Brevet FR2482729A1 — publié le 19811120

Procédé et réactif pour la détermination de la teneur en hémoglobine du sang. L'invention concerne un procédé et un réactif pour la détermination photométrique de la teneur en hémoglo- bine du sang qui fournit une coloration caractéristique lors de l'introduction de l'échantillon de sang. La détermination quantitative de l'hémoglobine dans le sang est l'une des analyses les plus souvent effectuées dans le domaine de la chimie clinique. Au cours du siè- cle actuel on a développé différents procédés dans ce but, qui cependant se différencient de façon considérable les uns des autres en ce qui concerne la précision, l'exac- titude et la reproductibilité (voir Lehrb cher der klinis- chen Chemie: HALLMANN, 1966; HENRY, 1964; RICHTERICH, 1971; HENRY et al., 1974; RICK, 1976): 1. Procédé spectrophotométrique (sous forme de carboxy- hémoglobine, d'oxy-hémoglobine ou de cyano-hémiglobine, sous forme de cyano-hématine, d'hématine acide ou alca- line ainsi que sous forme de pyridine-hémochromogène); 2. Procédé gasométrique (dosage de la capacité en oxygène ou en monoxyde de carbone); 3. Procédé chimique (détermination de la teneur en fer); 4. Autres procédés (réfractométrie, densitométrie, réac- tions enzymatiques telles que l'activité de la pseudo- peroxydase de l'hémoglobine). Parmi ceux-ci, le procédé spectrophotométrique à la cyano-hémiglobine s'est imposé et a trouvé une diffusion mondiale. Après que dans les années 1953 à 1963 pratique- ment tous les laboratoires aient introduit ce procédé au lieu d'autres procédés (voir SPAANDER, 1964; SUNDERMAN, 1965) et qu'une cyano-hémiglobine étalon ait été recomman- dée (CANNAN, 1958), ce procédé a été recommandé par le Comité Allemand pour la médecine interne (Deutsche Gesell- schaft fur innere Medizin) en 1962 et par le Comité Inter- national pour la standardisation en hématologie (Interna- tional Committee for, Standardization in Hematology - 2 'r82729 ICSH) en 1967. Depuis cette époque, ce procédé sert de procédé de routine. En Allemagne, il a la fonction d'un procédé de réfé- rence, c'est-à-dire que d'autres procédés ne peuvent être utilisés que lorsque la relation entre les résultats qu'ils permettent d'obtenir et le résultat de la méthode de référence est connu (projet de norme DIN 58 931). L'introduction du procédé à la cyano-hémiglobine en tant que procédé de référence a conduit en outre à ce queddans le monde techniquedes préjugés se sont formés à l'égard d'autres méthodes. "Le cyanure d'hémiglobine est le seul dérivé d'hémoglobine stable connu" (RICHTE- RICH, 1971); "tous les autres procédés....... doivent être rejetés" (RICK, 1976); "..... cyano-hémiglobine (détection la plus exacte)" (HALLMANN, 1966). Le principe du procédé à la cyano-hémiglobine con- siste en ce que l'hémoglobine est oxydée en hémiglobine par le ferricyanure de potassium et est transformée en cyano-hémiglobine par le cyanure de potassium. Pour ce faire, on utilise comme solution réactionnelle une solu- tion modifiée dite de Drabkin, telle que spécifiée à l'origine par van KAMPEN et ZIJLSTRA (van KAMPEN et ZIJLSTRA, 1961; ZILSTRA et van KAMPEN, 1960). Les avantages de ce procédé sont les suivants: 1. Utilisation d'une solution réactionnelle unique; 2. Tous les dérivés d'hémoglobine du sang sont englo- bés (désoxy-hémoglobine, oxy-hémoglobine, carboxy- hémoglobine, hémiglobine et dans une large mesure égalerment sulfohémoglobine); 3. Lacyano-hémiglobine possède un maximum d'extinction large et plat à 540 nm, de sorte que l'on peut ob- tenir des résultats surs même avec des photomètres à filtre simples; 4. La loi de Lambert-Beer est applicable dans un large domaine de mesure; 5. La préparation et la livraison de solutions étalons stables utilisables comme témoins est possible; elles peuvent être préparées aussi bien à partir d'hémoglo- bine cristallisée que d'érythrocytes lavés; 24827-2v 6. La cyano-hémiglobine est un dérivé stable d'hémoglo- bine, de sorte que la mesure de l'extinction peut avoir lieu après quelques minutes ou seulement après des jours. Les inconvénients du procédé à la cyano-hémiglobine sont les suivants (voir HENRY, 1964 page 740) o 1. La toxicité de la solution réactionnelle nécessite des mesures particulières lors de sa manipulation (utilisation de pipettes automatiques, rejet pré- cautionneux de la solution à l'évier); 2. la solution réactionnelle n'est pas stable longtemps, elle est sensible à la lumière et doit être conser- vée de façon correspondante (flacons bruns ou réci- pients analogues); 3. les concentrations des partenaires de la réaction doi- vent être respectées avec exactitude, ceci est valable en particulier pour le tampon qui doit garantir une valeur de pH définie; 4. les durées de réaction des différents dérivés d'hé- globine sont différentes et en partie considérablement trop longues. Initialement on avait indiqué une durée de réaction de 3 minutes pour tous les dérivés d'hé- moglobine (van KAMPEN et ZIJLSTRA, 1961), énonciation qui a été modifiée dans les années suivantes. En 1965 TAYLOR et MILLER établissent que la formation de cyanohémiglobine est nettement prolongée en présence de carboxy-hémoglobine et qu'en conséquence des erreurs importantes doivent se produirent lors du dosage de l'hé- moglobine. Van KAMPEN et ZIJLSTRA proposent en 1965 une durée de réaction de 90 minutes lorsqu'il faut compter avec de la carboxy-hémoglobine dans le sang à examiner. RODKEY indique en 1967 que la conversion de HbCO en cyano-hémiglobine à la température de la pièce demande -120 minutes, tandis que HbO2 ne réclame que 10 minutes. Cet auteur peut diminuer jusqu'à 15 minutes la durée de réaction pour la transformation de HbCO en cyano- hémiglobine, si la concentration en ferricyanure de potas- sium est quintuplée. RICE (EN 1967) résoud ce problème en chauffant la solution à 56 C. La réaction de HbCO pour donner la cyano-hémiglobi- ne est alors terminée après 3-5 minutes. Le fait que la carboxy-hénglobine s'oxyde beaucoup plus lente- ment en hémiglobine que d'autres dérivés (Hb, HbO2), est utilisé en outre dans l'échantillon dit de HOPPE-SEYLER pour une indication qua- litative de HbM0 dans le sang (voir MASSMANN, 1954). D'autres possi- bilités d'erreur ont pu être éliminées. Par exemple une précipitation d'albumine du plasma et un trouble lié à celle-ci (voir par exemple GREEN et TEAL, 1959) ont été évités par adjonction d'un détergent à la solution réactionnelle (voir KAMPEN et ZIJLSTRA, 1961). L'invention a pour but de développer un dosage quantitatif et sûr de l'hémoglobine qui possède les avantages énoncés du procédé actuel à la cyano-hénmiglobine et écarte les inconvénients énoncés de ce ne- me procédé. Ce but a été atteint selon l'invention avec un réactif constitué d'une solution aqueuse alcaline à laquelle est ajouté un détergent non ionique soluble dans l'eau, grâce auquel tous les dérivés d'hémoglobine et les dérivés de.1-ème (présents dans le sang) sont transformés en un produit final unique avec un maxirmun d'absorption marqué dans le domaine spectral visible. En particulier, on utilise des détergents tels qu'ils conduisent à un produit final avec un maximum d'absorption à environ 575 nm. De préférence, le détergent est un éther de polyéthylèneglycol et de p-alcoylphe nle de formule générale H4OCH2-C 2)x-, dans laquelle 7 radical alcoyle de type méthyle, étyle, propyle, butyle, pentyle, hexy- le, heptyle, octyle, nonyle, décyle, undécyle et dodécyle, ou est un éther de polyéthylèneglycol et de lauryle, cétyle, oléyle ou stéaryle. Le dosage de l'hémoglobine sous forme d'hématine alca- line a été décrit pour la première fois en 1922 par WU. En fait, ce procédé se distinguait par une certaine longueur: l'hémoglobine était transformée par addition d'acide chlorhy- drique concentré en hématine acide, laquelle était ensuite alcalinisée par addition de lessive de soude. Le temps nécessaire à un dosage était en conséquence également d'en- viron une heure. WU y voyait l'avantage, par rapport aux autres procédés tels que ceux à l'hématine acide, â' la méthémoglobine ou à la cyanohémiglobine que des perturbations par des constituants du plasma ne se pro- duisaient pas. CLEGG et KING (en 1942) indiqèrent un procédé pour- le dosage de l'hémoglobine par l'intermédiaire de l'hé- matine alcaline, selon lequel on utilisait, en tant que solution réactionnelle, une lessive de soude, 0,1 N qui était chauffée à 1000C au bain d'eau pendant 4-5 minutes après addition du sang. Ce processus apparaissait néces- saire aux auteurs du fait que l'hémoglobine fétale et l'hémoglobine des adultes résistante aux alcalins présen- taient un développement trop lent de la couleur. Après 1942 il y eut une série d'auteurs qui rapportè- rent des résultats satisfaisants avec le procédé à l'hé- matine alcaline (KING et al., 1948; Mac FARLANE et al., 1948; DONALDSON et al., 1951; KING et al., 1951; SCAIFE, 1955). On a également proposé quelques modifications, par exemple l'utilisation d'une autre longueur d'onde (SCAIPE, 1955) ou d'un étalon spécial (KING, 1947). Par contre d'autres auteurs rejetèrent le procédé à l'hématine alcaline en raison des temps de réaction trop longs ou des influences perturbantes dues à des consti- tuants du plasma (PONDER, 1942; SUNDERMAN et al., 1953). La méthode à la cyano-hémiglobine largement répandue au même moment a de plus en plus supplanté le procédé à l'hématine alcaline, de sorte que plus tard, même, "on pouvait faire abstraction de l'hématine alcaline" (LEGcW- SKY et BOROVICZENY, 1962). Par rapport au procédé classique, reposant sur l'hé- matine alcaline, le procédé selon l'invention se différen- cie en ce qu'il se forme une hématine alcaline avec des propriétés particulières en ce qui concerne - le spectre, - la vitesse de formation et - la stabilité qui, dans ce qui suit, est désignée en abrégé par "héma- tine alcaline D-575". Les particularités et avantages suivants sont liés à l'invention: 1. Tous les dérivés d'hème et d'hémoglobine sont trans- formés de façon quantitative en un produit de réaction unique, l'hématine alcaline D-575 et englobent, lors de la mesure photométrique: l'hémoglobine, l'oxy-hémoglobine, la carboxyhémoglobine, 1'hémiglobine, la sulfo-hémiglobine, la cyano-hémiglobine, l'hémoglobine fétale ainsi que la chlorhémine. 2. La formation de l'hématine alcaline D-575 après addi- tion de l'échantillon à la solution réactionnelle est ter- minée après au plus tard 2 minutes et le produit réac- tionnel présenteaprès des semaines,la meme extinction. Ceci est valable sans exception pour tous les dérivés d'hè- me et d'hémoglobine nommés sous 1. 3. La solution réactionnelle utilisée présente des pro- priétés idéales: a) Une seule solution réactionnelle est nécessaire. b) La solution réactionnelle est stable sans limitation. c) La manipulation de la solution réactionnelle est presque sans danger. d) La solution réactionnelle peut etre conservée à la tem- pérature de la pièce dans des récipients courants en verre ou en matière synthétique. e) La solution réactionnelle n'est pas sensible à la lu- mière. f) La solution réactionnelle peut être préparée de façon simple et est bon marché. g) Les produits chimiques utilisés pour la solution réac- tionnelle sont échangeables, c'est-à-dire que l'on peut utiliser, avec le même succès, différents produits chi- miques. On peut utiliser NaOH ou également KOH; comme déter- gents on peut utiliser par exemple: les éthers de polyéthylèneglycol et de p-t-octylphénol (en particulier l'éther de polyéthylèneglycol et de mono-tp- (1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényle/, tel que l'on peut l'obtenir sous la marque de commerce Triton X-100), l'éther de polyéthylèneglycol et de lauryle, l'éther de polyéthylèneglycol et de cétyle, l'éther de polyéthylène- glycol et d'oléyle et l'éther de polyéthylèneglycol et de stéaryle. h) La concentration des partenaires de la réaction, NaOH et le détergent, est non critique, c'est-à-dire qu'un écart important par rapport aux conditions optimales n'a pratiquement pas d'influence sur la possibilité de mise en oeuvre du procédé. Si celle de NaOH est dans le domaine de concentrations de 0,05 à 0,5 M et celle du détergent varie de 1 à 4 %, le comporte- ment spectral du produit de la réaction ne change pas, seul le temps de réaction nécessaire au dosage est prolongé de 1-2 minutes jusqu'à 5 - 10 minutes. i) La valeur du pH (voir plus haut la concentration en NaOH) et la température n'ont, dans un large domaine, aucune influence sur la possibilité de mise en oeuvre du procédé. k) Contrairement au sang dilué, le produit de la réaction, à savoir l'hématine alcaline D-575 est intensivement colorée en vert (impression colorée pour une longueur de trajet optique de 1-2 cm). Il en résulte que la fin de la réaction peut être, au moins de façon gros- sière, appréciée à l'oeil. 1) Le milieu alcalin de la solution réactionnelle con- vient particulièrement bien à un dosage de l'hémo- globine (voir BARER et GAFFNEY, 1957) * les érythro- cytes sont complètement hémolysés, les membranes des érythrocytes sont dissoutes et libèrent l'hémoglo- bine qui leur est adsorbée, enfin une précipitation des protéines du plasma (trouble) est empêchée. 4. Le produit de réaction, à savoir l'hématine alcaline D-575, présente des propriétés idéales a) L'extinction est suffisamment importante pour pou- voir procéder à un dosage de l'hémoglobine avec seule- ment 10-20 microlitres de sang (lorsqu'on utilise des quantités habituelles de solution réactionnelle, à sa- voir 2-5 ml). b) La loi de Lambert-Beer est applicable dans un large domaine. c) Le spectre du produit de réaction présente un maximum large à une longueur d'onde de 575 nm d'o la désigna- tion hématine alcaline D-575), de sorte que également avec des photomètres à filtre simples, on peut effectuer des dosages surs. Le spectre est indépendant des concen- trations des partenaires de la réaction dans le domaine susmentionné, il se différencie nettement de celui de 1'hématine alcaline sans addition d'un détergent. Le com- portement spectral de l'hématine alcaline D-575 est repro- duit par comparaison avec le spectre de l'hématine alca- line dans la figure 1. Les deux spectres ont été obtenus par dilution d'une solution étalon de cyano-hémiglobine (212,4 mg/100 ml) avec à chaque fois le meme volume de NaOH 0,1 M (formation d'hématine alcaline) ou respective- ment de NaOH 0,1 M avec une addition de 2,5 % d'éther de décaéthylène-glycol et de p-t-octylphényle (formation d'hé- matine alcaline D-575). Avec cette composition, on obtient des résultats optimaux en ce qui concerne la durée de la réaction. Tandis que l'hématine alcaline, dans NaOH, pré- sente le spectre maintes fois décrit dans la littérature avec un plateau entre 550 et 660 nm (voir par exemple HUNTER.; 1951), l'hématine alcaline D-575 présente, en présence d'un détergent non ionique, un maximum large à 575 nm. Cet effet n'est pasproduit par les détergents ioniques: tandis que les détergents anioniques, comme par exem- ple le dodécylsulfate de sodium, ne produit pas la bande caractéristique à 575 nm, il se produit lors de l'utili- sation de détergents cationiques comme le chlorure de benzyl-diisobutylphénoxy-éthoxydiméthyl-ammonium ou le chlorure de dodécyl-dioxyéthyl-benzyl-ammonium, un préci- pité brun lors de l'addition de sang. Dans le cas de l'action du détergent non ionique il doit s'agir d'une influence non spécifique, puisqu'elle est indépendante de sa structure (en ce qui concerne la modification du spectre de l'hémoglobine par des solvants indifférents, voir HEILMEYER, 1933, p. 116). 5. Du fait que l'hématine alcaline D-575 est très stable, on peut préparer des solutions étalor avec une concentra-- tion connue à partir d'érythrocytes lavés, à partir d'hé- moglobine cristallisée et à partir de chlorhémine cris- tallisée. En particulier le dernier procédé doit être beaucoup recommandé pour la préparation d'un étalon, du fait que la chlorhémine est une substance très simple, parfaite- ment définie (masse moléculaire 651,97; formule brute C34 32 ClFeN404), est bien soluble dans la solution réac- tionnelle décrite et présente de façon certaine les propriétés spectrales typiques de l'hématine alcaline D-575, c'est-à-dire qu'elle est transformée quantitati- vement en hématine alcaline D-575. Comme avantage particulier on peut citer que les solu- tions étalons de cyano-hémiglobine mondialement répan- dues peuvent être utilisées même après dilution avec la solution réactionnelle (fig. 1.). Cela signifie que l'on peut procéder à un étalonnage du nouveau procédé avec des étalons déjà existants. Dans ce qui suit on décrit un exemple de mise en oeuvre. Un volume de 20 /f1 de sang est transféré complètement à l'aide d'un capillaire calibré ou d'une pipette dite de Sahli dans une cuvette de mesure à une voie qui con- tient 3 ml de liquide de réaction. La cuvette de mesure est constituée par exemple de polystyrène ayant la limpi- dité du verre et a une largeur d'arête de 1 cm. A son ex- trémité supérieure se trouve une capsule de fermeture en matière synthétique qui est normalement fermée et n'est ouverte que peu de temps avant la mesure. La solution réactionnelle dans la cuvette de mesure reste stable pen- dant des mois, de sorte que, en conséquence, les cuvettes peuvent être entreposées pendant longtemps. La solution réactionnelle est constituée par exemple à partir de NaOH 0,1 M dans l'eau avec addition de 2,5 % d'éther de décaéthylèneglycol et de p.t-octyle. Ce déter- gent s'est révélé particulièrement approprié, car il se présente sous forme liquide et est par conséquent facile à manipuler. Après introduction de l'échantillon de sang, le sang est mélangé avec la solution réactionnelle par agitation de la cuvette de mesure. La transformation de tous les dérivés d'hémoglobine commence alors brusque- ment. La solution se colore immédiatement de manière intensive en vert. La mesure de l'extinction au photo- mètre à une longueur d'onde de 575 nm peut avoir lieu après 1, au plus tard 2 minutes. Du fait que l'extinction reste stable pendant des jours, la mesure peut également être effectuée plus tard. En tant que photomètres on peut uti- liser des photomètres à filtre du commerce, le filtre étant choisi de telle sorte qu'un domaine étroit à 575nm soit transmis. Un photomètre à filtre approprié est par exemple décrit dans la demande de brevet allemand pu- bliée après examen DE-AS 2 448 206. Si on utilise du sang avec une concentration normale en hémoglobine d'environ 16g/100 ml, il se produit à cette proportion de dilution une extinction d'environ 0,46 à la longueur d'onde indiquée, mesurée par rapport à une cuvette remplie d'eau de la même longueur de couche (1 cm). La comparaison avec une solution étalon (par exemple une solution de chlorhémine 0,1 mM dans la même solution réactionnelle ou une solution de cyano-hémiglobine de concentration connue, diluée avec le même volume de la solution réactionnelle) fournit la concentration en hémo- globine recherchée en g/100 ml. 248272.9 il Références biblioqraphiques BARER, R. et GAFFNEY, F.Mo The use of dilute alkaline in haemoglobinometry Clin. Chim. Acta 2, 140 - 156 (1957) Décision du Comité Allemand pour la Médecine Interne concer- nant la standardisation du dosage de l'hémoglobine. (Beschlu4 der Deutschen Gesellschaft fUr Innere Medizin betreffend Standardisierung der Hâmoglobin- Bestimmung) Arztl. 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Réactif pour la détermination photométrique de la teneur en hémoglobine du sang qui, lors de l'introduction de l'échantillon de sang, fournit une coloration caractéris- tique, caractérisé par une solution aqueuse alcaline à la- quelle est ajouté un détergent non ionique soluble dans l'eau, par lequel tous les dérivés d'hémoglobine et de hème(présents dans le sang) sont transformés en un seul pro- duit final avec un maximum d'absoprtion marqué dans le do- maine spectral visible. 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le maximum d'absorption se situe à environ 575 nm. 3. Réactif selon la revendication 1 à 2, caractérisé en ce que la solution réactionnelle alcaline est une lessive de soude ou de potasse 0, 05 - 0,5 molaire, à laquelle est ajouté 0,5 - 10 % en poids de détergent. 4. Réactif selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que le détergent est un éther de polyéthylèneglycol et de p-alcoylphén'yle de formule générale H-(OCH2-CH 2)x-O _-- -R, dans laquelle 7 e x i 12 et R signifie un radical alcoyle de type méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle, heptyle, octyle, nonyle, décyle, undécyle et dodécyle, ou est un éther de polyéthy- lèneglycol et de lauryle, cétyle, oléyle ou stéaryle. 5 Réactif selon la revendication 4, caractérisé en ce que le détergent est constitué d'éther de décaéthylène- glycol et de p-t-octylphényle. 6. Procédé pour la détermination de la teneur en hémo- globine d'un échantillon de sang, avec utilisation d'un réactif selon les revendications 1 à 5, selon lequel l'é- chantillon est hémolysé par addition d'une solution aqueuse alcaline et l'hématine alcaline est dosée photométrique- ment, caractérisé en ce qu'à la solution alcaline aqueuse est ajouté un détergent non ionique soluble dans l'eau, ce grace à quoi tous les dérivés d'hémoglobine et de hème (présents dans le sang) sont transformés en un seul produit final avec un maximum d'absorption marqué dans le domaine spectral visible, auquel la mesure photométrique est ef- fectuée. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'une hématine alcaline est formée par la réaction, qui présente un maximum d'absorption à une longueur d'onde d'environ 575 nm. 8. Procédé selon la revendication 6 à 7, caractérisé en ce que l'on utilise, en tant que solution alcaline, une lessive de soude ou de potasse 0,05 à 0,5 molaire à la- quelle sont ajoutés 0,5 à 10 % en poids de détergent. 9. Procédé selon la revendication 6 à 8, caractérisé en ce que, en tant que détergent, on utilise un éther de poly- éthylèneglycol et de p-alcoxyphényle, un éther de poly- éthylèneglycol et de lauryle, un éther de polyéthylène- glycol et de cétyle, un éther de polyéthylèneglycol et d'oléyle ou un éther de polyéthylèneglycol et de stéaryle.