Brevet FR2476677A1 — publié le 19810828

La présente invention concerne la mesure de peroxydes de lipides, en utilisant un réactif de mesure contenant de la peroxydase et un donneur d'hydrogène. Les peroxydes de lipides comprennent les peroxydes de lipides c;nprenant ceux des acides gras. Des problèmes se sont posés récemment au sujet de leurs toxicités, concernant particulièrement le vieillissement, l'athérosclérose, leurs caractères cancérigènes, etc... Il est donc très important de pouvoir mesurer facilement et précisément la quantité de peroxydes de lipides dans les aliments, comme les aliments instantanés, la margarine, le beurre, etc..., et dans les fluides du corps, comme le sérum, l'urine, etc..., du point de vue de la sécurité des aliments, et de la prophylaxie, du diagnostic et du traitement des maladies. Comme procédé de mesure des peroxydes de lipides, on disposait jusqu'à présent de la méthode de Wheeler, de la méthode au thiocyanate de fer, de la méthode à l'acide thio- barbiturique, etc... Ces méthodes ont leurs propres avantages et inconvénients et ne permettent pasd'arriver de façon satis- faisante auxbutsmentionnésprécédemment. La méthode de Wheeler [D.H. Wheeler - Oil and Soap, 9, 89-97 (1932)] est celle dans laquelle on fait réagir le peroxyde de lipide avec de l'iodure de potassium pour libérer de l'iode que l'on titre ensuite par une solution étalon de thiosulfate de sodium. Les incon- vénients de cette mesure résident dans la grande quantité de chloroforme et d'acide acétique qu'il faut utiliser comme solvant organique, dans la quantité importante de réactifs assez coûteux, comme l'iodure de potassium, qu'il faut utiliser, dans la quantité d'échantillon, pouvant aller jusqu'à 5 à 10 g, qui est nécessaire dans le cas d'un échantil- lon ayant une faible teneur en peroxyde, dans l'opération complexe due au titrage et dans la sensibilité inférieure à celle des autres méthodes. La méthode au thiocyanate de fer [C.M. Stine, H.A. Harland, S.T. Caulter and R. Jeness J. Dairy Sci., 37, 202 (1954)], est celle dans laquelle on ajoute à du peroxyde de lipide du thiocyanate d'ammonium et du chlorure ferreux, et on détermine par colorimétrie l'intensité de la couleur bleue provenant du thiocyanate de fer résultant. Bien que la sensibilité de mesure soit appré- ciable, cette méthode a les inconvénients que la colorimétrie doit être effectuée juste 3 minutes après, car la couleur a tendance à disparaître rapidement, et une précision quelque peu inférieure, l'opération nécessitant un bon entraînement et en ce que du temps et du travail sont nécessaires pour déterminer le rapport de dilution dû à l'intervalle de mesure étroit, etc...La méthode à l'acide thiobarbiturique [A.L. Tappel and H. Zalkin; Arch. Biochem. Biophys., 80, 326 (1959)] est celle dans laquelle on chauffe le peroxyde de lipide dans les conditions acides et on condense le malonodialdéhyde résultant avec de l'acide thiobarbiturique pour former un colorant rouge, que l'on détermine ensuite par calorimétrie. Bien que la sensibilité soit excellente, les inconvénients de cette méthode sont, entre autres, que l'échantillon contenant un aldéhyde autre que le malono- dialdéhyde, du glucose, etc..., ne donne pas de valeur précise car il se colore également à un certain degré, que l'iniervalle de mesure de cette méthode est étroit et que les peroxydes qui ne fournissent pas du malonodialdéhyde dans les conditions acides ne peuvent pas être mesurés selon cette méthode. Récemment, on a utilisé dans le but d'un diagnostic clinique et dans des buts similaires, diverses mesures enzymatiques dans lesquelles divers constituants de l'échantil- lon, y compris les fluides corporels, sont mesurés de façon simple et précise, en utilisant la spécificité de l'enzyme. Dans les analyses chimiques utilisées préalablement, si le composé recherché dans un échantillon contenant un certain nombre de composés analogues doit être mesuré exclusivement, le composé recherché doit être à l'avance séparé et extrait des autres constituants autant que possible avant l'analyse. Par ailleurs, une valeur précise ne peut pas être obtenue, et la majeure partie du travail, le pré-traitement gênant et la durée et le coût nécessaires à ce procédé ont été nécessités pour cela. Dans la méthode enzymatique utilisant la spécificité de l'enzyme comme mentionné précédemment, une mesure directe du composé recherché, sans séparation des autres composés analogues, est cependant possible en utilisant une enzyme agissant exclusivement sur le composé recherché avec une spécificité élevée et ayant une pureté élevée. Par exemple, il est devenu possible de mesurer rapidement et précisément l'acide urique, le glucose, les graisses neutres, le cholestérol, la créatine, le peroxyde d'hydrogène, etc..., en utilisant une méthode enzymatique. Pour le titrage du peroxyde d'hydrogène, on utilise dans la méthode enzymatique de la peroxydase de raifort. Des recherches détaillées ont été effectuées par un certain nombre de chercheurs sur la peroxydase de raifort. Paul et ai ont indiqué que la peroxydasede raifort a une spécificité extrêmement élevée vis-à-vis des substrats, et que les composés soumis à l'action enzymatique de la peroxydase de raifort sont limités à trois types de peroxydes, à savoir le peroxyde d'hydrogène (H [K.G. Paul; The Enzyme 8, 227 (1963)]. En ce qui concerne les peroxydes de lipides, une telle méthode de mesure enzymatique n'a cependant jamais été proposée, car on ne connaissait aucune enzyme pouvant agir sur ces composés. Ainsi, les analyses chimiques mentionnées précédemment étaient inévitablement utilisées pour mesurer les peroxydes de lipides, indépendamment des nombreux inconvénients des méthodes. La demanderesse a effectué des recherches, concernant la sécurité sanitaire des aliments contenant des peroxydes de lipides, sur les matériaux qui permettent de neutraliser la toxicité que contiEnentles aliments par suite de la décom- position du peroxyde de lipide impliqué. Par suite, elle a trouvé que la peroxydase décompose les peroxydes de lipides, au-delà de ce à quoi on pouvait s'attendre, et qu'un tel système réactionnel se colore intensément en fonction de la quantité de peroxyde de lipide, s'il existe dans le système réactionnel un donneur d'hydrogène approprié. En se basant sur ce phénomène, la demanderesse a mis au point la présente invention, qui consiste en un réactif de mesure des peroxydes de lipides. La présente invention concerne donc le réactif de mesure des peroxydes de lipides, o le réactif de mesure utilisé pour la mesure des peroxydes de lipides contient de la peroxydase et un donneur d'hydrogène. Dans les dessins annexés,la figure 1 est un graphique montrant la relation proportionnelle entre la quantité de peroxyde de linoléate de méthyle (en micromoles, en abscisses) et l'extinction de l'absorption à 565 nm (en ordonnées), et la figure 2 est un graphique montrant la corrélation entre l'analyse d'un peroxyde de lipide de sérum humain en utilisant la méthode de la présente invention (moles par millilitre en abscisses) et le dispositif d'analyse disponible dans le commerce par la méthode à l'acide thiobarbiturique (n moles/ml, en ordonnées). La peroxydase utilisée dans la présente invention peut être de préférence une quelconque peroxydase disponible dans le commerce et provenant du raifort, qui n'est pas inférieure à une unité (lu ci-après) par essai généralement, et est de préférence 1,5 à 5 unités. Le donneur d'hydrogène utilisé dans la présente invention est l'un quelconque de différents composés oxydables, qui peuvent de préférence donner une couleur, une fluorescence ou une luminescence par oxydation. On peut utiliser les réactifs colorants, fluorescents ou lumineux classiques. Comme réactifs colorants, on peut citer divers composés bien connus, par exemple, le gualacol, la 4-aminoantipyrine avec le phénol, la 4aminoantipyrine avec la N,N-diméthylaniline, la 3-méthyl-2benzothiazolinone avec la diméthylaniline, l'ortho-dianisidine, etc... Comme réactifs fluorescents, on peut citer l'acide homovanillique, l'acide p-hydroxy- phénylacétique, etc... Comme réactifs lumineux, on peut citer le luminol, etc... Ces réactifs sont mentionnés ici à titre d'exempleet non à titre limitatif, des donneurs d'hydrogène de la présente invention. La quantité de donneur d'hydrogène à utiliser doit être au moins équimolaire, de préférence non inférieure à 2 moles, par mole de peroxyde de lipide contenue dans l'échantillon d'essai, et peut varier selon la quantité de l'échantillon et la teneur en peroxyde de lipides dans l'échantillon. Dans la réaction selon la présente invention, on utilise un milieu de réaction approprié, comme une solution tampon de glutarate de diméthyle/hydroxyde de sodium, une solution tampon de phosphate, une solution tampon Tris-acide chlor- hydrique, et diverses autres solutions tampons que l'on utilise de façon générale. Le pH doit être choisi de façon à obtenir le but recherché, entre 5 et 9. Par exemple, on prépare unnécebsairede mesure (3 ml) qui est composé d'une solution tampon glutarate de diméthyl/ hydroxyde de sodium 50 ml (pH 6,0) contenant 0,03 % (poids/ volume) de 4-aminoantipyrine, 0,04 % (volume/volume) de N,N-diméthylaniline, et 4,5 unités de peroxydase. A titre d'exemple de la mesure, on chauffe préalablement le réactif jusqu'à la température de 370C puis on l'ajoute à 50 microlitres d'un échantillon d'essai contenant un peroxyde de lipide. On fait incuber le mélange à la température de 370C pendant minutes puis on mesure la profondeur de la couleur formée, en utilisant un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 565 nm, par exemple. On calcule la quantité de peroxyde de lipide dans l'échantillon à partir de la valeur d'extinction. La réaction selon la présente invention est vraisem- blablement basée sur l'équation suivante: ROOH + AHI2 -) ROH + A + H20 peroxydase o R représente un reste de lipide et AlH2représente un donneur d'hydrogène. Par exemple, l'acide linoléique contenu dans les aliments et autres matériaux donne deux types de peroxydes, à savoir, l'acide 9-hydroperoxy10,12-octadécadiénoique et/ou l'acide 13-hydroperoxy-9,11octadécadiénoîque. Ces peroxydes peuvent être avantageusement mesurés selon la présente invention. Dans la présente invention, on peut faire varier le pHl au moment de la réaction, la durée de la réaction, la longueur d'onde de mesure, etc..., selon le type de réactif utilisé, et l'on peut établir les conditions adéquates selon les cas. On illustrera maintenant la présente invention par référence aux exemples suivants qui ne doivent pas être considérés cependant comme limitatifs. Exemple 1 On prépare un nécessaire de mesure, composé de 3,0 ml d'une solution tampon glutarate de diméthyl/hydroxyde de sodium 50 mM (pH 6,0) contenant 0,03 % (poids/volume) de 4-aminoantipyrine, 0,04 % (volume/volume) de N,N- diméthylaniline et 5,0 unités deperoxydase (de raifort, provenant de chez Sigma Chemical Co., 100 unités/mg). On introduit chaque 3,0 ml du nécessaire de mesure dans des tubes à essai et on les chauffe préalablement jusqu'à la température de 37 C pendant 5 minutes. On ajoute aux tubes à essai 50 microlitres d'une solution d'isopropanol contenant 0 à 4 micromoles/ml de peroxyde de linoléate de méthyle (pureté de 95 %, indice de peroxyde 5850 mg/kg, mesuré par la méthode de Wheeler). On laisse chaque mélange réagir à la température de 37 C pendant 15 minutes, et on mesure la couleur formée à l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 565 nm. Les résultats sont donnés sur la figure 1 qui montre la relation directe entre la quantité de peroxyde de linoléate de méthyle et l'extinction. On peut donc mesurer d'une façon excellente la quantité de peroxyde de linoléate de méthyle. Exemple 2 On prépare un nécessaire de mesure, composé de 3,0 ml d'une solution tampon de phosphate 100 mM (pH 7,0) contenant 0,01 % (poids/volume) d'acide homovanillique et 5,0 unités de peroxyde de raifort. A cette solution de mesure, on ajoute 50 microlitres de sérum humain et on laisse le mélange réagir à la tempé- rature de 37 C pendant 15 minutes. Puis on mesure l'intensité de la fluorescence à l'aide d'un fluorospectrophotomètre Hitachi à une longueur d'onde d'excitation de 315 nm et une longueur d'onde d'émission de 425 nm, pour déterminer la corrélation avec les valeurs mesurées en utilisant un nécessaire du commerce (méthode par l'acide thiobarbiturique; fabriqué par Wako Pure Chemicals Co. Ltd.). On effectue l'essai à blanc par un mode opératoire similaire, mais en utilisant un milieu de réaction d'o la peroxydase a été omise. Les résultats sont indiqués sur la figure 2, qui montre une excellente correlation, pour l'analyse des peroxydes de lipides de sérum humain, entre le nécessaire de la présente invention et le nécessaire disponible dans le commerce. Coefficient de corrélation y = 0,934 y = 0,93x - 0,2 n = 48 REVENDICATIONS 1. Nécessaire de mesure des peroxydes de lipides, caractérisé en ce que le réactif de mesure utilisé pour la mesure des peroxydes de lipides contient de la peroxydase et un donneur d'hydrogène. 2. Nécessaire-selon la revendication 1, caractérisé en ce que la peroxydase est de la peroxydase de raifort. 3. Nécessaire selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le donneur d'hydrogène est un réactif colorant, un réactif fluorescent ou un réactif lumineux.