Brevet FR2480122A1 — publié le 19811016

Procédé de préparation d'une glycoprotéine à activité immunosuppressive, glycoprotéine telle qu'ainsi obtenue et médicament la renfermant. La présente invention concerne un procédé de préparation d'une glycoprotéine à activité notamment immu- nosuppressive, à partir du sérum ou du liquide d'ascite d'homme ou d'animaux à sang chaud, la glycoprotéine telle qu'ainsi obtenue et les médicaments, notamment à activité immunosuppressivela renfermant. Selon l'invention, pour obtenir une glycopro- téine ayant une activité immunosuppressive, on soumet le sérum ou le liquide d'ascite d'homme ou d'animaux à sang chaud à une concentration isoélectrique puis on recueille la fraction ayant un point isoélectrique compris dans la gamme de 2,6 à 3,6. Ltinvention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit faite en regard des dessins annexés dans lesquels: la figure 1 est un spectre d'absorption in- frarouge de la glycoprotéine obtenue selon le procédé de l'invention o le pourcentage de transmission est représenté en ordonnées, les longueurs d'onde (p) sont représentées sur l'échelle supérieure des abscisses et le nombre d'onde (cm 1) est représenté sur l'échelle inférieure des abscis- ses; et la figure 2 représente le spectre d'absorption ultraviolette de la glycoprotéine, la transmitance (%) étant représentée sur l'échelle des ordonnées et la lon- gueur d'onde (nm) étant représentée sur l'échelle des abs- cisses. A ce jour dans le domaine de la cancérologie clinique, on a couramment utilisé pour le diagnostic des cancers et l'évaluation du degré d'évolution des affections cancéreuses, la détermination d'une protéine foetale qui apparaît dans le sérum des cancéreux telle que l'a-foeto- protéine et l'antigène carcinoembryonnaire (CEA), la dé- termination de la sensibilité du malade à la tuberculine (dérivé de protéine purifiée - PPD) et au 2,4 dinitrochloro- benzène et la détermination du degré de blastogénèse des lymphocytes due à la phytohémagglutinine dans le sang péri- phérique des malades. Ces déterminations et ces réactions analyti- ques reposent sur la corrélation entre la réduction de l'im- munité des malades atteints d'un cancer et l'évolution de l'affection cancéreuse, et ces dernières années des publi- cations ont mentionné la présence de substances ayant une activité immunosuppressive vis-à-vis de l'homme et des animaux à sang chaud dans le sérum d'homme et d'animaux à sang chaud. Par exemple Cooperband et coll. ont décrit comme substance de ce type, une a-globuline immunorégula- trice (voir Transplantation Proceedings, vol. 8, n0 2 (1976) pp. 225-242) et Ishida et coll. ont décrit comme substance de ce type une protéine acide (XXXV Annual Mee- ting of Japanese Cancer Association, 1976). Ces substances e activité immunosuppressive réduisent l'immunité cellulaire et l'immunité humorale de l'homme et des animaux à sang chaud et elles évitent ainsi le rejet des greffes. Par conséquent une telle substance est utile pour la prévention et le traitement du rejet dans les cas de transplantation. Selon Ishida et coll., pour préparer la pro- téine acide ayant une activité immunosuppressive, on soumet le sérum ou le liquide d'ascite d'homme ou d'animaux à sang chaud à une chromatographie-avec échange d'anions et on recueille la fraction éluée à un pH compris dans la gamme de 2,9 à 3,3 (voir la demande de brevet JA n0 53-44611/ 1978 publiée le-6 Novembre 1980 sous le nO 55-43479/1980). Cependant, la protéine acide indiquée par Ishida et coll. est obtenue par fractionnement par adsorption et élution du sérum ou du liquide d'ascite et ce procédé de préparation a l'inconvénient de ne produire qu'une quantité relative- ment faible de la protéine acide ayant une activité immu- nosuppressive relativement faible par suite de la complica- tion des stades opératoires. L'invention découle de l'étude d'un procédé simplifié pour obtenir de façon efficace une quantité im- portante d'une glycoprotéine ayant une activité immunosup- pressive élevée à partir du sérum ou du liquide d'ascite d'homme ou d'animaux à sang chaud. L'objet principal de l'invention est une glycoprotéine ayant une activité immunosuppressive élevée chez l'homme et les animaux à sang chaud ainsi qu'un pro- cédé pour préparer une quantité importante de cette glyco- protéine à partir du sérum ou du liquide d'ascite de l'hom- me ou d'animaux à sang chaud. D'autres objets de l'invention ressortiront de la description qui suit. L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée. On peut citer comme exemples de matières pre- mières utiles dans l'invention, le sérum ou le liquide d'ascite d'un malade cancéreux ou d'un animal à sang chaud auquel on a transplanté des cellules cancéreuses ou un tissu cancéreux. Pour soumettre le sérum ou le liquide d'asci- te à une concentration isoélectrique, par exemple dans le cas o on utilise le liquide d'ascite d'un malade atteint d'un cancer, on centrifuge ou filtre le liquide d'ascite pour éliminer les matières solides qui n'y sont pas dissou- tes puis on soumet le liquide d'ascite clarifié à la concen- tration isoélectrique sur colonne décrite ci-après ou à la concentration isoélectrique sur gel granulaire à un pH dans la gamme de 2,6 à 3,6 décrite ci-après. Pour effectuer la concentration isoélectrique sur colonne, on dissout dans l'eau un support amphotère ayant un pH de 2,5 à 6,0 tel que celui commercialisé sous la marque Ampholine (fabriqué par LKB Company, Suède) et on utilise cette solution et une solution aqueuse de saccha- rose, d'éthylèneglycol ou de glycérol pour préparer une so- -lution ayant un gradient de densité dans un tube de verre. Dans une colonne de ce type, on soumet le sérum ou le liqui- de d'ascite clarifié à une concentration isoélectrique avec une puissance constante de 3 W à 20 W puis on recueille la fraction dont le point isoélectrique correspond à un pH de 2,6 à 3,6. Dans le cas de la concentration isoélectrique sur gel granulaire, on prépare une plaque avec de l'Ampho- line et un gel tel que celui commercialisé sous la marque Sephadex G-75 (fabriqué par Pharmacia Company, Suède) et on fractionne le sérum ou le liquide d'ascite clarifiés après concentration isoélectrique sur la plaque. Pour éliminer la substance amphotêre et la substance utilisée pour former un gradient de densité, qui demeurent dans la fraction recueillie, on soumet cette fraction à une dialyse ou à une ultrafiltration pour la purifier. On lyophilise la fraction d'électrophorèse ainsi obtenue pour obtenir la glycoprotéine désirée. La glycoprotéine obtenue selon l'invention présente les propriétés physiques suivantes: 1. Aspect: poudre blanche. 2. Solubilité: soluble dans l'eau, une solution salée phy- siologique aqueuse et une solution de tampon acide phospho- rique et insoluble dans le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétone, le chloroforme, l'éther et l'acétate d'éthyle. 3. Point isoélectrique: pH 2,6 à 3,6 (déterminé par concen- tration isoélectrique sur une plaque plane).. 4. Réactions colorées: positive pour la réaction de Lowry- Folin, la réaction d'Ehrlich, la réaction du biuret, la réaction à la ninhydrine et la réaction de Molisch (réac- tion à l'acide phénolsulfurique). 5. Spectre infrarouge: comme illustré par la figure 1, selon la méthode au KBr, la concentration étant de 0,2% en poids. 6. Spectre d'absorption ultraviolette: comme illustré par la figure 2, solution aqueuse pure à la concentration de 0,01%. L'activité immunosuppressive de cette substan- ce va maintenant être décrite. Lorsqu'on étudie l'activité immunosuppressive de la substance de l'invention selon l'inhibition de la blastogénèse des lymphocytes provoquée par la phytohémag- glutinine.(PHA) dans le sang périphérique humain et des cellules spléniques de la souris, 1,0 mg de cette substan- ce dans 1 ml provoque une inhibition de 100% dans le pre- mier cas et de 90% dans le second et même 0,1 mg de cette substance dans 1 ml provoque une inhibition de 80% dans le premier cas et de 55% dans le second. Selon les résultats de l'étude de la réac- tion retardée du coussinet plantaire de la souris ICR à l'injection d'érythrocytes de moutons, l'administration de pg par animal de la substance de l'invention inhibe la réaction d'environ 50% par rapport aux témoins auxquels on n'a pas administré cette substance. Les résultats ci-dessus montrent que la subs- tance de l'invention a une forte activité immunosuppressive. Par conséquent on peut dire que la substance de l'invention est utile pour la prévention et le traite- ment du rejet immunologique dans le cas d'une transplanta- tion chirurgicale. Pour appliquer la glycoprotéine obtenue selon l'invention à la prévention ou au traitement du rejet immu- nologique dans le cas d'une opération de transplantation, on administre la glycoprotéine par injection intrapéritoné- ale environ 24 heures avant l'opération et on répète l'ad- ministration intrapéritonéale de la glycoprotéine après l'opération. La dose journalière administrée est générale- ment de 20 mg/kg en une seule fois avant l'opération et on administre la même quantité pendant 14 jours consécutifs après l'opération. De plus on a étudié la toxicité aiguë de la glycoprotéine selon l'essai suivant. On injecte par voie intrapéritonéale à 15 souris de souche DKI une série de solutions aqueuses de la glycoprotéine pour observer la mortalité des souris une semaine après l'injection. Même à la concentration maximale correspondant à 1 000 mg/kg de poids corporel, on n'observe aucune mort des souris traitées.- L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 Après avoir laissé reposer pendant 30 à 60 minutes 10 ml de sang prélevé à un malade atteint d'un cancer du foie, on centrifuge à environ 1 500 g pendant minutes pour obtenir 5 ml d'un liquide surnageant. Séparément, on mélange deux solutions aqueu- ses d'Ampholine ayant des pH de 2,5 à 4,0 et de 4,0 à 6,0 respectivement pour obtenir une solution aqueuse de support amphotère ayant un pH de 2,6 à 6,0 (qu'on appelle ci-après solution d'Ampholine). On prépare ensuite deux types de mélanges liquides, le liquide dense (1) et le liquide léger (2): (1) on mélange 11 ml de la solution d'Ampholine avec 137 ml d'eau distillée contenant 108 g de saccharose et (2) on mélange 3,6 ml de la solution d'Ampholine et une solution préparée par dissolution de 5 ml du liquide surnageant de l'échantillon (sang) dans de l'eau distillée pour obtenir 211 ml d'une solution dans laquelle on dissout 10,8 g de saccharose. On garnit un tube de verre de 440 ml (colonne de verre pour concentration isoélectrique type 8102, fabri- quée par LKB Company, Suède) de ces deux types de mélange liquide après les avoir mélangés dans un mélangeur à "gra- dient". On commence la concentration isoélectrique à une tension de 550 V avec un courant de 9,1 mA, on la poursuit à une puissance constante de 5 W pendant 23 heures, puis on l'arrête à une tension de 1 5C0 V. Lorsque la concentration isoélectrique est achevée, on recueille de la colonne de verre la fraction ayant un pH compris entre 2,6 et 3,6 et on la soumet à une dialyse contre un courant d'eau pour éliminer l'Ampholine et le saccharose demeurant dans la fraction puis on lyophi- lise pour obtenir 5,2 mg de glycoprotéine purifiée pour 10 ml d'échantillon (sang). Les résultats de l'étude de l'inhibition par cette glycoprotéine de la blastogénèse due à la phytohémag- glutinine des lymphocytes du sang périphérique humain et des cellules spléniques de la souris montrent que les de- grés d'inhibition sont respectivement de 100 et de 90% à la concentration de 1,0 mg de glycoprotéine/ml et de 80 et 55% à la concentration de 0,1 mg de la glycoprotéine/ml. De plus, l'étude de l'inhibition par injec- tion intrapéritonéale de la glycoprotéine à des souris ICR à la dose de 100 pg/animal montre que le degré d'inhibition de la réaction retardée du coussinet plantaire par adminis- tration d'érythrocytes de moutons est de 49%. Exemple 2 Dans un centrifugeur réfrigérant on centrifu- ge à 10 000 g pendant 30 minutes 25 ml d'un liquide d'as- cite prélevé sur un malade atteint d'un cancer du colon pour obtenir un liquide surnageant. On soumet le liquide surnageant ainsi obtenu à une concentration isoélectrique dans un appareil de con- centration isoélectrique à plaque (fabriqué par LKB Company, Suède) avec une plaque préparée comme à l'exemple 1 à par- tir d'une solution d'Ampholine ayant un pH de 2,5 à 6,0 et de Sephadex G-75 avec une puissance constante de 8 W pen- dant 40 heures et en partant d'une tension de 300 V et d'un courant de 26, 7 mA. Lorsque la concentration atteint une tension de 1 200 V, on recueille la fraction ayant un pH de 2,6 a 3,6 avec le Sephadex G-75, et on lave a l'eau pour entraîner la fraction. On soumet le liquide ainsi ob- tenu à une dialyse contre de l'eau courante pour éliminer l'Ampholine et on lyophilise le dialysat pour obtenir 24 mg de glycoprotéine. Les résultats de l'étude effectuée comme dans l'exemple 1 de l'activité immunosuppressive de la glyco- protéine ainsi obtenue montrent que le degré d'inhibition de la blastogénèse due à la phytohémagglutinine des lymphocytes du sang périphérique humain est de 100% à la concentration de 1,0 mg de la glycoprotéine/mlo Exemple 3 On effectue une série d'expériences sur l'a- nimal pour rechercher l'effet préventif de la glycoprotéi- ne provenant du malade atteint d'un cancer de l'exemple 1 sur le rejet immunologique dans le cas d'une transplanta- tion chirurgicale. On utilise dans l'expérience des souris de souche DKI et à 15 de ces souris on injecte par voie in- trapéritonéale 20 mg/kg de la glycoprotéine avant la trans- 2 48 0 1 22 - 8 plantation d'un morceau de peau de souris C31i/He et à 15 autres souris servant de témoins, on injecte par voie in- trapéritonéale avant la transplantation 0,2 ml/kg de solu- tion salée aqueuse physiologique. Après l'opération de transplantation, on in- jecte par voiezintrapéritonéale la glycoprotéine à la dose journalière de 20 mg/kg pendant 14 jours aux souris du groupe d'essai et on injecte par voie intrapéritonéale la solution salée physiologique à la dose journalière de 0,2 ml/kg pendant le même nombre de jours aux souris témoins. On n'observe pas d'exfoliation du morceau de peau transplanté chez les souris du groupe d'essai ayant reçu la glycoprotéine lors des deux semaines qui suivent l'administration et même après, tandis que chez tous les animaux du groupe témoin, les morceaux de peau transplan- tés s'exfolient 10 jours après la transplantation. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limi- te nullement à ceux de ses modes d'application et de réali- sation qui ont été plus particulièrement envisagés; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Procédé pour préparer une glycoprotéine à activité notamment immunosuppressive, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre le sérum ou le liquide d'ascite d'homme ou d'animaux à sang chaud à une concentration iso- électrique et à recueillir la fraction ayant un point iso- électrique compris dans la gamme de 2,6 à 3,6. 2. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'on effectue la concentration isoélectrique par emploi d'une colonne. 3. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'on effectue la concentration isoélectrique par emploi d'un gel granulaire. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on a prélevé le sérum ou le li- quide d'ascite sur un malade atteint d'une affection can- céreuse. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on a prélevé le sérum ou le liqui- de d'ascite sur un animal à sang chaud auquel on a trans- planté des cellules cancéreuses ou un tissu cancéreux. 6. Glycoprotéine à activité immunosuppressi- ve ayant un point isoélectrique de 2,6 à 3,6 telle qu'ob- tenue par mise en oeuvre du procédé selon l'une des reven- dications 1 à 5. 7. Médicament, caractérisé en ce qu'il com- prend une glycoprotéine selon la revendication 6. 8. Composition immunosuppressive, notamment sous forme d'une dose unitaire, caractérisée en ce qu'elle comprend une glycoprotéine selon la revendication 6.