Brevet FR2481315A1 — publié le 19811030

Procédé pour la fabrication de l'enzyme alpha-galactoxydase et procédé pour l'hydrolyse du raffinose par utilisation de cet enzyme. La présente invention concerne un procédé pour la fabrication de l'enzyme alpha-galactoxydase (E.C.3.2.1.2.2) par la culture des micro-organismes du genre Saccharomyces et qui concerne également l'hydrolyse du raffinose par utilisation de cet enzyme. Le raffinose, un trisaccharide qui se produit en O10 quantités importantes dans les betteraves sucrières, retarde la cristallisation du saccharose et par conséquent les rende- ments d'extraction sont diminués. Ce fait pose un sérieux pro- blème économique pour les sucreries de sorte que l'hydrolyse du raffinose devient une nécessité afin d'améliorer à la fois la qualité et le rendement du procédé de cristallisation du sucre extrait. Beaucoup d'articles décrivent des procédés enzyma- tiques pour hydrolyser le raffinose qui utilisent des enzymes extraites d'un certain nombre d'espèces de micro-organismes du genre Absidia, Aspergillus, Bacillus, Circinella, Escheridtla, Micro- coccus Mortierella, Penicillium, etc. Toutefois, en cultivant un grand nombre de micro- organismes, l'extrait cellulaire contient non seulement l'alphagalactoxydase mais également contient l'invertase, de sorte, que dans le traitement des mélasses de betteraves su- crières, l'hydrolyse du raffinose s'accompagne d'une façon non désirable de l'hydrolyse du saccharose. L'avantage extraordinaire de la présente invention est dé au fait que les micro-organismes choisis par les auteurs de la présente invention, et qui appartiennent au genre Saccharomyces combinent d'une façon heureuse le bénéfice d'une durée de culture nettement réduite par rapport à celle des moisissures avec la propriété de posséder une grande activité enzymatique de l'alpha-galactoxydase mais non l'activité enzymatique de l'invertase. Ces micro-organismes, qui ont été isolés à partir des eaux résiduaires des broyeurs d'olives dans la région de Monterotondo (Rome, Italie) ont été classés sous les noms sui- vants: Saccharomyces cerevisiae, var, bleaceous et Saccha- romyces cerevisiae, var, oleaginosus et ont été dément déposés au Northern Regional certer du US Department of Agriculture, Peoria, Illinois, o ils ont reçu respectivement les désigna- tions NRRL Y 12056 et NRRL Y 12057. Leurs caractéristiques de culture, et leurs proprié- tés morphologiques et physiologiques sont indiquées ci-dessus. A.- Caractéristiques de culture 1. Milieu solide (3 jours): agar et malt Les colonies sont butyreuses, de couleur crème et brillante 2. Milieu liquide (3 jours): extrait de malt. Un dépôt s'est formé (dans le s.cerevisiae, var oleaginosus, on observe un léger anneau). B.- Propriétés morphologiques 1. Caractéristiques des cellules végétatives: Les cellules sont ellipsoidales, cylindriques et quelquefois allongées. 2. Formation de pseudomycélium ou de mycélium vrai: Un pseudomycélium rudimentaire est présent dans des conditions anaérobies. C.- Caractéristiques sexuelles: Les cellules végétatives sont directement transfor- mées en asci qui contiennent de une à quatre spores sphéroldales. D.- Propriétés physiologiques 1. Utilisation des sources de carbone a) Fermentation: S.cerevisiae S.cerevisiae var.o]eaceus var.oleaginosus Glucose 4 + Galactose *- + Maltose + Threalose - Mèlibiose + + Raffinose + b) Assimilation: S.cerevisiae S.cerevisiae var. oleaceus var.oleaginosus Glucose + + Calactose + Maltose + Threalose + + Melibiose + + Raffinose + + D-mannitol + D-glucitol - Ethanol + Glycérol + + Acide lactique DL + Les autres composés carbonés ne sont pas assimilés. 2. Essimilation de composés azotés: Nitrate de potassium: négatif 3. Croissance à 37 C: positive. Pour la classification, le plan décrit par J.P. Van der Walt dans "The Yeasts", 2ème édition, éditeur J. Lodder, a été suivi. Les cultures des souches qui appartiennent à la présente invention peuvent être préparées dans des conditions aérobies par un quelconque des procédés eonnus, par exemple en cultivant en surface, ou de préférence en cultures immergées utilisant des appareils de fermentation équipés d'agitateurs. Un milieu de culture qui peut 9tre solide ou liquide contient une source de carbone assimilable et une source d'azote et de sels minéraux. Comme sources de carbone, on peut utiliser le glucose, le mélibiose, le raffinose et tous les autres sucres, le glycérol et l'acétate de sodium. Comme sources d'azote, on peut utiliser des composés azotés minéraux et des composés azotés organiques tels que extrait de viande, extrait de levure, peptones, triptone, aminoacides, hydrolysats de caséine, farine de soJa et sels ammoniacaux. Un autre avantage dominant provenant de l'utilisa- tion des micro-organismes en question est le fait qu'ils fabriquent l'enzyme quand ils sont cultivés sur le glucose (l'enzyme est le constituant). Un milieu de culture approprié a par exemple la composition suivante: Extrait de levure 5-20 g/l l0 (grammes par litre) Glucose 10 g/l Traces de NaH2P04, MgS04, (NH4)2S04 1 g/l - La gamme du PH pour la culture va de 4 à 7 et est de préférence de 5,0 à 5,5, la température est comprise entre 20 C et 40 C, de préférence entre 250 C et 28 C. La production d'enzyme peut être augmentée par l'addition de petites quantités de mélibiose, qui, comme on le sait, est le disaccharide provenant de l'hydrolyse partielle du raffinose. Le mélibiose peut être ajouté directement au mi- lieu de culture avant l'inoculum, ou quand le stade de croissance logarithmique est terminé. Cette durée d'induction peut varier de 16 heures à 72 heures et de préférence est comprise entre heures et 48 heures. Les cellules recueillies pendant la fermentation ou à la fin de celle-ci peuvent être utilisées telles quelles ou sous forme de poudre sèche. 'D'une autre façon, on peut utiliser les extraits de ces cellules bruts ou purifiés. Pour cela, les cellules sont broyées par un quel- conaue des procédés connus et on utilise l'extrait brut ou purifié contenant l'enzyme. 'Récemment, un autre perfectionnement technique et économique a pu être réalisé en immobilisant l'enzyme par com- binaison avec des composés macromoléculaires, en formant des liaisons chimiques avec la matrice, ou par des liaisons ioniques ou également par immobilisation physique de l'enzyme ou des cellules. Les cellules ainsi obtenues sont ajoutées, telles quelles ou immobilisées, au mélange réactionnel qui contient les mélasses à un PH allant de 4 à 7 et à une température de 30 C à 60 C. Le raffinose contenu dans les mélasses est ainsi hydrolysé en galactose et saccharose, le rendement de celui-ci est ainsi amélioré. La présente invention est illustrée par les exem- ples descriptifs et non limitatifs ci-après. EXEMPLE 1 On prépare un bouillon de culture ayant la composi- tion suivante: (NH4)2S04 5 g/1 MgSO4. 7H20 5 g/ Na lipo,46g/1 Na21P04. 12H20 6/1 KH2PO4 3 g/i NaCl 0, g/1 CaC12 0,05 g/ Extrait de levure 10 g/1 lelibiose 10 g/1 On dissout ces composés dans l'eau désionisée et on acidifleà pH 3,5 avec l'acide chlorhydrique. Le milieu de culture ainsi préparé est réparti dans des flacons Erlenmayer de 500 cm3 à large col (100 ml de bouillon par flacon, stérilisation à 116 C pendant 30 minutes). Les flacons sont ensemencés avec 1 ml d'une culture de la souche du Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus dans des ballons de 250 ml contenant 50 ml du m9me bouillon et la croissance est amorcée à 25 C pendant 16 heures tout en agi- tant (180 tours/minute). Les flacons de fermentation sont mis en incubation sous agitation (180 tours/minute) à 25 C. heures après l'ensemencement, les cellules des cultures du bouillon sont recueillies par centrifugation et lavées avec un tampon phosphate (0,1 M, pH 5,6). A partir de ml de bouillon de culture, on obtient 0,55 g de cellules sèches. Les cellules humides recueillies des 100 ml de bouillon sont remises en suspension dans 100 ml de tampon phosphate (0,1 M, PH 5,6) et l'activité enzymatique est examinée. 1 g de cellules sèches contient environ 1.107 unités enzyme. L'activité enzymatique est mesurée par le procédé suivant. A 1 ml d'une suspension de cellules temponnée, on ajoute 4 ml de tampon phosphate (0,1 M, PH 5,6) et quelques gouttes de toluène pour rompre les parois des cellules. Après 15 minutes d'incubation sous agitation à 40 C, la suspension est additionnée de 10 ml d'une solution à i % (poids/volume) de mélibiose dans le tampon phosphate (0,1 M, pH 5,6). La réaction est soumise à l'incubation à 400 C pendant 2 heures dans un bain-marie agité et est arrêtée en faisant bouillir pendant 15 minutes les échantillons prélevés du mélange réactionnel. La concentration du glucose telle qu'obtenue par l'hydrolyse de mélibiose pendant la réaction est déterminée avec le procédé colorimétrique GODPerid par Boehringer Mannheim GmbH. La densité optique des échantillons colorés est mesurée à la température ordinaire avec un spectrophotomètre "Coleman", de Perkin-Elmer, le trajet optique de la cuvette est de 0,1 dm à la longueur d'onde de 436 millimicrons. Si l'on prend comme unité la quantité d'enzyme qui produit un microgramme de glucose en 2 heures dans les conditions d'essai établies ci-dessus, les unités d'enzyme par gramme de cellules séchées peuvent être calculées par la formule suivante: U _(E2h-Eoh). 18=2 . 15. 100 grammes de cellules séchées E référence ' C o: E2h est la densité optique de l'échantillon prélevé après 2 heures; -Eh est la densité optique de l'échantillon prélevé à Oh zéro heure; Eréférence est la densité optique d'une solution de glucose de référence qui contient 18,2 microgrammes de glucose par millilitre; C est la quantité en grammes de cellules séchées dans 100 ml de bouillon de culture. EXEMPLE 2. On prépare un boulon de culture ayant la composition suivante: (NH4)2S04 5 g/l MgS04.7H20 0 5 g/i Na2HP04.12H20 4,6 g/1 KH2P04 3 g/ NaCl 0,1 g/l CaCl2 0,,05 g/l Extrait de levure 10 g/1 Glucose 10 g/1 Les composés indiqués ci-dessus sont dissous dans l'eau désionisée et le PH est réglé à 5,3 avec de l'acide chlorhydrique. Les cultures dans ce bouillon de la souche Saccharomyces cerevisiae, var. oleaceus, préparées comme indiqué dans l'exemple l, sont mises en incubation sous agita- tion orbitale (180 tours/minute) à 27 C. 39 heures après l'ensemencement, les cellules du bouillon de culture sont recueillies par centrifugation et lavées avec un tampon phosphate (0,1 M PH 5,6). A partir de 100 ml de bouillon de culture, on obtient 0,546 g de cellules séchées. Les cellules recueillies à partir des 100 ml de bouillon sont remises en suspension dans ml de tampon phosphate (O,1 M, PH 5,6) et essayées pour 2481315' déterminer l'activité enzymatique. i g de cellules séchées contient 9,4.106 unités enzyme. EXEMPLE 3 0nprépare un milieu de culture ayant la composition suivante: (NH4)2S04 5, 00 g/l MgSO4.7H20 0,5 g/l Na2HPO4. 12H20 4/6 g/l KH2PO4 3/00 g/1 NaC] 0 1 g/1 CaC12 0,05 g/l Extrait de levure 10 g/l Glucose o10 g/l Mélibiose 1 g/l Les composés mentionnés ci-dessus sont dissous dans l'eau désionisée et le pH est réglé à 5,3 avec de l'acide chlorhydrique. Les cultures de la souche Saccharomyces cerevisiae, var. oleaceus, préparées comme dans l'exemple l, sont mises en incubation avec agitation orbitale (180 tours/minute) à 27 C. 43 heures après l'ensemencement, les cellules provenant des cultures du bouillon sont recueillies par centrifugation et lavées avec le tampon phosphate (0,1 M, PH 5,6). A partir des ml de culture du bouillon, on obtient 0,594 g de cellules séchées. Les cellules recueillies à partir des 100 ml de bouillon de culture sont remises en suspension dans 100 ml de tampon phosphate (0,1 M>pH 5,6) et essayées pour déterminer l'activité enzymatique: i g de cellules séchées contient 1,6.107 unités enzyme. EXEMPLE 4 Cb5 On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante: (Nil4) 2504 (NH4)2 504 5,00 g/l MgS04. 7i20 0,05 g/l NaHPO 4 12H20 4,6 g/i KH2P24 3,0 g/l NaCl 0,1 g/l CaC12 0,05 g/l Extrait de levure 10,0 g/l Glucose 5,0 g/l Les composés mentionnés ci-dessus sont dissous dans l'eau désionisée et le pH est réglé à 5,3 avec de l'acide chlorhydrique. Les cultures de Saccharomyces cerevisiae, var. oleaceus dans un bouillon de ce genre, préparées comme dans l'exemple 1, sont mises en incubation sous agitation orbitale (180 tours/minute) à 29 C. 48 heures après l'ensemencement du bouillon de culture, les cellules sont recueillies par centrifugation et lavées avec le tampon phosphate (0,1 M, pH 5,6). A partir des 100 ml de bouillon de culture, on obtient 0,365 g de cellules séchées. 6 ml du bouillon de culture sont ajoutés à 50 ml de mélasse à 35 Brix contenant 1,6 % en poids de raffinose par rapport aux matières solides totales, et sont réglés à un pH de ,2 avec H2SO 4. L'expression 35 Brix signifie que la mélasse contient 35 % en poids de matières solides solubles à la température de 20 C. Le traitement est effectué à 40 C sous agitation pendant 16 heures. La concentration de galactose, un produit de l'hydrolyse du raffinose pendant la réaction, est déterminée avec le procédé d'essai UV Lactose/galactose de Roehringer Manhenin GmbH. Dans les conditions mentionnées ci-dessus, on obtient 153 micromoles de galactose, équivalent à l'hydrolyse des 30 % du raffinose présent en totalité. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la fabrication de l'enzyme alpha- galactoxydase consistant à provoquer une fermmrtation de levures du genre Saccharomyces cerevisiae qui a lieu dans une gamme de pH de 4 à 7 et à une température comprise entre 20 C et C. 2. Procédé pour l'hydrolyse enzymatique du raffino- se, caractérisé par le fait que la réaction a lieu en présence de cellules, d'extraitsenzymatiques, d 'extraitsenzymatiquesenri- chis provenant de levures du genre Saccharomyces cerevisiae, ou en présence d'enzymes ou de cellules immobilisées.