Brevet FR2482620A1 — publié le 19811120

La présente invention concerne un procédé de purification de la levane saccharase. La lévane saccharase est une fructosyl-trançférase qui permet de synthétiser un polyfructose à partir de saccharose. En particulier la ss-2-6-fructane D glucose-l- fructosyl transférase ; EC.2.4.1.10 permet d'obtenir un homo-polymère ramifié de D-fructose : la chaîne princi pale du polymere résulte de liaisonsp entre les résidus de D-fructose et les branchements correspondent à des îiaisons/3 Les applications de ce polyfructose ou lévane sont variées : entre autres, il peut être substitué à l'amidon, aux dextrane, xanthane, pulilulane ou bien être hydrolysé de façon à préparer des solutions concentrées de fructose. DEDONDER et colt. (Bull. Soc. Chim. Biol. 45, 477-491, 1963) ont décrit une methode de purification de la lévane saccharase comportant trois étapes 1) précipitation à l'éthanol. 2) précipitation au sulfate d'ammonium. 3) chromatographie sur hydroxyl-apatite. Les activités spécifiques élevées (150 ULS/mg- de protéine) sont obtenues au détriment du rendement de la purification de l'enzyme. L'invention vise à pallier cet inconvénient et permet de purifier des lévanes saccharases de haute activite speci- fique avec un rendement très éleve. Le procédé de purification est caractérisé en ce qu'il comporte a) une étape d'acidification du milieu de fer mentation en fin de croissance bactérienne. b) une étape de centrifugation. c) une étape d'ultrafiltration des surnageants de fermentation. d) une etape d'éiimination des acides nucléiques et des pigments rouges. e) une étape de fractionnement des protéines. De préférence le pH de l'étape d'acidification est ajusté à 6,0 et la centrifugation ultérieure est operée à 4"C pendant 2Q minutes à 5 000 g. Les acides nucléiques et les pigments rouges sont pré capités par addition de sulfate de protamine. L'invention sera mieux comprise grâce aux exemples détaillés donnés ci-après concernant la production et la purification de la lévane saccharase. La souche bactérienne utilise pour produire la lévane saccharase est le Bacillus Subtilis C4 mutant constitutif du Bacillus Subtilis B.S.5 hyperproducteur de lévane saccharase exocellulaire. La composition du milieu de culture est donnée dans le Tableau 1. Solution A Sulfate d'ammonium 3,3 gel 1 Phosphate de potassium dipotassique 12,2 g.l Phosphate de potassium monopotassique 4,1 g.l Glycérol 10 g.1- Solution B Sulfate de magnésium 0,060 g.l 1 Sulfate de manganese 0,017 g.l 1 Fer (III) citrate ammoniacal 0,022 g.l 1 Solution C Antimousse RHODORSIL 410 1 à 2 g.1- TABLEAU 1 Afin d'éviter la précipitation des sels au cours de la stérilisation, le milieu est stérilisé en trois parties (solutions A,B,C). Les sels et l'antimousse sont ajoutés stérilement avant inoculation. Les conditions de culture sont données dans le tableau 2. pH initial 7,0 Température 37o C Aération Volume d'air injecté par volume de milieu et par minute compris entre 0,7 et 3 1.1 1 mn 1 TABLEAU 2 L'activité de la lévane saccharase est mesurée en determinant la liberation du glucose dans la réaction saccharose lévane + glucose. La synthèse des lévanes est effectuée dans les conditions données dans le tableau 3, pour un volume total de 1 ml. Température : 370 C x ml de solution enzymatique y ml de tampon phosphate 0,05 M, pH 5,8 0,3ml de solution de saccharose 1 M dans du tampon phosphate 0,5 M pH 5,8 TABLEAU 3 L'unité d'activité enzymatique (ULS) est définie comme étant la quantité de lévane saccharase qui libère 1 emole de glucose par minute dans les conditions définies dans le tableau 3. L'influence des divers paramètres sur la vitesse de. croissance bactérienne et l'activité de la levant saccharase est précisée dans le tableau 4. Débit d'aération Vitesse d'agitation Concentration Taux de Activité lh-l tr. mn-1 d'antimousse croissance ULS.m1- h-1 350 700 0 0,52 1,85 380 700 1%. 0,37 21,6 450 1300 1 %0 0,56 21,0 TABLEAU 4 On notera que le rôle de l'antimousse est très important puisqu'il permet d'obtenir des lévanes saccharases d'activité très élevée (21 ULS.ml -1 contre 1,85 ULS.ml 1) La figure 1 montre que si la culture du Bacillus Subtilis est effectuée dans un milieu standard - sans antimousse l'activité de la lévane saccharase décroit très rapidement lorsque la concentration cellulaire augmente. En fin de croissance bactérienne, lorsque l'activité de la levane saccharase du milieu de fermentation est maximale, le pH est ajusté à 6,0 puis le milieu est centrifugé à 40 C pendant 20 mn à 5000 g. Les surnageants de fermentation contenant la lévane saccharase sont concentrés par ultrafiltration à 40 C dans un module SARTORIUS SM 16525 garni de cinq membranes SM 12136 ayant un seuil de coupure de 10 000 daltons. En ultrafiltrant pendant 22 heures 9 litres de surnageant de culture contenant 11 ULS.ml on obtient 420 ml de solution ayant une activité lévane saccharase de 173 ULS.ml -1 Le rendement d'ultrafiltration en activité enzymatique est de 73,5 %. Les solutions de lévane saccharase obtenues par ultrafiltration contiennent des acides nucléiques et des pigments rouges. L'addition de sulfate de protamine dans du tampon phosphate 0,05 M pH 5,8 jusqu'à une concentration finale de 2 %, permet de précipiter totalement ces impuretés. A titre d'exemple, lorsqu'on traite ainsi une solution de levant saccharase d'activite 130 ULS.ml -1, on obtient une solution purifiée d'activité 111 ULS.ml 1. Le rendement en activité enzymatique de cette étape est donc de 90 %. Les surnageants de filtration ultrafiltrés et purifiés contiennent des protéines que l'on élimine par perméation de gel. On utilise à cette fin une colonne de 800 ml d'ULTROGEL AcA 34 (I.B.F.) qui permet de chromatographier 100 ml de solution ultrafiltrée. Le rendement en activité enzymatique de la perméation de gel est de 90 %. Le tableau 5 rappelle les divers rendements des étapes du procédé de purification de la lévane saccharase selon l'invention. Etape Rendement Rendement golbal % % Ultrafiltration 73,5 73,5 PréciPitation du 90 66,15 sulfate de protamine Perméation de gel 90 59,5 TABLEAU 5 Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'obtenir une lévane saccharase d'activité spécifique de 150 ULS.mg 1 de protéine avec un rendement de 59,5 %. Pour memoire, il est rappelé que DEDONDER et col. n'obtenaient qu'un rendement de 15 %. REVENDICATIONS 1. Procedé de purification de solutions contenant de la lévane saccharase, caractérisé en ce qu'il com porte les étapes succesives suivantes a) acidification du milieu de fermentation en fin de croissance bactérienne. b) ultrafiltration des surnageants de fermen station. c) élimination des acides nucléiques et des pigments rouges. d) fractionnement des protéines. 2. Procédé de purification de solutions contenant de la 7evane saccharase selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d'acidification consiste à ajuster le pH de la solution à 6,0. 3. Procédé de purification de solutions contenant de la lévane saccharase selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'étape d'ultrafiltra tion est conduite à 40 C. 4. Procédé de purification de solutions contenant de la lévane saccharase selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce que le dispositif d'ultra- filtration est garni de membranes ayant un seuil de coupure de 10 000 daltons. 5. Procedé de purification de solutions contenant de la lévane saccharase selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élimination des acides nucleiques et des pigments rouges est réalisée par addition de sulfate de protamine. 6. Procédé de purification de solutions contenant de la levane saccharase selon la revendication 5, caractérisé en ce que le sulfate de protamine est en solution dans tampon phosphate 0,05 M à pH 5,8. 7. Procédé de purification de solutions contenant de la levane saccharase selon l'une quelconque des revendications 1, 5 ou 6, caractérisé en ce que l'addition de sulfate de protamine est opérée jusqu'à ce que sa concentration finale soit de 2 % . 8. Procédé de purification de solutions contenant de la lévane saccharase selon la revendication 1, caractérisé en ce que les proteines sont fraction nées par permation de gel.