Brevet FR2482309A1 — publié le 19811113

--" 2482309 La présente invention concerne la mise en évidence, au niveau des tissus humains, d'antigènes d'un groupe sanguin A, B, O ou AB. Jusqu'à présent, la recherche de la présence de ces antigènes a été effectuée au niveau des tissus normaux grâce à une technique utilisée depuis -1956G Cette technique a révélé que l'antigène correspondant au groupe sanguin d'un individu est toujours présent à la surface des cellules qui composent ees tissus. La technique utilisée dans l'art antérieur utilise le marquage des antigènes par des globules rouges. Cette me'thode, peu maniable, ne convilent pas pour la pratique courante, pour les raisons suivantes: manque de rapidité, fiabilité ineertaine (appréciation à plus ou moins 30%), done difficeulté de quantification, et reprodutibilité très restreinte du fait de la variété du marqueur utilisé et des conséquences de sa fragilité (phénomènes d'hémolyse, fausse agglutination, mauvaise conservation, impossibilité de congélation). 2_0::.us ees facteurs, et notamment le manque de fiabilité du marqueur limitent la diffusion de cette méthode connue. Or, des travaux ont montré que la présence ou l'absefed'un antigène du type précité constitue un critère d'évaluation pronostrqedes tumeurs malignes% C'est ainsi que la méthode connue sus-mentionnée a été récemment utilisée pour rechercher à la surface des tumeurs malignes(sein, estomiac,colon, col utérin, etc...) l'existence des antigènes de groupes sanguins. En particulier, les derniers travaux ayant porté sur les tumeurs de vessie ont donné par cette technique des résultats intéressants en ce qui concerne l'évaluation pronostqe pour ce type tumoral. La présente invention a pour but de parvenir à un procédé de détection de la-présence d'antigènes d'un groupe sanguin A, B, 0 ou AB.dans une coupe histologique, ce procédé étant exempt des inconvénients de l'art antérieur eu pouvant être mis en oeuvre non pas seulement par un chercheur mais aussi par un laboratoire médical standard ou par un praticien ayant besoin d'un résultat immédiat et fiable, permettant de ce fait une thérapeutique appropriée. Selon l'invention, ce but est atteint par le fait qu'on expose la coupe histologique à un antisérum qui est monospécifique humain de l'antigène A ou B ou H (0) ou AB recherché, et l'on marque-directement ou indirectement- l'anticorps contenu dans cet antisérum, et par le fait qu'après fixation et marquage, ou marquage et fixation, de cet anticorps sur les antigènes de la coupe histologique, on lave cette dernière et on décèle optiquement la présence éventuelle de l'agent marqueur sur cette coupe histologique, unte telle présence témoignant que ladite coupe histolo- gique comporte des antigènes du groupe considéré, puisque l'anticorps a été fixé. Ce procédé admet plusieurs variantes: Dans une première variante le marquage de l'antisérum, c'est-à-dire de l'anticorps qu'il contient,est effectué avant l'exposition de la coupe histologique à l'antisérum. Dans ce cas, l'agent marqueur avec lequel l'antisérum est marqué peut etre une substance fuorescente, par exemple la fluorescéine (isothiocyanate de fluorescéine, par exemple) ou la rhodamine, et c'est alors par un examen en lumière ultraviolette que l'on décèle la présence éventuelle de l'agent marqueur sur la coupe histologique. Dans une deuxième variante, c'est après avoir exposé la coupe histologique à l'antisérum que l'on marque l'anticorps fixé par elle. Ce marquage de l'anticorps fixé peut alors etre effectué avee un autre sérum, à savoir /ou non un sérum anti-immunoglobuline humaine marque, par exemple, par un agent fluorescent tel que f1wrescéine ou rhodamine, l'examen optique de la coupe histologique étant ensuite effedué en lumière ultraviolette. Dans cette deuxième ou nob variante, le sérum antiimmunoglobuline,humainepeut!tre marqué non pas par un agent fluorescent mais par une péroxydase et, après application du sérum anti-immugobuline 0 Os. humaineansin marqué, on applique alors à la coupe histologique un révèlateur selon la technique de Coons des immunopéroxydases et l'on effectue l'examen optique en lumière naturelle. L'invention a également pour objet des produits 248230? pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention. Un tel produit convenant pour la mise en oeuvre du procédé dans la première variante est un antisérum mone- pécifique humain de l'um des groupes A, B, O ou AB, cet antisérum étant marqué soit par une substance fluorescente, telle que fluorescéine ou rhodamine (par exemple). L'antisérum peut toutefois être marqué par une immuno- péroxydase selon la procédé de Goons, et l'examen est alors fait en lumière blanche après application d'un révélateur. Pour mettre en oeuvre la deuxième variante du procédé, l'invention prévoit un antisérum monospécifique humain A, B, O ou AB non marqué, contenu dans un premier récipient, et un sérum anti-immunoglobuline humaine. ou non, contenu dans un deuxième récipient et marqué soit par une substance fluorescente telle que, par exemple, isothiocyanate de fluorescéine ou rhodamine, soit par une péroxydase. La figure unique du dessin annexé illustre la réaction mise en oeuvre dans le procédé, dans le cas du marquage indirect, c'est-à-dire dans le cas de la deuxième variante La référence 1 désigne une cellule avec son antigène, tandis que la référence 2 désigne un anticorps spécifique contenu dans l'antisérum non marqué mis en présence de cette cellule 1. La référence 3 désigne le corps résultant de la fixation de l'anticorps 2 sur la cellule 1. La référence 4 désigne un marqueur, par À ou non exemple une anti-immunoglobuline humainemarquee mise en présence du corps 3. La référence 5 désigne le corps complexe résultant de la fixation de l'anti-immunoglobuline marquée sur le corps 3. On comprend que si, après élimination complète (par lavage) de tous les éléments 2 et 4 non fixés, l'examen optique révèle la présence d'éléments 4 fixés, cela traduit la présence du l'antigène 1, Si l'on opère selon la première Variante (dom au moyen d'un antisérum déja marqué), c'est alors un corps composé, formé par la fixation d'un marqueur 4 à un anticorps 2 que l'on met en présence de la cellule avec antigène 1, pour obtenir finalement le corps complexe identifiable optiquement. Les modalités d'exécution sont particulièrement simples et à la portée de tout laboratoire courant. On opère avantageusement à partir de préparations histologiques déparaffinées non colorées, eonfeetionnées selon les techniques habituelles déja connues. Les préparations histologiques déparaffinées sont fixées dans un bain d'acétone pendant 15 minutes, après quoi ou les lave, de préférence dans trois bains différents, O10 avantageusement avec une solution tampon à Ph 7,3 (un tampon phosphate commercialisé sous le nom de P.B.S. convient parfaitement). La durée totale du lavage est de l'ordre de 15 minutes. Après séchage des lames (préparations histologiques), on les place dans une botte métallique, à plat sur des porte-obJets et on les recouvre de l'antisérum correspondant. La durée de oette exposition à l'antisérum peut atteindre 50 minutes, voire davantage sans que cela nuise à la réaetion. Si l'antisérum appliqué est un antisérum déja marqué par une substance fluorescente, on aJoute, au début de l'exposition, quelques gouttes de solution au i/1000 de bleu Evans (colorant histologique). Si c'est par um péroxydase que l'antisérum est déja marqué, on raJoute le substrat (ou révélateur) selon la technique de Coons des imnmnopéroxydases Si l'antisérum appliqué n'est pas un antisérum déJa marque, on applique, après lavage succédant à l'expo- sition, le sérum anti-immunoglobuline humaine ou non, marqué, ou plus avantageusement un sérum anti-immunoglobuline de spécificité M, et l'on procède à une deuxième exposition. Les préparations sont ensuite lavées, de préférence dans plusieurs bains successifs de solution tampon Ph 7,3 (5 minutes à chaque fois). Après cela on sèche les préparations histologiques et l'on monte les coupes comme suit: - si l'agent marqueur est une substance fluorescente, avec une goutte de glycérol placée sur une lamelle qui est collée sur la préparation. -si l'agent marqueur est une péroxydase, le montage se fait en utilisant une résine synthétique, par exemple la résine commercialisée sous le nom d'Eukitto On procède ensuite à la Jecture au microscope sous éclairage correspondant au type de marqueur g Eclairage UV et microscope à fluorescence avec filtres appropriés, si le marqueur est une substance fluorescente. Lumière blanche transmise, sans filtre, dans les autres cas. Bien entendu, ce mode=opératoire n'est pas limitatif, et certaines variantes pourraient être O10 envisagées à son égard sans pour autant sortir du cadre de l'invention, REVENDICATIONS 1.- Procédé de détection de la présence d'antigènes d'un groupe sanguin A, B, O ou AB dans une coupe histologique, caractérisé par le fait qu'on expose la coupe histologique à un antisérum qui est monospécifique humain de l'antigène A ou B ou H (O) ou AB recherché, et l'on marque - direc- tement ou indirectement - l'anticorps contenu dans cet antisérum, et par le fait qu'après fixation et marquage, ou marquage et fixation, de cet anticorps sur les antigènes de la coupe histologique, on lave, cette dernière et on décèle optiquement la présence éventuelle de l'agent marqueur sur cette coupe histologique, une telle présence témoignant que ladite coupe histologique comporte des antigènes du groupe considéré, puisque l'anticorps a été fixé. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le marquage de l'antisérum, c'est-à-dire de l'anticorps qu'il contient, est effectué avant l'expo- sition de la coupe histologique à cet antisérum. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'agent marqueur avec lequel l'antisérum est marqué est une substance fluorescente, par exemple la fluorescéine ou la rhodamine, et par le fait que c'est par un examen en lumière ultraviolette que l'on décèle la présence éventuelle de l'agent marqueur sur la coupe histologique. 4.Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que c'est après avoir exposé la coupe histologique à l'antisérum que l'on marque l'anticorps fixé par elle. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on marque l'anticorps avec un autre sérum, à savoir un sérum antiimmunoglobuline marqué. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le sérum anti-immunoglobuline est marqué par un agent fluorescent, par exemple la fluorescéine ou la rhodamine, et par le fait que c'est par un examen en lumière ultraviolette que l'on décèle la présence éventuelle de l'agent marqueur sur la coupe histologique. 7.Procédé sebn la revendication 6, caractérisé par le fait que le sérum anti-immunoglobuline est marqué par une péroxydase, et par le fait qu'après application de ce sérum à la coupe histologique préalablement exposée à l'antisérum on applique à celle-ci un révélateur selon la technique de Coons des immunopéroxydases, et l'on effectue l'examen optique en lumière naturelle. 8.- Produit pour mettre en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications l; 2 et 3, caractérisé par un antisérum monospécifique humain de l'un des groupes A, B, 0 ou AB, cet antisérum étant marqué. 9.- Produit selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'antisérum est marqué par une substance fluorescente telle que par exemple la fluoresceine ou la thodamine. 10.- Produits pour mettre en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1, et 4 à 7, caractérisés par un antisérum monospécifique humain A, B, 0 ou AB non marqué contenu dans un premier récipient, et par un sérum antiimmunoglobuline contenu dans un deuxième récipient et marqué. 11.- Produits selon la revendication 10, caractérisés par le fait que le sérum anti-immunoglobuline est marqué par une substance fluorescente telle que, par exemple, la fluorescéine ou la rhodamine. 12.- Produits selon la revendication 10, caractérisés par le fait.que le sérum anti-immunoglobuline est marqué par une péroxydase. 13.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'antisérum est un antisérum marqué par une immunopéroxydase selon le procédé de Coons.