Brevet FR2484077A1 — publié le 19811211

Z484077 i La présente invention a trait à un procédé et à un dispositif pour mesurer la capacité de déformation d'ob- jets microscopiques, et notamment de cellules vivantes,. telles que les globules rouges du sang. On sait que la capacité de déformation des globules rouges joue un rôle essentiel dans leurs fonctions et leur temps de survie et constitue une indication précieuse con- cernant la qualité de l'hémoglobine, la structure de la pa- roi et d'autres caractéristiques, de sorte que la mesure de cette capacité de déformation est maintenant utilisée pour l'exploration et le diagnostic de différentes affections, notamment hématologiques. On a déjà proposé de nombreuses techniques pour me- surer la capacité de défQrmation des globules rouges. Un procédé particulièrement précis et pratique se trouve dé- crit dans le brevet français 74 16160 publié sous le no 2.270.557 et consiste à placer' un liquide contenant des globules rouges du sang en suspension entre deux parois co- axiales transparentes et à communiquer à ces deux parois des vitesses de rotation différentes, par rapport à leur axe commun, en faisant passer à travers le liquide un fais- ceau parallèle de lumière, sensiblement normal à cet axe commun, pour obtenir une figure de diffraction sur laquelle on mesure les dimensions caractéristiques des anneaux de diffraction en fonction de la vitesse différentielle des deux parois. En effet, la gradient de vitesse d'écoulement provoqué par la différence de vitesses de rotation assure, par l'effet de cisaillement correspondant, une bonne défor- mation de l'ensemble de la population cellulaire en suspen- sion passant entre les parois. Ce procédé, s'il donne parfaitement satisfaction, nécessite cependant l'emploi d'un dispositif relativement complexe avec deux parois cylindriques coaxiales mobiles en rotation l'une par rapport à l'autre, des moyens pour com- muniquer à ces parois des vitesses de rotation différentes par rapport à leur axe commun et des moyens pour diriger un faisceau lumineux, notamment de lumière monochromatique cohérente, perpendiculairement à l'axe commun à travers l'écoulement ainsi provoqué. La présente invention se propose de fournir un pro- cédé pour mesurer la capacité de déformation d'objets mi- croscopiques, et notamment des cellules vivantes telles que des globules rouges du sang, qui soit de mise en oeuvre simple et peu onéreuse, tout en conduisant à des résultats de mesure pouvant atteindre une très grande précision. Un autre objectif de l'invention est d'apporter un procédé qui permette très facilement une exploration par va- riation d'un ou plusieurs des paramètres du milieu conte- nant lesdits objets, et notamment les globules rouges. Un autre objectif de l'invention est de fournir un dispositif particulièrement simple, économique et fiable pour mesurer la capacité de déformation d'objets microsco- piques, et notamment de cellules vivantes telles que les globules rouges du sang, permettant une mise en oeuvre fa- cile de ce procédé. L'invention a pour objet un procédé pour mesurer la capacité de déformation d'objets microscopiques, et notam- ment de cellules vivantes telles que les globules rouges du sang, en suspension dans un liquide à travers lequel on fait passer un faisceau parallèle de lumière pour observer la figure de diffraction produite par les objets microsco- piques afin de mesurer les dimensions caractéristiques des anneaux de diffraction, caractérisé par le fait que l'on fait passer ce liquide dans un canal tubulaire à paroi fixe dans une direction sensiblement perpendiculaire audit faisceau. L'invention repose sur la découverte surprenante qu'en faisant passer la suspension liquide à une vitesse - 2484077 suffisante à travers le canal, sans autre précaution, on obtient une figure de diffraction dont la qualité est suf- fisante pour permettre des mesures précises, malgré le fait que dans une partie importante de la section de passage de l'écoulement, le gradient de vitesse qui détermine le ci- saillement soit nul ou peu important. Conformément à l'invention, on réalise à travers ledit canal un écoulement laminaire ou proche de l'état laminaire, de ce liquide. Conformément à un premier mode de mise en oeuvre simplifié de l'invention, on prépare une suspension des objets microscopiques dans un liquide convenable, présen- tant les caractéristiques voulues de tonicité et de visco- sité, et l'on amène ce liquide à passer, sous forme d'écou- lement laminaire ou proche de l'état laminaire, à travers le canal, ledit canal ayant une longueur suffisante pour permettre l'instauration et/ou la conservation de cet état dans la zone traversée par le faisceau de lumière, de pré- férence de lumière monochromatique cohérente. De préférence, la section de passage du canal est supérieure à 0,0005 mm2 et le débit de liquide à t-ravers la section est supérieur à 0,1 ml/mn. Selon un perfectionnement de l'invention, on peut avantageusement modifier progressivement, pendant la mesure, une ou plusieurs des caractéristiques du milieu, par exem- ple les pressions partielles en oxygène ou gaz carbonique, la viscosité, la tonicité, etc..., sans être gêné par la nécessité, comme dans l'art antérieur, de faire passer un débit continu à travers un dispositif animé de mouvements de rotation. Dans un second mode de mise en oeuvre de l'inven- tion, permettant d'effectuer des mesures avec un degré par- ticulièrement élevé de précision, on peut amener le liquide, dépourvu d'objets microscopiques, à s'écouler à travers le canal et l'on peut injecter, dans le liquide, au niveau du canal, et en un emplacement de la section de passage à la fois éloigné du centre de cette section et de la paroi du canal, un flux d'objets microscopiques, tel que des globu- les rouges, dans une direction voisine ou identique à la direction d'écoulement du liquide, de sorte que lesdits objets microscopiques défilent à travers la trajectoire du faisceau lumineux en étant contenus dans cette partie de la section de passage. Dans ce mode de mise en oeuvre également, on peut avantageusement faire varier progressivement les caracté- ristiques du milieu dans lequel se trouvent les globules rouges, soit en modifiant les caractéristiques dudit liqui- de, soit en modifiant les caractéristiques du milieu de transfert des objets microscopiques vers le lieu d'injec- tion. La section de passage dans le canal peut présEnter toute forme voulue, notamment carrée, rectangulaire ou cir- culaire. De préférence, l'écartement entre deux points op- posés de la paroi, dans la direction du faisceau lumineux, est supérieur à 25 À, par exemple de 100 à 150 p. Dans le cas o les objets microscopiques sont injec- tés dans l'écoulement de liquide à travers le canal, l'in- jection peut s'effectuer soit en un ou plusieurs points distincts, soit selon une partie de section continue, de préférence annulaire. Ainsi, dans le cas d'un canal à sec- tion circulaire, l'injection peut s'effectuer selon une partie de section annulaire ou circulaire; par exemple pour un diamètre de canal de 100 Y, l'épaisseurdms l'anneau peut être d'environ 25 p. L'invention a également pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé, dispositif caractéri- sé par le fait qu'il comporte un canal à paroi transparente d'une longueur suffisante pour permettre l'établissement 24840?7 ou le maintien d'un écoulement de liquide laminaire ou proche de l'état laminaire, l'entrée dudit canal étant re- liée à des moyens permettant l'amenée d'un liquide sous une pression suffisante pour établir ledit écoulement, ledit dispositif comportant d'autre part, des moyens pour faire passer à travers ledit canal, et dans une direction sensi- blement perpendiculaire à la direction d'écoulement, un faisceau lumineux, de préférence de lumière monochromatique cohérente, destiné à fournir une image de diffraction. Les moyens d'amenée de liquide peuvent avantageuse- ment comprendre au moins une pompe reliée audit canal de façon à assurer un écoulement de liquide vers et à travers le canal. Dans une première forme de réalisation de l'inven- tion, le dispositif peut avantageusement comporter des moyens pour réaliser, en amont dudit canal, une suspension desdits objets microscopiques dans le liquide, par exemple en prévoyant dans le trajet de liquide vers le canal, une zone d'injectLon d'objets microscopiques de façon à réaliser une suspension homogène destinée à s'écouler à travers le canal. Le dispositif peut cependant être également dé- pourvu de ces moyens, la suspension étant réalisée en de- hors du dispositif, puis introduite déjà toute préparée dans celui-ci. Au contraire, dans une seconde forme de réalisation, le dispositif peut avantageusement comporter, au niveau du canal, des moyens d'introduction d'un flux d'objets micros- copiques dans une partie de la secton du canal éloignée par exemple du canal ou de sa paroi, et ceci dans une direction sensiblement parallèle à la direction d'écoulement. De façon particulièrement avantageuse, ces moyens d'injection peuvent comprendre une ou plusieurs aiguilles orientées dans le sens de l'écoulement et débouchant au 14840t? niveau désiré de la section du canal. De préférence, l'aiguille peut être une aiguille de section transversale annulaire permettant l'établisse- ment d'un flux annulaire d'objets microscopiques, la par- tie centrale de l'aiguille contenant un passage à travers lequel peut passer une partie de liquide dépourvu d'objets microscopiques et destinée à former la partie centrale de l'écoulement. Dans le cas o l'on désire provoquer une variation continue d'une ou plusieurs des caractéristiques du milieu liquide, le dispositif peut avantageusement comprendre au moins deux pompes aboutissant à une chambre de mélange, l'actionnement, la vitesse des pompes, d'une part et le réglage de la chambre de mélange, d'autre part étant tels que la modification progressive de milieu se produise selon un programme préétabli. D'autres avantages et caractéristiques de l'inven- tion apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif, et se référant au dessin annexé dans lequel: La figure 1 représente une vue schématique d'un dis- positif de mesure de capacité de déformation de globules rouges selon une première réalisation de l'invention. La figure 2 représente une vue en coupe transver- sale du canal de ce dispositif. La figure 3 représente une vue schématique des mo- yens d'injection et de la partie initiale du canal d'un dispositif de mesure de capacité de déformation de globules rouges selon une deuxième forme de réalisation de l'inven- tion. La figure 4 représente une vue en section transver- sale de la figure 3. On se réfère aux figures 1 et 2. Le dispositif de mesure de déformation de globules -484077 rouges représenté comporte un canal de mesure désigné dans son ensemble par 1 et présentant une lumière ou canal pro- prement dit 2 dont la section droite de passage, représen- tée sur la figure 2, est celle d'un rectangle aplati de largeur égale à 1 cm et de hauteur égale à 100 y. Le canal est formé d'une plaque de verre supérieure 3 de forme rec- tangulaire et d'une plaque de verre inférieure plus épaisse 4 de forme également rectangulaire, munie en ses extrémités antérieure et postérieure d'un passage d'arrivée 5 et d'un passage d'évacuation 6. Un joint périphérique étanche 7 est interposé entre les deux plaques de verre 3, 4, de façon à réaliser les bords latéraux de la section de passage. Comme on le voit sur la figure 1, le canal 1, dont la longueur est d'environ 4 cm, est disposé verticalement de façon à être traversé par le faisceau 8 d'un laser 9, ledit faisceau 8 étant dirigé perpendiculairement à l'en- semble des plaques de verre 3, 4 pour être récupéré sur un écran 10 ou autre dispositif permettant l'analyse de l'ima- ge de diffraction formée. Le passage d'évacuation 6 du canal 1 est relié par une tubulure 11 à un récipient d'évacuation 12. De son côté, le passage d'amenée 5 est relié à une tubulure d'amenée 13 aboutissant à une chambre de mélange 14 à laquelle aboutit une pompe 15, par exemple une pompe à piston matérialisée sous la forme d'une seringue et munie de moyens d'actionnement non représentés, ladite pompe 15 permettant une injection avec un débit régulier, de globu- les rouges, dans la chambre 14. La chambre 14 est d'autre part reliée à une chambre de mélange 16 à laquelle aboutis- sent les sorties de deux pompes 18, 19, également représen- tées sous forme de seringues, les pistons 20 desdites pompes étant également entraînés par des moyens moteurs convenables. Les liquides contenus dans les pompes 18 et 19 et qui se mélangent dans les proportions désirées dans la chambre 16, forment par mélange dans ladite chambre le li- quide destiné à contenir la-suspension de cellules. Ce li- quide est par exemple une solution de dextran présentant la viscosité de 10 cp et la tonicité désirée. Grâce à l'u- tilisatLon de deux pompes 18, 19 et de la chambre de mé- lange 16, il est possible de faire varier, comme on le dé- sire, la viscosité, la tonicité ou les pressions partielles ou encore d'autres paramètres du milieu, et ceci de façon à obtenir soit un milieu de composition constante pendant toute la mesure, soit même un milieu de composition pro- gressivement variable. En fonctionnement, on comprend donc que le disposi- tif permet d'instaurer à travers le canal proprement dit 2 un écoulement laminaire d'une suspension homogène de glo- bules rouges dans le liquide de composition prévu à l'avan- ce. Le mouvement de cette suspension à travers le canal produit une image de diffraction récupérée sur l'écran 10. Cette image de diffraction, qui présente des anneaux con- centriques circulaires lorsque le liquide est au repos, se met à s'allonger et à prendre une configuration caractéris- tique lorsque le liquide s'écoule d'un mouvement laminaire à travers le canal 2, la configuration de l'image étant ca- ractéristique de la déformation subie par les globules rou- ges en suspension. Le débit de l'écoulement i travers le canal 2, et par conséquent l'amplitude des vitesses d'écoulement, est déterminé par l'importance de la pression en amont fournie par les différentes pompes. On peut également prévoir des moyens de régulation de ce débit afin d'obtenir un débit parfaitement constant qui peut être établi à des valeurs désirées réglables. Les différentes caractéristiques de la suspension, à savoir la composition du liquide, ses pressions partielles, sa tonicité, ainsi que la densité de globules rouges dans le liquide, sont facilement définies par l'homme de l'art et n'ont pas besoin d'être modifiées par un rapport aux valeurs utilisées pour les mesures dans les appareils de l'art antérieur tels que celui décrit dans le brevet fran- çais précité. Au lieu d'être rectangulaire aplatie, la section du canal pourrait également être carrée, par exemple un carré de 150 P de côté, ou bien circulaire, par exemple d'un diamètre compris entre 25 et 100 pi, la longueur du canal étant telle que compte tenu des turbulences éventuel- lement provoquées par la disposition des entrées et sorties de liquide, la zone traversée par le faisceau lumineux soit parcourue par un écoulement de type laminaire. En général, une longueur de quelques centimètres est suffisante. On se réfère aux figures 3 et 4. Dans cette seconde forme de réalisation, le canal 21 est réalisé à l'intérieur d'un tube de verre 22 d'un diamètre interne de 150 Ce tube de verre cylindrique se raccorde à une par- tie évasée 23 en forme d'entonnoir dont le diamètre décrof t progressivement vers le tube 22 et dont l'extrémité de plus grand diamètre se raccorde à une chambre cylindrique 24. A l'intérieur de cette chambre 24, et concentriquement à l'axe commun de l'ensemble, se trouve disposée une aiguil- le annulaire, c'est-à-dire une aiguille présentant une paroi périphérique externe cylindrique 26 et une paroi périphëri-- que interne 25 définissant entre elles un espace annulaire étroit 27 ouvert par son extrémité antérieure, fermé à son extrémité postérieure et recevant au voisinage de celles-ci une amenée de flux de globules rouges 28 en suspension con- centrée dans un milieu liquide convenable. La paroi interne 25 se prolonge hors de la chambre 24, à son extrémité postérieure, et est reliée à une tubu- lure d'amenée de liquide. Ce même liquide est également introduit dans la chambre 24 par un passage 29, les débits de liquide à travers l'espace interne 30 de la paroi 25 et à travers l'espace périphérique 31 de la chambre 24 étant tel qu'aucune turbulence notable ne tend à se produire au niveau de l'extrémité antérieure de l'aiguille 24, 25 de façon à créer au voisinage de l'extrémité antérieure de l'aiguille une zone d'écoulement pratiquement laminaire, cet écoulement laminaire se poursuivant à l'intérieur du tube 22. Pour la mesure, on établit donc dans l'espace 30 et dans l'espace 31 un débit de liquide dépourvu de globules rouges de façon à tendre à provoquer dans la partie tronco- nique 23 et le tube 22 un écoulement de nature laminaire et l'on établit simultanément un flux de globules rouges à travers l'espace annulaire 27 qui réalise alors dans le li- quide une suspension annulaire 32 de globules rouges espa- cée à la fois de l'axe du tube 22 et de la paroi de celui- ci; comme on le voit notamment sur la figure 4, les globu- les rouges restent concentrées dans cette portion annulai- re 32 de la section dans laquelle le gradient de vitesse est important. On obtient de cette façon sur l'écran une image de diffraction encore plus nette et précise permet- tant des mesures d'une très grande précision. Bien entendu, l'injection de globules rouges dans une portion convenable de la section de passage du canal peut être effectuée selon des géométries différentes. Ainsi, dans l'exemple de la figure 1, il serait possible, au lieu d'injecter les globules rouges dans une chambre de mélange 14 en amont du canal 2 de façon à obte- nir une suspension homogène, d'injecter au contraire les globules rouges à l'intérieur de la chambre 1, dans le canal, de façon que les globules viennent se disposer se- lon une configuration plane de faible épaisseur disposée par exemple à mi-distance entre la paroi interne de la pla- que de verre supérieure 3 et la partie centrale du canal 2. Il va de soi que l'homme de l'art pourra faire va- rier, non seulement la géométrie de la section du canal, mais encore la dimension de celle-ci ainsi que la valeur du débit de suspension passant à travers le canal. Les va- leurs correspondantes peuvent être obtenues par des expé- riences simples, étant entendu que l'épaisseur du canal, c'est-à-dire la distance parcourue par le faisceau à l'in- térieur du canal, doit varier en fonction de l'état de dilution que l'on désire obtenir, comme cela est d'ail- leurs connu. La distance parcourue par le faisceau dans la solu- tion contenant effectivement des érythrocytes est au moins égale i 25 p. La valeur supérieure de cette distance est de préférence limitée à 150 y, ceci principalement pour éviter des débits trop importants, une dilution trop impor- tante, ainsi que les difficultés qu'il y a à maintenir un écoulement laminaire dans des sections de passage trop im- portantes, mais il va de soi que ces valeurs, indiquées pour des raisons de pratique, ne sont pas critiques d'un point de vue théorique. La dilution est de préférence telle, qu'environ 80 à 90UI de la section droite du faisceau lumineux soient in- terceptés par les particules. Enfin, les formes de réalisation de l'invention qui ont été décrites de façon détaillée sont simplement des formes de réalisation préférées et il va de soi que le pro- cédé peut être mis en oeuvre grâce à d'autres moyens. Ainsi, on a pu constater, de façon surprenante, qu'il était possible de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention dans les dispositifs tels que ceux du brevet français précité, à condition d'immobiliser les parois ro- tatives de celui-ci et de forcer le liquide à s'écouler avec le débit voulu à travers le dispositif. Le canal peut être aussi bien curviligne que rec- tiligne. Bien que l'invention ait été décrite à propos d'une forme de réalisation particulière, il est bien enten- du qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut lui ap- porter diverses modifications de forme sans pour cela l'éloigner ni de son cadre, ni de son esprit. REVENDICATIONS 1. Procédé pour mesurer la capacité de déformation d'objets microscopiques, et notamment de cellules vivantes telles que les globules rouges du sang, en suspension dans un liquide à travers lequel on fait passer un faisceau pa- rallèle de lumière pour observer la figure de diffraction reproduite par les objets microscopiques afin de mesurer les dimensions caractéristiques des anneaux de diffraction, caractérisé par le fait que l'on fait passer ce liquide dans un canal tubulaire à paroi fixe dans une direction sensiblement perpendiculaire audit faisceau, sous forme d'un écoulement laminaire ou proche de l'état laminaire, ledit faisceau traversant ledit canal. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on réalise une suspension homogène des- dits objets dans le liquide et que l'on amène ledit liquide à passer sous forme d'écoulement laminaire ou proche de l'état laminaire à travers ledit canal. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on amène le liquide, dépourvu d'objets microscopiques, à s'écouler à travers le canal et que l'on injecte dans le liquide, au niveau du canal, et en un em- placement de surface limitée de la section de passage, un flux d'objets microscopiques dans une direction voisine ou identique à la direction d'écoulement du liquide de sorte que lesdits objets microscopiques défilent à travers la trajectoire du faisceau lumineux en étant contenus dans cette partie de la section de passage. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on réalise ladite injection dans une partie de section de passage de forme annulaire. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisé par le fait que la section de pas- sage du canal est supérieure à 0,0005 mm2. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, caractérisé par le fait que le débit de liqui- de à travers le canal est supérieur à 0,1 ml/an. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à-6, caractérisé par le fait que l'épaisseur de la solu- tion contenant effectivement des particules et parcourue par le faisceau lumineux est supérieure à 25 À. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que l'on modifie progressive- ment, pendant la mesure, une ou plusieurs des caractéristi- ques du milieu liquide. 9. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé se- lon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu'il comporte un canal à paroi transparente (2, 22) d'une longueur suffisante pour établir ou maintenir un flux de liquide laminaire ou proche de l'état laminaire, l'entrée dudit canal étant reliée à des moyens permettant l'amenée d'un liquide sous une pression suffisante pour établir ledit écoulement, ledit dispositif comportant d'au- tre part des moyens (9) pour faire passer à travers ledit can canal, et dans une direction sensiblement perpendiculaire à la direction d'écoulement, un faisceau lumineux destiné à fournir une image de diffraction. 10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé par le fait qu'il comporte des moyens (14, 15) pour réaliser, en amont dudit canal (2), une suspension homogène desdits objets microscopiques dans le liquide. 11. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé par le fait qu'il comporte, au niveau du canal (22), des moyens d'introduction (25, 26) d'un flux d'objets micros- copiques dans une partie (32) de surface limitée de la sec- tion du canal, ceci dans une direction sensiblement paral- lèle à la direction d'écoulement. 2484O77 12. Dispositif selon la revendication 11, caracté- risé par le fait que lesdits moyens d'introduction com- prennent une aiguille annulaire (25, 26). orientée dans le sens de l'écoulement et débouchant dans la section du canal. 13. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 9 à 12, caractérisé par le fait que ledit canal (2) présente une section transversale carrée ou rectangu- laire. 14. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 9 à 12, caractérisé par le fait que ledit canal présente une section circulaire. 15. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 9 à 14, caractérisé par le fait qu'il comporte des moyens (16, 18, 19, 20) pour modifier progressivement l'un au moins des paramètres de la suspension pendant la mesure.