Brevet FR2482131A1 — publié le 19811113

La présente invention concerne une nouvelle protéase alcaline M13 qui est utile pour la prévention de la carie dentaire, un procédé pour sa préparation et une composition prophylactique contre la carie dentaire contenant la protéase alcaline M3. Divers médicaments ont été proposés jusqueà présent et utilisés pour la prévention et le traitement de la carie dentaire, mais on a encore souhaité la mise au point de nouveaux médicaments améliorés. On considère généralement que la carie dentaire semble apparaître dans les cinq stades suivants - (1) Des micro-organismes cariogènes, tels que Streptococcus mutans ou Streptococcus.sanuis poussent dans la cavité orale en prenant comme source nutritive le saccharose dérivé des aliments, etc. (2) Les micro-organismes cariogènes produisent de la glucosyltransférase (ciaprès dénommée "GTF"') pendant leur croissance. (3) Le saccharose contenu dans la cavité orale est transformé en polysaccharides solubles ou insolubles dans l'eau, tels que le dextrane sous l'action de la GTF. (4.) Les polysaccharides ainsi produits, en parti- culier les polysaccharides insolubles dans l'eau, recouvrent la surface des micro-organismes cariogènes et d'autres bactéries et adhèrent enfin sur la surface de la dent pour former une plaque dentaire. (5) Les bactéries contenues dans la plaque dentaire produisent des acides tels que l'acide lactique, en utilisant les saccharides, et les acides ainsi produits lysent l'émail de la dent, ce qui semble aboutir à la carie dentaire, En conséquence, on pourra empêcher la carie dentaire en inhibant le processus à l'un quelconque des cinq stades ci-dessus. On a proposé dans 'Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 3.751.561 et le brevet britannique n0 1.291.922 de détruire ou éliminer les résidus alimentaires ou la plaque dentaire en utilisant des protéases, en particulier la protéase neutre, mais ces protéases manifestent peu d'effet pour inhiber la carie dentaire. 248213 1 A la suite de recherches approfondies, la demanderesse a découvert qu'une certaine protéase alcaline est efficace pour inhiber l'activité de la GTF ci-dessus qui est l'un des facteurs de formation de la carie dentaire. Un objet de la présente invention est de proposer une nouvelle protéase alcaline utile pour la prévention de la carie dentaire. Un autre objet de l'invention est de proposer un procédé pour la production de la nouvelle protéase alcaline. Un autre objet de l'invention est de proposer une composition prophylac- tique contre la carie dentaire contenant ladite protéase alcaline. Ces objets et avantages de l'invention et d'autres apparaîtront à l'homme de l'art à la lecture de la description qui va suivre. La nouvelle protéase alcaline de la présente invention présente d'excellentes activités pour inhiber la carie dentaire et a été obtenue pour la première fois par la demanderesse par culture d'un certain microorganisme et a été dénommée "protéase alcaline M3". Les propriétés physiques et chimiques de la protéase alcaline M3 sont expliquées ci-dessous en référence aux dessins annexés. La figure 1 représente la relation entre la gamme de pH et l'activité de protéase de la protéase alcaline M13. La figure 2 représente la relation entre la gamme de pH et l'activité relative résiduelle (c'est-à-dire la stabilité au pH de la protéase alcaline c4). La figure 3 représente la relation entre la température et l'activité relative (c'est-à-dire la gamme de température dans laquelle la protéase alcaline M3 manifeste son activité). La figure 4 représente la relation entre la température et l'activité relative résiduelle (c'est-à-dire la stabilité thermique de la protéase alcaline %3). La figure 5 représente le spectre d'absorption UV de la protéase alcaline 143. La figure 6 représente le spectre d'absorption IR de la protéase alcaline 143. Dans les figures 1 et 2, les symboles ont les significations suivantes: (1) = tampon au phosphate, (2) = tampon tris-HCl, (3) = tampon Sbrensen et (4) = tampon au citrate. Ces solutions tampons sont utilisées à une concentration de 0,05 M dans la figure 1, et 0,02 M dans la figure 2. 2 48 2 13 1 (1) Activités Cette enzyme est une protéase alcaline qui peut hydrolyser la caséine et inhibe l'activité de la GTF. Cette enzyme n'a sensiblement pas d'activité cyto- lytique des micro-organismes cariogènes et, de ce pointde vue, elle est différente de l'enzyme cytolytique décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 3.929.579. (2) pH optimal et stabilité au pH: Comme le montre la figure 1 ci-annexée, lorsque-l'on utilise la caséine comme substrat, cette enzyme a un pH optimal de 9 à 12,5. De plus, comme le montre la figure 2, lorsque cette enzyme est maintenue dans une solution tampon (pH 4-9) à 370C pendant 6 jours, il resteenviron 50% ou plus de l'activité de protéase. (3) Température optimale et stabilité thermique Comme le montre la figure 3 ci-annexée, lorsque l'on utilise la caséine comme substrat, cette enzyme présente une température optimale à environ 65 C. De plus, comme le montre la figure 4, même lorsque l'on chauffe à 55 C pendant 10 min une solution aqueuse de c7ette enzyme, l'activité de protéase n'est pas perdue. (4) Conditions d'inactivation Comme le montre la figure 4 ci- annexée, lorsque l'on chauffe à 60C pendant 10 min une solution aqueuse de cette enzyme, environ 50% ou plus de l'activité de protéase snt perdus et,lorsque l'on chauffe la solution aqueuse à 650C pendant 10 min, plus de 90% de l'activité de protéase sont perdus. (5) Effets de divers additifs L'activité de protéase de cette enzyme est influencée par divers additifs, tels que les inhibiteurs et les ions métalli- ques, comme le montre le tableau I ci-après. Comme il est clair dans le tableau I ci-après, l'activité de protéase de cette enzyme n'est sensiblement pas inhibée par l'acide iodoacétique, le DFP, FeS04 et l'EDTA en quan- tité de 10-3 M, mais elle est totalement inhibée par le NBS en quan- tité de 10 4M. En outre, lorsque l'on ajoute en quantité de 10 M d'autres additifs que ceux indiqués dans le tableau I ci-après, tels que 8-hydroxyquinoléine, oxalate de potassium, diéthyldithio- carbamate de sodium, pyrophosphate de sodium, Na2HAsO4e FCH2COONa, NR2H, HC1, le thiosemicarbazide, NH2NH2, HCl, 1/2H2S 04 NaHSO3, HSCH2CH20H, le glutathion, le chlorhydrate de L-cystéine, le 2,3- dimercapto-l-propanol, NaF, un inhibiteur de trypsine, MgC12, Li2SO4 et Ag2SO4, l'activité relative de protéase de cette enzyme est de l'ordre de 85 à 110. Autrement dit, l'activité de protéase de cette enzyme n'est presque pas influencée par ces additifs. (6) Point isoélectrique: Le point isolélectriquq de cette enzyme est à environ pH 9,5 (mesuré en utilisant un support ampholite à pH 2-11,5, fabriqué par LKB Produkter AB, à 300 V pendant 40 h). (7) Poids moléculaire: Cette enzyme a un poids moléculaire d'environ 1,7. 10 (mesuré par la méthode de filtration sur gel en utilisant le "Sephadex G-75" fabriqué par la Société Pharmacia Fine Chemicals). (8) Spectre d'absorption UV: Cette enzyme présente le spectre d'absorption UV représenté à la figure 5 ci-annexée. (9) Spectre d'absorption IR: Cette enzyme présente le spectre d'absorption IR représenté à la figure 6 ci-annexée. (10) Procédé de purification: On peut purifier cette enzyme de la manière décrite dans l'exemple ci-après. (11) Mesure des activités: (A) Activité de protéase: On ajoute 1 ml d'une solution aqueuse convenablement diluée de protéase alcaline % à 2 ml d'une solution à 0,6% de caséine dans le tampon tris-HCl 0,05 M (pH 8,0), et on maintient le mélange à 37 C pendant 10 min, et on ajoute 3 ml d'une solution d'un agent d'arrêt de la réaction (acide trichioroacétique 0,01 M - acétate de sodium 0,02 M acide acétique 0,03 M). Après séparation du précipité résultant par filtration, on mesure l'absorption du filtrat à 275 nm. D'après la valeur résultante UV275, on calcule la quantité de tyrosine à la lumière de la valeur UV275 d'une solution étalon de tyrosine. Une unité d'activité de protéase est définie comme la quantité de l'enzyme qui est nécessaire pour une augmentation de 1 y de tyrosine en 1 min. (B) Activité inhibitrice de GTF: Réactifs (a) solution de GTF On cultive une souche K1R ou une souche AHT de Streptococcus mutans sur un milieu trypticase-tryptose-extrait de levure (pH 7,0) a 37 C pendant 24 h à l'état stationnaire. On centri- fuge le bouillon de culture et on ajoute à la liqueur surnageante une solution de sulfate d'ammonium à 50%. On sépare le précipité résultant et on le dissout dans un tampon au phosphate 0,05 M (pH 6,8), puis on dialyse contre l'eau. On utilise la solution résultante comme solution de GTF. (b) Solution saccharose à 5% - tampon au phosphate M/15 (pH 6,8). (c) Solution prot4ase alcaline M3 - tampon au phosphate M/15 (pH 6,8). (d) Solution de tampon au phosphate M/15 (pH 6,8). (e) Solution d'anthrone: On dissout 200 mg d'anthrone recristallisée dans 100 ml d'acide sulfurique à 95% en refroidissant, et on ajoute 20 ml d'eau pour donner une solution d'anthrone. Mode opératoire On maintient à 370C pendant 18 h un mélange des réactifs: 0,1 ml de (a), 2,0 ml de (b) et 0,05 ml de (c), et on ajoute de l'éthanol pour être à une concentration de 70%, et on laisse reposer le mélange résultant à 4C pendant 2 h. On sépare par centrifugation le précipité résultant (polysaccharides) et on le dissout dans 5,0 ml du réactif (d), puis on traite par l'éthanol de la meme manière que décrit ci-dessus. On dissout à nouveau le précipité résultant dans 5,0 ml du réactif (d). A 0,1 ml de la solu- tion, on ajoute 6,0 ml du réactif (e) et on agite bien le mélange et on le chauffe à 100C pendant 10 min. Après refroidissement, on mesure l'absorption de la solution à 620 nm, et on calcule la quan- tité de polysaccharides. L'activité de GTF est représentée par la quantité de polysaccharides produits (y/ml) et l'activité inhibitrice de GTF est calculée par l'équation suivante. Taux d'inhibition (M) = A x 100 A dans laquelle A est l'activité de la GTF lorsque l'on n'ajoute pas de protéase alcaline M3, et B est l'activité de la GTF lorsque l'on ajoute la protéase alcaline M3. Ces propriétés de la protéase alcaline M3 de l'invention sont comparées avec celles des protêases alcalines connues ayant un pll optimal de 10 ou plus,dans le tableau Il ci-après. Parmi les protéases alcalines connues, l'enzyme décrite dans la référence 5, la demande de brevet japonais mise à la dispo- sition du public n0 92582/1973, est la plus semblableà la protéase alcaline M3 de la présente invention, mais elle diffère de l'autre par l'effet du DFP et le point isoélectrique. Outre les références bibliographiques indiquées au tableau II ci-après, de nombreuses références décrivent diverses protéases alcalines, mais elles se distinguent également de la protéase alcaline M3 de l'invention. Par exemple, les protéases alcalines décrites dans les publications de brevets japonais n0 10193/1966, n0 10755/1969 et n0 5038/19è1 présentent une faible activité de protéase à pH 12,5 et sont différentes sur ce point de la protéase alcaline M3 de l'invention, les protéases alcalines décrites dans les publications de brevets japonais n 9230/1970 et n 41594/1971 et la demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 71191/1974 ont leur activité inhibée par le DFP et/ou l'acide iodoacétique et diffèrent sur ce point de la protéase alcaline M de l'invention. Ainsi donc, la protéase alcaline M3 de la présente invention se distingue des protéases alcalines connues par les propriétés physico-chimiques mentionnées ci-dessus et constitue une nouvelle enzyme. En particulier, la protéase alcaline M3 de l'inven- tion se distingue des protéases alcalines connues par les propriétés suivantes. (i) Elle a un pH optimal dans une gamme fortement alcaline de 9 à 12,5. (ii) L'activité n'est sensiblement pas inhibée par l'une quelconque des substances suivantes FeS04, le DFP, l'EDTA et l'acide iodoacétique. (iii) Elle a une activité inhibitrice de la GTF. (iv) Elle a le poids moléculaire le plus faible parmi les protéases alcalines. La nouvelle protéase alcaline M3 de la présente invention peut être produite par culture d'un micro-organisme du genre Streptomyces capable de produire la protéase alcaline 3 et ensuite récolte de la protéase alcaline M3 à partir du bouillon de culture. Un exemple convenable du micro-organisme du genre Streptomyces est la souche Streptomyces globisporus B-12829 qui a été déposée à l'American Type Culture Collection aux Etats-Unis d'Amérique sous le n ATCC 21553 et également au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology (BIKOKEN) au Japon sous le n FERM-P 596. Les propriétés physiologi- ques et morphologiques et les conditions de culture de ce micro- organisme sont décrites en détail dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3.929.579. La récolte de la protéase alcaline M3 du bouillon de culture peut être effectuée par une combinaison appropriée de traitement par l'Amberlite CG50 (de la Société Rohm & Haas Co.), relargage par le sulfate d'ammonium, traitement par le CM Sephadex C-25 (de la Société Pharmacia Fine Chemicals), traitement par la carboxyméthylcellulose (CMC), ou analogues. La souche Streptomyces globisporus B-1829 ci-dessus mentionnée produit également,en plus de la protéase alcaline M, une enzyme cytolytique des micro-organismes cariogènes, mais ces enzymes peuvent être séparées l'une de l'autre en appliquant le mélange sur une colonne de CM Sephadex C-25 ou de CMC. La protéase alcaline 143 de la présente invention possède d'excellentes activités prophylactiques contre la carie dentaire et peut être appliquée aux dents des humains en vue de la prévention de la carie dentaire par des techniques classiques, avec des types classiques de doses unitaires ou des supports ou diluants classiques. Les supports ou diluants classiques sont par exemple l'eau, la poudre dentifrice, la pâte dentifrice, la gomme à macher, la pommade, etc. L'enzyme de la présente invention est incorporée dans les compositions en une quantité de 0,001 à 5% en poids, de préférence de 0,05 à 1% en poids. Dans la préparation d'une p&te dentifrice et d'une poudre dentifrice contenant l'enzyme de l'invention, on utilise des véhi- cules classiques,à moins qu'ils donnent des effets sensiblement indésirables sur l'activité de l'enzyme. Un agent de polissage insoluble dans l'eau approprié peut etre contenu dans la pâte ou poudre dentifrice. Des exemples convenables des agents de polissage sont le phosphate dicalcique, le phosphate tricalcique, etc. Ces agents de polissage constituent ordinairement une proportion prépon- dérante en poids des ingrédients solides. La teneur des agents de polissage est de préférence d'environ 30 à 60% en poids de la compo- sition totale dans la pâte dentifrice et 85 à 95% en poids dans la poudre dentifrice. Dans la préparation d'une pâte dentifrice, on peut également ajouter quelques plastifiants. Des exemples convenables des plastifiants sont l'eau, le glycérol, le sorbitol, le propylène- 2 4 82 13 1 glycol, le monostéarate de glycérol, la vaseline de pétrole, l'alcool cétylique, etc. ou leurs mélanges. On incorpore de préfé- rence dans la pâte dentaire un agent gélifiant, tel que carboxy- méthylcellulose de sodium, hydroxyéthylcellulose, polyvinylpyrroli- done, gomme adragante, etc. et on peut également y incorporer facultativement d'autres additifs, tels qu'arômes, édulcorants et colorants. Dans la préparation d'une gomme à mâcher contenant l'enzyme de l'invention, on peut utiliser une base classique pour gomme à mâcher, telle que résine de chialé, acétate de polyvinyle, etc. On peut également incorporer dans la gomme à mâcher d'autres véhicules classiques, tels que des plastifiants, des adoucissants, des édulcorants, des arOmes et des colorants, Un autre moyen d'utiliser l'enzyme de l'invention est une forme de pommade. On applique sur les dents à traiter la pommade contenant l'enzyme de l'invention, puis on frotte avec le doigt ou avec une brosse a dent. On peut préparer la pommade par un procédé classique en utilisant des véhicules classiques que l'on peut appliquer sur la dent à moins qu'ils aient une action inhibitrice ou destructrice sur l'enzyme de l'invention. Des exemples conve- nables de substances à utiliser comme bases de pommade sont la carboxyméthylcellulose de sodium, l'hydroxyéthylcellulose et la base pour pate dentaire fabriquée par la Société Squibb Co., Ltd. sous le nom de "Plastibase 50 W", qui peut former une pommade gélifiée ou crémeuse. On peut également utiliser l'enzyme de l'invention sous la forme d'une tablette ou d'une pastille à mâcher. Lorsque l'on mâche ou l'on garde dans la bouche la tablette ou pastille à micher contenant l'enzyme de l'invention, l'enzyme peut être suffisamment en contact avec les dents pendant une longue durée. La tablette ou la pastille à mâcher peut être préparée par des techniques classiques en utilisant des véhicules classiques, tels que mannitol et sorbi- tol, et d'autres agents lubrifiants, édulcorants, colorants clas- siques, etc. On peut également mélanger l'enzyme de l'invention avec des confiseries, telles que bonbons, gateaux,etc. En outre, l'enzyme de l'invention peut être administrée en mélange avec des aliments ou des boissons. Dans ce cas, l'enzyme peut être mélangée avec les aliments ou la boisson avant ou après leur traitement. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Préparation de la protéase alcaline 13: - On obtient un bouillon de culture en cultivant la souche Streptomyces globisporus B-1829 (ATCC 21553) dans 70 1 d'un milieu de culture (pH 7,5) consistant en 2% de dextrine, 0,5% de poudre de soja, 0,25% de peptone, 0,5% de Na 2HPO4, 0, 1% de KH 2PO4 0,1% de MgSO4 et 0,5% de NaCl,de la même façon que décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 3.929.579, et l'on filtre le bouillon de culture ainsi obtenu au moyen d'un filtre-presse pour obtenir 70 1 de filtrat. On ajoute au filtrat 2,8 kg de résine Amberlite CG-50 (forme H. fabriquée par la Société Roham & Haas Co.) et on agite le mélange pendant 1 h pour adsorber l'enzyme sur la résine. On sépare la résine par centrifugation. On ajoute à la résine ayant adsorbé l'enzyme 10 litres de Na2HPO4 O,2 M et on maintient ensuite le mélange à pH 7,5 par l'ammoniaque aqueuse et on agite pendant 1 h, ce qui élue l'enzyme. On obtient 12 litres d'éluat auquel on ajoute du sulfate d'ammonium solide jusqu'à 60% de la saturation et on laisse reposer le mélange à 40C pendant une nuit. On sépare par filtration le précipité résultant et on le dissout dans 1,8 litre d'eau du robinet pour obtenir une solution aqueuse contenant les enzymes. On ajuste la solution à pH 2,0 par HCl N et on agite à la température ambiante pendant 30 min. Après neutralisation à pH 6,0 par NaOH N, on dialyse la solution contre l'eau courante pour obtenir 2,3 litres d'une solution. On fait passer la solution ainsi obtenue sur une colonne de 4 x 40 cm garnie de CM Sephadex C-25 (forme Na +) et on lave la colonne à l'eau désionisée jusqu'à ce que l'absorption à 280 nm n'apparaisse plus. On élue ensuite la colonne avec un gradient linéaire de concentration en utilisant 3 litres d'eau et 3 litres 248 2 131 de tampon au phosphate 0,2 M (pH 7,0). On recueille les fractions d'environ 400 ml qui sont éludes à la concentration du tampon d'environ 0, 03 à 0,05 M. On désionise les fractions recueillies et on concentre avec un filtre Dia-filter AS 201 de la Société Bio Engineering Co., Ltd. On obtient environ50 ml de solution concen- trée que l'on lyophilise pour obtenir 0,7 g de protéase alcaline M3. L'enzyme a une activité de protéase de 730 U/mg. D'après les résultats d'une analyse d'aminoacides de cette enzyme, elle est composée des aminoacides indiqués dans le tableau III ci-après, dans lequel on donne également à titre compa- ratif lés données pour la protéase alcaline décrite dans la demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 92582/1973. Expérience 1 Activité inhibitrice de la GTF: On mesure de la manière décrite précédemment l'activité inhibitrice contre la GTF de la protéase alcaline M3 et des protéases connues produites par la souche K -R et la souche AHT de Streptococcus mutans. Les protéases sont utilisées en quantité de U/ml. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau IV ci-après. Comme il ressort clairement du tableau IV ci-après, la protéase alcaline 3 de la présente invention présente une forte activité inhibitrice de la GTF. Comme mentionné précédemment, la mesure de l'activité inhibitrice de la GTF est effectuée à pH 6,8, auquel une protéase neutre présente une activité élevée, néanmoins la protéase neutre ne présente presque pas d'activité inhibitrice de la GTF. De plus, les protéases alcalines connues, pronase et a-chymotrypsine,présentent seulement une faible activité inhibi- trice de la GTF. Expérience 2 Inhibition de la carie dentaire: On nourrit un groupe de hamsters dorés âgés de trois semaines (10 animaux) avec le régime cariogène n0 2000 (voir Archives of Oral Biology, 9, page 377-400, 1964) pendant une semaine. On inocule aux hamsters dans les deux joues 0,1 ml d'une culture de la souche Streptococcus murant AHT. On nourrit encore les hamsters avec le régime cariogène n 2000 ci-dessus contenant des protéases pendant quatre semaines. Ensuite, on évalue la carie dentaire de la molaire des hamsters par la méthode de P.H. Keyes et col. (voir J. Dental Research, 23, pages 439-444, 1944). Le numéro d'échantillon de la molaire est masqué aux personnes qui observent les résultats. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau V ci-après. Comme il ressort des données du tableau V ci-après, la protéase alcaline 3 de la présente invention présente une excellente activité inhibitrice de la carie dentaire, mais les protéases connues, par contre, ne présentent pas d'activité inhi- bitrice de la carie dentaire. EXEMPLE 2 On prépare de la manière habituelle une pate dentaire ayant la composition suivante. Glycérol Carboxyméthylcellulose de sodium Eau distillée Phosphate dicalcique Carbonate de calcium Saccharine Arôme Protéase alcaline %3 obtenue a l'exemple 1 Total................ % en poids ,70 0,95 ,15 46,00- ,80 0,25 0,65 0,005 ,00 EXEMPLE 3 On prépare de la manière habituelle une poudre dentaire ayant la composition suivante. 248213 1 % en poids Laurylsulfate de sodium 0,3 Carboxyméthylcellulose de sodium 1 Hydrogénophosphate disodique 2 Saccharine 0>2 Arôme 1,8 Protéase alcaline M3 obtenue à l'exemple 1 0,5 Phosphate dicalcique q.s.p. 100 Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. TABLETU I Additifs *1 Activité Additifs *1 Activité relative (%) relative (%) -_ 100 CaCI2 78 , 2 Acide succinique 113 BaC12 79 Thiourée 119 CoC1 2 70 Acide iodoacétique 118 ZnSO4 69 Na2HAsO4 111 NiC12 62 Chlorhydrate de 116 FeSO4 95 semicarbazide Acide L-ascorbique 110 Fe(S0)3 95 e2 (S43 NaN3 111 Pb(CH3COO)2 64 DFP *2 86 Hg(CH3COO)2 46 NBS *3 (10 M) O CdC12 42 NBS *3 (10-3 2 NBS *3 (10 3M) 85 CuC12 64 MnC12 61 EDTA *4 87 * 1) La quantité des additifs est 10 3M * 2) DFP = fluorophosphate de diisopropyle * 3) NBS = N-bromosuccinimide * 4) EDTA = éthylènediaminetétraacétate N -A TABLFAU II Protéase Protéases alcalines décrites dans la Propriétés physicochimiques alcaline 3 littérature: * 1 1 2 3 4 5 pH optimal 9-12,5 10,5 11 10>7-11 10,5 11-12 Température optimale ( C) 65 40-50 40-45 55 50-70 - 60 Activité à 6500 Activité à 65 C x 100M 100 0 0 O4) - 100 Activité à la température optimale x (%) Activité à pH 12,5 x 100(o%)00 Effet de l'acide iodoacétique non.. . inhibée Point isoélectrique e 9,5 - - 9;75 - 10,6 Poids moléculaire _ 1,7. 104 - - 25000 19500- 17500 *1) Littérature: 1 = brevet japonais publié n 21786/1971; 2 = brevet japonais publié n 21787/1971; 3 = brevet japonais publié n 4501/1972 et brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 838 009; 4 = brevet japonais publié n 9870/75 et brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 713 983; 5 = demande de brevet japonais mise a la disposition du public n 92582/1973 *2) DFP = fluorophosphate de diisopropyle *3) EDTA = éthylènediaminetétraacétate *4) Le symbole "-" signifie qu'il n'y a pas de données dans la littérature oo ce TABLEAU III Protéase Protéase alcaline Aminoacides alcaline de la demande-de M3 brevet japonais 92582/1973 Acide aspartique 15 19 Thréonine 21 il Serine 24 21 Proline 5 10 Acide glutamique 7 9 Glycine 27 24 Alanine 13 25 Valine 15 17 Cystine2 0 Méthionine t 2 Isoleucine 4 6 Leucine 8 13 Tyrosine 8 5 Phénylalanine 6 1 Tryptophane 2 2 Lysine 2 3 Histidine 1 3 Arginine 8 5 | Poids molculaire 17 400 17 500 1.poids moléculaire j_17 40 0 17 500 TABLEAU IV GTF Protéases Protéases Souche K1-R Souche AHT (pH optimal) - Activité Taux Activité Taux enzymatique d'inhibition (%) enzymatique d'inhibition (%) - Témoin 577,5 580,0 - Protéase alcaline 3 160,4 72,3 135,0 76,8 (9-12,5) Pronase 421,3 27,0 418,5 27,8 (8,o) a-Chymotrypsine 432,8 25;1 429,0 26,0 (7,8) Proctase 489,0 15,3 498,5 14,0 (2,6) Papaine 589,4 -2,0 579,4 0 (5, 0) Protéase neutre * 520,0 10,0 532,4 8,2 (7,0) *) Enzyme produite par Bacillus subtilis -J Pa ro M) TABLEAU V Protéases Inhibition de la carie dentairé Type Type otml Quantité Note Taux d'inhi- (pH optimal)(U/g) bition *2 I__ _ _ _ _ (%) Protéase 600 62>81 + 7,12*3 42,5 alcaline M3 *3 (9-12,5) 1200 41,29 + 403 62,2 2400 10,16 + 3,24*3 90,7 Pronase 600 109,15 + 8,43*4 0,1 (830) *4 1200 93,55 + 6,98 14,4 *4 a-Cymo- 600 109,82 + 8,124 -0,5 trypsine *4 (7,8) 1200 99,60 + 6,74 8,8 *4 Proctase 600 108,93 + 6,23 4 0,3 (2,6) d (2,6) 1200 110,54 + 5,38*4 -1,2 Papaïne 600 110,13 + 7)82 *4 -0 8 (5,0) *4 1200 115,20 + 8,684 -5,5 Protéase 600 110,23 + 7,84 4 -0>9 neutre *1 *4 (7,0) 1200 110,00 + 8)23*4 -0,7 *4. - (témoin) - 109>24 + 4,194 (0) Notes: *1) Enzyme produite par Bacillus subtilis *2) Le taux d'inhition est calculé par l'équation suivante: Taux d'inhibition = A -B x 100 A A: Note du témoin B: Note avec addition de la protéase *3) Différence significative avec le témoin, P R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Protéase alcaline M3, caractérisée en ce qu'elle possède les propriétés physiques et chimiques suivantes: (1) Activités: Elle peut hydrolyser la caséine inhibe l'activité de la glucosyltransférase. (2) pH optimal et stabilité au pH: Elle a une gamme de pH optimale de 9 a 12,5 (substrat: caséine) etlorsqu'on la maintient dans une solution tampon (pH 4-9) à 37 C pendant 6 jours, il reste environ 50% ou plus de l'activité de protéase. (3) Température optimale et stabilité thermique: Elle a une température optimale d'environ 65 C (substrat: caséine) et, mme lorsqu'on maintient une solution de cette enzyme à 55 C pendant 10 min, elle est stable. (4) Conditions d'inactivation: Lorsque l'on chauffe une solution aqueuse de cette enzyme à 60 C pendant 10 min, environ % de l'activité de protéase sont perdus et, lorsque l'on chauffe la solution aqueuse à 65 C pendant 10 min, 90% ou plus de l'activité sont perdus. (5) Effets de divers additifs: L'activité de protéase de cette enzyme est totalement inhibée par le N-bromosuccinimide 4M, mais elle n'est presque pas inhibée par l'acide iodoacétique, le fluorophosphate de diisopropyle, l'éthylènediaminetétraacétate -3 et PeSO 10 M. (6) Point isoélectrique: Environ pH 9,5. (7) Poids moléculaire: Environ 1,7 x 104. 2. Procédé pour la préparation de la protéase alcaline M3 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un microorganisme du genre Streptomyces capable de produire la protéase alcaline et à récolter ensuite la protéase alcaline % à partir du bouillon de culture. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le microorganisme est une souche de l'espèce Streptomyces globisporus. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le micro-organisme est une souche de Streptomyces globisporus B-1829 (ATCC 21553). 5. Composition pour prévenir la carie dentaire, caracté- risée en ce qu'elle contient de la protéase alcaline M3 en mélange avec un support ou diluant classique. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,001 à 5% en poids de protéase alcaline M3. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'une pate dentifrice contenant 30 à 60% en poids d'un agent de polissage. 8. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'une poudre dentifrice contenant 85 à 95% en poids d'un agent de polissage.