Brevet FR2479261A1 — publié le 19811002

La présente invention se rapporte généralement à un procédé enzymatique pour la détermination d'acides gras libres, et elle se rapporte plus particulièrement à un procédé pour l'estimation d'acides gras libres en utilisant l'acyl coenzyme A (ci-après acyl-CoA) synthétase et l'acyl-CoA oxydase, o une séquence de réactions mises en cause est accélérée par addition de myokinase, afin de permettre ainsi une détermination rapide et précise des acides gras libres. e1C En général, les procédés de détermination des acides gras libres dépendent de procédés chimiques comme une extraction au solvant organique, qui sont difficiles à manipuler. En conséquence, il y a une forte demande d'un procédé plus simplifié. Récemment, cependant, un procédé enzymatique pour la détermination d'acides gras libres dans le sérum en utilisant l'acyl-CoA synthétase a été développé (voir publication du brevet japonais nO 52-17085). Ce type de détermination est basé sur une séquence de systèmes enzymatiques o l'acyl-CoA synthétase peut agir sur les acides gras libres en présence d'adénosine triphosphate (ci-après ATP) pour donner de l'adénosine monophosphate (ci-après AMP). La formation d'AMP est alors suivie de la production d'acide pyruvique par l'action de myokinase et de pyruvate kinase. La quantité d'acide pyruvique formé est principalement proportionnelle aux quantités des acides gras libres. Comme le sérum contient habituellement des enzymes décomposant ATP, comme des ATPases et des phosphatases, plus ou moins, 1'ATP dans le système de mesure se rompt sous l'action de ces enzymes en adénosine diphosphate (ADP), mesuré sous forme d'acide pyruvique. Une autre réaction apparente dûe à l'acide pyruvique endogène a lieu dans ce procédé. Ces défauts posent un problème parce que la valeur résultante est peu fiable. En_ plus du type ci-dessus mentionné de quantification, les procédés de détermination utilisant d'autres systèmes enzymatiques sont introduits. Dans ces procédés,on mesure l'acyl-CoA formé d'acides gras libres par l'action d'acyl- CoA synthétase comme la production de péroxyde d'hydrogène en utilisant l'acyl-CoA oxydase. Le péroxyde d'hydrogène formé est suivi colorimétriquement par l'action de péroxy- dase 4-aminoantipyrine et de phénol. Le procédé d'un tel type présente un grand avantage parce que l'influence de la réaction apparente est hors de considération, même si des ATPases, des phosphatases et de l'acide pyruvique sont présents dans le sérum. On trouve cependant qu'il y a encore beaucoup à demander du point de vue pratique. Quand l'acyl-CoA synthétase agit sur les acides gras libres en présence d'ATP, l'AMP résultant gêne la formation d'acyl-CoA. Par conséquent, les acides gras libres dans ce sérum ne sont pas totalement convertis en acyl-CoA. Même si une quantité donnée d'acyl-CoA oxydase est alors forcée à agir sur l'acyl-CoA pour donner du péroxyde d'hydrogène, les aciaes gras libres du sérum ne sont pas totalement convertis en péroxyde d'hydrogène; par consé- quent la mesure obtenue des acides gras est inférieure à la valeur réelle. Pour éliminer ce défaut d à un faible taux de réaction, il faut soit appliquer une plus forte concentra- tion d'acyl-CoA synthétase ou avoir une durée de mesure considérable. Une telle opération supplémentaire nuit à la valeur commercialeda procédé. Par suite de recherches intensives effectuées afin de remédier à ces défauts, les présents inventeurs ont trouvé qu'une séquence de réactions mises en cause pouvait être favorisée en convertissant AMP formé sous l'actioncelacyl-CoA synthétase en ADP par la myokinase. En introduisant cette conception, c'est-à-dire l'enlèvement de AMP des systèmes réactionnels, il est possible de supprimer les restrictions placées sur la formation d'acyl-CoA par AMP et de forcer la formation d'acyl-CoA jusqu'à un achèvement rapide. Ainsi, la présente invention concerne un procédé pour la détermination d'acides gras libres comprenant unpremier système réactionnel o l'acylCoA synthétase peut agir sur les acides gras libres en présence d'ATP et du coenzyme A pour formerl'acyl-CoA et un deuxième système réactionnel o on laisse agir l'acyl-CoA oxydase sur l'acyl-CoA obtenu dans le premier système pour donner du péroxyde d'hydrogène, caractérisé en ce que l'on ajoute de la myokinasedans le premier système réactionnel pour forcer la réaction à s'achever rapidement, et le péroxyde d'hydrogène résul- tant est soumis à un développement de couleur pour sa quantification en utilisant une colorimétrie. Si l'on fait agir l'acyl-CoA oxydase sur l'acyl-CoA pour permettre la formation rapide de peroxyde d'hydrogène, alors celui-ci se forme proportionnellement par rapport aux acides gras libres. Le peroxyde d'hydrogène résultant est traité avec de la 4-aminoantipyrine et du phénol comme réactifs avec coexistence de péroxydase pour développer une couleur d'o sont déterminées, à leur tour, les quantités réelles des acides gras libres dans le sérum, par colorimétrie. Cela contribue également à une réduction considérable de la durée de la réaction. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaî- tront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant un mode de réalisation de l'invention et dans lesquels: - la figure 1 illustre la relation entre l'activité de l'acyl-CoA synthétase, sur l'axe des abscisses et l'absorbance à 500 nm, sur l'axe des ordonnées, dans un système pour mesurer les acides gras libres selon la présente invention en présence et en l'absence de myokinase; - la figure 2 est un graphique illustrant l'inhibition des réactions imposées par AMP dans le. système de mesure selon la présente invention, le temps étant indiqué en abscisse et l'absorbance à 500 nm en ordonnée; et - la figure 3 montre une courbe standard obtenue dans le système demesure selon l'exemple de lInvention, le palmitate étant indiqué en abscisse et l'absorbance à 500 nm en ordonnée. On peut illustrer comme suit une séquence de réactions enzymatiques selon l'invention: 1) RCOOH + ATP + CoA RCO - CoA + H4P207 + AMP 2) AMP-+ ATP (2) 2ADP 3) RCO - CoA > H202 4) H202 + CH3- = C -NH2 CH -H 0=0 H3 - \ e N o 4-aioti I 4-aminoantipyrine (4) + 0H phénol CH- CH3 f = Y - N\ C = ô N O{ = V = o colorant rouge quinone (1) (2) (3) (4) Acyl-CoA synthétase Myokinase Acyl-CoA oxydase Péroxydase - Dans le procédé pour la détermination des acides gras libres selon la présente invention, qui est très simplifié et tout à fait souhaitable comme on l'a mentionné ci-dessus, on utilise divers enzymes. Par exemple, l'acyl- CoA synthétase peut provenir d'animaux ou de micro- organismes,mais on préfère celle provenant de Pseudomonas aeruginosa IFO 3919 (voir publication du brevet japonais nO 54-151187). Pour la myokinase, on peut utiliser celle ayant pour origine les animaux ou les micro-organismes, mais on4réfère celle des levures et qui est commercialisée par Sigma Chemical Company. L'acyl-CoA oxydase utilisée peut comprendre celle obtenue de sources animales ou de micro-organismes, de préférence celle de Candida tropicalis IAM 4965. Les activités enzymatiques dans le système de mesure selon l'invention sont exprimées en termesd'unités: à 200 milliunités pour l'acyl-CoA synthétase; I à 20 unités pour la myokinase; et 0,5 à 5,0 unités pour l'aoyl- CoA oxydase. La présente invention sera maintenant mieux expliquée en se référant aux essais et à l'exemple qui suivent. Essai 1. Une recherche a été effectuée sur la relation entre la quantité d'acylCoA synthétase et l'absorbance à 500 nm dans des systèmes réactionnels contenant de la myokinase et sans myoklinase. Pour les systèmes réactionnels, on peut se référer à l'exemple ci-après. Les résultats sont illustrés sur la figure 1, et indiquent que l'absorbance à 500 nm et le taux de réaction sont plus élevés, quelle que soit la quantité de l'acyl-CoA synthétase, dans le système contenant de la myokinase (+I4) que dans le système sans myokinase (-MK). Cela est dD au faitquel'AMP formé en laissant l'acyl- CoA synthétase agir sur les acides gras libres en présence d'ATP est converti en ADP du fait de la présence de la myokinase et n'inhibe plus la formation de l'acyl-CoA, avec pour résultat que la quantité de péroxyde d'hydrogène formé en laissant l'acyl-CoA oxydase agir sur l'acyl- CoA obtenu est proportionnelle aux quantités des acides gras libres. Essai 2. Une comparaison a été faite entre les systèmes de mesure (voir l'exemple) o AMP est présent à partir du début et o il n'y a pas de AMP du tout, et une recherche a été entreprise sur l'effet de la myokinase ajoutée à mi- chemin du système de mesure, o une quantité donnée de AMP est ajoutée à partir du début en terme de la durée de réaction et l'absorbance à 500 nm A 500). Ces résultats sont illustrés sur la figure 2. Sur le graphique, la courbe 1 indique une première séquence des systèmes réactionnels o une quantité donnée de myokinase, sans ADP, est ajoutée à partir du début; la courbe 2 indique une seconde séquence des systèmes réactionnels o ni AMP ni myokinase n'est ajouté au début, et une quantité donnée de myokinase est incorporée à mi-chemin; la courbe 3 indique une troisième séquence des systèmes réactionnels o une quantité donnée (60 n moles)de AMP, sans myokinase, est présente dès le début, et une quantité donnée de myokinase est ajoutée à mi-chemin; et la courbe 4 indique une quatrième séquence des systèmes réactionnels, modifica- tion de la troisième séquence o on utilise 2100 n moles de AMP. Il est évident, sur la figure 2, qu'une certaine restriction est imposée sur la formation d'acyl-CoA dans le système réactionnel, o AMP est ajouté à partir du début, mais est retiré par la myokinase qui est ajoutée à mi- chemin. Exemple. On a incubé, à 37 C pendant 5 minutes, 0,45 ml d'un miliUeu réactionnel (pH: 8,0) consistant en 9 F molesde tam- pon tris-HC1, 10 à 50 n molesd'acide palmitique, 0,9 u mole d'ATP, 0,2 y mole de MgCl, 0,2 p mole dc'EDTA (acide 2j éthylène diamine tétracétique), 0,34 r mole de CoA, 0,045 mg de Triton X-100, 138 milliunités d'acyl-CoA synthétase et 14 unités de myokinase. Au produit ainsi obtenu, on ajouta alors, 0,15 ml d'un milieu mélangé (pH: 7,4) consistant en 30 molesde tampon au phosphate de potassium (pH: 7,4), 0,006 u mole de flavine adénine dinucléotide (FAD), 0,5 fi mole de 4-aminoantipyrine, 0,36 p mole de phénol, 0,4 p mole de N-éthylmaléimide, 0,2 unité d'acyl-CoA oxydase et 3,0 unités de péroxydase. On incuba encore le liquide résultant à 37 C pendant 10 minutes pour produire une couleur, et on mesura alors à 500 nm par rapport à l'absor- bance, afin de préparer ainsi une courbe standard (figure 3). Ensuite, on traita 0,05 ml de sérum de la même façon qu'on l'a mentionné ci-dessus, afin de préparer ainsi une courbe de travail, permettant de trouver une valeur indiquant les quantités d'acides gras libres contenues. Bien entendu l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et représenté qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre de la protection comme revendiquée. R E V E N D I C A T I ON Procédé pour la détermination d'acides gras libres du type comprenant un premier système réactionnel o on laisse l'acyl coenzyme A synthétase agir sur les acides gras libresen présence d'adénosine triphosphate et de coenzyme A pour donner de l'acyl coenzyme A et un deuxième système réactionnel o on laisse agir l'acyl coenzyme A oxydase sur l'acyl coenzyme A pour former du peroxyde d'hydrogène, et ensuite on détermine celui-ci, caractérisé en ce que de la myokinase est ajoutée dans le premier système réactionnel pour arriver rapidement à un achèvement de la réaction.