Brevet FR2477719A1 — publié le 19810911

L'invention concerne un appareil d'analyse par réactif, notamment d'analyse immunologique,spFcialement pour rechercher la présence, dans un milieu biologique, d'un antigène ou d'un anticorps particulier, et pour doser l'antigène ou l'anticorps éventuellement présent. L'invention concerne également un dispositif support de réactif utilisable notamment dans ledit appareil d'analyse. Les analyses immunologiques sont maintenant d'utilisation fréquente, que ce soit dans le domaine de la recherche scientifique ou dans celui de la médecine. Plusieurs types d'analyses font appel au marquage de molécules de réactif (anticorps ou antigène) par un isotope permettant, en fin de réaction, de déterminer la présence ou l'absence de l'antigène ou de l'anticorps recherché et la concentration de ce dernier. On a également mis au point des techniques d'analyse immunologique faisant appel à un marquage autre que par un isotope, en raison des risques ou des règlements, par exemple à un marquage par un enzyme dont l'activité est révélée en fin de réaction, notamment sur un substrat chromogène. Ces réactions sont toujours mises en oeuvre sur de très faibles quantités d'échantillons ou de réactifs. Elles font appel à une série d'opérations délicates à effectuer. Par exemple, dans le cas d'un dosage immuno-enzymatique, pour rechercher la présence (ou l'absence) d'un antigène dans un sérum, on doit effectuer - le pipetage d'un échantillon du sérum à analyser; - la mise en contact de l'échantillon avec un matériau support, par exemple une bille support de molécules de l'anticorps spécifique de l'antigène à dépister, puis l'incubatinn; - le lavage pour éliminer les molécules qui ne sont pas fixées sur les molécules du réactif anticorps; - l'addition d'un milieu réactif comportant des molécules de l'anticorps spécifique de l'antigène à dépister et sur lesquelles on a fixé des molécules d'enzyme indicateur; - l'incubation; - le lavage du milieu pour éliminer les molécules encore libres; - l'addition au milieu d'un substrat chromogène spécifique de l'enzyme indicateur;; - l'addition, après la période appropriée par la réalisation de la réaction enzymatique, d'un agent propre à stopper la réaction enzymatique et la stabiliser; - la lecture spectrophotométrique. Jusqu'à présent, dans ces réactions, toutes les opérations de transfert de liquide, de lavage, de séchage éventuel, etc.. sont réalisées manuellement, ce qui est une cause d'erreurs. C'est un but de l'invention de fournir un appareil qui supprime la nécessité de telles interventions nanuelles. On a déjà proposé, en biologie clinique, un appareil dans lequel un transfert de liquide entre une celluleréservoir et une cellule de réaction a lieu par l'action de la force centrifuge. Ce mode de transfert est utilisé pour l'alimentation d'une multiplicité de cellules de réaction à partir d'une multiplicité de cellules-réservoirs dont chacune contient une quantité prédéterminée de liquide. L'appareil selon l'invention, du type à plateau centrifuge, comportant à sa périphérie des cellules de réactinn, est caractérisé en ce que chaque cellule de réaction, portée à l'extrémité d'un bras, peut être par sa partie supérieure chargée en un liquide de réaction et présente sur sa paroi éloignée du centre de rotation un orifice, de sorte que par simple mise en rotation du plateau il est possible, après un temps convenable de réaction, d'expulser le liquide de réaction par la simple action de la force centrifuge. Selon une caractéristique de l'invention, lesdites cellules sont disposées à l'extrémité de bras radiaux les réunissant mécaniquement à un réservoir central, la communication hydraulique entre chacune desdites cellules et ledit réservoir central étant fournie par un tube de sorte qu'en l'absence de rotation, aucun liquide contenu dans le réservoir ne parvient à la cellule de réaction tandis que,par mise en rotation de l'ensemble, le liquide de réaction parvient simultanément auxdites cellules, puis, dans une phase ultérieure, est expulsé desdites cellules par lesdits orifices. Sous un autre aspect, l'invention vise un dispositif de support de réactif. On a déjà proposé d'utiliser comme support de réactif desbilles,d'ailleurs de petite dimension, en matière plastique,sur lesquelles on fixe des molécules d'anticorps ou d'antigène. Pour la recherche d'un antigène déterminé parmi une multiplicité d'antigènes susceptibles d'être présents dans un liquide biologique, il est nécessaire de disposer de types de billes aussi nombreux que le nombre des antigènes qui doivent être recherchés. D'autre part, après utilisation de billes portant des molécules d'un anticorps déterminé, il n'est plus possible de réutiliser lesdites billes, même si elles n'ont pas révélé l'antigène correspondant aux molécules de l'anticorps qu'elles portent. On sait d'autre part que les molécules d'anticorps peuvent se fixer sur un matériau autre que la matière plastique des billes, par exemple du papier. L'invention a pour objet un dispositif de support de réactif qui combine les qualités propres aux billes et les qualités propres au papier. Le dispositif de support de réactif selon l'invention a un corps en matière plastique qui présente dans sa masse des cavités susceptibles de communiquer avec l'extérieur, lesdites cavités étant propres à recevoir un support de réactif proprement dit, par exemple en papier. On profite alors de la résistance mécanique conférée par le corps du dispositif, les chocs ou contraintes auxquels ce dernier est soumis n'atteignant pas le support proprement dit de réactif, à savoir la feuille de papier. D'autre part, le même corps en matière plastique peut, après avoir été débarrassé des feuilles de papier constituant les supports de réactifs, et lavé, être utilisé pour une autre analyse. Suivant une forme de réalisation, un dispositif de support de réactif est un corps creux, constitué en deux ou un plus grand nombre de parties facilement assemblables et désassemblables, présentant des orifices de communication entre l'intérieur du corps creux et l'extérieur, les supports de réactif, par exemple des bandes de papier, étant mis en place dans une ou plusieurs des diverses parties du corps creux, lesquelles sont ensuite assemblées. Les perforations prévues dans le corps creux permettent l'irrigation de l'intérieur du corps creux et l'évacuation du liquide par exemple sous l'action de la - force centrifuge. L'invention est décrite ci-après en référence aux dessins annexés, dans lesquels - la figure 1 est une vue schématique de dessus d'un appareil d'analyse selon l'invention; - la figure 2 est une vue de dessus, à plus grande échelle, et partiellement en arraché, d'un secteur de l'appareil selon la figure 1; - la figure 3 est une vue en coupe selon la ligne III-III de la figure 2, l'appareil se trouvant dans une première phase de fonctionnement; - la figure 4 est une vue analogue à la figure 3, mais pour une autre phase de fonctionnement; - la figure 5 est une vue en coupe selon la ligne V-V de la figure 3; et - la figure 6 est une vue partiellement en coupe d'une bille support de réactif selon l'invention. L'appareil selon l'invention (figures 1 à 4) se présente sous la forme d'un plateau circulaire rotatif 10 comportant essentiellement trois parties, à savoir un réservoir cylindrique central 11, une couronne médiane 12 et une couronne périphérique 13. Le plateau est destiné à être posé, par le fond 11' du réservoir 11, dans un logement correspondant d'une centrifugeuse, d'une machine d'entraînement à rotation pas à pas du plateau, ou encore d'un incubateur à thermostat. De telles machines sont connues et ne seront pas décrites ici plus en détail. Dans la couronne périphérique 13 sont formées une multiplicité de cellules de réaction individuelles 14 : c'est dans ces cellules que vont être réalisées toutes les phases de la réaction d'analyse, à savoir les phases d'incubation d'un réactif approprié et de l'échantillon à analyser, de lavage du milieu réactionnel, éventuellement de séchage, d'analyse spectrophotométrique, isotopique ou autre. Dans la couronne médiane 12 sont ménagés une pluralité de forages radiaux 151, 152, 153 ... en nombre correspondant à celui des cellules de réaction 141, 142, 1431 chaque forage 15 reliant une des cellules 14 au réservoir central 11 (figure 2). On peut également prévoir une multiplicité de bras radiaux tubulaires, séparés les uns des autres, et reliant chacun une cellule de réaction 14 au réservoir central. Chaque cellule de réaction 14 comprend une chambre supérieure 16 constituant la chambre de réaction proprement dite et une chambre inférieure 17 dans laquelle est effectuée l'analyse proprement dite par mesure spectrophotométrique ou isotopique suivant la nature de l'indicateur utilisé, ou par toute autre méthode appropriée. L'appareil d'analyse de l'invention est utilisé avec des billes "réactifs" 18 (figures 3 et 4) qui, dans le cas d'un dosage immuno-enzymatique, portent sur leur surface des molécules de l'anticorps spécifique de l'antigène à dépister. Les billes, à surface lisse ou à infractuosités, sont en un matériau plastique ou non, par exemple en polystyrene, polyacrylamide, dextran poTmerisé. Les chambres sont en un matériau plastique non mouillable et inerte à l'égard des liquides de réaction avec lesquels elles seront en contact. La chambre supérieure 16 de chaque cellule de réaction 14 présente avantageusement la forme d'une pyramide tronquée au sommet de laquelle se raccorde la chambre inférieure 17 de forme parallélépipédique.A la jonction des chambres supérieure 16 et inférieure 17 sont fixés des ergots ou colonnettes 19, par exemple au nombre de quatre 191, 192, 193, 194, disposés en oblique vers le haut à l'intérieur de la cellule de façon qu'une bille 18 soit retenue par les sommets desdites colonnettes à une distance d du fond 20 de la chambre inférieure 17. Dans la paroi supérieure ou couvercle 21 de chacune des cellules de réaction 14 est ménagé un trou 22 pour l':introduction d'une quantité appropriée de réactif liquide ou d'échantillon à analyser, prélevée et déversée dans la cellule 14 par une pipette 23 d'un distributeur automatique (non représenté). Les forages radiaux 15 sont destinés au transport d'un liquide de lavage depuis le réservoir central 11 jusqu'à chacune des cellules de réaction 14 sous l'effet de la force centrifuge engendrée lors d'une rotation du plateau 10 autour de son axe vertical. A cet effet, le diamètre de chacun destrages radiaux est tel que, d'une part, lorsque l'appareil d'analyse est immobile, le liquide de lavage contenu éventuellement dans le réservoir 11 ne se déverse pas à l'intérieur des cellules de réaction et que, d'autre part, lorsque le plateau est entraîné en rotatinn, le liquide de lavage s'échappe suivant un jet 24 (figure 4) qui exerce une action de lavage sur la bille 18.Par ailleurs, l'emplacement du débouché de chacun des forages radiaux 15 dans la cellule de réaction associée 14 est choisi de façon que, lors d'une =entrifugation a vitesse usuelle moyenne, laquelle correspond, par exemple, à 1500 g (g étant l'accélération due à la pesanteur), le liquide de lavage projeté dans la cellule suive à l'intérieur de celle-ci un trajet tel qu'il entraîne la bille 18 en rotation surelle-m8me comme indiqué par la flèche f sur la figure 4. Entre le bord supérieur de la paroi latérale périphérique 25 d'une cellule 14 et le bord externe du couvercle 21 de la cellule, est ménagé un orifice 26 éventuellement obturé par des moyens analogues à ceux assurant la séparation de la chambre inférieure 17 de la chambre inférieure 16, par exemple par une pluralité d'ergots ou colonnettes 27. L'orifice 26 est disposé pour empêcher que la bille 18, qui, sous l'effet d'une force centrifuge, remonte le long de la paroi latérale 2-5 de la cellule jusqu'à son bord supérieur , s'échappe de la cellule. C'est par cet orifice 26 que le liquide de lavage introduit ins la cellule sous l'action de la force centrifuge engendrée par une mise en rotation du plateau, est évacué de la cellule après avoir exercé sa fonction de lavage sur la bille 18. L'orifice d'évacuation 26, de même que l'orifice de communication entre la chambre supérieure 16 et la chambre inférieure 17 de la cellule,peut être obturé par un tamis, un filtre, une membrane ou tout autre moyen analogue. Un tel système d'obturation est en particulier nécessaire dans le cas où on utiliserait comme support de réactif, non pas une bille macroscopique telle que la bille 18 représentée sur le dessin, mais, comme il est courant dans des réactions d'analyses immunologiques, des billes microscopiques. Les forages radiaux 15 peuvent aussi être utilisés pour l'insufflation d'un courant d'air de séchage dans les cellules 14. L'appareil d'analyse peut être réalisé par moulage du plateau en deux parties (supérieure et inférieure) solidarisées l'une à l'autre après moulage. Dans une variante, les cellules de réaction disposées en couronne les unes à côté des autres suivant leurs faces latérales, constituent un anneau séparable de la partie centrale de l'appareil constituée par la couronne 12 et le réservoir 11 de liquide de lavage. Les cellules peuvent être reliées à articulation les unes aux autres au moyen d'une baguette en saillie ménagée sur une premiere arête verticale de la face périphérique interne d'une cellule et propre à être introduite dans une cheminée correspondante ménagée sur la deuxième arête verticale interne de la cellule adjacente. La face périphérique interne -ou dos- de chaque cellule présente un trou pour le passage du liquide de lavage. On peut prévoir sur les tubes radiaux 15 un élément en saillie tubulaire par lequel sont montées les cellules dans leur conformation en couronne. On peut ainsi, à l'aide de compartiments ou cellules identiques, constituer des couronnes de diamètre différent. De plus, les cellules peuvent être préparées à l'avance, en nombre adéquat, suivant les divers réactifs souhaités. Dans le cas d'une analyse immuno-enzymatique par la méthode immunométrique, l'appareil selon l'invention est mis en oeuvre de la façon suivante On utilise un appareil dans lequel chaque cellule de réaction 14 comporte une bille 18 sur laquelle sont fixées des molécules de l'anticorps spécifique de l'antigène à dépister. On introduit alors dans les cellules, par la pipette 23, et en faisant tourner pas à pas le plateau 10 pour amener chaque cellule successivement sous la pipette, un volume déterminé de l'échantillon de sérum à analyser et on laisse incuber le milieu réactionnel contenu dans chaque cellule à la température appropriée. Quand la période d'incubation s'est écoulée, on procède à une centrifugation : le liquide réactionnel contenu dans la cuve s'échappe par les orifices 26 et un jet de liquide de lavage provenant du réservoir lu par l'intermédiaire des forages radiaux 15 est introduit en permanence dans les cellules 14 puis évacué par les orifices 26. Après arrêt du plateau, on ajoute dans chaque cellule, au cours d'un déplacement pas à pas du plateau, une quantité appropriée de réactif contenant des molécules d'anticorps spécifique de l'antigène à dépister et sur lesquelles sont fixées des molécules d'enzyme indicateur. Après écoulement de la période d'incubation, on entraîne à nouveau en rotation le plateau 10 pour une phase de lavage. Après arrêt du plateau, on introduit dans chaque cellule une quantité appropriée de substrat chromogène spécifique de l'enzyme indicateur et on laisse la réaction se poursuivre pendant un temps suffisant pour la réaction enzymatique. Après une période correspondant à l'achèvement et la stabilisation de la réaction enzymatique, on envoie vers la chambre inférieure 17 de chaque cellule 14 dans laquelle s'est rassemblé le substrat chromogène, et suivant la direction de la flèche P indiquée sur la figure 4, le faisceau lumineux d'un spectrophotomètre-permettant d'observer le résultat, positif ou négatif, de la réaction et/ou de la quantifier. La cellule de réaction est réalisée en une matière plastique inerte vis-à-vis des réactifs et échantillons de la réaction d'analyse et, de plus, non mouillable. En outre, la chambre inférieure 17 doit être réalisee en un matériau plastique optique transparent vis-à-vis de la lumière : UV, visible, ou fluorescente, si les résultats sont exploités par lecture spectrophotométrique. L'invention propose un dispositif de support de réactif dont une réalisation est représentée sur la figure 6. I1 s'agit d'une bille qui est réalisée en matériau plastique hydrophobe, comportant deux demi-sphères creuses 31 et 32, la demi-sphère 31 présentant une collerette interne 33 sur la périphérie de laquelle est formé un bourrelet d'encliquetage 34 destiné à coopérer avec une rainure d'encliquetage correspondante 35 ménagée dans la paroi interne de la demi-sphère 32 (fig.6).Chacune des demi-sphères 31 et 32 est percée d'une multiplicité de trous 36 constituant des moyens de communication hydraulique entre l'intérieur et l'extérieur de la bille. A l'intérieur de la bille creuse 30 est placé un support en papier 37 de forme quelconque (disque, rectangle, hexagone, etc.) sur lequel sont fixées de manière connue des molécules de l'anticorps ou de l'antigène réactif spécifique de la réaction d'analyse à effectuer. Le support réactif 37 étant introduit à l'intérieur d'une des demi-sphères de la bille 30, on ferme la bille en faisant coopérer par encliquetage les deux demi-sphères 31 et 32. Le diamètre de la bille selon l'invention est de préférence de l'ordre de 8 mm. Dans ce cas, on utilise un disque de papier présent un diamètre de 4 à 5 mm. Lorsque la bille est utilisée avec l'appareil d'analyse suivant l'invention, le disque de papier placé en son intérieur doit pouvoir entrer en contact avec tout liquide réactionnel, que ce soit un liquide réactif ou l'échantillon à analyser, ou encore un liquide de lavage. On choisit à cet effet pour les trous 36 une dimension telle qu'il ne se produise, d'une part, aucun phénomène de tension superficielle empêchant le liquide de pénétrer à l'intérieur de la bille et que, par ailleurs, sous l'effet d'une rotation du plateau à vitesse élevée, lors d'une centrifugation par exemple, tout liquide ayant pénétré à l'intérieur de la bille puisse s'en échapper. L'appareil d'analyse selon l'invention peut être préparé de façon que toutes les cellules de réaction 14 comportent une macrobille 18 identique, ou plusieurs mi~robilles identiques, c'est-à-dire portant comme réactif le même anticorps ou antigène. Dans ce cas, l'appareil permet de réaliser la même réaction d'analyse surine multiplicité d'échantillons, un échantillon différent pouvant être placé dans chaque cellule de réaction 14. L'appareil d'analyse selon l'inventinn peut également être préparé de façon que les cellules deréaction 14 soient réparties en plusieurs groupes, les cellules de chacun des groupes comportant toutes une bille présentant le même anticorps ou antigène réactif,un anticorps ou antigène différent étant choisi por chaque groupe. Ceci permet d'utiliser l'appareil pour plusieurs analyses immunologiques différentes, ce qui peut être très avantageux pour un laboratoire qui n'aurait pas de façon courante un nombre important d'analyses identiques à mettre en oeuvre. Au lieu d'utiliser comme support de réactif une seule bille macroscopique 18, ou une pluralité de billes microscopiques, l'invention prévoit d'utiliser la paroi même de la chambre inférieure 17 de la cellule de réaction 14. A cet effet, le matériau constitutif de la chambre inférieure 17 est alors tel que, d'une part, on peut y fixer par tout moyen approprié des molécules d'anticorps ou antigène et, d'autre part, il permette la lecture du résultat de la réaction par la mesure choisie, par exemple par spectrophotométrie. On peut prévoir une liaison amovible de la chambre inférieure 17 à la chambre supérieure 16 de chacune des cellules de réaction 14. L'appareil selon l'invention peut être utilisé pour tous les dosages immuno-enzymatiques selon lesquels le résultat de l'analyse est exploité par une mesure spectrophotométrique ou autre. I1 peut également être utilisé pour la mise en oeuvre de dosages radio-immunologiques, le résultat de l'analyse étant alors exploité pour les mesures isotopiques correspondantes. REVENDICATIONS 1. Appareil d'analyse pour la mise en oeuvre de tout procédé faisant appel à des contacts entre un solide et liquide, notamment pour des réactions de nature immunologique, l'appareil étant du type à plateau centrifuge comprenant à sa périphérie des cellules de réaction, caractérisé en ce que chaque cellule de réaction peut être par sa partie supérieure chargée en un liquide de réaction et présente sur sa paroi éloignée du centre de rotation un orifice de sorte que par simple mise en rotatinn du plateau, il est possible, après un temps convenable de réaction, d'expulser le liquide réactionnel sous la simple action de la force centrifuge. 2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules sont disposées à l'extrémité de bras radiaux les réunissant mécaniquement à un réservoir central, la communication hydraulique entre chacune desdites cellules et ledit réservoir central étant fournie par un tube foré dans le bras associé de sorte qu'en l'absence de rotation aucun liquide contenu dans le réservoir ne parvient à la cellule de réaction tandis que, par mise en rotation de l'ensemble, le liquide de réaction parvient simultanément auxdites cellules puis est expulsé de ces dernières par lesdits orifices. 3. Appareil selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'emplacement du débouché de chaque tube radial dans la cellule de réaction associée est choisi de façon que, lors d'une centrifugation, le réservoir central deverse un liquide, avantageusement de lavage, qui est projeté dans la cellule suivant un trajet assurant une action de lavage sur chacune des faces d'un support solide de réactif contenu dans la cellule. 4. Appareil d'analyse suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque cellule comporte une chambre supérieure et une chambre inférieure communiquant entre elles par un orifice laissant passer le liquide réactionnel mais comportant des moyens maintenant dans la chambre supérieure tout solide utilisé comme réactif ou support de réactif. 5. Appareil d'analyse suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la chambre supérieure présente la forme d'une pyramide tronquée au sommet de laquelle se raccorde la chambre inférieure de forme parallélépipédique. 6. Appareil d'analyse suivant la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que la chambre supérieure et la chambre inférieure de chaque cellule sont séparables l'une de l'autre. 7. Appareil d'analyse suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules de réaction forment un anneau indépendant pouvant être facilement assemblé et désassemblé du reste de l'appareil. 8. Appareil d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque cellule de réaction contient un support solide de réactif sur lequel est fixé le même réactif. 9. Appareil d'analyse selon l'une quelconque des revendications l à 8, caractérisé en ce que les.cellules de réaction sont réparties en plusieurs groupes, les cellules de chacun des groupes comportant toutes un support de réactif sur lequel est fixé le même réactif, un réactif différent étant choisi pour chaque groupe de cellules. 10. Appareil d'analyse selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que le support solide de réactif contenu dans chaque cellule est une macrobille ou une multiplicité de microbilles dont la surface peut être lisse ou à infractuosités. 11. Appareil d'analyse selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que le support solide de réactif est constitué par la paroi de la chambre inférieure de chacune des cellules de réaction. 12. Dispositif de support de réactif propre à être utilisé dans toute réaction, notamment de nature immunologique, faisant appel à des contacts entre le support solide et un liquide, par exemple par l'action de la force centrifuge, caractérisé en ce qu'il comprend un corps en matière plastique qui présente dans sa masse des cavités susceptibles de communiquer avec l'extérieur et propres à recevoir un support de réactif proprement dit,par exemple en papier. 13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que le corps creux est constitué en deux ou en un plus grand nombre de parties facilement assemblables et désassemblables, présentant des orifices de communication entre l'intérieur du corps et l'extérieur, les supports de réactif,par exemple des bandes de papier, étant mis en place dans une ou plusieurs des diverses parties du corps creux, lesquelles sont ensuite assemblées. 14. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que le corps est une bille creuse formée de deux demi-sphères emboitables l'une dans l'autre, une des demisphères comportant, faisant saillie de son bord périphérique, une collerette sur laquelle sont formées des saillies d'encliquetage destinées à coopérer avec des encoches correspondantes ménagées dans la paroi interne de l'autre demi-sphère. 15. Dispositif selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que la dimension des orifices est telle que, quand le dispositif est placé dans un récipient dans lequel est versé ou projeté un liquide, aucun phénomène de tension superficielle n'empêche le liquide de pénétrer à l'intérieur du dispositif, d'une part, et, d'autre part, de façon que, sous l'effet d'une centrifugation par rotation du récipient autour d'un axe vertical, tout liquide ayant pénétré à l'intérieur du dispositif puisse s'en échapper.