Brevet FR2477573A1 — publié le 19810911

La présente invention concerne des réactifs et un procédé de dosage de l'aldolase musculaire humaine. "Aldolase" est un terme général désignant les enzymes qui catalysent la condensation aldolique et la coupure entre le phosphate de dihydroxyacétone et divers aldéhydes. Dans la présente invention, l'aldolase désigne une aldolase de fructose diphosphate (E.C. 4. 1. 2. 13. fructose- 1, 6-phosphate D-glyc6lalddhyde-3-phosphate lyase), qui décompose réversiblement le fructose-l,6-diphosphate en phosphate de dihydroxy acétone et en D-glycélaldéhyde -3- phosphate. Cette enzyme joue le role principal dans le système de la glycolyse et, en particulier, elle se répartit principalement dans le muscle, contribuant ainsi de manière importante au métabolisme de l'énergie. L'aldolase des manmmifères comprend trois types d'isoenzymes, à savoir celle du type musculaire (type A), celle du type hépatique (type B) et celle du type cérébral (type C). Il est connu que le rapport de formation de ces isoenzymles varie avec les transformations de l'organisme vivant, par exemple avec la différentiation du foie foetal chez le rat, avec la cancérisation de l'organisme chez l'homme, le rat etc... On connaît classiquement deux procédés de dosage de l'aldolase musculaire humaine, dont l'un est le procédé électrophorétique et l'autre un procédé consistant à mesurer les activités de décomposition de deux substrats, le fruc- tose-l,6-diphosphate (FDP) et le fructose-l-phosphate (FIP) pour l'aldolase activité FDP-ALD et activité FID- ALD, déterminant ainsi leur rapport d'activité. Ces procédés posent cependant divers problèmes. Dans la méthode électrophorétique, le problème est que les points ayant migré des isoenzymes de l'aldolase humaine sont tellement voisins les uns des autres que la discrimination est difficile et qu'on ne peut pas réaliser une détermination quantitative précise. Dans la méthode de mesure du rapport d'activité FDP/ FIP, il est à remarquer que l'opération est particulièrement compliquée pour la mesure de l'activité FIP-ALD, qui ne fait l'objet d'aucune détermination quantitative. On a indiqué récemment un procédé de dosage de l'al- dolase au moyen d'un dosage radioimmunologique par compé- tition (procédé au double anticorps).. Comparé aux procédés ci-dessus, ce procédé est supérieur par la sensibilité et aussi par la quantification. Mais il présente aussi l'in- convénient d'exiger une grande quantité du second anti- corps pour la séparation de B et F. En outre, le mode opé- ratoire de séparation est très compliqué, il exige beau- coup de temps et des frais de main-d'oeuvre importants. On observe en outre l'apparition d'une réaction non spéci- fique. La présente invention concerne un anticorps de l'aldolase du type musculaire marqué par un radioisotope et un procédé de dosage de l'aldolase musculaire humaine au moyen d'un dosage radioimmunologique, par le "procédé Sandwich", en utilisant l'anticorps de l'aldolase indiqué comme réactif. Ce procédé permet de supprimer ou de réduire divers défauts des procédés de l'art antérieur. Le procédé de l'invention se distingue à la fois par la sensibilité du dosage et du point de vue quantitatif. Par rapport au procédé au double anticorps, il est carac- térisé en ce qu'il n'exige pas de second anticorps; le procédé de séparation de B et F est simple et commode, et la réaction non spécifique est extraordinairement faible. Conformément au "procédé sandwich" de l'invention, le dosage de l'aldolase musculaire humaine comporte les opérations suivantes: (a) mettre en contact un échantillon avec un anticorps de l'aldolase musculaire insolubilisée et séparer la phase solide; et (b) mettre en contact la phase solide avec un anti- corps de l'aldolase musculaire marqué par un radioisotope, puis séparer la phase solide; et (c) doser la radioactivité de la phase solide. Dans ce qui suit, on illustrera plus particulièrement ce procédé. Dans l'opération (a), un anticorps insolubilisé par combinaison avec un support est mis à incuber avec un échantillon tel que sérum etc.. de telle sorte que l'antigène (aldolase du type muscle humain) de l'échantillon puisse réagir avec cet anticorps insolubilisé. Lorsque la réaction est terminée, on élimine la solution réactionnelle et on lave la phase solide avec une solution tampon, de l'eau distillée, du sérum physiologique etc... Dans l'opération (b), la phase solide obtenue dans l'opération (a) est mise à incuber avec un anticorps marqué par un radioisotope, de sorte que cet anticorps marqué par un radioisotope se combine avec l'antigène précédemment combiné à l'anticorps insolubilisé. Lorsque la réaction est terminée, on élimine la solution réactionnelle, et on lave la phase solide avec une solution tampon, de l'eau distillée, du sérum physiologique etc... Dans l'opération (c), on dose la radioactivité de la phase solide obtenue dans l'opération (b) en utilisant un compteur à scintillation etc... La radioactivité de l'antigène étalon est mesurée au préalable avec ce système de dosage, de façon à tracer une courbe d'étalonnage de la quantité d'antigène en fonc- tion de la radioactivité. On mesure la radioactivité d'un échantillon par le même système de dosage, puis on dose la quantité d'antigène dans l'échantillon au moyen de cette courbe d'étalonnage. La courbe 1 du dessin annexé représente une courbe d'étalonnage de l'aldolase musculaire humaine obtenue par le dosage radioimmunologique dans l'exemple 2 ci-après. On décrira dans ce qui suit le réactif à utiliser pour le dosage par le présent procédé et l'anticorps de l'aldolase musculaire à utiliser dans la préparation du réactif. A) anticorps de l'aldolase du type musculaire L'antisérum est obtenu en immunisant l'aldolase musculaire d'un mammifère tel que l'homme, le lapin, le chien, le singe etc... vis-à-vis de l'autre animal. L'animal est de préférence choisi parmi les oiseaux, car les aldolases musculaire ne présentent pas de diffé- rentiation immunologiqueimportanted'un mammifère à l'autre. Comme exemple des oiseaux préférés, on citera par exemple la poule, le dindon, le canard etc... Pour la purification de l'antisérum obtenu, on peut utiliser un procédé consistant à ajouter le sérum inactivé de l'animal qui est la source de l'aldolase musculaire, et à éliminer par absorption l'autre anticorps impur, une chromatographie d'affinité utilisant un support combiné à l'aldolase musculaire, etc... B) Anticorps de l'aldolase musculaire marqué par un radioisotope Le marquage de l'anticorps de l'aldolase musculaire par un radioisotope peut s'effectuer par n'importe quel procédé classique. Par exemple, on l'effectue par le procédé à la chlora- mine T, en utilisant comme radioisotope 125 I 131 I-, etc... ou par d'autres procédés. C) Anticorps de l'aldolase musculaire insolubilisée Comme support, on utilise un solide insoluble capable de se combiner avec un anticorps. Comme exemple d'un tel solide, on citera par exemple le polystyrène, la cellulose, l'agarose, le verres le dextrane pouté, des métaux etc.., par exemple sous forme de tubes, de plaques de microti- tration, de poudre, de sphère, de disques, de plaques, de feuilles etc... Dans le cas de la plaque de microtitration en polys- tyrène, on peut combiner l'anticorps à la surface de paroi de la plaque, en diluant convenablement l'anticorps avec une solution tampon etc...et en ajoutant ensuite la solu- tion diluée à la plaque, puis en laissant reposer le tout. Les descriptions ci-dessus se rapportent au procédé sandwich, mais l'aldolase musculaire humaine peut également être dosée par dosage immunoradiométrique en utilisant un anticorps de l'aldolase musculaire marqué par un radioi- sotope, qui est le réactif de la présente invention. Ce procédé consiste à faire réagir l'anticorps marqué par un radioisotope avec un échantillon (antigène) puis à séparer le réactif antigène - anticorps marqué par le radioisotope (B) de l'anticorps marqué par le radioisotope n'ayant pas réagi (F) et à doser la radioactivité de (B) ou de (F). Comme procédé de séparation de (B) et de (F), on peut citer le procédé de filtration sur gel, le procédé d'absorption utilisant un antigène insolubilisé etc... Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. EXPERIENCE 1 Anticorps de l'aldolase musculaire humaine On dissout l'aldolase musculaire humaine (1 mg) dans du sérum physiologique (0,5 ml) et on mélange à la solution un volume égal d'adjuvant complet de Freund. On immunise le produit par injection sous-cutanée à. une poule ( white Leghorn) à des intervalles d'une semaine, les injections étant au nombre de cinq. Une semaine après la dernière immunisation, on recueille le sang de la poule pour obtenir l'antisérum. On laisse reposer à 40C pendant une nuit du sépharose TM 4 BT-M (Pharmacia Fine Chemicals AB; Agarose) (lOg) active par du bromo-cyanure, et l'aldolase musculaire humaine (10 mg), dans 15 ml de solution tampon au carbonate de sodium 0,1 M(pEl 9,0). Le gel de Sépharose 4B obtenu, combiné à l'aldolase musculaire humaine est placé dans une colonne et lavé avec une solution tampon tris -HC1 0, 05 M(pH 8,0) contenant du chlorure de sodium 0,5 N. On ajoute à cette colonne l'anti- sérum de l'aldolase musculaire humaine mentionné ci-dessus et on élue avec la solution tampon tris - HC1 0,05 M(ph 8,0) contenant du chlorure de sodium 0,5 N. Puis on ajoute à la colonne une solution aqueuse de carbonate de sodium 0,1 M pour éluer l'anticorps de l'aldolase musculaire humaine. On soumet la fraction de l'éluat d'anticorps à une dialyse avec une solution tampon tris - HC1 0,05 M(pH 8,0) et l'on obtient 3 mg de l'anticorps de l'aldolase musculaire humaine. EXPERIENCE 2 Anticorps de l'aldolase musculaire humaine insolubilisé Dans chacune des cavités percées dans une plaque de microtitration en polystyrène, on dépose 200,-1 d'une solution d'aldolase musculaire humaine ajustée à une D.'028o m =0,10, et on laisse reposer le tout une nuit à 4 C. On retire la solution de la plaque. On lave la plaque avec de l'eau distillée et l'on obtient une plaque de micro- titration combinée à l'anticorps de l'aldolase musculaire humaine. EXEMPLE 1 Anticorps de l'aldolase musculaire humaine marqué au 125I Dans un petit tube à essai revêtu de silicone, on fait réagir Na125I (250/w curie, 10/, 1), du tampon phosphate 0,5 M à pH 7,4 (12,5/,l), de l'anticorps de l'aldolase mus- culaire humaine (1,85 mg/ml, 10/A1) et de la Chloramine T (3 mg/ml, 12,5^, '). Lorsque la réaction est terminée, on ajoute au mélange du métabisulfite de sodium (6 mg/ ml, ,>l) de façon à faire cesser la réaction. On ajoute au mélange obtenu de l'iodure de potassium (50 mg/ml), 12,5,/1) et de l'ovalbumine à 2% (250,/1) dans du tampon phosphate 0,05 M. On soumet ensuite le tout à une filtration sur gel en utilisant du Séphadex G-25TM (Pharmacia Fine Chemicals AB; dextrane pouté) de façon à éliminer le 125I libre. On obtient ainsi un anticorps de l'aldolase musculaire humaine marqué au 125i dont l'activité spécifique est de 11,6 t\curie/Ag. EXEMPLE 2 Dosage radioimmunologique (procédé Sandwich) Dans chacune des cavités d'une plaque de microtitration combinée à un anticorps de l'aldolase du type muscle humain on introduit respectivement 1001-l de la solution étalon d'aldolase musculaire humaine. On fait réagir le tout à 37 C pendant 2 heures. Lorsque la réaction est terminée, on élimine le liquide surnageant et on lave le reste 3 fois avec une solution de sérum physiologique. On dépose respec- tivement dans les cavités lavées 100,vl d'anticorps de l'al- dolase musculaire humaine marqué au 125I (environ 200.000 cpm). On fait réagir le tout à la température ambiante pendant 16 heures. Lorsque la réaction est terminée, on élimine le liquide surnageant. On lave le reste 3 fois avec une solution de sérum physiologique. Lorsque l'eau contenue est complètement évacuée, on découpe la plaque et on sépare les unes des autres les parties correspondant aux diverses cavités. On place dans de petits tubes à essais les diverses portions. On compte la radioactivité dans un compteur à scintillation. Comme le montre la Fig.l on obtient une courbe d'étalonnage dans laquelle sont portés des intervalles mesurables de 8 à 1000 ng/ml. Sur la figure, l'axe horizontal (logarithmique) indique la concentration (en rig/ml) de l'aldolase musculaire humaine et l'axe vertical indique la radioactivité (cpm). On dose ensuite des aldolases musculaires humaines par le système de dosage ci-dessus. On observe ainsi que l'aldolase musculaire humaine de 25 sujets normaux s'élève à 165 + 40 ng/ml, et qu'elle est inférieure à 210 ng/ml pour tous. Au contraire, 1'aldolase musculaire humairechez 20 malades atteints de cancer présente des valeurs supé- rieures à 210 ng/ml, à l'exception de 2 cas. Parmi les 20 malades atteints de cancer figuraient 7 hépatomes, 7 cancers de l'estomac, 3 cancers de l'intestin grêle et 2 cancers du pancréas. REVENDICATIONS 1 - Réactif pour le dosage d'une aldolase musculaire humaine, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps de l'aldolase musculaire marqué par un radioisotope. 2 - Réactif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ce radioisotope est 125I- 3 - Réactif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que cet anticorps de l'aldolase musculaire est un anticorps de l'aldolase musculaire humaine. 4 - Procédé de dosage de l'aldolase musculaire humai- ne, caractérisé en ce qu'il comprend les opérations sui- vantes: a) on met en contact un échantillon avec un anti- corps de l'aldolase musculaire insolubilisé, puis on sépare la phase solide; b) on met en contact la phase solide avec un anti- corps de l'aldolase musculaire marqué par un radioisotope, puis on sépare la phase solide; et c) on détermine la radioactivité de la phase solide.