigène ou son anticorps apparenté, porteurs d'un enzyme et présentant un rapport signal-bruit de fond qui n'est pas inférieur à 10, (b) un substrat pour l'enzymes (c) une matière de test à tester pour le complément, (d) un corps libre apparenté à l'autre, partenaire, l'anticorps ou l'antigène. Un procédé préféré d'immunotest comprend la formation d'un mélange constitué de: (a) liposomes ayant comme marquage un antigène ou son anticorps apparenté, porteurs d'un enzyme et présentant un rapport du 4.signal ou bruit de fond qui n'est pas inférieur à 10, (b) un substrat pour l'enzyme (c) une matière à tester pour l'antigène ou l'anticorps apparenté, (d) le complément, et (e) un corps libre correspondant à l'un ou l'autre anti-gène ou anticorps, et la détection de la présence ou absence d'activité enzymatique dans ce mélange. Dans ce procédé, l'antigène recherché peut être utilisé comme "label" des liposomes, et l'on peut utiliser un anticorps apparenté libre. Selon une alternative, l'anticorps recherché peut servir comme "label" pour le liposome et l'on peut utiliser l'anticorps libre apparenté. De préférence, le procédé est exécuté en une étape, et toute les matières sont ajoutées dans une seule fiole, avec incubation dans des conditions standards immunologiques, comme par exemple 3700o ou de l'ordre de 4 à 4500, pour des durées allant de 1 seconde à 120 minutes. Bn alternative, tout est mélangé, sauf le substrat d'enzyme et incubé durant 5 à minutes environ ou plus, et alors le mélange est ajouté à un substrat d'enzyme et le résultat est déterminé. Un kit pour détecter un antigène ou son anti- corps apparenté comporte, de préférence, un premier récipient contenant des liposomes ayant pour "label" soit l'antigène, soit son anticorps apparenté, suspendu dans un tampon approprié. Un second récipient contient de l'anticorps ou antigène concen- tré, lyophilisé en poudre, ou congelé, qui correspond à celui porté par le liposome. Une troisième fiole contient le complé- ment en poudre ou congelé, qui peut être constitué par du sérum de cochon d'Inde, et un quatrième récipient contient un substrat pour l'enzyme, qui peut être sous forme pulvérulente ou liquide. Une solution tampon se trouve dans un autre récipient. Un procédé en une étape peut être utilisé, dans lequel tous les composants sont mélangés et soumis à l'incuba- tion. Cependant, dans certains cas, le procédé peut s'effectuer en deux ou plusieurs étapes, avec certaines des matières lais- sées incuber ensemble avant de tout mélanger. Dans tous les cas, il n'est pas effectué de séparation après l'immuno-réaction ou après que l'on ait constaté son absence, et une observation di- recte des matières de la réaction est effectuée pour déterminer la présence ou l'absence de l'antigène ou anticorps dans le 5.- spécimen testé, par détection de l'activité enzymatique ou réac- tion avec le substrat. Une caractéristique de l'invention est que le test peut être effectué rapidement, par un personnel non en- trainé, à un prix relativement bas. L'évaluation peut être sub- jective, à savoir visuelle, pour observer un changement de cou- leur lorsqu'un résultat qualitatif est recherché. Des évalua- tions semi-quantitatives peuvent être obtenues de façon subjec- tive, lorsqu'il se produit un changement de couleur foncée en couleur claire. Des méthodes spectrophotomètriques et autres peuvent également être utiliséas 2our détecter la présence ou l'absence d'activité enzymatique en présence de substrat, ce qui indique la lyse du liposome ou la libération par le liposo- me de l'enzyme qu'il contient normalement. Cette libération ar- rive lorsque ilimmuno-réaction s'effectue sous forme d'un immuno- complexe, et affecte la membrane à deux couches renfermant l'en- zyme, du liposome. Lorsque l'anticorps ou l'antigène, selon le cas, réagit dans le système avec le corps opposé à celui qui sert de marquage au liposome, en présence de complément actif, l'enzyme est libéré. Néanmoins, si l'échantillon de test con- tient l'antigène ou l'anticorps recherché, la réaction du corps apparenté dans le milieu, empêche ou réduit la réaction avec le marquage apparenté, et ainsi empêche que l'enzyme soit détecté dans le substrat indiquant un résultat positif pour l'antigène ou l'anticorps-précédemment testé. Les liposomes de l'invention sont appelée par- fois mésophases smectiques ou vésicules synthétiques. Ce sont en fait, des pellicules lipidiques sèches, en suspension dans un milieu aqueux, comme décrit par Uemura, K. et Kinskyp S*C. (1972) Biochemistry 11, 4085-4094. On suppose que les liposomes sont constitués de bicouches lipidiques qui séparent un compar- timent aqueux interne d'un milieu aqueux externe, et sont en fait des prototypes de membranes biologiques. Les liposomes imitent les propriétés des membranes biologiques. Comme on le sait, ils peuvent être destinés à contenir, soit des substrats d'enzyme, soit des enzymes. Pour la présente invention, les liposomes contiennent un enzyme et présentent une surface ex- terne essentiellement exempte d'enzyme, cette surface externe renfermant V'enzyme et portant comme marquage un antigène ou son anticorps opposé, selon le test à effectuer. De préférence, 6.- si l'on recherche l'anticorps, le liposome va porter comme marquage cet anticorps, alors que, si l'on recherche l'antigène, le liposome va porter comme marquage l'antigène. Les liposomes sont connus dans la technique an- térieure. Néanmoins, on n'a pas obtenu jusqu'à présent des liposomes ayant des enzymes contenus par eux, ces liposomes pré- sentant un rapport du signal au bruit de fond qui n'est pas inférieur à 10. La cause en est probablement que la technique antérieure n'a pas vu quel avantage il y avait à obtenir de tels liposomes, pour l'utilisation dans des immunotests, Le rapport signal-bruit de fond devra être de ou plus, de préférence au moins 60, et peut être 1000 ou plus, de sorte que les liposomes contiennent l'enzyme et le sé- parent du substrat. Ainsi, il se produit une activité enzymati- que non détectable, en l'absence d'un complexe antigène-anticorps ou immunocomplexe, formé pour rompre ou rendre poreux la mamé brane du liposome. Dans certains cas, le rapport du signal au bruit de fond peut être de 5 ou plus dans des liposomes selon l'invention, tant qu'il n'apparait pas d'activité enzymatique détestable en l'absence de formation d'un complexe antigène- anticorps ou d'un immunocomplexe, Le rapport du signal au bruit de fond, comme connu dans la technique, est obtenu en comparant une première fiole ou fiole de bruit de fond, de li- posome portant comme marquage l'antigène ou l'anticorps appa- renté, en suspension dans une solution tampon isotonique, en présence d'un substrat d'enzyme, à une seconde fiole ou fiole de signal, contenant le substrat d'enzyme, le liposome comme décrit précédemment, en présence d'un agent de lyse connu, com- me un détergent fort. Le rapport du signal au bruit de fond est le résultat de la réaction enzymatique observée, De préférence, le tube de bruit de fond ne contenant pas l'agent de lyse, est aussi faible que possible, n'indiquant pas de bruit de fond et par suite, peu ou pas d'activité enzymatique. De préférence, le bruit de fond est maintenu faible ou non-existant pour une période aussi longue que possi- ble. Dans la forme préférée,.le niveau du bruit de fond est nul ou proche de zéro, après stockage durant au moins 60 jours, ou le rapport du signal auv bruit de fond n'est pas inférieur à 10. Ceci permet de préserver durant une longue période la qualité du produit, ce qui est important pour la vente des kits de test. 7,- Dans les procédés d'immunotest selon l'invention, le liposome sequestre l'enzyme en le séparant du substrat, et par la médiation du complément activé de façon immunospécifique, il apparait une activité enzymatique, autrement latente (cachée). Le liposome encapsule l'enzyme, c'est-à-dire que l'enzyme est physiquement piégé à l'intérieur d'un espace délimité par une membrane bi- couches. L'encapsulement physique agit également pour séquestrer l'activité enzymatique. Le paranitrophényl- phosphate (pNPP) est un- substrat pour l'enzyme phosphatase alca- line (AP). Dans des conditions alcalines (pH supérieur à 7), le AP va détacher le groupephosphate du pNPP (qui est incolore), produisant ainsi du para-nitrophénol qui est coloré en jaune intense en milieu alcalin. AinsiI lorsqu'on prépare une solu- tion aqueuse de pNPP, cette solution est incolore. Si l'on ajoute alors du AP à cette solution, une coloration jaune inten- se se produit assez rapidement. Les liposomes utilisés dans cette invention sont tels, qu'ils encapsulent le AP et séquestrent cet AP en le séparant du pNPP se trouvant dans la solution aqueuse environnante. Ainsi, les liposomes avec le AP encapsulé, peu- vent être dispersés dans des solutions de pNPP et il ne se pro- duit qu'une très faible coloration en jaune, tandis que si la même quantité de AP que celle encapsulée, devait être introduite directement, une coloration considérable se développerait assez rapidement. Pour les raisons évoquées ci-dessus, lors de la formation des liposomes, les enzymes dont l'activité peut être sequestrée de manière efficace par la bicouche lipidique intacte, sont sélectionnés; il en résulte un rapport du signal au bruit de fond qui est supérieur à 5. Il est préférable de ne pas uti- liser des enzymes qui: (a) seraient absorbés sur la surface externe de la membrane de liposome, et seraient donc tout le temps accessibles au subs- trat dans le milieu environnant, (b) seraient inclus dans la bicouche elle-même et pourraient donc être au contact aussi bien du milieu interne que du milieu externe, et deviendraient ainsi accessibles au substrat du milieu environnant, (c} réagiraient avec des substrats qui peuvent diffuser aisément à travers une bicouche lipidique intacte (ce serait le cas de petites molécules, non polaires, solubles dans les lipi- - 8.- des). Dans ce cas, même si l'enzyme peut être encapsulé,son activité ne serait pas sequestrée, dans la mesure oh le subs- trat se trouvant dans le milieu environnant, pourrait accé- der à l'enzyme encapsulé, en diffusant à travers la bicouche lipidique. La structure de la séquestration est importante da4s le contexte d'un immunotest selon l'invention. C'est parce que cette séquestration peut être rompue de façon immunospéci- fique que l'on peut obtenir un essai homogène, c'est-à-dire qu'il n'est pas nécessaire d'avoir une séparation physique du signal libre par centrifugation, chromatographie, filtration, immobi- lisation de phase solide, etc..Des séparations de ce genre sont très longues, exigent des instruments spéciaux, et sont diffici- les à automatiser. Les liposomes sont préparés à partir de lipides amphiphiliques. Les lipides peuvent être définis de façon gé- nérale comme des molécules de poids moléculaire intermédiaire (150-3000 daltons) constitués surtout d'unités hydrocarbonées saturées ou insaturées et/ou aromatiques ou aliphatiques. Les lipides amphiphiliques sont ceux qui contiennent aussi bien des parties aquo-solubles que des parties insolubles dans l'eau Small (J. Am. Oil Chem. Soc. 45, 108-117, 1968) donne une clas- sification des lipides basée sur leur interaction avec l'eau, aussi bien dans la masse qu'à la surface. Les lipides utilisables dans l'invention sont définis ci-dessous: CLASSE I - lipides amphiphiliques insolubles. noh gonflants - -di et triglycerides, acides gras protonés à longue chaine, ester steroliques, alcools à longue cha ne, phy- tols, retinals, vitamine A, vitamine K, vitamine E et de nom- breux sterols comme le cholesterol, le desmosterol, la vitamine D et un certain nombre d'hormones. CLASSE II - Lipides amphiphiliques insolubles gonflants - -Lecithines, éthanolamines phosphatidyl, inosi- tol phosphatidyl, sphingomycline, cerebrosides, acide phosphati- dique, plasmalogènes, serine phosphatidyl, cardiolipines, et certaines sulfolipides végétales. CLASSE III A - Amphiphiles solubles, type A - Froment des phases cristallines liquides lors- qu'on ajoute de petites quantités d'eau (mesomorphisme lyotro- pique). Comprend de nombreux détergents classiques, anioniques, 9._ cationiques et non-ioniques. CLASSE III B - Amphiphiles solubles, type B - Ne forment pas de cristaux liquides, pas de sels à polarité définie. Les lipides de la classe II sont particulière- ment appropriés pour la formation de liposomes, et ces derniers peuvent être souvent préparés à partir de ces lipides seul s. Par exemple, on peut préparer dei vésicules)u sacs membraneux assez importantes, à partir d'éthanolamine phosphatidyl, ou de serine phosphatidyl, selon Papahadjopulos Annals N.Y Scad. of Sci., 308, 1978. Dans certains cas, cependant, il est utile d'incorporer des lipides de classe I ou classe III dans la "vé- sicule" bicouche à des fins structurels. Pour produire des bicou- ches moins fluides, notamment par incorporation de cholesterol, ou pour favoriser un plus grand espacement entre les bicouches adjacentes, comme par exemple lors de répulsion électrostatique résultant de l'incorporation de lipides anioniques, phosphate dicetylt ou cationiques, lipides stearylamines, dans les bicouches. Des procédés pour préparer diverses structures vési- culaires ont été décrits (Szoka and Papahadjopoulos Proc. Nat. Scad. Sci. 75, 4194-4198, 1978). Beaucoup de ces structures peu- vent être adaptées à l'invention au moyen de modifications ap- propriées. Dans la sélection d'un mode de préparation approprié, on tient compte de divers critères: 1.- le mode d'incorporation d'enzyme dans les liposomes ne doit pas conduire à la désactivation ou la dénaturation de l'en- zyme. Ainsi, une exposition prolongée à des températures éle- vées ou à des solvants organiques dénaturants est à éviter. 2.- Des liposomes devront être suffisamment grands pour incorpo- rer l'activité enzymatique. Des structures d'un diamètre o inférieur à 50100 A ne pourront encapsuler plus de quelques molécules d'enzyme dans la plupart des cas, et ne sont pas conseillées. 3.- La bicouche liposomique devra être stable et relativement imperméable. On a montré (Kitagawa T-, et Inone K., Nature 254, 254-6 (1975)) que l'incorporation de lipides de la classe I, comme les sterols, conduit à une condensation des bicouches, entra nant une rigidité et une stabilité plus élevées, et une aptitude accrue à la lyse par intermédiaire du complément. 10.- Dans la préparation des liposomes, il est néces- saire que des lipides - comme ceux de la classe II - qui sont insolubles dans l'eau, soient introduits ians un environnement aqueux. Ceci peut être réalisé par divers procédés. Selon un tel procédé connu, les lipides sont dispersées par des moyens physiques dans une solution aqueuse. Une fine pellicule sèche de lipides est formée sur la surface intérieure d'un récipient appropriéo La solution aqueuse conte- nant les substances à renfermer dans les liposomes est alors * placée dans le récipient9 en contact avec la pellicule lipidique. La pellicule lipidique est alors dispersée dans la solution aqueuse par agitation vigoureuse du récipient (des billes de verre d'environ 01 mm de diamètre peuvent être incluses dans le récipient afin d'accélérer cette dispersion). La dispersion de la pellicule lipidique peut 8tre également activée par ultra- son, au moyen d'une immersion du récipient dans un appareil du type bain, ou par immersion d'un échantillon dans la solution aqueuse, L'action excessive peut désac- tiver les enzymes et produire de très petits liposomes. En alternative, les lipides peuvent être dissous dans une solution aqueuse contenant un lipide détergent de clas- se III A ou B, comme le laurylsulfate, ou le désoxycholate-de sodium. Le détergent est ensuite éliminé (par exemple par dialyse) et les bicouches de liposome sont formées. Enoch et Strittmatter (Proc. Nat. Scad. Sci 76, 145-149) ont décrit la préparation o de liposomes à bicouche unique, de 1000 A de diamètre, en uti- lisant du désoxycholate de sodium comme détergent dialysé. Une autre technique connue met en oeuvre l'addi- tion de solution aqueuse à un mélange de lipide et d'un solvant organique volatil, ce solvant étant éliminé ensuite par évapo- ration à pression réduite, Szoka et Papahadjopoulos (Proc, Nat. Scado Soi 75, 4194-4198 (1978)) ont décrit la préparation de liposomes avec un espace aqueux interne très grand par évapora- tion des solvants organiques, le diéthyl éther ou l'isopropylé- ther. Les procédés de dialyse de détergent et les pro- cédés physiques sont particulièrement appropriés à l'invention, car ils produisent des lvésicules" suffisamment grandes et de fagon assez douce, sans désactiver les enzymes0 Dans les cas o . l'on a recours à luévaporation du solvant organique, il ne faut 11o- pas que l'enzyme à encapsuler soit sensible au solvant. Par exem- ple, les "vésicules" de ce type peuvent être préparées en con- tenant une phosphatase alcaline, cet enzyme n'étant pas dénaturé par le diéthyléther utilisé dans le procédé. Les enzymes adaptés à l'utilisation dans l'in- vention, sont tous ceux qui conduisent à un bruit de fond peu élevé. Un grand nombre d'enzymes connus peut être utilisé dans l'invention. Ces enzymes sont très variés en ce quiconcerne leur substrat, la nature de la réaction catalysée, la stabilité, la demi-vie, les conditions de réaction optimales (pH, force ionique, température) et autres. L'Union International des Bio- climistes a classé divers enzymes selon la nature de la réaction catalysée. Il y a un certain nombre de critères qui peuvent être appliqués dans la sélection d'un enzyme donné# pour appli- cation industrielle. Ces enzymes qui sont disponibles mais en très faibles quantités, sont moins recommandés que les enzymes qui sont abondants et disponibles dans le commerce. L'enzyme devra être stable lorsqu'il est stocké à des températures adap- tées à l'application industrielle, c'est-à-dire 40 durant au moins 3 mois. L'activité catalytique ou demi-vie de l'enzyme de- vra être suffisamment élevée pour produire une réaction délec- table en une période relativement courte, de quelques secondes à 120 minutes. L'activité catalytique de l'enzyme devra être ai- sément détestable par des moyens disponibles dans le commerce, c'est-àdire que la réaction catalysée produit un décroissement ou accroissement dans l'absorption de la lumière dans les régions visibles ou ultraviolet, de l'ordre de 250-750 nm. De préférence, l'enzyme ne devra pas être pré- sent en quantité notable dans l'échantillon à tester et ne de- vra pas être susceptible d'être inhibé par des substances que l'on trouve couramment dans l'échantillon à tester. L'enzyme ne devra pas être désactivé ou empoi- sonné par les lipides employés dans la préparation du liposome -et ne devra pas être désactive ou dénaturé durant la préparation du liposome. L'enzyme sélectionné sera un enzyme qui puisse être complètement encapsulé. Des enzymes de ce type se trouvent dans la nature dans le cytoplasme cellulaire o circulent libre-- ment des fluides extra-cellulaires. Les protéines des membranes 12.naturelles ne sont pas recommandées. Celles-ci se trouvent dans la nature en association avec des membranes cellulaires et présentent des surfaces hydrophobes qui les accrochent à la bi- couche. Généralement, ces enzymes franchissent la bicouche avec leurs sites catalytiques exposés au milieu aqueux environnant. Le tableau suivant indique des enzymes présen- tant un intérgt particulier, classés selon l'Union Internationale des Biochimistes: 1. Oxidoreductases 1.1 Agissant sur le groupe CH-OH de donneurs 1.1.1. Avec NAD ou NADP comme accepteur 1. alcohol déhydrogènase 6. glycérol déhydrogènase 26. glyoxylate réductase 27. L-lactate déhydrogènase 37, malate déhydrogènase 49. glucose 6-phosphate déhydrogènase 17. mannitol 1-phosphate déhydrogènase 1.1.2. Avec cytochrome comme accepteur 3. L-laxtate déhydrogènase 1.1.3. Avec 02 comme accepteur 4. glucose oxidase 9. galactose oxidase 1,2 Agissant sur le groupe CH-NH2 de donneurs 1.4.3. Avec 02 comme accepteur 2. L-amino acide oxidase 3. D-amino acide oxidase 1.6 Agissant sur NAD ou NADP réduits comme donneur 1.6.99 Avec d'autres accepteurs diaphorase 1.10 Agissant sur diphenols et substances apparentées comme donneur 1.10.3 Avec 02 comme accepteur 1. polyphenol oxidase 3. ascorbate oxidase 1.11 Agissant sur H202 comme accepteur 1.11.1 6. catalase 7. peroxidase 3. Hydrolases 3.1 agissant sur liaison ester 13. - 3.1.1. carboxylique ester hydrolases 7. cholinesterase 3.1.3. phosphorique monoester hydrolase 1. phosphatase alcaline 3.1.4. Phosphorique diester hydrolase 3. phospholipase C 3.2 Agissant sur composés glycosyl 3.2.1. Glycoside hydrolases 1. d%-amylase 4. cellulase 17. lysozyme 23. P -galactosidase 27. amyloglucosidase 31. ê glucuronidase 3.4 Agissant sur liaison peptide 3.4.2. Peptidyl-amino acide hydrolase 1. carboxypeptidase A 3.4.4. Peptidyl-peptide Hydrolase 5. c> -chymotrypsin 10. papaine 3.5 Agissant sur liaisons C-N ou autres liaisons peptides 3.5.1. dans amides linéaires 5. urease 3.6 Agissant sur liaisons anhydride d'acide 3.6.1 Dans anhydrides contenant du phosphoryl 1. pyrophosphatase inorganique 4. Lyases 4.1 Carbon-carbon lyases 4.1.2 Aldehyde lyases 7. aldolase 4.2 Carbon-oxygène lyases 4.2.1. hydrolases 1. carbonique anhydrase 4.3 carbon-azote lyases 4.3.1 ammoniac lyases 3. histidase les substrats utilisables dans l'invention sont ceux qui réagissent avec les enzymes choisis, et comprennent, par exemple, les pnitrophényl phosphate et 4-méthyl umbelliferyl phosphate pour la phosphatase alcaline; l'acide 4-aminosalicyli- 14.- 15.- 2485038 que ou O0dianisidine et peroxyde d'hydrogène pour la peroxydase; et 0- ou p-nitrophényl glycosides pour les glycosidases. D'au- tres substrats utilisables sont ceux énumérés par Bergmeyer, Methods for Enzymatic Analysis, Academic Press NoYo 1965. Non désirables sont les substrats qui pourraient diffuser aisément à travers une membrane bicouche intacte. Ces substrats sont généralement de petites molécules, solubles dans des solvants lipidiques. Les antigènes que l'on peut rechercher ou uti- liser comme marquage pour les liposomes, conformément à lVinven- tion, sont nombreuxo I1 existe un certain nombre d'antigènes dont la quantité n'est pas significative dans les diagnostics cliniques. Beaucoupnd'entre eux sont testés maintenant par des procédés radioisotopiques0 Des essais effectués sur ces produits selon la présente invention, seraient un progrès considérable dans la mesure oh des réactifs dangereux, instables, ne sont pas employés, L 'invention era appliquée avec avantage à la détection et estimation d'hormones de circulations comme indi- cateurs de la fonction endocrinienneo Une énumération partielle de ces hormones comprend s Hormones de la tholde o thyroxine et triido-thyronine, hormone de parathyrolde et calcitonine. Hormones pancréatiques,: insuline9 proinsuline, et glueagone Hormones de pituitary: prolactine, hormone adrenocorticotropi- que, tyrotropine, oxytocine et vasopressine, Hormones utérines et placentales o gonadotropine chorionique, lactogène placental, thyrotropine chorionique et relaxine. Hormones stéroldes. estradiol, estrone, estriol, testosterone et dihydrotestosterone. facteurs de croissance - ugogastrone, facteur de croissance des nerfs, et somatomedines. Le procédé peut 8tre avantageusement appliqué aux porteurs de message intracellulaires, aux nucleotides cycli- C5 ques et aux prostaglandines, L'invention peut aussi être appliquée à la fil- tration de quantités en circulation de médicaments thérapeuti- ques, comme les glycosides cardiaques digoxine, digitoxinep anticonvulsants, diphénylhydantoine, mesantoIlne, phenobarbital et méphobarbitalo les médicaments présentant un intérSt parti- culier, sont ceux qui ont un indice thérapeutique étroit, donc un niveau minimal en circulation est nécessaire pour l'effica- cité thérapeutique, tandis qu'un niveau un peu plus élevé évite les réactions dangereuses ou toxiques. Le procédé peut être également adapté à la fil- tration d'antibiotiques comme les pénicilline, streptomycine et les tetracycline, chlorotétracycline, oxytetracycline, et tetra- cycline, chloramphénicol, erythromycine, caromycine, polymyxine B. Les antibiotiques aminoglycosides, comme les gentamycine, amikacine, tobramycine, kanamycine et néomycine, employés dans le traitement des infections bacillaires aérobie Gram négative, peuvent être testés aisément selon l'invention. Ce procédé peut également s'appliquer à la détec- tion et l'estimation de drogues comme les opiates-morphines, héroïne, meperidine et methadoneo les ergalcaloides, la diethy- lamide d'acide lysergique, marijuana, barbituriques et la cocaine et ses dérivés. Dans la mesure o l'invention est facile à mettre en oeuvre et n'emploie pas de réactifs dangereux ou instables la méthode d'essai est applicable dans des endroits qui sont équipés de façon moins sophistiquée que les laboratoires de diag- nostic. Par exemple, la méthode d'essai peut être appliquée pour la filtration des toxines alimentaires et de l'environne- ment. Dans la filtration alimentaire, les antigènes importants sont les mycotoxines et les produits toxiques naturels. Ce domai- ne comprend des toxines majeures comme les aflatoxines, ochrato- xine, patuline, acide pénicillique, zearclonone; et les toxines tricotheceniques comme les métabolites toxiques telsa que l'ipo- meamerone qui existe naturellement dans les aliments. Outre les produits toxiques naturels, il existe une grande variété de con- taminants environnants, dont la présence dans les aliments, même à l'état de traces, pose un grand problème. Ce peut être des produits secondaires industriels ou des pesticides comme les biphényls polychlorés, les dibenzo-p-dioxines chlorés, dibenzo- furanes chlorés, heptachlorepoxyde, dieldrine et DDT 1,1 '-2,2,2- Trichloroethylidene-bis (3-chlorobenzène);,1,11 trichloro-2, 2bis (p-chlorophenyl) éthane. D'autres contaminants alimentaires concernés sont les antibiotiques comme les pénicilline, chloramphenicol et tetracycline. 1 6.- 17.- 2485038 Le procédé n'est pas limité aux petites molécu- les car il a été démontré (Humphries et McConnell Proc. Nat. Acad. Sci. 71, 1691-1694; 1974), que des antigènes macromolécu- laires comme l'albumine de l'oeuf pouvaient être associés à la surface des liposomes immunoréactifs. Ainsi, l'invention peut être aussi appliquée à la détection d'antigènes macromoléculaires, comme les protéines du plasma, les antigènes associés à l'hépa- tite, les marqueurs d'histo-compatibilité. Les antigènes et les matières antigéniques qui doivent être analysés pour cette application, sont tous ceux qui produisent, seuls ou avec d'autres produites des anticorps ap- parentés, détectables par immunoréaction. Par exemple, la digo- xine est considérée comme un antigène parce qu'avec une autre matière, elle produit des anticorps, tels que l'anticorps à la digoxine peut être utilisé dans un test avec, soit l'anticorps, soit la digoxine utilisés comme marquages, selon que l'on recher- che l'anticorps apparenté ou la digoxine. Les matières comme l'albumine de sérum bovin, l'hemocyamine de patelle, ou autres porteurs de macromolécules sont associés de manière covalente à la digoxine ou autre antigène, pour former des anticorps. Le mot "antigène" utilisé ici signifie toute matière antigénique, soit des antigènes en eux-mêmes, soit en combinaison avec d'au- tres matières pour produire des anticorps apparentés aux êtres vivants comme les hommes, rats, lapins, chèvres, moutons, cochons d'Inde, 4es espèces bovines et autres mammifères. L'invention peut être utilisée pour détecter et quantifier des anticorps spécifiques dirigés contre des antigè- nes variés. La présence de ces anticorps, et leur quantité peu- vent servir comme indicateurs du potentiel d'immunité face à di- verses maladies infectieuses, avant l'exposition à la maladie, ou au cours de l'infection active. Par exemple, l'invention se prête aisément à la détection d'anticorps syphilitiques (dirigés contre le Trepone- ma Pallidum), ces anticorps etant réactifs contre la cardioli- pine (extraite du coeur de boeuf) qui est facilement incorporée dans les liposomes. Les anticorps dirigés contre les agents de ma- ladies infectieuses, virus, bactéries, parasites, peuvent aussi être détectés par couplage des marqueurs de surface antigénique à ceux de la surface du liposome. 18.- 2485038 Dans certains cas, la présence d'anticorps diri- gés contre des macromolécules spécifiques, peut indiquer un dé- sordre d'auto-immunité, par exemple des anticorps réactifs vis- à-vis d'acides nucléiques, acides polydesoxyribonucléiques, et acides polyribongclélques, collagène, gamma globulines, thyro- globuline, antigènes parathyroidiques, antigènes mitochondriaux des antigènes de muscle lisse, sont des indicateurs potentiels de maladies artoimmuniques. Les anticorps sont produits par introduction d'une substance immunogénique dans le circuit sanguin d'un animal vivant. L'animal répond par la production d'anticorps qui se lient à l'immunogène comme la première étape de la déto- xyfication de l'immunogène. De nombreux antigènes sont directe- ment immunogéniques, et induisent directement la production d'an- ticorps. Néanmoins, un certain nombre de substances ne sont pas en ellesmêmes immunogéniques, et nécessitent des modifications (couplage à un vecteur approprié2. Des procédés pour la produc- tion d'anticorps sont décrits en détail par Landsteiner Speficity of Serological Reactions, Dover Publications N.Y. 1962 et Weir. Un complément (un groupe comprenant au moins 9 protéines différentes) est un composant clé pour la défense im- munologique d'un h8te contre l'invasion de cellules pathogènes. Le complément, une fois activé (alerté à la présence d'un enva- hisseur cellulaire) s'attache à la membrane extérieure, et crée de petites lésions dans cette membrane. En fait, le complément découpe de petits trous sur toute la surface de la membrane. o Ces trous sont assez petits, de l'ordre de 100 A (100 x 10-8cm) de diamètre. De très petites molécules comme l'eau et des sels simples peuvent facilement diffuser à travers ces lésions. Néan- moins, des macromolécules comme les protéines sont couramment de la même dimension que ces lésions, 40 - 250 A, de sorte que ces macromolécules ne peuvent diffuser à travers ces lésions, ou alors que très lentement, voir Green H., Barrow P., et Gol- dberg B., (1959) J. Expo Med 110, 699. Dans l'invention, le com- plément utilisé permet à une réaction anticorps-antigène, de former effectivement des trous dans la couche de liposome ser- vant de capsule. On pense que cela permet au substrat de péné- trer dans la bicouche liposomique et de réagir avec l'enzyme qui y contenu. Ainsi, une réaction enzymatique apparait même si la lyse de la bicouche est incomplète0 Le complément rend la réac- tion possible soit en aidant la lyse à s'effectuer, soit en for- mant des trous qui permettent la réaction sans lyse. le terme "lyse" est utilisé ici pour désigner l'effondrement et la rup- ture complète de la bicouche de liposome aussi bien que l'ex- position e l'enzyme encapsulé au substrat h travers les trous formés dans la bicouche par la réactioi. immunologique. Dans un kit caractéristique pour la détection d'antigène9 une fiole contient un liposome marqué dtun antigène, en suspension dans une solution tampon appropriée, dans un volume de 0l1 à 10 ml" par exemple- La concentration du liposome dans la solution tampon varie normalement entre 1 et 50 fois micro-molaire. Les solutions tampon utilisables sont les solu- tions salines ou-autres tampons isotoniques. Une seconde fiole contient l'anticorps apparenté de l'antigène, sous forme de pou- dre lyophilisée ou congelée. Dans le cas oU l'anticorps doit être détecté par méthode directe9 cette fiole représente le contr8le positif de l'essai. Uniie troisième fiole contient le complément9 sous forme concentrée, congelée ou poudre lyophili- sée. Le complément classique pour le complexe antigène-anticorps formé est utilisé de manière connue, Par exemple, ce cohplément peut 8tre du sérum de cochon d'Inde. Une autre fiole contient le substrat d'enzyme, qui peut être un liquide, une poudre, ou au- tre, à une concentration suffisante pour permettre une détection facile de l'activité enzymatique, lorsque l'enzyme contenu dans le liposome est libéré. Une autre fiole peut contenir une solu- tion tampon pour diluer les matières durant le test selon l'in- vention. Selon le est le plus simple et le plus recomman- dé, toutes les matières, y compris le substrat sont ajoutées dans une fiole unique, soumises à l'incubation, et l'on détecte un changement de couleur ou l'absence d'un changement de cou- leur pour déterminer si la matière testée, qui peut être par exemple le sérum d'un individu, contient ou non un antigène ou anticorps spécifique, Dans certains cas, toutes les matières excepté le substrat sont ajoutées dans une seule fiole; on les laisse incuber, puis les mélange avec le substrat d'enzyme, et l'on détecte un changement de couleur, ou l'absence d'un chan- gement de couleur, pour déterminer si la matière testée, qui peut 8tre par exemple le sérum d'un individu, contient ou non un 19.- anticorps ou un antigène spécifique. Des enzymes particulière- ment recommandés sont le peroxydase et la phosphatase alcaline, parce que leur réaction avec le p-nitrophényl phosphate et l'acide 4-aminosalicylique donne des réactions colorées aisé- ment détectables à l'oeil, Dans les cas o la lyse par le complément est utilisée pour la quantification de l'analyte, il y a des limita- tions sur l'ordre de l'addition. Cela provient du fait que, lorsque les liposomes portant l'antigène et l'anticorps, le complément, et l'antigène ou anticorps correspondant sont mis en présence, la lyse commence à se produire. Pour des fins de précision quantitative, on préfère que l'échantillon analysé soit ajouté à la fiole avant que le complément puisse agir. Il s'en suit que l'addition devrait se faire dans cet ordre: (1) anticorps, (2) liposomes, (3) échantillon, (4) complément. Les composés 1, 2 et 4 peuvent être permutés, mais l'échantillon est toujours ajouté de préférence avant que le complément d'an- ticorps et les liposomes se combinent. Dans tous les cas, il est préférable d'inclure un test positif connu à réaliser pour le contrôle du test. Par exemple, s'il s'agit d'un test pour la digoxine, une fiole de digoxine standard va 4tre incluse dans le kit. Lorsque le test doit être aussi bien quantitatif que qualificatif, le kit peut comprendre divers échantillons de la matière à tester, à des concentrations différentes, de sorte que le changement de cou- leur obtenu, s'il y en a, dans l'échantillon, puisse être com- paré avec le changement de couleur ou autre activité enzymati- que de chaque échantillon standard, lorsque l'essai se déroule simultanément. La détermination de l'activité enzymatique est bien connue pour une grande variété d'enzymes. De tels tests connus peuvent être utilisés pour conduire l'activité enzymati- que après le test selon l'invention. Une liste de méthodes d'es- sai pour beaucoup d'entre eux est donnée par Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, Academic Press N.Y. 1965.,es plus re- commandés parmi les types d'essai sont ceux qui offrent, soit une sensibilité élevée, soit un emballage pratique. Pour déterminer l'activité du malate déhydrogè- nase (E.C. 1.1.1.40), on fait réagir l'enzyme avec les substrats acide Lmalique et nicotinamide adéninine dinucleotide, et l'on 20.- conduit la réaction à 340 nm selon le processus ci-dessous. On place dans des cuvettes s Test Témoin Tampon phosphate 2.6 ml 2.7 ml NaDH2 0.2 ml 0.2 ml Enzyme (dilué) 01ol ml 0.1 ml Substrat 001 ml - Enzyme - diluer avec le tampon phosphate 0,1 M, pH = 7,4, à une concentration de 0,1 - 0,3 unité/ml substrat - oxaloacetate 0,006 M (fraîchetent préparé)o Dissoudre 6,7 mg de l'acide dans 1 ml de tampon phosphate (1,OM, pH = 7,4), doser jusqu'à pH = 7,4 avec NaOH, et complé- ter à 10 ml. NaDH2 - 0,00375 M. Dissoudre 50 mg de NaDH2 et 240 mg de THAM dans 15 ml de H20, titrer à pH = 7,4 dans HOl, et com- pléter à 20 ml. Tampon phosphate - 0,1 M, pH = 7,4. Avant d'additionner le substrat, l'instrument est équilibré avec une cuvette témoin à une absorption de 0,200. Les lectures se font par intervalles de 15 secondes durant 2 minutes et le taux initial de changement d'absorption par minute est déterminé. Cet enzyme a une demi-vie très élevée, et, de ce fait, se prête à des essais hautement sensibles. De nombreux autres essais d'enzyme peuvent être sélectionnés, car ils se prêtent à des formats d'essai ou des emballages de substrat commodes. Parmi ceux-là, on peut citer: - Phosphatase alcaline (E C. 3.1.3.1). Le substrat synthétique p-nitrophénylphosphate est utilisé, et il peut 8tre conditionné aisément en capsule. - Recueillir par pipette 3,0 ml de substrat dans chacune de deux cuvettes de 1 mm. Ajuster le spectrophotomètre de façon à lire une absorption nulle à 410 mr. * Enzyme - diluer avec de l'eau de façon à obtenir environ 0,005 mg/ml. mg/ml = A278 x 1,43 (Plocke, et al. 1962) Substrat - p-nitrophényl phosphate 0,001 M dans une solution tampon Tris 1,0 M, pH = 8. A l'instant zéro, ajouter 0,1 ml de la solution d'enzyme à la cuvette d'essai, et enregistrer le changement 21.- d'absorption. L'indice d'absorption molaire pour le p-nitrophé- nol dans Tris 1,0 M, pH 8, est de 1,62 x 104. Une unité est l'activité libérant une micromole de p-introphénol par minute, dans les conditions définies, à 25 C. Dans cette réaction, un produit coloré en jaune est formé, ce que l'on peut observer di- rectement à l'oeil nu. L'enzyme peroxydase de raifort (E.C. 1.11.1.7) est également pratique, car il est disponible sur le marché. Une multitude de substrats et de formes d'essai existent pour cet enzyme. Un exemple est le suivant: Ajouter 0,05 ml de colorant à 6,0 ml de substrat. Transférer 2,9 ml dans la cuvette d'essai, et le reste dans la cuvette témoin. Au temps zéro, ajouter 0,1 ml de l'enzyme dilué. Introduire l'enzyme dans la cuvette avec une pipette de 0,1 ml avec la pointe sous la surface. Mélanger en renversant la cuvet- te avec du papier de cire sur le dessus. Enregistrer l'absorban- ce à 15 secondes d'intervalle durant 1-2 minutes et déterminer le taux de changement par minute. Substrat - Stock: 1 ml de H202 à 30 % (Super-oxol de Merck) dilué à 100 ml avec H20. Pour l'utilisation, diluer 1 ml de H202 stocké, à 100 ml avec un tampon phosphate à 0,01 N, pH 6 (frais tous les jours). Colorant: o-dianisidine à 1 % dans l'alcool méthylique (frais, en flacon teinté) Enzyme: solution stockée: 1 mg/ml dans l'eau. Immédiatement avant de s'en servir, diluer 0,1 ml à 250 ml. Une unité d'activité de peroxydase est la quan- tité d'enzyme décomposant 1 micromole de peroxyde par minute, à 250C. Afin que les liposomes fonctionnent dans les immunotests, il est nécessaire qu'ils soient sensibilités et marqués en surface avec l'antigène approprié. Les antigènes peuvent être liés par cdvalence ou dans certains cas, absorbés sur la surface des liposomes préalablement formés. Ou alors, les antigènes peuvent être liés par covalence à un amphiphile approprié, et ce complexe inclus dans le mélange lipidique dont on part pour former les liposomes. Dans ce dernier cas, l'am- phiphile est incorporé dans la bicouche lipidique, et l'antigène rattaché s'étend dans la solution aqueuse environnante. Lorsque les liposomes sont préformés, ils peu- vent comporter à leur surface extérieure diverses fonctions 22.- chimiques, auxquelles des antigènes peuvent 3tre liés par cova- lence. Parmi ceux-ci, on peut citer avant tout ô des groupes amino, dérivés de phosphatidyl éthanolamine, des groupes hydro- xyl provenant de phosphatidyl inositol, et des groupes carboxyl provenant d'acides gras ou de phosphatidyl serine. Ce sont pré- cisément les fonctions disponibles sur les protéines que l'on exploite pour coupler de petits antigènes afin de produire des immunogènes. Ainsi, les antigènes peuvent être associés à des liposomes préformés par réactions chimiques classiques, utili- sant des agents de couplage bifonctionnels comme l'aldéhyde glutarique, les esters diimide, lea diisocyanates aromatiques et aliphatiques, les esters bis-p-nitrophényl d'acides dicarboxy- liques, les chlorures disulfonyl aromatiques et des halogénures aryl bifonctionnels, comme les 1i5-difluoro-294-dinitrobenzène; ptp8-difluoro m, m'-dimitrodiphényl sulfone0 Des réactions ap- propriées pouvant 8tre appliquées à ces couplages sont décrites par Williams et al dans MethodS in Immunology and Immunochemis- try vol 1, Academic Press New York 1967, Dans certains cas, les antigènes peuvent 8tre absorbés sur la surface du liposome. C'est le cas avec certains lipopolysaccharides, comme l'ont montré Uemura et Kinsky (Bio- chemistry 11, 4085-4094 1972). C'est également obtenu pour des antigènes cogplés avec l'amphiphile lysolecithine de classe III. Le fait qu'un antigène puisse être d'abord cou- plé avec un amphiphile sélectionné, par exemple phosphatidyl - éthanolamine, serine - ou inositol - et ensuite inclus dans le mélange lipidique dont les liposomes sont formés, est très im- portant dans la mesure oh cette réaction de couplage peut s'ef- fectuer au sein de solvants variés, lorsqu'on couple des anti- gènes avec des liposomes préformés9 ou des protéines (comme pour préparer l'antigène), la réaction doit presque toujours se dérouler en solution aqueuse, car les solvants organiques pour- raient désactiver ou dénaturer ou détruire les protéines ou liposomes, Par exemple, si l'on souhaite coupler un antigène contenant un résidu carboxyl, on peut préparer le chlorure d'a- cide de l'antigène en utilisant le chlorure de thionyl, Ce chlo- rure d'acide peut alors être couplé au phosphatidyl éthanolamine dans le benzène comme solvant0 Cette souplesse dans le choix du solvant permet de coupler un grand nombre d'antigènes aux lipo- 23.- somes. L'invention sera ihieux comprise à l'aide des exemples décrits ci-après: EXEMPLE 1 - Afin de préparer des liposomes immunoréactifs, marqués en surface avec des groupes dinitrophényl, on a préparé un mélange contenant 40 mg de Lc(-lecithine (Products # P5763 Sigma Chemical Co. of St-Louis, Missouri), 11,6 mg de cholesterol (Products # CH-S Sigma Chemical Co. Lot 570 - 7190) , 2,18 mg de dicetyl phosphate (Product # D 2631 Sigma Chemical Co. Lot 28 (0460) et 2 mg de N-dinitrophenyl aminocaproyl phosphatidyl éthanolamine (Avanti Biochemicals of Birmingham, Alabama, lot DGPE 17) dans 6 ml de chloroforme. On a évaporé le solvant sous pression réduite (trompe à eau), dans un flacon de 50 ml, sur un évaporateur rotatif, produisant une mince pellicule de lipide sèche sur la surface interne du flacon. Afin de s'assurer que le solvant est complètement éliminé, on a poursuivi l'évapora- tion 30 minutes au-delà du moment o la pellicule paraissait sèche. Une solution de 4 mg de phosphatase alcaline (E.C. 3.1. 3.1) dans 4 ml de tampon phosphate 0,01 M, pH = 7,5, contenant du glucose 0,3 M, a été ajouté au flacon que l'on a purgé et scellé sous argon. le flacon scellé a été doucement agité afin de disperser la pellicule lipidique. La pellicule lipidique dis. parait graduellement de la surface du flacon et la phase aqueuse se trouble progressivement. A ce moment là, le flacon est main- tenu à 400 durant 2 heures. Les liposomes contenant la phospha- tase alcaline piégée sont alors séparés de l'enzyme libre par centrifugation à 27.000 g durant 60 minutes. Le liquide surna- geant est décanté et le granulé contenant les liposomes est remis en suspension dans un tampon salin isotonique (phosphate 0,01 M, pH = 7,5, contenant du chlorure de sodium 0,15 M). Une purifi- cation supplémentaire est obtenue, par centrifugations et remi- ses en suspension réitérées. La proportion dans laquelle l'enzyme est encap- sulé à l'intérieur des liposomes, est mesurée par essai de lyse détergente. En présence du détergent Triton X-100, un produit de Rohm and Haas Go, qui agit comme un détergent, les liposomes subissent une rupture et leur contenu est libéré. Une fraction de 10 p 1 des liposomes purifiés est ajoutée à I ml de Triton X-100 à 1 %, dans de l'eau déminéralisée. Comme témoin, 10 U 1 24.- de liposomes sont ajoutés à 1 ml d'une solution saline isotoni- que. L'enzyme est alors mesuré par addition d'une fraction de 50-100J1 de ces dilutions à-1 ml d'une solution de 0,4 mg/ml de substrat paranitrophénylphosphate dans un borate 0,1 M, pH 9. L'hydrolyse du substrat estconduite suivant l'apparition de paranitrophénol et une absorption croissante de la lumière à 410 nm. On laisse cette réaction se dérouler durant 10 minutes et on la termine alors par addition de 1 ml de NaOH 2N. L'acti- vité enzymatique produite par la lyse détergente est comparée au témoin, par mesure du signal de bruit de fond caractéristique des liposomes. Pour la préparation décrite, ce rapport a dépas- se 150, c'est-à-dire que l'augmentation d'absorption produite en 10 minutes par les liposomes soumis à une lyse détergente, était de 1,5, et le témoin a produit moins de 0,01 unité d'aug- mentation d'absorption. Au cours d'expériences subséquentes, des liposo- mes similaires ont été purifiés par chromatographie de filtration sur gel plut8t que par centrifugation. Trois ml de la préparation de liposome ont été déposés sur une colonne de 40 x 1 cm de Sephadex G-200, équilibré avec un tampon phosphate. On a procédé alors. l'évictio les liposomes de la colonne, apparaissant au volume d'environ 15 ml, bien séparés de l'enzyme libre, qui émergeait à 30 ml. EXEMPLE II - Les liposomes sont préparés par une méthode de dialyse détergente. A partir d'un mélange de 50 mg de lecithine d'oeuf, 3,5 mg de cholesterol et 0,5 mg de dinitrophenyl amino- caproylphosphatidyl éthanolamine dans le chloroforme, une pel- licule sèche a été préparée, comme décrit dans l'exemple I. A cette pellicule on a ajouté 5,5 ml de solution contenant 1 mg/ ml de phosphatase alcaline dans une solution tampon de phospha- te de sodium 0,05 M, pH = 7,5, en commun avec 3,6 ml de désoxy- cholate de sodium 10 mM dans l'eau. Le flacon contenant ce mé- lange a été placé dans un bain sonicateur à 35 00 durant 5 minu- tes et sonorisé sous argon. On a obtenu une suspension transpa- rente opalescente. Le détergent désoxycholate a été alors éli- miné par diafiltration, au moyen d'un séparateur immersible Millipore. Trente volumes de phosphate 0,05 M, pH 7,5 ont été échangés par transfert dans la suspension, tout en maintenant un volume constaht de 9,1 ml. Les liposomes ont été alors puri- 25.- fiés encore par chromatographie de filtration sur gel, comme dé- crit dans l'exemple I. Dans ce cas, on a obtenu un rapport si- gnal-bruit de fond de 225. EXEMPLE III- Dans cet exemple, nous avons voulu montrer qu'a- vec des liposomes préparés de façon appropriée, on peut détecter des anticorps dirigés contre un antigène spécifique, par libéra- tion de l'activité enzymatique, simultanément avec une lyse immu- nospécifique. Des poches multilamellaires sont préparées comme dans l'exemple I, et marqués avec N-dinitrophényl amino-caproyl phosphatidyl éthanolamine (5 % de concentration en lecithine). On a mélangé 5 pl de ceci avec 100 P 1 de complément (sérum de cochon d'Inde), 345f 1 d'une solution tampon constituée par du tris (hydroxyméthyl) aminomethane 50 U, pH 7,5, contenant du chlorure de sodium 0,15 M, du chlorure de calcium 0,15 mM et du chlorure de magnésium 0,5 mM, et 50 / 1 de dilutions variées d'antisérum de lapin à de l'albumine de sérum bovin dinitrophé- nylé. Comme témoins, on a inclus des mélanges dans lesquels du sérum de lapin normal remplaçait l'immuno-sérum. Comme autres témoins, on a préparé également des mélanges dans lesquels le complément a été désactivé par incubation à 5600 durant 30 mi- nutes. Ces mélanges ont incubé à 250C durant 15 minutes; après quoi l'on a prélevé des fractions de 100 p 1 et les a ajoutés à des tubes contenant 1 ml d'une solution à 0,4 mg/ml de parani- trophénylphosphate dans du borate de sodium 0,1 M, pH 9. Ces tu- bes ont subi une incubation de 5 minutes à 25 0. La réaction de phosphatase a été arrêtée par addition de 0,1 ml d'hydroxyde de sodium 2 M. L'absorption de plusieurs tubes à 410 nm a été alors déterminée par spectrophotomètrie. Plus l'absorption est grande, plus il y a eu de phosphatase libérée et plus grande est la proportion de lyse immuno-spécifique. Mélange Absorption à 410 nm Témoin: Mélange contenant du sérum de lapin normal (non-immunisé) 0,01 Témoin: Mélange contenant du sérum de lapin normal désactivé par la chaleur 0,01 Mélange testé contenant de l'antisérum à l'albumine de sérum bovin dinitro- 1,2 phénylé. 26.- EXEMPTE IV Dans cet exemple, la lyse immunospécifique des liposomes est appliquée à la détermination des concentrations relatives d'anticorps spécifiques. Toutes les conditions étaient identiques à celles de l'exemple III, mais on a employé des dilu- tions variées de l'anti-sérum DNTP-BSA, afin de déterminer l'in- fluence de différentes concentrations d'anticorps sur la propor- tion de lyse effectuée par l'intermédiaire du complément. L'augmentation de l'absorption à 410 nm en 5 minutes a été enregistrée pour des dilutions diverses Dilution d' antis6rum 410 1 50 1,5 1 À 75 194 1 100 1, 15_ 1 e 200 0,65 I: 300 - ',30 Ainsi, cette méthode peut 8tre employée pour définir les quantités d'anticorps spécifiques. EXEMPTU V - Afin de tester si l'antigène va inhiber la lyse effectuée par l'intermédiaire du complément, et si une telle inhibition peut Otre utilisée pour mesurer les quantités d'anti- gène dans l'échantillon à tester, on a modifié le mode opératoi- re de l'exemple IIIt pour permettre l'inclusion de 50 Pl de solutions de DN1P-lysine à des concentrations différentes dans le mélange initial d'incubation. Si l!on prend l'augmentation d'absorption à 410 nm en l'absence de DPN-lysine libre, comme correspondant à une lyse à 100 %, on a enregistré pour diverses concentrations d'antigène libre, les pourcentages suivants de lyse: DNTP-Lsine libre (_ieomoles) % dialyse 6 83 9 69 13,5 56 18 48 27 33 36 23 Aixdelà de cet ordre de grandeur2 il existe une relation linéaire entre le pourcentage de lyse et le logarithme de la cooncentration n antigène. Aalysée par récurrance des 27.- 28.- plus petits carrés linéaires, la relation linéaire est caracté- risée par les paramètres suivants e pente = -33,3 y intercepté = 143 coefficient de corrélation: 0,998 On observe 50 % pour 16,2 picomoles. Des modes de réalisation spécifiques de l'inven- tion ayant été décrits, il est à noter que de nombreuses varia- tions sont possibles. En particulier, les concentrations, combinaisons et les matières peuvent beaucoup varier, tant que les minimum du rapport signal-bruit de fond de l'invention sont maintenus pour éviter de fausses lectures. Une grande variété de matières peuvent être testées dans une grande variété de tests de filtration à grand volume par un personnel relativement peu entraîné. EXEMPILE VI - Un immunotest quantitatif est effectué selon un procédé en une étape, c'est-à-dire que tous les réactifs, y com- pris le substrat d'enzyme sont mélangés en m9me temps, de sorte que les réactions lytiques et enzymatiques se déroulent simulta- nément. Un procédé en une étape de ce type est simple et pratique, et facile à automatiser. mg de I- oq-lecithine - dipalmitoyl (Calbiochem Behring Corp. La Jolla, California), 8,6 mg de cholesterol (Sig- ma), 1,6 mg de dicetyl phosphate (Sigma) et 1,5 mg de dinitro- phényl aminocaproyl phosphatidyl éthanolamine (Avanti), ont été mélangés dans un solvant chloroforme. Le solvant a été éva- poré sous pression réduite dans un évaporateur rotatif, et une mince pellicule de lipides s'est formée sur la surface interne d'un ballon de 50 ml. Cette pellicule a été alors dispersée dans une solution aqueuse contenant 5 mg de phosphatase alca- line (Sigma) dans 3 ml de tampon PBS-Dextrose. Les liposomes ont été alors recueillis par centrifugation comme dans les exemples précédents. Dans un tube unique, on a introduit 2 microlitres de ces liposomes (20 nanomoles de phospholipide), 100 microlitres de complément de cochon d'Inde (dilué dans un tampon de lyse par le complément), 50 microlitres d'antisérum de lapin au DNP, microlitres de tampon ou de solution standard et 1 ml de substrat de phosphatase. Le mélange réactionnel a subi une incubation à 370C durant 10 minutes, après quoi l'on a ajouté 1 ml d'hydroxyde de sodium 0,5 N pour terminer la réaction enzy- matique. L'absorption à 405 nm a été obtenue par spectrophoto- mètrie. La réaction s'est effectuée dans une proportion dépen- dant de la quantité de DNP-lysine (Sigma) comme suit: Quantité de DNPLysine (pmole) Abs. at 405 nm 0 0,95 2,0 0,902 2,5 0,811 4 0,573 0,430 6 0,311 7 0,257 Si l'absorption à 405 Km, est représentée en fonction du logarithme de la quantité de DNP-lysine, on obtient une droite avec une pente de 66,8, un intercept de 143 et un coefficient de corrélation de 0,995. Une inhibition à 50 % de la lyse est réalisée avec 4 pmolesde DNP-lysine, EXEMPLE VII - Dans un exemple de quantification cinétique, des liposomes du type décrit dans l'exemple précédent sont appliqués à la détermination quantitative d'antigènes, en mesurant la vi- tesse de la réaction enzymatique. Dans ce cas, on mélange les réactifs dans les quantités décrites dans l'exemple VI, dans la cuvette de spectrophotomètrie. Le déroulement dans le temps de la réaction enzymatique peut être alors suivi directement. Après une phase de stagnation caractéristique, la vitesse d'augmenta- tion de l'accroissement d'absorption à 405 devient une fonction linéaire de la concentration en anticorps libre. Un mode opéra- toire type consiste à introduire dans une cuvette spectrophotomé- trique, 0,75 ml d'une solution de substrat de phosphatage, 50 1 d'anticorps, 0,1 ml de complément et 5P 1 de liposomes. La cu- vette est alors placée dans un spectrophotomètre thermostaté et l'on enregistre l'absorption à 405 nm. Il apparait une phase de stagnation caractéristique de 2-3 minutes, durant laquelle l'ab- sorption varie faiblement. Après cette phase, l'absorption aug- mente rapidement. Au-delà de 5 minutes, la vitesse d'augmenta- tion est une fonction de la quantité d'anticorps disponible* Les protéines et autres macromolécules peuvent être couplés aux liposomes. Les lyposomes ayant des protéines 29.- attachées à leur surface externe sont susceptibles de subir une lyse par complément, en présence d'anticorps dans les protéines attachées. On peut préparer des liposomes ayant dans la bicouche membraneuse des lipides adaptés au couplage avec des protéines et d'autres macromoléculeso Des lipides du type phosphatidyl éthanolamine, phosphatidyl serine ou phosphatidyl inositol sont appropriés. EXEMPIE VIII - Le procédé décrit dans l'exemple I est utilisé pour la préparation de liposomes contenant de la phosphatase al- caline. Dans ce cas, le mélange de lipides est constitué par mg de dipalmitoyl phosphatidyl choline, 10mg de phosphatidyl éthanolamine et 8,6 mg de cholesterol. Ces liposomes sont puri- fiés par centrifugation répétée, après quoi on les remet en suspension dans 2 ml de tampon borate 0,1 N, pH 8,5. A cette sus- pension on ajoute 20 p 1 d'aldéhyde glutarique à 25 %. Après minutes à la température ambiante, le mélange est dialysé toute la nuit avec 2 litres de tampon borate. Les liposomes ac- tivés sont alors ajoutés à 2,4 mg d'albumine de sérum bovin dans 1 ml de tampon borate. Le mélange est alors soumis à une incuba- tion pendant la nuit, à 4 C, après quoi les liposomes, ayant une protéine attachée, sont séparés des protéines non liées, par centrifugation à 25. 000 g durant 30 minutes. Suivant le procédé des exemples III et IV, en utilisant de l'anticorps de lapin avec de l'albumine de sérum bovin, on peut préparer un test de lyse immunologique qui va détecter l'albumine dans les échan- tillons de façon quantitative, dans un ordre de grandeur de 0,1 à 2 /Jg par ml. EXEMPLW IX - En vue d'un test, on a couplé la glycoside digo- xine cardiaque à la dipalmitoyl phosphatidyl éthanolamine. A cet effet, un mélange contenant 0,5 g (0,64 mmole) de digoxine dans ml d'éthanol/dioxane (4: 1, v/v) a été ajouté à 60 ml de metaperiodate de sodium à 0,1 M. Le mélange a été agité durant 30 minutes à la température ambiante puis on y a ajouté 4,5 ml d'éthylène glycol. Le mélange a été agité durant une demi- heure à la température ambiante, puis il a été évaporé sous pres- sion réduite. Le solide résultant a été extrait 3 fois par 50 ml de chloroforme. On a rassemblé les fractions extraites (volume total 150 ml) et l'on a évaporé le solvant sous pression réduite, produisant 0,9 g de résidu huileux, 25 mg de ce produit brut de dialdehyde de digoxine dans 1 ml d'éthanol/chloroforme (1 04) ont été ajoutés à 20 mg de dipalmitoyl phosphatidyl éthanolamine dans 1 ml d'éthanol/chloroforme (1:2). Quatre gouttes de triéthy- lamine ont été ajoutées et le mélange réactionnel (pH9) a été soumis à une incubation jusqu'au lendemain à 37oC, et finale- ment évaporé à sec sous pression réduite. Ce résidu a été mis en suspension dans 2 ml d'éthanol/chloroforme (1:1) et l'on a ajouté 4 mg de borobydrare de sodium. Ce mélange a été agité durant 30 minutes puis évaporé à sec sous pression réduite. Ce résidu a été alors trituré avec de l'éthanol et filtré pour donner un filtrat qui, après évaporation a donné 45 mg de di- palmitoyl phosphatidyl éthanolamine digoxine, qui est un produit conjugué. XEMILE x - Le produit conjugué de digoxine et de dipalmi- toyl phosphatidyl éthanolanine est utilisé pour la préparation de liposomes avec la digoxineo Dans ce cas, 22 mg de dimyristoyl- phosphatidyl choline, 8,6 mg de cholesterol,,6 mg de dicétyl phosphate, et 2,5 mg de digoxine-dipalmitoyl phosphatidyl éthano- lamine conjugué ont été dissous dans 3 ml de chloroforme, Le solvant a été évaporé sous pression réduite et les lipides se sont déposés sous forme de fine pellicule sur la paroi interne d'un ballon à fond rond de 100 ml. Le film lipidique a été alors dispersé dans une solution comme dans l1exemple I et pu- rifié également selon cet exemple. Des tests ont été effectués comme dans l'exemple VI. L'inhibition par la digoxine dans des échantillons de test a été observée pour un ordre de grandeur de 0,5-10 ng/ml de digoxine dans l'échantillon de test. Des liposomes peuvent être congelés avec succès s'ils sont d'abord mis en suspension dans un milieu isotonique, comme un tampon phosphate 0,01 N contenant du chlomure de so- dium 0,15 M. On peut également utiliser les solutions tamponnées entre pH4 et pH 10, contenant du glucose 0,3 M ou un hydrdcarbu- re semblable. Néanmoins, les liposomes congelés dans un milieu protéiné, comme l'albumiene de sérum bovin ou les gamma-globulines de lapin, ne sont pas recommandés car ils présentent des ni- veaux élevés d'activité enzymatique en l'absence de réactif lytique détergent ou complément-plus ahticorpso Les meilleurs 31.- résultats sont obtenus avec une congélation rapide d'au moins 500 par minute. Avant leur congélation, les liposomes sont mis en suspension dans un milieu isotonique à des concentrations de 1-10 mg/ml. Par exemple des liposomes préparés dans l'exemple I sont mis en suspension dans un tampon phosphate de sodium 0,01 M contenant du chlorure de sodium 0,15 M. Cette suspension con- tient 2,5 mg de lipides totaux sans 1 ml de liquide. On place des fractions de 0,1 ml de ce mélange dans des fioles de 5 ml. On * les congèle à -20 C à une vitesse de 5 C par minute. les liposo- mes peuvent être dégelés et utilisés après de longues périodes de stockage. La matière à tester peut être constituée par des fluides du corps ou des mélanges de toutes natures. Lorsque le sérum est testé, il est de préférence traité chimiquement et/ou par la chaleur, pour éviter une inhibition indésirable. Un traitement préalable avec des groupes amines est une de ces méthodes chimiques. On ajoute 0,1 ml d'ammoniaqu$ 2,54 M à 1,9 ml de sérum, qui est alors neutralisé par addition de 0,1 ml d'acide chlorohydrique 2,54 M. Des réactifs de blocage sulthy- dryl peuvent être également utilisés. Dans ce cas, 0,1 ml de so- lution saline mercaptoéthanoline phosphate 0,2 M est introduite dans 1 ml de sérum. Ensuite, 1 ml d'iodoacetamide 0,2 M est ajouté. On peut aussi utiliser le colorant azo d'acide sulfoni- que, le rose rapide chlorazol, qui inhibe sélectivement l'acti- vation par complément humain, mais pas le complément de cochon d'Inde. Un traitement thermique d'au moins 580C, durant 30 ou plut8t 60 minutes, est utile pour prévenir l'inhibition de la réaction du complément. 32.- REVEND I CA T I 0 N S 1.- Liposome immunoréactif marqué par un anti- gène ou son anticorps apparenté, séquestrant un enzyme et présentant un rapport du signal au bruit de fond, qui n'est pas inférieur à 5. 2.- Liposome selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il présente une combinaison avec l'antigène ou l'anticorps ne servant pas de marquage. 3.- Combinaison de liposome selon la revendica- tion 2, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, plusieurs liposomes semblables, en présence d'un substrat pour l'enzyme et uniformément dispersés lans ce substrat. 4.- Liposome en combinaison selon la revendica- tion 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, des liposomes marqués par un antigène. 5.- Liposome selon la revendication 3, caracté- risé en ce qu'il comprend en outre des liposomes marqués par l'anticorps. 6.- Liposome selon la revendication 3, caracté- risé en ce que le rapport signal-son est de l'ordre de 5 à 1000. 7.- Liposome selon la revendication 3, caracté- risé en ce que l'antigène est utilisable pour des diagnostics cliniques. 8.- Liposome selon la revendication 1, caracté- risé en ce que l'enzyme appartient au groupe constitué par les oxydoréductases, hydrolases ou leurs mélanges. 9.- liposome selon la revendication 8, caracté- risé en ce que l'enzyme appartient au groupe constitué par les phosphatses alcalins, peroxydases, malade déhydrogénase et leurs mélanges. 10.- Liposome selon la revendication 1, caractéri- sé en ce qu'il est formé d'un lipide appartenant au groupe cons- titué par les amphiphiles gonflant insolubles dans l'eau de la classe II, avec un sterol ou un amphiphile non-gonflant de la classe I, similaire. 11.- Procédé d'immunotest caractérisé en ce que l'on forme un mélange constitué par: a) un liposome marqué par un antigène ou par son anticorps ap- parenté, séquestrant un enzyme et présentant un rapport si- gnal-bruit de fond qui n'est pas inférieur à 5 33.- b) un substrat pour l'enzyme, c) une matière à tester pour l'activité spécifique de l'antigène ou de l'anticorps apparenté, d) un complément, et que l'on dé ecte la présente ou l'absence de l'activité en- zymatique dans ce mélange, dans des conditions permettant à une réactioi immunologique d'exposer l'enzyme au substrat. 12.- Procédé selon la revendication 11, carac- térisé en ce que la détection s'opère en phase homogène, sans nécessiter des étapes de séparation mécanique ou de purifica- tion. 13.- Procédé selon la revendication 11, caracté- risé en ce qu'il comporte en outre, l'incorporation dans ce mé- lange de l'antigène ou de l'anticorps apparenté, n'ayant pas servi au marquage, pour tester la présence ou l'absence du pro- duit apparenté. 14.- Procédé selon la revendication 13, caracté- risé en ce que la détection s'effectue en phase homogène. 15.- Procédé seloh la revendication 13, caracté- risé en ce que l'on effectue plusieurs tests avec différentes concentrations en produit apparenté, de façon à permettre une détermination quantitative du produit apparenté dans la matière testée. - 16.- Procédé d'immunotest caractérisé en ce que l'on forme unemélange constitué par: a) un liposome marqué par un antigène ou son anticorps apparenté, portant un enzyme et présentant un rapport signal-bruit de fond qui n'est pas inférieur à 65, b) un substrat pour l'enzyme, c) une matière à tester pour l'activité spécifique de l'antigène ou de l'anticorps n'ayant pas servi au marquage, d) un complément, et que l'on détecte la présence ou l'absence de l'activité en- zymatique dans le mélange, en phase homogène. 17.- Procédé selon la revendication 16, caracté- risé en ce qu'il comporte, en outre, l'incorporation dans le mé- lange de l'antigène ou de l'anticorps apparenté n'ayant pas servi au marquage pour tester la présence ou l'absence du produit ap- parenté. 18.- Kit pour immunotest, destiné à détecter 34.- un antigène ou son anticorps dans l'échantillon à tester, kit caractérisé en ce qu'il comprend un récipient contenant des liposomes marqués d'un antigène ou de l'anticorps apparenté cons- tituant l'objet du test, et portant un enzyme tout en présentant un rapport signal-bruit de fond qui n'est pas inférieur à 5. 19.- Kit pour immunotest selon la revendication , caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, un récipient contenant un substrat pour l'enzyme, et un récipient contenant un complément pour l'anticorps ou l'antigène. 20.- Kit pour immunotest selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, un récipient contenant l'anticorps ou l'antigène apparenté.. 21.- Kit pour immunotest, selon la revendica- tion 19, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une con- centration prédéterminée du correspondant de l'anticorps ou de l'antigène, agissant comme un mécanisme quantitatif pour effec- tuer l'immunotest. 22.- Kit pour immunotest selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, un substrat pour l'enzyme. 23.- Kit selon l'une quelconque des revendica- tions 19 à 22, caractérisé en ce que le rapport signal-bruit de fond, n'est pas inférieur à 60. 24.- Liposome immunor6actif selon la revendica- tion 1, caractérisé en ce que le rapport sigrl-bruit de fond n'est pas inférieur à 60. 25.- Liposome selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le rapport du signal au bruit de fond n'est pas inférieur à 10. 26.- Liposome selon la revendication 3, carac- térisé en ce que le rapport du signal au bruit de fond n'est pas inférieur à 10. 27.- Liposome selon la revendication 4, caracté- risé en ce que le rapport du signal au bruit de fond n'est pas inférieur à 10. 28.- Liposome selon la revendication 5, caracté- risé en ce que le rapport du signal au bruit de fond n'est pas inférieur à 10. 29.- Procédé déimmunotest selon la revendication 11, caractérisé en ce que le rapport du signal au bruit de fond 36 2485038 n'est pas inférieur à 10. 30.- Procédé d'immunotest selon la revendica- tion 12, caractérisé en ce que le rapport du signal au bruit de fond n'est pas inférieur à 10. 31.- Kit pour immunotest selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'enzyme présente un rapport du signal au bruit de fond qui n'est pas inférieur à 10. 32.- Procédé d'immunotest pour la détermination d'un antigène ou du corps correspondant, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de combinaison d'un liposome marqué d'un antigène ou son opposé, et séquestrant un enzyme ayant un rap- port élevé signal-bruit de fond, avec un substrat et une matière à tester, avec un agent pour permettre l'exposition du substrat à l'enzyme dans certaines conditions d'essai. 33.- Procédé selon la revendication 33, caracté- risé en ce qu'il s'effectue en milieu homogène.