Brevet FR2484791A1 — publié le 19811224

La présente invention cQncerne- un édulcorant peu cariogène (c'est-à-dire un agent édulcorant présen- tant une tendance faible ou nulle. à provoquer la carie dentaire), comprenant des oligosaccharides, obtenu en faisant réagir la fructosyl transférase avec le saccha- rose, et dans lequel 1 à 4 molécules de. fructose sont lées au saccharose. Elle concerne également des procé- dés de préparation et d'utilisation de l'édulcorant. Le saccharose a été jusqu'à présent largement utilisé en confiserie et pour la confection d'aliments en raison de son remarquable pouvoir édulcorant, de sa saveur, de sa cristallinité etc,... Mais le saccharose peut constituer un substrat pour la dextrane saccharase produite par les microorganismes intra-oraux, et par conséquent l'ingestion fréquente de saccharose conduit à. la formation de dextrane insoluble dans la bouche; la formation de la plaque dentaire s'en trouve donc accélérée. Par conséquent, on dit que le saccharose est cariogène. Le mécanisme de l'apparition de la carie dentaire parait comprendre les stades suivants: (1) un stade dans lequel le saccharose est transformé en dex- trane insoluble par action de la dextrane saccharase produite par un microorganisme carïogène, Streptococcus mutans ou analogue, et en même temps adsorbe les micro- organîsmes cariogènes pour former la plaque dentaire; et (2) un stade dans lequel des sucres fermentables tels que le glucose et le saccharose fermentent sous l'acteon.des microorganismes de la plaque dentaire déposés c la surface des dents en produisant des acides organiques (comprenant principalement de l'acide lactique) qui abaissent le pH et provoquent un phénomène de décal- cificatton. Des polyols comme le xylytol et la saccharine et des édulcorants synthétiques comme le cyclamate et l'aspartame sont connus pour être des édulcorantspeu 2 2484791 cariogènes. Mais ces édulcorants présentent l'inconvé- nient que, par exemple, les premiers provoquent souvent des diarrhées et que les derniers manquent de saveur. Il est donc souhaitable de mettre au point un édulcorant- peu cariogène possédant les excellentes propriétés du saccharose et n'ayant pas les défauts ci-dessus. Compte tenu de la cariogénicité du saccharose, un des buts de l'invention est de fournir un édulcorant présentant les propriétés favorables du saccharose, mais présentant une faible cariogénicité. L'invention fournit un édulcorant peu cariogé- ne comprenant des oligosaccharides dans lesquels de l à 4 molécules de fructose sont liées à du saccharose. L'invention comprend aussi un procédé de préparation d'un édulcorant peu cariogène, consistant à faire réagir du saccharose en présence de fructosyl transférase. L'invention comprend également un procédé de préparation de produits alimentaires peu cariogènes (parmi lesquels des aliments solides et des boissons),. et plus particulièrement un procédé de préparation de produits alimentaires peu cariogènes en utilisant le nouvel édulcorant de l'invention. - L'invention comprend en outre un procédé de préparation d'un édulcorant peu cariogène contenant du sorbitol et du mannitol par réduction catalytique sélective du glucose et du fructose contenus commne sousproduits dans une composition d'oligosaccharides obtenue en faisant réagir le saccharose en présence de fructosyl transférase et qui contient des-sucres d'oligosaccharides dans lesquels de 1 à 4 molécules de fructose sont liées au saccharose, du saccharose n'ayant pas réagi, et du glucose et du fructose. La présente invention résulte de recherches approfondies en vue de mettre au point une matière apparentée au saccharose peu cariogène et ayant les propriétés excellentes du saccharose; à la suite de ces recherches il a été découvert à présent que sur les oligosaccharides obtenus en faisant réagir le saccharose en présence de fructosyl transférase, en particulier sur les oligosaccharides tels que celui dans lequel une molécule de fructose est liée à du saccharose (désigné ci-après par GF2), celui dans lequel deux molécules de fructose sont liées à du saccharose (désigné ciaprès par GF3), celui dans lequel trois molécules de fructose sont liées à du saccharose (désigné ci-après par GP4), celui dans lequel quatre molécules de fructose sont liées à du saccharose (désigné ci-après par GF5), la dextrane saccharase produite par des microorganismes intra-oraux (tels que Streptococcus mutans) est prati- quement sans effet, et que ces oligosaccharides rédui- sent la formation de dextrane insoluble à partir du saccharose par la dextrane saccharase. Les oligosaccha- rides GF2, GF3, GF4, GF5 conformes à l'invention peuvent être isolés et purifiés en utilisant par exemple la chromatographie sur carbone (par exemple une chromato- graphie sur poudre de charbon activé), la chromatographie par échange d'ions etc...., à partir du mélange de sucres obtenu en faisant réagir la fructosyl transférase avec du saccharose. D'un point de vue pratique, cepen- dant, on utilise de préférence le mélange d'oligosaccha- rides tel quel. Le mélange de sucres contient aussi en général un peu de saccharose n'ayant pas réagi, des oligosaccharides GF2, GF3 etc. formés par la réaction de transfert, ainsi que du glucose et du fructose formés comme sous-produits de la réaction. Cependant, ce mélange de sucres donne lieu lui-aussi aux effets de la dextrane saccharase produite par des microorganismes intra-oraux, mais du fait de la présence des oligosaccharides, le dextrane insoluble est produit en quantité plus faible. Ceci est attri- bué au fait que les oligosaccharides GF2, GF3 etc. réduisent la formation de dextranes insolubles à partir du saccharose malgré la présence de saccharose, et qu'il ne se forme pas de dextrane insoluble à partir des oligosaccharides GF2, GF etc. Ainsi, un mélange ou une composition contenant des oligosaccharides dans lesquels 1 à 4 molécules de fructose sont liées à du saccharose produit moins de dextrane insoluble, que l'on suppose être la cause principale des caries dentaires, et les oligosaccharides GF2, GF3 etc. réduisent la formation de dextrane à partir du saccharose. En outre, la composition de l'invention possède d'excellentes propriétés comme édulcorant, telles qu'un bon pouvoir édulcorant, une saveur adéquate, une bonne rétention de l'humidité etc. en plus d'une faible cariogénicité. En particulier, la composition présente-un pouvoir édulcorant de 60 à 80, si l'on pose le pouvoir édulcorant du saccharose comme égal à 100, et elle possè- de un parfum spécial. Le pouvoir édulcorant est évalué par la méthode du seuil décrite dans Sweeteners and Dental Caries, de J.H. Shaw, p. 45, Information Retrie- val Incorporation. Par -ailleurs GF2, GF3 etc. se colo- rent difficilement lors de la mise en oeuvre, car- ce sont des sucres non réducteurs. En outre, cet édulcorant présente à peu près la même viscosité et la même pression osmotique que le saccharose, et il est non cristallin. Par conséquent, lorsqu'on le mélange à du saccharose, à du fructose, à du lactose, etc. il peut inhiber la cristallisation. Cette propriété est considérée -comme avantageuse dans la pratique. De plus, cet édulcorant présente à peu près le même abaissement du point de congélation que le saccharose, et il possède d'excellen- tes propriétés de rétention de l'humidité. Comme il a été décrit ci-dessus, cet édulco- rant possède diverses propriétés exigées des édulcorants classiques et par conséquent il peut être utilisé dans n'importe quel produit alimentaire à la place des édul- corants ordinairement utilisés tels que le sucre, le gluten de blé saccharifié par les acides (mizuame), le sucre isomérisé etc., et les produits alimentaires qu'il permet d'obtenir sont moins cariogènes que ceux obtenus avec des édulcorants classiques. Comme il a été décrit ci-dessus, la composi- tion contenant des oligosaccharides dans lesquels 1 à 4 molécules de fructose sont liées à du saccharose dési- gnée ci-après sous le nom d'édulcorant peu cariogène, est une composition d'édulcorant moins cariogène. La demanderesse a également étudié de manière approfondie le procédé de production industrielle de cet édulcorant peu cariogène et elle a fait une seconde invention, â savoir que l'édulcorant peut être obtenu en faisant réagir le saccharose en présence de fructosyl trans- férase. La fructosyl transférase agit principalement sur le saccharose en rompant la liaison e-1,2 entre le fructose et le glucose, et elle transfère le fructose obtenu sur le saccharose en donnant EF2, puis le fruc- tose sur GF2 pour donner GF3. Ce comportement est différent de ceux de l'inulosaccharase (2.4.1.9) et de *25 la levane saccharase (2.4.1.10) décrites dans Enzyme Nomemclature (Academic Press, 1978) en ce que les produits de la réaction sont des oligosaccharides dans lesquels le fructose est lié au saccharose tels que GF2, GF3 etc. Comme sources de l'enzyme, on citera des microorganismes tels que des champignons (genre Asper- gillus (Aspergillus niger ACE-2-1, ATCC 20611, etc.) genre Penicillium (Penicillium nigricans, etc.) genre Fusarium (Fusarium lini IAM 5008, etc. ), genre Gloeosporium (Gloeosporium kaki IAM 5011, etc.), etc.) et des levures, (par exemple genre Saccharomyces (Saccha- romyces cerevisiae, etc.) genre Rhodotorulla (Rhodotorulla 6 2484791 glutinis, etc.), genre Pichia (Pichia miso, etc.), genre Hansenula (Hansenula miso, etc.), genre Candida (Candida tropicalis, etc.), Aureobasidium pullulans var melanige- num A-8, ATCC 20612) et des enzymes d'origine végétale telles que celles produites par Asparagus officinalis, Helianthus tuberosus L., etc. La fructosyl transférase produite par des microorganismes peut être obtenue en cultivant le microorganisme à sa-température optimale, c'est-à-dire de 25 à 30'C pendant 24 à 96 heures en utilisant un milieu approprié connu, par exemple un milieu contenant 5,0 % de saccharose, 1,0 % de peptone, 0, 7 % d'extrait de viande, et 0,3 % de NaCl et, lorsque la culture est terminée, en éliminant les cellules du microorganisme par filtration ou centrifugation pour obtenir un filtrat de culture. On peut utiliser le filtrat lui-même ou l'enzyme obtenue en purifiant le filtrat par un procédé classique de purification de l'enzyme, tel que l'ultrafiltration, le relargage (salting out) (c'est-à-dire que le sel et d'autres impuretés en sont éliminés) par du sulfate de sodium, la précipitation par des solvants, la filtration sur gel ou la chromatographie par échange d'ions. Les enzymes d'origine végétale peuvent être obtenues en détruisant le tissu végétal par des moyens physiques tels que le broyage, et en extrayant l'enzyme. On peut utiliser l'extrait brut lui-même, ou l'enzyme obtenue en purifiant l'extrait d'une manière classique (par exemple par précipitation à l'éthanol, relargage avec (NH4)2SO4 etc.). L'édulcorant peu cariogène peut alors être obtenu en faisant réagir le saccharose en présence de l'enzyme ainsi obtenue. A la suite de diverses études concernant des conditions réactionnelles appropriées, on a trouvé que les conditions suivantes étaient préfé- rables. En particulier, la concentration en saccharose après la réaction de transfert est généralement ajustée à 5-70 %, de préférence à 30-60 % en poids. Le pH de la 7 2484791 réaction est généralement de 4,0 à 7,0 et la température réactionnelle de 25 C à 65 C, de préférence de 50 à 60 C, bien que les conditions préférées puissent varier en fonction de l'origine de l'enzyme. En ce qui concerne la quantité d'enzyme, on en utilise de 5 à 200 unités, et de préférence de 20 à 80 unités, par g de saccharose. La quantité d'enzyme est exprimée ici en "unités", une unité correspondant à la quantité d'enzyme ayant pour effet de donner 1 pmole de glucose pour 2,5 ml d'une solution réactionnelle lorsque la réaction est effectuée en ajoutant 0,5 ml d'une solution d'enzyme à 1,0 ml d'une solution de saccharose à 5 % et 1,0 ml d'une solution tampon à pH 5,0 puis en faisant réagir à 40 C pendant 60 minutes. Lorsque la réaction de transfert est terminée, on chauffe le mélange réactionnel à 100 C pour désacti- ver l'enzyme, on le décolore avec du carbone actif, on le désalinise avec une résine échangeuse d'ions et on le concentre, ce qui donne le produit final. L'analyse de la composition du milieu réactionnel de transfert peut être effectuée par exemple par chromatographie liquide à grande vitesse en utilisant une colonne Microbondapack CH (fabriquée par Waters Associates Incor- poration) et, comme solvant, de l'acrylonitrile/eau (80/20 en volume). L'édulcorant à faible cariogénicité ainsi obtenu présente par exemple la composition suivante: 28 % en poids de glucose, 2 % de fructose, 11 % de saccharose, 28 % de GF2, 25 % de GF3, 5 % de GF4 et 1 % de GF5. Cette composition en sucres varie beaucoup avec les conditions réactionnelles. Comme oligosaccharides GF2, on citera par exemple 1'0-e-D-fructofuranosyl-(2+1)-0---fructofuranosyl- (2+1)-a-D-glucopyranoside, 1 0-5-D-fructofuranosyl-(2+6)- 0-g-glucopyranosyl-(1+2)--D-fructofuranoside, i'0-$-D- fructofuranosyl-(2+6)-0--fructofuranosyl-(2+1)-a-D- glucopyranoside, etc. Comme GF,, on citera l'0-g-D- 8 2484791 fructofuranosyl-(2+ 1-0--D-fructofuranosyl] 2+1) --D- glucopyranoside, l'0-e-D-fructofuranosyl-(2+6)-0-[B-D- fructofuranosyl-(2+2)]-0-a-D-glucopyranosyl-(l12)-3-D- fructofuranoside, etc., et comme GF4, on citera l'0-g-D- fructofuranosyl- (2+ [1-0--D-fructofuranosyl-233+1)-a- D-glucopyranoside, etc. Comme GF5, on citera l'0-e-D- fructofuranosyl-(2+[1-0-e-D-fructofuranosyl-2]4+1)-a- D-glucopyranoside, etc. - Les effets de l'édulcorant de l'invention et ceux des divers ingrédients GF2, GF3, GF4 et GF5 seront décrits de manière plus détaillée dans les exemples expérimentaux ci-dessous. Le tableau 1 de l'exemple d'essai 1 qui sera décrit ci-après indique les quantités de dextrane insoluble obtenues à partir de GF2, GF3, GF4 et GF5 en utilisant la dextrane saccharase obtenue en cultivant Streptococcus mutans, souche ATCC 25115, par comparaison avec le résultat obtenu avec le saccharose. Il ressort clairement de ce tableau que l'on n'obtient pas de dextrane insoluble à partir de GF2, GF3, GF4 et GF5. Le tableau 2 de l'exemple d'essai 2 ci-après indique si GF2 et GF3 réduisent ou non la production de dextrane insoluble à partir du saccharose par la dextra- ne saccharase.Ce tableau montre clairement que GF2 et GF3 réduisent la production de dextrane insoluble à partir du saccharose. Le tableau 4 de l'exemple d'essai 3 ci-après indique la quantité de dextrane insoluble obtenue à partir de compositions d'édulcorant préparées dans diver- ses conditions et ayant par conséquent des compositions différentes, par comparaison avec le saccharose. Il ressort clairement du tableau que les compositions de transfert donnent des quantités de dextrane insoluble plus faibles que le saccharose. En particulier, on préfère que la teneur pondérale de la somme des oligosaccharides GF2, GF3, GF4 etc. soit supérieure de deux fois ou 248479'1 davantage à la teneur en saccharose libre dans la com- position d'édulcorant. C'est à dire que lorsque le rapport de la teneur pondérale de la somme des oligosaccharides à la teneur pondérale en saccharose libre est d'au moins 2,0/1, la quantité de dextrane insoluble produite repré- sente 50 % ou moins de celle produite en utilisant le saccharose. Ces compositions sont donc particulièrement préférées. Comme il a été décrit ci-dessus, un mélange ou une composition contenant les oligosaccharides dans - lesquels l à 4 molécules de fructose sont liées au sac- charose produit moins de dextrane insoluble (qui est la cause principale des caries dentaires) et les oligo- saccharides GF2, GF3 etc. réduisent la formation de dextrane à partir du saccharose. Cette composition de sucres n'est pas sensi- ble à la dextrane saccharase provenant de Streptococcus mutans etc., et pars.suite il ne se forme pas de dextrane insoluble lors de l'ingestion de la composition de sucres. En ce sens, la composition est moins-cariogène. Cependant, bien que les oligosaccharides GF2, GF3 etc. présents dans la composition ne fermentent pratiquement pas sous l'effet des microorganismes Streptococcus mutans etc., et qu'ils ne produisent donc que de faibles quantités d'acides organiques, le saccharose n'ayant pas réagi et le glucose et le fructose formés comme sous-produits dans la réaction de transfert peuvent être transformés en acides organiques. Ainsi, la composition de sucres donne moins d'acides organiques que le saccha- rose, mais elle n'est pas complètement satisfaisante. A la suite d'études approfondies sur ce point particulier, on a découvert également que le glucose et le fructose n'existent qu'en faibles quantités dans la composition, et qu'ils peuvent être transformés sélectivement en sorbitol et en mannitol par réduction catalytique de la composition de sucres obtenue en faisant réagir le saccharose en présence de fructosyl transférase, dans des conditions déterminées, et que la quantité d'acide lactique produite à partir de la com- position d'édulcorant ainsi obtenue par action des microorganismes n'est que 20 % environ de celle produite par le saccharose (voir exemple d'essai 4). C'est-à- dire que l'invention fournit également un procédé de préparation d'un nouvel édulcorant contenant du sorbi- tol et du mannitol, consistant à faire réagir le saccha- rose en présence de fructosyl transférase, pour obtenir une solution de sucres contenant du glucose, du fructose, du saccharose et des oligosaccharides dans lesquels 1 à 4 molécules de fructose sont liées au saccharose, et à soumettre cette solution de sucres à une réduction catalytique tout en maintenant le pH de la solution de 7 à 9. En particulier, on a trouvé que le glucose et le fructose sont sélectivement réduits avec formation de sorbitol à partir du glucose et de sorbitol et de mannitol à partir du fructose, sans décomposition des oligosaccharides GF2, GF3, GF4 etc., en ajoutant par exemple du phosphate disodique à une solution aqueuse de la composition de sucres ci-dessus pour ajuster son pH de 7 à 9, et en agitant le mélange en présence de 3 à 10 %, par rapport aux solides, d'un catalyseur au nickel (nickel de Raney, formiate de nickel, nickel sur terre de diatomées, etc.) pour effectuer la réaction de réduction à une température de 50 à 1300C sous une pression d'hydrogène réagissant de 50 à 120 bars. Parmi les conditions réactionnelles, l'ajustement du pH est particulièrement important. Lorsque la réduction cata- lytique est effectuée par exemple à un pH de 6 ou moins, les oligosaccharides GF2, GF3, GF4 etc. sont décomposés- en donnant de grandes quantités de sorbitol et de manni- tol, par conséquent la réduction sélective du glucose et du fructose est de préférence effectuée à un pH de 7 à 9. La composition d'édulcorant ainsi obtenue contient en général environ 37 % de sorbitol, 2 % de mannitol, 10 % de saccharose, 22 % de GF2, 22 % de GF3 et 7 % de GF4. Comme le montre l'exemple d'essai 4, il a été démontré que la quantité d'acide lactique produite à partir de la composition par Streptococcus mutans est très inférieure à celle produite à partir du saccha- rose ou de la composition de sucres obtenue en faisant agir la fructosyl transférase sur le saccharose. Comme il a été décrit ci-dessus, la composi- tion édulcorante de l'invention contenant du sorbitol, du mannitol, des oligosaccharides GF2, GF3, GF4 etco et une faible quantité de saccharose constitue un mauvais substrat pour la dextrane saccharase produite par Streptococcus mutans, elle ne permet donc la produc- tion que de faibles quantités de dextrane insoluble. En outre, la sensibilité plus faible de la composition à la fermentation par Streptococcusmutans réduit la quantité d'acide lactique cariogène formée. En conséquence, la composition est un édulco- rant présentant de nettes propriétés anti-cariogènes. Exemple d'essai 1. On cultive une souche de Streptococcus mutans ATCC 25175 en milieu anaérobie, en utilisant un milieu contenant du glucose et de la triptocase et, après avoir séparé les cellules du microorganisme, on concentre le filtrat et on le purifie par ultrafiltration pour pré- parer la dextrane saccharase. Puis on mélange 1,0 ml d'une solution de su- cres à 1 %, 1,5 ml d'une solution tampon phosphate 0,67 M (pH 7,0) et 0, 25 ml de la solution d'enzyme décrite ci-dessus, et on les fait réagir pendant 4 heu- res à 370C. On précipite par centrifugation à 3000 t/min le dextrane insoluble dans l'eau ainsi produit et on recueille le précipité. On lave le précipité 2 fois 12 2484791 avec à chaque fois 5 ml d'éthanol à 70%, on le dissout dans 2,5 ml de solution d'hydroxyde de potassium 1 M14 et on y dose le dextrane par la méthode au phénol - acide sulfurique. Comme solutions de sucres, on utilise respectivement des solutions à 1 % de GF2, GF3, GF4 et GF5. Comme GF2, GF3, GF4 et GF5, on utilise des frac- tions purifiées en soumettant une composition de sucres (obtenue en faisant réagir le saccharose en présence de fructosyl transférase) à une chromatographie sur carbone (en utilisant une poudre de charbon activé) jusqu'à obtention d'une tache unique en chromatographie sur couche mince. Le tableau 1 donne les résultats obtenus. Tableau 1 Dextrane formé dans Echantillon la solution réactionnelle (y) Saccharose 740 GF2 0 GF3 0 GF4 0 GF5 0 Comme le montre le tableau 1, il ne se forme pas de dextrane à partir de GF2, GF3, GF4 et GF5. Exemple d'essai 2. Dans cet exemple, on examine si GF2 et GF3 réduisent ou non la production de dextrane insoluble à partir du saccharose lorsque le saccharose est exposé à la dextrane saccharase préparée dans l'exemple d'essai 1 en présence de GF2 et GF3. Les conditions réactionnelles sont les suivantes: on mélange 1,0 ml de chacune des - solutions de sucres (contenant le sucre indiqué dans le tableau 2), 1,5 ml d'une solution tampon phosphate 0,67 M (pH 7,0), et 0,25 ml d'une solution d'enzyme et on les fait réagir à 37 C pendant 4 heures. On dose le dextrane insoluble formé dans la solution réaction- nelle de la même manière que dans l'exemple d'essai 1. Tableau 2 Teneur en sucre dans la solution réactionnelle Quantité de dextrane formée dans la solution réactionnelle (Y) Saccharose Saccharose Saccharose mg mg + GF2 30 mg mg + GF3 30 mg 740 (100) 300 ( 40) 350 ( 47) En outre, les nombres entre parenthèses du tableau 2 indiquent les quantités de dextrane insoluble sous forme d'indices, celle fournie par le saccharose étant posée égale à 100. Exemple d'essai 3. On prépare des édulcorants présentant les compositions ci-après en faisant réagir le saccharose en présence de fructosyl transférase dans diverses conditions. Tableau 3 ictose Glucose Saccharose -- 5,9 81,9 -- 13,7 58,5 -- 17,4 41,8 -- 23,5 23,9 -- 28,4 14,9 0,8 31,5 11,0 0,9 31,6 10,0 GF2 GF3 GF4 12,2 - - 27,8 - - ,7 5,0 - 41,2 11,4 - 39,2 17,4 - 26,4 25,1 5,0 23,5 24,1 7,0 G F5 Rapport? - 15,0 - 47,5 - 97,0 - 220 - 380 - 514 2,9 575 * GF + GF4 + GF5 (%) Saccharose libre (%) x-100 On mesure les quantités de dextrane insoluble formées à partir des compositions de sucres de transfert décrites cidessus de la même manière que dans J'exemple d'essai 1, et l'on obtient les résultats indiqués dans le tableau 4. Frt N 5 l 14 2484791 Tableau 4 Echantillon Dextrane formée dans la solution réactionnelle (%) Saccharose 490 (100) Sucre de transfert n 1 436 ( 89) " n 2 298 (61) " n 3 289 (59) " n 4 201 ( 41) " n 5 142 (29) " n 6 44 ( 9) " n 7 40( 8) Les nombres entre parenthèses sont des indices corres- pondant aux quantités de dextrane insoluble, en posant celle provenant du saccharose égale à 100. *Exemple d'essai 4. On cultive en milieu anaérobie Streptococcus mutans, Serotype C, en utilisant un milieu contenant 0,27 % de maltose, 0,01 % de chlorhydrate de L-cystéine, 0,1 % de L-glutamate de sodium, 0,2 % de NH4H2PO4, 0,02 % de MgSO4.7H20, 0,01 % de NaCl, 0,01 % de MnSO4 et 0,01 % de FeSO4.7H20. On recueille ensuite les cellules du microorganisme par centrifugation, puis on les disperse dans un tampon phosphate 0,05 M à la concentration de 10 mg/ml. On mélange 0,9 ml d'un tampon phosphate 0,2 M, 0,14 ml de MgC12 22,5 mM, 0,2 ml d'une solution de sucresà 1,7 % et 0,5 ml de la dispersion de cellules et on les agite à 37 C pendant 30 minutes pour les faire réagir. Puis on fait bouillir le mélange pendant 15 mi- nutes pour faire cesser la réaction, et, après élimina- tion des cellules par centrifugation, on dose l'acide lactique dans le liquide surnageant par une méthode enzymatique. Tableau 5 Substrat moe/ uAcide lactique Srmoles/solution réactionnelle Saccharose GF2 GF3 Composition-1 * *2 Composition-2 * 1 Composition-1: 16,8 8,0 0,1 12,6 3,7 Rapport de formation o0 22 - (composition de sucres obtenue en faisant réagir le saccharose en présence de fructosyl transférase)_ Glucose 37 % Fructose 2 % Saccharose 10 % GF 22 % 2% GF3 23 % GF4 6% * 2 Composition-2 :(Composition obtenue catalytique). Sorbitol 38 % Mannitol 1% Saccharose 10 % GF2 22 % GF3 23 % GF4 6% par réduction Exemple 1. On verse respectivement dans deux tubes à essai des portions de 10 ml de milieu BS contenant 5,0 % de sac- charose 1,0 % de peptone, 0,7 % d'extrait de viande, et 0,3 % de NaCl et, apres les avoir stérilisées à 1200 C pendant 30 minutes, on inocule à chacun d'eux une anse de fil de platine d'Aspergillus niger ACE-2-1, ATCC 20611, et on effectue la culture à 28 C pendant 24 heures. On introduit respectivement des portions de 16 2484791 ml des solutions de culture obtenues dans deux Erlenmeyers contenant 200 ml de milieu BS (stérilisé à 120'C pendant 30 minutes), et on effectue une culture agitée à 280C pendant 24 heures pour réaliser une pré- culture. Dans un fermenteur-jarre de 30 1,on introduit lde milieu BS et, après stérilisation à 1200C pen- dant 30 minutes, on le refroidit et on lui inocule 400 ml de la solution de culture ci-dessus. On effectue la culture à 300 tours/min à 28 C pendant 72 heures. Lorsque la culture est terminée, on élimine les cellules par filtration et l'on obtient 20 1 d'un filtrat de culture. On concentre 20 1 de ce filtrat de culture et on les purifie par ultrafiltration. On obtient 2 1 d'une solution d'enzyme ayant une activité enzymatiquede 240 unités/ml. On ajoute 6,7 1 d'eau à 10 kg de saccharose pour les dissoudre et, après avoir ajusté le pH à 5,0, on y ajoute l'enzyme à raison de 48 unités par g de saccharose, et on effectue la réaction de transfert à 50'C pendant 48 heures. Lorsque la réaction de trans- fert est terminée, on chauffe le mélange réactionnel à 1000C pendant 15 minutes pour désactiver l'enzyme, après quoi on ajoute du carbone activé à raison de 0,5 % par rapport aux solides pour le décolorer. On élimine le carbone actif, puis on traite la solution par les résines échangeuses d'ions Amberlite IR.120 B et Amberlite IRA.411 et on la concentre à 75 % P/P. On obtient 12 kg d'édulco- rant peu cariogène. L'édulcorant ainsi obtenu présente la compo- sition en sucres suivantes: glucose 26 %, fructose 2 %, saccharose 18 %, GF2 40 %, GF3 14 %. Exemple 2. On cultive Fusarium lini IAM 5008 de la même manière qu'à l'exemple 1, et l'on obtient 20 1 d'une solution de culture. On concentre cette solution et on la purifie par ultrafiltration. On obtient 2 1 d'une solution d'enzyme ayant une activité enzymatique de 200 unités/ml. On ajoute 7 1 d'eau à 3 kg de saccharose et, après avoir ajusté le pH à 6,0, on y ajoute l'enzyme à raison de 16 unités par g de saccharose, puis on effec- tue la réaction de transfert à 50 C pendant 24 heures. Lorsque la réaction est terminée, on chauffe la solution à 100 C pendant 15 minutes pour désactiver l'enzyme et on y ajoute du carbone activé dans la proportion de 0,5 % par rapport aux solides pour la décolorer. On désalinise ensuite la solution avec une résine échangeuse d'ions et on la concentre à 75 % P/P. On obtient 3,7 kg d'un édulcorant peu cariogène. L'édulcorant ainsi obtenu présente la compo- sition en sucres suivante: glucose 38,2 %; fructose 7,8 %; saccharose 17,2 %; GF2 25,4 %; et GF3 11,4 %. Exemple 3. On cultive Gloeosporium kaki IAM 5011 de la même manière qu'à l'exemple 1. On obtient 20 1 de filtrat. On concentre ce filtrat et on le purifie par ultrafiltration. On obtient 1,5 1 d'une solution d'enzy- me ayant une activité enzymatique de 200 unités/ml. On ajoute 7 1 d'eau à 3 kg de saccharose pour les dissoudre et, après avoir ajusté le pH à 6,0, on y ajoute l'enzyme à raison de 20 unités par g de saccharose, après quoi on effectue la réaction de transfert à 50 C pendant 24 heu- res. Lorsque la réaction est terminée, on décolore la solution et on la désalinise de la même manière qu'à l'exemple 1. On la concentre à 75 % P/P et l'on obtient 3,8 kg d'un édulcorant peu cariogène. L'édulcorant ainsi obtenu présente la composi- tion en sucres suivante: glucose 25 %, fructose 9 %, saccharose 36 %; GF2 24 %, et GF3 6 %. On donnera ci-après des exemples d'utilisation de l'édulcorant de l'invention dans divers aliments et boissons. 18 2484791 Exemple 4. Préparation d'un bonbon dur. On concentre sous vide un édulcorant peu cario- gène présentant la composition en sucres suivante: glucose 37 %, fructose 2 %, saccharose 10 %, GF2 22 %, GF3 23 % et GF4 6 % (teneur en eau: 25 % en poids) jusqu'à une teneur en eau finale d'environ 8 à 10 % en poids et, après l'avoir refroidi à 80'C environ, on y ajoute un parfum et un colorant alimentaire. On coule le mélange et on le refroidit à la température ambiante et l'on obtient un bonbon dur. Ce bonbon ne forme pas de cristaux de sucre, contrairement au bonbon fabriqué avec du sucre, et il est peu cariogène. Exemple 5. Préparation d'une confiture d'oranges. On ajoute 200 g de pulpe d'oranges à 90 g de peaux d'oranges préalablement trempées une nuit dans une solution aqueuse de chlorure de sodium pour en éliminer l'amertume, lavées à l'eau pour éliminer le sel, et mises à bouillir pendant 20 minutes environ. On y ajoute 370 ml d'eau, on fait réduire le mélange pendant 30 minutes environ tout en lui ajoutant 320 g d'un édul- corant peu cariogène présentant la même composition en sucres que celui de l'exemple 4 (teneur en eau: 25 % P/P). La confiture d'oranges obtenue a une teneur en sucres de 65 % P/P. Elle a le goût acidulé rafraîchissant de l'orange et elle est délicieuse. Exemple 6. Préparation d'une pâte douce de haricots cuits à la vapeur (également désignée sous le nom de "neri-yokan"). On plonge 12 g d'agaragar dans de l'eau pendant 3 heures et on les broie après avoir éliminé l'eau. Puis on ajoute 260 ml d'eau, et on chauffe pour les dissoudre. On ajoute 960 g d'édulcorant peu cario- gène ayant la même composition en sucres que celui de l'exemple 4 (teneur en eau: 25 % en poids) et on filtre après dissolution complète de l'agaragar. On place ce 19 2484791 mélange d'agar-agar sur le feu, on y ajoute 500 g de pâte de haricots crue, on le malaxe, et, après l'avoir fait bouillir jusqu'à une teneur en sucre de 70 à 71 %, on le coule dans une boite et le garnit pour préparer une pâte douce de haricots cuits à la vapeur (néri-yokan). Celle-ci est peu cariogène. Exemple 7. Préparation d'une crème glacée. Pour préparer un mélange pour crème glacée, on utilise 10 parties de lait écrèmé, 75,5 parties d'eau, 0,25 partie de stabilisant, 0,25 partie d'un agent émulsionnant, 14 parties d'un édulcorant peu cario- gène ayant la même composition en sucres que celui de l'exemple 4, et une quantité appropriée de parfum. Après filtration, on stérilise ce mélange à 700C pendant 30 minutes, puis on le refroidit. On le fait vieillir à 35OC pendant 6 heures, et on abaisse la température jusqu'à congélation tout en agitant. On obtient ainsi une crème glacée. Comme l'édulcorant peu cariogène présen- te à peu près le même abaissement du point de congélation que le sucre, la crème glacée obtenue présente une bonne conservation de la forme par comparaison à celle préparée avec du sucre. Exemple 8. Préparation de biscuits. On prépare une pâte à partir de 1 kg de farine de blé, 100 g d'amidon de mais, 333 g d'un édulcorant peu cariogène ayant la même composition en sucres que celui de l'exemple 4 (teneur en eau: 25 % P/P), 125 g de margarine, 5 g de chlorure de sodium, 2,5 g de carbonate de sodium, 8,8 g de carbonate d'ammonium, 6,3 g de léci- thine de soja, 75 g d'oeufs entiers, 6,3 g d'essence de vanille et 267 g d'eau et, après levée de cette pâte, on la moule et la cuit pour préparer des biscuits. L'état de la pâte est le même que lorsqu'on utilise du sucre, les biscuits ont un volume satisfaisant et une bonne couleur à l'état cuit, comme lorsqu'on utilise du sucre. 2484791 Exemple 9. Préparation d'une boisson sans alcool. On ajoute 1,5 partie d'acide citrique et 970 parties d'eau à 133 parties d'un édulcorant peu cariogè- ne ayant la même composition en sucres que celui de l'exemple 4 (teneur en eau: 25 % P/P) pour les dissoudre, et on y ajoute des quantités appropriées de colorant et de parfum. Puis on traite le mélange par l'anhydride carbonique pour préparer une boisson sans alcool. Celle- ci est peu cariogène, car elle ne contient que l'édul- corant peu cariogène. Exemple 10. Préparation d'une gomme à mâcher. On dissout et mélange 75 parties d'une poudre d'édulcorant peu cariogène ayant la même composition en sucres qu'à l'exemple 4 et 22 parties de gomme chiclé. Puis on y ajoute un parfum et du menthol, après quoi on malaxe. Après avoir passé le mélange dans un laminoir pour le laminer à une épaisseur déterminée, on découpe le produit laminé et on le sèche pour préparer une plaque de gomme à mâcher. Cette gomme est peu cariogène, car on n'a utilisé que l'édulcorant peu cariogène. Exemple 11. Préparation d'un chocolat. On mélange 100 parties de chocolat amer,116 parties de poudre d'édulcorant peu cariogène ayant la même composition en sucres que celui de l'exemple 4, 23 parties de beurre de cacao, 90 parties de poudre de lait et de faibles quantités de vanille et de lécithine pour préparer un chocolat de la manière habituelle. Ce chocolat est agréablement édulcoré et il a le même goût que celui préparé avec du sucre. Exemple 12. Préparation d'un aliment de conserve réduit dans de la sauce au soja (également désigné sous le nom de "tsukudani"). On mélange et fait réduire 1 1 de sauce au soja et 900 g d'un édulcorant peu cariogène ayant la même composition en sucres qu'à l'exemple 4. Puis on y ajoute 800 g de palourdes et 50 g de gingembre et on fait bouillir 21 2484791 pendant 40 à 60 minutes les palourdes flottant dans la sauce. On obtient une conserve de palourdes réduites dans de la sauce au soja, ayant une couleur et un goût satis- faisants. Exemple 13. Préparation de marrons glacés. On enlève les épicarpes de châtaignes, puis on fait bouillir les châtaignes pelées pendant 8 à 10 heures. On enlève ensuite la peau amère et on verse sur les châtaignes une solution chaude à 40 % d'un édulcorant peu cariogène ayant la même composition en sucres que celui de l'exemple 4. Après les avoir laissées reposer pendant une journée, on verse sur les châtaignes une solution de sucres à 45 %, puis on laisse reposer pendant une journée. En portant de la même façon la con- centration de la solution de sucre à 70 %, on obtient des marrons glacés. Comme la pression osmotique de l'édulcorant peu cariogène est à peu près la même que celle du sucre, on obtient de bons produits. Exemple 14. On verse respectivement dans deux tubes à essai des portions de 10 ml de milieu BS contenant 5,0 % de sac- charose 1,0 % de peptone, 0,7 % d'extrait de viande, et 0,3 % de NaCl. Après stérilisation à 120'C pendant 30 minutes, on inocule chacun des milieux avec une anse de platine d'Aspergillus niger et on effectue la culture à 280C pendant 24 heures. On introduit respectivement des portions de ml de la solution de culture obtenue dans deux Erlen- meyers contenant 200 ml de milieu BS (stérilisé à 120'C pendant 30 minutes) et on effectue une culture agitée à 280C pendant 24 heures pour réaliser une pré-culture. On introduit 20 1 de milieu BS dans un fermen- teur-jarre de 30 1 et, après stérilisation à 1200C pendant 30 minutes, on le refroidit et on lui inocule 400 ml de la solution de culture ci-dessus. La culture est effectuée à 300 tours/min, à 280C, pendant 72 heures. Lorsque la culture est terminée, on élimine les cellules par filtration et l'on obtient 20 1 de filtrat de cultu- re. On concentre 20 1 de ce filtrat de culture et on les purifie par ultrafiltration. On obtient 2 1 d'une solu- tion d'enzyme ayant une activité enzymatique de 240 unités/ml. On ajoute 3,3 1 d'eau à 5 kg de saccharose pour les dissoudre et, après avoir ajusté le pH à 6,0, on y ajoute la solution d'enzyme à raison de 60 unités/g de saccharose,, apres quoi on effectue la réaction de transfert à 50 C pendant 72 heures. Lorsque la réaction de transfert est terminée, on chauffe la solution à 100 C pendant 15 minutes pour désactiver l'enzyme. Puis on y ajoute du carbone activé dans la proportion de 0,5 % par rapport aux solides pour la décolorer. Après élimi- nation du carbone activé, on traite la solution par les résines échangeuses d'ions Amberlite IR.120 et Amberlite IRA-411, et on la concentre jusqu'à une concentration de 75 % en poids pour obtenir 6 kg d'un édulcorant. Cet édulcorant présente la composition en sucres suivante: glucose 37 %; fructose 2 %; saccharose 10 %; GF2 22 %; GF3 23 %; et GF4 6 %. On ajoute 700 ml d'eau à la composition d'édulcorant ci-dessus, on ajoute 15 ml de Na2HPO4 à 10 %, puis on ajuste le pH à 9,0 avec NaOH à 4 %. On y ajoute 50 g de nickel de Raney, et on effectue la réac- tion de réduction à 80-90 C pendant 50 minutes, en agitant, sous une pression d'hydrogène de 60 à 120 bars. Lorsque la réaction est terminée, on élimine le cataly- seur au nickel et on traite la solution par les résines échangeuses d'ions Amberlite IR-120B et Amberlite IRA-411, puis on concentre à 75 % P/P, ce qui fournit 1 kg de produit. Cet édulcorant présente la composition en sucres suivante: sorbitol 38 %; mannitol 2 %; saccharose 9 %; GF2 22 %; GF3 23 %; et GF4 6 %. Exemple 15. On verse respectivement dans 2 tubes à essais ml de milieu BS contenant 0, 5 % de saccharose, 1,0 % de peptone, 0,7 % d'extrait de viande et 0,3 % de NaCl et' après stérilisation à 120 C pendant 30 minutes, on inocu- le à chacun des milieux une anse de platine d'Aureoba- sidium pullulans, var. melanigenum A-8 ATCC 20612 et on effectue la culture à 28 C pendant 24 heures. On introduit respectivement 10 ml des solutions de culture obtenues dans deux Erlenmeyers contenant 300 ml de milieu BS (stérilisé à 120 C pendant 30 minutes) et on effectue une culture agitée à 28 C pendant 24 heures pour réaliser une préculture. On introduit 20 1 de milieu contenant 10 % de saccharose, 1,0 % de peptone, 0,7 % d'extrait de viande, 0,3 % de NaCl, 0,1 % de CoC12, 6H20, dans un fermenteur- jarre de 30 l,et, après stérilisation à 120 C pendant minutes, on'le refroidit et on lui inocule 600 ml de la solution de culture ci-dessus. On effectue la culture à 240 tours/min, à 28 C, pendant 24 heures. Apres la culture, on centrifuge les cellules pour obtenir 400 g d'enzyme brute. Cette enzyme brute (cellules obtenues par centrifugation) a une activité enzymatique de 12.000 unités/g. On ajoute 6,7 1 d'eau à 10 kg de saccharose pour les dissoudre, et, après avoir ajusté le pH à 6,0, on y ajoute l'enzyme à raison de 30 unités /g de saccharose, et on effectue la réaction de transfert à 60 C pendant 48 heures. Lorsque la réaction de trans- fert est terminée, on chauffe le mélange réactionnel à 100 C pendant 15 minutes pour désactiver l'enzyme, après quoi on ajoute du carbone activé dans la proportion de 0,5 %- par rapport aux solides pour le décolorer. On élimine le carbone active, puis on traite la solution par les résines échangeuses d'ions Amberlite-120B et Amberlite IRA-411, et on la concentre à 75 % P/P. On 24 2484791 obtient 11 kg d'un édulcorant peu cariogène. L'édulcorant ainsi obtenu présente la compo- sition suivante: fructose 0,8 %, glucose 31,5 %, saccharose 11,0 %, GF2 24,6 %, GF3 25,1 %, GF4 7,0 %. REVENDICATION Procédé de préparation d'un édulcorant conte- nant du sorbitol et du mannitol, caractérisé en ce qu'on fait réagir du saccharose en présence de fructosyl trans- férase pour obtenir une solution de sucres contenant du glucose, du fructose, du saccharose et des oligosacchari- des dans lesquels 1 à 4 molécules de fructose sont liées à du saccharose, et en ce qu'on soumet cette solution de sucres à une réduction catalytique tout en maintenant le pH de la solution entre 7 et 9.