Brevet FR2483947A1 — publié le 19811211

La présente invention concerne un procédé perfectionné pour la production de L-tryptophane par une technique de fermentation permettant d'obtenir ce compose avec un rendement accru, ainsi que le L-tryptophane obtenu par ce procédé et une culture pure d'une nouvelle souche de micro-organisme pour l'exécution du procédé. Plus précisément, l'invention apporte un procédé de production du Ltryptophane, comprenant la culture d'un mutant de Bacillus subtilis donnant le L-tryptophane dans des conditions aérobies, dans un milieu de culture contenant de l'acide anthranilique, une source de carbone, une source d'azote et une source de matières minérales, et la récupération du L-tryptophane formé du bouillon de culture, procédé caractérisé en ce que le mutant est une souche résistant au 5-fluoro-tryptophane et à la 8-aza- guanine. Oh sait que Bacillus subtilis peut produire le L-tryptophane (voir par exemple les brevets U.S. N s 3 801 457 et 3 700 558), mais son pouvoir de production est cependant relativement faible et diverses propositions ont été faites en vue de l'améliorer, par exemple l'emploi de plusieurs mutants de Bacillus subtilis donnant le L-tryptophane, ou bien l'addition d'un précurseur au milieu de culture. Par exemple, le brevet japonais publié N 20391/1974 décrit un procédé de production du L-trypto- phane consistant à cultiver un mutant de Bacillus subtilis donnant ce composé dans un milieu de culture contenant de l'acide anthranilique, une source de carbone, une source d'azote et une source de matières minérales, et à récupérer le L-tryptophane formé du bouillant de culture, procédé dans lequel le mutant est une souche résistant au 5-fluoro- tryptophane, telle que la souche SD-9 de Bacillus subtilis (FERM-P N 1483; Fermentation Research Instituts, Agency of Industrial Science and Technology, Japon). La présente Demanderesse a entrepris des recherches en vue de trouver un procédé encore meilleur pour l'obtention de L-tryptophane par fermentation, recher- ches qui ont conduit à la découverte que l'on peut obtenir 248394? à partir de Bacillus subtilis une souche, non décrite dans la littérature, qui résiste à la fois au 5-fluoro- tryptophane et à la 8-azaguanine, et que ce nouveau mutant peut produire le L -tryptophane plus rapidement et avec un rendement accru par rapport à la source de carbone (glu- cides) consommée. Cette invention a ainsi pour objet un procédé amélioré de production du Ltryptophane par fermentation, le L-tryptophane ainsi obtenu et une culture pure d'une souche de micro-organisme propre à l'exécution de ce pro- cédé. Le nouveau mutant de Bacillus subtilis donnant le L-tryptophane, qui estemployé dans cette invention, est une souche résistant au 5-fluorotryptophane et à la 8-aza- guanine, qui provient de souches de Bacillus subtilis connues et disponibles. Des exemples de la souche voisine ci-dessus comprennent Bacillus subtilis IAM-1026 (Institute of Applied Microbiology, Japon), Bacillus subtilis ATCC 9466 (American Type Culture Collection, U.S.A.), ainsi que les diverses souches, par exemple ATCC 4925,ATCC 6051 et ATCC 6633, qui sont décrites dans "Agriculture Handbook" N 427, The Genus Bacillus (Agricultural Research Service, Département de l'Agriculture des Etats-Unis, Octobre 1973),pages 182-183. La souche SD-10 de Bacillus subtilis, qui appartient à la souche employée selon cetteinvention, ré- sistante au 5-fluorotryptophane et la 8-azaguanine, est déposée auprès du Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japon, sous le numéro d'accès FERM BP-4, comme souche de dé. pôt international conformément au traité de Budapest. On peut facilement obtenir la souche employée ici, résistante au 5-fluorotryptophane et à la 8-ara- guanine, à partir des souches parentes de Bacillus subtilis connues et disponibles, dont des exemples ont été donnés plus haut, par des méthodes de mutation artificielles, par exemple des méthodes connues faisant appel à des mutagènes (substances induisant la mutation), ou à un rayonnement tel que l'ultraviolet ou les rayons X. L'invention comprend donc aussi un procédé de production d'une souche de Bacillus subtilis pouvant donner le L-tryptophane, et qui résiste au 5-fluoro- tryptophane et à la 8-azaguanine, procédé selon lequel (1) on soumet Bacillus subtilis à un traitement de mutation artificiel, (2) on cultive la souche ainsi traitée dans un milieu contenant du 5-fluorotryptophane à une concen- tration supérieure à la concentration minimaleinhibant la multiplication de la souche, (3) on poursuit eneuite la culture de la souche dans un milieu contenant de la 8-azaguanine à une concentration su- périeure à la concentration minimale inhibant la multi- plication de la souche, -et (4) on récupère la souche cultivée ayant une capacité accrue de production du L-tryptophane. Ces opérations (1) à (4) peuvent être répétées plusieurs fois, suivant les nécessités. Dans un mode d'exécution du procédé ci-dessus, on soumet une souche parente, par exemple Bacillus subtilis IAM-1026, à un traitement de mutation artificiel,par exemple à une irradiation avec une dose suffisante d'un rayonnement induisant la mutation, tel que l'ultraviolet ou les rayons X, ou bien à une culture dans un milieu contenant une quantité suffisante d'un agent mutagène, comme l'orange d'acridine ou la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. La souche ainsi traitée est ensuite cultivée dans un milieu contenant du 5-fluorotryptophane à une concentration su- périeure à la concentration minimale inhibant la multi- plication de la'souche (CMI),et on recueille les colonies formées. On détermine alors les capacités de production du L-tryptophane de ces colonies et on choisit une colonie de la souche ayant un pouvoir accru de formation du L- tryptophane. En général, on recommence plusieurs fois cette culture pour obtenir une souche de Bacillus subtilis résistante au 5-fluorotryptophane. Le mutant de Bacillus subtilis pouvant être obtenu de cette manière est connu, et 248394? décrit par exemple dans le brevet japonais publié No 20391/1974 précité. Ce mutant est déposé, par exemple sous le numéro FERM-P 1483 auprès du Fermentation Research Institut, Agency of Industrial Science and Technology,Japon. Pour obtenir le mutant propre à la production duL-trypto- phane,employé selon l'invention, qui résiste au 5-fluoro- tryptophane et à la 8-azaguanine, la souche telle qu'obtenue ci-dessus, qui résiste au 5-fluorotryptophane,est ensuite cultivée dans un milieu contenant de la 8-azaguanine à une concentration supérieure à la CIM de la souche, et on recueille les colonies formées. On détermine alors les capacités de production du L-tryptophane de ces colonies et on choisit une colonie de la souche ayant un pouvoir accru de formation du L-tryptophane. En général, en répé- tant plusieurs fois cette culture, on peut obtenir une souche ayant un pouvoir accru de production du L-trypto- phane,et qui résiste à la fois au 5-fluorotryptophane et à la 8-azaguanine. Le mutant utilisé selon cette invention, qui peut être facilement obtenu à partir de Bacillus subtilis ou de la souche de ce migro-organisme résistante au 5- fluorotryptophane, doit de préférence résister à au moins 5.000 ppm environ de 5-fluorotryptophane et à au moins l.00Oppm environ de 8-azaguanine. La dose d'ultraviolet pourra être par exemple d'environ 300 à 800 ergs/mm2, et celle de rayons X par exemple de l'ordre de 150.000 à 200. 000 roentgens. La proportion de l'agent mutagène peut être par exemple de 0,1 à 0,5 % en poids, et la durée du traitement d'une heure par exemple. Dans le mode d'exécution ci-dessus, la culture peut se faire dans des conditions aérobies dans le même milieu de culture, et dans les mêmes conditions de tempé- rature et de pH, que pour le procédé selon l'invention de production du Ltryptophane, conditions qui sont indiquées ci-après. Ainsi, l'invention apporte une culture biolo- giquement pure de la souche SD-10 de Bacillus subtilis dont les caractéristiques sont identifiées par le dépôt FERM BP-4 conformément au traité de Budapest, et qui per- met d'obtenir le L-tryptophane par fermentation dans un milieu de culture comprenant une source de carbone, une source d'azote et une source de matières minérales, dans des conditions aérobies. Le mutant employé selon cette invention, qui résiste au 5fluorotryptophane et à la 8-azaguanine, a sensiblement les mêmes caractéristiques morphologiques que la souche parente ou que la souche résistante au 5-fluoro- tryptophane, n'en différant que par le fait qu'il a un pouvoir accru de production du L-tryptophane, et qu'il nécessite de l'acide anthranilique (vitamine L1) pour cette production. Les caractéristiques morphologiquesde ce mutant sont décrites dans l'ouvrage précité "Agriculture Hanbook" No 427, The Genus Bacillus, pages 182 - 183. Dans le présent procédé, on cultive dans des conditions aérobies la souche résistante au 5-fluoro- tryptophane et à la 8-azaguanine, dans un milieu de culture contenant de l'acide anthranilique, une source de carbone, une source d'azote et une source de manières minérales, et on récupère du bouillant de culture le L-tryptophane formé. La source de carbone peut être constituée par toute matière carbonée assimilable par la souche, dont des exemples sont des glucides tels que le glucose, les mêlasses, le saccharose, l'amidon, une solution d'amidon saccharifié ou des produits de décomposition de la cellulose, des acides organiques comme l'acide acétique et des alcools comme l'éthanol. Des exemples de la source d'azote sont l'ammoniac, des sels d'ammonium tels que sulfate, chlorure, nitrate et phosphate, l'urée ainsi que des nitrates, tandis que des exemples de matières minérales comprennent les sels de P, Na, K, Mg, Fe et Mn, par exemple des sels d'acides minéraux comme les phosphates d'ammonium, de potassium et de sodium, le sultate de potassium, l'hydroxyde de potassium, le sul- fate de magnésium, le sulfate ferreux et le sulfate de manganèse. On peut aussi ajouter des traces de sels d'acides minéraux de Ca, Zn, B, Cu, Co, Mo etc..., de même que des traces de produits organiques nutritifs, vitamines et amino- acides, mais qui ne sont pas particulièrement nécessaires pour la multiplication de la souche, ainsi que d'autres matières organiques telles qu'une liqueur de macération de mais, un extrait de viande ou de levure et des peptones. L'acide anthranilique peut être ajouté sous la forme d'une solution aqueuse d'anthanilate de sodium, potassium ou ammonium, ou encore d'une solution d'acide anthranilique libre dans de l'éthanol ou de l'acétone. La culture se fait dans des conditions aérobies, par exemple suivant des techniques de culture avec secouage, barbotage ou agitation, ou autres techniques aérobies. On peut effectuer la culture à une température de 25 à 450C et à un pH de 5 à 9, de préférence de 6 à 8, la durée de culture pouvant être par exemple de l'ordre de à 60 heures. La teneur appropriée en acide anthranilique du milieu de culture peut s'élever jusqu'à la concentration inhibitrice minimale de multiplication de la souche (CIM), par exemple jusqu'à environ 0,1 %, de préférence de à 300 ppm, du poids du milieu de culture. L'acide anthranilique sera de préférence ajouté au début de la culture, d'une manière intermittente ou continue, de ma- nière que sa concentration ne dépasse pas la concentration inhibitrice minimale de multiplication de la souche, car si des teneurs en acide anthraniliaue légèrement supérieures à la CIM de la souche ne compromettent pas beaucoup la multiplication de celle-ci, elles inhibent par contre la production de L-tryptophane. L'acide anthranilique sera donc de préférence ajouté d'une manière intermittente ou continue suivant la vitesse à laquelle il est consommé, afin d'éviter son accumulation dans le milieu de culture ou une élévation temporaire de sa concentration dans ce milieu. Sans acide anthranilique, la souche du mutant employée selon cette invention donne une multiplication normale des cellules, mais c'est à peine si l'on observe une accumulation de L-tryptophane. On isole ensuite d'une manière habituelle le L-tryptophane formé du bouillant de culture. On peut par exemple stériliser le bouillon à 80 C pendant 30 minutes puis centrifuger, ajouter ensuite un acide pour abaisser le pH du liquide surnageant à 2 ou moins, et le faire passer sur une colonne d'une résine échangeuse de cations du type acide fort pour y adsorber le L-trytophane. La colonne est ensuite lavée à l'eau puis éluée avec une so- lution diluée d'ammoniac pour en séparer le L-tryptophane, l'éluat est ensuite débarrassé de l'ammoniac sous pression réduite, et on recueille des cristaux bruts de L-trypto- phane que l'on dissout à chaud dans de l'éthanol à 70 %, on ajoute une petite quantité de charbon actif et on filtre la solution chaude. En refroidissant le filtrat le L- tryptophane cristallise, et on recueille les cristaux par filtration. Les exemples qui suivent illustrent plus par- ticulièrement la présente invention. EXEMPLE 1 et exemple comparatif 1: Dans un fermenteur de 5 litres on met 2 litres d'un milieu de culture liquide de composition suivante: Glucose 10 %, Sulfate d'ammonium 0,3 %, Na2HP04.12H20 0,5 % KH2PO4x.H20 0,2 %, MgSO4.7H20 0,1 %, FeS04.7H20 0,5 mg %, et MnSO 4.4-6H20 0,1 mg %, que l'on stérilise à 115 C pendant 15 minutes. Dans ce fermenteur on inocule 5 % de la souche SD-10 de Bacillus subtilis (FERM BP-4) qui a été cultivée pendant 12 heures à 30 C avec secouage dans un milieu nutritif, et on cultive à 35 C avec aération, en agitant et en maintenant la teneur en oxygène dissous à 0,5 ppm ou plus. On ajoute d'une manière continue une solution aqueuse à 5 % d'anthranilate de sodium, de manière que la teneur en anthranilate du milieu de culture soit maintenue au-dessous de la concentration inhibitrice minimale de multiplication de la souche du micro-organisme, et on poursuit la culture pendant 30 heures tout en maintenant le pH du bouillon à 7,0, ce qui forme le L-tryptophane qui s'accumule à la concentration de 14,6 g/litre. Le rendement en L- tryptophane est ainsi de 16,5 % par rapport au glucose consommé, et de 99 moles % par rapport à l'acide anthra- nilique. A titre comparatif, on recommence les opéra- tions ci-dessus mais en supprimant la solution aqueuse d'anthranilate de sodium (exemple comparatif 1). La quantité de L-tryptophane formé n'est plus alors au bout de 30 heures de culture que de 250 mg/litre. EXEMPLE 2 et exemple comparatif 2: On cultive la souche SD-10 de Bacillus subtilis pendant 20 heures dans le même milieu qu'à l'exemple 1, dans un fermenteur de 5 litres, puis on inocule 750 ml du bouillon de culture obtenu dans 15 litres du même milieu de culture, dans un fermenteur de 30 litres, et on cultive à 35 C avec aération, en agitant et en maintenant la quantité d'oxygène dissous à 0,5 ppm au moins. On ajoute d'une manière continue une solution aqueuse à 10 % d'anthra- nilate de sodium de manière que la teneur en acide anthra- nilique du milieu de culture soit maintenue au-dessous de la concentration inhibitrice minimale de multipli- cation de la souche du micro-organisme, et on poursuit la culture pendant 24 heures tout en maintenant le pH du bouillon à 7,0, le L-tryptophane s'accumulant alors à une concentration de 15,6 g/litre. Le rendement en L-trypto- phane est alors de 17,4 % par rapport au glucose consommé, et de 99 moles % par rapport à l'acide anthranilique. A titre comparatif, on recommence les opérations ci-dessus mais avec la souche SD-9 de Bacillus subtilis (FERM-P 1483, décrite dans le brevet japonais publié N 20391/1974). A la fin de l'opération la concentration en L-tryptophane n'est plus alors que de 4,8 g/litre, le rendement en Ltryptophane étant de 5,2 % par rapport au glucose consommé et de 92 moles % par rapport à l'acide anthranilique. EXEMPLE 3: Production d'une culture biologiquement pure de Bacillus subtilis. On soumet au rayonnement ultraviolet la souche IAM-1026 de Bacillus subtilis (Institute of Applied Micro- biology) pour obtenir un mutant artificiel de la souche parente, de la manière habituelle dans un milieu nutritif, et on fait incuber le mutant dans un milieu de gélose contenant du 5-fluorotryptophane. Plusieurs centaines de colonies se développent sur la plaque de gélose, dont on examine le pouvoir de production du Ltryptophane par fermentation, et on choisit une colonie de la souche ayant le meilleur pouvoir de formation du L-tryptophane. On traite la souche choisie par la méthode de mutation arti- ficielle ci-dessus, et on opère la sélection d'un mutant résistant au 5fluorotryptophane. En recommençant plusieurs fois ce traitement et cette sélection on obtient un mutant qui résiste jusqu'à 5.000 ppm de 5-fluorotryptophane. Ensuite, on traite de nouveau ce mutant ré- sistant au 5-fluorotryptophane par la même méthode de muta- tion artificielle, et on opère la sélection d'un mutant résistant à la 8azaguanine de la même manière que pour le mutant résistant au 5fluorotryptophane. Le mutant finalement obtenu résiste jusqu'à 1.000 ppm de 8-aza- guanine, et il résiste aussi au 5-fluorotryptophane. REVENDICATIONS 1.- Procédé de production deL-tryptophane, compre- nant la culture d'un mutant de Bacillus subtilis donnant le L-tryptophane dans des conditions aérobies, dans un milieu de culture contenant de l'acide anthranilique, une source de carbone, une source d'azote et une source de matières minérales, et la récupération du L-trypto- phane formé du bouillon de culture, procédé caractérisé en ce que le mutant est une souche résistant au 5-fluoro- tryptophane et à la 8-azaguanine. 2.- Procédé selon la revendication 1,dans lequel le mutant est la souche SD-10 de Bacillus subtilis. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la culture est effectuée à une température de à 45 C et à un pH de 5 à 9. 4.- Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, lequel la teneur en acide anthranilique du milieu de culture est au plus égale à la concentra- tion inhibitrice minimale de multiplication de la souche. 5.- Procédé selon la revendication 4, dans lequel la teneur en acide anthranilique s'élève jusqu'à environ 0,1 % du poids du milieu de culture. 6.- Le L-tryptophane obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 7.- Culture biologiquement pure de la souche SD-10 de Bacillus subtilis dont les caractéristiques sont identifiées par le dép6t FERM BP-4 conformément au traité de Budapest, produisant le L-tryptophane par fermentation dans un milieu de culture contenant de l'acide anthranilique, une source de carbone, une source d'azote et une source de matières minérales, dans des conditions aérobies.