Brevet FR2484643A1 — publié le 19811218

La présente invention se rapporte généralement à la préparation de couches ou frottis de sang sur des lamelles de microscope ou substrats semblables, Tendis qu' on peut l'appliquer à toutes les techniques pour l'évaluation des frottis résultants, le procédé est particulièrement adapté à une utilisation en connexion avec une analyse automatisée des globules du sang en utilisant des systèmes de reconnaissance à motif de calculateur, couramment connus sous le nom d'analyseurs différentiels automatisés. Des monocouches de cellules ou globules ont été préparées par un certain nombre de techniques, par exemple par coincement, c'est-à-dire '"pousser les frottis",par des techniques de couvre-objet et plus récemment par centrifugation. Les avantages majeurs de la technique de centrifugation sont le recouvrement uniforme d'au moins une partie majeure d'une surface de 2,5 cm sur 8 cm d'une lamelle de microscope et la bonne analyse de la morphologie des globules que l'on peut obtenir, En particulier pour des analyseurs différentits automatisés, ces avantages ont rendu les frottis centrifugés très attrayants. La quantité du sang entier qu'il faut pour ces frottis centrifugés est comprise entre 100 et 200 micerolitres par lamelle, selon la densité des globules par quantité d'échantillon liquide considéréeappropriée, l'utilisation de sang entier ou de sang dilué et également la quantité du sang perdu, par exemple le sang restant sur la paroi des éprouvettes, dans des distributeurs et dans les dilueurso Si moins de fluide est distribué,oe n'obtient qu'un motif irrégulier en forme d'étoile, qui ne couvre qu'une partie de la surface de la lamelle, L'usage le plus fréquent de ces couches ou pellicules de sang est pour les comptes différentiels des globules blancs et pour b détermination de la morphologie des globules rouges. Dans des échantillons de sang normal, il y a environ 600 erythrocytes (globules rouges) pour chaque leucocyte (globule blanc). Par conséquent, afin de trouver un minimum de cent leucocytes pour un compte différentiel, il faut explorer suffisamment de la surface de la lamelle pour couvrir une moyenne de 6 x 104 érythrocytes. Pour trouver ces globules blancs en un temps raisonnable, de l'ordre de 2 minutes au total, on aimemti de façon idéale avoir une pellicule de sang avec des globules très peu espacés mais ne se touchant pas ou ne se chevauchant pas, avec des plaquettes bien définies, peu de globules endommagés, une dimension uniforme et reproductible des globules pour la détermina- tion des degrés de microcytose et macrocytose, une paleur bien développée des globules normaux et un manque d'objets façonnés et de débris. En supposant une-surface de lamelle de 2,5 cm sur 8 cm, du sang normal et une distribution, o en moyenne deux globules rouges sont contenus dans une surface de 16 y sur 16 p, on peut facilement calculer le volume de sang pouvant contenir suffisamment de globules pour former la monocouche ci-dessus décrite. Il faut dans ce but, *20 environ 1,5 pl de sang entier. Si, par ailleurs, on souhaite une couche ou pellicule de sang contenant 1000 globules blancs à partir de sang normal, il faudra seule- ment une surface de 76,8 mm2 constituant, par exemple, un cercle ayant moins de 1 cm de diamètre sur la lamelle. Le volume de sang entier requis pour cela ne sera que de l'ordre de 1, 5/25 = 0,06 pl. Meme si toute la lamelle est couverte, seulement environ 1% du sang utilisé devient une partie de la monocouche, tandis qu'environ 99% est retiré par centrifugation, c'est-à-dire 150 pl contre 1,5 -l. Si l'on peut trouver le procédé approprié de prépara- tion de la lamelle, il est apparent à la lecture de ce qui précède, que des lamelles centrifugées peuvent ttre préparées avec une quantité sensiblement plus faible de sang. La quantité d'échantillon de sang qu'il faut pour préparer une pellicule ou couche devient importante en particulier dans les applications qui suivent: piqCres au doigt; piqfres pédiatriques; nécessité de préparer plusieurs lamelles à partir du même donneur; applications de recherche, en utilisant du sang de petits animaux par exemple; et application de couches centrifugées hors de l'hématologie avec de faibles échantillons nécessaires. Selon un premier aspect de l'invention, on prévoit un procédé de préparation d'un frottis de sang centrifugé sur une lamelle de microscope ou substrat analogue, oû une quantité relativement faible de sang entier ou dilué peut ttre étendue sur -au moins la plus grande partie du substrat. Un liquide de revêtement, par exemple un diluant-, est distribué sur'le substrat et ensuite celui-ci est centrifugé de façon que le liquide de revêtement s'étale en une pellicule liquide mince sur le substrat. Ensuite, le sang entier ou dilué est distribué sur le substrat et le substrat est centrifugé une seconde fois pour étaler le sang sur le substrat et la pellicule liquide mince. Le procédé selon l'invention permet d'étaler une simple quantité de sang sur un substrat donné avec la densité et d'autres paramètres souhaités d'un frottis standard, mais nécessite plus d'un ordre de grandeur moins de sang que la quantité normalement utilisée avec des frottis centrifugés standards. Ce bénéfice provient du fait que très peu de sang est retiré par centrifugation pendant la centrifugation avec le procédé selon l'inven- tion. Ce procédé est extrêmement utile dans les situations précédemment décrites o seul un faible échantillon de sang est disponible pour un examen ou lorsque l'on souhaite n'obtenir que des petits échantillons. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaitront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence au dessin schématique annexé donné uniquement à titre d'exemple illustrant un mode de réalisation de l'invention et dans lequel: - la figure unique montre graphiquement la séquence de centrifugation utilisée pour la mise enoeuvre du procédé selon l'invention, le temps en secondesétant indiqué sur l'axe des abscisses et la vitesse de centri- fugation en t/mn étant indiquée sur l'axe des ordonnées. Une lamelle de microscope est placée sur un porte- lamelle d'un dispositif de centrifugation pour la prépa- ration d'une pellicule de sang, qui peut faire partie d'un système d'analyseur différentiel par exemple tel que révélé dans le brevet U.S. No. 4 016 828 au nom de Maher, Jr et autres. Les lamelles ont typiquement 2,5 cm sur 8 cm. Quand la lamelle est placée dans le porte- lamelle, on distribue au centre de celle-ci, de préfé- rence 200 à 300 pl, par exemple, d'un diluant. Pendant un cycle de centrifugation de mouillage, on fait tourner la lamelle avec pour résultat une couche liquide mince de diluant qui reste sur la lamelle. De préférence, avec un délai minimum, des quantités prédosées de sang et de diluant sont placées sur la lamelle. Pendant un second cycle de tournoiement ou centrifugation, on fait de nouveau tournoyer la lamelle. D'une façon traditionnelle, la lamelle est sortie, on la laisse sécher à l'air, on la fixe, on la teinte et on l'évalue. En se référant à la figure unique, on peut y voir un graphique de lavitesse de centrifugation ou tournoie- ment en fonction du temps, qui démontre la séquence de centrifugation pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus décrit sur le dispositif de centrifugation, tel que le dispositif précédemment mentionné pour la préparation de pellicules-ou couches de sang du brevet U.S. No. 4 016 828. Le diluant pour former la couche mince est distribué sur la lamelle au temps indiqué par le repère 10. Le diluant peutpar exempleEtre une solution saline. Une solution saline appropriée est vendue sous la marque déposée du diluant DIFF3, et contient 9,9 g/i de NaCl afin de produire un équilibre osmotique approprié pour les globules. Bien que l'utilisation d'un diluant soit préférée,d'autres liquides de revêtement peuvent btre utilisés. Pendant le cycle de centrifugation de mouillage, généralement indiqué par le repère 12, le diluant s'étend sur la plus grande partie ou toute la surface de la lamelle pour lui donner sa pellicule liquidemince initiale. Pendant le cycle de centrifugation de mouillage, le dispositif de centrifuga- tion fonctionne, par exemple, à 3500 t/mn, cormme cola est indiqué par le repère 14. Au temps indiqué par le repère 16, le sang ou le sang et le diluant ont été distribués. Deux exemples de prépara- tion de la lamelle pour cette étape du procédé seront le dépôt direct du sang entier, environ 20 pl et le dépût d'un mélange sang/diluant (1:1) provenant d'une pipette capillaire. On a déterminé que la lamelle résultante était encore assez dense dans le premier exemple, et la limite inférieure du procédé peut. tre en dessous de 10 yl de sang pour une lamelle, avec la densité moyenne des globules toujours comparable à une lamelle standard utilisant environ 2001 de sang par lamelle une partie reste dans le dilueur et est rincée subséquemment. De mmev la pipette utilisée peut ttre enduite d'un anti-coagulant ou celuioci peut ttre ajouté au diluant du sang. Le sang et le diluant doivent, dans ce cas, être mélangés, par exemple, 10 F1 de sang et 10 pl de diluant anticoagulé dans une pipette de 20 pl. On dispose de petits aimants en fil, ou d'un mélangeur du type à piston pour mélanger d'une façon traditionnelle. On centrifuge de nouveau la lamelle pendant cycle, généralement indiqué par le repère 18, pendant lequel le dispositif de centrifugation fonctionne par exemple à des vitesses de 3200 à 3500 t/mn pour le sang dilué, comme cela est indiqué par le repère 20o Le dispositif de centri- fugation, vers la fin du cycle 18 fonctionne par exemple à 1000 à 1500 t/mn, comme le montre le repère 22, Au temps indiqué par le repère 24, la lamelle est sortie et le traitement de centrifugation est terminé. On a déterminé qu'il était possible d'obtenir avec environ 10 1J ou moins de sang, une distribution sur la lamelle comparable, par la densité et d'autres paramètres, à un frottis centrifugé standard, mais nécessitant plus d'un ordre de grandeur moins de sang. Des frottis centrifugés de bonne qualité peuvent %tre préparés selon l'invention avec moins de sang que ce qu'il faut pour des frottis calés traditionnels. Il semble également qu'un compte différentiel puisse être fait sur un échantillon de sang d'une valeur aussi faible que. 3 pl, sil n'est pas nécessaire que sensiblement toute la surface de la lamelle soit couverte. Une surface généralement circulaire autour du centre de la lamelle peut ttre couverte, et doit ttre explorée dans ce cas. Le procédé peut également ttre étendu pour incorporer le processus de réticulocyte. Pour la préparation rétique, le sang ne sera pas mélangé au diluant, mais avec la coloration de réticulocyte. Un temps d'incubation de + 1 minutes sera par exemple laissé et ensuite la pellicule de sang préparée d'une façon analogue à celle décrite précédemment. R E V E N D I C A T I ONS 1. Procédé de preparation d'un frottis de sang sur un substrat de microscope, caractérisé en ce qu'on distribue un liquide de revêtement sur ledit substrat on centrifuge ledit substrat de façon que le liquide de revêtement s' étende en une couche relativement mince sur au moins une partie dudit substrat; ensuite on dis- tribue une quantité de sang sur le substrat enduit de liquide; et on centrifuge le substrat une seconde fois afin que le sang s'étale sur une partie du substrat enduit de liquide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape précitée de distribuer le liquide de revêtement consiste à distribuer un diluant du sang. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape précitée de distribuer une certaine quantité de sang consiste à distribuer du sang entier. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape précitée de distribuer une certaine quantité de sang consiste à distribuer du sang dilué. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour pré-conditionner un substrat pour un frottis de sang, caractérisé par les étapes d'appliquer un liquide sans globule de sang au substrat, puis de centrifuger le substrat pour forcer le liquide à s'étaler en une couche relativement mince sur au moins une partie du substrat. 6e Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le liquide précité ne contenant pas de globules rouges est un diluant du sang. 7 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la centifugation précitée dure environ 1 seconde à environ 3500 t/mn.